CN1684704A - 干扰素和免疫球蛋白Fc片段杂合体 - Google Patents

干扰素和免疫球蛋白Fc片段杂合体 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于消除或消退肿瘤或延迟肿瘤发展的干扰素－免疫球蛋白Fc融合蛋白(″IFN－Fc杂合体″)。IFN－Fc杂合体较佳包括在IFN及Fc片段之间的肽连接体。此等连接体为T细胞惰性序列或任何非免疫原序列，较佳为Gly－Ser重复单位。较佳Fc片段为人类免疫球蛋白Fc片段，较佳为γ4链。

Description

干扰素和免疫球蛋白Fc片段杂合体
技术领域
本发明涉及具有一与一免疫球蛋白Fc片段共价连接的干扰素蛋白的蛋白质杂合体，其包括具有连接干扰素蛋白和免疫球蛋白Fc片段的肽连接体的杂合体。
背景技术
干扰素，包括干扰素-α(″IFNα″)及干扰素-β(″IFNβ″)，其属于第一批通过重组DNA技术生产的细胞因子。经证明IFNα对例如发状细胞白血病和炎症及病毒性疾病(包括B型肝炎)等病症具有治疗价值。已批准IFNβ用于治疗多发性硬化症。
包括IFNα在内的大多数细胞因子具有相当短的循环半衰期，其原因是其在体内产生，仅局部起作用且作用时间短暂。为将IFNα用作一种有效的系统治疗药物，需要相当大的剂量及频繁投药。如此频繁投药很不方便且很疼痛。另外，与施与IFNα相关的毒性副作用相当严重，以致某些癌症患者不能忍受这种治疗。这些副作用很可能与高剂量投药有关。
为克服这些缺点，可修饰该分子以增加其循环半衰期或修饰该分子的调配物以延长其释放时间。于是可减少剂量和降低投药频率，从而提高效力。人们已努力建构一具有延长保留时间的重组IFNα-明胶杂合体(Tabata，Y.等人，Cancer Res.51：5532-8，1991)。亦将一种脂质包胶IFNα调配物在动物体内进行试验，且在腹膜内实现蛋白质的延长释放(Bonerti，A.及kim，S.CancerChemother Pharmacol.33：258-261，1993)。
IgG及IgM免疫球蛋白属于人体血液中最丰富的蛋白质。它们的循环半衰期在7天到2 1天范围内。已发现当IgG用于形成重组杂合体时可增加几种配体结合蛋白质(受体)的半衰期，这些受体包括可溶性CD4分子、LHR及IFN-γ受体(Mordenti J.等人，Nature，337：525-31，1989；Capon，D.J.及Lasky，L.A.，美国专利第5,116,964号；Kurschner，C.等人，J.Immunol.149：4096-4100，1992)。
已证明，多种连接体皆对产生蛋白质杂合体有用。1998年3月3日颁予Chang等人的美国专利第5,723,125号(名称为″通过一非免疫原肽连接在一起的干扰素-α和免疫素蛋白Fc杂合体(Hybrid with interferon-alpha and animmunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide)″)及1999年6月1日颁予Chang等人的美国专利第5,908,626号(名称为″通过一肽连接体连接在一起的干扰素-β和免疫素蛋白Fc杂合体(Hybrid with interferon-.beta.and an immunoglobulin Fc joined by a peptide linker)″，)揭示由通过一包含序列Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyGly Ser的肽连接体将人类干扰素及人类免疫球蛋白Fc片段连接在一起组成的杂合重组蛋白质。
考虑到使用干扰素治疗患者所存在的问题，有必要改进将干扰素施予患者的组合物及方法，同时延长体内半衰期并减少不利的副作用。
发明内容
因此，本发明的一个目标是提供其体内半衰期长于干扰素的干扰素杂合体。
本发明的另一目标是提供其投药频率低于干扰素的干扰素杂合体。
本发明的再一目标是提供可有效消除或消退肿瘤或延迟肿瘤发展的干扰素杂合体。
通过使用一包含一其C-末端共价连接到一免疫球蛋白Fc片段N-末端的干扰素蛋白的蛋白质杂合体或一包含一其C-末端共价连接到一肽连接体(该肽连接体的C-末端共价连接到一免疫球蛋白Fc片段的N-末端)的N-末端的干扰素蛋白的蛋白质杂合体，可实现这些及其他目标。较佳连接体为一由具有大约2到大约40个氨基酸的Gly Ser重复单位组成的免疫惰性肽。连接体也可为T细胞惰性氨基酸序列或任何非免疫原氨基酸序列。本发明的杂合体可有效治疗肿瘤患者以消除肿瘤、消退肿瘤或延迟肿瘤发展。
所属领域的技术人员将容易地了解本发明的其他及更多的目标、特点及优点。
序列表概述
SEQ ID NO：1为一IFN-α-Fc杂合体的核苷酸及氨基酸序列。
SEQ ID NO：2为SEQ ID NO：1中所示的一IFN-α-Fc杂合体的氨基酸序列。
SEQ ID NOS：3-9为用于将一重链γ4 Fc片段的N-末端结合到一IFN-β蛋白质的C-末端的各种长度肽连接体的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10为一用于将一重链γ1 Fc片段的N-末端结合到一下述测试法所用IFN-α蛋白质的C-末端的连接体的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11为一用于将一重链γ4 Fc片段的N-末端结合到一IFN-α蛋白质(其分子后来用于下述体外细胞病变效应分析中)的C-末端的连接体的氨基酸序列。
附图说明
图1所示为对一IFN-β-Fc杂合体中各种连接体的病毒诱导细胞病变效应抑制作用分析。
图2所示为对一IFN-α-Fc杂合体中两种不同连接体的病毒诱导细胞病变效应抑制作用分析。
具体实施方式
本发明提供一包含一其C-末端共价连接到一免疫球蛋白Fc片段N-末端的干扰素蛋白的蛋白质杂合体。
该干扰素蛋白可以是任一种包括干扰素-α、干扰素-β、干扰素-ω、干扰素-δ及干扰素-τ在内的I型干扰素或包括干扰素-γ在内的II型干扰素。较佳地，该干扰素蛋白为一干扰素-α或干扰素-β，最佳地为一干扰素-α2a或干扰素-α2b。
该免疫球蛋白Fc片段可以是来自包括IgA、IgD、IgE、IgG或IgM在内的任一类免疫球蛋白的一个片段。较佳地，该Fc片段为一人类免疫球蛋白Fc片段，最佳为一IgG4(γ4)亚类的IgG Fc片段。γ4链优于γ1链，因为前者经证明具有很少或不具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体激活能力，且在人体循环中很稳定。
本发明亦提供一蛋白质杂合体同型二聚体，其包含两个其C-末端共价连接到一免疫球蛋白Fc片段(较佳地为一γ4 Fc片段)的两个N-末端中每一个的干扰素蛋白。
本发明亦提供一包含一以其C-末端共价连接到一肽连接体(其C-末端共价连接到一免疫球蛋白Fc片段的N-末端)N-末端的干扰素蛋白的蛋白质杂合体。
干扰素蛋白与Fc片段通过一T细胞免疫惰性肽连接，较佳通过具有Gly Ser重复单位的肽连接。因为这些肽为免疫惰性，所以在融合点插入这些肽可消除任何当直接将干扰素和Fc片段连接在一起时可能会出现的新抗原性。
肽连接体较佳地为由具有约2到约40个氨基酸的Gly Ser重复单位组成的免疫惰性肽。该些肽连接体的典型氨基酸序列示于SEQ ID NOS 3、4、5、6、7、8及9中。此等连接体具有连接干扰素和Fc片段而不对干扰素的生物活性产生显著不良影响的独特能力。尽管在本发明中所有长度的连接体皆有效，但某些连接体比另一些略微有效一些，即具12或更多个氨基酸的连接体比短一些的连接体活性略微大一些。较佳地，肽连接体具有12到15个氨基酸或约17到40个氨基酸。
不含连接体的IFNα-Fc杂合体的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO：1中，且其氨基酸序列示于SEQ ID NO：2中。如果存在连接体，则其位于第188(Glu)和189(Glu)位氨基酸残基之间。所有经证明在体外具有大约相同细胞病变效应的大量合适连接体的序列示于SEQ ID NOS 3、4、5、6、7、8及9中。
本发明较佳实施例为一包含一其C-末端共价连接到一免疫球蛋白Fc片段N-末端的干扰素蛋白的蛋白质杂合体。然而，本发明亦包括一包含一其C-末端共价连接到一干扰素蛋白N-末端的免疫球蛋白Fc片段的蛋白质杂合体。此等蛋白质可直接连接或通过一本文所述肽连接体连接。
本发明亦提供一包含两个其C-末端共价连接到一免疫球蛋白Fc片段(较佳为一γ4 Fc片段)的两个N-末端中每一个的干扰素蛋白的蛋白质杂合体同型二聚体，或一包含两个其C-末端共价连接到一肽连接体(该肽连接体的C-末端共价连接到一免疫球蛋白Fc片段的两个N-末端中的每一个)N-末端的干扰素蛋白的蛋白质杂合体同型二聚体。这些连接体可含有相同数量的氨基酸或不同数量的氨基酸。
如果该Fc片段选自另一条链，例如μ链，则因为Fc片段会形成具有十个可能结合位点的五聚物，所以该杂合体可能包含干扰素及1至10种细胞因子(包括多种干扰素)。可在本发明中起作用的合适细胞因子包括但不限于介白素、集落刺激因子及肿瘤坏死因子。
在另一实例中，一干扰素蛋白直接或通过一连接体连接到一免疫球蛋白Fc片段的两个N-末端中的一个上，且另一细胞因子直接或通过一连接体连接到一免疫球蛋白Fc片段的两个N-末端中的另一个上。
本发明的杂合体的一个显著优于天然细胞因子的地方是该杂合体已证明可消除动物模型的肿瘤。已批准使用IFNα治疗某些肿瘤及B型肝炎。该些杂合体在治疗感染性疾病及各种肿瘤方面可能比IFNα更为有效。
IFNαcDNA可通过逆转录和PCR得到，使用从表达IFNα的细胞中提取的RNA，在提取后进行逆转录并在一标准表达系统中表达。有几种体外表达该重组蛋白质的方法，包括在大肠杆菌(E.coli)、杆状病毒(baculovirus)、酵母、哺乳动物细胞或其他表达系统中表达。原核系统E.coli不能进行转录后修饰，例如糖基化。此可能是这些系统的一个问题，由于这一原因哺乳动物表达可较佳，因为它能提供其他在简化纯化方面的优点。
现有几种用于测量IFNα生物活性的分析方法，包括抗病毒分析。根据体外实验结果可得出，本发明的杂合体在体内比天然IFNα具有更长的半衰期。即使比活性低一些，该些杂合体在临床使用上仍然优于天然IFNα。这是因为，由于半衰期更长，根据体外实验结果可得出其Cxt(浓度时间曲线下面积)比天然IFNα更大。这意味着同等摩尔剂量的天然IFNα及杂合体，后者将提供增加几百倍的IFNα接触时间，使剂量相同且投药频率减少的情况下效力大大增加。
在本发明中有用的免疫球蛋白Fc片段可通过熟习此项技术者所熟知的常见方法得到。
在本发明中有用的肽连接体可通过熟习此项技术者所熟知的常见方法得到，包括使用干扰素和Fc片段对连接体进行化学合成及重组表达。
本发明的IFNα-Fc杂合体比天然IFNα具有更长的体内半衰期。细胞因子通常为半衰期相当短的小蛋白质。它们通常快速消散在各组织中，包括不希望的位点。据信少量的某些细胞因子可穿过血脑屏障及进入中枢神经系统并造成严重的神经毒性。本发明的IFN-Fc杂合体尤其适于治疗肿瘤，包括淋巴瘤及白血病，因为该些产品在脉管系统内将有很长保留时间，且不会进入不希望的位点。
因此，本发明的杂合体可用于治疗肿瘤患者以消除肿瘤、消退肿瘤或延迟肿瘤发展。该杂合体以可有效治疗肿瘤患者的量投药。该剂量的确定涵盖在基于患者大小、肿瘤大小、肿瘤类型及相似参数的本项技术的技艺范围内。
IFN-Fc杂合体可以一包括合适赋形剂及添加剂的药物调配物形式施与。可容易地通过从动物数据推断(需补偿动物大小差别)并通过临床试验中的常规试验来确定适合人体的剂量。
现在将参照实例及实验结果对本发明予以阐述，然而应该理解，除非另有说明，否则所包括的这些实例仅用于举例说明目的而非意欲限制本发明的范围。
                            实例1
与天然IFNα相比，IFNα-Fc杂合体的半衰期大大延长
美国专利第5,723,125号(其以引用方式并入本文中)的揭示内容阐述制备一含有一具有序列：Gly Gly Ser Gly Gly Ser(SEQ ID NO：10)的连接体的IFNα-Fc(γ1)杂合体。此杂合体比活性用Daud i细胞在体外测试为7.7×108单位/微摩尔，用同样方法测得的未经修饰的干扰素-α的比活性为15.4×108单位/微摩尔。在后来进行的细胞病变效应抑制分析中，该杂合体显示的抗病毒比活性为2.2×108IU/微摩尔，低于未经修饰干扰素-α的3.8×109IU/微摩尔。为尝试增加杂合体的比活性，延长该连接体以增加弹性及减少空间位阻。使用一具序列：Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyGly Ser(SEQ ID NO：11)的连接体。新杂合体的另一区别是其Fc部分为γ4 Fc，而不是γ1 Fc。
体外对病毒诱导细胞病变效应的抑制作用分析结果显示，该新杂合体抗病毒比活性为1.1-2.2×109IU/皮摩尔，是旧杂合体的5至10倍。然而，仍然为未经修饰干扰素α的1/2至1/3，未经修饰干扰素α在同样分析中比活性为3.8×109IU/皮摩尔。但在灵长类体内进行的药代动力学研究中，所提出申请的新杂合体的血清半衰期约为未经修饰干扰素的40倍。该杂合体在皮下(s.c.)投药后的清除半衰期亦几乎为未经修饰干扰素的120倍。该杂合体皮下投药时亦可很好吸收。新杂合体AUC(曲线下面积)的大幅度增加意味着尽管其比活性比较低，但很可能比天然干扰素-α具有更高的效力。
然后实施下述实验测定不同长度连接体对细胞病变活性的影响。
                            实例2
            不同连接体对IFN-Fc细胞病变活性影响的研究
                  比较IFN-α(16)Fc及IFN-α-Ala-Fc
通过比较IFN-α(16)Fc和IFN-α-Ala-Fc来测试肽连接体的效果。IFN-α(16)Fc含有通过SEQ ID NO：11中所示十六氨基酸肽连接体(氨基酸序列如下：GlyGlySerGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)连接到人类IgG4Fc片段的铰链区域的IFNα。IFN-α-Ala-Fc构筑体含有通过一个在两个区域之间的氨基酸(Ala)连接到人类IgG1 Fc片段的铰链区域的IFN-α。将编码IFN-α(16)Fc及IFN-α-Ala-Fc的DNA片段分别插入到pcDNA3表达质粒的多克隆位点上。然后通过电穿孔使用纯化的质粒DNA转染NS0细胞。在存在G418的条件下选择稳定转化的细胞系。然后在旋转培养烧瓶内培养表达这些连接体变体的细胞系。收集使用过的培养上清液，用蛋白质A亲和管柱来制备纯化蛋白质。将纯化蛋白质用于实例1所述的病毒诱导细胞病变效应抑制作用分析。IFN-α-Ala-Fc和IFN-α(16)Fc二者显示出同样的活性(图1)。
                IFNβ-Fc连接体变体的构筑体
为确定连接体长度对IFNβ-Fc杂合体活性的影响，构建干扰素-β连接到一Fc(″IFNβ-Fc″)上的许多不同构筑体。这些构筑体的氨基酸序列列于下面的表1中。
                            表1
               多种IFNβ-Fc的翻译后氨基酸序列
连接体变体  IFNβ和IgG4(Fc)的铰链区域之间的连接体序列
IFNβ-(2)Fc  GlySer(SEQ ID NO：3)
IFNβ-(8)Fc  GlyGlyGlySerGlyGlyGlySer(SEQ ID NO：4)
IFNβ-(12)Fc  GlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer(SEQ ID NO：5)
IFNβ-(18)Fc  GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer(SEQ ID NO：6)
IFNβ-(23)Fc  GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer(SEQ ID NO：7)
IFNβ-(30)Fc  GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer(SEQ ID NO：8)
IFNβ-(40)Fc  GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer(SEQ ID NO：9)
                IFNβ-Fc连接体变体的表达
将含有不同IFNβ-Fc连接体变体的DNA序列分别插入到pcDNA3表达质粒的多克隆位点。然后通过电穿孔使用纯化的质粒DNA转染NS0细胞。在存在G418的条件对稳定转化的细胞系进行初步选择。然后，使表达这些连接体变体的细胞系在不存在G418的条件下生长。收集使用过的培养上清液，并将其用0.22μm的膜过滤。IFNβ-Fc浓度用纯化的IFNβ-Fc蛋白质作为标样通过PCFIA来估测。含有具2、8、12、18、23、30及40个氨基酸的肽连接体的IFNβ-Fc变体的培养上清液浓度分别估计为5.4、22.5、15.9、5.7、10.2、5.5及4.5μg/ml。将这些上清液用于下面的体外细胞病变效应实验中。
             用IFNβ-Fc变体进行的体外细胞病变效应分析
将人类肺癌A549细胞用含5％FBS的DMEM以100μl/孔(含5×104个细胞)的量铺涂在96-孔板上。将培养板在37℃于5％CO2培养箱中培养24小时。稀释含有IFNβ-Fc连接体变体的培养上清液。然后将这些溶液用含5％FBS的DMEM在96孔板中进行2倍系列稀释。每孔中加入100微升稀释样品，将培养板置于培养箱中在37℃再培养24小时。移走培养上清液，以100μl/孔加入脑心肌炎(EMC)病毒(病毒自病毒储液用含5％FBS的D15以1∶200稀释)。将培养板在37℃于5％CO2培养箱中培养48小时。移走培养物上清液，用PBS洗涤各孔2次。然后将细胞用低聚甲醛固定，用姬姆沙(giemsa)染料染色，然后于室温放置5分钟。此后，用自来水轻轻冲洗培养板数次。向各孔中加入甲醇，用Dynatech MR5000ELISA读数仪在630nm处对各孔进行读数。
如图2所示的IFNβ-Fc杂合体的几次实验结果及如实例2所示的两种不同IFNα-Fc杂合体的实验结果显示，不管使用哪种连接体，细胞病变效应均无显著变化。IFNα-(16)Fc杂合体之一的进一步体内实验如下所述进行。
                       实例3
                   动物肿瘤模型
                   在小鼠中引发肿瘤
雌性CB17/scid小鼠(Charles River Laboratories；七周半龄)右肋腹下部皮下(s.c.)接种总量为100μl的Daudi Burkitt淋巴瘤细胞。在各组的五只动物中对四种不同细胞密度进行检测(表2)。接种后一天监测注射位点，然后在接种后三周每天进行监测。
用卡钳测量可触及肿瘤。测定肿瘤体积并用方程式V＝4 xyz/3计算，其中2x、2y及2z为肿瘤的三个正交直径，且为两次测量的平均值。
对于接种，将细胞在体外用含10％胎牛血清的D15培养基在100ml旋转瓶中培养至生存力为94％且密度为0.6×106/ml。通过300g离心10分钟收集细胞，用冷PBS洗涤两次，以所需密度重新悬浮于PBS中。细胞计数及Tryptan Blue染色确认细胞密度及生存力。
                        表2
                 细胞密度及接种途径
    细胞密度     动物数量     接种途径
    PBS0.5×106/100μl PBS2.5×106/100μl PBS1.25×107/100μl PBS     5555     s.c.s.c.s.c.s.c.
1.25×107组接种后四周在接种位点可检测出人类肿瘤异种移植物。一周后肿瘤发生率达到80％，且在整个初步研究期内保持该水平。大约需要三周(2.5至3.5周)一可触及肿瘤长至动物体重的10至15％。2.5×106及0.5×106组在九个半周
末发生率达到60％。这些肿瘤不会杀死小鼠且没有转移迹象。因此，可得出以下结论，皮下接种1.25×107 Daudi Burkitt淋巴瘤细胞将在大约四周时获得约80％的肿瘤发生率。
                     体内抗增殖研究
                      每日给药实验
三十二只接种有12.5×106 Daudi Burkitt淋巴瘤细胞的小鼠随机分配给表3所示四个治疗组之一。肿瘤接种后当天开始用Roferon A(IFN-α-2a，Hoffmann LaRoche，Nutley，NJ)及IFN-α(16)-2a-Fc(含有SEQ ID NO：11中所示连接体)治疗。所有动物在颈背部每日皮下给药，且治疗继续连续进行八周。在治疗期间，每3至4天监测一次肿瘤发展，并如上测量肿瘤大小。在治疗期后，对停止治疗时无肿瘤的动物继续每周观察一次，再观察六个月。
在最后一次给药24小时后及终止IFN-α-2a-Fc治疗后一周、二周和四周或终止Roferon A治疗后一周、二周和三周自眼窝后采血。血清干扰素水平用ELISA测定。
                             表3
                     剂量、途径及给药程序表
    组别   剂量     投药途径     给药程序表
    对照Roferon AIFN-α-FcIFN-α-Fc   稀释剂1×106IU/100μl.1×106IU/100μl1×105IU/100μl     s.c.s.c.s.c.s.c.     每日一次每日一次每日一次每日一次
                   IFN-α对肿瘤发生率及肿瘤进展的影响
不同治疗小组肿瘤的发展示于表4。在对照组动物中，在接种后24天检测到最早的肿瘤，且在此后6天内7/8(87.5％)的动物已发展肿瘤。肿瘤检测的平均时间为25.1±2.3天(在第75天出现肿瘤的小鼠不包括在内)。在Roferon A治疗动物中，最早的肿瘤在接种后32天变得可检测到。在又两周后，87.5％发展成肿瘤。平均肿瘤检测时间为39.6±4.7天(t＞t 0.05(12)，P＜0.05)。Roferon A延迟肿瘤发展大约两周。两种剂量的IFN-α-2a-Fc治疗在整个给药期间均完全阻止Daudi淋巴瘤的发展。在低剂量中，两只小鼠在中止治疗后2及19天上出现可检测到的肿瘤。然而1×106IU/天组的所有小鼠及1×105IU/天组余下的六只小鼠治疗后六个月仍无肿瘤发生。(表4)。重复此实验一次，仍得到相似的结果，如表4所示。
                    表4
       CB17/scid小鼠肿瘤的发展(Exp.1.)
    小鼠I.D.   接种日期  肿瘤检测日期  肿瘤发展时间(天)     Mean±S.D.
    C*116117125134114101119R*133104103115110113128   5/27/985/27/985/27/985/27/985/27/985/27/985/27/985/27/985/27/985/27/985/27/985/27/985/27/985/27/98     6/20/986/20/986/20/986/20/986/20/986/22/986/26/986/28/987/1/987/6/987/6/987/7/987/9/987/12/98     2424242424263032354040414348 25.1±2.339.6±4.7
                             *C表示对照
                *R表示以1×106IU/天来施与Roferon A
                       IFN-α对肿瘤生长率的影响
一旦肿瘤生长到约为小鼠体重的1％，对照与Roferon A治疗动物的肿瘤生长率变得非常接近。对照动物平均肿瘤体积在两周内增加到原来的10倍，而RoferonA治疗小鼠显示增加到原来的9倍。
                             表5
                    不同治疗组的肿瘤发生率
    组别     治疗   肿瘤发生率(％)(N＝8)
    对照Roferon AIFN α-2a-FcIFN α-2a-Fc     稀释剂1×106IU/100μl1×106IU/100μl1×105IU/100μl     100(8/8)87.5(7/8)025.0(2/8)
                   定量分析血清IFN-α水平
IFN-α及IFN-α-2a-Fc的血清浓度用ELISA法测定。在Roferon A治疗小鼠中，在最后一次给药后24小时检测不到IFN-α-2a。在IFN-α-2a-Fc治疗小鼠中，在终止治疗后22天1×106IU/天组的血清IFN-α-2a-Fc浓度为3.5μg/ml，1×105IU/天组的为0.7μg/ml(表6)。在治疗结束后的1和22天之间血清浓度降低。数据指出，皮下注射1×106 IU/天IFN-α-2a-Fc，其在小鼠中的半衰期大约为一周，注射1×105 IU/天时，大约为8周。
                                表6
                       血清IFN-α-2a水平(μg/ml)
            治疗                         治疗终止后天数
       1        8       22
  IFN-α-2a-Fc 1×106IUIFN-α-2a-Fc 1×105IURoferon A   25.370±6.8852.766±1.138检测不到   12.080±3.4771.549±0.536检测不到   3.477±0.5250.691±0.141检测不到
                       给药间隔增加的实验
在该实验中，每3天给与一次Roferon A 1×106IU，每3天及每周给与一次1×106IU IFN-α-2a-Fc。结果示于表7。在8周治疗期间，和对照组比较，在肿瘤体积及肿瘤发展平均时间上，3天给与Roferon A 1×106IU未能显示任何防止肿瘤形成的保护作用，而每3天及每周给与1×106IU IFN-α-2a-Fc可有效抑制肿瘤形成。这种抑制作用延长到治疗周期后7周。
                            表7
                给药间隔增加的动物的肿瘤发展
  治疗    肿瘤发生率(％)(N＝8)    肿瘤平均发展时间(天)
  对照RoferonA106IU/3天    100(8/8)100(8/8)    21.1±1.122.0±1.9
    IFN-FC106IU/3天IFN-FC106IU/周     N/AN/A     N/AN/A
         对已建立的Daudi Burkitt淋巴瘤的初步研究
两只已建立Daudi Burkitt淋巴瘤5周的小鼠用IFN-α-Fc 106IU/天治疗。十天后在两只动物中均见到完全消退(表8)。另两只已建立Daudi Burkitt淋巴瘤6.5周的小鼠每三天用106IU Roferon A治疗，共治疗八周。后面的小鼠肿瘤体积在前两周快速减小，从2.7cm3及4.6cm3减小到0.3cm3，减少89％到94％。未能达成完全消退。
                             表8
                      对照小鼠的肿瘤消退
  小鼠ID.     日期     肿瘤体积(cm3)
    416     11/20/9811/24/9811/25/9811/26/9811/27/98     0.195(7mm×7.6mm)0.161(6.4mm×7.6mm)可触及可触及完全消退
    453     11/20/9811/24/9811/25/9811/26/9811/27/9811/28/9811/29/98     0.858(10mm×16mm)1.393(6.4mm×7.6mm，7.6mm×7.6mm)可触及可触及可触及不乎不可触及完全消退
                              概要及结论
通过在雌性CB17/scid小鼠(六周半龄)的右肋腹下部皮下接种总体积为100μl的1.25×107 Daudi Burkitt淋巴瘤细胞已建立一鼠人肿瘤异体移植物模型。Roferon A 1×106IU/天治疗可使Daudi B细胞淋巴瘤的发展延迟两周(t＞t 0.05(12)，P＜0.05)。IFN-α-2a-Fc 1×106IU/天在整个给药期间完全抑制肿瘤形成，且这种抑制可延长到终止治疗后六个月。在用1×105IU/天IFN-α-2a-Fc治疗的小鼠中亦显示部分至完全的抑制作用。
Roferon A 1×106IU/3天治疗未能显示任何防止肿瘤发展的保护作用，而IFN-α-Fc 1×106IU/3天或IFN-α-2a-Fc 1×106IU/周治疗均能完全抑制DaudiBurkitt淋巴瘤，且抑制作用在中止治疗后至少持续七周。
初步数据证明，建立5周的Daudi Burkitt淋巴瘤在用IFN-α-2a-Fc 106IU/天治疗十天时可完全消退。在用IFN-α-2a-Fc开始治疗前用106IU Roferon A/3天治疗七周亦可在2周内使肿瘤体积减小90％。
当在皮下施与IFN-α-2a-Fc 1×106IU/天或1×105IU/天八周时，其半衰期大约为一周。
应该理解，本文所用术语及表达仅作为例证而非限制，且本发明的范围仅由随附权利要求来界定，其包括彼等权利要求的标题物的所有等效项。
                               序列表
<110>唐纳士公司
<120>干扰素和免疫球蛋白Fc片段杂合体
<130>TNX9502PCT
<160>11
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1254
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1254)
<223>
<400>1
atg gcc ttg acc ttt gct tta ctg gtg gcc ctc ctg gtg ctc agc tgc    48
Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys
1               5                   10                  15
aag tca agc tgc tct ctg ggc tgt gat ctg cct caa acc cac agc ctg    96
Lys Ser Ser Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu
            20                  25                  30
ggt agc agg agg acc ttg atg ctc ctg gca cag atg agg aaa atc tct   144
Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser
        35                  40                  45
ctt ttc tcc tgc ttg aag gac aga cat gac ttt gga ttt ccc cag gag   192
Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu
    50                  55                  60
gag ttt ggc aac cag ttc caa aag gct gaa acc atc cct gtc ctc cat   240
Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His
65                  70                  75                  80
gag atg atc cag cag atc ttc aat ctc ttc agc aca aag gac tca tct   288
Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser
                85                  90                  95
gct gct tgg gat gag acc ctc cta gac aaa ttc tac act gaa ctc tac   336
Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr
            100                 105                 110
cag cag ctg aat gac ctg gaa gcc tgt gtg ata cag ggg gtg ggg gtg   384
Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val
        115                 120                 125
aca gag act ccc ctg atg aag gag gac tcc att ctg gct gtg agg aaa   432
Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys
    130                 135                 140
tac ttc caa aga atc act ctc tat ctg aaa gag aag aaa tac agc cct   480
Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro
145                 150                 155                 160
tgt gcc tgg gag gtt gtc aga gca gaa atc atg aga ggt ggc tca ggt   528
Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Gly Gly Ser Gly
                165                 170                 175
gga tcc ggt gga ggc gga agc ggc ggt gga gga tca gag tcc aaa tat   575
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr
            180                 185                 190
ggt ccc ccg tgc cca tca tgc cca gca cct gag ttc ctg ggg gga cca   624
Gly Pro Pro Cys Pro Ser cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
        195                 200                 205
tca gtc ttc ctg ttc ccc cca aaa ccc aag gac act ctc atg atc tcc   672
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
    210                 215                 220
cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cag gaa gac    720
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
225                 230                 235                 240
ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gat ggc gtg gag gtg cat aat    768
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
                245                 250                 255
gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag ttc aac agc acg tac cgt gtg    816
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
            260                 265                 270
gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag    864
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
        275                 280                 285
tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc ccg tcc tcc atc gag aaa    912
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
    290                 295                 300
acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gag cca cag gtg tac acc    960
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
305                 310                 315                 320
ctg ccc cca tcc cag gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc   1008
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
                325                 330                 335
tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag   1056
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
            340                 345                 350
agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg   1104
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
        355                 360                 365
gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc agg ctg acc gtg gac aag   1152
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
    370                 375                 380
agc agg tgg cag gag ggg aat gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag   1200
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
385                 390                 395                 400
gct ctg cac aac cac tac aca cag aag agc ctc tcc ctg tct ctg ggt   1248
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
                405                 410                 415
aaa tag                                                           1254
Lys
<210>2
<211>417
<212>PRT
<213>人类
<400>2
Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys
1               5                   10                  15
Lys Ser Ser Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu
            20                  25                  30
Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser
        35                  40                  45
Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu
    50                  55                  60
Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His
65                  70                  75                  80
Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser
                85                  90                  95
Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr
            100                 105                 110
Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val
        115                 120                 125
Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys
    130                 135                 140
Tyt Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro
145                 150                 155                 16O
Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Gly Gly Ser Gly
                165                 170                 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr
            180                 185                 190
Gly Pro Pro Cye Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
        195                 200                 205
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
    210                 215                 220
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
225                 230                 235                 240
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
                245                 250                 255
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
            260                 265                 270
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
        275                 280                 285
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
    290                 295                 300
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
                325                 330                 335
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
            340                 345                 350
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
        355                 360                 365
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
    370                 375                 380
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
385                 39O                 395                 400
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                405                 410                 415
<210>3
<211>2
<212>PRT
<213>人类
<400>3
Gly Ser
1
<210>4
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>4
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>5
<211>12
<212>PRT
<213>人类
<400>5
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10
<210>6
<211>18
<212>PRT
<213>人类
<400>6
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Gly Ser
<210>7
<211>23
<212>PRT
<213>人类
<400>7
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
            20
<210>8
<211>30
<212>PRT
<213>人类
<400>8
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
            20                  25                  30
<210>9
<211>40
<212>PRT
<213>人类
<400>9
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        35                  40
<210>10
<211>6
<212>PRT
<213>人类
<400>10
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1               5
<210>11
<211>16
<212>PRT
<213>人类
<400>11
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15

Claims (17)

1、一种蛋白质杂合体，其包含一共价连接到一免疫球蛋白Fc片段的干扰素蛋白。
2、如权利要求1所述的蛋白质杂合体，其包含一其C-末端共价连接到一免疫球蛋白Fc片段N-末端的干扰素蛋白。
3、如权利要求1或2所述的蛋白质杂合体，其进一步包含一在所述干扰素蛋白和所述免疫球蛋白Fc片段之间的肽连接体，其中所述干扰素蛋白的C-末端共价连接到所述肽连接体N-末端，且所述肽连接体的C-末端共价连接到所述免疫球蛋白Fc片段N-末端。
4、如权利要求3所述的蛋白质杂合体，其中所述连接体包含Gly Ser重复单位。
5、如权利要求4所述的蛋白质杂合体，其中所述Gly Ser重复单位包含2到40个氨基酸。
6、如权利要求4所述的蛋白质杂合体，其中所述Gly Ser重复单位包含12到15个氨基酸。
7、如权利要求4所述的蛋白质杂合体，其中所述Gly Ser重复单位包含17到40个氨基酸。
8、如权利要求3所述的蛋白质杂合体，其中所述连接体包含一T细胞惰性氨基酸序列或一非免疫原氨基酸序列。
9、如权利要求1、2或3所述的蛋白质杂合体，其中所述干扰素蛋白选自由干扰素-α和干扰素-β组成的群组。
10、如权利要求1、2或3所述的蛋白质杂合体，其中所述干扰素蛋白为干扰素-α。
11、如权利要求9所述的蛋白质杂合体，其中所述干扰素蛋白选自由干扰素α2a或干扰素α2b组成的群组。
12、如权利要求1、2或3所述的蛋白质杂合体，其中所述Fc片段为一IgGFc片段。
13、如权利要求1、2或3所述的蛋白质杂合体，其中所述Fc片段为一IgGγ4链Fc片段。
14、如权利要求1、2或3所述的蛋白质杂合体，其进一步包含另一其C-末端共价连接到所述免疫球蛋白Fc片段另一条链N-末端的细胞因子，由此形成一同型二聚体。
15、如权利要求1 4所述的蛋白质杂合体，其中所述细胞因子为一干扰素。
16、一种蛋白质杂合体，其包含一其C-末端共价连接到一肽连接体的N-末端的干扰素蛋白，所述肽连接体的C-末端共价连接到一免疫球蛋白Fc片段的N-末端，其中所述肽连接体包含具有2到15及17到40个氨基酸的Gly Ser重复单位。
17、一种治疗肿瘤患者以消除肿瘤、消退肿瘤或延迟肿瘤发展的方法，其包含以有效量施予患者如权利要求1到16任一项所述的蛋白质杂合体以消除肿瘤、消退肿瘤或延迟肿瘤发展。
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