ES2391905T3 - Método de ensayo para la enfermedad de alzheimer - Google Patents

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David J. Cummins
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Eli Lilly and Co
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Abstract

Un método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer preclínica o clínica que comprende:(a) medir el nivel de Aß42 en una muestra de sangre de un individuo obtenida al cabo de un intervalode tiempo después de administrar a dicho individuo una cantidad de un anticuerpo que se fijaespecíficamente a un epítope contenido en las posiciones 13-28 de Aß o un anticuerpo que secuestrael péptido Aß de su forma combinada circulante en la sangre y altera el aclaramiento de las formassoluble y combinada de Aß en el sistema nervioso central en plasma, en donde dicha cantidad eseficaz para alterar los niveles de péptidos Aß circulantes en la sangre de dicho individuo cuando dichoindividuo se encuentra en una fase preclínica o clínica de la enfermedad de Alzheimer; y(b) comparar el nivel de Aß42 en dicho individuo con un valor de control de dichos niveles, en dondelos niveles elevados de Aß42 en dicho individuo comparados con niveles de control identifican quedicho individuo se encuentra en una etapa preclínica o clínica de la enfermedad de Alzheimer;en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado que comprende:(i) una cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs)siguientes: CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1; CDR2 decadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2; y CDR3 de cadena ligera quetiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3; y(ii) una cadena pesada que comprende las CDRs siguientes: CDR1 de cadena pesada que tiene lasecuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 4; CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia deaminoácidos SEQ ID NO. 5; y CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SEQID NO.6.

Description

Método de ensayo para la enfermedad de Alzheimer
Campo Técnico
La invención se refiere a un ensayo que permite la diagnosis de la enfermedad de Alzheimer preclínica y clínica. El 5 test está basado en la evaluación de los niveles del péptido amiloide beta (A�) en plasma después de la administración de ciertos anticuerpos anti-A� a un individuo.
Técnica Anterior
Cierto número de sintomatologías que dan como resultado déficits cognitivos, accidente cerebrovascular, hemorragia cerebral, y debilitación mental general parecen estar asociadas con placas neuríticas y 10 cerebrovasculares en el cerebro que contienen el péptido amiloide beta (A�). Entre estas afecciones se encuentran tanto la enfermedad de Alzheimer preclínica como la clínica, el síndrome de Down y la angiopatía amiloide cerebral preclínica y clínica (CAA). Las placas amiloides están formadas por péptidos de amiloide beta. Estos péptidos circulan en la sangre y en el fluido cerebroespinal (CSF). El péptido A� en forma circulante está compuesto de 39-43 aminoácidos (en la mayoría de los casos 40 ó 42 aminoácidos) resultantes de la escisión de una proteína precursora
15 común, la proteína precursora de amiloide, designada a menudo APP.
La evidencia sugiere que A� puede transportarse alternativamente hacia atrás y adelante entre el cerebro y la sangre (Ghersi-Egea, J-F., et al., J. Neurochem. (1996) 67:880-883; Zlokovic, B.V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67:1034-1040; Shibata, M., et al., J. Clin. Invest. (2000)106:1489-1499. Adicionalmente, A� está en equilibrio en las placas con A� soluble en el cerebro y la sangre (Kawarabayashi, T., et al., J. Neurosci. (2001)
20 21:372-381), DeMattos et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci USA (2001) 98:8850-8855.
Como se describe en la solicitud PCT US00/35681 y U.S. Núm. de Serie 09/153130 incorporadas ambas en esta memoria por referencia, los niveles totales circulantes de péptido A� en CSF son similares en los individuos normales y los individuos predispuestos para exhibir los síntomas del Alzheimer. Sin embargo, los niveles de A�42 son más bajos por término medio en los individuos que padecen la enfermedad de Alzheimer (Nitsch, RM., et al.,
25 Ann. Neurol. (1995) 37:512-518). Es sabido que A�42 es más propenso a agregarse que lo es A�42, y cuando sucede esto, sobrevienen consecuencias adversas tales como la deposición de A� en placas amiloides, conversión de A� en formas tóxicas, deterioro de células nerviosas, y empeoramiento conductual tal como demencia (Golde T.E., et al., Biochem. Biophys. Acta. (2000) 1502:172-187).
La solicitud PCR PCT/US01/06191 titulada "Humanized Antibodies That Sequester A� Peptide", presentada el 26 de
30 febrero de 2001 e incorporada en esta memoria por referencia, describe anticuerpos que no atraviesan apreciablemente la barrera hematoencefálica y que secuestran los péptidos A� que circulan en los fluidos biológicos. Estos anticuerpos se describen como útiles para tratamiento preventivo y terapéutico de afecciones asociadas con la formación de placas difusas, neuríticas y cerebrovasculares que contienen A� en el cerebro. La solicitud describe la administración de los anticuerpos seguida por la medición de los niveles circulantes del péptido A� en la sangre a fin
35 de evaluar el progreso de la terapia. No se hace sugestión clara alguna, sin embargo, de que los niveles de péptido A� después de la administración de los anticuerpos sean diagnósticos de la afección propiamente dicha. La presente invención está basada en el resultado sorprendente de que niveles incrementados tanto de A�40 como de A�42, así como la ratio A�40/A�42 están correlacionados con los niveles de deposición del péptido A� en el cerebro cuando los anticuerpos se han administrado a un individuo. Así pues, la medida de estos componentes en la sangre
40 después de administración del anticuerpo proporciona un test de diagnóstico directo para la enfermedad de Alzheimer tanto clínica como preclínica y trastornos neurológicos afines.
Existen publicaciones relevantes adicionales concernientes al comportamiento de los anticuerpos del péptido A�. Por ejemplo, la publicación PCT WO 99/27944 publicada el 10 de junio de 1999 describe métodos para inducir una respuesta inmune a fin de reducir los depósitos amiloides. La publicación No. WO 99/60024 publicada el 25 de
45 noviembre de 1999 describe métodos para eliminación del amiloide utilizando anticuerpos anti-amiloide. Publicaciones PCT adicionales, que incluyen WO 00/72880, WO 00/72876 y WO 00/77178 describen todas ellas diversas actividades de anticuerpos anti-péptido A�. Se dice que los anticuerpos dirigidos al término N de este péptido reducen las placas en un modelo de murino transgénico; se describe la inmunización con el amiloide propiamente dicho, así como anticuerpos diseñados para catalizar la hidrólisis del péptido.
50 Se ha demostrado que un camino para el metabolismo de A� es por transporte desde el CNS al plasma (Zlokovic, B.V., et al., Proc. Natl. Acad Sci (USA) (1996) 93:4229-4234; Ghersi-Egea, J-F., et al., J. Neurochem. (1996) 67: 880-883). Adicionalmente, se ha demostrado que A� en el plasma puede atravesar la barrera hematoencefálica y entrar en el cerebro (Zlokovic, B. V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67:1034-1040). Se ha demostrado también que la administración de ciertos anticuerpos A� policlonales y monoclonales reduce la deposición de A� en
55 placas amiloides en el modelo de ratón transgénico APPV717F de la enfermedad de Alzheimer (Bard, F., et al., Nature Med. (2000) 6:916-919). Se dijo que esto era debido a que ciertos anticuerpos anti-A� atraviesan la barrera hematoencefálica y estimulan la fagocitosis de las placas amiloides por las células microgliales. En los experimentos de Bard, ensayos de cortes de cerebro ex vivo demostraron que la presencia de anticuerpo A añadido, junto con microglía añadida exógenamente, inducía la fagocitosis de A , dando como resultado la eliminación de los depósitos de A .
Los niveles de A 40 y A 42, ambos solubles, en CSF y sangre pueden ser detectados fácilmente utilizando ensayos
5 estandarizados que utilizan anticuerpos dirigidos contra los epítopes a lo largo de la cadena de A . Tales ensayos han sido consignados, por ejemplo, en las Patentes U.S. 5.766.846; 5.837.672; y 5.593.846. Estas Patentes describen la producción de anticuerpos monoclonales murinos para el dominio central del péptido A , y se consignó que éstos tienen epítopes alrededor de las posiciones 16 y 17, ambas inclusive. Se describían también anticuerpos dirigidos contra la región N-terminal. Se afirmaba que varios anticuerpos monoclonales inmunorreaccionan con las
10 posiciones 13-28 del péptido A ; éstos no se fijaban a un péptido que representa las posiciones 17-28, estableciendo por tanto, de acuerdo con las citadas Patentes, que es esta región, con inclusión de las posiciones 1617 (el sitio de la secretasa 0) la que constituía la diana de estos anticuerpos. Entre los anticuerpos conocidos que se fijan entre los aminoácidos 13 y 28 de A se encuentran los anticuerpos de ratón 266 (m266), 4G8 y 1C2.
Exposición de la Invención
15 Se ha encontrado ahora que anticuerpos que son útiles para realización de ensayos para el péptido A , y que son útiles en el tratamiento de afecciones asociadas con las placas amiloides en el cerebro, pueden provocar una respuesta que da como resultado un aumento acusado en el nivel de péptido A en la sangre, y este nivel puede utilizarse como marcador de diagnóstico para la enfermedad de Alzheimer clínica y preclínica. Estos anticuerpos, que pueden ser o no anticuerpos humanizados, secuestran el péptido A de su forma combinada circulante en la
20 sangre, y alteran el aclaramiento de las formas soluble y combinada de A en el sistema nervioso central y el plasma. Estos anticuerpos, y fragmentos de los mismos, se fijan específicamente a un epítope entre los aminoácidos 13 y 28 de la molécula A . La CDR de estos anticuerpos puede derivarse del anticuerpo monoclonal de ratón 266 (SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 6). Anticuerpos útiles incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, en donde las regiones variables tienen secuencias que comprenden la CDR del anticuerpo de ratón 266 y secuencias de
25 entramado humanas específicas (SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 10), en donde los anticuerpos retienen aproximadamente las propiedades de fijación del anticuerpo de ratón y tienen propiedades in vitro e in vivo funcionalmente equivalentes a las del anticuerpo 266 de ratón. Son especialmente útiles anticuerpos humanizados y fragmentos de los mismos, en los cuales la cadena ligera es SEQ ID NO: 11 y la cadena pesada es SEQ ID NO: 12.
Así, en un aspecto la invención está dirigida a un método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer preclínica o 30 clínica que comprende:
(a) medir el nivel de A 42 en una muestra de sangre de un individuo obtenida al cabo de un intervalo de tiempo después de administrar a dicho individuo una cantidad de un anticuerpo que se fija específicamente a un epítope contenido en las posiciones 13-28 de A o un anticuerpo que secuestra el péptido A de su forma combinada circulante en la sangre y altera el aclaramiento de las formas soluble y combinada de A en el
35 sistema nervioso central en plasma, en donde dicha cantidad es eficaz para alterar los niveles de péptidos A circulantes en la sangre de dicho individuo cuando dicho individuo se encuentra en una fase preclínica o clínica de la enfermedad de Alzheimer; y
(b) comparar el nivel de A 42 en dicho individuo con un valor de control de dichos niveles, en donde los
niveles elevados de A 42 en dicho individuo comparados con niveles de control identifican que dicho individuo 40 se encuentra en una etapa preclínica o clínica de la enfermedad de Alzheimer;
en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado que comprende:
(i) una cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) siguientes: CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1; CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2; y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia
45 de aminoácidos SEQ ID NO. 3; y
(ii) una cadena pesada que comprende las CDRs siguientes: CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 4; CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 5; y CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.6.
Breve Descripción de los Dibujos
50 Las Figuras 1A, B y C son gráficos que muestran los niveles de A 40 (Figura 1A), A 42 (Figura 1B), y ratio A 40/A 42 (Figura 1C) en plasma de ratones transgénicos antes de la administración del anticuerpo m266, y la falta de correlación con los depósitos cerebrales de A .
Las Figuras 2A y B son gráficos que muestran A 40 en plasma (Figura 2A) y la ratio A 40/A 42 en plasma (Figura 2B) en ratones transgénicos 1 hora después de la inyección del anticuerpo m266, y la correlación
55 significativa con los depósitos cerebrales de A .
Las Figuras 3A, B y C son gráficos que muestran las correlaciones significativas de los dos péptidos A (Figuras 3A y 3B) y su ratio (Figura 3C) con la deposición de péptidos A en el cerebro 24 horas después de inyección con el anticuerpo monoclonal m266.
Las Figuras 4A, B y C son gráficos que muestran las correlaciones significativas de las velocidades de 5 entrada en la circulación de los dos péptidos A (Figuras 4A y 4B) y su ratio (Figura 4C) y la deposición de péptido A en ratones transgénicos.
Las Figuras 5A y B son gráficos que muestran una representación gráfica alternativa de los niveles de A 40 en el plasma 24 horas (Figura 5A) y 1 hora (Figura 5B) después de inyección de m266 correlacionados con el porcentaje del hipocampo cubierto por depósitos A .
10 La Figura 6 es una tabla que muestra los coeficientes de correlación de Pearson (Pearson r) y la significación (valor P) determinados entre los valores de A en plasma (antes y después de inyección de m266) y la carga de A o amiloide en el hipocampo.
Modos de Realización de la Invención
Los péptidos A que circulan en los fluidos biológicos humanos representan una región del terminal carboxi de una
15 proteína precursora codificada en el cromosoma 21. Se ha informado, partiendo de los resultados de experimentos in vitro, que el péptido A tiene solubilidad deficiente en soluciones fisiológicas, dado que contiene un tramo de aminoácidos hidrófobos que forman parte de la región que ancla su precursor más largo a las membranas lipídicas de las células. Por tanto, no es sorprendente que el péptido A circulantes esté complejado normalmente con otros restos que impiden que el mismo se aglomere. Esto da como resultado dificultades en la detección del péptido A
20 circulante en los fluidos biológicos.
Los documentos de Patente arriba mencionados (Patentes U.S. 5.766.846; 5.837.672 y 5.593.846) describen la preparación de anticuerpos, con inclusión de un anticuerpo monoclonal, designado clon 266 (m266), que fue generado contra un péptido que comprende los aminoácidos 13-28 del péptido A , y que se ha demostrado se fija específicamente al mismo. Los solicitantes han encontrado que después de la administración de m266 a ratones 25 APPV717F, un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer, aquéllos pueden medir niveles de péptidos A en la circulación que son diagnósticos de los niveles de placas amiloides en el cerebro. Así pues, estos anticuerpos son útiles no sólo en la realización de ensayos para péptidos A circulantes per se, sino también para provocar niveles circulantes en sangre que son diagnósticos de la cantidad de placa amiloide en el cerebro, y son útiles por tanto en la identificación de individuos en las fases clínica y preclínica de la enfermedad de Alzheimer. Uno de tales
30 anticuerpos, m266, se fija a la región media del péptido A .
Por "anticuerpo monoclonal que se fija a la región media del péptido A " se entiende un anticuerpo monoclonal (Mab
o Mabs) que se fija a una secuencia de aminoácidos que representa un epítope contenido entre las posiciones 13 y 28 de A . No es preciso que esté direccionado a la región entera. Siempre que el anticuerpo se fije al menos a un epítope dentro de esta región (especialmente, v.g., que incluya el sitio 16-17 de a-secretasa o el sitio al que se fija el
35 anticuerpo 266), tales anticuerpos son eficaces en el método de la invención.
Por "anticuerpo" se entiende un anticuerpo monoclonal per se, o un fragmento inmunológicamente eficaz del mismo, tal como un fragmento Fab, Fab', o F(ab')2. En algunos contextos, en esta memoria, se mencionarán fragmentos específicamente por énfasis; no obstante, se entenderá que, con indiferencia de que se especifiquen o no fragmentos, el término "anticuerpo" incluye tales fragmentos así como formas monocatenarias. Siempre que la 40 proteína retenga la capacidad específica para fijarse a su diana propuesta, y en este caso, para secuestrar el péptido A de sus proteínas portadoras en la sangre, la misma se incluye dentro del término "anticuerpo". Se incluyen también dentro de la definición de "anticuerpo" por ejemplo, formas monocatenarias, designadas generalmente regiones Fv', de anticuerpos con esta especificidad. Preferiblemente, pero no de manera necesaria, los anticuerpos útiles en la invención se producen recombinantemente, dado que se requiere la manipulación de los
45 anticuerpos típicamente murinos u otros anticuerpos no humanos con la especificidad apropiada a fin de convertirlos en forma humanizada. Los anticuerpos pueden estar glicosilados o no, aunque se prefieren anticuerpos glicosilados. Los anticuerpos están reticulados adecuadamente por enlaces disulfuro, como es bien sabido.
Es sabido que la unidad estructural básica del anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa)
50 y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos fundamentalmente responsables del reconocimiento de antígeno. La porción del terminal carboxilo de cada cadena define una región constante fundamentalmente responsable de la función efectora.
Las cadenas ligeras se clasifican como gamma, mu, alfa, y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como
55 gamma, mu, alfa, delta, o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más.
Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de fijación del anticuerpo. Así, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de fijación. Las cadenas exhiben todas ellas la misma estructura general de 5 regiones de entramado (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, denominadas también regiones determinantes de la complementariedad o CDRs. Las CDRs de las dos cadenas de cada par están alineadas por las regiones de entramado, permitiendo la fijación a un epítope específico. Desde el terminal N al terminal C, ambas cadenas ligera y pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con convenciones bien conocidas [Kabat
10 "Sequences of Proteins of Immunological Interest" National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 y 1991; Chothia, et al., J. Mol. Bio. (1987)196:901-917; Chothia, et al., Nature (1989) 342:878-883].
Como es bien conocido en la técnica, pueden generarse fácilmente anticuerpos monoclonales con especificidad apropiada por técnicas estándar de inmunización de mamíferos, formando hibridomas a partir de las células productoras de anticuerpos de dichos mamíferos o inmortalizando las mismas de otro modo, y cultivando los 15 hibridomas o las células inmortalizadas para su evaluación en cuanto a la especificidad apropiada. En el caso presente, tales anticuerpos podrían generarse por inmunización de un humano, conejo, rata o ratón, por ejemplo, con un péptido que represente un epítope que abarque la región 13-28 del péptido A o una subregión apropiada del mismo. Los materiales para manipulación recombinante pueden obtenerse por recuperación de las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo deseado a partir del hibridoma u otra célula que produzca el mismo. Estas
20 secuencias de nucleótidos pueden manipularse luego para proporcionarlas en forma humanizada, si se desea.
Puede ser deseable utilizar formas humanizadas de estos anticuerpos a fin de provocar los niveles circulantes deseados de los péptidos en individuos humanos. Dado que la administración es de corta duración y únicamente para propósitos de diagnóstico, esto puede no ser necesario; sin embargo, es claramente preferible a fin de evitar cualquier posibilidad de una respuesta inmune, por lo que se prefiere el uso de formas humanizadas para este
25 propósito. Por supuesto, para la realización del ensayo de niveles de A ex vivo (v.g. por ELISA), pueden utilizarse las formas murinas propiamente dichas.
Por "anticuerpo humanizado" se entiende un anticuerpo que está compuesto parcial o totalmente de secuencias de aminoácidos derivadas de una línea germinal de anticuerpos humana por alteración de la secuencia de un anticuerpo que tenga regiones determinantes de la complementariedad (CDR) no humanas. La más simple de tales 30 alteraciones puede estar constituida simplemente por sustitución de la región constante de un anticuerpo humano en lugar de la región constante murina, dando así como resultado una quimera humana/murina que puede tener inmunogenicidad suficientemente baja para ser aceptable para uso farmacéutico. Preferiblemente, sin embargo, la región variable del anticuerpo e incluso la CDR se humaniza también por métodos que son ahora bien conocidos en la técnica. Las regiones de entramado de las regiones variables se sustituyen por las regiones de entramado 35 humanas correspondientes, dejando la CDR no humana sustancialmente intacta, o incluso reemplazando la CDR con secuencias derivadas de un genoma humano. Se producen anticuerpos totalmente humanos en ratones modificados genéticamente cuyos sistemas inmunes han sido alterados para corresponderse con los sistemas inmunes humanos. Como se ha mencionado arriba, es suficiente para uso en los métodos de la invención emplear un fragmento inmunológicamente específico del anticuerpo, con inclusión de fragmentos que representen formas
40 monocatenarias.
Un anticuerpo humanizado se refiere así a un anticuerpo que comprende un entramado humano, al menos una CDR de un anticuerpo no humano, y en el cual cualquier región constante presente es sustancialmente idéntica a una región constante de inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente 85-90%, con preferencia al menos 95% idéntica. Por tanto, todas las partes de un anticuerpo humanizado, excepto posiblemente las CDRs, son
45 sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de una o más secuencias de inmunoglobulina humana nativas. Por ejemplo, una inmunoglobulina inmunizada no abarcaría típicamente un anticuerpo quimérico región variable de ratón/región constante humana.
El diseño de inmunoglobulinas humanizadas puede realizarse como sigue. Cuando un aminoácido cae dentro de la categoría siguiente, el aminoácido de entramado de una inmunoglobulina humana a utilizar (inmunoglobulina 50 aceptora) se reemplaza por un aminoácido de entramado de una inmunoglobulina no humana que proporcione una CDR (inmunoglobulina donante): (a) el aminoácido en la región de entramado humana de la inmunoglobulina aceptora es inusual para la inmunoglobulina humana en dicha posición, mientras que el aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donante es típico para la inmunoglobulina humana en dicha posición; (b) la posición del aminoácido es inmediatamente adyacente a una de las CDRs; o (c) cualquier átomo de la cadena lateral de un 55 aminoácido de entramado está dentro de aproximadamente 5-6 Angstroms (centro a centro) de cualquier átomo de un aminoácido de CDR en un modelo tridimensional de inmunoglobulina [Queen, et al., Op. Cit., and Co, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2869]. Cuando cada uno de los aminoácidos en la región de entramado humana de la inmunoglobulina aceptora y un aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donante es inusual para la inmunoglobulina humana en dicha posición, dicho aminoácido se reemplaza por un aminoácido típico para
60 inmunoglobulina humana en dicha posición.
El anticuerpo humanizado es una forma humanizada del anticuerpo de ratón 266. Las CDRs de 266 humanizado tienen las secuencias de aminoácidos siguientes:
CDR1 de cadena ligera:
CDR2 de cadena ligera:
CDR3 de cadena ligera:
CDR1 de cadena pesada:
CDR2 de cadena pesada:
y CDR3 de cadena pesada:
Una región variable de cadena ligera preferida de un anticuerpo humanizado de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos siguiente, en la cual el entramado procedía de los segmentos Vk DPK18 de la línea germinal humana y el segmento J Jkl, con varias sustituciones de aminoácidos respecto a los aminoácidos de consenso en el mismo subgrupo humano V a fin de reducir la inmunogenicidad potencial:
en donde: Xaa en la posición 2 es Val o Ile; Xaa en la posición 7 es Ser o Thr;
5 Xaa en la posición 14 es Thr o Ser; Xaa en la posición 15 es Leu o Pro; Xaa en la posición 30 es Ile o Val; Xaa en la posición 50 es Arg, Gln, o Lys; Xaa en la posición 88 es Val o Leu;
10 Xaa en la posición 105 es Gln o Gly; Xaa en la posición 108 es Lys o Arg; y Xaa en la posición 109 es Val o Leu.
Una región variable de cadena pesada preferida de un anticuerpo humanizado de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos siguiente, en la cual el entramado se ha originado a partir de los segmentos VH DP53 de 15 la línea germinal humana y el segmento J JH4, con varias sustituciones de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos de consenso en el mismo subgrupo humano a fin de reducir inmunogenicidad potencial:
en donde: Xaa en la posición 1 es Glu o Gln; Xaa en la posición 7 es Ser o Leu; Xaa en la posición 46 es Glu, Val, Asp, o Ser;
5 Xaa en la posición 63 es Thr o Ser; Xaa en la posición 75 es Ala, Ser, Val, o Thr; Xaa en la posición 76 es Lys o Arg; Xaa en la posición 89 es Glu o Asp; y Xaa en la posición 107 es Leu o Thr.
10 Una región variable de cadena ligera particularmente preferida de un anticuerpo humanizado de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos siguiente, en la cual el entramado se ha originado a partir de segmentos Vk DPK18 de la línea germinal humana y el segmento J Jk1, con varias sustituciones de aminoácidos respecto a los aminoácidos de consenso en el mismo subgrupo humano V a fin de reducir inmunogenicidad potencial:
Una región variable de cadena pesada particularmente preferida de un anticuerpo humanizado de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos siguiente, en la cual el entramado se ha originado a partir de segmentos VH DP53 de la línea germinal humana y el segmento J JH4:
Una cadena ligera preferida para un anticuerpo humanizado de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos siguiente:
Una cadena pesada preferida para un anticuerpo humanizado de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos siguiente:
Son posibles otras secuencias para las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos humanizados y para 266 humanizado. Las inmunoglobulinas pueden tener dos pares de complejos cadena ligera/cadena pesada, comprendiendo al menos una cadena una o más regiones determinantes de la complementariedad de ratón, unidas
5 funcionalmente a segmentos de región de entramado humana.
Comenzando en la posición 56 de la región variable de cadena pesada, tanto m266 como 266 humanizado contienen la secuencia Asn-Ser-Thr. Esta secuencia es un ejemplo de la señal Asn-X-Ser/Thr para glicosilación unida a N, en donde Asn es el sitio de fijación de las cadenas glicosilo enlazadas a N. Tanto m266 como 266 humanizado están extensamente glicosilados en este sitio. De modo totalmente impredecible y ventajoso, la afinidad
10 de 266 humanizado que está desglicosilado en la CDR2 de la cadena pesada para el péptido A es notablemente mayor que la de 266 humanizado. La CDR2 de la cadena pesada de 266 desglicosilado humanizado tiene las secuencias de aminoácidos siguientes:
CDR2 de cadena pesada:
15 en donde: Xaa en la posición 7 es cualquier aminoácido, con la condición de que si Xaa en la posición 8 no es Asp ni Pro y Xaa en la posición 9 es Ser o Thr, entonces Xaa en la posición 7 no es Asn; Xaa en la posición 8 es cualquier aminoácido, con la condición de que si Xaa en la posición 7 es Asn y Xaa en la posición 9 es Ser o Thr, entonces Xaa en la posición 8 es Asp o Pro; y
5 Xaa en la posición 9 es cualquier aminoácido, con la condición de que si Xaa en la posición 7 es Asn y Xaa en la posición 8 no es Asp ni Pro, entonces Xaa en la posición 9 no es Ser ni Thr;
Por "cualquier aminoácido" se entiende cualquier aminoácido existente naturalmente. Aminoácidos existentes naturalmente preferidos son Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr.
10 Un anticuerpo humanizado desglicosilado preferido es una forma humanizada de m266, en la cual la CDR2 de la
cadena pesada desglicosilada es SEQ ID NO: 13, en donde: Xaa en la posición 7 de SEQ ID NO: 13 se selecciona del grupo constituido por Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr, con la condición de que si Xaa en la posición 8 no es Asp ni Pro y Xaa en la posición 9 es Ser o Thr, entonces Xaa en la posición 7 no es Asn;
15 Xaa en la posición 8 de SEQ ID NO:13 se selecciona del grupo constituido por Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr, con la condición de que si Xaa en la posición 7 es Asn y Xaa en la posición 9 es Ser o Thr, entonces Xaa en la posición 8 es Asp o Pro; y Xaa en la posición 9 de SEQ ID NO:13 se selecciona del grupo constituido por Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, y Tyr, con la condición de que si Xaa en la
20 posición 7 es Asn y Xaa en la posición 8 no es Asp ni Pro, entonces Xaa en la posición 9 no es Ser ni Thr.
Una región variable de cadena pesada preferida de un anticuerpo humanizado desglicosilado tiene la secuencia de aminoácidos siguiente, en la cual el entramado se ha originado a partir del segmento VH DP53 de la línea germinal humana y el segmento J JH4, con varias sustituciones de aminoácidos respecto a los aminoácidos de consenso en el mismo subgrupo humano a fin de reducir la inmunogenicidad potencial y en donde el sitio de N-glicosilación en la
25 CDR2 de la cadena pesada se ha modificado de tal modo que el mismo no puede glicosilarse en N:
en donde:
Xaa en la posición 1 es Glu o Gln; Xaa en la posición 7 es Ser o Leu;
30 Xaa en la posición 46 es Glu, Val, Asp, o Ser; Xaa en la posición 56 es cualquier aminoácido, con la condición de que si Xaa en la posición 57 no es Asp ni Pro y Xaa en la posición 58 es Ser o Thr, entonces Xaa en la posición 56 no es Asn; Xaa en la posición 57 es cualquier aminoácido, con la condición de que si Xaa en la posición 56 es Asn y Xaa en la posición 58 es Ser o Thr, entonces Xaa en la posición 57 es Asp o Pro; y
35 Xaa en la posición 58 es cualquier aminoácido, con la condición de que si Xaa en la posición 56 es Asn y Xaa en la posición 57 no es Asp ni Pro, entonces Xaa en la posición 58 no es Ser ni Thr Xaa en la posición 63 es Thr o Ser; Xaa en la posición 75 es Ala, Ser, Val, o Thr; Xaa en la posición 76 es Lys o Arg;
Xaa en la posición 89 es Glu o Asp; y Xaa en la posición 107 es Leu o Thr.
Una región variable de cadena pesada particularmente preferida de un anticuerpo humanizado desglicosilado tiene la secuencia de aminoácidos siguiente, en la cual el entramado se ha originado a partir del segmento VH DP53 de la línea germinal humana y el segmento J JH4 y en donde el sitio de glicosilación en N en la CDR2 de la cadena pesada está modificado de modo que el mismo no puede glicosilarse en N:
10 en donde: Xaa en la posición 56 es cualquier aminoácido, con la condición de que si Xaa en la posición 57 no es Asp ni Pro y Xaa en la posición 58 es Ser o Thr, entonces Xaa en la posición 56 no es Asn; Xaa en la posición 57 es cualquier aminoácido, con la condición de que si Xaa en la posición 56 es Asn y Xaa en la posición 58 es Ser o Thr, entonces Xaa en la posición 57 es Asp o Pro; y
15 Xaa en la posición 58 es cualquier aminoácido, con la condición de que si Xaa en la posición 56 es Asn y Xaa en la posición 57 no es Asp ni Pro, entonces Xaa en la posición 58 no es Ser ni Thr.
Una cadena pesada preferida para un anticuerpo humanizado desglicosilado en el cual el sitio de N-glicosilación en la CDR2 de la cadena pesada está modificado de tal modo que el mismo no puede glicosilarse en N, tiene la secuencia de aminoácidos:
5 en donde: Xaa en la posición 56 es cualquier aminoácido, con la condición de que si Xaa en la posición 57 no es Asp ni Pro y Xaa en la posición 58 es Ser o Thr, entonces Xaa en la posición 56 no es Asn; Xaa en la posición 57 es cualquier aminoácido, con la condición de que si Xaa en la posición 56 es Asn y Xaa en la posición 58 es Ser o Thr, entonces Xaa en la posición 57 es Asp o Pro; y
10 Xaa en la posición 58 es cualquier aminoácido, con la condición de que si Xaa en la posición 56 es Asn y Xaa en la posición 57 no es Asp ni Pro, entonces Xaa en la posición 58 no es Ser ni Thr.
Anticuerpos 266 desglicosilados preferidos que tienen la región variable pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, y SEQ ID NO: 16 son aquéllos en los cuales: Xaa en la posición 56 se selecciona del grupo constituido por Ala, Gly, His, Asn, Gln, Ser, y Thr, con la
15 condición de que si Xaa en la posición 58 es Ser o Thr, entonces Xaa en la posición 56 no es Asn; Xaa en la posición 57 se selecciona del grupo constituido por Ala, Gly, His, Asn, Gln, Ser, y Thr; y Xaa en la posición 58 se selecciona del grupo constituido por Ala, Gly, His, Asn, Gln, Ser, y Thr, con la condición de que si Xaa en la posición 56 es Asn, entonces Xaa en la posición 58 no es Ser ni Thr.
Secuencias preferidas para CDR2 (posiciones 56, 57, y 58) de la cadena pesada SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, y
20 SEQ ID NO: 16 incluyen aquéllas en las cuales se ha cambiado únicamente un aminoácido, aquéllas en las cuales se han cambiado solamente dos aminoácidos, o se han cambiado los tres aminoácidos. Se prefiere reemplazar Asn en la posición 56. Se prefiere reemplazar Thr en la posición 58 con un aminoácido distinto de Ser. Se prefiere no destruir el sitio de N-glicosilación en la CDR2 de la cadena pesada 266 por reemplazamiento de Ser en la posición 57 con Pro o Asp. Se prefieren sustituciones conservadoras en una, dos o las tres posiciones. Las especies más
25 preferidas son aquéllas en las cuales Asn en la posición 56 está reemplazado con Ser o Thr. Anticuerpos particularmente preferidos son aquéllos en los cuales Ser o Thr se encuentra en la posición 56, Ser se encuentra en la posición 57, y Thr se encuentra en la posición 58 de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, o SEQ ID NO: 16.
Especies desglicosiladas especialmente preferidas son anticuerpos que comprenden una cadena ligera de SEQ ID NO: 11 y una cadena pesada de SEQ ID NO: 16, en donde en SEQ ID NO: 16, Xaa en la posición 56 es Ser, Xaa en 30 la posición 57 es Ser, y Xaa en la posición 58 es Thr ("N56S"), o en donde en SEQ ID NO: 16, Xaa en la posición 56 es Thr, Xaa en la posición 57 es Ser, y Xaa en la posición 58 es Thr ("N56T").
La producción de los anticuerpos útiles en la invención implica típicamente técnicas recombinantes, como se describen en PCT/US01/06191 citada anteriormente e incorporada en esta memoria por referencia.
Los anticuerpos (con inclusión de fragmentos inmunológicamente reactivos) se administran a un individuo que va a
35 ser evaluado respecto a afecciones asociadas con depósitos de A tales como enfermedad de Alzheimer clínica o preclínica, o angiopatía amiloide clínica o preclínica, utilizando técnicas de administración estándar, preferiblemente de modo periférico (es decir, que no se administran al sistema nervioso central) por administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual, o en forma de supositorios.
40 Las composiciones para administración se diseñan de manera que sean apropiadas para el modo de administración seleccionado, y se utilizan, según sea apropiado, excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes dispersantes, tampones, agentes tensioactivos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidad, agentes estabilizadores y análogos. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA, última edición, proporciona un compendio de técnicas de formulación que son generalmente conocidas por los
45 especialistas. Puede ser particularmente útil alterar las características de solubilidad de los anticuerpos, haciéndolos más lipófilos, por ejemplo, por encapsulación de los mismos en liposomas o por bloqueo de grupos polares.
Se prefiere el suministro sistémico periférico por inyección intravenosa o intraperitoneal o subcutánea. Vehículos adecuados para tales inyecciones son sencillos. Adicionalmente, sin embargo, la administración puede efectuarse también a través de las membranas mucosas por medio de aerosoles nasales o supositorios. Formulaciones 50 adecuadas para tales modos de administración son bien conocidas e incluyen típicamente agentes tensioactivos que facilitan la transferencia a través de las membranas. Tales agentes tensioactivos se derivan a menudo de esteroides
o son lípidos catiónicos, tales como cloruro de N-[1-(2,3-dioleoil)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) o diversos compuestos tales como hemisuccinato de colesterol, fosfatidil-gliceroles y análogos.
La concentración del anticuerpo humanizado en las formulaciones puede ser desde tan baja como aproximadamente 0,1% hasta tan alta como 15 ó 20% en peso, y se seleccionará fundamentalmente basándose en 5 volúmenes de fluido, viscosidades, etcétera, de acuerdo con el modo de administración particular seleccionado. Así, una composición típica para inyección podría estar formada de modo que contuviera 1 ml de agua tamponada estéril de solución salina tamponada con fosfato y 1-1000 mg, preferiblemente 10-100 mg, del anticuerpo humanizado. La formulación podría filtrarse en condiciones estériles después de la preparación de la formulación, o hacerse de algún otro modo microbiológicamente aceptable. Una composición típica para infusión intravenosa podría tener volúmenes 10 comprendidos entre 1 y 250 ml de fluido, tal como solución estéril de Ringer, y 1-100 mg por ml o más en concentración de anticuerpo. Los agentes terapéuticos pueden congelarse o liofilizarse para almacenamiento y reconstituirse en un vehículo estéril adecuado antes de su utilización. La liofilización y reconstitución puede conducir a grados variables de pérdida de actividad del anticuerpo (v.g. con las inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos IgM tienden a exhibir mayor pérdida de actividad que los anticuerpos IgG). Las dosificaciones pueden
15 tener que ajustarse para compensar. El pH de la formulación se seleccionará a fin de equilibrar la estabilidad (química y física) del anticuerpo y la comodidad para el paciente durante la administración. Generalmente, se tolera un pH comprendido entre 4 y 8.
Aunque los métodos anteriores parecen ser los más convenientes y más apropiados para administración de proteínas tales como anticuerpos humanizados, por adaptación adecuada, pueden emplearse otras técnicas de
20 administración, tales como administración transdérmica y administración oral con tal que se diseñe una formulación apropiada.
Adicionalmente, puede ser deseable emplear formulaciones de liberación controlada que utilicen films y matrices biodegradables, o minibombas osmóticas, o sistemas de suministro basados en perlas de dextrano, alginato, o colágeno.
25 En suma, están disponibles formulaciones para administración de los anticuerpos y son bien conocidas en la técnica, pudiendo seleccionarse de una diversidad de opciones.
Los niveles típicos de dosificación pueden optimizarse utilizando técnicas clínicas estándar y dependerán del modo de administración.
Después de la administración del anticuerpo al individuo, se extraen muestras de sangre a intervalos periódicos
30 durante los minutos, horas o días subsiguientes. Los periodos de tiempo adecuados pueden ser tan cortos como unos cuantos minutos, 10 minutos, 30 minutos, o 1 hora, varias horas, o pueden dejarse transcurrir días antes de la extracción de la muestra de sangre. Se prefiere la medida después menos de 3 horas. Si se desea, puede obtenerse la fracción de plasma para facilidad de análisis. Se utilizan técnicas analíticas estándar para análisis del A 40, el A 42 y la ratio de los mismos. Estas técnicas se describen, por ejemplo, en la Patente U.S. 5.766.846. Sin embargo,
35 puede emplearse cualquier técnica de análisis adecuada, tal como separación cromatográfica, transferencia Western, ensayos ELISA, ensayos homogéneos y análogos.
La concentración del A 40, AP42, o su ratio se compara luego con estos valores en un control. Los controles típicos incluyen individuos que se sabe están exentos de afecciones asociadas con las placas amiloides, tales como personas adolescentes o adultos muy jóvenes y, adicionalmente, se obtienen controles cognitivamente normales de 40 edad similar promediando los valores de la población general. Si bien algunos controles ancianos cognitivamente normales de edad coincidente tienen AD preclínica, la mayoría no lo hacen. Por tanto, los valores medios para una población de este tipo serán útiles y de obtención crítica. El diseño de controles estará es un proceso bien conocido por el especialista ordinario. Los individuos que tienen niveles elevados de los péptidos indicados o de la ratio de A 40 a A 42 en comparación con los valores de control se identifican luego como personas que presentan una gran
45 probabilidad de afecciones clínicas o preclínicas asociadas con la formación de placas amiloides.
Puede ser deseable empaquetar los componentes para realización del ensayo de la invención en kits convenientes. Tales kits incluirán recipientes tales como frascos o viales que contienen muestras del anticuerpo a administrar así como los reactivos apropiados para realización del ensayo sobre la muestra de sangre extraída. El kit contendrá también instrucciones para la realización del ensayo y, opcionalmente, gráficos de valores de control. Sin embargo,
50 tales kits no forman parte de la invención reivindicada.
Los ejemplos siguientes tienen por objeto ilustrar la invención, pero sin limitar la misma.
Los ejemplos que se ofrecen a continuación emplean, entre otros, un anticuerpo monoclonal murino designado "266" que se preparó originalmente por inmunización con un péptido constituido por los residuos 13-28 del péptido A humano. Se confirmó que el anticuerpo inmunorreaccionaba con este péptido, pero se había confirmado
55 previamente que no reaccionaba con el péptido que contenía únicamente los residuos 17-28 del péptido A humano,
o con ningún otro epítope encontrado en el péptido A . La preparación de este anticuerpo se describe en la Patente
U.S. 5.766.846. Dado que los ejemplos de esta memoria describen experimentos realizados en sistemas murinos, el uso de anticuerpos monoclonales murinos es satisfactorio. Sin embargo, se prefieren formas humanizadas de los anticuerpos con la inmunoespecificidad correspondiente a la del anticuerpo 266.
EJEMPLO 1
Correlación de Niveles de Péptido Circulante con las Placas
5 En este ensayo se utilizó un modelo murino para la enfermedad de Alzheimer, ratones transgénicos APP V717F. Estos ratones han sido descritos por Games, D., et al., Nature (1995) 373:523-527; Bales, K.R., et al., Nature Genet. (1997) 17:263-264; y por Holtzman, D.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2000) 97:2892-2897. En este modelo, se expresa una forma mutante del gen humano APP y da como resultado una forma de aparición temprana de la enfermedad de Alzheimer familiar. Aunque los cerebros de estos ratones parecen normales inicialmente, la
10 deposición de A en la forma de placas difusas y neuríticas ocurre a los 6-15 meses, aunque ratones homocigóticos para el transgén exhiben variabilidad en el sentido de que a los 9-14 meses de edad, algunos ratones presentan depósitos A mientras que otros no lo hacen.
En este estudio se utilizaron 53 ratones homocigóticos de 12 meses.
Los niveles en plasma de A 40, A 42 y las ratios A 40/A 42 se midieron por ELISA en el plasma de estos ratones
15 antes de la administración de 500 Ig de m266 y en diversos intervalos de tiempo hasta 24 horas después de la administración de este anticuerpo. Después de 24 horas, se sacrificaron los ratones, y se estimó en el hipocampo y el córtex la cantidad de deposición de A en el cerebro como ha sido descrito por DeMattos, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001) 98:8850-8855, evaluándose como porcentaje del cerebro cubierto por depósitos de A .
Como se muestra en las Figuras 1A, B y C, si el porcentaje de cobertura de A debido a deposición en el hipocampo
20 se representa gráficamente en el eje x contra los niveles de los péptidos y su ratio en plasma en el eje y antes de la administración del anticuerpo, no se encuentra correlación alguna. Con indiferencia de si el porcentaje de deposición de A era esencialmente cero (0) o mayor que 75%, el nivel medio de A 40 era aproximadamente 250 (pg/ml) y el de A 42 aproximadamente 400 pg/ml). La ratio de A 40 a A 42 era por tanto aproximadamente 0,5-0,6.
En cambio, como se muestra en las Figuras 2A y B, el nivel en plasma de A 40 estaba fuertemente correlacionado
25 con el porcentaje de deposición de A en el hipocampo una hora después de la inyección de m266, al igual que lo hacía la ratio de A 40 a A 42.
Las Figuras 3A, B y C muestran resultados similares obtenidos 24 horas después de la inyección. Los niveles obtenidos de A 40 y la ratio A 40/A 42 estaban fuertemente correlacionados con el porcentaje de deposición de A en el hipocampo. Los niveles de A 42 estaban correlacionados también con el % de deposición de A pero no tanto
30 como los niveles de A 40.
Las Figuras 4A, B y C muestran resultados análogos con respecto a la velocidad de entrada de los dos péptidos A en el plasma y los valores calculados para la velocidad de entrada en función de la ratio de estos péptidos. Las mejores correlaciones con la deposición de A eran la velocidad de entrada de A 40 y la ratio de A 40/A 42.
Las Figuras 5A y B exhiben una presentación alternativa de los datos para los niveles en plasma de A 40 24 horas y
35 1 hora después de la inyección de m266. Cuando los ratones se agruparon de acuerdo con la cobertura de AB baja, media o alta en el hipocampo, los animales con baja deposición de A podían distinguirse completamente de aquéllos que tenían deposición alta en función del nivel de A 40 en plasma.
Ejemplo 2
En un estudio similar al expuesto en el Ejemplo 1, se utilizó un grupo de 49 ratones APP V717F homocigóticos.
40 Antes y después de la inyección de 500 Ig IV de m266, se obtuvieron muestras de plasma al cabo de 5 minutos, 1 hora, 3 horas, 6 horas y 24 horas, y se estimaron los niveles de A 40 y A 42 como se describe en el Ejemplo 1. Los ratones se sacrificaron después de 24 horas y se estimó un hemisferio respecto al porcentaje del área del hipocampo o el córtex cingulado ocupado por péptido A (utilizando tinción por inmunofluorescencia cuantitativa de A ) y el área ocupada por el amiloide (por tinción con tioflavina-S (amiloide)). Las regiones del otro hemisferio se
45 estimaron respecto a péptido A por ELISA.
Se determinaron el coeficiente de clonación de Pearson (Pearson r) y la significación (valor P) entre los valores de A en plasma (antes y después de la inyección de m266) y la carga de A o amiloide en el hipocampo utilizando el software GraphPad Prism (versión 3.00 para Windows, San Diego, USA). La carga de A se define como el área porcentual del hipocampo cubierta por depósitos de A inmunorreactivos. La carga de amiloide se define como el
50 área porcentual del hipocampo cubierta por depósitos positivos de tioflavina-S. Se determinaron también correlaciones entre la acumulación de A en plasma a lo largo de 24 horas (área bajo la curva, AUC) y la carga de A o carga de amiloide en el hipocampo.
La Figura 6 muestra los resultados obtenidos. Resumidamente, se encontró que los niveles de la línea base (antes de la inyección) de A 40, A 42 y la ratio A 40/A 42 calculada antes de la inyección con m266 no guardaban correlación con el porcentaje de A o deposición de amiloide. En cambio, después de la administración de m266, existían correlaciones significativas entre A 40, A 42, y la ratio A 40/A 42 en plasma tanto con A como con la carga de amiloide en el hipocampo y el córtex cingulado.
El análisis estadístico de los resultados permite una predicción exacta de la carga de A en el hipocampo en estos ratones basándose en los niveles de A 40 en plasma 24 horas después de la inyección de m266.
LISTADO DE SECUENCIAS
MÉTODO DE ENSAYO PARA LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
Secuencia artificial
Anticuerpo humanizado
CARACTERÍSTICA_DIVERSA (1)..(219) CADENA LIGERA DE ANTICUERPO HUMANIZADO Secuencia artificial
Anticuerpo humanizado
CARACTERÍSTICA_DIVERSA (1)..(442) CADENA LIGERA DE ANTICUERPO HUMANIZADO
<221) CARACTERÍSTICA_DIVERSA
<222> (57)..(57)
<223> Xaa en la posición 57 es cualquier aminoácido, con la condición de que si Xaa en la posición 56 es Asn y Xaa en la posición 58 es Ser o Thr, entonces Xaa en la posición 57 es Asp o Pro
<220> <221) CARACTERÍSTICA_DIVERSA
<222> (58)..(58)
<223> Xaa en la posición 58 es cualquier aminoácido, con la condición de que si Xaa en la posición 56 es Asn y Xaa en la posición 57 no es Asp ni Pro, entonces Xaa en la posición 58 no es Ser ni Thr
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_DIVERSA
<222> (75)..(75)
<223> Xaa en la posición 75 es Ala, Ser, Val o Thr
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_DIVERSA
<222> (76)..(76)
<223> Xaa en la posición 76 es Lys o Arg
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_DIVERSA
<222> (89)..(89)
<223> Xaa en la posición 89 es Glu o Asp
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_DIVERSA
<222> (107)..(107)
<223> Xaa en la posición 107 es Leu o Thr
<400> 14
<223> Xaa en la posición 58 es cualquier aminoácido, con la condición de que si Xaa en la posición 56 es Asn y Xaa en la posición 57 no es Asp ni Pro, entonces Xaa en la posición 58 no es Ser ni Thr

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer preclínica o clínica que comprende:
    (a) medir el nivel de A 42 en una muestra de sangre de un individuo obtenida al cabo de un intervalo de tiempo después de administrar a dicho individuo una cantidad de un anticuerpo que se fija
    5 específicamente a un epítope contenido en las posiciones 13-28 de A o un anticuerpo que secuestra el péptido A de su forma combinada circulante en la sangre y altera el aclaramiento de las formas soluble y combinada de A en el sistema nervioso central en plasma, en donde dicha cantidad es eficaz para alterar los niveles de péptidos A circulantes en la sangre de dicho individuo cuando dicho individuo se encuentra en una fase preclínica o clínica de la enfermedad de Alzheimer; y
    10 (b) comparar el nivel de A 42 en dicho individuo con un valor de control de dichos niveles, en donde los niveles elevados de A 42 en dicho individuo comparados con niveles de control identifican que dicho individuo se encuentra en una etapa preclínica o clínica de la enfermedad de Alzheimer;
    en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado que comprende:
    (i) una cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs)
    15 siguientes: CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1; CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2; y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3; y
    (ii) una cadena pesada que comprende las CDRs siguientes: CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 4; CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de
    20 aminoácidos SEQ ID NO. 5; y CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.6.
  2. 2.
    El método de la reivindicación 1, en el cual dicho intervalo de tiempo es menor que 1 semana.
  3. 3.
    El método de la reivindicación 1, en el cual dicho intervalo de tiempo es menor que o igual a 24 horas.
  4. 4.
    El método de la reivindicación 3, en el cual el intervalo de tiempo es menor que o igual a 3 horas.
    25 5. El método de la reivindicación 1, en el cual dicha administración se realizó por inyección de dichos anticuerpos.
  5. 6. El método de la reivindicación 1, en el cual el individuo es humano y el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo.
  6. 7. El método de la reivindicación 6, en el cual el anticuerpo humanizado o fragmento del mismo comprende una 30 cadena ligera de SEQ ID NO: 11 y una cadena pesada SEQ ID NO: 12.
  7. 8.
    El método de la reivindicación 6, en el cual el anticuerpo humanizado o fragmento del mismo comprende una cadena ligera de SEQ ID NO: 11 y una cadena pesada SEQ ID NO: 16.
  8. 9.
    El método de la reivindicación 6, en el cual el anticuerpo humanizado o fragmento del mismo comprende una
    cadena ligera que comprende una región variable de SEQ ID NO: 7 y una cadena pesada que comprende una 35 región variable de SEQ ID NO: 14.
  9. 10.
    El método de la reivindicación 1, en el cual dicho anticuerpo es un fragmento.
  10. 11.
    El método de la reivindicación 1, en el cual el anticuerpo es un anticuerpo monocatenario.
    LEs significativa a corre aci6n? (a fa=0 05)
    Si
    R cuadrado
    0 6380
    Parametro
    Pendiente de ve ocidad 40
    Numero de Pares XY Pearson r nterva o de confianza 95% Va or P (dos co as) Sumario de va ores P LEs significativa a corre aci6n? (a fa=0 05) R cuadrado
    52 0 8360 0 4394 a 0 7745 P<0 0001 ... Si 0 4046
    Parametro
    Pendiente de ve ocidad 42
    Numero de Pares XY Pearson r nterva o de confianza 95% Va or P (dos co as) Sumario de va ores P LEs significativa a corre aci6n? (a fa=0 05) R cuadrado
    52 0 4062 0 1499 a 0 6114 0 0028 .. Si 0 1850
    Ve ocidades de AS40
    Ve ocidades de AS40
    (og AS oor m oor min)
    (og AS oor m oor min)
    Ratio de ve ocidades
    Ve ocidad de Entrada de AS40 en P asma
    % Deoosici6n AS
    Ve ocidad de Entrada de AS42 en P asma
    % Deoosici6n AS
    Parametro
    Ratio de Ve ocidades
    Numero de Pares XY Pearson r nterva o de confianza 95% Va or P (dos co as) Sumario de va ores P LEs significativa a corre aci6n? (a fa=0 05) R cuadrado
    52 0 6551 0 4653 a 0 7873 P<0 0001 ... Si 0 4291
    Ratio de ve ocidades de Entrada AS401 AS42 en P asma
    % Deoosici6n AS
    Figura 4
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