CN1313158C - 促进核酸转移的方法 - Google Patents

促进核酸转移的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1313158C
CN1313158C CNB028164008A CN02816400A CN1313158C CN 1313158 C CN1313158 C CN 1313158C CN B028164008 A CNB028164008 A CN B028164008A CN 02816400 A CN02816400 A CN 02816400A CN 1313158 C CN1313158 C CN 1313158C
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
collagen
cell
complex
composite particles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB028164008A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1622831A (zh
Inventor
寺田雅昭
落谷孝广
阿苏雄
本间纪美
佐野明彦
永原俊治
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Government
Koken Co Ltd
Sumitomo Pharma Co Ltd
Original Assignee
Koken Co Ltd
Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Koken Co Ltd, Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd filed Critical Koken Co Ltd
Publication of CN1622831A publication Critical patent/CN1622831A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1313158C publication Critical patent/CN1313158C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6435—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a connective tissue peptide, e.g. collagen, fibronectin or gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种将所需核酸有效转移至细胞中的手段。本发明包括使用包含胶原或其衍生物及所需核酸的复合物。

Description

促进核酸转移的方法
发明领域
本发明属于医药领域，特别是基因治疗和遗传学基础研究领域。更特别的是，本发明涉及促进所需核酸向靶细胞中转移的制剂及相应的方法。
背景知识
最近，人们积极地研究基因治疗，并将之实际应用于各种癌症和遗传性疾病的临床治疗。基因治疗是通过修补或纠正缺陷型基因来治疗疾病的一种方法，包括将编码一种目的酶、细胞因子或类似物质的基因转移到病人的细胞中，使得基因在体内产生目的物质，从而治疗疾病。基因治疗是一种控制生命基础的药物疗法，在治疗AIDS、类风湿关节炎、生活方式相关疾病以及癌症和遗传性疾病等各种疾病方面具有潜力。
在基因治疗中，基因向靶细胞的转移效率是影响治疗效果增加的一个重要的因素。癌症的基因治疗包括通过腺病毒之类病毒的治疗(Cardiovascular Research， 28，445(1994)；Science， 256，808(1992)；Gastroenterology， 106，1076(1994)；TIBTECH， 11，182(1993)；J.Biol.Chem， 266，3361(1991)；Nature Medicine， 1，583(1995)和其中引用的参考文献)和通过脂质体制剂的治疗(Biochem Biophys Acta， 1097，1(1991)；Human Gene Therapy， 3，399(1992)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，11277(1992))。使用病毒载体治疗的基因转移效率通常比使用脂质体制剂治疗的基因转移效率要高。但是，使用病毒载体治疗存在一个问题，即机体对病毒的免疫应答使多次给药无法实施(J.Biol.Chem.，269，13695(1994)；Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.， 10，369(1994))。
另一方面，由于全部人类遗传信息(人类基因组)的分析几乎已经完成，研究焦点已经转移到了如何将收集到的人类遗传信息用于医药和工业领域的后基因组策略上。尤其是使用分析过的遗传信息验证人类基因功能以及基因编码的蛋白质的结构和功能。这种后基因组验证需要表达并产生蛋白质，这一过程必然涉及到将所需基因向细胞的转移。使用腺病毒载体和脂质体载体或质粒DNA载体向宿主细胞中导入的基因并不整合到细胞的基因组中，而是瞬时表达的。这种载体不能实现基因的持续表达，而持续表达在基因治疗和基因功能分析中是重要的。
发明内容
因此，有效地将代表一个基因的核酸转移到靶细胞中、使该基因不整合到宿主细胞的染色体上而长时间表达的方法将提供极大的用途。
本申请的发明人发现胶原具有意料不到的作用，并创造了将核酸有效导入靶细胞的一种方法。特别是，我们发现胶原和质粒DNA之类核酸的接触令人惊奇地形成一种复合物，这种复合物的形成促进核酸向细胞的转移和基因的长时间表达。日本专利申请(kokai)No.71542/1997介绍了包含一种基因的制剂，其中基因包含在由胶原之类生物相容性物质组成的载体中。但这种制剂是一种在活体内逐渐释放基因的缓释制剂。
本发明以新发现的胶原或胶原衍生物用途为根据。
更特别的是，本发明涉及到：
(1)促进核酸向靶细胞转移的制剂，其包含胶原或胶原衍生物；
(2)促进核酸向靶细胞转移的制剂，其包含和所需核酸形成复合物的胶原或胶原衍生物。优选的是促进核酸转移的制剂，其中复合物以颗粒形式存在。更优选的是促进核酸转移的制剂，其中颗粒的长轴(major axis)为300nm至300μm，优选的是300nm至100μm，较优选的是300nm至50μm，更优选的是300nm至30μm；特别的是，促进核酸转移的制剂，其中所需核酸是质粒DNA，其中复合物中胶原分子或胶原衍生物分子的数目和质粒DNA核苷酸单体的数目的比例是1∶20至1∶质粒DNA核苷酸单体数，优选的是1∶50至1∶质粒DNA核苷酸单体数，较优选的是1∶50至1∶4000，更优选的是1∶50至1∶2000，进一步优选的是1∶50至1∶1000；或促进核酸转移的制剂，其中核酸是寡核苷酸，复合物中胶原分子或胶原衍生物分子的数目和寡核苷酸中核苷酸单体的数目的比例是1∶1至1∶200，优选的是1∶3至1∶150，较优选的是1∶20至1∶120，更优选的是1∶50至1∶120；
(3)一种复合物颗粒，其包含胶原或胶原衍生物及所需核酸；
(4)一种制备根据本发明的复合物颗粒的方法，包括在含有抑制胶原缔合体(association body)形成的试剂的溶液中，将胶原或胶原衍生物和靶核酸相混合；
(5)一种医用器具，其表面包被有上述(3)中的复合物颗粒，或一种细胞培养器具，其表面包被有复合物颗粒；
(6)一种将所需核酸转移至靶细胞中的方法，或提高靶细胞中所需核酸表达水平的方法，包括使用上述(3)中的复合物颗粒；
(7)一种检验靶细胞中基因或蛋白质功能的方法，包括使用上述(3)中的复合物颗粒包被固体表面，所述复合物颗粒包含基因、编码蛋白质的基因或抑制基因或蛋白质在细胞中表达的核酸；在固体表面上培养靶细胞；测定靶细胞中的核酸表达水平，或基因或蛋白质表达水平，或细胞的增殖率或表型；和
(8)一种筛选用于治疗疾病的核酸的方法，包括使用上述(3)中的复合物颗粒包被固体表面，所述复合物颗粒包含抑制疾病相关基因在细胞中表达的核酸候选物；在固体表面上培养呈现疾病状态的细胞；测定受各种核酸候选物所抑制的基因的表达水平，或细胞的增殖率或表型；
以下的工作实施例说明：本发明用于促进核酸转移的制剂提高了基因向靶细胞的转移效率，表现为体外细胞培养系统中核酸表达。仅使用质粒DNA时这种体外细胞培养系统观察不到基因表达。那些实施例进一步说明：本发明用于促进核酸转移的制剂增加了细胞中核酸的稳定性，表现为与脂质体制剂相比，核酸表达持续的时间更长。
根据本发明，我们发现胶原和核酸之间发生静电和/或物理相互作用，形成复合物。因此，我们认为导致细胞内核酸稳定性增加的复合物形成是工作实施例中观察到核酸持续表达的原因。这和胶原持续释放基因的机制相当不同，传统上认为后者机制是随着胶原的生物降解，包裹在胶原基质中的基因逐渐释放。
附图简述
图1是代替绘图的琼脂糖凝胶电泳照片，描述特定浓度质粒DNA和不同浓度端胶原(atelocollagen)之间的静电相互作用。
图2是代替绘图的琼脂糖凝胶电泳照片，说明氯化钠对质粒DNA和端胶原之间静电相互作用的影响。
图3是代替绘图的琼脂糖凝胶电泳照片，说明硫酸乙酰肝素对质粒DNA和端胶原之间静电相互作用的影响。
图4是显微照片，显示了质粒DNA和各浓度端胶原之间复合物的一种形式。
图5是显微照片，显示了质粒DNA和各浓度端胶原之间复合物在保存一周后的一种形式。
图6是比较端胶原凝胶制剂、阳离子脂质体制剂和质粒DNA在PBS溶液中基因表达持续时间的图。
图7是说明包含各浓度胶原的复合物和质粒DNA转移效率之间关系的图，其中质粒DNA转移效率是以逐滴加入方式转染七天后测定的。
图8是说明包含各浓度胶原的复合物中以荧光强度表示的质粒DNA转移效率的图，其中质粒DNA转移效率是转染七天后测定的。
图9是说明包含各浓度胶原的复合物和质粒DNA转移效率之间关系的图，其中质粒DNA转移效率是以固相包被的方式转染七天后测定的。
图10是说明包含各浓度质粒DNA的复合物和质粒DNA转移效率之间关系的图，其中质粒DNA转移效率是以逐滴加入的方式转染七天后测定的。
图11是说明包含各浓度质粒DNA的复合物和质粒DNA转移效率之间关系的图，其中质粒DNA转移效率是以固相包被的方式转染七天后测定的。
图12是说明包含各浓度质粒DNA的复合物中以荧光强度表示的质粒DNA转移效率的图和显示荧光的显微照片，其中质粒DNA转移效率是以逐滴加入的方式转染七天后测定的。
图13是说明本发明对细胞增殖的抑制效应的图。
图14是说明以剂量依赖的方式进行固相包被来转移腺病毒的图和显示荧光的显微照片。
图15是说明与一分子质粒DNA相结合的胶原数和复合物平均长轴之间关系的图。
图16是说明于每个胶原分子对应所需核酸的核苷酸单体数和复合物平均长轴之间关系的图。
图17是说明混合时核苷酸对胶原的分子数比和复合物中与一个胶原分子相结合的核苷酸数之间关系的图。
图18是荧光显微照片，是使用荧光显微镜对包含从本发明的细胞培养器具表面释放的核苷酸的复合物进行观察时获得的。
图19是荧光显微照片，是使用荧光显微镜对包含从本发明的细胞培养器具表面释放的质粒DNA的复合物进行观察时获得的。
本发明的最佳实施模式
1)促进核酸转移的制剂
作为第一个实施方案，本发明提供了促进核酸向靶细胞中转移的制剂，其中该制剂包含胶原或胶原衍生物。该实施方案的理论依据是胶原或胶原衍生物对核酸向靶细胞中的转移具有促进作用，这种促进作用为首次发现。换句话说，本发明的这一实施方案提供了胶原或胶原衍生物促进核酸向靶细胞中转移的新用途。
本文所用的“胶原或胶原衍生物”通常指用于医药、化妆品、工业和食品领域的任何一种胶原或胶原衍生物。优选使用可溶的胶原和增溶性胶原。可溶的胶原可以溶于酸性或中性水或含有盐的水中；而增溶性胶原包括使用酶增溶的酶溶性胶原和使用碱增溶的碱溶性胶原。这两种胶原都能够优先穿透孔径为1μm的滤器。胶原的溶解性随胶原的交联程度的变化而变化，交联程度越高，胶原越难以溶解。相应的，举例来说，用于本发明的胶原的交联程度不超过三聚体，更优选的是不超过二聚体。举例来说，胶原的优选分子量约300,000至约900,000，更优选的是约300,000至约600,000。这里使用的胶原包括从任何动物物种中提取的胶原，优选的胶原需要从脊椎动物提取，较优选的胶原从哺乳动物、鸟、鱼中提取，更优选的胶原从哺乳动物或鸟中提取，具有较高的变性温度。任何类型的胶原都可以使用，优选I～V型胶原因为它们存在于动物体内。例如，这样的胶原包括通过酸提取法从哺乳动物皮肤中获得的I型胶原。更优选的是，它们包括通过酸提取法从小牛皮肤中获得的I型胶原和通过基因工程方法产生的I型胶原等。从腱中提取的胶原虽也是I型胶原，但不适用，这是因为它们交联程度高、不可溶。另外，出于安全考虑，优选使用通过酶学方法去除具有高抗原性的端肽的端胶原，或基因工程产生的端胶原；更优选的是使用每1000个氨基酸残基中含有三个或更少苏氨酸残基的端胶原。另一种方案是，可以根据需要使用具有一个此修饰侧链的胶原和交联的胶原等。举例来说，具有一个此修饰侧链的胶原包括琥珀酰胶原和甲基化胶原；举例来说，交联的胶原包括使用戊二醛、六甲撑二异氰酸酯、聚环氧化合物或其他这类化合物处理的胶原(Fragrance Journal 1989-12，104-109，Japanese Patent Publication(kokai)No.59522/1995)。优选的胶原衍生物是明胶，或明胶交联复合物，或其与胶原相连的交联复合物。
胶原或胶原衍生物可以和其他生物相容性物质混合使用。举例来说，生物相容性物质包括明胶、纤维蛋白、白蛋白、透明质酸、肝素、硫酸软骨素、壳多糖、脱乙酰壳多糖、藻酸、果胶、琼脂糖、羟磷灰石、聚丙烯、聚乙烯、聚二甲基硅氧烷；羟基乙酸、乳酸或氨基酸的多聚物；其共聚物；和包含两种或多种这些生物相容性物质的混合物。
2)促进核酸转移的制剂，其包括一种复合物
作为第二个实施方案，本发明提供了促进核酸向靶细胞中转移的制剂，包括胶原或胶原衍生物和所需的核酸，优选包括作为基本组分的复合物颗粒。
在有血清的条件下，对体外细胞仅施用核酸时，核酸难以转移至细胞中。当核酸和胶原或胶原衍生物形成复合物时，核酸可以有效地转移至细胞中。
本文所用的“核酸”可以是任何多聚核苷酸或任何寡核苷酸，可以是任何DNA或RNA分子。DNA分子包括质粒DNA、cDNA、基因组DNA或合成的DNA。DNA和RNA可以是双链或是单链。单链DNA包括编码链和非编码链。本文所用的“核酸”包括DNA衍生物和RNA衍生物，其中衍生物指具有硫代磷酸酯(phosphorothioate)键的核酸，或包含特定核苷酸的核酸，该核苷酸中的磷酸、糖或碱基组分为免遭酶解进行了化学修饰。本文所用的“核酸”还包括腺病毒和逆转录病毒之类的病毒。
优选的“核酸”是寡核苷酸或核酶，更优选的是由5～100个，更优选的是5～30个核苷酸聚合的寡核苷酸或核酶。优选使用编码具有生理活性的蛋白质的质粒DNA来治疗或改善病理状态，或使用编码能够诱导免疫应答的蛋白质的质粒DNA来治疗或改善病理状态。
当用于基因治疗的核酸是质粒DNA或病毒之类的载体时，优选的是构建用来在细胞中表达所编码的遗传信息的系统，比如包含表达目的基因所必需的启动子之类元件，或能够整合进染色体的元件的载体。这里用作核酸的质粒DNA大小没有限制，可以对其大小进行适当选择，使得可通过基因工程有效制备所编码的遗传信息，并使其在转移细胞中有效表达。
根据本发明，促进核酸转移的制剂可以含有数种独立的载体，这些载体包含不同的所需核酸。另外，一种载体可以包含许多遗传信息。用于促进转移的制剂中所包含载体的数量没有限制。
编码基因治疗中需要表达的蛋白质的核酸包括能够用于遗传性疾病治疗的任何基因，比如，但并不局限于编码腺苷脱氨酶、胸苷激酶之类酶；GM-CSF、IL-2之类细胞因子；或成纤维细胞生长因子HST-1(FGF4)的基因。编码基因治疗中需要表达的其他蛋白质的核酸包括，但并不局限于编码一种可以作为抗原来诱导免疫应答的蛋白质或肽、用于治疗或预防感染或肿瘤的基因，即所编码蛋白质或肽能够作为上文所提到的抗原的基因，比如编码流感病毒表面蛋白HA或NA或核蛋白NP；丙型肝炎病毒E2或NS1蛋白；乙型肝炎病毒HBs抗原蛋白；甲型肝炎病毒衣壳蛋白VP1或VP3或类衣壳蛋白；登革病毒Egp蛋白；RS病毒F或G蛋白；狂犬病病毒结构蛋白的G或N蛋白；疱疹gD蛋白；日本脑炎病毒E1或前M蛋白；轮状病毒外被蛋白VP7或外被蛋白VP4；人免疫缺陷病毒gp120或gp160蛋白；利什曼原虫主要表面抗原蛋白；疟疾环孢子体主要表面抗原蛋白；弓形虫54-kd或CS蛋白；导致骨疽的突变链球菌的细胞表面蛋白PAc的基因；编码MAGE-1、MAGE-2和BAGE之类的肿瘤抑制抗原；酪氨酸酶、Mart-1、gp100之类的组织特异性抗原；和gp75、p15、Muc1、CEA、HPV、E6、E7、HPR2/neu等的基因；和“Immunization withDNA”；Journal of Immunological Methods，vol.176，1994，pages 145-152一文中描述的基因。
在核酸为寡核苷酸的情况下，它们包括一种碱基序列，其中至少部分序列在生理条件下和基因的正义链或反义链互补结合。这样的基因包括所编码蛋白质具有打破生命体稳态的生理功能的基因，对病原性病毒、细菌或之类物质特异的基因。更特别的是，它们包括和基因的信使RNA互补结合的碱基序列。其中的基因包括对病原性病毒、细菌或之类物质特异的基因，或所编码蛋白质具有打破生命体稳态的生理功能的基因。
更特别的是，用于本发明的寡核苷酸包括和包含信使RNA起始密码子的区域、或前体信使RNA剪接位点相互补的序列。举例来说，用于本发明的此类寡核苷酸包括用于治疗或预防癌症的寡核苷酸，如具有5’-CTCGTAGGCGTTGTAGTTGT-3’序列(SEQ ID NO：1)、特异性抑制hst-1表达的寡核苷酸；特异性抑制蛋白激酶Cα来有效治疗非小细胞肺癌和结肠癌之类的渐进性癌症，并已在临床上用于治疗前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、大肠癌、小细胞肺癌的ISIS3521；特异性抑制C-raf激酶的表达，并已在临床上用于治疗前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、cephalophyma、胰腺癌、大肠癌、小细胞肺癌的ISIS5132/CGP69846A；特异性抑制Ha-ras激酶的表达，并已在临床上用于治疗大肠癌、乳腺癌、cephalophyma、胰腺癌、小细胞肺癌的ISIS2503；特异性抑制I型蛋白激酶A表达的GEM231；特异性抑制DNA甲基转移酶表达的MG98；抑制c-myc表达的INXC-6295；抑制c-myb表达、并已考虑用于治疗白血病的INX-3001；抑制bcl-2表达、并已考虑用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤、大肠癌、小细胞肺癌、慢性淋巴样白血病、急性髓细胞样白血病、乳腺癌、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、非小细胞肺癌、前列腺癌的G-3139(Genasense)；抑制MDM2蛋白表达的寡核苷酸；抑制VEGF表达的寡核苷酸等等。另外，用于治疗或预防感染性疾病的寡核苷酸包括抑制HIV生长的GEM92和GPI-2A；抑制巨细胞病毒生长的ISIS2922(fomivirsen)、Vitravene、ISIS13312和GEM132；抑制丙型肝炎病毒生长的ISIS14803等等。用于治疗或预防炎症的寡核苷酸包括特异性抑制ICAM-1表达、并已在临床上用于治疗Crohn’s症、溃疡性结肠炎、肾移植排斥抑制、牛皮癣、哮喘的ISIS2302；抑制腺苷A1受体表达、并已在临床上用于治疗哮喘的EPI-2000；抑制TNF-α、CD49d(VLA-4)、VCAM-1、PECAM-1的寡核苷酸等等。另外，预防非开胸经皮穿刺冠状血管成形术后再狭窄的寡核苷酸包括抑制c-myc表达的Resten-NG；
举例来说，所编码蛋白质具有破坏体内稳态的生理功能的基因包括一系列称为癌基因的基因。特别地说，它们包括生长因子、受体型酪氨酸激酶、非受体型酪氨酸激酶、GTP结合蛋白、丝氨酸-苏氨酸激酶、转录因子等基因。更特别地说，它们包括编码hst-1或其他鸟氨酸脱羧酶等的基因。
根据本发明，促进核酸转移的制剂除了包括本发明中的复合物之外，还可以包括药学上可接受的合适添加剂。药学上可接受的添加剂包括维持等渗的试剂、pH调节剂、复合物作为针剂使用情况下的安慰剂、赋形剂、崩解剂、复合物作为固体使用情况下的包被剂和日本药物赋形剂手册(日本药物赋形剂委员会)中提到的那些添加剂。特别的例子包括用于保持pH在6-8或使与细胞等渗的盐和糖类。
根据本发明，促进核酸转移的制剂可以是固体或溶液形态。固体形态的制剂可以直接加到目标细胞中，也可以用纯水、生理溶液、和生命体等渗的缓冲液等配制成溶液加到目标细胞中。溶液形态的这种制剂也是本发明的一个组成部分。
根据本发明，用于促进核酸转移的制剂可以选择使用口服途径、注射、滴眼、滴鼻、经肺途径、经皮吸收等途径。优选口服途径和注射。制剂的施用部位随疾病的不同而变动，操作时可以置于必要的位置上。
在本实施方案中，本发明提供了：
(1)促进核酸向靶细胞转移的制剂，其包括作为必要组分的复合物，优选的是包含所需核酸和胶原或胶原衍生物的复合物颗粒，其中颗粒的长轴优选是300nm至300μm，较优选的是300nm至100μm，更优选的是300nm至50μm，最优选的是300nm至30μm；
(2)根据(1)的促进核酸转移的制剂，其中靶细胞是动物细胞；
(3)根据(2)的促进核酸转移的制剂，其中靶细胞是需要进行处理的器官或组织，或其周围细胞；
(4)根据(1)至(3)任何一项的促进核酸转移的制剂，其中胶原是端胶原；
(5)根据(1)至(4)任何一项的促进核酸转移的制剂，其中胶原的分子量为约300,000至约900,000；
(6)根据(1)至(5)任何一项的促进核酸转移的制剂，其中胶原衍生物是明胶或明胶交联复合物；
(7)根据(1)至(5)任何一项的促进核酸转移的制剂，其中胶原衍生物是胶原交联复合物；
(8)根据(1)至(7)任何一项的促进核酸转移的制剂，其中核酸是一种寡核苷酸；
(9)根据(8)的促进核酸转移的制剂，其中寡核苷酸长度为5至30个核苷酸；
(10)根据(8)或(9)的促进核酸转移的制剂，其中寡核苷酸是DNA或DNA衍生物；
(11)根据(8)或(9)的促进核酸转移的制剂，其中寡核苷酸是RNA或RNA衍生物；
(12)根据(10)或(11)的促进核酸转移的制剂，其中DNA衍生物或RNA衍生物至少含一个硫代磷酸酯键；
(13)根据(1)至(7)任何一项的促进核酸转移的制剂，其中核酸是核酶或寡核苷酸；
(14)根据(1)至(7)任何一项的促进核酸转移的制剂，其中核酸是质粒DNA；
(15)根据(13)的促进核酸转移的制剂，其中质粒DNA所编码的蛋白质具有治疗或改善病理状态的生理活性；
(16)根据(13)的促进核酸转移的制剂，其中质粒DNA所编码的蛋白质能够诱导免疫应答以治疗或改善病理状态；
(17)根据(1)至(16)任何一项的促进核酸转移的制剂，其中制剂是溶液形态，复合物包含10mg/ml或更少的核酸；
(18)根据(17)的促进核酸转移的制剂，其中复合物包含1mg/ml或更少的核酸；
(19)根据(18)的促进核酸转移的制剂，其中复合物包含500μg/ml或更少的核酸；
(20)根据(1)至(19)任何一项的促进核酸转移的制剂，其中制剂为pH5至pH9，优选为pH6至pH8；
(21)根据(1)至(20)任何一项的促进核酸转移的制剂，还包含浓度为0.001M至0.1M的磷酸；
(22)根据(21)的促进核酸转移的制剂，还包含浓度为0.01M至0.1M的磷酸；
(23)根据(1)至(22)任何一项的促进核酸转移的制剂，进一步包含抑制胶原交联体形成的试剂，例如蔗糖或精氨酸；和
(24)根据(1)至(24)任何一项的促进核酸转移的制剂，进一步包含适量的药学上可接受的添加剂。
3)复合物
作为第三个实施方案，本发明提供了包含胶原或胶原衍生物和所需核酸的一种复合物。该复合物包括通过静电力结合并形成的静电型复合物，和通过疏水结合之类的物理力结合并形成的物理型复合物。两种结合系统可能共存，这一实施方案也属于本发明的范围。
我们首次发现胶原和核酸发生静电相互作用，并形成复合物。
本文所用的“静电型复合物”指分子中带有许多电荷的胶原或胶原衍生物和核酸之间形成的聚离子复合物。特别是指带有正电荷的胶原或胶原衍生物吸引带有负电荷的核酸的结合体。在聚离子复合物中，复合物形成时分子中释放出许多相反离子，因此熵值大大增加。从这种静电型复合物形成的角度看，工作实施例中核酸的持续表达归因于导致细胞中核酸稳定性增加的复合物的形成。
本发明中复合物的最小单位是由一分子胶原和一分子核酸形成的复合物。我们发现一个胶原和一个核酸形成复合物，同时和另一个胶原结合从而形成缔合体。长轴约300nm、直径1.5nm的圆柱形胶原分子主要以分子间纵向平行的方式结合而形成缔合体。相应的，通过多个缔合体和多个核酸分子之间的非共价键结合形成复合物，包括长轴为1nm或由于缔合体延长所导致长轴更长的细丝状复合物；其各个细小缔合体是通过核酸相结合的细丝状复合物；及由更细小复合物和核酸形成的颗粒状复合物。
本发明的复合物可以具有多种形状。
本发明的复合物优选的是颗粒形态。本文所用的“颗粒”指胶原或胶原衍生物所能够形成的形状，不一定就指球形。本发明最小的复合物大小为300nm，和由一分子胶原所形成的复合物长轴相一致。颗粒具有300nm至1mm的长轴，从核酸转移效率角度看，它们优选具有300nm至300μm的长轴，较优选的是300nm至100μm，更优选的是300nm至50μm，最优选的是300nm至30μm。
我们发现复合物中包含的胶原或胶原衍生物和核酸的比例决定了复合物所能形成的形态或形状，复合物的形式仅取决于由胶原或胶原衍生物和核酸之间复合物的形成所驱动的胶原或胶原衍生物缔合体的形成(纤维化)。我们还发现缔合体形成过量对核酸的转移并不合适，发现通过调整待混合的胶原或胶原衍生物和所需核酸的浓度及诸如盐浓度、温度、pH、葡萄糖浓度之类的环境因素，可以控制复合物的形式和形状。另外，我们观察到在缔合过程中长度为1000bp或更长的质粒DNA所受驱动作用最强；而长度为100bp或更短的质粒DNA所受驱动作用最弱；并发现复合物形成过程中胶原或胶原衍生物的缔合受核酸长度的影响。因此我们推断对于依赖于核酸长度的缔合作用来说，存在有胶原或胶原衍生物和核酸的最适组成。
复合物的形态或形状可能会影响核酸向细胞中的转移效率。胶原和核酸形成复合物，以及复合物形状影响转移效率和核酸在细胞中表达效率的发现提供了对核酸转移效率加以优化的策略。从多个实践角度看，实验室中用于将核酸导入靶细胞的脂质体都难以得到广泛应用，这是因为当和核酸相混合时他们会立刻聚集在一起，使用时转移效率发生变化，必须现用现配。而本发明的复合物形态或形状在冷处保存条件下是稳定的。基因转移技术中最重要的问题是广泛应用的方法相当少。本发明的复合物形态或形状是稳定的，可以用于实践中。
在本发明的实施方案中，本发明提供了：
(1)包含有所需核酸和胶原或胶原衍生物的复合物颗粒；
(2)根据(1)的复合物颗粒，其中长轴是300nm至300μm；
(3)根据(2)的复合物颗粒，其中长轴是300nm至100μm；
(4)根据(3)的复合物颗粒，其中长轴是300nm至50μm，优选300nm至30μm；
(5)根据(1)至(4)的复合物颗粒，其中核酸是质粒DNA；
(6)根据(5)的复合物颗粒，其中胶原分子或胶原衍生物分子的数目和质粒DNA核苷酸单体的数目的比例是1∶20至1∶质粒DNA核苷酸单体数，优选的是1∶50至1∶质粒DNA核苷酸单体数，较优选的是1∶50至1∶4000，更优选的是1∶50至1∶2000，进一步优选的是1∶50至1∶1000；
(7)根据(6)的复合物颗粒，其中比例是1∶96至1∶质粒DNA核苷酸单体数；
(8)根据(7)的复合物颗粒，其中比例是1∶96至1∶1122；
(9)根据(8)的复合物颗粒，其中比例是1∶96至1∶701；
(10)根据(1)至(4)的复合物颗粒，其中核酸是寡核苷酸；
(11)根据(10)的复合物颗粒，其中胶原或胶原衍生物的数目和复合物中寡核苷酸中核苷酸单体的数目的比例是1∶1至1∶200，优选的是1∶3至1∶150，较优选的是1∶3至1∶120；
(12)根据(11)的复合物颗粒，其中比例是1∶20至1∶120；
(13)根据(12)的复合物颗粒，其中比例是1∶50至1∶120；
(14)根据(1)至(13)的复合物颗粒，包含在pH5至pH9，优选pH6至pH8的溶液中；
(15)制备(1)至(13)中复合物颗粒的方法，包括将胶原或胶原衍生物和所需核酸在冷却至10℃或更低的溶液中相混合；
(16)制备(1)至(13)中复合物颗粒的方法，包括将胶原或胶原衍生物和所需核酸在所含磷酸浓度为0.001M至0.1M的溶液中相混合；
(17)制备(1)至(13)中复合物颗粒的方法，包括将胶原或胶原衍生物和所需核酸在所含磷酸浓度为0.01M至0.1M的溶液中相混合；
(18)制备(1)至(13)中复合物颗粒的方法，包括将胶原或胶原衍生物和所需核酸在含有抑制胶原缔合体形成的试剂(如蔗糖或精氨酸)的溶液中相混合；
(19)制备(1)至(13)中复合物颗粒的方法，包括将胶原或胶原衍生物和所需核酸在含有适量的药学上可接受添加剂的溶液中相混合，其中药学上可接受添加剂定义如上；
(20)制备(1)至(13)中复合物颗粒的方法，包括将(14)至(19)的两种或多种方法联用；
(21)制备(1)至(13)中复合物颗粒的方法，进一步包括使复合物透过孔径为100μm或更小的滤器(filter)，进行大小选择；
(22)根据(21)的方法，包括使复合物透过孔径为10μm或更小的滤器，进行大小选择；
(23)制备(1)至(13)中复合物颗粒的方法，进一步包括在10,000rpm或更高转速下将复合物加以离心，进行浓缩和分离；
(24)根据(23)的方法，包括在50,000rpm或更高转速下将复合物加以离心。
本文所用的“核苷酸单体数”指组成所需核酸的核苷酸的单体单元数。本文所用的“胶原分子或胶原衍生物分子的数目和质粒DNA核苷酸单体的数目的比例”指相对于静电型或物理型复合物中含有和一分子胶原或胶原衍生物，所需核酸中核苷酸的单体数。核苷酸单体数和“所需核酸中的负电荷”几乎相同。本文所用的“所需核酸中的负电荷”指插入组成核酸的核苷酸间的磷酸基团数。核酸中负电荷的数值和核酸中磷酸基团数、插入核苷酸间的磷酸基团数及插入核苷酸间的含磷基团数(磷酸基团和硫代磷酸基团)相等。
本文所用的“抑制胶原缔合体形成的试剂”指通过抑制静电相互作用从而抑制利用胶原分子中主要包含的碱性和酸性氨基酸电荷形成胶原缔合体的试剂，和抑制胶原分子有序排列的试剂。举例来说，前者包括氨基酸盐和脲；后者包括蔗糖之类的糖和精氨酸。
本发明的复合物颗粒可以包含在本发明中用于促进核酸转移的制剂中。
4)医用器具和细胞培养器具
作为第四个实施方案，本发明提供了表面包被有本发明的复合物颗粒的医用器具或细胞培养器具。
我们发现，和逐滴加入复合物颗粒相比，当本发明的复合物颗粒包被在固体表面并使靶细胞与之相接触时，能够提高核酸的转移效率。也就是说，从转染效率上讲，固相包被复合物颗粒比逐滴加入更好(如实施例6所示)。
特别地说，根据本实施方案，医用器具和细胞培养器具包括人造血管移植物、医用移植片固定模和人造心脏。需要使用人造血管移植物以使得血管内皮细胞增殖及在其内侧的伸展，从而抑制血管内纤维蛋白的形成和阻遏补体活化。因此，当包被在人造血管移植物上时，本发明的复合物颗粒——其中编码血管内皮生长因子(VEGF)之类内皮生长因子的核酸和胶原相结合——应该容易且快速地促进血管内皮细胞的增殖。
表面包被有包含所需核酸和胶原或胶原衍生物复合物颗粒的细胞培养器具包括细胞培养实验中通常使用的平皿、烧瓶、96微孔板。之后的实施例6说明包被在单位面积固体表面上的复合物颗粒量显著影响核酸向细胞中的转移。相应的，包被在单位面积固体表面上的复合物颗粒量构成了本发明的一部分。
在本实施方案中，本发明特别提供了：
(1)包被有包含所需核酸和胶原或胶原衍生物的复合物颗粒的医用器具或细胞培养器具；
(2)根据(1)的医用器具或细胞培养器具，其中包被有复合物颗粒，使1平方厘米的面积上含有0.1μg至50μg核酸；
(3)根据(1)的医用器具或细胞培养器具，其中包被有复合物颗粒，使1平方厘米的面积上含有0.1μg至50μg核酸；
(4)根据(3)的医用器具或细胞培养器具，其中包被有复合物颗粒，使1平方厘米的面积上含有1μg至10μg核酸；
(5)根据(1)的医用器具或细胞培养器具，当浸入与活体等渗的溶液时，从固体表面释放具有300nm至300μm的长轴的复合物颗粒；
(6)根据(5)的医用器具或细胞培养器具，其中与活体等渗的溶液是包含氯化钠的磷酸缓冲液；
本发明在市场上的易配送性(distribution)对于本实施方案的实现是重要的。如上所述，脂质体需要现用现配，说明脂质体配送性极差。一般认为，包被在固体表面的腺病毒是难以配送的。但是，人们意外的发现，和本发明的胶原一起包被在固体表面并加以干燥的腺病毒室温下保存7天后仍具有感染性。这说明本发明的医用器具和细胞培养器具有在市场上配送的可行性。
5)将所需核酸转移至靶细胞的方法或提高所需核酸在靶细胞中表达水平的方法
如上所述，本发明的复合物颗粒可以用于促进所需核酸向靶细胞中的转移。因此，作为第五个实施方案，本发明提供了将所需核酸转移至靶细胞中的方法或提高所需核酸在靶细胞中表达水平的方法，包括使用本发明中的复合物颗粒。本文所用的“提高表达水平”指增加所需核酸的表达水平或延长表达的持续时间。
因此，在本实施方案中，本发明提供了：
(1)将所需核酸转移至靶细胞中的方法，该方法包括使用上文定义的、包含所需核酸和胶原或胶原衍生物的复合物颗粒；
(2)提高所需核酸在靶细胞中表达水平的方法，该方法包括使用上文定义的、包含所需核酸和胶原或胶原衍生物的复合物颗粒；
(3)根据(2)的方法，其中方法是为了提高表达水平，或延长表达的持续时间；
(4)根据(1)至(3)任何一项的方法，其中上文定义的复合物颗粒包被在固体表面上，靶细胞在固体表面上培养。
6)检验基因或蛋白质在靶细胞中功能的方法
根据核酸向细胞中的转移得以促进的本发明，能够容易地验证基因或蛋白质在靶细胞中的功能。例如，人类基因组计划鉴定出大量基因，并公布了其碱基序列。有必要阐明这些已鉴定基因的功能，以将这些信息实际用于医药或食品工业领域。然而，逐一产生并纯化这些基因所表达的蛋白质来验证其功能的传统方法显然比较耗时，且不实际。相应地，往细胞中导入包含待验证基因的质粒DNA并将之表达来验证基因功能的方法，或往细胞中导入抑制待验证基因的反义寡核苷酸、使之抑制基因表达的方法将非常有用。通过观察如上所述的细胞表型来验证基因功能时，必须将质粒DNA或反义DNA导入细胞，而尽量不对细胞产生负面影响。因此，具有较高细胞毒性的脂质体会干扰所获得的结果。另一方面，这里所使用的胶原则几乎对细胞没有影响，这是因为胶原在活体中原本存在，并和细胞相接触。因此，本发明消除了基因功能测定中的杂音。特定的测定方法包括将胶原与表达待验证基因的质粒DNA或腺病毒，或抑制待验证基因表达的反义寡核苷酸相混合，使之形成复合物颗粒，然后将复合物颗粒包被并排列在培养板的固体表面。这里所使用的固体板包括96孔多孔板和微孔板。包被的复合物颗粒在固体上干燥并固定后，将细胞在板上接种并培养数天。包被的复合物颗粒有效进入与包被部位相接触的细胞中，使待验证基因在长时间内表达或表达受阻。数天后，检验细胞形态、细胞中基因表达水平或细胞所产生蛋白质的种类或含量，阐明靶基因的功能。本发明的特征还包括选择性地、有效地将包被在固体上的复合物颗粒转移到与包被部位相接触的细胞中。也就是说，不通过孔将细胞隔开，也有可能同时在微孔板上验证大量基因的功能。
在本实施方案中，本发明提供了：
(1)检验基因或蛋白质在靶细胞中的功能的方法，包括用本发明上述(3)的复合物颗粒包被固体表面，其中复合物颗粒包括基因、编码蛋白质的基因或抑制细胞中基因或蛋白质表达的核酸；将靶细胞培养在固体表面上；检验靶细胞中核酸的表达水平，或基因或蛋白质的表达水平，或增殖率或细胞表型；
(2)根据(1)的方法，其中编码蛋白质的基因或核酸是质粒DNA，检验核酸的表达水平；和
(3)根据(1)的方法，其中抑制细胞中蛋白质表达的基因或核酸是反义寡核苷酸或核酶，检验基因或蛋白质表达水平。
7)筛选用于治疗疾病的核酸的方法
根据核酸向细胞中的转移得以促进的本发明，有可能筛选到能够补偿正常基因、修复或纠正缺陷基因从而治疗遗传性疾病、癌症、AIDS、类风湿关节炎、生活类型相关疾病等各种病症的核酸。例如，包含有已证明对疾病具有疗效的核酸和胶原的复合物颗粒形成，并如6)中所述在固体上包被、干燥并固定之后，将代表病理状态的细胞培养在板上，将核酸有效转移至代表病理状态的细胞中。根据细胞形态、细胞死亡、细胞增殖、细胞内基因表达模式或细胞所产生蛋白质类型或含量的变化来验证核酸的影响。显然，本实施方案的核酸转移中，待转移质粒的影响应减至最小，这里所使用的胶原使我们能够在没有杂讯的情况下测定对病理状态的影响。本发明的特征还包括同时对大量基因进行验证，这是因为待进行功能验证的核酸可以固定并排列在具有微小面积的细胞培养固态载体上。
在本实施方案中，本发明提供了：
(1)筛选用于治疗疾病的核酸的方法，包括用本发明中的复合物颗粒包被固体表面，其中复合物颗粒包含抑制细胞中疾病相关基因表达的核酸候选物；将呈现疾病状态的细胞培养在固体表面上；检验受各核酸候选物抑制的基因的表达水平，或增殖率或细胞表型；
(2)检验预期抑制疾病相关基因表达的核酸的疗效的方法，包括用本发明中包含核酸的复合物颗粒包被固体表面；将呈现疾病状态的细胞培养在固体表面上；检验基因的表达水平，或增殖率或细胞表型；
(3)根据(1)和(2)的方法，其中核酸抑制细胞中疾病相关基因的表达，或具有抑制细胞中疾病相关基因表达的功能；和
(4)根据(3)的方法，其中抑制细胞中疾病相关基因表达的核酸是编码基因的质粒DNA，或具有抑制细胞中疾病相关基因表达的功能的核酸是反义寡核苷酸或核酶。
8)其他实施方案
在这些实施方案中，本发明提供了
(1)一种细胞培养器具，其表面包被有和胶原或胶原衍生物在一起的所需核酸；在优选的细胞培养器具中所需核酸和胶原或胶原衍生物相复合形成复合物颗粒；
(2)一种细胞培养器具，其表面包被有包含胶原或胶原衍生物的薄膜，所述胶原或胶原衍生物包裹(contain)所需核酸；在优选的细胞培养器具中所需核酸和胶原或胶原衍生物相复合形成复合物颗粒；
(3)一种细胞培养器具，其表面包被有包含胶原或胶原衍生物和所需核酸的薄膜；
(4)根据(1)至(3)的细胞培养器具，其中核酸组成一个文库；
(5)根据(4)的细胞培养器具，其中核酸是组成文库的cDNA或寡核苷酸；
(6)根据(4)或(5)的细胞培养器具，其中组成文库的核酸以一定的距离分隔开；
(7)包含胶原或胶原衍生物和所需核酸的薄膜，其中组成文库的核酸以一定的距离分隔开；在优选的薄膜中核酸和胶原或胶原衍生物相复合形成复合物颗粒；
(8)根据(7)的薄膜，其中核酸是组成文库的cDNA或寡核苷酸；
(9)根据(2)或(3)的细胞培养器具，其表面上包被有(7)或(8)中的薄膜；
(10)根据(9)的细胞培养器具，用于表达蛋白质；
(11)根据(9)的细胞培养器具，用于抑制基因表达；
(12)检验细胞中基因功能的方法，该方法包含在(1)至(6)的细胞培养器具上培养细胞，所述细胞培养器具上固定了含有基因的cDNA的核酸；检验增殖率或细胞表型或特定蛋白质的产生水平；
(13)检验细胞中基因功能的方法，该方法包含在(1)至(6)的细胞培养器具上培养细胞，所述细胞培养器具上固定了含有与基因信使RNA互补的碱基序列的寡核苷酸；检验增殖率或细胞表型或特定蛋白质的产生水平；
(14)(1)至(6)的细胞培养器具，其中细胞培养器具固定有核酸的部位之外的表面的亲水性或疏水性足够高，使得细胞不能与之粘附。
为了在固相上将核酸转移至靶细胞中，可以将细胞培养在细胞培养器具上，所述细胞培养器具上直接固定有和胶原或胶原衍生物在一起的所需核酸，或和胶原或胶原衍生物相复合形成复合物颗粒的所需核酸。另一个方案是，可以将靶细胞培养在细胞培养器具表面，其表面覆盖有包含包裹所需核酸的胶原或胶原衍生物的薄膜，或包含复合物颗粒的薄膜。可以使用由琼脂糖或清蛋白制成的、含有包裹所需核酸的胶原或胶原衍生物或复合物颗粒的薄膜。
本发明包括固相制备由分别复合有胶原或胶原衍生物的各种核酸组成的文库，从而使同样时间、同一条件下验证细胞中基因的功能成为可能。另外，本发明提供了用于基因表达的文库或用于抑制基因表达的文库，其中包含文库cDNA的核酸或寡核苷酸排列在固相上，使得能够验证细胞某个阶段上的基因功能。包含组成文库的cDNA的核酸没有种属限制，包括Gene Storm pcDNA3.1载体(In Vitrogen，Inc)。
当包含核酸的复合物排列在固相上，并在固相上进行细胞培养来验证导入基因的功能时，需要避免导入不同核酸的细胞间的交叉污染。
本发明的特征还包括有选择性地、高效地将固相包被的复合物颗粒导入和包被部位相粘附的细胞中。也就是说，不用孔将细胞隔开也有可能同时在微孔板上验证大量基因的功能。用孔将各个排列有核酸的部位分隔开，每块板分隔成6至384个孔。除了孔之外，固相上细胞不能相粘附的高亲水性或高疏水性表面可用于防止细胞在排列有核酸的多个部位间穿越。这里所用的高亲水性表面指水接触角为40度或更小的表面；高度疏水性表面指水接触角度为110度或更大的表面。所排列核酸之间的距离应该大于所接种细胞能延展的最大长度。因此，当细胞培养器具固定有核酸部位或包被有包含核酸的薄膜之外的表面高度亲水或高度疏水时，没有必要用孔将细胞隔开来进行细胞培养，有可能在一块微孔板上验证大量基因的功能。
实施例
下面的实施例和实验进一步说明了本发明，但从任何意义上说这些实施例和实验都没有对本发明加以限制。
实施例1
质粒DNA和胶原之间复合物的形成
将包含掺入成纤维生长因子HST-1(FGF4)基因(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，2890-2984(1987))的10μg/ml质粒DNA(pCAHST-1：7.9Kbp)的水溶液和包含200、60、20、6、2、0.6和0μg端胶原(KOKEN有限公司)的中性水溶液等量相混合，通过琼脂糖凝胶电泳对混合物进行分析。利用0.8％的琼脂糖凝胶在盛有TAE(Tris-acetate)缓冲液的水平电泳仪(Mupid，Advance CO.)中进行琼脂糖凝胶电泳。电泳后，用溴化乙锭对凝胶染色，利用透照仪进行照相。结果如图1所示。10μg/ml或更大浓度的胶原存在时，pCAHST-1并不泳动，滞留在点样孔中。这说明5μg/ml的pCAHST-1和10μg/ml的胶原形成了复合物。
类似地，将10μg/ml的pCAHST-1和100μg/ml的胶原等量混合在含有1.0M氯化钠的10mM Tris(pH7.5)盐酸缓冲液中，对混合物进行电泳，结果如图2所示。当同时存在1.0M氯化钠时，尽管胶原浓度为100μg/ml，pCAHST-1仍发生泳动。这说明pCAHST-1和胶原所形成的复合物是静电型的。
另外，在存在和不存在硫酸乙酰肝素的条件下，对10μg/ml的pCAHST-1和含有1.0M氯化钠的10mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)中的胶原之间复合物的形成加以比较。结果如图3所示。在不存在硫酸乙酰肝素的条件下，5μg/ml的pCAHST-1全部和100μg/ml的胶原形成复合物，而存在硫酸乙酰肝素的条件下，发现有些pCAHST-1和300μg/ml的胶原都不能形成复合物。这说明硫酸乙酰肝素具有和pCAHST-1相似的负电荷，在复合物形成过程中和pCAHST-1竞争与胶原的结合，说明pCAHST-1和胶原形成静电型复合物。
实施例2
复合物的显微分析
将包含200μg/ml pCAHST-1的水溶液和包含0、20、200和1000μg/ml端胶原的水溶液等量相混合，往混合物中加入PicoGreen dsDNA定量试剂(分子探针)对pCAHST-1进行染色，通过显微镜进行观察。结果如图4所示。混合后胶原浓度为500μg/ml(图中为0.05％胶原)时，主要观察到了长轴大于1mm的细丝状复合物；而胶原浓度为100μg/ml(图中为0.01％胶原)时，主要观察到了长轴为10至100μm的颗粒状复合物；而胶原浓度为10μg/ml(图中为0.001％胶原)时，主要观察到了长轴为10μm或更小的颗粒状复合物。这说明可以通过混合时质粒DNA和胶原的浓度来控制复合物形成的形态。5℃下，存放一周或更长时间复合物保持其形状不变(图5)。这说明复合物可以长时间保存，以即用形式在市场上配送，不需要现用现配。
实施例3
复合物对表达持续时间的延长作用
将包含编码有荧光蛋白(EGFP)的200μg/ml质粒DNA(pCMV-EGFP/pEGFP-N1，Clontech公司)的水溶液和包含0.02％(w/w)端胶原的水溶液等量相混合，配制成凝胶状制剂。
对于在平皿(直径：6cm)中培养的人胚肾细胞293细胞来说，在存在2ml无血清培养基的条件下加入100μl凝胶制剂(含pCMV-EGFP10ug)。随后，于37℃培养过夜，用PBS洗细胞，去除无血清培养基和凝胶制剂，在含有10％小牛血清的培养基中培养。定时通过荧光显微镜对细胞进行观察，检测EGFP的表达。含有等量pCMV-EGFP的PBS溶液、阳离子脂质体制剂和pCMV-EGFP之间形成的复合物作为对照加入293细胞中。
结果如图6所示。加入pCMV-EGFP凝胶制剂时，观察到了EGFP的表达，且发现加入后表达持续时间长达52天。另一方面，加入包含pCMV-EGFP的PBS溶液时，没有观察到EGFP的表达；加入阳离子脂质体制剂时，发现EGFP的表达持续时间仅为2天。这些结果说明质粒DNA和胶原制剂的形成促进质粒DNA的表达效率，并在较长时间内维持表达。
这说明质粒DNA和胶原所形成的复合物可以促进核酸向细胞中的转移，增加质粒DNA在细胞内和细胞外的稳定性，最终延长细胞内基因表达的时间。不局限于特定的操作理论，我们认为系统中不存在复合物时表达时间的延长是因为复合物和细胞的相互作用强，通过洗涤不能将其去除；或复合物进入了细胞中。
实施例4
复合物组分对质粒DNA转移效率的影响
利用pCMV-EGFP为质粒DNA，制备如表1所示的复合物组分。
表1
  复合物   端胶原(％)   pDNA(μg/ml)
  EGFG-1   0   100
  EGFG-2   0.001   100
  EGFG-3   0.01   100
  EGFG-4   0.05   100
  EGFG-5   0.1   100
结果表明转移效率得以促进的顺序为EGFG-3复合物＞EGFG-2复合物＞EGFG-4复合物＝EGFG-5复合物。EGFG-1中未发现核酸转移。这说明质粒DNA和端胶原之间复合物的形成促进了质粒DNA的表达效率，包含等量质粒DNA的复合物中的表达效率随端胶原含量的变化而发生变化。
实施例5
质粒DNA用量对DNA质粒转移效率的影响
将0、10、50、250、500μl的EGFG-3复合物(0.01％端胶原，100μg/mlpCMV-EGFP)加入到于6-孔板中用1ml无血清培养基培养的293细胞中，这是因为实施例4中发现这种EGFG-3复合物转移效率最高。随后，于37℃培养过夜，用PBS洗细胞，去除无血清培养基和复合物，换为10％FBS(含有10％小牛血清的培养基)培养。6天中定时通过荧光显微镜对细胞进行观察，检测EGFP表达。
当质粒DNA的用量增加时，转移效率也得以提高。下面列出了详细的数据。在表中，在显微镜视野所限定的区域内的所有细胞中，对发射由EGFP表达所导致的荧光的细胞进行计数，估算表达效率。
表2
EGFG-3(μl)   转染效率100 250 500
  EGFP表达细胞(细胞/孔)效率   2620.006   10570.03   10810.03
实施例6
逐滴加入和固相包被的复合物对表达持续时间的延长作用的比较
首先，以EGFG-3复合物组分(0.01％端胶原，100μg/ml pCMV-EGFP)为基础对胶原和质粒DNA的组成进行优化。这是因为发现这种EGFG-3复合物转移效率最高。随后，对逐滴加入和固相包被之间的表达持续时间进行比较。
(1)使用pCMV-EGFP作为质粒DNA，制备含有如表3所示各种浓度atelocollage组分的复合物。
表3相对于端胶原的基因转染效率
  复合物   端胶原(％)   pDNA(μg/ml)
  EGFG-3A   0.005   100
  EGFG-3B   0.008   100
  EGFG-3   0.01   100
  EGFG-3C   0.015   100
  EGFG-3D   0.02   100
  EGFG-3E   0.03   100
  仅pDNA   0   100
制备的复合物逐滴加入到于6-孔板中用1ml无血清培养基培养的293细胞中。随后，于37℃培养过夜，用PBS洗细胞，去除无血清培养基和复合物，换为含有10％牛血清的培养基培养。7天后，通过荧光显微镜对细胞进行观察，对表达EGFP的细胞进行计数。结果如图7所示。对于EGFG-3B、3D、3E来说，测定所表达EGFP的荧光强度(ArrayScan II系统，Cellomics公司)。相对荧光强度如图8所示。
制备的复合物以250μl/孔的用量包被在6-孔板上，将板晾干30分钟。随后，往板中加入在含有10％FBS的培养基中培养的293细胞(4～5×105细胞/孔)，于37℃培养过夜。数天后，通过荧光显微镜对细胞进行观察，对表达EGFP的细胞进行计数。结果如图9所示。
图7所示为逐滴加入的结果，图9所示为固相包被的结果，这些结果表明胶原浓度影响转移效率，并且在转移效率方面固相包被优于逐滴加入。
(2)制备含有如表4所示各种浓度质粒DNA组分的复合物，比较逐滴加入和固相包被之间的转移效率。
表4
  复合物   端胶原(％)   pDNA(μg/ml)
  EGFG-3B   0.008   100
  EGFG-3B2   0.008   60
  EGFG-3B3   0.008   40
EGFG-3B4 0.008 20
逐滴加入的结果如图10所示，固相包被的结果如图11所示。固相包被时各样品的EGFP相对荧光强度如图12所示。这些结果表明质粒DNA的浓度影响转移效率，特别地说EGFP的表达水平、质粒或DNA的浓度是正相关的，并且在转移效率方面固相包被优于逐滴加入。
实施例7
将固相包被应用于筛选方法
具有与成纤维生长因子HST-1(FGF4)基因(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，2890-2984(1987)中描述)的4196bp～4216bp之间序列互补的10μM硫代磷酸反义寡核苷酸(5’-CTCGTAGGCGTTGTAGTTGT-3’；分子量约6500；SEQ ID NO：2)(5)(Sawaday)，和0.05％端胶原溶液相混合形成复合物。复合物包被在用于细胞培养的96-孔板底部，晾干，从而获得底部包被有复合物的细胞培养器具。类似地，具有和HST-1相同序列的硫代磷酸正义寡核苷酸(5’-GAGCATCCGCAACATCAACA-3’；SEQ ID NO：3)(1)；和具有反义寡核苷酸序列被打乱的序列的硫代磷酸反义寡核苷酸(5’-AGTCGCATGCACACAACACA-3’；SEQ IDNO：4)(2)；和三个随机序列[(5’-GACCATCGTCGATTCCAGT-3’；SEQID NO：5)(3)、(5’-CATGAACATCCTGAGCATCC-3’；SEQ ID NO：6)(4)和(5’-GTTCACGAAGAAAGAAGGCT-3’；SEQ ID NO：7)(6)]分别和胶原复合形成复合物。复合物包被在底部并加以干燥。在包被有上述寡核苷酸的板中，对于细胞增殖为HST-1超表达所增强的NEC8细胞和细胞增殖为HST-1之外的基因所增强的HepG2细胞来说，接种密度为0.5×105细胞/孔，细胞培养4天。培养后，利用TetraColor ONE细胞增殖分析试剂来分析对细胞增殖的抑制作用。特别地说，使用450nm处的光吸收作为对照，利用分光光度法测定650nm处染色样品溶液的光吸收(图13)。
结果仅在包被由HST-1反义寡核苷酸和胶原形成的复合物时观察到了对NEC8细胞增殖的抑制作用(图13-5)。另一方面，板底部包被由HST-1正义寡核苷酸和胶原形成的复合物时没有观察到抑制作用(图13-1)。板底部包被由反义寡核苷酸序列得打乱后的硫代磷酸反义寡核苷酸(图13-2)、随机序列(图13-3、13-4、13-6)与胶原形成的复合物时也没有观察到抑制作用。这些结果表明：当和端胶原相复合的反义寡核苷酸包被在固相上，且细胞在上面培养时，不使用基因转移试剂如在活体中通常不存在的阳离子脂质体和阳离子脂类物质，也有可能进行负责细胞增殖的基因的筛选。另外，这些结果还表明：本方法使人们能够使用少量细胞和寡核苷酸来灵敏地检验基因功能，不存在细胞受基因转移试剂损伤所致的杂讯。
实施例8
使用端胶原在空气干燥条件下保存腺病毒载体
通过固相包被制备
10μl溶于DMEM溶液的、滴度为1×108pfu/ml的腺病毒载体AdCMVEGFP(K.Aoki，et al.，Mol.Ther.(2000)1(6)：555-565)溶液和溶于PBS(-)的5μl 2％端胶原溶液相混合。将50μl混合物加入到24-孔细胞培养板(未包被)(Corning Inc.)中，使用调至冷状态的干燥器在室温下吹15分钟使培养板干燥，实现固相包被。
检验存放过程中的病毒稳定性
包被好的培养板在室温下存放1天、7天和14天时往其中加入密度为2×105细胞/孔的人肝癌细胞系HepG2细胞，用荧光显微镜观察GFP的表达水平。使用仅包被有腺病毒和仅包被有端胶原的细胞培养板进行类似的实验，作为对照。
结果如表5所示。
表5
  接种2天后的GFP阳性细胞比(％)
  腺病毒/端胶原   仅腺病毒   仅端胶原
  r.t.存放r.t.存放   1天7天   6442   7210或更少   00
  r.t.存放   14天
r.t.指室温
表5说明存放14天后腺病毒载体仍然存活，意味着本发明的固相包被提供了包含腺病毒载体的筛选培养板，该培养板便于在市场上配送。
实施例9
固相包被的腺病毒剂量依赖式基因转移作用
溶于DMEM溶液的、滴度为4×104pfu/ml、4×105pfu/ml、4×106pfu/ml、4×107pfu/ml的腺病毒载体AdCMVEGFP(K.Aoki，et al.，Mol.Ther.(2000)1(6)：555-565)溶液和160μg/ml的端胶原溶液等量混合在一起。混合物可以在4℃长期保存，而不降低活性。将50μl混合物加入到24-孔细胞培养板(未包被)(Corning Inc.)中，将培养板晾干，实现固相包被。培养板至少可以保存2周至4周而不降低活性。胚胎干细胞(ES细胞)接种在包被的培养板上，三天后通过荧光显微镜检测GFP的表达，同时测定荧光强度。结果发现GFP的荧光强度和腺病毒的剂量呈正相关(图14)。该结果说明本发明为利用腺病毒进行ES细胞的高通量筛选提供了一个有用的工具，和用于筛选的、包被有由腺病毒和胶原形成的复合物的培养板。
实施例10
包含质粒DNA的复合物的组成和平均长轴之间的关系
含200μg/ml编码荧光蛋白(EGFP)(pCMV-EGFP/pEGFP-N1，4.1kbp，Clontech公司)的质粒DNA的等量水溶液、包含氯化钠的0.1M磷酸缓冲液(PB)或0.01M磷酸缓冲液(PBS)冷却至10℃或更低温度，和包含0.002％～0.02％端胶原、并冷却至10℃或更低温度的水溶液混合在一起。混合物于10℃或更低温度下放置过夜，形成凝胶状制剂。凝胶制剂通过孔径为70μm或10μm的滤器过滤，制备具有规则大小的凝胶制剂。
往制剂中加入PicoGreen dsDNA定量试剂(分子探针)，对pCMV-EGFP进行染色，通过荧光显微镜测定复合物的长轴。类似地，编码HST-1分泌性信号肽及白细胞介素-2的质粒DNA(pCMV-HST-1-IL-2，6.2kbp)和端胶原混合在一起，形成凝胶状制剂，测定复合物的长轴。另外，将凝胶制剂在琼脂糖凝胶上电泳(Tris-醋酸缓冲液，0.8％琼脂糖凝胶)，使掺入到复合物中的质粒DNA和未掺入复合物中的质粒DNA分开。使用溴乙锭对未掺入复合物的质粒DNA的条带进行染色，使用Fluor-S-Multi Imager(BIO-RAD)测定荧光强度。根据电泳中已知浓度质粒DNA条带的荧光强度绘制标准曲线，然后根据该标准曲线确定未掺入复合物的质粒DNA的量，和复合物中所含DNA负电荷与胶原分子量的比例。结果如表6所示。
表6
Figure C0281640000321
表中“Solv.”指溶剂。“C.C.(％)”指胶原浓度(％)。“每C.M的N.M数”指每个胶原分子对应的核苷酸单体数。“70μm滤器过滤后”指通过孔径为70μm的滤器过滤后。“10μm滤器过滤后”指通过孔径为10μm的滤器过滤后。
对于pCMV-EGFP和pCMV-HST-1-IL-2来说，当胶原浓度为0.05％或更大时，使用不含盐的水作为溶剂以获得平均长轴是122μm或更大的复合物。当胶原浓度为0.005％～0.02％时，获得平均长轴是6.1μm～53μm的复合物；当胶原浓度为0.001％时，获得平均长轴是10μm或更小的复合物。结果表明当使用不含盐的水作为溶解时，可以通过调整待混合的质粒DNA和胶原的浓度来控制复合物的形式或形状。
该结果和使用pCAHST-1制备复合物的实施例2中获得的结果相一致。其中所用的质粒DNA大小不同，pCAHST-1为7.9kbp，pCMV-EGFP为4.7kbp，pCMV-HST-1-IL-2为6.2kbp。说明质粒DNA的大小从不影响所形成复合物的形态或形状。
另一方面，包含氯化钠的0.1M磷酸缓冲液或0.01M磷酸缓冲液用作溶剂时获得平均长轴为3.4μm～29μm的复合物。当胶原浓度为0.001％～0.1％时，没有100μm或更大的复合物形成。人们认为这是由于溶液中的盐抑制了胶原缔合体的形成。说明在存在有抑制胶原缔合体形成的试剂的条件下制备复合物时，平均长轴为100μm或更小的复合物的制备不受胶原浓度的影响。
另外，通过将质粒DNA和胶原相混合获得凝胶制剂，并将之通过孔径为70μm或10μm的滤器进行过滤时，可以制备具有较小平均长轴和具有规则大小的复合物。
图15显示了与一分子质粒DNA相结合的胶原数和复合物平均长轴之间的关系。对于用在不含盐的水中的pCMV-EGFP和pCMV-HST-1-IL-2来说，发现随着与质粒DNA相结合的胶原数的增加，复合物平均长轴有延长的趋势。另一方面，当包含氯化钠的0.1M磷酸缓冲液或0.01M磷酸缓冲液用作溶剂来制备复合物时，未发现有这种趋势。即使在使用水作为溶剂、平均长轴为100μm或更大的胶原分子和质粒DNA相复合的条件下，用包含氯化钠的0.1M磷酸缓冲液或0.01M磷酸缓冲液用作溶剂所获得的复合物平均长轴也不超过50μm。这是因为如上所述用水作为溶剂时，沿着胶原缔合体长轴进行有延伸反应，其中胶原缔合体的形成是通过质粒DNA和胶原之间复合物的形成逐步展开的。另一方面，在有盐存在的情况下，通过一个胶原分子和一个质粒DNA分子的吸附所形成的胶原缔合体并不能充分地沿着长轴延长，因此许多细小的缔合体和质粒DNA相结合，形成特定的结构。已知在适当的盐浓度下胶原能够形成细小的缔合体。因此，可以认为在和质粒DNA相混合之前，部分胶原已经形成了细小的缔合体，细小的缔合体吸附质粒DNA并形成复合物。这表明可以通过将质粒DNA和已形成细小缔合体的胶原相混合，制备平均长轴为50μm或更小的复合物。
不考虑质粒DNA的大小，对和一个胶原分子对应的质粒DNA中核苷酸单体进行计数，对其结果进行一般分析。图16显示了每个胶原分子所对应的质粒DNA中核苷酸的单体数和复合物平均长轴的关系。我们发现随着质粒DNA中核苷酸单体数的减少，复合物的平均长轴有延长的趋势。
综合图16和表16，得出以下结论。当核苷酸单体数为95或更小时，获得平均长轴为120μm或更大的复合物。这说明每个胶原分子所对应的质粒DNA中核苷酸单体数的减少意味着复合物中和质粒DNA相对应的胶原分子数增多，从而将每个胶原分子所对应的质粒DNA中核苷酸单体数保持在96或更多，就可以制备平均长轴为120μm或更小的复合物。另一方面，复合物的最小单位是由一分子胶原和一分子质粒DNA所形成的复合物。因为质粒DNA具有负电荷，具有空间位阻，彼此之间相互排斥，一分子胶原难以和多个质粒DNA形成复合物。相应地，利用每一分子的胶原和质粒DNA形成复合物，即可得到每一分子胶原相对应的核苷酸单体的最大数目，所述最大数目由质粒DNA中包含的核苷酸单体数限定。
实施例11
包含寡核苷酸的复合物的组成和平均长轴之间的关系
含有浓度为2.0μM～40.0μM、和成纤维生长因子HST-1(FGF4)基因(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，2890-2984(1987)中描述)4196bp～4216bp之间序列互补的硫代磷酸反义寡核苷酸(5’-CTCGTAGGCGTTGTAGTTGT-3’；分子量约6500；SEQ ID NO：8)(Espec Inc)的等量水溶液或0.1M磷酸缓冲液(PB)冷却至10℃或更低温度，于10℃或更低的温度下和包含0.002％～3.0％(w/v)端胶原(KOKEN有限公司)、并冷却至10℃或更低温度的水溶液混合在一起。混合物于10℃或更低温度下放置过夜，制备凝胶状制剂。凝胶制剂中与胶原相复合的寡核苷酸用量依照如下方法确定。凝胶制剂于150,000转/小时、5℃条件下离心，使复合物沉淀，通过HPLC[柱：PuresilC18 5(Waters)；流动相：包含5mM四丁基胺盐和1mM EDTA的0.1M醋酸胺中，24.5％至35％的乙氰梯度35分钟以上；流速：1ml/min；测定波长：260nm]测定上清液中释放的寡核苷酸量。往所制备的制剂中加入单链核酸荧光染色剂YOYO(分子探针)，对寡核苷酸加以染色，通过荧光显微镜观察染色情况，并测定复合物的长轴。结果如表7所示。
表7
  样品   Solv.   O.C.(μM)   C.C.(％)   每C.M的O.M数   每C.M的N.M数   复合物的平均长轴(μm)
  11-1   水   1.0   0.05   0.6   12   32
  11-2   水   5.0   0.05   3   60   13
  11-3   水   10.0   0.05   4.4   88   12
  11-4   水   20.0   0.05   5.2   104   17
  11-5   水   10.0   0.01   6.3   126   32
  11-6   水   10.0   0.1   2.9   58   20
  11-7   PB   1.0   0.05   0.5   10   25
  11-8   PB   5.0   0.05   1.2   24   29
  11-9   PB   10.0   0.05   1.4   28   35
  11-10   PB   20.0   0.05   1.3   26   36
  11-11   PB   10.0   0.01   3.3   66   23
  11-12   PB   10.0   0.1   1.3   26   33
  11-13   PB   10.0   0.5   0.5   10   46
  11-14   PB   10.0   1.0   0.3   6   49
  11-15   PB   10.0   1.5   0.2   4   54
表中“Solv.”指溶剂。O.C.(μM)指寡核苷酸浓度(μM)。“C.C.(％)”指胶原浓度(％)。“每C.M的O.M数”指每个胶原分子所对应的寡核苷酸分子数。“每C.M的N.M数”指每个胶原分子所对应的核苷酸单体数。
和使用质粒DNA的实施例10相类似，通过将寡核苷酸和胶原相混合获得复合物。使用不含盐的水和使用0.1M磷酸缓冲液作为溶剂的情况下，随胶原和寡核苷酸浓度的不同，复合物的长轴没有显著变化。这一点和使用质粒DNA的情况不同。这是因为从分子大小上说寡核苷酸小于质粒DNA，胶原缔合体的形成受到抑制。
图17显示了混合时寡核苷酸和胶原分子数的比例和复合物中与一个胶原分子相结合的寡核苷酸数之间的关系。发现在水和磷酸缓冲液作为溶剂的情况下，随着相对于胶原分子数的寡核苷酸数的增加，所形成的复合物中结合至一个胶原分子的寡核苷酸数有增加的趋势。与一个胶原分子相结合的寡核苷酸分子最大数目取决于溶剂的种类，水作为溶剂时为6个分子，磷酸缓冲液作为溶剂时为3个分子。
由于胶原的分子量(300,000)远大于寡核苷酸的分子量(约6,500)，复合物的形态或形状仅取决于形成复合物的胶原分子数，具有相同长轴的复合物中的胶原分子数大致是相同的。相应的，对于具有相同长轴的复合物来说，复合物中包含的寡核苷酸分子数取决于和一个胶原分子相结合的寡核苷酸数。因为单个复合物和细胞相接触，使得寡核苷酸转移至细胞中。因此当使用包含较高含量的寡核苷酸的复合物时，寡核苷酸的转移较有效。相应的，需要每个胶原分子所对应的寡核苷酸分子数增多的复合物。通常来说，优选与一个胶原分子相结合的核苷酸单体数增多的复合物。
实施例12
包被有包含寡核苷酸的复合物的细胞培养器具
将50μl实施例11(11-3，实施例7的制剂组分)中制备的凝胶制剂逐滴加入到96-孔微孔板的底部，通过直接喷射冷空气(室温，2小时)或置入带有硅胶的干燥器(室温，2天)中加以干燥，制备细胞培养表面包被有复合物的细胞培养器具。往器具的孔中加入100μl 0.01M的磷酸缓冲液(PBS)，该磷酸缓冲液通过补充氯化钠进行调整，与活体等渗。器具于37℃培养过夜，随后微量取样。对于2μl样品来说，加入2μl单链核酸荧光染色剂YOYO(分子探针)，对寡核苷酸加以染色。通过荧光显微镜对从器具表面释放的复合物进行观察。荧光显微照片如图18所示。所有的样品中都观察到了具有50μm或更小的长轴的复合物。这说明和PBS的接触使复合物从细胞培养器具的表面得以释放。无论是用何种方法加以干燥，无论PBS条件如何，在器具表面包被之前和之后，所释放复合物的形态或形状都没有改变。这说明滞留在细胞培养器具表面的复合物能够保持其形态或形状，而不受干燥方法的影响。在细胞培养通常所用的37℃温度条件下，复合物的形态和形状保持不变。
实施例13
包被有包含质粒DNA的复合物的细胞培养器具
将50μl实施例10(10-3，具有实施例6中能够有效促进转移的组分)中制备的凝胶制剂逐滴加入到96-孔微孔板的底部，通过直接喷射冷空气(室温，2小时)或置入带有硅胶的干燥器(室温，2天)中加以干燥，制备细胞培养表面包被有复合物的细胞培养器具。往器具的孔中加入100μl 0.01M的磷酸缓冲液(PBS)，该磷酸缓冲液通过补充氯化钠进行调整，与活体等渗。立即微量取样。另外，往器具的孔中加入100μl 0.01M的磷酸缓冲液(PBS)，该磷酸缓冲液通过补充氯化钠进行调整，与活体等渗。器具于37℃培养过夜，随后微量取样。对于10μl样品来说，加入2μl单链核酸荧光染色剂YOYO(分子探针)，对寡核苷酸加以染色。通过荧光显微镜对从器具表面释放的复合物进行观察。荧光显微照片如图19所示。所有的样品中都观察到了具有100μm或更小的长轴的复合物。这说明和PBS的接触使复合物从细胞培养器具的表面得以释放。无论是用何种方法加以干燥，无论PBS条件如何，在器具表面包被之前和之后，所释放复合物的形态或形状都没有改变。这说明滞留在细胞培养器具表面的复合物能够保持其形态或形状，而不受干燥方法的影响。在细胞培养通常所用的37℃温度条件下，复合物的形态和形状保持不变。
实施例14
利用包被有复合物的细胞培养器具进行基因转移
将300μl实施例10、10-1、10-4和10-7中制备的、包含有pCMV-EGFP的凝胶制剂加入到6-孔细胞培养微孔板中，通过喷射冷空气加以干燥，制备表面包被有包含pCMV-EGFP的复合物的细胞培养器具。往板中加入300μl包含100μg/ml pCMV-EGFP的水溶液，并以类似方法干燥，作为对照。往各孔中接种7.5×104个293细胞，并向其中加入含有10％FBS的DMEM培养基，随后于37℃培养。自开始培养起，每4～5天更换新鲜的培养基。接种11天后，通过荧光显微镜对细胞进行观察，并对表达GFP的细胞进行计数，估算转移效率。
类似地，将300μl实施例10、10-13至10-22和10-24中制备的、包含有pCMV-HST-1-IL-2的凝胶制剂加入到6-孔细胞培养微孔板中，通过喷射冷空气加以干燥，制备表面包被有包含pCMV-HST-1-IL-2的复合物的细胞培养器具。往板中加入300μl或500μl包含100μg/mlpCMV-HST-1-IL-2的水溶液、PB溶液或PBS溶液，并以类似方法干燥，作为对照。
1)质粒DNA向293细胞中的转移
在包被有300μl凝胶制剂的各个孔中，每孔接种7.5×104个293细胞，并向其中加入含有10％FBS的DMEM培养基，随后于37℃培养，作为10-13至10-19。接种8天后，更换培养基，通过ELISA[Quamtikine人IL-2(R&D Systems)]测定接种11天后所取培养基中IL-2的浓度。对于10-20和10-22来说，往板中加入DMEM培养基，并于37℃培养过夜，第二天将培养基更换为含10％FBS的DMEM培养基，并于37℃培养。接种8天和11天后，更换培养基，通过ELISA测定接种15天后所取培养基中IL-2的浓度。另外，对于10-20、10-21和10-24来说，往板中加入含10％FBS的DMEM培养基，并于37℃培养。通过ELISA测定接种8天后所取培养基中IL-2的浓度。
2)质粒DNA向NIH3T3细胞中的转移
往包被有500μl10-14和10-17的孔中接种5×104个NIH3T3细胞，往其中加入含有10％FBS的DMEM培养基，随后于37℃培养。细胞接种8天后，培养基取样，通过ELISA测定其中IL-2的浓度。
表8和表9中总结了上文1)和2)中获得的结果。当和胶原相复合，并包被在细胞培养器具上时，pCMV-EGFP和pCMV-HST-1-IL-2都能够有效地转移至293细胞和NIH3T3细胞中。该结果表明本发明的复合物对基因转移的促进作用不受质粒DNA种类、细胞种类及培养基中血清存在与否的影响。另外，对于质粒DNA来说，还发现包被复合物中每个胶原分子所对应的核苷酸单体数为1112或更少、平均长轴为151μm或更小时，能够提供更好的基因转移效率和基因表达。
表8
Figure C0281640000391
表9
实施例15
通过加入复合物实现向细胞中的基因转移
往6-孔板中接种5×104个293细胞，在含有10％FBS的DMEM培养基中于37℃培养。接种3天后，加入300μl实施例10、10-1、10-4、10-7、10-8、10-9和10-10中制备的、包含有pCMV-EGFP的凝胶制剂。包含pCMV-EGFP浓度为100μg/ml的水或PB溶液作为对照加入板中。细胞在含有10％FBS的DMEM培养基中于37℃培养。第二天，将培养基更换为新鲜培养基。对于10-1、10-4和10-7来说，13天后取样；对于10-8、10-9和10-10来说，5天后取样。通过荧光显微镜对细胞进行观察，并对表达GFP的细胞进行计数。
类似地，往6-孔板中接种7.5×104个293细胞，在含有10％FBS的DMEM培养基中于37℃培养。接种2天后，加入300μl实施例10、10-20和10-21中制备的、包含有pCMV-HST-1-IL-2的凝胶制剂。包含pCMV-HST-1-IL-2浓度为100μg/ml的水或PB溶液作为对照加入板中。细胞在含有10％FBS的DMEM培养基中于37℃培养。第二天，将培养基更换为新鲜培养基。5天后，培养基取样，通过ELISA[Quamtikinehuman IL-2(R&D Systems)]测定其中IL-2的浓度。
表10、表11和表12中对结果进行了总结。当和胶原相复合，并加入到细胞中时，pCMV-EGFP和pCMV-HST-1-IL-2都能够有效地转移至细胞中。我们发现所加入复合物平均长轴如本实施例所示为53μm或更小，且复合物中每个胶原分子所对应的核苷酸单体数为2406或更少、更进一步为701或更少时，能够提供更好的基因转移和基因表达。
表10
Figure C0281640000411
表11
Figure C0281640000421
表12
Figure C0281640000422
工业应用性
根据本发明的复合物，有可能：1)通过使所需核酸和胶原或胶原衍生物形成复合物来保存所需核酸并使之稳定；2)当施用到活体上时有效地将所需核酸转移至细胞中；和3)不需要使用核酸转移试剂来表达和抑制所需核酸。本发明的复合物可以应用于多个方面，这是因为本发明的复合物具有以下优点：1)DNA、反义寡核苷酸和病毒载体可以被保存，并保持稳定；2)在包被有复合物的干燥平板中，复合物可以长期储存；3)当细胞接种在平板上时，基因表达不需要使用基因转移试剂；4)核酸受试者(subject)类型和固定方法不局限于特定的种类；和5)对于质粒DNA来说，表达的持续时间大大延长。
根据本发明，通过测定细胞的增殖或形态、细胞因子或受体的表达水平，能够容易地检验表达受反义寡核苷酸抑制的基因或蛋白质的功能。除了反义寡核苷酸，其他物质也可以和胶原复合形成复合物，并包被在培养板上；对于核酶来说，能够进行和反义寡核苷酸相类似的筛选；对于质粒DNA或腺病毒来说，通过测定细胞在特定基因表达上的变化，能够验证基因或蛋白质的功能。已知包含在本发明复合物中的胶原或胶原衍生物对细胞没有影响。利用本发明复合物进行的筛选能够验证基因功能而极少需要避开对细胞的非特异性影响，而用于基因转移的传统试剂则导致这种对细胞的非特异性影响。
<110>住友制药有限公司
<120>促进核酸转移的方法
<130>663264
<150>JP 2001-186320
<151>2001-06-20
<150>JP 2001-278293
<151>2001-09-13
<160>8
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：反义寡聚物
<400>1
ctcgtaggcg ttgtagttgt                                 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：硫代磷酸酯反义寡聚物
<400>2
ctcgtaggcg ttgtagttgt                                 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：硫代磷酸酯有义寡聚物
<400>3
gagcatccgc aacatcaaca                                 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：硫代磷酸酯蔓延(scramble)寡聚物
<400>4
agtcgcatgc acacaacaca                                 20
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：硫代磷酸酯随机寡聚物
<400>5
gaccatcgtc gattccagt                                  19
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：硫代磷酸酯随机寡聚物
<400>6
catgaacatc ctgagcatcc                                 20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：硫代磷酸酯随机寡聚物
<400>7
gttcacgaag aaagaaggct                                 20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：硫代磷酸酯反义寡聚物
<400>8
ctcgtaggcg ttgtagttgt                                 20

Claims (13)

1.含有胶原和所需核酸的复合物颗粒，其中长轴为300nm至100μm。
2.根据权利要求1的复合物颗粒，其中所需核酸是质粒DNA。
3.根据权利要求2的复合物颗粒，其中复合物中胶原分子的数目和质粒DNA核苷酸单体的数目的比例是由1∶20至1∶质粒DNA核苷酸单体数。
4.根据权利要求1的复合物颗粒，其中所需核酸是寡核苷酸。
5.根据权利要求4的复合物颗粒，其中复合物中胶原分子的数目和寡核苷酸的核苷酸单体的数目的比例是由1∶1至1∶200。
6.一种医用器具，其表面包被有根据权利要求1至5中任何一项的复合物颗粒。
7.一种细胞培养器具，其表面包被有根据权利要求1至5中任何一项的复合物颗粒。
8.权利要求1-5中任何一项的复合物颗粒在制备用于将所需核酸转移至靶细胞中的药物中的用途。
9.权利要求1-5中任何一项的复合物颗粒在制备用于提高所需核酸在靶细胞中表达水平的药物中的用途。
10.检验靶细胞中基因或蛋白质功能的方法，包括使用根据权利要求1至5中任何一项的复合物颗粒包被固体表面，所述复合物颗粒包括基因、编码蛋白质的核酸、或抑制所述基因或蛋白质在细胞中的表达的核酸；将靶细胞在固体表面上培养；检验靶细胞中核酸的表达水平或所述基因或蛋白质的表达水平，或检验所述细胞的增殖率或细胞表型。
11.筛选用于治疗疾病的核酸的方法，包括使用根据权利要求1至5中任何一项的复合物颗粒包被固体表面，所述复合物颗粒包括抑制细胞中疾病相关基因表达的核酸候选物；将呈现疾病状态的细胞在固体表面上培养；检验受各核酸候选物抑制的所述基因的表达水平，或所述细胞的增殖率或细胞表型。
12.将所需核酸转移到靶细胞的体外方法，其包括使用根据权利要求1至5中任何一项的复合物颗粒。
13.改进所需核酸在靶细胞中的表达水平的体外方法，其包括使用根据权利要求1至5中任何一项的复合物颗粒。
CNB028164008A 2001-06-20 2002-06-20 促进核酸转移的方法 Expired - Fee Related CN1313158C (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP186320/2001 2001-06-20
JP2001186320 2001-06-20
JP2001278293 2001-09-13
JP278293/2001 2001-09-13
PCT/JP2002/006137 WO2003000297A1 (fr) 2001-06-20 2002-06-20 Procede facilitant le transfert d'acides nucleiques

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1622831A CN1622831A (zh) 2005-06-01
CN1313158C true CN1313158C (zh) 2007-05-02

Family

ID=26617260

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB028164008A Expired - Fee Related CN1313158C (zh) 2001-06-20 2002-06-20 促进核酸转移的方法

Country Status (12)

Country Link
US (2) US8742091B2 (zh)
EP (1) EP1407787B1 (zh)
JP (1) JP4081436B2 (zh)
KR (1) KR100888566B1 (zh)
CN (1) CN1313158C (zh)
AT (1) ATE429930T1 (zh)
CA (1) CA2451603C (zh)
DE (1) DE60232149D1 (zh)
DK (1) DK1407787T3 (zh)
ES (1) ES2324525T3 (zh)
PT (1) PT1407787E (zh)
WO (1) WO2003000297A1 (zh)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5118285B2 (ja) * 2000-06-20 2013-01-16 大日本住友製薬株式会社 オリゴヌクレオチド導入製剤
DK1407787T3 (da) 2001-06-20 2009-06-02 Dainippon Sumitomo Pharma Co Fremgangsmåde til fremme af nukleinsyreoverförsel
US20080318319A1 (en) * 2003-12-19 2008-12-25 Yoshiko Minakuchi Novel Method of Nucleic Acid Transfer
US20080038824A1 (en) * 2004-01-29 2008-02-14 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Composition and Method for Elevating Gene Transfer Efficiency
JP2007267602A (ja) * 2004-06-25 2007-10-18 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 固相上で細胞に核酸を導入し、かつ、この細胞を分化誘導させるための方法および組成物
JP4585242B2 (ja) * 2004-06-29 2010-11-24 株式会社高研 核酸導入用セルトランスフェクションアレイ
US20090062184A1 (en) * 2005-03-24 2009-03-05 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Fine particulate preparation comprising complex of nucleic acid molecule and collagen
US7838502B2 (en) * 2005-05-06 2010-11-23 University Of Massachusetts Medical School Compositions and methods to modulate H. influenzae pathogenesis
WO2006126600A1 (ja) * 2005-05-25 2006-11-30 National University Corporation Nagoya Universtiy 血管閉塞性疾患用医薬組成物
WO2007010620A1 (ja) 2005-07-22 2007-01-25 Koken Co., Ltd. 核酸導入用セルトランスフェクションアレイ
WO2007107774A2 (en) * 2006-03-22 2007-09-27 Cartela R & D Ab Integrin alpha-10 subunit as therapeutic target and diagnostic/prognostic marker for cancer
WO2008099906A1 (ja) * 2007-02-16 2008-08-21 Anges Mg, Inc. 歯周病、及び外科手術による歯槽骨欠損の治療剤
JP5789927B2 (ja) * 2010-07-30 2015-10-07 Jnc株式会社 放射線照射コラーゲン様ペプチドを用いた核酸導入法
WO2013102878A2 (en) 2012-01-05 2013-07-11 Department Of Biotechnology (Dbt) Fat1 gene in cancer and inflammation
WO2021041870A1 (en) * 2019-08-30 2021-03-04 University Of Florida Research Foundation Aptamer assemblies for protein crosslinking
WO2022120338A1 (en) * 2020-12-03 2022-06-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Aptamer assemblies for protein crosslinking

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1193916A (zh) * 1995-07-03 1998-09-23 株式会社高研 基因制剂

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5115094B2 (zh) * 1972-11-01 1976-05-14
JPH0712375B2 (ja) * 1986-11-17 1995-02-15 株式会社高研 移植組成物及びその製造方法
US5069936A (en) * 1987-06-25 1991-12-03 Yen Richard C K Manufacturing protein microspheres
JPS6416581A (en) 1987-07-09 1989-01-20 Rikagaku Kenkyusho Frozen animal cell and production thereof
JPH01157388A (ja) 1987-12-11 1989-06-20 Mitsubishi Heavy Ind Ltd 形質転換方法
US5078997A (en) * 1988-07-13 1992-01-07 Cetus Corporation Pharmaceutical composition for interleukin-2 containing physiologically compatible stabilizers
US5098890A (en) * 1988-11-07 1992-03-24 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Antisence oligonucleotides to c-myb proto-oncogene and uses thereof
US5936035A (en) 1988-11-21 1999-08-10 Cohesion Technologies, Inc. Biocompatible adhesive compositions
US5614587A (en) * 1988-11-21 1997-03-25 Collagen Corporation Collagen-based bioadhesive compositions
JP3187410B2 (ja) 1989-08-10 2001-07-11 住友製薬株式会社 脳内投与用徐放性製剤
JP2789115B2 (ja) 1989-09-07 1998-08-20 株式会社高研 可溶性コラーゲンパウダーを担体とする粒状医薬徐放剤の製造方法
DE69031172T2 (de) 1989-12-22 1998-03-12 Applied Research Systems Modifikation der endogenen genexpression mit hilfe eines regulatorischen elements mittels homologe rekombination
US5542935A (en) * 1989-12-22 1996-08-06 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic delivery systems related applications
US5264618A (en) * 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
JP2666535B2 (ja) 1990-08-07 1997-10-22 東洋紡績株式会社 大腸菌のコンピテントセル化緩衝液および大腸菌のコンピテントセル化方法
FR2694895B1 (fr) * 1992-08-20 1994-11-10 Coletica Procédé de fabrication de microparticules en émulsion par modification de la composition chimique de la phase dispersée après émulsification.
US5646042A (en) * 1992-08-26 1997-07-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. C-myb targeted ribozymes
NZ267291A (en) * 1993-05-28 1997-09-22 Chiron Corp Peptide inhibitors of urokinase receptor activity
AU7655194A (en) * 1993-09-09 1995-03-27 Schering Aktiengesellschaft Active principles and gas containing microparticles
CA2140053C (en) * 1994-02-09 2000-04-04 Joel S. Rosenblatt Collagen-based injectable drug delivery system and its use
US5942496A (en) 1994-02-18 1999-08-24 The Regent Of The University Of Michigan Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells
US5583034A (en) * 1994-02-22 1996-12-10 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Enhancement of adoptosis using antisense oligonucleotides
US5844107A (en) * 1994-03-23 1998-12-01 Case Western Reserve University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
US5563255A (en) * 1994-05-31 1996-10-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of raf gene expression
EP0769063A1 (en) * 1994-06-27 1997-04-23 The Johns Hopkins University Targeted gene delivery system
NO180167C (no) * 1994-09-08 1997-02-26 Photocure As Fotokjemisk fremgangsmåte til å innföre molekyler i cellers cytosol
GB9422495D0 (en) 1994-11-08 1995-01-04 Medical Res Council DNA transfer method
JP3867160B2 (ja) 1995-07-03 2007-01-10 大日本住友製薬株式会社 遺伝子製剤
US6998268B2 (en) * 1995-07-03 2006-02-14 Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd. Gene preparations
NZ320006A (en) 1995-10-23 2001-12-21 Meditech Res Ltd An adjuvant composition comprising hyaluronic acid for gene therapy either in the sense or antisense direction
DE69636122T2 (de) 1995-11-13 2006-12-07 Takara Bio Inc., Otsu Verfahren zum gentransfer in zielzellen mit einem retrovirus
ES2420106T3 (es) * 1995-12-18 2013-08-22 Angiodevice International Gmbh Composiciones de polímeros reticulados y métodos para su uso
CA2248538A1 (en) * 1996-03-14 1997-09-18 The Immune Response Corporation Targeted delivery of genes encoding interferon
US5874006A (en) * 1996-10-31 1999-02-23 Matrix Pharmaceutical, Inc. Aseptic collagen concentration process
US6042820A (en) * 1996-12-20 2000-03-28 Connaught Laboratories Limited Biodegradable copolymer containing α-hydroxy acid and α-amino acid units
US6218112B1 (en) * 1996-12-23 2001-04-17 Cobra Therapeutics Limited Optimization of gene delivery and gene delivery system
US6524613B1 (en) * 1997-04-30 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Hepatocellular chimeraplasty
IT1293088B1 (it) 1997-07-10 1999-02-11 Isi Ist Sierovaccinogeno Ital Microparticelle per il rilascio controllato di molecole biologicamente attive e loro uso in terapia, profilassi e diagnostica in vitro e in
JPH11127843A (ja) 1997-10-27 1999-05-18 Sumitomo Bakelite Co Ltd 培養用着色容器
TW572758B (en) 1997-12-22 2004-01-21 Sumitomo Pharma Type 2 helper T cell-selective immune response inhibitors comprising purine derivatives
AU2868099A (en) * 1998-02-13 1999-08-30 Selective Genetics, Inc. Concurrent flow mixing methods and apparatuses for the preparation of gene therapy vectors and compositions prepared thereby
EP1078639A4 (en) 1998-05-22 2004-10-06 Sumitomo Pharma STABLE GENERATION
JP3587438B2 (ja) 1999-01-14 2004-11-10 住友ベークライト株式会社 培養細胞凍結用マルチウェルプレート
JP3557924B2 (ja) * 1998-12-10 2004-08-25 トヨタ自動車株式会社 電動機制御装置及び電動機制御方法
TR199901199A3 (tr) 1999-05-31 2001-09-21 Kocagoez Tanil Bakteri transformasyon kiti
JP2001199903A (ja) 1999-11-09 2001-07-24 Eizo Mori 核酸含有複合体
EP1274410A2 (en) * 2000-03-31 2003-01-15 Trustees Of Boston University Use of locally applied dna fragments
JP2001335512A (ja) 2000-05-23 2001-12-04 Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd 遺伝子導入のための微粒子
JP5118285B2 (ja) * 2000-06-20 2013-01-16 大日本住友製薬株式会社 オリゴヌクレオチド導入製剤
JP2002325572A (ja) * 2000-12-25 2002-11-12 Univ Osaka 外来物質の導入方法
DK1407787T3 (da) 2001-06-20 2009-06-02 Dainippon Sumitomo Pharma Co Fremgangsmåde til fremme af nukleinsyreoverförsel
JP4022614B2 (ja) 2002-03-25 2007-12-19 国立大学法人大阪大学 新規なバイオビーズの作製方法
ITMI20021444A1 (it) 2002-07-01 2004-01-02 Danieli Off Mecc Tubo forma spire
US7148342B2 (en) * 2002-07-24 2006-12-12 The Trustees Of The University Of Pennyslvania Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis
US20060030534A1 (en) * 2002-09-04 2006-02-09 Gabriele Dorn Treatment of neurological disorders by dsrna administration
JPWO2004026343A1 (ja) * 2002-09-20 2006-01-12 住友製薬株式会社 部位特異的遺伝子変換促進剤および遺伝子疾患治療剤
WO2004042024A2 (en) * 2002-11-01 2004-05-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania COMPOSITIONS AND METHODS FOR siRNA INHIBITION OF HIF-1 ALPHA
ATE477337T1 (de) * 2003-01-16 2010-08-15 Univ Pennsylvania Zusammensetzungen und verfahren zur sirna-hemmung von icam-1
US8227434B1 (en) * 2003-11-04 2012-07-24 H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Inc. Materials and methods for treating oncological disorders
JP4989456B2 (ja) * 2004-02-26 2012-08-01 ベイラー リサーチ インスティテュート 関節炎の全身処置のための組成物および方法
NZ553987A (en) * 2004-09-28 2011-01-28 Quark Pharmaceuticals Inc Oligoribonucleotides and methods of use thereof for treatment of alopecia, acute renal failure and other diseases
CA2584459A1 (en) * 2004-10-22 2006-04-27 Universite Laval Modulation of neuroglia-derived bdnf in the treatment and prevention of pain
US7585848B2 (en) * 2005-01-11 2009-09-08 Rush University Medical Center Methods and compositions for treating, inhibiting and reversing disorders of the intervertebral disc
WO2007082899A1 (en) * 2006-01-17 2007-07-26 Vib Vzw Inhibitors of prolyl-hydroxylase 1 for the treatment of skeletal muscle degeneration
US8106024B2 (en) * 2006-06-16 2012-01-31 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. Method of treating cancer with an RPN2 gene expression inhibitor
CN101490253A (zh) * 2006-07-21 2009-07-22 赛伦斯治疗公司 用于抑制蛋白激酶3表达的方法
WO2008028085A2 (en) * 2006-08-30 2008-03-06 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Modulation of mlck-l expression and uses thereof
US7902167B2 (en) * 2006-10-02 2011-03-08 Aprea Ab Compounds and methods for down-regulating Wrap53 protein by RNA interference
US7812002B2 (en) * 2007-03-21 2010-10-12 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotide inhibitors of NRF2 and methods of use thereof for treatment of cancer
CA2782728A1 (en) * 2009-12-04 2011-06-09 Opko Ophthalmics, Llc Compositions and methods for inhibition of vegf

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1193916A (zh) * 1995-07-03 1998-09-23 株式会社高研 基因制剂

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biomaterials for Gene Delivery: Atelocollagen-mediatedControlled Release of Molecular Medicines Takahiro Ochiya et al,Current Gene Therapy,Vol.1 2001 *
New delivery system for plasmid DNA in vivo usingatelocollagen as a carrier material:the Minipellet TAKAHIRO OCHIYA et al,Nature Medicine,Vol.5 No.6 1999 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20040266004A1 (en) 2004-12-30
DE60232149D1 (de) 2009-06-10
PT1407787E (pt) 2009-07-07
EP1407787A4 (en) 2006-02-08
CA2451603A1 (en) 2003-01-03
JPWO2003000297A1 (ja) 2005-04-07
ATE429930T1 (de) 2009-05-15
DK1407787T3 (da) 2009-06-02
EP1407787B1 (en) 2009-04-29
CN1622831A (zh) 2005-06-01
EP1407787A1 (en) 2004-04-14
KR100888566B1 (ko) 2009-03-12
ES2324525T3 (es) 2009-08-10
US8742091B2 (en) 2014-06-03
CA2451603C (en) 2012-07-10
US20100081202A1 (en) 2010-04-01
JP4081436B2 (ja) 2008-04-23
WO2003000297A1 (fr) 2003-01-03
KR20040023622A (ko) 2004-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1313158C (zh) 促进核酸转移的方法
CN1189562C (zh) 针对核糖核苷酸还原酶r1和r2组分的抗肿瘤反义序列
CN1305932C (zh) 碳水化合物修饰的聚合物、其组合物及其应用
CN1125082C (zh) 人类趋化因子β－8,趋化因子β－1和巨噬细胞炎性蛋白－4
CN1509292A (zh) 使用c-myc反义寡聚物治疗癌症的结合的方法
CN1780851A (zh) 将分子递送到细胞的方法和载体复合物
CN1268186A (zh) 重组诱发剂寡核碱基校正肝细胞遗传损害的体内应用
CN1174512A (zh) 蛋氨酸酶在抗蛋氨酸和抗高半胱氨酸的化学治疗中的应用
CN1845993A (zh) 具有平端和3＇修饰的干扰rna双链体
CN1491117A (zh) 含包合配合物的组合物
CN1416462A (zh) 人多能干细胞生长和分化的技术
CN1835971A (zh) 增加的神经胚素分泌
CN1741821A (zh) 用于癌症治疗的组合物
CN1256635A (zh) 肽包被的植入物及其制备方法
CN101065492A (zh) 病毒载体
CN1191094C (zh) 定向脂质体基因送递
CN1203632A (zh) P16表达构建物及其在癌治疗中的应用
CN101062952A (zh) 由人血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白及其编码基因与应用
CN1173744C (zh) 稳定的基因制剂
CN1189482C (zh) 一种新的血管发生抑制剂
CN1575338A (zh) 具有促细胞分裂活性的Bv8的核酸和多肽
CN1671836A (zh) 用于基因治疗的原代培养脂肪细胞
CN1220490C (zh) 哌嗪环氧乙烷衍生物在制备用于诱导肿瘤细胞死亡的药物中的应用
CN1171113A (zh) Rb和p53基因的突变型及其应用
CN1948483A (zh) 抑制人RabJ基因表达的siRNA及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: DAINIPPON PHARMACEUTICAL CO., LTD.; APPLICANT

Free format text: FORMER OWNER: SUMITOMO PHARMACEUTICALS CO., LTD.; APPLICANT

Effective date: 20060224

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20060224

Address after: Osaka Japan

Applicant after: Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.

Co-applicant after: Koken Co., Ltd.

Address before: Osaka Japan

Applicant before: Sumitomo Chemical Co., Ltd.

Co-applicant before: Koken Co., Ltd.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: KOKEN CO., LTD. INDEPENDENT ADMINISTRATIVE INSTITU

Free format text: FORMER OWNER: KOKEN CO., LTD.

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20100730

Address after: Osaka Japan

Co-patentee after: Koken Co., Ltd.

Patentee after: Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.

Co-patentee after: Japan Government

Address before: Osaka Japan

Co-patentee before: Koken Co., Ltd.

Patentee before: Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20070502

Termination date: 20150620

EXPY Termination of patent right or utility model