DE69836740T2

DE69836740T2 - Amyloid beta protein (globulärer aufbau und seine verwendung)

Info

Publication number: DE69836740T2
Application number: DE69836740T
Authority: DE
Inventors: A. Grant Glenview KRAFFT; L. William Winnetka KLEIN; A. Brett Evanston CHROMY; P. Mary Glenview LAMBERT; E. Caleb Altadena FINCH; Todd Manhattan Beach MORGAN; Pat Los Angeles WALS; Irina Pasadena ROZOVSKY; Ann Evanston BARLOW
Original assignee: Northwestern University; University of Southern California USC
Current assignee: Northwestern University; University of Southern California USC
Priority date: 1997-02-05
Filing date: 1998-02-05
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2018-02-06
Also published as: JP2001501972A; DE69836740D1; BR9807185A; PT998495E; US7638283B2; ES2280090T3; CA2279555A1; EP1808444A1; JP3512815B2; AU6273598A; CA2279555C; US6218506B1; EP0998495B1; JP2004091492A; DK0998495T3; ATE349467T1; EP0998495A1; AU735825B2; WO1998033815A1; US20060166275A1

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine neue Substanz-Zusammensetzung, „amyloid beta-derived dementing ligands" (ADDL). ADDL umfassen das Amyloid-β-Peptid, das zu löslichen, globulären, nicht fibrillären oligomeren Strukturen assembliert wird, die zur Aktivierung spezifischer Zellprozesse fähig sind. Gegenstand der Erfindung ist auch die Bereitstellung von Verfahren zur Bestimmung der Bildung, des Vorliegens, der Rezeptor-Proteinbindung und der Zellaktivitäten von ADDL. Auch beschrieben sind Verbindungen, die die Bildung oder Aktivität von ADDL blockieren und Verfahren zur Identifizierung solcher Verbindungen. Die ADDL-Bildung und -Aktivität ist unter anderem relevant für das Lernen und Gedächtnis. Die Modulation der ADDL-Bildung oder -Aktivität kann folglich erfindungsgemäß zur Behandlung von Lern- und Gedächtnisstörungen ebenso wie für andere Erkrankungen, Störungen oder Zustände eingesetzt werden, die auf die Wirkungen der ADDL zurückzuführen sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Alzheimer-Krankheit stellt eine progressive, neurodegenerative Erkrankung dar, die durch distinkte Pathologien gekennzeichnet ist, einschließlich neurofibrillärer Tangles, neuritischer Plaques, neuronaler Atrophie, des dendritischen „Prunings" und des neuronalen Tods. Aus historischer Perspektive hat sich die definitive Diagnose der Alzheimer-Krankheit immer auf die Identifizierung spezifischer pathologischer Kennzeichen verlassen, nämlich auf die neurofibrillären Tangles, welche das kollabierte Cytoskelett toter und sterbender Neuronen darstellen, und die neuritischen Plaques, bei denen es sich um extrazelluläre Ablagerungen von verschiedenen Protein-, Lipid-, Kohlenhydrat- und Salzverbindungen handelt, deren primäre Proteinkomponente ein Peptid mit 39–43 Resten, das als Amyloid-β bekannt ist, darstellt.
Vom Standpunkt der Auswirkung der Erkrankung her gesehen sind es jedoch die sich bei der Alzheimer-Krankheit manifestierenden Symptome, nämlich der Gedächtnisverlust, die Erosion kognitiver Funktionen und die signifikanten Veränderungen der Persönlichkeit und des Verhaltens, die am bedeutendsten sind. Diesen symptomatischen Veränderungen liegen spezifische Zellmechanismen zu Grunde, die zur Funktionsstörung der Nervenzellen und allmählich zu ihrer Degeneration und ihrem Tod führen. Diese Zellmechanismen wirken zweifelsohne in einer Hintergrundsumgebung, die verschiedentlich einen gewissen Schutzgrad bietet oder dazu beitragende und exazerbierende Wirkungen ausübt. Das Ergebnis stellt eine sehr breite Alters-/Inzidenzverteilungskurve, mit wenigen Hinweisen aus Populationsstudien, die auf spezifische Ursachen deuten würden, dar.
Die Molekulargenetik stellt einen Bereich von Studien dar, in dem sich ein klares Bild von der familiären Alzheimer-Krankheit abzuzeichnen beginnt. Wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird, geht nun aus Studien, die Mutationen in drei verschiedenen Proteinen, APP und den Presenilinen 1 und 2, identifizieren, deutlich hervor, dass es sich bei der zur Alzheimer-Krankheit (AD) führenden endgültigen gemeinsamen Bahn, um die verstärkte Produktion von Amyloid-β 1–42 (ebenso wie Amyloid-β 1–43) handelt, die in allen von diesen verschiedenen Mutationen der familiären AD vorkommt. Dies ist besonders bemerkenswert, weil sich ADDL, der hierin beschriebene erfindungsgemäße zentrale Fokus, nur als stabile Entitäten aus dieser längeren Amyloidform und nicht aus der prävalenteren kürzeren Form Aβ 1–40 bilden.
Amyloid-β bei der Alzheimer-Krankheit.
Im Jahr 1984 gelang Gienner und Wong die Isolierung und Identifizierung des mit der Alzheimer-Krankheit assoziierten cerebrovaskulären Amyloids (Glenner et al., Biochem. Biophys. Res. Commun, 120, 885–890, 1984a). Daran anschließend wurden die gleichen Peptide mit 39–43 Resten, nun als Amyloid-β bekannt, als die bedeutende Proteinkomponente der neuritischen Plaques bei der Alzheimer-Krankheit identifiziert (Glenner et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 122, 1131–1135, 1984b; Masters et al., EMBO J., 4, 2757–2764, 1985a; Masters et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 4245–4249, 1985b). Hierbei handelte es sich um das erste Mal, dass ein diskretes Molekül mit der Alzheimer-Krankheit, einer Erkrankung, die bis zu diesem Zeitpunkt lediglich durch neuroanatomische und neuropathologische Beschreibungen charakterisiert worden war, in Verbindung gebracht wurde. Amyloid-β wurde auch als die Plaque-Komponente in Gehirnen von Menschen mit Down-Syndrom identifiziert (Glenner et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 122, 1131–1135, 1984b; Masters et al., EMBO J., 4, 2757–2764, 1985a; Masters et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 4245–4249, 1985b), was zu dem Hinweis führt, dass das Gen, das für sie codiert, auf dem Chromosom 21 vorkommen könnte. Bis 1987 hatte eine Anzahl an Gruppen die Sequenzangaben zu Amyloid-β und Verfahren der Molekulargenetik zur Validierung dieses Hinweises genutzt, indem sie das Gen für das Amyloid-Präkursor-Protein (APP) identifizierten (Kang et al., Nature, 325, 733, 1987; Tanzi et al., Science, 235, 880–884, 1987).
Das APP-Gen stellt ein großes Multiexon-Gen dar, dass differenziell in eine Anzahl von APP gespleißt wird (besprochen in Selkoe, in: Annual Review of Neuroscience, Cowan (Hrsg.), 17, ix + 623 S., 489–517, 1994). Die Proteine stellen große Transmembranproteine dar, von denen nun bekannt ist, dass sie über mehrere Bahnen prozessiert werden, von denen eine oder mehr Amyloid-β generieren kann/können. Die frühesten Studien zum APP-Processing hatten darauf hingewiesen, dass es sich bei der Bildung von Amyloid-β um keinen normalen Vorgang handelt (Esch et al., Science, 248, 1122–1124, 1990; Sisodia et al., Science, 248, 492–495, 1990), obwohl sich in anschließenden Studien an kultivierten Zellen und der Analyse von Serum und Cerebrospinalflüssigkeit herausgestellt hat, dass die Bildung von Amyloid-β als ein normaler Vorgang in vielen Zelltypen abläuft, obwohl seine Bildung gegebenenfalls keine prädominante allgemeine Bahn darstellen könnte.
Genetische Pivotalstudien zur DNA von Personen, die an der familiären Alzheimer-Krankheit mit frühem Beginn leiden, zeigten, dass Mutationen in einem einzelnen Gen, diesem gleichen APP-Gen, für diese sehr schwere Form der Erkrankung kausal waren. Interessanterweise wurden mehrere verschiedene Mutationen im APP-Gen gefunden, einschließlich drei verschiedener einzelner Restsubstitutionen an Val 717, vier Reste unterstromig vom C-Terminus von Amyloid-β 1–42 (Goate et al., Nature, 349, 704–6 1991; Chartier-Harlan et al., Nature, 353, 844–6 1991; Murrell et al., Science, 254, 97–9, 1991) und eine Mutation, bestehend aus zwei Resten (670–671), unmittelbar oberstromig vom N-Terminus von Amyloid-β, die mit der familiären Alzheimer-Krankheit mit frühem Beginn in einer schwedischen Familie assoziiert ist (Mullan et al., Nature Genetics 1, 345–347, 1992). Wenn ein Vektor, der für die cDNA der schwedischen Mutante des APP-Gens codiert, zur Bewertung des APP-Processing in Zelllinien transfiziert wurde, wurde beim Vergleich mit den Spiegeln vom Wildtyp-APP (Citron et al., Nature, 360, 672–674, 1992; Cai et al., Science, 259, 514–516, 1993) gefunden, dass 6–8-mal mehr Amyloid-β gebildet wurde. Es wurde auch nachgewiesen, dass Hirngewebe-Extrakte, die native humane Hirn-Proteaseaktivitäten enthalten, dazu in der Lage waren, ein fluorogenes Oktapeptid-Substrat, das die schwedische Mutation umfasst, um mehr als das 100fache schneller als das entsprechende auf der Wildtyp-Sequenz basierende Substrat zu prozessieren (Ladror et al., J. Biol. Chem., 269, 18422-8, 1994). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Mechanismus, über den die schwedische Mutation die familiäre Alzheimer-Krankheit mit frühem Beginn verursacht, eine beträchtliche Überproduktion von Amyloid-β beinhaltet. Ähnliche Studien zur Amyloidbildung in mit der 717-Mutanten des APPs transfizierten Zellen wurden auch durchgeführt, die Spiegel des produzierten Amyloid-β unterschieden sich jedoch nicht von den vom Wildtyp-APP produzierten Spiegeln. Dies führte zu mechanistischen Spekulationen, dass etwas anderes als die Produktion von Amyloid-β für diese Mutationen pathogen war. Eine eingehendere Bewertung des Processing der 717-Mutanten des APP und des schwedischen Mutanten-APPs durch Younkin und Mitarbeiter (Suzuki et al., Science, 264, 1336–1340, 1994) stellte ein vereinheitlichtes Bild von diesen Fällen der genetischen Alzheimer-Krankheit bereit. In dieser Studie wurden nicht nur die Gesamtspiegel der Amyloid-β-Produktion bewertet, sondern es wurden auch die spezifischen Längen der produzierten Amyloid-β-Peptide analysiert. Die Ergebnisse bestätigten, dass die 717-Mutation zu mehr als einer Verdopplung des Verhältnisses von Amyloid-β 1–42 zu Amyloid-β 1–40 (einem hoch löslichen Peptid unter physiologischen Bedingungen) führte, obwohl sich die Spiegel des Gesamtamyloid-β nicht veränderten. Die vor kurzem entdeckten Mutationen von Presenilin 1 und 2 bei der familiären Alzheimer-Krankheit in Genen, die sich auf dem Chromosom 14 (Sherrington et al., Nature, 375, 754–758, 1995) bzw. Chromosom 1 (Levy-Lahad et al., Science, 269, 970–973, 1995) befinden, wurden auch mit einer signifikanten Überproduktion von Amyloid-β 1–42 in Verbindung gebracht (Mann et al., Annals of Neurology, 40, 149–56, 1996; Schuener et al., Nature Medicine, 2, 864–70, 1996). Auf der Grundlage dieser Befunde hat es den Anschein, dass der durch diese distinkt verschiedenen Mutationen der familiären Alzheimer-Krankheit vermittelte pathogene Vorgang die Produktion größerer Spiegel von Amyloid-β 1–42 darstellt. Hierbei handelt es sich um die Form des am schnellsten aggregierenden Amyloids (Snyder et al., Biophys. J., 67, 1216–28, 1994), welche die Aggregation von Amyloid-β zur Bildung neuritischer Plaques (Roher et al., Neurochem., 61, 1916–1926, 1993; Tamaoka et al., Biochem. Biophs. Res. Commun., 205, 834–842, 1994) aussät, und wie hierin beschrieben, die Form, die unerwartet als „ADDL" bezeichnete stabile Assemblierungen einer höheren Ordnung bildet.
Nichtamyloid-Plaque-Komponenten bei der Alzheimer-Krankheit.
Amyloid-β stellt die wichtige Proteinkomponente von Plaques dar, die mehr als 70 % des Gesamtproteins umfasst. Viele verschiedene andere Proteinkomponenten liegen auch vor, die jedoch α1-Antichymotrypsin (ACT), Heparinsulfat-Proteoglycane (HSPG), Apolipoproteine E und J, Butyrylcholinesterase (BChE), S-100B und mehrere Komplement-Komponenten einschließen. Während die Bedeutung dieser Komponenten zu Beginn und bei der Progression der Alzheimer-Krankheit nicht etabliert wurde, wurde die Beteiligung von Apo E-Isoformen an der Erkrankung anhand genetischer Studien von Roses und Kollegen etabliert (Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1977–81, 1993), die entdeckten, dass ein Polymorphismus im Apolipoprotein E-Gen, nämlich Apo E4, mit dem früheren Beginn der Alzheimer-Krankheit bei einer großen Reihe von Fällen der familiären Alzheimer-Krankheit mit spätem Beginn korrelierte. Sich anschließende Studien haben bestätigt, dass Gruppen von Personen mit Apo E4 ein signifikant größeres Risiko, an der Alzheimer-Krankheit zu erkranken aufweisen, und dass der Beginn der Alzheimer-Krankheit ungefähr mit der Gen-Dosierung für Apo E4 parallel läuft. Auf mechanistischer Ebene haben Studien zu erkennen gegeben, dass Apo E4 mit geringerer Affinität zu Amyloid-β als Apo E3 oder Apo E2, Isoformen, die mit dem späteren Beginn der Alzheimer-Krankheit assoziiert sind, binden. Es wurde vorgeschlagen, dass diese Isoformen durch eine wirksamere Clearance von Amyloid-β-1-42-Ablagerungen eine Schutzwirkung ausüben könnten (Ladu et al., J. Biol. Chem., 269, 23403–23406, 1994; Ladu et al., J. Biol. Chem., 270, 9039–42, 1995).
Die Rolle anderer Plaque-Komponenten ist nicht so eindeutig, obwohl neuere Studien (Oda et al., Exptl. Neurology, 136, 22–31, 1995) gezeigt haben, dass Apo J (Clusterin) die Toxizität von aggregiertem Amyloid-β 1–42 in vitro signifikant verstärken kann. Es wurde auch mitgeteilt, dass HSPG die Toxizität von Amyloid-β 1–40 verstärkt, wenn es in das Rattenhirn injiziert wird (Snow et al., Soc. Neurosci. Abstr., 18, 1465, 1992). Wright et al. (Ann Neurol. 34, 373–384, 1993) wiesen darauf hin, dass Amyloid-Plaques aus dem Gehirn bei Alzheimer-Krankheit signifikante BChE-Spiegel enthalten, während Amyloid-Plaques von älteren, nicht dementen Menschen diese nicht enthalten. Das inflammatorische Protein ACT im akuten Stadium wird im Gehirn bei Alzheimer-Krankheit auch upreguliert, und es ist bekannt, das es mit den N-terminalen 16 Resten von Amyloid-β assoziiert ist. Ma et al. (Ma et al., Nature, 372, 92–94, 1994) haben mitgeteilt, dass ACT die Aggregation von Amyloid-β 1–42 fördern kann, und diese Autoren vermuten, dass die geförderte Aggregation zu seiner Neurotoxizität beiträgt.
Zellresponses von Amyloid-β und in vivo-Pathologie.
Über die Plaques und Tangles hinausgehend, bei denen es sich um die Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit handelt, ist es eindeutig, dass eine Reihe von Zellresponses, sowohl in Neuronen als auch in den begleitenden Gliazellen, induziert wurden. Auf biochemischer Ebene ist die Hyperphosphorylierung des Tau-Proteins evident, die sich aus der Perturbation des Kinase-/Phosphatasegleichgewichts ergibt. Auf einer transkriptionalen Ebene werden viele verschiedene Gene zur Herstellung eines Spektrums von in der Regel nicht anwesenden oder nur in geringeren Spiegeln im Gehirn anwesenden Proteinen aktiviert. Es liegen auch signifikante Anzeichen vor, dass inflammatorische Prozesse aktiviert wurden. Insbesondere wurde dokumentiert, dass die Tau-Phosphorylierung durch aggregiertes Amyloid-β 1–42 in differenzierten SH-SY5Y-Zellen induziert wird (Lambert et al., J. Neurosci. Res., 39, 377–384, 1994), und dieses Ergebnis wurde in einem jüngeren Bericht von Busciglio et al. (Neuron, 14, 879–88, 1995) bestätigt, worin Amyloid-β die Tau-Phosphorylierung in kultivierten primären Neuronen aus dem Hippokampus von Ratten aktivierte.
Fibrilläres Amyloid-β und Neurodegeneration bei Alzheimer-Krankheit.
Der Mechanismus, über den Amyloid-β 1–42 die Alzheimer-Krankheit auslöst, wurde nicht abgeklärt, die Literatur enthält aber mehr als 200 Studien zur Amyloid-β-Neurotoxizität, von denen viele vor kurzem überprüft wurden (z. B. Yankner et al., Neuron, 16, 921–32, 1996; Iversen et al., Biochemical Journal, 311, 1–16, 1995). Die allgemeine Meinung besteht darin, dass sich Amyloid-β in fibrilläre Strukturen assemblieren muss, um toxisch zu sein (Pike et al., J. Neurosci., 13, 1676–87, 1993). Von Lösungen, die nur monomeres Amyloid-β enthalten, wurde wiederholt nachgewiesen, dass sie keine schädliche Wirkung auf Neuronen in Kultur ausüben. Überdies haben Studien die Bildung von Amyloid-β-Faltblatt enthaltenden Fibrillen und die Wahl des richtigen Zeitpunkts und das Ausmaß der Toxizität unter Verwendung von Verfahren, wie zum Beispiel des Zirkulardichroismus und der Elektronenmikroskopie zueinander in Beziehung gesetzt (Simmons et al., Molecular Pharmacology, 45, 373–9, 1994). Eine Studie folgerte explizit, dass Amyloid-β in fibrillärer Form existieren muss, um toxisch sein zu können (Lorenzo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12243–12247, 1994). Trotz dieses Konsens in Bezug auf die Amyloid-β-Struktur und -Aktivität, besteht weiterhin ein Problem hinsichtlich der Reproduzierbarkeit von veröffentlichten experimentellen Arbeiten, welche die Toxizität von Amyloid (Brining, Neurobiology of Aging, 18, 581–589, 1997) und eine weitverbreitete Variabilität der mit verschiedenen Amyloid-Chargen oder selbst mit der gleichen, auf leicht unterschiedliche Weise gehandhabten Amyloid-Charge erhaltenen Aktivität, trotz der identischen chemischen Zusammensetzung, beinhalten (May et al., Neurobiology of Aging, 13, 1676–87, 1993). Dies hat Fragen in Bezug auf die präzisen Strukturen von Amyloid-β, die für seine Aktivität verantwortlich sind, aufgeworfen.
Es wird erfindungsgemäß angestrebt, den Problemen im Stand der Technik zu begegnen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß die Bereitstellung einer neuen Substanz-Zusammensetzung, Amyloid β-Peptid, das zu löslichen, globulären, nicht fibrillären, oligomeren Strukturen (ADDL), die unerwartet neurotoxisch sind, assembliert wird. Diese und andere erfindungsgemäße Aufgaben und Vorteile ebenso wie zusätzliche erfinderische Merkmale, gehen aus der folgenden Beschreibung hervor.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 stellt ein Computer-erfasstes Bild von einem mit einem Densitometer gescannten, mit Silber gefärbten Polyacrylamidgel dar, welches die Elektrophorese von ADDL mit einer primären Bande, die ca. 30 kD entspricht, einer weniger reichlichen Bande, die ca. 17 kD entspricht, und keinen Hinweis auf Fibrillen oder Aggregate, zeigt.
2 stellt ein Computer-erfasstes Bild von einem mit einem Densitometer gescannten, mit Coomassie gefärbten SDS-Polyacrylamidgel dar, das die Elektrophorese von ADDL mit einer primären Bande (oberes Dublett) zeigt, die einer Größe von ca. 17 bis ca. 22 kD entspricht, und mit einer anderen Bande (untere dunkle Bande), die anzeigt, dass reichlich Monomer von 4 kD anwesend ist, wobei es sich vermutlich um ein Abbauprodukt handelt. Spuren: erste, molekulare Größenmarker; zweite ADDL-Präparation; dritte, schwerere Beladung mit der ADDL-Präparation.
3 stellt ein repräsentatives, Computer-erfasstes Bild einer AFM-Analyse von der ADDL-enthaltenden „Fraktion 3" (fraktioniert auf einer Superdex 75-Gelfiltrationssäule) dar.
4 stellt ein Computer-erfasstes Bild von mit einem Densitometer gescannten, mit Coomassie gefärbten SDS-Polyacrylamid-Gradientengel von ADDL dar, die durch Coinkubation mit Clusterin (Spur A) oder kaltem F12-Medium (Spur B) hergestellt wurden, und von ADDL, die durch Coinkubation mit Clusterin hergestellt wurden, und die durch eine Centricon 10 kD Cut-off-Membran (Spur C) passierten oder durch eine Centricon 10 kD Cut-off-Membran (Spur D) zurückgehalten wurden: MG, molekulare Größenmarker.
5 stellt eine graphische Darstellung der ADDL-Konzentration dar, die als Amyloid-β 1-42-Konzentratiön (nM) vs. tote Zellen (%) für Hirnschnitte aus mit den ADDL-Präparationen behandelten Mäusen gemessen wurde.
6 stellt ein Säulendiagramm dar, das die MTT-Reduktion (%) für PC 12-Zellen als Kontrolle, die nicht den ADDL ausgesetzt wurden („Kont"), PC 12-Zellen, die Clusterin allein ausgesetzt wurden („Apo J"), PC 12-Zellen, die monomerem Aβ („Aβ") ausgesetzt wurden, PC 12-Zellen, die Amyloid-β ausgesetzt wurden, das mit Clusterin coaggregiert und einen Tag gealtert wurde („Aβ:Apo J"), zeigt.
7 stellt einen FACScan dar, der die Fluoreszenz-Intensität (0–170) versus Ereignisse (0–300) für B103-Zellen zeigt, die nicht den ADDL (nicht schattierter Peak) ausgesetzt wurden und B103-Zellen, die an fluoreszenzmarkierte ADDL (schattierter Peak) gebunden waren.
8 stellt einen FACScan dar, der die Fluoreszenz-Intensität (0–200) versus Ereignisse (0–300) für hippokampale Zellen zeigt, die nicht den ADDL (nicht schattierter Peak, „–ADDL") ausgesetzt wurden, und hippokampale Zellen, die an fluoreszenzmarkierte ADDL (schattierter Peak, „+ADDL") gebunden waren.
9 stellt ein Säulendiagramm des maximalen prozentualen Anteils der ADDL-Bindung oder des durch ADDL hervorgerufenen Tods für B103-Zellen dar, die den Peptiden, die durch Trypsinisierung von B103-Zellen freigesetzt wurden, entweder nicht ausgesetzt („–") oder co-ausgesetzt („+") wurden.
10 stellt eine graphische Darstellung von der relativen ADDL-Konzentration vs. die toten Zellen (%) für Hirnschnitte aus Mäusen dar, die mit den ADDL-Präparationen behandelt wurden. Zur Bestimmung der relativen Konzentration wurde eine initiale Konzentration von 10 μM Aβ-Protein zur Bildung von ADDL am höchsten Datenpunkt (Punkt „16") eingesetzt, diese wurde anschließend auf die Hälfte (Punkt „8"), ein Viertel (Punkt „4") und dergleichen verdünnt.
11 stellt ein Säulendiagramm dar, das die im ELISA-Assay mittels ADDL-Bindung erhaltene optische Dichte zeigt, worin die B103-Zellen mit ADDL und dem 6E10-Antikörper coinkubiert wurden (Säule für „Zellen, ADDL, 6E10"), B103-Zellen mit ADDL coinkubiert wurden (Säule für „Zellen, ADDL"), B103-Zellen mit dem 6E10-Antikörper coinkubiert wurden (Säule für „Zellen, 6E10"), B103-Zellen allein inkubiert wurden (Säule für „Zellen"), der 6E10-Antikörper allein inkubiert wurde (Säule für „6E10") oder die optische Dichte des Verdünnungsmittels abgelesen wurde („Blind"-Säule).
12 stellt ein Säulendiagramm von toten Zellen (%) in entweder fyn +/+-Mäusen (Säulen für Wildtyp, „Fyn +"; kreuzschraffiert) oder fyn –/–-Mäusen (Säulen für Knockout, „Fyn"; ausgefüllt), entweder nicht behandelt („Medium") oder mit ADDL kontaktiert ("ADDL") dar.
13 stellt eine graphische Darstellung von der Aβ-Konzentration (μM) versus aktivierte Glia (Anzahl) dar, die nach Inkubation von Astrozyten mit ADLL (ausgefüllte Dreiecke) oder Aβ 17–42 (ausgefüllte Quadrate) erhalten wurde.
14 stellt eine graphische Darstellung von der Zeit (Minuten) versus die Spikeamplitude zur Baseline der Zellkörper (%) für Kontrollmäuse, die nicht mit ADDL behandelt wurden (ausgefüllte Dreiecke) oder Mäuse, die mit ADDL behandelt wurden (ausgefüllte Quadrate) dar.
15 stellt eine graphische Darstellung von der Zeit (Minuten) versus die mittlere Spikeamplitude für hippokampale Schnitte von Kontrollratten, die nicht den ADDL ausgesetzt wurden (ausgefüllte Dreiecke) versus hippokampale Schnitte von Ratten, die ADDL ausgesetzt wurden (ausgefüllte Quadrate), dar.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gegenstand der Erfindung ist eine neue Substanz-Zusammensetzung, die als „amyloid beta-derived dementing ligands" oder „amyloid beta-derived diffusible ligands" (ADDL) bezeichnet wird. ADDL bestehen aus Amyloid-β-Peptid, das zu löslichen, nicht fibrillären oligomeren Strukturen assembliert ist, die zur Aktivierung spezifischer Zellprozesse fähig sind. Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt besteht aus Verfahren zur Bestimmung der Bildung, Anwesenheit, Rezeptor-Proteinbindung und Zellaktivitäten von ADDL. Gegenstand der Erfindung sind weiter Assay-Verfahren und Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Bildung und/oder Aktivität von ADDL modulieren (z. B. verstärken oder vermindern). Solche Verbindungen können bei der Behandlung von Erkrankungen, Störungen oder Zuständen aufgrund der Wirkungen der ADDL eingesetzt werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In neurotoxischen Proben von Amyloid-β wurde nicht nur entdeckt, dass fibrilläre Strukturen existieren, sondern auch, dass unerwarteterweise einige kleine globuläre Proteinstrukturen existieren, die für die Neurotoxizität verantwortlich zu sein scheinen. Unter Verwendung neuer Verfahren wurden Proben, die prädominant diese löslichen globulären Proteinassemblierungen und keine fibrillären Strukturen enthalten, wie hierin beschrieben, herbeigeführt. In heterogenen Proben, die mittels verschiedener Verfahren hergestellt werden, beseitigt die Entfernung der größeren, fibrillären Amyloid-β-Formen mittels Zentrifugation nicht diese löslichen, globulären Amyloid-β-Assemblierungen in den Überstandsfraktionen. Diese Überstandsfraktionen weisen eine signifikant höhere Neurotoxizität als nicht fraktionierte Amyloid-β-Proben auf, die unter in der Literatur angegebenen Bedingungen aggregiert werden. Auf diese neuen und unerwarteten neurotoxischen löslichen, globulären Formen wird hierin als auf „amyloid beta-derived dementing ligands" oder „amyloid beta-derived diffusible ligands" (ADDL) verwiesen. Amyloid-β-Proben, die unter in der Literatur angegebenen Standardbedingungen (z. B. Pike et al., J. Neurosci., 13, 1676–1687, 1993) länger als drei Wochen „gealtert" wurden, verlieren ihre Neurotoxizität, obwohl diese Proben prädominant fibrilläre Strukturen mit wenig oder keinen ADDL enthalten. Diese Entdeckung, dass die globulären ADDL neurotoxisch sind, ist besonders überraschend, da aktuelles Denken der Annahme ist, dass es sich um die fribrillären Strukturen handelt, die die toxische Form von Amyloid-β ausmachen (Lorenzo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12243–12247, 1994; Howlett et al., Neurodegen, 4, 23–32, 1995).
Die ADDL können in vitro gebildet werden. Wenn eine Lösung (z. B. eine DMSO-Lösung), enthaltend monomeres Amyloid-β 1–42 (oder ein anderes entsprechendes Amyloid-β, wie hierin weiter beschrieben wird), in kaltem Gewebekulturmedium (z. B. F12-Zellkulturmedium) verdünnt wird, dann von ca. 2 bis ca. 48 Stunden bei ca. 4°C inkubieren darf und ca. 10 Minuten bei ca. 14 000 g bei einer Temperatur von 4°C zentrifugiert wird, enthält die Überstandsfraktion, z. B. in Kulturen von Nervenzellen und Hirnschnitten, kleine lösliche, oligomere Kügelchen, die hoch neurotoxisch sind. Die ADDL können auch durch Coinkubation von Amyloid-β mit bestimmten geeigneten Mitteln, z. B. Clusterin (einem senilen, auch als Apo J bekanntem Plaque-Protein) gebildet werden.
Die Analyse einer derartigen Überstandsfraktion mithilfe des Atomkraftmikroskops (AFM) zeigt, dass in der Fraktion eine Anzahl von Kügelchen verschiedener Größe vorliegen. Diese Kügelchen fallen in den Bereich von ca. 4,7 nm bis ca. 6,2 nm. Es können gegebenenfalls distinkte Spezies von Kügelchen vorliegen, die in diesen Bereich fallen. Eine geringe Variation der Höhenoberfläche resultiert nämlich daraus, wie die betreffenden Spezies zur Zeit der Analyse auf der Glimmeroberfläche sitzen. Trotz dieser geringen Variation scheinen jedoch zwei prädominante Größen von Kügelchen, d. h. von ca. 4,9 nm bis ca. 5,4 nm und von ca. 5,7 nm bis ca. 6,2 nm, vorzuliegen, die ca. 50 % der oligomeren Strukturen in einer typischen Probe ausmachen. Es kann auch eine Kügelchen-Spezies mit einer distinkten Größe mit Abmessungen von ca. 5,3 nm bis ca. 5,7 nm vorliegen. Es hat den Anschein, dass die Kügelchen mit Abmessungen von ca. 4,7 nm bis ca. 6,2 nm bei der AFM die Pentamer- und Hexamerform des oligomeren Amyloid-β-Proteins umfassen. Die Größe der Kügelchen bei der AFM von ca. 4,2 nm bis ca. 4,7 nm, scheint dem Aβ-Tetramer zu entsprechen. Die Größe der Kügelchen von ca. 3,4 nm bis ca. 4,0 nm, scheint dem Trimer zu entsprechen. Die Größe der Kügelchen von ca. 2,8 nm bis ca. 3,4 nm entspricht dem Dimer (Roher et al., J. Biol. Chem., 271, 20631–20635, 1996). Die Größe des Aβ-Monomers bei der AFM liegt im Bereich von ca. 0,8 nm bis ca. 1,8–2,0 nm. Monomeres und dimeres Amyloid-β sind in Nervenzellkulturen oder in organotypischen Hirnschnittkulturen nicht neurotoxisch.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist folglich die Bereitstellung einer isolierten und homogenen, löslichen, globulären, nicht fibrillären Amyloid-β-Proteinassemblierung (d. h. ADDL), die 4 bis 12 Amyloid-β 1-42-Proteine umfasst, worin die Struktur Neurotoxizität aufweist und kein Amyloid-β 1-40-Protein enthält. Gegenstand der Erfindung ist insbesondere die Bereitstellung einer isolierten Amyloid-β-Proteinassemblierung, worin die Assemblierung bevorzugt eine oligomere Form umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Tetramer, Pentamer und Hexamer. Die Proteinassemblierung weist optimal Neurotoxizitätsaktivität auf. Amyloid-β 1–42 mit Biocytin an Position 1 kann eingesetzt werden. Amyloid-β 1–42 mit einem Cystein am N-Terminus kann auch eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäße Assemblierung des isolierten Amyloid-β-Proteins umfasst gegebenenfalls Kügelchen mit Abmessungen von 4,7 nm bis 6,2 nm, wie anhand der Atomkraftmikroskopie gemessen wurde. Die Assemblierung des isolierten Amyloid-β-Proteins umfasst bevorzugt auch Kügelchen mit Abmessungen von 4,9 nm bis 5,4 nm, oder von 5,7 nm bis 6,2 nm, wie anhand der Atomkraftmikroskopie gemessen wurde. Insbesondere ist bevorzugt die erfindungsgemäße Assemblierung des isolierten Amyloid-β-Proteins dergestalt, dass von 30 % bis 85 %, noch bevorzugter von 40 % bis 75 % der Assemblierung zwei prädominante Kügelchengrößen umfassen, nämlich mit Abmessungen von 4,9 nm bis 5,4 nm, und von 5,7 nm bis 6,2 nm, wie anhand der Atomkraftmikroskopie gemessen wurde. Es ist jedoch auch wünschenswert, dass die Proteinassemblierung Kügelchen von einer Größe von 5,3 nm bis 5,7 nm mittels AFM umfasst.
Mit der nicht denaturierenden Gelelektrophorese laufen die Banden, die den ADDL entsprechen, bei von 26 kD bis 28 kD. Unter Denaturierungsbedingungen (z. B. auf einem 15%igen SDS-Polyacrylamidgel), umfassen die ADDL eine Bande, die bei von 22 kD bis 24 kD läuft, und können weiter eine Bande umfassen, die bei 18 kD bis 19 kD läuft. Demzufolge wird erfindungsgemäß bevorzugt eine Assemblierung eines isolierten Amyloid-β-Proteins (d. h. ADDL) bereitgestellt, die ein Molekulargewicht von 26 kD bis 28 kD, aufweist, wie durch die nicht denaturierende Gelelektrophorese bestimmt wurde. Gegenstand der Erfindung ist bevorzugt auch die Bereitstellung einer Assemblierung von isoliertem Amyloid-β-Protein (d. h. ADDL), die als eine Bande läuft, die einem Molekulargewicht von 22 kD bis 24 kD oder 18 bis 19 kD entspricht, wie anhand der Elektrophorese auf einem 15%igen SDS-Polyacrylamidgel bestimmt wurde.
Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung der Assemblierung des isolierten löslichen, nicht fibrillären Amyloid-β-Proteins offenbart. Dieses Verfahren umfasst optional die folgenden Schritte:

(a) Gewinnen einer Lösung aus monomerem Amyloid-β-Protein;
(b) Verdünnen der Proteinlösung in ein angemessenes Medium;
(c) Inkubieren des sich aus Schritt (b) ergebenden Mediums bei ca. 4°C;
(d) Zentrifugieren des Mediums bei ca. 14 000 g bei ca. 4°C; und
(e) Wiedergewinnen des sich aus der Zentrifugation ergebenden Überstands, der die Amyloid-β-Proteinassemblierung enthält. In Schritt (c) dieses Verfahrens wird die Lösung gegebenenfalls von ca. 2 Stunden bis ca. 48 Stunden, besonders von ca. 12 Stunden bis ca. 48 Stunden und am bevorzugtesten von ca. 24 Stunden bis ca. 48 Stunden inkubiert. In Schritt (d) dieses Verfahrens wird die Zentrifugation bevorzugt von ca. 5 Minuten bis ca. 1 Stunde, besonders von ca. 5 Minuten bis ca. 30 Minuten und optimal ca. 10 Minuten durchgeführt. Im Allgemeinen stellt dies jedoch nur eine Vorsichtsmaßnahme zur Entfernung von jedweden naszenten fibrillären oder protofibrillären Strukturen dar und könnte gegebenenfalls nicht notwendig sein, insbesondere wenn eine langzeitige Stabilität der ADDL-Präparation kein Problem darstellt.

Das Aβ-Protein wird in Schritt (b), gegebenenfalls bis zu einer Endkonzentration im Bereich von ca. 5 nM bis ca. 500 μM, insbesondere von ca. 5 μM bis ca. 300 μM, besonders zu ca. 100 μM verdünnt. Das „angemessene Medium", in das die Aβ-Proteinlösung in Schritt (b) verdünnt wird, stellt bevorzugt jedwedes Medium dar, das die ADDL-Bildung unterstützt, wenn nicht fördert. Insbesondere wird das F12-Medium (das sowohl gewerblich erhältlich ist, als auch leicht im Labor formuliert werden kann) zur Verwendung in diesem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt. Auf ähnliche Weise kann gegebenenfalls auch das „F12-Substitutionsmedium" eingesetzt werden. Das F12-Substitutionsmedium unterscheidet sich von F12-Medium, das gewerblich erhältlich ist oder das im Labor formuliert wird. Erfindungsgemäß umfasst das F12-Substitutionsmedium bevorzugt die folgenden Komponenten:
N,N-Dimethylglycin, D-Glucose, Calciumchlorid, Kupfersulfat-pentahydrat, Eisen(II)-sulfat-heptahydrat, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Natriumchlorid, Natriumbicarbonat, Dinatriumhydrogenphosphat und Zinksulfat-heptahydrat.
Das erfindungsgemäße synthetische F12-Medium umfasst optional insbesondere Folgendes: N,N-Dimethylglycin (von ca. 600 bis ca. 850 mg/l), D-Glucose (von ca. 1,0 bis ca. 3,0 g/l), Calciumchlorid (von ca. 20 bis ca. 40 mg/l), Kupfersulfat-pentahydrat (von ca. 15 bis ca. 40 mg/l), Eisen(II)-sulfat-heptahydrat (von ca. 0,4 bis 1,2 mg/l), Kaliumchlorid (von ca. 160 bis ca. 280 mg/l), Magnesiumchlorid (von ca. 40 bis ca. 75 mg/l), Natriumchlorid (von ca. 6,0 bis ca. 9,0 g/l), Natriumbicarbonat (von ca. 0,75 bis ca. 1,4 g/l), Dinatriumhydrogenphosphat (von ca. 120 bis ca. 160 mg/l) und Zinksulfat-heptahydrat (von ca. 0,7 bis ca. 1,1 mg/l). Das erfindungsgemäße synthetische F12-Medium umfasst optimal: N,N-Dimethylglycin (ca. 766 mg/l), D-Glucose (ca. 1,802 g/l), Calciumchlorid (ca. 33 mg/l), Kupfersulfat-pentahydrat (ca. 25 mg/l), Eisen(II)-sulfat-heptahydrat (ca. 0,8 mg/l), Kaliumchlorid (ca. 223 mg/l), Magnesiumchlorid (ca. 57 mg/L), Natriumchlorid (ca. 7,6 g/l), Natriumbicarbonat (ca. 1,18 g/l), Dinatriumhydrogenphosphat (ca. 142 mg/l) und Zinksulfat-heptahydrat (ca. 0,9 mg/l). Der pH des F12-Substitutionsmediums wird ferner zum Beispiel bevorzugt unter Verwendung von 0,1 M Natriumhydroxid, gegebenenfalls auf einen pH von ca. 7,0 bis ca. 8,5 und bevorzugt einen pH von ca. 8,0 eingestellt.
Das vorstehende Verfahren kann gegebenenfalls weiter durch Bildung der langsam sedimentierenden Proteinassemblierung in Gegenwart eines entsprechenden Mittels, wie zum Beispiel Clusterin, durchgeführt werden. Dies erfolgt zum Beispiel durch Zufügen von Clusterin in Schritt (c) und wie in den folgenden Beispielen dargelegt ist.
Wenn die ADDL durch die Inkorporation von 10 % biotinyliertem Amyloid-β 1–42 (oder einem anderen geeigneten biotinylierten Amyloid-β-Protein) hergestellt werden, können sie in einem Rezeptor-Bindungsassay unter Verwendung von Nervenzellen verwendet und zum Beispiel an einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierungsinstrument (FACS-Instrument) mit Markierung durch ein fluoreszierendes Avidinkonjugat durchgeführt werden. Anstelle der Inkorporation von Biotin in das Amyloid-β-Protein kann als Alternative ein anderes Reagenz, das zur Bindung des ADDL zur Bildung eines fluoreszenzmarkierten Moleküls fähig ist und das bereits einen Teil eines fluoreszenzmarkierten Konjugats darstellen kann, eingesetzt werden. Die Proteinassemblierung kann zum Beispiel dergestalt gebildet werden, dass das Amyloid-Protein einen anderen Bindungsteil einschließt, wobei ein „Bindungsteil" wie hierin verwendet, ein Molekül (wie zum Beispiel Avidin, Streptavidin, Polylysin und dergleichen) umfasst, das zur Bindung an ein Reagenz zur Bildung einer fluoreszenzmarkierten Verbindung oder eines Konjugats eingesetzt werden kann. Das „fluoreszierende Reagenz", an das die Proteinassemblierung bindet, braucht nicht selbst direkt zu fluoreszieren, sondern könnte gegebenenfalls lediglich durch Bindung an ein anderes Mittel zur Fluoreszenz fähig sein. Das fluoreszierende Reagenz, das die Proteinassemblierung bindet, kann zum Beispiel einen spezifischen Antikörper gegen ß-Amyloid (z. B. 6E10) umfassen, wobei die Fluoreszenz durch Verwendung eines fluoreszierenden sekundären Antikörpers generiert wird.
Zusammen mit anderen Experimenten kann die FACScan-Analyse an den B103-Zellen aus dem ZNS der Ratte ohne und mit ADDL-Inkubation durchgeführt werden. Die Ergebnisse dieser und weiterer Studien bestätigen, dass die Bindung an die Zelloberfläche sättigungsfähig ist, und eine kurze Behandlung mit Trypsin selektiv ein Subset von Zelloberflächenproteinen entfernt und die Bindung von ADDL eliminiert. Proteine, die durch eine kurze Behandlung mit Trypsin von der Oberfläche von B103-Zellen abspaltbar sind, verhindern auch die ADDL-Bindung an B103-Zellen oder kultivierte primäre hippokampale Neuronen von der Ratte. Diese Ergebnisse unterstützen alle, dass die ADDL durch einen bestimmten Zelloberflächenrezeptor wirken, und dass durch die ADDL vermittelte frühe Ereignisse (d. h. Ereignisse vor der Zellabtötung) vorteilhaft durch Verbindungen kontrolliert werden können (z. B. für die Behandlung oder Forschung), die die Bildung und Aktivität (z. B. einschließlich der Rezeptorbindung) der ADDL blockieren.
Gegenstand der Erfindung ist folglich die Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung von Verbindungen, die die Rezeptorbindung des ADDL modulieren (d. h. entweder fördern oder blockieren). Dieses Verfahren umfasst bevorzugt Folgendes:

(a) Kontaktieren getrennter Kulturen von Nervenzellen mit der Proteinassemblierung, entweder in An- oder Abwesenheit des Kontaktierens mit der Testverbindung;
(b) Zufügen eines Reagenzes, das an die Proteinassemblierung bindet, wobei das Reagenz fluoresziert;
(c) Analysieren der getrennten Zellkulturen durch fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren; und
(d) Vergleichen der Fluoreszenz der Kulturen, wobei Verbindungen, die die Rezeptorbindung der Proteinassemblierung blockieren, dadurch identifiziert werden, dass sie in einer reduzierten Fluoreszenz der Kultur resultieren, und Verbindungen, die die Rezeptorbindung fördern, dadurch identifiziert werden, dass sie im Vergleich zu der entsprechenden Kultur, die mit der Proteinassemblierung in Abwesenheit der Testverbindung in Kontakt gebracht wurde, in einer gesteigerten Fluoreszenz der Kultur resultieren. Anstatt des Zufügens eines fluoreszierenden Reagenzes, das selbst und von selbst dazu zu fähig ist, den Proteinkomplex zu binden, wird das Verfahren gegebenenfalls als Alternative durchgeführt, worin die Proteinassemblierung aus Amyloid-β 1-42-Protein (oder einem anderen Amyloid-β) gebildet wird, das dergestalt hergestellt wird, dass es einen Bindungsteil umfasst, der zur Bindung des fluoreszierenden Reagenzes fähig ist.

Auf ähnliche Weise kann das Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen eingesetzt werden, die die Bildung oder Rezeptorbindung der Proteinassemblierung modulieren (d. h. entweder fördern oder blockieren), umfassend:

(a) Herstellen getrennter Amyloid-β-Proben, die entweder mit der Testverbindung gemischt oder nicht gemischt wurden;
(b) Bilden der Proteinassemblierung in den getrennten Proben;
(c) Kontaktieren getrennter Kulturen von Nervenzellen mit den getrennten Proben;
(d) Zufügen eines Reagenzes, das an die Proteinassemblierung bindet, wobei das Reagenz fluoresziert;
(e) Analysieren der getrennten Zellkulturen durch fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren; und
(f) Vergleichen der Fluoreszenz der Kulturen, wobei Verbindungen, die die Bildung oder Rezeptorbindung der Proteinassemblierung blockieren, dadurch identifiziert werden, dass sie in einer reduzierten Fluoreszenz der Kultur resultieren, und Verbindungen, die die Bildung oder Rezeptorbindung der Proteinassemblierung fördern, dadurch identifiziert werden, dass sie, im Vergleich zur entsprechenden Kultur, die mit der Proteinassemblierung in Abwesenheit der Testverbindung in Kontakt gebracht wurde, in einer gesteigerten Fluoreszenz der Kultur resultieren. Anstatt des Zufügens eines fluoreszierenden Reagenzes, das selbst und von selbst dazu fähig ist, den Proteinkomplex zu binden, kann das Verfahren weiter durchgeführt werden, worin die Proteinassemblierung aus Amyloid-β-Protein gebildet wird, das dergestalt hergestellt wird, dass es einen Bindungsteil umfasst, der zur Bindung des fluoreszierenden Reagenzes fähig ist.

Die Fluoreszenz der Kulturen wird weiter optional mit der Fluoreszenz von Kulturen verglichen, die auf die gleiche Weise behandelt wurden, außer dass anstatt des Zufügens oder Nichtzufügens der Testverbindung vor der Bildung der Proteinassemblierung, die Testverbindung entweder nach der Bildung der Proteinassemblierung zugefügt wird oder nicht zugefügt wird. In dieser Situation werden Verbindungen, die die Bildung der Proteinassemblierung blockieren, dadurch identifiziert, dass sie in einer reduzierten Fluoreszenz der Kultur resultieren, und Verbindungen, die die Bildung der Proteinassemblierung fördern, dadurch identifiziert werden, dass sie im Vergleich zu der entsprechenden Kultur, die mit der Proteinassemblierung in Abwesenheit der Testverbindung in Kontakt gebracht wird, in einer gesteigerten Fluoreszenz der Kultur resultieren, nur wenn die Verbindung vor der Proteinassemblierung zugefügt wird.
Im Gegensatz dazu werden Verbindungen, die die Rezeptorbindung der Proteinassemblierung blockieren, dadurch identifiziert, dass sie in einer reduzierten Fluoreszenz in der Kultur resultieren, und Verbindungen, die die Rezeptorbindung der Proteinassemblierung fördern, dadurch identifiziert werden, dass sie im Vergleich zur entsprechenden Kultur, die mit der Proteinassemblierung in Abwesenheit der Testverbindung in Kontakt gebracht wird, in einer gesteigerten Fluoreszenz der Kultur resultieren, wenn die Verbindung entweder vor oder nach der Proteinassemblierung zugefügt wird.
Auf ähnliche Weise kann ein zellbasierter Assay, insbesondere ein zellbasierter Enzymelinked Immunosorbent Assay (ELISA) erfindungsgemäß zur Beurteilung der ADDL-Bindungsaktivität eingesetzt werden. Das Verfahren kann insbesondere zum Nachweis der Bindung der Proteinassemblierung an einen Zelloberflächenrezeptor eingesetzt werden. Dieses Verfahren umfasst bevorzugt:

(a) Bilden einer Proteinassemblierung aus Amyloid-β-Protein;
(b) Kontaktieren einer Kultur von Nervenzellen mit der Proteinassemblierung;
(c) Zufügen eines Antikörpers (z. B. 6E10), der diese Proteinassemblierung bindet, wobei dieser Antikörper einen konjugierenden Teil (z. B. Biotin oder ein anderes geeignetes Mittel einschließt);
(d) Auswaschen des ungebundenen Antikörpers;
(e) Verknüpfen eines Enzyms (z. B. Meerrettichperoxidase) mit genanntem Antikörper, der mittels des genannten konjugierenden Teils an die genannte Proteinassemblierung gebunden ist;
(f) Zufügen eines farblosen Substrats (z. B. ABTS), das durch genanntes Enzym gespalten wird, um eine Farbänderung zu ergeben; und
(g) Bestimmen der genannten Farbänderung (z. B. spektrophotometrisch) oder der Rate der Farbänderung als ein Maß der Rezeptorbindung von genannter Proteinassemblierung. Wie vorstehend beschrieben, kann es sich bei dem Antikörper um jedweden Antikörper handeln, der zum Nachweis von ADDL fähig ist (z. B. ein Antikörper, der auf eine exponierte Stelle auf Amyloid-β gerichtet ist), und der Antikörper-konjugierende Teil kann jedwedes Mittel darstellen, das zur Verknüpfung eines Nachweismittels (z. B. eines Enzyms) fähig ist. Das Enzym kann jedweden Teil (z. B. vielleicht sogar einen anderen als ein Protein) darstellen, der ein Mittel zum Nachweis (z. B. Farbänderung aufgrund der Spaltung eines Substrats) bereitstellt und kann weiter (z. B. kovalent oder nicht kovalent) an den Antikörper gebunden werden, der mittels eines anderen Teils (z. B. eines sekundären Antikörpers) an die Proteinassemblierung gebunden wird. Erfindungsgemäß werden die Zellen bevorzugt auch vor der Durchführung des Assays an ein festes Substrat (z. B. einen Gewebskultur-Kunststoff) angeheftet. Es braucht nicht speziell darauf hingewiesen werden, dass gegebenenfalls Schritt (b), wie hierin beschrieben, dergestalt durchgeführt werden sollte, dass die ADDL zum Binden an Zellen fähig sind. Ebenso sollte Schritt (c) bevorzugt für eine ausreichende Zeitdauer (z. B. von ca. 10 Minuten bis ca. 2 Stunden, gegebenenfalls für ca. 30 Minuten) und unter angemessenen Bedingungen (z. B. bei ca. Raumtemperatur, bevorzugt unter vorsichtigem Rühren) durchgeführt werden, damit der Antikörper an ADDL binden kann. Weiter können geeignete Blockierungsschritte, wie sie dem Fachmann zum Beispiel bekannt sind, unter Verwendung geeigneter Blockierungsreagenzien dergestalt durchgeführt werden, um jedwede nicht spezifische Bindung des Antikörpers zu reduzieren. Der Fachmann ist mit den ELISAs vertraut und kann Modifikationen an dem Assay dergestalt einsetzen, wie sie im Stand der Technik bekannt sind.

Der Assay kann gegebenenfalls auch durchgeführt werden, um auf diese Weise Verbindungen zu identifizieren, die die Bildung oder Rezeptorbindung der Proteinassemblierung modulieren (d. h. entweder fördern oder blockieren). In diesem Verfahren, wie auch in den zuvor beschriebenen Assays auf Testverbindungen, wird die Testverbindung der ADDL-Präparation, entweder vor dem Kontaktieren der Zellen mit den ADDL, zugefügt. Dieser Assay kann folglich zum Nachweis von Verbindungen eingesetzt werden, die die Bildung der Proteinassemblierung (z. B. wie zuvor beschrieben) modulieren. Die Testverbindung kann der ADDL-Präparation überdies vor dem Kontaktieren der Zellen (aber nach der ADDL-Bildung) oder den Zellen vor dem Kontakt mit ADDL zugefügt werden. Dieses Verfahren (z. B. wie zuvor beschrieben) kann zum Nachweis von Verbindungen eingesetzt werden, die die ADDL-Bindung an die Zelloberfläche modulieren. Eine Testverbindung kann auch dem Gemisch aus Zellen plus ADDL zugefügt werden. Dieses Verfahren kann (z. B. wie zuvor beschrieben) zum Nachweis von Verbindungen eingesetzt werden, die sich auf ADDL-vermittelte Ereignisse auswirken, die unterstromig von der ADDL-Rezeptorbindung auftreten. Die Spezifität der Verbindungen zur Einwirkung auf eine ADDL-vermittelte unterstromige Wirkung kann zum Beispiel durch einfaches Zufügen der Testverbindung in Abwesenheit von jedweder Coinkubation mit ADDL bestätigt werden. Selbstverständlich sollten weitere angemessene Kontrollen (z. B. wie sie aus den folgenden Beispielen hervorgehen und wie sie dem Fachmann bekannt sind) bei allen Assays eingeschlossen werden.
Diese Informationen über Verbindungen, die die Bildung und/oder Aktivität, einschließlich der Rezeptorbindung der Proteinassemblierung modulieren (d. h. fördern oder blockieren), können in der Forschung und Behandlung von ADDL-vermittelten Erkrankungen, Zuständen oder Störungen eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Verfahren können zur Untersuchung der Aktivität und Neurotoxizität der ADDL selbst eingesetzt werden. Wenn zum Beispiel 20 nl der ADDL-Präparation 60–70 Minuten vor der Durchführung eines Langzeitpotenzierungsexperiments (LTP-Experiments) in die hippokampale Region einer erwachsenen Maus injiziert wurden (z. B. Namgung et al., Brain Research, 689, 85–92, 1995), trat die Stimulierungsphase des Experiments auf eine Weise auf, die der mit Kontrollinjektionen mit Kochsalzlösung identisch waren, während die Konsolidierungsphase jedoch einen signifikanten, stetigen Abfall der synaptischen Aktivität zeigte, wie anhand der Spikeamplitude der Zellkörper über die sich anschließenden 2 Stunden im Vergleich zu Kontrolltieren, bei denen die synaptische Aktivität auf einer Höhe blieb, die mit der vergleichbar war, die während der Stimulationsphase auftrat, gemessen wurde. Die Analyse von Hirnschnitten nach dem Experiment deuteten darauf hin, dass kein Zelltod aufgetreten war. Diese Ergebnisse, ebenso wie andere in den folgenden Beispielen beschriebene bestätigen, dass die ADDL-Behandlung die LTP-Response beeinträchtigte. Dies deutet darauf hin, dass ADDL, anstelle durch Induktion des Nervenzelltods, vielmehr zu dem bei der Alzheimer-Krankheit durch Intervenieren mit neuronalen Signalisierungsabläufen beobachteten beeinträchtigten Lernen und Gedächtnis beitragen.
Zusätzliche Informationen zu den Wirkungen von ADDL (entweder in An- oder Abwesenheit von Testverbindungen, die potenziell die ADDL-Bildung und/oder -Aktivität modulieren) können unter Verwendung der weiteren erfindungsgemäßen Assays erhalten werden. So ist zum Beispiel auch ein Verfahren zur Bestimmung der Wirkungen von ADDL offenbart, das bevorzugt Folgendes umfasst:

(a) Verabreichung der Proteinassemblierung an den Hippokampus eines Tieres;
(b) Applikation eines elektrischen Stimulus; und
(c) Messung der Spikeamplitude des Zellkörpers in Abhängigkeit zur Zeit zur Bestimmung der Langzeitpotenzierungs-Response. Das Verfahren wird optional dahingehend durchgeführt, dass die Langzeitpotenzierungs-Response des Tieres mit der Langzeitpotenzierungs-Response eines anderen, auf die gleiche Weise behandelten Tieres verglichen wird, außer dass es vor der Applikation des elektrischen Stimulus Kochsalzlösung anstelle der Proteinassemblierung verabreicht bekam. Dieses Verfahren kann weiter zur Identifizierung von Verbindungen eingesetzt werden, die die Wirkungen der ADDL, zum Beispiel durch Vergleich der LTP-Response bei Tieren, denen ADDL entweder allein oder zusammen mit Testverbindungen verabreicht wurden, modulieren (d. h. verstärken oder vermindern).

Dahingehend wird auch ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen offenbart, die die Wirkungen der ADDL-Proteinassemblierung modulieren. Das Verfahren umfasst bevorzugt Folgendes:

(a) Verabreichung von entweder einer Kochsalzlösung oder einer Testverbindung an den Hippokampus eines Tieres;
(b) Applikation eines elektrischen Stimulus;
(c) Messung der Spikeamplitude des Zellkörpers in Abhängigkeit zur Zeit zur Bestimmung der Langzeitpotenzierungs-Response; und
(d) Vergleich der Langzeitpotenzierungs-Response von Tieren, denen Kochsalzlösung verabreicht wird, mit der Langzeitpotenzierungs-Response von Tieren, denen die Testverbindung verabreicht wird. Das Verfahren umfasst weiter optional die Verabreichung der Proteinassemblierung an den Hippokampus entweder vor, zusammen mit oder nach der Verabreichung der Kochsalzlösung oder der Testverbindung.

Es wird auf ähnliche Weise auch ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen offenbart, die die Neurotoxizität der ADDL-Proteinassemblierung modulieren (d. h. entweder verstärken oder vermindern), welches Verfahren Folgendes umfasst:

(a) Kontaktieren getrennter Kulturen aus Nervenzellen mit der Proteinassemblierung entweder in der An- oder Abwesenheit des Kontaktierens mit der Testverbindung;
(b) Messung des Anteils lebender Zellen in jeder Kultur; und
(c) Vergleich des Anteils lebender Zellen in jeder Kultur. Verbindungen, die die Neurotoxizität der Proteinassemblierung blockieren, werden dadurch identifiziert, dass sie zum Beispiel in einem erhöhten Anteil lebensfähiger Zellen in der Kultur resultieren, im Vergleich mit der entsprechenden Kultur, die mit der Proteinassemblierung in Abwesenheit der Testverbindung in Kontakt gebracht wird. Verbindungen, die die Neurotoxizität der Proteinassemblierung steigern, werden dadurch identifiziert, dass sie zum Beispiel in einem reduzierten Anteil lebensfähiger Zellen in der Kultur resultieren, im Vergleich zu der entsprechenden Kultur, die mit der Proteinassemblierung in Anwesenheit der Testverbindung in Kontakt gebracht wird.

Die erfindungsgemäßen Verfahren können auch zum Nachweis der ADDL in Testmaterialien (z. B. als ein Teil der Forschung, Diagnose und/oder Therapie) eingesetzt werden. So können ADDL zum Beispiel eine rasche morphologische Änderung bei Serum-verarmten B103-Zellen herbeiführen, und sie können auch die Fyn-Kinaseaktivität in diesen Zellen innerhalb von 30 Minuten der ADDL-Behandlung aktivieren (Daten werden nicht gezeigt). ADDL induzieren auch eine schnelle Komplexbildung zwischen Fyn und der fokalen Adhäsionskinase (FAK; Zhang et al. Neurosci. Leiters, 211, 1–4, 1996) und die Translokation von mehreren phosphorylierten Proteinen und dem Fyn-Fak-Komplex an eine Triton-unlösliche Fraktion (Berg et al., J. Neurosci. Res., 50, 979–989, 1997). Dies deutet darauf hin, dass Fyn und andere aktivierte Signalbahnen am von ADDL induzierten neurodegenerativen Vorgang beteiligt sind. Dies wurde anhand von Experimenten in Kulturen von Hirnschnitten von genetisch veränderten Mäusen, denen ein funktionelles fyn-Gen fehlt, bei denen im Vergleich zu Vehikel-Kontrollen das Zufügen von ADDL zu keiner gesteigerten Neurotoxizität führte, bestätigt.
Deshalb können Verbindungen, die eine oder mehr Funktionen) von Fyn oder die Relokalisierung von Fyn, nämlich durch die Auswirkung auf ADDL, blockieren, wichtige neuroprotektive Arzneimittel für die Alzheimer-Krankheit darstellen. Wenn ADDL auf ähnliche Weise Kulturen aus primären Astrozyten zugefügt werden, werden die Astrozyten aktiviert, und die mRNA für mehrere Proteine, einschließlich IL-1, induzierbarer Stickoxidsynthase, Apo E, Apo J und α1-Antichymotrypsin werden erhöht. Diese Phänomene werden gegebenenfalls in einem Verfahren zum Nachweis der ADDL-Proteinassemblierung in einem Testmaterial nachgewiesen. Solche Verfahren umfassen optional Folgendes:

(a) Kontaktieren des Testmaterials mit einem Antikörper (z. B. dem 6E10-Antikörper oder einem anderen Antikörper); und
(b) Nachweis der Bindung des Antikörpers an der Proteinassemblierung. Das Verfahren kann gegebenenfalls auf ähnliche Weise eingesetzt werden, worin
(c) das Testmaterial mit Serum-verarmten Neuroblastomzellen (z. B. B103-Neuroblastomzellen) in Kontakt gebracht wird; und
(d) morphologische Veränderungen der Zellen durch den Vergleich der Morphologie der Zellen gegen Neuroblastomzellen gemessen werden, die nicht mit dem Testmaterial in Kontakt gebracht wurden.

Das Verfahren kann auch bevorzugt eingesetzt werden, worin:

(a) das Testmaterial mit Kulturen von Hirnschnitten in Kontakt gebracht wird; und
(b) der Hirnzelltod im Vergleich gegen Kulturen von Hirnschnitten, die nicht mit dem Testmaterial in Kontakt gebracht wurden, gemessen wird. Das Verfahren kann gegebenenfalls weiter durchgeführt werden, worin:
(a) das Testmaterial mit Neuroblastomzellen (z. B. B103-Neuroblastomzellen) in Kontakt gebracht wird; und
(b) Zunahmen der fyn-Kinaseaktivität durch Vergleich der fyn-Kinaseaktivität in den Zellen gegen die fyn-Kinaseaktivität in Neuroblastomzellen gemessen werden, die nicht mit dem genannten Testmaterial in Kontakt gebracht wurden. Die Fyn-Kinaseaktivität kann insbesondere verglichen werden, wobei Gebrauch von einem gewerblich erhältlichen Kit (z. B. Kit Nr. QIA-28 von Oncogene Research Products, Cambridge, MA) gemacht wird oder unter Verwendung eines zu den in Borowski et al., J. Biochem. (Tokyo), 115, 825–829, 1994, beschriebenen analogen Assays.

In einer noch anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von ADDL in Testmaterial umfasst das Verfahren gegebenenfalls Folgendes:

(a) Kontaktieren des Testmaterials mit Kulturen von primären Astrozyten; und
(b) Bestimmen der Aktivierung der Astrozyten im Vergleich zu Kulturen von primären Astrozyten, die nicht mit dem Testmaterial in Kontakt gebracht wurden. In einer Variation dieses Verfahrens umfasst das Verfahren optional Folgendes:
(a) Kontaktieren des Testmaterials mit Kulturen von primären Astrozyten; und
(b) Messen in den Astrozyten der Zunahmen der mRNA für Proteine, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Interleukin-1, induzierbarer Stickoxidsynthase, Apo E, Apo J und α1-Antichymotrypsin durch Vergleich der mRNA-Spiegel in den Astrozyten mit den entsprechenden mRNA-Spiegeln in Kulturen von primären Astrozyten, die nicht mit dem Testmaterial in Kontakt gebracht wurden. Es gibt selbstverständlich andere Assay-Verfahren und weitere Variationen von diesen vorstehend beschriebenen, die von einem Fachmann, insbesondere hinsichtlich der Offenbarung der Spezifikation hierin, erkannt würden.

Folglich weisen die erfindungsgemäßen ADDL eindeutig einen Nutzen in vitro auf. Solche ADDL können unter anderem als ein Forschungswerkzeug in der Untersuchung der ADDL-Bindung und -Interaktion in Zellen und in einem Verfahren zur Bestimmung der ADDL-Aktivität verwendet werden. Auf ähnliche Weise können ADDL und die Untersuchungen der ADDL-Bildung, -Aktivität und -Modulation in vivo eingesetzt werden.
Insbesondere können die Verbindungen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert werden, zur Behandlung von jedweder einen von einer Anzahl an Erkrankungen, Störungen oder Zuständen verwendet werden, die zu Defiziten der Kognition oder des Lernens (d. h. aufgrund eines Versagens des Gedächtnisses) und/oder zu Defiziten des Gedächtnisses selbst führen. Eine derartige Behandlung oder Prävention kann durch Verabreichung von Verbindungen bewirkt werden, die die Bildung und/oder Aktivität der ADDL verhindern, oder die die Zellwirkstoffe, mit denen die ADDL interagieren (z. B. sogenannte „Downstream"-Ereignisse) modulieren (d. h. die Aktivität davon gegebenenfalls als eine Folge der Auswirkung von ADDL verstärken oder vermindern). Auf solche Verbindungen, die die Fähigkeit besitzen, sich auf ADDL auszuwirken, wird hierin als auf „ADDL-modulierende Verbindungen" verwiesen. ADDL-modulierende Verbindungen können nicht nur in negativer Weise wirken, sondern in einigen Fällen auch bevorzugt zur Steigerung der Bildung und/oder Aktivität der ADDL eingesetzt werden.
Das Verfahren kann, wenn es in vivo eingesetzt wird, gegebenenfalls zum Schutz eines Tieres gegen Verminderungen der Kognition, des Lernens oder Gedächtnisses aufgrund der Wirkungen der ADDL-Proteinassemblierung eingesetzt werden. Dieses Verfahren umfasst die Verabreichung einer Verbindung, die die Bildung oder Aktivität der ADDL blockiert. In dem Ausmaß, in dem sich Defizite der Kognition, des Lernens und/oder Gedächtnisses aufgrund der ADDL-Bildung und/oder -Aktivität ansammeln, können solche Defizite auf ähnliche Weise umgekehrt oder wiederhergestellt werden, sobald die Aktivität (und/oder Bildung) von ADDL blockiert wird. Gegenstand der Erfindung ist folglich bevorzugt die Bereitstellung eines Verfahrens zur Umkehr (oder Wiederherstellung) der Verminderungen der Kognition, des Lernens oder des Gedächtnisses aufgrund der Wirkungen einer erfindungsgemäßen Proteinassemblierung bei einem Tier. Dieses Verfahren umfasst bevorzugt die Bildung oder Aktivität der ADDL.
Dieses Verfahren kann insbesondere gegebenenfalls bei der Behandlung oder Prävention einer Erkrankung, Störung oder eines Zustands angewendet werden, die/der sich als ein Defizit der Kognition, des Lernens und/oder Gedächtnisses manifestiert und der auf die ADDL-Bildung oder -Aktivität, besonders einer Erkrankung, Störung oder eines Zustands zurückzuführen ist, die/der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus der Alzheimer-Krankheit, dem Down-Syndrom im Erwachsenenalter (d. h. im Alter von über 40 Jahren) und seniler Demenz.
Dieses Verfahren kann gegebenenfalls auch bei der Behandlung oder Prävention der frühen schädlichen Wirkungen auf die Zellaktivität, Kognition, das Lernen und Gedächtnis angewendet werden, die vor der Entwicklung der Erkrankung, Störung oder des Zustands selbst offensichtlich sein können und welche schädlichen Wirkungen zu der Entwicklung der Erkrankung, Störung oder dem Zustand selbst beitragen können oder sie/ihn letztlich konstituieren können. Das Verfahren kann bevorzugt insbesondere bei der Behandlung oder Prävention der frühen Funktionsstörung von Nervenzellen oder anderen Hirnzellen angewendet werden, die als eine Folge der ADDL-Bildung oder -Aktivität auftreten kann. Auf ähnliche Weise kann das Verfahren bevorzugt bei der Behandlung oder Prävention der fokalen Gedächtnisdefizite (FMD), wie sie zum Beispiel in der Literatur beschrieben wurden (z. B. Linn et al., Arch. Neurol., 52, 485–490, 1995), im Fall, wenn derartige FMD auf die ADDL-Bildung oder -Aktivität zurückzuführen sind, angewendet werden. Das Verfahren kann gegebenenfalls weiter bei der Behandlung oder Prävention des ADDL-induzierten aberranten neuronalen Signalisierens, einer Beeinträchtigung der Schreibfähigkeiten höherer Ordnung (z. B. Snowdon et al., JAMA, 275, 528–532, 1996) oder einer anderen kognitiven Funktion höherer Ordnung, Verminderungen (oder Abwesenheit) der Langzeitpotenzierung, die als Folge der ADDL-Bildung oder -Aktivität folgt, eingesetzt werden.
„ADDL-induziertes aberrantes neuronales Signalisieren" kann erfindungsgemäß mithilfe vieler verschiedener Mittel gemessen werden. Für normales neuronales Signalisieren (ebenso wie die Beobachtung einer Langzeitpotenzierungs-Response) hat es zum Beispiel den Anschein, dass unter anderem die Fyn-Kinase aktiviert werden muss, die Fyn-Kinase den NMDA-Kanal phosphorylieren muss (Miyakawa et al., Science, 278, 698–701, 1997; Grant, J. Physiol. Paris, 90, 337–338, 1996) und Fyn im entsprechenden Zellort anwesend sein muss (was durch die Bildung des Fyn-FAK-Komplexes erschwert sein kann, wie dies zum Beispiel bei bestimmten, durch ADDL induzierten cytoskeletalen Reorganisationen auftritt). Darauf basierend kann das ADDL-induzierte aberrante neuronale Signalisieren (bei dem es sich um eine Signalisierungsdysfunktion handelt, die durch die aberrante Aktivierung von Zellbahnen durch ADDL induziert wird) und Kenntnisse davon in den erfindungsgemäßen Verfahren dergestalt eingesetzt werden, dass sie dem Fachmann offensichtlich wären. So kann zum Beispiel das ADDL-induzierte aberrante Zellsignalisieren (z. B. als eine Folge des Kontaktierens von Nervenzellen mit ADDL, das weiter in An- oder Abwesenheit von Verbindungen, die auf ADDL-modulierende Aktivität getestet werden, weiter durchgeführt werden kann) unter Verwendung von jedweden dieser Maßnahmen oder dergestalt, wie es einem Fachmann offensichtlich sein würde, z. B. Fyn-Kinaseaktivierung (oder eine Veränderung davon), Bildung eines Fyn-FAK-Komplexes (oder eine Veränderung davon), cytoskeletale Reorganisation (oder eine Veränderung davon), subzelluläre Lokalisierung der Fyn-Kinase (oder eine Veränderung davon), Fyn-Kinase-Phosphorylierung des NMDA-Kanals (oder eine Veränderung davon) beurteilt werden.
Überdies können auch die ADDL selbst bei der Behandlung angewendet werden. Es wurde entdeckt, dass diese hierin beschriebenen neuen Assemblierungen zahlreiche unerwartete Wirkungen auf Zellen aufweisen, von denen denkbar ist, dass sie für die Therapie angewendet werden können. So können ADDL zum Beispiel Endothelzellen aktivieren, von welchen Endothelzellen bekannt ist, dass sie unter anderem mit Gefäßzellen interagieren. Dahingehend könnten ADDL zum Beispiel bei der Wundheilung eingesetzt werden. Zum Beispiel handelt es sich beim Botulinum-Toxin Typ A (Botox) auch um ein Blockierungsmittel der neuromuskulären Junktion, das vom Bakterium Clostridium botulinum produziert wird, das durch Blockierung der Freisetzung des Neurotransmitters Acetylcholin wirkt. Botox hat sich in der Behandlung behindernder Muskelspasmen, einschließlich Dystonie, als vorteilhaft erwiesen. Die ADDL selbst könnten theoretisch angewendet werden, um entweder die Nervenzellfunktion zu kontrollieren oder um targetierte Nervenzellen (z. B. in Fällen von Krebs, zum Beispiel des Zentralnervensystems, insbesondere des Gehirns) selektiv zu zerstören. Die ADDL scheinen in dieser Beziehung weiter vorteilhaft zu sein, vorausgesetzt, dass sie sehr frühe Wirkungen auf Zellen aufweisen, und vorausgesetzt, dass ihre Wirkung auf Zellen (außer ihrer zelltötenden Wirkung) reversibel zu sein scheint.
Wie vorstehend besprochen, können die erfindungsgemäßen ADDL-modulierenden Verbindungen, ebenso wie die ADDL selbst, zum Kontaktieren von Zellen, entweder in vitro oder in vivo, eingesetzt werden. Eine Zelle kann erfindungsgemäß jedwede Zelle darstellen und stellt bevorzugt eine eukaryote Zelle dar. Eine eukaryote Zelle stellt in der Regel eine Zelle dar, die in einer Phase ihres Lebens einen von einer Nukleusmembran umgebenen Nukleus besitzt. Die eukaryote Zelle stellt bevorzugt eine multizelluläre Spezies (z. B. im Gegensatz zu einer unizellulären Hefezelle) dar und stellt noch bevorzugter eine (optional humane) Säugerzelle dar. Das Verfahren kann jedoch auch unter Verwendung vieler verschiedener unterschiedlicher Zelltypen, wie zum Beispiel Vogel- und Säugerzellen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Zellen von Nagern, Primaten (wie zum Beispiel Schimpansen, Affen, Menschenaffen, Gorillas, Orang-Utans oder Gibbons), Katzen, Hunden, Huftieren (wie zum Beispiel Wiederkäuern oder Schweinen) ebenso wie insbesondere humanen Zellen, wirksam durchgeführt werden.
Bevorzugte Zelltypen stellen Zellen dar, die im Hirn gebildet werden, einschließlich Nervenzellen und Gliazellen. Ein besonders bevorzugter erfindungsgemäßer Zelltyp stellt eine Nervenzelle (entweder normal oder aberrant, z. B. transformiert oder kanzerös) dar. Wenn sie in der Gewebekultur eingesetzt wird, stellt die Nervenzelle gegebenenfalls eine Neuroblastomzelle dar.
Eine Zelle kann als eine einzelne Entität vorliegen oder sie kann einen Teil einer größeren Zellansammlung darstellen. Eine solche „größere Ansammlung von Zellen" kann zum Beispiel eine Zellkultur (entweder gemischt oder rein), ein Gewebe (z. B. ein neurales oder ein anderes Gewebe), ein Organ (z. B. Hirn oder andere Organe), ein Organsystem (z. B. Nervensystem oder ein anderes Organsystem) oder einen Organismus (z. B. Säuger oder dergleichen) umfassen. Bei den Organen/Geweben/Zellen von Interesse im erfindungsgemäßen Kontext handelt es sich bevorzugt um das Zentralnervensystem (z. B. Nervenzellen).
„Kontaktieren" umfasst erfindungsgemäß auch jedwedes Mittel, mit dem diese Stoffe physikalisch eine Zelle berühren. Das Verfahren ist nicht abhängig von jedwedem bestimmten Einführungsmittel und darf nicht auf diese Weise ausgelegt werden. Einführungsmittel sind dem Fachmann überall bekannt und sind auch hierin erläuternd enthalten. Die Einführung kann demzufolge zum Beispiel entweder in vitro (z. B. in einem Therapie-Verfahren des ex vivo-Typs oder in Gewebekulturstudien) oder in vivo bewirkt werden. Andere Verfahren stehen auch zur Verfügung und sind dem Fachmann bekannt.
Dieses „Kontaktieren" kann durch jedwedes dem Fachmann bekannte und hierin beschriebene Mittel, durchgeführt werden, durch das das scheinbare Berühren oder das mutuelle Kontaktieren der ADDL und der ADDL-modulierenden Verbindungen und der Zelle bewirkt werden kann. Das Kontaktieren kann zum Beispiel durch Mischen dieser Elemente in einem kleinen Volumen der gleichen Lösung vorgenommen werden. Die Elemente können optional weiter kovalent miteinander verbunden werden, z. B. durch dem Fachmann bekannte chemische Mittel oder andere Mittel oder können bevorzugt mithilfe nicht kovalenter Interaktionen (z. B. durch ionische Bindungen, Wasserstoffbindungen, Van der Waals Kräfte und/oder nicht polare Interaktionen) verknüpft werden. Im Vergleich dazu braucht die zu beeinflussende Zelle und die ADDL- oder ADDL-modulierende Verbindung nicht unbedingt in einem kleinen Volumen in Kontakt gebracht zu werden, da zum Beispiel in Fällen, in denen die ADDL- oder ADDL-modulierende Verbindung an einen Wirt verabreicht wird und der Komplex durch den Blutstrom oder eine andere Körperflüssigkeit, wie zum Beispiel die Cerebrospinalflüssigkeit, an die Zelle wandert, mit der er bindet. Das Kontaktieren der Zelle mit einer ADDL- oder ADDL-modulierenden Verbindung erfolgt manchmal entweder vor, zusammen mit oder nachdem eine andere Verbindung von Interesse verabreicht wird. Gegebenenfalls erfolgt dieses Kontaktieren dergestalt, dass mindestens eine Zeitspanne vorhanden ist, worin die gemeinsam verabreichten Mittel ihre Wirkungen auf eine Zelle oder auf die ADDL gleichzeitig ausüben.
Ein Fachmann wird erkennen, dass geeignete erfindungsgemäße Verfahren zur Verabreichung eines Mittels (z. B. einer ADDL- oder ADDL-modulierenden Verbindung) an ein Tier zwecks Therapie und/oder Diagnose, Forschung oder Studie zur Verfügung stehen und, obwohl mehr als eine Verabreichungsroute verwendet werden kann, eine spezielle Route eine unmittelbarere und wirksamere Reaktion bereitstellen kann als eine andere Route. Pharmazeutisch verträgliche Hilfsmittel sind dem Fachmann auch gut bekannt und sind ohne weiteres erhältlich. Die Wahl des Hilfsmittels wird teils durch das zur Verabreichung des Mittels verwendete bestimmte Verfahren bestimmt. Demzufolge gibt es viele verschiedene geeignete Formulierungen zur Verwendung im erfindungsgemäßen Kontext. Die follgenden Verfahren und Hilfsmittel sind lediglich beispielhaft und sind auf keinen Fall einschränkend.
Zur oralen Verabreichung geeignete Formulierungen können aus Folgendem bestehen: (a) flüssigen Lösungen, wie zum Beispiel einer wirksamen Menge der in Verdünnungsmitteln, wie zum Beispiel Wasser, Kochsalzlösung oder Orangensaft aufgelösten Mengen der Verbindung; (b) Kapseln, Sachets oder Tabletten, die jeweils eine prädeterminierte Menge des Wirkstoffs als Feststoff oder Granulat enthalten; (c) Suspensionen in einer entsprechenden Flüssigkeit; und (d) geeigneten Emulsionen. Die Tablettenformen können Folgendes einschließen: eines oder mehr von Lactose, Mannitol, Maisstärke, Kartoffelstärke, mikrokristalliner Cellulose, Akaziengummi, Gelatine, hochdispersem Siliziumdioxid, Croscarmellose-Natrium, Talcum, Magnesiumstearat, Stearinsäure und anderen Hilfsmitteln, Farbstoffen, Verdünnungsmitteln, Puffern, Feuchthaltemitteln, Konservierungsmitteln, Geschmacksstoffen und pharmakologisch kompatiblen Hilfsmitteln. Pastillenformen können den Wirkstoff in einem Geschmacksstoff, gewöhnlich Saccharose und Akaziengummi oder Tragant umfassen, ebenso wie Pastillen, die den Wirkstoff in einem inerten Grundbestandteil, wie zum Beispiel Gelatine und Glycerin umfassen, Emulsionen, Gele und dergleichen, die zusätzlich zum Wirkstoff, solche Hilfsmittel wie sie im Stand der Technik bekannt sind, enthalten.
Ein erfindungsgemäßes Mittel, allein oder in Kombination mit anderen geeigneten Bestandteilen, können zu über Inhalation zu verabreichende Aerosolformulierungen hergestellt werden. Diese Aerosolformulierungen können in unter Druck gesetzte verträgliche Treibmittel, wie zum Beispiel Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff und dergleichen, gegeben werden. Sie können auch als Pharmazeutika für nicht unter Druck gesetzte Präparationen, wie zum Beispiel in einem Vernebler oder einem Zerstäuber, formuliert werden.
Für die parenterale Verabreichung geeignete Formulierungen sind erfindungsgemäß bevorzugt und schließen wässrige und nicht wässrige, isotonische sterile Lösungen zur Injektion ein, die Folgendes enthalten können: Antioxidanzien, Puffer, Bakteriostate und gelöste Stoffe, die die Formulierung mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers isotonisch machen und wässrige und nicht wässrige sterile Suspensionen, die Suspensionsmittel, Lösungsvermittler, Verdickungsmittel, Stabilisatoren und Konservierungsmittel einschließen können. Die Formulierungen können in verschlossenen Einheitsdosis- oder Multidosis-Behältnissen, wie zum Beispiel Ampullen und Durchstichfläschchen, dargereicht werden und können in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, der nur das Zufügen des sterilen flüssigen Hilfsmittels, zum Beispiel Wasser für Injektionszwecke, unmittelbar vor Gebrauch erforderlich macht. Extemporane Injektionslösungen und -Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden.
Die an ein Tier, insbesondere einen Menschen, im erfindungsgemäßen Kontext verabreichte Dosis kann mit dem Mittel von Interesse, der eingesetzten Zusammensetzung, dem Verabreichungsverfahren und der entsprechenden Stelle und dem zu behandelnden Organismus variieren. Bevorzugt wird jedoch eine Dosis eingesetzt, die einer wirksamen Menge eines Mittels (z. B. einer erfindungsgemäßen ADDL- oder ADDL-modulierenden Verbindung) entspricht. Eine „wirksame Menge" stellt eine dar, die zur Herbeiführung der gewünschten Wirkung in einem Wirt ausreicht, die unter Verwendung mehrerer dem Fachmann bekannter Endpunkte überwacht werden kann. Einige Beispiele gewünschter Wirkungen schließen die folgenden ein, sind aber nicht beschränkt auf: eine Wirkung auf das Lernen, Gedächtnis, die LTP-Response, Neurotoxizität, ADDL-Bildung, ADDL-Rezeptorbindung, Antikörperbindung, zellmorphologische Veränderungen, Fyn-Kinaseaktivität, Astrozytenaktivierung und Änderungen der mRNA-Spiegel für Proteine, wie zum Beispiel Interleukin-1, induzierbare Stickoxidsynthase, ApoE, ApoJ und α1-Antichymotrypsin. Diese beschriebenen Verfahren sind auf keinen Fall allumfassend, und weitere für die spezifische Applikation geeignete Verfahren werden vom Durchschnittsfachmann erkannt werden.
Darüber hinaus können bei bestimmten Applikationen (z. B. entweder in vitro oder in vivo) die eigentliche Dosis und das Verabreichungsschema von ADDL- oder ADDL-modulierenden Verbindungen davon abhängig variieren, ob die Zusammensetzung in Kombination mit anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen oder in Abhängigkeit von interindividuellen Unterschieden in der Pharmakokinetik, Arzneimitteldisposition und dem Arzneimittelmetabolismus verabreicht wird. Auf ähnliche Weise können die Mengen bei in vitro-Applikationen in Abhängigkeit vom bestimmten verwendeten Zelltyp oder dem Mittel oder der Lösung, mit der die ADDL- oder ADDL-modulierende Verbindung zum Kultivieren transferiert wird, variieren. Ein Fachmann kann leicht jedwede notwendigen Anpassungen gemäß den Anforderungen der entsprechenden Situation vornehmen.
BEISPIELE
Die vorstehenden Beschreibungen (ebenso wie die, die folgen) sind lediglich beispielhaft. Andere Applikationen des Verfahrens und erfindungsgemäße Bestandteile werden von einem Fachmann erkannt werden. Folglich erläutern die folgenden Beispiele die vorliegende Erfindung weiter, sie sollten aber selbstverständlich keineswegs als den Umfang einschränkend ausgelegt werden.
Beispiel 1: Herstellung von Amyloid-β-Oligomeren
ADDL wurden erfindungsgemäß durch Auflösen von 1 mg festem Amyloid-β 1–42 (z. B. synthetisiert, wie in Lambert et al., J. Neurosci. Res., 39, 377–395, 1994, beschrieben), in 44 μl wasserfreiem DMSO hergestellt. Diese 5 mM Lösung wurde dann in kaltes (4°C) F12-Medium (Gibco BRL, Life Technologies) auf ein Gesamtvolumen von 2,20 ml (50fache Verdünnung) verdünnt und ca. 30 Sekunden gevortext. Das Gemisch wurde ca. 24 Stunden bei von ca. 0°C bis ca. 8°C inkubieren lassen, gefolgt von Zentrifugation bei 14 000 g für ca. 10 Minuten bei ca. 4°C. Der Überstand wurde um Faktoren von 1:10 bis 1:10 000 in das besonders definierte Medium, vor der Inkubation mit Hirnschnittkulturen, Zellkulturen oder Bindungsprotein-Präparationen verdünnt. Im Allgemeinen wurden jedoch ADDL in einer Konzentration des Aβ-Proteins von 100 μM gebildet. Die für die Experimente verwendete höchste Konzentration beträgt in der Regel 10 μM, und in einigen Fällen wurden die ADDL (gemessen als initiale Aβ-Konzentration) (z. B. in Zellkulturmedium) auf 1 nM verdünnt. Zur Analyse mittels der Atomkraftmikroskopie (AFM) wurde ein 20-μl-Aliquot der Verdünnung von 1:100 auf die Oberfläche einer frisch gespaltenen Glimmerscheibe aufgebracht und analysiert. Andere Manipulationen wurden wie folgt oder wie offensichtlich ist, beschrieben.
Als Alternative wurde die ADDL-Bildung, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das F12-Medium durch einen Puffer (d. h. ein „F12-Substitutionsmedium"), enthaltend die folgenden Komponenten, ersetzt wurde: N,N-Dimethylglycin (766 mg/l), D-Glucose (1,802 g/l), Calciumchlorid (33 mg/l), Kupfersulfat-pentahydrat (25 mg/l), Eisen(II)-Sulfat-heptahydrat (0,8 mg/l), Kaliumchlorid (223 mg/l), Magnesiumchlorid (57 mg/l), Natriumchlorid (7,6 g/l), Natriumbicarbonat (1,18 g/l), Dinatriumhydrogenphosphat (142 mg/l) und Zinksulfatheptahydrat (0,9 mg/l). Der pH des Puffers wurde unter Verwendung von 0,1 M Natriumhydroxid auf 8,0 eingestellt.
Beispiel 2: Vernetzung von Amyloid-β-Oligomeren
Glutaraldehyd wurde in vielen verschiedenen biochemischen Systemen erfolgreich verwendet. Glutaraldehyd neigt zur Vernetzung von Proteinen, die sich direkt in Kontakt miteinander befinden, im Gegensatz zu einer nicht spezifischen Reaktion mit hohen Konzentrationen von monomerem Protein. In diesem Beispiel wurde die Glutaraldehydkontrollierte Vernetzung von Amyloid-β untersucht.
Die Herstellung von Oligomer wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung des F12-Substitutionsmediums durchgeführt. Der im Anschluss an die Zentrifugation (und in einigen Fällen die Fraktionierung) erhaltene Überstand wurde mit 0,22 ml einer 25%igen wässrigen Lösung aus Glutaraldehyd (Aldrich), gefolgt von 0,67 ml 0,175 M Natriumborhydrid in 0,1 M NaOH (nach dem Verfahren von Levine, Neurobiology of Aging, 1995) behandelt. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei 4°C gerührt und wurde durch das Zufügen von 1,67 ml 20%iger wässriger Saccharose gequencht. Das Gemisch wurde an einem SpeedVac um das 5fache konzentriert und zur Entfernung von kleineren Komponenten als 1 kD dialysiert. Das Material wurde mittels SDS-PAGE analysiert. Die Gelfiltrationschromatographie wurde wie folgt durchgeführt: Die Superose 75PC 3,2/3,0-Säule (Pharmacia) wurde mit filtriertem und entgastem 0,15%igem Ammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH = 7,8) bei einer Fließrate von 0,02 ml/min über den Verlauf von 18 h bei Raumtemperatur äquilibriert. Die Fließrate wurde auf 0,04 ml/min geändert, und 20 ml Lösungsmittel wurden eluiert. 50 Mikroliter Reaktionslösung wurden auf die Säule geladen, und die Fließrate wurde bei 0,04 ml/min wieder aufgenommen. Die Elution der Verbindung wurde durch den UV-Nachweis bei 220 nm überwacht, und es wurden während des Ablaufs der Chromatographie Fraktionen von 0,5–1,0 ml gesammelt. Fraktion Nr. 3, die dem dritten Peak der UV-Absorbanz entsprach, wurde isoliert, und es wurde mittels der AFM (anhand der Breitenanalyse) nachgewiesen, dass sie Kügelchen von 4,9 +/– 0,8 nm enthielt. Diese Fraktion war hoch neurotoxisch, wenn sie, wie in den folgenden Beispielen beschrieben wird, mit Neuronen von Hirnschnitten in Kontakt gebracht wurde.
Beispiel 3: Größencharakterisierung von ADDL
Dieses Beispiel legt die Größencharakterisierung von wie in Beispiel 1 gebildeten ADDL und unter Verwendung von vielen verschiedenen Verfahren (z. B. nativer Gelelektophorese, SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, AFM, Feldfluss-Fraktionierung und Immunerkennung) vor.
Die AFM wurde im Wesentlichen wie zuvor beschrieben durchgeführt (z. B. Stine et al., J. Protein Chem., 15, 193–203, 1996). Das heißt, es wurden unter Verwendung eines Digital-Instruments (Santa Barbara, CA) Nanoscope IIIa Multimode Atomkraftmikroskop unter Verwendung eines J-Scanners mit einem xy-Bereich von 150 μm Bilder erhalten. Es wurde für alle Bilder unter Verwendung von TESP Nanoprobes (geätztem Silizium) (Digital Instruments) der Tapping Mode eingesetzt. Die AFM-Daten werden unter Verwendung der Nanoscope IIIa Software und der IGOR ProTM Wellenform-Analysen-Software analysiert. Für die AFM-Analyse wurden 4-μm-Scans (d. h. eine Beurteilung von einem Quadrat von 4 μm × 4 μm) durchgeführt. In der Regel wurden die berichteten Abmessungen mittels Schnittanalyse erhalten und wenn die Breitenanalyse eingesetzt wurde, wird dies angegeben. Die Schnitt- und Breitenanalyse befinden sich in der Nanoscope IIIa Software in getrennten Analysemodulen. Im Allgemeinen besteht für die ADDL-Analyse eine systematische Abweichung zwischen den mittels der Schnittanalyse erhaltenen Größen und den mit der Breitenanalyse erhaltenen. Für einen 4-μm-Scan ergibt die Schnittanalyse nämlich Höhen, die im Allgemeinen ca. 0,5 nm höher sind, die folglich zu einer Abweichung von ca. 0,5 nm der für die Größen der Kügelchen erhaltenen Werte führen.
Die Analyse mittels Gelelektrophorese wurde an 15 % Polyacrylamidgelen durchgeführt und durch Färbung mit Coomassieblau sichtbar gemacht. Die ADDL wurden auf 4–20 % Trisglycin-Gelen unter nicht denaturierenden Bedingungen (Novex) aufgetrennt. Die Elektrophorese wurde ca. 1,5 Stunden bei 20 mA durchgeführt. Die Proteine wurden mit SDS-PAGE, wie in Zhang et al., J. Biol. Chem., 269, 25247–25250, 1994, beschrieben, aufgetrennt. Das Protein wurde dann unter Verwendung der Silberfärbung (z. B. wie in Sherchenko et al., Anal. Chem., 68, 850–858, 1996, beschrieben) sichtbar gemacht. Die Gelproteine von sowohl nativen als auch SDS-Gelen wurden nach Zhang et al. (J. Biol. Chem., 269, 25247–50, 1994) auf Nitrocellulose-Membranen überführt. Die Immunblots wurden mit biotinyliertem 6E10-Antikörper (Senetak, Inc., St. Louis, Missouri) bei 1:5000 durchgeführt und unter Verwendung von ECL (Amersham) sichtbar gemacht. Die Gele wurden in der Regel unter Verwendung eines Densitometers gescannt. Dies ließ die Bereitstellung der Computer-erfassten Bilder von den Gelen (z. B. versus Fotografien von den Gelen selbst) zu.
Die Größencharakterisierung von ADDL durch die AFM-Schnittanalyse (z. B. wie in Stine et al., J. Protein Chem., 15, 193–203, 1996, beschrieben) oder die Breitenanalyse (Nanoscope III Software) zeigten, dass die prädominanten Spezies Kügelchen von ca. 4,7 nm bis ca. 6,2 nm entlang der z-Achse darstellten. Der Vergleich mit kleinen globulären Proteinen (Aβ 1-40-Monomer, Aprotinin, bFGF, Kohlensäureanhydrase) deuteten darauf hin, dass die ADDL eine Masse zwischen 17–42 kD aufwiesen. Das, was distinkte Spezies zu sein scheinen, kann erkannt werden. Diese scheinen den Kügelchen mit Abmessungen von ca. 4,9 nm bis ca. 5,4 nm, von ca. 5,4 nm bis ca. 5,7 nm und von ca. 5,7 nm bis ca. 6,2 nm zu entsprechen. Die Kügelchen mit Abmessungen von ca. 4,9–5,4 nm und 5,7–6,2 nm scheinen ca. 50 % der Kügelchen zu umfassen.
In Übereinstimmung mit der AFM-Analyse identifizierten die SDS-PAGE Immunblots von ADDL Aβ-Oligomere von ca. 17 kD bis ca. 22 kD, wobei reichlich Monomer von 4 kD anwesend war, bei dem es sich vermutlich um ein Abbauprodukt handelte. Konsistent mit dieser Interpretation zeigen nicht denaturierende Polyacrylamidgele von ADDL ein spärliches Monomer mit einer primären Bande nahe an 30 kD, einer weniger reichlichen Bande bei ca. 17 kD und keinen Hinweis auf Fibrillen oder Aggregate. Computer-erfasste Bilder von einem mit Silber gefärbten nativen Gel und einem mit Coomassie gefärbten SDS-Polyacrylamidgel sind in 1 bzw. 2 ersichtlich. Die Übereinstimmung zwischen den SDS- und nicht denaturierenden Gelen bestätigt, dass die kleine Oligomergröße von ADDL nicht auf eine Detergens-Wirkung zurückzuführen war. In ADDL-Präparationen gesehene Oligomere waren kleiner als Clusterin (M_r 80 kD, 40 kD in denaturierten Gelen), wie anhand der Verwendung von Clusterin in niedrigen Konzentrationen (1/40 bezogen auf Aβ, was die Assoziation von Aβ als Aβ-Clusterin-Komplexe von 1:1 ausschloss) erwartet wurde.
Eine erfindungsgemäße ADDL-Präparation wurde auf einer Superdex 75-Säule (Pharmacia, Superose 75PC 3,2/3,0-Säule) fraktioniert. Die Fraktion, die die ADDL umfasste, stellte die dritte Fraktion der UV-Absorbanz dar, die aus der Säule eluierte und mittels AFM und SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese analysiert wurde. Eine repräsentative AFM-Analyse von Fraktion 3 wird in 3 veranschaulicht. Die Fraktionierung führte zu einer größeren Homogenität für die ADDL, wobei die Mehrzahl der Kügelchen Abmessungen von ca. 4,9 nm bis ca. 5,4 nm aufwiesen. Die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese der Fraktion wies eine schwerere untere Bande nach, die der Monomer-/Dimerform von Aβ entsprach. Da dies auch für die nicht fraktionierte Präparation von ADDL beobachtet wurde, scheint es sich um ein Abbauprodukt der ADDL zu handeln. Eine schwerere Beladung der Fraktion ließ eine breite Bande einer größeren Größe (vielleicht ein Dublett) erkennen. Dies bestätigt weiter die Stabilität der nicht fibrillären oligomeren Aβ-Strukturen gegenüber SDS.
Beispiel 4: Clusterin-Behandlung von Amyloid-β
Obwohl vorgeschlagen wurde, dass fibrilläre Strukturen die toxische Form von Aβ darstellen (Lorenzo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12243–12247, 1994; Howlett et al., Neurodegen, 4, 23–32, 1995), bilden sich neue Neurotoxine, die sich nicht als sedimentierbare Fibrillen verhalten, wenn Aβ 1–42 mit niedrig dosiertem Clusterin, das auch als „Apo J" bekannt ist, inkubiert wird (Oda et al., Exper. Neurol, 136, 22–31, 1995; Oda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 204, 1131–1136, 1994). Zum Testen, ob diese langsam sedimentierenden Toxine noch kleine oder naszente Fibrillen enthalten könnten, wurden mit Clusterin behandelte Aβ-Präparationen anhand der Atomkraftmikroskopie untersucht.
Die Clusterin-Behandlung wurde wie in Oda et al. (Exper. Neurol, 136, 22–31, 1995) beschrieben, im Wesentlichen durch Zufügen von Clusterin zu der in Beispiel 1 beschriebenen Inkubation durchgeführt. Als Alternative könnte das Ausgangs-Aβ 1–42 in 0,1 N HCl, anstelle von DMSO, aufgelöst werden, und dieses Ausgangs-Aβ 1–42 könnte sogar von Anfang an fibrilläre Strukturen aufweisen. Die Inkubation mit Clusterin 24 Stunden bei Raumtemperatur von 37°C führte jedoch zu Präparationen, die überwiegend frei von Fibrillen waren, was mit ihrer langsamen Sedimentierung konsistent war. Dies wurde anhand von Experimenten bestätigt, die zeigen, dass die Bildung von Fibrillen abnimmt, wenn die zugefügte Clusterin-Menge zunimmt.
Die sich aus der Clusterin-Behandlung ergebenden Präparationen umfassten ausschließlich kleine globuläre Strukturen einer Größe von ca. 5–6 nm, wie anhand der AFM-Analyse von auf einer Superdex 75-Gelsäule fraktionierten ADDL bestimmt wurde. Äquivalente Ergebnisse wurden anhand der üblichen Elektronenmikroskopie erhalten. Demgegenüber zeigte Aβ 1–42, das sich unter Standardbedingungen in Abwesenheit von Clusterin eigenassoziiert hatte (Snyder et al., Biophys. J., 67, 1216–28, 1994) hauptsächlich große, nicht diffusionsfähige fibrilläre Spezies. Überdies wurden die sich ergebenden ADDL-Präparationen durch eine Centricon 10 kD Cut-off-Membran geleitet und auf einem SDS-Polyacrylamid-Gradientengel analysiert. Wie in 4 ersichtlich ist, passiert nur das Monomer durch das Centricon 10-Filter, wohingegen ADDL anhand des Filters zurückgehalten werden. Das nach der Trennung gefundene Monomer konnte nur von der Spezies mit dem größeren Molekulargewicht, die anhand des Filters zurückgehalten wurde, gebildet werden.
Diese Ergebnisse bestätigen, dass toxische ADDL-Präparationen kleine fibrillenfreie Oliogmere von Aβ 1–42 umfassen, und dass ADDL durch eine angemessene Clusterin-Behandlung von Amyloid-β erhalten werden können.
Beispiel 5: Physiologische Bildung von ADDL
Die toxischen Teile in Beispiel 4 könnten gegebenenfalls seltene Strukturen umfassen, die oligomeres Aβ und Clusterin enthalten. Wohingegen Oda et al. (Exper. Neurol., 136, 22–31, 1995) mitteilten, dass gefunden wurde, dass Clusterin die Toxizität von Aβ 1-42-Lösungen erhöht, haben andere gefunden, dass Clusterin in stöchiometrischen Konzentrationen gegen die Aβ 1-40-Toxizität schützt (Boggs et al., J. Neurochem., 67, 1324–1327, 1997). Demzufolge wurde die ADDL-Bildung in Abwesenheit von Clusterin in diesem Beispiel weiter charakterisiert.
Wenn monomere Aβ 1-42-Lösungen bei niedriger Temperatur in einem geeigneten Medium aufrechterhalten wurden, wurde die Bildung von sedimentierbaren Aβ-Fibrillen fast vollständig blockiert. Aβ eigenassoziierte jedoch in diesen Lösungen bei niedriger Temperatur, wobei ADDL gebildet wurden, die sich im Wesentlichen nicht von denen unterscheiden ließen, die von Clusterin „chaperoniert" waren. Schließlich deuten ADDL, die auch gebildet wurden, wenn monomere Aβ-Lösungen bei 37°C in Kulturmedium für Hirnschnitte, aber bei sehr niedriger Konzentration (50 nM) inkuziert wurden, auf ein Potenzial zur physiologischen Bildung hin. Alle ADDL-Präparationen waren relativ stabil und zeigten während der 24-stündigen Gewebekultur-Experimente keine Umwandlung in Fibrillen.
Diese Ergebnisse bestätigen, dass sich ADDL bilden und unter physiologischen Bedingungen stabil sind und weisen darauf hin, dass sie sich in vivo auf ähnliche Weise bilden können und stabil sind.
Beispiel 6: ADDL stellen diffusionsfähige, extrem potente ZNS-Neurotoxine dar
Ob ADDL durch Clusterin, niedrige Temperatur oder eine niedrige Aβ-Konzentration induziert wurden, handelte es sich bei den sich bildenden stabilen Oligomeren um potente Neurotoxine. Die Toxizität wurde in organotypischen Hirnschnittkulturen von der Maus untersucht, die ein physiologisch relevantes Modell für das mature ZNS bereitstellten. Das Hirngewebe wurde an der Atmosphäre-Medium-Grenzfläche durch ein Filter unterstützt, um eine hohe Viabilität in Kontrollen aufrechtzuerhalten.
Für diese Experimente wurden aus Stämmen B6 129 F2 und JR 2385 (Jackson Laboratories) Hirnschnitte gewonnen und wie zuvor beschrieben (Stoppini et al., J. Neurosci. Meth., 37, 173–182, 1991) mit Modifikationen kultiviert. Das heißt, eine erwachsene Maus wurde durch Inhalation von Kohlendioxid, gefolgt von schneller Dekapitation geopfert. Der Kopf wurde in kalten, sterilen Dissektionspuffer (94 ml Gey'sche ausgeglichene Salzlösung, pH 7,2, supplementiert mit 2 ml 0,5M MgCl₂, 2 ml 25%iger Glucose und 2 ml 1,0 M Hepes) eingetaucht, wonach das Hirn entfernt und auf eine mit Sylgard beschichtete sterile Platte gelegt wurde. Das Cerebellum wurde entfernt, und es wurde ein Medianschnitt zur Trennung der Hirnhemisphären durchgeführt. Jede Hemisphäre wurde getrennt geschnitten. Die Hemisphäre wurde mit dem Medianschnitt nach unten platziert, und es wurde ein Schnitt von 30° von der dorsalen Seite angefertigt, um die Hemisphäre zu orientieren. Die Hemisphäre wurde mit der Schnittseite nach unten auf die Kunststoffbühne eines Campden Gewebeschneiders (der zuvor mit Ethanol abgewischt wurde) geklebt und in eiskalten sterilen Puffer eingetaucht. Es wurden von einer lateralen nach medialen Richtung Schnitte von 200 μm Dicke angefertigt, wobei die gesammelt wurden, in denen der Hippokampus sichtbar war.
Jeder Schnitt wurde mit dem oberen Ende einer sterilen Pipette in eine kleine Petrischale überführt, die Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM) enthielt, enthaltend 10 % fetales Kalbserum, 2 % S/P/F (Streptomycin, Penicillin und Fungizon; Life Technologies (Gibco, BRL), Gaithersburg, MD), der mit einem Mikroskop zur Verifizierung der Anwesenheit des Hippokampus beobachtet und auf einen Millicell-CM-Einsatz (Millipore) in eine tiefe Well-Gewebekulturplatte platziert wurde (Falcon, 6-Well-Platte). Jedes Well enthielt 1,0 ml Wachstumsmedium, und auf jedem Einsatz befanden sich gewöhnlich zwei Schnitte. Die Schnitte wurden über Nacht in einen Inkubator (6 % CO₂, 100 % Feuchte) gebracht. Das Wachstumsmedium wurde entfernt, und die Wells wurden mit 1,0 ml warmer Hank's BSS (Gibco, BRL, Life Technologies) gewaschen. Definiertes Medium (DMEM, N₂-Supplemente, SPF, wie z. B. in Bottenstein et al., Proc. Natl. Aca. Sci., 76, 514–517, 1979) beschrieben, enthaltend die Amyloid-β-Oligomere, mit oder ohne Inhibitorverbindungen, wurde jedem Well zugefügt, und die Inkubation wurde 24 Stunden fortgesetzt.
Der Zelltod wurde unter Verwendung des LIVE/DEAD^®-Assaykits (Molecular Probes, Eugene, OR) gemessen. Hierbei handelte es sich um einen doppelt markierten Fluoreszenz-Assay, in dem Lebendzellen durch die Anwesenheit einer Esterase, die das Calcein-AM zu Calcein spaltet, nachgewiesen, was in einer grünen Fluoreszenz resultierte. Tote Zellen nehmen Ethidium-Homodimer auf, das mit DNA interkaliert und eine rote Fluoreszenz aufweist. Der Assay wurde gemäß den Anleitungen des Herstellers mit 2 μM Ethidium-Homodimer und 4 μM Calcein durchgeführt. Unter Verwendung eines Nikon Diaphot Mikroskops, das mit Epifluoreszenz ausgerüstet war, wurden innerhalb von 30 Minuten Bilder erhalten. Das MetaMorph-Bildanalysensystem (Universal Imaging Corporation, Philadelphia, PA) wurde zur Quantifizierung der Anzahl und/oder des Areals von Zellen verwendet, die eine grüne oder rote Fluoreszenz aufwiesen.
Für diese Experimente waren ADDL über 24 Stunden bei einer maximalen Gesamt-Aβ-Dosis von 5 μM anwesend (d. h. das Gesamt-Aβ betrug in jedwedem ADDL-Experiment niemals mehr als 5 μM). Der Zelltod, wie mittels „falsch-gelber Färbung gezeigt", war fast vollständig auf das Stratum pyramidale (CA 3–4) und den Gyrus dentatus (DG) beschränkt, was stark darauf hindeutet, dass die wichtigen Neuronen des Hippokampus (Pyramiden- bzw. Körnerzellen) die Targets der ADDL-induzierten Toxizität darstellen. Darüber hinaus bleibt die Viabilität der Glia durch eine 24-stündige ADDL-Behandlung der primären Hirnglia von Ratten unbeeinflusst, wie durch den Trypanblau-Ausschluss und den MTT-Assay bestimmt wurde (Finch et al., nicht veröffentlicht). Der Gyrus dentatus (DG) und die CA3-Regionen waren besonders empfindlich und zeigten in jeder von Tieren im Alter von P20 (abgesetzte Jungtiere) bis P84 (junge erwachsene Tiere) erhaltenen Kultur durch ADDL hervorgerufenen Zelltod. Bis zu 40 % der Zellen in dieser Region sterben nach der chronischen Exposition gegenüber ADDL ab. Das Muster des neuronalen Todes war nicht identisch mit dem, das für NMDA beobachtet wurde, das Neuronen im DG und CA1 abtötete, aber CA3 verschonte.
Einige Kulturen aus den hippokampalen DG- und CA3-Regionen von Tieren älter als 20 Tage wurden mit üblichen Präparationen von fibrillären Aβ behandelt. Konsistent mit der nicht diffusionsfähigen Beschaffenheit der Fibrillen war, dass selbst bei 20 μM kein Zelltod (gelbe Färbung) evident war. Das Färbungsmuster für Lebendzellen in dieser Kultur verifizierte, dass die Region von CA3/des Gyrus dentatus des Hippokampus untersucht wurde. Das nach der üblichen Aβ-Behandlung (d. h. fibrilläre Aβ-Präparationen) beobachtete Ausmaß des Zelltods war nicht unterscheidbar von den negativen Kontrollen, in denen den Kulturen Medium oder Medium mit Clusterin-Supplement zugesetzt wurde. In typischen Kontrollen betrug der Zelltod weniger als 5 %. Tatsächlich konnte in den Kontrollen, selbst in Kulturen, die mehrere Tage über ein typisches Experiment hinausgehend aufrechterhalten wurden, eine hohe Viabilität gefunden werden, welche bestätigt, dass das Überleben der Zellen durch Standardkulturbedingungen nicht beeinträchtigt wurde.
Ein Dosis-Wirkungs-Experiment wurde zur Bestimmung der Potenz von ADDL beim Hervorrufen des Zelltods durchgeführt. Die Bildanalyse wurde zur Quantifizierung der Färbung toter und lebender Zellen in Feldern verwendet, welche die DG/CA3-Areale enthalten. 5 erläutert die toten Zellen (%) versus die ADDL-Konzentration, gemessen als initiale Amyloid-β 1-42-Konzentration (nM). Aufgrund der Schwierigkeiten beim Quantifizieren von Hirnschnitten sind die Ergebnisse nicht detailliert genug, um die EC₅₀ mit Präzision zu bestimmen. Wie jedoch in 5 ersichtlich ist, betrug der durch ADDL hervorgerufene Zelltod, selbst nach einer 1000fachen Verdünnung (ca. 5 nM Aβ), mehr als 20 %. Eine Toxizität wurde sogar mit 0,3 nM ADDL beobachtet. Dies steht Ergebnissen gegenüber, die mit üblich gealtertem Aβ, das für Neuronen in Kultur bei ca. 20 bis ca. 50 μM toxisch ist, erhalten wurden. Diese Daten zeigen, dass ADDL in Dosen, die um das ca. 1 000–10 000fache kleiner als die in den fibrillären Aβ-Experimenten verwendeten sind, wirksam sind.
Diese Daten von den hippokampalen Schnitten bestätigen folglich die ultratoxische Beschaffenheit von ADDL. Da die ADDL zur Herbeiführung des Zelltods überdies durch das die Kultur tragende Filter passieren mussten, validieren die Ergebnisse, dass ADDL, konsistent mit ihrer kleinen oligomeren Größe, diffusionsfähig sind. Die hierin dargelegten Verfahren können auch als ein Assay auf ADDL-vermittelte Veränderungen der Zellviabilität eingesetzt werden. Der Assay kann insbesondere mittels Coinkubation oder Coadministration zusammen mit den ADDL-Stoffen durchgeführt werden, die die ADDL-Bildung und/oder -Aktivität potenziell erhöhen oder vermindern können. Die mit solcher Coinkubation oder Coadministration erhaltenen Ergebnisse können mit Ergebnissen verglichen werden, die mit dem Einschluss von ADDL allein erhalten werden.
Beispiel 7: Oxidativer Stresstoxizitätsassay mit MTT – PC12-Zellen
Dieses Beispiel legt einen Assay dar, der zum Nachweis einer frühen Toxizitätsveränderung als Response auf Amyloid-β-Oligomere eingesetzt werden kann.
Für diese Experimente wurden PC12-Zellen in Passage zu 4 × 10⁴ Zellen/Well auf eine 96-Well-Kulturplatte gebracht und 24 Stunden in DMEM + 10 % fetalem Kalbserum + 1 % S/P/F (Streptomycin, Penicillin und Fungizon) gezüchtet. Die Platten wurden 2 Stunden vor Ausplattierung der Zellen mit 200 μg/ml Poly-1-lysin zur Förderung der Zelladhäsion behandelt. Ein Set mit sechs Wells wurde unbehandelt gelassen und ihm wurde frisches Medium zugeführt, während ein anderes Set von Wells mit der Vehikelkontrolle (PBS, enthaltend 10 % 0,01 N HCl, gealtert über Nacht bei RT) behandelt wurde. Positive Kontrollen wurden mit Triton (1 %) und Na-Azid (0,1 %) in normalem Wachstumsmedium behandelt. Amyloid-β-Oligomere, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, oder gewonnen nach Coinkubation mit Clusterin, mit und ohne anwesenden Inhibitorverbindungen, wurden den Zellen 24 Stunden zugefügt. Nach der 24-stündigen Inkubation wurde den Zellen 2,5 Stunden (11 μl einer 5 mg/ml Stammlösung löslich gemacht in PBS in 100 μl Medium) MTT (0,5 mg/ml) zugefügt. Gesunde Zellen reduzieren das MTT zu einem mit Formazan (blau) gefärbten Produkt. Nach der Inkubation mit MTT wurde das Medium abgesaugt, und es wurden 100 μl 100%iges DMSO zugefügt, um die Zellen zu lysieren und die blauen Kristalle aufzulösen. Die Platte wurde 15 min bei RT inkubiert und auf einem Plattenleser (ELISA) bei 550 nm abgelesen.
Die Ergebnisse von einem derartigen Experiment sind in 6 erläutert. Wie aus dieser Figur ersichtlich ist, zeigen Kontrollzellen, die den ADDL („Kont") nicht ausgesetzt werden, Zellen, die dem Clusterin („Apo J") allein ausgesetzt werden und Zellen, die dem monomeren Aβ („Aβ") ausgesetzt werden, keine Zelltoxizität. Im Gegensatz dazu zeigen Zellen, die dem mit Clusterin coaggregierten Amyloid-β ausgesetzt und einen Tag gealtert wurden („Aβ:Apo J") eine Verminderung der MT7-Reduktion, was einen Hinweis auf eine frühe Toxizitätsveränderung liefert. Es wurde mittels AFM bestätigt, dass den letzteren Amyloid-Präparationen die Amyloid-Fibrillen fehlen.
Die Ergebnisse von diesem Experiment bestätigen folglich, dass ADDL-Präparationen, die aus der Coaggregation von mit Clusterin vermitteltem Aβ erhalten wurden, eine verstärkte Toxizität aufweisen. Darüber hinaus bestätigen die Ergebnisse, dass die oxidative Stressresponse von PC12 als ein Assay zum Nachweis von frühen Zellveränderungen aufgrund der ADDL eingesetzt werden kann. Der Assay kann mittels Coinkubation oder Coadministration zusammen mit den ADDL-Stoffen durchgeführt werden, die die ADDL-Bildung und/oder -Aktivität potenziell erhöhen oder vermindern. Die mit einer derartigen Coinkubation oder Coadministration erhaltenen Ergebnisse können mit Ergebnissen verglichen werden, die unter Einschluss von ADDL allein erhalten werden.
Beispiel 8: Oxidativer Stresstoxizitätsassay mit MTT – HN₂-Zellen
Dieses Beispiel legt einen weiteren Assay der ADDL-vermittelten Zellveränderungen dar.
Der im vorangehenden Beispiel vorlegte oxidative Stresstoxizitätsassay mit MTT kann nämlich mit HN₂-Zellen anstelle von PC 12-Zellen durchgeführt werden. Andere geeignete Zellen können auf ähnliche Weise eingesetzt werden.
Für diesen Assay werden HN₂-Zellen in Passage zu 4 × 10⁴ Zellen/Well auf eine 96-Well-Kulturplatte aufgebracht und 24 Stunden in DMEM + 10 % fetalem Kalbserum + 1 % S/P/F (Streptomycin, Penicillin und Fungizon) gezüchtet. Die Platten wurden 2 Stunden vor der Ausplattierung der Zellen mit 200 μg/ml Poly-1-lysin zur Förderung der Zelladhäsion behandelt. Die Zellen wurden 24–48 Stunden mit 5 μM Retinsäure differenziert und das Wachstum wurde mit 1 % Serum weiter inhibiert. Ein Set von Wells wurde unbehandelt gelassen und ihm wurde frisches Medium zugesetzt. Ein anderes Set von Wells wurde mit der Vehikelkontrolle (0,2 % DMSO) behandelt. Positive Kontrollen wurden mit Triton (1 %) und Na-Azid (0,1 %) behandelt. Wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellte Amyloid-β-Oligomere, mit und ohne anwesende Inhibitorverbindungen, wurden den Zellen 24 Stunden zugefügt. Nach der 24-stündigen Inkubation wurde den Zellen 2,5 Stunden (11 μl 5 mg/ml Stammlösung zu 100 μl Medium) MTT (0,5 mg/mL) zugefügt. Nach der Inkubation mit MTT wurde das Medium abgesaugt, und es wurden 100 μl 100%iges DMSO zugefügt, um die Zellen zu lysieren und die blauen Kristalle aufzulösen. Die Platte wurde 15 Minuten bei RT inkubiert und an einem Plattenleser (ELISA) bei 550 nm abgelesen.
Dieser Assay kann auf ähnliche Weise durch Coinkubation oder Coadministration zusammen mit den ADDL-Stoffen, die die ADDL-Bildung und/oder -Aktivität potenziell erhöhen oder vermindern können, durchgeführt. Die mit einer derartigen Coinkubation oder Coadministration erhaltenen Ergebnisse können mit den Ergebnissen verglichen werden, die unter Einschluss von ADDL allein erhalten werden.
Beispiel 9: Zellmorphologie mittels der Phasenmikroskopie
Dieses Beispiel legt einen noch anderen Assay der ADDL-vermittelten Zellveränderungen dar – einen Assay der Zellmorphologie mittels Phasenmikroskopie.
Für diesen Assay wurden Kulturen bis zu einer niedrigen Dichte (50–60 % Konfluenz) gezüchtet. Zur Initiierung des Experiments wurden die Zellen 1 Stunde in F12-Medium Serum-verarmt. Die Zellen wurden dann 3 Stunden mit, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellten Amyloid-β-Oligomeren, mit und ohne Inhibitorverbindungen, die den Zellen zugefügt wurden, 24 Stunden inkubiert. Nach 3 Stunden wurden die Zellen auf morphologische Unterschiede untersucht oder zur Immunfluoreszenzmarkierung fixiert. Die Proben wurden unter Verwendung des MetaMorph Bildanalysensystems und einer MRI-Videokamera (Universal Imaging, Inc.) untersucht.
Die Ergebnisse dieser Assays werden in den folgenden Beispielen vorgelegt. Der Assay kann insbesondere durch Coinkubation oder Coadministration zusammen mit den ADDL-Stoffen durchgeführt werden, die die ADDL-Bildung und/oder -Aktivität potenziell erhöhen oder vermindern können. Die mit dieser Coinkubation oder Coadministration erhaltenen Ergebnisse können mit Ergebnissen verglichen werden, die mit dem Einschluss von ADDL allein erhalten werden.
Beispiel 10: FACScan-Assay auf Bindung von ADDL an Zelloberflächen
Da Zelloberflächenrezeptoren vor kurzem auf Gliazellen für wie üblich hergestelltes Aβ identifiziert wurden (Yan et al., Nature, 382, 685–691, 1996; El Khoury et al., Nature, 382, 716–719, 1996) und weil der Neuronentod bei niedrigen ADDL-Dosen auf eine mögliche Beteiligung der Signalisierungsmechanismen hinwies, wurden Experimente zur Bestimmung durchgeführt, ob für ADDL spezifische Zelloberflächen-Bindungsstellen auf Neuronen existieren.
Für die Flowcytometrie wurden Zellen mit 0,1 % Trypsin dissoziiert und mindestens über Nacht auf Gewebekultur-Kunststoff bei niedriger Dichte ausplattiert. Die Zellen wurden mit kalter Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS)/0,5 mM EDTA entfernt, dreimal gewaschen und in eiskaltem PBS auf eine Endkonzentration von 500 000 Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden in kalter PBS mit Amyloid-β-Oligomeren inkubiert, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurden, außer dass 10 % des Amyloid-β, ein Amyloid-β 1-42-Analog, enthaltend Biocytin an Position 1, das Aspartat ersetzt, darstellt. Oligomere mit und ohne anwesende Inhibitorverbindungen wurden den Zellen 24 Stunden zugefügt. Die Zellen wurden zweimal in kalter PBS zur Entfernung von freien, ungebundenen Amyloid-β-Oligomeren gewaschen, in einer Verdünnung von 1:1 000 von an Fluorescein konjugiertem Avidin resuspendiert und eine Stunde bei 4°C unter vorsichtigem Rühren inkubiert. Als Alternative wurden Amyloid-β-spezifische Antikörper und fluoreszierende sekundäre Antikörper anstelle von Avidin eingesetzt, wobei die Notwendigkeit zur Inkorporation von 10 % des biotinylierten Amyloid-β-Analogs eliminiert wurde. Das heißt, der biotinylierte monoklonale 6E10-Antikörper (1 μl Senetec, Inc., St. Louis, Missouri) wurde der Zellsuspension zugefügt und 30 Minuten inkubiert. Nach der Pelletierung der Zellen und Resuspension in 500 μl PBS, unter Verwendung von FITC-konjugiertem Streptavidin (1:500, Jackson Laboratories) für 30 Minuten wurde gebundener Antikörper nachgewiesen.
Die Zellen wurden anhand eines Becton-Dickenson fluoreszenzaktivierten Zellscanners (FACScan) analysiert. In der Regel wurden 10 000 oder 20 000 Ereignisse für sowohl Vorwärtsstreuung (Größe) als auch Fluoreszenzintensität gesammelt, und die Daten wurden mittels der Consort 30 Software (Becton-Dickinson) analysiert. Die Bindung wurde durch Multiplikation der mittleren Fluoreszenz mit der Gesamtzahl der Ereignisse, und Subtraktion des Wertes für die Hintergrundfluoreszenz der Zellen in Anwesenheit von 6E10 und FITC quantifiziert.
Für diese Experimente wurde zum Vergleich der ADDL-Immunreaktivität in Suspensionen von Hefezellen in der log-Phase (einer größtenteils Kohlenhydrat- Oberfläche) und der B103 ZNS-Nervenzelllinie die FACScan-Analyse durchgeführt (Schubert et al., Nature, 249, 224–227, 1974). Für B103-Zellen verursachte das Zufügen von ADDL, wie in 7 gezeigt, eine bedeutende Steigerung der zellassoziierten Fluoreszenz. Die einminütige Behandlung der B103-Zellen mit Trypsin eliminierte die ADDL-Bindung. Demgegenüber wiesen Kontroll-Hefezellen (Daten nicht gezeigt) keine ADDL-Bindung auf, wodurch die Selektivität von ADDL für auf der Zelloberfläche vorliegende Proteine verifiziert werden konnte. Suspensionen von hippokampalen Zellen (trypsinisiertes Gewebe, gefolgt von einer zweistündigen metabolischen Erholung), banden auch ADDL, aber verglichen mit den B103-Zellen mit einer reduzierten Anzahl an Bindungsereignissen, wie durch die reduzierte Fluoreszenz-Intensität des markierten Peaks belegt werden konnte. Dies ist in 8 als eine Linksverschiebung des markierten Peaks ersichtlich.
Aus diesen Ergebnissen geht folglich hervor, dass die ADDL ihre Wirkungen durch Bindung an einen spezifischen Zelloberflächenrezeptor ausüben. Die Trypsin-Sensitivität von B103-Zellen zeigte insbesondere, dass ihre ADDL-Bindungsstellen Zelloberflächenproteine darstellten und dass die Bindung für einen Subset von speziellen Domänen in diesen Proteinen selektiv war.
Darüber hinaus kann der vorliegende Assay auch als ein Assay auf die ADDL-vermittelte Zellbindung eingesetzt werden. Der Assay kann insbesondere durch Coinkubation oder Coadministration zusammen mit den ADDL-Stoffen, die die ADDL-Bildung und/oder -Aktivität potenziell erhöhen oder vermindern können, durchgeführt werden. Die mit einer derartigen Coinkubation oder Coadministration erhaltenen Ergebnisse können mit Ergebnissen verglichen werden, die unter Einschluss von ADDL allein erhalten werden.
Beispiel 11: Inhibition der ADDL-Bildung durch Gossypol
Dieses Beispiel stellt die Art und Weise dar, auf die die ADDL-Bildung, zum Beispiel unter Verwendung von Gossypol, inhibiert werden kann.
Für diese Experimente wurden ADDL, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Gossipol (Aldrich) wurde einer Konzentration von 100 μM während der Inkubation des Aβ-Proteins zur Bildung von ADDL zugefügt. Die sich ergebende Präparation wurde unter Verwendung des LIVE/DEAD^®-Assaykits, wie zuvor beschrieben, auf Neurotoxizität beurteilt. Der Umfang des Zelltods, der nach 24-stündiger Exposition gegenüber der Gossypol/VADDL-Präparation auftrat, betrug weniger als 5 %. Dies ist mit dem Toxizitätsgrad vergleichbar, der für eine entsprechende DMSO-Kontrollpräparation (d. h. 6 %) oder eine Gossypol-Kontrollpräparation, die keine ADDL (d. h. 4 %) enthielt, erhalten wurde.
Diese Ergebnisse bestätigen folglich, dass Verbindungen, wie zum Beispiel Gossypol, zur Inhibition der ADDL-Bildung eingesetzt werden können.
Beispiel 12: Inhibition der ADDL-Bindung durch tryptische Peptide
Da gefunden wurde, dass die Trypsinisierung von B103-Zellen die sich anschließende ADDL-Bindung blockierte, wurden – wie in diesem Beispiel dargelegt – Experimente zum Testen durchgeführt, ob aus der Zelloberfläche freigesetzte tryptische Fragmente die ADDL-Bindungsaktivität retardieren.
Tryptische Peptide wurden unter Verwendung konfluenter B103-Zellen von vier Platten (100 mm), die durch Trypsinisierung (0,025 %, Life Technologies) für ca. 3 Minuten entfernt wurden, hergestellt. Trypsin-Chymotrypsin-Inhibitor (Sigma, 0,5 mg/ml in Hank's gepufferter Salzlösung) wurde zugefügt, und die Zellen wurden mittels Zentrifugation bei 500 × g für 5 Minuten entfernt. Der Überstand (ca. 12 ml) wurde unter Verwendung eines Centricon 3 Filters (Amicon) auf ca. 1,0 ml konzentriert und wurde nachdem die Proteinkonzentration bestimmt wurde, eingefroren. Für Blockierungsexperimente wurden dem organotypischen Hirnschnitt oder den suspendierten B103-Zellen im FAC-Assay zur gleichen Zeit mit den ADDL sterile konzentrierte tryptische Peptide (0,25 mg/ml) zugefügt.
In FACScan-Assays inhibierten in das Kulturmedium (0,25 mg/ml) freigesetzte tryptische Peptide, wie in 9 gezeigt, die ADDL-Bindung um > 90 %. Beim Vergleich wiesen die dem BSA ausgesetzten Kontrollzellen, selbst bei 100 mg/ml, keinen Bindungsverlust auf. Die tryptischen Peptide, die falls sie nach den ADDL zugefügt wurden, bereits an Zellen gebunden waren, senkten die Fluoreszenz-Intensitäten nicht signifikant. Dies deutet darauf hin, dass die Peptide die Fähigkeit des Assays bei der Quantifizierung gebundener ADDL nicht beeinträchtigen. Außer der Blockierung der ADDL-Bindung stellten die tryptischen Peptide auch Antagonisten des durch ADDL hervorgerufenen Zelltods dar. Wie in 9 ersichtlich ist, resultierte das Zufügen von tryptischen Peptiden nämlich in einer 75%igen Reduktion des Zelltods, p < 0,002.
Diese Daten bestätigen, dass bestimmte Zelloberflächenproteine ADDL-Bindung vermitteln und dass löslich gemachte tryptische Peptide aus der Zelloberfläche eine neuroprotektive, ADDL-neutralisierende Aktivität bereitstellen. Darüber hinaus kann der vorliegende Assay auch als ein Assay für Stoffe verwendet werden, die eine ADDL-Zellbindung oder ADDL-Wirkungen auf die Zellaktivität vermitteln. Der Assay kann insbesondere durch Coinkubation oder Coadministration zusammen mit den ADDL-Stoffen, die potenziell die ADDL-Bildung und/oder -Aktivität erhöhen oder vermindern können, durchgeführt werden. Die mit einer derartigen Coinkubation oder Coadministration erhaltenen Ergebnisse können mit Ergebnissen verglichen werden, die unter Einschluss von ADDL allein erhalten werden. Das Zufügen der Stoffe vor oder nach der Bindung der ADDL an die Zelloberfläche kann zur Identifizierung von Stoffen, die sich auf eine derartige Bindung auswirken oder die wirken, nachdem die Bindung aufgetreten ist, verglichen werden.
Beispiel 13: Dosis-Wirkungs-Kurve für die ADDL-Zellbindung
Dieses Beispiel legt die Dosis-Wirkungs-Experimente dar, die zur Bestimmung durchgeführt wurden, ob die ADDL-Bindung an die Zelloberfläche sättigungsfähig ist. Eine derartige Sättigungsfähigkeit würde erwartet, wenn die ADDL tatsächlich mit einem bestimmten Zelloberflächenrezeptor interagieren.
Für diese Studien wurden B103-Zellen mit zunehmenden ADDL-Mengen und zunehmender ADDL-Bindung durch die FACScan-Analyse quantifiziert. Die Ergebnisse sind in 10 ersichtlich. Diese Ergebnisse bestätigen, dass für die ADDL-Bindung ein distinktes Plateau erreicht wird. Die Sättigungsfähigkeit der ADDL-Bindung tritt bei einer relativen Aβ 1-42-Konzentration (d. h. ADDL-Konzentration bezogen auf Aβ) von ca. 250 nm auf.
Diese Ergebnisse bestätigen folglich, dass die ADDL-Bindung sättigungsfähig ist. Eine derartige Sättigungsfähigkeit der ADDL-Bindung, insbesondere wenn sie mit den Ergebnissen der Trypsin-Studien in Erwägung gezogen wird, validiert, dass die ADDL durch einen bestimmten Zelloberflächenrezeptor wirken.
Beispiel 14: Zellbasierter ELISA auf die ADDL-Bindungsaktivität
Dieses Beispiel legt einen zellbasierten Assay, insbesondere den zellbasierten Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) dar, der zur Beurteilung der ADDL-Bindungsaktivität eingesetzt werden kann.
Für diese Studien wurden 48 Stunden vor Durchführung des Experiments 2,5 × 10⁴ B103-Zellen, die als eine Suspension in 100 μl DMEM vorliegen, in jedes Assay-Well einer 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben und in einem Inkubator bei 37°C gehalten. 24 Stunden vor der Durchführung des Experiments wurden gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren ADDL hergestellt. Zu Beginn des Assays wurde jedes Well der Mikrotiterplatte, enthaltend die Zellen, 10 Minuten mit 50 μl Fixationsmittel (3,7 % Formalin in DMEM) bei Raumtemperatur behandelt. Dieses Fixationsmittel/diese DMEM-Lösung wurde entfernt, und eine zweite Behandlung mit 50 μl Formalin (keinem DMEM) wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Fixationsmittel wurde entfernt, und jedes Well wurde zweimal mit 100 μl Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Jedem Well wurden 200 μl eines Blockierungsmittels (1 % BSA in PBS) zugefügt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit 100 μl PBS wurden 50 μl ADDL (zuvor 1:10 in PBS verdünnt) den entsprechenden Wells oder PBS als Kontrolle allein zugefügt, und die resultierenden Wells wurden 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Es erfolgte dreimaliges Waschen mit 100 μl PBS, und den entsprechenden Wells wurden 50 μl biotinylierte 6E10 (Senetek), verdünnt 1:1000 in 1 % BSA/PBS, zugefügt. Anderen Wells wurde PBS als Kontrolle zugefügt. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur auf einem Rotator wurden die Wells dreimal mit 50 μl PBS gewaschen, und 50 μl des ABC-Reagenzes (Elite ABC-Kit, Vector Labs) wurden zugefügt und 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit 50 μl PBS wurden jedem Well 50 μl ABTS-Substratlösung zugefügt, und die Platte wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde auf zunehmende Absorption bei 405 nm analysiert. Nur wenn ADDL, Zellen und 6E10 vorlagen, trat – wie in 11 erläutert – ein signifikantes Signal auf.
Diese Ergebnisse bestätigen weiter, dass ein zellbasierter ELISA-Assay als ein Assay auf die ADDL-vermittelte Zellbindung eingesetzt werden kann. Der Assay kann insbesondere durch Coinkubation oder Coadministration zusammen mit den ADDL-Stoffen, die potenziell die ADDL-Bildung und/oder -Aktivität erhöhen oder vermindern können, durchgeführt werden. Mit einer derartigen Coinkubation oder Coadministration erhaltene Ergebnisse können mit Ergebnissen verglichen werden, die unter Einschluss von ADDL allein erhalten werden.
Beispiel 15: Fyn-Kinase-Knockout schützt gegen ADDL-Neurotoxizität
Zur weiteren Untersuchung der potenziellen Beteiligung der Signaltransduktion an der ADDL-Toxizität verglichen die Experimente in diesem Beispiel die Auswirkung von ADDL auf Hirnschnitte von isogenen fyn –/– fyn +/+ -Tieren. Fyn gehört zur Src-Familie der Protein-Tyrosinkinasen, die für multiple Zellsignale und -responses eine wichtige Rolle spielen (Clarke et al., Science, 268, 233–238). Fyn ist von besonderem Interesse, weil es in von AD betroffenen Neuronen upreguliert wird (Shirazi et al., Neuroreport, 4, 435–437, 1993). Es scheint auch durch konventionelle Aβ-Präparationen (Zhang et al., Neurosci. Letts., 211, 187–190, 1996) aktiviert zu werden, von denen anschließend mittels AFM gezeigt wurde, dass sie ADDL enthalten. Fyn-Knockout-Mäuse weisen im sich entwickelnden Hippokampus überdies eine reduzierte Apoptose auf (Grant et al., Science, 258, 1903–1910, 1992).
Für diese Studien wurden Fyn-Knockout-Mäuse (Grant et al., Science, 258, 1903–1910, 1992) wie in den vorangehenden Beispielen beschrieben behandelt, und zwar durch Vergleich von Bildern von Hirnschnitten von Mäusen, die entweder 24 Stunden mit ADDL zur Bestimmung der toten Zellen im DG- und CA3-Areal behandelt oder nicht behandelt wurden. Der quantitative Vergleich (ersichtlich in 12) wurde mit Fehlerbalken erhalten, welche das Mittel +/– SEM für 4–7 Schnitte darstellen.
Im Gegensatz zu Kulturen von Wildtyptieren zeigten Kulturen von fyn –/– -Tieren, wie in 12 gezeigt, einen vernachlässigbaren, durch ADDL hervorgerufenen Zelltod. Für ADDL war die Höhe des Zelltods in fyn +/+-Schnitten um mehr als das 5fache höher als in fyn –/– -Kulturen. In fyn –/– -Kulturen lag der Zelltod in Anwesenheit von ADDL auf dem Hintergrundsniveau. Die neuroprotektive Response war selektiv; der durch NMDA-Rezeptoragonisten hervorgerufene hippokampale Zelltod (Bruce et al., Exper. Neurol, 132, 209–219, 1995; Vornov et al., Neurochem., 56, 996–1006, 1991) wurde nicht beeinflusst (nicht gezeigt). Die Analyse (ANOVA) unter Verwendung des multiplen Vergleichs nach Tukey ergab einen Wert von P < 0,001 für die fyn +/+-Daten für ADDL im Vergleich zu allen anderen Bedingungen.
Diese Ergebnisse bestätigen, dass der Verlust der Fyn-Kinase die hippokampalen DG- und CA3-Regionen vor dem durch von ADDL induzierten Zelltod schützte. Die Ergebnisse validieren, dass die ADDL-Toxizität durch einen Mechanismus vermittelt wird, der durch Knockout von Fyn-Protein-Tyrosinkinase blockiert wird. Diese Ergebnisse weisen weiter darauf hin, dass neuroprotektive Vorteile durch Behandlungen erhalten werden können, die die Aktivität der Fyn-Protein-Tyrosinkinase oder die Expression des Gens, das für die Fyn-Proteinkinase codiert, außer Kraft setzen.
Beispiel 16: Astrozyten-Aktivierungsexperimente
Zur weiteren Untersuchung der potenziellen Beteiligung der Signaltransduktion bei der ADDL-Toxizität verglichen die Experimente in diesem Beispiel die Auswirkung von ADDL auf die Aktivierung von Astrozyten.
Für diese Experimente wurden die kortikalen Astrozytenkulturen aus neonatalen (1–2 Tage alten Sprague-Dawley-Rattenjungen anhand des Verfahrens von Levison und McCarthy (Levison et al., in: Banker et al. (Hrsg.), Culturing Nerve Cells, MIT-Press, Cambridge, MA, 309–36, 1991), wie vorstehend beschrieben (Hu et al., J. Biol. Chem., 271, 2543–2547, 1996) hergestellt. Der cerebrale Cortex wurde, um es kurz zusammenzufassen, herauspräpariert, trypsinisiert, und die Zellen wurden in einem α-MEM (Gibco, BRL), enthaltend 10 % fetales bovines Serum (Hyclone Laboratories Inc., Logan UT) und Antibiotika (100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin) kultiviert. Nach 11 Tagen in Kultur wurden die Zellen trypsinisiert und erneut auf 100-mm-Platten bei einer Dichte von ca. 6 × 10⁵ Zellen/Platte ausplattiert und bis zur Konfluenz gezüchtet (Hu et al., J. Biol. Chem., 271, 2543–2547, 1996).
Astrozyten wurden mit ADDL behandelt, die gemäß Beispiel 1 oder mit Aβ 17–42 (synthetisiert wie nach Lambert et al., J. Neurosci. Res., 39, 377–384, 1994; auch gewerblich erhältlich) präpariert wurden. Die Behandlung wurde durch Trypsinisierung konfluenter Astrozyten-Kulturen und Ausplattieren auf Gewebekulturplatten (60 mm) bei einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/Platte (z. B. für die RNA-Analyse und ELISAs), in 4-Well-Kammerobjektträgern zu 5 × 10⁴ Zellen/Well (z. B. für die Immunhistochemie), oder auf 96-Well-Platten bei einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/Well (z. B. für NO-Assays) durchgeführt. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Zellen zweimal mit PBS zur Entfernung von Serum gewaschen und die Kulturen in α-MEM, enthaltend N₂-Supplemente, für zusätzliche 24 Stunden vor dem Zufügen von Aβ-Peptiden oder Kontrollpuffer (d. h. von Puffer-enthaltendem Verdünnungsmittel) inkubiert.
Die Untersuchung der Astrozytenmorphologie wurde durch Untersuchung der Zellen unter einem Nikon TMS inversen Mikroskop, das mit einer Javelin SmartCam-Kamera, Sony Video-Monitor und einem Farbvideo-Drucker ausgerüstet war, durchgeführt. In der Regel wurden vier arbiträr ausgewählte mikroskopische Felder (20 × Vergrößerung) für jede experimentelle Bedingung fotografiert. Die morphologische Aktivierung wurde anhand der Fotografien mit NIH Image durch Zählen der Anzahl aktivierter Zellen (definiert als eine Zelle mit einem Fortsatz oder mehr Fortsätzen mit einer Länge von mindestens der eines Zellkörpers) in den vier Feldern quantifiziert.
Die mRNA-Spiegel in den Kulturen wurden durch Verwendung von Northern Blots und Slot-Blots bestimmt. Dies wurde durch eine 24-stündige Exposition der Zellen gegenüber ADDL oder Kontrollpuffer durchgeführt. Nach dieser Zeit wurden die Zellen zweimal mit Diethylpyrocarbonat-(DEPC)-behandelter PBS gewaschen, und die Gesamt-RNA wurde mittels RNeasy-Minisäulen zur Reinigung (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA), wie vom Hersteller empfohlen, isoliert. Typische Ausbeuten der RNA lagen bei 8 bis 30 mg der Gesamt-RNA pro Platte. Für die Northern Blot-Analyse wurden 5 mg Gesamt-RNA pro Probe auf einem Agarose-Formaldehydgel getrennt, durch Kapillarwirkung auf eine Hybond-N-Membran (Amersham, Arlington Heights IL) überführt und UV-vernetzt. Für die Slot-Blot-Analyse wurden 200 ng der Gesamt-RNA pro Probe auf eine Duralon-UV-Membran (Stratagene, La Jolla, CA) unter Vakuum geblotted und UV-vernetzt. Die Bestätigung äquivalenter RNA-Beladungen wurde mittels Färbung mit Ethidiumbromid oder durch Hybridisierung und Normalisierung mit einer GAPDH-Sonde durchgeführt.
Die Sonden wurden durch Restriktionsenzymverdau von Plasmiden und sich anschließender Gelreinigung des entsprechenden Fragments generiert. Die cDNA-Fragmente wurden nämlich unter Verwendung der Gesamt-RNA von kortikalen Astrozyten der Ratte durch RT-PCR hergestellt. Die RNA wurde mit einem Superscript II-System (GIBCO/BRL) revers transkribiert, und die PCR wurde an einem PTC-100 Thermoregler (MJ Research Inc., Watertown, MA) unter Verwendung von 35 Zyklen bei den folgenden Einstellungen durchgeführt: 40 Sekunden bei 52°C; 40 Sekunden bei 72°C; 40 Sekunden bei 96°C. Bei den zur Amplifikation eines 447 bp-Fragments von IL-1β von der Ratte verwendeten Primerpaaren handelte es sich um die folgenden: Forward: 5' GCACCTTCTTTCCCTTCATC 3' [SEQ ID NO:1]. Revers: 5' TGCTGATGTACCAGTTGGGG 3' [SEQ ID NO:2]. Bei den zur Amplifikation eines 435 bp-Fragments von den von der Ratten-GFAP verwendeten Primerpaaren handelte es sich um die folgenden: Forward: 5' CAGTCCTTGACCTGCGACC 3' [SEQIDNO:3]. Revers: 5' GCCTCACATCACATCCTTG 3'[SEQ ID NO:4]. Die PCR-Produkte wurden mit dem TA-Klonierungskit von der Fa. Invitrngen in den pCR2.1-Vektor cloniert, und die Konstrukte wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert. Die Sonden wurden durch EcoRI-Verdau des Vektors, gefolgt von der Gelreinigung der entsprechenden Fragmente hergestellt. Bei den Plasmiden handelte es sich um das iNOS-cDNA-Plasmid pAstNOS-4 von der Ratte, das den iNOS-cDNA-Basen 3007–3943 von der Ratte (Galea et al., J, Neurosci. Res., 37, 406–414, 1994) entsprach, und das GAPDH-cDNA-Plasmid pTRI-GAPDH von der Ratte (Ambion, Inc., Austin TX).
Die Sonden (25 ng) wurden unter Verwendung eines Prime-a-Gene Random-Prime Markierungskits (Promega, Madison WI) mit ³²P-dCTP markiert und von nicht inkorporierten Nukleotiden unter Verwendung von Push-Säulen (Stratagene) getrennt. Die Hybridisierung wurde unter stringenten Bedingungen mit QuikHyb-Lösung (Stratagene) unter Verwendung des für die stringente Hybridisierung empfohlenen Protökolls durchgeführt. Die Prähybridisierung wurde, kurz zusammengefasst, ca. 30 bis 60 Minuten bei 68°C durchgeführt, und die Hybridisierung fand ca. 60 Minuten bei 68°C statt. Die Blots wurden dann unter stringenten Bedingungen gewaschen und entweder gegenüber der Autoradiographie- oder der Phosphoimaging-Platte exponiert. Die Autoradiogramme wurden mit einem BioRad GS-670 Laser-Scanner gescannt, und die Bandendichte wurde mit Molecular Analyst v2.1 (BioRad, Hercules CA) Bildanalysen-Software quantifiziert. Die Phosphoimages wurden an einem Storm 840-System (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA) erfasst, und die Bandendichte wurde mit der Image Quant v1.1 (Molecular Dynamics) Bildanalysen-Software quantifiziert.
Für die Messung von NO anhand des Nitrit-Assays wurden die Zellen 48 Stunden mit Aβ-Peptiden oder Kontrollpuffer inkubiert, und dann wurden die Nitrit-Spiegel im konditionierten Medium durch die Griess-Reaktion, wie zuvor beschrieben, gemessen (Hu et al., J. Biol. Chem., 271, 2543–2547, 1996). Wenn der NOS-Inhibitor N-Nitro-Larginin-methylester (L-Bezeichnung) oder das inaktive Isomer mit der D-Bezeichnung verwendet wurde, wurden diese Stoffe den Kulturen zur gleichen Zeit wie das Aβ zugefügt.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 13 ersichtlich. Wie aus dieser Figur hervorgeht, nimmt die Glia-Aktivierung zu, wenn die Astrozyten mit ADDL inkubiert werden, nimmt aber nicht zu, wenn Astrozyten mit Aβ 17–42 inkubiert werden.
Diese Ergebnisse bestätigen, dass ADDL Gliazellen aktivieren. Es ist möglich, dass Glia-Proteine zu neuralen Defiziten beitragen können, wie sie zum Beispiel bei der Alzheimer-Krankheit auftreten, und dass einige Wirkungen der ADDL faktisch indirekt durch die Aktivierung von Gliazellen vermittelt werden können. Die Gliaproteine können insbesondere die Bildung von ADDL oder ADDL-vermittelten Wirkungen, die unterstromig von der Rezeptorbindung auftreten, fördern. Es ist auch bekannt, dass Clusterin im Gehirn von Alzheimer-Kranken upreguliert wird, und Clusterin wird bei erhöhten Spiegeln nur in Gliazellen, die aktiviert sind, gebildet. Basierend auf dieser Aktivierung von Gliazellen durch einen Nicht-ADDL könnte ein Nichtamyloid-Stimulus Clusterin produzieren, das wiederum zu ADDL führen könnte, die wiederum die Neuronen schädigen würden und zu weiterer Aktivierung von Gliazellen führen.
Ungeachtet des Mechanismus deuten diese Ergebnisse weiter darauf hin, dass neuroprotektive Vorteile durch Behandlungen erhalten werden können, die die ADDL-vermittelte Gliazellaktivierung modulieren (d. h. erhöhen oder vermindern). Die Ergebnisse deuten weiter darauf hin, dass die Blockierung dieser Wirkungen auf die Gliazellen, mit Ausnahme der Blockierung der neuronalen Wirkungen, vorteilhaft sein können.
Beispiel 17: LTP-Assay – Disruption von LTP durch ADDL
Die Langzeitpotenzierung (LTP) stellt ein klassisches Paradigma für die synaptische Plastizität und ein Modell für das Gedächtnis und Lernen, Fähigkeiten. die im Frühstadium der AD selektiv verloren gehen, dar.
Dieses Beispiel legt Experimente dar, die zur Untersuchung der Wirkungen von ADDL auf die LTP, insbesondere auf die LTP der Bahn des medialen Tractus perforans zu den Körnerzellen durchgeführt werden.
Injektionen für intakte Tiere:
Mäuse wurden mit Urethan anästhesiert und in einen stereotaktischen Apparat gebracht. Die Körpertemperatur wurde unter Verwendung eines erhitzten Wassermantelpolsters aufrechterhalten. Die Hirnoberfläche wurde durch Löcher im Schädel exponiert. Die Bregma- und Lambda-Positionen zur Injektion in die mittlere molekulare Schicht des Hippokampus befinden sich 2 mm posterior zum Bregma, 1 mm lateral zur Mittellinie und 1,2–1,5 mm ventral zur Hirnoberfläche. Die Amyloid-β-Oligomer-Injektionen erfolgten durch einen Stickstoffstoß durch Glaspipetten mit einem Durchmesser von ca. 10 nm. Über den Verlauf einer Stunde wurden Volumina von 20–50 nl einer Amyloid-β-Oligomerlösung (180 nM Amyloid-β in Phosphatgepufferter Salzlösung, PBS) gegeben. Kontrollmäuse erhielten ein äquivalentes Volumen von PBS allein. Dem Tier wurde erlaubt, für verschiedene Zeitperioden, bevor der LTP-Stimulus gegeben wird (in der Regel 60 Minuten) zu ruhen.
LTP bei injizierten Tieren:
Die Experimente folgen dem von Routtenberg und Kollegen für LTP bei Mäusen etablierten Paradigma (Namgung et al., Brain Research, 689, 85–92, 1995). Die Bahnstimulation des Tractus perforans vom entorhinalen Cortex wurde verwendet, wobei die Aufzeichnung von der mittleren molekularen Schicht und dem Zellkörper des Gyrus dentatus ausgehend erfolgte. Ein Populations-exzitatorisches postsynaptisches Potential (Pop-EPSP) und ein Populations-Spikepotential (Pop-Spike) wurden nach der elektrischen Stimulation beobachtet. Die LTP könnte in diesen Responses durch einen Stimulus von drei Folgen von 400 Hz, 8 × 0,4 ms Pulse/Folge (Namgung et al., Brain Research, 689, 85–92, 1995) induziert werden. Die Aufzeichnungen wurden 2–3 Stunden nach dem Stimulus (d. h. zum Zeitpunkt 0 aufgebracht) zur Bestimmung vorgenommen, ob die LTP beibehalten wird. Das Tier wurde dann sofort geopfert oder es wurde ihm erlaubt, sich 1, 3 oder 7 Tage zu erholen, und es wurde dann wie vorstehend geopfert. Das Hirn wurde mit 30 % Saccharose kryogeschützt, und dann wurden mit einem Mikrotom Schnitte angefertigt (30 μM). Einige Schnitte wurden auf einen mit Gelatine beschichteten Objektträger gebracht, und andere wurden unter Verwendung eines freifließenden Protokolls analysiert. Die Immunhistochemie wurde zur Überwachung der Veränderungen in GAP-43, in den PKC-Subtypen und der Proteinphosphorylierung von Tau (PHF-1), Paxillin und der fokalen Adhäsionskinase verwendet. Die Wellenformen wurden, wie zuvor beschrieben, maschinell analysiert (Colley et al., J. Neurosc., 10, 3353–3360, 1990). Ein 2-seitiger ANOVA vergleicht die Veränderungen der Spikeamplitude zwischen behandelten und unbehandelten Gruppen.
14 erläutert die Spikeamplituden-Wirkung von ADDL bei intakten Tieren. Wie in dieser Figur deutlich ersichtlich ist, blockieren die ADDL die Persistenzphase der LTP, induziert durch elektrische Stimuli einer hohen Frequenz, die auf den entorhinalen Cortex aufgebracht und als Spikeamplitude des Zellkörpers in der mittleren molekularen Schicht des Gyrus dentatus gemessen wurden.
Nachdem das LTP-Experiment durchgeführt war, wurde den Tieren erlaubt, sich für verschiedene Zeiten zu erholen, und sie wurden dann unter Verwendung von einem Natriumpentobarbitol-Anästhetikum und Perfusion mit 4 % Paraformaldehyd geopfert.
Für Viabilitätsstudien wurden Zeiten von 3 Stunden, 24 Stunden, 3 Tagen und 7 Tagen verwendet. Das Hirn wurde mit 30 % Saccharose kryogeschützt, und dann wurden mit einem Mikrotom Schnitte angefertigt (30 μM). Die Schnitte wurden auf einen mit Gelatine beschichteten Objektträger gebracht, und initial mit Cresylviolett gefärbt. Der Zellverlust wurde durch Zählen der Zellkörper im Gyros dentatus, CA3, CA1 und dem entorhinalen Cortex gemessen und mit der Dosis und der Zeit der Exposition gegenüber ADDL korreliert. Die Ergebnisse dieser Experimente bestätigten, dass 24 Stunden nach den LTP-Experimenten kein Zelltod auftrat.
Auf ähnliche Weise wurde die LTP-Response in hippokampalen Schnitten von jungen erwachsenen Ratten untersucht. Wie in 15 ersichtlich ist, verhindert die Inkubation von hippokampalen Schnitten von der Ratte mit ADDL weitgehend die LTP vor irgendwelchen offensichtlichen Zeichen der Zelldegeneration. Hippokampale Schnitte (n = 6), die vorher 45 Minuten 500 nM ADDL ausgesetzt wurden, zeigten 30 Minuten nach der tetanischen Stimulation (mittlere Amplitude 99 % +/– 7,6), trotz einer stetigen Kapazität für Aktionspotenziale, keine Potenzierung des Populations-Spikes. Im Gegensatz dazu wurde die LTP ohne weiteres in Schnitten induziert, die mit dem Vehikel (n = 6), mit einer Amplitude von 138 % +/– 8,1 für die letzten 10 Minuten inkubiert wurden; dieser Wert ist mit dem vergleichbar, der zuvor in dieser Altersgruppe nachgewiesen wurde (Trommer et al., Exper. Neurol., 131, 83–92, 1995). Obwohl die LTP in ADDL-behandelten Schnitten abwesend war, waren ihre Zellen zur Generierung von Aktionspotenzialen kompetent und zeigten keine Anzeichen einer Degeneration.
Diese Ergebnisse validieren, dass sowohl in intakten Tieren als auch Gewebeschnitten, das Zufügen von ADDL in weniger als einer Stunde, vor jedweder Zellgeneration oder Zellabtötung, zur signifikanten Disruption der LTP führte. Diese Experimente unterstützen folglich, dass ADDL sehr frühe Wirkungen ausüben, und das Intervenieren mit der ADDL-Bildung und/oder -Aktivität kann folglich zum Erhalt einer therapeutischen Wirkung vor dem Fortschreiten einer Erkrankung, Störung oder einem Zustand (z. B. der Alzheimer-Krankheit) zu einem Stadium, in dem Zelltod auftritt, eingesetzt werden. In anderen Worten bestätigen diese Ergebnisse, dass Verminderungen des Gedächtnisses auftreten, bevor die Neuronen absterben. Das Intervenieren vor einem solchen Zelltod kann folglich zum Umkehren der Progression eingesetzt werden und Verminderungen des Gedächtnisses potenziell wiederherstellen.
Beispiel 18: Frühe Wirkungen von ADDL in vivo
Dieses Beispiel legt die frühen Wirkungen von ADDL in vivo und die Art und Weise, wie die Kenntnis um solche frühen Wirkungen manipuliert werden kann, dar.
Die primären Symptome der Alzheimer-Krankheit beinhalten Lern- und Gedächtnisdefizite. Die Verbindung zwischen Verhaltensdefiziten und aggregierten Amyloid-Ablagerungen ist jedoch schwer zu etablieren gewesen. Bei transgenen Mäusen führte die Überexpression des Mutanten-APPs unter der Kontrolle des Plättchenwachstumsfaktor-Promotors zur Ablagerung großer Amyloid-Mengen (Games et al., Nature, 373, 523–527, 1995). Im Gegensatz dazu wurden unter Verwendung dieses Systems keine Verhaltensdefizite mitgeteilt. Andere Forscher (d. h. Nalbantoglu et al., Nature, 387, 500–505, 1997 und Holcomb et al., Nat. Med., 4, 97–100, 1998), die mit transgenen Mäusen arbeiten, teilen mit, dass sie signifikante Verhaltens- und Kognitionsdefizite beobachten, die lange bevor irgendwelche signifikanten Ablagerungen von aggregiertem Amyloid beobachtet werden, auftreten. Diese Verhaltens- und Kognitionsdefekte schließen das Versagen hinsichtlich einer Langzeitpotenzierung (Nalbantoglu et al., vorstehend) ein. Diese Modelle deuten kollektiv darauf hin, dass nicht abgelagerte Formen des Amyloids für die frühen Kognitions- und Verhaltensdefizite, die aufgrund der induzierten neuronalen Funktionsstörung auftreten, verantwortlich sind. Konsistent mit diesen Modellen ist, dass die hierin beschriebenen neuen ADDL diese nicht abgelagerte Form des Amyloids darstellen, die die frühen Kognitions- und Verhaltensdefekte verursachen. Im Hinblick darauf können erfindungsgemäß ADDL-modulierende Verbindungen in der Behandlung und/oder Prävention dieser frühen Kognitions- und Verhaltensdefizite, die sich aus der ADDL-induzierten neuronalen Funktionsstörung ergeben, eingesetzt werden, oder es können ADDL selbst, zum Beispiel in Tiermodellen, zur Untersuchung solcher induzierten neuronalen Funktionsstörung angewendet werden.
Auf ähnliche Weise können bei älteren Menschen kognitiver Verfall und fokale Gedächtnisdefizite, lange bevor eine Diagnose einer wahrscheinlichen Alzheimer- Krankheit im Stadium I gestellt wird (Linn et al., Arch. Neurol., 52, 485–499, 1995), auftreten. Diese fokalen Gedächtnisdefizite können sich aus dem induzierten aberranten Signalisieren in Neuronen anstelle von Zelltod ergeben. Andere Funktionen, wie zum Beispiel Schreibfähigkeiten höherer Ordnung (Snowdon et al., JAMA, 275, 528–532, 1996) können auch von der aberranten neuronalen Funktion betroffen sein, die lange vor dem Zelltod auftritt. Dies ist konsistent mit dem, was in Bezug auf diese Defekte und die hierin in Bezug auf ADDL bereitgestellten Informationen bekannt ist, dass ADDL diese Defekte auf eine Weise induzieren, die der beeinträchtigten LTP-Funktion ähnlich ist, wie sie zum Beispiel durch ADDL induziert wird. Dahingehend können erfindungsgemäße ADDL-modulierende Verbindungen in der Behandlung und/oder Prävention dieses frühen kognitiven Verfalls und dieser fokalen Gedächtnisdefizite eingesetzt werden, und die Beeinträchtigung der Schreibfähigkeiten höherer Ordnung, die sich aus der ADDL-Bildung oder -Aktivität ergibt, oder es können ADDL selbst, zum Beispiel in Tiermodellen, zur Untersuchung dieser induzierten Defekte angewendet werden. Wie dem Fachmann bekannt ist, können solche Studien insbesondere, zum Beispiel durch Vergleich behandelter oder Placebo-behandelter, altersabgestimmter Patienten, durchgeführt werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes und homogenes, lösliches, globuläres, nicht fibrilläres Amyloid, eine oligomere Struktur, bestehend aus 4–12 Amyloid-β1-42-Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass die Struktur Neurotoxizität aufweist und kein Amyloid-β1-40-Protein aufweist.
Oligomere Struktur nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine oligomere Form aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die tetramere, pentamere and hexamere Aggregate des Amyloid-β 1-42-Proteins enthält.
Oligomere Struktur nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Molekulargewicht von 26–28 kD aufweist, das durch eine nicht denaturierende Gelelektrophorese bestimmt wird.
Oligomere Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Molekulargewicht von 22–24 kD oder von 18–19 kD aufweist, das durch Elektrophorese auf einem 15%igen SDS-Polyacrylamid-Gel bestimmt wird.
Oligomere Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie Kügelchen mit Abmessungen von 4,7–6,2 nm aufweist, die mittels der Atomkraftmikroskopie gemessen werden.
Oligomere Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie Kügelchen mit Abmessungen von 4,9–5,4 nm aufweist, die mittels der Atomkraftmikroskopie gemessen werden.
Oligomere Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie Kügelchen mit Abmessungen von 5,7–6,2 nm aufweist, die mittels der Atomkraftmikroskopie gemessen werden.
Oligomere Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass 40–75 % der oligomeren Struktur Kügelchen mit Abmessungen von 4,9–5,4 nm und mit Abmessungen von 5,7–6,2 nm aufweist, die mittels der Atomkraftmikroskopie gemessen werden.
Verfahren zur Identifizierung von Testverbindungen, die die Neurotoxizität der oligomeren Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 8 blockieren, gekennzeichnet durch folgende Schritte: (a) getrennte Kulturen von Nervenzellen werden mit der oligomeren Struktur entweder zusammen mit der oder ohne die Testverbindung zusammengebracht, (b) der Anteil der lebensfähigen Zellen in jeder Kultur wird gemessen, und (c) der Anteil der lebensfähigen Zellen in jeder Kultur wird verglichen, wobei Verbindungen, die die Neurotoxizität der oligomeren Struktur blockieren, dadurch identifiziert werden, dass sich ein erhöhter Anteil von lebensfähigen Zellen in der betreffenden Kultur im Vergleich mit der entsprechenden Kultur ergibt, die mit der oligomeren Struktur in Abwesenheit der Testverbindung zusammengebracht worden ist.
Verfahren zur Identifizierung von Testverbindungen, die eine Bindung an ein Zelloberflächenprotein der oligomeren Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 8 blockieren, gekennzeichnet durch folgende Schritte: (a) getrennte Kulturen von Nervenzellen werden mit der oligomeren Struktur entweder zusammen mit der oder ohne die Testverbindung zusammengebracht, (b) ein Reagenz wird zugefügt, das sich an die oligomere Struktur bindet, wobei das Reagenz fluoreszierend ist, (c) die getrennten Zellstrukturen werden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung analysiert, and (d) die Fluoreszenz der Kulturen wird verglichen, wobei Verbindungen, die die Bindung an ein Zelloberflächenprotein der oligomeren Struktur blockieren, dadurch identifiziert werden, dass sich eine verminderte Fluoreszenz der betreffenden Kultur im Vergleich mit der entsprechenden Kultur ergibt, die mit der oligomeren Struktur in Abwesenheit der Testverbindung zusammengebracht worden ist.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die eine Bindung an ein Zelloberflächenprotein der oligomeren Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 8 blockieren, gekennzeichnet durch folgende Schritte: (a) die oligomere Struktur wird aus Amyloid-β1-42-Protein derart gebildet, dass sie zu einer markierten, oligomeren Struktur wird, die einen Bindungsteil aufweist, die ein fluoreszierendes Reagenz binden kann, (b) getrennte Kulturen aus Nervenzellen werden mit der markierten, oligomeren Struktur entweder unter Anwesenheit oder Abwesenheit der Testverbindung zusammengebracht, (c) ein fluoreszierendes Reagenz wird zugefügt, das sich an die oligomere Struktur bindet, (d) die getrennten Zellkulturen werden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung analysiert, and (e) die Fluoreszenz der Kulturen wird verglichen, wobei Verbindungen, die die Bindung an ein Zelloberflächenprotein der oligomeren Struktur blockieren, dadurch identifiziert werden, dass sich eine verminderte Fluoreszenz der betreffenden Kultur im Vergleich mit der entsprechenden Kultur ergibt, die mit der oligomeren Struktur in Abwesenheit der Testverbindung zusammengebracht worden ist.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Bildung einer oligomeren Struktur oder Bindung an ein Zelloberflächenprotein der oligomeren Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 8 blockieren, gekennzeichnet durch folgende Schritte: (a) getrennte Proben aus Amyloid-β1-42-Protein werden zubereitet, die entweder mit der Testverbindung gemischt oder mit dieser nicht gemischt worden sind, (b) die oligomere Struktur wird in den getrennten Proben gebildet, (c) die getrennten Kulturen aus Nervenzellen werden mit den getrennten Proben zusammengebracht, (d) ein Reagenz wird zugefügt, das sich an die oligomere Struktur bindet, wobei das Reagenz fluoreszierend ist, (e) die getrennten Zellstrukturen werden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung analysiert, und (f) die Fluoreszenz der Kulturen wird verglichen, wobei Verbindungen, die die Bildung der oligomeren Struktur oder die Bindung an ein Zelloberflächenprotein der oligomeren Struktur blockieren, dadurch identifiziert werden, dass sich eine verminderte Fluoreszenz der betreffenden Kultur im Vergleich mit der entsprechenden Kultur ergibt, die mit der oligomeren Struktur in Abwesenheit der Testverbindung zusammengebracht worden ist.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Bildung einer oligomeren Struktur oder Bindung an ein Zelloberflächenprotein der oligomeren Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 8 blockieren, gekennzeichnet durch folgende Schritte: (a) getrennte Proben aus Amyloid-β 1-42-Protein werden zubereitet, die entweder mit der Testverbindung gemischt oder mit dieser nicht gemischt worden sind, (b) die oligomere Struktur wird in den getrennten Proben derart gebildet, dass sie zu einer markierten oligomeren Struktur wird, die einen Bindungsteil aufweist, der ein fluoreszierendes Reagenz in jeder der getrennten Proben binden kann, (c) die getrennten Kulturen aus Nervenzellen werden mit den getrennten Proben zusammengebracht, (d) ein fluoreszierendes Reagenz wird zugefügt, das sich an die oligomere Struktur bindet, (e) die getrennten Zellstrukturen werden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung analysiert, and (f) die Fluoreszenz der Kulturen wird verglichen, wobei Verbindungen, die die Bildung der oligomeren Struktur oder die Bindung an ein Zelloberflächenprotein der oligomeren Struktur blockieren, dadurch identifiziert werden, dass sich eine verminderte Fluoreszenz der betreffenden Kultur im Vergleich mit der entsprechenden Kultur ergibt, die mit der oligomeren Struktur in Abwesenheit der Testverbindung zusammengebracht worden ist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenz der Kulturen ferner mit der Fluoreszenz derjenigen Kulturen verglichen wird, die in derselben Weise, jedoch mit der Ausnahme behandelt worden sind, dass anstatt des Zufügens oder Nichtzufügens der Testverbindung vor der Bildung der oligomeren Struktur die Testverbindung nach der Bildung der oligomeren Struktur entweder zugefügt oder nicht zugefügt wird, and zwar, wobei Verbindungen, die die Bildung der oligomeren Struktur blockieren, dadurch identifiziert werden, dass sich eine verminderte Fluoreszenz der betreffenden Kultur im Vergleich mit der entsprechenden Kultur ergibt, die mit der oligomeren Struktur in Abwesenheit der Testverbindung zusammengebracht worden ist, aber nur dann, wenn die Verbindung vor der oligomeren Struktur zugefügt worden ist, und Verbindungen, die die Bindung an ein Zelloberflächenprotein der oligomeren Struktur blockieren, dadurch identifiziert werden, dass sich eine verminderte Fluoreszenz der betreffenden Kultur im Vergleich mit der entsprechenden Kultur ergibt, die mit der oligomeren Struktur in Abwesenheit der Testverbindung zusammengebracht worden ist, wenn die Verbindung entweder vor oder nach der oligomeren Struktur zugefügt worden ist.
Verfahren zum Nachweis der Bindung an ein Zelloberflächenprotein der oligomeren Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch folgende Schritte: (a) die oligomere Struktur wird von einem Amyloid-β1-42-Protein gebildet, (b) eine Kultur aus Nervenzellen wird mit der oligomeren Struktur zusammengebracht, (c) ein Antikörper wird zugefügt, der die oligomere Struktur bindet, wobei der Antikörper einen konjugierenden Teil einschließt, (d) der ungebundene Antikörper wird weggewaschen, (e) ein Enzym wird mit dem Antikörper verknüpft, der an die oligomere Struktur mittels des konkugierenden Teils gebunden ist, (f) ein farbloses Substrat wird zugefügt, das durch das Enzym gespalten wird, um eine Farbänderung hervorzurufen, und (g) die Farbänderung wird als als ein Maß der Bindung an ein Zelloberflächenprotein der oligomeren Struktur bestimmt.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die eine Bindung an ein Zelloberflächenprotein der oligomeren Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 8 blockieren, gekennzeichnet durch folgende Schritte: (a) getrennte Proben aus Amyloid-β1-42-Protein werden zubereitet, die entweder mit der Testverbindung gemischt oder mit dieser nicht gemischt worden sind, (b) die oligomere Struktur wird in den getrennten Proben gebildet, (c) die getrennten Kulturen aus Nervenzellen werden mit den getrennten Proben zusammengebracht, (d) ein die oligomere Struktur bindender Antikörper wird zugefügt, wobei der Antikörper einen konjugierenden Teil aufweist, (e) der ungebundene Antikörper wird weggewaschen, (f) ein Enzym wird mit dem Antikörper verknüpft, der an die oligomere Struktur mittels des konjugierenden Teils gebunden ist, (g) ein farbloses Substrat wird zugefügt, das durch das Enzym gespalten wird, um eine Farbänderung hervorzurufen, und (h) die durch jede der getrennten Proben erzeugte Farbänderung wird verglichen, wobei Verbindungen, die die Bildung der oligomeren Struktur oder die Bildung an ein Zelloberflächenprotein der oligomeren Struktur blockieren, dadurch identifiziert werden, dass sich eine verminderte, durch die Kultur erzeugte Farbänderung im Vergleich mit der entsprechenden Kultur ergibt, die mit der oligomeren Struktur in Abwesenheit der Testverbindung zusammengebracht worden ist.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die durch die Kulturen erzeugte Farbänderung ferner mit derjenigen durch die Kulturen erzeugten Farbänderung verglichen wird, die in derselben Weise, jedoch mit der Ausnahme behandelt worden sind, dass anstatt des Zufügens oder Nichtzufügens der Testverbindung vor der Bildung der oligomeren Struktur die Testverbindung nach der Bildung der oligomeren Struktur entweder zugefügt oder nicht zugefügt wird, and zwar, wobei Verbindungen, die die Bildung der oligomeren Struktur blockieren, dadurch identifiziert werden, dass sich eine verminderte, durch die Kultur erzeugte Farbänderung im Vergleich mit der entsprechenden Kultur ergibt, die mit der oligomeren Struktur in Abwesenheit der Testverbindung zusammengebracht worden ist, aber nur dann, wenn die Verbindung vor der oligomeren Struktur zugefügt worden ist, und Verbindungen, die die Rezeptorbindung der oligomeren Struktur blockieren, dadurch identifiziert werden, dass sich eine verminderte, durch die Kultur erzeugte Farbänderung im Vergleich mit der entsprechenden Kultur ergibt, die mit der oligomeren Struktur in Abwesenheit der Testverbindung zusammengebracht worden ist, wenn die Verbindung entweder vor oder nach der oligomeren Struktur zugefügt worden ist.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Bildung der oligomeren Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 8 blockieren, gekennzeichnet durch folgende Schritte: (a) getrennte Proben aus Amyloid-β1-42-Protein werden zubereitet, die entweder mit der Testverbindung gemischt oder mit dieser nicht gemischt worden sind, (b) die oligomere Struktur wird in den getrennten Proben gebildet, (c) es wird beurteilt, ob sich Proteinassemblierungen in den getrennten Proben gebildet haben, wobei ein Verfahren verwendet wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der Elektrophorese, der Immunerkennung und der Atomkraftmikroskopie besteht, and (d) die Bildung der Proteinassemblierungen in den getrennten Proben wird verglichen, wobei Verbindungen, die die Bildung der oligomeren Struktur blockieren, dadurch identifiziert werden, dass sich eine verminderte Bildung der oligomeren Struktur in der Probe im Vergleich mit einer Probe ergibt, in der die oligomere Struktur in Abwesenheit der Testverbindung gebildet wird.
Verfahren zum Präparieren der oligomeren Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch folgende Schritte: (a) eine Lösung aus monomerem Amyloid-β1-42-Protein wird hergestellt, die die oligomere Struktur bilden kann, (b) die Proteinlösung wird mit einem geeigneten Medium auf eine Endkonzentration von etwa 5 nM bis etwa 500 μM verdünnt, (c) das sich aus dem Schritt (b) ergebende Medium wird bei etwa 4°C für etwa 2–48 Stunden inkubiert, (d) die Lösung wird bei etwa 14 000 g and bei etwa 4°C zentrifugiert und (e) der Überstand, der sich aus der Zentrifugation als oligomere Amyloid-β1-42-Struktur ergibt, wird zurückgewonnen.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es das Inkubieren des sich aus dem Schritt (b) ergebenden Mediums bei etwa 4°C in Gegenwart von Clusterin umfasst.
Oligomere Struktur aus einem isolierten, löslichen, globulären, nicht fibrillären β-Amyloid, die nach Anspruch 19 oder 20 präpariert ist.
Verwendung der oligomeren Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für die Änderung der Langzeitpotenzierungs-Response einer Nervenzelle, wobei das Zusammenbringen der Zelle mit der oligomeren Struktur in vitro stattfindet.
Verwendung der oligomeren Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für das Bewirken einer morphologischen Änderung einer Nervenzelle, wobei das Zusammenbringen der Zelle mit der oligomeren Struktur in vitro stattfindet.
Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die morphologische Änderung eine Wirkung umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der Zellabtötung, der Änderung der Fyn-Kinase-Aktivität, der Änderung der subzellulären Lokalisierung der Fyn-Kinase und der Änderung des mRNA-Spiegels für Proteine besteht, die Interleukin-1, induzierbare Stickoxidsynthase, Apo E, Apo J und α1-Antichymotrypsin umfassen.
Verwendung der oligomeren Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für das Bewirken einer Astrozytenaktivierung, wobei das Zusammenbringen eines Astrozyten mit der oligomeren Struktur in vitro stattfindet.
Verwendung der oligomeren Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Identifizierung der Testverbindungen, die die Neurotoxizität der oligomeren Struktur blockieren, wobei das Zusammenbringen einer Nervenzelle mit der oligomeren Struktur und der Testverbindung in vitro stattfindet.
Verwendung der oligomeren Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Identifizierung der Testverbindungen, die die Bindung an ein Zelloberflächenprotein der oligomeren Struktur blockieren, wobei das Zusammenbringen einer Nervenzelle mit der oligomeren Struktur und der Testverbindung in vitro stattfindet.
Verwendung der oligomeren Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Identifizierung der Testverbindungen, die die Bildung der oligomeren Struktur blockieren, wobei das Zusammenbringen des Amyloid-β1-42-Proteins mit der Testverbindung während der Inkubation zur Bildung der oligomeren Struktur stattfindet.
Verwendung der oligomeren Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zum Bewirken von ADDL-induziertem, aberrantem, neuronalem Signalisieren einer Nervenzelle, wobei das Zusammenbringen der Zelle mit der oligomeren Struktur stattfindet.