DE69933565T2 - Serinprotease-spezifischer monoklonaler antikörper und seine verwendung - Google Patents

Serinprotease-spezifischer monoklonaler antikörper und seine verwendung Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft monoclonale Antikörper, die spezifisch an eine gewisse Serinprotease binden, d.h. Neurosin. Sie betrifft auch den Produktionsprozeß dafür und ein Verfahren für die Diagnose verschiedener Krankheiten unter Verwendung der monoclonalen Antikörper.
  • OFFENBARUNG DES STANDS DER TECHNIK
  • Im Allgemeinen werden Proteasen als inaktive Vorläufer biologisch synthetisiert. Sie untergehen eine beschränkte Hydrolyse in Moleküle, um sich in aktivierte Arten von Proteasen umzuwandeln. Insofern als Enzyme Proteasen sind, haben sie eine Aktivität für die Hydrolyse einer Peptidbindung. Entsprechend der Art der Proteasen haben sie jedoch verschiedene Wirkmechanismen. Gemäß der speziellen Art der katalytischen Stellen werden Proteasen in Serinproteasen, Cysteinproteasen, Aspartatproteasen, Metallproteasen und dergleichen eingeteilt. Die Proteasen aller Art haben eine Reihe von Eigenschaften wie diejenigen allgemeiner verdauender Eigenschaften bis zu denjenigen, daß sie verschiedene regulatorische Domänen und strikte Substratspezifität haben und somit spezifisch nur charakteristische Proteine hydrolysieren.
  • Der optimale pH-Bereich von Serinproteasen ist neutral bis schwach basisch und im Allgemeinen haben viele von ihnen ein Molekulargewicht von etwa 30.000 oder niedriger. Alle Proteasen vom Blutkoagulations-, Fibrinolyse- und Komplementsystem, die ein hohes Molekulargewicht haben, gehören zu den trypsinähnlichen Serinproteasen. Sie haben viele regulatorische Domänen und bilden eine Proteasekaskade, die bei Reaktionen in einem lebenden Körper von großer Bedeutung sind.
  • Entsprechend ihrer Primärstruktur können Serinproteasen in die Subtilisin-Familie und die Chymotrypsin-Familie eingeteilt werden. Diejenigen der Subtilisin-Familie werden nur von Bacillus subtilis produziert, während die der Chymotrypsin-Familie in Mikroorganismen, Tieren und Pflanzen weit verbreitet sind. His-57, Asp-102 und Ser-195 (Chymotrypsin Nrs.) sind an ihrer katalytischen Aktivität beteiligt und im Allgemeinen werden sie durch Diisopropylfluorphosphat (DFP) inaktiviert. Zur Ausübung ihrer Aktivität ist eine katalytische Triade erforderlich, bei der His, beeinflußt von Asp, Ser-195 sein Proton abnimmt, um Ser zu aktivieren. Weiterhin bindet es an ein Substrat, um eine Polarisierung der Carbonylgruppe zu verursachen, und das Sauerstoffatom bildet ein Oxyanion. Trypsin hat Asn-189 an dieser Stelle und interagiert mit der positiven Ladung einer basischen Aminosäure wie Lys, Arg oder dergleichen. Andererseits ist die entsprechenden Stelle bei Chymotrypsin Ser-189 und eine aromatische Aminosäure wie Tyr, Phe, Trp oder dergleichen oder Leu oder Met kann auch daran binden. In Analogie zu Chymotrypsin hat eine Esterase Ser-189 und interagiert mit einer nicht-aromatischen Aminosäure wie Ala oder dergleichen. Als andere Enzyme, die zur Chymotrypsin-Familie gehören, gibt es die Achromobacter-Protease, Plasmin, Medullasin, Acrosin, V8-Protease, Cathepsin G, Chymase, die Prolin-spezifische Endopeptidase, die Protease A der Unterkieferdrüse, XIIa, XIa, Plasma-Kallikrein, Ixa, Xa, α-Thrombin, VIIa, Protein C, Gewebeplasminogen-Aktivator, Urokinase, C1r, C1s, C2, B, D, I, γ-Seminoprotein, Gewebe-Kallikrein, C- und B-Faktoren von Blutzellen von Limulus polyphemus, Blutkoagulationsenzyme und dergleichen.
  • Kürzlich wurden mittels PCR unter Verwendung von Oligonucleotidprimern für Consensussequenzen von Serinproteasen die cDNA- und Aminosäuresequenzen von vielen neuen Proteasen bestimmt. Gemäß diesem Verfahren wurden von verschiedenen Forschern wie Yamamura et al. (Yamanura, Y et al., Biochem.
  • Biophys. Res. Commun., 239, 386, 1997), Gschwend, et al. (Gschwend, T. P. et al., Mol. Cell. Neurosc., 9. 207, 1997), Chen et al. (Chen, Z-L, et al., J. Neurosc., 15, 5088, 1995) und anderen neue Proteasen gefunden.
  • Die SEQ ID NO: 3 der JP 9-149790 A offenbart Neurosin als eine neue Serinprotease. Über Neurosin wurde auch in Biochimica et Biophysica Acta, 1350, 11–14, 1997, berichtet. Neurosin, das nicht mehr als 30% Identität mit bekannten Serinproteasen hat, wurde als Resultat der Erkennung einer Serinproteaseaktivität in einem Kulturüberstand von Zellen des menschlichen Dickdarmkrebses COLO201 und der Isolierung aller Serinproteasegene erhalten. Damit wird ein Verfahren für die Massenproduktion von Neurosin unter Verwendung des Serinproteasegens und ein Verfahren für die Durchmusterung auf spezifische Inhibitoren unter Verwendung des Enzyms bereitgestellt. Außerdem wurde gezeigt, daß das Durchmusterungsverfahren für die Durchmusterung auf Arzneimittel für die Behandlung verschiedener Krankheiten von Nutzen ist.
  • Gegenwärtig sind die Funktionen von Neurosin noch unbekannt. Da jedoch μg Neurosin im Gehirn reichlich produziert wird, nimmt man an, daß es eine wichtige Rolle bei der Erhaltung der Hirnfunktionen spielt. Weiterhin besteht die Möglichkeit, daß unter Verwendung des rekombinanten Moleküls weitere detaillierte Funktionen aufgeklärt werden können.
  • Die JP 6-62855 A offenbart eine neue Serinprotease, Zyme, und darüber wird auch in J. Biol. Chem., 272 (40), 25135–2514, 1997 berichtet. Die cDNA- und Aminosäuresequenzen von Zyme wurden mittels PCR-Amplifikation von Consensussequenzen bestimmt, die eine Chymotrypsin-ähnliche Aktivität haben, um unter Verwendung von mRNA des Gehirns eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit eine cDNA-Bibliothek zu konstruieren. Die mRNA, die Zyme codiert, ist in mehreren Säugern zu erkennen. Obwohl Zyme im Gehirn, der Niere und Speicheldrüse reichlich produziert wird, wird es bezüglich des Gehirns nicht in fötalem Gehirn exprimiert, sondern es wird nur in erwachsenem Gehirn exprimiert. Weiterhin hat Zyme ein Gen im Chromosom 19g13.3, und von dieser Region wurde gezeigt, daß sie ein Teil ist, der mit dem späten Auftreten der familiären Alzheimer-Krankheit verknüpft ist. Somit überlegt man, daß Zyme bei der Aufklärung von Charakteristika von neuralen Krankheiten wie der Alzheimer-Krankheit und dem Down-Syndrom von Nutzen sein würde.
  • Die WO 98/11238 und EP-A1 0 576 152 offenbaren eine neue Protease, Protease M, auch Zyme genannt, und darüber wird auch in Molecular Medicine, 2(5), 624–636, 1996, berichtet. Die cDNA von Protease M wird aus der normalen menschlichen Brustepithel-Zelllinie 76 N gewonnen und hat eine Sequenz, die Kallikrein, Prostata-spezifischem Antigen (PSA) und Trypsin sehr ähnlich ist. Und Protease M ist im Chromosom 19g13.3 vorhanden. Protease M wird als ein Marker betrachtet, der für primäres Brustadenokarzinom und primären Eierstockkrebs von Nutzen ist; während ihre mRNA in einer metastatischen Brustkrebszelllinie heruntergeregelt ist, wird sie in einer primären Brustkrebszelllinie, in Eierstockkrebsgewebe und einer Krebszelllinie stark exprimiert.
  • Obwohl die Quellen von diesen, Neurosin, Zyme und Protease M, verschieden sind, sind ihre cDNA-Sequenzen und Aminosäuresequenzen und darüber hinaus die Positionen in der Chromosomenkonformation der Gene, die sie codieren, völlig miteinander identisch. Da es sehr wahrscheinlich ist, das diese Substanzen dieselben Substanzen sind, wird hier der Name "Neurosin" verwendet, um sich auf sie gemeinsam zu beziehen. Wie vorstehend beschrieben, wurde diese Serinprotease von verschiedenen Forschergruppen fast zur selben Zeit gefunden und ihre pharmakologischen Aktivitäten wurden untersucht. Es wird nun erwartet, daß in Zukunft ihre Bedeutung bei verschiedenen Gelegenheiten aufgeklärt wird. Zum Beispiel gelangen 1995 bzw. 1996 Games et al. (Games, D. et al., Nature, 373, 523 (1995) und Hsiao et al. (Hsiao, K, et al., Science, 274, 99 (1996) die Expression einer großen Menge des β-Amyloid-Vorläuferproteins (βAPP) und die Produktion von transgenen Mäusen, bei denen die Ablagerung des Amyloid-β-Proteins (Aβ) beobachtet wurde. Damit wird die Rolle der vorstehenden Serinprotease bei der Alzheimer-Krankheit und ähnlichem in der Zukunft weiter aufgeklärt werden.
  • Wie in der JP 6-62855 A offenbart, spielt Zyme (d.h. Neurosin) eine wichtige Rolle bei der Alzheimer-Krankheit und dem Down-Syndrom. Während vorgeschlagen wurde, daß die Alzheimer-Krankheit in die präsenile Alzheimer-Krankheit und die senile Demenz vom Alzheimer-Typ, die sich aus pathologischer Sicht im Alter manifestiert, aufgeteilt werden sollte, wird der Ausdruck "Alzheimer-Krankheit" hier verwendet, um sie beide zu bezeichnen.
  • Klinisch ist die Alzheimer-Krankheit durch ein progressives Abnehmen verschiedener kognitiver Funktionen charakterisiert und die neuropathologische Hauptbeobachtung ist das Auffinden abnormaler Strukturen wie seniler Plaques und einer Veränderung bei den Neurofibrillen, zusätzlich zu Nervenzelldegeneration und – mängeln (Trojanowski, J. Q. et al., In Current Neurology, 16, 93, 1996). Während senile Plaques auch im Falle von normalem Altern auftreten, erscheinen diese deutlich häufiger im Falle von Alzheimer-Krankheit und sind eine pathologische Beobachtung, die eine hohe Krankheitsspezifität hat. Darüber hinaus kann man von der β-Amyloidgenese sagen, daß sie aus pathogenetischer Sicht ein sehr wichtiges aufzuklärendes Thema ist, da zum Beispiel die Ablagerung von Aβ, das eine wesentliche Komponente der senilen Plaques ist, die früheste pathologische Beobachtung im Gehirn bei Alzheimer-Krankheit ist, und darüber hinaus wurde bei der familiären Alzheimer-Krankheit gefunden, daß eine Punktmutation im βAPP-Gen auftritt, welches der Vorläufer von Aβ ist.
  • Beim Down-Syndrom, bei dem das 21ste Chromosom, das βAPP aufweist, dreifach ist, wird bei allen Fällen oberhalb eines Alters von 30 dieselbe pathologische Beobachtung im Gehirn gefunden wie bei der Alzheimer-Krankheit. Teller et al. (Teller, J. K. et al., Nature Med., 2, 93, 1996) haben auf der Basis der Resultate der Bestimmung von löslichem Aβ durch Immunpräzipitation und Western-Blot-Verfahren, das aus den Gehirnen von Föten bis zu Patienten von 60 mit Down-Syndrom extrahiert wurde, berichtet, daß sich lösliches Aβ 42 relativ zum Alter und der Dichte an senilen Plaques erhöht. Außerdem haben sie nahe gelegt, daß der Anstieg an löslichem Aβ mit einer Überproduktion von βAPP und der Bildung von senilen Plaques einhergeht, weil lösliches Aβ selbst in Fällen von juvenilem Down-Syndrom gefunden wird, wo keine senilen Plaques vorhanden sind, während das bei einer Kontrollgruppe nicht beobachtet wird. Weiterhin haben Tokuda et al. (Tokuda et al., Ann. Neurol., 41, 271, 1997) berichtet, daß eine signifikante Erhöhung bei Aβ1-40 und Aβ1-42 im Plasma (43) in einer Gruppe mit Down-Syndrom im Vergleich mit einer Kontrollgruppe gefunden wird. Angesichts dieser Fakten gibt es eine Möglichkeit, daß Neurosin bei Down-Syndrom eine gewisse Wirkung haben würde.
  • Weiterhin wird auch angenommen, daß Neurosin eine gewisse Wirkung bei Dementia pugilistica und diffuser Lewy-Körper-Krankheit hat, die mit der Alzheimer-Krankheit nahe verwandt sind.
  • Ein seniler Plaque ist eine Fleckenstruktur, die 50 bis 200 μm Durchmesser hat und die vor allem im cerebralen Cortex eines Gehirns mit Alzheimer-Krankheit auftritt.
  • Nach Ablauf einer Zeit hat ein seniler Plaque einen Amyloid-Kern im Zentrum und um ihm herum wird eine Ansammlung von degenerierten Axonen und reaktiven Gliazellen beobachtet. Aβ wird in der Form einer β-Faltblattstruktur polymerisiert, um eine Amyloid-Faser zu bilden. Im Allgemeinen nimmt man an, daß extrazellulär polymerisiertes Amyloid Aβ für Nervenzellen toxisch ist (Yankner, B. A. et al., Science, 250, 279, 1990; Simmons, L. K. et al., Mol. Pharmacol., 45, 373, 1994). Aβ ist eine Hauptkomponente des Amyloid-Kerns, der ein Molekulargewicht von etwa 4 kDa hat und aus etwa 42 Aminosäuren aufgebaut ist. Zusätzlich zu senilen Plaques reichert es sich in kleinen Blutgefäßen in Meninx und Cortex an, um Amyloid-angiosis zu verursachen. Kang et al. (Kang et al., Nature, 325, 733, 1987) haben durch Clonierung auf der Basis der Information der Aminosäuresequenz von Aβ, die von Glenner et al. (Glenner, G. G. und Wong, C. W., Biochem. Biophys. Res. Commun., 120, 185, 1984) ermittelt wurde, gezeigt, daß Aβ von dem größeren Vorläufer βAPP abgeleitet ist.
  • βAPP ist ein Glycoprotein, das eine Struktur hat, die ähnlich der eines Transmembranrezeptors ist, und ein Molekulargewicht von 120.000 bis 130.000 hat. Aβ wird in der Region von der Transmembrandomäne durch die extrazelluläre Domäne von βAPP integriert. Bis jetzt wurden 6 Arten von βAPP identifiziert. Als identifiziertes βAPP, das an der Amyloid-Ablagerung beteiligt ist, gibt es βAPP659, das vor allem im Gehirn exprimiert wird (Kang, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 4245, 1985), βAPP751, das eine Aminosäureregion hat, die aus 56 Aminosäuren besteht, die homolog zu einem Serinproteaseinhibitor der Kuntiz-Familie sind, βAPP770, das eine Aminosäureregion hat, die aus 19 Aminosäuren besteht, die homolog zum MRC X-2-Antigen sind, und dergleichen. βAPP751 und βAPP770 werden vor allem in Organen des gesamten Körpers exprimiert. Da alle von ihnen den Aβ-Teil bei der 99sten Aminosäure vom C-Terminus haben, nimmt man an, daß sie an der Amyloidbildung im Gehirn beteiligt sind.
  • Während die physiologischen Funktionen von βAPP noch unbekannt sind, wurde von βAPP, das auf Zelloberflächen exprimiert wird, oder von löslichem βAPP, das in der Aβ-Region gespalten und von Zellen freigesetzt wird, berichtet, daß es extrazellulär als ein Zelladhäsionsmolekül (Schubert, D. und Behl, C., Brain Res., 629, 275, 1993) oder als ein gewisser Nährfaktor (Saitoh, T. et al., Cell, 58, 615, 1989) wirkt. Andererseits vermutet man von βAPP, daß es mit einem axonalen Fluß zum Ende des Axons transportiert wird, gefolgt von der Expression in der synaptischen Membran, wobei es eine wichtige Rolle bei der Synapsenbildung oder ihrer Erhaltung in Nervenzellen spielt (Schubert, W, et al., Brain Res., 563, 184, 1991).
  • Hinsichtlich des Metabolismus von βAPP werden im Allgemeinen zwei Wege vermutet. Das heißt einen Sekretionsweg, bei dem die Aβ-Domäne mit sogenannter α-Sekretase an ihrem Zentrum gespalten wird und sein N-terminates-Produkt in den Außenraum der Zellenfreigesetzt wird. Der andere ist der endosomale-lysosomale Weg, bei dem βAPP direkt oder nach Expression auf Zelloberflächen in Zellen eingebaut wird und letztlich wird es in den Lysosomen zersetzt. Obwohl die Region, in der Aβ während dieser metabolischen βAPP-Wege produziert wird, noch unbekannt ist, ist eine Möglichkeit, die man vermuten kann, die, daß Aβ direkt nach dem Einbau von βAPP in die endocytischen Vesikel ausgeschnitten wird und unmittelbar außerhalb der Zellen freigesetzt wird (Koo, E. H. und Squazzo, S. L., J. Biol. Chem., 269, 17386, 1994).
  • Nach der Entdeckung von Aβ nahm man an, daß das Ausschneiden von Aβ nur im Krankheitszustand bewirkt wird. Spätere Untersuchungen offenbarten jedoch, daß Aβ physiologisch produziert wird und in löslichem Zustand in einem Kulturüberstand (Haass, C. et al., Nature, 359, 322, 1992; Shoji, M. et al., Science, 258, 126, 1992) oder in der cerebrospinalen Flüssigkeit (Shoji, M. et al., Science, 258, 126, 1992; Seubert, P. et al., Nature, 359, 325, 1992) vorhanden ist. Zum Ausschneiden von Aβ aus βAPP ist ein Enzym zur Spaltung der Stelle am N-Terminus von Aβ (β-Sekretase) und ein Enzym zur Spaltung der Stelle am C-Terminus von Aβ (γ-Sekretase) erforderlich (Haass, C. et al., Cell, 75, 1039, 1993). Während diese Sekretasen von Aβ noch nicht identifiziert sind, wurde kürzlich offenbart, daß die Spaltung mit β-Sekretase strikt von der Aminosäuresequenz abhängt (Citron, M. et al., Neuron, 14, 661, 1995).
  • Zur Zeit wird berichtet, daß zum Beispiel Cathepsin B, das eine Cystein-Protease ist (Tagawa, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 177, 377, 1991), und eine Metalloprotease, die ein Molekulargewicht von 105–120 kDa hat (McDermott, J. R. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 179, 1148, 1991), Kandidaten für α-Sekretase sind. Es wird berichtet, daß Prolyl-Endopeptidase (Ishiura, S. et al., FEBS Lett., 260, 131, 1990) ein Kandidat für γ-Sekretase ist. Von Clipsin (Nelson, R. B. et al., J. Biol. Chem., 265, 3836, 1990) und Ingesin (Ishiura S. et al., FEBS Lett., 257, 388, 1989) wird berichtet, daß sie Kandidaten für β-Sekretase sind.
  • Unter diesen Umständen wurde Neurosin als eine neue Serinprotease gefunden, die die N-terminale Stelle von βAPP zwischen Met596 und Asp597 spaltet, um Aβ zu produzieren. Wie vorstehend beschrieben, ist zur Durchführung von detaillierten Untersuchungen zu Aβ und βAPP ebenso wie zur Alzheimer-Krankheit und zum Down-Syndrom ein Meßsystem für Neurosin dringend erforderlich.
  • Heutzutage wird die klinische Diagnose der Alzheimer-Krankheit im Allgemeinen auf der Basis des Diagnosestandards von DSM-IIIR und NINCDS-ADRDA (Mckhann, G. et al., Neurology, 34, 939, 1994) oder des Diagnosestandards von DSM-IV (American Psychiatric Association; Diagnostic and statistical manuals of mental disorders, 4te Aufl., Washington DC, American Psychiatric Association, 1994) durchgeführt. Diese Standards werden jedoch bedingt durch ein Nachlassen der kognitiven Funktionen, die eine ernsthafte Beeinträchtigung im Alttagsleben und sozialen Leben verursachen. Dann wird hervorgehoben, daß die Diagnose von geringer wissenschaftlicher Objektivität ist, weil die Diagnose durch das Niveau des sozialen Lebens eines Individuums und weiterhin die Spezialisierung und Erfahrung des Arztes beeinflußt sein kann, der die speziellen Bedingungen diagnostiziert. Außerdem wird die endgültige Diagnose der Alzheimer-Krankheit durch eine pathohistologische Analyse durchgeführt und in diesem Zusammenhang wird auf eine substantielle Inkonsistenz zwischen klinischer Diagnose und Autopsiediagnose hingewiesen.
  • Heutzutage wird die Bilddiagnose als ein ergänzendes Mittel bei der klinischen Diagnose der Alzheimer-Krankheit verwendet und es ist möglich, Gehirnfunktionen mittels PET und SPECT (Fukuyama, H. et al., J. Nucl. Med., 35, 1, 1994) zu analysieren, zum Beispiel die Verminderung des Metabolismus und der Atrophie an spezifischen Stellen wie dem Hippocampus, dem Scheitellappen des cerebralen Cortex und dergleichen, die spezifisch für die Alzheimer-Krankheit sind. Während es schwierig ist, viele Fälle mit PET zu analysieren, gibt es einen Bericht, der zeigt, daß auf der Basis von SPECT-Daten zur Beobachtung des Blutflusses in vielen Fällen die Verminderung eines Blutflusses vom Scheitellappen zum Schläfenlappen bei etwa 80% der Fälle von Alzheimer-Krankheit beobachtet wird (Haruo HANYUU, et al., Gazoshindan of Alzheimer's Disease, Nippon Ronen Igaku Zasshi, 31, 683, 1994). Die Definition der Alzheimer-Krankheit auf der Basis der Verminderung eines Blutflusses vom Scheitellappen zum Schläfenlappen ist jedoch sehr gefährlich und es sollte festgehalten werden, daß in einigen verbleibenden Fällen eine Verminderung eines Blutflusses im Stirnlappen gefunden wird. Bezüglich dieser Beobachtungen ist es von Bedeutung, die Alzheimer-Krankheit von degenerativer cerebraler Atrophie wie der Pick-Krankheit und der progressiven Aphasia ebenso wie der progressiven supranukleären Lähmung zu unterscheiden, und der einzige, zur Zeit zuverlässige Weg ist die pathologische Diagnose.
  • Während weiterhin nützliche Beobachtungen zur Verwendung bei bösartigem Tumor, Angiopathie und Krankheiten mit einer metabolischen Veränderung mittels Analyse mit MRS (Magnetische Resonanz-Spektroskopie) erhalten werden, werden nur wenige Berichte hinsichtlich Patienten mit Demenz einschließlich Alzheimer-Krankheit gefunden. Insbesondere kann gegenwärtig wegen einer Überlappung mit Enzephalatorophie-Beobachtung wie der Verringerung des NAA (N-Acetylaspartat)-Peaks (Pettegrew, J. W. et al., J. Neuropathol.; Exp.; Neurol., 46, 419, 1987; Barany, M. et al., Lancet, i, 517, 1985; Smith, L. et al., Book of Abstracts, Society of Magnetic Resonance in Medicine 1986, Bd. 4, Berkeley, Society of Magnetic Resonance, 1386, 1986) keine charakteristische Beobachtung von Demenz mit 1H-MRS nachgewiesen werden.
  • Des weiteren wird die CT-MRI-Bilddiagnose verwendet. Mit CT kann man lokalisierte Atrophie besonders am Schläfenlappen und Scheitellappen und progressive generelle Atrophie ebenso wie ventrikuläre Vergrößerung und periventrikuläre niedrige Dichte (PVL) oder Veränderung der Substantia alba um den Ventrikel, genannt Leuko-Araiosis, parallel zur Atrophie beobachten. Läsionen der Substantia alba wie Atrophie des Gehirns, PVL und dergleichen sind jedoch keine spezifischen Charakteristika der Demenz vom Alzheimer-Typ. Weiterhin wird ein Fortschreiten der Atrophie des Gehirns mit dem Altem berichtet (Barron, S. A. et al., Neurology, 26, 1011, 1976; Zatz, L. M. et al., AJNR, 3, 1, 1982). Dann werden diese Beobachtungen nicht notwendigerweise bei der Demenz vom Alzheimer-Typ gefunden.
  • MRI ist von großem Nutzen, da insbesondere jede Stelle des Gehirns in jeder Bildebene beobachtet werden kann und die Anwesenheit von Mikroangiopathie und dergleichen bestätigt werden kann, was mit Röntgen-CT nicht gefunden werden kann. Wenn hinsichtlich der Alzheimer-Krankheit an einem axialen Abschnitt und einem pfeilförmigen Abschnitt ebenso wie einem Kranzabschnitt ein Bild gemacht wird, können auch Bebachtungen erhalten werden, die mit CT übersehen werden. Als erstes wurde gefunden, daß Atrophie des Corpus callosum durch Abbildung an einem pfeilförmigen Abschnitt von einem frühen Stadium der Krankheit beobachtet werden kann und es war möglich, eine detaillierte Beobachtung des Schläfenlappens einschließlich des Hippocampus durch Abbildung am Kranzabschnitt durchzuführen. Weiterhin kann bei der Beobachtung des Gehirnparenchyms mit Protonengewichteter Abbildung die Cinerea einfach von der Substantia alba unterschieden werden. Da jedoch ein Bild, das mit MRI erhalten wurde, entsprechend der Stärke des Magnetfeldes, der Leistung eines Apparats und der Bildgebungsbedingungen variiert, können die numerischen Daten, die in verschiedenen Einrichtungen erhalten wurden, nicht miteinander verglichen werden, außer der atrophischen Veränderung. Außerdem gibt es bei der Bildmessung eine Grenze. Obwohl man annimmt, daß die Flächenmessung empfindlicher ist als die lineare, und man annimmt, daß die Volumenmessung empfindlicher ist als die Flächenmessung, ist es schwierig, eine solche Messung routinemäßig durchzuführen. Weiterhin kann die Vergrößerung der Ventrikel in Fällen von vaskulärer Demenz erkannt werden und es gibt Fälle, bei denen die Atrophie des Hippocampus nach Ischämie der Schädelbasisarterie beobachtet wird.
  • Unter diesen Umständen haben viele Forscher die Entwicklung von biologischen Diagnosemarkern als ein Mittel für die Bereitstellung einer höheren Präzision und Objektivität bei der klinischen Diagnose der Alzheimer-Krankheit verlangt. Gleichzeitig werden die folgenden wichtigen Rollen in der Zukunft erwartet.
    • 1) Ein objektives Beurteilungssystem für die Wirkung von Arzneimitteln für die Behandlung der Alzheimer-Krankheit.
    • 2) Der Nachweis der Alzheimer-Krankheit, bevor ein diagnostischer Standard erreicht wird oder die Krankheitsbedingungen manifest werden.
  • Außerdem können die Daten, die in verschiedenen Einrichtungen erhalten werden, bei Verwendung desselben diagnostischen Markers miteinander verglichen werden. Daher wird anerkannt, daß die Entwicklung von biologischen Diagnosemarkern das wichtigste Gebiet unter den Gebieten der Untersuchungen der Alzheimer-Krankheit ist und eine aussichtsreiche Zukunft wird erwartet.
  • Im Allgemeinen werden die Wege zur Entwicklung von biologischen Diagnosemarkern bis jetzt eingeteilt in diejenigen, die auf Bestandskomponenten von charakteristischen pathologischen Veränderungen bei der Alzheimer-Krankheit basieren, wie senile Plaques und Veränderungen der Neurofibrillen, und einen Weg, der auf anderen Messungen beruht. Beispiele für den ersteren umfassen tau-Protein der cerebrospinalen Flüssigkeit, Aβ und seinen Vorläufer βAPP. Beispiele für den letzteren umfassen den Mydriasis-Test mit einem cholilytischen Wirkstoff Apo E und andere Gene, die die Alzheimer-Krankheit betreffen. Es werden jedoch keine guten Ergebnisse erhalten.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung erwarten, daß von jetzt an verschiedene Gehirnkrankheiten (z.B. Alzheimer-Krankheit, Down-Syndrom usw.) unter Verwendung der Sekretion von Neurosin identifiziert werden können, dessen Expression im Gehirn und in der cerebrospinalen Flüssigkeit, die eine nützliche Probe für physiologische Untersuchungen des Gehirns ist, erkannt wird, und daß die Sekretion von Neurosin als ein effektiver biologischer Diagnosemarker selbst bei frühen Stadien von Gehirnkrankheiten verwendet werden kann. Dafür ist auch ein Meßsystem für Neurosin essentiell.
  • Wie in der WO98/11238 beschrieben, spielt die Protease M (d.h. Neurosin) auch in Krebszellen eine wichtige Rolle. Der Grund, warum die Ausrottung von Krebs mit chirurgischer Behandlung oder topischer Bestrahlung mit radioaktiven Strahlen schwierig ist, ist die Fähigkeit von Krebs zur Metastatisierung. Zum Ausbreiten von Zellen eines soliden Tumors in einem Körper sollten sie ihre Adhäsion zu ursprünglich benachbarten Zellen lockern, gefolgt von der Ablösung von einem ursprünglichen Gewebe, durch andere Gewebe wandern, um Blutgefäße oder Lymphknoten zu erreichen, durch die Basalschicht und Endothelschicht des Gefäßes in das Kreislaufsystem eindringen, das Kreislaufsystem irgendwo im Körper verlassen und in einer neuen Umgebung überleben und proliferieren. Während die Adhäsion an benachbarte epidermale Zellen verloren geht, wenn die Expression von Cadherin gestoppt wird, welches ein intrazelluläres Adhäsionsmolekül ist, nimmt man an, daß das Durchbrechen von Geweben von proteolytischen Enzymen abhängt, die eine extrazelluläre Matrix zersetzen. Als Enzyme, die die Matrix zersetzen, sind vor allem Metallproteasen (Rha, S. Y. et al., Breast Cancer Research Treatment, 43, 175, 1997) und Serinproteasen bekannt. Sie wirken zusammen, um Matrixproteine wie Kollagen, Laminin und Fibronectin zu zersetzen. Unter den Serinproteasen, von denen bekannt ist, daß sie bei der Zersetzung der Matrix mitwirken, ist insbesondere der Plasminogenaktivator vom Urokinasetyp (U-PA) (Kinojo, M. et al., Br. J. Cancer, 39, 15, 1979; Danl, K. et al., Adv. Cancer Res., 44, 146, 1985; Nakanishi, K. et al., Cancer, 82, 724, 1998 ; Shiba, E. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncology, 123, 555, 1997). U-PA spielt eine auslösende Rolle und ist für eine Kettenreaktion zur Proteinzersetzung spezifisch. Sein direktes Ziel ist Plasminogen. Er ist im Blut im Überfluß vorhanden und ist der Vorläufer einer inaktiven Serinprotease, die sich an wiederhergestellten Stellen von Gewebe anreichert, wie verletzten Stellen und Tumoren, ebenso wie Entzündungsstellen. Zusätzlich sind als Proteasen, die bei der Metastatisierung und Infiltration von Krebs eine Rolle spielen, zum Beispiel ein Gewebefaktor (Kinjo, M. et al., Br. J. Cancer, 39, 15, 1979), eine Hydrolase vom lysosomalen Typ (Sloane, B. F. et al., Cancer Res., 42, 980, 1982) und Kollagenase (Mignatti, P. et al., Cell, 47, 487, 1986) bekannt.
  • Zur Zeit ist Krebs die Haupttodesursache in Japan und jährlich sterben mehr als 200.000 Personen. Daher werden spezifische Substanzen, die als Marker bei der Diagnose und Therapie oder Prophylaxe von Krebs verwendet werden können, intensiv erforscht. Solche spezifischen Substanzen werden als Tumormarker oder als Biomarker mit Bezug zu Tumormarkern bezeichnet. Sie werden als Hilfsmittel bei der Diagnose vor der Krebsbehandlung zur Mutmaßung eines karzinogenen Organs und Gewebes vom pathologischen Typ, zur Beobachtung des Effekts einer Behandlung, zum frühen Auffinden eines Rückfalls, zur Erstellung einer Prognose und dergleichen verwendet. Zur Zeit sind Tumormarker essentiell bei klinischen Analysen. Von ihnen werden alpha-Fötoprotein (AFP), welches eine hohe Spezifität für hepatozelluläres Karzinom und Dottersacktumor hat (Taketa K. et al., Tumour Biol., 9, 110, 1988), und karzinoembryonales Antigen (CEA) weltweit verwendet. In Zukunft werden Tumormarker mehr und mehr erforderlich werden und es ist wünschenswert, zum Beispiel organspezifische und tumorzellspezifische Marker zu entwickeln, die hoch zuverlässig bei der serologischen Diagnose von Krebs sind.
  • Bis heute wurde von menschlichem glandulärem Kallikrein (hK2), welches eine Serinprotease ist, die in menschlichen Prostataepithelzellen exprimiert wird, als Marker für Prostatakrebs berichtet. Und hK2 hat 78% Homologie mit der Sequenz von prostataspezifischem Antigen (PSA) und PSA wird ebenfalls breit als ein biochemischer Marker für Prostatakrebs verwendet (Mikolajczyk, S. d. et al., Prostate, 34, 44, 1998; Pannek, J. et al., Oncology, 11, 1273, 1997; Chu, T. M. et al., Tumour Biology, 18, 123, 1997; Hsieh, M. et al., Cancer Res., 57, 2651, 1997). Darüber hinaus wird von hK2 berichtet, daß es als ein Marker nicht nur für Prostatakrebs von Nutzen ist, sondern auch Magenkrebs (Cho, J. Y. et al., Cancer, 79, 878, 1997).
  • Darüber hinaus wird von CYFRA (CYFRA 21-1) für die Messung des Cytokeratin 19-Fragments im Serum berichtet, daß es für Lungenkrebs von Nutzen ist (Sugiyama, Y. et al., Japan J. Cancer Res., 85, 1178, 1994). Von dem Vorläufer des Gastrin freisetzenden Peptids (ProGRP) wird berichtet, daß er als ein Tumormarker von Nutzen ist (Yamaguchi, K. et al., Japan J. Cancer Res., 86, 698, 1995) Daher ist zu erwarten, daß die Kombination von CYFRA und ProGRP ein sehr nützliches Diagnosehilfsmittel bei der frühen Diagnose von Lungenkrebs werden kann.
  • Insbesondere werden Tumormarker häufig bei der Diagnose von Eierstockkrebs verwendet, weil zum Beispiel Eierstockkrebs in einem frühen Stadium schwer zu finden ist, in vielen Fällen im fortgeschrittenen Stadium gefunden wird, viele unterschiedliche Gewebetypen hat, es schwierig ist, den Gewebetyp nur durch Bilddiagnose herauszufinden, gutartiger Eierstocktumor selten ist und es erforderlich ist, vom bösartigen zu unterscheiden. Zur Zeit wird zum Beispiel CA125, welches ein Antigen bezüglich einer Zuckerkette ist, klinisch als ein Tumormarker für Eierstockkrebs verwendet. Es wurde jedoch offenbart, daß der Durchschnittswert von CA125 einer gesunden Person mit dem Alter oder nach der Menopause abnimmt. Dann ist es erforderlich und erwünscht, einen Marker zu entwickeln, der die Schwäche von CA125 ausgleicht. Außerdem werden für Brustkrebs zum Beispiel CEA, TPA und CA15-3 verwendet. Sie sind jedoch angesichts der Sensitivität und Spezifität weit davon entfernt, exzellente Marker zu sein, und sind unzureichend für die frühe Diagnose.
  • Unter diesen Umständen wurde eine Serinprotease, Neurosin, gefunden, die als ein Marker für frühen Brustkrebs und frühen Eierstockkrebs verwendet werden kann. Wie verstehend beschrieben, ist ein Meßsystem der Serinprotease, d.h. Neurosin, essentiell für weitere detaillierte Untersuchungen des Metastatisierungs- und Infiltrationsmechanismus von Krebs. Außerdem wird ab jetzt erwartet, daß es ein biologischer Diagnosemarker ist, der frühen Eierstockkrebs und frühen Brustkrebs identifizieren ebenso wie effektiv diagnostizieren kann. Daher ist auch ein Meßsystem für Neurosin wünschenswert.
  • Obwohl die WO98/11238 und die EP-A1 0 576 152 einen monoclonalen Antikörper beschreiben, wird darüber hinaus tatsächlich aktuell kein Hybridom produziert und es wird aktuell kein monoclonaler Antikörper erhalten, der Spezifität für eine Serinprotease hat. Obwohl diese Dokumente offenbaren, daß der monoclonale Antikörper durch bekannte Techniken produziert werden kann, ist es ungewiß, ob ein Hybridom, das einen monoclonalen Antikörper produziert, der spezifisch an eine Serinprotease bindet, bei einem Durchmusterungsschritt von Hybridomen erhalten werden kann oder nicht.
  • AUFGABEN DER ERFINDUNG
  • Angesichts der vorstehenden Umstände haben sich die Erfinder der vorliegende Erfindung die Produktion eines monoclonalen Antikörpers vorgenommen, der spezifisch an eine Serinprotease bindet.
  • Somit ist die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines monoclonalen Antikörpers, der spezifisch an Neurosin bindet und der für die Messung der Serinprotease Neurosin verwendet werden kann, wobei der besagte monoclonale Antikörper durch die Hybridomlinien 2B2-6 (FERM P-16843) oder S2E5 (FERM P-16844) produziert wird, die hier beschrieben werden.
  • Diese Aufgabe ebenso wie andere Aufgaben oder Vorteile der vorliegende Erfindung werden dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet aufgrund der folgenden Beschreibung mit Bezug auf die begleitenden Abbildungen offensichtlich werden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • 1 ist eine Genkarte des Expressionsplasmids pSecTaq/Neurosin.
  • 2 zeigt den Vergleich der Resultate von einem Western-Blot-Verfahren mit dem monoclonalen Antikörper der vorliegende Erfindung (elektrophoretische Photographie).
  • 3 ist eine Kalibrierungskurve eines rekombinanten Neurosins.
  • 4 ist eine Abbildung, die die Korrelation zwischen der Konzentration von co-existierenden Substanzen und der optischen Dichte veranschaulicht und die zeigt, daß die co-existierenden Substanzen keinen substantiellen Einfluß auf die Bestimmung von Neurosin mit einem ELISA-System haben.
  • 5 zeigt den Vergleich der Korrelation zwischen dem Western-Blot-Verfahren und einem ELISA-System von Patientenproben (elektrophoretische Photographie).
  • 6 sind Elektrophoresemuster von Neurosin, das von menschlichem CSF abgeleitet ist und mit einer Kationenaustauschersäule isoliert und gereinigt wurde. 7 zeigt die Resultate der Aminosäuresequenzierung am N-Terminus von Neurosin, das von menschlichem CSF abgeleitet ist.
  • 8 zeigt die Resultate der Immunblot-Analyse unter Verwendung eines Hirngewebes, das von einem neurologisch normalen Patienten erhalten wurde. Die Spuren W, C und M sind die Ergebnisse, die unter Verwendung einer Homogenatfraktion, Cytosolfraktion bzw. Membranfraktion erhalten wurden.
  • 9 zeigt die Resultate der Immunfärbung von Hirngewebe mit einem anti-Neurosin-Antikörper. A und B sind diejenigen, die unter Verwendung von neurologisch normalen Hirngewebe erhalten wurden. C–F sind diejenigen, die unter Verwendung von Hirngewebe von Patienten mit Alzheimer-Krankheit erhalten wurden.
    A: Die Kerne von Nervenzellen, die im Scheitellappen Cinerea vorhanden sind und Axone haben, wurden ähnlich gefärbt wie andere Zellen.
    B: Die Kerne von Gliazellen wurden in der Substantia alba des Scheitellappens gefärbt.
    C, D: Nur wenige Nervenzellen, die im Scheitellappen vorhanden sind und Axone haben, wurden im Falle von Gehirn mit Alzheimer-Krankheit gefärbt. Die Kerne und Nucleoli der Nervenzellen wurden gefärbt (gezeigt durch Pfeilspitze). Auch senile Plaques wurden mit dem anti-Neurosin-Antikörper gefärbt (durch einen Pfeil gezeigt).
    E: Kegelzellen, die in der CA4-Region des Hippocampus vorhanden sind und die Axone haben, waren Neurosin-positive Zellen.
    F: Die Region mit veränderten extrazellulären Neurofibrillen, die in der CA1-Region des Hippocampus vorhanden ist, war Neurosin-positiv.
  • 10 zeigt die Resultate der Immunfärbung von Hirngewebe mit einem anti-Neurosin-Antikörper. A und B sind diejenigen, die unter Verwendung von neurologisch normalen Gehirngeweben erhalten wurden. C und D sind diejenigen, die unter Verwendung von Mittelhirngewebe von Patienten mit Parkinson-Krankheit erhalten wurden.
    A: Viele Nervenzellen, die im oculomotorischen Nerv vorhanden sind, waren ähnlich Gliazellen Neurosin-positiv.
    B: Einige der Melanin enthaltenden Zellen waren Neurosin-positiv.
    C: Im Gehirn mit Parkinson-Krankheit wurde die Zahl der Melanin enthaltenden Zellen sehr niedrig und eine kleine Zahl der verbleibenden Nervenzellen war Neurosin-positiv.
  • 11 ist eine verbesserte ELISA-Standardkurve.
  • 12 ist der Serumneurosinspiegel, der mit dem verbesserten ELISA bestimmt wurde.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben intensiv die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung von Neurosin untersucht, das eine ausgezeichnete Spezifität und eine gute Empfindlichkeit hat. Als Ergebnis wurde gefunden, daß ein monoclonaler Antikörper, wie hier beschrieben wird, der eine ausgezeichnete Spezifität hat, unter Verwendung von rekombinantem Neurosin als Antigen erhalten werden kann. Somit wurde die vorliegende Erfindung fertiggestellt. Die vorliegende Erfindung stellt mindestens einen monoclonalen Antikörper, wie hier beschrieben, bereit, der für den Nachweis von Neurosin in einer Probe verwendet werden kann.
  • Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel für die Diagnose der Alzheimer-Krankheit und ein Diagnoseverfahren dafür unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung bereit. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Arzneimittel für die Diagnose der Parkinson-Krankheit und ein Diagnoseverfahren dafür bereit.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden monoclonale Antikörper gegen Neurosin erhalten, die durch zwei Arten von Hybridomen produziert werden, die Zelllinie 2B2-6 und die Zelllinie S2E5. Diese Hybridome wurden am 17. Juni 1998 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology (NIBH), Agency of Industrial Science & Technology, 1-1-3 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, unter den Hinterlegungsnummern FERM P-1684 bzw. FERM P-16844 hinterlegt. Die beiden monoclonalen Antikörper, die von diesen Hybridomen, der Zelllinie 2B2-6 und der Zelllinie S2E5, produziert werden, haben den Isotyp von IgG1 für H-Ketten-IgG1 und k für die L-Kette. Die vorliegende Erfindung umfaßt die Klasse wechselnde Mutanten der vorstehenden Antikörper, zum Beispiel Mutanten, die zum Isotyp IgG3, IgG1, IgG2b, IgG2a und andere Immunglobulin-Subklassen gehören, und solche Mutanten können gemäß dem Verfahren von Marin et al. (Coco, Martin et al., J. Immunol. Methods, 145, 1118, 1991) produziert werden.
  • Für die Produktion eines Antikörpers gegen Neurosin ist Neurosin erforderlich, das als immunogenes Antigen verwendet werden kann. Aus natürlichen Quellen gewonnenes Neurosin als ein Antigen kann durch Anwendung von zum Beispiel der Affinitätschromatographie unter Verwendung eines polyclonalen Antikörpers höher gereinigt werden. Zusätzlich zu einem aus natürlichen Quellen gewonnenen kann Neurosin vorzugsweise aus gezüchteten Zellen erhalten werden, zum Beispiel Neurosin produzierenden Zellen. Beispiele für Neurosin produzierende Zellen umfassen Zellen, die aus menschlichem Gehirn gewonnen werden, Zellen, die aus menschlichem Speicheldrüsen gewonnen werden, Zellen, die aus menschlicher Niere gewonnen werden, Krebszellen und dergleichen. Die Neurosin produzierenden Zellen können in einem Kulturmedium und mit einem Züchtungsverfahren, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, oder im Wesentlichen den gleichen gezüchtet werden. Das in einem Kulturüberstand produzierte Neurosin kann zum Beispiel mittels Ionenaustauscherchromatographie und/oder Affinitätschromatographie unter Verwendung eines polyclonalen Antikörpers gereinigt werden.
  • Außerdem kann rekombinantes Neurosin verwendet werden. Spezifisch werden Wirtszellen mit einem rekombinanten Vektor transformiert, der ein Genfragment enthält, das eine Nucleotidsequenz hat, die die Aminosäuresequenz von Neurosin codiert, gefolgt von Züchtung der resultierenden Transformante, um ein Polypeptid zu produzieren, das die Aminosäuresequenz von Neurosin enthält, und seiner Verwendung als ein Antigen. Ein rekombinanter Vektor, der die cDNA-Sequenz von Neurosin enthält, kann mittels herkömmlicher Genrekombinationsverfahren konstruiert werden, zum Beispiel Inserierung in einen Plasmidvektor. Beispiele für den zu verwendenden Vektor umfassen Viren wie den Vacciniavirus, den Baculovirus und dergleichen, zusätzlich zu Plasmiden und Phagen.
  • Beispiele für die zu verwendenden Wirtszellen umfassen Prokaryonten wie E. coli, Bacillus subtilis und Actinomyceten ebenso wie Eukaryonten wie verschiedene Zellen, zum Beispiel tierische Zellen und kommerziell verfügbare Zelllinien, z.B. CHO-Zellen, und des weiteren Pflanzenzellen und Insektenzellen. Beispiele für den zu verwendenden Promotor für Prokaryonten umfassen das Tryptophansynthase-Operon, das Lactose-Operon und dergleichen. Beispiele für den zu verwendenden Promotor für Eukaryonten umfassen Viruspromotoren, den Promotor für Alkoholdehydrogenase, Promotoren für Enzyme des glycolytischen Wegs und dergleichen. Zusätzlich können kommerziell verfügbare Vektoren und Plasmide, die Vielfachclonierungsstellen, einen Promotor, ein Resistenzgen, einen Ori, einen Terminator, eine Ribosomenbindungsstelle und dergleichen haben, auch verwendet werden. Das Resistenzgen umfaßt diejenigen gegen Tetracyclin, Ampicillin, Neomycin oder dergleichen. Das so hergestellte Neurosin kann weiterhin in ein antigenes Konjugat umgewandelt werden oder es kann, wie es ist, für die Immunisierung eines Tieres verwendet werden, indem es mit einem geeigneten Adjuvans gemischt wird.
  • Somit kann das Antigen von verschiedenen Ausgangsmaterialien erhalten werden, zum Beispiel von Antigen produzierenden Rohstoffen wie gezüchteten Zellen, gezüchtetem Gewebe und transformierten Zellen, indem man es gemäß bekannten Verfahren reinigt, zum Beispiel Aussalzen wie die Ammoniumsulfatfällung, Gelfiltration mit Sephadex oder dergleichen, Ionenaustauscherchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Pigmentgelchromatographie, Elektrophorese, Dialyse, Ultrafiltration, Affinitätschromatographie oder Hochleistungsflüssigchromatographie.
  • Des weiteren kann Neurosin ein fragmentiertes Produkt davon oder ein Polypeptidfragment sein, das durch Clonierung und Bestimmung einer cDNA-Sequenz von Neurosin, Ableitung der Aminosäuresequenz, Auswahl einer charakteristischen Sequenzregion basierend auf der Aminosäuresequenz, um ein Polypeptid zu entwerten, und dann chemische Synthese des geplanten Polypeptids erhalten wird. Das Fragment kann mit einem kondensierenden Mittel an verschiedene Trägerproteine gebunden werden, um Hapten-Protein-Immunkonjugate zu bilden. Diese können für die Konstruktion eines monoclonalen Antikörpers verwendet werden, der nur eine spezifische Sequenz erkennt. Um die Herstellung eines immunogenen Konjugats zu erleichtern, kann ein Cysteinrest oder dergleichen zuvor zu dem zu konstruierenden Polypeptid zugegeben werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird mindestens ein monoclonaler Antikörper bereitgestellt, wie hier beschrieben, der spezifisch an Neurosin bindet. Der monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung kann durch Schritte wie die Immunisierung eines Tieres mit rekombinantem Neurosin als einem Immunogen, gefolgt von der Zellfusion von Myelomzellen und Antikörper produzierenden Zellen, der Selektion und Monoclonierung eines Hybridoms, der Produktion des monoclonalen Antikörpers und ggf. der Sammlung von Ascites produziert werden. Es ist erforderlich, vor der Zellfusion Myelomzellen herzustellen. Eine Tumorzelllinie, die vor der Zellfusion verwendet werden soll, kann aus denjenigen ausgewählt werden, die kein Immunglobulin produzieren.
  • Beispiele für ein Adjuvans, das zusammen mit dem Antigen verwendet werden kann, umfassen vollständiges Freundsches Adjuvans, das RIBI-Adjuvans, das Pertussis-Adjuvans, BCG, Liposom, Aluminiumhydroxid, Silikagel und dergleichen. Für die Immunisierung eines Tieres können zum Beispiel Mäuse wie eine Balb/c-Maus, eine F1-Maus und dergleichen verwendet werden.
  • Andererseits ist es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, unter Verwendung von rekombinantem Neurosin einen polyclonalen Antikörper gegen Neurosin zu produzieren. Der Antikörper kann ein Antiserum sein. Es kann ein zusätzlich gereinigter Antikörper sein.
  • Die Zellfusion von Antikörper produzierenden Zellen und Myelomzellen kann wie folgt durchgeführt werden. Die Milzzellen oder Lymphknotenzellen eines immunisierten Tieres werden entfernt, um eine Zellsuspension zu erhalten. Die resultierende Zellsuspension und die Myelomzellen werden in MEM-, DMEM- oder RPMI-1640-Kulturmedium platziert und ein die Fusion förderndes Mittel wie Polyethylenglycol oder dergleichen wird dazugegeben. Ggf. wird eine kleine Menge Dimethylsulfoxid zugegeben, um die Zellfusion weiter zu fördern.
  • Die so erhaltenen Hybridome können unter Verwendung eines Kulturmediums wie MEM-Kulturmedium oder RPMI-1640-Kulturmedium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin und außerdem FCS enthält, selektiert werden. Die Kulturüberstände der Hybridome werden der Durchmusterung mit zum Beispiel einem Radioimmuntest, ELISA, FIA oder der Durchflußcytometrie unter Verwendung von Neurosin oder seinem Peptidfragment als einem Antigen oder markiertem anti-Maus-Antikörper unterzogen, um das gewünschte Hybridom abzutrennen.
  • Das so clonierte Hybridom wird gezüchtet und zur Produktion des monoclonalen Antikörpers verwendet. Das Hybridom kann in einem geeigneten Kulturmedium wie MEM-Kulturmedium oder RPMI-1640-Kulturmedium, das FCS enthält, gezüchtet werden und der gewünschte Antikörper kann aus dem Kulturüberstand gewonnen werden. Zur Gewinnung einer großen Menge des monoclonalen Antikörpers kann das Hybridom in Ascites gesammelt werden. In diesem Fall kann jedes Hybridom intraperitoneal in ein Tier transplantiert werden, das mit dem Tier histokompatibel ist, von dem die Myelomzellen stammen, und dort proliferieren, oder jedes Hybridom kann in eine Nacktmaus oder dergleichen implantiert werden, gefolgt von Gewinnung des monoclonalen Antikörpers, der im Ascites produziert wird. Dem Tier wird vor der Transplantation des Hybridoms intraperitoneal Pristan oder dergleichen verabreicht. Die Ascitesflüssigkeit kann verwendet werden, wie sie ist, oder sie kann mit herkömmlichen Verfahren gereinigt werden. Zum Beispiel kann sie durch Aussalzen wie Ammoniumsulfatfällung, Gelfiltration mit Sephadex oder dergleichen, Ionenaustauscherchromatographie, Elektrophorese, Dialyse, Ultrafiltration, Affinitätschromatographie oder Hochleistungsflüssigchromatographie gereinigt werden.
  • Beispiele für eine Substanz, die für die Markierung des Antikörpers verwendet werden kann, umfassen ein Enzym, ein Enzymsubstrat, ein Coenzym, einen Enzymvorläufer, ein Apoenzym, eine fluoreszierende Substanz, eine Pigmentsubstanz, eine chemisch lumineszierende Substanz, eine leuchtende Substanz, eine farbproduzierende Substanz, eine magnetische Substanz, einen Metallpartikel, eine radioaktive Substanz und dergleichen. Für die Markierung des Antikörpers kann zum Beispiel die Reaktion der Thiolgruppe mit der Maleimidgruppe, der Pyridylsulfidgruppe mit der Thiolgruppe oder der Aminogruppe mit der Aldehydgruppe verwendet werden.
  • Als Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann der Antikörper der vorliegenden Erfindung bei der Immunfärbung verwendet werden, zum Beispiel beim immunologischen Färben von Gewebe oder Zellen, bei der Immunpräzipitation, beim Immunblot-Verfahren, bei einem Immuntest, zum Beispiel einem kompetitiven oder nicht kompetitiven Immuntest, Radioimmuntest, ELISA, Latexagglutination, der Proteinreinigung, einer Affinitätssäule und dergleichen. Im Falle von ELISA wird ein Sandwichtyptest bevorzugt. Der Immuntest umfaßt alle Verfahren wie immunhistologische Untersuchungen, das Immunblot-Verfahren und Verfahren unter Verwendung von immunologischen Reaktionen, zum Beispiel die Immunpräzipitation und dergleichen.
  • Untersuchungsstücke und Proben, bei denen der monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung angewendet werden kann, können in jeder Form sein, einschließlich Lösungen, kolloidaler Flüssigkeiten und nicht-flüssiger Proben. Vorzugsweise sind es Proben, die von lebenden Körpern gewonnen werden, wie Blut, Serum, Gelenkflüssigkeit, cerebrospinale Flüssigkeit, Speichel, amniotische Flüssigkeit, Urin, andere Körperflüssigkeiten, Zellkulturflüssigkeit, Gewebekulturflüssigkeit, Gewebehomogenat, Biopsieproben, Zellen, Gewebe, Gehirngewebe, vom Gehirn abgeleitete Zelllinien, Nervenzelllinien, von Nerven abgeleitete Zelllinien, von der Milchlinie abgeleitete Zelllinien, Milchliniengewebe, vom Eierstock abgeleitete Zelllinien, Eierstockgewebe, Krebszellen, Krebsgewebe und dergleichen.
  • Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung auch eine solche Hybridomzelllinie einen Immuntest und einen Testkit bereit. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung den monoclonalen Antikörper, der Neurosin spezifisch erkennt, einen Immuntest zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Neurosin, der durch der Verwendung des Antikörpers charakterisiert ist, und einen Testkit zur Durchführung des Immuntests bereit.
  • Wie man zusätzlich nachstehend in Beispiel 4 sieht, zeigt der monoclonale Antikörper, der mit der vorliegenden Erfindung gewonnen wird, keine Kreuzreaktivität mit IgG, Albumin und Trypsinogen und hat eine hohe Spezifität zu Neurosin. Somit ist er für den Nachweis und die quantitative Bestimmung von Neurosin von großem Nutzen.
  • Wie man weiterhin nachstehend in Beispiel 5 sieht, zeigt der monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung nicht nur eine Immunreaktivität mit dem Neurosin vom reifen Typ, sondern auch mit seiner Proform.
  • Im Allgemeinen durchlaufen Proteine nach der Translation verschiedene Arten von Prozessierung, um das Protein des aktiven Typs zu produzieren. Zunächst werden viele sekretorische Proteine an den Ribosomen in einer Zelle in der Form eines Proteins vom inaktiven Vorläufertyp (Proform) synthetisiert. Eine solche inaktive Proform hat ein Peptid (Sekretionssignal), das mit Sekretion zu tun hat und normalerweise aus etwa 15 bis 60 Aminosäureresten am N-Terminus des entsprechenden Proteins vom aktiven Typ besteht. Dieses Peptid steht mit einem Mechanismus für den Durchgang des Proteins durch die Zellmembran in Beziehung und in fast allen Fällen wird es beim Durchgang durch die Membran durch ein spezifisches Enzym abgespalten und entfernt, um das entsprechende Protein vom reifen Typ zu bilden. Ein Sekretionssignal hat eine breite hydrophobe Region, die in ihrem Zentrum aus hydrophoben Aminosäuren besteht, und hat auch einen basischen Aminosäurerest an einer Stelle nahe am N-Terminus. Darüber hinaus gibt es ein gewisses Protein, das ein zusätzliches Sekretionssignal am N-Terminus eines inaktiven Proteins vom Vorläufertyp (Proform) hat, und ein solches Protein wird als Präproprotein bezeichnet (Präproform).
  • Zum Beispiel existiert Trypsin unmittelbar nach der Translation in Aminosäuren in der Präproform und nach der Sekretion aus der Zelle existiert es in der Proform. Dann durchläuft es im Duodenum eine eingeschränkte Zersetzung durch eine Enteropeptidase oder Trypsin selbst, um sich in Trypsin vom aktiven Typ umzuwandeln.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Proteil" bedeutet den Teil der Proform, von dem der entsprechende Proteinteil vom aktiven Typ entfernt wird. Der hier verwendete Ausdruck "Präteil" bedeutet den Teil der Präproform, von dem die entsprechende Proform entfernt wird. Der hier verwendete Ausdruck "Präproteil" bedeutet den Teil der Präproform, von dem der entsprechende Proteinteil vom aktiven Typ entfernt wird.
  • Ohne Ausnahme wird Neurosin auch in die Präproform translatiert. Dann wird es in seine Proform umgewandelt und der Proteil wird entfernt, um aktives Neurosin zu bilden.
  • Wie vorstehend beschrieben, wurde gefunden, daß der monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung eine Immunreaktivität nicht nur mit dem reifen Typ von Neurosin hat, sondern auch mit seiner Proform. Das heißt, es wurde gefunden, daß in der cerebrospinalen Flüssigkeit vorhandenes Neurosin in der Proform ist und daß der mir der vorliegenden Erfindung erhaltene monoclonale Antikörper eine Immunreaktivität nicht nur mit rekombinantem aktivem Neurosin hat, sondern auch mit natürlicherweise vorkommendem Neurosin.
  • Der monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung kann für die Diagnose der Alzheimer-Krankheit und der Parkinson-Krankheit verwendet werden.
  • Es gibt einen Bericht, daß Serinproteasen im Gehirn mit einem Entwicklungsstadium, mit synaptischer Plastizität und neurologischen Krankheiten einschließlich der Alzheimer-Krankheit zu tun haben. Kürzlich haben Davies et al. berichtet, daß Gewebe-Plasminogenaktivator (RNK-Met-1) ebenso wie BSP1 und BSP2, die Serinproteasen im Gehirn sind, im Hippocampus der Ratte hoch exprimiert werden (Davis, B. J. et al., J. Biol. Chem., 273, 23004–23011, 1998). BSP1 und BSP2 sind neue Trypsin-ähnliche Proteanen und BSP1 wurde als Neuropsin definiert (Chen, Z.-L. et al., J. Neurosc., 15, 5083–5097, 1995).
  • Kürzlich wurde eine neue Trypsin-ähnliche Protease, die im Gehirn hoch exprimiert wird, cloniert und als Neurosin definiert (Yamashiro, K. et al., Biochem. Biophys. Acta, 1350, 11–14, 1997). Neurosin besteht aus 244 Aminosäuren und ist der, Familie der Serinproteasen ähnlich. Darüber hinaus hat Neurosin 28,4% Homologie mit menschlichem Trypsinogen 1, 26,3% Homologie mit menschlichem Trypsinogen 2, 22,9% Homologie mit menschlichem Kallikrein, 13,8% Homologie mit menschlichem Faktor X und 12,5% Homologie mit menschlichem Chymotrypsinogen. Es spaltet jedoch nicht Substrate von Thrombin, Chymotrypsin und Plasmin. Daher nimmt man an, daß Neurosin im Gehirn eine Trypsin-ähnliche Rolle spielt.
  • Außerdem wurden, wie nachstehend in den Beispielen 6 und 7 gezeigt wird, als ein Resultat der Immunfärbung von Hirngewebeschnitten mit dem monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung alle Kerne angefärbt, die im Gehirn vorhanden sind. Zusätzlich wurden bei Nervenzellen ihr Nervencytoplasma, die Nervenzellenkerne und die Axone gefärbt. Im Gegensatz dazu wurden die Axone, die an der Störungsstelle des Gehirns von Patienten mit der Alzheimer-Krankheit vorhanden sind, kaum gefärbt. Die Anwesenheit von Neurosin wurde in den senilen Plaques, in der Veränderungsregion der extrazellulären Neurofibrillen und den Lewy-Körpern nachgewiesen. Angesichts dessen nimmt man an, daß Neurosin beim Abbau von Proteinen wie β-Amyloid eine Rolle spielt.
  • Darüber hinaus ist gemäß der vorliegenden Erfindung gezeigt worden, daß Neurosin in verschiedenen Arten von Zellen im Gehirn vorhanden ist.
  • Im Gegensatz zu Gliazellen, in denen Neurosin spezifisch in ihren Kernen vorhanden ist, sind hinsichtlich der Nervenzellen das Cytoplasma, die Kerne, die Nucleoli und ihre Axone Neurosin-positiv. Neurosin ist in den Nervenzellen der Störungsstelle eines Patienten mit Parkinson-Krankheit oder Alzheimer-Krankheit kaum enthalten. In einem Gehirn mit Alzheimer-Krankheit ist Neurosin in mehreren senilen Plaques und der Veränderungsregion der Neurofibrillen vorhanden.
  • Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) ist unterteilt in drei Arten (APP695, APP751 und APP770), gemäß der Anzahl an Aminosäuren. APP751 und APP770 enthalten 56 Aminosäuren, die die Funktionen eines Serinproteaseinhibitors vom Kunitz-Typ (KPI) haben. Kürzlich haben Moir et al. berichtet, daß Gehirn eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit ein signifikant höheres Verhältnis von APP-Arten einschließlich KPI im Vergleich mit normalem Gehirn hat (Moir, R. d. et al., J. Biol. Chem., 273, 5013–5019, 1988). Sie haben vorgeschlagen, daß bei der späteren Alzheimer-Krankheit ein Anwachsen dieser Amyloid produzierenden Produkte an der Amyloidpräzipitation beteiligt ist.
  • Die sezernierte Isoform, die die KPI-Domäne enthält, ist dieselbe wie die Protease Nexin 2 (PN-2). Von PN-2 ist bekannt, daß es ein Inhibitor von Serinproteasen wie Trypsin (Kitaguchi, N. et al., Nature, 331, 530–532, 1988; Sinha, S. et al., J. Biol. Chem., 265, 8983–8985, 1990), Chymotrypsin (Kitaguchi, N. et al., Nature, 331, 530–532, 1988, Sinha, S. et al., J. Biol. Chem., 265, 8983–8985, 1990), Faktor IXa (Schmaler, A. N. et al., J. Clin. Invest., 92, 2540–2543, 1993), Xa (Mahdi, F. et al., J. Biol. Chem., 270, 23468–23474, 1995) und XIa (Van Nostrand, W. E. et al., J. Biol. Chem., 265, 9591–9594, 1990) ist. Es gibt Berichte, die zeigen, daß Trypsin (Smith, M. A. et al., Mol. Chem. Neuropathol., 27, 145–154, 1996; Wiegan, U. et al., Gene, 136, 167–175, 1993), Factor Xa (Hass, C. et al., Bioch. Biophys. Acta, 1343, 85–94, 1997), XIa (Saportito-Irwin, S. M. et al., J. Biol. Chem, 270, 26265–26269, 1995), andere Serinproteasen und Thrombin (Igarashi, K. et al.,. Biochem. Biophys. Res. Com., 185, 1000-1004, 1992), und neues Chymotrypsin-ähnliches Enzym (Little, S. qqP. et al., J. Biol. Chem, 272, 25135–25142, 1998) Enzyme sind, die bei der Prozessierung von APP eine Rolle spielen. Darüber hinaus wird bei Thrombin (Akiyama, N. et al., Neurosc. Lett., 146, 142–154, 1992) und Trypsin (Smith, M. A. et al., Mol. Chem. Neuropathol., 27, 145–154, 1996) gezeigt, daß sie in an der Stelle im Gehirn mit Alzheimer-Krankheit lokalisiert sind, an der β-Amyloid präzipitiert ist.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gezeigt, daß Neurosin ein Enzym ist, das bei der Amyloid-Präzipitation eine Rolle spielt, weil es in den senilen Plaques lokalisiert ist. Darüber hinaus gibt es einen Bericht, daß APP an eine Membran bindet und mit einer Sekretase gespalten wird (Roberts, S. B. et al., J. Biol.
  • Chem, 269, 3111–3116, 1994; Vassilacopoulou, F. et al., J. Neurochem., 64, 2140–2146, 1995). Von Neurosin nimmt man an, daß es bei der Prozessierung von APP eine Rolle spielt, weil es auch in der Membranfraktion vorhanden ist. Von Neurosin nimmt man an, daß es von Nerven sezerniert wird und daß es bei der Proteolyse von pathogenen Gewebestrukturen eine gewisse Rolle spielt, weil die Veränderung bei den extrazellulären Fibrillen von dem anti-Neurosin-Antikörper gefärbt wird. Von Trypsin wurde bereits berichtet, daß es in der Region der Veränderung der Neurofibrillen vorhanden ist (Smith, M. A. et al., Mol. Chem. Neuropathol., 27, 145–154, 1996). Es gibt eine Möglichkeit, daß Neurosin eine proteolytische Funktion von aggregierter Struktur hat, weil es in den Lewy-Körpern vorhanden ist.
  • Das heißt, daß man von Neurosin annimmt, daß es bei der Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit eine Rolle spielt, und es deshalb möglich ist, eine Krankheit zu diagnostizieren, bei der Neurosin eine Rolle spielt, indem man die exprimierte Menge an Neurosin nachweist und bestimmt.
  • Während die Beispiele 6 und 7 hier nachstehend zusätzlich experimentelle Systeme unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers gegen Neurosin sind, kann derselbe Effekt als derjenige dieser experimentellen Systeme bei Verwendung eines experimentellen Systems erwartet werden, das auf die mRNA von Neurosin abzielt. Dann können die vorstehenden Krankheiten auch unter Verwendung der mRNA diagnostiziert werden, die aus einer Probe oder einem Untersuchungsstück gewonnen wurde.
  • Da darüber hinaus die bei der vorliegenden Erfindung erhaltenen zwei monoclonalen Antikörper eine unterschiedliche Spezifität zu Neurosin haben, kann durch ihre Kombination eine zusätzlich verbesserte Spezifität erhalten werden, und daher kann die Diagnose der vorstehenden Krankheiten mit hoher Sensitivität durchgeführt werden.
  • Wenn der monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung einem menschlichen Wesen für die Diagnose oder Behandlung einer mit Neurosin zusammenhängenden Krankheit verabreicht wird, kann darüber hinaus ein Verfahren für die Minimierung der Antigenizität gegen das menschliche Wesen angewendet werden. Das heißt, daß dies durch Umwandlung des monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung in einen chimären Antikörper oder einen humanisierten Antikörper gemäß einem bekannten Verfahren erreicht werden kann. Der monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung umfaßt diese Antikörper, welche ihre Antigenizität gegen ein menschliches Wesen vermindern. Hier wird nachstehend ein Verfahren für die Produktion des Antikörpers beschrieben.
  • Der Ausdruck "chimärer Antikörper" bedeutet ein chimäres Molekül eines Maus-Antikörpers und eines humanen Antikörpers. Es ist aus ethischer Sicht unmöglich, einen Antikörper durch Immunisierung eines menschlichen Wesens mit irgendeinem Antigen zu produzieren. Daher wird eine Maus immunisiert und die variable Region eines Antikörpers (V-Region), die an ein Antigen bindet, wird aus einem Gen des Maus-Antikörpers ausgeschnitten, gefolgt von ihrer Verbindung mit dem Gen der konstanten Region (C-Region) des Antikörpers, das von einem humanen Knochentumor abgeleitet ist, um ein chimäres Gen zu produzieren. Ein monoclonaler Mensch-Maus-Antikörper kann durch Expression des chimären Gens in einer Wirtszelle produziert werden. Da der chimäre Antikörper weniger Antigenizität gegen ein menschliches Wesen hat, kann er als der monoclonale Antikörper für die Verabreichung an ein menschliches Wesen zur Behandlung einer Krankheit oder zur Durchführung einer Bilddiagnose verwendet werden. Als Techniken, die bekannte chimäre Antikörper betreffen, gibt es diejenigen, wie sie in der JP 5-304989, JP 4-33-295, WO91/06649, JP 63-036786 A, JP 6-98021 und dergleichen beschrieben sind.
  • Kürzlich wurde jedoch ein humanisierter Antikörper entwickelt, der nützlicher ist als ein chimärer Antikörper. Ein humanisierter Antikörper wird durch Transplantation nur einer Gensequenz einer Antigen bindenden Stelle (CDR: Komplementaritätsbestimmende Region) in einem Antikörpermolekül in ein humanes Antikörpergen (CDR-Grafting) erhalten, um das gesamte Molekül außer der CDR des Antikörpermoleküls zu humanisieren. Da der Maus-Antikörperteil in diesem Antikörper weniger ist als derjenige in einem chimären Mensch-Maus-Antikörper, sagt man von dem Antikörper, daß er eine geringere Antigenizität und eine höhere Sicherheit hat als der chimäre Mensch-Maus-Antikörper. In Japan wird zur Zeit ein klinischer Test eines humanisierten Antikörpers gegen adulte T-Zell-Leukämie durchgeführt. Durch eine US-Firma, Genentech (WO92/22653, WO98/45332, WO94/04679, WO98/37200, WO94/04679), eine GB-Firma, Celltech (WO94/29451, WO94/29351, WO94/13805, WO93/06231, WO92/01059, WO91/16927, WO91/16928, WO91/09967, WO89/01974, WO89/01783) und dergleichen wurden Patentanmeldungen eingereicht, die auf das Produktionsverfahren für humanisierte Antikörper und verwandte Techniken gerichtet sind.
  • Es besteht eine Gefahr bei der Verabreichung eines monoclonalen Antikörpers der Maus, weil der Antikörper ein fremdes Protein für ein menschliches Wesen ist und es sein kann, daß er Nebenwirkungen verursacht. Dann ist ein humaner monoclonaler Antikörper wünschenswert. Bisher war jedoch die Fusionseffizienz unzureichend und es war schwierig, ein Hybridom zu erhalten, das stabil einen Antikörper produziert. Dennoch macht es zur Zeit ein Fortschritt bei der Technologie möglich, einen humanen monoclonalen Antikörper zu produzieren.
  • Als ein Produktionsverfahren für einen humanen monoclonalen Antikörper gibt es zum Beispiel zusätzlich zu einem Zellfusionsverfahren die Transformation mit Epstein-Barr-Virus(EBV), die Fusion von Zellen, die nach Transformation mit diesem Virus erhalten werden, mit Ausgangszellen und ein Verfahren für die Produktion eines chimären Antikörpers und eines humanisierten Antikörpers unter Verwendung der Gentechnik. Ein chimärer Antikörper ist ein Antikörper, der durch Verknüpfung der Immunglobulinfragmente von Tieren verschiedener Arten miteinander gewonnen wird. Ein humanisierter Antikörper ist ein Antikörper, der durch Modifikation eines Antikörpers erhalten wird, der heterogen zu einem menschlichen Wesen ist, wie ein Maus-Antikörper, um seine Primärstruktur außer der CDR der H-Kette und L-Kette durch die entsprechende Primärstruktur eines humanen Antikörpers zu ersetzen. Wenn die SHM-D 33-Linie (ATCC CRL 1668) oder die RF-S1-Linie, die ein hetero-Myelom aus menschlichem Wesen/Maus ist, als eine Ausgangszelle für die Produktion eines humanen monoclonalen Antikörpers verwendet wird, kann dieselbe hohe Fusionseffizienz wie diejenige unter Verwendung von Ausgangszellen der Maus erhalten werden. Ein Hybridom, das unter Verwendung dieser Ausgangszellen erhalten wird, kann ohne Feederzellen cloniert werden. Dann kann ein Antikörper vom Typ IgG relativ stabil in großen Mengen produziert werden. Für die Züchtung der Ausgangszellen wird ERDF-Kulturmedium verwendet, das mit 15% FCE ergänzt ist, und das andere Verfahren ist dasselbe wie das bei der Maus. Außerdem ist es für die Produktion eines humanen monoclonalen Antikörpers vom Typ IgG bevorzugt, menschliche Lymphocyten zu verwenden, die aus peripherem Blut gesammelt werden, das mit einem Antigen ausreichend sensibilisiert wurde. Wenn Lymphocyten, die mit einem Antigen ausreichend sensibilisiert wurden, schwer verfügbar sind, kann die Sensibilisierung mit einem Antigen in vitro durchgeführt werden.
  • Unter Verwendung des vorstehenden Verfahrens kann der Antikörper der vorliegenden Erfindung humanisiert werden und er ist für die Verabreichung an ein menschliches Wesen von großem Nutzen.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung weiter im Detail, sind aber nicht als Limitierung ihres Umfangs gedacht.
  • Beispiel 1
  • Produktion eines monoclonalen anti-Neurosin-Antikörpers
  • Ein monoclonaler anti-Neurosin-Antikörper wurde gemäß dem folgenden Verfahren produziert.
  • (a) Gewinnung von Antigen (Produktion von Zellen, die rekombinantes Neurosin-Protein exprimieren)
  • Gemäß demselben Verfahren, wie in der JP 9-14790 oder Biochim. Biophys, Acta, 11, 1350, 1997, beschrieben, wurde aus COLO201-Zellen mRNA gewonnen, gefolgt von der Synthese von cDNA und Clonierung von pSPORT/Neurosin.
  • Eine Translationsregion des reifen Proteins wurde mittels PCR aus pSPORT/Neurosin gewonnen und sie wurde in pSecTagB (hergestellt von Invitrogen) eingebracht, um ein Expressionsplamid zu konstruieren. Zunächst wurden Sequenzen, die von dem Restriktionsenzym BamHl erkannt werden, an die 5'- und 3'-Termini der Translationsregion von Neurosin angefügt, um Primer zu produzieren. Sie sind in den SEQ ID NOS: 1 und 2 gezeigt.
    SEQ ID NO: 1: CGCGATCCTTGGTGCATGGCGGACCC
    SEQ ID NO: 2: CGCGGATCCTCACTTGGCCTGAATGGT
  • Die PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung dieser Primer und pSPORT/Neurosin als einer Matrize durchgeführt, um eine BamHl erkennende Region zur translatierten Region von Neurosin hinzugefügt zu bekommen. Das PCR-Produkt und pSecTagB wurden mit dem Restriktionsenzym BamHl verdaut und unter Verwendung des Ligierungskits Ver. 1 (hergestellt von Takara) ligiert, um E. coli JM109 (hergestellt von Takara) damit zu transformieren. Unter den transformierten Kolonien wurde eine Kolonie, die das Neurosingen enthielt, mittels PCR bestätigt, um ein Expressionsplasmid pSecTag/Neurosin zu erhalten. Seine Genkarte ist in 1 gezeigt.
  • Ein rekombinantes Neurosinprotein wurde unter Verwendung des exprimierten Plamids pSecTaq/Neurosin und von CHO-Zellen produziert. Die CHO-Zellen (1 × 106 Zellen) wurden in einem Kulturgefäß von 10 cm Durchmesser (hergestellt von Corning) ausgesät. Am folgenden Tag wurde die Zellen mit Opti-MEMTM (Minimales Essentielles Medium, 5 ml) (hergestellt von Gibco) gespült, gefolgt von der Zugabe von frischem Opti-MEMTM (5 ml) und 2 Stunden Züchten bei 37°C. Dann wurden pSecTag/Neurosin (1 μg) und LipofectaminTM (hergestellt von Gibco BRL) (10 μ zum Kulturüberstand zugegeben und der Überstand wurde 6 Stunden bei 37°C gezüchtet. Nach dem Züchten wurde die Zellen mit α-MEM mit Zugabe von 10% fötalem Rinderserum gewaschen und in einem T-förmigen Kolben von 25 cm2 gezüchtet. Nach dem Einbringen des Gens wurde ZeosinTM (hergestellt von Invitrogen) zu dem Medium zugegeben und nur die Zellen, in die das Plasmid eingebracht worden war, wurden durch Wirkstoffselektion selektiert. Das Medium wurde zweimal in der Woche gewechselt und das Züchten wurde fortgesetzt, bis die Zellen konfluent wurden. Die so bis zur Konfluenz gezüchteten Zellen wurde aus dem Kolben entnommen und subkultiviert.
  • Die so erhaltenen, Neurosin exprimierenden Zellen wurden in einem serumfreien Medium gezüchtet und aus dem Kulturüberstand wurde rekombinantes Neurosin gewonnen. Dann wurde der Kulturüberstand bei 1.5000 U/Min 15 Minuten zentrifugiert, unter Verwendung von MES-Puffer (Dozin) dialysiert und durch zwei Kationenaustauscherharze gegeben (Hitrap-SPTM und Mono-STM, hergestellt von Pharmacia), die mit demselben Puffer äquilibriert waren. Als nächstes wurde es mittels Durchgang durch eine Gelfiltrationssäule (Sephacril S-200TM, hergestellt von Pharmacia) mit PBS (phoshatgepufferte Salzlösung) gereinigt, um eine Antigenlösung zu erhalten.
  • Zum Beispiel werden Zellen im Falle der Verwendung eines anderen Vektors, der kein Sekretionssignal hat, mit PBS ausgefällt, das Triton-X 100TM oder Tween-20TM enthält, und die ausgefällten Zellen werden aufgebrochen, um rekombinantes Neurosin zu gewinnen. Alternativ werden Zellen mechanisch mit zum Beispiel einem Homogenisierungsgerät oder Ultraschallgerät aufgebrochen, um rekombinantes Neurosin zu gewinnen. Ein Überstand einer löslichen Fraktion, der mittels des vorstehenden Verfahrens nach der Zentrifugation der aufgebrochenen Zellen gereinigt wurde, kann auch verwendet werden.
  • Außerdem wird gemäß dem Verfahren, das in der JP 9-14790 oder in Biochim. Biophys. Acta, 1350, 11, 1997 beschrieben ist, ein Expressionsplamid pdKCR/Trp59 konstruiert und CHO-Zellen werden durch Einbringung des Plamids transformiert. Die transformierten CHO-Zellen werden gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren gezüchtet und aus dem Kulturüberstand wird rekombinantes Neurosin gereinigt. Auch dies kann als Antigenlösung verwendet werden.
  • Weiterhin kann natürlicherweise vorkommendes humanes Neurosin aus einem Kulturüberstand (10 I) einer Zelllinie mit natürlichem Neurosin mit hoher Produktion, HPC-Y3, die proteinfrei gezüchtet wird, mit Gelfiltration, einer Ionenaustauschersäule, hydrophober Chromatographie, präparativer Acrylamid-Elektrophorese und dergleichen gereinigt werden. Auch dies kann als ein Immunogen verwendet werden.
  • (b) Immunisierung
  • Die Antigenlösung für die Immunisierung, die vorstehend in (a) hergestellt wurde, wurde mit komplettem Freundschem Adjuvans (hergestellt von DIFCO) im Verhältnis 1 : 1 gemischt und das Gemisch wurde emulgiert. Die Emulsion wurde in fünf weibliche Balb/C-Mäuse (8 Wochen als, etwa 100 μg Neurosinprotein/Maus) subkutan injiziert. Dann wurde dreimal mit Intervallen von etwa 2 Wochen eine Verstärkungsimmunisierung (etwa 100 μg Neurosinprotein/Maus) durch subkutane Injektion eines emulgierten Gemisches der Antigenlösung für die Immunisierung und inkomplettem Freundschem Adjuvans (hergestellt von DIFCO) im Verhältnis 1 : 1 durchgeführt. Drei Tage nach der dritten Verstärkung wurde aus der Schwanzvene eine Blutprobe entnommen und der Antikörpertiter im Serum mit dem nachstehenden ELISA gemessen. Zwei Wochen nach der dritten Verstärkung wurde eine Lösung der Antigenlösung für die Immunisierung in physiologischer Kochsalzlösung (etwa 100 μg Neurosinprotein/Maus) den Mäusen intraperitoneal verabreicht. Drei Tage nach der Verabreichung wurden von den immunisierten Mäusen für die Verwendung bei der nachstehenden Zellfusion Milzzellen gewonnen.
  • (c) ELISA (direktes Festphasenverfahren)
  • Eine Neurosinproteinlösung, die auf dieselbe Weise wie bei der Herstellung des Immunisierungsantigens hergestellt worden war, wurde mit PBS auf 5 μg/ml eingestellt und die Lösung (50 μl/Mulde) wurde 2 Stunden an einer ELISA-Platte adsorbiert. Die Platte wurde durch vierfache Verdünnung von BlockaceTM (hergestellt von Snow Brand Milk Products) in PBS blockiert. Nach dem Waschen der Platte wurde eine 5.000-fache Verdünnung (50 μl/Mulde) des Serums, das vorstehend in (b) erhalten worden war, in einem Serumverdünnungspuffer (PBS, das 5% FBS enthielt) zu jeder Mulde der Platte zugegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach dem Waschen der Platte wurde eine 2.000-fache Verdünnung (50 μl/Mulde) von IgG-Antikörper der Maus, der mit alkalischer Phosphatase markiert war (hergestellt von ICN/Cappel), zu jeder Mulde der Platte zugegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Dinatrium-p-nitrophenylphosphat (SIGMA 104-Phosphatasesubstrattabellen) wurde in Substratreaktionsgemisch (9,6% Diethanolaminpuffer, der 0,5 mM Magnesiumchlorid enthielt, pH 9,7) mit einer Konzentration von 2 mg/ml aufgelöst, um eine Substratlösung herzustellen. Die Platte wurde sieben mal mit gereinigtem Wasser gewaschen und die Substratlösung (50 μl/Mulde) wurde dazugegeben. Nach der Reaktion mit der Substratlösung wurde 3N NaOH (50 μl) zugegeben, um die Reaktion zu stoppen und die Absorption bei 405 nm wurde gemessen.
  • (d) Zellfusion und Produktion von Hybridomen
  • Drei Tage nach der letzten Immunisierung wurde aus drei Mäusen die Milz entnommen, die als Ergebnis des vorstehenden ELISA einen erhöhten Antikörpertiter gegen das Neurosinprotein hatten, und gemäß herkömmlichen Verfahren wurde Milzzellen hergestellt. Die Ausgangszellen für die Fusion war die von Balb/c-Mäusen gewonnene Myelom SP-Zelllinie, von der durch Selektion mit einem Kulturmedium, das 8-Azaguanin (20 μg/ml) enthielt, bestätigt wurde, daß sie eine bezüglich Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT) defekte Linie war. SP2-Zellen (2 × 107 Zellen) und Milzzellen (1 × 108 Zellen) wurden kombiniert und die Zellfusion unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG4000TM, hergestellt von Merck) als Zellfusionspromotor gemäß einem herkömmlichen Verfahren durchgeführt. Nach vollständiger Zellfusion wurden die Zellen in einem Kulturmedium (HAT-Medium), das unter Zugabe von Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin zu EscloneTM-Medium (hergestellt von Sanko Pure Chemicals) hergestellt wurde, mit einer Konzentration von 3,0 × 108 Zellen/ml bezüglich der Milzzellen suspendiert und in einer Mikrotiterplatte mit 96 Mulden (hergestellt von Corning) (100 μl/Mulde) verteilt. Die fusionierten Zellen wurden in einem CO2-Inkubator (37°C, 5% CO2) gezüchtet, wobei alle 3 bis 5 Tage die Hälfte des Mediums ausgetauscht wurde. Nur Hybridome, die in dem Medium überlebten, wurden ausgewählt und gezüchtet.
  • (e) Durchmusterung der Hybridome
  • Für die Mulden, bei denen eine Koloniebildung bestätigt wurde, wurde mit demselben ELISA wie vorstehend unter (c) eine Durchmusterung durchgeführt, um die Anwesenheit eines Antikörpers gegen das Neurosinprotein im Kulturüberstand zu bestätigen. Es wurde zwei Arten von Platten verwendet, an denen Neurosin bzw. Trypsinogen absorbiert waren, und die Kolonien, die stark mit dem Neurosinprotein reagierten, wurden selektiert und cloniert.
  • (f) Durchmusterung der Hybridome
  • Die Clonierung von Hybridomen, die Antikörper produzierten, die an das Neurosinprotein banden, wurde dreimal durch limitierte Verdünnung wiederholt, um zwei Arten von Hybridomen zu erhalten, die 2B2-6-Zelllinie und die S2E5-Zelllinie, die Antikörper produzierten, die spezifisch an das Neurosinprotein banden und eine stabile Proliferationskapazität hatten. Diese Hybridome wurden am 17. Juni 1998 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology (NIBH), Agency of Industrial Science & Technology, 1-1-3 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, unter den Hinterlegungsnummern FERM P-16843 bzw. FERM P-16844 hinterlegt.
  • (g) Typisierung der monoclonalen Antikörper
  • Der Isotyp wurde unter Verwendung der Kulturüberstände (jeweils 5 ml) der vorstehend erhaltenen zwei Hybridome, der 2B2-6-Zelllinie und der S2E5-Zelllinie, mit dem Mouse Antibody Isotyping KitTM (hergestellt von Gibco BRL) bestimmt. Die beiden Isotypen der monoclonalen Antikörper, die von den Hybridomen, der 2B2-6-Zelllinie und der S2E5-Zelllinie, produziert wurden, waren dieselben. Nämlich, die H-Kette war IgG1 und die L-Kette war κ.
  • (h) Herstellung und Reinigung von monoclonalem Antikörper
  • Einer weiblichen Balb/c-Maus (8 Wochen alt) wurde intraperitoneal Pristan (0,5 ml/Maus) verabreicht und zehn Tage nach der Verabreichung wurden zwei Hybridome, die 2B2-6-Zelllinie und die S2E5-Zelllinie, die bei der vorstehenden Clonierung (d) erhalten worden waren, intraperitoneal injiziert (etwa 107 Zellen/0,5 ml/Maus). Nach etwa 10 Tagen wurde bei den Mäusen eine abdominale Hypertrophie beobachtet. Dann wurde durch eine 18G-Injektionsnadel Ascites gewonnen. Der gewonnene Ascites wurde mit 1.000 U./Min. 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert und der Überstand 30 Minuten bei 37°C stehen gelassen. Dann wurde er über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Nach 10 Minuten Zentrifugation bei 12.000 U./Min und bei 4°C wurde der resultierende Überstand auf eine Affinitätssäule mit Sepharose Protein ATM (hergestellt von Pharmacia Bioteck) aufgetragen, um den jeweiligen monoclonalen Antikörper zu reinigen. Die Absorption einer Lösung des Antikörpers wurde bei 260, 280 und 320 nm gemessen und die Antikörperkonzentration wurde mit dem Werbulg-Christian-Verfahren bestimmt.
  • (i) Western-Blot-Verfahren
  • Die Expression des rekombinanten Neurosinproteins wurde wie folgt bestätigt. Nach der Gewinnung des Kulturüberstands der jeweiligen clonierten Zellen wurde er mit derselben Menge von 2 x SDS-Auftragsspuffer (hergestellt von Daiichi Kagaku) gemischt und das Gemisch wurde 5 Minuten in einem kochenden Bad erhitzt. Dies wurde als Probenlösung verwendet. Die Probenlösung wurde auf einem 10 bis 20 %-igen Polyacrylamidgel (hergestellt von Daiichi Kapaku) unter Verwendung eines SDS Elektrophoresegeräts (hergestellt von Daiichi Kagaku) und Tris-Glycinpuffer (hergestellt von Daiichi Kagaku) einer Elektrophorese unterzogen. Andererseits wurden während der Elektrophorese für das Blot-Verfahren zwei Blätter 3MM-Filterpapier (hergestellt von Whattman) in Puffer A (hergestellt von Daiichi Kagaku) getaucht, ein Blatt des Filterpapiers wurde in Puffer B (hergestellt von Daiichi Kagaku) getaucht und drei Blätter des Filterpapiers wurde in Puffer C (hergestellt von Daiichi Kagaku) getaucht. Weiterhin wurde eine Polyvinylidenfluoridmembran (PVDF-Membran, hergestellt von Milipore) in Methanol getaucht und dann in Wasser, um sie an Wasser anzupassen.
  • Die Übertragung des Proteins auf die PVDF-Membran wurde durch Herausnahme des Gels nach der Elektrophorese aus der Apparatur und Platzierung von zwei Blättern des Filterpapiers, die in Puffer A getaucht worden waren, von einem Blatt des Filterpapiers, das in Puffer B getaucht worden war, der PVDF-Membran, des Gels und drei Blättern des Filterpapiers, die in Puffer C getaucht worden waren, in dieser Ordnung in ein Blot-Apparatur (hergestellt von Pharmacia) von seiner Kathodenseite aus und dem Anlegen von einer Spannung von 8 mV für 1,5 Stunden durchgeführt. Nach der Übertragung wurde die PVDF-Membran durch 1 Stunde Schütteln bei Raumtemperatur mit BlockaceTM (hergestellt von Snow Brand Milk Products) blockiert. Man ließ die Membran mit einer Verdünnung des polyclonalen anti-Neurosin-Antikörpers des Kaninchens, nachstehend in Beispiel 2 hergestellt, mit zu dem 5% fötales Kälberserum zugegeben waren PBS, bei 4°C über Nacht reagieren. Dann wurde mit alkalischer Phosphatase markierter IgG-Antikörper der Maus dazugegeben und nach 1 Stunde Reaktion bei Raumtemperatur wurde mit NBT-BCIP-Lösung die Farbe entwickelt, um die Expression des rekombinanten Neurosinproteins im Kulturüberstand zu bestätigen.
  • Beispiel 2
  • Produktion von polyclonalem anti-Neurosin-Antikörper
  • (a) Immunisierung
  • Gereinigtes Neurosinprotein, das mittels rekombinanter Gentechnik produziert worden war (100 μg), wurde mit vollständigem Freundschem Adjuvans gemischt und mit dem Gemisch wurde eine anfängliche Immunisierung von Kaninchen vorgenommen. Dann wurden gemäß derselben Immunisierungsweise mit Intervallen von 2 Wochen Verstärkungsimmunisierungen durchgeführt. Insgesamt wurden vier Verstärkungsimmunisierungen durchgeführt.
  • (b) Reinigung von Antiserum
  • Kaninchenantiseren, die von Kaninchen gewonnen wurden, die vorstehend immunisiert worden waren, wurden auf einer Affinitätssäule mit Sepharose Protein ATM (hergestellt von Pharmacia Biotech) gereinigt, um die IgG-Fraktion zu erhalten.
  • (c) Herstellung der Neurosinantigensäule und Reinigung von Antikörper
  • Ein aktiviertes Affinitätsträgerharz, das mit Wasser (0,3 g, FMP: 2-Fluor-1-methylpyridiniumtoluol-4-sulfonat, hergestellt von Seikagaku Kogyo) gequollen war, wurde in eine Säule gefüllt und mit gereinigtem Wasser gewaschen (10 ml). Gereinigtes Neurosinprotein, das mittels rekombinanter Gentechnik gewonnen worden war (10 μg), wurde in einem Kopplungspuffer (50 mM Natriumcarbonat-Natriumbicarbonatpuffer, pH 8,5) aufgelöst. Das in dem Kopplungspuffer gelöste Antigen wurde in die Säule gefüllt und beide Enden der Säule wurden mit Paraffinfilmen versiegelt. Die Säule wurde umgedreht und bei 4°C über Nacht gemischt. Dann wurde die Säule mit dem Kopplungspuffer (5 ml) gewaschen. Die Säule wurde weiterhin mit einem Blockierungspuffer (20 ml) gewaschen und der Blockierungspuffer (10 ml) wurde zu der Säule zugegeben. Beide Enden der Säule wurden mit Paraffinfilmen versiegelt und die Säule wurde umgedreht und bei Raumtemperatur 3 Stunden gemischt. Dann wurde die Säule mit gereinigtem Wasser (20 ml), mit 1M Gly-HCl (pH 2,5, 20 ml) und dann mit gereinigtem Wasser (20 ml) gewaschen. Die vorstehend unter (b) gereinigte IgG-Fraktion wurde durch diese Neurosinantigensäule auf herkömmliche Weise gereinigt.
  • Beispiel 3
  • Entwicklung eines ELISA-Systems unter Verwendung des anti-Neurosin-Antikörpers
  • Der in Beispiel 1 erhaltene monoclonale Antikörper wurde mit PBS auf eine Konzentration von 5 μg/ml verdünnt. Eine Portion von jeweils 100 μl davon wurde zu jeder Mulde einer Platte mit 96 Mulden (hergestellt von Corning) zugegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach fünf mal Waschen mit gereinigtem Wasser wurde die Platte mit einer vierfachen Verdünnung von BlockaceTM (hergestellt von Snow Brand Milk Products) in PBS (300 μl) blockiert. Die Blockierungslösung wurde verworfen und eine Portion von jeweils 100 μl von gereinigtem Neurosinprotein, das mittels rekombinanter Gentechnik produziert und mit PBS zu einer geeigneten Konzentration (0 bis 1.000 ng/ml) verdünnt worden war, wurde dazugegeben, gefolgt von 2 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur. Nach fünf mal Waschen mit gereinigtem Wasser wurde das in Beispiel 2 erhaltene Kaninchenantiserum mit einem Serumverdünnungspuffer (PBS, das 5% FBS enthält) zu einer Konzentration von 5 μg/ml verdünnt und eine Portion von jeweils 100 μl der Verdünnung wurde zu jeder Mulde zugegeben und die Reaktion 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Platte wurde gewaschen und dann wurde eine Portion von jeweils 100 μl einer 2.000-fachen Verdünnung eines mit alkalischer Phosphatase markierten IgG-Antikörpers von Kaninchen (hergestellt von ICN/Cappl) dazugegeben, gefolgt von 1 Stunde Reaktion bei Raumtemperatur. Durch Auflösen von Dinatrium-p-nitrophenylphosphat (SIGMA 104-Phosphatasesubstrattabellen) in einer Substratreaktionslösung (9,6% Diethanolaminpuffer, der 0,5 mM Magnesiumchlorid enthielt, pH 9,7) mit einer Konzentration von 2 mg/ml wurde eine Substratlösung hergestellt. Die Platte wurde sieben mal mit gereinigtem Wasser gewaschen und die Substratlösung (100 μl/Mulde) dazugegeben. Nach 30 Minuten Reaktion mit der Substratlösung wurde 3N NaOH (100 μl) dazugegeben, um die Reaktion zu stoppen und die Absorption wurde bei 405 nm gemessen.
  • (b) Einfluß von co-existierendem Material beim Sandwich-Enzymimmuntest
  • Einfluß von menschlichem Albumin, menschlichem Immunglobulin (IgG) und Trypsinogen wurden untersucht.
  • Auf dieselbe Weise wie diejenigen, die bezüglich des vorstehenden ELISA beschrieben wurde, wurde derselbe Test durchgeführt, außer daß, wenn die Reaktion mit dem Antigen durchgeführt wurde, zu dem Neurosinprotein (200 ng/ml, 50 μl) menschliches Albumin mit einer geeigneten Konzentration (0 bis 2.000 μg/ml), menschliches Immunglobulin (IgG) mit einer geeigneten Konzentration (0 bis 20.000 μg/ml) und Trypsinogen mit einer geeigneten Konzentration (0 bis 40 μg/ml) zugegeben wurden.
  • Beispiel 4
  • Messung von Proben von einem Patienten
  • (a) Spezifität von monoclonalem Antikörper
  • Für die Untersuchung der spezifischen Reaktivität der monoclonalen Antikörper 2B2-6 und S2E5 gegen Neurosin, die durch die vorliegende Erfindung etabliert werden, wurde das Western-Blot-Verfahren durchgeführt. Die Resultate werden in 2 gezeigt (Elektrophoresemuster). Die Resultate zeigen, daß 2B2-6 und S2E5 rekombinantes Neurosin erkennen. Darüber hinaus wurde gefunden, daß 2B2-6 und S2E5 spezifisch für Neurosin sind, weil sie nicht an Trypsinogen binden, das eine hohe Homologie mit Neurosin hat.
  • Zusätzlich ließ man gleichzeitig einen Kulturüberstand der natürlicherweise vorkommenden Pankreaskrebszelllinie HPC-Y3 und weiterhin cerebrospinale Flüssigkeit (CSF) aufgrund eines möglichen Unterschieds zwischen rekombinantem Neurosin und natürlicherweise vorkommendem reagieren. Als ein Resultat wurden Banden bestätigt, die dieselbe Größe hatten.
  • (b) Herstellung der Kalibrationskurve
  • Während eine Kalibrationskurve für den ELISA mit dem etablierten monoclonalen Antikörper hergestellt werden kann, wurde zunächst eine Kalibrationskurve für rekombinantes Neurosin für die positive Kontrolle hergestellt. Wenn eine Kalibrationskurve gut ist, kann eine sigmoide Kurve erhalten werden. Die Resultate werden in 3 gezeigt. In 3 ist auf der Abszisse die Konzentration von Neurosin aufgetragen (ng/ml) und auf der Ordinate ist die optische Dichte (bei 405 nm) aufgetragen. Wie man von den Resultaten sehen kann, wurde innerhalb des Neurosin-Konzentrationsbereichs von 5 bis 1.000 ng/ml eine sigmoide Kurve erhalten und im Bereich von 10 bis 500 ng/ml wurde Linearität erhalten. Eine Probe kann somit innerhalb dieses Bereichs quantitativ bestimmt werden. Weiterhin kann die Sensitivität durch Zugabe einer geeigneten Menge an BSA (d.h. 5 μg/ml) verbessert werden.
  • (c) Untersuchung des Einflusses von co-existierendem Material
  • In einem ELISA zur Bestimmung von menschlichen Proben gibt es viele coexistierende Materialien, die die Antigen-Antikörper-Reaktion beeinflussen. Daher wurde der Einfluß von co-existierenden Materialien auf den Test der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines ELISA-Systems und unter Verwendung des Verfahrens, das im vorstehenden Beispiel 3 beschrieben wird, untersucht. Bei den Proteinen nimmt man an, daß Albumin und Antikörper Probleme verursachen. Daher wurde die quantitative Bestimmung unter Beimischung mit einer gewissen Menge an Neurosin durchgeführt. Darüber hinaus wurde, obwohl Trypsinogen, das eine hohe Homologie mit Neurosin hat, auch beigemischt wurde, kein Einfluß erkannt. Die Resultate sind in den 4A bis 4C gezeigt. In diesen Abbildungen sind auf den Abszissen die Konzentration (μg/ml) der co-existierenden Materialien IgG, Albumin und Trypsinogen aufgetragen. Auf den Ordinaten ist die optische Dichte (bei 405 nm) aufgetragen. Wie bei diesen Resultaten zu sehen, kann man verstehen, daß eine genaue Menge an Neurosin ohne substantiellen Einfluß von co-existierenden Materialien durch das Testverfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines ELISA-Systems bestimmt werden kann.
  • (d) Bestimmung von Neurosin in CSF
  • Proben von cerebrospinaler Flüssigkeit (CSF) wurden von Patienten mit verschiedenen Krankheiten, einschließlich der Alzheimer-Krankheit, mit Western-Blot-Verfahren und ELISA miteinander verglichen. Für den ELISA wurde die CFS-Proben 1/10 verdünnt.
  • Die Resultate sind in 5 (Elektrophoresemuster) gezeigt. Wie man von diesen Resultaten sieht, werden mit Western-Blot-Verfahren und ELISA dieselben Resultate erhalten. Weiterhin wird eine Variation in den Mengen an Neurosin in den Patientenproben gefunden. Deshalb ist es möglich, die Beziehung mit jeder Krankheit durch Bestimmung der Menge an Neurosin zu beweisen.
  • Beispiel 5
  • Reinigung von Neurosin in CSF
  • (a) Herstellung der Antikörpersäule
  • Der Antikörper (S2E5, 10 mg), der über eine Protein A-Säule gereinigt war, wurde mit 0,2 M Natriumhydrogencarbonat, das 0,5 M Natriumchlorid enthielt, (pH 8,3) dialysiert. Der dialysierte Antikörper wurde zu einer NHS-aktivierten Sepharose High PerformerTM (Pharmacia)-Säule zugegeben, die zuvor mit 1 mM Salzsäure aktiviert worden war, und die Reaktion wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Säule wurde mit dem sechsfachen Volumen an Waschlösung A (0,5 M Ethanolaminlösung, die 0,5 M Natriumchlorid enthält, pH 8,3) gewaschen und weiterhin mit dem sechsfachen Volumen an Waschlösung B (0,1 M Essigsäurelösung, die 0,5 M Natriumchlorid enthält, pH 4,0). Die Säule wurde erneut mit dem sechsfachen Volumen an Waschlösung A gewaschen und die Säule, gefüllt mit der Waschlösung A, 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurde die Säule mit dem sechsfachen Volumen an Waschlösung B gewaschen. Das Waschen mit den Waschlösungen A und B wurde einmal wiederholt und letztlich wurde die Säule mit PBS äquilibriert.
  • (b) Reinigung von Neurosin in CSF
  • Nach 20 Minuten Zentrifugation von CSF (10 ml) mit 15.000 U./Min. wurde der Überstand gegen PBS dialysiert. Die dialysierte CSF wurde auf eine S2E5- Antikörpersäule aufgetragen, die zuvor mit PBS äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 5 M Natriumthiocyanat und PBS eluiert. Dann wurde die eluierte Fraktion mit 20 mM MES-Puffer (pH 6,0) dialysiert. Die dialysierte Fraktion wurde auf eine Kationenaustauschersäule aufgetragen (High Trap SPTM, Pharmacia), die zuvor mit 20 mM MES-Puffer (pH 6,0) äquilibriert worden war. Die Säule wurde der Gradientenelution mit Natriumchlorid (0 bis 0,2 M) unterzogen. Alle Reinigungsschritte wurde bei 4°C durchgeführt.
  • (c) Elektrophorese und Western-Blot-Verfahren der eluierten Fraktion
  • Die mit Natriumchlorid eluierte Fraktion wurde, wie in Beispiel 1 gezeigt, der SDS-PAGE unterzogen und das Gel wurde mit Silberfärbung angefärbt. Weiterhin wurde eine Elektrophorese durchgeführt und dann gemäß derselben Weise, wie vorstehend beschrieben, wurde das Western-Blot-Verfahren durchgeführt, gefolgt von der Immunfärbung mit dem monoclonalen S2E5-Antikörper, der in der Antikörpersäule verwendet worden war. Die Resultate sind in 6 gezeigt. Wie in 6 zu sehen, wurde mit Silberfärbung eine einzelne Bande (A) bei einem Marker für ein Molekulargewicht von etwa 30.000 nachgewiesen. Diese Bande wurde in der Fraktion gefunden, die bei etwa 0,15 M Natriumchlorid eluierte. Wenn diese Fraktion der Immunfärbung mit dem S2E5-Antikörper unterzogen wurde, wurde darüber hinaus dieselbe Bande (B) nachgewiesen.
  • (d) Primärstrukturanalyse von gereinigtem, von CNF abgeleitetem Neurosin
  • Die Aminosäuresequenz am N-Terminus von gereinigtem, von CSF abgeleitetem Neurosin wurde unter Verwendung eines Aminosäure-Sequenziergeräts (Applied Biosystems, Modell 473A) analysiert. Die mit 0,15 M Natriumchlorid eluierte Fraktion wurde mit der Kationenaustauschersäule gereinigt, konzentriert und mit ProSorbTM (Pharmacia) an der PVDF-Membran absorbiert und dem Aminosäure-Sequenziergeräts zugeführt. Als ein Resultat wurde eine Aminosäuresequenz am N-Terminus bestätigt. Die Aminosäuresequenz entspricht der Aminosäuresequenz der Proform, die abgeleitet ist von einer Nucleotidsequenz von Neurosin. Somit wurde gefunden, daß der monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung Immunreaktivität mit der Proform von Neurosin hat (7).
  • Beispiel 6
  • Western-Blot-Verfahren von Hirngewebe
  • Hinsichtlich der immunologischen Spezifität des anti-Neurosin-Antikörpers wurde unter Verwendung von Hirngewebe, das von zwei normalen Gehirnen und zwei Gehirnen mit Alzheimer-Krankheit gewonnen wurde, eine Immunblot-Analyse durchgeführt. Jede Probe vom Scheitellappen wurde im fünffachen Volumen eines Puffers (20 mM Tris-HCl (pH = 7,4), 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 10 μM Leupeptin, 1 μM Pepstatin und 0,3 μM Aprotinin) homogenisiert und das Homogenat wurde 30 Minuten bei 15.000 U./Min. und bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde als eine rohe Zellsolfraktion gesammelt. Der Niederschlag wurde erneut in dem Homogenisierungspuffer gelöst, um ihn als Membranfraktion zu verwenden. Eine Teilprobe, die Proteine von jeder Fraktion enthielt (50 μg), wurde der SDS-Polyacrylamidgel (15%-iges Polyacrylamidgel)-Elektrophorese unter reduzierenden Bedingungen unterzogen, gefolgt von der Übertragung auf eine Nitrocellulosemembran unter Verwendung von 25 mM Tris-Glycin-Puffer, der 20% Ethanol (pH = 8,3) enthielt. Die verwendete Nitrocellulosemembran war vorbehandelt mit 25 mM Tris, das 150 mM NaCl (TBS) (pH = 7,4) und 5% Magermilchpulver enthielt, und wurde 18 Stunden bei 4°C mit dem anti-Neurosin-Antikörper (2B2-6) zur Reaktion gebracht, der mit TBS, das 2% Magermilchpulver enthielt, 1/1.000 verdünnt war. Die gesamte Membran wurde mit TBS gewaschen, das 0.1% Tween 20 enthielt, und mit alkalische Phophatase bindendem anti-Maus-Antikörper in TBST, das 1% Magermilch enthielt, 2 Stunden bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Dann wurde die Membran mit einem Substratpuffer für alkalische Phophatase (0,1 M Tris-HCl, der 0,33 mg/ml Nitroblautetrazolium (BRL), 0,44 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphorsäure (BRL), 0,1 M NaCl und 50 mM MgCl2 enthielt, gewaschen.
  • Die Resultate sind in 8 gezeigt. Wie in 8 zu sehen, wurde hinsichtlich der Homogenatfraktion (W) und der Membranfraktion (M) eine einzelne Bande mit dem anti-Neurosin-Antikörper bestätigt, während sie in der Zellsolfraktion (C) nicht beobachtet wurde. Somit wurde bewiesen, daß Neurosin in der Membranfraktion in Hirngewebe vorhanden ist.
  • Beispiel 7
  • Immunfärbung von Hirngewebe
  • (a) Gewinnung von Hirngewebe
  • Hirngewebe wurde von 7 neurologisch normalen Patienten ohne Alzheimer-Krankheit, 6 Patienten mit Alzheimer-Krankheit und 5 Patienten mit Parkinson- Krankheit gewonnen und es wurde bei diesem Experiment verwendet. Die Alzheimer-Krankheit wurde entsprechend dem Standard des National Institute on Aging (Khachaturian, Z. S. et al., Arch. Neurol., 42, 1097–1105, 1985) diagnostiziert. Die Parkinson-Krankheit wurde entsprechend dem Standard von Calne et al. (Calne, D. B. et al., Ann. Neurol., 32, S125127, 1992) diagnostiziert. Die neurologisch normalen 3 männlichen und 4 weiblichen Patienten waren 60 bis 82 Jahre alt. Die zwei männlichen und 4 weiblichen Patienten mit Alzheimer-Krankheit waren 67 bis 82 Jahre alt. Die zwei männlichen und 3 weiblichen Patienten mit Parkinson-Krankheit waren 70 bis 75 Jahre alt. Alles Hirngewebe wurde innerhalb von 2 bis 12 Stunden nach dem Tod des Patienten gewonnen.
  • (b) Immunfärbung
  • Es wurden Gewebestücke aus dem jeweiligen Scheitellappen, Hippocampus und Mittelhirngewebe ausgeschnitten und 2 Tage in einem Phosphatpuffer fixiert, der 4% Paraformaldehyd enthielt. Dann wurden sie unter Bedingungen niedriger Temperatur bei 4°C in 0,1 M Phosphatpuffer aufbewahrt, der 15% Saccharose (pH = 7,4) enthielt, bis sie in dem Experiment verwendet wurden. Wenn es in dem Experiment verwendet wurde, wurde jedes Gewebestück gefroren und mit einem Mikrotom in Schnitte von 20 μm Dicke geschnitten und mit immunhistologischen Techniken gefärbt (McGeer, P. L. et al., Can. J. Neurol. Sci., 16, 516–526 (1989). Der anti-Neurosin-Antikörper (S2E5) wurde 1/1.000-fach verdünnt und der primäre Antikörper und der Gewebeschnitt wurden 48 Stunden bei niedrigen Temperaturen reagieren gelassen, gefolgt von Waschen mit PBS, das 0,3% Triton X-100 enthielt (PBST). Dann wurde er weiter mit dem Avidin-Biotin-HRP-Komplex (Vector) reagieren gelassen, gefolgt von 2 Stunden weiterer Reaktion bei Raumtemperatur mit dem Biotin bindenden anti-Maus-IgG-Antikörper (Vector). Nach dem Waschen mit PBST wurde die Peroxidase-Markierung mit einer Lösung sichtbar gemacht, die 0,001 3,3'-Diaminobenzidin, 0,6% Ammoniumnickelsulfat, 0,05% Imidazol und 0,0003% H2O2 enthielt, Wenn eine dunkelviolette Farbentwicklung beobachtet wurde, wurde die Reaktion gestoppt. Der Schnitt wurde gewaschen, auf einen Glasobjektträger aufgebracht, mit Alkohol dehydratisiert und dann mit Enteran geschützt.
  • (c) Resultate
  • Die unter Verwendung des Hirngewebes der Patienten mit der Alzheimer-Krankheit erhaltenen Resultate sind in 9 gezeigt und diejenigen, die mit dem Hirngewebe der Patienten mit der Parkinson-Krankheit erhalten wurden, sind in 10 gezeigt.
  • Bei der immunhistochemischen Färbung mit dem anti-Neurosin-Antikörper wurden alle Kerne von Neuronen in Gehirn, das als Kontrolle verwendet wurde, gefärbt (9). Und auch die anderen Neuronenkomponenten wie die Nucleoli, die Axone und das Cytoplasma wurden gefärbt (9A und 9B). Ähnliche Resultate wurden bezüglich der Färbung der Kerne bei allen Gehirnen erhalten, die in dem Experiment verwendet wurden.
  • Bei den Gehirnen der Patienten mit Alzheimer-Krankheit wurden die Neuronen, die Axone hatten, in der beschädigten Region wie der Region des Scheitellappens (9C) und der Hippocampus CA1-Region (9F), schwach gefärbt. In dieser Region wurden nur die Kerne von Neuronen gefärbt. In der Hippocampus CA4-Region wurden jedoch alle Komponenten der Neuronen eindeutig gefärbt (9E). Mehrere senile Plaques wurden gefärbt (9C und 9D) und die veränderte Region der extrazellulären Nervenfibrillen war auch Neurosin-positiv (9F). Die veränderte Region der intrazellulären Nervenfibrillen war Neurosin-negativ.
  • Im Mittelhirngewebe der Patienten mit Parkinson-Krankheit waren alle Neuronen im oculomotorischen Nucleus Neurosin-positiv (10A). In dem Kontrollgehirn waren mehrere Nervenzellen, die Melanin in der Substantia nigra enthielten, Neurosin-positiv (10B). In dem Gehirn mit Parkinson-Krankheit wurden kaum Neuronen beobachtet, die Neurosin-positiv waren und Melanin enthielten (10C). Lewy-Körper waren Neurosin-positiv (10D).
  • Wie in den 9 und 10 zu sehen ist, sind bei den Hirngeweben von Patienten mit Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit und normalen Patienten die Resultate der Immunfärbung mit dem anti-Neurosin-Antikörper verschieden voneinander. Somit können diese Krankheiten mit einem immunhistologischen Test diagnostiziert werden.
  • Beispiel 8
  • Verbesserung des ELISA
  • (a) Verbesserter ELISA (Sandwich-Verfahren)
  • Der monoclonale Antikörper (S2E5), der in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde mit PBS auf 5 μg/ml verdünnt. Je eine Portion von 100 μl davon wurde zu jeder Mulde einer Platte mit 96 Mulden (hergestellt von Corning) zugegeben, gefolgt von 2 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur. Nach fünf mal Waschen mit PBS wurde die Platte mit einer vierfachen Verdünnung von BlockaceTM (hergestellt von Snow Brand Milk Products) in PBS (300 μl) blockiert. Die Blockierungslösung wurde verworfen und es wurde erneut mit PBS gewaschen, das 0,05% Tween 20TM enthielt (PBS-T). Dann wurde das in Beispiel 1 produzierte und gereinigte rekombinante Neurosinprotein mit PBS, das 0,5% BSA enthielt (PBS-B), auf eine geeignete Konzentration (0 bis 1.000 ng/ml) verdünnt. Je eine Portion von 100 μl davon wurde zu jeder Mulde zugegeben, gefolgt von 2 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur. Nach fünf mal Waschen mit PBS-T wurde je eine Portion von 100 μl des in Beispiel 2 erhaltenen Antiserums, das mit PBS-B auf 5 μg/ml verdünnt worden war, zu jeder Mulde zugegeben, gefolgt von 2 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen der Platte mit PBS-T wurde je eine Portion von 100 μl einer 5.000-fachen Verdünnung von mit alkalischer Phosphatase markiertem IgG-Antikörper von Kaninchen (hergestellt von Biochem) in PBS-B zu jeder Mulde zugegeben, gefolgt von 1 Stunde Reaktion bei Raumtemperatur. Dinatrium-p-nitrophenylphosphat (SIGMA 104-Phosphatasesubstrattabletten) wurde in Substratreaktionsgemisch (9,6% Diethanolaminpuffer, der 0,5 mM Magnesiumchlorid enthielt, pH 9,7) mit einer Konzentration von 2 mg/ml aufgelöst, um eine Substratlösung herzustellen. Die Platte wurde sieben mal mit PBS-T gewaschen und die Substratlösung (100 μl/Mulde) wurde zu der Platte zugegeben. Nach der Reaktion mit der Substratlösung wurde 3 N NaOH (100 μl) zugegeben, um die Reaktion zu stoppen, und die Absorption bei 405 nm wurde gemessen.
  • Die ELISA-Standardkurve nach der Verbesserung ist in 11 gezeigt. In der 11 ist auf der Abszisse die Konzentration von Neurosin (ng/ml) aufgetragen und auf der Ordinate ist die optische Dichte (bei 405 nm) aufgetragen. Wie von diesen Resultaten zu sehen, wurde im Neurosinkonzentrationsbereich von 1 bis 30 ng/ml Linearität erhalten und die Sensitivität war bei Verwendung des vorstehenden verbesserten ELISA signifikant erhöht.
  • (b) Messung von Serumneurosin
  • Die Serumneurosinspiegel von normalen Personen und Patienten (mit Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit und verschiedenen anderen Krankheiten) wurde mit dem vorstehenden verbesserten ELISA gemessen. Für den ELISA wurde das Serum 1/200 verdünnt und der Messung unterworfen. Als ein Resultat wurde gefunden, daß der Serumneurosinspiegel unter Verwendung des experimentellen ELISA-Systems selbst bei einer Konzentration von 80 ng/ml mit hoher Sensitivität gemessen werden konnte. Wie in 12 zu sehen, enthielten von 50 gemessenen Proben 48 Proben kaum Neurosin im Serum, während 2 Proben hohe Serumneurosinspiegel hatten.
  • (c) Korrelation zwischen verschiedenen Krankheiten und dem Neurosinspiegel in CSF
  • Neurosinspiegel in der CSF eines Patienten wurden mit dem vorstehenden ELISA gemessen. Als ein Ergebnis war der CSF-Neurosinspiegel eines Patienten mit einer Krankheit der peripheren Nerven im Unterschied zu einer Krankheit des zentralen Nervensystems (einer Kontrollgruppe für Krankheiten des zentralen Nervensystems) erhöht, wenn der Patient älter wurde. Und die Demenz von Krankheiten des zentralen Nervensystems wurde in drei Gruppen aufgeteilt, d.h. degenerative Demenz, vaskuläre Demenz und Demenz vom Alzheimer-Typ, und ihre CSF-Neurosinspiegel wurden gemessen. Als ein Ergebnis war der CSF-Neurosinspiegel bei der Gruppe mit der degenerativen Demenz, ähnlich wie bei der Kontrollgruppe, erhöht, wenn der Patient älter wurde, und war verteilt in der Zone mit höherer Konzentration. Andererseits war in der Gruppe mit vaskulärer Demenz keine Korrelation zwischen Alter und CSF-Neurosinspiegel zu beobachten. Insbesondere war der CSF-Neurosinspiegel eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit in der Zone mit niedrigerer Konzentration verteilt. Dieses Resultat stützt die Resultate der Gewebeimmunfärbung.
  • Wie hier vorstehend beschrieben, wird gemäß der vorliegenden Erfindung der monoclonale Antikörper bereitgestellt, der Spezifität für Neurosin hat. Der anti-Neurosin-Antikörper der vorliegenden Erfindung macht es möglich, Neurosin in einer Probe (z.B. CSF) nachzuweisen.
  • Weiterhin zeigt der monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung keine Kreuzreaktivität mit IgG, Albumin und Trypsinogen, von denen man annimmt, daß sie Verunreinigungen in einem Untersuchungsstück oder einer Probe sind. Somit kann ein ELISA-System etabliert werden, daß eine gute Sensitivität hat.
  • Es kann gesagt werden, daß durch die vorliegende Erfindung eine neue Diagnose etabliert wurde, weil der Neurosinspiegel mehrere Krankheiten betrifft.
  • Darüber hinaus können zum Beispiel Hirnschnitte unter Verwendung des anti-Neurosin-Antikörpers der vorliegenden Erfindung durch Immunfärbung angefärbt werden. Das macht es möglich, verschiedene Krankheiten immunhistologisch zu analysieren.
  • SEQUENZPROTOKOLL FREIER TEXT
    • SEQ ID NO: 1 Entworfener Oligonucleotidprimer für die Amplifikation des Neurosingens
    • SEQ ID NO: 2 Entworfener Oligonucleotidprimer für die Amplifikation des Neurosingens
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00460001
  • Figure 00470001

Claims (5)

  1. Monoclonaler Antikörper, der selektiv an Neurosin und/oder seine Vorstufe bindet, wobei der monoclonale Antikörper von der Hybridomlinie 2B2-6 (FERM P-16843) oder der Hybridomlinie S2E5 (FERM P-16844) hergestellt wird.
  2. Hybridom, welches die Hybridomlinie 2B2-6 (FERM P-16843) oder die Hybridomlinie S2E5 (FERM P-16844) ist.
  3. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1, der keine Kreuzreaktivität mit IgG, Albumin und Trypsinogen aufweist.
  4. Antikörper gegen Neurosin, erhältlich durch Verbessern des Antikörpers nach Anspruch 1 oder 3, so dass seine Antigenizität gegen einen Menschen verringert ist.
  5. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Neurosin und/oder seiner Vorstufe, das/die in einer zu testenden Probe enthalten ist, umfassend das Verwenden des Antikörpers nach Anspruch 1, 3 und/oder 4. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Verfahren in einem ELISA-System verwendet wird. Immunhistologisches Nachweisverfahren zur Bestätigung der Anwesenheit von Neurosin und/oder seiner Vorstufe in einem Gewebe, umfassend das Verwenden des Antikörpers nach Anspruch 1, 3 und/oder 4. In-vitro-Verfahren zur Diagnose von Alzheimer- oder Parkinson-Krankheit, umfassend das Verwenden des Antikörpers nach Anspruch 1, 3 und/oder 4. Arzneimittel zur Diagnose von Alzheimer- oder Parkinson-Krankheit, umfassend den Antikörper nach Anspruch 1, 3 und/oder 4. Verwenden des Antikörpers nach Anspruch 1, 3 und/oder 4 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Diagnose von Alzheimer- oder Parkinson-Krankheit. Arzneimittel, umfassend den Antikörper nach Anspruch 1, 3 und/oder 4.
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