KR20020060733A - 핵산 함유 복합체 - Google Patents

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Abstract

핵산 및 생분해성 중합체, 특히 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체를 포함한 핵산 함유 복합체가 개시된다. 복합체는 치료가 필요한 자리로 원하는 핵산, 특히 DNA를 지속적으로 방출하는 우수한 성질을 가진다. 복합체는 대식세포와 같은 식세포에 흡수되고, 특이적으로 표적 자리에 전달될 수 있기 때문에, 핵산의 기능은 표적 자리 특이적인 방식으로 나타날 수 있어, 더욱 특이적인 유전자 치료가 성취될 수 있다. 복합체는 재조합체의 발생 또는 아데노바이러스와 같은 바이러스 벡터 또는 리포좀을 사용함으로써 야기될 수 있는 독성과 같은 역 효과가 없다. 그리하여, 복합체는 유전자 치료의 분야에 특히 바람직하다. 더욱이, 복합체는 세포내로 도입된 핵산의 생물학적 효과를 증진시켜, 낮은 투여량의 핵산으로써 유전자 치료를 가능하게 한다.

Description

핵산 함유 복합체 {NUCLEIC ACID-CONTAINING COMPLEX}
최근에, 인간 질병의 분자 유전학 인자가 명확해짐에 따라, 유전자 치료의 연구가 더욱 더 강조되고 있다. 유전자 치료는 표적 자리 또는 세포에서 DNA를 발현하는 것을 목적으로 한다. 이 치료를 위해, DNA를 직접 표적 자리 또는 세포로 가지고 오고, DNA를 표적 자리 또는 세포내로 효율적으로 전달하고, 특정 자리 또는 세포내에서 기능적으로 발현하는 것이 이로울 것이다. 외래 DNA의 효과적인 전달 및 발현에 대한 다양한 방법이 보고되었다 (Fumimaro Takaku, 저 "Idenshichiryo no Saizensen: Kisogijutu kara Rinsho Oyo made (The Forefront of Gene Therapy, Basic Technology to Clinical Applications 제공)",Experimental Medicine, Vol. 12, No. 15, 1994; Robert E. Sobol 및 Kevin J. Scanlon, The Internet Book of Gene Therapy, Appleton & Lange Stamford, Connecticut, 1995). 이들은 대충 (1) DNA 전달의 물리적 방법 (미세주입법, 전기천공법), (2) DNA 전달의 화학적 방법 (칼슘 포스페이트 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 트랜스펙션) 및 (3) 생물학적 방법 (레트로바이러스 및 아데노바이러스와 같은 바이러스 벡터)으로 분류된다. 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 및 DEAE-덱스트란 트랜스펙션과 같은, 현존하는 화학적 방법은 유전자 전달의 효율에서 일반적으로 낮다. 미세주입법 및 전기천공법과 같은, 물리적 방법은 특별한 장치를 요구할 수 있고, 이들은 일상적인 임상 용도로는 실질적이지 않다. 바이러스 벡터는 유전자 전달의 높은 효율성때문에 임상 적용을 발견하리라 기대되었다. 그러나, 이들 벡터는 바이러스로서의 이들 성질에 기인한, 면역 반응과 같은 역 반응의 위험이 있다.
상기 결점을 극복하기 위해, 새로운 기술이 개발되었다. 리포좀 방법은 유전자를 리포좀내로 혼입하여 유전자를 불활성 또는 분해로부터 보호한다. 리포좀은 바이러스 DNA가 없고, 이것에 의해 잠재적으로 위험한 재조합 사건이 일어날 수 있는 가능성을 배제한다. 그러나, 다양한 세포 유형에 대한 이들 강력한 독성은 DNA 운반체로서 리포좀의 사용을 제한한다. 유전자 전달의 신규 물질 및 수단의 개발은 지금까지도 계속된다.
혈관성 병변에 대한 유전자 치료의 분야에서, 혈관내로 도입되는 도관 (catheter)의 표면에 히드로겔을 부착하고, 히드로겔내에 플라스미드 유전자를 위치하고, 히드로겔을 직접 혈관내로 코팅시키는 것을 포함하는 소위 히드로겔 (hydrogel) 방법이 또한 개발되었다 (Marchall, E., Science, 269, 1050-1055, 1995). 상기 방법에 따라, 플라스미드는 단순 확산에 의해 히드로겔로부터 천천히 방출된다. 상기 방법에 대해, 일반적으로 느린 방출의 기간이 짧고, 이 기간은 속도 및 길이에 대하여 조절하기 어렵다. 유전자 치료는 치료용 유전자의 양 또는 이의 공급 기간이 치료할 병 또는 병의 상태에 의존하여 조절될 것을 요구한다. 그리하여, 치료의 조건에 따라 치료용 유전자의 느린 방출의 기간을 조절할 수 있는 방법에 대한 요구가 존재한다.
외래 유전자가 유전자 치료와 같은 임상 세팅에 사용될 경우에, 상기 유전자의 표적 자리로 안정한 수준으로 지속적인 공급이 유전자의 기능성 발현을 위해 필요하다.
더욱이, 안티센스 올리고핵산을 이용한 유전자 치료의 연구가 최근에 관심을 끌었다. 그러한 핵산을 조절된 시간 동안 생체내에서 자리 특이적으로 및 안정하게 공급하기 위한 수단은 그러한 접근의 효능을 증진시켜야 한다.
발명의 개요
본 발명의 목적은 핵산 함유 복합체로부터 핵산의 방출 속도를 조절하는 방법을 제공함과 더불어, 안전하고, 핵산을 세포내로 도입하는 높은 효율성을 가지며, 지속적으로 핵산을 표적 자리로 공급할 수 있는 핵산 함유 복합체를 공급하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 핵산 함유 복합체의 사용으로 표적 자리에 핵산의기능을 특이적으로 나타낼 수 있는 방법과 더불어, 안전하고, 취급이 용이하고, 생체내 자리 특이적 기능성 발현에서 우수한 핵산 함유 복합체를 제공하는 것이다.
본원에 사용된, 표현 "핵산의 기능"은 핵산내에 코딩된 유전자의 발현을 말하나, 또한 직접적인 효과를 발하는 핵산을 말할 수 있다. 직접적인 효과를 발하는 핵산의 예는 안티센스 뉴클레오티드 (Robert E. Sobol 및 Kevin J. Scanlon, The internet book of gene therapy, Appleton & Lange Stamford, Connecticut, 1995), 리보자임 (미국 특허 제 6,127,173호), 미끼로서 기능할 수 있는 이중 가닥 DNA 분자 (Sobol, 이하 동일) 및 DNA/RNA 하이브리드 (Bartlett 등, (2000) Nat. Biotech 18:615)를 포함한다.
이들 목적의 견지에서, 본 발명의 발명가는 광대한 연구를 수행하고, 하기 열거된 발견을 수득하였다. 먼저, 안정한 복합체를 형성하기 위해 음전하의 핵산 및 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체를 복합시킴으로써, 생체내 핵산의 분해가 억제될 수 있고, 핵산이 원하는 표적 자리 또는 세포에서 지속된 속도로 방출될 수 있다. 두번째, 핵산과 생분해성 중합체를 복합시킴으로써 수득된 복합체는, 본원에 기재된 핵산 함유 복합체와 같이, 면역 시스템에서 중요한 역할을 하는 식세포내로 쉽게 들어간다 (먼저, 복합체를 식세포로 표적화시킴). 복합체를 수용한 식세포는 표적 자리로 이동하여 (두번째, 식세포를 표적 자리로 표적화시킴), 식세포는 첨가된 핵산의 효과를 표적 자리로 표적화시킴으로써 기술의 효율성을 증가시킨다. 상기 발견에 기초하여, 발명가는 본 발명을 수행하였다.
하나의 면에서, 본 발명은 핵산이 생분해성 중합체의 분해를 통해 방출될 수있는, 핵산 및 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체를 포함한, 핵산 함유 복합체의 특징이 있다.
또다른 면에서, 본 발명은 핵산 및 중합체에 첨가된 양전하기를 가진 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체를 포함한, 핵산 함유 복합체의 특징이 있다.
본 발명의 핵산 함유 복합체에서, 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체는 콜라겐, 젤라틴, 키틴, 키토산, 히알루론산, 알긴산, 전분 및 임의의 이들 물질의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 포함한다. 바람직하게는, 유도체는 아미노 유도체이다.
바람직한 구현예에서, 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체는 도입된 양전하기를 가진 가교된 젤라틴이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 핵산은 플라스미드 DNA, 올리고뉴클레오티드 및 이중 가닥 핵산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원이다.
바람직한 구현예에서, 핵산은 혈관 내피세포 성장인자 유전자, 간세포성장인자 유전자 및 섬유아세포 성장인자 유전자뿐만 아니라 키나아제, 포스파타아제, 전사 인자, 시토카인, 프로테아제, 세포 자멸(apoptosis) 유도 인자 및 세포 자멸 지연 인자와 같은 다른 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 더욱 바람직하게는, DNA는 FGF4/HST1을 코딩하는 서열 목록의 서열 번호 1로서 기재된 염기 서열을 함유한다.
또다른 면에서, 본 발명은 활성 성분으로서 본 발명의 핵산 함유 복합체를 함유한 약제학적 조성물의 특징이 있다. 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 유전자 치료, 특히 유전자 치료가 유전자의 국부 투여에 의해 영향을 받는 경우에 사용된다.
또다른 면에서, 본 발명은 핵산을 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체내로 혼입하고, 생분해성 중합체의 분해에 의해 핵산을 방출시키는 것을 특징으로 하는, 핵산 방출의 속도를 조절하는 방법의 특징이 있다.
또다른 면에서, 본 발명은 핵산을 도입된 양전하기를 가진 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체내로 혼입하고, 생분해성 중합체의 분해에 의해 핵산을 방출시키는 것을 특징으로 하는, 핵산 방출의 속도를 조절하는 방법의 특징이 있다.
또다른 면에서, 본 발명은 핵산을 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체내로 혼입하고, 핵산의 기능을 나타내기 위해 생분해성 중합체의 분해에 의해 핵산을 방출시키는 것을 특징으로 하는, 핵산의 기능성 발현을 증진시키는 방법의 특징이 있다. 본 발명은 또한 핵산을 도입된 양전하기를 가진 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체내로 혼입하고, 핵산의 기능을 나타내기 위해 생분해성 중합체의 분해에 의해 핵산을 방출시키는 것을 특징으로 하는, 핵산의 기능성 발현을 증진시키는 방법의 특징이 있다.
바람직한 구현예에서, 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체는 콜라겐, 젤라틴, 키틴, 키토산, 히알루론산, 알긴산, 전분 및 임의의 이들 물질의 유도체 (예를 들면, 아미노 유도체)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 가진다. 바람직하게는, 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체는 도입된 양전하기를 가진 가교된 젤라틴이다. 핵산은 유전자를 코딩하는 DNA, 올리고뉴클레오티드 및 이중가닥 핵산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원이다. 핵산은 혈관 내피세포 성장인자 유전자, 간세포 성장인자 유전자 및 섬유아세포 성장인자 유전자뿐만 아니라 키나아제, 포스파타아제, 전사 인자, 시토카인, 프로테아제, 세포 자멸 유도 인자 및 세포 자멸 지연 인자와 같은 다른 유전자를 코딩할 수 있다. 바람직한 구현예에서, DNA 분자는 서열 목록의 서열 번호 1로서 기재된 염기 서열을 함유한다.
또다른 면에서, 본 발명은 핵산 및 생분해성 중합체를 포함한 핵산 함유 복합체를 함유한 식세포의 특징이 있다. 바람직한 구현예에서, 생분해성 중합체는 콜라겐, 젤라틴, 키틴, 키토산, 히알루론산, 알긴산, 전분 및 임의의 이들 물질의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 가진다.
또다른 면에서, 본 발명은 적어도 (i) 핵산 및 생분해성 중합체를 포함한 핵산 함유 복합체를 식세포로 하여금 수용하도록 하는 단계, (ii) 식세포내에서 수용된 핵산의 기능을 발휘하게 하거나 핵산의 발현을 유도하고, 식세포를 표적 자리로 전달하는 단계를 포함하는, 표적 자리에서 핵산의 기능을 나타내는 방법의 특징이 있다. 바람직하게는, 생분해성 중합체는 콜라겐, 젤라틴, 키틴, 키토산, 히알루론산, 알긴산, 전분 및 임의의 이들 물질의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원이다.
또다른 면에서, 본 발명은 활성 성분으로서 핵산 함유 복합체, 핵산 및 생분해성 중합체를 포함한 핵산 함유 복합체를 포함한, 유전자 치료용 약제학적 조성물에 특징이 있는데, 유전자 치료는 적어도 (i) 핵산 및 생분해성 중합체를 포함한핵산 함유 복합체를 식세포로 하여금 수용하도록 하는 단계, (ii) 식세포내에서 수용된 핵산의 기능을 발휘하게 하거나 핵산의 발현을 유도하는 단계 및 (iii) 식세포를 표적 자리로 전달하는 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 생분해성 중합체는 콜라겐, 젤라틴, 키틴, 키토산, 히알루론산, 알긴산, 전분 및 임의의 이들 물질의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 가진다.
본 발명은 핵산 및 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체를 포함함을 특징으로 하는, 핵산 함유 복합체 및 또한 복합체로부터 핵산의 방출 속도를 조절하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 핵산 및 생분해성 중합체를 포함한 핵산 함유 복합체를 함유한 식세포 (이후부터 식세포라 언급됨)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 활성 성분으로서 핵산 함유 복합체를 가지며, 식세포 매개 유전자 치료에 사용할 수 있는 약물에 관한 것이다.
도 1은 절라틴 히드로겔 및 플라스미드 DNA의 3차원 격자의 이온 결합을 보여주는 모식도이다.
도 2는 시간에 따라 젤라틴 히드로겔내로 lacZ 플라스미드의 혼입 과정을 보여주는 그래프이다.
도 3은 ddY 마우스의 오른쪽 대퇴 근육내로 투여에 따른 젤라틴 히드로겔-접합된 플라스미드 DNA의 생체내 생존의 조사 결과를 보여주는 그래프이다. 생존은 방사성요오드의 잔존 방사성에 의해 확인되었다.
도 4는 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔-접합된 lacZ 플라스미드의 투여 후 2주에 토끼 다리 허혈성 모델에서 lacZ 유전자의 발현을 증명하는 현미경사진이다. 도 4A: 미립자 아민화 젤라틴 히드로겔-접합된 lacZ 플라스미드 (lacZ 플라스미드: 500㎍). 도 4B: 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔에 접합되지 않은 드러난 lacZ 플라스미드 (500㎍). 도 4C: 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔-접합된 lacZ 플라스미드 (lacZ 플라스미드: 50㎍).
도 5는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 lacZ 유전자의 투여 후 토끼 다리허혈성 모델에서 lacZ 유전자의 발현을 증명하는 현미경사진을 보여준다. 도 5A: lacZ 유전자의 투여 후 3일. 도 5B: lacZ 유전자의 투여 후 2주.
도 6A-D는 FGF4/HST1 플라스미드의 투여 후 토끼 다리 허혈성 모델에서 혈관생성을 증명하는 방사성 사진을 보여준다. 도 6A: 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔-접합된 FGF4/HST1 플라스미드 (500㎍). 도 6B: 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔-접합된 FGF4/HST1 플라스미드 (5㎍). 도 6C: 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔-접합된 lacZ 플라스미드 (500㎍). 도 6D: 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔에 접합되지 않은 드러난 FGF4/HST1 플라스미드 (500㎍).
도 7은 토끼 동맥벽의 대식세포에서 lacZ 발현을 보여주는 현미경사진이다. 발현된 lacZ 를 가진 대식세포가 존재한다 (화살표).
도 8은 방사 미세혈관 조영술에 의해 수득된, 기준선 (상단) 및 혈관확장 동안 (아데노신 처리)(하단) 혈관 밀도를 보여주는 디스플레이상에 나타나는 중간 색조부 이미지의 사진을 보여준다. 드러난 VEGF165플라스미드의 투여 후의 결과를 제공한다.
도 9는 방사 미세혈관 조영술에 의해 수득된, 기준선 (상단) 및 혈관확장 동안 (아데노신 처리)(하단) 혈관 밀도를 보여주는 디스플레이상에 나타나는 중간 색조부 이미지의 사진을 보여준다. 젤라틴 히드로겔-접합된 VEGF165플라스미드의 투여 후의 결과를 제공한다.
도 10은 가교된 젤라틴 입자-GFP 플라스미드를 수용하는 대식세포를 증명하는 현미경사진을 보여준다. 도 10A는 위상차 이미지를 보여주는 반면에, 도 10B는 도 10A와 동일한 필드에서 형광 이미지를 보여준다. 가교된 젤라틴 입자-GFP 플라스미드가 대식세포내로 혼입된 것을 보여주는, 형광이 대식세포에서 관찰된다.
도 11은 인간 수상세포 (DC)내로의 유전자 전달의 효율성의 FACS 분석 결과를 증명하는 그림을 보여준다. 도 11A: 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔-접합된 GFP 플라스미드와 함께 배양된 DC에 대한 결과. 도 11B: 드러난 GFP 플라스미드와 함께 배양된 DC에 대한 결과.
본 발명의 복합체내로 혼입될 수 있는 핵산은 제한되지 않는다. 그러나, 바람직한 구현예는 이의 도입이 치료 효과를 가져오고, 이들이 원하는 대로, 복합체의 사용의 목적에 따라 선택되는 핵산이다. 본 발명에서, 특정 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 미끼 핵산과 같은, 이중 가닥 핵산 화합물이 유전자를 코딩하는 다양한 DNA (Sobol, 이하 동일)와 더불어 바람직하게 사용될 수 있다. 핵산 구축물은 또한 점 돌연변이를 교정하기 위해 전달될 수 있다 (Bartlett 등 (2000) Nat. Biotech 18:615). 더욱 구체적으로, 심장혈관 분야에서의 유전자 치료뿐만 아니라 암의 유전자 치료를 위해 본 발명의 핵산 함유 복합체내로 혼입될 수 있는 핵산이 이들 치료 목적과 함께 표 1에 열거된다. 그러나, 본 발명은 이들에 제한되지 않고, 본 발명은 당업자에 공지된, 다른 임상 분야에 적용가능하다.
목적 핵산 유형
심장혈관 분야의 유전자 치료 혈관생성을 증진시키고, 폐쇄성 동맥경화 및 허혈성 심장 질병에 적용가능하다 -혈관 내피세포 성장인자 (VEGF) 유전자-간세포 성장인자 (HGF) 유전자-섬유아세포 성장인자 (FGF) 유전자
혈관 내피세포를 재생시키며, 동맥성형술에 따른 재협착의 예방에 적용가능하다. -VEGF 유전자-HGF 유전자-내피세포 일산화질소 합성효소 유전자-PGI2합성 유전자
혈관 평활근 세포의 세포 주기를 조절하며, 동맥성형술 또는 우회수술에 따른 재협착의 예방에 사용가능하다. -C-myb에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드-PCNA 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드-cdc-2 키나아제에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드
우회수술에 따른 재협착의 예방 등에 대해 사용가능하다. -전사 인자 E2F 접합된 서열과 동일한 서열을 가진 이중 가닥 핵산 화합물-E2F 미끼
허혈-재관류 손상에 대한 유전자 치료에 적용가능하다. -NFκB 미끼
암의 유전자 치료 자살 유전자 전달 -헤르페스 심플렉스 (Herpes simplex)바이러스-티미딘 키나아제 유전자
종양 억제 유전자 전달 -p53 유전자
항암약물로부터 골수 간세포의 보호 -다중약물 저항성 (MDR) 유전자
면역요법 -인터루킨 12 유전자-B7 유전자
안티센스 RNA -ras 유전자
본 발명의 핵산 함유 복합체내로 혼입되는 핵산의 바람직한 예는 혈관 내피세포 성장 인자 유전자, 간세포 성장인자 유전자 및 섬유아세포 성장인자 유전자이다. 키나아제, 포스파타아제, 전사 인자, 시토카인, 프로테아제, 세포 자멸 유도 인자 및 세포 자멸 지연 인자를 포함한 다른 그러한 유전자가 당업자에게 공지된다. 섬유아세포 성장인자 유전자의 예로서, 서열 목록의 서열 번호 1로서 기재된 염기 서열을 가진 FGF4/HST1 유전자가 인용될 수 있다.
NIH3T3 세포를 형질전환시키는 활성을 갖는 유전자로서 FGF4/HST1 유전자를분리하고, 확인하였다 (hst-1; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:3997-4001, 1986). 이어서, 상기 유전자는 섬유아세포 성장인자 (FGF)와 유사성을 가지는 것으로 발견되었고, FGF 군의 4번째 일원 (FGF4)이 되었다. 현재로, FGF 군의 20 일원 (FGF 1 내지 20)이 공지된다.
FGF4/HST1 단백질은 신호 펩티드를 가진 분비 단백질이고, 하기 활성을 갖는 것으로 보고되었다: 섬유아세포 및 혈관 내피세포에 대한 세포 성장 증진; 혈관생성; 거핵세포(megakaryocyte)의 성장 및 분화의 증진; 거핵세포로부터 시토카인의 분비 증진; 거핵세포 및 내피세포 사이의 부착의 증진; 말초 혈소판 카운트에서 증가의 시험관내 유도; 화학요법 또는 방사성요법에 기인한 혈소판 감소성 모델에서 이전의 투여에 의한 혈소판 감소의 경감 및 회복기의 단축; 및 이전의 투여에 의한 치명적인 방사성 투여량에 따른 생존율의 증가.
유전자 치료에의 FGF4/HST1 유전자의 적용으로서, 상기 유전자가 삽입되는 것내로 아데노바이러스 벡터를 동맥경화에 기인한 만성 안정한 협심증의 치료 (병행 치료법)에 적용하기 위한 시도가 이루어졌다.
본 발명에서, 세포내로 도입되는 형태로 핵산이 사용되고, 세포내에서 이의 기능을 나타낼 수 있다. DNA의 경우에, 예를 들면, 도입된 세포에서 DNA가 전사되고, 이어서 DNA에 의해 코딩된 폴리펩티드가 생산되고, 이어서 원하는 기능이 그 폴리펩티드에 의해 나타나도록 하기 위해 거기에 위치한 DNA를 가진 플라스미드로서 사용된다. 바람직하게는, 프로모터 부위, 개시 코돈, 원하는 기능을 가진 단백질을 코딩하는 DNA, 종결 코돈 및 종결자 부위가 연속적으로 플라스미드내에배열된다. 그러한 기술 및 DNA 원소가 당업자에게 주지된다.
원한다면, 두 개 이상의 핵산이 하나의 플라스미드내로 혼입될 수 있다. 또한, 원한다면, 두 개 이상의 핵산이 수 불용성 생분해성 중합체에 별개로 연결되어 (하기에 기재된 바와 같이) 하나의 핵산 함유 복합체를 형성할 수 있다.
편리하게, 적당한 제한 효소 자리의 사용으로, 의도된 벡터를 원하는 핵산을 당업계에 유용한, 플라스미드내로 삽입함으로써 제조할 수 있다. 도입되는 핵산의 염기 서열에 기초하여 합성 수단 또는 반합성 수단에 의해 벡터를 제조하는 것이 또한 가능하다. 그러한 기술이 당업자에게 주지된다. ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory, Sambrook, Fritsch & Maniatis, 저, 1989]에 설명된 것과 같은 기술이 임의의 그림, 표 또는 도면을 포함하여 전적으로 본원에 참고로 포함된다.
본 발명에서, 핵산이 도입되는 "세포"는 바람직하게는 핵산의 기능성 발현이 요구되는 세포뿐만 아니라, 세포외부의 물질을 수용하는 특징을 갖는 세포 (즉, 대식세포)이다. 바람직한 구현예에서, 상기 세포는 하기에 기재된, 대식세포와 같은 식세포이다. 핵산의 기능성 발현이 나타나야 하는 세포는 예를 들면, 사용된 핵산 (즉, 이의 기능)에 의존하여, 다양하게 선택된다. 예는 심근 세포, 근육 세포 및 혈관 내피세포이다. 단핵세포, 수상세포, 대식세포, 조직구, 쿠퍼(Kupffer) 세포, 파골세포, 윤활세포 A, 소신경교세포, 랑게르한스 (Langerhans)세포, 유상피세포 및 다핵 거대세포와 같은 식세포; 백혈구; 섬유아세포; 및 특정 상피세포 (위장관 상피세포, 세뇨관 상피세포)가 효율적으로 핵산 함유 복합체를이들의 식세포작용에 의해 이들 내부로 가지고 갈 수 있고 (첫째, 핵산 함유 복합체를 식세포로 표적화함), 생체내에서 이동하는 경향에 의해 원하는 자리로 핵산을 전달하는데 이롭다 (둘째, 식세포를 표적 자리 및 세포로 표적화함). 그리하여, 심장, 근육, 혈관, 혈액, 골수, 림프 조직, 연결 조직, 간, 뼈, 윤활막, 신경, 피부, 염증 조직, 또는 암 조직과 같은, 모든 기관 또는 조직이 유전자 치료에 의해 영향을 받을 수 있다.
본 발명에서, "생분해성 중합체"는 생체내 존재하는 생리학적으로 활성 물질, 예를 들면, 효소의 작용에 의해 처음으로 가수분해되는 중합체를 말한다. 생분해성 중합체의 예는 키틴, 키토산, 히알루론산, 알긴산, 전분 및 펙틴과 같은 다당류, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 알부민과 같은 단백질 및 이들의 유도체이다. 바람직한 예는 젤라틴 또는이의 유도체이다. 본 명세서의 목적을 위해, "생분해성 중합체"는 핵산을 포함하지 않는다. 본 발명에서, "생분해성 중합체의 분해"는 생체내 존재하는 생리학적으로 활성 물질, 예를 들면, 효소의 작용 또는 상기에 언급된, 이의 생체내 비효소 작용에 의한 중합체의 가수분해를 말한다.
여기에서, "유도체"는 핵산 함유 복합체의 형성에 적합한 생분해성 중합체의 변형된 형태를 말하고, 예를 들면, 하기에 기재될 중합체상에 도입된 아미노기를 가진 아미노 유도체를 포함한다.
본 발명에서, 핵산 함유 복합체로부터 핵산의 더욱 조절된 방출을 원할 경우, 핵산과 복합체를 형성하는 생분해성 중합체는 바람직하게는 수 불용성이다. 여기에서, 수 불용성 성질은 분자 사이의 화학적 또는 물리적 가교때문에 물에 용해되지 않는 성질을 말한다. 일본 약전의 규정에 따라서, 수 불용성 성질은 "거의 불용성인" 내지 "실질적으로 불용성인"에 해당한다.
생분해성 중합체는 핵산과 복합체를 형성할 수 있는 한, 특정 세트의 분자에 제한되지 않는다. 지속된 방출을 원할 경우, 중합체는 바람직하게는 안정한 핵산 함유 복합체가 형성되도록 양전하이어야 한다. 양전하의 정도는 다중이온이 정상적으로 음전하의 핵산과 복합체를 형성하도록 허용하기 위해 다양하다. 다중이온 복합체의 형성은 수용성 상태로 존재하는 물 성분을 혼합함으로써 수득되는 혼합물의 혼탁도의 증가를 측정함으로써 확인될 수 있다.
핵산의 음전하 및 생분해성 중합체의 양전하 사이의 강한 결합 (이온 결합)은 안정한 핵산 함유 복합체의 형성을 초래한다. 중성 또는 단지 약간 양전하인 생분해성 중합체가 본 발명에서 사용된다면, 중합체는 미리 거기에 아미노기 등을 도입함으로써 양이온성으로 될 수 있다. 이미 양전하의 생분해성 중합체에서조차, 아미노기와 같은, 양전하기가 도입될 수 있다. 그렇게 함으로써, 전체 분자의 양전하가 증가되고, 핵산에 대한 결합이 증가하여, 더욱 안정한 핵산 함유 복합체가 형성될 수 있다. 양이온을 부여하는 절차는 당업자에게 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
양이온 부여 방법은 그러한 방법이 생리적 조건하에 양이온성일 작용기를 도입할 수 있는 한, 제한되지 않는다. 바람직한 방법은 부드러운 조건하에, 이미 생분해성 중합체의 부분인, 히드록실기 또는 카르복실기상에 아미노기 또는 암모늄기를 도입하는 것이다. 방법의 예는 임의의 다양한 축합제, 예를 들면,1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드, 시아누릭 클로라이드, N,N'-카르보디이미다졸, 시아노겐 브로마이드, 디에폭시 화합물, 토실 클로라이드, 디에틸트리아민-N,N,N',N",N"-펜탄산 이무수물과 같은 이무수물 화합물, 또는 트리틸 클로라이드의 사용으로, 중합체를 에틸렌디아민 또는 N,N-디메틸-1,3-디아미노프로판과 같은 알킬디아민, 트리메틸암모늄 아세토히드라지드, 스퍼민, 스퍼미딘, 또는 디에틸아미도클로라이드와 반응시키는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 방법은 편리하고 용도가 넓기 때문에 에틸렌디아민과의 반응이 관여된다.
본 발명에서, "양전하기를 도입하는" 단계는 생리적 조건하에 생분해성 중합체를 양이온성으로 만드는 작용기의 도입을 말한다. 그것은 상기 언급된 작용기를 생분해성 중합체상에 도입하는 것을 의미한다.
더욱이, 본 발명에서, 핵산의 조절된 방출을 가능하게 하기 위해 가교 처리 또는 다른 유사하게 효과적인 처리에 의해 생분해성 중합체를 수 불용성으로 만드는 것이 바람직하다. 일반적으로, 많은 생분해성 중합체가 수용성이어서, 생성된 핵산 함유 복합체가 또한 수용성이다. 상기 복합체가 생체내로 투여될 경우에, 핵산은 신속하게 복합체로부터 방출되어, 핵산의 안정한 국부적 및 지속된 공급을 수득하는 것이 어렵다. 본 발명은 수 불용성 생분해성 중합체를 이용하여, 생체내에서 생분해성 중합체의 분해능에 따라서 조절된 방식으로 핵산의 방출을 가능하게 한다. 즉, 핵산 방출의 지속된 속도가 생분해성 중합체의 분해에 따라 조절될 수 있다. 더욱이, 지속된 방출 형태는 핵산 함유 복합체에 의한유전자의 국부 발현의 효율성의 증가를 허용한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용된 수 불용성 생분해성 중합체는 가교에 의해 물에 불용화된 젤라틴 히드로겔이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 젤라틴 히드로겔은 85%, 88%, 91%, 94%, 95%, 97%, 99% 또는 이상의 수분 함량을 가진다.
생분해성 중합체의 가교는 당업자에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 예는 가교제, 열 처리를 이용한 방법 및 자외선 조사를 이용한 방법이다.
바람직한 가교제는 사용된 생분해성 중합체의 유형에 따라 선택될 수 있다. 정상적으로, 하기 가교제가 사용된다: 포르말린, 글루타르알데히드, 수용성 카르보디이미드 [1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드, 1-시클로헥실-3-(2-모르폴린에틸)카르보디이미드-메토-p-톨루엔술포네이트 등], 에피클로로히드린 및 디에폭시 화합물 [비스에폭시디에틸렌 글리콜, 1,4-비스-(2,3-에폭시프로폭시)-부탄 등]. 가교 반응에서, 생분해성 중합체의 농도는 1 내지 30 중량%, 바람직하게는 5 내지 10 중량%인 반면에, 가교제의 농도는 10-3내지 10 중량%, 바람직하게는 10-2내지 1 중량%이다. 반응은 1 내지 48 시간, 바람직하게는 12 내지 24 시간 동안, 0 내지 40℃, 바람직하게는 25 내지 30℃에서 수행된다.
생분해성 중합체의 가교는 또한 열 처리에 의해 수행될 수 있다. 열 가교의 방법이 예로서 선택된 젤라틴과 함께, 하기 실시예에서 기재될 것이다.
젤라틴 수용액 (바람직하게는, 약 10 중량%)을 플라스틱 페트리 접시내로 도입하고, 공기 건조시켜 젤라틴 필름을 수득한다. 필름을 1 내지 48 시간, 바람직하게는 6 내지 24 시간 동안, 110 내지 160℃, 바람직하게는 120 내지 150℃의 온도에서, 감압하에, 바람직하게는 약 10mmHg에서 방치하여, 필름을 열적으로 가교시킨다.
젤라틴 필름을 자외선으로써 가교할 경우에, 젤라틴 필름을 살균등하에 정상적으로 0 내지 40℃, 바람직하게는 상온에서 방치한다.
사용된 젤라틴은 상이한 물리적 성질, 예를 들면, 용해도, 안정성 및 팽창 성질을 가진 젤라틴의 혼합물일 수 있다. 물리적 성질에서 상이한 가교된 젤라틴의 혼합물을 또한 사용할 수 있다.
본 발명의 핵산 함유 복합체내에 혼입된 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체가 하기 방식으로 복합체내에 혼입될 수 있다: 상기 언급한 특성을 가진 생분해성 중합체가 단독으로 혼입되거나, 두 가지 이상의 유형의 생분해성 중합체가 혼합물로서 혼입된다 (동일한 핵산 함유 복합체로 혼입되도록 단순 혼합됨). 대안적으로, 두 가지 이상의 유형의 생분해성 중합체가 미리 화학적으로 결합될 수 있고, 이어서 복합체내에 혼입된다. 임의의 이들 구현예가 본 발명에 포함된다.
두 가지 이상의 유형의 생분해성 중합체를 미리 화학적으로 결합하기 위해, 그리고 복합체내에 결합 산물을 혼입하기 위해, 각각의 생분해성 중합체는 별개로 수 불용성으로 만들어질 수 있고, 이어서 화학적으로 결합되거나, 화학적으로 결합될 수 있고, 이어서 수 불용성이 된다. 바람직한 구현예에서, 각각의 생분해성 중합체는 먼저 화학적으로 결합되고, 이어서 수 불용성이 되도록 처리된다.
본 발명에서, 핵산 및 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체를 함유한 복합체는 전술한 핵산 및 전술한 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체를 혼합함으로써 쉽게 제조될 수 있다. 핵산 및 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체의 양 사이의 비율은 사용된 생분해성 중합체의 양전하의 정도에 따라 상이하다. 통상 혼합 동안, 핵산은 생분해성 중합체에 대해 포화 농도로 사용된다.
가교된 젤라틴 겔 내에 핵산을 함유한 핵산 함유 복합체를 제조하는 바람직한 구현예에서, 가교제는 가교된 젤라틴 겔을 제조하기 위해 5 내지 30 중량%의 젤라틴 수용액에 직접 첨가된다. 더욱 바람직한 구현예에서, 가교되지 않은 젤라틴 겔을 가교된 젤라틴 겔을 제조하기 위해 가교제의 수용액에 담근다. 생성된 가교된 젤라틴 겔을 이어서 핵산을 함유한 용액에 직접 담근다. 바람직한 구현예에서, 가교된 젤라틴 겔을 건조하고, 이어서 다시 핵산을 함유한 용액에서 팽창시킨다.
강한 음전하의 핵산을 이온적으로 양전하의 생분해성 중합체에 결합하여 복합체를 형성한다. 본 발명의 그러한 복합체에서, 복합체내에 혼입된 핵산은 효소의 작용 또는 다른 생리적 방법에 의해 생분해성 중합체의 분해에 의해 복합체로부터 방출되는 특징이 있다. 도 1은 핵산의 예로서 선택된 DNA와 함께, 복합체의 모식도를 보여준다.
핵산을 복합시킬 때, 원한다면, 생성된 핵산 함유 복합체의 안정성, 핵산의 지속된 방출 및 방출된 핵산의 기능성 발현과 같은 목적을 위해, 다른 성분을 첨가할 수 있다. 이들 다른 성분의 예는 아미노당 또는 이들 거대분자 화합물 또는키토산 올리고머, 염기성 아미노산 또는 이들 올리고머 또는 거대분자 화합물 및 폴리알릴아민, 폴리디에틸아미노에틸아크릴아미드 및 폴리에틸렌이민과 같은 염기성 중합체이다. 더욱이, 기관 특이적 방식으로 발현된 수용체에 결합할 수 있는 리간드 단백질 또는 선택된 표적에 특이적인 항체가 첨가되어, 핵산 함유 복합체의 원하는 자리로의 전달 및 결국, 핵산의 국부 방출을 가능하게 한다. 그러한 리간드 및/또는 항체는 당업자에게 주지된다.
본 발명은 또한 핵산을 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체내로 혼입하고, 생리적 세팅에서 핵산의 방출을 허용하는 특징이 있는, 핵산 방출의 속도를 조절하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라 핵산 방출의 속도를 조절하는 방법에 사용된 핵산 및 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체로서, 본원에 명명된 모든 그러한 생분해성 중합체 및 핵산뿐만 아니라, 당업자에게 공지된 것들을 사용할 수 있다.
복합체내에 혼입된 핵산은 수 불용성 생분해성 중합체가 생체내에서 분해될 때 복합체로부터 천천히 방출된다 (즉, 분해 속도는 방출 속도를 결정한다). 이 방출은 방출 속도를 더욱 재생가능하게 조절할 수 있기 때문에, 바람직하게는 생분해성 중합체의 매개를 통해 단지 영향을 받는다. 방출 속도는 사용된 생분해성 중합체의 생분해능의 정도외에, 복합체의 안정성과 더불어, 복합체내의 핵산 및 생분해성 중합체 사이의 결합 강도와 밀접하게 관련된다 (이에, 이는 생분해성 중합체의 수분 함량에 의존할 수 있다). 방출 속도는 또한 복합체내의 양전하 및 음전하 사이의 균형에 의해 조절될 수 있다. 통상, 사용된 생분해성 중합체의 양전하가 높을수록, 생성된 핵산 함유 복합체내의 핵산이 더 많이 보유된다. 그리하여, 더 높은 양전하를 가진 생분해성 중합체는 수 불용성 생분해성 중합체의 분해를 통해 핵산의 조절된 방출의 면에서 우수하다. 생분해성 중합체의 양전하가 조절된 방출을 제공하기에 불충분하다면, 아미노기 또는 유사한 치환체가 추가로 중합체내로 도입되어 중합체를 양이온성으로 만들고, 이로 인해 이의 양전하를 증가시킨다.
본 발명은 또한 핵산 및 생분해성 중합체를 포함한 핵산 함유 복합체를 함유하는 식세포를 제공한다. 이것은 그러한 복합체가 면역 시스템에서 중요한 역할을 하는 식세포내로 쉽게 들어가고 (첫째, 식세포에서의 복합체의 표적화), 식세포가 이들 정상적인, 생체내 이동에 기초하여 표적 자리로 운반되어 (둘째, 표적 자리에서의 식세포의 표적화), 표적 자리에서 쉽고 안정하게 핵산의 기능을 나타내는 것을 가능하게 하는 새로운 발견에 기초한다. 본 발명에 사용된 식세포는 이들이 식세포작용을 나타내는 세포이고, 손상부위로 (예를 들면, 염증 자리, 암 조직 등) 이동하는 한, 제한되지 않는다. 예를 들면, 대식세포 및 단핵세포가 그러한 세포의 바람직한 예이다. 또한, 이들 이동이 최소일지라도, 수상세포, 조직구, 쿠퍼(Kupffer) 세포, 파골세포, 윤활세포 A, 소신경교세포, 랑게르한스 (Langerhans)세포, 유상피세포 및 다핵 거대세포가 또한 바람직하다. 핵산 및 생분해성 중합체를 포함한 핵산 함유 복합체는 식세포작용에 의해 식세포내로 쉽게 들어간다. 식세포에 의한 핵산 함유 복합체의 수용은 사용의 목적에 따라 그 자리에서 또는 시험관 내에서 수행될 수 있다.
사용된 핵산 함유 복합체내로 혼입된 핵산 및 생분해성 중합체로서, 본원에 열거된 모든 그러한 생분해성 중합체 및 핵산을 사용할 수 있다. 생분해성 중합체의 전하 성질 및 용해도는 제한되지 않는다. 식세포에 의한 수용의 용이성, 수용 효율성 및 수용 속도의 관점에서, 생분해성 중합체가 바람직하게는 수 불용성이다. 핵산에의 단단한 결합이 핵산의 믿을만한 결합에 대해 바람직하다는 관점에서, 생분해성 중합체가 바람직하게는 양전하이다. 용어 "수 불용성" 및 "양전하의"는 이전에 기재된 바와 같이 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다.
핵산 및 생분해성 중합체를 포함한 핵산 함유 복합체를 혼입한 식세포는 실험 목적으로 사용될 수 있고, 또한 약물로서 바람직하게는 사용될 수 있다. 즉, 핵산 함유 복합체를 혼입한 식세포는 시험관 내에서 제조되고, 이어서 생성된 식세포는 생체내로 투여되어, 핵산으로부터 원하는 유전 정보가 손상 부위 또는 다른 질병 자리에서 식세포의 특징적인 축적을 이용함으로써 표적 자리에서 발현될 수 있다.
본 발명은 또한 적어도 (i) 핵산 및 생분해성 중합체를 포함한 핵산 함유 복합체를 식세포로 하여금 수용하도록 하는 단계, (ii) 식세포내에서 핵산의 발현을 유도하는 단계 및 (iii) 식세포를 표적 자리로 전달하는 단계를 포함하는, 표적 자리 특이적인 방식으로 핵산의 기능을 나타내는 방법을 제공한다. 단계의 각각은 하기에 기재될 것이다.
(i) 핵산 및 생분해성 중합체를 포함한 핵산 함유 복합체를 식세포로 하여금 수용하도록 하는 단계:
이전에 기재된 바와 같이, 이 단계는 식세포에 본질적인 식세포 작용에 의해 핵산 함유 복합체의 식세포내로의 혼입에 의해 성취된다. 이 단계는 시험관 내에서 미리 핵산 함유 복합체와 식세포를 혼합하거나 핵산 함유 복합체를 생체내에서 투여하고, 생체내에서 식세포에 의해 이의 수용을 이용함으로써 수행될 수 있다. 시험관 내 식세포에 대한 핵산 함유 복합체의 혼합비는 제한되지 않고, 식세포가 핵산 함유 복합체를 수용할 수 있는 임의의 비율일 수 있다. 정상적으로, 단계는 과량으로 핵산 함유 복합체를 첨가함으로써 수행된다. 생체내 핵산 함유 복합체의 투여, 또는 생체내 조건하에 시험관 내 제조된 식세포의 투여는 핵산 함유 복합체 및 본 발명의 약물의 투여 방식 (하기에 기재됨)에 따라서 수행될 수 있다. 시험관 내에서 제조될 경우 그러한 핵산 함유 복합체-식세포는 또한 본 발명의 목적의 약물로 고려될 수 있다. 핵산 함유 복합체를 함유한 본 발명의 식세포를 생물체에 투여할 경우, 식세포의 생존성 및 활성을 유지하면서 투여를 수행하는 것이 필요하다. 골수 이식 또는 면역치료에 따르는 방법이 채택될 수 있고, 당업자에게 공지된다. 바람직하게는, 투여 방법의 전형적인 예는 하기와 같다: (a) 손상 부위 또는 근처 조직내로 투여; (b) 체강내로 투여 (심낭강, 흉강, 복강, 뇌척수강); (c) 혈관 또는 손상부위를 다스리는 림프 조직내로 투여; (d) 혈관 또는 진피, 손상 부위를 제외한 지방 또는 골격 근육 조직내로 투여. 식세포의 본질적인 이동 능력때문에, 임의의 이들 투여 방법은 투여 자리보다 오히려, 손상 자리에서 효과를 나타내리라 기대될 수 있다.
(ii) 식세포내에서 핵산의 발현을 유도하는 단계:
이 단계는 당업자에 공지된 기술을 사용하여 수행된다. 즉, 단계는 이들 세포에 도입될 경우, 핵산이 식세포내에서 이의 기능을 나타낼 수 있는 방식으로 핵산을 혼입함으로써 수행된다. 바람직한 구현예에서, 혼입된 핵산의 기능은 핵산에 의해 코딩된 유전자의 발현이다. 다른 바람직한 구현예에서, 핵산의 기능은 복합체내에 혼입된 핵산의 직접적인 작용에 의할 수 있다. 본 발명에서, 핵산은 생분해성 중합체와 복합된 핵산을 가진 핵산 함유 복합체로서 식세포내로 들어간다. 그리하여, 핵산 함유 복합체의 생분해능에 의해 조절된 핵산의 지속적 방출은 핵산의 세포내로의 도입의 효율성을 증가시키고, 세포내에서 핵산의 발현 또는 다른 기능을 증진시킨다.
(iii) 식세포를 표적 자리로 전달하는 단계:
이 단계는 식세포의 이동에 의해 쉽고 안전하게 수행된다. 바람직하게는, 식세포는 원하는 표적 자리에 따라서 선택된다. 암 조직 또는 염증 조직에서 표적화를 원한다면, 예를 들면, 대식세포, 유상피세포 및 다핵 거대세포가 바람직하게 사용된다. 단핵세포가 혈액 표적에 대해 바람직하게 사용되고; 골수 및 림프 조직에서 표적에 대해 수상세포; 연결 조직에서 표적에 대해 조직구; 간에서 표적에 대해 구퍼 세포; 뼈에서 표적에 대해 파골세포; 활막에서 표적에 대해 윤활세포 A; 신경계에서 표적에 대해 소신경교세포; 및 피부에서 표적에 대해 랑게르한스 (Langerhans)세포가 바람직하게 사용된다. 더욱이, 다양한 기관의 표면에의 식세포의 투여는 핵산을(식세포에 운반됨) 표적 기관에 깊이 이동하게 한다.
본 발명은 또한 식세포의 식세포 작용에 기초한 핵산 함유 복합체의 수용을이용하고, 상기에 상설한, 식세포의 본질적인 이동 능력에 기초한 복합체의 표적 자리로의 전달을 이용하는 유전자 치료를 위한 신규 약물을 제공한다. 이 약물은 활성 성분으로서 핵산 및 생분해성 중합체를 함유한 핵산 함유 복합체를 가진다. 복합체 성분의 의도한 범위는 상기 및 하기에 기재된다.
본 발명의 핵산 함유 복합체는 다양한 방법에 의해 생체내로 투여될 수 있다. 원하는 특정 자리에서 핵산의 지속적이고 국부적인 방출을 위해, 비경구적 투여가 특히 바람직하다. 활성 성분으로서 본 발명의 핵산 함유 복합체를 함유한 약물은 필요하다면, 복합체를 약제학적으로 허용가능한 운반체 (안정제, 보존제, 가용화제, pH 조절제, 점도 증진제 등)와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이들 운반체가 당업자에게 공지되어 있다. 지속된 방출 효과를 조절하는 다양한 첨가제가 추가로 혼입될 수 있고, 당업자에게 공지된다.
활성 성분으로서 본 발명의 핵산 함유 복합체를 가진 약물은 또한 상이한 종류의 핵산을 포함한 두 가지 이상의 유형의 핵산 함유 복합체를 포함한다. 복수의 치료용 목적을 가진 그러한 약물은 다양화된 유전자 치료의 분야에서 특히 유용하다.
본 발명의 핵산 함유 복합체는 의도한 목적에 따라서 다양한 형태로 약제학적으로 제조될 수 있다. 형태의 예는 과립, 실린더 또는 프리즘, 시트, 디스크, 페이스트 등의 형태의 고체 및 반고체 제제, 또는 현탁액 및 에멀션과 같은 주사제이다. 바람직한 것은 원하는 특정 자리에서 우수한 지속된 방출 효과를 가지고, 국부 투여에 바람직한 고체 제제이다. 예를 들면, 시트 형태로 제조된본 발명의 핵산 함유 복합체는 국부 혈관의 내벽에 고정하기에 적합하다. 더욱 구체적으로, 시트 모양의 핵산 함유 복합체가 동맥성형술을 위한 스텐트에 감기고, 스텐트는 도관에 의해 적당한 혈관 가지내로 삽입되고, 풍선이 국부 혈관내에서 팽창되어 핵산 함유 복합체를 혈관의 내벽에 고정되는 방법이 유용하다. 이 방법은 복합체가 고정된 자리에서 혈관벽내로의 유전자 전달 및 고정자리의 말초부위의 유전자 치료를 가능하게 한다. 바람직한 구현예는 항 혈관생성 치료와 같은 암 유전자 치료, 또는 혈관생성 치료와 같은 순환 질병의 유전자 치료를 포함한다.
핵산 함유 복합체의 주사는 근육내로, 지방 조직내로, 피하로, 피내로, 정맥내로, 림프관내로, 림프구내로, 동맥내로, 체공내로 (심낭강, 흉강, 복강, 뇌척수강), 또는 골수내로 투여될 수 있다. 근육내 투여가 바람직하다. 질병 조직내로의 직접적 투여가 또한 가능하다.
고체 및 반고체 제제의 경우에, 하기 방법이 예로서 인용된다: 제제가 핵산의 방출이 기대되는 자리에 직접 끼어 들고; 페이스트형 제제가 주사기에 의해 주사되고; 과립 제제가 비경구적 현탁액으로서 주사되고; 도관이 경피적, 경혈관 방식으로 삽입되고, 스텐트에 부착된 복합체가 도관을 통해 혈관내에서 자가 유지되고; 복합체의 미립자 (입경: 약 수 마이크론 내지 약 15 마이크론)가 도관을 통해 주사되고, 핵산의 방출이 기대되는 자리에 위치한다. 이들 방법 및 다른 것이 당업자에게 공지된다.
본 발명의 복합체를 약제학적으로 제조할 때, 그것을 멸균 여과와 같은 멸균 단계 처리하는 것이 추가로 바람직하다.
본 발명에 따라, 동물, 특히 인간에 투여된 투여량은 원하는 핵산, 사용된 생분해성 중합체, 투여 방식 및 치료할 특정 자리와 같은, 다양한 인자에 따라 다양하다. 그러나, 투여량은 치료 반응을 가져오기에 충분한 양이어야 한다. 그러한 투여량은 당업자에게 공지된다.
본 발명의 핵산 함유 복합체가 바람직하게는 유전자 치료에 적용된다. 복합체가 적용가능한 질병은 복합체내에 혼입된 핵산의 유형에 따라 상이하다. 질병의 예는 말초 동맥 질병, 관상 동맥 질병 및 손상을 일으키는 질병, 예를 들면, 동맥팽창 수술에 따른 재협착과 같은, 심장혈관 분야의 질병이다. 다른 예는 암 (악성 흑색종, 두개내 종양, 전이성 악성 종양, 유방암 등), 감염 (HIV 등) 및 일유전자성 질병 (낭성섬유증, 만성 육아종병, α1-항트립신 결핍증, 고셰병 등)이다.
바람직한 구현예에서, 섬유아세포 성장인자 유전자, 특히 서열 목록의 서열 번호 1로서 기재된 염기 서열을 함유한 DNA가 복합체내에 혼입된 핵산으로서 사용되고, 전술한 FGF4/HST1 단백질의 생리적 활성이 치료적으로 효과적인 다양한 질병에 적용될 수 있다.
실시예 및 실험 실시예가 본 발명을 더욱 상세히 설명하기 위해 제공될 것이나, 이들은 본 발명을 결코 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
(1) 아민화된 젤라틴의 제조
등전점이 9.0인 1그램의 젤라틴 (Nitta Gelatin Company)을 50ml의 0.1M 인산 완충액 (PB, pH 5.0) 중에 용해시켰다. 이어서, 젤라틴 (분자량: 10,000, 카르복실기 함량: 95몰/젤라틴 분자)의 카르복실기의 몰당 50몰의 양으로 에틸렌디아민 (분자량: 60.1)을 용액에 첨가하고, 카르복실기의 몰당 50몰의 양으로 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (분자량: 191.7)을 추가로 첨가하였다. 생성된 혼합 용액을 37℃에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응 완결시, 반응 혼합물을 2일 동안 물로 투석하고, 동결건조하여 아민화된 젤라틴을 수득하였다. 소듐 트리니트로벤젠술포네이트를 사용한 아미노기의 비색 정량 분석은 젤라틴의 카르복실기의 56%가 아민화되었다는 것을 보여 주었다.
(2) 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔의 제조
40℃로 전처리된 아민화된 젤라틴의 100mg/ml의 수용액(0.2ml)을 올리브 오일의 5ml내로 충진시켰다. 혼합물을 40℃에서 1분 동안 터치 혼합함으로써 유화시켰다. 유화된 혼합물을 40초 동안 추가로 초음파로 유화시키고, 얼음에서 신속하게 냉각시켰다. 아세톤(1.43ml)을 첨가하고, 혼합물을 원심분리하여 (5,000rpm, 5분, 4℃) 가교되지 않은 입자를 회수하였다. 생성된 입자를 아세톤을 사용하여 원심분리 세척하였다 (5,000rpm, 5분, 4℃). 이어서, 생성된 입자를 30㎕의 25% (w/v) 글루타르알데히드의 수용액과 20ml의 0.1%(w/v) Tween 80의 수용액의 수용액 혼합물 중에 현탁시켰다. 현탁액을 4℃에서 40 시간 동안 교반하여 젤라틴 입자를 화학적으로 가교시켰다. 이어서, 생성된 입자를 원심분리에 의해 회수하였다 (5,000rpm, 5분, 4℃). 이어서, 미반응 알데히드기를 봉쇄하기 위해, 입자를 100mM 글리신의 0.1 (w/v)% Tween 80 수용액 (20ml) 중에 분산시키고, 분산액을 37℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후에, 반응 혼합물을 0.1 (w/v)% Tween 80 수용액 (2회) 및 증류수 (3회)로써 원심분리 세척하여 입자를 회수하였다. 아세톤으로써 철저히 헹군 후에, 입자를 공기 건조시켰다. 건조된 입자 및 37℃에서 12 시간 동안 PB (pH 7.0)에서 팽창된 입자의 크기를 이들 현미경 사진으로부터 측정하였다. 이들 크기의 비율에 기초하여, 수분 함량은 98.6 부피%로서 평가되었다 (미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔). 건조 상태로 생성된 입자의 평균 크기는 100㎛ 이었다 (팽창 상태로 200㎛).
(3) 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔에 접합된 DNA의 제조
사용된 DNA는 대장균의 lacZ 유전자를 근육에서 특히 높은 활성을 가진 프로모터 CAG (병아리 p-액틴 프로모터; Gene, 108:193-200, 1991) 를 가진 pCAGGS 발현 벡터의 EcoRI 자리내로 삽입함으로써 수득된 lacZ 발현 플라스미드 DNA 이었다 (플라스미드는 pCAGGS-lacZ 또는 단지 lacZ 플라스미드라 언급될 것이다; Miyazaki Laboratory, Molecular Defense Medicine, Osaka University Faculty of Medicine에 의해 제공됨). 이 DNA를 TlCl3로써 방사성표지시켰다. 즉, 5㎕의 Na125I 용액 (0.1M NaOH 수용액 중에 740 MBq/ml, NEN Research Products, DuPont)을 0.3 mM Na2SO3수용액 (2㎕)과 혼합하고, 혼합물을 25℃에서 30분 동안 방치하였다.혼합물에, 5㎍ DNA가 용해된 5㎕의 0.1M CH3COONa-40 mM CH3COOH 혼합 용액 (pH 5.0)을 첨가하였다. 추가로, 0.3mg TlCl3가 용해된 0.3 ml의 0.2M CH3COONa-1.0 mM CH3COOH 혼합 용액 (pH 4.0)을 첨가하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 60℃에서 40분 동안 방치하였다. 이어서, 0.1ml의 0.1mM Na2SO3수용액을 혼합 용액에 첨가하고, 0.9ml의 1 mM EDTA를 포함한 0.1 mM NaCl-50 mM 트리스-염산 용액 (pH 7.0)을 추가로 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃에서 30분 동안 가열하였다. 반응의 종결시, 생성된 용액을 냉각시키고, PD-10 겔 칼럼 크로마토그래피(Amersham Pharmacia Biotech)하여 방사성 요오드화된 DNA 및 유리 방사성 요오드를 분리하였다. 이어서, 10㎕의 방사성 요오드화된 DNA의 수용액을 동결건조된 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔에 적가하고, 시스템을 25℃에서 1 시간 동안 방치하였다. 이 기간 동안, 입자를 수용액으로써 포화시켜 방사성 요오드화된 DNA를 포함한 복합체를 수득하였다.
실시예 2
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 수용액 (최종 농도: 10.7 mM)을 젤라틴 수용액 (최종 농도: 5 중량%)에 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 15 cm x 15 cm의 플라스틱 페트리 접시내로 쏟고, 4℃에서 24 시간 동안 유지하여 가교 반응을 수행하였다. 사용된 젤라틴은 등전점이 4.9인 알칼리-처리된 젤라틴이었다. 반응이 종결된 후에, 가교된 젤라틴 겔을 페트리 접시로부터 제거하여 두께 200㎛의 젤라틴 시트를 수득하였다. 생성된 시트를 물로써 철저히 세척하고, 이어서 동결건조시켰다. 건조 가교된 젤라틴 시트를 실시예 1과 동일한 방식으로 제조된 방사성 요오드화된 DNA (lacZ 플라스미드) 수용액에서 1시간 동안 방치하여 방사성 요오드화된 DNA를 함유한 가교된 젤라틴 시트를 수득하였다.
실험 실시예 1
미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔내로의 유전자의 혼입
핵산이 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체내로 들어간다는 것이 확인되었다.
500㎍/ml의 농도로 lacZ 플라스미드를 포함한 수용액 및 실시예 1-(2)에서 제조된 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔을 혼합하고, 수용액내의 lacZ 플라스미드 농도를 자외선 흡수 방법 (파장: 260nm)에 의해 시간에 따라 측정하였다. 대조군으로서, 물 (lacZ 플라스미드를 포함하지 않음)을 사용하였다. 결과를 도 2에 보여준다.
수용액내의 lacZ 플라스미드는 1 시간내에 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔내로 신속하게 혼입되었다 (수용액내의 lacZ 플라스미드 농도의 감소에 의해 측정됨). lacZ 플라스미드가 계속하여 젤라틴 히드로겔에 흡착하였다는 것을 증명하는, 수용액내의 lacZ 플라스미드 농도의 감소는 24 시간 후까지 지속되었다.
참조 실험 실시예 1
미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔의 생분해능
본 발명의 핵산 함유 복합체의 성분인 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔은생분해성으로 확인되었다.
125I-Bolton-Hunter 시약의 무수 벤젠 용액 (NEN-120X, 무수 벤젠 중 147 MBq/ml, NEN Research Products, DuPont)을 0.1ml 의 양으로 시험관내에 취하였다. 벤젠을 질소 기체 버블링에 의해 증발시켰다. 시험관에, 실시예 1-(2)에서 제조된 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔이 10mg/ml의 농도로 분산된, 5ml의 증류수를 첨가하였다. 혼합물을 4℃에서 12 시간 동안 교반하여 젤라틴 히드로겔을 방사성 요오드화시켰다. 생성된 방사성 요오드화된 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔을 증류수로써 원심분리하여 세척하여 (5,000rpm, 5분, 4℃) 표지에 관여하지 않은125I-Bolton-Hunter 시약을 제거하였다. 최종적으로, 입자의 농도를 0.1M 인산 완충된 염수 (PBS, pH 7.0)을 사용하여 0.5mg/ml로 조정하였다.
생성된 방사성 요오드화된 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔을 마우스당 0.1ml의 투여량으로 ddY 마우스 (암컷, 6주, Shimizu Experimental Material Company로부터 구입함)의 오른쪽 대퇴 근육내로 투여하였다. 예정된 시간의 경과 후에, 오른쪽 대퇴 근육을 절제하고, 방사성을 측정하였다. 측정된 방사성을 투여된 초기 방사성과 비교하여, 잔존 방사성을 평가하였다. 실험을 각각의 실험 조건하에 3마리의 마우스에서 수행하였다. 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔은 생체내에서 시간에 따라 분해되어, 생분해성으로 확인되었다.
실험 실시예 2
DNA의 생체내 생존의 평가
참조 실험 실시예 1과 동일한 방식으로 제조된 방사성 요오드화된 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔 및 실시예 1(3)에서 제조된 방사성 요오드화된 DNA로써 포화된 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔을 각각 0.1ml의 PBS에 분산하였다. 이어서, 분산액을 ddY 마우스 (암컷, 6주, Shimizu Experimental Material Company로부터 구입함)의 오른쪽 대퇴 근육내로 투여하였다. 대조군으로서, 90㎕의 PBS를 10㎕의 방사성 요오드화된 DNA 수용액에 첨가하고, 이어서 혼합물을 마우스의 오른쪽 대퇴 근육내로 투여하였다. 실험 동물의 수는 실험 조건의 각각에 대해 3마리이고, 잔존 방사성은 평균치±표준편차로서 표현되었다. 결과를 도 3에 보여준다.
입자가 생체내에서 분해된다는 것, 즉, 이들은 생분해성 (-·-)이라는 것을 보여주면서, 젤라틴 입자의 잔존 방사성은 시간에 따라 점차로 감소하였다. 젤라틴 히드로겔내로 포화된 DNA의 잔존 방사성은 또한 시간의 경과에 따라 감소했고, 이의 시간에 따른 프로필은 미립자 아민화된 히드로겔 그 자체의 잔존 방사성의 것(-°-)과 동일했다. 이것은 입자가 분해될 때 입자로부터 지속적인 방식으로 DNA가 방출된다는 증거이다. DNA가 수용액으로서 투여될 경우에, 잔존 방사성은 급속히 감소했다 (-△-). 이 발견은 DNA가 투여의 자리에서 보유되지 않고 신속하게 배출되거나 대사된다는 것을 보여준다.
실험 실시예 3
미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔 접합된 DNA의 유전자 발현
토끼의 대퇴 동맥을 제거하여 다리 허혈성 모델을 제조하였다. 10일 후에, lacZ 플라스미드를 허혈성 자리의 근육내로 투여하였다. 투여 후 2주에, 허혈성 부분의 근육 조직을 LacZ에 대해 염색하여 유전자의 발현을 조사하였다. 결과를 도 4A 내지 4C에 보여준다.
실시예 1(3)에서 제조된 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔 (팽창시 직경 200㎛) 접합된 lacZ 플라스미드 (lacZ 플라스미드의 양으로서 500㎍: 도 4A) 및 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔에 접합되지 않은 드러난 lacZ 플라스미드 (500㎍, 대조군: 도 4B)에 대해 조사를 수행하였다. lacZ 플라스미드의 양이 1/10로 감소된 (lacZ 플라스미드의 양으로서 50㎍: 도 4C) 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔 접합된 lacZ 플라스미드의 투여에 대해 조사를 또한 수행하였다.
lacZ의 염색을 하기 방식으로 수행하였다:
1. 시료를 4℃에서 5분 동안 37% 포름알데히드-25% 글루타르알데히드 혼합 용액에서 고정시킨다.
2. PBS로써 세척한다 (3회).
3. 염색 용액 (1 mg/ml X-gal, 5 mM 포타슘 헥사시아노페레이트(III), 5 mM 포타슘 헥사시아노페레이트(II), 1M 염화 마그네슘)으로써 염색한다.
lacZ 플라스미드 단독 투여와 비교할 때, 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔에 결합된 lacZ 플라스미드는 유전자의 더욱 광대한 발현을 보여 주었다 (A와 B의 비교).
미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔에 결합된 lacZ 플라스미드는 또한 이의 투여량이 1/10으로 감소되었을 때 조차도 유전자의 현저한 발현을 보여 주었다.
참조 실험 실시예 2
아데노바이러스 벡터를 사용한 유전자 발현
아데노바이러스 벡터를 사용한 유전자 전달을 실험 실시예 3과 동일한 방식으로 토끼의 다리 허혈성 모델에서 조사하였다.
lacZ 유전자 (Saito Laboratory, The Institute of Medical Science, The University of Tokyo에 의해 제공됨)의 1×109pfu 를 혼입하는 아데노바이러스 벡터를 투여하였다. 투여 후 3일에, lacZ 유전자의 발현은 lacZ 플라스미드 단독의 투여 및 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔에 결합된 lacZ 플라스미드의 투여에 의한 것보다 더 강했다 (도 5A). 그러나, 유전자 발현은 투여 후 2주에 현저히 감소했다 (도 5B).
실험 실시예 4
토끼의 다리 허혈성 모델에서 혈관생성
섬유아세포 성장인자 FGF4/HST1 플라스미드의 투여에 의한 혈관생성을 실험 실시예 3에서와 같이 토끼 다리 허혈성 모델에서 조사하였다.
미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔 접합된 FGF4/HST1 플라스미드를, 사용된 핵산이 FGF4/HST1 플라스미드 (500㎍ 또는 5㎍)인 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방식으로 제조하였다. 플라스미드로서, FGF4/HST1 유전자를 (서열 목록의 서열 번호 1) pRc/CMV2 벡터 (INVITROGEN)의 HindIII 자리내로 삽입함으로써 수득된 사용된 FGF4/HST1 발현 플라스미드 DNA (이후부터 단지 FGF4/HST1 플라스미드로서 언급됨)가 있었다.
대조군으로서, 드러난 FGF4/HST1 플라스미드 (500㎍) 및 동일한 젤라틴 히드로겔에 접합된 lacZ 플라스미드 (500㎍)를 사용하였다.
다리 허혈성 모델의 제조 후 10일에, 상기 구현예의 다양한 플라스미드를 각각 허혈성 자리에 근육내로 주사하였다. 투여 후 2주에, 신생 혈관의 조영술 (방사성 사진법)을 수행하였다. 결과를 도 6A 내지 6D에 보여준다.
도 6A 및 6B는 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔-접합된 FGF4/HST1 플라스미드의 투여에 대한 결과를 보여준다 (FGF4/HST1 플라스미드의 양: 도 6A에서 500㎍, 도 6B에서 5㎍). 도 6C는 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔-접합된 lacZ 플라스미드의 투여에 대한 결과를 보여준다 (500㎍, 대조군). 도 6D는 드러난 FGF4/HST1 플라스미드의 투여에 대한 결과를 보여준다 (500㎍, 대조군). 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔에 접합된 FGF4/HST1 플라스미드의 투여는 이의 드러난 형태로 플라스미드의 투여보다 더욱 많은 혈관의 신규 성장을 초래했다. 그리하여, FGF4/HST1 플라스미드의 기능성 발현이 증진되는 것으로 발견되었다 (도 6A와 도 6C 및 6D의 비교). 이 효과는 이의 투여량이 1/100으로 감소되었을 때 조차 관찰되었다 (도 6B). 더욱이, FGF4/HST1 플라스미드가 드러난 형태로보다 오히려, 젤라틴 히드로겔에 접합된 형태로 투여될 경우에 고 효율로서 국부적으로 기능하는 것이 가능해졌다.
FGF4/HST1 플라스미드 대신에 VEGF165플라스미드 (500㎍)을 사용한 실험은유사한 결과를 제공하였다. VEGF165플라스미드는 도쿄 대학의 Shibuya 교수에 의해 제공되었다. 이 플라스미드는 VEGF165유전자를 pCAGGS 발현 벡터의 XhoI 자리내로 삽입함으로써 수득된다 (Shibuya M, Adv. Cancer Res., 67, 281-316, 1995).
실험 실시예 5
토끼 동맥벽에 유전자 전달
(1) lacZ 플라스미드
실험 실시예 2에서 제조된 건조 가교된 젤라틴의 얇은 시트를 스테인레스 스텐트상에 올렸다 (합성; Cardio Vascular Dynamics, Inc.). lacZ 플라스미드 용액 (5 내지 10㎍/ml)을, 건조를 피하기 위해 적가를 2 시간 동안 반복하면서 (적가된 총량: 50 내지 100㎕), 가교된 젤라틴의 얇은 시트에 적가하였다. 이 조치에 의해, 가교된 젤라틴과 lacZ 플라스미드를 접합하였다. 이 가교된 젤라틴으로써 코팅된 스텐트를 토끼의 장골 동맥내로 이식하였다. 5일 후에, 장골 동맥을 꺼내어, Tissue-Tek(R) O.C.T. 화합물에 끼워 넣고, 액체 질소에서 고정하였다. 이 시료를 -80℃에서 저장하였다. 고정된 시료로부터 슬라이스를 제조하고, 헤마톡실린-에오신 (HE) 염색, DAB (디아미노벤젠지덴) 및 Xgal 염색을 하였다. 결과를 도 7에 보여준다.
혈관 평활근층의 바깥 층에서, 대식세포에 의한 플라스미드의 수용 및 플라스미드의 발현을 확인하는, lacZ의 발현이 관찰되었다.
(2) VEGF165 플라스미드
상기 (1)에 기재된 것과 동일한 방식으로, 1 내지 2 ㎍/ml의 VEGF165 플라스미드 용액을 가교된 젤라틴의 얇은 시트에 50 내지 100㎕의 양으로 적가하였다. 이 플라스미드의 발현은 면역 조직화학적 염색에 의해 확인되었다 (항 인간 VEGF IgG 분획 (Austral Biologicals)을 1차 항체로서 사용하였다).
실험 실시예 6
방사 미세혈관 조영술에 의한 신생 혈관신경절의 성숙의 연구
(1) 플라스미드의 투여
가교된 젤라틴에 접합되지 않은 500㎍의 드러난 VEGF165플라스미드를 포함한 수용액을 다리 허혈증을 가진 토끼의 병든 다리 대퇴 근육내로 가시적으로 투여하였다 (실험 실시예 3에서와 같이).
별개로, 직경이 약 200㎛인 4mg의 미립자 가교된 젤라틴에 접합된 500㎍의 VEGF165플라스미드를 포함한 생리 식염수를 다리 허혈증을 가진 토끼의 병든 다리 대퇴 근육내로 가시적으로 투여하였다.
(2) 아데노신 적재
아데노신을 100㎍/kg/분의 투여량으로 복부대동맥에 투여하였다.
(3) 측정 및 결과
신생 혈관신경절의 성숙을 방사 미세혈관 조영술에 의해 (공간 해상도 25마이크론) 드러난 VEGF165플라스미드 군 및 젤라틴 히드로겔 접합된 VEGF165플라스미드 군에서 측정하였다. 드러난 VEGF165플라스미드 처리의 결과를 도 8에 보여준 반면에, 젤라틴 히드로겔 접합된 VEGF165플라스미드 처리의 결과를 도 9에 보여준다. 드러난 VEGF165플라스미드 처리된 군에서, 아데노신 적재 (혈관확장 동안)에 따른 혈관 밀도는 기준선 (아데노신을 적재하지 않음)과 비교할 때 감소했다. 젤라틴 히드로겔 접합된 VEGF165플라스미드 처리된 군에서, 아데노신 적재에 따른 혈관 밀도는 명백히 증가하였다. 이들 발견은 젤라틴 히드로겔 접합된 VEGF165플라스미드 군에서, 기준선에서의 혈류가 낮은 수준으로 조절되고, 혈관확장 보유 능력은 아데노신 적재 동안 유동적이었다. 한편, 드러난 VEGF165플라스미드 군에서, 기준선에서의 혈류는 낮은 수준으로 조절되지 않았고, 아데노신 적재 동안 유동적인 혈관확장 보유 능력이 없었다. 혈관 평활근과 같은 혈관계의 성숙 및 신생 혈관에서의 신경 또는 체액성 조절 기작은 아데노신 적재 동안 혈류의 조절 및 혈관확장에 필수불가결하다. 젤라틴 히드로겔 접합된 VEGF165플라스미드의 투여는 이들 상태를 달성할 수 있는 것으로 발견되었다.
참조예 3
대식세포에 의한 핵산 함유 복합체의 수용
핵산 함유 복합체를 혼입한 대식세포를 시험관 내에서 제조하였다. 티오글리콜레이트를 마우스에게 복강내로 주사하고, 대식세포를 4일 후에 취하였다. 별개로, 100㎍의 2mg 녹색 형광 단백질 (GFP) 플라스미드 (Prasher DC 등 Gene,111, 229-233, 1992; Heim R 등 Nature, 373, 663-664, 1995)를 실시예 1에서 제조된 가교된 젤라틴 입자와 접합하였다. 플라스미드를 GFP 의 cDNA (Clontech로부터 구입함)를 HIV-CS 벡터의 다중클로닝 자리내로 삽입함으로써 제조하였다. 가교된 젤라틴 입자-GFP 플라스미드를 수집된 대식세포와 혼합하고, 혼합물을 33℃에서 4일 동안 PBS에서 배양하였다. 배양 4일 후에, GFP의 형광을 형광 현미경 및 형광 활성화된 세포 분류기 (FACS)로써 검사하였다. 결과를 도 10에 보여준다. 가교된 젤라틴 입자-GFP의 수용을 확인하는, 형광이 대식세포에서 관찰되었다. 유사한 결과가 에오신 염색 용액에 잠긴 가교된 젤라틴 입자를 사용한 실험에서 확인되었다 (대식세포내에서의 에오신 입자의 확인).
실험 실시예 7
수상세포에의 유전자 전달 및 특정 항원에 대한 CTL의 유도
인간 말초혈로부터 분리된 수상세포 (DC)를 GFP 플라스미드로써 투여하고, 항원 제공 능력에 대해 조사하였다.
미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔 접합된 GFP 플라스미드를, 사용된 핵산이 GFP 플라스미드인 것 (이전에 기재됨; 20㎍)을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방식으로 제조하였다.
CD 14 양성 분획을 건강한 대상의 단핵세포로부터 수득하고, GM-CSF 및 IL-4와 함께 모은 인간 혈청/RPMI 배지에 첨가하여 DC를 유도하였다. 4 내지 6일 경과 후에, 미립자 아민화된 젤라틴 히드로겔 접합된 GFP 플라스미드를 DC에 첨가하였다. 혼합물을 60분 동안 방치하고, 젤라틴 히드로겔을 제거하고, 이어서세포를 추가로 3일 동안 배양하였다. 배양 후의 DC를 DC 마커로서 CD1a-PE 및 CD83-PE로써 염색하고, DC에 유전자 전달의 효율성을 FACS 분석에 의해 조사하였다. 결과를 도 11A 및 11B에 보여준다. 대조군으로서, 드러난 GFP 플라스미드 (20㎍)를 사용하였다. 유전자 전달 효율은 77%이었다.
GFP 플라스미드 대신에 WT1 플라스미드 (Call KM 등, Cell, 60, 509-520, 1990)를 사용할 경우 유사하게 높은 유전자 전달 효율이 수득되었다.
거기에 전달된 WTI 유전자를 가진 DC가 유전자 산물에 대한 세포 제공의 능력을 가지는가는 CTL 유도 능력에 의해 측정하였다. 유도된 DC를 가진 동일한 건강한 대상의 T 림프구를 활성화된 T 림프구를 수득하기 위해 WT1 유전자를 가진 DC와 함께 배양하였다. 이들 세포를 표적 세포를 형성하기 위해51Cr로써 표지하였다. 이들 표적 세포를 사용하여, CTL 검정을 수행하였다. CTL은 전달된 WT1에 대해 유도되어, WT1 유전자 형질전환된 DC의 항원 제공 능력을 보여주었다.
상기에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따라, 핵산의 음전하와 생분해성 중합체의 양전하 사이의 안정하고 단단한 결합은 복합체의 형성을 초래한다. 핵산의 방출은 생분해성 중합체의 생체내 분해에 의해 조절된다. 그리하여, 종래의 느린 방출 제제에 대해 관찰된 단순 확산에 의한 느린 방출 및 수용성 생분해성 중합체의 사용에 의한 핵산의 일시적인 방출과 비교할 때, 방출 속도의 더욱 정확한 조절이 성취될 수 있다. 더욱이, 장시간에 걸친 지속적인 방출이 개선된다.
본 발명의 핵산 함유 복합체에 대해, 이 복합체는 불용성이고, 핵산은 생체내 분해로부터 보호된다. 그리하여, 핵산은 유전자의 발현 또는 둘러싸인 핵산의 직접적인 작용에 의해 이의 기능이 나타나야 하는 자리에 도달할 때까지 충분히 활성 상태로 유지될 수 있다. 그리하여, 핵산의 국부 발현 및/또는 작용이 달성될 수 있다. 즉, 처리를 요구하는 자리에 제한된 유전자 치료가 달성될 수 있다.
더욱이, 핵산의 방출 속도는 사용된 생분해성 중합체의 유형 및 양전하 및 음전하 사이의 균형에 의해 조절된다. 그리하여, 방출 속도는 일정하고, 복합체를 제형할 때 이의 모양에 특별한 주의를 할 필요가 없다.
장기간 핵산을 국부적으로, 일정하게 및 지속적으로 방출하는 것이 유전자 치료의 분야에서 특히 유용하다. 치료를 요하는 자리 또는 생물체에 원하는 유전자를 장기간 투여할 때, 유전자 전달의 시기 및 유전자 발현 및 기능성 발현에 가장 바람직한 핵산을 도입하는 시기를 조절하는데 대한 증가된 요구가 있을 것이다.
본 발명에 따라, 통상 투여량의 약 1/10 내지 1/100인 핵산의 양으로 원하는 효과를 기대할 수 있다. 즉, 본 발명은 핵산의 효과적인 활성을 증진시키기 위해 작용한다. 이 작용은 유전자가 낮은 투여량으로 투여될 수 있고, 원하는 자리이외의 다른 자리에 유전자의 병행 효과가 감소될 수 있다는 관점에서 바람직하다.
본 발명의 핵산 함유 복합체의 또다른 구현예는 대식세포와 같은 식세포의식세포 작용의 사용 및 식세포의 이동에 의해 핵산의 표적 자리-특이적 기능성 발현을 달성할 수 있는 신규 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 안전하고 용이한 유전자 치료를 가능하게 한다.

Claims (49)

  1. 핵산 및 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체를 포함한 핵산 함유 복합체로서, 상기 핵산이 생분해성 중합체의 분해에 의해 방출될 수 있는 핵산 함유 복합체.
  2. 핵산, 및 도입된 양전하기를 가진 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체를 함유하는 핵산 함유 복합체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체가 콜라겐, 젤라틴, 키틴, 키토산, 히알루론산, 알긴산, 전분 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 함유하는 핵산 함유 복합체.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 유도체가 아미노 유도체를 함유하는 핵산 함유 복합체.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체가 도입된 양전하기를 가진 가교된 젤라틴을 함유하는 핵산 함유 복합체.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 핵산이 플라스미드 DNA, 올리고뉴클레오티드 및 이중 가닥 핵산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 함유하는 핵산 함유 복합체.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 핵산이 혈관 내피세포 성장인자 유전자, 간세포 성장인자 유전자 및 섬유아세포 성장인자 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 함유하는 핵산 함유 복합체.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 섬유아세포 성장인자 유전자가 서열 번호 1을 함유하는 핵산 함유 복합체.
  9. 활성 성분으로서 제 1 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항의 핵산 함유 복합체를 함유하는 약제학적 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 유전자 치료에 사용되는 약제학적 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 유전자 치료가 유전자의 국부 투여에 의해 성취되는 약제학적 조성물.
  12. 하기를 포함하는, 핵산 방출의 속도를 조절하는 방법:
    양전하의 수 불용성 생분해성 중합체내로 핵산을 혼입하는 것; 및
    상기 생분해성 중합체의 분해에 의해 핵산의 방출을 허용하는 것.
  13. 하기를 포함하는, 핵산 방출의 속도를 조절하는 방법:
    도입된 양전하기를 가진 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체내로 핵산을 혼입하는 것; 및
    상기 생분해성 중합체의 분해에 의해 핵산의 방출을 허용하는 것.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 상기 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체가 콜라겐, 젤라틴, 키틴, 키토산, 히알루론산, 알긴산, 전분 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 함유하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 유도체가 아미노 유도체를 함유하는 방법.
  16. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 상기 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체가, 도입된 양전하기를 갖는 가교된 젤라틴을 함유하는 방법.
  17. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 상기 핵산이 플라스미드 DNA, 올리고뉴클레오티드 및 이중 가닥 핵산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 함유하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 핵산이 혈관 내피세포 성장인자 유전자, 간세포 성장인자 유전자 및 섬유아세포 성장인자 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 함유하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 섬유아세포 성장인자 유전자가 서열 번호 1을 함유하는 DNA를 함유하는 방법.
  20. 하기를 포함하는, 핵산의 기능을 증진시키는 방법:
    양전하의 수 불용성 생분해성 중합체내로 핵산을 혼입하는 것; 및
    핵산의 기능을 나타내기 위해 생분해성 중합체의 분해에 의해 핵산의 방출을 허용하는 것.
  21. 하기를 포함하는, 핵산의 기능을 증진시키는 방법:
    도입된 양전하기를 가진 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체내로 핵산을 혼입하는 것; 및
    핵산의 기능을 나타내기 위해 생분해성 중합체의 분해에 의해 핵산의 방출을 허용하는 것.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 상기 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체가 콜라겐, 젤라틴, 키틴, 키토산, 히알루론산, 알긴산, 전분 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 함유하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 유도체가 아미노 유도체를 함유하는 방법.
  24. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 상기 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체가, 도입된 양전하기를 갖는 가교된 젤라틴을 함유하는 방법.
  25. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 상기 핵산이 플라스미드 DNA, 올리고뉴클레오티드 및 이중 가닥 핵산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 함유하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 핵산이 혈관 내피세포 성장인자 유전자, 간세포 성장인자 유전자 및 섬유아세포 성장인자 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 함유하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 섬유아세포 성장인자 유전자가 서열 번호 1을 함유하는 방법.
  28. 핵산 및 생분해성 중합체를 포함한 핵산 함유 복합체를 함유하는 식세포.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 생분해성 중합체가 콜라겐, 젤라틴, 키틴, 키토산, 히알루론산, 알긴산, 전분 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 함유하는 식세포.
  30. 제 28 항에 있어서, 상기 핵산 함유 복합체가 제 1 항 또는 제 2 항의 핵산 함유 복합체를 함유하는 식세포.
  31. 하기 단계를 포함하는, 표적 자리에서 핵산의 기능을 나타내는 방법:
    (i) 핵산 및 생분해성 중합체를 함유한 핵산 함유 복합체의 식세포내로의 수용을 허용하는 단계;
    (ii) 식세포내에서 핵산의 기능을 유도하는 단계; 및
    (iii) 식세포를 표적 자리로 전달하는 단계.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 핵산 함유 복합체가 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느한 항의 핵산 함유 복합체를 함유하는 방법.
  33. 제 31 항에 있어서, 상기 생분해성 중합체가 콜라겐, 젤라틴, 키틴, 키토산, 히알루론산, 알긴산, 전분 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 함유하는 방법.
  34. 활성 성분으로서 핵산 함유 복합체를 함유한 유전자 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 핵산 함유 복합체가 핵산 및 생분해성 중합체를 함유하고, 상기 유전자 치료가 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물:
    (i) 핵산 및 생분해성 중합체를 포함한 핵산 함유 복합체의 식세포내로의 수용을 허용하는 단계;
    (ii) 식세포내에서 핵산의 기능을 유도하는 단계; 및
    (iii) 식세포를 표적 자리로 전달하는 단계.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 생분해성 중합체가 콜라겐, 젤라틴, 키틴, 키토산, 히알루론산, 알긴산, 전분 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 함유하는 약제학적 조성물.
  36. 제 34 항에 있어서, 상기 핵산 함유 복합체가 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느한 항의 핵산 함유 복합체를 함유하는 약제학적 조성물.
  37. 핵산 및 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체를 포함하는 핵산 함유 복합체를 그러한 치료가 필요한 환자에게 투여함으로써 질병 또는 장애를 치료하는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체가 콜라겐, 젤라틴, 키틴, 키토산, 히알루론산, 알긴산, 전분 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 함유하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 상기 유도체가 아미노 유도체를 함유하는 방법.
  40. 제 37 항에 있어서, 상기 양전하의 수 불용성 생분해성 중합체가, 도입된 양전하기를 가진 가교된 젤라틴을 함유하는 방법.
  41. 제 37 항에 있어서, 상기 핵산이 플라스미드 DNA, 올리고뉴클레오티드 및 이중 가닥 핵산 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 함유하는 방법.
  42. 제 37 항에 있어서, 상기 핵산이 혈관 내피세포 성장인자 유전자, 간세포 성장인자 유전자 및 섬유아세포 성장인자 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 함유하는 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 섬유아세포 성장인자 유전자가 서열 번호 1을 함유하는 DNA를 함유하는 방법.
  44. 제 37 항에 있어서, 상기 질병 또는 장애가 암, 면역관련 질병 및 장애, 심장혈관 질병, 뇌 또는 신경 관련 질병, 대사 질병 및 일유전자성 질병으로 구성된군으로부터 선택되는 방법.
  45. 제 44 항에 있어서, 상기 심장혈관 질병이 말초 동맥 질병, 관상 동맥 질병 및 손상을 일으키는 질병으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  46. 제 44 항에 있어서, 상기 일유전자성 질병이 낭성섬유증, 만성 육아종병, α1-항트립신 결핍증 및 고셰병으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  47. 제 37 항에 있어서, 상기 질병 또는 장애가 암; 중추 신경계 질병; 말초 신경계 질병; 알츠하이머 질병; 파킨슨 질병; 다발성 경화증; 근위축성 측삭 경화증; 바이러스 감염; 프리온에 의해 야기된 감염; 세균에 의해 야기된 감염; 곰팡이에 의해 야기된 감염; 및 안구 질병으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  48. 제 47 항에 있어서, 상기 암이 악성 흑색종, 두개내 종양, 전이성 악성 종양 및 유방암으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  49. 제 37 항에 있어서, 상기 질병 또는 장애가 편두통; 통증; 성기능장애; 기분장애; 주의 장애; 인지 장애; 저혈압; 고혈압; 정신 장애; 신경성 장애; 운동 장애; 대사 장애; 및 기관 이식 거부로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
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