KR102502356B1 - 타우 (tau) 활동 계측 - Google Patents

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치히로 사토
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워싱턴 유니버시티
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Abstract

본 발명은 개체에서 타우 (tau)의 생체내 물질대사를 계측하기 위한 시험관내 방법에 관계한다.

Description

타우 (TAU) 활동 계측{TAU KINETIC MEASUREMENTS}
정부 권리
본 발명은 국립보건원에 의해 수여된 R-01-NS065667 하에 정부 지원을 받아 만들어졌다. 정부는 본 발명에서 일정한 권리를 갖는다.
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2014년 9월 30자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/057,853에 우선권을 주장하고, 이것은 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 개체에서 타우 (tau)의 생체내 물질대사를 계측하기 위한 시험관내 방법에 관계한다.
서열 목록에 대한 언급
서열 목록의 종이 사본 및 동일한 서열 목록의 컴퓨터 판독가능한 형태가 아래에 첨부되고 본원에서 참조로서 편입된다. 컴퓨터 판독가능한 형태에서 기록된 정보는 37 C.F.R. 1,821(f)에 따라, 기재된 서열 목록과 동일하다.
발명의 배경
알츠하이머병 및 다른 타우병증에서 신경원섬유 매듭 (NFTs)은 불용성 과인산화된 타우 단백질로 구성되지만, 고도로 가용성 타우의 불용성 NFTs로의 전환의 근원적인 기전은 여전히 규정하기 어렵다. 이런 이유로, CNS에서 타우의 생체내 물질대사를 계측하기 위한 민감하고, 정확하고, 그리고 재현가능한 방법이 요구된다.
발명의 요약
본 발명의 한 가지 양상은 표지화된 모이어티를 제공받은 개체로부터 획득된 하나 또는 그 이상의 생물학적 표본에서 표지화된 타우 및 표지화되지 않은 타우의 양을 검출하고, 그리고 생물학적 표본에서 표지화된 타우 대 표지화되지 않은 타우의 비율을 결정함으로써, 타우의 생체내 물질대사를 계측하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 하루 이상의 일차에 최소한 하나의 표지화된 아미노산을 개체에 투여하고; (b) 약 1 일차 및 약 20 일차, 약 20 일차 및 약 40 일차, 약 40 일차 및 약 100 일차, 또는 이들의 조합 사이에 개체로부터 최소한 하나의 생물학적 표본을 수집하고; (c) 각 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양 및/또는 표지화되지 않은 타우의 양을 검출하고 계측하고; 그리고 (d) 단계 (c)로부터 치수를 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영한다.
본 발명의 다른 양상은 개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 하루 이상의 일차에 최소한 하나의 표지화된 아미노산을 개체에 투여하고; (b) 약 2 일차 및 약 20 일차, 약 20 일차 및 약 40 일차, 약 40 일차 및 약 100 일차, 또는 이들의 조합 사이에 개체로부터 최소한 하나의 생물학적 표본을 수집하고; (c) 각 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양 및/또는 표지화되지 않은 타우의 양을 검출하고 계측하고; 그리고 (d) 단계 (c)로부터 치수를 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영한다.
본 발명의 다른 양상은 개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 2개 또는 그 이상의 일에 최소한 하나의 표지화된 아미노산을 개체에 투여하고; (b) 약 1 일차 및 약 20 일차, 약 20 일차 및 약 40 일차, 약 40 일차 및 약 100 일차, 또는 이들의 조합 사이에 개체로부터 최소한 하나의 생물학적 표본을 수집하고; (c) 각 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양 및/또는 표지화되지 않은 타우의 양을 검출하고 계측하고; 그리고 (d) 단계 (c)로부터 치수를 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영한다.
본 발명의 다른 양상은 개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 2개 또는 그 이상의 일에 최소한 하나의 표지화된 아미노산을 개체에 투여하고; (b) 약 2 일차 및 약 20 일차, 약 20 일차 및 약 40 일차, 약 40 일차 및 약 100 일차, 또는 이들의 조합 사이에 개체로부터 최소한 하나의 생물학적 표본을 수집하고; (c) 각 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양 및/또는 표지화되지 않은 타우의 양을 검출하고 계측하고; 그리고 (d) 단계 (c)로부터 치수를 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영한다.
본 발명의 다른 양상은 개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 시험관내 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 개체로부터 획득된 각 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양 및/또는 표지화되지 않은 타우의 양을 검출하고 계측하고; 그리고 (b) 단계 (a)에서 결정된 표지화된 및/또는 표지화되지 않은 타우의 양을 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영하고; 그리고 여기서 (i) 상기 표지는 하루 이상의 일차에 개체에 투여되었고, 그리고 (ii) 각 생물학적 표본은 1 일차 및 20 일차, 20 일차 및 40 일차, 40 일차 및 100 일차, 또는 이들의 조합 사이에 상기 개체로부터 수집되었다.
본 발명의 다른 양상은 개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 시험관내 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 개체로부터 획득된 각 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양 및/또는 표지화되지 않은 타우의 양을 검출하고 계측하고; 그리고 (b) 단계 (a)에서 결정된 표지화된 및/또는 표지화되지 않은 타우의 양을 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영하고; 그리고 여기서 (i) 상기 표지는 하루 이상의 일차에 개체에 투여되었고, 그리고 (ii) 각 생물학적 표본은 2 일차 및 20 일차, 20 일차 및 40 일차, 40 일차 및 100 일차, 또는 이들의 조합 사이에 상기 개체로부터 수집되었다.
본 발명의 다른 양상은 개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 시험관내 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 개체로부터 획득된 각 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양 및/또는 표지화되지 않은 타우의 양을 검출하고 계측하고; 그리고 (b) 단계 (a)에서 결정된 표지화된 및/또는 표지화되지 않은 타우의 양을 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영하고; 그리고 여기서 (i) 상기 표지는 2개 또는 그 이상의 일에 개체에 투여되었고, 그리고 (ii) 각 생물학적 표본은 1 일차 및 20 일차, 20 일차 및 40 일차, 40 일차 및 100 일차, 또는 이들의 조합 사이에 상기 개체로부터 수집되었다.
본 발명의 다른 양상은 개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 시험관내 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 개체로부터 획득된 각 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양 및/또는 표지화되지 않은 타우의 양을 검출하고 계측하고; 그리고 (b) 단계 (a)에서 결정된 표지화된 및/또는 표지화되지 않은 타우의 양을 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영하고; 그리고 여기서 (i) 상기 표지는 2개 또는 그 이상의 일에 개체에 투여되었고, 그리고 (ii) 각 생물학적 표본은 1 일차 및 20 일차, 20 일차 및 40 일차, 40 일차 및 100 일차, 또는 이들의 조합 사이에 상기 개체로부터 수집되었다.
본 발명의 추가 양상은 개체에서 신경 유래된 단백질의 생체내 물질대사를 계측하기 위한 키트를 포괄하고, 여기서 상기 단백질의 물질대사는 신경학적 또는 신경변성 질환의 예측자, 상기 질환의 진행의 모니터, 또는 상기 질환에 대한 치료의 유용성의 지표로서 이용될 수 있다.
도면의 간단한 설명
출원 파일은 칼라로 실행된 최소한 하나의 사진을 내포한다. 칼라 사진을 포함하는 본 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 요금의 납부 시에 사무국에 의해 제공될 것이다.
도면 1a-c는 프레세닐린 돌연변이 (PSmt))를 갖는 개체 및 대조로부터 획득된 유도된 다능성 세포 (iPSCs)로부터 유래된 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포 또는 뉴런의 성공적인 표지화를 보여주는 이미지 및 그래프를 묘사한다. (a) 시험관내 타우 SILK 실험의 작업 흐름을 도해하는 계통도. SH-SY5Y 세포 및 iPSC 뉴런 (왼쪽 끝: 각각, 현미경사진 및 도해)은 50% 13C6 류신 표지화된 배지로 6 일 동안 표지화된다 (중앙 패널, 위쪽). 배지 및 세포 용해물은 12 일 동안 매일 표본추출되었다 (중앙 패널, 아래쪽). 최종적으로, 표지화된 및 표지화되지 않은 타우는 타우 특이적 항체를 이용하여 각 표본으로부터 면역침전되고, 효소적으로 소화되고, 그리고 표지화된 및 표지화되지 않은 타우 단편의 양이 질량 분광분석법에 의해 검출되었다. (b) SH-SY5Y 세포 용해물 및 배지의 타우 표지화 활동 곡선. TTR = 추적자 대 흔적 비율. (c) iPSC 대조 (Ctrl) 및 프레세닐린 돌연변이 (PSmt) 세포의 타우 표지화 활동 곡선. TTR = 추적자 대 흔적 비율.
도면 2a-c는 트립신에 의한 타우 소화를 묘사한다. (a) 인간 전장 타우의 아미노산 서열 (2N4R; 서열 번호: 1). 류신은 적색에서 표지화된다. 밑줄 표시된 청색의 아미노산 서열은 트립신으로 효소적 개열에 의해 생산되는 타우의 류신-내포 단편을 확인한다. 정량에 이용된 트립신 펩티드 단편은 TPSLPTPPTR (서열 번호:2)이다. 이들 실험에서 이용된 항-타우 항체에 의해 인식된 에피토프는 RSGYS (서열 번호: 3)이다. (b) (a)에서 확인된 타우 트립신 펩티드의 크로마토그램. 이들 펩티드는 그들의 소수성에 따라 용리되었다. 위쪽에서 아래쪽으로: IGSTENLK (서열 번호: 4), TPSLPTPPTR (서열 번호: 2), (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK (서열 번호: 5), STPTAEDVTAPLVDEGAPGK (서열 번호: 6), 그리고 LQTAPVPMPDLK (서열 번호: 7). (c) TPSLPTPPTR (서열 번호: 2)의 표준 곡선.
도면 3a-d는 본 발명의 방법의 한 구체예의 개요를 제공하는 도해이다. (a) 개체는 안정성 동위원소 표지화된 아미노산 (13C6 류신)으로 경구 표지화된다. (b) 뇌척수액 (CSF) 및 혈액 표본은 표지화의 시작 후 수집된다. (c) 타우는 CSF 표본으로부터 면역침전되고 질량 분광분석법 분석을 위해 처리된다. 표본 내에 표지화되지 않은 및 표지화된 타우의 양은 질량 분광분석법에 의해 결정된다. (d) CNS에서 타우의 동위원소 농축의 계통도 (위쪽), 그리고 표지화 및 표본추출 시각표의 실례 (아래쪽). 생산 시기 동안 표지화된 타우의 증가 및 소실 시기 동안 표지화된 타우의 제거는 중추신경계 (CNS)에서 타우의 상대적 생산 및 소실을 각각 반영한다.
도면 4a-f는 생체내에서 타우의 성공적인 표지화 및 시험관내에서 표지화된 타우 동역학의 분석을 보여주는 그래프를 묘사한다. 5명의 어린, 정상적인 대조 (NC) 개체는 13C6 류신이 5 일 (NC01) 동안 또는 10 일 (NC02, NC03, NC05, NC06) 동안 경구 투여되었다. CSF 표본은 14 일차, 28 일차, 42 일차, 그리고 67-84 일차에 획득되었다. 각 CSF 표본 내에 % 유리 류신 및 전체 단백질은 GC-MS에 의해 계측되었다. 항-타우 항체로 면역침전 및 트립신 소화 이후에, 각 CSF 표본 내에 13C6 류신-표지화된 타우 및 표지화되지 않은 타우는 LC-MS를 이용하여 계측되었다. TPSLPTPPTR (서열 번호:2)이 표지화된 타우의 정량에 이용되었다. (a) NC01, (b) NC02, (c) NC03, (d) NC05, (e) NC06. 각 패널에서 % 유리 류신 (사각형), 전체 단백질 (다이아몬드) 및 타우 트립신 펩티드 TPSLPTPPTR (서열 번호: 2; 삼각형).
도면 5a-b는 6명 참가자 (즉, NC02, NC03, NC05, NC06, NC07, 그리고 NC08)에 대한 타우 SILK 분석을 보여주는 그래프를 묘사하는데, 이들 참가자는 13C6-류신으로 10 일 동안 경구 표지화되었고, 그리고 CSF 표본이 이들로부터 획득되었다. (a) 가스 크로마토그래피 (GC)-MS에 의해 계측된 혈장 내에 유리 류신, 그리고 (b) 액체 크로마토그래피 LC/MS를 이용하여 삼중으로 계측된 CSF 내에 13C6 류신 표지화된 타우.
도면 6a-d는 1명 개체에 대한 타우 SILK의 구획 모형의 한 구체예를 보여주는 도해 및 그래프를 묘사한다. (a) 혈장 류신, CSF 타우, CSF 전체 단백질, 그리고 혈장 전체 단백질 추적자 표지화 동역학을 설명하는 구획 모형을 도해하는 계통도. 표본 내에서 동역학이 계측된 다른 느린 전환 단백질, SOD1 역시 비교를 위해 상기 모형 내에 포함되었다. 상기 모형은 일차 속도 상수, k에 의해 연결된 일련의 구획을 포함하고, 이들은 하루에 구획 i에 수송된 구획 j의 분율을 반영한다. (b) 혈장 류신 추적자 표지화 동역학. 상기 모형은 10 일에 걸쳐 혈장 내로 경구 추적자의 3x/일 출현, 그리고 추적자 섭취 이후에 84 일까지 혈장 류신 시간 코스의 모양을 설명하는 전신 혈장 단백질 풀로 시작한다. 뇌 (CSF 포함) 및 혈장 단백질은 혈장으로부터 추적자 류신을 도출한다. 이런 이유로, 혈장 류신 시간 코스의 모양은 이들 단백질의 형성에 대한 추적자 이용가능성의 시간 코스를 규정한다. (c) CSF 타우 및 SOD1 추적자 표지화 동역학. 각 단백질에 대한 SILK 곡선의 모양은 이의 분할 교체율 (FTR)에 의해 독특하게 결정된다. 타우 및 SOD1에 대한 FTR은 각각, 0.049 및 0.039 풀/일이다. (d) CSF 전체 단백질 및 혈장 전체 단백질 추적자 표지화 동역학.
도면 7a-g는 타우의 13C6 경구 표지화의 구획 모형의 한 구체예를 보여주는 도해 및 그래프를 묘사한다. (a) 상기 모형은 일차 속도 상수 k(i,j)에 의해 연결된 일련의 구획 (q1-q3)으로 구성되는데, 이들은 하루에 구획 i에 수송된 구획 j의 분율을 반영한다. 상기 모형은 모든 참가자의 혈장 유리 류신 (녹색) 및 CNS 타우 (적색)의 표지화에 적합된다. Y 축: 유리 13C-류신 및 13C-류신 표지화된 CSF 타우. X 축: 시간 (일차). NC02 (b), NC03 (c), NC05 (d), NC06 (e), NC07 (f), 그리고 NC08 (g)의 모형이 도시된다.
상세한 설명
본 발명은 중추신경계 (CNS)에서 타우 물질대사의 동역학을 결정하기 위한 방법을 포괄한다. 본 발명의 방법을 이용함으로써, 당업자는 타우의 물질대사에서 가능한 변화를 연구할 수도 있다. 본 발명의 유용성은 치료 섭생이 치료가 필요한 개체에서 타우의 물질대사를 변경하는 지가 결정될 수 있다는 점에서, 당업자에게 명백할 것이다.
I. 타우 단백질
타우 단백질은 단일 유전자로부터 대안적 스플라이싱의 산물이다. 인간, 비인간 영장류, 설치류, 어류, 소, 개구리, 염소, 그리고 닭을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 많은 동물에서, 상기 유전자는 MAPT로 지칭된다. 유전자가 MAPT로서 확인되지 않은 동물에서, 동족체가 당분야에서 널리 공지된 방법에 의해 확인될 수 있다. 용어 "타우 단백질", "타우" 및 "타우 아이소형"은 교체가능하게 이용될 수 있다. 타우 단백질은 번역후 변형되거나 또는 변형되지 않을 수 있다. 가령, 타우는 인산화되고, 유비퀴틴화되고, 글리코실화되고, 그리고 당화될 수 있는 것으로 당분야에서 알려져 있다.
인간에서, MAPT의 엑손 2, 3, 그리고 10의 대안적 스플라이싱에 의해 산출되는 타우의 6가지 아이소형이 있다. 이들 아이소형은 길이에서 352개 내지 441개 아미노산의 범위에 있다. 엑손 2 및 3은 N 말단 (N으로 불림)에서 각각 29-아미노산 삽입물을 인코딩하고, 그리고 따라서, 타우 아이소형은 2N (양쪽 삽입물), 1N (엑손 2 단독), 또는 0N (어느 쪽에도 없음)일 수 있다. 모든 인간 타우 아이소형은 미소관 결합 도메인의 3개의 반복 (R로 불림)을 갖는다. C 말단에서 엑손 10의 포함은 엑손 10에 의해 인코딩된 네 번째 미소관 결합 도메인의 포함을 야기한다. 따라서, 인간 타우 아이소형은 미소관 결합 도메인의 4개 반복 (엑손 10 포함됨) 또는 미소관 결합 도메인의 3개 반복 (엑손 10 배제됨)으로 구성될 수 있다. 따라서, 타우 아이소형은 (2N, 3R), (2N, 4R), (1N, 3R), (1N, 4R), (0N, 3R), 또는 (0N, 4R)일 수 있다. 타우를 인코딩하는 유전자의 대안적 스플라이싱은 다른 동물에서 유사하게 발생한다.
타우는 가용성 및 불용성 구획에서, 단위체성 및 응집된 형태에서, 정연한 또는 무질서한 구조에서, 세포내에서 및 세포외에서 발견될 수 있고, 그리고 다른 단백질 또는 분자로 복합화될 수 있다. 타우의 한 가지 응집된 형태는 아밀로이드이다. 아밀로이드는 파라결정, 정연한 단백질 어셈블리이다. 아밀로이드는 일반적으로, 생체내에서 또는 시험관내에서 교차-베타 구조를 갖는다. 전부는 아니지만 대부분의 경우에, 교차-베타 구조는 콩고 레드로 염색되고 편광 하에 관찰될 때 밝은 녹황색 이중굴절에 의해, 또는 X선 섬유 회절 패턴에 의해 확인될 수 있다. 아밀로이드는 말초신경계에서 또는 중추신경계에서, 또는 둘 모두에서 위치될 수 있다. 아밀로이드는 당분야에서 널리 공지된다. 가령, Eisenberg et al. Cell. 2012 Mar 16;148(6):1188-203을 참조한다.
아밀로이드는 질환 연관되거나 또는 연관되지 않을 수 있다. 아밀로이드는 하나 이상의 질환과 또한 연관될 수 있다. 용어 "아밀로이드증"은 개체에서 아밀로이드의 침적을 지칭한다. 용어 "타우 아밀로이드증"은 이런 이유로, 개체에서 타우 아밀로이드의 침적을 지칭한다. 타우 아밀로이드증은 당분야에서 공지된 방법에 의해 임상적으로 확진될 수 있다. 가령, 뇌에서 타우 침적의 증거는 타우 응집체를 선별적으로 표적으로 하는 영상 작용제 (가령, PET, SPECT 또는 MRI 영상 작용제)를 이용함으로써 사정될 수 있다. 가령, Zhang et al. J Alzheimer's Disease 31(3): 601-612, 2012를 참조한다. 다른 실례는 Avid로부터 상업적으로 가용한 T-807 추적자를 포함한다.
타우 아밀로이드증을 앓는 개체는 또한, 타우 아밀로이드증과 연관된 질환이 발달할 증가된 위험에 처해 있다. 타우 아밀로이드증과 연관된 질환은 "타우병증"으로서 지칭될 수 있다. 당분야에서 공지된 타우병증은 진행성 핵상 마비, 권투 선수 치매, 만성 외상 뇌병증, 염색체 17에 연계된 전두측두엽 치매 및 파킨슨증, 리티코-보디그병, 괌의 파킨슨성 치매 복합체, 매듭 우세 치매, 신경절교종 및 신경절세포종, 수막혈관주위세포종, 아급성 경화성 범뇌염, 연뇌증, 결절성 경화증, 할러포르덴-스파츠병, 라이포푸신증, 픽병, 피질기저 퇴행, 호은성 입자 질환 (AGD), 전두측두엽 변성, 알츠하이머병, 그리고 전두측두엽 치매를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
II. 신경에서 유래된 생체분자의 생체내 물질대사를 계측하기 위한 방법
본 발명은 개체에서 타우의 생체내 물질대사를 계측하기 위한 시험관내 방법을 제공한다. "타우 물질대사"는 타우의 합성, 수송, 파괴, 변형, 또는 청소율의 임의의 조합을 지칭한다. 타우 물질대사는 표지화된 모이어티를 제공받은 개체로부터 획득된 하나 또는 그 이상의 생물학적 표본에서 표지화된 타우 및 표지화되지 않은 타우의 양을 검출하고, 그리고 생물학적 표본에서 표지화된 타우 대 표지화되지 않은 타우의 비율을 결정함으로써 계측될 수 있다. 일반적으로, 생물학적 표본에서 표지화된 타우 대 표지화되지 않은 타우의 비율은 CNS에서 타우의 물질대사에 직접적으로 비례한다. 이들 계측은 또한, 타우 물질대사의 하나 또는 그 이상의 파라미터를 계산하는데 이용될 수 있다. 특히, 본 발명은 타우 표지화의 동역학을 계측하기 위해, 하나 또는 그 이상의 생물학적 표본을 획득하는 결정적인 시간 프레임을 제공한다.
(a) 개체
본 발명은 타우의 생체내 물질대사, 다시 말하면, 개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 방법을 제공한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "개체"는 포유동물을 지칭한다. 적합한 개체는 인간, 반려 동물, 가축 동물, 동물원 동물, 또는 연구 동물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 반려 동물의 무제한적 실례는 개 또는 고양이를 포함한다. 가축 동물의 무제한적 실례는 소, 돼지, 말, 양 또는 염소를 포함한다. 연구 동물의 무제한적 실례는 비인간 영장류 또는 설치류를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 개체는 인간이다.
당업자는 본 발명의 방법이 타우 아밀로이드증을 앓는 개체에서 타우 물질대사를 특징짓는데 이용될 수 있긴 하지만, 본 발명은 타우 아밀로이드증을 앓는 개체에 한정되지 않는다는 것을 인지할 것이다. 본 발명의 방법은 변경된 타우 물질대사가 질환, 장애 또는 과정의 임상적 징후 또는 증상에 기여하는 것으로 알려져 있거나 또는 생각되는 임의의 질환, 장애 또는 과정을 비롯한 임의의 질환, 장애, 또는 과정을 앓는 개체에서 타우 물질대사를 특징짓는데 이용될 수 있는 것으로 구상된다. 이에 더하여, 본 발명의 방법은 건강한 개체에서 정상적인 타우 물질대사를 특징짓는데 이용될 수 있는 것으로 구상된다. 일부 구체예에서, 개체는 타우 아밀로이드증이 없는 개체이고, 여기서 상기 개체는 치매 없음, 경미한 치매, 중등도 치매 또는 심각한 치매를 앓는다. 일부 구체예에서, 개체는 타우 아밀로이드증을 앓는 개체이고, 여기서 상기 개체는 치매 없음, 경미한 치매, 중등도 치매 또는 심각한 치매를 앓는다. 일정한 구체예에서, 치매는 알츠하이머 유형의 치매, 혈관 치매, 레비 소체 치매, 혼합형 치매, 파킨슨병 유형의 치매, 그리고 전두측두엽 치매로 구성된 군에서 선택되는 유형의 치매이다. 일부 구체예에서, 개체는 타우 아밀로이드증이 없는 개체이고, 여기서 상기 개체는 치매 없음, 경미한 치매, 중등도 치매 또는 심각한 치매를 앓는다. 일정한 구체예에서, 치매는 알츠하이머 유형의 치매, 혈관 치매, 레비 소체 치매, 혼합형 치매, 파킨슨병 유형의 치매, 그리고 전두측두엽 치매로 구성된 군에서 선택되는 유형의 치매이다. 치매의 진단을 내리기 위한 임의의 적절한 사정 규모가 이용될 수 있다.
(b) 표지화된 모이어티
타우 물질대사는 표지화된 모이어티, 바람직하게는 표지화된 아미노산을 제공받았던 개체에서 계측된다. 여러 상이한 모이어티가 타우를 표지화하는데 이용될 수 있다. 대체로 말하면, 본 발명의 방법에서 전형적으로 활용되는 표지화 모이어티의 2가지 유형은 방사성 동위원소 및 비방사성 (안정성) 동위원소이다. 바람직한 구체예에서, 비방사성 동위원소가 이용되고 질량 분광분석법에 의해 계측될 수 있다. 바람직한 안정성 동위원소는 중수소 2H, 13C, 15N, 17 또는 18O, 33, 34, 또는 36S를 포함하지만, 유력한 선천적 형태에서 목격되는 것보다 더욱 많은 또는 더욱 적은 중성자에 의해 원자의 질량을 변화시키는 다수의 다른 안정성 동위원소 역시 효과적일 것으로 인식된다. 적합한 표지는 일반적으로, 연구 중인 타우가 질량분광계에서 검출될 수 있도록, 이의 질량을 변화시킬 것이다. 한 구체예에서, 표지화된 모이어티는 비방사성 동위원소를 포함하는 아미노산이고, 그리고 표지화된 타우의 양은 질량 분광분석법에 의해 계측된다. 바람직한 구체예에서, 비방사성 동위원소는 13C이다. 다른 구체예에서, 방사성 동위원소가 이용될 수 있고, 그리고 표지화된 타우의 양은 섬광 계수기로 계측될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 표지화된 모이어티가 동시에 또는 차례차례로 이용될 수 있다.
당업자는 여러 표지화된 아미노산이 타우를 표지화하는데 이용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 일반적으로, 아미노산의 선택은 다음과 같은 다양한 인자에 근거된다: (1) 아미노산은 일반적으로, 관심되는 단백질 또는 펩티드의 최소한 하나의 잔기 내에 존재한다; (2) 아미노산은 일반적으로, 단백질 합성의 부위에 빠르게 도달하고, 그리고 CNS에서 합성된 단백질의 경우에, 혈액 뇌 장벽을 교차하여 급속히 평형화될 수 있다; (3) 아미노산은 이상적으로는, 더욱 높은 퍼센트의 표지화가 달성될 수 있도록 필수 아미노산 (신체에 의해 생산되지 않음)일 수 있다 (비필수 아미노산 역시 이용될 수 있다; 하지만, 계측이 아마도 덜 정확할 것이다); (4) 선별된 용량에서 아미노산 표지는 일반적으로, 관심되는 단백질의 물질대사에 영향을 주지 않는다; 그리고 (5) 원하는 아미노산의 이용가능성 (즉, 일부 아미노산은 다른 것들보다 훨씬 비싸거나 또는 제조하기 더욱 어렵다). 류신 및 페닐알라닌은 CNS에서 합성되는 단백질을 표지화하기 위한 선호되는 아미노산이다. 한 구체예에서, 13C6-페닐알라닌이 타우를 표지화하는데 이용된다. 다른 구체예에서, 13C6-류신이 타우를 표지화하는데 이용된다.
표지화된 아미노산 (비방사성 동위원소 및 방사성 동위원소 둘 모두)의 다양한 상업적인 공급원이 있다. 일반적으로, 표지화된 아미노산은 생물학적으로 또는 합성적으로 생산될 수 있다. 생물학적으로 생산된 아미노산은 생물체가 단백질을 생산할 때 아미노산 내로 통합되는 13C, 15N, 또는 다른 동위원소의 농축된 혼합물에서 성장된 생물체 (가령, 켈프/해초)로부터 획득될 수 있다. 이들 아미노산은 이후, 분리되고 정제된다. 대안으로, 아미노산은 공지된 합성 화학적 과정으로 만들어질 수 있다.
(c) 표지화된 모이어티의 투여
표지화된 모이어티는 여러 방법에 의해 개체에 투여될 수 있다. 적합한 투여 방법은 정맥내, 동맥내, 피하, 복막내, 근육내, 또는 경구를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 표지화된 모이어티는 표지화된 아미노산이고, 그리고 표지화된 아미노산은 정맥내 주입에 의해 투여된다. 다른 구체예에서, 표지화된 모이어티는 표지화된 아미노산이고, 그리고 표지화된 아미노산은 경구 투여된다.
표지화된 모이어티의 양 (또는 용량)은 지속 기간 및 투여 빈도가 그러한 것처럼 변할 수 있고 변할 것이다. 표지화된 모이어티는 하나 또는 그 이상의 일 (가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 또는 그 이상)에서 하루 1회 또는 그 이상 (가령, 하루 1, 2, 3, 4, 5회 또는 그 이상) 개체에 투여될 수 있다. 각 경우에서, 표지화된 모이어티는 기간에 걸쳐 천천히 또는 큰 단일 용량으로서 투여될 수 있다. 표지화된 모이어티는 표지화된 타우가 생물학적 표본 내에, 확실하게 정량될 수 있는 양으로 존재할 만큼 충분한 양으로 및 충분한 지속 기간 동안 투여되어야 한다. 모든 경우에서, "0 일차"는 표지화의 첫 번째 일차를 지칭하고, "1 일차"는 지칭한다.
표지화된 타우의 양은 투여된 표지의 백분율 및 표지화의 지속 기간에 의존한다 (그리고 이들에 의해 추정된다). 대체로 말하면, 표지화된 타우의 양은 표지화의 지속 기간에 의해 곱셈된 투여된 표지의 백분율과 대략적으로 동등할 것이다. 달리 말하면, 표지화의 시간의 양은 표지화되지 않은 아미노산과 비교하여 표지화된 아미노산의 퍼센트 (가령, 10%, 50% 또는 100%)에 역으로 관련된다. 표지화의 시간이 적을수록, 동일한 양의 타우 표지화를 달성하는데 더욱 많은 양의 표지화된 아미노산이 필요하다. 타우의 느린 회전율로 인해, 표지화된 타우의 고도로 민감한 정량 방법 (가령, <5%) 및/또는 표지화의 긴 지속 기간 (가령, >9 시간)이 전형적으로 필요하다.
표지화된 타우의 신뢰할 만한 정량을 위한 충분한 표지화 시간은 생물학적 표본에 따라 변할 수 있다. 가령, 혈액 표본을 이용할 때 필요한 표지화 시간은 CSF 표본에서 동일한 타우 아이소형의 신뢰할 만한 정량을 위해 필요한 시간보다 적을 수 있다.
신뢰할 만한 정량을 위해 필요한 표지화된 타우의 양은 정량 방법의 감수성의 함수이다. 현재 질량 분광분석법 방법은 비록 약 1% 내지 약 2% 표지화된 타우가 선호되긴 하지만, 낮게는 대략 0.01-0.2% 표지화된 타우를 계측할 수 있다. 하지만, 이들 계측은 기술의 진전으로 향상될 가능성이 높다 (즉, 더욱 낮은 수준의 표지화된 타우가 계측될 수 있다). 당업자는 다른 검출 방법을 통한 신뢰할 만한 정량을 위해 필요한 퍼센트 표지화된 타우가 일과적인 실험에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 그리고 표지화 프로토콜이 본원에서 교시에 근거하여 변형될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
일부 구체예에서, 표지화된 아미노산은 하루 이상의 일차에 개체에 정맥내 또는 경구 투여될 수 있다. 가령, 표지화된 아미노산은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일, 또는 그 이상에서 투여될 수 있다. 표지화된 아미노산의 전체 일일량은 각 투약 사이에 시간 경과가 거의 없이 순차적으로 투여되는 복수의 더욱 적은 용량으로 나눠질 수 있거나, 또는 복수 용량은 하루 종일 규칙적인 또는 불규칙한 간격에서 투여될 수 있다. 각 투약 사이에 경과하는 시간의 양은 수초, 수분, 또는 수시간일 수 있다. 정맥내 투여될 때, 1회 용량의 표지화된 아미노산은 최소한 10 분, 최소한 20 분, 최소한 30 분, 최소한 1.0 시간, 최소한 1.5 시간, 최소한 2.0 시간, 최소한 2.5 시간, 최소한 3.0 시간, 최소한 3.5 시간, 최소한 4.0 시간, 최소한 4.5 시간, 최소한 5.0 시간, 최소한 5.5 시간, 최소한 6.0 시간, 최소한 6.5 시간, 최소한 7.0 시간, 최소한 7.5 시간, 최소한 8.0 시간, 최소한 8.5 시간, 최소한 9.0 시간, 최소한 9.5 시간, 최소한 10.0 시간, 최소한 10.5 시간, 최소한 11.0 시간, 최소한 11.5 시간, 또는 최소한 12 시간을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 수분 내지 수시간의 지속 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 다른 양상에서, 1회 용량의 표지화된 아미노산은 약 1 시간 내지 약 12 시간, 또는 약 3 시간 내지 약 15 시간의 지속 기간에 걸쳐 정맥내 투여될 수 있다. 다른 양상에서, 1회 용량의 표지화된 아미노산은 약 1 시간 내지 약 6 시간, 약 6 시간 내지 약 12 시간, 또는 약 9 시간 내지 약 15 시간의 지속 기간에 걸쳐 정맥내 투여될 수 있다. 다른 양상에서, 1회 용량의 정맥내 표지화된 아미노산은 약 10 분 내지 약 30 분, 약 10 분 내지 약 1 시간, 또는 약 30 분 내지 약 3 시간의 지속 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 다른 양상에서, 1회 용량의 표지화된 아미노산은 약 1 시간 내지 약 3 시간, 약 3 시간 내지 약 6 시간, 약 6 시간 내지 약 9 시간의 지속 기간에 걸쳐 정맥내 투여될 수 있다. 다른 양상에서, 1회 용량의 표지화된 아미노산은 약 9 시간 내지 약 12 시간, 약 10 시간 내지 약 13 시간, 또는 약 12 시간 내지 약 15 시간 동안 정맥내 투여될 수 있다. 경구 투여될 때, 표지화된 아미노산의 각 용량은 하루 이상의 일차에 단일 용량 또는 복수 용량으로서 투여될 수 있다. 복수 경구 용량은 순차적으로 투여될 수 있거나 또는 각 투약 사이에 일정한 양의 시간이 경과할 수 있다. 각 경구 투약 사이에 경과하는 시간의 양은 수초, 수분, 또는 수시간일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 표지화된 아미노산이 경구 투여될 때, 이것은 개체에 음료로서 제공된다. 한 예시적인 구체예에서, 표지화된 아미노산은 표지화된 타우를 검출하기 위해, 20%에서 최소한 9 시간, 최소한 10 시간, 최소한 11 시간, 최소한 12 시간 또는 그 이상 동안 투여될 수 있다. 다른 예시적인 구체예에서, 표지화된 아미노산은 하루에 약 3% 내지 약 4% 표지화된 아미노산에서 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 일 동안 매일 투여될 수 있다.
당업자는 하나 이상의 표지가 단일 개체에서 이용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이것은 동일한 생체분자의 복수 표지화를 허용할 것이고, 그리고 상이한 시점에서 상기 생체분자의 생산 또는 소실에 관한 정보를 제공할 수 있다. 가령, 첫 번째 표지가 초기 기간에 걸쳐 개체에 제공되고, 그 이후에 약리학적 작용제 (약물)가 제공되고, 그리고 이후, 두 번째 표지가 투여될 수 있다. 일반적으로, 이러한 개체로부터 획득된 표본의 분석은 약물 투여 전후에, 동일한 개체에서 약물의 약력학적 효과를 직접적으로 계측하는, 물질대사의 계측을 제공할 것이다.
대안으로, 생체분자의 표지화를 증가시킬 뿐만 아니라 더욱 넓은 범위의 생체분자의 표지화를 획득하기 위해 복수 표지가 동시에 이용될 수 있다.
(d) 생물학적 표본
계측되는 표지화된 타우는 개체로부터 획득된 생물학적 표본 내에 있다. 적합한 생물학적 표본은 표지화된 타우가 검출될 수 있는 체액 또는 조직을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 가령, 일부 구체예에서, 생물학적 표본은 뇌척수액 (CSF)이다. 다른 구체예에서, 생물학적 표본은 사이질액 (ISF)이다. 또 다른 구체예에서, 생물학적 표본은 혈액 표본이다. 본원에서 이용된 바와 같이, "혈액"은 전혈, 혈장 또는 혈청을 지칭한다. 다른 구체예에서, 생물학적 표본은 조직 표본이다. 적합한 조직 표본은 뇌 조직 및 척수 조직을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
뇌척수액은 유치 CSF 카테터가 있거나 또는 없는 요추 천자에 의해 획득될 수 있다. 혈액은 정맥내 카테터가 있거나 또는 없는 정맥천자에 의해, 또는 핑거 스틱 (또는 이의 등가물)에 의해 수집되고, 그리고 당분야에서 공지된 방법에 따라 처리될 수 있다. 다른 유형의 표본은 표준 의약품 제조 품질 관리 기준 (GMP) 방법을 이용한 직접적인 수집에 의해 수집될 수 있다. 생물학적 표본은 즉시 이용될 수 있거나 또는 동결될 수 있고 무기한으로 보관될 수 있다.
첫 번째 생물학적 표본은 개체에 대한 기준선을 제공하기 위해, 표지의 투여에 앞서 개체로부터 채취될 수 있다. 대안으로, 첫 번째 생물학적 표본이 표지의 투여에 앞서 개체로부터 채취되지 않을 때, 기준선 표본이 정상적인 동위원소 분포를 갖는다는 가정이 만들어질 수 있다. 표지의 투여 후, 하나 또는 그 이상의 표본이 개체로부터 획득될 수 있다. 생물학적 표본은 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 일의 코스에 걸쳐 채취될 수 있다. 대안으로, 생물학적 표본은 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 주의 코스에 걸쳐 수집될 수 있다. 모든 경우에서, "0 일차"는 표지화의 첫 번째 일을 지칭하고, 이것은 표본 수집의 첫 번째 일이거나 또는 아닐 수 있다. 일반적으로, 표지화 시기 동안 획득된 생물학적 표본은 타우의 합성의 속도를 결정하는데 이용될 수 있고, 그리고 소실 시기 동안 채취된 혈액 표본은 타우의 청소율을 결정하는데 이용될 수 있다. 이에 더하여, 타우 표지화 곡선 전역에서 다양한 시점에서 획득된 생물학적 표본은 타우 물질대사의 다른 양상 (가령, 표지화된 타우 피크 시간, 표지화된 타우 피크 양, 절대적 정량, 상대적 표지화, 분할 교체율)을 결정하는데 이용될 수 있다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 표본의 숫자 및 시기선택은 일반적으로, 다수의 인자, 예를 들면: 분석의 유형, 표지화 시기의 길이, 관심되는 타우 단백질, 생물학적 표본, 검출의 유형, 개체 등에 의존할 수 있다.
타우 표지화의 활동 곡선은 비록 타우의 동역학 (가령, 생산, 소실, 회전율)이 실제적으로 변하지 않을 것이긴 하지만, 표지화 시기의 길이에 의해 영향을 받을 수 있다. 실시예에서 보여지는 바와 같이, 표지화된 타우는 10 일의 표지화와 비교하여 5 일의 표지화 이후에 더욱 이른 및 더욱 낮은 정점에 도달한다. 유사하게, 표지화된 타우는 10 일의 표지화와 비교하여 10 일 이상 동안 표지화 이후에 더욱 늦은 및 더욱 높은 정점에 도달할 것이다. 하지만, 개체의 유사한 군 (가령, 연령 및/또는 질환 상태에 의해 정합됨) 사이에서, 상기 곡선의 모양은 전반적으로 동일할 것이다. 따라서, 당업자는 본원에서 제공된 데이터를 이용하여, 표지화 프로토콜에 근거된 적합한 표본추출 시간 프레임을 선별할 수 있을 것이다.
타우 물질대사의 동역학은 또한, 생물학적 표본의 유형 사이에 다를 수 있다. 가령, 혈액 표본에서 계측된 타우 물질대사의 동역학은 CSF 표본에서 계측된 동역학보다 빠를 것으로 예상된다. 가령, CSF 표본과 비교하여 혈액 표본에서 계측된 타우 물질대사의 동역학은 약 2 내지 약 15 배 빠르거나, 또는 약 5 내지 약 10 배 빠를 수 있다.
일부 구체예에서, 생물학적 표본은 CSF 표본 또는 혈액 표본이고, 그리고 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 표본이 0 일차 및 20 일차 사이에, 1 일차 및 20 일차 사이에, 또는 2 일차 및 20 일차 사이에 수집된다. 가령, 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 CSF 표본은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 일차, 또는 이들의 임의의 조합에 수집될 수 있다. 다른 구체예에서, 생물학적 표본은 CSF 표본이고, 그리고 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 표본이 0 일차 및 20 일차 사이에, 1 일차 및 20 일차 사이에, 또는 2 일차 및 20 일차 사이에 수집된다. 다른 구체예에서, 생물학적 표본은 CSF 표본이고, 그리고 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 표본이 0 일차 및 15 일차 사이에, 1 일차 및 15 일차 사이에, 2 일차 및 15 일차 사이에 수집된다. 다른 구체예에서, 생물학적 표본은 CSF 표본이고, 그리고 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 표본이 0 일차 및 10 일차 사이에, 1 일차 및 10 일차 사이에, 또는 2 일차 및 10 일차 사이에 수집된다. 다른 구체예에서, 생물학적 표본은 CSF 표본이고, 그리고 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 표본이 5 일차 및 20 일차 사이에, 또는 5 일차 및 15 일차 사이에 수집된다. 생물학적 표본이 CSF 표본인 구체예에서, 0 일차 및 20 일차 사이에 표본 수집은 표지화된 타우 생산의 속도, 또는 타우 생산과 연관된 물질대사 파라미터를 결정하는데 이용될 수 있다. 생물학적 표본이 혈액 표본인 구체예에서, 표지화된 타우 생산은 CSF에서 표지화된 타우 생산과 비교하여 아마도 더욱 짧은 시간 프레임에서 발생할 것이다.
일부 구체예에서, 생물학적 표본은 CSF 표본 또는 혈액 표본이고, 그리고 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 표본이 20 일차 및 40 일차 사이에 수집된다. 가령, 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 CSF 표본은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40 일차, 또는 이들의 임의의 조합에 수집될 수 있다. 다른 구체예에서, 생물학적 표본은 CSF 표본이고, 그리고 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 표본이 20 일차 및 35 일차 사이에, 20 일차 및 30 일차 사이에, 또는 20 일차 및 25 일차 사이에 수집된다. 다른 구체예에서, 생물학적 표본은 CSF 표본이고, 그리고 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 표본이 25 일차 및 40 일차 사이에, 25 일차 및 35 일차 사이에, 또는 25 일차 및 30 일차 사이에 수집된다. 생물학적 표본이 CSF 표본인 구체예에서, 20 일차 및 40 일차 사이에 표본 수집은 표지화된 타우 생산의 피크, 또는 표지화된 타우 피크 생산과 연관된 물질대사 파라미터 (가령, 피크까지 시간, 피크 높이 등)를 결정하는데 이용될 수 있다. 생물학적 표본이 혈액 표본인 구체예에서, 표지화된 타우 생산의 피크는 아마도, CSF에서보다 앞서 발생할 것이다. 표지화된 타우 생산의 피크가 합리적으로 공지될 때, 20 일차 및 40 일차 사이에 표본 수집은 또한, 표지화된 타우 생산 및 표지화된 타우 소실과 연관된 물질대사 파라미터를 결정하는데 이용될 수 있다 (가령, 표지화된 타우 생산의 피크 전에 수집된 표본은 표지화된 타우 생산과 연관된 물질대사 파라미터를 계산하는데 이용될 수 있고, 그리고 표지화된 타우 생산의 피크 후에 수집된 표본은 표지화된 타우 소실과 연관된 물질대사 파라미터를 계산하는데 이용될 수 있다).
일부 구체예에서, 생물학적 표본은 CSF 표본 또는 혈액 표본이고, 그리고 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 표본이 25 일차 및 45 일차 사이에 수집된다. 가령, 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 CSF 표본은 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 또는 45 일차, 또는 이들의 임의의 조합에 수집될 수 있다. 다른 구체예에서, 생물학적 표본은 CSF 표본이고, 그리고 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 표본이 25 일차 및 40 일차 사이에, 25 일차 및 35 일차 사이에, 또는 25 일차 및 30 일차 사이에 수집된다. 다른 구체예에서, 생물학적 표본은 CSF 표본이고, 그리고 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 표본이 30 일차 및 45 일차 사이에, 30 일차 및 40 일차 사이에, 또는 30 일차 및 35 일차 사이에 수집된다. 생물학적 표본이 CSF 표본인 구체예에서, 20 일차 및 40 일차 사이에 표본 수집은 표지화된 타우 생산의 피크, 또는 표지화된 타우 피크 생산과 연관된 물질대사 파라미터 (가령, 피크까지 시간, 피크 높이 등)를 결정하는데 이용될 수 있다. 생물학적 표본이 혈액 표본인 구체예에서, 표지화된 타우 생산의 피크는 아마도, CSF에서보다 앞서 발생할 것이다. 표지화된 타우 생산의 피크가 합리적으로 공지될 때, 25 일차 및 45 일차 사이에 표본 수집은 또한, 표지화된 타우 생산 및 표지화된 타우 소실과 연관된 물질대사 파라미터를 결정하는데 이용될 수 있다 (가령, 표지화된 타우 생산의 피크 전에 수집된 표본은 표지화된 타우 생산과 연관된 물질대사 파라미터를 계산하는데 이용될 수 있고, 그리고 표지화된 타우 생산의 피크 후에 수집된 표본은 표지화된 타우 소실과 연관된 물질대사 파라미터를 계산하는데 이용될 수 있다).
일부 구체예에서, 생물학적 표본은 CSF 표본 또는 혈액 표본이고, 그리고 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 표본이 40 일차 및 100 일차 사이에 수집된다. 가령, 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 CSF 표본은 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 일차에 수집될 수 있다. 일부 구체예에서, 생물학적 표본은 CSF 표본이고, 그리고 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 표본이 40 일차 및 90 일차 사이에, 40 일차 및 80 일차 사이에, 40 일차 및 70 일차 사이에, 또는 40 일차 및 60 일차 사이에 수집된다. 다른 구체예에서, 생물학적 표본은 CSF 표본이고, 그리고 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 표본이 50 일차 및 100 일차 사이에, 50 일차 및 90 일차 사이에, 50 일차 및 80 일차 사이에, 50 일차 및 70 일차 사이에, 또는 50 일차 및 60 일차 사이에 수집된다. 또 다른 구체예에서, 생물학적 표본은 CSF 표본이고, 그리고 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 표본이 60 일차 및 100 일차 사이에, 60 일차 및 90 일차 사이에, 60 일차 및 85 일차 사이에, 60 일차 및 80 일차 사이에, 또는 60 일차 및 70 일차 사이에 수집된다. 또 다른 구체예에서, 생물학적 표본은 CSF 표본이고, 그리고 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 표본이 70 일차 및 100 일차 사이에, 70 일차 및 95 일차 사이에, 70 일차 및 90 일차 사이에, 70 일차 및 85 일차 사이에, 또는 70 일차 및 80 일차 사이에 수집된다. 생물학적 표본이 CSF 표본인 구체예에서, 40 일차 및 100 일차 사이에 표본 수집은 표지화된 타우 생산의 속도, 또는 타우 생산과 연관된 물질대사 파라미터를 결정하는데 이용될 수 있다. 생물학적 표본이 혈액 표본인 구체예에서, 표지화된 타우 소실은 아마도, CSF에서보다 앞서 시작하고 더욱 빨리 완료할 것이다.
(e) 표지화된 타우 및 표지화되지 않은 타우의 양을 검출
표지화된 및 표지화되지 않은 타우의 검출을 위한 적합한 방법은 연구 중인 타우의 형태 및/또는 타우를 표지화하는데 이용된 표지화된 모이어티의 유형에 따라 변할 수 있고 변할 것이다. 만약 표지화된 모이어티가 방사성으로 표지화된 아미노산이면, 검출 방법은 섬광 계수기일 수 있다. 만약 표지화된 모이어티가 비방사성 표지화된 아미노산이면, 검출 방법은 전형적으로, 표지화되지 않은 단백질에 대하여 표지화된 단백질의 질량에서 변화를 검출할 만큼 충분히 민감해야 한다. 바람직한 구체예에서, 질량 분광분석법이 표지화된 및 표지화되지 않은 타우 사이에 질량에서 차이를 검출하는데 이용된다. 일정한 구체예에서, 가스 크로마토그래피 질량 분광분석법이 이용된다. 대안적 구체예에서, MALDI-TOF 질량 분광분석법이 이용된다. 바람직한 구체예에서, 고해상 탠덤 질량 분광분석법이 이용된다.
추가 기술이 검출에 앞서 생물학적 표본에서 다른 단백질 및 생체분자로부터 표지화된 및 표지화되지 않은 타우를 분리하는데 활용될 수 있다. 실례로서, 면역침전이 타우 (이의 단편 포함)가 질량 분광분석법에 의해 분석되기 전에, 이를 단리하고 부분적으로 또는 완전하게 정제하는데 이용될 수 있다. 타우 단백질을 분리하거나 또는 농축하는 다른 방법은 단독으로 또는 면역침전과 합동으로 이용될 수 있다. 가령, 크로마토그래피 기술이 크기, 소수성 또는 친화성에 의해 타우 단백질 (또는 이의 단편)을 분리하는데 이용될 수 있다. 특히, 크로마토그래피 단계를 질량 분광분석법과 연결하는 기술이 이용될 수 있다. 한 예시적인 구체예에서, 타우는 면역침전되고, 그리고 이후, 고해상 탠덤 MS 단위와 접속된 액체 크로마토그래피 시스템에 의해 분석된다. 다른 예시적인 구체예에서, 타우는 면역침전되고, 그리고 이후, 전기분무 이온화 공급원이 구비된 고해상 탠덤 MS 단위와 접속된 액체 크로마토그래피 시스템 (LC-ESI-탠덤 MS)에 의해 분석된다.
표지화된 및 표지화되지 않은 타우는 또한, 검출에 앞서 더욱 작은 펩티드로 개열될 수 있다. 가령, 타우는 여러 작은 펩티드를 창출하기 위해 프로테아제로 효소적으로 개열될 수 있다. 적합한 프로테아제는 트립신, Lys-N, Lys-C, 그리고 Arg-N을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 한 예시적인 구체예에서, 표지화된 및 표지화되지 않은 타우는 생물학적 표본으로부터 완전하게 또는 부분적으로 정제되고, 프로테아제로 효소적으로 개열되고, 그리고 이후, 고해상 탠덤 MS 단위와 접속된 액체 크로마토그래피 시스템에 의해 분석된다. 다른 예시적인 구체예에서, 표지화된 및 표지화되지 않은 타우는 프로테아제로 효소적으로 개열되고, 완전하게 또는 부분적으로 정제되고, 그리고 이후, 고해상 탠덤 MS 단위와 접속된 액체 크로마토그래피 시스템에 의해 분석된다. 일정한 예시적인 구체예에서, 타우는 면역침전에 의해 완전하게 또는 부분적으로 정제된다.
본 발명은 또한, 동일한 생물학적 표본 내에 타우의 복수 아이소형이 동일한 질량분광계 표본에서 동시에 계측될 수 있다는 것을 제시한다. 다시 말하면, 표지화되지 않은 및 표지화된 타우의 양 둘 모두 복수 타우 아이소형에 대해 별도로 또는 동시에 검출되고 계측될 수 있다. 따라서, 본 발명은 대규모로 상이한 아이소형의 합성 및 소실에서 변화를 선별검사하는데 유용한 방법을 제공하고, 그리고 근원적인 병태생리학에 관련된 단백질을 검출하고 계측하기 위한 민감한 수단을 제공한다.
(f) 물질대사 분석
일단 표지화된 및 표지화되지 않은 타우의 양이 검출되면, 타우의 상대적 표지화가 계산될 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, "상대적 표지화"는 표지화된 타우 대 표지화되지 않은 타우의 비율 또는 표지화된 타우의 퍼센트를 지칭할 수 있다. 표지화된 타우의 양, 표지화되지 않은 타우의 양, 또는 타우의 상대적 표지화 역시 타우 물질대사의 하나 또는 그 이상의 추가 파라미터를 계산하는데 이용될 수 있다. 타우에 대한 적합한 물질대사 파라미터의 무제한적 실례는 분할 합성율, 분할 청소율, 절대 합성율, 절대 청소율, 분할 교체율, 지체 시간, 반감기, 피크 높이까지 시간, 피크 높이 등을 포함한다. 이들 파라미터를 계산하기 위한 방법은 당분야에서 널리 공지되고, 그리고 당업자는 본 발명의 방법에서 이용될 수 있는 표지화의 일차 활동 모형에 익숙할 것이다. 이에 더하여, 다른 파라미터, 예를 들면, 지체 시간 및 동위원소 추적자 항정 상태가 결정되고 타우의 물질대사 및 생리학의 치수로서 이용될 수 있다. 또한, 모형화는 복수 구획 모형을 적합시켜 구획 사이에 전달을 추정하기 위해 이들 데이터에서 수행될 수 있다. 당연히, 선택된 수학적 모형화의 유형은 개별 단백질 합성 및 소실 파라미터 (가령, 1-풀, 복수 풀, 항정 상태, 비-항정 상태, 구획 모형화 등)에 의존할 것이다. 일반적으로, 생물학적 표본에서 타우의 상대적 표지화는 CNS에서 타우의 물질대사에 직접적으로 비례한다. 가령, 생산 시기 동안 표지화된 타우의 증가 및 소실 시기 동안 표지화된 타우의 제거는 CNS에서 타우의 상대적 생산 및 소실을 반영한다. 따라서, 표지화된 및/또는 표지화되지 않은 타우의 계측을 이용하여 계산된 타우 물질대사의 파라미터는 또한, CNS에서 타우의 물질대사를 반영한다.
소정의 시점에서 생물학적 표본 내에 표지화된 타우의 양은 합성율 (즉, 생산) 또는 청소율 (즉, 제거 또는 파괴)을 비롯한 타우의 물질대사를 반영한다. 본 발명은 타우의 합성이 전형적으로, 시간의 추이에서 표지화된/표지화되지 않은 단백질 비율의 증가의 속도에 근거한다는 것을 제시한다 (즉, 기울기, 지수적 적합 곡선, 또는 구획 모형 적합이 타우 합성율을 규정한다). 이들 계산을 위해, 최소한 하나의 표본이 전형적으로 필요하고 (기준선 표지는 추정될 수 있었다), 그리고 시간의 추이에서 표지의 증가의 속도를 계산하기 위해 2개 또는 그 이상의 표본이 선호된다. 반대로, 표지화된 아미노산의 투여가 종결된 후, 표지화된 단백질 대 표지화되지 않은 단백질의 비율의 감소의 속도는 전형적으로, 상기 단백질의 청소율을 반영한다. 이들 계산을 위해, 최소한 하나의 표본이 전형적으로 필요하고 (기준선 표지는 추정될 수 있었다), 그리고 시간의 추이에서 타우로부터 표지의 감소의 속도를 계산하기 위해 2개 또는 그 이상의 표본이 선호된다.
한 예시적인 구체예에서, 실시예에서 예시된 바와 같이, 타우의 생체내 물질대사는 13C6-류신을 개체에 5 또는 10 일 동안 경구 투여하고, 그리고 표지의 첫 번째 투여 후 2 일 이상의 시점에서 최소한 하나의 생물학적 표본을 수집함으로써 계측된다. 생물학적 표본은 CSF로부터 수집될 수 있다. 생물학적 표본 내에 표지화된 및 표지화되지 않은 타우의 양은 전형적으로, 면역침전, 그 이후에 LC-ESI-탠덤 MS에 의해 결정된다. 이들 계측으로부터, 표지화된 타우 및 표지화되지 않은 타우의 양이 결정될 수 있고, 그리고 이들 계측은 타우 동역학의 물질대사 파라미터, 예를 들면, 타우의 상대적 표지화, 합성율, 청소율의 결정을 허용한다.
(g) 바람직한 구체예
개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 방법, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 최소한 하나의 일시 주사 또는 최소한 하나의 주입의 형태에서, 약 0.1 g 내지 약 10 g의 전체 일일량의 최소한 하나의 표지화된 아미노산을 개체에 최소한 3 일, 최소한 5 일, 또는 최소한 10 일 동안 투여하고; (b) 1 일차 또는 2 일차 및 20 일차, 20 일차 및 40 일차, 40 일차 및 100 일차, 또는 이들의 조합 사이에, 최소한 하나의 생물학적 표본을 개체로부터 수집하고; (c) 각 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양, 또는 표지화된 타우 및 표지화되지 않은 타우의 양을 질량 분광분석법에 의해 검출하고 계측하고; 그리고 (d) 단계 (c)로부터 치수를 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본 내에 타우의 상대적 표지화로서 임의선택적으로 표시된, 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영한다. 대안으로, 일일량은 약 0.5 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산, 0.5 g 내지 약 1 g의 표지화된 아미노산, 또는 약 1 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산일 수 있다. 각 구체예에서, 일일량은 일회에, 또는 하루 종일 규칙적인 또는 불규칙한 간격에서 투여되는 복수의 더욱 적은 용량으로 나눠질 수 있다. 바람직한 생물학적 표본은 CSF 표본, 혈액 표본 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 방법은 단계 (b) 및 (c) 사이에 타우를 프로테아제로 효소적으로 개열하고 및/또는 타우 또는 이의 단편을 완전하게 또는 부분적으로 정제하는 것을 더욱 포함할 수 있다.
개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 방법, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 최소한 하나의 일시 주사 또는 최소한 하나의 주입의 형태에서, 최소한 하나의 표지화된 아미노산을 개체에 투여하고, 여기서 상기 표지는 2개 또는 그 이상의 일에 0 일차 및 약 3 일차 사이에, 바람직하게는 0 일차 및 약 5 일차 사이에, 더욱 바람직하게는 0 일차 및 약 10 일차 사이에, 약 0.1 g 내지 약 10 g의 전체 일일량으로서 개체에 투여되고; (b) 1 일차 또는 2 일차 및 20 일차, 20 일차 및 40 일차, 40 일차 및 100 일차, 또는 이들의 조합 사이에, 최소한 하나의 생물학적 표본을 개체로부터 수집하고; (c) 각 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양, 또는 표지화된 타우 및 표지화되지 않은 타우의 양을 질량 분광분석법에 의해 검출하고 계측하고; 그리고 (d) 단계 (c)로부터 치수를 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본 내에 타우의 상대적 표지화로서 임의선택적으로 표시된, 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영한다. 대안으로, 일일량은 약 0.5 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산, 0.5 g 내지 약 1 g의 표지화된 아미노산, 또는 약 1 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산일 수 있다. 바람직한 생물학적 표본은 CSF 표본, 혈액 표본 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 방법은 단계 (b) 및 (c) 사이에 타우를 프로테아제로 효소적으로 개열하고 및/또는 타우 또는 이의 단편을 완전하게 또는 부분적으로 정제하는 것을 더욱 포함할 수 있다.
개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 방법, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 최소한 하나의 일시 주사 또는 최소한 하나의 주입의 형태에서, 최소한 하나의 표지화된 아미노산을 개체에 투여하고, 여기서 상기 표지는 2, 3, 4 또는 그 이상의 일에 0 일차 및 약 5 일차 사이에, 바람직하게는 0 일차 및 약 10 일차 사이에, 약 0.1 g 내지 약 10 g의 전체 일일량으로서 개체에 투여되고; (b) 1 일차 또는 2 일차 및 20 일차, 20 일차 및 40 일차, 40 일차 및 100 일차, 또는 이들의 조합 사이에, 최소한 하나의 생물학적 표본을 개체로부터 수집하고; (c) 각 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양, 또는 표지화된 타우 및 표지화되지 않은 타우의 양을 질량 분광분석법에 의해 검출하고 계측하고; 그리고 (d) 단계 (c)로부터 치수를 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본 내에 타우의 상대적 표지화로서 임의선택적으로 표시된, 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영한다. 대안으로, 일일량은 약 0.5 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산, 0.5 g 내지 약 1 g의 표지화된 아미노산, 또는 약 1 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산일 수 있다. 각 구체예에서, 일일량은 일회에, 또는 하루 종일 규칙적인 또는 불규칙한 간격에서 투여되는 복수의 더욱 적은 용량으로 나눠질 수 있다. 바람직한 생물학적 표본은 CSF 표본, 혈액 표본 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 방법은 단계 (b) 및 (c) 사이에 타우를 프로테아제로 효소적으로 개열하고 및/또는 타우 또는 이의 단편을 완전하게 또는 부분적으로 정제하는 것을 더욱 포함할 수 있다.
개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 방법, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 최소한 하나의 일시 주사 또는 최소한 하나의 주입의 형태에서, 최소한 하나의 표지화된 아미노산을 개체에 투여하고, 여기서 상기 표지는 2, 3, 4, 5, 7, 8, 또는 9 일에 0 일차 및 약 10 일차 사이에, 약 0.1 g 내지 약 10 g의 전체 일일량으로서 개체에 투여되고; (b) 1 일차 또는 2 일차 및 20 일차, 20 일차 및 40 일차, 40 일차 및 100 일차, 또는 이들의 조합 사이에, 최소한 하나의 생물학적 표본을 개체로부터 수집하고; (c) 각 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양, 또는 표지화된 타우 및 표지화되지 않은 타우의 양을 질량 분광분석법에 의해 검출하고 계측하고; 그리고 (d) 단계 (c)로부터 치수를 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본 내에 타우의 상대적 표지화로서 임의선택적으로 표시된, 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영한다. 대안으로, 일일량은 약 0.5 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산, 0.5 g 내지 약 1 g의 표지화된 아미노산, 또는 약 1 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산일 수 있다. 각 구체예에서, 일일량은 일회에, 또는 하루 종일 규칙적인 또는 불규칙한 간격에서 투여되는 복수의 더욱 적은 용량으로 나눠질 수 있다. 바람직한 생물학적 표본은 CSF 표본, 혈액 표본 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 방법은 단계 (b) 및 (c) 사이에 타우를 프로테아제로 효소적으로 개열하고 및/또는 타우 또는 이의 단편을 완전하게 또는 부분적으로 정제하는 것을 더욱 포함할 수 있다.
개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 방법, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 최소한 하나의 일시 주사 또는 최소한 하나의 주입의 형태에서, 약 0.1 g 내지 약 10 g의 전체 일일량의 최소한 하나의 표지화된 아미노산을 개체에 최소한 3 일, 최소한 5 일, 또는 최소한 10 일 동안 투여하고; (b) 계산: 타우의 반감기 ± 타우의 반감기로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 일에 근거하여 개체로부터 최소한 하나의 생물학적 표본을 수집하고; (c) 각 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양, 또는 표지화된 타우 및 표지화되지 않은 타우의 양을 질량 분광분석법에 의해 검출하고 계측하고; 그리고 (d) 단계 (c)로부터 치수를 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본 내에 타우의 상대적 표지화로서 임의선택적으로 표시된, 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영한다. 대안으로, 일일량은 약 0.5 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산, 0.5 g 내지 약 1 g의 표지화된 아미노산, 또는 약 1 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산일 수 있다. 각 구체예에서, 일일량은 일회에, 또는 하루 종일 규칙적인 또는 불규칙한 간격에서 투여되는 복수의 더욱 적은 용량으로 나눠질 수 있다. 바람직한 생물학적 표본은 CSF 표본, 혈액 표본 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 방법은 단계 (b) 및 (c) 사이에 타우를 프로테아제로 효소적으로 개열하고 및/또는 타우 또는 이의 단편을 완전하게 또는 부분적으로 정제하는 것을 더욱 포함할 수 있다.
개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 방법, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 최소한 하나의 일시 주사 또는 최소한 하나의 주입의 형태에서, 약 0.1 g 내지 약 10 g의 전체 일일량의 최소한 하나의 표지화된 아미노산을 개체에 최소한 3 일, 최소한 5 일, 또는 최소한 10 일 동안 투여하고; (b) 계산: 타우의 반감기 ± 타우의 반감기로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 일에만 근거하여 개체로부터 하나 또는 그 이상의 생물학적 표본을 수집하고 (다시 말하면, 이러한 시간 프레임을 벗어나는 어떤 표본도 수집되지 않는다); (c) 각 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양, 또는 표지화된 타우 및 표지화되지 않은 타우의 양을 질량 분광분석법에 의해 검출하고 계측하고; 그리고 (d) 단계 (c)로부터 치수를 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본 내에 타우의 상대적 표지화로서 임의선택적으로 표시된, 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영한다. 대안으로, 일일량은 약 0.5 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산, 0.5 g 내지 약 1 g의 표지화된 아미노산, 또는 약 1 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산일 수 있다. 각 구체예에서, 일일량은 일회에, 또는 하루 종일 규칙적인 또는 불규칙한 간격에서 투여되는 복수의 더욱 적은 용량으로 나눠질 수 있다. 바람직한 생물학적 표본은 CSF 표본, 혈액 표본 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 방법은 단계 (b) 및 (c) 사이에 타우를 프로테아제로 효소적으로 개열하고 및/또는 타우 또는 이의 단편을 완전하게 또는 부분적으로 정제하는 것을 더욱 포함할 수 있다.
개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 시험관내 방법, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 개체로부터 획득된 각 생물학적 표본 내에 표지화된 타우의 양, 또는 표지화된 타우 및 표지화되지 않은 타우의 양을 질량 분광분석법에 의해 검출하고 계측하고; 그리고 (b) 단계 (a)에서 결정된 표지화된 타우의 양, 또는 표지화된 및 표지화되지 않은 타우의 양을 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본 내에 타우의 상대적 표지화로서 임의선택적으로 표시된, 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영하고; 그리고 여기서 (i) 상기 표지는 0 일차 내지 최소한 약 3 일차, 바람직하게는 0 일차 내지 최소한 약 5 일차, 더욱 바람직하게는 0 일차 내지 최소한 약 10 일차에 최소한 하나의 일시 주사 또는 최소한 하나의 주입으로서 매일 투여되었고, 그리고 (ii) 각 생물학적 표본은 1 일차 또는 2 일차 및 20 일차, 20 일차 및 40 일차, 40 일차 및 100 일차, 또는 이들의 조합 사이에 개체로부터 수집되었다. 대안으로, 일일량은 약 0.5 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산, 0.5 g 내지 약 1 g의 표지화된 아미노산, 또는 약 1 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산일 수 있다. 각 구체예에서, 일일량은 일회에, 또는 하루 종일 규칙적인 또는 불규칙한 간격에서 투여되는 복수의 더욱 적은 용량으로 나눠질 수 있다. 바람직한 생물학적 표본은 CSF 표본, 혈액 표본 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 방법은 단계 (a) 및 (b) 사이에 타우를 프로테아제로 효소적으로 개열하고 및/또는 타우 또는 이의 단편을 완전하게 또는 부분적으로 정제하는 것을 더욱 포함할 수 있다.
개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 시험관내 방법, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 개체로부터 획득된 각 생물학적 표본 내에 표지화된 타우의 양, 또는 표지화된 타우 및 표지화되지 않은 타우의 양을 질량 분광분석법에 의해 검출하고 계측하고; 그리고 (b) 단계 (a)에서 결정된 표지화된 타우의 양, 또는 표지화된 및 표지화되지 않은 타우의 양을 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본 내에 타우의 상대적 표지화로서 임의선택적으로 표시된, 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영하고; 그리고 여기서 (i) 상기 표지는 2개 또는 그 이상의 일에 0 일차 및 약 3 일차 사이에, 바람직하게는 0 일차 및 약 5 일차 사이에, 더욱 바람직하게는 0 일차 및 약 10 일차 사이에 최소한 하나의 일시 주사 또는 최소한 하나의 주입으로서 투여되었고, 그리고 (ii) 각 생물학적 표본은 1 일차 또는 2 일차 및 20 일차, 20 일차 및 40 일차, 40 일차 및 100 일차, 또는 이들의 조합 사이에 개체로부터 수집되었다. 대안으로, 일일량은 약 0.5 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산, 0.5 g 내지 약 1 g의 표지화된 아미노산, 또는 약 1 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산일 수 있다. 각 구체예에서, 일일량은 일회에, 또는 하루 종일 규칙적인 또는 불규칙한 간격에서 투여되는 복수의 더욱 적은 용량으로 나눠질 수 있다. 바람직한 생물학적 표본은 CSF 표본, 혈액 표본 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 방법은 단계 (a) 및 (b) 사이에 타우를 프로테아제로 효소적으로 개열하고 및/또는 타우 또는 이의 단편을 완전하게 또는 부분적으로 정제하는 것을 더욱 포함할 수 있다.
개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 시험관내 방법, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 개체로부터 획득된 각 생물학적 표본 내에 표지화된 타우의 양, 또는 표지화된 타우 및 표지화되지 않은 타우의 양을 질량 분광분석법에 의해 검출하고 계측하고; 그리고 (b) 단계 (a)에서 결정된 표지화된 타우의 양, 또는 표지화된 및 표지화되지 않은 타우의 양을 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본 내에 타우의 상대적 표지화로서 임의선택적으로 표시된, 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영하고; 그리고 여기서 (i) 상기 표지는 2, 3, 4 또는 그 이상의 일에 0 일차 및 약 5 일차 사이에, 바람직하게는 0 일차 및 약 10 일차 사이에 최소한 하나의 일시 주사 또는 최소한 하나의 주입으로서 개체에 투여되고, 그리고 (ii) 각 생물학적 표본은 1 일차 또는 2 일차 및 20 일차, 20 일차 및 40 일차, 40 일차 및 100 일차, 또는 이들의 조합 사이에 개체로부터 수집되었다. 대안으로, 일일량은 약 0.5 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산, 0.5 g 내지 약 1 g의 표지화된 아미노산, 또는 약 1 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산일 수 있다. 각 구체예에서, 일일량은 일회에, 또는 하루 종일 규칙적인 또는 불규칙한 간격에서 투여되는 복수의 더욱 적은 용량으로 나눠질 수 있다. 바람직한 생물학적 표본은 CSF 표본, 혈액 표본 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 방법은 단계 (a) 및 (b) 사이에 타우를 프로테아제로 효소적으로 개열하고 및/또는 타우 또는 이의 단편을 완전하게 또는 부분적으로 정제하는 것을 더욱 포함할 수 있다.
개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 시험관내 방법, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 개체로부터 획득된 각 생물학적 표본 내에 표지화된 타우의 양, 또는 표지화된 타우 및 표지화되지 않은 타우의 양을 질량 분광분석법에 의해 검출하고 계측하고; 그리고 (b) 단계 (a)에서 결정된 표지화된 타우의 양, 또는 표지화된 및 표지화되지 않은 타우의 양을 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본 내에 타우의 상대적 표지화로서 임의선택적으로 표시된, 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영하고; 그리고 여기서 (i) 상기 표지는 2, 3, 4, 5, 7, 8, 또는 9 일에 0 일차 및 약 10 일차 사이에 최소한 하나의 일시 주사 또는 최소한 하나의 주입으로서 개체에 투여되고, 그리고 (ii) 각 생물학적 표본은 1 일차 또는 2 일차 및 20 일차, 20 일차 및 40 일차, 40 일차 및 100 일차, 또는 이들의 조합 사이에 개체로부터 수집되었다. 대안으로, 일일량은 약 0.5 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산, 0.5 g 내지 약 1 g의 표지화된 아미노산, 또는 약 1 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산일 수 있다. 각 구체예에서, 일일량은 일회에, 또는 하루 종일 규칙적인 또는 불규칙한 간격에서 투여되는 복수의 더욱 적은 용량으로 나눠질 수 있다. 바람직한 생물학적 표본은 CSF 표본, 혈액 표본 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 방법은 단계 (a) 및 (b) 사이에 타우를 프로테아제로 효소적으로 개열하고 및/또는 타우 또는 이의 단편을 완전하게 또는 부분적으로 정제하는 것을 더욱 포함할 수 있다.
개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 시험관내 방법, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 개체로부터 획득된 각 생물학적 표본 내에 표지화된 타우의 양, 또는 표지화된 타우 및 표지화되지 않은 타우의 양을 질량 분광분석법에 의해 검출하고 계측하고; 그리고 (b) 단계 (a)에서 결정된 표지화된 타우의 양, 또는 표지화된 및 표지화되지 않은 타우의 양을 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본 내에 타우의 상대적 표지화로서 임의선택적으로 표시된, 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영하고; 그리고 여기서 (i) 상기 표지는 0 일차 내지 최소한 약 3 일차, 바람직하게는 0 일차 내지 최소한 약 5 일차, 더욱 바람직하게는 0 일차 내지 최소한 약 10 일차에 최소한 하나의 일시 주사 또는 최소한 하나의 주입으로서 매일 투여되었고, 그리고 (ii) 각 생물학적 표본은 계산: 타우의 반감기 ± 타우의 반감기로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 일에 근거하여 개체로부터 수집되었다. 대안으로, 일일량은 약 0.5 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산, 0.5 g 내지 약 1 g의 표지화된 아미노산, 또는 약 1 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산일 수 있다. 각 구체예에서, 일일량은 일회에, 또는 하루 종일 규칙적인 또는 불규칙한 간격에서 투여되는 복수의 더욱 적은 용량으로 나눠질 수 있다. 바람직한 생물학적 표본은 CSF 표본, 혈액 표본 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 방법은 단계 (a) 및 (b) 사이에 타우를 프로테아제로 효소적으로 개열하고 및/또는 타우 또는 이의 단편을 완전하게 또는 부분적으로 정제하는 것을 더욱 포함할 수 있다.
개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 시험관내 방법, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 개체로부터 획득된 각 생물학적 표본 내에 표지화된 타우의 양, 또는 표지화된 타우 및 표지화되지 않은 타우의 양을 질량 분광분석법에 의해 검출하고 계측하고; 그리고 (b) 단계 (a)에서 결정된 표지화된 타우의 양, 또는 표지화된 및 표지화되지 않은 타우의 양을 이용하여 타우의 물질대사를 계산하고, 여기서 소정의 시점에서 생물학적 표본 내에 타우의 상대적 표지화로서 임의선택적으로 표시된, 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영하고; 그리고 여기서 (i) 상기 표지는 0 일차 내지 최소한 약 3 일차, 바람직하게는 0 일차 내지 최소한 약 5 일차, 더욱 바람직하게는 0 일차 내지 최소한 약 10 일차에 최소한 하나의 일시 주사 또는 최소한 하나의 주입으로서 매일 투여되었고, 그리고 (ii) 각 생물학적 표본은 계산: 타우의 반감기 ± 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 일에만 근거하여 개체로부터 수집되었다 (다시 말하면, 이러한 시간 프레임을 벗어나는 어떤 표본도 수집되지 않는다). 대안으로, 일일량은 약 0.5 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산, 0.5 g 내지 약 1 g의 표지화된 아미노산, 또는 약 1 g 내지 약 5 g의 표지화된 아미노산일 수 있다. 각 구체예에서, 일일량은 일회에, 또는 하루 종일 규칙적인 또는 불규칙한 간격에서 투여되는 복수의 더욱 적은 용량으로 나눠질 수 있다. 바람직한 생물학적 표본은 CSF 표본, 혈액 표본 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 방법은 단계 (a) 및 (b) 사이에 타우를 프로테아제로 효소적으로 개열하고 및/또는 타우 또는 이의 단편을 완전하게 또는 부분적으로 정제하는 것을 더욱 포함할 수 있다.
III. 신경학적 및 신경변성 질환의 진행 또는 치료를 진단하거나 또는 모니터링하기 위한 키트
본 발명은 개체에서 타우의 생체내 물질대사를 계측함으로써, 타우를 계측하기 위한, 또는 타우와 연관된 신경학적 또는 신경변성 질환의 진행 또는 치료를 모니터링하기 위한 키트를 제공한다. 일반적으로, 키트는 표지화된 아미노산, 표지화된 아미노산을 투여하기 위한 수단, 시간의 추이에서 생물학적 표본을 수집하기 위한 수단, 그리고 물질대사 파라미터가 계산될 수 있도록 표지화된 타우 및/또는 표지화되지 않은 타우의 양을 검출하고 계측하기 위한 사용설명서를 포함한다. 상기 물질대사 파라미터는 이후, 정상적인, 건강한 개체의 물질대사 파라미터와 비교되거나 또는 앞선 시점에서 산출된 동일한 개체로부터 물질대사 파라미터와 비교될 수 있다. 적합한 물질대사 파라미터는 전술된다. 바람직한 구체예에서, 키트는 13C6-류신 또는 13C6-페닐알라닌을 포함하고, 표지화되는 단백질은 타우이고, 그리고 사정되는 질환은 타우 아밀로이드증이다.
정의
달리 정의되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 다음의 참고문헌은 본 발명에서 이용된 많은 용어의 일반적인 정의를 당업자에게 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 그리고 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 본원에서 이용된 바와 같이, 다음의 용어는 달리 명시되지 않으면, 그들에 생득된 의미를 갖는다.
"청소율"은 관심되는 생체분자, 예를 들면, 타우가 제거되는 비율을 지칭한다.
"분할 청소율" 또는 FCR은 특정된 기간에 걸쳐, 표지화된 생체분자, 예를 들면, 타우의 비율의 자연 로그로서 계산된다.
"분할 합성율" 또는 FSR은 표지화된 전구체의 예측된 값에 의해 나눗셈된, 특정된 기간에 걸쳐 표지화된 생체분자, 예를 들면, 타우의 증가하는 비율의 기울기로서 계산된다.
"분할 교체율" 또는 FTR은 CNS로부터 생체분자, 예를 들면, 타우의 비가역성 상실의 비율이고, 그리고 CSF에 대한 상실 및 다른 상실 경로 (가령, 국부 조직 흡수, 단백질분해, 아밀로이드 내로 침적)의 합이다.
"동위원소"는 핵이 동일한 원자 번호를 갖지만, 상이한 숫자의 중성자를 내포하기 때문에 상이한 질량수를 갖는 소정의 원소의 모든 형태를 지칭한다. 무제한적 실례로서, 12C 및 13C는 둘 모두 탄소의 안정성 동위원소이다.
"지체 시간"은 생체분자, 예를 들면, 타우가 처음 표지화될 때부터 표지화된 생체분자가 검출될 때까지 시간의 지연을 일반적으로 지칭한다.
"물질대사"는 생체분자, 예를 들면, 타우의 합성, 수송, 파괴, 변형, 또는 청소율의 임의의 조합을 지칭한다.
"신경으로부터 유래된 세포"는 뉴런, 별아교세포, 소교 세포, 맥락막총 세포, 상의 세포, 다른 신경아교 세포 등을 비롯하여, 혈액-뇌-장벽 내에 모든 세포를 포함한다.
"상대적 표지화"는 표지화된 타우 대 표지화되지 않은 타우의 비율 또는 퍼센트 표지화된 타우를 지칭한다. 상대적 표지화는 임의의 적절한 단위를 이용하여 표시될 수 있다. 무제한적 실례로서, 표지화된 타우 대 표지화되지 않은 타우의 비율은 질량 분광계 분석으로부터 획득된 추적자 대 흔적 관계 (TTR)로서 표시될 수 있다. 다른 무제한적 실례로서, TTR 비율은 표지화된 몰 분율로 전환될 수 있다.
"표지화의 시작"은 표지화가 시작되는 시점, 다시 말하면, 시간 = 0을 지칭한다. 복수 일에서 표지의 투여를 필요로 하는 타우 표지화 프로토콜의 경우에, "표지화의 시작"은 표지가 투여되는 첫 번째 시점을 지칭한다. 표지화의 시작 후, 표지화된 타우가 확실하게 검출되자마자 표본 수집이 시작될 수 있는데, 이것은 표지화의 시작으로부터 한 시간 또는 그 이상의 시간 내에 일어날 수 있다.
"항정 상태"는 특정된 기간에 걸쳐 계측된 파라미터에서 변화가 미미한 상태를 지칭한다.
"합성율"은 관심되는 생체분자가 합성되는 비율을 지칭한다.
물질대사 추적 연구에서, "안정성 동위원소"는 가장 풍부한 자연발생 동위원소보다 덜 풍부한 비방사성 동위원소이다.
본원에서 이용된 바와 같이, "개체"는 중추신경계를 갖는 살아있는 생물체를 의미한다. 특히, 개체는 포유동물이다. 적합한 개체는 연구 동물, 반려 동물, 경작용 동물, 그리고 동물원 동물을 포함한다. 바람직한 개체는 인간이다.
실시예
다음 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 예시하기 위해 포함된다. 다음 실시예에서 개시된 기술은 발명의 실시에서 충분히 기능하는 것으로 발명자에 의해 발견된 기술을 대표하고, 그리고 따라서, 이의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있는 것으로 당업자에 의해 인지되어야 하다. 하지만, 당업자는 본 발명에 비추어, 개시되는 특정한 구체예에서 많은 변화가 만들어질 수 있고 발명의 사상과 범위로부터 벗어나지 않으면서 비슷한 또는 유사한 결과를 여전히 획득할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
실시예 1. 타우 면역침전 (IP) 및 질량 분광분석법 방법의 개발.
CSF 타우는 절두된 단편의 이질성 풀인 것으로 추정되고 존재비가 낮다. 가령, 어린 정상적인 대조에서 전체 타우는 대략 200pg/mL =4.4fmol/mL인 것으로 추정된다. 인간 CSF로부터 타우의 높은 회수를 달성하기 위해, 전장 타우의 N 말단 내지 C 말단의 범위에서 변하는 에피토프에 대한 다양한 타우 항체가 IP 효율에 대해 시험되었다 (표 1, 도면 2). 다양한 타우 (pg 내지 ng)를 내포하는 인간 CSF 및 피코그램 내지 나노그램의 타우를 내포하는 세포 배양 배지 (SH-SY5Y 인간 신경모세포종 및 전장 타우를 일시적으로 과다발현하는 HEK293T 세포)가 검증 검정에 이용되었다. 회수율은 N 말단 타우 ELISA (HJ8.5 포획, HJ8.7-비오틴 검출)에 의해 사정되었고, 그리고 타우의 N 말단을 인식하는 3개의 항체 (타우12, HJ8.5, 그리고 HJ8.7)는 CSF 타우에 대한 가장 높은 면역침전 효율 (평균적으로 99.3%)을 가졌다. 본 데이터는 전장 타우가 인간 CSF 내에 존재하지 않는다는 것을 암시하는데, 이것은 기존 문헌과 일치한다. N 말단 항체 HJ8.5 및 중간-도메인 항체 타우1은 CSF에서 복수 타우 종의 면역침전을 위한 최적 항체로서 확인되었다.
질량 분광분석법 (MS) 분석을 이용하여 타우 펩티드를 정량하기 위해, 면역침전된 타우는 차후에, 37℃에서 16 시간 동안 400ng 트립신으로 소화되었다. 소화의 대안적 효소 및 지속 기간 역시 이용될 수 있다. 소화된 표본은 Toptip C18 칼럼 (glygen)을 이용하여 탈염되거나 또는 청소되었다. 청소 이후에, 표본은 건조되고, 2% 아세토니트릴 및 0.1% 포름산에서 재현탁되고, 그리고 나노 LC-MS 분석 (Thermoscientific TSQ, 또는 Thermoscientific Orbitrap Fusion)을 위해 주입되었다. 펩티드 지문확인에 의해, 우리는 인간 CSF, SH-SY5Y 배지 (실시예 2 참조), 그리고 인간 타우를 과다발현하는 HEK293T로부터 배지에서 타우로부터 복수 단편을 검출하였는데, 이들은 단일 또는 이중 류신을 갖는 펩티드, 예를 들면, TPSLPTPPTR (서열 번호: 2) 및 LQTAPVPMPDLK (서열 번호: 7)를 포함하였다. TPSLPTPPTR (서열 번호: 2)은 모든 표본에서 가장 크고 가장 일관된 신호를 가졌고, 그리고 따라서, 13C6-류신 표지화된 타우의 정량의 추가 분석에 이용되었다.
TPSLPTPPTR 펩티드 (서열 번호: 2)에 대한 표준 곡선을 산출하기 위해, 타우를 과다발현하는 HEK293T가 배지 내에 표지화된 세포외 타우의 수집을 위한 13C6-류신 표지화된 배지와 함께 배양되었다. 간단히 말하면, HEK293T 세포는 0%, 0.078%, 0.156%, 0.312%, 0.625%, 1.250%, 그리고 2.5%에서 13C6-류신으로 표지화되었고, 그리고 표지화된 세포 배지는 앞서 설명된 IP/MS 방법에 종속되었다. 표준 곡선은 예측된 및 계측된 퍼센트 표지의 선형 상관을 보여주고, 그리고 TPSLPTPPTR 펩티드 (서열 번호: 2)의 검출 한계 (LOQ)가 대략 0.1%이라는 것을 암시한다 (도면 2c).
2N4R 전장 타우 에피토프
Tau12 아미노산 9-18
HJ8.5 아미노산 27-35
HJ8.7 아미노산 118-122
Tau1 아미노산 194-198
Tau5 아미노산 210-230
HJ9.3 아미노산 306-321
HJ9.1 아미노산 392-399
Tau7 아미노산 430-441
실시예 2. 시험관내에서 타우의 안정성 동위원소 표지화 동역학 (SILK).
시험관내에서 타우 SILK 방법의 실행가능성을 시험하기 위해, 2가지 세포 배양 모형이 원리 증명 실험에 이용되었다. 첫 번째 모형에서, SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포가 이용되었는데, 그 이유는 이들 세포가 배지에서 세포외 타우를 생산하는 것으로 이전에 밝혀졌기 때문이다. SH-SY5Y 세포는 배양되고, 6 일 동안 50% 13C6-류신 표지화된 배지로 표지화되고, 그 이후에 6 일의 비표지화가 뒤이었고, 그리고 배지 및 세포 용해물이 수집되고 타우에 대한 IP/MS 분석에 종속되었다 (도면 1a). 표지화된 타우를 정량하기 위해 TPSLPTPPTR (서열 번호: 2)을 이용하여, 우리는 용해물 및 배지 내에서 40-50% 13C6-류신 전구체를 향한 표지화에서 꾸준한 증가를 관찰하였다 (도면 1b). 용해물과 비교하여 배지에서 표지화된 타우의 검출 전에 2 내지 3 일 지연이 관찰되었는데, 이것은 표지화된 타우를 용해물로부터 배지로 방출하는데 2 내지 3 일이 소요된다는 것을 암시한다. 기준선을 향한 표지화에서 꾸준한 감소가 또한, 12C6-류신 배지로 다시 전환한 후에 배지 및 용해물에서 관찰되었다. 생산 곡선 상에서 2-3 일차에 (용해물) 또는 5-6 일차에 (배지) 20-25% 표지화 (즉, 50% 표지의 표지화된 류신 전구체의 절반)에 근거하여, 우리는 용해물 및 배지에서 세포외 타우의 반감기가 대략 3 일이라고 추정한다.
두 번째 모형에서, 프레세닐린 1 돌연변이체 H163R (PSmt) 보유자 및 비-보유자 (Ctrl)의 피부 섬유모세포로부터 획득된 유도된 다능성 세포 (iPSCs)가 이용되었다. 이들 iPSCs는 뉴런으로 분화되고 타우 SILK 방법에 종속되었다. AD 환자로부터 iPSCs는 배지에서 증가된 타우를 분비하는 것으로 이미 보고되었다. 이들 실험에서, iPSCs는 6 일의 50% 13C6-류신 표지화된 배지, 그 이후에 6 일의 비표지화에 종속되었다 (도면 1a). 단지 배지만 수집되었다. 타우 류신 표지화를 정량하기 위해 TPSLPTPPTR (서열 번호: 2)을 이용하여, 우리는 배지 내에서 20% 13C6-류신 전구체를 향한 표지화에서 꾸준한 증가를 관찰하였다 (도면 1c). 6 일은 50% 표지화에 도달하는데 충분하지 않았고, 그리고 표지화는 정규 배지로 다시 전환한 후에 계속 증가하였다. SH-SY5Y 세포 및 iPSC 뉴런 사이에 표지화 곡선에서 차이는 iPSCs는 종말 분화된 세포인 반면, SH-SY5Y 세포는 분열하는 세포라는 사실에 기인할 수 있다. 흥미롭게도, PSmt는 더욱 가파른 생산 곡선을 가졌는데, 이것은 타우의 생산이 PSmt의 iPSC 뉴런에서 증가된다는 것을 암시한다.
이들 시험관내 원리 증명 실험은 2가지 세포 배양 모형을 이용한 타우 트립신 펩티드, TPSLPTPPTR (서열 번호: 2)의 정량을 보여준다. 종합하면, 이들 결과는 타우 SILK 연구가 인간에서 실현가능하다는 것을 강하게 암시한다.
실시예 3. 인간에서 타우의 안정성 동위원소 표지화 동역학 (SILK).
도면 3은 본 발명의 방법의 한 구체예의 개요를 도시한다. 간단히 말하면, 정상적인 대조 (NC) 개체 (32-73세)는 미리 포장된 낮은 류신 식이에 배정되고, 그리고 5 (NC01) 또는 10 (NC02, NC03, NC05, NC06, NC07, NC08) 일 동안 13C6-류신으로 표지화되었다. 13C6-류신은 330 mg의 분말을 Kool-Aid 내로 용해시키고, 그리고 1g의 총 가용성 일일량을 위해 하루 3회 흡음함으로써 참가자에게 투여되었다. 표지화 기간 동안, 야간 공복 채혈이 혈장 류신 계측을 위해 1 일차 및 10일차에 수행되었다. 표지화 후, 참가자는 정상 식이를 재개하였다. 요추 천자 (LPs) 및 채혈이 표지화가 시작된 후 대략 14 일, 28 일, 42 일, 그리고 67-84 일에 수행되었다 (실제 시점은 참가자 사이에 약간씩 달랐다). 1mL의 각 CSF 표본은 인간 타우를 계측하기 위해 면역침전 / 질량 분광분석법 (IP/MS) 방법에 종속된다. 간단히 말하면, 타우는 타우 특이적 항체를 이용하여 생물학적 표본으로부터 면역침전되고, 그리고 이후, 소화되어 류신을 포함하는 복수 펩티드를 유발한다 (도면 2). 특히, 트립신이 소화에 이용될 수 있고, 그리고 펩티드 TPSLPTPPTR (서열 번호: 2)이 정량에 이용될 수 있다. 다른 효소 및 펩티드 역시 이용될 수 있다.
생체내에서 타우 SILK 방법을 검증하기 위해, CSF 표본이 5 (NC01) 또는 10 일 (NC02, NC03, NC05, NC06) 일 동안 13C6 류신이 경구 투여된 5명의 정상적인 대조 (NC) 참가자로부터 초기에 획득되었다 (도면 4). 이들 개체에 대한 인간 CNS에서 타우의 반감기는 대략 15 일이다. 타우의 반감기의 정확한 척도는 범위, 다시 말하면, 약 10 내지 약 30 일을 갖는다. 도면 5는 2명의 추가 참가자 (즉, NC07 및 NC08)로부터 데이터를 포함한다. 이들 2명의 추가 개체의 포함 후, 반감기는 대략 19.6 일인 것으로 결론이 나고, 범위는 초기 계산과 유사하였다 (13-30 일, CV 32.2%).
도면 4 및 도면 5에서 타우 활동 곡선은 타우 전환이 전체 단백질보다 느리다는 것을 집합적으로 보여준다. 10 일의 경구 표지화로, 13C6-류신 (유리 아미노산 풀)의 견실한 표지화가 혈장 (2-3%)에서 달성될 수 있었는데, 이것은 추적자 농도가 제어된 류신 식이 동안 충분한 수준에 도달하였다는 것을 지시한다 (도면 5a). CNS 타우 표지화 곡선은 느린 상승 (10-30 일) 및 하락 (+80 일)을 전시하였는데, 이것은 CNS 타우의 느린 회전율을 지시한다 (도면 5b).
실시예 4. 타우 활동 모형.
제한된 숫자의 계측 시점으로부터 완전한 활동 곡선을 획득하고 타우의 반감기를 계산하기 위해, 혈장 류신, CSF 타우, CSF 전체 단백질, 그리고 혈장 전체 단백질 추적자 표지화 동역학을 설명하는 구획 모형이 개발되었다 (10 d의 1 g/일 경구 13C6-류신). 동일한 표본 내에서 동역학이 계측된 다른 느린 전환 단백질, SOD1 역시 비교를 위해 상기 모형 내에 포함되었다. 데이터 수집의 복수 시야를 설명하는 포괄적인 모형이 전환 동역학을 사정하는 이전에 활용된 "모형-독립된" 방법보다 바람직한데, 그 이유는 이것이 전구체 (즉, 혈장 류신) 시간 코스의 모양을 고려하기 때문이다. 가령, 단일지수적 기울기 분석은 기울기 분석의 기간 동안 산물 단백질 내에서 어떤 추적자 통합도 발생하지 않는다, 다시 말하면, 전구체 풀 (혈장 류신)이 어떤 표지도 내포하지 않는다고 가정한다. 긴 반감기 및 장기간 표지화를 갖는 단백질에서, 구획 모형은 전구체 풀의 농축을 시간의 함수로서 설명하는데 필요하다. 상기 모형은 10 일에 걸쳐 혈장 내로 경구 추적자의 3x/일 출현, 그리고 추적자 섭취 이후에 84 일까지 혈장 류신 시간 코스의 모양을 설명하는 전신 혈장 단백질 풀로 시작한다. 뇌 (CSF 포함) 및 혈장 단백질은 혈장으로부터 추적자 류신을 도출하고, 따라서 혈장 류신 시간 코스의 모양은 이들 단백질의 형성에 대한 추적자 이용가능성의 시간 코스를 규정한다. 상기 모형은 일차 속도 상수 k(i,j)에 의해 연결된 일련의 구획으로 구성되는데, 이들은 하루에 구획 i에 수송된 구획 j의 분율을 반영한다.
이러한 추적자 입력 시간 코스가 규정되면, 각 단백질에 대한 SILK 곡선의 모양은 이의 분할 교체율 (FTR) 또는 비가역성 상실에 의해 독특하게 결정된다. 한 개체에 대한 결과는 도면 6에서 도시된다. 개체 NC02, NC03, NC04, NC05, NC06, NC07 및 NC08에 대한 결과는 각각, 도면 7b-g에서 도시된다. 참가자의 분할 교체율 (FTR), CNS 타우의 반감기, 그리고 다른 정보 (연령, 체중, 신장, BMI, 성별 및 인구학)의 요약은 아래 표 2에서 도시된다.
Figure 112017040393012-pct00001
실시예의 방법.
13 C 6 -류신 표지화된 타우 표준 곡선의 준비 : 표지화된 배지 표준은 HEK293T 세포에서 일시적으로 과다발현된 전장 (FL. 2N4R) 타우를 표지화함으로써 제조되었다. HEK293T 세포는 10% 소 태아 혈청 (Sigma, F6178)으로 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 (DMEM, Sigma, D5546)에서 성장되고, 그리고 형질감염 전날에 6-웰 평판으로 분할되었다. 형질감염의 당일에, 배지는 2.5%, 1.25%, 0.625%, 0.312%, 0.156%, 0.078% 및 0%의 최종 추적자 대 흔적 비율 (TTR)까지 1.05g/L의 12C6-류신을 내포하는 DMEM 내로 13C6-류신 (Cambridge Isotopes, CLM-2262)으로 스파이크되었다. HEK293T는 Fugene HD (Promega, E2312)를 이용하여 FLtau-pcDNA3.1로 일시적으로 형질감염되었다. 배지 및 세포는 6 일 후 수확되었다. 배지는 15K g에서 5 분 동안 회전되었고, 그리고 상층액은 인간 CSF 타우로부터 획득된 신호에 정합하도록 희석되고, 분취되고, 그리고 이후, -80℃에서 동결되었다. 세포는 PBS로 1회 세척되고, 단백질분해효소 저해제 칵테일 (Roche, 04693116001)을 포함하는 차가운 PBS에서 수집되고, 15K g에서 5 분 동안 회전되고, 이후 분취량이 -80℃에서 동결되었다.
13 C 6 -류신 표지화된 타우 및 혈장 유리 13 C 6 -류신의 단리 및 질량 분광계 분석 : CNBr-활성화된 세파로오스 비드 (GE Healthcare 17-0430-01)가 비드의 g당 3mg 항체의 농도에서 타우12, 타우1, 타우5 항체 (생쥐 단일클론, Michigan State University에서 Dr. Skip Binder 및 Nick Kanaan에 의해 제공됨), HJ8.5, HJ8.7, HJ9.3, HJ9.1 (생쥐 단일클론, Dr. David Holtzman 및 Hong Jiang에 의해 제공됨)에 교차연결되었다. 가용성 타우는 세정제 (1% NP-40), 무질서 시약 (5mM 구아니딘), 그리고 단백질분해효소 저해제 (Roche 완전 프로테아제 저해제 칵테일)에서 참가자로부터 1mL의 인간 CSF, Barnes-Jewish Hospital Neurology Critical Care Unit (St. Louis, MO)로부터 수집된 인간 CSF 및 세포 배양 배지 (SH-SY5Y 인간 신경모세포종 및 전장 타우를 일시적으로 과다발현하는 HEK293T 세포)로부터 면역침전되었다. 타우 항체 비드의 30uL의 50% 슬러리가 실온에서 90 분 동안 상기 용액과 함께 회전되었다. 이들 비드는 0.5M 구아니딘에서 1회 및 25mM 트리에틸 암모늄 중탄산염 완충액 (TEABC, Fluka 17902)에서 2회 세척되었다. 결합된 타우는 37℃에서 16 시간 동안 400ng 질량 분광분석법 등급 트립신 (Promega, V5111)으로 비드 상에서 소화되었다. 트립신 소화액은 제조업체의 사용설명서에 따라, TopTip C18 (Glygen, TT2C18.96) 위에 적하되고, 탈염되고, 청소되고, 용리되었다. 용리된 펩티드 용액은 진공 원심분리기 (CentriVap 농축기 Labconco)에 의해 건조되고, 그리고 MS 등급 물에서 2% 아세토니트릴 및 0.1% 포름산의 25uL의 용액에서 재현탁되었다. 펩티드 재현탁의 5uL 분취량은 나노-Acquity LC 및 MS 분석에 종속되었다. 나노-Acquity LC (Waters Corporation, Milford, MA)는 HSS T3 130C18 100μm x 100mm 칼럼으로 적합되고, 그리고 용액 A 및 B의 0.5 μl/분의 유속의 구배가 펩티드를 분리하는데 이용되었다. 용액 A는 MS 등급 물에서 0.1% 포름산으로 구성되었고, 그리고 용액 B는 아세토니트릴에서 0.1% 포름산이었다. 펩티드는 8 분 동안 용액 B의 2% 내지 20%, 이후 다른 3 분 동안 20% 내지 40% 용액 B의 구배로 칼럼으로부터 용리되고, 그 이후에 칼럼을 청소하기 위해 다른 3 분 동안 85% 용액 B까지 램핑되었다. Orbitrap Fusion은 nanoflex 전기분무 공급원 (Thermo Scientific, San Jose, CA)이 구비되었다. 이온-공급원 내로 분무된 펩티드 이온은 표적화되고 사중극에서 단리되고, 이들은 이후, HCD에 의해 단편화되고 60,000의 분해능에서 Orbitrap에서 검출되었다. 표지화된 타우 펩티드는 표지화되지 않은 펩티드와 공동용리하고, 그리고 둘 모두 순차적으로 단편화되었다. 이들의 크로마토그래피 피크 프로필 아래 면적이 계산되고 면적비로서 표시되었다.
각 시점에서 혈장 내에 전구체 13C6-류신의 퍼센트 농축을 결정하기 위해, 혈장 단백질은 4℃에서 하룻밤 동안 10% 삼염화아세트산으로 침전되고, 이후 21,000xg에서 10 분 동안 회전시킴으로써 제거되었다. 상층액 내에 유리 아미노산은 N-헵타플루오로부티릴 n-프로필 에스테르 유도체로 전환되었고, 그리고 13C6-류신에 대한 동위원소 농축 [질량/전하 비율 (m/z) 349 및 355]은 앞서 설명된 바와 같이 가스 크로마토그래피 (GC)-음성 화학적 이온화-MS (Agilent 6890N 가스 크로마토그래프 및 Agilent 5973N 질량 선택적 검출기)에 의해 분석되었다23. 전체 단백질 내로 13C6-류신 통합의 계측은 50 μL의 조직 용해물을 4℃에서 하룻밤 동안 10% TCA 침전에 종속시키고, 표본을 21,000xg에서 10 분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 그리고 펠렛을 차가운 10% TCA 용액에서 2회 초음파처리함으로써 결정되었다. 이들 펠렛은 이후, 110℃에서 24 시간 동안 6 N HCl에서 산 가수분해에 종속되었다. 양이온-교환 크로마토그래피 (50W-X8 수지)가 이후, 6N NH4OH를 용리 완충액으로 이용하여 결과의 아미노산을 단리하는데 이용되었다. 표본은 이후, 고속 진공에서 건조되고 GC-MS를 위해 처리되었다. 추적자 농축이 증가함에 따라서 발생하는 추적자: 흔적 비율 (TTRs)에서 바이어스를 설명하기 위해, TTR은 방정식: MFL = (TTR)/(1+TTR)을 이용함으로써 몰 분율 표지 (MFLs)로 전환되었다.
인간 개체: 인간 개체를 수반하는 연구는 Washington University Human Studies Committee 및 General Clinical Research Center (GCRC)에 의해 승인되었다. 모든 참가자로부터 사전 동의가 획득되었다. 참가자는 물리적 및 신경학적 검사로 구성되는 초기 선별검사 방문을 받았다. 배제 기준은 병력 또는 검사에 의한 신경학적 장애의 증거, 입에 의해 식품 및 음료를 안전하게 섭취하는 능력 없음, 정상보다 2배 이상 큰 실험실 값, 특별식 (가령, 글루텐-없는), 임신, 리도카인에 대한 알레르기, 출혈 장애의 병력, 또는 요추 천자에 대한 금기를 포함하였다. 참가자는 이후, 미리 포장된 낮은 류신 식이에 배정되고 10 일 동안 13C6-류신으로 표지화되었다. 낮은 류신 식이 (약 2000 mg 류신/일)는 Washington University Research Kitchen에서 영양사에 의해 준비되고, 참가자에게 건네지고, 이후 집에서 소비되었다. 식품 섭취는 자가-보고된 식품 저널에 의해 모니터링되었다. Cambridge Isotope Laboratories로부터 획득된 13C6-표지화된 류신 (CLM-2262)이 330 mg의 분말을 120 mL의 Kool-Aid 내로 용해시킴으로써 참가자에게 투여되었다. 참가자는 1 g의 전체 가용성 일일량을 위해 이러한 13C6-류신을 하루 3회 흡음하였다. 표지화 기간 동안, 야간 공복 채혈이 1 일차 및 10 일차에 수행되었다. 표지화 후, 참가자는 정상 식이를 재개하였다. 요추 천자 및 채혈이 표지화가 시작된 후 대략 14 일, 28 일, 42 일, 그리고 67-84 일에 수행되었다 (실제 시점은 참가자 사이에 약간씩 달랐다).
혈액은 1800xg에서 10 분 동안 원심분리되었고, 그리고 상층액 (혈청)은 낮은 결합 1.5 mL 튜브 내로 분취되고, 드라이아이스 위에서 동결되고, 그리고 -80℃ 에서 보관되었다. CSF는 4℃에서 10 분 동안 1000xg에서 회전되었고, 그리고 1 mL 분취량이 낮은 결합 1.5 mL 튜브 내로 배치되고, 드라이아이스 위에서 동결되고, 그리고 -80℃에서 보관되었다.
활동적 데이터의 구획 모형화: 모형화는 앞서 설명된 바와 같이 SAAM II 소프트웨어 (Resource for Kinetic Analysis, University of Washington, Seattle)를 이용하여 수행되었다23. 이러한 모형은 일차 속도 상수 k(i,j)에 의해 연결된 일련의 구획으로 구성되는데, 이들은 하루에 구획 i에 수송된 구획 j의 분율을 반영한다. 혈장 유리 13C6-류신에 대한 활동 데이터는 도면 4에서 설명된 바와 같이 구획 모형 내로 통합되었다. TPSLPTPPTR 펩티드가 모형화에 이용되었는데, 그 이유는 이것이 가장 견실한 LC-MS 신호를 가졌기 때문이다.
SEQUENCE LISTING <110> WASHINGTON UNIVERSITY BATEMAN, Randall HOLTZMAN, David SATO, Chihiro MAWUENYEGA, Kwasi MILLER, Tim <120> TAU KINETIC MEASUREMENTS <130> 047563-494936 <150> US 62/057,853 <151> 2014-09-30 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met Gly 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser 305 310 315 320 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln 325 330 335 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser 340 345 350 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 355 360 365 Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala 370 375 380 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 385 390 395 400 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 405 410 415 Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val 420 425 430 Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 435 440 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Arg Ser Gly Tyr Ser 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys 1 5 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val Asp Glu Gly 1 5 10 15 Ala Pro Gly Lys 20 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys 1 5 10

Claims (20)

  1. 다음 단계를 포함하는, 개체에서 타우의 물질대사를 계측하기 위한 시험관내 방법:
    (a) 개체로부터 얻은 최소한 하나의 생물학적 표본으로부터 표지화된 타우, 또는, 표지화된 타우와 표지화되지 않은 타우를, 타우의 N-말단 또는 중간-도메인 내부에서 친화성을 가지는 시약을 사용하여 분리하는 단계, 이 때 상기 각 생물학적 표본은 뇌척수액 (CSF) 표본이며, 이때 타우는 가용성(soluble) 타우이며;
    (b) 각 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양, 또는 표지화된 및 표지화되지 않은 타우의 양을 질량 분광분석법으로 검출 및 계측하는 단계; 그리고
    (c) 단계 (b)의 측정치들을 이용하여 타우의 물질대사를 계산하는 단계, 이 때 소정의 시점에서 생물학적 표본에서 표지화된 타우의 양은 타우의 물질대사를 반영하고; 그리고
    이때, (i) 상기 개체는 하루 이상의 일차에 최소한 하나의 표지화된 아미노산을 제공받고, 그리고 (ii) 제공받은 후 5일차 내지 20일차, 20 일차 내지 40 일차, 40 일차 내지 100 일차, 또는 이들의 조합 일차에 최소한 하나의 생물학적 표본을 개체로부터 수집한다.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 시약은 타우의 아미노산 9-18 또는 194-198 내부에서 친화성을 가지는 시약인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 시약은 타우의 아미노산 9-18 또는 194-198 내부에서 친화성을 가지는 항체임을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 개체에게 0일차 내지 3일차의 2 이상의 일차에 표지화된 아미노산이 투여되었음을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 개체에게 0일차 내지 5일차의 2 이상의 일차에 표지화된 아미노산이 투여되었음을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 개체에게 0일차 내지 10일차의 2 이상의 일차에 표지화된 아미노산이 투여되었음을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 개체에게 표지화된 아미노산이 매일 투여되었음을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 1 또는 2에 있어서, 표지화된 아미노산은 비방사성 동위원소로 표지화된 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 비방사성 동위원소는 2H, 13C, 15N, 17O, 18O, 33S, 34S, 그리고 36S로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 1 또는 2에 있어서, 표지화된 아미노산은 13C6 류신인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 개체에게 표지화된 아미노산이 정맥내 또는 경구 투여되었음을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 타우는 면역침전에 의해 분리됨을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 표지화된 아미노산은 상기 생물학적 표본에서 0.1%, 0.2%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 0.1 내지 20%, 그리고 0.1 내지 10%로 구성된 군에서 선택되는 양의 표지화된 아미노산을 생산하도록 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 1 또는 2에 있어서, 개체는 설치류인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 1 또는 2에 있어서, 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 방법은 청구항 1의 단계 (c)에서 결정된 표지화된 및/또는 표지화되지 않은 타우의 양을 이용하여 타우 물질대사의 물질대사 파라미터를 계산하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 물질대사 파라미터는 상대적 표지화, 분할 합성율, 분할 청소율, 절대 합성율, 절대 청소율, 분할 교체율, 지체 시간, 반감기, 피크 시간, 그리고 피크 높이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 청구항 1 또는 2에 있어서, 타우는 (2N 3R), (2N 4R), (1N 3R), (1N 4R), (0N 3R), 그리고 (0N 4R)로 구성된 군에서 선택되는 타우 아이소형인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 청구항 1 또는 2에 있어서, 타우는 인산화된 타우 아이소형인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 삭제
  20. 삭제
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