JP2003516365A - 核酸送達系 - Google Patents

核酸送達系

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アルトウルソン，ペル
グアン，ホリー
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アルトウルソン，ペル
グアン，ホリー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、送達系により宿主組織中の細胞にオリゴもしくはポリヌクレオチドを包含する核酸を導入するための組成物および製薬学的製剤、ならびにこうした組成物の製造方法に向けられる。核酸の送達のための組成物は、正の電荷を有する基を本質的に含まないポリマー担体粒子を含んで成り、また、核酸は本質的に該粒子の表面上に提供される。該担体粒子は水に不溶性であるが、しかし、適しては、それは水を迅速に吸収することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、核酸のための非ウイルス性の縮合しない（ｎｏｎ−ｃｏｎｄｅｎｓ
ｉｎｇ）送達系、およびより具体的には、宿主組織への投与後にその組織中の細
胞への核酸の導入を助長する系に関する。本製剤は、縮合されない形態のオリゴ
もしくはポリヌクレオチドのような生物学的に活性の核酸を、粘膜組織のような
宿主組織に効率的に送達しかつその組織中に存在する細胞中での所望の産物もし
くは活性の発現を助長する、安定かつ濃縮された乾燥粉末の形態にある。
【０００２】 （背景技術） 核酸は、遺伝子治療、アンチセンス治療に、および遺伝子ワクチン接種におい
て適用されており、そしてタンパク質およびペプチドを包含する伝統的な医薬／
ワクチンを上回る多くの利点を有する。しかしながら、製薬学的見地から、ウイ
ルスに基づく遺伝子送達系に比較してインビボで比較的低い発現が得られるため
、核酸の送達方法は未だ難題のままである（Ｓａｅｋｉら １９９７）。
【０００３】 オリゴもしくはポリヌクレオチドのような負に荷電した核酸は、最も普遍的に
は、陽イオン性脂質、陽イオン性ペプチドもしくは陽イオン性ポリマーのような
正に荷電した分子との複合体形成および縮合後に送達される（Ｆｅｌｇｎｅｒら
１９８７；Ｇａｏら １９９５；Ｋａｂａｎｏｖら １９９５）。これらの陽
イオン性分子は、ヌクレアーゼ分解に対する保護を提供することができ、そして
また細胞とのそれらの相互作用および細胞による取込みに味方する核酸−陽イオ
ン性分子複合体の表面特性も生じさせるかもしれない。例えば、陽イオン性脂質
は広範囲に研究されており、そして多くのインビトロの系およびまたいくつかの
インビボの系での多様な遺伝子の効率的発現を媒介することが示されている（Ｆ
ｅｌｇｎｅｒら １９８７；Ｄｅｓｈｐａｎｄｅら １９９８；Ｆｒｅｉｍａｒ
ｋら １９９８；Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ−Ｇａｂｌｅら １９９８；Ｐｉｌｌａｉ
ら １９９８；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇら １９９８）。
【０００４】 興味深いことに、これらの送達系はいくつかの組織、主として肺組織中で効率
的である（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅら １９９８；Ｆｒｅｉｍａｒｋら １９９８；
Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ−Ｇａｂｌｅら １９９８；Ｐｉｌｌａｉら １９９８；Ｓ
ｔｅｒｎｂｅｒｇら １９９８）一方、それらは他の組織中で非効率的なままで
ある。従って、インビボでの遺伝子トランスフェクションは、予測不可能な方法
で組織依存性であり、そして従って難題のままである。
【０００５】 例えば、マウス肺中での遺伝子発現に至適化された陽イオン性脂質およびプラ
スミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の製剤は、裸のｐＤＮＡ溶液に比較して鼻上皮での遺
伝子発現を助長せず、そして、嚢胞性線維症トランスジェニックマウスのイオン
輸送の欠陥のわずかの是正のみが観察された（Ｊｉａｎｇら １９９８）。裸の
ｐＤＮＡは、多陽イオン性ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）もしくはキトサンを使
用して縮合された複合体より効率的に鼻上皮細胞をトランスフェクションしたこ
とが示されている（Ｋｏｅｐｉｎｇ−Ｈｏｅｇｇａｒｄら １９９８）。さらに
、陽イオン性複合体製剤は、鼻上皮のような組織中のみならずしかしまたある種
の他の組織中でも遺伝子送達系として無効果であることが示されている。マウス
脳もしくは筋への裸のｐＤＮＡの注入は用量依存性の遺伝子発現をもたらし、こ
れは陽イオン性脂質との複合体形成により向上されなかった（Ｓｃｈｗａｒｔｚ
ら １９９６）。
【０００６】 対照的に、ｐＤＮＡおよび陰イオン性脂質より構成される送達系は、マウス脳
、筋および肝でのトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）発現を有意に高めた一
方、陽イオン性脂質の使用は遺伝子発現を劇的に低下させた（Ｓｃｈｗａｒｔｚ
ら １９９５；Ｓａｅｋｉら １９９７）。
【０００７】 しかしながら、多くの他の研究は、一般に、陰イオン性もしくは中性の脂質は
、インビトロおよびインビボの遺伝子トランスフェクションに関して、陽イオン
性脂質に比較してより少なく有効もしくは無効であることを観察した（Ｂａｒｔ
ｈｅｌら １９９３；Ｆａｓｂｅｎｄｅｒら １９９５；Ｌｅｅら １９９７）
。
【０００８】 嚢胞性線維症患者の気道上皮への遺伝子移入に関する１つの臨床試験を包含す
る他の研究は、裸のｐＤＮＡの溶液が陽イオン性リポソームｐＤＮＡ複合体と少
なくとも同じくらい有効であったことを示した（Ｍｅｙｅｒら １９９５；Ｚａ
ｂｎｅｒら １９９７）。
【０００９】 従って、多様な組織中でのｐＤＮＡの陽イオン性複合体製剤の遺伝子トランス
フェクション効率に関していかなる一般的結論も引き出すことが困難である。
【００１０】 しかしながら、裸のｐＤＮＡの投与のアプローチは幼児の免疫感作に十分に安
全と考えられており（Ｂｏｔら １９９８）、また、ｐＤＮＡ構築物は所望の部
位で、通常は筋にただ注入することができる（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら １９９７
）。従って、例えば裸のｐＤＮＡ溶液の形態の縮合されないｐＤＮＡの使用は、
ある種の組織への遺伝子移入の興味深い手段であるかもしれない。
【００１１】 マウスへの裸のｐＤＮＡの溶液の筋肉内投与後の遺伝子発現に関する最初の報
告（Ｗｏｌｆｆら １９９０）以来、縮合されないｐＤＮＡの送達を向上させる
ためのいくつかの試みのみがなされた。
【００１２】 ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびポリビニルアルコール（ＰＶＡ）のよ
うな縮合しないがしかし「相互作用する」ポリマーと複合体形成されたｐＤＮＡ
溶液の注入は、ラット筋において裸のｐＤＮＡ対照を上回る遺伝子発現の約１０
倍の増強をもたらした（Ｍｕｍｐｅｒら １９９６；Ｍｕｍｐｅｒら １９９８
；Ｂａｒｒｙら １９９９）。過剰のこれらの可溶性ポリマー分子は溶液中のｐ
ＤＮＡ分子と相互作用しかつ安定化することが見出された。
【００１３】 別のアプローチは、ポリ乳酸コグリコール酸（ＰＬＧＡ）分子のような遅延放
出特性をもつ素材を使用した。比較的小さな大きさ（１０μｍ未満の直径）のＰ
ＬＧＡ微小球は細胞の取込みに適すると見出されている。
【００１４】 本微粒子系において、核酸はある種の製造技術により担体のポリマー網状構造
中に捕捉される（Ｈｅｄｌｅｙら １９９８；Ｈｅｄｌｅｙら １９９８；Ｌｅ
ｗｉｓら １９９８；Ａｎｄｏら １９９９）。例えば、核酸およびポリマーを
多様な液相に溶解してよく、次いで乳化段階、およびマイクロもしくはナノ粒子
を生じさせるコアセルベーション過程によるポリマー粒子の形成が続き、ここで
核酸はポリマーマトリックス中に比較的均質に組込まれる。
【００１５】 こうした微粒子製剤の特徴は、それらがポリマー粒子の分解に関係する持続性
かつ制御された方法でｐＤＮＡを送達させることである。しかしながら、こうし
た微粒子製剤はむしろ製造するのが複雑かつまた高価である。さらに、それらは
、ｐＤＮＡの放出がポリマーマトリックスの分解に依存するため、例えば粘膜の
環境中での標的細胞との接触直後のｐＤＮＡの即座の放出に使用するのに適して
いない（Ｃａｐａｎら １９９９；Ｗａｎｇら １９９９）。最後に、効率的で
あるためには、こうした粒子製剤は、標的細胞が粒子を貪食することが可能であ
ることを必要とするかもしれない。貪食されるためには、粒子が直径が１０μｍ
未満である必要があることが一般に受け入れられている（Ｍｉｇｌｉｅｒｉｎａ
１９８６）。従って、こうした粒子は粘膜組織を内張りする上皮細胞のような
食作用能力を有しないもしくは低い食作用能力のみを有する細胞への核酸の導入
において効率的でないことがありそうである。
【００１６】 （発明の要約） 本発明は、宿主組織の細胞、好ましくは粘膜組織の細胞への核酸の送達のため
の組成物、およびまたこうした組成物の安価かつ便宜的な製造方法に向けられる
。本発明の基礎は、本質的にその表面上に正の電荷を有する基を本質的に含まず
かつｐＤＮＡのような核酸を運搬する、セルロースのような最低１種のポリマー
より構成される大型の微粒子担体を、選択された組織の細胞中に核酸を送達する
のに使用することができるという予期されない結果である。驚くべきことに、不
溶性のポリマー粒子の表面から迅速に放出される核酸分子が標的細胞により取り
込まれ、そして、多様な核酸によりコードされる所望の分子がこれらの細胞中で
効率的に発現される。ｐＤＮＡの本製剤は、安定な（例えば水分を含まない）製
剤を製造するのに安価かつ容易である。従って、製造に関してスケールアップす
ることが容易であるはずである。
【００１７】 より具体的には、本発明は、不溶性ポリマー送達系により宿主組織中にオリゴ
もしくはポリヌクレオチドのような核酸を導入するための組成物および製薬学的
製剤に向けられる。該ポリマー担体粒子は、粘液のような細胞外体液に本質的に
不溶性でありかつ正の電荷をもつ化学基を本質的に含まない１種もしくはそれ以
上のポリマーより構成される。本発明はこうした送達系の製造方法を提供し、こ
の系は、哺乳動物へのオリゴもしくはポリヌクレオチドを包含する核酸の投与に
適する。
【００１８】 大部分の場合、オリゴもしくはポリヌクレオチドのような負に荷電した核酸は
、陽イオン性脂質、陽イオン性ペプチドもしくは陽イオン性ポリマーのような正
に荷電した分子との複合体形成後に宿主組織に送達される（Ｆｅｌｇｎｅｒら
１９８７；ＧａｏとＨｕａｎｇ １９９５；ＫａｂａｎｏｖとＫａｂａｎｏｖ
１９９５）。本発明は、他方、正の電荷を有する化学基を本質的に含まずかつ／
もしくは本質的に陽イオン性よりはむしろ本質的に電気的に中性である不溶性の
担体分子を扱っている。
【００１９】 より具体的には、陽イオン性脂質、陽イオン性ペプチドもしくは陽イオン性ポ
リマーを使用するＤＮＡ複合体の以前の製剤は、陽イオン基を使用してＤＮＡ、
ＲＮＡもしくは別の核酸のリン酸もしくは類似のバックボーン基上の負の電荷を
中和する。対照的に、本発明の担体粒子は、固定された正の電荷が核酸上の負の
電荷を中和することができる十分な密度で固定された正の電荷を有しない。従っ
て、本発明のＤＮＡ／担体粒子組成物が処方される場合、負に荷電したバックボ
ーン基は、一般に、溶液由来の（そして担体粒子由来のでなく）陽イオンにより
中和されなければならない。例えば、好ましい一態様において、担体粒子は、Ｄ
ＮＡ上の負の電荷の１０パーセント未満を効果的に中和することができる、十分
低い密度の固定された陽イオン基を有する。より好ましい一態様において、担体
粒子は、ＤＮＡ上の負の電荷の１パーセント未満を効果的に中和することができ
る、十分低い密度の固定された陽イオン基を有する。
【００２０】 本発明の組成物の基礎は、核酸が提供もしくは結合される予め形成された担体
粒子（核酸を含まない）の使用である。
【００２１】 これは、核酸およびポリマーの双方が分子的に分散されている液体溶液から薬
物送達系の粒子が形成される、以前に既知の技術と対照的である。核酸を含有す
る粒子のこうした製剤は、しばしば、乳化技術の使用もしくはコアセルベーショ
ン手順により製造されてきた（Ｊｏｎｅｓら １９９７；Ｊｏｎｅｓら １９９
７；Ｈｅｄｌｅｙら １９９８；Ｌｅｗｉｓら １９９８；Ａｎｄｏら １９９
９；Ｓｈｅａら １９９９）。
【００２２】 以前に使用された製造技術は、本発明に比較して核酸の配置の重要な差異をも
たらす。以前の文献において、核酸はポリマーマトリックスの網状構造内に組込
まれる（Ｌｅｗｉｓら １９９８；Ｓｈｅａら １９９９）。例えば、核酸は粒
子の内部全体に分布される。あるいは、核酸はポリマーの殻により被包化される
。これらの型の捕捉処置は、一般に捕捉された化合物の遅延放出をもたらす。こ
うした遅延放出製剤の一般的な一特徴は、被包化マトリックスが溶解して核酸を
放出することができることである。対照的に、本発明の核酸／担体粒子製剤によ
れば、担体粒子は比較的不溶性であり、そして、核酸の多くが、担体粒子の可溶
化、分解もしくは物理的破壊よりずっとより早い時間的尺度で担体から放出され
る。
【００２３】 対照的に、本発明により、核酸は例えば担体粒子を核酸溶液中に単に浸積する
ことにより、本質的に担体粒子の表面上に提供もしくは結合される。これにより
、核酸は、粒子の外面の表面上、および粒子が粒子凝集物より構成される場合は
担体粒子の外面の表面から内部に伸長する孔の表面上でもまた優先的に見出され
る。
【００２４】 該組成物の製造方法は、凍結防止剤のような１種もしくは数種の安定剤の添加
を伴い、選択された核酸を本ポリマー担体上に提供もしくは結合すること、該混
合物をドライケーキに乾燥すること、およびドライケーキの乾燥粉末への粉砕を
含んで成る。該乾燥粉末組成物は本質的に担体粒子の表面上に提供された濃縮さ
れた核酸を含有する。担体粒子は水に本質的に不溶性であるが、しかし、適する
一態様によれば、それらは水を吸収する。
【００２５】 本発明は、さらに、とりわけ「裸の」もしくは縮合されない核酸が縮合された
核酸より効率的にトランスフェクションする組織中での、遺伝子ワクチン接種も
しくはアンチセンスおよび遺伝子治療のような予防もしくは治療の目的上の本送
達系に基づく製薬学的製剤に関する。さらに、本発明はとりわけ、核酸の迅速な
放出およびその後の細胞のトランスフェクションに関する。
【００２６】 より具体的には、本発明は請求項１に定義されるところの組成物に向けられる
。本発明のさらなる態様は請求項２〜４７の主題に向けられる。
【００２７】 （発明の詳細な記述） 本発明は、全般として、ポリマー担体粒子および核酸を含んで成る組成物に関
し、ここで、ポリマー担体粒子は１種もしくはそれ以上のポリマーより構成され
、８未満のｐＨで体液および水性溶液に本質的に不溶性であり、また、ここで、
さらに本質的には、各ポリマー粒子は、前記核酸の最低一部がポリマー粒子の表
面上に配置されるような方法で、本質的に縮合されない形態のかつそれと会合し
た最低１種の核酸を運搬する。適しては、前記核酸は、前記核酸が宿主細胞に導
入される場合にその機能を発現することができるコーディング配列を含んで成る
。
【００２８】 本発明の一態様によれば、前記核酸はＲＮＡおよびＤＮＡ分子より成る群から
選択される。これらのＲＮＡおよびＤＮＡ分子は環状分子、直鎖状分子もしくは
双方の混合物より構成されることができる。適しては、前記核酸はプラスミドＤ
ＮＡより構成される。
【００２９】 本発明の一局面によれば、前記核酸は、治療、診断、免疫原もしくは抗原活性
を有するタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドのような生物学的に活性な
産物をコードするコーディング配列を含んで成る。抗原もしくは免疫原活性を有
するコードされる産物は、適しては、哺乳動物中で免疫応答を導き出す抗原エピ
トープもしくは決定基を含んで成るか、または、哺乳動物中での免疫応答の抑制
物質として作用する産物である。
【００３０】 本発明はまた、前記核酸が、タンパク質、酵素、ポリペプチド抗原もしくはポ
リペプチドホルモンをコードするコーディング配列を含んで成るか、または、前
記核酸が、アンチセンスＲＮＡのようなアンチセンス分子として機能するヌクレ
オチド配列を含んで成る、上述されるところの組成物にも関する。
【００３１】 本発明のさらなる一態様は、核酸が、該核酸の最低５０重量パーセントがポリ
マー粒子の外面部分の２５容積パーセント以内に配置されるような方法でポリマ
ー粒子と会合される組成物に関する。
【００３２】 適しては、本発明のポリマー粒子は、それら自身の重量に関して最低５０パー
セントの量の水性溶液を吸収する能力を有し、また、より具体的には、ポリマー
粒子は、最低６０秒以内、および適しては１０秒以内に前記量の水性溶液を吸収
することが可能である。
【００３３】 本発明によれば、前記ポリマー粒子は、適してはポリマー、例えば架橋ポリマ
ーを含んで成り、前記ポリマーは、天然のポリマー、修飾された天然のポリマー
、合成ポリマーおよびそれらの混合物より成る群から選択される。
【００３４】 より具体的には、前記ポリマー粒子は、天然のセルロース、天然のデンプンお
よびそれらの混合物より成る群から選択される天然のポリマーを含むことができ
る。
【００３５】 適しては、前記天然のセルロースは微晶質セルロースを含んで成る。
【００３６】 本発明はまた、前記ポリマー（１種もしくは複数）が、最低１００サブユニッ
トを含んで成る凝集物より構成される組成物にも関する。
【００３７】 本発明のさらなる一局面は、前記ポリマー粒子の本質的に９０重量％が、２０
０μｍより小さい、適しては１００μｍより小さい、および好ましくは６０μｍ
より小さい大きさを有する組成物に関する。適しては、前記ポリマー粒子の本質
的に９０重量％が、約１０μｍより大きい大きさを有する。さらに、前記ポリマ
ー粒子は、適しては規則的な、およびとりわけ球形の形態を有する。
【００３８】 本発明の別の態様は、正の電荷および負の電荷の比が、該組成物が本質的に正
味の負の電荷を有するようである組成物に関する。
【００３９】 適しては、ポリマー担体粒子それ自体は正の電荷を有する基を本質的に含まず
、かつ、好ましくはそれらは本質的に中性である。
【００４０】 本発明のさらなる一態様によれば、前記ポリマー担体粒子は粘液に本質的に不
溶性である。
【００４１】 本発明の別の局面は、凍結防止剤のような最低１種の安定剤をさらに含んで成
る、上述されたところの組成物に関する。
【００４２】 適しては、前記安定剤は、トレハロース、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、ソルビト
ールもしくはマンニトールのような糖および糖アルコール；またはヒスチジン、
アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、アラニンもしくはグリシ
ンのようなアミノ酸から選択される。
【００４３】 他の安定剤の具体的説明は、エチレングリコール、ポリエチレングリコールも
しくはグリセロールのような多価アルコール；エタノール；イヌリン、デキスト
ラン、ヒドロキシエチルデンプン、デンプン、シクロデキストリン、ヘパリン、
ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールのような多糖もしくはポリマー、
またはトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）４０、トゥイ
ーン（Ｔｗｅｅｎ）８０、ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８、ポロキ
サマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）４０７、アシル−β−Ｄ−マルトシド、ドデシル
硫酸ナトリウムもしくは臭化セチルトリメチルアンモニウムのような界面活性剤
である。
【００４４】 本発明の別の態様は、生理学的に投与可能な形態の本明細書に前述されたとこ
ろの組成物を含んで成る製薬学的製剤に関する。適しては、前記製剤は、本質的
に水を含まず、かつ、経口、口腔内、舌下、直腸、膣、肺もしくは鼻経路により
粘膜組織に、または非経口経路により粘膜下組織に投与可能である。こうした製
剤は、例えば顆粒剤、錠剤、微小錠剤、坐剤、吸入粉末もしくは鼻粉末として提
供することができる。
【００４５】 本発明はまた、本組成物の製造方法にも向けられ、前記方法は： （ａ）本質的に水を含まない上で開示された本ポリマー担体粒子を提供すること
； （ｂ）水性溶媒中に、上述されたような最低１種の核酸を含んで成る溶液を提供
すること； （ｃ）段階（ｂ）からの溶液と段階（ａ）からの粒子を接触させること； （ｄ）段階（ｃ）で得られた生成物を乾燥して溶媒を除去すること；および （ｆ）段階（ｄ）で得られた生成物を崩壊させてそれにより本発明の核酸を運搬
するポリマー粒子を製造すること、 の段階を含んで成る。
【００４６】 適しては、段階（ｄ）の乾燥が凍結乾燥により達成される。
【００４７】 さらに、本方法は、その再構成に十分な量の水を、段階（ｄ）からの乾燥され
た生成物に添加すること、およびその後急速真空を適用してドライケーキを形成
させ、その後前記ドライケーキを段階（ｆ）で粉砕することにより崩壊させるこ
とを含んで成る段階（ｅ）をさらに包含してよい。
【００４８】 適しては、段階（ｂ）の溶液は、凍結防止剤のような最低１種の安定剤、例え
ば上に挙げられたところの安定剤をさらに含有する。
【００４９】 本発明は、さらに、本発明の組成物を提供すること；および該組成物を哺乳動
物に導入することを含んで成る、哺乳動物への核酸の投与方法に関する。適して
は、前記組成物は本質的に水を含まず、かつ、経口、口腔内、舌下、直腸、膣、
肺もしくは鼻経路による粘膜組織への投与により哺乳動物に導入される。特定の
一態様によれば、前記組成物は本質的に水を含まず、かつ、非経口経路による粘
膜下組織への投与により哺乳動物に導入される。
【００５０】 本発明のさらなる一局面は、粒子が１種もしくはそれ以上のポリマーより構成
され、そして細胞中に核酸もしくはポリヌクレオチドを導入するように、８未満
のｐＨで体液および水性溶液に本質的に不溶性であり、かつ、適しては正の電荷
を有する基を本質的に含まず、それにより前記核酸もしくはポリヌクレオチドが
前記細胞の内側でその機能を発現することが可能である、ポリマー担体粒子の使
用方法に関する。
【００５１】 本発明はまた、哺乳動物の予防的もしくは治療的治療のための医薬の製造、ま
たはインビボもしくはインビトロでの診断方法のための診断薬の製造、およびと
りわけ悪性病変、自己免疫疾患、遺伝病、病原体の感染症および他の病理学的疾
患の予防的もしくは治療的治療のための遺伝子治療、アンチセンス治療もしくは
遺伝子ワクチン接種での使用のための医薬の製造における、上述された組成物の
使用にも関する。
【００５２】 本発明のさらなる局面は、哺乳動物中でのタンパク質に対する免疫応答の誘導
方法、もしくは動物の全身循環へのタンパク質の送達方法に関し、前記方法は、
本明細書に前述されたところの組成物を使用するＤＮＡの粘膜もしくは鼻送達を
含んで成る。
【００５３】 実施例 実施例１ ポリマー担体粒子の製造および特徴づけ セルロース担体粒子を、改変を伴う早期に記述された方法（Ｏｒｌａｎｄｏら
、米国特許第３，１４６，１６８号明細書、１９６４）に従って製造した。簡潔
には、アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）微晶質セルロース（ＮＦＥＰ、ＦＭＣ、アイル
ランド）を、５０℃および１のｐＨで蒸留水（ｄＨ2Ｏ）中で６日間加水分解し
、次いでｐＨが５に増大するまでｄＨ2Ｏ（５０℃）で洗浄した。その後、セル
ロースを固いペーストまで真空乾燥した。セルロースペーストを、光学顕微鏡下
で観察されるような糸状のセルロースが消失するまで、粉砕機（ｍｏｒｔａｒ
ｇｒｉｎｄｅｒ）（Ｒｅｔｓｃｈ ＫＭ１、ドイツ）により粉砕した。粉砕され
たセルロースサンプルを、５０％（ｗ／ｖ）濃度でｄＨ2Ｏに再懸濁し、そして
ミキサー（シルバーソン マシーンズ リミテッド（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ Ｍａ
ｃｈｉｎｅｓ Ｌｔｄ．）、英国）により攪拌し、次いで噴霧乾燥した（Ａ／Ｓ
ニロ オートミスター（Ｎｉｒｏ Ａｕｔｏｍｉｓｔｅｒ）、デンマーク・コ
ペンハーゲン）。
【００５４】 噴霧乾燥された生成物をさらに処理した。最初に、セルロース担体粒子を空気
洗脱装置（Ａｌｐｉｎｅ １００ ＭＺＲ、アルパイン有限会社（Ａｌｐｉｎｅ
ＡＧ）、ドイツ）により小（＜１０μｍ）および大（＞１０μｍ）大きさ群に
分離し、次いでｄｄＨ2Ｏおよびエタノールで洗浄して、セルロース担体粒子の
自由に流動する粉末を生じさせた。セルロース担体粒子のサンプルを、図１およ
び２に示されるとおり走査型電子顕微鏡検査により検査した。セルロース担体粒
子の凝集物の大きさ分布を、図３に示されるとおりレーザー粒子径分析装置（Ｃ
ｏｕｌｔｅｒ ＬＳ ２３０、コールター コーポレーション（Ｃｏｕｌｔｅｒ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、米国フロリダ州）により分析した。大きさ分布は
正常な対数大きさ分布に従うことが見出された。
【００５５】 実施例２ ポリマー（セルロース）粒子およびｐＤＮＡより構成される組成物の処方および
特徴づけ ホタルルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ（ｐＬｕｃ、９５．８％より大きいス
ーパーコイルの形態）およびＧＭＰ等級のプソラテン蛍光標識されたｐＤＮＡは
ジーンメディシン インク（ＧｅｎｅＭｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｃ．）（米国テキ
サス州）により恵与された。製剤安定剤セロビオースおよびα−乳糖もしくはＤ
（＋）−ガラクトースはそれぞれファンシュティール ラボラトリーズ インク
（Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）（米国イリノ
イ州）およびシグマ（Ｓｉｇｍａ）（米国セントルイス）から購入した。ｐＤＮ
Ａ負荷用量は、別に示されない限り、ポリマー担体粒子および安定剤１ｍｇあた
り６０μｇであった。ポリマー担体粒子に対する安定剤のｗ／ｗ比は１／３であ
った。最初に、安定剤の１種をｐＤＮＡ溶液に添加し、次いで混合した（Ｖｏｒ
ｔｅｘ Ｈｅｉｄｏｌｐｈ ＲＥＡＸ ２０００、ＫＥＢＯラブ（ＫＥＢＯ Ｌ
ａｂ）、スウェーデン・スパンガ）。その後、ポリマー担体粒子を混合物に添加
した。混合した後に、生じる懸濁物を液体窒素中で５分間凍結させ、そして−４
０℃および４００Ｐａ（Ｅｄｗａｒｄｓ Ｐｉｒａｎｉ ５０１、ドイツ）で一
夜凍結乾燥した。凍結乾燥された粉末を、凍結乾燥されたセルロース粒子を湿ら
せるのに十分な容量の蒸留脱イオン水（ｄｄＨ2Ｏ）中で再構成した。その後、
湿らされた粒子を、室温で迅速真空遠心分離器（例えばＳｐｅｅｄＶａｃ Ｐｌ
ｕｓ ＳＣ１１０Ａ、セイヴァント インストゥルメンツ（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、米国・ニューヨーク）中で乾燥してドライケーキを形成
させた。最後に、ドライケーキを微細な粉末に粉砕した。
【００５６】 セルロース担体粒子およびｐＤＮＡの組成物の大きさ分布のだいたいの評価を
、共焦点レーザー走査型顕微鏡検査（Ｌｅｉｃａ ＴＣ４Ｄ共焦点スキャナー、
ライカ レーザー テクニーク有限会社（Ｌｅｉｃａ Ｌａｓｅｒ Ｔｅｃｈｎ
ｉｋ ＧｍｂＨ）、ドイツ・ハイデルベルク）により実施した。２野を無作為に
選び（図４ａおよび４ｂ）、そして各粒子の長さおよび幅を測定した。全体で３
８０個の粒子を計数し、幅および長さについてそれぞれ約２０μｍおよび２４．
７μｍの平均直径を生じた（図４）。従って、セルロース担体粒子およびｐＤＮ
Ａの組成物は、セルロース粒子のものに匹敵する比較的均一な大きさ分布を有し
た（図３）。図４ｃは、蛍光標識されたｐＤＮＡを含まないセルロース担体粒子
を走査することにより生じられた対照であり、全部の緑色がセルロースよりむし
ろｐＤＮＡにより寄与されたことを示した。セルロース担体粒子中のｐＤＮＡの
配置を検査するために、セルロース担体粒子およびｐＤＮＡの組成物の光学的区
分化を、走査型共焦点顕微鏡により実施した（図５）。結果は、ｐＤＮＡが粒子
の外側表面および内側（すなわち孔）表面に結合したことを示す。
【００５７】 セルロース担体粒子およびｐＤＮＡの組成物からのｐＤＮＡの放出を室温でイ
ンビトロで検討した。ｐＤＮＡ負荷用量は、本試験のセルロース担体粒子１ｍｇ
あたり１２．５μｇであった。セルロース担体粒子およびｐＤＮＡの組成物のア
リコートを５００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４、５４ｍＭ、Ｃａ2+／Ｍｇ2+を含ま
ない）に添加した。多様な時間間隔で、上清中に放出されたｐＤＮＡを、２６０
ｎｍの波長でＵＶ分光計（ユニコム リミテッド（Ｕｎｉｃｏｍ Ｌｔｄ．）、
英国・ケンブリッジ）により定量した。ｐＤＮＡを含まないセルロース担体粒子
の対応する懸濁物からの上清が参照としてはたらいた。結果は即時の放出を示し
、７０％以上のｐＤＮＡ分子が最初の５分以内に放出された（図６）。
【００５８】 実施例３ ポリマー（セルロース）担体粒子およびｐＤＮＡより構成される組成物の鼻内投
与後の定量的トランスジーン発現 インビボでの遺伝子のトランスフェクションおよび発現に対する多様なｐＤＮ
Ａ組成物の有効性を評価するため、ＬａｃＺレポーター遺伝子を含有するプラス
ミド（ｐＬａｃＺ、（Ｂｅｒｇｌｕｎｄら １９９８））を等張溶液単独中で使
用し、そして実施例２で記述されたとおりセルロース担体粒子の組成物に処方し
た。最初に、安定剤の１種をｐＬａｃＺ溶液に添加し、次いで混合した（Ｖｏｒ
ｔｅｘ Ｈｅｉｄｏｌｐｈ ＲＥＡＸ ２０００、ＫＥＢＯラブ（ＫＥＢＯ Ｌ
ａｂ）、スウェーデン・スパンガ）。その後、セルロース担体粒子を混合物に添
加した。混合した後に、生じる懸濁物を液体窒素中で５分間凍結させ、そして−
４０℃および４００Ｐａ（Ｅｄｗａｒｄｓ Ｐｉｒａｎｉ ５０１、ドイツ）で
一夜凍結乾燥した。凍結乾燥された粉末を、凍結乾燥されたセルロース粒子を湿
らせるのに十分な容量の蒸留脱イオン水（ｄｄＨ2Ｏ）中で再構成した。その後
、湿らされた粒子を、室温で迅速真空遠心分離器（例えばＳｐｅｅｄＶａｃ Ｐ
ｌｕｓ ＳＣ１１０Ａ、セイヴァント インストゥルメンツ（Ｓａｖａｎｔ Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、米国・ニューヨーク）中で乾燥してドライケーキを形
成させた。最後に、ドライケーキを微細な粉末に粉砕した。加えて、ｐＬａｃＺ
は、５：１のＰＥＩ（２５ｋＤ）：ｐＤＮＡの以前に至適化された条件（Ｂｏｕ
ｓｓｉｆら １９９５；Ｋoｐｉｎｇ−Ｈoｇｇaｒｄら １９９８）でＰＥＩを
用いて処方した。
【００５９】 マウス（雌性の７〜９週齢のＢａｌｂ／ｃ、一群あたり３〜５匹の動物、チャ
ールズ リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）、スウェーデン・ウプサラ）を
、動物の体重１０ｇあたり５０μｌの用量でケタミンおよびキシラジン（ｄｄＨ 2 Ｏ中４０ｖ／ｖ％のカタラール（Ｋａｔａｌａｒ）および１０ｖ／ｖ％のキシ
ラジン）で麻酔した。セルロースもしくはＰＥＩいずれかの担体粒子と会合され
た２５μｇの量のｐＬａｃＺ、または２０μｌの量のｐＬａｃＺの等張溶液を、
シリンジもしくはピペットを介して動物の鼻腔の一方に送達させた。安楽死およ
びＰＢＳでの灌流の約１０分後に、各群の鼻組織を最初に３％パラホルムアルデ
ヒド中４℃で３時間固定し、次いでＸ−ｇａｌ溶液中３７℃で一夜インキュベー
トした（Ｗｅｉｓｓら １９９７）。その後、鼻組織を同一の固定溶液中４℃で
一夜後固定し、次いで脱灰し、標準的に組織を切開し、そしてニュークリアファ
ストレッドで対染色した。
【００６０】 図７はｐＬａｃＺの多様な組成物を投与されたマウスからのＬａｃＺ遺伝子の
トランスフェクションおよび発現の有意差を示す。ＬａｃＺ遺伝子発現のレベル
は鼻組織の青緑色により示される。驚くべきことに、セルロース担体粒子および
ｐＬａｃＺの組成物のみが有意のレベルの遺伝子発現を示した（図７ｂ）一方、
他の組成物（それぞれ、ＰＥＩおよびｐＬａｃＺならびに溶液中ｐＬａｃＺ単独
）は遺伝子発現をもたらさなかった（図７ａおよび７ｃ）。この結果は、セルロ
ース担体粒子およびｐＬａｃＺの組成物がインビボで遺伝子のトランスフェクシ
ョンを高める可能性があることを示す。
【００６１】 図８は、図７ｂでと同一の実験のマウスからの鼻組織；および対照（すなわち
図７ｃでと同一のもの）の組織化学的切片を示す。切片はニュークリアファスト
レッドで対染色した。レポーター遺伝子ＬａｃＺの発現は青色により示される。
染色された切片は、鼻組織の上皮がセルロース担体粒子およびｐＬａｃＺの組成
物でトランスフェクションされた（図８ａ）一方、ＰＥＩおよびｐＬａｃＺの縮
合された組成物を受領したマウスからの鼻組織中で目に見える青色が見出されな
かった（図８ｂ）ことを示す。
【００６２】 実施例４ ポリマー担体粒子およびｐＤＮＡより構成される組成物の鼻内投与後の定量的ト
ランスジーン発現 遺伝子発現を、酵素ルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有する組成物
でのトランスフェクション後にもまた研究した。ルシフェラーゼレポーター遺伝
子を含有するプラスミド（ｐＬｕｃ）は等張溶液単独中で処方した。セルロース
またはコリドン［Ｋｏｌｌｉｄｏｎ］（商標）（不溶性の架橋されたＰＶＰ）も
しくはＡｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ（商標）（改変されたデンプンおよびセルロース誘導
体／カルボキシメチルセルロースナトリウム）担体粒子のいずれかおよびｐＬｕ
ｃの不溶性ポリマー粒子の３種の異なる組成物、ならびに、乳糖およびｐＬｕｃ
もしくはＰＥＩおよびｐＬｕｃより構成される可溶性担体粒子の２種の組成物を
、実施例３に記述されたとおり処方した。
【００６３】 ラット（雄性、５週齢、シュプラグ−ドーレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅ
ｙ）、チャールズ リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）、スウェーデン・ウ
プサラ）もしくはマウス（雌性、７〜９週齢のＢａｌｂ／ｃ、一群あたり３〜５
匹の動物、チャールズ リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）、スウェーデン
・ウプサラ）に、実施例３に記述されたとおり動物あたり２５μｇの量のｐＬｕ
ｃで多様な組成物を投与した。投与後の示された時点で、処理された動物および
処理されない対照動物を二酸化炭素により殺し、そして、鼻、気管および肺の気
道組織を外科的に切除し、液体窒素中で迅速に凍結しかつ分析まで−８０℃で保
存した。
【００６４】 低温室において、組織サンプルを、プロテアーゼインヒビターカクテル（ベー
リンガー マンハイム ＡＢ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＡＢ
）、スウェーデン・ブロンマ）を含有する氷冷溶解緩衝液（プロメガ（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ）、米国ウィスコンシン州）中でホモジェナイズした（Ｈｏｍｏｇｅｎｉ
ｚｅ、バイオスペック プロダクツ インク（Ｂｉｏｓｐｅｃ．Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ，Ｉｎｃ．）、米国オクラホマ州）。その後、サンプルを４℃かつ１５，００
０ｒｐｍで８分間遠心分離した（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４０３、エッペンド
ルフ−ネテラー−ヒンツェ有限会社（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−Ｎｅｔｈｅｌａｒ−
Ｈｉｎｚｅ ＧｍｂＨ）、ドイツ・ハンブルク）。各試験管からの５０μｌの量
の澄明な上清を５０μｌのルシフェラーゼ試薬（プロメガ コーポレーション（
Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、米国ウィスコンシン州）と混合し
、そして、８秒の積分時間を用いて発光計（メディエイターズ ＰｈＬ（Ｍｅｄ
ｉａｔｏｒｓ ＰｈＬ）、オーストリア・ウィーン）により分析した。ルシフェ
ラーゼ発現を定量するために、処理されない対照動物からのホモジェナイズされ
た組織の上清に規定された量のルシフェラーゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、米国ミ
ズーリ州セントルイス）標準を添加することにより、各実験についてルシフェラ
ーゼの標準曲線を調製した。各サンプル中の総タンパク質含量はＢＣＡアッセイ
（Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、米国イリノイ州）により分
析し、そして参照タンパク質としてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）（シグマ（Ｓ
ｉｇｍａ）、米国ミズーリ州セントルイス）を使用して定量した。吸光度はマイ
クロプレートリーダー（ＦＬ５０００、バイオ−テック インストゥルメンツ（
Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、スウェーデン・スパンガ）にて５
４０ｎｍで測定した。
【００６５】 図９は、ラットにおける担体およびｐＬｕｃの多様な組成物の遺伝子トランス
フェクション活性を示す。実施例３に記述されるとおり調製されたＰＥＩ（アル
ドリッチ スウェーデン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｗｅｄｅｎ）、スウェーデン・ス
トックホルム）担体およびｐＬｕｃの組成物を陽性対照として適用した。驚くべ
きことに、セルロース担体粒子およびｐＤＮＡの組成物を投与されたラットの鼻
組織中でのみ有意の量のルシフェラーゼが発現された一方、他の２種の組成物を
投与されたラットで検出可能なレベルのルシフェラーゼ発現が存在しなかった。
【００６６】 図１０は、それぞれｐＬｕｃ溶液またはｐＬｕｃおよびセルロース担体もしく
はＰＥＩの組成物の鼻内投与後の時間依存性のルシフェラーゼ遺伝子発現を示す
。ｐＬｕｃの発現は、マウス（雄性、７〜１０週齢、Ｂａｌｂ／ｃ）の鼻、気管
および肺の組織中で力学的に評価した。セルロース担体粒子およびｐＬｕｃの組
成物からの遺伝子発現は迅速な開始を示した。有意の量のルシフェラーゼ活性が
１０時間後に既に検出され、また、ルシフェラーゼ発現は第１日にピークに達し
たからである。即座に可溶性の乳糖粒子およびｐＬｕｃより構成されるの組成物
からずっとより低いルシフェラーゼ発現が得られた一方、ｐＬｕｃ溶液から発現
は検出されなかった（図１１）。興味深いことに、気管もしくは肺で遺伝子発現
が観察されず、該遺伝子発現が投与部位の近傍の領域に制限されたことを示唆し
た（図１１）。
【００６７】 図１２は、ｐＬｕｃの２種の組成物、ならびに正の電気を有する基を本質的に
含まずかつ水中で膨潤する能力を有する２種の他の不溶性のポリマー粒子、すな
わちコリドン［Ｋｏｌｌｉｄｏｎ］（商標）およびＡｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ（商標）
の鼻内投与後のｐＬｕｃ発現を示す。対照製剤はＰＥＩおよびｐＬｕｃもしくは
ｐＬｕｃ溶液単独より構成された。結果は、類似の物理化学的特性をもつｐＬｕ
ｃおよびポリマー担体の多様な組成物からの匹敵するレベルの遺伝子発現を示す
一方、縮合されたｐＬｕｃ（ｐＬｕｃおよびＰＥＩの組成物）もしくは溶液中の
ｐＬｕｃの対照からの遺伝子発現が存在しなかった。興味深いことに、図１３に
示されるとおり、セルロース担体粒子およびｐＬｕｃの組成物で達成された高め
られた遺伝子のトランスフェクションおよびルシフェラーゼの発現は、セルロー
ス担体粒子、次いでｐＬｕｃ溶液の別個の投与により再現することができず、組
成物中のセルロース担体粒子およびｐＤＮＡの同時投与の重要性を示唆した。
【００６８】 実施例５ 動物での免疫応答を誘導するための鼻送達の使用 核酸の鼻送達を、鼻で送達された核酸によりコードされる抗原に対する免疫応
答を誘導するのに使用することができるかどうかを扱うため、３ないし５匹のマ
ウスの群を、ポリエチレンイミンに基づく製剤（ＰＥＩ）もしくは裸のＤＮＡ（
「裸の溶液」；ＮＳ）のいずれかとともに本発明の好ましいセルロース担体粒子
製剤（ＣＣＰ）を用いて処方された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダー
ゼをコードするプラスミドで、第０日もしくは第０日および第１４日のいずれか
に鼻で免疫化した。マウスあたり１、２５もしくは７５マイクログラムの用量を
使用した。第３５日に、各動物からの脾および血清サンプルを収集しかつプール
した。脾細胞は、１マイクログラム／ｍｌのβ−ガラクトシダーゼ876-884ペプ
チドの存在下で標準的条件下で培養し、次いで洗浄し、そしてβ−ガラクトシダ
ーゼ876-884ペプチドもしくは対照ペプチドのいずれかで１８〜２２時間再刺激
した。再刺激された培養物の上清を収集し、そしてＥＬＩＳＡキット（ファーミ
ンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、米国サンディエゴ）を使用してＩＦＮ−γお
よびＩＬ−４の放出についてアッセイした。血清サンプルから、ＩｇＧ1、Ｉｇ
Ｇ2a、ＩｇＧ2b、ＩｇＧ3およびＩｇＡ抗β−ガラクトシダーゼ抗体もまたＥＬ
ＩＳＡにより分析した。糞便もまた収集しかつβ−ガラクトシダーゼに特異的な
ＩｇＡについて分析した。
【００６９】 ＣＣＰを用いて処方されたβ−ガラクトシダーゼをコードする１マイクログラ
ムのＤＮＡの単回鼻内投与は、強い抗原特異的な細胞性免疫応答をもたらした。
図１４は典型的な結果を示す。該応答は、インターフェロン−γ（しかしインタ
ーロイキン−４でなく）の誘導により立証され、Ｔｈ１応答が起こっていたこと
を示した。検出可能な応答は他の製剤で観察されなかった。
【００７０】 抗体応答もまた観察した。ＩｇＧ１サブクラスのβ−ガラクトシダーゼ特異的
抗体が、マウスあたり１、２５もしくは７５マイクログラムで処理された動物で
検出された。
【００７１】 実施例６ 動物に治療的タンパク質を送達するためのＤＮＡの鼻送達の使用 上述された方法は、マウス、ウサギ、サルもしくはヒトのような哺乳動物に治
療的タンパク質を間接的に送達させるのに使用される。例えば、分泌型タンパク
質をコードする発現プラスミドをセルロース担体粒子とともに処方し、そして動
物に投与する。鼻上皮の細胞が発現プラスミドを取込み、分泌型タンパク質をコ
ードする遺伝子を転写し、生じるｍＲＮＡを翻訳し、そしてタンパク質を分泌す
る。分泌されたタンパク質は動物の全身循環中で検出される。
【００７２】 要するに、上の実施例は、本発明により、粘膜組織の上皮細胞が、正の電荷を
本質的に含まない本質的に水に不溶性のポリマー担体粒子を含んで成る本組成物
できわめて予期しないことに効率的にトランスフェクションされることができ、
また、ここで、本質的に縮合されない核酸（例えばｐＤＮＡ）が担体粒子の表面
上に局在することを示す。この単純な製剤は、保存するのが容易であることがで
きる水分を含まない形態で製造するのが安価かつ容易である。従って、それは大
スケールの生産に適する。それは、ヒトの遺伝子／アンチセンス治療および遺伝
子ワクチン接種において多様な形態で適用することができる。例えば、それは、
ワクチン接種の目的上、もしくは嚢胞性線維症のような気道上皮に限局される疾
患の治療のための鼻スプレーもしくは吸入粉末として処方することができる。乾
燥粒子粉末は他の粘膜組織にもまた投与することができることが当業者に明らか
である。当業者により容易に理解される本発明のさらなる一態様によれば、該組
成物は経口投与のために錠剤に圧縮することができるかもしくはカプセルに充填
することができる。オリゴヌクレオチドのような他の核酸薬物を同一の原理によ
り送達させることができることもまた当業者に明らかである。ここに記述される
新たな組成物の具体的に説明する治療的、予防的および診断的応用は、限定され
るものでないが、遺伝子治療、アンチセンス治療および遺伝子ワクチン接種の分
野で例示されるものを挙げることができる。従って、本発明の多数の適する態様
を記述した一方、これらは本発明を具体的に説明することを意図しているがしか
し制限することを意図していない。他の局面、利点および改変は以下の請求の範
囲の範囲内にある。
【００７３】 本明細で挙げられる全部の特許および刊行物は、各個々の刊行物が引用するこ
とにより組み込まれることをとりわけかつ個々に意図された場合と同一の程度ま
で、引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００７４】
【表１】
【００７５】
【表２】
【００７６】
【表３】
【００７７】
【表４】
【００７８】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 発明にかかる、セルロース担体粒子の全般的外見を示す走査型電子顕微鏡写真
である。尺度の棒は２００μｍを示す。セルロース担体粒子は実施例１に記述さ
れるとおり製造した。
【図２】 発明にかかる、典型的なセルロース担体粒子のより近接した図を示す走査型電
子顕微鏡写真である。セルロース担体粒子の凝集物は、粒子の内部に伸長する大
型の孔を伴う粗くかつ非常に多孔質の表面を有することがここに示される。尺度
の棒は２０μｍを示す。
【図３】 発明にかかる、コールターカウンター粒子径分析装置により測定されたあるバ
ッチのセルロース担体粒子の大きさ分析の一例を示す。この場合、平均直径は２
９．３０μｍである。該粒子は、本質的に、通常は１０から６０μｍまでの範囲
にわたる直径で分布しているようである。
【図４ａおよび４ｂ】 発明にかかる、共焦点レーザー走査型顕微鏡により写真撮影されたところのセ
ルロース担体粒子および蛍光で標識されたｐＤＮＡの組成物を示す。蛍光で標識
されたｐＤＮＡを含まないセルロース担体粒子が対照としてはたらいた（図４ｃ
）。（ａ）、（ｂ）および（ｃ）中の尺度の棒はそれぞれ１００、５０および２
０μｍの距離を表す。
【図５】 発明にかかる、セルロース担体粒子および蛍光で標識されたｐＤＮＡの組成物
の上部から下部までの共焦点光学的区分化を示し、（ａ）は第一の上部区分を表
す一方、（ｊ）は最後の下部区分を表す。各光学的区分の間の距離は３μｍであ
る。該区分は、蛍光で標識されたｐＤＮＡ分子がセルロース粒子の外側の外面の
表面上に優先的に分布されることを示す。粒子の内部の蛍光は、ｐＤＮＡが凝集
されたセルロース粒子間の大型の孔の表面上にもまた分布されていることを示す
。尺度の棒は２０μｍの距離を表す。
【図６】 発明にかかる、セルロース担体粒子およびｐＤＮＡの組成物からのインビトロ
ｐＤＮＡ放出プロフィルを示す。ｐＤＮＡ分子は粒子から緩衝溶液中に即座に放
出される。７０％以上のｐＤＮＡ分子が５分以内に放出される。
【図７】 発明にかかる、レポーター遺伝子ＬａｃＺをコードするｐＤＮＡ（ｐＬａｃＺ
）を受領したマウスからの切開された鼻組織の肉眼写真を示す。成功裏のトラン
スジーン発現が緑青色により示される。２５μｇのｐＬａｃＺ単独（ａ）、もし
くは陽イオン性ポリマーポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用する縮合された形
態（ｃ）の鼻内投与はトランスジーン発現をもたらさなかった。対照的に、セル
ロース担体粒子およびｐＬａｃＺ（マウスあたり２５μｇ）の組成物（ｂ）の鼻
内投与は鼻組織中でのトランスジーンの発現をもたらした。
【図８】 発明にかかる、セルロース担体粒子およびｐＬａｃＺの組成物で処理されたマ
ウスからの鼻組織（すなわち図７ｂでと同一の実験）；ならびに縮合された遺伝
子送達系で処理されたマウスからの組織（すなわち図７ｃでと同一の実験）の組
織化学的切片を示す。切片はニュークリアファストレッドで対染色した。レポー
ター遺伝子ＬａｃＺの発現は青色により示される。セルロース担体粒子およびｐ
ＬａｃＺの組成物を受領したマウスからの鼻組織の上皮はレポーター遺伝子を発
現した（ａ）一方、ＰＥＩおよびｐＬａｃＺの縮合された組成物を受領したマウ
スからの鼻組織中で目に見える青色は見出されなかった（ｂ）。
【図９】 発明にかかる、ラットにおける２５μｇのｐＬｕｃの鼻内投与２日後のインビ
ボの鼻のルシフェラーゼ発現（ｐｇ／ｍｇ）ことを示す（一群あたり３匹の動物
）。図７および８でのとおり、陽イオン性ポリマーＰＥＩを使用するｐＬｕｃ溶
液および縮合された組成物を、セルロース担体粒子およびｐＬｕｃの組成物に対
する対照として使用した。セルロース担体粒子およびｐＬｕｃの組成物のみが、
図７および８の結果と矛盾せず、有意のレベルのトランスジーン発現をもたらし
た。
【図１０】 発明にかかる、マウス（一群あたり３〜５匹の動物）への鼻内投与後の時間お
よびｐＤＮＡ製剤の関数としてのインビボの鼻のルシフェラーゼ発現（ｐｇ／ｍ
ｇ）を示す。ｐＬｕｃ単独を含む溶液ならびに可溶性乳糖粉末およびｐＬｕｃの
組成物を、不溶性のセルロース担体粒子およびｐＬｕｃの組成物に対する対照と
して使用した。投与されたｐＤＮＡの用量はマウスあたり２５μｇであった。セ
ルロース担体粒子と会合されたｐＬｕｃを含んで成る組成物のみが、高レベルの
トランスジーン発現をもたらした。
【図１１】 発明にかかる、マウス（一群あたり３〜５匹の動物）あたり２５μｇのｐＬｕ
ｃの鼻内投与後第１日のマウスにおけるルシフェラーゼ発現（ｐｇ／ｍｇ）の気
道器官分布を示す。図１０でと同一の組成物を使用した。遺伝子発現は鼻組織中
でのみ観察され、また、鼻内投与後の気管もしくは肺で発現は見出されなかった
。
【図１２】 発明にかかる、それぞれ代替の不溶性のポリマー担体粒子、コリドン（Ｋｏｌ
ｌｉｄｏｎ）およびＡｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ、ならびにｐＬｕｃの２種の他の組成物
の鼻内投与後の鼻のｐＬｕｃ発現を示す。セルロース担体粒子およびｐＬｕｃの
組成物は、ＰＥＩおよびｐＬｕｃの縮合された組成物がはたらいたように対照と
してはたらいた。等張溶液中の裸のｐＬｕｃの組成物もまた対照として使用した
。セルロース、コリドン（Ｋｏｌｌｉｄｏｎ）、Ａｃ−Ｄｉ−ＳｏｌおよびＰＥ
Ｉは乾燥粉末として処方し、そしてマウスあたり２５μｇの量でマウス（一群あ
たり３〜５匹の動物）への鼻内投与後にｐＬｕｃ遺伝子発現について試験した。
２種の不溶性の縮合しないポリマー担体のいずれか１種の組成物を使用した場合
に、セルロース組成物で得られたものに匹敵するｐＬｕｃの発現が得られた。対
照的に、ＰＥＩおよびｐＬｕｃの縮合された製剤、ならびに裸のｐＬｕｃ溶液は
トランスジーン発現をもたらさなかった。
【図１３】 発明にかかる、インビボのトランスジーン発現のための組成物中でのセルロー
ス担体粒子およびｐＤＮＡの同時投与の重要性を示す。セルロース担体粒子の投
与後５、１５もしくは２５分のマウス（一群あたり３〜５匹の動物）へのｐＬｕ
ｃ溶液の投与はルシフェラーゼ発現をもたらさなかった。しかしながら、前の実
施例でのとおり、セルロース担体粒子およびｐＬｕｃの組成物を使用することに
より、トランスジーン発現が大きく高められた。
【図１４】 発明にかかる、抗原タンパク質をコードする鼻で送達された核酸によりワクチ
ン接種されたマウス由来の脾細胞からの抗原特異的サイトカイン誘導のレベルを
示す。マウス（一群あたり３〜５匹の動物）に、第０日に、β−ガラクトシダー
ゼをコードする１マイクログラムのＤＮＡを鼻に接種した。ＤＮＡはＣＣＰ、Ｐ
ＥＩもしくはＮＳのいずれかを用いて処方した。脾細胞を第３５日に収穫し、β
−ガラクトシダーゼ８７６−８８４ペプチドの存在下で培養し、洗浄し、そして
β−ガラクトシダーゼ８７６−８８４ペプチドもしくは対照ペプチドのいずれか
で再刺激した。インターフェロン−γもしくはインターロイキン−４のレベルを
ＥＬＩＳＡにより測定した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｇ 38/22 47/10 38/43 47/16 39/00 47/18 47/10 47/20 47/16 47/22 47/18 47/26 47/20 47/30 47/22 47/34 47/26 47/36 47/30 47/38 47/34 Ａ６１Ｐ 31/00 47/36 35/00 47/38 37/02 Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｋ 37/02 35/00 37/24 37/02 37/48 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アルトウルソン，ペル スウエーデン・エス−75263ウプサラ・ノ レーンスベグ57 (72)発明者 グアン，ホリー アメリカ合衆国マサチユセツツ州01944・ マンチエスターバイザシー・プレザントス トリート82 Ｆターム(参考） 4C076 AA01 AA29 AA31 AA36 AA95 BB01 BB02 BB21 BB22 BB25 BB27 BB29 BB30 CC07 CC27 CC31 DD05Q DD19Q DD37Q DD38Q DD51Q DD67Q DD68Q EE01 EE16Q EE23Q EE30Q EE31 EE38 EE39Q 4C084 AA03 AA13 MA05 MA31 MA35 MA43 MA52 MA55 MA57 MA59 MA60 NA13 ZB072 ZB262 ZB322 4C085 AA03 BA01 GG08 4C086 AA01 EA16 MA05 MA31 MA35 MA43 MA52 MA55 MA57 MA59 MA60 NA13 ZB07 ZB26 ZB32

Claims (47)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ポリマー担体粒子が、１種もしくはそれ以上のポリマーより
    構成され、８未満のｐＨで体液および水性溶液に本質的に不溶性であり；また、
    さらに本質的に、各ポリマー粒子が、核酸の最低一部がポリマー粒子の表面上に
    配置されるような方法で、本質的に縮合されない形態のかつそれと会合した最低
    １種の前記核酸を運搬する、ポリマー担体粒子および核酸を含んで成る組成物。
  2. 【請求項２】 前記ポリマー担体粒子が正の電荷を有する基を本質的に含ま
    ない、請求項１記載の組成物。
  3. 【請求項３】 前記ポリマー担体粒子が、前記核酸が宿主細胞に導入される
    場合にその機能を発現することができるコーディング配列を含んで成る、請求項
    １記載の組成物。
  4. 【請求項４】 前記核酸がＲＮＡおよびＤＮＡ分子より成る群から選択され
    る、請求項１記載の組成物。
  5. 【請求項５】 前記ＤＮＡがプラスミドＤＮＡより構成される、請求項４記
    載の組成物。
  6. 【請求項６】 前記コーディング配列が生物学的に活性な産物をコードする
    、いずれかの先行する請求項記載の組成物。
  7. 【請求項７】 前記コードされる産物が、治療、診断、免疫原もしくは抗原
    活性を有するタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドである、請求項６記載
    の組成物。
  8. 【請求項８】 抗原もしくは免疫原活性を有する前記産物が、哺乳動物中で
    免疫応答を導き出す抗原エピトープもしくは決定基を含んで成る産物であるか、
    または、哺乳動物中での免疫応答の抑制物質として作用する産物である、請求項
    ７記載の組成物。
  9. 【請求項９】 前記生物学的に活性な産物が、タンパク質、酵素、ポリペプ
    チド抗原もしくはポリペプチドホルモンである、請求項６記載の組成物。
  10. 【請求項１０】 前記核酸が、アンチセンスＲＮＡのようなアンチセンス分
    子として機能するヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１記載の組成物。
  11. 【請求項１１】 核酸が、該核酸の最低５０重量パーセントがポリマー粒子
    の外面部分の２５容積パーセント以内に配置されるような方法でポリマー粒子と
    会合される、いずれかの先行する請求項記載の組成物。
  12. 【請求項１２】 ポリマー粒子が、それら自身の重量に関して最低５０パー
    セントの量の水性溶液を吸収する能力を有する、いずれかの先行する請求項記載
    の組成物。
  13. 【請求項１３】 ポリマー粒子が、最低６０秒以内、および適しては１０秒
    以内に前記量の水性溶液を吸収することが可能である、請求項１２記載の組成物
    。
  14. 【請求項１４】 ポリマー粒子が、天然のポリマー、修飾された天然のポリ
    マー、合成ポリマーおよびそれらの混合物より成る群から選択されるポリマーを
    含んで成る、いずれかの先行する請求項記載の組成物。
  15. 【請求項１５】 前記ポリマー粒子が、天然のセルロース、天然のデンプン
    およびそれらの混合物より成る群から選択される天然のポリマーを含んで成る、
    請求項１４記載の組成物。
  16. 【請求項１６】 前記天然のセルロースが微晶質セルロースを含んで成る、
    請求項１５記載の組成物。
  17. 【請求項１７】 前記ポリマーが架橋ポリマーより構成される、請求項１４
    記載の組成物。
  18. 【請求項１８】 前記ポリマー（１種もしくは複数）が、最低１００サブユ
    ニットを含んで成る凝集物より構成される、いずれかの先行する請求項記載の組
    成物。
  19. 【請求項１９】 前記ポリマー粒子の本質的に９０重量％が、２００μｍよ
    り小さい、適しては１００μｍより小さい、および好ましくは６０μｍより小さ
    い大きさを有する、いずれかの先行する請求項記載の組成物。
  20. 【請求項２０】 前記ポリマー粒子の本質的に９０重量％が、約１０μｍよ
    り大きい大きさを有する、請求項１記載の組成物。
  21. 【請求項２１】 前記ポリマー粒子が、規則的な、および適しては球形の形
    態を有する、請求項１８もしくは１９記載の組成物。
  22. 【請求項２２】 正の電荷および負の電荷の比が、該組成物が本質的に正味
    の負の電荷を有するようである、いずれかの先行する請求項記載の組成物。
  23. 【請求項２３】 ポリマー担体粒子それ自体が本質的に中性である、請求項
    ２２記載の組成物。
  24. 【請求項２４】 ポリマー担体粒子が粘液に本質的に不溶性である、いずれ
    かの先行する請求項記載の組成物。
  25. 【請求項２５】 前記組成物が、凍結防止剤のような最低１種の安定剤をさ
    らに含んで成る、いずれかの先行する請求項記載の組成物。
  26. 【請求項２６】 前記安定剤が、トレハロース、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、
    ソルビトールもしくはマンニトールのような糖および糖アルコール；またはヒス
    チジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、アラニンもしく
    はグリシンのようなアミノ酸から選択される、請求項２５記載の組成物。
  27. 【請求項２７】 前記安定剤が、エチレングリコール、ポリエチレングリコ
    ールもしくはグリセロールのような多価アルコール；エタノール；イヌリン、デ
    キストラン、ヒドロキシエチルデンプン、デンプン、シクロデキストリン、ヘパ
    リン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールのような多糖もしくはポリ
    マー、またはトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）４０、
    トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０、ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８、
    ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）４０７、アシル−β−Ｄ−マルトシド、ド
    デシル硫酸ナトリウムもしくは臭化セチルトリメチルアンモニウムのような界面
    活性剤から選択される、請求項２５記載の組成物。
  28. 【請求項２８】 生理学的に投与可能な形態のいずれかの先行する請求項の
    組成物を含んで成る製薬学的製剤。
  29. 【請求項２９】 該製剤が、本質的に水を含まず、かつ、経口、口腔内、舌
    下、直腸、膣、肺もしくは鼻経路により粘膜組織に、または非経口経路により粘
    膜下組織に投与可能である、請求項２８記載の製剤。
  30. 【請求項３０】 顆粒剤、錠剤、微小錠剤、坐剤、吸入粉末もしくは鼻粉末
    である、請求項２９記載の製剤。
  31. 【請求項３１】 （ａ）本質的に水を含まない請求項１記載のポリマー担体
    粒子を提供すること； （ｂ）水性溶媒中に、請求項１で定義されるような最低１種の核酸を含んで成る
    溶液を提供すること； （ｃ）段階（ｂ）からの溶液と段階（ａ）からの粒子を接触させること； （ｄ）段階（ｃ）で得られた生成物を乾燥して溶媒を除去すること；および （ｆ）段階（ｄ）で得られた生成物を崩壊させてそれにより請求項１記載の核酸
    を運搬するポリマー粒子を製造すること、 の段階を含んで成る、請求項１記載の組成物の製造方法。
  32. 【請求項３２】 段階（ｄ）の乾燥が凍結乾燥により達成される、請求項３
    １記載の方法。
  33. 【請求項３３】 その再構成に十分な量の水を、段階（ｄ）からの乾燥され
    た生成物に添加すること、およびその後急速真空を適用してドライケーキを形成
    させ、その後前記ドライケーキを段階（ｆ）で粉砕することにより崩壊させるこ
    とを含んで成る段階（ｅ）をさらに包含する、請求項３１記載の方法。
  34. 【請求項３４】 段階（ｂ）の溶液が、凍結防止剤のような最低１種の安定
    剤をさらに含有する、請求項３１、３２もしくは３３記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記安定剤が、トレハロース、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、
    ソルビトールもしくはマンニトールのような糖および糖アルコール；またはヒス
    チジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、アラニンもしく
    はグリシンのようなアミノ酸から選択される、請求項３４記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記安定剤が、エチレングリコール、ポリエチレングリコ
    ールもしくはグリセロールのような多価アルコール；エタノール；イヌリン、デ
    キストラン、ヒドロキシエチルデンプン、デンプン、シクロデキストリン、ヘパ
    リン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールのような多糖もしくはポリ
    マー、およびトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）４０、
    トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０、ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８、
    ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）４０７、アシル−β−Ｄ−マルトシド、ド
    デシル硫酸ナトリウムもしくは臭化セチルトリメチルアンモニウムのような界面
    活性剤、または塩化ナトリウムのような塩から選択される、請求項３４記載の方
    法。
  37. 【請求項３７】 請求項１記載の組成物を提供すること；および該組成物を
    哺乳動物に導入することを含んで成る、哺乳動物への核酸の投与方法。
  38. 【請求項３８】 該組成物が本質的に水を含まず、かつ、経口、口腔内、舌
    下、直腸、膣、肺もしくは鼻経路による粘膜組織への投与により哺乳動物に導入
    される、請求項３７記載の方法。
  39. 【請求項３９】 該組成物が本質的に水を含まず、かつ、非経口経路による
    粘膜下組織への投与により哺乳動物に導入される、請求項３７記載の方法。
  40. 【請求項４０】 １種もしくはそれ以上のポリマーより構成され、かつ、８
    未満のｐＨで体液および水性溶液に本質的に不溶性であるポリマーは担体粒子の
    、細胞中に核酸もしくはポリヌクレオチドを導入するめの使用方法であって、そ
    れにより前記核酸もしくはポリヌクレオチドが前記細胞の内側でその機能を発現
    することが可能である、方法。
  41. 【請求項４１】 哺乳動物の予防的もしくは治療的処置のための医薬の製造
    、またはインビボもしくはインビトロでの診断方法のための診断薬の製造におけ
    る、請求項１記載の組成物の使用。
  42. 【請求項４２】 悪性病変、自己免疫疾患、遺伝病、病原体の感染症および
    他の病理学的疾患の予防的もしくは治療的治療のための遺伝子治療、アンチセン
    ス治療もしくは遺伝子ワクチン接種での使用のための医薬の製造における、請求
    項１記載の組成物の使用。
  43. 【請求項４３】 請求項１記載の組成物を使用するＤＮＡの粘膜送達を含ん
    で成る、哺乳動物におけるタンパク質に対する免疫応答の誘導方法。
  44. 【請求項４４】 請求項１記載の組成物を使用するＤＮＡの粘膜送達を含ん
    で成る、動物の全身循環へのタンパク質の送達方法。
  45. 【請求項４５】 請求項１記載の組成物を使用するＤＮＡの鼻送達を含んで
    成る、哺乳動物におけるタンパク質に対する免疫応答の誘導方法。
  46. 【請求項４６】 請求項１記載の組成物を使用するＤＮＡの鼻送達を含んで
    成る、動物の全身循環へのタンパク質の送達方法。
  47. 【請求項４７】 前記担体粒子が正の電荷を有する基を本質的に含まない、
    請求項４０記載の方法。
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