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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft
in-vitro-Verfahren der Bindung von Tau-Protein in Zellen, der Bindung von
MAP2-Protein in Zellen, der Hemmung der Bildung von neurofibrillären Tangles,
Verwendungen zur Bekämpfung
der Alzheimer-Krankheit durch Bindung von Tau-Protein an entweder
ein Apolipoprotein E oder ein Apolipoprotein-E-Fragment, welches
an Tau bindet, und Verwendungen zur Bekämpfung der Alzheimer-Krankheit
durch Bindung von MAP2c-Protein an entweder ein Apolipoprotein E
oder ein Apolipoprotein-E-Fragment, welches an MAP2c-Protein bindet.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Apolipoprotein E existiert bei Menschen
in drei verschiedenen Isoformen. Diese Isoformen sind als Apolipoprotein
E2, Apolipoprotein E3 und Apolipoprotein E4 (abgekürzt ApoE2,
ApoE3 bzw. ApoE4) bekannt. ApoE3 ist in der allgemeinen Population
die häufigste
Isoform und enthält
ein einzelnes Cystein am Rest 112. ApoE4 enthält ein Arginin an dieser Position,
aber ist ansonsten identisch mit ApoE3.
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ApoE4 ist genetisch mit spät beginnender
familiärer
und sporadischer Alzheimer-Krankheit verknüpft. Siehe z. B. W. Strittmatter
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1977 (1993). Die Allelfrequenz
von ApoE4 ist bei Patienten in Familien mit spät beginnender Alzheimer-Krankheit
statistisch in hohem Maße
vergrößert. Darüber hinaus
war bei einer Reihe von 176 Patienten mit durch Autopsie bestätigter spät beginnender
sporadischer Alzheimer-Krankheit die Allelfrequenz von ApoE4 ebenfalls
deutlich erhöht.
Weiterhin wird das Risiko von Alzheimer-Krankheit als Funktion der
ererbten Dosis von ApoE4 vergrößert, und
das mittlere Alter des Beginns wird mit jedem ApoE4-Allel herabgesetzt.
Bis zu dem Alter von 80 Jahren entwickeln praktisch alle Personen,
die homozygot für
ApoE4 sind, Alzheimer-Krankheit. Siehe E. Corder et al., Science
261, 921 (1993). So wird die Krankheit als codominantes Merkmal
vererbt und manifestiert sich, wenn die Individuen lange genug leben,
um gefährdet
zu sein. Diese Arbeit stellt ein wichtiges diagnostisches und prognostisches Werkzeug
zur Identifizierung von Patienten mit Alzheimer-Krankheit oder Personen, die in Gefahr
sind, Alzheimer-Krankheit zu entwickeln, bereit. Sie zeigt jedoch
nicht direkt eine zugrundeliegende Ursache für Alzheimer-Krankheit an.
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Alzheimer-Krankheit wird von der
Bildung neurofibrillärer
Tangles und der Ablagerung von Amyloid-beta-Peptid (Aβ) begleitet.
Es wird allgemein akzeptiert, daß Demenz bei Alzheimer-Krankheit
besser mit der Pathologie der neurofibrillären Tangles als mit dem Ausmaß der Aβ-Ablagerung
korreliert. Diese neurofibrillären Tangles
enthalten gepaarte helikale Filamente, deren Hauptbestandteil abnorm
phosphoryliertes Tau (Ptau), ein Mikrotubulus-assoziiertes Protein,
ist. Jedoch ist der genaue Grund für die Ansammlung von Ptau und
die daraus folgende Bildung von neurofibrillären Tangles nicht bekannt.
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Das Mikrotubulus-assoziierte Protein
MAP2c bewirkt auch Aufbau und Stabilität des Mikrotubulus. Tau und
MAP2 sind beide Mitglieder einer Familie neuronaler Mikrotubulus-assoziierter
Proteine (MAPS), die den Mikrotubulusaufbau fördern und Mikrotubuli stabilisieren.
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Sowohl Tau- als auch MAP2-Protein
enthalten einen Wiederholungsbereich hochkonservierter Mikrotubulusbindung,
obgleich der Wiederholungsbereich von jedem sich in der Sequenz
unterscheidet (siehe Lewis et al., Science 242, 936 (1988); Bulinski,
MAP4, in Microtubules, Hyams und Lloyd (Hrsg.), Wiley-Liss, New York,
S. 167–182
(1994)). MAP2c ist eine 70-kDa-Form von MAP2, die aus alternativem
mRNA-Splicing des MAP2-Gens entsteht (Garner und Matus, J. Cell.
Biol., 106, 779 (1988)). Wie andere Formen von MAP2 enthält MAP2c
drei oder vier Kopien der Mikrotubulus-Bindungswiederholungen, welche
in hohem Maße
homolog zu den Mikrotubulus-Bindungswiederholungen von Tau sind.
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V. Ingram und H. Roder, PCT-Anmeldung
WO 93/03148, beschreiben die Verwendung von Inhibitoren der Kinasen
PK40 und PK36 (z. B. ATP), um die Bildung von gepaarten helikalen
Filamenten in Zellen zu hemmen, um die Bildung von neurofibrillären Tangles
in Zellen zu hemmen und um Alzheimer-Krankheit bei Patienten zu behandeln.
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C. Preston und I. Ace, PCT-Anmeldung
WO 91/02788, beschreiben die Verabreichung der Nervenwachstumsfaktor-Beta-Untereinheit
durch eine Mutante des Herpes-simplex-Virus Typ 1 für die Behandlung von
Alzheimer-Krankheit.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung beruht
auf der Feststellung, daß ApoE3
begierig an das Tau-Protein bindet, aber ApoE4 das nicht tut, daß weder
ApoE3 noch ApoE4 an phosphoryliertes Tau bindet und daß ApoE3
begierig an das MAP2c-Protein bindet, aber ApoE4 das nicht tut.
So stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der
Bildung von gepaarten helikalen Filamenten und/oder neurofibrillären Tangles
in einer Zelle durch Verabreichen an (oder Einführen in) die Zelle entweder
eines Apolipoproteins E, welches an Tau bindet (z. B. ApoE2, ApoE3),
oder eines Apolipoprotein-E-Fragments, welches an Tau in dieser
Zelle bindet, bereit. Die Verabreichung kann entweder durch Zuführen des
wirksamen Mittels direkt in die Zelle oder durch Zuführen von
genetischem Material in die Zelle, welches dann wieder das wirksame
Mittel in die Zelle zuführt,
ausgeführt
werden.
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Ein zweiter Aspekt der vorliegenden
Erfindung ist die Verwendung für
die Herstellung eines Medikaments zur Bekämpfung der Bildung von neurofibrillären Tangles
und/oder der Alzheimer-Krankheit bei einem Patienten, der einer
derartigen Behandlung bedarf, von ApoE, welches an Tau bindet, oder
eines Fragments davon, welches an Tau bindet.
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Ein dritter Aspekt der vorliegenden
Erfindung ist eine pharmazeutische Formulierung, umfassend ein ApoE,
welches an Tau bindet, oder ein Fragment davon, welches an Tau bindet,
(d. h. „das
wirksame Mittel") in
einem pharmazeutisch verträglichen
Träger.
Vorzugsweise ist der Träger
einer, der das wirksame Mittel durch die Blut-Hirn-Schranke trägt. So stellt
die vorliegende Erfindung die Verwendung eines wie vorstehend angegebenen
wirksamen Mittels für
die Herstellung eines Medikaments zur Bekämpfung der Bildung von neurofibrillären Tangles
und/oder die Bekämpfung
der Alzheimer-Krankheit bereit.
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Ein vierter Aspekt der vorliegenden
Erfindung ist die Verwendung für
die Herstellung eines Medikaments zur Bekämpfung der Alzheimer-Krankheit
bei einem Patienten, der einer derartigen Behandlung bedarf, eines
wirksamen Mittels, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Apolipoprotein E, welches an Mikrotubulus-assoziiertes
Protein 2c (MAP2c) bindet, und Apolipoprotein-E-Fragmenten, welche
an MAP2c binden, in einer Menge, die wirksam ist, um Alzheimer-Krankheit
bei dem Patienten zu bekämpfen.
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Ein fünfter Aspekt der vorliegenden
Erfindung ist eine pharmazeutische Formulierung, verwendbar zur Bekämpfung der
Alzheimer-Krankheit, umfassend ein wirksames Mittel, ausgewählt aus der
Gruppe, bestehend aus ApoE, welches an MAP2 bindet, und Fragmenten
davon, welche an MAP2 binden, in Kombination mit einem pharmazeutisch
verträglichen
Träger.
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Eine besondere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist, wie vorstehend bemerkt, die Bekämpfung der
Bildung von neurofibrillären
Tangles und/oder der Alzheimer-Krankheit bei einem Patienten, der einer
derartigen Behandlung bedarf, indem an einen Patienten ein Vektor
verabreicht wird, der imstande ist, in die Nervenzellen einzutreten.
Der Vektor kann entweder sein (a) ein Vektor, der eine Nucleinsäure trägt, kodierend
ein ApoE, welches Tau oder Mikrotubulus-assoziiertes Protein 2c
(MAP2c) bindet, oder eines Fragments davon, welches Tau oder MAP2c
bindet, welche Nucleinsäure
operabel mit einem Promotor assoziiert ist, welcher die Nucleinsäure in einer
Nervenzelle exprimiert; oder (b) ein Vektor, enthaltend eine Nucleinsäure, welche
imstande ist, in einer Nervenzelle das Codon des ApoE-Gens, kodierend
die Aminosäure
am Rest 112 darin, in Cystein umzuwandeln (z. B. das Apo4-Gen in
vivo in das Apo3-Gen umzuwandeln, indem das Codon, das Arginin kodiert,
in Cystein am Rest 112 umgewandelt wird).
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Ebenfalls offenbart hierin sind ein
Vektor, wie vorstehend beschrieben, pharmazeutische Formulierungen,
enthaltend einen derartigen Vektor, und die Verwendung derartiger
Vektoren für
die Herstellung eines Medikaments zur Bekämpfung der Bildung von neurofibrillären Tangles
und/oder der Alzheimer-Krankheit bei einem Patienten, der einer
derartigen Behandlung bedarf.
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Die vorhergehenden und andere Aufgaben
und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden ausführlich in
den Zeichnungen hierin und in der nachstehend angegebenen Beschreibung
erklärt.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 veranschaulicht
die Bindung des Tau-Proteins an ApoE3.
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2A veranschaulicht
die pH-unabhängige
Bindung von Tau an ApoE3 und die Abwesenheit der Bindung von phosphoryliertem
Tau an ApoE3.
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2B veranschaulicht
die Abwesenheit der Tau-Bindung an ApoE4 und die Abwesenheit der
Bindung von phosphoryliertem Tau an ApoE4.
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3 veranschaulicht
die Bindung verschiedener ApoE3-Fragmente an Tau.
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4 veranschaulicht
den Zeitverlauf der Bindung von MAP2c an ApoE3; der Pfeil zeigt
den ApoE3/MAP2c-Komplex an.
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5 veranschaulicht
die Abwesenheit der Bindung von MAP2c an ApoE4.
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6 veranschaulicht
die Konzentrationsabhängigkeit
von ApoE3 bei der Bindung von MAP2c. Der Pfeil zeigt den ApoE3/MAP2c-Komplex
an.
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7 veranschaulicht
die Konzentrationsabhängigkeit
von MAP2c bei der Bindung von ApoE3. Der Pfeil zeigt den ApoE3/MAP2c-Komplex
an.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Zellen, die nach dem Verfahren der
vorliegenden Erfindung behandelt werden, sind typischerweise Säugerzellen
(z. B. Mensch, Hund, Katze, Ratte, Maus) und sind typischerweise
Nervenzellen. Die Nervenzellen können
Nervenzellen des zentralen Nervensystems oder des peripheren Nervensystems
sein.
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Die Zellen können in vitro oder in vivo
in einem tierischen Wirt behandelt werden. Das Verfahren ist beim
Analysieren des Beitrages der Tau-Phosphorylierung zu der Zellerhaltung,
ebenso wie beim Analysieren des Beitrages der Tau-Phosphorylierung,
der Bildung gepaarter helikaler Filamente und/oder der Bildung neurofibrillärer Tangles
zu der neurozellulären
Degenerierung sowohl in vitro als auch in vivo verwendbar. Das Verfahren
ist auch beim Analysieren des Beitrags von MAP2c-Protein zu neurozellulärer Degeneration
sowohl in vitro als auch in vivo verwendbar.
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Geeignete Patienten für die Ausführung der
vorliegenden Erfindung sind typischerweise männliche oder weibliche menschliche
Patienten und schließen
sowohl diejenigen, bei denen vorher festgestellt worden ist, daß sie gefährdet sind,
Alzheimer-Krankheit zu entwickeln, als auch diejenigen, bei denen
anfänglich
diagnostiziert worden ist, daß sie
an Alzheimer-Krankheit leiden, ein. Zum Beispiel sind Patienten,
bei denen diagnostiziert oder festgestellt ist, daß sie an
Demenz leiden, besonders Patienten, die zuvor klinisch normal gewesen
sind, bei denen festgestellt ist, daß sie an progressiver Demenz
leiden, geeignete Versuchspersonen. Die vorliegende Erfindung kann
bei der Bekämpfung
sowohl von familiärer
Alzheimer-Krankheit (spät
beginnend und früh
beginnend) als auch von sporadischer Alzheimer-Krankheit angewandt
werden. Eine zu bevorzugende Gruppe von Versuchspersonen sind diejenigen,
bei denen festgestellt worden ist, daß sie heterozygot oder homozygot
für das
ApoE4-Gen sind. Verfahrensweisen zum Auswählen und Bewerten von Versuchspersonen
werden weiterhin diskutiert in A. Roses, W. Strittmatter, G. Salvensen,
J. Enghild und D. Schmichel, Methods of Detecting Alzheimer's Disease (Verfahren
zum Nachweisen der Alzheimer-Krankheit), US-Patentanmeldung, Seriennummer
08/114448, eingereicht am 31. August 1993 (Anwaltsregister-Nr. 5405-75A),
welche eine teilweise Fortsetzung von A. Roses et al. US-Patentanmeldung,
Seriennummer 07/959992 (eingereicht 13. Oktober 1992) ist (siehe
auch W. Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1977
(1992); E. Corder et al., Science 261, 921 (1993 )).
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Die Begriffe „bekämpfen" und „Bekämpfung", wie sie hier verwendet werden, sollen
keine Umkehrung der Bildung gepaarter helikaler Filamente, der Bildung
neurofibrillärer
Tangles oder des Alzheimer-Krankheitsprozesses anzeigen, sondern
sie sollen statt dessen eine Verlangsamung dieser Ereignisse, wie
beispielsweise eine Verzögerung
des Beginns von Demenz oder eine Verlangsamung des Fortschreitens
von Demenz anzeigen. So kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung
entweder therapeutisch bei einem Patienten ausgeführt werden,
bei dem anfängliche
Zeichen von Alzheimer-Krankheit
vorhanden sind, oder prophylaktisch bei einer Versuchsperson, die
gefährdet
ist, Alzheimer-Krankheit
zu entwickeln.
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ApoE2, ApoE3 und Fragmente davon,
welche an Tau-Protein und/oder MAP2c-Protein binden, ("wirksame Mittel") können nach
Standardtechniken hergestellt werden. Fragmente, die bei der Ausführung der
vorliegenden Erfindung angewendet werden, können Peptide, abgeleitet von
ApoE, sein, die N-terminale,
C-terminale oder sowohl N-terminale als auch C-terminale Aminosäurereste
deletiert haben, aber die biologische Aktivität des Stammproteins, wie hier
beschrieben, behalten (z. B. vorzugsweise ein Cystein in der Position
in dem Fragment, entsprechend der Position l 12 des vollständigen ApoE2-
oder ApoE-3-Proteins,
behalten und Tau an der Stelle, gebunden durch vollständiges ApoE3,
binden) und MAP2c an der Stelle, gebunden durch vollständiges ApoE3,
binden. Zu Beispielen derartiger Fragmente, die Tau binden, gehören die
ApoE3-Fragmente 1–191,
1–244
und 1–272
(wobei 1 die N-terminale Aminosäure
des ursprünglichen
Moleküls
bezeichnet). Derartige wirksame Fragmente können durch enzymatische Digestion
eines ApoE (insbesondere ApoE3 oder ApoE4), durch direkte Synthese
oder durch Verfahrensweisen der Gentechnik hergestellt werden. Verfahren
zur Bewertung der Bindung derartiger Fragmente an Tau oder an MAP2c
sind dem Fachmann leicht ersichtlich. Es ist ebenfalls leicht ersichtlich,
daß einige
Fragmente imstande sein können,
sowohl Tau- als auch MAP2c-Proteine zu binden.
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Die Begriffe ApoE (z. B. ApoE2, ApoE3)
und ApoE-Fragmente, wie sie verwendet werden, sollen die Analogen
davon einschließen.
Ein „Analoges" ist eine chemische
Verbindung, ähnlich
in der Struktur einer anderen, welche eine ähnliche physiologische Wirkung
hat (z. B. ein anderes Peptid). Solche Analoge können am Anfang durch Hinzugeben,
Verändern
oder Deletieren von Aminosäuren
hergestellt werden. Zum Beispiel können von 1 bis 5 zusätzliche
Aminosäuren
zu dem terminalen N, terminalen C oder sowohl dem terminalem N als
auch dem terminalen C eines wirksamen Fragments hinzugegeben werden.
In einem anderen Beispiel können
eine oder mehrere Aminosäuren
einer synthetischen Peptidsequenz durch eine oder mehrere Aminosäuren ersetzt
werden, welche die Aktivität
dieser Sequenz nicht beeinflussen. Analoge können auch kleine organische
Verbindungen sein, die die Aktivität der Stammverbindung, wie
beispielsweise ApoE3, nachahmen oder sie haben, wie hierin beschrieben
ist (z. B. an das Tau-Protein an der Bindungsstelle, gebunden durch ApoE3,
binden). Änderungen
in der Stammverbindung zum Aufbau des Analogen können durch bekannte Ähnlichkeiten
zwischen Aminosäuren
und anderen Molekülen
oder Substituenten in physikalischen Merkmalen, wie beispielsweise
Ladungsdichte, Hydrophobie, Hydrophilie, Größe und Konfiguration usw.,
gesteuert werden. Zum Beispiel kann Thr durch Ser ersetzt werden
und umgekehrt, kann Asp durch Glu ersetzt werden und umgekehrt und
kann Leu durch Ile ersetzt werden und umgekehrt. Weiterhin kann
die Auswahl von Analogen durch dem Fachmann bekannte Techniken des
Massenscreenings (z. B. Screening nach Verbindungen, die an die
Bindungsstelle an dem Tau-Protein, gebunden durch ApoE3, binden)
getroffen werden.
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Wirksame Mittel der vorliegenden
Erfindung können
für sich
oder in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes verabreicht
werden. Zu solchen pharmazeutisch verträglichen Salzen gehören, ohne
aber darauf begrenzt zu sein, diejenigen, die aus den folgenden
Säuren
hergestellt werden: Chlorwasserstoff , Bromwasserstoff , Schwefel-,
Salpeter-, Phosphor-, Malein-, Salicyl-, p-Toluolsulfon-, Wein-,
Zitronen-, Methansulfon-, Ameisen-, Malon-, Succin-, Naphthalin-2-sulfon-
und Benzolsulfonsäure.
Außerdem
können
pharmazeutisch verträgliche
Salze, wie beispielsweise Alkalimetall- oder Erdalkalisalze, wie
beispielsweise Natrium-, Kalium- oder Calciumsalze einer Carbonsäuregruppe,
hergestellt werden.
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Die Menge von wirksamem Mittel, die
an eine Versuchsperson zu verabreichen ist, variiert abhängig von
dem Alter, Gewicht und Zustand des Patienten, dem besonderen wirksamen
Mittel, das zugeführt
wird, dem Zuführungsplan
und anderen derartigen Faktoren, aber beträgt im allgemeinen von 0,1 Nanogramm
bis 100 Mikrogramm, und beträgt
typischerweise eine Menge in dem Bereich von 1 Nanogramm bis 10
Mikrogramm.
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Pharmazeutische Zusammensetzungen,
die die wirksamen Mittel der vorliegenden Erfindung enthalten, können in
entweder flüssiger
oder fester Form hergestellt werden. Um die pharmazeutischen Zusammensetzungen
dieser Erfindung herzustellen, werden eines oder mehrere der wirksamen
Mittel entsprechend herkömmlichen
pharmazeutischen Compoundierungstechniken innig mit einem pharmazeutischen
Träger
vermischt, und dieser Träger
kann eine breite Vielfalt von Formen annehmen, die von der Form
der Zubereitung abhängen,
die für
die Verabreichung gewünscht
wird, z. B. oral oder parenteral (z. B. intravenös, subkutan, intrathekal).
Bei der Herstellung der Zusammensetzungen in oraler Dosierungsform
kann ein beliebiges der gewöhnlichen
pharmazeutischen Medien angewendet werden. Somit gehören für flüssige orale
Zubereitungen, wie zum Beispiel Suspensionen, Elixiere und Lösungen,
zu geeigneten Trägern
und Zusatzstoffen Wasser, Glycole, Öle, Alkohole, Duftmittel, Konservierungsstoffe,
Färbemittel
und dergleichen; für
feste orale Zubereitungen, wie zum Beispiel Pulver, Kapseln und
Tabletten, gehören
zu geeigneten Trägern
und Zusatzstoffen Stärken,
Zucker, Verdünnungsmittel,
Granulierungsmittel, Schmiermittel, Bindemittel, Aufschlußmittel
und dergleichen. Wegen ihrer leichten Verabreichung stellen Tabletten
und Kapseln die vorteilhafteste Form der oralen Dosierungseinheit
dar, und in diesem Fall werden selbstverständlich feste pharmazeutische
Träger
verwendet. Wenn gewünscht,
können
Tabletten durch Standardtechniken zuckerbeschichtet oder enterisch
beschichtet werden. Für
parenteral injizierbare Zusammensetzungen wird der Träger gewöhnlich steriles
pyrogenfreies Wasser oder sterile, pyrogenfreie physiologische Kochsalzlösung umfassen,
obgleich andere Bestandteile, zum Beispiel für Zwecke wie Unterstützung der
Löslichkeit
oder zur Konservierung, eingeschlossen werden können. Parenteral injizierbare
Suspensionen (z. B. für
intravenöse
oder intrathekale Injektion) können ebenfalls
hergestellt werden, in welchem Fall geeignete flüssige Träger, Suspendiermittel und dergleichen
angewendet werden können.
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Wenn notwendig, kann die pharmazeutische
Zusammensetzung so hergestellt werden, daß das wirksame Mittel durch
die Blut-Hirn-Schranke hindurchtritt. Ein Weg, um den Transport
durch die Blut-Hirn-Schranke
zu bewerkstelligen, ist, das wirksame Mittel mit einem sekundären Molekül (einem „Träger"), welches entweder
ein Peptid oder eine nichtproteinartige Einheit ist, zu koppeln
oder zu paaren. Der Träger
wird so ausgewählt,
daß er
imstande ist, die Blut-Hirn-Schranke zu durchdringen. Beispiele
geeigneter Träger
sind Pyridinium-, Fettsäure-,
Inositol-, Cholesterin- und Glucosederivate. Alternativ kann der
Träger
eine Verbindung sein, die durch ein spezifisches Transportsystem
in Endothelzellen des Gehirns, wie beispielsweise Transportsysteme
zur Übertragung
von Insulin oder den insulinähnlichen
Wachstumsfaktoren I und II, in das Gehirn eintritt. Diese Kombination
von wirksamem Mittel und Träger
wird ein Prodrug genannt. Beim Eintreten in das zentrale Nervensystem
kann das Prodrug intakt bleiben oder kann die chemische Verknüpfung zwischen
dem Träger und
dem wirksamen Mittel hydrolysiert werden, wodurch der Träger von
dem wirksamen Mittel getrennt wird. Siehe allgemein die US-Patentschrift
5017566 von Bodor.
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Ein alternatives Verfahren zum Transportieren
des wirksamen Mittels durch die Blut-Hirn-Schranke ist, den Träger in ein Lipidvesikel, wie
beispielsweise ein Mikrokristall oder Liposom, einzukapseln. Solche
Lipidvesikel können
einzeln oder mehrschichtig sein und das wirksame Mittel entweder
in ihrer Mitte oder zwischen ihren Schichten einkapseln. Solche
Zubereitungen sind bekannt. Zum Beispiel beschreibt die PCT-Anmeldung WO
91/04014 von Collins et al. ein Liposomzuführungssystem, in welchem das
therapeutische Mittel innerhalb des Liposoms eingekapselt ist und
zu der äußeren Schicht
des Liposoms Moleküle
hinzugefügt
worden sind, die normalerweise durch die Blut-Hirn-Schranke transportiert
werden. Solche Liposome können
auf endogene Hirntransportsysteme zielen, die spezifische Liganden
durch die Blut-Hirn-Schranke transportieren, einschließlich, ohne
aber darauf begrenzt zu sein, der Übertragung von Insulin und
den insulinähnlichen
Wachstumsfaktoren I und II. Alternativ können Antikörper zu Hirnendothelzellen-Rezeptoren
für solche
Liganden zu der äußeren Liposomschicht
hinzugefügt
werden. Die US-Patentschrift 4704355 von Bernstein beschreibt Verfahren
zum Koppeln von Antikörpern
mit Liposomen.
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Ein anderes Verfahren der Formulierung
des wirksamen Mittels für
den Durchtritt durch die Blut-Hirn-Schranke
ist, eine pharmazeutische Zusammensetzung wie vorstehend beschrieben
herzustellen, wobei das wirksame Mittel in Cyclodextrin eingekapselt
wird. Ein beliebiges geeignetes Cyclodextrin, welches durch die
Blut-Hirn-Schranke hindurchtritt, kann angewendet werden, einschließlich β-Cyclodextrin, γ-Cyclodextrin und
Derivaten davon. Siehe allgemein die US-Patentschrift 5017566 von
Bodor; die US-Patentschrift 5002935
von Bodor; die US-Patentschrift 4983586 von Bodor.
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Ein anderes Verfahren zum Hindurchführen des
wirksamen Mittels durch die Blut-Hirn-Schranke ist, eine pharmazeutische
Zusammensetzung wie vorstehend beschrieben herzustellen und zu verabreichen,
wobei die Zusammensetzung weiterhin ein Glycerolderivat einschließt, wie
in der US-Patentschrift 5153179 beschrieben ist.
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In einer alternativen Ausführungsform
wird die vorliegende Erfindung ausgeführt, indem an den Patienten
ein Vektor verabreicht wird, der eine Nucleinsäure als wirksames Mittel trägt, welcher
Vektor imstande ist, in Nervenzellen einzutreten. Derartige Vektoren
können
mit pharmazeutischen Trägem
formuliert und in ähnlicher
Weise wie vorstehend beschrieben verabreicht werden. Geeignete Vektoren
sind typischerweise virale Vektoren, die DNA-Viren (wobei das wirksame
Nucleinsäure-Mittel
DNA ist) und RNA-Viren oder Retroviren (wobei das wirksame Nucleinsäure-Mittel
RNA ist) einschließen.
Es wird bevorzugt, aber nicht wesentlich, daß der Vektor ein neurotroper
Vektor ist, der vorzugsweise Nervenzellen infiziert. Techniken zur
Ausführung der
Gentherapie sind bekannt. Siehe z. B. T. Friedmann, Progress Toward
Human Gene Therapy (Fortschritt in Richtung humaner Gentherapie),
Science 244, 1275 (1989); 1. Pastan, US-Patentschrift 5166059.
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Verfahren zum Hindurchführen von
genetischem Material durch die Blut-Hirn-Schranke, speziell von viralem
oder retroviralem Capsidmaterial, sind in der US-Patentschrift 4866042
von Neuwelt beschrieben.
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Herpes-Virus-Vektoren (z. B. Herpes-Virus
Typ 1, Herpes-Virus Typ 2, Cytomegalovirus) sind ein besonderer
Typ von Vektor, welcher angewendet werden kann, um die vorliegende
Erfindung auszuführen.
Vektoren des Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) werden besonders
bevorzugt. Solche Vektoren umfassen im allgemeinen mindestens die
Capsidbildungssegmente eines HSV-1-DNA-Genoms in einem HSV-1-viralen Capsid.
Die HSV-1-DNA trägt
ein heterologes DNA-Insert, welches entweder das DNA-Molekül des wirksamen Mittels
enthält
oder das DNA-Molekül
enthält,
welches das zu exprimierende Peptid oder Protein enthält. Wo das
Insert-DNA-Molekül
ein Protein oder Peptid kodiert, steht das Insert unter Kontrolle
eines Promotors, der in Nervenzellen operativ ist, so daß das Protein
oder Peptid in Nervenzellen exprimiert wird. Der Promotor kann eine
beliebige geeignete Herkunft einschließlich viraler Herkunft haben
(z. B. Promotoren, welche die Latenz-assoziierten Transkripte (Lat-s)
von HSV-1 steuern; der Immediate-Early-4/5-Promotor von HSV-1) und aus
Promotoren bestehen, die normalerweise in Säuger-Nervenzellen operabel
sind (z. B. der Tau-Protein-Promotor). Das heterologe Insert wird
typischerweise in eine beliebige Region des viralen Genoms insertiert,
welche für
die Kultur des Virus nicht wesentlich ist, um die Produktion davon
in Zellkultur und wenn notwendig in Helferzellen zu ermöglichen.
Solche Herpes-Virus-Vektoren sind bekannt. Siehe z. B. A. Geller
und X. Breakefield, Science, S. 1667 (23. Sept. 1988); C. Ace et
al., J. Virol. 63, 2260 (1989); C. Preston et al., PCT-Anmeldung
WO 91/02788.
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Ein Promotor ist für homologe
Rekombinationsstrategien nicht wesentlich. In derartigen Strategien umfaßt, an Stelle
einer DNA, die exprimiert werden soll, das heterologe Insert ein
DNA-Molekül,
welches imstande ist, in einer Nervenzelle durch homologe Rekombination
das Codon des ApoE-Gens, kodierend die Aminosäure am Rest 112 darin, in Cystein
umzuwandeln. Das DNA-Molekül
hat typischerweise eine Länge von
50 oder 100 bis 300 oder 5000 Nucleotiden und ist ausreichend homolog
zu der chromosomalen ApoE4-DNA als Ziel, um an den komplementären Strang
davon anzulagern und mit dem Teil des chromosomalen DNA-Segments,
welcher das Codon, kodierend den ApoE4-Aminosäurerest 112, enthält, durch
homologe Rekombination auszutauschen, wodurch das den Rest 112 kodierende
Codon in ein Cystein kodierendes umgewandelt wird. Verfahrensweisen
der homologen Rekombination sind bekannt. Siehe z. B. O. Smithies, Nature
317, 230 (1985); W. Bertling, US-Patentschrift 4950599.
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Hier wird auch ein Verfahren zum
Screening von Verbindungen nach der Fähigkeit offenbart, eine oder mehrere
von den Wirkungen der Bindung von Tau, der Hemmung der Phosphorylierung
von Tau, der Hemmung der Bildung gepaarter helikaler Filamente,
der Hemmung der Bildung neurofibrillärer Tangles und der Bekämpfung der
Alzheimer-Krankheit, zu erreichen. Ein derartiges Verfahren umfaßt, eine
Testverbindung mit dem Tau-Protein in Kontakt zu bringen und dann
nachzuweisen, ob die Testverbindung an die Bindungsstelle an Tau
bindet, welche durch ApoE3 gebunden ist. Das Format des Tests und
die Art, in der der Schritt des Inkontaktbringens ausgeführt wird,
ist nicht kritisch, und eine Vielfalt von Möglichkeiten wird dem Fachmann leicht
ersichtlich sein. Typischerweise wird der Schritt des Inkontaktbringens
in vitro in einer wässerigen
Lösung
ausgeführt
und wird der Schritt des Nachweisens mittels eines kompetitiven
Bindungstests ausgeführt, bei
welchem eine bekannte Verbindung, die an die ApoE3-Bindungsstelle
an Tau bindet, wie vorstehend beschrieben ist, in die Lösung eingeschlossen
wird und die Fähigkeit
der Testverbindung, die Bindung der bekannten Verbindung zu hemmen,
bestimmt wird. Für
derartige Tests wird die bekannte Verbindung mit einer geeigneten
nachweisbaren Gruppe, wie beispielsweise Tritium, markiert. Andere
Tests, wie beispielsweise die Tests der Verschiebung der Gelmobilität, können ebenfalls
angewendet werden. Das Vorhandensein von Bindung an die Stelle,
die durch ApoE3 gebunden ist, zeigt an, daß die Verbindung verwendbar
ist oder sein kann, um eine oder mehrere der vorstehend vermerkten
Wirkungen zu erreichen. Die in dieser Weise nachgewiesenen Verbindungen
sind für
die Untersuchung in vitro und in vivo der Tau-Phosphorylierung,
der Bildung gepaarter helikaler Filamente, der Bildung neurofibrillärer Tangles
und die Behandlung von Alzheimer-Krankheit
verwendbar.
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Ebenfalls offenbart hierin ist ein
Verfahren zum Screening von Verbindungen auf die Fähigkeit,
eine oder mehrere der Wirkungen der Bindung von MAP2c und der Bekämpfung von
Alzheimer-Krankheit zu erreichen. Ein derartiges Verfahren umfaßt Inkontaktbringen
einer Testverbindung mit dem MAP2c-Protein und dann Nachweisen, ob die
Testverbindung an die Bindungsstelle an MAP2c bindet, welche durch
ApoE3 gebunden ist. Das Format des Tests und die Art, durch welche
der Schritt des Inkontaktbringens ausgeführt wird, ist nicht kritisch,
und eine Vielfalt von Möglichkeiten
wird dem Fachmann leicht ersichtlich sein. Typischerweise wird der
Schritt des Inkontaktbringens in vitro in einer wässerigen
Lösung
ausgeführt
und wird der Schritt des Nachweisens mittels eines kompetitiven
Bindungstests ausgeführt,
bei welchem eine bekannte Verbindung, die an die ApoE3-Bindungsstelle
an MAP2c, wie vorstehend beschrieben, bindet, in die Lösung eingeschlossen
wird und die Fähigkeit
der Testverbindung, die Bindung der bekannten Verbindung zu hemmen,
bestimmt wird. Für
derartige Tests wird die bekannte Verbindung mit einer geeigneten
nachweisbaren Gruppe, wie beispielsweise Tritium, markiert. Andere
Tests, wie beispielsweise Tests der Verschiebung der Gelmobilität, können ebenfalls
angewendet werden. Das Vorhandensein von Bindung an die Stelle,
die durch ApoE3 gebunden ist, zeigt an, daß die Verbindung verwendbar
ist oder sein kann, um eine oder mehrere der vorstehend vermerkten
Wirkungen zu erreichen. Die in dieser Weise nachgewiesenen Verbindungen
sind für
die Untersuchung in vitro oder in vivo von neurozellulärer Degeneration
und die Behandlung von Alzheimer-Krankheit verwendbar.
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Die vorliegende Erfindung wird in
größerer Ausführlichkeit
durch die folgenden Beispiele erklärt. Diese Beispiele sind für die vorliegende
Erfindung veranschaulichend und sind nicht als deren Begrenzung
auszulegen.
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BEISPIEL 1
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APOE3 BINDET AN TAU-PROTEIN
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Rekombinantes Tau-40 (die größte Tau-Isoform
im Gehirn) wurde in Übereinstimmung
mit bekannten Techniken exprimiert und gereinigt (siehe M. Goedert
et al., Neuron 3, 519 (1989)). ApoE wurde, ebenfalls in Übereinstimmung
mit bekannten Techniken, von Individuen, homozygot für ApoE3
oder ApoE4, gereinigt (siehe S. Rall et al., Methods Enzymol. 128,
273 (1986)). Das aminoterminale 22-kDa-Fragment von ApoE3 oder ApoE4 wurde
durch Thrombinspaltung hergestellt (siehe W. Bradley et al., Biochem.
Biophys. Res. Comm. 109, 1360 (1982)). Tau-40 (2 μg Protein)
und ApoE (2 μg
Protein) wurden in einem Gesamtvolumen von 20 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH
7,30, für
60 min bei 37°C
inkubiert. Die Inkubation wurde durch Hinzufügen von 20 μl von 2 × Laemmli-Puffer ohne β-Mercaptoethanol (außer den
Bahnen 9 und 10, die 0,2 Vol.-% β-Mercaptoethanol
enthielten) beendet. Die Proben wurde für 5 min in siedendem Wasser
erhitzt. Die Proteine wurden elektrophoretisch auf einem 7,5%-Polyacrylamid-Gel
getrennt und auf Immobilon P überführt. Die Membran
wurde in Übereinstimmung
mit Standardtechniken gewaschen und über Nacht in primärem Antikörper inkubiert.
Der primäre
Antikörper
ist ein im Handel erhältlicher
monoklonaler Anti-Tau-Antikörper
(erhalten von Boehringer, Mannheim), verdünnt 1 : 2000 in Blotto (5%
getrocknete Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,6). Nach dem Waschen
wurde die Membran mit Ziegen-anti-Maus-F(ab')2, konjugiert
mit Meerettichperoxidase (1 : 1500), für eine Stunde inkubiert. Nach
dem Waschen wurde die Meerettichperoxidase mit einem Nachweis-Kit
mit verbesserter Chemilumineszenz (Amersham) sichtbar gemacht und
Hyperfilm ECL ausgesetzt (siehe Y. Namba et al., Brain Res. 541,
163 (1991)).
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In 1 sind
Werte angegeben, welche eine Demonstration der Bindung von Tau an
ApoE3 bereitstellen. Der geschlossene Pfeil zeigt die Position des
ApoE3/Tau-Komplexes an; der offene Pfeil zeigt die Position des
aminoterminalen 22-kDa-Fragments des ApoE3/Tau-Komplexes an. Die
Bedingungen für
die verschiedenen Bahnen sind wie folgt: Bahn 1) Tau-40 allein;
Bahn 2) Tau-40 und ApoE3; Bahn 3) Tau-40 und ApoE4; Bahn 4) Tau-40 und aminoterminales
22-kDa-Fragment von ApoE3; Bahn 5) Tau-40 und 22-kDa-Fragment von
ApoE4; Bahn 6) ApoE3 allein; Bahn 7) ApoE4 allein; Bahn 8) Blindprobe;
Bahn 9) Tau-40 und ApoE3, inkubiert und dann in Laemmli mit β-Mercaptoethanol
gekocht; Bahn 10) Tau-40 und ApoE4, inkubiert und dann in Laemmli
mit β-Mercaptoethanol
gekocht.
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Diese Werte zeigen, daß in vitro
ApoE3 rekombinant exprimiertes Tau bindet, wobei ein bimolekularer Komplex
gebildet wird, der Dissoziation durch Kochen in 2%igem Natriumdodecylsulfat
widersteht. Wie in 1 gezeigt
ist, hat der ApoE3/Tau-Komplex ein scheinbares Molekulargewicht
von ungefähr
105000 Dalton (Tau-40-Isoform in diesen Experimenten, 68000 Dalton;
glycosyliertes ApoE3, 39000 Dalton) und wird in keiner Proteinzubereitung
allein beobachtet. Die Bindung von Tau und ApoE3 ist innerhalb von
dreißig
Minuten bei 37°C
maximal und ist zwischen pH 7,6,6 vorhanden. Der ApoE3/Tau-Komplex
wird durch Kochen mit dem Reduktionsmittel β-Mercaptoethanol zerstört (1).
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BEISPIEL 2 UND 3
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APOE4 BINDET NICHT AN
TAUWEDER APOE3 NOCH APOE4 BINDEN AN PHOSPHORYLIERTES TAU
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Die pH-unabhängige Bindung von Tau und ApoE3,
die Abwesenheit von Tau-Bindung mit ApoE4 und die Abwesenheit von
Bindung von phosphoryliertem Tau mit entweder ApoE3 oder ApoE4 sind
in 2A und 2B gezeigt. ApoE3 (2A) oder ApoE4 (2B) wurden mit entweder
Tau-40 (Bahnen 1–5
in sowohl 2A als auch 2B) oder phosphoryliertem
Tau-40 (Bahnen 6–10
in sowohl 2A als auch 2B) in Zitronensäure-Na2HPO4-Puffer (6)
bei dem angezeigten pH für
30 min bei 37°C
inkubiert. Die Inkubation wurde, wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben,
gestoppt, die Proteine wurden durch Elektrophorese getrennt und
dann auf Immobilon überführt. Tau-immunoreaktives
Material wurde wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben nachgewiesen.
In 2A und 2B zeigt der geschlossene
Pfeil die Position des ApoE3/Tau-Komplexes an und zeigen offene
Pfeile vorhergesagte Positionen von ApoE4/Tau- oder ApoE3/P-Tau-Komplexen
an. Phosphoryliertes Tau wurde durch Inkubieren von rekombinantem
Tau-40 mit dem Überstand
von homogenisiertem Gehirn in Übereinstimmung
mit bekannten Techniken (siehe J. Biernat et al., EMBO J. 11, 1593
(1992)) hergestellt. Man beachte die langsamere Wanderung von phosphoryliertem
Tau (markiert b), verglichen mit nichtphosporyliertem Tau (markiert
a). Die 2A und 2B zeigen zusammengenommen,
daß es
unbedeutende Bindung von Tau durch ApoE4 unter einer Vielfalt von
Bedingungen, einschließlich
vermehrter Dauer der Inkubation, vermehrter Konzentration von ApoE4
oder zwischen pH 7,6–4,6
gibt.
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In gepaarten helikalen Filamenten
ist Tau an ser-pro- und thr-pro-Stellen abnorm phosphoryliert (siehe N.
Gustke et al., FEBS Letter 307, 199 (1992)). Rekombinantes Tau kann
an diesen Stellen in Übereinstimmung
mit bekannten Techniken durch Inkubation mit einem Extrakt von rohem
Rattenhirn phosphoryliert werden (siehe J. Biernat et al., vorstehend).
Rekombinantes Tau, das durch diese Mittel phosphoryliert war, wurde sogar
mit verlängerter
Inkubation von zwölf
Stunden durch weder ApoE3 noch ApoE4 gebunden (2A und 2B).
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BEISPIEL 4
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HERSTELLUNG VON APOE3-FRAGMENTEN
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Das Plasmid pTV 194, das ApoE3 mit
voller Länge
in Escherichia coli exprimiert (T. Vogel et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82, 8696–8700
(1985)), wurde modifiziert, um vier carboxylterminal verkürzte Varianten von
ApoE3 zu erzeugen. Diese Varianten enden an den Resten 266 (Glu),
244 (Glu), 223 (Ser) und 191 (Arg). Sie unterscheiden sich von nativem
ApoE3 nur dadurch, daß sie
ein anfängliches
Methionin an dem Aminoende haben und an dem endständigen Carboxyl
verkürzt
sind. Sie werden als Met-E266, Met-E244,
Met-E223 bzw. Met-E191 bezeichnet.
Die kürzeste
Variante, Met-E191, ist mit dem 22-kDa-Thrombin-Fragment von ApoE
(Reste 1–191) äquivalent.
Die Verkürzungen
wurden durch Einführen
von Stopcodons erzeugt, wobei mutagene Primer und die Polymerasekettenreaktion
verwendet wurden, um DNA-Inserts zu erzeugen, die in pTV 194 1igiert wurden.
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Der Stamm E. coli N4830-1 (Pharmacia
LKB, Uppsala, Schweden) wurde mit den vorstehend beschriebenen Ligationsprodukten
transformiert, und Kolonien auf Ampicillin-Platten wurden auf das
Vorhandensein von Inserts und auf geeignete Proteinexpression gescreent.
Die Integrität
jedes Konstrukts wurde durch doppelsträngige DNA-Sequenzierung bestätigt (R.
Kraft et al., BioTechniques 6, 544 (1988)). Humanes ApoE3 und seine
zwei hauptsächlichen
thrombolytischen Fragmente wurden in Übereinstimmung mit bekannten
Techniken hergestellt (T. Innerarity et al., J. Biol. Chem. 258,
12341 (1983); S. Rall et al., Methods Enzymol. 128, 273 (1986)).
Verkürzte
Proteine wurden in Übereinstimmung
mit Standardtechniken exprimiert und gereinigt (siehe H. Yorie et
al., J. Biol. Chem. 267, 11962 (1992)). Gereinigte Proteine wurden
in 100 mM NH4HCO3 dialysiert,
nach dem Verfahren von Lowry (J. Biol. Chem. 193, 265 (1951)) quantifiziert
und bis zum Gebrauch bei –20°C gehalten.
Durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE),
durchgeführt wie
früher
beschrieben (J. Wetterau et al., J. Biol. Chem. 263, 6240 (1988)),
wurde bewertet, daß die
Zubereitungen zu mehr als 98% rein waren.
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BEISPIEL 5
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APOE3-FRAGMENT-BINDUNG
AN TAU
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Die Bindung von ApoE3-Fragmenten
an Tau ist in 3 gezeigt.
Rekombinante Fragmente von ApoE3 wurden wie vorstehend in Beispiel
4 beschrieben hergestellt und gereinigt, und 2 μg Protein wurden mit Tau-40
inkubiert, wie ebenfalls vorstehend beschrieben ist. Der Pfeil in 3 zeigt Tau-40, 68000 kDa,
an. Die Bedingungen in 3 sind
wie folgt: Bahn 1) Tau-40 allein; Bahn 2) Tau-40 und ApoE3 (natives
Protein; Aminosäuren
1–299);
Bahn 3) Tau-40 und aminoterminales 22-kDa-Fragment von ApoE3 (Aminosäuren 1–191); Bahn
4) Tau-40 und rekombinantes ApoE (Aminosäuren 1–244); Bahn 5) Tau-40 und rekombinantes
ApoE (Aminosäuren
1–266),
Bahn 6) Tau-40 und rekombinantes ApoE (Aminosäuren 1–272); Bahn 7) Tau-40 allein; Bahn
8) Tau-40 und ApoE4 (natives Protein; Aminosäuren 1–299); Bahn 9) Tau-40 allein.
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ApoE enthält zwei funktionell wichtige
Domänen,
eine, die den LDL-Rezeptor, und die andere, die Lipoproteinteilchen
bindet (VLDL oder HDL). Thrombin spaltet ApoE an den Resten 191
und 215 und ergibt ein aminoterminales 22-kDa-Fragment und ein carboxylterminales
10-kDa-Fragment (W. Bradley et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.
109, 1360 (1982); T. Innerarity et al., vorstehend). Die Rezeptorbindungsdomäne befindet
sich innerhalb des aminoterminalen 22-kDa-Fragments, und das 10-kDa-Fragment enthält die Lipidbindungsregion
von ApoE (N. Gustke et al., vorstehend) und die Region, die das
Aβ-Peptid
bindet. Tau bindet an das aminoterminale 22-kDa-Fragment von ApoE3
(1). Rekombinante ApoE3-Fragmente,
1–244,
1–266 und
1–272,
binden äquivalente
Mengen von Tau, verglichen mit denen, die durch das 22-kDa-Fragment
(Aminosäuren
1–191)
gebunden werden (3).
So bindet Tau das Fragment von ApoE3, welches auch den LDL-Rezeptor
bindet, in einer Region, unterschiedlich von der Domäne (zwischen
den Aminosäuren
245–272), die
Lipoproteinteilchen und das Aβ-Peptid
bindet. Das aminoterminale 22-kDa-Fragment von ApoE4 bindet Tau
nicht (1).
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BEISPIEL 6
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MAP2C BINDET AN APOE3,
ABER NICHT AN APOE4
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Ratten-MAP2c (siehe Kindler et al.,
J. Biol. Chem., 265, 19679 (1990)) wurde durch eine Modifizierung einer
bekannten Verfahrensweise (Goedert and Jakes EMBO J. 9, 4225 (1990))
in Escherichia coli exprimiert. Das MAP2c-Protein wurde durch Innenaustausch-Chromatographie
auf einer Säule
Mono-S HR 5/5 (Pharmacia) unter Verwendung einer Modifizierung der
zuvor beschriebenen Verfahrensweise von Goedert und Jakes gereinigt.
Humane ApoE3- und ApoE4-Isoformen wurden unter Verwendung bekannter
Techniken (siehe Rall et al., Methods Enzymol., 128, 273 (1986))
von Patienten mit den E3/3- und E4/4-homozygoten Phänotypen isoliert.
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MAP2c (0,2 μg; endgültige Konzentration 3 × 10–7 M)
wurde mit 0,1 μg
ApoE3 oder ApoE4 (endgültige Konzentration
3 × 10–7 M)
in einem Gesamtvolumen von 10 μl
in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,30, bei 37°C für 1, 2 oder
4 Stunden inkubiert. Die Inkubation wurde durch Hinzufügen von
10 μl von
2 × Laemmli-Puffer
(2% Natriumdodecylsulfat, ohne (3-Mercaptoethanol) beendet. Die
Proben wurden für
5 Minuten in siedendem Wasser erhitzt. Die Proteine wurden elektrophoretisch
auf einem 7,5%igen Polyacrylamidgel getrennt und dann auf eine PVDF-Membran
(Millipore) überführt, wie
früher
beschrieben ist (Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90,
8098 (1993)). Die Membran wurde in Übereinstimmung mit Standardtechniken
gewaschen und über
Nacht in Antikörper
inkubiert. Der primäre
Antikörper
war ein im Handel erhältlicher
monoklonaler Anti-MAP2-Antikörper (erhalten
von Boehringer, Mannheim), der den MAP2c-ApoE-Komplex nachwies.
Die Bindung von MAP2c an ApoE3, die einen in Natriumdodecylsulfat
stabilen Komplex erzeugte, war innerhalb von 1 Stunde der Inkubation
nachweisbar (4; der
Pfeil zeigt den ApoE3/MAP2c-Komplex an). Jedoch wurde, sogar nach
einer Inkubation von 4 Stunden (Bahn E), keine derartige Bindung
von MAP2c durch ApoE4 beobachtet. 4 zeigt
Ergebnisse der MAP2c- und ApoE3-Inkubation; Ergebnisse der MAP2c- und
der ApoE4-Inkubation sind in 5 gezeigt.
In 4 und 5 erfolgte Inkubation mit
rekombinantem MAP2c für
1 Stunde (Bahn C); 2 Stunden (Bahn D); 4 Stunden (Bahne E); oder
8 Stunden (Bahn F). Die Bahnen A und H enthalten ApoE und kein MAP2c;
die Bahnen B und G enthalten MAP2c und kein ApoE.
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Um die niedrigste Konzentration von
ApoE3, die nachweisbar MAP2 bindet, zu bestimmen, wurden 0,2 μg MAP2c mit
0,1, 0,01 oder 0,001 μg
(endgültige
Konzentrationen von 3 × 10–7,
3 × 10–8 bzw.
3 × 10–9 M) ApoE3
in 10 μl
PBS für
2 Stunden bei 37°C
inkubiert. Wie in 6 zu
sehen, war der MAP2c-ApoE3-Komplex noch bei einer ApoE3-Konzentration
von 3 × 10–8 M
nachweisbar. Die Menge von gebundenem ApoE3 nahm mit der Konzentration
von ApoE3 zu. Die in 6 dargestellten
ApoE3-Konzentrationen
sind: 3 × 10–7 M
(Bahn A); 3 × 10–8 M
(Bahn B); und 3 × 10–9 M
(Bahn C). Bahn D enthielt MAP2c und kein ApoE3. Der Pfeil zeigt
den ApoE3/MAP2c-Komplex an.
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In ählicher Weise wurde die niedrigste
Konzentration von MAP2c, die an ApoE3 bindet, bestimmt, indem 0,1 μg ApoE3 mit
0,2, 0,02 oder 0,002 μg
MAP2c (endgültige
Konzentration von 3 × 10– 7, 3 × 10–8 bzw. 3 × 10–9 M)
in 10 μl
PBS für
2 Stunden bei 37°C
inkubiert wurden. Die in 7 angegebenen
Werte zeigten, daß der
MAP2c-ApoE3-Komplex bei einer MAP2c-Konzentration von 3 × 10– 9 M nachweisbar war. Die Menge des gebildeten
Komplexes nahm mit der MAP2c-Konzentration zu. Die in 7 dargestellten MAP2c-Konzentrationen
sind: 3 × 10–8 M
(Bahnen A und B); 3 × 10–9 M
(Bahnen C und D). Die Bahnen A und C enthielten kein ApoE3. Der
Pfeil zeigt den ApoE3/MAP2c-Komplex an.
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Diese Ergebnisse demonstrieren, daß MAP2c
mit hoher Avidität
ApoE3 bindet, aber ApoE4 nicht bindet. Diese Ergebnisse unterstützen weiterhin
die verallgemeinerte Schutzfunktion der ApoE3-Bindung an Mikrotubulus-assoziierte
Proteine, einschließlich
Tau.
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BEISPIEL 7
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APOE IST IN
HIPPOKAMPALEN NEURONEN VORHANDEN
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Immunozytochemie wurde verwendet,
um ApoE3-Lokalisation in dem Hippokampus von histologisch bestätigten Fällen von
Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD) und normalen
Kontrollen zu vergleichen (Han et al., Experimental Neurology, im
Druck). ApoE-Lokalisation wurde mit Aβ-nachgewiesener Plaque und Tau-nachgewiesener
Tangle-Pathologie verglichen.
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Verfahren: Gehirne wurden eine bis
drei Stunden nach dem Tod von 24 AD-Patienten, 5 Patienten mit idiopathischer
PD ohne Demenz, 8 PD-Patienten mit Demenz (AD-Pathologie) und sechs
klinisch untersuchten nicht demenzkranker Patienten, die an nicht-neurologischer
Krankheit starben, gesammelt. Die 24 AD-Patienten schlossen jeden
hauptsächlichen
ApoE-Genotyp ein: APOE 3/3, APOE 3/4 und APOE 4/4. Die pathologischen
Diagnosen wurden durch Routineuntersuchung unter Verwendung von
auf dem Fachgebiet bekannten Techniken gestellt. Der mittlere hippokampale
Block mit angrenzendem unteren temporalen Gyrus wurde für immunozytochemische
Analyse verwendet. APOE-Genotypisierung wurde für jeden Patienten wie früher beschrieben
unter Verwendung von Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion
ausgeführt
(Saunders et al., Neurology, 43, 1467 (1993)).
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Immunozytochemie: Routinemäßige Blöcke der
hippokampalen Region, des Frontallappens und des Parietallappens,
entnommen bei der Autopsie, wurden 5–7 Tage lang in 10%igem Formalin
fixiert und dann zur pathologischen Analyse in Paraffin eingebettet.
Paraffinschnitte von 6–8
Mikrometern wurden geschnitten und auf beschichteten Objektträgern für Immunozytochemie
befestigt. Die Schnitte wurden entparaffiniert, für 3–5 Minuten
mit 90%iger Ameisensäure
behandelt, gewaschen und dann zur Immunlokalisation mit spezifischen Antikörpern inkubiert.
Die verwendeten Antikörper
waren: polyklonaler Kaninchenantikörper für humanes ApoE (Verdünnung 1
: 5000), welcher auf Western Blots eine einzelne Bande zeigt und
mit allen ApoE-Isoformen reagiert (Strittmatter et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 90, 1977 (1993) und Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 90, 8098 (1993)); monoklonales Mäuse-„Clone Tau-2" für Rinder-Tau
(Verdünnung
1: 1000, Leinco Technologies, St. Louis, MO), welches sowohl phosphoryliertes
als auch nichtphosphoryliertes humanes Tau erkannte (Binder et al., 1985);
monoklonales Mäuse-„Clone
10D5" für Aβ 1–28 (Athena
Neurosciences), welches beta-gefaltetes Aβ-Fragment erkennt (Hyman et
al., J. Neuropath. Exp. Neurol., 51, 76 (1992)). Kontrollen des
Verfahrens, unter Auslassung von primärem Antikörper oder Substitution von
anderen Mäuse-Monoklonalen, wurden
mit jeden Durchlauf einbezogen. Für ApoE wurde Präimmunserum
parallel mit den gleichen Konzentrationen wie der post-immune primäre Antikörper laufen
gelassen. Parallele Kontrollen waren ungefärbt. Der Tau-Antikörper färbte bei
Patienten mit AD-Pathologie zuverlässig und empfindlich senile oder
neuritische Plaquen, Neuropilfäden
und Neuronen mit mutmaßlichen
neurofibrillären
Tangles oder ungeordnetem Zytoskelett.
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Immunozytochemie für ApoE wurde
für jeden
der vorstehenden Fälle
auf routinemäßigen Paraffinschnitten
von dem Paraffin-fixierten hippokampalen Block durchgeführt und
mit Immunozytochemie von β-Amyloid
(Aβ) und
Tau kombiniert, um senile Plaque und neuronale Pathologie zu definieren.
Die Ergebnisse spiegeln fest gebundenes ApoE wider, dessen Antigenität resistent
gegenüber
chemischer Fixierung, Extraktion während der Prozeduren der Fixierung,
Dehydratisierung, Paraffineinbettung und Entwachsung war und weiterhin
der Extraktion während
der Ameisensäurebehandlung
widerstand.
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Immunozytochemische Analyse: Mehrere
Personen beobachteten Schnitte von jedem Fall. In der Analyse wurden
nur Schnitte von der hippokampalen Region verwendet. Neuronen, die
als ApoE-immunoreaktiv
angegeben wurden, waren diejenigen, die mehrere Felder zeigten,
die immunoreaktive Neuronen enthielten, die dunkel genug waren,
um mit einem 10X-Objektiv (2,92 mm2 Feld)
bemerkt zu werden, und wo zytologische und immunochemische Identifizierung
bei höherer
Vergrößerung positiv
war. Angrenzende Schnitte, analysiert auf ApoE-Tau-Colokalisation,
wurden von zwei Beobachtern unter Verwendung der Camera Lucida und
eines 20X-Objektivs untersucht. Jedes Feld wurde mit geeigneten
Erkennungspunkten dargestellt und auf jedem Schnitt wurden immunoreaktive
Neuronen verglichen.
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Ergebnisse in Kontrollen und nicht
demenzkranken PD-Patienten: Die Ergebnisse sind in TABELLE 1 angegeben.
ApoE-Immunoreaktivität
ließ Färbung von
Gliazellen, deren Morphologie der von Astrozyten ähnelte,
zahlreichen kleinen und größeren zerebralen
Gefäßen und
oftmals Ependymzellen, die den hippokampalen Recessus des Seitenventrikels
auskleideten, sehen. Die am meisten intensive und übereinstimmende ApoE-Immunofärbung erfolgte
in den Wänden
zerebraler Gefäße (nicht
gezeigt). Diese Färbung
schloß kleine Parenchymgefäße ebenso
wie an die Ependymgrenze angrenzende größere Gefäße ein. Meningeale Gefäße waren
gewöhnlich
nicht stark immunoreaktiv. ApoE-Immunoreaktivität (ApoE-IR) wurde auch in der
gelegentlichen senilen Plaque (SP) oder im amyloiden Gefäß (ungeeignet,
den CERAD
-Kriterien für AD-Diagnose
zu entsprechen, außer
in einem Fall, siehe TABELLE 1) beobachtet, welche leicht mit Aβ-Färbung in
angrenzenden Schnitten nachgewiesen wurde. ApoE-IR wurde in Gliazellen
beobachtet, von denen durch ihre Größe angenommen wurde, daß sie Astrozyten
sind. Im allgemeinen variierte die Intensität von ApoE-Immunoreaktivität in Gehirnen
von nicht demenzkranken Personen in breitem Maße, wobei vier von den sechs
Fällen
relativ schwache Färbung
von Gefäßen und
Gliazellen, kaum oberhalb des Untergrunds der Kontrollen, aufwiesen.
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ApoE-Immunoreaktivität wurde
in hippokampalen Neuronen von 2 der sechs nicht demenzkranken Kontrollgehirne
gefunden. Das Gehirn eines Patienten (APOE 3/4) erfüllte die
CERAD-Kriterien
für AD-Pathologie
für Plaque-Zählungen,
aber hatte im wesentlichen keine neurofibrillären Tangles (keine Werte angegeben).
Die andere normale Kontrolle (APOE 3/3) hatte mehrere Felder von
ApoE-IR-Neuronen
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ApoE-Immunoreaktivität wurde
in fünf
PD-Fällen
ohne Demenz gefunden. Bei jedem der fünf Patienten wurden mehrere
Felder von ApoE-immunoreaktivem hippokampalen Neuron beobachtet.
Gliale und vaskuläre
Färbung ähnlich nicht
demenzkranken Kontrollen wurde ebenfalls beobachtet.
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Bei den sechs nicht demenzkranken
normalen Kontrollen und den fünf
PD-Patienten stellten ApoE-immunoreaktive Neuronen deutlich Färbung von
Neuronen ohne Tau-Immunoreaktivität oder neurofibrilläre Tangles
dar. Bei keinem dieser elf Patienten waren nennenswerte Tau-immunoreaktive
Neuronen vorhanden oder wurden während
routinemäßiger neurophathologischer
Untersuchung Neuronen mit neurofibrillären Tangles nachgewiesen.
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ApoE bei AD-Patienten und demenzkranken
PD-Patienten: In allen 24 AD-Fällen
wurde ApoE-Immunoreaktivität von zerebralen
Gefäßen, Gliazellen,
von denen vermutet wurde, daß sie
Astrozyten sind, und hippokampalen Neuronen beobachtet und war qualitativ ähnlich derjenigen,
die bei nicht demenzkranken Kontrollen gesehen wurde. Zusätzlich zu
ApoE-Immunoreaktivität
von senilen Plaquen wurden amyloide Gefäße und Neuronen mit neurofibrillären Tangles,
wie früher
beschrieben, gefunden (Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 90, 1977 (1993)). Es wurden keine signifikanten Unterschiede
in der ApoE-Immunolokalisation unter den APOE-Genotypen gefunden,
abgesehen von einer größeren Anzahl
amyloider meningealer Gefäße und größeren Plaquedichten
in vielen APOE-4/4-Fällen,
wie früher
berichtet, durch Aβ-Immunolokalisation (Schmechel
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 9649 (1993)). Hippokampale
Schnitte von acht Patienten mit PD und Demenz (AD-Pathologie) wurden
ebenfalls untersucht; ApoE-Immunlokalisation in diesen acht Fällen ähnelte derjenigen,
die in AD-Fällen
beobachtet wurde (TABELLE 1).
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ApoE-Immunoreaktivität und Aβ-nachgewiesene
extrazelluläre
Amyloid-Ablagerungen: ApoE-Immunoreaktivität korrelierte
im allgemeinen mit Aβ-Immunoreaktivität in angrenzenden
Schnitten einschließlich
diffusen subpialen Ablagerungen, amyloiden Gefäßen und senilen Plaquen (Werte
nicht angegeben). Stark ApoE-immunoreaktive amyloide Gefäße in angrenzenden
Schnitten waren ebenfalls Aβ-immunoreaktiv. Übereinstimmend
mit früheren
Berichten (Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90,
1977 (1993); Schmechel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 9649
(1993)) unterstützen
diese Ergebnisse eine enge Entsprechung zwischen ApoE und Amyloid-Ablagerung.
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ApoE-Immunoreaktivität von vaskulären Endothelzellen
und Gliazellen: Im Gegensatz zu Kontrollen stand die ApoE-Immunoreaktivität in AD-Gehirnen
offensichtlich in Zusammenhang mit sowohl parenchymalen als auch
meningealen Gefäßen. Zusätzlich zur
Färbung
von Kapillaren und kleinen Gefäßen, die
in Kontrollen gesehen wurde, waren mittlere bis große Gefäße bei AD-Patienten
oft stark immunoreaktiv für
ApoE-Antikörper
(Werte nicht angegeben). Ausgedehnte Regionen von ApoE-immunoreaktiven Gliazellen
und zerebralen Gefäßen in sowohl
grauer als auch weißer
Substanz des Hippokampus waren bei AD-Patienten aller ApoE-Genotypen
(Werte nicht angegeben) häufig.
In einigen Fällen
konnten intensive isolierte Herde von ApoE-immunoreaktiven Gliazellen
mit der Morphologie von Astrozyten nahe bei und umgebend ein einzelnes ApoE-IR-Gefäß beobachtet
werden (Werte nicht angegeben). Die Möglichkeit, daß einige
dieser immunoreaktiven Gliaprofile aktivierte Mikrogliazellen darstellten,
konnte nicht ausgeschlossen werden, da in den Kontrollgehirnen keine
Zellen mit klar mikroglialer Morphologie beobachtet wurden.
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ApoE-Immunoreaktivität von Neuriten
in senilen Plaquen: ApoE-Immunozytochemie von AD-Gehirnen ließ zahlreiche immunoreaktive
Plaquen erkennen (Werte nicht angegeben). Mit nur wenigen Ausnahmen
entsprach jeder immunoreaktive ApoE-Herd einer Aβ-immunoreaktiven Plaque (Werte
nicht angegeben). Jedoch war, während
die ApoE-Immunoreaktivität übereinstimmend
senile Plaquen nachwies, der Charakter der ApoE-Färbung nicht
identisch mit Aβ-Immunoreaktivität.
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ApoE-Immunoreaktivität von hippokampalen
Neuronen bei AD-Patienten: In dem Hippokampus von AD-Patienten waren
ApoE-immunoreaktive Neuronen bei allen Patienten häufig (Werte
nicht angegeben). Die ApoE-immunoreaktiven Neuronen waren in veränderlicher
Anzahl in allen Sektoren des Hippokampus und der angrenzenden Temporallappenrinde
vorhanden, wobei sie in einigen Fällen Neuronen der Körnerzellschicht des
Gyrus dentatus einschlossen.
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Beziehung von ApoE-immunoreaktiven
Neuronen zu Tau-nachgewiesenen neurofibrillären Tangles: In vielen Fällen hatte
das Muster der Apo-Immunoreaktivität in einigen Neuronen deutlich
die Morphologie intrazellulärer
neurofibrillärer
Tangles mit linearer, Zytoplasma verzerrender immunoreaktiver Gestalt.
Jedoch war es öfter
nicht sofort ersichtlich, daß ApoE-
und Tau-Immunoreaktivität in dem
gleichen Neuron vorhanden sein könnten,
abgesehen von der Tatsache, daß der
spezielle Sektor eine reichliche Anzahl von gesondert identifizierten
ApoE- und Tau-immunoreaktiven Neuronen enthielt. ApoE-Tau-Cololoka1isation
in benachbarten Schnitten, gefärbt
für Aβ-, Tau- und
ApoE-Immunolokalistion,
wurde versucht. Es wurden hippokampale Neuronen gefunden, die sowohl
ApoE-immunoreaktiv
als auch Tau-immunoreaktiv waren (Werte nicht angegeben). Andere
Tau-immunoreaktive Neuronen in dem angrenzenden ApoE-Neuron waren
nicht gefärbt.
Diese Werte lassen vermuten, daß einige
ApoE-immnoreaktive Neuronen bei AD-Patienten Tau-immunoreaktiv sind, aber
daß ApoE-
und Tau-Immunoreaktivität
unter den Bedingungen dieser Untersuchung (Formaldehydfixierung,
Paraffineinbettung und Entwachsen, Ameisensäurebehandlung) häufiger nicht überlappen.
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Dem Überlappen von ApoE- und Tau-Immunoreaktivität wurde
sich auch zugewandt, indem mit der Camera Lucida die Profile von
ApoE- und Tau-immunoreaktiven Neuronen in angrenzenden Schnitten
dargestellt wurden und Koinzidenzen der Färbung verglichen wurden. Zählungen
von mehreren Feldern im CAI-2-Sektor und im entorhinalen Kortex
(ca. 380 Neuronen insgesamt) eines einzelnen Patienten ließ eine extensive
Anzahl von ApoE- und Tau-immunoreaktiven pyramidalen Neuronen in
jedem Feld erkennen (100 Tau-IR-Neuronen/mm2 und
1010 ApoE-IR-Neuronen/mm2 pro Feld) (Werte
nicht angegeben).
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Diskussion: Die vorliegende Untersuchung
der ApoE-Lokalisation im humanen Hippokampus und ihre Beziehung
zu Aβ- und
Tau-definierter AD-Pathologie war darauf angelegt, systematisch
zu untersuchen, ob (1) ApoE an relevanten Zellstellen mit AD-Pathologie
vorhanden ist und ob (2) das Vorhandensein von ApoE in Neuronen
eine direkte und frühe
Rolle in der neuronalen Pathologie unterstützen würde. Die immunozytochemischen
Ergebnisse unterstützen
die erwartete Lokalisation von ApoE in Astrozyten. Korrelation mit
Aβ-Lokalisation
bei AD-Patienten bestätigt
den nahen Zusammenhang von ApoE mit extrazellulären Amyloid-Ablagerungen in
senilen Plaquen und zerebralen Gefäßen. Diese Erkenntnisse zeigen
an, daß ApoE
nicht nur in den erwarteten nicht-neuronalen Zellklassen in dem
Hippokampus älterer
Menschen – Astrozyten,
vaskuläre Endothelzellen
und Ependymzellen – vorhanden
ist, sondern auch in hippokampalen Neuronen ohne neurofibrilläre Veränderungen
vorhanden ist. Intraneuronales ApoE ist nicht spezifisch für AD, da
ApoE auch in hippokampalen Neuronen in zwei von sechs nicht demenzkranken
Kontrollen, ebenso wie in dreizehn Gehirnen von Patienten mit Parkinson-Krankheit mit und
ohne Demenz gefunden wurde. Diese Erkenntnisse zeigen an, daß ApoE im
Inneren vieler „normaler" hippokampaler pyramidaler
Neuronen bei älteren
Personen vorhanden ist, und stellen eine mögliche Basis für die Wirkung
von ApoE auf den neuronalen Metabolismus bereit.
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Die Ergebnisse zeigen, daß ApoE-
und Tau-immunoreaktive Neuronen in befallenen Sektoren des Hippokampus
von AD-Patienten zahlreich sind, und daß es eine signifikante Überlappung
geben kann. Die Beobachtung von ApoE in Neuronen mit neurofibrillären Tangles
in vielen normalen Kontrollen und Patienten ohne AD läßt vermuten,
daß ApoE
imstande sein würde,
die neuronale Pathologie von AD von den frühesten Zeitpunkten an zu beeinflussen.
Die vorstehenden Werte zeigen an, daß neurofibrilläre Tangles
ein Nebenprodukt von abnormem ApoE/Tau-neuronalen Metabolismus sein
können.
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BEISPIEL 8
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Apolipoprotein
und Lokalisation in kortikalen Neuronen
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Trotz Berichten über ApoE in Neuronen mit neurofibrillären Tangles
(siehe z. B. Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90,
1977 (1993)) ist das Vorhandensein von ApoE in anderen Neuronen
noch umstritten. Um die subzelluläre Verteilung von ApoE auf
dem ultrastrukturellen Niveau zu bestimmen, wurden chirurgische Prüfstücke von
humanen Temporallappen von fünf
Patienten erhalten, die sich wegen internistisch schwer zu behandelnder
Temporallappenepilepsie einer Temporallappenentfernung unterzogen.
Nach Fixieren, Schneiden und spezieller Immunozytochemie für ApoE wurde
das Gewebe für
Licht- und Elektronenmikroskopie verarbeitet. Inspektion dieses
Gewebes im Elektronenmikroskop unterstützte frühere lichtmikroskopische Beobachtungen
humaner Gehirne von Patienten mit AD und bejahrten Kontrollen: ApoE
war in Astrozyten stark lokalisiert und schwächer, aber gerade so definitiv,
in Neuronen lokalisiert (Strittmatter et al, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 90, 1977 (1993); Han et al., Exp. Neural. (1994) (im Druck)).
In Gliazellen füllte
ApoE-Immunoreaktivität
das perinukleare Zytoplasma ebenso wie distale Prozesse. In Neuronen
war ApoE-Immunoreaktivität
in einer punktförmigen
Weise lokalisiert und war auf den Zellkörper beschränkt. Das Vorhandensein von
ApoE in kortikalen Neuronen von AD-Patienten in altersmäßig angepaßten Kontrollen
und relativ jungen Patienten mit Epilepsie läßt vermuten, daß das astrozytische
Protein ApoE in einigen kortikalen Neuronen häufig vorhanden sein kann. Weiterhin
bringt die Lokalisation von ApoE in dem Zellkörper von Neuronen es in eine
Position, um mit dem intraneuronalen, Mikrotubulus-assoziierten
Protein, Tau, in Wechselwirkung zu treten und so die Geschwindigkeit
der AD-Pathologie zu beeinflussen (siehe Strittmatter et al., Exp.
Neurol., 125, 163 (1994)).
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Gewebezubereitung: Blöcke von
Temporallappengewebe wurden zu der Zeit der Operation von der Temporallappenrinde
von drei männlichen
und zwei weiblichen internistisch schwer zu behandelnden Anfall-Patienten,
die im Alter von 21 bis 55 Jahre reichten, und bei der Autopsie
von einem 77 Jahre alten männlichen
Patienten mit Alzheimer-Krankheit (AD-Patient) erhalten. Das Gewebe
wurde sofort in 4 %iges Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer
(pH 7,4) gelegt. Bald danach wurden die Blöcke von jedem Fall in zwei Portionen
geschnitten, wobei eine Portion in 4%igem Paraformaldehyd belassen
wurde und die andere in eine Lösung
mit 2% Paraformaldehyd/0,2% Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer
(pH 7,4) überführt wurde.
Nach Immersionsfixierung für
24 Stunden bei 4°C
wurden beide Blöcke
in 0,05 M Phosphatpuffer mit normaler Kochsalzlösung (PBS) gespült und bis
zum Zerschneiden für
die Immunozytochemie in 2%igem Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer
(pH 7,4) aufbewahrt.
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Immunozytochemie mit Voreinbettung:
Serienschnitte wurden auf einem Vibratom mit 35–50 Mikrometern geschnitten
und freischwimmend in PBS gesammelt. Die Schnitte wurden in frisch
hergestellter 90%iger Ameisensäure
für 3–5 Minuten
oder in 1% Methanol-Wasserstoffperoxid für 5 Minuten vorbehandelt, um
die Immunogenität
zu erhöhen
und um endogene Peroxidaseaktivität zu unterdrücken. Nach
einer Serie von drei Spülungen
in PBS für
jeweils 5 Minuten wurden die Schnitte für 1 Stunde bei Raumtemperatur
und dann über Nacht
bei 4°C
in einer Lösung,
enthaltend einen monoklonalen Mäuse-Antikörper, gegen
humanes ApoE (3H1, verdünnt
1 : 1000 in 2%igem normalen Ziegenserum) inkubiert. Der 3H1-Antikörper wurde
unter Verwendung von Tests der Hemmung von Heparinbindungsstellen
auf ApoE entdeckt und erkennt die Aminosäurereste 243–272 (Weisgraber
et al., J. Biol. Chem. 261, 2068 (1986)).
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Nach 3 Waschungen für jeweils
5 Minuten in PBS wurden die Gewebeschnitte dann für 30 Minuten
in biotinyliertem Pferde-anti-Maus-IgG (verdünnt 1 : 50, Vector Laboratories,
Burlingame, CA) inkubiert, nachfolgend gewaschen und für 30 Minuten
in Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (Vector Laboratories) inkubiert.
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Die Peroxidaseaktivität wurde
durch Inkubieren der Schnitte für
7–10 Minuten
in einer Lösung,
enthaltend 0,01% 3,3'-Diaminobenzidin
(DAB) und 0,0003% Wasserstoffperoxid in PBS, sichtbar gemacht. Um nichtspezifische
Bindung auszuschließen
und die Spezifität
sicherzustellen, wurden Kontrollreaktionen an angrenzenden Schnitten
durchgeführt,
wobei entweder das primäre
Antiserum weggelassen wurde oder der relevante sekundäre Antikörper durch
einen in einer anderen Spezies gezüchteten ersetzt wurde. Nach
der DAB-Reaktion wurden 35-Mikrometer-Schnitte auf Objektträgern befestigt,
in einer Serie von Alkoholen dehydratisiert, in Xylol geklärt und mit
einem Deckglas bedeckt. Die 50-Mikrometer-Schnitte wurden für Elektronenmikroskopie
verarbeitet.
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Elektronenmikroskopie: Die immunoumgesetzten
50-Mikrometer-Schnitte wurden in einer Lösung von 1% Osmiumtetroxid
in 0,1 M Phosphatpuffer nachfixiert, in einer abgestuften Serie
von Alkoholen dehydratisiert und in Epon flach eingebettet. Nach
lichtmikroskopischer Beobachtung der gehärteten Schnitte wurden kleine
Bereiche, enthaltend ApoE-immunoreaktive Neuronen und Gliazellen,
aus dem Schnitt zurechtgeschnitten, auf eine Epon-Stütze geklebt
und auf einem Reichert-Ultramikrotom zu ungefähr 80 nm geschnitten. Diese Schnitte
wurden auf Formvar-beschichteten Gittern mit Schlitzen gesammelt
und zur Beobachtung unter dem Elektronenmikroskop JEOL 1200EX mit
80 kV ungefärbt
belassen. Die Schnitte wurden untersucht und interessierende Bereiche
wurden mit Vergrößerungen
von 4400–20000
X für weitere
Analyse photographiert.
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Lichtmikroskopische Ergebnisse: Mit
dem Lichtmikroskop wurde ApoE-Immunoreaktivität in Schnitten beobachtet,
die sowohl aus dem Autopsie-Prüfstück des Temporallappens
des Patienten mit AD als auch aus den fünf chirurgischen Prüfstücken des
Temporallappens genommen wurden (Werte nicht angegeben). Sowohl
bei dem AD- als auch dem Temporallappenepilepsie-Material war das
Muster der Immunoreaktivität
spezifisch für
den anti-ApoE-Antikörper,
und es wurde in Kontrollschnitten keine Färbung beobachtet. In den AD-Fällen entsprachen
Plaquen, viele Gliazellen und das Muster der Immunoreaktivität früheren Beobachtungen
in unserem Laboratorium über
ApoE-Lokalisation in Prüfstücken von
humanem Gehirn, erhalten bei der Autopsie von 32 Patienten, die
normale Kontrollen, Patienten mit AD und Patienten mit Parkinson-Krankheit einschlossen
(Han et al., Exp. Neurol (1994) (im Druck)). In den chirurgischen
Fällen,
wo keine neuritischen Plaquen oder neurofibrillären Tangles beobachtet wurden,
waren nur Gliazellen und Neuronen ApoE-immunoreaktiv (Werte nicht
angegeben).
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ApoE-Immunoreaktivität wurde
in Gewebe beobachtet, das in 2% Paraformaldehyd/0,2% Glutaraldehyd
fixiert war, ebenso wie in Gewebe, das in 4%igem Paraformaldehyd
fixiert war; jedoch war die ApoE-Immunoreaktivität in dem Gewebe, das in nur
Paraformaldehyd fixiert war, robuster. In diesen Gewebeblöcken war
die Färbung
von astrozytischen Gliazellen besonders dicht und vollständig; intensive
ApoE-Immunoreaktivität
war nicht nur in dem dünnen
Rand von Zytoplasma, das den Zellkern umgab, vorhanden, sondern
auch in den Prozessen, wenn sie sich durch das Neuropil ausbreiteten
und wenn sie an Blutgefäßen endeten
(Werte nicht angegeben). Im Gegensatz dazu war die Färbung von
Neuronen weniger intensiv und auf die Region von Zytoplasma gerade
um den Zellkern herum und in proximalen Prozessen beschränkt (Werte
nicht angegeben). Gelegentlich wurden ApoE-immunoreaktive Satellitengliazellen
in enger Nachbarschaft zu markierten Neuronen beobachtet.
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Ausgeprägte Astrogliose wurde sowohl
in dem AD-Gehirn als auch in den chirurgischen Temporallappen-Prüfstücken beobachtet,
und intensive ApoE-Färbung
von Astrozyten wurde besonders in Schicht I und in subkortikaler
weißer
Substanz beobachtet. Gefärbte
Gliazellen schlossen Zellen mit der Morphologie von protoplasmatischen
und fibrillären
Astrozyten ebenso wie neuronale Satellitengliazellen ein. Es wurde
keine offensichtliche Immunoreaktivität von Oligodendrozyten der
weißen
Substanz beobachtet. Es wurde etwas Färbung von Endothelzellen und
Blutgefäßwänden beobachtet.
Es wurde etwas Färbung
von Endothelzellen und Blutgefäßwänden beobachtet
und wurde der starken Einhüllung
astrozytischer Endfüßchen zugeordnet.
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Elektronenmikroskopische Ergebnisse:
Kontrollschnitte, die parallel unter Weglassen von primärem Antikörper umgesetzt
wurden, waren auf dem Niveau des Lichtmikroskops ungefärbt (Werte
nicht angegeben), und es wurde in ihren dünnen Begleitschnitten im ultrastrukturellen
Niveau in keiner Zellklasse ein Immunopräzipitat gefunden (Werte nicht
angegeben). Im Gegensatz dazu ließen Schnitte, die mit anti-ApoE-Antikörper umgesetzt
waren, auf lichtmikroskopischem Niveau stark gefärbte Gliazellen erkennen (Werte
nicht angegeben) und zeigten auf dem Niveau des Elektronenmikroskops
reichliche Profile von stark immunoreaktiven Gliazellen mit dichtem
HRP-Reaktionsprodukt, das ihre Zellkörper und Prozesse füllte (Werte
nicht angegeben). Obgleich Immunoreaktivität oft die äußeren Membranen von Mitochondrien
ausstattete, wurde keine spezifische Kompartimentierung des Reaktionsprodukts
beobachtet. Die meisten Strukturen waren stark immunomarkiert, und
die Markierung anderer angemessener Organellen, wie beispielsweise
Golgi-Vesikel oder Cisternae, konnte nicht gesichert werden. Die
gleiche intensive Immunoreaktivität der Somas von Gliazellen
wurde auch in zahlreichen kleineren Prozessen in dem umgebenden
Neuropil beobachtet. Basierend auf den Lichtmikroskop-Schnitten
und auf ihrer intensiven Immunoreaktivität sind diese Prozesse wahrscheinlich
kleinere distale Prozesse immunoreaktiver Gliazellen. In diesen
Prozessen wurden keine assoziierten synaptischen Dichten oder Vesikel
beobachtet. Die starke Immunoreaktivität von Astrozyten aus dem Soma
gegenüber
distalen Prozessen wird durch die Färbung der astrozytischen Endfüßchen unterstützt, die
auf zerebralen Blutgefäßen endete,
welche über
ihre gesamte Ausdehnung stark immunoreaktiv waren (Werte nicht angegeben).
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In ApoE-immunoumgesetzten Schnitten
war viel von dem Neuropil ungefärbt.
Insbesondere waren häufig
große
ungefärbte
Bereiche von feinen axonalen und dendritischen Prozessen mit gelegentlichen
Profilen von stark immunoreaktiven, vermutlich astrozytischen Prozessen
zu sehen. Färbung
von Neuronen oder Neuropil wurde in den Kontrollschnitten nicht
beobachtet (Werte nicht angegeben). In ApoE-immunoumgesetzten Schnitten, untersucht
auf dem ultrastrukturellen Niveau, waren häufig Neuronen zu finden, die
in Regionen von Neuropit, die immunoreaktive Prozesse enthielten,
keine Immunoreaktivität
enthielten. Jedoch waren, wie durch die für Lichtmikroskopie hergestellten
Begleitschritte vermutet, einige Neuronen deutlich ApoE-immunoreaktiv.
Im Gegensatz zu den Gliazellen enthielten diese Neuronen Reaktionsprodukt,
das leichter und in punktförmiger
Verteilung war (Werte nicht angegeben). Wie in Gliazellen war die
ApoE-Immunoreaktivität
nicht auf irgendein besonderes subzelluläres Kompartiment begrenzt,
sondern war eher in Klumpen in dem Zytoplasma vorhanden, anscheinend
assoziiert mit der Membran des endoplasmatischen Retikulums oder
anderen Organellen und Zellstrukturen. Schweres Immunopräzipitat
wurde auf den äußeren Membranen
von Strukturen mit dem Aussehen von Mikrokörpern ebenso wie auf Mitochondrien
gesehen (Werte nicht angegeben); Immunopräzipitat im Inneren definierter
Organellen oder auf dem Plasma oder der Kernmembran wurde nicht gesehen.
Ungleich der Situation für
Gliazellen wurde trotz Inspizieren vieler Felder mit Profilen von
distalen prä-
und postsynaptischen neuronalen Elementen, eng angrenzend an stark
immunoreaktive kleine Prozesse, von denen vermutet wurde, daß sie glial
sind, kein Beweis für
irgendeine Immunoreaktivität
oder irgendwelche identifizierten distalen neuronalen Prozesse,
weder axonal noch dendritisch, gefunden.
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Diese Ergebnisse demonstrieren die
Immunolokalisation von ApoE in kortikalen Neuronen ebenso wie in
Gliazellen. Der zusätzliche
licht- und elektronenmikroskopische Beweis für neuronale Lokalisation von
ApoE steht im Gegensatz zu dem häufig
vertretenen Gesichtspunkt, daß ApoE
nur in Astrozyten und Gliazellen lokalisiert ist (siehe z. B. Rebeck
et al., Neuron 11, 575 (1993)). Die meisten früheren Untersuchungen zu der Immunolokalistion
von ApoE sind in Nagetiergehirn ausgeführt worden und haben über das
Vorhandensein von ApoE in Gliazellen und insbesondere Astrozyten
berichtet. Eine astrozytische Lokalisation für ApoE paßt zu der Beobachtung, daß ApoE rnRNA
nur in Gliazellen und nicht in Neuronen im zentralen Nervensystem
gefunden wird.
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Die vorliegenden Ergebnisse demonstrieren,
daß (a)
ApoE in der Zellkörperregion
vieler kortikaler Neuronen ist, (b) ApoE in dem Zytoplasma vorhanden
ist, (c) ApoE X oftmals mit der äußeren Membranoberfläche einiger,
aber nicht aller intrazellulären
Organellen assoziiert ist und (d) der scheinbare Gehalt von ApoE in
Neuronen weniger reichlich ist als in Gliazellen.
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Der Mißerfolg bei der Beobachtung
neuronaler Lokalisation von ApoE in anderen Untersuchungen könnte zurückzuführen sein
auf angewendete Immunoreagenzien, Verlust von Antigen/Veränderung
von Antigen während
der Fixierung und Verarbeitung, und Spezies oder individuelle Unterschiede
in der ApoE-Lokalisation.
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Schließlich sind die meisten Untersuchungen,
die über
die Abwesenheit von ApoE in Neuronen berichten, in Nagetieren durchgeführt wurden.
Wir finden, daß bei
Nagetieren ApoE in kortikalen Neuronen kaum lokalisiert ist, oftmals
nur in älteren
Prüfstücken (Arbeit
in Vorbereitung). Wie in Beispiel 7 beschrieben ist, wurde in normalen,
humanen bejahrten Kontrollen Lokalisation von ApoE in hippokampalen
Neuronen in 2 von 6 Fällen
gefunden, und neuronale ApoE-Lokalisation wurde in im wesentlichen
allen Fällen
von AD und PD gefunden.
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Diese Ergebnisse zeigen an, daß ApoE direkt
an neuronaler Funktion beteiligt ist und in einer Position ist,
um mit dem Mikrotubulus-assoziierten Protein, Tau, in Wechselwikung
zu treten.
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Die vorstehenden Beispiel sind veranschaulichend
für die
vorliegende Erfindung und sollen nicht als deren Begrenzung ausgelegt
werden. Die Erfindung wird durch die folgenden Ansprüche definiert.