DE69907156T2

DE69907156T2 - Krebsbehandlung

Info

Publication number: DE69907156T2
Application number: DE69907156T
Authority: DE
Inventors: Meek Hilmar Heswall WARENIUS; Laurence Anthony Heswall SEABRA
Original assignee: Theryte Ltd
Current assignee: Theryte Ltd
Priority date: 1998-02-18
Filing date: 1999-02-18
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2019-02-19
Also published as: EP1057031A1; EP1057033A1; AU2538199A; ATE238555T1; JP2002504683A; CA2321481A1; WO1999042828A3; AU2538599A; JP2002504687A; WO1999042828A2; DE69907153D1; AU2537999A; AU2630099A; DE69907154D1; US6878526B1; AU749180B2; JP2002504688A; JP2002504496A; WO1999042834A2; WO1999042090A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Strahlungsempfindlichkeit von Krebszellen zur Vorhersage, ob ein Patient wahrscheinlich auf eine Strahlentherapie anspricht. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines zur Messung der Strahlungsempfindlichkeit nützlichen Antikörpers und eine Ausstattung zur Messung der Strahlungsempfindlichkeit.
Obwohl die Strahlentherapie in der zweiten Hälfte dieses Jahrhunderts für die Heilung vieler Menschen von Krebs verantwortlich war, gibt es immer noch eine große Anzahl von Tumoren, die entweder ein geringes Ansprechen auf die Behandlung zeigen oder anfangs auf diese ansprechen, nur um später wiederaufzutreten. Ein besseres Verständnis der Mechanismen, die der Ansprechempfindlichkeit von Krebserkrankungen auf die Strahlentherapie zugrunde liegen, könnte bei der Vorhersage helfen, welche Patienten am wahrscheinlichsten von der Strahlentherapie profitieren, und birgt auch die Möglichkeit, diese Mechanismen gezielt zu modulieren, um die Behandlung einer Krebserkrankung des Menschen unter Einsatz der Strahlentherapie zu verbessern.
Seit vielen Jahren wird die molekulare Grundlage einer intrinsischen Strahlungsempfindlichkeit untersucht. Ein beträchtlicher Umfang von Forschungsarbeit konzentrierte sich auf den Grad der DNA-Beschädigung und deren nachfolgende Reparatur, wie durch das Auftreten von Doppelstrangbrüchen (dsbs) in der DNA wiedergespiegelt (Kelland et al, 1988; Schwartz et al, 1991), den Restschaden, der nach einer zellulären Wiederverbindung von dsbs in der DNA verbleibt (Nunez et al, 1995; Whitaker et al, 1995) und die Genauigkeit der DNA-Reparatur (Powell & McMillan, 1994). Zusätzlich zur DNA-Beschädigung wurde jedoch zunehmend offensichtlich, dass bestimmte Onkogene und Tumorunterdrückungsgene nicht nur bei der Krebsentstehung ein Rolle spielen können, sondern auch die Empfindlichkeit von bösartigen Zellen auf eine ionisierende Bestrahlung beeinflussen können.
Als Resultat dieses zunehmenden Hinweises auf die Rolle von Onkogenen und Tumorunterdrückungsgenen bei der Empfindlichkeit von bösartigen Zellen gegenüber therapeutischen Wirkstoffen wurden Versuche unternommen, diese und andere Gene zu verwenden, um das therapeutische Ansprechen einer Krebserkrankung beim Menschen auf die zur Zeit verfügbaren Behandlungsmodalitäten, wie z. B. eine Strahlentherapie und/oder eine cytotoxische Chemotherapie, zu untersuchen und vorherzusagen. Die Forschung hat bis zum heutigen Zeitpunkt jedoch im Allgemeinen nur versucht, als Methoden zur Vorhersage des therapeutischen Ansprechens die Expression von einzelnen, mit Tumoren in Verbindung stehenden Genen zu untersuchen. Bei der Untersuchung der Beziehung zwischen der Expression eines ausgewählten Gens und der intrinsischen Strahlungsempfindlichkeit wurde nicht darauf geachtet, ob andere Kandidaten-Gene als jenes, das für die Studie ausgesucht wurde, auch den Ausgang von Versuchen beeiflussen könnten.
Die Forschung bezüglich der Rolle von einzelnen Genen konzentrierte sich auf eine Reihe von Zellzyklusgenen und Signal-Transduktionsgenen. Die Transfektion von normalen Zelllinien mit dominanten Onkogenen, wie z. B, myc und ras (McKenna et al, 1991), führte zu einer verstärkten Strahlungsbeständigkeit sogar bei Fehlen von nachweisbaren Veränderungen der Geschwindigkeit der dsb-Induktion (Iliakis et al, 1990). Es wurde auch berichtet, dass mehrere andere dominante Onkogene einschließlich c-fms, v-sis, v-erb-B, vabl, v-src, v-cot (Fitzgerald et al, 1990, Suzuki et al, 1992, Shimm et al, 1992) und c-Raf (Kasid et al, 1989, Pirollo et al, 1989) die zellulare Strahlungsempfindlichkeit in Säugetierzellen modulieren. Die mögliche Relevanz dieser Entdeckungen für die klinische Strahlungstherapie wurde betont durch Beobachtungen, dass hohe Pegel von Raf-1 (das normale Proteinprodukt des c-Raf-l-Proto-Onkogens) mit der intrinsischen Strahlungsempfindlichkeit in menschlichen in vitro-Zelllinien in Verbindung stehen (Warenius et al, 1994). Diese Ergebnisse reichen allein jedoch nicht aus, um in einer klinischen Analyse die Empfindlichkeit eines Tumors auf eine Strahlungstherapie zu bestimmen.
Eine zusätzliche Reihe von Hinweisen zeigt eine positive Beziehung zwischen einer Mutation im p53-Tumorunterdrückungsgen und einer verstärkten zellularen Strahlungsbeständigkeit sowohl in Tumorzellen des Nagetiers und Menschen (Fan et al, 1994, Radford 1994, Zhen et al, 1995, Xia et al, 1995, Lee und Bernstein 1993) als auch in mit mutierten p53 (mp53)-Genen transfizierten, normalen Zellen (Pardo et al, 1994, Bristow et al, 1994, Kawashima et al, 1995). Die Forschung im öffentlichen Bereich legte nahe, dass Mutationen im p53-Tumorunterdrückungsgen, welche bei etwa 50% der häufigen Krebserkrankungen, wie z. B. jenen der Brust, der Lunge und des Eierstocks, zu finden sind, mit der Resistenz gegenüber einer Behandlung mit cytotoxischen Arzneimitteln oder einer Bestrahlung zusammenhängen. Trotz eines beträchtlichen Umfangs von Arbeiten gibt es zur Zeit dennoch keine erfolgreichen klinischen Tests, bei welchen die Detektion von Mutationen im p53-Gen allein dazu eingesetzt werden kann, mit einem akzeptablen Grad an Gewissheit vorherzusagen, ob die Krebserkrankung eines Patienten wahrscheinlich auf eine Strahlungstherapie ansprechen wird oder nicht. Die große Unterschiedlichkeit der Ergebnisse bei klinisch-pathologischen Studien, welche das Ansprechen eines Tumors und den p53-Status vergleichen, führt zur Schlussfolgerung, dass derzeit eine p53-Mutation oder die Überexpression des p53-Proteins allein zur Vorhersage, ob die Krebserkrankung eines Menschen wahrscheinlich auf eine Strahlungstherapie anspricht oder nicht, nicht ausreicht.
Eine Reihe von Berichten legt nahe, dass Onkogene und Unterdrückungsgene die intrinsische Strahlungsempfindlichkeit durch deren Einfluss auf das Wachstum von bestrahlten Zellen durch strahlungsinduzierte Blöcke an Zellzyklus-Kontrollpunkten modulieren können. Die G1/S-Verzögerung, die nach dem Ausgesetztsein an eine ionisierende Strahlung durch p53 herbeigeführt wird, wurde als wichtiges Maß einer Zellzyklusstörung, die mit der relativen Strahlungsempfindlichkeit korreliert, ins Spiel gebracht (Kastan et al, 1991, McIlwrath et al, 1994; Siles et al, 1996). Es zeigte sich auch, dass die Expression von dominanten Onkogenen, wie z. B. myc und ras (McKenna et al, 1991) oder SV40 (Su & Little, 1993), sowohl eine Strahlungsbeständigkeit als auch einen gleichzeitigen Anstieg der nach der Bestrahlung auftretenden Verzögerung an der G2/M-Kontrollstelle hervorruft. Es zeigte sich auch, dass das Proteinprodukt des normalen c-Raf-1-Proto-Onkogens in 19 menschlichen in vitro-Zelllinien mit der Strahlungsempfindlichkeit zusammenhing (Warenius et al, 1994). In jüngster Zeit erwies sich weiters, dass in 6 der obenstehenden 19 Zelllinien die zuvor beobachtete Beziehung zwischen Raf-1 und der Strahlungsempfindlichkeit sehr stark war und damit in Verbindung stand, wie rasch Zellen aus einem strahlungsinduzierten Block an der G2/M-Zellzykluskontrollstelle austraten. Diese strahlungsempfindlichen menschlichen Krebszellen mit einer gesteigerten Expression des normalen Raf-l-Proteins weisen einen schnelleren Austritt aus einem durch 2Gy einer Strahlung induzierten G2/M-Block auf als strahlungsbeständige Zellen mit einer geringen Expression von Raf-1 (Warenius et al, 1996). Eine starke Expression des Raf-1-Proteinprodukts des normalen c-Raf-Proto-Onkogens steht mit der Strahlungsempfindlichkeit in Zusammenhang. Die Beziehung zwischen Raf-1 und der Strahlungsempfindlichkeit ist allein jedoch nicht stark genug, um die Basis für im klinischen Bereich nützliche Vorhersageanalysen zu bilden. Dasselbe trifft auf andere Versuche einer Korrelation der Wirkungen einzelner Gene mit dem Erfolg von Therapien zu.
Leider ist wenig darüber bekannt, ob oder wie Onkogene und Unterdrückungsgene interagieren können, um den Phänotyp der Strahlungsempfindlichkeit von menschlichen Krebszellen zu beeinflussen. Transfektionsversuche unter Verwendung von Zellen von anderen Säugetieren, wie z. B. REF (Fibroblasten von Rattenembryos), zeigten jedoch stärkere Anstiege der Strahlungsbeständigkeit bei Zellen, die dominante plus kooperierende Onkogene exprimieren, als bei solchen, die allein die einzeln dominanten Onkogene exprimieren (McKenna et al, 1990, Su & Little 1992, Pirollo et al, 1993). Gleichermaßen war die Strahlungsbeständigkeit, die in REF-Zellen durch eine Transfektion mit mehrfach integrierten mutierten p53-prol93-Allelen hervorgerufen wurde, viel stärker, wenn das mutierte p53-Gen gleichzeitig mit H-ras transfiziert wurde (Bristow et al, 1994).
In jüngerer Zeit wurde gezeigt (Warenius et al, 1994, 1996), dass eine Messung des Raf-1-Proteins im Zusammenhang mit Wildtyp-p53 eine Wechselbeziehung schafft, die möglicherweise die Basis für eine Vorhersageanalyse hinsichtlich der Strahlungsempfindlichkeit bilden könnte. Diese Beziehung wurde demonstriert, indem das Raf-1-Protein unter Anwendung des quantitativen Western-Blottings gemessen wurde. Western-Blotting ist jedoch kostspielig, zeitaufwendig und arbeitsreich. Überdies erfordert es eine große Anzahl von Zellen. Es ist daher in diesem speziellen Fall als klinischer Routinetest unbrauchbar. Eine klinische Analyse ist vorzugsweise in der Lage, Proteinpegel eher in einzelnen Zellen als in Homogenaten von einer Million oder mehr Zellen, wie sie beim Western-Blotting verwendet werden, zu messen. Es ist auch wichtig, eine Raf-Proteinexpression in Tumorzellen von jener in normalen Zellen unterscheiden zu können. Dies erfordert die Fähigkeit, in Durchflusszytometrie-Analysen Zellen auf Basis der Tatsache, dass sie diploid anstatt aneuploid sind, auszusperren, oder die Fähigkeit, das Raf-Protein in einzelnen Zellen zu messen, welche auf Gewebeabschnitten, bei denen morphologische Kritieren die Unterscheidung von Tumorbereichen von Bindegewebe, weiße Blutkörperchen infiltrierenden Blutgefäßen oder nekrotischen Bereichen ermöglichen, histologisch beobachtet werden können.
Leider kreuzreagieren alle verfügbaren Antikörper gegen Raf bei einer Untersuchung mittels Western-Blots mit einem irrelevanten Epitop auf einem 48 kD-Molekül (siehe 1). Raf-1 ist ein 72-74 kD-Molekül und kann somit durch Western-Blotting unterschieden und getrennt gemessen werden. Zellanalysen hinsichtlich Raf-1, wie z. B. die Durchfluss-Zytometrie oder die Immunzytochemie, wären jedoch nicht in der Lage, das richtige 72-74 kD-Molekül vom irrelevanten 48 kD-Molekül zu unterscheiden. Das 48 kD-Protein ist wahrscheinlich kein Fragment des 72 kD-Raf-Proto-Onkogens, da das 48 kD-Protein beim Western-Blotting viel häufiger vorkommt als das 72 kD-Protein.
Somit gibt es basierend auf dem obigen Stand der Technik zur Zeit keine Indikatoren dafür, dass eine Messung des Mutationsstatus oder der Expressionsstärken der Proteinprodukte von Onkogenen, Proto-Onkogenen oder Tumorunterdrückungsgenen in menschlichen Krebszellen die Basis für einen verlässlichen klinischen Test hinsichtlich der Frage, ob klinische Tumore wahrscheinlich auf eine Arzneimittel- und/oder Strahlungsbehandlung ansprechen, bilden könnte. Ein Ziel dieser Erfindung besteht in der Überwindung der obenstehend erwähnten Probleme und in der Schaffung einer Analyse, die als klinische Analyse zur Vorhersage, ob Krebszellen wahrscheinlich auf eine Strahlentherapie ansprechen, eingesetzt werden kann. Diese Erfindung umfasst einen Antikörper gegen Raf-1, der für dieses Protein spezifisch ist, um kostengünstigere diagnostische Tests zu ermöglichen. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens unter Verwendung des Antikörpers zur Vorhersage, ob Krebszellen wahrscheinlich auf eine Strahlentherapie ansprechen, indem die Eigenschaften zweier oder mehrerer mit Krebs in Verbindung stehender Gene gleichzeitig gemessen werden.
Demgemäß sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Messung der Strahlungsempfindlichkeit von Zellen vor, welches Verfahren die Untersuchung einer Zellen umfassenden Probe oder eines Extrakts davon hinsichtlich Folgendem umfasst:

(a) hinsichtlich der Expressionsstärke von p21 oder hinsichtlich der Häufigkeit des p21-Proteins; sowie
(b) hinsichtlich der Expressionsstärke von Raf-1 oder hinsichtlich der Häufigkeit des Raf-1-Proteins.

Die Reihenfolge, in der die Schritte (a) und (b) ausgeführt werden, ist nicht besonders beschränkt. So kann der Schritt (a) dem Schritt (b) vorangehen, oder wahlweise kann der Schritt (b) dem Schritt (a) vorangehen.
Die vorliegende Erfindung schlägt auch ein Verfahren zur Herstellung eines für das Raf-1-Protein spezifischen Antikörpers vor, welcher Antikörper nicht mit einem 48 kD-Protein kreuzreagiert, welches in Zellen, die das Raf-l-Protein enthalten, gleichzeitig vorhanden ist, welches Verfahren die Bildung eines Peptids umfasst, das am Raf-l-Protein ein Epitop umfasst oder einen Teil davon bildet, welches am 48 kD-Protein nicht vorhanden ist, sowie die Herstellung eines Antikörpers gegen das Peptid. Die Erfindung schlägt ein weiteres Verfahren zur Herstellung eines für das Raf-l-Protein spezifischen Antikörpers vor, welcher Antikörper nicht mit einem 48 kD-Protein kreuzreagiert, welches in Zellen, die das Raf-1-Protein enthalten, gleichzeitig vorhanden ist, welches weitere Verfahren die Immunisierung eines Tieres mit dem Raf-l-Protein und einem für das 48 kD-Protein spezifischen Antikörper umfasst, um potentielle Epitopenstellen am Raf-l-Protein zu maskieren, die ebenfalls am 48 kD-Protein vorhanden sind, sowie das Erhalten eines Antikörpers gegen das maskierte Raf-1-Protein.
Überdies sieht die vorliegende Erfindung eine Ausstattung zur Messung der Strahlungsempfindlichkeit von Zellen vor, welche Ausstattung Folgendes umfasst:

(i) ein Mittel zum Untersuchen der Expressionsstärke von Raf-1 oder der Häufigkeit des Raf-1-Proteins; sowie
(ii) ein Mittel zum Untersuchen der Expressionsstärke von p21 oder der Häufigkeit des p21-Proteins.

Diese Anmeldung betrifft im Speziellen die Messung der Pegel des Raf-1-Proteinprodukts des C-Raf-1-Proto-Onkogens in Zellen, deren p21-Proteinpegel (z. B. durch Western-Blotting) bestimmt wurde, um die Strahlungsempfindlichkeit des Tumors zu bestimmen, und folglich, ob eine Strahlungstherapie eine geeignete Behandlung für den Patienten darstellt. In Zelllinien mit erhöhten p21-Proteinpegeln (oder einem Anstieg der p21-Expression) ist die Empfindlichkeit des Tumors gegenüber einer ionisierenden Bestrahlung umso stärker, je größer die Raf-l-Expressionsstärke ist.
Die Expressionsstärke von Raf-1 oder der Anstieg der Raf-l-Proteinpegel kann durch jegliches geeignetes Verfahren, das hier besprochen ist, z. B. Western-Blotting, gemessen werden. Der Punkt, an dem der Proteinpegel oder die Expression als in einem ausreichenden Maß über den Normalwert angehoben angesehen wird, wodurch eine nützliche Strahlungsempfindlichkeit angezeigt wird, ist dem Fachmann auf diesem Gebiet klar gemäß der allgemeinen Lehre aus der Literatur bezüglich üblicher Raf-l-Pegel in menschlichen Zelllinien (siehe European Journal of Cancer, B Oral Oncology, 1995, Nov., 31B(6), 384-391). Dieser Punkt kann gemäß der Beurteilung durch die das vorliegende Verfahren durchführende Person bestimmt werden, und zwar abhängig von den speziellen Krebszellen und dem Patienten, die involviert sind.
Die Expression von p21 oder der Pegel des p21-Proteins kann durch irgendein geeignetes Verfahren gemessen werden. Im Speziellen ist p21 ein Cyclin-abhängiger Kinasehemmer, welcher durch Western-Blotting, Immunzytochemie oder in jüngerer Zeit entwickelte Techniken, wie z. B. die Bestimmung der relativen Häufigkeit von p21 mRNA, nachgewiesen werden kann. Der Punkt, an dem davon ausgegangen wird, dass die p21-Expression wirksam erhöht ist oder die p21-Proteinpegel wirksam erhöht sind, ist dem Fachmann auf diesem Gebiet klar gemäß der allgemeinen Lehre aus der Literatur bezüglich üblicher p21-Proteinpegel in menschlichen Zelllinien (siehe Oncogene, 1995, Band 11, 2021-2028; und Oncogene, 1996, Band 12(6), 1319-1324).
Die vorliegende Erfindung wird rein beispielhaft detaillierter beschrieben, und zwar unter Bezugnahme auf die angeschlossene Zeichnung, in welcher:
1 einen Western-Blot zeigt, der den Bereich der Raf-1-Proteinpegel pro Gesamtzellprotein, insbesondere die relative Häufigkeit des 74 kD- und des 48 kD-Proteins, in den folgenden 17 in vitro-Zelllinien des Menschen zeigt:

1. KB, orales Epidermoidkarzinom
2. HT29, Adenokarzinom, Kolon
3. MGH-U1, Blasenkarzinom
4. HRT 18, Adenokarzinom, Mastdarm
5. A431, schuppenförmiges Karzinom der Vulva
6. NCTC 2544, Hautfibroblaste
7. COR L23, Großzellen-Lungenkarzinom
6. SK-MEL3, Melanom
9. AT5BNA, Ataxia teleangiectatica-Fibroblast
10. OAW42, Eierstockkarzinom
11. I407, embryonales Darmepithel
12. 2780, Eierstockkarzinom
13. HEP-2, schuppenförmiges Karzinom
14. HX142, Neuroblastom
15. RT112, Blasenkarzinom
16. HeLa, schuppenförmiges Karzinom
17. NCTC 2544

für eine Probenproteinladung von 100 μg/50 μl auf einem 7,5%igen Gel, wobei die primären Antiseren monoklonale URP-2653 gegen Raf-1 in einer Verdünnung von 1/750 sind;
2 die Beziehung zwischen der als SF2 gemessenen Strahlungsempfindlichkeit und der Raf-1-Häufigkeit in Zelllinien zeigt, in denen die p21-Proteinpegel nicht erhöht (nicht nachweisbar) sind; und
3 die Beziehung zwischen der als SF2 gemessenen Strahlungsempfindlichkeit und der Raf-1-Häufigkeit in Zelllinien zeigt, in denen die p21-Proteinpegel erhöht sind.
Während die Mechanismen, welche die beobachteten Beziehungen zwischen der Strahlungsempfindlichkeit, dem Zellzykluswachstum und den Funktionen von Raf-1 und p21 erklären, unklar bleiben, erlaubt die starke Beziehung zwischen Raf-1 und der Strahlungsempfindlichkeit in menschlichen Krebszellen, in denen die p21-Pegel nachweisbar (vorzugsweise erhöht) sind, die Entwicklung eines Doppelparameter-Raf-1/p21-Tests hinsichtlich der klinischen Strahlungsempfindlichkeit.
3 zeigt, dass in Zelllinien, in denen die p21-Proteinpegel erhöht sind, die Zellen umso strahlungsempfindlicher sind, je stärker das Raf-1-Protein ist, wie durch log-Überlebendenbruchteil bei 2 Gy (SF2) gemessen. Andererseits zeigt 2, dass in Zelllinien, in denen p21 nicht nachweisbar ist, eine schwache oder keine Beziehung zwischen den Raf-l-Pegeln und der Strahlungsempfindlichkeit besteht.
Der von der vorliegenden Erfindung bereitgestellte klinische Test erfordert die Bestimmung der Expressionsstärke von p21 oder des p21-Proteinpegels, und zwar in Verbindung mit einer Messung der Raf-1-Expressionsstärke im Biopsiematerial von Tumoren bei Patienten.
Die Bestimmung der Expressionsstärke von Raf-1 wird durch die Messung der Häufigkeit des Raf-1-Proteins bewirkt. Die Raf-1-Proteinpegel können durch Immunzytochemie oder Durchflusszytometrie (FCM) gemessen werden. Zuvor bestand ein Problem mit letzterem Zugang, der sich aus einer Kreuzreaktivität von existierenden Antikörpern mit Nicht-Raf-1-Proteinen ergab. Bis zum heutigen Zeitpunkt gab es keine verfügbaren Antikörper gegen Raf-1, die beim Western-Blotting nicht auch mit einem sehr häufigen, aber irrelevanten 48 kD-Protein kreuzreagieren. Techniken, wie z. B. die Immunzytochemie oder FCM, erbrachten nur unspezifische Ergebnisse. Dies erforderte irgendeine Art der molekularen Trennung, wie z. B. durch Elektrophorese beim Western-Blotting, um Raf-1 (ein 72-74 kD-Protein) von der irrelevanten 48 kD-Spezies zu trennen. Säulenchromatographietechniken waren geeignet, wie z. B. die Gelfiltration oder die Ionenaustauschchromatographie. Die Hochleistungsflüssigchromatographie oder die Kapillar-Elektrophorese waren ebenfalls als Trenntechniken einsetzbar. All diesen könnte ein Immunoassay folgen. Andere Mittel zur spezifischen Erkennung hätten ebenfalls vorstellbar sein können, einschließlich der Entwicklung von RNA-Aptameren zum Raf-1-Protein. All diese Techniken sind jedoch zeitaufwendig und kostspielig, was sie für einen klinischen Test ungeeignet macht. Die Verfügbarkeit eines für Raf-1 spezifischen Antikörpers erlaubt die Durchführung von Diagnoseanalysen ohne das Erfordernis einer Trennung.
Das erste Verfahren zur Herstellung des Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung erforderte eine Isolierung und Identifizierung des kreuzreagierenden 48 kD-Epitops, so dass seine DNA und seine genetische Proteinsequenz bestimmt werden konnten. Diese Information wurde zum Vergleich der 48 kD-Proteinsequenz mit der Raf-Proto-Onkogen-Proteinsequenz der vollen Länge verwendet, um ein Epitop am Proto-Onkogen-Protein der vollen Länge auszuwählen, das nicht vom 48 kD-Protein geteilt wird. Dies konnte unter Verwendung einer Zelllinie mit hohen Raf-1- und 48 kD-Proteinpegeln, wie z. B. NCTC 2544, erzielt werden (siehe 1). Lysatmengen wurden hergestellt, und das 48 kD-Protein wurde gereinigt. Die Reinigung konnte unter Anwendung einer Immunpräzipitation oder Affinitätsreinigung mit einem von den Erfindern hergestellten, monoklonalen Antikörper oder mit einem handelsüblichen Anti-Raf-1-Antikörper erzielt werden, wobei sich bei beiden gezeigt hatte, dass sie sich beim Western-Blotting stark an das 72-74 kD- sowie an das 48 kD-Protein banden. Die den monoklonalen Antikörper produzierenden Zellen wurden in großen Ausbeuten für eine Affinitätschchromatographie gezüchtet, und zwar als Bauchwasser bei Balb/C-Mäusen. Der Antikörper aus der Bauchflüssigkeit wurde mit Cyanbromid-Sephacryl umgesetzt, und das Antikörper-Sephacryl wurde zur Herstellung einer Affinitätssäule eingesetzt. Die Lysate von den NTCT-Zellen wurden auf der – Affinitätssäule aufgegeben, nicht spezifisches Material wurde durchgewaschen, und 48 kDund 72-74 kD-Moleküle, die dasselbe Epitop teilten und sich an den Antikörper auf der Säule banden, wurden bei niedrigem pH eluiert. Das Immunpräzipitat oder Eluat von der Affinitätschchromatographiesäule wurde danach konzentriert, eine Proteinabschätzung wurde durchgeführt, und 150 μg pro Quelle wurden auf 10-20 nebeneinanderliegenden Quellen in einer Elektrophorese mit 10%igem SDS-Polyacrylamidgel und molekularen Markern laufen gelassen. Das 48 kD-Band wurde danach herausgeschnitten, und eine Aminosäuresequenz, die so lang wie möglich war, wurde vom N-Terminus (oder wahlweise vom C-Terminus) sequenziert. Unter Verwendung der Peptidsequenz wurden Primer hergestellt, deren genetische Sequenzen mit den Proteinsequenzen (wobei beim Codieren hinsichtlich bestimmter Aminosäuren die Degeneration berücksichtigt wurde) für den N(oder C-)-Terminus übereinstimmten. Eine Reihe von PCRs wurde durchgeführt, bis eine 48 kD-Länge einer DNA erhalten wurde. Diese wurde danach sequenziert. Ein Sequenzvergleich zwischen dem 48 kD- und dem 72-74 kD-Raf-1-Proto-Onkogen der vollen Länge ermöglichte den zweckmäßigen Entwurf synthetischer Peptide aus potentiellen Epitopen am 72-74 kD-Raf-Proto-Onkogenprotein der vollen Länge, die am 48 kD-Protein nicht vorhanden waren. Die einzigartigen synthetischen Peptide wurden zur Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern eingesetzt, welche auf das Raf-l-Protein, aber nicht auf das 48 kD-Protein reagierten, wobei diese Antikörper bei der Durchflusszytometrie oder der konfokalen mikroskopischen Zytometrie und/oder der Immunfluoreszenz oder Immunzytochemie von Nutzen sind.
Das zweite Verfahren zur Herstellung des Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung erfordert die Immunisierung eines Tieres mit dem Raf-Protein zusätzlich zu einem Antikörper gegen das 48 kD-Protein. Beispielsweise kann entweder das (aus der DNA-Sequenz in einem Expressionsvektor in Bakterien hergestellte) 72-74 kD-Raf-1-Protein der vollen Länge mit zuvor verfügbaren Anti-Raf-1-Antikörpern (die mit dem 48 kD-Protein kreuzreagieren) und den mittels Zentrifugation abgetrennten, resultierenden Immmunkomplexen präinkubiert und danach in ein Tier (z. B. eine Maus) injiziert werden, oder die Anti-Raf-1(Anti-48 kD-Protein)-Antikörper und das 72-74 kD-Raf-1-Protein der vollen Länge können getrennt in dasselbe Tier injiziert werden. Unter Verwendung des 72-74 kD-Raf-Proto-Onkogenproteins der vollen Länge als Immunogen wurden polyklonale und monoklonale Antikörper hergestellt. Das Protein wurde durch das rekombinante Raf-1-Gen in einem Expressionsvektor produziert. Der Antikörper gegen das 48 kD-Protein war ein im Handel erhältlicher Antikörper. Seine Funktion bestand darin, potentielle Epitopenstellen am Raf-Protein, die mit dem 48 kD-Protein kreuzreagieren, abzudecken. Ein solches maskiertes Raf-Protein-Immunogen regt die Produktion von Antikörpern, welche das 72-74 kD-Raf-Proto-Onkogenprotein der vollen Länge eher als das 48 kD-Protein selektiv erkennen.
Oligonucleotid-Reihen
Die Bestimmung der mRNA-Pegel kann auf eine Reihe von Arten durchgeführt werden. Unter Anwendung der Reverse Transcription kann eine poly-A-tragende mRNA ohne weiteres in cDNA umgewandelt werden – ein Verfahren ist im diese Erfindung erläuternden Beispiel beschrieben. Reverse Transcriptase-PCR (RTPCR)-Verfahren erlauben die Bestimmung der Menge der einzelnen RNAs, jedoch mit einem relativen niedrigen Genauigkeitsgrad. Oligonucleotid-Reihen stellen einen relativ neuartigen Zugang zur Nucleinsäure-Analyse dar, wobei eine Mutationsanalyse, eine Sequenzierung durch Hybridisierung und eine mRNA-Expressionsanalyse ermöglicht werden. Es wurden Verfahren zur Konstruktion solcher Reihen entwickelt (siehe beispielsweise A.C. Pease et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5022-5026, 1994; U. Maskos und E.M. Southern, Nucleic Acids Research 21, 2269-2270, 1993; E.M. Southern et al, Nucleic Acids Research 22, 1368-1373, 1994), und weitere Verfahren werden ins Auge gefasst. Reihen sind in Entwicklung, welche die Expressionsstärken von mRNAs messen und in diesen RNAs Mutationen nachweisen, und diese bieten eine attraktive Ausführungsform des diagnostischen Tests, der von dieser Erfindung vorgeschlagen wird.
Immunzytochemie
Eine alternative Ausführungsform dieser Erfindung kann Raf-1-Proteinpegel mittels Immunzytochemie messen, wobei die konfokale Laserfluoreszenzmikroskopie angewandt wird. Vorzugsweise wird ein Abtastsystem eingesetzt, wie jene, die in der PCT/US91/09217, PCT/NL/00081 und PCT/US95/01886 beschrieben sind. Zusätzlich ist es wünschenswert, dass das Mikroskopiesystem auch in der Lage ist, mehrere fluoreszierende Farbstoffe zu analysieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden Antikörper gegen p21 mit einem Farbstoff markiert und wird ein Antikörper gegen Raf-1 mit einem zweiten Farbstoff markiert, während ein dritter DNA-bindender Farbstoff zum Auswählen von Aneuploidzellen eingesetzt werden kann. DNA-bindende Farbstoffe, wie z. B. der Hoechst 33258-Farbstoff, welcher AT-reiche DNA bindet, oder Chromomycin A₃, welcher GC-reiche DNA bindet, sind geeignet. Ein diagnostischer Test kann die folgenden Schritte umfassen:

– Das Entnehmen einer Biopsie des Tumors eines Patienten.
– Gegebenenfalls das Zerlegen des Materials unter dem Mikroskop, um normales Gewebe von Tumormaterial zu trennen.
– Das Vorbereiten des Biopsiematerials für die mikroskopische Untersuchung, was die folgenden Schritte umfasst:
– Das Markieren des Biopsiematerials mit den obenstehenden fluoreszenzmarkierten Antikörpersonden gegen Raf-1. Das Biopsiematerial kann gegebenenfalls auch mit Antikörpersonden gegen p21 und mit einem DNAbindenden Farbstoff markiert werden.
– Das Trennen der markierten Zellen von ungebundenen markierten Sonden.
– Das Legen des markierten Biopsiematerials in ein konfokales Rastermikroskop, um Zellen zu zählen, welche:
– Raf-1 überexprimieren oder erhöhte Anteile davon aufweisen, d.h. mit zumindest einer Schwellenwert-Menge eines Antikörpers gegen Raf-1 markiert sind.
– Gegebenenfalls solche, welche p21 exprimieren, d.h. mit zumindest der Schwellenwert-Menge von Antikörpern gegen p21 markiert sind. Wahlweise könnte die p21-Expression durch eine Analyse der mRNA oder der genomischen DNA bestimmt werden, wie obenstehend besprochen.
– Gegebenenfalls solche, welche chromosomale Amplifikationen besitzen, wie durch die Intensität der Fluoreszenz von DNA-bindenden Fluoreszenzfarbstoffen nachgewiesen.

Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung
Eine weitere Ausführungsform des diagnostischen Tests kann sich die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) zunutze machen. Ein FACS-Instrument trennt die Zellen in einer Suspension in einer Weise, die von den Zellen, die mit einem Fluoreszenz-Marker markiert sind, abhängt. Ein typisches FACS-Gerät funktioniert wie folgt: Die Zellen in einer Suspension, welche sich in einer einzelnen Reihe fortbewegen, werden durch eine Schwingdüse geleitet, welche die Bildung von eine einzelne Zelle oder überhaupt keine Zelle enthaltenden Tröpfchen hervorruft. Die Tröpfchen passieren einen Laserstrahl. Die Fluoreszenz, die von jeder einzelnen Zelle in ihrem Tröpfchen durch den Laser angeregt wird, wird gemessen. Nach dem Detektor tritt der Strom von Zellen, die sich in Suspension befinden, durch einen elektrostatischen Ring, welcher den Tröpfchen eine Oberflächenladung verleiht. Den Tröpfchen, die Zellen tragen, wird eine positive oder negative Ladung verliehen. Enthält der Tropfen eine Zelle, die mit einer oberhalb eines bestimmten Schwellenwerts liegenden Intensität fluoresziert, so erhält der Tropfen eine Ladung von einer Polarität. Unmarkierte Zellen erhalten eine Ladung von entgegengesetzter Polarität. Die geladenen Tröpfchen werden danach von einem elektrischen Feld abgelenkt und werden in Abhängigkeit von ihrer Oberflächenladung in getrennte Behälter geleitet und gezählt. Tröpfchen, die mehr als eine Zelle enthalten, streuen das Licht mehr als einzelne Zellen, was leicht nachzuweisen ist, und somit bleiben diese ungeladen und kommen in einen dritten Entsorgungsbehälter. Mehrkanal-Fluoreszenz-Detektionsgeräte wurden konstruiert, die basierend auf der Markierung mit mehreren verschiedenen Fluoreszenzmarkierungen Zellen trennen können. Diese haben Mehrfachlaser, die Fluoreszenz in verschiedenen Frequenzen anregen können, und der Detektor weist verschiedene Emissionsfrequenzen nach. Ein System mit drei Markierungen ist für diesen Test geeignet. Dieselben markierten Sonden wie jene, die obenstehend hinsichtlich der Verwendung in einem konfokalen Rasterfluoreszenzmikroskop beschrieben wurden, wären geeignet. Ein diagnostischer Test könnte die folgenden Schritte umfassen:

– Das Entnehmen einer Biopsie des Tumors eines Patienten.
– Gegebenenfalls das Zerlegen des Materials unter dem Mikroskop, um normales Gewebe von Tumormaterial zu trennen.
– Das Zerstören der intrazellulären Adhäsion zwecks Bildung einer Einzelzellen-Suspension.
– Das Markieren der suspendierten Zellen mit den obenstehenden fluoreszenzmarkierten Sonden gegen Raf-1. Das Biopsiematerial kann gegebenenfalls auch mit Antikörpersonden gegen p21 und mit einem DNA-bindenden Farbstoff markiert werden.
– Das Trennen der markierten Zellen von ungebundenen markierten Sonden.
– Das Leiten der Suspension von markierten Zellen durch ein FACS-Gerät, um Zellen zu zählen, welche:
– Raf-1 überexprimieren oder erhöhte Anteile davon aufweisen, d. h. mit dem Anti-Raf-1-Antikörper markiert sind, und zwar oberhalb eines Schwellenwerts für die „normale" Expression.
– Gegebenenfalls Zellen, die p21 exprimieren, d. h. mit zumindest einer Schwellenwert-Menge eines Antikörpers gegen p21 markiert sind.
– Gegebenenfalls Zellen, die chromosomale Amplifikationen besitzen, wie durch die Intensität der Fluoreszenz von DNA-bindenden Fluoreszenzfarbstoffen nachgewiesen.

Beispiel 1
Eine Reihe von Zelllinien wurde ausgewählt, und ihre Strahlungsempfindlichkeit wurde in Kombination mit ihren Raf-1-Proteinpegeln gemessen. Die p21- und die Raf-1-Expression wurden jeweils unter Anwendung des Western-Blotting gemäß Verfahren, die im Wesentlichen standardmäßig waren, gemessen. Die Ergebnisse für Zelllinien, bei denen das p21 nicht nachweisbar ist, sind in 2 dargestellt, und die entsprechenden Ergebnisse für Zelllinien, bei denen die p21-Pegel erhöht sind, sind in 3 dargestellt.
Materialien und Verfahren
Zelllinien

Über die klonogenen Analysevorgänge hinsichtlich der Wachstumscharakteristika der menschlichen in vitro-Zelllinien, die bei dieser Analyse verwendet werden, wurde bereits berichtet (Warenius et al, 1994). Die bei dieser Analyse eingesetzten Zelllinien sind mit ihrer histologischen Klassifizierung in Tabelle 1 aufgelistet. Alle sind gut etabliert; viele wurden mehrere Jahre lang in vitro wachsen gelassen. Die Zelllinien waren entweder Schenkungen oder wurden von unseren Laboratorien erworben. Nach dem Erhalt wurden alle 5 Passagen lang wachsen gelassen, um genügend Zellen für eine chargenweise Lagerung in flüssigem Stickstoff zu ergeben. In dieser Periode wurde die Kontamination durch zumindest eine Passage in einem antibiotisch freien Medium ausgeschlossen, und eine Mycoplasma-Untersuchung wurde mit allen Linien durchgeführt. Für die Zellüberlebensanalysen wurden aus einer bestimmten primären Charge in flüssigem Stickstoff Zellen entnommen und 3-6 Passagen lang wachsen gelassen, bis genügend gut wachsende Zellen existierten. Weitere Chargen von diesen Zellen wurden in flüssigem Stickstoff gefroren. Die Zellen wurden, routinemäßig in einem DMEM-Medium aufbewahrt, mit Ausnahme von RT112 und H322, die in RPMI1640 wachsen gelassen wurden, und von MGHU-1, das in einem Ham-F12-Medium wachsen gelassen wurde. Alle Linien wurden mit 10%igem, durch Hitze deaktiviertem Kälberfötusserum (HIFCS) ergänzt. Tabelle 1

	Zelllinie
I407	Embryonales Darmepithel
HEP 2	Schuppenförmiges Karzinom des Kehlkopfs
MGHU1	Übergangskarzinom der Blase
HRT 18	Adenokarzinom des Mastdarms
2780	Eierstockkarzinom
OAW 42	Eierstockkarzinom
HT 29/5	Adenokarzinom des Kolons
COLO 320	Adenokarzinom des Kolons
H 322	Kleinzellen-Lungenkarzinom
H 417	Kleinzellen-Lungenkarzinom,
RPMI 7951	Melanom
RT 112	Übergangskarzinom der Blase
MOR	Adenokarzinom der Lunge
MEL 2	Melanom

Die Beziehung zwischen den Raf-1-Pegeln, den p21-Pegeln und der Strahlungsempfindlichkeit wurde bei den Zelllinien untersucht. Bei Zellen, in denen die p21-Proteinpegel erhöht waren, wurde eine nützliche Wechselbeziehung zwischen den Raf-1-Proteinpegeln und der Strahlungsempfindlichkeit festgestellt.
Somit ist es bei Zelllinien, in denen die p21-Proteinpegel erhöht sind, umso wahrscheinlicher, dass die Zellen strahlungsempfindlich sind, je höher die Raf-1-Pegel sind (3). Diese Wechselbeziehung ist bei Zelllinien, in denen das p21-Protein nicht nachweisbar ist, nicht zu finden (2).
Referenzliste

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Claims

Verfahren zur Messung der Strahlungsempfindlichkeit von Zellen, welches Verfahren die Untersuchung einer Zellen umfassenden Probe oder eines Extrakts davon hinsichtlich Folgendem umfasst: (a) hinsichtlich der Expressionsstärke von p21 oder hinsichtlich der Häufigkeit des p21-Proteins; sowie (b) hinsichtlich der Expressionsstärke von Raf-1 oder hinsichtlich der Häufigkeit des Raf-1-Proteins.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Untersuchung unter Verwendung einer Sonde für Raf-1 mRNA oder unter Verwendung eines für das Raf-1-Protein spezifischen Antikörpers durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Antikörper nicht mit einem gemeinsam mit dem Raf-1-Protein in der Probe vorhandenen 48 kD-Protein kreuzreagiert.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Antikörper erhältlich ist, indem ein Peptid gebildet wird, das einen Teil eines am 48 kD-Protein nicht vorhandenen Epitops am Raf-1-Protein umfasst oder bildet, und indem der Antikörper gegen das Peptid hergestellt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Antikörper erhältlich ist, indem ein Tier mit dem Raf-1-Protein und einem für das 48 kD-Protein spezifischen Antikörper immunisiert wird, um eine auch am 48 kD-Protein vorhandene, epitopische Stelle am Raf-1-Protein zu maskieren, und indem der Antikörper gegen das maskierte Raf-1-Protein erhalten wird.
Verfahren gemäß Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2-6, wobei der Antikörper ein markierter Antikörper ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Markierung eine Fluoreszenzmarkierung ist.
Verfahren gemäß jedem vorhergehenden Anspruch, weiters umfassend das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem DNA-bindenden Farbstoff zur Markierung von Aneuploidzellen.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei der DNA-bindende Farbstoff Hoechst 33258 oder Chromomycin A₃ ist.
Verfahren gemäß jedem vorhergehenden Anspruch, wobei die Probe eine Zellprobe ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Untersuchung mittels Durchführung einer Zellzählung bewerkstelligt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Zellzählung unter Anwendung einer Multiparameter-Durchflusszytometrie durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Zellzählung unter Anwendung der konfokalen Rastermikroskopie durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Zellzählung unter Anwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12-15, wobei die Zellprobe vor der Durchführung der Zellzählung unter dem Mikroskop zerlegt wird, um normales Gewebe von Tumorgewebe zu trennen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12-16, wobei vor der Durchführung der Zellzählung die intrazelluläre Adhäsion in der Probe zerstört wird, um eine Einzetzellen-Suspension zu bilden.
In vitro-Verfahren zum Auswählen eines Wirkstoffs zur Krebsbehandlung, welches Verfahren Folgendes umfasst: (a) die Untersuchung einer Probe, die Zellen umfasst, in welchen p21 exprimiert wird oder in welchen das p21-Protein nachweisbar ist, oder eines Extrakts davon hinsichtlich der Expressionsstärke von Raf-1 oder hinsichtlich der Häufigkeit des Raf-1-Proteins; sowie (b) ob Raf-1 überexprimiert wird und/oder das Raf-1-Protein in erhöhten Anteilen vorhanden ist, wobei zur Behandlung eine ionisierende Strahlung ausgewählt wird; (c) ob Raf-1 nicht überexprimiert wird und/oder das Raf-1-Protein im Wesentlichen nicht in erhöhten Anteilen vorhanden ist, wobei zur Behandlung ein von einer ionisierenden Strahlung verschiedener Wirkstoff ausgewählt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei die Auswahl für die Behandlung gemäß Schritt (c) durchgeführt wird und der von einer ionisierenden Strahlung verschiedene Wirkstoff ein ein Platinierungsmittel, wie z. B. CDDP, und/oder ein Taxan, wie z. B. Taxol, umfassender Wirkstoff ist.
Ausstattung zur Messung der Strahlungsempfindlichkeit von Zellen, welche Ausstattung Folgendes umfasst: (i) ein Mittel zum Untersuchen der Expressionsstärke von Raf-1 oder der Häufigkeit des Raf-1-Proteins; sowie (ii) ein Mittel zum Untersuchender Expressionsstärke von p21 oder der Häufigkeit des p21-Proteins.
Ausstattung gemäß Anspruch 20, wobei das Mittel zum Untersuchen der Häufigkeit des Raf-1-Proteins eine Sonde für Raf-1 mRNA oder einen für das Raf-1-Protein spezifischen Antikörper umfasst.
Ausstattung gemäß Anspruch 21, wobei der Antikörper ein markierter Antikörper ist.
Ausstattung gemäß Anspruch 22, wobei die Markierung eine Fluoreszenzmarkierung ist.
Ausstattung gemäß einem der Ansprüche 20-23, weiters umfassend einen DNAbindenden Farbstoff zur Markierung von Aneuploidzellen.
Ausstattung gemäß Anspruch 24, wobei der DNA-bindende Farbstoff Hoechst 33258 oder Chromomycin A₃ ist. 26 Verwendung eines Mittels zum Untersuchen der Expressionsstärke von Raf-1 oder der Häufigkeit des Raf-1-Proteins und zusätzlich eines Mittels zum Untersuchen der Expressionsstärke von p21 oder der Häufigkeit des p21-Proteins zur Messung der Strahlungsempfindlichkeit von Zellen in einem Verfahren gemäß Anspruch 1.