ES2714692T3 - Tratamiento de tauopatías - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo especifico para la proteina tau truncada preovillo soluble, no mostrando dicho anticuerpo union y/o reactividad para la proteina tau normal, para su uso en el tratamiento o la prevencion de la EA, en donde el uso desacelera, reduce o previene la acumulacion, la agregacion y/o la polimerizacion de la tau truncada, en donde la proteina tau truncada es tau1-421 (ΔTau), o un fragmento C-terminal de la misma, el fragmento C-terminal de la misma es tau411-421, tau412-421, tau413-421, tau414-421, tau415-421, tau416- 421, tau417-421 o tau418-421, la proteina tau normal es hTau40, y el anticuerpo reconoce especificamente el fragmento C-terminal en una tau escindida por caspasa, pero no reconoce la misma secuencia en la proteina tau normal.

Description

DESCRIPCION

Tratamiento de tauopatias

Antecedentes de la invencion

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa cronica progresiva comun, en la que hay una perdida irreversible de funciones cognitivas y conductuales. La enfermedad puede persistir por mas de 10 anos, pasando de smtomas leves a manifestaciones extremadamente graves. Se dice que la EA afecta aproximadamente al 10 % de la poblacion de mas de 65 anos y a mas del 30 % de la poblacion de mas de 80 anos.

Desde el punto de vista patologico, La enfermedad de Alzheimer se presenta como placas amiloides extracelulares y ovillos neurofibrilares intracelulares. Los ovillos neurofibrilares estan compuestos, por ejemplo, de la proteina de union a microtubulos tau, que se ensambla en filamentos helicoidales y rectos emparejados. Se ha sugerido que estas entidades pueden estar vinculadas funcionalmente, aunque los mecanismos por los que la deposicion amiloide propicia el ensamblaje patologico de filamentos de tau no estan claros.

El denominador comun de las estructuras neurofibrilares intracelulares (ovillos neurofibrilares, neuritas distroficas y ovillos neurofilos) son los filamentos helicoidales emparejados (los FHE). La subunidad proteica principal de los FHE es la proteina asociada a los microtubulos tau, en una forma hiperfosforilada de forma anormal (Grundke-Iqbal et al., 1986; Wischik et al., 1988 a,b). Las neuronas con cambios neurofibrilares degeneran, y el grado de esta degeneracion se correlaciona directamente con el grado de demencia en los individuos afectados (Blessed et al., 1968).

Tau normal es una proteina asociada a microtubulos que se distribuye principalmente en los axones. La proteina tau participa en la modulacion del ensamblaje, la organizacion espacial y el comportamiento de los microtubulos (MT) en las neuronas y, probablemente, en los cuerpos de los gliocitos (Drewes et al., 1998; Drubin y Kirschner, 1986; Lo-Presti et al., 1995). Las proteinas tau estan codificadas por un unico gen ubicado en el cromosoma 17, pero se detectan como multiples isoformas en extractos de tejidos de cerebros de adulto (Goedert et al., 1989; Himmler A., 1989; Kosik et al., 1989). La heterogeneidad de las proteinas tau se debe en parte a corte y empalme alternativo, dando lugar a seis isoformas en el cerebro humano adulto. Estas distintas isoformas difieren en la presencia o ausencia de insertos de 29 o 58 aminoacidos en la region amino terminal y por la adicion o delecion de una repeticion en tandem (que puede estar repetida 3 o 4 veces) en una region carboxilo terminal de tau denominada dominio de union a microtubulos. Esta region esta compuesta por repeticiones imperfectas de 31 o 32 restos de aminoacido. En referencia a la isoforma de la proteina tau humana mas larga, htau40, que contiene todos los insertos (441 aminoacidos de longitud) en humanos, la isoforma de tau mas pequena contiene 352 restos de aminoacido con tres repeticiones en tandem en el dominio de union a MT y sin insertos amino terminales, mientras que la isoforma mas grande contiene 441 restos con cuatro repeticiones y ambos insertos amino terminales.

Se sabe que varias enfermedades neurologicas tienen inclusiones celulares filamentosas que contienen la proteina tau asociada a microtubulos, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer (EA), paralisis supranuclear progresiva (PSP), degeneracion corticobasal (DCB), enfermedad de Pick (EPi) y un grupo de trastornos relacionados denominados de forma colectiva demencia frontotemporal con parkinsonismo asociada al cromosoma 17 (DFTP-17), esclerosis lateral amiotrofica (ELA), enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), demencia pugilistica (DP), enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker (EGSS), enfermedad con cuerpos de Lewy y enfermedad de Huntington (Dickinson et al., 1998; DiFiglia et al., 1997; Forno, 1986; Hirano y Zimmerman, 1962; Nishimura et al., 1995; Prusiner 1996; Reed et al., 1998; Roberts, 1998; Schmidt et al., 1996; Shankar et al., 1989; Spillantini et al., 1998). Aunque la etiologia, los sintomas clinicos, los hallazgos patologicos y la composicion bioquimica de las inclusiones en estas enfermedades son distintos, hay nuevas evidencias que sugieren que los mecanismos implicados en la agregacion de proteinas celulares normales para formar diversas inclusiones filamentosas son comparables. Se cree que una alteracion inicial en la conformation de la proteina tau asociada a microtubulos, que inicia la generation de nucleos o puntos de inicio para el ensamblaje de filamentos, es una de las caracteristicas clave. Este proceso puede verse influenciado por la modification postraduccional de proteinas normales, por la mutation o la deletion de determinados genes y por factores que se unen a proteinas normales y, asi, alteran su conformacion.

La proteina tau es muy hidrofila y es una de las proteinas mas solubles conocidas. Se puede extraer facilmente de tejido cerebral o de celulas cultivadas. Por lo tanto, la agregacion de la proteina tau en la EA es altamente sospechosa. En comparacion, la tau filamentosa extraida de tejidos cerebrales afectados de enfermedad de Alzheimer es relativamente insoluble. Ademas de la fosforilacion, las tau insoluble y soluble normal difieren en el grado de modificaciones postraduccionales, las cuales incluyen glucosilacion, glucacion, ubiquitinacion y racemizacion (Kenessey et al., 1995; Ko et al., 1999; Mori et al., 1987; Wang et al., 1996; Yan et al., 1994).

Anteriormente se ha informado de que la tau en los depositos neurofibrilares del cerebro con EA esta truncada en su extremo C en el resto de acido glutamico Glu391(Novak, et al., 1989; Novak et al., 1993). El truncamiento de tau en Glu391 conduce a cambios conformacionales especificos para la EA que son reconocidos por el anticuerpo conformacional MN423 (Novak, et al., 1989; Novak, et al., 1993; Csokova, et al., 2006; Skrabana, et al., 2006; y Skrabana et al., 2007).

El mecanismo por el cual la proteina tau se modifica para participar en la formacion de filamentos en la EA es desconocido. La fosforilacion de tau afecta el potencial de tau para formar agregados, produciendo efectos estimulantes o inhibidores, presumiblemente dependiendo del sitio de fosforilacion (Crowther et al., 1994; Schneider et al., 1999). La hiperfosforilacion de tau en muchos sitios parece preceder el ensamblaje en filamentos, basandose en hallazgos en lmeas de raton que expresan tau humana con mutaciones de FTDP-17T (Lewis et al. 2000; Allen et al., 2002). Muchos estudios in vitro tomados en conjunto sugieren (a) que el dominio de union a microtubulos es importante para el ensamblaje de los filamentos de tau; y (b) que la formacion de filamentos de tau precisa un cambio (o cambios) conformacional de tau. Estos estudios tambien indican que ninguna de las modificaciones de tau descritas en ellos tiene la capacidad de inducir formaciones filamentosas de tau que se correlacionen con la expresion clinica de la enfermedad de Alzheimer.

Asuni et al., "Immunotherapy Targeting Pathological Tau Conformers in a Tangle Mouse Model Reduces Brain Pathology with Associated Functional Improvements", Journal of Neuroscience, 27 (34): 9115-9129 (2 agosto de 2007) discutieron un estudio en el que buscaron determinar la eficacia de la inmunizacion activa dirigida contra los conformeros de tau fosforilada en el SNC mediante la inmunizacion de ratones P301L con un epitopo de tau fosforilado, con el analisis posterior de la patologia de tau y las afectaciones funcionales asociadas. Determinaron que la inmunizacion activa con un epitopo de tau fosforilado Tau 379-408 (P-ser³⁹⁶, 404) reduce la tau agregada en el cerebro y ralentiza la progresion del fenotipo conductual relacionado con ovillos en los ratones.

Gamblin et al. "Caspase Cleavage of Tau: Linking Amyloid and Neurofibrillary Tangles of Alzheimer's Disease", PNAS vol. 100, n.° 17, pag. 10032-10037 (19 de agosto de 2003), informaron que multiples caspasas proteolizan a tau en un resto de aspartato altamente conservado (Asp⁴²¹) en su extremo C in vitro y en neuronas tratadas con peptido amiloide-p (Api-42). Se informo que tau se escindio rapidamente en Asp⁴²¹ en neuronas tratadas con Ap (en 2 horas) y que su proteolisis parece preceder a los sucesos de apoptosis nucleares. Gamblin et al. tambien demostraron que la escision por caspasa de tau genera una proteina truncada que carece de sus 20 aminoacidos C-terminales y se ensambla in vitro mas rapidamente y de forma mas extensa en filamentos de tau que tau de tipo silvestre. Usando un anticuerpo monoclonal que reconoce especificamente tau truncada en Asp⁴²¹, Gamblin et al. demostraron que tau se escinde proteoliticamente en este sitio en las patologias fibrilares del cerebro con EA y sugirieron que los peptidos Ap propician en las neuronas el ensamblaje patologico de filamentos de tau al desencadenar la escision por caspasa de tau y generar un producto proteolitico con una cinetica de polimerizacion potenciada.

Delobel et al., "Analysis of Tau Phosphorylation and Truncation in a Mouse Model of Human Tauopathy", American Journal of Pathology, Vol. 172, n.° 1, pag. 123-131 (enero de 2008), investigaron la evolucion temporal de la aparicion de tau fosforilada y truncada en el cerebro y la medula espinal de ratones transgenicos para la proteina tau P301S humana. Informaron que la tau soluble estaba fuertemente fosforilada entre los 1 a 6 meses, y se detectaron bajos niveles tau fosforilada, insoluble en sarcosil a los 2 meses, con un aumento estable hasta los 6 meses de edad. Informaron ademas que la tau truncada en D421 se detecto a niveles bajos en tau soluble en Tris y soluble en detergente a los 3-6 meses de edad. Llegaron a la conclusion de que la aparicion tardia y la baja abundancia de tau que termina en D421 indican que es improbable que el truncamiento en este sitio sea necesario para el ensamblaje de tau en filamentos.

Zhang et al., "Truncated Tau at D421 is Associated with Neurodegeneration and Tangle Formation in the Brain of Alzheimer Transgenic Models", Acta Neuropathol 117:687-697 (2009), analizaron las relaciones espaciales entre el truncamiento de tau, la fosforilacion de tau y la neurodegeneracion o formacion de ovillos en ratones con tau P302L y en un modelo de raton triple transgenico que produce placas amiloides y ovillos neurofibrilares. Informaron que se detectaron unas pocas neuronas que contenian abundante tau truncada pero que carecian de hiperfosforilacion, y estas neuronas presentaban condensation nuclear, mientras que la tau truncada se asocio comunmente con una alta inmunorreactividad de la tau hiperfosforilada y una tincion densa con plata de Gallyas. Llegaron a la conclusion de que el truncamiento de tau aparece despues de la hiperfosfforilacion de tau en el cerebro de estos dos modelos de raton transgenico, y que la acumulacion de tau truncada, en ausencia o en presencia de tau fosforilada, esta estrechamente asociada con un subconjunto de neuronas que experimentan degeneration o que contienen ovillos neurofibrilares.

Asimismo, Khurana, et al., 2010), " Lysosomal Dysfunction Promotes Cleavage and Neurotoxicity of Tau InVivo", PLoS Genet 6(7): e1001026. doi:10.1371/journal.pgen.1001026, demostraron que la elimination de la catepsina D en neuronas postmitoticas adultas conduce a una expansion lisosomica anomala y a la activation de la caspasa in vivo, lo que sugiere un mecanismo para el truncamiento C-terminal de tau. Llegaron a la conclusion de que la escision por caspasa de tau puede ser un mecanismo molecular a traves del cual la disfuncion lisosomica y la neurodegeneracion estan asociadas causalmente en la EA.

Sigurdsson, "Tau-Focused Immunotherapy for Alzheimer's Disease and Related Tauopathies", Current Alzheimer Research, Vol. 6, pag. 446-450 (2009), inmunizo ratones transgenicos que expresaban la mutation de tau P301L con un fragmento tau de 30 aminoacidos que contenia dos sitios de fosforilacion que son importantes en la EA (Tau 379-408[P-Ser396,404] y descubrio que la inmunizacion activa dirigida a este epitopo de fosfo-tau de EA reduce la tau agregada en el cerebro y previene/desacelera la progresion del fenotipo conductual relacionado con ovillos, incluyendo el deterioro cognitivo. Concluyo que estos anticuerpos entran al cerebro y se unen a tau patologica dentro de las neuronas, aunque el efecto terapeutico puede deberse, al menos en parte, a la depuracion de tau extracelular que pueda tener efectos biologicos.

Calignon et al., "Caspase Activation Precedes and Leads to Tangles", Nature Vol. 464/22, pag. 1201-1205 (abril de 2010), utilizando la obtencion de imágenes multifotonica in vivo para observar los ovillos y la activacion de las caspasas ejecutoras en ratones transgenicos para tau vivos (cepa Tg4510), descubrieron que la activacion de la caspasa se produce en primer lugar y precede a la formacion de ovillos entre horas y dias. Basandose en estos datos, Calignon et al. propusieron que la activacion de la caspasa escinde a tau para iniciar la formacion de ovillos, despues, la tau truncada incorpora tau normal para el plegamiento erroneo y formar enredos. Ademas, sugirieron que los ovillos estan "fuera de ruta" hacia la muerte neuronal aguda, y que la tau soluble, en lugar de la tau fibrilar, puede ser la fraccion toxica clave subyacente a la neurodegeneracion.

Kovacech et al., "Tau Truncation is a Productive Posttranslational Modification of Neurofibrillary Degeneration in Alzheimer's Disease", Current Alzheimer Research, vol. 7, pag. 708-716 (2010), concluyen que se supone que dos modificaciones postraduccionales de tau encontradas en la EA desempenan un papel inductor en la degeneration neurofibrilar; el truncamiento y la hiperfosforilacion, y que es imposible determinar de forma precisa el papel temporal de la fosforilacion en el desarrollo de la patologia de tau debido a que se sabe que las mutaciones de tau alteran la conformation de la proteina y conducen a su fosforilacion mayor y mas rapida in vitro.

Horowitz et al., "Early N-Terminal Changes and Caspase-6 Cleavage of Tau in Alzheimer's Disease", The Journal of Neuroscience, 24(36), pag. 7895-7902 (2004), informaron sobre la tincion inmunohistoquimica en una cohorte de 35 casos que variaban desde personas con deterioro cognitivo hasta una EA precoz, con un panel de tres anticuerpos anti-tau N-terminales: Tau-12, 5A6 y 9G3-pY18. De estos tres, el epitopo independiente de fosforilacion de 5A6 fue el mas temprano en surgir en las lesiones patologicas de tau, seguido de la aparicion del epitopo de Tau-12. Se informo que el desenmascaramiento del epitopo de Tau-12 en ovillos positivos para 5A6 mas maduros no se correlacionaba con la fosforilacion de tau en la tirosina 18 (9G3-pY18). El extremo N de tau se perdio mas tarde en el transcurso de la evolution de los ovillos, lo que se correlacionaba temporalmente con la aparicion de un epitopo C-terminal truncado por caspasa que carece de los restos 422-441. Ademas, la caspasa-6 escindio el extremo N de tau in vitro, previniendo la inmunorreactividad tanto con Tau-12 como con 5A6, identificandose el sitio de truncamiento por caspasa-6 in vitro como Asp13. Los autores concluyeron que sus resultados sugerian un papel para la caspasa-6 y el truncamiento N-terminal de tau durante la evolucion de ovillos neurofibrilares y la progresion de la EA.

El documento WO 2010/144711 divulga metodos y composiciones para el tratamiento, la prevention y el diagnostico de la enfermedad de Alzheimer u otras tauopatias en un sujeto, mediante la administration de un peptido tau inmunogenico o de un anticuerpo que reconoce el epitopo de tau inmunogenica en condiciones eficaces para tratar, prevenir o diagnosticar la enfermedad de Alzheimer u otras tauopatias. Ademas se describen metodos para propiciar la depuracion de los agregados en el cerebro del sujeto y para ralentizar la progresion del fenotipo conductual relacionado con la patologia de tau en un sujeto.

Seria conveniente proporcionar tratamientos que pudieran interferir en el inicio de los cambios de tau que conducen a la formacion de filamentos o que pudieran interferir con la formacion de filamentos que conduce a ovillos en enfermedades tales como la EA, y desarrollar agentes terapeuticos y formas de dosificacion para tratar, prevenir o interferir en la progresion de las tauopatias.

La cita de cualquier documento en el presente documento no pretende ser una admision de que tal documento es de la tecnica anterior pertinente o se considere material para la patentabilidad de cualquier revindication de la presente solicitud. Cualquier declaration sobre el contenido o la fecha de cualquier documento esta basada en la information disponible para el solicitante en el momento de la presentation y no constituye una admision en cuanto a la precision de tal declaracion.

Sumario de la invencion

Un objetivo de la presente invencion es, por lo tanto, proporcionar metodos de tratamiento, agentes terapeuticos y composiciones para la intervention terapeutica en y/o la prevencion de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatias.

Es un objetivo adicional de la invencion proporcionar anticuerpos que tengan la capacidad de reconocer selectivamente una tau truncada en su extremo C (por ejemplo, en el resto de acido glutamico Glu391 o en el resto de acido aspartico Asp421) o su extremo N (por ejemplo, en aminoacido Asp13) (por ejemplo, tau1-13, tau14-441, tau14-391, tau391-414, tau1-391, tau1-421, tau14-421, tau14-410, tau391-410, tau14-412, tau391-412, tau14-383, tau14-381 o tau14-355, o un fragmento de cualquiera de las anteriores). Estos anticuerpos solo reconocerian, se unirian o mostrarian reactividad con tau truncada, pero no reconoceran, se uniran o mostraran reactividad con una proteina tau normal (por ejemplo, una htau40 no truncada de longitud completa). En otras palabras, estos anticuerpos reconocerian el neoepitopo creado por la escision de tau (es decir, las secuencias de aminoacidos del extremo N libre o el extremo C libre del peptido creado por la escision de tau), pero no reconoceran la misma secuencia de aminoacidos presente en la proteina tau normal. Por lo tanto, no se espera que estos anticuerpos afecten las funciones biologicas de la proteina tau normal, y, en las realizaciones preferentes, se espera que eliminen los peptidos creados por la escision de tau y minimicen o prevengan la formacion de ovillos neurofibrilares. Por lo tanto, estos anticuerpos pueden usarse en el tratamiento y/o la prevention de la EA y otras tauopatias, y en la preparation de composiciones farmaceuticas (por ejemplo, vacunas) para el tratamiento y la prevencion de estos trastornos.

Es un objetivo adicional de la invention proporcionar anticuerpos que tengan la capacidad de reconocer selectivamente una tau truncada fosforilada de forma anormal, preferentemente, tau1-13, tau14-441, tau14-391, tau391-414, tau1-391, tau1-421, tau14-421, tau14-410, tau391-410, tau14-412, tau391-412, tau14-383, tau14-381 o tau14-355, o un fragmento de cualquiera de las anteriores (por ejemplo, tau fosforilada en una o mas de las siguientes ubicaciones: Ser199, Ser202, Ser214, Ser235, Ser396, Ser404, Thr205, Thr231 y Thr212). Estos anticuerpos solo reconocerian, se unirian o mostrarian reactividad con la tau truncada fosforilada de forma anormal, pero no reconoceran, se uniran o mostraran reactividad con una proteina tau normal (es decir, una htau40 no truncada de longitud completa). En otras palabras, estos anticuerpos reconocerian el neoepitopo creado por la escision y la fosforilacion anormal de tau, pero no reconocerian la misma secuencia de aminoacidos pero que no esta fosforilada, que esta presente internamente en la proteina tau normal. Ademas, no se espera que estos anticuerpos afecten las funciones biologicas de la proteina tau normal y/o inhiban la escision por caspasa de tau, y, en las realizaciones preferentes, se espera que eliminen los peptidos creados por la escision de tau y minimicen o prevengan la formacion de ovillos neurofibrilares, y se utilicen para tratar y/o prevenir la EA y otras tauopatias.

En realizaciones preferentes, los anticuerpos utiles en la presente invencion deben ser adecuados para (i) la inhibition, reduction, depuration y elimination de tau truncada en su extremo C, por ejemplo, en el resto de acido glutamico Glu391 o en el resto de acido aspartico Asp421, o en su extremo N (por ejemplo, en el resto de acido aspartico Asp13), (ii) la inhibicion, reduccion, depuracion y eliminacion de tau truncada forforilada anormal (por ejemplo, tau fosforilada en Ser396 y/o Ser404), y/o (iii) adecuada para la prevencion de la formacion de ovillos neurofibrilares y/o la depuracion aumentada de los ovillos neurofibrilares, todo ello sin afectar las funciones biologicas de la proteina tau normal. Por lo tanto, estos anticuerpos deben ser adecuados para el tratamiento sintomatico y la prevencion de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatias, y/o para la preparacion de una composition farmaceutica para el tratamiento de estos trastornos.

Es un objetivo adicional de la invencion proporcionar un peptido inmunogenico aislado que comprende o que consiste en una secuencia de aminoacidos que es identica a la secuencia de aminoacidos del neoepitopo creado por la escision de tau, por ejemplo, en el resto de acido glutamico Glu391, en el resto de acido aspartico Asp421 o en el resto de acido aspartico Asp13, o un fragmento de tal peptido, que puede usarse para inducir una respuesta inmunogenica en un mamifero, y, en las realizaciones preferentes, es para su uso en el tratamiento y/o la prevencion de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatias, y/o para la preparacion de una composicion farmaceutica para el tratamiento de estos trastornos.

Es un objetivo adicional de la invencion proporcionar un mimotopo que comprende dos peptidos fusionados entre si con o sin restos espaciadores, imitando el primer peptido la estructura del neoepitopo creado por la escision de tau (es decir, las secuencias de aminoacidos unidas a las porciones de los extremos N o C libres de un peptido creado por la escision de tau) en un mamifero, e imitando el segundo peptido la estructura de un epitopo de linfocitos T procedente de una fuente distinta (por ejemplo, toxoide tetanico), mimotopo que es adecuado para inducir una respuesta inmunitaria en un mamifero, y, en las realizaciones preferentes, es para su uso en el tratamiento y/o la prevencion de la EA y de otras tauopatias, y/o en la preparacion de una composicion farmaceutica para el tratamiento de estos trastornos.

Estos objetivos se abordan con la presente invencion, la cual se refiere a un anticuerpo especifico para la proteina tau truncada preovillo soluble, no mostrando dicho anticuerpo union y/o reactividad para la proteina tau normal, y es para su uso en el tratamiento o la prevencion de la Ea como se define mediante la revindication 1. Las reivindicaciones dependientes detallan realizaciones ventajosas de la invencion. Un aspecto preferente se refiere a un metodo para tratar o prevenir, o ralentizar la progresion de un fenotipo conductual relacionado con ovillos en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que necesita terapia para la enfermedad de Alzheimer u otras tauopatias, uno o mas anticuerpos con una especificidad por formas anormales de la proteina tau truncada soluble que es o es potencialmente neurotoxica, no mostrando dicho anticuerpo union y/o reactividad con una proteina tau normal. Estos anticuerpos son, preferentemente, especificos para el neoepitopo creado por la escision de tau, no reconocen la misma secuencia de aminoacidos presente internamente en la proteina tau normal y se administran en condiciones y en una cantidad (o cantidades) eficaz para retardar, inhibir y/o invertir un fenotipo conductual relacionado con ovillos en el sujeto. En determinadas realizaciones preferentes, los anticuerpos tienen especificidad para una tau truncada en su extremo C en el resto de acido glutamico Glu391 o en el resto de acido aspartico Asp421, y/o una tau truncada en su extremo N en el resto de acido aspartico Asp13 (por ejemplo, tau1-13, tau14-441, tau14-391, tau391-414, tau1-391, tau1-421, tau14-421, tau14-410, tau391-410, tau14-412, tau391-412, tau14-383, tau14-381 o tau14-355, o un fragmento de cualquiera de las anteriores) y se administran en condiciones y en una cantidad (o cantidades) eficaces para retardar, inhibir y/o invertir un fenotipo conductual relacionado con ovillos en el sujeto. En determinadas realizaciones, estos anticuerpos reconocen selectivamente un peptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 2-30, o un fragmento de la misma, de tau; un peptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 380-405, o un fragmento de la misma, de tau; y/o un peptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoacidos que comprende o que consiste en los aminoacidos 410-436, o un fragmento de la misma, de tau; peptido (o peptidos) que se crea (o crean) por escision de tau; y no reconocen estas secuencias cuando estas secuencias estan presentes internamente en la tau no escindida/no truncada. En algunas de estas realizaciones, estos anticuerpos reconocen selectivamente un C-terminal de tau1-421 (ATau), por ejemplo, secuencias de aminoacidos que comprenden o que consisten en tau416-421, tau417-421, tau418-421 o tau419-421 de ATau, no reconocen estas secuencias en htau40 y no inhiben la escision por caspasa de tau (por ejemplo, en Asp421).

La invencion tambien se refiere a la administracion a un sujeto que necesita terapia para la enfermedad de Alzheimer u otras tauopatias, de uno o mas anticuerpos con una especificidad para formas anormales de la proteina tau que son conformacionalmente distintas de tau normal y/o especificidad para tau truncada, no mostrando dichos anticuerpos union y/o reactividad con una proteina tau normal. Estos anticuerpos son, preferentemente, especificos para el neoepitopo creado por la escision de tau y no reconocen la misma secuencia de aminoacidos cuando esta presente internamente en la proteina tau normal. En determinadas realizaciones preferentes, los anticuerpos tienen especificidad para una tau truncada en su extremo C en el resto de acido glutamico Glu391 o en el resto de acido aspartico Asp421, y/o una tau truncada en su extremo N en el resto de acido aspartico Asp13 (por ejemplo, tau1-13, tau14-441, tau14-391, tau391-414, tau1-391, tau1-421, tau14-421, tau14-410, tau391-410, tau14-412, tau391-412, tau14-383, tau14-381 o tau14-355, o un fragmento de cualquiera de las anteriores), y se administran en condiciones y en una cantidad (o cantidades) eficaces para prevenir la agregacion, inhibir la agregacion y/o propiciar la depuracion de agregados en el cerebro de un sujeto. En algunas de estas realizaciones, estos anticuerpos reconocen selectivamente un C-terminal de tau1-421 (ATau), por ejemplo, secuencias de aminoacidos que comprenden o que consisten en tau416-421, tau417-421, tau418-421 o tau419-421 de ATau, no reconocen estas secuencias en htau40 y no inhiben la escision por caspasa de tau (por ejemplo, en Asp421).

Otro aspecto de la presente invencion incluye un metodo para ralentizar la progresion de un fenotipo conductual relacionado con ovillos en un sujeto. Este metodo incluye la administracion, a un sujeto que necesita terapia para la enfermedad de Alzheimer u otras tauopatias, de uno o mas anticuerpos con especificidad para formas anormales de la proteina tau (por ejemplo, tau truncada) que son lineales o conformacionalmente distintas de tau normal, no mostrando dichos anticuerpos union y/o reactividad con una proteina tau normal. Estos anticuerpos son, preferentemente, especificos para el neoepitopo creado por la escision de tau y no reconocen la misma secuencia de aminoacidos presente internamente en la proteina tau normal. Por lo tanto, no se espera que estos anticuerpos afecten las funciones biologicas de la proteina tau normal, y, en las realizaciones preferentes, se espera que eliminen los peptidos creados por la escision de tau y minimicen o prevengan la formacion de ovillos neurofibrilares. En determinadas realizaciones preferentes, los anticuerpos tienen especificidad para una tau truncada en su extremo C en el resto de acido glutamico Glu391 o en el resto de acido aspartico Asp421, y/o una tau truncada en su extremo N en el resto de acido aspartico Asp13 (por ejemplo, tau1-13, tau14-441, tau14-391, tau391-414, tau1-391, tau1-421, tau14-421, tau14-410, tau391-410, tau14-412, tau391-412, tau14-383, tau14-381 o tau14-355, o un fragmento de cualquiera de las anteriores), y se administran en condiciones y en una cantidad (o cantidades) eficaces para retardar, inhibir y/o invertir un fenotipo conductual relacionado con ovillos en el sujeto.

En otro aspecto de la presente invencion, los anticuerpos administrados reconocen selectivamente una forma fosforilada de la proteina tau anormal (es decir, una tau truncada) y no muestran union y/o reactividad con una proteina tau normal. Por lo tanto, no se espera que estos anticuerpos afecten las funciones biologicas de la proteina tau normal, y, en las realizaciones preferentes, se espera que eliminen los peptidos creados por la escision de tau y minimicen o prevengan la formacion de ovillos neurofibrilares.

En determinadas realizaciones preferentes, los anticuerpos administrados reconocen selectivamente una forma fosforilada de una tau truncada en su extremo C en el resto de acido glutamico Glu391 o en el resto de acido aspartico Asp421, o una tau truncada en su extremo N en el resto de acido aspartico Asp13. Preferentemente, los anticuerpos de la presente invencion reconocen selectivamente solo la forma lineal o conformacionalmente distinta de la proteina tau truncada, y los anticuerpos no muestran union y/o afinidad con la proteina tau normal (es decir, no muestra reactividad con la htau40 normal no truncada). En determinadas realizaciones, estos anticuerpos reconocen un peptido fosforilado que comprende o que consiste en una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 1-30, o un fragmento de la misma, de tau; un peptido fosforilado que comprende o que consiste en una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 380-405, o un fragmento de la misma, de tau; y/o un peptido fosforilado que comprende o que consiste en una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 410-436, o un fragmento de la misma, de tau; peptido (o peptidos) que se crea (o crean) por escision de tau; y no reconocen estas secuencias cuando estas secuencias estan presentes internamente en la tau no escindida/no truncada. En algunas de estas realizaciones, estos anticuerpos reconocen selectivamente un C-terminal de ATau, por ejemplo, secuencias de aminoacidos que comprenden o que consisten en tau416-421, tau417-421, tau418-421 o tau419-421 de ATau, y no reconocen estas secuencias en htau40.

La invencion se refiere adicionalmente a una composition farmaceutica que comprende uno o mas anticuerpos con especificidad para una proteina tau truncada en su extremo C y/o su extremo N. En determinadas realizaciones, el anticuerpo reconoce selectivamente una protema tau preovillo soluble truncada en el resto de acido glutamico Glu391 o en el resto de acido aspartico Asp421, o en su extremo N en el resto de acido aspartico Asp13. En realizaciones preferentes, los anticuerpos no muestran union y/o afinidad con la proteina tau normal (es decir, no muestran reactividad con la proteina tau normal no truncada). En algunas de estas realizaciones, el anticuerpo es especifico para ATau, y no muestra union y/o afinidad por htau40. En las realizaciones preferentes, la composicion es para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

La invencion se refiere adicionalmente a una composicion farmaceutica para el tratamiento y/o la prevencion de la enfermedad de Alzheimer, comprendiendo la composicion una pluralidad de anticuerpos que son especificos para el neoepitopo creado por la escision de tau (es decir, las secuencias de aminoacidos unidas a las porciones del extremo N o C libres de un peptido creado por la escision de tau), y no reconocen la misma secuencia de aminoacidos cuando estan presentes internamente en la proteina tau normal. En las realizaciones preferentes, el neoepitopo comprende o consiste en una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 7-94 o 116, o un fragmento de las mismas.

La invencion se refiere adicionalmente a anticuerpos que reconocen epitopos del extremo libre lineales o conformacionales de tau truncada. En realizaciones preferentes, los anticuerpos no muestran union y/o afinidad con la proteina tau normal (es decir, no muestran reactividad con la proteina tau normal no truncada).

La invencion tambien se refiere en parte a un peptido inmunogenico (por ejemplo, un peptido inmunogenico aislado), que comprende una porcion o fragmento de tau truncada, por ejemplo, expresado por un virus o bacteria, incorporado en un genoma o episoma del virus o bacteria (es decir, el virus o bacteria comprende un gen que codifica el peptido inmunogenico), aislado de un mamifero, sintetizado quimicamente o producido utilizando tecnicas de ADN recombinante, como parte de una composicion inmunogenica. En todas estas realizaciones, la porcion inmunogenica de los peptidos comprende una secuencia lineal de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoacidos unidos covalentemente a un extremo N libre o un extremo C libre de una tau truncada, cuya secuencia es identica a la secuencia de los primeros dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoacidos o los ultimos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoacidos de un peptido (por ejemplo, ATau) creado por la escision de tau. En determinadas realizaciones preferentes, el peptido inmunogenico comprende una porcion de una proteina tau truncada en su extremo C en el resto de acido glutamico Glu391, una porcion de la proteina tau truncada en su extremo C en el resto de acido aspartico Asp421, de una tau truncada en su extremo N en el resto de acido aspartico Asp13, o combinaciones de las mismas (por ejemplo, tau1-13, tau14-441, tau14-391, tau391-414, tau1-391, tau1-421, tau14-421, tau14-410, tau391-410, tau14-412, tau391-412, tau14-383, tau14-381 o tau14-355, o un fragmento de cualquiera de las anteriores). La porcion inmunogenica del peptido, en las realizaciones preferentes, comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos que se selecciona de las SEQ ID NO: 7-94 o 1l6, o un fragmento de las mismas. El peptido inmunogenico tiene la capacidad de inducir una respuesta inmunogenica en un mamifero, y, preferentemente, es para su uso en el tratamiento y/o la prevencion de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatias, y/o en la preparacion de una composicion farmaceutica para el tratamiento de estos trastornos. En las realizaciones preferentes, la respuesta inmunogenica es la produccion de los anticuerpos especificos para neoepitopo descritos en el presente documento, por ejemplo, in situ en un animal vivo (por ejemplo, un ser humano).

La invencion tambien se refiere a un mimotopo que comprende dos peptidos fusionados entre si con o sin restos espaciadores, imitando el primer peptido la estructura del neoepitopo creado por la escision de tau (es decir, las secuencias de aminoacidos unidas a las porciones de los extremos N o C libres de un peptido creado por la escision de tau) en un mamifero, e imitando el segundo peptido la estructura de un epitopo de linfocitos T procedente de una fuente distinta (por ejemplo, toxoide tetanico), mimotopo que es adecuado para inducir una respuesta inmunitaria en un mamifero. En las realizaciones preferentes, la respuesta inmunogenica es la produccion de los anticuerpos especificos para neoepitopo descritos en el presente documento. En las realizaciones preferentes, es para su uso en el tratamiento y/o la prevencion de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatias, y/o en la preparacion de una composicion farmaceutica para el tratamiento de estos trastornos.

La invencion se refiere tambien a una composicion farmaceutica que comprende un mimotopo que comprende dos peptidos fusionados entre si con o sin restos espaciadores, imitando el primer peptido la estructura del neoepitopo creado por la escision de tau (es decir, las secuencias de aminoacidos unidas a las porciones de los extremos N o C libres de un peptido creado por la escision de tau) en un mamifero, e imitando el segundo peptido la estructura de un epitopo de linfocitos T procedente de una fuente distinta (por ejemplo, toxoide tetanico), mimotopo que es adecuado para inducir una respuesta inmunitaria en un mamifero. En las realizaciones preferentes, la respuesta inmunogenica es la produccion de los anticuerpos especificos para neoepitopo descritos en el presente documento. La composicion se utiliza para inducir una respuesta inmunogenica en un mamifero, y, en las realizaciones preferentes, para el tratamiento y/o la prevencion de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatias, y/o en la preparacion de una composicion farmaceutica para el tratamiento de estos trastornos.

La invencion se refiere adicionalmente a una composicion farmaceutica que comprende (i) un mimotopo que comprende dos peptidos fusionados entre si con o sin restos espaciadores, imitando el primer peptido la estructura del neoepitopo creado por la escision de tau (es decir, las secuencias de aminoacidos unidas a las porciones de los extremos N o C libres de un peptido creado por la escision de tau) en un mamifero, e imitando el segundo peptido la estructura de un epitopo de linfocitos T procedente de una fuente distinta (por ejemplo, toxoide tetanico); (ii) un mimotopo que comprende dos peptidos fusionados entre si con o sin restos espaciadores, imitando el primer peptido la estructura del neoepitopo creado por la escision de APP (es decir, las secuencias de aminoacidos unidas a las porciones de los extremos N o C libres de un peptido creado por la escision de APP) en un mamifero, e imitando el segundo peptido la estructura de un epitopo de linfocitos T procedente de una fuente distinta (por ejemplo, toxoide tetanico). La composition se utiliza para inducir una respuesta inmunogenica en un mamifero y, en las realizaciones preferentes, es para su uso en el tratamiento y/o la prevention de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatias, y/o en la preparation de una composicion farmaceutica para el tratamiento de estos trastornos.

La invention se refiere adicionalmente a un metodo para tratar, prevenir y/o ralentizar la progresion de un fenotipo conductual relacionado con ovillos en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que necesita tal tratamiento uno o mas anticuerpos especificos de extremo libre generados a partir de peptidos sinteticos que comprenden secuencias inmunogenicas lineales o conformacionales de tau anormal, anticuerpos que reconocen selectivamente los extremos libres de la tau truncada (por ejemplo, tau truncada soluble) y no muestran reactividad (union o afinidad por tau no truncada normal). En determinadas realizaciones, estos anticuerpos pueden (i) inhibir o desacelerar, por ejemplo, la polimerizacion de tau y la formation de ovillos neurofibrilares, y (ii) propiciar la depuration de tau anormal y/o de los agentes responsables de la formacion de tau anormal.

Otro aspecto de la presente invencion incluye un metodo de prevencion o tratamiento de la enfermedad de Alzheimer u otras tauopatias en un sujeto, a traves de la administration de una proteina tau truncada, preferentemente una tau truncada en su extremo C en el resto de acido glutamico Glu391 o en el resto de acido aspartico Asp421 (por ejemplo, ATau), y/o una tau truncada en su extremo N en el resto de acido aspartico Asp13, o un fragmento de cualquiera de las anteriores, en condiciones y en las cantidades para inducir la production in situ de anticuerpos especificos de extremo libre para la proteina (o proteinas) truncada y eficaces para prevenir o tratar la enfermedad de Alzheimer u otras tauopatias. En las realizaciones preferentes, los anticuerpos especificos de extremo libre reconocen selectivamente un peptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 2-30, o un fragmento de la misma, de tau; un peptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 380-405, o un fragmento de la misma, de tau; y/o un peptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 410-436, o un fragmento de la misma, de tau; peptido (o peptidos) que se crea (o crean) por escision de tau; pero no reconocen estas secuencias cuando estas secuencias estan presentes internamente en la tau no escindida/no truncada. En algunas de estas realizaciones, el metodo comprende la administracion de ATau, o un fragmento del mismo, y los anticuerpos producidos en respuesta a esta administracion reconocen selectivamente un C-terminal de ATau, y no reconocen estas secuencias en htau40.

Otro aspecto de la presente invencion incluye un metodo para ralentizar la progresion de un fenotipo conductual relacionado con ovillos en un sujeto. Este metodo incluye la administracion, a un sujeto que necesita terapia para la enfermedad de Alzheimer u otras tauopatias, de una proteina tau truncada, preferentemente una tau truncada en su extremo C en el resto de acido glutamico Glu391 o en el resto de acido aspartico Asp421 y/o una tau truncada en su extremo N en el resto de acido aspartico Asp13, en condiciones y en las cantidades para inducir la produccion in situ de anticuerpos especificos de extremo libre para la proteina (o proteinas) truncada y eficaces para retardar, inhibir y/o invertir un fenotipo conductual relacionado con ovillos en un sujeto.

La invencion se refiere adicionalmente, en parte, a un vector de terapia genica unido operativamente a un gen que codifica un inmunogeno, comprendiendo el inmunogeno una portion de una proteina tau truncada. En determinadas realizaciones, la proteina tau truncada se selecciona del grupo que consiste en una proteina tau truncada en su extremo C en el resto de acido glutamico Glu391, una proteina tau truncada en el resto de acido aspartico Asp421, una tau truncada en su extremo N en el resto de acido aspartico Asp13, y combinaciones de las mismas (por ejemplo, tau1-13, tau14-441, tau14-391, tau391-414, tau1-391, tau1-421, tau14-421, tau14-410, tau391-410, tau14-412, tau391-412, tau14-383, tau14-381 o tau14-355, o un fragmento de cualquiera de las anteriores). En algunas de estas realizaciones, el inmunogeno comprende o consiste en los ultimos diez, nueve, ocho, siete, seis, cinco, cuatro o tres aminoacidos de ATau.

La invencion tambien se refiere en parte a una composicion farmaceutica que comprende ADN desnudo que codifica un inmunogeno que comprende una porcion de la proteina seleccionada del grupo que consiste en una proteina tau truncada en su extremo C en el resto de acido glutamico Glu391, una proteina tau truncada en el resto de acido aspartico Asp421, una tau truncada en su extremo N en el resto de acido aspartico Asp13, y combinaciones de las mismas (por ejemplo, tau1-13, tau14-441, tau14-391, tau391-414, tau1-391, tau1-421, tau14-421, tau14-410, tau391-410, tau14-412, tau391-412, tau14-383, tau14-381 o tau14-355, o un fragmento de cualquiera de las anteriores, y combinaciones de las mismas).

La invencion se refiere adicionalmente a una vacuna que comprende una porcion de una o mas proteinas tau anormales o truncadas como se expone en el presente documento, en combination con un transportador farmaceuticamente aceptable, o una vacuna que comprende uno o mas anticuerpos especificos para una porcion (o porciones) de una protema (o protemas) tau anormal o truncada como se expone en el presente documento y que tienen la capacidad de cruzar la barrera hematoencefalica, en combinacion con un transportador farmaceuticamente aceptable. En las realizaciones preferentes, la vacuna es para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y comprende un mimotopo fusionado con un peptido bacteriano, imitando el mimotopo la estructura del neoepftopo creado por la escision de tau (es decir, las secuencias de aminoacidos unidas a las porciones de los extremos N o C libres de un peptido creado por la escision de tau) en un mamifero, y comprendiendo o consistiendo el peptido bacteriano en un toxoide tetanico bacteriano natural o equivalente. El uso del mimotopo, en las realizaciones preferentes, previene la posibilidad de una respuesta autoinmunitaria que no se aplica a un peptido bacteriano. La vacuna puede o no comprender un mimotopo adicional que comprende un mimotopo que imita la estructura del neoepitopo creado por la escision de APP (es decir, las secuencias de aminoacidos unidas a las porciones de los extremos N o C libres de un peptido creado por la escision de la APP ) en un mamifero, estando fusionado el mimotopo adicional, con o sin restos espaciadores, a un peptido bacteriano que es un toxoide tetanico bacteriano natural o equivalente. La vacuna es para inducir una respuesta inmunogenica en un mamifero. En las realizaciones preferentes, la respuesta inmunogenica es la produccion de los anticuerpos especificos para neoepitopo descritos en el presente documento. En las realizaciones preferentes, la vacuna es para su uso en el tratamiento y/o la prevencion de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatias, y/o en la preparation de una composition farmaceutica para el tratamiento de estos trastornos.

La invention se refiere adicionalmente a una vacuna que comprende un mimotopo que imita la estructura del neoepitopo creado por la escision de tau en un mamifero, estando el mimotopo fusionado, con o sin restos espaciadores, a un peptido bacteriano que comprende o que consiste en un toxoide tetanico bacteriano natural o equivalente, en donde el neoepitopo comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 1­ 30, o un fragmento de la misma, de tau; un peptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 380-405, o un fragmento de la misma, de tau; y/o un peptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 410-436, o un fragmento de la misma, de tau; y el mimotopo es adecuado para inducir una respuesta inmunogenica en un mamifero. En algunas de estas realizaciones, el neoepitopo comprende o consiste en los aminoacidos 16-421, 17-421, 18-421 o 19-421 de ATau. En las realizaciones preferentes, la vacuna es para su uso en una composicion farmaceutica para el tratamiento y/o la prevencion de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatias.

La invencion se refiere adicionalmente a una vacuna que comprende (i) un mimotopo que imita la estructura del neoepitopo creado por la escision de tau en un mamifero, (por ejemplo, en Asp421), estando el mimotopo fusionado, con o sin restos espaciadores, a un peptido bacteriano que comprende o que consiste en una estructura de un epitopo de linfocitos T procedente de una fuente distinta (por ejemplo, toxoide tetanico); y (ii) un mimotopo que imita la estructura del neoepitopo creado por la escision de Ap en un mamifero, fusionado, con o sin restos espaciadores, a un peptido bacteriano que comprende o que consiste en la estructura de un epitopo de linfocitos T procedente de una fuente distinta (por ejemplo, toxoide tetanico). El epitopo de linfocitos T en el primer mimotopo y el segundo mimotopo pueden ser el mismo o distintos. En determinadas realizaciones, el epitopo de linfocitos T en el primer mimotopo y en el segundo mimotopo comprenden la misma estructura que un epitopo promiscuo bien estudiado del toxoide tetanico de la SEQ ID NO: 95 (Ho et al., 1990; Panina-Bordignon et al. 1989), dado que se sabe que este epitopo funciona en varios de diversos contextos geneticos humanos (Valmori et al., 1992 y 1994). En las realizaciones preferentes, la vacuna es para el tratamiento y/o la prevencion de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatias.

En determinadas realizaciones, la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un peptido (o peptidos) quimerico que comprende (i) unos 2-10 o 2-6 restos de aminoacido del extremo N o C libre de una tau truncada (por ejemplo, ATau) fusionado con o sin un espaciador a (ii) un epitopo promiscuo de linfocitos T auxiliares procedente de una fuente distinta a la de los restos de aminoacido. La tau truncada se selecciona del grupo que consiste en la tau truncada en su extremo C en el resto de acido glutamico Glu391 o en el resto de acido aspartico Asp421, o una tau truncada en su extremo N, por ejemplo, en el resto de acido aspartico Asp13. En determinadas realizaciones, la tau truncada es ATau. En determinadas realizaciones, el epitopo de linfocitos T auxiliares es el muy estudiado epitopo promiscuo del toxoide tetanico de la SEQ ID NO: 95. La composicion que comprende una cantidad eficaz inmunizante del peptido o peptidos quimericos y un transportador, excipiente, diluyente o agente auxiliar farmaceuticamente aceptable, se puede administrar entonces a un mamifero (por ejemplo, un ser humano) para inducir la formation de anticuerpos que son especificos para el neoepitopo creado por la escision de tau (es decir, las secuencias de aminoacidos unidas a las porciones del extremo N o C libres de un peptido creado por la escision de tau), y no reconocen la misma secuencia de aminoacidos cuando estan presentes en la proteina tau normal.

El epitopo promiscuo de linfocitos T auxiliares puede ser un epitopo de linfocito T procedente de, por ejemplo, la toxina tetanica, la toxina pertusica, la toxina difterica, la proteina F del virus del sarampion, el antigeno de superficie del virus de la hepatitis B, la proteina principal de la membrana externa de Chlamydia trachomitis, del circumsporozoito de Plasmodium falciparum, la triosa fosfato isomerasa de Schistosoma mansoni o TraT de Escherichia coli. En las realizaciones preferentes el epitopo de linfocitos T es el muy estudiado epitopo promiscuo del toxoide tetanico de la SEQ ID NO: 95 (Ho et al., 1990; Panina-Bordignon et al. 1989), dado que se sabe que este epitopo funciona en varios de diversos contextos geneticos humanos (Valmori et al., 1992 y 1994).

Aspectos adicionales de la invencion se refieren a una proteina tau truncada en donde los ultimos 20 aminoacidos en el C-terminal o N-terminal de tau se retiran y no estan presentes en la proteina truncada (por ejemplo, ATau); la porcion inmunogenica de la protema tau truncada; genes que codifican la proteina truncada y/o un peptido que contienen la porcion inmunogenica de la proteina; anticuerpos selectivos/especificos para la proteina truncada -monoclonales, policlonales, quimericos, recombinantes, humanizados y porciones de cualquiera de los anteriores; producidos in situ y ex situ; "animales" transgenicos que secretan anticuerpos selectivos/especificos para la proteina truncada; la inmunizacion activa (administracion de la proteina truncada o porciones inmunogenicas de la misma a un sujeto); la inmunizacion pasiva (administracion de anticuerpos en conformidad con la invencion a un sujeto); y formulaciones farmaceuticas para las inmunizaciones activa y pasiva.

El fragmento inmunogenico de la tau truncada, en determinadas realizaciones, comprende una secuencia lineal de dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete aminoacidos unidos covalentemente a un extremo N libre o un extremo C libre, cuya secuencia es identica a la secuencia de los primeros dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete aminoacidos o los ultimos dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete aminoacidos de un peptido (por ejemplo, ATau) creado por la escision de tau. En determinadas realizaciones, el peptido comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 1-30, o un fragmento de la misma, de tau; una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 380-405, o un fragmento de la misma, de tau; o una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 410-436, o un fragmento de la misma. En algunas de estas realizaciones, la secuencia comprende o consiste en los aminoacidos 16-421, 17­ 421, 18-421 o 19-421 de ATau.

En una realization, el fragmento inmunogenico de la tau truncada comprende una secuencia lineal de al menos cinco aminoacidos de la proteina tau que garantiza que el grupo amino libre especifico en el extremo N constituye una parte esencial del epitopo reconocido por el nuevo anticuerpo especifico de extremo libre de epitopo lineal. En otras realizaciones, los fragmentos de tau truncada tienen al menos los ultimos 20, 30 o 45 aminoacidos de la tau truncada, y se generan anticuerpos especificos de conformation o especificos de extremo libre de epitopo lineal. En determinadas realizaciones adicionales preferentes, la invencion se refiere a una vacuna que es una combination de una composition que proporciona inmunizacion contra productos de escision de tau (es decir, proteina tau truncada) y una composicion que proporciona inmunizacion contra productos de escision de APP.

En determinadas realizaciones preferentes, la composicion que proporciona inmunizacion contra la proteina tau truncada comprende un peptido (o peptidos) quimerico que comprende (i) unos 2-10 o 2-6 restos de aminoacido del extremo N o C libre de una tau truncada (por ejemplo, ATau) fusionado con o sin un espaciador a (ii) un epitopo promiscuo de linfocitos T auxiliares procedente de una fuente distinta a la de los restos de aminoacido; y la composicion que proporciona inmunizacion contra el producto de escision de APP comprende un peptido (o peptidos) quimerico que comprende (i) unos 2-10 o 2-6 restos de aminoacido del extremo N o C libre de una APP truncada (por ejemplo, Api-40, Api-42, Api-43, etc.) fusionado con o sin un espaciador a (ii) un epitopo promiscuo de linfocitos T auxiliares procedente de una fuente distinta a la de los restos de aminoacido. El epitopo de linfocitos T en la composicion que proporciona inmunizacion contra productos de escision de tau y en la composicion que proporciona inmunizacion contra productos de escision de APP puede ser el mismo o uno distinto. En determinadas realizaciones, el epitopo de linfocitos T de ambas composiciones comprende el muy estudiado epitopo promiscuo del toxoide tetanico de la SEQ ID NO: 95.

"Anticuerpo", como se usa en el presente documento pretende incluir moleculas intactas y fragmentos de las mismas, asi como derivados sinteticos y biologicos de las mismas, tales como, por ejemplo, Fab, F(ab'2 y F^v - libres o expresados, por ejemplo, en la superficie de fagos filamentosos en pIII o pVIII, u otras proteinas de superficie, o en la superficie de bacterias, que tienen la capacidad de unirse a un antigeno. Los fragmentos Fab, F(ab'2 y F^v carecen de los fragmentos F^c del anticuerpo intacto, se depuran mas rapidamente de la circulation y pueden tener menos union a tejido no especifica del anticuerpo. Adicionalmente, el anticuerpo Fv (a menudo llamado minicuerpo) puede manipularse facilmente para portar un indicador especifico en su C-terminal y usarse para el diagnostico precoz intravital presintomatico de la enfermedad de Alzheimer, dado que los estadios I, II y III de la EA, que son reconocidos por los anticuerpos de acuerdo con la presente invencion no estan asociados con el deterioro intelectual. El termino anticuerpo abarca, por ejemplo, anticuerpos quimericos y humanizados. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. Ademas abarca anticuerpos recombinantes. Los anticuerpos pueden ser, preferentemente, anticuerpos lineales o anticuerpos conformacionales.

Las expresiones "no se une", "no reconoce", y "no muestra reactividad" como se usa en la presente solicitud significa que un anticuerpo no muestra una union detectable a un peptido o proteina (por ejemplo, htau40), o que la constante de equilibrio KD del anticuerpo con el peptido o proteina es de 1x10^-4 molar a 1x10^-6 M, como se mide mediante un ensayo de resonancia de plasmon superficial utilizando peptido capturado en un chip de estreptavidina.

Las expresiones "se une especificamente", "reconoce especificamente", "reconoce selectivamente", "que tiene especificidad" y "especifico para" como se usa en la presente memoria descriptiva significa que un anticuerpo se une al antigeno para el que es especifico (por ejemplo, el neoepitopo creado por escision de htau en Asp421) con una constante de equilibrio KD de 1x10^-9 M a 1x10^-11 M, como se mide mediante un ensayo de resonancia de plasmon superficial utilizando peptido capturado en un chip de estreptavidina; y tiene una constante de equilibrio KD con otros peptidos o protemas (por ejemplo, htau40) que es de 1x10^-4 M a 1x10^-6 M, como se mide mediante un ensayo de resonancia de plasmon superficial utilizando peptido capturado en un chip de estreptavidina, o no muestra union detectable con estos otros peptidos o proteinas.

La expresion "proteina tau", como se usa en la presente solicitud, se refiere a una cualquiera de las isoformas conocidas de tau (por ejemplo, la isoforma mas larga de la proteina tau asociada a microtubulos humana que contiene todos los insertos que han sufrido corte y empalme de forma alternativa, como se describe en M. Goedert et al., 1989 (htau40)).

La expresion "anticuerpo humanizado" al que se hace referencia anteriormente en el presente documento a un anticuerpo en el que las regiones determinantes de complementariedad (las CDR) de un raton u otro anticuerpo no humano se injertan en un armazon de anticuerpo humano. Por armazon de anticuerpo humano se entiende el anticuerpo humano completo excluyendo las CDR.

La expresion "anticuerpo quimerico" se refiere a un anticuerpo en el que la totalidad de las regiones variables de un anticuerpo de raton o rata se expresa junto con regiones constantes humanas.

El termino "tratamiento" al que se hace referencia anteriormente en el presente documento a retrasar o prevenir la aparicion, retardar la progresion o mejorar los sintomas relacionados con la enfermedad de Alzheimer u otra enfermedad o trastorno caracterizado por la deposition de Ap.

El termino "mimotopo", como se usa en la presente solicitud, es una macromolecula, a menudo un peptido (es decir, un peptido inmunogenico o inmunogeno), que imita la estructura de un epitopo.

El termino "tauopatia" se refiere a trastornos o afecciones relacionadas con tau, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, paralisis supranuclear progresiva (PSP), degeneration corticobasal (DCB), enfermedad de Pick, demencia frontotemporal y parkinsonismo asociados con el cromosoma 17 (FTDP-17), enfermedad de Parkinson, ictus, traumatismo craneoencefalico, deterioro cognitivo leve y similares.

El termino "inmunogeno" se refiere a una molecula que tiene la capacidad de unirse a un anticuerpo, un receptor de linfocito B (BCR) o un receptor de linfocitos T (TCR), si la presentan moleculas de MHC. El termino "inmunogeno", como se usa en el presente documento, tambien abarca epitopos de linfocitos T. Adicionalmente, un inmunogeno tiene la capacidad de ser reconocido por el sistema inmunitario y/o la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria humoral y/o una respuesta inmunitaria celular que conduce a la activation de los linfocitos B y/o T. Esto puede, sin embargo, precisar que, al menos en determinados casos, el inmunogeno contenga o este unido a un epitopo de linfocitos T auxiliares y se administre un adyuvante. Un inmunogeno puede tener uno o mas epitopos (por ejemplo, epitopos B y T). El "inmunogeno", como se usa en el presente documento, tambien puede ser mezclas de varios inmunogenos individuales. El termino "inmunogeno" abarca, pero sin limitation, peptidos.

Como se usa en el presente documento, el termino "fosforilado", en referencia a un resto de aminoacido, se refiere a la presencia de un grupo fosfato en la cadena lateral del resto donde normalmente esta presente un grupo hidroxilo. Dicha fosforilacion normalmente se produce como una sustitucion del atomo de hidrógeno de un grupo hidroxilo por un grupo fosfato.(--PO³H²). Como reconocen un experto en la materia, dependiendo del pH del entorno local, este grupo fosfato puede existir como un grupo neutro no cargado (--PO3H2), o con una carga negativa unica (--PO3H-) o una doble (--PO32-). Los restos de aminoacidos que normalmente pueden fosforilarse incluyen las cadenas laterales de la serina, la treonina y la tirosina.

Los articulos “un" y “una" se usan en el presente documento para referirse a uno o mas de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del articulo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o mas de un elemento. Adicionalmente, a no ser que el contexto requiera otra cosa, Los terminos en singular incluiran las pluralidades, y los terminos en plural incluiran el singular, a no ser que el contenido indique claramente otra cosa. El termino "aislado", con respecto a un peptido inmunogenico, se refiere a un peptido que, en virtud de su origen o fuente de procedencia (1) no esta asociado con los componentes asociados de manera natural que lo acompanan en su estado nativo, (2) esta sustancialmente exento de otras proteinas de la misma especie, (3) lo expresa una celula de una especie distinta o (4) no esta presente en la naturaleza. Por lo tanto, un peptido que se sintetiza quimicamente o se sintetiza en un sistema celular distinto de la celula a partir de la que se origina de forma natural, estara "aislado" de sus componentes asociados de manera natural. Un peptido tambien puede volverse esencialmente exento de componentes asociados de manera natural mediante el aislamiento, usando tecnicas de purification de proteinas bien conocidas en la tecnica.

El termino "neoepitopo", como se usa en la presente solicitud, se refiere a un epitopo que no es de origen natural creado como resultado de la escision de una proteina precursora (por ejemplo, tau, APP, etc.) y/o Tau fosforilada. Descripcion detallada de la invencion

Un modelo propuesto para la formacion de ovillos neurofibrilares estipula que los estimulos apoptoticos (por ejemplo, Api-42) dan como resultado la escision por caspasa de tau, por ejemplo, en el aminoacido Asp421, lo que conduce a una formacion patologica aumentada de filamentos neurofibrilares (los FNF) y de filamentos helicoidales emparejados (los FHE), asi como a la agregacion patologica de tau. Por ejemplo, Rissman et al., J. Clin. Invest. 114: 121-130 (2004), proponen el siguiente mecanismo para la formacion de ovillos neurofibrilares:

De acuerdo con Rissman et al., la exposicion a estimulos apoptoticos tales como Api-42 da como resultado la escision por caspasa de tau despues de Asp421 (I); la tau escindida por caspasa adopta rapidamente el epitopo conformacional MC1 (II), lo que conduce a la formacion aumentada de filamentos y la agregacion de tau (III); para compensar la agregacion de tau, tau puede posteriormente hiperfosforilarse y disociarse de los microtubulos (IV); y, como resultado, la escision por caspasa de tau puede conducir a la formacion de FHE (V).

La formacion aumentada de los FNF y FHE patologicos y la agregacion patologica de tau se observa comunmente en mamiferos que padecen trastornos neurodegenerativos progresivos (por ejemplo, EA y otras tauopatias), y se asocia con la perdida de funciones cognitivas y conductuales en mamiferos. Dado que se cree que la escision de tau por caspasas ejecutoras despues de la exposicion a un estimulo apoptotico (por ejemplo, Ap) da como resultado una forma que es especialmente propensa a la formacion de ovillos, una inhibicion o disminucion de tau escindida por caspasa deberia, por lo tanto, disminuir y/o prevenir la formacion patologico de FNF y FHE, y la agregacion patologica de tau. La inhibicion o disminucion de la tau escindida por caspasa tambien deberia ser util en el tratamiento y/o la prevencion de enfermedades neurodegenerativas progresivas.

La presente invencion se refiere a anticuerpos especificos para extremos libres de tau truncada (por ejemplo, htau40 escindida por caspasa (por ejemplo, ATau) y que no muestra union y/o reactividad con la tau normal, y a usos de estos anticuerpos en el tratamiento y/o prevencion de la EA y otras tauopatias, en la depuracion de tau truncada soluble del cerebro de un paciente que padece EA u otra tauopatia, y en la preparacion de composiciones farmaceuticas para el tratamiento y/o la prevencion de estos trastornos. Estos anticuerpos reconocerian el neoepitopo creado por la escision de tau (por ejemplo, el extremo C de ATau), pero no reconoceran la misma secuencia de aminoacidos presente en la proteina tau normal (por ejemplo, htau40), que carece del neoepitopo. No se espera que estos anticuerpos afecten las funciones biologicas de la proteina tau normal y se espera que depuren los peptidos creados por la escision de tau y minimicen o prevengan la formacion patologica de los FNF y los FHE, y la agregacion patologica de tau. Tampoco se espera que estos anticuerpos inhiban la escision por caspasa de htau40 en Asp421.

Los anticuerpos que pueden reconocer selectivamente el extremo (o extremos) libre (neoepitopo o neoepitopos) de los peptidos solubles (por ejemplo, ATau) formados por la escision de tau (por ejemplo, de htau40), aunque no reconocen y no muestran reactividad con la proteina tau de longitud completa, se cree que tienen la capacidad de inhibir directamente la polimerizacion de tau y/o la formacion de los FNF, los FHE y/u otros precursores patologicos de tau. Un significado del uso de estos anticuerpos especificos de neoepitopo es que estos anticuerpos pueden usarse para depurar la tau neurotoxica soluble antes de que se formen los FNF y los FHE, y/o antes de que tau se agregue o polimerice patologicamente, y/o antes de que estos neoepitopos se vuelvan inaccesibles o menos accesibles para los anticuerpos, y/o el dano neurologico este hecho.

Se contempla especificamente que estos anticuerpos se puedan usar para (i) la inhibicion, reduccion, depuracion y eliminacion de tau truncada en su extremo C, por ejemplo, en el resto de acido glutamico Glu391 o en el resto de acido aspartico Asp421, o en su extremo N (por ejemplo, en el resto de acido aspartico Asp421), (ii) la inhibicion, reduccion, depuracion y eliminacion de tau truncada forforilada anormal (por ejemplo, tau fosforilada en Ser396 y/o Ser404), y/o (iii) la prevencion de la formacion de los FNF y/o los FHE, y/o la depuracion aumentada de los FNF y los FHE, todo ello sin afectar las funciones biologicas de la proteina tau normal (por ejemplo, htau40).

Dos anticuerpos especificos para neoepitopos especificamente contemplados por la presente invencion para los usos descritos anteriormente son: un anticuerpo que es especifico para el extremo C-terminal libre de tau truncada en Asp421 (es decir, ATau) y no muestra union y/o reactividad con la tau normal (por ejemplo, htau40); y un anticuerpo que es espedfico para el extremo C-terminal libre de tau14-421 y no muestra union y/o reactividad con la protema tau normal. En las realizaciones preferentes, estos anticuerpos no inhiben la escision por caspasa de htau40 en Asp421.

Se cree que, desde la fecha efectiva de presentation de la presente solicitud, no hay informes en la bibliografia sobre el uso de anticuerpos especificos o selectivos para tau truncada preovillos soluble, por ejemplo, en Asp421, Glu391 y/o Asp13, y que no muestren una union o reactividad especifica para la protema tau de longitud completa (o anticuerpos que tengan estructuras tridimensionales similares a los anticuerpos especificos para la tau truncada preovillos soluble en Asp421, Glu391 y/o Asp13) en el tratamiento o la prevention de la EA y otras tauopatias. El uso de estos anticuerpos especificos de neoepitopo para tratar la EA u otra tauopatia no es obvio, por ejemplo, debido a que la literatura no informa donde existen las formas truncadas solubles de tau en la celula y si tales formas y ubicaciones son accesibles para los anticuerpos. Este enfoque tampoco depende de la production de anticuerpos conformacionales para los ovillos de tau preformados que ya esten provocando dano, y esta destinado a abordar el problema antes de que se formen los FNF y/o los FHE patologicos, y que tau se agregue patologicamente.

La presente invention tambien abarca un metodo de tratamiento o de prevencion de la enfermedad de Alzheimer u otras tauopatias en un sujeto. Este metodo incluye administrar anticuerpos frente a proteinas tau truncadas, que reconocen selectivamente estas proteinas tau truncadas, o porciones de las proteinas tau truncadas, a un paciente, en condiciones y en las cantidades eficaces para tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer u otras tauopatias. Los anticuerpos pueden administrarse, por ejemplo, por via intravenosa, via subcutanea, via nasal, via bucal, via transdermica, etc., como se describe con mayor detalle a continuation. En determinadas realizaciones preferentes, los anticuerpos reconocen selectivamente a tau truncada preovillos soluble, y no muestran union y/o reactividad con tau normal. Por lo tanto, los anticuerpos deben facilitar la depuration de la tau truncada y no deben afectar las funciones biologicas de la tau normal. En determinadas realizaciones, los anticuerpos administrados bloquean la agregacion de ATau directamente (por ejemplo, uniendose al extremo C de ATau y, de este modo, interfiriendo directamente con la capacidad del extremo C de ATau para interactuar con proteinas y peptidos externos). Los anticuerpos que bloquean la agregacion tau directamente tendran, preferentemente, una baja constante de disociacion.

En un aspecto, la presente invencion incluye un metodo para propiciar la depuracion de los agregados tau del cerebro de un sujeto. Este metodo incluye administrar anticuerpos con una especificidad para formas anormales (truncadas) de la proteina tau (o porciones de las formas anormales (truncadas) de la proteina tau) que pueden o no ser conformacionalmente distintas de tau normal, siendo los anticuerpos no especificos para una proteina tau normal (no muestran afinidad, union o reactividad con tau normal), a un mamifero (por ejemplo, un paciente humano). En determinadas realizaciones preferentes, los anticuerpos tienen especificidad para una tau truncada en su extremo C en el resto de acido glutamico Glu391 o en el resto de acido aspartico Asp421. En otras realizaciones preferentes, los anticuerpos tienen especificidad para una tau truncada en su extremo N, por ejemplo, en el aminoacido Asp13. En realizaciones preferentes adicionales, los anticuerpos tienen especificidad para ATau (tau1-421) y/o tau14-421. Los agregados a depurar incluyen, por ejemplo, ovillos neurofibrilares o sus precursores patologicos de tau. Los ovillos neurofibrilares estan asociados a menudo con enfermedades neurodegenerativas, que incluyen, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal hereditaria y parkinsonismo asociados con el cromosoma 17 (FTDP-17), enfermedad de Pick, degeneration corticobasal esporadica y paralisis supranuclear progresiva. Los anticuerpos pueden administrarse, por ejemplo, por via intravenosa, via subcutanea, via nasal, via bucal, via transdermica, etc., como se describe con mayor detalle a continuacion.

Otro aspecto de la presente invencion incluye un metodo para ralentizar la progresion de o invertir un fenotipo conductual relacionado con ovillos en un sujeto. Este metodo incluye administrar una tau truncada o una portion de la tau truncada (por ejemplo, como una vacuna), o anticuerpos que reconocen especificamente una tau truncada o una porcion de una tau truncada, en condiciones y en las cantidades eficaces para retardar o invertir un fenotipo conductual relacionado con ovillos en un sujeto. La tau truncada, una porcion de tau truncada, o los anticuerpos, se pueden administrar, por ejemplo, por via intravenosa, via subcutanea, via nasal, via bucal, via transdermica, etc., como se describe con mayor detalle a continuacion.

En determinadas realizaciones preferentes, la invencion se refiere a la administration de anticuerpos con una especificidad para formas anormales (truncadas) de la proteina tau (o porciones de las formas anormales (truncadas) de la proteina tau) que pueden o no ser conformacionalmente distintas de tau normal, siendo dicho anticuerpos no especificos para una proteina tau normal (no muestran union o reactividad con tau normal), por ejemplo, a un paciente humano. Preferentemente, estos anticuerpos reconocen epitopos de extremo libre lineales o conformacionales de tau truncada. En determinadas realizaciones preferentes, estos anticuerpos especificos de extremo libre inhiben la polimerizacion tau. Los anticuerpos pueden administrarse, por ejemplo, por via intravenosa, via subcutanea, via nasal, via bucal, via transdermica, etc., como se describe con mayor detalle a continuacion.

Como afirma Kovacech et al., "Tau Truncation is a Productive Posttranslational Modification of Neurofibrillary Degeneration in Alzheimer's Disease", Current Alzheimer Research Vol. 7 pag. 708-716 (2010), teniendo en cuenta que varios truncamientos de tau C-terminales puede promover el ensamblaje de tau en filamentos helicoidales emparejados (los FHE), diversas proteinas tau truncadas de forma N- y C-terminal ejercen un ensamblaje anormal de los microtubulos, y tanto las moleculas tau truncadas en Glu391 como Asp421 indujeron niveles similares de celulas apoptoticas, muchas de las proteinas presentes en el proteoma de tau truncada del cerebro afectado pueden servir como inductores de la degeneration neurofibrilar de tau. Se sabe que las mutaciones de tau alteran la conformation de la proteina y conducen a su fosforilacion mayor y mas rapida in vitro. El truncamiento de tau puede incluso inducir su hiperfosforilacion. Aunque no se ha determinado el papel temporal de la fosforilacion en el desarrollo de la patologia de tau, Kovacech et al. informan que el modelo in vivo de tauopatias basado en la proteina tau truncada muestra claramente que el truncamiento es una modification "productiva" que puede iniciar la degeneracion neurofibrilar por tau. Kovacech et al. afirman que el mapeo inmunohistoquimico de la distribution de tau truncada en Asp421 y Glu391 en cerebros con EA indico que estos epitopos aparecen en un orden temporal especifico en el desarrollo de ovillos, y proponen que los ovillos neurofibrilares (los ONF) pasan por varias fases durante las cuales tau cambia de conformacion varias veces y se trunca progresivamente en los extremos N y C; inicialmente, ensamblandose las moleculas de tau de longitud completa en neuronas de preovillo que presentan el epitopo conformacional Alz50, y se propone que los sucesos de truncamiento se producen poco despues de la formation de ovillos, truncandose en primer lugar tau en el punto de escision Asp421 (por ejemplo, por caspasa-3) y escindiendose mas tarde adicionalmente en Glu391.

Asuni et al. 2007 informaron sobre la depuration de tau del cerebro mediante inmunoterapia. El resultado fue sorprendente e ilogico, debido a que se pensaba que la diana era principalmente intracelular y estaba principalmente en el citoplasma y, por lo tanto, generalmente inaccesible a los anticuerpos generados o suministrados fuera de la celula. Se han postulado diversos mecanismos, pero ninguno ha mostrado explicar de forma definitiva como funciona la inmunoterapia en este caso. Una sugerencia fue que la proteina tau que se depuro del cerebro de los ratones transgenicos, era, en realidad, extracelular. Otra sugerencia fue que el complejo tau-anticuerpo se formaba en un compartimento vacuolar que esta asociado a la ruta endosomica secretoria. Una tercera idea fue que los anticuerpos entraban en las celulas nerviosas degenerativas (vease la revision de Sigurdsson, Current Alzheimer's Research 2009, 6, 446-450).

Tau truncada

Las formas anormales de las proteinas tau que son objeto de la presente invention son normalmente proteinas tau truncadas (por ejemplo, proteinas tau escindidas por caspasa), muy preferentemente tau truncada en su extremo C en el resto de acido glutamico Glu391 o en el resto de acido aspartico Asp421, o una tau truncada en su extremo N, por ejemplo, en el resto de acido aspartico Asp13 (por ejemplo, tau1-13, tau14-441, tau14-391, tau391-414, taul-391, tau1-421, tau14-421, tau14-410, tau391-410, tau14-412, tau391-412, tau14-383, tau14-381 o tau14-355, o un fragmento de cualquiera de las anteriores). En determinadas realizaciones, la proteina tau truncada es tau1-421 (ATau), o un fragmento C-terminal de la misma. Estas proteinas tau anormales pueden ser conformacionalmente distintas de tau normal y en ocasiones se las denomina "tauones" (vease, por ejemplo, la Publication de Patente de Estados Unidos N.° 2004/0082763, incorporada en el presente documento como referencia en su totalidad). Distintas conformaciones en comparacion con la tau humana normal pueden atribuirse desde el punto de vista patologico a un truncamiento anormal en el extremo N o en el extremo C o en ambos extremos de la molecula de tau.

Estas proteinas tau anormales o truncadas, o fragmentos de las mismas, pueden usarse como inmunogenos o mimotopos para generar anticuerpos especificos para la proteina tau truncada (por ejemplo, neoepitopos creados por la escision de tau en, por ejemplo, Asp421) y no especificos para tau no truncada, in situ y ex situ del cerebro de un sujeto, y/o administrarse a un sujeto para inducir la formacion de los anticuerpos especificos de neoepitopo en el sujeto. Por ejemplo, las proteinas tau truncadas mencionadas anteriormente pueden administrarse a un mamifero (por ejemplo, un paciente humano), que puede ser susceptible a la formacion de ovillos neurofibrilares, para producir anticuerpos contra tales proteinas tau truncadas, siempre y cuando se formen in vivo. En determinadas realizaciones, la proteina tau truncada comprende una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 1-30, o un fragmento de la misma, de tau; una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 380-405, o un fragmento de la misma, de tau; o una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 410-436, o un fragmento de la misma, de tau. En determinadas realizaciones, la proteina tau truncada es tau1-421 (ATau), o un fragmento C-terminal de la misma (por ejemplo, tau411-421, tau412-421, tau413-421, tau414-421, tau415-421, tau416-421, tau417-421 o tau418-421). En algunas de estas realizaciones, la proteina tau truncada esta fosforilada en Ser412 y/o Ser413.

En determinadas realizaciones, la tau truncada comprende o consiste en tau1-13, tau14-441, tau14-391, tau391-414, tau1-391, tau1-421, tau14-421, tau14-410, tau391-410, tau14-412, tau391-412, tau14-383, tau14-381, tau14-355, o un fragmento de cualquiera de las anteriores, de una cualquiera de las seis isoformas de la proteina tau humana. La tau truncada, en determinadas realizaciones, puede estar fosforilada en uno o mas de los siguientes: Ser199, Ser202, Ser214, Ser235, Ser396, Ser404, Thr205, Thr231 y Thr212, en el caso de estar presentes.

La proteina tau truncada descrita anteriormente se puede obtener de una cualquiera de las seis isoformas de la proteina tau humana o un segmento de las mismas. La proteina tau tiene 0, 1 o 2 insertos N-terminales que son el resultado del corte y empalme de los exones dos y tres, y 3 o 4 dominios de union a microtubulos que son el resultado del corte y empalme del exon diez. En determinadas realizaciones, la proteina tau truncada se obtiene de la isoforma mas larga de tau (es decir, htau40). Las secuencias de aminoacidos correspondientes a las isoformas de la proteina tau humana de la presente invencion se proporcionan en las SEQ ID NO: 1-6.

La SEQ ID NO: 1, la isoforma de tau mas larga, htau40, que contiene dos insertos N-terminales y cuatro dominios de union a microtubulos (2N4R), es la siguiente:

MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKESPLQT PTEDGSEEPG 60

SETSDAKSTP TAEDVTAPLV DEGAPGKQAA AQPHTEIPEG TTAEEAGIGD TPSLEDEAAG 120

HVTQARMVSK SKDGTGSDDK KAKGADGKTK IATPRGAAPP GQKGQANATR IPAKTPPAPK 180

TPPSSGEPPK SGDRSGYSSP GSPGTPGSRS RTPSLPTPPT REPKKVAWR TPPKSPSSAK 240

SRLQTAPVPM PDLKNVKSKI GSTENLKHQP GGGKVQIINK KLDLSNVQSK CGSKDNIKHV 300

PGGGSVQIVY KPVDLSKVTS KCGSLGNIHH KPGGGQVEVK SEKLDFKDRV QSKIGSLDNI 360

THVPGGGNKK IETHKLTFRE NAKAKTDHGA EIVYKSPVVS GDTSPRHLSN VSSTGSIDMV 420

DSPQLATLAD EVSASLAKQG L 441

La SEQ ID NO: 2 contiene dos insertos N-terminales y tres dominios de union a microtubulos (2N3R) de la siguiente manera:

MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKESPLQT PTEDGSEEPG 60

SETSDAKSTP TAEDVTAPLV DEGAPGKQAA AQPHTEIPEG TTAEEAGIGD TPSLEDEAAG 120

HVTQARMVSK SLDGTGSDDK KAKGADGKTK IATPRGAAPP GQKGQANATR IPAKTPPAPK 180

TPPSSGEPPK SGDRSGYSSP GSPGTPGSRS RTPSLPTPPT REPKKVAWR TPPKSPSSAK 240

SRLQTAPVPM PDLKNVKSKI GSTENLKHQP GGGKVQIVYK PVDLSKVTSK CGSLGNIHHK 300

PGGGQVEVKS EKLDFKDRVQ SKIGSLDNIT HVPGGGNKKI ETHKLTFREN AKAKTDHGAE 360

IVYKSPWSG DTSPAHLSNV SSTGSIDMVD SPQLATLADE VSASLAKQGL 410

La SEQ ID NO: 3 contiene un inserto N-terminal y cuatro dominios de union a microtubulos (IN4R) de la siguiente manera:

MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKESPLQT PTGDGSEEPG 60

SETSDAKSTP TAEAEEAGIG DTPSLEDEAA GHVTQARMVS KSLDGTGSDD KKAKGADGKT 120

LIATPRGAAP PGQKGQANAT RIPAKTPPAP KTPPSSGEPP KSGDRSGYSS PGSPGTPGSR 180

SRTPSLPTPP TREPKKVAVV RTPPKSPSSA KSRLQTAPVP MPDLKNVKSK IGSTENLKHQ 240

PGGGKVQIIN KKLDLSNVQS KCGSLDNILH VPGGGSVQIV YKPVDLSKVT SKCGSLGNIH 300

HKPGGGQVEV KSEKLDFKDR VQSKIGSLDN ITHVPGGGNK KIETHKLTFR ENAKAKTDHG 360

AEIVYKSPVV SGDTSPRHLS NVSSTGSIDM VDSPQLATLA DEVSASLAKQ GL 412

La SEQ ID NO: 4 no contiene inserto N-terminal y contiene cuatro dominios de union a microtubulos (0N4R) de la siguiente manera:

MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRLDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKAEEAGI GDTPSLEDEA 60

AGHVTQARMV SKSKDGTGSD DKKAKGADGK TKIATPRGAA PPGQKGQANA TRIPAKTPPA 120

PKTPPSSGEP PKSGDRSGYS SPGSPGTPGS RSRTPSLPTP PTREPKKVAV VATPPKSPSS 180

AKSRLQTAPV PMPDLKNVKS LIGSTENLKH QPGGGKVQII NKKLDLSNVQ SKCGSKDNIK 240

HVPGGGSVQI VYKPVDLSKV TSKCGSLGNI HHKPGGGQVE VKSEKLDFKD RVQSKIGSLD 300

NITHVPGGGN KKIETHKLTF RENAKALTDH GAEIVYKSPV VSGDTSPRHL SNVSSTGSID 360

MVDSPQLATL ADEVSASLAK QGL 383

La SEQ ID NO: 5 contiene un inserto N-terminal y tres dominios de union a microtubulos (1N3R) de la siguiente manera:

MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKESPLQT PTEDGSEEPG 60

SETSDAKSTP TAEAEEAGIG DTPSLEDEAA GHVTQARMVS KSKDGTGSDD KKAKGADGKT 120

KIATPRGAAP PGQKGQANAT RIPAKTPPAP KTPPSSGEPP KSGDRSGYSS PGSPGTPGSR 180

SRTPSLPTPP TREPKKVAVV RTPPKSPSSA KSRLQTAPVP MPDLKNVKSK IGSTENLKHQ 240

PGGGKVQIVY KPVDLSKVTS KCGSLGNIHH KPGGGQVEVK SEKLDFKDRV QSKIGSLDNI 300

THVPGGGNKK IETHKLTFRE NAKAKTDHGA EIVYKSPVVS GDTSPRHLSN VSSTGSIDMV 360

DSPQLATLAD EVSASLAKQG L 381

La SEQ ID NO: 6 no contiene inserto N-terminal y contiene tres dominios de union a microtubulos (0N3R) de la siguiente manera:

MAEPRQEFEV MEDHAGTYGLGDRKDQGGYT MHQDQEGDTDAGLKAEEAGIGDTPSLEDEA 60

AGHVTQARMV SKSKDGTGSDDKKAKGADGK TKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPA 120

PKTPPSSGEP PKSGDRSGYSSPGSPGTPGS RSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSS 180

AKSR'liQTAPV PMPDLKNVKSKIGSTENLKH QPGGGKVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIH 240

HKPGGGQVEV KSEKLDFKDRVQSKIGSLDN ITHVPGGGNKKIGTHKLTFRENAKAKTDHG 300

AEIVYKSPVV SGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL 352

La protema tau truncada de la presente invencion puede estar fosforilada en uno o mas restos de aminoacidos. En una realizacion, la proteina tau truncada esta totalmente fosforilada. Los restos de aminoacido en la proteina tau de longitud completa, la SEQ ID NO: 1, que estan fosforilados o pueden fosforilarse incluyen tirosinas en las posiciones de aminoacido 18, 29, 97, 310 y 394; serinas en las posiciones de aminoacido 184, 185, 198, 199, 202, 208, 214, 235, 237, 238, 262, 293, 324, 356, 396, 400, 404, 409, 412, 413 y 422; y treoninas en las posiciones de aminoacido 175, 181,205, 212, 217, 231 y 403. Los restos de aminoacido que estan fosforilados o pueden fosforilarse en la SEQ ID NO: 2 incluyen tirosinas en las posiciones 18, 29, 197, 279 y 363; serinas en las posiciones 184, 185, 198, 199, 202, 208, 214, 235, 237, 238, 262, 293, 325, 365, 369, 373, 378, 381, 382, 391; y treonina en las posiciones 175, 181, 205, 212, 217, 231, 372. Los restos de aminoacido que estan fosforilados o pueden fosforilarse en la SEQ ID NO: 3 incluyen tirosinas en las posiciones 18, 29, 168, 281 y 365; serinas en las posiciones 155, 156, 169, 170, 173, 179, 185, 206, 208, 209, 233, 264, 295, 327, 367, 371, 375, 380, 383, 384, 393; y treoninas en las posiciones 146, 152, 176, 183, 188, 202 y 374. Los restos de aminoacido que estan fosforilados o pueden fosforilarse en la SEQ ID NO: 4 incluyen tirosinas en las posiciones 18, 29, 139, 252, 336; serinas en las posiciones 126, 127, 140, 141, 144, 150, 156, 177, 179, 180, 204, 235, 266, 298, 338, 342, 346, 351, 354, 355, 364 y treoninas en las posiciones 117, 123, 147, 154, 159, 173 y 345. Los restos de aminoacido que estan fosforilados o pueden ser restos fosforilados en la SEQ ID NO: 5 incluyen tirosinas en las posiciones 18, 29, 168, 250, 334; serinas en las posiciones 155, 156, 169, 170, 173, 179, 185, 206, 208, 209, 233, 264, 296, 336, 340, 344, 349, 352, 353, 362; y treoninas en las posiciones 146, 152, 1376, 183, 188, 202, 343. Los restos de aminoacido que estan fosforilados o pueden fosforilarse en la SEQ ID NO: 6 incluyen tirosinas en las posiciones 18, 29, 139, 221 y 305; serinas en las posiciones 126, 127, 140, 141, 144, 150, 156, 177, 179, 180, 204, 235, 267, 307, 311, 315, 320, 323, 324, 333; y treonina en las posiciones 117, 123, 147, 154, 159, 173 y 314. Tambien pueden ser fosforilados dentro de las secuencias de tau aminoacidos tirosina, serina o treonina adicionales.

Por lo tanto, un aspecto adicional de la invencion se refiere a una proteina tau truncada fosforilada o una porcion de la misma, y a una composition farmaceutica que contiene la proteina tau truncada fosforilada o una porcion de la misma. En determinadas realizaciones, la proteina tau truncada es tau1-421 (ATau), o un fragmento C-terminal de la misma (por ejemplo, tau411-421, tau412-421, tau413-421, tau414-421, tau415-421, tau416-421, tau417-421, tau418-421 o tau419-421), que esta fosforilada en una o mas de las siguientes Tyr18, Tyr29, Ser184, Ser185, Ser198, Ser199, Ser202, Ser208, Ser214, Ser235, Ser237, Ser238, Ser262, Ser293, Thr175, Thr181, Thr205, Thr212, Thr217, Ser411, Ser412, Ser416, Thr414. En algunas de estas realizaciones, la proteina tau truncada es un fragmento C-terminal de ATau que esta fosforilado en uno o mas de las siguientes Ser411, Ser412, Ser416 y Thr414. La proteina tau truncada fosforilada puede ser una isoforma, un fragmento o una forma recombinante de la proteina. Asimismo, la proteina tau truncada fosforilada tambien puede contener una o mas mutaciones de aminoacidos. Ademas de la proteina tau truncada fosforilada, la composicion farmaceutica tambien puede contener un transportador farmaceutico y/o un adyuvante adecuado como se describe a continuation. En determinadas realizaciones, la vacunacion de un sujeto con una proteina tau truncada fosforilada, o un fragmento de la misma, conduce a la generation de anticuerpos que pueden cruzar la barrera hematoencefalica y/o producirse en el cerebro, y posteriormente se unen y reaccionan selectivamente con tau anormal y, por ejemplo, reducen el grado de tau agregada en el cerebro y disminuyen la progresion de la enfermedad de Alzheimer u otras tauopatias. En determinadas realizaciones, la tau truncada esta fosforilada en 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de las siguientes posiciones: Tyr18, Tyr29, Ser184, Ser185, Ser198, Ser199, Ser202, Ser208, Ser214, Ser235, Ser237, Ser238, Ser262, Ser293, Thr175, Thr181, Thr205, Thr212, Thr217, Thr231, Ser411, Ser412, Ser416, y Thr414.

En determinadas realizaciones, la tau truncada esta fosforilada en uno o mas de los siguientes aminoacidos: Ser199, Ser202, Ser214, Ser235, Ser396, Ser404, Thr205, Thr231, y Thr212, Ser411, Ser412, Ser416, y Thr414.

A menos que se indique otra cosa, la referencia a tau incluye las secuencias de aminoacidos humanas naturales (SEQ ID NO: 1-6), y se refiere especificamente a la isoforma mas larga de tau (SEQ ID NO: 1), tambien conocida como htau40. Ademas pueden usarse variantes de tales segmentos, analogos y mimeticos del peptido tau natural que inducen y/o reaccionan de forma cruzada con anticuerpos para las proteinas tau anormales. Las variantes analogas, incluyendo las alelicas, de especie e inducidas, normalmente difieren de los peptidos de origen natural en una, dos, o unas pocas posiciones, a menudo en virtud de sustituciones conservativas. Los analogos normalmente presentan al menos el 80 o 90 % de identidad de secuencia con los peptidos naturales. Algunos analogos tambien incluyen aminoacidos no naturales o modificaciones de los aminoacidos N o C-terminales en una, dos, o unas pocas posiciones.

Ademas de las proteinas tau de tipo silvestre o naturales, tambien se contempla el uso de proteinas tau truncadas que contienen una o mas sustituciones de aminoacidos. En una realización de la presente invencion, la proteina tau truncada contiene una mutation de prolina a leucina en la position de aminoacido 301 (P301L) de la SEQ ID NO: 1. Tambien se contemplan otras mutaciones de aminoacidos de la proteina tau. Estas mutaciones incluyen una mutacion de lisina a treonina en el resto de aminoacido 257 (K257T) en la SEQ ID NO: 1; una mutacion de isoleucina a valina en la posicion de aminoacido 260 (1260V) de la SEQ ID NO: 1; una mutacion de glicina a valina en la posicion de aminoacido 272 (G272V) de la SEQ ID NO: 1; una mutacion de asparagina a lisina en la posicion de aminoacido 279 (N279K) de la SEQ ID NO: 1; una mutacion de asparagina a histidina en la posicion de aminoacido 296 (N296H) de la SEQ ID NO: 1; una mutacion de prolina a serina en la posicion de aminoacido 301 (P301S) de la SEQ ID NO: 1; una mutacion de glicina a valina en la posicion de aminoacido 303 (G303V) de la SEQ ID NO: 1; una mutacion de serina a asparagina en la posicion de 305 (S305N) de la SEQ ID NO: 1; una mutacion de glicina a serina en la posicion de aminoacido 335 (G335S) de la SEQ ID NO: 1; una mutacion de valina a metionina en la posicion de 337 (V337M) de la SEQ ID NO: 1; una mutacion de acido glutamico a valina en la posicion de 342 (E342V) de la SEQ ID NO: 1; una mutacion de lisina a isoleucina en la posicion de aminoacido 369 (K3691) de la SEQ ID NO: 1; una mutacion de glicina a arginina en la posicion de aminoacido 389 (G389R) de la SEQ ID NO: 1; y una mutacion de arginina a triptofano en la posicion de aminoacido 406 (R406W) de la SEQ ID NO: 1. En una realización de la presente invencion, la proteina mutante tau truncada, o el fragmento peptidico, esta fosforilada.

Los fragmentos inmunogenicos de la proteina tau truncada utiles para la presente invencion pueden identificarse basandose en la antigenicidad, hidrofilicidad y accesibilidad de la secuencia. En una realizacion preferente, la proteina tau truncada o sus epitopos inmunogenicos pueden o no estar fosforilados en uno o mas aminoacidos. Aunque en algunos casos se han utilizado peptidos de longitudes mas largas para generar satisfactoriamente anticuerpos especificos de extremo, Saido y colaboradores (1993; 1994) establecieron que hay una longitud de cinco aminoacidos para cualquier peptido dado que garantiza que el grupo amino libre especifico en el extremo N constituya una parte esencial del epitopo reconocido por el nuevo anticuerpo. Por lo tanto, en una realizacion preferente, el fragmento inmunogenico de la tau truncada comprende una secuencia lineal de al menos cinco aminoacidos de la proteina tau que garantiza que el grupo amino libre especifico en el extremo N constituye una parte esencial del epitopo reconocido por el nuevo anticuerpo especifico de extremo libre de epitopo lineal. En otras realizaciones, los fragmentos de tau truncada tienen al menos los ultimos 20, 30 o 45 aminoacidos de la tau truncada, y se generan anticuerpos especificos de conformacion o especificos de extremo libre de epitopo lineal. En realizaciones adicionales, un fragmento de una tau truncada comprende o consiste en una secuencia lineal de cuatro aminoacidos de la tau truncada.

En determinadas realizaciones, el fragmento inmunogenico de la tau truncada comprende o consiste en las siguientes secuencias, o fragmentos de las mismas, o una secuencia homologa:

SEQ ID NO:7 EPRQEFEVMED;

SEQ ID NO:8 PRQEFEVMED;

SEQ ID NO:9 QEFEVMED;

SEQ ID NO:10 EFEVMED;

SEQ ID NO:11 FEVMED;

SEQ ID NO:12 EVMED;

SEQ ID NO:13 VMED;

SEQ ID NO:14 MED;

SEQ ID NO:15 HAGTYGLGDRKD;

SEQ ID NO:16 HAGTYGLGDRK;

SEQ ID NO:17 HAGTYGLGDR;

SEQ ID NO:18 HAGTYGLGD;

SEQ ID NO:19 HAGTYGLG;

SEQ ID NO:20 HAGTYGL;

SEQ ID NO:21 HAGTYG;

SEQ ID NO:22 HAGTY;

SEQ ID NO:23 HAGT;

SEQ ID NO:24 IVYKSPVVSGD;

SEQ ID NO:25 IVYKSPVVSG;

SEQ ID NO:26 IVYKSPVVS;

SEQ ID NO:27 IVYKSPVV;

SEQ ID NO:28 IVYKSPV;

SEQ ID NO:29 IVYKSP;

SEQ ID NO:30 IVYKS;

SEQ ID NO: 31 IVYK;

SEQ ID NO: 32 IVY;

SEQ ID NO:33 PQLATLADEVS

SEQ ID NO:34 PQLATLADEV;

SEQ ID NO:35 PQLATLADE;

SEQ ID NO:36 PQLATLAD;

SEQ ID NO:37 PQLATLA;

SEQ ID NO:38 PQLATL;

SEQ ID NO:39 PQLAT;

SEQ ID NO:40 PQLA;

SEQ ID NO:41 PQL;

SEQ ID NO:42 SPQLATLADE;

SEQ ID NO:43 SPQLATLAD;

SEQ ID NO:44 SPQLATLA;

SEQ ID NO:45 SPQLATL;

SEQ ID NO:46 SPQLAT;

SEQ ID NO:47 SPQLA;

SEQ ID NO:48 SPQL;

SEQ ID NO:49 SPQ;

SEQ ID NO:50 DSPQLATL;

SEQ ID NO:51 NAKAKTDHGAE;

SEQ ID NO:52 AKAKTDHGAE;

SEQ ID NO:53 KAKTDHGAE;

SEQ ID NO:54 AKTDHGAE;

SEQ ID NO:55 KTDHGAE;

SEQ ID NO:56 TDHGAE;

SEQ ID NO:57 DHGAE;

SEQ ID NO:58 HGAE;

SEQ ID NO:59 GAE;

SEQ ID NO:60 SSTGSIDMVDS;

SEQ ID NO:61 STGSIDMVDS;

SEQ ID NO:62 TGSIDMVDS;

SEQ ID NO:63 GSIDMVDS;

SEQ ID NO:64 SIDMVDS;

SEQ ID NO:65 IDMVDS;

SEQ ID NO:66 DMVDS;

SEQ ID NO:67 MVDS;

SEQ ID NO:68 VDS;

SEQ ID NO:69 NVSSTGSIDMV;

SEQ ID NO:70 VSSTGSIDMV;

SEQ ID NO:71 SSTGSIDMV;

SEQ ID NO:72 STGSIDMV;

SEQ ID NO:73 TGSIDMV;

SEQ ID NO:74 GSIDMV;

SEQ ID NO:75 SIDMV;

SEQ ID NO:76 IDMV;

SEQ ID NO:77 DMV;

SEQ ID NO:78 NVSTGSIDMVD;

SEQ ID NO:79 VSTGSIDMVD;

SEQ ID NO:80 STGSIDMVD;

SEQ ID NO:81 TGSIDMVD;

SEQ ID NO:82 GSIDMVD;

SEQ ID NO:83 SIDMVD;

SEQ ID NO:84 IDMVD;

SEQ ID NO:85 DMVD;

SEQ ID NO:86 SSTGSIDMVD;

SEQ ID NO:87 SPQLATLADE;

SEQ ID NO:88 SPQLATLAD;

SEQ ID NO:89 SPQLATLA;

SEQ ID NO:90 SPQLATL;

SEQ ID NO:91 SPQLAT;

SEQ ID NO:92 SPQLA;

SEQ ID NO:93 SPQL;

SEQ ID NO: 94 SPQ; y

SEQ ID

En algunas de estas realizaciones, el fragmento inmunogenico de la tau truncada comprende o consiste en una secuencia de las SEQ ID NO: 78-86 o 116 y, preferentemente, las SEQ ID NO: 83-86 o 1l6.

El extremo libre (extremo N o extremo C) del peptido trucado es parte del fragmento inmunogenico y es necesario para la generacion de los anticuerpos especificos de neoepitopo de la presente invencion (es decir, el extremo N o el extremo C libre es una parte esencial del epitopo del anticuerpo). En determinadas realizaciones, al menos una de las serinas y treoninas en estas secuencias esta fosforilada, y la serina (o serinas) y/o treonina (o treoninas) fosforiladas tambien forman parte esencial del epitopo del anticuerpo.

En determinadas realizaciones, la tau truncada comprende o consiste en tau391-421 fosforilado o no fosforilado, tau395-421 (por ejemplo, fosforilado o no fosforilado en uno o mas de los siguientes Ser396, Ser400, Ser404, Ser409, Ser412, Ser413, Tyr394, Thr205 y/o Thr212), tau408-421(por ejemplo, fosforilado o no fosforilado en uno o mas de los siguientes Ser409, Ser412 y/o Ser413), tau414-421(por ejemplo, fosforilado o no fosforilado en uno o mas de los siguientes Ser396, Ser400, Ser404, Ser409, Ser412, Ser413, Tyr394, Thr205 y/o Thr212), tau415-421, tau416-421, tau417-421, tau418-421 o tau419-421, tau361-391, tau386-391, tau385-391, tau384-391.

En una realización de la presente invencion, los peptidos de tau truncada de la presente invencion pueden contener uno o mas restos de D-aminoacido. Los aminoacidos en forma de U tendrian el efecto de potenciar la estabilidad del peptido. Estos D-aminoacidos pueden estar en el mismo orden que la forma L del peptido o ensamblarse en orden inverso a partir de la secuencia de la forma L para mantener la topologia global de la secuencia nativa (Ben-Yedidia et al., "A Retro-Inverso Peptide Analogue of Influenza Virus Hemagglutinin B-cell Epitope 91-108 Induces a Strong Mucosal and Systemic Immune Response and Confers Protection in Mice after Intranasal Immunization," Mol Immunol. 39:323 (2002); Guichard, et al., "Antigenic Mimicry of Natural L-peptides with Retro-Inverso-Peptidomimetics," PNAS 91:9765-9769 (1994); Benkirane, et al., "Antigenicity and Immunogenicity of Modified Synthetic Peptides Containing D-Amino Acid Residues," J. Bio. Chem. 268(35):26279-26285 (1993)).

Los agentes terapeuticos pueden ser polipeptidos mas largos que incluyen, por ejemplo, un fragmento activo (por ejemplo, una porcion inmunogenica) del peptido de tau (por ejemplo, ATau), junto con otros aminoacidos. Por ejemplo, en determinadas realizaciones los agentes terapeuticos incluyen proteinas de fusion que comprenden un segmento de tau unido, con o sin un espaciador, a un epitopo promiscuo de linfocitos T auxiliares que propicia una respuesta de linfocitos B contra el segmento de tau.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a una composition farmaceutica que contiene (uno o mas de) los epitopos inmunogenicos de la proteina tau truncada. En determinadas realizaciones, el epitopo inmunogenico de tau truncada comprende tau391-421(por ejemplo, fosforilado o no fosforilado en uno o mas de los siguientes Ser396, Ser400, Ser404, Ser409, Ser412, Ser413, Tyr394, Thr205 y/o Thr212), tau395-421(por ejemplo, fosforilado o no fosforilado en uno o mas de los siguientes Ser396, Ser400, Ser404, Ser409, Ser412, Ser413, Tyr394, Thr205 y/o Thr212), tau408-421(por ejemplo, fosforilado o no fosforilado en uno o mas de los siguientes Ser409, Ser412 y/o Ser413), tau361-391(por ejemplo, fosforilado o no fosforilado en Ser396), tau411-421, tau416-421, tau417-421, tau418-421, tau419-421, o un fragmento de cualquiera de las anteriores. En determinadas realizaciones, la secuencia del epitopo inmunogenico comprende o consiste en una cualquiera de las SEQ ID NO: 7-94, o 116, o un fragmento de las mismas.

Otras porciones o fragmentos de la proteina tau que son adecuados para poner en practica la presente invencion pueden incluir formas recombinantes de proteina tau anormal (por ejemplo, tau truncada) creadas por escision y/o fosforilacion de la proteina tau normal.

Las formas truncadas anormalmente de las proteinas tau humanas -tauones- se pueden preparar utilizando cualquiera de numerosas tecnicas de sintesis recombinante bien conocidas. En resumen, la mayoria de las tecnicas que se usan para transformar celulas, construir vectores, extraer ARN mensajero, preparar bibliotecas de ADNc y similares, se practican extensamente en la tecnica, y la mayoria de los expertos estan familiarizados con los materiales de recurso convencionales, que describen las condiciones y procedimientos especificos extensamente practicados en la tecnica. Las proteinas tau anormales, tales como la tau truncada, pueden sintetizarse mediante sintesis peptidica en fase solida o expresion recombinante, o pueden obtenerse de fuentes naturales. Los sintetizadores automaticos de peptidos estan disponibles en el mercado de numerosos proveedores, tales como Applied Biosystems (Foster City, California). Los sistemas de expresion recombinantes pueden incluir bacterias, tales como E. coli, levaduras, celulas de insecto o celulas de mamifero. Los procedimientos para la expresion recombinante se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2a ed., 1989).

El sistema procariotico mas comunmente utilizado para la production de proteinas recombinantes sigue siendo E. coli, sin embargo, tambien se pueden usar otras cepas bacterianas, tales como Bacilli, por ejemplo Bacillus subtilis, diversas especies de Pseudomonas, u otras cepas bacterianas. En tales sistemas procarioticos, se utilizan vectores plasmidicos que contienen sitios de replication y secuencias de control procedentes de una especie compatible con el hospedador. Las secuencias de control procarioticas comunmente usadas incluyen promotores para el inicio de la transcription, opcionalmente con un operador, junto con secuencias del sitio de union al ribosoma.

Ahora tambien hay disponible una amplia diversidad de hospedadores eucarioticos para la produccion de proteinas recombinantes exogenas. Como en las bacterias, los hospedadores eucarioticos pueden transformarse con sistemas de expresion que producen la proteina deseada directamente, pero mas comunmente, para efectuar la secretion de la proteina se proporcionan secuencias serial. Los sistemas eucarioticos tienen la ventaja adicional de que tienen la capacidad de procesar intrones que pueden estar presentes en las secuencias genomicas que codifican proteinas de organismos superiores. Los sistemas eucarioticos tambien proporcionan diversos mecanismos de procesamiento que dan como resultado, por ejemplo, la glucosilacion, la oxidation o la derivatizacion de determinados restos de aminoacido, el control conformacional y asi sucesivamente.

Los sistemas eucarioticos usados comunmente incluyen levaduras, celulas de insecto, celulas de mam^fero, celulas de ave y celulas de plantas superiores. El listado no es exhaustivo. Se dispone de promotores adecuados que son compatibles y operativos para su uso en cada uno de estos tipos de hospedadores, asi como secuencias de terminacion y potenciadores, como por ejemplo, el promotor de poliedros de baculovirus. Al igual que en el caso anterior, los promotores pueden ser constitutivos o inducibles. Por ejemplo, en un sistema de mamifero, se puede inducir el promotor MTII mediante la adicion de iones de metales pesados.

Los detalles para la construction de sistemas de expresion adecuados para un hospedador deseado son conocidos por los expertos en la materia. Para la production recombinante de la proteina, el ADN codificante se liga de forma adecuada en el sistema de expresion de election, y despues el sistema se transforma en la celula hospedadora compatible, que despues se cultiva y se mantiene en condiciones en donde tiene lugar la expresion del gen exogeno. Los tauones de la presente invention producidos de esta manera, se recuperan del cultivo, ya sea lisando las celulas o a partir del medio de cultivo, sea apropiado y conocido se pgoúrn los expertos en la materia.

Los ligamientos correctos para la construccion del plasmido se pueden confirmar transformando en primer lugar un hospedador adecuado con la mezcla de ligamiento. Los transformantes satisfactorios se seleccionan mediante ampicilina, tetraciclina u otra resistencia a antibiotico, o usando otros marcadores dependiendo del modo de construccion del plasmido, como se entiende en la tecnica.

En una variacion de la presente invencion, un peptido inmunogenico, tal como una tau truncada, se puede expresar/presentar mediante un virus o bacteria como parte de una composition inmunogenica. Se incorpora en un genoma o episoma del virus o bacteria un acido nucleico que codifica el peptido inmunogenico. Opcionalmente, el acido nucleico se incorpora de tal manera que el peptido inmunogenico se expresa como una proteina secretada o como una proteina de fusion con una proteina de superficie externa de un virus o una proteina transmembrana de bacterias, de forma que se presente el peptido. Los virus o bacterias utilizados en tales metodos deben ser atenuados o no patogenos. Los virus adecuados incluyen adenovirus, VHS, virus de la encefalitis equina venezolana y otros alfavirus, virus de la estomatitis vesicular y otros rabdovirus, virus de la variolovacuna y de la viruela aviar. Las bacterias adecuadas incluyen Salmonella y Shigella. Es particularmente adecuada la fusion de un peptido inmunogenico a HBsAg del VHB.

Las respuestas inmunitarias contra los ovillos neurofibrilares tambien pueden inducirse mediante la administration de acidos nucleicos que codifican segmentos de un peptido de tau anormal o una tau truncada, y fragmentos de los mismos, otros inmunogenos peptidicos, o de anticuerpos y sus cadenas componentes, utilizados para inmunizacion pasiva. Dichos acidos nucleicos pueden ser ADN o ARN. Un segmento de acido nucleico que codifica un inmunogeno se asocia, normalmente, a elementos reguladores, tal como un promotor y un potenciador, lo que permite la expresion del segmento de ADN en las celulas diana deseadas de un paciente. Para la expresion en celulas sanguineas, como es conveniente para la induction de una respuesta inmunitaria, son adecuados para la expresion directa los elementos promotores y potenciadores de los genes de la cadena ligera o pesada de inmunoglobulina, o el promotor temprano intermedio principal y el potenciador de CMV. Los elementos reguladores asociados y las secuencias codificantes a menudo se clonan en un vector. Para la administracion de anticuerpos bicatenarios, las dos cadenas pueden clonarse en el mismo vector o en vectores separados.

Se dispone de varios sistemas de vectores viricos, incluyendo los sistemas retroviricos (vease, por ejemplo, Lawrie et al., Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109 (1993); vectores adenoviricos (Bett et al., J. Virol. 67:5911 (1993); vectores de virus adenoasociados (Zhou et al., J. Exp. Med. 179:1867 (1994), que se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad), vectores viricos de la familia de la viruela, incluyendo el virus de la variolovacuna y los virus de la viruela aviar, vectores viricos del genero de los alfavirus, tales como los obtenidos de los virus Sindbis y del bosque Semliki (Dubensky et al., J. Virol 70:508-519 (1996)), virus de la encefalitis equina venezolana (vease la Patente de los Estados Unidos n.° 5.643.576, para Johnston et al.) y los rabdovirus, tales como el virus de la estomatitis vesicular (vease el documento WO 96/34625) y los papilomavirus (Ohe, et al., Human Gene Therapy 6:325-333 (1995); documento WO 94/12629 para Woo et al.; y Xiao y Brandsma, Nucleic Acids. Res.

24:2630-2622 (1996).

El ADN que codifica un inmunogeno, o un vector que lo contenga, se puede empaquetar en liposomas. Los lipidos adecuados y los analogos relacionados se describen en las patentes de Estados Unidos 5.208.036 de Eppstein et al., la patente de Estados Unidos n.° 5.264.618 para Felgner et al, la Patente de los Estados Unidos n.° 5.279.833 para Rose y la Patente de los Estados Unidos n.° 5.283.185, para Epand et al. Los vectores y el ADN que codifican un inmunogeno tambien pueden adsorberse o asociarse con transportadores de particulas, los ejemplos de los cuales incluyen polimeros de polimetil metacrilato y polilactidas, y poli(lactida-co-glicolidos).

Los vectores de terapia genica o el ADN desnudo se pueden suministrar in vivo mediante la administracion a un paciente individual, normalmente, mediante administracion sistemica (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, nasal, gastrica, intradermica, intramuscular, subdermica o infusion intracraneal) o aplicacion topica (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.° 5.399.346 para Anderson et al.). Dichos vectores pueden incluir, adicionalmente, agentes facilitadores (patente de Estados Unidos n.° 5.593.970 para Attardo et al.). El ADN tambien se puede administrar usando una pistola genica (Xiao y Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24:2630-2622 (1996)). El ADN codificante de un inmunogeno se precipita sobre la superficie de perlas de metal microscopicas. Los microproyectiles se aceleran con una onda de choque o gas de helio en expansion, y penetran en los tejidos a una profundidad de varias capas de celulas. Por ejemplo, es adecuado el Accel™ Gene Delivery Device fabricado por Agacetus, Inc. Middleton Wis. Como alternativa, el ADN desnudo puede pasar a traves de la piel al torrente sanguineo simplemente aplicando de forma puntual el ADN sobre la piel, con irritacion quimica o mecanica (vease el documento WO 95/05853 de Carson et al.).

En una variacion adicional, los vectores que codifican inmunogenos se pueden suministrar a celulas ex vivo, tal como a celulas explantadas de un paciente individual (por ejemplo, linfocitos, aspirados de medula osea, biopsia de tejido) o celulas madre hematopoyeticas de donantes universales, seguido de la reimplantacion de las celulas en un paciente, generalmente despues de la seleccion de las celulas que han incorporado el vector.

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a una proteina tau truncada fosforilada y a una composicion farmaceutica que contiene la proteina tau truncada fosforilada. La proteina tau truncada fosforilada puede ser una isoforma, un fragmento o una forma recombinante de la proteina. Asimismo, la proteina tau truncada fosforilada tambien puede contener una o mas mutaciones de aminoacidos. Ademas de la proteina tau truncada fosforilada, la composicion farmaceutica tambien contiene un transportador farmaceutico y/o un adyuvante adecuado como se describe a continuacion.

Los peptidos de tau tambien pueden producirse por sintesis quimica de la secuencia de aminoacidos de una proteina tau (Goedert et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4051-4055), como se predijo a partir de la clonacion y secuenciacion de un ADNc codificante de una proteina tau. Esta información de la secuencia de la proteina tau puede utilizarse para predecir los peptidos de tau amino y carboxilo terminales apropiados para ser sintetizados quimicamente utilizando metodos de sintesis peptidica convencionales conocidos en la tecnica. Estos metodos incluyen un metodo en fase solida ideado por R. Bruce Merrifield, (Erickson y Merrifield, "Solid-Phase Peptide Synthesis", en The Proteins, Volumen 2, H. Neurath y R. Hill (eds.) Academic Press, Inc., Nueva York pag.

255-257; Merrifield, 1986, "Solid phase synthesis", Science, 242:341-347). En el metodo en fase solida, los aminoacidos se anaden paso a paso a una cadena peptidica en crecimiento que esta unida a una matriz insoluble, tal como perlas de poliestireno. Una ventaja importante de este metodo es que el producto deseado en cada fase esta unido a perlas que pueden filtrarse y lavarse rapidamente y, por lo tanto, se evita la necesidad de purificar los intermediarios. Todas las reacciones se llevan a cabo en un solo recipiente, lo que elimina perdidas debidas a las repetidas transferencias de productos. Este metodo de sintesis quimica de peptidos en fase solida se puede automatizar facilmente haciendo factible sintetizar de forma rutinaria peptidos que contienen aproximadamente 50 restos con buen rendimiento y pureza (Stewart y Young, 1984, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed., Pierce Chemical Co.; Tam et al., 1983, J. Am. Chem. Soc., 105:6442). Por ejemplo, podrian sintetizarse los peptidos de tau correspondientes a los restos de aminoacido 1 a 30 y 331 a 352.

La produccion de peptidos de tau se puede conseguir ademas mediante tecnologia de ADN recombinante. Por ejemplo, las secuencias nucleotidicas codificantes de tau apropiadas pueden sintetizarse, clonarse y expresarse en celulas hospedadoras apropiadas. Dado que la secuencia de ADN que codifica una proteina tau es conocida (Goeddert et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:4051-4055), pueden sintetizarse sondas de ADN mediante metodos convencionales conocidos en la tecnica para analizar bibliotecas de ADNc preparadas a partir de tejido cerebral de pacientes con enfermedad de Alzheimer, en cuanto a ADNc especificos de la proteina tau. Estas sondas de ADN pueden usarse ademas para aislar la familia completa de genes de proteina tau a partir de estas bibliotecas de ADNc, utilizando metodos que son bien conocidos por los expertos en la materia. Vease, por ejemplo, las tecnicas descritas en Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., Capitulo 7.

Se puede utilizar la tecnica de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar los miembros individuales de la familia tau, para la posterior clonacion y expresion de los ADNc de proteina tau, vease las patentes de Estados Unidos n.° 4.683.202; 4.683.195; 4.889.818; Gyllensten et al., 1988, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 85:7652-7656; Ochman et al., 1988, Genetics, 120:621-623; Triglia et al., 1988, Nucl. Acids. Res., 16:8156; Frohman et al., 1988, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 85:8998-9002; Loh et al., 1989, Science, 243:217-220).

Pueden usarse metodos que conocen bien los expertos en la materia para construir vectores de expresion que contienen las secuencias codificantes de proteinas tau o fragmentos de las mismas y senales de control transcripcional/traduccional apropiadas. Estos metodos incluyen tecnicas de ADN recombinante in v/tro, tecnicas de sintesis y recombinacion/recombinacion genetica in v/vo. Vease, por ejemplo, las tecnicas descritas en Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., Capitulo 12.

Se puede utilizar diversos sistemas de vectores de expresion en hospedadores para expresar las proteinas tau o fragmentos de las mismas. Estos incluyen, pero sin limitacion, microorganismos tales como bacterias transformadas con ADN de bacteriofago recombinante, ^a Dⁿ plasmidico o vectores de expresion de ADN cosmido que contienen una secuencia codificante para una proteina tau o un fragmento de la misma; levaduras transformadas con vectores de expresion en levaduras recombinantes que contienen una secuencia codificante para una proteina tau o un fragmento de la misma; sistemas de celulas de insecto infectadas con vectores de expresion de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contienen una secuencia codificante de una protema tau un fragmento de la misma; o sistemas de celulas animales infectadas con vectores de expresion de virus recombinantes (por ejemplo, adenovirus, virus de la variolovacuna) que contienen una secuencia codificante para una proteina tau o fragmento de la misma.

Los elementos de expresion de estos vectores varian en su fuerza y especificidades. Dependiendo del sistema de hospedador/vector utilizado, se puede usar en el vector de expresion cualquier numero de elementos de transcripcion y de traduccion adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, se pueden usar promotores inducibles tales como pL del bacteriofago lambda, plac, ptrp, ptac (promotor hibrido de ptrp-lac) y similares; cuando se clona en celulas de insecto, se pueden usar promotores tales como el promotor de polihedrina de baculovirus; cuando se clona en sistemas de celulas de mamifero, se pueden usar promotores tales como el promotor tardio de baculovirus o el promotor 7.5K del virus de la variolovacuna. Ademas pueden usarse promotores producidos por tecnicas de ADN recombinante o de sintesis para proporcionar la transcripcion de la secuencia codificante de una proteina tau insertada o fragmento de la misma.

En levaduras, pueden usarse varios vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles. Para una revision vease, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience Cap. 13; Grant et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, en Methods in Enzymology, Ed. Wu y Grossman, 1987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pag. 516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C. Cap.3; y Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Ed. Berger y Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pag. 673-684; y The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Ed. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, vol. I y II. Para los ensayos de complementacion en levaduras, los ADNc de las proteinas tau o fragmentos de las mismas pueden clonarse en plasmidos episomicos de levadura (YEp) que se replican de forma autonoma en la levadura debido a la presencia del plasmido 2|j de levadura. La secuencia de la proteina tau o fragmento de la misma puede clonarse detras de un promotor de levadura constitutivo, tal como ADH o LEU2, o de un promotor inducible tal como GAL (Cloning in Yeast, Cap. 3, R. Rothstein en; DNA Cloning Vol. 11, A Practical Approach, Ed. DM Glover, 1986, IRL Press, Wash., D.C.). Las construcciones pueden contener las regiones 5' y 3' no traducidas de un ARNm de una proteina tau afin o las correspondientes a un gen de levadura. Los plasmidos YEp se transforman con alta eficiencia y son extremadamente estables. Como alternativa, se pueden usar vectores que propicien la integracion de secuencias de ADN exogenas en el cromosoma de la levadura.

En determinadas realizaciones, se podria usar un sistema de insecto para expresar proteinas de tau o fragmentos de las mismas. En uno de tales sistemas, se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (VPNAc) como un vector para expresar genes exogenos. El virus crece en celulas de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante de la proteina tau o fragmento de la misma puede clonarse en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor del VPNAc (por ejemplo, el promotor de la polihedrina). La insertion satisfactoria del gen de la polihedrina da como resultado la production de un virus recombinante no ocluido (es decir, un virus que carece de la cubierta proteinacea, codificada por el gen de la polihedrina). Despues, estos virus recombinantes se utilizan para infectar celulas de Spodoptera frugiperda, en las que se expresa el gen insertado. (por ejemplo, vease Smith et al., 1983, J. Biol., 46:586; Smith, Patente de Estados Unidos n.° 4.215.051).

En los casos en que se usa un adenovirus como vector de expresion, la secuencia codificante de la proteina tau o fragmento de la misma puede ligarse a un complejo de control de la transcripcion/traduccion de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardio y la secuencia lider tripartita. Despues, este gen quimerico puede insertarse en el genoma del adenovirus mediante recombination in vivo o in vitro. La insercion en una region no esencial del genoma virico (por ejemplo, la region E1 o E3) da como resultado un virus recombinante que es viable y que tiene la capacidad de expresar la proteina tau o fragmento de la misma en hospedadores infectados. (por ejemplo, vease Logan y Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., (EE.UU.) 81:3655-3659). Como alternativa, puede usarse el promotor 7,5K del virus de la variolovacuna. (por ejemplo, vease Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci., (EE.UU.) 79:7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol., 49:857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci., 79: 4927-4931).

Ademas pueden precisarse senales de initiation especificas para la traduccion eficaz de las secuencias codificantes de la proteina tau insertada o fragmento de la misma. Estas senales incluyen el codon de iniciacion ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en que todo el genoma de la proteina tau, incluyendo su propio codon de iniciacion y las secuencias adyacentes, se insertan en vectores de expresion apropiados, pueden no necesitarse senales de control traduccional adicionales. Sin embargo, en los casos en que solo se inserta una portion de la secuencia codificante de la proteina tau, deben proporcionarse las senales de control traduccional exogenas, incluyendo el codon de iniciacion ATG. Adicionalmente, el codon de iniciacion debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante de la proteina tau o fragmento de la misma, para garantizar la traduccion de todo el inserto. Estas senales de control traduccionales y codones de iniciacion exogenos pueden ser de diversos origenes, tanto naturales como sinteticos. La eficacia de la expresion puede potenciarse mediante la inclusion de elementos potenciadores de la transcripcion, de terminadores de la transcripcion, etc. apropiados (vease Bitter et al., 1987, Methods in Enzymol., 153:516-544).

Ademas, se puede escoger una cepa de celulas hospedadoras que module la expresion de las secuencias insertadas o modifique y procese el producto genico en la forma especifica deseada. La expresion dirigida por determinados promotores puede elevarse en presencia de determinados inductores, (por ejemplo, iones de zinc y cadmio para los promotores de metalotioneina). Por lo tanto, puede controlarse la expresion de la proteina tau modificada geneticamente o un fragmento de la misma. Esto es importante si el producto proteico del gen exogeno clonado es letal para las celulas hospedadoras. Adicionalmente, las modificaciones (por ejemplo, glucosilacion) y el procesamiento (por ejemplo, escision) de los productos proteicos pueden ser importantes para la funcion de la proteina. Distintas celulas hospedadoras tienen caracteristicas y mecanismos especificos para el procesamiento y la modification postraduccionales de proteinas. Se pueden escoger lineas celulares o sistemas hospedadores apropiados para garantizar la modificacion y el procesamiento correctos de la proteina exogena expresada.

Las celulas hospedadoras que contienen la secuencia codificante de la proteina tau o fragmento de la misma y que expresan el producto genico biologicamente activo de la proteina tau o fragmento de la misma, pueden identificarse mediante al menos cuatro enfoques generales: (a) hibridacion ADN-ADN; (b) la presencia o ausencia de funciones geneticas "marcadoras"; (c) evaluation del nivel de transcription se mide por la expresion de transc srietogsún de ARNm de la proteina tau en celulas hospedadoras; y (d) detection de productos genicos de la proteina tau segun se mide por inmunoensayos o por su actividad biologica. Vease la Patente de Estados Unidos n.° 5.492.812.

Una vez que se identifica un recombinante que expresa una proteina tau o fragmento de la misma, se debe analizar el producto genico. Esto se puede lograr mediante ensayos basados en las propiedades fisicas, inmunologicas o funcionales del producto.

Una proteina tau o fragmento de la misma debe ser inmunoreactiva, ya sea que sea el resultado de la expresion de la secuencia genica completa, de una portion de la secuencia genica o de dos o mas secuencias genicas que se ligan para dirigir la production de proteinas quimericas. Esta reactividad se puede demostrar mediante tecnicas inmunologicas convencionales, tales como radioinmunoprecipitacion, competition radioinmunitaria o inmunotransferencias.

1. Anticuerpos frente a tau truncada

Los anticuerpos que se unen a y/o reconocen especificamente cualquiera de las seis isoformas de la proteina tau truncada o la version hiperfosforilada de las mismas y no reconocen, se unen o muestran reactividad con tau no truncada, pueden ser terapeuticamente eficaces en el contexto de la presente invention, por ejemplo, para tratar y/o prevenir la EA y/u otra tauopatia.

Preferentemente, los anticuerpos de la invencion reconocen especificamente el neoepitopo creado por la escision de tau (es decir, las secuencias de aminoacidos del extremo N libre o el extremo C libre del peptido creado por la escision de tau), pero no reconocen la misma secuencia de aminoacidos presente internamente en la proteina tau normal. Los anticuerpos de la invencion, preferentemente, no inhiben la escision por caspasa de tau en Asp421. En determinadas realizaciones, los anticuerpos reconocen especificamente una secuencia de las SEQ ID NO: 7-94 o 116, o cualquier fragmento de las mismas, en la tau truncada, y no reconocen la misma secuencia de aminoacidos cuando esta presente en la proteina tau normal. En determinadas realizaciones, los anticuerpos reconocen especificamente una secuencia de las SEQ ID NO: 78-86 o 116, y no reconocen la misma secuencia de aminoacidos cuando esta presente en la proteina tau normal. Los anticuerpos de la invencion, en las realizaciones preferentes, tienen la capacidad de cruzar la barrera hematoencefalica (BHE) y tienen la capacidad de depurar los peptidos o la tau truncada creados por la escision de tau, y de minimizar o prevenir la formation de ovillos neurofibrilares. Al mismo tiempo, no se espera que estos anticuerpos afecten funciones biologicas de la proteina tau normal, debido a que estas secuencias en la proteina tau normal son internas y no contienen un extremo N o C libre, lo que es necesario para el reconocimiento de los anticuerpos de su epitopo. Por lo tanto, estos anticuerpos pueden usarse en el tratamiento y/o la prevention de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatias, y en la preparation de composiciones farmaceuticas (por ejemplo, vacunas) para el tratamiento y la prevencion de estos trastornos.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invencion reconocen especificamente el neoepitopo creado por la escision de tau (es decir, las secuencias de aminoacidos del extremo N libre o el extremo C libre del peptido creado por la escision de tau), pero no reconocen especificamente la misma secuencia de aminoacidos presente en la proteina tau normal o no se unen de forma suficiente para depurar la tau normal o afectar su funcion. En algunas de estas realizaciones, los anticuerpos reconocen especificamente el neoepitopo creado por la escision de tau en Asp421 (es decir, el extremo C libre de ATau), pero no reconocen especificamente la misma secuencia de aminoacidos presente en la proteina tau normal o no se unen de forma suficiente para depurar la tau normal o afectar su funcion.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos reconocen, se unen o muestran reactividad con ATau, y no reconocen, se unen o muestran reactividad con la isoforma mas larga de tau (es decir, htau40).

En determinadas realizaciones, cuando el objetivo es bloquear directamente la polimerizacion de ATau, el anticuerpo tiene una baja constante de disociacion.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo reconoce un sitio de escision (por ejemplo, Asp421) y un aminoacido fosforilado dentro de diez, seis, cinco o cuatro aminoacidos desde el sitio de escision.

En las realizaciones preferentes de la invencion, los anticuerpos de la invencion (i) inhiben, reducen, depuran y/o eliminan a tau truncada en su extremo C, por ejemplo, en el resto de acido glutamico Glu391 o en el resto de acido aspartico Asp421, o en su extremo N (por ejemplo, en el resto de acido aspartico Asp13), (ii) inhiben, reducen, depuran y/o eliminan a tau truncada forforilada anormal (por ejemplo, tau fosforilada en Ser396 y/o Ser404), y/o (iii) previenen la formacion de ovillos neurofibrilares y/o aumentan la depuracion de los ovillos neurofibrilares, todo ello sin afectar las funciones biologicas de la proteina tau normal.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo usado en los metodos de la invencion es el anticuerpo conformacional MN423, TauC3, Tau12, 5A6, DC11, anti-Tau escindida (ASP421), clon C3 o anticuerpos estructuralmente similares. En algunas de estas realizaciones, el anticuerpo es TauC3, o un anticuerpo estructural y/o funcionalmente similar. Se ha postulado que el truncamiento de tau en Glu391 conduce a cambios conformacionales especificos para la enfermedad de Alzheimer, que son reconocidos por el anticuerpo conformacional MN423 [Kovacech, et al. 2010; Novak, et al. 1989; Novak, et al. 1993; Csokava, et al. 2006; Skrabana, et al. 2006; Skrabana, et al. 2007]. Otro anticuerpo antitau, DC11, reconoce proteinas tau anormales presentes en cerebros con EA.

Adicionalmente, se ha informado de que el anticuerpo TauC3 reconoce especificamente tau truncada en Asp421, mientras que tau de tipo silvestre, que contiene tres repeticiones de union a microtubulos (producidas por corte y empalme alternativo, designadas 3R), o las proteinas tau truncadas en los restos de aminoacido Glu391 o Ala429, no fueron reconocidas por TauC3. (Gamblin, et al., citado anteriormente).

Ademas, el anti-tau escindida (ASP421), clon C3 esta disponible en el mercado de Millipore y se puede usar en los metodos de la presente invencion. El anti-tau escindida (ASP421) es selectivo para un peptido sintetico correspondiente a los aminoacidos 412-421 (CSSTGSIDMVD) de tau humana con una Cys en el extremo N-terminal. Se cree que, sin embargo, hasta la presente invencion, no hubo ensenanza ni sugerencia en la bibliografia sobre el uso de TauC3, DC11, MN423 y anti-Tau escindida (ASP421), clon C3, o de anticuerpos relacionados, para tratar o prevenir la EA u otra tauopatia.

Se piensa adicionalmente que TauC3, DC11, MN423 y anti-Tau escindida (ASP421), clon C3, o un anticuerpo que tenga una forma/estructura tridimensional como TauC3, MN423 y anti-Tau escindida (ASP421), pueden usarse en los metodos de la presente invencion para tratar y/o prevenir la eA u otra tauopatia.

El anticuerpo 5A6 fosfoindependiente es el primero de los tres anticuerpos N-terminales para marcar ovillos difusos tempranos. (Horowitz, 2004). Horowitz, et al. informan que el epitopo Tau-12 se desenmascara a medida que las lesiones asumen una morfologia fibrilar y, posteriormente, los epitopos del extremo N-terminal de tau se pierden en los ovillos de cerebros humanos afectados de EA, un proceso que se correlaciona de forma temporal con la aparicion epitopo especifico del truncamiento por caspasa C-terminal en D421. Adicionalmente, Horowitz, et al. informan que la caspasa-6 escinde a tau in vitro en el resto de acido aspartico Asp421, provocando perdida de inmunorreactividad con los anticuerpos Tau-12 y 5A6.

Se cree que la barrera hematoencefalica ("BHE") esta comprometida en diversas enfermedades neurodegenerativas tales como la EA, y los inmunologos son conscientes del hecho de que las celulas secretoras de anticuerpos pueden entrar al cerebro y secretar anticuerpos a nivel local. En sujetos sanos, la BHE seria relativamente impermeable a los anticuerpos de tau. A medida que la patologia de tau comienza, los cambios inflamatorios asociados y el estres celular pueden facilitar la captation de anticuerpos selectivos para tau truncada, y que no muestran union y/o reactividad con tau normal, en el cerebro y posteriormente en las neuronas, permitiendo de este modo la depuracion de tau patologica antes de que se forme y/o a medida que se forma, lo que, a su vez, retrasaria el inicio, mejoraria o prevendria la enfermedad. Los anticuerpos de las realizaciones preferentes de la invencion tienen la capacidad de cruzar la BHE en un mamifero que padece o con riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa (por ejemplo, EA).

Los anticuerpos para tau truncada de acuerdo con la invencion pueden dirigirse a tau truncada patologicos de forma extracelular, intracelular o ambas. En el direccionamiento extracelular, los anticuerpos que se unen a sus dianas pueden propiciar directamente su desensamblaje y pueden ser una senal para que la microglia depure los complejos de anticuerpo-proteina, previniendo o reduciendo de este modo el potencial efecto toxico directo o indirecto de los agregados extracelulares de tau. La tau intracelular puede depurarse a traves de la captacion de anticuerpos o mediante la depuracion mediada por anticuerpos de tau extracelular, propiciando la secretion de tau intracelular a traves de un cambio en el equilibrio.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo es especifico y reconoce y reacciona selectivamente con Tau391-421, o un fragmento del mismo, (por ejemplo, fosforilado o no fosforilado en uno o mas de los siguientes Ser396, Ser400, Ser404, Ser409, Ser412, Ser413, Tyr394, Thr205 y/o Thr212), Tau395-421 (por ejemplo, fosforilado o no fosforilado en uno o mas de los siguientes Ser396, Ser400, Ser404, Ser409, Ser412, Ser413, Tyr394, Thr205 y/o Thr212), Tau408-421, o un fragmento del mismo, (por ejemplo, fosforilado o no fosforilado en uno o mas de los siguientes Ser409, Ser412 y/o Ser413), o Tau361-391, o un fragmento del mismo, (por ejemplo, fosforilado o no fosforilado en Ser396), y no reconoce y no muestra reactividad con tau normal (por ejemplo, tau no truncada), o los peptidos mencionados anteriormente acoplados/conjugados a una proteina soporte. En realizaciones adicionales, el anticuerpo es espedfico para los primeros sitios de escision N-terminales de tau, por ejemplo, el sitio de truncamiento Asp13.

En las realizaciones preferentes, el anticuerpo reconoce una secuencia de las SEQ ID NO: 7-94 o 116, o cualquier fragmento de las mismas, en la tau truncada, y no reconocen la misma secuencia de aminoacidos cuando esta presente internamente en la proteina tau normal. En algunas de estas realizaciones, los anticuerpos reconocen una secuencia de las SEQ ID NO: 78-86 o 116, y no reconocen la misma secuencia de aminoacidos cuando esta presente en la proteina tau normal (por ejemplo, la isoforma mas larga de la proteina tau (htau40)).

Por lo tanto, una realización preferente de la invention se refiere a la inmunoterapia (pasiva y/o activa) contra los epitopos de extremo libre de tau truncada o los neoepitopos creados por la escision de tau (por ejemplo, en Asp421). Se cree que la inmunoterapia contra los epitopos de extremo libre de tau truncada depura a tau truncada soluble del cerebro y minimiza o previene la formation de los ovillos neurofibrilares, filamentos helicoidales emparejados y/o la agregacion patologica de tau. En determinadas realizaciones, la inmunoterapia contra los epitopos de extremo libre de tau truncada bloquea la polimerizacion de tau de forma directa. La inmunoterapia puede prevenir o retrasar la perdida de memoria y el deterioro mental asociados con las tauopatias (por ejemplo, la EA), y en las realizaciones preferentes puede mejorar la funcion cognitiva o mental en pacientes que padecen o con riesgo de desarrollar una tauopatia (por ejemplo, EA). Esto no se ensena o sugiere en la literatura hasta la fecha. La bibliografia tampoco informa donde existen formas truncadas solubles en la celula y si tales formas y ubicaciones son accesibles para los anticuerpos. Este enfoque puede ser util para depurar la tau neurotoxica soluble antes de que forme ovillos, microfibrillas y/o agregados patologicos, y no depende de la production de anticuerpos conformacionales frente a los ovillos de tau preformados que ya estan provocando dano. Se cree que los anticuerpos generados contra secuencias lineales que reconocen extremos libres de las proteinas tau solubles (por ejemplo, proteinas/peptidos creados por la escision de tau) pueden inhibir directamente la polimerizacion de tau.

Se pueden usar diversos procedimientos conocidos en la tecnica para la produccion de anticuerpos especificos para los neoepitopos creados por la escision de la proteina tau (por ejemplo, anticuerpos que reconocen una secuencia de la SEQ ID NO: 7-94 o 116, o cualquier fragmento de la misma, en la tau truncada, y que no reconocen la misma secuencia de aminoacidos cuando este presente en la proteina tau normal). Dichos anticuerpos incluyen, pero sin limitation, policlonales, monoclonales, quimericos, humanizados, monocatenarios, fragmentos Fab y una biblioteca de expresion de Fab. Para la produccion de anticuerpos, pueden inmunizarse diversos animales hospedadores mediante inyeccion con una proteina tau truncada particular, o con un peptido sintetico de tau, o porciones inmunogenicas de la misma, que pueden o no estar conjugados (por ejemplo, a seroalbumina bovina), incluyendo, pero sin limitacion, conejos, ratones, ratas, etc., usando un protocolo de inmunizacion convencional (Taggert y Samloff, 1983). Despues acabar la inmunizacion, se puede realizar un procedimiento de fusion usando, por ejemplo, esplenocitos de los ratones hiperinmunizados y una linea celular de mieloma SP2/0 Ag14 (ATCC CRL 1581, NS-1 (ATCC TIB18), o equivalente, usando, por ejemplo, polietilenglicol, y los productos de fusion satisfactorios pueden seleccionarse mediante medios HAT y despues se pueden crecer las colonias de hibridoma viables en placas de pocillos. Despues, los pocillos que contienen los productos de fusion satisfactorios pueden explorarse usando, por ejemplo, ELISA (por ejemplo, especificidad y afinidades de union) y pueden aislarse anticuerpos selectivos para proteinas tau truncadas especificas de extremo libre o porciones inmunogenicas de las mismas, y que no muestran union y/o reactividad frente a una tau normal.

Se pueden utilizar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunologica, dependiendo de la especie hospedadora, incluyendo, pero sin limitacion, el de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles pluronicos, polianiones, peptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente utiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. En determinadas realizaciones, el adyuvante es alumbre.

En una realización preferente, los metodos para generar anticuerpos que son especificos de extremo libre para sitios de escision internos de tau son los mismos que los metodos descritos en la Patente de Estados Unidos n.° 7.901.689 y la correspondiente Patente EP n.° 2203433 ("Recall-Vax" de Intellect), excepto en que se utiliza el epitopo especifico de extremo N- o C-terminal libre de una tau truncada, en lugar de un epitopo de linfocito B N- o C-terminal especifico de extremo de un producto de escision de peptido interno de origen natural de una proteina precursora o madura descrito en la patente de Estados Unidos n.° 7.901.689. Estas presentaciones de patente proporcionan metodos para generar anticuerpos que son especificos de extremo libre para los sitios de escision internos de determinadas proteinas. En determinadas realizaciones de la presente invencion, un peptido quimerico o una mezcla de peptidos quimericos en que el extremo N- o C-terminal libre de una tau truncada (en lugar de un epitopo de linfocito B N- o C-terminal especifico de extremo de un producto de escision de peptido interno de origen natural de una proteina precursora o madura descrito en la patente de Estados Unidos n.° 7.901.689) se fusiona con o sin un resto (o restos) de aminoacido espaciador a un epitopo de linfocitos T auxiliares de una fuente distinta. El peptido o los peptidos quimericos se usan despues en una composicion inmunizante para inmunizar a un mamifero contra el extremo N libre o el extremo C libre de un producto de escision de peptido interno que es una molecula propia del mamifero inmunizado (es decir, una tau truncada). Mas espedficamente, como una realizacion preferente de la presente invencion, el peptido (o peptidos) quimerico tiene un epitopo de tau truncada espedfico de extremo N­ o C-terminal, que son los primeros dos a diez o los primeros dos a cinco restos de aminoacido del extremo N o los ultimos dos a diez o los ultimos dos a cinco restos de aminoacido del extremo C de un peptido tau truncado fusionado a un epitopo de linfocitos T auxiliares. Cuando tal peptido (o peptidos) quimerico se administra a un individuo humano como parte de una composicion inmunizante, el individuo se inmunizara contra el peptido o peptidos tau truncados de los que procede el epitopo especifico de extremo.

Es bien sabido que las respuestas de anticuerpos producidas por los linfocitos B frente a una region definida de una proteina o peptido precisan que los linfocitos T auxiliares del sistema inmunitario reconozcan otra parte de ese antigeno de forma simultanea. Esto se denomina comunmente colaboracion de linfocitos B/T. De acuerdo con un aspecto de la presente invencion, este fenomeno se puede imitar fabricando un peptido quimerico sintetico que contenga epitopos de linfocitos B y T en una secuencia lineal contigua. Dichos peptidos quimericos se han utilizado de forma muy satisfactoria para dirigir la produccion de anticuerpos en ratones, quimeras de ser humano/ratones y primates (Sharma et al., 1993; Ifversen et al., 1995; O'Hern et al., 1997). En algunas de estas realizaciones, el epitopo que contiene los primeros dos a veinte, dos a diez o dos a cinco restos de aminoacido del extremo N libre o los ultimos dos a cinco, dos a diez, cinco a treinta, diez a veinticinco, o quince a veinticinco restos de aminoacido del extremo C libre de una tau truncada (por ejemplo, ATau) se fusiona, con o sin restos de aminoacido espaciadores, a un epitopo fuerte de linfocitos T auxiliares conocido, para formar un peptido quimerico. Un ejemplo no limitante de tal epitopo fuerte de linfocitos T conocido es el epitopo promiscuo del toxoide tetanico muy estudiado de la SEQ ID NO: 95. La inmunizacion con el peptido (o peptidos) quimerico que contiene un epitopo especifico de extremo de tau truncada fusionado con el epitopo promiscuo de linfocitos T auxiliares del toxoide tetanico, como una realizacion preferente, deberia dar lugar a anticuerpos especificos para esa tau truncada.

Los anticuerpos para tau truncada especificos anti-extremo N-terminal o anti-extremo C-terminal deseados generados por el metodo de inmunizacion de acuerdo con la presente invencion tienen la capacidad de discriminar entre una tau truncada (por ejemplo, tau escindida por caspasa (por ejemplo, ATau)) y la tau de la que se obtiene proteoliticamente (tau no truncada (por ejemplo, la isoforma mas larga de tau). Estos anticuerpos para tau truncada especificos de extremo se unen especificamente al extremo/final de una tau truncada para desacelerar, reducir o prevenir la acumulacion, la agregacion y/o la polimerizacion de la tau truncada (ya sea en forma soluble o la forma conformacionalmente distinta de tau).

Tambien pueden producirse, de acuerdo con la presente invencion, anticuerpos monocatenarios como moleculas especificas de extremo libre para el extremo N o C de tau truncada (por ejemplo, ATau). Estos anticuerpos monocatenarios pueden ser polipeptidos combinados monocatenarios que tienen capacidad de union a tau truncada, especificos de extremo libre y que comprenden una pareja de secuencias de aminoacidos homologas o analogas a las regiones variables la cadena ligera y pesada de una inmunoglobulina (V^h-V^l unidas o un Fv monocatenario). Tanto V^h como V^l pueden copiar secuencias de anticuerpos naturales, o una o ambas de las cadenas pueden comprender una construccion de CDR del tipo descrito en la patente de Estados Unidos 5.091.513. Los polipeptidos separados analogos a las regiones variables de las cadenas ligera y pesada se mantienen unidos por un enlazador peptidico. Los metodos de produccion de tales anticuerpos monocatenarios, por ejemplo, Fv individual (scFv), particularmente cuando el ADN que codifica las estructuras polipeptidicas de las cadenas V^h y V^l esta caracterizado o puede determinarse facilmente mediante analisis de secuencia, se pueden llevar a cabo en conformidad con los metodos descritos, por ejemplo, en la patente Estados Unidos n.° 4.946.778, la Patente de los Estados Unidos n.° 5.091.513, la Patente de los Estados Unidos n.° 5.096.815, Biocca et al., 1993, Duan et al., 1994, Mhashilkar et al., 1995, Marasco et al., 1993 y Richardson et al., 1995. Las FIG. 3A-3D (de Biocca et al., 1995) muestran de forma esquematica un anticuerpo intacto (FIG. 3A), un fragmento Fab (FIG. 3B), un fragmento Fv que consiste en un complejo de la region variable unido no covalentemente (V, -V, (FIG. 3C) y un anticuerpo Fv monocatenario (FIG.

3D).

Theo y colaboradores (1993; 1994) establecieron que hay una longitud de cinco aminoacidos para cualquier peptido dado que garantiza que el grupo libre especifico en el extremo N constituya una parte esencial del epitopo reconocido por el nuevo anticuerpo. Por lo tanto, un anticuerpo generado contra un peptido inmunogenico puede evaluarse o se evalua para la selectividad del anticuerpo en su reconocimiento de un extremo N o C libre de una proteina tau truncada. Un ensayo de inhibicion competitiva, utilizando el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o inmunoprecipitacion con peptidos correspondientes a distintas regiones de la proteina tau truncada, y la region inmediatamente anterior al sitio de escision por caspasa en el dominio extracelular de la proteina tau, puede determinar la selectividad del anticuerpo.

Los expertos en la materia apreciaran que se puede anadir un resto de cisteina en el extremo de los peptidos inmunogenicos anteriores, junto al extremo correspondiente al extremo N libre o al extremo C libre de la proteina tau truncada, para facilitar el acoplamiento a una proteina soporte. Por ejemplo, se puede anadir un resto de cisteina a los peptidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 7-94 o 116 (por ejemplo, la SeQ ID NO: 14, La SEQ ID NO: 32, La SEQ ID NO: 41, La SEQ ID NO: 49, La SEQ ID NO: 59, La SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 77 o SEQ ID NO: 94). La hemocianina de lapa californiana (KLH, forma siglada de keyhole limpet hemocyanin), la ovoalbumina y la seroalbumina bovina (BSA) son ejemplos no limitantes de protemas que pueden usarse como soporte de inmunogenos. La presencia de un resto de cisteina N-terminal o C-terminal en los peptidos sinteticos inmunogenos proporciona un grupo sulfhidrilo libre para el acoplamiento covalente a una proteina activada con maleimida. Se utiliza un reactivo heterobifuncional, tal como un ester de N-madeimido-6-aminocaproilo o un ester de mmaleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), para acoplar covalentemente el peptido sintetico inmunogenico a la protema soporte (vease, por ejemplo, Hartlow, E. et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1988). Ademas estan disponibles kits comerciales para su uso en el acoplamiento de antigenos peptidicos a proteinas soporte grandes activadas con maleimida.

La invencion proporciona adicionalmente una celula de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monocatenario que es especifico de extremo libre para el extremo N o el extremo C libres de una proteina tau truncada (por ejemplo, tau1-13, tau14-441, tau14-391, tau391-414, tau1-391, tau1-421, tau14-421, tau14-410, tau391-410, tau14-412, tau391-412, tau14-383, tau14-381 o tau14-355) o un fragmento de la misma, y discrimina entre una proteina tau truncada y el precursor de la proteina tau del que procede proteoliticamente. En determinadas realizaciones, el hibridoma produce anticuerpos que son especificos para los neoepitopos formados por el truncamiento de tau, comprendiendo los neoepitopos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 7-94 o 116, o un fragmento de las mismas. En determinadas realizaciones, el hibridoma produce anticuerpos especificos para ATau. Los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales de la presente invencion se producen siguiendo los procedimientos generales descritos por Kohler. y Milstein, Nature, 256, pag. 495 (1975). En ese procedimiento, los hibridomas se preparan fusionando celulas productoras de anticuerpos (normalmente celulas de bazo de ratones inmunizados previamente con una beta amiloide como fuente de antigeno) con celulas de una linea inmortal de celulas tumorales utilizando procedimientos de hibridacion de celulas somaticas.

Para la produccion de anticuerpos, pueden inmunizarse diversos hospedadores, incluyendo cabras, conejos, ratas, ratones, ratones humanizados, seres humanos, y otros, mediante inyeccion con el epitopo pertinente o con cualquier fragmento u oligopeptido del mismo, que tenga propiedades inmunogenicas. Dependiendo de la especie hospedadora, se pueden utilizar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunologica. Dichos adyuvantes incluyen, pero sin limitacion, el de Freund, geles minerales tales como hidróxido de aluminio y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles pluronicos, polianiones, peptidos, emulsiones oleosas, KLH y dinitrofenol. En determinadas realizaciones, el adyuvante es alumbre.

Los agentes inmunoestimulantes o adyuvantes se han usado durante muchos anos para mejorar las respuestas inmunitarias del hospedador, por ejemplo, para vacunas. Los adyuvantes intrinsecos, tales como los lipopolisacaridos, normalmente son los componentes de bacterias destruidas o atenuadas usadas como vacunas. Los adyuvantes extrinsecos son inmunomoduladores que normalmente estan unidos de forma no covalente a antigenos, y estan formulados para potenciar la respuesta inmunitaria del hospedador. Por lo tanto, se han identificado adyuvantes que potencian la respuesta inmunitaria frente a antigenos suministrados por via parenteral. No obstante, algunos de estos adyuvantes son toxicos, y pueden producir efectos secundarios indeseables, haciendolos inadecuados para el uso en seres humanos y muchos animales. De hecho, se usan rutinariamente solo el hidróxido de aluminio y el fosfato de aluminio (comunmente denominados colectivamente alumbre) como adyuvantes en vacunas humanas y veterinarias. La eficacia del alumbre en el aumento de las respuestas de anticuerpos contra los toxoides difterico y tetanico esta bien establecida y la vacuna de HBsAg tambien se ha adyuvantado con alumbre.

Se dejan crecer los hibridomas que son el resultado del proceso de fusion. Posteriormente, los sobrenadantes resultantes se exploran utilizando procedimientos de inmunoensayo, para detectar anticuerpos presentes en los sobrenadantes que tengan la capacidad de unirse a los antigenos especificos.

En otra realization, la tecnologia de biblioteca de anticuerpos combinatoria, es decir, la selection basada en antigeno de bibliotecas de anticuerpos expresados en la superficie del fago filamentoso M13, se puede usar para la generation de anticuerpos monoclonales y posee varias ventajas con respecto a las metodologias de hibridoma (Huse, et al, 1989. Barbas, et al. 1991; Clackson, et al, 1991: Burton y Barbas, 1994). El anticuerpo de la invencion puede generarse a partir de bibliotecas de anticuerpos de fagos. Las metodologias generales implicadas en la creation de grandes bibliotecas combinatorias que utilizan tecnologia de presentation en fagos se describen y divulgan en las patentes de Estados Unidos n.° 5.223.409 presentada el 29 de junio de 1993.

Una vez que se han generado los anticuerpos monoclonales, la selectividad y la afinidad de union (Kd) pueden evaluarse mediante ELISA, Biacore u otro metodo. Por ejemplo, pueden realizarse sobre los anticuerpos bioensayos in vitro para probar la eficacia de los anticuerpos especificos de tau truncada en el bloqueo de la citotoxicidad inducida por tau. Ademas, pueden realizarse sobre los anticuerpos bioensayos in vitro para probar la falta de interferencia con la funcion de la tau normal. Despues, pueden aislarse los anticuerpos selectivos para la tau truncada, y que no muestren union y/o reactividad con tau normal y evaluarse adicionalmente en experimentos in vivo, por ejemplo, en modelos transgenicos de EA. Los experimentos in vivo, si se realizan, evaluaran la seguridad y la eficacia de los anticuerpos aislados, utilizando diversos metodos para medir la seguridad y la eficacia, que incluyen, por ejemplo, herramientas bioquimicas, neuropatologicas, de formation de imágenes y cognitivas.

Los anticuerpos preferentes pueden unirse espedficamente a la forma agregada de tau truncada, sin unirse a la forma disociada. Como alternativa, un anticuerpo puede unirse espedficamente a la forma disociada sin unirse a la forma agregada. Un anticuerpo puede reconocer otras formas de tau que se acumulan en el cerebro con EA y trastornos relacionados. Estas formas difieren de la tau normal en terminos de modificacion postraduccional, glucacion, truncamiento proteolitico y racemizacion. Los anticuerpos utilizados en los metodos terapeuticos habitualmente tienen una region constante intacta o al menos una porcion suficiente de la region constante para interactuar con un receptor de Fc. Es preferente el isotipo IgG 1 humano debido a que tiene la mayor afinidad de los isotipos humanos por el receptor FcR1 en fagocitos. Ademas se pueden usar fragmentos Fab biespedficos, en los que un brazo del anticuerpo tiene especificidad por tau y el otro por un receptor de Fc. Algunos anticuerpos se unen a tau con una afinidad de union mayor o igual a aproximadamente 106, 107, 108, 109, o 1010 M-1.

Los anticuerpos utiles en conformidad con la presente invencion (por ejemplo, los que tienen la capacidad de cruzar la barrera hematoencefalica) pueden administrarse a un paciente humano que puede ser susceptible de, o que padece, la formacion de ovillos neurofibrilares, para unirse y tratar selectivamente, reducir o eliminar la neurotoxicidad provocada por, por ejemplo, las proteinas tau truncadas diana a las que se unen selectivamente, siempre y cuando tales proteinas tau truncadas se formen in vivo.

Como alternativa, los anticuerpos pueden expresarse en el cerebro de un mamifero (por ejemplo, un paciente humano), por ejemplo, administrando un peptido inmunogenico aislado que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 7-94 o 116, o un fragmento de la misma, o un gen o una molecula de ADN que codifica el anticuerpo.

Los anticuerpos utilizados en conformidad con la invencion pueden ser anticuerpos monoclonales y derivados de los mismos, nativos o recombinantes, estar inmovilizados, libres en solucion o presentarse en la superficie de diversas moleculas o bacterias, virus u otras superficies. Los anticuerpos tambien pueden ser humanizados.

Los sueros policlonales normalmente contienen poblaciones mixtas de anticuerpos que se unen a varios epitopos a lo largo de la longitud de tau. Sin embargo, los sueros policlonales pueden ser espedficos de un segmento particular de tau, tal como tau379-408. Los anticuerpos monoclonales se unen a un epitopo espedfico dentro de la tau truncada que puede ser un epitopo conformacional o no conformacional.

En algunos metodos, se utilizan multiples anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de union para distintos epitopos. Dichos anticuerpos pueden administrarse de forma secuencial o simultanea.

En otra realizacion, los anticuerpos se produciran in vivo, en el sujeto que lo necesite, administrando un antigeno tal como un peptido de tau truncada o fragmentos del mismo. En determinadas realizaciones, el antigeno comprende o consiste en una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 7-94 o 116, o un fragmento de las mismas. El titulo de los anticuerpos se determinara mediante tecnicas que son conocidas por un experto en la materia y se administrara antigeno adicional si es necesario.

En otra realizacion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende los anticuerpos descritos anteriormente y un metodo para usar la composicion para la inhibicion de la formacion de ovillos neurofibrilares. La presencia disminuida de ovillos neurofibrilares retrasara la progresion de la enfermedad de Alzheimer u otras enfermedades caracterizadas por la agregacion/formacion de tau de ovillos neurofibrilares, en un sujeto que lo necesite.

En una realizacion, la composicion incluye un anticuerpo en una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz suficiente para inhibir la neurotoxicidad de tau truncada, y un transportador farmaceuticamente aceptable.

En realizaciones preferentes, los anticuerpos de acuerdo con la presente invencion inhiben la actividad de la proteina tau anormal o truncada deseada de forma intraneuronal y, por lo tanto, pueden usarse como farmacos intracelulares. Estos anticuerpos reconocen preferentemente la conformacion espedfica de tauon de la proteina tau diana (por ejemplo, truncada), sin reconocer la tau soluble humana normal. En otras palabras, en realizaciones preferentes, los anticuerpos de la presente invencion se unen a y tienen reactividad con la proteina tau anormal o truncada diana y no se unen y no muestran reactividad con tau normal. Se puede decir que los anticuerpos de acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invencion son "espedficamente reactivos" con la proteina tau anormal diana si son capaces de unirse con esa proteina tau anormal, para acoplarse de este modo la molecula al anticuerpo. La especificidad se puede analizar mediante cualquier prueba convencional disponible para detectar la especificidad de anticuerpos, por ejemplo, pruebas de ELISA, radioinmunoensayos, microscopio de fuerza atomica con companeros de union unidos a un voladizo, etc.

En un aspecto adicional de la invencion, los anticuerpos de acuerdo con la presente invencion pueden usarse para la preparacion de un farmaco o una composicion farmaceutica para el tratamiento de tauopatias tales como la Ea, por modificacion biotecnologica en moleculas monocatenarias equipadas con una secuencia de direccionamiento capaz de suministrarlos a las celulas de neuroblastoma que expresan tauones, donde se unen a los tauones e interfieren con sus efectos patologicos, y aumentan la degradacion de las proteinas tau anormalmente truncadas.

En aun otra realización de la invencion, los anticuerpos de la presente invencion pueden conjugarse con un agente citoprotector o un agente que facilitara y/o mejorara la capacidad del anticuerpo para cruzar la BHE. El agente citoprotector puede ser un antioxidante (por ejemplo, melatonina); y el agente que facilita o mejora la capacidad del anticuerpo para cruzar la BHE es una sustancia hidrofoba que tiene la capacidad de cruzar la BHE y que generalmente es reconocida como segura (GRAS, forma siglada de generally recognized as safe) por la Administracion de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos ("FDA", forma siglada de Food and Drug Administration). El agente citoprotector o el agente que facilita o mejora la capacidad del anticuerpo de cruzar la BHE puede conjugarse con el anticuerpo directamente o a traves de un enlazador. El enlazador se puede seleccionar del grupo que comprende o consiste en un enlazador de hidrazina, un enlazador de disulfito, un enlazador de tioeter, un enlazador peptidico. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es especifico para ATau, y el agente citoprotector es la melatonina.

2. Peptido inmunogenico

Un peptido inmunogenico aislado de la presente invencion comprende o consiste en de aproximadamente 2 a aproximadamente 427 aminoacidos. En determinadas realizaciones, el peptido inmunogenico aislado comprende o consiste en tau1-13, tau14-441, tau14-391, tau391-414, tau1-391, tau1-421, tau14-421, tau114-410, tau391-410, tau14-412, tau391-412, tau14-383, tau14-381, tau143-355, o un fragmento de cualquiera de las anteriores.

En las realizaciones preferentes, la porcion inmunogenica del peptido aislado comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos que es identica u homologa a la secuencia de aminoacidos del neoepitopo creado por la escision de tau, por ejemplo, en el resto de acido glutamico Glu391, en el resto de acido aspartico Asp421 o en el resto de acido aspartico Asp421, o un fragmento de tal peptido (por ejemplo, tau1-13, tau14-441, tau14-391, tau391-414, tau1-391, tau1-421, tau13-421, tau14-410, tau391-410, tau14-412, tau391-412, tau14-383, tau14-381, tau14-355, o un fragmento de cualquiera de las anteriores). La porcion inmunogenica del peptido aislado generalmente comprende de dos a diez, de dos a nueve, de dos a ocho, de dos a siete, de dos a seis, de dos a cinco, o de dos a cuatro aminoacidos en una secuencia identica u homologa a la secuencia de estos aminoacidos en un neoepitopo creado por la escision de tau, por ejemplo, en el resto de acido glutamico Glu391, en el resto de acido aspartico Asp421 o en el resto de acido aspartico Asp13. En las realizaciones preferentes, la secuencia inmunogenica se selecciona de las SEQ ID NO: 7-94 o 116, o un fragmento de las mismas. En algunas de estas realizaciones preferentes, el peptido inmunogenico aislado comprende o consiste en tau1-421 (ATau) o un fragmento del mismo, en donde la porcion inmunogenica del peptido comprende o consiste en las SEQ ID NO: 78-86 o 116, o un fragmento de las mismas. En determinadas realizaciones, la porcion inmunogenica del peptido aislado comprende o consiste en una secuencia de los ultimos seis, cinco, cuatro, tres o dos aminoacidos de ATau. Como se ha indicado anteriormente, el extremo libre (extremo N o extremo C) del peptido inmunogenico aislado es parte del fragmento inmunogenico y es necesario para la generacion de los anticuerpos especificos de neoepitopo de la presente invencion; y cualquiera de las serinas y/o treoninas en las secuencias enumeradas anteriormente puede o no estar fosforilada.

En determinadas realizaciones, el peptido inmunogenico aislado es un mimotopo que comprende dos peptidos fusionados entre si con o sin restos espaciadores, imitando el primer peptido la estructura del neoepitopo creado por la escision de tau (es decir, las secuencias de aminoacidos unidas a las porciones de los extremos N o C libres de un peptido creado por la escision de tau) en un mamifero, e imitando el segundo peptido la estructura de un epitopo de linfocitos T procedente de una fuente distinta (por ejemplo, toxoide tetanico), mimotopo que puede usarse para inducir una respuesta inmunitaria en un mamifero, y, en las realizaciones preferentes, es para su uso en el tratamiento y/o la prevencion de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatias, y/o en la preparacion de una composition farmaceutica para el tratamiento de estos trastornos. En las realizaciones preferentes, el primer peptido comprende o consiste en una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 7-94 o 116, o un fragmento de las mismas. En algunas de estas realizaciones, el peptido inmunogenico aislado comprende o consiste en tau1-421 (ATau) o un fragmento del mismo, en donde la porcion inmunogenica del peptido comprende o consiste en las SEQ iD NO: 78-86 o 116, o un fragmento de las mismas.

En determinadas realizaciones, el peptido inmunogenico aislado es un peptido (o peptidos) quimerico que comprende una secuencia de 2-10 o 2-5 restos de aminoacido del neoepitopo de linfocito B creado por la escision de tau (por ejemplo, las SEQ ID NO: 78-86 o 116), estando el neoepitopo fusionado a, con o sin un resto (o restos) de aminoacido espaciador, a un epitopo promiscuo de linfocitos T auxiliares de una fuente distinta a la del neoepitopo de linfocito B en una secuencia lineal contigua, dando como resultado un peptido quimerico sintetico. Los peptidos quimericos que contienen epitopos de linfocitos B y T en una secuencia lineal contigua se han utilizado de forma muy satisfactoria para dirigir la production de anticuerpos en ratones, quimeras de ser humano/ratones y primates (Sharma et al., 1993; Ifversen et al., 1995; O'Hern et al., 1997).

El peptido inmunogenico aislado de la invencion (por ejemplo, un mimotopo, peptidos quimericos, etc.) puede obtenerse de fuentes naturales y aislarse de un mamifero, tal como, por ejemplo, un ser humano, un primate, un gato, un perro, un caballo, un raton o una rata, utilizando tecnicas convencionales de purification de proteinas.

El peptido inmunogenico aislado (por ejemplo, un mimotopo, peptidos quimericos, etc) tambien puede sintetizarse qmmicamente o producirse utilizando tecnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, el peptido inmunogenico (por ejemplo, una tau truncada) se puede sintetizar mediante procedimientos en fase solida muy conocidos en la tecnica. Las sintesis adecuadas se pueden realizar utilizando los procedimientos de "T-boc" o "F-moc". Los peptidos ciclicos se pueden sintetizar mediante metodos en fase solida que emplean el bien conocido procedimiento de "F-moc" y resina de poliamida en un aparato completamente automatizado. Como alternativa, los expertos en la materia conoceran los procedimientos de laboratorio necesarios para realizar el proceso manualmente. Las tecnicas y procedimientos para la sintesis en fase solida se describen en Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach por E. Atherton y R. C. Sheppard, publicado por IRL en Oxford University Press (1989) y Methods in Molecular Biology, Vol. 35: Peptide Synthesis Protocols (ed. M. W. Pennington y B. M. Dunn), capitulo 7, pag. 91-171 por D. Andreau et al.

En determinadas realizaciones, los peptidos quimericos aislados de la presente invencion pueden fabricarse por metodos quimicos de sintesis que son muy conocidos para los expertos en la materia. Por ejemplo, los peptidos quimericos se pueden sintetizar usando las tecnicas de sintesis en fase solida automatizada de Merrifield con quimica t-Boc o F-moc en sintetizadores de peptidos, tal como un sintetizador de peptidos de Applied Biosystems. Despues de completar el ensamblaje del peptido quimerico deseado, la resina se trata de acuerdo con los procedimientos habituales para escindir el peptido de la resina y desbloquear los grupos protectores en las cadenas laterales de los aminoacidos. El peptido libre se purifica por HPLC y se caracteriza bioquimicamente, por ejemplo, por analisis de aminoacidos o por secuenciacion. Los metodos de purificacion y caracterizacion de peptidos son muy conocidos para un experto en la materia. Como alternativa, los peptidos quimericos lineales mas largos pueden sintetizarse mediante tecnicas de ADN recombinante muy conocidas. Cualquier manual convencional sobre tecnologia de ADN proporciona protocolos detallados para producir los peptidos quimericos de la invencion. Para construir un gen que codifica un peptido quimerico de la presente invencion, la secuencia de aminoacidos se transcribe de forma inversa en una secuencia de acido nucleico y preferentemente utilizando el uso de codones optimizado para el organismo en que se expresara el gen. A continuacion, se fabrica un gen sintetico, normalmente sintetizando oligonucleotidos solapantes que codifican el peptido y cualquier elemento regulador, si es necesario. El gen sintetico se inserta en un vector de clonacion adecuado y se obtienen y caracterizan los clones recombinantes. El peptido quimerico se expresa despues en condiciones adecuadas apropiadas para el sistema de expresion y el hospedador seleccionados, y el peptido quimerico se purifica y se caracteriza por metodos convencionales.

Como alternativa, la secuencia de aminoacidos del peptido inmunogenico aislado (por ejemplo, un mimotopo, peptidos quimericos, etc.) puede introducirse en un vector de expresion que puede expresarse en un sistema de expresion adecuado, usando tecnicas muy conocidas en la tecnica, seguido de aislamiento o purificacion del polipeptido expresado de interes. Se dispone en la tecnica de diversos sistemas de expresion bacterianos, de levaduras, de plantas, de mamiferos y de insectos, y se puede usar cualquiera de tales sistemas de expresion. Opcionalmente, un polinucleotido que codifica el peptido inmunogenico puede traducirse en un sistema de traduccion sin celulas.

El peptido inmunogenico aislado (por ejemplo, un mimotopo, peptidos quimericos, etc.) tambien puede comprender un peptido que se produce como resultado de la existencia de multiples genes, sucesos alternativos de transcripcion, sucesos alternativos de corte y empalme de ARN, y sucesos alternativos de traduccion y postranscripcionales. El peptido se puede expresar en sistemas, por ejemplo, celulas cultivadas, que dan como resultado sustancialmente las mismas modificaciones postraduccionales presentes cuando el peptido se expresa en una celula nativa, o en sistemas que dan como resultado la alteracion u omision de las modificaciones postraduccionales, por ejemplo, glucosilacion o escision, presentes cuando se expresa en una celula nativa.

El peptido inmunogenico aislado de la invencion, en determinadas realizaciones, puede producirse como una proteina de fusion que contiene otras secuencias de aminoacidos que no son de tau o no procedentes de tau, tales como enlazadores de aminoacidos o secuencias senal o soportes inmunogenicos, asi como ligandos utiles en la purificacion de proteinas, tales como la glutation- S-transferasa, una etiqueta de histidina y la proteina estafilococica A. Puede estar presente en una proteina de fusion mas de un peptido inmunogenico de la invencion. El polipeptido heterologo se puede fusionar, por ejemplo, al extremo N o al extremo C del peptido inmunogenico de la invencion. Un polipeptido de la divulgacion tambien se puede producir como un polipeptido de fusion que comprende secuencias de aminoacidos homologas, es decir, otras secuencias de tau u obtenidas de tau.

En determinadas realizaciones, el peptido inmunogenico aislado puede estar unido a una molecula transportadora inmunogenica para formar inmunogenos para protocolos de vacunacion. El soporte inmunogenico puede comprender un material que tiene la propiedad de suscitar de forma independiente una respuesta inmunogenica en un mamifero y que puede estar unido (por ejemplo, acoplado covalentemente) al peptido inmunogenico o una porcion del mismo, ya sea directamente a traves de la formacion de enlaces peptidicos o ester entre grupos carboxilo, amino o hidroxilo libres en el peptido, y los correspondientes grupos en el material soporte inmunogenico, o alternativamente enlazando a traves de un grupo de union bifuncional convencional, o como una proteina de fusion.

Los expertos en la materia conoceran facilmente los tipos de transportadores que se pueden usar en los peptidos inmunogenicos de la invencion. En determinadas realizaciones, el transportador se selecciona del grupo que comprende o consiste en particulas similivmcas (VLP, forma sigla del ingles virus-like particles); seroalbuminas (por ejemplo, seroalbumina bovina (BSA)); globulinas; tiroglobulinas; hemoglobinas; hemocianinas (en particular hemocianina de lapa californiana (KLH)); protemas extraidas de ascaris, toxinas o toxoides bacterianos inactivados tales como las toxinas tetanica o difterica (TT y TD) o CRM197, el derivado proteico purificado de la tuberculina (PPD); o la Proteina D de Haemophilus influenzae (Publication PCT No. WO 91/18926) o fragmentos recombinantes de los mismos (por ejemplo, Dominio 1 del Fragmento C de la TT, o el dominio de translocation de la TD o el 1/3 de la Proteina D que comprende los aminoacidos 100 a 110 del extremo N-terminal de la proteina D de Haemophilus influenzae (documento GB 9717953. 5); polilisina; acido poliglutamico; copolimeros de lisina-acido glutamico; copolimeros que contienen lisina u ornitina; transportadores de liposomas, o similares. En determinadas realizaciones, el soporte inmunogenico es la KLH. En otra realization, el soporte inmunogenico es una particula similivirica (VLP), preferentemente una particula similivirica recombinante.

En determinadas realizaciones, la particula transportadora es un epitopo promiscuo del toxoide tetanico de la SEQ ID NO: 95. En otras realizaciones, la particula transportadora es un peptido de una cualquiera de las SEQ ID NO: 96­ 115.

En determinadas realizaciones, el peptido inmunogenico se puede acoplar a soportes inmunogenicos a traves de conjugation quimica o por expresion de companeros de fusion modificados geneticamente. El acoplamiento no necesariamente necesita ser directo, pero puede producirse a traves de secuencias enlazadoras. Mas en general, en el caso en que los peptidos antigenicos se fusionan, conjugan o se unen de otro modo a un soporte inmunogenico, las secuencias espaciadoras o enlazadoras se anaden normalmente en uno o ambos extremos de los peptidos antigenicos. Dichas secuencias enlazadoras generalmente comprenden secuencias reconocidas por el proteasoma, las proteasas de los endosomas u otro compartimento vesicular de la celula.

En una realizacion, el peptido inmunogenico se expresa como una proteina de fusion con el soporte inmunogenico. La fusion del peptido se puede efectuar mediante insertion en la secuencia primaria del soporte inmunogenico o mediante fusion con el extremo N o C del soporte inmunogenico. En lo sucesivo en el presente documento, cuando se hace referencia a proteinas de fusion de un peptido con un soporte inmunogenico, se abarcan la fusion a cualquiera de los extremos de la secuencia de la subunidad o la insercion interna del peptido dentro de la secuencia del transportador. La fusion, como se denomina en la sucesivo en el presente documento, se puede llevar a cabo mediante insercion del peptido inmunogenico en la secuencia del transportador, mediante la sustitucion de parte de la secuencia del transportador por el peptido inmunogenico o mediante una combinacion de delecion, sustitucion o inserciones.

Un experto en la materia encontrara facilmente orientation sobre como construir proteinas de fusion utilizando tecnicas clasicas de biologia molecular. Se han descrito vectores y plasmidos que codifican proteinas de fusion de HBcAg y HBcAg utiles para la expresion de proteinas de fusion de HBcAg y HBcAg (Pumpens et al., Intervirology 44: 98-114 (2001), Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5:1157-1163 (1999)) y puede utilizarse en la practica de la presente divulgacion.

Se pueden anadir restos de aminoacido flanqueantes a cualquiera de los extremos de la secuencia del peptido inmunogenico aislado a fusionar con cualquier extremo de la secuencia de la subunidad de una VLP, o para la insercion interna de tal secuencia peptidica en la secuencia de la subunidad de una VLP. Los restos de glicina y serina son aminoacidos particularmente favorecidos su uso en las secuencias flanqueantes anadidas al peptido a fusionar. Los restos de glicina confieren flexibilidad adicional, lo que puede disminuir el efecto potencialmente desestabilizador de fusionar una secuencia extrana en la secuencia de una subunidad de VLP.

En determinadas realizaciones, el peptido inmunogenico aislado se acopla quimicamente a un soporte inmunogenico, usando tecnicas muy conocidas en la tecnica. La conjugacion puede estar presente para permitir el movimiento libre de los peptidos a traves de una conjugacion de un solo punto (por ejemplo, N-terminal o C-terminal), o como una estructura bloqueada en la que ambos extremos de los peptidos se conjugan con una proteina transportadora inmunogenica o con una estructura de armazon tal como, por ejemplo, una VLP. Dicha conjugacion se puede llevar a cabo a traves de quimica de conjugacion, conocida por los expertos en la materia, tal como a traves de restos de cisteina, restos de lisina u otras fracciones carboxilo conocidas comunmente como puntos de conjugacion, tales como acido glutamico o acido aspartico. Por lo tanto, por ejemplo, para el acoplamiento covalente directo, es posible utilizar una carbodiimida, glutaraldehido o un ester de (N-[y-malcimidobutiriloxi]succinimida, utilizando enlazadores heterobifuncionales disponibles en el mercado, tales como CDAP y SPDP (siguiendo las instrucciones del fabricante). Los ejemplos de conjugacion de peptidos, en particular de peptidos ciclados, a un soporte proteico a traves de derivados peptidicos de acilhidrazina, se describen en la publicacion PCT n.° WO 03/092714. Despues de la reaction de acoplamiento, el inmunogeno puede aislarse facilmente y purificarse mediante un metodo de dialisis, un metodo de filtration en gel, un metodo de fraccionamiento, etc. Los peptidos que terminan con un resto de cisteina (preferentemente con un enlazador fuera de la region ciclada) pueden conjugarse convenientemente a una proteina soporte a traves de quimica de maleimida.

3. Vacunas

Una vacuna en conformidad con la presente invencion puede comprender uno o mas anticuerpos espedficos de neoepftopo descritos anteriormente, o un fragmento de los mismos. La vacuna se utiliza para inducir una respuesta inmunogenica en un mamifero. En las realizaciones preferentes, la respuesta inmunogenica es una reaccion inmunogenica frente a tau truncada patogena creada por escision y, en determinadas realizaciones, la fosforilacion de tau normal, y/o la production in vivo de los anticuerpos espedficos de neoepitopo descritos anteriormente. En determinadas realizaciones, la respuesta tambien incluye una reaccion inmunogenica frente al peptido (o peptidos) de Ap patogeno (por ejemplo, reaccion inmunogenica frente al peptido (o peptidos) de Ap patogeno y/o la generation de los anticuerpos que son espedficos de extremo libre para el peptido (o peptidos) de Ap patogeno y no reconocen, reaccionan con o se unen a APP), ademas de la reaccion inmunogenica frente a tau truncada patogena creada por escision y, en determinadas realizaciones, la fosforilacion de tau normal, y/o la produccion in vivo de los anticuerpos espedficos de neoepitopo descritos anteriormente.

En determinadas realizaciones, la vacuna comprende uno o mas anticuerpos espedficos de neoepitopo descritos anteriormente. La presencia de anticuerpos espedficos anti-neoepitopo para la tau truncada en la sangre y en el espacio extracelular, el liquido intersticial y el liquido cefalorraquideo del cerebro, donde esta presente la tau truncada (fosforilada o no fosforilada), en determinadas realizaciones, propicia la formation de complejos de tau truncada solubles. Estos complejos truncados solubles pueden depurarse del sistema nervioso central mediante el drenaje del espacio extracelular, el liquido intersticial y el liquido cefalorraquideo en la circulation sanguinea general a traves de, por ejemplo, las vellosidades aracnoideas del seno longitudinal superior. De esta manera, se impide que la tau truncada se agregue en los ovillos neurofibrilares. Por lo tanto, en las realizaciones preferentes de la invencion, los anticuerpos anti-neoepitopo espedficos para la tau truncada: (i) inhiben y/o reducen a tau truncada en su extremo C, por ejemplo, en el resto de acido aspartico Asp421, y/o (iii) previenen la formacion de ovillos neurofibrilares y/o aumentan la depuration de los ovillos neurofibrilares, todo ello sin afectar las funciones biologicas de la proteina tau normal. En realizaciones adicionales, los anticuerpos espedficos anti-neoepitopo pueden bloquear directamente la polimerizacion de ATau. En las realizaciones preferentes, la vacuna es para su uso en el tratamiento y/o la prevention de la enfermedad de Alzheimer y/o otra tauopatia.

En una divulgation adicional, la vacuna comprende el peptido inmunogenico aislado descrito anteriormente, o un fragmento del mismo (un peptido de la SEQ ID NO: 7-94 o 116). La respuesta inmunogenica proporcionada por la administration de la vacuna que comprende el peptido inmunogenico, o un fragmento del mismo, en las realizaciones preferentes, es la produccion de los anticuerpos espedficos de neoepitopo descritos anteriormente.

Los anticuerpos administrados o producidos en el cuerpo en respuesta a la administracion del peptido inmunogenico aislado reconocen el neoepitopo creado por la escision de tau (es decir, las secuencias de aminoacidos del extremo N libre o el extremo C libre del peptido creado por la escision de tau), pero no reconocen la misma secuencia de aminoacidos presente en la proteina tau normal. En determinadas realizaciones, los anticuerpos reconocen espedficamente una secuencia de las SEQ ID NO: 7-94 o 116, o cualquier fragmento de las mismas, en la tau truncada, y no reconocen la misma secuencia de aminoacidos cuando este presente en la proteina tau normal. En algunas de estas realizaciones, los anticuerpos reconocen el neoepitopo creado por la escision de tau en Asp421 (por ejemplo, el neoepitopo que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 78-86 o 116, que puede estar o no estar fosforilada). En las realizaciones preferentes de la invencion, los anticuerpos administrados y/o producidos en respuesta a la administracion de la vacuna (i) inhiben, reducen, depuran y/o eliminan a tau truncada en su extremo C, por ejemplo, en el resto de acido glutamico Glu391 o en el resto de acido aspartico Asp421, o en su extremo N (por ejemplo, en el resto de acido aspartico Asp13), (ii) inhiben, reducen, depuran y/o eliminan a tau truncada forforilada anormal (por ejemplo, tau fosforilada en Ser396 y/o Ser404), y/o (iii) previenen la formacion de ovillos neurofibrilares y/o aumentan la depuracion de los ovillos neurofibrilares, todo ello sin afectar las funciones biologicas de la proteina tau normal. En las realizaciones preferentes, la vacuna es para su uso en el tratamiento y/o la prevencion de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatias.

En una divulgacion adicional, la vacuna comprende un peptido inmunogenico aislado que comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos que es identica u homologa a la secuencia de aminoacidos del neoepitopo creado por la escision de tau, por ejemplo, en el resto de acido glutamico Glu391, en el resto de acido aspartico Asp421 o en el resto de acido aspartico Asp13, o un fragmento de tal peptido (por ejemplo, tau1-13, tau14-441, tau14-391, tau391-414, tau1-391, tau1-421, tau13-410, tau391-410, tau14-412, tau391-412, tau13-383, tau13-381, tau13-355, o un fragmento de cualquiera de las anteriores). La portion inmunogenica del peptido generalmente comprende de dos a diez, de dos a nueve, de dos a ocho, de dos a siete, de dos a seis, de dos a cinco, o de dos a cuatro aminoacidos en una secuencia identica a u homologa a la secuencia de estos aminoacidos en un neoepitopo creado por la escision de tau, por ejemplo, en el resto de acido glutamico Glu391, en el resto de acido aspartico Asp421 o en el resto de acido aspartico Asp13. En las realizaciones preferentes, la secuencia inmunogenica se selecciona de las SEQ ID NO: 7-94 o 116, o un fragmento de las mismas. En algunas de estas realizaciones, el peptido inmunogenico aislado comprende o consiste en tau1-421 (ATau), o un fragmento del mismo, y la porcion inmunogenica del peptido comprende o consiste en las SEQ ID NO: 78-86 o 116, o un fragmento de las mismas.

En determinadas realizaciones, la tau truncada se selecciona del grupo que consiste en la tau truncada en su extremo C en el resto de acido glutamico Glu391 o en el resto de acido aspartico Asp421, o una tau truncada en su extremo N, por ejemplo, en el resto de acido aspartico Asp13. El peptido quimerico, en determinadas realizaciones, comprende o consiste en una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 7-94 o 116, o un fragmento de las mismas. En determinadas realizaciones preferentes, la tau truncada se selecciona del grupo que consiste en tau1-13, tau14-441, tau14-391, tau391-414, tau1-391, tau1-421, tau13-421, tau14-410, tau391-410, tau14-412, tau391-412, tau14-383, tau14-381, tau14-355, o un fragmento de cualquiera de las anteriores, de una cualquiera de las seis isoformas de la proteina tau humana. La tau truncada, en determinadas realizaciones, puede estar fosforilada en uno o mas de los siguientes: Ser199, Ser202, Ser214, Ser235, Ser396, Ser404, Thr205, Thr231 y Thr212, en el caso de estar presentes. En determinadas realizaciones, el resto de aminoacido comprende o consiste en una secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NO: 7-94 o 116, o un fragmento de las mismas.

En determinadas realizaciones preferentes, la porcion de tau truncada del peptido quimerico se obtiene de linfocitos B. Es bien sabido que las respuestas de anticuerpos producidas por los linfocitos B frente a una region definida de una proteina o peptido precisan que los linfocitos T auxiliares del sistema inmunitario reconozcan otra parte de ese antigeno de forma simultanea. Esto se denomina comunmente colaboracion de linfocitos B/T. Este fenomeno se puede imitar fabricando un peptido quimerico sintetico que contenga epitopos de linfocitos B y T en una secuencia lineal contigua.

En una divulgacion adicional, la vacuna comprende una composicion (por ejemplo, un mimotopo) que comprende un peptido (o peptidos) quimerico que comprende 2-10 o 2-5 restos de aminoacido del neoepitopo de linfocito B creado por la escision de tau, estando el neoepitopo fusionado, con o sin un resto (o restos) de aminoacido espaciador, a un epitopo promiscuo de linfocitos T auxiliares de una fuente distinta a la del neoepitopo de linfocito B en una secuencia lineal contigua, dando como resultado un peptido quimerico sintetico. Los peptidos quimericos que contienen epitopos de linfocitos B y T en una secuencia lineal contigua se han utilizado de forma muy satisfactoria para dirigir la produccion de anticuerpos en ratones, quimeras de ser humano/ratones y primates (Sharma et al., 1993; Ifversen et al., 1995; O'Hern et al., 1997). El epitopo promiscuo de linfocitos T auxiliares (Th) generalmente se obtiene de una fuente natural distinta de la fuente del neoepitopo B. En otras palabras, el epitopo Th no se reconoce como parte de una molecula propia en el sujeto mamifero inmunizado de acuerdo con el metodo de la presente invencion. Dado que las tau truncadas son moleculas propias, no poseen ningun epitopo Th reconocible, y los epitopos de linfocito B de 2 a 10 o 2-5 restos de aminoacido carecerian por completo de epitopos de linfocitos T. Dichos epitopos pueden proporcionarse, en determinadas realizaciones, mediante secuencias especificas procedentes de inmunogenos potentes, incluyendo, por ejemplo, la toxina tetanica, la toxina pertusica, la proteina F del virus del sarampion y el antigeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg). Los epitopos Th seleccionados tienen, preferentemente, la capacidad de suscitar respuestas de linfocitos T auxiliares en un gran numero de individuos que expresan diversos haplotipos del MHC. Estos funcionan en muchos individuos distintos de una poblacion heterogenea y se consideran epitopos Th promiscuos. Los epitopos Th promiscuos proporcionan la ventaja de suscitar respuestas de anticuerpos potentes en la mayoria de los miembros de grupos de poblacion geneticamente diversos.

En una divulgacion adicional, las composiciones en conformidad con la presente invencion comprenden un peptido (o peptidos) quimerico que comprende unos 2-5 restos de aminoacido del extremo N o C libre de una tau truncada (por ejemplo, ATau) fusionado con o sin un resto (o restos) espaciador a un epitopo promiscuo de linfocitos T auxiliares. El epitopo promiscuo de linfocitos T auxiliares (Th) generalmente se obtiene de una fuente distinta de la fuente del peptido quimerico. La tau truncada se selecciona, por ejemplo, del grupo que consiste en tau truncada en su extremo C en el resto de acido glutamico Glu391 o en el resto de acido aspartico Asp421, o una tau truncada en su extremo N, por ejemplo, en el resto de acido aspartico Asp13. En determinadas realizaciones, la tau truncada es ATau. Un ejemplo no limitante de tal epitopo fuerte de linfocitos T conocido es el epitopo promiscuo del toxoide tetanico muy estudiado de la SEQ ID NO: 95.

En una divulgacion adicional, la vacuna es para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y comprende un mimotopo fusionado con un peptido bacteriano, imitando el mimotopo la estructura del neoepitopo creado por la escision de tau (es decir, las secuencias de aminoacidos unidas a las porciones de los extremos N o C libres de un peptido creado por la escision de tau) en un mamifero, y comprendiendo o consistiendo el peptido bacteriano en un toxoide tetanico bacteriano natural o equivalente. El uso del mimotopo, en las realizaciones preferentes, previene la posibilidad de una respuesta autoinmunitaria que no se aplica a un peptido bacteriano.

En una divulgacion adicional, la vacuna comprende un mimotopo que imita la estructura del neoepitopo creado por la escision de tau en un mamifero, estando el mimotopo fusionado, con o sin restos espaciadores, a un peptido bacteriano que comprende o que consiste en un toxoide tetanico bacteriano natural o equivalente, en donde el neoepitopo comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 1-30, o un fragmento de la misma, de tau; un peptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 380-405, o un fragmento de la misma, de tau; y/o un peptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 410-436, o un fragmento de la misma, de tau; y el mimotopo es adecuado para inducir una respuesta inmunogenica en un mamifero. En algunas de estas realizaciones, el neoepitopo comprende o consiste en los aminoacidos 16-421, 17-421, 18-421 o 19-421 de ATau. En las realizaciones preferentes, la vacuna es para su uso en una composicion farmaceutica para el tratamiento y/o la prevention de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatias.

En una divulgacion adicional, la composicion que proporciona inmunizacion contra la protema tau truncada tambien comprende la composicion que proporciona inmunizacion contra Ap. La composicion que proporciona inmunizacion contra Ap, en determinadas realizaciones, se prepara a partir de un peptido quimerico o una mezcla de peptidos quimericos con un epttopo de linfocito B especifico de extremo de un producto de escision de peptido interno de origen natural de una proteina precursora o madura, como extremo N o extremo C libre, fusionado con o sin un resto (o restos) de aminoacido espaciador a un epitopo de linfocitos T auxiliares procedente de una fuente distinta a la del producto de escision de peptido interno. La composicion que proporciona inmunizacion contra Ap se explica en detalle, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos n.° 7.901.689 de los cesionarios. Mas particularmente, en tales realizaciones, el peptido quimerico de la presente invencion esta representado por

la formula (I): N-(S)m-(Th)n (I);

o

la formula (II): (Th)n-(S)m-C (II), donde:

N es los primeros 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 restos de aminoacido del extremo N libre de un producto de escision de peptido interno de origen natural de una cualquiera de las seis isoformas de la proteina tau normal, tal como, por ejemplo, tau1-13, tau14-441, tau14-391, tau391-414, tau1-391, tau1-421, tau13-410, tau391-410, tau14-412, tau391-412, tau13-383, tau13-381, tau13-355, o un fragmento de cualquiera de las anteriores;

C es los ultimos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 restos de aminoacido del extremo C libre del producto de escision de peptido interno de origen natural (por ejemplo, ATau) de una cualquiera de las seis isoformas de la proteina tau normal;

Th es un epitopo de linfocitos T auxiliares procedente de una fuente natural (es decir, una especie de organismo vivo) distinta de la del producto de escision de peptido interno de origen natural;

S es un resto (o restos) de aminoacido espaciador;

m es 0, 1,2, 3, 4, o 5; y

n es 1,2, 3 o 4.

En las realizaciones, el peptido quimerico de la patente de n.° acabado en 689 esta representado por

la formula (I): N-(S)m-(Th)n (I);

o

la formula (II): (Th)n-(S)m-C (II), donde:

N es los primeros 2, 3, 4 o 5 restos de aminoacido del extremo N libre de un producto de escision de peptido interno de origen natural, tal como un peptido Ap, el cual, cuando es de origen natural en un mamifero, se obtiene de una proteina precursora o una proteina madura;

C es los ultimos 2, 3, 4 o 5 restos de aminoacido del extremo C libre del producto de escision de peptido interno de origen natural;

Th es un epitopo de linfocitos T auxiliares procedente de una fuente natural (es decir, una especie de organismo vivo) distinta de la del producto de escision de peptido interno de origen natural;

S es un resto (o restos) de aminoacido espaciador;

m es 0, 1, 2, 3, 4, o 5; y

n es 1, 2, 3 o 4.

En una divulgacion adicional, la vacuna comprende (i) un mimotopo que imita la estructura del neoepitopo creado por la escision de tau en un mamifero, (por ejemplo, en Asp421), estando el mimotopo fusionado, con o sin restos espaciadores, a un peptido bacteriano que comprende o que consiste en una estructura de un epitopo de linfocitos T procedente de una fuente distinta (por ejemplo, toxoide tetanico); y (ii) un mimotopo que imita la estructura del neoepitopo creado por la escision de Ap en un mamifero, fusionado, con o sin restos espaciadores, a un peptido bacteriano que comprende o que consiste en la estructura de un epitopo de linfocitos T procedente de una fuente distinta (por ejemplo, toxoide tetanico). El epitopo de linfocitos T en el primer mimotopo y el segundo mimotopo pueden ser el mismo o distintos. En determinadas realizaciones, el epitopo de linfocitos T en el primer mimotopo y en el segundo mimotopo comprenden la misma estructura que un epitopo promiscuo bien estudiado del toxoide tetanico de la SEQ ID NO: 95.

El epitopo promiscuo de linfocitos T auxiliares es, en general, un epitopo de linfocitos T de la toxina tetanica, la toxina pertusica, toxina difterica, la proteina F del virus del sarampion, el antigeno de superficie del virus de la hepatitis B, la proteina principal de la membrana externa de Chlamydia trachomitis, del circumsporozoito de Plasmodium falciparum, la triosa fosfato isomerasa de Schistosoma mansoni o TraT de Escherichia coli. En determinadas realizaciones, el epitopo promiscuo de linfocitos T auxiliares es un epitopo fuerte de linfocito T conocido, es el epitopo promiscuo del toxoide tetanico de la SEC ID NO: 95.

En una divulgacion adicional, los epitopos de linfocitos T auxiliares en el peptido quimerico de la presente divulgacion se seleccionan no solo por una capacidad de provocar respuestas inmunitarias en la mayoria de los miembros de una poblacion dada, sino tambien por una capacidad de provocar respuestas de memoria/recuerdo. Cuando el mamifero es un ser humano, la gran mayoria de los sujetos/pacientes humanos que reciben inmunoterapia con el peptido quimerico de la presente invention ya se habran inmunizado con las vacunas pediatricas (es decir, las vacunas triple virica SPR y la de difteria+tos ferina+tetanos) y, posiblemente, la vacuna de la hepatitis B. Por lo tanto, estos pacientes han estado expuestos previamente a al menos uno de los epitopos Th presentes en las vacunas quimericas pediatricas. La exposition previa a un epitopo Th a traves de la inmunizacion con las vacunas habituales deberia establecer clones de linfocitos Th que puedan proliferar inmediatamente tras la administration del peptido quimerico (es decir, una respuesta de recuerdo), estimulando de este modo respuestas rapidas de linfocitos B frente al peptido quimerico. Ademas, los epitopos Th evitan cualquier epitopo de linfocito B y/o linfocito T supresor especifico de patogeno, lo que podria conducir a una supresion inmunitaria inducida por el soporte, un problema encontrado cuando se utilizan moleculas de toxina para suscitar respuestas de linfocitos T auxiliares.

Los epitopos Th en el peptido quimerico de la divulgacion son promiscuos pero no universales. Esta caracteristica significa que los epitopos Th son reactivos en un gran segmento de una poblacion exogamica que expresa distintos antigenos del MHC (reactivos en el 50 al 90 % de la poblacion), pero no en todos los miembros de esa poblacion. Para proporcionar una reactividad inmunitaria amplia casi universal para un producto de escision de peptido interno, se puede preparar una combination de peptidos quimericos con distintos epitopos Th. Por ejemplo, una combination de cuatro peptidos quimericos con epitopos Th promiscuos procedentes de las toxinas tetanica y pertusica, de la proteina F del virus del sarampion y el HBsAg, puede ser mas eficaz.

Los epitopos Th promiscuos a menudo comparten caracteristicas estructurales comunes. Por ejemplo, los epitopos Th promiscuos varian en tamano de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 restos. Las helices anfipaticas son una caracteristica comun de los epitopos Th. Una helice anfipatica se define por una estructura de a-helice con restos de aminoacido hidrofobos que dominan las caras circundantes. Los epitopos Th con frecuencia contienen patrones de aminoacidos primarios adicionales, tal como una Gly o un resto cargado, seguido de dos o tres restos hidrofobos seguidos a su vez por un resto cargado o polar. Este patron define las secuencias de Rothbard. Los epitopos Th a menudo obedecen la regla 1,4, 5, 8, en la que un resto cargado positivamente esta seguido de restos hidrofobos en la cuarta, quinta y octava posiciones despues del resto cargado. Dado que todas estas estructuras estan compuestas de aminoacidos hidrofobos, cargados y polares comunes, cada estructura puede existir simultaneamente dentro de un unico epitopo Th.

Por lo tanto, Th es una secuencia de aminoacidos (naturales o no naturales) que contiene un epitopo Th. El epitopo Th puede ser un epitopo continuo o discontinuo. Por lo tanto, no todos los aminoacidos de la Th son necesariamente parte del epitopo. Por consiguiente, los epitopos Th, incluyendo los analogos y segmentos de epitopos Th, tienen la capacidad de potenciar o estimular una respuesta inmunitaria frente al producto de escision del peptido interno. Los epitopos Th inmunodominantes son reactivos en sentido amplio en poblaciones animales y humanas con tipos de MHC extensamente divergentes (Celis et al., 1988; Demotz et al., 1989; y Chong et al., 1992). El dominio Th de los peptidos quimericos de la presente divulgacion tiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 restos de aminoacido y, preferentemente, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 restos de aminoacido. Cuando estan presentes multiples epitopos Th, entonces cada epitopo Th es independientemente igual o distinto.

Los analogos del epitopo Th incluyen sustituciones, deleciones e inserciones de uno a aproximadamente cinco restos de aminoacido en el epitopo Th. Los segmentos Th son porciones contiguas de un epitopo Th que son suficientes para potenciar o estimular una respuesta inmunitaria frente al producto de escision de peptido interno. Un ejemplo de segmentos Th es una serie de peptidos solapantes que proceden de un unico peptido mas largo.

Los epitopos Th de la presente divulgacion incluyen, por ejemplo, los epitopos de linfocitos T auxiliares del antigeno de superficie de la hepatitis B (HBs Th); los epitopos de linfocitos T auxiliares de la toxina pertusica (TP Th); los epitopos de linfocitos T auxiliares de la toxina tetanica (TT Th); el epitopo de linfocitos T auxiliares de la proteina F del virus del sarampion (VS^fi Th); los epitopos de linfocitos T auxiliares de la proteina principal de la membrana externa de Chlamydia trachomitis (CT Th); los epitopos de linfocitos T auxiliares de la toxina difterica (TD Th); los epitopos de linfocitos T auxiliares del circumsporozoito de Plasmodium falciparum (PF Th); los epitopos de linfocitos T auxiliares de la triosa fosfato isomerasa de Schistosoma mansoni (SM Th); los epitopos de linfocitos T auxiliares de TraT de Escherichia coli (TraT Th) y los analogos inmunopotenciadores de cualquiera de los anteriores. Los epitopos de estos linfocitos T auxiliares son los que se proporcionan en la Tabla 1:

Tabla 1

En una divulgacion adicional, la vacuna comprende un peptido (o peptidos) quimerico que comprende 2-10 o 2-5 restos de aminoacido del neoepitopo de linfocito B creado por la escision de tau, estando el neoepttopo fusionado a, con o sin un resto (o restos) de aminoacido espaciador, el epitopo promiscuo del toxoide tetanico de la SEQ ID NO: 95 en una secuencia lineal contigua. La inmunizacion con el peptido (o peptidos) quimerico que comprende 2-10 o 2­ 5 restos de aminoacido del neoepitopo de linfocito B creado por la escision de tau, estando el neoepitopo fusionado, con o sin un resto (o restos) de aminoacido espaciador, a un epitopo promiscuo del toxoide tetanico de la SEQ ID NO: 95 en una secuencia lineal contigua, deberia dar lugar a los siguientes anticuerpos:

(1) anticuerpo anti-tetanico, que seria irrelevante en los seres humanos dado que la mayoria de los individuos ya son seropositivos para el toxoide tetanico (es decir, por las inmunizaciones previas contra el tetanos), o que serviria como un refuerzo para la inmunizacion previa contra el tetanos;

(2) anticuerpos anti-uniones, que reconocen nuevos epitopos creados por la union que une el neoepitopo de linfocitos B especifico de extremo creado por la escision de tau y el epitopo de linfocitos T auxiliares del toxoide tetanico, pero no reconocerian nada mas que el inmunogeno en si y, por lo tanto, no se espera que produzcan alguna respuesta en un ser humano; y

(3) anticuerpos anti-neoepitopo especificos para la tau truncada, que son los anticuerpos deseados que se busca generar mediante el metodo de acuerdo con la presente invencion para inhibir, reducir o incluso quizas invertir los ovillos neurofibrilares y/o depurar la tau truncada del cerebro de un mamifero. Estos anticuerpos especificos anti-neoepitopo para la tau truncada reconocen el neoepitopo creado por la escision de tau (es decir, las secuencias de aminoacidos del extremo N libre o el extremo C libre del peptido creado por la escision de tau), pero no reconocen la misma secuencia de aminoacidos presente en la proteina tau normal. En determinadas realizaciones, los anticuerpos reconocen una secuencia de las SEQ ID NO: 7-94 o 116, o cualquier fragmento de las mismas, en la tau truncada, y no reconocen la misma secuencia de aminoacidos cuando este presente en la proteina tau normal. En determinadas realizaciones, estos anticuerpos reconocen (es decir, se unen y muestran reactividad) a ATau y no reconocen (es decir, no se unen ni muestran reactividad) a htau40. Las ventajas de este metodo de inmunizacion incluyen, por ejemplo: (1) que se utiliza en la inmunizacion activa un inmunogeno peptidico barato, que se produce y controla para garantizar la calidad sin problemas y facilmente; (2) la inclusion de solo dos a tres, y quizas hasta cuatro o cinco, restos de aminoacido del extremo N o C de un producto de escision de peptido interno de tau debe minimizar la cantidad de anticuerpo producido que pueda reaccionar con la normal proteina tau de la que se obtuvo la tau truncada (es decir, se escindio); (3) el uso de un epitopo de linfocitos T independiente no propio debe romper la autotolerancia y permitir la produccion de anticuerpos frente a un antigeno propio (Schofield et al., 1991); (4) la ausencia en el peptido (o peptidos) quimerico de un epitopo de linfocitos T procedente del producto de escision de peptido interno (tau truncada) debe evitar cualquier problema significativo de autoinmunidad, dado que la inmunidad de linfocitos T anti-lo propio subyace a la progresion de todas las enfermedades autoinmunitarias conocidas; y (5) la inmunizacion debe ser reversible y autolimitada, con trtulos de anticuerpos que caigan gradualmente con el tiempo, dado que no se espera que el sistema inmunitario del paciente encuentre de forma natural como inmunogeno la combinacion de la tau truncada o un fragmento de la misma con la toxina tetanica.

En una divulgacion adicional, la inmunogenicidad se puede mejorar a traves de la adicion de restos espaciadores (por ejemplo, Gly-Gly) entre el epftopo Th promiscuo y el epitopo de linfocito B del peptido quimerico de acuerdo con la presente divulgacion. Ademas de separar fisicamente el epitopo Th del epitopo de linfocitos B, los restos espaciadores de glicina pueden alterar cualquier estructura secundaria artificial creada por la union del epitopo Th con el epitopo de linfocitos B y, de este modo, eliminar la interferencia entre las respuestas de linfocitos T y/o B. La separacion conformacional entre el epitopo auxiliar y el dominio que suscita anticuerpos permite asi interacciones mas eficaces entre el inmunogeno presentado y los linfocitos Th y B apropiados. El resto (o restos) de aminoacido para el resto (o restos) espaciador pueden ser aminoacidos de origen natural o aminoacidos que no son de origen natural, que incluyen, pero sin limitacion, p-alanina, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, tiroxina, acido gamma aminobutirico, homoserina, citrulina y similares.

En una divulgacion adicional, se puede unir un epitopo inmunoestimulante de la proteina invasina de una especie de Yersinia al epitopo de linfocitos T auxiliares del peptido quimerico junto al epitopo de linfocitos B, como un segmento opcional para el peptido quimerico. Las invasiones de la bacteria patogena Yersinia spp. son por proteinas de membrana externa que median la entrada de las bacterias en celulas de mamiferos (Isberg et al., 1990). Se demostro que las invasiones por la bacteria de celulas de mamiferos cultivadas precisan la interaccion entre la molecula de invasina de Yersinia y varias especies de la familia pi de integrinas presentes en las celulas cultivadas (Tran Van Nhieu et al., 1991). Dado que los linfocitos T son ricos en integrinas pi (especialmente, los linfocitos T inmunitarios o de memoria activados), se han investigado los efectos de la invasina en los linfocitos T humanos (Brett et al., 1993). Se piensa que las integrinas facilitan la migracion de los linfocitos T inmunitarios fuera de los vasos sanguineos y a traves del tejido conectivo a los sitios de exposicion antigenica, a traves de su interaccion con proteinas de la matriz extracelular, incluyendo la fibronectina, la laminina y el colageno. Se descubrio que el extremo carboxilo de la molecula de invasina es coestimulante para los T CD4+ humanos sin tratamiento previo en presencia de un mitogeno no especifico, el anticuerpo anti-CD3, provocando una marcada proliferation y expresion de citocinas. Ademas, se identifico el dominio de invasina especifico que interactua con las integrinas p1 para provocar esta estimulacion (Brett et al., 1993). Debido a las propiedades coestimulantes de linfocitos T demostradas asociadas con este dominio, se lo puede unir al epitopo Th promiscuo en el peptido quimerico de la presente divulgacion junto al epitopo de linfocitos B.

En una divulgacion adicional, se puede acoplar un lipido comun para las proteinas de la membrana bacteriana a los peptidos sinteticos que representan epitopos de linfocitos B o de linfocitos T citotoxicos. Muchas de las proteinas de la membrana externa de las bacterias gramnegativas estan modificadas por lipidos y son muy inmunogenicas. Debido a la evidente correlation entre el enlace covalente de lipidos y la inmunogenicidad, se puede acoplar tripalmitoil-S-glicerol cisteina (Pam3Cys), un lipido comun para las proteinas de la membrana bacteriana, a los peptidos sinteticos que representan epitopos de linfocitos B o de linfocitos T citotoxicos. Debido a que este enlace iipidico suscita respuestas adyuvantes significativas, el epitopo Th promiscuo del peptido quimerico puede modificarse con lipidos junto a su enlace con el epitopo de linfocitos B. Es probable que tales peptidos quimericos modificados con lipidos sean mas inmunogenicos que la version no modificada del mismo peptido. La Patente de Estados Unidos n.° 5.843.446, incluye una divulgacion de los epitopos Th y las propiedades inmunoestimulantes de los epitopos de invasina y los restos lipidicos.

La vacuna tambien puede incluir opcional o preferentemente agentes inmunoestimulantes o adyuvantes. Los adyuvantes se han usado durante muchos anos para mejorar las respuestas inmunitarias del hospedador, por ejemplo, para vacunas. Los adyuvantes intrinsecos, tales como los polisacaridos, normalmente son componentes de bacterias destruidas o atenuadas usadas como vacunas. Los adyuvantes extrinsecos son inmunomoduladores que normalmente estan unidos de forma no covalente a antigenos, y estan formulados para potenciar la respuesta inmunitaria del hospedador. Por lo tanto, se han identificado adyuvantes que potencian la respuesta inmunitaria frente a antigenos suministrados por via parenteral. No obstante, algunos de estos adyuvantes son toxicos, y pueden producir efectos secundarios indeseables, haciendolos inadecuados para el uso en seres humanos y muchos animales. De hecho, se usan rutinariamente solo el hidróxido de aluminio y el fosfato de aluminio (comunmente denominados colectivamente alumbre) como adyuvantes en vacunas humanas y veterinarias. La eficacia del alumbre en el aumento de las respuestas de anticuerpos contra los toxoides difterico y tetanico esta bien establecida y la vacuna de HBsAg tambien se ha adyuvantado con alumbre.

Una amplia variedad de adyuvantes extrinsecos puede provocar respuestas inmunitarias potentes contra los inmunogenos. estos incluyen saponinas formando complejos con antigenos proteicos de membrana (complejos inmunoestimulantes), polimeros pluronicos con aceite mineral, micobacterias destruidas en aceite mineral, adyuvante completo de Freund, productos bacterianos, tales como muramil dipeptido (MDP) y lipopolisacarido (LPS), asi como lipido A y liposomas. Para inducir de forma eficaz respuestas inmunitarias humorales (RIH) y la inmunidad mediada por celulas (IMC), se emulsionan los inmunogenos en adyuvantes. Muchos adyuvantes son toxicos, induciendo granulomas, inflamaciones agudas y cronicas (adyuvante completo de Freund, ACF), citolosis (saponinas y polimeros de Pluronic) y pirogenicidad, artritis y uveitis anterior (LPS y MDP). Aunque ACF es un excelente adyuvante y se usa extensamente en investigation, no esta autorizado para su uso en vacunas humanas o veterinarias debido a su toxicidad. En determinadas realizaciones, el adyuvante es alumbre.

La patente de Estados Unidos n.° 4.855.283 ensena analogos de glucoKpido, que incluyen N-glucosilamidas, N-glucosilureas y N-glucosilcarbamatos, cada uno de los cuales esta sustituido en el resto de azucar por un aminoacido, como inmunomoduladores o adyuvantes. La Patente de Estados Unidos 4.258.029 ensena que el clorhidrato de octadecil tirosina (OTH) actua como un adyuvante cuando se esta formando complejo con el toxoide tetanico y con vacuna para el poliovirus de tipo I, II y III inactivado con formalina. Ademas, Nixon-George et al., 1990, informaron que los octadecil esteres de aminoacidos aromáticos formando complejo con un antigeno de superficie de hepatitis B recombinante potenciaron las respuestas inmunitarias del hospedador contra el virus de la hepatitis B. Es preferente la adicion de formulaciones adyuvantes/de emulsiones exogenas que maximicen las respuestas inmunitarias frente al producto de escision de peptido interno. Los adyuvantes y tansportadores que son adecuados son los: (1) que se han utilizado satisfactoriamente en ensayos de Fase I en humanos; (2) basandose en su falta de reactogenia en los estudios de seguridad preclinicos, tienen potencial de aprobacion para su uso en seres humanos; o (3) se han aprobado para su uso en alimentos y animales de compania.

Los regimenes de inmunoterapia que producen respuestas inmunitarias maximas despues de la administration del menor numero de dosis, idealmente solo una dosis, son muy convenientes. Este resultado se puede abordar a traves del aprisionamiento del inmunogeno en microparticulas. Por ejemplo, el copolimero de poli(lactida-coglicolido) de material de sutura absorbible puede conformarse en microparticulas que contienen inmunogeno. Despues de la administracion oral o parenteral, la hidrolisis de microparticulas in vivo produce los subproductos no toxicos, los acidos lactico y glicolico, y libera el inmunogeno, en gran parte no alterado por el proceso de aprisionamiento. La velocidad de degradation de las microparticulas y la liberation de inmunogeno aprisionado pueden controlarse mediante varios parametros, que incluyen (1) la relation de polimeros utilizada en la formation de particulas (las particulas con concentraciones mas altas de co-glicolido se degradan mas rapidamente); (2) el tamano de particula, (las particulas mas pequenas se degradan mas rapidamente que las mas grandes); y, (3) la eficacia de aprisionamiento, (las particulas con concentraciones mas altas de antigeno aprisionado se degradan mas rapidamente que las particulas con cargas mas bajas). Las formulaciones de microparticulas tambien pueden proporcionar las inmunizaciones primarias y las posteriores de refuerzo en una unica administracion, mezclando microparticulas con inmunogeno aprisionado con distintas velocidades de liberacion. Se pueden lograr facilmente formulaciones de dosis unicas que tienen la capacidad de liberar antigeno variando de menos de una semana a mas de seis meses. Ademas, el suministro de peptido quimerico de acuerdo con la presente divulgation, aprisionado en microparticulas, tambien puede proporcionar una eficacia mejorada cuando el inmunogeno microparticulado se mezcla con formulaciones de adyuvantes/de emulsiones exogenas.

La eficacia de los peptidos quimericos puede establecerse y analizarse inyectando a un animal, por ejemplo, ratones o ratas, el peptido quimerico formulado en alumbre y, despues, siguiendo la respuesta inmunitaria frente al producto de escision de peptido interno.

En una divulgacion adicional, la vacuna contiene una mezcla de dos o mas de los peptidos quimericos de la presente divulgacion, por ejemplo, para potenciar la inmunoeficacia en una poblacion mas amplia, y asi, proporcionar una mejor respuesta inmunitaria contra la tau truncada. Otros inmunogenos de peptidos quimericos sinteticos inmunoestimulantes se obtienen mediante la modification en lipopeptidos, para proporcionar una capacidad adyuvante incorporada para vacunas potentes. La respuesta inmunitaria frente a los inmunogenos de peptidos quimericos sinteticos de la presente divulgacion puede mejorarse mediante el suministro a traves de aprisionamiento en o sobre microparticulas biodegradables del tipo descrito por O'Hagan et al (1991). Los inmunogenos pueden encapsularse con o sin adyuvante, incluyendo una fraction lipidica unida covalentemente, tal como Pam3Cys, y tales microparticulas pueden administrarse con un adyuvante inmunoestimulante tal como adyuvante incompleto de Freund o alumbre. Las microparticulas actuan para potenciar las respuestas inmunitarias frente a un inmunogeno y para proporcionar una liberacion controlada en el tiempo para respuestas sostenidas o periodicas para la administracion oral y para la administracion topica (O'Hagan et al., 1991).

La composition que comprende una cantidad inmunizante eficaz del peptido o peptidos quimericos y un transportador, adyuvante, excipiente, diluyente o agente auxiliar farmaceuticamente aceptable, se puede administrar un a un mamifero (por ejemplo, un ser humano) para el que el peptido tau truncado es una molecula propia del mamifero.

En determinadas realizaciones, la composicion vacunal incluye adicionalmente un peptido quimerico o una mezcla de peptidos quimericos con un epitopo de linfocito B especifico de extremo de un producto de escision de peptido interno de origen natural de una proteina precursora o madura (por ejemplo, APP), como extremo N o extremo C libre, fusionado con o sin un resto (o restos) de aminoacido espaciador a un epitopo de linfocitos T auxiliares procedente de una fuente distinta a la del producto de escision de peptido interno. Dichas composiciones se explican con detalle, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos n.° 7.901.689 de los cesionarios.

En una divulgacion adicional, la vacuna comprendera uno o mas de los peptidos quimericos de la divulgacion y un vehiculo, excipiente, diluyente o agente auxiliar farmaceuticamente aceptable, incluyendo adyuvantes. La vacuna puede administrate por cualquier via conveniente incluyendo, la oral, la intramuscular, u otra via parenteral o interna. De manera similar, las vacunas se pueden administrar como una dosis unica o se pueden dividir en multiples dosis para la administracion. El experto en la materia determina facilmente los programas de inmunizacion. Por ejemplo, los adyuvantes o emulsionantes que se pueden usar en la presente invention incluyen alumbre, adyuvante incompleto de Freund, liposyn, saponina, escualeno, L121, emulsigen y ISA720. En realizaciones preferentes, los adyuvantes/emulsionantes son el alumbre, adyuvante incompleto de Freund, una combination de liposyn y saponina, una combinacion de escualeno y L121, o una combinacion de emulsigen y saponina.

En determinadas realizaciones, la vacuna contiene una mezcla de dos o mas de los anticuerpos especificos de neoepitopo descritos anteriormente, por ejemplo, para potenciar la inmunoeficacia en una poblacion mas amplia y, asi, proporcionar una mejor respuesta inmunitaria contra la tau truncada, y uno o mas de los agentes seleccionados del grupo que comprende o consiste en transportadores, adyuvantes, excipientes, diluyentes o agentes auxiliares farmaceuticamente aceptables. En algunas de estas realizaciones, la vacuna tambien comprende uno o mas anticuerpos especificos del extremo N o C libre de una APP truncada (por ejemplo, Api-40, Api-42, Api-43, etc.).

4. Administracion

La administracion de una proteina tau truncada, su epitopo inmunogenico o un anticuerpo que reconoce especificamente la proteina o el epitopo, y/o una vacuna descrita anteriormente, se pueden usar como una terapia para tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer u otra tauopatia asociada con el desarrollo de ovillos neurofibrilares. Adicionalmente, la administracion de una proteina tau truncada, su epitopo inmunogenico y/o un anticuerpo especifico que reconoce especificamente la proteina o el epitopo, y/o la vacuna, tambien se pueden usar como un tratamiento profilactico para prevenir el inicio de la enfermedad de Alzheimer u otra tauopatia asociada con ovillos neurofibrilares.

Los pacientes susceptibles de tratamiento incluyen individuos con riesgo de enfermedad pero que no presentan sintomas, asi como pacientes que presentan sintomas actualmente. En el caso de la enfermedad de Alzheimer, practicamente cualquiera esta en riesgo de padecer la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, Los presentes metodos pueden administrarse de forma profilactica a la poblacion general sin necesidad de evaluar el riesgo del sujeto en cuestion. Dicha administracion profilactica puede comenzar, por ejemplo, a los 50 anos o mas tarde. Los presentes metodos son especialmente utiles para individuos que tienen un riesgo genetico conocido de enfermedad de Alzheimer. Dichos individuos incluyen los que tienen familiares que han experimentado esta enfermedad y aquellos cuyo riesgo esta determinado por el analisis de marcadores geneticos o bioquimicos. Los marcadores geneticos de riesgo para la enfermedad de Alzheimer incluyen mutaciones en el gen de APP, particularmente las mutaciones, en la position 717 y en las posiciones 670 y 671, denominadas mutaciones Hardy y Swedish, respectivamente. Otros de las marcadores de riesgo son mutaciones en los genes de presenilina, PS1 y PS2, y ApoE4, antecedentes familiares de EA, hipercolesterolemia o ateroesclerosis. Los individuos que actualmente padecen la enfermedad de Alzheimer pueden reconocerse por la demencia caracteristica, por la presencia de los factores de riesgo descritos anteriormente. Ademas, estan disponibles varias pruebas de diagnostico para identificar a los individuos que tienen EA. Estas incluyen diagnostico por imagen y/o la medicion de los niveles de tau y Ap42 en LCR. Los niveles elevados de tau y reducidos de Ap42 significan la presencia de EA. Los individuos que padecen la enfermedad de Alzheimer tambien pueden diagnosticarse por los criterios de la Asociacion de Enfermedad de Alzheimer y T rastornos Relacionados.

En pacientes asintomaticos, el tratamiento puede comenzar a cualquier edad (por ejemplo, a los 10, 20, 30, 40, 50 o 60 anos). Habitualmente, sin embargo, no es necesario comenzar el tratamiento hasta que el paciente alcance los 40, 50, 60, 70, 75 u 80 anos. El tratamiento normalmente implica multiples dosificaciones a lo largo de un periodo de tiempo. El tratamiento puede controlarse sometiendo a ensayo el anticuerpo o las respuestas de linfocitos T o B activados frente al agente terapeutico a lo largo del tiempo. Si la respuesta cae, se indica una dosis de refuerzo. En el caso de posibles pacientes de sindrome de Down, el tratamiento puede comenzar de forma prenatal mediante la administracion a la madre del agente terapeutico o poco despues del nacimiento.

En aplicaciones profilacticas, las composiciones farmaceuticas o los medicamentos se administran a un paciente susceptible de, o de otra forma con riesgo de, Enfermedad de Alzheimer en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo, reducir la gravedad o retrasar el inicio de la enfermedad, incluyendo los sintomas bioquimicos, histologicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patologicos intermedios presentados durante el desarrollo de la enfermedad. En aplicaciones terapeuticas, se administran las composiciones o medicamentos a un paciente que se sospecha que tiene, o que ya padece, tal enfermedad, en una cantidad suficiente para curar, o al menos, detener parcialmente, los sintomas de la enfermedad, bioquimicos, histologicos y/o conductuales), incluyendo sus complicaciones y los fenotipos patologicos intermedios en el desarrollo de la enfermedad. En algunos metodos, la administracion del agente reduce o elimina el deterioro cognitivo leve en pacientes que aun no han desarrollado la patologia caracteristica del Alzheimer. Una cantidad adecuada para llevar a cabo un tratamiento terapeutico o profilactico se define como una dosis terapeuticamente - o profilacticamente -eficaz. En los regimenes profilacticos y terapeuticos, los agentes habitualmente se administran en varias dosis hasta que se haya logrado una respuesta inmunitaria suficiente. Normalmente, se controla la respuesta inmunitaria y se proporcionan dosificaciones repetidas si la respuesta inmunitaria comienza a declinar.

Las dosis eficaces de las composiciones de la presente invencion, para el tratamiento de las afecciones descritas anteriormente, varian dependiendo de muchos factores distintos, incluyendo los medios de administration, el sitio diana, el estado del paciente, otros medicamentos administrados, y de si el tratamiento es profilactico o terapeutico. Las dosificaciones de tratamiento deben titularse para optimizar la seguridad y la eficacia. La cantidad de inmunogeno depende de si tambien se administra adyuvante, precisandose dosificaciones mas altas en ausencia de adyuvante. Una ventaja adicional de los anticuerpos especificos de extremo libre de la presente invencion en determinadas realizaciones puede ser que, para dosificaciones igual masa, las dosificaciones de los anticuerpos que se unen especificamente a neoepitopos de tau truncada (por ejemplo, ATau) contienen una dosificacion molar mayor de los anticuerpos eficaces en la depuration y/o la "inactivation", que una composition que comprende una mezcla de los anticuerpos especificos de neoepitopo y anticuerpos no especificos. La cantidad de un inmunogeno para administracion en ocasiones varia de 1-500 |jg por paciente y mas habitualmente de 5-500 |jg por inyeccion para la administracion en humanos. Ocasionalmente, se utiliza una dosis mayor, de 1-2 mg por inyeccion. Normalmente, para cada inyeccion humana se utilizan aproximadamente 10, 20, 50 o 100 jg . La masa del inmunogeno tambien depende de la relation en masa del epitopo inmunogenico dentro del inmunogeno con respecto a la masa de inmunogeno en su conjunto. Normalmente, se utilizan 10-3 a 10-5 micromoles de epitopo inmunogenico por cada microgramo de inmunogeno. El momento de las inyecciones puede variar significativamente, de una vez al dia, a una vez al ano, a una vez cada decada. En cualquier dia dado en que se proporciona una dosificacion de inmunogeno, la dosificacion es mayor que 1 jg/paciente y, habitualmente, mayor que 10 jg paciente si se administra tambien adyuvante, y mayor que 10 jg/paciente y, habitualmente, mayor que 100 jg/paciente en ausencia de adyuvante. Una pauta tipica consiste en una inmunizacion seguida de inyecciones de refuerzo a intervalos, tales como de 6 semanas. Otra pauta consiste en una inmunizacion seguida de inyecciones de refuerzo 1, 2 y 12 meses mas tarde. Otro regimen implica una inyeccion cada dos meses de por vida. Como alternativa, las inyecciones de refuerzo pueden ser irregulares, según indique el control de la respuesta inmunitaria.

Para la inmunizacion pasiva con un anticuerpo, la dosificacion varia de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y mas habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg, del peso corporal del hospedador. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o de 10 mg/kg de peso corporal, o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg. Un regimen de tratamiento a modo de ejemplo implica la administracion una vez cada dos semanas o una vez al mes, o una vez cada 3 a 6 meses. En algunos metodos, se administran simultaneamente dos o mas anticuerpos (por ejemplo, recombinantes, monoclonales, quimericos y/o humanizados) con las mismas o distintas especificidades de union, en cuyo caso la dosificacion de cada anticuerpo administrado se encuentra dentro de los intervalos indicados. En tales circunstancias, los dos o mas anticuerpos pueden dirigirse a, por ejemplo, la tau truncada. Como alternativa, uno o mas de los anticuerpos pueden dirigirse a, por ejemplo, tau truncada, y uno o mas anticuerpos adicionales pueden dirigirse a los peptidos p-amiloide (Ap) asociados con la enfermedad de Alzheimer. Los anticuerpos se administran habitualmente en multiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones individuales pueden ser cada hora, a diario, semanales, mensuales o anuales. En algunos metodos, la dosificacion se ajusta para lograr una concentration plasmatica de anticuerpos de 1-1000 jg/ml y, en algunos metodos, de 25-300 jg ml. Como alternativa, el anticuerpo puede administrarse como una formulation de liberation sostenida, en cuyo caso se precisa una administracion menos frecuente. La dosificacion y la frecuencia varian dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la semivida mas larga, seguidos de los anticuerpos humanizados, anticuerpos quimericos y anticuerpos no humanos. La dosificacion y la frecuencia de administracion pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profilactico o terapeutico. En aplicaciones profilacticas, se administra una dosificacion relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un periodo de tiempo largo. Algunos pacientes continuan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapeuticas, en ocasiones se precisa una dosificacion relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que se reduce o finaliza la progresion de la enfermedad y preferentemente hasta que el paciente muestra una mejoria parcial o completa de los sintomas de la enfermedad. Posteriormente, la patente se puede administrar un regimen profilactico.

Las dosis para los acidos nucleicos que codifican inmunogenos varian de aproximadamente 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 jg a 10 mg o 30-300 jg de ADN por paciente. Las dosis para los vectores viricos infecciosos varian de 10-100, o mas, viriones por dosis.

Se puede obtener la eficacia de la administracion/tratamiento midiendo los niveles de tau patogena en el plasma y/o en el LCR. Basandose en esta evaluation, la dosis y/o la frecuencia de administracion pueden ajustarse en consecuencia. Ademas o como alternativa, se obtiene la eficacia de la administracion/tratamiento mediante el control de la relacion de la concentracion de ATau con respecto a htau40, o viceversa.

Ademas o como alternativa, tambien se puede obtener la eficacia de la administracion/tratamiento por obtencion de imágenes de placas amiloides mediante PET. Un aumento del metabolismo del cerebro indicaria que la administracion/tratamiento es eficaz. Tambien se puede obtener la eficacia mediante un grado de atrofia cerebral, determinado mediante RM.

Ademas o como alternativa, se puede obtener la eficacia de la administracion/tratamiento midiendo los niveles de IgG e IgM contra ATau.

Se puede obtener la seguridad de la administracion/tratamiento controlando las microhemorragias y/o el edema angiogenico, por ejemplo, mediante RM. Basandose en esta evaluacion, la dosis y/o la frecuencia de administracion pueden ajustarse en consecuencia.

Los anticuerpos e inmunogenos pueden administrarse por via intranasal, mediante una inyeccion subcutanea, inyeccion intramuscular, infusion i.v., por v^a transcutanea, v^a bucal, etc., o como se describe con mayor detalle a continuacion.

5. Formulaciones farmaceuticas

Las formulaciones farmaceuticas en conformidad con la presente invencion pueden comprender (i) un agente activo que comprende o consiste en uno o mas anticuerpos especificos de neoepitopo descritos anteriormente y (ii) uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. El agente activo generalmente comprendera de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 90 % de la formulacion, y el uno o mas excipientes generalmente comprenderan de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 99,99 % de la formulacion. En las realizaciones preferentes, las formulaciones se utilizan para la introduccion del agente activo en el cuerpo de un mamifero vivo (por ejemplo, un ser humano) y van acompanadas de instrucciones (por ejemplo, un prospecto de envase) que recitan las indicaciones para la administracion del agente activo en el cuerpo del mamifero vivo. En algunas de estas realizaciones, las formulaciones se utilizan para el tratamiento o la prevention de la EA y/u otra tauopatia, y van acompanadas de las instrucciones que recitan indicaciones para el tratamiento y/o la prevencion de la EA y/u otra tauopatia.

En determinadas realizaciones, la formulacion farmaceutica comprende una pluralidad de anticuerpos que reconocen y se unen a ATau y no reconocen y no se unen a htau1-40, y uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. Los anticuerpos generalmente comprenderan de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 90 % de la formulacion, y el uno o mas excipientes generalmente comprenderan de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 99,99 % de la formulacion. En las realizaciones preferentes, la formulacion farmaceutica esta acompanada de instrucciones que recitan las indicaciones para la administracion del agente activo en el cuerpo del mamifero vivo, y/o las indicaciones para el tratamiento y/o la prevencion de la EA y/u otra tauopatia.

En una divulgation adicional, la formulacion farmaceutica comprende un inmunogeno que comprende o consiste en una cualquiera de las SEQ ID NO: 7-94 o 116, y uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. El inmunogeno generalmente comprendera de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 90 % de la formulacion, y el uno o mas excipientes generalmente comprenderan de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 99,99 % de la formulacion. En las realizaciones preferentes, la formulacion farmaceutica esta acompanada de instrucciones que recitan las indicaciones para la administracion del agente activo en el cuerpo del mamifero vivo, y/o las indicaciones para el tratamiento y/o la prevencion de la EA y/u otra tauopatia.

Las formulaciones administradas en conformidad con la presente invencion, por ejemplo, los anticuerpos especificos de neoepitopo descritos anteriormente, se pueden administrar por medios parenterales, topicos, intranasales, intravenosos, orales, subcutaneos, intrarteriales, intracraneales, intraperitoneales, intranasales o intramusculares para el tratamiento profilactico y/o terapeutico. La via de administracion mas tipica de un agente inmunogenico es subcutanea, aunque otras vias pueden ser igualmente eficaces. La siguiente via mas comun es la inyeccion intramuscular. Este tipo de inyeccion se realiza muy normalmente en los musculos del brazo o la pierna. En algunos metodos, los agentes se inyectan directamente en un tejido particular donde se han acumulado depositos, por ejemplo, inyeccion intracraneal. Es preferente para la administracion de anticuerpos la inyeccion intramuscular en infusion intravenosa. En algunos metodos, se inyectan anticuerpos terapeuticos particulares directamente en el craneo. En algunos metodos, los anticuerpos se administran como una composition o dispositivo de liberation sostenida, tal como un dispositivo Medipad™ (Elan Pharm. Technologies, Dublin, Irlanda). En determinadas realizaciones, el adyuvante es alumbre.

Las formulaciones farmaceuticas en conformidad con la presente invencion tambien pueden contener uno o mas transportadores farmaceuticos y/o adyuvantes adecuados.

Una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo de la invencion puede variar de acuerdo con factores tales como la patologia, la edad, el sexo y el peso del individuo, y de la capacidad del modulador para suscitar una respuesta deseada en el individuo. Las pautas posologicas se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapeutica optima. Una cantidad terapeuticamente eficaz tambien es una en que cualquiera de los efectos toxicos o perjudiciales del modulador se ven superados por los efectos terapeuticamente beneficiosos.

Una "cantidad profilacticamente eficaz" (por ejemplo, de un anticuerpo especifico para una tau truncada o una portion de tau truncada) se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profilactico deseado, tal como prevenir o inhibir la tasa de deposition, agregacion, polimerizacion y/o neurotoxicidad de tau en un sujeto predispuesto a la formation de ovillos neurofibrilares. Una cantidad profilacticamente eficaz puede determinarse como se describe anteriormente para la cantidad terapeuticamente eficaz. Normalmente, dado que una dosis profilactica se usa en los sujetos antes de o en un estadio mas temprano de la enfermedad, la cantidad profilacticamente eficaz sera menor que la cantidad terapeuticamente eficaz. Una "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el apoyo terapeutico deseado, tal como la progresion ralentizada de la enfermedad de Alzheimer, el inicio retrasado, la reduccion o la inversion de la formacion de agregados y/o de ovillos neurofibrilares, y/o reduccion o inversion de la neurotoxicidad. Una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo de la invencion puede variar de acuerdo con factores tales como la patologia, la edad, el sexo y el peso del individuo, y de la capacidad del modulador para suscitar una respuesta deseada en el individuo. Las pautas posologicas se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapeutica optima. Una cantidad terapeuticamente eficaz tambien es una en que cualquiera de los efectos toxicos o perjudiciales del modulador se ven superados por los efectos terapeuticamente beneficiosos.

Un factor que puede considerarse cuando se determina una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de un anticuerpo para tau truncada es la concentration de tau natural en un compartimiento biologico de un sujeto, tal como en el liquido cefalorraquideo (LCR) o el plasma del sujeto. Cabe destacar que los valores de dosificacion pueden variar con la gravedad de la afeccion a aliviar. Ademas, hay que entender que, para cualquier sujeto particular, las pauta posologicas especificas podrian ajustarse a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administration de las composiciones. Por ejemplo, se puede administrar un unico bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o se puede reducir o aumentar proporcionalmente la dosis indiquen las exigencias de se lagú snituation terapeutica.

Las composiciones farmaceuticas se pueden administrar por via subcutanea, via intravenosa, via intradermica, via intramuscular, via intraperitoneal, via intracerebral, via intranasal, via oral, via transdermica, via bucal, via intraarterial, via intracraneal o via intracefalica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administracion y la uniformidad de la dosis. La forma de dosificacion unitaria como se usa en el presente documento se refiere a unidades fisicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamiferos a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el transportador farmaceutico necesario. La especificacion para las formas de dosis unitaria de la invencion esta dictada por y depende directamente de (a) las caracteristicas exclusivas del compuesto activo y del efecto terapeutico particular a lograr y de (b) las limitaciones inherentes en la tecnica de componer tal compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos. Como se usa en el presente documento, "transportador farmaceuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion, y similares, que sean fisiologicamente compatibles. En una realization, el transportador es adecuado para la administracion parenteral. Preferentemente, el transportador puede ser adecuado para la administracion intravenosa, intraperitoneal o intramuscular. Como alternativa, el transportador es adecuado para la administracion en el sistema nervioso central (por ejemplo, por via intraespinal o intracerebral). En otra realizacion, el transportador es adecuado para la administracion oral. Los transportadores farmaceuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas esteriles o dispersiones, y polvos esteriles para la preparation extemporanea de soluciones esteriles inyectables o dispersiones. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas se conoce en la tecnica. Excepto en el caso de que algun agente o medio convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmaceuticas de la invencion. Ademas, pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones.

Las formulaciones preparadas en conformidad con la presente invencion deben ser esteriles y estables en las condiciones de fabrication y almacenamiento. La composition puede formularse como una solution, microemulsion, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentracion de farmaco. El transportador puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol liquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de particula necesario en el caso de una dispersion y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, sera preferente incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composicion. Puede lograrse la absorcion prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composicion un agente que retrasa la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Ademas, el anticuerpo puede administrarse en una formulation de liberation temporal, por ejemplo, en una composicion que incluya un polimero de liberacion lenta. Los compuestos activos pueden prepararse con transportadores que protegeran al compuesto frente a su rapida liberacion, tal como una formulacion de liberacion controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polimeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhidridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres, acido polilactico y copolimeros de polilactico poliglicolico (PLG). Muchos metodos para la preparacion de tales formulaciones estan patentados o se conocen generalmente por los expertos en la materia.

Las soluciones inyectables esteriles pueden prepararse incorporando el compuesto activo (por ejemplo, el anticuerpo para una tau truncada en la cantidad necesaria) en un disolvente apropiado con uno o una combination de los ingredientes enumerados anteriormente, sea necesario, s seeggúunido de esterilizacion por filtration. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehiculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes necesarios de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparation de soluciones inyectables esteriles, los metodos de preparation preferentes son el secado al vatio y la liofilizacion, que producen un polvo del principio activo mas cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solution de los mismos previamente esterilizado por filtracion.

La aplicacion topica puede ser el resultado de la aplicacion transdermica o intradermica. La administration topica se puede facilitar mediante la coadministracion del agente con toxina colerica o derivados destoxificados o subunidades de la misma. Como alternativa, la administracion transdermica se puede lograr usando un parche cutaneo o usando transfersomas.

Otros sistemas de suministro pueden incluir la liberation temporal, sistemas de suministro de liberation retardada o liberation sostenida. Dichos sistemas pueden evitar las administraciones repetidas de los compuestos activos de la invention, aumentando la conveniencia para el sujeto y el medico. Estan disponibles muchos tipos de sistemas suministro por liberacion y son conocidos para expertos en la materia. Incluyen sistemas basados en polimeros tales como polianhidridos de acidos polilacticos y poliglicolicos, y policaprolactona; sistemas no polimericos que son lipidos que incluyen esteroles tales como el colesterol, esteres de colesterol y acidos grasos o grasas neutras tales como mono-, di- y trigliceridos; sistema de liberacion de hidrogel; sistemas silasticos; sistemas basados en peptidos; recubrimientos de cera, comprimidos compactados que utilizan aglutinantes y excipientes convencionales, implantes parcialmente fusionados y similares. Ademas, se pueden utilizar sistemas de suministro con hardware basado en una bomba, algunos de los cuales estan adaptados para su implantation.

Ademas se puede usar un implante de liberacion sostenida prolongada. Liberacion "prologada", como se usa en el presente documento, significa que el implante se construye y dispone para suministrar niveles terapeuticos del principio activo durante al menos 30 dias, y preferentemente 60 dias. Los implantes de liberacion sostenida prolongada son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen algunos de los sistemas de liberacion descritos anteriormente. Dichos implantes pueden ser particularmente utiles para tratar afecciones caracterizadas por agregados de peptidos beta amiloides, colocando el implante cerca de porciones del cerebro afectadas por tales agregados, efectuando de este modo dosis altas localizadas de los compuestos de la invencion.

Los agentes inmunogenicos de la presente divulgacion, tales como peptidos, se administran en ocasiones en combination con un adyuvante. Se puede usar diversos adyuvantes en combination con un peptido, tal como tau, para suscitar una respuesta inmunitaria. Los adyuvantes preferentes aumentan la respuesta intrinseca a un inmunogeno sin provocar cambios conformacionales en el inmunogeno que afecten la forma cualitativa de la respuesta.

Una clase preferente de adyuvantes son las sales de aluminio (alumbre), tal como el hidróxido de aluminio, el fosfato de aluminio y el sulfato de aluminio. Dichos adyuvantes se pueden usar con o sin otros agentes inmunoestimulantes especificos, tales como monofosforil lipido A (MPL) 3 Des-O-acilado, o 3-DMP, aminoacidos polimericos o monomericos, tales como acido poliglutamico o polilisina. Dichos adyuvantes se pueden usar con o sin otros agentes inmunoestimulantes especificos, tales como muramil peptidos (por ejemplo, N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanin-2-(1'-2'dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida (DTP-DPp) teramida (TM) u otros componentes de la pared celular bacteriana. Las emulsiones de aceite en agua incluyen (a) MF59 (documento WO 90/14837 para Van Nest et al.), conteniendo escualeno al 5 %, Tween 80 al 0,5 % y Span 85 al 0,5 % (que contiene opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE), formulada en particulas submicrometricas utilizando un microfluidificador, tal como el microfluidificador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton Mass.), (b) SAF, conteniendo escualeno al 10 %, Tween 80 al 0,4 %, polimero bloqueado con pluronic L121 al 5 % y thr-MDP, microfluidificados en una emulsion submicrometrica o sometidos a agitation para generar una emulsion de mayor tamano de particula y (e) el sistema adyuvante Ribi ™ (RAS), (Ribi ImmunoChem, Hamilton, Mont.) conteniendo escualeno al 2 %, Tween 80 al 0,2 %, y uno o mas componentes de la pared bacteriana del grupo que consiste en monofosforilipido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de pared celular (EPC), preferentemente MPL+EPC (Detox.TM.). Otros adyuvantes incluyen el adyuvante completo de Freund (ACF) y el adyuvante incompleto de Freund (AIF). Otros adyuvantes incluyen citocinas, tales como interleucinas (lL-1, IL-2 y IL-12), factor estimulante de colonias de macrofagos (M-CSF) y factor de necrosis tumoral (TNF). En determinadas realizaciones, el adyuvante es alumbre.

Un adyuvante se puede administrar con un inmunogeno como una composition unica, o se puede administrar antes, de manera simultanea o despues de la administracion del inmunogeno. El inmunogeno y el adyuvante se pueden envasar y suministrar en el mismo vial o se pueden envasar en viales separados, y mezclar antes de su uso. Normalmente, el inmunogeno y el adyuvante se envasan con una etiqueta, que indica la aplicacion terapeutica prevista. Si el inmunogeno y el adyuvante se envasan por separado, el embalaje normalmente incluye instrucciones para la mezcla antes del uso. La election de un adyuvante y/o transportador depende de la estabilidad de la formulation inmunogenica que contiene el adyuvante, la via de administracion, la pauta posologica, la eficacia del adyuvante para las especies a vacunar, y, en seres humanos, un adyuvante farmaceuticamente aceptable es uno que ha sido aprobado o es aprobable para la administracion humana por los organismos reguladores pertinentes. Por ejemplo, el adyuvante completo de Freund no es adecuado para la administracion en seres humanos. Sin embargo, el alumbre, el MPL o el adyuvante incompleto de Freund (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32:173-186 (1998)) solos u, opcionalmente, todas las combinaciones de los mismos, son adecuados para la administracion en seres humanos.

Los agentes de la presente invencion a menudo se administran como composiciones farmaceuticas que comprenden un agente terapeutico activo y otros diversos componentes farmaceuticamente aceptables. Vease Remington's Pharmaceutical Science (15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980). La forma preferente depende del modo pretendido de administracion y de la aplicacion terapeutica. Las composiciones pueden incluir tambien, dependiendo de la formulacion deseada, transportadores o diluyentes no toxicos farmaceuticamente aceptables, los cuales se definen como vehiculos comunmente usados para formular composiciones farmaceuticas para la administracion animal o humana. El diluyente se selecciona para que no afecte la actividad biologica de la combinacion. Los ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solucion salina fisiologica tamponada con fosfato, soluciones de Ringer, solucion de dextrosa y solucion de Hank. Ademas, la composicion farmaceutica o formulacion tambien puede incluir otros transportadores, adyuvantes, o estabilizantes no toxicos, no terapeuticos, no inmunogenicos y similares.

Las composiciones farmaceuticas tambien pueden incluir macromoleculas grandes, metabolizadas lentamente, tales como proteinas, polisacaridos como el quitosano, acidos polilacticos, acidos poliglicolicos y copoKmeros (por ejemplo, sefarosa funcionalizada con latex, agarosa, celulosa y similares), aminoacidos polimericos, copolimeros de aminoacidos y agregados lipidicos (por ejemplo, gotitas de aceite o liposomas). Adicionalmente, estos transportadores pueden actuar como agentes inmunoestimulantes (es decir, adyuvantes).

Para administracion parenteral, los agentes de la presente invencion se pueden administrar como dosificaciones inyectables de una solucion o suspension de la sustancia en un diluyente fisiologicamente aceptable, con un transportador farmaceutico que puede ser un liquido esteril tal como agua, aceite, solucion salina, glicerol o etanol. Adicionalmente, pueden estar presentes en las composiciones sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias tamponadoras del pH, y similares. Otros componentes de las composiciones farmaceuticas son los de origen en el petroleo, animal, vegetal o sintetico. El aceite de cacahuete, el aceite de soja y el aceite mineral son todos ejemplos de materiales utiles. En general, los glicoles, tales como propilenglicol o polietilenglicol, son transportadores liquidos preferentes, particularmente para soluciones inyectables. Los agentes de la invencion, particularmente, los anticuerpos, se pueden administrar en forma de una inyeccion o preparacion de implante de efecto prolongado, que se puede formular de tal forma que permita una liberacion sostenida del principio activo. Una composicion a modo de ejemplo comprende anticuerpo monoclonal a 5 mg/ml, formulado en un tampon acuoso que consiste en L-histidina 50 mM, NaCl 150 mM, ajustado a pH 6,0 con HCl. Normalmente, las composiciones se preparan como inyectables, como soluciones o suspensiones liquidas; tambien pueden prepararse formas solidas adecuadas para solucion en, o suspension en, vehiculos liquidos antes de la inyeccion. La preparacion tambien puede emulsionarse o encapsularse en liposomas o microparticulas, tales como polilactida, poliglicolido o copolimero, para potenciar el efecto adyuvante (Langer, et al., Science 249:1527 (1990); Hanes, et al., Advanced Drug Delivery Reviews 28:97-119 (1997)).

Las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administracion incluyen formulaciones orales, intranasales y pulmonares, supositorios y aplicaciones transdermicas.

Para los supositorios, los aglutinantes y transportadores incluyen, por ejemplo, polialquilenglicoles o trigliceridos; tales supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contienen el principio activo en el intervalo del 0,5 % al 10 %, preferentemente el 1 %-2 %. Las formulaciones orales incluyen excipientes, tales como manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, celulosa y carbonato de magnesio de calidades farmaceuticas. Estas composiciones adoptan la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, pildoras, capsulas, formulaciones o polvos de liberacion sostenida, y contienen el 10 %-95 % de principio activo, preferentemente el 25 %-70 %.

La aplicacion topica puede dar como resultado el suministro transdermico o intradermico. La administracion topica se puede facilitar mediante la coadministracion del agente con toxina colerica o derivados destoxificados o subunidades de la misma, u otras toxinas bacterianas similares (ver Glenn et al., Nature 391: 851 (1998)). La coadministracion se puede lograr utilizando los componentes como una mezcla o como moleculas unidas obtenidas mediante reticulacion quimica o expresion como una proteina de fusion. Como alternativa, el suministro transdermico se puede lograr usando un parche cutaneo o usando transfersomas (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25:3521-24 (1995); Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368:201-15 (1998)).

6. Terapia de combinacion

Otro aspecto de la presente divulgacion es una terapia de combinacion en donde se emplean inmunogenos peptidicos tanto de tau truncada como de Ap ("mimotopos") como una terapia de combinacion para un mamifero (por ejemplo, un ser humano) que lo necesite. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, una proteina tau truncada, su epitopo inmunogenico o anticuerpos especificos para la proteina tau truncada o un epitopo inmunogenico, se administra (o administran) en combinacion entre si y/o con otros agentes que son eficaces para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas relacionadas.

En el caso de enfermedades amiloidogenicas, tales como la enfermedad de Alzheimer y el smdrome de Down, la modulacion inmunitaria para depurar los depositos de beta-amiloide (Ap) es una terapia novedosa. Las inmunoterapias dirigidas a Ap han dado como resultado mejoras cognitivas de manera sistematica. Es probable que las patologias por tau y Ap sean sinergicas. Por lo tanto, una terapia de combinacion dirigida a la depuracion de ambas patologias al mismo tiempo puede ser mas eficaz que tener como objetivo a cada una de forma individual. En el caso de la enfermedad de Parkinson y las enfermedades neurodegenerativas relacionadas, la modulacion inmunitaria para depurar las formas agregadas de la proteina a-sinuclema tambien es una terapia novedosa. Una terapia de combinacion que tiene como objetivo la depuracion de ambas proteinas tau y sinucleina de forma simultanea, puede ser mas eficaz que tener como objetivo a cada una de forma individual.

En determinadas realizaciones preferentes, la terapia de la presente invencion se combina con las terapias divulgadas en la Publicacion de Patente de Estados Unidos n.° 2003/0073655 (n.° de serie de Estados Unidos 10/084.380). Esa invencion se refiere al uso de anticuerpos frente a los peptidos p amiloides como un metodo para inhibir selectivamente la acumulacion y/o neutralizar la citotoxicidad asociada con las especies p amiloides, y en determinadas realizaciones preferentes, especificamente, Ap1-40 (que forma la mayor parte del peptido p amiloide en circulacion, LCR, plasma y orina humanos), o las especies Ap1-42 y Ap1-43 mas toxicas pero menos abundantes, que pueden ser el inicio de la deposicion de amiloide. En determinadas realizaciones adicionales preferentes, la divulgacion se refiere a una vacuna que es una combinacion de una composicion que proporciona inmunizacion contra la proteina tau truncada y una composicion que proporciona inmunizacion contra Ap.

En determinadas realizaciones preferentes, la composicion que proporciona inmunizacion contra la proteina tau truncada y la composicion que proporciona inmunizacion contra Ap se administran a un mamifero en las mismas o distintas formulaciones. En determinadas realizaciones preferentes, la composicion que proporciona la inmunizacion contra la proteina tau truncada y/o la composicion que proporciona la inmunizacion contra Ap se preparan a partir de un peptido quimerico o una mezcla de peptidos quimericos con un epitopo de linfocito B especifico de extremo de un producto de escision de peptido interno de origen natural de una proteina precursora o madura, como extremo N o extremo C libre, fusionado con o sin un resto (o restos) de aminoacido espaciador a un epitopo de linfocitos T auxiliares procedente de una fuente distinta a la del producto de escision de peptido interno. Mas particularmente, en tales realizaciones, la composicion que proporciona inmunizacion contra la proteina tau truncada esta representada por

la formula (I): N-(S)m-(Th)n (I); o

la formula (II): (Th)n-(S)m-C (II), donde:

N es los primeros 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 restos de aminoacido del extremo N libre de un producto de escision de peptido interno de origen natural de una cualquiera de las seis isoformas de la proteina tau normal, tal como, por ejemplo, tau1-13, tau14-441, tau14-391, tau391-414, tau1-391, tau1-421, tau13-410, tau391-410, tau14-412, tau391-412, tau13-383, tau13-381, tau13-355, o un fragmento de cualquiera de las anteriores;

C es los ultimos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 restos de aminoacido del extremo C libre del producto de escision de peptido interno de origen natural de una cualquiera de las seis isoformas de la proteina tau normal;

Th es un epitopo de linfocitos T auxiliares procedente de una fuente natural (es decir, una especie de organismo vivo) distinta de la del producto de escision de peptido interno de origen natural;

S es un resto (o restos) de aminoacido espaciador;

m es 0, 1,2, 3, 4, o 5; y

n es 1,2, 3 o 4.

La composicion que proporciona inmunizacion contra la proteina Ap esta representada por

la formula (I): N-(S)m-(Th)n (I); o

la formula (II): (Th)n-(S)m-C (II), donde:

N es los primeros 2, 3, 4 o 5 restos de aminoacido del extremo N libre de un producto de escision de peptido interno de origen natural, tal como un peptido Ap, el cual, cuando es de origen natural en un mamifero, se obtiene de una proteina precursora o una proteina madura;

C es los ultimos 2, 3, 4 o 5 restos de aminoacido del extremo C libre del producto de escision de peptido interno de origen natural;

Th es un epitopo de linfocitos T auxiliares procedente de una fuente natural (es dedr, una especie de organismo vivo) distinta de la del producto de escision de peptido interno de origen natural;

S es un resto (o restos) de aminoacido espaciador;

m es 0, 1,2, 3, 4, o 5; y

n es 1,2, 3 o 4.

En determinadas realizaciones, la terapia de combinacion emplea uno o mas anticuerpos espedficos para el neoepitopo creado por la escision de tau (por ejemplo, en Asp421), y uno o mas anticuerpos espedficos para el neoepitopo creado por escision de APP. El uno o mas anticuerpos espedficos para el neoepitopo creado por la escision de tau puede ser cualquier anticuerpo descrito anteriormente en la seccion "Anticuerpos frente a Tau truncada". El uno o mas anticuerpos espedficos para el neoepitopo creado por escision de APP incluyen, por ejemplo, anticuerpos espedficos para el extremo (o extremos) libre de los peptidos Ap, anticuerpos espedficos de conformacion para estos peptidos y anticuerpos que se unen a los dominios medios de estos peptidos. En determinadas realizaciones, el uno o mas anticuerpos espedficos para el neoepitopo creado por la escision de APP es un anticuerpo que es espedfico de extremo libre para peptidos Ap (Ap1-39, Ap1-40, Ap1-41, Ap1-42, Ap1-43, etc.) y/o los sitios de escision internos en las posiciones 11 y 17 de cualquiera de los anteriores, los que pueden o no tener modificaciones de piroglutamato como un acontecimiento natural. En determinadas realizaciones, el uno o mas anticuerpos espedficos para el neoepitopo creado por escision de APP pueden seleccionarse de un grupo que comprende o consiste en bapineuzumab, ponezumab, gantenerumab, solaneszumab, MABT5102A y GSK933756. Se puede obtener la eficacia del tratamiento de combinacion midiendo los niveles de tau patogena (por ejemplo, ATau) y de Ap en el plasma y/o en el LCR. Ademas o como alternativa, pueden medirse los niveles de IgG/IgM para Ap y tau patogena (por ejemplo, ATau). Ademas o como alternativa, se puede obtener al metabolismo cerebral mediante obtencion de imágenes por PET. Ademas o como alternativa, tambien se pueden tomar los perfiles de citocinas de la sangre. Basandose en estas evaluaciones, pueden ajustarse la dosis y/o la frecuencia de la administracion.

Se puede obtener la seguridad del tratamiento de combinacion controlando las microhemorragias y/o el edema angiogenico, por ejemplo, mediante RM. Basandose en esta evaluacion, la dosis y/o la frecuencia de administracion pueden ajustarse en consecuencia. Por ejemplo, ante la aparicion de microhemorragias y/o de edema angiogenico, el tratamiento de combinacion puede suspenderse temporalmente y/o pueden disminuirse las dosis.

Descripcion detallada de las realizaciones preferentes

El siguiente ejemplo representa realizaciones espedficas de la presente invencion y no es representativo de todo el alcance de la invencion.

Ejemplo 1

La estrategia y los protocolos para generar anticuerpos que reconocen espedficamente el neoepitopo creado por la escision de tau en Asp421 (es decir, ATau), pero no a tau de longitud completa (es decir, htau40), se describen en este ejemplo vaticinador.

Los siguientes peptidos se preparan utilizando un sintetizador de peptidos de Applied Biosystems (430A): un peptido correspondiente a tau416-421 (SEQ ID NO: 83 SIDMVD); un peptido correspondiente a tau417-421 (SEQ ID NO: 84); un peptido correspondiente a tau418-421 (SEQ ID NO: 85); y un peptido correspondiente a la SEQ ID NO: 86, toda la htau40.

Los peptidos sinteticos se purifican despues por HPLC y se caracterizan utilizando la composicion de aminoacidos. Una vez purificados y caracterizados, los peptidos se conjugan con hemocianina de lapa californiana y se inmunizan cuatro conjuntos de 10 ratones Balb/c con los peptidos conjugados.

Despues de acabada la inmunizacion, se realiza un procedimiento de fusion utilizando esplenocitos de ratones hiperinmunizados y una linea celular de mieloma apropiada, SP2/0-Ag14 (ATCC CRL 1581), Ns -1 (ATCC TIB18), o equivalente, usando polietilenglicol.

La seleccion de los productos de fusion satisfactorios se logra a traves de medio HAT. Las colonias de hibridomas viables se cultivan en placas de 96 pocillos.

La exploracion de todos los pocillos que contienen productos de fusion satisfactorios se lleva a cabo utilizando un conjunto de peptidos correspondientes a htau40, ATau y los restos 416-421, 417-421, 418-421 y 419-421 de ATau mediante ensayos de ELISA. Basandose en los resultados de los ensayos ELISA, se realizan subclonaciones por dilucion limitante sobre las colonias seleccionadas. Se seleccionan los anticuerpos espedficos para ATau, los restos 416-421, 417-421, 418-421 y 419-421 de ATau; y no espedficos para tau40. Estos anticuerpos solo reconocen, se unen o muestran reactividad con ATau, o los restos 416-421, 417-421,418-421 o 419-421 de ATau, y no reconocen, se unen o muestran reactividad con tau40.

Para confirmar que el protocolo puede utilizarse posteriormente para generar anticuerpos monoclonales que reconocen espedficamente el neoepitopo creado por la escision de tau en Asp421 (es decir, ATau), pero no a tau de longitud completa (es decir, htau40), se generan anticuerpos policlonales de alta afinidad espedficos para ATau y no espedficos para htau40 utilizando el peptido restringido: H2N - SEQ ID NO:86 - aminohexanoato-C-amida. El peptido se sintetiza utilizando quimica Fmoc en fase solida. Despues, el peptido se escinde y se analiza mediante espectroscopia de masas y cromatografia liquida de alto rendimiento (HPLC). La purificacion por HPLC se logra utilizando una columna YMC C-18 (empaquetamiento de 10 |j, tamano de poro 120 A, 10 X 250 mm) en un sistema tamponador de A: H2O/TFA 0,1 % y B:CH3CN/TFA 0,08 %. Las fracciones apropiadas se agrupan, se liofilizan y se someten otra vez a espectroscopia de masas y analisis por HPLC. El peptido se acopla a KLH para la inmunizacion, a BSA para detection por ELISA, con el reticulador MBS. Se inmunizan conejos a intervalos de 3 semanas y se evalua el titulo mediante ELISA utilizando acetal-Asp-Ser-aminohexanoato-C-amida ("peptido abarcador"). Este peptido corresponde a una secuencia de restos de aminoacido que abarca el sitio de corte y empalme de 0 a 1 de htau40, que produce ATau. El mismo peptido abarcador se acopla a un gel de acoplamiento de tiol a traves de su resto de cisteina y se usa para preabsorber todos los anticuerpos que no dependen de la presencia de carboxi-Asp libre. Despues, los anticuerpos se purifican y se recogen utilizando el peptido restringido. Mientras que el suero crudo muestra una actividad sustancial hacia el peptido que abarca, una vez purificado por afinidad, no hay reactividad del anticuerpo resultante con el peptido abarcador, solo con el peptido restringido. Esto confirma que los anticuerpos monoclonales son espedficos para ATau y no espedficos para el peptido abarcador. Dado que estos anticuerpos no son espedficos para el peptido abarcador, estos anticuerpos, ademas, serian no espedficos para htau40, debido a que htau40 tampoco tiene un extremo C libre de ATau, el cual se crea por escision de htau40 en Asp421. Por consiguiente, estos anticuerpos solo reconocen, se unen o muestran reactividad con ATau, los restos 416-421,417-421,418-421 o 419-421 de ATau, y no reconocen, se unen o muestran reactividad con tau40.

Para generar anticuerpos monoclonales espedficos para el extremo C de ATau, se inmunizan ratones a intervalos de 3 semanas usando: H2N-SEQ ID NO:86-aminohexanoato-C-amida conjugado a BSA, preparado como se describe para la preparation del policlonal. Ademas, se evalua el titulo en cada raton mediante ELISA como se describe anteriormente. Despues de la fusion de las celulas de bazo de los ratones que presentan el titulo mas alto, se aislan y exploran varios clones utilizando el metodo de deteccion ELISA con peptido abarcador. Las secuencias peptidicas inmunogenicas, correspondientes al extremo C de tau40 y conjugadas a una proteina soporte distinta, tal como la seroalbumina bovina (BSA) y la ovoalbumina, se utilizan para confirmar que los anticuerpos monoclonales resultantes son espedficos de para extremo C de ATau y no espedficos para la proteina soporte y htau40.

Opcionalmente, la especificidad de los anticuerpos para reconocer selectivamente htau40 escindida en Asp421 (es decir, ATau), pero no a tau de longitud completa, se evalua in vivo, utilizando el modelo de traumatismo craneoencefalico, un modelo que conduce a la activation de la caspasa neuronal en ratones. El analisis muestra que los anticuerpos detectan espedficamente a tau escindida en Asp421 (es decir, ATau), restos 416-421,417-421,418­ 421 o 419-421 de tau40, y no detectan espedficamente ni reaccionan de forma cruzada con la tau de longitud completa (es decir, tau40). En otras palabras, estos anticuerpos solo reconocen, se unen o muestran reactividad con ATau, los restos 416-421, 417-421, 418-421 o 419-421 de ATau, y no reconocen, se unen o muestran reactividad con htau40.

Ejemplo 2

En el Ejemplo 2, se evalua el potencial terapeutico de una vacuna contra Ap, tau y en combination, en un modelo de enfermedad de Alzheimer de raton triple transgenico (3xTg-EA), que expresa la patologia por placas y por ovillos. Una primera meta del Ejemplo 2 es evaluar tales vacunas como preventivas contra la neuropatologia y el deterioro cognitivo de la EA. La segunda meta del Ejemplo 2 es evaluar tales vacunas como terapeuticas una vez que se ha establecido la neuropatologia de la EA. En el Ejemplo 2, se utiliza la tecnologia de vacuna RECALL-Vax del cesionario.

El modelo de raton triple transgenico contiene 3 mutaciones importantes para la patologia del Alzheimer (PS1^mi46v, pAPPswe, y taup30iL) (Oddo et al., 2003). (Dr. Frank LaFerla, UC Irvine). Los ratones se generaron mediante microinyeccion de dos transgenes (pAPPSwe y tauP301L) en un embrion de una sola celula procedente de un animal homocigotico con insertion de presenilina-1. El gen de presenilina-1 insertado contiene la mutation M146V, que aumenta la cantidad de Ap1-42 producida con respecto a Ap1-40. A partir de esta estrategia se obtuvieron varias lineas triple transgenicas y estas lineas desarrollan caracteristicas clave de la neuropatologia del Alzheimer en un modo dependiente de la edad. Presentan patologia por placas y ovillos, asi como disfuncion sinaptica, incluyendo deficiencia de la PLP (Oddo et al., 2003). Adicionalmente, la formation de placas precede a la formation de ovillos y, asi, se imita el desarrollo de la enfermedad en los seres humanos, y se acompana de una inflamacion extensa y un deterioro cognitivo sustancial. Por lo tanto, los ratones 3xTg-EA representan un modelo avanzado de EA.

Diseno y metodos:

Objetivo 1: Estudio preventivo sobre las vacunas RECALL-VAX™ en ratones 3xTg-EA.

Ratones 3xTg-EA homocigoticos de 6 meses de edad se trataran con un adyuvante, la vacuna anti-amiloide RECALL-VAX, la vacuna anti-ATau RECALL-VAX o la combination de la vacuna anti-amiloide y anti-ATau RECALL-VAX (n=20 por grupo). RECALL-VAX™ es una vacuna patentada propiedad de Intellect Neurosciences, un ejemplo de la cual se describe en la patente de Estados Unidos n.° 7.901.689.

Doce meses mas tarde, estos ratones 3xTg-EA se analizaran con una serie de tareas cognitivas, como se detalla a continuation. Mas tarde, los ratones se sacrificaran y sus cerebros se extraeran, y despues se cortaran por la linea media, para analisis patologicos. Ademas, se extraera sangre para analisis.

Se enviaran dos grupos de ratones 3xTg-EA (n=20 por grupo) a CEA-DSV-I2BM-MIRCen, Francia, para utilizar estrategias de obtencion de imágenes por RM y PET traslacionales in vivo y ex vivo, basadas en biomarcadores que potencialmente se pueden trasladar a ensayos clinicos en seres humanos. Algunos de los biomarcadores potenciales que se pueden usar en las instalaciones de MIRCen incluyen: Atrofia cerebral (RM), obtencion de imágenes de placas amiloides (RM, AV45, PET), nivel plasmatico de Ac y Tau, Metabolismo cerebral (FDG-PET, autorradiografia 2DG), Transporte axonico, salud neuronal (MEMRI), conducta (LAM), Microhemorragias, Edema angiogenico (RM).

Este objetivo utilizara un total de 120 ratones 3xTg-EA.

Objetivo 2: Estudio terapeutico sobre las vacunas RECALL-VAX en ratones 3xTg-EA.

Ratones 3xTg-EA homocigoticos de 12 meses de edad se trataran con un adyuvante, la vacuna anti-amiloide RECALL-VAX, la vacuna anti-ATau RECALL-VAX o la combinacion de la vacuna anti-amiloide y anti-ATau RECALL-VAX (n=15 por grupo). Seis meses mas tarde, los ratones se analizaran con una serie de tareas cognitivas, como se detalla a continuacion. Mas tarde, los ratones se sacrificaran y sus cerebros se extraeran, y despues se cortaran por la linea media, para analisis patologicos. Ademas, se extraera sangre para analisis.

Este objetivo utilizara un total de 60 ratones 3xTg-EA.

Ensayos conductuales

Reconocimiento de objeto/lugar/contexto

Estas tareas estan basadas en la tendencia espontanea de los roedores a explorar un objeto nuevo con mas frecuencia que un objeto conocido (Ennaceur y Delacour, 1988) y se ha descubierto que no es dependiente de la amigdala (Moses et al., 2005).

Las lesiones de la corteza perirrinal y los estudios de activation neuronal y de respuestas en ratas sugieren que son neuronas corticales y no del hipocampo las que estan implicadas en la tarea de reconocimiento de objetos (Aggleton et al., 1997; Wan et al., 1999). Para la tarea de objeto nuevo, los ratones se familiarizaran con un campo abierto vacio durante un periodo de 10 minutos. Al dia siguiente, los ratones se someteran a una sesion de exploration de 5 minutos en el mismo contexto, con dos objetos identicos (Objeto A; por ejemplo, dos bolas identicas o dos dados identicos) colocados en ubicaciones simetricas en el campo abierto. Noventa minutos y 24 horas mas tarde, los animales se someteran a una prueba de fase de retention de 3 minutos, donde estaran expuestos a un Objeto A y tambien a un objeto nuevo, el Objeto B (para el punto de tiempo de 90 minutos) y el Objeto C (para el punto de tiempo de 24 horas), colocados en las mismas ubicaciones simetricas en el campo abierto.

Una version distinta de la tarea de novedad requiere que los ratones reconozcan que un objeto esta colocado en una nueva ubicacion (Save et al., 1992; Ennaceur et al., 1997). Esta tarea depende principalmente del hipocampo (Mumby et al., 2002). Para el paradigma de lugar nuevo, los ratones se colocaran otra vez en el campo abierto con dos objetos identicos (Objeto D), distintos de los objetos utilizados para la tarea de objeto nuevo, durante 5 minutos.

90 minutos mas tarde, los animales se someteran a una prueba de fase de retencion de 3 minutos, donde se expondran a los Objetos D nuevamente, pero uno de los objetos se habra movido de su ubicacion original.

Otra version del paradigma de novedad-preferencia requiere que los ratones recuerden un objeto encontrado en un contexto particular (Dix y Aggleton, 1999). Ademas, se ha demostrado que esta tarea de memoria depende del hipocampo (Mumby et al., 2002). La tarea de contexto nuevo requeria que los ratones se familiarizaran con un segundo contexto. Los ratones se colocaran en un segundo campo abierto en una habitation distinta durante 10 minutos. Se presentara a los ratones dos objetos identicos en el contexto 1 (Objeto E) y despues se les presentaran dos objetos identicos distintos en el contexto 2 (Objeto F). Para la prueba de la fase de retencion de 90 minutos, los animales se colocaran en el contexto 1 con el Objeto E y un objeto del contexto 2 (Objeto F).

El tiempo utilizado para explorar el objeto conocido y el objeto nuevo se calculara cuando la exploracion es igual a tocar el objeto con la nariz o las patas, u olfatear dentro una distancia de 1,5 cm del objeto. El tiempo utilizado con el objeto nuevo en comparacion con el tiempo utilizado con ambos objetos se utilizara como indice de memoria. La puntuacion la realizaran de forma independiente dos puntuadores, con ocultacion, para eliminar el sesgo experimental.

Laberinto acuatico de Morris (adaptado de (Roozendaal et al., 2003))

El laberinto acuatico de Morris (LAM) es una prueba para la memoria espacial (es decir, dependiente del hipocampo) y el aprendizaje inducido (es decir, no hipocampo) en roedores. En las ultimas dos decadas, muchos estudios han usado esta prueba como una medida fiable del aprendizaje dependiente del hipocampo (D'Hooge y De Deyn, 2001), incluyendo varios modelos transgenicos (Hsiao et al., 1996; Hsiao, 1997).

El laberinto acuatico es una piscina circular con agua opaca. Los ratones se entrenaran previamente nadando en una plataforma de plexiglas sumergida a 1,5 cm por debajo de la superficie del agua. La ubicacion de la plataforma se seleccionara al azar para cada raton individual a lo largo del entrenamiento. El laberinto esta ubicado en una habitacion que contiene varias senales visuales fuera del laberinto. Para el entrenamiento espacial, los ratones se someteran a cuatro ensayos por dia durante tres dias consecutivos. Antes del primer ensayo, el raton se colocara en la plataforma durante 30 s. En cada ensayo, el raton se colocara en el tanque en uno de los cuatro puntos de inicio designados en un orden aleatorio. Los ratones podran encontrar y escapar sobre la plataforma sumergida. Si un animal no encuentra la plataforma dentro de los 60 s, se lo guiara manualmente a la plataforma y permanecera alli durante 15 s.

La retencion del entrenamiento espacial se evaluara 1,5 y 24 horas despues del ultimo ensayo de entrenamiento. Ambos ensayo de sondeo consistiran en 60 s de nado libre en la piscina con la plataforma retirada. Los ratones se controlaran mediante una camara montada en el techo directamente encima de la piscina para su posterior analisis. Los parametros medidos durante la prueba de sondeo incluiran (1) el tiempo utilizado en el cuadrante que contiene la plataforma durante el entrenamiento y (2) el tiempo de latencia hasta cruzar a la ubicacion de la plataforma. Los datos de escape se examinaran con un analisis de varianza multifactorial (ANOVA) que incluye el genotipo (transgenico frente a no transgenico) y el ensayo de sondeo (1,5 y 24 horas).

Evitacion inhibitoria pasiva (El)

La tarea de evitacion inhibitoria se utiliza en ratones para evaluar principalmente el aprendizaje dependiente de la amigdala (Blanchard y Blanchard, 1972; Phillips y LeDoux, 1992; Holahan y White, 2002). El analisis de El consiste en una sesion de entrenamiento seguida de una analisis a las 1,5 y 24 horas posentrenamiento. Durante la sesion de entrenamiento, se coloca un raton en una camara iluminada y, cuando el raton cruce hacia el compartimiento oscuro, recibira una descarga electrica en las patas (0,15 mA/1 s). Durante el ensayo, el raton se colocara otra vez en el compartimiento con luz y se medira el tiempo de latencia para cruzar hacia el compartimiento oscuro. Esta medida del tiempo de latencia se usara como un indice de la evitacion pasiva por miedo.

b. Marcadores bioquimicos

Mediciones de Ap: Datos cuantitativos sobre los efectos del compuesto sobre diversas especies de Ap (por ejemplo, Ap40 frente a ApP42; Ap soluble frente a insoluble) (Oddo et al, 2003). La proteina extraida del tejido cerebral de ratones tratados con compuesto se utilizara para generar extractos de proteinas solubles e insolubles y se analizara mediante ELISA de tipo sandwich. Se realizaran transferencias de Western para medir los niveles de equilibrio de la holoproteina APP, los fragmentos C99/C83 y de sAPPp, para determinar los efectos del compuesto en estos biomarcadores. Se analizaran las rutas enzimaticas que conducen a la production de Ap, asi como las enzimas que se sabe que degradan Ap.

Hiperfosforilacion de tau: Debido a que los ratones 3xTg-EA acumulan inclusiones neuronales inmunorreactivas de tau argirofilicas y filamentosas en la corteza y el hipocampo con el aumento de la edad (Oddo et al, 2003), se pueden evaluar los efectos del compuesto sobre la hiperfosforilacion de tau como un biomarcador funcional. Esto se lograra con la transferencia de Western cuantitativa con anticuerpos (tales como AT8, AT100 o PHF1), que reconocen especificamente la tau hiperfosforilada. Se analizaran las supuestas tau quinasas y fosfatasas para observar como el tratamiento podria estar afectando la fosforilacion de tau.

c. Inmunohistoquimica

Para evaluar las placas y ovillos totales y tambien la activation microglial, los cerebros de ratones 3xTg-EA se fijaran con paraformaldehido y se cortaran a 55 |^jM. Utilizando diversos anticuerpos contra diversas formas de Ap (1-40, 1­ 42 y oligomerica) y formas fosforiladas de tau, se puede visualizar las placas y los ovillos en cuanto a la ubicacion y la gravedad dentro del cerebro. Ademas, se tenira con anticuerpos contra CD45 en cuanto a la activacion microglial, para observar si las placas y los ovillos todavia inician una respuesta inmunitaria. Tambien se analizaran los cambios

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo espedfico para la protema tau truncada preovillo soluble, no mostrando dicho anticuerpo union y/o reactividad para la proteina tau normal, para su uso en el tratamiento o la prevencion de la EA, en donde el uso desacelera, reduce o previene la acumulacion, la agregacion y/o la polimerizacion de la tau truncada,

en donde

la proteina tau truncada es tau1-421 (ATau), o un fragmento C-terminal de la misma,

el fragmento C-terminal de la misma es tau411-421, tau412-421, tau413-421, tau414-421, tau415-421, tau416-421, tau417-421 o tau418-421,

la protema tau normal es hTau40, y

el anticuerpo reconoce especificamente el fragmento C-terminal en una tau escindida por caspasa, pero no reconoce la misma secuencia en la proteina tau normal.

2. El anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivind 1ic,a enci dóonnde dicho anticuerpo es TauC3.

3. El anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicac 1,ió enn donde el fragmento inmunogenico de la tau truncada comprende o consiste en una secuencia de las SEQ ID NO: 83-86 o 116.

4. El anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindica 1c,ió enn donde dicho anticuerpo se une a un peptido sintetico correspondiente a los aminoacidos 412-421, o a un fragmento del mismo, de A tau y no reconoce la secuencia del peptido sintetico cuando esta presente internamente en htau40.

5. El anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

6. El anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho anticuerpo se une al neoepitopo creado por la escision de htau en Asp42i con una constante de equilibrio KD de 1x10-9 M a 1x10-11 M, según se mide mediante un ensayo de resonancia de plasmon superficial utilizando peptido capturado en un chip de estreptavidina.