KR20180027566A - 타우 결합 항체 - Google Patents

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KR20180027566A
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케리 루이스 타이슨
테런스 슈어드 베이커
조르쥬 메레-코엘로
패트릭 다우니
장-필립 쿠라드
데이비드 에드워드 오르몬드 나이트
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유씨비 바이오파마 에스피알엘
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Abstract

본 발명은 타우 결합 항체 및 이의 결합 단편에 관한 것이다.

Description

타우 결합 항체
본 발명은, 특히 치료용 및 진단용 타우(Tau) 결합 항체 및 이의 결합 단편, 상기 항체의 제조 방법, 그리고 타우병증, 예를 들어 알츠하이머병; 근위축성 측색 경화증/파킨슨증 치매 복합; 은친화성 입자병; 만성 뇌상성 뇌병증; 피질 기저핵 변성; 석회화에 의한 광범위 신경 섬유 매듭; 다운 증후군; 가족성 영국형 치매; 가족성 덴마크형 치매; MAPT 돌연변이에 의해 유발된 17번 염색체에 연관된 전두 측두엽 치매 및 파킨슨증; 게르스트만 슈투로이슬러 샤잉커병(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease); 과들루프 파킨슨증(Guadeloupean parkinsonism); 근긴장성 이영양증; 뇌 철분 축적으로 인한 신경변성; 니만 피크병((Niemann-Pick disease) C형; 신경 섬유 매듭으로 인한 비-과마니안(non-Guamanian) 운동 뉴런 질환; 피크 병; 뇌염 후 파킨슨증; 프라이온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증; 진행성 피질하 신경아교증; 진행성 핵상 마비; SLC9A6 관련 정신지체; 아급성 경화성 범뇌염; 매듭 우세 치매(Tangle-only dementia); 구형 교세포 포함물로 인한 백질 타우병증(Clavaguera et al. Brain Pathology 23 (2013) 342-349)의 치료 및/또는 진단을 위한 이들의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기에 기재된 타우병증, 특히 알츠하이머병 및 진행성 핵상 마비와 같은 타우병증에 걸렸거나 걸리기 쉬운 것으로 의심되는 인간 피험체의 치료 방법에 관한 것이다.
알츠하이머병(AD: alzheimer's disease) 및 진행성 핵상 마비(PSP: progressive supranuclear palsy)는 높은 미충족 의료 수요, 고비용의 사회 의료 체계와 환자 가족의 무거운 부담을 가진 신경 퇴행성 질환이다. AD 임상 징후는 기억, 인지, 이성, 판단 및 정서 안정성의 소실과 결국에는 사망을 포함한다. PSP는 심각하고 점진적인 보행 제어 및 균형 문제, 추락, 수직 안구운동 장애, 인지문제, 우울증, 무관심, 및 경증 치매를 수반한다. 후기 증상은 시력 흐림, 제어되지 않는 안구 운동, 불분명한 발음, 연하 곤란 및 사망을 포함한다.
10년 이상 동안, AD 질환 교정 프로그램은 다양한 기전을 통해 아밀로이드-베타-펩티드를 표적화하여 왔다. 대조적으로, AD의 2번째 주요 특징인 세포 내 타우 병리기전을 다루는 데 있어 진보는 훨씬 적었다. 응집된 과인산화 타우를 포함하는 신경 섬유 포함물 또는 매듭은 AD 병리기전 및 PSP를 포함한 기타 많은 타우병증을 정의하는 특징이다.
상기 질병에서, 증상의 진행과 신경 내 타우 응집체의 수준 및 분포 사이에 밀접한 연관성이 있다. AD에서 신경 타우 매듭은 이들이 해마 및 신피질로 확산되는 횡단 내후각 피질에서 처음 나타난다. AD 뉴런에서 발견된 매듭은 과인산화되고 응집된 불용성 타우로 이루어진다. 병리학적 타우 종의 직접적인 독성 효과 및/또는 기능적인 타우가 과인산화 응집된 형태로 격리되어 더이상 측삭 수송을 지원할 수 없음으로 인한 측삭 수송의 소실이 질환의 원인이 된다고 제안되어왔다.
타우는 비병리학적 상태에서 높은 가용성의 세포질의 미세소관-결합 단백질로, 인간 중추 신경계(CNS: central nervous system)에서 선택적 스플라이싱으로 인해 352 내지 441개 아미노산 길이 범위의 6가지 주요 이소형으로 존재한다. 이들 이소형은 0, 1 또는 2개의 N-말단 삽입체(0N, 1N, 2N), 및 3 또는 4개의 C-말단 "반복" 서열(3R 또는 4R)을 가질 수 있다. 이들 30-32개 아미노산 C-말단 반복 서열, R1, R2, R3 및 R4는 함께 타우 미세소관 결합 영역(MTBR: microtubule-binding region)을 구성한다. 실제로 타우의 주요 역할은 측삭 미세소관의 조립 및 안정화에 있다고 생각된다. 미세소관은 세포 성장을 위한 측삭 수송 경로 및 세포골격 요소를 형성한다(Clavaguera et al., Brain Pathology 23 (2013) 342-349). 3가지 타우 이소형은 3개의 미세소관 결합 영역(MTBR)을 포함한다고 입증되었다:
- 3R0N으로도 불리는 이소형 4, NCBI 참조 서열 NP_058525.1(352개 아미노산),
- 3R1N으로도 불리는 이소형 7, NCBI 참조 서열 NP_001190180.1(381개 아미노산)
- 3R2N으로도 불리는 이소형 8, NCBI 참조 서열 NP_001190181.1(410개 아미노산).
반면 나머지 3가지 타우 이소형은 4개 MTBR을 포함한다:
- 4R2N으로도 불리는 이소형 2, NCBI 참조 서열 NP_005901.2(441개 아미노산),
- 4R0N으로도 불리는 이소형 3, NCBI 참조 서열 NP_058518.1(383개 아미노산), 및
- 4R1N으로도 불리는 이소형 5, NCBI 참조 서열 NP_001116539.1(412개 아미노산).
타우는 85개의 잠재적인 세린(S), 트레오닌(T), 및 티로신(Y) 인산화 부위를 포함한다. 타우에서 인산화된 많은 잔기는 미세소관 결합 도메인 측면의 타우의 프롤린 풍부 도메인에서 발견된다. 6가지 타우 이소형 모두 정상적인 성숙한 인간 뇌에 존재하며, 이 단계에서 타우 인산화는 상대적으로 감소한다(Noble et al., 2013 Front Neurol. 2013; 4: 83). 여러 가지 타우병증에서, 병리학적 병변에서 침착된 타우는 항상 고도로 인산화되어 있다. 포스포-세린202 및 포스포-트레오닌205는 PSP 및 AD 환자의 뇌 시료 및 뇌척수액으로부터 응집된 타우에서 검출되었다(Buee et al., Brain Research Reviews 33 (2000) 95-130; Wray et al J Neurochem. 2008 Jun 1; 105(6):2343-52; Hanger et al., J Biol Chem. 2007 Aug 10; 282(32):23645-54; Maccioni et al Neurobiol Aging. 2006 Feb;27(2):237-44)
현재 상기 질환에는 효능이 약하거나 없는 대증요법만이 이용 가능하다. 질환의 발생을 지연시키거나 이상적으로 정지시키는 치료법은 현재 이용 가능하지 않다. 따라서 당 업계에서는 타우병증의 치료에 유용한 신규 화합물 및 조성물이 요구된다.
본 발명의 목적 및 요약
본 발명의 목적은 특히 타우병증, 예를 들어 알츠하이머병(AD) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)의 치료 또는 진단용 제제를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 특히 타우병증, 예를 들어 알츠하이머병(AD) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)의 치료 또는 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 및 기타 목적은 이후에 뒤이은 설명으로부터 명백할 것이며, 이들은 독립적인 청구항의 청구 대상에 의해 성취된다. 본 발명으로부터 고려되는 일부 구체적인 측면 및 이의 실시양태는 종속항의 청구 대상을 형성한다. 그러나 본 발명에 의해 고려되는 기타 측면 및 이의 실시양태는 뒤이은 설명으로부터 취할 수 있다.
제1 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
서열 번호 1로부터 선택된 CDR1 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열, 서열 번호 2로부터 선택된 CDR2 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열, 및 서열 번호 3으로부터 선택된 CDR3 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는
서열 번호 4로부터 선택된 CDR1 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열, 서열 번호 5로부터 선택된 CDR2 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열, 및 서열 번호 6으로부터 선택된 CDR3 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
제2 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
서열 번호 7 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는
서열 번호 8 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
서열 번호 9 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는
서열 번호 10 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
제4 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
서열 번호 13 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는
서열 번호 16 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 타우 결합 항체 또는 결합 단편을 제공한다.
제5 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206을 포함하는 인산화된 타우 단편에 결합하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합에 결합한다.
제1 및 제5 측면의 한 실시양태로서, 본 발명은 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항체 또는 이의 결합 단편일 수 있는 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
제2 또는 제3 측면의 한 실시양태로서, 본 발명은 키메라 항체 또는 이의 결합 단편일 수 있는 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
제4 측면의 한 실시양태로서, 본 발명은 인간화 항체 또는 이의 결합 단편일 수 있는 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
제6 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 제1 내지 제4 측면 또는 이의 실시양태 중 어느 하나의 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편과 타우 결합에 대해 경쟁하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
제7 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 제1 내지 제5 측면 또는 이의 실시양태 중 어느 하나의 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편과 실질적으로 동일한 타우의 에피토프에 결합하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
제6 및 제7 측면의 한 실시양태로서, 본 발명은 인간화 항체 또는 이의 결합 단편인 단클론 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
제1 내지 제7 측면 및 이의 실시양태의 항체 및 이의 결합 단편은 인간 타우의 가용 형태, 인간 타우의 쌍 나선 필라멘트(PHF: paired helical filament) 또는 인간 타우의 가용 형태 및 인간 타우의 쌍 나선 필라멘트(PHF) 둘 다에 결합할 수 있으며, 상기 인간 타우는 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역을 포함한다.
제8 측면에서, 본 발명은 제1 내지 제7 측면 및 이의 실시양태의 항체 또는 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산 서열, 예를 들어 DNA 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
제9 측면에서, 본 발명은 상기에 언급한 핵산 분자를 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터를 제공한다.
제10 측면에서, 본 발명은 상기에 언급한 핵산 분자, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
제11 측면에서, 본 발명은 제1 내지 제7 측면 및 이의 실시양태의 항체 및 이의 결합 단편의 제조 방법을 제공한다.
제12 측면에서, 본 발명은 특히 AD 및 PSP와 같은 타우병증의 치료를 위한 제1 내지 제7 측면 및 이의 실시양태의 항체 및 이의 결합 단편의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 특히 AD 및 PSP와 같은 타우병증의 진단을 위한 제1 내지 제7 측면 및 이의 실시양태의 항체 및 이의 결합 단편의 용도에 관한 것이다.
도 1: 실험 2.3의 ELISA 분석에서 서열 번호 7의 토끼 VL 서열 AB1(VL_AB1) 및 서열 번호 8의 토끼 VH 서열(VH_AB1)을 가진 AB1의 비오티닐화된 T197 펩티드에 대한 결합 vs 비오티닐화된 T174, T211, T230 및 T396에 대한 결합.
도 2: 실험 3.1의 세포 응집 분석을 보여주는 다이아그램.
도 3: 인간 PSP 환자(PSP-PHF8)로부터 회수한 인간 타우 병리학적 원섬유를 시드(seed)로서 사용한 세포 타우 응집 분석에서 서열 번호 17의 경쇄 및 서열 번호 20의 중쇄를 가진 타우 결합 항체 (A), 및 서열 번호 17의 경쇄 및 서열 번호 21의 중쇄를 가진 타우 결합 항체 (B), 또는 음성 대조군 IgG4 항체 A33 (C)의 효능.
도 4: 인간 AD 또는 PSP로부터의 타우 포함 용해액에 대한 서열 번호 9의 경쇄 및 서열 번호 10의 중쇄를 가진 타우 결합 항체 AB1의 결합 특성을 나타내는 웨스턴 블롯.
도 5: A)는 밑줄로 표시된 CDR 1(서열 번호 1), 2(서열 번호 2) 및 3(서열 번호 53)을 가진 서열 번호 7의 AB1의 공여 VL(VL_AB1)을 도시한다. B)는 밑줄로 표시된 수용 CDR 1, 2, 및 3을 가진 서열 번호 44의 인간 수용 영역 IGKV1-39의 VL 서열을 도시한다. C) 밑줄로 표시된 CDR 1(서열 번호 1), 2(서열 번호 2) 및 3(서열 번호 53)을 가진 서열 번호 11의 CDR-이식된 서열 gVL4_AB1을 도시한다. D) 밑줄로 표시된 CDR 1(서열 번호 1), 2(서열 번호 2) 및 3(서열 번호 54)을 가진 서열 번호 12의 CDR-이식된 서열 gVL9_AB1을 도시한다; CDR3은 VL_AB1과 비교하여 A91 돌연변이를 포함한다.
도 6: A)는 밑줄로 표시된 CDR 1(서열 번호 4), 2(서열 번호 5) 및 3(서열 번호 48)을 가진 서열 번호 8의 AB1의 공여 VH(VH_AB1)를 도시한다. B)는 밑줄로 표시된 수용 CDR 1, 2, 및 3을 가진 서열 번호 45의 인간 수용 영역 IGHV4-39의 VH 서열을 도시한다. C) 밑줄로 표시된 CDR 1(서열 번호 4), 2(서열 번호 5) 및 3(서열 번호 49)을 가진 서열 번호 14의 CDR-이식된 서열 gVH41_AB1을 도시한다. 공여 잔기는 기울임 체와 볼드체로 나타낸다: K71 및 V78. 골격 내 돌연변이는 음영으로 나타낸다(E1). CDR3은 VH_AB1과 비교하여 N100Q 치환을 포함한다. D) 밑줄로 표시된 CDR 1(서열 번호 4), 2(서열 번호 5) 및 3(서열 번호 50)을 가진 서열 번호 15의 CDR-이식된 서열 gVH49_AB1을 도시한다. 공여 잔기는 기울임 체와 볼드체로 나타낸다(K71 및 V78). 골격 내 돌연변이는 음영으로 나타낸다(E1). CDR3은 VH_AB1과 비교하여 N100A 치환을 포함한다.
도 7: 인간 AD 환자로부터 회수한 인간 타우 병리학적 원섬유를 시드로서 사용한 세포 타우 응집 분석에서 서열 번호 9의 경쇄 및 서열 번호 10의 중쇄를 가진 타우 결합 항체, 및 서열 번호 55의 인산화된 잔기 202 및 205를 포함하는 에피토프에 결합하는 것으로 문헌에 기재된 타우 결합 항체 AT8, 또는 음성 대조군 항체 101.4의 효능.
도 8: 인간 AD 환자, 또는 인간 PSP 환자, 또는 인간 FTD 환자로부터 회수한 인간 타우 병리학적 원섬유를 시드로서 사용한 세포 타우 응집 분석에서 서열 번호 17의 경쇄 및 서열 번호 20의 중쇄를 가진 타우 결합 항체의 효능.
하기에서 예시적으로 기재된 본 발명은 본원에서 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제약 또는 제약들이 없이도 적절하게 실시될 수 있다.
본 발명은 특정 측면 및 이의 실시양태와 관련하여 그리고 특정 도면 및 실시예를 참고로 하여 기재될 것이지만 본 발명은 이로써 제한되지 않는다.
기술 용어는 달리 명시되지 않는다면 이들의 통상의 의미로 사용된다. 특정 의미가 특정 용어를 시사하는 경우, 용어의 정의는 하기에 용어가 사용되는 상황에서 제공될 것이다.
용어 "포함하는(comprising)"이 본 설명 및 청구 범위에 사용되는 경우, 다른 요소를 배제하지 않는다. 본 발명을 위해서, 용어 "∼로 이루어진"은 용어 "∼로 구성된"의 바람직한 실시양태로 간주해야 한다. 이후에 군이 적어도 특정 개수의 실시양태를 포함한다고 정의된다면, 이는 또한 바람직하게는 이들 실시양태만으로 이루어진 군을 개시하는 것으로 이해해야 한다.
본 발명을 위해서, 용어 "획득된(얻은)"은 용어 "획득 가능한(얻을 수 있는)의 바람직한 실시양태로 간주한다. 이후에, 예를 들어 항체가 구체적인 공급원으로부터 획득 가능하다고 정의된다면, 이는 또한 이 공급원으로부터 획득되는 항체를 개시하는 것으로 이해해야 한다.
단수 명사를 언급할 때 부정관사 또는 정관사, 예를 들어 "하나의(a, an)" 또는 "그(the)"가 사용될 경우, 이는 그 밖에 어떤 것이 구체적으로 언급되지 않는다면 그 명사의 복수를 포함한다. 용어 "약" 또는 "대략"은 당업자가 논의되고 있는 특징의 기술적인 효과를 여전히 보장한다고 이해할 정확도의 간격을 나타낸다. 용어는 전형적으로 명시된 수치의 ±10%, 바람직하게는 ±5%의 편차를 나타낸다.
여러 가지 측면의 바람직한 실시양태로서 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편에 대한 모든 언급은 단클론 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 고려하는 것으로 이해해야 한다.
여러 가지 측면에 대해, 본 발명은 각각의 경쇄 및/또는 중쇄 영역의 CDR 및 가변 영역을 포함하는 항체 및 이의 결합 단편을 언급한다. 가변 경쇄 영역 또는 가변 중쇄 영역만을 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편은 상응하는 기타 가변 영역과 효과적으로 결합할 수 있는 가변 영역의 제조 방법 또는 예를 들어 스크리닝 방법에 유용할 수 있다. 그러나 각각의 경쇄 및/또는 중쇄 영역의 CDR 및 가변 영역을 포함하는 항체 및 이의 결합 단편을 언급하는 경우, 이는 언제나 각각의 경쇄 및 중쇄 영역의 CDR 및 가변 영역을 포함하는 바람직한 실시양태의 항체 및 이의 결합 단편으로서 고려한다는 것을 이해해야 한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료", "치료하는" 등은 바라는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 획득하는 것을 언급한다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 것과 관련하여 예방적일 수 있고/거나 질환 및/또는 질환으로 인한 부작용의 부분적인 또는 완전한 치유와 관련하여 치료적일 수 있다. 따라서, 치료는 포유동물, 특히 인간에서 질환의 모든 치료를 포함하고, (a) 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 걸렸다고 진단받지 않은 피험체에서 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉 이의 발생을 방지하는 것; 및 (c) 질환을 완화하는 것, 즉 질환의 퇴행을 일으키는 것을 포함한다.
"치료학적 활성제"로서 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편의 언급은 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편의 질환 치료에 있어서의 용도를 언급한다.
"치료 유효량"은 질환 치료를 위해 포유동물 또는 기타 피험체에 투여될 때, 질환을 위한 상기 치료에 효과를 일으키기에 충분한 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편의 양을 언급한다. 치료 유효량은 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 치료되는 피험체의 질환 및 이의 중증도 및 나이, 체중 등에 따라 달라질 것이다.
"진단 활성제"로서 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편의 언급은 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편의 질환 진단에 있어서의 용도를 언급한다.
"진단 유효량"은 생물학적 시료의 진단 시험에 사용될 때, 질환의 확인을 가능하게 하거나 치료 개입의 효능을 모니터링하는 수단으로서 질환 조직의 양을 모니터링하는데 충분한 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편의 양을 언급한다.
본 출원은 인간 타우에 결합하는 AB1로 명명된 항체의 확인에 부분적으로 기초한다. 본 분야의 관례대로, 본 명세서에서 타우 잔기 넘버링은 서열 번호 55(NCBI 참조 서열: NP_005901.2)의 타우 이소형 2를 언급한다. 아래에서 제시되는 바와 같이, 면역화된 토끼로부터 단리된 AB1은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역을 인식한다.
실시예는 AB1이 인간 타우의 쌍 나선 필라멘트(PHF)에 결합할 수 있다(실시예 2.4 참조)는 것과 AB1이 인간 시료의 동결 절편에서 신경 내 신경 섬유 매듭(NFT: neurofibrillary tangle), 신경 외 NFT, 신경반(neuritic plaque) 유사 구조 및 신경망 실(neurophil thread)을 검출할 수 있었다(실시예 3.2 참조)는 것을 입증한다. 이러한 양상이 AB1의 가변 경쇄 영역(VL) 및 가변 중쇄 영역(VH)의 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)에 의해 적어도 부분적으로 매개된다고 추정하는 것은 타당해 보인다.
상기 배경에 대해서, 본 발명은 AB1의 VL 영역의 CDR 또는 특이성 결정 잔기(서열 번호 7) 및/또는 AB1의 VH 영역의 CDR(서열 번호 8)을 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
항체 가변 도메인 내 잔기는 통상적으로 카밧(Kabat) 연구자들이 고안한 체계에 따라 넘버링된다. 이 체계는 문헌(Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (이후로 "Kabat et al. (상기 문헌)")에 개시되어 있다. 달리 명시되는 경우를 제외하고 본 명세서에서 이 넘버링 체계가 사용된다.
카밧 잔기 지정은 항상 아미노산 잔기의 선형 넘버링과 직접적으로 일치하지는 않는다. 실제 선형 아미노산 서열은 기본 가변 도메인 구조의 골격 또는 상보성 결정 영역(CDR)인 구조적 요소의 단축 또는 이에 삽입에 상응하는 엄격한 카밧 넘버링에서보다 더 적거나 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 잔기의 정확한 카밧 넘버링은 "표준" 카밧 넘버링된 서열과 항체의 서열에서 상동성 잔기의 정렬에 의해 주어진 항체에 결정될 수 있다. 그러나 코티아(Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901- 917 (1987))에 따르면 CDR-H1에 해당하는 루프는 잔기 26 내지 잔기 32에 걸쳐 있다.
따라서, AB1의 VL의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열 번호 1, 2 및 53에 해당하는 것으로 확인되었다. AB1의 VH의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열 번호 4, 5, 및 48에 해당하는 것으로 확인되었다. CDR에 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실의 효과는 예를 들어, 실시예에 기재된 방법을 이용하여, 당 업자에 의해 쉽게 시험될 수 있다. 본래 확인된 VH의 CDR3(CDRH3), 즉 서열 번호 48에서, 예를 들어 가능한 아스파라긴 탈아미드화 부위를 확인하고 아스파라긴 잔기를 글루타민, 알라닌, 아스파르트산 또는 세린으로 대체하여 변형하였다. 이는 결과적으로 CDRH3에 대해 각각 서열 번호 49, 50, 51 및 52 서열이 된다. 간략하게 하기 위해서, CDRH3에 대한 3가지 서열, 즉 서열 번호 48, 49, 50, 51 및 52는 서열 번호 6으로 결합하였다. 유사하게, VL의 CDR3(CDRL3)에서, 가능한 글루타민 탈아미드화 부위를 확인하고 인접한 글리신을 알라닌으로 대체하여 변형하였다. 이는 결과적으로 서열 번호 54 서열이 된다. 간략하게 하기 위해서, CDRL3에 대한 두 서열 모두, 즉 서열 번호 53 및 54는 서열 번호 3으로 결합하였다.
추가의 변형, 예를 들어 치환, 첨가 및/또는 결실은 AB1과 비교하여 예를 들어 결합 특성을 실질적으로 변화시키지 않으면서 CDR에 만들어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이는 주로 CDR 내 아미노산을 유사한 아미노산으로 대체하여 달성될 수 있다. 본원에서 사용되는 "유사성"은 정렬된 서열 내 임의의 특정 위치에서 아미노 잔기가 서열 사이에 유사한 유형인 것을 나타낸다. 예를 들어, 류신은 이소류신 또는 발린에 치환될 수 있다. 대개 또 다른 아미노산에 치환될 수 있는 기타 아미노산은 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는다:
- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 가진 아미노산);
- 리신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 가진 아미노산);
- 아스파테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 가진 아미노산);
- 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 가진 아미노산); 및
- 시스테인 및 메티오닌(황을 포함하는 측쇄를 가진 아미노산).
상기 배경에 대하여, 본 발명은 한 측면에서 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
서열 번호 1 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열로부터 선택된 CDR1, 서열 번호 2 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열로부터 선택된 CDR2, 및 서열 번호 3 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열로부터 선택된 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는
서열 번호 4 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열로부터 선택된 CDR1, 서열 번호 5 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열로부터 선택된 CDR2, 및/또는 서열 번호 6 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열로부터 선택된 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
서열 번호 1 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열로부터 선택된 CDR1, 서열 번호 2 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열로부터 선택된 CDR2, 및 서열 번호 3 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열로부터 선택된 CDR3을 포함하는 경쇄; 및
중쇄를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
경쇄; 및
서열 번호 4 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열로부터 선택된 CDR1, 서열 번호 5 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열로부터 선택된 CDR2, 및/또는 서열 번호 6 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열로부터 선택된 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
본원에서 사용되는 "동일성"은 정렬된 서열 내 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열 사이에서 동일하다는 것을 나타낸다. 동일성의 정도는 예를 들어 NCBI로부터 이용 가능한 블라스트(BLAST)™ 소프트웨어를 이용하여 쉽게 계산될 수 있다(Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. k Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).
CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3의 각각 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 및 6과의 동일성은 적어도 90%일 수 있지만, 경우에 따라 더 높은 동일성을 선호하는 경우 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%와 같이 더 높을 수도 있다. 상이한 동일성의 위치는 유사성을 고려하여 선택될 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명은 구체적으로 각각 서열 번호 1, 2, 및 3의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 가진 VL 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 6의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 가진 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 고려한다. 또한, 본 발명은 각각 서열 번호 1, 2, 및 53의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 가진 VL 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 6의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 가진 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 각각 서열 번호 1, 2, 및 54의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 가진 VL 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 6의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 가진 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 각각 서열 번호 1, 2, 및 3의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 가진 VL 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 48의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 가진 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 각각 서열 번호 1, 2, 및 3의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 가진 VL 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 49의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 가진 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 각각 서열 번호 1, 2, 및 3의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 가진 VL 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 50의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 가진 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 각각 서열 번호 1, 2, 및 3의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 가진 VL 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 50의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 가진 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 각각 서열 번호 1, 2, 및 3의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 가진 VL 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 51의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 가진 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 및 각각 서열 번호 1, 2, 및 3의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 가진 VL 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 52의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 가진 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 각각 서열 번호 1, 2, 및 53의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 가진 VL 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 48의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 가진 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 각각 서열 번호 1, 2, 및 53의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 가진 VL 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 49의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 가진 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 각각 서열 번호 1, 2, 및 53의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 가진 VL 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 50의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 가진 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 각각 서열 번호 1, 2, 및 53의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 가진 VL 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 51의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 가진 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 및 각각 서열 번호 1, 2, 및 53의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 가진 VL 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 52의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 가진 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편; 각각 서열 번호 1, 2, 및 54의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 가진 VL 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 48의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 가진 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 각각 서열 번호 1, 2, 및 54의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 가진 VL 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 49의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 가진 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 각각 서열 번호 1, 2, 및 54의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 가진 VL 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 50의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 가진 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 각각 서열 번호 1, 2, 및 54의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 가진 VL 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 51의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 가진 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 및 각각 서열 번호 1, 2, 및 54의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 가진 VL 및 각각 서열 번호 4, 5, 및 52의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 가진 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 고려한다.
상기 제1 측면에서 고려되는 바와 같은 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 상이한 기원의 골격 영역에 포함된 상기 CDR을 포함할 수 있다. 따라서, CDR은 AB1의 본래 골격 영역, 즉 서열 번호 7의 토끼 VL 영역 및 서열 번호 8의 토끼 VH 영역 내에 포함될 수 있다. 그러나 CDR은 생쥐 또는 인간 골격 영역과 같이 상이한 종의 기원의 골격 영역 내에 포함될 수도 있다. 이 같은 골격 영역과 조합될 수 있는 골격 영역 및 불변 영역의 기원에 따라서, 키메라, 설치류화 또는 인간화 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 얻을 수 있다.
키메라 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 설치류 또는 인간 기원과 같이 상이한 종으로부터의 불변 영역과 결합된 비인간 기원의 골격 영역 내에 CDR을 포함할 것이다. 설치류화 타우 결합 항체 또는 이의 단편은 설치류 기원의 불변 영역과 함께 결합된 설치류 기원의 골격 영역 내에 CDR을 포함할 것이다. 인간화 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 인간 기원의 불변 영역과 함께 결합된 인간 기원의 골격 영역 내에 CDR을 포함할 것이다.
상기 배경에 대하여, 본 발명은 또 다른 측면에서 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
서열 번호 7 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는
서열 번호 8 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
VL 및 VH의 각각 서열 번호 7 및 8과의 동일성은 적어도 80%일 수 있지만, 경우에 따라 더 높은 동일성을 선호하는 경우 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%와 같이 더 높을 수도 있다. 상이한 동일성의 위치는 유사성을 고려하여 선택될 수 있다. 동일성과 관련하여 CDR에 비해 골격 영역이 더 가변적일 수 있다는 것을 이해할 것이다.
이와 관련하여, 본 발명은 구체적으로 서열 번호 7의 VL 및 서열 번호 8의 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 고려한다.
인간화 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 특히 본 발명에 의해 고려된다.
상기를 위하여, CDR은 인간 골격 영역에 이식될 수 있다. 이 같이 인간화 CDR-이식된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 당 업계에 확립된 접근법에 따라 확인될 수 있다는 것을 이해할 것이다. CDR 또는 특이성 결정 잔기가 이식될 때, 임의의 적합한 수용 인간 가변 영역 골격 서열은 CDR이 유래하는 공여 항체의 부류/유형을 고려하여 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,816,397호(Boss et al.); 유럽 특허 제0,120,694 B1호(Boss et al.); WO 86/01533호(Neuberger, M. S. et al.); 유럽 특허 제0,194,276 B1호(Neuberger, M. S. et al.); 미국 특허 제5,225,539호(Winter); 유럽 특허 제0,239,400 B1호(Winter); 유럽 특허 출원 제0,519,596 A1호(Padlan, E. A. et al.) 참조).
또한, 본 발명의 CDR-이식된 항체 가변 영역에서, 골격 영역은 수용 항체의 서열과 정확하게 동일한 서열을 가질 필요는 없다. 따라서, CDR은 골격 변화가 있거나 없이 이식될 수 있다. 공여 가변 영역의 골격 영역과 수용 골격 영역 사이의 비교를 기초로 한 골격 변화의 도입은 예를 들어 그렇지 않으면 인간화의 결과로서 감소될 수 있는 항체의 친화도의 유지를 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 드문 잔기는 그 수용 쇄 부류 또는 유형에 더 빈번하게 존재하는 잔기로 변화될 수 있다. 별법으로, 수용 골격 영역에서 선택된 잔기는 이들이 공여 항체의 동일한 위치에서 발견되는 잔기와 일치하도록 변화될 수 있다(문헌(Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324) 참조). 이러한 변화는 공여 항체의 친화도를 회복하는데 필수적인 최소한으로 유지되어야 한다. 변화를 위한 잔기는 WO91/09967호(Adair et al.(1991), Humanised antibodies)에 개략적으로 설명된 프로토콜을 이용하여 선택될 수 있다. 본 발명의 CDR-이식된 항체에서, 수용 중쇄 및 경쇄는 반드시 동일한 항체로부터 유래할 필요는 없고, 바라는 경우, 상이한 쇄로부터 유래한 골격 영역을 가진 합성 쇄를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 인간 수용 골격의 예는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM이다(Kabat et al., 상기 문헌)이다. 예를 들어, KOL 및 NEWM은 중쇄에 사용될 수 있고, REI는 경쇄에 사용될 수 있고, EU, LAY 및 POM은 중쇄와 경쇄 둘 다에 사용될 수 있다. 별법으로, 인간 생식세포 계열 서열이 사용될 수 있다; 이들은 http://vbase.mrc-ce.cam.ac.uk/ 또는 http://www.imgt.org에서 이용 가능하다). 본 발명은 구체적으로 경쇄 CDR의 수용 골격 영역으로서 서열 번호 44의 인간 V-영역 IGKV1-39 + JK4 J-영역(IMGT, http://www.imgt.org/) 및 중쇄 CDR의 수용 골격 영역으로서 서열 번호 45의 인간 V-영역 IGHV4-39 + JH4 J-영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 사용하는 것을 고려한다. 서열 번호 45에서, 위치 1, 75 및 80은 예를 들어 골격 영역 내 잔기 변화에 대해 고려될 수 있다. 위치 1의 글루타민 잔기는 글루타메이트로 변화될 수 있다. 위치 73의 발린 잔기는 리신으로 변화될 수 있다. 위치 80의 페닐알라닌은 발린으로 변화될 수 있다. 골격 영역 내 잔기 변화를 위한 서열 번호 45의 기타 위치는 위치 39 및/또는 75일 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 45의 위치 39에서 이소류신 잔기는 발린으로 변화될 수 있다. 위치 75의 트레오닌 잔기는 세린으로 변화될 수 있다. 골격 영역 내 잔기 변화를 위한 서열 번호 44의 위치는 위치 2 및/또는 63일 수 있다. 예를 들어, 서열 44의 위치 2의 이소류신 잔기는 발린으로 변화될 수 있다. 서열 번호 44의 위치 63에서 세린 잔기는 리신으로 변화될 수 있다.
상기 배경에 대하여, 본 발명은 또 다른 측면에서 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
서열 번호 9 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는
서열 번호 10 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다.
또한, 본 발명은 또 다른 측면에서 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
서열 번호 13 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는
서열 번호 16 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
상기 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은
서열 번호 13 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는
서열 번호 14, 15 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함할 수 있다.
또한, 상기 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은
서열 번호 11, 12 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는
서열 번호 16 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함할 수 있다.
상기 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은
서열 번호 11 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는
서열 번호 14, 15 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함할 수 있다.
상기 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은
서열 번호 12 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는
서열 번호 14, 15 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함할 수 있다.
VL 및 VH의 각각 서열 번호 13 및 16과의 동일성은 적어도 80%일 수 있지만, 경우에 따라 더 높은 동일성을 선호하는 경우 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%와 같이 더 높을 수도 있다. 상이한 동일성의 위치는 유사성을 고려하여 선택될 수 있다. 동일성과 관련하여 CDR에 비해 골격 영역이 더 가변적일 수 있다는 것을 이해할 것이다.
이와 관련하여, 본 출원은 구체적으로 서열 번호 11의 VL 및 서열 번호 14의 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 및 서열 번호 11의 VL 및 서열 번호 15의 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 서열 번호 12의 VL 및 서열 번호 14의 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 및 서열 번호 12의 VL 및 서열 번호 15의 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 고려한다.
인간화 CDR-이식된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 인간 기원의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 항체 또는 면역글로불린은 부류 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 나뉘고, 이들 중 몇몇은 하위 부류(아형), 예를 들어 IgGl, IgG2, IgG3, 및 IgG4, IgAl, 및 IgA2로 더 나뉠 수 있다. 특히, 인간 IgG 불변 영역 도메인은 항체 분자가 치료 용도로 의도되거나 항체 이펙터 기능이 필요할 때 특히 IgG1 및 IgG3 이소형일 수 있다. 별법으로, IgG2 및 IgG4 이소형은 항체 분자가 치료 목적으로 의도되고 항체 이펙터 기능이 필요하지 않을 때 사용될 수 있다. 본 발명은 구체적으로 IgG1 및 IgG4 아형의 인간화 항체를 고려한다.
상기 불변 영역 도메인의 서열 수정이 또한 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 타우에 결합하는 항체의 능력을 크게 변화시키지 않으면서 항체 불변 도메인에 하나 이상의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실이 만들어질 수도 있다. 또한, 문헌(Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (I), 105-108)에 기재된 바와 같이 위치 241의 세린이 프롤린으로 변화된 IgG4 분자가 사용될 수 있다.
항체 이펙터 기능은 ADCC 및 CDC를 포함한다. ADCC는 항체 의존성 세포 독성(antibody-dependent celluar cytotoxicity)을 가리킨다. 항체가 원칙적으로 ADCC를 매개할 수 있는 지를 결정하기 위해서, ADCC는 예를 들어 소위 Cr51, Eu, 및 S35-방출 분석에 의해 시험관 내에서 측정될 수 있다. 관심 항원, 즉 타우를 포함하는 표적 세포는 이들 화합물로 표지될 수 있다. 치료 항체를 결합시킨 후, 세포를 세척하고, FcγRIII과 같은 Fc 수용체를 발현하는 이펙터 세포를 항체 표지된 표적 세포와 함께 인큐베이션하고 표적 세포의 용해를 표지의 방출에 의해 모니터할 수 있다. 또 다른 접근법은 소위 아셀라 톡스(aCella TOX)TM 분석을 이용한다. CDC는 보체 의존성 세포 독성(complement-dependent cellular cytotoxicity)을 언급한다. 항체가 원칙적으로 CDC를 매개할 수 있는지를 결정하기 위해서, CDC는 예를 들어, 문헌(Delobel A et al, Methods Mol Biol. (2013); 988:115-43 또는 Current Protocols in Immunology, Chapter 13 Complement(Print ISSN: 1934-3671)에 기재된 바와 같이 시험관 내에서 측정될 수 있다.
상기 배경에 대하여, 본 발명은 또 다른 측면에서 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
서열 번호 19 또는 이와 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 경쇄, 및/또는
서열 번호 22 또는 이와 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 중쇄
를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
상기 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은
서열 번호 19 또는 이와 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 경쇄, 및/또는
서열 번호 20, 21 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄
를 포함할 수 있다.
상기 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은
서열 번호 17, 18 또는 이와 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 경쇄, 및/또는
서열 번호 22 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄
를 포함할 수 있다.
상기 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은
서열 번호 17, 18 또는 이와 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 경쇄, 및/또는
서열 번호 20, 21 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄
를 포함할 수 있다.
경쇄 및 중쇄의 각각 서열 번호 19 및 22와의 동일성은 적어도 70%일 수 있지만, 경우에 따라 더 높은 동일성을 선호하는 경우 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%와 같이 더 높을 수도 있다. 상이한 동일성의 위치는 유사성을 고려하여 선택될 수 있다. 동일성과 관련하여 CDR에 비해 골격 영역이 더 가변적일 수 있고 불변 영역이 훨씬 더 가변적일 수 있다는 것을 이해할 것이다.
이와 관련하여, 본 출원은 구체적으로 서열 번호 17의 경쇄 및 서열 번호 20의 중쇄를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 서열 번호 17의 경쇄 및 서열 번호 21의 중쇄를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 서열 번호 18의 경쇄 및 서열 번호 20의 중쇄를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 및 서열 번호 18의 경쇄 및 서열 번호 21의 중쇄를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 고려한다.
게다가, 본 발명은 또 다른 측면에서 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
서열 번호 19 또는 이와 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 경쇄, 및/또는
서열 번호 25 또는 이와 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 중쇄
를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
상기 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은
서열 번호 19 또는 이와 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 경쇄, 및/또는
서열 번호 23 또는 서열 번호 24 또는 이와 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 중쇄
를 포함할 수 있다.
상기 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은
서열 번호 19 또는 이와 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 경쇄, 및/또는
서열 번호 23 또는 서열 번호 24 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄
를 포함할 수 있다.
상기 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은
서열 번호 17, 18 또는 이와 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 경쇄, 및/또는
서열 번호 23 또는 서열 번호 24 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄
를 포함할 수 있다.
이와 관련하여, 본 출원은 구체적으로 서열 번호 17의 경쇄 및 서열 번호 23의 중쇄를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 서열 번호 17의 경쇄 및 서열 번호 24의 중쇄를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 서열 번호 18의 경쇄 및 서열 번호 23의 중쇄를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 및 서열 번호 18의 경쇄 및 서열 번호 24의 중쇄를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 고려한다.
경쇄 및 중쇄의 각각 서열 번호 19 및 서열 번호 23 또는 24와의 동일성은 적어도 70%일 수 있지만, 경우에 따라 더 높은 동일성을 선호하는 경우 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%와 같이 더 높을 수도 있다. 상이한 동일성의 위치는 유사성을 고려하여 선택될 수 있다. 동일성과 관련하여 CDR에 비해 골격 영역이 더 가변적일 수 있고 불변 영역이 훨씬 더 가변적일 수 있다는 것을 이해할 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 항체 또는 이의 결합 단편, 특히 CDR-H1(서열 번호 4), CDR-H2(서열 번호 5), CDR-H3(서열 번호 6), CDR-L1(서열 번호 1), CDR-L2(서열 번호 2) 또는 CDR-L3(서열 번호 3) 중 어느 하나를 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편, 예를 들어 서열 번호 7의 VL 및 서열 번호 8의 VL을 포함하는 항체에 의해 결합된 인간 타우의 특정 영역 또는 에피토프를 제공한다.
또한, 본 발명에 의해 제공되는 항체 또는 이의 결합 단편, 특히 서열 번호 7의 VL 및 서열 번호 8의 VH를 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편에 의해 결합된 인간 타우의 특정 영역 또는 에피토프, 특히 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역을 제공한다.
서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 타우 영역은 위치 198(S198), 199(S199), 202(S202)의 세린 잔기 및 위치 205(T205)의 트레오닌 잔기에 상응하는 4개의 가능한 인산화 부위를 포함한다.
용어 "서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역"은 S198, S199, S202 및 T205로부터 선택된 적어도 하나의 인산화 잔기를 포함하는 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 타우 영역을 언급한다.
타우의 상기 특정 영역 또는 에피토프에 타우 결합 항체의 결합은 본 발명에 의해 제공된 항체 중 어느 하나와 결합하여 당 업계에 공지된 임의의 적합한 에피토프 맵핑 방법에 의해 확인될 수 있다. 상기 방법의 예는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편에 의해 인식되는 에피토프의 서열을 포함하는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 가장 작은 단편을 가진 본 발명의 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편에 결합에 대해 서열 번호 55로부터 유래한 다양한 길이의 펩티드를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 중추 신경계에서 다양한 타우 이소형이 존재하기 때문에, 임의의 이러한 이소형이 본원에서 상세하게 설명된 방법에서 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 구체적인 예로, 타우의 가장 긴 이소형, 즉 서열 번호 55에 정의된 이소형 2가 사용될 수 있다. 서열 번호 55의 타우 펩티드는 재조합, 합성에 의해 또는 타우 폴리펩티드의 단백질 분해에 의해 생산될 수 있다. 항체에 결합하는 항체는 예를 들어 웨스턴 블롯 또는 질량 분광 분석에 의해 확인될 수 있다. 또 다른 예로, NMR 분광학 또는 X선 결정학은 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편에 의해 결합되는 에피토프를 확인하는데 이용될 수 있다. 일단 확인되면, 본 발명의 항체에 결합하는 에피토프 단편은 필요한 경우 동일한 에피토프에 결합하는 추가의 항체를 얻기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 게다가, 본 발명의 항체에 결합하는 에피토프 단편은 동일한 에피토프에 결합하고, 필요한 경우, 적어도 타우의 응집을 억제하는 단백질, 예를 들어 당 업계에 공지된 바와 같은(Tomlinson, 2004; Mosavi et al., 2004; Gill and Damle, 2006; Nilsson and Tolmachev, 2007; Binz et al., 2004) 리포칼린("안티칼린"), 피브로넥틴("아드넥틴", 트리넥틴), 쿠니츠 도메인, C-형 렉틴, 트랜스페린, 감마형 결정, 시스테인-노트(cystein-knot), 안키린 반복("DARPins") 또는 단백질 A("애피바디")로부터의 단백질 스캐폴드에 기초한 10개 초과의 아미노산을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드 화합물을 얻기 위해 사용될 수 있다. 추가로, 동일한 에피토프에 결합하는 분자는 10개 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 및 고리형 펩티드뿐 아니라 펩티드 모방체를 포함하는 추가의 유기 분자를 포함한다. 펩티드 모방체는 단백질-단백질 상호작용 부위에서 발견된 아미노산 서열에 기초하거나 당 업계에 공지된 화합물이다(Sillerud and Larson, 2005).
상기 배경에 대하여, 본 발명은 또 다른 측면에서 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
상기 항체는 키메라, 설치류화, 인간화 또는 완전 인간 단클론 항체일 수 있거나 키메라, 설치류화, 인간화 또는 완전 인간 단클론 항체를 얻기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S198, S199, S202 및 T205로부터 선택된 적어도 하나의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S198 및 S199로부터 선택된 적어도 하나의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S202 및 T205로부터 선택된 적어도 하나의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S198을 포함하는 적어도 하나의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S199를 포함하는 적어도 하나의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S202를 포함하는 적어도 하나의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 T205를 포함하는 적어도 하나의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S198, S199, S202 및 T205로부터 선택된 적어도 2개의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S198 및 S199를 포함하는 적어도 2개의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S199 및 S202를 포함하는 적어도 2개의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S202 및 T205를 포함하는 적어도 2개의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S198 및 T205를 포함하는 적어도 2개의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S198 및 S202를 포함하는 적어도 2개의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S199 및 T205를 포함하는 적어도 2개의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S198, S199, S202 및 T205로부터 선택된 적어도 3개의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S198 및 S199를 포함하는 적어도 3개의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S199 및 S202를 포함하는 적어도 3개의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S202 및 T205를 포함하는 적어도 3개의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S198 및 T205를 포함하는 적어도 3개의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S198 및 S202를 포함하는 적어도 3개의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 S199 및 T205를 포함하는 적어도 3개의 인산화된 잔기를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하고, 상기 인산화된 타우 영역은 하기 4개의 인산화된 잔기 S198, S199, S202 및 T205를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
상기 항체는 키메라, 설치류화, 인간화 또는 완전 인간 단클론 항체일 수 있거나 키메라, 설치류화, 인간화 또는 완전 인간 단클론 항체를 얻기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 중화 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 서열 번호 35의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하는 중화 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
상기 항체는 키메라, 설치류화, 인간화 또는 완전 인간 단클론 항체일 수 있거나 키메라, 설치류화, 인간화 또는 완전 인간 단클론 항체를 얻기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기에 기재된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편과 실질적으로 동일한 타우의 에피토프에 결합하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다. 에피토프에의 결합은 예를 들어 기준으로서 서열 번호 7의 VL 및 서열 번호 8의 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 이용하여 에피토프 맵핑에 대해 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
상기 항체는 키메라, 설치류화, 인간화 또는 완전 인간 단클론 항체일 수 있거나 키메라, 설치류화, 인간화 또는 완전 인간 단클론 항체를 얻기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 타우와의 결합에 대해 상기에 기재된 타우 결합 항체와 경쟁하는, 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
이와 관련하여, 본 발명은 구체적으로 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 타우와의 결합에 대해 서열 번호 7의 VL 및 서열 번호 8의 VH를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편과 경쟁하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 고려한다.
상기 항체는 키메라, 설치류화, 인간화 또는 완전 인간 단클론 항체일 수 있거나 키메라, 설치류화, 인간화 또는 완전 인간 단클론 항체를 얻기 위해 사용될 수 있다.
타우와의 결합에 대한 경쟁은 서열 번호 7의 VL 및 서열 번호 8의 VH, 또는 서열 번호 9의 VL 및 서열 번호 10의 VH를 포함할 수 있는 기준 항체 또는 이의 결합 단편의 존재하에서 항체 또는 이의 결합 단편의 타우와의 결합에 있어 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 또는 약 100% 감소에 의해 결정될 수 있다. 결합은 바이아코어(BIAcore)® 장치를 이용한 표면 플라스몬 공명, 여러 형광 검출 기술(예를 들어, 형광 상관 분광법, 형광 상호 연관법, 형광 수명 측정법 등) 또는 여러 유형의 방사 면역 측정법 또는 표적 분자와 항체 결합을 추적하는데 사용되는 기타 분석을 이용하여 측정될 수 있다.
용어 "타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편"은 항체 또는 이의 결합 단편이 이의 가변 영역에 의해 타우에 특이적으로 결합한다는 것, 즉 타우와 상동성을 갖지 않는 기타 항원보다 더 큰 친화도로 타우 항원에 결합한다는 것을 의미한다. "타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편"은 이의 가변 영역에 의해 타우와 상동성을 갖지 않는 기타 항원보다 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10, 20, 100, 103, 104, 105 또는 적어도 106배의 친화도로 타우에 결합한다. 그럼에도, 타우 결합 항체 및 이의 결합 단편이 타우 결합 항체 및 이의 결합 단편의 가변 영역 밖 서열과의 상호작용을 통해 기타 단백질(예를 들어, ELISA 기술에서 에스. 아우레우스(S. aureus) 단백질 A 또는 기타 항체)과도 상호작용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 타우 결합 항체 및 이의 결합 단편의 가변 영역 밖 서열, 특히 타우 결합 항체 및 이의 결합 단편의 불변 영역에 의해 매개되는 상기 후자 결합 특성을 용어 "타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편"에 포함하고자 하는 것은 아니다. 항체의 결합 특이성을 결정하는 스크리닝 분석은 당 업계에 잘 알려저 있으며 당 업계에서 통상적으로 실시된다. 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 항체(또는 이의 결합 단편)의 이의 항원에의 결합의 친화도에 대해 나노몰 범위의 평형 해리 상수(KD)를 가질 수 있다. 따라서, KD는 약 1*10-6, 예를 들어 약 2*10-7 이하와 같은 약 5*10-7 미만일 수 있고 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같이 표면 플라스몬 공명 및 바이아코아 장치를 이용하여 측정될 수 있다.
상기에 언급된 바와 같이, 본 발명은 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다. 전장의 항체는 불변 도메인 및 가변 영역을 포함한다. 불변 영역은 항체의 항원 결합 단편 내에 이의 전체 길이로 존재할 필요는 없을 수 있다. 그러나 본 출원이 ADCC 및/또는 CDC를 매개하는 항체의 용도를 고려할 경우, 결합 단편은 여전히 ADCC 및/또는 CDC를 매개할 수 있는 충분한 길이의 불변 영역을 포함해야만 한다는 것을 이해해야 한다.
상기에 언급된 바와 같이, 본 발명은 또한 인간화의 대안으로서 생성될 수 있는 인간 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 언급한다. 예를 들어, 면역화시 내인성 설치류 항체를 생산하지 않으면서 전체 모든 인간 항체를 생산할 수 있는 형질전환 동물(예를 들어, 생쥐)은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포 계열 돌연변이 생쥐에서 항체 중쇄 연결 영역(JH) 유전자의 동형 결실은 결과적으로 내인성 항체 생산을 완전히 억제한다고 개시되었다. 이러한 생식세포 계열 돌연변이 생쥐에서 인간 생식세포 계열 면역글로불린 유전자 배열의 전달은 결과적으로 인간 생식세포 계열 면역글로불린 유전자를 포함하는 형질전환 동물을 특정 항원으로 면역화시 상기 항원에 대한 특이성을 가진 인간 항체를 생산할 것이다. 상기 형질전환 동물의 생산 기술 및 상기 형질전환 동물로부터 인간 항체의 단리 및 생산 기술은 당 업계에 잘 알려져 있다(Lonberg, 2005; Green, 1999; Kellermann and Green, 2002; Nicholson et al., 1999). 별법으로, 형질전환 동물, 예를 들어 생쥐에서, 생쥐 항체의 가변 영역을 코딩하는 면역글로불린 유전자만이 상응하는 인간 가변 면역글로불린 유전자 서열로 대체된다. 항체 불변 영역을 코딩하는 생쥐 생식세포 계열 면역글로불린 유전자는 여전히 변화되지 않는다. 이 방법에서, 형질전환 생쥐의 면역계에서 항체 이펙터 기능 및 결과적으로 B 세포 발생은 본질적으로 변화되지 않으며, 이는 생체 내에서 항원 공격 시 향상된 항체 반응을 유발할 수 있다. 관심의 특정 항체를 코딩하는 유전자가 상기 형질전환 동물로부터 단리되면, 불변 영역을 코딩하는 유전자는 완전 인간 항체를 얻기 위해서 인간 불변 영역 유전자로 대체될 수 있다. 시험관 내에서 인간 항체, 항체 단편을 얻기 위한 기타 방법은 적어도 부분적으로 인공적으로, 또는 공여체의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 모두로부터 생성된 재조합 DNA 라이브러리가 사용되는 디스플레이 기술, 예를 들어 파지 디스플레이 또는 리보솜 디스플레이에 기초한다. 인간 항체를 생성하기 위한 파지 및 리보솜 디스플레이 기술은 당 업계에 잘 알려져 있다(Winter et al., 1994; Hoogenboom, 2002; Kretzschmar and von Ruden, 2002; Groves and Osbourn, 2005; Dufner et al., 2006).
또한, 단리된 인간 B 세포를 관심 항원으로 생체 외 면역화하고, 계속하여 융합하여, 하이브리도마를 생성한 후, 이를 최적의 인간 항체에 대해 스크리닝할 수 있어, 단리된 인간 B 세포로부터 인간 항체를 생성할 수 있다(Grasso et al., 2004; Li et al., 2006).
본원에서 사용되는 용어 "중화 타우 결합 항체"는 타우에 결합하거나 타우의 적어도 하나의 생물학적 활성을 억제하는 항체를 언급한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 사용되는 "중화 타우 결합 항체"는 시험관 내 분석 예를 들어 하기 실험 3.1에 기재된 것과 같은 시험관 내 분석에서 타우 응집에 결합하거나 이를 억제하는 항체를 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 '항체'는 일반적으로 완전(전체, 전장) 항체, 즉 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 요소를 포함하는 항체에 관한 것이다. 항체는 예를 들어 WO 2007/024715호에 개시된 분자 DVD-Ig, 또는 WO2011/030107호에 기재된 소위 (FabFv)2Fc와 같이 추가의 결합 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 이용되는 항체는 2가, 3가, 또는 4가의 전장 항체를 포함한다.
항체의 결합 단편은 단쇄 항체(즉, 전장의 중쇄 및 경쇄); Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, Fab-scFv, Fab-scFc, 디설피드 안정화된 Fab-scFv, 단일 도메인 항체(예를 들어, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, scFv-scFc, dsscFv, dsscFv-scFc, 2가, 3가, 또는 4가 항체, 비스-scFv, 디아바디, 트리바디, 트리아바디, 테트라바디, 도메인 항체(dAb), 예를 들어 sdAb, VHH 및 VNAR 단편, 및 상기 중 어느 하나의 에피토프 결합 단편을 포함한다(예를 들어, 문헌(Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217) 참조). 상기 항체 단편의 생성 및 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌(Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181) 참조). Fab-Fv 형식은 WO2009/040562호에서 최초로 개시되었고 이의 디설피드 안정화된 형태인 Fab-dsFv는 WO2010/035012호에 최초로 개시되었다. 디설피드 안정화된 형태의 Fab-scFv는 WO2013/068571호에 기재되었다. scFc 형식을 포함하는 항체 형식은 WO2008/012543호에 최초로 기재되었다. 본 발명에 사용하기 위한 기타 항체 단편은 국제 특허 출원 WO2005/003169호, WO2005/003170호 및 WO2005/003171호에 기재된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다.
다가 항체는 다중 특이성을 포함할 수 있으며, 예를 들어 이중 특이적일 수 있거나 단일 특이적일 수 있다(예를 들어, WO92/22583호 및 WO05/113605호 참조). 후자의 이러한 한 예는 WO92/22583호에 기재된 트리-Fab(또는 TFM)이다.
한 실시양태에서, Fab 단편이 제공된다.
한 실시양태에서, Fab' 단편이 제공된다.
전형적인 Fab' 분자는 중쇄가 가변 영역 VH, 불변 도메인 CH1 및 중성 또는 변형된 힌지 영역을 포함하고 경쇄가 가변 영역 VL 및 불변 도메인 CL을 포함하는 중쇄 및 경쇄 쌍을 포함한다.
한 실시양태에서, 예를 들어 이량체화가 힌지를 통해서 이루어질 수 있는 (Fab')2를 생성하는 본 발명에 따른 Fab'의 이량체가 제공된다.
한 실시양태에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 결합 도메인을 포함한다. 결합 도메인은 일반적으로 중쇄로부터 3개 및 경쇄로부터 3개인 6개 CDR을 포함한다. 한 실시양태에서, CDR은 골격에 존재하며 함께 가변 영역을 형성한다. 따라서, 한 실시양태에서, 항체 또는 결합 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 항원에 특이적인 결합 도메인을 포함한다.
본 발명에 의해 제공되는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편의 친화도는 당 업계에 공지된 적합한 방법을 이용하여 변경될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러므로 본 발명은 또한 타우에 대해 향상된 친화도를 갖는 본 발명의 항체 분자의 변이체에 관한 것이다. 이러한 변이체는 CDR를 변이시키는 것(Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), 쇄 셔플링(Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), 이. 콜라이의 뮤테이터 균주의 사용(Low et al., J. Mol.Biol., 250, 359-368, 1996), DNA 셔플링(Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), 파지 디스플레이(Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) 및 성적(sexual) PCR(Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998)을 포함한 많은 친화도 성숙 프로토콜에 의해 얻을 수 있다. 문헌(Vaughan et al.(상기 문헌))은 상기 친화도 성숙의 방법을 논의한다.
따라서, 타우 결합 항체 및 이의 결합 단편은 또한 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 보존적 치환)을 가진 경쇄 또는 중쇄의 상기에 구체적으로 언급된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 누구든 보존적 치환의 후보가 되는 아미노산 서열의 위치를 결정할 수 있고, 누구든 임의의 특정 아미노산에 보존적 치환의 효과를 주는 합성 및 천연 아미노산을 선택할 수 있다. 보존적 치환을 선택하기 위한 고려 사항은 임의의 특정 아미노산 치환이 만들어지는 상황, 측쇄의 소수성 또는 극성, 측쇄의 일반적 크기, 및 생리 조건하에서 산성 또는 염기성 특성을 가진 측쇄의 pK 값을 포함한다. 예를 들어, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘은 대개 서로에 대해 적합하게 치환된다. 당 업계에 공지된 바와 같이, 이는 세 가지 모든 아미노산이 염기성 측쇄를 가지기 때문이며, 한편 리신과 아르기닌의 측쇄에 대한 pK 값(약 10과 12)은 히스티딘(약 6)에 대해서보다 서로 훨씬 더 근접하다. 유사하게, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신은 대개 서로에 대해 적합하게 치환된다. 단, 글리신은 종종 상기 군의 다른 일원에 대해 적합하게 치환되지 않는다. 서로에 대해 빈번하게 적합하게 치환되는 아미노산의 다른 군은 글루탐산과 아스파르트산으로 이루어진 군; 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판으로 이루어진 군; 및 세린, 트레오닌, 및, 경우에 따라, 티로신으로 이루어진 군을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명과 관련하여 언급될 때 타우 결합 항체 및 이의 결합 단편은 본원에 개시된 대표적인 항체, 단편 및 서열의 유도체를 포함할 수 있다. "유도체"는 화학적으로 변형된 타우 결합 항체 및 이의 결합 단편을 포함한다. 화학 변형의 예는 하나 이상의 중합체, 예를 들어 수용성 중합체, N-결합되거나 O-결합된 탄화수소, 당, 인산염, 및/또는 형광단과 같이 검출 가능한 표지와 같은 기타 분자의 공유적인 부착을 포함한다.
따라서, 바람직한 경우, 본 발명에 사용하기 위한 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 하나 이상의 이펙터 분자(들)에 접합될 수 있다. 이펙터 분자는 단일 이펙터 분자 또는 본 발명의 항체에 부착될 수 있는 단일 모이어티를 형성하도록 결합된 두 개 이상의 이펙터 분자를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이펙터 분자에 결합된 항체 단편을 얻는 것이 바람직한 경우, 이는 항체 단편이 이펙터 분자에 직접 또는 커플링제에 의해 결합되는 표준 화학적 또는 재조합 DNA 절차에 의해 제조될 수 있다. 이러한 이펙터 분자를 항체 접합하는 기술은 당 업계에 잘 알려져 있다(문헌(Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 및 Dubowchik et al , 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123) 참조). 상기 이펙터 분자의 접합 방법은 부위 특이적 접합 또는 비-부위 특이적 또는 무작위 접합을 포함할 수 있다. 구체적인 화학적 절차는, 예를 들어, WO 93/06231호, WO 92/22583호, WO 89/00195호, WO 89/01476호 및 WO 03/031581호에 기재된 것들을 포함한다. 별법으로, 이펙터 분자가 단백질 또는 폴리펩티드일 경우, 결합은, 예를 들어 WO 86/01533호 및 EP0392745호에 기재된 바와 같이, 재조합 DNA 절차를 이용하여 달성될 수 있다. 별법으로, 이펙터 분자의 특정 부착 부위는 예를 들어 WO2008/038024호에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 조작될 수 있다. 게다가, 커플링제가, 예를 들어 WO 2005/113605호에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 이펙터 분자를 결합시키는데 사용될 수 있다. 상기에 나열된 가능성은 그들 자체로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 이펙터 분자는, 예를 들어, 약물, 독성, 생물학적 활성 단백질, 예를 들어 효소, 기타 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 천연 중합체, 핵산 및 이의 단편, 예를 들어 DNA, RNA 및 이의 단편, 방사성 핵종, 특히 방사성 요오드, 방사성 동위원소, 킬레이트 금속, 나노입자 및 리포터 기, 예를 들어 NMR 또는 ESR 분광법에 의해 검출될 수 있는 형광 화합물 또는 화합물들을 포함한다. 또한, 본원에서 사용되는 이펙터 분자는 치료제 예를 들어 화학치료제, 치료 폴리펩티드, 나노입자, 리포솜 또는 치료 핵산을 포함한다.
기타 이펙터 분자는 킬레이트 방사성 핵종 예를 들어 111In 및 90Y, Lu177, 비스무트213, 칼리포르늄252, 이리듐192 및 텅스텐188/레늄188; 또는 약물, 예를 들어, 그러나 이에 제한되지 않는, 알킬포스포콜린, 토포이소머라아제 I 억제제, 택소이드 및 수라민을 포함할 수 있다.
기타 이펙터 분자는 단백질, 펩티드 및 효소를 포함한다. 관심 효소는 단백질 분해 효소, 가수분해효소, 리아제, 이소머라아제, 트랜스퍼라아제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 관심의 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드는 면역글로불린, 독소 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소, 단백질 예를 들어 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자, 혈전제 또는 항-혈관형성제, 예를 들어 안지오텐신 또는 엔도스타틴, 또는, 생체반응 조절 인자, 예를 들어 림포카인, 인터류킨-1(IL-I), 인터류킨-2(IL-2), 과립구 대식구 집락 자극 인자(GM-CSF: granulocyte macrophage colony stimulating factor), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF: granulocyte colony stimulating factor), 신경 성장 인자(NGF: nerve growth factor): 또는 기타 성장 인자 및 면역글로불린, 또는 예를 들어 당 업계에 공지된 바와 같이(Tomlinson, 2004; Mosavi et al., 2004; Gill and Damle, 2006; Nilsson and Tolmachev, 2007; Binz et al., 2004; Silacci et al. 2014) 리포칼린("안티칼린"), 피브로넥틴("아드넥틴", 트리넥틴), 쿠니츠 도메인, C-형 렉틴, 트랜스페린, 감마형 결정, 시스테인-노트, 안키린 반복("DARPin"), Fyn SH3 도메인("피노머") 또는 단백질 A("애피바디")로부터의 단백질 스캐폴드에 기초한 10개 초과의 아미노산을 포함하는 기타 단백질 또는 폴리펩티드 화합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
기타 이펙터 분자는 혈관-뇌 장벽 침투를 향상시키거나 촉진하는 펩티드 및 단백질을 포함한다. 예를 들어, WO2010/043047호, WO2010/063122호, WO2010/063123호 또는 WO2011/041897호는 혈관-뇌 장벽을 통과하여 치료 분자를 운반할 수 있는 벡터로서 작용할 수 있는 펩티드 또는 폴리펩티드 및 이들을 치료 분자에 접합시키는 방법을 기재한다. 혈관-뇌 장벽 침투와 관련하여 관심의 펩티드 및 단백질은 혈관 뇌 장벽 수용체에 결합하는 펩티드 및 단백질, 예를 들어 트랜스페린 수용체, 글루코오스 수용체, 인슐린 수용체, 인슐린 유사 성장 인자 수용체, 저밀도 지질 단백질 수용체 관련 단백질 8, 저밀도 지질 단백질 수용체 관련 단백질 1 및 헤파린 결합 상피 성장 인자 유사 성장 인자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 별법으로, 이펙터 분자는 상기 혈관-뇌 장벽 수용체 중 하나에 특이적으로 결합하는 항체 단편, 예를 들어 도메인 항체, 낙타과 항체, 또는 상어 유래 항체(VNAR)이다.
기타 이펙터 분자는 예를 들어 진단에 유용한 검출 가능 물질을 포함할 수 있다. 검출 가능 물질의 예는 여러 가지 효소, 보결 분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 핵종, 양전자 방출 단층촬영 또는 단일 광자 방사형 컴퓨터 단층촬영에 사용될 수 있는 것과 같은 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다. 일반적으로 진단제로서 사용하기 위해 항체에 접합될 수 있는 금속이온에 대해 미국 특허 제4,741,900호를 참조한다. 적합한 효소는 겨자무 과산화효소, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라아제를 포함하고; 적합한 보결 분자단은 스트렙타비딘, 아비딘 및 비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질은 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 피코에리트린을 포함하고; 적합한 발광 물질은 루미놀을 포함하고; 적합한 생물발광 물질은 루시페라아제, 루시페린, 및 에쿠오린을 포함하고; 적합한 방사성 핵종은 124I, 125I, 131I, 111In, 99Tc, 89Zr, 90Y, 64Cu, 68Ga 및 18F를 포함한다. 진단에 유용한 검출 가능한 물질로서 적합한 이펙터 분자의 구체적인 유형은 문헌(Wyffels et al. 2014, Nuclear Medicine and biology 41 (2014):513-523)에 기재된 바와 같이 전자 결핍 테트라진 및 트랜스-시클로옥텐(TCO: trans-cyclooctene)을 포함한다. 상기 문헌에서, 테트라진에 결합된 본 발명의 타우 결합 항체를 투여하여 최대의 흡수 및 비표적 부위로부터 충분한 제거를 가능하게 하고, 이어서 적합한 방사성 핵종으로 표지된 TCO 또는 최적화된 TCO 유사체를 계속하여 투여하여, 그 결과 TCO가 본 발명의 타우 결합 항체 상 테트라진에 공유적으로 결합하고, 예를 들어 양전자 방출 단층촬영 또는 단일 광자 방사형 컴퓨터 단층촬영에 의해, 이의 검출을 가능하게 할 것이다.
한 실시양태에서, 방사성 핵종 또는 테트라진에 결합된 타우 결합 Fab, Fab', 또는 scFv를 제공한다. 방사성 핵종 또는 테트라진과의 결합은 항체 단편에 위치한 임의의 이용 가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기, 예를 들어 임의의 유리 아미노, 이미노, 티올, 히드록실 또는 카복실 기를 통한 부착을 통해 이루어질 수 있다. 이러한 아미노산은 항체 단편에 자연적으로 존재할 수 있거나 재조합 DNA 방법(예를 들어 US 제5,219,996호; US 제5,667,425호; WO98/25971호, WO2008/038024호)을 이용하여 단편에 조작될 수 있다. 한 예로, 본 발명의 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 변형된 Fab 단편으로, 변형이 이펙터 분자의 부착을 가능하게 하는 하나 이상의 아미노산을 이의 중쇄의 C-말단 끝에 첨가하는 것인 Fab 단편이다. 적합하게는, 추가의 아미노산은 이펙터 분자가 부착될 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 변형된 힌지 영역을 형성한다. 한 실시양태에서, 방사성 핵종이 금속이온, 예를 들어 111In, 99Tc, 89Zr, 90Y, 64Cu, 또는 68Ga일 경우, 이는 예를 들어 문헌(Turner et al. (Br. J. Cancer, 1994, 70:35-41; Comparative biodistribution of indium-111-labelled macrocycle chimeric B72.3 antibody conjugates in tumour -bearing mice)에 기재된 바와 같이 매크로사이클 킬레이트제에 의해 결합될 수 있으며, 이로써 후자는 차례로 상기에 언급된 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기 또는 항체 또는 항체 단편의 기에 공유적으로 결합된다. 또 다른 실시양태에서, 결합된 방사성 핵종을 가진 후자의 매크로사이클 킬레이트는 두 개 이상의 항-타우 항체 또는 이의 단편을 결합시키는 교차 링커의 일부분인, WO05/113605호에 기재된 이펙터 분자일 수 있다.
또 다른 예로, 이펙터 분자는 생체 내에서 항체의 반감기를 증가시키고/거나 항체의 면역원성을 감소시키고/거나 면역계의 상피 장벽을 통과하는 항체의 전달을 향상시킬 수 있다. 이러한 유형의 적합한 이펙터 분자의 예는 중합체, 알부민, 및 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물, 예를 들어 WO05/117984호에 기재된 것들을 포함한다.
이 같은 이펙터 분자가 중합체일 경우, 이는 일반적으로 합성 또는 천연 중합체, 예를 들어 경우에 따라 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌, 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지형 또는 비분지형 다당류, 예를 들어 호모- 또는 헤테로-다당류일 수 있다.
상기에 언급된 합성 중합체에 존재할 수 있는 구체적이고, 경우에 따른 치환기는 하나 이상의 히드록시, 메틸 또는 메톡시 기를 포함한다.
합성 중합체의 구체적인 예는 경우에 따라 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜) 폴리(비닐알코올) 또는 이들의 유도체, 특히 경우에 따라 치환된 폴리(에틸렌글리콜) 예를 들어 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체를 포함한다.
구체적인 천연 중합체는 락토오스, 아밀로오스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이들의 유도체를 포함한다.
한 실시양태에서, 이펙터 분자는 알부민 또는 이의 단편, 예를 들어 인간 혈청 알부민 또는 이의 단편이다.
중합체의 크기는 바라는 바에 따라 달라질 수 있지만 일반적으로 500Da 내지 50000Da, 예를 들어 5000 내지 40000Da, 예를 들어 20000 내지 40000Da 범위의 평균 분자량일 것이다. 중합체 크기는 특히 산물의 의도하는 용도, 예를 들어 뇌와 같은 특정 조직에 국소화하거나 순환 반감기를 연장하는 능력을 기준으로 선택될 수 있다(리뷰를 위해 문헌(Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545) 참조). 따라서, 예를 들어, 산물은 순환을 떠나 조직에 침투하도록 의도된다.
적합한 중합체는 폴리알킬렌 중합체, 예를 들어 폴리(에틸렌글리콜) 또는, 특히, 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체, 및 특히 약 15000Da 내지 약 40000Da 범위의 분자량을 가진 것을 포함한다.
한 예로, 본 발명에 사용하기 위한 항체는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 모이어티에 부착된다. 하나의 구체적인 예로, 항체는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편이고 PEG 분자는 항체 단편에 위치한 임의의 이용 가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기, 예를 들어 임의의 유리 아미노, 이미노, 티올, 히드록실 또는 카복실 기를 통해 부착될 수 있다. 상기 아미노산은 항체 단편에 자연적으로 존재할 수 있거나 재조합 DNA 방법을 이용하여 단편에 조작될 수 있다(예를 들어 US 5,219,996호; US 5,667,425호; WO98/25971호, WO2008/038024호 참조). 한 예로, 본 발명의 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 변형된 Fab 단편으로서, 변형은 이펙터 분자의 부착을 가능하게 하는 하나 이상의 아미노산을 이의 중쇄의 C-말단 끝에 첨가하는 것인 Fab 단편이다. 적합하게는, 추가의 아미노산은 이펙터 분자가 부착될 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 변형된 힌지 영역을 형성한다. 여러 부위가 2개 이상의 PEG 분자를 부착하는데 사용될 수 있다.
적합하게는 PEG 분자는 항체 단편에 위치한 적어도 하나의 시스테인 잔기의 티올 기를 통해 공유 결합된다. 변형된 항체 단편에 부착된 각 중합체 분자는 단편에 위치한 시스테인 잔기의 황 원자에 공유 결합될 수 있다. 공유 결합은 일반적으로 디설피드 결합 또는, 특히, 황-탄소 결합일 것이다. 티올 기가 부착 지점으로 사용될 경우, 적합하게 활성화된 이펙터 분자, 예를 들어 티올 선택적인 유도체, 예를 들어 말레이미드 및 시스테인 유도체가 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 상기에 기재된 중합체-변형된 항체 단편의 제조에 출발 물질로서 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 티올 반응기를 포함하는 임의의 중합체, 예를 들어 α-할로카복실산 또는 에스테르, 예를 들어 요오도아세트아미드, 이미드, 예를 들어 말레이미드, 비닐 설폰 또는 디설피드일 수 있다. 상기 출발 물질은 (예를 들어 이전에 쉐어워터 폴리머스(Shearwater Polymers Inc., 미국 앨라배마주 헌츠빌 소재)인 넥타(Nektar)로부터) 상업적으로 구입할 수 있거나 통상의 화학 절차를 이용하여 상업적으로 이용 가능한 출발 물질로부터 제조할 수 있다. 구체적인 PEG 분자는 20K 메톡시-PEG-아민(이전에 쉐어워터인 넥타; 랩 폴리미어(Rapp Polymere); 및 선바이오(SunBio)로부터 구입 가능) 및 M-PEG-SPA(이전에 쉐어워터인 넥타로부터 구입 가능)를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 타우 결합 항체 및 이의 결합 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자, 이의 가변 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 핵산 서열 포함하는 핵산 분자 및 이의 가변 경쇄 및/또는 중쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
예로써, AB1의 VL(서열 번호 7)은 서열 번호 26에 의해 코딩될 수 있다. AB1의 VH(서열 번호 8)는 서열 번호 27에 의해 코딩될 수 있다.
서열 번호 11의 인간화 VL은 서열 번호 30에 의해 코딩될 수 있다. 서열 번호 12의 인간화 VL은 서열 번호 31에 의해 코딩될 수 있다. 서열 번호 14의 인간화 VH는 서열 번호 32에 의해 코딩될 수 있고, 서열 번호 15의 인간화 VH는 서열 번호 33에 의해 코딩될 수 있다.
서열 번호 17의 인간화 경쇄는 서열 번호 34에 의해 코딩될 수 있다. 서열 번호 18의 인간화 경쇄는 서열 번호 35에 의해 코딩될 수 있다. 서열 번호 20의 인간화 중쇄는 서열 번호 36에 의해 코딩될 수 있고 서열 번호 21의 인간화 중쇄는 서열 번호 37에 의해 코딩될 수 있다. 서열 번호 23의 인간화 중쇄는 서열 번호 38에 의해 코딩될 수 있고 서열 번호 24의 인간화 중쇄는 서열 번호 39에 의해 코딩될 수 있다.
타우 결합 항체 및 이의 결합 단편은 단일 핵산(예를 들어 항체의 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 핵산), 또는 각각이 항체 또는 항체 단편의 상이한 부분을 코딩하는 2개 이상의 분리된 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 상기 임의의 항체 또는 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 제공한다. 핵산 분자는 DNA, cDNA, RNA 등일 수 있다.
예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄의 일부분 또는 전체를 코딩하는 DNA 서열은 결정된 DNA 서열로부터 또는 상응하는 아미노산 서열을 기초로 하여 바라는 대로 합성될 수 있다. 수용 골격 서열을 코딩하는 DNA는 당 업자에게 널리 이용 가능하고 이들의 공지된 아미노산 서열을 기초로 하여 쉽게 합성될 수 있다.
분자 생물학의 표준 기술이 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열을 제조하는데 사용될 수 있다. 바라는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 이용하여 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 부위 지정 돌연변이 유발법 및 중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction)이 적절하게 이용될 수 있다.
바람직하게는, 코딩하는 핵산 서열은 원핵 또는 진핵 세포에서 발현을 가능하게 하는 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 상기 폴리뉴클레오티드의 발현은 폴리뉴클레오티드의 번역 가능한 mRNA로의 전사를 포함한다. 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물에서 발현을 보장하는 조절 인자는 당 업자에게 잘 알려져 있다. 이들은 대개 전사의 개시를 보장하는 조절 서열, 및 경우에 따라 전사의 종료 및 전사체의 안정화를 보장하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가의 조절 인자는 전사 및 번역 인핸서, 및/또는 자연적으로 결합되거나 이종의 프로모터 영역을 포함할 수 있다.
따라서, 또 다른 측면에서 본 발명은 타우 결합 항체 및 이의 결합 단편을 코딩하는 상기 핵산 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터를 제공한다.
"벡터"는 핵산 서열을, 예를 들어 코딩된 폴리펩티드의 합성이 일어날 수 있는, 적합한 숙주 세포에 운반하는 능력을 가진 임의의 분자 또는 조성물이다. 전형적으로 그리고 바람직하게는, 벡터는 당 업계에 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 바라는 핵산 서열(예를 들어 본 발명의 핵산)을 포함하도록 조작된 핵산이다. 발현 벡터는 전형적으로 (이들이 핵산분자에 의해 미리 제공되지 않을 경우) 하기 구성요소 중 하나 이상을 포함한다: 프로모터, 하나 이상의 인핸서 서열, 복제 기점, 전사 종료 서열, 공여 및 수용 스플라이스 부위를 포함하는 전체 인트론 서열, 분비를 위한 선도서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현될 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 삽입하기 위한 폴리링커 서열, 및 선별 마커 인자.
벡터는 전형적으로 벡터가 사용될 숙주 세포에서 기능적인 것으로 선택된다(벡터는 유전자의 증폭 및/또는 유전자의 발현이 일어날 수 있도록 하기 위해서 숙주 세포 기구와 적합하다).
따라서, 추가의 측면에서 본 발명은 상기에 기재된 클로닝 또는 발현 벡터 및/또는 상기에 기재된 타우 결합 항체 및 이의 결합 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
숙주 세포는 핵산 또는 벡터로 형질전환되어 이로써 코딩되는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 생산할 수 있는 임의의 유형의 세포일 수 있다. 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편, 또는 이의 일부분(예를 들어, 핵산 또는 벡터에 의해 코딩되는 중쇄 서열, 또는 경쇄 서열)을 생산하는데 사용될 수 있다. 핵산 또는 벡터를 세포에 도입한 후, 세포는 코딩된 서열의 발현에 적합한 조건하에서 배양된다. 그 후, 항체, 항원 결합 단편, 또는 항체의 일부분은 세포로부터 단리될 수 있다.
숙주 세포는 원핵 숙주 세포(예를 들어, 이. 콜라이) 또는 진핵 숙주 세포(예를 들어, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 척추동물 세포)일 수 있다. 숙주 세포는 적합한 조건하에서 배양될 때 항체 또는 이의 결합 단편을 발현하고 (숙주 세포가 이를 배지로 분비할 경우) 이는 계속하여 배양 배지로부터 수집되거나 (분비되지 않을 경우) 이를 생산하는 숙주 세포로부터 직접 수집될 수 있다. 적합한 숙주 세포의 선택은 여러 가지 인자, 예를 들어 바라는 발현 수준, 활성에 바람직하거나 필요한 폴리펩티드 변형, 예를 들어 글리코실화 및 인산화, 및 생물학적 활성 분자로의 폴딩의 용이성에 따라 결정될 것이다. 숙주 세포의 선택은 부분적으로 항체 또는 이의 결합 단편이 전사 후 변형되는지(예를 들어, 글리코실화되고/거나 인산화되는지)의 여부에 따라 결정될 것이다. 그럴 경우, 효모, 곤충, 또는 포유동물 숙주 세포가 바람직하다.
적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO(Chinese Hamster Ovary), 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 유형의 중국 햄스터 난소(CHO 세포)는 CHO 및 CHO-K1 세포를 포함할 수 있으며, 이들은 DHFR 선별 마커와 사용될 수 있는 dhfr- CHO 세포, 예를 들어 CHO-DG44 세포 및 CHODXB11 세포, 및 글루타민 신테타아제 선별 마커와 사용될 수 있는 CHOKI-SV 세포를 포함한다. 많은 것이 미국 균주 은행(ATCC: American Type Culture Collection)(버지이나주 마나사스 소재)로부터 이용 가능하다. 예로는 포유동물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소 세포(CHO)(ATCC No. CCL61), 인간 배아 신장(HEK: human embryonic kidney) 293 또는 293T 세포(ATCC No. CRL1573), 3T3 세포(ATCC No. CCL92), 또는 PER.C6 세포가 포함된다. 항체를 발현하는데 사용되는 기타 세포 유형은 림프구 세포 주, 예를 들어 NSO 골수종 세포 및 SP2 세포, COS 세포를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편의 제조 방법으로서, 예를 들어 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 코딩하는 DNA로부터, 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편의 발현을 유도하는데 적합한 조건하에서, 예를 들어 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 항체 분자를 단리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드만을 포함할 수 있으며, 이 경우, 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드 코딩 서열만이 숙주 세포에 형질감염 시키는데 사용되어야 한다. 중쇄 및 경쇄 모두를 포함하는 산물을 생산하기 위해, 세포 주는 2개의 벡터, 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 제1 벡터 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 제2 벡터로 형질감염될 수 있다. 별법으로, 단일 벡터, 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 벡터가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 숙주 세포로부터 우수한 수준으로 발현된다. 따라서, 항체 및/또는 단편의 특성은 상업적인 공정에 도움이 된다.
따라서 숙주 세포를 배양하고, 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 발현하고, 후자를 단리하고, 경우에 따라 상기를 정제하여 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 제공하는 과정이 제공된다. 한 실시양태에서, 과정은 이펙터 분자를 단리된 항체 또는 단편에 접합하는 단계, 예를 들어 특히 본원에서 상기에 기재된 PEG 중합체에 접합하는 단계를 더 포함한다.
타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 조성물, 특히 약학 또는 진단 조성물에 제제화될 수 있다. 약학 조성물은 적합한 담체, 예를 들어 약학적으로 허용 가능한 제제와 혼합하여 치료 또는 예방 유효량의 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 진단 조성물은 적합한 담체, 예를 들어 진단상 허용 가능한 제제와 혼합하여 진단 유효량의 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다.
본 약학 조성물에 사용하기 위한 약학적으로 허용 가능한 제제는 담체, 부형제, 희석제, 항산화제, 방부제, 착색제, 향미제 및 희석제, 유화제, 현탁제, 용매, 충전제, 증량제, 완충제, 전달 비히클, 긴장제, 보조용매, 습윤제, 착화제, 완충 제제, 항미생물제, 및 계면활성제를 포함한다.
조성물은 액체 형태 또는 동결건조된(lyophilized 또는 freeze-dried) 형태일 수 있고 하나 이상의 동결건조 보호제, 부형제, 계면활성제, 고분자량 구조 첨가제 및/또는 증량제를 포함할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,685,940호, 제6,566,329호, 및 제6,372,716호 참조).
조성물은 비경구 투여에 적합할 수 있다. 대표적인 조성물은 당 업자에게 이 용 가능한 임의의 경로, 예를 들어 관절 내, 피하, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 뇌 내(뇌실질 내), 뇌실 내, 근육 내, 안구 내, 동맥 내, 또는 병변 내 경로에 의한 동물로의 주사 또는 주입에 적합하다. 비경구 제제는 전형적으로 멸균, 발열성 물질이 제거된 등장성 수용액으로, 경우에 따라 약학적으로 허용 가능한 방부제를 포함한 용액일 수 있다.
비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 예를 들어 올리브유, 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 식염수 및 완충 매질을 포함하여 물, 알코올/수성 용액, 유탁액 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링커 덱스트로오스, 덱스트로오스 염화나트륨, 젖산 링거액, 또는 고정유를 포함한다. 정맥 내 비히클은 액체 및 영양 보충제, 전해질 보충제, 예를 들어 링거 덱스트로오스를 기반으로 하는 것들 등을 포함한다. 또한, 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 기체 등과 같은 방부제 및 기타 첨가제가 존재할 수 있다. 일반적으로, 본원에서 참고로 포함된 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 16th Ed., Mack Eds., 1980)을 참조한다.
본원에 기재된 약학 조성물은 산물의 국소 농도(예를 들어, 볼러스, 데포 효과) 및/또는 특정 국소 환경에서 증가된 안정성 또는 반감기를 제공하는 방식으로 제어 또는 지속 전달을 위해 제제화될 수 있다. 조성물은 중합체 화합물 예를 들어 폴리락트산, 폴리글리콜산 등의 입자상 제제뿐 아니라 데포 주사로서 전달될 수 있는 활성제의 제어 방출 또는 지속 방출을 제공하는 생체 분해성 기질, 주사 가능한 미세소구, 미세캡슐 입자, 미세캡슐, 생체 부식성 입자 비드, 리포솜, 및 이식 가능한 전달 장치와 같은 제제를 이용한 본 발명의 항체, 결합 단편, 핵산, 또는 벡터의 제형을 포함할 수 있다.
별법으로 또는 추가로, 조성물은 본 발명의 항체, 결합 단편, 핵산 또는 벡터가 흡수되거나 캡슐화된 막, 스펀지, 또는 기타 적합한 물질을 환부에 이식하여 국소 전달될 수 있다. 이식 장치가 사용될 경우, 장치는 임의의 적합한 조직 또는 기관에 이식될 수 있고, 본 발명의 항체, 결합 단편, 핵산, 또는 벡터는 볼러스에 의해서, 또는 연속 투여에 의해서, 연속 주입을 이용하여 카테터에 의해서 장치를 통해 직접 전달될 수 있다.
타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 약학 조성물은 흡입용으로, 예를 들어 건조 분말로서 제제화될 수 있다. 또한, 흡입 용액은 에어로졸 전달을 위해 액화 압축가스에 제제화될 수 있다. 또 다른 제제에서, 용액은 분무될 수 있다.
본 발명의 한 측면은 질환의 치료에 치료학적 활성제로서 타우 결합 항체 및 이의 결합 단편의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 타우병증의 치료에 타우 결합 항체 및 이의 결합 단편의 용도에 관한 것이다. 타우 포함물을 포함한다고 기재된 타우병증(Clavaguera et al. Brain Pathology 23 (2013) 342-349)은 알츠하이머병(AD); 근위축성 측색 경화증/파킨슨증 치매 복합; 은친화성 입자병; 만성 뇌상성 뇌병증; 피질 기저핵 변성; 석회화에 의한 광범위 신경 섬유 매듭; 다운 증후군; 가족성 영국형 치매; 가족성 덴마크형 치매; MAPT 돌연변이에 의해 유발된 17번 염색체에 연관된 전두 측두엽 치매 및 파킨슨증; 게르스트만 슈투로이슬러 샤잉커병; 과들루프 파킨슨증; 근긴장성 이영양증; 뇌 철분 축적으로 인한 신경변성; 니만 피크병 C형; 신경 섬유 매듭으로 인한 비-과마니안 운동 뉴런 질환; 피크 병; 뇌염 후 파킨슨증; 프라이온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증; 진행성 피질하 신경아교증; 진행성 핵상 마비(PSP); SLC9A6 관련 정신지체; 아급성 경화성 범뇌염; 매듭 우세 치매; 및 구형 교세포 포함물로 인한 백질 타우병증을 포함한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 알츠하이머병 및/또는 진행성 핵상 마비의 치료에 타우 결합 항체 및 이의 결합 단편의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 타우병증, 특히 알츠하이머병 및/또는 진행성 핵상 마비의 치료 방법으로 치료 활성량의 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계에 의한 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 타우병증, 특히 알츠하이머병 및/또는 진행성 핵상 마비의 치료를 위한 의약의 제조에 있어 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 요법에서 단독으로 또는 다른 제제와 병용하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 적어도 하나의 추가의 치료제와 동시 투여될 수 있다. 특정 측면에서, 추가의 치료제는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편이 치료하는 데 사용되고 있는 것과 동일하거나 상이한 장애를 치료하는데 영향을 주는 치료제이다. 대표적인 추가의 치료제는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 콜린에스테라아제 억제제(예를 들어 도네페질, 갈란타민, 리바스티그민 및 타크린), NMDA 수용체 길항체(예를 들어 메만틴), 아밀로이드 베타 펩티드 응집 억제제, 항산화제, 감마-세크레타아제 조절 인자, 신경 성장 인자(NGF) 모방체 또는 NGF 유전자 요법, PPARy 작용제, HMS-CoA 리덕타아제 억제제(스타틴), 암파킨, 칼슘 경로 차단제, GABA 수용체 길항제, 글리코겐 신타아제 키나아제 억제제, 정맥 내 면역글로불린, 무스카린 수용체 작용제, 니코틴 수용체 조절 인자, 능동 또는 수동 아밀로이드 베타 펩티드 면역화, 포스포디에스테라아제 억제제, 세로토닌 수용체 길항제 및 항-아밀로이드 베타 펩티드 항체 또는 추가의 항-타우 항체. 추가의 대표적인 신경계 약물은 성장 호르몬 또는 신경 영양 인자로부터 선택될 수 있다; 예는 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF: brain-derived neurotrophic factor), 신경 성장 인자(NGF), 뉴로트로핀-4/5, 섬유모세포 성장 인자(FGF: fibroblast growth factor)-2 및 기타 FGF, 뉴로트로핀(NT: neurotrophin)-3, 에리트로포이에틴(EPO: erythropoietin), 간세포 성장 인자(HGF: hepatocyte growth factor), 상피 성장 인자(EGF: epidermal growth factor), 형질전환 성장 인자(TGF: transforming growth factor)-알파, TGF-베타, 혈관 내피 성장 인자(VEGF: vascular endothelial growth factor), 인터류킨-1 수용체 길항제(IL-lra), 섬모체 신경 영양 인자(CNTF: ciliary neurotrophic factor), 교세포 유래 신경 영양 인자(GDNF: glial-derived neurotrophic factor), 뉴투린, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF: platelet-derived growth factor), 헤레굴린, 뉴레굴린, 아르테민, 페르세핀, 인터류킨, 교세포 주 유래 신경 영양 인자(GDNF: Glial cell-line derived neurotrophic factor), 과립구 집락 자극 인자(CSF), 과립구 대식구-CSF, 네트린, 카디오트로핀-1, 헤지호그, 백혈병 억제 인자(LIF: leukemia inhibitory factor), 미드카인, 플레이오트로핀, 뼈 형성 단백질(BMP: bone morphogenetic protein), 네트린, 사포신, 세마포린, 및 줄기세포 인자(SCF: stem cell factor)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 추가의 치료제는 신경계 약물의 하나 이상의 부작용을 완화하는 이의 능력에 대해 선택된다. 상기에 나타낸 이 같은 병용 요법은 조합된 투여(2가지 이상의 치료제가 동일하거나 분리된 제제에 포함될 경우), 및 분리 투여를 포함하여, 이 경우, 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편의 투여는 추가의 치료제 및/또는 애주번트의 투여 전에, 동시에, 그리고/또는 후에 일어날 수 있다. 또한, 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편은 기타 중재 요법, 예를 들어, 그러나 이에 제한되지 않는, 방사선 요법, 행동 요법, 또는 당 업계에 공지된, 치료되거나 예방될 신경계 장애에 적합한 기타 요법과 병용하여 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 진단 활성제로서의 타우 결합 항체 및 이의 결합 단편의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 한 측면은 타우병증, 특히 알츠하이머병 및/또는 진행성 핵상 마비의 진단에 있어 타우 결합 항체 및 이의 결합 단편의 용도에 관한 것이다.
이 같은 진단 시험은 바람직하게는 생물학적 시료에 실시될 수 있다. "생물학적 시료"는 개체로부터 얻은 다양한 시료 유형을 포함하며 진단 또는 모니터링 분석에 사용될 수 있다. 정의는 뇌척수액, 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액체 시료, 고체 조직 시료, 예를 들어 생검 검체 또는 조직 배양 또는 이로부터 유래한 세포 및 이의 자손을 포함한다. 또한, 정의는 이의 획득 후, 임의의 방법으로, 예를 들어 시약의 처리, 용해화, 또는 특정 구성요소, 예를 들어 폴리뉴클레오티드의 증식에 의해 조작된 시료를 포함한다. 용어 "생물학적 시료"는 임상 시료를 포함하고, 또한 배양물 내 세포, 세포 상등액, 세포 용해액, 혈청, 혈장, 생체액, 및 조직 시료를 포함한다. 용어 "생물학적 시료"는 소변, 타액, 뇌척수액, 혈액 분획, 예를 들어 혈장 및 혈청 등을 포함한다.
진단 시험은 바람직하게는 인간 또는 동물 신체와 접촉되지 않은 생물학적 시료에 실시될 수 있다. 이 같은 진단 시험은 또한 시험관 내 시험으로도 언급된다.
시험관 내 진단 시험은 개체로부터 얻은 생물학적 시료 내에서 타우의 시험관 내 검출 방법으로서 (i) 생물학적 시료를 본원에 기재된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편과 접촉하는 단계, (ii) 본원에 기재된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편의 타우와의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법에 의존할 수 있다. 그 후, 검출된 타우 수준과 적합한 대조군을 비교하여, 타우병증, 예를 들어 알츠하이머병 및/또는 진행성 핵상 마비의 존재 또는 발생 가능성을 진단할 수 있다. 따라서, 이 같은 검출 방법을 이용하여 피험체가 타우병증의 단계(중증도)를 결정하는 것을 포함하여 타우병증을 가지거나 발생할 위험에 있는 지를 결정할 수 있다.
따라서, 본 발명은 피험체에서 타우병증, 예를 들어 알츠하이머병 및/또는 진행성 핵상 마비의 시험관 내 진단 방법으로서, i) 본원에 기재된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 이용하여 피험체로부터 얻은 생물학적 시료에서 타우의 수준 또는 상태를 평가하는 단계; 및 ii) 타우의 수준 또는 상태를 정상 대조군 피험체에서 타우의 수준 또는 상태를 나타내는 기준, 표준 또는 정상 대조군 값과 비교하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 생물학적 시료 내 타우 폴리펩티드의 수준 및/또는 상태와 정상 대조군 값 사이의 유의한 차이는 개체가 타우병증, 예를 들어 알츠하이머병 및/또는 진행성 핵상 마비를 가진다는 것을 나타낸다.
본원에서 기재된 상기 여러 측면 및 실시양태와 관련하여, 본 발명은 특히 하기를 고안한다:
1. 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
서열 번호 1로부터 선택된 CDR1 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열, 서열 번호 2로부터 선택된 CDR2 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열, 및 서열 번호 3으로부터 선택된 CDR3 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는
서열 번호 4로부터 선택된 CDR1 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열, 서열 번호 5로부터 선택된 CDR2 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열, 및/또는 서열 번호 6으로부터 선택된 CDR3 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
2. 실시양태 1에 있어서,
서열 번호 1로부터 선택된 CDR1, 서열 번호 2로부터 선택된 CDR2, 및 서열 번호 3으로부터 선택된 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
서열 번호 4로부터 선택된 CDR1, 서열 번호 5로부터 선택된 CDR2, 및/또는 서열 번호 6으로부터 선택된 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 서열 번호 3의 X1은 A인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
4. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 서열 번호 3의 X1은 G인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
5. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 서열 번호 6의 X2는 A인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
6. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 서열 번호 6의 X2는 Q인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
7. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 서열 번호 6의 X2는 N인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
8. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 서열 번호 6의 X2는 D인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
9. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 서열 번호 6의 X2는 S인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
10. 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단클론 항체인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
11. 실시양태 10에 있어서, 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항체인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
12. 실시양태 11에 있어서, IgG1 또는 IgG4 아형의 인간화 항체인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
13. 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 어느 한 실시양태에 있어서, 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
14. 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13 중 어느 한 실시양태에 있어서, 인간 타우의 가용 형태, 인간 타우의 쌍 나선 필라멘트(PHF), 또는 인간 타우의 가용 형태 및 인간 타우의 쌍 나선 필라멘트(PHF) 둘 다에 결합하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
15. 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
서열 번호 7 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는
서열 번호 8 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역.
을 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
16. 실시양태 15에 있어서,
서열 번호 7을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
서열 번호 8을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
17. 실시양태 15, 또는 16에 있어서, 서열 번호 7의 X1은 A인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
18. 실시양태 15, 또는 16에 있어서, 서열 번호 7의 X1은 G인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
19. 실시양태 15, 또는 16에 있어서, 서열 번호 8의 X2는 A인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
20. 실시양태 15, 또는 16에 있어서, 서열 번호 8의 X2는 Q인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
21. 실시양태 15, 또는 16에 있어서, 서열 번호 8의 X2는 N인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
22. 실시양태 15, 또는 16에 있어서, 서열 번호 8의 X2는 D인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
23. 실시양태 15, 또는 16에 있어서, 서열 번호 8의 X2는 S인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
24. 실시양태 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단클론 항체인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
25. 실시양태 24에 있어서, 키메라 항체인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
26. 실시양태 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 중 어느 한 실시양태에 있어서, 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
27. 실시양태 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26 중 어느 한 실시양태에 있어서, 인간 타우의 가용 형태, 인간 타우의 쌍 나선 필라멘트(PHF), 또는 인간 타우의 가용 형태 및 인간 타우의 쌍 나선 필라멘트(PHF) 둘 다에 결합하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
28. 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
서열 번호 9 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는
서열 번호 10 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
29. 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
서열 번호 13 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는
서열 번호 16 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
30. 실시양태 29에 있어서,
서열 번호 13를 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
서열 번호 16을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
31. 실시양태 29 또는 30에 있어서, 서열 번호 13의 X1은 A인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
32. 실시양태 29 또는 30에 있어서, 서열 번호 13의 X1은 G인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
33. 실시양태 29 또는 30에 있어서, 서열 번호 16의 X2는 A인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
34. 실시양태 29 또는 30에 있어서, 서열 번호 16의 X2는 Q인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
35. 실시양태 29 또는 30에 있어서, 서열 번호 16의 X2는 N인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
36. 실시양태 29 또는 30에 있어서, 서열 번호 16의 X2는 D인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
37. 실시양태 29 또는 30에 있어서, 서열 번호 16의 X2는 S인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
38. 실시양태 29에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 14 또는 15를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
39. 실시양태 29에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 11 또는 12를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
40. 실시양태 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단클론 항체인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
41. 실시양태 40에 있어서, 인간화 항체인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
42. 실시양태 41에 있어서, IgG1 또는 IgG4 아형인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
43. 실시양태 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 또는 42중 어느 한 실시양태에 있어서, 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
44. 실시양태 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 또는 43 중 어느 한 실시양태에 있어서, 인간 타우의 가용 형태, 인간 타우의 쌍 나선 필라멘트(PHF), 또는 인간 타우의 가용 형태 및 인간 타우의 쌍 나선 필라멘트(PHF) 둘 다에 결합하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
45. 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
서열 번호 19 또는 이와 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 경쇄, 및/또는
서열 번호 22 또는 이와 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 중쇄
를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
46. 실시양태 45에 있어서,
서열 번호 19를 포함하는 경쇄, 및
서열 번호 22를 포함하는 중쇄.
를 포함하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
47. 실시양태 45 또는 46에 있어서, 서열 번호 19의 X1은 A인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
48. 실시양태 45 또는 46에 있어서, 서열 번호 19의 X1은 G인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
49. 실시양태 45 또는 46에 있어서, 서열 번호 22의 X2는 A인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
50. 실시양태 45 또는 46에 있어서, 서열 번호 22의 X2는 Q인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
51. 실시양태 45 또는 46에 있어서, 서열 번호 22의 X2는 N인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
52. 실시양태 45 또는 46에 있어서, 서열 번호 22의 X2는 D인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
53. 실시양태 45 또는 46에 있어서, 서열 번호 22의 X2는 S인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
54. 실시양태 45에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 14 또는 15를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
55. 실시양태 45에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 11 또는 12를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
56. 실시양태 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 또는 55 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단클론 인간화 항체인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
57. 실시양태 56에 있어서, IgG1 또는 IgG4 아형인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
58. 실시양태 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 또는 57 중 어느 한 실시양태에 있어서, 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
59. 실시양태 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 또는 58 중 어느 한 실시양태에 있어서, 인간 타우의 가용 형태, 인간 타우의 쌍 나선 필라멘트(PHF), 또는 인간 타우의 가용 형태 및 인간 타우의 쌍 나선 필라멘트(PHF) 둘 다에 결합하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
60. 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
61. 실시양태 60에 있어서, 단클론 항체인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
62. 실시양태 60 또는 61에 있어서, 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항체인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편
63. 실시양태 62에 있어서, IgG1 또는 IgG4 아형의 단클론 인간화 항체 또는 이의 결합 단편인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
64. 실시양태 60, 61, 62, 또는 63 중 어느 한 실시양태에 있어서, 인간 타우의 가용 형태, 인간 타우의 쌍 나선 필라멘트(PHF), 또는 인간 타우의 가용 형태 및 인간 타우의 쌍 나선 필라멘트(PHF) 둘 다에 결합하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
65.단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 타우와의 결합에 대해 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 또는 64 중 어느 한 실시양태의 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편과 경쟁하는, 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
66. 실시양태 65에 있어서, 타우와의 결합에 대해
서열 번호 11 또는 12를 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
서열 번호 14 또는 15를 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 타우 결합 항체 또는 결합 단편과 경쟁하는, 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
67. 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 또는 67 중 어느 한 실시양태의 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편과 실질적으로 동일한 타우의 에피토프에 결합하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
68. 실시양태 67에 있어서,
서열 번호 11 또는 12를 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
서열 번호 14 또는 15를 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 타우 결합 항체 또는 결합 단편과 실질적으로 동일한 타우의 에피토프에 결합하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
69. 실시양태 65, 66, 67, 또는 68 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단클론 항체인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
70. 실시양태 69에 있어서, 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항체인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
71. 실시양태 70에 있어서, IgG1 또는 IgG4 아형의 인간화 항체인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
72, 실시양태 65, 66, 67, 68, 69, 70, 또는 71 중 어느 한 실시양태에 있어서, 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
73. 실시양태 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 또는 72 중 어느 한 실시양태에 있어서, 인간 타우의 가용 형태, 인간 타우의 쌍 나선 필라멘트(PHF), 또는 인간 타우의 가용 형태 및 인간 타우의 쌍 나선 필라멘트(PHF) 둘 다에 결합하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
74. 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 또는 73 중 어느 한 실시양태에 있어서, Fab, Fab', F(ab')2, Fd 및 Fv, scFv, Fab-Fv, Fab-scFv, Fab-dsFv, Fab-scFc, scFv-scFc, dsscFv, dsscFv-scFc, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 또는 VHH 포함 항체인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
75. 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74 중 어느 한 실시양태의 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
76. 실시양태 75의 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
77. 실시양태 76의 하나 이상의 핵산 서열 또는 실시양태 76의 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
78. 실시양태 77에 있어서, 인간 배아 줄기세포가 아닌 숙주 세포.
79. 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74 중 어느 한 실시양태의 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편의 제조 방법으로서, 적어도
a) 실시양태 77 또는 78의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
b) 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 단리하는 단계
를 포함하는 방법.
80. 치료학적 활성제로서 사용하기 위한 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74 중 어느 한 실시양태의 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
81. 타우병증의 치료에 사용하기 위한 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74 중 어느 한 실시양태의 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
82. 실시양태 81에 있어서, 상기 타우병증은 알츠하이머병인 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
83. 실시양태 81에 있어서, 상기 타우병증이 진행성 핵상 마비인 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
84. 타우병증의 치료 방법으로서, 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74 중 어느 한 실시양태의 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
85. 실시양태 84에 있어서, 상기 타우병증은 알츠하이머병인 방법.
86. 실시양태 85에 있어서, 상기 타우병증은 진행성 핵상 마비인 방법.
87. 진단제로서 사용하기 위한 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74 중 어느 한 실시양태의 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
88. 타우병증의 진단에 사용하기 위한 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74 중 어느 한 실시양태의 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
89. 실시양태 88에 있어서, 상기 타우병증은 알츠하이머병인 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
90. 실시양태 88에 있어서, 상기 타우병증은 진행성 핵상 마비인 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
실험
실험 1 - 타우 결합 항체의 생성
1.1 타우 펩티드 설계 및 생산
펩티드 및 면역원은 영국 비숍스 월섬 소재의 펩티드 프로테인 리서치(Peptide Protein Research Ltd.)에 의해 공급받았고 애서턴 및 셰퍼드(Atherton and Sheppard.)(Ref: Atherton, E.; Sheppard, R.C. (1989). Solid Phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford, England: IRL Press)의 방법에 따라 Fmoc 고상 펩티드 화학에 의해 합성하였다. 포스포세린(pSer), 포스포트레오닌(pThr), 3-니트로티로신(nTyr) 및 N-ε-아세틸 리신(aLys)을 포함하는 펩티드는 Fmoc-보호된 전구체 Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH, Fmoc-Thr(PO(OBzl)OH)-OH, Fmoc-Tyr(3-NO2)-OH 및 Fmoc-Lys(Ac)-OH를 사용하여 합성하였다.
펩티드를 설계하여 번역 후 포스포세린(pSer), 포스포트레오닌(pThr) 및/또는 니트로소-티로신(nTyr)으로 변형된 모든 타우 이소형을 인식하는 타우 결합 항체를 생산하는데 사용하였다; 이는 타우 이소형 2(서열 번호 55, 유니프롯 코드(Uniprot code):P10636-8, NCBI 참고 번호: NP_005901.2)에 정렬된 바와 같이 잔기 197 내지 206을 나타낸다:
N-아세틸-nTyr pSer pSer Pro Cys* pSer Pro Gly pThr Pro-아미드
(T197로 지정하고 서열 번호 56에 정의된 펩티드).
N 및 C 펩티드 말단을 각각 아세틸 및 아미드 기로 캡핑하였으며 cys*는 시스테인 측쇄 티올 기가 하기에 상세하게 설명되는 바와 같이 각각 면역원의 제조 또는 분석 시약의 제조를 위한 담체 단백질 또는 비오틴에 결합하기 위한 접합 지점이라는 것을 의미한다. 항혈청 역가를 모니터하기 위한 분석 시약은 동일 질량의 말레이미도-PEG-비오틴과 펩티드를 반응시켜 제조하였다. 3가지 상이한 면역원은 ε-아미노 리신 측쇄의 말레이미드 기로 치환된 하기 담체 단백질과 펩티드의 반응에 의해 제조하였다: 열쇠 구멍 삿갓 조개 헤모시아닌(KLH: keyhole limpet haemocyanin), 소 혈청 알부민(BSA) 및 난백 알부민(OVA: ovalbumin).
1.2 면역화
2마리 암켯 뉴질랜드 흰 토끼(>2kg)는 동일 부피의 완전 프로인트 애주번트(CFA: complete Freund's adjuvant)에 주사기로 격렬하게 혼합하여 유화시킨 500μg 전체 펩티드 혼합물(T197 & T211)로 피하에 면역화하였다. 펩티드를 KLH, OVA 및 BSA에 접합되도록 설계하여 교대로 면역화하였다. 면역화 후 14일에 귀로부터 얻은 혈액과 함께 불완전 프로인트 애주번트(IFA: incomplete Freund's adjuvant)를 사용하여 토끼에 21일 간격으로 2회 추가 주사하였다. 제조하여 -80℃에서 10% DMSO/FCS에 냉동한 비장, 골수 및 말초혈 단핵 세포의 단일 세포 현탁액으로 최종 추가 접종 후 14일에 종료하였다.
1.3 B 세포 배양물
B 세포 배양물은 문헌(Zubler et al. (1985))에 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 제조하였다. 간략하게, 면역화된 토끼의 PBMC 유래 B 세포는 바코드된 96웰 조직 배양 플레이트에서 10% FCS(PAA laboratories ltd), 2% HEPES(Sigma Aldrich), 1% L-글루타민(Gibco BRL), 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(Gibco BRL), 0.1% β-머캅토에탄올(Gibco BRL), 3% 활성화된 비장 세포 배양 상등액 및 감마 조사된 돌연변이체 EL4 설치류 흉선종 세포(5x104/웰)가 보충된 200 ㎕/웰 RPMI 1640 배지(Gibco BRL)와 대략 웰당 3000개 세포의 밀도로 5% CO2 대기, 37℃에서 7일간 배양하였다. 통틀어, 대략 1.2 x 108개 B 세포를 시료로 사용하였다.
1.4 1차 스크리닝
B 세포 배양 상등액 중에 T197 펩티드 특이적인 항체의 존재는 표적 항원의 공급원으로서 비오티닐화된 T197 펩티드로 코팅된 수퍼아비딘(Superavidin)™ 비드(Bangs laboratories)를 이용한 균일 형광 기반 결합 분석법(homogeneous fluorescence-based binding assay)을 이용하여 결정하였다. 스크리닝을 위해 매트릭스 플레이트메이트(Matrix Platemate) 액체 처리기를 사용하여 바코드된 96웰 조직 배양 플레이트로부터 비드(10㎕/웰)에 고정된 T197을 포함하는 바코드된 384웰 검정 벽 분석 플레이트로 10㎕의 상등액을 옮겼다. 염소 항-토끼 IgG Fcγ-특이적 Cy-5 접합체(Jackson)로 결합을 밝혔다. 플레이트는 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 8200 세포 검출 시스템에서 판독하였다.
1.5 2차 스크리닝
1차 스크리닝 후, 양성 상등액은 아비소 오닉스 히트-피킹 로봇(Aviso Onyx hit-picking robot)을 사용하여 96웰 바코드된 마스터 플레이트로 합하고 세포 배양 플레이트 내 B 세포는 -800℃에서 냉동하였다. 그 후 마스터 플레이트는 T197 펩티드에 대해 그리고 또한 스트렙타비딘 단독에 대해 ELISA 분석으로 스크리닝하였다. 이는 각 웰에 대한 펩티드 특이성을 결정하고, 수퍼아비딘 비드에 비특이적인 결합을 나타내는 위양성 웰을 배제하기 위해 실시하였다. ELISA 분석을 위해 탄산 코팅 완충액(dH2O + 0.16%Na2CO3 + 0.3% NaHCO3) 중 스트렙타비딘으로 코팅된 384웰 맥시솝(Maxisorp) 플레이트(ThermoScientific/Nunc)에 비오티닐화된 T197를 캡쳐하였다. 플레이트를 1% w/v PEG/PBS로 차단한 후, 10㎕/웰의 (차단 완충액으로 1:1 희석된) B 세포 배양 상등액과 인큐베이션하였다. 2차 HRP-접합된 염소 항-토끼 IgG Fc 항체(Stratech Scientific Ltd/ Jackson ImmunoResearch)를 플레이트에 첨가한 후, TMB 기질(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(EMD Millipore); 10㎕/웰)과의 결합을 가시화하였다. 광학 밀도는 바이오텍 시너지(BioTek Synergy) 2 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 630nM에서 측정하였다. 1차 결합 분석으로 880개 히트를 확인하였으며, ELISA 스크리닝 후, 이들 중 406개가 T197에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다. T197에 특이성을 나타내는 B 세포 상등액을 바이아코어에 의한 추가 분석을 위해 선택하여 최고의 친화도를 갖는 것을 확인하였다.
1.6 가변 영역 회수
선택된 관심 웰로부터 항체 가변 영역 유전자의 회수를 가능하게 하기 위해서, 이종 집단의 B 세포를 포함한 주어진 웰에서 항원 특이적 B 세포를 확인할 수 있도록 디콘볼루션 단계를 실시해야만 했다. 이는 형광 초점 방법(Clargo et al., 2014)을 이용하여 달성하였다. 간략하게, 양성 웰의 면역글로불린-분비 B 세포를 비오티닐화된 T197 펩티드로 코팅된 스트렙타비딘 비드(New England Biolabs) 및 1:1200 최종 희석된 염소 항-토끼 Fcγ 단편-특이적 FITC 접합체(Jackson)와 혼합하였다. 37℃에서 1시간 동안 정지 상태로 인큐베이션한 후, 항원 특이적 B 세포는 그 B 세포를 둘러싸는 형광 할로의 존재로 인해 확인할 수 있었다. 많은 이들 각각의 B 세포 클론을 올림푸스(Olympus) 현미경을 사용하여 확인한 후, 에펜도르프 현미 조작 장치로 찍어 PCR 튜브에 넣었다.
항체 가변 영역 유전자는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 특이적 프라이머를 사용하여 역전사(RT: reverse transcription)-PCR에 의해 단일 세포로부터 회수하였다. 토끼 IgG(VH) 또는 토끼 카파(VL) 포유동물 발현 벡터에 가변 영역의 클로닝을 가능하게 하는 3' 및 5' 말단의 제한 부위를 포함시키는 네스티드(nested) 2° PCR을 이용하여 아비소 오닉스 액체 처리 로봇에서 2차례의 PCR을 실시하였다. 31개의 상이한 웰의 항-T197 항체 유전자를 발현 벡터에 성공적으로 클로닝하였다. 중쇄 및 경쇄 구조물은 펙틴(Fectin) 293(Invitrogen)을 사용하여 HEK-293 세포에 동시 형질감염시키고 재조합 항체는 125ml 엘렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에서 30ml 부피로 발현시켰다. 5-7일의 발현 후에, 상등액을 수거하고 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.
실험 2 - 확인된 항체의 추가의 스크리닝
2.1 이. 콜라이에서 타우 생산
상이한 타우 이소형을 코딩하는 유전자는 합성으로 이. 콜라이에서 발현을 위해 코돈을 최적화하여 생성하였다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 N-말단 6His-TEV 태그를 가진 타우를 생산하도록 조작된 변형된 pET32 벡터에 서브클로닝하였다.
이. 콜라이 BL 21(DE3) 세포를 상기 벡터로 형질전환시키고, 표준 기술을 이용하여 단백질을 발현하였다.
그 후, 이. 콜라이 세포는 원심분리에 의해 회수하고, 용해하고, 타우 단백질은 NiNTA(Qiagen)를 이용한 친화도 크로마토그래피에 의해 가용성 분획으로부터 캡쳐하였다. 6His 태그는 TEV 프로테아제, 이어서 2차 NiNTA 크로마토그래피 단계를 이용하여 제거하였다. 정제된 타우는 적용에 따라 결정되는 적합한 완충액으로 완충액을 교환하였다. 면역화를 위해 생성된 시료는 프로테우스 노엔도(Proteus NoEndo)TM 컬럼(Vivaproducts)을 이용하여 내독소를 제거하였다.
핵 자기 공명(NMR: nuclear magnetic resonance) 연구를 위한 동위원소 표지된 타우의 생성:
단백질 발현은 단백질에 15N, 13C 및 2H가 포함되도록 하기 위해 최소 배지를 사용한 것을 제외하고 상기에 기재된 바와 같이 실시하였다. 이. 콜라이 세포 펠렛을 용해하고 NiNTA(Qiagen) 친화도 크로마토그래피 단계를 이용하여 타우 단백질을 정제하고, 6His 태그를 TEV 프로테아제로 제거한 후, 수퍼덱스(Superdex) 200 유니트(GE-Healthcare)를 이용한 겔 여과에 의해 타우 단백질을 정제하였다.
2.2 HEK293에서 타우 생산
타우 이소형 2를 코딩하는 유전자는 야생형 DNA 서열을 이용하여 합성하여 생성하였다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 이를 N-말단 10His-TEV 태그를 가진 타우를 생산하도록 조작된 발현 벡터 pMV-10HisTEV(CMV 프로모터 포함)에 서브클로닝하였다.
생성 벡터는 Expi293TM 발현 시스템(Invitrogen)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 이 시스템은 HEK293 세포 주로부터 유래한 Expi293F 인간 세포를 사용한다.
타우 단백질은 배양 배지에 축적되었으며, 이로부터 고정된 금속이온 친화도 크로마토그래피 Ni 세파로스 엑셀(Sepharose Excel)(GE Healthcare)을 이용하여 회수하였다. 그 후 10His 태그는 TEV 프로테아제를 사용하여 제거한 후 Ni 세파로스 컬럼에 다시 적용하여 통과액에서 절단된 타우를 수집하였다. 정제된 타우는 적용에 따라 결정되는 적합한 완충액으로 완충액을 교환하였다.
2.3 인간 뇌 시료로부터 PHF 타우 원섬유의 제조
쌍 나선 필라멘트(PHF)-타우 단백질은 알츠하이머병(AD) 또는 진행성 핵상 마비(PSP) 또는 전두 측두엽 치매(FTD)를 가진 공여자의 뇌 시료로부터 문헌(Ksiezak-Reding and Wall, Neurobiology of Aging 15, 11-19, 1994)에 공개된 프로토콜에 따라 정제하였다. 이전에 PHF-타우가 많다고 기재된 분획 8(상기 참고에서 슈크로스 구배 원심분리 전에 조 PHF-Tau에 해당) 및 11(상기 참고에 기재된 분획 A2의 SDS 가용성 PHF에 해당)을 회수하고 실험 3의 바이아코어 분석 및 세포 분석에 사용하였다.
2.4 ELISA 스크리닝
그 후 재조합 항체의 활성을 확인하고 최고의 친화도 및 가장 특이적인 항체를 선택하기 위해 정제된 항체를 ELISA 및 바이아코어에 의해 추가로 스크리닝하였다. ELISA 분석을 위해 다시 탄산 코팅 완충액(dH2O + 0.16%Na2CO3 + 0.3% NaHCO3) 중 스트렙타비딘으로 코팅된 384웰 맥시솝 플레이트(ThermoScientific/Nunc)에 비오티닐화 T197을 캡쳐하였다. T197 서열에만 결합하는 특이성에 대해 확인하기 위해서 별개의 플레이트를 또한 타우 분자의 또 다른 영역을 맵핑하는 상이한 타우 펩티드로 코팅하였다. 플레이트를 1% PEG/PBS로 차단한 후 정제된 일시적인 상등액의 여러 희석액과 인큐베이션하였다. 2차 HRP 접합된 염소 항-토끼 IgG Fc 항체(Stratech Scientific Ltd/ Jackson ImmunoResearch)를 플레이트에 첨가한 후, TMB 기질(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)(EMD Millipore; 10㎕/웰)과의 결합을 가시화하였다. 광학 밀도는 바이오텍 시너지 2 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 630nM에서 측정하였다. 선택된 항체, 서열 번호 7의 토끼 VL 및 서열 번호 8의 토끼 VH를 가진 AB1를 도 1에 나타낸다. 보는 바와 같이, AB1은 T197에만 매우 선택적인 결합을 나타내고 타우 분자의 다른 영역에 해당하는 4개의 펩티드에는 결합을 나타내지 않는다:
- T174 N-아세틸-C*K pT P P A P K pT P P 아미드 (서열 번호 62);
- T211 N-아세틸- R pT P pS L P pT P C* 아미드 (서열 번호 63);
- T230 N-아세틸-R pT P P K pS P pS SC* 아미드 (서열 번호 57); 및
- T396 N-아세틸-C*pS P V V pS G D pT pS 아미드 (서열 번호 64);
* 비오틴 접합 위치.
2.5 바이아코어 스크리닝
선택된 토끼 항-타우 IgG 항체 클론을 일시적으로 발현하고, 정제하여 SPR 바이아코어 T200 플랫폼을 이용하여 분석하였다. 우선, 고정된 염소 F(ab')2 항-토끼 Fc 감마 시약을 사용하여 CM5 센서 칩에 항체를 캡쳐하였다. 유동 세포 2, 3 및 4는 5600 - 6100 RU 사이의 고정 수준을 보이는 반면, 차단된 유동 세포 1(덱스트란 단독)은 기준으로 사용되었다. 정제된 IgG를 GE 헬스케어(GE Healthcare)의 HBS-EP+ 완충액에 0.5㎍/ml로 희석하고 유속 10㎕/분으로 칩에 캡쳐하였다. 각각의 캡쳐 단계 후에 펩티드/스트렙타비딘 복합체, 완충액 대조군 및 탈인산화된 펩티드/스트렙타비딘 복합체를 갖는 180s 분석물 주입을 수행하였다. 펩티드는 3mM EDTA와 1% DMSO를 포함한 HBS-EP+ 내 100μM 펩티드 용액 10㎕를 사용하여, 이를 0.3mM EDTA를 포함한 HBS-N 완충액(GE Healthcare)에 1:10으로 희석하고 2㎕의 0.5M MgCl2로 EDTA를 포화시켜 탈인산화하였다. (HBS-N에) 1:10 희석된 송아지 장 알칼리 포스파타아제(NEB, Cat# M0290S) 2㎕를 첨가하고 37℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 4℃에 보관하였다. 0.5M EDTA 1㎕를 혼합물에 첨가하여 포스파타아제 반응을 억제하였다. 용액은 탈인산화된 펩티드/스트렙타비딘 복합체의 제조에 사용하였다. 서열 번호 7의 VL 영역 및 서열 번호 8의 VH를 가진 토끼 항체에 대해, 서열 번호 57의 아미노산 서열 가진 타우 영역 230-238로부터의 펩티드 T230을 음성 대조군으로 사용하였다. 데이터는 2가 분석물 모델로 적합하였다.
표 1은 T197 및 T230 인산화 및 탈인산화된 펩티드/스트렙타비딘 복합체에 결합될 때 상기 항체에 대해 측정된 친화도 값을 나타낸다.
<표 1>
Figure pct00001
선택된 단클론 Fab 단편(mFab)은 서열 번호 58의 경쇄 및 서열 번호 59의 중쇄를 가진 설치류화 mAB1 항체로부터 피어스 피신(Pierce Ficin) 절단 키트(Cat.No. 44980, Thermo Scientific)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 제조하였다. 280nm에서 흡광도를 사용하여 바이아코어 분석을 위한 Fab 저장 용액의 농도를 결정하였다. 알츠하이머병 환자의 불용성 타우 단백질 제제(AD-PHF, 분획 11), HEK 유래 타우 이소형-2 단량체(아미노 산 1-441), 및 이. 콜라이에서 발현된 이소형-2 단량체를 CM5 칩 위에 아민 고정하고, 항-타우 mFab의 결합은 바이아코어 T200 장치로 측정하였다. 10mM 아세트산(pH3.0)이 사용된 AD-PHF를 제외하고 GE 헬스케어(GE Healthcare)의 완충액 HBS-EP를 고정에 사용하였다. HBS-EP + 완충액에 300mM NaCl 및 1.25% CM-덱스트란(Sigma)을 보충하고 분석 완충액으로 사용하였다. 유세포(Fc: flow cell) 1을 기준으로 사용할 때, Fc2-4에 대해 하기 RU 값을 얻었다: 5μg/ml 이. 콜라이 타우는 44 RU, 5μg/ml HEK 타우는 56 RU, AD-PHF 물질의 1:20 희석된 용액은 500 RU. 10mM 글리신(pH1.7)의 2회의 60초 사이클을 재생에 이용하였다. 10㎕/분의 유속을 고정 및 재생에 사용하는 한편, 30㎕/분의 유속을 분석물 결합에 사용하였다. AD-PHF의 경우, EDC/NHS 및 EtoA 캡핑을 포함하여 500RU에 도달하도록 다회 수동 주입을 적용하였다. 해리를 위해 180s 또는 300s 동안 90㎕ 분석물 주입을 이용하여, mFA 시료 또는 완충 대조군에 대해 5회의 스타트-업 사이클 및 12 사이클을 적용하였다. 600nM 용액 + 완충액의 11회의 1:3 희석액을 각 mFab에 사용하였다.
<표 2>
Figure pct00002
2.6 바이아코어에 의한 에피토프 맵핑
HEK 세포로부터 발현 및 정제된 재조합 타우 이소형-2 단량체(아미노산 1-441), 및 알츠하이머병 환자 뇌로부터 단리된 쌍 나선 필라멘트(AD-PHF) 형태의 불용성 타우 단백질은 바이아코어 3000 장치 및 러닝(running) 완충액으로서 HBS-EP(GE Healthcare)를 사용하여 CM5 칩에 고정하였다. 전자는 유세포 2 및 4에 각각 아민 커플링하기 전에 50 mM N-히드록시숙시니미드와 200 mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드의 새로운 혼합물 70㎕를 10 ㎕/분의 유속으로 주입하여 이들과 기준 유세포의 카복시메틸 덱스트란 표면을 활성화하였다. 타우 단량체의 고정은 10 mM 아세테이트 pH 5.0 완충액 중 50μg/ml로 160 ㎕를 주입하여 달성한 반면, AD-PHF는 10mM 아세트산(pH3.0) 중 2μg/ml로 20회의 160 ㎕ 분액을 주입하여 고정하였다. 시험 및 대조군 유세포 표면은 1 M 에탄올아민.HCl pH 8.5의 50㎕ 펄스로 불활성화하였다.
에피토프 맵핑은 서열 번호 17의 경쇄 및 서열 번호 20의 중쇄를 가진 타우 결합 인간화 항체(L17H20) 및 각각 200 nM 및 5000 nM의 러닝 완충액에 제조된 시험 펩티드 또는 완충액 대조군의 예비 인큐베이션 용액에 의해 수행하였다. 이들은 기준, 타우 단량체 및 AD-PHF 유세포에 대해 50㎕를 주입하여 10㎕/ml의 일정한 유속으로 일련의 센서그램 사이클에 각기 시험하였다. 항체 결합의 반응 단위는 시험과 기준 유세포의 값 사이의 차이로서 각 주입 종료 후 15초에 취한 보고 시점에 기록하였다. 칩은 각 사이클 종료시 인산 완충 식염수 중 1.5 M 구아니딘을 20㎕로 2회 주입하여 재생하였다.
<표 3>
Figure pct00003
주어진 시험 펩티드에 대한 항체 반응성은 대조군 사이클에 대해 계산된 평균 항체 결합 값에 비해 고정된 타우 단량체 또는 AD-PHF에 대한 항체 결합의 억제율의 수준으로 입증되었다.
시험 펩티드는 타우 단백질의 잔기 196 내지 206(서열 번호 65)를 포함하는 펩티드를 기초로 하여 제조하여 분석하였으며, 포스포 세린, 포스포 트레오닌 및/또는 니트로소 티로신을 가진 번역 후 변형의 역할은 표 3에 정의된 바와 같이 분석하였다.
상기 분석을 기초로 하여, 최소 에피토프가 서열 번호 55의 아미노산 201 내지 206(모티프 Gly pSer Pro Gly pThr Pro에 해당)에 의해 한정된 인산화된 타우 영역이라는 것과 이 에피토프가 서열 번호 55의 위치 205에서 포스포 트레오닌 및 서열 번호 55의 위치 202에서 포스포 세린의 존재를 절대적으로 필요로 한다고 결론지어진다.
실험 3 - 확인된 항체의 추가의 특성화
3.1 세포 분석
타우 응집을 유도하는 타우 형질전환 생쥐로부터의 조 가용성 및 불용성 분획의 제조
본 실험을 위해, 인간 타우 P301S(Allen et al., 2002 J. Neurosci.22(21):9340-51), 및 P301L(Lewis et al., 2000 Nat Genet. (4):402-5. ; Gotz J, et al., 2001 J Biol Chem. 276(1):529-34)을 발현하는 형질전환 생쥐를 사용하였다.
조 가용성 및 불용성 분획은 P301S 및 P301L 타우 형질전환 생쥐의 뇌로부터 분별 원심분리에 의해 제조하였다. 간략하게, P301S(척수 및 뇌간) 및 P301L(중뇌 및 뇌간) 타우 형질전환 생쥐의 뇌 조직은 얼음 위 1.5 ml 마이크로원심분리 튜브에서 소형 균질기 펠렛 페슬 모터(Pellet Pestle Motor)(Kontes)를 사용하여 냉각된 TBS(Fisher Scientific)에서 균질화하였다. 그 후, 균질화물(H)은 4,000g, 4℃에서 10분간 원심분리하여 조직 파편을 제거하였다. 생성된 상등액(S0)은 20,000g, 4℃에서 20분간 원심분리하여 조 가용성 분획(S1)에 해당하는 상등액을 제공하였다. 남아있는 펠렛(P1)은 TBS 중에 제조된 1% 사코실 용액 1 ml에 재현탁하고, 실온에서 1h 인큐베이션한 후, 100,000g, 4℃에서 1h 원심분리하였다. 상등액(S2)은 버렸다. 펠렛(P2)은 5 ml 냉각 TBS로 세척한 후, TBS에 재현탁하여 조 불용성 분획(P2')을 제공하였다.
P301S 돌연변이를 가진 인간 타우를 발현하는 HEK-293-F 세포의 제조
HEK-293-F 세포(Life Technologies)는 P301S 돌연변이를 가진 인간 타우 이소형 2를 발현하는 pcDNA3.1(+) 벡터로 293펙틴(Life Technologies)을 사용하여 제조사의 설명에 따라 형질감염시켰다. 감염된 세포 분액은 액체 질소에 보관하였다.
타우 응집의 유도
도 2는 타우 치료 항체의 활성을 특성화하는데 사용되는 세포 응집 분석의 여러 단계를 예시한다. 제1일에, P301S 돌연변이를 가진 인간 타우 이소형 2(P301S-tau)를 발현하는 HEK-293-F 세포를 37℃에서 해동하고 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 293 발현 배지(FFBS)(Life Technologies)에 희석하였다. 세포는 자동 세포 계수기(Vi-CELL XR, Beckman Coulter)를 사용하여 계수한 후, 폴리-D-리신으로 미리 코팅된 96웰 플레이트(Greiner Bio-One)에 웰당 25,000개의 생존 세포 농도로 플레이트하였다. 세포는 5% CO2, 37℃에서 유지하였다. 같은 날, 알츠하이머병(AD-PHF, 분획 8) 또는 진행성 핵상 마비(PSP-PHF, 분획 8) 또는 전두 측두엽 치매(FTD-PHF) 환자의 초음파 처리된 인간 불용성 타우 또는 P301S 또는 301L 형질전환 생쥐 뇌의 뇌 분획(타우 응집을 유도하는 시드로 사용됨)을 FFBS 배지 중에 항-타우 항체와 함께 또는 없이 4℃에서 서서히 흔들어주면서 하룻밤 인큐베이션하였다. AD-PHF, 분획 8은 AD 및 PSP 시료에 각각 80 ng/㎕ 및 60 ng/㎕로 사용하였다; 형질전환 생쥐 P301S 및 P301L의 가용성 뇌 분획은 각각 0.1 μg/㎕ 및 1.2 μg/㎕로 사용하였다. 제2일에, 시드 또는 시드/항체 혼합물을 세포에 24h 동안 적용하였다. 제3일에, 배양 배지를 항체를 포함하는 새로운 FFBS 배지로 교체하고, 세포를 배양물에서 추가 24h 동안 유지시켰다. 제4일에, 타우 응집을 균일 시간 분해 형광 에너지 전달(HTRF: homogenous time-resolved fluorescence energy transfer)에 기반한 타우 응집 분석 키트(Cisbio)를 사용하여 제조사의 설명에 따라 측정하였다. 형광도는 스펙트라맥스 패러다임(SpectraMax Paradigm)(Molecular Devices)으로 측정하였다. 응집은 항체 없이 외인성 원섬유 또는 분획에 의해 유도된 최대 응집 반응에 상응하는 대조군(-)에 대한 응집율로서 보고하였다.
유도된 타우 응집에 대한 AB1 및 선행 기술의 기타 타우 결합 항체의 효과를 시험하였다. 선행 기술 항체는 WO2014/028777A2호의 IPN002, WO2013/096380A2호의 PT3, WO2010/142423A2호의 mAb2.10.3 및 WO 2014/008404호의 HJ8.5였다.
상기 분석의 결과는 표 3 및 도 3에 요약한다.
표 4는 서열 번호 9의 설치류화 VL 및 서열 번호 10의 설치류화 VH를 가진 AB1(VL9VH10), 서열 번호 17의 경쇄 및 서열 번호 23의 중쇄를 가진 타우 결합 항체(L17H23), 서열 번호 17의 경쇄 및 서열 번호 24의 중쇄를 가진 타우 결합 항체(L17H24), 서열 번호 17의 경쇄 및 서열 번호 20의 중쇄를 가진 타우 결합 항체(L17H20), 서열 번호 17의 경쇄 및 서열 번호 21의 중쇄를 가진 타우 결합 항체(L17H21) 및 여러 뇌 추출물의 다양한 타우 시드에 대해 경쟁 항체의 역가(IC50) 및 최대 효능(300 nM에서 Imax)을 요약한다. 한편, 도 3은 인간 PSP 환자의 인간 타우 병리학적 원섬유를 이용한 세포 응집 분석에서 서열 번호 17의 경쇄 및 서열 번호 20의 중쇄를 가진 타우 결합 항체(L17H20), 및 서열 번호 17의 경쇄 및 서열 번호 21의 중쇄를 가진 타우 결합 항체(L17H21)의 효능을 나타낸다.
<표 4>
Figure pct00004
ND: 결정되지 않음.
(*) 100 nN에서 최대 효능
P301L(n=2), AD(n=3) 및 PSP(n=3)로부터의 타우 시드를 사용하여 서열 9의 설치류화 VL 및 서열 10의 설치류화 VH를 가진 AB1(VL9VH10)의 활성을 결정하기 위해 세포 분석에서 추가의 실험을 실시하여, 각각 15 nM, 27 nM 및 70 nM의 최종 IC50 값; 및 각각 79%, 68% 및 57%의 Imax 값을 얻었다.
3.2 조직학적 분석
서열 번호 7의 토끼 VL 및 서열 번호 8의 토끼 VH를 가진 AB1, 서열 번호 11의 VL 및 서열 번호 14의 VH(VL11VH14) 또는 서열 번호 11의 VL 및 서열 번호 15의 VH(VL11VH15)를 가진 인간화 AB1, 및 선행 기술의 항체 IPN002, PT3 및 Mab2.10.3을 분석하고 AT8 면역염색(예를 들어 문헌(Braak & Braak, 1995, Neurobiol Aging; 16(3):271-8 및 Porzig et al., 2007 Biochem Biophys Res Commun; 359(2): 644-9)에 기재됨)을 이용하여 이전에 병리학적 타우 구조를 포함한다고 밝혀진 알츠하이머병 공여자로부터의 인간 해마의 동결 절편을 사용하여 최적 농도를 결정하였다. AB1 및 모든 선행 기술 항체는 101.4(음성 대조군 항체)를 제외하고 특이적이고 농도 의존적 면역 반응성을 나타냈다. 상기 데이터로부터, 항체의 단일, 최적 농도를 선택하여 일련의 6개의 인간 뇌 시료를 스크리닝하는데 사용하였다. 3개의 시료는 알츠하이머병 공여자 또는 높은 수준의 타우 병태(AT8 면역염색을 이용하여 검출된 양성 타우 병태)를 나타낸 초고령 공여자로부터 유래하였고, 타우 병태가 없는(AT8 면역염색을 이용하여 검출된 음성 타우 병태) 공여자로부터 3개의 시료가 유래하였다.
AB1, VL11VH14, VL11VH15, PT3 및 Mab2.I0.3은 AT8 양성 시료에서 유사한 양상의 면역염색을 나타냈다. 신경 섬유 매듭(신경 내 NFT), 세포질 타우, 신경반 유사 구조 및 신경망 실의 특이적인 면역염색이 양성 타우 병태 시료의 해마 및 측두엽에서 관찰되었다. 그러나 AT8 음성 조직에서는 훨씬 더 낮은 면역염색이 검출되었다. 이 결과는 상기 항체가 비병리학적 타우와 비교하여 병리학적 타우를 우선적으로 인식한다는 것을 시사한다. IPN002는 양성 및 음성 타우 병태 시료에서 모두 유사한 신호를 나타냈다.
3.3 웨스턴 블롯
웨스턴 블롯을 화학발광 판독을 이용하여 실시하였다: AD, PSP 인간으로부터 제조된 용해액을 10% 폴리아크릴아미드 겔(레인당 20μg 단백질)에 로딩하였다. 단백질은 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis: 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동)에 의해 분리하고 PVDF(Polyvinylidene fluoride: 폴리비닐리덴 플루오라이드) 막에 전기이동시켰다. 막은 4% BSA(bovine serum albumin: 소 혈청 알부민)(TBST: 50 mM 트리스(Tris), 150 mM NaCl, 0.05% 트윈(Tween) 20 중에, pH는 HCl로 pH 7.6으로 조정됨)에서 차단하였다. 막은 1차 항체 또는 비면역 IgG 대조군 항체와 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하고, TBST에서 세척하고, 2차 항체(생쥐 항-비오틴)와 1시간 인큐베이션하고, TBST에서 세척하고, 3차 항체(항-생쥐 IgG 페록시다아제)와 1시간 인큐베이션하고, TBST에서 세척하고, ECL(enhanced chemiluminescence: 증강 화학발광)을 이용하여 현상하였다.
서열 번호 9의 설치류화 VL 및 서열 번호 10의 설치류화 VH를 가진 AB1은 인간 AD의 시료의 병리학적 타우에 결합하지만, PSP에는 약하게 결합한다. 도 4를 참조한다.
실험 4 - 확인된 항체의 인간화
서열 번호 7의 VL 및 서열 번호 8의 VH를 가진 항체 AB1은 토끼 항체 V-영역의 CDR을 인간 생식세포 계열 항체 V-영역 골격에 이식하여 인간화하였다. 항체의 활성을 회복하기 위해서, 토끼 V-영역의 많은 골격 잔기도 인간화 서열에 포함시켰다. 이들 잔기는 WO91/09967호(Adair et al. (1991), Humanised antibodies)에 개략적으로 설명된 프로토콜을 이용하여 선택하였다. 인간 생식세포 계열(수용체(acceptor)) V-영역 서열과 토끼 항체(공여체) V-영역 서열의 정렬은 설계된 인간화 서열과 함께, 도 5, 및 6에 나타낸다. 공여체로부터 수용체 서열로 이식된 CDR은 결합된 코티아/카밧 정의가 이용된 CDR-H1(WO91/09967호(Adair et al., 1991 Humanised antiboies) 참조)을 제외하고 카밧(Kabat et al., 1987) 에 의해 정의된다.
인간 V-영역 IGKV1-39 + JK4 J-영역(IMGT, http://www.imgt.org/)은 항체 AB1 경쇄 CDR의 수용체로서 선택하였다. 이식체 gVL4 및 gL9의 경쇄 골격 잔기는 모두 인간 생식세포 계열 유전자이다. CDRL3은 이식체 gL9에서 돌연변이시켜 가능한 탈아미드화 부위를 변형하였다. 인간 V-영역 IGHV4-39 + JH4 J-영역(IMGT, http://www.imgt.org/)은 항체 AB1의 중쇄 CDR의 수용체로서 선택하였다. 많은 토끼 항체에서 일반적으로, 항체 AB1의 VH 유전자는 선택된 인간 수용체보다 더 짧다. 인간 수용체 서열과 정렬될 때, 항체 AB1의 VH 영역의 골격 1은 인간화 항체에 포함된 N-말단 잔기가 없다(도 6). AB1 토끼 VH 영역의 골격 3은 베타 시트 가닥 D와 E 사이에 루프 내 2개의 잔기(75 및 76)가 없다: 이식체 gH41 및 gH49에서, 갭은 선택된 인간 수용체 서열(도 6)의 상응하는 잔기(리신 75, K75; 아스파라긴 76, N76)로 채워진다. 이식체 gH41 및 gH49에서 중쇄 골격 잔기는 공여체 잔기 리신(K71) 및 발린(V78)이 각각 포함된 잔기 71 및 78(카밧 넘버링)을 포함하는 군으로부터의 하나 이상의 잔기를 제외하고는 모두 인간 생식세포 계열 유전자이다. 잔기 K71 및 V78의 보유는 인간화 항체의 최대 역가에 필수적이었다. 인간 골격의 위치 1의 글루타민 잔기는 글루탐산(E1)으로 대체하여 동종의 산물의 발현 및 정제를 제공하였다: 항체 및 항체 단편의 N-말단에서 글루타민의 피로글루타메이트로의 전환은 널리 보고되어 있다. CDRH3은 이식체 gH41 및 gH49에서 돌연변이시켜 가능한 탈아미드화 부위를 변형하였다.
각 항체의 많은 변이 중쇄 및 경쇄 V-영역 서열을 코딩하는 유전자를 설계하여 DNA2.0 Inc.에 의한 자동 합성 접근법에 의해 제작하였다. 중쇄 및 경쇄 V-영역의 추가 변이체는 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이 유발법에 의해 VH 및 VK 유전자를 변형하여 생성하였으며, 이는 일부 경우에 가능한 탈아미드화 부위를 변형하는 CDR 내 돌연변이를 포함한다. 일시적인 발현을 위해, 인간화 경쇄 V-영역 유전자는 인간 카파쇄 불변 영역(Km3 동종이인자형)을 코딩하는 DNA를 포함하는 UCB 인간 경쇄 발현 벡터 pMhCK에 클로닝하였다. 인간화 중쇄 V-영역 유전자는 힌지 안정화 돌연변이 S241P를 가진 인간 감마-4 중쇄 불변 영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 UCB 인간 감마-4 중쇄 발현 벡터 pMhγ4P FL에 클로닝하였다(Angal et al., Mol Immunol. 1993, 30(1):105-8). 별법으로, 인간화 VH 유전자는 인간 감마-1 불변 영역(G1m17, 1 동종이인자형)을 코딩하는 DNA를 포함하는 UCB 감마-1 중쇄 발현 벡터 pMhγ1FL에 클로닝하였다. 인간화 항체의 1가 결합 반응 속도론을 평가하기 위해서, 인간화 VH 유전자를 또한 10개 히스티딘 잔기의 C-말단 태그를 가진 인간 감마-1 CH1-힌지 도메인을 코딩하는 DNA를 포함하는 UCB 인간 Fab-HIS 발현 벡터 pMhFab10HIS에 또한 클로닝하였다: 히스티딘 태그는 친화도 크로마토그래피에 의해 발현된 Fab의 정제를 용이하게 한다. 생성된 중쇄 및 경쇄 벡터의 HEK293 현탁 세포로의 동시 형질감염은 293 펙틴(12347-019 Invitrogen)을 사용하여 달성하고, 인간 IgG4P, IgG1 또는 Fab-HIS 형식의 인간화 재조합 항체의 발현을 제공하였다.
변이 인간화 항체 쇄, 및 이들의 조합을 발현하고 부모 항체에 비교한 이들의 효능, 이들의 생물물리학적 특성 및 하류 공정에 대한 적합성을 평가하였다.
포유동물 세포에서 인간화 재조합 항체의 안정한 발현을 위해, 인간화 경쇄 V-영역 유전자는 인간 C-카파 불변 영역(Km3 동종이인자형)을 코딩하는 DNA 서열에 연결하여 인접한 경쇄 유전자를 생성하였다. 인간화 중쇄 유전자는 인간 감마-4P 중쇄 불변 영역, 또는 인간 감마-1 중쇄 불변 영역(G1m17, 1 동종이인자형)을 코딩하는 DNA에 연결하여 인접한 중쇄 유전자를 생성하였다. 중쇄 및 경쇄 유전자는 포유동물 발현 벡터에 클로닝하였다.
SEQUENCE LISTING <110> UCB BIOPHARMA sprl <120> Tau-binding antibodies <130> PF0031-WO-PCT <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 <400> 1 Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 <400> 2 Ala Ala Ser Tyr Leu Ala Ser 1 5 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa can be A or G <400> 3 Gln Gln Xaa Tyr Thr Arg Thr Asp Ile Asp Asn Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 <400> 4 Gly Ile Asp Leu Ser Thr Trp Arg Met Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 <400> 5 Ile Ile Gly Thr Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be A, Q, N, D or S <400> 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taactccatg 420 gtgaccctgg gatgcctggt caagggctat ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac 480 tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacacc ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac 540 actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc agcacctggc ccagcgagac cgtcacctgc 600 aacgttgccc acccggccag cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt 660 ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca 720 aagcccaagg atgtgctcac cattactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac 780 atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac 840 acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa 900 cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt 960 gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct 1020 ccacaggtgt acaccattcc acctcccaag gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg 1080 acctgcatga taacagactt cttccctgaa gacattactg tggagtggca gtggaatggg 1140 cagccagcgg agaactacaa gaacactcag cccatcatgg acacagatgg ctcttacttc 1200 gtctacagca agctcaatgt gcagaagagc aactgggagg caggaaatac tttcacctgc 1260 tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac catactgaga agagcctctc ccactctcct 1320 ggtaaa 1326 <210> 62 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Position of Biotin Conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> AMIDATION <400> 62 Cys Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro 1 5 10 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Position of Biotin Conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> AMIDATION <400> 63 Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Cys 1 5 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Position of Biotin Conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> AMIDATION <400> 64 Cys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser 1 5 10 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 65 Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro 1 5 10

Claims (20)

  1. 서열 번호 1로부터 선택된 CDR1, 서열 번호 2로부터 선택된 CDR2, 및 서열 번호 3으로부터 선택된 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    서열 번호 4로부터 선택된 CDR1, 서열 번호 5로부터 선택된 CDR2, 및/또는 서열 번호 6으로부터 선택된 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는, 단리된 타우(Tau) 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
  2. 서열 번호 13을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    서열 번호 16을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는, 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
  3. 제2항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열 번호 11 또는 12를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
  4. 제2항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열 번호 14 또는 15를 포함하는 것인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호 11 또는 12 또는, 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄, 및/또는
    서열 번호 14 또는 15를 포함하는 중쇄
    를 포함하는, 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
  6. 타우와의 결합에 대해 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편과 경쟁하는, 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
  7. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항의 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편과 실질적으로 동일한 타우의 에피토프에 결합하는, 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단클론 인간화 항체인 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 55의 아미노산 197 내지 206 내의 인산화된 타우 영역에 결합하는, 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 타우의 가용 형태, 인간 타우의 쌍 나선 필라멘트(PHF: paired helical filament), 또는 인간 타우의 가용 형태와 인간 타우의 쌍 나선 필라멘트(PHF) 둘 다에 결합하는 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편의 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  12. 제11항의 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
  13. 제11항의 하나 이상의 핵산 서열 또는 제12항의 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  14. 제1항 내지 10항 중 어느 한 항의 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편의 제조 방법으로서, 적어도
    a) 제13항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
    b) 상기 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편을 단리하는 단계
    를 포함하는 제조 방법.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 치료학적 활성제로서 사용하기 위한, 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 타우병증의 치료에 사용하기 위한, 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
  17. 제16항에 있어서, 상기 타우병증이 알츠하이머병 또는 진행성 핵상 마비인, 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 진단제로서 사용하기 위한, 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
  19. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 타우병증의 진단에 사용하기 위한, 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
  20. 제19항에 있어서, 상기 타우병증이 알츠하이머병 또는 진행성 핵상 마비인, 단리된 타우 결합 항체 또는 이의 결합 단편.
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