KR20190133216A - 비흑색종 피부암(nmsc)의 예방 및 치료 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비-흑색종 피부암(NMSC)의 예방 및 치료에 사용하기 위한 인터페론 알파(IFN-α) 메신저-RNA(mRNA)로서, mRNA는 5' CAP 영역, 5' 비번역 영역(5'-UTR), 코딩 영역, 3' 비번역 영역(3'-UTR) 및 폴리-아데노신 테일(폴리-A 테일)을 갖는 IFN-α mRNA, 및 이러한 IFN-α mRNA를 인간 환자에 투여하기 위한 키트를 기재한다.
Description
본 발명은 비흑색종 피부암(NMSC)의 예방 및 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
비흑색종 피부암(NMSC)은 전세계적으로 가장 흔한 형태의 암이다. NMSC는 멜라닌세포에서 시작되지 않은 모든 형태의 암, 가장 두드러지게는, 기저 세포 암종(BCC)(모든 NMSC의 약 75-80%) 및 편평 세포 암종(SCC)(모든 NMSC의 약 20-25%)을 포함한다.
광선 각화증(AK)은 중요한 NMSC 실체이다. 역사적으로, 이는 SCC의 전구체 병변으로 여겨졌다. 요즘, 과학계는 이를 침습적 단계로 진행될 수 있는 제자리 암종으로 파악하고 있다. 다른 NMSC와 대조적으로, AK는 매우 풍부하다.
AK는 만성 태양 노출 피부 부위에서 전형적으로 발병하는 피부병이다. 현재 제자리 암종으로서 간주되는 AK의 병리생리학적 개념 변화는 세포검사 AK의 수준이 SCC와 구별가능하고, 분자 생물학 수준에서, SCC와 다수의 유사점을 공유한다는 점에 의해서 주장된다.
AK는 표피에서 비정형 케라틴세포의 범위에 기초하여 3 등급(AK I-III)으로 조직병리학적으로 분류된다. 임상적으로, AK는 홍반 바탕에 비늘 패치(scaly patch)로서 전형적으로 나타난다. 촉진에 의해서는 사포-유사 질감을 드러낸다. 주변 피부는 모세혈관확장증, 피부이상변색증 및 탄력섬유증을 포함하는 만성 태양 손상의 징후를 보일 수 있다. 피부경검법은 (예를 들어, 얼굴의 색소침착 병변의) 다양한 진단 및 임상적 등급화 둘 모두를 지원한다. 해부학적 분포(얼굴, 대머리, 목, 손등)는 AK의 발병에 주요 위험 인자로서 만성 태양 노출의 중요성을 추가로 강조한다. 다른 위험 인자로는 노년, 남성 성별 및 흰 피부 유형을 포함한다. 면역억제(예를 들어, 이식 수령자)는 또한, AK에 대한 더 높은 발병 위험을 부가한다. UVB 방사선은 직접적인 DNA 손상으로 이어질 수 있다. 그 결과, p53과 같은 종양 억제인자 단백질의 기능이 억제된다. 사실, p53 경로의 조절장애는 AK 병변의 발생 및 이들의 SCC로의 추가적인 진행에서 가장 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 일부 증거는 인간 유두종 바이러스로의 감염이 공동인자로서 작용함을 시사한다.
AK는 영역 종양화(field cancerization) 맥락에서 다중 병변(≥6) 또는 다중 병변(≥6)(즉, 하나의 몸체 부위 또는 영역, 및 만성 태양 손상의 연속 영역에서 적어도 6개의 AK 병변)으로서 또는 단일 병변(≤5)으로서 발생할 수 있다. 일반적인 분류는 네 번째 하위그룹인 AK를 갖는 면역억제된 환자를 추천한다.
AK의 자연적 병력에서 입수가능한 데이터는 적절한 치료가 없는 AK의 존재는 역동적이면서 만성 상태임을 나타낸다. AK로부터 침습성 SCC로의 진행 위험은 개별 병변에 있어서 10%로 추정된다. 현재 어떤 AK 병변이 SCC로 진행될지 예측이 불가능하기 때문에, 가능한 빨리 모든 경우에 개입하는 것이 중요하다.
현재의 AK 치료법은 2가지 주요 부류로 나누어질 수 있다: 병변 유도 및 영역 유도. 가장 일반적인 병변 유도 요법은 냉동수술에 이은 외과적 제거이다. 두 병변-유도 방법의 주요 단점은 이들이 가시적인 병변만 다룰 수 있으며 손상된 영역에는 그렇지 못하다는 점이다. 게다가, 이들의 미용적 결과는 영역-유도 치료법의 결과보다 열등한 것으로 판단된다. 이러한 이유로, 영역-유도 치료법이 SCC로의 이들의 전환을 예방하기 위해 임상적으로 보이는 병변뿐만 아니라 무증상 병변을 제거하는데 점점 더 많이 사용되고 있다.
현재 영역 유도 치료법은 국소 제제 예컨대, 이미퀴모드(Imiquimod) (Aldara®, Zyclara®로 판매), 디클로페낙(Diclofenac) (Solaraze®로 판매), 5-플루오로우라실(Efudix® 또는 Actikerall®로 판매), 인게놀 메부테이트(ingenol mebutate) (Picato®로 판매) 및 광역학적 요법(Ameluz®, Metvix®)을 포함한다. 영역 요법은 무증상 병변에 영향을 미칠 가능성이 있다.
이러한 당업계 치료의 현재 상태는 종종 광범위한 치료 기간과 빈번한 가정 적용 및 실질적인 정지 시간을 필요로 한다. 이는 환자 순응도를 심각하게 저하시키며, 임상 실습에서 NMSC 치료의 효능을 제한하고 있다. 추가로, 기존 치료에 대한 반응자 비율은 다양하며, 표준 치료 후 AK의 조직학적 제거율은 플루오로우라실 이후 67% 및 이미퀴모드 이후 73%로 낮은 것으로 보고되었다. 영역 유도 치료법의 장기간 효과 및 재발률에 대한 정보는 부족하며 인상적이지 않다. 1년 시점에서 재발률은 10 내지 56% 범위이다.
이러한 특별하지 않은 낮은 성공률은 NMSC의 치료에서 의료적 필요를 충족시키기 위한 신규한 치료 패러다임의 개발을 타당하게 한다.
인터페론 알파(인터페론 α, IFN-α, IFNa)인 타입 I 인터페론은 항바이러스, 항혈관신생뿐만 아니라 아폽토시스 유도 특성을 나타내며, 입증된 치료학적 항-종양 효능을 갖는 주요 면역자극 분자이다. 인터페론은 1957년에 처음 설명되었다. IFNa 및 이후, 인터페론 베타(IFN-β; IFNb) 및 인터페론 감마(IFN-γ; IFNg)에 대한 유전자의 클로닝은 1980년 초기에 단지 보고만 되었다.
1980년대에, 재조합 IFNa 단백질은 AK 및 다른 형태의 NMSC의 치료를 위해 제안되었다. 그 시간에, 복수의 보고서는 BCC 및 SCC의 치료를 위한 재조합 IFNa 단백질의 안전성 및 효능을 주장하였다. 3주 동안 1.5x106 IU IFNa의 용량의 주 3x의 반복된 병변 주변 투여는 대부분의 BCC 및 SCC에 적합한 것으로 밝혀졌다(더 큰 종양은 더 많은 총 용량을 필요로 함).
US 5 002 764 A 및 US 5 028 422 A는 재조합 인간 IFNa-2 단백질을 이용한 AK의 병변내 투여 치료를 기술하고 있다.
다양한 BCC 아형은 표재 및 궤양 형태와 다르게 반응하여 결절형보다 IFNa 치료법에 더욱 적합한 것으로 보인다. 인간 BCC의 치료를 위해 3주의 기간에 걸쳐 3회 재조합 인간 IFNa-2b의 병변내 투여가 또한 EP 0 248 583 B1에 논의된다.
SCC는 일반적으로 BCC보다 더욱 공격적이며, 잠재적으로 생명을 위협한다. 원발성 피부 SCC의 전반적인 5년 재발률은 8%이다(BCC <0.1%와 비교).
편평 세포 암종에서 병변내 IFNa를 평가하는 연구에 대한 몇 가지 보고가 있다.
고용량 병변내 IFNa의 빈번하고 장기간 지속되는 적용은 작은 편평 세포 암종의 치료에 효과적이다. AK에 있어서, 에드워드(Edwards) 및 동료들은 AK를 제거하기 위해 용량 당 5x105 IU의 높은 용량의 6회 병변 주위 주입을 보고하였다(Arch. Dermatol., 1986. 122(7): p. 779-82). IFNa 단백질의 더 낮은 용량(주입 당 1x105, 1x104 IU)은 각각 원위치에서 AK 제거에서 덜 효과적임을 입증하였다.
다양한 유형의 NMSC의 치료에서 IFNa의 작용 메카니즘은 부분적으로 알려져있다. 항종양 효과는 종양 기질 및 미세환경에 의존적인, 직접적인 항증식성뿐만 아니라 간접적인 효과의 조합으로 인한 것으로 보인다. 후자는 종양 혈관뿐만 아니라 선천성 및 후천성 면역계 둘 모두에 대한 효과를 포함한다. 카포시 육종 및 혈관종에서 IFNa의 효과는 이의 항혈관신생 활동의 임상적 관련성을 입증한다.
IFNa는 NMSC, 특히 AK, BCC 및 SCC에 효과적인 것으로 입증되었지만, 이는 결코 임상 루틴에 대한 치료 옵션은 되지 않았다. 그 이유는 명백하다. 치료는 몇 주에 걸친 빈번한 (매일 또는 주 3회) 병변 주위 주입을 필요로 한다. 또한, 재조합 IFNa 단백질은 고가이며, 제조물의 품질 및 중요하게는, 생물활성이 달랐다. IFNa는 유전자 조작된 E. 콜라이 균주를 사용하여 재조합 DNA 기법에 의해 생산되었다. E. 콜라이의 발현이 높은 단백질 수율을 유도하지만, 생성물 중의 다양한 등급의 비활성 및 활성 단백질로 치료에 대한 유사한 수준의 생물활성을 제공하기 위해 생성물은 과도하게 정제되고 효능 및 생물활성이 테스트되어야 한다.
현대 의학에서 인터페론, 특히 IFNa를 피하려는 욕구가 존재하는 이유는 이들 단백질이 많은 특징적인 독성 효과를 갖고 있기 때문이다. 4가지 주요 군의 부작용이 발생한다: 체질적, 신경정신과적, 혈액학적/면역학적 및 간염. 많은 이러한 부작용의 심각성은 IFN 단백질 치료의 용량 및 기간과 직접적으로 관련이 있는 것으로 보인다(Borden et al., Semin Oncol, 1998. 25(1 Suppl 1): p. 3-8).
체질적 증상은 인플루엔자-형 증상, 예컨대, 피로, 발열, 오한 및 한기를 포함한다. 체질적 증상은 초기에, 종종 투여 후 3-6시간 이내에 발생한다. 환자는 또한, 두통, 근육통 및 권태를 경험할 수 있다. 트랜스아미니티스(transaminitis) 및 호중구감소증은 처리 후 처음 며칠 이내에 발생할 수 있으며, 용량을 감소시킴으로써 조절될 수 있다. 적절하게 다루지 않을 경우, 트랜스아미니티스는 치명적인 간독성을 일으킬 수 있다. IFN에 대한 환자가 겪는 가장 빈번한 만성 증상은 또한 피로(70-100%), 식욕부진(40-70%) 및 신경정신병 장애(30% 이하)를 포함한다. 이들 증상은 용량 관련되고, 누적되며, 시간 경과에 따라 악화된다. 자동-면역 독성은 루푸스 에리테마토스, 건선 및 갑상선 기능 장애의 촉발을 포함한다. 명시적 내지 무증상의 갑상샘과다증 또는 갑상샘저하증 범위의 갑상선 기능장애는 IFNa 치료를 받은 환자의 8-20%에서 발생한다. 대부분의 환자가 따르는 패턴은 자가면역 갑상선염 중 하나이며, 갑상샘과다증 이어서 갑상샘저하증의 기간을 갖는다.
단백질 인터페론, 특히 IFNa 단백질을 대체할 필요는 C형 간염의 치료(IFNa 대체(리바비린과 조합하여))에서 레디파스비르/소포스부비르(상표명 Harvoni로 판매됨)의 조합물의 막대한 시장 성공으로 이끌었다.
그러나, 또한, NMSC, 특히 AK에 대한 이러한 시중에서 성공적인 치료 옵션은 치료 과정에서 현저한 부작용 및 제한된 효능을 보여준다: 물론, 특별한 개체에서, 국소적 IFN 유도인자, 예컨대, TLR7 아고니스트, 이미퀴모드는 아급성 피부 홍반성 루푸스의 발병과 같은 자가면역 독성 유형에 대해 더 많은 것을 이끌어낼 수 있다. 게다가, 특정 개체는 또한, TLR7에서 단일 뉴클레오티드 다형성을 수반하며, 이는 이들을 TLR7 아고니스트, 예컨대, 이미퀴모드에 대한 비-반응인자로 만든다(Pharmacogenomics. 2015. Nov.; 16 (17): p. 1913-17).
따라서, 개선된 환자의 순응도 및 개선된 부작용 사건을 제공하는 NMSC에 대한 개선된 예방 및 치료 계획에 대한 중요한 의학적 필요성이 여전히 존재한다.
현재 영역 유도 치료법은 이형성 유형의 이미퀴모드, 인게놀 메부테이트, 디클로페낙을 포함하는 국소제 및 광역동 치료법(PDT)을 위한 광감제 및 플루오로우라실을 나타낸다. 이러한 최근의 최신 치료는 플루오로우라실 이후 67% 및 이미퀴모드 이후 73%로 낮은 것으로 보고된 표준 치료 후 AK의 조직학적 제거율을 보여준다. 이러한 최근의 최신 제제 모두는 NMSC/AK 치료법에 대한 바로 직접적인(예를 들어, 플루오로우라실, 인게놀 메부테이트, PDT) 또는 간접적인 메카니즘(이미퀴모드)에 의존적이다.
가장 널리 사용되는 치료제 중 하나인 이미퀴모드는 선천적인 면역계의 활성화를 통해 작용하며, 이어서 항-종양 활성을 발휘한다.
이미퀴모드 적용은 일반적으로 병원체 인식에 관여하는 톨-유사 수용체 7(TLR7) 시그널링을 활성화시킨다. 중요하게는, NMSC에서 이미퀴모드 활성을 위한 표적 세포로서 표피 케라틴세포는 TLR 계열의 여러 구성원을 항시적으로 발현시킨다. 그러나, TLR7 발현은 부재하거나 단지 매우 드물게 검출가능하다. 따라서, 케라틴세포에 대한 이미퀴모드의 직접 효과는 다소 가능성이 낮다.
이에 반해서, 이미퀴모드의 간접적인 항-종양-기능에 대한 설득력 있는 증거가 존재한다: 이미퀴모드는 TLR-7을 통해 선천성 면역 세포를 활성화시키며, 이는 특히 사이토킨, 주로 인터페론-α (IFNa), 인터루킨-6(IL-6) 및 종양 괴사 인자-α (TNF-α)의 과도한 분비 및 피부 적용 측면에의 플라스마사이토이드 수지상 세포(pDC)의 빠른 모집으로 이어진다. 이미퀴모드는 pDC 성숙 및 이들의 세포질 킬러 세포로의 전환을 유도하며, 이는 후천성 면역계와 독립적으로 종양을 제거할 수 있다. 이미퀴모드에 의해 활성화된 다른 세포 유형은 자연 킬러 세포 및 대식세포를 포함한다. 또한, 피부에 국소적으로 적용될 경우, 이미퀴모드는 랑게르한스 세포의 활성화를 일으키며, 이는 후속적으로 국소 림프절로 이동하여 B-림프구를 포함하는 후천성 면역계를 활성화시킨다는 설득력 있는 증거가 존재한다.
NMSC, BCC, SCC 및 특히 AK에서 비정상적인 세포에 대한 이미퀴모드의 미약한 간접 효과 또는 플루오로우라실, 인게놀 메부테이트 및 PDT의 미약한 직접 효과에 반해, IVT mRNA 매개된 IFNa 단백질 발현은 발병된 세포에 대한 특이적인 직접 및 간접 효과를 발휘하는 중이다(예를 들어, 성공적으로 형질감염되어 IFNa를 발현하는 케라틴세포). IFNa는 IFN 자극된 유전자(ISG)로 불리는 유전자 서브셋의 유도로부터 발생하는 종양 세포의 아폽토시스, 증식 또는 세포 분화에 직접적으로 영향을 끼치는 것으로 공지되어 있다. 항혈관신생, 면역조절 및 세포 주기 억제 효과에 관련된 ISG 이외에, 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 연구는 아폽토틱 기능을 갖는 ISG를 식별하였다. 이들은 TNF-α 관련된 아폽토시스 유도 리간드(TRAIL/Apo2L), Fas/FasL, XIAP 관련 인자-1(XAF-1), 카스파제-4, 카스파제-8, dsRNA 활성화된 단백질 키나제(PKR), 2'5'A 올리고아데닐화 합성효소(OAS), 치사 활성화 단백질 키나제(DAP 키나제), 포스포리피드 스크램블라제, 갈렉틴 9, IFN 조절 인자(IRF), 전골수구 백혈병 유전자(PML) 및 IFN 유도된 치사의 조절인자(RID)를 포함한다. 물론, IFNa는 또한, 면역 조절인자에 의해 발휘되는 바와 같이 간접적 항종양 활성을 이용할 것인데, 이는 현재 이미퀴모드의 항종양 활성 발휘와 관련된 주요 인자 중 하나를 구성하는 것으로 예상되기 때문이다.
따라서, IVT mRNA 기반 IFNa 발현은 여러 항-종양 전략(직접 및 간접)을 동시에 이용함으로써 NMSC, BCC, SCC 및 특히 AK 치료에 있어서 최근 최신의 것을 변화시킬 가능성을 보여주는 것이다. 특히 표적 세포에서 직접 IFNa 활성, 및 면역 조절인자를 사용하는 최근의 최신 접근법으로서 선천성 면역계의 세포의 활성화 및 후속의 항-종양 활성. 이렇게 함으로써, 효능을 향상시킬 수 있고/거나 치료법에 반응하는 환자의 서브셋을 확대시킬 수 있기 때문에 이러한 이중 전략이 치료의 전반적인 활동을 향상시킨다는 것을 쉽게 생각할 수 있다.
본 발명의 추가의 목적은 용이하게 가역적이며, 환자 몸체에 전체(즉, 치료로 인한 (부작용) 전신 결과)로서 심각한 영향을 끼치지 않는 방법을 제공하는 것이다. 게다가, 환자에 대해 일반적으로 수반되는 부담 없이 사이토킨 치료를 제공하고, 치료 효율, 반응율(responder rate) 및 환자 순응도를 증가시키는 것이 요구된다.
따라서, 상기 요약된 현재의 치료 옵션의 한계를 극복하기 위해, 본 발명은 비-흑색종 피부암(NMSC)의 예방 및 치료에 사용하기 위한 인터페론 알파(IFN-α) 메신저-RNA(mRNA)를 제공하며, 여기에서, mRNA는 5' CAP 영역, 5' 비번역 영역(5'-UTR), 코딩 영역, 3' 비번역 영역(3'-UTR) 및 폴리-아데노신 테일(폴리-A 테일)을 갖는다.
놀랍게도, (재조합) IFN-α 단백질의 투여와 관련된 것으로 공지된 과도한 결과 없이 NMSC로부터 고통받는 환자에게 IFN-α mRNA를 적용하는 것이 가능하였다. 본 발명은 일반적으로 IFN-α 치료와 연관된 전신 부작용 없이 NMSC 환자, 특히 광선 각화증(AK)으로 고통받는 환자의 피부 상에 또는 내에의 예를 들어, 국소 투여를 허용한다.
중요하게는, 본 발명은 재조합 분자 대신 전장 IFNa 전구체 분자를 사용한다: 예를 들어, 지금까지 임상 적용에 사용된 재조합 인간 IFNa2a는 박테리아로 제조된 기원의 165aa 길이의 단백질인 반면, 본 발명에 사용된 작제물은 형질감염된 세포에서 전체 인간 188aa 전구체 단백질을 생성한다. 이러한 전장 전구체는 165aa의 분비된 생물활성 단백질의 형성을 허용하도록 세포내 처리된다. 중요하게는, 박테리아 생성된 로페론 A와 같은 재조합 단백질과 대조적으로, 이러한 자연 처리된 단백질은 또한, 포유동물, 특히 인간에서 완전한 생물활성에 필요한 자연 발생 번역후 변형을 포함한다. 따라서, 재조합의 정제된 IFNa와 대조적으로, 본 발명에 제시된 바와 같은 IVT mRNA로부터 생성된 모든 단백질은 주요 전신 노출 없이 의도된 표적 장기에서 국소적으로 100% 생물활성을 갖는 것으로 예상된다.
이는 재조합 물질 중 단지 한 부분만이 생물활성이며, 높은 단백질 용량 및 주입 부피뿐만 아니라 적용 방식으로 인해, 또한 전신 활성인 재조합 IFNa와 대조적이다. 예를 들어, 로페론 A의 근육내 주입 후, 생체이용률은 80%보다 높다. 3천6백만 IU의 근육내 및 피하 투여 후, 피크 혈청 농도는 각각 3.8시간의 피크까지의 평균 시간에서 1,500 내지 2,580 pg/ml(평균: 2,020 pg/ml)의 범위이며, 7.3시간의 피크까지의 평균 시간에서 1,250 내지 2,320 pg/ml (평균: 1,730 pg/ml)의 범위이다(이스라엘 보건당국(MOH) 승인 처방 정보 2001년 12월). 흥미롭게도, 재조합 IFNa는 5.1h의 평균 제거 반감기를 갖는 볼루스 적용 후 빠르게 제거되며, 이는 환자에서 NMSC 치료에 필요한 빈번한 고용량의 적용에 대한 필요성을 설명한다.
본 발명으로, 당업계에 공지된 IFNa 단백질 치료법의 단점이 놀랍게도 극복되었다. 다른 한편으로, 단백질 투여를 추가로 개발시키는 대신에 (더욱 우수한 IFNa 단백질을 제공하고, 더욱 우수한 투여 경로를 개발하는 등에 의해) 본 발명은 NMSC 치료 방향에서의 유의한 변화를 제공한다: IFNa-mRNA 투여. IFNa-mRNA는 놀랍게도 재조합 IFNa에 대해 관찰된 부작용 대부분을 초래하지 않는다. 따라서, IFNa의 mRNA 포맷은 IFNa 단백질을 사용하는 종래 치료법에 비해 현저한 이점을 제공한다. 본 발명에 따르면, 예를 들어, 국소 및/또는 영역 유도 투여 후, IFNa mRNA는 표적 세포에 잔류하여, 볼루스 유사 적용 스케줄 및 과도 투여의 필요 없이 비정형 케라틴세포의 제거에 충분한 수준으로 수일 동안 국소적으로 발현될 것이다. 이는 본 발명의 실시예 부문에서 인상적으로 제시된다. 본 발명에 따른 IFNa 시험관내 전사된(IVT) mRNA는 주로 투여 방식, 즉, 국소 대 영역 유도된 방식에 따라 단일 및 다중 둘 모두의 AK 병변의 치료에 적합하다. 마찬가지로, 예를 들어, AK의 모든 3 단계(I-III 등급)는 본 발명에 따른 IFNa IVT mRNA로의 치료에 대한 표적이다.
본 발명은 또한, 생체내에서 IVT mRNA의 지속가능한 발현을 기반으로 하여 이상적으로는, 단일 적용으로 최소로 침습성인 효율적인 국소 또는 영역-유도 치료법으로서 IFNa IVT mRNA의 사용을 허용한다. 또한, 이러한 전략은 환자 순응도와 무관하게 하며, AK에 대한 최근의 치유 표준, 및 잠재적으로, SCC 및 BCC 각각의 직접 치료, 특히 30년 넘게 전에 제안된 IFNa 단백질로의 더 높은 반응율을 갖는 치료 효능을 증가시킴이 입증된다. AK 및 NMSC의 맥락에서 장기간 재발률 및 미용적 결과를 포함한 다른 변수는 고려할 가치가 있으며, 또한, 마찬가지로 현재 치유 표준 대비 우수하다.
본 발명에 사용되는 mRNA는, 모두 공지되어 있으며 당업자에게 이용가능한 (적어도) 5개의 필수 요소를 함유한다(5'에서 3'로 순서로): 5' CAP 영역, 5' 비번역 영역(5'-UTR), IFN-α에 대한 코딩 영역, 3' 비번역 영역(3'-UTR) 및 폴리-아데노신 테일(폴리-A 테일). 코딩 영역은 물론 (인간) IFN-α를 인코딩해야 하며, 다른 구성요소는 (천연) IFN-α UTR 또는 바람직하게는 다른 UTR일 수 있다. 본 발명에 따른 특히 바람직한 UTR은 본 발명에 따른 mRNA 분자의 특성을 개선시키는 즉, 투여 부위에서 IFN-α 단백질로의 mRNA의 더욱 우수하고/거나 길고/거나 더욱 효과적인 번역을 수행함으로써 본 발명에 따른 mRNA 분자의 특성을 개선시키는 UTR이다.
"CAP 영역"("5' CAP")은 mRNA 분자의 5' 말단에서 발견된 구조를 나타내며, 일반적으로 일반적이지 않은 5' 내지 5' 트리포스페이트 연결을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오티드로 구성된다. 이러한 구아노신 뉴클레오티드는 메틸 트랜스퍼라제에 의한 생체내 캡핑 직 후 7-위치에서 메틸화된다("7-메틸구아닐레이트 캡"("m7G"), "cap-0"). 추가의 변형은 mRNA의 5' 말단의 처음 2개의 리보스 당의 2' 하이드록시-기의 가능한 메틸화를 포함한다(즉, "CAP1" 및 "CAP2"): "CAP1"은 제1 리보스 당에 메틸화된 2'-하이드록시 기를 갖는 반면, "CAP2"는 제1의 2개 리보스 당에 메틸화된 2'-하이드록시 기를 갖는다. 5' 캡은 RNA 분자의 3' 말단과 화학적으로 유사하다(캡 리보스의 5' 탄소는 결합되며, 3'은 비결합됨). 이는 5' 엑소뉴클레아제에 대한 유의한 내성을 제공하며, 따라서, 또한, 생체내 안정성을 제공한다. 본 발명에 따른 mRNA의 생성에 있어서, 비제한적으로 하기를 포함하는 CAP 유사체가 또한 사용될 수 있다: 모노메틸화된 CAP 유사체(mCAP), 항-역 Cap 유사체(ARCA CAP), m7G(5')ppp(5')A RNA CAP 구조 유사체, G(5')ppp(5')A RNA CAP 구조 유사체, 및 G(5')ppp(5')G RNA CAP 구조 유사체.
용어 "(5'- 또는 3'-)UTR"은 분자 유전학에서 mRNA의 비번역 영역의 잘 확립된 개념을 나타낸다. mRNA 가닥의 코딩 서열의 각 측에 하나의 UTR이 존재한다. 5' 측의 UTR은 5'-UTR (또는 리더 서열)이며, 3' 측의 UTR은 3'-UTR (또는 꼬리 서열)이다. 5'-UTR은 코딩 서열로부터 업스트림이다. 5'-UTR 내에는 리보솜이 결합되게 하여 번역을 개시시키는 리보솜에 의해 인지되는 서열이 있다. 번역 개시 메카니즘은 원핵생물 및 진핵생물에서 상이하다. 3'-UTR은 번역 종료 코돈 바로 뒤에 발견된다. 3'-UTR은 번역 종료는 물론 전사후 유전자 발현에서 중요한 역할을 한다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 UTR은 일반적으로 본 발명에 따른 mRNA 분자에 대한 유익한 안정성 및 발현(번역) 특성을 전달하고 있다. 3'-UTR의 3' 말단은 또한, 핵 유출, 번역 및 mRNA의 안정성에 중요한 다중 아데노신 모노포스페이트의 트랙을 함유한다. 이러한 소위 폴리-아데노신(폴리-A) 테일은 적어도 60개의 아데노신 모노포스페이트, 바람직하게는 100개 및 가장 바람직하게는 120개 아데노신 모노포스페이트로 구성된다.
"폴리-A 테일"은 다중의 아데노신 모노포스페이트로 구성된다; 이는 단지 아데닌 염기만을 갖는 자연 발생 mRNA의 일부이다. "폴리아데닐화"로 불리는 이러한 과정은 유전자 발현 과정에서 번역을 위한 성숙한 메신저 RNA(mRNA)를 생성하는 과정의 일부이다. 폴리아데닐화의 자연적 과정은 유전자의 전사가 종료될 때 시작된다. 새로 만들어진 프리(pre)-mRNA의 가장 3'의 세그먼트는 단백질 세트에 의해 먼저 절단된다; 그 후, 이들 단백질은 RNA 3' 말단에서 폴리(A) 테일을 합성한다. 일부 유전자에서, 이들 단백질은 여러 가능한 부위 중 하나에서 폴리(A) 테일을 추가한다. 따라서, 폴리아데닐화는 선택적 스플라이싱과 유사하게, 단일 유전자로부터 하나 초과의 전사물을 생성할 수 있다(선택적 스플라이싱). 폴리(A) 테일은 핵 유출, 번역 및 mRNA의 안정성에 중요하다. 따라서, 본 발명에 있어서, 주로 번역 및 안정성 특성이 본 발명에 따른 mRNA 분자의 충분한 폴리아데닐화에 중요하다. 단백질 생성 동안, 테일은 시간 경과에 따라 짧아지며, 충분히 짧아진 경우, mRNA는 효소 분해된다. 본 발명에 따른 폴리-A 테일은 인간 치료법에서 mRNA 분자의 투여 기술에 현재 사용되고 적용되는 방식으로 제공된다. 예를 들어, 폴리-A 테일은 적어도 60개 아데노신 모노포스페이트 길이일 수 있다. 바람직한 구체예에 따르면, 폴리-A 테일은 적어도 100개 아데노신 모노포스페이트 길이, 특히 적어도 120개 아데노신 모노포스페이트이다. 이는 탁월한 안정성 및 단백질 생성을 허용한다; 그러나, 다른 특징과 마찬가지로, 본 발명에 따른 mRNA 분자의 작용 및 활성은 또한, 폴리-A 테일 특징에 의해 조절될 수 있다.
본 발명에 따른 mRNA 분자에 사용된 서열은 천연일 수 있거나 아닐 수 있다. 이는 IFN-α 코딩 영역뿐만 아니라 UTR에도 적용된다.
용어 "천연"은 이의 자연적 환경에서의 인간 IFN-α mRNA에 관한 것이다.
바람직하게는 서열은 천연이 아니며, mRNA 분자의 다양한 변수, 예컨대, 효능, 안정성, 전달성, 생산성, 번역 개시 및 번역을 증가시키기 위해 개선된다.
예를 들어, 천연 IFN-α 코딩 서열을 사용하는 대신에, GC-함량 또는 코돈 적응 지수(CAI)에 대해 최적화된 서열은 본 발명의 바람직한 구체예에 따라 사용될 수 있다(하기 참조).
이의 메카니즘으로 인해, 본 발명은 일반적으로 NMSC의 치료 및 예방을 목표로 한다; 그러나, 광선 각화증(AK), 기저 세포 암종(BCC) 및 편평 세포 암종(SCC), 특히 AK가 본 발명으로 다뤄지는 바람직한 징후이다. 본 발명은 환자에 대한 성공적인 임상 결과 및 적어도, 질환, 특히 AK의 유의한 개선을 수득하기 위해 매우 공들인 방식으로 강력한 분자(IFN-α 인코딩 mRNA)의 투여를 허용한다. AK의 경우, 질환 개선은 사전-규정된 영역, 전형적으로, 유사한 정도의 발암원(주로 UV 방사선)에 노출된 피부 영역에서 병변의 수를 평가함으로써 측정된다. 병변 계수는 처리 후, 전형적으로, 1 및 3개월 후 기준선 및 규정된 시점에서 이루어진다. 개별 병변의 반응은 시각적으로 그리고, 촉진에 의해 평가된다. 보고되는 변수는 기준선으로부터 평가까지 병변 수의 평균 감소, 규정된 영역 내의 모든 병변이 완전히 제거된 참가자 비율, 규정된 영역 내의 AK 병변 수가 적어도 75% 감소된 참가자 비율을 포함한다.
바람직한 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 IFN-α mRNA는 IFN-α 타입 1 mRNA (IFNa1), IFN-α 타입 2a mRNA (IFNa2a), 또는 IFN-α 타입 2b mRNA (IFNa2b)이다. 이러한 3개 타입은 본 발명이 추구하는 가장 간단한 IFN-α 실체이다.
본 발명의 주요 치료/예방 영역은 인간 의학이기 때문에, 물론 가장 바람직한 구체예는 mRNA로서, 코딩 영역이 인간 IFN-α, 특히 인간 IFNa1, 인간 IFNa2a, 또는 인간 IFNa2b를 인코딩하는 mRNA이다(IFN-α를 인코딩하는 본 발명의 실시예 부문에 기재된 다양한 SEQ ID NO에 의해 인코딩됨).
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 본 mRNA는 5'-UTR 및/또는 3'-UTR(바람직하게는 3' UTR)에서 mRNA의 반감기를 세포내에서 증가시킬 수 있는 하나 이상의 안정화 서열을 포함한다. 이러한 안정화 서열은 바이러스, 박테리아 및 진핵생물 세포에 존재하는 자연 발생 서열과 100% 서열 상동성을 나타낼 수 있으며, 그러나, 이는 또한 부분적으로 또는 완전히 합성될 수 있다. 이러한 안정화 서열의 예는 하기에 기술되어 있다: Nucleic Acids Res. 2010; 38 (Database issue): D75-D80. UTRdb and UTRsite (RELEASE 2010): a collection of sequences and regulatory motifs of the untranslated regions of eukaryotic mRNAs and under http://utrdb.ba.itb.cnr.it/.
본 발명에 사용될 수 있는 안정화 서열의 추가 예로서, 예를 들어, 호모 사피엔스(Homo sapiens) 또는 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis)의 β-글로빈 유전자의 비-번역된 서열(UTR)이 언급될 수 있다.
안정화 서열의 또 다른 예는 문헌 [Holcik et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 to 2414)]에 기술되어 있으며, 하기 일반식을 갖는다:
(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC (SEQ ID NO:38),
이는, 예를 들어, 알파(1)-콜라겐 또는 알파 글로빈, 및 ALOX15 또는 티로신 하이드록실라제를 코딩하는 매우 안정한 mRNA의 3' UTR에 함유된다(그리고, 여기에서 "x"는 (독립적으로, Nx 및 Pyx에서) 0 내지 10, 바람직하게는 0 내지 5(Holcik et al., 1997), 특히 0, 1, 2, 4 및/또는 5의 정수임).
이러한 안정화 서열은 개별적으로 사용될 수 있거나 본 발명의 mRNA를 안정화시키기 위해 서로 조합되어 사용될 수 있으며, 뿐만 아니라 당업자에게 공지된 다른 안정화 서열과 조합되어 사용될 수 있다. 예: 인간 β-글로빈 3'-UTR 서열의 안정화 효과는 헤드부터 꼬리 방향으로 배열된 2개의 인간 β-글로빈 3'-UTR을 사용함으로써 추가로 강화된다.
따라서, 본 발명에 따른 IFN-α mRNA의 바람직한 구체예는, 5'-UTR 또는 3'-UTR 또는 5'-UTR 및 3'-UTR이 천연 IFN-α mRNA와 상이하며, 바람직하게는 5'-UTR 또는 3'-UTR 또는 5'-UTR 및 3'-UTR은 적어도 하나의 안정화 서열, 바람직하게는 일반식 (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC (SEQ ID NO:38)을 갖는 안정화 서열을 함유하는, mRNA 분자이다.
바람직하게는 5'-UTR 및/또는 3'-UTR은 IFN-α 이외의 상이한 인간 mRNA의 5'-UTR 및/또는 3'-UTR이며, 이는 바람직하게는 알파 글로빈, 베타 글로빈, 알부민, 리폭시게나제, ALOX15, 알파(1) 콜라겐, 티로신 하이드록실라제, 리보솜 단백질 32L, 진핵세포 신장 인자 1a(EEF1A1), 오르토폭스바이러스에 존재하는 5'-UTR 요소 및 이들의 혼합물로부터 선택되며, 특히 알파 글로빈, 베타 글로빈, 알파(1) 콜라겐 및 이의 혼합물로부터 선택된다.
따라서, 본 발명은 바람직하게는 시토솔 중의 mRNA의 반감기를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 안정화 서열을 3'-UTR에서 포함하는 mRNA에 관한 것이다. 이러한 안정화 서열은 바이러스, 박테리아 및 진핵생물 세포에 존재하는 자연 발생 서열과 100% 서열 상동성을 나타낼 수 있으며, 그러나, 이는 또한 부분적으로 또는 완전히 합성될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 안정화 서열의 예로서, 예를 들어, 호모 사피엔스 또는 제노푸스 라에비스의 β-글로빈 유전자의 비-번역 서열(UTR)이 언급될 수 있다. 이미 언급된 바와 같이, 안정화 서열의 또 다른 예는 일반식 (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC를 가지며, 이는 알파-글로빈, 알파-(1)-콜라겐, 15-리폭시게나제 또는 티로신 하이드록실라제를 코딩하는 매우 안정한 mRNA의 3'-UTR에 함유된다(문헌 [Holcik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 to 2414] 참조). 이러한 안정화 서열은 개별적으로 사용될 수 있거나 본 발명의 변형된 mRNA를 안정화시키기 위해 서로 조합되어 사용될 수 있으며, 뿐만 아니라 당업자에게 공지된 다른 안정화 서열과 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예는 리보솜 단백질 32L로부터 유래된 5'-TOP-UTR에 이은, 알부민-3'-UTR로부터 유래된 안정화 서열이다.
따라서, 본 발명에 따른 IFN-α mRNA의 바람직한 구체예는 3'-UTR의 3' 말단에서 다중 아데노신 모노포스페이트의 트랙을 함유하는 mRNA 분자이다. 이러한 소위 폴리-아데노신(폴리-A) 테일은 적어도 60개의 아데노신 모노포스페이트, 바람직하게는 적어도 100개 및 가장 바람직하게는 적어도 120개 아데노신 모노포스페이트로 구성된다. 추가의 안정화 및 전이 효율적 mRNA는 예를 들어, WO 02/098443 A2 및 EP 3 112 469 A1에 기재된다.
특정 경우에, mRNA 탈안정화는 또한 단백질 생성 기간을 제한시키는데 바람직할 수 있다. 이러한 효과는 AU-풍부 요소와 같은 탈안정화 서열 요소(DSE)를 3'-UTR에 혼입시키고, 따라서, 신속한 mRNA 분해 및 짧은 기간의 단백질 발현을 보장함으로써 달성될 수 있다.
특정 구체예에 있어서, 3' 및/또는 5' UTR에서 탈안정화 서열 요소(DSE)가 없는 mRNA를 제공하는 것이 바람직할 수 있지만, 다른 구체예에서, 이러한 DSE의 존재 또는 도입이 유리할 수 있다. 일반적으로, "DSE"는 세포 및/또는 유기체, 예를 들어, 인간 환자 내부에서 전사물의 반감기, 예를 들어, 본 발명에 따른 mRNA의 반감기를 감소시키는 서열을 나타낸다. 따라서, DSE는 RNA 전사물의 세포내 반감기를 감소시키는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
DSE 서열은 짧은 수명 mRNA, 예를 들어, 하기에서 발견된다: c-fos, c-jun, c-myc, GM-CSF, IL-3, TNF-알파, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, 유로키나제, bcl-2, SGL T1 (Na(+)-결합된 글루코스 수송인자), Cox-2(사이클로옥시게나제 2), PAI-2(플라스미노겐 활성인자 억제제 타입 2), 베타(1)-아드레날린 수용체 또는 GAP43 (5'-UTR 및 3'-UTR).
추가의 DSE는 노나머 UUAUUUA(U/A)(U/A)(여기에서, U/A는 A 또는 U임) 및/또는 펜타머 AUUUA 및/또는 테트라머 AUUU의 단일, 탠덤 또는 다중 또는 중복 복사체를 포함하는 AU-풍부 요소(ARE) 및/또는 U-풍부 요소(URE)이다. 추가의 DSE는 하기에 기술되어 있다: Nucleic Acids Res. 2010; 38 (Database issue): D75-D80. UTRdb and UTRsite (RELEASE 2010): a collection of sequences and regulatory motifs of the untranslated regions of eukaryotic mRNAs and under http://utrdb.ba.itb.cnr.it/.
따라서, 5'-UTR 또는 3'-UTR 또는 5'-UTR 및 3'-UTR은 적어도 하나의 탈안정화 서열 요소(DSE), 바람직하게는 AU-풍부 요소(ARE) 및/또는 U-풍부 요소(URE), 특히 노나머 UUAUUUA(U/A)(U/A)의 단일, 탠덤 또는 다중 또는 중복 복사체, 예컨대, 펜타머 AUUUA 및/또는 테트라머 AUUU(용어 "U/A"는 A 또는 U를 의미함)를 함유하는 것이 또한 바람직할 수 있다.
이러한 안정화 및 탈안정화 요소는 주어진 기간의 단백질 생성을 목적으로 하고, 본 발명의 치료를 특정 NMSC 타입, 질환의 특정 단계, 특정 환자군 또는 심지어 이러한 환자에서 특정 질환 상태의 특정 환자로 개별 맞춤화시키기 위해 조합되어 또는 단독으로 사용될 수 있다.
또한, IFNa를 인코딩하는 핵산이 치료학적 분야에 제안되었지만, 이러한 제안은 상당한 시간 전에 제안되었고, 대부분 DNA(RNA는 아니거나, 특히 mRNA는 아님)에 관한 것이며, 완전하게 상이한 분야 및 투여 모드에 관한 것이다. 게다가, IFNa-mRNA의 이러한 종래 기술 사용에 있어서 본 발명과 관련하여 드러난 이점은 관찰되지 않았다. IFNa 핵산을 포함하는 치료 요법은 주로 간 질환 및 바이러스 질환 예컨대, C형 간염에 사용되었다. WO 98/17801 A1은 방광내 간암 치료를 위한 약학적 조성물을 기재하고 있으며, 이에 의해 조성물은 간-특이적 프로모터 서열 및 IFNa-b 인코딩 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 포함한다. WO 2006/134195 A2에 기술된 상이한 접근법에서, IFNa DNA는 바이러스 질환 치료를 위한 IL-6 계열, Gpl30 계열 또는 ADN 서열과의 조합 요법으로서 투여된다. 유사하게는, WO 00/69913 A1에는 시그널 서열, 면역글로불린 Fc 영역 및 간염 치료를 위해 사용되는 IFNa를 포함하는 표적 단백질 서열을 포함하는 핵산 서열 또는 바이러스 발현 벡터에 대해 논의되어 있다.
피부과 질환과 관련하여, IFNa-DNA 치료는 첨형콘딜로마(음부 사마귀)로 고통받는 환자에 적용되었다. 한 접근법에서, 출원 WO/9000406 A1에는 첨형콘딜로마를 갖는 환자에서 재조합 인간 DNA IFN-2a 또는 2b의 병변내 주입과 함께 국소 포도필린 치료제 또는 이의 활성 성분의 조합이 기술되어 있다. WO/9004977 A2에서, 동일한 질환에 대한 조합 요법으로 액체 질소로의 저온수술 처리 후 재조합 인간 DNA IFN-2a 또는 2b의 병변내 주입이 기재되었다.
이전에 종양 질환, 자가면역, 감염성 및 알레르기 질환의 예방, 치료 및/또는 개선을 위한, 종양 항원을 인코딩하는 자유 mRNA와 조합된 양이온성 또는 다중양이온성 화합물과 복합된 애주번트 mRNA를 포함하는 면역자극 조성물의 용도가 WO 2010/037408 A1에 기술되었다. 이러한 접근법은 투여된 자유 mRNA의 관심 단백질로의 효율적인 번역을 허용하는 반면, 애주번트 구성요소와 복합된 mRNA는 면역 반응을 유도한다. WO 99/47678 A2는 암 치료를 위한 IFN-α 플라스미드의 용도를 기재하고 있다. 생체내 적용을 위해 핵산을 안정화시키기 위한 또 다른 접근법은 Kunitz 도메인인 프로테아제 억제제의 첨가와 같은 핵산 서열의 변형이다(WO 2009/030464 A2).
희귀 피부과 질환의 치료를 위한 RNA-기반 치료법, 및 AK를 포함하는 의학적 피부과학 및 미용 의학에 사용하기 위한 치료가 제안되었다: WO 2015/117021 A1은 AK의 치료를 위한 하나 이상의 비-정준(non-canonial) 뉴클레오티드로 구성된 RNA를 포함하여, 핵산이 피부-특이적 구조 또는 성장 인자 단백질 군의 관심 단백질 또는 유전자-편집 단백질 표적을 인코딩하는, 약학적 조성물의 용도를 기재하고 있다. 유사하게는, WO 2016/131052 A1에는 광선 각화증을 포함하는 외피계의 질환을 치료하기 위한 인터루킨계 단백질, LIF, FGF 성장 인자, SERPINB1, 카스파제-1 또는 BMP를 인코딩하는 비-정준 뉴클레오티드를 포함하는 RNA의 투여가 논의된다. 두 특허 출원 모두에서, 합성 RNA를 포함하는 약학적 조성물의 투여는 피하, 피내, 진피 또는 근육내 주입은 물론 국소 주입과 같은 다중 방식으로 발생할 수 있다.
그러나, 사이토킨, 예컨대, 인터페론, 특히 IFNa는 이러한 상황에 적용할 것으로 제안되지 않았다.
개선된 mRNA-기반 치료제에 대한 일반적인 개념(예를 들어, 문헌 [Sahin et al., Nat. Rev. Drug Disc. 2014. 13(10): 759-780]참조)이 또한, 본 발명에 적용가능하다.
예를 들어, 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 IFN-α mRNA는 시티딘(C), 우리딘(U), 아데노신(A) 또는 구아노신(G) 잔기 이외의 다른 잔기를 함유할 수 있다. 이들 뉴클레오시드의 현저한 수의 자연 발생 유사체 및 또한 (심지어 더 많은) 이러한 mRNA의 합성 변이체가 존재한다. 이러한 변이체의 바람직한 구체예는 예를 들어, WO 2014/153052 A2 및 WO 2015/062738 A1에서 찾아볼 수 있다.
바람직한 구체예에 따르면, 본 IFN-α mRNA에서,
- 모든 시티딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 5-메틸-시티딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 시티딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 2-아미노-2-데옥시-시티딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 시티딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 2-플루오로-2-데옥시-시티딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 시티딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 2-티오-시티딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 시티딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 5-아이오도-시티딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 우리딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 슈도-우리딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 우리딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 1-메틸-슈도-우리딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 우리딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 2-티오-우리딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 우리딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 5-메틸-우리딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 아데노신 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 N6-메틸-아데노신 잔기에 의해 대체된다.
특히 바람직한 구체예는 IFN-α mRNA에서,
- 모든 시티딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 5-메틸-시티딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 우리딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 슈도-우리딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 우리딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 2-티오-우리딘 잔기에 의해 대체된, IFN-α mRNA이다.
본 발명 동안, mRNA 중 GC-함량( 또는 GC 대 AU 비율)이 추가로 증가될 경우 심지어 더욱 개선된 결과가 수득될 수 있음이 놀랍게도 발견되었다. 이것이 특히 놀라운 이유는, 천연 IFNa 서열이 번역/발현 효율과 관련하여 이미 최적인 것으로 간주되었다는 점이다. 그러나, 본 발명에 따른 IFN-α mRNA가 적어도 49.5% 또는 더욱 바람직하게는 적어도 49.6%(예를 들어, 적어도 49.7, 적어도 49.8, 적어도 49.9)의 GC 대 AU 비율로 설계되는 경우, 본 발명에 따른 성능은 추가로 증가된다. 따라서, GC 대 AU 비율은 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 55%, 특히 적어도 60%이다.
상기 기재된 뉴클레오시드 변이체와 관련하여, 상기 기술된 특히 바람직한 변이체는 GC 함량에 영향을 끼치지 않는 것이 중요하며, 즉, 변이체는 이러한 면에서 보존적임이 중요하다(예를 들어, GC 함량의 계산에 있어서 시티딘 변이체는 시티딘으로서 여전히 계수된다).
본 발명 동안 드러난 또 다른 놀라운 관찰 결과는, 증가된 코돈 적응 지수(CAI)를 갖는 IFNa-mRNA가 또한, 본 발명에서, 특히 세포 내의 발현 용량과 관련하여 개선된 성능을 보여주었다는 점이다.
CAI는 고도로 발현되는 유전자의 코돈 사용에 대한 유전자의 코돈 사용의 상대적 적응성의 측정치이다. 각 코돈의 상대적 적응성(w)은 동일한 아미노산에 있어서 가장 풍부한 코돈의 사용에 대한 각 코돈의 사용 비율이다. CAI 지수는 이러한 상대적 적응성 값의 기하 평균으로서 정의된다. 비-동의의(non-synonymous) 코돈 및 종료 코돈(유전자 코드에 따라)은 배제된다. CAI 값은 0 내지 1의 범위이며, 더 높은 값은 가장 풍부한 코돈의 더 높은 비율을 나타낸다(Sharp et al., Nucleic Acids Res. 15 (1987): 1281-1295., Jansen et al., Nucleic Acids Res. 31 (2003): 2242-2251).
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예는 IFN-α mRNA가 적어도 0.8, 바람직하게는 적어도 0.81, 적어도 0.82, 적어도 0.83, 적어도 0.84, 적어도 0.85, 적어도 0.86, 적어도 0.87, 적어도 0.88, 적어도 0.89의 코돈 적응 지수(CAI)를 갖는 IFN-α mRNA에 관한 것이다. 본 발명에 따른 mRNA의 심지어 더욱 바람직한 CAI는 적어도 0.9, 특히 적어도 0.91이다.
비교에 있어서: IFNa1의 천연 GC 대 AU 비율은 49.5%이며, IFNa2a의 비율은 48.7%이며, IFNa2b의 비율은 48.9%이며; IFNa1의 천연 CAI는 0.8이며, IFNa2a는 0.8이며, IFNa2b는 0.8이다.
더욱 더 바람직하게는 본 발명에 따른 mRNA는 적어도 0.8의 CAI 및 적어도 49.5%의 GC 함량(또는 더욱 더 바람직하게는 더 높은 CAI/GC 함량)을 갖는다.
IFNa2a에 있어서 본 발명에 따른 mRNA의 바람직한 컨센서스 서열은 SEQ ID NO:12, 13 및 14이며; 가장 바람직하게는 SEQ ID NO:12이다.
SEQ ID NO:12는 단지 GC 풍부 서열을 포함하며; SEQ ID NO:13이 또한 최적화되며, AU 풍부 서열을 포함하며; SEQ ID NO:14는 최적화된 서열이다.
따라서, 인간 IFNa2a를 인코딩하는 IFN-α mRNA의 코딩 영역은 바람직하게는 SEQ ID NO:12, 특히 SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11이며; 인간 IFNa2b를 인코딩하는 IFN-α mRNA의 코딩 영역은 바람직하게는 SEQ ID NO:26, 특히 SEQ ID NO: 19, 20, 22, 또는 25이며; 인간 IFNa1을 인코딩하는 IFN-α mRNA의 코딩 영역은 바람직하게는 SEQ ID NO:36이며, 특히 SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 34, 또는 35이다.
본 발명의 바람직한 구체예는 본 발명의 과정 내에서 개선된 성능을 보여주는 IFN-α mRNA로서, 특히,
- IFN-α mRNA가 0.8 이상의 CAI 및 48.7% 이상의 GC 함량을 갖는 분자;
- IFN-α mRNA가 0.8 내지 0.99, 바람직하게는 0.81 내지 0.97, 특히 0.83 내지 0.85의 CAI를 갖는 분자(예컨대, SEQ ID NO: 3);
- IFN-α mRNA가 48.7% 내지 63.7%, 바람직하게는 48.7% 내지 60%, 특히 48.7% 내지 58.0%의 GC 함량을 갖는 분자;
- IFN-α mRNA가 0.80 내지 0.97의 CAI 및 48.7% 내지 63.7%의 GC 함량을 갖는 분자;
- IFN-α mRNA가 0.6 내지 0.8의 CAI 및 48.7% 내지 65.0%의 AU 함량을 갖는 분자;
- IFN-α mRNA가 0.6 내지 0.8, 바람직하게는 0.6 내지 0.7, 특히 0.65 내지 0.75의 CAI를 갖는 분자(예컨대, SEQ ID NO: 4); 및
- IFN-α mRNA가 48.7% 내지 65.0%, 바람직하게는 51.3% 내지 60.0%의 AU 함량을 갖는 분자이다.
본 발명은 또한, 본 발명에 제공되는 mRNA 분자에 관한 것이다(천연 RNA 서열 및 IFN-α의 천연 코딩 영역을 포함하는 모든 mRNA 서열 배제).
바람직한 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 IFN-α mRNA는 피하, 피내, 경피, 표피, 또는 국소, 특히 표피 투여된다.
본 발명의 IFN-α mRNA의 투여는 적용된 mRNA의 양, mRNA 분자의 안정성 및 질환 상태에 따라 최적화된 발현 목적에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, IFN-α mRNA는 적어도 1회, 적어도 2회, 1개월에 적어도 2회, 바람직하게는 매주 투여될 수 있다. 예를 들어, IFN-α mRNA는 적어도 2회, 1개월에 적어도 2회, 바람직하게는 매주 투여될 수 있으며, 적용되는 용량은 달라질 수 있다.
용량 당 전달된 mRNA의 양은 또한, 분자의 안정성 등에 의존적으로 만들어질 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 IFN-α mRNA는 용량 당 0.001μg 내지 100 mg, 바람직하게는 용량 당 0.01μg 내지 100 mg, 더욱 바람직하게는 용량 당 0.1μg 내지 10mg, 특히 용량 당 1μg 내지 1mg의 양으로 투여된다.
mRNA 치료제에 적합한 제형은 당업계에 널리 이용가능하다(예를 들어, 문헌 [Sahin et al., 2014]; WO 2014/153052 A2 (문단 122 내지 136), 등등 참조).
따라서, 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 IFN-α mRNA를 포함하는 약학적 제형에 관한 것이다. 본 제형은 예를 들어, mRNA 치료제에 일반적으로 제공된 적합한 성분(부형제, 담체, 완충액, 보조 물질(예를 들어, 안정화제) 등)과 약학적으로 허용되는 환경에서 mRNA를 포함한다.
본 발명에 따른 mRNA 제형은 바람직하게는 적합한 담체를 함유한다. 적합한 담체는 폴리머 기반 담체, 예컨대, 선형 및 분지형 PEI 및 비로머를 포함하는 양이온 폴리머, 지질 나노입자 및 리포솜, 나노리포솜, 세라미드-함유 나노리포솜, 프로테오리포솜, 양이온 양친성 지질, 예를 들어: SAINT®-Lipids, 천연 및 합성적으로-유래된 엑소좀, 천연, 합성 및 반합성 층판소체, 나노미립자, 칼슘 포스포르-실리케이트 나노미립자, 칼슘 포스페이트 나노미립자, 실리콘 디옥사이드 나노미립자, 나노크리스탈린 미립자, 반도체 나노미립자, 건조 분말, 폴리(D-아르기닌), 나노덴드리머, 전분-기반 전달 시스템, 미셀, 에멀젼, 졸-겔, 니오솜, 플라스미드, 바이러스, 칼슘 포스페이트 뉴클레오티드, 압타머, 펩티드, 펩티드 컨쥬게이트, 소분자 표적화 컨쥬게이트, 및 기타 바이러스 태그를 포함한다. 적합한 캐리어로서 바이오나노캡슐 및 기타 바이러스 캡시드 단백질 어셈블리의 사용이 또한 고려된다. (Hum. Gene Ther. 2008 Sep;19(9):887-95).
바람직한 담체는 선형 및 분지형 PEI 및 비로머, 지질 나노입자 및 리포솜, 트랜스퍼솜, 및 칼슘 포스페이트 나노미립자를 포함하는 나노미립자를 포함하는 양이온성 폴리머이다(즉, CaCl2로 침전된 후 투여된 네이키드 RNA).
본 발명의 바람직한 구체예는 비-복합된 mRNA, 즉, 적합한 수성 완충 용액, 바람직하게는 생리학적 글루코스 완충 수용액(생리학적) 중의 비-복합된 mRNA의 사용에 관한 것이다. 예를 들어, 1xHEPES 완충 용액; 1x포스페이트 완충 용액, Na-시트레이트 완충 용액; Na-아세테이트 완충 용액; 바람직하게는 글루코스를 가짐(예를 들어, 5% 글루코스); 생리적 용액이 바람직하게는 적용될 수 있다.
바람직하게는 본 발명은 리포솜, 특히 DOTAP, DOTMA, Dotap-DOPE, DOTAP-DSPE, Dotap-DSPE-PEG, Dotap-DOPE-PEG, Dotap-DSPE-PEG-Na-Cholate, Dotap-DOPE-PEG-Na-Cholate, 복합물로서 양이온 양친성 마크로분자(CAM)를 갖는 DOTAP 및 이들의 조합물을 기반으로 하는 리포솜에 적용된다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기를 포함하는, 본 발명에 따른 IFN-α mRNA를 환자에 투여하기 위한 키트에 관한 것이다:
- 본원에 정의된 바와 같은 IFN-α mRNA, 및
- 피부 전달 장치.
바람직하게는 피부 전달 장치는
- 바람직하게는 바늘 기반 주사 시스템, 및 바늘-비함유 주사 시스템으로 구성된 군으로부터 선택된 피내 전달 장치,
- 바람직하게는 경피 패치, 할로우 및 솔리드 마이크로니들 시스템, 미세구조 경피 시스템, 전기영동법 시스템, 및 이온이동법 시스템으로 구성된 군으로부터 선택된 경피 전달 장치, 또는
- 바람직하게는 바늘 비함유 주사 시스템, 레이저 기반 시스템, 특히 Erbium YAG 레이저 시스템, 및 유전자 총 시스템으로 구성된 군으로부터 선택되는 상피 전달 장치이다.
이들 투여 장치는 원칙적으로, 당업계에서 이용가능하다; 당업자에 있어서 본 발명에 따른 mRNA의 투여에 대한 적응은 쉽게 가능하다.
본 발명은 또한, NMSC, 바람직하게는 AK, BCC 및 SCC를 치료하고 예방하는 방법에 관한 것이며, 이 때 본 발명에 따른 mRNA는 이를 필요로 하는 환자에게 유효량으로 투여된다.
추가의 양태에 따르면, 본 발명은 또한, 곤지름 및 혈관 기형의 예방 또는 치료를 위한 본 발명에 따른 mRNA의 용도에 관한 것이다. 또한, 이들 양태에 있어서, 본 발명이 적합하다.
NMSC(특히: AK, BCC 및 SCC) 이외에, 다른 피부 질병/질환의 치료가 또한 본 발명의 대상일 수 있다. 이들 질병/질환은 비제한적으로, 혈관 종양 및/또는 기형 예컨대, 혈관종, 및 화염상 모반(불꽃모반, 파이어마크(firemark))을 포함한다.
표재 혈관종은 피부에서 더 높이 위치하며, 밝은 적색의 홍반성 내지 적자색 외형을 갖는다. 표재 병변은 편평하고 모세관 확장되며, 작고 다양한 분지의 모세 혈관의 반점 또는 패치로 구성될 수 있다. 이들은 또한, 피부로부터 올라와서 상승되어 있을 수 있어, 솟아오른 섬처럼 융합된 밟은 적색의 플라크 및 구진을 형성할 수 있다. 특정 위치, 예컨대, 후부 두피, 목 주름 및 사타구니/항문주위 영역에서의 표재 혈관종은 궤양 발생의 잠재적 위험이 있다. 궤양화된 혈관종은 검은색 가피의 구진 또는 플라크, 또는 고통스러운 진무름 또는 궤양으로서 나타날 수 있다. 궤양은 황색 가피, 드레나쥐(drainage), 통증 또는 냄새와 함께 나타날 수 있는 2차 박테리아 감염에 취약하다. 또한, 궤양은 특히 깊은 병변 또는 마찰 부위에서 출혈의 위험이 있다. 5개 초과의 다수의 표재 혈관종은 피부외 혈관종과 연합될 수 있으며, 가장 흔한 것은 간(간의) 혈관종이며, 초음파 검사가 필요하다.
심혈관종은 초기에는 종종 잘 규정되지 않은 푸르스름한 황반으로 나타내며, 이는 구진, 결절 또는 더 큰 종양으로 증식될 수 있다. 증식 병변은 종종 압축 가능하지만, 상당히 단단하다. 많은 심혈관종은 주요 심부 구성요소 또는 주변 정맥 융기 위에 몇 개의 분명한 가시적인 표재 모세혈관을 가질 수 있다. 심혈관종은 표재 혈관종보다 조금 늦게 발병하는 경향이 있으며, 마찬가지로 더 길고 더욱 나중의 증식 단계를 가질 수 있다. 심혈관종은 궤양이 거의 없지만, 이들의 위치, 크기 및 성장에 따라 문제를 일으킬 수 있다. 민감한 구조 근처의 심혈관종은 증식 단계 동안 연질의 주변 구조체, 예컨대, 외이도 및 눈꺼풀의 압축을 초래할 수 있다. 혼합 혈관종은 단순히 표재 혈관종과 심혈관종의 조합이며, 수개월 동안 눈에 띄지 않을 수 있다. 환자는 표재 혈관종, 심혈관종 또는 혼합 혈관종의 임의의 조합일 수 있다.
혈관종을 위한 치료 옵션은 의학 치료법(전신, 병변내 및 국소), 수술 및 레이저 치료법을 포함한다. 2008년 전에, 문제의 혈관종에 대한 치료의 주요 물질은 경구용 코르티코스테로이드이며, 이는 효과적이며, 베타-차단제 요법이 사용 금지되거나 내성이 불량한 환자에 대한 옵션으로 남아있다. 비-선택성 베타 차단제인 프로프라놀롤은 매우 내성이며, 혈관종의 치료에 효과적이라는 우연한 발견 후, 이러한 제제는 대량의 무작위 제어 시험으로 연구되었으며, 2014년 이러한 징후에 대해 미국 식품 의약국으로부터 승인을 받았다. 후속하여 프로프라놀롤은 이들 병변의 치료를 위한 일차 전신 의학 치료법이 되었다. 혈관종 치료에 효과적일 수 있는 다른 전신 치료법은 빈크리스틴, 인터페론- 및 항혈관생성 특성을 갖는 다른 제제를 포함한다. 투여를 위해 중앙 정맥 접근이 필요한 빈크리스틴은 전통적으로 화학요법제로서 사용되나, 혈관종 및 다른 소아 혈관 종양, 예컨대, 카포시형 혈관내피종 및 혈관모세포종에 대해 효능을 갖는 것으로 입증되었다. 피하 주입을 통해 제공된 인터페론-알파 2a 및 2b는 혈관종에 대한 효능을 나타냈으나(Wilson et al., Ophthalmology 2007; 114 (5): 1007-11), 처리된 소아의 20% 이하에서 경련성 양측마비를 발생시킬 수 있다(Barlow et al., J. Pediatr. 1998;132(3 pt 1):527-30; and Worle et al., Eur. J. Pediatr. 1999;158(4):344). 따라서, IFNa 제제는 혈관종에 대한 베타 차단제 치료법 시대에 거의 활용되지 않고 있다.
서열:
콘센서스 서열 SEQ ID NO:12, 13, 14, 26 및 36은 하기 IUPAC 명명법으로 제공된다:
IUPAC 명명법:
표 1: IFNa2a 변이체의 코돈 적응 지수 및 GC 함량(SEQ ID NO:1은 발현 표준이며; SEQ ID NO: 2, 3 및 5: 고(higher), SEQ ID NO: 4: 저(lower); 따라서, CAI ≥ 0.8 및 GC 함량 ≥ 49.5%를 갖는 것이 바람직함; 천연 서열 SEQ ID NO: 1, 18 및 28과 비교)
표 2: IFNa2b 변이체의 코돈 적응 지수 및 GC 함량(표 1에서와 같이 바람직한 CAI 및 GC가 또한 여기에 적용됨)
표 3: IFNa1 변이체의 코돈 적응 지수 및 GC 함량(표 1에서와 같이 바람직한 CAI 및 GC 또한 여기에 적용됨)
본 발명은 하기 실시예 및 도면에 의해 추가로 설명되나, 이에 제한되지 않는다.
도 1은 인간 BJ 세포의 형질감염 후 24-120h째에 IVT mRNA의 RT-PCR 기반 검출을 보여준다(24-120h: 형질감염 후 24-120h째에 취해진 샘플; 0μg: 세포를 TransIT 단독으로 처리하고, 형질감염 후 24h째에 수확하였다; H2O: cDNA를 함유하지 않는 음성 대조군; 양성 대조군: 세포 RNA 및 IVT mRNA 변이체로부터의 cDNA; 빈 세포: 형질감염되지 않은 BJ 섬유모세포).
도 2는 코돈 및 GC 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 인간 BJ 섬유모세포에서 증가된 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SEQ ID NO: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; TransIT: TransIT mRNA 형질감염 시약 단독; ctrl: 완충액 단독; A: 형질감염 후 24h째에 분석; B: 형질감염 후 72h째에 분석).
도 3은 코돈 및 AU 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 인간 BJ 섬유모세포에서 낮은 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; TransIT: TransIT mRNA 형질감염 시약 단독; ctrl: 완충액 단독; A: 형질감염 후 24h째에 분석; B: 형질감염 후 72h째에 분석).
도 4는 코돈 및 GC 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 돼지 피부 상피 시트에서 증가된 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; TransIT: TransIT mRNA 형질감염 시약 단독; ctrl: 완충액 단독; A: 형질감염 후 24h째에 분석; B: 형질감염 후 48h째에 분석).
도 5는 코돈 및 AU 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 돼지 피부 상피 시트에서 낮은 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; TransIT: TransIT mRNA 형질감염 시약 단독; ctrl: 완충액 단독; A: 형질감염 후 24h째에 분석; B: 형질감염 후 48h째에 분석).
도 6은 TransIT mRNA 형질감염 시약을 사용한 돼지 상피 시트의 EGFP mRNA 형질감염이 돼지 피부 상피 시트에서 eGFP 발현을 유도함을 보여준다(A: 리포솜 단독으로 형질감염된 돼지 피부; B: 0.5μg/ml eGFP IVTm RNA로 형질감염되고, TransIT에서 제형화된 돼지 피부; C: 1μg/ml eGFP IVTm RNA로 형질감염되고, TransIT에서 제형화된 돼지 피부).
도 7은 mRNA/리포솜 복합물을 사용한 돼지 상피 시트의 EGFP mRNA 형질감염이 돼지 피부 상피 시트에서 eGFP 발현을 유도함을 보여준다(A: 리포솜 단독으로 형질감염된 돼지 피부; B: 2μg/ml eGFP IVTm RNA로 형질감염되고, 리포솜에서 제형화된 돼지 피부; C: 10μg/ml eGFP IVTm RNA로 형질감염되고, 리포솜에서 제형화된 돼지 피부).
도 8은 LacZ IVT mRNA로의 형질감염 후 24h째에 돼지 피부 외식편에서 홀마운트 β-갈락토시다제(bGal) 활성의 검출을 보여준다(A: Rnase 억제제 없이 DOTAP-리포솜 단독으로 형질감염된 돼지 피부; B: 5μg LacZ IVTm RNA로 형질감염되고, Rnase 억제제 없이 DOTAP-리포솜에서 제형화된 돼지 피부; C: DOTAP-리포솜 단독+ Rnase 억제제로 형질전화된 돼지 피부; D: 5μg LacZ IVTm RNA로 형질감염되고, Rnase 억제제 없이 DOTAP-리포솜에서 제형화된 돼지 피부; 성공적인 형질감염은 각각 B 및 D의 둥글게 표시한 영역에서 강조된다).
도 9는 eGFP IVT mRNA로의 형질감염 후 24h째에 돼지 피부 외식편에서 eGFP 발현 검출을 보여준다(비처리: 비처리된 생검체; LNP ctrl: 돼지 피부 LNP 대조군 처리됨; eGFP-LNP: mRNA-지질-나노 입자로 형질감염된 돼지 피부(제시된 농도: 2.4μg eGFP mRNA/용량); eGFP 5μg 및 eGFP 10μg: 비-복합된 eGFP IVT-mRNA로 형질감염된 돼지 피부(제시된 농도: 5+10μg mRNA/용량); 완충액 단독으로 처리된 완충액 대조군 돼지 피부).
도 10은 쥣과동물 3T3 세포의 형질감염 후 24-120h째에 IVT mRNA의 검출을 보여준다(24-120h: 형질감염 후 24-120h째에 취해진 샘플; 0.1-1μg: 형질감염에 사용된 mRNA 용량; 0μg: 세포를 TransIT 단독으로 처리하고, 형질감염 후 24h째에 수확하였다; H2O: cDNA를 함유하지 않는 음성 대조군; ctr: 대조군/참조 유전자로서 쥣과동물 ACTB(muACTB)를 사용한 RT PCR 대조군).
도 11은 코돈 및 GC 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 쥣과동물 3T3 섬유모세포에서 증가된 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SEQ ID NO: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; TransIT: TransIT mRNA 형질감염 시약 단독; ctrl: 완충액 단독; A: 형질감염 후 96h째에 분석; B: 형질감염 후 120h째에 분석).
도 12는 코돈 및 AU 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 형질감염 후 24h째에 쥣과동물 3T3 섬유모세포에서 낮은 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; TransIT: TransIT mRNA 형질감염 시약 단독; ctrl: 완충액 단독).
도 13은 코돈 및 GC 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 형질감염 후 48h째에 돼지 피부 상피 시트에서 증가된 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; TransIT: TransIT mRNA 형질감염 시약 단독).
도 14는 U에 대해 슈도-U 및 C에 대해 5mC의 100% 대체를 갖는 IVT mRNA가 형질감염 후 24-72h째에 돼지 상피 시트에서 상이한 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SEQ ID NO: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; 시험관내 전사에 사용된 비-변형된 뉴클레오티드 단독; SEQ ID NO1_MN/SEQ ID NO:3_MN: U에 대해 슈도-U 및 C에 대해 5mC의 완전한 대체를 함유하는 mRNA).
도 15는 U에 대해 슈도-U 및 C에 대해 5mC의 100% 대체를 갖는 IVT mRNA가 형질감염 후 24-120h째에 인간 BJ 섬유모세포에서 상이한 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SEQ ID NO: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; 시험관내 전사에 사용된 단독의 비변형된 뉴클레오티드; SEQ ID NO1_MN/SEQ ID NO:3_MN:U에 대해 슈도-U 및 C에 대해 5mC의 완전한 대체를 함유하는 mRNA). A) IVT mRNA SEQ ID NO1 및 SEQ ID NO1_MN 비교; B) IVT mRNAs SEQ ID NO3및 SEQ ID NO3_MN 비교;
도 16은 코돈 및 GC 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 형질감염 후 24h 내지 72h째에 인간 BJ 세포에서 증가된 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열).
도 17은 코돈 및 GC 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 형질감염 후 24h 및 48h째에 돼지 피부 상피 시트에서 증가된 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; TransIT: TransIT mRNA 형질감염 시약 단독).
도 18은 통상적인 아가로스 겔 전기영동을 이용한 IVT mRNA 코팅된 골드 입자(1μg/μl IVT-mRNA로 로딩된 1.6μm 골드 마이크로담체)로의 로딩 대조군을 보여준다. 유사한 IVT mRNA 양이 골드 입자 상에 고정화되었다.
도 19는 코돈 및 GC 함량 최적화된 mRNA 변이체의 유전자총법 IVT mRNA 형질감염이 형질감염 후 24h째에 인간 피부로부터 증가된 인간 IFNa2a 단백질 분비를 유도함을 보여준다(SeqID: 각 IFNa2 mRNA 서열 코팅된 골드 입자; 형질감염되지 않은 피부로부터의 CTRL 배지; eGFP: eGFP 코팅된 골드 입자 처리된 피부로부터의 배지). 결과는 평균 +/- SEM으로서 제시된다; A) 5가지 인간 도너의 평균; B) 개별 도너 #1의 예(값: 3개 생검체로부터 풀링된 상청액); C) 개별 도너 #2의 예(값: 3개 생검체로부터 풀링된 상청액).
도 20은 코돈 및 GC 함량 최적화된 mRNA 변이체의 유전자총법 IVT mRNA 형질감염이 형질감염 후 24h째에 인간 피부에서 증가된 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: 각 IFNa2 mRNA 서열 코팅된 골드 입자; 형질감염되지 않은 피부로부터의 CTRL 배지; eGFP: eGFP 코팅된 골드 입자 처리된 피부로부터의 추출물). 결과는 평균 +/- SEM으로서 제시된다; A) 5가지 인간 도너의 평균; B) 개별 도너 #1의 예(3개 생검체로부터의 평균); C) 개별 도너 #2의 예(3개 생검체로부터의 평균).
도 21은 유전자총법 IVT mRNA 형질감염이 사용된 IVT mRNA에 의해 유도된 표피 단백질 발현을 유도함을 보여준다. eGFP 발현은 냉동절편에서 항 eGFP 면역조직화학에 의해 검출될 수 있다. (A, H, I, J, K, L) 형질감염되지 않은 대조군 생검체. (B, C, D, E, F, G) 1μg/μl eGFP-mRNA로 처리된 생검체.
도 22는 코돈 및 AU 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 형질감염 후 24h 및 48h째에 돼지 피부 상피 시트에서 증가된 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; TransIT: TransIT mRNA 형질감염 시약 단독).
도 23은 코돈 및 AU 함량 최적화된 mRNA 변이체의 유전자총법 IVT mRNA 형질감염이 형질감염 후 24h째에 인간 피부로부터 증가된 인간 IFNa2a 단백질 분비를 유도함을 보여준다(SeqID: 각 IFNa2 mRNA 서열 코팅된 골드 입자; 형질감염되지 않은 피부로부터의 CTRL 배지; eGFP: eGFP 코팅된 골드 입자 처리된 피부로부터의 배지). 결과는 평균 +/- SEM으로서 제시된다; A) 5가지 인간 도너의 평균; B) 개별 도너 #1의 예(값: 3개 생검체로부터 풀링된 상청액); C) 개별 도너 #2의 예(값: 3개 생검체로부터 풀링된 상청액)
도 24는 코돈 및 AU 함량 최적화된 mRNA 변이체의 유전자총법 IVT mRNA 형질감염이 형질감염 후 24h째에 인간 피부로부터 증가된 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: 각 IFNa2 mRNA 서열 코팅된 골드 입자; 형질감염되지 않은 피부로부터의 CTRL 추출물; eGFP: eGFP 코팅된 골드 입자 처리된 피부로부터의 추출물). 결과는 평균 +/- SEM으로서 제시된다; A) 5가지 인간 도너의 평균; B) 개별 도너 #1의 예(3개 생검체로부터의 평균); C) 개별 도너 #2의 예(3개 생검체로부터의 평균)
도 25는 양이온 폴리머에 복합된(0.03-0.1μg mRNA/형질감염) 또는 비복합된(0.1μg mRNA/형질감염) FLuc IVT mRNA로의 피내 주입 후 24h 및 48h째에 돼지 피부 생검체에서 반딧불이 루시퍼라제(FLuc) 발현의 검출을 보여준다. 형질감염되지 않은 돼지 피부는 대조군 A로서 사용되었다: 형질감염 후 24h째에 상대적 발광 유닛(RLU)의 검출; B: 형질감염 후 48h째에 RLU의 검출. 0.03μg FLuc_폴리머 및 0.1μg FLuc_폴리머… 형질감염 시약에 복합된 IVT mRNA; 0.1μg FLuc… 비-복합된 mRNA, 비처리… 형질감염되지 않은 피부
도 1은 인간 BJ 세포의 형질감염 후 24-120h째에 IVT mRNA의 RT-PCR 기반 검출을 보여준다(24-120h: 형질감염 후 24-120h째에 취해진 샘플; 0μg: 세포를 TransIT 단독으로 처리하고, 형질감염 후 24h째에 수확하였다; H2O: cDNA를 함유하지 않는 음성 대조군; 양성 대조군: 세포 RNA 및 IVT mRNA 변이체로부터의 cDNA; 빈 세포: 형질감염되지 않은 BJ 섬유모세포).
도 2는 코돈 및 GC 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 인간 BJ 섬유모세포에서 증가된 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SEQ ID NO: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; TransIT: TransIT mRNA 형질감염 시약 단독; ctrl: 완충액 단독; A: 형질감염 후 24h째에 분석; B: 형질감염 후 72h째에 분석).
도 3은 코돈 및 AU 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 인간 BJ 섬유모세포에서 낮은 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; TransIT: TransIT mRNA 형질감염 시약 단독; ctrl: 완충액 단독; A: 형질감염 후 24h째에 분석; B: 형질감염 후 72h째에 분석).
도 4는 코돈 및 GC 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 돼지 피부 상피 시트에서 증가된 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; TransIT: TransIT mRNA 형질감염 시약 단독; ctrl: 완충액 단독; A: 형질감염 후 24h째에 분석; B: 형질감염 후 48h째에 분석).
도 5는 코돈 및 AU 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 돼지 피부 상피 시트에서 낮은 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; TransIT: TransIT mRNA 형질감염 시약 단독; ctrl: 완충액 단독; A: 형질감염 후 24h째에 분석; B: 형질감염 후 48h째에 분석).
도 6은 TransIT mRNA 형질감염 시약을 사용한 돼지 상피 시트의 EGFP mRNA 형질감염이 돼지 피부 상피 시트에서 eGFP 발현을 유도함을 보여준다(A: 리포솜 단독으로 형질감염된 돼지 피부; B: 0.5μg/ml eGFP IVTm RNA로 형질감염되고, TransIT에서 제형화된 돼지 피부; C: 1μg/ml eGFP IVTm RNA로 형질감염되고, TransIT에서 제형화된 돼지 피부).
도 7은 mRNA/리포솜 복합물을 사용한 돼지 상피 시트의 EGFP mRNA 형질감염이 돼지 피부 상피 시트에서 eGFP 발현을 유도함을 보여준다(A: 리포솜 단독으로 형질감염된 돼지 피부; B: 2μg/ml eGFP IVTm RNA로 형질감염되고, 리포솜에서 제형화된 돼지 피부; C: 10μg/ml eGFP IVTm RNA로 형질감염되고, 리포솜에서 제형화된 돼지 피부).
도 8은 LacZ IVT mRNA로의 형질감염 후 24h째에 돼지 피부 외식편에서 홀마운트 β-갈락토시다제(bGal) 활성의 검출을 보여준다(A: Rnase 억제제 없이 DOTAP-리포솜 단독으로 형질감염된 돼지 피부; B: 5μg LacZ IVTm RNA로 형질감염되고, Rnase 억제제 없이 DOTAP-리포솜에서 제형화된 돼지 피부; C: DOTAP-리포솜 단독+ Rnase 억제제로 형질전화된 돼지 피부; D: 5μg LacZ IVTm RNA로 형질감염되고, Rnase 억제제 없이 DOTAP-리포솜에서 제형화된 돼지 피부; 성공적인 형질감염은 각각 B 및 D의 둥글게 표시한 영역에서 강조된다).
도 9는 eGFP IVT mRNA로의 형질감염 후 24h째에 돼지 피부 외식편에서 eGFP 발현 검출을 보여준다(비처리: 비처리된 생검체; LNP ctrl: 돼지 피부 LNP 대조군 처리됨; eGFP-LNP: mRNA-지질-나노 입자로 형질감염된 돼지 피부(제시된 농도: 2.4μg eGFP mRNA/용량); eGFP 5μg 및 eGFP 10μg: 비-복합된 eGFP IVT-mRNA로 형질감염된 돼지 피부(제시된 농도: 5+10μg mRNA/용량); 완충액 단독으로 처리된 완충액 대조군 돼지 피부).
도 10은 쥣과동물 3T3 세포의 형질감염 후 24-120h째에 IVT mRNA의 검출을 보여준다(24-120h: 형질감염 후 24-120h째에 취해진 샘플; 0.1-1μg: 형질감염에 사용된 mRNA 용량; 0μg: 세포를 TransIT 단독으로 처리하고, 형질감염 후 24h째에 수확하였다; H2O: cDNA를 함유하지 않는 음성 대조군; ctr: 대조군/참조 유전자로서 쥣과동물 ACTB(muACTB)를 사용한 RT PCR 대조군).
도 11은 코돈 및 GC 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 쥣과동물 3T3 섬유모세포에서 증가된 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SEQ ID NO: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; TransIT: TransIT mRNA 형질감염 시약 단독; ctrl: 완충액 단독; A: 형질감염 후 96h째에 분석; B: 형질감염 후 120h째에 분석).
도 12는 코돈 및 AU 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 형질감염 후 24h째에 쥣과동물 3T3 섬유모세포에서 낮은 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; TransIT: TransIT mRNA 형질감염 시약 단독; ctrl: 완충액 단독).
도 13은 코돈 및 GC 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 형질감염 후 48h째에 돼지 피부 상피 시트에서 증가된 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; TransIT: TransIT mRNA 형질감염 시약 단독).
도 14는 U에 대해 슈도-U 및 C에 대해 5mC의 100% 대체를 갖는 IVT mRNA가 형질감염 후 24-72h째에 돼지 상피 시트에서 상이한 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SEQ ID NO: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; 시험관내 전사에 사용된 비-변형된 뉴클레오티드 단독; SEQ ID NO1_MN/SEQ ID NO:3_MN: U에 대해 슈도-U 및 C에 대해 5mC의 완전한 대체를 함유하는 mRNA).
도 15는 U에 대해 슈도-U 및 C에 대해 5mC의 100% 대체를 갖는 IVT mRNA가 형질감염 후 24-120h째에 인간 BJ 섬유모세포에서 상이한 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SEQ ID NO: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; 시험관내 전사에 사용된 단독의 비변형된 뉴클레오티드; SEQ ID NO1_MN/SEQ ID NO:3_MN:U에 대해 슈도-U 및 C에 대해 5mC의 완전한 대체를 함유하는 mRNA). A) IVT mRNA SEQ ID NO1 및 SEQ ID NO1_MN 비교; B) IVT mRNAs SEQ ID NO3및 SEQ ID NO3_MN 비교;
도 16은 코돈 및 GC 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 형질감염 후 24h 내지 72h째에 인간 BJ 세포에서 증가된 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열).
도 17은 코돈 및 GC 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 형질감염 후 24h 및 48h째에 돼지 피부 상피 시트에서 증가된 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; TransIT: TransIT mRNA 형질감염 시약 단독).
도 18은 통상적인 아가로스 겔 전기영동을 이용한 IVT mRNA 코팅된 골드 입자(1μg/μl IVT-mRNA로 로딩된 1.6μm 골드 마이크로담체)로의 로딩 대조군을 보여준다. 유사한 IVT mRNA 양이 골드 입자 상에 고정화되었다.
도 19는 코돈 및 GC 함량 최적화된 mRNA 변이체의 유전자총법 IVT mRNA 형질감염이 형질감염 후 24h째에 인간 피부로부터 증가된 인간 IFNa2a 단백질 분비를 유도함을 보여준다(SeqID: 각 IFNa2 mRNA 서열 코팅된 골드 입자; 형질감염되지 않은 피부로부터의 CTRL 배지; eGFP: eGFP 코팅된 골드 입자 처리된 피부로부터의 배지). 결과는 평균 +/- SEM으로서 제시된다; A) 5가지 인간 도너의 평균; B) 개별 도너 #1의 예(값: 3개 생검체로부터 풀링된 상청액); C) 개별 도너 #2의 예(값: 3개 생검체로부터 풀링된 상청액).
도 20은 코돈 및 GC 함량 최적화된 mRNA 변이체의 유전자총법 IVT mRNA 형질감염이 형질감염 후 24h째에 인간 피부에서 증가된 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: 각 IFNa2 mRNA 서열 코팅된 골드 입자; 형질감염되지 않은 피부로부터의 CTRL 배지; eGFP: eGFP 코팅된 골드 입자 처리된 피부로부터의 추출물). 결과는 평균 +/- SEM으로서 제시된다; A) 5가지 인간 도너의 평균; B) 개별 도너 #1의 예(3개 생검체로부터의 평균); C) 개별 도너 #2의 예(3개 생검체로부터의 평균).
도 21은 유전자총법 IVT mRNA 형질감염이 사용된 IVT mRNA에 의해 유도된 표피 단백질 발현을 유도함을 보여준다. eGFP 발현은 냉동절편에서 항 eGFP 면역조직화학에 의해 검출될 수 있다. (A, H, I, J, K, L) 형질감염되지 않은 대조군 생검체. (B, C, D, E, F, G) 1μg/μl eGFP-mRNA로 처리된 생검체.
도 22는 코돈 및 AU 함량 최적화된 mRNA 변이체의 IVT mRNA 형질감염이 형질감염 후 24h 및 48h째에 돼지 피부 상피 시트에서 증가된 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: TransIT와 복합된 각 IFNa2 mRNA 서열; TransIT: TransIT mRNA 형질감염 시약 단독).
도 23은 코돈 및 AU 함량 최적화된 mRNA 변이체의 유전자총법 IVT mRNA 형질감염이 형질감염 후 24h째에 인간 피부로부터 증가된 인간 IFNa2a 단백질 분비를 유도함을 보여준다(SeqID: 각 IFNa2 mRNA 서열 코팅된 골드 입자; 형질감염되지 않은 피부로부터의 CTRL 배지; eGFP: eGFP 코팅된 골드 입자 처리된 피부로부터의 배지). 결과는 평균 +/- SEM으로서 제시된다; A) 5가지 인간 도너의 평균; B) 개별 도너 #1의 예(값: 3개 생검체로부터 풀링된 상청액); C) 개별 도너 #2의 예(값: 3개 생검체로부터 풀링된 상청액)
도 24는 코돈 및 AU 함량 최적화된 mRNA 변이체의 유전자총법 IVT mRNA 형질감염이 형질감염 후 24h째에 인간 피부로부터 증가된 인간 IFNa2a 단백질 발현을 유도함을 보여준다(SeqID: 각 IFNa2 mRNA 서열 코팅된 골드 입자; 형질감염되지 않은 피부로부터의 CTRL 추출물; eGFP: eGFP 코팅된 골드 입자 처리된 피부로부터의 추출물). 결과는 평균 +/- SEM으로서 제시된다; A) 5가지 인간 도너의 평균; B) 개별 도너 #1의 예(3개 생검체로부터의 평균); C) 개별 도너 #2의 예(3개 생검체로부터의 평균)
도 25는 양이온 폴리머에 복합된(0.03-0.1μg mRNA/형질감염) 또는 비복합된(0.1μg mRNA/형질감염) FLuc IVT mRNA로의 피내 주입 후 24h 및 48h째에 돼지 피부 생검체에서 반딧불이 루시퍼라제(FLuc) 발현의 검출을 보여준다. 형질감염되지 않은 돼지 피부는 대조군 A로서 사용되었다: 형질감염 후 24h째에 상대적 발광 유닛(RLU)의 검출; B: 형질감염 후 48h째에 RLU의 검출. 0.03μg FLuc_폴리머 및 0.1μg FLuc_폴리머… 형질감염 시약에 복합된 IVT mRNA; 0.1μg FLuc… 비-복합된 mRNA, 비처리… 형질감염되지 않은 피부
실시예
:
재료 및 방법:
쥣과동물
3T3
섬유모세포
및 인간
B.J
. 피부
섬유모세포의
형질감염
형질감염에 있어서, 쥣과동물 3T3 섬유모세포 및 인간 B.J. 피부 섬유모세포를 12-웰 플레이트에 4-6 x 104 세포/웰로 시딩하였다. 완전 EMEM 또는 DMEM 배지(Gibco, Thermo Fisher, USA)에서 24시간 인큐베이션 후, 배양 배지를 교체하였다. TransIT mRNA 형질감염 시제(Mirus Bio; 제조업체 지시에 따른 복합물 형성)와 복합시킨 IVT mRNA의 다양한 포뮬레이션을 제조하여 세포에 첨가하였다. 형질감염후 24시간째에, 배지를 완전 DMEM으로 교체하였다. 세포를 결과 평가때까지 매일 배지를 교체하면서 5일 이하 동안 표준 조건하에서 추가로 배양하였다.
온전한 돼지 피부
생검체의
분리 및 형질감염:
전체 두께의 돼지 피부 플랩(flap)을 돼지로부터 치사전후에 분리하고(샘플은 현재 국내 법규(즉, Tierversuchsgesetz 2012, TVG 2012)의 완전한 준수하에 수득하였음), Octenisept® 살균제(Schuelke + Mayr GmbH, Germany)를 사용하여 멸균시켰다.
온전한 돼지 피부의 형질감염은 IVT-mRNA 용액의 직접적인 피내 주입에 의해 수행하였다(1-10μg mRNA/용량). LacZ IVTmRNA(5-메틸시티딘, 슈도우리딘을 사용하여 완전하게 변형됨; Trilink Inc., USA)를 제조업자의 지시에 따라 (문헌 [Kariko et al.; Mol. Ther. 2012. 20(5): 948-53]에 따라 약간 변형시킴) TransIT®-mRNA 형질감염 키트(Mirus Bio™) 또는 DOTAP 기반 리포솜 제형(Sigma Aldrich, USA)을 이용하여 제형화시켰다. DOTAP 기반 제형은 5/1의 지질/RNA(μg/μg)의 비율을 이용하여 제조하였다. 또한, mRNA 복합물에 RNAse 억제제(5U/용량, RNasin, Promega, USA)를 추가로 보충하였다. 주입 부피는 20μl 내지 30μL 범위였다.
대안적으로, 온전한 돼지 피부의 형질감염은 eGFP IVT-mRNA 용액(0.5-25μg mRNA/용량)의 직접적 피내 주입에 의해 수행하였다. eGFP IVTmRNA (AMPTec, Germany)는 제조업자의 지시(카리코(Kariko et al., 2012)에 따라 약간 변형됨)에 따라 TransIT®-mRNA 형질감염 키트(Mirus Bio™), 또는 DOTAP 기반 리포솜 제형(Sigma Aldrich, USA), 또는 지질-나노-입자 제형(Polymun, Austria) 또는 SAINT 기반 리포솜 제형(Synvolux, Netherlands)을 이용하여 제형화시켰다. DOTAP 기반 리포솜 제형은 5/1의 지질/RNA의 비율(μg/μg)을 이용하여 제조하였다. SAINT 지질 기반 제형은 2.5-4/1의 지질/RNA의 비율(μg/μg)을 이용하여 제조하였다. 또한, 생리학적 완충액 중 비-복합화된 mRNA를 피내로 적용하였다. 주입 부피는 20μl 내지 30μL 범위였다.
주입 후, 주입된 영역(8mm, 직경)의 펀치 생검체를 취하고, 피하 지방을 제거하고, 생검체를 표피가 위로 향하게 하여 페트리스의 표준 완전 배양 배지에 옮겼다(5mL; GlutaMAX를 갖는 둘베코 개질된 이글 배지(DMEM), 10% FCS, 1X 페니실린-스트렙토마이신-훈기존 함유; Gibco. Life Technologies로부터 수득). 후속 배양을 24h 동안 37℃/5% CO2에서 수행하였다. 생검체의 수확은 일반적으로, 형질감염 후 24시간에 수행하였다.
돼지 상피 시트의 분리 및 형질감염
전체 두께의 돼지 피부 플랩을 돼지로부터 치사전후에 분리하고(샘플은 현재 국내 법규(즉, Tierversuchsgesetz 2012, TVG 2012)의 완전한 준수하에 수득하였음), Octenisept® 살균제(Schuelke + Mayr GmbH, Germany)를 사용하여 멸균시켰다. 펀치 생검체(6 또는 8 mm, 직경)를 전체 두께의 피부 플랩으로부터 취하고, 피하 지방을 제거하고, 생검체를 2 부분으로 잘랐다. 그 직 후, 절단 검사체를 5 mL 디스파제 II 분해액을 함유하는 9cm(직경) 페트리-디쉬에 표피가 위로 향하게 하여 옮겼다(약 2.5 Units/mL; 디스파제 II; Sigma Aldrich, USA). 후속 분해를 4℃에서 밤새 수행하였다. 디스파제 II 분해액을 1xDMEM (Gibco)로 디스파제 II 스톡액(50mM HEPES/150 mM NaCl 중의 10 mg/mL; pH-7.4)으로 1:2 희석하고, 1x 페니실린/스트렙토마이신을 첨가함으로써 제조하였다. 다음날 상피 시트를 포셉(forcep)을 사용하여 아래의 진피로부터 제거하고, 짧은 (5분) 세척 단계 동안 DMEM에 옮겼다. 후속하여, 시트를 완전 DMEM 배양 배지에 넣고, 형질감염이 24-웰 배양 플레이트에서 수행될 때까지 37℃/5% CO2(6 내지 8 시간)에서 인큐베이션하였다. 돼지 진피 시트의 형질감염은 IFNa에 대한 eGFP IVTmRNA(AmpTec, Germany) 또는 IVT mRNA 작제물(예를 들어, SEQ ID NO: 1-5 및 NO:53)을 사용하여 수행하였다. mRNA를 제조업체 지시에 따라 TransIT®-mRNA 형질감염 키트(Mirus Bio™) 또는 리포솜 제형(Polymun, Austria)을 사용하여 제형화시켰다. 리포솜 제형은 5/1의 지질/RNA(μg/μg)의 비율을 이용하여 제조하였다. 0.1μg 내지 10μg mRNA/mL DMEM 배지 및 표피 시트를 함유한 형질감염을 위한 모든 리포플렉스 용액을 1 내지 3일 배양하였다.
분석에 있어서, 조직 배양 상청액을 후속 ELISA 분석을 위해 수집하였다. RNA 및 단백질 추출을 위해 시트를 수확하고, qPCR 및 ELISA에 의해 각각 후속 분석하였다. 또한, eGFP 형질감염된 표피 시트는 또한, 원위치에서 eGFP를 검출하는 직접 형광 현미경 및 면역조직화학에 의해 eGFP 발현에 대해 분석하였다.
IVT
mRNA
제조물을 사용하여 형질감염된 세포의 RT-
PCR
분석
인간 B.J. 세포 및 쥣과동물 3T3 섬유모세포를 TransIT mRNA 형질감염 시약과 복합된 0.1 내지 1μg IFNa2 IVT mRNA를 사용하여 형질감염시켰다. 총 세포 RNA는 트리-시약(Thermo Fisher, USA, 제조업체 지시)을 사용하여 형질감염 후 상이한 시점에서 쥣과동물 및 인간 섬유모세포 또는 돼지 상피 시트로부터 분리하고, mRNA를 통상적인 RT-PCR에 의해 cDNA로 역전사하였다(Protoscript First Strand cDNA 합성 키트, New England Biolabs, 제조업체 지시에 따름). 그 후, cDNA 샘플을 통상적인 PCR 및 qPCR로 처리하였다. 사용된 프라이머는 Invitrogen으로부터 수득하였다.
IFNa2 변이체를 검출하는 PCR 분석은 Platinum Taq Polymerase (Invitrogen, USA) 및 IFNa2 변이체 특이적 프라이머(Invitrogen, USA)를 사용하여 상이한 IFNa2 변이체로 형질감염시킨 세포/시트로부터 수득된 cDNA로부터 수행하였다. 인간 RPL4 및 쥣과동물 ACTB(Eurofins Genomics)를 양성 대조군으로서 사용하였다. PCR 생성물은 통상적인 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 분석하였다.
표 4: PCR 프라이머
EG: Eurofins Genomics, IVG: Invitrogen
IVT
mRNA
유도된 인간
IFNa2
단백질의 분석
인간 B.J. 세포 및 돼지 상피 시트는 TransIT mRNA 형질감염 시약과 복합된 상이한 IFNa2 변이체에 대한 0.1-1μg IVT mRNA를 사용하여 형질감염시키고, 형질감염 후 120h 이하 동안 배양하였다. 형질감염된 세포 및 상피 시트로부터의 상청액을 형질감염 후 여러 시점에서 수득하였다. 유사하게는, 세포를 동일한 시점에서 수확하고, 단백질을 추출하였다. 단백질을 세포 추출 완충액을 사용하여 추출하였다(10mM HEPES, 10mM KCl, 0.1μM EDTA, 0.3% NP40 및 Roche Protease Inhibitor, 제조업체의 프로토콜에 따름). 인간 IFN-α (아형 2; IFNa2) ELISA 발생 키트(MABTECH AB, Sweden, 제조업체 지시에 따라)를 사용하여 상청액뿐만 아니라 세포 추출물에서 IFN-α 결정을 수행하고, Infinite 200 PRO 다중모드 판독기(Tecan AG, Switzerland)에서 측정치를 취하였다.
IVT
mRNA
유도된
eGFP
단백질의 분석
온전한 돼지 피부 외식편 및 돼지 상피 시트는 TransIT mRNA 형질감염 시약 또는 상이한 리포솜 담체와 복합되거나 복합되지 않은(생리학적 완충액 중 "네이키드") 0.1-10μg eGFP IVT mRNA를 사용하여 형질감염시키고, 형질감염 후 24h 동안 배양하였다. 샘플을 수확하고, 단백질을 세포 추출 완충액을 사용하여 추출하였다(10mM HEPES, 10mM KCl, 0.1μM EDTA, 0.3% NP40 및 Roche Protease Inhibitor, 제조업체의 프로토콜에 따름). eGFP 결정은 GFP 시험관내 SimpleStep ELISA® 키트(Abcam Plc., UK, 제조업체의 지시에 따름)를 사용하여 수행하였으며, 측정치는 Infinite 200 PRO 다중모드 판독기(Tecan AG, Switzerland)에서 취하였다.
돼지 조직에서 베타-
갈락토시다제
활성의 검출
생검체의 홀-마운트 베타-갈락토시다제(bGal) 염색은 37℃에서 24 또는 48h 동안 24웰 배양 플레이트에서 수행하였다. 양성 염색 대조군은 bGal 효소(1U 재조합 bGal 단백질/주입)를 돼지 피부에 피내 주입함으로써 생성시켰다. 염색 절차 시작 전에, 생검체를 실온에서 1시간 동안 4% 포름알데하이드 용액(PBS)에서 약간 고정시켰다. 고정 후, 샘플을 PBS(3x)로 세척하고, 후속하여 LacZ-세척 완충액(PBS에 용해된 2mM MgCl2, 0.01% Na-데옥시클로레이트 및 0.02% NP-40)으로 평형화시켰다. LacZ 완충액 중에서 평형화시킨 후, 샘플을 밤새 보관하였다(4℃). 후속하여, 샘플을 37℃에서 염색 용액에서 인큐베이션시키고, 색상 반응을 모니터링하였다. 염색 용액을 새로 제조하고(LacZ 완충액 중 5mM K4Fe(CN)6 및 5mM K3Fe(CN)6), 1 mg/mL 5-브로모-3-인돌릴 β-D-갈락토피라노시드 (Bluo-Gal)를 색 기질로서 첨가하였다. 염색을 48시간 동안 수행한 경우, 염색 용액을 24시간 후 교체하였다. 염색 부피는 일반적으로, 0.5 mL/웰이었다. 염색을 LacZ 세척 완충액 및 3x PBS로 세척함으로써 중단하였다. 후속하여, 샘플을 완충된 4% 포름알데하이드 용액에 밤새 고정시키고, 표준 조직학을 위해 추가로 처리하거나 후속 조직 분석을 위해 OCT에서 냉동시켰다.
온전한 인간 피부
생검체의
분리 및
유전자총법
형질감염:
완전 두께의 인간 피부 플랩을 표준 미적 및 재건 수술 절차로부터 수득하였으며(샘플은 현 국내 법률을 완전히 준수하여 수득함), Octenisept® 살균제(Schuelke + Mayr GmbH, Germany)를 사용하여 살균하였다.
유전자총법 mRNA 형질감염에 있어서, BioRad Helios 유전자 총 시스템을 사용하였다. 시스템에 IVT mRNA 코팅된 골드 입자를 로딩하였다(1μg/μl IVT-mRNA가 로딩된 1.6μm 골드 마이크로담체; Biorad; 제조업체의 프로토콜에 따름). 유전자총 형질감염은 인간 피부 외식편에 2.5cm의 간격을 두고 400 psi의 헬륨 가스 압력을 사용하여 수행하였다. 형질감염 후, 형질감염된 영역의 펀치 생검체(8mm, 직경)를 취하고, 피하 지방을 제거하고, 생검체를 표피가 위로 향하게 하여 페트리 디쉬에서 표준 완전 배양 배지에 옮겼다. 생검체를 24시간 동안 5% CO2에서 공기-액체 계면에서 αMEM + 10% pHPL 배지에서 유지시켰다. 생검체의 수확은 일반적으로, 형질감염 후 24시간째에 수행하였다.
인간 피부에서 원위치에서의
eGFP
단백질의 분석
유전자총법 형질감염에 있어서, 8mm 인간 피부 외식편에 2.5 cm 간격을 두고 400 psi의 헬륨 가스 압력을 이용하여 eGFP-mRNA 코팅된 골드 입자(1μg/μl eGFP-mRNA가 로딩된 1.6μm 골드 마이크로담체)가 로딩된 BioRad Helios Gene Gun System을 사용하였다. 외식편을 24시간 동안 5% CO2에서 공기-액체 계면에서 αMEM + 10% pHPL 배지에서 유지시켰다. 생검체를 4℃에서 밤새 4% 포름알데하이드에서 고정시키고, 10 μm 냉동절편을 수득하였다. GFP 항체(Anti-GFP; 닭 IgY)를 사용하고, Alexa Fluor 488-컨쥬게이션된 당나귀 항-닭 IgY 항체에 의해 검출하였다. 세포골격은 Alexa Fluor 568 Phalloidin을 사용하여 F-액틴을 염색함으로써 검출하고, 슬라이드는 대비염색을 위한 DAPI(4',6-디아미딘-2-페닐인돌)를 함유하는 Roti-mount Fluor Care DAPI에 탑재시켰다. 슬라이드를 Olympus Slidescanner VS-120-L 100-W 시스템에 의해 20x 배율로 스캐닝하였다. 기준자 (A,B) = 500μm; 기준자 (C-L) = 50μm
반딧불이
루시퍼라제
IVT
mRNA의
생체내
적용 및
IVT
mRNA
유도된
FLuc
단백질의 분석
모든 동물 실험은 돼지 대학 클리닉(University Clinic for Swine) (University of Veterinary Medicine Vienna)에서 배타적으로 수행하고, 돼지(잡종; Edelschwein x Pietrain)를 사용하여 Austrian Animal Experiments Act (TVG2012)로 수행하였다. 실험은 비엔나 수의과 대학 동물 실험 윤리위원회(the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the University of Veterinary Medicine Vienna)와 오스트리아 연방 교육 과학 연구부(the Austrian Federal Ministry of Education, Science and Research)에서 승인받았으며, 승인 번호: GZ 68.205/0192-WF/V/3b/2017로 수행하였다. 돼지는 실험 시작 시에 30kg 내지 50kg이었다. 계획된 주입 전날에, 모든 돼지의 측면은 가능한 한 피부 자극을 피하기 위해 조심스럽게 면도하였다. 주입 일에, 돼지를 마취하였다. 주입 전에 면도한 피부 영역은 따뜻한 물로 완전히 세척하고, 옥테니셉트(Octenisept)(Schuelke + Mayr GmbH, Germany)로 2회 멸균시켰다. 피내 주입에 있어서, 30μL를 인슐린 주사기를 사용하여 적용하였다(BD Micro-FineTM+). 주입 스팟은 적합한 마커(Securline® Laboratory Markers)로 뚜렷하게 표시하고, 주입 계획에 따라 라벨링하였다. 샘플 분석에 있어서, 돼지를 훈련된 인원에 의해 주입 후 24h 및 48h째에 깊은 마취(deep anaesthesia) 하에 안락사시켰다. 모든 주입 스폿을 함유하는 피부 플랩을 절제하고, 즉시 얼음 위에 놓았다. 라벨링된 영역으로부터의 돼지 피부 생검체를 10mm 펀치 생검체를 사용하여 수확하였다. 샘플을 백색 96 웰 플레이트(MicroWell™, Nunc)에서 100uL의 둘베코 개질된 이글 배지(DMEM), 고 글루코스(Gibco)에서 수집하였다. 샘플을 루시퍼라제 활성 측정을 지시하도록 처리하였다. 측정은 Firefly Luc One-Step Glow Assay Kit(Thermo Scientific, USA, 제조업체의 지시에 따름)를 사용하여 수행하고, Infinite 200 PRO 다중모드 판독기(Tecan AG, Switzerland)로 분석하였다.
실시예 1: 형질감염 후 24h-120h째에 인간 BJ 섬유모세포로부터 수득된 cDNA로부터의, IFNa2-변이체 특이적 PCR에 의한 다양한 IFNa2 변이체를 인코딩하는 mRNA의 검출.
IFNa2 mRNA 변이체가 연장된 기간에 걸쳐 인간 피부 섬유모세포에서 안정한지의 여부를 평가하기 위해, SEQ ID NO:1-5를 인코딩하는 상이한 mRNA를 사용하여 B.J. 세포를 형질감염시켰다. RNA를 다양한 시점(형질감염 후 24-120h)에서 분리하고, 형질감염된 세포에서 mRNA의 존재를 비-정량적 RT PCR에 의해 형질감염 후 120h까지 결정하였다.
결과: 도 1에 도시된 바와 같이, 모든 IFNa2 mRNA 변이체는 평가된 모든 시점에서 1μg mRNA/12 웰을 사용하여 형질감염 후 검출될 수 있으며, 이는 ≥120h 동안 인간 세포에서 코돈 최적화 또는 GC 함량에도 불구하고 mRNA 안정성을 보여준다.
도 1은 TransIT mRNA 형질감염 시약과 복합되거나 복합되지 않은 1μg mRNA를 사용하여 형질감염된 BJ 세포를 보여준다. 총 세포 RNA를 형질감염 후 다양한 시점에서 분리하고(24h-120h), mRNA를 통상적인 RT-PCR에 의해 cDNA로 역전사시켰다. 그 후, cDNA 샘플을 PCR 대조군으로부터 인간 RPL4(crt로서 제시됨) 및 형질감염된 IFNa2 mRNA의 검출을 위해 SEQ ID NO:1-5에 대해 프라이머를 사용하여 변이체 특이적 PCR로 처리하였다. 따라서, 제시된 바와 같은 모든 IFNa2a 변이체는 인간 세포에서 연장된 기간에 걸쳐 안정적이었다(mRNA는 또한 돼지 상피 시트에서 연장된 시간 동안 검출가능하였다). 이는 CAI 및 G+C 함량에 따라 IFNα의 상이한 발현/분비가 존재한다는 것과 같다.
실시예 2: 인간 IFNα IVT mRNA 변이체로의 형질감염 후 24h 및 72h째에 인간 BJ 섬유모세포의 세포 배양 상청액으로부터의, 단백질 ELISA에 의한 인간 IFNa2a 단백질 수준 평가.
인간 시스템에서 최적의 번역 효율을 위한 코돈 최적화(코돈 적응 지수, CAI에 의해 결정된 바와 같음) 및 IFNa2 mRNA 변이체의 코딩 서열(CDS)에서 GC 함량의 수반되는 증가가 인간 피부 섬유모세포에서 인간 IFNa2a 단백질의 발현을 변화시키는지의 여부를 평가하기 위해, BJ 섬유모세포를 다양한 IFNa2a mRNA 변이체로 형질감염시켰다. SEQ ID NO: 1, 2, 3 및 5를 인코딩하는 mRNA를 사용하여 BJ 세포를 형질감염시켰다. 후속하여, 형질감염된 세포로부터 인간 IFNa2a의 분비 수준을 형질감염 후 120h 이하 동안 결정하였다.
결과: 모든 4개의 IFNa2 mRNA 변이체가 평가된 모든 시점에서 1μg mRNA/웰을 사용하여 인간 IFNa2a 단백질의 높은 수준을 유도한다(도 2). 천연 인간 IFNa2a 및 3개의 변이체를 인코딩하는 IVT mRNA의 비교 분석은 mRNA의 CDS에서 G+C 함량(GC 함량 ≥49.5%)의 증가 및 코돈 최적화(즉, CAI 수준 ≥0.8)의 예상치 못한 조합된 효과를 보여주었다. 도 2는 TransIT mRNA 형질감염 시약과 복합된 IVT mRNA(1μg mRNA/웰)를 사용하여 형질감염된 BJ 세포(4*104-5*104/웰)를 보여준다. 상청액(≤n=6/조건)을 수득하고, 인간 IFNa2 특이적 단백질 ELISA(MABTECH)로 처리하였다. 서술된 값은 ng/ml IFNa2a 단백질로서 측정된다.
(CAI≥0.8 및 GC 함량 ≥49.5%)의 임계값을 초과하는 이들 서열은 초기 및 후기 단계에서 IFNa2a의 현저하게 더 높은 발현 수준을 유도하며, 이는 발현의 수명(longevity) 및 진폭(amplitude)에서 wt, 천연 서열 대비 현저하게 높은 이점을 나타낸다.
실시예 3: 인간 IFNα IVT mRNA 변이체로의 형질감염 후 24h 및 72h째에 인간 BJ 섬유모세포의 세포 배양 상청액으로부터의, 단백질 ELISA에 의한 인간 IFNa2a 단백질 수준 평가.
이러한 실시예에서, IFNa2 mRNA 변이체의 코딩 서열(CDS)에서 더 낮은 CAI 수준(즉, CAI<0.8) 및 임계값(49.5%) 미만의 GC 함량에 대한 차별적인 코돈 최적화의 효과를 평가하였다. BJ 섬유모세포를 천연(SEQ ID NO:1)뿐만 아니라 상기 기술된 바와 같은 CAI<0.8 및/또는 GC 함량<49.5%(예를 들어, SEQ ID NO:4)을 나타내는 변이체로 형질감염시켰다. 후속하여, 형질감염된 세포로부터 인간 IFNa2a의 분비 수준을 형질감염 후 120h 이하 동안 결정하였다.
결과: 두 IFNa2 mRNA 변이체 모두가 평가된 모든 시점에서 1μg mRNA/12 웰을 사용하여 인간 IFNa2a 단백질의 높은 수준을 유도한다(도 3). 그럼에도 불구하고, 천연, 비-변형된 IFNa2a mRNA는 평가된 모든 시점에서 SeqID4 mRNA와 비교하여 IFNa2a 단백질의 더 높은 발현을 보여주었다. 도 3은 TransIT mRNA 형질감염 시약과 복합된 IVT mRNA(1μg mRNA/웰)를 사용하여 형질감염된 BJ 세포(50.000/웰)를 보여준다. 상청액(≤n=6/조건)을 수득하고, 인간 IFNa2 특이적 단백질 ELISA(MABTECH)로 처리하였다. 서술된 값은 ng/ml IFNa2a 단백질로서 측정된다.
따라서, 최적화를 겪었으나, (CAI≥0.8 및 GC 함량 ≥49.5%)의 임계값 미만인 서열은 인간 세포에서 IFNa2a를 유도하는데 있어서 덜 효율적이었다(발현의 수명 및 진폭).
실시예 4: 인간 IFNα IVT mRNA 변이체로의 형질감염 후 24h 및 48h째에 돼지 상피 시트의 세포 배양 상청액으로부터의, 단백질 ELISA에 의한 인간 IFNa2a 단백질 수준 평가.
인간 시스템에서 최적의 번역 효율을 위한 코돈 최적화(코돈 적응 지수, CAI에 의해 결정된 바와 같음) 및 IFNa2 mRNA 변이체의 코딩 서열(CDS)에서 GC 함량의 수반되는 증가가 돼지 피부에서 인간 IFNa2a 단백질의 발현을 변화시키는지의 여부를 평가하기 위해, 돼지 피부로부터 유래된 상피 시트는 다양한 IFNa2a mRNA 변이체로 형질감염시켰다. SEQ ID NO: 1, 2, 3 및 5를 인코딩하는 mRNA를 사용하여 상피 시트를 형질감염시켰다. TransIT 단독뿐만 아니라 eGFP mRNA에 복합된 TransIT를 대조군으로서 사용하였다. 후속하여, 형질감염된 조직으로부터 인간 IFNa2a의 분비 수준을 형질감염 후 72h 이하 동안 결정하였다.
결과: 모든 4개의 IFNa2 mRNA 변이체가 평가된 모든 시점에서 1μg mRNA/웰을 사용하여 인간 IFNa2a 단백질의 높은 수준을 유도한다(도 4, 추가 데이터에 있어서 또한 도 13 참조). 천연 인간 IFNa2a 및 3개의 변이체를 인코딩하는 IVT mRNA의 비교 분석은 mRNA의 CDS에서 G+C 함량(GC 함량 ≥49.5%) 및 코돈 최적화(즉, CAI 수준 ≥0.8)의 예상치 못한 조합된 효과의 증가를 보여주었다. 도 4는 TransIT mRNA 형질감염 시약과 복합된 IVT mRNA(1μg mRNA/웰)를 사용하여 형질감염된 돼지 상피 시트를 보여준다. 상청액(≤n=6/조건)을 수득하고, 인간 IFNa2 특이적 단백질 ELISA(MABTECH)로 처리하였다. 서술된 값은 ng/ml IFNa2a 단백질로서 측정된다.
(CAI≥0.8 및 GC 함량 ≥49.5%)의 임계값을 초과하는 이들 서열은 초기 및 후기 단계에서 IFNa2a의 현저하게 더 높은 발현 수준을 유도하며, 이는 온전한 돼지 조직에서 발현의 수명 및 진폭에서 wt, 천연 서열 대비 현저하게 높은 이점을 나타낸다.
실시예 5: 인간 IFNα IVT mRNA 변이체로의 형질감염 후 24h 및 48h째에 돼지 상피 시트의 세포 배양 상청액으로부터 단백질 ELISA에 의한 인간 IFNa2a 단백질 수준 평가.
이러한 실시예에서, IFNa2 mRNA 변이체의 코딩 서열(CDS)에서 더 낮은 CAI 수준(즉, CAI<0.8) 및 임계값(49.5%) 미만의 GC 함량에 대한 차별적인 코돈 최적화의 효과를 평가하였다. 돼지 상피 시트를 천연(SEQ ID NO:1)뿐만 아니라 상기 기술된 바와 같은 CAI<0.8 및/또는 GC 함량<49.5%(예를 들어, SEQ ID NO:4)을 나타내는 변이체로 형질감염시켰다. 또한, TransIT 단독뿐만 아니라 eGFP mRNA에 복합된 TransIT를 대조군으로서 사용하였다. 후속하여, 형질감염된 조직으로부터 인간 IFNa2a의 분비 수준을 형질감염 후 72h 이하 동안 결정하였다.
결과: IFNa2 mRNA 변이체 둘 모두는 평가된 모든 시점에서 1μg mRNA/웰을 사용하여 인간 IFNa2a 단백질의 높은 수준을 유도한다(도 5). 그럼에도 불구하고, 천연의 비-변형된 IFNa2a mRNA는 평가된 모든 시점에서 SeqID4 mRNA와 비교하여 IFNa2a 단백질의 더 높은 발현을 보여주었다. 도 5는 TransIT mRNA 형질감염 시약과 복합된 IVT mRNA(1μg mRNA/웰)를 사용하여 형질감염된 돼지 상피 시트를 보여준다. 상청액(≤n=6/조건)을 수득하고, 인간 IFNa2 특이적 단백질 ELISA(MABTECH)로 처리하였다. 서술된 값은 ng/ml IFNa2a 단백질로서 측정된다.
따라서, 최적화를 겪었으나, (CAI≥0.8 및 GC 함량 ≥49.5%)의 임계값 미만인 서열은 돼지 조직에서 IFNa2a를 유도하는데 있어서 덜 효율적이었다(발현의 수명 및 진폭).
실시예 6: TransIT mRNA 형질감염 시약을 사용하여 제형화된 eGFP IVT mRNA로의 형질감염 후 24h째에 돼지 상피 시트에서 eGFP의 검출.
본 실시예에서, eGFP 발현을 실시예 4+5 각각에서 수행된 실험의 형질감염 효능에 대한 양성 대조군으로서 시간 경과에 따라 모니터링하였다.
돼지 상피 시트를 상기 기술된 바와 같은 eGFP mRNA와 복합된 TransIT 및 TransIT로 형질감염시켰다. 또한, TransIT 및 eGFP mRNA(즉, 0.5μg mRNA/웰)의 제2 제형을 또한 투여 대조군으로서 포함시켰다. 후속하여, 형질감염된 조직에서 eGFP 단백질 발현은 직접 형광 현미경 관찰에 의해 모니터링하였다.
결과: eGFP 발현의 유사한 수준이 분석된 두 실시예 모두에서 검출가능하였으며, 이는 두 실험 모두에서 형질감염 효능의 상호유사성을 나타낸다(도 6). 중요하게는, eGFP 발현의 용량 의존적 효과 또한 본 실험에서 검출가능하였다.
도 6은 다양한 농도: 0.5 및 1μg mRNA/ml에서 사용된 TransIT에서 제형화된 eGFP mRNA를 보여준다. 형질감염 후 24h째에 천연 기관(organ) 샘플을 Vectashield DAPI-Hard 세트 매립 배지를 사용하여 Superfrost 플러스 유리 슬라이드 상에 탑재시키고, Zeiss AxioImage Z2 현미경과 Apotome 2를 사용하여 형광 검출을 지시하도록 처리하였다. 성공적인 형질감염은 리포솜 단독으로 처리된 시트와 비교하여 상피 시트에서 eGFP 양성 세포에 의해 각각 검출가능하였다.
실시예 7: 리포솜 형질감염 시약을 사용하여 제형화된 eGFP IVT mRNA로의 형질감염 후 24h째에 돼지 상피 시트에서 eGFP의 검출.
본 실시예에서, 대체 형질감염 제형에 의해 유도된 eGFP 발현을 시간 경과에 따라 모니터링하였다.
돼지 상피 시트를 상기 기술된 바와 같은 2개의 상이한 eGFP mRNA 농도(2μg/ml 및 10μg/ml mRNA)를 사용하여 리포솜 기반 제형으로 형질감염시켰다. 후속하여, 형질감염된 조직에서 eGFP 단백질 발현은 직접 형광 현미경 관찰에 의해 모니터링하였다.
결과: eGFP 발현은 본 실험에서 용량 의존적 방식으로 검출가능하였다(도 7 및 표 5). 전체적인 형질감염 효능은 실시예 4-6에서 각각 수득된 결과와 유사하였다.
표 5: 형질감염 후 24h째에 돼지 상피 시트에서 eGFP 발현
도 7은 2개의 농도: 2 및 10μg mRNA/ml로 사용된 리포솜에서 제형화된 eGFP mRNA를 보여준다. 형질감염 후 24h째에 천연 기관 샘플을 Vectashield DAPI-Hard 세트 매립 배지를 사용하여 Superfrost 플러스 유리 슬라이드 상에 탑재시키고, Zeiss AxioImage Z2 현미경과 Apotome 2를 사용하여 형광 검출을 지시하도록 처리하였다. 성공적인 형질감염은 리포솜 단독으로 처리된 시트와 비교하여 상피 시트에서 eGFP 양성 세포의 농도 의존성 증가에 의해 각각 검출가능하였다.
실시예 8: DOTAP 기반 리포솜 형질감염 시약을 사용하여 제형화된 LacZ IVT mRNA로의 형질감염 후 24h째에 돼지 피부 외식편에서 홀 마운트 β-갈락토시다제(bGal) 활성의 검출.
mRNA 변이체가 원위치에서 포유동물 피부를 형질감염시킬 수 있는지의 여부를 평가하기 위해, 돼지 피부로부터 수득된 펀치 생검체를 다양한 LacZ mRNA 제형으로 형질감염시켰다. 본 실시예에서, 피내 형질감에 의해 유도된 LacZ 발현을 형질감염 후 24h째에 홀 마운트 β-갈락토시다제 염색에 의해 모니터링하였다.
온전한 돼지 피부의 형질감염은 IVT-mRNA 용액의 직접적인 피내 주입에 의해 수행하였다(5μg mRNA/용량; +/- Rnase 억제제). mRNA는 DOTAP-리포솜을 사용하여 제형화하였다. 형질감염 후 24h째에 기관 샘플을 홀 마운트 β-갈락토시다제(bGal) 염색으로 처리하였다. 성공적인 형질감염은 원위치에서 BluoGal 염색에 의해 검출가능하다. 후속하여, 주입된 영역의 펀치 생검체(8mm, 직경)를 취하고, 피하 지방을 제거하고, 생검체를 24h 동안 배양하였다.
결과: LacZ 발현은 형질감염된 생검체에서 bGal 활성의 검출에 의해 가시화시켰다(도 8). LacZ mRNA(+/- RNAse 억제제)의 다양한 제형에 있어서 bGal 활성은 유사하였으며, 발현은 형질감염된 생검체의 상위 피부 구획에서 청색 염색에 의해 볼 수 있는 바와 같이 검출가능하였다.
실시예 9: 다양한 형질감염 시약 및 비-복합된 RNA를 사용하여 제형화된 eGFP IVT mRNA로의 형질감염 후 24h째에 돼지 피부 외식편에서 eGFP의 검출.
mRNA 변이체가 원위치에서 포유동물 피부를 형질감염시킬 수 있는지의 여부를 평가하기 위해, 돼지 피부로부터 수득된 펀치 생검체를 다양한 eGFP mRNa 제형으로 형질감염시켰다. 본 실시예에서, 피내 형질감염에 의해 유도된 eGFP 발현은 형질감염 후 24h째에 수득된 조직 추출물로부터 eGFP 단백질 ELISA에 의해 모니터링하였다. 이들 라인을 따라, eGFP mRNA의 다양한 제형을 생성시키고 주입하였다(상세한 사항에 있어서 표 6 참조).
표 6: i.d. 형질감염 후 24h째에 돼지 피부 생검체에서 eGFP 발현
사용된 제형은 하기를 포함하였다: 생리학적 완충액에서 제형화된 TransIT mRNA 형질감염 시약과 복합된 eGFP mRNA, DOTAP 기반 리포솜 제조물과 복합된 eGFP mRNA, SAINT 지질 기반 리포솜 제조물과 복합된 eGFP mRNA, 지질 나노 입자를 함유하는 eGFP mRNA 및 비-복합된 eGFP mRNA.
온전한 돼지 피부의 형질감염은 IVT-mRNA 용액의 직접적인 피내 주입에 의해 수행하였다(eGFP IVTm RNA (1-25μg mRNA/용량)). mRNA를 생리학적 완충액 중 TransIT mRNA 형질감염 시약, DOTAP 기반-리포솜, SAINT 지질 기반-리포솜, 지질 나노 입자 또는 비-복합된 mRNA를 사용하여 제형화시켰다. 후속하여, 주입된 영역의 펀치 생검체(8mm, 직경)를 취하고, 피하 지방을 제거하고, 생검체를 24h 동안 배양하고, 후속하여 eGFP 발현에 대해 분석하였다. 형질감염 후 24h째에 기관 샘플을 단백질 추출 및 후속 eGFP 단백질 ELISA로 처리하였다.
결과: eGFP 발현은 주입 수 24h째에 eGFP 단백질 ELISA에 의해 검출가능하였다. (도 9, 표 5). eGFP 리포플렉스(LNP 및 리포솜 복합물) 및 TransIT(표준으로서 사용함)는 유사한 농도 의존성 eGFP 유도를 보여주었다. 최적 발현은 2.4μg 내지 5μg mRNA/용량 사이에서 검출가능하였다. 비-복합된 mRNA는 또한 성공적인 형질감염을 보여주었다. 그러나, 이러한 실험 설정에 필요한 최소 농도는 돼지 진피에서 검출가능한 eGFP 발현을 유도하기 위해 5μg mRNA/용량이었으며, 이는 형질감염 시약의 부재하에 mRNA의 덜 효율적인 형질감염을 나타낸다.
실시예 10: 형질감염 후 24h-120h째에 쥣과동물 3T3 섬유모세포로부터 수득된 cDNA로부터의, IFNa2-변이체 특이적 PCR에 의한 다양한 IFNa2 변이체를 인코딩하는 mRNA의 검출.
IFNa2 mRNA 변이체가 연장된 기간에 걸쳐 쥣과동물 섬유모세포에서 안정한지의 여부를 평가하기 위해, SEQ ID NO:1-5를 인코딩하는 다양한 mRNA를 사용하여 3T3 세포를 형질감염시켰다. RNA를 다양한 시점(형질감염 후 24-120h)에서 분리하고, 형질감염된 세포에서 mRNA의 존재를 비-정량적 RT PCR에 의해 형질감염 후 120h까지 결정하였다.
결과: 도 10에 도시된 바와 같이, 모든 IFNa2 mRNA 변이체는 평가된 모든 시점에서 1μg mRNA/12 웰을 사용하여 형질감염 후 검출할 수 있으며, 이는 ≥120h 동안 인간 세포에서 코돈 최적화 또는 GC 함량에도 불구하고 mRNA 안정성을 보여준다.
도 10은 TransIT mRNA 형질감염 시약과 복합되거나 복합되지 않은 0.1-1μg mRNA를 사용하여 형질감염된 3T3 세포를 보여준다. 총 세포 RNA를 형질감염 후 다양한 시점에서 분리하고(24h-120h), mRNA를 통상적인 RT-PCR에 의해 cDNA로 역전사시켰다. 그 후, cDNA 샘플을 PCR 대조군으로부터 쥣과동물 ACTB(crt로서 제시됨) 및 형질감염된 IFNa2 mRNA의 검출을 위해 SEQ ID NO:1-5에 대한 프라이머를 사용하여 변이체 특이적 PCR로 처리하였다. 따라서, 제시된 바와 같은 모든 IFNa2a 변이체는 인간 세포에서 연장된 기간에 걸쳐 안정적이었다. 이는 CAI 및 G+C 함량에 따라 IFNα의 상이한 발현/분비가 존재한다는 것과 같다.
실시예 11: 인간 IFNα IVT mRNA 변이체로의 형질감염 후 96h 및 120h째에 쥣과동물 3T3 섬유모세포의 세포 배양 상청액으로부터의, 단백질 ELISA에 의한 인간 IFNa2a 단백질 수준 평가.
인간 시스템에서 최적의 번역 효율을 위한 코돈 최적화(코돈 적응 지수, CAI에 의해 결정된 바와 같음) 및 IFNa2 mRNA 변이체의 코딩 서열(CDS)에서 GC 함량의 수반되는 증가가 인간 피부 섬유모세포에서 인간 IFNa2a 단백질의 발현을 변화시키는지의 여부를 평가하기 위해, 3T3 섬유모세포를 다양한 IFNa2a mRNA 변이체로 형질감염시켰다. SEQ ID NO: 1, 2, 3 및 5를 인코딩하는 mRNA를 사용하여 3T3 세포를 형질감염시켰다. 후속하여, 형질감염된 세포로부터 인간 IFNa2a의 분비 수준을 형질감염 후 120h 이하 동안 결정하였다.
결과: 모든 4개의 IFNa2 mRNA 변이체가 평가된 모든 시점에서 1μg mRNA/웰을 사용하여 인간 IFNa2a 단백질의 높은 수준을 유도한다(도 11). 천연 인간 IFNa2a 및 3개의 변이체를 인코딩하는 IVT mRNA의 비교 분석은 코돈 최적화의 예상치 못한 조합된 효과(즉, CAI 수준 ≥0.8) 및 mRNA의 CDS에서 G+C 함량(GC 함량 ≥49.5%)의 증가를 보여주었다. 도 11은 TransIT mRNA 형질감염 시약과 복합된 IVT mRNA(1μg mRNA/웰)를 사용하여 형질감염된 3T3 세포(4*104-5*104/웰)를 보여준다. 상청액을 수득하고, 인간 IFNa2 특이적 단백질 ELISA(MABTECH)로 처리하였다. 서술된 값은 ng/ml IFNa2a 단백질로서 측정된다.
(CAI≥0.8 및 GC 함량 ≥49.5%)의 임계값을 초과하는 이들 서열은 초기 및 후기 단계에서 IFNa2a의 현저하게 더 높은 발현 수준을 유도하며, 이는 발현의 수명 및 진폭에서 wt, 천연 서열 대비 현저하게 높은 이점을 나타낸다.
실시예 12: 인간 IFNα IVT mRNA 변이체로의 형질감염 후 24h째에 쥣과동물 3T3 섬유모세포의 세포 배양 상청액으로부터의, 단백질 ELISA에 의한 인간 IFNa2a 단백질 수준 평가.
이러한 실시예에서, IFNa2 mRNA 변이체의 코딩 서열(CDS)에서 더 낮은 CAI 수준(즉, CAI<0.8) 및 임계값(49.5%) 미만의 GC 함량에 대한 차별적인 코돈 최적화의 효과를 평가하였다. 3T3 섬유모세포를 천연(SEQ ID NO:1)뿐만 아니라 상기 기술된 바와 같은 CAI<0.8 및/또는 GC 함량<49.5%(예를 들어, SEQ ID NO:4)을 나타내는 변이체로 형질감염시켰다. 후속하여, 형질감염된 세포로부터 인간 IFNa2a의 분비 수준을 형질감염 후 120h 이하 동안 결정하였다.
결과: 두 IFNa2 mRNA 변이체 모두는 평가된 모든 시점에서 1μg mRNA/12 웰을 사용하여 인간 IFNa2a 단백질의 높은 수준을 유도한다(도 12). 그럼에도 불구하고, 천연, 비-변형된 IFNa2a mRNA는 평가된 모든 시점에서 SeqID4 mRNA와 비교하여 IFNa2a 단백질의 더 높은 발현을 보여주었다. 도 12는 TransIT mRNA 형질감염 시약과 복합된 IVT mRNA(1μg mRNA/웰)를 사용하여 형질감염된 3T3 세포(40-50.000/웰)를 보여준다. 상청액을 수득하고, 인간 IFNa2 특이적 단백질 ELISA(MABTECH)로 처리하였다. 서술된 값은 ng/ml IFNa2a 단백질로서 측정된다.
따라서, 최적화를 겪었으나, (CAI≥0.8 및 GC 함량 ≥49.5%)의 임계값 미만인 서열은 인간 세포에서 IFNa2a를 유도하는데 있어서 덜 효율적이었다(발현의 수명 및 진폭).
실시예 13: 인간 IFNα IVT mRNA 변이체로의 형질감염 후 48h째에 돼지 상피 시트의 세포 추출물로부터의, 단백질 ELISA에 의한 인간 IFNa2a 단백질 수준 평가.
인간 시스템에서 최적의 번역 효율을 위한 코돈 최적화(코돈 적응 지수, CAI에 의해 결정된 바와 같음) 및 IFNa2 mRNA 변이체의 코딩 서열(CDS)에서 GC 함량의 수반되는 증가가 돼지 피부에서 인간 IFNa2a 단백질의 발현을 변화시키는지의 여부를 평가하기 위해, 돼지 피부로부터 유래된 상피 시트를 다양한 IFNa2a mRNA 변이체로 형질감염시켰다. SEQ ID NO: 1, 2, 3 및 5를 인코딩하는 mRNA를 사용하여 상피 시트를 형질감염시켰다. TransIT 단독은 대조군으로 사용되었다. 후속하여, 형질감염된 조직으로부터 인간 IFNa2a의 세포내 수준을 형질감염 후 72h 이하 동안 결정하였다.
결과: 모든 4개의 IFNa2 mRNA 변이체는 평가된 모든 시점에서 1μg mRNA/웰을 사용하여 인간 IFNa2a 단백질의 높은 수준을 유도한다(도 13은 형질감염 후 48h째에 예를 보여준다). 천연 인간 IFNa2a 및 3개의 변이체를 인코딩하는 IVT mRNA의 비교 분석은 mRNA의 CDS에서 G+C 함량(GC 함량 ≥49.5%) 및 코돈 최적화(즉, CAI 수준 ≥0.8)의 예상치 못한 조합된 효과의 증가를 보여주었다. 도 13은 TransIT mRNA 형질감염 시약과 복합된 IVT mRNA(1μg mRNA/웰)를 사용하여 형질감염된 돼지 상피 시트를 보여준다. 세포 추출물을 수득하고, 인간 IFNa2 특이적 단백질 ELISA(MABTECH)로 처리하였다. 묘사된 값은 ng 인간 IFNa2 단백질/mg 총 단백질로서 측정된다.
(CAI≥0.8 및 GC 함량 ≥49.5%)의 임계값을 초과하는 이들 서열은 초기 및 후기 단계에서 IFNa2a의 현저하게 더 높은 발현 수준을 유도하였으며, 이는 온전한 돼지 조직에서 발현의 수명 및 진폭에서 wt, 천연 서열 대비 현저하게 높은 이점을 나타낸다.
실시예 14: 인간 IFNa IVT mRNA 변이체로 형질감염 후 24h째에 돼지 상피 시트의 세포 배양 상청액으로부터의 단백질 ELISA에 의한 인간 IFNa2a 단백질의 수준 평가에 의한, SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:3 mRNA와 U에 있어서 슈도-U 및 C에 있어서 5mC로 100% 대체된 이들의 변이체의 비교.
본 실시예에서, IFNa2 mRNA 변이체의 발현 수준에 대한 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 슈도U 및 m5C)의 효과를 평가하였다. 돼지 상피 시트를 2가지 형태의 천연(SEQ ID NO: 1) IVT mRNA(U에 있어서 슈도-U 및 C에 있어서 5mC로 100% 대체된 하나의 형태 및 변형된 뉴클레오티드를 함유하지 않는 하나의 형태)뿐만 아니라 상기 기술된 바와 같이 CAI>0,8 및/또는 GC 함량 >49.5%를 나타내는 2가지 형태의 IFNa 변이체(SEQ ID NO:3)(예를 들어, U에 있어서 슈도-U 및 C에 있어서 5mC로 100% 대체된 SEQ ID NO:3의 하나의 변이체 형태 및 변형된 뉴클레오티드를 함유하지 않는 하나의 형태)로 형질감염시켰다. 또한, TransIT 단독뿐만 아니라 eGFP mRNA에 복합된 TransIT를 대조군으로서 사용하였다. 후속하여, 형질감염된 조직으로부터 인간 IFNa2a의 분비 수준을 형질감염 후 24h 동안 결정하였다.
결과: 도 14에 도시된 바와 같이, IFNa2 발현을 세포 상청액 중에 분비된 IFNa2a의 검출에 의해 가시화하였다.
(CAI≥0.8 및 GC 함량 ≥49.5%)의 임계값을 초과하는 이들 서열은 초기 및 후기 단계에서 IFNa2a의 현저하게 더 높은 발현 수준을 유도하며, 이는 온전한 돼지 조직에서 발현의 수명 및 진폭에서 wt, 천연 서열 대비 현저하게 높은 이점을 나타낸다.
실시예 15: 인간 IFNa IVT mRNA 변이체로 형질감염 후 24-120h째에 인간 BJ 섬유모세포의 세포 배양 상청액으로부터의 단백질 ELISA에 의한 인간 IFNa2a 단백질의 수준 평가에 의한, SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:3 mRNA와 U에 있어서 슈도-U 및 C에 있어서 5mC로 100% 대체된 이들의 변이체의 비교.
본 실시예에서, IFNa2 mRNA 변이체의 발현 수준에 대한 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 슈도U 및 5mC)의 효과를 평가하였다. 인간 BJ 섬유모세포를 2가지 형태의 천연(SEQ ID NO: 1) IVT mRNA(U에 있어서 슈도-U 및 C에 있어서 5mC로 100% 대체된 하나의 형태 및 변형된 뉴클레오티드를 함유하지 않는 하나의 형태)뿐만 아니라 상기 기술된 바와 같이 CAI>0,8 및/또는 GC 함량 >49.5%를 나타내는 2가지 형태의 IFNa 변이체(SEQ ID NO:3)(예를 들어, U에 있어서 슈도-U 및 C에 있어서 5mC로 100% 대체된 SEQ ID NO:3의 하나의 변이체 형태 및 변형된 뉴클레오티드를 함유하지 않는 하나의 형태)로 형질감염시켰다. 또한, TransIT 단독뿐만 아니라 eGFP mRNA에 복합된 TransIT를 대조군으로서 사용하였다. 후속하여, 형질감염된 세포로부터 인간 IFNa2a의 분비 수준을 형질감염 후 24-120h 동안 결정하였다.
결과: 도 15에 도시된 바와 같이, IFNa2 발현을 세포 상청액 중에 분비된 IFNa2a의 검출에 의해 가시화하였다.
(CAI≥0.8 및 GC 함량 ≥49.5%)의 임계값을 초과하는 이들 서열은 초기 및 후기 단계에서 IFNa2a의 현저하게 더 높은 발현 수준을 유도하며, 이는 온전한 돼지 조직에서 발현의 수명 및 진폭에서 wt, 천연 서열 대비 현저하게 높은 이점을 나타낸다.
실시예 16: 인간 IFNα IVT mRNA 변이체로의 형질감염 후 24h-120h째에 인간 BJ 섬유모세포의 세포 배양 상청액으로부터의 단백질 ELISA에 의한 인간 IFNa2a 단백질 수준 평가에 의한 Seq ID NO:1 및 SEQ ID NO:53의 비교.
본 실시예에서, IFNa2 mRNA 변이체의 코딩 서열(CDS)에서 UTR 변형 및 차별적 코돈 최적화의 효과를 평가하였다.
인간 BJ 섬유모세포를 완전 인간 IFNa(SEQ ID NO: 53)뿐만 아니라 천연 IFNa 코딩 서열을 함유하는 IVT mRNA(CDS; SEQ ID NO:1)로 형질감염시켰다. 또한, TransIT 단독뿐만 아니라 eGFP mRNA에 복합된 TransIT를 대조군(미도시됨)으로서 사용하였다. 후속하여, 형질감염된 조직으로부터 인간 IFNa2a의 분비 수준을 형질감염 후 120h 이하 동안 결정하였다.
결과: 모든 IFNa2 mRNA 변이체는 평가된 모든 시점에서 1μg mRNA/웰을 사용하여 인간 IFNa2a 단백질의 높은 수준을 유도한다(도 16). 그럼에도 불구하고, 전체 인간 IFNa (SEQ ID NO:53)는 평가된 모든 시점에서 SEQ ID NO: 1과 비교하여 IFNa2a 단백질의 더 낮을 발현을 보여주었다. 도 16은 TransIT mRNA 형질감염 시약과 복합된 IVT mRNA(1μg mRNA/웰)를 사용하여 형질감염된 인간 BJ 섬유모세포를 보여준다. 상청액을 수득하고, 인간 IFNa2 특이적 단백질 ELISA(MABTECH)로 처리하였다. 서술된 값은 ng/ml IFNa2a 단백질로서 측정된다.
따라서, UTR 및/또는 CDS 최적화를 겪은 서열은 전장 인간 IFNa mRNA보다 돼지 조직에서 IFNa2a를 유도하는데 더욱 효과적이었다(발현의 수명 및 진폭). SEQ ID NO:53과 비교하여 SEQ ID NO:1에 대한 증가 범위는 각각 형질감염 후 24h째에 6.2배이며; 형질감염후 48h째에 4.8배이며; 형질감염 후 72h째에 92.5배이다.
실시예 17: 인간 IFNα IVT mRNA 및 인간 IVT mRNA 변이체로의 형질감염 후 24h 및 48h째에 돼지 상피 시트의 세포 배양 상청액으로부터의, 단백질 ELISA에 의한 인간 IFNa2a 단백질 수준 평가.
본 실시예에서, IFNa2 mRNA 변이체의 코딩 서열(CDS)에서 UTR 변형 및 차별적 코돈 최적화의 효과를 평가하였다.
돼지 상피 시트를 전장 인간 IFNa(SEQ ID NO: 53)뿐만 아니라 천연 IFNa 코딩 서열을 함유하는 IVT mRNA(CDS; SEQ ID NO:1)는 물론 상기 기술된 바와 같은 CDS 변이체(SEQ ID NO: 3)로 형질감염시켰다. 또한, TransIT 단독뿐만 아니라 eGFP mRNA에 복합된 TransIT를 대조군으로서 사용하였다. 후속하여, 형질감염된 조직으로부터 인간 IFNa2a의 분비 수준을 형질감염 후 48h 이하 동안 결정하였다.
결과: 모든 IFNa2 mRNA 변이체는 평가된 모든 시점에서 1μg mRNA/웰을 사용하여 인간 IFNa2a 단백질의 높은 수준을 유도한다(도 17). 그럼에도 불구하고, 전체 인간 IFNa (SEQ ID NO:53)는 평가된 모든 시점에서 SEQ ID NO: 1-3과 비교하여 IFNa2a 단백질의 더 낮을 발현을 보여주었다. 도 17은 TransIT mRNA 형질감염 시약과 복합된 IVT mRNA(1μg mRNA/웰)를 사용하여 형질감염된 돼지 상피 시트를 보여준다. 상청액을 수득하고, 인간 IFNa2 특이적 단백질 ELISA(MABTECH)로 처리하였다. 서술된 값은 ng/ml IFNa2a 단백질로서 측정된다.
따라서, UTR 및/또는 CDS 최적화를 겪은 서열은 전장 인간 IFNa mRNA보다 돼지 조직에서 IFNa2a를 유도하는데 더욱 효과적이었다(발명의 수명 및 진폭). SEQ ID NO: 53과 비교하여 증가 정도는 각각 SEQ ID NO:1에 있어서 7.4배 및 SEQ ID NO:3에 있어서 8.6배이다.
실시예 18: 인간 IFNα mRNA 및 인간 IVT mRNA 변이체로의 형질감염 후 24h째에 유전자총법 형질감염된 인간 피부 생검체의 세포 배양 상청액 및 조직 추출물로부터의, 단백질 ELISA에 의한 인간 IFNa2a 단백질 수준 평가.
본 실시예에서, IFNa2 mRNA 변이체의 코딩 서열(CDS)에서 UTR 변형 및 차별적 코돈 최적화의 효과를 평가하였다. n=5 상이한 도너로부터의 인간 피부 생검체를 전장 인간 IFNa(SEQ ID NO:53), 뿐만 아니라 천연 IFNa 코딩 서열을 함유하는 IVT mRNA(CDS; SEQ ID NO:1) 또는 상기 기술된 바와 같은 CDS 변이체(SEQ ID NO: 2, 3, 5)로 Helios 유전자 총 시스템을 사용하여 유전자총법으로 형질감염시켰다. 형질감염되지 않은 피부뿐만 아니라 eGFP IVT mRNA로 형질감염된 피부를 대조군으로서 사용하였다. 후속적으로, 형질감염된 조직으로부터의 분비된 인간 IFNa2a의 수준 및 조직 중 IFNa2a의 수준을 형질감염 후 24h 이하 동안 결정하였다.
결과: 도 18은 사용된 mRNA와 관계없이 골드 입자의 코팅에서 유사한 효능을 보인다. 도 19는 IVT mRNA 입자를 사용하여 형질감염된 인간 피부 생검체로부터 분비된 IFNa2a를 보여준다. 상청액을 수득하고, 인간 IFNa2 특이적 단백질 ELISA(MABTECH)로 처리하였다. 서술된 값은 ng/ml IFNa2a 단백질로서 측정된다. 도 20은 IVT mRNA 입자를 사용하여 형질감염된 인간 피부 생검체로부터의 피부 조직에서 인간 IFNa2a 단백질의 수준을 보여준다. 세포 추출물을 수득하고, 인간 IFNa2 특이적 단백질 ELISA(MABTECH)로 처리하였다. 도 21은 유전자총법 eGFP 입자 형질감염을 이용한 표피 형질감염을 보여준다.
eGFP mRNA는 형질감염 후 인간 피부로부터 인간 IFNa2a의 매우 낮은 수준의 분비를 유도한다(157 pg/ml; SEQ ID NO: 53보다 12배 낮음(1873 pg/ml)). 사용된 모든 IFNa2 mRNA 변이체는 1μg mRNA/μl 로딩된 입자를 사용하여 높은 수준의 인간 IFNa2a 단백질 분비를 유도한다(도 18-20). 그럼에도 불구하고, 전장 인간 IFNa (SEQ ID NO:53)는 SEQ ID NO: 1-5와 비교하여 IFNa2a 단백질의 더 낮은 분비를 보여주었다. 따라서, UTR 및/또는 CDS 최적화를 겪은 서열은 전장 인간 IFNa mRNA보다 인간 조직에서 IFNa2a 분비를 유도하는데 더욱 효과적이었다(발현의 수명 및 진폭). 모두 5개 도너를 기재로 하는 SEQ ID NO:53과 비교하여 증가 정도는 본 실험에서 각각 SEQ ID NO:1에 있어서 10.9배; SEQ ID NO:2에 있어서 2.7배; SEQ ID NO: 3에 있어서 19.2배; 및 SEQ ID NO:5에 있어서 5.8배이다. 도 19에 제시된 바와 같은 개별 도너는 상기 언급된 교시 내용을 지지하는 다양한 진폭을 보여준다.
eGFP mRNA는 형질감염 후 인간 피부에서 매우 낮은 수준의 인간 IFNa2a를 유도한다(44 pg/mg 조직; SEQ ID NO: 53보다 26배 낮음(1150 pg/mg 조직)). 사용된 모든 IFNa2 mRNA 변이체는 1μg mRNA/μl 로딩된 입자를 사용하여 높은 수준의 인간 IFNa2a 단백질을 유도한다(도 18-20). 그럼에도 불구하고, 전장 인간 IFNa (SEQ ID NO:53)는 SEQ ID NO: 1-5와 비교하여 IFNa2a 단백질의 더 낮은 발현을 보여주었다. 따라서, UTR 및/또는 CDS 최적화를 겪은 서열은 전장 인간 IFNa mRNA보다 인간 조직에서 IFNa2a를 유도하는데 더욱 효과적이었다(발현의 수명 및 진폭). 모두 5개 도너를 기재로 하는 SEQ ID NO:53과 비교하여 증가 정도는 본 실험에서 각각 SEQ ID NO:1에 있어서 4.2배; SEQ ID NO:2에 있어서 1.4배; SEQ ID NO: 3에 있어서 10.1배; 및 SEQ ID NO:5에 있어서 3배이다. 도 20에 제시된 바와 같은 개별 도너는 상기 언급된 교시 내용을 지지하는 다양한 진폭을 보여준다.
실시예 19: eGFP mRNA로의 형질감염 후 24h째에 유전자총법으로 형질감염된 인간 피부 생검체로부터의, 면역형광 분석에 의한 eGFP 단백질 발현의 평가.
본 실시예에서, 인간 피부에서 eGFP 단백질의 발현 및 국소화를 평가하였다. 다양한 도너로부터의 인간 피부 생검체를 Helios 유전자 총 시스템을 사용하여 eGFP IVT mRNA로 유전자총법으로 형질감염시켰다. 빈 골드 입자로 처리된 피부는 대조군으로서 사용하였다. 후속적으로, 생검체를 4% 파라포름알데하이드에서 형질감염 후 24h째에 고정시키고, eGFP 특이적 면역형광 분석을 10μm 냉동절편에서 수행하였다.
결과: 도 21에 도시된 바와 같이, eGFP의 광범위한 발현은 유전자총법으로 형질감염된 인간 피부에서 형질감염 후 24h째에 검출될 수 있다. 흥미롭게도, 유전자총법 형질감염은 F-액틴 양성 표피 구획(적색)에서는 검출가능하나 하부 피부 구획에는 부재하는 녹색 세포로서 eGFP 양성으로서 표시된 표피 구획으로 제한된다. 이러한 표피 표적화는 표피에서 발병 세포(예를 들어, 케라틴세포)를 직접적으로 표적으로 하여, 이미퀴모드와 같은 면역 조절인자의 최신 국소 적용에 의해 또한 처리될 수 있는 잠재적인 간접 효과 이외에 IFNa mRNA 매개된 단백질 발현에 의해 발병 세포에 직접적인 효과를 발휘한다는 이전에는 불가능했던 신규한 개념의 실행가능성 및 적용성을 강력하게 지지한다.
실시예 20: 인간 IFNα IVT mRNA 및 인간 IVT mRNA 변이체로의 형질감염 후 24h 및 48h째에 돼지 상피 시트의 세포 배양 상청액으로부터의, 단백질 ELISA에 의한 인간 IFNa2a 단백질 수준 평가.
본 실시예에서, IFNa2 mRNA 변이체의 코딩 서열(CDS)에서 UTR 변형 및 차별적 코돈 최적화의 효과를 평가하였다.
돼지 상피 시트를 전장 인간 IFNa(SEQ ID NO:53)는 물론 상기 기술된 바와 같은 CDS 변이체(SEQ ID NO:4)로 형질감염시켰다. 또한, TransIT 단독뿐만 아니라 eGFP mRNA에 복합된 TransIT를 대조군으로서 사용하였다. 후속하여, 형질감염된 조직으로부터 분비된 인간 IFNa2a의 수준을 형질감염 후 48h 이하 동안 결정하였다.
결과: 모든 IFNa2 mRNA 변이체가 평가된 모든 시점에서 1μg mRNA/웰을 사용하여 인간 IFNa2a 단백질의 높은 수준을 유도한다(도 22). 그럼에도 불구하고, 전체 인간 IFNa (SEQ ID NO:53)는 평가된 모든 시점에서 SEQ ID NO: 4와 비교하여 IFNa2a 단백질의 더 낮을 발현을 보여주었다. 도 20은 TransIT mRNA 형질감염 시약과 복합된 IVT mRNA(1μg mRNA/웰)를 사용하여 형질감염된 돼지 상피 시트를 보여준다. 상청액을 수득하고, 인간 IFNa2 특이적 단백질 ELISA(MABTECH)로 처리하였다. 서술된 값은 ng/ml IFNa2a 단백질로서 측정된다.
따라서, UTR 및/또는 CDS 최적화를 겪은 서열은 전장 인간 IFNa mRNA보다 돼지 조직에서 IFNa2a를 유도하는데 더욱 효과적이었다(발현의 수명 및 진폭).
실시예 21: 인간 IFNα mRNA 및 인간 IVT mRNA 변이체로의 형질감염 후 24h째에 유전자총법으로 형질감염된 인간 피부 생검체의 세포 배양 상청액 및 조직 추출물로부터의, 단백질 ELISA에 의한 인간 IFNa2a 단백질 수준 평가.
본 실시예에서, IFNa2 mRNA 변이체의 코딩 서열(CDS)에서 UTR 변형 및 차별적 코돈 최적화의 효과를 평가하였다. n=5 상이한 도너로부터의 인간 피부 생검체는 Helios 유전자 총 시스템을 사용하여 전장 인간 IFNa (SEQ ID NO:53), 뿐만 아니라 상기 기술된 바와 같은 IVT mRNA 함유 CDS 변이체(SEQ ID NO: 4)로 유전자총법으로 형질감염시켰다. 형질감염되지 않은 피부뿐만 아니라 eGFP IVT mRNA로 형질감염된 피부를 대조군으로서 사용하였다. 후속적으로, 형질감염된 조직으로부터의 분비된 인간 IFNa2a의 수준 및 조직 중 IFNa2a의 수준을 형질감염 후 24h 이하 동안 결정하였다.
결과: 도 23은 IVT mRNA 입자를 사용하여 형질감염된 인간 피부 생검체로부터 IFNa2a의 분비를 보여준다. 상청액을 수득하고, 인간 IFNa2 특이적 단백질 ELISA(MABTECH)로 처리하였다. 서술된 값은 pg/ml IFNa2a 단백질로서 측정된다. 도 24는 IVT mRNA 입자를 사용하여 형질감염된 인간 피부 생검체로부터 피부 조직에서 인간 IFNa2a 단백질의 수준을 보여준다. 세포 추출물을 수득하고, 인간 IFNa2 특이적 단백질 ELISA(MABTECH)로 처리하였다.
eGFP mRNA는 형질감염 후 인간 피부로부터 인간 IFNa2a의 매우 낮은 수준의 분비를 유도한다(157 pg/ml; SEQ ID NO: 53보다 12배 낮음(1873 pg/ml)). 사용된 모든 IFNa2 mRNA 변이체는 1μg mRNA/μl 로딩된 입자를 사용하여 높은 수준의 인간 IFNa2a 단백질 분비를 유도한다(도 23). 그럼에도 불구하고, 전장 인간 IFNa (SEQ ID NO:53)는 SEQ ID NO: 4와 비교하여 IFNa2a 단백질의 더 낮은 발현을 보여주었다. 따라서, UTR 및/또는 CDS 최적화를 겪은 서열은 전장 인간 IFNa mRNA보다 인간 조직에서 IFNa2a 분비를 유도하는데 더욱 효과적이었다(발현의 수명 및 진폭). 도 23에 제시된 바와 같은 개별 도너는 상기 언급된 교시 내용을 지지하는 다양한 진폭을 보여준다.
eGFP mRNA는 형질감염 후 인간 피부에서 매우 낮은 수준의 인간 IFNa2a를 유도한다(44 pg/mg 조직; SEQ ID NO: 53보다 26배 낮음(1150 pg/mg 조직)). 사용된 모든 IFNa2 mRNA 변이체는 1μg mRNA/μl 로딩된 입자를 사용하여 높은 수준의 인간 IFNa2a 단백질을 유도한다(도 24). 그럼에도 불구하고, 전장 인간 IFNa (SEQ ID NO:53)는 SEQ ID NO: 4와 비교하여 IFNa2a 단백질의 더 낮은 발현을 보여주었다. 따라서, UTR 및/또는 CDS 최적화를 겪은 서열은 전장 인간 IFNa mRNA보다 인간 조직에서 IFNa2a를 유도하는데 더욱 효과적이었다(발현의 수명 및 진폭). 도 24에 제시된 바와 같은 개별 도너는 상기 언급된 교시 내용을 지지하는 다양한 진폭을 보여준다.
실시예 22: 양이온 폴리머-기반 형질감염 시약을 사용하여 제형화된 반딧불이 루시퍼라제 IVT mRNA로 형질감염 후 24h 및 48h째에 돼지 피부에서 반딧불이 루시퍼라제 활성의 생체내 검출.
본 실시예에서, 양이온 폴리머-기반 형질감염 제형에 의해 유도된 생체내 반딧불이 루시퍼라제(FLuc) 발현을 시간 경과에 따라 모니터링하였다. 루시퍼라제 활성의 검출에 있어서, 돼지(약 45kg, 잡종; Edelschwein x Pietrain)를 2개의 상이한 용량의 mRNA를 사용하는 폴리머 기반 제형으로 피내 주입하였다: 1ng/μl(즉: 0.03μg/용량) 및 3.3ng/μl(즉: 0.1μg/용량) mRNA는 물론 상기 기술된 바와 같은 비-복합된 mRNA(3.3ng/μl; 즉: 0.1㎍/용량). 천연의 형질감염되지 않은 기관 샘플(즉, 피부 생검체)을 배경 대조군으로서 사용하였다. 후속하여, 형질감염된 조직의 루시퍼라제 활성을 직접 활성 측정에 의해 형질감염 후 24h 및 48h째에 모니터링하였다. 분석에 있어서, 주입 부위를 분리하고, 생성된 생검체를 Firefly Luc One-Step Glow Assay Kit로 처리하였다. 성공적인 형질감염은 생물발광에 의해 검출가능하였다(검출: 상대적 발광 유닛(RLU)).
결과: 루시퍼라제 활성은 형질감염 후 두 용량 모두의 복합된 FLuc mRNA를 사용하여 검출가능하였다(도 25). 본 실험에서, 루시퍼라제 활성은 mRNA 용량 의존적 방식으로 생체내 피내 주입 후 24h(도 25a: n=6 샘플에 있어서 0.03μg/용량 및 n=9에 있어서 0.1μg/용량; 비복합된 mRNA: n=3; 비처리된 생검체: n=6) 및 48h(도 25B n=9 샘플에 있어서 0,03μg/용량 및 n=9에 있어서 0,1μg/용량; 비처리된 생검: n=6)(0.1㎍ FLuc mRNA 복합물 유도된 RLU > 0.03㎍ FLuc mRNA 복합물 유도된 RLU). 비복합된 FLuc mRNA는 각각 비처리된 피부 샘플에서 또한 검출가능한 배경 신호와 유사한 RLU를 유도하였다.
따라서, 본 발명의 하기 바람직한 구체예에 관한 것이다:
1. 인간 환자에서 비-흑색종 피부암(NMSC)의 예방 및 치료에 사용하기 위한 인터페론 알파(IFN-α) 메신저-RNA(mRNA)로서, mRNA는 5' CAP 영역, 5' 비번역 영역(5'-UTR), 인간 IFN-α를 인코딩하는 코딩 영역, 3' 비번역 영역(3'-UTR) 및 폴리-아데노신 테일(폴리-A 테일)을 갖는, IFN-α mRNA.
2. 구체예 1에 있어서, NMSC가 광선 각화증(AK), 기저 세포 암종(BCC) 및 편평 세포 암종(SCC), 특히 AK인, IFN-α mRNA.
3. 구체예 1 또는 2에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, IFN-α mRNA가 IFN-α 타입 1 mRNA(IFNa1), IFN-α 타입 2a mRNA(IFNa2a), 및 IFN-α 타입 2b mRNA(IFNa2b)로부터 선택되는, IFN-α mRNA.
4. 구체예 1 내지 3 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, 폴리-A 테일이 적어도 100개의 아데노신 모노포스페이트, 바람직하게는 적어도 120개의 아데노신 모노포스페이트를 포함하는, IFN-α mRNA.
5. 구체예 1 내지 4 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, 5'-UTR 또는 3'-UTR 또는 5'-UTR 및 3'-UTR이 천연 IFN-α mRNA와 상이하며, 바람직하게는 5'-UTR 또는 3'-UTR 또는 5'-UTR 및 3'-UTR은 적어도 하나의 안정화 서열, 바람직하게는 일반식 (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC (SEQ ID NO:38)(여기에서, 독립적으로 Nx 및 Pyx에서 "x"는 0 내지 10, 바람직하게는 0 내지 5, 특히 0, 1, 2, 4 및/또는 5의 정수임)을 갖는 안정화 서열을 함유하는, IFN-α mRNA.
6. 구체예 1 내지 5 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, 5'-UTR 또는 3'-UTR 또는 5'-UTR 및 3'-UTR이 천연 IFN-α mRNA와 상이하며, 적어도 하나의 탈안정화 서열 요소(DSE), 바람직하게는 AU-풍부 요소(ARE) 및/또는 U-풍부 요소(URE), 특히 노나머 UUAUUUA(U/A)(U/A의 단일, 탠덤 또는 다중 또는 중복 복사체를 함유하는, IFN-α mRNA.
7. 구체예 1 내지 6 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, 5'-UTR 또는 3'-UTR 또는 5'-UTR 및 3'-UTR이 천연 IFN-α mRNA와 상이하며, 5'-UTR 및/또는 3'-UTR은 IRN-α 이외의 상이한 인간 mRNA의 5'-UTR 및/또는 3'-UTR이며, 이는 바람직하게는 알파 글로빈, 베타 글로빈, 알부민, 리폭시게나제, ALOX15, 알파(1) 콜라겐, 티로신 하이드록실라제, 리보솜 단백질 32L, 진핵세포 신장 인자 1a(EEF1A1), 오르토폭스바이러스에 존재하는 5'-UTR 요소 및 이들의 혼합물로부터 선택되며, 특히 알파 글로빈, 베타 글로빈, 알파(1) 콜라겐 및 이들의 혼합물로부터 선택되는, IFN-α mRNA.
8. 구체예 1 내지 7 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, IFN-α mRNA에서,
- 모든 시티딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 5-메틸-시티딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 시티딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 2-아미노-2-데옥시-시티딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 시티딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 2-플루오로-2-데옥시-시티딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 시티딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 2-티오-시티딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 시티딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 5-아이오도-시티딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 우리딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 슈도-우리딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 우리딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 1-메틸-슈도-우리딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 우리딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 2-티오-우리딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 우리딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 5-메틸-우리딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 아데노신 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 N6-메틸-아데노신 잔기에 의해 대체되는, IFN-α mRNA.
9. 구체예 1 내지 8 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, IFN-α mRNA에서,
- 모든 시티딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 5-메틸-시티딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 우리딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 슈도-우리딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 우리딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 2-티오-우리딘 잔기에 의해 대체되는, IFN-α mRNA.
10. 구체예 1 내지 9 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, IFN-α mRNA가 적어도 49.5%, 바람직하게는 적어도 49.6, 더욱 바람직하게는 50%, 심지어 더욱 바람직하게는 적어도 55%, 특히 적어도 60%의 GC 대 AU 비율을 갖는, IFN-α mRNA.
11. 구체예 1 내지 10 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, IFN-α mRNA가 적어도 0.8, 바람직하게는 적어도 0.9의 코돈 적응 지수(CAI)를 갖는, IFN-α mRNA.
12. 구체예 1 내지 11 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, IFN-α mRNA의 코딩 영역이 인간 IFNa2a를 인코딩하며, 바람직하게는 SEQ ID NO:12, 특히 SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11인, IFN-α mRNA.
13. 구체예 1 내지 10 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, IFN-α mRNA의 코딩 영역이 인간 IFNa2b를 인코딩하며, 바람직하게는 SEQ ID NO:26, 특히 SEQ ID NO: 19, 20, 22 또는 25인, IFN-α mRNA.
14. 구체예 1 내지 10 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, IFN-α mRNA의 코딩 영역이 인간 IFNa1를 인코딩하며, 바람직하게는 SEQ ID NO:36, 특히 SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 34, 또는 35인, IFN-α mRNA.
15. 구체예 1 내지 11 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, IFN-α mRNA가 피하, 피내, 경피, 표피 또는 국소, 특히 표피 투여되는, IFN-α mRNA.
16. 구체예 1 내지 15 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, IFN-α mRNA가 1개월 이내에 적어도 2회, 바람직하게는 매주 투여되는, IFN-α mRNA.
17. 구체예 1 내지 16 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, IFN-α mRNA가 용량 당 0.001μg 내지 100 mg, 바람직하게는 용량 당 0.01μg 내지 100 mg, 더욱 바람직하게는 용량 당 0.1μg 내지 10mg, 특히 용량 당 1μg 내지 1mg의 양으로 투여되는, IFN-α mRNA.
18. 구체예 1 내지 17 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, IFN-α mRNA가 0.8 이상의 CAI 및 48.7% 이상의 GC 함량을 갖는, IFN-α mRNA.
19. 구체예 1 내지 18 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, IFN-α mRNA가 0.8 내지 0.99, 바람직하게는 0.81 내지 0.97, 특히 0.83 내지 0.85의 CAI를 갖는 IFN-α mRNA.
20. 구체예 1 내지 19 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, IFN-α mRNA가 48.7% 내지 63.7%, 바람직하게는 48.7% 내지 60%, 특히 48.7% 내지 58.0%의 GC 함량을 갖는, IFN-α mRNA.
21. 구체예 1 내지 20 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, IFN-α mRNA가 0.80 내지 0.97의 CAI 및 48.7% 내지 63.7%의 GC 함량을 갖는, IFN-α mRNA.
22. 구체예 1 내지 19 및 12 내지 17 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, IFN-α mRNA가 0.6 내지 0.8의 CAI 및 48.7% 내지 65.0%의 AU 함량을 갖는, IFN-α mRNA.
22. 구체예 1 내지 10 및 12 내지 17 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, IFN-α mRNA가 0.6 내지 0.8, 바람직하게는 0.6 내지 0.7, 특히 0.65 내지 0.75의 CAI를 갖는, IFN-α mRNA.
23. 구체예 1 내지 19 및 11 내지 17 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA에 있어서, IFN-α mRNA가 48.7% 내지 65.0%, 바람직하게는 51.3 내지 60.0%의 AU 함량을 갖는, IFN-α mRNA.
24. NMSC, 바람직하게는 AK, BCC 및 SCC, 특히 AK의 예방 및 치료에 사용하기 위한, 구체예 1 내지 23 중 어느 한 구체예에 정의된 바와 같은 IFN-α mRNA를 포함하는 약학적 제형.
25. 구체예 24에 따라 사용하기 위한 약학적 제형으로서, 약학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 폴리머 기반 담체, 특히 선형 및 분지형 PEI 및 비로머를 포함하는 양이온 폴리머; 지질 나노입자 및 리포솜, 나노리포솜, 세라미드-함유 나노리포솜, 프로테오리포솜, 양이온 양친성 지질, 예를 들어: SAINT-지질, 천연 및 합성적으로-유래된 엑소좀, 천연, 합성 및 반합성 층판소체, 나노미립자, 칼슘 포스포르-실리케이트 나노미립자, 칼슘 포스페이트 나노미립자, 실리콘 디옥사이드 나노미립자, 나노크리스탈린 미립자, 반도체 나노미립자, 건조 분말, 폴리(D-아르기닌), 나노덴드리머, 전분-기반 전달 시스템, 미셀, 에멀젼, 졸-겔, 니오솜, 플라스미드, 바이러스, 칼슘 포스페이트 뉴클레오티드, 압타머, 펩티드, 펩티드 컨쥬게이트, 벡터 태그, 바람직하게는 소분자 표적화 컨쥬게이트, 또는 바이러스 캡시드 단백질, 바람직하게는 바이오나노캡슐을 포함하는 약학적 제형.
26. 구체예 24 또는 25에 따라 사용하기 위한 약학적 제형으로서, 선형 및 분지형 PEI 및 비로머를 포함하는 양이온 폴리머, 지질 나노입자 및 리포솜, 트랜스퍼솜 및 나노미립자, 바람직하게는 칼슘 포스페이트 나노미립자를 포함하는 약학적 제형.
27. 구체예 24에 따라 사용하기 위한 약학적 제형으로서, mRNA가 비복합된 mRNA이며, 바람직하게는 비복합된 mRNA가 적합한 수성 완충액, 특히 생리학적 글루코스 완충 수용액에 함유되는 약학적 제형.
28. 구체예 24 내지 27 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 약학적 제형으로서, 제형이 1xHEPES 완충액; 1x포스페이트 완충액, Na-시트레이트 완충액; Na-아세테이트 완충액을 포함하며; 바람직하게는 글루코스, 특히 5% 글루코스를 추가로 포함하는 약학적 제형.
29. 구체예 1 내지 23 중 어느 한 구체예에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA를 환자에 투여하기 위한 키트로서,
- 구체예 1 내지 23 중 어느 한 구체예에서 규정된 바와 같은 IFN-α mRNA, 및
- 피부 전달 장치를 포함하는 키트.
30. 구체예 29에 있어서, 피부 전달 장치가 바늘 기반 주사 시스템, 및 바늘-비함유 주사 시스템으로 구성된 군으로부터 선택되는 피내 전달 장치인, 키트.
31. 구체예 29에 있어서, 피부 전달 장치가 바람직하게는 경피 패치, 할로우 및 솔리드 마이크로니들 시스템, 미세구조 경피 시스템, 전기영동법 시스템, 및 이온이동법 시스템으로 구성된 군으로부터 선택되는 경피 전달 장치인, 키트.
32. 구체예 29에 있어서, 피부 전달 장치가 바늘 비함유 주사 시스템, 레이저 기반 시스템, 특히 Erbium YAG 레이저 시스템, 및 유전자 총 시스템으로 구성된 군으로부터 선택되는 표피 전달 장치인, 키트.
33. NMSC, 바람직하게는 AK, BCC 및 SCC의 치료 및 예방을 위한 방법에서, 구체예 1 내지 23 중 어느 한 구체예에 정의된 바와 같은 IFN-α mRNA가 이를 필요로 하는 환자에게 유효량으로 투여하는 방법.
34. 천연 IFN-α mRNA 서열을 제외하고, 청구항 제1항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 m-RNA 분자.
SEQUENCE LISTING
<110> Accanis Biotech F&E GmbH & Co KG
<120> Prevention and treatment of non-melanoma skin cancer (NMSC)
<130> R 72204
<140> PCT/EP2018/058036
<141> 2018-03-29
<150> EP 17164257.2
<151> 2017-03-31
<150> EP 17200162.0
<151> 2017-11-06
<160> 53
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
auggccuuga ccuuugcuuu acugguggcc cuccuggugc ucagcugcaa gucaagcugc 60
ucugugggcu gugaucugcc ucaaacccac agccugggua gcaggaggac cuugaugcuc 120
cuggcacaga ugaggaaaau cucucuuuuc uccugcuuga aggacagaca ugacuuugga 180
uuuccccagg aggaguuugg caaccaguuc caaaaggcug aaaccauccc uguccuccau 240
gagaugaucc agcagaucuu caaucucuuc agcacaaagg acucaucugc ugcuugggau 300
gagacccucc uagacaaauu cuacacugaa cucuaccagc agcugaauga ccuggaagcc 360
ugugugauac aggggguggg ggugacagag acuccccuga ugaaggagga cuccauucug 420
gcugugagga aauacuucca aagaaucacu cucuaucuga aagagaagaa auacagcccu 480
ugugccuggg agguugucag agcagaaauc augagaucuu uuucuuuguc aacaaacuug 540
caagaaaguu uaagaaguaa ggaauga 567
<210> 2
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
auggcacuga cauuugcccu gcucguugcu cuuuuggucc uuuccugcaa gaguagcugc 60
ucuguuggcu gugauuugcc ccaaacccac ucucucgguu caaggagaac ucugaugcug 120
cuugcccaaa ugcggaagau uagccuguuc ucaugccuga aagaccggca ugauuucggc 180
uuuccucagg aggaauuugg gaaccaguuc cagaaagcgg aaaccauucc cguccuucac 240
gagaugaucc agcagaucuu caaccuguuu ucuaccaagg auuccagugc ugcuugggau 300
gagacacugc uggacaaguu cuacacugag cucuaucagc agcugaauga ccuggaagcc 360
ugugugaucc aaggaguagg agugacugag acaccacuca ugaaagagga cuccauacuc 420
gcagugcgca aguacuucca gaggauuacc cuguaucuga aggagaagaa auacaguccg 480
ugugcauggg aaguggugag agccgagauc augcguagcu uuucccuguc aacgaaucug 540
caggaaagcu ugcgaagcaa agaauga 567
<210> 3
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
auggcacuga cauucgcccu gcucgucgcu cuccucgucc ucuccugcaa gaguagcugc 60
ucugucggcu gugauuugcc ccaaacccac ucccucgguu ccaggcgcac ucugaugcug 120
cucgcccaga ugcggaagau uagccuguuc ucaugccuga aggaccggca ugauuucggc 180
uucccucagg aggaauucgg gaaccaguuc cagaaggcgg agaccauccc cguccuccac 240
gagaugaucc agcagaucuu caaccuguuc ucuaccaagg acuccagugc ugcuugggac 300
gagacccugc ucgacaaguu cuacacugag cucuaccagc agcugaacga ccuggaggcc 360
ugugugaucc aaggagucgg agugacugag acaccacuca ugaaggagga cuccauccuc 420
gcaguccgca aguacuucca gaggaucacc cuguaccuga aggagaagaa guacaguccg 480
ugugcauggg agguggugag agccgagauc augcguagcu ucucccuguc aacgaaccug 540
caggagagcc uccgaagcaa ggaguga 567
<210> 4
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
auggcacuga cauuugcccu gcucguugcu cuuuuggucc uuucuugcaa gaguagcugu 60
ucuguuggau gugauuugcc ucaaacucau ucuuuggguu caagaagaac uuugaugcuu 120
cuugcacaaa ugagaaagau uagccuuuuc ucauguuuga aagaucgaca ugauuucgga 180
uuuccucaag aagaauuugg uaaccaauuc caaaaagcug aaaccauucc uguccuucau 240
gaaaugaucc aacaaaucuu caaucuuuuu ucuacuaagg auucuagugc ugcuugggau 300
gaaacacuuc uugauaaguu cuacacugaa cucuaucaac agcugaauga cuuggaagcc 360
uguguuaucc aaggaguugg aguuacugag acaccacuca ugaaagaaga uuccauacuc 420
gcaguucgca aguacuucca aaggauuacc uuguaucuga aggaaaagaa auacaguccu 480
ugugcauggg aagugguuag agcugaaauc augcguagcu uuucccuguc aacgaauuug 540
caggaaagcu ugcgaagcaa agaauga 567
<210> 5
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
auggcccuga cauucgcucu gcugguggcc cugcuggugc ugagcugcaa gagcagcugu 60
agcgugggcu gcgaccugcc ucagacacac agccugggca gcagacggac ccugaugcug 120
cuggcccaga ugcggaagau cagccuguuc agcugccuga aggaccggca cgacuucggc 180
uucccucagg aagaguucgg caaccaguuc cagaaggccg agacaauccc cgugcugcac 240
gagaugaucc agcagaucuu caaccuguuc uccaccaagg acagcagcgc cgccugggac 300
gagacacugc uggacaaguu cuacaccgag cuguaccagc agcugaauga ccuggaagcc 360
ugcgugaucc agggcguggg cgugacagag acaccccuga ugaaggaaga uagcauccug 420
gccgugcgca aguacuucca gcggaucacc cuguaccuga aagagaagaa guacagcccc 480
ugcgccuggg aggucgugcg ggccgagauc augagaagcu ucagccugag caccaaccug 540
caggaaagcc ugcggagcaa agaguga 567
<210> 6
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
auggcucuca ccuucgcccu gcugguggca cuucuugucc ucucauguaa aucuagcugu 60
agcguuggcu gcgaucugcc ucagacucau agucugggau cucggaggac gcuuaugcug 120
uuggcccaga ugaggaagau cucccuguuc uccugucuca aagaccggca cgauuuuggc 180
uucccacagg aggaguuugg gaaccaguuc cagaaagcug agaccauccc ggugcuucau 240
gaaaugaucc agcagaucuu caaucuguuc aguacaaagg auaguucugc ugcuugggac 300
gagacacucc ucgacaaauu uuacacugaa cuguaucagc aguugaacga ccuugaggcu 360
ugcguuauuc agggagucgg ugugacagaa acuccccuca ugaaggagga cagcauccuc 420
gccguucgaa aguauuucca acgaaucaca cuguaucuua aggagaaaaa guacagccca 480
ugugccuggg agguuguccg ggcugagaua augcgaaguu ucucacugag uacaaacuug 540
caggagagcc uccgaucaaa ggaguga 567
<210> 7
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
auggcucuua cguucgcucu uuugguugcc cucuuggugc ugaguuguaa auccucaugu 60
uccgugggau gcgaucugcc gcagacucac ucucuuggca guagaaggac ccugaugcug 120
cuggcucaaa ugcggaagau uagucuguuc uccugccuga aggaccggca ugacuucggu 180
uuuccacagg aggaauucgg aaaccaguuu cagaaggcug agacaauccc ugugcugcac 240
gaaaugaucc aacagauuuu caaccuuuuc ucaaccaagg acuccucagc cgccugggac 300
gaaacacugc uggauaaauu cuauaccgag cucuaccaac agcugaacga uuuggaggca 360
ugugucaucc agggggucgg ggucacugag acuccacuga ugaaggaaga cuccauucuc 420
gcgguaagga aauacuucca gaggaucacg cuguaccuga aggaaaagaa auacagcccu 480
ugcgcauggg aggugguucg cgcugagauc augcggagcu ucagucugag cacuaaucug 540
caggaaagcc ucaggucaaa ggaauag 567
<210> 8
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
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ucagugggcu gcgauuugcc ccagacccac ucacugggaa guaggaggac uuugaugcug 120
uuggcucaga ugcggaaaau cucucuguuc uccugccuga aggauaggca ugacuuuggu 180
uuuccucaag aggaguuugg aaaccaguuc caaaaggccg aaaccauccc ugugcuccac 240
gaaaugaucc agcagauauu uaaccuuuuc ucuacuaaag auuccagcgc cgcaugggac 300
gagacccugc uugacaaguu cuacacugag cucuaccagc agcucaacga ccuggaggcg 360
ugugugaucc agggugucgg ugugacggag acuccccuua ugaaagagga uucuauccug 420
gcagugcgga aauauuuuca gagaaucacg cuguauuuga aggagaagaa guauagcccc 480
ugcgccuggg aaguggugag ggcugaaauu augcgcaguu ucagcuugag caccaaccug 540
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<210> 9
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
auggcccuga ccuucgcacu gcugguggca cugcugguuc uuuccuguaa gagcaguugc 60
agcguuggau gugaccugcc acagacucau ucucugggua gccggcgcac ucuuaugcuc 120
cucgcacaaa ugaggaagau uagucuguuc agcugucuca aagauagaca cgauuuuggc 180
uucccucagg aagaauucgg aaaccaguuu cagaaggccg agaccauccc cguguugcau 240
gagaugauuc agcagaucuu caaccuguuu ucuaccaagg acagcuccgc ugcuugggac 300
gagacucugc uggacaaguu cuacacugag cucuaccagc agcugaacga ccuugaagcc 360
ugcguuauuc agggcgucgg cgugacagag acuccacuga ugaaagagga caguauccug 420
gccgugcgga aguauuuuca gaggauuaca cuuuauuuga aggaaaagaa guacuccccc 480
ugcgcauggg aagugguaag ggcugaaauc augcggagcu uuucccuguc uaccaaccug 540
caggaauccc ugagauccaa agaauaa 567
<210> 10
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
auggcacuga cauuugccuu gcucgucgcc cugcuuguuc uguccuguaa gagcuccugc 60
ucaguuggcu gcgaucuucc ucaaacccau agccucggua gccgccgaac ccugaugcug 120
cuggcccaga ugcgcaagau uagucuguuc ucuugucuga aagacaggca cgauuucgga 180
uucccacagg aggaguucgg caaucaauuc cagaaagcgg agaccauccc cgugcuucac 240
gagaugauuc agcaaauuuu caaccuguuc aguacuaaag auucuagcgc ugcgugggac 300
gagacccugc uggacaaauu cuauacagaa cucuaucagc agcugaacga ucuggaggcc 360
uguguuaucc aggggguagg ugugaccgaa accccucuua ugaaggaaga uuccauccug 420
gccguuagga aauacuucca gcgcaucaca uuguaccuga aggagaaaaa guacagcccu 480
ugcgcauggg agguggucag agcugaaauc augcgaucau uuagucucag uacuaaucuc 540
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<210> 11
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
auggcccuga ccuucgcccu gcugguggcc cugcuggugc ugagcugcaa gagcagcugc 60
agcgugggcu gcgaccugcc ccagacccac agccugggca gccgccgcac ccugaugcug 120
cuggcccaga ugcgcaagau cagccuguuc agcugccuga aggaccgcca cgacuucggc 180
uucccccagg aggaguucgg caaccaguuc cagaaggccg agaccauccc cgugcugcac 240
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gagacccugc uggacaaguu cuacaccgag cuguaccagc agcugaacga ccuggaggcc 360
ugcgugaucc agggcguggg cgugaccgag accccccuga ugaaggagga cagcauccug 420
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<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
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<221> variation
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<223> any nucleotide
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auggchyuba cvuuygchyu byusgubgch cubyubgubc ubwshugyaa rwsywshugy 60
wshgubggmu gygayyukcc ncarachcay wshcubgghw shmgvmgvac byukaugcus 120
yubgchcara ugmgsaarau ywsycuguuc wshugycusa argaymgvca ygayuuyggh 180
uuycchcarg argaruuygg vaaycaruuy caraargcbg aracmauycc bgusyubcay 240
garaugauyc arcarauhuu yaaycukuuy wshachaarg aywsywshgc ygcnugggay 300
garachcusc ubgayaaruu yuayachgar cusuaycarc agyusaayga yyukgargcn 360
ugygubauyc arggnguvgg ngusacngar achcchcuba ugaargarga ywsyauhcus 420
gcvgunmgva aruayuuyca rmgvauyacv yukuayyuka argaraaraa ruaywsyccn 480
ugygcmuggg argubgunmg vgcygarauh augmgnwshu uywshyusws hacnaayyus 540
cargarwsmy ubmgvwsmaa rgarurr 567
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<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> variation
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<223> any nucleotide
<400> 13
auggchyuba cvuuygchyu byusgubgch cubyubgubc ubwshugyaa rwsywshugy 60
wshgubggmu gygayyukcc ncarachcay wshyubgghw shmgvmgvac byukaugcub 120
yubgchcara ugmgvaarau ywsycukuuc wshugyyusa argaymgvca ygayuuyggh 180
uuycchcarg argaruuygg naaycaruuy caraargcbg aracmauycc bgusyubcay 240
garaugauyc arcarauhuu yaaycukuuy wshachaarg aywsywshgc ygcnugggay 300
garachcubc ubgayaaruu yuayachgar cusuaycarc agyusaayga yyukgargcn 360
ugygubauyc arggngungg ngubacngar achcchcuba ugaargarga ywsyauhcus 420
gcvgunmgva aruayuuyca rmgvauyacv yukuayyuka argaraaraa ruaywsyccn 480
ugygcmuggg argubgunmg vgcygarauh augmgnwshu uywshyusws hacnaayyus 540
cargarwsmy ubmgvwsmaa rgarurr 567
<210> 14
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> variation
<222> 21,81,201,294,312,360,375,378,381,387,423,426,450,480,498,516,534,552
<223> any nucleotide
<400> 14
auggchyuba cvuuygchyu nyusgubgch cubyubgubc ubwshugyaa rwshwshugy 60
wshgubggmu gygayyukcc ncarachcay wshyubgghw shmgvmgvac byukaugcub 120
yubgchcara ugmgvaarau ywsycukuuc wshugyyusa argaymgvca ygayuuyggh 180
uuycchcarg argaruuygg naaycaruuy caraargcbg aracmauycc bgusyubcay 240
garaugauyc arcarauhuu yaaycubuuy wshachaarg aywshwshgc ygcnugggay 300
garachcubc ungayaaruu yuayachgar cusuaycarc agyusaayga yyukgargcn 360
ugygubauhc arggngungg ngubacngar achcchcuba ugaargarga ywsyauhcus 420
gcngunmgva aruayuuyca rmgvauyacn yubuayyuka argaraaraa ruaywsyccn 480
ugygcmuggg argubgunmg vgchgarauh augmgnwshu uywshyusws hacnaayyus 540
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<210> 15
<211> 188
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys
1 5 10 15
Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu
20 25 30
Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser
35 40 45
Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu
50 55 60
Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His
65 70 75 80
Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser
85 90 95
Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr
100 105 110
Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val
115 120 125
Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys
130 135 140
Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro
145 150 155 160
Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu
165 170 175
Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
180 185
<210> 16
<211> 72
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> 5'UTR
<222> 1..72
<223> /standard_name="alpha-Globin"
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> 3'UTR
<222> 1..230
<223> /standard_name="alpha-Globin"
<220>
<221> polyA_signal
<222> 110..230
<400> 17
gctggagcct cggtggccat gcttcttgcc ccttgggcct ccccccagcc cctcctcccc 60
ttcctgcacc cgtacccccg tggtctttga ataaagtctg agtgggcggc aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 230
<210> 18
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
auggccuuga ccuuugcuuu acugguggcc cuccuggugc ucagcugcaa gucaagcugc 60
ucugugggcu gugaucugcc ucaaacccac agccugggua gcaggaggac cuugaugcuc 120
cuggcacaga ugaggagaau cucucuuuuc uccugcuuga aggacagaca ugacuuugga 180
uuuccccagg aggaguuugg caaccaguuc caaaaggcug aaaccauccc uguccuccau 240
gagaugaucc agcagaucuu caaucucuuc agcacaaagg acucaucugc ugcuugggau 300
gagacccucc uagacaaauu cuacacugaa cucuaccagc agcugaauga ccuggaagcc 360
ugugugauac aggggguggg ggugacagag acuccccuga ugaaggagga cuccauucug 420
gcugugagga aauacuucca aagaaucacu cucuaucuga aagagaagaa auacagcccu 480
ugugccuggg agguugucag agcagaaauc augagaucuu uuucuuuguc aacaaacuug 540
caagaaaguu uaagaaguaa ggaauga 567
<210> 19
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
auggcccuga ccuucgcccu gcugguggcc cugcuggugc ugagcugcaa gagcagcugc 60
agcgugggcu gcgaccugcc ccagacccac agccugggca gccgccgcac ccugaugcug 120
cuggcccaga ugcgccgcau cagccuguuc agcugccuga aggaccgcca cgacuucggc 180
uucccccagg aggaguucgg caaccaguuc cagaaggccg agaccauccc cgugcugcac 240
gagaugaucc agcagaucuu caaccuguuc agcaccaagg acagcagcgc cgccugggac 300
gagacccugc uggacaaguu cuacaccgag cuguaccagc agcugaacga ccuggaggcc 360
ugcgugaucc agggcguggg cgugaccgag accccccuga ugaaggagga cagcauccug 420
gccgugcgca aguacuucca gcgcaucacc cuguaccuga aggagaagaa guacagcccc 480
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caggagagcc ugcgcagcaa ggaguaa 567
<210> 20
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
auggcccuga cauucgcucu gcugguggcc cugcuggugc ugagcugcaa gagcagcugu 60
agcgugggcu gcgaccugcc ucagacacac agccugggca gcagacggac ccugaugcug 120
cuggcccaga ugcggagaau cagccuguuc agcugccuga aggaccggca cgacuucggc 180
uucccucagg aagaguucgg caaccaguuc cagaaggccg agacaauccc cgugcugcac 240
gagaugaucc agcagaucuu caaccuguuc uccaccaagg acagcagcgc cgccugggac 300
gagacacugc uggacaaguu cuacaccgag cuguaccagc agcugaauga ccuggaagcc 360
ugcgugaucc agggcguggg cgugacagag acaccccuga ugaaggaaga uagcauccug 420
gccgugcgca aguacuucca gcggaucacc cuguaccuga aagagaagaa guacagcccc 480
ugcgccuggg aggucgugcg ggccgagauc augagaagcu ucagccugag caccaaccug 540
caggaaagcc ugcggagcaa agaguga 567
<210> 21
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
auggcuuuga cauucgcacu guuggucgcc cugcuugugc ucucaugcaa aagcaguugu 60
uccguggguu gcgauuugcc acagacucac agucugggau cucgccgcac ucugaugcuu 120
cucgcgcaaa ugcgccggau uagucuuuuc uccugucuga aggauagaca cgacuuuggg 180
uuuccccagg aggaguuugg gaaucaguuc caaaaggcgg aaacuauucc uguccuucac 240
gaaaugaucc agcagauauu uaauuuguuc ucaacaaaag auucaucagc ugcaugggac 300
gaaacccugc uggauaaguu cuacacggag cucuaccagc agcugaauga ucucgaagcc 360
ugugucaucc agggcguagg agugacagaa accccacuga ugaaggagga uucaauccug 420
gcggugagga aguauuucca gcggaucacc cuguaucuga aggaaaagaa guauucccca 480
ugugcuuggg aggugguccg agcagagauc augaggagcu ucucucucuc aacaaaucug 540
caggagaguc uuagguccaa ggaguga 567
<210> 22
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
auggcucuca cuuucgcacu ccucguggca cugcuugugc uguccugcaa aaguucuugc 60
agcguggggu gcgaccuccc acagacccac ucacuggggu caaggcgcac ccugaugcug 120
cuggcccaga ugagacgaau uucccuguuu uccugccuca aggaucggca ugacuucggc 180
uuuccccaag aggaguucgg caaccaguuc cagaaagccg agaccauccc ugugcugcau 240
gagaugaucc agcaaauauu caaucucuuu uccaccaagg acagcuccgc cgccugggau 300
gagacauugc ucgauaaguu uuauacugaa cuguaccagc agcugaacga ucuugaggcc 360
uguguaauac aggguguagg cgugacagag accccccuua ugaaggagga cucaauucug 420
gcagucagga aauauuucca gcggauaacu cuguaccuga aggagaaaaa guauagucca 480
ugugcuuggg aaguggugcg ggccgagauc augcgcagcu uuucacuuag uacuaaucuc 540
caggagucuu ugaggucaaa ggaguga 567
<210> 23
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
auggcacuua ccuucgcccu uuugguggca cugcugguac ucucaugcaa gaguaguugc 60
aguguggggu gcgaucuccc acagacucac uccuugggau caaggcggac gcucaugcuc 120
cuggcucaaa ugagaagaau uuccuuguuc ucaugcuuga aagauagaca cgacuuuggc 180
uucccacagg aggaauuugg gaaccaguuc caaaaagcug agacgauccc aguccugcac 240
gagaugauac agcagaucuu uaaucuuuuu uccaccaagg acagcagugc cgccugggac 300
gagacucucc uugauaaauu cuacacugaa cucuaucaac aguugaauga cuuggaagcc 360
ugugugaucc aaggagucgg cgugaccgaa acaccacuua ugaaggagga cagcauccuu 420
gccguuagaa aguacuuuca acggaucacu cucuaucuca aagagaaaaa guacaguccc 480
ugugcuuggg aggugguccg cgccgaaauc augaggaguu ucagccucuc cacuaaucuu 540
caagaauccc uccgaagcaa agaauga 567
<210> 24
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 24
auggcucuca ccuucgcacu guugguggcu cuccuugugc ugagcuguaa aucuuccugu 60
ucugucgguu gcgauuugcc gcagacacac agccugggga gucggagaac ccugauguug 120
cuggcucaga ugcggagaau uucucuguuc aguugccuua aggaccgcca ugauuuuggg 180
uucccccagg aggaauuugg aaaucaguuu cagaaggcgg agacgauccc gguucugcac 240
gaaaugaucc agcagaucuu caauuuguuu ucaaccaagg acuccucugc ugccugggau 300
gaaacacugc uggacaaguu cuauaccgag cuguaccaac agcugaacga ucuugaggca 360
ugugugauuc aaggagucgg ggucaccgaa accccacuga ugaaagaaga uucuauucug 420
gcugugagaa aauauuucca aagaauaacu cucuaccuga aggagaagaa auauucacca 480
ugugccuggg aagucgugcg cgcugagaua augcgcagcu uuagucuuag uacaaaccug 540
caggagucuc ugcgcucuaa ggaguga 567
<210> 25
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
auggcccuua cuuuugcccu gcugguggca cuucuggucc ucucuugcaa gucaagcugc 60
aguguuggau gcgaucuucc ucagacacac ucccugggga guagaagaac ucugauguug 120
cucgcucaga ugcgcagaau aagucuguuu aguugucuga aggaucgcca cgauuucggg 180
uuuccacagg aagaguucgg caaccaguuc cagaaagcug agacuauccc uguacuucac 240
gaaaugauuc agcagaucuu uaaucuguuc uccaccaagg acuccucugc cgcuugggau 300
gagacucucc uggacaaauu uuacacugag cuguaucaac agcugaauga ucuggaagcc 360
ugcguaaucc aggggguggg ugugacagaa acaccguuga ugaaggaaga cuccauacuu 420
gcugugcgca aguacuuuca gcggaucacu cuguaucuga aagagaagaa auauucuccu 480
ugcgcuuggg aggucgucag ggcggaaaua augcggucuu ucagccucuc uaccaaucug 540
caggaguccc ugagaucuaa ggaauga 567
<210> 26
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 26
auggcycuba chuuygchcu scusguggcm cukcukgusc uswsyugcaa rwshwsyugy 60
agygukggvu gcgaycubcc hcagacmcac wsmcugggsw shmgvmgvac ycugaugyug 120
cusgcycaga ugmgvmgmau hwsycuguuy wsyugycusa aggaycgsca ygayuucggs 180
uuycchcarg argaguucgg caaccaguuc cagaargcyg agachauccc ygurcukcay 240
garaugauyc agcaraumuu yaaycusuuy wscaccaagg acwscwsygc cgcyugggay 300
gagachyusc usgayaaruu yuayacygar cuguaycarc agcugaayga ycukgargcc 360
ugyguraumc agggbgurgg ygugacmgar acmccsyuka ugaaggarga ywsmauhcuk 420
gchgusmgsa aruayuuyca gcgsaumacy cuguaycuga argagaaraa ruaywsycch 480
ugygcyuggg argusgusmg sgcsgaraum augmgvwsyu uywsmcubws yacyaaycus 540
caggarwsyy ugmgvwshaa rgarura 567
<210> 27
<211> 188
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys
1 5 10 15
Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu
20 25 30
Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser
35 40 45
Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu
50 55 60
Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His
65 70 75 80
Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser
85 90 95
Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr
100 105 110
Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val
115 120 125
Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys
130 135 140
Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro
145 150 155 160
Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu
165 170 175
Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
180 185
<210> 28
<211> 570
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 28
auggccucgc ccuuugcuuu acugaugguc cugguggugc ucagcugcaa gucaagcugc 60
ucucugggcu gugaucuccc ugagacccac agccuggaua acaggaggac cuugaugcuc 120
cuggcacaaa ugagcagaau cucuccuucc uccugucuga uggacagaca ugacuuugga 180
uuuccccagg aggaguuuga uggcaaccag uuccagaagg cuccagccau cucuguccuc 240
caugagcuga uccagcagau cuucaaccuc uuuaccacaa aagauucauc ugcugcuugg 300
gaugaggacc uccuagacaa auucugcacc gaacucuacc agcagcugaa ugacuuggaa 360
gccuguguga ugcaggagga gaggguggga gaaacucccc ugaugaaugc ggacuccauc 420
uuggcuguga agaaauacuu ccgaagaauc acucucuauc ugacagagaa gaaauacagc 480
ccuugugccu gggagguugu cagagcagaa aucaugagau cccucucuuu aucaacaaac 540
uugcaagaaa gauuaaggag gaaggaauaa 570
<210> 29
<211> 570
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
auggccucuc cauucgcccu gcugauggug cugguggugc ugagcugcaa gagcagcugc 60
agccugggcu gcgaccugcc ugagacacac agccuggaca accggcggac ccugaugcug 120
cuggcccaga ugagcagaau cagccccagc agcugccuga uggaccggca cgauuucggc 180
uucccucagg aagaguucga cggcaaccag uuccagaagg ccccugccau cagcgugcug 240
cacgagcuga uccagcagau cuucaaccug uucaccacca aggacagcag cgccgccugg 300
gacgaggacc ugcuggauaa guucugcacc gaacuguauc agcagcugaa cgaccuggaa 360
gccugcguga ugcaggaaga gagagugggc gagacacccc ugaugaacgc cgacucuauc 420
cuggccguga agaaguacuu ucggcggauc acccuguacc ugaccgagaa aaaguacagc 480
cccugcgccu gggaagucgu gcgggccgag aucaugagaa gccugagccu gagcaccaac 540
cugcaggaac ggcugcggcg gaaagaguaa 570
<210> 30
<211> 570
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 30
auggccagcc ccuucgcccu gcugauggug cugguggugc ugagcugcaa gagcagcugc 60
agccugggcu gcgaccugcc cgagacccac agccuggaca accgccgcac ccugaugcug 120
cuggcccaga ugagccgcau cagccccagc agcugccuga uggaccgcca cgacuucggc 180
uucccccagg aggaguucga cggcaaccag uuccagaagg cccccgccau cagcgugcug 240
cacgagcuga uccagcagau cuucaaccug uucaccacca aggacagcag cgccgccugg 300
gacgaggacc ugcuggacaa guucugcacc gagcuguacc agcagcugaa cgaccuggag 360
gccugcguga ugcaggagga gcgcgugggc gagacccccc ugaugaacgc cgacagcauc 420
cuggccguga agaaguacuu ccgccgcauc acccuguacc ugaccgagaa gaaguacagc 480
cccugcgccu gggagguggu gcgcgccgag aucaugcgca gccugagccu gagcaccaac 540
cugcaggagc gccugcgccg caaggaguaa 570
<210> 31
<211> 570
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 31
auggccucuc ccuucgcuuu gcugaugguu cucgugguuc ucagcugcaa guccuccugu 60
agucuggggu gugaccuucc cgagacucac agccuugaca accgacggac ucugaugcug 120
cuggcccaga ugagucgcau auccccuucu ucuugcuuga uggauagaca cgauuucggc 180
uucccucagg aggaguucga ugggaaccaa uuccagaaag cgccugcgau cagcguacuc 240
caugagcuga uccagcagau cuuuaauuug uucacaacga aggacagcag ugcugcuugg 300
gacgaagacc ugcuggacaa guucuguaca gaauuguacc agcagcugaa ugaccucgag 360
gccuguguga ugcaggagga aagagucggc gagacuccuc ucaugaacgc cgacagcauc 420
cucgccguga agaaguauuu ccggcggauc acccucuauc ugacagagaa gaaguacucc 480
cccugcgccu gggagguggu gcgagccgaa auaaugcgca gccucucucu gucaacuaau 540
cuccaggagc ggcuucggcg aaaggaguga 570
<210> 32
<211> 570
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 32
auggcaucuc cauucgcucu gcugauggug cugguggucc ugucauguaa gagcagcugc 60
ucccuggggu gcgaucugcc agagacccac agccuugaca acagaagaac cuugaugcuc 120
uuggcccaaa ugucaagaau aagcccuagc ucaugucuga uggaccggca ugauuucggc 180
uuuccgcagg aggaguucga cggaaaucag uuucagaaag caccagcaau aagcgugcuc 240
cacgaacuca uucagcagau uuucaaucug uuuacuacaa aagauucauc cgcugcuugg 300
gaugaagacu ugcuugacaa guucugcacu gagcucuacc aacaacugaa cgaucuggag 360
gcaugcguca ugcaagagga gagagugggg gaaacccccc ugaugaacgc ugauuccaua 420
cuggccguga agaaauauuu ccgcagaauc acucuguacu ugacugagaa gaaguauucu 480
cccugcgcuu gggagguggu gcgcgcugag auaaugcggu ccuugucacu cagcaccaau 540
cuucaagagc ggcugaggcg caaggaauga 570
<210> 33
<211> 570
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 33
auggccucuc ccuucgcucu ucucaugguc cuugucguuc ugaguuguaa gagcaguugu 60
uccuugggcu gugacuugcc cgaaacucac agucuggaca accgccgcac gcucaugcuc 120
cucgcccaga ugucacggau cagcccguca aguugccuga uggacaggca cgauuucggg 180
uucccacagg aagaguucga ugguaaucaa uuccaaaaag cuccugcaau uucuguacug 240
caugaacuua uucagcagau cuucaaccuc uuuaccacua aagauuccuc ugccgccugg 300
gaugaggauu ugcucgauaa guucugcacc gaacucuacc agcagcugaa cgaccucgag 360
gcuuguguua ugcaggaaga gcgggugggg gagacacccc ucaugaacgc cgacagcauu 420
cuggccguga aaaaguacuu uagaagaaua acgcuguacc ucaccgaaaa gaaauacucc 480
cccugcgcuu gggaggucgu gcgcgccgag auaaugcgcu cacucucuuu gagcacaaau 540
cuccaagaac ggcugaggag aaaagaguga 570
<210> 34
<211> 570
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 34
auggcaucuc cuuucgcucu gcuuauggug cugguugugc ucucuugcaa guccagcugu 60
agccuuggau gcgaccuucc ugagacccau ucucuggaua accggaggac gcucaugcug 120
cuggcacaga ugagucggau cagcccgucc agcugucuca uggacaggca cgacuuuggu 180
uuuccccagg aggaguucga ugguaaccag uuccagaagg cgccagcaau aagcgugcug 240
cacgagcuga uucagcagau cuuuaaccuc uucacuacua aggacaguag cgcugcaugg 300
gacgaggauc uguuggauaa guucuguacg gaacuguauc agcagcucaa ugaucucgaa 360
gcauguguga ugcaagaaga gcgcgucggu gaaacuccac ugaugaacgc ugauagcauc 420
cuggccguua agaaauacuu uaggcgcauu acucuguauc ugacugagaa aaaguauagc 480
ccaugcgcau gggagguagu gcgagccgag aucaugcgca gccugucauu gucaacuaac 540
cuccaggaac gccuccgacg aaaggaguga 570
<210> 35
<211> 570
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 35
auggcaucac ccuucgcucu gcugaugguc cugguggugc ugucauguaa auccagcugc 60
agcuugggau gcgaccugcc ggaaacacau ucccucgaca auaggcggac gcugaugcug 120
cucgcucaga ugucccgcau aagcccauca agcugccuca uggaccggca cgauuuuggu 180
uucccacagg aggaguucga uggaaaccag uuccagaagg cucccgcuau cuccguucug 240
caugagcuua uucagcagau uuucaaccuc uuuacgacaa aggauucauc cgccgccugg 300
gaugaagacc ugcuggauaa guucuguacc gaguuguacc aacagcugaa cgaucucgaa 360
gccuguguca ugcaggagga gcgcgugggg gagacucccu ugaugaacgc agacucaauu 420
cuugcaguga agaaauacuu ucgccggauu acucuuuauc ucaccgagaa gaaguacagu 480
cccugcgcau gggaagucgu ucgggccgaa aucaugcggu cccugucccu uuccaccaac 540
cugcaggaac gccuucgcag aaaagaguaa 570
<210> 36
<211> 570
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> variation
<222> 81,147,186,204,222,228,276,279,330
<223> any nucleotide
<400> 36
auggcmwshc chuucgcyyu gcukauggub cusgukgubc uswshugyaa rwscwscugy 60
wsyyukggvu gygaycukcc ngarachcay wsycubgaya aymgvmgvac byusaugcus 120
yusgchcara ugwshmgvau mwscccnwsh wshugyyusa uggaymgvca ygayuuyggy 180
uuyccncagg argaguucga yggnaaycar uuycagaarg cncchgcnau mwscgudcus 240
caygarcuba uycagcagau yuuyaayyus uuyacnacna argaywshws ygcygchugg 300
gaygargayy ugyukgayaa guucugyacn garyusuayc arcarcusaa ygaycusgar 360
gcmugygusa ugcargarga rmgmgusggb garachcchy usaugaacgc hgaywshauh 420
cubgcmguka agaaruayuu ymgsmgvauy acycubuayy usachgagaa raaguaywsy 480
ccmugcgchu gggarguvgu kcgvgcygar aumaugmgvw scyuswshyu bwsmacyaay 540
cubcargarc gscubmgvmg vaargarura 570
<210> 37
<211> 189
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Met Ala Ser Pro Phe Ala Leu Leu Met Val Leu Val Val Leu Ser Cys
1 5 10 15
Lys Ser Ser Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu
20 25 30
Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser
35 40 45
Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu
50 55 60
Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu
65 70 75 80
His Glu Leu Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser
85 90 95
Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu
100 105 110
Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg
115 120 125
Val Gly Glu Thr Pro Leu Met Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys
130 135 140
Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser
145 150 155 160
Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser
165 170 175
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu
180 185
<210> 38
<211> 15
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> variation
<222> 5,10
<223> any nucleotide
<400> 38
yccancccwn ucycc 15
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> /PCR_primers="fwd_huRPL4"
<400> 39
agcgtggctg tctcctctc 19
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> /PCR_primers="rev_huRPL4"
<400> 40
gagccttgaa tacagcaggc 20
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> /PCR_primers="fwd_hu_IFNA2_v2"
<400> 41
gcttgggatg agaccctcct a 21
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> /PCR_primers="rev_huIFNA2_v2"
<400> 42
cccaccccct gtatcacac 19
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> /PCR_primers="fwd_huIFNA2_ACC1"
<400> 43
cacgagatga tccagcagat 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> /PCR_primers="rev_huIFNA2_ACC1"
<400> 44
cttgtccagc agtgtctcgt 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> /PCR_primers="fwd_huIFNA2_AMP_humod"
<400> 45
ctgctctgtt ggctgtgatt 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> /PCR_primers="rev_huIFNA2_AMP_humod"
<400> 46
caggcatgag aacaggctaa 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> /PCR_primers="fwd_huIFNA2_AMP_AU"
<400> 47
tgatgcttct tgcacaaatg 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> /PCR_primers="rev_huIFNA2_AMP_AU"
<400> 48
aggacaggaa tggtttcagc 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> /PCR_primers="fwd_huIFNA2_AMP_GC"
<400> 49
caaggagtcg gagtgactga 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> /PCR_primers="rev_huIFNA2_AMP_GC"
<400> 50
cagggtgatc ctctggaagt 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<223> /PCR_primers="fwd_muACTB"
<400> 51
ggctgtattc ccctccatcg 20
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<223> /PCR_primers="rev_muACTB"
<400> 52
ccagttggta acaatgccat gt 22
<210> 53
<211> 948
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 53
gggagaugag ccuaaaccuu aggcucaccc auuucaacca gucuagcagc aucugcaaca 60
ucuacaaugg ccuugaccuu ugcuuuacug guggcccucc uggugcucag cugcaaguca 120
agcugcucug ugggcuguga ucugccucaa acccacagcc uggguagcag gaggaccuug 180
augcuccugg cacagaugag gaaaaucucu cuuuucuccu gcuugaagga cagacaugac 240
uuuggauuuc cccaggagga guuuggcaac caguuccaaa aggcugaaac caucccuguc 300
cuccaugaga ugauccagca gaucuucaau cucuucagca caaaggacuc aucugcugcu 360
ugggaugaga cccuccuaga caaauucuac acugaacucu accagcagcu gaaugaccug 420
gaagccugug ugauacaggg ggugggggug acagagacuc cccugaugaa ggaggacucc 480
auucuggcug ugaggaaaua cuuccaaaga aucacucucu aucugaaaga gaagaaauac 540
agcccuugug ccugggaggu ugucagagca gaaaucauga gaucuuuuuc uuugucaaca 600
aacuugcaag aaaguuuaag aaguaaggaa ugaaaacugg uucaacaugg aaaugauuuu 660
cauuaauucg uaugccagcu caccuuuuua ugaucugcca uuucaaagac ucauguuucu 720
gcuaugacca ugacacgauu uaaaucuuuu ucaaauguuu uuaggaguau uaaucaacau 780
uguauucagc ucuuaaggca cuagucccuu acagaggacc augcugacug auccauuauc 840
uauuuaaaua uuuuuaaaau auuauuuauu uaacuauuua uaaaacaacu uauuuuuguu 900
cauauuacgu caugugcacc uuugcacagu gguuaaugua auaaaaua 948
Claims (15)
- 인간 환자에서 비-흑색종 피부암(NMSC)의 예방 및 치료에 사용하기 위한 인터페론 알파(IFN-α) 메신저-RNA(mRNA)로서, 상기 mRNA는 5' CAP 영역, 5' 비번역 영역(5'-UTR), 인간 IFN-α를 인코딩하는 코딩 영역, 3' 비번역 영역(3'-UTR) 및 폴리-아데노신 테일(폴리-A 테일)을 가지며, 특히 상기 NMSC는 광선 각화증(AK), 기저 세포 암종(BCC) 및 편평 세포 암종(SCC), 특히 AK인, IFN-α mRNA.
- 제1항에 있어서, IFN-α mRNA가 IFN-α 타입 1 mRNA(IFNa1), IFN-α 타입 2a mRNA(IFNa2a), 및 IFN-α 타입 2b mRNA(IFNa2b)로부터 선택되는, IFN-α mRNA.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리-A 테일이 적어도 100개의 아데노신 모노포스페이트, 바람직하게는 적어도 120개의 아데노신 모노포스페이트를 포함하는, IFN-α mRNA.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 5'-UTR 또는 3'-UTR 또는 5'-UTR 및 3'-UTR이 천연 IFN-α mRNA와 상이하며, 바람직하게는 5'-UTR 또는 3'-UTR 또는 5'-UTR 및 3'-UTR은 적어도 하나의 안정화 서열, 바람직하게는 일반식 (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC (SEQ ID NO:38)(여기에서, 독립적으로 Nx 및 Pyx에서 "x"는 0 내지 10, 바람직하게는 0 내지 5, 특히 0, 1, 2, 4 및/또는 5의 정수임)을 갖는 안정화 서열을 함유하는, IFN-α mRNA.
- 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 5'-UTR 또는 3'-UTR 또는 5'-UTR 및 3'-UTR이 천연 IFN-α mRNA와 상이하며, 5'-UTR 및/또는 3'-UTR은 IFN-α 이외의 상이한 인간 mRNA의 5'-UTR 및/또는 3'-UTR이며, 이는 바람직하게는 알파 글로빈, 베타 글로빈, 알부민, 리폭시게나제, ALOX15, 알파(1) 콜라겐, 티로신 하이드록실라제, 리보솜 단백질 32L, 진핵세포 신장 인자 1a(EEF1A1), 오르토폭스바이러스에 존재하는 5'-UTR 요소 및 이들의 혼합물로부터 선택되며, 특히 알파 글로빈, 베타 글로빈, 알파(1) 콜라겐 및 이들의 혼합물로부터 선택되는, IFN-α mRNA.
- 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, IFN-α mRNA에서,
- 모든 시티딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 5-메틸-시티딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 시티딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 2-아미노-2-데옥시-시티딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 시티딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 2-플루오로-2-데옥시-시티딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 시티딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 2-티오-시티딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 시티딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 5-아이오도-시티딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 우리딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 슈도-우리딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 우리딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 1-메틸-슈도-우리딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 우리딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 2-티오-우리딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 우리딘 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 5-메틸-우리딘 잔기에 의해 대체되고/거나,
- 모든 아데노신 잔기의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 50%가 N6-메틸-아데노신 잔기에 의해 대체되는, IFN-α mRNA. - 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, IFN-α mRNA가 적어도 49.5%, 바람직하게는 적어도 49.6, 더욱 바람직하게는 50%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 55%, 특히 적어도 60%의 GC 대 AU 비율을 갖는, IFN-α mRNA.
- 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, IFN-α mRNA가 적어도 0.8, 바람직하게는 적어도 0.9의 코돈 적응 지수(CAI)를 갖는, IFN-α mRNA.
- 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, IFN-α mRNA의 코딩 영역이,
- 인간 IFNa2a를 인코딩하며, 바람직하게는 SEQ ID NO:12, 특히 SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11이고/거나;
- 인간 IFNa2b를 인코딩하며, 바람직하게는 SEQ ID NO:26, 특히 SEQ ID NO: 19, 20, 22 또는 25이고/거나;
- 인간 IFNa1을 인코딩하며, 바람직하게는 SEQ ID NO:36, 특히 SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 34 또는 35인, IFN-α mRNA. - 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, IFN-α mRNA가 피하, 피내, 경피, 표피 또는 국소, 특히 표피 투여되는, IFN-α mRNA.
- NMSC, 바람직하게는 AK, BCC 및 SCC, 특히 AK의 예방 및 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 IFN-α mRNA를 포함하는 약학적 제형.
- 제11항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 폴리머 기반 담체, 특히 선형 및 분지형 PEI 및 비로머(viromer)를 포함하는 양이온 폴리머; 지질 나노입자 및 리포솜, 나노리포솜, 세라미드-함유 나노리포솜, 프로테오리포솜, 양이온 양친성 지질, 예를 들어: SAINT-지질, 천연 및 합성적으로-유래된 엑소좀, 천연, 합성 및 반합성 층판소체, 나노미립자, 칼슘 포스포르-실리케이트 나노미립자, 칼슘 포스페이트 나노미립자, 실리콘 디옥사이드 나노미립자, 나노크리스탈린 미립자, 반도체 나노미립자, 건조 분말, 폴리(D-아르기닌), 나노덴드리머, 전분-기반 전달 시스템, 미셀, 에멀젼, 졸-겔, 니오솜, 플라스미드, 바이러스, 칼슘 포스페이트 뉴클레오티드, 압타머, 펩티드, 펩티드 컨쥬게이트, 벡터 태그, 바람직하게는 소분자 표적화 컨쥬게이트 또는 바이러스 캡시드 단백질, 바람직하게는 바이오나노캡슐을 포함하는 약학적 제형.
- 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 IFN-α mRNA를 환자에 투여하기 위한 키트로서,
- 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 IFN-α mRNA, 및
- 피부 전달 장치를 포함하는 키트. - 제13항에 있어서, 피부 전달 장치가,
- 바람직하게는 바늘 기반 주사 시스템, 및 바늘-비함유 주사 시스템으로 구성된 군으로부터 선택되는 피내 전달 장치, 또는
- 바람직하게는 경피 패치, 할로우 및 솔리드 마이크로니들 시스템(hollow and solid microneedle system), 미세구조 경피 시스템, 전기영동법 시스템 및 이온이동법 시스템으로 구성된 군으로부터 선택되는 경피 전달 장치, 또는
- 바람직하게는 바늘 비함유 주사 시스템, 레이저 기반 시스템, 특히 Erbium YAG 레이저 시스템, 및 유전자 총 시스템으로 구성된 군으로부터 선택되는 표피 전달 장치인, 키트. - NMSC, 바람직하게는 AK, BCC 및 SCC의 치료 및 예방을 위한 방법으로서, 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 IFN-α mRNA가 이를 필요로 하는 환자에게 유효량으로 투여되는 방법.
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