WO2015090212A1 - 多肽及其作为递送载体的用途 - Google Patents

多肽及其作为递送载体的用途 Download PDF

Info

Publication number
WO2015090212A1
WO2015090212A1 PCT/CN2014/094198 CN2014094198W WO2015090212A1 WO 2015090212 A1 WO2015090212 A1 WO 2015090212A1 CN 2014094198 W CN2014094198 W CN 2014094198W WO 2015090212 A1 WO2015090212 A1 WO 2015090212A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sirna
polypeptide compound
assembly
str
polypeptide
Prior art date
Application number
PCT/CN2014/094198
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
陈璞
初大丰
陈宝玲
徐雯
潘然
Original Assignee
苏州宝时得电动工具有限公司
陈璞
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 苏州宝时得电动工具有限公司, 陈璞 filed Critical 苏州宝时得电动工具有限公司
Priority to EP19169415.7A priority Critical patent/EP3572421B1/en
Priority to EP14872058.4A priority patent/EP3088413B1/en
Priority to US15/106,108 priority patent/US10076575B2/en
Publication of WO2015090212A1 publication Critical patent/WO2015090212A1/zh
Priority to US16/110,713 priority patent/US20180355357A1/en
Priority to US16/751,783 priority patent/US11306313B2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5169—Proteins, e.g. albumin, gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

提供的是多肽，其包括疏水部分和亲水部分，而且该亲水部分包括带有正电荷的氨基酸残基。该多肽能用作为载体来递送诸如siRNA的药物。

Description

多肽化合物、多肽化合物与siRNA的组装体及其应用 技术领域
本发明涉及一种多肽化合物，多肽化合物与siRNA的组装体，及其在基因治疗领域的应用。
背景技术
在过去的十年中，我们见证了RNA分子在基因表达调控领域中角色的理解方面取得的巨大进步。这一进步的主要贡献是RNA干扰(RNAI)的发现。其首次由Fire和Mello在线虫里提取，是一种通过短链RNA带来序列特异性、转录后基因沉默的进化保守机制。RNA干扰是一种由21-23个核苷酸组成的双链小分子干扰RNA(siRNA)介导的、序列特异性的、转录后基因沉默技术。由于RNA干扰技术能高效、特异的沉默疾病相关基因，使其已逐渐被发展成为新型的治疗遗传性或获得性疾病包括病毒感染和癌症等的基因治疗手段，到目前为止已经开展了大量利用siRNA进行疾病治疗的动物实验和临床实验。
虽然siRNA在体外应用研究中及细胞水平上显示出良好的沉默效果，但由于其巨大的分子量及自身所携带的大量负电荷使其不能自主穿越细胞膜进入细胞发挥作用，在系统运输时易引起非特异性的脱靶效应和免疫应答，同时还面临被核酸酶降解等障碍，导致在以治疗人类疾病为目的的siRNA体内系统运输面临着巨大的挑战。所以siRNA的转染问题成为限制其应用的主要瓶颈。如何增强siRNA穿透细胞膜的能力，提高其在体内的稳定性和靶向性等都是siRNA药物载体急需解决的问题。因此设计和合成安全有效的siRNA药物载体已成为目前siRNA药物研发的重要方向。糖、核苷以及siRNA主链上磷酸酯的化学修饰，已经被用于抑制核酸酶，消除对沉默效率的干扰。疏水基团的结合也有加强细胞吸收的作用。
与化学修饰的核酸相比，载体介导方法制定核酸疗法并保护其不被降解，显得简单快速。这些载体，包括病毒载体和非病毒载体，它们与siRNA共组装或者共价结合。这些载体可以加强细胞靶向，延长药物流通时间，提高膜的穿透性。病毒载体因潜在的安全性问题及高成本等缺点使其广泛的临床应用受到极大的限制。常见的非病毒基因药物的传递载体往往为带有正电的阳离子化合物，包括聚阳离子、正电磷脂、壳聚糖、白蛋白、树枝状大分子以 及多肽等，它们通过带正电的基团中和DNA/RNA上的负电磷酸基团，从而将基因压缩保护成组装体颗粒，使得基因能够顺利通过各种障碍，诸如逃逸免疫系统、穿透细胞膜、从内含体释放等等，而完成基因传递。虽然DNA或RNA组装体的结构以及性质与转染效率之间明晰的决定关系还存在争议，但是有很多经验性的条件决定了组装体的生物相容性以及传递DNA或RNA的效率。虽然DNA或RNA复合物的结构以及性质与转染效率之间明晰的决定关系还存在争议，但是有很多经验性的条件决定了复合物的生物相容性以及传递DNA或RNA的效率。单纯简单的混合方式和仅仅利用静电作用形成的DNA/RNA载体体系很不稳定，因此设计更稳定、尺寸大小合适的载体体系是基因药物取得好的疗效的先决条件。
多肽作为生物分子的一种，在作为基因载体上具有很多合成高分子不具备的优势：多肽有20种性质各异的氨基酸可以组成性质丰富的一级序列；通过设计可以拿到beta折叠或者alpha螺旋等二级结构；通过固相合成可以拿到纯度高、分布单一、结构明确的分子；可以很方便的改性或者连入生物可识别功能的靶向序列提高专一性。多肽已经被用于合成药物、小分子、生物活性肽、治疗性蛋白的传递，但是核酸机理尚未完全清楚。这些肽可以包括源于蛋白质的生物穿膜肽(cell penetrating peptide,CPP)，阳离子肽，设计出的多肽化合物，融合肽，细胞靶向肽(cell targeting peptides，CTP)以及包含核定位信号的肽(Nuclear localization signal,NLS)等。阳离子肽富含氨基酸，可以与小的核酸或者浓缩的核酸相互作用形成稳定的小颗粒。生物穿膜肽可以促进组装体通过细胞膜。富含组氨酸对pH敏感的或者膜融合的肽可以加强内涵体逃逸能力和基因组装体向细胞质的释放。基因传递系统中所包含的细胞靶向肽可以介导细胞或者组织特异性靶向。核定位细胞肽的连接可以提高基因组装体的核定位能力。
尽管针对siRNA药物运输载体的研究取得了一定的突破和发展，但要使siRNA药物成功用于治疗人类疾病，仍有一些关键性问题需要解决，如：毒性、特异性、靶向性、免疫刺激、转染效率低等。由此，生物相容性好、能快速去质子化的可生物降解的双性的多肽载体因能有效结合和保护siRNA分子，增强细胞对siRNA分子的吸收，提高其稳定性和靶向性，并能使siRNA分子有效释放，实现治疗目的，而使得这类载体在siRNA药物给药中具有更好的优势和应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种多肽化合物，并能用其与siRNA形成可以进行基因传递的组装体。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：一种多肽化合物，所述多肽化合物包括疏水部分和亲水部分，所述亲水部分由带有正电的氨基酸残基组成。
优选地，所述多肽化合物包含的氨基酸残基总数目范围为8-50。
优选地，所述多肽化合物具有通式：
GLWHxAWLWHyAFLASHzRLLRLLR，1≤x≤5，1≤y≤5，1≤z≤6，x、y、z为整数。
优选地，所述多肽化合物氮端乙酰化，碳端酰胺化。
优选地，所述多肽化合物具有通式：CH3(CH2)16CONH-B-CONH2，所述B为氨基酸序列。
优选地，所述B具有通式：GLWHxAWLWHyAFLASHzRLLRLLR，1≤x≤5，1≤y≤5，1≤z≤6，x、y、z为整数。
优选地，所述B具有通式：HaKbVc，3≤a≤8，3≤b≤8，6≤c≤8，a、b、c为整数。
优选地，所述B具有通式：HdRe，8≤d≤30，8≤e≤20，d、e为整数。
优选地，所述B为：RLWRLLWRLWRRLWRLLR。
优选地，所述B为：RLWHLLWRLWRRLHRLLR。
本发明还提供了一种组装体，所述组装体包括货物分子和以上所述的多肽化合物。
优选地，所述货物分子与所述多肽化合物通过非共价键连接组装。
优选地，所述组装体颗粒粒径尺寸范围为20nm-999nm。
优选地，所述核酸为siRNA。
优选地，多肽化合物与siRNA的摩尔比范围为1:1-80:1。
优选地，多肽化合物与siRNA的摩尔比为20:1。
优选地，多肽化合物与siRNA的摩尔比为40:1。
优选地，多肽化合物与siRNA的摩尔比为60:1。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含以上所述的组装体。
本发明还提供了一种给病人递送药物的试剂盒，所述试剂盒包括上述的药物组合物、一种或者多种电解质、缓冲液、递送装置以及适合把一种或者多种其他药剂混合到一起的容器。
本发明还提供了一种多肽化合物在向细胞或者组织传递siRNA上的应用。
优选地，所述细胞为卵巢细胞。
优选地，所述细胞为肿瘤细胞或者所述组织为肿瘤组织。
本方案的有益效果是：本发明提供的多肽化合物可以与siRNA非共价连接，简便的形成纳米形态的多肽化合物/siRNA组装体。本发明所设计的多肽化合物同时具有亲水和疏水的性质，通过与细胞膜的双分子层的亲水部和疏水部作用，有效加强了siRNA往细胞的传递以及在细胞内部的释放，提高了siRNA对细胞靶点介导的基因沉默效率。
附图说明
图1为GL5/siRNA组装体在中国仓鼠卵巢细胞的沉默效率，GL5和siRNA的摩尔比率20/1、40/1，siRNA浓度50nM。
图2为STR-KV/siRNA组装体在中国仓鼠卵巢细胞的沉默效率，STR-KV和siRNA的摩尔比率分别为30/1、40/1和60/1，siRNA浓度50nM。
图3为STR-HR/siRNA组装体在中国仓鼠卵巢细胞的沉默效率，STR-HR和siRNA的摩尔比率分别为30/1、45/1、60/1，siRNA浓度100nM。
图4为STR-C6M1/siRNA and STR-C6M3/siRNA组装体在中国仓鼠卵巢细胞的沉默效率，STR-C6M1或者STR-C6M3，和siRNA的摩尔比率分别为40/1和60/1，siRNA浓度50nM。
图5为GL5/siRNA组装体在中国仓鼠卵巢细胞中的毒性测试结果，GL5和siRNA的摩尔比率为分别20/1、40/1，siRNA浓度50nM。
图6为STR-KV/siRNA组装体在中国仓鼠卵巢细胞中的毒性测试结果，STR-KV和siRNA的摩尔比率为分别30/1、45/1、60/1，siRNA浓度50nM。
图7为STR-HR/siRNA组装体在中国仓鼠卵巢细胞中的毒性测试结果，STR-HR和siRNA的摩尔比率为分别30/1、45/1、60/1，siRNA浓度100nM。
图8为STR-C6M1/siRNA and STR-C6M3/siRNA组装体在中国仓鼠卵巢细胞中的毒性测试结果，STR-C6M1或者STR-C6M3，和siRNA的摩尔比率为分别40/1、60/1，siRNA浓度50nM。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果，但不以任何方式限制本发明的范围。
本发明提供了一种多肽化合物，其包括疏水部分和亲水部分，亲水部分包括带有正电的氨基酸残基。疏水部分包括疏水性氨基酸残基或硬脂酸或硬脂酸与疏水性氨基酸残基。疏水氨基酸残基选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)及其衍生物中的一种或者多种；所述亲水部分选自精氨酸(R)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)及其衍生物中的一种或者几种。
本发明中的多肽化合物包括多肽及多肽衍生物。多肽衍生物包括对氮端或碳端修饰的多肽。本发明的多肽由于同时具有疏水和亲水的性质，因而具有双性。本发明的多肽化合物由于具有特有的序列或者基团，易于发生自组装或者共组装产生二级结构。
本发明还提供了一种上述多肽化合物与货物分子的组装物。优选地，货物分子为核酸。更优选地，核酸为siRNA。
本发明所设计的多肽化合物与带有负电的siRNA发生共组装，形成纳米颗粒。优选地，纳米颗粒选自纳米纤维、纳米线、纳米薄膜、纳米球。优选地，由多肽化合物与siRNA形成的纳米结构的颗粒粒径范围为20nm-999nm，这是因为一定尺寸的纳米颗粒才能够穿过细胞膜。优选地，多肽化合物的氨基酸残基个数范围为8-50。这个范围内的氨基酸形成的多肽，与siRNA组装后比较适合形成纳米结构。
在一个实施例中，疏水部分与亲水部分可以直接相连接，也可以通过设置连接链段相连接。优选地，连接链段为甘氨酸(G)、组氨酸(H)中的一种。
在一个实施例中，多肽化合物具有通式：
GLWHxAWLWHyAFLASHzRLLRLLR，简称GL5-M，1≤x≤5，1≤y≤5，1≤z≤6，x、y、z为整数。优选地，GL5-M的碳端酰胺化，氮端乙酰化。在一个实施例中，多肽化合物为GLWHAWLWHAFLASHRLLRLLR(SEQ ID No:1)。在一个实施例中，多肽化合物为CH3CONH-GLWHAWLWHAFLASHR LLRLLR-CONH2，简称GL5。GL5的设计源自国际专利申请WO2013/075244A1中公开的多肽GL1，其由一个疏水部分GLWRAWLWKAFL ASNW以及一个阳离子域RRLLRLLR组成。当溶于水时，多肽化合物可以自组装，并与带 负电的siRNA共组装形成功能性纳米粒子。GL1可以获得95％的siRNA传递效率(吸收效率)，以及约50％的基因沉默效率，GL1在释放siRNA方面不够高效。组氨酸H，可以增强内涵体逃逸能力，用其取代GL1的4个氨基酸形成一个新的氨基酸序列GL5。通过改变H的数量，GL5的序列可以进一步延伸出一系列的多肽，即为通式GL5-M。
优选地，本发明提供的多肽化合物的氮端被硬脂酰化(Stearylated，简称STR)，碳端被酰胺化。STR由硬脂酸与氮端的氨基脱水形成。硬脂酰化已经被证明对细胞膜具有高亲和性，多肽的硬脂酰化可以增加siRNA的转染效率。优选地，多肽化合物还包括组氨酸及其衍生物。
优选地，本发明的多肽化合物具有通式：CH3(CH2)16CONH-B-CONH2，其中B为氨基酸序列，CH3(CH2)16CONH为硬脂酰基，CONH2为酰胺基。硬脂酰基与B的氮端相连，酰胺与B的碳端相连。
优选地，B具有通式：GLWHxAWLWHyAFLASHzRLLRLLR，1≤x≤5，1≤y≤5，1≤z≤6，x、y、z为整数。多肽化合物的通式为CH3(CH2)16CONH-GLWHxAWLWHyAFLASHzRLLRLLR-CONH2，简称STR-GL5-M。硬脂酸的引入，可以有效提高多肽化合物的膜穿透能力。
优选地，B具有通式：HaKbVc，3≤a≤8，3≤b≤8，6≤c≤8，a、b、c为整数。多肽化合物具有通式：CH3(CH2)16CONH-HaKbVc-CONH2，简称STR-KV-M。在一个实施例中，B为HHHKKKVVVVVV(SEQ ID No:2)，多肽化合物为：CH3(CH2)16CONH-HHHKKKVVVVVV-CONH2，简称STR-KV。STR-KV多肽化合物采用一个硬脂酰基作为其疏水部分。硬脂酰基已经被证明对细胞膜具有高亲和性，生物穿膜肽的硬脂酰化可以增加DNA或者siRNA的转染效率。组氨酸合在一起形成HHH，作为连接部。组氨酸是一种对pH敏感的氨基酸，在低pH下会被质子化。通过引入组氨酸部，多肽可以像质子海绵一样，打破内涵体的膜，使得siRNA复合物释放到细胞质中。高正电位密度会导致细胞毒性，这是因为正电位的氨基酸残基可能与带负电的细胞膜作用形成团聚，使得细胞膜表面破裂。因此，三个赖氨酸引入到以上序列中，来与siRNA分子通过静电作用共组装。带正电的部分能通过静电相互作用与siRNA分子磷酸基团所带的负电荷结合形成聚合电解质络合物，该络合物通过刺激非特异性的细胞内吞将siRNA运输进细胞，然后经“质子海绵”效应介导的内涵体逃逸将siRNA分子从运输载体上解离，从而实现对siRNA 的运输。序列的另一疏水部分由六个缬氨酸组成。两个疏水末端的结构已经被用于基于脂质体的基因传递。脂质体的末端对于有效的基因传递很重要，其可以通过与细胞的双分子脂质层的疏水端相互作用帮助细胞对其吸收。由两个疏水末端组成的脂质体，比单链脂质体具有更低的临界团聚浓度。含有六个赖氨酸的疏水部分模仿脂质体两个末端的结构，更加有益于穿透细胞膜。
优选地，B具有通式：HdRe，8≤d≤30，8≤e≤20，d、e为整数。多肽化合物具有通式：CH3(CH2)16CONH-HdRe-CONH2，简称STR-HR-M。在一个实施例中，B为HHHHHHHHHHHHHHHHRRRRRRRR(SEQ ID No:3)，多肽化合物为：CH3(CH2)16CONH-HHHHHHHHHHHHHHHHRRRRRRRR-CONH2，简称STR-HR。多肽化合物STR-HR是通过高通量筛选出的一种新设计的分子序列。STR-HR由三部分组成：疏水的硬脂酸部，16个组氨酸部，8个精氨酸的亲水部。序列RRRRRRRR是生物穿膜肽，可以与细胞膜强烈作用。硬脂酰化和低聚组氨酸的应用可以增强多肽/siRNA复合物的内涵体逃逸能力。
在一个实施例中，B为RLWRLLWRLWRRLWRLLR(SEQ ID No:4)，多肽化合物为：CH3(CH2)16CONH-RLWRLLWRLWRRLWRLLR-CONH2，简称STR-C6M1。
在一个实施例中，B为RLWHLLWRLWRRLHRLLR(SEQ ID No:5)，多肽化合物为：CH3(CH2)16CONH-RLWHLLWRLWRRLHRLLR-CONH2，简称STR-C6M1。
STR-C6M1和STR-C6M3分别是多肽C6M1和C6M3的，C6M1为RLWRLL WRLWRRLWRLLR，C6M3为RLWHLLWRLWRRLHRLLR。C6M1和C6M3可以通过国际专利申请WO2013075244中揭示的方法获得。富含精氨酸的多肽可以传递siRNA进入细胞，并且具有高效率和低毒性。优选地，多肽至少包括五个精氨酸残基，以此来保持转染效率。疏水残基如亮氨酸，也包含在C6序列中。这些疏水氨基酸可以通过与细胞脂质双分子层中的疏水端作用加强多肽的传递，或者辅助形成细胞膜上的孔加强多肽的传递。丙氨酸、亮氨酸和组氨酸大量存在于蛋白质的螺旋区域，说明亮氨酸是所研究的蛋白质中形成残基最强的结构。为了提高溶解性和转染效率，采用芳香的色氨酸和组氨酸取代了一些氨基酸。硬脂酸是一种大量存在于人体的脂肪酸，其与细胞 膜具有高作用能力。利用硬脂酸和C6M1和C6M3进行修饰，进一步加强了其穿过细胞膜的能力。
本发明还提供了一种药物组合物，所述组合物包括上述多肽化合物与货物分子的组装体。优选地，货物分子选自siRNA、miRNA、shRNA中的一种或者多种。更优选地，货物分子为siRNA。在一个实施例中，本发明的药物组合物可以降低细胞或者组织内的一种内源性蛋白的水平。优选地，上述细胞为肿瘤细胞或者肿瘤组织。
本发明还提供了一种给病人递送材料的试剂盒，试剂盒药物组合物；和一种或者多种电解质、缓冲液、递送装置、适合把一种或者多种其他药剂混合到一起的容器。试剂盒还包括为使用配置所述药物的说明书，混合药物与其他试剂的说明书，将所述组合物给予受试者的说明书。
本发明还提供了一种多肽化合物为载体给细胞或者组织传递siRNA的应用。在一个实施例中，所用细胞为中国仓鼠卵巢细胞。在一个实施例中，细胞为肿瘤细胞。在一个实施例中，组织为肿瘤组织。
实验仪器及样品的配制
1、实验仪器
siRNA的摩尔浓度由核酸蛋白分析仪Nanodrop ND-1000测定，买自赛默飞公司。mRNA数量由安捷伦公司Mx3005PTM Real-Time PCR System测定(Wilmington,美国)。
2、样品
试验使用磷酸甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为目标基因。GAPDH是一种常用基因，在不同组织和细胞类型里有广泛表达，并在多种细胞过程中表现功能。相关的siRNA，即沉默试剂GAPDH siRNA(人，鼠，大鼠)，买自Ambion公司。所有多肽化合物买自Pepscan公司(Leystad，荷兰)。
3、细胞试验
以来自一个成年中国仓鼠卵巢组织的卵巢细胞CHO-K1(ATCC CCL-61)作为细胞试验对象。
4、mRNA的检测
实时反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription PCR，RT-PCR)是当前检测低含量mRNA最为灵敏的方法。细胞内所有的RNA通过TRIzol试剂 萃取，然后用氯仿和2-丙醇处理。RNA浓度由Nanodrop测试。所有的RNAs根据本协议与Bio-Rad公司的iScript cDNA合成试剂盒进行反转录。cDNA合成用一个独特的混合寡核苷酸(DT)和随机引物预先准备。用于鼠GAPDH基因的引物的序列为：5’-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGA G-3’(SEQ ID No:6)和5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’(SEQ ID No:7)(Sigma，Oakville，Canada)。环素是一种管家基因，被用来作为内部对照来标准化的GAPDH基因的表达。小鼠亲环蛋白mRNA的扩增使用下列引物：5'-AGGGTTTCTCCAC TTCGA TCTTGC-3'(SEQ ID No:8)和5'-AGATGGCACAGGAGGAAAGAGC AT-3'(SEQ ID No:9)(Sigma，Oakville，Canada)。
5、细胞毒性测试
CHO-K1细胞一式三份接种在含有5,000-8,000细胞/孔，96孔的平底孔板中，并在37℃下生长24小时，控制氛围含有5％的CO2。将组装体或对照样品加到细胞中在标准介质150微升，并将细胞温育48小时。CCK8试剂用于测定细胞活力。CCK8库存110微升加入到每个孔中并在37℃下5％CO2氛围温育2小时。然后，将培养物从培养箱的吸光度在570nm处读取的读板仪(FLUOstar OPTIMA，BMG，德国)中移除。多孔板在690nm处的背景吸光度测定，并从570nm测量中减去。从一式三份的孔中获得的结果进行平均，并使用非处理的细胞获得归一化的值。
本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。在本发明中，若非特指，所有的百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。
实施例1-1
本实施例采用多肽化合物GL5作为传递siRNA的载体。
GAPDH siRNA/GL5组装体的制备
以20:1的摩尔比将1000nM的GL5多肽化合物和50nM的GAPDH siRNA分别溶于无血清培养基Opti-MEM溶液中，然后利用均匀混合的方法将基因加入多肽溶液中，放置半小时后等待载体充分稳定可以进行测量和下一步使 用。
GAPDH siRNA/GL5组装体的体内转染
在含有10％FBS不含抗菌剂的F12K培养基中育种35000-40000个细胞/孔板，转染之前培育24小时。第二天，转染之前使用PBS缓冲液洗涤细胞，加入200微升Opti-MEM溶液。100微升的组装体(GAPDH siRNA/多肽)溶液加入到每个孔板中。细胞与组装体在37℃的培养皿中温育，4小时后，加入300微升F12-K以及20％FBS。细胞在转染开始48小时后，洗涤并溶解。
实时RT-PCR检测细胞内的mRNA含量，并进行细胞毒性测试。
实施例1-2
以40:1的摩尔比将2000nM的GL5多肽化合物和50nM的GAPDH siRNA用于制备GL5/siRNA组装体，制备方法铜实施例1-1。
GL5/siRNA组装体的体内转染，方法同实施例1-1。
实时RT-PCR检测细胞内的mRNA含量，并进行细胞毒性测试。
实施例2-1
本实施例采用多肽化合物STR-KV作为传递siRNA的载体。
以30:1的摩尔比将1500nM的STR-KV多肽化合物和50nM的GAPDH siRNA用于制备STR-KV/siRNA组装体，制备方法同实施例1-1。
STR-KV/siRNA组装体的体内转染，方法同实施例1-1。
实时RT-PCR检测细胞内的mRNA含量，并进行细胞毒性测试。
实施例2-2
本实施例采用多肽化合物STR-KV作为传递siRNA的载体。
以45:1的摩尔比将2250nM的STR-KV多肽化合物和50nM的GAPDH siRNA用于制备STR-KV/siRNA组装体，制备方法同实施例1-1。
STR-KV/siRNA组装体的体内转染，方法同实施例1-1。
实时RT-PCR检测细胞内的mRNA含量，并进行细胞毒性测试。
实施例2-3
本实施例采用多肽化合物STR-KV作为传递siRNA的载体。
以60:1的摩尔比将3000nM的STR-KV多肽化合物和50nM的GAPDH siRNA用于制备STR-KV/siRNA组装体，制备方法同实施例1-1。
STR-KV/siRNA组装体的体内转染，方法同实施例1-1。
实时RT-PCR检测细胞内的mRNA含量，并进行细胞毒性测试。
实施例3-1
本实施例采用多肽化合物STR-HR作为传递siRNA的载体。
以30:1的摩尔比将3000nM的STR-HR多肽化合物和100nM的GAPDH siRNA用于制备STR-HR/siRNA组装体，制备方法同实施例1-1。
STR-HR/siRNA组装体的体内转染，方法同实施例1-1。
实时RT-PCR检测细胞内的mRNA含量，并进行细胞毒性测试。
实施例3-2
本实施例采用多肽化合物STR-HR作为传递siRNA的载体。
以45:1的摩尔比将4500nM的STR-HR多肽化合物和100nM的GAPDH siRNA用于制备STR-HR/siRNA组装体，制备方法同实施例1-1。
STR-HR/siRNA组装体的体内转染，方法同实施例1-1。
实时RT-PCR检测细胞内的mRNA含量，并进行细胞毒性测试。
实施例3-3
本实施例采用多肽化合物STR-HR作为传递siRNA的载体。
以60:1的摩尔比将6000nM的STR-HR多肽化合物和100nM的GAPDH siRNA用于制备STR-HR/siRNA组装体，制备方法同实施例1-1。
STR-HR/siRNA组装体的体内转染，方法同实施例1-1。
实时RT-PCR检测细胞内的mRNA含量，并进行细胞毒性测试。
实施例4-1
本实施例采用多肽化合物STR-C6M1作为传递siRNA的载体。
以40:1的摩尔比将2000nM的STR-C6M1多肽化合物和50nM的GAPDH siRNA用于制备STR-C6M1/siRNA组装体，制备方法同实施例1-1。
STR-C6M1/siRNA组装体的体内转染，方法同实施例1-1。
实时RT-PCR检测细胞内的mRNA含量，并进行细胞毒性测试。
实施例4-2
本实施例采用多肽化合物STR-C6M1作为传递siRNA的载体。
以60:1的摩尔比将3000nM的STR-C6M1多肽化合物和50nM的GAPDH siRNA用于制备STR-C6M1/siRNA组装体，制备方法同实施例1-1。
STR-C6M1/siRNA组装体的体内转染，方法同实施例1-1。
实时RT-PCR检测细胞内的mRNA含量，并进行细胞毒性测试。
实施例5-1
本实施例采用多肽化合物STR-C6M3作为传递siRNA的载体。
以40:1的摩尔比将2000nM的STR-C6M3多肽化合物和50nM的GAPDH siRNA用于制备STR-C6M3/siRNA组装体，制备方法同实施例1-1。
STR-C6M3/siRNA组装体的体内转染，方法同实施例1-1。
实时RT-PCR检测细胞内的mRNA含量，并进行细胞毒性测试。
实施例5-2
本实施例采用多肽化合物STR-C6M3作为传递siRNA的载体。
以60:1的摩尔比将3000nM的STR-C6M3多肽化合物和50nM的GAPDH siRNA用于制备STR-C6M3/siRNA组装体，制备方法同实施例1-1。
STR-C6M3/siRNA组装体的体内转染，方法同实施例1-1。
实时RT-PCR检测细胞内的mRNA含量，并进行细胞毒性测试。
对比例1
本对比例采用脂质体(lipofactamine 2000,lipo)作为传递siRNA的载体。
制备GAPDH siRNA与脂质体(lipo)的组装体，制备方法同实施例1-1。
GAPDH siRNA与脂质体(lipo)组装体的体内转染，方法同实施例1-1。
实时RT-PCR检测细胞内的mRNA含量，并进行细胞毒性测试。
不同多肽化合物与GAPDH siRNA组装以及不同摩尔比组装的的RT-PCR结果如图1-4所示。图1显示了以GL5为载体时GAPDH基因在CHO细胞中的沉默效率，其中GL5与siRNA分别以20/1和40/1的摩尔比进行组装。图2显示了以STR-KV为载体时GAPDH基因在CHO细胞中的沉默效率，其中STR-KV与siRNA分别以30/1，40/1和60/1的摩尔比进行组装。图3显示了以STR-HR为载体时GAPDH基因在CHO细胞中的沉默效率，其中STR-HR与siRNA分别以30/1、45/1、和60/1的摩尔比进行组装。图4显示了以STR-C6M1和STR-C6M3为载体时GAPDH基因在CHO细胞中的沉默效率，其中STR-C6M1和STR-C6M3与siRNA分别以40/1、60/1的摩尔比进行组装。在图1至4所示的结果，对应于平均至少三个独立的实验。
GAPDH siRNA的摩尔比为20-60与不同的多肽化合物组装后的细胞毒性结果示于图5至8。图5显示了在CHO细胞中，其中的siRNA进行组装与GL5在20/1和40/1的摩尔比的细胞毒性。图6显示了在CHO细胞中，siRNA与STR-KV分别以30/1、45/1和60/1的摩尔比组装后的配合物，GAPDH基因的细胞内的沉默效率。图7显示了在CHO细胞中摩尔比为30/1、 45/1、60/1的STR-HR/siRNA配合物的沉默效率。图8显示了在CHO细胞中，以40/1和60/1的摩尔比进行组装siRNA与STR-C6M1和STR-C6M3的细胞毒性。在图5至8中所示的结果对应于平均至少三个独立的实验。
由图1和图5可以看出，GL5与siRNA的摩尔比分别为20/1和40/1时，siRNA的基因沉默效率分别41％和65％，低于脂质体转染siRNA的基因沉默效率；但是无论是多肽化合物GL5本身还是GL5/siRNA组装体，其细胞成活率分别约为105％、104％，均远高于脂质体或者脂质体/siRNA组装体58％的成活率。本发明的多肽化合物GL5是基于现有技术的多肽GL1改进而来，GL5是在GL1的基础上用四个具有正电的组氨酸取代其中的四个氨基酸得到。而组氨酸已被证明具有更好的内涵体逃逸能力，可以使进入细胞的siRNA能够从内涵体中释放出来进入细胞质中，从而与mRNA产生沉默效应。根据国际专利申请公开号为WO2013/075244A1的专利文献，以GL1为载体的siRNA基因沉默效率约为50％，因此，本发明的改进相对于现有技术沉默效率和生物兼容性均有了很大的提高。
由图2和图6可以看出，STR-KV与siRNA的摩尔比分别为30/1、45/1、60/1时，基因沉默效率随之增加，分别为47％、65％、73％，接近同条件下脂质体/siRNA组装体85％的基因沉默效率；同样的，STR-KV、STR-KV/siRNA组装体的细胞成活率分别约为98％、97％、90％，随摩尔比增加则略有减小，但均高于脂质体或者脂质体/siRNA组装体75％的细胞成活率。综合比较，本发明设计的多肽化合物STR-KV具有良好的siRNA传递性能和优秀的生物相容性，适于体内应用。
由图3和图7可以看出，STR-HR与siRNA的摩尔比分别为30/1、45/1、60/1时，基因沉默效率随之增加而增加，分别约为50％、67％、87％，其中摩尔比为60/1时基因沉默效率高于脂质体转染siRNA的基因沉默效率85％；STR-HR、STR-HR/siRNA组装体的细胞成活率在摩尔比45/1时达到最大，但三种摩尔比下的细胞成活率均高于脂质体或者脂质体/siRNA组装体的细胞成活率。同时通过细胞吸收试验发现，STR-HR相比于脂质体2000具有更高的吸收效率。由STR-HR/siRNA复合物引发的沉默效率与脂质体2000/siRNA复合物的沉默效率相当。每摩尔比率的STR-HR用于沉默效率试验的细胞毒性不高于脂质体2000。此外，通过动态光散射试验证明STR-HR/siRNA在摩尔比率范围15-60内，所有STR-HR与siRNA复合物的 颗粒尺寸均在50-150nm内，而这个范围适合通过静脉控制的体内应用。STR-HR/siRNA摩尔比范围为15-60，Zeta电位随着摩尔比的增加从21mV-28mV。以上说明本发明设计的多肽化合物STR-HR具有优秀的siRNA传递性能和生物相容性，其中STR-HR与siRNA的摩尔比为60/1时具有最好的效果。
由图4和图8可以看出，STR-C6M1与siRNA的摩尔比分别为40％、60％时，基因沉默效率随之增加而增加，分别约为47％、49％，均低于脂质体转染siRNA的基因沉默效率；STR-C6M1、STR-C6M1/siRNA组装体的细胞成活率分别约为93％、88％，随摩尔比增加则逐渐减小，但均远高于脂质体或者脂质体/siRNA组装体的细胞成活率。此外，在国际专利申请WO2013075244中，C6M3/siRNA以40/1的摩尔比转染的细胞成活率低于40％，远小于本发明的细胞成活率。由图4和图8还可以看出，STR-C6M3与siRNA的摩尔比分别为40％、60％时，基因沉默效率随之增加而增加，分别约为50％、61％，均低于脂质体转染siRNA的基因沉默效率；STR-C6M3、STR-C6M3/siRNA组装体的细胞成活率分别约为96％、91％，随摩尔比增加则逐渐减小，但均远高于脂质体或者脂质体/siRNA组装体的细胞成活率。此外，在国际专利申请WO2013075244中，C6M3/siRNA以40/1的摩尔比转染的细胞成活率低于50％，远小于本发明的细胞成活率。以上说明经过在多肽的N端被硬脂酰化后，多肽化合物STR-C6M1和STR-C6M3具有良好的siRNA传递性能和生物相容性，更适于体内应用。
综上，本发明提供了一种多肽化合物，可以通过自组装或者共组装与siRNA非共价连接，并形成纳米结构，将siRNA迁移到细胞质中，然后能快速去质子化的可生物降解的双性的多肽或多肽载体因能有效结合和保护siRNA分子，增强细胞对siRNA分子的吸收，提高其稳定性和靶向性，并能使siRNA分子有效释放，实现治疗目的。试验表明，siRNA的沉默效率得到明显提高，且本发明所设计的多肽化合物毒性相对较低，生物相容性好。本发明的多肽化合物载体在siRNA药物给药中具有很好的优势和应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (24)

  1. 一种多肽化合物，其特征在于：所述多肽化合物包括疏水部分和亲水部分，所述亲水部分包括带有正电的氨基酸残基。
  2. 根据权利要求1所述的多肽化合物，其特征在于：所述多肽化合物包含的氨基酸残基总数目范围为8-50。
  3. 根据权利要求1所述的多肽化合物，其特征在于：所述多肽化合物为：GLWHxAWLWHyAFLASHzRLLRLLR，1≤x≤5，1≤y≤5，1≤z≤6，x、y、z为整数。
  4. 根据权利要求3所述的多肽化合物，其特征在于：所述多肽化合物的氮端乙酰化，碳端酰胺化。
  5. 根据权利要求1所述的多肽化合物，其特征在于：所述多肽化合物具有通式：CH3(CH2)16CONH-B-CONH2，所述B为氨基酸序列。
  6. 根据权利要求5述的多肽化合物，其特征在于：所述B具有通式：
    GLWHxAWLWHyAFLASHzRLLRLLR，1≤x≤5，1≤y≤5，1≤z≤6，x、y、z为整数。
  7. 根据权利要求5所述的多肽化合物，其特征在于：所述B具有通式：
    HaKbVc，3≤a≤8，3≤b≤8，6≤c≤8，a、b、c为整数。
  8. 根据权利要求5所述的多肽化合物，其特征在于：所述B具有通式：HdRe，8≤d≤30，8≤e≤20，d、e为整数。
  9. 根据权利要求5所述的多肽化合物，其特征在于：所述B为
    RLWRLLWRLWRRLWRLLR。
  10. 根据权利要求5所述的多肽化合物，其特征在于：所述B为
    RLWHLLWRLWRRLHRLLR。
  11. 一种组装体，其特征在于：所述组装体包括货物分子和权利要求1-10中任一所述的多肽化合物。
  12. 根据权利要求11所述的组装体，其特征在于：所述货物分子与所述多肽化合物通过非共价键连接。
  13. 根据权利要求11所述的组装体，其特征在于：所述组装体颗粒粒径尺寸范围为20nm-999nm。
  14. 根据权利要求11所述的组装体，其特征在于：所述货物分子为核酸。
  15. 根据权利要求14所述的组装体，其特征在于：所述核酸为siRNA。
  16. 根据权利要求15所述的组装体，其特征在于：多肽化合物与siRNA的摩尔比范围为1:1-80:1。
  17. 根据权利要求15所述的组装体，其特征在于：多肽化合物与siRNA的摩尔比为20:1。
  18. 根据权利要求15所述的组装体，其特征在于：多肽化合物与siRNA的摩尔比为40:1。
  19. 根据权利要求15所述的组装体，其特征在于：多肽化合物与siRNA的摩尔比为60:1。
  20. 一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包含权利要求11至19中任一所述的组装体。
  21. 一种给病人递送药物的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求20所述的药物组合物、一种或者多种电解质、缓冲液、递送装置以及适合把一种或者多种其他药剂混合到一起的容器。
  22. 一种根据权利要求1至10中任一所述的多肽化合物在向细胞或者组织传递siRNA上的应用。
  23. 根据权利要求22所述的应用，其特征在于：所述细胞为卵巢细胞。
  24. 根据权利要求22所述的应用，其特征在于：所述细胞为肿瘤细胞或者所述组织为肿瘤组织。
PCT/CN2014/094198 2013-12-18 2014-12-18 多肽及其作为递送载体的用途 WO2015090212A1 (zh)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19169415.7A EP3572421B1 (en) 2013-12-18 2014-12-18 Peptide, complex of peptide and sirna and use thereof
EP14872058.4A EP3088413B1 (en) 2013-12-18 2014-12-18 Polypeptide and use thereof as delivery carrier
US15/106,108 US10076575B2 (en) 2013-12-18 2014-12-18 Peptide, complex of peptide and siRNA and use thereof
US16/110,713 US20180355357A1 (en) 2013-12-18 2018-08-23 Peptide, Complex of Peptide and siRNA, and Methods of Use Thereof
US16/751,783 US11306313B2 (en) 2013-12-18 2020-01-24 Peptide, complex of peptide and siRNA, and methods of use thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310698871.0 2013-12-18
CN201310698871.0A CN104725478B (zh) 2013-12-18 2013-12-18 多肽化合物、多肽化合物与siRNA的组装体及其应用

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US15/106,108 A-371-Of-International US10076575B2 (en) 2013-12-18 2014-12-18 Peptide, complex of peptide and siRNA and use thereof
US16/110,713 Continuation US20180355357A1 (en) 2013-12-18 2018-08-23 Peptide, Complex of Peptide and siRNA, and Methods of Use Thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015090212A1 true WO2015090212A1 (zh) 2015-06-25

Family

ID=53402118

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2014/094198 WO2015090212A1 (zh) 2013-12-18 2014-12-18 多肽及其作为递送载体的用途

Country Status (4)

Country Link
US (3) US10076575B2 (zh)
EP (2) EP3572421B1 (zh)
CN (1) CN104725478B (zh)
WO (1) WO2015090212A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104725478B (zh) 2013-12-18 2018-12-25 纳肽得有限公司 多肽化合物、多肽化合物与siRNA的组装体及其应用
CN107629118A (zh) * 2017-10-31 2018-01-26 天津大学 基于组氨酸的靶向性穿膜肽载体及用途
WO2023083323A1 (en) * 2021-11-12 2023-05-19 The Hong Kong University Of Science And Technology A peptide and the selection method thereof
WO2023184332A1 (zh) * 2022-03-31 2023-10-05 深圳先进技术研究院 一种靶向卵巢多肽及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013075244A1 (en) 2011-11-24 2013-05-30 Pu Chen Peptide sequence design and use thereof for peptide-mediated sirna delivery
CN103272242A (zh) * 2013-05-23 2013-09-04 北京大学 用作基因和siRNA传递载体的嵌段多肽

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101801340A (zh) 2007-06-28 2010-08-11 新加坡科技研究局 用于将制剂递送到细胞中的阳离子肽
WO2009026729A1 (en) 2007-08-30 2009-03-05 University Of Waterloo Amino acid pairing-based self assembling peptides and methods
AU2008308679B2 (en) * 2007-10-02 2015-01-29 Marina Biotech, Inc. Lipopeptides for delivery of nucleic acids
WO2011020188A1 (en) 2009-08-21 2011-02-24 University Of Waterloo Peptide sequences and peptide-mediated sirna delivery
WO2012137036A1 (en) * 2011-04-04 2012-10-11 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
US9043410B2 (en) 2011-08-15 2015-05-26 Skype Retrieval of stored transmissions
CN104725478B (zh) 2013-12-18 2018-12-25 纳肽得有限公司 多肽化合物、多肽化合物与siRNA的组装体及其应用
US20160271258A1 (en) * 2015-03-20 2016-09-22 Musc Foundation For Research Development Dual Peptide-Mediated Targeted Delivery System

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013075244A1 (en) 2011-11-24 2013-05-30 Pu Chen Peptide sequence design and use thereof for peptide-mediated sirna delivery
CN103272242A (zh) * 2013-05-23 2013-09-04 北京大学 用作基因和siRNA传递载体的嵌段多肽

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3088413A4

Also Published As

Publication number Publication date
EP3572421B1 (en) 2021-07-14
US20170119900A1 (en) 2017-05-04
CN104725478B (zh) 2018-12-25
CN104725478A (zh) 2015-06-24
US10076575B2 (en) 2018-09-18
US20180355357A1 (en) 2018-12-13
EP3572421A1 (en) 2019-11-27
US20200190518A1 (en) 2020-06-18
US11306313B2 (en) 2022-04-19
EP3088413A1 (en) 2016-11-02
EP3088413A4 (en) 2017-08-02
EP3088413B1 (en) 2019-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Promoting siRNA delivery via enhanced cellular uptake using an arginine-decorated amphiphilic dendrimer
Hayashi et al. Cell penetrating peptide-mediated systemic siRNA delivery to the liver
Dohmen et al. Nanosized multifunctional polyplexes for receptor-mediated siRNA delivery
US11306313B2 (en) Peptide, complex of peptide and siRNA, and methods of use thereof
Lindberg et al. PepFect15, a novel endosomolytic cell-penetrating peptide for oligonucleotide delivery via scavenger receptors
Baoum et al. Calcium condensed cell penetrating peptide complexes offer highly efficient, low toxicity gene silencing
O’Mahony et al. In vitro investigations of the efficacy of cyclodextrin-siRNA complexes modified with lipid-PEG-Octaarginine: towards a formulation strategy for non-viral neuronal siRNA delivery
Schroeder et al. Alkane-modified short polyethyleneimine for siRNA delivery
Li et al. A novel cationic liposome formulation for efficient gene delivery via a pulmonary route
WO2014201276A1 (en) Polycation-functionalized nanoporous silicon carrier for systemic delivery of gene silencing agents
CN104487450B (zh) 多肽序列设计及其在多肽介导的siRNA传递中的应用
WO2011011631A2 (en) Nucleic acid delivery vehicles
Zhang et al. Polycation liposomes combined with calcium phosphate nanoparticles as a non-viral carrier for siRNA delivery
Xu et al. Efficient siRNA delivery using PEG-conjugated PAMAM dendrimers targeting vascular endothelial growth factor in a CoCl2-induced neovascularization model in retinal endothelial cells
Heo et al. Gold-installed biostable nanocomplexes for tumor-targeted siRNA delivery in vivo
CN108424437B (zh) 一种递送分子及纳米颗粒、制备方法、用途
US20230000999A1 (en) Compositions and methods for nucleic acid delivery
Arif et al. Self-assembled amphiphilic phosphopyridoxyl-polyethylenimine polymers exhibit high cell viability and gene transfection efficiency in vitro and in vivo
Yang et al. Production and characterization of a fusion peptide derived from the rabies virus glycoprotein (RVG29)
CA3105584A1 (en) Peptides for use as cell-penetrating peptides
Xu et al. In vitro and in vivo therapeutic siRNA delivery induced by a tryptophan-rich endosomolytic peptide
KR101448800B1 (ko) 핵산 전달 복합체
CA3179016A1 (en) Double-stranded oligonucleotide and composition for treating covid-19 containing same
CN114632161B (zh) 肿瘤坏死因子-α作为一种核酸基因药物体内递送载体的应用
JP5789927B2 (ja) 放射線照射コラーゲン様ペプチドを用いた核酸導入法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14872058

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2014872058

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15106108

Country of ref document: US

Ref document number: 2014872058

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE