DE69738331T2 - Therapeutische anwendungen von laminin und von proteinfragmenten die von laminin abgeleitet sind - Google Patents

Therapeutische anwendungen von laminin und von proteinfragmenten die von laminin abgeleitet sind Download PDF

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung von Laminin, von von Laminin abstammenden Proteinfragmenten und von von Laminin abstammenden Polypeptiden für die therapeutische Intervention bei Alzheimer-Krankheit und anderen Amyloidosen. Außerdem führte die Entdeckung und Identifizierung einer für das Alzheimer-Beta-Amyloidprotein (Aβ) spezifischen Bindungsregion innerhalb der Repeats der globulären Domänen der Laminin-A-Kette zu neuen therapeutischen Anwendungen für die Alzheimer-Krankheit und andere Amyloidosen, welche geoffenbart sind.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Alzheimer-Krankheit ist gekennzeichnet durch die Ansammlung eines 39–43 Aminosäuren-Peptids, genannt Beta-Amyloid-Protein oder Aβ, in fibrillärer Form, das als extrazelluläre Amyloid-Plaques und als Amyloid innerhalb der Wände der zerebralen Blutgefäße existiert. Man nimmt an, dass die Ablagerung von fibrillärem Aβ-Amyloid bei der Alzheimer-Krankheit für den Patienten schädlich ist und schließlich zu Toxizität und neuronalem Zelltod führt, welche charakteristische Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit sind. Eine Ansammlung von Beweisen impliziert nun Amyloid als einen wesentlichen ursächlichen Faktor für die Pathogenese der Alzheimer-Krankheit. Man sucht verzweifelt danach, neue Verbindungen, Mittel, Proteine, Polypeptide oder Protein-Derivate als potentielle therapeutische Mittel zu entdecken und zu identifizieren, um die Aβ-Amyloid-Bildung, Ablagerung, Ansammlung und/oder Persistenz der Alzheimer-Krankheit zum Stillstand zu bringen.
  • Es ist bekannt, dass Aβ normalerweise im menschlichen Blut und in der Zerebrospinalflüssigkeit vorhanden ist. Es ist jedoch nicht bekannt, warum dieses potentielle fibrilläre Protein in zirkulierenden biologischen Flüssigkeiten löslich bleibt. Kann das bzw. können die für diese außerordentliche Löslichkeit von fibrillärem Aβ verantwortliche(n) Mittel für diagnostische und therapeutische Schemata gegen das im Alzheimerschen Gehirn vorhandene fibrilläre Aβ-Amyloid angewendet werden?
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung sieht Antworten auf diese Fragen vor und betrifft die neue und überraschende Entdeckung, dass Laminin und spezifische, von Laminin abstammende Proteinfragmente tatsächlich starke Inhibi toren der Amyloidose der Alzheimer-Krankheit sind und daher eine potentielle Verwendbarkeit für die therapeutische Intervention bei diesen Amyloidosen haben. Außerdem wurde eine spezifische Region innerhalb von Laminin identifiziert, welche mit dem Beta-Amyloid-Protein der Alzheimer-Krankheit interagiert und zu den beobachteten inhibitorischen und therapeutischen Wirkungen beiträgt. Außerdem wurde entdeckt, dass spezifische von Laminin abstammende Proteinfragmente, die auch mit dem Aβ der Alzheimer-Krankheit interagieren, im menschlichen Serum und in der Zerebrospinalflüssigkeit vorhanden sind.
  • Gemäß einem ersten Aspekt sieht die Erfindung die Verwendung von Laminin oder von einem Fragment eines Laminin-Proteins bei der Herstellung eines Medikaments zu Behandlung einer Amyloid-Erkrankung bei einem Patienten vor.
  • Gemäß einem zweiten Aspekt sieht die Erfindung ein in vitro-Verfahren zur Inhibierung oder Reduktion der Beta-Amyloid-Protein-Fibrillen-Bildung, -Ablagerung oder -Ansammlung vor, wobei das Verfahren das Verabreichen von Laminin oder von einem Fragment eines Laminin-Proteins an eine Beta-Amyloid-Protein enthaltende Stelle umfasst.
  • Besondere Ausführungsformen des ersten und des zweiten Aspekts der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen angeführt.
  • Laminin ist eine spezifische Basal-Membran-Komponente, die an mehreren fundamentalen biologischen Prozessen beteiligt ist und kann eine wichtige Rolle bei der Pathogenese einer Anzahl verschiedener humaner Erkrankungen spielen. Unter Verwendung eines Festphasenbindungs-Immunoassays stellte die vorliegende Erfindung fest, dass Laminin das Aβ der Alzheimer-Krankheit mit einer einzigen Bindungskonstante von Kd = 2,7 × 10–9 M bindet. Außerdem stellte die vorliegende Erfindung unter Verwendung eines Thioflavin T-Fluorimetrie-Tests (der die Menge des gebildeten fibrillären Amyloid quantitativ bestimmt) fest, dass Laminin überraschenderweise ein extrem starker Inhibitor der Aβ-Fibrillen-Bildung ist. In dieser letzteren Studie wurden 25 μM Aβ (Reste 1-40) bei 37°C 1 Woche lang in Anwesenheit oder Abwesenheit von 100 nM Laminin inkubiert. Es zeigte sich, dass Laminin die Aβ(1-40)-Amyloid-Fibrillen-Bildung zum Zeitpunkt 1 Stunde um das 2,9-Fache, zum Zeitpunkt 1 Tag um das 4,6-Fache, zum Zeitpunkt 3 Tage um das 30,6-Fache und zum Zeitpunkt 1 Woche um das 27,1-Fache signifikant (p < 0,001) inhibiert. Andere Basal-Membran-Komponenten einschließlich Perlecan, Fibronectin und Typ IV-Kollagen waren im Vergleich zu Laminin keine wirksamen Inhibitoren der Aβ(1-40)-Fibrillogenese, was die Spezifität der inhibitorischen Wirkung, die Laminin aufweist, beweist. Es wurde auch festgestellt, dass die inhibitorische Wirkung von Laminin auf die Aβ-Fibrillogenese in Dosis-abhängiger Weise auftritt. Außerdem zeigte es sich, dass Laminin die Auflösung vorgeformter Amyloid-Fibrillen der Alzheimer-Krankheit in Dosis-abhängiger Weise nach 4 Tagen Inkubation bewirkt. Laminin wurde mit V8, Trypsin oder Elastase verdaut, um kleine, Protease-resistente Fragmente von Laminin zu bestimmen, die noch immer mit Aβ interagierten. Es zeigte sich, dass ein ~55 Kilodalton (kDa) Lamininfragment, das von mit V8 oder Elastase verdautem Laminin abstammte, mit biotinyliertem Aβ(1-40) interagiert. Die Aminosäure-Sequenzierung des ~55 kDa-Fragments identifizierte eine Aβ-Bindungsdomäne innerhalb von Laminin, die sich innerhalb der globulären Repeats der Laminin-A-Kette befindet.
  • Es zeigte sich, dass intaktes Laminin in Humanserum, jedoch nicht in humaner Zerebrospinalflüssigkeit vorhanden ist, wogegen es sich zeigte, dass Laminin-Protein-Fragmente im Bereich von ~120 kDa bis ~200 kDa sowohl in Humanserum als auch in Zerebrospinalflüssigkeit vorhanden sind. Von all den oben beschriebenen, in humanen biologischen Flüssigkeiten vorhandenen Laminin-Proteinfragmenten fand man eine vorherrschende ~130 Kilodalton-Bande in Humanserum und Zerebrospinalflüssigkeit, die hauptsächlich mit Aβ interagierte, wie mittels der Liganden-Blotting-Methodologie bestimmt. Dieses ~130-Kilodalton-Lamininfragment ist als das E8-Fragment bekannt (d. h. generiert nach Elastase-Verdau von Laminin) (Yurchenco und Cheng, J. Biol. Chem. 268: 17286–17299, 1993), und man nimmt auch an, dass es aus den globulären Domänen der Laminin-A-Kette besteht. Man nimmt an, dass die Interaktion spezifischer Lamininfragmente, wie des neu entdeckten ~130 kDa-Proteins, Aβ in biologischen Flüssigkeiten bindet und in einem löslichen Zustand hält. Die vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung von Laminin, von von Laminin abstammenden Proteinfragmenten und von von Laminin abstammenden Polypeptiden für die therapeutische Intervention bei Alzheimer-Krankheit und anderen Amyloidosen. Außerdem führte die Entdeckung und Identifizierung einer spezifischen Alzheimer-Aβ-bindenden Region innerhalb der Repeats der globulären Domänen der Laminin-A-Kette und die Entdeckung des Vorhandenseins von diese Region enthaltenden Lamininfragmenten in Humanserum und Zerebrospinalflüssigkeit zu neuen therapeutischen Anwendungen für die Alzheimer-Krankheit und andere Amyloidosen.
  • Merkmale der Erfindung
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, neue therapeutische Ver fahren für Amyloid-Erkrankungen zu etablieren. Die Amyloid-Erkrankungen inkludieren – ohne Einschränkung darauf – das mit der Alzheimer-Krankheit und dem Down-Syndrom verbundene Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Beta-Amyloid-Protein oder Aβ bezeichnet wird), das Amyloid, welches mit chronischer Entzündung, verschiedenen Formen von Malignomen und Familiärem Mittelmeerfieber verbunden ist (wobei das spezifische Amyloid als AA-Amyloid oder entzündungsassoziierte Amyloidose bezeichnet wird), das mit Multiplem Myelom assoziierte Amyloid und andere B-Zellen-Dyskrasien (wobei das spezifische Amyloid als AL-Amyloid bezeichnet wird), das mit Typ II-Diabetes assoziierte Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Amylin oder Inselamyloid bezeichnet wird), das Amyloid, das mit Prionen-Krankheiten, einschließlich Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, Gerstmann-Straussler-Syndrom, Kuru und Tier-Scrapie assoziiert ist (wobei das spezifische Amyloid als PrP-Amyloid bezeichnet wird), das mit der Langzeit-Hämodialyse und dem Karpaltunnel-Syndrom assoziierte Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Beta2-Mikroglobulin-amyloid bezeichnet wird), das mit senilem kardialen Amyloid und familiärer amyloidotischer Polyneuropathie assoziierte Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Transthyretin oder Präalbumin bezeichnet wird) und das mit endokrinen Tumoren assoziierte Amyloid, wie das medulläre Carcinom der Schilddrüse (wobei das spezifische Amyloid als Procalcitonin-Varianten bezeichnet wird).
  • Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Laminin von von Laminin abstammenden Proteinfragmenten und/oder von von Laminin abstammenden Polypeptiden als starke Inhibitoren der Amyloid-Bildung, -Ablagerung, -Ansammlung und/oder Persistenz bei der Alzheimer-Krankheit und anderen Amyloidosen. „Lamininfragmente, von Laminin abstammende Fragmente, von Laminin abstammende Proteinfragmente und/oder von Laminin abstammende Polypeptide" können – jedoch ohne Einschränkung darauf – inkludieren: Laminin A (oder A1)-Kette, Laminin B1-Kette, Laminin B2-Kette, Laminin A2-Kette (Merosin), Laminin G1-Kette, die Repeats der globulären Domänen innerhalb der Laminin A1-Kette, SEQ ID NO: 1 (11 Aminosäuren-Sequenz innerhalb der Maus-Laminin A-Kette), SEQ ID NO: 2 (viertes globuläres Repeat bei der Maus-Laminin A-Kette), SEQ ID NO: 3 (viertes globuläres Repeat innerhalb der humanen Laminin A-Kette), SEQ ID NO: 4 (Maus-Laminin A-Kette), SEQ ID NO: 5 (humane Laminin A-Kette), SEQ ID NO: 6 (humane Laminin-B1-Kette), SEQ ID NO: 7 (Maus-Laminin B1-Kette), SEQ ID NO: 8 (Ratten-Laminin B2-Kette), SEQ ID NO: 9 (humane Laminin B2-Kette), SEQ ID NO: 10 (Maus-Laminin G1-Kette), SEQ ID NO: 11 (humane Laminin G1-Kette) und alle Fragmente oder Kombinationen davon.
  • Konformational abhängige Proteine, Polypeptide oder Fragmente davon können zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit und anderer Amyloidosen verwendet werden. Solche konformational abhängige Proteine inkludieren – sind jedoch nicht eingeschränkt auf – Laminin, von Laminin abstammende Fragmente, einschließlich Laminin A1-Kette (SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5), die globulären Repeat-Domänen innerhalb der Laminin A1-Kette (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3), eine 11-Aminosäuren-Peptid-Sequenz innerhalb der globulären Domäne der Laminin A-Kette (SEQ ID NO. 1), Laminin B1-Kette (SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7), Laminin B2-Kette (SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9), Laminin G1-Kette (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11) und/oder Teile davon.
  • Peptidomimetische Verbindungen, die aus Laminin, von Laminin abstammenden Proteinfragmenten und/oder von Laminin abstammenden Polypeptiden modelliert sind, einschließlich – jedoch ohne Einschränkung auf – SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 und Fragmente davon, können als starke Inhibitoren der Amyloid-Bildung, -Ablagerung, -Ansammlung und/oder -Persistenz bei Alzheimer-Krankheit und anderen Amyloidosen verwendet werden.
  • Die dreidimensionale(n) Aβ-bindende(n) Stelle(n) an Laminin, an von Laminin abstammenden Proteinfragmenten und/oder an von Laminin abstammenden Polypeptiden können nachgeahmt werden, und diese „Mimics" können als starke Inhibitoren der Amyloid-Bildung, -Ablagerung, -Ansammlung und/oder -Persistenz bei Alzheimer-Krankheit und anderen Amyloidosen verwendet werden.
  • Anti-idiotypische Antikörper zu Laminin, zu von Laminin abstammenden Proteinfragmenten und/oder zu von Laminin abstammenden Polypeptiden können als starke Inhibitoren der Amyloid-Bildung, -Ablagerung, Ansammlung und/oder -Persistenz bei Alzheimer-Krankheit und anderen Amyloidosen verwendet werden.
  • Neue und neuartige polyklonale und/oder monoklonale Peptid-Antikörper können in einer Anzahl von in vitro-Tests verwendet werden, um Aβ-bindende, von Laminin abstammende Proteinfragmente und/oder Aβ-bindende, von Laminin abstammende Polypeptide in Humangeweben und/oder biologischen Flüssigkeiten spezifisch nachzuweisen. Polyklonale oder monoklonale Antikörper, die spezifisch gegen einen Peptidteil oder ein Fragment von Laminin, welches mit Aβ interagiert, hergestellt werden, können verwendet werden, um für die Amyloid-Erkrankung spezifische Lamininfragmente in Humangeweben und/oder biologischen Flüssigkeiten nachzuweisen und zu quantifizieren. Diese Antikörper können durch Verabreichung der Peptide in antigener Form an einen geeigneten Wirt hergestellt werden. Polyklonale oder monoklonale Antikörper können mittels Standard-Techniken, die den Fachleuten bekannt sind, hergestellt werden.
  • Laminin, die Aβ-bindenden Lamininfragmente und/oder von Laminin abstammenden Polypeptide, auf die oben hingewiesen wurde, können auch zur Detektion und spezifischen Lokalisierung von Laminin-Peptiden verwendet werden, die bei den Amyloid-Erkrankungen in Humangeweben, -Zellen und/oder -Zellkultur wichtig sind, wobei immunhistochemische Standard-Techniken verwendet werden.
  • Antikörper, die Laminin, jegliche der Aβ-bindenden Lamininfragmente und/oder von Laminin abstammende Polypeptide erkennen, einschließlich – jedoch ohne Einschränkung darauf – SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 und Fragmente davon, können zur in vivo-Markierung verwendet werden; zum Beispiel mit einem Radionukleotid für das Radioimaging zur Verwendung bei der in vivo-Diagnose und/oder bei der in vitro-Diagnose.
  • Laminin, Aβ-bindende Laminin-Proteinfragmente und/oder Aβ-bindende, von Laminin abstammende Polypeptide einschließlich – jedoch ohne Einschränkung darauf – SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 und Fragmente davon können verwendet werden, um die Ablagerung, Bildung und Ansammlung von fibrillärem Amyloid bei Alzheimer-Krankheit und anderen (oben beschriebenen) Amyloidosen zu inhibieren, und um die Clearance und/oder das Entfernen von vorgeformten Amyloid-Ablagerungen im Gehirn (für Alzheimer-Krankheit- und Down-Syndrom-Amyloidose) und bei systemischen Organen (für systemische Amyloidosen) zu verbessern.
  • Aβ-bindende, von Laminin abstammende Polypeptide oder Fragmente davon können zusammen mit gegen diese Peptid-Fragmente erzeugten polyklonalen und/oder monoklonalen Antikörpern verwendet werden, wobei in vitro-Tests zur Detektion von für die Amyloid-Erkrankung spezifischen Autoantikörpern in humanen biologischen Flüssigkeiten verwendet werden. Spezifische Test-Systeme können verwendet werden, um nicht nur das Vorhan densein von Autoantikörpern gegen Aβ-bindende, von Laminin abstammende Proteinfragmente oder Polypeptide davon in biologischen Flüssigkeiten nachzuweisen, sondern auch zur Überwachung der Progression der Krankheit durch Verfolgen der Erhöhung oder Verringerung von Laminin-Proteinfragmenten und/oder der von Laminin abstammenden Polypeptid-Autoantikörper-Mengen.
  • Laminin, von Laminin abstammende Proteinfragmente und/oder von Laminin abstammende Polypeptid-Antikörper und/oder Molekularbiologische Sonden können zur Detektion dieser Laminin-Derivate in Humangeweben bei den Amyloid-Erkrankungen verwendet werden.
  • Die von Laminin abstammenden Proteinfragmente der vorliegenden Erfindung können bei jeder der oben beschriebenen Anwendungen benützt werden. Die von Laminin abstammenden Proteinfragmente inkludieren – ohne darauf eingeschränkt zu sein – die Laminin A1-Kette, die globulären Repeats innerhalb der Laminin A1-Kette, die Laminin B1-Kette, die Laminin B2-Kette, die Laminin G1-Kette, die Laminin A2-Kette (auch als Merosin bekannt) und alle Bestandteile oder Variationen davon, einschließlich – jedoch ohne Einschränkung darauf – SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 und Fragmente davon, einschließlich der Peptide, die eine mindestens 70% Homologie mit den hierin geoffenbarten Sequenzen haben. Spezifische von Laminin abstammende Proteinfragmente oder Peptide, wie oben beschrieben, können von jeder Spezies abstammen, einschließlich – jedoch ohne Einschränkung darauf – der Spezies Mensch, Maus, Rind, Schwein und/oder Pferd.
  • Polyklonale und/oder monoklonale Peptid-Antikörper können in einer Reihe von in vitro-Tests verwendet werden, um Laminin-Proteinfragmente in Humangeweben und/oder biologischen Flüssigkeiten spezifisch nachzuweisen. Polyklonale oder monoklonale Antikörper, die spezifisch gegen einen Peptidteil oder ein Fragment irgendeines der hierin beschriebenen Lamininfragmente hergestellt sind, können verwendet werden, um von Laminin abstammende Proteinfragmente in Humangeweben und/oder biologischen Flüssigkeiten nachzuweisen und zu quantifizieren. Ein bevorzugter polyklonaler Antikörper ist ein polyklonaler Antikörper, der zum ~130 Kilodalton Aβ-bindenden Lamininfragment, das in Humanserum und Zerebrospinalflüssigkeit vorhanden ist, erzeugt wurde. Diese Antikörper können durch Isolieren und Verabreichen der von Laminin abstammenden Fragmente und/oder Polypeptide in antigener Form an einen geeigneten Wirt erzeugt werden. Po lyklonale oder monoklonale Antikörper können vom Fachmann mittels Standardtechniken hergestellt werden.
  • Von Laminin abstammende Fragment-Antikörper, wie hierin beschrieben, können auch als spezifischer Indikator für das Vorhandensein und das Ausmaß eines Laminin-Abbaus im Gehirn oder in systemischen Organen verwendet werden durch Überwachen biologischer Flüssigkeiten einschließlich – jedoch ohne Einschränkung darauf – Zerebrospinalflüssigkeit, Blut, Serum, Harn, Speichel, Sputum und Stuhl.
  • Von Laminin abstammende Fragment-Antikörper, wie hierin beschrieben, können auch als spezifischer Indikator für das Vorhandensein, Ausmaß und/oder die Progression der Alzheimer-Krankheit und/oder anderer Gehirn-Amyloidosen verwendet werden durch Überwachen biologischer Flüssigkeiten einschließlich – jedoch ohne Einschränkung darauf – Zerebrospinalflüssigkeit, Blut, Serum, Harn, Speichel, Sputum und Stuhl.
  • Von Laminin abstammende Fragment-Antikörper, wie hierin beschrieben, können auch als spezifischer Indikator für das Vorhandensein und Ausmaß der Amyloidose bei Typ II-Diabetes und anderen systemischen Amyloidosen verwendet werden durch Überwachen biologischer Flüssigkeiten einschließlich – jedoch ohne Einschränkung darauf – Zerebrospinalflüssigkeit, Blut, Serum, Harn, Speichel, Sputum und Stuhl.
  • Die Peptide oder Fragmente von Laminin, wie hierin beschrieben, einschließlich – jedoch ohne Einschränkung darauf – SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 und Fragmente davon, können als potentiell blockierende Therapeutika für die Interaktion von Laminin und von von Laminin abstammenden Fragmenten bei einer Anzahl biologischer Prozesse und Erkrankungen (wie bei der Alzheimer-Krankheit und anderen hierin beschriebenen Amyloid-Erkrankungen) verwendet werden.
  • Spezifische, von Laminin abstammende Fragment-Antikörper, wie hierin beschrieben, können zur Detektion dieser Lamininfragmente in Humangeweben bei den Amyloid-Erkrankungen verwendet werden.
  • Laminin, von Laminin abstammende Proteinfragmente und von Laminin abstammende Polypeptide, wie hierin beschrieben, können zur Behand lung der Amyloid-Bildung, -Ablagerung, -Ansammlung und/oder -Persistenz bei Alzheimer-Krankheit und anderen Amyloidosen verwendet werden.
  • Pillen, Tabletten, Kapletten, weiche und harte Gelatine-Kapseln, Pastillen, Sachets, Kachets, Vegicaps, flüssige Tropfen, Elixiere, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirupe, Teebeutel, Aerosole (als festes oder in einem flüssigen Medium), Suppositorien, sterile injizierbare Lösungen und steril verpackte Pulver, die Laminin, von Laminin abstammende Proteinfragmente und von Laminin abstammende Polypeptide enthalten, einschließlich – jedoch ohne Einschränkung darauf – SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 und Fragmente davon können zur Behandlung von Patienten mit Alzheimer-Krankheit und anderen Amyloidosen verwendet werden.
  • Laminin, von Laminin abstammende Proteinfragmente und von Laminin abstammende Polypeptide, einschließlich – jedoch ohne Einschränkung darauf – SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 und Fragmente davon können als starke Mittel verwendet werden, die die Amyloid-Bildung, Amyloid-Ablagerung, Amyloid-Ansammlung, Amyloid-Persistenz inhibieren und/oder eine Auflösung vorgeformter oder vorher abgelagerter Amyloid-Fibrillen bei Alzheimer-Krankheit und anderen Amyloidosen bewirken.
  • Zusammensetzungen, die eine therapeutische Dosis von Laminin, von von Laminin abstammenden Proteinfragmenten und von von Laminin abstammenden Polypeptiden aufweisen, welche die Amyloid-Ablagerung inhibieren, einschließlich – jedoch ohne Einschränkung darauf – SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 und Fragmente davon können einem Subjekt verabreicht werden. Demgemäß sind die Zusammensetzungen zur Inhibition der Amyloidose bei Krankheiten, bei welchen eine Amyloid-Ablagerung auftritt, nützlich. Die Proteine oder Polypeptide der Erfindung können therapeutisch zur Behandlung von Amyloidose oder prophylaktisch bei einem Subjekt, das für Amyloidose anfällig ist, verwendet werden. Die Verfahren der Erfindung basieren zumindest teilweise darauf, dass die Amyloid-Fibrillen-Bildung direkt inhibiert wird und/oder darauf, dass eine Auflösung vorgeformter Amyloid-Fibrillen bewirkt wird.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung der Amyloidose sind ebenfalls vorgesehen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen inkludieren eine therapeutische Verbindung der Erfindung in einer Menge, die wirksam ist, die Amyloid-Ablagerung zu inhibieren, und ein pharmazeutisch akzeptables Vehikel.
  • Diese und andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden beim Lesen der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den beiliegenden Figuren genauer ersichtlich.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die folgenden Zeichnungen dienen zur Veranschaulichung von Ausführungsformen der Erfindung und nicht zur Einschränkung des Umfangs der Erfindung.
  • 1 ist eine Bindungskurve, die die Bindungs-Interaktion von EHS-Laminin an Substrat-gebundenes Aβ(1-40) zeigt. Eine einzelne Bindungsstelle mit einem Kd = 2,7 × 10–9 M wird bestimmt.
  • 2 zeigt die starke Inhibierung der Aβ-Amyloid-Fibrillen-Bildung durch Laminin, wie mittels eines Thioflavin T-Fluorimetrie-Tests im Laufe eines einwöchigen Versuchszeitraums bestimmt.
  • 3 vergleicht die starke Inhibierung der Aβ-Amyloid-Fibrillen-Bildung durch Laminin mit anderen Basalmembran-Komponenten, einschließlich Fibronectin, Typ IV-Kollagen und Perlecan. Es zeigt sich, dass nur Laminin eine starke inhibitorische Wirkung auf die Aβ-Fibrillogenese schon eine Stunde nach Inkubation hat.
  • 4 ist eine graphische Darstellung eines einwöchigen Thioflavin T-Fluorimetrie-Tests, der zum Bestimmen der möglichen Dosis-abhängigen Wirkungen von Laminin auf die Inhibierung der Aβ-Amyloid-Fibrillen-Bildung verwendet wird. Eine signifikante, Dosis-abhängige Inhibierung der Aβ (1- 40)-Amyloid-Fibrillen-Bildung wird zum Zeitpunkt 1 Tag, 3 Tage und 1 Woche Behandlung mit steigenden Laminin-Konzentrationen beobachtet.
  • 5 ist eine graphische Darstellung eines Thioflavin T-Fluorimetrie-Tests, der zum Bestimmen der möglichen Dosis-abhängigen Wirkungen von Laminin auf die Auflösung von vorgeformten Aβ(1-40)-Amyloid-Fibrillen innerhalb eines 4-tägigen Inkubationszeitraums verwendet wird. Laminin bewirkt die Auflösung vorgeformter Aβ-Amyloid-Fibrillen auf Dosis-abhängige Weise.
  • 6 ist eine graphische Darstellung eines einwöchigen Thioflavin T-Fluorimetrie-Tests, der zum Bestimmen der Auswirkungen von Laminin auf die Insel-Amyloid-Polypeptid(Amylin)-Fibrillogenese und zum Feststellen, ob Laminin eine Dosis-abhängige Inhibierung der Amylin-Fibrillen-Bildung bewirkt, verwendet wird. Laminin inhibiert nicht signifikant die Amylin-Fibrillogenese, was seine Spezifität für die Amyloidose der Alzheimer-Krankheit nahelegt.
  • 7 ist eine Schwarzweiß-Aufnahme von mit V8-Protease verdautem, mittels SDS-PAGE getrenntem Laminin nach Interaktion mit biotinyliertem Aβ(1-40). Das kleinste Fragment von V8-resistentem Laminin, das mit Aβ interagiert, ist ein ~55 Kilodalton-Fragment.
  • 8 ist eine Schwarzweiß-Aufnahme von mit Trypsin verdautem, mittels SDS-PAGE getrenntem Laminin nach Interaktion mit biotinyliertem Aβ(1-40). Das kleinste Fragment von Trypsin-resistentem Laminin, das mit Aβ interagiert, ist ein ~30 Kilodalton-Fragment.
  • 9 ist eine Schwarzweiß-Aufnahme von mit Elastase verdautem, mittels SDS-PAGE getrenntem Laminin nach Interaktion mit biotinyliertem Aβ(1-40). Ein ~55 Kilodalton-Lamininfragment (Pfeil), das biotinyliertes Aβ bindet, wurde identifiziert und sequenziert. Es sei auch das Vorhandensein eines ~130 kDa-Fragments(Pfeilspitzen) bemerkt, das Aβ nach 1,5 h Elastase-Verdau bindet (Bahn 2). Tafel A ist ein Liganden-Blot unter Verwendung von biotinyliertem Aβ als Sonde, wogegen Tafel B eine Coomassie-Blau-Färbung desselben Blots der Tafel A zum Auffinden der spezifischen Band(en) zur Sequenzierung ist.
  • 10 zeigt die vollständige Aminosäuresequenz der Maus-Laminin A-Kette. Die Sequenzierung der in 9 gezeigten ~55 Kilodalton-Aβ-bindenden Bande führt zur Identifizierung eines 11 Aminosäuren-Segments (unterstrichen und Pfeilspitze) innerhalb der Laminin-A-Kette. Diese Aβ-bindende Region von Laminin befindet sich innerhalb der Repeats der globulären Domänen der Laminin A-Kette.
  • 11 zeigt schematische Darstellungen von Laminin und der neu entdeckten „Aβ bindenden Region" von Laminin (in der linken Tafel gezeigt; zwischen den beiden Pfeilspitzen), welche sich innerhalb der letzten drei globulären Domänen der Laminin A-Kette befindet.
  • 12 ist eine Schwarzweiß-Aufnahme eines Western Blots, welche das Vorhandensein vom Laminin (Pfeilspitzen) und/oder von von Laminin abstammenden Proteinfragmenten (Bande zwischen den beiden Pfeilen) in Humanserum (Bahnen 1–7, linke Seite) und humaner Zerebrospinalflüssigkeit (Bahnen 1–7, rechte Seite) zeigt, die von Alzheimer-, Typ II-Diabetes- und normal gealterten Patienten erhalten wurden. Ein ~110–130 Kilodalton-Bereich von Laminin-positiven Proteinfragmenten (zwischen den beiden Pfeilen) ist sowohl im Humanserum als auch in der Zerebrospinalflüssigkeit vorhanden, wogegen intaktes Laminin (Pfeilspitzen) nur in Serum, jedoch nicht in Zerebrospinalflüssigkeit vorhanden ist.
  • 13 ist eine Schwarzweiß-Aufnahme, die zeigt, dass intaktes Laminin (Pfeil) und eine markante ~130 Kilodalton-Bande (Pfeilspitze), die in Humanserum von Alzheimer-, Typ II-Diabetes- und normal gealterten Patienten vorhanden ist, Aβ binden. Das Aβ-bindende Laminin und spezifische Aβ-bindende Lamininfragmente im Humanserum wurden nach Trennung mit SDS-PAGE und Interaktion mit nanomolaren Konzentrationen von biotinyliertem Aβ(1-40) identifiziert.
  • 14 ist eine Schwarzweiß-Aufnahme, die das Vorhandensein einer markanten ~130 Kilodalton-Bande (Pfeil) in der humanen Zerebrospinalflüssigkeit von Alzheimer- und normal gealterten Patienten zeigt, identifiziert nach Trennung mittels SDS-PAGE und nach Interaktion mit nanomolaren Konzentrationen von biotinyliertem Aβ(1-40). Dasselbe ~130 Kilodalton-Aβ- bindende Protein ist auch in Humanserum vorhanden (13).
  • Die folgenden Abschnitte sind als zusätzliche Hintergrundinformation zum besseren Verständnis der Erfindung vorgesehen.
  • Alzheimer-Krankheit
  • Die Alzheimer-Krankheit ist die häufigste Ursache für eine Demenz in der Lebensmitte und im hohen Alter und manifestiert sich durch eine progressive Beeinträchtigung des Gedächtnisses, der Sprache, der visuell-räumlichen Wahrnehmungen und des Verhaltens (A Guide to the Understanding of Alzheimer's Disease and Related Disorders, herausgegeben von Jorm, New York University Press, New York 1987). Eine Diagnose einer wahrscheinlichen Alzheimer-Krankheit kann aufgrund klinischer Kriterien (üblicherweise durch das Ausschließen anderer Krankheiten, Gedächtnis-Tests usw.) erstellt werden, doch eine definitive Diagnose erfordert die histologische Untersuchung spezifischer Abnormitäten im Gehirngewebe, das üblicherweise bei der Autopsie erhalten wird.
  • Bei der Alzheimer-Krankheit degenerieren Teile des Gehirns, die für kognitive Prozesse, wie das Gedächtnis, die Aufmerksamkeit, die Sprache und das logische Denken, was deren Opfern vieles raubt, das uns zu Menschen macht, einschließlich der Unabhängigkeit. Bei einigen ererbten Formen der Alzheimer-Krankheit ist der Beginn im mittleren Lebensalter, aber allgemeiner treten die Symptome ab Mitte 60 auf. Die Alzheimer-Krankheit ist durch die Ablagerung und Ansammlung eines 39–43-Aminosäuren-Peptids gekennzeichnet, das als Beta-Amyloid-Protein, Aβ oder β/A4 bezeichnet wird (Glenner und Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 120: 885-890, 1984; Masters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4245–4249, 1985; Husby et al., Bull. WHO 71: 105–108, 1993). Aβ stammt von größeren Vorläufer-Proteinen, genannt Beta-Amyloid-Präkursor-Proteine (oder βPPs), ab, von welchen es mehrere alternativ gespleißte Varianten gibt. Die zahlreichsten Formen der βPPs inkludieren Proteine, die aus 695, 751 und 770 Aminosäuren bestehen (Tanzi et al., Nature 331: 528–530, 1988; Kitaguchi et al., Nature 331: 530–532, 1988; Ponte et al., Nature 331: 525–528, 1988). Das kleine Aβ-Peptid ist ein Hauptbestandteil, der die Amyloid-Ablagerungen neuritischer „Plaques" und in den Wänden von Blutgefäßen (als zerebro-vaskuläre Amyloid-Ablagerungen) im Gehirn von Patienten mit Alzheimer-Krankheit ausmacht. Außerdem ist die Alzheimer-Krankheit gekennzeichnet durch das Vorhandensein von zahlreichen neurofibrillären „Bündeln" („tangles") bestehend aus gepaarten helikalen Filamenten, die sich im neuronalen Zytoplasma abnorm anhäufen (Grundke-Iqbal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4913–4917, 1986; Kosik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4044–4048, 1986; Lee et al., Science 251: 675–678, 1991). Die pathologischen Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit sind daher das Vorhandensein von „Plaques" und von „Bündeln", wobei Amyloid im zentralen Kern von Plaques und innerhalb der Blutgefäßwände abgelagert wird. Es ist wichtig zu bemerken, dass in einem so genannten „normalen gealterten Gehirn" einige Amyloid-Plaques und neurofibrilläre Bündel vorhanden sind. Im Vergleich dazu zeigt jedoch ein Gehirn mit Alzheimer-Krankheit ein Übermaß an Plaques und Bündeln. Daher beruht die Unterscheidung zwischen einem Gehirn mit Alzheimer-Krankheit und einem normalen Gehirn vom diagnostischen Standpunkt aus hauptsächlich auf der quantitativen Beurteilung von „Plaques” und „Bündeln".
  • Bei einem Gehirn mit Alzheimer-Krankheit gibt es gewöhnlich Tausende neuritischer Plaques. Die neuritischen Plaques sind aus extrazellulären Ablagerungen zusammengesetzt, die aus einem Amyloidkern bestehen, der üblicherweise von vergrößerten Axonen und synaptischen Anschlüssen, die als Neuriten bekannt sind, und abnormalen dendritischen Prozessen sowie variablen Mengen infiltrierender Mikroglia und umgebender Astrozyten umgeben ist. Die im Alzheimer-Gehirn vorhandenen neurofibrillären Bündel bestehen hauptsächlich aus Tau-Protein, das ein Mikrotubulus-assoziiertes Protein ist (Grundke-Iqbal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4913–4917, 1986; Kosik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4044–4048, 1986; Lee et al., Science 251: 675–678, 1991). Auf ultrastruktureller Ebene besteht das Bündel aus gepaarten helikalen Filamenten, die wie ein Band gedreht sind, mit einer spezifischen Überkreuzung über eine Periodizität von 80 Nanometern. In vielen Fällen gibt es sowohl gepaarte helikale Filamente als auch gerade Filamente innerhalb eines neurofibrillären Bündels. Außerdem sterben die Nervenzellen oft ab und hinterlassen die Filamente. Diese Bündel sind als „Geister-Bündel" („ghost tangles") bekannt, da sie die filamentösen Überreste der toten Neuronen sind.
  • Die andere Haupt-Läsionsart, die man im Gehirn eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit findet, ist die Ansammlung von Amyloid in den Wänden von Blutgefäßen, sowohl innerhalb des Gehirn-Parenchyms als auch in den Wänden der größeren Hirnhautgefäße, die außerhalb des Gehirns liegen. Die an den Wänden der Blutgefäße lokalisierten Amyloid-Ablagerungen werden als zerebrovaskuläres Amyloid oder kongophile Angiopathie bezeichnet (Mandybur, J. Neuropath. Exp. Neurol. 45: 79–90, 1986; Pardridge et al., J. Neurochem. 49: 1394–1401, 1987).
  • Außerdem weisen Patienten mit Alzheimer-Krankheit einen neuronalen Verlust und synaptischen Verlust auf. Weiters weisen diese Patienten auch einen Verlust von Neurotransmittern, wie Acetylcholin, auf. Tacrine, das erste von der FDA genehmigte Medikament für Alzheimer-Krankheit, ist ein Cholinesterase-Inhibitor (Cutler und Sramek, New Engl. J. Med. 328: 808–810, 1993). Dieses Medikament zeigte jedoch – wenn überhaupt – nur einen begrenzten Erfolg in der kognitiven Verbesserung bei Alzheimer-Patienten und hatte anfangs gravierende Nebenwirkungen, wie eine Leber-Toxizität.
  • Seit vielen Jahren gibt es eine laufende Debatte in der Wissenschaft hinsichtlich der Bedeutung des „Amyloids" bei der Alzheimer-Krankheit, und ob die für diese Krankheit charakteristi-schen „Plaques” und die „Bündel" eine Ursache oder lediglich die Folgen der Krankheit seien. Jüngste Untersuchungen während der letzten fünf Jahre implizierten nun, dass Amyloid tatsächlich ein ursächlicher Faktor für die Alzheimer-Krankheit ist und nicht nur ein unbeteiligter Zuschauer. Es zeigte sich, dass das Aβ-Protein der Alzheimer-Krankheit in der Zellkultur ein Degenerieren von Nervenzellen innerhalb kurzer Zeitspannen bewirkte (Pike et al., Br. Res. 563: 311–314, 1991; J. Neurochem. 64: 253–265, 1994). Untersuchungen lassen vermuten, dass es die fibrilläre Struktur, ein Charakteristikum aller Amyloide ist, die für die neurotoxischen Wirkungen verantwortlich ist. Das Aβ erwies sich auch als neurotoxisch in Schnitt-Kulturen des Hippocampus (der wesentlichen Gedächtnis-Region, die bei der Alzheimer-Krankheit betroffen ist) (Harrigan et al., Neurobiol. Aging 16: 779–789, 1995) und bei transgenen Mäusen den Tod von Nervenzellen induziert (Games et al., Nature 373: 523–527, 1995; Hsiao et al., Neuron 15: 1203–1218, 1995). Außerdem bewirkt die Injektion des Alzheimer-Aβ in das Rattengehirn eine Beeinträchtigung des Gedächtnisses und eine neuronale Dysfunktion (Flood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 3363–3366, 1991; Br. Res. 663: 271–276, 1994), zwei zusätzliche Merkmale der Alzheimer-Krankheit. Wahrscheinlich kommt der überzeugendste Beweis dafür, dass Amyloid (d. h. Beta-Amyloid-Protein) direkt an der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit beteiligt ist, aus genetischen Untersuchungen. Es wurde entdeckt, dass die Erzeugung von Aβ aus Mutationen im Gen, das seinen Vorläufer, bekannt als Beta-Amyloid-Präkursor-Protein codiert, resultieren kann (Van Broeckhoven et al., Science 248: 1120–1122, 1990; Europ. Neurol. 35: 8–19, 1995; Murrell et al., Science 254: 97–99, 1991; Haass et al., Nature Med. 1: 1291–1296, 1995). Wenn es normal prozessiert wird, erzeugt dieses Vorläufer-Protein gewöhnlich nur sehr wenig toxisches Aβ. Die Identifizierung von Mutationen im Amyloid-Vorläufer-Protein-Gen, das einen familiären, frühen Beginn der Alzheimer-Krankheit bewirkt, ist das stärkste Argument dafür, dass Amyloid für den dieser Krankheit zugrunde liegenden pathogenetischen Prozess von zentraler Bedeutung ist. Vier berichtete, krankheitsverursachende Mutationen wurden nun entdeckt, die die Wichtigkeit des Beta-Amyloid-Proteins bei der Verursachung von familiärer Alzheimer-Krankheit beweisen (Überblick in Hardy, Nature Genet. 1: 233–234, 1992). Alle diese Studien legen nahe, dass das Vorsehen eines Medikaments zur Reduktion, Eliminierung oder Prävention der fibrillären Aβ-Bildung, -Ablagerung, -Ansammlung und/oder – Persistenz im Gehirn von Humanpatienten als wirksames Therapeutikum angesehen werden sollte.
  • Andere Amyloid-Erkrankungen
  • Die „Amyloid-Erkrankungen" bestehen aus einer Gruppe klinisch und allgemein nicht miteinander verwandter Humanerkrankungen, die alle eine deutliche Ansammlung einer unlöslichen extrazellulären, als „Amyloid" bekannten Substanz in Geweben aufweisen, üblicherweise in einer Menge, die ausreicht, um die normale Organ-Funktion zu beeinträchtigen. Rokitansky war im Jahr 1842 (Rokitansky, „Handbuch der pathologischen Anatomie", Bd. 3, Braumüller und Seidel, Wien) der erste, der wachsartige und amorph aussehende Gewebeablagerungen in einer Anzahl von Geweben verschiedener Patienten beobachtete. Es war jedoch erst im Jahre 1854, dass Virchow (Virchow, Arch. Path. Anat. 8: 416, 1854) diese Ablagerungen als „Amyloid" bezeichnete, was „stärkeartig" heißt, da sie eine positive Färbung bei der Schwefelsäure-Jod-Reaktion ergaben, die in den 1850er Jahren zum Nachweis von Cellulose verwendet wurde. Obwohl Cellulose kein Bestandteil von Amyloid ist, war dennoch die Färbung, die Virchow beobachtete, vermutlich auf die Anwesenheit von Proteoglykanen (PGs) zurückzuführen, die mit allen Arten von Amyloid-Ablagerungen verbunden zu sein scheinen. Die Bezeichnung Amyloid blieb trotz der Tatsache, dass Friedrich und Kekule im Jahr 1859 die Protein-Natur des Amyloid entdeckten (Friedrich und Kekule, Arch. Path. Anat. Physiol. 16: 50, 1859). Viele Jahre lang wurde auf Grund der Tatsache, dass alle Amyloide dieselbe Färbung und dieselben strukturellen Eigenschaften haben, postuliert, dass ein einziger pathogener Mechanismus an der Amyloid-Ablagerung beteiligt sei, und man dachte, dass die Amyloid-Ablagerungen aus einem einzigen Satz von Bestandteilen zusammengesetzt seien. Jüngste Forschungen zeigten deutlich, dass das Amyloid keine einheitliche Ablagerung ist und dass Amyloide aus verschiedenen Proteinen bestehen können, die miteinander überhaupt nichts zu tun haben (Glenner, N. England J. Med. 302: 1283–1292, 1980).
  • Obwohl sich zeigte, dass das Wesen des Amyloid selbst aus völlig verschiedenen und nicht verwandten Proteinen besteht, scheinen alle Amyloide ähnlich zu sein, wenn man sie unter dem Mikroskop betrachtet, weil das dem Amyloid zugrunde liegende Protein eine fibrilläre Struktur annehmen kann. Alle Amyloide, unabhängig vom Wesen des zugrunde liegenden Proteins, 1) färben charakteristisch mit der Farbe Kongo-Rot und weisen eine klassische Rot/Grün-Doppelbrechung auf, wenn man sie unter polarisiertem Licht betrachtet (Puchtler et al., J. Histochem. Cytochem. 10: 355–364, 1962), 2) bestehen ultrastrukturell aus Fibrillen mit einem Durchmesser von 7–10 Nanometern und einer unbestimmten Länge, 3) nehmen eine vorwiegend beta-gefaltete sekundäre Blatt-Struktur an. Somit würden unter einem Elektronenmikroskop (30.000fache Vergrößerung) betrachtete Amyloid-Fibrillen aus einem obduzierten Gehirn eines Alzheimer-Patienten fast identisch aussehen wie das Amyloid, das in einer einer Biopsie unterzogenen Niere eines Patienten mit Rheumatoider Arthritis vorhanden ist. Diese beiden Amyloide würden einen ähnlichen Fibrillen-Durchmesser von 7–10 Nanometern aufweisen.
  • In den späten 1970er-Jahren wurde Amyloid klinisch in vier Gruppen eingeteilt, primäres Amyloid, sekundäres Amyloid, familiäres Amyloid und isoliertes Amyloid. Das primäre Amyloid ist ein de novo auftretendes Amyloid, ohne jegliche vorhergehende Krankheit. Bei 25–40% dieser Fälle ging primäres Amyloid einer Plasma-Zellen-Dysfunktion, wie der Entstehung von Multiplem Myelom oder anderen Malignomen vom B-Zellen-Typ, voraus. Hier tritt das Amyloid vor anstatt nach dem offenkundigen Malignom auf. Sekundäres Amyloid trat als Komplikation einer zuvor bestehenden Krankheit auf. Bei 10–15% der Patienten mit Multiplem Myelom tritt schließlich Amyloid auf (Hanada et al., J. Histochem. Cytochem. 19: 1–15, 1971). Patienten mit Rheumatoider Arthritis, Osteoarthritis, Spondylitis ankylosans können eine sekundäre Amyloidose bekommen, so wie Patienten mit Tuberkulose, Lungenabszessen und Osteomyelitis (Benson und Cohen, Arth. Rheum. 22: 36–42, 1979; Kamei et al., Acta Path. Jpn. 32: 123–133, 1982; McAdam et al., Lancet 2: 572–575, 1975). Bei Benützern intravenöser Drogen, die sie sich selbst verabreichen, bei welchen dann chronische Hautabszesse auftreten, kann auch sekundäres Amyloid auftreten (Novick Mt. Sin. J. Med. 46: 163–167, 1979). Sekundäres Amyloid findet man auch bei Patienten mit spezifischen Malignomen, wie Morbus Hodgkin und Nierenzellkarzinom (Husby et al., Cancer Res. 42: 1600–1603, 1982). Obwohl diese alle anfangs als sekundäres Amyloid klassifiziert wurden, zeigte es sich, sobald die Amyloid- Proteine isoliert und sequenziert waren, dass viele davon verschiedene Amyloid-Proteine enthielten.
  • Die familiären Formen von Amyloid wiesen auch keine Einheitlichkeit hinsichtlich des für die abgelagerten Amyloid-Fibrillen verantwortlichen Peptids auf. Mehrere geographische Populationen mit genetisch vererbten Amyloidformen wurden jetzt identifiziert. Eine Gruppe findet man in Israel, und diese Krankheit wird Familiäres Mittelmeerfieber genannt und ist durch eine Amyloid-Ablagerung gekennzeichnet, zusammen mit wiederkehrenden Entzündungen und hohem Fieber (Mataxas, Kidney 20: 676–685, 1981). Eine andere Form von ererbtem Amyloid ist die Familiäre amyloidotische Polyneuropathie und wurde bei schwedischen (Skinner und Cohen, Biochem. Biophys. Res. Comm., 99: 1326–1332, 1981), portugiesischen (Saraiva et al., J. Lab. Clin. Med. 102: 590–603, 1983; J. Clin. Invest. 74: 104–119, 1984) und japanischen (Tawara et al., J. Lab. Clin. Med. 98: 811–822, 1981) Staatsangehörigen gefunden. Bei dieser Krankheit erfolgt die Amyloid-Ablagerung vorwiegend in den peripheren und autonomen Nerven. Die erbliche Amyloid-Angiopathie isländischen Ursprungs ist eine autosomal dominante Form der Amyloid-Ablagerung, die vorwiegend die Gefäße im Gehirn beeinträchtigt und wurde bei einer Gruppe von Familien in Westisland identifiziert (Jennson et al., Clin. Genet. 36: 368–377, 1989). Diese Patienten weisen klinisch massive zerebrale Blutungen im frühen Lebensalter auf, die gewöhnlich vor dem 40. Lebensjahr zum Tod führen.
  • Die oben beschriebenen primären, sekundären und familiären Formen des Amyloids weisen die Tendenz auf, viele Körperorgane einzubeziehen, einschließlich Herz, Niere, Leber, Milz, Magen-Darm-Trakt, Haut, Bauchspeicheldrüse und Nebennieren. Diese Amyloid-Erkrankungen werden auch als „systemische Amyloide" bezeichnet, weil so viele Organe innerhalb des Körpers eine Amyloid-Ansammlung aufweisen. Für die meisten dieser Amyloidosen gibt es keine offensichtliche Heilung oder wirksame Behandlung, und die Folgen einer Amyloid-Ablagerung können für den Patienten nachteilig sein. Beispielsweise kann eine Amyloid-Ablagerung in der Niere zu Nierenversagen führen, wogegen eine Amyloid-Ablagerung im Herz zu einem Herzversagen führen kann. Bei diesen Patienten führt die Amyloid-Ansammlung in systemischen Organen später zum Tod, im Allgemeinen innerhalb von 3 bis 5 Jahren.
  • Andererseits haben vereinzelte Formen von Amyloid die Tendenz, ein einzelnes Organsystem einzubeziehen. Vereinzelte Amyloid-Ablagerungen wurden in der Lunge und im Herz gefunden (Wright et al., Lab. Invest. 30: 767–773, 1974; pitkanen et al., Am. J. Path. 117: 391–399, 1984). Bis zu 90% der Typ II-Diabetes-Patienten (nicht-Insulin-abhängige Form der Diabetes) weisen vereinzelte Amyloid-Ablagerungen in der Bauchspeicheldrüse auf, die auf die Beta-Zellen in den Langerhans-Inseln beschränkt sind (Johnson et al., New Eng. J. Med. 321: 513–518, 1989; Lab. Invest. 66: 522–535, 1992). Vereinzelte Formen von Amyloid wurden auch in endokrinen Tumoren gefunden, die Polypeptid-Hormone sezernieren, wie im medullären Karzinom der Schilddrüse (Butler und Khan, Arch. Path. Lab. Med. 110: 647– 649, 1986; Berger et al., Virch. Arch. A Path. Anat. Hist. 412: 543–551, 1988). Eine ernste Komplikation der Langzeit-Hämodialyse ist im medialis-Nerv abgelagertes und klinisch mit dem Karpaltunnel-Syndrom verbundenes Amyloid (Gejyo et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 129: 701–706, 1985; Kidney Int. 30: 385–390, 1986). Die bei weitem häufigste und klinisch relevante Art des Organ-spezifischen Amyloids und des Amyloids im Allgemeinen ist jene, die man im Gehirn von Alzheimer-Patienten findet (vgl. US-Patent Nr. 4,666,829 und Glenner und Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 120: 885–890, 1984; Masters et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 4245–4249, 1985). Bei dieser Krankheit ist das Amyloid vorwiegend auf das Zentralnervensystem beschränkt. Eine ähnliche Amyloid-Ablagerung im Gehirn tritt bei Down-Syndrom-Patienten auf, sobald sie ein Alter von 35 Jahren erreicht haben (Rumble et al., New England J. Med. 320: 1446–1452, 1989; Mann et al., Neurobiol. Aging 10: 397–399, 1989). Andere Arten der Amyloid-Ablagerung im Zentralnervensystem umfassen seltene, jedoch hoch-infektiöse Krankheiten, die als Prionen-Krankheiten bekannt sind, zu welchen die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, das Gerstmann-Sträussler-Syndrom und Kuru zählen (Gajdusek et al., Science 197: 943–960, 1977; Prusiner et al., Cell 38: 127–134, 1984; Prusiner, Scientific American 251: 50–59, 1984; Prusiner et al., Micr. Sc. 2: 33–39, 1985; Tateishi et al., Ann. Neurot. 24: 35–40, 1988).
  • Es war irreführend, die verschiedenen amyloidotischen Krankheiten strengstens auf Basis ihrer klinischen Merkmale in Gruppen einzuteilen, da sich die beteiligten Hauptproteine, wenn sie isoliert und sequenziert wurden, als verschieden herausstellten. Beispielsweise war das bei Rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis gefundene Amyloid, das nun als AA-Amyloid bekannt ist, dasselbe Amyloid-Protein, das bei Patienten mit der familiären Form von Amyloid, die als Familiäres Mittelmeerfieber bekannt ist, identifiziert worden war. Um eine Verwirrung dieses Problems zu vermeiden wurde beschlossen, dass die Klassifikation des Amyloid am besten nach dem Hauptprotein erfolgen sollte, sobald dieses gefunden, sequenziert und identifiziert war.
  • Somit wird Amyloid heutzutage nach dem spezifischen abgelagerten Amyloid-Protein klassifiziert. Zu den Amyloid-Erkrankungen zählen – ohne Einschränkung darauf – das Amyloid, das mit Alzheimer-Krankheit, Down-Syndrom und erblicher Gehirnblutung mit Amyloidose des holländischen Typs („Dutch-type") verbunden ist (wobei das spezifische Amyloid jetzt als das Beta-Amyloid-Protein oder Aβ bekannt ist), das mit einer chronischen Entzündung verbundene Amyloid, verschiedene Malignom-Formen und Familiäres Mittelmeer-Fieber (AA-Amyloid oder mit Entzündungen verbundene Amyloidose), das mit dem Multiplen Myelom und anderen B-Zellen-Abnormitäten verbundene Amyloid (AL-Amyloid), das mit der Typ II-Diabetes verbundene Amyloid (Amylin oder Insel-Amyloid), das mit den Prionen-Krankheiten, einschließlich Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, Gerstmann-Sträussler-Syndrom, Kuru und Tier-Scrapie verbundene Amyloid (PrP-Amyloid), das mit der Langzeit-Hämodialyse und dem Karpaltunnel-Syndrom verbundene Amyloid (Beta2-Mikroglobulin-Amyloid), das mit senilem kardialem Amyloid- und Familiärer amyloidotischer Polyneuropathie verbundene Amyloid (Präalbumin- oder Transthyretin-Amyloid), und das mit endokrinen Tumoren, wie dem medullären Karzinom der Schilddrüse verbundene Amy loid (Varianten von Procalcitonin).
  • Laminin und seine strukturellen Domänen
  • Laminin ist ein großes und komplexes 850 kDa-Glykoprotein, das normalerweise auf der Basalmembran vorliegt und von vielerlei Zellen, einschließlich embryonalen, epithelialen und Tumor-Zellen, erzeugt wird (Foidart et al., Lab. Invest. 42: 336–342, 1980; Timpl et al., Methods Enzymol. 82: 831–838, 1982). Laminin-1 (es stammt vom Engelbreth-Holm-Swarm-Tumor) besteht aus drei unterschiedlichen Polypeptid-Ketten, A, B1 und B2 (auch als alpha 1, β1 bzw. gamma-1 bezeichnet), die in einer Multidomänen-Struktur verbunden sind, welche drei kurze Arme und einen langen Arm hat (Burgeson et al., Matrix Biol. 14: 209–211, 1994). Jeder dieser Arme ist in globuläre und stabartige Domänen unterteilt. Untersuchungen mit einem Selbstzusammenbau in vitro und der Analyse von aus Zellen gebildeten Baselmembranen zeigten, dass Laminin als ein Polymer existiert, das Teil eines Basalmembran-Netzwerks bildet (Yurchenco et al., J. Biol. Chem. 260: 7636–7644, 1985; Yurchenco et al., J. Cell Biol. 117: 1119–1133, 1992; Yurchenco und Cheng, J. Biol. Chem. 268: 7286–17299, 1993). Man nimmt an, dass Laminin bei einer Anzahl grundlegender biologischer Prozesse eine wichtige Rolle spielt, einschließlich der Förderung der Neuralleisten-Migration (Newgreen und Thiery, Cell Tissue Res. 211: 269–291, 1980; Rovasio et al., J. Cell Biol. 96: 462–473, 1983), der Förderung des Auswachsens von Neuriten (Lander et al., Proc. Natl. Acad. Scie. 82: 2183–2187, 1985; Bronner-Fraser und Lallier, Cell Biol. 106: 1321–1329, 1988), der Bildung von Baselmembranen (Kleinman et al., Biochem. 22: 4969–4974, 1983), der Zelladhäsion (Engvall et al., J. Cell Biol. 103: 2457–2465, 1986) und in adulten Gehirn-Astrozyten durch Verletzung induzierbar ist (Liesi et al., EMBO J. 3: 683–686, 1984). Laminin interagiert mit anderen Komponenten, einschließlich Typ IV-Kollagen (Terranova et al., Cell 22: 719–726, 1980; Rao et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 128: 45–52, 1985; Charonis et al., J. Cell Biol. 100: 1848–1853, 1985; Laurie et al., J. Mol. Biol. 189: 205–216, 1986), Heparan-Sulfat-Proteoglykanen (Riopelle und Dow, Brain Res. 525: 92–100, 1990; Battaglia et al., Eur. J. Biochem. 208: 359–366, 1992) und Heparin (Sakashita et al., FEBS Lett. 116: 243–246, 1980; Del Rosso et al., Biochem. J. 199: 699–704, 1981; Skubitz et al., J. Biol. Chem. 263: 4861–4868, 1988).
  • Es stellte sich heraus, dass mehrere der Laminin-Funktionen mit den kurzen Armen in Verbindung stehen. Erstens zeigte es sich, dass die kurzen Arme an der Laminin-Polymerisation beteiligt sind (Yurchenco et al., J. Cell Biol. 117: 1119–1133, 1992; Yurchenco und Cheng, J. Biol. Chem. 268: 17286–17299, 1993). In einer kürzlich vorgeschlagenen Dreiarm-Interaktionshypothese der Laminin-Polymerisation (Yurchenco und Cheng, J. Biol. Chem. 268: 17286–17299, 1993) wird weiters die Meinung vertreten, dass der Selbstzusammenbau durch die Endbereiche jedes der drei kurzen Arme vermittelt wird. Eine Vorhersage dieses Modells ist, dass jeder kurze Arm unabhängig voneinander und kompetitiv die Laminin-Polymerisation inhibieren kann. Es war jedoch nicht möglich, diese Vorhersage unter Verwendung herkömmlicher biochemischer Techniken formell zu testen, weil es nicht möglich war, die alpha- und gamma-Ketten zu trennen. Zweitens dachte man, dass mehrere Heparin-Bindungsstellen in den kurzen Armen vorliegen (Yurchenco et al., J. Biol. Chem. 265: 3981–3991, 1990; Skubitz et al., J. Cell Biol. 115: 1137–1148, 1991), obwohl die Position dieser Stellen unklar blieb. Drittens stellte man fest, dass das alpha1β1-Integrin mit großen Kurzarm-Fragmenten, die alle oder den Großteil der Kurzarm-Domänen enthalten, selektiv interagiert (Hall et al., J. Cell Biol. 110: 2175–2184, 1990; Goodman et al., J. Cell Biol. 113: 931–941, 1991).
  • Die meisten funktionellen Aktivitäten von Laminin scheinen vom Konformationszustand des Glykoproteins abhängig zu sein. Insbesondere stellte man fest, dass der Selbstzusammenbau und dessen Calcium-Abhängigkeit, die Nidogen(Entactin)-Bindung an Laminin, die alpha6β1-Integrin-Erkennung des langen Arms, die Heparin-Bindung an die proximale G-Domäne (kryptisch) und die RGD-abhängige Erkennung der kurzen A-Kette von Laminin (kryptisch) alle Konformations-abhängig sind (Yurchenco et al., J. Biol. Chem. 260: 7636–7644, 1985; Fox et al., EMBO J. 10: 3137–3146, 1991; Sung et al., J. Cell Biol. 123: 1255–1268, 1993. Zwei Konsequenzen von inkorrekt gefaltetem Laminin, der Verlust der normalen funktionalen Aktivität und die Aktivierung von zuvor kryptischen Aktivitäten, lassen vermuten, dass es wichtig ist, unter Verwendung von korrekt gefaltetem Laminin oder Konformations-Homologen zu jedem bestimmten Laminin oder Lamininfragment biologische Aktivitäten zu kartieren und zu charakterisieren.
  • Laminin könnte auch an der Pathogenese einer Anzahl wichtiger Krankheiten beteiligt sein. Beispielsweise zeigt bei Diabetes die signifikante Verringerung der Laminin-Mengen an den glomerulären Basalmembranen an, dass ein molekulares Ungleichgewicht vorliegt (Shimomura und Spiro, Diabetes 36: 374–381, 1987). Bei experimenteller AA-Amyloidose (d. h. der mit einer Entzündung verbundenen Amyloidose) werden an den Stellen der AA-Amyloid-Ablagerung erhöhte Laminin-Mengen beobachtet (Lyon et al., Lab. Invest. 64: 785–790, 1991). Die Rolle(n) des Laminin in der systemischen Amyloidose ist (sind) jedoch nicht bekannt. Bei der Alzheimer-Krankheit und beim Down-Syndrom wird angenommen, dass Laminin in der Nähe der Aβ-enthaltenden Amyloid-Plaques vorhanden ist (Perlmutter und Chui, Brain Res. Bull. 24: 677–686, 1990; Murtomaki et al., J. Neurosc. Res. 32: 261–273, 1992; Perlmutter et al., Micro. Res. Tech. 28: 204–215, 1994).
  • Frühere Untersuchungen wiesen darauf hin, dass die verschiedenen Isoformen der Beta-Amyloid-Präkursor-Proteine der Alzheimer-Krankheit die beiden Basalmembran-Proteine Perlecan (Narindrasorasak et al., J. Biol. Chem. 266: 12878–12883, 1991) und Laminin (Narindrasorasak et al., Lab. Invest. 67: 643–652, 1992) bindet. Was Laminin betrifft, so war zuvor nicht bekannt, ob Laminin mit Aβ interagiert, ob eine bestimmte Domäne von Laminin (wenn überhaupt) an Aβ-Interaktionen beteiligt ist, und ob Laminin irgendeine (irgendwelche) wichtige(n) Rolle(n) bei der Aβ-Amyloid-Fibrillogenese spielte.
  • Mit der vorliegenden Erfindung wurde entdeckt, dass Laminin Aβ mit relativ hoher Affinität bindet und dass überraschenderweise Laminin ein starker Inhibitor der Aβ-Amyloid-Bildung ist und die Auflösung vorgeformter Alzheimer-Amyloid-Fibrillen bewirkt. Außerdem wurde ein 55 Kilodalton Elastase-resistentes Fragment von Laminin, das auch Aβ bindet, an den Repeats der globulären Domänen innerhalb der A-kette von Laminin lokali siert. Man nimmt an, dass diese Region für viele der inhibitorischen Wirkungen, die Laminin auf die Amyloidose der Alzheimer-Krankheit hat, verantwortlich ist. Diese Erkenntnisse zeigen an, dass Laminin, von Laminin abstammende Proteinfragmente und/oder von Laminin abstammende Polypeptide, insbesondere jene, die die geoffenbarte Aβ-Bindungsstelle innerhalb der Repeats der globulären Domänen innerhalb der Laminin A-Kette enthalten, als neue Inhibitoren der Aβ-Amyloidose bei der Alzheimer-Krankheit und bei anderen Amyloidosen dienen könnten. Außerdem führt die Entdeckung und Identifizierung einer Alzheimer-Aβ-bindenden Region innerhalb der Repeats der globulären Domänen der Laminin A-Kette und die Entdeckung von deren Vorhandensein in Humanserum und humaner Zerebrospinalflüssigkeit als ein 130 kDa von Laminin abstammendes Fragment zu neuen therapeutischen Anwendungen für die Alzheimer-Krankheit und für andere Amyloidosen.
  • Weitere Beschreibung der Erfindung
  • Von Laminin abstammende Proteinfragmente und Polypeptide
  • Eine therapeutische Anwendung der vorliegenden Erfindung ist es, Laminin, Laminin-Proteinfragmente, die Aβ oder andere Amyloid-Proteine binden, und/oder Laminin-Polypeptide, die aus der Aminosäure-Sequenzierung von Aβ bindenden Lamininfragmenten stammen (wie dem hierin beschriebenen ~130 Kilodalton Protein) oder andere Amyloid-Proteine als starke Inhibitoren der Amyloid-Bildung, -Ablagerung, -Ansammlung und/oder Persistenz bei Alzheimer-Krankheit und anderen Amyloidosen zu verwenden.
  • Die oben angeführten Polypeptide können ein natürliches Polypeptid, ein synthetisches Polypeptid oder ein rekombinantes Polypeptid sein. Die Fragmente, Derivate oder Analoga der Polypeptide jedes hierin angeführten Lamininfragments können a) eines sein, bei welchem einer oder mehrere der Aminosäurereste durch einen konservierten oder nicht-konservierten Aminosäurerest substituiert sind, und solche substituierten Aminosäurereste können durch den genetischen Code codiert sein oder auch nicht, oder b) eines sein, bei welchem einer oder mehrere der Aminosäurereste eine Sub stituentengruppe inkludiert, oder c) eines, bei welchem das reife Polypeptid mit einer anderen Verbindung fusioniert ist, wie mit einer Verbindung, die zur Steigerung der Halbwertszeit des Polypeptids verwendet wird (z. B. Polylysin), oder d) eines sein, bei welchem die zusätzlichen Aminosäuren mit dem reifen Polypeptid fusioniert sind, wie eine Leader- oder sekretorische Sequenz oder eine Sequenz, die zur Reinigung des reifen Poylpeptids verwendet wird, oder eine Proprotein-Sequenz. Solche Fragmente, Derivate und Analoga werden als im Rahmen der Erfindung liegend erachtet.
  • Die tertiäre Struktur von Proteinen bezieht sich auf die gesamte 3-dimensionale Architektur einer Polypeptid-Kette. Die Komplexität einer 3-dimensionalen Struktur ergibt sich aus der intrinsischen Fähigkeit einzelner kovalenter Bindungen, gedreht zu werden. Eine Drehung um mehrere solcher Bindungen in einem linearen Molekül wird verschiedene, nicht übereinanderlegbare 3-dimensionale Anordnungen der Atome ergeben, die allgemein als Konformationen beschrieben werden.
  • Die Protein-Konformation ist eine wesentliche Komponente der Protein-Protein-, Protein-Substrat-, Protein-Agonist-, Protein-Antagonist-Wechselwirkungen. Änderungen in den Bauelement-Aminosäuren der Proteinsequenzen können zu Veränderungen führen, die eine geringe oder keine Auswirkung auf die resultierende Protein-Konformation haben. Umgekehrt können Veränderungen in den Peptidsequenzen Auswirkungen auf die Protein-Konformation haben, die zu verringerten oder vermehrten Protein-Protein- usw. Wechselwirkungen führen. Solche Veränderungen und ihre Auswirkungen sind allgemein geoffenbart in Proteins: Structures and Molecular Properties von Thomas Creightonm W. H. Freeman and Company, New York, 1984.
  • „Konformation" und „Konformationsähnlichkeit" bezieht sich bei Verwendung in dieser Beschreibung auf die Fähigkeit eines Polypeptids (oder irgendeines anderen organischen oder anorganischen Moleküls), eine bestimmte Form durch Faltung u. dgl. anzunehmen, so dass die Form oder Konformation des Moleküls zu einem wesentlichen Teil seiner Funktionalität wird, manchmal bis zum Ausschluss seines chemischen Aufbaus. Es ist all gemein bekannt, dass bei biologischen Prozessen zwei konformationsmäßig ähnliche Moleküle im Prozess untereinander austauschbar sein können, selbst die chemisch verschiedenen. „Konformationsmäßige Ähnlichkeit" bezieht sich auf die letztere Austauschbarkeit oder Substituierbarkeit. Beispielsweise gehören Laminin und von Laminin abstammende Proteinfragmente zum Erfindungsgegenstand, weil es sich zeigte, dass sie das Aβ-Protein binden und es in der Fibrillenbildung inaktiv machen; es wird erwogen, dass andere Moleküle, die konformationsmäßig ähnlich Laminin oder irgendeinem beanspruchten Lamininfragment oder -Polypeptid sind, in den beanspruchten Verfahren substituiert werden können, um das Aβ in ähnlicher Weise in der Fibrillogenese und anderen Amyloid-Prozessen inaktiv zu machen. Im Allgemeinen wird in Erwägung gezogen, dass eine Größe einer Konformationsähnlichkeit von 70% oder darüber ausreicht, um eine homologe Funktionalität in den beanspruchten Verfahren anzunehmen, obwohl geringere Größen einer Konformationsähnlichkeit auch so hergestellt werden können, dass sie gleichermaßen dienlich sind. Konformationsmäßig ähnliche Größen von 90% oder darüber sollten ein gewisses Maß an zusätzlicher Homolog-Funktionalität vorsehen.
  • Sc würde der Fachmann sich vorstellen, dass Änderungen an der Laminin-Sequenz oder an Fragmenten oder Polypeptiden davon vorgenommen werden können, die die Bindung von Laminin oder Fragmenten davon an Aβ-Amyloid verstärken, verringern oder unbeeinflusst lassen würden. Außerdem würde sich der Fachmann vorstellen, dass verschiedene posttranslationale Modifikationen, wie Phosphorylierung, Glykosylierung u. dgl., die Bindung von Laminin, Lamininfragmenten oder Laminin-Polypeptiden an Aβ-Amyloid verändern würde.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung inkludieren die hierin beschriebenen Polypeptide oder Fragmente von Laminin, einschließlich – jedoch ohne Einschränkung darauf – SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 und Fragmente davon, sowie Polypeptide, die zumindest 70% Ähnlichkeit (vorzugsweise 70% Identität), und mehr bevorzugt 90% Ähnlichkeit (mehr bevorzugt 90% Identität) mit den oben beschriebenen Polypeptiden aufweisen.
  • Fragmente oder Teile der Polypeptide oder Fragmente von Laminin der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung der entsprechenden Gesamtlängen-Polypeptide mittels Peptid-Synthese verwendet werden; daher können die Fragmente als Zwischenprodukte zur Herstellung der Gesamtlängen-Polypeptide verwendet werden.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können ein natürlich gereinigtes Produkt oder ein Produkt chemisch-synthetischer Verfahren sein oder mittels rekombinanter Techniken aus einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt erzeugt werden (z. B. durch Bakterien-, Hefe-, höhere Pflanzen-, Insekten- und Säuger-Zellen in Kultur). Je nach dem bei einem rekombinanten Verfahren verwendeten Wirt können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glykosyliert oder nicht-glykosyliert sein. Die Polypeptide der Erfindung können auch einen anfänglichen Methionin-Aminosäurerest aufweisen.
  • Die chemische Polypeptid-Synthese ist ein sich rasch entwickelnder Bereich auf dem Gebiet, und Verfahren der Festphasen-Polypeptid-Synthese sind in den folgenden Literaturstellen gut beschrieben (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149–2154, 1963; Merrifield, Science 232: 341–347, 1986; Fields, Int. J. Polypeptide Prot. Res. 35, 161, 1990).
  • Die rekombinante Herstellung von Laminin-Polypeptiden kann gemäß bekannter Verfahrensschritte vorgenommen werden. Zu den Standard-Referenzwerken, die die allgemeinen Prinzipien der rekombinanten DNA-Technologie darlegen, zählen Watson, Molecular Biology of the Gene, Band I und II, Verlag: The Benjamin/Cummings Publishing Company Inc., Menlo Park, Calif. 1987; Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, Verlag: Wiley Interscience, New York, N. Y. 1987; 1992; und Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2. Auflage, Verlag: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 1989.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch als Forschungsreagentien und Materialien zur Entdeckung von Behandlungen und Diagnostika für Humanerkrankungen verwendet werden.
  • Antikörper
  • Antikörper gegen die Polypeptide, die spezifischen Sequenzen entsprechen, welche die Lamininfragmente der vorliegenden Erfindung erkennen, die Aβ oder andere Amyloid-Proteine binden, können durch direkte Injektion der Polypeptide in ein Tier oder durch Verabreichen der Polypeptide an ein Tier, vorzugsweise nicht an einen Menschen, erhalten werden. Der so erhaltene Antikörper bindet dann die Polypeptide selbst. Auf diese Weise kann selbst eine Sequenz, die nur für ein Fragment der Polypeptide codiert, verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die die ganzen nativen Polypeptide binden. Solche Antikörper können dann verwendet werden, um die Polypeptide aus Gewebe zu isolieren, das dieses Polypeptid exprimiert. Zu den bevorzugten Polypeptiden zählen – jedoch ohne Einschränkung darauf – SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 und Fragmente davon, sowie Polypeptide, die mindestens 70% Ähnlichkeit (vorzugsweise 70% Identität) und mehr bevorzugt 90% Ähnlichkeit (mehr bevorzugt, 90% Identität) mit den oben beschriebenen Polypeptiden aufweisen.
  • Der Ausdruck „Antikörper" soll polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, chimäre Antikörper, anti-idiotypische Antikörper zu Antikörpern, die für von Laminin abstammende Proteinfragmente oder Polypeptide der vorliegenden Erfindung spezifisch sind, inkludieren.
  • Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörper-Molekülen, die aus den Seren von mit einem Antigen immunisierten Tieren abstammen.
  • Ein monoklonaler Antikörper enthält eine im Wesentlichen homogene Population von gegen Antigene spezifischen Antikörpern, welche Population im Wesentlichen ähnliche Epitop-Bindungsstellen enthält. Zur Herstellung monoklonaler Antikörper kann jede Technik, die durch kontinuierliche Zelllinien-Kulturen erzeugte Antikörper vorsieht, verwendet werden. Zu den Beispielen zählen die Hybridom-Technik (Köhler und Milstein, Nature 256: 495– 497, 1975), die Triom-Technik, die humane B-Zellen-Hybridom-Technik (Kozbor et al., Immunology Today 4: 72, 1983), und die EBV-Hybridom-Technik zur Erzeugung humaner monoklonaler Antikörper (Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. S. 77–96, 1985). Solche Antikörper können zu jeder Immunglobulin-Klasse gehören, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, GILD und jede Unterklasse davon.
  • Chimäre Antikörper sind Moleküle, von welchen verschiedene Teile von verschiedenen Tier-Spezies stammen, wie jene, die eine von einem monoklonalen Maus-Antikörper stammende variable Region und eine konstante Humanimmunglobulin-Region aufweisen, die vor allem zur Verringerung der Immunogenität bei der Anwendung und zur Erhöhung der Ausbeuten bei der Produktion verwendet werden. Chimäre Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind auf dem Gebiet bekannt (ex. Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273–3277, 1984; Harlow und Lane: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • Ein anti-idiotypischer Antikörper ist ein Antikörper, der einzigartige Determinanten erkennt, die allgemein zur Antikörper-Bindungsstelle eines Antikörpers zugehörig sind. Ein anti-idiotypischer Antikörper kann durch Immunisieren eines Tiers derselben Spezies und desselben genetischen Typs (z. B. Maus-Stamm) als Quelle des monoklonalen Antikörpers mit dem monoklonalen Antikörper, zu welchem ein anti-idiotypischer Antikörper hergestellt wird, erzeugt werden. Das immunisierte Tier erkennt die idiotypischen Determinanten des immunisierenden Antikörpers und reagiert auf diese durch Erzeugen eines Antikörpers zu diesen idiotypischen Determinanten (den anti-idiotypischen Antikörper). Vgl. z. B. U.S. Patent Nr. 4,699,880 .
  • Der Ausdruck „Antikörper" soll sowohl intakte Moleküle als auch deren Fragmente inkludieren, wie z. b. Fab und F(ab')2, die Antigen binden können. Den Fab und F(ab')2-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment des intakten Antikörpers, sie haben eine raschere Clearance aus dem Blutkreislauf und können eine geringere unspezifische Gewebe-Bindung haben als ein intakter Antikörper (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316–325, 1983).
  • Antikörper oder Fragmente von Antikörpern können verwendet wer den, um Laminin oder von Laminin abstammende Fragmente in einer Probe quantitativ oder qualitativ zu detektieren oder um das Vorhandensein von Zellen, die ein Laminin-Polypeptid der vorliegenden Erfindung exprimieren, zu detektieren. Dies kann durch Immunfluoreszenz-Techniken unter Verwendung eines fluoreszierend markierten Antikörpers, gekoppelt mit einer Detektion durch Lichtmikroskopie, Durchfluss-Zytometrie oder Fluorometrie, erreicht werden.
  • Einer der Wege, auf welchem ein Lamininfragment-Antikörper detektierbar markiert werden kann, ist durch Verbinden desselben mit einem Enzym und Verwendung in einem Enzym-Immunoassay (EIA). Wenn es später einem geeigneten Substrat ausgesetzt wird, reagiert dieses Enzym seinerseits mit dem Substrat auf eine Weise, dass ein chemischer Anteil erzeugt wird, der z. B. mittels spektrophotometrischen, fluorimetrischen oder visuellen Mitteln detektiert werden kann. Enzyme, die verwendet werden können, um den Antikörper detektierbar zu markieren, inkludieren – ohne Einschränkung darauf – Malatdehydrogenase, Staphylokokken-Nuklease, Delta-5-Steroid-Isomerase, Hefealkohol-dehydrogenase, Alpha-Glycerophosphatdehydrogenase, Triosephosphat-isomerase, Meerrettich-Peroxidase („horseradish peroxidase"), alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glukoseoxidase, Beta-Galaktosidase, Ribunuklease, Uresse, Catalase, Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glukoamylase und Acetylcholinesterase. Die Detektion kann mittels kolorimetrischer Methoden erfolgen, bei welchen ein chromogenes Substrat für das Enzym verwendet wird. Die Detektion kann auch durch visuellen Vergleich des Ausmaßes der enzymatischen Reaktion eines Substrats mit ähnlich hergestellten Standards erfolgen (vgl. Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1988; Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, N. Y. 1987, 1992).
  • Die Detektion kann unter Verwendung eines aus einer Vielzahl von anderen Immunoassays erfolgen. Beispielsweise ist es mittels Radiomarkierung der Antikörper oder Antikörperfragmente möglich, R-PTPase durch die Verwendung eines Radioimmunoassays (RIA) nachzuweisen. Eine gute Be schreibung des RIA kann man in Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, von Work et al., North Holland Publishing Company, N. Y. (1978) mit besonderer Bezugnahme auf das Kapitel mit dem Titel „An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" von Chard finden. Das radioaktive Isotop kann mit solchen Mitteln wie Verwendung eines Gamma-Zählers, eines Szintillations-Zählers oder mittels Autoradiogaphie detektiert werden.
  • Es ist auch möglich, einen Lamininfragment-Polypeptid-Antikörper mit einer fluoreszierenden Verbindung zu markieren. Wenn ein fluoreszierend markierter Antikörper Licht der richtigen Wellenlänge ausgesetzt wird, kann seine Anwesenheit infolge der Fluoreszenz detektiert werden. Zu den am häufigsten verwendeten Fluroreszenz-Markierungsverbindungen gehören Fluorescein-Isothiocyanat, Rhodamin, Phycoerytrhin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin, im Handel erhältlich z. B. von Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oregon, USA).
  • Der Antikörper kann auch unter Verwendung von Fluoreszenzemittierenden Metallen, wie z. B. 152EU, oder anderen der Lanthanid-Serie detektierbar markiert werden. Diese Metalle können unter Verwendung von Metallgruppen, wie Diethylentriamin-pentaessigsäure (EDTA) am Antikörper befestigt werden.
  • Der Antikörper kann auch detektierbar markiert werden, indem er an eine chemilumineszierende Verbindung gekoppelt wird. Das Vorhandensein des chemilumineszierend-markierten Antikörpers wird dann bestimmt durch Detektion des Vorhandenseins der Lumineszenz, die sich im Laufe einer chemischen Reaktion ergibt. Beispiele für besonders nützliche chemilumineszierende Markierungs-Verbindungen sind Luminol, Isoluminol, der aromatische Acridiniumester, Imidazol, Acridinium-Salz und Oxalatester.
  • Ebenso kann eine biolumineszierende Verbindung verwendet werden, um den Antikörper der vorliegenden Erfindung zu markieren. Die Biolumineszenz ist eine Art Chemilumineszenz, die man in biologischen Systemen findet, in welchen ein katalytisches Protein die Effizienz der Chemilumineszenz-Reaktion erhöht. Das Vorhandensein eines biolumineszierenden Prote ins wird durch Detektion des Vorhandenseins von Lumineszenz bestimmt. Wichtige biolumineszierende Verbindungen für die Zwecke des Markierens sind Luciferin, Luciferase und Aequorin.
  • Die bei der vorliegenden Erfindung nützlichen Antikörper (oder deren Fragmente) können histologisch verwendet werden wie bei einer Immunfluoreszenz- oder Immunelektronen-Mikroskopie zur in situ-Detektion eines Lamininfragments der vorliegenden Erfindung. Die in situ-Detektion kann durch Entnehmen einer histologischen Probe von einem Patienten und Vorsehen des markierten Antikörpers der vorliegenden Erfindung für eine solche Probe erfolgen. Der Antikörper (oder das Fragment) wird vorzugsweise durch Auftragen oder durch Überlagern des markierten Antikörpers (oder Fragments) auf einer biologischen Probe vorgesehen. Durch Verwendung einer solchen Vorgangsweise ist es möglich, nicht nur das Vorhandensein eines Lamininfragment-Polypeptids zu bestimmen, sondern auch dessen Verteilung auf dem untersuchten Gewebe. Der Durchschnittsfachmann wird leicht sehen, dass jede von einer großen Vielfalt histologischer Methoden (wie Färbeverfahren) modifiziert werden kann, um eine solche in situ-Detektion zu erreichen.
  • Antikörper gegen Laminin, Lamininfragmente und/oder von Laminin abstammende Polypeptide können mit Aβ oder mit anderen Amyloid-Proteinen oder Derivaten davon interagieren. Diese Antikörper können für eine Reihe wichtiger diagnostischer und/oder therapeutischer Anwendungen, wie hierin beschrieben, verwendet werden. Gegen Laminin, Lamininfragmente und/oder von Laminin abstammende Polypeptide, die Aβ oder andere Amyloid-Proteine binden, hergestellte polyklonale und/oder monoklonale Antikörper können für die Western Blot-Analyse (unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Standard-Western-Blot-Techniken) verwendet werden, um das Vorhandensein von Amyloid-Protein-bindenden Lamininfragmenten oder Amyloid-Protein-bindenden Laminin-Polypeptiden in Humangeweben und in Geweben anderer Spezies zu detektieren. Die Western-Blot-Analyse kann auch verwendet werden, um die apparente Größe jedes Amyloid-Protein-bindenden Lamininfragments zu bestimmen. Au ßerdem kann Western Blot gefolgt von (dem Fachmann bekannter) Scanning-Densitometrie zur Quantifizierung und zum Vergleichen der Mengen jedes der Lamininfragmente in Gewebeproben, biologischen Flüssigkeiten oder Biopsiematerial von Individuen mit spezifischen Krankheiten (wie den Amyloid-Erkrankungen) im Vergleich zu Gewebeproben, biologischen Flüssigkeiten oder Biopsiematerial von normalen Individuen oder Kontrollen verwendet werden. Zu den biologischen Flüssigkeiten zählen – jedoch ohne Einschränkung darauf – Blut, Plasma, Serum, Zerebrospinalflüssigkeit, Sputum, Speichel, Harn und Stuhl.
  • Gegen Laminin, Lamininfragmente und/oder von Laminin abstammende Peptide, die Aβ oder andere Amyloid-Proteine binden, hergestellte polyklonale und/oder monoklonale Antikörper können für Immunpräzipitations-Studien (unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Standard-Immunpräzipitationstechniken) benützt werden, um Laminin, Lamininfragmente und/oder von Laminin abstammende Peptide, die Aβ oder andere Amyloid-Proteine binden, in Geweben, Zellen und/oder biologischen Flüssigkeiten zu detektieren. Die Verwendung von Laminin-, Lamininfragment- und/oder Laminin-hergeleiteten Peptid-Antikörpern für Immunpräzipitations-Studien kann auch quantifiziert werden, um relative Mengen an Laminin, Lamininfragmenten und/oder von Laminin abstammenden Peptiden, die mit Aβ oder anderen Amyloid-Proteinen interagieren, in Geweben, Zellen und/oder biologischen Flüssigkeiten zu bestimmen. Die quantitative Immunpräzipitation kann verwendet werden, um die Mengen an Laminin, Lamininfragmenten und/oder Laminin-Amyloid-Protein bindenden Peptiden in Gewebeproben, biologischen Flüssigkeiten oder Biopsiematerialien, die von Individuen mit spezifischen Krankheiten (wie den Amyloid-Erkrankungen) erhalten wurden, mit jenen in Gewebeproben, biologischen Flüssigkeiten oder Biopsiematerialien, die von normalen Individuen oder Kontrollen erhalten wurden, zu vergleichen.
  • Die vorliegende Erfindung sieht die Verwendung von Laminin, Lamininfragmenten und/oder von Laminin abstammenden Polypeptiden bei der Herstellung von Medikamenten zur Behandlung einer Amyloid-Erkrankung vor. Die von Laminin abstammenden Peptid-Sequenzen oder Fragmente können unter Verwendung von Standard-Techniken (d. h. unter Verwendung eines automatisierten Synthesizers) synthetisiert werden. Laminin, Lamininfragmente und/oder von Laminin abstammende Polypeptide, die Aβ oder andere Amyloid-Proteine binden, können als potenzielle blockierende Therapeutika zur Interaktion von Laminin bei einer Reihe biologischer Prozesse und Erkrankungen verwendet werden (wie bei den oben beschriebenen Amyloid-Erkrankungen). Spezifische Peptide, die gegen die Aminosäuresequenz von Laminin hergestellt sind, die innerhalb des in der vorliegenden Erfindung beschriebenen ~55kDa Lamininfragments enthalten ist (d. h. globuläre Repeats innerhalb der Laminin A-Kette; SEQ ID NO: 3) können in vitro verwendet werden, um die Inhibierung der Amyloid-Bildung, -Ablagerung, -Ansammlung und/oder -Persistenz zu unterstützen. Anti-idiotypische Antikörper, die gegen Laminin, Lamininfragmente und/oder von Laminin-abstammende Polypeptide (wie oben beschrieben) hergestellt wurden, können einem kranken Menschen als potentielle blockierende Antikörper gegeben werden, um die fortgesetzte Amyloid-Bildung, -Ablagerung, -Ansammlung und/oder -Persistenz bei diesem Patienten zu unterbrechen.
  • Präparate von von Laminin abstammenden Polypeptiden zur parenteralen Verabreichung inkludieren sterile wässerige oder nicht-wässerige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen, die Hilfsmittel oder Exzipienten enthalten können, die auf dem Gebiet bekannt sind. Pharmazeutische Zusammensetzungen, wie Tabletten, Pillen, Kapletten, weiche und harte Gelatine-Kapsein, Pastillen, Sachets, Kachets, Vegicaps, flüssige Tropfen, Elixiere, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirupe, Teebeutel, Aerosole (als festes oder in einem flüssigen Medium), Suppositorien, sterile injizierbare Lösungen, steril verpackte Pulver können gemäß Routine-Verfahren hergestellt werden und sind auf dem Gebiet bekannt.
  • Laminin, Lamininfragmente und/oder von Laminin abstammende Polypeptide können als wirksame Therapie zum Blockieren der Amyloid-Bildung, -Ablagerung, -Ansammlung und/oder -Persistenz verwendet werden, wie sie bei der Amyloid-Erkrankung beobachtet werden. Beispielsweise kann eine pharmazeutische Zusammensetzung bei der Behandlung von Amyloidosen verwendet werden, die eine pharmazeutisch wirksame Menge eines Laminin-, Lamininfragment- und/oder eines Laminin-abgeleiteten Polypeptid-anti-idiotypischen Antikörpers und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist. Die Zusammensetzungen können den Laminin-, Lamininfragment- und/oder Laminin-abgeleiteten Polypeptid-anti-idiotypischen Antikörper entweder unmodifiziert, konjugiert mit einer potentiellen therapeutischen Verbindung, konjugiert mit einem zweiten Protein oder Protein-Teil oder in rekombinanter Form (d. h. chimärer oder bispezifischer Laminin-, Lamininfragment- und/oder Laminin-Polypeptid-Antikörper) enthalten. Die Zusammensetzungen können zusätzlich andere Antikörper oder Konjugate aufweisen. Die Antikörper-Zusammensetzungen können unter Verwendung herkömmlicher Verabreichungsarten verabreicht werden, einschließlich – jedoch ohne Einschränkung darauf – topisch, intravenös, intraarteriell, intraperitoneal, oral intralymphatisch, intramuskulär oder intralumbal. Die intravenöse Verabreichung wird bevorzugt. Die Zusammensetzungen können vielerlei Dosisformen haben, wobei die bevorzugte Form von der Verabreichungsart und der therapeutischen Anwendung abhängt. Die optimale Dosierung und Verabreichungsart für einen individuellen Patienten ist mittels herkömmlicher Protokolle leicht bestimmbar.
  • Laminin, von Laminin abstammende Proteinfragmente und von Laminin abstammende Polypeptide oder Antikörper können mit allen Mitteln, die ihren beabsichtigten Zweck erreichen, verabreicht werden, beispielsweise zur Behandlung von Krankheiten, bei welchen Laminin eine Rolle spielt, wie Alzheimer-Krankheit und andere Amyloid-Erkrankungen, oder von anderen verwandten Krankheiten, wobei ein hierin beschriebenes, von Laminin abstammendes Polypeptid in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet wird.
  • Beispielsweise kann die Verabreichung einer solchen Zusammensetzung auf verschiedenen parenteralen Wegen erfolgen, wie auf subkutanem, intravenösem, intradermalem, intramuskulärem, intraperitonealem, intranasalem, transdermalem oder bukkalem Weg. Alternativ oder gleichzeitig kann die Verabreichung auf oralem Weg erfolgen. Die parenterale Verabreichung kann durch Bolus-Injektion oder durch allmähliche Perfusion über einen Zeitraum erfolgen.
  • Eine bevorzugte Verwendungsweise eines von Laminin abstammenden Polypeptids oder einer pharmazeutischen Antikörper-Zusammensetzung ist die orale Verabreichung oder intravenöse Anwendung.
  • Ein typisches Schema zur Verhinderung, Unterdrückung oder Behandlung von Krankheiten, an welchen Laminin beteiligt ist, wie die Amyloidose der Alzheimer-Krankheit, umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge an von Laminin abstammenden Polypeptiden, die über einen Zeitraum von einem oder mehreren Tagen bis zu und einschließlich zwischen einer Woche und etwa 24 Monaten verabreicht wird.
  • Es sei verstanden, dass die Dosierung der in vivo oder in vitro verabreichten, von Laminin abstammenden Polypeptide vom Alter, Geschlecht, der Gesundheit und dem Gewicht des Empfängers, der Art der gleichzeitigen Behandlung, sofern eine besteht, der Häufigkeit der Behandlung und dem Wesen der gewünschten Wirkung abhängt. Die am meisten bevorzugte Dosierung wird für das einzelne Subjekt maßgeschneidert sein, wie vom Fachmann verstanden und von diesem ohne unzumutbare Versuche bestimmbar ist.
  • Die gesamte, für jede Behandlung benötigte Dosis kann durch mehrfache Dosen oder in einer einzigen Dosis verabreicht werden. Ein von Laminin abstammendes Polypeptid kann alleine verabreicht werden oder in Verbindung mit anderen Therapeutika, die auf Krankheiten gerichtet sind, bei welchen Laminin eine Rolle spielt, wie die Alzheimer-Krankheit oder Amyloid-Erkrankungen, wie hierin beschrieben.
  • Wirksame Mengen eines von Laminin abstammenden Polypeptids oder einer Zusammensetzung, die auch einen von einem Lamininfragment abstammenden Antikörper umfassen kann, sind etwa 0,01 μg bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht, und vorzugsweise von etwa 10 μg bis etwa 50 mg/kg Körpergewicht, wie 0,05, 0,07, 0,09, 0,1, 0,5, 0,7, 0,9, 1, 2, 5, 10, 20, 25, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 oder 100 mg/kg.
  • Präparate zur parenteralen Verabreichung inkludieren sterile wässerige oder nicht-wässerige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen, die Hilfsmittel oder Exzipienten, die auf dem Gebiet bekannt sind, enthalten können. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die mindestens ein von Laminin abstammendes Polypeptid, wie 1–10 oder 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 von Laminin abstammende Polypeptide umfassen, können alle Zusammensetzungen inkludieren, bei welchen das von Laminin abstammende Polypeptid in einer Menge enthalten ist, die wirksam ist, den beabsichtigten Zweck zu erreichen. Zusätzlich zu mindestens einem von Laminin abstammenden Polypeptid kann eine pharmazeutische Zusammensetzung geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger enthalten, wie Exzipienten, Träger und/oder Hilfsmittel, welche die Verarbeitung der aktiven Verbindungen zu Präparaten, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die mindestens ein von Laminin abstammendes Polypeptid oder einen Antikörper enthalten, können auch geeignete Lösungen enthalten für eine intravenöse, subkutane, dermale, orale, mukosale, rektale Verabreichung oder durch Injektion oder oral, und von etwa 0,01 bis 99 Prozent, vorzugsweise etwa 20 bis 75 Prozent aktive Verbindung (z. B. Polypeptid oder Antikörper) zusammen mit dem Exzipienten enthalten. Zu den pharmazeutischen Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung zählen Pillen, Tabletten, Kapletten, weiche und harte Gelatine-Kapseln, Pastillen, Sachets, Kachets, Vegicaps, flüssige Tropfen, Elixiere, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen und Sirupe.
  • Das Laminin, die von Laminin abstammenden Proteinfragmente und die von Laminin abstammenden Polypeptide für Alzheimer-Krankheit und andere Amyloidosen des Zentralnervensystems können otpimiert werden, damit sie die Blut-Hirn-Schranke überqueren. Verfahren zur Einführung inkludieren – ohne auf darauf eingeschränkt zu sein – die systemische Verabreichung, die parenterale Verabreichung, d. h. über einen intraperitonealen, intravenösen, peroralen, subkutanen, intramuskulären, intraarteriellen, intradermalen, intramuskulären, intranasalen, epiduralen und oralen Weg. Laminin, von Laminin abstammende Proteinfragmente und von Laminin ab stammende Polypeptide können durch intraventrikuläre Injektion direkt an die Zerebrospinalflüssigkeit verabreicht werden. Es kann wünschenswert sein, Laminin, von Laminin abstammende Proteinfragmente und von Laminin abstammende Polypeptide lokal an die Fläche oder das Gewebe, welche(s) einer Behandlung bedarf, zu verabreichen; dies kann beispielsweise – jedoch ohne Einschränkung darauf – durch lokale Infusion während der Operation, topische Anwendung, durch Injektion, durch Infusion unter Verwendung einer Kanüle mit osmotischer Pumpe, mittels eines Katheters, mittels eines Zäpfchens oder mittels eines Implantats erreicht werden.
  • Laminin, von Laminin abstammende Proteinfragmente und von Laminin abstammende Polypeptide können in einem System mit gesteuerter Freisetzung, wie einer osmotischen Pumpe, abgegeben werden. Ein System mit gesteuerter Freisetzung kann in der Nähe des therapeutischen Ziel, d. h. des Gehirns, platziert werden, wodurch nur ein Bruchteil der systemischen Dosis erforderlich ist.
  • Peptido-mimetische Verbindungen, die von Laminin, Lamininfragmenten und/oder von von Laminin abstammenden Polypeptiden, welche(s) als Aβ oder andere Amyloid-Proteine bindend identifiziert wurde(n), modelliert wurden, können als starke Inhibitoren der Amyloid-Bildung, -Ablagerung, -Ansammlung und/oder -Persistenz bei der Alzheimer-Krankheit und anderen Amyloidosen dienen. Die peptidomimetische Modellierung wird mittels den Fachleuten bekannten Standardverfahren durchgeführt.
  • Verbindungen, die die 3-dimensionale Aβ-Bindungsstelle an Laminin unter Verwendung der Computer-Modellerstellung nachahmen, können als starke Inhibitoren der Amyloid-Bildung, -Ablagerung, -Ansammlung und/oder -Persistenz bei der Alzheimer-Krankheit und anderen Amyloidosen dienen. Das Entwerfen und die Produktion solcher Verbindungen unter Verwendung der Computer-Modellerstellungstechnologien wird mittels den Fachleuten bekannten Standardverfahren durchgeführt.
  • Die rekombinante DNA-Technologie, einschließlich der humanen Gentherapie, ist für die erfindungsgemäßen Laminin-Proteine und ihre Fragmente direkt anwendbar. Der Fachmann kann die hierin geoffenbarten Peptidse quenzen nehmen und entsprechende Nukleotidsequenzen schaffen, die für die korrespondierenden Peptidsequenzen codieren. Diese Sequenzen können in Vektoren, wie retrovirale Vektoren u. dgl., kloniert werden. Diese Vektoren können wiederum in Humanzellen, wie Hepatozyten oder Fibroblasten u. dgl., transfiziert werden. Solche transfizierte Zellen können in Menschen eingeführt werden, um Amyloid-Erkrankungen zu behandeln. Alternativ können die Gene direkt in die Patienten eingeführt werden. Die grundlegenden Techniken der rekombinanten DNA-Technologie sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und sind in Recombinant DNA Second Edition, Watson, et al., W. H. Freeman and Company, New York, 1992, geoffenbart.
  • Polyklonale und/oder monoklonale Antikörper gegen Laminin, Lamininfragmente und/oder von Laminin abstammende Polypeptide, die Aβ oder andere Amyloid-Proteine binden, könnten verwendet werden, um Laminin, Lamininfragmente und/oder von Laminin abstammende Polypeptide in Humangeweben und/oder biologischen Flüssigkeiten spezifisch nachzuweisen. Polyklonale oder monoklonale Antikörper, die gegen einen Peptid-Teil oder ein Fragment von Laminin erzeugt wurden, können zur Detektion und Quantifizierung von Laminin, Lamininfragmenten und/oder von Laminin abstammenden Polypeptiden in Humangeweben und/oder biologischen Flüssigkeiten verwendet werden. Polyklonale und/oder monoklonale Peptid-Antikörper können auch verwendet werden, um Lamininfragmente und/oder von Laminin abstammende Polypeptide in Humangeweben und/oder biologischen Flüssigkeiten spezifisch nachzuweisen. Ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, der spezifisch bereitgestellt wurde gegen einen Peptidteil oder ein Fragment eines ~55 kDa Elastase-resistenten Proteins, das (wie hierin beschrieben) Aβ bindet, kann zur Detektion und zur Quantifizierung dieses Lamininfragments in Humangeweben und/oder biologischen Flüssigkeiten verwendet werden. Ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, der spezifisch hergestellt wurde gegen einen Peptidteil oder ein Fragment eines von Laminin abstammenden ~130 kDa Proteins, das in humanen biologischen Flüssigkeiten vorhanden ist und (wie hierin beschrieben) Aβ bindet, kann zur Detektion und Quantifizierung dieses Lamininfragments in Humangeweben und/oder biologischen Flüssigkeiten verwendet werden. Man kann auch polyklonale oder monoklonale Antikörper herstellen, die spezifisch erzeugt sind gegen einen Peptidteil oder ein Fragment von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 sowie Polypeptide, die eine zumindest 70% Ähnlichkeit (vorzugsweise 70% Identität), und mehr bevorzugt eine 90% Ähnlichkeit (mehr bevorzugt, eine 90% Identität) mit den oben beschriebenen Polypeptiden aufweisen.
  • Zur Detektion von oben beschriebenen Lamininfragmenten und/oder von Laminin abstammenden Polypeptiden in Humangeweben, Zellen und/oder in einer Zellkultur können die polyklonalen und/oder monoklonalen Antikörper unter Verwendung von immunhistochemischen und immunzytochemischen Standard-Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, benützt werden.
  • Zur Detektion und Quantifizierung von Laminin, Laminin-Fragmenten und/oder von Laminin abstammenden Polypeptiden in biologischen Flüssigkeiten, einschließlich Zerebrospinalflüssigkeit, Blut, Plasma, Serum, Harn, Sputum und/oder Stuhl, können verschiedene Arten von ELISA-Tests verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Ein Antikörper-Molekül kann zur Verwendung in einem immunometrischen Test, der auch als „Zweistellen" („two site")- oder „Sandwich"-Test bekannt ist, angepasst werden. Bei einem typischen immunometrischen Test wird eine Menge des unmarkierten Antikörpers (oder Antikörper-Fragments) an eine feste Auflage oder einen Träger gebunden, und eine Menge an nachweisbarem markiertem löslichem Antikörper wird zugegeben, um eine Detektion und/oder Quantifizierung des ternären Komplexes, der zwischen dem Festphasenantikörper, dem Antigen und dem markierten Antikörper gebildet ist, zu ermöglichen.
  • Eine „Sandwich”-ELISA-Art kann benützt werden. Unter Verwendung dieses Verfahrens, wird zuerst eine Pilot-Untersuchung durchgeführt, um die Menge der Bindung jedes monoklonalen Lamininfragment-Antikörpers an Mikrotitier-Vertiefungen zu bestimmen. Sobald diese bestimmt ist, werden Aliquots (üblicherweise in 40 μl TBS; pH 7,4) des spezifischen Lamininfragment-Antikörpers über Nacht an Mikrotiter-Vertiefungen (Maxisorb C-Platte von Nunc) bei 4°C binden lassen. Eine Reihe von leeren Vertiefungen, die keinen spezifischen monoklonalen Lamininfragment-Antikörper enthalten, werden ebenfalls als Kontrollen verwendet. Am nächsten Tag wird der nicht-gebundene monoklonale Antikörper aus den Mikrotiter-Vertiefungen geschüttelt. Alle Mikrotiter-Vertiefungen (einschließlich der leeren Vertiefungen) werden dann durch zweistündige Inkubation mit 300 μl Tris-gepufferte Kochsalzlösung, enthaltend 0,05% Tween-20 (TTBS) plus 2% Rinderserumalbumin, gefolgt von 5 Spülungen mit TTBS, blockiert. 200 μl Zerebrospinalflüssigkeit, Blut, Plasma, Serum, Harn, Sputum und/oder Stuhl und/oder irgendeine andere Art einer biologischen Probe wird dann in TTBS, enthaltend 2% Rinderserumalbumin, verdünnt (was empirisch festzustellen ist) und dann in Vertiefungen (im Triplikat) platziert, die gebundenen Lamininfragment-Antikörper enthalten (oder leer sind) und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen werden danach 5 Mal mit TTBS gewaschen. Ein zweiter, biotinylierter monoklonaler Antikörper gegen dasselbe von Laminin abstammende Fragment (der aber gegen ein anderes Epitop ist) wird dann in jede Vertiefung zugegeben (üblicherweise in 40 μl TBS; pH 7,4) und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur an jegliches Lamininfragment binden lassen, das vom ersten Antikörper gefangen wurde. Nach der Inkubation werden die Vertiefungen 5 Mal mit TTBS gewaschen. Die gebundenen Materialien werden dann durch einstündige Inkubation mit 100 μl Peroxidase-Avidin-Komplex (1:250 Verdünnung in TTBS mit 0,1% BSA) auf einem Kreisschüttler („rotary shaker") detektiert. Nach 5 Waschungen mit TTBS wird eine Substratlösung (100 μl, OPD-Sigma Fast von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) zugegeben und eine signifikante Farbe entwickeln lassen (üblicherweise 8–10 Minuten). Die Umsetzung wird mit 50 μl 4 N Schwefelsäure gestoppt und auf einem Standard-Spektrophotometer bei 490 nm abgelesen. Dieser ELISA kann zum Bestimmen der Unterschiede in spezifischen Lamininfragmenten (und/oder Aβ-bindenden Lamininfragmente) in biologischen Flüssigkeiten verwendet werden, was als diagnostischer Marker verwendet werden kann, um die Progression an einem lebenden Patienten während der Progression der Krankheit zu verfolgen (d. h. Überwachen einer Amyloid-Erkrankung als Beispiel). Außerdem können auch quantitative Änderungen bei Lamininfragmenten als prognostischer Indikator dienen, wobei überwacht wird, wie ein lebender Patient auf eine Behandlung reagiert, die auf eine bestimmte Amyloid-Erkrankung, wie Alzheimer-Krankheit, abzielt. Solche Tests können in Set-Form vorgesehen werden.
  • Ein Kompetitions-Test kann ebenfalls verwendet werden, wobei Antikörper, die für Laminin, Lamininfragmente und/oder von Laminin abstammende Polypeptide spezifisch sind, an einem festen Träger befestigt werden und markiertes Laminin, Lamininfragmente und/oder von Laminin abstammende Polypeptide und eine von einem Wirt stammende Probe über den festen Träger geleitet werden und die am festen Träger angelagerte detektierte Menge der Markierung mit der Menge des Laminins, der Lamininfragmente und/oder der von Laminin abstammenden Polypeptide in der Probe korreliert werden kann. Diese Standard-Technik ist dem Fachmann bekannt.
  • Laminin, Lamininfragmente und/oder von Laminin abstammende Polypeptide in Verbindung mit Laminin, einem Lamininfragment und/oder von Laminin abstammenden Peptid-Antikörpern können in einem ELISA-Test zur Detektion von potentiellen Laminin-, Lamininfragment- und/oder Laminin-abgeleiteten Peptid-Autoantikörpern in humanen biologischen Flüssigkeiten verwendet werden. Ein solcher diagnostischer Test kann in Set-Form erzeugt werden. Peptide, die die Sequenzen von Laminin, von Laminin abstammenden Fragmenten und von Laminin abstammenden Polypeptiden enthalten, wie in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11, sowie Polypeptide, die zumindest 70% Ähnlichkeit (vorzugsweise 70% Identität), und mehr bevorzugt 90% Ähnlichkeit (mehr bevorzugt 90% Identität) mit den oben beschriebenen Polypeptiden aufweisen, werden verwendet, damit sie anfangs an Mikrotiter-Vertiefungen in einer ELISA-Platte binden. Zuerst wird eine Pilot-Studie durchgeführt, um die Menge der Bindung von jedem Lamininfragment- Polypeptid an Mikrotiter-Vertiefungen zu bestimmen. Sobald dies bestimmt ist, lässt man Aliquots (üblicherweise 1–2 gg in 40 RI von TBS; pH 7,4) spezifischer Lamininfragment-Polypeptide (wie hierin beschrieben) über Nacht an Mikrotiter-Vertiefungen (Maxisorb C-Patte von Nunc) bei 4°C binden. Alle Mikrotiter-Vertiefungen (einschließlich leerer Vertiefungen ohne die Lamininfragment-Polypeptide) werden durch zweistündiges Inkubieren mit 300 μl Tris-gepufferte Kochsalzlösung (pH 7,4) mit 0,05% Tween 20 (TTBS), enthaltend 2% Albumin, blockiert. Darauf folgen 5 Spülungen mit TTBS. Die biologischen Flüssigkeiten der Patienten (d. h. Zerebrospinalflüssigkeit, Blut, Plasma, Serum, Sputum, Harn und/oder Stuhl) werden dann benützt, und 200 μl werden (zur empirischen Bestimmung) mit TTBS, das 2% Rinderserumalbumin enthält, verdünnt und in Mikrotiter-Vertiefungen (im Triplikat), die ein spezifisches Lamininfragment-Polypeptid enthalten, oder in leere Vertiefungen (die kein Peptid enthalten), platziert und 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Jegliche in den biologischen Flüssigkeiten vorhandenen Autoantikörper gegen das Lamininfragment werden an das Substrat-gebundene Lamininfragment-Polypeptid (oder Fragmente davon) binden. Die Vertiefungen werden dann durch fünfmaliges Waschen mit TTBS gespült, 100 μl biotinylierte polyklonale Ziegen-anti-human-IgGs (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA), 1:500 in TTBS mit 0,1% Rinderserumalbumin verdünnt, werden dann in jede Vertiefung aliquot zugegeben. Gebundene Materialien werden durch Inkubieren mit 100 μl Peroxidase-Avidin-Komplex (1:250 Verdünnung in TTBS mit 0,1% Rinderserumalbumin) 1 Stunde lang auf einem Kreisschüttler („rotary shaker") detektiert. Nach 5 Waschungen mit TTBS wird eine Substratlösung (100 μl, OPD-Sigma Fast von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) zugegeben und eine signifikante Farbe entwickeln lassen (üblicherweise 8–10 Minuten). Die Umsetzung wird mit 50 μl 4 N Schwefelsäure, die in jede Vertiefung zugegeben werden, gestoppt und auf einem Standard-Spektrophotometer bei 490 nm abgelesen. Dieses Test-System kann nicht nur zur Detektion des Vorhandenseins von Autoantikörpern gegen Lamininfragmente in biologischen Flüssigkeiten verwendet werden, sondern, auch zur Überwachung der Progression der Krankheit durch Verfolgen der Erhöhung oder Verringerung der Lamininfragment-Autoantikörper-Mengen. Man nimmt an, dass Patienten mit übermäßiger Lamininfragment-Bildung, -Ablagerung, -Ansammlung und/oder -Persistenz, wie man sie bei den Amyloid-Erkrankungen finden kann, auch Autoantikörper gegen die Lamininfragmente in ihren biologischen Flüssigkeiten tragen. Verschiedene ELISA-Testsysteme, die dem Fachmann bekannt sind, können zur genauen Überwachung des Grades der Lamininfragmente in biologischen Körperflüssigkeiten als potentieller diagnostischer Indikator und prognostischer Marker für Patienten während der Progression der Krankheit verwendet werden (d. h. beispielsweise Überwachen einer Amyloid-Erkrankung). Solche Tests können in Set-Form vorgesehen werden. Zusätzlich können quantitative Veränderungen in den Mengen der Lamininfragment-Autoantikörper auch als prognostischer Indikator dienen, der überwacht, wie ein lebender Patient auf eine Behandlung, die auf eine bestimmte Amyloid-Erkrankung abzielt, reagiert.
  • Andere diagnostische Methoden unter Verwendung der Erfindung umfassen diagnostische Tests zur Messung der veränderten Mengen an Laminin, Lamininfragmenten und/oder von Laminin abstammenden Polypeptiden in verschiedenen Geweben im Vergleich zu normalen Kontrollgewebe-Proben. Tests, die zur Detektion der Mengen an Laminin, Lamininfragmenten und/oder von Laminin abstammenden Polypeptiden in einer von einem Wirt stammenden Probe verwendet werden, sind dem Fachmann wohl bekannt und inkludieren Radioimmunoassays, kompetitive Bindungstests, Western Blot-Analyse und vorzugsweise ELISA-Tests (wie oben beschrieben).
  • Antikörper, die Laminin, Lamininfragmente und/oder von Laminin abstammende Polypeptide erkennen, können für Markierungen verwendet werden, z. B. mit einem Radionukleotid, für Radioimaging oder sondengesteuerte Chirurgie („radioguided surgery") zur in vivo-Diagnose und/oder zur in vitro-Diagnose. Radioaktiv markierte Peptide oder Antikörper die (vom Fachmann) gegen Laminin, Lamininfragmente und/oder von Laminin abstammende Polypeptide hergestellt wurden, können als minimal-invasive Techniken verwendet werden, um Laminin, Lamininfragmente und/oder von Laminin abstammende Polypeptide und gleichzeitig Amyloid-Ablagerungen in einem lebenden Patienten zu finden. Diese selben Bildgebungstechniken könnten dann in regelmäßigen Abständen (d. h. alle 6 Monate) verwendet werden, um die Progression der Amyloid-Erkrankung durch Verfolgen der spezifischen Mengen an Laminin, Lamininfragmenten und/oder von Laminin abstammenden Polypeptiden zu überwachen.
  • Ein Verfahren, mit welchem die Fähigkeit einer Verbindung bewertet werden kann, die Affinität eines gegebenen Aymloidproteins (wie hierin beschrieben) oder Amyloid-Vorläufer-Proteins, zu Laminin, von Laminin abstammenden Fragmenten oder von Laminin abstammenden Polypeptiden zu ändern (zu verringern oder zu eliminieren), kann entworfen werden. Durch Vorsehen eines Verfahrens zum Identifizieren von Verbindungen, die die Bindung von Amyloidproteinen oder Amyloid-Vorläufer-Proteinen an solche von Laminin abstammende Fragmente beeinflussen, können Verbindungen identifiziert werden, die eine solche Bindungsinteraktion verhindern oder beeinträchtigen können. Somit können Verbindungen identifiziert werden, die ein mit der Amyloidbildungs-, Amyloidablagerungs- und/oder Amyloidpersistenz-Bedingung, welche mit der Alzheimer-Krankheit und mit anderen Amyloid-Erkrankungen verbundenes Ereignis, wie hierin beschriebenen, spezifisch beeinflussen.
  • Um Verbindungen, welche die Interaktion von Amyloidproteinen oder – Vorläufer-Proteinen mit von Laminin abstammenden Fragmenten oder Lamininpolypeptiden ermöglichen, zu identifizieren, werden entweder Amyloid oder Lamininfragmente immobilisiert, und das andere von den beiden wird als freie Entität beibehalten. Die freie Entität wird mit der immobilisierten Entität in Anwesenheit einer Testverbindung für eine Zeitdauer kontaktiert, die ausreicht, um eine Bindung der freien Entität an die immobilisierte Entität zu ermöglichen, wonach die ungebunden freie Entität entfernt wird. Unter Verwendung von Antikörpern, die die freie Entität erkennen, oder anderer Mittel zur Detektion des Vorhandenseins von gebundenen Komponenten kann die Menge der freien Entität, die an die immobilisierte Entität gebunden ist, gemessen werden. Durch Durchführung dieses Tests in Anwesenheit einer Reihe bekannter Konzentrationen einer Testverbindung und, als Kontrolle, des vollständigen Fehlens der Testverbindung kann die Wirksamkeit der Testverbindung, eine Bindung der freien entität an die immobilisierte Entität zu ermöglichen bestimmt werden und kann eine quantitative Bestimmung der Wirkung der Testverbindung auf die Affinität der freien Entität zur immobilisierten Entität vorgenommen werden. Durch Vergleichen der Bindungsaffinität des Amyloid-Lamininfragment-Komplexes in Anwesenheit einer Testverbindung mit der Bindungsaffinität des Amyloid-Lamininfragment-Komplexes in Abwesenheit einer Testver-bindung kann die Fähigkeit der Testverbindung, die Bindung zu modulieren, bestimmt werden.
  • In dem Fall, in welchem das Amyloid immobilisiert ist, wird es mit freien, von Laminin abstammenden Fragmenten oder Polypeptiden in Anwesenheit einer Reihe von Konzentrationen der Testverbindung kontaktiert. Als Kontrolle wird immobilisiertes Amyloid mit freien, von Laminin abstammenden Polypeptiden oder Fragmenten davon in Abwesenheit der Testverbindung kontaktiert. Unter Verwendung einer Reihe von Konzentrationen der von Laminin abstammenden Polypeptide können die Dissoziationskonstante (Kd) oder andere Indikatoren der Bindungsaffinität der Amyloid-Lamininfragment-Bindung bestimmt werden. Im Test werden, nachdem die von Laminin abstammenden Polypeptide oder deren Fragmente genügend lange in Kontakt mit dem immobilisierten Amyloid gebracht worden sind, um eine Bindung zu ermöglichen, die ungebundenen Laminin-Polypeptide entfernt. Danach kann die Menge der Lamininfragment-Amyloid-Bindung beobachtet werden. Bei einem Verfahren werden von Laminin abstammende Fragment-Antikörper verwendet, um die Menge der spezifischen Lamininfragmente, die an das Amyloid gebunden sind, oder die Menge der freien Lamininfragmente, die in Lösung bleiben, zu detektieren. Diese Information wird benützt, um zuerst qualitativ zu bestimmen, ob die Testverbindung eine fortgesetzte Bindung zwischen von Laminin abstammenden Fragmenten und Amyloid ermöglichen kann oder nicht. Zweitens können die Daten von unter Verwendung einer Reihe von Testverbindungen bei verschiedenen Konzent rationen durchgeführten Tests verwendet werden, um die Bindungsaffinität des Lamininfragment-Amyloid-Komplexes quantitativ zu messen und dadurch die Wirkung der Testverbindung auf die Affinität zwischen Lamininfragmenten und Amyloid zu bestimmen. Unter Verwendung dieser Informationen können Verbindungen identifiziert werden, die die Bindung von spezifischem Laminin an Amyloid nicht modulieren und es dadurch den Lamininfragmenten ermöglichen, die Amyloid-Bildung, -Ablagerung, -Ansammlung und/oder -Persistenz und die nachfolgende Entstehung und Persistenz einer Amyloidose zu verringern.
  • Daher würde ein Set zur Ausübung des Verfahrens zum Identifizieren geeigneter Verbindungen, die Laminin, von Laminin abstammende Fragmente oder von Laminin abstammende Polypeptide, welche an immobilisiertes Amyloidprotein binden, nicht verändern, umfassen: a) einen ersten Behälter, der Amyloidprotein an seiner Innenfläche immobilisiert hat, b) einen zweiten Behälter, der Laminin, von Laminin abstammende Fragmente oder von Laminin abstammende Polypeptide in einer Lösung aufgelöst enthält, c) einen dritten Behälter, der Antikörper enthält, die für das Laminin, die von Laminin abstammenden Fragmente oder von Laminin abstammenden Polypeptide spezifisch sind, wobei diese Antikörper in einer Lösung gelöst sind, und d) einen vierten Behälter, der markierte Antikörper enthält, die für Laminin, von Laminin abstammende Fragmente oder von Laminin abstammende Polypeptide spezifisch sind, wobei diese Antikörper in einer Lösung gelöst sind.
  • Beispiele
  • Die folgenden Beispiele sind vorgesehen, um bevorzugte Ausführungsformen der Bindungsinteraktion von Laminin mit Aβ und die starken inhibitorischen Wirkungen von Laminin und geoffenbarten Fragmenten auf die Aβ-Fibrillenbildung in Detail zu offenbaren. Es sollte jedoch nicht so ausgelegt werden, dass die Erfindung auf diese spezifischen Beispiele eingeschränkt ist.
  • Beispiel 1
  • Bindung von Laminin an das Beta-Amyloid-Protein (Aβ) der Alzheimer-Krankheit
  • 2 μg von Aβ(1-40) (Bachem Inc., Torrance, CA USA; Lot #WM365) in 40 μl Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) (pH 7,0) wurde über Nacht bei 4°C an Mikrotiter-Vertiefungen (Nunc-Platten, Maxisorb) binden lassen. Am nächsten Tag wurden alle Mikrotiter-Vertiefungen durch Inkubieren mit 300 μl Tris-gepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 100 nM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0,05% Tween-20 und 3 mM NaN3 (pH 7,4) (TTBS) plus 2% Rinderserumalbumin (BSA), blockiert. Verschiedene Verdünnungen (d. h. 1:10, 1:30, 1:90, 1:270, 1:810, 1:2430 und 1:7290) von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maus-Tumor-Laminin (1 mg/ml) (Sigma Chemical Col, St. Louis, MO, USA) in 250 μl TBS (pH 7,4) wurden in Vertiefungen (im Triplikat) gegeben, die entweder Substrat-gebundenes Aβ(1-40) enthielten oder leer waren, und über Nacht bei 4°C binden lassen. Am nächsten Tag wurden die Vertiefungen dreimal mit TTBS gespült und danach 2 Stunden lang mit 100 μl Kaninchen-anti-Laminin-Antikörper (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), 1:10.000 in TTBS verdünnt, untersucht. Nach drei Spülungen mit TTBS wurden die Vertiefungen dann 2 Stunden lang auf einem Kreisschüttler mit 100 μl Sekundärsonde, bestehend aus biotinylierter Ziegen-anti-Kaninchen (1:1000) und Streptadivin-Peroxidase (1:500 Verdünnung einer 2 μg/ml Lösung) in TTBS, enthaltend 0,1% BSA, inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit TTBS gespült, und 100 μl einer Substratlösung (OPD-Sigma Fast von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurden in jede Vertiefung zugegeben und 10 Minuten lang oder bis zur Beobachtung signifikanter Farbunterschiede entwickeln lassen. Die Umsetzung wurde mit 50 μl 4 N H2SO4 gestoppt und auf einem Modell 450-Mikroplatten-Ablesegerät (Biorad, Hercules, CA USA) bei 490 nm abgelesen. Datenpunkte, die ein Mittel von Triplikat-Bestimmungen repräsentieren, wurden aufgetragen, und die Affinitätskonstanten (d. h. Kd) wurden unter Verwendung von Ultrafit (Version 2.1, Biosoft, Cambridge, U. K.) wie nachstehend beschrieben, bestimmt.
  • Die Bindungsdaten wurden unter Annahme eines thermodynamischen Gleichgewichts für die Bildung des Komplexes BL aus dem Laminin-Liganden in Lösung, L, und dem nicht-komplexierten Aβ, das an der Mikrotiter-Vertiefung adsorbiert war, B, gemäß der Gleichung Kd = [B] × [L]/[BL]analysiert. Es wurde die Wahl getroffen, die Kd's unter Verwendung eines Enzyme-linke Immunoassays zu bestimmen, was ein Farbsignal ergibt, das zur Menge des nicht-modifizierten, an Aβ gebundenen Laminins proportional ist (Engel, J. und Schalch, W., Mol. Immunol. 17: 675–680, 1980; Mann, K. et al., Eur. J. Biochem. 178: 71–80, 1988, Fox, J. W. et al., EMBO J. 10: 3137–3146, 1991; Battaglia, C. et al., Eur. J. Biochem. 208: 359–366, 1992)
  • Um der potentiellen unspezifischen Bindung Rechnung zu tragen, wurden Kontroll-Vertiefungen ohne Aβ (in Triplikat) für jede Laminin-Konzentration, die bei jedem Bindungsversuch verwendet wurde, inkludiert. Die optischen Dichten der Kontroll-Vertiefungen gingen bei allen für diese Versuche verwendeten Laminin-Konzentrationen nie über 0,050 hinaus. Die optischen Dichten der Kontroll-Vertiefungen wurden von den optischen Dichten der Aβ enthaltenden Vertiefungen, die ähnliche Laminin-Konzentrationen erhielten, abgezogen. Unspezifische Absorption, die von Aβ-hältigen Vertiefungen erhalten wurde, die kein Laminin erhielten, wurde ebenfalls von allen Daten-Punkten subtrahiert. Somit wird die Gleichung in der Form von: ODexp = ODo + (S × [Laminin]) + (ODmax × [Laminin]/([Laminin] + Kd,worin (S × [Laminin]) die unspezifische Bindung (Kontroll-Vertiefungen) darstellt und ODo die unspezifische Absorption ist, zu ODexp = ODmax × [Laminin]/([Laminin] + Kd).
  • Daher ist bei 50% Sättigung ODexp = 0,50 ODmax und Kd = [Laminin]. Die Bestimmung von [Laminin] bei 50% Sättigung erfolgte durch das nicht-lineare Least Square-Programm (Ultrafit von Biosoft, UK) unter Verwendung eines one-site-Modells.
  • Wie in 1 dargelegt, band EHS-Laminin immobilisiertes Aβ(1-40) mit einer einzigen Bindungskonstante mit einer apparenten Dissoziationskonstante von Kd = 2,7 × 10–9 M. Mehrere wiederholte Versuche unter Verwendung dieses Festphasen-Bindungstests wiesen darauf hin, dass Laminin Aβ(1-40) wiederholt mit einer apparenten Bindungskonstante band.
  • Beispiel 2
  • Inhibierung der Aβ-Fibrillenbildung der Alzheimer-Krankheit durch Laminin
  • Die Auswirkungen von Laminin auf die Aβ-Fibrillogenese wurde unter Verwendung des früher beschriebenen Verfahrens der Thioflavin T-Fluorometrie (Naiki et al, Lab. Invest. 65: 104–110, 1991; Levine III; Protein Sci. 2: 404–410; 1993; Levine III, Int. J. Exp. Clin. Invest. 2: 1–6, 1995; Naiki und Nakakuki, Lab. Invest. 74: 374–383, 1996) bestimmt. Bei diesem Test bindet Thioflavin T spezifisch an fibrilläres Amyloid, und diese Bindung erzeugt eine Fluoreszenz-Verstärkung bei 480 nm, die zur Menge der gebildeten Amyloid-Fibrillen direkt proportional ist (Naiki et al., Lab. Invest. 65: 104–110, 1991; Levine III, Protein Sci. 2: 404–410, 1993; Levine III, Int. J. Exp. Clin. Invest. 2: 1–6, 1995; Naiki und Nakakuki, Lab. Invest. 74: 374–383, 1996). In einer ersten Studie wurden die Auswirkungen von EHS-Laminin auf die Aβ(1-40)-Fibrillogenese bewertet. Für diese Studie wurden 25 μM frisch solubilisiertes Aβ(1-40) (Bachem Inc., Torrance, CA, USA; Lot#WM365) in Mikrozentrifugenröhrchen bei 37°C 1 Woche lang (in Triplikat) entweder alleine oder in Gegenwart von 100 nM EHS-Laminin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) in 100 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7,0 (TBS) inkubiert. 100 nM Laminin, das für diese Studien verwendet worden war, stellte ein Aβ:Laminin-Mol-Verhältnis von 250:1 dar. 50 μl Aliquots wurden dann aus jedem Röhrchen zwecks Analyse zum Zeitpunkt 1 h, 1 Tag, 3 Tage und 1 Woche entnommen. In einem zweiten Satz von Studien wurden die Auswirkungen von Laminin auf die Aβ(1-40)-Fibrillenbildung mit anderen Basalmembran-Komponenten, einschließlich Fibronectin, Typ IV-Kollagen und Perlecan direkt verglichen. Für diese Studien wurden 25 μM frisch solubilisiertes Aβ(1-40) in Mikrozentrifugenröhrchen 1 Woche lang (in Triplikat) entweder alleine oder in Gegenwart von 100 nM EHS Perlecan (das wie früher beschrieben isoliert worden war)(Castillo et al., J. Biochem. 120: 433–444, 1996), Fibronectin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) oder Typ IV-Kollagen (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) inkubiert. 50 μl Aliquots wurden dann zum Zeitpunkt 1 Stunde, 1 Tag, 3 Tage und 1 Woche zur Analyse entnommen. In einem dritten Satz von Studien wurden 25 μM frisch solubilisiertes Aβ(1-40) in Mikrozentrifugenröhrchen 1 Woche lang (in Triplikat) entweder alleine oder in Anwesenheit von zunehmenden Laminin-Konzentratio-nen (d. h. 5 nM, 15 nM, 40 nM und 100 nM) inkubiert. 50 μl Aliquots wurden zum Zeitpunkt 1 Stunde, 1 Tag, 3 Tage und 1 Woche zur Analyse entnommen.
  • Für jede oben beschriebene Bestimmung wurden nach jedem Inkubationszeitraum Aβ-Peptide +/– Laminin, Perlecan, Fibronectin oder Typ IV-Kollagen zu 1,2 ml von 100 μM Thioflavin T (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 50 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0) zugegeben. Die Fluoreszenz-Emission bei 480 nm wurde auf einem Turner-Instrument-Modell 450-Fluorometer bei einer Anregungswellenlänge von 450 nm gemessen. Für jede Bestimmung wurde das Fluorometer durch Nullstellen in Anwesenheit von Thioflavin T-Reagens allein kalibriert und indem das 50 ng/ml Riboflavin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) im Thioflavin T-Reagens auf 1800 Fluorezenz-Einheiten eingestellt wurde. Alle Fluoreszenz-Bestimmungen basierten auf diesen Referenzen und jegliche durch Laminin, Perlecan, Typ IV-Kollagen oder Fibronectin alleine in Anwesenheit des Thioflavin T-Reagens abgegebene Hintergrund-Fluoreszenz wurde immer von allen relevanten Ablesungen abgezogen.
  • Wie in 2 gezeigt, wies frisch suspendiertes Aβ(1-40) alleine nach einer einstündigen Inkubation bei 37°C eine anfängliche Fluoreszenz von 41 Fluoreszenz-Einheiten auf. Während der einwöchigen Inkubationszeit gab es ein allmähliches Ansteigen der Fluoreszenz von 25 μM Aβ(1-40) alleine, das von 1 Stunde bis zu 1 Woche um das 6,7-Fache anstieg, mit einer Peak-Fluoreszenz von 379 Fluoreszenz-Einheiten, die zum Zeitpunkt 1 Woche beobachtet wurden. Die Steigerung war im Vergleich zu Aβ alleine signifikant gehemmt, wenn Aβ(1-40) mit Laminin ko-inkubiert wurde. Aβ(1-40), das mit Laminin ko-inkubiert wurde, wies Fluoreszenz-Werte auf, die um das 2,9-Fache niederiger waren (p < 0,001) zum Zeitpunkt 1 Stunde, um das 4,6-Fache niedriger waren (p < 0,001) zum Zeitpunkt 1 Tag, um das 30,6-Fache niedriger waren (p < 0,001) zum Zeitpunkt 3 Tage und um das 27,1-Fache niedriger waren (p < 0,001) zum Zeitpunkt 1 Woche. Diese Studie wies darauf hin, dass Laminin ein starker Inhibitor der Aβ-Amyloid-Fibrillenbildung war und selbst nach einwöchiger Inkbuation die Amyloid-Fibrillenbildung fast vollständig inhibierte.
  • Um festzustellen, ob die inhibitorische Wirkung von Laminin für diese Basalmembran-Komponente spezifisch ist, wurde ein direkter Vergleich mit anderen Basalmembran-Komponenten, einschließlich Perlecan, Fibronectin und Typ IV-Kollagen vorgenommen. Bei diesen Studien wurden 25 μM Aβ(1-40) in Abwesenheit oder Anwesenheit von entweder 100 nM Laminin, 100 nM Fibronectin, 100 nM Typ IV-Kollagen und 100 nM Perlecan (3) inkubiert. Wenn es bei 37°C inkubiert wurde, nahmen bei frisch solubilisiertem Aβ(1-40) die Fluoreszenz-Höhen allmählich von 1 Stunde bis zu 1 Woche zu (um das 10,8-Fache)(3), wie zuvor gezeigt (2). Es zeigte sich, dass Perlecan die Aβ(1-40)-Amyloidbildung zum Zeitpunkt 1 Tag und 3 Tage stark beschleunigte, wogegen Fibronectin und Typ IV-Kollagen nur eine signifikante Inhibition der Aβ(1-40)-Fibrillogenese nur zum Zeitpunkt 1 Woche zeigten. Laminin anderseits erwies sich wiederum als ein sehr starker Inhibitor der Aβ-Fibrillogenese, wobei es zum Zeitpunkt 1 Tag und 3 Tage eine 9-fache Verringerung und zum Zeitpunkt 1 Woche eine 21-fache Verringerung bewirkte. Diese Studie bestätigte erneut die starken inhibitorischen Wirkungen von Laminin auf die Aβ-Fibrillogenese und bewies die Spezifität dieser Inhibierung, da keine der anderen Basalmembran-Komponenten (einschließlich Fibronectin, Typ IV-Kollagen und Perlecan) sehr wirksame Inhibitoren waren.
  • Um zu bestimmen, ob die inhibitorischen Wirkungen von Laminin auf die Aβ-Fibrillogenese auf Dosis-abhängige Weise stattfand, wurden verschiedene Konzentrationen von Laminin (d. h. 5 nM, 15 nM, 40 nM und 100 nM) getestet. Wie in 4 gezeigt, nahm frisch solubilisiertes Aβ (1- 40), wenn es bei 37°C inkubiert wurde, allmählich von 1 Stunde bis zu 1 Woche zu, wie zuvor gezeigt (2 und 3). 100 nM Laminin inhibierte die Aβ-Fibrillenbildung zu allen untersuchten Zeitpunkten, einschließlich 1 Stunde, 1 Tag, 3 Tage und 7 Tage, signifikant. Es zeigte sich auch, dass Laminin die Aβ-Fibrillenbildung auf Dosis-abhängige Weise inhibierte, was signifikant (p < 0,05) zum Zeitpunkt 3 Tage Inkubation war. Zu den Zeitpunkten 3 Tage und 7 Tage inhibierten sowohl 100 nM als auch 40 nM Laminin signifikant die Aβ-Fibrillenbildung. Diese Studie bestätigte erneut, dass Laminin ein starker Inhibitor der Aβ-Fibrillenbildung ist und dass diese Inhibition auf Dosis-abhängige Weise stattfindet.
  • Beispiel 3
  • Laminin bewirkt eine Dosis-abhängige Auflösung von vorgeformten Amyloid-Fibrillen der Alzheimer-Krankheit
  • Die nächste Studie wurde durchgeführt, um festzustellen, ob Laminin eine Dosis-abhängige Auflösung von vorgeformten Aβ(1-40)-Amyloid-Fibrillen der Alzheimer-Krankheit bewirken kann. Diese Art von Aktivität wäre wichtig für jedes potentielle Medikament gegen Alzheimer-Amyloid, das bei Patienten verwendet werden kann, die bereits eine wesentliche Amyloid-Ablagerung im Gehirn haben. Beispielsweise weisen Alzheimer-Patienten im mittleren bis späten Krankheitsstadium reichliche Amyloid-Ablagerungen in ihrem Gehirn, sowohl als Teil neuritischer Plaques als auch zerebrovaskulärer Amyloid-Ablagerungen. Ein Therapeutikum, das die Auflösung von zuvor bestehendem Amyloid bewirken kann, wäre zur Verwendung bei diesen Patienten, die sich in späteren Stadien des Krankheitsprozesses befinden, vorteilhaft.
  • Für diese Studie wurde 1 mg Aβ(1-40) (Bachem Inc., Torrance, CA, USA; Lot #WM365) in 1,0 ml doppelt destilliertem Wasser (1 mg/ml Lösung) gelöst und danach bei 37°C 1 Woche lang inkubiert. 25 μM fibrilliertes Aβ wurde dann bei 37°C in Anwsenheit oder Abwesenheit von Laminin (von EHS-Tumor; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) in Konzentrationen von 125 nM, 63 nM, 31 nM und 16 nM, enthaltend 150 mM Tris HCl, 10 mM NaCl, pH 7,0, inkubiert. Nach einer viertägigen Inkubation wurden 50 μl Aliquots zu 1,2 ml von 100 μM Thioflavin T (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 50 mM NaPO4 (pH 6,0) für Fluorometrie-Ablesungen, wie in Beispiel 2 beschrieben, zugegeben.
  • Wie in 5 gezeigt, fand die Auflösung vorgeformter Aβ-Amyloid-Fibrillen der Alzheimer-Krankheit durch Laminin auf Dosis-abhängige Weise statt. Eine signifikante (p < 0,001) 41% Auflösung vorgeformter Aβ-Amyloidfibrillen wurde mit 125 nM Laminin beobachtet, wogegen 63 nM Laminin eine signifikante (p < 0,001) 39% Auflösung bewirkte. Weiters bewirkten 31 nM und 16 nM Laminin noch immer eine signifikante (p < 0,01) 28% und 25% Auflösung vorgeformter Aβ-Amyloid-Fibrillen. Diese Daten zeigten, dass Laminin eine Auflösung vorgeformter Amyloid-Fibrillen der Alzheimer-Krankheit auf Dosis-abhängige Weise nach einer viertägigen Inkubation bewirkt.
  • Beispiel 4
  • Laminin inhibiert die Insel-Amyloid-Polypeptid(Amylin)-Fibrillenbildung nicht signifikant
  • In der nächsten Studie wurde die Spezifität der inhibitorischen Wirkungen von Laminin auf das Amyloid der Alzheimer-Krankheit bestimmt, indem die potentiellen Auswirkungen von Laminin auf einen anderen Amyloid-Typ getestet wurden. Eine Amyloid-Ansammlung erfolgt in den Inseln von Langerhans bei ~90% der Patienten mit Typ II-Diabetes (Westermark et al., Am. J. Path. 127: 414–417, 1987). Das Hauptprotein bei Insel-Amyloid ist ein 37 Aminosäuren-Peptid, Insel-Amyloid-Polypeptid oder Amylin genannt, von dem bekannt ist, dass es ein normales sekretorisches Produkt der Beta-Zellen der Pankreas ist (Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 8628–8632, 1987). Die Dosis-abhängigen Auswirkungen von Laminin auf die Amylin-Fibrillogenese wurden unter Verwendung des Thioflavin T-Fluorometrie-Tests bestimmt. 25 μM von Aβ(1-40) (Bachem Inc., Torrance, CA, USA; Lot #Wm365) wurden in Mikrozentrifugenröhrchen bei 37°C 1 Woche lang (im Triplikat) entweder alleine oder in Anwesenheit von 5 nM, 15 nM, 40 nM und 100 nM Laminin in 150 mM Tris HCl, 10 mM NaCl, pH 7,0 (TBS) inkubiert. 50 μl Aliquots wurden aus jedem Röhrchen zur Analyse zum Zeitpunkt 1 Stunde, 1 Tag, 3 Tage und 1 Woche entnommen, wobei die Thioflavin T-Fluorometrie verwendet wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben.
  • Wie in 6 gezeigt erreichte frisch suspendiertes Amylin alleine nach einer einstündigen Inkubation bei 37°C eine maximale Fluoreszenz von 1800 Fluoreszenz-Einheiten, was sich während des einwöchigen Versuchszeitraums nicht signifikant änderte. Die anfängliche starke Fluoreszenz von Amylin wurde der Fähigkeit von Amylin zugeschrieben, innerhalb einer sehr kurzen Inkubationszeit spontan Amyloidfibrillen zu bilden. Laminin mit 100 nM inhibierte die Amylin-Fibrillenbildung zu allen Zeitpunkten innerhalb des einwöchigen Versuchszeitraums nicht signifikant (6). Außerdem wurde keine signifikante Inhibierung der Amylin-Fibrillogenese durch Laminin bei abnehmenden Konzentrationen (d. h. 40 nM, 15 nM und 5 nM) beobachtet, obwohl eine Verringerung (jedoch keine signifikante) in der Amylin-Fibrillenbildung bei 40 nM Laminin zum Zeitpunkt 1 Tag, 3 Tage und 1 Woche beobachtet wurde (6). Diese Studie zeigte, dass die inhibitorischen Auswirkungen von Laminin bei der Amylin-Fibrillenbildung nicht auftraten, und bewiesen die Spezifität der beobachteten inhibitorischen Wirkungen von Laminin auf das Amyloid der Alzheimer-Krankheit.
  • Beispiel 5
  • Identifizierung von V8 und Trypsin-resistenten Lamininfragmenten, die mit dem Beta-Amyloid-Protein der Alzheimer-Krankheit interagieren
  • Im nächsten Satz von Studien wurde bestimmt, ob (ein) kleine(s) Fragment(e) von Laminin, das durch V8 oder Trypsin-Verdau erzeugt worden war, an Aβ binden würde. Dies würde es ermöglichen, die Domäne(n) von Laminin zu bestimmen, die Aβ binden und vermutlich eine Rolle bei der Inhibierung der Aβ-Fibrillenbildung spielen und die Auflösung vorgeformter Amyloid-Fibrillen der Alzheimer-Krankheit bewirken (wie in der Erfindung gezeigt).
  • Für diese Versuche wurde Aβ(1-40) gemäß dem Protokoll des Herstellers (Pierce, Rockford, Illinois) biotinyliert. Für die Liganden-Studien wurden intaktes EHS-Laminin unverdaut gelassen oder mit V8 oder Trypsin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) verdaut. Insbesondere wurden 2 μg Trypsin oder V8-Protease in 2 μl von 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) zu 50 μl Laminin (50 μg) (im selben Puffer) zugegeben und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden 10 μl des mit Protease verdauten Laminin (oder unverdautes Laminin) mit 10 μl von 2 × Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE)-Probenpuffer gemischt und 5 Minuten lang in einem kochenden Wasserbad erhitzt. SDS-PAGE wurde gemäß dem Verfahren von Laemmli (Laemmli, U. K. Nature 227: 680–685, 1970) oder gemäß dem Verfahren von Schägger und Jagow (Schägger und Jagow, Anal. Biochem. 166: 368–379; 1987) unter Verwendung eines Mini-Protean II-Elektrophorese-Systems (Biorad) mit vorgegossenen 4–15% Tris-Glycin- bzw. 10–20% Tricin-Polyacrylamid-Gelen und unter nicht-reduzierenden Bedingungen durchgeführt. Die Elektrophorese erfolgte bei 200 V 45 Minuten lang zusammen mit vorgefärbten Molekulargewicht-Standards.
  • Nachdem SDS-PAGE (10–20% Tricin- oder 4–15% Tris-Glycin-Gele) wie oben beschrieben durchgeführt worden war, wurden das getrennte Laminin und seine Fragmente (Gesamtprotein von 10 μg/Bahn) auf eine Polyvinylidin-Difluorid-Membran (PVDF) unter Verwendung einer Mini-Transblot-Elektrophorese-Transferzelle (Biorad, Hercules, CA, USA) transferiert. Der Elektrotransfer wurde bei 100 V 2 Stunden lang vorgenommen. Nach dem Transfer wurden die Membranen mit Methanol gespült und getrocknet. Das (die) Fragment(e) von Laminin, die an der Bindung an Aβ beteiligt waren, wurden dann unter Verwendung von biotinyliertem Aβ(1-40), wie oben beschrieben, detektiert. Die Blots wurden 2 Stunden lang mit 2 μM biotinyliertem Aβ(1-40) in TTBS untersucht. Die Membranen wurden danach dreimal (je 10 Sekunden) mit TTBS gespült, 30 Minuten lang mit Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat (Vectastain) untersucht, wiederum gespült (wie oben beschrieben) und verfolgt durch die Zugabe einer alkalischen Phosphatase-Substrat-Lösung (Vectastain). Nach der Farbentwicklung wurde die Umsetzung durch Spülen der Membranen mit doppelt destilliertem Wasser gestoppt.
  • Wie in 7 gezeigt, erzeugte das mit V8 verdaute Laminin mehrere Proteinfragmente, die mit biotinyliertem Aβ(1-40) interagierten. Bei Verwendung eines 4–15% Tris-Glycin-Gel-Systems (7, Bahn 1) inkludierten die V8-resistenten Lamininfragmente, die mit Aβ interagierten, Fragmente von ~400 kDa (welche vermutlich intaktes Laminin darstellten, das unverdaut geblieben war), ~100–130 kDa, ~85 kDa und ein markantes Fragment bei ~55 kDa. Bei Verwendung eines 10–20% Tricin-Gel-Systems (7, Bahn 2) inkludierten die V8-resistenten Lamininfragmente, die mit Aβ interagierten, Fragmente von ~130 kDa, ~85 kDa und ein markantes Fragment bei ~55 kDa (7, Bahn 2, Pfeil). Es ist wichtig anzumerken, dass die in Kilodalton (kDa) ausgedrückte Molekülgröße im Allgemeinen annähernd ist. Diese Studie zeigte, dass das kleinste V8-resistente Proteinfragment von Laminin, das mit Aβ(1-40) interagierte, ~55 kDa war.
  • Wie in 8 gezeigt, erzeugte mit Trypsin verdautes Laminin mehrere Proteinfragmente, die mit biotyniliertem Aβ(1-40) interagierten. Bei Verwendung eines 4–15% Tris-Glycin-Gel-Systems (8, Bahn 1) inkludierten die Trypsin-resistenten Lamininfragmente, die mit Aβ interagierten, Fragmente von ~400 kDa (welche vermutlich intaktes Laminin darstellen, welches unverdaut blieb), ~150–200 kDa, ~97 kDa, ~65 kDa und ein markantes Fragment bei ~30 kDa. Bei Verwendung eines 10–20% Tricin-Gel-Systems (8, Bahn 2) inkludierten die Trypsin-resistenten Lamininfragmente, die mit Aβ interagierten, Fragmente von ~97 kDa, ~90 kDa, ~65 kDa und ein markantes Fragment bei ~30 kDa (8, Bahn 2, Pfeil). Diese Studie zeigte, dass das kleinste, Trypsin resistente Fragment von Laminin, welches mit Aβ(1-40) interagierte, ~30 kDa war.
  • Beispiel 6
  • Identifizierung von Elastase-resistenten Lamininfragmenten, die mit dem Beta-Amyloid-Protein der Alzheimer-Krankheit interagieren
  • Im nächsten Satz von Studien wurde bestimmt, ob (ein) kleine(s) Fragment(e) von Laminin, das (die) durch Elastase-Verdau erzeugt wurde(n), an Aβ binden würde. Außerdem wurde der Bereich innerhalb des Elastase-resistenten Laminins, welcher mit Aβ interagierte, sequenziert und identifiziert. Für diese Versuche wurde Aβ(1-40) gemäß dem Protokoll des Herstellers (Pierce, Rockford, Illinois) biotinyliert. Für die Liganden-Studien wurde intaktes EHS-Laminin unverdaut gelassen oder mit Elastase (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) verdaut. Für den Elastase-Verdau wurden 2 μg Elastase in 8 μl 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) zu 50 μl Laminin (50 μg)(im selben Puffer) zugegeben und 1,5 Stunden oder 2,5 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Zusätzlich wurden als Kontrolle 2 μg Elastase in 50 μl von 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) 2,5 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach den angemessenen Inkubationszeiten, wie oben beschrieben, wurden 10 μl von jeder der obigen Inkubationen mit 10 μl von 2 × SDS-PAGE-Elektrophorese-Proben-Puffer gemischt und 5 Minuten lang in einem kochenden Wasserbad erhitzt. SDS-PAGE wurde gemäß dem Verfahren von Laemmli (Laemmli, Nature 227: 680–685, 1970) unter Verwendung eines Mini-Protean II-Elektrophorese-Systems mit vorgegossenen 4–15% Tris-Glycin-Polyacrylamid-Gelen und unter nicht-reduzierenden Bedingungen durchgeführt. Die Elektrophorese erfolgte bei 200 V 45 Minuten lang zusammen mit vorgefärbten Molekulargewicht-Standards (Biorad).
  • Nachdem SDS-PAGE wie oben beschrieben durchgeführt worden war, wurden die getrennten Lamininfragmente auf PVDF transferiert, wobei eine Mini-Transblot-Elektrophorese-Transferzelle (Millipore, Redford, MA, USA) verwendet wurde. Der Elektrotransfer wurde bei 100 V 2 Stunden lang durchgeführt. Nach dem Transfer wurden die Membranen mit Methanol gespült, getrocknet und in zwei gleiche Stücke geschnitten, die für das Aβ-Liganden-Blotten oder für Coomassie-Blue-Färbung und nachfolgende Aminosäuren-Sequenzierung verwendet wurden. Das (die) Fragment(e) von Laminin, die an der Bindung an Aβ beteiligt waren, wurden dann unter Verwendung von biotinyliertem Aβ(1-40), wie oben beschrieben, detektiert. Die Bluts wurden 2 Stunden lang mit 2 μM biotinylier-tem Aβ(1-40) in TTBS untersucht. Die Membranen wurden danach dreimal (je 10 Sekunden) mit TTBS gespült, 30 Minuten lang mit Streptavidin-alkalischem Phosphatase-Konjugat (Vectastain) untersucht, wiederum gespült (wie oben beschrieben) und verfolgt durch die Zugabe einer alkalischen Phosphatase-Substrat- Lösung (Vectastain). Nach der Farbentwicklung wurde die Umsetzung durch Spülen der Membranen mit doppelt destilliertem Wasser gestoppt.
  • Für die Coomassie-Blau-Färbung wurden PVDF-Membranen in 0,2% Coomasie Brilliant Blue (Gew./Vol.) in 50% Methanol, 10% Essigsäure und 40% destilliertem Wasser 2 Minuten lang eingetaucht und danach mit 50% Methanol, 10% Essigsäure und 40% destilliertem Wasser gespült, bis sichtbare Banden beobachtet wurden und keine Hintergrundfärbung vorhanden war. Das nachstehend beschriebene 55 kDa Aβ-bindende Lamininfragment wurde an das Biotechnology Service Center (Peptide Sequence Analysis Facility an der Universität von Toronto, Toronto, Ontario, Kanada) geschickt und einer Aminosäure-Sequenzierung unter Verwendung eines Porton 2090 Gas-Phase-Microsequencers (Porton Instruments, Tarzans, CA) mit einer on-line-Analyse von Phenylthiohydantoin-Derivaten unterzogen.
  • In 9 repräsentiert Tafel A einen Aβ-Liganden-Blot, wogegen Tafel B den äquivalenten mit Coomassie-Blue gefärbten Blot zeigt. Wie in 9 gezeigt (Tafel A, Bahnen 2 und 3) erzeugte mit Elastase verdautes Laminin mehrere Proteinfragmente, die biotinyliertes Aβ(1-40) banden. Tafel A, Bahn 1, repräsentiert unverdautes Maus-EHS-Laminin, wogegen die Bahnen 2 und 3 Laminin repräsentieren, das 1,5 Stunden bzw. 2,5 Stunden lang mit Elastase verdaut worden war. Tafel A, Bahn 4 repräsentiert einen 2,5 Stunden langen Elastase-Verdau in Abwesenheit von Laminin. Unverdautes Laminin (9, Tafel A, Bahn 1), welches mit Aβ interagierte, inkludierte mehrere Banden von >~400 kDa bis >~86 kDa, wobei die markanteste Aβ-Interaktion mit intaktem Laminin (d. h. ~400 kDa) auftrat. Elastase-resistente Laminin-Proteinfragmente, die mit Aβ interagierten (9, Tafel A, Bahnen 2 und 3) inkludierten Fragmente von >~400 kDa, ~130 kDa (Pfeilspitze), ~80–90 kDa, ~65 kDa und eine markante Bande bei ~55 kDa (Pfeil). Die Interaktion dieser Elastase-resistenten Laminin-Proteinfragmente mit Aβ wurde nur unter nicht-reduzierenden Bedingungen beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Aβ-Interaktion auch Konformations-abhängig war. Man nimmt an, dass das 130 kDa Elastase-resistente Lamininfragment, das mit Aβ interagiert, auch Teil des E8-Fragments ist (vgl. 11) und dasselbe Proteinfragment von Laminin ist, das in Humanserum und Zerebrospinalflüssigkeit vorhanden zu sein scheint (vgl. Beispiele 10 und 11). 9, Tafel A, Bahn 4 zeigt, dass die bei ~29 kDa beobachtete Bande eine unspezifische Aβ-Bindung darstellt, weil nur das Elastase-Enzym anwesend ist.
  • 9, Tafel B zeigt alle der zahlreichen Proteinbanden, die mit Coomassie Blue gefärbt waren. Es sei bemerkt, dass z. B. in Tafel B, Bahnen 2 und 3 der Elastase-Verdau von Laminin mehrere Proteinfragmente zwischen ~55 kDa und ~90 kDa erzeugte, die Aβ nicht banden und im Aβ-Liganden-Blot (9, Tafel A, Bahnen 2 und 3) nicht beobachtet wurden.
  • Beispiel 7
  • Eine Aβ-bindende Domäne innerhalb von Laminin wird innerhalb der globulären Repeats der Laminin-A-Kette identifiziert
  • Das 55 kDa-Lamininfragment (d. h. nach 1,5-stündigem Elastase-Verdau erzeugt), das eine positive Aβ-Eindungs-Interaktion mittels Liganden-Blot zeigte, wurde danach in großen Mengen hergestellt (9, Tafel B, Bahn 2, Pfeil) für die Aminosäure-Sequenzierung (wie in Beispiel 6 beschrieben). Die Sequenz-Daten bestimmten die exakte Position innerhalb von Laminin, die an der Bindung an Aβ beteiligt war. Eine 11-Aminosäuren-Sequenz wurde aus der Sequenzierung der 55 kDa-Bande bestimmt. Die identifizierte Sequenz war:
    Figure 00610001
  • Die spezifische Aβ-bindende Domäne im Laminin wurde dann identifiziert durch Vergleichen mit der bekannten Maus-Laminin-Sequenz (Sasaki und Yamada, J. Biol. Chem. 262: 17111–17117, 1987; Sasaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 935–939, 1987; Durkin et al., Biochem. 27: 5198–5204, 1988; Sasaki et al., J. Biol. Chem. 263: 16536–16544, 1988), da Maus-EHS-Laminin bei den Studien der vorliegenden Erfindung verwendet wurde. Außerdem wurde die vollständige Aminosäuresequenz innerhalb von Laminin vom National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Maryland, USA erhalten.
  • 10 zeigt die vollständige Aminosäuressequenz der Maus-Laminin A-Kette (Genebank Hinterlegungsnummer P19137; SEQ ID NO: 4). Das aus dem ~55 kDa Protein innerhalb von Laminin sequenzierte 11-Aminosäure-Proteinfragment, welches Aβ bindet, ist identifiziert (10, fett unterstrichen und Pfeilspitze; SEQ ID NO: 1) und passt genau zur Region innerhalb des dritten Repeats der globulären Domänen der Laminin A-Kette (11). Das vierte Repeat der globulären Domänen der Maus-Laminin A-Kette ist als SEQ ID NO. 2 gezeigt (Genebank Hinterlegungsnummer P19137; Aminosäuren #2746–2922), wogegen das vierte Repeat der globulären Domänen der humanen Laminin A-Kette als SEQ ID NO: 3 gezeigt ist (Genebank Hinterlegungsnummer P25391; Aminosäuren #2737–2913).
  • 11 zeigt zwei schematische Darstellungen von Laminin (Colognato-Pyke et al., J. Biol. Chem. 270: 9398–9406, 1995) und die neu entdeckte Aβ-bindende Region von Laminin (in der linken Tafel gezeigt; zwischen den beiden Pfeilspitzen), welche sich innerhalb der letzten drei globulären Domänen der Laminin A-Kette befindet. Die linke Tafel der 11 veranschaulicht Laminin und Fragmente, die nach Protease-Verdauen erzeugt wurden. Elastase-Fragmente E1', E1X (Rand mit dunkler Linie), E-alpha-35 und E4 entsprechen alle Regionen der kurzen Arme von Laminin. Langarm-Fragmente sind E8, E3 und das Cathepsin G-Fragment C8-9. Das E8-Fragment, das durch Elastase-Verdau von Laminin erzeugt wurde, enthält die Langarm-Fragmente, die den distalen Teil des langen Arms und die G-Subdomänen 1–3 enthalten und besteht aus 130–150 kDa (Yurchenco und Cheng, J. Biol. Chem. 268: 17286–17299, 1993). E3-Fragmente, die auch durch Elastase-Verdau von Laminin erzeugt wurden, enthalten die am distalen langen Arm vorhandene Globule mit den G-Subdomänen 4 und 5. Es wurde gezeigt, dass das in 11, Tafel A gezeigte E3-Fragment ein Doublette zu ~60 kDa und ~55 kDa ist (Yurchenco und Cheng, J. Biol. Chem. 268: 17286–17299, 1993). Dies bestätigt auch unsere Entdeckung, wobei das ~55 kDa-Fragment, von welchem festgestellt wurde, dass es Aβ bindet, innerhalb der E3-Region von Laminin lokalisiert ist (11, linke Tafel).
  • Die rechte Tafel der 11 zeigt die Funktionskarte mit der Alpha-(A-Kette), β-(B1-Kette) und Gamma-(B2-Kette) Kette von Laminin, die in Schat tierungen mit abnehmender Dunkelheit gezeigt sind. EGF-Repeats sind durch Balken in den Stab-Domänen des kurzen Arms angegeben. Domänen, die auf der Seuqenz-Analyse basieren, sind in kleinen römischen Ziffern und Buchstaben angegeben. Die Lagen der Heparin-bindenden, Polymer-bildenden und der aktiven alpha1β1-Integrin-bindenden Stellen sind für den kurzen Arm der alpha-Kette in Fettdruck gezeigt. Die Funktionen des langen Armes der Heparin-bindenden (Heparin), alpha6β1-Integrin-Erkennungsstelle (alpha6β1) und Dystroglykan (DG), die in anderen Studien kartiert wurden, sind in grau schattierten Markierungen gezeigt. Es ist interessant festzustellen, dass die Aβ-bindende Region von Laminin auch eine Region ist, die an der Bindung an Heparin beteiligt ist.
  • Es sollte auch betont werden, dass die Repeats der globulären Domänen der Laminin A-Kette vermutlich mit Aβ in Konformations-abhängiger Weise interagieren, da die Interaktion der ~55 Kilodalton-Elastase-resistenten Proteinfragmente mit Aβ nur unter nicht-reduzierenden Bedingungen beobachtet wurde.
  • Beispiel 8
  • Identifizierung von Laminin und von Laminin-Proteinfragmenten in Humanserum und Zerebrospinalflüssigkeit von Alzheimer-, Typ II-Diabetes- und/oder normal gealterten Patienten
  • Bei der nächsten Studie wurden Western Blot-Techniken unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers gegen Laminin benützt, um festzustellen, ob intaktes Laminin und/oder Lamininfragmente in Humanserum und Zerebrospinalflüssigkeit vorhanden waren, die von Alzheimer-, Typ II-Diabetes und/oder normal gealterten Patienten erhalten worden waren. Bei dieser Studie wurde Humanserum vom Alzheimer's Disease Research Center an der University of Washington entweder von lebenden alten Patienten, die entsprechende Mini-Mental-Status-Untersuchungen gehabt haben könnten (wo eine Bewertung von 30 normal ist, eine Bewertung von 15 auf eine moderate Demenz und ein Wert von < 10 auf eine schwere Demenz hindeutet), oder von lebenden alten Patienten, die in der Folgezeit gestorben waren und bei welchen bei der Autopsie Alzheimer-Krankheit di agnostiziert wurde (nach einer Untersuchung ihres Gehirns, das bei der Obduktion erhalten worden war). Außerdem wurde Humanserum vom Diabetes Endocrinology Research Center an der University of Washington erhalten. Die folgenden Humanseren wurden als Teil dieser Studie erhalten und analysiert: 1) Patient #9: eine normale 67-jährige Frau mit einem Mini-Mental-Score von 30; 2) Patient #5226 – eine 70-jährige Frau mit bestätigter moderater Alzheimer-Krankheit, die auch einen Mini-Mental-Score von 12 hatte; 3) Patient #5211 – ein 66-jähriger Mann mit bestätigter Alzheimer-Krankheit, der auch einen Mini-Mental-Score von 25 hatte, 4) Patient B – ein 63-jähriger Mann mit bestätigter Typ II-Diabetes; 5) Patient #5223: eine 68-jährige Frau mit bestätigter Alzheimer-Krankheit, die auch einen Mini-Mental-Score von 22 hatte; 6) Patient #22 – eine 83-jährige, normal gealterte Frau, die auch einen Mini-Mental-Score von 30 hatte; 7) Patient #C – ein 68-jähriger Mann mit bestätigter Typ II-Diabetes. Jedes dieser Seren wurde in dieser Studie verwendet und repräsentiert die Bahnen 1–7 (linke Seite) der 12 (in derselben Reihenfolge wie oben).
  • Zusätzlich wurde Zerebrospinalflüssigkeit vom Alzheimer's Disease Research Center an der University of Washington erhalten, das entweder von lebenden alten Patienten stammte, die die entsprechenden Mini-Mental-Status-Untersuchungen gehabt haben könnten, oder von lebenden alten Patienten, die in der Folgezeit gestorben waren und bei welchen bei der Autopsie Alzheimer-Krankheit diagnostiziert wurde (nach einer Untersuchung ihres Gehirns, das bei der Obduktion erhalten worden war). Die folgenden humanen Zerebrospinalflüssigkeiten wurden als Teil dieser Studie erhalten: 1) Patient #6 – eine normale 64-jährige Frau mit einem Mini-Mental-Score von 30; 2) Patient #7 ein normaler 67-jähriger Mann mit einem Mini-Mental Score von 30; 3) Patient #8 – eine normale 80-jährige Frau mit einem Mini-Mental Score von 30; 4) Patient #9 – eine normale 67-jährige Frau mit einem Mini-Mental Score von 30; 5) Patient # 1111P – eine normale 78-jährige Frau mit einem Mini-Mental Score von 30; 6) Patient #50 – ein 66-jähriger männlicher Patient mit vermutlich moderater Alzheimer-Krankheit, wie durch einen Mini-Mental Score von 15 angezeigt; 7) Patient #54 – ein 73-jähriger Mann mit vermutlich schwerer Alzheimer-Krankheit , wie durch einen Mini-Mental Score von 8 angezeigt. Jede dieser Zerebrospinalflüssigkeitsproben wurde in dieser Studie verwendet und stellt Bahnen 1–7 (rechte Seite) der 12 (in derselben Reihenfolge wie oben) dar.
  • Für die oben beschriebene Studie wurden 10 μl Humanserum 1:10 verdünnt, oder 10 μl unverdünnte humane Zerebrospinalflüssigkeit zu 10 μl SDS-PAGE-Puffer zugegeben, und Liganden-Blots wurden wie in Beispiel 6 hergestellt. Die Blots wurden 2 Stunden lang mit einem polyklonalen Antikörper untersucht (bei einer Verdünnung 1:10.000 in TTBS verwendet) gegen EHS-Laminin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). Die Membranen wurden dann dreimal (je 10 Sekunden lang) mit TTBS gespült und 1 Stunde lang mit einem biotinyliertem sekundären Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper inkubiert, der 1:1000 mit TTBS verdünnt war. Die Membranen wurden dann dreimal (je 10 Sekunden lang) mit TTBS gespült, 30 Minuten lang mit Strepavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat (Vectastain) untersucht, wiederum gespült (wie oben beschrieben), gefolgt von der Zugabe einer alkalischen Phosphatase-Substratlösung (Vectastain). Nach der Farbentwicklung wurde die Umsetzung durch Spülen der Membranen mit doppelt destilliertem Wasser gestoppt.
  • Wie in 12 gezeigt, war intaktes Laminin (Pfeilspitzen) in Humanserum anwesend (Bahnen 1–7, linke Seite), jedoch nicht in humaner Zerebrospinalflüssigkeit (Bahnen 1–7; rechte Seite). Qualitative Beobachtungen deuten darauf hin, dass intaktes Laminin (wie oben beschrieben) im Serum der Alzheimer-Patienten im Vergleich zu Kontrollen abgenommen haben könnte (d. h. vergleiche intaktes Laminin in 12, Bahn 1, linke Seite – normales Individuum; mit 12, Bahn 2, linke Seite – Alzheimer-Patient). Zusätzlich zu intaktem Laminin enthielt Humanserum, das von Alzheimer-, Typ II-Diabetes- und normal gealterten Patienten stammte, auch eine Laminin-Immunreaktivität bei einer Reihe von Banden von ~120 kDa bis ~200 kDa (12, zwischen den beiden Pfeilen beobachtete Banden). Anderseits enthielten Zerebrospinalflüssigkeitsproben kein intaktes Laminin (12; Bahnen 1–7, rechte Seite), sondern enthielten nur eine Reihe von immunreaktiven Laminin-Proteinfragmenten von ~120 kDa bis ~200 kDa (d. h., 12, zwischen den beiden Pfeilen beobachtete Banden). Diese Studie bestimmte, dass eine Reihe von Laminin-Proteinfragmenten sowohl im Humanserum als auch in der Zerebrospinalflüssigkeit von Alzheimer-, Typ II-Diabetes- und normal gealterten Patienten vorhanden ist, wogegen intaktes Laminin nur im Humanserum vorhanden ist. Die neue Entdeckung der Lamininfragmente in humaner Zerebrospinalflüssigkeit legt nahe, dass sie als Marker verwendet werden kann, um das Ausmaß des Laminin-Abbaus im Gehirn während der Alzheimer-Krankheit und anderer Gehirnerkrankungen zu bestimmen.
  • Beispiel 9
  • Identifizierung eines ~130 Kilodalton Laminin-Proteinfragments im Humanserum von Alzheimer-, Typ II-Diabetes und normal gealterten Patienten, welches Aβ bindet.
  • In der nächsten Studie wurden Aβ-Liganden-Blotting-Techniken verwendet, um festzustellen, ob in Humanserum vorhandenes Laminin oder Laminin-Proteinfragmente an Aβ binden. In dieser Studie wurde Humanserum vom Alzheimers Disease Research Center an der University of Washington erhalten, das entweder von lebenden Patienten stammte, die entsprechende Mini-Mental-Status-Untersuchungen gehabt haben könnten (wo eine Bewertung von 30 normal ist, eine Bewertung von 15 auf eine moderate Demenz und ein Wert von < 10 auf eine schwere Demenz hindeutet), oder von lebenden Patienten, die in der Folgezeit gestorben waren und bei welchen bei der Autopsie Alzheimer-Krankheit diagnostiziert wurde (nach einer Untersuchung ihres Gehirns, das bei der Obduktion erhalten worden war). Außerdem wurde Humanserum vom Diabetes Endocrinology Research Center an der University of Washington erhalten. Die ersten sechs Humanserum-Proben (d. h. 13, Bahnen 1–6) waren dieselben Serum-Proben wie in Beispiel 8 angegeben. Zusätzlich bestand 13, Bahnen 7–10 aus Humanserum, das von Bahn 7) Patient #E – einem 54-jährigen Mann mit bestätigter Typ II-Diabetes, Bahn 8) Patient #5230 – einer 72-jährigen Frau mit bestätigter moderater Alzheimer-Krankheit, die einen Mini-Mental-Score von 19 hatte, Bahn 9) Patient #E – einem 54-jährigen Mann mit bestätigter Typ II-Diabetes, und Bahn 10) Patient #F – einem 69-jährigen Mann mit bestätigter Typ II Diabetes stammte.
  • Für diese Studie wurde Aβ(1-40) gemäß dem Protokoll des Herstellers (Pierce, Rockford, IL) biotinyliert. Für die Liganden-Studien nach SDS-PAGE, wie oben in Beispiel 8 beschrieben, wurden abgetrenntes Laminin und dessen Fragmente, die in Humanserum vorhanden waren, auf eine Polyvinylidin-Difluorid-Membran (PVDF) transferiert, wobei eine Mini-Transblot-Elektrophorese-Transfer-Zelle verwendet wurde. Der Elektrotransfer wurde bei 100 V 2 Stunden lang durchgeführt. Nach dem Transfer wurden die Membranen mit Methanol gespült und getrocknet. Das (die) an der Bindung an Aβ beteiligte(n) Fragment(e) von Laminin in Humanserum wurden dann unter Verwendung von biotinyliertem Aβ(1-40) detektiert. Die Blots wurden 2 Stunden lang mit 1 μM biotinyliertem Aβ(1-40) in TTBS untersucht. Die Membranen wurden dann dreimal (je 10 Sekunden lang) mit TTBS gespült, 30 Minuten lang mit Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat (Vectastain) untersucht, wiederum gespült (wie oben beschrieben) und durch Zugabe einer alkalischen Phosphatase-Substrat-Lösung (Vectastain) verfolgt. Nach der Farbentwicklung wurde die Umsetzung durch Spülen der Membranen mit doppelt destilliertem Wasser gestoppt.
  • Wie in 13 gezeigt, interagierte Aβ mit intaktem humanem Laminin (Pfeil) in den meisten Humanserum-Proben. Es war jedoch überraschend, festzustellen, dass intaktes Laminin im Serum von 2 der 4 Alzheimer-Patienten praktisch fehlte (13, Bahnen 5 und 8), was darauf hindeutet, dass von Laminin abstammende Fragmente bei Alzheimer-Krankheit als diagnostischer Marker von Bedeutung sein könnte. Die interessanteste Entdeckung war, dass von allen im Humanserum gefundenen immunreaktiven Laminin-Proteinfragmenten (d. h. ~120 kDa bis ~200 kDa, zwischen den Pfeilen beobachtete Banden, 12, Bahnen 1–7, rechte Seite), nur von einer markanten ~130 kDa-Bande festgestellt wurde, dass sie mit Aβ interagiert (13, Pfeilspitze). Diese selbe markante Bande hat etwa dasselbe Molekulargewicht wie die E8-Bande, die aus Maus-Laminin nach Elastase- Verdau erzeugt wurde (vgl. 9), und die auch die Repeats der globulären Domänen der Laminin A-Kette enthält. Diese Studie zeigte daher, dass Humanserum neben intaktem Laminin ein ~130 kDa-Lamininfragment enthält, das an Aβ bindet, und das wichtig sein könnte, um Aβ in biologischen Flüssigkeiten, wie Blut, löslich zu halten. Diese Studie deutet auch darauf hin, dass sich die qualitative und quantitative Bewertung von Lamininfragmenten in Humanserum als diagnostisch erweisen könnte für das Ausmaß und die Progression von Alzheimer-Krankheit, Typ II-Diabetes und andere Amyloidosen.
  • Beispiel 10
  • Identifizierung eines ~130 Kilodalton Laminin-Proteinfragments in humaner Zerebrospinalflüssigkeit von Alzheimer- und normal gealterten Patienten, welches Aβ bindet
  • In der nächsten Studie wurden Aβ-Liganden-Blotting-Techniken verwendet, um festzustellen, ob Laminin-Proteinfragmente (< 200 kDa), die in humaner Zerebrospinalflüssigkeit vorhanden sind, Aβ binden. In dieser Studie wurde humane Zerebrospinalflüssigkeit vom Alzheimer's Disease Research Center an der University of Washington erhalten, die entweder von lebenden Patienten stammte, die entsprechende Mini-Mental-Status-Untersuchungen gehabt haben könnten (wo eine Bewertung von 30 normal ist, eine Bewertung von 15 auf moderate Alzheimer-Krankheit und eine Bewertung von < 10 auf moderate Alzheimer-Krankheit hindeutet), oder von lebenden alten Patienten, die in der Folgezeit gestorben waren und bei welchen bei der Autopsie Alzheimer-Krankheit diagnostiziert wurde (nach einer Untersuchung ihres Gehirns, das bei der Obduktion erhalten worden war). Die folgenden humanen Zerebrospinalflüssigkeiten wurden erhalten und als Teil dieser Studie analysiert (in 14, Bahnen 1–10 gezeigt): 1) Patient #65 – ein 71-jähriger Mann mit vermutlich schwerer Alzheimer-Krankheit, wie durch einen Mini-Mental-Score von 0 angezeigt; 2) Patient #54 – ein 73-jähriger Mann mit vermutlich schwerer Alzheimer-Krankheit, wie durch einen Mini-Mental-Score von 8 angezeigt, 3) Patient #6 – eine normale 64-jährige Frau mit einem Mini-Mental Score von 30; 4) Patient #7 – ein normaler 67- jähriger Mann mit einem Mini-Mental Score von 30; 5) Patient #8 – eine normale 80-jährige Frau mit einem Mini-Mental Score von 30; 6) Patient #9 – eine normale 67-jährige Frau mit einem Mini-Mental Score von 30; 7) Patient #1111P – eine normale 78-jährige Frau mit einem Mini-Mental Score von 30; 8) Patient #50 – ein 66-jähriger männlicher Patient mit vermutlich moderater Alzheimer-Krankheit, wie durch einen Mini-Mental Score von 15 angezeigt; 9) Patient #52 – ein 69-jähriger Mann mit vermutlich moderater Alzheimer-Krankheit, wie durch einen Mini-Mental-Score von 16 angezeigt; 10) Patient #64 – ein 64-jähriger Mann mit vermutlich schwerer Alzheimer-Krankheit, wie durch einen Mini-Mental Score von 0 angezeigt. Jede dieser Zerebrospinalflüssigkeitsproben wurde in dieser Studie verwendet und stellt die Bahnen 1–10 der 14 dar (in derselben Reihenfolge wie oben).
  • Für diese Studie wurde Aβ-Liganden-Blotting verwendet, wie in Beispiel 9 beschrieben. Das (die) an der Bindung an Aβ beteiligte(n) Fragment(e) von Laminin in humaner Zerebrospinalflüssigkeit wurde(n) unter Verwendung von biotinyliertem Aβ(1-40) detektiert. Die Blots wurden 2 Stunden lang mit 50 nM biotinyliertem Aβ(1-40) in TTBS untersucht. Der Rest des Aβ-Liganden-Blotting-Verfahrens ist wie voranstehend in Beispiel 9 beschrieben.
  • Wie in 14 gezeigt, interagierte Aβ mit Lamininfragment-Banden zwischen ~120 kDa und ~200 kDa in den meisten humanen Zerebrospinalflüssigkeitsproben. Wie bei Humanserum beobachtet, enthielten auch die meisten Proben der humanen Zerebrospinalflüssigkeit ein markantes ~130 kDa Laminin-Fragment (14, Pfeil), welches mit Aβ interagierte. Es wurde kein intaktes Aβ-bindendes Laminin in humaner Zerebrospinalflüssigkeit gefunden (nicht gezeigt), wie zuvor dargelegt (12, Beispiel 8). Wiederum hat dieses selbe markante ~130 kDa Aβ-bindende Lamininfragment, das in humaner Zerebrospinalflüssigkeit vorhanden ist, etwa dasselbe Molekulargewicht wie die aus Laminin erzeugte E8-Bande, die auch die Repeats der globulären Domänen der Laminin A-Kette enthält. Diese Studie stellte daher fest, dass humane Zerebrospinalflüssigkeit auch ein ~130 kDa-Lamininfragment enthält, das an Aβ bindet, und das wichtig sein kann, um Aβ in biologischen Flüssigkeiten, wie Zerebrospinalflüssigkeit, löslich zu halten.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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  • Figure 01090001

Claims (11)

  1. Verwendung von Laminin oder eines Fragments eines Laminin-Proteins bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Amyloid-Erkrankung bei einem Patienten.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Laminin oder das Fragment davon synthetisiert ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Laminin-Fragment ein globuläres Domänen-Repeat innerhalb der Laminin-A-Kette oder ein Fragment davon aufweist.
  4. Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Laminin oder das Fragment davon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus humanem Laminin, Maus-Laminin, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ I NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 und Fragmenten davon.
  5. Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Amyloid-Erkrankung Alzheimer-Krankheit oder Down-Syndrom ist.
  6. Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Laminin oder das Fragment davon zur Verabreichung in einer Dosis zwischen 0,01 μg und 100 mg/kg Körpergewicht bestimmt ist.
  7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Dosis zwischen 10 μg und 50 mg/kg Körpergewicht beträgt.
  8. In vitro-Verfahren zum Inhibieren oder Reduzieren der beta-Amyloid-Protein-Fibrillen-Bildung, -Ablagerung oder -Ansammlung, welches Verfahren das Verabreichen von Laminin oder einem Fragment eines Laminin-Proteins an eine beta-Amyloid-Protein enthaltende Stelle umfasst.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Laminin oder das Fragment davon synthetisiert ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, wobei das Laminin-Fragment ein globuläres Domänen-Repeat innerhalb der Laminin-A-Kette oder ein Fragment davon aufweist.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, 10 oder 11, wobei das Laminin oder das Fragment davon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus humanem Laminin, Maus-Laminin, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ I NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 und Fragmenten davon.
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