ES2622958T3 - ARNip frente a Cbl-b combinado con citocinas e interferones en el tratamiento de cáncer - Google Patents

ARNip frente a Cbl-b combinado con citocinas e interferones en el tratamiento de cáncer Download PDF

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Abstract

Inhibidor de Cbl-b seleccionado de ácidos nucleicos inhibidores, que reducen o inhiben la expresión de Cbl-b, en combinación con al menos una citocina o un interferón seleccionado de * IL-2 y una o varias citocinas o interferones adicionales seleccionados de IL-12, IL-23, IFN-alfa e IFN-beta, o * IFN-alfa y una o varias citocinas adicionales seleccionadas de IL-15 e IL-21, o * IL-12 e IL-7, o * IL-12 e IL-15, para su uso en el tratamiento terapéutico de cáncer en un paciente, que comprende la administración in vivo del inhibidor de Cbl-b a un paciente y/o la administración ex vivo del inhibidor de Cbl-b a células NK del paciente, por lo que se inmunoactivan las células NK, y que comprende la administración in vivo de las citocinas y/o interferones a un paciente y/o la administración ex vivo de las citocinas y/o interferones a células NK del paciente, y que comprende la recirculación de células NK tratadas ex vivo al paciente.

Description

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DESCRIPCION
ARNip frente a Cbl-b combinado con citocinas e interferones en el tratamiento de cancer
La presente invencion se refiere a procedimientos terapeuticos para la activacion del sistema inmunitario innato, en particular de celulas NK.
Las celulas NK (celulas citotoxicas naturales) pertenecen a los linfocitos (subgrupo de los globulos blancos o leucocitos). Son capaces de reconocer y matar celulas anomalas, como celulas tumorales y celulas infectadas por virus. Las celulas NK no poseen receptores especlficos de antlgeno y pertenecen al sistema inmunitario innato. Las celulas NK reconocen entre otros el complejo MHC-I, que esta presente en casi todas las celulas corporales sanas. Si una celula se infecta con virus o se transforma en una celula tumoral, entonces eventualmente puede perderse el complejo MHC-I en la superficie. Las celulas NK se desarrollan al igual que los otros linfocitos a partir de celulas linfaticas precursoras en la medula osea y despues circulan en el torrente sangulneo.
Loeser y otros. (JEM (2007) doi:10.1084/iem.20061699) mostraron que Cbl-b es un regulador negativo, que es responsable de manera determinante para la “inmunorreactividad” de celulas T. Cbl-b suprime la activacion de celulas T y es capaz de impedir una reaccion autoinmunitaria. En ausencia de Cbl-b, sustancias administradas pero apenas inmunogenicas pueden conducir a la induccion de una respuesta inmunitaria fuerte. Ademas los ratones deficientes en Cbl-b (inactivacion genica homocigotica) son viables y su sistema inmunitario es capaz de reconocer de manera eficaz tumores inducidos de manera autologa y establecer contra esto una respuesta inmunitaria lltica basada sobre todo en celulas T CD8+. Sin embargo, la inactivacion total descrita de la enzima condujo igualmente a una autoinmunidad elevada tras la inmunizacion con superantlgenos.
Chiang y otros. (Journal of Clinical Investigation 117 (4) (2007): 1033-1034) escribieron que pueden usarse celulas T Cbl-b'r CD8+, para aumentar la reactividad anti-tumoral en ratones E.G7.
Kojo y otros. (PNAS 2009; 106(42): 17847-17851) describe un mecanismo influenciado por Cbl-b en una anergia desencadenada de manera artificial de celulas NKT.
El documento WO 2008/033403 A describe el aumento de la reactividad de celulas T CD8+ mediante la reduccion de la actividad de Cbl-b. Se dan a conocer secuencias de ARN inhibitorias, en particular de ARNip, frente a Cbl-b.
El documento WO 2009/073905 A2 describe un procedimiento in vitro o ex vivo para el aumento de la reaccion inmunitaria de celulas del sistema inmunitario, que se han puesto en contacto con un antlgeno, que comprende la reduccion o inhibition de la funcion Cbl-b de estas celulas, por lo que se aumenta la inmunorreactividad de las celulas frente al antlgeno.
El documento WO 2010/119061 A1 se refiere a un procedimiento para la determination intracelular de la expresion de Cbl-b.
Lametschwandtner y otros. (Journal of Immunotherapy 31 (9) (2008): 943) describen inmunoterapias que se basan en la supresion de Cbl-b en celulas T.
Wigginton y otros. (Expert Opinion on Biological Therapy 2002; 2(5): 513-524) describen la infiltration de tejido tumoral por celulas T CD8+ en el caso de la administration de IL-12 e IL-2.
Weiss y otros. (Expert Opinion on Biological Therapy, 2007; 7(11): 1705-1721) describen diferentes combinaciones de IL-12 con citocinas adicionales como principios activos frente a cancer.
Lametschwandtner y otros. (J. of Immunotherapy 2010; 33(8): 899) describen que los efectos inmunopotenciadores de IL-7 sobre T celulas humanas tienen lugar debido a una activacion de la ruta de serialization de STAT, y no debido a una represion de Cbl-b.
Stromnes y otros. (J. of Clinical Investigation 2010; 120(10): 3722-3734) muestran que la administracion de celulas T Cbl-b'A cD8 expandidas ex vivo en el caso de inmunoterapia adoptiva en ratones desencadena una reaccion antitumoral in vivo.
Por tanto se conocla que celulas T, es decir, celulas del sistema inmunitario adaptativo, pueden activarse por medio de la inhibicion de Cbl-b para fomentar una respuesta inmunitaria. Un fomento de este tipo de la respuesta inmunitaria es de interes terapeutico especialmente para enfermedades cronicas graves, en las que la actividad insuficiente del sistema inmunitario es causal para el desarrollo de la enfermedad. Tales enfermedades son por ejemplo enfermedades tumorales o infecciones cronicas. Sin embargo, precisamente respuestas inmunitarias eficaces en estas enfermedades requieren una interaction eficaz del sistema inmunitario adaptativo y del innato, en el que en particular para la activacion de celulas NK todavla no estan disponibles suficientes enfoques de tratamiento de manera cllnica.
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Por tanto, un objetivo prioritario es encontrar nuevos procedimientos, que a traves de la activacion del sistema inmunitario innato, haciendo referencia especial a celulas NK, por consiguiente puedan conducir a una efectividad fuertemente mejorada de respuestas inmunitarias.
Segun la invention este objetivo se alcanzo mediante la inhibition de Cbl-b en celulas NK.
La invencion se define mediante las reivindicaciones independientes. Todos los aspectos y objetos que difieran se describen en este caso solo para fines explicativos, y afirmaciones de que estas son parte de la invencion o similares, deben considerarse en el contexto de la solicitud tal como se ha entregado y no modifican el campo de proteccion de las reivindicaciones.
En un primer aspecto la invencion se refiere a un inhibidor de Cbl-b seleccionado de acidos nucleicos inhibidores, que reducen o inhiben la expresion de Cbl-b, en combination con al menos una citocina o un interferon seleccionado de
• IL-2 y una o varias citocinas o interferones adicionales seleccionados de IL-12, IL-23, IFN-alfa e IFN-beta, o
• IFN-alfa y una o varias citocinas adicionales seleccionadas de IL-15 e IL-21, o
• IL-12 e IL-7, o
• IL-12 e IL-15,
para su uso en el tratamiento terapeutico de cancer en un paciente que comprende la administration in vivo del inhibidor de Cbl-b a un paciente y/o la administracion ex vivo de las citocinas y/o interferones a celulas NK del paciente, y que comprende la recirculation de celulas NK tratadas ex vivo al paciente.
“Administracion de un inhibidor de Cbl-b” o “inhibicion de Cbl-b” son terminos, que en el presente documento, en particular en el caso de la description de formas de realization especiales, pueden usarse de manera intercambiable.
La combinacion de inhibidor de Cbl-b segun la invencion puede usarse para inmunoterapias en un paciente, en particular para la activacion del sistema inmunitario o del sistema inmunitario innato, especialmente mediada por celulas nK. En particular puede emplearse la divulgation para el tratamiento de cancer, de una infection vlrica, de una infeccion bacteriana, en particular de una infeccion cronica, especialmente de una infeccion cronica con bacterias intracelulares persistentes, o de una infeccion parasitaria, en particular de una micosis, en el paciente. La terapia puede ser una inmunoterapia de una enfermedad cronica, incluyendo infecciones cronicas. La infeccion puede afectar a uno o varios organos, por ejemplo el hlgado. Preferiblemente la infeccion es una infeccion vlrica. Un ejemplo es hepatitis cronica, por ejemplo desencadenada por una infeccion vlrica. Se prefiere especialmente el tratamiento de hepatitis B o hepatitis C. La activacion de celulas NK segun la invencion por medio de la inhibicion de Cbl-b es especialmente eficaz en el caso de enfermedades de este tipo. El paciente es preferiblemente un mamlfero, especialmente un ser humano.
En particular en el caso de cancer puede combinarse la activacion de celulas NK segun la invencion con terapias convencionales. Muchas terapias frente a tumores, como por ejemplo radioterapia, quimioterapia o extraction tumoral operativa, estan establecidas desde hace anos y se perfeccionan y mejoran constantemente. Las terapias nuevas comprenden inmunoterapias y terapias, que seleccionan como diana marcadores especlficos de celulas tumorales, en particular usando anticuerpos monoclonales. Precisamente el efecto de los ultimos depende tambien esencialmente de la actividad de las celulas NK, que reconocen los anticuerpos unidos a celulas tumorales a traves de determinantes de anticuerpos generales y posteriormente matan la celula tumoral. Por tanto, mediante la activacion del sistema inmunitario innato a traves del efecto de las celulas NK, se pone a disposition una estrategia adicional, que puede complementar y completar los enfoques hasta el momento para fomentar lo mas ampliamente posible las reacciones inmunitarias, especialmente para combatir celulas cancerosas. En particular, terapias que tienen una influencia citotoxica directa sobre las celulas tumorales, por ejemplo quimioterapias o radioterapias, inducen la expresion de moleculas de la clase MHC y otros receptores inmunoactivadores, por ejemplo ligandos de NKG2D. Estas modificaciones celulares se reconocen por celulas del sistema inmunitario innato, en particular celulas NK, y conducen a su activacion, que mediante la sinergia con la activacion de celulas NK segun la invencion pueden lograr un efecto terapeutico esencialmente mayor.
Segun esto la carcinomatosis que va a tratarse segun la invencion se selecciona preferiblemente de carcinomatosis del aparato reproductor, en particular cancer de ovario, cancer de testlculo, cancer de prostata o cancer de mama; carcinomatosis del aparato digestivo, en particular cancer de estomago, cancer de intestino, carcinoma rectal, cancer de pancreas, cancer de esofago y cancer de hlgado; cancer de rinon, cancer de piel, en particular melanomas, carcinomas de celulas basales y carcinomas del epitelio escamoso; neuroblastomas y glioblastomas, cancer de pulmon, cancer de tiroides, sarcomas, carcinoma de cabeza/cuello, carcinomas del epitelio escamoso,
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linfomas y leucemias (usandose en el presente documento las expresiones “cancer”, “tumor”, “carcinoma”, etc. siempre de manera sinonima y se refieren a enfermedades malignas).
El gen Cbl-b as! como sus productos genicos se han descrito detalladamente en el estado de la tecnica (UniGene Id. Hs.3144 y Hs.381921). Las secuencias de Cbl-b estan publicadas por ejemplo en la base de datos de GenBank con el n.° de registro NM_008279 y NP_009112. Los anticuerpos anti-Cbl-b, ARNip e inhibidores antisentido estan disponibles comercialmente. Determinados ARNip adecuados para la reduccion o inhibicion de la expresion de Cbl-b y por consiguiente tambien de la funcion Cbl-b se dan a conocer por ejemplo en el documento US 2007/0054355 con nucleotidos de ARN/ADN mixtos y una longitud de aproximadamente 20 bases.
Los inhibidores de Cbl-b son suficientemente conocidos en el estado de la tecnica. Cualquier inhibidor de Cbl-b puede emplearse segun la presente invencion. El inhibidor de Cbl-b se selecciona de acidos nucleicos inhibidores, en particular oligonucleotidos antisentido, en particular ARN antisentido, ARNip (ARN de interferencia pequeno) o ARNhp (ARN en horquilla pequeno). Los inhibidores de acido nucleico pueden usarse como tal o en forma de vectores, que codifican y expresan la inhibicion. Inhibidores de Cbl-b adecuados son por ejemplo antagonistas, aptameros o intrameros, preferiblemente se emplea ARNip de Cbl-b. La tecnologla de ARNip para atenuar la expresion genica especlfica ya se ha descrito para Cbl-b. Los inhibidores de Cbl-b en el sentido de la presente invencion son sustancias, que reducen o inhiben la expresion y/o la funcion de Cbl-b y pueden determinarse, tal como se conoce en el estado de la tecnica (Loeser y otros. (JEM (2007) doi:10.1084/iem.20061699; Chiang y otros. (Journal of Clinical Investigation 117 (4) (2007): 1033-1034); Lametschwandtner y otros. (Journal of Immunotherapy 31 (9) (2008): 943); Paolini y otros. (J Immunol. 15 de febrero de 2011;186(4):2138-47), o tal como se describe en los presentes ejemplos.
El documento US 2007/0087988 se refiere a un procedimiento para la regulacion de HPK1, cuya expresion puede aumentarse mediante el aumento de la expresion de Cbl-b y viceversa (por ejemplo mediante inhibicion por ARNip de Cbl-b).
Preferiblemente se reduce o inhibe la funcion Cbl-b mediante la reduccion o inhibicion de la expresion de Cbl-b. Los terminos reduccion o inhibicion se refieren a la disminucion de la funcion (o de la expresion) de Cbl-b en comparacion con la funcion natural sin cambios, hasta la inhibicion completa de la funcion. Preferiblemente se reduce la funcion (o expresion) en al menos el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90% o el 95%.
La reduccion o inhibicion de la funcion de Cbl-b tiene lugar en formas de realization preferidas de manera transitoria. Es decir la funcion se reduce solo temporalmente tal como se indica anteriormente y puede volver a recuperarse tras esto, por ejemplo mediante consumo o degradation de inhibidores, como por ejemplo ARNip de Cbl-b, o mediante neoformacion o de celulas no alteradas por Cbl-b in vivo. A este respecto la reduccion transitoria de Cbl-b en celulas inmunitarias tambien puede tener lugar de manera repetitiva, por ejemplo hasta lograr un exito terapeutico.
Preferiblemente se reduce o inhibe la expresion de Cbl-b mediante el uso de ARN antisentido o ARNip de Cbl-b. Para esto se emplean secuencias cortas de ADN y/o de ARN complementarias a una parte de la secuencia de ARNm (Cbl-b) diana, de modo que estas por consiguiente se hibriden e inactiven. La longitud de estas secuencias es preferiblemente de al menos 15, 18, 20, 22, 25, 28, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 o 200 bases hasta la completa secuencia diana, preferiblemente hasta 2.500, 2.000, 1.500, 1.000, 500 o 300 bases. Preferiblemente se emplean las secuencias de SEQ ID n.° 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 y/u 8.
Igualmente puede reducirse o inhibirse la funcion de Cbl-b mediante un gran numero de componentes adicionales conocidos, como por ejemplo mediante el uso de antagonistas, inhibidores, en particular aptameros o intrameros de Cbl-b. Cualquier antagonista o inhibidor, que suprime el efecto o la funcion de Cbl-b puede usarse segun la invencion para aumentar la inmunorreactividad de las celulas NK. Para la inhibicion de Cbl-b tambien pueden usarse sustancias, que o bien inhiben especlficamente la actividad enzimatica de ligasa E3 o bien inhiben la asociacion intracelular de Cbl-b con sus componentes de interaction o bien inhiben la expresion de Cbl-b. Preferiblemente se emplean antagonistas o inhibidores para la production de un agente farmaceutico para el aumento segun la invencion de la inmunorreactividad de las celulas NK. Se posibilitan tratamientos de enfermedades con un sistema inmunitario suprimido o ineficaz, en particular cancer o infecciones cronicas.
Se observo, que la inhibicion de Cbl-b junto con otras sustancias estimulantes de celulas NK (activadores de celulas NK) causa un efecto sinergico, que va mas alla de los efectos esperados de los efectos aditivos de la inhibicion de Cbl-b y activation de celulas nK. Por tanto, la administration del inhibidor de Cbl-b o la inhibicion de Cbl-b tiene lugar preferiblemente junto con una sustancia estimulante de celulas NK adicional (activador de celulas NK). A continuation se emplean los terminos “sustancia estimulante de celulas NK”, “sustancia activadora de celulas NK”, y “activador de celulas NK” de manera sinonima. Una sustancia estimulante de celulas NK de este tipo es una sustancia distinta del inhibidor de Cbl-b segun la invencion. Una sustancia estimulante de celulas Nk es una sustancia, que en uno o varios ensayos in vitro adecuados causa una activacion o estimulacion de celulas NK. Preferiblemente, la sustancia estimulante de celulas NK causa la produccion de IFN-gamma, y/o TNF-alfa, y/o la expresion en superficie de CD107a, por las celulas NK, independientemente de una inhibicion de Cbl-b. Una produccion de IFN-gamma, y/o TNF-alfa, y/o la expresion en superficie de CD107a de este tipo, puede medirse con
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los metodos conocidos en el estado de la tecnica (Fauriat Blood. 18 de marzo de 2010;115(11):2167-76; Dons'koi y otros., J Immunol Methods. 30 de septiembre de 2011;372(1-2):187-95.), o tal como se describe en los ejemplos de la presente invencion. Igualmente puede someterse a prueba el efecto de las sustancias estimulantes de celulas NK mediante la determinacion directa de la citotoxicidad o “actividad citocida” de las celulas NK (tal como se describe en el ejemplo 4, metodos correspondientes adicionales se conocen en el estado de la tecnica (Beano y otros., J Transl Med. 16 de Mayo de 2008;6:25; Claus y otros., J Immunol Methods. 28 de febrero de 2009;341(1-2):154-64; Fujisaki y otros., Cancer Res. 1 de mayo de 2009;69(9):4010-7; Cho y otros., Clin Cancer Res. 1 de agosto de 2010;16(15):3901-9), es decir se determina la citotoxicidad de las celulas NK o PBMC frente a determinadas celulas objetivo o diana (en el ejemplo 4 celulas tumorales SKBR3), por ejemplo mediante la medicion de la liberacion de la enzima LDH del citosol de la celula tumoral como medida para la lisis celular. En el caso de una medicion in vitro correspondiente preferiblemente se activan o estimulan las celulas NK, para poder medir un efecto de la inhibicion de Cbl-b, por ejemplo mediante el contacto con celulas tumorales (por ejemplo K562), y/o mediante una sustancia estimulante de celulas NK (por ejemplo una o varias citocinas, como por ejemplo IL-2 y/o IL-12), y/o un anticuerpo (por ejemplo trastuzumab (Herceptin®)).
Se da a conocer la administracion conjunta del inhibidor de Cbl-b con un activador de celulas NK, seleccionado en particular de una citocina estimulante de celulas inmunitarias, por ejemplo de una citocina de las citocinas con cadena gamma comunes, en particular IL-2, IL-15, IL-21; citocinas que estimulan celulas del sistema inmunitario tanto adaptativo as! como innato, en particular IL-12, IL-23, IL-27; citocinas de celulas efectoras como IL-1, IL-17, IL-18; un interferon, en particular interferon-alfa; o un estimulante de interferones; un anticuerpo, en particular un anticuerpo, que reconoce moleculas de la superficie de celulas tumorales, y/o un anticuerpo cuya region constante en el receptor de Fc correspondiente puede unirse a celulas NK; o un ligando de receptor de TLR o PAMP, en particular agonistas, preferiblemente de TLR-1, TLR-2, TLR-3, TLR-7, TLR-8 o TLR-9, as! como combinaciones de los activadores de celulas NK mencionados anteriormente. Con los terminos “conjuntamente” o “junto con” o “en combinacion con” o “combinado con” en relacion con la administracion de las sustancias dadas a conocer, se define la administracion de al menos un inhibidor de Cbl-b y al menos un activador de celulas NK en un paciente, que puede tener lugar en forma de una (contiene al menos un inhibidor de Cbl-b y al menos un activador de celulas NK) o varias composiciones farmaceuticas distintas (conteniendo la una al menos un inhibidor de Cbl-b, la otra al menos un activador de celulas NK, y opcionalmente composiciones farmaceuticas adicionales). Si la administracion tiene lugar por medio de varias composiciones farmaceuticas distintas, puede tener lugar la administracion conjunta al mismo tiempo o con un desfase temporal. Se prefiere en particular la administracion del inhibidor de Cbl-b junto con al menos un activador de celulas NK, en particular IL-2, IL-15, IL-12, IL-23, interferon, un estimulante de interferones, imiquimod y otros agonistas de TLR7/8, como por ejemplo resiquimod, nucleotidos ssPolyU, loxoribina, gardiquimod, CL075, CL097, CL264, 3M002; oligonucleotidos poli(I:C), oligonucleotidos CpG, ligandos de CD205 o ligandos de CD206, as! como combinaciones de los mismos. Combinaciones preferidas de activadores de celulas NK, que pueden combinarse con la administracion del inhibidor de Cbl-b, comprenden por ejemplo una citocina de las citocinas con cadena gamma comunes con uno de los otros activadores de celulas NK anteriores; o una citocina del sistema inmunitario adaptativo as! como innato con uno de los otros activadores de celulas NK anteriores. Combinaciones segun la invencion son tales con una citocina de las citocinas con cadena gamma comunes y una citocina del sistema inmunitario adaptativo as! como innato, concretamente que se administra el inhibidor de Cbl-b en combinacion con IL-2 y uno adicional seleccionado de IL-12, IL-23, IFN-alfa e IFN-beta; en combinacion con IFN-alfa y uno adicional de IL-15 e IL-21; en combinacion con IL-12 e IL-7 o en combinacion con IL-12 e IL-15.
Una citocina de las citocinas con cadena gamma comunes se selecciona de la familia de citocinas, que comparten la denominada cadena gamma de receptor de citocinas comun o “common cytokine-receptor gamma-chain" (gc o CD132) en sus complejos de receptores, y esta compuesta de diferentes miembros con una estructura similar con cuatro haces de helices alfa. Esta familia comprende por ejemplo interleucina (IL)-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21 y “linfopoyetina derivada de estroma tlmico” (TSLP). Una citocina estimulante de celulas inmunitarias, una citocina del sistema inmunitario adaptativo as! como del innato, una citocina de celulas efectoras, o un estimulante de interferones se seleccionan preferiblemente del grupo que comprende IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17a, IL-17f, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL- 35, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, IFN-lambda, TNF-alfa, y TNF-beta.
Una forma de realizacion especialmente preferida de la invencion consiste en la administracion de un inhibidor de Cbl-b junto con IL-2, opcionalmente con uno o varios activadores de celulas NK adicionales, en particular IL-12, IL-23, IFN-alfa y/o IFN-beta. Una forma de realizacion especialmente preferida adicional de la invencion consiste en la administracion de un inhibidor de Cbl-b junto con IFN-alfa, opcionalmente con uno o varios activadores de celulas NK adicionales, en particular IL-15 y/o iL-21. Una forma de realizacion especialmente preferida adicional de la invencion consiste en la administracion de un inhibidor de Cbl-b junto con lL-12, opcionalmente con uno o varios activadores de celulas NK adicionales, en particular IL-15 y/o IL-7.
Preferiblemente las sustancias estimulantes de celulas NK empleadas causan en celulas NK una produccion de IFN-gamma y/o una produccion de TNF-alfa, y/o una expresion en superficie de CD107a aumentada, y/o una citotoxicidad aumentada sobre celulas objetivo o diana. IFN-alfa, IL-12 o IL-23 causan por ejemplo especialmente fuertes respuestas a IFN-gamma en celulas NK. Sorprendentemente se observo que la activacion de celulas NK
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mediante la inhibicion de Cbl-b con sustancias estimulantes de celulas NK que causan una produccion de IFN-gamma generaba efectos sinergicos especialmente fuertes, que va mucho mas alla de los efectos esperados de las sustancias individuales.
Igualmente puede administrarse el inhibidor de Cbl-b junto con un anticuerpo por ejemplo frente a determinantes de celulas tumorales, opcionalmente combinado con uno o varios de los activadores inmunitarios enumerados anteriormente o una o varias de las sustancias estimulantes de celulas NK mencionadas anteriormente. La inhibicion de Cbl-b en celulas NK as! como la administracion del activador de celulas NK adicional o del anticuerpo dirigido contra celulas tumorales puede tener lugar in vivo por ejemplo mediante la administracion directa al paciente.
Preferiblemente el inhibidor de Cbl-b esta unido a un ligando de una molecula de reconocimiento de celulas NK, por ejemplo de una molecula de la superficie de celulas NK. Un ligando de este tipo puede ser por ejemplo una protelna u otra biomolecula que se produce de manera natural o un derivado funcional de la misma, que puede unir celulas NK. En particular un ligando de este tipo puede ser un anticuerpo frente a una molecula de reconocimiento de celulas Nk. Segun la invencion, preferiblemente se activan especlficamente las celulas NK mediante la inhibicion de Cbl-b, por ejemplo mediante el acoplamiento a un ligando de una molecula de reconocimiento de celulas NK de este tipo, in vivo. La activacion “especlfica” de celulas NK debe entenderse como un efecto aumentado sobre las celulas NK en comparacion con inespeclficas, por ejemplo administraciones de inhibidor de Cbl-b no controlado o no acoplado, que tambien pueden desarrollar efectos en otras celulas. En particular debe entenderse la activacion “especlfica” de celulas NK como un efecto sobre en particular celulas NK en comparacion con la administracion de un inhibidor de Cbl-b solo (sin la administracion conjunta con un activador de celulas NK), o en comparacion con la administracion de un inhibidor de Cbl-b, que no esta unido a un ligando de una molecula de reconocimiento de celulas NK. Una administracion inespeclfica tiene lugar por ejemplo mediante una administracion simple del inhibidor sin una administracion adicional de estimulantes de celulas NK o modificaciones especlficas de celulas NK del inhibidor mediante acoplamiento a una molecula de reconocimiento de celulas NK. Mediante la activacion especlfica de celulas NK puede controlarse de manera dirigida la respuesta inmunitaria transmitida por celulas NK (sistema inmunitario innato) segun la invencion, con efectos secundarios menores o no deseados, por ejemplo mediante el sistema inmunitario adaptativo.
Por el termino “anticuerpos” se entienden todos los anticuerpos que se producen de manera natural, como anticuerpos IgG, IgD, IgA, IgE, IgM, as! como sus derivados funcionales, que comprenden por ejemplo fragmentos Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, anticuerpos monocatenarios (scAb o scFv), o un fragmento de un dominio variable de anticuerpo, y que unen especlficamente un antlgeno, en este caso en particular una molecula de reconocimiento de celulas NK, o el receptor de Fc correspondiente a celulas NK o estan dirigidas contra las mismas. Los anticuerpos segun la invencion presentan preferiblemente una region constante, en particular un dominio Fc, que puede unirse al receptor de Fc correspondiente a celulas NK. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Los anticuerpos, que deben administrarse tal como se ha descrito anteriormente en una terapia en combinacion con el inhibidor de Cbl-b segun la invencion, estan dirigidos contra un epltopo de un agente patogeno, o un epltopo tumoral, y presentan preferiblemente un dominio Fc.
A las moleculas de reconocimiento de celulas NK preferidas pertenecen en particular aquellas que o bien solo aparecen especlficamente en celulas NK o bien que se expresan de manera especialmente frecuente en celulas NK y dado el caso adicionalmente incluso en celulas inmunitarias adicionales cuya actividad puede aumentarse segun lo deseado mediante la inhibicion de Cbl-b por ejemplo CD2, CD8a, CD16, Cd25, CD27, cD56, CD71, CD158, CD159, CD160, CD161, CD205, CD206, CD205, CD314, CD335, CD336, CD337. De esta manera puede acercarse el inhibidor de Cbl-b especlficamente o bien a celulas NK o bien a celulas NK y subtipos relevantes adicionales de celulas inmunitarias en un paciente y absorberse por las celulas. Por consiguiente puede causarse que el inhibidor de Cbl-b solo sea terapeuticamente eficaz especlficamente en las celulas objetivo deseadas.
En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un inhibidor de Cbl-b seleccionado de acidos nucleicos inhibidores, que reducen o inhiben la expresion de Cbl-b, y
• IL-2 y una o varias citocinas o interferones adicionales seleccionados de IL-12, IL-23, IFN-alfa e IFN-beta, o
• IFN-alfa y una o varias citocinas adicionales seleccionadas de IL-15 e IL-21, o
• IL-12 e IL-7, o
• IL-12 e IL-15,
para su uso en el tratamiento terapeutico de cancer en un paciente.
En una forma de realizacion preferida adicional, la composicion comprende IL-2 e IL-12, o IL-2 e IFN-beta, o IL-2 e IL-23, o IL-12 e IL-7, o IL-12 e IL-15, o IFN-alfa e IL-2, o IFN-alfa e IL-15, o IFN-alfa e IL-21.
Preferiblemente la composicion comprende un portador farmaceuticamente aceptable, preferiblemente adecuado
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para la administracion intracelular en un paciente, en particular vehlcuios como formulaciones de liposomas o microsomas, que se prefieren en particular para la administracion de acidos nucleicos. Las composiciones farmaceuticas pueden comprender sales farmaceuticamente adecuadas, adicionalmente tampones, componentes de tonicidad o portadores farmaceuticamente adecuados. En particular los acidos nucleicos inhibitorios, como acidos nucleicos antisentido, ARNip, ARNhp, pueden preverse en sistemas de vectores terapeuticos adecuados. Las sustancias portadoras farmaceuticas sirven para conferir una mejor tolerancia de la composition y permiten una mejor solubilidad as! como mejor biodisponibilidad de las sustancias activas. Ejemplos de esto son emulgentes, agentes espesantes, componentes redox, almidon, disoluciones alcoholicas, polietilenglicol o llpidos. La election de un portador farmaceutico adecuado depende fuertemente del tipo de administracion. Para administraciones orales pueden usarse portadores llquidos o solidos, para inyecciones son ventajosas composiciones finales llquidas.
Preferiblemente el medicamento que va a emplearse segun la invention comprende sustancias tamponantes o sustancias tonicas. Por medio de tampones puede ajustarse el valor de pH del medicamento a condiciones fisiologicas y posteriormente pueden disminuirse o tamponarse oscilaciones de pH. Un ejemplo para esto es un tampon fosfato. Las sustancias tonicas sirven para ajustar la osmolaridad y pueden comprender sustancias ionicas, como por ejemplo sales inorganicas, como NaCl, o tambien sustancias no tonicas, como por ejemplo glicerina o hidratos de carbono.
Preferiblemente la composicion que va a emplearse segun la invencion se prepara de manera adecuada para la administracion sistemica, topica, oral o intranasal. Estas formas de administracion del medicamento de la presente invencion permiten una absorcion rapida y simple. Para la administracion oral pueden tomarse por ejemplo medicamentos solidos o llquidos directamente o disueltos o diluidos.
El medicamento que va a emplearse segun la invencion se prepara preferiblemente de manera adecuada para la administracion intravenosa, intraarterial, intramuscular, intravascular, intraperitoneal o subcutanea. Para esto son adecuadas por ejemplo inyecciones o transfusiones. Las administraciones directamente en el torrente sangulneo tienen la ventaja de que los principios activos del medicamento se reparten por todo el cuerpo y alcanzan rapidamente los tejidos diana. Adicionalmente estan previstas administraciones topicas. En particular una administracion directamente en o cerca del punto, en el que debe desencadenarse o potenciarse una respuesta inmunitaria, por ejemplo el lugar de una infection o de un tumor, tiene la ventaja de que la activation de celulas NK tiene lugar de manera prioritaria en el punto de destino.
Aparte de la administracion in vivo tambien son posibles tratamientos ex vivo de celulas NK. Para esto se alslan celulas NK de un paciente, se tratan y activan ex vivo segun la invencion y a continuation se recirculan de nuevo al paciente. Un procedimiento ex vivo de este tipo para el tratamiento de celulas del sistema inmunitario se describe por ejemplo en el documento WO 2009/073905, y puede usarse aplicandolo a celulas NK segun la invencion. Preferiblemente tiene lugar la variante ex vivo del procedimiento segun la invencion en combination con los activadores de celulas NK adicionales mencionados anteriormente como citocinas estimulantes de celulas inmunitarias, en particular IL-2 y/o IL-12, un interferon o estimulante de interferones, un anticuerpo, o un ligando de receptor de TLR o PAMP, preferiblemente de TLR-2, TLR-7 o TLR-8, as! como combinaciones de los mismos. Es posible, que o bien la inhibition de Cbl-b o bien los activadores de celulas NK adicionales se administren ex vivo a las celulas NK y la activacion adicional tiene lugar in vivo, por ejemplo inhibicion de Cbl-b ex vivo y administracion in vivo del activador de celulas NK adicional, o al reves. Preferiblemente pueden realizarse ambas etapas, inhibicion de Cbl-b y activacion de celulas NK adicional, ex vivo. Las celulas NK aisladas y activadas pueden administrarse de manera dirigida en el punto de destino. Las celulas NK pueden aislarse ex vivo. Para la activacion especlfica de celulas NK pueden enriquecerse ex vivo celulas NK en un aislado celular, por ejemplo PBMC, o aislarse del mismo.
El tratamiento ex vivo de las celulas NK tambien puede comprender una expansion, preferiblemente tal como se describe en el documento US 7.435.596 B2 o WO 2006/52534 A2. Para esto pueden ponerse en contacto por ejemplo celulas NK con celulas activadoras de celulas NK, que expresan el complejo MHC-I solo de manera reducida y expresan IL-15 unido a la membrana. Alternativa o adicionalmente pueden ponerse en contacto celulas NK con iL-15 o un anticuerpo frente al receptor de IL-15 y un ligando de CD137 o un anticuerpo frente a CD137. Esta expansion se realiza opcionalmente en combinacion con los activadores de celulas NK adicionales mencionados como citocinas estimulantes de celulas inmunitarias.
La presente invencion se representa adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos, sin limitarse obligatoriamente a los mismos.
Figuras:
Figura 1: PBMC o fracciones celulares aisladas del mismo se inhibieron por medio de ARNip de Cbl-b y entonces se estimularon con IL-2 e IL-12 y se midio la production de IFN-gamma tras 24 h.
Figura 2: PBMC o fracciones celulares aisladas del mismo se inhibieron por medio de ARNip de Cbl-b, se estimularon por medio de coincubacion con la llnea celular tumoral K562 y se midio la produccion de IFN-gamma tras 24 h.
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Figura 3: Celulas NK aisladas se inhibieron por medio de ARNip de Cbl-b, y estimularon por medio de K562 o IL-2 e IL-12 y se midio la produccion de TNF-alfa tras 24 h.
Figura 4: PBMC se inhibieron con ARNip de Cbl-b, y se incubaron durante 4 h con la llnea celular tumoral SKBR3 y tal como se indica adicionalmente con la adicion de Herceptin o citocina. Entonces se determino la citotoxicidad basandose en la enzima LDH celular liberada, que se midio por medio de ensayos enzimaticos.
Figura 5: El silenciamiento de Cbl-b en celulas NK aumenta la reactividad frente a la estimulacion por IFN-alfa: las celulas NK se inhibieron por medio de ARNip de Cbl-b, y se estimularon por medio de IFN-alfa y se midio la produccion de IFN-gamma tras 24 h.
Figura 6: El silenciamiento de Cbl-b en celulas NK aumenta la reactividad frente a combinaciones de interleucinas e IFN-alfa: las celulas NK se inhibieron por medio de ARNip de Cbl-b, y se estimularon por medio de IL-2, IL-7, IL-15 o IL-21 o bien solo o bien junto con IL-12, IL-23 o IFN-alfa y se midio la produccion de TNF-alfa tras 24 h.
Figura 7: El silenciamiento de Cbl-b en celulas NK aumenta la reactividad frente a combinaciones de IL-12 con diferentes citocinas con cadena gamma de receptor de citocinas comun: las celulas NK se inhibieron por medio de ARNip de Cbl-b, y se estimularon por medio de IL-2, IL-7 o IL-15 o bien solo o bien junto con IL-12 y se midio la produccion de IFN-gamma tras 24 h.
Figura 8: El silenciamiento de Cbl-b en celulas NK aumenta la reactividad no solo frente a combinaciones de IL-2 con IL-12, IL-23 e IFN-alfa o IFN-beta: las celulas NK se inhibieron por medio de ARNip de Cbl-b, y se estimularon por medio de IL-23, IFN-alfa o IFN-beta o bien solo o bien en presencia de IL-2 y se midio la produccion de IFN-gamma tras 24 h.
Figura 9: La reactividad aumentada de celulas NK tras el silenciamiento de Cbl-b frente a estimulacion de citocinas conduce a un aumento del marcador de activacion CD69 sobre la superficie celular: las celulas NK se inhibieron por medio de ARNip de Cbl-b, y se estimularon por medio de IL-2 y o bien IFN-alfa o bien IL-12 y se determino la expresion de CD69 tras 48 h.
Ejemplo 1: Secuencias
Las siguientes secuencias de ARNip se emplearon para la inhibicion de Cbl-b:
A. Secuencia sentido:
GUACUGGUCCGUUAGCAAAUU (SEQ ID n.° 1)
Secuencia antisentido:
5'-PUUUGCUAACGGACCAGUACUU (SEQ ID n.° 2)
B. Secuencia sentido:
GGUCGAAUUUUGGGUAUUAUU (SEQ ID n.° 3)
Secuencia antisentido:
5'-PUAAUACCCAAAAUUCGACCUU (SEQ ID n.° 4)
Ejemplo 2: Inhibicion de Cbl-b en celulas NK
Por medio de tubitos CPT (Vacutainer) se le extrajo sangre completa a un donante y de esta se separo PBMC mediante centrifugacion. A partir de PBMC se aislaron celulas NK (incluyendo la fraccion CD8+ CD3-) y despues las celulas T CD8 y CD4 por medio de seleccion magnetica. Por medio de FACS se verifico que la pureza de las poblaciones celulares correspondientes era de al menos el 90%. Se transfectaron tanto las PBMC as! como las fracciones celulares aisladas de las mismas con ARNip de Cbl-b usando un aparato de transfeccion de Amaxa y se estimularon con IL-2 (50 ng/ml) e IL-12 (10 ng/ml) humanas recombinantes durante la noche en medio Xvivo15 (figura 1). La secrecion de IFN-gamma de las celulas tratadas de este modo se midio entonces por medio de ELISA. El resultado muestra claramente que la produccion de IFN-gamma fuertemente aumentada de PBMC inhibidas por Cbl-b tras la estimulacion por IL-2 e IL-12 puede asignarse inequlvocamente a la reaccion de las celulas NK.
Ejemplo 3: Inhibicion de Cbl-b en celulas NK y coestimulacion
Una posibilidad de coestimular celulas NK es a traves de llneas celulares tumorales, cuya expresion aberrante de
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marcadores en superficie ya no puede mantener el equilibrio correspondiente entre receptores de NK inhibitorios y activadores y que por consiguiente causan una activacion de las celulas NK, por ejemplo la llnea celular tumoral K562. Se aislaron PBMC as! como las celulas CD8 y NK tal como se ha descrito anteriormente y se transfectaron con ARNip de Cbl-b. Se incubaron entonces 1x10A5 de estas celulas transfectadas o bien solas (sin estimular) o bien con en cada caso 6x10A4 celulas tumorales K562 en medio Xvivo durante la noche y se determino la secrecion de IFN-gamma del mismo modo que anteriormente. La incubacion de PBMC inhibidas por Cbl-b con esta llnea celular tumoral condujo igualmente de nuevo a una fuerte produccion de IFN-gamma y a su vez pudo atribuirse la produccion de IFN-gamma claramente al aporte de las celulas NK (figura 2). Ambos metodos de estimulacion tambien condujeron a un aumento de la produccion de TNF-alfa de celulas NK tras la inhibicion de Cbl-b (figura 3).
Ejemplo 4: Citotoxicidad tumoral mediante la inhibicion de Cbl-b en celulas NK
Una de las funciones principales de las celulas NK en el contexto de la aparicion de tumores es la destruccion directa de celulas tumorales. Por tanto se sometio a prueba si las PBMC inhibidas por Cbl-b son mas capaces de destruir celulas tumorales. Como llnea celular objetivo o diana se empleo a este respecto la llnea de carcinoma de mama SKBR3 positiva para Her2, dado que en este contexto tambien puede someterse a prueba el anticuerpo frente a Her2 empleado en la terapia antitumoral (trastuzumab o Herceptin). Se volvieron a aislar PBMC tal como se ha descrito anteriormente y se transfectaron con ARNip de Cbl-b y se incubaron o bien solas o bien con 4x10A4 celulas SKBR3 en medio Xvivo durante 4 h. Adicionalmente en las condiciones especificadas con Herceptin se anadieron 10 mg/ml de anticuerpos Herceptin as! como en las condiciones especificadas con IL-2 e IL-12 se estimularon tal como se ha descrito anteriormente. La citotoxicidad de las PBMC sobre las celulas tumorales SKBR3 se determino entonces mediante la medicion colorimetrica de la liberation de la enzima LDH del citosol de la celula tumoral. Se determino y se resto la liberacion espontanea de esta enzima de las PBMC o las celulas tumorales, tal como se recomienda por el fabricante del kit de medicion de colorimetrla (Biovision), a partir de las condiciones de control individuales correspondientes. A este respecto se mostro que la lisis celular mediante las celulas inmunitarias inhibidas por Cbl-b era principalmente mayor que mediante las celulas tratadas con ARNip de control, en la que en particular la estimulacion simultanea con IL-2 e IL-12 conducla a un aumento significativo de la lisis de celulas tumorales (figura 4).
Estos resultados in vitro mostraron por tanto, que es posible la inhibicion simultanea de Cbl-b en celulas del sistema inmunitario adaptativo y del innato ex vivo en PBMC humanas sin separar, y adicionalmente conducen a la conclusion de que la inhibicion de Cbl-b en celulas NK crea una base racional para la combination de la inhibicion de Cbl-b con terapias frente a tumores como la administration de IL-2 recombinante o anticuerpos terapeuticos dirigidos contra antlgenos tumorales.
Ejemplo 5: El silenciamiento de Cbl-b en celulas NK aumenta la reactividad frente a la estimulacion por IFN-alfa
Se aislaron las celulas NK obtenidas en PBMC como en el ejemplo 2 y se silenciaron por medio de ARNip. Las secuencias de ARNip dirigidas contra Cbl-b empleadas a este respecto eran:
ARNip de Cbl-b 1:
5' - CUCUAUUUGCGGAAUUA - 3' (SEQ ID n.° 5)
3' - AAUUCCGCAAAAUAGAGC- 5' (SEQ ID n.° 6)
ARNip de Cbl-b 2:
5' - GUGAGAAUGAGUACUUUAAA - 3' (SEQ ID n.° 7)
3' - ACACUCUUACUCAUAAGAUU - 5' (SEQ ID n.° 8)
A continuation de esto se estimularon las celulas o bien sin citocina o bien con IFN-alfa durante la noche (5 o 50 ng/ml tal como se indica en la figura 5) y se midio entonces la secrecion de IFN-gamma de las celulas tratadas de este modo por medio de ELISA. El resultado muestra claramente que la inhibicion de Cbl-b en celulas NK conduce a una produccion de IFN-gamma fuertemente aumentada (figura 5). La produccion de IFN-gamma de celulas T y NK en el hlgado se ha definido como uno de los factores causales de la eficacia de la terapia con IFN-alfa en el tratamiento de infecciones de hepatitis cronicas. Por consiguiente existe un fundamento para una terapia de combinacion de silenciamiento de Cbl-b con terapia sistemica con IFN-alfa, en particular en los casos en los que la terapia convencional con IFN-alfa solo no basta para la curacion completa.
El hlgado es principalmente un organo diana ideal para terapias con ARNip, dado que puede modificarse bien la expresion genica en el hlgado mediante la administracion sistemica de ARNip. En el caso figurativo por tanto es posible tanto una inhibicion de Cbl-b en celulas NK mediante una administracion sistemica directa de ARNip especlfico de Cbl-b as! como una terapia celular mediante la transferencia de celulas NK silenciadas ex vivo, dado
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que hay que partir de la base de que estas migran tras la refusion intravenosa de manera suficiente a la zona del hlgado enfermado.
Ejemplo 6: El silenciamiento de Cbl-b en celulas NK aumenta la reactividad frente a combinaciones de IL-2 con IFN-alfa o IL-12/IL-23.
Dado que en los ejemplos 2 y 5 pudo mostrarse que la inhibicion de Cbl-b en celulas NK conducla a una capacidad de estimulacion aumentada mediante IFN-alfa o IL-2 e IL-12, se realizo un analisis esquematizado de la capacidad de estimulacion de celulas NK con Cbl-b silenciado. IL-2 es un miembro de la denominada familia “common cytokine receptor gamma-chain". Miembros adicionales de esta familia son entre otros IL-7, IL-15 e IL-21. IL-23 a su vez es, en distintos aspectos, estructural y funcionalmente similar a IL-12, y de ese modo se produce como IFN-alfa e IL-12 por celulas dendrlticas activadas, que de esta manera entre otros tambien desempenan un papel esencial en la activacion de celulas NK. Por tanto en este experimento se estimularon las celulas NK con las citocinas con cadena gamma de receptor de citocinas IL-2, IL-7, IL-15 e IL-21 o bien solas o bien junto con IL-12, IL-23 o IFN-alfa. En comparacion tambien se anadieron las citocinas DC IL-12, IL-23 e IFN-alfa sin citocinas con cadena gamma de receptor de citocinas. Ademas se aislaron las celulas NK obtenidas en PBMC como en el ejemplo 5 y se silenciaron por medio de ARNip (con ARNip de Cbl-b 2) y se compararon directamente las celulas NK tratadas con control o con Cbl-b silenciado entre si. Las celulas NK se estimularon con las citocinas durante la noche tal como se indica (todas las citocinas con cadena gamma de receptor de citocinas 50 ng/ml, las citocinas DC IL-12, IL-23 e IFN-alfa 10 ng/ml). Como lectura se eligio TNF-alfa (determinacion mediante ELISA), dado que TNF-alfa es una citocina clave en reacciones inmunitarias y su produccion no es tan dependiente de IL-12 como IFN-gamma. Los resultados en la figura 6 muestran que la inhibicion de Cbl-b de celulas NK conduce a una activacion esencialmente mayor y por consiguiente una mayor produccion de TNF-alfa. Especialmente fuerte era la produccion de TNF-alfa, cuando se coestimularon las celulas NK con Cbl-b silenciado con combinaciones de IL-2 y una citocina DC como IL-12, IL-23 e IFN-alfa. Sin embargo se mostro que tambien otras citocinas con cadena gamma de receptor de citocinas, especialmente IL-15 en presencia de IFN-alfa, conduclan a una reaccion esencialmente mayor de celulas NK con Cbl-b silenciado. Dado que la produccion de citocinas DC como IL-12, IL-23 e IFN-alfa in vivo se estimula sobre todo mediante componentes de patogenos que actuan como ligandos de TLR, existe por tanto un fundamento terapeutico de emplear la inhibicion de Cbl-b de celulas NK o bien en la situacion de infecciones cronicas o bien emplearla en la terapia de enfermedades tumorales con ligandos de TLR artificiales (por ejemplo ligandos de TLR7/8 como imiquimod o ligandos de TLR9 como CpG). El estlmulo adicional mediante citocinas con cadena gamma de receptor de citocinas IL-2 o IL-15 in vivo se puede trasmitir a este respecto por ejemplo mediante inmunizacion con vacunas anti-tumorales, que conducen a una produccion de IL-2 e IL-15 mediante celulas T especlficas de antlgeno activadas, o mediante la administracion terapeutica directa al paciente.
Ejemplo 7: El silenciamiento de Cbl-b en celulas NK aumenta la reactividad frente a combinaciones de IL-12 con diferentes citocinas con cadena gamma de receptor de citocinas comun.
Dado que en el ejemplo 6 se pudo mostrar que la inhibicion de Cbl-b en celulas NK puede conducir a una capacidad de estimulacion aumentada mediante diferentes citocinas con cadena gamma de receptor de citocinas, especialmente cuando se usan en combinacion con citocinas que habitualmente producen DC, se sometio a prueba si aparte de IL-2 tambien IL-7 o IL-15 junto con IL-12, el factor clave para la induccion de IFN-gamma, podlan conducir a una produccion aumentada de esta citocina. Ademas se aislaron las celulas NK obtenidas en PBMC como en el ejemplo 5 y 6, se silenciaron y se estimularon con las citocinas IL-2 (50 ng/ml), IL-7 e IL-15 (en cada caso 20 ng/ml) o bien solas o bien en presencia de IL-12 (10 ng/ml) durante la noche tal como se indica. La produccion de IFN-gamma se determino por medio de ELISA. Los resultados en la figura 7 muestran que las celulas NK con Cbl-b silenciado son capaces de presentar una reaccion esencialmente mas fuerte en forma de produccion de IFN-gamma en las 3 citocinas sometidas a prueba con cadena gamma de receptor de citocinas en presencia de IL-12. Igualmente se mostro que solo las celulas NK con Cbl-b silenciado eran capaces de presentar una produccion medible de IFN-gamma debido solo a estimulacion con IL-2. IL-2 se ha autorizado para la terapia de determinadas enfermedades tumorales malignas, pero solo muestra en una pequena proporcion de los pacientes un efecto suficiente. La inhibicion de Cbl-b en celulas NK es segun esto una estrategia potencial de mejorar la eficacia de IL-2 en la terapia antitumoral. Adicionalmente las celulas NK con Cbl-b silenciado son capaces de reaccionar de manera esencialmente mas fuerte a la presencia de IL12 e IL-7 o IL-15.
Ejemplo 8: El silenciamiento de Cbl-b en celulas NK aumenta la reactividad no solo frente a combinaciones de IL-2 con IL-12, IL-23 e IFN-alfa sino tambien con IFN-beta.
Dado que en el ejemplo 6 se mostro que la inhibicion de Cbl-b en celulas NK conducla a una capacidad de estimulacion aumentada mediante IL-2 e IFN-alfa, tambien se sometio a prueba si IFN-beta era capaz de provocar un efecto del mismo tipo. Ademas se aislaron las celulas NK obtenidas en PBMC como en el ejemplo 6, se silenciaron y se estimularon con las citocinas IL-23, IFN-alfa o IFN-beta y o bien solas o bien en presencia de IL-2 (50 ng/ml) durante la noche tal como se indica. La produccion de IFN-gamma se determino por medio de ELISA. Los resultados en la figura 8 muestran que las celulas NK con Cbl-b silenciado son capaces de presentar una reaccion esencialmente mas fuerte en forma de produccion de IFN-gamma en las 3 citocinas sometidas a prueba en presencia de IL-2.

Claims (11)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    REIVINDICACIONES
    1. Inhibidor de Cbl-b seleccionado de acidos nucleicos inhibidores, que reducen o inhiben la expresion de Cbl-b, en combinacion con al menos una citocina o un interferon seleccionado de
    • IL-2 y una o varias citocinas o interferones adicionales seleccionados de IL-12, IL-23, IFN-alfa e IFN-beta, o
    • IFN-alfa y una o varias citocinas adicionales seleccionadas de IL-15 e IL-21, o
    • IL-12 e IL-7, o
    • IL-12 e IL-15,
    para su uso en el tratamiento terapeutico de cancer en un paciente, que comprende la administracion in vivo del inhibidor de Cbl-b a un paciente y/o la administracion ex vivo del inhibidor de Cbl-b a celulas NK del paciente, por lo que se inmunoactivan las celulas NK, y que comprende la administracion in vivo de las citocinas y/o interferones a un paciente y/o la administracion ex vivo de las citocinas y/o interferones a celulas NK del paciente, y que comprende la recirculacion de celulas NK tratadas ex vivo al paciente.
  2. 2. Combinacion de inhibidor de Cbl-b para su uso, segun la reivindicacion 1, caracterizada por que el inhibidor de Cbl-b se selecciona de oligonucleotidos antisentido, ARNip o ARNhp.
  3. 3. Combinacion de inhibidor de Cbl-b para su uso, segun una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada por que el inhibidor de Cbl-b se administra en combinacion con IL-2 e IL-12, IL-2 e IFN-beta, IL-2 e IL-23, o IL-2 e IFN-alfa.
  4. 4. Combinacion de inhibidor de Cbl-b para su uso, segun una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada por que el inhibidor de Cbl-b se administra en combinacion con IL-12 y una o varias citocinas adicionales seleccionadas de IL-2, IL-15 e IL-7.
  5. 5. Combinacion de inhibidor de Cbl-b para su uso, segun una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que el paciente se selecciona de un mamlfero o un ser humano.
  6. 6. Composicion farmaceutica que comprende un inhibidor de Cbl-b seleccionado de acidos nucleicos inhibidores, que reducen o inhiben la expresion de Cbl-b, y
    • IL-2 y una o varias citocinas o interferones adicionales seleccionados de IL-12, IL-23, IFN-alfa e IFN-beta, o
    • IFN-alfa y una o varias citocinas adicionales seleccionadas de IL-15 e IL-21, o
    • IL-12 e IL-7, o
    • IL-12 e IL-15,
    para su uso en el tratamiento terapeutico de cancer en un paciente.
  7. 7. Composicion, segun la reivindicacion 6, caracterizada por que el inhibidor de Cbl seleccionado de oligonucleotidos antisentido, es ARNip o ARNhp.
  8. 8. Composicion, segun la reivindicacion 6 o 7, que comprende IL-2 e IL-12, o IL-2 e IFN-beta, o IL-2 e IL-23, o IL-12 e IL-7, o IL-12 e IL-15, o IFN-alfa e IL-2, o IFN-alfa e IL-15, o IFN-alfa e IL-21.
  9. 9. Composicion, segun una de las reivindicaciones 6 a 8, que comprende un portador farmaceuticamente aceptable.
  10. 10. Composicion, segun la reivindicacion 9, caracterizada por que el portador farmaceuticamente aceptable es adecuado para la administracion intracelular en un paciente.
  11. 11. Composicion, segun la reivindicacion 9 o 10, caracterizada por que el portador farmaceuticamente aceptable es una formulacion de liposomas o microsomas.
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