PT1944040E - Método de avaliação para a doença de alzheimer - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO "MÉTODO DE AVALIAÇÃO PARA A DOENÇA DE ALZHEIMER"

Campo Técnico A invenção relaciona-se com uma avaliação que permite o diagnóstico da doença de Alzheimer pré-clinica e clinica. 0 teste baseia-se na avaliação dos níveis de péptido beta-amiloide (Αβ) no plasma após administração de certos anticorpos anti-Αβ a um sujeito.

Arte antecedente

Um número de sintomatologias que resultam em défices cognitivos, derrame cerebral, hemorragia cerebral, e debilitação mental geral parece estar associado com placas neuríticas e cerebrovasculares no cérebro contendo o péptido beta-amiloide (Αβ). Entre estas condições patológicas estão quer a doença de Alzheimer pré-clínica e clínica, síndrome de Down, e angiopatia amiloide cerebral pré-clínica e clínica (CAA). As placas amiloides são formadas a partir de péptidos beta-amiloides. Estes péptidos circulam no sangue e no fluído cerebrospinal (CSF). 0 péptido Αβ na forma circulante é composto de 39-43 aminoácidos (maioritariamente 40 ou 42 aminoácidos) resultante da clivagem de uma proteína precursora comum, proteína precursora amiloide, frequentemente designada APP. A evidência sugere que Αβ pode ser transportado para a frente e para trás entre cérebro e sangue (Ghersi-Egea, J.F., et al., J. Neurochem. (1996) 67:880-883; Zlokovic, B.V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67:1034- 1040; Shibata, M., et al., J. Clin. Invest. (2000)106:1489-1499 . Além disso, Αβ nas placas está em equilíbrio com Αβ solúvel no cérebro e sangue (Kawarabayashi, T., et al., J. Neurosci. (2001) 21:372-381), DeMattos et al., Proc.

Nat'l.Acad. Sei. USA (2001) 98:8850-8855.

Como descrito no pedido PCT US00/35681 e U.S. N.° de 2 série 09/153 130 ambos incorporados aqui por referência, os níveis totais circulantes de péptido Αβ no CSF são semelhantes em indivíduos normais e indivíduos com predisposição para exibir os sintomas de Alzheimer. Contudo, os níveis de Αβ42 são inferiores em média em indivíduos com doença de Alzheimer (Nitsch,RM., et al., Ann. Neurol. (1995) 37:512-518). É sabido que Αβ42 é mais propenso a agregar do que ο Αβ42 e, quando isto acontece, ocorrem consequências adversas tais como deposição de Αβ em placas amiloides, conversão de Αβ em formas tóxicas, lesão de células nervosas, e défice comportamental tal como demência (Golde, T.E., et al., Biochem. Biophys. Acta. (2000) 1502:172-187). O pedido PCT PCT/US01/06191 titulado "Humanized Antibodies That Sequester Αβ Peptide" emitido a 26 de Fevereiro de 2001 e incorporado aqui por referência descreve anticorpos que não atravessam consideravelmente a barreira hemato-encefálica e que sequestram péptidos Αβ circulantes em fluídos biológicos. Estes anticorpos são descritos como úteis para tratamento terapêutico e preventivo de condições patológicas associadas com a formação de placas cerebrovasculares neuríticas, difusas, contendo Αβ no cérebro. O pedido descreve a administração dos anticorpos seguida da medição dos níveis circulantes de péptido Αβ no sangue de maneira a avaliar o progresso da terapêutica. Não há uma sugestão clara, contudo, de que os níveis de péptido Αβ após administração dos anticorpos sejam diagnósticos da própria condição patológica. A presente invenção reside no resultado surpreendente de que níveis aumentados de ambos Αβ40 e Αβ42 bem como a razão Αβ4ο/Αβ42 estão correlacionados com os níveis de deposição de péptido Αβ no cérebro quando os anticorpos foram administrados a um indivíduo. Por isso, a medição destes componentes no sangue após administração do anticorpo providencia um teste diagnóstico direto simples para ambas 3 as fases clínica e pré-clínica da doença de Alzheimer e distúrbios neurológicos relacionados.

Existem publicações adicionais relevantes referentes ao comportamento de anticorpos do péptido Αβ. Por exemplo, a publicação PCT W099/27944 publicada a 10 de Junho de 1999 descreve métodos para induzir uma resposta imune de maneira a reduzir depósitos amiloides. A publicação N.° W099/60024 publicada a 25 de Novembro de 1999 descreve métodos para remoção amiloide utilizando anticorpos anti-amiloides. Publicações PCT adicionais, incluindo os documentos WO00/72880, WOOO/72876 e WOOO/77178 todos descrevem várias atividades de anticorpos anti-péptido Αβ. Diz-se que os anticorpos dirigidos ao terminal N deste péptido reduzem placas num modelo murino transgénico; imunização com a própria amiloide é descrita bem como anticorpos concebidos para catalisar a hidrólise do péptido.

Foi demonstrado que uma via para o metablismo de Αβ é através do transporte do CNS para o plasma (Zlokovic, B.V., et al., Proc. Natl. Acad Sei (USA) (1996) 93:4229-4234; Ghersi-Egea, J-F., et al., J. Neurochem.(1996)67:880-883). Além disso, foi demonstrado que ο Αβ no plasma pode atravessar a barreira hemato-encefálica e entrar no cérebro (Zlokovic, B.V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67:1034-1040). Também foi demonstrado que a administração de certos anticorpos monoclonais e policlonais Αβ diminui a deposição de Αβ em placas amiloides no modelo de ratinho transgénico APP V717F da doença de Alzheimer (Bard, F., et al., Nature Med (2000) 6:916-919). Foi proposto que isso ocorreu porque certos anticorpos anti-Αβ que atravessavam a barreira hemato-encefálica e estimulavam a fagocitose de placas amiloides por células microgliais. Nas experiências de Bard, avaliações de cortes ex vivo de cérebro mostraram que a presença de anticorpo Αβ adicionado, junto com microglia adicionada exogenamente, induziu a fagocitose de Αβ, 4 resultando na remoção de depósitos de Αβ.

Os níveis de ambos Αβ40 e Αβ42 solúveis em CSF e sangue podem ser rapidamente detetados utilizando testes padronizados utilizando anticorpos dirigidos contra epítopos ao longo da cadeia Αβ. Tais testes foram reportados, por exemplo, nas patentes U.S. 5 766 846; 5 837 672; e 5 593 846. Estas patentes descrevem a produção de anticorpos monoclonais murinos para o domínio central do péptido Αβ, e estes foram reportados terem epítopos à volta e incluídos nas posições 16 e 17. Anticorpos dirigidos contra a região terminal N também foram descritos. Vários anticorpos monoclonais foram declarados imunorreagir com as posições 13-28 do péptido Αβ; estes não se ligaram ao péptido representando as posições 17-28, assim, de acordo com as patentes citadas, estabelecendo que se trata desta região, incluindo as posições 16-17 (o local O-secretase) que foi o alvo destes anticorpos. Entre os anticorpos que se sabe que se ligam entre os aminoácidos 13 e 28 do Αβ estão os anticorpos de ratinho 266 (m266), 4G8, e 1C2. Revelação da invenção

Foi agora descoberto que anticorpos que são úteis para realizar testes para o péptido Αβ, e que são úteis no tratamento de condições patológicas associadas com placas amiloides no cérebro podem obter uma resposta que resulta num aumento marcado no nível do péptido Αβ no sangue e este nível pode ser utilizado como um marcador diagnóstico para doença de Alzheimer clínica e pré-clínica. Estes anticorpos, que podem ou não ser humanizados, sequestram o péptido Αβ da sua forma circulante ligada no sangue e alteram a libertação de formas ligadas e solúveis de Αβ no sistema nervoso central no plasma. Estes anticorpos, e fragmentos dos mesmos, ligam-se especificamente a um epítopo entre os aminoácidos 13 e 28 da molécula de Αβ. As CDR destes anticorpos podem ser derivadas do anticorpo monoclonal de ratinho 266 (SEQ. ID N.° 1 através da SEQ. ID 5 Ν.° 6). Anticorpos úteis incluem anticorpos e fragmentos dos mesmos, em que as regiões variáveis têm sequências compreendendo a CDR do anticorpo de ratinho 266 e sequências estrutura humanas especificas (SEQ. ID N.° 7 através da SEQ. ID N.° 10), em que os anticorpos retêm aproximadamente as propriedades de ligação do anticorpo de ratinho e têm propriedades in vitro e in vivo funcionalmente equivalentes ao anticorpo de ratinho 266. Especialmente úteis são os anticorpos humanizados e fragmentos dos mesmos, em que a cadeia leve é a SEQ. ID N.° 11 e a cadeia pesada é a SEQ. ID N.° 12.

Assim, num aspeto da invenção é dirigida a um método de diagnosticar doença de Alzheimer pré-clinica ou clinica compreendendo: (a) medir o nivel de Αβ42 numa amostra de sangue de um sujeito obtida num intervalo de tempo após administrar ao dito sujeito uma quantidade de um anticorpo que se liga especificamente a um epítopo contido nas posições 13-28 do Αβ ou um anticorpo que sequestra o péptido Αβ da sua forma circulante ligada no sangue e altera a libertação de formas solúveis e ligadas do Αβ no sistema nervoso central no plasma, em que dita quantidade é eficaz para alterar os níveis de péptidos Αβ circulantes no sangue de dito sujeito quando dito sujeito está numa fase pré-clínica ou clínica da doença de Alzheimer; e (b) comparar o nível de Αβ42 em dito sujeito com um valor controlo de ditos níveis, em que níveis aumentados de Αβ42 em dito sujeito quando comparados com níveis controlo identifica dito sujeito como estando numa fase pré-clínica ou clínica da doença de Alzheimer; em que dito anticorpo é um anticorpo monoclonal humanizado compreendendo; (i) uma cadeia leve compreendendo as regiões determinantes de complementaridade seguintes (CDR): CDR1 da cadeia leve com sequência de aminoácido SEQ. ID N.° 1; CDR2 da cadeia 6 leve com sequência de aminoácido SEQ. ID N.° 2; e CDR3 da cadeia leve com sequência de aminoácido SEQ. ID N.° 3; e (ii) uma cadeia pesada compreendendo as seguintes CDR: CDR1 da cadeia pesada com sequência de aminoácido SEQ. ID N.° 4; CDR2 da cadeia pesada com sequência de aminoácido SEQ. ID N.° 5; e CDR3 da cadeia pesada com sequência de aminoácido SEQ. ID N.0 6.

Breve descrição dos desenhos

As Figuras IA, B e C são gráficos que mostram os níveis de Αβ4ο (Figura ΙΑ) , Αβ42 (Figura 1B) , e a razão Αβ4ο/Αβ42 (Figura 1C) no plasma de ratinhos transgénicos antes da administração do anticorpo m266, e a ausência de correlação com os depósitos de Αβ no cérebro.

As Figuras 2A e B são gráficos que mostram Αβ40 no plasma (Figura 2A) e a razão Αβ40/Αβ42 no plasma (Figura 2B) em ratinhos transgénicos uma hora após a injeção do anticorpo m266, e a correlação significativa com os depósitos de Αβ no cérebro.

As Figuras 3A, B e C são gráficos que mostram as correlações significativas dos dois péptidos Αβ (Figuras 3A e 3B) e da sua razão (Figura 3C) com a deposição do péptido Αβ no cérebro 24 horas após a injeção com anticorpo monoclonal m266.

As Figuras 4A, B e C são gráficos que mostram as correlações significativas das taxas de entrada na circulação dos dois péptidos Αβ (Figuras 4A e 4B) e a sua razão (Figura 4C) e deposição do péptido Αβ em ratinhos transgénicos.

As Figuras 5A e B são gráficos que mostram uma representação gráfica alternativa dos níveis de Αβ40 no plasma 24 horas (Figura 5A) e 1 hora (Figura 5B) após a injeção de m266 correlacionada com a percentagem do hipocampo coberto pelos depósitos de Αβ. A Figura 6 é uma tabela que mostra os coeficientes de correlação de Pearson (r Pearson) e a significância (valor 7 P) determinados entre os valores de Αβ no plasma (pré- e pós-injeção do m266) e Αβ no hipocampo ou carga amiloide. Modos de realizar a invenção

Os péptidos Αβ que circulam em fluidos biológicos humanos representam uma região terminal carboxi de uma proteína precursora codificada no cromossoma 21. Foi reportado a partir de resultados de experiências in vitro que o péptido Αβ tem uma solubilidade fraca em soluções fisiológicas, já que contém um trecho de aminoácidos hidrofóbicos que são uma parte da região que ancora para o seu precursor mais longo para as membranas lipídicas das células. Não é, por isso, surpreendente que o péptido Αβ circulante esteja normalmente complexado com outras frações que o previnem de agregar. Isto resultou em dificuldades em detetar péptido Αβ circulante em fluídos biológicos.

Os documentos de patente anteriormente mencionados (patentes U.S. 5 766 846; 5 837 672 e 5 593 846) descrevem a preparação de anticorpos, incluindo um anticorpo monoclonal, designado clone 266 (m266), que foi criado contra o, e demonstrou-se que se liga especificamente a, péptido compreendendo aminoácidos 13-28 do péptido Αβ. Os candidatos descobriram que após administrar m266 a ratinhos APP V717F, um ratinho modelo de doença de Alzheimer, podem medir os níveis de péptidos Αβ na circulação que são diagnósticos dos níveis de placas amiloides no cérebro. Assim, estes anticorpos são úteis não só em conduzir testes para péptidos Αβ circulantes por si, mas também para obter níveis circulantes no sangue que são diagnósticos da quantidade de placa amiloide no cérebro, e por isso, úteis em identificar indivíduos em fases clínica e pré-clínica da doença de Alzheimer. Um tal anticorpo, m266, liga-se à região intermédia do péptido Αβ.

Por "anticorpo monoclonal que se liga à região intermédia do péptido Αβ" entende-se um anticorpo monoclonal (Mab ou Mabs) que se liga a sequência de aminoácido que representa um epítopo contido entre as posições 13-28 do Αβ. A região inteira não precisa de ser alvo. Desde que o anticorpo se ligue, pelo menos, a um epitopo dentro desta região (especialmente, por exemplo, incluindo o local da a-secretase 16-17 ou o local ao qual o anticorpo 266 se liga) , tais anticorpos são eficazes no método da invenção.

Por "anticorpo" entende-se um anticorpo monoclonal por si, ou um fragmento imunologicamente eficaz do mesmo, tal como um fragmento Fab, Fab-, ou F(ab»)2 do mesmo. Em alguns contextos, aqui, serão mencionados fragmentos especificamente para dar ênfase; contudo, será entendido que independentemente de se os fragmentos são especificados, o termo "anticorpo" inclui tais fragmentos como também formas de cadeia simples. Desde que a proteína retenha a capacidade de se ligar especificamente ao seu alvo pretendido, e neste caso, de sequestrar o péptido Αβ das suas proteínas transportadoras no sangue, está incluído no termo "anticorpo." Também incluído na definição de "anticorpo" por exemplo, são as formas de cadeia simples, geralmente designadas Fv, regiões, de anticorpos com esta especificidade. Preferencialmente, mas não necessariamente, os anticorpos úteis na invenção são produzidos de forma recombinante, uma vez que a manipulação dos anticorpos tipicamente murinos ou outros não-humanos com a especificidade apropriada é requerida de maneira a convertê-los na forma hmanizada. Anticorpos podem ou não ser glicosilados, apesar dos anticorpos glicosilados serem preferidos. Anticorpos são devidamente reticulados através de ligações dissulfido, como é bem conhecido.

Sabe-se que a unidade estrutural básica do anticorpo compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, tendo cada par uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa). A porção terminal amino de cada 9 cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsável pelo reconhecimento de antigeno. A porção terminal carboxi de cada cadeia define uma região constante primariamente responsável pela função efetora.

As cadeias leves são classificadas como gama, mu, alfa, e lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou epsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respetivamente. Dentro das cadeias leve e pesada, as regiões variável e constante são unidas pela região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada a incluir também uma região "D" de cerca de 10 ou mais aminoácidos.

As regiões variáveis de cada par cadeia leve/cadeia pesada formam o local de ligação do anticorpo. Assim, um anticorpo intacto tem dois locais de ligação. Todas as cadeias exibem a mesma estrutura geral de regiões estrutura relativamente conservadas (FR) unidas por três regiões hipervariáveis, também designadas regiões determinantes de complementaridade ou CDR. As CDR das duas cadeias de cada par são alinhadas pelas regiões estrutura, permitindo a ligação a um epitopo especifico. Do terminal N ao terminal C, ambas cadeias leve e pesada compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2,CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição dos aminoácidos a cada domínio está em concordância com convenções bem conhecidas [Kabat "Sequences of Proteins of Immunological Interest" Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, Md., 1987 e 1991; Chothia, et al., J. Mol. Bio. (1987) 196:901-917; Chothia, et al., Nature (1989) 342:878-883] .

Como é bem entendido na arte, anticorpos monoclonais podem ser rapidamente gerados com especificidade apropriada por técnicas padrão de imunização de mamíferos, formando hibridomas a partir das células produtoras de anticorpo de ditos mamíferos ou, de outra forma, imortalizando-as, e 10 cultivando os hibridomas ou células imortalizadas para as avaliar pela sua especificidade apropriada. No presente caso tais anticorpos poderiam ser gerados imunizando um humano, coelho, rato ou ratinho, por exemplo, com um péptido representando um epítopo que abrange a região 13-28 do péptido Αβ ou uma subregião apropiada do mesmo. Os materiais para a manipulação recombinante podem ser obtidos recuperando as sequências nucleotidicas que codificam o anticorpo desejado a partir do hibridoma ou outra célula que o produz. Estas sequências nucleotidicas podem depois ser manipuladas para os providenciar na forma humanizada, se desejado.

Pode ser desejável utilizar formas humanizadas destes anticorpos de maneira a obter os niveis circulantes desejados dos péptidos em sujeitos humanos. Uma vez que a administração é a curto-prazo e apenas para fins diagnósticos, isto pode não ser necessário, mas claramente é preferível para evitar qualquer possibilidade de uma resposta imune, por isso a utilização de formas humanizadas para este fim é preferida. Obviamente, para o desempenho do teste dos níveis de Αβ ex vivo (por exemplo por ELISA), as próprias formas murinas podem ser utilizadas.

Por "anticorpo humanizado" entende-se um anticorpo que é composto parcialmente ou totalmente por sequências de aminoácido derivadas de uma linha germinativa de anticorpo humano alterando a sequência de um anticorpo que tem regiões determinantes de complementaridade (CDR) não humanas. A alteração mais simples de tais alterações pode consistir simplesmente em substituir a região constante de um anticorpo humano por região constante murina, resultando assim numa quimera humano/murino que pode ter imunogenicidade suficientemente baixa para ser aceitável para utilização farmacêutica. Preferencialmente, contudo, a região variável do anticorpo e mesmo a CDR é também humanizada por técnicas que já são bem conhecidas na arte. 11

As regiões estrutura das regiões variáveis são substituídas pelas regiões estrutura humanas correspondentes deixando a CDR não humana substancialmente intacta, ou mesmo substituindo a CDR com sequências derivadas de um genoma humano. Anticorpos inteiramente humanos são produzidos em ratinhos geneticamente modificados cujos sistemas imunes foram alterados para corresponder aos sistemas imunes humanos. Como mencionado anteriormente, é suficiente para utilização nos métodos da invenção, para empregar um fragmento imunologicamente específico do anticorpo, incluindo fragmentos representando formas de cadeia simples.

Um anticorpo humanizado refere-se, assim, a um anticorpo compreendendo uma estrutura humana, pelo menos uma CDR de um anticorpo não humano, e no qual qualquer região constante presente é substancialmente idêntica a uma região constante de imunoglobulina humana, isto é, pelo menos cerca de 85-90%, preferencialmente pelo menos 95% idêntica. Assim, todas as partes de um anticorpo humanizado, exceto possivelmente as CDR, são substancialmente idênticas às partes correspondentes de uma ou mais sequências da imunoglobulina humana nativa. Por exemplo, uma imunoglobulina humanizada não abrangeria tipicamente uma região variável de ratinho quimérica/região constante de anticorpo humano. O desenho das imunoglobulinas humanizadas pode ser realizado como se segue. Quando um aminoácido cai na seguinte categoria, o aminoácido estrutura de uma imunoglobulina humana a ser utilizado (imunoglobulina recetora) é substituído por um aminoácido estrutura de uma imunoglobulina não humana que providencia CDR (imunoglobulina dadora): (a) o aminoácido na região estrutura humana da imunoglobulina recetora é invulgar para a imunoglobulina humana naquela posição, ao passo que o aminoácido correspondente na imunoglobulina dadora é típico 12 para a imunoglobulina humana naquela posição; (b) a posição do aminoácido é imediatamente adjacente à das CDR; ou (c) qualquer átomo de cadeia lateral de um aminoácido estrutura está dentro de cerca de 5-6 angstroms (centro-a-centro) de qualquer átomo de um aminoácido da CDR num modelo tridimensional de imunoglobulina [Queen, et al., op. cit., e Co, et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA (1991) 88:2869]. Quando cada aminoácido na região estrutura humana da imunoglobulina recetora e aminoácido correspondente na imunoglobulina dadora é invulgar para a imunoglobulina humana naquela posição, tal aminoácido é substituído por um aminoácido típico para a imunoglobulina humana naquela posição. 0 anticorpo humanizado é uma forma humanizada do anticorpo de ratinho 266. As CDR do 266 humanizado têm as seguintes sequências de aminoácido: CDR1 da cadeia leve: 15 10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO:1) CDR2 da cadeia leve: 1 5

Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ 1D NO:2) CDR3 da cadeia leve: 1 5

Ser Gin Ser Thr His Vai Pro Trp Thr (SEQ ID NO:3) CDR1 da cadeia pesada: 1 5

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO:4) CDR2 da cadeia pesada: 15 10 15

Gin Ile Asn Ser Vai Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Vai Lys Gly (SEQ ID NO:5) e, CDR3 da cadeia pesada: 1

Gly Asp Tyr (SEQ ID NO:6). 13 Uma região variável da cadeia leve preferida de um anticorpo humanizado da presente invenção tem a seguinte sequência de aminoácido, na qual a estrutura é oiginária de uma linha germinativa humana Vk segmentos DPK18 e J segmento Jkl, com várias substituições de aminoácido para os aminoácidos de consenso no mesmo subgrupo humano V para reduzir a imunogenicidade potencial: 1 5 10 15 Asp Xaa Vai Met Thr Gin Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Vai Xaa Xaa 20 25 30 Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Xaa 35 40 45 Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro 50 55 60 Gly Gin Ser Pro Xaa Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe 65 70 75 Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 80 85 90 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Vai 95 100 105 Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser Thr His Vai Pro Trp Thr Phe Gly Xaa 110 Gly Thr Xaa Xaa Glu Ile Lys Arg (SEQ IO NO: 7) em que Xaa na posição 2 é Vai ou Ile; Xaa na posição 7 é Ser ou Thr; Xaa na posição 14 é Thr ou Ser; Xaa na posição 15 é Leu ou Pro; Xaa na posição 30 é Ile ou Vai; Xaa na posição 50 é Arg, Gin, ou Lys r Xaa na posição 88 é Vai ou Leu; Xaa na posição 105 é Gin ou Gly; Xaa na posição 108 é Lys ou Arg; e Xaa na posição 109 é Vai ou Leu. 14 Uma região variável da cadeia pesada preferida de um anticorpo humanizado da presente invenção tem a seguinte sequência de aminoácido, na qual a estrutura é originária da linha germinativa humana VH segmentos DP53 e J segmento JH4, com várias substituições de aminoácido para os aminoácidos de consenso no mesmo subgrupo humano para reduzir a imunogenicidade potencial: 1 5 10 15 Xaa Vai Gin Leu Vai Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 35 40 45 Arg Tyr Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Xaa Leu Vai Ala Gin Ile Asn Ser Vai Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 Pro Asp Xaa Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Xaa 80 85 90 Xaa Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp 95 100 105 Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 110 Thr Xaa Vai Thr Vai Ser Ser (SEQ ID NO:! B) em que:

Xaa na posição 1 é Glu ou Gin;

Xaa na posição 7 é Ser ou Leu;

Xaa na posição 46 é Glu, Vai, Asp, ou Ser;

Xaa na posição 63 é Thr ou Ser;

Xaa na posição 75 é Ala, Ser, Vai, ou Thr;

Xaa na posição 76 é Lys ou Arg;

Xaa na posição 89 é Glu ou Asp; e Xaa na posição 107 é Leu ou Thr.

Uma região variável da cadeia leve particularmente preferida de um anticorpo humanizado da presente invenção 15

tem a seguinte sequência de aminoácido, na qual a estrutura é originária da linha germinativa humana Vk segmentos DPK18 e J segmento Jkl, com várias substituições de aminoácido para os aminoácidos de consenso no mesmo subgrupo humano V para reduzir a imunogenicidade potencial: 15 10 15

Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Leu 20 25 30

Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro 50 55 60

Gly Gin Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe 65 70 75

Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 80 85 90

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai 95 100 105

Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser Thr His Vai Pro Trp Thr Phe Gly Gin 110

Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg (SEQ ID NO:9).

Uma região variável da cadeia pesada particularmente preferida de um anticorpo humanizado da presente invenção tem a seguinte sequência de aminoácido, na qual a estrutura é originária da linha germinativa humana VH segmentos DP53 e J segmento JH4: 16 16 15 Leu Vai Gin Pro Gly 30 Gly Phe Thr Phe Ser 45 Pro Gly Lys Gly Leu 60 Asn Ser Thr Tyr Tyr 75 15 10

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly 20 25

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 35 40

Arg Tyr Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala 50 55

Glu Leu Vai Ala Gin Ile Asn Ser Vai Gly 65 70

Pro Asp Thr Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 80 85 90 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 95 100 105 Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 110 Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser (SEQ ID MO: 10) .

Uma cadeia leve preferida para um anticorpo humanizado da presente invenção tem a sequência de aminoácido: 17 15 10 15

Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Leu 20 25 30

Gly Gin Pro Ala Ser Xle Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyx Leu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro 50 55 60

Gly Gin Ser Pxo Arg Leu Leu Ile tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe 65 70 75

Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 80 8S 90

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai 95 100 105

Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser Thr His Vai Pro Trp Thr Phe Gly Gin 110 115 120

Gly thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai 125 130 135

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala 140 145 150

Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 155 160 165

Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 170 175 180

Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 185 190 195

Ser ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 200 205 210

Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai 215

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys (SEQ XO HO: 11).

Uma cadeia pesada preferida para um anticorpo humanizado da presente invenção tem a sequência de aminoácido: 18 15 10 15

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 20 25 30

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 35 40 ' 45

Axg Tyr Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Leu Vai Ala Gin Ile Asn Ser Vai Gly Asn Ser thr tyr tyr 65 70 75

Pro Asp thr Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 80 85 90

Lys Asn thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 95 100 105

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 110 115 120

Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai 125 130 135

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 140 145 150

Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr 155 160 165

Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe 170 175 180

Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu ser Ser Vai 185 190 195

Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys 200 205 ' 210

Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai 215 220 225

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 19 230 235 240

Ai a Pro Giu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Het Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr 260 265 270

Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe 275 280 285

Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys 290 295 300

Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai 305 310 315

Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 320 325 330

Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr 335 340 345

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr 350 355 360

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu 365 370 375

Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu 380 385 390

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 395 400 405

Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 410 415 420

Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys 425 430 435

Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 440

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys {SEQ 10 NO; 12}.

Outras sequências são possíveis para as cadeias leve e pesada para os anticorpos humanizados e para o 266 humanizado. As imunoglobulinas podem ter dois pares de complexos cadeia leve/cadeia pesada, pelo menos uma cadeia compreendendo uma ou mais regiões determinantes de 20 complementaridade de ratinho funcionalmente unidas a segmentos de região estrutura humana.

Começando na posição 56 da região variável da cadeia pesada, ambos m266 e 266 humanizado contêm a sequência Asn-Ser-Thr. Esta sequência é um exemplo do sinal Asn-X-Ser/Thr para a glicosilação ligada a N, em que o Asn é o local de anexação das cadeias glicosil ligadas a N. Tanto m266 como 266 humanizado são extensivamente glicosilados neste local. De forma bastante imprevisível e vantajosa, a afinidade do 266 humanizado que é deglicosilado na CDR2 da cadeia pesada para o péptido Αβ é marcadamente superior do que a do 266 humanizado. A CDR2 da cadeia pesada do 266 humanizado deglicosilado tem as seguintes sequências de aminoácido: CDR2 da cadeia pesada: 15 10 15

Gin Ile Asn Ser Vai Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Pro Asp Thr Vai Lys Gly (SEQ ID NO:13) em que:

Xaa na posição 7 é qualquer aminoácido, desde que se Xaa na posição 8 não é nem Asp nem Pro e Xaa na posição 9 é Ser ou Thr, então Xaa na posição 7 não é Asn;

Xaa na posição 8 é qualquer aminoácido, desde que se Xaa na posição 7 é Asn e Xaa na posição 9 é Ser ou Thr, então Xaa na posição 8 é Asp ou Pro; e

Xaa na posição 9 é qualquer aminoácido, desde que se Xaa na posição 7 é Asn e Xaa na posição 8 não é nem Asp nem Pro, então Xaa na posição 9 não é nem Ser nem Thr;

Por "qualquer aminoácido" entende-se qualquer aminoácido que ocorre naturalmente. Aminoácidos que ocorrem naturalmente preferidos são Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp, e Tyr.

Um anticorpo humanizado deglicosilado preferido é uma forma humanizada do m266, em que a CDR2 da cadeia pesada deglicosilada é a SEQ. ID N.° 13, em que:

Xaa na posição 7 da SEQ. ID N.° 13 é selecionada a partir 21 do grupo que consiste em Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His,

Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp, e Tyr, desde que se Xaa na posição 8 não é nem Asp nem Pro e Xaa na posição 9 é Ser ou Thr, então Xaa na posição 7 não é Asn;

Xaa na posição 8 da SEQ. ID N.° 13 é selecionada a partir do grupo que consiste em Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His,

Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp, e Tyr, desde que se Xaa na posição 7 é Asn e Xaa na posição 9 é Ser ou Thr, então Xaa na posição 8 é Asp ou Pro; e Xaa na posição 9 da SEQ. ID N.° 13 é selecionada a partir do grupo que consiste em Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His,

Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp, e Tyr, desde que se Xaa na posição 7 é Asn e Xaa na posição 8 não é Asp nem Pro, então Xaa na posição 9 não é Ser nem Thr.

Uma região variável da cadeia pesada preferida de um anticorpo humanizado deglicosilado tem a seguinte sequência de aminoácido, na qual a estrutura é originária da linha germinativa humana VH segmento DP53 e J segmento JH4, com várias substituições de aminoácido para os aminoácidos de consenso no mesmo subgrupo humano para reduzir a imunogenicidade potencial e em que o local de N-glicosilação na CDR2 da cadeia pesada é modificado de maneira a não poder ser N-glicosilado: 22 22 15 Gly 30 Ser 45 Leu 60 Tyr 75 Xaa 90 Asp 105 Gly 15 10

Xaa Vai Gin Leu Vai Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro 20 25

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40

Arg Tyr Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 50 55

Xaa Leu Vai Ala Gin Ile Asn Ser Vai Gly Xaa Xaa Xaa Tyr 65 70

Pro Asp Xaa Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 80 85

Xaa Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Mét Asn Ser Leu Arg Ala Xaa 95 100

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin 110 NO: 14)

Thr Xaa Vai Thr Vai Ser Ser (SEQ ID em que:

Xaa na posição 1 é Glu ou Gin;

Xaa na posição 7 é Ser ou Leu;

Xaa na posição 46 é Glu, Vai, Asp, ou Ser;

Xaa na posição 56 é qualquer aminoácido, desde que se Xaa na posição 57 não é Asp nem Pro e Xaa na posição 58 é Ser ou Thr, então Xaa na posição 56 não é Asn;

Xaa na posição 57 é qualquer aminoácido, desde que se Xaa na posição 56 é Asn e Xaa na posição 58 é Ser ou Thr, então Xaa na posição 57 é Asp u Pro; e

Xaa na posição 58 é qualquer aminoácido, desde que se Xaa na posição 56 é Asn e Xaa na posição 57 não é Asp nem Pro, então Xaa na posição 58 não é Ser nem Thr Xaa na posição 63 é Thr ou Ser;

Xaa na posição 75 é Ala, Ser, Vai, ou Thr;

Xaa na posição 76 é Lys ou Arg;

Xaa na posição 89 é Glu ou Asp; e Xaa na posição 107 é Leu ou Thr. 23

Uma região variável da cadeia pesada particularmente preferida de um anticorpo humanizado deglicosilado tem a seguinte seguência de aminoácido, na gual a estrutura é originária da linha germinativa humana VH segmento DP53 e J segmento JH4 e em que o local de N-glicosilação na CDR2 da cadeia pesada é modificado de maneira a não poder ser N-glicosilado: 15 10 15

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 20 25 30

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 35 40 45

Arg Tyr Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pru Gly Lys Gly I.eu 50 55 60

Glu Leu Vai Ala Gin lie Asn Snr VoJ Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr 65 70 75

Pro Asp Thr vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala 80 85 90

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 95 10Q 105

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 110

Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser (SEQ ID NQ:15). em gue:

Xaa na posição 56 é qualquer aminoácido, desde que se Xaa na posição 57 não é Asp nem Pro e Xaa na posição 58 é Ser ou Thr, então Xaa na posição 56 não é Asn;

Xaa na posição 5 7 é qualquer aminoácido, desde que se Xaa na posição 56 é Asn e Xaa na posição 58 é Ser ou Thr, então Xaa na posição 57 é Asp ou Pro; e

Xaa na posição 58 é qualquer aminoácido, desde que se Xaa na posição 56 é Asn e Xaa na posição 57 não é Asp nem Pro, então Xaa na posição 58 não é Ser nem Thr.

Uma cadeia pesada preferida para um anticorpo 24 humanizado deglicosilado em que o local de N-glicosilação na CDR2 da cadeia pesada é modificado de maneira a não poder ser N-glicosilado, tem a sequência de aminoácido: 15 10 15

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 20 25 30

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cya Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 35 . 40 45

Arg Tyr Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Leu Vai Ala Gin lie Asn Ser Vai Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr 65 70 75

Pro Asp Thr Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 80 85 90

Lys Asn Thr Lou Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 95 100 105

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 110 115 120 •rhr Leu val The Vai Ser Ser Ala Sur Thr Lys Gly Pro Ser Vai 125 130 135 25

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 140 145 150

Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr 155 160 165

Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai Hia Thr Phe 170 175 180

Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai 185 190 195

Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys 200 205 210

Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai 215 220 225

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 230 235 240

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr 260 265 270

Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe 275 280 285

Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys 290 295 300

Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai 305 310 315

Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 320 325 330

Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 335 340 345

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr 350 355 360

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu 365 370 375

Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu 380 385 390

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 395 400 405

Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 410 415 420

Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys 26 425 430 4.15

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Tlu' Gin Lys Ser 440

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys (SEQ 10 NO:16) em que:

Xaa na posição 56 é qualquer aminoácido, desde que se Xaa na posição 57 não é Asp nem Pro e Xaa na posição 58 é Ser ou Thr, então Xaa na posição 56 não é Asn;

Xaa na posição 5 7 é qualquer aminoácido, desde que se Xaa na posição 56 é Asn e Xaa na posição 58 é Ser ou Thr, então Xaa na posição 57 é Asp ou Pro; e

Xaa na posição 58 é qualquer aminoácido, desde que se Xaa na posição 56 é Asn e Xaa na posição 57 não é Asp nem Pro, então Xaa na posição 58 não é Ser nem Thr.

Anticorpos 266 deqlicosilados preferidos tendo a região variável pesada de acordo com a SEQ. ID N.° 14, SEQ. ID N.° 15, e SEQ. ID N.° 16 são aqueles em que:

Xaa na posição 56 é selecionado a partir do grupo que consiste em Ala, Gly, His, Asn, Gin r Ser, e Thr, desde que se Xaa na posição 58 é Ser ou Thr, então Xaa na posição 56 não é Asn; Xaa na posição 57 é selecionado a partir do grupo que consiste em Ala, Gly, His, Asn, Gin, Ser, e Thr; e Xaa na posição 58 é selecionado a partir do grupo que consiste em Ala, Gly, His, Asn, Gin r Ser, e Thr, desde que se Xaa na posição 56 é Asn, então Xaa na posição 58 não é Ser nem Thr.

Sequências preferidas para CDR2 (posições 56, 57, e 58) da cadeia pesada de SEQ. ID N.° 14, SEQ. ID N.° 15, e SEQ. ID N.° 16 incluem aquelas nas quais apenas um único aminoácido é alterado, aquelas nas quais apenas dois aminoácidos são alterados, ou os três são alterados. É preferido substituir Asn na posição 56. É preferido substituir Thr na posição 58 com outro aminoácido que não Ser. É preferido não destruir o local de N-glicosilação na 27 CDR2 da cadeia pesada do 266 substituindo Ser na posição 57 com Pro ou Asp. Substituições conservadoras em uma, duas, ou nas três posições são preferidas. As espécies mais preferidas são aquelas nas quais Asn na posição 56 é substituído com Ser ou Thr. Anticorpos particularmente preferidos são aqueles nos quais Ser ou Thr está na posição 56, Ser está na posição 57, e Thr está na posição 58 da SEQ. ID N.° 14, SEQ. ID N.° 15, OU SEQ. ID N.° 16.

Espécies deglicosiladas especialmente preferidas são anticorpos compreendendo a cadeia leve da SEQ. ID N.° 11 e a cadeia pesada da SEQ. ID N.° 16, em que na SEQ. ID N.° 16, Xaa na posição 56 é Ser, Xaa na posição 57 é Ser, e Xaa na posição 58 é Thr ("N56S"), ou em que na SEQ. ID N.° 16, Xaa na posição 56 é Thr, Xaa na posição 57 é Ser, e Xaa na posição 58 é Thr ("N56T"). A produção dos anticorpos úteis na invenção envolve tipicamente técnicas recombinantes, como é descrito no documento PCT/US01/06191 citado anteriormente e incorporado aqui por referência.

Os anticorpos (incluindo fragmentos imunologicamente reativos) são administrados a um sujeito a ser avaliado para condições patológicas associadas com depósitos de Αβ tais como doença de Alzheimer clínica ou pré-clínica, ou angiopatia amiloide clínica ou pré-clínica, utilizando técnicas de administração padrão, preferencialmente perifericamente (isto é, não por administração no sistema nervoso central) por administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual, ou supositório.

As composições para administração são designadas apropriadas para o modo de administração selecionado, e excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes dispersantes, tampões, tensoativos, conservantes, agentes solubilizadores, agentes de isotonicidade, agentes 28 estabilizadores e afins são utilizados como apropriado. Pharmaceutical Sciences da Remington, Mack Publishing Co., Easton PA, última edição, providencia um compêndio de técnicas de formulação como são geralmente conhecidas pelos profissionais. Pode ser particularmente útil alterar as caracteristicas de solubilidade dos anticorpos, tornando-os mais lipofílicos, por exemplo, encapsulando-os em lipossomas ou bloqueando grupos polares. A entrega sistémica periférica por injeção intravenosa ou intraperitoneal ou subcutânea é preferida. Veículos adequados para tais injeções são diretos. Além disso, contudo, a administração também pode ser efetuada através de membranas mucosas por meios de aerossóis nasais ou supositórios. Formulações adequadas para tais modos de administração são bem conhecidos e tipicamente incluem tensoativos que facilitam a transferência através da membrana. Tais tensoativos são frequentemente derivados de esteroides ou são lípidos catiónicos, tais como cloreto N-[1-(2,3-dioleoil)propil]-N,N,N-trimetilamónio (DOT-MA) ou vários compostos tais como hemisuccinato de colesterol, fosfatidil glicerois e afins. A concentração do anticorpo humanizado nas formulações tão baixa quanto cerca de 0,1% a tanto quanto 15 ou 20% por peso e será selecionada primariamente com base nos volumes, viscosidades, e por aí em diante, do fluído de acordo com o modo de administração particular selecionado. Assim, uma composição típica para injeção poderia ser preparada para conter 1 mL de água estéril tamponada de solução salina tamponada com fosfato e 1-1000 mg, preferencialmente 10-100 mg, do anticorpo humanizado. A formulação poderia ser filtrada estéril após a preparação da formulação, ou de outra forma preparada microbiologicamente aceitável. Uma composição típica para infusão intravenosa poderia ter volumes entre 1-250 mL de fluído, tais como solução estéril de Ringere, e 1-100 mg por mL, ou mais na concentração do 29 anticorpo. Agentes terapêuticos podem ser congelados ou liofilizados para armazenamento e reconstituídos num veículo estéril adequado antes da utilização. A liofilização e reconstituição pode conduzir a graus variáveis de perda de atividade do anticorpo (por exemplo com imunoglobulinas convencionais, os anticorpos IgM tendem a ter maior perda de atividade do que os anticorpos IgG) . As dosagens podem ter de ser ajustadas para compensar. 0 pH da formulação será selecionado para equilibrar a estabilidade do anticorpo (química e física) e confortar o paciente quando administrado. Geralmente é tolerado pH entre 4 e 8.

Apesar dos métodos precedentes parecerem ser os mais convenientes e mais apropriados para administração de proteínas tais como os anticorpos humanizados, por adaptação adequada, outras técnicas para administração, tais como administração transdérmica e administração oral podem ser empregues desde que uma formulação adequada seja desenhada.

Além disso, pode ser desejável empregar formulações de libertação controlada utilizando filmes e matrizes biodegradáveis, ou mini-bombas osmóticas, ou sistemas de entrega baseados em contas de dextrano, alginato, ou colagénio.

Resumindo, estão disponíveis formulações para administrar os anticorpos e são bem conhecidas na arte e podem ser escolhidas a partir de uma variedade de opções.

Os níveis típicos de dosagem podem ser otimizados utilizando técnicas clínicas padrão e serão dependentes do modo de administração.

Após administração do anticorpo ao sujeito, amostras de sangue são colhidas em intervalos periódicos ao longo dos minutos, horas, ou dias seguintes. Períodos de tempo adequados podem ser tão curtos como poucos minutos, 10 minutos, 30 minutos, ou 1 hora, várias horas, ou dias podem 30 ser permitidos passar antes da colheita da amostra de sangue. A medição após menos de 3 horas é preferida. Se desejado, pode ser obtida uma fração do plasma para facilidade da análise. São utilizadas técnicas analíticas padrão para análise do Αβ40, Αβ42 e da razão deles. Estas técnicas estão descritas, por exemplo, na patente U.S. 5 766 846. Contudo, qualquer técnica adequada para análise pode ser empregue, tal como separação cromatográfica, técnica de Western blotting, ensaios ELISA, ensaios homogéneos e afins. A concentração do Αβ4ο, AP42, ou da sua razão é depois comparada com estes valores num controlo. Controlos típicos incluem indivíduos que se sabe estarem livres de condições patológicas asssociadas com as placas amiloides, tais como adolescentes ou adultos muito jovens e além disso, controlos normais cognitivamente emparelhados por idade são obtidos fazendo a média dos valores da população geral. Enquanto controlos normais cognitivamente emparelhados por idade idosos têm doença de Alzheimer pré-clínica, a maioria não tem. Por isso, os valores médios de tal população serão úteis e críticos de obter. O desenho de controlos padrão é um processo que é bem conhecido pelo profissional comum. Indivíduos que têm níveis aumentados dos péptidos mencionados ou da razão de Αβ40 para Αβ42 como comparados com os valores controlo são depois identificados como tendo uma alta probabilidade de condições patológicas clínicas ou pré-clínicas associadas com a formação de placas amiloides.

Pode ser desejável empacotar os componentes para realizar o teste da invenção em kits convenientes. Tais kits incluirão recipientes tais como garrafas ou frascos que contêm amostras do anticorpo a ser administrado bem como os reagentes apropriados para realizar o teste na amostra de sangue colhida. O kit também pode conter instruções para conduzir o teste e, opcionalmente, gráficos com valores controlo. Contudo, tais kits não formam parte 31 da invenção reivindicada.

Pretende-se que os seguintes exemplos ilustrem mas não limitem a invenção.

Os exemplos daqui em diante empregam, entre outros, um anticorpo monoclonal murino designado "266" que foi originalmente preparado por imunização com um péptido compreendido de resíduos 13-28 do péptido Αβ humano. 0 anticorpo foi confirmado imunorreagir com este péptido, mas tinha sido reportado previamente não reagir com o péptido contendo apenas resíduos 17-28 do péptido Αβ humano, ou em quaisquer outros epítopos dentro do péptido Αβ. A preparação deste anticorpo está descrita na patente U.S. 5 766 846. Como os exemplos aqui descrevem experiências conduzidas em sistemas murinos, a utilização de anticorpos monoclonais murinos é satisfatória. Porém, formas humanizadas dos anticorpos com a imunoespecificidade correspondente àquela do anticorpo 266 são preferidas. Exemplo 1

Correlação de níveis de péptido circulante com placas

Um modelo murino para a doença de Alzheimer, ratinhos transgénicos APP V717F, foi utilizado neste teste. Estes ratinhos são descritos por Games, D., et al., Nature (1995) 373:523-527; Bales, K.R., et al., Nature Genet. (1997) 17:263-264; e por Holtzman, D.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (2000) 97:2892-2897. Neste modelo, uma forma mutante do gene APP humano é expressa e resulta numa forma de início precoce da doença de Alzheimer familiar. Apesar dos cérebros destes ratinhos parecerem normais inicialmente, a deposição de Αβ na forma de placas difusas e neuríticas ocorre aos 6-15 meses, apesar dos ratinhos homozigóticos para o transgene mostrarem variabilidade nisso aos 9-14 meses de idade, alguns ratinhos desenvolvem depósitos de Αβ enquanto outros não.

Foram utilizados 53 ratinhos homozigóticos aos 12 meses neste estudo. 32

Os níveis de Αβ40, Αβ42, e razões Αβ40/Αβ42 no plasma foram medidos por ELISA no plasma destes ratinhos antes da administração de 500 pg de m266 e a vários intervalos de tempo até 24 horas após administrar este anticorpo. Após 24 horas, os ratinhos foram sacrificados, e a quantidade de deposição de Αβ no cérebro foi avaliada no hipocampo e córtex como descrito por DeMattos, et al. Proc. Nat'1. Acad. Sei USA (2001) 98:8850-8855, e avaliado como a percentagem de cérebro coberto por depósitos de Αβ.

Como representado nas Figuras IA, B e C, se a percentagem de cobertura por Αβ devido à deposição no hipocampo for representada num gráfico no eixo dos x contra os níveis dos péptidos e a sua razão no plasma no eixo dos y antes da administração do anticorpo, não se encontraria correlação. Independentemente de se a deposição de Αβ percentual foi essencialmente zero (0) ou mais de 75%, o nível médio de Αβ40 foi aproximadamente 250 (pg/ml) e do Αβ42 aproximadamente 400 (pg/ml) . A razão de Αβ40 para Αβ42 foi, assim, aproximadamente 0,5-0,6.

Como representado nas Figuras 2A e B, contudo, o nível no plasma de Αβ40 correlacionou-se fortemente com a percentagem de deposição de Αβ no hipocampo uma hora após a injeção de m266, tal como a razão de Αβ40 para Αβ42.

As Figuras 3A, B e C mostram resultados semelhantes obtidos 24 horas após a injeção. Os níveis obtidos de Αβ40 e a razão Αβ40/Αβ42 correlacionaram-se fortemente com a % de deposição de Αβ no hipocampo. Os níveis de Αβ42 também se correlacionaram com a % de deposição de Αβ mas não tão bem quanto os níveis de Αβ4ο·

As Figuras 4A, B e C mostram resultados análogos com respeito à taxa de entrada dos dois péptidos Αβ no plasma e os valores calculados para a taxa de entrada como uma função da razão destes péptidos. As melhores correlações com a deposição de Αβ foram a taxa de entrada de Αβ40 e a razão de Αβ40/Αβ42. 33

As Figuras 5A e B mostram uma apresentação alternativa dos dados para os niveis no plasma de Αβ40 24 horas e 1 hora após a injeção de m266. Quando os ratinhos são agrupados de acordo com cobertura por Αβ no hipocampo baixa, média, ou alta, os animais com baixa deposição de Αβ poderiam ser completamente distinguidos daqueles com alta deposição como uma função do nível de Αβ40 no plasma.

Exemplo 2

Num estudo semelhante ao apresentado no Exemplo 1, foi utilizada uma cohorte de 49 ratinhos APP V717F homozigótico. Antes e depois da injeção de 500 pg IV de m266, foram obtidas amostras de plasma aos 5 minutos, 1 hora, 3 horas, 6 horas e 24 horas e os níveis de Αβ40 e Αβ42 foram avaliados como descrito no Exemplo 1. Os ratinhos foram sacrificados após 24 horas e foi avaliado 1 hemisfério para a percentagem da área do hipocampo ou córtex cingulado ocupado pelo péptido Αβ (utilizando coloração imunofluorescente de Αβ quantitativa) e a área ocupada por amiloide (por coloração com tioflavina-S (amiloide)). As regiões do outro hemisfério foram avaliadas para o péptido Αβ por ELISA. O coeficiente de correlação de Pearson (r de Pearson) e de significância (valor P) foram determinados entre os valores de Αβ no plasma (pré e pós injeção de m266) e ο Αβ no hipocampo ou carga amiloide utilizando o software GraphPad Prism (versão 3.00 para Windows, San Diego, USA). A carga de Αβ é definida como a área percentual do hipocampo coberta por depósitos imunorreativos de Αβ. A carga amiloide é definida como a área percentual do hipocampo coberta por depósitos positivos à tioflavina-S. As correlações também foram determinadas entre a acumulação de Αβ no plasma ao longo de 24 horas (área sob a curva, AUC) e carga de Αβ no hipocampo ou carga amiloide. A Figura 6 mostra os resultados obtidos.

Resumidamente, verificou-se que os níveis de linha base 34 (antes da injeção) de Αβ40, Αβ42 e a razão Αβ40/Αβ42 calculada antes da injeção com m266 não estavam correlacionados com a percentagem de Αβ ou deposição amiloide. Contudo, após a administração do m266, houve correlações significativas etre Αβ40, Αβ42, e razão Αβ40/Αβ42 no plasma com ambas Αβ e carga amiloide no hipocampo e córtex cingulado. A análise estatística dos resultados permite a previsão rigorosa da carga de Αβ no hipocampo nestes ratinhos com base nos níveis de Αβ40 no plasma 24 horas após a injeção do m266. 35

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> ELI LILLY AND COMPANY e UNIVERSIDADE DE WASHINGTON

<120> MÉTODO TESTE PARA DOENÇA DE ALZHEIMER <130> 8792/292 <150> 60/334 987 <151> 2001-10-23 <150> 60/313 221 <151> 2001-08-17 <150> 60/313 224 <151> 2001-08-17 <160> 16 <170> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(16)

<223> CDR1 DA CADEIA LEVE <400> 1

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His 15 10 15 <210> 2 <211> 7 36 <212> PRT <213> Mus sp. <220>

<221> MISC_FEATURE <223> CDR2 DA CADEIA LEVE <400> 2

Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9)

<223> CDR3 DA CADEIA LEVE <400> 3

Ser Gin Ser Thr His Vai Pro Trp Thr 1 5 37 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <221> ΜΙSC_FEATURE <222> (1) .. (5)

<223> CDR1 DA CADEIA PESADA <400> 4

Arg Tyr Ser Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp. <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17)

<223> CDR2 DA CADEIA PESADA <400> 5

Gin Ile Asn Ser Vai Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Vai Lys 1 5 10 15

Gly <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <221> MI SC _FEATURE <222> (D . . (3) 38

<223> CDR3 DA CADEIA PESADA <400> 6 Gly Asp Tyr 1 <210> 7 <211> 113 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Anticorpo Humanizado <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (D .· (113) <223> REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA LEVE DO ANTICORPO HUMANIZADO <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(88) <223> Xaa na posição 88 é Vai ou Leu <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (105) .. (105) <223> Xaa na posição 105 é Gin ou Gly <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (108)..(108) <223> Xaa na posição 108 é Lys ou Arg 39 <220> <221> ΜΙSC_FEATURE <222> (109) .. (109) <223> Xaa na posição 109 é Vai ou Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) .. (14) <223> Xaa na posição 14 é Thr ou Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa na posição 15 é Leu ou Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30).. (30) <223> Xaa na posição 30 é lie ou Vai <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50).. (50) <223> Xaa na posição 50 é Arg, Gin, ou Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7).. (7) <223> Xaa na posição 7 é Ser ou Thr <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa na posição 2 é Vai ou lie 40 <400> 7 40 Asp Xaa Vai Met Thr Gin Xaa Pro 1 5

Leu Ser Leu Pro Vai Xaa Xaa Gly 10 15

Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg 20

Ser Ser Gin Ser Leu Xaa Tyr Ser 25 30

Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp 35 40

Phe Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 45

Pro Xaa Leu Leu Ile Tyr Lys Vai 50 55

Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 65 70

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 75 80

Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Xaa 85

Gly Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser 90 95

Xaa Gly Thr Xaa Xaa Glu lie Lys 105 110

CADEIA PESADA DO ANTICORPO

Thr His Vai Pro Trp Thr Phe Gly 100

<210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (112) <223> REGIÃO VARIÁVEL DA HUMANIZADO <220>

<221> MISC_FEATURE 41 <222> (76).. (76) <223> Xaa na posição 76 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89) .. (89) <223> Xaa na posição 89 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (107)..(107) <223> Xaa na posição 107 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (1) <223> Xaa na posição 1 é <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa na posição 7 é <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> Xaa na posição 46 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (63) .. (63) <223> Xaa na posição 63 e Lys ou Arg é Glu ou Asp é Leu ou Thr

Glu ou Gin

Ser ou Leu é Glu, Vai, Asp, ou Ser é Thr ou Ser

<220> <221> MISC_FEATURE 42 <222> (75) .. (75) <223> Xaa na posição 75 é Ala, Ser, Vai, ou Thr <400> 8

Xaa Vai Gin Leu Vai Glu Xaa Gly 1 5

Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 25 30

Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala 35 40

Pro Gly Lys Gly Leu Xaa Leu Vai 45

Ala Gin Ile Asn Ser Vai Gly Asn 50 55

Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Xaa Vai 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70

Asp Asn Xaa Xaa Asn Thr Leu Tyr 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 85

Xaa Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95

Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin 100

Gly Thr Xaa Vai Thr Vai Ser Ser 105 110

<210> 9 <211> 113 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <220> <221> MISC_FEATURE <222> (D .· (113) <223> REGIÃO VARIÁVEL HUMANIZADO

CADEIA LEVE DO ANTICORPO

43 <400> 9 Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ile Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser 85 90 95 Thr His Vai Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <220> <221> ΜΙSC_FEATURE <222> (1)..(112) <223> REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA PESADA DO ANTICORPO HUMANIZADO <400> 10 44

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30

Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Vai 35 40 45

Ala Gin Ile Asn Ser Vai Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 10 15 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 100 105 110

<210> 11 <211> 219 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <220> <221> MISC_FEATURE <2 2 2> (1) . . (219) <223> CADEIA LEVE DO ANTICORPO HUMANIZADO <400> 11 45

Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ile Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser 85 90 95 Thr His Vai Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 46

<210> 12 <211> 442 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <220> <221> ΜΙSC_FEATURE <222> (1)..(442) <223> CADEIA PESADA DO ANTICORPO HUMANIZADO <400> 12

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30

Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Vai 35 40 45

Ala Gin Ile Asn Ser Vai Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 47 100 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 130 135 140 Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 155 160 Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 180 185 190 Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 195 200 205 Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys 245 250 255 Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu 48 290 295 300 HÍS Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn 305 310 315 320 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 340 345 350 Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 405 410 415 Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440

<210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Variante de ratinho <220> <221> ΜΙSC_FEATURE <222> (1)..(17)

<223> CDR2 DA CADEIA PESADA <220> 49 <221> ΜΙSC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa na posição 7 é qualquer aminoácido, desde que Xaa na posição 8 não seja Asp nem Pro e Xaa na posição 9 é Ser ou Thr, então Xaa na posição 7 não é Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) .. (8) <223> Xaa na posição 8 é qualquer aminoácido, desde que Xaa na posição 7 seja Asn e Xaa na posição 9 é Ser ou Thr, então Xaa na posição 8 é Asp ou Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa na posição 9 é qualquer aminoácido, desde que Xaa na posição 7 seja Asn e Xaa na posição 8 não é Asp nem Pro, então Xaa na posição 9 não é Ser nem Thr <400> 13

Gin Ile Asn Ser Vai Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Pro Asp Thr Vai Lys 15 10 15

Gly <210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <220> <221> MI SC FEATURE 50 <222> (1) .. (112) <223> REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA PESADA DO ANTICORPO HUMANIZADO Deglicosilado <220> <221> MISC_FEATURE. <222> (63) .. (63) <223> Xaa na posição 63 é Thr ou Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (1) <223> Xaa na posição 1 é Glu ou Gin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) .. (7) <223> Xaa na posição 7 é Ser ou Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46) .. (46) <223> Xaa na posição 46 é Glu, Vai, Asp, ou Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56) .. (56) <223> Xaa na posição 56 é qualquer aminoácido, desde que se Xaa na posição 57 não é Asp nem Pro e Xaa na posição 59 é Ser ou Thr, então Xaa na posição 56 não é Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57) .. (57) <223> Xaa na posição 57 é qualquer aminoácido, desde que se 51

Xaa na posição 56 é Asn e Xaa na posição 58 é Ser ou Thr, então Xaa na posição 57 é Asp ou Pro <220> <221> MISC FEATURE <222> (58) .. (58) <223> Xaa na posição 58 é qualquer aminoácido, desde que se Xaa na posição 56 é Asn e Xaa na posição 57 não é Asp nem Pro, então Xaa na posição 58 não é Ser nem Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75) .. (75) <223> Xaa na posição 75 é Ala, Ser, Vai, ou Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76) .. (76) <223> Xaa na posição 76 é Lys ou Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89) .. (89) <223> Xaa na posição 89 é Glu ou Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (107)..(107) <223> Xaa na posição 107 é Leu ou Thr <400> 14 52

Xaa Vai Gin Leu Vai Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30

Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Xaa Leu Vai 35 ' 40 45

Ala Gin Ile Asn Ser Vai Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Pro Asp Xaa Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Xaa Xaa Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 50 95

Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Xaa Vai Thr Vai Ser Ser 100 105 110

<210> 15 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (112) <223> REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA PESADA DO ANTICORPO HUMANIZADO Deglicosilado <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56) .. (56) <223> Xaa na posição 56 é qualquer aminoácido, desde que se Xaa na posição 57 não é Asp nem Pro e Xaa na posição 59 é 53

Ser ou Thr, então Xaa na posição 56 nao é Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57) .. (57) <223> Xaa na posição 57 é qualquer aminoácido, desde que se Xaa na posição 56 é Asn e Xaa na posição 58 é Ser ou Thr, então Xaa na posição 57 é Asp ou Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58) .. (58) <223> Xaa na posição 58 é qualquer aminoácido, desde que se Xaa na posição 56 é Asn e Xaa na posição 57 não é Asp nem Pro, então Xaa na posição 58 não é Ser nem Thr <400> 15

Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Vai 35 40 45

Ala Gin Ile Asn Ser Vai Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Pro Asp Thr Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 100 105 110

<210> 16 <211> 442 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado 54 <220> <221> ΜΙSC_FEATURE <222> (1) .. (442) <223> CADEIA PESADA DO ANTICORPO HUMANIZADO <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56) .. (56) <223> Xaa na posição 56 é qualquer aminoácido, desde que

Xaa na posição 57 não seja Asp nem Pro e Xaa na posição 59 é Ser ou Thr , então Xaa na posição 56 não é Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57) .. (57) <223> Xaa na posição 57 é qualquer aminoácido, desde que

Xaa na posição 56 seja Asn e Xaa na posição 58 é Ser ou Thr, então Xaa na posição 57 é Asp ou Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58) .. (58) <223> Xaa na posição 58 é qualquer aminoácido, desde que

Xaa na posição 56 seja Asn e Xaa na posição 57 não é Asp nem Pro, então Xaa na posição 58 não é Ser nem Thr <400> 16 55

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly 1 5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20 Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala 35 40 Ala Gin Ile Asn Ser Vai Gly Xaa 50 55 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 85 Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin 100 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai 115 120

Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 10 15 Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Vai 45 Xaa Xaa Tyr Tyr Pro Asp Thr Vai 60 Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 75 80 Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95 Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 105 110 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 125 56

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly cys Leu Vai Lys Asp Tyr 130 135 140 Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 155 160 Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 180 185 190 Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 195 200 205 Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys 245 250 255 Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu 290 295 300 His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn 305 310 315 320 57

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 340 345 350 Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 405 410 415 Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 58

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • us 0035681 W [0004] • us 09153130 B [0004] • us 0106191 W [0005] [0041] • wo 9927944 A [0006] • wo 9960024 A [0006] • wo 0072880 A [0006] • wo 0072876 A [0006] • wo 0077178 A [0006] • us 5766846 A [0008] [0013] [0050] [0054] • us 5837672 A [0008] [0013] • us 5593846 A [0008] [0013] • us 60334987 B [0067] • us 60313221 B [0067] • us 60313224 B [0067] Literatura não relacionada com patentes descrição • GHERSI-EGEA, J -F. et al. J. Neurochem., 880- -883 [0003] [0007] • ZLOKOVIC, B .V et al. Biochem. Biophys 1993, vol. 67, 1034-1040 [0003] [0007] SHIBATA, M. et al. J. Clin. Invest., 2000, vol. 106, 1489-1499 [0003] KAWARABAYASHI, T. et al. J. Neurosci., 2001, vol. 21, 372-381 [0003] DEMATTOS et al. Proc. Nat'l.Acad. Sei USA, 2001, vol. 59 98, 8850-8855 [0003] • NITSCH, RM. et al. Ann. Neurol., 1995, vol. 37, 512-518 [0004] • GOLDE, T.E. et al. Biochem. Biophys. Acta, 2000, vol. 1502, 172-187 [0004] • ZLOKOVIC, B.V. et al. Proc. Natl. Acad Sei (USA), 1996, vol. 93, 4229-4234 [0007] • BARD, F. et al. Nature Med, 2000, vol. 6, 916-919 [0007] • KABAT. Sequences of Proteins of Immunological Interest. National Institutes of Health, 1987 [0018] • CHOTHIA et al. J. Mol. Bio., 1987, vol. 196, 901-917 [0018] • CHOTHIA et al. Nature, 1989, vol. 342, 878-883 [0018] • CO et al. Proc. Natl. Acad Sei. USA, 1991, vol. 88, 2869 [0023] • GAMES, D. et al. Nature, 1995, vol. 373, 523-527 [0055] • BALES, K.R. et al. Nature Genet., 1997, vol. 17, 263- 264 [0055] • HOLTZMAN, D.M. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 2000, vol. 97, 2892-2897 [0055] • DEMATTOS et al. Proc. Nat'l. Acad. Sei USA, 2001, vol. 98, 8850-8855 [0057]

Claims (11)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para diagnosticar a doença de Alzheimer pré-clínica ou clínica compreendendo: (a) medir o nível de Αβ42 numa amostra de sangue de um sujeito obtida num intervalo de tempo após administrar ao dito sujeito uma quantidade de um anticorpo que se liga especificamente a um epítopo contido nas posições 13-28 de Αβ ou um anticorpo que sequestra o péptido Αβ da sua forma circulante ligada no sangue e altera a depuração das formas solúveis e ligadas de Αβ no sistema nervoso central no plasma, em que a dita quantidade é eficaz para alterar os níveis de péptidos circulantes de Αβ no sangue do dito sujeito quando o dito sujeito está numa fase pré-clínica ou clínica da doença de Alzheimer; e (b) comparar o nível de Αβ42 no dito sujeito com um valor controlo dos ditos níveis, em que os níveis aumentados de Αβ42 no dito sujeito em comparação com níveis controlo identificam o dito sujeito como estando numa fase pré-clínica ou clínica da doença de Alzheimer; em que o dito anticorpo é um anticorpo monoclonal humanizado compreendendo; (i) uma cadeia leve compreendendo as regiões determinantes de complementaridade (CDR) seguintes: CDR1 da cadeia leve com uma sequência de aminoácidos SEQ. ID N.° 1; CDR2 da cadeia leve com sequência de aminoácidos SEQ. ID N.° 2; e CDR3 da cadeia leve com sequência de aminoácidos SEQ. ID N.° 3; e (ii) uma cadeia pesada compreendendo as seguintes CDR: CDR1 da cadeia pesada com sequência de aminoácidos SEQ. ID N.° 4; CDR2 da cadeia pesada com sequência de aminoácidos SEQ. ID N.° 5; e CDR3 da cadeia pesada com sequência de aminoácidos SEQ. ID N.° 6.

2. 0 método da reivindicação 1, em que o dito intervalo de 2 tempo é inferior a 1 semana.

3. 0 método da reivindicação 1, em que o dito intervalo de tempo é inferior ou igual a 24 horas.

4. 0 método da reivindicação 3, em que o intervalo de tempo é inferior ou igual a 3 horas.

5. 0 método da reivindicação 1, em que a dita administração foi por injeção dos ditos anticorpos.

6. 0 método da reivindicação 1, em que o sujeito é humano e o anticorpo é um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo.

7. 0 método da reivindicação 6, em que o anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo compreende uma cadeia leve da SEQ. ID N.° 11 e uma cadeia pesada da SEQ. ID N.° 12.

8. 0 método da reivindicação 6, em que o anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo compreende uma cadeia leve da SEQ. ID N.° 11 e uma cadeia pesada da SEQ. ID N.° 16.

9. 0 método da reivindicação 6, em que o anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo compreende uma cadeia leve compreendendo uma região variável da SEQ. ID N.° 7 e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da SEQ. ID N.° 14.

10. O método da reivindicação 1, em que o dito anticorpo é um fragmento.

11. O método da reivindicação 1, em que o anticorpo é um anticorpo de cadeia simples.