DE69735436T2

DE69735436T2 - Methode zum nachweis von zell-apoptose

Info

Publication number: DE69735436T2
Application number: DE69735436T
Authority: DE
Inventors: Robert Wilmington SIMAN; Donna Landenberg BOZYCZKO-COYNE; L. Sheryl Collegeville MEYER; Venkatraman Ratan West Chester BHAT
Original assignee: Cephalon LLC
Current assignee: Cephalon LLC
Priority date: 1996-11-15
Filing date: 1997-11-13
Publication date: 2006-10-26
Anticipated expiration: 2017-11-14
Also published as: EP0975971A4; DE69735436D1; HK1026739A1; EP0975971B1; ATE320006T1; US7256252B1; US6048703A; AU5169998A; EP0975971A1; CA2270866A1; DK0975971T3; WO1998021590A1

Description

Querverweis zu betroffenden Anmeldung
Diese Anmeldung beansprucht den Zeitrang der provisorischen U.S. Anmeldung mit der Ser. Nr. 60/030,961, angemeldet am 15. November 1996, und der U.S. Anmeldung mit dem Titel „Methods For Detecting Cell Apoptosis", angemeldet im Namen von Robert Siman, Donna Bozyczko-Coyne, Sheryl Meyer, und Ratan Venkatraman Bhat am 12. November, 1997, auf deren Offenbarungsgehalte hier vollumfänglich Bezug genommen wird.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper, die an Peptide binden, die in Apoptose durchlaufenden Zellen erzeugt werden. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung den Nachweis von Zell-Apoptose unter Verwendung derartiger Antikörper zum Nachweis von Apoptose durchlaufenden Zellen und Zellen, die den apoptotischen Zelltod durchlaufen haben.
Hintergrund der Erfindung
Die Apoptose ist ein physiologischer Mechanismus des Zelltods, der die Fragmentierung einer Zelle in Membran-gebundene Partikel betrifft. Der Prozess der Apoptose betrifft eine Vielzahl von normalen und pathogenen biologischen Ereignissen, sowohl während der Entwicklung als auch im ausgewachsenen Stadium. Mittel, die die Apoptose beeinflussen, können bei der Behandlung von Krankheiten und krankhaften Störungen, die durch eine anomale Zellproliferation oder Tod charakterisiert sind (besprochen in Hoeppner et al., Biochim. Biophys. Acta 1242:217–220, 1966; Thompson, Science 267:1456–1462, 1995) von therapeutischem Nutzen sein. Techniken zum Nachweis einer Apoptose können zum Screenen möglicher therapeutischer Mittel, die eine Apoptose induzieren oder verhindern können, nützlich sein.
Im Hinblick auf die biologische Bedeutung der Apoptose besteht ein Bedarf an Verfahren zum spezifischen Nachweis von Apoptose durchlaufenden Zellen und solchen, die einen apoptotischen Zelltod erlitten haben. Diese Verfahren sind für die Identifizierung, Charakterisierung und Diagnose von Krankheiten, die sich durch eine anomale Apoptose auszeichnen, und für das Screening möglicher therapeutischer Mittel, die eine Apoptose induzieren oder verhindern können, entscheidend.
Für den Nachweis der Apoptose in vitro und in vivo sind mehrere Verfahren bekannt, jedoch weisen diese signifikante Nachteile auf, die ihren Nutzen beschränken. Im Allgemeinen ist die Apoptose durch eine Kondensation und Abgrenzung von Kernchromatin und eine Fragmentierung der Kernstruktur in so genannte apoptotische Körper charakterisiert. Diese apoptotische Morphologie kann unter Verwendung herkömmlicher Färbungen, Farbstoffe, die sich selektiv in Kernen ansammeln, wie zum Beispiel Propidiumiodid oder Hoechst 33258, oder durch Elektronenmikroskopie beobachtet werden (zum Beispiel Nicoletti et al., J. Immunol. Methods 139:271–279 1991; Crompton et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 183:532–537 1992; Frey, Cytometry 21:265–274 1995; Woo, N. Engl. J. Med. 333:18–25 1995). Leider weisen diese Techniken entweder eine nicht ausreichende Spezifität auf oder sie sind für die routinemäßige selektive Identifizierung und Quantifizierung von apoptotischen Zellen in situ zu arbeitsintensiv und technisch komplex.
Jüngste Versuche zur Identifizierung und Quantifizierung der Apoptose nutzten die internucleosomale Fragmentierung der DNA, die häufig im Zusammenhang mit dem Zelltod durch Apoptose steht, jedoch nicht dafür diagnostisch ist. Verschiedene histochemische in situ Techniken sind für das End-Markieren einer geschnittenen DNA angewandt worden (Gavrieli et al., J. Cell Biol. 119:493–501 1992; Wijsman et al., J. Histochem. Cytochem. 41:7–12 1993; Wood et al., Neuron 11:621–632 1993). Obwohl diese Techniken zum Markieren apoptotischer Zellen in situ beliebt geworden sind, wurde in letzter Zeit erkannt, dass die DNA-Fragmentierung ebenfalls aus Zellstress oder nekrotischem Abbau resultieren kann. Daher sind die in situ Techniken, die fragmentierte DNA nachweisen, nicht selektiv im Nachweisen von Apoptose durchlaufenden Zellen (Nitatori et al., J. Neurosci. 15:1001–1011 1995; Lassmann et al., Acta Neuropathol. 89:35–41 1995).
Es wurden ebenfalls molekulare Techniken zum Nachweis von dem mit der Apoptose zusammenhängenden internucleosomalen DNA-Abbau in Zell- und Gewebeextrakten verwendet (Wyllie, AH, Nature 284:555–556 (1980); Wyllie et al., J. Pathol. 142:67–77 (1984)). Die in situ und molekularen Techniken, die auf dem Nachweis der internucleosomalen DNA-Fragmentierung beruhen, sind nicht ausreichend eingehend für den Nachweis des apoptotischen Zelltods, da sie keine Formen der Apoptose nachweisen, die nicht mit dem internucleosomalen DNA-Abbau assoziiert sind (Cohen et al., Biochem. J. 286:331–334 1992; Schulze-Osthoff et al., J. Cell Biol. 127:15–20 1994). Überdies fehlt den molekularen Verfahren die Empfindlichkeit und zelluläre Auflösung, die zum Definieren der Rolle der Apoptose spezieller Zelltypen in Krankheitsprozessen nötig ist. Dies gilt insbesondere für chronische langsame degenerative Erkrankungen, in denen der Zelltod langwierig und asynchron ist und einzelne apoptotische Zellen nur für eine begrenzte Zeitdauer vorhanden sind.
Ein zunehmendes Verständnis des biochemischen Mechanismus des apoptotischen Zelltods entstand aus jüngsten genetischen und zellbiologischen Untersuchungen. Es wurde festgestellt, dass eine Familie von Cysteinproteasen, die das Interleukin-1β konvertierende Enzym (ICE) betreffen, eine wesentliche Rolle im intrazellulären Weg der Apoptose spielt (besprochen in Martin et al., Cell 82:349–352 1995). ICE selbst ist in den meisten Säugerzelltypen kein Mediator der Apoptose. Bis heute ist vielmehr eine Familie homologer Proteasen, umfassend mindestens neun menschliche Proteasen der ICE-Familie, identifiziert worden (ICE, CPP32/Apopain/Yama, ICH-1, TX/ICH-2/ICE_relIII, ICE_relIII, MH-1/MH-3/ICE-LAP3, Mch2, FLICE/Mch5, ICE-LAP6/Mch6), von denen jede zur Apoptose führt, wenn sie in einer proteolytisch aktiven Form in kultivierten Säugerzellen überexprimiert werden (Miura et al., Cell 75:653–660 1993; Wang et al., Cell 78:739–750 1994; Fernandes-Alnemri et al., J. Biol. Chem. 269:30761–30764 1994; Faucheu et al., EMBO J. 14:1914–22 (1995); Kamens et al., J. Biol. Chem. 270:15250–15256 1995; Alnenui et al., J. Biol. Chem. 270:4312–4317 1995; Fernandes-Alnemri et al., Cancer Res. 55:6045–6052 1995; Lippke et al., J. Biol. Chem. 271:1825–1828 1996; Muzio et al., Cell 85:817–827 1996; Duan et al., J. Biol. Chem. 271:16720–16724 1996). Überdies erhöht eine Behandlung von Zellen mit apoptotischen Stimulantien eine ICE-artige proteolytische Aktivität in Zellextrakten (Los et al., Nature 375:81–83 1995; Enari et al., Nature 380:723-726 1996). Zur Initiierung einer Apoptose ist eine proteolytische Aktivität durch ICE-Homologe erforderlich, da eine Überexprimierung mutierter inaktiver ICE-Homologe nicht zu einer Apoptose führt und mehrere Proteaseinhibitoren der ICE-Familie eine Apoptose blockieren (Miura et al., ebd.; Gagliardini et al., Science 263:826–828 1994; Enari et al., Nature 375:78–81 1995; Milligan et al., Neuron 15:385–393 1995; Los et al., ebd.; Zhivotovsky et al., Exp. Cell Res. 221:404–412 1995; Schlegel et al., J. Biol. Chem. 271:1841–1844 1996).
Der Abbau spezifischer Zellproteine, von dem erwartet werden würde, dass er nach der Aktivierung einer ICE-artigen Protease stattfindet, ist ebenfalls mit einer Apoptose in Verbindung gebracht worden. Zum Beispiel wird Poly(ADP-Ribose)Polymerase (PARP) spezifisch während der Apoptose in Säugerzellen gespalten (Kaufmann et al., Cancer Res. 53:3976–3985 1993) und ist in vitro ein ausgezeichnetes Substrat für mehrere ICE-Homologe (Tewari et al., Cell 81:801–809 1995; Nicholson et al., Nature 376:37–43 1995; Gu et al., J. Biol. Chem. 270:18715–18718 1995; Fernandes-Alnemri et al., Cancer Res. 55:2737–2742 1995; Fernandes-Alnemri et al., ebd.; Lippke et al., J. Biol. Chem. 271:1825–1828 1996). In der menschlichen promyelocytischen Leukämiezelllinie HL60 (Collins et al., Nature 270:347–349 1977) wird als Antwort auf die Inkubation mit Etoposid PARP abgebaut, was zum Zelltod durch Apoptose führt (Kaufmann et al., ebd.). Proteaseinhibitoren, die die Aktivität von ICE-Homologen blockieren, verhindern nicht nur eine Apoptose sondern ebenfalls einen PARP-Abbau (Schlegel et al., ebd.).
Ein Nachweis von PARP und seiner Apoptose-assoziierter Form mit 85 kDa wurde mit einem Anti-PARP monoklonalen Antikörper in einem in vitro Modell eines proteolytischen Wegs zur Apoptose erreicht (Quan Long et al., PNAS 93:1972–1976 1996). Ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper wurde gegen die DNA-Bindungsdomäne von menschlichem PARP (Anti-FII) hervorgerufen und in der Immunfluoreszenz verwendet (Küpper et al., Histochem. J. 28:391–395 1996). Monoklonale Antikörper gegen PARP wurden durch Immunisieren von Mäusen mit gereinigter Poly(ADP-Ribose)Polymerase hergestellt. Einige reagierten ausschließlich mit den 74- und 54 kDa Fragmenten, die die Substrat-Bindungsdomäne besaßen, während andere ausschließlich mit dem 46 kDa Fragment reagierten, das als DNA-Bindungsdomäne identifiziert wurde (Lamarre et al., Biochem. & Cell Biol. 64:368–376 1986).
Aufgrund der Unzulänglichkeiten bei vielen der bekannten Verfahren zum Nachweis der Zell-Apoptose gibt es einen fortwährenden Bedarf an neuen selektiven Nachweisverfahren. Die vorliegende Erfindung betrifft dieses sowie andere wichtige Ziele.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für den biochemischen und histochemischen Nachweis der Apoptose bereit. Die Verfahren basieren auf der Verwendung von Antikörpern, die selektiv mit Fragmenten von Proteinen reagieren, deren Abbau während der Apoptose stimuliert wird.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper, der durch Immunisieren mit dem Peptid SEQ ID Nr: 2 (CKGDEVD) erhalten wird. Der Antikörper reagiert vorzugsweise selektiv mit dem etwa 30 kDa NH₂-terminalen Polypeptid-Derivat der Poly(ADP-Ribose)Polymerase, das in Apoptose durchlaufenden Zellen erzeugt wird.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Peptid bereit, das aus der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr: 2 besteht.
Eine weitere Ausführungsform stellt ein Verfahren zum Nachweis von Apoptose in situ bereit, das auf der Verwendung von immunhistochemischem Färben von Zellen in einem fixierten Präparat basiert. Das Präparat kann eine Kultur von Zellen, die fixiert worden sind, oder eine fixierte und geschnittene Gewebeprobe sein. Das fixierte Präparat wird mit einem Antikörper in Kontakt gebracht, der durch Immunisieren mit der Peptidsequenz SEQ ID Nr: 2 (CKGDEVD) erhalten wird.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine erste Probe von Zellen, die ein Protein enthalten, das immunreaktive Fragmente während der Apoptose erzeugt, einer Testverbindung unter Bedingungen oder einer Behandlung ausgesetzt, von denen oder der bekannt ist, dass sie eine Apoptose in den Zellen auslösen (auslöst). Eine zweite Probe derselben Zellen wird in Abwesenheit jeglicher Testverbindung ebenfalls Bedingungen ausgesetzt, von denen bekannt ist, dass sie eine Apoptose auslösen. Eine Testverbindung inhibiert eine Apoptose, wenn die Antikörperbindung an die erste Probe schwächer ist als die Antikörperbindung an die zweite Probe.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine erste Probe von Zellen einer Testverbindung ausgesetzt. Eine zweite Probe derselben Zellen wird nicht der Testverbindung ausgesetzt. Eine Testverbindung stimuliert eine Apoptose, wenn die Antikörperbindung an die erste Probe stärker ist, als die Antikörperbindung an die zweite Probe.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verbindungskandidat einem Säuger, vorzugsweise einem Nagetier, beispielsweise einer Wüstenrennmaus, einer Maus oder Ratte, unter Bedingungen verabreicht, von denen bekannt ist, dass sie eine Apoptose stimulieren. Der Gehalt an apoptosegenerierten Proteinfragmenten wird wie vorstehend beschrieben unter Verwendung von Immunoassays bestimmt. Eine Verbindung wird als Inhibitor von Apoptose positiv getestet, wenn die Menge an apoptosegenerierten Proteinfragmenten, die von einem Tier entnommen wurden, dem der Verbindungskandidat verabreicht worden war, geringer ist als diejenige, die in einer äquivalenten Probe von einem Tier vorhanden ist, das denselben Apoptose stimulierenden Bedingungen ausgesetzt wurde, jedoch nicht dem Verbindungskandidat ausgesetzt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verbindungskandidat einem Säuger verabreicht, wie zum Beispiel einer Wüstenrennmaus, einer Maus oder Ratte, und der Gehalt an apoptosegenerierten Proteinfragmenten wird unter Verwendung von Immunoassays bestimmt, wie vorstehend beschrieben ist. Eine Verbindung wird als positiv getestet, wenn die Menge an apoptosegenerierten Proteinfragmenten, die einem Tier entnommen wurden, dem der Verbindungskandidat verabreicht worden ist, größer ist als diejenige, die in einer äquivalenten Probe von einem Tier vorhanden ist, das nicht dem Verbindungskandidat ausgesetzt worden war.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Nachweis einer Krankheit, krankhaften Störung oder Zustand, welcher mit der Zell-Apoptose assoziiert ist, in einem Versuchstier. Eine Probe von Zelle wird von dem Versuchstier erhalten. Die Probe wird mit einem Antikörper in Kontakt gebracht, der durch Immunisierung mit dem Peptid SEQ ID NR: 2 erhalten wird. Das Ausmaß der Bindung des Antikörpers mit Zellen in der Probe wird vorzugsweise durch einen Immunoassay in Be zug auf eine Kontrollprobe bestimmt, von der bekannt ist, dass sie frei von Apoptose ist.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur in vitro Bestimmung des Gehalts an apoptosegenerierten Proteinfragmenten in einer Probe. Das Kit umfasst:

a) einen primären Antikörper, erhalten durch Immunisierung mit einem Polypeptid der Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2, welcher an Peptide bindet, die in Zellen während der Apoptose hergestellt werden, und vorzugsweise an das etwa 30 kDa NH₂-terminale Polypeptid-Derivat der Poly(ADP-Ribose)Polymerase, hergestellt in Apoptose durchlaufenden Zellen und
b) einen sekundären Antikörper, welcher mit einer signalererzeugenden Markierung konjugiert ist, wobei der sekundäre Antikörper spezifisch an den primären Antikörper bindet.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Zum Zwecke der Erläuterung der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in den Zeichnungen bestimmte Merkmale gezeigt. Es versteht sich jedoch von selbst, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die genauen gezeigten Ausführungsformen beschränkt ist.
1 zeigt eine Konstruktion eines Antikörpers, der selektiv mit Proteinfragmenten reagiert, die während der Apoptose erzeugt werden. Die Sequenz um die Stelle innerhalb der Poly(ADP-Ribose)Polymerase (PARP), die in apoptotischen Zellen gespalten wird, ist mit dem Pfeil angezeigt. Die Antikörper wurden so konstruiert, dass sie mit der COOH-terminalen Domäne des NH₂-terminalen Fragments von PARP und anderen Polypeptiden reagieren, die nach Spaltung die bevorzugte Sequenz an ihrem Carboxylende tragen.
2 zeigt einen Immunblotnachweis der apoptotischen Proteolyse in Etoposidbehandelten HL60-Zellen. Spur 1 – unbehandelte Zellen; Spur 2 – zwei Stunden Etoposidbehandlung; Spur 3 – vier Stunden Etoposidbehandlung. Aus den Zellen hergestellte Kernextrakte wurden durch SDS-PAGE getrennt (15 μg Protein pro Spur) und durch Western-Blotting auf Nitrocellulose übertragen. Mit Ab127 (1/5000) immunreaktive Polypeptide wurden durch Standardtechniken markiert (zum Beispiel Harlow und Lane (1988) ebd.; Roberts-Lewis et al. (1994) ebd.). Beachte, dass Etoposid-behandelte apoptotische HL60-Extrakte, jedoch keine Extrakte von unbehandelten Zellen ein immunreaktives Polypeptid von etwa 30 kDa (Pfeil), der von dem NH₂-terminalen PARP-Fragment erwarteten Größe, enthalten (Lazebnik et al. (1994) ebd.). Gehalte eines immunreaktiven Polypeptids mit näherungsweise 80 kDa waren ebenfalls in apoptotischen Zellen reproduzierbar erhöht, wohingegen eine schwache Immunmarkierung eines Polypeptids mit näherungsweise 100 kDa unabhängig von der Zellbehandlung beobachtet wurde.
3 stellt eine Bestätigung dar, dass das etwa 30 kDa immunreaktive Polypeptid durch Ab127 markiert ist und ein während der Apoptose erzeugtes Proteinfragment ist. Kernextrakte (10 μg pro Spur) wurden aus Etoposid-behandelten apoptotischen HL60 Zellen (Spuren 1, 3) oder unbehandelten Zellen (Spuren 2, 4) hergestellt. Extrakte von Zellen, die nicht mit Etoposid behandelt wurden, wurden 15 Minuten bei Raumtemperatur mit der ICE-artigen Protease rekombinanten menschlichen Caspase 3 (rhCPP32) inkubiert. Spuren 1,2 – immunmarkiert mit Ab127, wie für 2 beschrieben ist. Spuren 3, 4 – immunmarkiert mit Ab127, das mit 1,5 μg Peptidimmunogen (CKGDEVD – SEQ ID NR: 2) pro μl Antiserum präabsorbiert worden war. Beachte, dass das immunreaktive etwa 30 kDa Polypeptid in apoptotischen Zellen ebenfalls durch rhCPP32-Behandlung eines nicht mit Etoposid behandelten Zellextrakts erzeugt wird (vergleiche Spuren 1 und 2). Die Immunreaktivität wird nicht nach Präabsorption des Antisense mit Peptidimmunogen beobachtet (Spuren 3, 4).
4 zeigt den Immunoblotnachweis der apoptotischen Proteolyse in neuronal differenzierten PC12-Zellen mit entzogenem Wachstumsfaktor. NGF-differenzierte PC12-Zellen wurden entweder mit dem Wachstumsfaktor bewahrt (+NGF) oder dieser wurde während 24 Stunden entzogen (–NGF). Kernextrakte von differenzierten PC12-Zellen (NUC) wurden mit rekombinantem CPP32 während entweder 0, 10 oder 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zum Vergleich ist ebenfalls ein Kernextrakt von HL60-Zellen gezeigt, das mit CPP32 inkubiert worden war. Es ist zu beachten, dass ein stark immunreaktives Polypeptid mit näherungsweise 46 kDa (und ein schwaches mit näherungsweise 35 kDa, das nicht in dieser Figur gezeigt ist) in PC12-Zellen mit entzogenem NGF, aber nicht in NGF-bewahrenden PC12-Zellen nachgewiesen ist. In mit rekombinantem CPP32 inkubierten PC12-Kernextrakten werden immunreaktive Polypeptide mit identischer Größe gebildet. Den immunreaktiven Polypeptiden wird nicht PARP entzogen, da sie differentiell, ausgehend von dem 30 kDa PARP-Fragment, das in dem HL60-Extrakt sichtbar ist, wandern.
Die 5A und 5B zeigen einen immunhistochemischen Nachweis der apoptotischen Proteolyse in neuronal differenzierten PC12-Zellen mit entzogenem Wachstumsfaktor. PC12-Zellen, die entweder auf NGF (5A) bewahrt oder denen NGF während 24 Stunden entzogen wurde (5B) wurden mit Ab127 mit 1/20000 unter Verwendung einer indirekten Standardimmunperoxidasetechnik (zum Beispiel Roberts-Lewis et al. (1994) ebd.) markiert. Die Zellen wurden mit 200X Vergrößerung, 1260X Vergrößerung für den Einschub photographiert. Beachte, dass Ab127 einen Untersatz von Zellen mit entzogenem NGF stark markiert. Die Immunfärbung nahm die Form einer Reihe kleiner intensiv markierter Punkte an, die manchmal einen Kreisring um die Zelle bildeten. In Abwesenheit von Ab127 wurde keine Immunmarkierung von PC12-Zellen mit entzogenem NGF beobachtet (Daten sind nicht gezeigt).
Die 6A–6C zeigen den immunhistochemischen Nachweis der apoptotischen Proteolyse in der Entwicklung des postnatalen Rattenhirns. Sagittalschnitte von einem Aldehyd-fixierten Rattenhirn wurden mit 40 μm auf einem Gefriermikrotom hergestellt und mit Ab127 (1/3000) unter Verwendung einer indirekten Standardimmunperoxidasetechnik markiert (Roberts-Lewis et al. (1994) ebd.). A – hippocampale Bildung, postnataler Tag 4 (100X Vergrößerung); DG – Gyrus dentatus; CA3 – das CA3-Unterfeld des Hippocampus; CA1 – das CA1-Unterfeld des Hippocampus; S – Subiculum. Beachte die verstreuten stark immunreaktiven Zellen (nicht gefüllte Pfeilspitzen). Bei höherer Vergrößerung weisen diese Zellen die Morphologie von Neuronen auf. B – Unterer Colliculus, postnataler Tag 9 (200X Vergrößerung). Verstreute Neuronen zeigen eine starke Immunreaktivität in ihren Zellkörpern und dentritischen Prozessen. Beachte das perlenartige Aussehen der immunmarkierten Dendriten, welches eine aktive Degeneration anzeigt. C – parietaler Neocortex, postnataler Tag 9 (100X Vergrößerung). Die Immunreaktivität, die die apoptotische Proteolyse anzeigt, ist auf einen kleinen Untersatz von Neuronen in Schicht 2 beschränkt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die folgenden Begriffe, wie sie vorstehend und in der gesamten Offenbarung hindurch verwendet werden, sollen, sofern nicht anders angegeben, mit den folgenden Bedeutungen verstanden werden.
„Apoptose" bezieht sich auf eine spezifische morphologische Form des Zelltods, die durch Fragmentierung von Zellen und deren Kerne in Membran-gebundene Partikel charakterisiert ist. Eine Apoptose kann zum Beispiel durch Behandlung mit Verbindungen, wie zum Beispiel Etoposid, Staurosporin, Tumornekrosefaktor-α, Ceramid und dergleichen, oder durch Bedingungen, wie zum Beispiel x-Bestrahlung ausgelöst werden.
In Bezug auf Zahlenwerte bedeutet „etwa" ± 5% des einzelnen Werts. Zum Beispiel speziell bezogen auf das NH₂-terminale Polypeptidderivat von PARP, das in Apoptose durchlaufenden Zellen erzeugt wird, liegt das unter Western-Blot-Bedingungen, basierend auf dem Nachweis mit hierin offenbarten Antikörpern, bestimmte Molekulargewicht zwischen 30 und 31 kDa, das heißt, bei etwa 30 kDa (30 ± 5% = Bereich zwischen 28,5 und 31,5).
„Apoptosegeneriertes Proteinfragment-spezifischer Antikörper" bezieht sich auf einen Antikörper, der apoptosegenerierte Proteinfragmente aber keine intakten Proteine erkennt.
„SEQ ID NR: 1" bezieht sich auf die Aminosäuresequenz GDEVD/Gly-Asp-Glu-Val-Asp).
„SEQ ID NR: 2" bezieht sich auf die Aminosäuresequenz CKGDEVD/Cys-Lys-Gly-Asp-Glu-Val-Asp).
„Im Wesentlichen rein" beschreibt eine Verbindung, die von anderen Komponenten, die sie natürlicherweise begleiten, abgetrennt worden ist. Eine Verbindung ist typischerweise im Wesentlichen rein, wenn mindestens 75%, bevorzugter mindestens 90% und besonders bevorzugt mindestens 99% des gesamten Materials (bezüglich dem Volumen, Naß- oder Trockengewicht oder Molprozent oder Molenbruch) in einer Probe die interessierende Verbindung ist. Die Reinheit kann durch jedes geeignete Verfahren gemessen werden, zum Beispiel im Fall von Polypeptiden durch Säulenchromatographie, Polyacrylamid-Gelelektrophorese, oder durch HPLC-Analyse. Insbesondere ist ein Protein im Wesentlichen gereinigt, wenn es von den natürlichen Verunreinigungen, die es in seinem natürlichen Zustand begleiten, getrennt ist.
Die Begriffe „reagiert selektiv" oder „bindet spezifisch" beschreiben einen Antikörper, der Zielproteinfragmente erkennt und daran bindet, der jedoch andere Moleküle, wie zum Beispiel intakte Proteine, im Wesentlichen nicht erkennt und daran bindet.
„Etoposid" bedeutet ein halbsynthetisches Derivat von Podophyllotoxin, das als Antineoplastikum verwendet wird.
Ein „Antineoplastikum" beabsichtigt die Reifung und Proliferation bösartiger Zellen zu inhibieren.
„Epitop" bedeutet eine Stelle auf der Oberfläche eines Antigenmoleküls, an welches ein einzelnes Antikörpermolekül bindet.
„Vehikel" bezieht sich auf eine relativ inerte Substanz, die einem biologisch aktiven Mittel zugegeben wird, um dem Mittel eine geeignete Konsistenz oder Form zu verleihen.
Die vorliegende Erfindung richtet sich teilweise auf die Verbesserung von Verfahren zum Nachweis von Zell-Apoptose. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen das in Kontakt bringen einer Probe mit einem Antikörper, der selektiv an Proteinfragmente bindet, die während der Apoptose erzeugt werden. Die Menge des Antikörpers, der an die Zielproteinfragmente gebunden wird, wird durch einen Immunoassay bestimmt, wobei als Vergleich eine Probe verwendet wird, von der bekannt ist, dass sie frei von Apoptose ist.
Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP) ist eines der Proteine, dessen proteolytischer Abbau in einer Vielzahl von Apoptose durchlaufenden Zellen stimuliert ist (Kaufmann et al., ebd; Lazebnik et al., Nature 371:346–347 1994; Tewari et al., ebd.). Wie in 1 schematisch gezeigt ist wird das PARP mit näherungsweise 115 kDa in apoptotischen Zellen vorzugsweise an einer einzelnen Stelle gespalten, wobei ein NH₂-terminales Fragment mit ungefähr 30 kDa und ein COOH-terminates Derivat mit näherungsweise 85 kDa erzeugt wird (scheinbare Molekulargewichte entsprechend der Bestimmung durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese; Kaufmann et al., ebd; Lazebnik et al., ebd.). Die unmittelbar NH₂-terminal zur Spaltungsstelle liegenden fünf Reste sind vollständig in PARP von mehreren vertebralen Spezies konserviert, wohingegen die unmittelbar COOH-terminal zur Spaltungsstelle liegenden Reste divergent sind (Cherney et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84:8370–8374 1987; Saito et al., Gene 90:249–254 1990; Huppi et al., Nuc. Acids Res. 17:3387–3401 1989; Ittel et al., Gene 102:157–164 1991; Lazebnik et al., ebd.).
In Apoptose durchlaufenden Zellen werden zusätzliche Peptidfragmente erzeugt. Es ist bekannt, dass zum Beispiel der DNA-Replikationskomplex C, die DNA-abhängige Proteinkinase, die Proteinkinase von Presenilin 1 und 2, Spectrin (Fodrin) sowie andere Polypeptide abgebaut werden und während der Apoptose Peptidfragmente erzeugen. Antikörper gegen die Peptidfragmente dieser Polypeptide konnten zur Identifikation von Apoptose durchlaufenden Zellen hergestellt werden.
Wir nahmen an, dass die hochkonservierte Pentapeptidsequenz zur Erkennung durch die während der Apoptose aktivierte Protease(n) entscheidend ist – das heißt, dass sie die Erkennungsstelle zur Apoptosespaltung ist – und ein gegen diese Sequenz hervorgerufener Antikörper selektiv mit dem ungefähr 30 kDa NH₂-terminalen Derivat von PARP, das in Apoptose durchlaufenden Zellen erzeugt wird, reagieren kann (1). Sollte die Sequenz in dem intakten PARP oder in unterschiedlichen während der normalen Umwandlung des Proteins gebildeten PARP-Derivaten unzugänglich sein, dann kann erwartet werden, dass ein Antikörper gegen die Sequenz eine hochspezifische Sonde für die apoptotische Proteolyse von PARP ist. Es ist denkbar, dass der Antikörper ebenfalls mit Fragmenten von Proteinen selektiv reagieren kann, die andere als PARP sind, die ebenfalls die spezielle Sequenz enthalten und daher einen verstärkten Abbau während der Apoptose zeigen.
Wir offenbaren hier Antikörper, die vorzugsweise an Proteinfragmente binden, die während der Apoptose erzeugt werden, und daher unsere Hypothese, die die Erkennungsstelle zur Apoptosespaltung betrifft, bestätigen.
Eine Messung von Apoptose-assoziierten Proteolysegehalten kann durch Verwendung eines Immunoassays ausgeführt werden, der den Nachweis der Bindung zwischen apoptosegenerierten Proteinfragmenten und einem gegen apoptosegenerierte Proteinfragmente spezifischen Antikörper erlaubt. Die Menge an gebundenem Antiköper kann durch den Nachweis von enzymischen, chromogenischen, radioaktiven, fluoreszierenden oder lumineszierenden Markierungen bestimmt werden, die entweder an den Antikörper gebunden sind, der an die apoptosegenerierten Proteinfragmente bindet, oder an einen sekundären Antikörper gebunden sind, der den Antikörper erkennt, der an die apoptosegenerierten Proteinfragmente bindet.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung reagieren selektiv mit apoptosegenerierten Proteinfragmenten und reagieren nicht mit einem intakten Protein. Der gegen das Peptid CKGDEVD (SEQ ID NR: 2) hergestellte Antikörper der vorliegenden Erfindung reagiert vorzugsweise mit dem etwa 30 kDa NH₂-terminalen Polypeptid-Derivat von Poly(ADP-Ribose)Polymerase (PARP), hergestellt in Apoptose durchlaufenden Zellen. Dieser Antikörper reagiert ebenfalls selektiv mit Fragmenten von Proteinen, die andere als PARP sind, das heißt, die Polypeptide mit näherungsweise 46 und näherungsweise 35 kDa in apoptotischen PC12 Zellen. Obwohl unterschiedliche Proteine in apoptotischen Zellen aus verschiedenen Quellen abgebaut werden können, wodurch reaktive Proteinfragmente mit unterschiedlicher Größe erzeugt werden, werden sie jedoch durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung nachgewiesen, wenn die Proteinfragmente die COOH-terminale Sequenz GDEVD (SEQ ID NR: 1) enthalten.
Das Peptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2 (CKGDEVD) kann zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden, die spezifisch daran binden. Antikörper für die hierin beschriebenen speziellen Aminosäuresequenzen können zum Beispiel durch Immunisieren eines Säugers mit dem geeigneten Peptid oder Peptidkonjugat erzeugt werden. Verfahren zur Erzeugung von sowohl monoklonalen als auch polyklonalen Antikörpern, die diese Peptide erkennen, sind in Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988) beschrieben, auf dessen Offenbarungsgehalt hierin vollumfänglich Bezug genommen wird.
Antikörper, die spezifisch apoptosegenerierte Proteinfragmente aber keine intakten Proteine erkennen, können durch Standardimmunisierungsverfahren unter Verwendung eines Peptids hergestellt werden, das einer von dem etwa 30 kDa NH₂-terminalen Fragment von PARP (GDEVD; SEQ ID NR: 1) abgeleiteten Sequenz als Immunogen entspricht. Dieses Peptid kann durch Standardverfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden. Die NH₂-terminate Verlängerung von SEQ ID NR: 1 (GDEVD), die zur Herstellung von SEQ ID NR: 2 (CKGDEVD) verwendet wird, kann selbst als Immunogen verwendet werden. Andere Protein- oder Peptidantigene, die ohne Rücksicht auf ihren Ursprung, Länge oder Homologiegrad mit natürlich vorkommenden aoptosegenerierten Proteinfragmenten zu der Erzeugung von Antikörpern führen, die spezifisch an die apoptosegenerierten Proteinfragmente binden, können ebenfalls in den Verfahren der Erfindung verwendet werden. Zur Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung bevorzugte Antikörper sind jedoch Ab127 und Ab128. Zur Bestimmung der Wirksamkeit von Antikörpern zur Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung werden die Reaktivitäten der Antikörper gegen normalerweise vorkommende Proteine und apoptosegenerierte Proteinfragmente verglichen. Verfahren für einen derartigen Vergleich sind hier durch Beispiele erläutert.
Die Antikörper können für den Nachweis und die Messung der apoptotischen Proteolyse, für das immunhistochemische Markieren und die quantitative Bestimmung von Apoptose durchlaufenden Zellen in vitro und in vivo und für die Identifikation von Mitteln, die die Apoptose stimulieren oder blockieren, verwendet werden.
Die Verfahren der Erfindung können zum Diagnostizieren von Zell-Apoptose und damit assoziierten Zuständen in einem Versuchstier, wie zum Beispiel ein Säuger und insbesondere in einer Versuchsperson verwendet werden. Die Verfahren können zum Bestimmen, ob ein Versuchstier ein Risiko aufweist oder gefährdet ist, einen pathologischen Zustand zu entwickeln, verwendet werden.
Die Verfahren der Erfindung können ebenfalls zur Diagnose einer Krankheit, einer krankhaften Störung oder eines Zustands entweder pathologischen oder nicht pathologischen Ursprungs, einschließlich aber nicht beschränkt auf eine chronische neurodegenerative Erkrankung, Krebs, Blutvergiftung, Trauma, Hypoxie, Anoxie, Ischämie, spinales Trauma, Kopftrauma, Verletzungen und Aussetzung gegen Gifte verwendet werden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls zur Identifikation von Verbindungen verwendbar, die einen apoptotischen Zelltod (zum Beispiel in der Onkologie) inhibieren oder stimulieren, indem bestimmt wird, dass die Verbindungen die Bildung von apoptosegenerierten Proteinfragmenten inhibieren oder stimulieren. Die Proteinfragmente werden durch Bestimmung des Ausmaßes der Bindung eines Antikörpers, der gegen die Peptidsequenz SEQ ID NR: 2 (CKGDEVD) hergestellt ist, nachgewiesen.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können ebenfalls zur Bestimmung des Ausmaßes der Aktivität eines Verbindungskandidats zum Erniedrigen oder Erhöhen der apoptotischen Aktivität in einem Säuger verwendet werden.
In Verbindung mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann eine Analyse an Proteinen durchgeführt werden, die aus lysierten Zellen erhalten wurden, die mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese („PAGE") abgetrennt worden sind. Die Proteine werden mit einem selektiven Antikörper in Kontakt gebracht und eine Analyse wird vorzugsweise mittels eines Immunoassays zur Bestimmung des Vorhandenseins von Proteinfragmenten, die an den Antikörper binden, durchgeführt. Es kann ein Vergleich mit einer Kontrolle durchgeführt werden, die aus Proteinen aus ähnlichen lysierten Zellen besteht, von denen bekannt ist, dass sie frei von Apoptose sind.
Immunoassays, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: ELISA, Zell-basiertem ELISA, Filterbindendem ELISA, Inhibitions-ELISA, Western-Blots, Immunofällung, Slot- oder Dot-Blot-Assays, Immunfärbung, RIA, Szintillations-Annäherungs-Assays, fluoreszierende Immunoassays unter Verwendung von Antikörper-Konjugaten oder Antigen-Konjugaten fluoreszierender Substanzen, wie zum Beispiel Fluorescein oder Rho damin, Ouchterlony Doppel-Diffusions-Analyse, und Immunoassays, welche ein Avidin-Biotin- oder ein Streptavidin-Biotin-Detektionssystem verwenden. Modifikationen der bekannten Immunoassaytechniken können ebenfalls verwendet werden.
Für den Fachmann ist es ebenfalls selbstverständlich, dass alle der vorstehend beschriebenen Immunoassays zum Analysieren einer Gewebeprobe von einem lebenden Versuchstier verwendet werden können. Mögliche biologische Proben für diese Analyse umfassen Blutzellen oder biopsierte Zell- oder Gewebeproben, die durch Standardverfahren erhalten werden können. Die Gehalte der apoptosegenerierten Peptidfragmente in den vorstehend beschriebenen biologischen Proben können in jedem der vorstehend beschriebenen Immunoassays unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch an die Peptidsequenz GDEVD (SEQ ID NR: 1) binden, bestimmt werden. Der Gehalt der in der biologischen Probe von dem analysierten Versuchstier bestimmten apoptosegenerierten Peptidfragmente wird mit dem Gehalt verglichen, der in einem nicht betroffenen Patienten oder in einem bekannten Standard gefunden wird. Dieses Verfahren kann zur Diagnose degenerativer Zustände, die durch eine abnormale Apoptose charakterisiert sind, verwendet werden. Eine Zunahme der apoptosegenerierten Peptidfragmente von vorzugsweise 50 Prozent und bevorzugter 150 Prozent im Vergleich zu Kontrollproben kann als auf einen degenerativen Zustand hinweisend betrachtet werden.
Die vorstehend beschriebenen diagnostischen Assays können durch die Verwendung von Kits erleichtert werden, die die zur Ausführung des Assays erforderlichen Reagenzien enthalten.
Die vorliegende Erfindung stellt Kits bereit, die in dem Nachweis von Zell-Apoptose und in der Diagnose von damit assoziierten Erkrankungen verwendet werden können. Ein derartiges Kit umfasst: (1) einen primären Antikörper, der zur Bindung an Proteinfragmente, die während der Apoptose erzeugt werden, in der Lage ist, (2) einen sekundären Antikörper, welcher mit einer signalerzeugenden Markierung konjugiert ist, wobei der sekundäre Antikörper einer ist, der an den primären Antikörper bindet; und (3) ein signalerzeugendes tertiäres Reagenz, das zur Erkennung eines markierten sekundären Antikörpers in der Lage ist.
Ein weiteres Kit, das zum erfindungsgemäßen Nachweis von apoptosegenerierten Proteinfragmenten verwendbar ist, umfasst (1) einen ersten Antikörper, der zum Binden an während der Apoptose erzeugte Proteinfragmente in der Lage ist; und (2) einen sekundären Antikörper, der mit einer signalerzeugenden Markierung konjugiert ist, wobei der sekundäre Antikörper ebenfalls mit einem apoptosegenerierten Proteinfragment reagiert, wobei er jedoch ein Antikörper ist, der an eine Stelle bindet, die sich von derjenigen, an die der erste Antikörper bindet, unterscheidet. Dieses Kit ist besonders zur Ausführung eines Immunoassays mit einem oder zwei Antikörpern, zum Beispiel ein Sandwich-ELISA, geeignet.
In den erfindungsgemäß bereitgestellten Assaykits kann die signalerzeugende Markierung, die an den sekundären Antikörper gebunden ist, zum Beispiel ein Enzym, wie zum Beispiel Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase sein. Vorzugsweise werden sowohl das Enzym als auch das Substrat in dem Kit bereitgestellt. Das Kit kann ebenfalls einen unbeschichteten Träger umfassen, auf dem eine zu untersuchende Probe oder der erste Antikörper immobilisiert werden können.
Die vorliegende Erfindung ist weiterhin in den folgenden Beispielen beschrieben. Diese Beispiele werden nur für erläuternde Zwecke bereitgestellt und beabsichtigen nicht, die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zu beschränken. Andere geeignete Modifikationen und Anpassungen der Vielzahl von Bedingungen und Parametern, auf die man normalerweise in der Immunodiagnostik trifft und die für den Fachmann offensichtlich sind, liegen innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung.
BEISPIELE
Beispiel 1: Herstellung von Antikörpern, die selektiv mit während der Apoptose erzeugten Proteinfragmenten reagieren
Antikörper wurden durch Immunisieren von Kaninchen mit einem Immunogen, umfassend das Pentapeptid GDEVD (SEQ ID NR: 1) und das Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin (KLH), hergestellt. Das Pentapeptid war direkt mit KLH durch NH₂-terminale Cystein-Lysin-Reste konjugiert (Harlow und Lane (1998) Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird), das heißt, als das Heptapeptid CKGDEVD (SEQ ID NR: 2). Das Heptapeptid wurde durch Standardfestphasenverfahren synthetisiert und seine Struktur wurde durch schnelle Atombeschußmassenspektrometrie bestätigt. Es wurde unter Verwendung von Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (Calbiochem, San Diego, CA) mit KLH konjugiert. Zwei Kaninchen wurden mit dem Immunogen immunisiert und die resultierenden Antiseren wurden durch Standardtechniken gesammelt. Die Antiseren werden als Ab127 und Ab128 bezeichnet.
Beispiel 2: Immun-Blotting zum Nachweis von apoptoseassoziierter Proteolyse in HL60 Zellen und Bewertung der Reaktivität von Ab127 oder Ab128 mit einem apoptoseassoziierten etwa 30 kDa PARP-Fragment
HL60-Zellen (erhalten von der American Type Culture Collection, Rockville, MD) wurden unter Verwendung veröffentlichter Techniken (Collins et al., Nature, 270:347-349 (1977), auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird) kultiviert. Kulturen von Zellen wurden mit entweder 17 mikromolarem Etoposid (von einer 1000X Stammlösung in Dimethylsulfoxid hergestellt) zum Auslösen von Apoptose oder einem Vehikel inkubiert. Nach entweder 2 oder 4 Stunden wurden die Zellen in eiskaltem 25 millimolarem (mM) HEPES (pH 7,5), 5 mM MgCl₂, 0,1% Triton X-100 und einem Cocktail von Proteaseinhibitoren (1 mM EGTA, 10 Mikrogramm pro ml Aprotinin, 10 Mikrogramm pro ml Leupeptid, 7 Mikrogramm pro ml Pepstatin A, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) lysiert. Die resultierenden Zelllysate wurden einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf 4–20% Tris-Glycin-Gradientgelen unterzogen, und die getrennten Proteine wurden durch Western-Blotting auf Nitrocellulose übertragen. Die Blots wurden mit Ab127 (1/5000) immungefärbt, anschließend mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege-Anti-Kaninchen IgG (Bio-Raf, Burlingame, CA) inkubiert und, wie vorstehend beschrieben ist, sichtbar gemacht (Roberts-Lewis et al., J. Neurosci. 14:3934–3944 (1994), auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird).
Wie in 2 gezeigt ist, markiert der Antikörper drei Polypeptide in den HL60-Extrakten. Zwei der Polypeptide wiesen ein Molekulargewicht von näherungsweise 100 und näherungsweise 80 kDa auf und wurden ohne Rücksicht auf die Zellbehand lung markiert, obwohl in apoptotischen Zellen Gehalte des Polypeptids mit näherungsweise 80 kDa zunahmen. Ab127 markiert zusätzlich ein etwa 30 kDa Polypeptid, das nur in Etoposid-behandelten jedoch nicht in Vehikel-behandelten Zellen leicht nachgewiesen wurde. Der Gehalt des etwa 30 kDa immunreaktiven Polypeptids nahm mit zunehmender Zeit des Aussetzen der Zelle gegenüber Etoposid zu. Im Unterschied zu der Angabe banden die hier verwendeten Antikörper nicht an das Polypeptid mit näherungsweise 100 kDa oder das Polypeptid mit näherungsweise 100 kDa unter Ausschluss des PARP Polypeptids mit etwa 30 kDa.
Zur Kontrolle der Spezifität der Antikörperreaktivität wurden ebenfalls Präimmunseren und Immunseren, die mit einem Überschuss an Peptidimmunogen präabsorbiert worden waren, untersucht. Präimmunseren von den zwei Kaninchen markierten nicht das etwa 30 kDa Polypeptid. Für die Präabsorption wurde das Ab127 Serum auf ein fünfzigstel in Tris-gepufterter Salzlösung (pH 7,4) verdünnt und in zwei Aliquoten aufgeteilt. Das Peptid CKGDEVD wurde zu einem Aliquot mit 300 Mikgrogramm/ml zugegeben und die zwei Aliquoten wurden bei Raumtemperatur während 1 Stunde inkubiert. Dann wurde jedes Aliquot auf ein hundertstel verdünnt und zum Immun-Blotting verwendet. Wie in 3 gezeigt ist wurde die Immunmarkierung des etwa 30 kDa Polypeptids durch die Ab127-Präabsorption blockiert.
Beispiel 3: Bestätigung, dass das etwa 30 kDa immunreaktive Polypeptid ein während der Apoptose erzeugtes Proteinfragment ist.
Kernextrakte von HL60-Zellen wurden mit einem enzymatisch aktiven Präparat der ICE-artigen Protease CPP32 behandelt. Zur Erzeugung von rhCPP32 wurde das Baculovirus-Expressionssystem verwendet (Meyer et al., Neurosci. Abstr. 22:565 (1996), auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird) und es wurde gezeigt, dass es, basierend auf der Spaltung eines synthetischen Peptidsubstrats, proteolytisch aktiv ist (das Verfahren wurde in Nicholson et al., Nature 376:37–43 (1995) beschrieben, auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird). Die Protease wurde durch Chromatographie auf einem Q-Sepharose FF Anionenaustauscherharz auf eine Homogenität von ~95% gereinigt. Kernextrakte wurden mit katalytischen Mengen des teilweise gereinigten rhCpp32 behandelt und bei 23°C während bis zu 60 Minuten inkubiert. Wie in 3 gezeigt ist, führte eine Inkubation mit rhCpp32 zu einem erhöhten Gehalt an Ab127-immunreaktivem etwa 30 kDa Polypeptid (Spur 2). Das markierte Polypeptid wanderte präzise zusammen mit dem immunreaktiven etwa 30 kDa Polypeptid, das aus Apoptose durchlaufenden intakten HL60-Zellen extrahiert worden war (Spur 1). Eine Präabsorption des Antikörpers mit dem Peptid CKGDEVD eliminierte eine Reaktivität mit dem etwa 30 kDa Polypeptid. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass der apoptoseassoziierte Abbau von PARP spezifisch durch einen auf den GDEVD-Spaltungs-Locus am COOH-Ende des etwa 30 kDa Fragments gerichteten Antikörper nachgewiesen werden kann.
Beispiel 4: Verwendung des Immun-Blottings zum Nachweis von apoptotischer Proteolyse in neuronartigen Zellen
Die Zelllinie PC12 differenziert in eine sympathische neuronartige Zelle als Antwort auf den Nervenwachstumsfaktor (NGF) und stirbt durch Apoptose nach NGF-Entzug (Batistatou et al. (1993) J. Neurosci. 13, 4433–4438). Es wurde ein Proteaseinihibitor der ICE-Familie gefunden, um den durch Apoptose induzierten NGF-Entzug zu verringern (Troy et al. (1996) Proc. Acad. Sci. 93, 5635–5640). Dementsprechend wurde die Reaktivität von Ab127 und Ab128 mit Polypeptiden in NGF-bewahrenden PC12-Zellen und apoptotischen Zellen mit entzogenem NGF verglichen.
PC12-Zellen wurden in NGF-enthaltendem Medium unter Bedingungen mit geringem Serum (0,18% fetales Rinderserum) während 7 Tagen aufbewahrt. Der NGF-Entzug wurde durch dreimal Waschen mit NGF-freiem Kulturmedium, gefolgt von Zugabe eines neutralisierenden Antikörpers zu NGF (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) initiiert. In verschiedenen Zeitabständen nach dem NGF-Entzug wurde der apoptotische Zelltod durch Messungen des Zellüberlebens, der internucleosomalen DNA-Fragmentierung und Chromatinkondensation bewertet. Ein Immun-Blotting mit Ab127 (4) oder Ab128 (Daten sind nicht gezeigt) wurde entsprechend der Beschreibung in vorstehendem Beispiel 2 durchgeführt und zeigte, dass 8 Stunden nach dem NGF-Entzug zwei immunreaktive Polypeptide mit näherungsweise 46 und näherungsweise 35 kDa in den Zellen mit NGF-Entzug erschienen (4). Der Gehalt dieser Polypeptide nahm mit längeren Zeitdauern des NGF-Entzugs zu.
Beispiel 5: Bestätigung, dass die immunreaktiven Polypeptide mit näherungsweise 46 und näherungsweise 35 kDa während der Apoptose erzeugte Proteinfragmente sind
Zellfreie Kernextrakte von PC12 wurden mit rekombinantem menschlichen CPP32, der ICE-artigen Protease, wie in Beispiel 3 für HL60-Zellextrakte beschrieben ist, inkubiert. Die Inkubation von Kernextrakten von PC12-Zellen mit CPP32 führte zu einer zeitabhängigen Zunahme im Gehalt der Polypeptide mit näherungsweise 46 und näherungsweise 35 kDa, die zusammen mit zwei immunreaktiven Spezies wanderten, die aus NGF-differenzierten PC12-Zellen mit entzogenem NGF erhalten wurden (4). Die Wanderung der zwei Polypeptide ist von dem immunreaktiven etwa 30 kDa PARP-Fragment in apoptotischen HL60-Zellen unterscheidbar. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Polypeptide mit näherungsweise 46 und näherungsweise 35 kDa Fragmente von Proteinen darstellen, die andere als PARP sind, die die GDEVD-Domäne an ihren COOH-Enden enthalten und spezifisch in Apoptose durchlaufenden PC12-Zellen erzeugt werden. Der Fachmann wird erkennen, dass Ab127 oder Ab128 für eine Affinitätsreinigung dieser ICE-artigen Proteasesubstrate und ihre Identifizierung durch Protein-Mikrosequenzierungs- oder Massenspektrometrieverfahren verwendet werden können.
Beispiel 6: Immunhistochemischer Nachweis des Zelltods durch Apoptose
NGF-differenzierte PC12-Zellen wurden auf Objektträger mit Kammern, die mit Polyornithin und Laminin vorbehandelt worden waren, vermehrt. Nach 7 Tagen wurde das Kulturmedium gewechselt und der Hälfte der Kulturen wurde NGF entzogen, wie in Beispiel 4 beschrieben ist. Nach 24 Stunden wurden die Zellen für die Immunhistochemie unter Verwendung von Ab127 folgendermaßen verarbeitet. Die Zellen wurden in 2% Paraformaldehyd in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4 (60 Minuten) fixiert und aufeinanderfolgend in 0,09% H₂O₂ in Phosphatpuffer (20 Minuten), gefolgt von 10% normalem Ziegenserum/0,5% Triton X-100/Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) während 60 Minuten inkubiert. Kulturen wurden während 2 Stunden nur in TBS oder in TBS inkubiert, das Ab127 mit Verdünnungen von 1/10000 bis 1/40000 enthielt. Nach dreimaligem Waschen in TBS wurden alle Kulturen in biotinyliertem Anti-Kaninchen IgG (Vector, Burlingame, CA), in TBS mit 1/200 verdünnt, inkubiert.
Nach 30 Minuten wurden die Kulturen in TBS gewaschen und mit dem Avidin-Biotin-Peroxidasekomplex (ABC Elite Kit, Vector) gemäß den Anweisungen des Herstellers inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen in TBS wurde die Farbentwicklung unter Verwendung eines nickelintensivierten Standarddiaminobenzidinverfahrens ausgeführt. Nach Spülen wurden Kulturen von Zellen unter Deckgläser gelegt und mikrophotographische Aufnahmen wurden unter Verwendung eines Nikon Microphotsystems gemacht.
Wie in 5 gezeigt ist, wurde nur eine sehr leichte Hintergrundfärbung für Ab127-gefärbte auf NGF bewahrte Zellen beobachtet (5A). Somit reagierte Ab127 nicht mit Proteinen in gesunden auf NGF bewahrten PC12-Zellen. Zellen mit entzogenem NGF, die in Abwesenheit des Ab127 primären Antikörpers markiert worden waren, zeigten keine Immunreaktivität. In Kulturen mit entzogenem NGF wiesen viele Zellen keine Markierung mit Ab127 oberhalb des Hintergrunds auf, jedoch war ein Untersatz von Zellen intensiv immunmarkiert (5B). Dieses spezifische Färben wurde nur mit der Ab127-Behandlung beobachtet und nahm die Form von Clustern aus dunkel gefärbten Punkten an, die häufig einen Ring zu bilden schienen (5B, Einschub). Das Muster der Immunmarkierung ist ähnlich zu dem Aussehen apoptotischer Substanzen, die sich aus der Zersetzung des Plasmas und der Kernmembranen in Apoptose durchlaufenden Zellen bilden.
Ähnliche Ergebnisse wurden mit anderen Zellen erhalten. In einer primären Kultur vermehrte hippocampale Neuronen wurden durch Einsatz des neurotoxischen Stoffwechselgifts 3-Nitropropionsäure zum Sterben stimuliert. Ein unabhängiges Markieren der Kulturen mit dem Kernfarbstoff Hoechst 33258 offenbarte die Anwesenheit apoptotischer Neuronen, mit kondensierter Chromatinfragmentierung in apoptotische Substanzen mitten unter lebensfähigen Zellen. Wenn die Kulturen mit Ab127 immungefärbt wurden, waren die meisten der Zellen nicht markiert, jedoch war ein Untersatz von Neuronen intensiv immunreaktiv. Im Gegensatz dazu wurden keine Ab127-immunreaktive Zellen in Kontrollkulturen gefunden, die nicht mit dem Neurotoxin behandelt worden waren.
Beispiel 7: Immunhistochemisches Markieren der apoptoseassoziierten Proteolyse in der Entwicklung eines Rattenhirns
Zur Untersuchung der Verwendung von Ab127 als Sonde zum Identifizieren von Apoptose durchlaufenden Zellen in situ wurde eine Ab127-Immunhistochemie an neonatalen Ratten durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass überschüssige Zahlen von Neuronen während der frühen Entwicklung des Rattenhirns gebildet werden und ein signifikanter programmierter neuronaler Tod durch Apoptose während der ersten 2 postnatalen Wochen stattfindet (besprochen in Oppenheim (1991) Annu. Rev. Neurosci. 14, 453–501). Zur Untersuchung des Nutzens von Ab127 zur Identifizierung von Apoptose durchlaufenden Zellen in situ wurde eine Ab127-Immunhistochemie an neonatalen Ratten durchgeführt.
Gehirne von Ratten im Alter von 1, 4, 7 und 9 Tagen wurden in 4% Paraformaldehyd fixiert, durch Tieftemperatur geschützt, in der sagittalen Ebene mit 40 Mikrometern auf einem Gleitmikrotom geschnitten und auf Ab127-Immunreaktivität unter Verwendung eines indirekten Standardimmunperoxidaseverfahrens gefärbt (beschrieben zum Beispiel in Roberts-Lewis et al., J. Neurosci. 14:3934–3844 (1994), auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird). Das Ab127 wurde in Verdünnungen im Bereich von 1/1000 bis 1/50000 verwendet. Kontrollschnitte wurden entsprechend der vorstehenden Beschreibung von Roberts-Lewis et al. bearbeitet abgesehen davon, dass der primäre Antikörper (Ab127) weggelassen wurde. Nach dem Immunfärben wurden die Schnitte auf Objektträger befestigt, entwässert, entfettet, unter Deckgläser gesetzt und untersucht und unter Verwendung eines Nikon Microphot-Systems photographiert.
Die Immunfärbung mit Ab127 der Entwicklung des Rattenhirns offenbarte eine äußerst eingeschränkte Verteilung intensiv immunreaktiver Zellen. Nahezu alle Gehirnzellen waren während der ersten 10 postnatalen Tage ohne eine Ab127-Immunreaktivität. Jedoch waren Gruppen von Zellen innerhalb spezifischer Gehirnregionen und in besonderen Entwicklungsstadien stark immunpositiv.
6 zeigt die Immunmarkierung von Untersätzen von Zellen in dem parietalen Cortex, die hippocampale Bildung und den unteren Colliculus. Wie in 6A gezeigt ist, enthält der Hippocampus am postnatalen Tag 4 intensiv immunreaktive Zellen, die unter mehreren Unterfeldern verstreut sind. 6B erläutert die starke Im munfärbung von Neuronen des unteren Colliculus am postnatalen Tag 9. Die Neuronen sind in einem akuten Stadium der Degeneration, wie durch das perlenartige fragmentierte Aussehen ihrer Dendriten offenbar wird. Wie in 6C gezeigt ist waren nur selten neocorticale Zellen immunreaktiv. Im parietalen Cortex wurden verstreute Neuronen in einem akuten Stadium der Degeneration beinahe ausschließlich in Schicht 2 markiert. In einem späteren Entwicklungsstadium wurden weniger immunpositive Neuronen im Neocortex, Hippocampus und anderen Gehirnregionen nachgewiesen, was mit diesen Neuronen übereinstimmt, die die kurze Verweilzeit aufweisen, die für an Apoptose sterbende Zellen charakteristisch ist. Jedoch erschienen mit dem postnatalen Tag 9 zahlreiche intensive immunpositive Zellen in dem Corpus callosum. Ihr Ort und ihre Morphologie identifizieren die immunmarkierten Zellen als Oligodendroglia.
Weder in Neuronen noch Oligodendrocyten wurde in Schnitten, die in Abwesenheit von Ab127 gefärbt waren, eine Immunmarkierung beobachtet. Die Ergebnisse bestätigen und erweitern die Beobachtungen, die vorstehend für kultivierte Zellen berichtet worden waren, und sie weisen darauf hin, dass ein Antikörper, der auf die bevorzugte ICE-homologe proteolytische Spaltungsstelle GDEVD gerichtet ist, zum selektiven Markieren von Zellen, die eine sich entwickelnde Apoptose durchlaufen, in situ verwendet werden kann.
Auf den Offenbarungsgehalt aller hier zitierter Verweisstellen wird vollumfänglich Bezug genommen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Antikörper, erhalten durch Immunisierung mit einem Polypeptid der Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2, welcher an Peptide bindet, die in Apoptose durchlaufenden Zellen erzeugt werden, und vorzugsweise an das etwas 30kDa NH2-terminale Polypeptid-Derivat der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase, hergestellt in Apoptose durchlaufenden Zellen.
Peptid, bestehend aus Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2.
in vitro-Verfahren zur Detektion von Apoptose in Zellen oder Geweben, umfassend die Schritte: a) Inkontaktbringen einer Zellprobe oder einer Gewebeprobe mit einem Antikörper, erhalten durch Immunisierung mit einem Polypeptid der Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2, welcher an Peptide bindet, die in Apoptose durchlaufenden Zellen hergestellt werden, und vorzugsweise an das etwa 30kDa NH₂-terminate Polypeptid-Derivat der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase, hergestellt in Apoptose durchlaufenden Zellen, b) Bestimmen der Menge des Antikörpers, die an die Probe bindet, mittels Immunoassay oder mittels Immunohistochemie, und c) Vergleichen der Menge des in Schritt (b) gebundenen Antikörpers mit der Menge des Antikörpers, die an eine Probe bindet, welche bekannterweise frei von Apoptose ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Menge des gebundenen Antikörpers unter Verwendung von enzymischen, chromogenischen, radioaktiven, fluoreszierenden oder lumineszierenden Markierungen bestimmt wird, welche entweder an den Antikörper oder an einen sekundären Antikörper, der den Antikörper erkennt, gebunden sind.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Immunoassay ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus ELISA, Zell-basiertem ELISA, Filter-bindendem ELISA, Inhibitions-ELISA, Western-Blots, Immunofällung, Slot- oder Dot-Blot-Assays, Immunofärbung, RIA, Szintillations-Annäherungs-Assays, fluoreszierende Immunoassays unter Verwendung von Antikörper-Konjugaten oder Antigen-Konjugaten fluoreszierender Substanzen wie Fluorescein oder Rhodamin, Ouchterlony Doppel-Diffusions-Analyse, und Immunoassays, welche ein Avidin-Biotin- oder ein Streptavidin-Biotin-Detektionssystem verwenden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die Zellen Blutzellen, biopsierte Zellen oder Gewebe-Proben einschliessen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei die Zellen oder Gewebe Nagetierzellen oder -gewebe sind.
Kit zur Bestimmung der Menge apoptosegenerierter Proteinfragmente in einer biologischen Probe, umfassend a) einen primären Antikörper, erhalten durch Immunisierung mit einem Polypeptid der Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2, welcher an Peptide bindet, die in Zellen während der Apoptose hergestellt werden, und vorzugsweise an das 30 kDa NH₂-terminale Polypeptid-Derivat der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase, hergestellt in Apoptose durchlaufenden Zellen, und b) einen sekundären Antikörper, welcher mit einer signalerzeugende Markierung konjugiert ist, wobei der sekundäre Antikörper spezifisch and den primären Antikörper bindet.
Kit nach Anpruch 8, wobei die signalerzeugende Markierung, welche mit dem sekundären Antikörper verbunden ist, ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus enzymischen, chromogenischen, radioaktiven, fluoreszierenden und lumineszierenden Markierungen.
Kit nach einem der Ansprüche 8 oder 9, wobei die signalerzeugende Markierung, welche mit dem sekundären Antikörper verbunden ist, ein Enzym ist, und das Kit weiter ein signalerzeugendes tertiäres Reagenz umfasst, welches mit dem Enzym reagiert.
Kit nach Anspruch 10, wobei das Enzym Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase ist.
Kit nach einem der Ansprüche 8 bis 11, weiter umfassend einen unbeschichteten Träger, auf dem eine zu untersuchende Probe oder der erste Antikörper immobilisiert werden kann.
Kit nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei der sekundäre Antikörper spezifisch an ein apoptosegeneriertes Proteinfragment an einem Epitop bindet, welches unterschiedlich zu dem ist, an dem der erste Antikörper bindet.