DE102012009948B4

DE102012009948B4 - Verfahren zum spezifischen und quantitativen Nachweis von Antikörpern in einer Probe

Info

Publication number: DE102012009948B4
Application number: DE102012009948.7A
Authority: DE
Inventors: Christian Probst; Lars Komorowski; Inga Blöcker; Swantje Mindorf; Christiane Radzimski
Original assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Current assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Priority date: 2012-05-18
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2016-01-14
Anticipated expiration: 2032-05-19
Also published as: DE102012009948A1; WO2013170855A1

Abstract

Verfahren zur Quantifizierung von Antikörpern in einer Probe, die spezifisch an ein Zielantigen binden, mit den Schritten: – Bereitstellen wenigstens eines ersten und eines zweiten Substrates, die Zellen einer Zellpopulation aufweisen, die stabil gentechnisch verändert sind, wobei die Zellen auf dem ersten Substrat derart induziert sind, dass diese Zellen zur rekombinanten Produktion wenigstens des Zielantigens angeregt sind, während die Zellen auf dem zweiten Substrat nicht zur rekombinanten Produktion des Zielantigens angeregt sind, – Inkubation des ersten und des zweiten Substrats mit einer die Antikörper enthaltenden Probe, so dass die Antikörper zumindest teilweise an das Zielantigen binden, – Markierung wenigstens eines Bestandteils der Zellen auf dem ersten und dem zweiten Substrat, der zellzahlabhängig und zumindest zum überwiegenden Teil unabhängig von rekombinanter Expression ist, – Erzeugen eines ersten und eines zweiten Signals (F1,Ak, F2,Ak), deren Signalstärken von einer Anzahl von Antikörper-Bindungen auf den Substraten abhängig sind, – Erzeugen eines ersten und eines zweiten Signals (F1,mZ, F2,mZ), deren Signalstärken von einer Anzahl von auf den Substraten markierten Zellen abhängig sind, – Bilden der Quotienten Q1 = F1,Ak/F1,mZ und Q2 = F2,Ak/F2,mZ aus den Signalstärken der mittels des ersten und des zweiten Substrats erzeugten Signale sowie – Bestimmen der Anzahl der in der Patientenprobe befindlichen zielantigenspezifischen Antikörper auf der Grundlage eines Vergleichs der beiden Quotienten Q1, Q2.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung von Antikörpern in einer Probe, die spezifisch an einen ersten Biomarker in einem Substrat binden. Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung oder eines Zustands, der sich durch das Vorhandensein oder die Anzahl der vorhandenen Antikörper gegen einen ersten Biomarker in einer Patientenprobe auszeichnet.
Eine gängige Testmethode zur Bestimmung von Antikörpern in einer Patientenprobe ist die indirekte Immunfluoreszenz: Um die verschiedensten Autoantikörper zu identifizieren, werden in einem ersten Inkubationsschritt antigenhaltige Gewebeschnitte oder Zellen in Kontakt mit verdünntem Patientenserum gebracht. Hierbei binden sich bei positiven Proben die nachzuweisenden Antikörper an die Antigene. Ungebundene Antikörper werden durch einen Waschschritt entfernt, gebundene Antikörper beispielsweise durch einen gegen diese Immunglobulinklasse gerichteten und mit einem Fluorophor markierten Zweitantikörper nachgewiesen. Der Nachweis der Bindung des Antikörpers in der Probe erfolgt also indirekt über eine Detektion des Fluorophores des Zweitantikörpers. Insbesondere beim Einsatz von komplexen antigenhaltigen Substraten wie Gewebeschnitten oder kultivierten Zellen im Zuge eines Antikörper-Screening-Ansatzes ist eine ortsauflösende Fluoreszenzauswertung über ein bildgebendes Verfahren erforderlich. Aus der Art des so zu beobachtenden Fluoreszenzmusters können Rückschlüsse auf die Spezifität des in der Probe enthaltenen Antikörpers gezogen werden.
Ein anderer Ansatz wird gewählt, sofern das Antigen für den diagnostisch auswertbaren Antikörper bekannt und in aufgereinigter und zu einer Antikörperbindung befähigter Form vorliegt. In diesen Fällen kann das Antigen in Form aufgedruckter Antigene in der Immunfluoreszenz oder in ELISA-Verfahren eingesetzt werden. Manche Antigene können trotz ihrer Identifikation auf molekularer Ebene nicht in einer der in vivo-Situation ausreichend entsprechender Form aufgereinigt und für monospezifische Testverfahren, wie beispielsweise den ELISA bereitgestellt werden.
Bei diesen Antigenen handelt es sich häufig um Rezeptoren- bzw. kanalformende Moleküle, die eine komplexe Struktur innerhalb der Zellmembran einnehmen. In einem solchen Fall können diese Antigene mit Hilfe rekombinanter Techniken in humanen Zelllinien, beispielsweise HEK293, produziert und ohne Aufreinigungsschritte zur Antikörperbestimmung genutzt werden. Hierzu wird die für das Antigen bzw. den Antigenkomplex kodierende DNA in geeigneter Form in die Zellen eingeschleust, woraufhin es zu einer Ausbildung der die Epitope-tragenden Struktur kommt.
Bei der Auswahl des Transfektions- bzw. Expressionssystems sind Verfahren bevorzugt, die keine „Helferproteine” wie beispielsweise virale Proteine erfordern, da diese unerwünschte Antikörperbindungen verursachen können.
Die gentechnische Veränderung der Zellen kann transient erfolgen. Hierbei werden in der Regel nicht alle Zellen gentechnisch verändert. Das Substrat enthält also das zu analysierende Antigen-enthaltende und -nicht enthaltende Zellen in gemischter Anordnung. Eine spezifische Antikörperbestimmung unter Einsatz solcher Substrate erfordert die parallele Untersuchung von Zellsubstraten, die das rekombinante Antigen nicht produzieren (Negativkontrollsubstrat). Durch einen Vergleich der Signalintensität sowie dem Anteil positiver Zellen zwischen dem Antigen-haltigen und dem Negativkontrollsubstrat wird auf das Vorliegen Antigen-spezifischer Antikörper geschlossen.
Der Nachteil bei diesem Vorgehen besteht darin, dass die das rekombinante Antigen produzierenden Zellen nicht von den unveränderten Zellen unterschieden werden und folglich sporadisch auftretende meist schwach positive Reaktionen nicht sicher auf eine Reaktion von Antikörpern mit dem rekombinanten Antigen zurückgeführt werden können. Besonders problematisch ist die Bewertung in Fällen, bei denen eine Antikörperbindung an einzelne Zellen des Negativkontroll- sowie des Testsubstrates erfolgt. Da die das rekombinante Antigen produzierende Zellen nicht lokalisiert werden können. Eine Markierung der das rekombinante Antigen produzierenden Zellen mit Hilfe von Antikörpern tierischen Ursprungs stellt zwar eine Möglichkeit dar, hat jedoch den Nachteil einer potentiellen Kompetition mit den Antikörpern in der zu untersuchenden Probe.
Dieser Nachteil kann durch eine Markierung der das rekombinante Antigen produzierenden Zellen, beispielweise durch ein auf dem Expressionsplasmid zusätzlich kodiertes fluoreszierendes Protein wie grün-fluoreszierendes Protein (GFP), erreicht werden (z. B.: Brain (2008), 131, 1940–1952). Dieser Marker kann als Einzelprotein oder zusammen mit dem Antigen als Fusionsprotein bereitgestellt werden. Die Spezifität der Antikörperbindung wird bei diesem Verfahren dadurch verbessert, dass lediglich die Antikörperbindung an die das Antigen und Markerprotein produzierenden Zellen ausgewertet und mit einer lediglich das Markerprotein produzierenden Negativkontrolle verglichen wird. Dieses Verfahren ist auch mit Hilfe eines Fluoreszenzaktivierten Zellsortierers (FACS) auswertbar. Sowohl die Auswertung am FACS als auch die Auswertung mittels bildgebender Immunfluoreszenz sind apparativ aufwendig. Darüber hinaus ist die Bereitstellung stabiler bzw. fixierter Testsubstrate, die sich für einen Einsatz im Diagnostiklabor eignen auf Grund der Verwendung empfindlicher fluoreszierender Proteine beschränkt.
Eine Markierung von Zellen, die das zur Antikörpererfassung erforderliche rekombinante Antigen produzieren ist nur dann erforderlich, wenn die Zellsubstrate auch nicht das rekombinante Antigen produzierende Zellen enthalten, die Zellpopulation also nicht homogen ist.
Durch den Einsatz von Zelllinien, die das rekombinante Antigen produzieren kann sichergestellt werden, dass alle auf dem Testsubstrat enthaltenen Zellen das Zielantigen enthalten, wodurch auf eine Zellmarkierung, beispielsweise durch fluoreszierende Markerproteine, verzichtet werden kann. Besonders bevorzugt sind induzierbare Zelllinien, die sich beispielsweise mit Hilfe des von Yao et al. (Hum Gene Ther. 1998 Sep 1; 9(13): 1939–50 (PMID: 9741432)) beschriebenen und unter der Bezeichnung „T-REx^TM” kommerzialisierten Tetracyclin-induzierbaren Expressionssystem herstellen lassen. Neben dem Vorteil der weitestgehenden Ausschaltung eines Selektionsdruckes durch das rekombinante Protein, wie er bei einer konstitutiven rekombinanten Antigenexpression auftritt und einer dadurch verbesserten Herstellbarkeit der Zelllinien, besteht ein weiterer wesentlicher Vorteil darin, dass sich aus einer Zellpopulation ein bestmöglich vergleichbares uninduziertes Negativkontroll- sowie ein induziertes und Antigen-haltiges Testsubstrat herstellen und durch Fixation stabilisieren lassen. Bei Bild-basierter Auswertung wird die für das zu untersuchende Antigen-spezifische Antikörperbindung durch einen Vergleich der Signalstärken beider korrespondierender Substrate ermittelt, die separat hinsichtlich der Antikörperbindung beurteilt werden. Durch dieses Verfahren ist insbesondere die Interpretation sporadisch auftretender Bindungen von Antikörpern an einige Zellen deutlich verbessert, da inhomogene Signale auf den für das zu untersuchende Antigen homogenen Substraten als nicht signifikant für die zu untersuchende Antikörperbindung beurteilt werden können.
Insbesondere bei Proben, die eine starke und vom zu untersuchenden Antigen unabhängige Antikörperbindung an die Zellsubstrate aufweisen und bei Proben, die eine sehr geringe Antigen-spezifische Antikörperkonzentration besitzen ist eine spezifische Antikörperbindung nur unzureichend ohne photometrische Messsysteme zu ermitteln. Eine elektronische Quantifizierung des Messsignals individueller Zellen eines Substrates ist möglich, erfordert jedoch eine auf die Objektebene fokussierte, bildbasierte und folglich technisch aufwendige Auswertung (Fokussierung, Zellerkennung und Abgrenzung). Darüber hinaus müssen zahlreiche Test- und Negativkontrollzellen ausgewertet werden, um Heterogenitäten der jeweils analysierten Zellsubstrate z. B. hinsichtlich der zellspezifischen Antigenmenge oder der Antikörperbindung an Zellzyklus-spezifische und nicht mit dem zu untersuchenden Antigen in Zusammenhang stehende Antigene der „Wirtszelle” statistisch zu bewerten und zu normalisieren.
Ein großes Problem ist in der Bereitstellung von Testsubstraten zu sehen, die eine völlig homogene und mit dem korrespondierenden Kontrollsubstrat übereinstimmende Zellverteilung aufweisen. Dieses Problem ist beispielsweise dadurch begründet, dass die das rekombinante Antigen produzierenden Zellen häufig ein gegenüber der nicht zur Antigenproduktion angeregten Zellpopulation veränderte Teilungs- bzw. Wachstumsrate aufweisen. Dieses Problem kann in einigen Fällen durch die Kultivierung der korrespondierenden induzierten- sowie uninduzierten Zellpopulation bis zu einem Zeitpunkt der optimalen rek. Proteinexpression und einem anschließenden normierten Transfer der abdissoziierten Zellen auf das Testsubstrat und kurz darauf stattfindender Fixation erfolgen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass insbesondere im Falle der Ausbringung der Zellen auf Glasoberflächen und einer anschließenden Fixation sowie Fragmentierung der Substrate, keine ausreichend hohe Vergleichbarkeit der Zelldichte gewährleistet werden kann. Auch durch die Inkubationsschritte im Zuge der Antikörperbestimmung wird teilweise eine Heterogenität der Substratpaare, beispielsweise durch inhomogenen Verlust von Zellen, verursacht.
Aufgrund der ausgeführten technisch bedingten Inhomogenitäten hinsichtlich der Menge von Zellen pro Messfeld erfordert eine automatisierte Auswertung eine Fokussierung der Bildebene und eine bildgestützte Auswertung, bei der die Fluoreszenzintensitäten und ggf. Muster mehrerer Zellen pro Testsubstrat bewertet und quantifiziert werden. Eine Normierung der mittels Fluoreszenz quantifizierbaren Antikörperbindung erfordert hierbei eine bildbasierte Bestimmung der Zellzahl, durch die diese Fluoreszenz generiert wird. Ein solches Verfahren ist vergleichsweise aufwendig und langwierig.
Eine Zellquantifizierung basierend auf einer Markierung von Zellen wurde als DIMSCAN-Technologie (Proffitt et al. 1996; PubMed) beschrieben, jedoch nicht als Referenzmessung bei der Normierung von Antikörperbestimmungen genutzt.
Als besonders problematisch an den aus dem Stand der Technik bekannten Lösungen gilt, dass bei Verwendung von Zellsubstraten, die durch transiente Expression zur Antigenproduktion befähigt sind und für Antikörperbindungsstudien eingesetzt werden, eine FACS- oder Objektfokus-abhängige Auswertung erforderlich ist, um die das rekombinante Antigen produzierenden Zellen zu identifizieren. Insbesondere werden bei Markierung der das Antigen produzierenden Zellen, beispielsweise durch ein fluoreszierendes Protein, unterschiedlich transfizierte Zellsubstrate vergleichend bewertet. Da die alleinige Herstellung des Markerproteins auf dem Kontrollsubstrat jedoch quantitativ anders erfolgt als bei Koexpression mit dem zu analysierenden Antigen, ist eine Normierung des Antigen-spezifischen Antikörperbindungsfluoreszenzsignals über die Fluoreszenzintensität des Markerproteins nicht möglich und eine normierte Antikörperquantifizierung erschwert. In diesem Zusammenhang sind aus dem Stand der Technik keine Verfahren bekannt, die eine Objektfokus-unabhängige, also von einem „scharfen” Bild-unabhängige, und gleichzeitig normierte Quantifizierung einer antigenspezifischen Antikörperbindung an rekombinante induzierbare Zellsubstrate erlauben.
Ausgehend von den aus dem Stand der Technik bekannten Problemen liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde ein Verfahren anzugeben, mit dem auf vergleichsweise einfache Weise eine genaue Quantifizierung von Antikörpern in einer Probe ermöglicht werden soll. Das anzugebende Verfahren soll hierbei genau, kostengünstig auszuführen und leicht in bestehende Laborarbeitsabläufe zu integrieren sein. Mögliche Fehlerquellen, die während der Durchführung und Auswertung eines Versuchs auftreten können, sollen minimiert werden. Insbesondere soll es mit der anzugebenden technischen Lösung möglich sein, eine normierte Quantifizierung einer antigenspezifischen Antikörperbindung an rekombinante, induzierbare Zellsubstrate durchzuführen, ohne dass während der Messung die Einstellung des Objektfokus, insbesondere zwischen einem Mikroskop und dem zu untersuchenden Zellsubstrat, erforderlich ist. Auf diese Weise soll sicher gestellt werden, dass auch bei einem verhältnismäßig großen Probendurchsatz in einem Labor eine zügige und trotzdem genaue Befundung der einzelnen Proben möglich ist.
Die zuvor beschriebene Aufgabe wird mit einem Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden in der folgenden Beschreibung unter teilweiser Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung von Antikörpern in einer Probe, die spezifisch an ein Zielantigen binden, und zeichnet sich durch die Kombination folgender Schritte aus:

– Bereitstellen eines ersten und eines zweiten Substrates, die Zellen einer Zellpopulation aufweisen, die stabil gentechnisch verändert sind, wobei die Zellen auf dem ersten Substrat derart induziert sind, dass diese Zellen zur rekombinanten Produktion wenigstens des Zielantigens angeregt sind, während die Zellen auf dem zweiten Substrat nicht zur rekombinanten Produktion des Zielantigens angeregt sind,
– Inkubation des ersten und des zweiten Substrats mit einer die Antikörper enthaltenden Probe, so dass die Antikörper zumindest teilweise an das Zielantigen binden,
– Markierung wenigstens eines Bestandteils der Zellen auf dem ersten und dem zweiten Substrat, der zellzahlabhängig und zumindest zum überwiegenden Teil unabhängig von rekombinanter Expression ist,
– Erzeugen eines ersten und eines zweiten Signals (F_1,Ak, F_2,Ak), deren Signalstärken von einer Anzahl von Antikörper-Zielantigen-Bindungen auf den Substraten abhängig sind,
– Erzeugen eines ersten und eines zweiten Signals (F_1,mZ, F_2,mZ), deren Signalstärken von einer Anzahl von auf den Substraten markierten Zellen abhängig sind,
– Bilden der Quotienten Q₁ = F_1,Ak/F_1,mZ und Q₂ = F_2,Ak/F_2,mZ aus den Signalstärken der mittels des ersten und des zweiten Substrats erzeugten Signale sowie
– Bestimmen der Anzahl der in der Patientenprobe befindlichen Antikörper auf der Grundlage eines Vergleichs der beiden Quotienten Q₁, Q₂.

Auf dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Quantifizierung von Antikörpern in einer Probe kann ein Verfahren zur Diagnose einer Krankheit beruhen.
Grundlegend für das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Erfassung spezifischer Antikörper in einer Probe, vorzugsweise der Patientenprobe eines Menschen, ist zunächst die Bereitstellung eines gleichartig behandelten Paares zweier Substrate. Das Substratpaar verfügt einerseits über ein erstes Substrat mit stabil gentechnisch veränderten Zellen, die zur rekombinanten Produktion des Zielantigens angeregt sind, und andererseits über ein zweites Substrat mit Zellen, die nicht angeregt wurden. Das zweite Substrat dient hierbei der Quantifizierung einer Antikörperbindung, die nicht auf das rekombinante Antigen zurückzuführen und deswegen im Sinne der Diagnostik als unspezifisch einzustufen ist. Ferner erfolgt eine Normierung der gebundenen Antikörpermenge auf den beiden Substraten auf einen endogenen Marker, der in Zellzahl-abhängiger Menge auf den Substraten vorhanden und unabhängig von rekombinanter Expression ist. Schließlich wird die spezifische Antikörperbindung an das rekombinante Antigen ermittelt, indem die Differenz der Zellzahl normierten Antikörpermengen auf den Substraten gebildet wird. Eine Quantifizierung der in der Probe enthaltenen Antikörpermenge ist auf diese Weise mit verhältnismäßig einfachen Mitteln und dennoch hochgenau möglich. Die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile werden vor allem dadurch überwunden, dass induzierbare Zelllinien als homogene Zellpopulationen in zur Antigenproduktion angeregter bzw. unangeregter Form zur Antikörperbindung eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Normierung der Zellzahl, die mittels der Mengenbestimmung einer zellzahlabhängigen endogenen Größe realisiert wird, durch Anfärben des zellulären DNA-Gehaltes mit einem DNA-Fluorophor, vorzugsweise Hoechst 33342. Unabhängig von der Wahl des Zellbestandteils der markiert wird zeichnet sich die beschriebene technische Lösung vor allem dadurch aus, dass im Vergleich zu anderen Verfahren, insbesondere solchen, die auf einer visuellen Auswertung von Fluoreszenzmustern beruhen, eine vom Objektfokus und folglich von einem Bild gebenden Verfahren unabhängige Quantifizierung der Antigen-spezifischen Antikörperbindung realisiert wird, da lediglich das Immunglobulin-abhängige Fluoreszenzsignal in Relation zum Zellzahl-abhängigen Referenz-Fluoreszenzsignal ausgewertet wird.
Ebenso ist es denkbar, für die Durchführung einer Referenzmessung stabile zelluläre Proteine wie Actin (Cytoskelett) oder Histone (Chromatin) zur Ermittlung der Bezugsgröße zu verwenden. Bevorzugt erfolgt der Nachweis dieser Stoffe mit Hilfe von Flurophor-gekoppelten monoklonalen Antikörpern, wobei auf geeignete Weise ein Fluorophor verwendet wird, das nicht oder zumindest nur geringfügig mit dem Fluorophor am Detektionsantikörper zur Markierung der nachzuweisenden humanen Antikörper interferiert.
Gemäß einer speziellen Weiterbildung ist es denkbar, dass zur Bereitstellung des benötigten Zielantigens unpermeabilisierte, insbesondere Formalin-fixierte, das rekombinante Protein auf der Zelloberfläche exponierende Zellsubstrate verwendet werden. Hierbei sind Zelllinien, die den GABAB1- und 2-Rezeptor, den muskulären Azetylcholinrezeptor (AChR), PhospholipaseA2-Rezeptor (PLA2R), Muskel-spezifische Kinase (MuSk) und/oder Aquaporin 4 (AQP4) rekombinant und induzierbar produzieren als Substrat besonders geeignet.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich im Wesentlich dadurch aus, dass zum einen wenigstens eine gentechnisch veränderte Zelllinie, die durch einen externen Stimulus zur Produktion eines spezifischen Antigens anregbar ist und auch als induzierbare Zelllinie zu bezeichnen ist bereitgestellt wird, und zum anderen ein Testfeldpaar, auf dem in räumlicher Trennung induzierte, also das rekombinante Antigen produzierende, und uninduzierte, also das Antigen nicht rekombinant produzierende Zellen, in homogener, stabilisierter bzw. fixierter Form vorliegen, verwendet wird.
Auf bevorzugte Weise ist es denkbar, einen physiologischer Puffer zur Verdünnung der auf das Vorhandensein Antigen-spezifischer Antikörper zu untersuchenden Probe, insbesondere ein Patientenserum menschlichen Ursprungs, zu verwenden. Ebenso wird auf vorteilhafte Weise ein üblicherweise physiologischer Waschpuffer eingesetzt, um das mit der Probe inkubierte Substrat vor einer weiteren Prozessierung zu reinigen, insbesondere um nicht gebundene Antikörper zu entfernen. Gemäß einer besonderen Weiterbildung wird ferner ein auch für andere Tests verwendeter physiologischer Puffer zur Verdünnung eines Fluorophor-tragenden Zweit-Antikörpers, der den nachzuweisenden Erst-Antikörper spezifisch binden und dadurch markieren kann, verwendet. Mit Hilfe eines derartigen Fluorophor-tragenden Zweit-Antikörpers, wie etwa Cy3 oder Fluorescein, ist die Bildung von Zielantigen-Antikörper-Komplexen besonders vorteilhaft möglich. Vorzugsweise werden die verwendeten Stoffe hinsichtlich der Minimierung möglicher Kreuzreaktivitäten mit anderen Spezies optimiert.
Sofern die Auswertung der emittierten Strahlung nicht manuell sondern in einem automatisierten Prozess abläuft, ist es grundsätzlich ebenfalls denkbar, Fluorophore, die in einem für das menschliche Auge nicht sichtbaren Bereich Strahlung emittieren, einzusetzen. Wesentlich ist lediglich, dass für die eigentliche Messung einerseits und die Referenzmessung andererseits Fluorophore verwendet werden, deren Wellenlängenbereiche der emittierten Strahlung möglichst geringfügig überlappen.
In einer besonderen Ausführungsform erfolgt die Markierung der Zellen auf den bereitgestellten Substraten, indem dem bevorzugt einzusetzendem physiologischem Puffer zur Verdünnung eines Fluorophor-tragenden Zweit-Antikörpers ein Normierungs-Fluoreszenzfarbstoff zugesetzt wird, der vorzugsweise eine Markierung der genomischen DNA der Zellsubstrate ermöglicht. Das Fluorophor sollte hierbei derart gewählt werden, dass eine möglichst geringe Überstrahlung mit dem Fluorophor des Zweitantikörpers auftritt. Eine Kombination von Cy3 oder Fluorescein als Zweitantikörper mit dem Normierungsfarbstoff Hoechst 33342 erscheint hierbei besonders geeignet.
Alternativ zu der zuvor beschriebenen Markierung ist es ebenfalls denkbar, die Zellen bereits bei der Herstellung der Substrate auf geeignete Weise zu markieren. In diesem Fall ist es allerdings denkbar, dass die Referenzmarkierungen chargenabhängig leichte Unterschiede aufweisen. Derartige Unterschiede können durch das Vorsehen der Referenzmarkierung in einem Inkubationsfeld, das ein oder mehrere Substratpaare enthält, weitestgehend ausgeschlossen werden.
Gemäß einer besonders geeigneten Weiterbildung erfolgt die Auswertung der durch Fluoreszenzstrahlung verursachten Signale, also die so genannte Fluoreszenzquantifizierung, indem ein möglichst großes Messfeld mit einer darin befindlichen großen Anzahl von Zellen gewählt wird. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung sind auf einer Fläche von 1 mm² etwa 1.000 bis 3.000 Zellen vorgesehen. Wird die Fläche größer gewählt, sinkt die Fehlerwahrscheinlichkeit. Insofern sehen spezielle Ausführungsformen vor, Flächen von 4 mm² Größe mit 4.000 bis 12.000 Zellen oder von 9 mm² Größe mit 9.000 bis 27.000 Zellen vorzusehen.
Ferner ist es besonders vorteilhaft, wenn optional eine Möglichkeit zur Verifikation der Untersuchungsergebnisse vorgesehen ist. Besonders geeignet hierfür ist der Einsatz eines Epifluoreszenzverfahrens unter Verwendung schwarzer Zellträger, insbesondere eines schwarzen Deckglases. Sofern keine bildgestützte Verifikation der Untersuchungsergebnisse vorgesehen ist, kann auf der Oberfläche des Substrats, die der mit Zellen beschichteten Oberfläche gegenüber liegt, ein verspiegelter Substratträger, insbesondere ein verspiegeltes Deckglas vorgesehen sein, dass die Fluoreszenzdetektionssensitivität erheblich verstärkt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die ersten und zweiten Zellsubstrate in räumlich getrennten Kavitäten von Mikrotiterplatten angeordnet. In diesem Fall ist es auf vorteilhafte Weise möglich, in einem der IFT analogen Verfahrensablauf die Zellzahl-normierte und Antigen-spezifische Fluoreszenz beispielsweise in einem Fluoreszenzreader ermittelt wird.
Im Folgenden werden die Auswertung der einzelnen Signale und die hierauf resultierende quantitative Ermittlung der in einer Probe enthaltenen Antikörper näher erläutert.
Die Auswertung beruht auf einer Quantifizierung der Fluoreszenz des Fluorophores am Zweitantikörper sowie einer Normierungsfluoreszenz auf dem ersten Substrat, das induzierte Zellen aufweist, und einer Quantifizierung der gleichen Messwerte auf dem zweiten Substrat, das nicht induzierte Zellen aufweist und die Funktion eines Kontrollsubstrats hat.
Auf dem ersten Substrat mit induzierten Zellen werden folgende Signale erfasst:

a. Fluoreszenz aufgrund der Bindung des Fluoreszenz-markierten Zweitantikörpers: F_1,Ak
b. Zellzahlabhängige Fluoreszenz: F_1,mZ
Auf dem zweiten Substrat mit nicht induzierten Zellen werden folgende Signale erfasst:
c. Fluoreszenz aufgrund der Bindung des Fluoreszenz-markierten Zweitantikörpers: F_2,Ak
d. Zellzahlabhängige Fluoreszenz: F_2,mZ

In einem zweiten Schritt wird jeweils das auf die Zellzahl normierte Zweitantikörperspezifische Signal wie folgt ermittelt:

e. Q₁ = F_1,Ak/F_1,mZ
f. Q₂ = F_2,Ak/F_2,mZ

Gemäß einer weiteren speziellen Ausführungsform der Erfindung kann in Ergänzung anstelle der Verwendung von nicht induzierten Zellen auf dem zweiten Substrat eine statistische Erkennung von Störungen insbesondere durch fluoreszierende Staubpartikel erfolgen. In diesem Fall wird die Normierung mit Hilfe der fluoreszierenden Staubpartikel durchgeführt, das Grundprinzip der Erfindung, nämlich die Normierung und der Vergleich der Signale des ersten sowie wenigstens eines zweiten Substrates bleibt erhalten. Bei dieser speziellen Ausführung der Erfindung, die auf dem Verzicht auf ein nicht induziertes Substrat beruht, wird allerdings nicht erkannt, ob die Antikörper spezifisch an das rekombinante Antigen binden. Der Einsatz eines derart zellfreien Substrats eignet sich allerdings auf vorteilhafte Weise, um nicht vom Zellsubstrat verursachte Störungen, die zu einem Fluoreszenzsignal führen, zu erkennen.
Weiterhin wird die zielantigenspezifische Zweitantikörperbindung bestimmt durch

g. F_Ak,ratio = Q₁/Q₂

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann unter Zugrundelegung des Wertes für die zielantigenspezifische Zweitantikörperbindung, insbesondere durch dessen Vergleich mit einer mitgeführten Kalibrationsreihe, die absolute Antikörper-Konzentration in einer Patentenprobe ermittelt werden. Wesentlich hierbei ist, dass die Ermittlung anhand objektiv nachprüfbarer Kriterien erfolgt, insbesondere unabhängig von der Einstellung eines Objektfokus und/oder der Qualität der visuellen Auswertung ist.
Im Folgenden wird die Erfindung ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert. Es zeigen:
1: Darstellung von Zellklonen, die im uninduzierten Zustand keine PLA2R-Produktion aufweisen, im induzierten Zustand jedoch eine starke und homogene PLA2R Bildung zeigen; der Nachweis des PLA2R-Bildung erfolgte auf Formalin fixierten Zellen mit einem Humanserum, welches Autoantikörper der Klasse IgG gegen des PLA2R enthält. Der Nachweis des gebundenen humanen IgG erfolgte mit Hilfe eines FITC-markierten anti-human-IgG-Konjugates (EUROMMUN).
2: Vergleich verschiedener Oberflächen eines Substrats, das zur Beschichtung mit Zellen einer Zelllinie vorgesehen ist sowie
3: Schematische Darstellung der vom ersten und zweiten Substrat ausgehenden Fluoreszenzsignale.
Der Nachweis von Autoantikörpern gegen den Phospholipase-A-2-Rezeptor ist ein wichtiges Kriterium im Rahmen der Diagnose einer idiopathisch membranösen Nephropathy (IMN) (Beck et al. 2009). Hierzu wurde cDNA (Genbank Zugriffsnummer NM_007366), kodierend für die Isoform 1 des humanen Phospholipase-A-2-Rezeptors von der Firma imaGenes GmbH bezogen. Die für das PLA2R-Protein kodierende cDNA wurde durch PCR-amplifiziert und in einen Plasmidvektor kloniert, der eine Tetracyclin-induzierbare Transkription der PLA2R-cDNA ermöglicht (Yao et al. 1998). Auf demselben Plasmid befinden sich auch die für den authentischen Tetracayclin-Repressor kodierende Sequenz unter Kontrolle eines CMV-Promotors sowie das Hygromycin-Resistenzgen unter Kontrolle des Thymidin-Kinase-Promotors, welches zur Selektion transformierter Säugerzellen genutzt wird. Die durch einen enzymatischen Verdau linearisierte Plasmid-DNA wird zur Transfektion von HEK293T Zellen eingesetzt, welche am Folgetag der Transfektion durch limitierte Verdünnung und Aussaat auf 96 well-Gewebekulturschalen in D-MEM high Glucose (PAA; E15-843) + 10% FKS(PAA; A15-151) + 200 μg/ml Hygromycin B (Invitrogen; VX10687-010) kloniert und selektiert werden. Nach ungefähr 2 Wochen werden Zellklone gewonnen, die Zellen vermehrt und zur Funktionstestung eingesetzt. Hierzu werden ein erster Teil der Zellen eines zu analysierenden Klones auf CultureSlides (Becton Dickinson BD; 734-0402) inokuliert und uninduziert sowie ein zweiter Teil durch die Zugabe von 1 μg/ml Tetracyclin induziert jeweils für 48 h kultiviert. Anschließend werden die Zellen auf dem CultureSlide in PBS + 1,8% Formalin für 5 Minuten bei Raumtemperatur fixiert, in PBS gewaschen und luftgetrocknet.
Die Rate PLA2R produzierender Zellen wird mittels IFT durch die Inkubation mit einem Humanserum, welches Antikörper der Klasse IgG gegen PLA2R besitzt analysiert. Gemäß einer speziellen Ausführungsform wird ein in PBS 1:200 verdünntes Humanserum für 30 Minuten auf dem Zellsubstratpaar inkubiert, anschließend wird ungebundener Antikörper durch einen PBS-Waschschritt entfernt und gebundener Antikörper durch eine Inkubation mit einem anti-human-IgG-FITC-Konjugat markiert.
Nach 30 Minuten Inkubation wird durch einen PBS-Waschschritt ungebundenes Konjugat entfernt und das Substrat mit EUROIMMUN Eindeckmedium und einem Deckglas versehen zur IFT Auswertung am Axioskop2 (Zeiss) eingesetzt. Es werden Zellklone zur weiteren Bearbeitung genutzt, die im uninduzierten Zustand keine PLA2R-Produktion aufweisen, im induzierten Zustand jedoch eine starke und homogene PLA2R Bildung zeigen. Ein solcher Zellklon ist in 1 exemplarisch dargestellt.
Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren mit Hilfe eines automatisierten Scannersystems durchgeführt. Eine visuelle Auswertung, insbesondere spezieller Strukturen bzw. Fluoreszenzmuster auf der Substratoberfläche, ist hierbei überflüssig. In diesem Zusammenhang werden gemäß einer besonderen Ausführungsform BioChip-Substrate, bevorzugt beschichtete Deckglasfragmente geeigneter Größe, die vergleichsweise große Substratpaare von bis zu etwa 10 mm² enthalten verwendet. Hierbei erfolgt die Inkubation vollständig auf dem geschlossenen Chip, so dass ein so genanntes Lab-on-a-Chip-System realisierbar ist.
Alternativ können die Substratpaare auf Probenträgern bereitgestellt werden, die eine Inkubation der Substrate, quasi kopfüber in einem Reagenzträger mit wannen- oder rinnenförmigen Fluidaufnahmen ermöglichen. Bevorzugt werden hierbei die Reagenzträger mit den in den Fluidaufnahmen befindlichen Proben während der Inkubation derart geschwenkt, dass ein in der Fluidaufnahme enthaltenes Reagens hin- und herströmt. Auch hier erfolgt die Inkubation zumindest weitgehend automatisiert.
Im Anschluss an die Inkubation können die Fluoreszenzsignale wiederum nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgewertet werden. Sofern dies gewünscht ist, kann ergänzend auch eine mikroskopische, also Bild gebende Auswertung der Substrate erfolgen. Für eine derartige mikroskopische Auswertung werden bevorzugt ein Doppelfluoreszenz taugliches automatisiertes Mikroskop und eine entsprechende Softwareoption verwendet. Aufgrund des Einsatzes des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Antikörperbestimmung dient die mikroskopische Untersuchung, die eine Fokussierung sowie Bildauswertung erfordert, nur der Verifikation der mit einem Scanner erhaltenen Untersuchungsergebnisse.
2 zeigt schematisch einige mögliche Oberflächen eines festen Trägers und die daraus resultierende Abstrahlung. Als Träger werden bevorzugt Objektträger aus Glas oder Kunststoff verwendet. Diese können transparent, schwarz oder verspiegelt ausgeführt sein, wobei in der Regel die Oberfläche mit einer entsprechenden Beschichtung versehen wird.
3 zeigt die schematisch einen Vergleich der Signalstärken der vom ersten und zweiten Substrat ausgehenden Fluoreszenzsignale. Dargestellt sind ein erstes Substrat (1) und ein zweites Substrat (2), von denen das erste Substrat mit induzierten und das zweite Substrat mit nicht induzierten Zellen beschichtet sind. Die Substrate sind mit einem einen Antigen-spezifischen Antikörper enthaltenden Patientenserum und einem fluoreszenzmarkierten Zweit-Antikörper inkubiert worden. Sofern die Antikörper an das auf dem ersten Substrat von den induzierten Zellen produzierte Zielantigen gebunden haben, kann dies im Wege einer Fluoreszenzmessung nachgewiesen werden.
Darüber hinaus sind die auf dem ersten und dem zweiten Substrat befindlichen Zellen mit einem zellspezifischen, von der rekombinanten Expression des Zielantigens unabhängigen endogenen Marker markiert worden. Auch diese Markierung und damit die Anzahl der auf einem Substrat befindlichen Zellen kann im Wege einer Fluoreszenzmessung ermittelt werden.
Von den beiden verwendeten Substraten (1, 2) dient das zweite (2) der Quantifizierung einer Antikörperbindung, die nicht auf das rekombinante Antigen zurückzuführen und deswegen im Sinne der Diagnostik als unspezifisch einzustufen ist. Mit Hilfe des auf den beiden Substraten vorgesehenen endogenen Markers, der in Zellzahlabhängiger Menge auf den Substraten vorhanden und unabhängig von rekombinanter Expression ist, erfolgt eine Normierung der gebundenen Antikörpermenge auf den beiden Substraten. Die spezifische Antikörperbindung an das rekombinante Zielantigen wird ermittelt, indem die Differenz der Zellzahl normierten Antikörpermengen auf den Substraten gebildet wird. Eine Quantifizierung der in der Probe enthaltenen Antikörpermenge ist auf diese Weise mit verhältnismäßig einfachen Mitteln und dennoch hochgenau möglich.
In dem hier erläuterten Ausführungsbeispiel erfolgt die Normierung der Zellzahl, die mittels der Mengenbestimmung einer zellzahlabhängigen endogenen Größe realisiert wird, durch Anfärben des zellulären DNA-Gehaltes mit einem DNA-Fluorophor, vorzugsweise Hoechst 33342.
Referenzen

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Claims

Verfahren zur Quantifizierung von Antikörpern in einer Probe, die spezifisch an ein Zielantigen binden, mit den Schritten: – Bereitstellen wenigstens eines ersten und eines zweiten Substrates, die Zellen einer Zellpopulation aufweisen, die stabil gentechnisch verändert sind, wobei die Zellen auf dem ersten Substrat derart induziert sind, dass diese Zellen zur rekombinanten Produktion wenigstens des Zielantigens angeregt sind, während die Zellen auf dem zweiten Substrat nicht zur rekombinanten Produktion des Zielantigens angeregt sind, – Inkubation des ersten und des zweiten Substrats mit einer die Antikörper enthaltenden Probe, so dass die Antikörper zumindest teilweise an das Zielantigen binden, – Markierung wenigstens eines Bestandteils der Zellen auf dem ersten und dem zweiten Substrat, der zellzahlabhängig und zumindest zum überwiegenden Teil unabhängig von rekombinanter Expression ist, – Erzeugen eines ersten und eines zweiten Signals (F_1,Ak, F_2,Ak), deren Signalstärken von einer Anzahl von Antikörper-Bindungen auf den Substraten abhängig sind, – Erzeugen eines ersten und eines zweiten Signals (F_1,mZ, F_2,mZ), deren Signalstärken von einer Anzahl von auf den Substraten markierten Zellen abhängig sind, – Bilden der Quotienten Q₁ = F_1,Ak/F_1,mZ und Q₂ = F_2,Ak/F_2,mZ aus den Signalstärken der mittels des ersten und des zweiten Substrats erzeugten Signale sowie – Bestimmen der Anzahl der in der Patientenprobe befindlichen zielantigenspezifischen Antikörper auf der Grundlage eines Vergleichs der beiden Quotienten Q₁, Q₂.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die in der Probe vorhandenen Antikörper konzentriert oder aus der Probe aufreinigt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das erste und das zweite Substrat mit einem Medium inkubiert wird, das zumindest teilweise an die an das Zielantigen gebundenen Antikörper bindet.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium einen Fluoreszenzfarbstoff aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eines der Signale im dynamischen Messbereich eines mit einer Untersuchungseinheit aufgenommenen Bildes des ersten und/oder des zweiten Substrates liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Auswertung wenigstens zeitweise die high-dynamic-range-Aufnahmetechnik (high dynamic range imaging) eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das erste und das zweite Substrat auf einem festen Träger, vorzugsweise gemeinsam auf einem festen Träger, immobilisiert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe Blut, Serum, Plasma, Fäzes oder Liquor cerebrospinalis eines Säugers, insbesondere eines Menschen, aufweist.