AT508109A1 - Verfahren zur bestimmung der cbl-b expression - Google Patents

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung intrazellulärer Proteine und Biomarker.

Der Verlauf einer Reihe von lebensbedrohlichen Erkrankungen hängt wesentlich von der Reaktion des patienteneigenen Immunsystems ab. Dies ist klarerweise bei Infektionskrankheiten der Fall, und von besonderer Bedeutung bei chronischen Infektionskrankheiten, bei denen es zu einer dauerhaften Etablierung des Erregers im Körper des Patienten kommen kann. Einer der dafür verantwortlichen Mechanismen liegt in der Entstehung von sogenannten regulatorischen T-Zellen, die in weiterer Folge die Immunantwort von Effektorzellen gegen den Erreger unterdrücken. Diese Suppression von Effektor T-Zellen erfolgt unter anderem durch von regulatorischen T-Zellen generiertes Adenosin, welches T-Zellen in einen anergischen Zustand versetzen kann. In einem solchen anergischen Zustand befindliche T-Zellen haben einen erhöhten intrazellulären Gehalt der E3-Ubiquitinligase Cbl-b.

In Abwesenheit von Cbl-b können verabreichte aber kaum immu-nogene Substanzen zur Induktion einer starken Immunantwort führen. Ferner sind Cbl-b defiziente Mäuse (homozygotischer Gen knock-out) lebensfähig und deren Immunsystem ist in der Lage effizient autolog-induzierte Tumore zu erkennen und dagegen eine vor allem auf CD8+ T Zellen-beruhende lytische Immunantwort aufzubauen (Loeser et al., JEM (2007) doi:10.1084/iem.20061699). Allerdings führte die beschriebene, gänzliche Abschaltung des Enzyms ebenfalls zu einer erhöhten Autoimmunität nach Immunisierung mit- Superantigenen. Loeser at al. konnten aufzeigen, dass Cbl-b als negativer Regulator maßgeblich für die „Immunreaktivität'' von T-Zellen verantwortlich ist.

Die Bestimmung des intrazellulären Cbl-b Proteins in T-Zellen des Patienten ist daher ein relevanter Biomarker für den Status der Immunantwort gegen bestimmte Antigene. Dieses Enzym stellt einen entscheidenden Weichenstellpunkt in der Steuerung der Immunreaktivität dar (Chiang et al., J Clin Invest (2007) doi:10.1172/JC129472).

Zhou et al. (Neurosci. Lett. (2008), doi: 10.1016/ j.neulet.2008.05.089) zeigen einen Zusammenhang der Cbl-b Menge, gemessen mittels Western-Blot von Zellhomogenisaten, und Multipler Sklerose. Der Nachteil dieser Methode liegt darin, dass die Auswertung von Zellhomogenisaten diverser Zellen keine einfache Unterscheidung aktivierter und inaktiver Immunzellen zulässt. ί ·· #··· ·#·· Μ·· · - 2 -

Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung klinisch relevante Cbl-b Mengen in Zellen bestimmen zu können.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von intrazellulärem Cbl-b-Protein in Zellen einer Probe umfassend • Einbringen eines Antikörpers, welcher Cbl-b intrazellulär bindet, in eine Zelle, • Kontaktieren lassen des Antikörpers und potentiell vorhandenem Cbl-b-Protein in der Zelle, • Detektieren von Bindungsereignissen zwischen dem Antikörper und Cbl-b, und gegebenenfalls • Quantifizieren der detektierten Bindungsereignisse, wodurch der Gehalt an Cbl-b-Protein bestimmt wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher die direkte Messung des intrazellulären Gehalts von Cbl-b in Immunzellen, die z.B. direkt aus dem Blut oder anderen Geweben (z.B. Tumorgewebe, Organbiopsien, Darmbiopsien sowie Lavage, Gelenksflüssigkeit, Cerebrospinalflüssigkeit, etc.) von Patienten gewonnen werden können. Zur weiteren Analyse können die Zellen des Patienten dabei durch in vitro oder ex vivo Verfahren mit einem Antigen kontaktiert wurden, das z.B. mit einer entsprechenden Erkrankung in funktionellem Zusammenhang steht (z.B. ein Erregerisolat für Infektionskrankheiten, Tumorantigene bei Krebserkrankungen, Autoantigene bei Autoimmunkrankheiten, Alloantigen bei Allotransplantaten, Allergene bei Allergien, etc.) um die Immunreaktivität der Zellen gegenüber solchen Stimulantien festzustellen .

Die Genprodukte des Cbl-b Gens sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben (UniGene Id. Hs.3144 und Hs.381921).

Cbl-b Sequenzen sind z.B. in der NCBI GenBank Datenbank unter den Acc. Nr. DQ349203 (Nukleinsäure) und ABC86700 (Protein) veröffentlicht. Anti-Cbl-b Antikörper sind kommerziell erhältlich, allerdings sind keine davon zur Bestimmung von intrazellulärem Cbl-b Proteingehalt bisher ausgewiesen worden.

Die intrazelluläre Messung von bestimmten Proteinen durch Antikörper hängt von diversen Faktoren ab die nicht mit Batch Methoden, wie beispielsweise die Messungen in Homogenisaten für Western-Blots, vergleichbar sind. Zum einen muss bei der intrazellulären Messung ein Antikörper in eine Zelle eingebracht werden. Dafür wird die Zelle permeabilisiert, wodurch bestimmte Mo- ·;

«I ··♦· ···· ·« • · · · · · * • t · « · · · • · · ·« · J | - 3 -leküle in die Zelle durch künstlich geschaffene Poren eindringen können. Dieses Eindringen ist nicht bei beliebige Antikörpergrößen möglich. Die Antikörper sollten möglichst klein gehalten werden. Zur intrazellulären Messung können Antikörper modifiziert werden um einen Marker anzubringen. Normalerweise wird auf Fluoreszenz-Farbstoffe als Marker bei der intrazellulären Messung zurückgegriffen. Dadurch kann sich bei bisherigen Verfahren ein Problem mit einer geringeren Nachweisgrenze und einem erhöhten Signal/Rauschverhältnis ergeben.

Ein weiterer Faktor der bei der intrazellulären Messung berücksichtigt werden muss, ist dass die Zellkomponenten bei der Permeabilisation nicht aus der Zelle heraus diffundieren sollen. Daher werden die Zellen fixiert. Darunter versteht man die Fixierung zumindest der für die Messung relevanten Zellbestandteile (Proteine, Ionen und kleine Moleküle können ausdiffundieren). Hierzu werde Proteine und gegebenenfalls auch Nukleinsäuren der Zelle durch Quervernetzungsreagenzien quervernetzt, damit diese ein stabiles Netzwerkgerüst bilden. Ein solches Quervernetzungsreagens ist beispielsweise Formaldehyd. Damit ein Antikörper zur intrazellulären Bestimmung von Cbl-b geeignet ist muss er daher vorzugsweise dessen quervernetzte Form im zellulären Kontext erkennen können. In einer Zelle sind Proteine nicht bzw. nur zu einem geringen Anteil isoliert vorhanden sondern bilden Komplexe mit diversen Bindungspartnern. Insbesondere Phosphoepitope, welche auch auf Cbl-b Vorkommen, sind generell durch Komplexierung mit anderen Proteinen verborgen (Krutzik et al., Clin. Immun. 110 (2004) : 206 - 221) .

Zur intrazellulären Messung geeignete Antikörper sollten in der Lage sein, das Protein in seinem dreidimensional gefalteten Zustand zu erkennen. Da viele Antikörper, die mit Hilfe von Peptiden oder kurzen rekombinanten Fragmenten des Antigens generiert wurden, bevorzugt lineare Epitope erkennen können ergibt sich daraus nicht unmittelbar eine Eignung für intrazelluläre Anwendungen. Die intrazelluläre Fixierung der Zellen erschwert die Erkennbarkeit von Epitopen durch Antikörper häufig zusätzlich. Eventuell können die Antikörper zwar denaturiertes Cbl-b erkennen, allerdings nur in Form von linearen Epitopen und nicht mehr im zellulären Kontext des vollständigen Proteins in permea-bilisierten und fixierten Zellen. Überraschenderweise konnte erfindungsgemäß gezeigt werden, i «··· ···· ···· ♦

t ι 4 -dass zumindest ein Antikörper auch noch nach Zellfixierung dazu geeignet ist, den Cbl-b Proteingehalt in Zellen zu bestimmen.

Die Detektion der Bindungsereignisse zwischen dem Antikörper und Cbl-b kann auf herkömmliche Art und Weise erfolgen, wie beispielsweise durch Markierung der Antikörper wobei nur jene Antikörper detektiert werden die auch Cbl-b-Proteine in den Zellen binden. Eventuell können hierzu ungebundene Antikörper durch einen Waschschritt entfernt werden. Eine entsprechende Markierung ist beispielsweise eine Fluoreszenz-Markierung oder auch eine radioaktive Markierung. Technisch nicht ausgeschlossen soll auch eine enzymatische Markierung sein, die jedoch für bestimmte Anwendungen und Zellpermeabilisationsmethoden ungeeignet sein könnte.

Die Detektion an sich kann z.B. durch geeignete Detektoren erfolgen, wobei Signale gegebenenfalls auch durch Photomultiplier verstärkt werden können. Geeignete Detektionsmittel umfassen eine Lichtquelle geeignet zur Fluoreszenz-Anregung eines ausgewählten Fluoreszenz-Markers und einen optischen Detektor.

Die Detektion der Zellen kann gegebenenfalls in einer Messzelle wie beispielsweise einer Durchflusszelle erfolgen, in der die Zellen aus z.B. einer Zellsuspension durchgeleitet werden. "Antikörper" nach der vorliegenden Erfindung betrifft sämtliche Antikörperformen und funktionelle Antikörperäquivalente, insbesondere Antikörper vom IgA, IgD, IgE, IgG, IgM Typ inklusive aller Subtypen wie z.B. IgGl oder IgG2, sowie funktionelle Antigen-spezifische Fragmente wie Fab, F(ab>2, Fv etc.. Ebenso werden künstliche und künstlich modifizierte Antikörper, wie z.B. single chain Antikörper-Fragmente (scFv) als "Antikörper" der vorliegenden Erfindung verstanden.

Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein. Er kann von einem beliebigen Organismus (inklusive isolierten Zellen desselben) stammen, insbesondere einem Säuger, im speziellen einem Primaten oder Menschen, oder einem Nager wie einer Maus,

Ratte oder Hamster.

In bevorzugten Ausführungsformen sind die Antikörper markiert, vorzugsweise Fluoreszenz-markiert.

In den weiteren Ausführungsformen umfassen die Zellen Leukozyten, vorzugsweise PBMCs (mononukleare Zellen des peripheren Blutes). In bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäß einzusetzenden Zellen Leukozyten, (T-Lymphozyten, B- 5

Lymphozyten, NK Zellen oder NKT Zellen, Monozyten, Makrophagen und/oder dendritische Zellen) insbesondere PBMCs, T-Lymphozyten, CD8+ T-Lymphozyten, CD4 + T-Lymphozyten, insbesondere Thl, Th2, Thl7, Tregs (regulatorische T-Zellen). Die Unterscheidung der verschiedenen T-Zell Subpopulationen kann Oberflächenmarker, vorzugsweise CD4, CD8, CD25, CD69, CD70, CD27, CD39, CD54, CD45RÄ, CD45RO, CD62L, CD73, CD95, CD107a, CD127, CD134, CDwl37, CD152, CD154, CCR4, CCR6, CCR7, CCR8, CXCR3, GITR, PD-1, A2AR, Zytokine insbesondere IL-2, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-26, IL-27, Interferon-γ, Lymphotxin-a, TNF-a, und weitere intrazelluläre Moleküle, insbesondere Foxp3, GATA-3, RORc, T-bet umfassen. Ebenso ist die Unterscheidung von verschiedenen Subpopulationen von NK-zellen, vorzugsweise aufgrund der Expression von CD1, CD3, CD16, CD69, CD95, CD107a, CD127, KIR- und NKR-molekülen möglich. Weiters ist die Unterscheidung von verschiedenen B-Zell-Subpopulationen möglich, vorzugsweise aufgrund der Expression von CD19, CD20, CD22, CD27, CD38, CD40, CD267, CD268, CD269, (Membran gebundenes) IgD.

Zusätzlich kann die Reaktivität von Leukozyten von Individuen gegen bestimmte Antigene in verschiedenen Subfraktionen von Immunzellen bestimmt werden. Dazu werden die Leukozyten aus Blut oder Gewebe isoliert, und dann mit für die entsprechende Krankheit relevantem Antigen kontaktiert. Dies kann durch direkte Zugabe zur unseparierten Leukozytenpräparation (z.B. PBMCs) geschehen. Ebenso kann die Kontaktierung mit dem Antigen auch in vivo erfolgen - z.B. im Verlauf einer Erkrankung. Alternativ können für die Präsentation des Antigens antigen-präsentierende Zellen verwendet werden, vorzugsweise dendritische Zellen, Monozyten, Makrophagen oder B-Zellen. Mit derart Antigen-beladenen Zellen können dann Lymphozyten, vorzugsweise T-Zellen, in Kontakt gebracht werden, um eine antigen-spezifische in vitro Stimulation zu erreichen. Die solcherart stimulierten T-Zellen können dann nach einer bestimmten Zeitspanne, vorzugsweise nach 4, 8, 12, 16, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240 Stunden auf ihre Cbl-b Expression untersucht werden, und die Cbl-b Expression kann mit der Expression der vorhin angeführten Molekülklassen korreliert werden.

Vorzugsweise werden die Zellen einzeln zur Detektion der Bindungsereignisse gemessen, vorzugsweise bei gleichzeitiger Klassifizierung oder Bestimmung des Zelltyps. Durch eine Einzel-

Vermessung der Zellen ist es. möglich aus einer Zellpopulation jene Zellen zu isolieren, die eine besonders hohe oder besonders niedrige Cbl-b Proteinmenge aufweisen. Bei bisherigen Methoden bei denen z.B. gesamte Zellfraktionen aufgeschlossen wurden besteht immer die Gefahr, dass lediglich ein Mittelwert bestimmt wird und besonders aktivierte bzw. inaktivierte Zellen nicht mehr anhand ihres Cbl-b Gehalts erkannt werden. Beim Vorkommen von gleichzeitig besonderen hohen Cbl-b-Mengen und niederen Cbl-b-Mengen in anderen Zellen würde nur ein Mittelwert bestimmt werden, der auf kein besonderes immunologisches Verhalten Rückschlüsse zulassen würde. Bei der Einzelvermessung von Zellen ist es möglich gleichzeitig z.B. andere unterschiedliche Marker, insbesondere andersfarbige Fluoreszenz-Marker einzusetzen, die ein zweites Signal aufgrund festgestellter Zelloberflächenmarker liefern, womit Zelltypen unterschieden werden können, wie oben bereits ausgeführt wurde.

In speziellen Fällen werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Zellen mit hohem Durchsatz von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 50, insbesondere mindestens 100, spezielle bevorzugt mindestens 200, Zellen pro Sekunde gemessen. Verfahren mit hohem Durchsatz (high throughput-Verfahren) haben den Vorteil, dass eine große Anzahl an Zellen pro Zeiteinheit vermessen werden. Dabei ist es insbesondere auch vom Vorteil, wenn eine oder mehrere weitere Marker neben Cbl-b zusätzlich gleichzeitig vermessen werden kann und eine parallele Zuordnung bzw. Sortierung der Zellen nach diesen Parametern ermöglicht wird. Ein solches Verfahren ist beispielsweise die Durchflusszytometrie, bei der sogar bis zu 1.000 Zellen pro Sekunde oder mehr typisiert und nach dem Cbl-b Gehalt vermessen werden können. Vorzugsweise werden Fluoreszenz-Farbstoffe zur Detektion von Cbl-b bzw. weiterer zellulärer Marker verwendet („multicolor"-basiertes Verfahren) . Durch die zusätzliche Messung von anderen intrazellulären Proteine ist es zusätzlich auch möglich die Cbl-b Menge zu Normalisieren und Abzugleichen wenn neben dem Cbl-b Gehalt weitere Kontrollwerte bzw. Kontrollproteine gemessen werden, welche einen konstanten Referenzwert der jeweiligen Zellen von Interesse darstellen und zur Normalisierung bzw. zum Vergleich der Cbl-b Werte geeignet sind.

Die in der Literatur verwendeten Bestimmungsmethoden (Western Blot) unterscheiden nicht zwischen den verschiedenen Frak- tionen von Zellen oder Zelltypen. Eine solche Unterscheidung wäre nur möglich, wenn der intrazelluläre Gehalt von Cbl-b in den entsprechenden Subfraktionen von Zellen detailliert aufgeschlüsselt werden könnte. Eine solche Analyse ist prinzipiell möglich mittels multicolorbasierter durchflusszytometrischer Verfahren. Allerdings gelang es bislang noch nicht, ein solches für klinische Anwendungen geeignetes Verfahren zu etablieren. Dies wurde erstmals mit der vorliegenden Erfindung, durch Zurverfügungstellung eines praxistauglichen Verfahrens zur Bestimmung des Cbl-b Proteingehalts in verschiedenen Subfraktionen von Zellen der Immunsystems, insbesondere von T-Zellen, ermöglicht.

Erfindungsgemäß ist es zudem möglich bei der Quantifizierung von Cbl-b einerseits die Cbl-b-Menge in den einzelnen Zellen zu unterscheiden oder auch jene Zellen zu Quantifizieren in den Cbl-b detektiert wird (ab einen bestimmten Schwellenwert). In einer Ausführungsformen eines erfindungsgemäßen Verfahrens wird daher der Anteil der Zellen, in welchen Cbl-b detektiert wird, und/oder die Menge an Cbl-b-Protein in den Zellen quantifiziert.

Es ist zudem möglich anhand der Bestimmung des Gehalts an Cbl-b-Protein in den Zellen die Immunreaktivität der Zellen zu bestimmten immunologischen Ereignissen, wie beispielsweise die Exposition zu einem Antigen, zu beurteilen. Daher wird in einer weiteren Ausführungsform die Zelle vor der Detektion der Bindungsereignisse, vorzugsweise auch vor dem Einbringen des Antikörpers, mit einem Antigen stimuliert, wobei vorzugsweise die Zellen Antigen-präsentierende Zellen umfassen. Werden nun die Zellen durch Kontakt mit dem Antigen stimuliert führt dies in weiterer Folge zu einem wesentlich erhöhten Gehalt des Cbl-b-Proteins sofern eine Anergie einsetzt, im Gegensatz zu einer optimalen Stimulation der Zellen. Zusätzlich kann das Ausmaß der Zellstimulation durch die gleichzeitige Messung weiterer Marker bestimmt werden, und damit eine Cbl-b Erhöhung durch Zellstimulation von der Cbl-b Erhöhung durch Anergie differenziert werden.

Analog zu Antigenen können die Zellen auch mit weiteren immunmodulierenden Substanzen behandelt werden, wie beispielsweise Cytokine oder Liganden von immunmodulierenden Rezeptoren. Daher werden vorzugsweise die Zellen während oder vor Detektion der Bindungsereignisse mit immunstimulierenden Substanzen, vorzugsweise Cytokin(e) oder Liganden immunmodulierender Rezeptoren, 8 insbesondere TLR (toll-like receptors), oder Antikörper gegen Oberflächenmoleküle, insbesondere CD3 und/oder CD28, behandelt.

Cbl-b ist ein potentiell phosphoryliertes oder ubiquitinier-tes Protein. Durch die Auswahl geeigneter Antikörper oder auch Unterbindung von der Detektion von Bindungsereignissen mit Cbl-b ohne Phosphat- oder Ubiquitin-Rest können gegebenenfalls Selektionen des detektieren Cbl-b vorgenommen werden. Daher wird in speziell bevorzugten Ausführungsformen die Menge von posttrans-lational modifiziertem, vorzugsweise phosphoryliertem und/oder ubiquitiniertem Cbl-b-Protein, bestimmt.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Krankheit oder Prognose des Auftretens oder des Verlaufs einer Krankheit umfassend • bestimmen des Cbl-b-Proteingehalts in Zellen einer Probe eines Subjekts wie hierin beschrieben, vorzugsweise an mindestens 2 verschiedenen Tagen, • Vergleichen des Cbl-b-Proteingehalts von Zellen erkrankter oder gesunder Vergleichssubjekte, • Feststellen eines Unterschieds zwischen dem Cbl-b-Proteingehalts des Subjekts und der Vergleichssubjekte, wodurch eine Krankheit bzw. die Prognose festgestellt wird.

Die vorliegende Erfindung beschreibt erstmals ein Verfahren zur z.B. durchflusszytometrischen Bestimmung des Cbl-b Proteingehalts in Leukozyten und ermöglicht damit eine detaillierte Analyse des Immunstatus des Patienten. Für die Bestimmung des Cbl-b Proteingehalts in Leukozyten des Patienten werden diese aus Patientengewebe isoliert, vorzugsweise aus dem peripheren Blut, Körperflüssigkeiten oder Gewebebiopsien.

Um den Verlauf einer Krankheiten zu verfolgen bzw. um eine Prognose des Auftretens einer Krankheiten vorzunehmen im Hinblick auf die Änderung des intrazellulären Gehalts an Cbl-b werden vorzugsweise Messungen des Cbl-b-Proteingehalts an 2, vorzugsweise 3, insbesondere bevorzugt 4 oder mehr, verschiedenen Zeitpunkten vorgenommen. Diese Daten können mit den Cbl-b-Proteingehalt der Vergleichssubjekte korreliert werden um signifikante Abweichungen zu einem gesunden Zustand bzw. charakteristisch für den Verlauf oder für das Auftreten einer bestimmten Krankheiten zu erkennen. Diese unterschiedlichen Zeitpunkte können im Abstand von mindestens 4, mindestens 8, mindestens 12, mindestens 16, mindestens 24, mindestens 36, mindestens 48, min- 4 «t ·* «#·· ##·* ···· · • « * · « · ·

destens 72, mindestens 96, mindestens 120, mindestens 144, mindestens 168, mindestens 192, mindestens 216 oder mindestens 240 Stunden, von mindestens 2 Tagen, vorzugsweise mindestens 1 Woche, insbesondere bevorzugt mindestens 2 Wochen oder 1 Monat oder mehr liegen.

Vorzugsweise ist das Subjekt ein Säuger oder ein Vogel, vorzugsweise ein Primat, Mensch, Nager insbesondere eine Maus, eine Ratte, ein Hamster, ein Haustier insbesondere ein Schwein,

Pferd, Kuh, Huhn, Pute, Hund oder Katze. Insbesondere bevorzugt ist das Subjekt ein Mensch.

Wie bereits oben ausgeführt können vor Bestimmung des Gehalts an Cbl-b-Protein in den Zellen diese Zellen mit einem bestimmten Antigen kontaktiert werden um eine bestimmte immunologische Reaktion festzustellen. Vorzugsweise wird hierbei ein An-tigen ausgewählt, welches in einem Zusammenhang mit den Krankheiten steht, beispielsweise welches die Krankheiten auslösen oder beeinflussen kann. Solche Antigene sind beispielsweise Allergene oder Immunogene von Patogenen. Damit umfasst ist auch die Verwendung der Epitope der Antigene. Ebenso können auch Krebsantigene oder Krebsepitope ausgewählt werden.

Vorzugsweise werden bei der Diagnose und/oder Prognose weitere Zellmarker, insbesondere zur Unterscheidung bestimmter Zelltypen und -population, vorgenommen. Für bestimmte Krankheiten ist oft ein bestimmter Zelltyp bzw. eine bestimmte Zellpopulation maßgeblich (oder ursächlich) und somit kann bei der Diagnose oder Prognose spezifisch die relevante Zellgruppe angesprochen werden.

Die Krankheiten die erfindungsgemäß untersucht werden können sind sämtliche die in einem Zusammenhang mit einer Beeinflussung einer immunologischen Antwort stehen. Insbesondere solche Krankheiten, in denen eine Veränderung der Immunantwort ursächlich für die Krankheit ist, sind besonders bevorzugt. Hierbei soll „Krankheit" als allgemeiner gesundheitsschädlicher Zustand angesehen werden, welcher sich von einem Normalzustand einer gesunden Person unterscheidet.

Eine besonders spezielle Krankheit ist eine chronische Infektion. Erfindungsgemäß kann über Cbl-b als Biomarker festgestellt werden, ob eine Immunantwort gegen eine bestimmte Infektion (z.B. Kontaktieren von Zellen des Immunsystems mit einem 10

Antigen wie oben beschrieben) ausreicht um eine Infektion zü bekämpfen oder ob die Gefahr besteht, dass sich aus einer Infektion eine chronische Infektion bildet, welche nicht ausreichend oder nicht erfolgreich durch das Immunsystem verhindert werden kann.

Eine weitere Krankheit die erfindungsgemäß bestimmt oder prognostiziert werde kann, ist eine Tumorerkrankung. Tumore die nicht ausreichend durch das Immunsystem des Subjekt bekämpft werden sind in der Lage weiter zu bestehen bzw. sich auszubreiten. Es konnte gezeigt werden, dass Cbl-b ein mitverantwortlicher Immunmodulator ist, der bei Hochregulation, oder zumindest nicht-herunterregulierung dazu führt, dass Tumore mit bestimmten Tumorantigenen nicht ausreichend durch das Immunsystem bekämpft werden. Somit ist ein weiteres wichtiges Anwendungsgebiet für Cbl-b als Biomarker Tumorerkrankungen. Für viele Tumorerkrankungen gilt der Anteil an regulatorischen und anergischen Zellen im Tumorenviroment als negativer prognostischer Marker. Daher ist auch hier die Bestimmung des Proteingehalts von Cbl-b in den im Tumor befindlichen sowie zirkulierenden Immunzellen (insbesondere in T-Zellen und NK-zellen) ein relevanter Biomarker. Da ein gewisser Anteil der an sich in einem bestimmten Gewebe befindlichen („homing") T-Zellen auch durch das Blut zirkuliert, kann bereits die Bestimmung von Cbl-b in Immunzellen des peripheren Bluts von Patienten ebenfalls als Biomarker genutzt werden.

Im weiteren Ausführungsformen ist die Krankheit eine Entzün-dungs- oder Autoimmunerkrankung. Ein weiteres Anwendungsgebiet für Cbl-b als Biomarker sind Autoimmunerkrankungen (z.B. MS, Colitis, Psoriasis, Arthritis) sowie Inflammationserkrankungen (z.B. allergisches Asthma). Die Entstehung dieser Immunerkrankungen steht in ursächlichem Zusammenhang mit der Reaktion gegen körpereigene Antigene oder an sich unschädliche Fremdantigene. Eine solche Autoimmunreaktion bzw. allergische Immunreaktion gegen unschädliche Fremdantigene wird im Normalfall durch regulatorische T-Zellen unterdrückt und T-Zellen, die auch eine gewisse Reaktivität gegen körpereigene Antigene haben befinden sich daher vorwiegend in einem anergischen Zustand. Im Verlauf von (Auto)-Immunerkrankungen werden aber autoreaktive T-Zellen aktiviert und es kommt zu chronischen entzündlichen Prozessen in betroffenen Geweben. Es wurde bereits gezeigt, dass die Menge von Cbl-b in peripheren Lymphozyten des Bluts signifikant zwischen

Multipe Sklerose (MS) Patienten und gesunden Kontrollpersonen differierte (Zhou et al., Neuroscience Letters 2008 Äug 8;440(3):336-9). Darüber hinaus war eine hochsignifikante Korrelation mit dem momentanen Zustand der MS-Patienten (Relapse versus Remission) gegeben.

In bestimmten Ausführungsformen umfasst bzw. ist die Krankheit eine Immunreaktion auf Allotransplantate. Mittels Cbl-b als Biomarker ist das Monitoring von Transplantatabstoßung in Patienten mit Allotransplantaten möglich. Auch hier herrscht ein Bedarf an Biomarkern, die ohne Biopsie des transplantierten Organs bestimmt werden können. Da in der Immuntoleranz gegenüber dem Transplantat dieselben molekularen Mechanismen wie oben skizziert relevant sind, ist die Cbl-b Expression in Leukozyten ein geeigneter Biomarker auch für den Immunstatus von Patienten in Bezug auf die Abstoßung des transplantierten Organs.

Die Krankheit kann insbesondere in speziellen Ausführungsformen eine Immunreaktion gegen Allergene, exogene Antigene oder gegen körpereigene Antigene (Autoreaktivität) umfassen. Allergien gehören zu den klassischen immunmodulierten Krankheiten welche beispielsweise auch durch eine Herunterregulation von Cbl-b maßgeblich beeinflusst werden können. Dadurch ist es möglich Cbl-b als Marker für die Diagnose oder Prognose insbesondere der Prognose des Verlaufs der Kranheit einzusetzen.

Ein weiteres Anwendungsgebiet für Cbl-b als Biomarker ist die Bestimmung der generellen Disposition von noch gesunden Individuen auf immunologische Reaktivität. Da diese Disposition die individuelle Reaktion sowohl auf exogene als auch auf körpereigene Antigene beeinflusst, ist deren Bestimmung relevant für zur Prognose der Reaktion von gesunden Individuen auf durch Impfung, Infektion oder sonstigen Kontakt in den Organismus ein-gebrachte Antigene sowie für die Disposition bezüglich immunologischer Autoreaktivität. Daher betrifft die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Bestimmung der Immunreaktivität von Zellen eines Subjekts, insbesondere Leukozyten, gegen ein Antigen umfassend • kontaktieren der Zellen mit dem Antigen, • bestimmen des Cbl-b-Proteingehalts in Zellen einer Probe des Subjekts wie hierin beschrieben, • Vergleichen des Cbl-b-Proteingehalts mit Vergleichswerten eines Cbl-b-Proteingehalts bei Immunreaktivität gegen ein

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Ve'rgleichsantigen oder Ausbleiben einer Immunreaktivität gegen ein V.ergleichsantigen, • Feststellen eines Unterschieds zwischen des Cbl-b-

Proteingehalts des Subjekts und den Vergleichswerten.

Daher kann die Cbl-b Expression als Biomarker für die immunologische Disposition von Individuen bezüglich der Reaktivität gegen Allergene, exogene Antigene oder körpereigene Antigene (Autoreaktivität) verwendet werden.

Die Expression von Cbl-b in T-Zellen ist unter anderem abhängig vom Aktivierungszustand der Zellen, T-Zellaktivierung führt zu einem Anstieg der Menge von Cbl-b mRNA und Protein.

Dies bedeutet, dass es nicht von vornherein klar ist, ob Änderungen in der Gesamtmenge von Cbl-b in Leukozyten des peripheren Bluts auf volle funktionelle T-Zellaktivierung an sich oder im Gegenteil auf einen anergischen Phänotyp zurückzuführen sind, hierin ist es daher vorteilhaft zusätzlich zu unterscheiden ob es sich bei den Zellen um solche handelt die durch ihre Aktivierung eine Immunreaktion fördern (TH, Tc) oder drosseln (Treg) . Auch beinhalten im peripheren Blut nicht nur T-Zellen Cbl-b Protein sondern bekanntermaßen beinahe alle Subtypen von Leukozyten. Es ist daher vorteilhaft, die Menge von Cbl-b Protein spezifisch nur in bestimmten Fraktionen von T-Zellen bestimmen zu können. Dies wird erfindungsgemäß z.B. durch Co-Bestimmung des Zelltyps, zumindest zur Unterscheidung Immunantwort-steigender oder -abschwächender Zellen ermöglicht.

Die Vergleichswerte um eine signifikant abweichende Cbl-b-Menge festzustellen können aus Proben anderer Subjekte ermittelt werden, vorzugsweise wobei das Antigen, mit dem die Zellen kontaktiert werden, identisch mit dem Vergleichsantigen ist, um die allgemeine Reaktivität des Antigens mit Zellen abzugleichen bzw. normalisieren. Manche Antigene neigen eher zu einer starken Bindung und Zellaktivierung und andere eher zu einer schwachen.

Vorzugsweise sind auch bei diesem Verfahren die Antigene Al lergene, exogene Antigene oder körpereigene Antigene des Subjekts.

Auch bei der Bestimmung der Immunreaktivität von Zellen eines Subjekts werden vorzugsweise die oben genannten Parameter oder Auswahl der Zellen (bzw. Kobestimmung spezieller Zell-Klassifierzungsmarker) vorgenommen.

Hierin beschrieben ist die Auswahl eines Antikörpers der ge 13 eignet ist intrazelluläres. Cbl-b zu binden, im speziellen wel-! eher ein Epitop von Cbl-b im intrazellulärem Umfeld bindet, insbesondere nach einer Fixierung, im speziellen einer Quervernetzung im zellulären Kontext. Ein solcher Antikörper stellt ebenfalls einen Erfindungsgegenstand dar, insbesondere zur Verwendung zur intrazellulären Bestimmung von Cbl-b. Daher liefert die vorliegende Erfindung einen weiteren Aspekt die Verwendung eines Antikörpers welcher intrazelluläres Cbl-b bindet zur intazellu-lären Bestimmung von Cbl-b. Mitumfasst sind hierbei Antikörperderivate oder -fragmente, wie hierin bereits beschrieben wurde. Der Antikörper ist vorzugsweise gegen den C-Terminus von Cbl-b gerichtet (bzw. spezifisch hierfür). In speziellen Ausführungsformen bindet der Antikörper ein Epitop im Bereich der C-terminalen 300, vorzugsweise 250 oder 200, vorzugsweise 180, im speziellen bevorzugt 170, besonders bevorzugt 150 oder 149, Aminosäuren von Cbl-b. Vorzugsweise ist der Antikörper spezifisch bzw. gerichtet gegen die Aminosäuren ab 833 bis zum C-Terminus, vorzugsweise Aminosäuren 833 bis 964 von Cbl-b (bzw. bindet ein Epitop in diesem Bereich), wobei die Nummerierung der Aminosäuren menschlichem Cbl-b entspricht. Der Antikörper kann z.B. durch Immunisierung mit einem Fragment umfassend Aminosäuren 833-964 von Cbl-b erzeugt werden. Der Antikörper kann von einem beliebigen Organismus, insbesondere Säuger und Nagetiere wie oben erläutert, sein. Ein Beispiel für einen erfindungsgemäß verwendbaren Antikörper ist der Antikörper Abcam ab54362 (kommerziell erhältlich von Abcam, www.abcam.com/CBLB-antibody-246C5a-ab54362.html), ein monoklonaler Mausantikörper, welcher gegen ein rekombinantes C-terminales Fragment (aa833-964) von humanem Cbl-b erzeugt wurde. Ein solcher Antikörper kann in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Insbesondere wird der Antikörper zur Bestimmung einer Krankheit wie hierin beschrieben, verwendet.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit umfassend diesen Antikörper, vorzugsweise markiert, insbesondere fluoreszenzmarkiert, und Zellfixierungsmittel und/oder Zellper-meabilisierungsmittel, vorzugsweise ausgewählt aus Formaldehyd, Methanol, Ethanol, Aceton, Triton X-100 und Saponin, vorzugsweise zusätzlich einen oder mehrere Antikörper gegen einen Oberflächenrezeptor von Lymphozyten, insbesondere T-Zellen, vorzugsweise ausgewählt aus CD3, CD4, CD8, CD19, CD69, oder auch CD4, CD8, «······ · · . ····#··♦· - 1.4 - CD25, CD69, CD70, CD27, CD39, CD54, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD73, CD95, CD107a, CD127, CD134, CDwl37, CD152, CD154, CCR4, CCR6, CCR7, CCR8, CXCR3, GITR, PD-1, A2AR, Zytokine insbesondere IL-2, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-26, IL-27, Interferon-γ, Lymphotxin-oc, TNF-a, und weitere intrazelluläre Moleküle, insbesondere Foxp3, GATA-3, RORc, T-bet, und weitere Oberflächenmarker zur funktionellen Charakterisierung von anderen Immunzellen als CD4 oder CD8 T-Zellen wie CD1, CD3, CD16, CD69, CD95, CDl07a, CD127, KIR- und NKR-moleküle, CD19, CD20, CD22, CD27, CD38, CD40, CD267, CD268, CD269, IgD.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Figuren und Beispiele illustriert, ohne darauf beschränkt zu sein.

Figuren :

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 dass bei humanen T-Zellen der Cbl-b Proteingehalt durch die Anergie-vermittelnde alleinige Stimulation des T-Zellrezeptors wesentlich höher ist, als der von optimal stimulierten (anti-CD3 und anti-CD28) T-Zellen und hohe Cbl-b Expression somit als ein Marker für anergische T-Zellen benutzt werden kann.

Fig. 2 den Test verschiedener gegen humanes und murines Cbl-b gerichteter Antikörper, ob sie im durchflusszytometrischen Bestimmungsverfahren zur Bestimmung des Cbl-b Proteingehalts in fixierten und permeabilisierten murinen Leukozyten geeignet sind.

Fig. 3 die Korrelation der Expressionsbestimmung von cblb durch RT-PCR (A), Western blot (B) und icFACS (C)von humanen T-Zellen und damit die Validierung der Cbl-b Spezifität des icFACS Stainings von Cbl-b durch ein spezifisches Silencing der Cbl-b Expression durch gegen cblb gerichtete siRNA

Beispiele :

Beispiel 1: Anergische T-Zellen haben einen besonders hohen Gehalt an intrazellulärem Cbl-b Protein. Für Fig. 1 wurden PBMCs von gesunden freiwilligen Donoren mittels dem Standardprotokoll für Dichtegradientenzentrifugation (Ficoll) präpariert und die CD8 T-Zellen durch MACS isoliert Μ · • ·

*· \ I • + • · • · 15 - (Miltenyi, Protokoll folgend den Herstellerempfehlungen). Die T-Zellen wurden dann mittels anti-CD3 oder anti-CD3 und anti-CD28-Antikörpern stimuliert, nach 24h geerntet und die Menge an Cbl-b Protein wurde durch Western-Blot mithilfe von anti-Cbl-b Antikörpern bestimmt. Dabei zeigte sich, dass ein besonders hoher Cbl-b Proteingehalt durch die Anergie-vermittelnde alleinige Stimulation des T-Zellrezeptors erreicht wird.

Beispiel 2: Bestimmung des intrazellulären Gehalts von Cbl-b in primären murinen Splenozyten mittels Durchflusszytometrie Für die Etablierung eines Protokolls zur Färbung mit spezifischen Antikörpern für die nachfolgende Erfassung mittels Durchflusszytometrie ist es wichtig, die Spezifität der Färbung zu validieren. Idealerweise verwendet man dafür zur Spezifizi-tätskontrolle Zellen, die das zu bestimmende Protein nicht mehr enthalten. Bedauerlicherweise stehen aber keine humanen Zellen zur Verfügung, die genetisch vollständig defizient für cblb gemacht wurden, sondern nur murine Zellen aus cblb knockout-Mäusen. Jedoch ist die Homologie des humanen und des murinen Cbl-b Proteins ausserordentlich hoch (>= 95%). Dies wird auch in der Spezifikation der meisten getesteten anti-Cbl-b Antikörper widergespiegelt, die als reaktiv sowohl gegen humanes als auch murines Cbl-b beschrieben wurden, allerdings nur für andere Anwendungen als die Durchflusszytometrie (Westernblot, Immunhisto-chemie), keiner der getesteten Antikörper wurde als in der Durchflusszytmoetrie funktionell beschrieben. Ein Test eines Panels kommerziell erhältlicher Antikörper ergab aber das überraschende Resultat, dass doch einer der getesteten Antikörper spezifisch Wildtypzellen färben konnte, allerdings nicht Zellen von Cbl-b defizienten Mäusen. Dieser Antikörper (Antikörper 4) ist der Antikörper Abcam ab54362, erzeugt gegen ein rekombinantes C-terminales Fragment (aa833-964) von humanem Cbl-b. Fig. 2 zeigt eine Zusammenfassung dieser Versuchsreihe, gezeigt wird dabei jeweils der Prozentanteil von Zellen der in der positiven Markerregion im Histogramm der durchflusszytometrisch detektierten Antikörper-vermittelten Fluoreszenz liegt.

Die Zellen wurden dabei nach folgendem Protokoll gefärbt:

Eine Million Zellen wurden mit 200μ1 FACS Puffer (PBS + 2% FCS) einmal gewaschen und dann fixiert und permeabilisiert durch Inkubation für 20 Minuten in 250μ1 Cytofix/Cytoperm-Lösung (Her-

V • ••«•ft·· · ·· ·····*· - 16 - steller: Becton Dickinson). Danach wurden die Zellen einmal mit 200μ1 Perm/Wash-Buffer desselben Herstellers gewaschen und mit Antikörper (verdünnt in Perm/Wash-Buffer auf eine Antikörper-Konzentration von 2pg/ml) auf Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Daraufhin wurden die Zellen zweimal in 200μ1 Perm/Wash Buffer gewaschen und mit einem Fluoreszenz-gelabelten Sekundärantikörper (anti mouse IgG-PE, Hersteller: Southern Biotech) für weitere 30 Minuten inkubiert. Schlussendlich wurden die Zellen jeweils einmal mit Wash/Perm-Buffer und mit FACS Puffer gewaschen und für die FACS-Analyse in 250μ1 FACS Puffer resuspen-diert.

Da der Fluoreszenzfarbstoff des Sekundärantikörpers in diesem Protokoll frei wählbar ist, können auch alle möglichen Multico-lorfärbungen mit anderen Markern erfolgen, um die Cbl-b Expression spezifisch in bestimmten Subpopulationen von Zellen zu de-tektieren.

Beispiel 3: Validierung des intrazellulären Cbl-b staining Protokolls durch der Cbl-b Bestimmung vorangehende Inhibition der Cbl-b Expression durch cblb spezifische siRNA

Um nachzuweisen, dass die Detektion durch den oben beschriebenen anti-Cbl-b Antikörper spezifisch für Cbl-b ist, wurden nun humane T-Zellen wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert und mittels Nukleofektion mit Cbl-b siRNA transfiziert. Die Inhibition der mRNA Neusynthese von Cbl-b wurde mittels quantitativer Real-Time PCR nachgewiesen (Fig. 3A). Folgerichtig zeigte sich auch eine signifikante Verringerung von Cbl-b im Western blot nach 24h anti CD3/28 Stimulation (Fig. 3B).

Zur Färbung von intrazellulärem Cbl-b wurden die humanen T-Zellen nach folgendem Protokoll behandelt: 100000 T-Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen, in 50μ1 PBS re-suspendiert und durch Zugabe von 50μ1 4%-Paraformaldehydlösung fixiert. Danach wurden die Zellen einmal in 200μ1 PBS und dann 2x in 200μ1 Perm Puffer (PBS mit 2% FCS und 0,1% Saponin) gewaschen. Zur Färbung mit dem cbl-b Antikörper wurden die Zellen mit einer 2pg/ml Lösung in 50μ1 Perm Puffer 30 Minuten auf 4° inkubiert. Danach wurden die Zellen zweimal mit Perm Puffer gewaschen und mit direkt gelabeltem Sekundärantikörper (anti mouse IgG-PE, Hersteller: Southern Biotech) weitere 30 Minuten auf 4° inkubiert. Schlussendlich wurden die Zellen jeweils einmal mit

Perm-Buffer und mit FACS Puffer gewaschen und für die FACS-Analyse in 250μ1. FACS Puffer resuspendiert.

In Übereinstimmung mit den Daten des Western Blots wurde auch eine signifikante Verringerung der Cbl-b Staining-Intensität in der Messung mittels Durchflusszytometrie detektiert (Fig. 3C). Diese Daten weisen somit eindeutig nach, dass das erfindungsgemäße Protokoll zur spezifischen Bestimmung des zellulären Cbl-b Proteingehalts von humanen Leukozyten mittels Durchflusszytometrie geeignet ist.

Claims (27)

1. Ansprüche: 1. Verfahren zur Bestimmung von intrazellulärem Cbl-b-Protein in Zellen einer Probe umfassend • Einbringen eines Antikörpers, welcher Cbl-b intrazellulär bindet, in eine Zelle, • Kontaktieren lassen des Antikörpers und potentiell vorhandenem Cbl-b-Protein in der Zelle, • Detektieren von Bindungsereignissen zwischen dem Antikörper und Cbl-b, • Quantifizieren der detektierten Bindungsereignisse, wodurch der Gehalt an Cbl-b-Protein bestimmt wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Leukozyten umfassen, vorzugsweise PBMCs.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper markiert sind, vorzugsweise fluoreszenzmarkiert .
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen einzeln zur Detektion der Bindungsereignisse gemessen werden, vorzugsweise bei gleichzeitiger Klassifizierung oder Bestimmung des Zelltyps.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen mit hohem Durchsatz von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 50, insbesondere mindestens 100, spezielle bevorzugt mindestens 200, Zellen pro Sekunde gemessen werden.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen durchflusszytometrisch gemessen werden .
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil der Zellen, in welchen Cbl-b detek- tiert wird, und/oder die Menge an Cbl-b-Protein in den Zellen quantifiziert wird. 19
8. .8. Verfahren nach einem; der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen vor der Detektion der Bindungsereignisse, vorzugsweise auch vor dem Einbringen des Antikörpers, mit einem Antigen stimuliert werden, wobei vorzugsweise die Zellen Antigen-präsentierende Zellen umfassen.
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen mit immunstimulierenden Substanzen, vorzugsweise Cytokin(e) oder Liganden immunmodulierender Rezeptoren, insbesondere TLR (toll-like receptors), oder Antikörper gegen Oberflächenmoleküle, insbesondere CD3 und/oder CD28, behandelt werden.
10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge von posttranslational modifiziertem, vorzugsweise phosphoryliertem und/oder ubiquitiniertem Cbl-b-Protein, bestimmt wird.
11. 11. Verfahren zur Diagnose einer Krankheit oder Prognose des Auftretens oder des Verlaufs einer Krankheit umfassend • Bestimmen des Cbl-b-Proteingehalts in Zellen einer Probe eines Subjekts nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, vorzugsweise an mindestens 2 verschiedenen Tagen, • Vergleichen des Cbl-b-Proteingehalts mit erkrankten oder gesunden Vergleichssubjekten, • Feststellen eines Unterschieds zwischen des Cbl-b-Proteingehalts des Subjekts und der Vergleichssubjekte, wodurch eine Krankheit bzw. die Prognose festgestellt wird.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 11 gekennzeichnet durch Bestimmen des Cbl-b-Proteingehalts an 2, vorzugsweise 3, insbesondere bevorzugt 4 oder mehr, verschiedenen Zeitpunkten und korrelieren des Cbl-b-Proteingehalts des Subjekts an den unterschiedlichen Zeitpunkten mit dem Cbl-b-Proteingehalt der Vergleichssubjekte.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die 2 oder mehr Zeitpunkte im Abstand von mindestens 2 Tagen, vorzugsweise mindestens 1 Woche, insbesondere bevorzugt mindestens 2 Wochen oder 1 Monat oder mehr, sind. ·· » · · « » · · « ·· »··· ···· ···· · - 20 -
14. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Subjekt ein Säuger, vorzugsweise ein Mensch ist.
15. 15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, in Verbindung mit dem Verfahren nach Anspruch 7, wobei ein Antigen ausgewählt wird, welches die Krankheit auslösen oder beeinflussen kann.
16. 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit eine chronische Infektion ist.
17. 17. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit eine Tumorerkrankung ist.
18. 18. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit eine Entzündungs- und Autoimmunerkrankung ist.
19. 19. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit eine Immunreaktion auf Allotransplantate umfasst.
20. 20. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit eine Immunreaktion gegen Allergene, exogene Antigene oder gegen körpereigene Antigene umfasst.
21. 21. Verfahren zur Bestimmung der Immunreaktivität von Zellen ei nes Subjekts, insbesondere Leukozyten, gegen ein Antigen umfassend • Kontaktieren der Zellen mit dem Antigen, • Bestimmen des Cbl-b-Proteingehalts in Zellen einer Probe des Subjekts nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, • Vergleichen des Cbl-b-Proteingehalts mit Vergleichswerten eines Cbl-b-Proteingehalts bei Immunreaktivität gegen ein Vergleichsantigen oder Ausbleiben einer Immunreaktivität gegen ein Vergleichsantigen, • Feststellen eines Unterschieds zwischen des Cbl-b- w 4- • · · 4 • · · * ·» ·· ··· · • · • · · • ···· • · • · - 21 Proteingehalts des Subjekts und den Vergleichswerten.
22. 22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Vergleichswerte aus Proben anderer Subjekte festgestellt wurden, vorzugsweise wobei das Antigen identisch mit dem Vergleichsantigen ist.
23. 23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene Allergene, exogene Antigene oder körpereigene Antigene des Subjekts sind.
24. 24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich der Gehalt oder die Aktivität von PKCtheta bestimmt wird und vorzugsweise zusätzlich mit PKCtheta Kontollwerten verglichen wird und zur Bestimmung der Immunreaktivität der Zellen verwendet wird.
25. 25. Verwendung eines Antikörpers, welcher ein Epitop von Cbl-b im intrazellulärem Umfeld bindet, insbesondere ein Epitop der C-terminalen 300 Aminosäuren von Cbl-b, zur intazellulären Bestimmung von Cbl-b.
26. 26. Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Bestimmung nach einem der Verfahren der Ansprüche 1 bis 24 durchgeführt wird, insbesondere zur Bestimmung einer Krankheit definiert wie in einem der Ansprüche 16 bis 20.
27. 27. Kit umfassend Antikörper, welcher ein Epitop von Cbl-b im intrazellulärem Umfeld bindet, insbesondere ein Epitop der C-terminalen 300 Aminosäuren von Cbl-b, vorzugsweise markiert, insbesondere fluoreszenzmarkiert, und Zellfixierungsmittel und/oder Zellpermeabilisierungsmittel, vorzugsweise ausgewählt aus Formaldehyd, Methanol, Ethanol, Aceton, Triton X-100 und Saponin, vorzugsweise zusätzlich einen oder mehrere Antikörper gegen einen Oberflächenrezeptor von Lymphozyten, insbesondere T-Zellen, vorzugsweise ausgewählt aus CD3, CD4, CD8, CD19, CD69.