JP4424850B2 - 安定な遺伝子製剤 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は遺伝子治療に使用される安定な遺伝子製剤に関する。さらに詳細には、本発明は製造工程中および組成物の保存安定性が良好な遺伝子または該遺伝子を組み込んだベクターを含有する製剤に関する。
背景技術
近年、疾病、特に遺伝病の治療あるいは予防を目的として遺伝子治療が試験的に臨床応用されるようになっている。遺伝子治療に関する研究の初期においては、細胞に導入される遺伝子の導入効率が高いことを主たる理由としてウイルスをベクターとして用いる手法が専ら研究されてきた。しかし、自己翻訳能力を有するプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を動物の筋肉内に直接投与することで遺伝情報を発現できることが見いだされて以来、ｐＤＮＡがウイルスベクターに比べて安全性が高く、また工業的に生産しやすいため、ｐＤＮＡを用いる遺伝子治療法が盛んに研究されるようになっている。
ｐＤＮＡを用いる遺伝子治療の基礎研究における現在の最大の関心事は、ｐＤＮＡの細胞への導入効率の向上と遺伝情報発現期間の延長である。ｐＤＮＡの細胞への導入効率の向上を目的としては、ｐＤＮＡをカチオン性のリポソームに封入する方法やポリマーと複合体を形成させる方法が報告されている。また、遺伝情報発現期間を延長することを目的としては、生体との親和性が高いコラーゲン（特開平９−７１５４２）あるいはポリエチレンビニル酢酸（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ４７，１２３，（１９９７））を担体として用いた徐放性製剤に関する報告がなされている。これらの目的が解決できたとしても、遺伝子を含有している遺伝子製剤自体が一定の高品質を保持でき、安定かつ経済的に供給できなければ、実際には、遺伝子治療を広く普及させることはできない。
遺伝子製剤における有効成分たる遺伝子の生物活性を製剤の製造工程あるいは保存中に安定に保持させることは重要である。閉環状のｐＤＮＡを制限酵素で切断し、それを筋肉内に投与すると遺伝情報の発現が閉環状のｐＤＮＡを投与した場合の１０％程度に低下することが知られている。よって、遺伝子の生物活性保持のためにｐＤＮＡの一次構造を製造工程中あるいは様々な条件が予想される保存中に保持させることが重要となる。
先述の基礎研究においてもｐＤＮＡの保存時の安定性に言及した報告が一部にあるが（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ，９３，７３０５（１９９６））、遺伝子製剤の製造あるいは製剤の安定性について系統的な検討はこれまで殆ど行われていない。後述の試験例に示すように、ｐＤＮＡを単独で含有する、またはｐＤＮＡの導入効率を高めるための化合物もしくは遺伝子発現期間を延長するための化合物を添加した遺伝子調製物を、製剤化工程で一般に用いられる凍結乾燥条件に曝すと、あるいは品質が安定に保持されるべき保存状態に曝すと、有効成分であるｐＤＮＡは分解を受け、生物活性が著しく損なわれてしまう。
発明の開示
本発明者らは、安定な遺伝子製剤を得ることを目的として鋭意研究を重ねた結果、ｐＤＮＡを含有する溶液中に糖類および／または非疎水性アミノ酸類および／またはカルボキシル基を２個以上有する有機酸類（アミノ酸類を除く）を添加した場合、またはコラーゲンまたはゼラチンを含有するときにはアミノ酸類を添加した場合、溶液状態での保存中および／または当該溶液を凍結乾燥する工程中および／または当該溶液の乾燥品の保存中でのｐＤＮＡの分解が大きく抑えられることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
本発明は１つの態様として、所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベクターと、少なくとも１つの糖類および／または少なくとも１つの非疎水性アミノ酸類および／または少なくとも１つのカルボキシル基を２個以上有する有機酸類（アミノ酸類を除く）とを含む安定な遺伝子製剤に関する。
糖類は具体的には単糖、二糖、三糖以上のオリゴ糖またはそれらの糖アルコールであり、より具体的にはグルコース、ガラクトース、フルクトース、シュークロース、マルトース、ラクトース、トレハロース、ソルビトールまたはマンニトールである。
非疎水性アミノ酸類は具体的にはグルタミン酸、アスパラギン酸またはその塩である。
カルボキシル基を２個以上有する有機酸類は具体的にはカルボキシル基を２個もしくは３個有する有機酸またはその塩であり、より具体的にはクエン酸または酒石酸である。
所望の遺伝子を組み込んだベクターは具体的にはプラスミドＤＮＡである。
本発明の遺伝子製剤は、細胞への遺伝子導入を促進する物質、または医学的に許容される添加剤をさらに含んでもよい。細胞への遺伝子導入を促進する物質としてはカチオン性脂質、カチオン性ポリマーまたは疎水性ポリマーがある。医学的に許容される添加剤としては生体親和性材料がある。
本発明遺伝子製剤に含まれる所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベクターは生体親和性材料に担持されていてもよい。生体親和性材料は具体的にはコラーゲン、ゼラチンまたはそれらの混合物である。
本発明には、溶液状態、ゲル状態あるいは懸濁液状態である所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベクターを含む調製物を乾燥工程、好ましくは凍結乾燥に付することにより得られる本発明遺伝子製剤が包含される。
また、本発明には、溶液状態、ゲル状態もしくは懸濁液状態である遺伝子製剤または溶液状態、ゲル状態もしくは懸濁液状態の工程を経て製造される遺伝子製剤において、溶液状態、ゲル状態または懸濁液状態における糖類、非疎水性アミノ酸類およびカルボキシル基を２個以上有する有機酸類（アミノ酸類を除く）の全体に対する含有量が約１ｗ／ｖ％以上である本発明遺伝子製剤が包含される。
本発明は別の態様として、所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベクターを含む遺伝子調製物に、少なくとも１つの糖類および／または少なくとも１つの非疎水性アミノ酸類および／または少なくとも１つのカルボキシル基を２個以上有する有機酸類（アミノ酸類を除く）を添加することからなる、遺伝子製剤を安定化する方法に関する。
さらに別の態様として、本発明は本発明の遺伝子製剤を生体に投与することからなる遺伝子治療方法に関する。
本発明は、もう１つの態様として、所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベクター、少なくとも１つのアミノ酸類、および生体親和性材料、特にコラーゲンまたはゼラチンを含む安定な遺伝子製剤に関する。かかる遺伝子製剤は、細胞への遺伝子導入を促進する物質、例えばカチオン性脂質、カチオン性ポリマーまたは疎水性ポリマーをさらに含むことができる。本発明は、所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベクターが生体親和性材料、特にコラーゲンあるいはゼラチンに担持されていることを特徴とする遺伝子製剤を包含する。
本発明はこの態様においても、溶液状態、ゲル状態あるいは懸濁液状態である所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベクターを含む調製物を乾燥状態、特に凍結乾燥に付することにより得られる本発明遺伝子製剤を包含する。
また、本発明には、溶液状態、ゲル状態もしくは懸濁液状態である遺伝子製剤または溶液状態、ゲル状態もしくは懸濁液状態の工程を経て製造される遺伝子製剤において、溶液状態、ゲル状態または懸濁液状態におけるアミノ酸類の全体に対する含有量が約１ｗ／ｖ％以上である本発明遺伝子製剤が包含される。
別の態様として、本発明は、所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベクターと生体親和性材料、特にコラーゲンまたはゼラチンとを含む遺伝子調製物に、少なくとも１つのアミノ酸類を添加することからなる、遺伝子製剤を安定化する方法に関する。
さらに別の態様として、本発明は、上記本発明遺伝子製剤を生体に投与することからなる遺伝子治療方法に関する。
発明を実施するための最良の形態
上記のように、本発明の要旨は、所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベクターと少なくとも１つの糖類および／または少なくとも１つの非疎水性アミノ酸類および／または少なくとも１つのカルボキシル基を２個以上有する有機酸類とを含む安定な遺伝子製剤、ならびに所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベクター、コラーゲンまたはゼラチンおよび少なくとも１つのアミノ酸類を含む安定な遺伝子製剤である。本発明製剤は別の局面では、これら糖類、非疎水性アミノ酸類および／または有機酸類を含む、あるいはコラーゲンまたはゼラチンおよびアミノ酸類を含む、含有される遺伝子またはベクターの安定化（分解抑制作用）増強製剤である。
「所望の遺伝子」としては、遺伝子治療が可能な遺伝子であればいずれでもよい。ここに、遺伝子治療とは、遺伝子を用いて行われる治療を意味する。例えば、遺伝子治療時に発現が要求されるタンパク質の遺伝子情報をコードする遺伝子、細胞内で特定のＤＮＡやＲＮＡと対合し遺伝子の発現を抑制するアンチセンス配列が挙げられる。アンチセンス配列は、ベクター等に組み込まれることなく使用することができる。
「所望の遺伝子を組み込んだベクター」としては、細胞内に導入されたとき、コードした遺伝情報を細胞内で発現するように構成された形態が好ましく、プロモーター等、目的遺伝子の発現に必要な要素を含有する、あるいは染色体への組み込みを可能とする要素を含有するベクター、例えばｐＤＮＡが挙げられる。
本発明の遺伝子製剤中には、別個の所望の遺伝子を組み込んだ数種類のベクターが同時に存在してもよい。また、一つのベクターには複数の遺伝情報がコードされていてもよい。遺伝子製剤中に含有されるベクターの量に特に制限はない。
遺伝子治療時に発現が要求されるタンパク質をコードする遺伝子には遺伝病の処置に用いられ得る遺伝子、例えばアデノシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ等の酵素類、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２等のサイトカイン類、または繊維芽細胞増殖因子ＨＳＴ−１（ＦＧＦ４）をコードする遺伝子が挙げられるがこれに限られるものではない。また、遺伝子治療時に発現が要求される別のタンパク質をコードする遺伝子として、発現されるタンパク質あるいはペプチドが抗原として免疫を誘導し、感染症もしくは腫瘍の予防または治療を行うことを目的とする遺伝子、即ち上記の抗原となり得るタンパク質あるいはペプチドをコードする遺伝子、例えばインフルエンザウイルスの表面タンパク質であるＨＡやＮＡまたは核タンパク質であるＮＰの各タンパク質、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２やＮＳ １タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｓ抗原タンパク質、Ａ型肝炎ウイルスのカプシドタンパク質であるＶＰ １やＶＰ ３、あるいはカプシド様タンパク質、デングウイルスのＥｇｐタンパク質、ＲＳウイルスのＦあるいはＧタンパク質、狂犬病ウイルスの構造タンパク質であるＧやＮタンパク質、ヘルペスウイルスのｇＤタンパク質、日本脳炎ウイルスのＥ １あるいはｐｒｅ−Ｍタンパク質、ロタウイルスの外殻糖タンパク質ＶＰ ７や外殻タンパク質ＶＰ ４、ヒト免疫不全ウイルスのｇｐ１２０やｇｐ１６０タンパク質、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒの主要表面抗原タンパク質、マラリアのスポロゾイドの主要表面抗原（ｃｉｒｃｕｍ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質、トキソプラズマの５４−ｋｄやＣＳタンパク質、虫歯の原因となるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓの菌体表層タンパク質ＰＡｃをコードする遺伝子；また、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３またはＢＡＧＥなどの癌退縮抗原や、チロシナーゼ、Ｍａｒｔ−１、ｇｐ１００、ｇｐ７５などの組織特異抗原、ｐ１５、Ｍｕｃｌ、ＣＥＡ、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＨＰＲ２／ｎｅｕなどをコードする遺伝子、および「Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＤＮＡ」：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１７６巻，１９９４年，１４５−１５２頁に記載されている遺伝子の核酸を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
「糖類」としては、医学的に許容される単糖、二糖、三糖以上のオリゴ糖もしくはこれらの糖アルコールまたはこれらの誘導体が挙げられる。本発明の遺伝子製剤に添加されることにより、製剤の安定性を改善するならば、糖類の種類は特に限定されない。また、本発明遺伝子製剤は２つ以上の糖類の混合物を含有することができる。
糖類としては例えば、単糖としてグルコース、ガラクトース、フルクトース等が挙げられ、好ましくはグルコースである。二糖としてはシュークロース、マルトース、ラクトース、トレハロースが好ましい例として挙げられる。
糖アルコールとしてはソルビトール、マンニトール等が挙げられ、好ましくはマンニトールである。
糖誘導体には、デオキシ糖、アミノ糖、リン酸エステル類等、およびこれらを構成成分とする二糖がある。
「非疎水性アミノ酸類」とは、アミノ酸類の中でも、非疎水性の性質を有するアミノ酸類を意味する。ここに、「非疎水性」とは、水との親和性が比較的強い性質を意味し、本発明では、グリシンの水親和性を基準として、それよりも水親和性が強い性質を「非疎水性」と称する。なお、水親和性を数値化する指標は、例えばｋｙｔｅ，Ｊ．＆Ｄｏｏｌｉｔｔｅｌｅ，Ｒ．Ｆ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１５７，１０５−１３２に記載されている。この基準によれば、非疎水性でないアミノ酸はグリシン、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンである。「非疎水性アミノ酸類」として、好ましくはグルタミン、アスパラギン、グルタミン酸ナトリウム、アスパラギン酸ナトリウム、プロリンが挙げられ、より好ましくはグルタミン、グルタミン酸ナトリウム、アスパラギン酸ナトリウムが挙げられる。
コラーゲンまたはゼラチンを含む本発明製剤における「アミノ酸類」としては医学的に許容されるアミノ酸およびその塩、ならびにこれらの誘導体が挙げられる。本発明の遺伝子製剤に添加されることにより、製剤の安定性を改善するならばアミノ酸類はこれらに限定されない。アミノ酸類としてはグルタミン酸またはアスパラギン酸などの酸性アミノ酸のみならず、一般に塩基性アミノ酸として分類されるリジン、アルギニン、ヒスチジン、および酸性、塩基性アミノ酸以外のグリシン、アラニン、メチオニン、プロリン、シスチン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、イソロイシン、システイン、チロシン、トリプトファン、ロイシンも包含される。よって、本発明におけるアミノ酸類とは、その水溶液における液性とは無関係であり、他に塩基性あるいは中性の側鎖が存在しているアミノ酸も包含される。アミノ酸の塩としてはナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。コラーゲンまたはゼラチンを含む本発明製剤における「アミノ酸類」として、好ましくはグルタミン、アスパラギン、グルタミン酸ナトリウム、アスパラギン酸ナトリウム、プロリン、アルギニン、ヒスチジン、リジンが挙げられる。より好ましくは、コラーゲンとＤＮＡの静電的な相互作用を弱める働きを有するグルタミン酸ナトリウム、アスパラギン酸ナトリウム、アルギニン、ヒスチジン、リジンが挙げられ、さらに好ましくはアルギニン、ヒスチジンが挙げられる。
「カルボキシル基を２個以上有する有機酸」としては、医学的に許容されるカルボキシル基を２個以上する有機酸（アミノ酸類を除く）およびその塩、ならびにこれらの誘導体が挙げられる。本発明の遺伝子製剤に添加されることにより、製剤の安定性を改善するならば有機酸類の種類はアミノ酸類以外であれば、特に限定されない。
カルボキシル基を２個以上有する有機酸およびその塩としては、好ましくはカルボキシル基を２あるいは３個含む有機酸およびその塩が挙げられ、より好ましくは飽和または不飽和脂肪族の該有機酸である。カルボキシル基を２あるいは３個含む有機酸およびその塩として、例えばクエン酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸およびその塩が挙げられ、好ましくはクエン酸、酒石酸の塩である。
本発明の遺伝子製剤には、上記の糖類、非疎水性アミノ酸類およびカルボキシル基を２個以上有する有機酸類のいずれかを含有する製剤およびこれらのうち任意の２者または３者すべてを含有する製剤が含まれ、またいずれの場合でも糖類、アミノ酸類および有機酸類ともに一つ以上を含有することができる。
本発明の遺伝子製剤における、糖類、非疎水性アミノ酸類、カルボキシル基を２個以上有する有機酸類の個別の、またはこれらを混合して用いた場合の全体の含有量、あるいはコラーゲンもしくはゼラチンを含む本発明遺伝子製剤におけるアミノ酸類の含有量は、本発明製剤に含有される遺伝子またはベクターの分解を抑制する効果が得られる量以上に設定することが望ましいが、該遺伝子またはベクターの濃度および量あるいは遺伝子製剤の実施形態によって適宜設定することができる。例えば、ｐＤＮＡを１０μｇ／ｍｌの濃度で溶解した１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液を凍結乾燥して目的の遺伝子製剤を得る、あるいはこのようにして乾燥した遺伝子製剤を保存する場合には、１％（ｗ／ｖ）以上の糖類および／または非疎水性アミノ酸類および／またはカルボキシル基を２個以上有する有機酸類を溶液に含有することが好ましい。なお、乾燥前あるいは実施形態である溶液状態の遺伝子製剤の通常用いられるｐＨはｐＨ５〜ｐＨ８の範囲であるが、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８の範囲であり、より好ましくはｐＨ７〜ｐＨ８の範囲である。
本発明遺伝子製剤には、医学的に許容される添加剤あるいは遺伝子発現を改善し得る物質を添加することができる。糖類、アミノ酸類および有機酸類の量は従ってこれらの添加剤の種類および量によっても変動し得る。
医学的に許容される添加剤として、例えば生体親和性材料あるいはゴマ油、スクワレン等の油類等が挙げられるがこれに限定されるものではない。
添加剤として使用する生体親和性材料に所望の遺伝子または該遺伝子を含むベクターを担持させれば、本発明遺伝子製剤を徐放性製剤にすることができる。ここに言う生体親和性材料とは、例えば、１）コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アルブミン、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、キチン、キトサン、アルギン酸、ペクチン、アガロースおよびアラビアゴム、２）グリコール酸、乳酸、アミノ酸の重合体およびこれらの二以上の共重合体、ならびに、３）ハイドロキシアパタイト、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレンおよびポリエチレン等を挙げることができるがこれに限られるものではない。好ましい例として、コラーゲン、ゼラチンまたはその混合物が挙げられる。
ここに、「担持させる」とは、所望の遺伝子または該遺伝子を含むベクターを生体親和性材料に均一に分散または包括させることを意味する。
遺伝子発現を改善し得る物質としては、遺伝子の細胞への導入を促進する物質または遺伝子の核への移行を促進する物質を挙げることができる。前者の例として、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、疎水性ポリマー等を挙げることができる。「カチオン性脂質」として、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド）、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタクレシルアンモニウムブロミド）、ＴＭ−ＴＰＳ（Ｎ，Ｎ^Ｉ，Ｎ^ＩＩ，Ｎ^ＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラパルミチルスペルミン）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメートクロライド（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，１９６，１０４２（１９９４））等が挙げられ、これらのカチオン性脂質とＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）等の中性脂質からなるカチオン性リポソーム、カチオン性脂質とコレステロールとの混合物も用いることができる。「カチオン性ポリマー」は遺伝子と静電的な相互作用をするポリマーであり、例えばＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）等のリポポリアミン、ＡｌｋＣＷＫ_１８等のペプチド、ポリリジンやその誘導体（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ａｃａｄｅｍｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ，８９，６０９４（１９９２））等のカチオン性ポリアミノ酸およびその誘導体、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。「疎水性ポリマー」は遺伝子と疎水的な相互作用をするポリマーであり、例えばポリビニルアルコールやポリビニルピロリドン等が挙げられる。その他、ＡｌｋＣＷＫ_１８等のペプチドも用いることができる。ここに、カチオン性リポソームとしては、例えばＤＯＳＰＡとＤＯＰＥを１：１で含むＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ロックビル，ＭＤ，ＵＳＡ）、ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥを１：１で含むリポソーム、ＤＤＡＢとＤＯＰＥを１：２．５で含むＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（登録商標、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ロックビル，ＭＤ，ＵＳＡ）、ＴＭ−ＴＰＳとＤＯＰＥを１：１．５で含むＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（登録商標、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ロックビル，ＭＤ，ＵＳＡ）等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、ここで言うカチオン性脂質とコレステロールの混合物とは、例えばＤＭＲＩＥとコレステロールのモル比で１：１の混合物であるＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ，，ロックビル，ＭＤ，ＵＳＡ）を挙げることできる。あるいは、遺伝子の細胞内におけるエンドソームでの分解を抑えるために、例えばエンドソームの内容物を放出する能力を有する不活化したアデノウイルス、ＣＨＥＭＳ（コレステロールヘミスクシネートモルホリン塩）等を用いることもできる。
遺伝子の核への移行を促進する物質としては、ＨＭＧ−１、２混合物（ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ−１，２ ｍｉｘｔｕｒｅ：実験医学，１２，１８４（１９９４））等を挙げることができる。
本発明遺伝子製剤の形状には特に制限はなく、例えば溶液状、懸濁液状、ゲル状、スポンジ状、粉末状、微粒子状、棒状、フィルム状などの形態をとることができる。
溶液状の遺伝子製剤の製造方法としては、例えば、
１）必要に応じて添加剤を添加した所望の遺伝子または該遺伝子を含有するベクターの溶液に糖類および／または非疎水性アミノ酸類および／またはカルボキシル基を２個以上有する有機酸類を加えて溶解し、均一な溶液状態の遺伝子製剤を得る方法、および
２）必要に応じて添加剤を添加した所望の遺伝子または該遺伝子を含有するベクターの溶液に糖類および／または非疎水性アミノ酸類および／またはカルボキシル基を２個以上有する有機酸類の溶液を加えて混合し、均一な溶液状態の遺伝子製剤を得る方法、が挙げられる。
あるいは、コラーゲンまたはゼラチンを含む溶液に、必要に応じて添加剤を添加した所望の遺伝子または該遺伝子を含有するベクターの溶液およびアミノ酸類またはアミノ酸類の溶液を加えて溶解または混合し、均一な溶液状態の遺伝子製剤を得る方法も包含される。
微粒子状の遺伝子製剤の製造方法としては、例えば、
１）所望の遺伝子または該遺伝子を含有するベクター、糖類および／または非疎水性アミノ酸類および／またはカルボキシル基を２個以上有する有機酸類、さらに必要に応じて添加剤を添加した溶液を噴霧乾燥する方法、および
２）所望の遺伝子または該遺伝子を含有するベクター、糖類および／または非疎水性アミノ酸類および／またはカルボキシル基を２個以上有する有機酸類、さらに必要に応じて添加剤を添加した溶液を凍結乾燥し、得られたスポンジを粉砕する方法、が挙げられる。
あるいは、コラーゲンまたはゼラチンを含む溶液に、必要に応じて添加剤を添加した所望の遺伝子または該遺伝子を含有するベクターの溶液およびアミノ酸類またはアミノ酸類の溶液を加えて溶解または混合して得た溶液を噴霧乾燥し、あるいは該溶液を凍結乾燥し該凍結乾燥品を粉砕する方法も包含される。
棒状の遺伝子製剤の製造方法としては、例えば、
１）所望の遺伝子または該遺伝子を含有するベクター、糖類および／または非疎水性アミノ酸類および／またはカルボキシル基を２個以上有する有機酸類、さらに必要に応じて添加剤を添加した溶液を噴霧乾燥して得られた微粒子を棒状に圧縮成形する方法、
２）所望の遺伝子または該遺伝子を含有するベクター、糖類および／または非疎水性アミノ酸類および／またはカルボキシル基を２個以上有する有機酸類、さらに必要に応じて添加剤を添加した溶液を凍結乾燥し、得られたスポンジを粉砕して得られた微粒子を棒状に圧縮成形する方法、
３）所望の遺伝子または該遺伝子を含有するベクター、糖類および／または非疎水性アミノ酸類および／またはカルボキシル基を２個以上有する有機酸類、さらに必要に応じて添加剤を添加した溶液を凍結乾燥し、得られたスポンジを棒状に圧縮成形する方法、
４）所望の遺伝子または該遺伝子を含有するベクター、糖類および／または非疎水性アミノ酸類および／またはカルボキシル基を２個以上有する有機酸類、さらに必要に応じて添加剤を添加した溶液を凍結乾燥し、得られたスポンジに水等を加えた後、練合し、ノズルから棒状に押し出し、乾燥する方法、および
５）所望の遺伝子または該遺伝子を含有するベクター、糖類および／または非疎水性アミノ酸類および／またはカルボキシル基を２個以上有する有機酸類、さらに必要に応じて添加剤を添加した溶液を噴霧乾燥し、得られた微粒子を液状あるいは混粘可能な程度に柔らかいゴム状のシリコーンと混合し、硬化剤を加え、ノズルから棒状に押し出す方法、が挙げられる。
あるいは、コラーゲンまたはゼラチンを含む場合は、上記方法にコラーゲンまたはゼラチンおよびアミノ酸類を使用する以外は同様の方法が包含される。
本発明の遺伝子製剤は、治療目的の疾患、標的臓器等に応じ、種々の方法で投与することができる。例えば、皮下、筋肉内等に投与することができ、また腎臓、肝臓、肺、脳等の疾患の対象部位に直接投与することができる。疾患部位に直接投与すれば臓器選択的に治療することができる。
本発明により得られる遺伝子製剤の効果を、所望の遺伝子を含有するベクターとしてプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を用いた場合を例に以下説明する。
１） ｐＤＮＡ単独あるいはｐＤＮＡと糖類、非疎水性アミノ酸類およびカルボキシル基を２個以上有する有機酸類以外の添加物（医学的に許容される添加剤、生体親和性材料、遺伝子導入を促進する物質等）を含有した溶液を製剤化すべく一般に用いられる凍結乾燥に付した場合、いずれの場合も凍結乾燥後にｐＤＮＡの分解がみられるが、糖類および／または非疎水性アミノ酸類および／またはカルボキシル基を２個以上有する有機酸類を含有する組成で凍結乾燥した場合、これらを含まない組成で凍結乾燥した場合に比べて、ｐＤＮＡの分解が抑制された。
２） ｐＤＮＡ単独あるいはｐＤＮＡと糖類、非疎水性アミノ酸類およびカルボキシル基を２個以上有する有機酸類以外の添加物（医学的に許容される添加剤、生体親和性材料、遺伝子導入を促進する物質等）を含有した溶液を乾燥させて得た乾燥品を４０℃で保存した場合、いずれの場合もｐＤＮＡの分解が見られるが、糖類および／または非疎水性アミノ酸類および／またはカルボキシル基を２個以上有する有機酸類を含有する組成の溶液を乾燥させて得た乾燥品を保存した場合、これらを含まない場合に比べて、ｐＤＮＡの分解が抑制された。
３） ｐＤＮＡとコラーゲンまたはゼラチンを含有する溶液を製剤化すべく一般に用いられる凍結乾燥に付した場合、いずれの場合にも凍結乾燥後にｐＤＮＡの分解が見られるが、アミノ酸類を含有する組成で凍結乾燥した場合、これらを含まない組成で凍結乾燥した場合に比べ、ｐＤＮＡの分解が抑制された。
４） ｐＤＮＡとコラーゲンまたはゼラチンを含有する溶液を乾燥させて得た乾燥品を４０℃で保存した場合、いずれの場合もｐＤＮＡの分解が見られるが、アミノ酸類を含有する組成の溶液を乾燥させて得た乾燥品を保存した場合、これらを含まない場合に比べ、ｐＤＮＡの分解が抑制された。
このような糖類および／または非疎水性アミノ酸類および／またはカルボキシル基を２個以上有する有機酸類を含有する組成によるｐＤＮＡの安定化効果は、上記のような乾燥工程および乾燥状態での保存時のみならず、溶液状態でも得ることができる。特に、遺伝子の導入効率を向上させることを目的に用いられるカチオン脂質類を含有した組成でその効果が顕著である。すなわち、
５） ｐＤＮＡ単独あるいはｐＤＮＡと糖類、非疎水性アミノ酸類およびカルボキシル基を２個以上有する有機酸類以外の添加物（医学的に許容される添加剤、生体親和性材料、遺伝子導入を促進する物質等）およびカチオン脂質類を含有した組成の溶液を溶液状態で保存した場合、いずれの場合もｐＤＮＡの分解が見られるが、糖類および／または非疎水性アミノ酸類および／またはカルボキシル基を２個以上有する有機酸類を含有する組成の溶液を保存した場合、これらを含まない場合に比べて、ｐＤＮＡの分解が抑制された。
前記本発明製剤の遺伝子分解抑制（安定化）効果は、後述の試験例と表９に具体的に示されている。
また、本発明で得られたＨＳＴ−１／ＦＧＦ４をコードするｐＤＮＡとコラーゲンおよびグルコースからなる棒状の遺伝子製剤をマウスの筋肉内に投与した場合、投与後３８日間に亘って血中にｐＤＮＡが検出され、投与後６０日以上に亘ってＨＳＴ−１遺伝子の発現が血中および投与部位で認められた。一方、溶液でｐＤＮＡを投与した場合には、投与後３０日間しかＨＳＴ−１遺伝子の発現が認められなかった。この結果は、ｐＤＮＡはコラーゲンおよびグルコースからなる棒状の遺伝子製剤から徐放されたのと同時に、遺伝子製剤内で長期間安定に保存されていることを示している。
実施例
以下に実施例、参考例および試験例を挙げ、本発明を更に詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例および試験例により限定されるものではない。
以下の実施例においては、繊維芽細胞増殖因子ＨＳＴ−１（ＦＧＦ４）の遺伝子（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，２９８０−２９８４（１９８７））を組み込んだプラスミドベクターｐＣＡＨＳＴ−１を含む製剤の調製につき説明する。ＨＳＴ−１遺伝子産物は巨核球に対して血小板増加因子として作用するものであり、癌の化学療法や放射線療法の際の重篤な副作用である血小板減少症を効果的に抑制することが明らかとなっている（Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｉｎｖｅｓｔ．，９６：１１２５−２２３０，１９９５，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１３：９−１９，１９９６）。ｐＣＡＨＳＴ−１は、発現ベクターｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ，１０８，１９３−２００（１９９１））のＣＡＧプロモーター部とポリＡ配列との間にＨＳＴ−１遺伝子を組み込んだプラスミドベクターである。なお、ＣＡＧプロモーターは、高発現ベクターとして特開平３−１６８０８７号公報に記載されている。
実施例１
アミノ酸を含有する遺伝子製剤（乾燥状態）
１０μｇ／ｍｌのｐＣＡＨＳＴ−１および１０ｍｇ／ｍｌのグリシン、アラニン、グルタミン酸一ナトリウムまたはリジン塩酸塩を含有する１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液をそれぞれ調製した。調製した溶液の１ｍｌを−４０℃で凍結させた後、陰圧下室温で一晩乾燥した。このように凍結乾燥によって、乾燥状態の遺伝子製剤を調製した。
実施例２
糖類を含有する遺伝子製剤（乾燥状態）
１０μｇ／ｍｌのｐＣＡＨＳＴ−１および１０ｍｇ／ｍｌのグルコース、シュークロース、マルトース、ラクトースまたはマンニトールを含有する１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液をそれぞれ調製した。調製した溶液の１ｍｌを−４０℃で凍結させた後、陰圧下室温で一晩乾燥した。このように凍結乾燥によって、乾燥状態の遺伝子製剤を調製した。
実施例３
カルボキシル基２個以上を含む有機酸類およびアミノ酸を含有する遺伝子製剤（ 乾燥状態）
１０μｇ／ｍｌのｐＣＡＨＳＴ−１および１０ｍｇ／ｍｌのグルタミン酸一ナトリウム、アスパラギン酸ナリウム、酒石酸ナトリウム二水和物またはクエン酸三ナトリウム二水和物を含有する１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液を調製した。調製した溶液の１ｍｌを−４０℃で凍結させた後、陰圧下室温で一晩乾燥した。このように凍結乾燥によって、乾燥状態の遺伝子製剤を調製した。
実施例４
糖類およびカチオン性脂質を含有する遺伝子製剤（乾燥状態）
３μｇ／ｍｌのｐＣＡＨＳＴ−１、２４μｇ／ｍｌのＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、遺伝子導入促進成分）および１０ｍｇ／ｍｌのシュークロースを含有する１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液を調製した。調製した溶液の１ｍｌを−４０℃で凍結させた後、陰圧下室温で一晩乾燥した。このように凍結乾燥によって、乾燥状態の遺伝子製剤を調製した。
実施例５
糖類および遺伝子導入促進成分を含有する遺伝子製剤（溶液状）
１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液に、ｐＣＡＨＳＴ−１、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）およびグルコースをそれぞれの最終濃度が３μｇ／ｍｌ、２４μｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌになるように混合した。このようにして、液状の遺伝子製剤を得た。
実施例６
徐放性遺伝子製剤（ゲル状）
０．１ｗ／ｗ％アテロコラーゲン溶液（５００ｍｇ）に１００μｇ／ｍｌのｐＣＡＨＳＴ−１溶液（２００μｌ）および１０ｍｇ／ｍｌのグルコース、シュークロースまたはグルタミン酸一ナトリウム溶液（５００μｌ）を加え、混合後３７℃に保温することによって、ゲル状の遺伝子製剤を調製した。なお、本実施例および以下の実施例・参考例において用いたアテロコラーゲンは（株）高研から入手できる。
実施例７
徐放性遺伝子製剤（スポンジ状）
実施例６で調製した、グルコースを含有するゲル状の遺伝子製剤を凍結乾燥した。これにより５００μｇのアテロコラーゲン、２０μｇのｐＣＡＨＳＴ−１、５ｍｇのグルコース、シュークロースまたはグルタミン酸ナトリウム塩を含有するスポンジ状の遺伝子製剤を得た。
実施例８
徐放性遺伝子製剤（棒状）
０．８６ｗ／ｗ％アテロコラーケン溶液（２９．１ｇ）に水（６０ｇ）、１１ｍｇ／ｍｌのグルコース溶液（１０ｍｌ）を加え混合した後、１００μｇ／ｍｌのｐＣＡＨＳＴ−１溶液（８０ｍｌ）を加え混合した。得られた溶液を凍結乾燥した後、この凍結乾燥品に適当量の蒸留水を加えて練合した。その後、練合品をシリンジに入れ押し出しを行い、さらに乾燥してｐＣＡＨＳＴ−１の収率７４％の製剤を得た。すなわち、１ｍｇあたり１７μｇのｐＣＡＨＳＴ−１、３００μｇのグルコースを含有する棒状の遺伝子製剤を得た。
参考例１
アミノ酸を加えないこと以外は、実施例１に記載の操作に従い、乾燥状態の組成物を調製した。
参考例２
シュークロースを加えないこと以外は、実施例４に記載の操作に従い、乾燥状態の組成物を調製した。
参考例３
グルコースを加えないこと以外は、実施例５に記載の操作に従い、液状の組成物を得た。
参考例４
糖類の溶液またはグルタミン酸一ナトリウム溶液を加えないこと以外は、実施例６および７に記載の操作に従い、５００μｇのアテロコラーゲンおよび２０μｇのｐＣＡＨＳＴ−１を含有するスポンジ状の組成物を得た。
参考例５
グルコース溶液を加えないこと以外は、実施例８に記載の操作に従い、１ｍｇあたり２０μｇのｐＣＡＨＳＴ−１を含有する棒状の乾燥組成物を得た。
参考例６
ｐＣＡＨＳＴ−１溶液を加えないこと以外は、実施例８に記載の操作に従い、１ｍｇあたり３００μｇのグルコースを含有する棒状の乾燥組成物を得た。
試験例１
凍結乾燥時におけるアミノ酸の遺伝子分解抑制効果
実施例１の遺伝子製剤および参考例１の組成物を、凍結乾燥直後に水に溶解し、アガロース電気泳動に付してｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造を評価した。
アガロース電気泳動は水平型電気泳動ユニット（Ｍｕｐｉｄ、（株）アドバンス）にて、ＴＡＥ緩衝液中で０．８％アガロースゲルを用いて行った。電気泳動後、エチジウムブロマイドでゲルを染色し、トランスイルミネーター上で撮影した。その映像を写真スキャナーで取り込み、一次構造が保持されたスーパーコイル型ｐＤＮＡ（ＣＣ）と切断されたｐＤＮＡ（ＯＣ）のバンドを含むすべてのバンドの強度を解析ソフトで算出し、ＣＣの比率、すなわち一次構造保持率（ＣＣ保持率）を計算した。この場合、無処理のｐＤＮＡのＣＣ保持率を１００とした。試験例２以降においてもアガロース電気泳動を実施する場合にはこの方法を用いた。
得られた結果を以下の表１および図１に示す。図中、ＣＣは一次構造が保持されたスーパーコイル型ｐＣＡＨＳＴ−１を示し、ＯＣは切断されたｐＣＡＨＳＴ−１を示す。各レーンは次を意味する；
レーン１：分子量マーカー（λＨｉｎｄ ＩＩＩ）
レーン２：無添加（参考例１）
レーン３：グルタミン酸一ナトリウム（実施例１）
レーン４：グリシン（実施例１）
レーン５：アラニン（実施例１）
レーン６：フェニルアラニン
レーン７：リジン塩酸塩（実施例１）
レーン８：無処理

結果は、グルタミン酸一ナトリウムを製剤に加えることで、アミノ酸無添加の製剤に比べて、ｐＣＡＨＳＴ−１の分解が抑えられることを示している。
試験例２
凍結乾燥時における糖類の遺伝子分解抑制効果
実施例２の遺伝子製剤および参考例１の組成物を、凍結乾燥直後に水に溶解し、試験例１の操作に従い、アガロース電気泳動に付してｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造を評価した。得られた結果を以下の表２および図２に示す。結果は、グルコース、シュークロース、マルトース、ラクトースおよびマンニトールを製剤に加えることで、糖類無添加の製剤に比べてｐＣＡＨＳＴ−１の分解が大幅に抑えられることを示している。

図２中、ＣＣは一次構造が保持されたスーパーコイル型ｐＣＡＨＳＴ−１を示し、ＯＣは切断されたｐＣＡＨＳＴ−１を示す。各レーンは次を意味する；
レーン１：分子量マーカー（λＨｉｎｄ ＩＩＩ）
レーン２：無添加（参考例１）
レーン３：グルコース（実施例２）
レーン４：シュークロース（実施例２）
レーン５：マルトース（実施例２）
レーン６：ラクトース（実施例２）
レーン７：マンニトール（実施例２）
レーン８：無処理
試験例３
凍結乾燥時におけるカルボキシル基２個以上を含む有機酸類およびアミノ酸の遺伝子分解抑制効果
実施例３の遺伝子製剤および参考例１の組成物を凍結乾燥直後に水で溶解し、試験例１に記載の操作に従って、アガロース電気泳動に付してｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造を評価した。得られた結果を以下の表３および図３に示す。結果は、グルタミン酸一ナトリウム、アスパラギン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム二水和物あるいはクエン酸三ナトリウム二水和物を製剤に加えることで、有機酸類無添加の製剤に比べてｐＣＡＨＳＴ−１の分解が大幅に抑えられることを示している。

図３中、ＣＣは一次構造が保持されたスーパーコイル型ｐＣＡＨＳＴ−１を示し、ＯＣは切断されたｐＣＡＨＳＴ−１を示す。各レーンは次を意味する；
レーン１：分子量マーカー（λＨｉｎｄ ＩＩＩ）
レーン２：無添加（参考例１）
レーン３：グルタミン酸一ナトリウム（実施例３）
レーン４：アスパラギン酸ナトリウム（実施例３）
レーン５：酒石酸ナトリウム二水和物（実施例３）
レーン６：クエン酸三ナトリウム二水和物（実施例３）
レーン７：無処理
試験例４
カチオン性脂質を含有する遺伝子溶液の凍結乾燥時におけるシュークロースの遺伝子分解抑制効果
実施例４の遺伝子製剤および参考例２の組成物を凍結乾燥直後に水で溶解し、試験例１の操作に従ってアガロース電気泳動に付してｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造を評価した。得られた結果を以下の表４および図４に示す。結果は、シュークロースを製剤に加えることで、無添加の製剤に比べてｐＣＡＨＳＴ−１の分解が抑制されることを示している。

図４中、ＣＣは一次構造が保持されたスーパーコイル型ｐＣＡＨＳＴ−１を示し、ＯＣは切断されたｐＣＡＨＳＴ−１を示す。各レーンは次を意味する；
レーン１：分子量マーカー（λＨｉｎｄ ＩＩＩ）
レーン２：無添加（参考例２）
レーン３：シュークロース（実施例４）
レーン４：無処理
試験例５
４０℃保存時におけるグルコースの遺伝子分解抑制効果（１）
実施例２の遺伝子製剤のうちグルコース処方の乾燥状態の製剤および参考例１の組成物を４０℃で１、２、および４週間保存した。保存後のｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造を試験例１の操作に従ってアガロース電気泳動で評価した。得られた結果を以下の表５および図５に示す。結果は、グルコースを製剤に加えることで、グルコース無添加の製剤に比べ、係る条件下でのｐＣＡＨＳＴ−１の保存安定性が大幅に改善されることを示している。

図５中、ＣＣは一次構造が保持されたスーパーコイル型ｐＣＡＨＳＴ−１を示し、ＯＣは切断されたｐＣＡＨＳＴ−１を示す。各レーンは次を意味する；
レーン１：分子量マーカー（λＨｉｎｄ ＩＩＩ）
レーン２：無添加（参考例１／４０℃−１週間）
レーン３：無添加（参考例１／４０℃−２週間）
レーン４：無添加（参考例１／４０℃−４週間）
レーン５：グルコース（実施例２／４０℃−１週間）
レーン６：グルコース（実施例２／４０℃−２週間）
レーン７：グルコース（実施例２／４０℃−４週間）
レーン８：無処理
試験例６
３７℃保存時におけるシュークロースの遺伝子分解抑制効果
実施例４の遺伝子製剤および参考例２の組成物を３７℃で４週間保存した。保存後のｐＣＡＨＳＴ−１の構造を試験例１記載のアガロース電気泳動で評価した。得られた結果を以下の表６および図６に示す。結果は、シュークロースを製剤に加えることで、シュークロース無添加の製剤に比べ、係る条件下でのｐＣＡＨＳＴ−１の保存安定性が大幅に改善されることを示している。

図６中、ＣＣは一次構造が保持されたスーパーコイル型ｐＣＡＨＳＴ−１を示し、ＯＣは切断されたｐＣＡＨＳＴ−１を示す。各レーンは次を意味する；
レーン１：分子量マーカー（λＨｉｎｄ ＩＩＩ）
レーン２：無添加（参考例２／３７℃−４週間）
レーン３：シュークロース（実施例４／３７℃−４週間）
レーン４：無処理
試験例７
４０℃保存時におけるグルコースの遺伝子分解抑制効果（２）
実施例５の液状遺伝子製剤および参考例３の組成物を４０℃で４週間保存した。保存後のｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造を試験例１記載のアガロース電気泳動で評価した。得られた結果を図７に示す。結果は試験例５における乾燥製剤と同様に、グルコースを製剤に加えることで、グルコース無添加の製剤に比べ、係る条件下でのｐＣＡＨＳＴ−１の保存安定性が大幅に改善されることを示している。
図７中、ＣＣは一次構造が保持されたスーパーコイル型ｐＣＡＨＳＴ−１を示し、ＯＣは切断されたｐＣＡＨＳＴ−１を示す。各レーンは次を意味する；
レーン１：無処理
レーン２：グルコース（実施例５／４０℃−４週間）
レーン３：無添加（参考例３／４０℃−４週間）
レーン４：分子量マーカー（λＨｉｎｄ ＩＩＩ）
試験例８
コラーゲン含有時における糖類等の遺伝子分解抑制効果（１）
実施例７のスポンジ状の遺伝子製剤および参考例４のスポンジ状の組成物を１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液で加温下に溶解し、コラゲナーゼで処理した。処理後、試験例１に記載のようにしてアガロース電気泳動に付してｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造を評価した。その結果、グルコース、シュークロースおよびグルタミン酸一ナトリウムを製剤に加えることで、糖類無添加の製剤に比べてｐＣＡＨＳＴ−１の分解を大幅に抑えることができた（図８、表７）。

図８中、ＣＣは一次構造が保持されたスーパーコイル型ｐＣＡＨＳＴ−１を示し、ＯＣは切断されたｐＣＡＨＳＴ−１を示す。各レーンは次を意味する；
レーン１：分子量マーカー（λＨｉｎｄ ＩＩＩ）
レーン２：グルコース（実施例７）
レーン３：シュークロース（実施例７）
レーン４：グルタミン酸一ナトリウム（実施例７）
レーン５：無添加（参考例４）
レーン６：無処理
試験例９
コラーゲン含有時における糖類等の遺伝子分解抑制効果（２）
実施例８の棒状の遺伝子製剤および参考例５の棒状の組成物を１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液で加温下で溶解し、コラゲナーゼで処理した。処理後、試験例１に記載のようにしてアガロース電気泳動に付し、ｐＣＡＨＳＴ−１の構造を評価した。その結果、グルコースを製剤に加えることで、グルコース無添加の製剤に比べてｐＣＡＨＳＴ−１の分解を大幅に抑えることができた（図９、表８）。

図９中、ＣＣは一次構造が保持されたスーパーコイル型ｐＣＡＨＳＴ−１を示し、ＯＣは切断されたｐＣＡＨＳＴ−１を示す。各レーンは次を意味する；
レーン１：分子量マーカー（λＨｉｎｄ ＩＩＩ）
レーン２：無添加▲１▼（参考例５）
レーン３：無添加▲２▼（参考例５）
レーン４：グルコース▲１▼（実施例８）
レーン５：グルコース▲２▼（実施例８）
レーン６：無処理
試験例１０
安定な遺伝子製剤を用いた遺伝子導入
実施例８の棒状の遺伝子製剤（アテロコラーゲン／グルコース−ｐＣＡＨＳＴ−１）および参考例５の棒状の組成物（アテロコラーゲン−ｐＣＡＨＳＴ−１）をそれぞれ５０μｇのｐＣＡＨＳＴ−１を含有するように切断した。これらをＩＣＲマウス（雌性、６−７週齢）の右大腿部筋肉内に投与した（投与群１：実施例８の遺伝子製剤、投与群２：参考例５の組成物）。また、５０μｇのｐＣＡＨＳＴ−１を含有するリン酸緩衝液１００μｌもマウス右大腿部筋肉内に投与した（投与群３）。
インビボにおける徐放効果を調べるため、血中ｐＣＡＨＳＴ−１の検出、血中および投与部位のＨＳＴ−１量および血中の血小板数の３つの測定値を利用した。血中のｐＣＡＨＳＴ−１はＰＣＲ法で検出し、血中および投与部位（筋肉組織中）のＨＳＴ−１量はＥＬＩＳＡ法で測定し、血中の血小板数は顕微鏡下でのカウントにて、それぞれ経時的に行った。
ＰＣＲ法では、ｐＣＡＨＳＴ−１（約８ｋｂｐ）中の２６２ｂｐを検出するプローブを使用し、Ａｍｐｒｉｄｉｒｅｃｔ法（島津製作所）を用いた。測定限界は、サザンブロッティングで１ｐｇ／５μｌ、エチジウム染色で２ｐｇ／５μｌであった。ＥＬＩＳＡ法では、ＦＧＦ４キット（Ｒ＆Ｄシステムス社、アメリカ合衆国、検出限界２０ｐｇ／ｍｌ）を使用した。血小板数の測定は、採血後、血小板以外の血球成分を分解処理し、顕微鏡下でカウントすることにより実施した。
ＰＣＲ法による血中ｐＣＡＨＳＴ−１の測定結果を図１０に示す。投与群１では、血中でｐＣＡＨＳＴ−１は投与後６時間から検出され、その後３８日間に亘って検出された。投与群２では、血中でｐＣＡＨＳＴ−１は投与後６時間から検出され、その後１８日間に亘って検出された。投与群３では、血中でｐＣＡＨＳＴ−１は投与後７日間のみ検出された。
血中および投与部位でのＨＳＴ−１量の測定結果をそれぞれ図１１、図１２に示す。図１１中、各記号は次を意味する； 白抜き丸：アテロコラーゲン／グルコース−ｐＣＡＨＳＴ−１（投与群１、実施例８）、黒塗り丸：アテロコラーゲン−ｐＣＡＨＳＴ−１（投与群２、参考例５）、黒塗り四角：ｐＣＡＨＳＴ−１を含有するリン酸緩衝液（投与群３、対照例）、白抜き四角：アテロコラーゲン／グルコース（参考例６）。
図１２中、各記号は次を意味する； 白抜き丸：アテロコラーゲン／グルコース−ｐＣＡＨＳＴ−１（投与群１、実施例８）、黒塗り丸：アテロコラーゲン−ｐＣＡＨＳＴ−１（投与群２、参考例５）、黒塗り四角：ｐＣＡＨＳＴ−１を含有するリン酸緩衝液（投与群３、対照例）、白抜き四角：アテロコラーゲン／グルコース（参考例６）。
投与群１では、ＨＳＴ−１量は血中および投与部位共に投与後増加し、３０日後に最大に達した後徐々に減少したが、６０日後も検出された。投与群２では、投与群１と同様に血中および投与部位でのＨＳＴ−１量は投与後増加し、３０日後に最大に達した後徐々に減少し４０日後殆ど検出限界となり、総体的に投与群１に比べて産生されたＨＳＴ−１量は少なかった。投与群３では、血中および投与部位でのＨＳＴ−１量は、投与後増加し、１０日後に最大に達した後徐々に減少し、３０日後には検出されなかった。
血中の血小板数を経時的に測定した結果（図１３）、投与群１では、血小板数は投与後増加し、３０日後に最大に達した後徐々に減少したが、６０日後も増加傾向を維持した。投与群２では、血小板数は投与後徐々に増加し、１４日後に最大に達した後減少し、２８日以降も低値ながら増加傾向を維持した。投与群３では、血小板数は投与後増加し、１０日後に最大に達した後徐々に減少し、２５日間に正常値に戻った。
図１３中、各記号は次を意味する； 白抜き丸：アテロコラーゲン／グルコース−ｐＣＡＨＳＴ−１（投与群１、実施例８）、黒塗り丸：アテロコラーゲン−ｐＣＡＨＳＴ−１（投与群２、参考例５）、黒塗り四角：ｐＣＡＨＳＴ−１を含有するリン酸緩衝液（投与群３、対照例）、白抜き四角：アテロコラーゲン／グルコース（参考例６）。
対照として、ｐＣＡＨＳＴ−１を含まない参考例６の組成物も同様にマウス右大腿部筋肉内に投与し、投与後、血中および投与部位のＨＳＴ−１量をＥＬＩＳＡ法で測定し、血中の血小板数を経時的に測定した。その結果、測定期間中、血中および投与部位でＨＳＴ−１は検出されなかった。また、測定期間中、血小板数は増加しなかった。このことは、実施例８の遺伝子製剤を用いて得られた投与群１および投与群２でのＨＳＴ−１の産生および血小板数の増加が、製剤中に含有されたｐＣＡＨＳＴ−１が細胞内に導入され、細胞内でＨＳＴ−１の遺伝情報を発現したことによって生じたことを示している。
投与群１と投与群３の結果から、ｐＣＡＨＳＴ−１を単独で投与した場合、ＨＳＴ−１の体内での発現および産生されたＨＳＴ−１による生物学的な効果は一過的であるのに対して、実施例８の遺伝子製剤では長期間ｐＣＡＨＳＴ−１を徐放すると共に、安定に体内で保持してＨＳＴ−１の発現期間を延長し、かつ産生されたＨＳＴ−１による生物学的な効果を長期間維持できることが判った。
投与群１と投与群２の結果から、実施例８と参考例５の遺伝子製剤では共に、ｐＣＡＨＳＴ−１を単独で投与した場合に比べて、ｐＣＡＨＳＴ−１を徐放すると共にＨＳＴ−１の発現期間を延長できるが、グルコースを含有する実施例８の遺伝子製剤では参考例５の遺伝子製剤に比べて、ｐＣＡＨＳＴ−１を安定に体内で保持し、ＨＳＴ−１の発現期間を高い産生量で延長維持し、それによってＨＳＴ−１による生物学的な効果をより高い状態で長期間維持できることが判った。
以下、実施例９−１２により調製した調製物について試験例１１−１６を行い、コラーゲンの存在または不存在下におけるアミノ酸または糖類の遺伝子に対する安定性の寄与を主として調べた。
実施例９
アミノ酸を含有する遺伝子製剤（乾燥状態）
１０μｇ／ｍｌのｐＣＡＨＳＴ−１および１０ｍｇ／ｍｌのアルギニン、リジン塩酸塩、アスパラギン、アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン、グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン、プロリン、セリン、トレオニン、グリシン、アラニン、メチオニン、バリン、イソロイシンあるいは５ｍｇ／ｍｌのロイシンを含有する１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液をそれぞれ調製した。調製した溶液の１ｍｌを−４０℃で凍結させた後、陰圧下室温で一晩乾燥した。このように凍結乾燥によって、乾燥状態の遺伝子製剤を調製した。
実施例１０
糖類を含有する遺伝子製剤（乾燥状態）
１０μｇ／ｍｌのｐＣＡＨＳＴ−１および１０ｍｇ／ｍｌのトレハロース、マルチトール、ラクトース、マルトース、グルコース、ソルビトール、コンドロイチン硫酸ナトリウムまたはキシリトールを含有する１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液をそれぞれ調製した。調製した溶液の１ｍｌを−４０℃で凍結させた後、陰圧下室温で一晩乾燥した。このように凍結乾燥によって、乾燥状態の遺伝子製剤を調製した。
実施例１１
アミノ酸を含有する徐放性遺伝子製剤（スポンジ状）
０．１ｗ／ｗ％アテロコラーゲン溶液（５００ｍｇ）に２０μｇ／ｍｌのｐＣＡＨＳＴ−１溶液（１ｍｌ）および４０ｍｇ／ｍｌのアルギニン、リジン塩酸塩、アスパラギン、アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン、グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン、プロリン、セリン、トレオニン、グリシン、アラニン、メチオニン、バリン、イソロイシンあるいは２０ｍｇ／ｍｌのロイシン溶液（１２５μｌ）を混合した溶液をそれぞれ調製した。調製した溶液の１ｍｌを−４０℃で凍結させた後、陰圧下室温で一晩乾燥した。このように凍結乾燥によって、スポンジ状の遺伝子製剤を調製した。
実施例１２
糖類を含有する徐放性遺伝子製剤（スポンジ状）
０．１ｗ／ｗ％アテロコラーゲン溶液（５００ｍｇ）に２０μｇ／ｍｌのｐＣＡＨＳＴ−１溶液（１ｍｌ）および４０ｍｇ／ｍｌのトレハロース、マルチトール、ラクトース、マルトース、グルコース、ソルビトール、コンドロイチン硫酸ナトリウムまたはキシリトール溶液（１２５μｌ）を混合した溶液をそれぞれ調製した。調製した溶液の１ｍｌを−４０℃で凍結させた後、陰圧下室温で一晩乾燥した。このように凍結乾燥によって、スポンジ状の遺伝子製剤を調製した。
試験例１１
凍結乾燥時におけるアミノ酸の遺伝子分解抑制効果
実施例９の遺伝子製剤および参考例１の組成物を、凍結乾燥直後に水に溶解し、試験例１の操作に従い、アガロース電気泳動に付してｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造を解析した。電気泳動後、エチジウムブロマイドでゲルを染色し、トランスイルミネーター上で撮影した。その映像を写真スキャナーで取り込み、一次構造が保持されたスーパーコイル型ｐＤＮＡ（ＣＣ）と一ヵ所が切断されたリラックス型ｐＤＮＡ（ＯＣ）、さらに切断され開環状になった直鎖型ＤＮＡ（ＬＳ）のバンドの強度を解析ソフトで算出し、下式に従ってアミノ酸の添加による安定化度を計算した。結果を図１４に示した。図１４中のアミノ酸の順は、疎水親水度（Ｋｙｔｅ，Ｊ．＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｅｌｅ，Ｒ．Ｆ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７，１０５−１３２）の順である。結果は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン、グルタミン酸ナトリウム、ヒシチジン、プロリン、セリンまたはトレオニンを製剤に加えることで、アミノ酸無添加の製剤に比べてｐＣＡＨＳＴ−１の分解が抑制されていることを示している。

試験例１２
凍結乾燥時における糖類の遺伝子分解抑制効果
実施例１０の遺伝子製剤および参考例１の組成物を、凍結乾燥直後に水に溶解し、試験例１１の操作に従い、アガロース電気泳動に付してｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造を解析した。試験例１１と同様に安定化度を算出し、その結果を図１５に示した。結果は、糖類を製剤に加えることで、糖類無添加の製剤に比べてｐＣＡＨＳＴ−１の分解が抑制されていることを示している。
試験例１３
コラーゲン含有時におけるアミノ酸類の遺伝子分解抑制効果
実施例１１のスポンジ状の遺伝子製剤及び参考例４のスポンジ状の組成物を１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液で加温下に溶解し、コラゲナーゼで処理した。処理後、試験例１１に記載したようにしてアガロース電気泳動に付してｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造を評価した。試験例１１と同様に安定化度を算出し、その結果を図１６に示した。図１６中のアミノ酸の順は、疎水親水度（Ｋｙｔｅ，Ｊ．＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｅｌｅ，Ｒ．Ｆ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７，１０５−１３２）の順である。結果は、アミノ酸類を製剤に加えることで、アミノ酸類無添加の製剤に比べてｐＣＡＨＳＴ−１の分解を大幅に抑えることができたことを示す。
試験例１４
コラーゲン含有時における糖類の遺伝子分解抑制効果
実施例１２のスポンジ状の遺伝子製剤及び参考例４のスポンジ状の組成物を１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液で加温下に溶解し、コラゲナーゼで処理した。処理後、試験例１１に記載したようにしてアガロース電気泳動に付してｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造を評価した。試験例１１と同様に安定化度を算出し、その結果を図１７に示した。糖類を製剤に加えることで、糖類無添加の製剤に比べてｐＣＡＨＳＴ−１の分解を大幅に抑えることができた。
試験例１５
４０℃保存時におけるアミノ酸類および糖類の遺伝子分解抑制効果
実施例９の遺伝子製剤のうちアスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸一ナトリウム、プロリン、グルタミン処方の乾燥状態の製剤と実施例１０の遺伝子製剤のうちグルコース、シュークロース、マルトース、ラクトース、マンニトール処方の乾燥状態の製剤および参考例１の組成物を４０℃で１、２、および４週間保存した。保存後のｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造を試験例１の操作に従ってアガロース電気泳動で評価した。得られた結果を図１８に示す。結果は、非疎水性アミノ酸類あるいは糖類を製剤に加えることで、無添加の製剤に比べ、かかる条件下でのｐＣＡＨＳＴ−１の保存安定性が大幅に改善されることを示している。
試験例１６
４０℃保存時におけるコラーゲン含有遺伝子製剤に対するアミノ酸類および糖類の遺伝子分解抑制効果
実施例１１のスポンジ状の遺伝子製剤のうちリジン、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン処方の乾燥状態の製剤と実施例１２のスポンジ状遺伝子製剤のうちグルコース、シュークロース、マルトース、ラクトース、マンニトール処方の乾燥状態の製剤および参考例４のスポンジ状の組成物を４０℃で１、２、および４週間保存した。保存後のｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造を試験例１３の操作に従ってアガロース電気泳動で評価した。得られた結果を図１９に示す。結果は、アミノ酸類あるいは糖類を製剤に加えることで、無添加の製剤に比べ、係る条件下でのｐＣＡＨＳＴ−１の保存安定性が大幅に改善されることを示している。
発明の効果
試験例１から９にて得られた本発明製剤の遺伝子分解抑制（安定化）効果を以下の表９にまとめる。

産業上の利用の可能性
安定性が増強された遺伝子または遺伝子を組み込んだベクターを含有する安定な遺伝子製剤は、今後利用頻度が高くなると思われる遺伝子治療に安全かつ容易に利用される。本発明製剤は、遺伝子治療が広く普及するための基盤を提供できる。特に本発明製剤は遺伝子または遺伝子を組込んだベクターを常温で流通あるいは保管することを可能とし、コールドチェーンが整備されていない地域で使用可能なＤＮＡワクチンを提供できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、アミノ酸を含有する遺伝子製剤（実施例１）に含まれるｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造の評価結果を示す電気泳動の写真である。
図２は、糖類を含有する遺伝子製剤（実施例２）に含まれるｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造の評価結果を示す電気泳動の写真である。
図３は、カルボキシル基２個を含む有機酸類およびアミノ酸を含有する遺伝子製剤（実施例３）に含まれるｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造の評価結果を示す電気泳動の写真である。
図４は、糖類および遺伝子導入促進成分を含有する遺伝子製剤（実施例４）に含まれるｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造の評価結果を示す電気泳動の写真である。
図５は、糖類を含有する遺伝子製剤（実施例２）を４０℃で保存した後、ｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造を評価した結果を示す電気泳動の写真である。
図６は、糖類および遺伝子導入促進成分を含有する遺伝子製剤（実施例４）を３７℃−４週間保存した後、ｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造を評価した結果を示す電気泳動の写真である。
図７は、糖類および遺伝子導入促進成分を含有する溶液状遺伝子製剤（実施例５）を４０℃−４週間保存した後、ｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造を評価した結果を示す電気泳動の写真である。
図８は、コラーゲンを含有するスポンジ状遺伝子製剤（実施例７）に含まれるｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造の評価結果を示す電気泳動の写真である。
図９は、コラーゲンを含有する棒状の遺伝子製剤（実施例８）に含まれるｐＣＡＨＳＴ−１の一次構造の評価結果を示す電気泳動の写真である。
図１０は、コラーゲンを含有する棒状の遺伝子製剤（実施例８）における血中でのｐＣＡＨＳＴ−１の検出期間を示すグラフである。
図１１は、コラーゲンを含有する棒状の遺伝子製剤（実施例８）における血中のＨＳＴ−１濃度の経時変化を示すグラフである。
図１２は、試験例１０における投与部位でのＨＳＴ−１量の経時変化を示すグラフである。
図１３は、実施例１０における血中の血小板数の経時変化を示すグラフである。
図１４は、アミノ酸を含有する遺伝子製剤（実施例９）に含まれるｐＣＡＨＳＴ−１の凍結乾燥時の安定化度を示すグラフである（試験例１１）。
図１５は、糖類を含有する遺伝子製剤（実施例１０）に含まれるｐＣＡＨＳＴ−１の凍結乾燥時の安定化度を示すグラフである（試験例１２）。
図１６は、アテロコラーゲンおよびアミノ酸を含有する遺伝子製剤（実施例１１）に含まれるｐＣＡＨＳＴ−１の凍結乾燥時における安定化度を示すグラフである（試験例１３）。
図１７は、アテロコラーゲンおよび糖類を含有する遺伝子製剤（実施例１２）に含まれるｐＣＡＨＳＴ−１の凍結乾燥時における安定化度を示すグラフである（試験例１４）。
図１８は、アミノ酸を含有する遺伝子製剤（実施例９）および糖類を含有する遺伝子製剤（実施例１０）を４０℃で保存した場合のｐＣＡＨＳＴ−１の安定化度を示すグラフである（試験例１５）。
図１９は、アテロコラーゲンおよびアミノ酸を含有する遺伝子製剤（実施例１１）およびアテロコラーゲンおよび糖類を含有する遺伝子製剤（実施例１２）を４０℃で保存した場合のｐＣＡＨＳＴ−１の安定化度を示すグラフである（試験例１６）。

Claims (8)

1. 所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベクターと、クエン酸三ナトリウム二水和物または酒石酸ナトリウム二水和物とを含む安定な凍結乾燥遺伝子製剤。
2. 所望の遺伝子を組み込んだベクターがプラスミドＤＮＡである請求項１記載の凍結乾燥遺伝子製剤。
3. 溶液状態、ゲル状態もしくは懸濁液状態の工程を経て製造される凍結乾燥遺伝子製剤において、溶液状態、ゲル状態または懸濁液状態におけるクエン酸三ナトリウム二水和物または酒石酸ナトリウム二水和物の全体に対する含有量が約１ｗ／ｖ％以上である請求項１記載の凍結乾燥遺伝子製剤。
4. 細胞への遺伝子導入を促進する物質をさらに含む請求項１ないし３のいずれかに記載の凍結乾燥遺伝子製剤。
5. 細胞への遺伝子導入を促進する物質が、カチオン性脂質、カチオン性ポリマーまたは疎水性ポリマーである請求項４記載の凍結乾燥遺伝子製剤。
6. 医学的に許容される添加剤をさらに含む請求項１ないし５のいずれかに記載の凍結乾燥遺伝子製剤。
7. 添加剤がコラーゲンである請求項６記載の凍結乾燥遺伝子製剤。
8. 溶液状態、ゲル状態あるいは懸濁液状態である所望の遺伝子または所望の遺伝子を組み込んだベクターを含む調製物を凍結乾燥工程に付することにより得られる請求項１ないし７のいずれかに記載の凍結乾燥遺伝子製剤。

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