CN114007653B - 药物递送载体以及使用其的药物制剂 - Google Patents
药物递送载体以及使用其的药物制剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114007653B CN114007653B CN202080022099.9A CN202080022099A CN114007653B CN 114007653 B CN114007653 B CN 114007653B CN 202080022099 A CN202080022099 A CN 202080022099A CN 114007653 B CN114007653 B CN 114007653B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- liposome
- sirna
- drug
- polyethylene glycol
- dspe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 68
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims abstract description 246
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 132
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 121
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims abstract description 52
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 25
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 12
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 184
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 180
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 107
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 107
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 86
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 84
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 57
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 claims description 55
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 53
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 52
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 51
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 51
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 51
- LVNGJLRDBYCPGB-LDLOPFEMSA-N (R)-1,2-distearoylphosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[NH3+])OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC LVNGJLRDBYCPGB-LDLOPFEMSA-N 0.000 claims description 33
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 26
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 25
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 20
- -1 Cationic lipid Chemical class 0.000 claims description 16
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 14
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 11
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 claims description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 9
- KWVJHCQQUFDPLU-YEUCEMRASA-N 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KWVJHCQQUFDPLU-YEUCEMRASA-N 0.000 claims description 8
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 7
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 6
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 claims description 5
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 claims description 5
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims description 5
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 claims description 5
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 claims description 5
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 5
- 201000007983 brain glioma Diseases 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 33
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 abstract description 22
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 abstract description 14
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 140
- IVFYLRMMHVYGJH-PVPPCFLZSA-N calusterone Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@](O)(C)CC[C@H]2[C@@H]2[C@@H](C)CC3=CC(=O)CC[C@]3(C)[C@H]21 IVFYLRMMHVYGJH-PVPPCFLZSA-N 0.000 description 95
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 87
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 35
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 31
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 17
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 15
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 14
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 13
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 12
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 11
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 9
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 9
- MCYTYTUNNNZWOK-LCLOTLQISA-N penetratin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 MCYTYTUNNNZWOK-LCLOTLQISA-N 0.000 description 9
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 9
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 9
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 8
- 210000004492 nuclear pore Anatomy 0.000 description 8
- 108010043655 penetratin Proteins 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 7
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 7
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 6
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 6
- REZZEXDLIUJMMS-UHFFFAOYSA-M dimethyldioctadecylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC REZZEXDLIUJMMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 6
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 6
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 6
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 5
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 5
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 5
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 5
- 229960001008 heparin sodium Drugs 0.000 description 5
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 5
- SRLOHQKOADWDBV-NRONOFSHSA-M sodium;[(2r)-2,3-di(octadecanoyloxy)propyl] 2-(2-methoxyethoxycarbonylamino)ethyl phosphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCCNC(=O)OCCOC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC SRLOHQKOADWDBV-NRONOFSHSA-M 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N DOSPA trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N 0.000 description 4
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 4
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 4
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- DEQANNDTNATYII-OULOTJBUSA-N (4r,7s,10s,13r,16s,19r)-10-(4-aminobutyl)-19-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-16-benzyl-n-[(2r,3r)-1,3-dihydroxybutan-2-yl]-7-[(1r)-1-hydroxyethyl]-13-(1h-indol-3-ylmethyl)-6,9,12,15,18-pentaoxo-1,2-dithia-5,8,11,14,17-pentazacycloicosane-4-carboxa Chemical compound C([C@@H](N)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC1=O)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 DEQANNDTNATYII-OULOTJBUSA-N 0.000 description 3
- AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 4'-epidoxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 0.000 description 3
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 3
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 3
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 3
- HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N Epirubicin Natural products COc1cccc2C(=O)c3c(O)c4CC(O)(CC(OC5CC(N)C(=O)C(C)O5)c4c(O)c3C(=O)c12)C(=O)CO HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010016076 Octreotide Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 229930183665 actinomycin Natural products 0.000 description 3
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 3
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000812 cholinergic antagonist Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 3
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 3
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 3
- 229960001904 epirubicin Drugs 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000008384 membrane barrier Effects 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 3
- 229960002700 octreotide Drugs 0.000 description 3
- 210000000196 olfactory nerve Anatomy 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 description 3
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 3
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 3
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 3
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 3
- 229920000723 poly(D-arginine) polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 3
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 3
- NEZDNQCXEZDCBI-WJOKGBTCSA-N (2-aminoethoxy)[(2r)-2,3-bis(tetradecanoyloxy)propoxy]phosphinic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC NEZDNQCXEZDCBI-WJOKGBTCSA-N 0.000 description 2
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 2
- SLKDGVPOSSLUAI-PGUFJCEWSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine zwitterion Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC SLKDGVPOSSLUAI-PGUFJCEWSA-N 0.000 description 2
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 2
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N Spermidine Natural products NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- YCNIBOIOWCTRCL-UHFFFAOYSA-N azane;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound [NH4+].[O-]C(=O)C(F)(F)F YCNIBOIOWCTRCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- UMGXUWVIJIQANV-UHFFFAOYSA-M didecyl(dimethyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCC UMGXUWVIJIQANV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 2
- OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N dimethyl(dioctadecyl)azanium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N gelred Chemical compound [I-].[I-].C=1C(N)=CC=C(C2=CC=C(N)C=C2[N+]=2CCCCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)CCCCC[N+]=3C4=CC(N)=CC=C4C4=CC=C(N)C=C4C=3C=3C=CC=CC=3)C=1C=2C1=CC=CC=C1 JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol Substances OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 2
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229940042880 natural phospholipid Drugs 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000007903 penetration ability Effects 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 238000013042 tunel staining Methods 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 2
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N (4S)-2-(6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,2-f][1,3]benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(=N1)c1nc2cc3CCNc3cc2s1 HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- LPMKADABKPYRHE-UHFFFAOYSA-N 2-aminobutanoic acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O.CCC(N)C(O)=O LPMKADABKPYRHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDVBTTICUXAATP-UHFFFAOYSA-N 2-aminohexanoic acid Chemical compound CCCCC(N)C(O)=O.CCCCC(N)C(O)=O UDVBTTICUXAATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- CNPURSDMOWDNOQ-UHFFFAOYSA-N 4-methoxy-7h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-amine Chemical compound COC1=NC(N)=NC2=C1C=CN2 CNPURSDMOWDNOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical class O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 229940124810 Alzheimer's drug Drugs 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 1
- 208000031648 Body Weight Changes Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 229940127291 Calcium channel antagonist Drugs 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 102100024458 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Human genes 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 1
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102100021592 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 229940121948 Muscarinic receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- GBHKPEUYFYTIOM-UHFFFAOYSA-N NC(C(=O)O)CCC.NC(C(=O)O)CCC Chemical compound NC(C(=O)O)CCC.NC(C(=O)O)CCC GBHKPEUYFYTIOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPFGBEBEVVDQKD-UHFFFAOYSA-N NC(C(=O)O)CCCCC.NC(C(=O)O)CCCCC Chemical compound NC(C(=O)O)CCCCC.NC(C(=O)O)CCCCC GPFGBEBEVVDQKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 102100028452 Nitric oxide synthase, endothelial Human genes 0.000 description 1
- 101710090055 Nitric oxide synthase, endothelial Proteins 0.000 description 1
- 102100029438 Nitric oxide synthase, inducible Human genes 0.000 description 1
- 101710089543 Nitric oxide synthase, inducible Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- TZRXHJWUDPFEEY-UHFFFAOYSA-N Pentaerythritol Tetranitrate Chemical compound [O-][N+](=O)OCC(CO[N+]([O-])=O)(CO[N+]([O-])=O)CO[N+]([O-])=O TZRXHJWUDPFEEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 239000000150 Sympathomimetic Substances 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 1
- 108050002568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 101150115889 al gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002160 alpha blocker Substances 0.000 description 1
- 229940124308 alpha-adrenoreceptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000507 anthelmentic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124339 anthelmintic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000921 anthelmintic agent Substances 0.000 description 1
- 230000007131 anti Alzheimer effect Effects 0.000 description 1
- 230000001142 anti-diarrhea Effects 0.000 description 1
- 230000002686 anti-diuretic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001348 anti-glioma Effects 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000001139 anti-pruritic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000561 anti-psychotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001754 anti-pyretic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003416 antiarrhythmic agent Substances 0.000 description 1
- 229940124346 antiarthritic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000924 antiasthmatic agent Substances 0.000 description 1
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 1
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 description 1
- 229940005513 antidepressants Drugs 0.000 description 1
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 1
- 229940125708 antidiabetic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940124538 antidiuretic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940125715 antihistaminic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 239000002220 antihypertensive agent Substances 0.000 description 1
- 229940030600 antihypertensive agent Drugs 0.000 description 1
- 229960005475 antiinfective agent Drugs 0.000 description 1
- 229940125684 antimigraine agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002282 antimigraine agent Substances 0.000 description 1
- 239000003908 antipruritic agent Substances 0.000 description 1
- 239000002221 antipyretic Substances 0.000 description 1
- 239000003435 antirheumatic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 229940121357 antivirals Drugs 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002830 appetite depressant Substances 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002876 beta blocker Substances 0.000 description 1
- 229940097320 beta blocking agent Drugs 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 210000005101 blood-brain tumor barrier Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000004579 body weight change Effects 0.000 description 1
- 239000000480 calcium channel blocker Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000002327 cardiovascular agent Substances 0.000 description 1
- 229940125692 cardiovascular agent Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- BHONFOAYRQZPKZ-LCLOTLQISA-N chembl269478 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 BHONFOAYRQZPKZ-LCLOTLQISA-N 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N chloral hydrate Chemical compound OC(O)C(Cl)(Cl)Cl RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002327 chloral hydrate Drugs 0.000 description 1
- 150000001841 cholesterols Chemical class 0.000 description 1
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 1
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 229940037530 cough and cold preparations Drugs 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000000850 decongestant Substances 0.000 description 1
- 229940124581 decongestants Drugs 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002934 diuretic Substances 0.000 description 1
- 229940030606 diuretics Drugs 0.000 description 1
- 230000001819 effect on gene Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 230000037440 gene silencing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000887 hydrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003326 hypnotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 description 1
- 230000008316 intracellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 229940083747 low-ceiling diuretics xanthine derivative Drugs 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229940035363 muscle relaxants Drugs 0.000 description 1
- 239000003158 myorelaxant agent Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000000956 olfactory bulb Anatomy 0.000 description 1
- 230000003606 oligomerizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012634 optical imaging Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000003450 potassium channel blocker Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003368 psychostimulant agent Substances 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000003786 sclera Anatomy 0.000 description 1
- 229940125723 sedative agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000932 sedative agent Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000002048 spasmolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001975 sympathomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940064707 sympathomimetics Drugs 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- IMCGHZIGRANKHV-AJNGGQMLSA-N tert-butyl (3s,5s)-2-oxo-5-[(2s,4s)-5-oxo-4-propan-2-yloxolan-2-yl]-3-propan-2-ylpyrrolidine-1-carboxylate Chemical compound O1C(=O)[C@H](C(C)C)C[C@H]1[C@H]1N(C(=O)OC(C)(C)C)C(=O)[C@H](C(C)C)C1 IMCGHZIGRANKHV-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003204 tranquilizing agent Substances 0.000 description 1
- 230000002936 tranquilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 description 1
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000000733 zeta-potential measurement Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明提供了一种药物递送载体，其包含穿膜肽修饰的脂质体和聚合物，其中所述聚合物是带正电的多聚氨基酸。通过使用所述药物递送载体制备了脂质体复合物形式的药物制剂，粒径介于50nm至300nm，其是将带正电的多聚氨基酸和一种或多种药物分子形成的物理复合物与表面修饰有穿膜肽的脂质体混合而制备的，所述药物制剂能够有效地转染细胞，尤其是促进药物经鼻腔吸收入脑，提高药物的疗效。
Description
技术领域
本发明涉及药物递送载体、使用所述药物递送载体来制备药物制剂的方法、以及由此制备的药物制剂。具体地，本发明的药物递送载体包含穿膜肽修饰的脂质体和聚合物，其中所述聚合物是带正电的多聚氨基酸。使用本发明的药物递送载体制备的药物制剂为脂质体复合物，其是将带正电的多聚氨基酸和一种或多种药物分子形成的物理复合物与穿膜肽修饰的脂质体混合而制备的，所述药物制剂能够有效地转染细胞，尤其是促进药物经鼻腔吸收入脑，提高药物的疗效。
背景技术
穿膜肽(cell-penetrating peptide，CPP)是一种生理条件下带正电荷的短肽，能够共价或非共价连接基因、多肽和蛋白质等药物分子，并将药物分子递送至细胞内或携载药物分子穿透生物膜屏障。但是，单个穿膜肽携载药物分子的能力非常有限，这导致穿膜肽与药物分子所形成的复合物粒径较大且稳定性差。
此外，现有技术中递送药物分子(如，基因、多肽和蛋白质等药物分子)的载体如脂质体存在递送效率低而且易产生组织毒性等问题。在脂质体的研究领域，如何利用脂质体更高效地递送药物分子，使得疾病的治疗和/或预防更具有特异性、高效性仍然是一个巨大的挑战。研究人员主要通过对脂质体添加各种辅助性成分、研制并使用新型脂质材料、对脂质体表面进行结构修饰、设计并使用新的制备工艺等措施来提高脂质体的稳定性、靶向性和药物递送效率。
因此，本领域仍需要新的利用穿膜肽的药物递送载体，当药物分子(如基因、多肽、蛋白质等)与所述药物递送载体复合后具有提高的稳定性、且所制备的药物制剂粒径可控制和稳定性好，以及借助制剂表面修饰的穿膜肽能够实现更有效的药物递送、且有助于药物从细胞的内涵体中逃逸出来而发挥药物的功效。
发明概述
本发明人通过锐意研究，开发了一种新的利用穿膜肽的药物递送载体，其包含穿膜肽修饰的脂质体和聚合物，其中所述聚合物是带正电的多聚氨基酸，所述聚合物用于与一种或多种药物混合形成聚合物-药物的复合物，所述穿膜肽修饰的脂质体用于与聚合物-药物的复合物混合形成包含聚合物-药物的复合物的脂质体复合物。
在一个实施方案中，本发明的药物递送载体中的穿膜肽是具有下述氨基酸序列的penetratin或penetratin的亲脂性衍生物：
RX1 IKIWFX2X3 RRMKWKK(SEQ ID NO:1)
其中，X1、X2和X3独立地选自天然来源的氨基酸谷氨酰胺(glutamine，Q)、天冬酰胺(asparagine，N)、丙氨酸(alanine，A)、缬氨酸(valine，V)、亮氨酸(leucine，L)、异亮氨酸(isoleucine，I)、脯氨酸(proline，P)、苯丙氨酸(phenylalanine，F)、色氨酸(tryptophan，W)、甲硫氨酸(methionine，M)和非天然来源的氨基酸α-氨基丁酸(α-aminobutyric acid)、α-氨基戊酸(α-aminopentanoic acid)、α-氨基己酸(α-aminohexanoic acid)、α-氨基庚酸(α-aminoheptanoic acid)。例如，本发明的药物递送载体中的一些穿膜肽是将Penetratin第2位谷氨酰胺(Q)和/或第8位谷氨酰胺(Q)和/或第9位天冬酰胺(N)突变为疏水性氨基酸的Penetratin衍生物。
在一个实施方案中，本发明的药物递送载体中的所述带正电的多聚氨基酸是例如聚合度为2-50的带正电的多聚氨基酸，所述带正电的多聚氨基酸的空间结构包括线性和环形，氨基酸残基的构型包括L型和D型；例如聚合度为6-12的精氨酸和/或赖氨酸。在所述带正电的多聚氨基酸中，任选地在带正电的氨基酸残基之间，间插有1-20个(例如1－6个)生理条件下不带电荷的氨基酸残基，优选地，所述带正电的多聚氨基酸是聚合度为6-12的多聚精氨酸，其中所述多聚精氨酸的空间结构包括线性和环形，多聚精氨酸的构型包括L型和D型。
在一个实施方案中，本发明的药物递送载体中的穿膜肽修饰的脂质体包含如下膜材料：
(i)阳离子脂质，包括但不限于：1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)；二甲基双十八烷基铵(DDAB)；1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)；1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷；1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷；双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、1,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-1,3-二甲基羟乙基铵(DMRIE)和2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷三氟乙酸铵(DOSPA)及其组合。优选为DOTMA、DOTAP、DODAC和DOSPA。最优选为DOTAP；
(ii)非阳离子脂质，包括但不限于：1,2-二-(9Z-十八酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(DOPG)及其组合。优选为DOPE和/或DOPC。最优选为DOPE；
(iii)胆固醇；和
(iv)聚乙二醇化(PEG化)的磷脂和与CPP共轭的聚乙二醇磷脂，所述磷脂例如是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和鞘磷脂，优选地，所述PEG化磷脂是例如聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)和其衍生物甲氧基-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE))，所述与CPP共轭的聚乙二醇磷脂是例如Penetratin/Penetratin衍生物-PEG-DSPE。
在一些实施方案中，膜材料(i):(ii):(iii):(iv)的摩尔比为约20－40:20－40:20－40:1－20，且与CPP共轭的聚乙二醇磷脂占膜材料(iv)中的约20％－80％摩尔比。在一些具体的实施方案中，膜材料(i):(ii):(iii):(iv)的摩尔比为约27.0－31.6:27.0－31.6:31.6－39.6:1－10，且与CPP共轭的聚乙二醇磷脂占膜材料(iv)中的约20％－80％摩尔比。
在一些具体的实施方案中，本发明的药物递送载体中的阳离子脂质体包含如下膜材料：(i)DOTAP；(ii)DOPE；(iii)胆固醇；(iv)mPEG2000-DSPE和89WPenetratin-PEG3400-DSPE，且膜材料(i):(ii):(iii):(iv)的摩尔比为约20－40:20－40:20－40:1－20，且89WPenetratin-PEG3400-DSPE占膜材料(iv)中的约20％－80％摩尔比。在一些实施方案中，膜材料(i):(ii):(iii):(iv)的摩尔比为约27.0－31.6:27.0－31.6:31.6－39.6:1－10，且89WPenetratin-PEG3400-DSPE占膜材料(iv)中的约20％－80％摩尔比。在一些实施方案中，本发明的药物递送载体中的阳离子脂质体由如下膜材料组成：(i)DOTAP；(ii)DOPE；(iii)胆固醇；(iv)mPEG2000-DSPE和89WPenetratin-PEG3400-DSPE，且膜材料(i):(ii):(iii):(iv)的摩尔比为约28.5:28.5:38:5，89WPenetratin-PEG3400-DSPE占膜材料(iv)中的约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％摩尔比。
在另一个方面，本发明提供了一种药物制剂，其是使用本发明的药物递送载体制备的药物制剂，其中将药物递送载体中包含的带正电的多聚氨基酸和欲递送的一种或多种药物分子形成物理复合物，并将所述物理复合物与所述的表面修饰有穿膜肽的阳离子脂质体混合形成脂质体复合物形式的药物制剂。
对欲递送的一种或多种药物分子没有特别的限定，包括但不限于：肽类药物(例如奥曲肽(octreotide))、抗体(例如，依那西普(etanercept)、阿达木单抗(adalimumab)、利妥昔单抗(rituximab)、派姆单抗(pembrolizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)和纳武单抗(nivolumab))、细胞因子、激素、抗生素(例如，化疗药阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、放线菌素(actinomycin)和万古霉素(vancomycin))、核酸、以及它们的组合等。在一个实施方案中，所述药物制剂递送的药物分子是质粒DNA、RNA如小干扰RNA(siRNA)、有义RNA、反义寡核苷酸(ASO)、适配体(aptamers)、核酶等的核酸。在一个实施方案中，所述药物制剂递送的药物分子是核酸和能够嵌入到生物体基因组中的药物(如阿霉素)的组合。
在一个实施方案中，所述药物制剂中药物分子(例如，化疗药)与阳离子脂质(例如，DOTAP)的摩尔比为约0.1-10，优选约0.1-5，进一步优选约0.1-2。在一个实施方案中，所述药物制剂对药物分子(例如，化疗药)的载药量为：药物分子(例如，化疗药)占药物制剂的约1％-30％(w/w)，优选约1％-25％(w/w)，进一步优选约3％-20％(w/w)。
在一个实施方案中，所述药物制剂中带正电的多聚氨基酸(例如，寡聚精氨酸)和欲递送的药物分子的电荷比介于1:1至30:1，优选5:1；且阳离子脂质体与药物分子的电荷比介于1:1至30:1，优选4:1。
在一个实施方案中，本发明的药物制剂的粒径介于50nm至300nm，优选80nm至150nm，且稳定性好。
在又一个方面，提供了本发明的药物制剂的制备方法，包括(a)制备表面修饰有穿膜肽的脂质体；(b)制备带正电的多聚氨基酸和欲递送的药物分子的物理复合物；(c)按一定的摩尔比或电荷比混合步骤(a)获得的表面修饰有穿膜肽的脂质体和步骤(b)获得的物理复合物。
在一个实施方案中，本发明的药物制剂的制备方法包括(a)混合脂质体的膜材料(i)、(ii)和(iii)，制备空白脂质体；(b)制备带正电的多聚氨基酸和欲递送的药物分子的物理复合物；(c)按一定的摩尔比或电荷比混合步骤(a)获得的空白脂质体和步骤(b)获得的物理复合物；(d)将步骤(c)获得的脂质体与膜材料(iv)混合并孵育，获得本发明的药物制剂。
使用本发明的药物递送载体制备的药物制剂能够例如通过口腔、鼻腔、眼、呼吸道、消化道、生殖道、局部植入、注射或输注(经由硬膜外、动脉内、关节内、囊内、心内、脑室内、颅内、皮内、肌内、眶内、眼内、腹膜内、脊柱内、胸骨内、鞘内、静脉内、蛛网膜下、被膜下、皮下、气管、直肠、舌下等途径)施用，用于治疗和/或预防疾病。
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入本文作为参考。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。
附图简述：
图1：显示了R8(8聚精氨酸)与siRNA不同电荷比(表示为正电荷/负电荷的比例)和/或CLS与siRNA不同电荷比的各复合物的琼脂糖凝胶电泳结果和粒径结果。图1中的小图A和B分别显示了R8/siRNA不同电荷比的R8/siRNA复合物的琼脂糖凝胶电泳结果和粒径结果；小图C和D分别显示了CLS/siRNA不同电荷比的CLS/siRNA复合物的琼脂糖凝胶电泳结果和粒径结果；小图E和F分别显示了R8/siRNA电荷比为1:1时，CLS/siRNA不同电荷比的CLS/R8/siRNA脂质体复合物的琼脂糖凝胶电泳结果和粒径结果。
图2：显示了R8与siRNA电荷比为1:1的情况下，细胞对CLS与siRNA不同电荷比制备的CLS/R8/siRNA脂质体复合物的摄取。
图3：显示了CLS/siRNA/R8复合物的电泳、粒径和稳定性研究结果。图3中的小图A和B分别显示了在CLS与siRNA电荷比为4:1的情况下，R8与siRNA不同电荷比的脂质体复合物的琼脂糖凝胶电泳结果和粒径结果；小图C和D分别显示了在CLS与siRNA电荷比为4:1的情况下，R8与siRNA不同电荷比的脂质体复合物高速离心后的沉淀情况和离心后上清液的琼脂糖凝胶电泳结果。
图4：显示了表面修饰有不同比例穿膜肽的药物制剂的细胞摄取定量评价结果，其中，Lipo2000组为市售基因转染试剂阳离子脂质体Lipofectamine2000与siRNA的非共价复合物。
图5：显示了细胞对使用实施例8表2中所示的不同配方脂质体膜材料制备的药物制剂的摄取情况。
图6：显示了组分(iv)占脂质体膜材料的1％、5％、8％、10％摩尔份数的脂质体药物制剂的粒径。
图7：显示了使用35mm Dimple NanoCulture Dish培养不同细胞球的形态学结果，其中，35mm Dimple NanoCulture Dish为日本JSR Corporation的细胞球培养板。
图8：显示了修饰于脂质体表面的穿膜肽对细胞球穿透能力的评价结果。
图9：显示了包载GFP-siRNA的药物制剂对293T细胞球的转染效果。
图10：显示了包载GFP-siRNA的药物制剂对U87细胞球的转染效果。
图11：显示了使用不同寡聚精氨酸的药物制剂对LUC-U87细胞的转染效果的定性评价和定量评价结果。
图12：显示了包载siRNA的药物制剂的粒径。
图13：显示了包载siRNA的药物制剂的电势。
图14：显示了包载siRNA的药物制剂对bEnd.3细胞和U87细胞的促凋亡效果评价和细胞毒性评价结果。
图15：显示了细胞膜荧光探针DiD标记的药物制剂经鼻给药后的体内分布情况。
图16：显示了细胞膜荧光探针DiD标记的载体递送FAM-siRNA入胞的流式细胞术检测结果。
图17：显示了DiD细胞膜荧光探针标记的基因递送载体在U87原位脑瘤模型鼠中经鼻给药后的体内分布情况。
图18：显示了包载siRNA的递送载体的抗U87脑原位瘤的药效学评价结果，其中，Lipo2000/siRNA组为市售基因转染试剂阳离子脂质体Lipofectamine 2000与siRNA的非共价复合物。
图19：显示了包载siRNA的递送载体在U87原位脑瘤模型鼠中的体内促凋亡能力评价结果，其中，Lipo2000/siRNA组为市售基因转染试剂阳离子脂质体Lipofectamine 2000与siRNA的非共价复合物。
图20：显示了包载siRNA的递送载体的体内鼻粘膜毒性评价结果，其中Lipo2000/siRNA组为市售基因转染试剂阳离子脂质体Lipofectamine 2000与siRNA的非共价复合物，脱氧胆酸钠组的脱氧胆酸钠为大连美仑生物技术有限公司的市售产品。
发明详述：
本发明提供了一种新型的药物递送载体，其包含穿膜肽修饰的脂质体和聚合物，其中所述聚合物是带正电的多聚氨基酸。本发明的药物递送载体能够与药物分子组装形成复合物，可压缩(compact)药物分子并包载药物分子于脂质体中，由此利用脂质体表面修饰的具有穿膜功能的穿膜肽帮助药物穿透受试者体内的生物膜屏障。
本发明的药物递送载体具有很强的携载药物、递送药物以及组织穿透能力，且组织毒性低，可通过多种施用途径将药物分子高效递送至受试者体内的目标部位，克服因受试者的生物膜屏障导致的药物难以到达目标部位的技术问题，增强药物治疗疾病的有效性且具有良好的生物安全性。本发明还提供了使用所述药物递送载体制备的药物制剂。
如本文中所用，术语“受试者”是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，牛、羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，受试者是人。
本发明的药物递送载体的各种特征在下面进行了讨论。
如本文中所用，术语“约”旨在是指定值的±10％的调整。例如，术语“约5％”旨在包含4.5％至5.5％的范围。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。
I.表面修饰有穿膜肽的脂质体的膜材料：
如本文所用的术语“脂质体”是指由脂质双层组成的人工制备的囊泡。不限制本发明中被穿膜肽修饰的脂质体的类型，可以是能够形成脂质囊泡并包载药物的任何脂质体。
在一些实施方案中，本发明的表面修饰有穿膜肽的脂质体包含如下膜材料：
(i)阳离子脂质：
脂质体包含一种或多种阳离子脂质。如本文中所用，术语“阳离子脂质”是在选择的pH(例如生理pH)下具有净正电荷的脂质。许多阳离子脂质是商业可获得的。用于脂质体中的特别合适的阳离子脂质包括国际专利公开WO2010/053572和WO 2012/170930中描述的那些阳离子脂质，所述两篇专利文献均以引用的方式并入本文作为参考。
对脂质体中包含的阳离子脂质没有特别的限制，只要是在选择的pH(例如生理pH)下具有净正电荷的脂质均可使用，例如但不限于：1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)；二甲基双十八烷基铵(DDAB)；1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)；1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷；1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷；双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、1,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-1,3-二甲基羟乙基铵(DMRIE)和2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷三氟乙酸铵(DOSPA)及其组合。优选的阳离子脂质为DOTMA、DOTAP、DODAC和DOSPA。最优选的阳离子脂质为DOTAP。
(ii)非阳离子脂质：
脂质体包含一种或多种非阳离子脂质。如本文中所用，术语“非阳离子脂质”指任何中性、两性离子或阴离子脂质。如本文中所用，术语“阴离子脂质”指在选择的pH，例如生理pH下携带净负电荷的许多脂质物质中的任一种。
对脂质体中包含的非阳离子脂质没有特别的限制，可使用任何中性、两性离子或阴离子脂质，例如但不限于：1,2-二-(9Z-十八酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(DOPG)及其组合。优选的非阳离子脂质为DOPE和/或DOPC。最优选的非阳离子脂质为DOPE。
(iii)胆固醇：
胆固醇是构成哺乳动物细胞膜的一种重要组成成分，占细胞膜脂类的20％以上。术语“胆固醇”在本文中以最广意义使用并且涵盖胆固醇衍生物。研究表明，温度高时，胆固醇能阻止细胞膜双分子层的无序化；温度低时，胆固醇又可干扰细胞膜双分子层的有序化，阻止液晶的形成，保持细胞膜双分子层的流动性。
考虑到胆固醇在膜双分子层中的重要性，本发明的阳离子脂质体也包含胆固醇。
(iv)PEG化磷脂和与CPP共轭的聚乙二醇磷脂
脂质体包含PEG化磷脂和与CPP共轭的聚乙二醇磷脂。在本文中，PEG化磷脂不包含连接有CPP的聚乙二醇磷脂。
PEG化磷脂是将磷脂共价键合一个或多个聚乙二醇分子(PEG)而形成。PEG化磷脂包括但不限于长度高达10kDa的聚乙二醇链，例如，1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、以及它们之间的任何值的聚乙二醇链，其与磷脂共价键合。所述磷脂可以是合成的、半合成的或天然的磷脂，例如是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和鞘磷脂。在一些实施方案中，所述PEG化磷脂是例如聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)和其衍生物甲氧基-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)，其中PEG的分子量为1kDa－10kDa之间的任何值。
与CPP共轭的聚乙二醇磷脂是将CPP共价键合至聚乙二醇磷脂而形成。
本发明中使用的CPP不仅包括野生型多肽penetratin(氨基酸序列：RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:2))，还包括其一系列亲脂性衍生物，例如，将Penetratin第2位谷氨酰胺(Q)和/或第8位谷氨酰胺(Q)和/或第9位天冬酰胺(N)突变为疏水性氨基酸的Penetratin衍生物。在一些实施方案中，Penetratin亲脂性衍生物是中国发明专利申请CN201710414334.7中公开的那些衍生物，所述衍生物已被证明经结膜囊内滴眼给药后，可促进药物穿过诸多眼部吸收屏障(角膜、结膜、巩膜等)进入眼内，甚至将其携带的基因、多肽和蛋白质等生物大分子药物递送至眼后段的视网膜部位。中国发明专利申请CN201710414334.7中公开的Penetratin亲脂性衍生物的氨基酸序列此处引述如下：
表1：Penetratin衍生物的氨基酸序列
根据本发明，CPP是通过与聚乙二醇磷脂共价键合而被连接至作为脂质体的脂质双层的一部分的化合物。在本文中，术语“作为脂质体的脂质双层的一部分”旨在表明CPP-PEG-磷脂中的所述磷脂被整合到脂质双层中的事实。所述磷脂可以是合成的、半合成的或天然的磷脂，例如是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和鞘磷脂。
CPP-PEG-磷脂中的聚乙二醇链包括但不限于长度高达10kDa的聚乙二醇链，例如，1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、以及它们之间的任何值的聚乙二醇链，其两端分别与磷脂和与CPP共价键合。在一些实施方案中，所述与CPP共轭的聚乙二醇磷脂是例如Penetratin/Penetratin衍生物-PEG-DSPE，其中PEG的分子量为1kDa－10kDa之间的任何值。
本发明将CPP修饰在阳离子脂质体的表面，旨在增强药物递送载体在组织中的穿透能力，由此帮助携带更多药物分子的脂质体到达目标部位，从而发挥疾病的治疗和/或预防效果。
在一些实施方案中，脂质体膜材料(iv)中PEG化磷脂和与CPP共轭的聚乙二醇磷脂中的聚乙二醇链长不相等，且与CPP共轭的聚乙二醇磷脂中的聚乙二醇链较PEG化磷脂中的聚乙二醇链更长，例如，更长0.5kDa－5kDa之间，优选地更长0.75kDa－4kDa之间，更优选地更长1kDa－2kDa之间的任何值。在一个实施方案中，脂质体膜材料(iv)中PEG化磷脂的聚乙二醇链长分别是约1kDa、2kDa、3kDa，与CPP共轭的聚乙二醇磷脂的聚乙二醇链长分别是约2.5kDa、3.5kDa、4.5kDa。
在一些实施方案中，本发明的表面修饰有穿膜肽的阳离子脂质体的膜材料(i):(ii):(iii):(iv)的摩尔比为约20－40:20－40:20－40:1－20，且与CPP共轭的聚乙二醇磷脂占膜材料(iv)中的约20％－80％摩尔比，对应于占总的脂质体膜材料中的约2％－8％摩尔比。在一些实施方案中，膜材料(i):(ii):(iii):(iv)的摩尔比为约27.0－31.6:27.0－31.6:31.6－39.6:1－10，且与CPP共轭的聚乙二醇磷脂占膜材料(iv)中的约20％－80％摩尔比，对应于占总的脂质体膜材料中的约2％－8％摩尔比。
在一些具体的实施方案中，本发明的药物递送载体中的阳离子脂质体包含如下膜材料：(i)DOTAP；(ii)DOPE；(iii)胆固醇；(iv)PEG-DSPE(例如，mPEG2000-DSPE)和Penetratin/Penetratin衍生物-PEG-DSPE(例如，89WPenetratin-PEG3400-DSPE)，且膜材料(i):(ii):(iii):(iv)的摩尔比为约20－40:20－40:20－40:1－20，且Penetratin/Penetratin衍生物-PEG-DSPE(例如，89WPenetratin-PEG3400-DSPE)占膜材料(iv)中的约20％－80％摩尔比。在一些实施方案中，膜材料(i):(ii):(iii):(iv)的摩尔比为约27.0－31.6:27.0－31.6:31.6－39.6:1－10，且Penetratin/Penetratin衍生物-PEG-DSPE(例如，89WPenetratin-PEG3400-DSPE)占膜材料(iv)中的约20％－80％摩尔比。在一些实施方案中，本发明的药物递送载体中的阳离子脂质体由如下膜材料组成：(i)DOTAP；(ii)DOPE；(iii)胆固醇；(iv)mPEG2000-DSPE和89WPenetratin-PEG3400-DSPE，且膜材料(i):(ii):(iii):(iv)的摩尔比为约28.5:28.5:38:5，89WPenetratin-PEG3400-DSPE占膜材料(iv)中的约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％摩尔比。
II.带正电的多聚氨基酸
本发明的药物递送载体中包含的带正电的多聚氨基酸用于压缩药物分子。
所述带正电的多聚氨基酸是在选择的pH(例如生理pH)下具有净正电荷的多聚氨基酸。对多聚氨基酸中氨基酸残基的聚合度没有特别的限制，例如聚合度为2-50的带正电的多聚氨基酸(即，带正电的多聚氨基酸具有2-50个氨基酸残基)，例如聚合度为6-12的精氨酸和/或赖氨酸，任选地在所述聚合度为2-50的带正电的多聚氨基酸中间插有1-20个(例如1－6个)生理条件下不带电荷的氨基酸残基。带正电的多聚氨基酸可以是线性或环形，且氨基酸残基的构型包括L型和D型。优选地，所述带正电的多聚氨基酸是聚合度为6-12的多聚精氨酸，其中所述多聚精氨酸的空间结构包括线性和环形，多聚精氨酸的构型包括L型和D型。
在一些实施方案中，带正电的多聚氨基酸是寡聚精氨酸(oligo-arginine)，包括线性的多肽，例如6聚精氨酸(氨基酸序列为RRRRRR，R6(SEQ ID NO:85))、8聚精氨酸(氨基酸序列为RRRRRRRR，R8(SEQ ID NO:86))、10聚精氨酸(氨基酸序列为RRRRRRRRRR，R10(SEQID NO:87))、12聚精氨酸(氨基酸序列为RRRRRRRRRRRR，R12(SEQ ID NO:88))，以及环化的多肽，例如环化的6聚精氨酸(c-R6)、环化的8聚精氨酸(c-R8)、环化的10聚精氨酸(c-R10)、环化的12聚精氨酸(c-R12)，以及不同构型的多肽，例如L型寡聚精氨酸和D型寡聚精氨酸如6聚D-精氨酸(氨基酸序列为rrrrrr，D-R6)、8聚D-精氨酸(氨基酸序列为rrrrrrrr，D-R8)、10聚D-精氨酸(氨基酸序列为rrrrrrrrrr，D-R10)、12聚D-精氨酸(氨基酸序列为rrrrrrrrrrrr，D-R12)。
以下描述了使用本发明的药物递送载体来制备药物制剂的方法，并描述了药物制剂的特征。
通过使用本发明的药物递送载体，能够制备出CPP修饰在阳离子脂质体的表面、在组织中的穿透能力强的药物制剂。
在一个实施方案中，本发明的药物制剂的制备方法为：
(1)称取上述本发明的脂质体的膜材料，其中膜材料(i):(ii):(iii):(iv)摩尔比为约20－40:20－40:20－40:1－20，且与CPP共轭的聚乙二醇磷脂占膜材料(iv)中的约20％－80％摩尔比，对应于占总的脂质体膜材料中的约2％－8％摩尔比。
(2)将膜材料(i):(ii):(iii):(iv)加入有机溶剂中溶解，然后蒸发除去有机溶剂，获得均匀的干燥脂质膜。
(3)将所得的干燥脂质膜用含水溶液水化完全后，使用微型挤出器挤出脂质体(过核孔膜的顺序依次是200nm、100nm和50nm)。
(4)将带正电的多聚氨基酸与药物分子在合适的溶液中混合并孵育，获得带正电的多聚氨基酸与药物分子的物理复合物。
(5)以一定的摩尔比或电荷比混合上述(3)获得的脂质体和上述(4)获得的复合物，得到脂质体复合物形式的药物制剂。
又在一个实施方案中，本发明的药物制剂的制备方法为：
(1)称取上述本发明的脂质体的膜材料，其中膜材料(i):(ii):(iii):(iv)摩尔比为约20－40:20－40:20－40:1－20，且与CPP共轭的聚乙二醇磷脂占膜材料(iv)中的约20％－80％摩尔比，对应于占总的脂质体膜材料中的约2％－8％摩尔比。
(2)将膜材料(i):(ii):(iii)加入有机溶剂中溶解，然后蒸发除去有机溶剂，获得均匀的干燥脂质膜。
(3)将所得的干燥脂质膜用含水溶液水化完全后，使用微型挤出器挤出脂质体(过核孔膜的顺序依次是200nm、100nm和50nm)。
(4)将带正电的多聚氨基酸与药物分子在合适的溶液中混合并孵育，获得带正电的多聚氨基酸与药物分子的物理复合物。
(5)以一定的摩尔比或电荷比混合上述(3)获得的脂质体和上述(4)获得的复合物，然后与膜材料(iv)混合并孵育，获得本发明的药物制剂。
对欲递送的药物分子没有特别地限定，所述药物分子包括广泛类型的递送至受试者的化合物，包括但不限于：核酸；抗感染药如抗生素和抗病毒药；镇痛药和镇痛药组合；食欲抑制药；驱蠕虫药；抗关节炎药；平喘药；抗惊厥药；抗抑郁药；抗糖尿病药；止泻药；抗组胺药；抗炎药；抗偏头痛制剂；止恶心药；抗肿瘤药；抗震颤麻痹药；止痒药；抗精神药；退热药；解痉药；抗胆碱能药；拟交感神经药；黄嘌呤衍生物；心血管制剂包括钾通道阻滞剂、钙通道阻滞剂、β-阻滞剂、α-阻滞剂和抗心律失常药；抗高血压药；利尿药和抗利尿药；血管舒张药包括全身神经、心神经、周围神经和脑神经、中枢神经系统的兴奋剂、血管抑制药；咳嗽和感冒制剂，包括减充血药；激素，如雌二醇和其它固醇类，包括皮质类固醇；催眠药；免疫抑制药；肌肉松弛药；副交感神经阻滞药；精神兴奋剂；镇静药和安定药。本发明的药物递送载体可以递送例如处于离子化的、非离子化的、游离碱、酸加成盐等所有形式的药物，可以递送高分子量或低分子量药物。
在一些实施方案中，本发明的药物制剂递送的药物分子是例如肽类药物(例如奥曲肽(octreotide))、抗体(例如，依那西普(etanercept)、阿达木单抗(adalimumab)、利妥昔单抗(rituximab)、派姆单抗(pembrolizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)和纳武单抗(nivolumab))、细胞因子、激素、抗生素(例如，化疗药阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、放线菌素(actinomycin)和万古霉素(vancomycin))、核酸等。
在一些实施方案中，所述药物制剂递送的药物分子是质粒DNA、RNA如小干扰RNA(siRNA)、有义RNA、反义寡核苷酸(ASO)、适配体(aptamers)、核酶等的核酸。质粒DNA是含有这样的DNA序列的基因表达系统，所述DNA序列编码例如选自白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-7、白细胞介素-12、白细胞介素-15、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞刺激因子、抗血管生成剂、肿瘤抑制基因、胸苷激酶、eNOS、iNOS、p53、p16、TNF-α、Fas-配体、突变的癌基因、肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原。质粒DNA还可以编码shRNA分子，所述shRNA分子设计为旨在抑制参与肿瘤细胞或其它过度增生性细胞生长或维持的蛋白质。质粒DNA可以同时编码治疗性蛋白质和一种或多种shRNA。此外，本发明药物制剂中的核酸还可以是质粒DNA与包含有义RNA、反义寡核苷酸或核酶的人工合成RNA的混合物。
在一个实施方案中，本发明药物制剂中药物分子(例如，化疗药)与阳离子脂质(例如，DOTAP)的摩尔比为约0.1-10，例如，约0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10，优选约0.1-5，进一步优选约0.1-2。在一个实施方案中，所述药物制剂对药物分子(例如，化疗药)的载药量为：药物分子(例如，化疗药)占药物制剂的约1％-30％(w/w)，例如，约1％、2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％、22.5％、25％、27.5％、30％(w/w)，优选约1％-25％(w/w)，进一步优选约3％-20％(w/w)。
本发明的药物制剂可通过口腔、鼻腔、眼、呼吸道、消化道、生殖道、局部植入、注射或输注(经由硬膜外、动脉内、关节内、囊内、心内、脑室内、颅内、皮内、肌内、眶内、眼内、腹膜内、脊柱内、胸骨内、鞘内、静脉内、蛛网膜下、被膜下、皮下、气管、直肠、舌下等途径)施用。
可使用本领域已知的医学设备来施用本发明的药物制剂。例如，在一个实施方案中，可用无针头皮下注射设备，例如美国专利号5,399,163中公开的设备来施用本发明的药物制剂。
在一个实施方案中，使用本发明的药物递送载体制备了递送核酸的药物制剂，由此发挥基因治疗的作用。
与传统的手术、放疗、化疗等治疗方法相比，基因治疗作为一种具有突破性意义的治疗方法，优点在于针对性强、副作用低，对正常细胞损伤小，治疗过程中痛苦少，因此在免疫缺陷病、代谢性疾病、癌症、心脏病等疾病领域显示出良好前景。目前全球有2597种核酸药物进入或完成临床试验，其中65％是用于癌症治疗，有181项临床试验的基因药物是通过抑制肿瘤生长发挥治疗作用(Ginn SL等人，Gene therapy clinical trials worldwideto 2017:An update，Journal of Gene Medicine,2018,20(5):e3015)。基于此，本领域希望能够通过递送核酸的药物制剂来实现对疾病(例如，肿瘤疾病)的治疗。
递送核酸的载体是基因治疗的关键技术之一，可保护所递送的核酸不被内源性核酸酶降解，从而使基因治疗的体内应用成为可能。目前基因治疗所使用的核酸载体主要是病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体的转染效率很高，但同时病毒载体也存在诱导免疫反应、致癌等临床问题。非病毒载体主要包括聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺-胺(PAMAM)、阳离子脂质体等。相比较PEI和PAMAM，阳离子脂质体作为药物载体，具有靶向、长效、低毒、保护药物等优点(Wang J等人，c-Myc is required for maintenance of glioma cancer stemcells，PLoS ONE,2008,3(11):e3769)。阳离子脂质体通常由带正电荷的脂类和中性辅助脂类混合形成，当阳离子脂质体与带负电荷的核酸靠近时，聚集的阳离子脂质可发挥“双面粘胶带”的作用，自发形成核酸/阳离子脂质体复合物。对脂质体的表面基团进行特殊修饰后，阳离子脂质体能很好地包封核酸，促进核酸/阳离子脂质体复合物与细胞膜的融合，提高细胞对核酸的摄取(Huang L等人，In vivo delivery of RNAi with lipid-basednanoparticles，Annual Review of Biomedical Engineering,2011年8月15日,13:507-530)。
在制备递送核酸的药物制剂时，使用本发明的药物递送载体中的人工合成的带正电的多聚氨基酸(例如寡聚精氨酸)来压缩核酸，其中所述寡聚精氨酸和核酸这两者通过静电作用形成物理复合物，然后借助带有正电荷的阳离子脂质体进一步压缩核酸，形成脂质体复合物，进一步地由于穿膜肽修饰在阳离子脂质体的表面，可以提高所制得的核酸脂质体复合物对细胞和组织的穿透能力，由此构建的核酸脂质体制剂能够通过多种途径给药，并将核酸分子高效递送至目标身体部位，且具有良好的生物安全性。
在一个实施方案中，本发明的核酸脂质体制剂的制备方法为：
(1)称取上述本发明的脂质体的膜材料，其中膜材料(i):(ii):(iii):(iv)摩尔比为约约20－40:20－40:20－40:1－20，且与CPP共轭的聚乙二醇磷脂占膜材料(iv)中的约20％－80％摩尔比，对应于占总的脂质体膜材料中的约2％－8％摩尔比。
(2)将膜材料(i):(ii):(iii)加入有机溶剂中溶解，然后蒸发除去有机溶剂，获得均匀的干燥脂质膜。
(3)将所得的干燥脂质膜用含水溶液水化完全后，使用微型挤出器挤出脂质体(过核孔膜的顺序依次是200nm、100nm和50nm)。
(4)将带正电的多聚氨基酸(例如寡聚精氨酸)与核酸分子按照一定的电荷比在合适的溶液中混合并孵育，获得带正电的多聚氨基酸(例如寡聚精氨酸)与核酸分子的复合物。
(5)按照一定的摩尔比或电荷比混合上述(3)获得的脂质体和上述(4)获得的复合物，获得脂质体复合物。
(6)将上述(5)获得的脂质体与膜材料(iv)混合并孵育，获得本发明的核酸脂质体制剂。
在一个实施方案中，本发明的核酸脂质体制剂的制备方法为：
(1)称取上述本发明的脂质体的膜材料，其中膜材料(i):(ii):(iii):(iv)摩尔比为约约20－40:20－40:20－40:1－20，且与CPP共轭的聚乙二醇磷脂占膜材料(iv)中的约20％－80％摩尔比，对应于占总的脂质体膜材料中的约2％－8％摩尔比。
(2)将膜材料(i):(ii):(iii)加入有机溶剂中溶解，然后蒸发除去有机溶剂，获得均匀的干燥脂质膜。
(3)将所得的干燥脂质膜用含水溶液水化完全后，使用微型挤出器挤出脂质体(过核孔膜的顺序依次是200nm、100nm和50nm)。
(4)将上述(3)获得的脂质体与膜材料(iv)混合并孵育，获得穿膜肽修饰的阳离子脂质体。
(5)将带正电的多聚氨基酸(例如寡聚精氨酸)与核酸分子按照一定的电荷比在合适的溶液中混合并孵育，获得寡聚精氨酸与核酸分子的复合物。
(6)按照一定的摩尔比或电荷比混合上述(4)获得的脂质体和上述(5)获得的复合物，获得脂质体复合物形式的本发明的核酸脂质体制剂。
在一个实施方案中，本发明的核酸脂质体制剂的制备方法为：
(1)称取上述本发明的脂质体的膜材料，其中膜材料(i):(ii):(iii):(iv)摩尔比为约约20－40:20－40:20－40:1－20，且与CPP共轭的聚乙二醇磷脂占膜材料(iv)中的约20％－80％摩尔比，对应于占总的脂质体膜材料中的约2％－8％摩尔比。
(2)将膜材料(i):(ii):(iii):(iv)加入有机溶剂中溶解，然后蒸发除去有机溶剂，获得均匀的干燥脂质膜。
(3)将所得的干燥脂质膜用含水溶液水化完全后，使用微型挤出器挤出脂质体(过核孔膜的顺序依次是200nm、100nm和50nm)。
(4)将带正电的多聚氨基酸(例如寡聚精氨酸)与核酸分子按照一定的电荷比在合适的溶液中混合并孵育，获得寡聚精氨酸与核酸分子的复合物。
(5)按照一定的电荷比混合上述(3)获得的脂质体和上述(4)获得的复合物，获得脂质体复合物形式的本发明的核酸脂质体制剂。
在一个实施方案中，所述核酸分子是siRNA，本发明的siRNA脂质体制剂的制备方法为：DOTAP、DOPE、胆固醇、mPEG2000-DSPE与Penetratin/Penetratin衍生物-PEG3400-DSPE的摩尔比为约28.5:28.5:38:5，称取DOTAP、DOPE、胆固醇置于圆底烧瓶中，加入氯仿溶解，通过旋转蒸发仪除去氯仿得均匀的干燥脂质膜。将脂质膜用5％的葡萄糖水溶液通过水浴超声水化，待脂质膜水化完全后，再使用微型挤出器挤压脂质体(过核孔膜的顺序依次是200nm、100nm和50nm)，完成空白脂质体CLS的制备。然后将寡聚精氨酸Rn(R为精氨酸的单字母代码，n为例如2、3、4、5、6、7、8、9、10等整数)与siRNA按照一定电荷比混合，涡旋30s，置于37℃条件下孵育30分钟后得到复合物Rn/siRNA，再将复合物Rn/siRNA与空白阳离子脂质体按照一定电荷比(阳离子脂质体与siRNA的电荷比)混合，涡旋30s，置于37℃条件下孵育30分钟后得到复合物CLS/Rn/siRNA，最后将CLS/Rn/siRNA和mPEG2000-DSPE与Penetratin/Penetratin衍生物-PEG3400-DSPE混合后置于55℃孵育半小时，完成siRNA脂质体制剂的制备。
在一个实施方案中，将本发明的核酸脂质体制剂经鼻给药，由鼻脑通路将核酸高效递送进入脑部，核酸脂质体制剂被脑部肿瘤细胞摄取后能够借助穿膜肽和阳离子脂质体的表面正电荷实现内涵体逃逸，将核酸分子释放到细胞质中，发挥基因治疗脑部肿瘤(例如，脑胶质瘤)的作用。
本领域技术人员公知，脑部特殊的生理结构及功能上的复杂性，特别是血脑屏障的存在以及某些药物自身的理化性质，使治疗药物通常难以达到脑组织。然而，经鼻入脑的给药途径为脑部疾病的治疗提供了可行性的思路，药物经鼻腔入脑的直接通路有两条，一条是嗅神经通路，这是经鼻入脑绕过血脑屏障最直接的方法，药物经鼻黏膜吸收，经嗅神经摄取后，通过轴突运输至嗅球，进一步抵达嗅脑的过程。第二条是鼻黏膜上皮通路，药物穿过基膜进入固有层，进一步到达周围嗅神经，进而转运至中枢神经系统，最终实现在脑部的蓄积。由于经鼻入脑给药具有无创伤性，因此患者的顺应性良好(Agrawal M等人，Nose-to-brain drug delivery:An update on clinical challenges and progress towardsapproval of anti-Alzheimer drugs，Journal of Controlled Release,2018,281:139-177)。另一方面，脑部肿瘤例如脑胶质瘤是一种中枢神经系统恶性肿瘤，发病率高，生存率低，对人类健康的危害极大，但临床预后并不乐观，主要体现在手术复发、化疗耐药等，且由于存在血脑屏障、血脑肿瘤屏障，全身给药后药物入脑量非常少，因此，一直以来人们都在致力寻找一种有效的药物治疗方式。
本发明的药物脂质体制剂经鼻给药后，能够将药物递送至脑部，进而促进药物发挥治疗作用。
在本发明的实施例中，发明人以8聚精氨酸R8为例，以siRNA为药物分子模型，构建了携载siRNA的阳离子脂质体递送载体。通过一系列体外和体内实验，考察了由穿膜肽修饰的脂质体和带正电的多聚氨基酸共同构建的递送载体的细胞摄取能力以及细胞球穿透能力。结果表明，与商品化的递送核酸的阳离子脂质体相比，本发明的药物递送载体能够显著提高核酸的入胞量，具备较高的递送效率。
本发明构建的药物递送载体的优势在于高效、低毒，且易释放药物。高效体现在本发明的递送载体具备较高的细胞摄取能力和较强的细胞球穿透能力；低毒体现在本发明所用的穿膜肽无致病性，且易于在体内降解，相比于PEI和PAMMA等其他药物递送载体具备更好的生物安全性；易释放药物体现在多聚氨基酸和表面修饰的穿膜肽均带有正电荷，阳离子脂质体带有的正电荷能够帮助药物的内涵体逃逸，从而使药物能够成功释放到细胞质中，发挥治疗作用。此外，使用本发明的药物递送载体制备的药物制剂可通过多种途径施用至受试者，尤其可通过经鼻给药途径实现药物的脑内递送，有利于提高患者的顺应性。
描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成限制本发明的保护范围。
实施例
实施例1
阳离子脂质体的制备：
称取摩尔比为28.5:28.5:38:5的膜材，即3.5mg的DOTAP(上海艾韦特医药科技有限公司,132172-61-3)、3.72mg的DOPE(上海艾韦特医药科技有限公司,4004-05-1)、2.59mg的胆固醇(Sigma-Aldrich,C8667)和2.46mg的mPEG2000-DSPE(上海艾韦特医药科技有限公司,147867-65-0)。
将所述量的DOTAP、DOPE、胆固醇置于50mL圆底烧瓶中，加入1mL氯仿，溶解作为脂质膜材料的所述DOTAP、DOPE、胆固醇，即16.67μM的CLS含有5μM的DOTAP，5μM的DOPE，6.67μM的DOPE。将所得溶液通过旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司，R201L)除去氯仿，获得均匀的干燥脂质膜。
将所得的干燥脂质膜用1mL 5％的葡萄糖水溶液通过37℃水浴超声水化约10分钟。待脂质膜水化完全后，使用微型挤出器(Hamilton,81320)挤出脂质体(过核孔膜的顺序依次是200nm、100nm和50nm)，获得了阳离子脂质体(文中也称为CLS)。
将所制得的阳离子脂质体与2.46mg的mPEG2000-DSPE(溶于水)混合后置于55℃孵育半小时，获得了包含mPEG2000-DSPE的阳离子脂质体。
实施例2
阳离子脂质体和带正电的多聚氨基酸对药物的压缩(compact)作用：
琼脂糖凝胶电泳实验常用于测定药物载体对药物如核酸的包载能力。在本实施例中，制备了R8/siRNA复合物、CLS/siRNA复合物和CLS/R8/siRNA复合物，通过琼脂糖凝胶电泳实验分别测定了单独的CLS、单独的R8、以及CLS和R8的组合对核酸的包载能力。
将4mg的寡聚精氨酸R8(上海昕浩生物科技有限公司)作为带正电的多聚氨基酸溶于DEPC处理水(大连美仑生物技术有限公司，MA0018)中制备4mg/mL寡聚精氨酸R8溶液，将33μg的siRNA(在本实施例中，使用的是针对c-myc的小干扰RNA,下文中也缩写为siRNA，其有义链(5'-3')为AACGUUAGCUUCACCAACAdTdT(SEQ ID NO:79)，反义链(5'-3')为UGUUGGUGAAGCUAACGUUdTdT(SEQ ID NO:80))溶于125μL的DEPC处理水中制备20μM的siRNA溶液。
将寡聚精氨酸R8溶液与siRNA溶液按照电荷比为0、1、5、10、15、20、25、30的比例等体积混合(由于R8的一个氨基氮带一个正电荷，siRNA的一个磷酸根带一个负电荷，1μM的R8含8μM的氨基氮，即1μM的R8含8μM的正电荷，1μM的siRNA含有42μM的磷酸根，即1μM的siRNA含42μM的负电荷，R8与siRNA的电荷比＝(R8的μM值×8)/(siRNA的μM值×42)＝0.19×R8(μM)/siRNA(μM))，涡旋30s，置于37℃条件下孵育30分钟得到不同电荷比的R8/siRNA复合物。
使用上述不同电荷比的R8/siRNA复合物和CLS制备脂质体复合物。具体而言，取8μL不同电荷比的R8/siRNA复合物(即，4μL siRNA溶液和4μL R8溶液制备而得)与2.67μL的实施例1制备的16.67μM阳离子脂质体CLS混合，涡旋30s，置于37℃条件下孵育30分钟，得到R8/siRNA不同电荷比的脂质复合物CLS/R8/siRNA。在所述脂质复合物CLS/R8/siRNA中，以siRNA的电荷数为基准，阳离子脂质体CLS与siRNA的电荷比固定为4(由于DOTAP的一个氨基氮带一个正电荷，siRNA的一个磷酸根带一个负电荷，16.67μM的CLS含5μM的DOTAP，即1μM的CLS含0.3μM的正电荷，1μM的siRNA含42μM的负电荷，CLS与siRNA的电荷比＝(CLS的μM值×0.3)/(siRNA的μM值×42)＝0.007×CLS(μM)/siRNA(μM))。琼脂糖凝胶电泳结果表明，使用不同R8/siRNA电荷比的R8/siRNA复合物均能够与CLS混合制备脂质体复合物。
接下来，使用R8/siRNA电荷比为1:1的R8/siRNA复合物和CLS制备脂质体复合物。具体而言，将实施例1制备的CLS与8μL如上制备的R8/siRNA电荷比为1:1的R8/siRNA复合物按照CLS/siRNA电荷比为2、4、6、8、10、12的比例混合，涡旋30s，置于37℃条件下孵育30分钟得到CLS与siRNA不同电荷比的CLS/R8/siRNA复合物。
为了比较的目的，还制备了CLS/siRNA复合物，其中将实施例1制备的CLS与本实施例制备的20μL siRNA溶液按照CLS/siRNA电荷比为2、4、6、8、10、12的比例等体积混合，涡旋30s，置于37℃条件下孵育30分钟得到不同CLS/siRNA电荷比的CLS/siRNA复合物。如下实施CLS/siRNA电荷比的计算：由于DOTAP的一个氨基氮带一个正电荷，siRNA的一个磷酸根带一个负电荷，16.67μM的CLS含5μM的DOTAP，即1μM的CLS含0.3μM的正电荷，1μM的siRNA含42μM的负电荷，因此，CLS与siRNA的电荷比＝(CLS的μM值×0.3)/(siRNA的μM值×42)＝0.007×CLS(μM)/siRNA(μM))。
将上述制备的R8/siRNA复合物、CLS/siRNA复合物和CLS/R8/siRNA复合物分别小心加入琼脂糖凝胶加样孔中，并设置游离siRNA对照组，进行电泳。电泳结束后，用GelRed工作液(Biotium Inc.)避光泡染30分钟，在紫外302nm条件下进行凝胶成像。结果如图1所示。
图1中小图A的结果表明，单独的寡聚精氨酸R8无法完全压缩基因；图1中小图C和D的结果表明，单独的阳离子脂质体CLS虽然能够一定程度地压缩基因，但是CLS/siRNA复合物的粒径较大；图1中小图E和F的结果表明，阳离子脂质体和寡聚精氨酸R8的组合能够有效地共同压缩基因。
实施例3
阳离子脂质体和带正电的多聚氨基酸压缩药物后含有药物的脂质体复合物的粒径和电势表征：
根据实施例2中所述方法分别制备R8/siRNA复合物、CLS/siRNA复合物和CLS/R8/siRNA复合物，并进行粒径与电势测定。
采用动态光散射技术直接测量粒径。粒径测定结果如图1、图3和图12所示。在图12中，来自动态光散射测量的结果以横坐标为粒径，纵坐标为光强度显示，由各粒子所贡献的光强度计算而得。
由图3中的小图B可见，当寡聚精氨酸R8/siRNA的电荷比为5、10、20时，物理复合物R8/siRNA的粒径约为200nm。当寡聚精氨酸R8/siRNA的电荷比为5，阳离子脂质体CLS与siRNA的电荷比为4时，使用阳离子脂质体和寡聚精氨酸的组合压缩siRNA后，含有siRNA的脂质体复合物(CLS/R8/siRNA)的粒径测定结果如图12所示，粒径减小至108nm。当寡聚精氨酸R8/siRNA的电荷比为5时，89WPenetratin修饰的阳离子脂质体89W-CLS与siRNA的电荷比为4时，使用阳离子脂质体和寡聚精氨酸的组合压缩siRNA后，89WPenetratin修饰的含有siRNA的脂质体复合物(89W-CLS/R8/siRNA)的粒径与CLS/R8/siRNA相近，为105nm。89WPenetratin修饰的含有siRNA的脂质体复合物的最高光强度相对于CLS/R8/siRNA的最高光强度变低，这是因为前者的粒径分布范围变宽所致。
当寡聚精氨酸R8/siRNA的电荷比为5，阳离子脂质体CLS或89WPenetratin修饰的阳离子脂质体89W-CLS与siRNA的电荷比为4时，分别制备了R8/siRNA复合物、CLS/siRNA/R8复合物和89W CLS/siRNA/R8复合物，采用ζ电势分析仪，在23℃使用5V/cm的电场强度、0.4cm的电极间距在水中测量ζ电势。ζ电势测定结果如图13所示。
由图13可见，物理复合物R8/siRNA、脂质体复合物CLS/R8/siRNA和89WPenetratin修饰的脂质体复合物的ζ电势分别为22mV、43mV和38mV。
实施例4
含有药物的脂质体复合物的稳定性表征之一：
根据实施例2中所述方法制备DEPC处理水中的各CLS/R8/siRNA复合物，高速离心后观察各含有药物的脂质体复合物(即，脂质体制剂)的稳定性。
具体而言，将根据实施例2中所述方法制备的各CLS/R8/siRNA复合物在12000×g的速度下离心20分钟，观察各脂质体制剂的沉淀情况。
结果如图3中的小图C所示。由图3中的小图C可见，当寡聚精氨酸R8/siRNA的电荷比大于5，且当阳离子脂质体CLS与siRNA的电荷比为4时，CLS/R8/siRNA复合物经高速离心后没有明显的沉淀析出，这表明阳离子脂质体和寡聚精氨酸共同压缩siRNA，能够形成稳定的脂质体制剂。
实施例5
含有药物的脂质体复合物的稳定性表征之二：
将根据实施例2中所述方法制备的DEPC处理水中的各CLS/R8/siRNA复合物在12000×g的速度下离心20分钟，小心地将各上清加入琼脂糖凝胶加样孔中，并设置游离siRNA对照组，进行电泳。电泳结束后，用GelRed工作液避光泡染30分钟，在紫外302nm条件下进行凝胶成像。结果如图3中的小图D所示。
由图3中的小图D可见，当寡聚精氨酸R8/siRNA的电荷比大于5，且当阳离子脂质体CLS与siRNA的电荷比为4时，CLS/R8/siRNA复合物经高速离心后，CLS/R8/siRNA仍保留在上清溶液中，而且没有游离的siRNA电泳出来。这表明阳离子脂质体和寡聚精氨酸共同压缩siRNA，能够形成稳定的脂质体制剂。
实施例6
表面修饰的脂质体药物制剂的配制：
对脂质体药物制剂使用穿膜肽进行表面修饰，获得表面修饰的药物制剂。
i.穿膜肽-PEG-磷脂的制备：
由DSPE-聚乙二醇马来酰亚胺(DSPE-PEG3400-马来酰亚胺)(Laysan Bio，146-123)与末端修饰有半胱氨酸的penetratin衍生物(89WPenetratin-Cys)经一步反应制备得到穿膜肽-PEG-DSPE。
具体而言，将20mg DSPE-PEG3400-马来酰亚胺溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺中，在搅拌状态下向其中加入溶于10mL磷酸缓冲溶液(10mM,pH7.2)介质中的18mg 89WPenetratin-Cys，在25℃的条件下继续搅拌过夜使反应完全。反应结束后，将所得混合物在冰浴条件下置于纯水中透析2天，冷冻干燥得到白色絮状物，为89WPenetratin-PEG3400-DSPE。
其中，所述多肽89WPenetratin是penetratin的一种衍生物，具体氨基酸序列为RQIKIWFWWRRMKWKK(SEQ ID NO:29)。穿膜肽-PEG-DSPE中的穿膜肽也可以使用其他penetratin衍生物，例如，使用表1中所示的其他penetratin衍生物，例如，对penetratin第2位谷氨酰胺和/或第8位谷氨酰胺和/或第9位天冬酰胺进行了疏水性氨基酸突变的产物(也可参见中国发明专利申请CN201710414334.7)。
为了便于与聚乙二醇末端基团反应，穿膜肽89WPenetratin或其他penetratin衍生物的N-端或C-端可以额外添加一个半胱氨酸残基(cysteine,C)。
ii.表面修饰的脂质体药物制剂的配制：
在总的脂质体膜材料中，DOTAP:DOPE:胆固醇:(mPEG2000-DSPE和89WPenetratin-PEG3400-DSPE)的摩尔比为约28.5:28.5:38:5。
称取3.5mg的DOTAP(上海艾韦特医药科技有限公司,132172-61-3)、3.72mg的DOPE(上海艾韦特医药科技有限公司,4004-05-1)、2.59mg的胆固醇(Sigma-Aldrich,C8667)。将所述量的DOTAP、DOPE、胆固醇置于50mL圆底烧瓶中，加入1mL氯仿，溶解作为脂质膜材料的所述DOTAP、DOPE、胆固醇，即16.67μM的CLS含有5μM的DOTAP，5μM的DOPE，6.67μM的DOPE。将所得溶液通过旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司，R201L)除去氯仿，获得均匀的干燥脂质膜。
将所得的干燥脂质膜用1mL 5％的葡萄糖水溶液通过37℃水浴超声水化10分钟。待脂质膜水化完全后，使用微型挤出器(Hamilton,81320)挤出脂质体(过核孔膜的顺序依次是200nm、100nm和50nm)，获得了阳离子脂质体(文中也称为CLS)。
将4mg的寡聚精氨酸R8(上海昕浩生物科技有限公司)溶于DEPC处理水(大连美仑生物技术有限公司，MA0018)中制备4mg/mL寡聚精氨酸R8溶液，将33μg的FAM标记的siRNA(在本实施例中，使用的是针对c-myc的siRNA，其有义链(5'-3')为FAM-AACGUUAGCUUCACCAACAdTdT(SEQ ID NO:79)，即，5'修饰有FAM；反义链(5'-3')为UGUUGGUGAAGCUAACGUUdTdT(SEQ ID NO:80))溶于125μL的DEPC处理水中制备20μM的FAM-siRNA溶液。
将寡聚精氨酸R8溶液与20μM的FAM-siRNA溶液按照电荷比为5的比例等体积混合，涡旋30s，置于37℃条件下孵育30分钟得到复合物R8/FAM-siRNA。取8μL R8/FAM-siRNA复合物，与上述制备的阳离子脂质体CLS按照脂质体与FAM-siRNA的电荷比为4的比例混合，涡旋30s，得CLS/R8/FAM-siRNA复合物。
对于占脂质体总摩尔数为5％的mPEG2000-DSPE和89WPenetratin-PEG3400-DSPE，分别配制了89WPenetratin-PEG3400-DSPE的摩尔数占mPEG2000-DSPE和89WPenetratin-PEG3400-DSPE的摩尔数为0％、20％、40％、60％、80％、100％的混合物。即，89WPenetratin-PEG3400-DSPE摩尔数分别占总的脂质体膜材料摩尔数的0％、1％、2％、3％、4％、5％。
将所制得的CLS/R8/FAM-siRNA复合物分别与89WPenetratin-PEG3400-DSPE的摩尔数占mPEG2000-DSPE和89WPenetratin-PEG3400-DSPE的摩尔数为0％、20％、40％、60％、80％、100％的混合物混合后置于55℃孵育半小时，获得表面修饰有0％、1％、2％、3％、4％、5％比例的穿膜肽的脂质体药物制剂，即89W-CLS/R8/FAM-siRNA。
实施例7
定量评价细胞对表面修饰有不同比例穿膜肽的药物制剂的摄取：
将U87细胞(人恶性胶质母细胞瘤细胞，购自ATCC)培养于DMEM完全培养基(添加10％FBS和1％青霉素-链霉素)中。取生长状态良好的U87细胞重悬于DMEM完全培养基中，按5×105个细胞/孔接种到6孔板中，每孔1mL，接种后每天更换新鲜培养液一次，培养2～3天后进行实验。
弃去培养液后，无菌PBS洗U87细胞三次，加入1mL实施例6制备的表面修饰有不同比例的穿膜肽的脂质体药物制剂(包载FAM标记的siRNA)的无血清DMEM培养基，37℃、5％CO2条件下孵育4h。孵育结束后弃去培养液，用含0.02mg/mL肝素钠的PBS缓冲溶液洗去吸附在孔上或细胞表面的正电性物质。用胰酶将细胞消化下来，重悬于200μL无菌PBS缓冲溶液中，吹打均匀后对每个样品计数细胞，取104个细胞进行流式细胞术检测。使用无血清DMEM培养基孵育的细胞作为阴性对照组。所有实验均一式三份实施，结果如图4所示(平均值±SD，n＝3，*p<0.05，*表示两组之间在统计学上有显著性差异；**p<0.01，***p<0.001，**和***表示两组之间在统计学上有非常显著的差异)。图4横坐标上的“0％、1％、2％、3％、4％、5％”分别表示表面修饰有0％、1％、2％、3％、4％、5％比例的穿膜肽的脂质体药物制剂，即89W-CLS/R8/siRNA。
由图4可见，89WPenetratin-PEG3400-DSPE摩尔数占总的脂质体膜材料摩尔数的2％、3％、4％时，细胞对表面修饰有所述比例穿膜肽的药物制剂的摄取效果优于市售的基因转染试剂Lipo2000。
实施例8
定量评价细胞对使用不同配比的脂质体膜材料制备的药物制剂的摄取：
将U87细胞(人恶性胶质母细胞瘤细胞，购自ATCC)培养于DMEM完全培养基(添加10％FBS和1％青霉素-链霉素)中。取生长状态良好的U87细胞重悬于DMEM完全培养基中，按5×105个细胞/孔接种到6孔板中，每孔1mL，接种后每天更换新鲜培养液一次，培养2～3天后进行实验。
按照实施例6所述方法制备脂质体膜材料配比如表2所示的脂质体药物制剂(包载FAM标记的siRNA)。
表2.脂质体膜材料的不同配比(以摩尔份数表示，％)
将培养的U87细胞弃去培养液后，无菌PBS洗三次。每孔分别加入含有配方1、配方2、配方3制备的脂质体药物制剂的1ml无血清DMEM培养基中，37℃、5％CO2条件下孵育4h。孵育结束后弃去培养液，用含0.02mg/mL肝素钠的PBS缓冲溶液洗去吸附在孔上或细胞表面的正电性物质。用胰酶将细胞消化下来，重悬于200μL无菌PBS缓冲溶液中，吹打均匀后对每个样品计数细胞，取104个细胞进行流式细胞术检测。使用无血清DMEM培养基孵育的细胞作为阴性对照组。所有实验均一式三份实施，结果如图5所示(平均值±SD，n＝3，*p<0.05，*表示两组之间在统计学上有显著性差异；**p<0.01，***p<0.001，**和***表示两组之间在统计学上有非常显著的差异)。
由图5可见，使用配方1、配方2、配方3制备的脂质体药物制剂均能够被细胞摄取，与对照组比较存在显著性差异，并且其中细胞对使用配方2制备的脂质体药物制剂的摄取效果最佳。
实施例9
使用组分(iv)不同配比的脂质体膜材料制备的药物制剂的粒径：
按照实施例6所述方法，在脂质体膜材料的组分(i)：组分(ii)：组分(iii)的摩尔比为3：3：4时，制备组分(iv)的配比如表3所示的脂质体药物制剂(包载FAM标记的siRNA)。
表3.组分(iv)的不同配比(以摩尔份数表示，％)
获得了组分(iv)占脂质体膜材料的1％、5％、8％、10％摩尔份数的脂质体药物制剂。对所述脂质体药物制剂进行粒径测定。粒径测定结果如图6所示。图6横坐标上的“1％、5％、8％、10％”分别表示组分(iv)占脂质体膜材料的1％、5％、8％、10％摩尔份数的脂质体药物制剂。
由图6可见，当组分(iv)占脂质体膜材料的1％－10％摩尔份数时，脂质体药物制剂的粒径在100nm－200nm之间；且随着组分(iv)占脂质体膜材料的摩尔份数的提高，粒径呈现增大的趋势。
实施例10
定量评价细胞对使用阳离子脂质体/siRNA的不同电荷比制备的药物制剂的摄取：
将U87细胞(人恶性胶质母细胞瘤细胞，购自ATCC)培养于DMEM完全培养基(添加10％FBS和1％青霉素-链霉素)中。取生长状态良好的U87细胞重悬于DMEM完全培养基中，按5×105个细胞/孔接种到6孔板中，每孔1mL，接种后每天更换新鲜培养液一次，培养2～3天后进行实验。
按照实施例6所述方法，将寡聚精氨酸R8溶液与20μM的FAM-siRNA溶液按照电荷比为5的比例等体积混合，涡旋30s，置于37℃条件下孵育30分钟得到复合物R8/FAM-siRNA。取8μL R8/FAM-siRNA复合物，与制备的阳离子脂质体CLS按照脂质体与FAM-siRNA的电荷比为2、4、6、8、10、12的比例混合，涡旋30s，获得阳离子脂质体/siRNA的不同电荷比的CLS/R8/FAM-siRNA复合物。
进一步地，按照实施例6所述方法，获得表面修饰有3％穿膜肽的脂质体药物制剂，即89W-CLS/R8/FAM-siRNA复合物。
将培养的U87细胞弃去培养液后，无菌PBS洗三次。每孔分别加入含有阳离子脂质体/siRNA的电荷比为2、4、6、8、10、12的药物制剂的1ml无血清DMEM培养基，37℃、5％CO2条件下孵育4h。孵育结束后弃去培养液，用含0.02mg/mL肝素钠的PBS缓冲溶液洗去吸附在孔上或细胞表面的正电性物质。用胰酶将细胞消化下来，重悬于200μL无菌PBS缓冲溶液中，吹打均匀后对每个样品计数细胞，取104个细胞进行流式细胞术检测。使用无血清DMEM培养基孵育的细胞作为阴性对照组。所有实验均一式三份实施，结果如图2所示(平均值±SD，n＝3，*p<0.05，*表示两组之间在统计学上有显著性差异；**p<0.01，***p<0.001，**和***表示两组之间在统计学上有非常显著的差异)。
由图2可见，使用阳离子脂质体/siRNA的电荷比为2、4、6、8、10、12制备的药物制剂均能够被细胞摄取，与对照组比较存在显著性差异，并且其中细胞对使用阳离子脂质体/siRNA的电荷比为4时制备的脂质体药物制剂的摄取效果最佳。
实施例11
表面修饰有不同比例穿膜肽的药物制剂对细胞的转染效果评价：
首先，使用35mm Dimple NanoCulture Dish培养细胞，观察细胞的成球能力和形态，建立细胞球模型。
具体而言，取1.5mL的DMEM完全培养基加入35mm Dimple NanoCulture Dish(JSRCorporation提供的细胞球培养板)中，然后将Dish放置在冷冻离心机内离心(Dish里只有培养基，没有细胞)，离心速度为1000×g，离心时间为5分钟。离心结束后，将Dish放在超净台上静置30分钟。
取生长状态良好的各种细胞，消化离心后，加入培养基调整细胞浓度为5×105个/mL，用移液枪吹打使细胞分散均匀，缓慢小心向Dish中加入1.5mL细胞悬液，然后放操作台上静置20分钟，放到37℃的孵箱内培育。隔天换液，取出Dish，小心吸出1.5mL的培养基(悬浮细胞与贴壁细胞的操作相同，因为换液时细胞已经初步形成细胞球，沉在Dish的底部)，加入新鲜的1.5mL DMEM完全培养基。在倒置显微镜下观察相应细胞球的形态，其中A549细胞是人非小细胞肺癌细胞，Caco-2是人克隆结肠腺癌细胞，Rb-1是人视网膜神经胶质瘤细胞，U87是人恶性胶质母细胞瘤细胞，293T是人肾上皮细胞，所述细胞均购自ATCC。A549和Caco-2是贴壁细胞，且贴壁性较强，而U87和293T贴壁性较弱的贴壁细胞，Rb-1则是悬浮细胞。结果如图7所示。在图7中，样品1和样品2分别是同一种细胞的不同放大倍数，且样品3和样品4是样品2的重复实验孔。
由图7可见，A549和Caco-2由于贴壁性较好，容易贴在壁上生长不易成球，Rb-1虽然是悬浮细胞，但细胞容易聚集成球，且处理过程中非常容易松散。相比较而言，U87和293T的成球能力最好，形态大致为球型，且大小均一，适合作为建立的细胞球模型进一步的探索。
由图8的结果可见，不同多肽对细胞球的渗透能力有显著差异，而且利用35mmDimple NanoCulture Dish建立的细胞球模型能够对不同多肽的渗透能力进行区分。注：图8中的“S8”为8聚丝氨酸，作为阴性对照；“PE”为野生型Penetratin；89W为对penetratin第8位谷氨酰胺和第9位天冬酰胺进行了色氨酸突变的产物；289W为对penetratin第2位谷氨酰胺、第8位谷氨酰胺和第9位天冬酰胺进行了色氨酸突变的产物。野生型Penetratin的衍生物对细胞球的渗透能力显著提高。
接下来，使用293T细胞球来评估包载有GFP-siRNA的表面修饰有不同比例穿膜肽的药物制剂对细胞的转染效果。
与上述实施例6类似地，制备表面修饰有不同比例穿膜肽的GFP-siRNA脂质体药物制剂，其中使用的GFP-siRNA有义链(5'-3')为GCAUGUACCACGAGUCCAATT(SEQ ID NO:81)；反义链(5'-3')为UUGGACUCGUGGUACAUGCTT(SEQ ID NO:82)。具体而言，将寡聚精氨酸R8溶液与20μM的GFP-siRNA溶液按照电荷比为5的比例等体积混合，涡旋30s，置于37℃条件下孵育30分钟得到复合物R8/GFP-siRNA。取8μLR8/GFP-siRNA复合物，与制备的阳离子脂质体CLS按照脂质体与FAM-siRNA的电荷比为4的比例混合，涡旋30s，获得CLS/R8/GFP-siRNA复合物。
进一步地，按照实施例6所述方法，获得表面修饰有1％、3％、5％穿膜肽的脂质体药物制剂，即89W-CLS/R8/GFP-siRNA复合物。
向293T细胞球模型中加入包载有400nM GFP-siRNA的脂质体药物制剂的无血清DMEM溶液，37℃、5％CO2条件下孵育4h，然后弃去药液，加入新鲜的DMEM完全培养基继续孵育24小时，用PBS缓冲溶液洗3次，在激光共聚焦显微镜下观察GFP荧光情况(文中也称为GFP-293T细胞球)。使用无血清DMEM培养基孵育的细胞作为阴性对照组。所有实验均一式三份实施，结果如图9所示(平均值±SD，n＝3，*p<0.05，*表示两组之间在统计学上有显著性差异；**p<0.01，***p<0.001，**和***表示两组之间在统计学上有非常显著的差异)。
类似地，进行了包载有400nM GFP-siRNA的脂质体药物制剂对U87细胞球的转染效果评价(文中也称为GFP-U87细胞球)。结果如图10所示。
图9和图10中的“1％、3％、5％”分别表示表面修饰有1％、3％、5％比例的穿膜肽的脂质体药物制剂，即89W-CLS/R8/siRNA。
图9中，使用35mm Dimple NanoCulture Dish建立GFP-293T细胞球，293T细胞不是肿瘤细胞，89WPenetratin-PEG-DSPE在脂质体膜材料中所占摩尔比例越高，脂质体药物对细胞球的渗透程度越高。图10中，使用35mm Dimple NanoCulture Dish建立GFP-U87细胞球，U87细胞是脑胶质瘤细胞，89WPenetratin-PEG-DSPE在脂质体膜材料中所占摩尔比例达到3％－5％时，脂质体药物对细胞球具有较高的渗透能力。
实施例12
包含不同结构类型带正电的多聚氨基酸的药物制剂对LUC-U87细胞的转染效果的定性和定量评价：
选用R8、R10、R12、c-R8、c-R10和c-R12等寡聚精氨酸作为不同结构类型带正电的多聚氨基酸，以所述寡聚精氨酸分别与siRNA的电荷比为5，CLS与LUC-siRNA的电荷比为4，按照实施例6制备含有不同寡聚精氨酸的表面修饰有3％比例穿膜肽的脂质体药物制剂，其中使用的LUC-siRNA有义链(5'-3')为GCUGCACUCUGGCGACAUUTT(SEQ ID NO:83)；反义链(5'-3')为AAUGUCGCCAGAGUGCAGCTT(SEQ ID NO:84)。
取生长状态良好的U87细胞(购自ATCC)按5×104个细胞/孔分别接种到48孔板中，接种后每天换液一次，培养2～3天后进行实验。弃去DMEM完全培养基后，无菌PBS洗三次，分别加入包载400nM LUC-siRNA的脂质体药物制剂的无血清DMEM培养基，37℃、5％CO2条件下孵育4h，然后弃去药液，加入DMEM完全培养基继续孵育24小时(文中也称为LUC-U87细胞)，用含0.02mg/mL肝素钠的PBS缓冲溶液洗去正电性吸附物质，加入萤火虫萤光光素酶底物，在小动物活体荧光/生物发光成像系统(IVIS Spectrum)内测定荧光强度。利用小动物活体光学成像系统的目的区域(Region of interest，ROI)定量圈选功能进行定性分析。结果见图11所示。
此实施例是为了探究不同结构类型带正电的多聚氨基酸的基因沉默效果，由图11可以发现，改变脂质体药物制剂中的寡聚精氨酸的聚合度和结构对基因的沉默作用没有显著影响。
实施例13
包载siRNA的递送载体对bEnd.3细胞和U87细胞的促凋亡能力评价：
取DMEM培养基中对数期生长状态良好的bEnd.3细胞和U87细胞(均购自ATCC)按5×104/孔的浓度分别铺于12孔板中，在37℃、5％CO2条件下培养至细胞单层铺满板底。
弃去培养液，无菌PBS缓冲液洗3次后，加入400μL含400nmol/L siRNA的实施例6制备的脂质体制剂(89W-CLS/R8/siRNA)，即，寡聚精氨酸与siRNA的电荷比为5，CLS与siRNA的电荷比为4，表面修饰有3％比例89WPenetratin-PEG3400-DSPE的脂质体药物制剂，细胞培养箱中孵育6h后，弃去药液，无菌PBS缓冲液洗3次后，加入完全培养基1mL继续培养18h，之后收集细胞，先用PBS清洗，无EDTA的胰酶消化1分钟，DMEM培养液终止消化后收集细胞至离心管中，按照细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，KGA108)的步骤对细胞进行双染，然后用流式细胞分析仪检测。使用无血清DMEM培养基孵育的细胞作为阴性对照组。所有实验均一式三份实施，结果如图14中的小图A和B所示(平均值±SD，n＝3，*p<0.05，*表示两组之间在统计学上有显著性差异；**p<0.01，***p<0.001，**和***表示两组之间在统计学上有非常显著的差异)。
结果表明，本发明设计的递送载体能够特异性促进肿瘤细胞U87的凋亡，而对正常细胞bEnd.3细胞的生长没有较大的影响。
实施例14
包载siRNA的递送载体对bEnd.3细胞和U87细胞的细胞毒性评价：
取对数期生长状态良好的bEnd.3(购自ATCC)和U87细胞，用DMEM完全培养基培养，按5×103个细胞/cm2浓度分别铺于96孔平底板的中间60孔中，边缘孔用无菌PBS缓冲溶液填充，在37℃、5％CO2条件下培养至细胞单层铺满板底，弃去培养液，无菌PBS缓冲液洗3次后，加入200μL含400nM siRNA的递送载体的培养液，细胞培养箱中孵育6h后，弃去药液，无菌PBS缓冲液洗3次后，加入完全培养基继续培养12h。之后每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h后，小心弃去液体，PBS缓冲液洗三次后每孔加入150μL DMSO，在摇床上低速振荡(50转/分钟)20分钟后，于酶标仪(BioTek，PowerWave XS)OD 490nm处测定各孔吸光度值。同时设置空白调零孔(孔中仅添加DMEM完全培养基、MTT和DMSO)和阴性对照孔(孔中仅添加细胞、DMEM完全培养基、MTT和DMSO)。所有实验均一式三份实施，结果如图14中的小图C和D所示(平均值±SD，n＝3，*p<0.05，*表示两组之间在统计学上有显著性差异；**p<0.01，***p<0.001，**和***表示两组之间在统计学上有非常显著的差异)。
结果表明，相比商品化的阳离子基因递送载体Lipofectamine 2000(Lipo2000，Invitrogen)，本发明设计的递送载体对bEnd.3细胞和U87细胞生长状态影响较小，在所考察的浓度条件下未见细胞毒性。
实施例15
DiD细胞膜荧光探针标记的基因递送载体经鼻给药后的体内分布情况：
首先制备了亲脂性荧光染料DiD标记的脂质体，用于对脂质体进行示踪。DiD细胞膜红色荧光探针购自大连美仑生物技术有限公司,MB6190。如实施例1所述类似地，称取膜材，按试剂盒说明书所述加入DiD染料，一同溶解在氯仿中，制备DiD标记的CLS/R8/siRNA。另外，如实施例6所述类似地，制备寡聚精氨酸与siRNA的电荷比为5，CLS与siRNA的电荷比为4，表面修饰有3％比例89WPenetratin-PEG3400-DSPE的DiD标记的脂质体药物制剂89W-CLS/R8/siRNA。
将12只ICR小鼠(20g，雄性，6周龄)分为3个组(89W-CLS/R8/siRNA组、CLS/R8/siRNA组和生理盐水(N.S.)组)，每只小鼠以鼻腔给药的方式给予DiD标记的核酸递送载体30μL左右(DiD浓度为0.01μM)，2.5h后将动物安乐死，经灌流、固定后，收集动物的主要脏器，使用小动物活体成像系统检测各脏器荧光分布。结果如图15所示。
结果表明，相比CLS/R8/siRNA组，89W-CLS/R8/siRNA组在脑部的荧光强度更大，穿膜肽的修饰能够显著增强递送载体的组织穿透能力，进而增强其入脑能力，提高基因在脑部的蓄积量。
实施例16
探究DiD细胞膜荧光探针标记的载体递送FAM-siRNA的入胞机制：
如实施例1所述类似地，称取膜材，按试剂盒说明书所述加入DiD细胞膜荧光探针(大连美仑生物技术有限公司,MB6190)，制备DiD细胞膜荧光探针标记的CLS，即CLS/DiD。按照实施例6所述方法类似地，制备DiD和/或FAM荧光标记的各药物制剂。
将U87细胞(购自ATCC)培养于DMEM完全培养基(添加10％FBS和1％青-链霉素)中。取生长状态良好的U87细胞重悬于DMEM完全培养基中，按5×105个细胞/孔接种到6孔板中，每孔1mL，接种后每天更换新鲜培养液一次，培养2～3天后进行实验。
将培养的U87细胞弃去培养液后，无菌PBS洗三次。每孔分别加入含有1μM siRNA的不同荧光标记的药物制剂的1mL无血清DMEM培养基，37℃、5％CO2条件下孵育4h。孵育结束后弃去培养液，用含0.02mg/mL肝素钠的PBS缓冲溶液洗去吸附在孔上或细胞表面的正电性物质。用胰酶将细胞消化下来，重悬于200μL无菌PBS缓冲溶液中，吹打均匀后对每个样品计数细胞，取104个细胞进行流式细胞术检测。实验中设置与空白的无血清DMEM培养基孵育的细胞作为阴性对照组；另外，设置了两组阳性对照组，分别为只含有FAM的89W-CLS/R8/FAM-siRNA，以及只含有DiD的89W-CLS/DiD/R8/siRNA；还设置了如下制剂组：R8/FAM-siRNA组、CLS/DiD组、CLS/DiD/R8/FAM-siRNA组、89W-CLS/DiD/R8/FAM-siRNA组。所有实验均一式三份进行。结果如图16所示。
由图16中的小图D可见，单独的R8压缩siRNA形成的药物制剂入胞量很少，然而CLS和R8共同压缩siRNA形成的药物制剂能够成功入胞(见小图F)，且89W修饰的CLS和R8共同压缩siRNA形成的药物制剂能够显著提高细胞对基因载体的摄取量(见小图G)。通过图16的小图B和C以及小图G可见，细胞对89W-CLS/R8/FAM-siRNA药物制剂的摄取呈现DiD和FAM双荧光阳性结果，由此可以推测CLS和siRNA是以复合物的形式共同入胞的，并非以游离的形式被摄取。
实施例17
DiD细胞膜荧光探针标记的基因递送载体在U87原位脑瘤模型鼠中经鼻给药后的体内分布情况：
首先制备亲脂性荧光染料DiD标记的脂质体，用于对脂质体进行示踪。DiD细胞膜红色荧光探针购自大连美仑生物技术有限公司,MB6190。如实施例15所述类似地，称取膜材，按试剂盒说明书所述加入DiD染料，一同溶解在氯仿中，制备DiD标记的CLS/R8/siRNA。另外，如实施例6所述，制备寡聚精氨酸与siRNA的电荷比为5，CLS与siRNA的电荷比为4，表面修饰有3％比例89WPenetratin-PEG3400-DSPE的DiD标记的脂质体药物制剂89W-CLS/R8/siRNA。
取对数生长期的U87细胞，计数，用PBS缓冲液重悬细胞。每只BALB/c裸鼠(上海西普尔-必凯试验动物有限公司，中国)接种6×105个U87细胞(分散于5μL PBS缓冲液中)。将裸鼠用7％水合氯醛麻醉，脑立体定位仪固定，采用微量注射器将细胞接种于纹状体部位(前囟向前0.6mm，向右1.8mm，纵深3mm)，构建U87原位脑瘤模型。
将9只接种U87肿瘤细胞18天的荷U87脑原位瘤小鼠随机分为3组(89W-CLS/R8/siRNA组、CLS/R8/siRNA组和生理盐水组)，每只小鼠以鼻腔给药的方式给予DiD标记的核酸递送载体30μL(DiD浓度为0.01μM)，2.5h后将动物安乐死，经灌流、固定后，收集动物的脑部组织及肿瘤，进行冷冻切片处理，并在荧光显微镜(德国Leica)上观察DiD荧光信号的分布，结果如图17所示，标尺＝100μm。
结果表明，相比CLS/R8/siRNA组，89W-CLS/R8/siRNA组在肿瘤部位的荧光强度更高，穿膜肽的修饰能够显著增强递送载体的组织穿透能力，进而增强其入脑能力，提高基因在肿瘤部位的蓄积量。
实施例18
包载siRNA的递送载体的抗U87脑原位瘤的药效学评价：
按照实施例6所述方法，制备脂质体药物制剂，即CLS/R8/siRNA和89W-CLS/R8/siRNA复合物，按照商品化的阳离子基因递送载体Lipofectamine 2000(Lipo2000，Invitrogen)说明书制备Lipo2000/siRNA复合物。
按照实施例17所述方法构建U87原位脑瘤模型，U87脑原位瘤接种后将小鼠随机分为5组(n＝10)：生理盐水组、siRNA组、Lipo2000/siRNA组、CLS/R8/siRNA组和89W-CLS/R8/siRNA组。接种U87肿瘤细胞后第5天开始鼻腔给药(47μg/kg siRNA)，每天给药一次，共给药22次，记录小鼠体重及生存期，绘制体重变化曲线及生存曲线，结果如图18所示(*p<0.05，*表示两组之间在统计学上有显著性差异；**p<0.01，**表示两组之间在统计学上有非常显著的差异)。
结果表明，生理盐水组、siRNA组、Lipo2000/siRNA组、CLS/R8/siRNA组的中位生存期分别为23.5天、21.5天、24.5天和26天，89WP-CLS/R8/siRNA组则成功将中位生存时间延长到29天，并且生存曲线与其他各组均没有交叉，实现了最显著的抗脑胶质瘤效果，这些数据证实了89WP-CLS/R8/siRNA能够将药物递送至脑部肿瘤，发挥抗肿瘤效果，其独特递送优势可以转化为更高的治疗功效。
实施例19
包载siRNA的递送载体在U87原位脑瘤模型鼠中的体内促凋亡能力评价：
按照实施例18所述方法制备脂质体药物制剂，构建U87原位脑瘤模型，并进行鼻腔给药。最后一次给药后2天(第28天)，随机选择每组3只小鼠并对其实施安乐死，取脑部肿瘤进行免疫荧光组化分析。用4％多聚甲醛固定肿瘤，包埋在石蜡中并切成薄片。通过TUNEL染色检测凋亡细胞，通过CaseViewer软件分析肿瘤部位的TUNEL荧光强度，结果如图19所示，标尺＝20μm。
结果表明，在TUNEL染色切片中，绿色荧光的强度表示发生凋亡的肿瘤细胞的数量，Lipo2000/siRNA组，CLS/R8/siRNA组和89WP-CLS/R8/siRNA组均能引起肿瘤细胞发生凋亡，其中，89WP-CLS/R8/siRNA组的荧光强度最高，即细胞凋亡比例最高，表明本发明设计的递送载体能够在体内通过诱发肿瘤细胞的凋亡发挥抗肿瘤效果。
实施例20
包载siRNA的递送载体的体内鼻粘膜毒性评价：
将18只SD大鼠(上海灵畅生物科技有限公司，中国)随机分为6组(n＝3)，生理盐水组(阴性对照)，1％脱氧胆酸钠组(阳性对照)，siRNA组，CLS/R8/siRNA组，89WP-CLS/R8/siRNA组和Lipo2000/siRNA组。按照实施例6所述方法，制备脂质体药物制剂，即CLS/R8/siRNA和89W-CLS/R8/siRNA复合物，按照商品化的阳离子基因递送载体Lipofectamine2000(Lipo2000，Invitrogen)说明书制备Lipo2000/siRNA复合物。连续7天向SD大鼠左侧鼻腔进行鼻腔给药50μL制剂(包含或不包含160nM siRNA)，最后一次给药后24h，处死大鼠，分离左鼻腔鼻粘膜并用生理盐水洗涤。样品用4％多聚甲醛固定，并切片以进行苏木精-伊红(HE)染色，结果如图20所示，标尺＝50μm。
结果表明，阳性对照组(脱氧胆酸钠组和Lipo2000/siRNA组)的鼻粘膜上皮细胞出现较为明显的形态变化，并伴有鼻纤毛脱落(红色箭头)，但是在生理盐水组，siRNA组，CLS/R8/siRNA组和89WP-CLS/R8/siRNA组中，鼻粘膜上皮细胞形态完整且排列整齐，表明本发明设计的递送载体对鼻粘膜上皮细胞没有明显的毒性，可以认为是经鼻入脑递送的安全载体。
尽管已经出于说明本发明的目的显示了某些代表性实施方案和细节，但是本领域技术人员显而易见的是可以对它们进行多种变化和修改而不脱离主题发明的范围。在这个方面，本发明范围仅由以下权利要求限定。
Claims (16)
1.一种药物制剂，其是使用药物递送载体制备的经鼻腔施用的药物制剂，其中所述药物递送载体包含穿膜肽修饰的阳离子脂质体和SEQ ID NO:86所示的寡聚精氨酸R8，其中所述穿膜肽是SEQ ID NO:29所示的89WPenetratin；穿膜肽修饰的阳离子脂质体包含如下膜材料：
(i)阳离子脂质，为1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷DOTAP；
(ii)非阳离子脂质，为1,2-二-(9Z-十八酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺DOPE；
(iii)胆固醇；
(iv)聚乙二醇化(PEG化)的磷脂和与穿膜肽共轭的聚乙二醇磷脂，其中，所述PEG化的磷脂是甲氧基-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)，所述与穿膜肽共轭的聚乙二醇磷脂是89WPenetratin-PEG-DSPE；且所述PEG化磷脂和与穿膜肽共轭的聚乙二醇磷脂中的聚乙二醇链长不相等，其中与穿膜肽共轭的聚乙二醇磷脂中的聚乙二醇链较PEG化磷脂中的聚乙二醇链更长0.5kDa－5kDa之间；且其中所述膜材料(i):(ii):(iii):(iv)的摩尔比为20－40:20－40:20－40:1－20，且与穿膜肽共轭的聚乙二醇磷脂占膜材料(iv)中的20％－80％摩尔比；
所述药物制剂是通过将药物递送载体中包含的带正电的寡聚精氨酸R8和药物分子混合形成聚合物-药物的物理复合物，其中所述药物分子是针对脑部疾病的核酸，选自小干扰RNA(siRNA)、有义RNA、反义寡核苷酸(ASO)；且寡聚精氨酸R8与药物分子的电荷比为5；
并将所述物理复合物与所述穿膜肽修饰的阳离子脂质体混合，其中，所述阳离子脂质体与药物分子的电荷比为4，或者
所述药物制剂是通过如下方法制备的，所述方法包括(a)混合脂质体的所述膜材料(i)、(ii)和(iii)，制备空白脂质体；(b)以寡聚精氨酸R8与药物分子的电荷比为5来制备带正电的寡聚精氨酸R8和药物分子的物理复合物，其中所述药物分子是针对脑部疾病的核酸，选自小干扰RNA(siRNA)、有义RNA、反义寡核苷酸(ASO)；(c)以空白脂质体与药物分子的电荷比为4来混合步骤(a)获得的空白脂质体和步骤(b)获得的物理复合物；(d)将步骤(c)获得的脂质体与膜材料(iv)混合并孵育；
由此，形成包含聚合物-药物的物理复合物的脂质体复合物，其粒径介于50nm至300nm之间。
2.根据权利要求1所述的药物制剂，其中所述阳离子脂质体包含如下膜材料：(i)DOTAP；(ii)DOPE；(iii)胆固醇；(iv)mPEG2000-DSPE和89WPenetratin-PEG3400-DSPE，且膜材料(i):(ii):(iii):(iv)的摩尔比为20－40:20－40:20－40:1－20，且89WPenetratin-PEG3400-DSPE占膜材料(iv)中的20％－80％摩尔比。
3.根据权利要求2所述的药物制剂，其中，所述膜材料(i):(ii):(iii):(iv)的摩尔比为27.0－31.6:27.0－31.6:31.6－39.6:1－10，且89WPenetratin-PEG3400-DSPE占膜材料(iv)中的20％－80％摩尔比。
4.根据权利要求3所述的药物制剂，其中，所述膜材料(i):(ii):(iii):(iv)的摩尔比为28.5:28.5:38:5，且89WPenetratin-PEG3400-DSPE占膜材料(iv)中的20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％摩尔比。
5.根据权利要求1－4中任一项所述的药物制剂，其中所述药物分子是针对脑部肿瘤的siRNA。
6.根据权利要求5所述的药物制剂，其中所述药物分子是针对脑胶质瘤的c-myc的siRNA。
7.根据权利要求6所述的药物制剂，其中所述siRNA的有义链如SEQ ID NO:79所示，反义链如SEQ ID NO:80所示。
8.根据权利要求1－4中任一项所述的药物制剂，其为经鼻腔施用的核酸脂质体制剂，用于治疗脑部疾病。
9.根据权利要求8所述的药物制剂，其为经鼻腔施用的siRNA脂质体制剂，用于治疗脑部肿瘤。
10.根据权利要求9所述的药物制剂，其为经鼻腔施用的针对c-myc的siRNA脂质体制剂，用于治疗脑胶质瘤。
11.一种药物递送载体，其包含穿膜肽修饰的阳离子脂质体和聚合物，其中所述聚合物是带正电的SEQ ID NO:86所示的寡聚精氨酸R8，所述聚合物用于与药物以寡聚精氨酸R8与药物分子的电荷比5混合形成聚合物-药物的复合物，其中所述药物是针对脑部疾病的核酸，选自小干扰RNA(siRNA)、有义RNA、反义寡核苷酸(ASO)；
所述穿膜肽修饰的阳离子脂质体用于与聚合物-药物的复合物以阳离子脂质体与药物分子的电荷比为4混合形成包含聚合物-药物的复合物的脂质体复合物，其中所述穿膜肽是SEQ ID NO:29所示的89WPenetratin，穿膜肽修饰的阳离子脂质体包含如下膜材料：
(i)阳离子脂质，为1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷DOTAP；
(ii)非阳离子脂质，为1,2-二-(9Z-十八酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺DOPE；
(iii)胆固醇；
(iv)聚乙二醇化(PEG化)的磷脂和与穿膜肽共轭的聚乙二醇磷脂，其中，所述PEG化的磷脂是甲氧基-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)，所述与穿膜肽共轭的聚乙二醇磷脂是89WPenetratin-PEG-DSPE；且所述PEG化磷脂和与穿膜肽共轭的聚乙二醇磷脂中的聚乙二醇链长不相等，其中与穿膜肽共轭的聚乙二醇磷脂中的聚乙二醇链较PEG化磷脂中的聚乙二醇链更长0.5kDa－5kDa之间；且其中所述膜材料(i):(ii):(iii):(iv)的摩尔比为20－40:20－40:20－40:1－20，且与穿膜肽共轭的聚乙二醇磷脂占膜材料(iv)中的20％－80％摩尔比。
12.根据权利要求11所述的药物递送载体，其中阳离子脂质体包含如下膜材料：(i)DOTAP；(ii)DOPE；(iii)胆固醇；(iv)mPEG2000-DSPE和89WPenetratin-PEG3400-DSPE，且膜材料(i):(ii):(iii):(iv)的摩尔比为20－40:20－40:20－40:1－20，且89WPenetratin-PEG3400-DSPE占膜材料(iv)中的20％－80％摩尔比。
13.根据权利要求12所述的药物递送载体，其中，所述膜材料(i):(ii):(iii):(iv)的摩尔比为27.0－31.6:27.0－31.6:31.6－39.6:1－10，且89WPenetratin-PEG3400-DSPE占膜材料(iv)中的20％－80％摩尔比。
14.根据权利要求13所述的药物递送载体，其中，所述膜材料(i):(ii):(iii):(iv)的摩尔比为28.5:28.5:38:5，且89WPenetratin-PEG3400-DSPE占膜材料(iv)中的20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％摩尔比。
15.制备权利要求1－10中任一项所述的药物制剂的方法，包括(a)制备表面修饰有89WPenetratin的阳离子脂质体；(b)以寡聚精氨酸R8与药物分子的电荷比为5来制备带正电的寡聚精氨酸R8和药物分子的物理复合物；(c)以阳离子脂质体与药物分子的电荷比为4来混合步骤(a)获得的表面修饰有89WPenetratin的阳离子脂质体和步骤(b)获得的物理复合物。
16.制备权利要求1－10中任一项所述的药物制剂的方法，包括(a)混合脂质体的膜材料(i)、(ii)和(iii)，制备空白脂质体；(b)以寡聚精氨酸R8与药物分子的电荷比为5来制备带正电的寡聚精氨酸R8和药物分子的物理复合物；(c)以空白脂质体与药物分子的电荷比为4来混合步骤(a)获得的空白脂质体和步骤(b)获得的物理复合物；(d)将步骤(c)获得的脂质体与膜材料(iv)混合并孵育。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910367665 | 2019-05-05 | ||
| CN2019103676659 | 2019-05-05 | ||
| PCT/CN2020/087279 WO2020224475A1 (zh) | 2019-05-05 | 2020-04-27 | 药物递送载体以及使用其的药物制剂 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114007653A CN114007653A (zh) | 2022-02-01 |
| CN114007653B true CN114007653B (zh) | 2024-02-09 |
Family
ID=73051396
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202080022099.9A Active CN114007653B (zh) | 2019-05-05 | 2020-04-27 | 药物递送载体以及使用其的药物制剂 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2022531010A (zh) |
| CN (1) | CN114007653B (zh) |
| WO (1) | WO2020224475A1 (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114452397A (zh) * | 2020-11-04 | 2022-05-10 | 复旦大学 | 药物递送载体和使用其共递送多种治疗剂的药物制剂 |
| CN114522246A (zh) * | 2020-11-23 | 2022-05-24 | 上海洛启生物医药技术有限公司 | 含vegf纳米抗体的药物组合物及其用途 |
| CN113616602B (zh) * | 2021-08-31 | 2022-05-10 | 中国药科大学 | 一种重组高密度脂蛋白-聚酰胺-胺纳米复合物、制法及应用 |
| CN114958912B (zh) * | 2022-05-30 | 2023-11-10 | 新乡医学院 | 一种hek293细胞瞬时表达转染用试剂和瞬时表达系统转染方法 |
| CN115006351B (zh) * | 2022-07-01 | 2023-03-21 | 广州迈凯安生物医药研究院有限公司 | 一种peg化带正电荷的脂质体及其制备方法 |
| CN116832051B (zh) * | 2023-07-08 | 2024-02-09 | 首都医科大学 | 抗氧化抗炎和促脂质代谢协同纳米给药系统 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105801668A (zh) * | 2016-04-01 | 2016-07-27 | 天津大学 | 一种寡聚精氨酸修饰的磷脂与其组装的纳米粒及制备方法和应用 |
| EP3158992A1 (en) * | 2015-10-21 | 2017-04-26 | Universität Heidelberg | Liposomes containing cell penetrating peptides and tetraetherlipids for the oral delivery of macromolecules |
| CN107875400A (zh) * | 2017-11-20 | 2018-04-06 | 南通大学 | 一种壳‑核结构的siRNA仿病毒递送系统及应用 |
| CN108976288A (zh) * | 2017-06-05 | 2018-12-11 | 复旦大学 | 基于野生型穿膜肽penetratin的亲脂性衍生物 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102552929A (zh) * | 2010-12-30 | 2012-07-11 | 北京大学 | 通过修饰细胞穿透肽提高给药系统的靶向选择性的方法 |
| CN104497147B (zh) * | 2014-12-23 | 2018-07-03 | 四川大学 | 一种双受体识别的串联型穿膜肽修饰的肿瘤靶向纳米递药系统 |
| CN107129521B (zh) * | 2016-02-26 | 2020-11-20 | 上海市第一人民医院 | 一种具有透过细胞膜或体组织屏障功能的肽及其应用 |
| EP3823634A4 (en) * | 2018-07-21 | 2022-08-03 | University of Tennessee Research Foundation | NEUTRAL LIPOSOMES CONTAINING BIOLOGICAL ACTIVE INGREDIENTS |
| CN110772645A (zh) * | 2018-07-31 | 2020-02-11 | 复旦大学 | 功能化穿膜肽修饰的药物递送系统 |
-
2020
- 2020-04-27 CN CN202080022099.9A patent/CN114007653B/zh active Active
- 2020-04-27 WO PCT/CN2020/087279 patent/WO2020224475A1/zh active Application Filing
- 2020-04-27 JP JP2021565727A patent/JP2022531010A/ja active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3158992A1 (en) * | 2015-10-21 | 2017-04-26 | Universität Heidelberg | Liposomes containing cell penetrating peptides and tetraetherlipids for the oral delivery of macromolecules |
| CN105801668A (zh) * | 2016-04-01 | 2016-07-27 | 天津大学 | 一种寡聚精氨酸修饰的磷脂与其组装的纳米粒及制备方法和应用 |
| CN108976288A (zh) * | 2017-06-05 | 2018-12-11 | 复旦大学 | 基于野生型穿膜肽penetratin的亲脂性衍生物 |
| CN107875400A (zh) * | 2017-11-20 | 2018-04-06 | 南通大学 | 一种壳‑核结构的siRNA仿病毒递送系统及应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 余多慰 等.分子生物学.南京师范大学出版社,2007,156-158. * |
| 杨明.中药药剂学.中国中医药出版社,2012,452-454. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114007653A (zh) | 2022-02-01 |
| WO2020224475A1 (zh) | 2020-11-12 |
| JP2022531010A (ja) | 2022-07-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114007653B (zh) | 药物递送载体以及使用其的药物制剂 | |
| US10512606B2 (en) | Liposome structures and methods of use thereof | |
| CA2695901C (en) | Nucleic acid-lipopolymer compositions | |
| Conley et al. | Nanoparticles for retinal gene therapy | |
| KR20020060733A (ko) | 핵산 함유 복합체 | |
| CN108143718B (zh) | 一种抗肿瘤纳米基因药物及其制备方法和应用 | |
| US20100203112A1 (en) | Composition of cationic phospholipid nanoparticles for effective delivery of nucleic acids | |
| Park et al. | Dissolving microneedles delivering cancer cell membrane coated nanoparticles for cancer immunotherapy | |
| CN107184987B (zh) | 一种硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体及其制备方法和应用 | |
| EP2382994A1 (en) | Ligand targeted nanocapsules for the delivery of RNAi and other agents | |
| US20230313181A1 (en) | Histidine-lysine polymers and methods for delivering mrna using the same | |
| Teng et al. | Fibroblast activation protein-α-adaptive micelles deliver anti-cancer drugs and reprogram stroma fibrosis | |
| JP2022075622A (ja) | 薬物送達キャリア及びそれを用いて多種類の治療剤を共同送達する医薬製剤 | |
| CN114206906B (zh) | Peg化的合成kl4肽、其组合物和方法 | |
| US20210180089A1 (en) | Nanoparticles for transfection | |
| US11793756B2 (en) | Anionic nanocomplexes for nucleic acid delivery | |
| WO2023093596A1 (zh) | 一种用于有效递送核酸的环状多肽载体及其变化形式 | |
| US11560575B2 (en) | High efficient delivery of plasmid DNA into human and vertebrate primary cells in vitro and in vivo by nanocomplexes | |
| Paredes et al. | The state of the art of investigational and approved nanomedicine products for nucleic acid delivery | |
| Bansal | Non-viral vectors for gene delivery | |
| Tong et al. | Dual-targeted cationic liposomes modified with hyaluronic acid and folic acid deliver siRNA Bcl-2 in the treatment of cervical cancer | |
| Zhou et al. | Dendritic lipopeptide liposomes decorated with dual-targeted proteins | |
| WO2024041372A1 (zh) | 一种用于有效递送核酸的分支链结构多肽载体及其变化形式 | |
| Li et al. | Research Progress on the Nano-Delivery Systems of Antitumor Drugs | |
| Asrorov | Hyalurosomes: a newer approach for drug delivery |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |