CN1173744C - 稳定的基因制剂 - Google Patents

Abstract

本发明以使基因治疗用制剂在制造及保存期间保持其稳定性为目的。本基团制剂中至少含有一种糖类和/或至少一种非疏水性氨基酸和/或至少一种具有两个以上羧基的有机酸类(氨基酸除外)，或者是含有胶原蛋白或明胶及至少含有一种氨基酸类。

Description

稳定的基因制剂

技术领域

本发明为有关用于基因治疗的稳定的基因制剂。更为详细地说，本发明有关的制剂含有在制造过程中及组合物的保存稳定性良好的基因或含有导入了该基因的载体。

技术背景

近年来，以治疗或预防疾病、特别是遗传病为目的的基因治疗开始了试验性的临床应用。在基因治疗研究的初期，基于导入细胞基因的转导高效率主要研究了以病毒用作载体的方法。但是，自从发现将有自己翻译能力的质粒DNA(pDNA)直接投入到动物的肌肉内后能够表达遗传信息以来，由于pDNA比病毒载体有较高的安全性，且易于工业化生产，于是用pDNA的基因治疗法开始了广泛的研究。

在用pDNA基因治疗的基础研究中，现在最为关注的是提高pDNA向细胞的导入效率和延长遗传信息的表达期。已经报道了以提高pDNA的细胞导入效率为目的将pDNA封入阳离子性的脂质体的方法及与聚合物形成复合体的方法。而且，也报道了以延长遗传信息表达期为目的用与生物体亲和性高的胶原蛋白(特开平9-71542)或聚乙酸乙烯酯(Journal of Controlled Release 47，123，(1997))为载体的缓释性制剂。尽管这些问题已获解决，但是含有基因的基因制剂本身如果不能保持一定的高品质、稳定且经济地供给的话，基因治疗实际上就不能得到广泛的推广。

在制剂的制造或保存中保持基因制剂中有效成分基因的生物活性的稳定性是重要的。众所周知，将闭环状的pDNA用限制性酶切断、将其置入肌肉内后，其遗传信息的表达降低到投入闭环状的pDNA时的10％。因此，为了保持基因的生物活性，在制造和各种可以预料条件下的保存中保持pDNA的一级结构是很重要的。

尽管在前述的基础研究中有一部分报告提及了pDNA保存时的稳定性(Proceedings of National Academy of Sciences of the USA，93，7305(1996))，但是，关于基因制剂的制造或制剂的稳定性至今还未进行过系统的探讨。如同后述的试验例所示，将单独含有pDNA，或者为提高pDNA导入效率或为延长基因表达时间而添加了化合物的基因配制品置于制剂化工艺中一般使用的冷冻干燥条件下，或者置于适当的保持其品质稳定的保存状态下的话，有效成分pDNA便被分解，生物活性显著受损。

发明公开

本发明者以获得稳定的基因制剂为目的进行了锐意研究，其结果发现，含有pDNA的溶液中添加了糖类和/或非疏水性氨基酸和/或具有2个以上羧基的有机酸(除氨基酸外)时，或者是在含有胶原或明胶时添加了氨基酸类的情况下，溶液状态的保存过程中和/或该溶液的冻结干燥工艺中和/或该溶液的干燥品在保存过程中其pDNA的分解受到了大大地抑制。基于此完成了本发明。

本发明一种方式是稳定的基因制剂，它含有所需的基因或导入了所需基因的载体、和至少一种糖类和/或至少一种非疏水性氨基酸和/或至少一种具有两个以上羧基的有机酸(氨基酸除外)。

具体的说糖类是单糖、二糖、三糖以上的寡糖或它们的糖醇。更具体地说它们是葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、山梨糖醇或甘露醇。

非疏水性氨基酸类具体地说是谷氨酸、天门冬氨酸或其盐。

含有一种具有两个以上羧基的有机酸具体为有2个或3个羧基的有机酸或他们的盐，更具体地是指柠檬酸或酒石酸。

导入了所需基因的载体具体地说是质粒DNA。

本发明的基因制剂也可以含有促进基因导入细胞的物质、或医学上允许的添加剂。促进基因导入细胞的物质有阳离子性脂质、阳离子性聚合物或疏水性聚合物。医学上允许的添加剂为有生物体亲和性的材料。

本发明的基因制剂中含有的所需基因或导入了所需基因的载体可以被生物体亲和性材料所担载。生物体亲和性材料具体地说是指胶原、明胶或它们的混合物。

本发明包括将含有所需基因或含有导入了所需基因的载体的溶液状态、凝胶状态或悬浊液状态的配制品经干燥工艺、最好是冻结干燥而得到的本发明基因制剂。

另外，本发明包括在溶液状态、凝胶状态或悬浊液状态的基因制剂或经过溶液状态、凝胶状态、或者是悬浊液状态的工艺制造的基因制剂中，在溶液状态、凝胶状态、或者是悬浊液状态中的糖类、非疏水性氨基酸类及有2个以上羧基的有机酸(氨基酸除外)类相对于总体的含量约为1W/V％以上的本发明基因制剂。

本发明的另一种方式涉及基因制剂稳定化的方法，该方法包括：向含有所需基因或导入了所需基因载体的基因配制品中加入至少一种糖类和/或至少一种非疏水性氨基酸和/或至少一种具有两个以上羧基的有机酸(氨基酸除外)。

进一步的，本发明的另一种方式涉及通过将本发明的基因制剂给予生物体进行基因治疗的方法。

本发明还有一种方式涉及含有所需基因或导入了所需基因的载体、至少含有一种氨基酸、及生物体亲和性材料、特别是胶原或明胶的稳定性基因制剂。相关的基因制剂进一步地可以含有促进基因导入细胞的物质，例如阳离子性脂质、阳离子性聚合物或疏水性聚合物。本发明包括有如下特征的基因制剂，该制剂的所需基因或导入了所需基因的载体被生物体亲和性材料、特别是胶原或明胶所担载为特征。

在这样的方式中本发明包括将含有所需基因或导入了所需基因的载体的溶液状态、凝胶状态或悬浊液状态的配制品经干燥状态特别是冻结干燥而得到的本发明基因制剂。

另外，本发明包括，在溶液状态、凝胶状态或悬浊液状态的基因制剂或者是经溶液状态、凝胶状态或悬浊液状态工程而制造的基因制剂中，溶液状态、凝胶状态或悬浊液状态中的氨基酸相对于总体的含量为1％W/V以上的本发明基因制剂。

作为另外一种方式，本发明涉及基因制剂稳定化的方法，包括向含有所需基因或导入了所需基因的载体和生体材料、特别是胶原或明胶的基因配制品中加入至少一种以上的氨基酸类。

作为另一种方式，本发明涉及将上述本发明基因制剂给与生物体的基因治疗方法。

图的简单说明

图1为含有氨基酸的基因制剂中(实施例1)所含pCAHST-1的一级结构评价结果的电泳照片。

图2为含有糖类的基因制剂中(实施例2)所含pCAHST-1的一级结构评价结果的电泳照片。

图3为含有带2个羧基的有机酸和氨基酸的基因制剂中(实施例3)所含pCAHST-1的一级结构评价结果的电泳照片。

图4为含有糖类和基因导入促进成分的基因制剂中(实施例4)所含pCAHST-1的一级结构评价结果的电泳照片。

图5为将含有糖类的基因制剂(实施例2)在40℃条件下保存后pCAHST-1的一级结构评价结果的电泳照片。

图6为含有糖类和基因导入促进成分的基因制剂(实施例4)经37℃4周保存后pCAHST-1的一级结构评价结果的电泳照片。

图7为含有糖类和基因导入促进成分的基因制剂(实施例5)经40℃4周保存后pCAHST-1的一级结构评价结果的电泳照片。

图8为含有胶原的海棉状基因制剂(实施例7)所含pCAHST-1的一级结构评价结果的电泳照片。

图9为含有胶原的棒状基因制剂(实施例8)所含pCAHST-1的一级结构评价结果的电泳照片。

图10为含有胶原的棒状基因制剂(实施例8)在血中pCAHST-1的检出时间的图。

图11为含有胶原的棒状基因制剂(实施例8)在血中HST-1浓度随时间变化的图。

图12为试验例10中投药部位的HST-1量随时间变化的图。

图13为实施例10在血中的血小板数随时间变化的图。

图14为含有氨基酸的基因制剂(实施例9)所含pCAHST-1冻结干燥时的稳定化度的图(试验例11)。

图15为含有糖类的基因制剂(实施例10)所含pCAHST-1冻结干燥时的稳定化度的图(试验例12)。

图16为含有脂肪变性(athero)胶原和氨基酸的基因制剂(实施例11)所含pCAHST-1冻结干燥时的稳定化度的图(试验例13)。

图17为含有脂肪变性胶原和糖类的基因制剂(实施例12)中pCAHST-1冻结干燥时的稳定化度(试验例14)。

图18为含有氨基酸的基因制剂(实施例9)和含有糖类基因制剂(实施例10)在40℃条件下保存时的pCAHST-1稳定化度的图(试验例15)。

图19为含有脂肪变性胶原和氨基酸的基因制剂(实施例11)和含有脂肪变性胶原和糖类的基因制剂(实施例12)在40℃条件下保存时的pCAHST-1稳定化度的图(试验例16)。

本发明的最佳实施方式

如上所述，本发明的主要内容是含有所需基因或导入了所需基因的载体和至少一种糖类和/或至少一种非疏水性氨基酸和/或至少一种有2个以上羧基的有机酸的稳定基因制剂；以及含有所需基因或导入了所需基因的载体、胶原或明胶及至少一种氨基酸类的稳定基因制剂。另一方面本发明的制剂是这些含有糖类、非疏水性氨基酸和/或有机酸，或者含有胶原或明胶及氨基酸使所含基因或载体更稳定的稳定化增强(分解抑制作用)制剂。

“所需基因”只要是可以进行基因治疗的基因便可。在此，所谓的基因治疗是指用基因进行治疗的意思。例如，基因治疗时编码要求表达的蛋白质遗传信息的基因、和细胞内特定的DNA及RNA相对应抑制基因表达的反义序列。反义序列不导入载体也可使用。

作为“导入了所需基因的载体”，在导入细胞的时候优选在细胞内表达编码的遗传信息的形态、含有启动子等表达目的基因所需的要素，或者含有可以导入染色体的要素，例如pDNA。

本发明的基因制剂中即使同时存在导入了其他所需基因的数种载体也可以。另外，一个载体即使编码了复数的遗传信息也可以。对基因制剂中含有的载体的量没有特别的限制。

基因治疗时编码要求表达的蛋白质的基因例如可以用于遗传病的处置的基因，如编码腺苷脱氨酶、脱氧胸腺嘧啶核苷酶等酶类，GM-CSF、IL-2等细胞因子类、或成纤维细胞增殖因子HST-1(FGF4)的基因，但并不仅仅限于这些因子。另外，作为基因治疗时编码要求表达的其他蛋白质的基因是以下述内容为目的基因。即以表达的蛋白质或肽为抗原诱导免疫反应，进行感染症或肿瘤的预防或治疗。也就是说，编码上述成为抗原的蛋白质或肽的基因，例如编码流感病毒的表面蛋白质HA和NA或核蛋白质NP的各种蛋白质、丙型肝炎病毒的E2和NS1蛋白质、乙型肝炎病毒的HBs抗原蛋白质、甲型肝炎病毒的衣壳蛋白质VP1和VP3、或者是类衣壳蛋白质、登革热病毒的Esp蛋白质、RS病毒的F或G蛋白质、狂犬病病毒的结构蛋白质G和N蛋白质、疱疹病毒的gD蛋白质、日本脑炎病毒的E1或pre-M蛋白质、轮状病毒的外壳蛋白质VP7和外壳蛋白质VP4、人免疫缺陷病毒的gp120和gp160蛋白质、利什曼原虫的主要表面抗原蛋白质、疟疾生殖芽胞的主要表面抗原蛋白质(circum sporozoite protein)、弓浆虫的54-kd和CS蛋白质、导致龋齿的Streptococcus mutans菌体表层蛋白质Pac的基因。另外，还有编码MAGE-1、MAGE-3或BAGE等癌退缩抗原、及酪氨酸酶、Mart-1、gp100、gp75等组织特异抗原、p15、Muc1、CEA、HPV E6、E7、HPR2/neu等的基因；以及“Immunization with DNA”：Journal of Immunological Methods，176卷，1994年，145-152页发表的基因核酸。但是，并不只限这些。

“糖类”是指医学上允许的单糖、二糖、三糖以上的寡糖或者这些糖的糖醇或它们的诱导体。只能添加到本发明的基因制剂中能改善制剂的稳定性，就不限定糖的种类。另外，本发明基因制剂可以含有两种以上糖类的混合物。

糖类中单糖例如葡萄糖、半乳糖、果糖等，优选葡萄糖；二糖优选蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖。

糖醇例如山梨糖醇、甘露醇。优选甘露醇。

糖的衍生物例如脱氧糖、氨基糖、磷酸脂类等、以及将这些作为构成成分的二糖。

“非疏水性氨基酸”是指氨基酸中具有非疏水性的氨基酸类。在此“非疏水性”是指和水的亲和性比较强的性质。本发明中以甘氨酸的水亲和性为基准，比它水亲和性强的性质称为“非疏水性”。其中将水亲和性数值化的指标记载于Kyte，J.& Doolittele，R.F.，1982在J.Mol.Biol.157，105-132。根据这一基准，不是非疏水性的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。“非疏水性氨基酸类”优选谷氨酰受、天门冬酰胺、谷氨酸钠、天门冬氨酸钠、脯氨酸。最优选谷氨酰胺、谷氨酸钠、天门冬氨酸钠。

含有胶原或明胶的本发明制剂中，“氨基酸类”是指医学上允许的氨基酸及其盐、以及它们的衍生物。如果通过添加到发明基因制剂中能改变制剂的稳定性的话，氨基酸的种类并不限于这些。氨基酸类不仅是谷氨酸或天门冬氨酸等酸性氨基酸，也包括一般氨基酸分类上的碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸、及酸性、碱性以外的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天门冬氨酰胺、谷氨酰胺、异亮氨酸、半胱胺酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸。因此，本发明中氨基酸类与其水溶液的性质无关，此外也包括存在碱性或中性侧链的氨基酸。氨基酸盐是指钠盐、钾盐等。含有胶原或明胶的本发明制剂中的“氨基酸类”优选谷氨酰胺、天门冬酰胺、谷氨酸钠、天门冬氨酸钠、脯氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸。更优选具有削弱胶原和DNA的静电相互作用的谷氨酸钠、天门冬氨酸钠、精氨酸、组氨酸、赖氨酸。最优选的为精氨酸、组氨酸。

“具有2个以上羧基的有机酸”是指医学上允许的有2个以上羧基的有机酸(氨基酸除外)及其盐，以及他们的衍生物。如果通过添加到本发明的基因制剂中能改善制剂的稳定性的话有机酸的种类除氨基酸外没有特别的限定。

具有2个以上羧基的有机酸及其盐优选含有2个或3个羧基的有机酸及其盐，更优选饱和或不饱和脂肪族的有机酸。2个或3个羧基的有机酸及其盐是指柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、延胡索酸及其盐，优选柠檬酸、酒石酸的盐。

本发明的基因制剂包括以下制剂。含有上述的糖类、非疏水性氨基酸类及有2个以上羧基的有机酸类中任何一种的制剂，以及含有它们当中任意2者或3者全含有的制剂。并且，任何情况下糖类、氨基酸类及有机酸类同时可以含有一种以上。

本发明的基因制剂中，糖类、非疏水性氨基酸类、含有2个以上羧基的有机酸类的各个含量，或将它们混合使用时的总体含量，或者是含有胶原或明胶的本发明基因制剂中氨基酸的含量最好设定在对本发明制剂中含有的基因或载体分解具有抑制效果的量以上。但是，可以根据该基因或载体的浓度及量或者基因制剂实施的方式进行适当的设定。例如，将pDNA以浓度10μg/ml溶解的NaCl 150mM、及10mM Tris-HCl(pH 7.4)溶液经冻结干燥后可得到目的基因制剂。或者是保存这样加工干燥的基因制剂时，应优选含有1％(W/V)以上的糖类和/或非疏水性氨基酸类和/或具有2个以上羧基的有机酸类溶液。其中，干燥前或实施干燥时溶液状态的基因制剂通常采用的pH范围为pH5-8，优选pH6-8，更优选pH7-8。

本发明的基因制剂可以添加医学上允许的添加剂或能够改善基因表达的物质。糖类、氨基酸类及有机酸类的量也可以根据这些添加剂的种类及量进行变动。

医学上允许的添加剂如生物体亲和材料或芝麻油、角鲨烯等油类，但并不仅限于此。

作为添加剂如果使用的生物体亲和材料能够担载基因或担载含有该基因载体的话，可以将本发明的基因制剂做成缓释性制剂。此处所说的生物体亲和性材料如，1)胶原、明胶、血纤维蛋白、白蛋白、透明质酸、肝素、硫酸软骨素、甲壳质、壳聚糖、海藻酸、果胶、琼脂糖及阿拉伯胶；2)乙醇酸、乳酸、氨基酸的聚合物及这些物质的两个以上的共聚物；及3)羟基磷灰石、聚甲基丙烯甲脂、聚二甲基硅氧烷、聚四氟乙稀、聚丙烯及聚稀等。但并不仅限于此。优选的例为胶原、明胶或它们的混合物。

此处的“担载”是指将所需基因或含有该基因的载体均匀地分散或包裹在生物体亲和性材料中。

能够改善基因表达的物质可以举出促进基因向细胞导入或促进基因向核移动的物质。前者例如，阳离子性脂质、阳离子性聚合物、疏水性聚合物等。“阳离子性脂质”如DOTMA(N-(1-(2，3-二(十八碳烯氧))丙基)-N-三甲基铵氯化物、DOSPA(2，3-二(十八碳烯氧)-N-[2-(精胺甲酰胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟醋酸盐)、DDAB(二甲基二(八甲苯基)铵溴化物)、TM-TPS(N，N^I，N^II，N^III-四甲基-N’，N”，N_-四软脂酰基精胺)、DMRIE(1，2-二肉豆蔻酰基氧丙基-3-二甲基羟乙基铵溴化物)、N-(α-三甲基铵乙酰基)-二(十二烷基)-D-谷氨酸盐氯化物(Biochemical Biophysical ResearchCommunication， 196，1042(1994)等，也可以使用这些阳离子性脂质和DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)等中性脂质构成的阳离子性脂质体，阳离子性脂质和胆固醇的混合物。“阳离子性聚合物”是和基因具有静电作用的聚合物，例如，DOGS(二(十八烷酰胺甘氨酰精胺)等脂聚胺、AlkCWK₁₈等肽、聚赖氨酸及其衍生物(Proceedings of Academy Sciences of the USA， 89，6094(1992))等阳离子聚氨基酸及其衍生物、聚乙烯亚胺、聚酰胺、枝接共聚物等。疏水性聚合物是和基因有疏水性相互作用的聚合物。例如，聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等。此外，AlkCWD₁₈等肽也可以使用。在此所指阳离子性脂质体如，以1∶1含有DOSPA和DOPE的LIPOFECTAMINE注册商标，Life Technologids，Inc.，罗可维尔，MD.USA)，以1∶1含有DOTMA和DOPE的脂质体，以1∶2.5含有DDAB和DOPE的LIPOFECTACE(注册商标，Life Technologise，Inc.，罗可维尔，MD.USA)，以1∶1.5含有TM-TPS和DOPE的CELLFECTIN(注册商标：Life Technologise，Inc.，罗可维尔，MD.USA)等，但并不限于这些。此外，此处所言阳离子性脂质和胆固醇的混合物以下列物质为例，如DMRIE和胆固醇的摩尔比为1∶1的混合物DMRIE-C(Life Technologise，Inc.，罗可维尔，MD.USA)。或者是为了抑制细胞内的核内体引起的基因分解，也可以使用具有将核内体的内容物放出的能力的惰性化病毒、CHEMS(胆固醇半琥珀酸吗啉盐)等。

作为促进基因向核移动的物质，如，HMG-1、2混合物等(highmobility group-1，2mixture：实验医学，12，184(1994))。

关于本发明的基因制剂的形态没有特殊的限制，例如，可以是溶液状、悬浊状、凝胶状、海棉状、粉末状、微粒状、棒状、膜状等形态。

溶液状基因制剂的制造方法可例举如下：

1)按需要在添加了添加剂并含有所需基因或含该基因的载体的溶液中加入糖类和/或非疏水性氨基酸和/或具有2个以上羧基的有机酸类，经溶解后制得均一的、溶液状态的基因制剂的方法；及

2)按需要在添加了添加剂并含有所需基因或含该基因的载体的溶液中加入糖类和/或非疏水性氨基酸和/或具有2个以上羧基的有机酸类，经混合后制得均一的、溶液状态的基因制剂的方法。

或也包括这样的方法，即在含有胶原或明胶的溶液中，添加已按需要添加了添加剂并含有所需的基因或含该基因的载体的溶液及氨基酸类或氨基酸类的溶液，经溶解或混合后制得均一的、溶液状态的基因制剂。

微粒状基因制剂的制造方法可例举如下：

1)将含有所需基因或含该基因的载体、糖类和/或非疏水性氨基酸和/或具有2个以上羧基的有机酸类，及按需要添加了添加剂的溶液进行喷雾干燥的方法；及

2)将含有所需基因或含该基因的载体、糖类和/或非疏水性氨基酸和/或具有2个以上羧基的有机酸类，及按需要添加了添加剂的溶液进行冻结干燥、然后将得到的海棉状物进行粉碎的方法；

或也包括这样的方法，即在含有胶原或明胶的溶液中，添加已按需要添加了添加剂并含有所需基因或含该基因的载体的溶液及氨基酸类或氨基酸类的溶液，经溶解或混合后，将得到的溶液进行喷雾干燥、或将该溶液冻结干燥，再将冻结干燥品进一步地粉碎的方法。

棒状基因制剂的制造方法可例举如下：

1)将含有所需基因或含该基因的载体、糖类和/或非疏水性氨基酸和/或具有2个以上羧基的有机酸类，及按需要添加了添加剂的溶液经喷雾干燥后制得微粒子，然后将微粒子压缩成棒状的方法。

2)将含有所需基因或含该基因的载体、糖类和/或非疏水性氨基酸和/或具有2个以上羧基的有机酸类，及按需要添加了添加剂的溶液进行冻结干燥得到的海棉状物、然后将其粉碎成微粒子后再压缩成棒状的方法。

3)将含有所需基因或含该基因的载体、糖类和/或非疏水性氨基酸和/或具有2个以上羧基的有机酸类，及按需要添加了添加剂的溶液进行冻结干燥，然后将得到的海棉状物再压缩成棒状的方法。

4)将含有所需基因或含该基因的载体、糖类和/或非疏水性氨基酸和/或具有2个以上羧基的有机酸类，及按需要添加了添加剂的溶液进行冻结干燥，将得到的海棉状物加入水等后进行混炼，然后从喷咀孔挤压出棒状物，最后再干燥的方法。

5)将含有所需基因或含该基因的载体、糖类和/或非疏水性氨基酸和/或具有2个以上羧基的有机酸类，及按需要添加了添加剂的溶液进行冻结干燥，将得到的微粒子和液状或具有粘和性软膏状的硅酮混合，加入硬化剂，然后从喷咀孔挤压出棒状物的方法。

或者是在含有胶原或明胶的情况下，也包括在上述方法中除了使用胶原或明胶及氨基酸类以外其他同样的方法。

本发明的基因制剂可以按治疗目的的疾患、目标器官等以各种方法给药。例如，可以进行皮下、肌肉内等给药，或者是可以直接对肾脏、肝脏、肺、脑等患病的对象部位直接给药。如果直接对患病部位给药的话就可以进行器官选择性治疗。

以下，以使用质粒DNA(pDNA)作为含有所需基因的载体的场合为例，说明本发明得到的基因制剂。

1)将单独含有pDNA或含有除pDNA与糖类、非疏水性氨基酸类及具有2个羧基以上的有机酸类以外的添加物(医学上允许的添加剂、生物体亲和性材料、促进基因导入的物质等)的溶液进行一般的冻结干燥制剂化时，无论哪种情况冻结干燥后都能观察到pDNA分解。而组成中含有糖类和/或非疏水性氨基酸类和/或具有2个羧基以上的有机酸类进行冻结干燥时，与组成中不含这些物质时进行冻结干燥相比pDNA分解被抑制了。

2)将单独含有pDNA或含有除pDNA与糖类、非疏水性氨基酸类及具有2个羧基以上的有机酸类以外的添加物(医学上允许的添加剂、生物体亲和性材料、促进基因导入的物质等)的溶液进行干燥，得到的干燥品在40℃条件下保存时，无论哪种情况都能观察到pDNA分解。而将组成中含有糖类和/或非疏水性氨基酸类和/或具有2个羧基以上的有机酸类的溶液经干燥得到的制品进行保存时，与不含这些物质时相比pDNA分解被抑制了。

3)将含有pDNA和胶原或明胶的溶液制剂化、进行常规的冻结干燥时，无论哪种情况冻结干燥后都观察到pDNA的分解。而组成中含有氨基酸类的溶液进行冻结干燥时与组成中不含这些物质的溶液进行冻结干燥时相比pDNA分解被抑制了。

4)将含有pDNA和胶原或明胶的溶液经干燥得到的制品置于40℃条件下保存时，无论哪种情况都观察到pDNA的分解。而将组成中含有氨基酸类溶液经干燥得到的制品进行保存时，与不含这些物质的相比pDNA分解被抑制了。

象这样以含有糖类和/或非疏水性氨基酸和/或具有2个羧基以上的有机酸类组成使pDNA稳定化的效果不止限于上述干燥工艺及干燥状态下的保存，即使是溶液状态也能得到同样的效果。特别是组成中含有以提高基因导入效率为目的而使用的阳离子脂质时其效果更显著。即，

5)将单独含有pDNA或含有除pDNA与糖类、非疏水性氨基酸类及具有2个羧基以上的有机酸类以外的添加物(医学上允许的添加剂、生物体亲和性材料、促进基因导入的物质等)及含有阳离子脂质类组成的溶液以溶液状态保存时，无论哪种情况都能观察到pDNA的分解。而将组成中含有糖类和/或非疏水性氨基酸类和/或具有2个羧基以上的有机酸类的组成溶液保存时，与不含这些物质时相比pDNA分解被抑制了。

前述的有关本发明制剂的基因分解抑制(稳定化)效果在后述的试验例和表9有更具体的阐述。

另外，将在本发明中得到的编码HST-1/FGF4的pDNA和胶原及葡萄糖构成的棒状基因制剂对小鼠的肌肉内给药时，给药后38日内血中始终检出了pDNA，给药60天后在血中及给药部位有HST-1的基因表达。另一方面，以溶液态给与pDNA时，给药后仅30天有HST-1的表达。这一结果表明，pDNA从胶原及葡萄糖构成的棒状的基因制剂中被缓慢的释放，同时，在基因制剂内能长期间稳定地保存。

实施例

以下举实施例、参考例及试验例更详细地说明本发明。但是，本发明并不受这些实施例及试验例的限定。

在以下的实施例中就制剂的制备进行说明。该制剂含有导入了成纤维细胞增殖因子HST-1(FGF4)基因(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，2980-2984(1987)的质粒载体pCAHST-1。现已明确HST-1基因产物对巨核细胞具有血小板增加因子的作用，能有效地抑制癌的化疗和放疗时的严重副作用——血小板减少症(J.Clin.Invest.，96：1125-2230，1995，Oncogene，13：9-19，1996)。pCAHST-1是在表达载体pCAGGS(Gene，108，193-200(1991))的CAG启动子部分和聚合A序列间导入了HST-1基因的质粒载体。其中，CAG启动子作为高表达的载体已登记在特开平3-168087号公报中。

实施例1

含有氨基酸的基因制剂(干燥状态)

分别调制含有10μg/ml的pCAHST-1及10mg/ml的甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸钠或赖氨酸盐酸盐的150mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH 7.4)溶液。将调制的溶液1ml经-40℃冻结后，在室温、负压下干燥一夜，由此冻结干燥制备干燥状态的基因制剂。

实施例2

含有糖类的基因制剂(干燥状态)

分别调制含有10μg/ml的pCAHST-1及10mg/ml的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖或甘露醇的150mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.4)溶液。将调制的溶液1ml经-40℃冻结后，室温、负压下干燥一夜，由此冻结干燥制备干燥状态的基因制剂。

实施例3

含有2个以上羧基的有机酸及氨基酸类的基因制剂(干燥状态)

分别调制含有10μg/ml的pCAHST-1及10mg/ml的谷氨酸钠、天门冬氨酸钠、酒石酸钠二水合物或柠檬酸三钠二水合物的150mMNaCl、10mM Tris-HCl(pH 7.4)溶液。将调制的溶液1ml经-40℃冻结后，室温负压下干燥一夜，由此冻结干燥制备干燥状态的基因制剂。

实施例4

含有糖类及阳离子性脂质的基因制剂(干燥状态)

分别调制含有3μg/ml的pCAHST-1、24μg/ml的DMRIE-C(Gibco BRL公司制，基因导入促进成分)及10mg/ml蔗糖的150mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH 7.4)溶液。将调制的溶液1ml经-40℃冻结后，在室温负压下干燥一夜，由此制备干燥状态的基因制剂。

实施例5

含有糖类及基因导入促进成分的基因制剂(溶液状)向150mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH 7.4)溶液中分别加入pCAHST-1、DMRIE-C(Gibco BRL公司制)及蔗糖，并混合，使其最终浓度分别为3μg/ml的、24μg/ml、10mg/ml。由此制备液状基因制剂。

实施例6

缓释性基因制剂(凝胶状)

向0.1w/w％脂肪变性胶原溶液(500mg)中分别加入100μg/ml的pCAHST-1溶液(200μl)及10mg/ml葡萄糖、蔗糖或谷氨酸一钠溶液(500μl)，混合后37℃下保温，由此制备凝胶状基因制剂。其中，本实验例及以下的实施例、参考例中使用的脂肪变性胶原可以从高研(股份公司)获得。

实施例7

缓释性基因制剂(海棉状)

将实施例6制备的含有葡萄糖的凝胶状基因制剂进行了冻结干燥。由此得到含有500μg脂肪变性胶原、20μg pCAHST-1、5mg葡萄糖、蔗糖或谷氨酸钠盐的海棉状基因制剂。

实施例8

缓释性基因制剂(棒状)

向0.86w/w％脂肪变性胶原溶液(29.1g)中分别加入60g水、11mg/ml的葡萄糖溶液(10ml)，混合，然后加入100μg/m1的pCAHST-1溶液(80ml)，混合。将得到的溶液进行冻结干燥。在干燥品中加入适当的蒸馏水进行混炼，然后将混炼制品放入注射器中挤出成型，再干燥获得pCAHST-1的收率为74％的制剂。即获得每1mg含有17μg pCAHST-1、300μg葡萄糖的棒状基因制剂。

参考例1

除不加氨基酸外，按实施例1记录的操作，制备了干燥状态的组合物。

参考例2

除不加蔗糖外，按实施例4记录的操作，制备了干燥状态的组合物。

参考例3

除不加葡萄糖外，按实施例5记录的操作，获得了液状的组合物。

参考例4

除不加糖类溶液或谷氨酸一钠溶液外，按实施例6及7记录的操作，获得了含有500μg的脂肪变性胶原及20μg pCAHST-1的海棉状组合物。

参考例5

除不加葡萄糖溶液外，按实施例8记录的操作，获得了每1mg含有20μg pCAHST-1的棒状干燥组合物。

参考例6

除不加pCAHST-1溶液外，按实施例8记录的操作，获得了每1mg含有300μg葡萄糖的棒状干燥组合物。

试验例1

冻结干燥时氨基酸抑制基因分解的效果

将实施例1的基因制剂及参考例1的组合物在冻结干燥后溶解于水，进行琼脂糖电泳，评价pCAHST-1的一级结构。

琼脂糖电泳是采用水平型电泳仪(Mupid，Adobansu(股份公司))，在TAE缓冲液中用0.8％琼脂糖进行的。电泳后，用溴化乙锭进行了染色，然后在透射仪上进行了照相。其成象用扫描仪扫描，用解析软件算出了一级结构完好的超卷曲型pDNA(CC)和被切断的pDNA(OC)的所有谱带的强度，CC比率，即计算了一级结构的保持率(CC保持率)。此时，将没有处理的pDNA(CC)保持率设为100％。在试验例2以后进行琼脂糖电泳时也用了这一方法。

得到的结果列入表1和图1。图中，CC表示一级结构保持完整的超卷曲型的pCAHST-1，OC表示被切断了的pCAHST-1。各泳道所示内容如下：

泳道1：分子量参照物(λHind III)

泳道2：无添加(参考例1)

泳道3：谷氨酸一钠(实施例1)

泳道4：甘氨酸(实施例1)

泳道5：丙氨酸(实施例1)

泳道6：苯丙氨酸

泳道7：赖氨酸盐酸盐(实施例1)

泳道8：无处理

表1

含有氨基酸的pCAHST-1溶液冻结干燥后的CC保持率(％无处理)

              处方                           CC保持率(％无处理)

          无添加(参考例1)                           72

          谷氨酸钠(实施例1)                         96

          甘氨酸(实施例1)                           79

          丙氨酸(实施例1)                           83

          苯丙氨酸                                  73

          赖氨酸盐酸盐(实施例1)                     84

          无处理                                    100

结果表明，制剂中添加谷氨酸一钠与无添加氨基酸的制剂相比，pCAHST-1的分解被抑制了。

试验例2

冻结干燥时糖类抑制基因分解的效果

将实施例2的基因制剂及参考例1的组合物在冻结干燥后溶于水。按试验例1的操作通过琼脂糖电泳评价pCAHST-1的一级结构。结果如表2和图2所示。结果表明，与未添加糖类相比，加入葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖及甘露醇制剂其pCAHST-1的分解被大幅度地抑制了。

表2

pCAHST-1含糖溶液冻结干燥后的CC保持率(％无处理)

              处方                        CC保持率(％无处理)

          无添加(参考例1)                         78

          葡萄糖(实施例2)                         95

          蔗糖(实施例2)                           96

          麦芽糖(实施例2)                         95

          乳糖(实施例2)                           100

          甘露醇(实施例2)                         95

          无处理                                  100

图2中，CC表示一级结构保持完整超卷曲型的pCAHST-1，OC表示被切断了的pCAHST-1。各泳道所示内容如下

泳道1：分子量参照物(λHind III)

泳道2：无添加(参考例1)

泳道3：蔗糖(实施例2)

泳道4：蔗糖(实施例2)

泳道5：麦芽糖(实施例2)

泳道6：乳糖(实施例2)

泳道7：甘露醇(实施例2)

泳道8：无处理

试验例3

冻结干燥时具有2个以上羧基的有机酸及氨基酸抑制基因分解的 效果

将实施例3的基因制剂及参考例1的组合物在冻结干燥后溶于水。按试验例1的操作通过琼脂糖电泳评价pCAHST-1的一级结构。结果如表3和图3所示。结果表明，与未添加有机酸的制剂相比，加入谷氨酸一钠、天门冬氨酸钠、酒石酸钠二水合物或柠檬酸三钠二水合物的制剂其pCAHST-1的分解被大幅度地抑制了。

表3

含有具有2个以上羧基的有机酸及氨基酸的pCAHST-1缓冲液冻结干燥后的CC保持率(％无处理)

              处方                  CC保持率(％无处理)

         无添加(参考例1)                     76

         谷氨酸一钠(实施例3)                 103

         天门冬氨酸钠(实施例3)               91

         酒石酸钠二水合物(实施例3)           95

         柠檬酸三钠二水合物(实施例3)         102

         无处理                              100

图3中，CC表示一级结构保持完整超卷曲型的pCAHST-1，OC表示被切断了的pCAHST-1。各泳道所示内容如下：

泳道1：分子量参照物(λHind III)

泳道2：无添加(参考例1)

泳道3：谷氨酸一钠(实施例3)

泳道4：天门冬氨酸钠(实施例3)

泳道5：酒石酸钠二水合物(实施例3)

泳道6：柠檬酸三钠二水合物(实施例3)

泳道7：无处理

试验例4

含有阳离子性脂质的基因溶液在冻结干燥时蔗糖抑制基因分解 的效果

将实施例4的基因制剂及参考例2的组合物在冻结干燥后溶于水。按试验例1的操作通过琼脂糖电泳评价pCAHST-1的一级结构。结果如表4和图4所示。结果表明，与未添加的制剂相比，加入蔗糖抑制了pCAHST-1的分解。

表4

含有阳离子性脂质的pCAHST-1溶液冻结干燥后的CC保持率(％无处理)

            处方                  CC保持率(％无处理)

       无添加(参考例2)                    69

       蔗糖(实施例4)                      100

       无处理                             100

图4中，CC表示一级结构保持完整超卷曲型的pCAHST-1，OC表示被切断了的pCAHST-1。各泳道所示内容如下：

泳道1：分子量参照物(λHind III)

泳道2：无添加(参考例2)

泳道3：蔗糖(实施例4)

泳道4：无处理

试验例5

40℃保存时葡萄糖抑制基因分解的效果(1)

将实施例2基因制剂中的葡萄糖处方的干燥制剂及参考例1的组合物在40℃条件下保存1、2及4周。保存后的pCAHST-1一级结构按试验例1的操作通过琼脂糖电泳评价。结果如表5和图5所示。结果表明，与未添加葡萄糖的制剂相比，加入葡萄糖的制剂在相关条件下其pCAHST-1的保存稳定性被大幅度地改善了。

表5

含有葡萄糖的pCAHST-1干燥品在40℃保存后的CC保持率(％无处理)

            处方                      CC保持率(％无处理)

        无添加(参考例1/40℃-1周)               67

        无添加(参考例1/40℃-2周)               56

        无添加(参考例1/40℃-4周)               34

        蔗糖(实施例2/40℃-1周)                 92

        蔗糖(实施例2/40℃-2周)                 91

        蔗糖(实施例2/40℃-4周)                 71

        无处理                                 100

图5中，CC表示一级结构保持完整超卷曲型的pCAHST-1，OC表示被切断了的pCAHST-1。各泳道所示内容如下：

泳道1：分子量参照物(λHind III)

泳道2：无添加(参考例1/40℃-1周)

泳道3：无添加(参考例1/40℃-2周)

泳道4：无添加(参考例1/40℃-4周)

泳道5：蔗糖(实施例2/40℃-1周)

泳道6：蔗糖(实施例2/40℃-2周)

泳道7：蔗糖(实施例2/40℃-4周)

泳道8：无处理

试验例6

37℃保存时蔗糖抑制基因分解的效果

将实施例4基因制剂及参考例2的组合物在37℃条件下保存4周。保存后的pCAHST-1一级结构按试验例1的操作通过琼脂糖电泳评价。结果如表6和图6所示。结果表明，与未添加蔗糖的制剂相比，添加了蔗糖的制剂在相关条件下其pCAHST-1的保存稳定性被大幅度地改善了。

表6

        含阳离子性脂质的pCAHST-1干燥品

      在37℃-4周保存后的CC保持率(％无处理)

                处方                      CC保持率(％无处理)

        无添加(参考例2/37℃-4周)                 8.5

        蔗糖(实施例4/37℃-4周)                   67

        无处理                                   100

图6中，CC表示一级结构保持完整超卷曲型的pCAHST-1，OC表示被切断了的pCAHST-1。各泳道所示内容如下：

泳道1：分子量参照物(λHind III)

泳道2：无添加(参考例2/37℃-4周)

泳道3：蔗糖(实施例4/37℃-4周)

泳道4：无处理

试验例7

40℃保存时葡萄糖抑制基因分解的效果(2)

将实施例5的液状基因制剂及参考例3的组合物在40℃条件下保存4周。保存后的pCAHST-1一级结构按试验例1的操作通过琼脂糖电泳评价。结果如图7所示。结果表明，与试验例5的干燥制剂相同，与未添加葡萄糖的制剂相比，加入葡萄糖的制剂在相关条件下其pCAHST-1的保存稳定性被大幅度地改善了。

图7中，CC表示一级结构保持完整超卷曲型的pCAHST-1，OC表示被切断了的pCAHST-1。各泳道所示内容如下：

泳道1：无处理

泳道2：葡萄糖(实施例5/40℃-4周)

泳道3：无添加(参考例3/40℃-4周)

泳道4：分子量参照物(λHind III)

试验例8

含有胶原时糖类等抑制基因分解的效果(1)

将实施例7的海棉状基因制剂及参考例4的海棉状组合物用150mM的NaCl，10mM Tris-HCl(pH 7.4)的溶液加热溶解，然后用胶原酶处理。处理后，按试验例1的操作通过琼脂糖电泳评价了pCAHST-1一级结构。结果表明，与未添加糖类的制剂相比，葡萄糖、蔗糖及谷氨酸钠的添加制大幅度地抑制了pCAHST-1的分解(图8、表7)。

表7

含有胶原、糖类及氨基酸的pCAHST-1溶液冻结后的CC保持率(％无处理)

           处方                 CC保持率(％无处理)

      无添加(参考例4)                  85

      葡萄糖(实施例7)                  94

      蔗糖(实施例7)                    95

      谷氨酸一钠(实施例7)              95

      无处理                           100

图8中，CC表示一级结构保持完整超卷曲型的pCAHST-1，OC表示被切断了的pCAHST-1。各泳道所示内容如下：

泳道1：分子量参照物(λHind III)

泳道2：葡萄糖(实施例7)

泳道3：蔗糖(实施例7)

泳道4：谷氨酸一钠(实施例7)

泳道5：无添加(参考例4)

泳道6：无处理

试验例9

含有胶原时糖类等抑制基因分解的效果(2)

将实施例8的棒状基因制剂及参考例5的棒状组合物用137mM的NaCl，2.7mM KCl，25mM Tris-HCl(pH 7.4)的溶液加热溶解，然后用胶原酶处理。处理后，按试验例1的操作通过琼脂糖电泳评价了pCAHST-1一级结构。结果表明，与未添加糖类的制剂相比，葡萄糖添加到制剂中大幅度地抑制了pCAHST-1的分解(图9、表8)。

表8

棒状组合物中含有的pCAHST-1的CC保持率(％无处理)

           处方                     CC保持率(％无处理)

      无添加(参考例5)                     66

      葡萄糖(实施例8)                     92

      无处理                              100

图9中，CC表示一级结构保持完整超卷曲型的pCAHST-1，OC表示被切断了的pCAHST-1。各泳道所示内容如下：

泳道1：分子量参照物(λHind III)

泳道2：无添加①(参考例5)

泳道3：无添加②(参考例5)

泳道4：葡萄糖①(实施例8)

泳道5：葡萄糖②(实施例8)

泳道6：无处理

试验例10

应用了稳定基因制剂的基因导入

将实施例8的棒状基因制剂(脂肪变性胶原/葡萄糖-pCAHST-1)及参考例5的棒状组合物(脂肪变性胶原-pCAHST-1)分别切断，使之含有50μg的pCAHST-1。然后将它们注入ICR小鼠(雌性，6-7周龄)的右大腿部肌肉内。(给药组1：实施例8的基因制剂；给药组2：参考例5的组合物)。另外，将含有50μg的pCAHST-1磷酸缓冲液100μl也注入小鼠的右大腿部肌肉内(给药组3)。

为了调查活体内的缓释效果，利用了血液中pCAHST-1的检测值、血液中及给药部位的HST-1量及血液中的血小板数3个测定值。血液中pCAHST-1的检测利用了PCR法；血液中及给药部位的HST-1量用ELISA法进行了测定；血液中的血小板数在显微镜下进行了计数分析。并分析了它们随时间的变化。

PCR法利用Ampridirect法(岛津制作所)，使用了检测pCAHST-1(约8kbp)中的262bp的探针。测定极限Southern印迹法为1pg/5μl，采用溴化乙锭染色为2pg/5μl。ELISA法使用了FGF4试剂盒(R&D Systems公司，美国，检量限为20pg/ml)。血小板数的测定是在采血后，将血小板以外的血球成分分解处理，然后在显微镜下计数进行实施的。

根据PCR法测得血中pCAHST-1的结果如图10所示。给药组1血中的pCAHST-1从给药6小时后被检测出来，并且在以后的38天内一直可以检出。给药组2血中的pCAHST-1从给药6小时后被检测出来，在以后的18天内一直可以检出。而给药组3的血中只在给药后7日间检出了pCAHST-1。

血中及给药部位的HST-1的含量测定结果分别如图11，图12所示。图11中各记号代表的内容如下：圆圈：脂肪变性胶原/葡萄糖-pCAHST-1(给药组1，实施例8)；黑圆：脂肪变性胶原-pCAHST-1(给药组2，参考例5)；黑正方形：含有pCAHST-1的磷酸缓冲液(给药组3，对照例)；正方形：脂肪变性胶原/葡萄糖(参考例6)。

图12中各记号代表的意思如下，圆圈：脂肪变性胶原/葡萄糖-pCAHST-1(给药组1，实施例8)；黑圆：脂肪变性胶原-pCAHST-1(给药组2，参考例5)；黑正方形：含有pCAHST-1的磷酸缓冲液(给药组3，对照例)；正方形：脂肪变性胶原/葡萄糖(参考例6)。

给药组1中，血中及给药部位的HST-1含量在给药后都增加了，30天达到最大后开始渐渐地减少，但60日后也有检出。给药组2中，与给药组1同样血中及给药部位的HST-1含量在给药后都增加了，30天达到最大后开始渐渐地减少，40天后几乎达到检出极限，总体上与给药组1相比产生的HST-1的量少。给药组3中血中及给药部位的HST-1含量在给药后都增加了，10天达到最大值后渐渐地减少，30天后没能检出。

血小板数值随时间变化的测定结果(图13)，在给药组1中，血小板数在给药后增加了，30天达到最大后渐渐地减少，但60天后也维持增加倾向。给药组2的血小板数在给药后渐渐地增加，14天达到最大后减少，28天以后一边维持低值一边维持增加的倾向。给药组3的血小板数在给药后增加，10天达到最大后渐渐地减少，25天内恢复到正常值。

图13中各记号代表的意思如下：圆圈：脂肪变性胶原/葡萄糖-pCAHST-1(给药组1，实施例8)；黑圆：脂肪变性胶原-pCAHST-1(给药组2，参考例5)；黑正方形：含有pCAHST-1的磷酸缓冲液(给药组3，对照例)；正方形：胶原/葡萄糖(参考例6)。

作为对照是将不含pCAHST-1的参考例6的组合物与上述方法同样注入小鼠的右大腿部肌肉内，给药后，用ELISA法测定了血中及给药部位的HST-1含量，及血小板数随时间的变化。其结果，在测定期间血中及给药部位的HST-1没能检出。并且，测定期间血小板数没有增加。这一结果表明，使用实施例8的基因制剂得到的给药组1及给药组2的HST-1的产生及血小板数的增加是由于制剂中含有的pCAHST-1被导入细胞并在细胞内表达了HST-1的遗传信息所至。

从给药组1和给药组3的结果可以判断，将pCAHST-1单独给药时，由HST-1的体内表达及产生HST-1引起的生物学的效果是一时性的，与此相反，实施例8的基因制剂则长时间地缓释pCAHST-1，同时，在体内保持稳定并延长HST-1的表达期，并且能长期间地维持由产生的HST-1引起的生物学效果。

从给药组1和给药组3的结果可以判断，与将pCAHST-1单独给药相比，实施例8和参考例5的基因制剂均在缓释pCAHST-1的同时还能够延长HST-1的表达期。但是，含有葡萄糖的实施例8的基因制剂与参考例5的基因制剂相比，在体内稳定地保持pCAHST-1，以高产量延长维持HST-1的表达期，由此，能够长时间地、以更高的状态维持由HST-1引起的生物学效果。

以下，就实施例9-12制备的配制品进行了试验例11-16，主要研究了在胶原存在或不存在的条件下氨基酸或糖类对基因稳定性的贡献。

实施例9

含有氨基酸的基因制剂(干燥状态)

分别调制含有10μg/ml的pCAHST-1及10mg/ml的精氨酸、赖氨酸盐酸盐、天门冬酰胺、天门冬酸钠、谷氨酸、谷氨酸钠、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或含有5mg/ml亮氨酸150mM NaCl、10mMTris-HCl(pH7.4)溶液，将调制的溶液1ml在-40℃下冻结后，在室温以减压的形式干燥液。根据这样的冻结干燥工艺制备干燥状态的基因制剂。

实施例10

含有糖类的基因制剂(干燥状态)

分别调制含有10μg/ml的pCAHST-1及10mg/ml的海藻糖、麦芽糖醇、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、山梨糖醇、硫酸钠软骨素或木糖醇的150mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH 7.4)溶液。将调制的溶液1ml置于-40℃条件下冻结，然后在负压、室温下干燥一夜，经过这样冻结干燥后，可得到干燥状态的基因制剂。

实施例11

含有氨基酸的缓释性基因制剂(海棉状)

分别调制在0.1w/w％脂肪变性胶原溶液中(500mg)混合了20μg/ml的pCAHST-1(1ml)及40mg/ml的精氨酸、赖氨酸盐酸盐、天门冬酰胺、天门冬氨酸钠、谷氨酰胺、谷氨酸钠、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或20mg/ml的亮氨酸溶液(125ml)。将调制的溶液1ml置于-40℃条件下冻结，然后在负压、室温下干燥一夜，经过这样冻结干燥后，制备了海棉状的基因制剂。

实施例12

含有糖类的缓释性基因制剂(海棉状)

分别调制在0.1w/w％脂肪变性胶原溶液中(500mg)混合了20μg/ml的pCAHST-1(1ml)及40mg/ml的海藻糖、麦芽糖醇、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、山梨糖醇、硫酸钠软骨素或木糖醇溶液(125μl)。将调制的1ml溶液置于-40℃条件下冻结，然后在负压、室温下干燥一夜，经过这样冻结干燥后，制备了海棉状的基因制剂。

试验例11

冻结干燥时氨基酸抑制基因分解的效果

将实施例9的基因制剂及参考例1的组合物在冻干过后溶于水，按试验例1的操作进行琼脂糖电泳解析了pCAHST-1的一级结构。电泳后进行了溴化乙锭染色，然后在反转施照器上进行了照相。其成相用扫描仪扫描，用解析软件算出了一级结构完好的超卷曲型pDNA(CC)和一处被切断的松弛型pDNA(OC)、以及进一步被切断、成开环状的直线型DNA(LS)的谱带强度，按下式计算了添加氨基酸引起的稳定化度的变化。结果如图14所示。图14中的氨基酸顺序为疏水亲水度的顺序(Hyte，J.& DOOLittel，R.F.，1982，J.Mol.Biol.157，105-132)。结果表明添加精氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸钠、谷氨酰胺、谷氨酸钠、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸的制剂与未添加氨基酸的制剂相比pCAHST-1的分解被抑制了。

试验例12

冻结干燥时糖类抑制基因分解的效果

将实施例10的基因制剂及参考例1的组合物在冻结干燥后溶解于水中，按试验例11操作进行琼脂糖电泳解析了pCAHST-1的一级结构。和试验例11算出稳定化度，其结果如表15所示。结果表明，添加糖类的制剂与未添加糖类的制剂相比pCAHST-1的分解被抑制了。

试验例13

含有胶原时氨基酸类抑制基因分解的效果

将实施例11的海棉状的基因制剂及参考例4的海棉状组合物用150mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH 7.4)溶液加热溶解，用胶原酶作了处理。处理后，按试验例11操作进行琼脂糖电泳评价了pCAHST-1的一级结构。和试验例11同样算出稳定化度，其结果如表16所示。图16中的氨基酸的顺序是疏水亲水度的顺序(Kyte，J.&Doolittele，R.F.，1982，J.Mol.Biol.157，105-132)。结果表明，与未添加氨基酸的制剂相比，制剂中添加氨基酸能大幅度地抑制pCAHST-1的分解。

试验例14

含有胶原时糖类抑制基因分解的效果

将实施例12海棉状的基因制剂及参考例4的海棉状组合物用150mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH 7.4)溶液加热溶解，用胶原酶作了处理。处理后，按试验例11操作进行琼脂糖电泳评价了pCAHST-1的一级结构。和试验例11同样算出稳定化度，其结果如表17所示。与未添加糖类的制剂相比，制剂中添加糖类能大幅度地抑制pCAHST-1的分解。

试验例15

40℃保存时氨基酸及糖类抑制基因分解的效果

将实施例9基因制剂中的天门冬氨酸钠、谷氨酸一钠、脯氨酸、谷氨酰氨处方的干燥状态制剂和实施例10基因制剂中的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇处方的干燥状态制剂，以及参考例1的组合物置于40℃条件下保存1、2及4周。保存后的pCAHST-1的一级结构按试验例1的操作利用琼脂糖电泳进行了评价。结果表明，制剂中添加非疏水性氨基酸类或糖类与未添加的制剂相比，有关实施添加处理制剂子中的pCAHST-1保存稳定性得到了大幅度改善。

试验例16

含有胶原基因制剂在40℃保存时氨基酸及糖类抑制基因分解的 效果

将实施例11海棉状基因制剂中的赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、组氨酸处方的干燥状态制剂和实施例12的海棉状基因制剂中的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇处方的干燥状态制剂，以及参考例4的海棉状组合物置于40℃条件下保存1、2及4周。保存后的pCAHST-1的一级结构按试验例13的操作利用琼脂糖电泳进行了评价。其结果如图19所示。结果表明，制剂中添加氨基酸类或糖类与未添加的制剂相比，有关实施添加处理制剂子中的pCAHST-1保存稳定性得到了大幅度改善。

发明效果

将试验例1到9得到的本发明制剂抑制基因分解的效果(稳定化)整理列于表9。

表9

本发明制剂中抑制基因分解的效果

(1)冻结干燥时的稳定性

①无添加剂时                    a)                     b)

    对照                       72％                  (76％)

  氨基酸类       甘氨酸        79％

                 丙氨酸        83％

                 赖氨酸        84％

                 天门冬氨酸                          (91％)

                 谷氨酸        96％                  (103％)

                                c)

   对照                        78％

   糖类          葡萄糖        95％

                 蔗糖          96％

                 麦芽糖        95％

                 乳糖          100％

                 甘露醇        95％

                                b)

   对照                        76％

 有机酸类：      酒石酸        95％

                 柠檬酸        102％

②有添加剂时：

   (胶原)                       d)

    对照                       85％

稳定剂：              葡萄糖                94％

                      蔗糖                  95％

                      谷氨酸                95％

(DMRICE-C)                                   e)

  对照                                      69％

 稳定剂：             蔗糖                  100％

[注]a)试验例1(表1)、b)试验例3(表3)、c)试验例2(表2)、d)试验例8(表7)、e)试验例4(表4)

(2)冻结干燥制剂的保存稳定性

①无添加剂时              c)           f)          f)         f)

(40℃)                 (冻干时)      一周后      二周后     四周后

对照                    (78％)        67％         56％      34％

稳定剂：                葡萄糖

                        (95％)        92％         91％      71％

②有添加剂(DMRIE-C)时：

(37℃)                     e)                g)

                       (冻干时)            四周后

 对照                   (69％)              8.5％

稳定剂：蔗糖            (100％)             67％

[注]f)试验例5(表5)、g)试验例6(表6)

(3)凝胶化·混炼时的稳定性

(将冻干品混炼制成棒状制剂时)

                           d)                 h)

                        (冻干时)         棒状制剂形成后

   对照                  (85％)               66％

稳定剂：蔗糖

添加剂：胶原             (95％)               92％

[注]h)试验例8(表8)

(4)水溶液制剂的保存稳定性            I)

     (40℃)                        四周后

      对照                        载体消失

  稳定剂：葡萄糖

  添加剂：DMRI E-C                载体残存

[注]I)试验例7(图7)

工业实用性

含有增强了稳定性的含有基因或导入了基因的载体的、稳定的基因制剂，将安全、简单地用于今后利用频度越来越高的基因治疗。本发明制剂能为基因治疗提供推广、普及的基础。特别是本发明制剂使基因或导入了基因的载体在常温下流通或保管成为可能，能够在冷链设备不充分的地区提供可以使用的DNA疫苗。

Claims (4)

1.从一种含水溶液冻干所得的稳定的基因制剂，该基因制剂包含：

a)一个整合了所需基因的超卷曲质粒载体；及

b)一种选自柠檬酸和酒石酸的成分。

2.权利要求1的稳定的基因制剂，其还含有脂肪变性胶原。

3.权利要求2的稳定的基因制剂，其还含有阳离子脂质、阳离子性聚合物或疏水性聚合物。

4.一种使整合了所需基因的超卷曲质粒载体稳定的方法，该方法包括：

a)在整合了所需基因的超卷曲质粒载体的含水溶液中加进柠檬酸或酒石酸以形成混合物的步骤，及

b)将上述步骤a)的混合物冻干的步骤。

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