JP5789927B2 - 放射線照射コラーゲン様ペプチドを用いた核酸導入法 - Google Patents
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本実施例では、核酸とコラーゲン様ペプチドとの複合体を形成させることによる、核酸の安定性に与える影響について評価した。
核酸の細胞内への導入キャリアとしては、コラーゲン様ペプチド、及びATCOLを用いた。コラーゲン様ペプチドとしては、Pro−Hyp−Glyのアミノ酸配列からなるトリペプチドを縮重合して生産したポリ(Pro−Hyp−Gly)を、40kGyの電子線を2分間照射して使用した。当該コラーゲン様ペプチドの分子量は105以上であった。なお、当該コラーゲン様ペプチドを、合成コラーゲン(SYCOL)とも称する。当該コラーゲン様ペプチドは、チッソ株式会社より入手した。ATCOLは、株式会社高研より、生体内siRNA導入キットとして購入し、製造元の指示に従い使用した。
滅菌水にSYCOLを溶解し、0.06%SYCOL溶液を調製した。SYCOL溶液とsiRNA溶液を等量ずつ合わせ、ピペッティングにより混合し、siRNA/0.03%SYCOL複合体を形成した。同様に、siRNA/0.05%ATCOL複合体、及びsiRNA/0.5%ATCOL複合体を調製した。なお、0.03%SYCOL、0.05%ATCOL、及び0.5%ATCOLとは、いずれもsiRNAと混合した後の終濃度を示す(以下、同じ)。調製した複合体は、4℃で16時間置いてから、以降の実験に用いた。
各導入キャリアと複合体を形成させた0.9μgのGL3siRNAを、0.1μg/μlのRNaseA(ニッポンジーン製)の共存下で、37℃、0、5、15、30、45、及び60分の各時間インキュベートした。インキュベート後の溶液を、フェノール処理、及びフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1、容量比)処理に供し、残存するGL3siRNAをエタノール沈殿により回収した。回収したGL3siRNAを、15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウムにより染色した。染色後のゲルをImageJ(アメリカ国立衛生研究所(NIH)で配布)により解析し、蛍光強度を数値化した。
各複合体形成時のGL3siRNA残存率の推移を図1に示す。siRNA単独の場合と比較し、siRNA/リポフェクタミン2000複合体及びsiRNA/0.5%ATCOL複合体においては、顕著に高いsiRNA残存率が認められた。また、siRNA/0.03%SYCOL複合体及びsiRNA/0.05%ATCOL複合体においても、リポフェクタミン2000や0.5%ATCOLと複合体を形成した場合には劣るが、siRNA単独の場合と比較し高いsiRNA残存率が認められた。よって、siRNAはSYCOLと複合体を形成することにより、RNaseによる分解を受けにくくなることが示された。
本実施例では、核酸とコラーゲン様ペプチドとの複合体を形成させることによる、核酸の細胞への導入効率に与える影響について評価した。
細胞としては、恒常的にルシフェラーゼを発現したB16−F10−luc−G5メラノーマ細胞(以下、単に細胞とも言う)を用いた。細胞は、10%非働化ウシ胎児血清(FBS)及び0.2mg/mlのゼオシン(登録商標)を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)により維持した。培養細胞は、トリプシン処理により回収し、以降の実験に用いた。
GL3siRNA単独、SYCOL単独、及び各siRNA/コラーゲン複合体を、公知の手法(ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucl.Acids Res.)2004; 32: e109)により24ウェルプレートに結合させた。siRNAの結合量は、10〜173pmol/50μl/ウェルとした。培養細胞を、3.5x104細胞/ウェルとなるよう24ウェルプレートに播種し、siRNAの導入を行った。また、リポフェクタミン2000を用いた際のsiRNA導入は、製造元の指示に従い行った。導入効率はルシフェラーゼを利用したレポーターアッセイにより測定した。siRNA導入後2日で細胞(n=3)を溶解させ、マイクロプレートリーダー モデル680(BioRad製)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。統計処理は、ボンフェローニ補正法による多重比較検定を行い、危険率は5%とした。
本実施例では、核酸とコラーゲン様ペプチドとの複合体を形成させることによる、核酸のマウス咬筋への局所投与の効果に与える影響について評価した。
被験体としては、C57BL/6系統マウス(20週齢、オス)を各試験群に4匹ずつ用いた。
ネンブタール(25mg/kg、腹腔内注射)によりマウスを麻酔し、ミオスタチンsiRNA/SYCOL複合体を左側咬筋に、スクランブルsiRNA/SYCOL複合体を右側咬筋に、それぞれ100μl注射した。2週間後、両側の咬筋を単離し、分析に供した。左側咬筋を試験群、右側咬筋を対照群とした。
総RNAをマウス咬筋から抽出し、ミオスタチンmRNAの定量を行った。mRNAの定量は、SYBR Premix Ex Taq(宝酒造製)とDNAエンジンOPTICONシステム(Bio−Rad製)によりミオスタチンmRNAから逆転写を行い、転写量をモニターすることで行った。用いた特異的プライマーの配列は、5’−CAGCCTGAATCCAACTTAGG−3’(フォワード)(配列番号10)、5’−CTGAAACCCGAACTGACGCT−3’(リバース)(配列番号11)とした。結果を図3Cに示す。ミオスタチンsiRNA/SYCOL複合体で処理した試験群においては、スクランブルsiRNA/SYCOL複合体で処理した対照と比較し、ミオスタチンmRNAの量が48%程度まで減少していた。よって、ミオスタチンsiRNAによりRNA干渉が起こったものと考えられる。
本実施例では、核酸とコラーゲン様ペプチドとの複合体を形成させることによる、核酸のマウスへの全身投与の効果に与える影響について評価した。
被験体としては、無胸腺ヌードマウスを、各試験群に2匹ずつ用いた。
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に懸濁したB16−F10−luc−G5メラノーマ細胞を、無胸腺ヌードマウスの左心室に皮下注射し(1x106細胞/100μl PBS/箇所)、腫瘍の転移モデルを作成した。メラノーマ細胞を注射してから2日後、GL3siRNA単独、SYCOL単独、並びにGL3siRNAとSYCOL及びATCOLそれぞれとの複合体をマウスの頭部に注射して投与した。投与量は、4nmol/50μl/50mm3腫瘍とした。siRNAの投与日を0日目とし、0日目と3日目に、極低温冷却されたIVISシステムを用いた非侵襲バイオイメージングにより導入効果を測定した。導入効果はバイオイメージングの結果を基に発光強度として数値化した。なお、IVISシステムによる測定によっては、腫瘍の成長は影響を受けなかった。
Claims (17)
- 放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチドを含む、核酸の細胞内への導入促進剤であって、
前記コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Pro−X−Glyの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Xは繰り返しにおいて独立にHyp又はProであり、分子量は1×10 5 〜1×10 6 である、導入促進剤。 - 前記コラーゲン様ペプチドが、ポリ(Pro−Hyp−Gly)である、請求項1に記載の導入促進剤。
- 前記放射線が、電子線である、請求項1又は2に記載の導入促進剤。
- 前記核酸が、siRNAである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の導入促進剤。
- 放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチド及び核酸を含む、核酸/コラーゲン様ペプチド複合体であって、
前記コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Pro−X−Glyの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Xは繰り返しにおいて独立にHyp又はProであり、分子量は1×10 5 〜1×10 6 である、複合体。 - 前記コラーゲン様ペプチドが、ポリ(Pro−Hyp−Gly)である、請求項5に記載の複合体。
- 前記放射線が、電子線である、請求項5又は6に記載の複合体。
- 前記核酸が、siRNAである、請求項5〜7のいずれか1項に記載の複合体。
- 放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチド及び核酸を含む、医薬組成物であって、
前記コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Pro−X−Glyの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Xは繰り返しにおいて独立にHyp又はProであり
、分子量は1×10 5 〜1×10 6 である、医薬組成物。 - 前記コラーゲン様ペプチドが、ポリ(Pro−Hyp−Gly)である、請求項9に記載の医薬組成物。
- 前記放射線が、電子線である、請求項9又は10に記載の医薬組成物。
- 前記核酸が、siRNAである、請求項9〜11のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 請求項5〜8のいずれか1項に記載の核酸/コラーゲン様ペプチド複合体を保持する医療用又は実験用器具。
- 放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチドを核酸の細胞内導入キャリアとして用いることを特徴とする、核酸を細胞内に導入する方法(但しヒトの細胞にin vi
voで導入する態様を除く)であって、
前記コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Pro−X−Glyの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Xは繰り返しにおいて独立にHyp又はProであり、分子量は1×105〜1×106である、方法。 - 前記コラーゲン様ペプチドが、ポリ(Pro−Hyp−Gly)である、請求項14に記載の方法。
- 前記放射線が、電子線である、請求項14又は15に記載の方法。
- 前記核酸が、siRNAである、請求項14〜16のいずれか1項に記載の方法。
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