EA045348B1 - БИСПЕЦИФИЧНОЕ АНТИТЕЛО К α-SYN/IGF1R И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ - Google Patents
БИСПЕЦИФИЧНОЕ АНТИТЕЛО К α-SYN/IGF1R И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Download PDFInfo
- Publication number
- EA045348B1 EA045348B1 EA202091183 EA045348B1 EA 045348 B1 EA045348 B1 EA 045348B1 EA 202091183 EA202091183 EA 202091183 EA 045348 B1 EA045348 B1 EA 045348B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- igf1r
- antibody
- containing seq
- seq
- antigen
- Prior art date
Links
- 101001034652 Homo sapiens Insulin-like growth factor 1 receptor Proteins 0.000 title claims description 45
- 102100039688 Insulin-like growth factor 1 receptor Human genes 0.000 title claims description 19
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 297
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 296
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 208
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 208
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 208
- 108090000185 alpha-Synuclein Proteins 0.000 claims description 158
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 157
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 43
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 32
- 102000045648 human IGF1R Human genes 0.000 claims description 26
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 15
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 9
- 101100340620 Rattus norvegicus Igf1r gene Proteins 0.000 claims description 8
- 101100340618 Mus musculus Igf1r gene Proteins 0.000 claims description 6
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 claims description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 4
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 claims description 4
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 claims description 3
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000003802 alpha-Synuclein Human genes 0.000 claims 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 claims 1
- 102000038455 IGF Type 1 Receptor Human genes 0.000 description 195
- 108010031794 IGF Type 1 Receptor Proteins 0.000 description 195
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 168
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 162
- 102100026882 Alpha-synuclein Human genes 0.000 description 157
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 114
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 114
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 86
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 85
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 82
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 63
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 52
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 49
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 description 47
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 39
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 37
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 35
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 34
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 34
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 32
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 30
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 30
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 30
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 29
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 28
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 24
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 24
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 23
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 23
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 23
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 21
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 20
- 208000032859 Synucleinopathies Diseases 0.000 description 20
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 20
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 18
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 18
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 18
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 18
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 17
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 16
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 16
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 15
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 15
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 15
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 14
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 14
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 14
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 13
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 13
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 13
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 12
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 description 12
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 12
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 11
- 210000004558 lewy body Anatomy 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 11
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 10
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 10
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 10
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 10
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 230000031998 transcytosis Effects 0.000 description 10
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 9
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 9
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 9
- 208000037875 astrocytosis Diseases 0.000 description 9
- 230000007341 astrogliosis Effects 0.000 description 9
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 8
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 8
- 102220618489 Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit gamma, mitochondrial_N54Q_mutation Human genes 0.000 description 8
- 102220620245 Pituitary-specific positive transcription factor 1_N51D_mutation Human genes 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 8
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 8
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 8
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 8
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 8
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 201000002832 Lewy body dementia Diseases 0.000 description 7
- 208000001089 Multiple system atrophy Diseases 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 7
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 7
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 6
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 6
- 206010067889 Dementia with Lewy bodies Diseases 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 6
- 102000019355 Synuclein Human genes 0.000 description 6
- 108050006783 Synuclein Proteins 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 6
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 6
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 6
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 6
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 6
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 5
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 5
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 102000003799 beta-Synuclein Human genes 0.000 description 5
- 108090000182 beta-Synuclein Proteins 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 5
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 102000004963 gamma-Synuclein Human genes 0.000 description 5
- 108090001121 gamma-Synuclein Proteins 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 5
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 4
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 4
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 4
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 4
- -1 small molecule compound Chemical class 0.000 description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 3
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 3
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 3
- 101000787265 Homo sapiens Beta-synuclein Proteins 0.000 description 3
- 101000787273 Homo sapiens Gamma-synuclein Proteins 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 3
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 3
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 3
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 3
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 3
- 238000011188 deamidation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 3
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 3
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000007903 penetration ability Effects 0.000 description 3
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000006453 vascular barrier function Effects 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IHCCLXNEEPMSIO-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperidin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 IHCCLXNEEPMSIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001049 Amyloid Human genes 0.000 description 2
- 108010094108 Amyloid Proteins 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 2
- 101000746263 Conus leopardus Conotoxin Lp5.1 Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001092197 Homo sapiens RNA binding protein fox-1 homolog 3 Proteins 0.000 description 2
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100036721 Insulin receptor Human genes 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 2
- 101000834887 Mus musculus Alpha-synuclein Proteins 0.000 description 2
- 208000036110 Neuroinflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 2
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102100035530 RNA binding protein fox-1 homolog 3 Human genes 0.000 description 2
- 101000834882 Rattus norvegicus Alpha-synuclein Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 2
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229960000106 biosimilars Drugs 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 2
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003959 neuroinflammation Effects 0.000 description 2
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 2
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CN1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPZOCVVDSHQFST-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-3-ethylpyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C=1C(=NN(C=1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2)CC LPZOCVVDSHQFST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYELSNVLZVIGTI-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-5-ethylpyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C=1C=NN(C=1CC)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 FYELSNVLZVIGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 230000007730 Akt signaling Effects 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108050005273 Amino acid transporters Proteins 0.000 description 1
- 102000034263 Amino acid transporters Human genes 0.000 description 1
- 102100030356 Arginase-2, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 101100043731 Caenorhabditis elegans syx-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003908 Cathepsin D Human genes 0.000 description 1
- 108090000258 Cathepsin D Proteins 0.000 description 1
- 102000009193 Caveolin Human genes 0.000 description 1
- 108050000084 Caveolin Proteins 0.000 description 1
- 102000003727 Caveolin 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000026 Caveolin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 101100535673 Drosophila melanogaster Syn gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 208000012661 Dyskinesia Diseases 0.000 description 1
- 101150059079 EBNA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100023078 Early endosome antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 108091052347 Glucose transporter family Proteins 0.000 description 1
- 102000042092 Glucose transporter family Human genes 0.000 description 1
- 101000792835 Homo sapiens Arginase-2, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101001050162 Homo sapiens Early endosome antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001076292 Homo sapiens Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 description 1
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000984042 Homo sapiens Protein lin-28 homolog A Proteins 0.000 description 1
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100025087 Insulin receptor substrate 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710201824 Insulin receptor substrate 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100025092 Insulin receptor substrate 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710201820 Insulin receptor substrate 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100031419 Insulin receptor substrate 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710201816 Insulin receptor substrate 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100025947 Insulin-like growth factor II Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 208000015592 Involuntary movements Diseases 0.000 description 1
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 208000009829 Lewy Body Disease Diseases 0.000 description 1
- 101000834884 Macaca mulatta Alpha-synuclein Proteins 0.000 description 1
- 108090000744 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004232 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Human genes 0.000 description 1
- 101100368134 Mus musculus Syn1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 102100025460 Protein lin-28 homolog A Human genes 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004584 Somatomedin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017622 Somatomedin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- ZHAFUINZIZIXFC-UHFFFAOYSA-N [9-(dimethylamino)-10-methylbenzo[a]phenoxazin-5-ylidene]azanium;chloride Chemical compound [Cl-].O1C2=CC(=[NH2+])C3=CC=CC=C3C2=NC2=C1C=C(N(C)C)C(C)=C2 ZHAFUINZIZIXFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 102000035181 adaptor proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005764 adaptor proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000002482 anti-endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001405 anti-neuronal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 210000004781 brain capillary Anatomy 0.000 description 1
- 238000000339 bright-field microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000004858 capillary barrier Effects 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N chloral hydrate Chemical compound OC(O)C(Cl)(Cl)Cl RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002327 chloral hydrate Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 210000001947 dentate gyrus Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000009762 endothelial cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000004954 endothelial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007387 gliosis Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000025563 intercellular transport Effects 0.000 description 1
- 230000010039 intracellular degradation Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108091005446 macrophage receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004925 microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000017311 musculoskeletal movement, spinal reflex action Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000478 neocortex Anatomy 0.000 description 1
- 201000007601 neurodegeneration with brain iron accumulation Diseases 0.000 description 1
- 230000002314 neuroinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003962 neuroinflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000002981 neuropathic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000002853 ongoing effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 210000000063 presynaptic terminal Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 102000009929 raf Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010077182 raf Kinases Proteins 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008458 response to injury Effects 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 1
- 210000001578 tight junction Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000021542 voluntary musculoskeletal movement Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к биспецифичному антителу против альфа-синуклеина и IGFR, к фармацевтической композиции для предотвращения и/или лечения синуклеинопатий (αсинуклеинопатий), содержащей указанное биспецифичное антитело, и к способу выявления агрегатов альфа-синуклеина или предоставления информации для диагностики альфа-синуклеинопатий, включающему указанное биспецифичное антитело.
Предшествующий уровень техники
Альфа-синуклеин (α-синуклеин, α-syn) экспрессируется преимущественно в пресинаптических окончаниях нейронов и в нормальных условиях представляет собой естественным образом развернутый мономер. Альфа-синуклеин способствует регуляции высвобождения дофамина, который является нейромедиатором, контролирующим произвольные или непроизвольные движения. В частности, функция альфа-синуклеина важна при повышении синаптической активности и старении и является важным фактором нейродегенерации.
Тем не менее, в патологическом состоянии альфа-синуклеин претерпевает структурные изменения посредством связывания и взаимодействия с капельками, фосфолипидными бислоями или липидными мембранами с образованием свернутой или свернутой α-спиральной вторичной структуры, в результате чего его количество кратно уменьшается. Образуются агломераты, содержащие молекулы в форме димеров, олигомеров и/или волокон.
Известно, что эти агрегаты альфа-синуклеина оказывают токсическое действие на клетки и являются основным компонентом аномальных белковых агрегатов телец Леви, обнаруженных в нейронах при болезни Паркинсона (БП), деменции при болезни Паркинсона (ДБП), мультисистемной атрофии (МСА), деменции с тельцами Леви (ДТЛ) и различных заболеваниях. Также известно, что посттрансляционные модификации альфа-синуклеина, такие как фосфорилирование или убиквитинирование, также ассоциированы с образованием агрегатов альфа-синуклеина и их нейротоксичностью. Известно, что альфасинуклеин приводит к гибели дофаминовых нейронов, индуцирует воспалительные реакции в экспериментах на животных и клетках и вызывает двигательные симптомы, сходные с болезнью Паркинсона, у экспериментальных животных. Кроме того, известно, что образование агрегатов альфа-синуклеина связано с этиологией группы нейродегенеративных заболеваний, называемых α-синуклеинопатиями, включая болезнь Паркинсона, деменцию при болезни Паркинсона, деменцию с тельцами Леви, мультисистемную атрофию и многие другие нейроаксональные заболевания.
В качестве методов иммунотерапии синуклеиновых заболеваний были предложены антитела к альфа-синуклеину или фрагменты альфа-синуклеина для индукции таких антител. Однако проникновение антител в головной мозг может быть ограничено гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ).
Кроме того, дефицит высоко специфичных переносчиков через ГЭБ привел к задержке разработки новых терапевтических и диагностических средств для лечения и диагностики заболеваний, возникающих в головного мозге, включая опухоли головного мозга и нейродегенеративные заболевания. Существует отчетливая потребность в способе доставки терапевтических и диагностических молекул в фармацевтически эффективной дозе в головной мозг без нарушения физиологии и гомеостаза ГЭБ.
Подробное описание изобретения
Техническая проблема.
Согласно одному воплощению настоящего изобретения предложен белковый комплекс, содержащий антигенсвязывающую область против альфа-синуклеина (α-syn) и антигенсвязывающую область против IGF1R, или способ получения указанного белкового комплекса.
Согласно другому воплощению предложен полинуклеотид, кодирующий указанный белковый комплекс, рекомбинантный вектор, содержащий указанный полинуклеотид, и рекомбинантная клетка, содержащая указанный рекомбинантный вектор.
Согласно другому воплощению предложено биспецифичное антитело против α-syn и IGF1R, полученное из указанного белкового комплекса, и способ получения указанного биспецифичного антитела.
Согласно другому воплощению предложена фармацевтическая композиция для предотвращения и/или лечения альфа-синуклеинопатий, содержащая указанное биспецифичное антитело против α-syn и IGF1R и фармацевтически приемлемый эксципиент.
Предложен способ доставки лекарственных средств, применяемых для диагностики, лечения или предотвращения альфа-синуклеинопатий, в головной мозг с использованием антитела или антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению.
Техническое решение
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.
Одно воплощение настоящего изобретения представляет собой белковый комплекс, содержащий антигенсвязывающую область для альфа-синуклеина (α-syn) и антигенсвязывающую область для IGF1R, и биспецифичное антитело против альфа-синуклеина и IGF1R (далее биспецифичное антитело против α-syn/против IGF1R), полученное из указанного белкового комплекса. Таким образом, биспецифичное антитело по настоящему изобретению может распознавать и связывать, в качестве антигенов, как альфа-синуклеин, так и IGF1R.
- 1 045348
Биспецифичное антитело против a-syn/против IGF1R по настоящему изобретению содержит антитело против альфа-синуклеина или его антигенсвязывающий фрагмент и специфично распознает и связывается с альфа-синуклеином, в особенности с С-концевой областью альфа-синуклеина, благодаря чему его используют для предотвращения, лечения и/или диагностики заболеваний, связанных с альфасинуклеином или агрегатами альфа-синуклеина, то есть альфа-синуклеинопатий.
Согласно настоящему изобретению, термин синуклеинопатии включает все нейродегенеративные расстройства, характеризующиеся патологическими агрегатами синуклеина. В общую группу синуклеинопатий включают болезнь Паркинсона, деменцию при болезни Паркинсона (ДБП), деменцию с тельцами Леви (ДТЛ), болезнь телец Леви, деменцию, сопровождающуюся тельцами Леви, синдром Паркинсона с деменцией, мультисистемную атрофию (МСА), множественную атрофию нервной системы и нейродегенерацию I типа с накоплением железа в головном мозге (NBIA I типа). Кроме того, агрегаты альфасинуклеина также были вторично обнаружены при болезни Альцгеймера (Kim et al. Alzheimer's Research & Therapy 2014, 6:73).
Синуклеинопатии представляют собой разнородную группу нейродегенеративных расстройств со сходными патологическими признаками. В нейропатологическом аспекте, можно обнаружить отчетливые очаги в форме аномальных агрегатов альфа-синуклеина в отдельных группах нейронов и олигодендроцитов. альфа-синуклеин (ранее известный как PARK1 и PARK4) представляет собой белок, содержащий 140 аминокислот, который широко экспрессируется в неокортексе, гиппокампе, зубчатой извилине, задней нейросфере, полосатом теле, таламусе и мозжечке. Экспрессия альфа-синуклеина также высока в кроветворных клетках, включая моноциты, такие как В-клетки, Т-клетки, NK-клетки и тромбоциты. Его точная роль в этих клетках неизвестна, но она связана с дифференцировкой мегакариоцитов (предшественников тромбоцитов).
В настоящем описании заболевание, ассоциированное с агрегатами альфа-синуклеина, представляет собой группу нейродегенеративных заболеваний, называемых синуклеинопатиями, с агрегатами альфа-синуклеина в патологических очагах, включая нейроны и глию, и такими характеристиками, как дегенерация дофаминовой системы, изменения двигательных функций, расстройство когнитивных функций и образование телец Леви и/или нейритов Леви (Kim et al. Alzheimer's Research & Therapy 2014, 6:73; McKeith et al., Neurology (1996) 47:1113-24). Эти заболевания включают, без ограничения, болезнь Паркинсона, деменцию при болезни Паркинсона, деменцию с тельцами Леви, вариант болезни Альцгеймера с тельцами Леви, сочетание болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона, мультисистемную атрофию и многие другие нейроаксональные заболевания. В одном воплощении антитело по настоящему изобретению эффективно используют для лечения болезни Паркинсона.
Кроме того, биспецифичное антитело против a-syn/против IGF1R по настоящему изобретению содержит антитело против IGF1R или его антигенсвязывающий фрагмент, благодаря чему антитело против a-syn или его антигенсвязывающий фрагмент могут проникать через гематоэнцефалический барьер для оказания своего действия и имеют больший период полувыведения, сохраняя эффективность на протяжении длительного времени.
Более того, биспецифичное антитело против a-syn/ против IGF1R по настоящему изобретению связывается с IGF1R на поверхности клеток, не влияя на его связывание с лигандом, и не оказывает влияния на сигнальный путь IGF1R. Поскольку оно не ингибирует связывание IGF1R с его лигандом и передачу сигналов через IGF1R, оно может быть использовано в качестве переносчика для проникновения через гематоэнцефалический барьер.
В частности, антитело против IGF1R или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению специфично распознают IGF1R (рецептор инсулиноподобного фактора роста 1-го типа) и связываются с IGF1R, в частности с человеческим IGF1R, мышиным IGF1R, крысиным IGF1R и IGF1R обезьяны. Тем не менее, они не препятствуют связыванию лигандов IGF1R, таких как IGF-1, IGF-2 и/или инсулин, с IGF1R, не ингибируют передачу сигналов через IGF1R и могут быть использованы для трансцитоза с целью прохождения через ГЭБ. Они не обладают антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (ADCC) и, таким образом, не снижают уровни IGF1R в головном мозге даже при их многократном введении животным, благодаря чему они нетоксичны.
В частности, антитело против IGF1R по настоящему изобретению связывается с IGF1R, расположенным на поверхности эндотелиальных клеток головного мозга, образующих ГЭБ, и проходит интернализацию, проникая во внутреннюю часть клетки. Например, интернализацию антитела против IGF1R по настоящему изобретению клетками можно выявить с использованием клеточной линии, экспрессирующей IGF1R (например, MCF-7). Антитела против IGF1R по настоящему изобретению, например, 1564, 48G5, 54Н4, 60н6, В11 и аффинные варианты 1564, такие как С04, F06, VH2, VH5, VH7, VH9, VH16, VH32 и VH35, имеют более высокую степень интернализации по сравнению с отрицательным контролем. Полученные результаты показывают, что степень интернализации проанализированных антител против IGF1R специфична относительно IGF1R на поверхности клеток. Кроме того, антитело против IGF1R по настоящему изобретению имеет форму scFv и может быть получено связанным с терапевтическим антителом различными способами. Например, scFv антитела против IGF1R может быть полу- 2 045348 чен в составе биспецифичного антитела, например, бивалентной формы биспецифичного антитела, где с С-концом терапевтического антитела, например, антитела к α-syn, связаны два scFv, или моновалентной формы биспецифичного антитела, где с С-концом терапевтического антитела связан один scFv. Оба из этих биспецифичных антител могут быть интернализованы клетками, экспрессирующими IGF1R. Антитело к IGF1R имеет высокую аффинность связывания с антигеном на поверхности клеток, что усиливает эффект интернализации и приводит к способности проходить через ГЭБ. Тем не менее, если антитело обладает способностью проходить через ГЭБ и препятствует передаче сигналов через IGF1R, оно может вызывать побочные эффекты. Антитело по настоящему изобретению характеризуется как связывающей способностью, подходящей для прохождения через ГЭБ, так и отсутствием блокировки передачи сигналов через IGF1R.
Антитело против IGF1R или его антигенсвязывающий фрагмент обладают отличным свойством простоты их разработки. В этом аспекте, посттрансляционные модификации, такие как дезамидирование, происходящие в области CDR антитела против IGF1R и снижающие стабильность и эффективность антитела, должны быть устранены. Замена аминокислоты, по которой происходит дезамидирование, позволяет повысить стабильность и эффективность антитела по сравнению с исходным антителом без изменения способности к связыванию с ECD антигена IGF1R. Заменяя Asn сайта дезамидирования на другие остатки, включая Q, Н и K, один за другим, получают мутанты и сходство аффинности связывания мутантов с аффинностью исходного антитела подтверждают по результатам ELISA-анализа аффинности связывания мутантов с IGF1R.
Кроме того, при связывании с биологически активным веществом, действующим в головном мозге, антитело против IGF1R по настоящему изобретению может улучшать его способность к проникновению через ГЭБ и эффективность по сравнению с тем же биологически активным веществом самим по себе.
Антитело против IGF1R согласно одному аспекту настоящего изобретения может быть использовано как биспецифичное антитело, содержащее различные вторые терапевтические антитела. В эксперименте проникновения через in vitro ГЭБ-систему, имеющую происхождение от человеческих IPSC (фиг. 16а), было показано, что по сравнению с одиночным антителом, состоящим только из терапевтического антитела, оно усиливает проникновение через ГЭБ в 15 раз. Антитело против IGF1R может быть связано со вторым антителом в биспецифичном антителе в моновалентной или бивалентной форме. Например, при анализе количества антитела в крови и СМЖ после однократного введения биспецифичного антитела с антителом против IGF1R в моновалентной форме или бивалентной форме нормальным крысам моновалентная форма и бивалентная форма антител против IGF1R продемонстрировали увеличение количества в крови до 5 раз и увеличение количества в СМЖ до 5 раз по сравнению с исходным антителом против IGF1R (клон 1564). Они продемонстрировали увеличение количества в СМЖ приблизительно в 3 раза и повышение проникновения в головной мозг приблизительно в 4,5 раза по сравнению с исходным антителом против IGF1R (клон 1564) (фиг. 16с). Поэтому ожидается, что биспецифичное антитело, содержащее антитело против IGF1R, усовершенствованное указанным выше способом, продемонстрирует увеличение количества антитела в СМЖ приблизительно до 15 раз и повысит его способность к проникновению в головной мозг приблизительно до 23 раз по сравнению с одиночным антителом, состоящим из второго терапевтического антитела самого по себе.
Было установлено, что антитело против IGF1R по настоящему изобретению связывается с IGF1R, в частности с IGF1R млекопитающих, включая людей, обезьян, крыс и мышей, и, таким образом, может быть полезным для скрининга при разработке лекарственных средств, для клинических исследований и тому подобного.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент против IGF1R по настоящему изобретению представляют собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфично распознающие IGF1R (рецептор инсулиноподобного фактора роста 1-го типа).
Подразумевают, что антитело или антигенсвязывающий фрагмент против IGF1R по настоящему изобретению специфично связываются со своей мишенью, такой как антиген, когда они связываются с ней с константой диссоциации (KD) 10-6 М или менее. Антитело специфично связывается с мишенью с высокой аффинностью, когда Kd составляет 1х10-8М или менее или когда его средняя эффективная концентрация (ЕС50) составляет 2 нМ или менее. В одном воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны связываться с IGF1R или человеческим IGF1R с KD 1х10-8 или менее. Было обнаружено, что антитела, раскрытые здесь, связываются с IGF1R, особенно с человеческим IGF1R, мышиным IGF1R, крысиным IGF1R и IGF1R обезьяны.
При использовании здесь термин эпитоп представляет собой антигенную детерминанту, интерпретируемую как означающая часть антигена, распознаваемого антителом. Согласно одному воплощению, сайт связывания антитела против IGF1R по настоящему изобретению может представлять собой внеклеточный домен белка IGF1R, например, человеческого белка IGF1R (SEQ ID NO:99). Конкретнее, сайты связывания антитела против IGF1R по настоящему изобретению, например, клона 1564 антитела к человеческому белку IGF1R, представляют собой сайт связывания 1, содержащий Y775, Р776, F778, R650, S791, L798 и Glu779, сайт связывания 2, содержащий L641, Н808, Ε8θ9 и L813, и сайт связывания
- 3 045348
3, содержащий V397, D435, W434, Y460 и С488 в белке, состоящем из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:99. Таким образом, эпитоп антитела к IGF1R по настоящему изобретению может представлять собой конформационный эпитоп, содержащий все или часть из этих трех сайтов связывания.
При использовании здесь термин антитело относится к веществу, полученному стимуляцией иммунной системы антигеном, и оно может, без ограничения, быть получено in vivo, получено рекомбинантным методом или синтезировано искусственно. В настоящем изобретении антитела включают антитела животных, химерные антитела, гуманизированные антитела и человеческие антитела. Кроме того, в настоящем изобретении антитело также включает антигенсвязывающий фрагмент антитела, обладающий антигенсвязывающей способностью.
Антитело также включает моноклональное антитело и поликлональное антитело, и моноклональное антитело может быть человеческим антителом, гуманизированным антителом или химерным антителом, представляющим собой выделенное антитело, специфично связывающееся с IGF1R. Моноклональное антитело представляет собой выделенное антитело типа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, связывающееся с IGF1R.
Антитела по настоящему изобретению включают, без ограничения, биспецифичные антитела, минитела, доменные антитела, миметики антител (или синтетические антитела), слитые антитела (или конъюгаты антител) и их фрагменты. Структура различных антител дополнительно раскрыта ниже.
При использовании здесь термин антигенсвязывающий фрагмент относится к части антитела или полипептиду, содержащему указанную часть, обладающим специфичной аффинностью связывания с антигеном. Например, часть антитела содержит аминокислотный остаток, обеспечивающий специфичность и аффинность в отношении антигена посредством взаимодействия с антигеном. Эта антигенсвязывающая область обычно содержит одну или более чем одну определяющую комплементарность область (CDR). Специфичная антигенсвязывающая область также содержит одну или более чем одну каркасную область (FR). CDR представляют собой аминокислотные последовательности, способствующие специфичности и аффинности связывания с антигеном. Каркасные области способствуют поддержанию подходящей конформации этих CDR, облегчая посредством этого связывание антигенсвязывающей области с антигеном.
В настоящем изобретении определяющие комплементарность области (CDR) обозначают области, придающие вариабельным областям антитела специфичность связывания с антигеном.
Антитело может быть выбрано из всех подтипов иммуноглобулинов (например, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM и так далее). IgG-форма антитела может представлять собой антитело подтипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, например, подтипа IgG1 или IgG2. Антитело типа IgG содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи, каждая тяжелая цепь и легкая цепь соединены дисульфидными связями с образованием двух димеров тяжелая цепь - легкая цепь, и два образованных димера тяжелая цепь легкая цепь соединены дисульфидной связью в Fc-области тяжелой цепи. IgG-форма антитела включает антитело к одной мишени, направленное на один антиген, где обе конструкции тяжелая цепь - легкая цепь содержат сайты связывания одного и того же антигена, или биспецифичное антитело, направленное на два антигена, где конструкции тяжелая цепь - легкая цепь содержат сайты связывания различных антигенов.
Термин антигенсвязывающий фрагмент цепи (тяжелой цепи или легкой цепи) антитела или иммуноглобулина включает часть антитела, которая не имеет некоторых аминокислот по сравнению с полноразмерной цепью, но может специфично связываться с антигеном. Этот фрагмент можно рассматривать как обладающий биологической активностью, в том аспекте, что он может специфично связываться с антигеном-мишенью или может конкурировать с другими антителами или антигенсвязывающими фрагментами за связывание с определенным эпитопом. Конкретно, антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из фрагментов антител, содержащих одну или более чем одну определяющую комплементарность область, таких как, без ограничения, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' и F(ab')2. Такие биологически активные фрагменты могут быть получены технологией рекомбинантных ДНК или могут быть получены ферментативным или химическим расщеплением интактных антител. Иммунологически функциональные фрагменты иммуноглобулинов не ограничены указанными фрагментами.
В настоящем изобретении, например, вариант полипептида, такого как антигенсвязывающий фрагмент, белок или антитело, представляет собой полипептид, в котором присутствует вставка, делеция, присоединение и/или замена одного или более чем одного аминокислотного остатка по сравнению с другими полипептидными последовательностями, и включает слитые полипептиды. Например, некоторые антитела содержат консервативные аминокислотные замены одного или более чем одного остатка тяжелой или легкой цепи, вариабельной области или последовательности CDR.
Термин производное полипептида в настоящем изобретении обозначает полипептид, химически модифицированный посредством конъюгации с другими химическими группировками и отличный от вариантов с вставками, делециями, присоединениями или заменами.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент против IGF1R по настоящему изобретению не предотвращают связывание лигандов IGF1R, таких как IGF-1, IGF-2 и/или инсулин, с IGF1R. Конкретно, антитело или антигенсвязывающий фрагмент против IGF1R обеспечивают преимущество, состоящее в
- 4 045348 том, что они не препятствуют связыванию лиганда IGF1R с IGF1R, расположенным на мембране клеток, экспрессирующих IGF1R, а также не ингибируют передачу сигналов через IGF1R и не влияют на экспрессию IGF1R на поверхности клеток. Таким образом, антитело или антигенсвязывающий фрагмент против IGF1R по настоящему изобретению могут быть эффективно использованы для проникновения через гематоэнцефалический барьер посредством трансцитоза.
Человеческий IGF1R может быть активирован инсулиноподобными факторами роста IGF-1 и IGF-2 и инсулином (INS). Передача сигналов через IGF1R стимулирует рост и выживание клеток через адаптерный белок IRS, от которого зависит активация пути PI3-киназы/Akt. IGF1R передает сигналы своим основным субстратам IRS-1, IRS-2, IRS-3 и IRS-4 и белкам Shc, что приводит к активации сигнальных путей Ras /Raf/MAP-киназы и PI3-киназы/Akt. Было показано, что IGF1R имеет относительно высокий уровень экспрессии в головном мозге по сравнению с другими мишенями для трансцитоза, экспрессия которых подтверждена в эндотелиальных клетках головного мозга, используемыми в настоящее время для повышения способности к проникновению через ГЭБ.
Антитело против IGF1R по настоящему изобретению не препятствует связыванию IGF1, IGF2 и/или инсулина с IGF1R и не препятствует передаче сигналов через путь IGF1R, как описано выше. Кроме того, в одном воплощении настоящего изобретения, при сравнении IGF1R с другими мишенями, разрабатываемыми в настоящее время с целью повышения способности терапевтических антител к проникновению через ГЭБ, например, рецептором трансферрина или рецептором инсулина, было показано, что он имеет относительно низкий уровень экспрессии в нормальном головном мозге и периферических тканях, таких как печень, легкие или толстая кишка.
IGF1R является мишенью при рецептор-опосредованном трансцитозе (RTM), позволяющем доставлять полезные вещества через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) в головной мозг. Однако для его использования в качестве мишени при доставке лекарственных средств посредством их проникновения через гематоэнцефалический барьер желательно связывание с IGF1R на поверхности клеток без влияния на его связывание с лигандом и передачу сигналов через путь IGF1R. Поэтому антитело против IGF1R и его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению не ингибируют связывание IGF1R с его лигандом и передачу сигналов через IGF1R, благодаря чему они могут быть использованы в качестве переносчиков для проникновения через гематоэнцефалический барьер.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент против IGF1R по настоящему изобретению способны к трансцитозу и могут проходить через эндотелиальные клетки головного мозга. Кроме того, после его введения в кровеносный сосуд мыши антитело по настоящему изобретению локализуется в том же месте, что и кровеносные сосуды головного мозга мыши. Эти результаты показывают, что антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут быть эффективно использованы в качестве носителя лекарственного средства, который проходит через гематоэнцефалический барьер.
Таким образом, антитело или антигенсвязывающий фрагмент против IGF1R по настоящему изобретению позволяют биологически активному веществу, действующему в головном мозге, проходить через гематоэнцефалический барьер. В настоящем изобретении биологический барьер относится к клеткам, тканям, мембранам или клетке, мембране или структуре, предотвращающим эффективное прохождение, диффузию или перенос биологической молекулы. Эти биологические барьеры включают нервные клетки/ткани, соединительную ткань, мышцы, мембраны или эпителиальные клетки (например, слизистых оболочек или сосудов). Типичным примером является гематоэнцефалический барьер.
В настоящем изобретении термин гематоэнцефалический барьер или ГЭБ представляет собой барьер, образованный плотными контактами в эндотелиальной мембране капилляров головного мозга, который отделяет головной мозг и спинной мозг от окружающей их кровеносной системы. Этот барьер настолько сильный, что он ограничивает прохождение в головной мозг даже тех молекул, молекулярная масса которых мала и составляет приблизительно 60 Да. Гематоэнцефалический барьер головного мозга, сосудистый барьер спинного мозга и сосудистый барьер сетчатки представляют собой непрерывные капиллярные барьеры центральной нервной системы, и их обычно обозначают как ГЭБ.
В настоящем изобретении переносчик через гематоэнцефалический барьер может проходить через гематоэнцефалический барьер и обеспечивать доставку антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению и, например, включает белок, в том числе пептид и полипептид, нуклеиновую кислоту, антитело или низкомолекулярное соединение.
Получение и отбор антител по настоящему изобретению могут быть проведены в трансгенных мышах, например, описанных выше, где мышам вводят ген, кодирующий антиген-специфичные человеческие mAb с желаемой специфичностью с применением гибридомной технологии. Такие антитела могут быть клонированы и экспрессированы с использованием подходящих векторов и клеток-хозяев, или антитела могут быть получены из культивированных гибридомных клеток. Кроме того, антитело может иметь происхождение от фаговой дисплейной библиотеки. Технология фагового дисплея представляет собой метод, имитирующий, в некоторой степени, иммунный отбор посредством селекции репертуара антител на поверхности нитчатых бактериофагов и отбора из них тех фагов, которые связываются с желаемым антигеном. Такая методика может относиться к воплощению настоящего изобретения или РСТ-публикации № WO 1999/010494. В одном воплощении отбор гуманизированного антитела к IGF1R по настоящему изобретению проводят методом фагового дисплея.
- 5 045348
Настоящее изобретение относится к выделенному антителу или антигенсвязывающему фрагменту, специфично связывающимся с IGF1R, которые могут представлять собой полипептид, белок, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфично связывающиеся с IGF1R, содержащие определяющие комплементарность области тяжелой цепи и определяющие комплементарность области легкой цепи.
Далее это описано конкретно для антител, специфично связывающихся с IGF1R.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент против IGF1R по настоящему изобретению специфично распознают IGF1R (рецептор инсулиноподобного фактора роста 1-го типа), распознают и связываются с IGF1R, в частности с человеческим IGF1R, мышиным IGF1R, крысиным IGF1R и IGF1R обезьяны, не препятствуют связыванию IGF1R, IGF-1R, IGF-2 и/или инсулина с IGF1R, не ингибируют передачу сигналов через IGF1R и могут быть использованы для трансцитоза с целью прохождения барьера в крови. Они не обладают антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (ADCC) и не снижают уровни IGF1R в головном мозге даже при их многократном введении животным.
В частности, антитело против IGF1R по настоящему изобретению связывается с IGF1R, расположенным на поверхности эндотелиальных клеток головного мозга, образующих ГЭБ, и проходит интернализацию, проникая во внутреннюю часть клетки. Например, интернализацию антитела против IGF1R по настоящему изобретению клетками можно выявить с использованием клеточной линии, экспрессирующей IGF1R (например, MCF-7). Антитела против IGF1R по настоящему изобретению, например, 1564, 48G5, 54Н4, 60Н6, В11 и аффинные варианты 1564, такие как С04, F06, VH2, VH5, VH7, VH9, VH16, VH32 и VH35, имеют более высокую степень интернализации по сравнению с отрицательным контролем. Полученные результаты показывают, что степень интернализации проанализированных антител против IGF1R специфична относительно IGF1R на поверхности клеток. Кроме того, антитело против IGF1R по настоящему изобретению имеет форму scFv и может быть получено связанным с терапевтическим антителом различными способами. Например, scFv антитела против IGF1R может быть получен в составе биспецифичного антитела, например, бивалентной формы биспецифичного антитела, где с С-концом терапевтического антитела, например, антитела к α-syn, связаны два scFv, или моновалентной формы биспецифичного антитела, где с С-концом терапевтического антитела связан один scFv. Биспецифичные антитела могут быть интернализованы клетками, экспрессирующими IGF1R. Антитело к IGF1R имеет высокую способность к связыванию с антигеном на поверхности клеток, что усиливает эффект интернализации и приводит к способности проходить через ГЭБ. Однако, если антитело обладает способностью проходить через ГЭБ и препятствует передаче сигналов через IGF1R, оно может вызывать побочные эффекты. Антитело по настоящему изобретению характеризуется как связывающей способностью, подходящей для прохождения через ГЭБ, так и отсутствием блокировки передачи сигналов через IGF1R.
Настоящее изобретение относится к выделенному антителу или антигенсвязывающему фрагменту, специфично связывающимся с IGF1R, которые могут представлять собой полипептид, белок или антитело, специфично связывающиеся с IGF1R, содержащие определяющие комплементарность области тяжелой цепи и определяющие комплементарность области легкой цепи.
В конкретных примерах антитело против IGF1R или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать:
(i) одну или более чем одну определяющую комплементарность область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3, описанные в табл. 1, или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую указанную одну или более чем одну определяющую комплементарность область тяжелой цепи;
(ii) одну или более чем одну определяющую комплементарность область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3, описанные в табл. 1, или вариабельную область легкой цепи, содержащую указанную одну или более чем одну определяющую комплементарность область легкой цепи;
комбинацию одной или более чем одной определяющей комлементарность области (CDR) тяжелой цепи и одной или более чем одной определяющей комлементарность области (CDR) легкой цепи; или комбинацию вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи.
Кроме того, в указанных вариабельной области тяжелой цепи, вариабельной области легкой цепи или комбинации вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи вариабельная область тяжелой цепи может содержать одну или более чем одну каркасную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из H-FR1, H-FR2, H-FR3 и H-FR4, а вариабельная область легкой цепи может содержать одну или более чем одну каркасную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из L-FR1, L-FR2, L-FR3 и L-FR4.
(1) H-CDR1, H-CDR2 или H-CDR3 тяжелой цепи по настоящему изобретению выбраны из аминокислотных последовательностей, перечисленных в табл. 1, или содержат по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, по существу идентичную выбранной аминокислотной последовательности. Кроме того, (ii) L-CDR1, L-CDR2 или L-CDR3 легкой цепи выбраны из аминокислотных последовательностей, перечисленных в табл. 2, или содержат одну или более чем одну аминокислотную последовательность, по существу идентичную выбранной аминокислотной последовательности.
- 6 045348
Идентичность последовательности по существу означает, что последовательность содержит изменения, но сохраняет эффекты, раскрытые в настоящем изобретении. Указанная последовательность идентична вариабельной области тяжелой цепи, раскрытой в одном из воплощений, приблизительно на 90%, 95% или 99%. Указанная последовательность идентична вариабельной области легкой цепи, раскрытой в других воплощениях, приблизительно на 90%, 95% или 99%. Например, в случае варианта, демонстрирующего приблизительно 90%, 95% или 99% идентичность последовательности антитела или антигенсвязывающего фрагмента, раскрытых в настоящем изобретении, любое изменение последовательности происходит в каркасной области вариабельной области, но не в CDR.
Таблица 1
Последовательности CDR вариабельной области тяжелой цепи в клоне антитела по изобретению
Идентификатор клона | CDR-H1 | SEQ ID NO: | CDR-H2 | SEQ ID NO: | CDR-H3 | SEQ ID NO: |
996-1 | GFTFSSYDMS | 1 | GIYHDGSSTYYADSVKG | 10 | VSGTLSEPYAFFFNAMDV | 50 |
996-2 | GFTFSSYDMS | 1 | GIYHDGSSTYYADSVKG | 10 | VSGTLSEPYAFFFNAMDV | 50 |
1226-1 | GFTFSNYDM S | 2 | SISPDGGSKYYADSVKG | 11 | DGGTHWLSLFDY | 51 |
1226-2 | GFTFSNYDM S | 2 | SISPDGGSKYYADSVKG | 11 | DGGTHWLSLFDY | 51 |
1564-1 | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
1564-2 | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
1564-ЗР | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
1564-DM | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDQGNTYYADSVKG | 13 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
1564-DMP | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDQGNTYYADSVKG | 13 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
48G5-1 | GFTFSDYDM S | 3 | SIYPNGSSKYYADSVKG | 14 | AGINCTTLRCS SYD AMD V | 53 |
48G5-2 | GFTFSDYDM S | 3 | SIYPNGSSKYYADSVKG | 14 | AGINCTTLRCS SYD AMD V | 53 |
49G11-1 | GFTFSSYDMS | 1 | GISYSGGSTYYADSVKG | 15 | VGLACTPHTCSSYDAMDV | 54 |
49G11-2 | GFTFSSYDMS | 1 | GISYSGGSTYYADSVKG | 15 | VGLACTPHTCSSYDAMDV | 54 |
54Н4-1 | GFTFSDYDM S | 3 | AISSDGSSAYYADSVKG | 16 | ATIYTSDAPWSSYDAMDV | 55 |
54Н4-2 | GFTFSDYDM S | 3 | AISSDGSSAYYADSVKG | 16 | ATIYTSDAPWSSYDAMDV | 55 |
60А11-1 | GFTFSNYDM S | 2 | VISHSSSGTYYADSVKG | 17 | VGVACGETDCSSYDAMDV | 56 |
60А11-2 | GFTFSNYDM S | 2 | VISHSSSGTYYADSVKG | 17 | VGVACGETDCSSYDAMDV | 56 |
60Н6-1 | GFTFSDYDM S | 3 | MIYSGSSSKYYADSVKG | 18 | ASIACTLQACSYDNAMDV | 57 |
60Н6-2 | GFTFSDYDM S | 3 | MIYSGSSSKYYADSVKG | 18 | ASIACTLQACSYDNAMDV | 57 |
60Н6-ЗР | GFTFSDYDM S | 3 | MIYSGSSSKYYADSVKG | 18 | ASIACTLQACSYDNAMDV | 57 |
- 7 045348
Alompseq | GFTFSSYDMS | 1 | AIYHDGGNTYYADSVK G | 19 | AASPCNVHDCSYDYAMD V | 58 |
A3_ompseq | GFTFSDYDM S | 3 | GISYNGGSKYYADSVKG | 20 | VGIMCSETGCSYDNAMDV | 59 |
A6_ompseq | GFTFSDYYM S | 4 | GISSDGGSIYYADSVKG | 21 | YASPTWLHILYYSDAMDV | 60 |
A8_ompseq | GFTFSNYDM S | 2 | MIYSGSSSKYYADSVKG | 18 | ALIPCTPEGCYSYDAMDV | 61 |
AlOompseq | GFTFSGYAM S | 5 | AISSDGGSTYYADSVKG | 22 | DPWFSRWTAFDY | 62 |
A12_ompseq | GFTFSDYDM S | 3 | GIYPDGGNIYYADSVKG | 23 | GIGQCELRECS SDDGMD V | 63 |
B5_ompseq | GFTFSDYDM S | 3 | AIYYDSGSIYYADSVKG | 24 | AVSECNPLNCSYSDAMDV | 64 |
B9_ompseq | GFTFSDYDM S | 3 | MIYSGSSSKYYADSVKG | 18 | VILGCSKHSCPSSDAMDV | 65 |
Bllompseq | GFTFSDYDM S | 3 | AISYDNGNKYYADSVK G | 25 | AGVACTEHMCSSYDAMD V | 66 |
C2_ompseq | GFTFSSYDMS | 1 | LIYPGGGNIYYADSVKG | 26 | GRVPCHPGGCSYAYGMDV | 67 |
C6_ompseq | GFTFSNYAM S | 6 | WISSGGGSTYYADSVKG | 27 | LGSLFPNATASYAYGMDV | 68 |
C7_ompseq | GFTFSNYDM S | 2 | SISYDSGSKYYADSVKG | 28 | AGILCTPTHCSSYDAMDV | 69 |
Cllompseq | GFTFSDYAM S | 7 | SIYPDDGNTYYADSVKG | 29 | DGWTPDGTHFDY | 70 |
D4_ompseq | GFTFSDYDM S | 3 | WISHSSSGTYYADSVKG | 30 | VGLSCAETACSSYDAMDV | 71 |
E6_ompseq | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | VGLDCDTTKCSSYDAMDV | 72 |
ElOompseq | GFTFSNYDM S | 2 | VISHSSSGTYYADSVKG | 17 | VGVACGETDCSSYDAMDV | 56 |
E12_ompseq | GFTFSDYDM S | 3 | WISHSSSGTYYADSVKG | 30 | VGLSCAETACSSYDAMDV | 71 |
F6_ompseq | GFTFSDYDM S | 3 | MIYSGSSSKYYADSVKG | 18 | AVRPCTDLHCS SDD AMD V | 73 |
Fllompseq | GFTFSDYDM S | 3 | AISYDSGSKYYADSVKG | 31 | VGRMCNITHCSSYDAMDV | 74 |
- 8 045348
F12_ompseq | GFTFSDYDM S | 3 | SIYYGSGNIYYADSVKG | 32 | DLTAPDGSSFDY | 75 |
G9_ompseq | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGSSIYYADSVK G | 33 | VGLECTVEHCYSYDGMDV | 76 |
C04-1 | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
C04-2 | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
C04-3P | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
C04-DM | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDQGNTYYADSVKG | 13 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
C04-DMP | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDQGNTYYADSVKG | 13 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
F06-1 | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
F06-2 | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
F06-3P | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
F06-DM | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDQGNTYYADSVKG | 13 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
F06-DMP | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDQGNTYYADSVKG | 13 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
BOI | GFTFSSYDMS | 1 | AISWDKAQPYYADSVK G | 34 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
A07(AR) | GFTFSSYDMS | 1 | AISWDQGNSYYADSVK G | 35 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
E09 | GFTFSSYDMS | 1 | AISWGQGKTYYADSVK G | 36 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
D03 | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGQTYYADSVKG | 37 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
A02 | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
B09 | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
BIO | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
E06 | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
H04 | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
A06 | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
A07(AM) | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
B02 | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
VH02-1 | GFTFSSYAMS | 8 | AISGSNGNTYYADSVKG | 38 | GVLTTLANWFDY | 77 |
VH02-2 | GFTFSSYAMS | 8 | AISGSNGNTYYADSVKG | 38 | GVLTTLANWFDY | 77 |
VH02-3P | GFTFSSYAMS | 8 | AISGSNGNTYYADSVKG | 38 | GVLTTLANWFDY | 77 |
VH02-DM | GFTFSSYAMS | 8 | AISGSQGNTYYADSVKG | 39 | GVLTTLANWFDY | 77 |
VH02-DMP | GFTFSSYAMS | 8 | AISGSQGNTYYADSVKG | 39 | GVLTTLANWFDY | 77 |
VH05-1 | GFTFSSYDMS | 1 | AISGDNGSTYYADSVKG | 40 | GVLTTLMNWFDS | 78 |
VH05-2 | GFTFSSYDMS | 1 | AISGDNGSTYYADSVKG | 40 | GVLTTLMNWFDS | 78 |
VH05-3P | GFTFSSYDMS | 1 | AISGDNGSTYYADSVKG | 40 | GVLTTLMNWFDS | 78 |
- 9 045348
VH05-DM | GFTFSSYDMS | 1 | AISGDQGSTYYADSVKG | 41 | GVLTTLMNWFDS | 78 |
VH05-DMP | GFTFSSYDMS | 1 | AISGDQGSTYYADSVKG | 41 | GVLTTLMNWFDS | 78 |
VH06-1 | GFTFSSYDMS | 1 | AISYSNGNTYYADSVKG | 42 | GVLTTLANWFDY | 77 |
VH06-2 | GFTFSSYDMS | 1 | AISYSNGNTYYADSVKG | 42 | GVLTTLANWFDY | 77 |
VH06-3P | GFTFSSYDMS | 1 | AISYSNGNTYYADSVKG | 42 | GVLTTLANWFDY | 77 |
VH06-DM | GFTFSSYDMS | 1 | AISYSQGNTYYADSVKG | 43 | GVLTTLANWFDY | 77 |
VH06-DMP | GFTFSSYDMS | 1 | AISYSQGNTYYADSVKG | 43 | GVLTTLANWFDY | 77 |
VH07-1 | GFTFSSYAMS | 8 | AISYDNGSTYYADSVKG | 44 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
VH07-2 | GFTFSSYAMS | 8 | AISYDNGSTYYADSVKG | 44 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
VH07-3 | GFTFSSYAMS | 8 | AISYDNGSTYYADSVKG | 44 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
VH07-DM | GFTFSSYAMS | 8 | AISYDQGSTYYADSVKG | 45 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
VH07-DMP | GFTFSSYAMS | 8 | AISYDQGSTYYADSVKG | 45 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
VH09-1 | GFTFSSYDMS | 1 | AISGDNGNTYYADSVKG | 46 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
VH09-2 | GFTFSSYDMS | 1 | AISGDNGNTYYADSVKG | 46 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
VH09-3P | GFTFSSYDMS | 1 | AISGDNGNTYYADSVKG | 46 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
VH09-DM | GFTFSSYDMS | 1 | AISGDQGNTYYADSVKG | 47 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
VH09-DMP | GFTFSSYDMS | 1 | AISGDQGNTYYADSVKG | 47 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
VH16-1 | GFTFSSYDMS | 1 | AISGSNGNTYYADSVKG | 38 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
VH16-2 | GFTFSSYDMS | 1 | AISGSNGNTYYADSVKG | 38 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
VH16-3P | GFTFSSYDMS | 1 | AISGSNGNTYYADSVKG | 38 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
VH16-DM | GFTFSSYDMS | 1 | AISGSQGNTYYADSVKG | 39 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
VH16-DMP | GFTFSSYDMS | 1 | AISGSQGNTYYADSVKG | 39 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
VH27-1 | GFTFSSYAMS | 8 | AISYDNGSTYYADSVKG | 44 | GVLTTLMNWFDS | 78 |
VH27-2 | GFTFSSYAMS | 8 | AISYDNGSTYYADSVKG | 44 | GVLTTLMNWFDS | 78 |
VH27-3P | GFTFSSYAMS | 8 | AISYDNGSTYYADSVKG | 44 | GVLTTLMNWFDS | 78 |
VH27-DM | GFTFSSYAMS | 8 | AISYDQGSTYYADSVKG | 45 | GVLTTLMNWFDS | 78 |
VH27-DMP | GFTFSSYAMS | 8 | AISYDQGSTYYADSVKG | 45 | GVLTTLMNWFDS | 78 |
VH32-1 | GFTFSSYAMS | 8 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLANWFDY | 77 |
VH32-2 | GFTFSSYAMS | 8 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLANWFDY | 77 |
VH32-3 | GFTFSSYAMS | 8 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLANWFDY | 77 |
VH32-DM | GFTFSSYAMS | 8 | AISYDQGNTYYADSVKG | 13 | GVLTTLANWFDY | 77 |
VH32-DMP | GFTFSSYAMS | 8 | AISYDQGNTYYADSVKG | 13 | GVLTTLANWFDY | 77 |
VH35-1 | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGSTYYADSVKG | 44 | GVLTTLMNWFDS | 78 |
VH35-2 | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGSTYYADSVKG | 44 | GVLTTLMNWFDS | 78 |
VH35-3 | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGSTYYADSVKG | 44 | GVLTTLMNWFDS | 78 |
VH35-DM | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDQGSTYYADSVKG | 45 | GVLTTLMNWFDS | 78 |
VH35-DMP | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDQGSTYYADSVKG | 45 | GVLTTLMNWFDS | 78 |
- 10045348
VH48 | GFTFSSYAMS | 8 | AISGSNGNTYYADSVKG | 38 | GVLTTLANWFDS | 79 |
VH55 | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLANWFDY | 77 |
VH81 | GFTFSSYDMS | 1 | AISGSNGSTYYADSVKG | 48 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
С12 | GFTFICPILS | 9 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMCLRHL | 80 |
1564-VL(N51D) | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
1564- VL(N95aD) | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
1564- VL(N95aH) | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
1564- VL(N95aK) | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
1564- VL(N95aR) | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDNGNTYYADSVKG | 12 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
1564-VH(N54D) | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDDGNTYYADSVKG | 49 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
1564-VH(N54Q) | GFTFSSYDMS | 1 | AISYDQGNTYYADSVKG | 13 | GVLTTLMNWFDY | 52 |
Таблица 2
Последовательности CDR вариабельной области легкой цепи в клоне антитела по изобретению
Идентификатор клона | CDR-L1 | SEQ ID NO: | CDR-L2 | SEQ ID NO: | CDR-L3 | SEQ ID NO: |
996-1 | TGSSSNIGSNAVN | 96 | SNSHRPS | 114 | ATWDYSLSGYV | 133 |
996-2 | TGSSSNIGSNAVN | 96 | SNSHRPS | 114 | ATWDYSLSGYV | 133 |
1226-1 | TGSSSNIGNNTVS | 97 | YDNHRPS | 115 | GSWDASLNGYV | 134 |
1226-2 | TGSSSNIGNNTVS | 97 | YDNHRPS | 115 | GSWDASLNGYV | 134 |
1564-1 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
1564-2 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
1564-3 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
1564-DM | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
1564-DMP | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
48G5-1 | SGSSSNIGNNDVS | 99 | DNNHRPS | 118 | AAWDDSLNAYV | 137 |
48G5-2 | SGSSSNIGNNDVS | 99 | DNNHRPS | 118 | AAWDDSLNAYV | 137 |
49G11-1 | TGSSSNIGSNTVY | 100 | SDSNRPS | 119 | GTWDDSLNGYV | 138 |
49G11-2 | TGSSSNIGSNTVY | 100 | SDSNRPS | 119 | GTWDDSLNGYV | 138 |
54H4-1 | SGSSSNIGSNTVT | 101 | ADSKRPS | 120 | GTWDDSLNAYV | 139 |
54H4-2 | SGSSSNIGSNTVT | 101 | ADSKRPS | 120 | GTWDDSLNAYV | 139 |
60A11-1 | SGSSSNIGSNAVT | 102 | DDNHRPS | 121 | GAWDDSLNGYV | 135 |
60A11-2 | SGSSSNIGSNAVT | 102 | DDNHRPS | 121 | GAWDDSLNGYV | 135 |
- 11 045348
60H6-1 | TGSSSNIGNNDVS | 103 | ANSHRPS | 122 | GSWDDSLNGYV | 140 |
60H6-2 | TGSSSNIGNNDVS | 103 | ANSHRPS | 122 | GSWDDSLNGYV | 140 |
60H6-3 | TGSSSNIGNNDVS | 103 | ANSHRPS | 122 | GSWDDSLNGYV | 140 |
Alompseq | SGSSSNIGNNAVT | 104 | DDSQRPS | 123 | GSWDDSLNGYV | 140 |
A3_ompseq | SGSSSNIGNNDVD | 105 | YDSQRPS | 124 | GTWDDSLNAYV | 139 |
A6_ompseq | SGSSSNIGNNAVT | 104 | DDSHRPS | 125 | GSWDSSLNGYV | 141 |
A8_ompseq | TGSSSNIGNNDVS | 103 | DDSKRPS | 126 | GAWDDSLNGYV | 135 |
AlOompseq | SGSSSNIGNNAVN | 106 | SNSKRPS | 127 | GTWDYSLSGYV | 142 |
A12_ompseq | TGSSSNIGNNDVN | 107 | SNSHRPS | 114 | GTWDDSLNGYV | 138 |
B5_ompseq | SGSSSNIGNNDVS | 99 | DDNQRPS | 128 | ATWDASLNGYV | 143 |
B9_ompseq | SGSSSNIGNNNVT | 108 | DDSQRPS | 123 | GSWDDSLNGYV | 140 |
Bllompseq | SGSSSNIGNNDVS | 99 | DDNHRPS | 121 | GAWDYSLSGYV | 144 |
C2_ompseq | SGSSFNIGSNDVS | 109 | DNSKRPS | 129 | GTWDDSLNGYV | 138 |
C6_ompseq | SGSSSNIGSNDVS | 110 | DNSQRPS | 648 | GSWDASLNAYV | 145 |
C7_ompseq | SGSSSNIGNNDVN | 111 | SNSHRPS | 114 | GTWDDSLNGYV | 138 |
Cllompseq | SGSSSNIGNNDVS | 99 | SNSHRPS | 114 | GSWDASLNGYV | 134 |
D4_ompseq | SGSSSNIGSNDVS | 110 | DDSNRPS | 130 | GSWDDSLNGYV | 140 |
E6_ompseq | SGSSSNIGNNDVN | 111 | SNSHRPS | 114 | GAWDYSLSAYV | 146 |
ElOompseq | SGSSSNIGSNAVT | 102 | DDNHRPS | 121 | GAWDDSLNGYV | 135 |
E12_ompseq | SGSSSNIGSNDVS | 110 | DDSNRPS | 130 | GSWDDSLNGYV | 140 |
F6_ompseq | SGSSSNIGNNDVS | 99 | DNNHRPS | 118 | AAWDDSLNAYV | 137 |
Fllompseq | TGSSSNIGSNYVS | 112 | DDSHRPS | 125 | GAWDDSLNGYV | 135 |
F12_ompseq | TGSSSNIGNNDVS | 103 | SDSQRPS | 131 | GAWDASLNGYV | 147 |
G9_ompseq | TGSSSNIGSNTVN | 113 | DNSQRPS | 648 | ASWDDSLNAYV | 148 |
C04-1 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWEQWLNGYV | 149 |
C04-2 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWEQWLNGYV | 149 |
C04-3 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWEQWLNGYV | 149 |
C04-DM | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWEQWLHGYV | 150 |
C04-DMP | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWEQWLHGYV | 150 |
F06-1 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GTWAGSLNGYV | 151 |
F06-2 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GTWAGSLNGYV | 151 |
F06-3 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GTWAGSLNGYV | 151 |
F06-DM | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GTWAGSLHGYV | 152 |
F06-DMP | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GTWAGSLHGYV | 152 |
BOI | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
A07(AR) | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
E09 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
- 12 045348
D03 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
A02 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDTTLNGYV | 153 |
B09 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWEESLNGYV | 154 |
BIO | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GSWDVSLNGYV | 155 |
E06 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDHSLNGYV | 156 |
H04 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDQSLNGYV | 157 |
A06 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GASWDEWLNGYV | 158 |
A07(AM) | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDETLNGYV | 159 |
B02 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GTWDDSLNGYV | 138 |
VH02-1 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH02-2 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH02-3 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH02-DM | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
VH02-DMP | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
VH05-1 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH05-2 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH05-3 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH05-DM | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
VH05-DMP | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
VH06-1 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH06-2 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH06-3 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH06-DM | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
VH06-DMP | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
VH07-1 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH07-2 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH07-3 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH07-DM | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
VH07-DMP | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
VH09-1 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH09-2 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH09-3 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH09-DM | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
VH09-DMP | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
VH16-1 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH16-2 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH16-3 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
- 13 045348
VH16-DM | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
VH16-DMP | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
VH27-1 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH27-2 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH27-3 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH27-DM | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
VH27-DMP | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
VH32-1 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH32-2 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH32-3 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH32-DM | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
VH32-DMP | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
VH35-1 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH35-2 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH35-3 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH35-DM | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
VH35-DMP | TGSSSNIGSNDVS | 98 | AQSNRPS | 117 | GAWDDSLHGYV | 136 |
VH48 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH55 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
VH81 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
С12 | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
1564-VL(N51D) | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ADSNRPS | 132 | GAWDDSLNGYV | 135 |
1564-VL(N95aD) | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLDGYV | 160 |
1564-VL(N95aH) | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLHGYV | 136 |
1564-VL(N95aK) | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLKGYV | 161 |
1564-VL(N95aR) | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLKGYV | 161 |
1564-VH(N54D) | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
1564-VH(N54Q) | TGSSSNIGSNDVS | 98 | ANSNRPS | 116 | GAWDDSLNGYV | 135 |
Каркасная область тяжелой цепи, выбранная из группы, состоящей из H-FR1, H-FR2, H-FR3 и НFR4, по настоящему изобретению может быть выбрана из аминокислотных последовательностей табл. 3. Каркасная область легкой цепи, выбранная из группы, состоящей из L-FR1, L-FR2, L-FR3 и L-FR4, по настоящему изобретению может быть выбрана из аминокислотных последовательностей табл. 4.
Конкретно, вариабельная область тяжелой цепи антитела против IGF1R по настоящему изобретению содержит H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3, описанные в табл. 1, или дополнительно H-FR1, H-FR2, НFR3 и H-FR4, показанные в табл. 3.
Вариабельная область легкой цепи антитела против IGF1R по настоящему изобретению содержит L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3, показанные в табл. 3, или дополнительно L-FR1, L-FR2, L-FR3 и L-FR4, показанные в табл. 4. В одном воплощении настоящего изобретения антитело против IGF1R или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDRН1, CDR-H2 и CDR-H3 каждого клона, выбранные из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, показанных в табл. 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 каждого клона, выбранные из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, показанных в табл. 2.
В одном воплощении настоящего изобретения аминокислотная модификация, например, устранение дезамидирования аминокислоты в Fc-области антитела против IGF1R, может улучшать ФК (фармакокинетику) антитела благодаря снижению его клиренса в крови без изменения способности к связыванию с ECD антигена IGF1R и приводить к увеличению периода полувыведения. В одном примере аминокислотное положение в антителе против IGF1R, в котором устраняют дезамидирование, может представлять собой N51D в L-CDR2 легкой цепи, или N95aK, N95aH, N95aR или N95aD в L-CDR3 легкой цепи, или N54D или N54Q в H-CDR2 тяжелой цепи клона 1564.
- 14045348
Таблица 3
Последовательности каркасных областей вариабельной области тяжелой цепи в клоне антитела по изобретению
Идентификатор клона | H-FR1 | SEQ ID NO: | H-FR2 | SEQ ID NO: | H-FR3 | SEQ ID NO: | H-FR4 | SEQ ID NO: |
996-1 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 87 | WGQGTL VTVSS | 92 |
996-2 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 87 | WGQGTL VTVSS | 92 |
1226-1 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
1226-2 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
1564-1 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
1564-2 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
1564-ЗР | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
1564-DM | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
1564-DMP | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
48G5-1 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
48G5-2 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
49G11-1 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
49G11-2 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
54Н4-1 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
54Н4-2 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL ATVSS | 93 |
- 15 045348
60A11-1 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
60A11-2 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
60H6-1 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
60H6-2 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
60H6-3P | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
Alompseq | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
A3_ompseq | EVQLLESGGGLV QTGGSLRLSCAA S | 82 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
A6_ompseq | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
A8_ompseq | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAR | 89 | WGQGTL VTVSS | 92 |
AlOompseq | EVQLLESGGGLA QPGGSLRLSCAA S | 83 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAR | 89 | WGQGTL VTVSS | 92 |
A12_ompseq | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAR | 89 | WGQGTL VTVSS | 92 |
B5_ompseq | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
- 16 045348
B9_ompseq | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
Bllompseq | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
C2_ompseq | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAR | 89 | WGQGTL VTVSS | 92 |
C6_ompseq | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
C7_ompseq | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
Cllompseq | EVQLLESGGGLV QTGGSLRLSCAA S | 82 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
D4_ompseq | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDAA VYYCAK | 90 | WGQGTL VTVSS | 92 |
E6_ompseq | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAR | 89 | WGQGTL VTVSS | 92 |
ElOompseq | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNPKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 91 | WGQGTL VTVSS | 92 |
E12_ompseq | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDAA VYYCAK | 90 | WGQGTL VTVSS | 92 |
F6_ompseq | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
Fllompseq | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
- 17 045348
F12_ompseq | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTQ VTVSS | 94 |
G9_ompseq | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
C04-1 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
C04-2 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK cLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
C04-3P | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK cLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
C04-DM | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
C04-DMP | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
F06-1 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
F06-2 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
F06-3P | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
F06-DM | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
F06-DMP | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
- 18 045348
B01 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
A07(AR) | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
E09 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
D03 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
A02 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
B09 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
BIO | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
E06 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
H04 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
A06 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
A07(AM) | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
B02 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
- 19 045348
VH02-1 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH02-2 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH02-3P | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH02-DM | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH02-DMP | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH05-1 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH05-2 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH05-3P | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH05-DM | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH05-DMP | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH06-1 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH06-2 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
- 20 045348
VH06-3P | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH06-DM | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH06-DMP | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH07-1 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH07-2 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH07-3 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH07-DM | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH07-DMP | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH09-1 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH09-2 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH09-3P | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH09-DM | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
- 21 045348
VH09-DMP | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH16-1 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH16-2 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH16-3P | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH16-DM | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH16-DMP | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH27-1 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH27-2 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH27-3P | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH27-DM | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH27-DMP | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH32-1 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
- 22 045348
VH32-2 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH32-3 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH32-DM | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH32-DMP | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH35-1 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH35-2 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH35-3 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH35-DM | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH35-DMP | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK CLEWVS | 86 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH48 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH55 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
VH81 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
- 23 045348
С12 | EVQLLESGGGLV QPGGSLRRSCAA S | 84 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGSL VTVSS | 95 |
1564- VL(N51D) | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
1564- VL(N95aD) | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
1564- VL(N95aH) | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
1564- VL(N95aK) | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
1564- VL(N95aR) | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
1564- VH(N54D) | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
1564- VH(N54Q) | EVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAA S | 81 | WVRQAPGK GLEWVS | 85 | RFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAV YYCAK | 88 | WGQGTL VTVSS | 92 |
Таблица 4
Последовательности каркасных областей вариабельной области легкой цепи в клоне антитела по изобретению
Идентификатор клона | L-FR1 | SEQ ID NO: | L-FR2 | SEQ ID NO: | L-FR3 | SEQ ID NO: | L-FR4 | SEQ ID NO: |
996-1 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
996-2 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
1226-1 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
1226-2 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
-24045348
1564-1 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
1564-2 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
1564-3 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
1564-DM | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
1564-DMP | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
48G5-1 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
48G5-2 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
49G11-1 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
49G11-2 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
54H4-1 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
54H4-2 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
60A11-1 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
60A11-2 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
60H6-1 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
60H6-2 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
60H6-3 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
Alompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRATISC | 163 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
A3_ompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
- 25 045348
A6_ompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
A8_ompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
AlOompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
A12_ompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDGADYYC | 168 | FGGGT KLTVL | 169 |
B5_ompseq | QSVLTQPPSAS GPPGQRVTISC | 164 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
B9_ompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
Bllompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
C2_ompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
C6_ompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
C7_ompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDGADYYC | 168 | FGGGT KLTVL | 169 |
Cllompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
D4_ompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
E6_ompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
ElOompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTFL | 171 |
E12_ompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
F6_ompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
Fllompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGGGT KLTVL | 169 |
F12_ompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
- 26 045348
G9_ompseq | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
C04-1 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
C04-2 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
C04-3 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
C04-DM | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
C04-DMP | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
F06-1 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
F06-2 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
F06-3 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
F06-DM | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
F06-DMP | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
BOI | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGGGT KLTVL | 169 |
A07(AR) | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGGGT KLTVL | 169 |
E09 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGGGT KLTVL | 169 |
D03 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGGGT KLTVL | 169 |
A02 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGGGT KLTVL | 169 |
B09 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGGGT KLTVL | 169 |
BIO | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGGGT KLTVL | 169 |
- 27 045348
E06 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGGGT KLTVL | 169 |
H04 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGGGT KLTVL | 169 |
A06 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGGGT KLTVL | 169 |
A07(AM) | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGGGT KLTVL | 169 |
B02 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGGGT KLTVL | 169 |
VH02-1 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
VH02-2 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH02-3 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH02-DM | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH02-DMP | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH05-1 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
VH05-2 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH05-3 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH05-DM | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH05-DMP | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH06-1 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
VH06-2 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH06-3 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
- 28 045348
VH06-DM | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH06-DMP | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH07-1 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
VH07-2 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH07-3 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH07-DM | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH07-DMP | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH09-1 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
VH09-2 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH09-3 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH09-DM | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH09-DMP | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH16-1 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
VH16-2 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH16-3 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH16-DM | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH16-DMP | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH27-1 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
- 29 045348
VH27-2 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH27-3 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH27-DM | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH27-DMP | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH32-1 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
VH32-2 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH32-3 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH32-DM | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH32-DMP | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH35-1 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
VH35-2 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH35-3 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH35-DM | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH35-DMP | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGCGT KLTVL | 170 |
VH48 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
VH55 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
VH81 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
C12 | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
1564- VL(N51D) | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGGGT KLTVL | 169 |
1564- VL(N95aD) | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGGGT KLTVL | 169 |
1564- VL(N95aH) | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGGGT KLTVL | 169 |
1564- VL(N95aK) | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGGGT KLTVL | 169 |
1564- VL(N95aR) | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVSDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 167 | FGGGT KLTVL | 169 |
1564- VH(N54D) | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
1564- VH(N54Q) | QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC | 162 | WYQQLPG TAPKLLIY | 165 | GVPDRFSGSKSGTSASL AISGLRSEDEADYYC | 166 | FGGGT KLTVL | 169 |
- 30 045348
Антитело против IGF1R по настоящему изобретению может представлять собой антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, и различные вариабельные области тяжелой и легкой цепи, раскрытые в настоящем описании, показаныв табл. 5 и 6, CDR1 CDR3 и каркасные области 1-4 каждого клона описаны как SEQ ID NO.
Вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи, описанные в табл. 5 и 6, можно свободно комбинировать для получения различных типов антител. Примеры комбинаций вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи показаны в табл. 5 и 6.
Таблица 5 ___________Вариабельная область тяжелой цепи антитела по изобретению___________
SEQ ID NO | Тяжелая цепь (VH) | CDR- Ш | CDR- Н2 | CDR- НЗ | Н- FR1 | Н- FR2 | Н- FR3 | Н- FR4 |
172 | 996-1 | 1 | 10 | 50 | 81 | 85 | 87 | 92 |
173 | 996-2 | 1 | 10 | 50 | 81 | 86 | 87 | 92 |
174 | 1226-1 | 2 | и | 51 | 81 | 85 | 88 | 92 |
175 | 1226-2 | 2 | и | 51 | 81 | 86 | 88 | 92 |
176 | 1564-1 | 1 | 12 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
177 | 1564-2 | 1 | 12 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
178 | 1564-3 | 1 | 12 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
- 31 045348
179 | 1564-DM | 1 | 13 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
180 | 1564-DMP | 1 | 13 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
181 | 48G5-1 | 3 | 14 | 53 | 81 | 85 | 88 | 92 |
182 | 48G5-2 | 3 | 14 | 53 | 81 | 86 | 88 | 92 |
183 | 49G11-1 | 1 | 15 | 54 | 81 | 85 | 88 | 92 |
184 | 49G11-2 | 1 | 15 | 54 | 81 | 86 | 88 | 92 |
185 | 54H4-1 | 3 | 16 | 55 | 81 | 85 | 88 | 92 |
186 | 54H4-2 | 3 | 16 | 55 | 81 | 86 | 88 | 93 |
187 | 60A11-1 | 2 | 17 | 56 | 81 | 85 | 88 | 92 |
188 | 60A11-2 | 2 | 17 | 56 | 81 | 86 | 88 | 92 |
189 | 60H6-1 | 3 | 18 | 57 | 81 | 85 | 88 | 92 |
190 | 60H6-2 | 3 | 18 | 57 | 81 | 86 | 88 | 92 |
191 | 60H6-3 | 3 | 18 | 57 | 81 | 86 | 88 | 92 |
192 | A1OMPSEQ | 1 | 19 | 58 | 81 | 85 | 88 | 92 |
193 | A3OMPSEQ | 3 | 20 | 59 | 82 | 85 | 88 | 92 |
194 | A6OMPSEQ | 4 | 21 | 60 | 81 | 85 | 88 | 92 |
195 | A8OMPSEQ | 2 | 18 | 61 | 81 | 85 | 89 | 92 |
196 | A10OMPSEQ | 5 | 22 | 62 | 83 | 85 | 89 | 92 |
197 | A12OMPSEQ | 3 | 23 | 63 | 81 | 85 | 89 | 92 |
198 | B5OMPSEQ | 3 | 24 | 64 | 81 | 85 | 88 | 92 |
199 | B9OMPSEQ | 3 | 18 | 65 | 81 | 85 | 88 | 92 |
200 | B11OMPSEQ | 3 | 25 | 66 | 81 | 85 | 88 | 92 |
201 | C2OMPSEQ | 1 | 26 | 67 | 81 | 85 | 89 | 92 |
202 | C6OMPSEQ | 6 | 27 | 68 | 81 | 85 | 88 | 92 |
203 | C7OMPSEQ | 2 | 28 | 69 | 81 | 85 | 88 | 92 |
204 | C11OMPSEQ | 7 | 29 | 70 | 82 | 85 | 88 | 92 |
205 | D4OMPSEQ | 3 | 30 | 71 | 81 | 85 | 90 | 92 |
206 | E06OMPSEQ | 1 | 12 | 72 | 81 | 85 | 89 | 92 |
207 | E10OMPSEQ | 2 | 17 | 56 | 81 | 85 | 91 | 92 |
208 | E12OMPSEQ | 3 | 30 | 71 | 81 | 85 | 90 | 92 |
209 | F06OMPSEQ | 3 | 18 | 73 | 81 | 85 | 88 | 92 |
- 32 045348
210 | F11OMPSEQ | 3 | 31 | 74 | 81 | 85 | 88 | 92 |
211 | F12OMPSEQ | 3 | 32 | 75 | 81 | 85 | 88 | 94 |
212 | G9OMPSEQ | 1 | 33 | 76 | 81 | 85 | 88 | 92 |
213 | C04-1 | 1 | 12 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
214 | C04-2 | 1 | 12 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
215 | C04-3 | 1 | 12 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
216 | C04-DM | 1 | 13 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
217 | C04-DMP | 1 | 13 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
218 | F06-1 | 1 | 12 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
219 | F06-2 | 1 | 12 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
220 | F06-3 | 1 | 12 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
221 | F06-DM | 1 | 13 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
222 | F06-DMP | 1 | 13 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
223 | BOI | 1 | 34 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
224 | A07(AR) | 1 | 35 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
225 | E09 | 1 | 36 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
226 | D03 | 1 | 37 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
227 | A02 | 1 | 12 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
228 | B09 | 1 | 12 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
229 | BIO | 1 | 12 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
230 | E06 | 1 | 12 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
231 | H04 | 1 | 12 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
232 | A06 | 1 | 12 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
233 | A07(AM) | 1 | 12 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
234 | B02 | 1 | 12 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
235 | VH2-1 | 8 | 38 | 77 | 81 | 85 | 88 | 92 |
236 | VH2-2 | 8 | 38 | 77 | 81 | 86 | 88 | 92 |
237 | VH2-3 | 8 | 38 | 77 | 81 | 86 | 88 | 92 |
238 | VH2-DM | 8 | 39 | 77 | 81 | 86 | 88 | 92 |
239 | VH2-DMP | 8 | 39 | 77 | 81 | 86 | 88 | 92 |
240 | VH5-1 | 1 | 40 | 78 | 81 | 85 | 88 | 92 |
- 33 045348
241 | VH5-2 | 1 | 40 | 78 | 81 | 86 | 88 | 92 |
242 | VH5-3 | 1 | 40 | 78 | 81 | 86 | 88 | 92 |
243 | VH5-DM | 1 | 41 | 78 | 81 | 86 | 88 | 92 |
244 | VH5-DMP | 1 | 41 | 78 | 81 | 86 | 88 | 92 |
245 | VH6-1 | 1 | 42 | 77 | 81 | 85 | 88 | 92 |
246 | VH6-2 | 1 | 42 | 77 | 81 | 86 | 88 | 92 |
247 | VH6-3 | 1 | 42 | 77 | 81 | 86 | 88 | 92 |
248 | VH6-DM | 1 | 43 | 77 | 81 | 86 | 88 | 92 |
249 | VH6-DMP | 1 | 43 | 77 | 81 | 86 | 88 | 92 |
250 | VH7-1 | 8 | 44 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
251 | VH7-2 | 8 | 44 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
252 | VH7-3 | 8 | 44 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
253 | VH7-DM | 8 | 45 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
254 | VH7-DMP | 8 | 45 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
255 | VH9-1 | 1 | 46 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
256 | VH9-2 | 1 | 46 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
257 | VH9-3 | 1 | 46 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
258 | VH9-DM | 1 | 47 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
259 | VH9-DMP | 1 | 47 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
260 | VH16-1 | 1 | 38 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
261 | VH16-2 | 1 | 38 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
262 | VH16-3 | 1 | 38 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
263 | VH16-DM | 1 | 39 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
264 | VH16-DMP | 1 | 39 | 52 | 81 | 86 | 88 | 92 |
265 | VH27-1 | 8 | 44 | 78 | 81 | 85 | 88 | 92 |
266 | VH27-2 | 8 | 44 | 78 | 81 | 86 | 88 | 92 |
267 | VH27-3 | 8 | 44 | 78 | 81 | 86 | 88 | 92 |
268 | VH27-DM | 8 | 45 | 78 | 81 | 86 | 88 | 92 |
269 | VH27-DMP | 8 | 45 | 78 | 81 | 86 | 88 | 92 |
270 | VH32-1 | 8 | 12 | 77 | 81 | 85 | 88 | 92 |
271 | VH32-2 | 8 | 12 | 77 | 81 | 86 | 88 | 92 |
- 34 045348
272 | VH32-3 | 8 | 12 | 77 | 81 | 86 | 88 | 92 |
273 | VH32-DM | 8 | 13 | 77 | 81 | 86 | 88 | 92 |
274 | VH32-DM | 8 | 13 | 77 | 81 | 86 | 88 | 92 |
275 | VH35-1 | 1 | 44 | 78 | 81 | 85 | 88 | 92 |
276 | VH35-2 | 1 | 44 | 78 | 81 | 86 | 88 | 92 |
277 | VH35-3 | 1 | 44 | 78 | 81 | 86 | 88 | 92 |
278 | VH35-DM | 1 | 45 | 78 | 81 | 86 | 88 | 92 |
279 | VH35-DMP | 1 | 45 | 78 | 81 | 86 | 88 | 92 |
280 | VH48 | 8 | 38 | 79 | 81 | 85 | 88 | 92 |
281 | VH55 | 1 | 12 | 77 | 81 | 85 | 88 | 92 |
282 | VH81 | 1 | 48 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
283 | С12 | 9 | 12 | 80 | 84 | 85 | 88 | 95 |
284 | 1564-VL(N51D) | 1 | 12 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
285 | 1564-VL(N95aD) | 1 | 12 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
286 | 1564-VL(N95aH) | 1 | 12 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
287 | 1564-VL(N95aK) | 1 | 12 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
288 | 1564-VL(N95aR) | 1 | 12 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
289 | 1564-VH(N54D) | 1 | 49 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
290 | 1564-VH(N54Q) | 1 | 13 | 52 | 81 | 85 | 88 | 92 |
Таблица 6
Вариабельная область легкой цепи антитела по изобретению
SEQ ID NO | Легкая цепь (VH) | CDR- L1 | CDR- L2 | CDR- L3 | L- FR1 | L- FR2 | L- FR3 | L- FR4 |
291 | 996-1 | 96 | 114 | 133 | 162 | 165 | 166 | 169 |
292 | 996-2 | 96 | 114 | 133 | 162 | 165 | 166 | 170 |
293 | 1226-1 | 97 | 115 | 134 | 162 | 165 | 166 | 169 |
294 | 1226-2 | 97 | 115 | 134 | 162 | 165 | 166 | 170 |
295 | 1564-1 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 169 |
296 | 1564-2 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 167 | 170 |
297 | 1564-3 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 170 |
298 | 1564-DM | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 167 | 170 |
- 35 045348
299 | 1564-DMP | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 166 | 170 |
300 | 48G5-1 | 99 | 118 | 137 | 162 | 165 | 166 | 169 |
301 | 48G5-2 | 99 | 118 | 137 | 162 | 165 | 166 | 170 |
302 | 49G11-1 | 100 | 119 | 138 | 162 | 165 | 166 | 169 |
303 | 49G11-2 | 100 | 119 | 138 | 162 | 165 | 166 | 170 |
304 | 54H4-1 | 101 | 120 | 139 | 162 | 165 | 166 | 169 |
305 | 54H4-2 | 101 | 120 | 139 | 162 | 165 | 166 | 170 |
306 | 60A11-1 | 102 | 121 | 135 | 162 | 165 | 166 | 169 |
307 | 60A11-2 | 102 | 121 | 135 | 162 | 165 | 166 | 170 |
308 | 60H6-1 | 103 | 122 | 140 | 162 | 165 | 166 | 169 |
309 | 60H6-2 | 103 | 122 | 140 | 162 | 165 | 167 | 170 |
310 | 60H6-3 | 103 | 122 | 140 | 162 | 165 | 166 | 170 |
311 | A1OMPSEQ | 104 | 123 | 140 | 163 | 165 | 166 | 169 |
312 | A3OMPSEQ | 105 | 124 | 139 | 162 | 165 | 166 | 169 |
313 | A6OMPSEQ | 104 | 125 | 141 | 162 | 165 | 166 | 169 |
314 | A8OMPSEQ | 103 | 126 | 135 | 162 | 165 | 166 | 169 |
315 | A10OMPSEQ | 106 | 127 | 142 | 162 | 165 | 166 | 169 |
316 | A12OMPSEQ | 107 | 114 | 138 | 162 | 165 | 168 | 169 |
317 | B5OMPSEQ | 99 | 128 | 143 | 164 | 165 | 166 | 169 |
318 | B9OMPSEQ | 108 | 123 | 140 | 162 | 165 | 166 | 169 |
319 | B11OMPSEQ | 99 | 121 | 144 | 162 | 165 | 166 | 169 |
320 | C2OMPSEQ | 109 | 129 | 138 | 162 | 165 | 166 | 169 |
321 | C6OMPSEQ | 110 | 648 | 145 | 162 | 165 | 166 | 169 |
322 | C7OMPSEQ | 111 | 114 | 138 | 162 | 165 | 166 | 169 |
323 | C11OMPSEQ | 99 | 114 | 134 | 162 | 165 | 166 | 169 |
324 | D4OMPSEQ | 110 | 130 | 140 | 162 | 165 | 166 | 169 |
325 | E06OMPSEQ | 111 | 114 | 146 | 162 | 165 | 166 | 169 |
326 | E10OMPSEQ | 102 | 121 | 135 | 162 | 165 | 166 | 171 |
327 | E12OMPSEQ | 110 | 130 | 140 | 162 | 165 | 166 | 169 |
328 | F06OMPSEQ | 99 | 118 | 137 | 162 | 165 | 166 | 169 |
-36045348
329 | F11OMPSEQ | 112 | 125 | 135 | 162 | 165 | 167 | 169 |
330 | F12OMPSEQ | 103 | 131 | 147 | 162 | 165 | 166 | 169 |
331 | G9OMPSEQ | 113 | 648 | 148 | 162 | 165 | 166 | 169 |
332 | C04-1 | 98 | 116 | 149 | 162 | 165 | 166 | 169 |
333 | C04-2 | 98 | 116 | 149 | 162 | 165 | 167 | 170 |
334 | C04-3 | 98 | 116 | 149 | 162 | 165 | 166 | 170 |
335 | C04-DM | 98 | 117 | 150 | 162 | 165 | 167 | 170 |
336 | C04-DMP | 98 | 117 | 150 | 162 | 165 | 166 | 170 |
337 | F06-1 | 98 | 116 | 151 | 162 | 165 | 166 | 169 |
338 | F06-2 | 98 | 116 | 151 | 162 | 165 | 167 | 170 |
339 | F06-3 | 98 | 116 | 151 | 162 | 165 | 166 | 170 |
340 | F06-DM | 98 | 117 | 152 | 162 | 165 | 167 | 170 |
341 | F06-DMP | 98 | 117 | 152 | 162 | 165 | 166 | 170 |
342 | BOI | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 167 | 169 |
343 | A07(AR) | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 167 | 169 |
344 | E09 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 167 | 169 |
345 | D03 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 167 | 169 |
346 | A02 | 98 | 116 | 153 | 162 | 165 | 167 | 169 |
347 | B09 | 98 | 116 | 154 | 162 | 165 | 167 | 169 |
348 | BIO | 98 | 116 | 155 | 162 | 165 | 167 | 169 |
349 | E06 | 98 | 116 | 156 | 162 | 165 | 167 | 169 |
350 | H04 | 98 | 116 | 157 | 162 | 165 | 167 | 169 |
351 | A06 | 98 | 116 | 158 | 162 | 165 | 167 | 169 |
352 | A07(AM) | 98 | 116 | 159 | 162 | 165 | 167 | 169 |
353 | B02 | 98 | 116 | 138 | 162 | 165 | 167 | 169 |
354 | VH2-1 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 169 |
355 | VH2-2 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 167 | 170 |
356 | VH2-3 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 170 |
357 | VH2-DM | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 167 | 170 |
358 | VH2-DMP | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 166 | 170 |
- 37 045348
359 | VH5-1 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 169 |
360 | VH5-2 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 167 | 170 |
361 | VH5-3 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 170 |
362 | VH5-DM | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 167 | 170 |
363 | VH5-DMP | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 166 | 170 |
364 | VH6-1 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 169 |
365 | VH6-2 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 167 | 170 |
366 | VH6-3 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 170 |
367 | VH6-DM | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 167 | 170 |
368 | VH6-DMP | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 166 | 170 |
369 | VH7-1 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 169 |
370 | VH7-2 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 167 | 170 |
371 | VH7-3 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 170 |
372 | VH7-DM | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 167 | 170 |
373 | VH7-DMP | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 166 | 170 |
374 | VH9-1 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 169 |
375 | VH9-2 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 167 | 170 |
376 | VH9-3 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 170 |
377 | VH9-DM | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 167 | 170 |
378 | VH9-DMP | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 166 | 170 |
379 | VH16-1 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 169 |
380 | VH16-2 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 167 | 170 |
381 | VH16-3 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 170 |
382 | VH16-DM | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 167 | 170 |
383 | VH16-DMP | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 166 | 170 |
384 | VH27-1 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 169 |
385 | VH27-2 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 167 | 170 |
386 | VH27-3 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 170 |
387 | VH27-DM | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 167 | 170 |
388 | VH27-DMP | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 166 | 170 |
- 38 045348
389 | VH32-1 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 169 |
390 | VH32-2 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 167 | 170 |
391 | VH32-3 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 170 |
392 | VH32-DM | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 167 | 170 |
393 | VH32-DM | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 166 | 170 |
394 | VH35-1 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 169 |
395 | VH35-2 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 167 | 170 |
396 | VH35-3 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 170 |
397 | VH35-DM | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 167 | 170 |
398 | VH35-DMP | 98 | 117 | 136 | 162 | 165 | 166 | 170 |
399 | VH48 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 169 |
400 | VH55 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 169 |
401 | VH81 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 169 |
402 | С12 | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 169 |
403 | 1564-VL(N51D) | 98 | 132 | 135 | 162 | 165 | 167 | 169 |
404 | 1564-VL(N95aD) | 98 | 116 | 160 | 162 | 165 | 167 | 169 |
405 | 1564-VL(N95aH) | 98 | 116 | 136 | 162 | 165 | 167 | 169 |
406 | 1564-VL(N95aK) | 98 | 116 | 161 | 162 | 165 | 167 | 169 |
407 | 1564-VL(N95aR) | 98 | 116 | 161 | 162 | 165 | 167 | 169 |
408 | 1564-VH(N54D) | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 169 |
409 | 1564-VH(N54Q) | 98 | 116 | 135 | 162 | 165 | 166 | 169 |
Различные вариабельные области тяжелой и легкой цепи, раскрытые здесь, представленыв табл. 5 и 6. Каждая вариабельная область может быть связана с константными областями тяжелой и легкой цепи с образованием соответствующих тяжелых и легких цепей интактного антитела. Примером комбинации вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, составляющих антитело против IGF1R по настоящему изобретению, может быть комбинация вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи с одинаковым названием клона, как описано в табл. 5 и табл. 6.
В одном конкретном примере настоящего изобретения антитело против IGF1R или его антигенсвязывающий фрагмент содержат по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из:
CDR1 тяжелой цепи (H-CDR1), содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1-9,
CDR2 тяжелой цепи (H-CDR2), содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10-49,
CDR3 тяжелой цепи (H-CDR3), содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:50-80;
CDR1 легкой цепи (L-CDR1), содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:96-113,
CDR2 легкой цепи (L-CDR2), содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:114-132, и
CDR3 легкой цепи (L-CDR3), содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:133-161.
Конкретно, антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи (H-CDR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1-9, CDR2 тяжелой цепи (H-CDR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:10-49, и CDR3 тяжелой цепи (H-CDR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:50-80, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи (L-CDR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:96-113, CDR2 легкой цепи (L-CDR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:114-132, и CDR3 легкой цепи (LCDR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:133-161.
Антитело против IGF1R или его антигенсвязывающий фрагмент, специфично распознают и связываются по меньшей мере с одной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Y775, Р776, F778,
- 39 045348
R650, S791, L798, Glu779, L641, Н808, Е809, L813, V397, D435, W434, Y460 и С488 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:410. Конкретно, антитело против IGF1R или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут связываться по меньшей мере с одним, выбранным из сайтов связывания 1-3 белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:410. Сайт связывания 1 содержит по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Y775, Р776, F778, R650, S791, L798 и Glu779, сайт связывания 2 содержит по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из L641, Н808, Е809 и L813, и сайт связывания 3 содержит по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из V397, D435, W434, Y460 и С488.
Вариабельная область тяжелой цепи антитела или антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению может содержать каркасную область 1 тяжелой цепи (H-FR1), расположенную на N-конце H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:81-84, каркасную область тяжелой цепи (H-FR2), расположенную между H-CDR1 и H-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:85-86, каркасную область тяжелой цепи (H-FR3), расположенную между H-CDR2 и H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:87-91, и каркасную область тяжелой цепи (H-FR4), расположенную на С-конце H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:92-95.
Вариабельная область легкой цепи антитела или антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению может содержать каркасную область 1 легкой цепи (L-FR1), расположенную на N-конце LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:162-164, каркасную область легкой цепи (L-FR2), расположенную между L-CDR1 и L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:165, каркасную область легкой цепи (L-FR3), расположенную между L-CDR2 и L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:166-168, и каркасную область легкой цепи (L-FR4), расположенную на С-конце L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:169-171.
Каждая из вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи, раскрытыхв табл. 5 и 6, могут быть использованы как отдельные доменные антитела, могут быть свободно скомбинированы друг с другом с образованием различных антител и связаны в одноцепочечной форме с получением одноцепочечных антител, таких как scFv.
В настоящем описании доменное антитело представляет собой иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, содержащий только вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи. В одном воплощении две или более VH-области связаны ковалентной связью посредством пептидного линкера с образованием доменного антитела. Две VH-области этого бивалентного доменного антитела могут быть направлены на один и тот же антиген или на разные антигены.
Антигенсвязывающие фрагменты антител против IGF1R по настоящему изобретению могут представлять собой фрагмент антитела, выбранный из scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab', F(ab')2, минитела и диатела, включая фрагменты антител, содержащие один или более чем один гипервариабельный участок.
Среди антигенсвязывающих фрагментов, Fab содержит вариабельную область легкой цепи, вариабельную область тяжелой цепи, константную область легкой цепи и первую константную область (СН1) тяжелой цепи и имеет один сайт связывания антигена. Fab' имеет шарнирную область в составе Fab, содержащую один или более чем один цистеиновый остаток, на С-конце домена СН1 тяжелой цепи. F(ab')2антитело получают связыванием двух Fab' с образованием дисульфидной связи между цистеиновыми остатками шарнирных областей Fab'.
Fv представляет собой минимальный фрагмент антитела, имеющий только вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, и включает одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv) и двуцепочечные вариабельные фрагменты (Fv). В двуцепочечном Fv вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи могут быть связаны нековалентными связями. В одноцепочечном Fv вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи связаны ковалентно, напрямую или через пептидный линкер, или связаны напрямую на С-конце с образованием структуры, подобной димеру scFv (di-scFv), такой как двуцепочечный Fv. В настоящем изобретении одноцепочечный Fv представляет собой единую полипептидную цепь антигенсвязывающей области, где вариабельные области тяжелой и легкой цепи связаны напрямую или через линкер, и может представлять собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из scFv, имеющего одну цепь, связанную с вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи, формы структуры, подобной димеру scFv (di-scFv), scFv-Fc, где вариабельная область тяжелой цепи, вариабельная область легкой цепи и Fc связаны в форме единой цепи, и тому подобного.
Пептидный линкер может быть таким, как описано выше, и может иметь длину, например, от 1 до 100 аминокислот, такую как от 2 до 50 или от 5 до 25 аминокислот, и пептидный линкер может иметь различную длину в пределах интервала, не влияющего на функцию антитела. Типы аминокислот, входящих в пептидный линкер, могут включать одну или более чем одну аминокислоту, выбранную из груп- 40 045348 пы, состоящей, например, из Gly, Ser и Leu, и конкретные примеры включают остатки Gly и Ser или остатки Leu и Ser. В одном конкретном примере пептидный линкер может представлять собой (G4S)n, где n представляет собой число повторений (G4S), представленное целым числом от 1 до 10, таким как от 2 до 5, особенно 3 или 4. Примером пептидного линкера может быть пептид, состоящий из аминокислот
SEQ ID NO:411 или 412.
SEQ ID NO:411: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS.
SEQ ID NO:412: GGGGSGGGGSGGGGS.
Одноцепочечный Fv (scFv) может быть получен слиянием ДНК, кодирующей пептидный линкер, между ДНК, кодирующими полипептиды двух вариабельных доменов (VL и VH). Полученный полипептид может образовывать антигенсвязывающие мономеры или мультимеры (например, димеры, тримеры или тетрамеры), в зависимости от длины гибкого линкера между двумя вариабельными доменами, с формированием их пространственной структуры. При комбинировании полипептидов, содержащих разные VL и VH, могут быть получены мультимерные scFv, связывающиеся с разными эпитопами.
Антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с использованием протеолитических ферментов (например, рестрикционное расщепление полноразмерного антитела папаином с получением Fab и расщепление пепсином с получением F(ab')2-фрагмента) или с применением генетической рекомбинантной технологии.
Одноцепочечные антитела, раскрытые в настоящем описании, включают, без ограничения, scFv, содержащие комбинации доменов вариабельных областей тяжелой и легкой цепи или комбинации вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи, содержащие CDR.
Кроме того, антитело против IGF1R и его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи. Конкретно, вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи могут быть связаны с константной областью тяжелой цепи и константной областью легкой цепи, и последовательности тяжелой цепи и легкой цепи можно также комбинировать с получением структуры интактного антитела.
Последовательности константных областей, которые можно комбинировать с вариабельными областями по настоящему изобретению, приведены в качестве примера и могут быть надлежащим образом выбраны из константных областей тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов (например, человеческих иммуноглобулинов). Например, без ограничения, константная область тяжелой цепи может представлять собой константную область тяжелой цепи IgG1, константную область тяжелой цепи IgG3 или константную область тяжелой цепи IgG4, а константная область легкой цепи может представлять собой константную область каппа или константную область легкой цепи лямбда.
В качестве примера, вариабельная область по настоящему изобретению может быть связана с константной областью с образованием последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи, описанных ниже. в табл. 7 показаны примеры комбинаций тяжелых и легких цепей. Кроме того, примеры полноразмерных антител приведены в табл. 16. Константная область может быть надлежащим образом выбрана из константной области тяжелой цепи и константной области легкой цепи иммуноглобулина (например, человеческого иммуноглобулина).
- 41 045348
Таблица 7
Примеры антител
HC SEQ ID | LC SEQ ID | |
1564 IgG | 413 | 420 |
1226 IgG | 414 | 421 |
996 IgG | 415 | 422 |
48G5 IgG | 416 | 423 |
54H4 IgG | 417 | 424 |
60H6 IgG | 418 | 425 |
Bll IgG | 419 | 426 |
1564 scFv | 427 | |
1226 scFv | 428 | |
996 scFv | 429 | |
48G5 scFv | 430 | |
54H4 scFv | 431 | |
60H6 scFv | 432 | |
Bll scFv | 433 |
Антитела, описанные в настоящем изобретении, также включают биспецифичные антитела и бифункциональные антитела, содержащие один или более чем один CDR или одну или более чем одну вариабельную область, как описано выше. Биспецифичные или бифункциональные антитела представляют собой искусственные гибридные антитела, распознающие две разные родственные или неродственные мишени. Биспецифичные антитела могут быть получены с применением множества методов, таких как слияние гибридом или лигирование Fab'-фрагментов.
В настоящем описании мультиспецифичный антигенсвязывающий белок или мультиспецифичное антитело направлены на два или более чем два антигена или эпитопа. В настоящем описании биспецифичные антигенсвязывающий белок или антитело или антигенсвязывающий белок или антитело с двойной специфичностью представляют собой гибридный антигенсвязывающий белок или гибридное антитело, имеющие два (2) разных сайта связывания антигена. Это биспецифичное антитело является одной из разновидностей мультиспецифичного антигенсвязывающего белка или мультиспецифичного антитела, и оно может быть получено различными известными методами, например, такими методами, как слияние гибридом или связывание Fab'-фрагментов.
Мультиспецифичное антитело, например, антитело против IGF1R и его антигенсвязывающий фрагмент, из которых можно получить биспецифичное антитело, может содержать как антитело против IGF1R, так и его антигенсвязывающий фрагмент, например, полноразмерное антитело. Антигенсвязывающий фрагмент может быть выбран из группы, состоящей из доменных антител, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' и F(ab')2.
Антигенсвязывающий фрагмент антитела против IGF1R может быть связан с линкером, таким как пептидный линкер, или без него. Кроме того, тяжело- и легкоцепочечные части антигенсвязывающего фрагмента, такие как вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи scFvфрагмента, могут также быть связаны с пептидным линкером или без него. Пептидный линкер может быть таким, как описано выше.
В биспецифичном антителе антитело против IGF1R и его антигенсвязывающие фрагменты могут выполнять функцию доставки второго связанного с ними антитела или антигенсвязывающего фрагмента, направленных на другие антигены или эпитопы, через гематоэнцефалический барьер в головной мозг. Второе антитело может представлять собой, без ограничения, антитело, действующее в головном мозге.
Антитело против IGF1R или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут иметь определенную общую область или последовательность с отличным от них вторым антителом. Например, антитело против IGF1R может иметь общую константную область или Fc-область с антителом или антигенсвязывающим фрагментом второго антитела.
- 42 045348
Кроме того, структура биспецифичного антитела в настоящем изобретении включает бивалентную форму биспецифичного антитела, где scFv антитела против IFG1R связан с каждой Fc двух тяжелых цепей полноразмерного иммуноглобулина, например, на концах тяжелых цепей, напрямую или через линкер, и моновалентную форму биспецифичного антитела, где scFv антитела против IFG1R связан только с одним концом двух тяжелых цепей полноразмерного иммуноглобулина, напрямую или через линкер, однако моновалентное двойное антитело является предпочтительным.
Конкретно, в одном воплощении настоящего изобретения есть случай, когда период полувыведения клона моновалентной формы лучше, чем у клона бивалентной формы, а структура клона моновалентной формы представляет собой форму, где доменное антитело (scFv) против IGF1R связано только с концом одной тяжелой цепи интактного иммуноглобулина через линкер. Конкретно, антитело представляет собой гетеродимер, полученный методом выступ во впадину (Knob-In-Hole), содержащий две разные тяжелые цепи интактного иммуноглобулина, где одна тяжелая цепь имеет доменное антитело (scFv) против IGF1R, связанное с ее С-концом, а другая тяжелая цепь не имеет доменного антитела на ее С-конце.
В биспецифичном антителе второе антитело, связанное с антителом против IGF1R или его антигенсвязывающим фрагментом, может представлять собой человеческое антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело или выделенное антитело, специфично связывающееся с IGF1R. Второе антитело включает, без ограничения, полноразмерные антитела, биспецифичные антитела, минитела, доменные антитела, миметики антител (или синтетические антитела), слитые антитела (или конъюгаты антител) и их фрагменты.
Далее настоящее изобретение относится к антителу против syn и его антигенсвязывающему фрагменту.
Альфа-синуклеин, который может быть распознан антителом, предложенным в настоящем описании, может быть выбран из альфа-синуклеинов млекопитающих, человеческого альфа-синуклеина, альфа-синуклеина обезьяны (например, альфа-синуклеина резуса), мышиного альфа-синуклеина, крысиного альфа-синуклеина и тому подобного. Например, человеческий альфа-синуклеин может представлять собой, без ограничения, альфа-синуклеин (NCBI ID: NP_000336). Если в настоящем описании не указано иное, альфа-синуклеин может относиться к человеческому альфа-синуклеину, и антитела или антигенсвязывающие фрагменты, предложенные в настоящем описании, имеют свойство специфично связываться не только с человеческим альфа-синуклеином, но также с альфа-синуклеином обезьяны (например, резуса), крысиным альфа-синуклеином и/или мышиным альфа-синуклеином.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с С-концевой областью альфасинуклеина, конкретно, с С-концевой областью, содержащей пептид, содержащий по меньшей мере 11 или 12 расположенных друг за другом аминокислот, включая остатки 110-120 или остатки 111-122 в SEQ ID NO:559 человеческого альфа-синуклеина. Было подтверждено, что антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут распознавать область распознавания антигена и связываться с агрегатами альфа-синуклеина с высокой аффинностью.
В настоящем описании аффинность или степень аффинности представляют собой силу взаимодействия между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и антигеном и могут определяться свойствами антигена, такими как размер, форма и/или заряд антигена, и последовательностями CDR и/или физико-химическими свойствами (гидрофильными/гидрофобными свойствами, электростатическими свойствами и так далее) антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Методы определения аффинности известны в области техники, и обычно, без ограничения, ее указывают как константу диссоциации (KD).
В настоящем описании специфичное связывание с альфа-синуклеином или агрегатами альфасинуклеина означает, что аффинность связывания с белком альфа-синуклеина или агрегатами альфасинуклеина относительно высока по сравнению с другими антигенами и, например, константа диссоциации (KD). может составлять от 0,1х10’10М до 2х10’10М или от 0,05х10’1°М до 0,3х10’9М в отношении агрегатов альфа-синуклеина, конкретно, фибрилл, протофибрилл и олигомеров амилоида, в особенности фибрилл амилоида, как измерено, без ограничения, анализом Octet или анализом SPR.
Гуманизированные антитела к альфа-синуклеину, содержащие легкую цепь и тяжелую цепь по одному воплощению настоящего изобретения, например, Hu11F11 (ver.1), Hu11F11 (ver.2) и Hu11F11_ABL2-4, демонстрируют высокую активность в отношении стимуляции фагоцитарного захвата по сравнению с химерными антителами к альфа-синуклеину. В сравнении с химерным антителом к альфа-синуклеину, Hu11F11 (ver.1), Hu11F11 (ver.2),u H11F11 (ver.3), Hu11F11 (ver.4) и ABL2-4 демонстрируют высокую активность в отношении ингибирования связывания фибрилл с мембраной нервных клеток. Hu11F11 (ver.2), Hu11F11 (ver.4) и ABL2-4 имеют высокую активность в отношении ингибированию распространения альфа-синуклеина, секретированного из клеток, сверхэкспрессирующих альфасинуклеин, на другие нервные клетки по сравнению с химерным антителом к альфа-синуклеину и демонстрируют аффинность связывания с агрегатами альфа-синуклеина, например, сходную или превышающую активность химерного антитела к альфа-синуклеину, в клеточном анализе.
Антитело к альфа-синуклеину по настоящему изобретению может ингибировать перенос агрегатов альфа-синуклеина, секретированных из нервной клетки в нервную систему субъекта, в другие нормаль
- 43 045348 ные клетки во внеклеточном пространстве и инфицирование нервных клеток (ингибировать передачу агрегатов от клетки к клетке) и обладает способностью стимулировать фагоцитарное действие микроглии на агрегаты альфа-синуклеина во внеклеточном пространстве. Агрегаты альфа-синуклеина распространяются от одной клетки к другой клетке подобно прионам, и альфа-синуклеин, в особенности агрегаты альфа-синуклеина, распространяется по головному мозгу, приводя к синуклеинопатиям в нормальных клетках. Поэтому агрегаты альфа-синуклеина токсичны для нейронов головного мозга, и хорошо известно, что они приводят к гибели нейронов головного мозга (нейродегенерации) и нейровоспалению. Соответственно, по мере распространения агрегатов альфа-синуклеина в различные части головного мозга гибель клеток головного мозга и нейровоспалительные реакции становятся более выраженными, приводя к гибели клеток головного мозга, расстройствам поведения и когнитивным расстройствам, которые отмечают при прогрессировании синуклеинопатий, таких как болезнь Паркинсона.
Соответственно, антитело к альфа-синуклеину по настоящему изобретению может предотвращать явление распространения агрегатов альфа-синуклеина в различные области головного мозга, ингибируя передачу альфа-синуклеина или агрегатов альфа-синуклеина между нервными клетками, и снижать уровень агрегатов альфа-синуклеина, являющихся важной причиной синуклеинопатий, уменьшая количество или устраняя сами агрегаты альфа-синуклеина во внеклеточной области нервных клеток нервной системы субъекта и стимулируя фагоцитарную активность микроглии, что приводит к снижению интенсивности гибели нервных клеток головного мозга и нейровоспалительных реакций, и, кроме того, ожидается, что оно будет улучшать, облегчать или предотвращать симптомы и прогрессирование синуклеинопатий, таких как болезнь Паркинсона.
Более того, антитело к альфа-синуклеину по настоящему изобретению имеет отличную активность по выполнению обеих из двух функций (1) ингибирования передачи альфа-синуклеина или агрегатов альфа-синуклеина между нервными клетками (см. результаты клеточного анализа, раскрытые в настоящем описании) и (2) снижения уровня агрегатов альфа-синуклеина в нервной системе головного мозга посредством стимуляции фагоцитарной активности клеток микроглии. В частности, поскольку антитела к альфа-синуклеину, проходящие в данный момент клинические исследования или опубликованные в научной литературе, обладают одной из двух активностей (1) и (2), есть основания предполагать, что антитело к альфа-синуклеину по настоящему изобретению обладает преимуществом в отношении более эффективного предотвращения или лечения синуклеинопатий по сравнению с известными антителами к альфа-синуклеину. Таким образом, антитело к альфа-синуклеину по настоящему изобретению имеет более высокую эффективность в отношении уменьшения количества и устранения агрегатов альфасинуклеина и ингибирования действия агрегатов альфа-синуклеина как этиологического фактора и поэтому оно более эффективно при синуклеинопатиях или связанных с ними симптоматических заболеваниях (например, когнитивных расстройствах).
Антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению, имеющие высокую аффинность в отношении агрегатов альфа-синуклеина, могут уменьшать образование агрегатов альфасинуклеина, снижая посредством этого концентрацию агрегатов в головном мозге. Кроме того, антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению с высокой аффинностью в отношении агрегатов альфа-синуклеина могут уменьшать образование агрегатов альфа-синуклеина вне центральной нервной системы и, в конечном счете, изменять состояние равновесия между формами альфасинуклеина, разграниченными ГЭБ, приводя посредством этого к снижению концентрации агрегатов альфа-синуклеина в центральной нервной системе.
Это является большим преимуществом в клинической практике, поскольку позволяет получить достаточную эффективность даже при введении более удобным способом, например, без ограничения, подкожной инъекцией. Кроме того, антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут, без ограничения данной теорией, ингибировать образование агрегатов, удаляя мономеры, или устранять как мономеры, так и агрегаты.
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению, специфично связывающиеся с белками альфа-синуклеина или агрегатами альфа-синуклеина, могут не являться продуктами, встречающимися в природе (они могут быть продуктами, не встречающимися в природе, например, продуктами химического синтеза или рекомбинантного метода). Методики рекомбинации хорошо известны в области техники
В настоящем описании антитело обозначает полноразмерный иммуноглобулин любого изотипа или антигенсвязывающий фрагмент, который может конкурировать с полноразмерным антителом за связывание с антигеном-мишенью. Например, оно включает химерные, гуманизированные, полноразмерные человеческие антитела, антитела с двойной специфичностью или их антигенсвязывающие фрагменты. Само по себе антитело является одной из разновидностей антигенсвязывающих белков. Обычно полноразмерное антитело содержит по меньшей мере 2 полноразмерные тяжелые цепи и 2 полноразмерные легкие цепи, но в некоторых случаях антитело может содержать только тяжелые цепи.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут иметь происхождение только от одного источника или представлять собой химерное антитело. Химерное антитело содержит часть, имеющую происхождение от двух типов разных антител, и описано более подробно ниже. Антитело или его антиген- 44 045348 связывающий фрагмент могут быть получены с использованием гибридомы, методикой рекомбинантных
ДНК или ферментативным или химическим разделением интактного антитела. Если в настоящем описании не указано иное, термин антитело включает антитела, содержащие 2 полноразмерные тяжелые цепи и 2 полноразмерные легкие цепи, и их производные, варианты, фрагменты и мутанты, и их примеры описаны ниже.
В одном воплощении антитело включает, без ограничения, моноклональное антитело, биспецифичное антитело, минитело, доменное антитело, миметик антитела (или синтетическое антитело), химерное антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело, слитое антитело (или конъюгат антитела), их фрагменты и различные типы антител, раскрытые здесь. В одном воплощении фрагменты антител, раскрытые здесь, могут представлять собой Fab-фрагменты, Fab'-фрагменты,
F(ab')2-фрагменты, Fv-фрагменты, одноцепочечные фрагменты (scFv), диатело или молекулу одноцепочечного антитела из одной цепи, полученной соединением вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи через спейсер.
В настоящем описании легкая цепь включает полноразмерную легкую цепь и ее фрагменты, имеющие последовательность вариабельной области, достаточную для обеспечения специфичности связывания с антигеном или эпитопом. Полноразмерная легкая цепь содержит домен вариабельной области VL и домен константной области CL. Домен вариабельной области легкой цепи присутствует на N-конце полипептида легкой цепи. Типы легкой цепи включают цепи каппа и лямбда.
В настоящем описании тяжелая цепь включает полноразмерную тяжелую цепь и ее фрагменты, имеющие последовательность вариабельной области, достаточную для обеспечения специфичности связывания с антигеном или эпитопом. Полноразмерная тяжелая цепь содержит домен вариабельной области VH и три (3) домена константных областей CH1, CH2 и СН3. Домен VH присутствует на N-конце полипептида тяжелой цепи, а домены СН присутствуют на С-конце, при этом СН3 расположен ближе всех к С-концу. Тяжелая цепь включает IgG (включая подтипы IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 и IgG4), IgA (включая подтипы IgA1 и IgA2) и изотипы IgM и IgE.
В настоящем описании антигенсвязывающий фрагмент обозначает часть антитела, обладающую специфичной аффинностью связывания с антигеном, и/или полипептид, содержащий такую часть. Например, антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой часть антитела, содержащую аминокислотный остаток, придающий антителу специфичность и/или аффинность в отношении антигена посредством его взаимодействия с антигеном (например, эпитопом), или полипептид, содержащий такую часть. Этот антигенсвязывающий фрагмент обычно содержит одну или более чем одну определяющую комплементарность (CDR), а также одну или более чем одну каркасную область (FR). CDR представляют собой аминокислотные последовательности, способствующие специфичности и аффинности связывания антитела с антигеном, а каркасные области представляют собой аминокислотные последовательности, способствующие поддержанию подходящей конформации этих CDR, и содействуют связыванию антигенсвязывающей области с антигеном.
При использовании в настоящем описании антигенсвязывающий фрагмент цепи (тяжелой цепи или легкой цепи) антитела или иммуноглобулина включает часть антитела, которая не имеет некоторых аминокислот по сравнению с полноразмерной цепью, но может специфично связываться с антигеном. Этот фрагмент можно рассматривать как обладающий биологической активностью, в том аспекте, что он может специфично связываться с антигеном-мишенью или может конкурировать с другими антителами или антигенсвязывающими фрагментами за связывание с определенным эпитопом. В одном аспекте данный фрагмент содержит по меньшей мере одну CDR, присутствующую в полноразмерной легкой цепи или тяжелой цепи, и в некоторых воплощениях он содержит одну цепь из тяжелой цепи и/или легкой цепи или ее часть. Этот биологически активный фрагмент может быть получен методикой рекомбинантных ДНК или может быть получен, например, ферментативным или химическим разделением интактного антитела. Иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина включает, без ограничения, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, доменное антитело и одноцепочечное антитело (например, scFv, scFv-Fc и так далее) и может иметь происхождение от любого млекопитающего, включая, без ограничения, человека, мышь, крысу, представителей семейства верблюдовых или кролика. Функциональная часть антитела, такая как одна или более чем одна CDR, описанные здесь, может быть связана с вторичным белком или низкомолекулярным соединением ковалентной связью и использована в качестве терапевтического агента, направленного на определенную мишень.
В настоящем описании Fab-фрагмент состоит из одной легкой цепи и одной тяжелой цепи, содержащей только вариабельную область и СН1. Тяжелая цепь молекулы Fab не может образовывать дисульфидную связь с другой тяжелой цепью.
В настоящем описании Fc-область содержит два фрагмента тяжелой цепи, содержащие домены СН2 и СН3 антитела. Эти 2 фрагмента тяжелой цепи связаны друг с другом двумя или более дисульфидными связями и гидрофобным взаимодействием доменов СН3.
В настоящем описании Fab'-фрагмент дополнительно содержит, помимо Fab-фрагмента, область между доменами СН1 и СН2 тяжелой цепи, и между двумя тяжелыми цепями двух Fab'-фрагментов может быть образована дисульфидная связь.
- 45 045348
В настоящем описании F(ab')2-фрагмент содержит две легких цепи и две тяжелых цепи, содержащие вариабельную область, СН1 и часть константной области между доменами СН1 и СН2, как указано выше, и между 2 тяжелыми цепями образована межцепочечная дисульфидная связь. Таким образом,
F(ab')2-фрагмент состоит из двух Fab'-фрагментов, и эти два Fab'-фрагмента связаны друг с другом дисульфидной связью, образованной между ними.
В настоящем описании Fv-область представляет собой фрагмент антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи и легкой цепи, но не содержащий константной области.
В настоящем описании одноцепочечное антитело представляет собой единую полипептидную цепь антигенсвязывающей области, образованную соединением вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи через гибкий линкер. Например, одноцепочечное антитело может представлять собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из scFv, где вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи связаны в одноцепочечной форме, scFv-Fc, где вариабельная область тяжелой цепи, вариабельная область легкой цепи и Fc связаны в одноцепочечной форме, и тому подобного. Одноцепочечное антитело может относиться, например, к патенту США № 5,260,203.
В настоящем описании бивалентный антигенсвязывающий белок или бивалентное антитело содержит два сайта связывания антигена. Это бивалентное антитело может содержать два сайта связывания антигена, обладающих специфичностью в отношении одного и того же антигена, или может представлять собой антитело с двойной специфичностью, связывающееся с разными антигенами, соответственно. В настоящем описании мультиспецифичный антигенсвязывающий белок или мультиспецифичное антитело направлены на два или более чем два антигена или эпитопа.
В настоящем описании биспецифичные антигенсвязывающий белок или антитело или антигенсвязывающий белок либо антигенсвязывающий белок или антитело с двойной специфичностью представляют собой гибридные антигенсвязывающий белок или антитело, имеющие два разных сайта связывания антигена. Такое биспецифичное антитело является разновидностью мультиспецифичного антигенсвязывающего белка или мультиспецифичного антитела и может быть получено различными известными методами, такими как слияние гибридом или слияние Fab'-фрагментов.
В настоящем описании биспецифичные антигенсвязывающий белок или антитело, антигенсвязывающий белок или антитело с двойной специфичностью представляют собой гибридные антигенсвязывающий белок или антитело, имеющие 2 разных сайта связывания антигена. Это биспецифичное антитело является одной из разновидностей мультиспецифичного антигенсвязывающего белка или мультиспецифичного антитела, и оно может быть получено различными известными методами, например, такими методами, как слияние гибридом или связывание Fab'-фрагментов. Возможные ссылки включают, например, Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 1990, 79:315-321, Kostelny et al., J. Immunol. 1992, 148:1547-1553 и тому подобное. Два эпитопа, отличающиеся друг от друга, с которыми связываются два сайта связывания антигена, присутствующие в биспецифичном антигенсвязывающем белке или антителе, могут быть расположены на одном и том же белке-мишени или на разных белках-мишенях. В одном воплощении антитело по настоящему изобретению может иметь форму биспецифичного антитела, дополнительно включающего связывание с носителем для доставки антитела через гематоэнцефалический барьер. Один способ доставки лекарственных средств через гематоэнцефалический барьер включает использование систем доставки, таких как рецептор-опосредованный трансцитоз, например, через переносчик глюкозы, переносчик аминокислот, рецептор инсулина или рецептор трансферрина в клетке.
В настоящем описании конъюгат обозначает химерную молекулу антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, раскрытых в настоящем описании, с другой молекулой, в особенности с переносчиками через гематоэнцефалический барьер или терапевтическим агентом, описанными ниже. В конъюгате антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению связаны с другими молекулами ковалентной связью или физическими силами, такими как силы Ван-дер-Ваальса или силы гидрофобного взаимодействия, капсулированием, заключением или комбинацией указанных методов. В конъюгате по одному воплощению антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут быть соединены пептидным линкером.
Настоящее изобретение также включает одну или более чем одну аминокислотную последовательность, в существенной степени идентичную одной или более чем одной аминокислотной последовательности, раскрытой в настоящем описании. Существенная идентичность последовательности означает, что последовательность с изменением сохраняет эффекты, раскрытые в настоящем изобретении. В одном воплощении указанная последовательность идентична раскрытой вариабельной области тяжелой цепи приблизительно на 90%, 95% или 99%. В одном воплощении указанная последовательность идентична раскрытой вариабельной области легкой цепи приблизительно на 90%, 95% или 99%. Например, в случае варианта, демонстрирующего 90%-ю, 95%-ю или 99%-ю идентичность последовательности антитела или антигенсвязывающего фрагмента, раскрытых в настоящем изобретении, любое изменение последовательности происходит в каркасной области вариабельной области, но не в CDR.
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, специфично связывающиеся с альфасинуклеином или его агрегатами, по настоящему изобретению содержат вариабельную область тяжелой
- 46 045348 цепи, содержащую определяющие комплементарность области CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области CDRL1, CDRL2 и
CDRL3.
В одном воплощении антитело против альфа-синуклеина или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать следующие последовательности CDR:
CDR1 тяжелой цепи (H-CDR1), выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:434 и SEQ ID NO:439,
CDR2 тяжелой цепи (H-CDR2), выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:435-437 и 649 и SEQ ID NO:440-441,
CDR3 тяжелой цепи (H-CDR3), выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:438 и SEQ ID NO:442,
CDR1 легкой цепи (L-CDR1), выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:443 и SEQ ID NO:446,
CDR2 легкой цепи (L-CDR2), выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:444 и SEQ ID NO:447, и
CDR3 легкой цепи (L-CDR3), выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:445 и SEQ ID NO:448.
Аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 тяжелой цепи и аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 легкой цепи изложеныв табл. 8 и 9.
Таблица 8
Аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 тяжелой цепи
Идентификатор клона | SEQ ID NO: | VHCDR1 Аминокислотная последователь- ность | SEQ ID NO: | VHCDR2 Аминокислотная последовательность | SEQ ID NO: | VHCDR3 Аминокислотная последовательность |
chllFll-VH | 434 | GFTFSDFYME | 435 | ASRNKANDYTTEYSASVKG | 438 | DAHGKPFAY |
HullFll-VHl | 434 | GFTFSDFYME | 436 | AIRNKANDYTTEYAASVKG | 438 | DAHGKPFAY |
HullFll-VH2 | 434 | GFTFSDFYME | 436 | AIRNKANDYTTEYAASVKG | 438 | DAHGKPFAY |
HullFll-VH3 | 434 | GFTFSDFYME | 649 | AIRNKANDYTTEYADSVKG | 438 | DAHGKPFAY |
HullFll-VH4 | 434 | GFTFSDFYME | 649 | AIRNKANDYTTEYADSVKG | 438 | DAHGKPFAY |
HullFll-VHv3 | 434 | GFTFSDFYME | 437 | ATRNKANDYTTEYSASVKG | 438 | DAHGKPFAY |
HullFll- VHvlmul newmu | 434 | GFTFSDFYME | 437 | ATRNKANDYTTEYSASVKG | 438 | DAHGKPFAY |
HullFll-VHv3 newmu | 434 | GFTFSDFYME | 437 | ATRNKANDYTTEYSASVKG | 438 | DAHGKPFAY |
HullFll-VH-vl | 434 | GFTFSDFYME | 435 | ASRNKANDYTTEYSASVKG | 438 | DAHGKPFAY |
HullFll-VH-v2 | 434 | GFTFSDFYME | 435 | ASRNKANDYTTEYSASVKG | 438 | DAHGKPFAY |
HullFll-VH-v3 | 434 | GFTFSDFYME | 435 | ASRNKANDYTTEYSASVKG | 438 | DAHGKPFAY |
HullFll-VH-v4 | 434 | GFTFSDFYME | 435 | ASRNKANDYTTEYSASVKG | 438 | DAHGKPFAY |
ch3A9-VH | 439 | GFTFSSYAMS | 440 | TISNGGGYTYYPDSVKG | 442 | HITTVRPTKYFDY |
Hu3A9-VHl | 439 | GFTFSSYAMS | 440 | TISNGGGYTYYPDSVKG | 442 | HITTVRPTKYFDY |
Hu3A9-VH2 | 439 | GFTFSSYAMS | 441 | TISNGGGYTYYADSVKG | 442 | HITTVRPTKYFDY |
Hu3A9-VH3 | 439 | GFTFSSYAMS | 440 | TISNGGGYTYYPDSVKG | 442 | HITTVRPTKYFDY |
Hu3A9-VH4 | 439 | GFTFSSYAMS | 441 | TISNGGGYTYYADSVKG | 442 | HITTVRPTKYFDY |
Hu3A9-VH-vl | 439 | GFTFSSYAMS | 440 | TISNGGGYTYYPDSVKG | 442 | HITTVRPTKYFDY |
Hu3A9-VH-v2 | 439 | GFTFSSYAMS | 440 | TISNGGGYTYYPDSVKG | 442 | HITTVRPTKYFDY |
- 47 045348
Таблица 9
Аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 легкой цепи
Идентификатор клона | SEQ ID NO: | VLCDR1 Аминокислотная последовательность | SEQ ID NO: | VLCDR1 Аминокислотная последовательность | SEQ ID NO: | VLCDR1 Аминокислотная последовательность |
chllFll-VL | 443 | KSSQSLLYSSNQKNYLA | 444 | WASTRES | 445 | QQYYSYPWT |
HullFll-VLl | 443 | KSSQSLLYSSNQKNYLA | 444 | WASTRES | 445 | QQYYSYPWT |
HullFll-VL2 | 443 | KSSQSLLYSSNQKNYLA | 444 | WASTRES | 445 | QQYYSYPWT |
HullFll-VL3 | 443 | KSSQSLLYSSNQKNYLA | 444 | WASTRES | 445 | QQYYSYPWT |
HullFll-VL4 | 443 | KSSQSLLYSSNQKNYLA | 444 | WASTRES | 445 | QQYYSYPWT |
HullFll-VL5 | 443 | KSSQSLLYSSNQKNYLA | 444 | WASTRES | 445 | QQYYSYPWT |
HullFll-VLv3 4с | 443 | KSSQSLLYSSNQKNYLA | 444 | WASTRES | 445 | QQYYSYPWT |
ch3A9-VL | 446 | KASQNVGTTVA | 447 | SASNRYT | 448 | QQYSNYPLT |
Hu3A9-VLl | 446 | KASQNVGTTVA | 447 | SASNRYT | 448 | QQYSNYPLT |
Hu3A9-VL2 | 446 | KASQNVGTTVA | 447 | SASNRYT | 448 | QQYSNYPLT |
Hu3A9-VL3 | 446 | KASQNVGTTVA | 447 | SASNRYT | 448 | QQYSNYPLT |
Hu3A9-VL4 | 446 | KASQNVGTTVA | 447 | SASNRYT | 448 | QQYSNYPLT |
Hu3A9-VL-vl | 446 | KASQNVGTTVA | 447 | SASNRYT | 448 | QQYSNYPLT |
Hu3A9-VL-v2 | 446 | KASQNVGTTVA | 447 | SASNRYT | 448 | QQYSNYPLT |
Hu3A9-VL-v2 | 446 | KASQNVGTTVA | 447 | SASNRYT | 448 | QQYSNYPLT |
В одном воплощении антитело против альфа-синуклеина или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи (H-CDR1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:434, CDR2 тяжелой цепи (H-CDR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:435-437 и 649, и CDR3 тяжелой цепи (H-CDR3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:438, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи (L-CDR1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:443, CDR2 легкой цепи (L-CDR2), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:444, и CDR3 легкой цепи (L-CDR3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:445.
Кроме того, в одном воплощении антитело против альфа-синуклеина или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:439, CDR2 тяжелой цепи (HCDR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:440-441, и CDR3 тяжелой цепи (H-CDR3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:442, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи (L-CDR1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:446, CDR2 легкой цепи (LCDR2), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:447, и CDR3 легкой цепи (LCDR3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:448.
В другом воплощении антитело против альфа-синуклеина или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать каркасную область тяжелой цепи (H-FR1), расположенную на N-конце H-CDR1, содержащую полипептидный фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:449-450 и SEQ ID NO:468-473, каркасную область тяжелой цепи (H-FR2), расположенную между H-CDR1 и H-CDR2, содержащую полипептидный фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:451-452 и SEQ ID NO:474-477, каркасную область тяжелой цепи (H-FR3), расположенную между H-CDR2 и H-CDR3, содержащую полипептидный фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:453-464 и SEQ ID NO:478-483, каркасную область тяжелой цепи (H-FR4), расположенную на С-конце H-CDR3, содержащую полипептидный фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:465467 и SEQ ID NO:484-485, каркасную область легкой цепи (L-FR1), расположенную на N-конце L-CDR1, содержащую поли- 48 045348 пептидный фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:486491 и SEQ ID NO:504-510, каркасную область легкой цепи (L-FR2), расположенную между L-CDR1 и L-CDR2, содержащую полипептидный фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID
NO:492-494 и SEQ ID NO:511-514, каркасную область легкой цепи (L-FR3), расположенную между L-CDR2 и L-CDR3, содержащую полипептидный фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:495-500 и SEQ ID NO:515-521, и/или каркасную область легкой цепи (L-FR4), расположенную на С-конце L-CDR3, содержащую полипептидный фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:501503 и SEQ ID NO:522.
Как аминокислотные последовательности, полезные здесь в качестве каркасных областей, примеры последовательностей каркасных областей тяжелой цепи приведеныв табл. 3 и 4, а примеры последовательностей каркасных областей легкой цепи приведеныв табл. 10 и 11.
Таблица 10
Аминокислотные последовательности каркасных областей 1 -2 тяжелой цепи
Клон | SEQ ID NO: | Последовательность VH-FR1 | SEQ ID NO: | Последовательность VH-FR2 |
chllFll-VH | 449 | EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCA TS | 451 | WVRQPPGKRLEWIA |
HullFll- VH1 | 471 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA AS | 452 | WVRQAPGKGLEWIA |
HullFll- VH2 | 471 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA AS | 452 | WVRQAPGKGLEWIA |
HullFll- VH3 | 471 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA AS | 475 | WVRQAPGKGLEWIA |
HullFll- VH4 | 471 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA AS | 452 | WVRQAPGKGLEWVA |
HullFll- VHv3 | 450 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA TS | 451 | WVRQPPGKRLEWIA |
HullFll- VHvlmul newmu | 450 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA TS | 451 | WVRQPPGKRLEWIA |
- 49 045348
HullFll- VHv3 newmu | 450 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA TS | 451 | WVRQPPGKRLEWIA |
HullFll-VHvl | 450 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA TS | 451 | WVRQPPGKRLEWIA |
HullFll-VH- v2 | 450 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA TS | 451 | WVRQPPGKRLEWIA |
HullFll-VH- v3 | 450 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA TS | 451 | WVRQPPGKRLEWIA |
HullFll-VH- v4 | 450 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA TS | 451 | WVRQPPGKRLEWIA |
ch3A9-VH | 468 | EVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCA AS | 474 | WVRQTPEKRLEWVA |
Hu3A9-VHl | 469 | QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA AS | 475 | WVRQAPGKGLEWVA |
Hu3A9-VH2 | 470 | EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCA AS | 476 | WVRQAPDKGLEWVA |
Hu3A9-VH3 | 471 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA AS | 475 | WVRQAPGKGLEWVA |
Hu3A9-VH4 | 471 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA AS | 475 | WVRQAPGKGLEWVA |
Hu3A9-VHvl | 472 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA AS | 477 | WVRQTPEKGLEWVA |
Hu3A9-VH- v2 | 473 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA AS | 477 | WVRQTPEKGLEWVA |
- 50 045348
Таблица 11
Аминокислотные последовательности каркасных областей 3-4 тяжелой цепи
Клон | SEQ ID NO: | Последовательность VH-FR3 | SEQ ID NO: | Последовательность VH-FR4 |
chllFll-VH | 453 | RFIVSRDTSQSILYLQMNALRAED TAIYYCAR | 465 | WGQGTLVTVSA |
HullFll- VH1 | 454 | RFTVSRDTSKNSLYLQMNSLKTE DTAVYYCAR | 466 | WGQGTLVTVSS |
HullFll- VH2 | 455 | RFTISRDTSKNSLYLQMNSLKTED TAVYYCAR | 466 | WGQGTLVTVSS |
HullFll- VH3 | 456 | RFTVSRDTSQNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCAR | 466 | WGQGTLVTVSS |
HullFll- VH4 | 457 | RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAE DTAVYYCSR | 466 | WGQGTLVTVSS |
HullFll- VHv3 | 458 | RFTISRDDSKSSLYLQMNSLRAED TAIYYCAR | 467 | WGQGTTVTVSS |
HullFll- VHvlmul newmu | 459 | RFTISRDTSQSSLYLQMNSLKTED TAVYYCAR | 467 | WGQGTTVTVSS |
HullFll- VHv3 newmu | 460 | RFTISRDTSQSSLYLQMNSLRAED TAIYYCAR | 467 | WGQGTTVTVSS |
HullFll-VHvl | 461 | RFT IS RD D SKS SL YLQMNSLRAED TAIYYCAR | 467 | WGQGTTVTVSS |
HullFll-VH- v2 | 462 | RFTVSRDDSKSSLYLQMNSLRAE DTAIYYCAR | 467 | WGQGTTVTVSS |
HullFll-VH- v3 | 463 | RFTISRDTSKSSLYLQMNSLRAED TAIYYCAR | 467 | WGQGTTVTVSS |
HullFll-VH- v4 | 464 | RFTVSRDTSKSSLYLQMNSLRAE DTAIYYCAR | 467 | WGQGTTVTVSS |
ch3A9-VH | 478 | RFTISRDNAKNTLYLQMS SLRSED TAMYYCAR | 484 | WGQGTTLTVSS |
Hu3A9-VHl | 479 | RFTISRDNAKNTLYLQMNSLRSE DSAMYYCAR | 485 | WGQGTLVTVSS |
Hu3A9-VH2 | 480 | RFTISRDNAKNTLYLQMS SLKAE DSAVYYCAR | 485 | WGQGTLVTVSS |
Hu3A9-VH3 | 481 | RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCAR | 485 | WGQGTLVTVSS |
- 51 045348
Hu3A9-VH4 | 482 | RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAE DTAVYYCAR | 485 | WGQGTLVTVSS |
Hu3A9-VH- vl | 483 | RFTISRDNSKNTLYLQMS SLRAED TAMYYCAR | 484 | WGQGTTLTVSS |
Hu3A9-VH- v2 | 483 | RFTISRDNSKNTLYLQMS SLRAED TAMYYCAR | 484 | WGQGTTLTVSS |
Таблица 12
Аминокислотные последовательности каркасных областей 1 -2 легкой цепи
Клон | SEQ ID NO: | Последовательность VL-FR1 | SEQ ID NO: | Последовательность VL-FR2 |
chllFll-VL | 486 | DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMSC | 492 | WYQQKPGQSPKLLIY |
HullFll-VLl | 487 | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC | 493 | WYQQKPGQPPKLLIY |
HullFll-VL2 | 488 | DIVMTQSPSSLAVSLGERVTITC | 493 | WYQQKPGQPPKLLIY |
HullFll-VL3 | 489 | DIVMTQSPSSLAVSLGERATINC | 493 | WYQQKPGQPPKLLIY |
HullFll-VL4 | 490 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC | 494 | WYQQKPGKAPKLLIY |
HullFll-VL5 | 486 | DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMSC | 493 | WYQQKPGQPPKLLIY |
HullFll- VLv3 4c | 491 | DIVMTQSPSSLAVSLGERVTMSC | 492 | W YQQKPGQ SPKLLIY |
ch3A9-VL | 504 | DIVMTQSPKFMSTSVGDRVSITC | 511 | WYQQKPGQSPKLLIY |
Hu3A9-VLl | 505 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC | 512 | WYQQKPGKAPKLLIY |
Hu3A9-VL2 | 506 | DIVMTQSPSTLSASVGDRVTITC | 513 | AWYQQKPGKAPKLLI Y |
Hu3A9-VL3 | 507 | DIVMTQSPATLSVSLGERATLSC | 514 | W YQQKPGQ APRLLIY |
Hu3A9-VL4 | 508 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC | 512 | WYQQKPGKAPKLLIY |
Hu3A9-VL-vl | 509 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC | 511 | WYQQKPGQSPKLLIY |
Hu3A9-VL-v2 | 510 | DIVMTQSPSSMSTSVGDRVTITC | 511 | WYQQKPGQSPKLLIY |
Hu3A9-VL-v2 | 510 | DIVMTQSPSSMSTSVGDRVTITC | 511 | WYQQKPGQSPKLLIY |
- 52 045348
Таблица 13
Аминокислотные последовательности каркасных областей 3-4 легкой цепи
Клон | SEQ ID NO: | Последовательность VL-FR3 | SEQ ID NO: | Последовательность VL-FR4 |
chllFll-VL | 495 | GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKA EDLAVYYC | 501 | FGGGTKLEIK |
HullFll-VLl | 496 | GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQA EDVAVYYC | 502 | FGGGTKVEIK |
HullFll-VL2 | 497 | GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQA EDVAVYYC | 501 | FGGGTKLEIK |
HullFll-VL3 | 496 | GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQA EDVAVYYC | 501 | FGGGTKLEIK |
HullFll-VL4 | 498 | GVPSRF SGSGSGTDFTLTIS SLQPE DFATYYC | 503 | FGQGTKVEIK |
HullFll-VL5 | 499 | GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQA EDLAVYYC | 501 | FGGGTKLEIK |
HullFll- VLv3 4c | 500 | GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKA EDVAVYYC | 501 | FGGGTKLEIK |
ch3A9-VL | 515 | GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNMQS EDLADYFC | 522 | FGAGTKLELR |
Hu3A9-VLl | 516 | GVPDRF SGSGSGTDFTLTIS SLQPE DFATYYC | 522 | FGAGTKLELR |
Hu3A9-VL2 | 517 | GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPD DFASYYC | 522 | FGAGTKLELR |
Hu3A9-VL3 | 518 | GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSE DFAVYYC | 522 | FGAGTKLELR |
Hu3A9-VL4 | 519 | GVPSRF SGSGSGTDFTLTIS SLQPE DFATYYC | 522 | FGAGTKLELR |
Hu3A9-VL-vl | 520 | GVPDRFSGSGSGTDFTFTISSMQS EDIATYFC | 522 | FGAGTKLELR |
Hu3A9-VL-v2 | 521 | GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQS EDLADYYC | 522 | FGAGTKLELR |
Hu3A9-VL-v2 | 521 | GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQS EDLADYYC | 522 | FGAGTKLELR |
В другом воплощении антитело против альфа-синуклеина или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи (H-CDR1), содержащую аминокислоту, выбранную из SEQ ID NO:434 и SEQ ID NO:439, CDR2 тяжелой цепи (HCDR2), содержащую аминокислоту, выбранную из SEQ ID NO:435-437 и 649 и SEQ ID NO:440-441, и CDR3 тяжелой цепи (H-CDR3), содержащую аминокислоту, выбранную из SEQ ID NO:438 и SEQ ID NO:442, где вариабельная область тяжелой цепи дополнительно содержит каркасную область тяжелой цепи (H-FR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:449-450 и SEQ ID NO:468-473, каркасную область тяжелой цепи (H-FR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:451-452 и SEQ ID NO:474-477, каркасную область тяжелой цепи (H-FR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:453-464 и SEQ
- 53 045348
ID NO:478-483, и каркасную область тяжелой цепи (H-FR4), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:465-467 и SEQ ID NO:484-485. Более конкретно, вариабельная область тяжелой цепи содержит каркасную область тяжелой цепи (H-FR1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:450, каркасную область тяжелой цепи (H-FR2), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:451, каркасную область тяжелой цепи (H-FR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:462-464, и каркасную область тяжелой цепи (H-FR4), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:467.
Кроме того, антитело против альфа-синуклеина или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи (L-CDR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:443 и SEQ ID NO:446, CDR2 легкой цепи (L-CDR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:444 и SEQ ID NO:447, и CDR3 легкой цепи (L-CDR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:445 и SEQ ID NO:448, где вариабельная область легкой цепи дополнительно содержит каркасную область легкой цепи (LFR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:486-491 и SEQ ID NO:504-510, каркасную область легкой цепи (L-FR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:492-494 и SEQ ID NO:511-514, каркасную область легкой цепи (L-FR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:495-500 и SEQ ID NO:515521, и каркасную область легкой цепи (L-FR4), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:501-503 и SEQ ID NO:522. Более конкретно, вариабельная область легкой цепи содержит каркасную область легкой цепи (L-FR1), содержащую полипептидный фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:491, каркасную область легкой цепи (L-FR2), содержащую полипептидный фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:492, каркасную область легкой цепи (L-FR3), содержащую полипептидный фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:500, и каркасную область легкой цепи (L-FR4), содержащую полипептидный фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:501.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно одному воплощению настоящего изобретения могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:434, CDR2 тяжелой цепи (HCDR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:435-437 и 649, и CDR3 тяжелой цепи (H-CDR3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:438, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи (L-CDR1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:443, CDR2 легкой цепи (L-CDR2), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:444, и CDR3 легкой цепи (L-CDR3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:445, где вариабельная область тяжелой цепи содержит каркасную область тяжелой цепи (H-FR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:449,450 и 471, каркасную область тяжелой цепи (H-FR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:451, 452 и 475, каркасную область тяжелой цепи (H-FR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:453-464, и каркасную область тяжелой цепи (H-FR4), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:465-467, и где вариабельная область легкой цепи содержит каркасную область легкой цепи (L-FR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:486-491, каркасную область легкой цепи (L-FR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:492494, каркасную область легкой цепи (L-FR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:495-500, и каркасную область легкой цепи (L-FR4), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:501-503.
Предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно одному воплощению настоящего изобретения содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1-CDR3 тяжелой цепи, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:434, 435 и 438, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1-CDR3 легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:443, 444 и 445, где вариабельная область тяжелой цепи содержит каркасную область 1 тяжелой цепи (H-FR1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:450, каркасную область тяжелой цепи (H-FR2), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:451, каркасную область тяжелой цепи (H-FR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:462-464, и каркасную область тяжелой цепи (H-FR4), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:467, и вариабельная область легкой цепи содержит каркасную область 1 легкой цепи (L-FR1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:491, каркасную область легкой цепи (L-FR2), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:492, каркасную область легкой цепи (L-FR3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:500, и каркасную область легкой цепи (L-FR4), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:501.
- 54 045348
Антитело против альфа-синуклеина или его антигенсвязывающий фрагмент согласно одному воплощению настоящего изобретения содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи (H-CDR1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:439, CDR2 тяжелой цепи (H-CDR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:440-441, и CDR3 тяжелой цепи (H-CDR3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:442, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи (L-CDR1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:446, CDR2 легкой цепи (L-CDR2), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:447, и CDR3 легкой цепи (L-CDR3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:448, где вариабельная область тяжелой цепи содержит каркасную область 1 тяжелой цепи (H-FR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:463-473, каркасную область тяжелой цепи (H-FR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:474-477, каркасную область тяжелой цепи (H-FR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:478-483, и каркасную область тяжелой цепи (H-FR4), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:484-485, и где вариабельная область легкой цепи содержит каркасную область 1 легкой цепи (L-FR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:504-510, каркасную область легкой цепи (L-FR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:511514, каркасную область легкой цепи (L-FR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:515-521, и каркасную область легкой цепи (L-FR4), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:522.
В полноразмерных формах легкой цепи и тяжелой цепи вариабельная область и константная область соединены J-областью длиной приблизительно 12 или более аминокислот, а тяжелая цепь также содержит D-область длиной приблизительно 10 или более аминокислот. Возможные ссылки включают, например, Fundamental Immunology, 2nd ed., Ch. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press. Обычно пара из вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи антитела могут образовывать антигенсвязывающую область.
Вариабельная область цепи иммуноглобулина обычно имеет одну и ту же общую структуру и содержит относительно консервативные каркасные области (FR), соединенные тремя гипервариабельными участками, называемыми областями или доменами, определяющими комплементарность, или CDR. CDR вариабельных областей каждой цепи, образующей пару тяжелая цепь/легкая цепь, обычно выровнены каркасными областями с образованием структуры, специфично связывающейся с определенным эпитопом белка-мишени (альфа-синуклеина). Эти элементы встречающихся в природе вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи обычно включены в следующем порядке от Nконца к С-концу: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Положение аминокислотных последовательностей, соответствующих каждому из этих элементов, в вариабельной области, обозначают в соответствии с системой нумерации Kabat (Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (в редакциях от 1987 г. и 1991 г., NIH, Bethesda, MD)) или Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196 : 901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 878-883.
Различные вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи, раскрытые здесь, показаныв табл. 14 и 15. Каждая из этих вариабельных областей может быть соединена с константной областью тяжелой цепи и константной областью легкой цепи с образованием тяжелой цепи и легкой цепи интактного антитела. Кроме того, полученные последовательность тяжелой цепи и последовательность легкой цепи можно также сочетать, образуя структуру полноразмерного антитела. Например, антитело против альфа-синуклеина или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:523-534 или SEQ ID NO:535-541, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:542-548 или SEQ ID NO:549-556, и, конкретнее, вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:523-534, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:542-548, или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:535-541, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:549-556.
В одном конкретном воплощении настоящего изобретения антитело против альфа-синуклеина или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:531-534, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:548 (например, Hu11F11 (ver.1), Hu11F11 (ver.2), Hu11F11 (ver.3), Hu11F11 (ver.4) и так далее), или могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:525, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:546 (например, антитело Hu11F11 (ABL2-4)).
- 55 045348
Примеры аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи антитела или антигенсвязывающего фрагмента согласно одному воплощению приведеныв табл. 14 и 15.
Таблица 14
Вариабельная область тяжелой цепи (VH)
Клон | SEQ ID NO: | Аминокислотная последовательность |
chllFll-VH | 523 | EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPG KRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQM NALRAEDTAIYYCARDAHGKPFAYWGQGTLVTVSA |
HullFll-VHl | 524 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDFYMEWVRQAPG KGLEWIAAIRNKANDYTTEYAASVKGRFTVSRDTSKNSLYLQ MNSLKTEDTAVYYCARDAHGKPFAYWGQGTL VTVSS |
HullFll-VH2 | 525 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDFYMEWVRQAPG KGLEWIAAIRNKANDYTTEYAASVKGRFTISRDTSKNSLYLQM NSLKTEDTAVYYC ARD AHGKPFAYWGQGTL VTVSS |
- 56 045348
HullFll-VH3 | 526 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDFYMEWVRQAPG KGLEWIAAIRNKANDYTTEYADSVKGRFTVSRDTSQNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCARD AHGKPF AYWGQGTL VTVSS |
HullFll-VH4 | 527 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDFYMEWVRQAPG KGLEWVAAIRNKANDYTTEYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQ MNSLRAEDTAVYYC SRD AHGKPF AYWGQGTL VTVS S |
HullFll-VHv3 | 528 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPG KRLEWIAATRNKANDYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSSLYLQM NSLRAEDT AIYYC ARD AHGKPF AYWGQGTT VTVS S |
HullFll- VHvlmul newmu | 529 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPG KRLEWIAATRNKANDYTTEYSASVKGRFTISRDTSQSSLYLQM NSLKTEDTAVYYCARD AHGKPF AYWGQGTTVTVSS |
HullFll-VHv3 newmu | 530 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPG KRLEWIAATRNKANDYTTEYSASVKGRFTISRDTSQSSLYLQM NSLRAEDT AIYYC ARD AHGKPF AYWGQGTT VTVS S |
HullFll-VH- vl | 531 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPG KRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSSLYLQM NSLRAEDT AIYYC ARD AHGKPF AYWGQGTT VTVS S |
HullFll-VH- v2 | 532 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPG KRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFTVSRDDSKSSLYLQ MNSLRAEDT AI YYC ARD AHGKPF AYWGQGTT VTVS S |
HullFll-VH- v3 | 533 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPG KRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFTISRDTSKSSLYLQM NSLRAEDT AIYYC ARD AHGKPF AYWGQGTT VTVS S |
HullFll-VH- v4 | 534 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPG KRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFTVSRDTSKSSLYLQ MNSLRAEDT AI YYC ARD AHGKPF AYWGQGTT VTVS S |
ch3A9-VH | 535 | EVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPE KRLEWVATISNGGGYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMS SLRSEDTAMYYCARHITTVRPTKYFDYWGQGTTLTVSS |
- 57 045348
Hu3A9-VHl | 536 | QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG KGLEWVATISNGGGYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMN SLRSED SAM YYC ARHITTVRPTKYFD YWGQGTL VT VS S |
Hu3A9-VH2 | 537 | EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPD KGLEWVATISNGGGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMS SLKAED S AVY YC ARHITTVRPTKYFD YWGQGTL VT VS S |
Hu3A9-VH3 | 538 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG KGLEWVATISNGGGYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDT AVY YC ARHITTVRPTKYFD YWGQGTL VTVSS |
Hu3A9-VH4 | 539 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG KGLEWVATISNGGGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMN SLRAEDT AVY YC ARHITTVRPTKYFD YWGQGTL VT VS S |
Hu3A9-VH-vl | 540 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEK GLEWVATISNGGGYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSL RAEDT AM YYC ARHITTVRPTKYFD YWGQGTTLT VS S |
Hu3A9-VH-v2 | 541 | EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEK GLEWVATISNGGGYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSL RAEDT AM YYC ARHITTVRPTKYFD YWGQGTTLT VS S |
ch9Bll-VH | 557 | EVQLQESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPG KGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQ MNNLKTEDT AMYYC VRQDFD YWGQGTTLT VS S |
Таблица 15
Вариабельная область легкой цепи (VL)
Клон | SEQ ID NO: | Аминокислотная последовательность |
chllFll-VL | 542 | DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWY QQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKA EDLAVYYCQQYYSYPWTFGGGTKLEIK |
HullFll-VLl | 543 | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQ QKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAE |
- 58 045348
DVAVYYCQQYYSYPWTFGGGTKVEIK | ||
HullFll-VL2 | 544 | DIVMTQSPSSLAVSLGERVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQ QKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAE DVAVYYCQQYYSYPWTFGGGTKLEIK |
HullFll-VL3 | 545 | DIVMTQSPSSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQ QKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAE DVAVYYCQQYYSYPWTFGGGTKLEIK |
HullFll-VL4 | 546 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQ QKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPED FATYYCQQYYSYPWTFGQGTKVEIK |
HullFll-VL5 | 547 | DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWY QQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQA EDLAVYYCQQYYSYPWTFGGGTKLEIK |
HullFll-VLv3 4c | 548 | DIVMTQSPSSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQ QKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAE DVAVYYCQQYYSYPWTFGGGTKLEIK |
ch3A9-VL | 549 | DIVMTQSPKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTTVAWYQQKPGQ SPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNMQSEDLADY FCQQYSNYPLTFGAGTKLELR |
Hu3A9-VLl | 550 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTTVAWYQQKPGK APKLLIYSASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYY CQQYSNYPLTFGGGTKLEIK |
Hu3A9-VL2 | 551 | DIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCKASQNVGTTVAWYQQKPGK APKLLIYSASNRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFASYY CQQYSNYPLTFGQGTKVEIK |
Hu3A9-VL3 | 552 | DIVMTQSPATLSVSLGERATLSCKASQNVGTTVAWYQQKPGQ APRLLIYSASNRYTGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYY CQQYSNYPLTFGGGTKVEIK |
Hu3A9-VL4 | 553 | DIQMTQSPSSLSA L- SVGDRVTITCKASQNVGTTVAWYQQKPG KAPKLLIYSASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQQYSNYPLTFGQGTKVEIK |
- 59 045348
Hu3A9-VL-vl | 554 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTTVAWYQQKPGQS PKLLIYSASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTFTISSMQSEDIATYFC QQYSNYPLTFGQGTKLEIK |
Hu3A9-VL-v2 | 555 | DIVMTQSPSSMSTSVGDRVTITCKASQNVGTTVAWYQQKPGQ SPKLLIYSASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQSEDIADYY CQQYSNYPLTFGQGTKLEIK |
Hu3A9-VL-v2 | 556 | DIVMTQSPSSMSTSVGDRVTITCKASQNVGTTVAWYQQKPGQ SPKLLIYSASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQSEDLADY YCQQYSNYPLTFGQGTKLEIK |
ch9Bll-VL | 558 | DIVMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQ KPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAED LGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKLEQKR |
Кроме того, антитела, содержащие комбинацию вариабельной области тяжелой цепи с вариабельной областью легкой цепи и константную область антитела или антигенсвязывающего фрагмента по одному воплощению, описаны в табл. 16.
Таблица 16
Примеры антител по изобретению
Название образца | Цепь | Аминокислотная последовательность |
hullFll (ver.l) | Тяжелая (SEQ ID NO:560) | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPG KRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSSLYLQ MNSLRAEDTAIYYCARDAHGKPFAYWGQGTTVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVF SC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
-60045348
Легкая (SEQ ID NO:566) | DIVMTQSPS SLAVSLGERVTMSCKS SQSLL YS SNQKNYL AWY QQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVK AEDVAVYYCQQYYSYPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC | |
hullFll (ver. 2) | Тяжелая (SEQ ID NO:561) | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPG KRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFTVSRDDSKSSLYLQ MNSLRAEDTAIYYCARDAHGKPFAYWGQGTTVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVF SC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
Легкая (SEQ ID NO:566) | DIVMTQSPS SLAVSLGERVTMSCKS SQSLL YS SNQKNYL AWY QQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVK AEDVAVYYCQQYYSYPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC |
- 61 045348
hullFll (ver.3) | Тяжелая (SEQ ID NO:562) | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPG KRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFTISRDTSKSSLYLQ MNSLRAEDTAIYYCARDAHGKPFAYWGQGTTVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVF SC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
Легкая (SEQ ID NO:566) | DIVMTQSPSSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWY QQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVK AEDVAVYYCQQYYSYPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC | |
hullFll (ver. 4) | Тяжелая (SEQ ID NO:563) | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPG KRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFTVSRDTSKSSLYLQ MNSLRAEDTAIYYCARDAHGKPFAYWGQGTTVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVF SC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
- 62 045348
Легкая (SEQ ID NO:566) | DIVMTQSPS SLAVSLGERVTMSCKS SQSLL YS SNQKNYL AWY QQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVK AEDVAVYYCQQYYSYPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC | |
hullFll (H2L4) | Тяжелая (SEQ ID NO:564) | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDFYMEWVRQAP GKGLEWIAAIRNKANDYTTEYAASVKGRFTISRDTSKNSLYL QMNSLKTEDTAVYYCARDAHGKPFAYWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
Легкая (SEQ ID NO:567) | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWY QQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQYYSYPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC | |
hu3A9 (VH5/L3) | Тяжелая (SEQ ID NO:565) | EVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPE KGLEWVATISNGGGYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQM NSLRSEDTAVYYCARHITTVRPTKYFDYWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
Легкая (SEQ ID NO:568) | DIVMTQSPATLSVSLGERATLSCKASQNVGTTVAWYQQKPG QAPRLLIYSASNRYTGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAV YYCQQYSNYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC |
Для того чтобы вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, описанные здесь, образовали тяжелую цепь и легкую цепь интактного антитела, каждая вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи может быть связана с константной областью тяжелой цепи и константной областью легкой цепи. Каждую из тяжелой цепи и легкой цепи, полученных как
- 63 045348 описано выше, можно надлежащим образом комбинировать с получением комбинации тяжелая цепь легкая цепь, и полученная комбинация тяжелая цепь - легкая цепь может образовывать мультимер (например, димер в случае антитела типа IgG), что приводит к построению структуры интактного антитела.
Константная область может быть надлежащим образом выбрана из константных областей тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов (например, человеческих иммуноглобулинов). Например, без ограничения, константная область тяжелой цепи может представлять собой константную область тяжелой цепи IgG1, константную область тяжелой цепи IgG3 или константную область тяжелой цепи IgG4, а константная область легкой цепи может представлять собой константную область каппа или константную область лямбда. Для стабильности антитела, простоты его получения, аффинности в отношении антигена и/или других желаемых характеристик могут быть надлежащим образом выбраны и использованы другие типы константных областей или модифицированные константные области, которые очевидны специалистам в области техники.
В другом воплощении каждая из вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи, раскрытыхв табл. 14 и 15, могут быть свободно скомбинированы друг с другом с образованием различных антител и связаны в одноцепочечной форме с получением одноцепочечных антител, таких как scFv.
Антитело, описанное здесь, может иметь определенную общую область или последовательность с другим антителом, раскрытым здесь. В одном воплощении антитело может иметь общую константную область с другим антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В другом воплощении оно может иметь общую Fc-область.
В одном воплощении антитело против альфа-синуклеина по настоящему изобретению также включает моноклональное антитело и поликлональное антитело. В другом воплощении антитело против альфа-синуклеина может представлять собой человеческое антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело или антитело, имеющее происхождение от животного. В другом воплощении антитело против альфа-синуклеина может быть получено рекомбинантным методом или химическим синтезом.
Антигенсвязывающие фрагменты или фрагменты антител, описанных здесь, могут представлять собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из молекул одноцепочечных антител scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab', F(ab')2, минитела, диатела, scFv и тому подобного.
В другом воплощении антитело, предложенное здесь, может представлять собой гуманизированное антитело или человеческое антитело и может относиться к различным изотипам (например, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE или IgD), особенно к типам IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, таким как типы IgG1 или IgG2.
В другом воплощении антитело против альфа-синуклеина может содержать только тяжелую цепь или легкую цепь, описанные выше. В другом воплощении антитело против альфа-синуклеина имеет только вариабельную область тяжелой цепи или только вариабельную область легкой цепи.
Специалистам в данной области будет ясно, что, когда антитело содержит один или более чем один CDR, раскрытые здесь, каждый из раскрытых CDR можно выбирать и комбинировать независимо от других. Таким образом, могут быть получены антитела, содержащие 1, 2, 3, 4, 5 или 6 независимо выбранных CDR. Специалистам в данной области также будет ясно, что, при выборе CDR для комбинации, CDR одного и того же типа не используют повторно и обычно не получают антитела, содержащие, например, два участка CDR-H2.
В одном воплощении антитело может представлять собой моноклональное антитело или поликлональное антитело. Антитела, раскрытые здесь, включают моноклональные антитела, связывающиеся с альфасинуклеином. Моноклональные антитела могут быть получены с применением любой методики, известной в данной области. Например, они могут быть получены иммортализацией клеток селезенки, полученных от иммунизированных трансгенных животных. Моноклональные антитела, секретированные гибридомными клеточными линиями, могут быть очищены с применением методик, известных в данной области.
В других воплощениях антитело может представлять собой антитело животного происхождения (например, мышиное антитело и так далее), химерное антитело (например, мышиное-человеческое химерное антитело), гуманизированное антитело или человеческое антитело. Антитело может также быть модифицировано различными способами для различных целей. Также предложены химерные антитела и гуманизированные антитела. Химерные антитела представляют собой антитела, в которых полипептидные фрагменты, имеющие происхождение от разных антител, ковалентно связаны с образованием иммунологически функциональных легкой цепи, тяжелой цепи или их фрагмента.
В таком моноклональном антителе определенный аминокислотный остаток, обычно входящий в состав части антитела, не участвующей в распознавании антигена, модифицирован, чтобы быть гомологичным соответствующему остатку изотипа, соответствующего человеческому антителу. Гуманизация может быть проведена различными известными методами, например, заменой по меньшей мере части вариабельной области грызуна на соответствующую область человеческого антитела (патенты США №№ 5,585,089 и 5,693,762; Jones et al., Nature 1986, 321: 522-525; Riechmann et al., Nature 1988, 332: 32327; Verhoeyen et al., Science 1988, 239: 1534-1536).
- 64 045348
Полноразмерное человеческое антитело может быть получено иммунизацией трансгенного животного (обычно мыши), которое может вырабатывать человеческое антитело ввиду отсутствия выработки эндогенного иммуноглобулина. Полноразмерное человеческое антитело может также иметь происхождение от фаговой дисплейной библиотеки. Использование полноразмерных человеческих антител позволяет минимизировать иммуногенные и аллергические реакции, которые могут быть вызваны введением человеку мышиного mAb или mAb мышиного происхождения.
В одном воплощении отбор человеческих антител к альфа-синуклеину по настоящему изобретению проводят методом фагового дисплея. Моноклональные фаговые антитела, специфичные в отношении альфа-синуклеина, отобранные методом фагового скрининга, превращают в полноразмерную форму IgG с применением рекомбинантного метода. Последовательность каждого моноклонального фагового антитела получают для рекомбинантного получения антител против альфа-синуклеина. После соединения последовательности вариабельной области тяжелой цепи с последовательностью константной области тяжелой цепи и последовательности вариабельной области легкой цепи с последовательностью константной области легкой цепи в полученных последовательностях, аминокислотные последовательности преобразуют в нуклеотидную последовательность методом оптимизации кодонов. После клонирования полученных нуклеотидных последовательностей в векторы, используемые для культивирования клеток животных, клетки-хозяева, используемые для получения белков, такие как клетки СНО, трансформируют полученными векторами и культивируют. Для очистки антител, присутствующих в культуральной среде, рекомбинантные антитела выделяют и очищают с применением методики очистки, такой как аффинная хроматография.
В другом воплощении антитело может иметь типичную структуру встречающегося в природе антитела или модифицированную структуру.
Антитело, имеющее типичную структуру, может иметь мультимерную структуру, включающую структурные единицы, содержащие две разные полипептидные цепи (то есть тяжелую цепь и легкую цепь). Указанные две разные полипептидные цепи включают одну полноразмерную легкую цепь (приблизительно 25 кДа) и одну полноразмерную тяжелую цепь (приблизительно 50-70 кДа). Каждая цепь имеет характерную пространственную структуру и состоит из нескольких иммуноглобулиновых доменов, состоящих из приблизительно 90-110 аминокислот. Эти домены являются основными структурами, из которых состоит полипептид антитела. N-концевая часть каждой цепи обычно содержит часть, называемую вариабельной областью или V-областью, которая представляет собой часть, распознающую антиген. С-концевая часть эволюционно более консервативна, чем N-концевая, и содержит часть, называемую константной областью или С-областью. Человеческую легкую цепь обычно классифицируют как легкие цепи каппа (к) и лямбда (λ), и они содержат одну вариабельную область и одну константную область. Тяжелую цепь обычно классифицируют как цепь мю (μ), дельта (δ), гамма (γ), альфа (α) или эпсилон (ε), и их определяют как изотипы IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. IgG включает многочисленные подтипы, в том числе, без ограничения, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Константная область тяжелой цепи обычно содержит один или более чем один домен, демонстрирующие эффекторную функцию. Число доменов в константной области тяжелой цепи варьирует в зависимости от изотипа. Тяжелая цепь IgG, например, содержит три домена С-области, известные как CH1, CH2 и СН3, соответственно. Антитело, раскрытое здесь, может представлять собой антитело любого из этих изотипов и подтипов. В одном воплощении антитело по настоящему изобретению представляет собой антитело подтипа IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 или IgG4.
Агрегат альфа-синуклеина по настоящему изобретению специфично распознает агрегаты альфасинуклеина с высокой аффинностью и специфичностью, указывая на то, что антитело к альфасинуклеину может быть полезно для диагностики или выявления таких заболеваний. Кроме того, антитело к альфа-синуклеину, специфично распознающее агрегаты альфа-синуклеина, по настоящему изобретению ингибирует образование агрегатов альфа-синуклеина, разрушает агрегаты или ингибирует межклеточный перенос агрегатов, благодаря чему оно может быть полезным образом использовано для лечения синуклеинопатий, в частности болезни Паркинсона.
Примеры биспецифичных антител по настоящему изобретению показаны в табл. 17.
- 65 045348
Таблица 17
Биспецифичное антитело Идентификатор клона | Легкая цепь биспецифичног о антитела | Комбинированная тяжелая цепь биспецифичного антитела | SE Q ID | Пояснения по тяжелой цепи биспецифичного антитела | SEQ ID |
chi 1F11-1564-3 bivalent | chllFll-VL | chi 1F11-1564-3 бивалентная (НС) | 569 | CH11F11 (IGG)- | 640 |
(G4S)3- | 412 | ||||
1564-3 VL- | 297 | ||||
(G4S)4- | 411 | ||||
1564-3 VH | 178 | ||||
chi 1F11-1564-2 bivalent | chllFll-VL | chi 1F11-1564-2 бивалентная (НС) | 570 | CH11F11 (IGG), | 640 |
(G4S)3, | 412 | ||||
1564-2 VL, | 296 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
1564-2 VH | 177 | ||||
chi 1F11-1564-3 monovalent | chllFll-VL | chi 1F11-1564-3 моновалентная (НС 1, -впадина) (1564-3 scFv) | 571 | CHI IF 11 (IGG) C МУТАЦИЕЙ ТИПА «ВПАДИНА» AT FC, | 641 |
(G4S)3, | 412 | ||||
1564-3 VL, | 297 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
1564-3 VH | 178 | ||||
chi1F11-1564 моновалентная (НС 2, -выступ) | 573 | CHI IF 11 (IGG) WITH МУТАЦИЯ ТИПА «ВЫСТУП» | 573 | ||
chi 1F11-1564-2 monovalent | chllFll-VL | chi 1F11-1564-2 моновалентная (НС 1, -впадина) (1564-2 scFv) | 572 | CH11F11 (IGG) С МУТАЦИЕЙ ТИПА «ВПАДИНА» АТ FC, | 641 |
(G4S)3, | 412 | ||||
1564-2 VL, | 296 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
1564-2 VH | 177 | ||||
chi1F11-1564 моновалентная (НС 2, -выступ) | 573 | CHI IF 11 (IGG) C МУТАЦИЕЙ ТИПА «ВЫСТУП» | 573 | ||
ch3A9-1564-3 bivalent | ch3A9-VL | ch3A9-1564-3 бивалентная (НС) | 574 | CH3A9 (IGG), | 642 |
(G4S)3, | 412 | ||||
1564-3 VL, | 297 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
1564-3 VH | 178 | ||||
ch3A9-1564-2 bivalent | ch3A9-VL | ch3A9-1564-2 бивалентная (НС) | 575 | CH3A9 (IGG), | 642 |
(G4S)3, | 412 |
- 66 045348
1564-2 VL, | 296 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
1564-2 VH | 177 | ||||
ch3A9-1564-3 monovalent | ch3A9-VL | ch3A9-1564-3 моновалентная (НС 1, -впадина) | 576 | СНЗА9 (IGG) С МУТАЦИЕЙ ТИПА «ВПАДИНА» АТ FC | 643 |
(G4S)3, | 412 | ||||
1564-3 VL, | 297 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
1564-3 VH | 178 | ||||
ch3A9-1564 моновалентная (НС 2, -выступ) | 578 | CH3A9 (IGG) C МУТАЦИЕЙ ТИПА «ВЫСТУП» | 578 | ||
ch3A9-1564-3 monovalent | ch3A9-VL | ch3A9-1564-2 моновалентная (НС 1, -впадина) | 577 | CH3A9 (IGG) С МУТАЦИЕЙ ТИПА «ВПАДИНА» АТ FC, | 643 |
(G4S)3, | 412 | ||||
1564-2 VL, | 296 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
1564-2 VH | 177 | ||||
ch3A9-1564 моновалентная (НС 2, -выступ) | 578 | CH3A9 (IGG) C МУТАЦИЕЙ ТИПА «ВЫСТУП» | 578 | ||
hullFll(ver.2)-1564-3 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-1564-3 бивалентная (НС) | 579 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
1564-3 VL, | 297 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
1564-3 VH | 178 | ||||
hullFll(ver.2)-1564-2 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-1564-2 бивалентная (НС) | 580 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
1564-2 VL, | 296 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
1564-2 VH | 177 | ||||
hullFll(ver.2)-1564-3 monovalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-1564-3 моновалентная (НС 1, -впадина) | 581 | hullFll(ver.2 (IGG) С МУТАЦИЕЙ ТИПА «ВПАДИНА» AT FC, | 645 |
(G4S)3, | 412 | ||||
1564-3 VL, | 297 | ||||
(G4S)4, | 411 |
- 67 045348
1564-3 VH | 178 | ||||
hullFll(ver.2)-1564 моновалентная (НС 2, -выступ) | 583 | hullFll(ver.2 (IGG) С МУТАЦИЕЙ ТИПА «ВЫСТУП» | 583 | ||
hullFll(ver.2)-1564-2 monovalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-1564-2 моновалентная (НС 1, -впадина) | 582 | hullFll(ver.2 (IGG) С МУТАЦИЕЙ ТИПА «ВПАДИНА» AT FC, | 645 |
(G4S)3, | 412 | ||||
1564-2 VL, | 296 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
1564-2 VH | 177 | ||||
hullFll(ver.2)-1564 моновалентная (НС 2, -выступ) | 583 | hullFll(ver.2 (IGG) С МУТАЦИЕЙ ТИПА «ВЫСТУП» | 583 | ||
** | человеческий IgGl M428L mutated (CHI, СН2, СНЗ) | 584 | ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ IGG1 M428L МУТАЦИЯ AT FC | 584 | |
hullFll(ver.2)(M428L )-1564-DMP bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-1564-DMP bivalent(HC) | 585 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, | 646 |
(G4S)3, | 412 | ||||
1564-DMP VL, | 299 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
1564-DMP VH | 180 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-1564-DM bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-1564-DM bivalen t(HC) | 586 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, | 646 |
(G4S)3, | 412 | ||||
1564-DM VL, | 298 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
1564-DM VH | 179 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-1564-DMP monovalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-1564-DMP моновалентная (НС 1, -впадина) | 587 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L, МУТАЦИЯ ТИПА «ВПАДИНА», | 647 |
(G4S)3, | 412 | ||||
1564-DMP VL, | 299 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
1564-DMP VH | 180 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-1564 monovalent, (НС 2, -выступ) | 589 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L, МУТАЦИЯ ТИПА «ВЫСТУП» | 589 | ||
hullFll(ver.2)(M428L )-1564-DM monovalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-1564-DMP | 588 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L, | 647 |
- 68 045348
monovalent, (HC 1, впадина) | МУТАЦИЯ ТИПА «ВПАДИНА», | ||||
(G4S)3, | 412 | ||||
1564-DM VL, | 298 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
1564-DM VH | 179 | ||||
hullFH(ver.2)(M428L )-1564 monovalent, (HC 2, -выступ) | 589 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L, МУТАЦИЯ ТИПА «ВЫСТУП» | 589 | ||
hullFll(ver.2)-C04-3 monovalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-C04-3 моновалентная (HC 1, -впадина) | 590 | hullFll(ver.2 (IGG), МУТАЦИЯ ТИПА «ВПАДИНА», | 645 |
(G4S)3, | 412 | ||||
С04-3 VL, | 334 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
C04-3 VH | 215 | ||||
hullFll(ver.2)-C04 моновалентная (HC 2, -выступ) | 583 | hullFll(ver.2 (IGG), МУТАЦИЯ ТИПА «ВЫСТУП» | 583 | ||
hullFll(ver.2)-C04-2 monovalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-C04-2 моновалентная (HC 2, -выступ) | 591 | hullFll(ver.2 (IGG), МУТАЦИЯ ТИПА «ВЫСТУП» | 645 |
(G4S)3, | 412 | ||||
С04-2 VL, | 333 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
C04-2 VH | 214 | ||||
hullFll(ver.2)-C04 моновалентная (HC 2, -выступ) | 583 | hullFll(ver.2 (IGG), МУТАЦИЯ ТИПА «ВЫСТУП» | 583 | ||
hullFll(ver.2)-F06-03 monovalent | hullFll(ver.2)-F06-3 моновалентная (HC 1, -впадина) | 592 | hullFll(ver.2 (IGG), МУТАЦИЯ ТИПА «ВПАДИНА», | 645 | |
(G4S)3, | 412 | ||||
F06-3 VL, | 339 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
F06-3 VH | 220 | ||||
hullFll(ver.2)-C04 моновалентная (HC 2, -выступ) | 583 | hullFll(ver.2 (IGG), МУТАЦИЯ ТИПА «ВЫСТУП» | 583 | ||
hullFll(ver.2)-F06-02 monovalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-F06-02 моновалентная (HC 1, -впадина) | 593 | hullFll(ver.2 (IGG), МУТАЦИЯ ТИПА «ВПАДИНА», | 645 |
(G4S)3, | 412 |
- 69 045348
F06-2 VL, | 338 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
F06-2 VH | 219 | ||||
hullFll(ver.2)-C04 моновалентная (НС 2, -выступ) | 583 | hullFll(ver.2 (IGG), МУТАЦИЯ ТИПА «ВЫСТУП» | 583 | ||
hullFll(ver.2)-VH2-3 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-VH2-3 бивалентная (НС) | 594 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH2-3 VL, | 356 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH2-3 VH | 237 | ||||
hullFll(ver.2)-VH2-2 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-VH2-2 бивалентная (НС)_2 | 595 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH2-2 VL, | 355 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH2-2 VH | 236 | ||||
hullFll(ver.2)-VH5-3 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-VH5-3 бивалентная (НС) | 596 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH5-3 VL, | 361 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH5-3 VH | 242 | ||||
hullFll(ver.2)-VH5-2 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-VH5-2 бивалентная (НС)_2 | 597 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH5-2 VL, | 360 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH5-2 VH | 241 | ||||
hullFll(ver.2)-VH6-3 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-VH6-3 бивалентная (НС) | 598 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH6-3 VL, | 366 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH6-3 VH | 247 | ||||
hullFll(ver.2)-VH6-2 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-VH6-2 бивалентная (НС)_2 | 599 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH6-2 VL, | 365 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH6-2 VH | 246 |
- 70 045348
hullFll(ver.2)-VH7-3 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-VH7-3 бивалентная (НС) | 600 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH7-3 VL, | 371 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH7-3 VH | 252 | ||||
hullFll(ver.2)-VH7-2 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-VH7-2 бивалентная (HC)_2 | 601 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH7-2 VL, | 370 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH7-2 VH | 251 | ||||
hullFll(ver.2)-VH9-3 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-VH9 бивалентная (НС) | 602 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH9-3 VL, | 376 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH9-3 VH | 257 | ||||
hullFll(ver.2)-VH9-2 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-VH9 бивалентная (НС)_2 | 603 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH9-2 VL, | 375 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH9-2 VH | 256 | ||||
hullFll(ver.2)-VH16-3 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-VH16 бивалентная (НС) | 604 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH16-3 VL, | 381 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH16-3 VH | 262 | ||||
hullFll(ver.2)-VH16-2 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-VH16 бивалентная (НС)_2 | 605 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH16-2 VL, | 380 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH16-2 VH | 262 | ||||
hullFll(ver.2)-VH27 3 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-VH27 бивалентная (НС) | 606 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH27-3 VL, | 386 | ||||
(G4S)4, | 411 |
- 71 045348
VH27-3 VH | 267 | ||||
hullFll(ver.2)-VH27-2 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-VH27 бивалентная (HC)_2 | 607 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH27-2 VL, | 385 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH27-2 VH | 266 | ||||
hullFll(ver.2)-VH32-3 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-VH32 бивалентная (НС) | 608 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH32-3 VL, | 391 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH32-3 VH | 272 | ||||
hullFll(ver.2)-VH32-2 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-VH32 бивалентная (HC)_2 | 609 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH32-2 VL, | 390 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH32-2 VH | 271 | ||||
hullFll(ver.2)-VH35-3 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-VH35 бивалентная (НС) | 610 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH35-3 VL, | 396 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH35-3 VH | 277 | ||||
hullFll(ver.2)-VH35-2 bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)-VH35 бивалентная (НС)_2 | 611 | hullFll(ver.2 (IGG), | 644 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH35-2 VL, | 395 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH35-2 VH | 276 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-C04-DMP monovalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-C04-DMP моновалентная (НС 1, -впадина) | 612 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L, МУТАЦИЯ ТИПА «ВПАДИНА», | 647 |
(G4S)3, | 412 | ||||
C04-DMP VL, | 336 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
C04-DMP VH | 217 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-С04 (НС 2, -выступ) | 589 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, МУТАЦИЯ ТИПА | 589 |
- 72 045348
«ВЫСТУП» | |||||
hullFll(ver.2)(M428L )-C04-DM monovalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-C04-DM моновалентная (НС 1, -впадина) | 613 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L, МУТАЦИЯ ТИПА «ВПАДИНА», | 647 |
(G4S)3, | 412 | ||||
C04-DM VL, | 335 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
C04-DM VH | 216 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-C04 (НС 2, -выступ) | 589 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, МУТАЦИЯ ТИПА «ВЫСТУП» | 589 | ||
hullFll(ver.2)(M428L )-F06-DMP monovalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-F06-DMP моновалентная (НС 1, -впадина) | 614 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L, МУТАЦИЯ ТИПА «ВПАДИНА», | 647 |
(G4S)3, | 412 | ||||
F06-DMP VL, | 341 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
F06-DMP VH | 222 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-F06 моновалентная (НС 2, -выступ) | 589 | hullFll(ver.2 (IGG),M428L МУТАЦИЯ, МУТАЦИЯ ТИПА «ВЫСТУП» | 589 | ||
hullFll(ver.2)(M428L )-F06-DM monovalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-F06-DM моновалентная (НС 1, -впадина) | 615 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L, МУТАЦИЯ ТИПА «ВПАДИНА», | 647 |
(G4S)3, | 412 | ||||
F06-DM VL, | 340 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
F06-DM VH | 221 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-F06 monovalent, deamidated, S->P (НС 2, -выступ) | 589 | hullFll(ver.2 (IGG),M428L МУТАЦИЯ, МУТАЦИЯ ТИПА «ВЫСТУП» | 589 | ||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH2-DMP bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH2-DMP бивалентная (НС) | 616 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, | 646 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH2-DMP VL, | 358 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH2-DMP VH | 239 |
- 73 045348
hullFll(ver.2)(M428L )-VH2-DM bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH2-DM бивалентная (HC) | 617 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, | 646 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH2-DM VL, | 357 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH2-DM VH | 238 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH5-DMP bivalent, (HC) | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH5-DMP bivalent, (HC) | 618 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, | 646 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH5-DMP VL, | 363 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH5-DMP VH | 244 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH5-DM bivalent, (HC) | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH5-DM bivalent, (HC) | 619 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, | 646 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH5-DM VL, | 362 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH5-DM VH | 243 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH5-DMP monovalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH5-DMP monovalent, (HC 1, впадина) | 620 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L, МУТАЦИЯ ТИПА «ВПАДИНА», | 647 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH5-DMP VL, | 363 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH5-DMP VH | 244 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH5 monovalent, deamidated, S->P (HC 2, -выступ) | 589 | hullFll(ver.2 (IGG),M428L МУТАЦИЯ, МУТАЦИЯ ТИПА «ВЫСТУП» | 589 | ||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH5_DM monovalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH5_DM monovalent, (HC 1, впадина) | 621 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L, МУТАЦИЯ ТИПА «ВПАДИНА», | 647 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH5-DM VL, | 362 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH5-DM VH | 243 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH5 monovalent, deamidated, S->P (HC 2, -выступ) | 589 | hullFll(ver.2 (IGG),M428L МУТАЦИЯ, МУТАЦИЯ ТИПА | 589 |
- 74 045348
«ВЫСТУП» | |||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH6-DMP bivalen | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH-DMP6 бивалентная (НС) | 622 | hullFll (ver. 2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, | 646 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH6-DMP VL, | 368 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH6-DMP VH | 249 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH6-DM bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH6-DM бивалентная (НС) | 623 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, | 646 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH6-DM bivalent VL, (G4S)4, | 367 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH6-DM VH | 248 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH7-DMP bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH7-DMP бивалентная (НС) | 624 | hullFll (ver. 2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, | 646 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH7-DMP VL, | 373 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH7-DMP VH | 254 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH7-DM bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH7-DM bivalent, (HC) | 625 | hullFll (ver. 2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, | 646 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH7-DM VL, | 372 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH7-DM VH | 253 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH9-DMP bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH9-DMP бивалентная (HC) | 626 | hullFll (ver. 2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, | 646 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH9-DMP VL, | 378 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH9-DMP VH | 259 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH9-DM bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH9-DM bivalent, (HC) | 627 | hullFll (ver. 2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, | 646 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH9-DM VL, | 377 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH9-DM VH | 258 |
- 75 045348
hullFll(ver.2)(M428L )-VH9 -DMP monovalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH9 - DMPmonovalent, (HC 1, -впадина) | 628 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L, МУТАЦИЯ ТИПА «ВПАДИНА», | 647 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH9-DMP VL, | 378 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH9-DMP VH | 259 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH9 monovalent, deamidated, S->P (HC 2, -выступ) | 589 | hullFll(ver.2 (IGG),M428L МУТАЦИЯ, МУТАЦИЯ ТИПА «ВЫСТУП» | 589 | ||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH9-DM monovalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH9-DM моновалентная (HC 1, -впадина) | 629 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L, МУТАЦИЯ ТИПА «ВПАДИНА», | 647 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH9-DM VL, | 377 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH9-DM VH | 258 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH9 monovalent, deamidated, S->P (HC 2, -выступ) | 589 | hullFll(ver.2 (IGG),M428L МУТАЦИЯ, МУТАЦИЯ ТИПА «ВЫСТУП» | 589 | ||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH16-DMP bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH16-DMP bivalent, (HC) | 630 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, | 646 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH16-DMP VL, | 383 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH16-DMP VH | 264 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH16-DM bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH16-DM бивалентная (HC) | 631 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, | 646 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH16-DM VL, | 382 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH16-DMVH | 263 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH16-DMP monovalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH16-DMP моновалентная (HC 1, -впадина) | 632 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L, МУТАЦИЯ ТИПА «ВПАДИНА», | 647 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH16-DMP VL, | 383 |
- 76 045348
(G4S)4, | 411 | ||||
VH16-DMP VH | 264 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH16 monovalent, deamidated, S->P (HC 2, -выступ) | 589 | hullFll(ver.2 (IGG),M428L МУТАЦИЯ, МУТАЦИЯ ТИПА «ВЫСТУП» | 589 | ||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH16-DM monovalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH16-DM моновалентная (HC 1, -впадина) | 633 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L, МУТАЦИЯ ТИПА «ВПАДИНА», (G4S)3, VH16-DMVL, (G4S)4, VH16-DMVH | 647 412 382 411 263 |
hullFll(ver.2)(M428L )-VH27-DMP бивалентная (НС) | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH16 monovalent, deamidated, S->P (HC 2, -выступ) hullFll(ver.2)(M428L )-VH27-DMP бивалентная (HC) | 589 634 | hullFll(ver.2 (IGG),M428L МУТАЦИЯ, МУТАЦИЯ ТИПА «ВЫСТУП» hullFll(ver.2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, (G4S)3, VH27-DMP VL, | 589 646 412 388 |
(G4S)4, | 411 | ||||
VH27-DMP VH | 269 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH27-DM бивалентная (НС) | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH27-DM бивалентная (HC) | 635 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, (G4S)3, VH27-DM VL, | 646 412 387 |
(G4S)4, | 411 | ||||
VH27-DM VH | 268 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH32 -DMP bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH32 -DMP бивалентная (HC) | 636 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, (G4S)3, VH32-DMP VL, | 646 412 393 |
(G4S)4, | 411 | ||||
VH32-DMP VH | 274 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L | HullFll-VLv3 | hullFll(ver.2)(M428L )-VH32-DM bivalent(HC) | 637 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, | 646 |
)-VH32-DM bivalent | 4c | (G4S)3, | 412 | ||
VH32-DM VL, | 392 |
- 77 045348
(G4S)4, | 411 | ||||
VH32-DM VH | 273 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH35-DMP bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH35-DMP бивалентная (НС) | 638 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, | 646 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH35-DMP VL, | 398 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH35-DMP VH | 279 | ||||
hullFll(ver.2)(M428L )-VH35-DM bivalent | HullFll-VLv3 4c | hullFll(ver.2)(M428L )-VH35-DMbivalen t(HC) | 639 | hullFll(ver.2 (IGG), M428L МУТАЦИЯ, | 646 |
(G4S)3, | 412 | ||||
VH35-DMVL, | 397 | ||||
(G4S)4, | 411 | ||||
VH35-DMVH | 278 |
Эффект изобретения
Антитело, полученное в одном воплощении настоящего изобретения, специфично связывается с IGF1R с оптимизированной силой связывания, подходящей для трансцитоза через эндотелий головного мозга, и может быть полезно для доставки терапевтических антител для применения при дегенеративных заболеваниях головного мозга и раке головного мозга, терапевтическая эффективность которых ограничена из-за низкой способности к проникновению через сосудистый барьер головного мозга. В частности, моноклональное антитело, раскрытое в настоящем изобретении, не влияет на связывание лигандов, таких как IGF-1, IGF-2 и инсулин, и их гомологов с IGF1R и действует, не ингибируя передачу сигналов через IGF1R. Таким образом, его полезность связана с проникновением через гематоэнцефалические барьеры.
Антитела, раскрытые здесь, позволяют эффективно удалять агрегаты альфа-синуклеина или стимулировать их распад, ингибируют проникновение альфа-синуклеина в клетки и поэтому могут быть полезным образом использованы в лечении заболеваний, ассоциированных с накоплением агрегатов альфасинуклеина.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 представлены результаты дот-блоттинга, демонстрирующие, что антитело против альфасинуклеина, полученное в одном воплощении настоящего изобретения, специфично связывается с нативным альфа-синуклеином в аггрегированной форме.
На фиг. 2 представлены результаты ELISA-анализа аффинности антитела против альфа-синуклеина, полученного в одном воплощении настоящего изобретения.
На фиг. 3 а представлены результаты BIAcore-анализа специфичности и аффинности преимущественного связывания антитела против альфа-синуклеина, полученного в одном воплощении настоящего изобретения, с агрегатами альфа-синуклеина. На фиг. 3 b представлена таблица, в которой показаны результаты, представленные на фиг. 3а.
На фиг. 4а представлены результаты Octet-анализа специфичности преимущественного связывания антитела против альфа-синуклеина, полученного в одном воплощении настоящего изобретения, с агрегатами альфа-синуклеина. На фиг. 4b представлена таблица, в которой показаны результаты, представленные на фиг. 4а.
На фиг. 5а и 5b показаны результаты, согласно которым антитела против альфа-синуклеина 3А9 и 11F11 в одном воплощении настоящего изобретения могут специфично распознавать тельца Леви и нейриты Леви в ткани головного мозга человека, соответственно. Показано, что антитела по настоящему изобретению связываются с тельцами Леви (стрелки) и нейритами Леви (нитевидная форма в нижней левой части).
На фиг. 6 представлено схематическое отображение результатов картирования эпитопов антител против альфа-синуклеина по одному воплощению настоящего изобретения, где антитела по настоящему изобретению связываются, в основном, с С-концевой областью.
На фиг. 7 представлены результаты ELISA-анализа аффинности химерного антитела против альфасинуклеина и гуманизированного антитела 11F11, полученных в одном воплощении настоящего изобретения.
На фиг. 8 представлены результаты BIAcore-анализа специфичности и аффинности преимущественного связывания химерного антитела против альфа-синуклеина и гуманизированного антитела 11F11, полученных в одном воплощении настоящего изобретения, с агрегатами α-syn.
На фиг. 9а, 9b и 10 представлены результаты дот-блоттинга и результаты ELISA-анализа, демонстрирующие, что химерное антитело к альфа-синуклеину, полученное в одном воплощении настоящего изобретения, специфично связывается с альфа-синуклеином, в особенности с агрегатами альфасинуклеина, но не с бета-синуклеином, гамма-синуклеином, амилоидом бета1-42 или белком тау.
- 78 045348
На фиг. 11a-11b представлены данные по связыванию антитела против IGF1R, полученного в одном из воплощений настоящего изобретения, с белком IGF1R.
На фиг. 12 представлены данные по связыванию антитела против IGF1R, полученного в одном из воплощений настоящего изобретения, с клеточными линиями, экспрессирующими IGF1R.
На фиг. 13 представлены данные по результатам, связанным с интернализацией антитела против IGF1R, полученного в одном из воплощений настоящего изобретения, клеточными линиями, экспрессирующими IGF1R, и тем, что происходит с ним в этих клеточных линиях.
На фиг. 14 представлены данные по результатам, демонстрирующим, что антитело против IGF1R, полученное в одном из воплощений настоящего изобретения, не влияет на передачу сигналов через IGF1R или инсулин.
На фиг. 15а представлены данные по результатам, демонстрирующим, что антитело против IGF1R, полученное в одном из воплощений настоящего изобретения, не обладает ADCC.
На фиг. 15b представлены данные по результатам, демонстрирующим, что многократное введение антитела против IGF1R, полученного в одном из воплощений настоящего изобретения, не влияет на уровень IGF1R в головном мозге.
На фиг. 15с представлена микроскопическая картина, демонстрирующая, что антитело против IGF1R, полученное в одном из воплощений настоящего изобретения, связывается с эндотелиальной клеткой головного мозга без связывания с нормальным нейроном в головном мозге.
На фиг. 16 представлены данные по результатам, демонстрирующим, что биспецифичное антитело, содержащее антитело против IGF1R и терапевтическое антитело, может проникать в ГЭБ-систему эффективнее, чем терапевтическое антитело.
На фиг. 17 представлены данные по результатам, демонстрирующим, что антитело против IGF1R и биспецифичное антитело, содержащее антитело против IGF1R и терапевтическое антитело, имеют распределение в головном мозге и СМЖ больше, чем терапевтическое антитело само по себе, когда их однократно вводят крысе.
На фиг. 18а представлены результаты, идентифицирующие остаток, подверженный дезамидированию, в антителе против IGF1R, полученном в одном из воплощений настоящего изобретения.
На фиг. 18b представлены варианты, полученные посредством замены конкретных аминокислот для предотвращения дезамидирования.
На фиг. 19 представлены результаты картирования эпитопов антитела против IGF1R.
На фиг. 20а и 20b представлены результаты ELISA-анализа по измерению аффинности биспецифичного антитела по одному воплощению настоящего изобретения в отношении каждого антигена.
На фиг. 20с и 20d представлены результаты ELISA-анализа по сравнению химерного антитела и гуманизированного антитела применительно к каждому антигену.
На фиг. 20е представлены результаты оценки фагоцитарной активности микроглии применительно к биспецифичному антителу, полученному в одном воплощении настоящего изобретения.
На фиг. 21а-21е представлены результаты оценки эффективности биспецифичного антитела, полученного в одном воплощении настоящего изобретения, по сравнению с одиночным антителом в модели на мышах.
На фиг. 22 представлен результат, демонстрирующий увеличенный период полувыведения и лучшее проникновение через ГЭБ в результате конструирования Fc биспецифичного антитела, полученного в одном воплощении настоящего изобретения.
Вариант осуществления изобретения
Пример 1. Получение мышиного антитела к альфа-синуклеину.
1-1. Иммунизация и получение гибридомы.
Мономерный альфа-синуклеин, полноразмерный (140 остатков) или без 21 остатков на С-конце (119 остатков), помещали в термомиксер при 37°С, агрегировали с покачиванием при 1050 об/мин на протяжении 14 суток и обрабатывали ультразвуком. Фибриллы α-syn, 140 остатков и 119 остатков, 1 мг/мл, смешивали с адъювантом в отношении 1:1 (об./об.).
Аминокислотная последовательность альфа-синуклеина Homo sapiens (SEQ ID NO:559): MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVAT
VAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQ
EGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA.
Затем 200 мкл полученной смеси вводили подкожно самкам мышей BALB/c в возрасте от 5 до 7 недель. Через 2 недели проводили еще одно подкожное введение 200 мкл полученной смеси для стимуляции выработки антител. Через одну неделю после второй инъекции проводили забор крови и титрование иммунизации методом ELISA с использованием введенного антигена. Затем проводили третью инъекцию с подкожным введением антигена самого по себе.
У иммунизированных мышей удаляли селезенку и получали из нее клетки селезенки. Полученные клетки селезенки суспендировали в среде Hybridoma-SFM (Thermo Fisher Scientific, США), дополненной
- 79 045348
10%FBS. Для получения гибридомы клетки селезенки и клетки мышиной миеломы SP2/0-Ag14 смешивали в среде Hybridoma-SFM без сыворотки с последующим центрифугированием для удаления среды.
Затем к полученному клеточному осадку добавляли ПЭГ и проводили инкубацию при 37°С на протяжении 1 минуты для индукции слияния клеток.
1-2. Клонирование отдельных клеток и очистка антител.
Через 2 недели после индукции слияния, слияние с мышиными В-клетками, продуцирующими антитела, подтверждали методом ELISA с использованием антигена, вводимого мышам, и среды для культивирования клеток. Затем проводили клонирование отдельных клеток с использованием гибридомы, отбирая 16 гибридом, продуцирующих моноклональные антитела. Клоны 9В11 (IgG1 каппа) были получены с использованием агрегатов полноразмерного (140 остатков) α-syn в качестве антигена, а клоны 3А9 и 11F11 (IgG2b каппа и IgG2b каппа, соответственно) были получены с использованием агрегатов αsyn без 21 остатков на С-конце в качестве антигенов.
Для очистки антител каждую гибридому культивировали в среде RPMI1640, содержавшей 10%FBS. Для получения антител культуральную среду заменяли бессывороточной средой SFM и проводили культивирование на протяжении приблизительно 4 суток. Супернатант клеточной культуры отделяли, центрифугировали, фильтровали через 0,22 мкм фильтр и очищали с использованием колонки с белком G для типа IgG1 и колонки с белком А для остальных антител.
1-3. Определение последовательности вариабельной области.
Последовательности вариабельных областей и CDR определяли по Ahn et of al, Mol. Cells 2004, 18 (2): 237-241. Гибридомы культивировали и центрифугировали, выделяя только клетки. Из выделенных гибридом выделяли РНК, добавляя триазол, и использовали ее в качестве матрицы для синтеза кДНК. Последовательности вариабельных областей и CDR подтверждали секвенированием.
Пример 2. Получение (химерных) антител против альфа-синуклеина.
2-1. Клонирование и экспрессия антител.
Используя нуклеотидные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи антитела, полученного после гуманизации, синтезировали gBlock (M.Biotech) короткого нуклеотидного фрагмента и клонировали его в вектор для культур клеток животных (pcDNA3.4). gBlock синтезировали, включая перекрывающиеся последовательности длиной приблизительно 20 п.о. до и после вариабельной области, и часть вектора pcDNA3.4 без вариабельной области амплифицировали посредством ПЦР и клонировали методом сборки по Гибсону.
Для трансфекции и экспрессии клонированного антитела полученный вектор использовали для Maxi-Prep (Qiagen) с получением большого количества плазмидной ДНК и затем вводили ее в клетки следующим образом. В день, предшествовавший трансфекции, концентрацию клеток ExpiCHO™ (Gibco, номер по каталогу А29127) доводили до 3-4x106 жизнеспособных клеток на 1 мл в экспрессионной среде ExpiCHO™ (Gibco, номер по каталогу А29100-01) и проводили культивирование при 8% СО2, 37°С и 120 об/мин на протяжении 1 суток. В день трансфекции ДНК проводили подготовку клеток, выращенных до 7-10x106 жизнеспособных клеток на 1 мл, с показателями выживаемости 95% или более, разводя их свежей средой до 6x106 жизнеспособных клеток на 1 мл.
Для трансфекции исходных клеток подготавливали комплекс ExpiFectamine™ СНО и плазмидной ДНК с использованием набора для трасфекции ExpiFectamine™ СНО Transfection Kit (Gibco, номер по каталогу А29129). ДНК и реагенты ExpiFectamine™ СНО подготавливали в подходящих концентрациях, разводя их холодной средой OptiPRO™ SFM® (Gibco, номер по каталогу 12309019), вносили соответствующим образом и перемешивали, оставляя стоять при комнатной температуре на 5 минут. Полученный продукт добавляли к исходным клеткам и проводили их посттрансфекционное культивирование. На следующий день после трансфекции к трансфицируемым клеткам добавляли реагенты Enhancer и Feed, входящие в состав набора ExpiFectamine™ CHO Transfection Kit, и через 5 суток еще раз добавляли реагент Feed, после чего проводили инкубацию на протяжении 10 суток при 8% СО2, 37°С и 120 об/мин с получением трансфицированных клеток.
Для получения культурального раствора культуральную среду переносили в центрифужную бутылку для центрифугирования и центрифугировали при 4°С и 6500 об/мин на протяжении 30 минут с последующей фильтрацией через фильтр размером 0,2 мкм, получая культуральную среду без взвешенных твердых частиц, и затем полученную культуральную среду использовали для последующей очистки.
2-2. Очистка и секвенирование антитела.
Культуру очищали с использованием HiTrap MabSelect SuRe (GE Healthcare, 11-0034-94). После уравновешивания уравновешивающим буфером (50 мМ трис-HCl, рН 7,2, 100 мМ NaCl) полученную культуру загружали на колонку. По завершении загрузки среду промывали 50 мМ цитратом натрия (рН 5,0) и затем проводили элюирование с использованием 50 мМ цитрата натрия (рН 3,4). К элюату добавляли 1 М трис-HCl, рН 9,0, для нейтрализации до рН 6,0. Затем в элюате заменяли буфер, концентрировали его с использованием PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор, рН 7,4) и хранили при 4°С до последующего использования.
При необходимости дополнительной очистки проводили вторую очистку исходя из размера элюи- 80 045348 рованного образца, пропуская первый очищенный продукт через IX PBS-буфер на колонке HiLoad 26/600
Superdex 200. Аминокислотную последовательность очищенного антитела анализировали массспектрометрией и подтверждали ее соответствие вариабельной области моноклонального антитела мышиного происхождения.
Остов вариабельной области человеческого антитела изотипа IgG1 заменяли вариабельными областями антител 3А9, 9В11 и 11F11, определенными описанным выше методом, с получением химерного человеческого антитела IgG1. Среди полученных химерных антител, в частности, антитело Ch11F11 представляет собой антитело в форме IgG и содержит комбинацию последовательности вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:90 (ch11F11-VH) и последовательности вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:109 (ch11F11-VL), и антитело Ch3A9 представляет собой антитело в форме IgG и содержит комбинацию последовательности вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:102 (ch11F11VH) и последовательности вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:116 (chl 1F11-VL).
Пример 3. Получение гуманизированного антитела.
3-1. Получение фаговой библиотеки.
Конструировали минибиблиотеку, в которой последовательность мышиного или человеческого происхождения была введена в каждый остаток CDR, при связывании человеческих каркасных областей с остатками CDR1, CDR2 и CDR3 химерного антитела.
Компетентные клетки полученной минибиблиотеки вносили в 2Х среду YT (17 г триптона (CONDA, 1612.00), 10 г дрожжевого экстракта (CONDA, 1702.00) и 5 г NaCl (Sigma, S7653)), содержавшую 34 мкг/мл хлорамфеникола (Sigma, C0857), 2% глюкозы (Sigma, G5400) и 5 мМ MgCl2 (Sigma, C0857), при 30°С на 3 часа до OD600 0,5-0,7. Затем клетки инфицировали фагом-помощником и культивировали в 2Х среде YT, содержавшей 34 мкг/мл хлорамфеникола, 5 мМ MgCl2, 70 мкг/мл канамицина (Sigma, K1876) и 1 мМ IPTG (ELPISBIO, IPTG025), при 30°С на протяжении 6 часов для индукции упаковки фагов. Культуральный раствор центрифугировали при 4500 об/мин и 4°С на протяжении 15 минут. В супернатант добавляли 4% ПЭГ 6000 (Fluka, 81253) и 3% NaCl (Sigma, S7653) и проводили инкубацию на протяжении 1 часа на льду. Полученный продукт центрифугировали при 8000 об/мин на протяжении 20 минут при 4°С, затем осадок суспендировали в PBS и центрифугировали снова при 4°С и 12000 об/мин на протяжении 10 минут с получением супернатанта, содержавшего фаговую библиотеку. Полученный супернатант хранили при 4°С до последующего использования.
3-2. Пэннинг с фаговым дисплеем.
Для отбора антител, связывающихся преимущественно с агрегатами альфа-синуклеина, а не с его мономерами, проводили пэннинг с использованием агрегатов полноразмерного альфа-синуклеина, полученных в примере 1, и в общей сложности три пэннинга проводили следующим образом.
Бычий сывороточный альбумин (BSA) добавляли к клеткам в концентрации 3% в пробирке при 4°С на ночь, вносили в нее 10 мкг/мл агрегатов и мономеров рекомбинантного альфа-синуклеина в растворе PBS в иммунологической пробирке (Maxisorp 444202) и защищали поверхности, на которые не были сорбированы агрегаты и мономеры альфа-синуклеина. После опорожнения пробирки фаговую библиотеку антител, разведенных в 3%-м растворе BSA до 1012КОЕ, помещали в иммунологическую пробирку, на которую были сорбированы агрегаты и мономеры альфа-синуклеина, и проводили взаимодействие на протяжении 1 часа (отрицательный отбор). Затем фаги, не связанные с агрегатами и мономерами альфасинуклеина, выделяли и подвергали взаимодействию на протяжении 2 часов при комнатной температуре с сорбированными агрегатами и мономерами альфа-синуклеина. Забуференный фосфатом физиологический раствор (0,05% Tween 20) использовали для восстановления 100 мкМ раствора триэтиламина, который восстанавливали с использованием раствора PBS-T. E. coli при 37°С на протяжении 1 часа, и инфицированные Е. coli высевали на 2Х агаровую среду YT и культивировали при 37°С в течение ночи (рН 7,4), их инфицировали ER2537. На следующий день культивированные Е. coli суспендировали в 4 мл 2Х культурального раствора YT, содержавшего карбенициллин, добавляли 15% глицерин и часть хранили при -80°С, а остальное использовали для получения фагов для последующих экспериментов. Повторяя этот процесс на протяжении в общей сложности 3 раундов, амплифицировали и концентрировали пул фагов, специфичных в отношении антигена альфа-синуклеина. Во время более поздних раундов пэннинга число промывок с использованием PBS-T увеличивали для увеличения количества и концентрации антигенспецифичных фагов.
3-3. Скрининг отдельных клонов.
Для отбора моноклональных антител, специфично связывающихся с агрегатами альфа-синуклеина из пула фагов, полученного при пэннинге, проводили следующий эксперимент.
Для выделения моноклонов из концентрированного пула, после высева пула фагов на агаровую среду LB с тетрациклином/карбенициллином и культивирования, выделяли отдельные колонии. Затем, после внесения моноклонов в глубокий 96-луночный планшет, в каждую лунку которого вносили по 400 мкл 2Х среды YT с тетрациклином/карбенициллином, и выращивания в течение ночи, по 10 мкл культурального раствора вносили в новый глубокий 96-луночный планшет, в который вносили по 390 мкл 2Х среды YT с тетрациклином/карбенициллином, и культивировали при 37°С на протяжении
- 81 045348 часов. В культуральный раствор вносили 1 мМ IPTG и культивировали его при 30°С в течение ночи.
Культуральный раствор, культивированный в течение ночи, центрифугировали, отбирая супернатант.
Затем клоны, экспрессирующие моноклональные растворимые scFv, связывающиеся с агрегатами альфа-синуклеина, отбирали с применением метода ELISA, как описано ниже (Steinberger. Rader and Barbas III. 2000. Phage display vectors. In: Phage Display Laboratory Manual, lsted. Cold Sprin gHarbor Laboratory Press. NY. USA. pp. 11.9-11.12). Конкретно, антитело 7В7, отобранное в Примере 1-1, вносили в 96луночный планшет (Nunc-Immuno Plates, NUNC, США) и проводили сорбцию при 4°С в течение ночи. В каждую лунку вносили 3% BSA в количестве 200 мкл с последующей блокировкой при 37°С на протяжении 2 часов. Затем вносили агрегаты и мономеры альфа-синуклеина в концентрации 100 нг на лунку, проводили взаимодействие при 37°С на протяжении 2 часов и пятикратную промывку с использованием 300 мкл PBS-T. Полученный супернатант отдельного клона смешивали с 3% BSA в объемном отношении 1:1 (об./об.) и 100 мкл полученного раствора вносили в планшет, с которым были связаны агрегаты и мономеры, с последующим взаимодействием при 37°С на протяжении 2 часов. Клетки промывали пять раз с использованием 300 мкл PBS-T и инкубировали при 37°С на протяжении 1 часа с антителом против НА, конъюгированным с HRP, с последующей пятикратной промывкой PBS-T. После добавления 100 мкл ТМВ (тетраметилбензидин, Sigma, Т0440), реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 Н H2SO4 для измерения оптической плотности при 450 нм. Клоны с оптической плотностью 0,5 или более рассматривали как положительную реакцию связывания, а клоны, неспецифично связывавшиеся с BSA, исключали.
Остатки CDR клонов, обнаруженных в библиотеке, анализировали на компьютере параллельно и отбирали клоны, приводившие к серьезным проблемам со связыванием с каркасными областями, или клоны, не имевшие Т-клеточного эпитопа, В-клеточного эпитопа и эпитопа MHCII в каркасных областях, отличных от CDR.
Затем для пяти антител, полученных с использованием следующих комбинаций вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи, вариабельную область гуманизированного антитела человеческого изотипа IgG1 заменяли на остов вариабельной области с получением пяти гуманизированных антител с остовом IgG1. Конкретно, Hu11F11 (ABL2-4) представляет собой антитело типа IgG и содержит комбинацию последовательности вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:92 (Hu11F11-VH2) и последовательности вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:113 (Hu11F11-VL4). Hu11F11 (ver.1) представляет собой антитело типа IgG и содержит комбинацию последовательности вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:98 (Hu11F11-VH-v1) и последовательности вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:115 (Hu11F11-VLv3 4c). Hu11F11 (ver.2) представляет собой антитело типа IgG и содержит комбинацию последовательности вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:99 (Hu11F11-VH-v2) и вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:115 (Hu11F11-VLv3 4c). Hu11F11 (ver.3) представляет собой антитело типа IgG и содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:100 (Hu11F11-VH-v3) и последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:115 (Hu11F11-VLv3 4c).
Hu11F11 (ver.4) представляет собой комбинацию последовательности вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:101 (Hu11F11-VH-v4) и последовательности вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:115 (Hu11F11-VLv3 4c).
Пример 4. Анализ специфичности и аффинности связывания с антигеном при использовании антитела к альфа-синуклеину.
4-1. Дот-блоттинг-анализ с использованием антитела против альфа-синуклеина.
Эксперименты с дот-блоттингом проводили для анализа возможного связывания антитела по настоящему изобретению с мономерами или агрегатами в нативном состоянии. Для эксперимента 50 нг или 100 нг мономерного или фибриллярного белка α-syn (полученного профессором Lee Seung-jae из Национального университета Сеула (Seoul National University); Bae et al., J. Neurosci 32: 13454, 2012) наносили пятнами на нитроцеллюлозную мембрану. Двукратные разведения мономерного или фибриллярного белка наносили последовательно от правого края мембраны к левому (12,5, 25, 50, 100 нг). Мембрану блокировали 5% нежирным сухим молоком с TBST на протяжении 1 часа при комнатной температуре. 1 мг/мл антитела к α-syn, полученного в примере 1, добавляли к TBST, содержавшему 1% бычьего сывороточного альбумина, и инкубировали при комнатной температуре на протяжении 1 часа. После промывки с использованием TBST сигналы анализировали с использованием хемилюминесцентного субстрата (NEN) в качестве субстрата и вторичного антитела, конъюгированного с HRP (пероксидаза хрена), следуя инструкциям изготовителя. Результаты визуализировали с использованием системы анализа люминесцентных изображений LAS-3000 Luminescent Image Analysis System (FUJIFILM Life Science). Результаты показаны на фиг. 1.
Как показано на фиг. 1, было обнаружено, что антитело к альфа-синуклеину по настоящему изобретению связывается преимущественно с агрегатами, но не с мономерами альфа-синуклеина. В частности, 9В11, 3А9 и 11F11 связывались с агрегатами. Антитело 274 (Bae et al., J Neurosci. 2012 Sep 26; 32 (39): 13454-13469) использовали в качестве антитела сравнения, связывающегося как с мономерами, так и с агрегатами.
- 82 045348
4-2. ELISA-анализ с использованием мышиного моноклонального антитела против α-syn.
ELISA-анализ проводили для количественного анализа аффинности связывания антитела по настоящему изобретению с антигеном. Для этого антитело к альфа-синуклеину, полученное в примере 1, сорбировали на 96-луночный планшет в концентрации 1 мкг/мл и обрабатывали агрегатами фибрилл альфа-синуклеина в концентрации 10, 100, 1000 и 10000 нг/мл. После промывки с использованием PBS вносили стрептавидин, конъюгированный с HRP, и конъюгат вторичного антитела с биотином и затем проводили взаимодействие с ТМВ в качестве субстрата. Измеряли оптическую плотность, и полученные результаты показаны на фиг. 2.
Как показано на фиг. 2, было обнаружено, что антитела по настоящему изобретению связываются преимущественно с агрегатами с высокой аффинностью связывания. Результаты ELISA показали, что антитела, связывающиеся преимущественно с агрегатами, имеют аффинность от 0,1x10’9 М до 2x10’9 М, в то время как аффинность антител, связывавшихся как с мономерами, так и с агрегатами, была выше и составляла приблизительно 1х10’10М. Антитело по настоящему изобретению связывалось преимущественно с агрегатами альфа-синуклеина с высокой аффинностью, но получить аффинность в отношении мономера не удалось, поскольку оно связывалось с мономером с меньшей аффинностью, чем с агрегатами, или не связывалось с мономером. Эти результаты показывают, что рассматриваемое антитело позволяет эффективно устранять или ингибировать действие агента, вызывающего нейродегенеративные заболевания, связанные с альфа-синуклеиновой этиологией, такие как болезнь Паркинсона.
4-3. BIAcore-анализ с использованием антитела против альфа-синуклеина.
Проводили количественный анализ связывания антитела к альфа-синуклеину, полученного в примере 1, с мономерными и агрегированными антигенами с применением BIAcore-анализа.
Используемый прибор представлял собой Т200 (GE Healthcare, серийный номер 1565888). В качестве чипа использовали белок A (GE Healthcare, номер по каталогу 29-1275-56). 10 мМ глицин-HCl, рН 1,5 (GE Healthcare, номер по каталогу BR-1003-54), был восстанавливающим буфером. Рабочим буфером, буфером для разведения аналитов и буфером для разведения образцов был HBS-EP. Антитела к α-syn (3A9, 9В11 и 11F11), полученные в примере 1, разводили в 1x HBS-EP (GE Healthcare, номер по каталогу BR-1006-69), альфа-синуклеин в форме мономерного (1 мг/мл) и фибриллярного (3 мг/мл) белка разводили серийно в двух повторах и анализировали в общей сложности 6 концентраций(0, 0,39, 1,56, 6,25, 25, 100 нМ), включая 0 нМ. Для захвата число RU мономера составляло 800 (теоретическое), а число RU фибрилл -100 (теоретическое). Фазу захвата проводили при времени контакта 60 секунд, скорости потока 30 мкл/мин и периоде стабилизации 180 секунд. Фазу ассоциации проводили при времени ассоциации 120 секунд, и скорость потока составляла 30 мкл/мин. Фазу диссоциации проводили при времени диссоциации 360 секунд и скорости потока 30 мкл/мин. Фазу регенерации проводили дважды при времени регенерации 240 секунд (первичная) и 60 секунд (вторичная) и скорости потока 30 мкл/мин. Приближение проводили с использованием модели связывания 1:1, и аналитическим программным обеспечением было программное обеспечение BIACore T200 Evaluation Software (GE Healthcare). Полученные результаты показаны на фиг. 3а и 3b.
На фиг. 3а представлены результаты BIAcore-анализа специфичности и аффинности преимущественного связывания моноклонального антитела, полученного в одном примере настоящего изобретения, с агрегатами альфа-синуклеина. Показано, что антитело по настоящему изобретению связывается с агрегатами с высокой аффинностью. Эти результаты показывают, что рассматриваемое антитело позволяет эффективно устранять или ингибировать действие агента, вызывающего нейродегенеративные заболевания, связанные с альфа-синуклеиновой этиологией, такие как болезнь Паркинсона. На фиг. 3b представлена таблица, в которой показаны результаты, представленные на фиг. 3а.
Как показано на фиг. 3а и 3b, 3A9, 9В11 и 11F11, у которых среди четырех антител к альфасинуклеину, проанализированных другими методами, описанными выше, было подтверждено преимущественное связывание с агрегатами, в BIAcore-анализе связывались только с агрегатами с высокой аффинностью, составлявшей приблизительно от 1x10’9 М до 3x10’9 М.
4-4. Octet-анализ с использованием мышиного моноклонального антитела против α-syn.
Проводили количественный анализ связывания антител к альфа-синуклеину (3А9, 9В11, 11F11), полученных в примере 1, с мономерными и агрегированными антигенами с применением Octet.
Конкретно, рабочий буфер представлял собой 1х буфер KB (номер по каталогу 18-1092) или 1х буфер PBS при 1000 об/мин, а буфер для иммобилизации представлял собой ацетат натрия, рН 5 (10 мМ, номер по каталогу 18-1068). Мономеры α-syn. иммобилизовали как антиген α-syn, а фибриллы иммобилизовали для анализируемых антител. Целевые концентрации составляли 20 мкг/мл для мономера и 0,4 мкг/мл для фибрилл. Для оценки кинетики концентрации последовательно снижали в два раза, начиная с 50 нМ для мономеров и 100 нМ для фибрилл, получая в общей сложности 7 точек, соответственно. Время ассоциации/диссоциации составляло 5 мин/20 мин для мономера и 5 мин/25 мин для фибрилл. Биосенсор представлял собой ARG2, и приближение проводили с применением модели приближения 1:1. Полученные результаты показаны на фиг. 4. На фиг. 4а представлены результаты Octet-анализа специфичности преимущественного связывания антитела к альфа-синуклеину по одному воплощению настоящего изобретения с агрегатами α-syn.
- 83 045348
Как показано на фиг. 4а, 3А9, 9В11 и 11F11 продемонстрировали незначительное связывание с мономерами (рамка с красными точками), но хорошо связывались с агрегатами (возрастающая часть графика в рамке с красными точками). Эти результаты сходны или согласуются с результатами дот-блоттинга, Octet-анализа и ELISA-анализа, и показывают, что 3А9, 9В11 и 11F11, у которых среди четырех антител к альфа-синуклеину, проанализированных другими методами, описанными выше, было подтверждено преимущественное связывание с агрегатами, в Octet-анализе связывались только с агрегатами. На фиг. 4b представлена таблица, в которой показаны результаты, представленные на фиг. 4а. Результаты, представленные на фиг. 4а и 4b, демонстрируют преимущественное связывание с агрегатами альфасинуклеина и согласуются с результатами, представленными на фиг. 1. Антитело #274, использованное в качестве контрольной группы, хорошо связывалось как с мономерами, так и с агрегатами.
Пример 5. Выявление телец Леви в ткани головного мозга человека антителом против альфасинуклеина.
Тельца Леви и нейриты Леви в заключенных в парафин срезах головного мозга толщиной десять микрометров, полученных от пациентов, умерших от болезни Паркинсона (Dr. Halliday, Сиднейский университет (University of Sydney)), окрашивали с использованием антитела, использованного в примере 5, следующим образом. Срезы ткани обрабатывали 90% муравьиной кислотой на протяжении 3 минут для демаскировки антигенов и затем пероксидазную активность самой ткани ингибировали 1% Н2О2 (на основе 50% этанола). Проводили обработку 10% нормальной лошадиной сывороткой для предотвращения неспецифического связывания с тканями. Затем, после промывки фосфатным буфером, соседние срезы обрабатывали антителами 3А9, 11F11 и 11F11 по настоящему изобретению при 4°С в течение ночи. После промывки фосфатным буфером проводили обработку антителом против человеческого IgG, конъюгированным с биотином, при 37°С на протяжении 30 минут и взаимодействие с образованием авидин-биотинового комплекса при комнатной температуре на протяжении 30 минут (набор Vectastatin Elite; Vector Laboratories).
Затем проводили окрашивание с использованием DAB, содержавшего 0,005% Н2О2, и контрастирующее окрашивание срезов 0,5% крезил-виолетом для различения каждой клетки. Полученные результаты показаны на фиг. 5а и 5b.
На фиг. 8а и 8b показаны результаты, согласно которым моноклональные антитела 3А9 и 11F11 согласно одному воплощению настоящего изобретения могут специфично распознавать тельца Леви и нейриты Леви в ткани головного мозга человека, соответственно. Они показывают, что антитела по настоящему изобретению связываются с тельцами Леви (стрелки) и нейритами Леви (нитевидная форма в нижней левой части).
Как показано на фиг. 8а и 8b, антитело по настоящему изобретению продемонстрировало эффективное связывание с тельцами Леви и нейритами Леви (показано стрелками). Эти результаты показывают, что оно способно эффективно связываться с агрегатами альфа-синуклеина, входящими в состав телец Леви, в ткани головного мозга человека. Показано, что антитела, доставленные в головной мозг человека, могут эффективно и специфично связываться с агрегатами альфа-синуклеина. Эти результаты указывают на то, что антитела по настоящему изобретению фактически могут специфично связываться с агрегатами альфа-синуклеина в ткани головного мозга человека и могут быть эффективно использованы для предотвращения и/или лечения заболеваний, связанных с альфа-синуклеиновой этиологией.
Пример 6. Анализ эпитопов антитела против альфа-синуклеина.
Картирование эпитопов антител 3А9 и 11F11 как химерных антител, полученных в примере 2, проводили, запрашивая пептидный аллельный анализ у PEPSCAN (Нидерланды). Полученные результаты показаны на фиг. 6. На фиг. 6 представлено схематическое отображение результатов картирования эпитопов антител согласно одному воплощению настоящего изобретения.
Как показано на фиг. 6, было продемонстрировано, что большинство антител по настоящему изобретению связываются с С-концевой областью. Антитела к альфа-синуклеину, распознающие N-конец, не могли распознавать агрегаты при других заболеваниях, таких как мультисистемная атрофия, принадлежащих к синуклеинопатиям, которые, вместе взятые, называют заболеваниями, связанными с альфасинуклеином. В отличие от этого, антитела к альфа-синуклеину, распознающие С-концевую область, обладают тем преимуществом, что они распознают агрегаты при различных других синуклеинопатиях так же, как при болезни Паркинсона. В частности, как описано выше, было показано, что антитела, распознающие область между остатками 110 и 122, связываются преимущественно с агрегатами.
Пример 7. ELISA-анализ с использованием антитела против альфа-синуклеина.
Для количественного анализа аффинности связывания химерных антител (ch11F11), полученных в примере 2, и гуманизированных антител (Hu11F11), полученных в примере 3, проводили сэндвич-ELISA, применяя почти такой же метод, как в примере 4-2.
Конкретно, каждое антитело разводили в отношении 1/10, получая концентрации от 0,04 до 400 нМ, и сорбировали на 96-луночный планшет, после чего в каждую лунку вносили агрегаты фибрилл синуклеина в концентрации 2000 нг/мл. После промывки с использованием 1X PBS вносили стрептавидин, конъюгированный с HRP, и конъюгат вторичного антитела с биотином и затем проводили взаимодейст- 84 045348 вие с ТМВ в качестве субстрата. Измеряли оптическую плотность. Полученные результаты показаны на фиг. 7.
Как показано на фиг. 7, было подтверждено, что гуманизированные антитела по настоящему изобретению, в частности гуманизированные антитела, имеющие происхождение от химерного 11F11 (гуманизированные антитела 11F11), демонстрируют аффинность связывания, эквивалентную химерному клону 11F11. Было подтверждено, что гуманизированные антитела, особенно гуманизированные антитела, имеющие происхождение от химерного 11F11, такие как Hu11F11 (ver. 1), содержащее комбинацию Hu11F11-VH-v1 и Hu11F11-VLv3 4c, Hu11F11 (ver.2), содержащее комбинацию Hu11F11-VH-v2 и Hu11F11-VLv3 4c, hu11F11 (ver.3) содержащее комбинацию Hu11F11-VH-v3 и Hu11F11-VLv3 4c, Hu11F11 (ver.4), содержащее комбинацию Hu11F11-VH-v4 и Hu11F11-VLv3 4с, демонстрировали аффинность связывания, эквивалентную химерному 11F11, а их EC50 составляла от 11,5 до 15,1 нМ, что сходно с ЕС50 химерного антитела 11F11, составлявшей 12,5 нМ.
Пример 8. BIAcore-анализ с использованием антитела против альфа-синуклеина.
Для количественного анализа аффинности связывания химерных антител (ch11F11), полученных в примере 2, и гуманизированных антител (Hu11F11), полученных в примере 3, проводили BIAcore-анализ, применяя почти такой же метод, как в примере 4-3. Результаты анализа показаны на фиг. 8 и в следующей таблице.
Таблица 18
Название клона | Kd (hM) |
ChllFll | 0,02472 |
HullFll(ver.2) | 0,0596 |
HullFll(ver.3) | 0,0316 |
HullFll(ver.4) | 0,0204 |
В результате, гуманизированные антитела по настоящему изобретению, особенно варианты клона 11F11, а именно Hu11F11 (ver.2) (комбинация Hu11F11-VH-v2 и Hu11F11-VLv3 4c), Hu11F11 (ver.3) (комбинация Hu11F11-VH-v3 и Hu11F11-VLv3 4c) или Hu11F11 (ver.4) (комбинация Hu11F11-VH-v4 и Hu11F11-VLv3 4c), продемонстрировали значения KD, сходные со значениями KD химерного клона 11F11. Применительно к аффинности связывания, гуманизированные клоны продемонстрировали KD 0,02-0,06х10-9 М, а химерный клон 11F11 продемонстрировал KD 0,02х10-9М. То есть гуманизированные клоны продемонстрировали высокую аффинность связывания с агрегатами.
Пример 9. Оценка специфичного связывания химерного антитела с альфа-синуклеином.
9-1. ELISA-анализ с бета-синуклеином и гамма-синуклеином.
После получения трех химерных антител 3А9, 9В11 и 11F11 по примеру 2 проводили сравнение специфичности связывания этих антител с альфа-синуклеином по результатам ELISA-анализа с бетасинуклеином и гамма-синуклеином, которые являются гомологами альфа-синуклеина.
Для проведения оценки каждый белок из человеческого бета-синуклеина (Uniprot: Q16143) (CUSABIO, номер по каталогу CSB-EP624090HU) и человеческого гамма-синуклеина (Uniprot: 076070) (CUSABIO, номер по каталогу CSB-EP021915HU) сорбировали на 96-луночный планшет в концентрации 100 нг/мл, проводили промывку и последующую блокировку 5% BSA на протяжении 2 часов. В данном случае в качестве положительного контроля использовали антитело ко всем типам синуклеина (pan-syn) (Santa Cruz, номер по каталогу FL-140, sc-10717, кроличье), связывающееся с альфа-синуклеином, бетасинуклеином и гамма-синуклеином. После промывки химерные антитела (3А9, 9В11, 1F11) разводили 1/10 до концентраций от 400 нМ до 0,04 нМ и вносили на 2 часа, проводили промывку с использованием PBS и затем вносили козьи антитела против hFc, связанные с HRP, в качестве антител для выявления. Затем измеряли оптическую плотность при 450 нм и 650 нм после взаимодействия с ТМВ в качестве субстрата. Для положительного контроля в качестве антитела для выявления использовали козье противокроличье антитело, связанное с HRP.
Результаты эксперимента показаны на фиг. 9а и 9b, где представлены результаты ELISA-анализа, демонстрирующие, что химерные антитела (33А9, 9В11, 11F11) имеют очень низкую аффинность связывания с человеческим бета-синуклеином и человеческим гамма-синуклеином. В отличие от них, антитело pan-syn, использованное в качестве положительного контроля, продемонстрировало высокую аффинность связывания с бета-синуклеином и гамма-синуклеином. Фиг. 9а относится к человеческому бетасинуклеину, а фиг. 9b относится к человеческому гамма-синуклеину.
9-2. Дот-блоттинг-анализ с агрегатами бета-амилоида и белка тау.
Три типа химерных антител 3А9, 9В11 и 11F11, полученных в примере 2, подвергали взаимодействию с агрегатами амилоида бета1-42 (Uniprot: P05067; CAS-номер: 107761-42-2) и белка тау (Uniport: P10636-8). Способность антител к специфичному связыванию с агрегатами альфа-синуклеина анализировали блоттингом по следующей причине.
Амилоид бета1-42 и белок тау образуют агрегаты, которые, как полагают, являются важными этио- 85 045348 логическими факторами нейродегенеративных заболеваний, особенно болезни Альцгеймера, и эти агрегаты имеют олигомеры, протофибриллы и фибриллы, аналогично агрегатам альфа-синуклеина. Таким образом, дот-блоттинг позволил подтвердить, что химерные антитела 3А9, 9В11 и 11F11 распознают специфическую последовательность альфа-синуклеина и не распознают общую структуру агрегатов, имеющих происхождение от альфа-синуклеина, амилоида бета и белка тау.
В данном примере метод дот-блоттинга применяли почти таким же образом, как в примере 4-3, и рекомбинантный амилоид бета1.42, белок тау и их агрегаты были получены профессором Seung-jae Lee из Национального университета Сеула (Seoul National University). Syn-1, 6E10 и Tau5 представляют собой известные антитела, связывающиеся с альфа-синуклеином, амилоидом бета1-42 и белком тау, соответственно. Результаты анализа показаны на фиг. 10.
Результаты эксперимента показаны на фиг. 10 и демонстрируют, что химерные антитела 3А9, 9В11 и 11F11 по настоящему изобретению специфично связываются только с агрегатами, имеющими происхождение от альфа-синуклеина, но не с агрегатами, имеющими происхождение от амилоида бета1-42 и белка тау. В отличие от них, антитела 6Е10 и Tau5, которые, как известно, связываются с амилоидом бета1_42 и белком тау, соответственно, продемонстрировали связывание с соответствующими агрегатами при дот-блоттинге.
Согласно описанным выше результатам, химерные антитела не связываются с гомологами альфасинуклеина и агрегатами, имеющими происхождение от других белков, но эффективно связываются только с белком-мишенью. Это позволяет предполагать, что они могут быть эффективнее антител или лекарственных средств, связывающихся с гомологами и агрегатами, имеющими происхождение от других белков.
Пример 10. Получение биспецифичных антител.
10-1. Клонирование бивалентного биспецифичного антитела.
Для конструирования вектора экспрессии бивалентного биспецифичного антитела нуклеотидную последовательность антитела, содержащую сигнальную последовательность, вводили в множественный сайт клонирования (MCS) вектора pcDNA3.4 (Invitrogen). Вектор экспрессии биспецифичного антитела представлял собой моноцистронный вектор, и, соответственно, были получены вектор экспрессии тяжелой цепи и вектор экспрессии легкой цепи.
В качестве последовательности тяжелой цепи, вводимой в вектор экспрессии тяжелой цепи, scFv против IGF1R был связан через линкер с С-концом иммуноглобулина, где были связаны вариабельная область тяжелой цепи, кодирующая антитело против альфа-синуклеина, и человеческая константная область тяжелой цепи. В качестве последовательности легкой цепи, вводимой в вектор экспрессии легкой цепи, были связаны вариабельная область легкой цепи, кодирующая антитело против альфа-синуклеина, и человеческая константная область легкой цепи.
10-2. Клонирование моновалентного биспецифичного антитела.
Моновалентное биспецифичное антитело представляло собой гетеродимер, содержащий тяжелую цепь (впадина) иммуноглобулина против альфа-синуклеина, с С-концом которой был связан scFv против IGF1R, и тяжелую цепь (выступ) иммуноглобулина против альфа-синуклеина без связанного scFv, и легкую цепь, конъюгированную с указанным гетеродимером.
Для повышения эффективности конъюгации гетеродимера тяжелых цепей применяли методику выступ во впадину (Knob-in-Hole). To есть в СН3-части кодирующей последовательности тяжелой цепи типа впадина проводили замены T366S, L368A и Y406V, а в СН3-части кодирующей последовательности тяжелой цепи типа выступ проводили аминокислотную замену T366W.
10-3. Транзиторная трансфекция.
Полученный вектор использовали в Maxi-Prep (Qiagen) с получением большого количества плазмидной ДНК. Затем ее вводили в клетки следующим образом. Для получения моновалентного BsAb, ДНК вектора экспрессии тяжелой цепи и ДНК вектора экспрессии легкой цепи использовали для трансфекции в отношении 1:1. Для получения моновалентного BsAb ДНК вектора экспрессии тяжелой цепи типа впадина, ДНК вектора экспрессии тяжелой цепи типа выступ и ДНК вектора экспрессии легкой цепи использовали для трансфекции в отношении 0,5:0,5:1.
В день, предшествовавший трансфекции, концентрацию клеток ExpiCHO™ (Gibco, номер по каталогу А29127) в экспрессионной среде ExpiCHO™ (Gibco, номер по каталогу А29100-01) корректировали до 3-4x106 жизнеспособных клеток на 1 мл и затем проводили инкубацию при 8% СО2, 37°C и 120 об/мин на протяжении 1 суток. В день трансфекции ДНК проводили разведение клеток, выращенных до 7-10x106 жизнеспособных клеток на 1 мл, с показателями выживаемости 95% или более свежей средой до 6x106 жизнеспособных клеток на 1 мл.
Для трансфекции исходных клеток подготавливали комплекс ExpiFectamine™ СНО и плазмидной ДНК с использованием набора для трасфекции ExpiFectamine™ СНО Transfection Kit (Gibco, номер по каталогу А29129). ДНК и реагенты ExpiFectamine™ СНО подготавливали в подходящих концентрациях, вносили в старую среду OptiPRO™ SFM® (Gibco, номер по каталогу 12309019) и перемешивали, оставляя при комнатной температуре на 5 минут. Полученный продукт добавляли к исходным клеткам и на- 86 045348 чинали их посттрансфекционное культивирование. На следующий день после трансфекции к трансфицируемым клеткам добавляли реагенты Enhancer и Feed, входящие в состав набора ExpiFectamine™ СНО
Transfection Kit, через 5 суток еще раз добавляли реагент Feed и проводили инкубацию на протяжении 10 суток при 8% СО2, 37°С и 120 об/мин с получением трансфицированных клеток.
10-4. Сбор среды.
Для получения культурального раствора по завершении продуцирования культуральную среду переносили в центрифужную бутылку для центрифугирования и центрифугировали при 4°С и 6500 об/мин на протяжении 30 минут с последующей фильтрацией через фильтр размером 0,2 мкм, получая культуральную среду без взвешенных твердых частиц. Затем полученную культуральную среду использовали для последующей очистки.
Пример 11. Получение антитела к IGF1R (scFv).
11-1. Получение антитела к IGF1R (scFv).
Моноклональные антитела получали с применением методики фагового дисплея/пэннинга. Конкретно, антигены, использованные в пэннинге с фаговым дисплеем и других анализах, использовали в виде следующих белков. Пептид, состоящий из остатков 31-932 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:99, где из внеклеточного домена человеческого IGF1R была удалена сигнальная последовательность, метили гистидином на С-конце и использовали для данного примера (R&D Systems, США, 391-GR). IGF1R обезьяны (Национальный научно-исследовательский совет Канады), мышиный IGF1R (R&D Systems, 6630-GR/CF) и крысиный IGF1R (Национальный научно-исследовательский совет Канады) с His-меткой на С-конце использовали в качестве антигена для анализа межвидовой перекрестной реактивности.
1х1010 клеток полученной библиотеки scFv (одноцепочечный вариабельный фрагмент), обладавших разнообразием и имевших происхождение от человека (получены SHIM Hyunbo в Женском университете Ихва), вносили в 2Х среду YT (17 г триптона (CONDA, 1612.00), 10 г дрожжевого экстракта (CONDA, 1702.00) и 5 г NaCl (Sigma, S7653)), содержавшую 34 мкг/мл хлорамфеникола (Sigma, C0857), 2% глюкозы (Sigma, G5400) и 5 мМ MgCl2 (Sigma, C0857), при 30°С на 3 часа до OD600 0,5-0,7. Затем клетки инфицировали фагом-помощником и культивировали в 2Х среде YT, содержавшей 34 мкг/мл хлорамфеникола, 5 мМ MgCl2, 70 мкг/мл канамицина (Sigma, K1876) и 1 мМ IPTG (ELPISBIO, IPTG025), при 30°С на протяжении 16 часов для индукции упаковки фагов. Затем культуральный раствор центрифугировали при 4500 об/мин и 4°С на протяжении 15 минут. В супернатант добавляли 4% ПЭГ 6000 (Fluka, 81253) и 3% NaCl (Sigma, S7653) и проводили инкубацию на протяжении 1 часа на льду. Полученный продукт центрифугировали при 8000 об/мин на протяжении 20 минут при 4°С, затем осадок суспендировали в PBS и центрифугировали снова при 4°С и 12000 об/мин на протяжении 10 минут с получением супернатанта, содержавшего фаговую библиотеку. Полученный супернатант хранили при 4°С до последующего использования.
11-2. Пэннинг с фаговым дисплеем.
Для скрининга человеческого антитела к IGF1R проводили три раунда пэннинга, как описано ниже. Фаговая библиотека представляла собой синтетическую библиотеку человеческих scFv, а процедура пэннинга с фаговым дисплеем и полученные результаты показаны в табл. 19.
Таблица 19
Стадия | Пэннинг | |||
1-й раунд | 2-й раунд | 3-й раунд | ||
Антиген | ECD IGF1R (биотинилированный) | ECD IGF1R (биотинилированный) | Клетки MCF-7 | |
Метод сорбции | Непрямая иммобилизация | Непрямая иммобилизация | — | |
Исходное количество | 7,0 х 1012 | 6,0 х 1012 | 5,0 х 1012 | |
Выход | IGF1R или MCF-7 | 4,9 х 108 | 3,3 х 105 | 1,2 х 105 |
Промывка | PBS-T** | 5 раз | 10 раз | 10 раз |
PBS | 2 раза | 2 раз | 2 раз |
Конкретно, 1 мл рекомбинантного человеческого белка IGF1R в концентрации 5 мкг/мл (R&D Systems, США, 391-GR, или Sino Biological Life Technologies, США, 10164-H08H-50R) вносили в иммунологическую пробирку (Maxisorp 444202) и сорбировали на поверхность иммунологической пробирки при 4°С на протяжении 16 часов. Затем супернатант удаляли и проводили инкубацию с добавлением PBS, содержавшего 3% BSA, при 37°С на протяжении 1 часа для блокировки неспецифического связывания
- 87 045348 посредством связывания BSA с поверхностью, не связанной с IGF1R. После удаления супернатанта фаговую библиотеку, полученную в Примере 11-1, смешанную с 1,5% раствором BSA, помещали в иммунологическую пробирку и проводили взаимодействие при 37°С на протяжении 1 часа, позволяя IGF1Rспецифичным фагам связаться с антигеном. Затем полученный продукт промывали раствором PBS-T (забуференный фосфатом физиологический раствор с 0,05% Tween 20) для удаления фагов, связанных неспецифично, и фаги, связанные с IGF1R, собирали с использованием 100 мМ раствора триэтиламина.
Собранные фаги нейтрализовали буферным раствором с 1 М трис (рН 7,4), трансфицировали Е. coli K12ER2738 при 37°С на протяжении 1 часа и инфицированные Е. coli распределяли по агаровой среде LB, содержавшей тетрациклин и карбенициллин, и культивировали при 37°С в течение ночи. На следующий день культивированные Е. coli суспендировали в 5 мл среды SB (superbroth), содержавшей тетрациклин и карбенициллин, и добавляли равный объем 50% глицерина. Одну часть хранили при -80°С, а 50 мкл продукта суспендировали в 40 мл среды SB (superbroth), содержавшей тетрациклин и карбенициллин, добавляли 1012БОЕ фага-помощника VCSM13 и проводили культивирование с перемешиванием при 37°С на протяжении 1 часа. Затем в культуральный раствор добавляли канамицин и проводили культивирование при 30°С на протяжении приблизительно 16 часов, культивируя только Е. coli, инфицированные фагом-помощником.
На следующий день, после центрифугирования культурального раствора, отбирали супернатант и вносили его в буфер, содержавший 4% ПЭГ 8000 и 3% хлорида натрия (NaCl), проводили взаимодействие при 4°С на протяжении приблизительно 1 часа, фаги осаждали и проводили центрифугирование. После удаления супернатанта пул осажденных фагов ресуспендировали в PBS-буфере, содержавшем 1% BSA, и использовали для следующего раунда пэннинга. Во время более поздних раундов пэннинга число промывок с использованием PBS-T увеличивали для увеличения количества и концентрации антигенспецифичных фагов.
11-3. Скрининг отдельных клонов.
Проводили отбор клеточных клонов, демонстрировавших аффинность связывания с ECD (внеклеточный домен) человеческого IGF1R и MCF-7, экспрессирующими IFG1R.
Конкретно, для отбора моноклональных антител, специфично связывающихся с IGF1R, из пула фагов, полученного в примере 11-2, проводили следующий эксперимент.
Для выделения моноклонов из концентрированного пула, пул фагов, полученных на агаровой среде LB с тетрациклином/карбенициллином, высевали на среду и культивировали, получая отдельные колонии. После высева этих колоний в глубокий 96-луночный планшет и инкубации в течение ночи 10 мкл полученного культурального раствора еще раз вносили в глубокий 96-луночный планшет и инкубировали таким же образом при 37°С на протяжении приблизительно 4 часов до получения подходящей OD (от 0,5 до 0,7). После добавления 20 MOI фага-помощника в культуральный раствор полученную смесь подвергали взаимодействию при 37°С на протяжении 1 часа. Затем в культуральную среду добавляли канамицин и проводили культивирование в течение ночи при 30°С. На следующий день культуральную среду центрифугировали и отбирали супернатант для проведения ELISA для отбора IGF1R-специфичных фагов (Steinberger. Rader and Barbas III. 2000. Phage display vectors. In: Phage Display Laboratory Manual. 1 sted.Cold Spring Harbor Laboratory Press NY.USA. Pp.11.9-11.12).
По 100 нг рекомбинантного IGF1R вносили в каждую лунку планшета для ELISA и проводили взаимодействие при 4°С на протяжении приблизительно 15 часов для сорбции антигена на планшет. Для предотвращения неспецифического связывания в каждую лунку вносили по 200 мкл PBS-буфера, содержавшего 3% BSA, и проводили взаимодействие при 37°С на протяжении приблизительно 1 часа. Супернатант удаляли.
В каждую лунку вносили по 100 мкл раствора, содержавшего полученный моноклональный фаг, проводили взаимодействие при 37°С на протяжении 1 часа и 3-кратную промывку с использованием 300 мкл PBS-T. Для выявления фага, связанного с антигеном IGF1R, антитело против НА с HRP разводили 1:5000 в PBS-буфере, содержавшем 3% BSA, и проводили взаимодействие при 37°С на протяжении 1 часа. После 3-кратной промывки с использованием 300 мкл PBS-T вносили 100 мкл ТМВ (тетраметилбензидин, Sigma, T0440) для окрашивания, а для остановки реакции вносили 50 мкл 1 Н H2SO4. Измеряя оптическую плотность при 450 нм, отбирали клоны с высокой оптической плотностью по сравнению с контрольной группой BSA как клоны антигенспецифичных антител.
При двукратном скрининге были отобраны семь (7) видов клонов: 1564, 48G5, 49G11, 54Н4, 60А11, 60Н6 и В11.
Пример 12. Получение аффинного варианта антитела к IGF1R.
Антитела оптимизировали, варьируя аффинность отобранных клонов, посредством оценки их способности к связыванию с лигандом и проникновению через ГЭБ. В первом эксперименте получали ручную смесь NNS-праймеров для рандомизации CDR2 тяжелой цепи и CDR3 легкой цепи на основе scFv 1564 и ген scFv 1564, содержавший рандомизационную последовательность, амплифицировали с применением методики ПЦР. Амплифицированные генные продукты вводили в вектор pComb3x с получением библиотеки в форме, подходящей для фагового дисплея, и при пэннинге с использованием этой библио- 88 045348 теки и ELISA-скрининге удалось отобрать несколько клонов scFv, которые связывались с IGF1R. У отобранных клонов определяли аминокислотную последовательность вариабельной области посредством секвенирования генов.
Во втором эксперименте конструировали две минибиблиотеки тяжелой и легкой цепи с введением обратной мутации эмбрионального типа в CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно. По результатам анализа 96 колоний было подтверждено, что 31 клон VL и 39 клонов VH имели уникальные последовательности. В итоге, при отборе аффинных вариантов на основе продуктивности и аффинности связывания клонов с антигеном были получены клоны.
Пример 13. Получение вариантов антител, имеющих остаток, подверженный дезамидированию.
13-1. Определение остатка, подверженного дезамидированию.
При дезамидировании в области CDR происходит деградация антитела и ослабление его связывания с антигеном, что может приводить к снижению эффективности и к неоднородности образцов. Неоднородность образцов приводит к сложностям при его идентификации в клинических исследованиях. Поэтому была предпринята попытка определить положения, по которым происходит дезамидирование, с применением компьютерного анализа и пептидного картирования.
Как показано на фиг. 8а, при компьютерном анализе и пептидном картировании был установлен факт дезамидирования исходного клона 1564. Для этого образцы хранили при 4°С или 40°С на протяжении одной недели до анализа, и было подтверждено, что дезамидирование происходит в L-CDR2, LCDR3 и H-CDR2. Для подтверждения мест дезамидирования были также проанализированы аффинные варианты, раскрытые в примере 12.
13-2. Получение вариантов антител.
При компьютерном анализе исходный клон 1564 имел результирующий заряд -0,7. Обычно при результирующем заряде менее 0 или более 5,5 антитело подвержено быстрому клиренсу в организме. Поэтому предполагается, что замена остатков, подверженных дезамидированию, на положительные заряды, такие как Н, R, K и так далее, позволит предотвратить быстрый клиренс благодаря устранению дезамидирования и увеличению общего заряда. Таким образом, были получены мутанты с заменами сайтов дезамидирования, как показано на фиг. 18b.
Для удаления остатка, подверженного дезамидированию, получали мутант, имеющий замену по этому остатку, следующим образом.
1) В аминокислотной последовательности Asn заменяли на D или Q, сходные с Asn. При отсутствии изменений аффинности связывания мутанта все остатки заменяли на Q.
2) Поскольку результирующий заряд исходного клона составлял -0,7, а результирующий заряд, приводящий к быстрому клиренсу, составляет менее 0 или более 5,5, предпочтительно, чтобы заряд стал положительным. Поэтому N95a, остаток L-CDR3, подверженный дезамидированию, заменяли на Н, R и K, имеющие положительный заряд.
Пример 14. Получение различных форм антител против IGF1R.
14-1. Получение минитела против IGF1R.
Минитело получали соединением полноразмерного scFv IGF1R-специфичного моноклонального фагового антитела, полученного в примерах 11-13, с С-концом Fc. Для этого получали нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность scFv, как раскрыто в настоящем изобретении, и полученную нуклеотидную последовательность расщепляли рестриктазой и клонировали в вектор экспрессии на основе pcDNA, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую Fc.
14-2. Получение бивалентного антитела против IGF1R.
Получали полноразмерный scFv IGF1R-специфичного моноклонального фагового антитела, полученного в примерах 11-13, и два полноразмерных scFv связывали с каждым С-концом терапевтического антитела в форме IgG с получением бивалентного антитела. Для этого получали нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность scFv, как раскрыто в настоящем изобретении, расщепленную рестриктазой, и клонировали ее в вектор экспрессии на основе pcDNA, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую терапевтическое антитело.
14-3. Получение IgG-антитела (Full-IgG) против IGF1R.
Для преобразования последовательностей антитела 1564 и антитела F06 в форму полноразмерных IgG1 (Full IgG) IGF1R-специфичных моноклональных фаговых антител, полученных в примерах 11 и 12, синтезировали нуклеотидные последовательности областей тяжелой цепи и легкой цепи (Genotec Inc.). Синтезированные гены тяжелой цепи и легкой цепи клонировали в векторы экспрессии.
14-4. Получение моновалентного антитела с scFv против IGF1R.
В примере 14-1 представлена форма минитела, где scFv-форма антитела против IGF1R связана с каждым С-концом двух Fc тяжелой цепи. В данном примере один scFv связан с С-концом только одного Fc тяжелой цепи. В форме антитела, полученной в примерах 11-13, конструировали вектор, где IGF1Rспецифичные моноклональные фаговые антитела 1564, F06, С04, VH5, VH16, VH35, VH9, VH2, VH7 и VH32 были связаны с С-концом только одного Fc, и вектор без антитела против IGF1R, связанного с Сконцом. При получении антител в клетках в Fc-области вводили мутации типа выступ во впадину для получения гетеродимерной формы. При трасфекции в клетки CHO-S для получения антитела все три
- 89 045348 вектора, в том числе вектор, соответствующий тяжелой цепи, в которой антитело против IGF1R связано с
С-концом Fc терапевтического антитела, вектор, соответствующий тяжелой цепи, в которой антитело против IGF1R не связано с С-концом Fc терапевтического антитела, и вектор, соответствующий легкой цепи терапевтического антитела, были инъецированы в клетки CHO-S.
14-5. Экспрессия и очистка различных антител против IGF1R.
Векторы, полученные в примерах 14-1, 14-2 14-3 и 14-4, вводили в клетки следующим образом.
Конкретно, концентрацию клеток CHO-S доводили до 1,5х106 клеток/мл в среде CD-CHO (Gibco, 10743) и затем проводили культивирование при 8% CO2 и 37°С на протяжении 1 суток. В день трансфекции ДНК проводили подготовку клеток, выращенных до 2,5-3х106 клеток/мл, в концентрации 2,1х106 клеток/мл с использованием среды CD-CHO, содержавшей 1% DMSO, и затем культивировали их в условиях 8% СО2 и 37°С на протяжении 3 часов. После центрифугирования при 3000 об/мин на протяжении 15 минут супернатант удаляли и проводили ресуспендирование в среде RPMI 1640 с 2,5% FBS.
Затем комбинацию векторов разводили в среде Opti-MEM до концентрации 1 мкг на 1 мл среды и PEI (Polysciences, 23966, исходная концентрация 1 мг/мл) разводили до 8 мкг/мл культуральной среды. После смешивания ДНК со смесями PEI и оставления полученной смеси при комнатной температуре на 10 мин эту смесь выливали во флакон, содержавший клетки, и проводили инкубацию на протяжении 4 часов при 5% СО2, 37°C, 100 об/мин. Затем смесь культивировали с добавлением среды CD-CHO в объеме, равном объему культуры, и инкубировали при 8% СО2, 37°C, 110 об/мин на протяжении 4 суток.
Полученный культуральный раствор пропускали через MabSelect SuRe (GE healthcare, 5 мл), уравновешенную пропусканием уравновешивающего буфера (50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ NaCl), позволяя экспрессированному антителу связаться с колонкой. Затем, после элюирования раствором 50 мМ цитрата натрия (рН 3,4) и 100 мМ NaCl проводили нейтрализацию с использованием 1М трис-HCl (рН 9,0) таким образом, что конечный рН составлял 7,2. После этого проводили замену буферного раствора с использованием PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор, рН 7,4) и, когда степень чистоты была высокой, полученный раствор хранили при -20°С, а при необходимости дополнительной очистки хранили его при 4°С до последующей очистки.
Когда была необходима дополнительная очистка, ее проводили с использованием HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare, номер по каталогу 28-9893-36) с возможностью применения различных вариантов эксклюзионной хроматографии. После уравновешивания уравновешивающим буфером (1х забуференный фосфатом физиологический раствор, рН 7,4, Gibco, номер по каталогу 10010-023) образец, прошедший первичную очистку, загружали на колонку. Полученный образец, прошедший полную очистку, хранили в замороженном состоянии при -20°С.
14-6. Получение биспецифичного антитела с антителом против альфа-синуклеина.
Антитело против IGF1R в форме scFv по настоящему изобретению получали связыванием вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи с использованием линкера (SEQ ID NO:411) и соединяли его с С-концом константной области тяжелой цепи полноразмерной IgG-формы антитела против альфа-синуклеина, описанного в следующей таблице, с использованием линкера (SEQ ID NO:412), получая биспецифичное антитело. В данном примере моновалентное антитело получали связыванием одной молекулы scFv-формы антитела против IGF1R на молекулу IgG-антитела против альфа-синуклеина, а бивалентное антитело получали связыванием двух молекул scFv-формы антитела против IGF1R на молекулу IgG-антитела против альфа-синуклеина, соответственно. Последовательности антитела против альфа-синуклеина, использованных для получения биспецифичного антитела в данном примере, и примеры биспецифичных антител, полученных в соответствии с настоящим изобретением, описаны в табл. 17. Биспецифичные антитела, примеры которых приведены в табл. 17, были использованы для экспериментов в последующих примерах.
Пример 15. Анализ IGF1R-специфичной аффинности связывания с использованием антитела против IGF1R.
15-1. Анализ IGF1R-специфичной аффинности связывания с использованием антитела против IGF1R в форме минитела (ELISA).
Проводили ELISA-анализ для оценки аффинности связывания и зависимого от концентрации связывания клонов 996, 1226, 1564 и MKJP2 в форме минител, полученных в примере 14-1, с рекомбинантным IGF1R.
Конкретно, человеческий рекомбинантный IGF1R, являющийся мишенью, с которой связывается антитело, представляет собой внеклеточный домен (ECD) и был приобретен у R&D Systems (6630GR/CF). Человеческий IGF1R разводили до 1 мкг/мл в PBS-буфере, вносили в 96-луночный планшет для ELISA (Nunc-Immuno Plates, NUNC, Рочестер, штат Нью-Йорк) в количестве 100 мкл на лунку, сорбировали, проводя взаимодействие при 4°С на протяжении 16 часов, и затем удаляли супернатант.
Добавляли PBS-буфер, содержавший 3%BSA (бычий сывороточный альбумин), 200 мкл на лунку, и проводили взаимодействие на протяжении 2 часов для блокировки неспецифического связывания.
Проводили 3-кратное разведение минител клонов 996, 1226, 1564 и MKJP2, полученных в примере 14-1, начиная с максимальной концентрации 20 нМ, с получением 12 точек, затем переносили по 100 мкл
- 90 045348 в каждую лунку и оставляли при комнатной температуре на 1 час. После этого планшет промывали 4 раза PBS-буфером, содержавшим 0,05% Tween 20, и проводили взаимодействие при комнатной температуре на протяжении часа, добавляя в каждую лунку по 100 мкл противочеловеческого антитела с HRP, распознававшего человеческий Fc минитела, в разведении 1:5000 в блокирующем буфере. После 4кратной промывки с использованием 300 мкл PBS-T (Tween 20, 0,05%) проводили окрашивание с использованием ТМВ (тетраметилбензидин, Sigma, T0440). Ферментативную реакцию гасили серной кислотой, 0,5 моль/л, и оптическую плотность определяли и анализировали при 450 нм с использованием устройства для прочтения микропланшетов. Результаты эксперимента показаны на фиг. 1а.
Было подтверждено, что четыре клона минител связывались с человеческим рекомбинантным белком IGF1R зависимым от концентрации образом, и, конкретно, MKJP2 продемонстрировал наиболее высокую связывающую способность, и, после него, клоны 996 и 1564 продемонстрировали сходную силу связывания, а клон 1226 продемонстрировал несколько меньшую силу связывания.
15-2. ELISA-анализ межвидовой перекрестной реактивности антител к IGF1R.
Активность антитела 1564 против IGF1R, полученного методом, описанным в Примере 14-2, и антител против IGF1R, полученных в примере 11-3, по межвидовому перекрестному связыванию анализировали посредством ELISA-анализа. С этой целью сначала разводили антигены IGF1R человека, обезьяны, мыши и крысы до 1 мкг/мл, вносили по 100 мкл в каждую лунку и проводили взаимодействие при 4°С на протяжении 15 часов для их сорбции на дно планшета. После удаления супернатанта в каждую лунку вносили по 200 мкл PBS-буфера, содержавшего 3%BSA, для блокировки неспецифического связывания. Проводили 5-кратное разведение антител против IGF1R в PBSB (BSA, 3% в PBS) от максимальной концентрации 400 нМ, вносили их в каждую лунку и проводили взаимодействие при 37°С на протяжении 1 часа. Затем, после 5-кратной промывки PBS-буфером, антитело против человеческого Fab с HRP, распознающее Fab-часть связанного антитела, разводили 1:20000, вносили по 100 мкл в каждую лунку и проводили взаимодействие при 37°С на протяжении 1 часа. Полученный продукт промывали 5 раз PBS-буфером и проводили окрашивание с использованием ТМВ (тетраметилбензидин, Sigma, T0440), следуя методу изготовителя. Ферментативную реакцию гасили серной кислотой, 0,5 моль/л, и оптическую плотность измеряли при 450 нм с использованием устройства для прочтения микропланшетов (Molecular Devices). При включении в ELISA-анализ большого количества образцов использовали два планшета. Результаты эксперимента показаны в табл. 12 ниже.
Конкретно, в табл. 12 результатов ELISA биспецифичных антител к человеческому IGF1R результаты ELISA IgG 1564 и биспецифичных антител с человеческим IGF1R, мышиным IGF1R, крысиным IGF1R и IGF1R обезьяны показаны в табл. 12.
Результаты эксперимента, изложенные ниже, демонстрируют преимущество оценки эффективности с применением моделей у различных видов животных и показывают, что эффективность терапевтических агентов в моделях заболеваний у различных видов можно оценивать с использованием антител по настоящему изобретению.
Таблица 20
Результаты ELISA-анализа способности антител к связыванию с IGF1R различных видов
Эксперимент | Клон антитела | ECso (нМ) |
ELISA с человеческим IGF1R | chllFll-1564 | 0,914 |
chllFll-48G5 | 1,21 | |
chllFll-54H4 | 2,88 | |
chllFll-60H6 | 10 | |
chllFll-Bll | 7,13 | |
ELISA с человеческим IGF1R | 1564 IgG | 0,0823 |
chllFll-1564 | 0,379 | |
ELISA с мышиным IGF1R | chllFll | N/A* |
chllFll-1564 | 3,02 |
- 91 045348
chllFll | N/A* | |
chi 1F11-48G5 | 6,2 | |
chllFll-54H4 | N/A | |
chllFll-60H6 | 18,6 | |
chllFll-Bll | 148 | |
ELISA с крысиным IGF1R | chllFll | N/A* |
chllFll-1564 | 1,05 | |
chllFll-48G5 | 2,44 | |
chllFll-54H4 | 14,2 | |
chllFll-201** | N/A* | |
chllFll-1564 | 0,874 | |
chllFll-60H6 | 38 | |
chllFll-Bll | 35,1 | |
ELISA с IGF1R обезьяны | chllFll | N/A* |
chllFll-1564 | 2,48 | |
chllFll-48G5 | 6,69 | |
chllFll-54H4 | 8,83 | |
chllFll-201** | N/A* | |
chllFll-1564 | 2,21 | |
chllFll-60H6 | N/A | |
chllFll-Bll | 180 |
* Недоступно, ** scFv-форма биоаналога герцептина.
15-3. Анализ аффинности связывания аффинных вариантов с IGF1R (FACS).
Аффинность связывания аффинных вариантов, полученных в примере 12, оценивали посредством ELISA с ECD IGF1R, а аффинность связывания с MCF-7 анализировали посредством FACS.
В качестве анализа первичных клонов в табл. 21 показаны результаты ELISA-анализа соответствующих первично отобранных клонов в форме биспецифичных антител с ECD IGF1R, а в табл. 22 показаны результаты анализа аффинности связывания с клеточной линией MCF-7 посредством FACS.
- 92 045348
В результате, клон F06 был отобран как клон, обладающий наиболее высокой связывающей способностью при связывании с клетками по сравнению с исходным клоном (клон 1564) (созревание аффинности), а клон С04 был отобран как клон с наименее высокой связывающей способностью при связывании с клетками по сравнению с исходным клоном 1564 (снижение аффинности).
В качестве анализа вторичных клонов в табл. 23 показаны результаты ELISA связывания клонов, полученных вторично, в форме биспецифичных антител с ECD IGF1R.
- 93 045348
Таблица 23
Результаты ELISA вторично отобранных клонов с ECD IGF1R
Клон антитела | EC5o (hM) |
HullFll(ver.2)-1564 | 0,259 |
Моновалентное chllFll-1564 | 0,347 |
Hui 1F1 l(ver.2)-C04 | 0,15 |
Hui 1F1 l(ver.2)-F06 | 0,147 |
HullFll(ver.2)-1564 | 0,864 |
chllFll-F06 | 0,857 |
Hui 1F1 l(ver.2)-VH2 | 135 |
Hui 1F1 l(ver.2)-VH5 | 0,366 |
HullFll(ver.2)-1564 | 0,157 |
Hui 1F1 l(ver.2)-VH7 | 402 |
Hui 1F1 l(ver.2)-VH9 | 6,06 |
HullFll(ver.2)-VH16 | 0,236 |
HullFll(ver.2)-1564 | 0,149 |
Hui 1F1 l(ver.2)-VH32 | 121 |
Hui 1F1 l(ver.2)-VH35 | 0,167 |
Hui 1F1 l(ver.2)-VH27 | N/A* |
Клоны для анализа посредством FACS были отобраны, как показано в табл. 24, после того как из вторично полученных клонов были исключены клоны с существенно сниженной продуктивностью и ухудшенными физическими свойствами.
Таблица 24
Клоны для анализа с применением FACS-анализа
Категория аффинности связывания | Клон антитела | Пояснение |
Аффинность связывания сходна с исходным клоном 1564 | С04 | FACS и анализ in vivo |
F06 | FACS и анализ in vivo | |
VH5 | FACS и анализ in vivo | |
VH16 | FACS и анализ in vivo | |
VH35 | FACS и анализ in vivo | |
Аффинность связывания снижена в 50 раз | VH9 | FACS и анализ in vivo |
С12 | Нежелательные физические свойства | |
Аффинность связывания снижена в 50 раз или более | VH2 | FACS и анализ in vivo |
VH6 | Нежелательные физические свойства | |
VH7 | FACS и анализ in vivo | |
VH27 | Нежелательные физические свойства | |
VH32 | FACS и анализ in vivo |
На фиг. 12с представлены результаты анализа связывания клонов с клеточной линией MCF-7 с применением FACS, и все проанализированные клоны обладали меньшей аффинностью связывания с MCF-7, чем исходный клон 1564. Эти результаты показывают, что клоны, продемонстрировавшие сниженную связывающую способность при ELISA, также продемонстрировали сниженную связывающую способность при FACS.
Были отобраны клоны антител F06, С04, VH2, VH5, VH7, VH9, VH16 и VH32, и аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи этих антител показаны в табл. 5 и 6 выше.
- 94 045348
15-4. BIAcore-анализ с человеческим IGF1R.
Анализировали способность антитела по настоящему изобретению к связыванию с человеческим
IGF1R.
Степень связывания IgG-формы клона 1564 с человеческим IGF1R анализировали посредством SPR-анализа. Антитело anti-his против His-метки, связанной с ECD человеческого IGF1R как антигена, разводили до 20 мкг/мл в ацетатном буфере, рН 4,0, и затем иммобилизовали в референсном/аналитическом канале чипа СМ4 до 10000 RU как целевого числа RU методом аминного сочетания. Во время захвата в качестве рабочего буфера использовали PBS и поддерживали скорость потока 30 мкл/мин. Во время ассоциации/диссоциации скорость потока составляла 40 мкл/мин, а в качестве рабочего буфера использовали PBS. Время ассоциации/диссоциации составляло 5 минут и 20 минут, соответственно. Анализ проводили в следующем порядке: 1 измерение исходных значений, активация (EDC NHS), внесение человеческого IGF1R, гашение (1 М этаноламин), 2 измерение исходных значений, ассоциация и диссоциация. Полученные результаты оценивали с применением бивалентной модели и анализировали с использованием программного обеспечения Biacore T200 Evaluation Software (версия 1.0, серийный номер 04Y15X11-0149).
По результатам анализа было подтверждено, что KD IgG-антитела 1564 составляла 2,5305 х 10-9 нМ, а KD IgG-антитела F06 - 4,7802х10-7 нМ, и все они продемонстрировали высокую способность к связыванию с человеческим IGF1R. Результаты анализа показаны на фиг. 11b. В частности, при получении клона 1564 в форме IgG он продемонстрировал константу диссоциации 2,5305х10-9 нМ применительно к человеческому IGF1R и позволил подтвердить отсутствие значимого изменения аффинности связывания в зависимости от формы антител.
Пример 16. Анализ способности антитела против IGF1R к связыванию с клеточной линией, экспрессирующей человеческий IGF1R, и клетками эндотелия головного мозга.
16-1. FACS-анализ на MCF-7.
Для подтверждения того, что клоны 996, 1226 и 1564 в форме минител, полученные в примере 14-1, связываются с эндогенным IGF1R на поверхности клеток, проводили анализ аффинности связывания с клеточными линиями, экспрессирующими человеческий IGF1R, и клетками эндотелия головного мозга с применением FACS. Степень связывания с MCF-7, известной как клеточная линия рака молочной железы, сверхэкспрессирующая IGF1R, анализировали посредством FACS.
Конкретно, каждое из трех минител разводили до 20 мкг/мл, в каждый образец вносили по 0,43х106 клеток линии MCF-7 и проводили взаимодействие при 4°С на протяжении 1 часа. После двукратной промывки PBS-буфером вносили человеческое антитело с FITC, разведенное 1: 500, и проводили взаимодействие при 4°С на протяжении 1 часа. После двукратной промывки PBS-буфером степень связывания минител против IGF1R измеряли с использованием прибора FACS Calibur. В качестве контроля использовали клетки MCF-7, обработанные только вторичными антителами. Результаты эксперимента показаны на фиг. 12а.
Аффинность связывания А02, А06, А07, В01, В02, В09, B10, C04, D03, Е06, F06, H04(Gly), H04(Val), VH2, VH5, VH7, VH9, VH16, VH32 и VH35, полученных в примере 12 и примере 14-2, с MCF7 анализировали таким же образом, как описано выше. В качестве исходных клонов сравнения использовали клон 1564, полученный методом, примененным в примере 14-2, а в качестве контролей использовали клетки MCF-7, обработанные только вторичными антителами. Результаты анализа показаны в табл. 22 и на фиг. 12с.
Результаты описанного выше эксперимента выражали как среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) образца, и три минитела scFv, аффинные варианты биспецифичных антител и исходный клон (клон 1564) специфично связывались с эндогенным IGF1R, экспрессированным на поверхности клеток. Эти результаты демонстрируют, что клоны, полученные в описанных выше примерах, могут быть использованы по своему целевому назначению посредством их связывания с IGF1R в форме, фактически присутствующей в организме.
16-2. FACS-анализ на JIMT-1 и ВТ474.
Минитела клонов 996, 1226 и 1564, полученные в примере 14-1, анализировали почти таким же образом, за исключением того, что вместо клеточной линии MCF-7, использованной в примере 16-1, использовали клеточные линии рака молочной железы ЛМТ-1 и ВТ474. Связывание с эндогенным IGF1R на поверхности клеток было подтверждено морфологически. Результаты эксперимента показаны на фиг. 12а.
Результаты описанного выше эксперимента выражали как среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) соответствующего образца, и было подтверждено, что три проанализированных минитела scFv специфично связывались с эндогенным IGF1R на поверхности различных клеточных линий, экспрессирующих IGF1R.
16-3. FACS-анализ клеток эндотелия головного мозга мыши.
Анализировали возможное связывание клона 1564 в форме биспецифичного антитела, полученного методом, примененным в примере 14-2, и в форме IgG, полученного методом, примененным в примере
- 95 045348
14-3, с клетками эндотелия головного мозга bEND.3. В этой связи в качестве отрицательных контролей использовали группу обработки только вторичным антителом и группу обработки только терапевтическим антителом в форме IgG (CH11F11). FACS-анализ проводили таким же образом, как в примерах 16-1 и 16-2. Результаты анализа показаны на фиг. 12b.
Все проанализированные клоны продемонстрировали связывание с bEND.3, за исключением отрицательных контролей. Эти результаты подтверждают, что различные формы клона 1564 специфично связываются с IGF1R, экспрессированным на поверхности клеток эндотелия головного мозга.
Пример 17. Анализ внутриклеточной интернализации антитела против IGF1R.
17-1. Анализ интернализации MCF-7 - 1564, 996, 1226, MKJP2 (минитела).
Данный пример проводили для проверки того, проходят ли клоны 996, 1226, 1564 и MKJP2 в форме минител, полученные в примере 14-1, внутриклеточную интернализацию клеточной линией, экспрессирующей IGF1R, и проходят ли эти антитела, проникнув в клетки, через путь RMT, не подвергаясь деградации. Для того чтобы антитело против IGF1R можно было использовать в качестве переносчика для повышения способности к проникновению через ГЭБ, оно должно проходить интернализацию клетками эндотелия головного мозга, составляющими ГЭБ.
Внутриклеточную интернализацию антител по настоящему изобретению анализировали с использованием клеточной линии MCF-7, экспрессирующей IGF1R. Конкретно, после высева 30000 клеток линии MCF-7 в 8-луночное предметное стекло клетки культивировали на протяжении 1 суток. В каждую лунку с культивированными клетками вносили минитела клонов 996, 1226, 1564 и MKJP2, полученные в примере 14-1, в концентрации 5 мкг/мл при 4°С на 2 часа, проводили трехкратную промывку холодной средой DMEM и вносили антитело против человеческого Fc, конъюгированное с А1еха488, при 4°С на 1 час.
Для оценки интернализации комплексов антител планшет переносили в СО2-инкубатор и инкубировали при 37°С на протяжении 30 минут. Культуру фиксировали, добавляя 100% метанол, и одновременно останавливали реакцию. После фиксации планшет промывали 3 раза с использованием PBS. На флуоресцентном микроскопе степень интернализации антитела визуализировали в области зеленого фильтра (Alexa488). При визуализации ядра внутри клеток окрашивали с использованием DAPI для подтверждения расположения каждой лунки. Результаты эксперимента показаны на фиг. 13а.
По результатам эксперимента было показано, что все четыре антитела, проанализированные в данном эксперименте с использованием клеточной линии MCF-7, хорошо проходили интернализацию. В частности, было обнаружено, что клоны MKJP2 и 1564 были подвержены интернализации в большей степени, чем другие клоны.
17-2. Анализ интернализации MCF-7-CO4, F06, VH5, VH16. VH35, VH9, VH2, VH7, VH32.
Связывание вариантов 1564, обладающих измененной способностью к связыванию с IGF1R, с IGF1R на поверхности клеток анализировали посредством FACS-анализа с использованием клеточной линии MCF-7, экспрессирующей IGF1R. 2x105 клеток MCF-7 обрабатывали биспецифичным антителом, полученным с использованием scFv-антитела против IGF1R, в концентрации 10 мкг/мл на протяжении 30 минут. После промывки PBS-буфером, содержавшим 1%BSA, вносили вторичное антитело, связанное с FITC, для выявления человеческих антител на 1 час. После промывки PBS-буфером FACS-анализ позволил подтвердить внеклеточное связывание и интернализацию различных вариантов с измененной аффинностью связывания.
Как показано в табл. 25, было обнаружено, что биспецифичное антитело, содержащее антитело 1564 к IGF1R, при 37°С демонстрирует большую интернализацию и большую интенсивность, чем в условиях охлаждения. Эти результаты показывают, что варианты 1564 хорошо связываются с клетками и проходят интернализацию клетками зависимым от связывания образом.
Таблица 25
Образец | Среднее геометрическое |
Интернализация при 37°С | |
Без обработки | 1,88 |
Только 2-е антитело | 2,86 |
hu3A9 WT | 3,4 |
hu3A9xl564 WT | 7,72 |
hullFll WT | 3,18 |
hullFl1x1564 WT | 7,34 |
hu3A9xl564_C04 | 7,23 |
- 96 045348
hu3A9xl564_F06 | 19,8 |
hul 1F1 lxl564_VH5 | 6,1 |
hul 1F11X1564 VH16 | 5,83 |
hul 1F1 lxl564_VH35 | 7,28 |
hul 1F11X1564 VH9 | 5,01 |
hul 1F1 lxl564_VH2 | 3,19 |
hul 1F1 lxl564_VH7 | 3,84 |
hul 1F1 lxl564_VH32 | 3,24 |
17-3. Анализ интернализации клетками эндотелия головного мозга человека.
Проверяли, проходят ли бивалентная форма и моновалентная форма клона 1564, полученные в примерах 14-2 и 14-4, интернализацию первичными эндотелиальными клетками микрососудов головного мозга человека (НМВЕС). В качестве отрицательного контроля использовали терапевтическое антитело IgG (11F11).
НМВЕС (Cell Systems, номер по каталогу ACBRI376) высевали в 12-луночный планшет до 90% смыкания монослоя с последующим внесением анализируемого антитела. На следующий день после фиксации 4% параформальдегидом и промывки с использованием PBS проводили блокировку и пермеабилизацию с использованием раствора, содержавшего 3% BSA и TritonX, на протяжении 50 минут. После промывки PBS антитело против человеческого Fc (козье противочеловеческое антитело) инкубировали на протяжении 2 часов и 30 минут, проводили промывку с использованием PBS и вносили вторичное антитело против соответствующего первичного антитела на 1 час. После промывки PBS клетки окрашивали красителем Hoechst на протяжении 10 минут в концентрации 1:1000 для окрашивания ядер. Результаты анализировали в условиях LSM 780 NLO EC Plan-Neofluar 100X /1.3 Oil на конфокальном микроскопе. Результаты эксперимента показаны на фиг. 13b.
Бивалентная форма и моновалентная форма клона 1564 продемонстрировали большую нейтрализацию, чем терапевтическое антитело отрицательного контроля (11F11). Эти результаты показывают, что антитело против IGF1R, описанное выше, может эффективно обеспечивать интернализацию терапевтического антитела клетками эндотелия головного мозга, составляющими ГЭБ, в различных формах биспецифичных антител, содержащих связанное с ним терапевтическое антитело, увеличивая посредством этого способность терапевтического антитела к проникновению через ГЭБ.
17-4. Анализ дальнейших превращений антител в клетках эндотелия головного мозга человека.
Если антитело интернализуется и колокализуется с лизосомальным маркером внутри клетки, то такое антитело не может проходить через ГЭБ из-за его разрушения в клетках эндотелия головного мозга. В отличие от этого, если антитело колокализуется с ранней эндосомой, ассоциированной с экзоцитозом, или известным маркером, ассоциированным с прохождением через ГЭБ, то ожидают, что это антитело пересекает ГЭБ посредством рецептор-опосредованного трансцитоза, то есть проходит интернализацию клетками эндотелия головного мозга и затем существует в головном мозге.
После такой же обработки НМВЕС бивалентной формой 1564 из антител, проанализированных в примере 17-2, анализировали, какой клеточный компонент этих клеток колокализуется с этими антителами. Тем не менее, козьими противочеловеческими антителами, выявляющими обработанные антитела после блокировки и пермеабилизации, обрабатывали одновременно каждое из следующих антител:
антитело против катепсина D: лизосомальный маркер;
антитело против кавеолина-1: маркер кавеолин-опосредованного трансцитоза (предположительно являющегося основным механизмом прохождения через ГЭБ);
антитело против ЕЕА1: маркер ранних эндосом.
Остальные методы были такими же, как в примере 17-2, но для маркеров использовали соответствующие вторичные антитела.
Результаты анализа показаны на фиг. 13с. Клон 1564 в форме биспецифичного антитела не колокализовался с катепсином D, но колокализовался с кавеолином-1 и ЕЕА1 в клеточной мембране и клетках. Эти результаты показывают, что после интернализации клона 1564 он мог проходить через ГЭБ по пути RMT, минуя механизмы внутриклеточной деградации.
Пример 18. Анализ влияния антитела против IGF1R на передачу сигналов через IGF1R.
18-1. Анализ пролиферации клеточной линии MCF-7 при использовании IGF1R.
Возможное влияние антитела против IGF1R по настоящему изобретению на связывание IGF1R (рецептора IGF1) с его лигандом анализировали по эффективности пролиферации клеток под действием IGF1.
Проводили 5-кратное разведение минител клонов 996, 1226, 1564 и MKJP2, полученных в примере 14-1, от 400 нМ, соответственно, с получением разведенных образцов и затем к 25 мкл каждого разве- 97 045348 денного образца добавляли по 25 мкл 20 нг/мл IGF1. Клетки линии MCF-7, экспрессирующие IGF1R, культивировали, пассировали, удаляя среду в день эксперимента, и в каждую лунку 96-луночного планшета, в который вносили IGF1 и анализируемое антитело, добавляли по 20000 клеток (что соответствовало 50 мкл).
После 3 суток инкубации при подходящих температуре и влажности вносили 10 мкл реагента ССК8 для оценки степени роста клеток и проводили инкубацию в СО2-инкубаторе на протяжении 4-5 часов. Затем планшет вынимали и измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм с использованием спектрофотометра.
Результаты эксперимента показаны на фиг. 14А.
По результатам эксперимента было подтверждено, что антитело по настоящему изобретению не ингибировало пролиферацию клеток MCF-7, вызванную передачей сигналов IGF1 через IGF1R. Антитело против IGF1R (Imclone), использованное в качестве контрольной группы, ингибировало пролиферацию клеток MCF-7, обусловленную передачей сигналов IGF1 через IGF1R, зависимым от вносимой концентрации образом. Поэтому антитело по настоящему изобретению является антителом, обладающим способностью к связыванию с IGF1R, экспрессированным на эндотелиальных клетках, составляющих ГЭБ, и к проникновению через ГЭБ, но не ингибирует передачу сигналов IGF1 в организме. Таким образом, было подтверждено, что антитело по настоящему изобретению может быть использовано в качестве переносчика через ГЭБ.
18-2. Анализ ингибирования компонентов передачи сигналов через IGF1R в клеточной линии MCF7.
Когда связывание IGF1 с клетками, экспрессирующими IGF1R, приводило к передаче сигнала в эти клетки, антитело против IGF1R по настоящему изобретению анализировали для определения связывания IGF1 с его рецептором и последующих компонентов передачи сигнала. То есть, антителом против IGF1R обрабатывали клеточные линии MCF-7, экспрессирующие IGF1R, и затем анализировали общий IGF1R, фосфорилированный IGF1R, общий Akt как последующий фактор IGF1R и количество фосфорилированного Akt в клетках.
После культивирования клеток MCF-7 культуральную среду заменяли бессывороточной культуральной средой за 20 часов до обработки антителом против IGF1R. Клетки линии MCF-7 обрабатывали минителами клонов 996, 1226, 1564 и MKJP2, полученными в примере 4-1, в концентрации 100 нМ, соответственно, и через 1 час вносили 200 нг/мл IGF1. Через 20 минут клетки промывали с использованием PBS и затем лизировали M-PER с добавлением смеси ингибиторов протеаз и фосфатаз. После измерения концентрации белка с использованием набора для ВСА-анализа 12,5 мкг белка вносили в гель для электрофореза (SDS-PAGE) и затем переносили на PVDF-мембрану. Блокировку проводили при комнатной температуре с легким покачиванием на протяжении 1 часа с использованием PBST (0,1% Tween 20), содержавшего 5% BSA, и затем проводили обработку первичным антителом против IGF1R или Akt с медленным покачиванием при 4°С в течение ночи. В качестве контроля внесения использовали антитело к бета-актину. После промывки проводили обработку вторичным антителом с медленным покачиванием при комнатной температуре на протяжении 1 часа с последующей промывкой. Добавляли ECL-раствор и сигналы наблюдали с использованием ImageQuant LAS 4000. Результаты эксперимента показаны на фиг. 14b.
По результатам эксперимента было подтверждено, что антитело по настоящему изобретению не влияло на общий IGF1R, фосфорилированный IGF1R, общий Akt как последующий фактор IGF1R и количество фосфорилированного Akt в клетках.
18-3. Анализ ингибирования компонентов передачи сигналов через IGF1R в клетках эндотелия головного мозга мыши.
Когда связывание IGF1 с клетками, экспрессирующими IGF1R, приводило к передаче сигнала в эти клетки, антитело против IGF1R по настоящему изобретению анализировали для определения связывания IGF1 с его рецептором и последующих компонентов передачи сигнала. То есть, клетки линии bEND3, экспрессирующие IGF1R, обрабатывали 11F11-1564, 3А9-1564 CH11F11 и ch3A9, отдельными антителами против альфа-синуклеинуа, описанными в публикации патента Кореи № 2018-0081465, полученными способом, примененным в примере 14-2, и затем анализировали общий IGF1R, фосфорилированный IGF1R, общий Akt как последующий фактор IGF1R и количество фосфорилированного Akt в клетках.
Во время инкубации клеток bEND3 культуральную среду заменяли бессывороточной культуральной средой за 20 часов до обработки антителом против IGF1R. Клетки линии bEND обрабатывали биспецифичными антителами клонов 1564 и MKJP2, полученными в примере 14-2, в концентрации 100 нМ и через 1 час вносили 200 нг/мл IGF1. Через 20 минут клетки промывали с использованием PBS и затем лизировали M-PER с добавлением смеси ингибиторов протеаз и фосфатаз. После измерения концентрации белка с использованием набора для ВСА-анализа 12,5 мкг белка вносили в гель для электрофореза (SDS-PAGE) и затем переносили на PVDF-мембрану. Блокировку проводили при комнатной температуре с легким покачиванием на протяжении 1 часа с использованием PBST (0,1% Tween 20), содержавшего 5% BSA, и затем проводили обработку первичным антителом против IGF1R или Akt с медленным пока- 98 045348 чиванием при 4°С в течение ночи. В качестве контроля внесения использовали антитело к бета-актину.
После промывки проводили обработку вторичным антителом с медленным покачиванием при комнатной температуре на протяжении 1 часа с последующей промывкой. Добавляли ECL-раствор и сигналы наблюдали с использованием ImageQuant LAS 4000. Результаты эксперимента показаны на фиг. 14с.
По результатам эксперимента было подтверждено, что антитело по настоящему изобретению не влияло на общий IGF1R, фосфорилированный IGF1R, общий Akt как последующий фактор IGF1R и количеств о фосфорилированного Akt в клетках.
Пример 19. Анализ нетоксичности антитела против IGF1R.
19-1. Анализ ADCC антитела к IGF1R в форме IgG.
Антитело против IGF1R в форме IgG по примеру 14-3 анализировали для определения того, приводило ли оно к гибели клеток посредством IGF1R-зависимого связывания с поверхностью клеток, экспрессирующих IGF1R. То есть, набор для репортерного биологического анализа ADCC использовали для анализа активации натуральных клеток-киллеров (NK-клеток) и нежелательного влияния на клетки, экспрессирующие IGF1R, при связывании клона 1564 антитела против IGF1R с клеточными линиями, экспрессирующими IGF1R.
После инкубации клеток MCF-7, сверхэкспрессирующих IGF1R, и клеток SKBR3 с низким уровнем экспрессии IGF1R в каждую лунку 96-луночного планшета вносили по 5000 клеток за 20 часов до обработки антителом. После культивирования клеток проводили замену среды на RPMI 1640, содержавшую 4% сыворотки с низким содержанием IgG, и в каждую лунку вносили клон 1564 в форме IgG в 8-кратном разведении, начиная со 133,3 нМ. В каждую лунку вносили стабилизированные ADCC-эффекторные клетки, инкубировали их на протяжении 6 часов и затем оставляли при комнатной температуре приблизительно на 10 минут. После внесения подготовленного реагента для люциферазного анализа Bio-Glo в каждую лунку измеряли степень люминесценции с использованием оборудования PHERAstarFS, BMG LABTECH, анализируя степень индукции ADCC. Результаты эксперимента показаны на фиг. 15а.
По результатам эксперимента было подтверждено, что антитело по настоящему изобретению, в частности клон 1564, связывалось с клетками MCF-7, представляющими собой клеточную линию, сверхэкспрессирующую IGF1R, и клетками SKBR3 с низким уровнем экспрессии IGF1R, но не индуцировало ADCC эффекторными клетками.
19-2. Анализ уровня IGF1R в головном мозге после многократного введения антитела против IGF1R.
Антитела, используемые в качестве переносчиков через ГЭБ, связываются с рецепторамимишенями на клетках эндотелия головного мозга, увеличивая проникающую способность терапевтических антител, но не должны изменять уровень соответствующих рецепторов. Понижающая регуляция рецепторов-мишеней может влиять на их роль в головном мозге, вызывая побочные эффекты.
Анализировали, влияет ли многократное введение антитела против IGF1R по настоящему изобретению на уровни IGF1R в головном мозге. Согласно примеру 14-6, мышам со смоделированной болезнью Паркинсона проводили многократное введение биспецифичного антитела в бивалентной форме, где клон 1564 был связан с терапевтическим антителом для лечения болезни Паркинсона, терапевтического антитела для лечения болезни Паркинсона самого по себе и IgG отрицательного контроля один раз в неделю на протяжении 3 месяцев и затем уровни IGF1R в ткани головного мозга анализировали вестернблоттингом.
После перфузии ткани головного мозга трех мышей в каждой группе с использованием PBS и ее гомогенизации 10 мкг лизата вносили в 4-12% бис-трис-гель, проводили электрофорез и перенос на PVDF-мембрану. В остальном метод был таким же, как в примере 19-1.
Результаты эксперимента показаны на фиг. 15b. Биспецифичное антитело, в состав которого входил клон 1564, продемонстрировало уровень IGF1R, сходный с группами введения терапевтического антитела для лечения болезни Паркинсона самого по себе и IgG. Эти результаты показывают, что клон 1564 не приводит к серьезным изменениям уровня IGF1R в головном мозге даже после его многократного введения, и поэтому ожидается, что у данного антитела будет мало побочных эффектов при его использовании в качестве переносчика через ГЭБ.
19-3. Анализ распределения антитела в головном мозге после введения антитела против IGF1R.
Переносчик через ГЭБ связывается с рецептором на поверхности клетки эндотелия головного мозга и доставляет терапевтическое антитело в головной мозг, но с рецептором на поверхности нормальной клетки головного мозга должно связываться небольшое количество антитела. Если с нормальными клетками, экспрессирующими антиген в головном мозге, будет связываться большое количество переносчика через ГЭБ, до мишени будет доходить небольшое количество терапевтического антитела, связанного с переносчиком.
Для анализа распределения антитела против IGF1R по настоящему изобретению в головном мозге распределение антитела против IGF1R анализировали иммунным окрашиванием головного мозга животных, использованных в in vivo эксперименте, проведенном в примере 21-2. Крыс SD, которым вводили бивалентную форму клона 1564, перфузировали физиологическим раствором посредством транскардиальной перфузии. Левое полушарие фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине на про- 99 045348 тяжении 24 часов. Головной мозг промывали с использованием 1X PBS и замораживали на 24 часа в растворе, содержавшем 30% сахарозы. Головной мозг замораживали в ОСТ и хранили при -80°С до приготовления срезов. Получали фронтальные срезы толщиной 25 мкм и помещали их в 1x PBS, содержавший 0,1% азида натрия, в 24-луночной чашке Петри. Ткани блокировали и пермеабилизировали инкубацией с бессывороточным белковым блоком Dako (X0909, DAKO), содержавшим 0,3% Tween-20, в свободном режиме при комнатной температуре на протяжении 1 часа. Первичное антитело обрабатывали биотинилированным антителом к человеческому Fc (BA3080, Vector Labs) в отношении 1:50 и инкубировали в течение ночи при 4°С. После трехкратной промывки с использованием TBS антитело против клеток эндотелия обрабатывали RECA-1 (ab9774, AbCam) в отношении 1:2000 или антителом к нейронам NeuN (MAB377, Millipore) в отношении 1:250 на протяжении 2 часов. После промывки проводили связывание с Alexa488 и обработку вторичным антителом для каждого антитела на протяжении 45 минут. После промывки срезы помещали на предметное стекло и окрашивали ядра, добавляя среду для заключения флуоресцентных микропрепаратов ProLong Gold, содержавшую DAPI, или Dako, содержавшую Hoechst 33258. Кору головного мозга и гиппокамп анализировали на конфокальном микроскопе при подходящей длине волны флуоресценции. Результаты анализа показаны на фиг. 15с.
Полученные результаты показывают, что биспецифичное антитело, связанное с клоном 1564, не связывалось с нормальными нейронами, но специфично связывалось с клетками эндотелия головного мозга. Поэтому ожидается, что у антитела против IGF1R по настоящему изобретению будет мало побочных эффектов благодаря тому, что оно лишь увеличивает способность терапевтического антитела к проникновению через ГЭБ без связывания с нормальными клетками головного мозга, и будет приводить к повышению терапевтической эффективности терапевтического антитела.
Пример 20. Анализ способности антитела против IGF1R к проникновению через ГЭБ in vitro.
20-1. Анализ способности бивалентного антитела к проникновению через ГЭБ в модели ГЭБ, имеющей происхождение от sv-ARBEC.
Антитела, полученные в примерах 11 и 12, использовали для получения биспецифичного антитела в примере 14-2 и затем анализировали способность полученного биспецифичного антитела к проникновению через ГЭБ in vitro в модели ГЭБ на основе sv-ARBEC. sv-ARBEC высевали одним слоем на проницаемую мембрану и целостность ГЭБ-системы оценивали заранее исходя из сопротивления (TEER) и степени прохождения сахарозы через ГЭБ-систему. При этом sv-ARBEC обрабатывали культуральной средой для астроцитов крысы (RAS-CM), которая, как известно, способствует обеспечению целостности такой системы. Через 90 минут после нанесения анализируемых антител 1564, 48G5, 54Н4, 60Н6 и В11 в форме биспецифичных антител на мембрану количество антител в нижней камере анализировали массспектрометром. Для масс-спектрометрии анализировали и затем использовали сигнатурные пептиды из Fc и scFv каждого антитела. При этом в качестве отрицательных контролей использовали терапевтическое антитело для лечения болезни Паркинсона (11F11) само по себе и биспецифичное антитело, где с этим терапевтическим антителом была связана scFv-форма биоаналога Герцептина™. Калибровочные пределы системы определяли, пропуская антитело А20.1 (полученное Национальным научноисследовательским советом), которое, как известно, не проникает через ГЭБ. Значения, полученные при масс-спектрометрии, заносили в формулы, известные из ранее опубликованной литературы, получая Рарр-значение, которое отражало степень способности к проникновению через ГЭБ in vitro.
Результаты анализа показаны на фиг. 16а. Проанализированные антитела, за исключением В11, продемонстрировали более высокую способность к проникновению через ГЭБ, чем отрицательный контроль. В частности, клон 1564 продемонстрировал более высокую способность к проникновению через ГЭБ, чем остальные клоны. Эти результаты показывают, что клоны 1564, 48G5, 54Н4, 60Н6 и биспецифичные антитела, связанные с клонами 1564, 48G5, 54Н4, 60Н6, могут иметь более высокую способность к проникновению через ГЭБ in vivo, чем одиночное антитело.
20-2. Анализ способности моновалентного антитела к проникновению через ГЭБ в модели ГЭБ, имеющей происхождение от sv-ARBEC.
В такой же модели, как в примере 20-1, анализировали способность моновалентных, полученных согласно примеру 14-4, и бивалентных антител, полученных согласно примеру 14-2, к проникновению через ГЭБ in vitro. Бивалентное антитело и моновалентное антитело, полученные с использованием клона 1564, и терапевтическое антитело для лечения болезни Паркинсона (3А9) в качестве отрицательного контроля пропускали через sv-ARBEC ГЭБ-систему и затем анализировали количество прошедших через нее антител. Результаты анализа показаны на фиг. 16b.
Бивалентная форма и моновалентная форма клона 1564 продемонстрировали более высокую способность к проникновению через ГЭБ in vitro, чем антитело 3 А9 само по себе, и, в частности, способность бивалентной формы к проникновению через ГЭБ была выше, чем у моновалентной формы. Эти результаты показывают, что клон 1564 может усиливать способность терапевтических антител, связанных с ним в различных формах, к проникновению через ГЭБ in vitro.
- 100 045348
20-3. Анализ способности антитела против IGF1R к проникновению через ГЭБ в модели ГЭБ, имеющей происхождение от человеческих IPSC.
Модель ГЭБ, имеющая происхождение от человеческих стволовых клеток, демонстрирует более высокое сопротивление (TEER), чем ГЭБ-системы, имеющие происхождение от клеток крысы или мыши, и экспрессирует все из различных маркеров, обнаруженных в ГЭБ. Поэтому проницаемость ГЭБ в модели, имеющей происхождение от человеческих стволовых клеток, ниже, чем у ГЭБ, имеющего происхождение от клеток животных, и данная модель хорошо воспроизводит ГЭБ человека.
Векторы, такие как эписомные векторы oriP/EBNA1, кодирующие ОСТ4, SOX2, с-Мус, KLF4, NANOG и LIN28, вводили в клетки, имеющие происхождение от человеческой амниотической жидкости (AF-iPSC), и репрограммированные на iPSC. Полученные колонии обрабатывали KODMEM/F12, KOSR, glutamax, NEAA и бета-меркаптоэтанолом с получением клеток эндотелия в предифференцированном состоянии и затем обрабатывали бессывороточной дифференцировочной средой для эндотелия, 1% PDS и 20 нг/мл bFGF для дифференцировки с получением клеток эндотелия головного мозга. Забор клеток амниотической жидкости и подготовка ГЭБ-системы с использованием этих клеток были проведены Национальным научно-исследовательским советом. После подтверждения целостности системы по показателю сопротивления и показателю прохождения сахарозы антитело против IGF1R анализировали на предмет его способности к проникновению через ГЭБ в форме биспецифичного антитела в виде комбинации терапевтического антитела для лечения болезни Паркинсона с scFv-формой антитела против IGF1R. Анализируемые антитела представляли собой бивалентную форму клона 1564, моновалентную форму клона 1564, бивалентную форму клона F06 и бивалентную форму клона С04. В качестве отрицательного контроля использовали терапевтическое антитело 11F11 для лечения болезни Паркинсона. Антитела, прошедшие через ГЭБ-систему анализировали таким же образом, как в примере 20-1.
Результаты анализа показаны на фиг. 16с. Все проанализированные клоны продемонстрировали более высокую способность к проникновению через ГЭБ, чем группа отрицательного контроля. В частности, бивалентное F06 и бивалентное С04 продемонстрировали способность к проникновению через ГЭБ, до 15 раз выше, чем у одиночного антитела. Полученные результаты показывают, что антитела против IGF1R по настоящему изобретению эффективно проходят через ГЭБ-систему человеческого происхождения по сравнению с одиночным антителом.
Пример 21. Анализ способности антитела против IGF1R к проникновению через ГЭБ in vivo (анализ колокализации).
21-1. Колокализация минител с сосудами головного мозга.
Для подтверждения распределения антител против IGF1R по настоящему изобретению по сосудам головного мозга in vivo проводили следующий эксперимент.
Конкретно, PBS-буфер или 10 мг/кг контрольного IgG и минител клонов 996, 1226 и 1564, полученных в примере 14-1, вводили в хвостовую вену самцов мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель, соответственно. Через 4 часа проводили интракардиальную перфузию головного мозга мыши достаточным количеством 0,9% раствора NaCl и 4% параформальдегида. Выделяли фиксированный головной мозг, приготавливали срезы толщиной 20 мкм и проводили одновременное окрашивание антителом против мышиного CD31 как сосудистого маркера и антителом против человеческого Fc для подтверждения колокализации сосудов головного мозга и анализируемого IGF1R. Для визуализации CD31 и человеческого Fc под флуоресцентным микроскопом использовали вторичное антитело, конъюгированное с Alexa 488, для CD31, вторичное антитело, конъюгированное с Alexa 594, для человеческого Fc.
Результаты эксперимента показаны на фиг. 17а.
По результатам эксперимента было подтверждено, что антитела по настоящему изобретению, не блокирующие связывание с лигандом, обладали отличной способностью к проникновению через ГЭБ. В результате окрашивания тканей головного мозга сосудистыми маркерами (антитело против CD31, верхний ряд) и человеческими антителами (антитело против человеческого Fc, нижний ряд) методом анализа степени колокализации антитела с кровеносными сосудами головного мозга посредством иммунного окрашивания (Neuron (2016) Yu-Zuchero et al.) антитела по настоящему изобретению, не блокирующие связывание с лигандом, продемонстрировали более высокую степень колокализации, чем IgG контрольной группы.
21-2. Анализ способности биспецифичного антитела к проникновению через ГЭБ in vivo.
Была предпринята попытка подтвердить способность антитела против IGF1R по настоящему изобретению к проникновению через ГЭБ in vivo у нормальных крыс. PBS-буфер или 10 мг/кг контрольного IgG и терапевтическое антитело для лечения болезни Паркинсона (11F11) или бивалентное биспецифичное антитело (11F11-1564), содержащее клон 1564, связанный с терапевтическим антителом, вводили в хвостовую вену крыс SD, соответственно. Через 24 часа количество антител в СМЖ и головном мозге анализировали масс-спектрометрией. Масс-спектрометрию проводили тем же методом, что в примере 20-1.
Биспецифичное антитело, с которым был связан клон 1564, продемонстрировало более высокую способность к проникновению в СМЖ и головной мозг, чем терапевтическое антитело без антитела против IGF1R, и его эффективность была подтверждена как при дозе 10 мг/кг, так и при дозе 30 мг/кг. При
- 101 045348 дозе 30 мг/кг биспецифичное антитело продемонстрировало способность к проникновению в головной мозг, приблизительно до 4,5 раз превосходившую соответствующую способность одиночного антитела.
Клон 1564 получали в бивалентной форме и моновалентной форме согласно Примерам 14-2 и 14-4, и затем вводили в дозе 30 мг/кг или 60 мг/кг таким же образом, как описано выше, и через 24 часа анализировали количество антител в СМЖ и головном мозге. Эти два типа биспецифичных антител, связанных с клоном 1564, продемонстрировали более высокую способность к проникновению в СМЖ и головной мозг, чем одиночные антитела. В частности, бивалентная форма продемонстрировала способность к проникновению через ГЭБ в головной мозг, до 5 раз более высокую, чем моновалентная форма.
Результаты, представленные на фиг. 17b, демонстрируют, что клон 1564 повышает способность терапевтического антитела к проникновению через ГЭБ в организме даже при связывании с терапевтическим антителом в различных формах.
Ожидалось, что аффинные варианты клона 1564, полученные согласно примеру 2, будут улучшать ФК в сыворотке по сравнению с исходным клоном. Таким образом, ожидалось, что способность к проникновению через ГЭБ будет улучшена благодаря более продолжительному присутствию антитела в сыворотке и постоянному поддержанию входящего потока через ГЭБ. Через 0, 24 и 48 часов после внутривенного введения аффинных вариантов, полученных в бивалентной форме согласно примеру 14-2 или в моновалентной форме согласно примеру 14-4, крысам SD в дозе 30 мг/кг проводили забор крови из глазной вены. Анализируемые антитела разделяли на два эксперимента в соответствии с остовом терапевтического антитела. Биспецифичные антитела соответствующих вариантов, использованные в эксперименте, показаны в табл. 26 ниже.
Таблица 26
Биспецифические антитела, используемые для
in vivo анализа ГЭБ-п | роникающей способности |
Клоны с химерным остовом | Клоны с гуманизированным остовом |
Бивалентное Ch 11 fl 1 -15 64 | Бивалентное Hui Ifl l(ver.2)-1564 |
Моновалентное Chi Ifl 1-1564 | Бивалентное Hui Ifl l(ver.2)-VH5 |
Моновалентное Chi Ifl 1-С04 | Бивалентное Hui Ifl l(ver.2)-VH16 |
Бивалентное Chi Ifl 1-F06 | Бивалентное Hui Ifl l(ver.2)-VH35 |
Моновалентное Chi Ifl 1-FOf | Бивалентное Hui Ifl l(ver.2)-VH9 |
** | Бивалентное Hui Ifl l(ver.2)-VH2 |
** | Бивалентное Hui Ifl l(ver.2)-VH7 |
** | Бивалентное Hui Ifl l(ver.2)-VH32 |
Уровни антител в крови анализировали посредством ELISA. После сорбции козьего антитела против человеческого Fc на 96-луночный планшет, вносили подходящее количество разведенного образца и затем проводили выявление антителом против человеческого Fab, конъюгированного с HRP. Результаты анализа показаны на фиг. 17d.
В результате, в первой анализируемой группе моновалентная форма 1564, моновалентная форма F06 и моновалентная форма С04 продемонстрировали более продолжительную ФК в сыворотке, чем бивалентная форма исходного клона 1564. Во второй анализируемой группе бивалентные формы VH2, VH5, VH7, VH9, VH16 и VH32, за исключением VH35, продемонстрировали лучшую ФК в сыворотке по сравнению с бивалентной формой 1564.
Для анализа способности к проникновению через ГЭБ в этих группах через 48 часов у крыс проводили забор СМЖ и анализировали ее тем же методом ELISA. Результаты анализа показаны на фиг. 17е.
В первой анализируемой группе моновалентная форма 1564, моновалентная форма F06 и моновалентная форма С04, продемонстрировавшие лучшую ФК в сыворотке, продемонстрировали более высокие уровни антител в СМЖ по сравнению с бивалентной формой исходного 1564. Во второй анализируемой группе бивалентные формы VH2, VH5, VH7, VH9, VH16 и VH32, также продемонстрировавшие лучшую ФК в сыворотке, продемонстрировали более высокие уровни антител в СМЖ по сравнению с бивалентной формой исходного 1564. VH35 продемонстрировал менее продолжительную ФК в сыворотке и низкий уровень антитела в СМЖ по сравнению с бивалентной формой исходного 1564.
Результаты, представленные на фиг. 17d и 17е, показывают, что ФК в сыворотке является важным фактором для способности антитела к проникновению через ГЭБ благодаря непрерывному входящему потоку антитела через ГЭБ и что биспецифичные антитела, имеющие переносчик через ГЭБ и лучшую ФК в сыворотке, имеют более высокую способность к проникновению через ГЭБ. В частности, в случае моновалентной формы F06 с максимальным уровнем антитела в СМЖ ее способность к проникновению через ГЭБ была приблизительно в 5 раз выше, чем у бивалентной формы исходного 1564. В Примерах 18-2 и 18-3, поскольку способность бивалентного антитела 1564 к проникновению в СМЖ была прибли- 102 045348 зительно в 3 раза выше, чем у одиночного антитела, ожидалось, что способность моновалентной формы
F06 к проникновению через ГЭБ будет приблизительно до 15 раз выше, чем у одиночного антитела.
Пример 22. Дезамидирование антитела к IGF1R.
Реакция дезамидирования обозначает, например, атаку пептидной связи между двумя сторонами аспарагина с образованием симметричного сукцинимидного промежуточного продукта, который, в результате гидролиза, трансформируется в аспарагиновую кислоту или изоаспарагиновую кислоту. Поскольку реакция дезамидирования может влиять на непрерывную активность белка, проводили замену одних аминокислот легкой цепи и тяжелой цепи на другие аминокислоты для предотвращения дезамидирования и для обеспечения долгосрочной стабильности.
Для подтверждения сайта дезамидирования, определенного компьютерным анализом, антитело 1564 к IGF1R оставляли при 40°С и оценивали степень дезамидирования. В результате, было подтверждено, что от 4,6 до 47,3% реакций дезамидирования происходят в CDR2 и CDR3 легкой цепи и CDR2 тяжелой цепи, как показано на фиг. 18а. Для предотвращения дезамидирования проводили замену аминокислот в каждом сайте, как показано на фиг. 18b, и анализировали изменения способности к связыванию с белком IGF1R в зависимости от каждой аминокислотной замены. Отбирали мутанты, демонстрирующие такую же аффинность связывания, как 1564 дикого типа, и было подтверждено, что способность этих мутантов, имевших по 3 или 4 мутации, была такой же, как у 1564 дикого типа. Введение этих мутаций означает, что состав буфера и условия хранения позволяют длительное время поддерживать аффинность связывания и стабильную форму. Результаты анализа показаны в табл. 27.
Таблица 27
Экспериментальная классификация | Клон антитела | ECso (нМ) | Значение насыщения |
Первый | 1564(WT) | 2,15 | 1,1 |
N95aH | 2,63 | 1,08 | |
N95aR | 2,3 | 1,17 | |
N95aK | 2,07 | 1,18 | |
Второй | 1564(WT) | 2,66 | 0,977 |
N95aD | 2,07 | 0,896 | |
N54D | 2,89 | 0,933 | |
N54Q | 2,2 | 0,885 | |
Третий | 1564(WT) | 6,87 | 0,863 |
N51D | 7,35 | 0,932 |
Пример 23. Картирование эпитопов антител против IGF1R.
23-1. ELISA-анализ антитела против IGF1R, термически обработанного белка IGF1R и нативного белка IGF1R.
В данном примере была предпринята попытка определить какой эпитоп распознает антитело против IGF1R: линейный или конформационный. ELISA проводили с использованием бивалентных биспецифичных антител 1564, 48G5, 54Н4, 60Н6 и В11 и белка ECD нативного человеческого IGF1R или прогретого белка (термически обработанного IGF1R). ELISA проводили так же, как показано в примере 15. Результаты анализа показаны в табл. 28.
Таблица 28
Название клона | ECso (нМ) в отношении нативного IGF1R | ECso в отношении термически обработанного IGF1R (нМ) |
chllFll-1564 | 0,914 | N/A* |
chllFll-48G5 | 1,21 | N/A |
chllFll-54H4 | 2,88 | N/A |
chllFll-60H6 | 10 | N/A |
chllFll-Bll | 7,13 | 410 |
* N/A - Недоступно.
Клоны продемонстрировали связывание с белком ECD нативного человеческого IGF1R, сходное с отмеченным в примере 15, но не связывались с белком ECD термически обработанного человеческого IGF1R, третичная структура которого была разрушена нагреванием. Это означает, что антитело против IGF1R по настоящему изобретению связывается с конформационным эпитопом, но не с линейным эпитопом.
- 103 045348
23-2. Картирование эпитопов антитела против IGF1R.
Для анализа конформационного эпитопа клона 1564 проводили аланиновое сканирование, как описано ниже. Клетки OGFAR3, являющиеся линией клеток рака яичника с подтвержденной низкой экспрессией IGF1R, модифицировали для экспрессии библиотеки IGF1R, где с N-концом была слита метка eGFP, а С-концевой киназный домен был удален. Библиотека IGF1R содержит мутации, где остатки, расположенные на поверхности IGF1R, заменены аланином. Полученной библиотекой трансфицировали клетки OVCAR3. Клетки, в которых была определена экспрессия IGF1R, обрабатывали антителом 1564 и затем проводили их флуоресцентное мечение обработкой вторичным антителом, меченным DyLight650. Меченные клетки классифицировали по наличию или отсутствию экспрессии IGF1R, экспрессии IGF1R и наличию или отсутствию связывания с 1564 и проводили глубокое секвенирование РНК с применением методики IlluminaHiSeq для анализа частоты каждой аланиновой мутации в соответствующей группе клеток. Соответствующую частоту нормализовали по результату, полученному для клеток, экспрессировавших IGF1R дикого типа, и затем рассчитывали относительную частоту для отбора тех мутаций, число которых уменьшалось в группе клеток, меченных 1564. Исходя из этих наблюдений, было обнаружено, что эпитоп клона 1564 был расположен в домене FN2, а принадлежащие к нему остатки представляли собой Y775, Р776, F778, R650, S791 и L798. Полученные результаты и последовательности, распознаваемые клоном 1564, показаны на фиг. 19. С учетом отсутствия данных об участии этих остатков в связывании с IGF1 в опубликованной ранее литературе эти результаты правдоподобно описывают свойства клона 1564, использованного в примере 23-1.
Пример 24. Сравнение аффинности связывания одиночного антитела и биспецифичного антитела с антигеном.
24-1. Аффинность связывания одиночного антитела и биспецифичного антитела с антигеном альфасинуклеина.
Когда scFv-форма антитела к IGF1R была связана с антителом типа IgG к альфа-синуклеину, анализировали влияние такого связывания на аффинность связывания антитела к альфа-синуклеину.
Агрегаты альфа-синуклеина сорбировали на 96-луночный планшет в концентрации 1 мкг/мл на протяжении 18 часов и после промывки проводили обработку каждым антителом в 5-кратном разведении, начиная с 400 нМ. Связанные антитела связывали с антителом против человеческого Fc с HRP и затем проводили окрашивание раствором ТМВ, измеряя степень связывания антител.
Как показано на фиг. 20а, было подтверждено, что аффинность связывания одиночного антитела и биспецифичного антитела с агрегатами альфа-синуклеина была одинаковой.
24-2. Аффинность связывания одиночного антитела и биспецифичного антитела с антигеном IGF1R.
Для сравнения степени связывания одиночного антитела к альфа-синуклеину и биспецифичного антитела с антигеном IGF1R проводили эксперимент таким же образом, как в примере 22.
Как показано на фиг. 20b, было подтверждено хорошее зависимое от концентрации связывание биспецифичного антитела, имевшего scFv-форму антитела против IGF1R, однако одиночное антитело без области антитела к IGF1R не продемонстрировало связывания.
24-3. Анализ связывающей способности гуманизированного антитела к альфа-синуклеину.
Разницу в аффинности связывания биспецифичного химерного антитела и биспецифичного гуманизированного антитела анализировали, проводя эксперимент таким же образом, как в примере 24-1.
Как показано на фиг. 20с, биспецифичные гуманизированные антитела имели аффинность связывания с агрегатами альфа-синуклеина на уровне, сходном с биспецифичным химерным антителом, и было подтверждено, что моновалентное биспецифичное антитело с одним scFv к IGF1R также демонстрировало аффинность связывания на уровне, сходном с химерными антителами.
По результатам анализа аффинности связывания биспецифичного химерного антитела и биспецифичного гуманизированного антитела с IGF1R посредством проведения эксперимента таким же образом, как в примере 24-2, все биспецифичные антитела продемонстрировали одинаковую аффинность связывания, однако одиночное антитело без scFv к IGF1R не продемонстрировало связывания, как показано на фиг. 20d.
Эти результаты показывают, что при гуманизации антитела с заменой области мышиного антитела, действующей в организме человека как иммуноген, антитело имеет такую же активность без изменения аффинности связывания с агрегатами альфа-синуклеина и IGF1R.
24-4. Сравнение фагоцитоза при использовании одиночного антитела и биспецифичного антитела.
Фагоцитоз относится к активности по удалению внеклеточных веществ при участии различных рецепторов макрофагов. Различные белковые агрегаты индуцируют иммунный ответ или воспалительную реакцию, что оказывает неблагоприятное влияние на организм человека. В частности, известно, что при введении антитела для удаления агрегатов альфа-синуклеина он опосредован взаимодействием Fcобласти антитела и FcrR на поверхности клеток. По этой причине проводили сравнение фагоцитарной активности при использовании одиночного антитела и биспецифичного антитела, связанного с scFv к IGF1R.
Для сравнения фагоцитоза при использовании одиночного антитела и биспецифичного антитела использовали микроглиальные клетки BV-2 мышиного происхождения. Клетки BV-2 культивировали в
- 104 045348 среде RPMI1640, получали в концентрации 2x106 клеток/мл и вносили в количестве 100 мкл в 96луночные планшеты с U-образным дном. 10 мкг/мл агрегатов альфа-синуклеина и 25 мкг/мл антител разводили в среде RPMI1640, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 20 минут. Клетки BV-2 обрабатывали смесью агрегатов альфа-синуклеина и антител и оставляли на 15 минут. Агрегаты альфа-синуклеина удаляли из супернатанта центрифугированием при 1200 об/мин и проводили трехкратную промывку PBS-буфером (рН 2,5) для удаления агрегатов или антител, связанных с поверхностью клеток. Клетки фиксировали 4% параформальдегидом и промывали PBS-буфером. Для подтверждения фагоцитоза агрегатов и антител клетками добавляли 0,5% Triton Х-100 для разрушения клеточных мембран, проводили промывку PBS-буфером и обработку антителом против всех форм альфасинуклеина на протяжении 1 часа. Связанное антитело против всех форм альфа-синуклеина обрабатывали противокроличьим антителом с Alexa 488 на протяжении 1 часа и затем проникновение агрегатов в макрофагальные клетки подтверждали FACS-анализом.
Как показано на фиг. 20е, было подтверждено, что нормальный человеческий IgG не влиял на макрофаги, а при обработке антителом к альфа-синуклеину фагоцитоз агрегатов альфа-синуклеина был усилен. При сравнении одиночного антитела и биспецифичного антитела были подтверждены сходный уровень фагоцитоза и отсутствие влияния scFv-формы антитела к IGF1R, связанной с С-концом IgG, на активность антитела к альфа-синуклеину.
Пример 25. Оценка эффективности биспецифичного антитела.
В соответствии с примером 14-6 получали бивалентное биспецифичное антитело, содержащее химерное антитело 11F11 и scFv клона 1564, и полученное биспецифичное антитело и одиночное антитело к альфа-синуклеину анализировали на предмет их эффективности in vivo у трансгенных мышей, сверхэкспрессировавших человеческий альфа-синуклеин (mThy-1, человеческий α-синуклеин, Калифорнийский университет в Сан-Диего). 2,5 мг/кг одиночного антитела или человеческого IgG или то же молярное количество бивалентных биспецифичных антител вводили внутрибрюшинно один раз в неделю на протяжении 3 месяцев. Использовали по пять мышей на группу и в качестве контроля использовали нетрансгенных животных из того же помета. Затем проводили перфузию следующим образом.
По завершении последнего введения животных анестезировали хлоралгидратом в соответствии с требованиями по гуманному обращению с животными и затем проводили перфузию 0,9% физиологическим раствором для анализа патологических изменений в головном мозге. Затем одну половину (сагиттальный срез) перфузированного головного мозга хранили в 4% параформальдегиде (рН 7,4, 4°С) в фосфатном буфере до момента анализа, а другую половину сразу замораживали (-70°С).
Патоморфологический анализ проводили следующим образом. Из половины головного мозга, фиксированной в параформальдегиде, получали непрерывные срезы толщиной 40 мкм методом свободноплавающих срезов с использованием виброметра. Для подтверждения уровня экспрессии альфасинуклеина в головном мозге в каждой группе введения срезы, включавшие кору, гиппокамп и полосатое тело, инкубировали с антителами против альфа-синуклеина (антитело к р129 α-syn, маркер агрегатов, Abcam, ab59264, или антитела к полноразмерному альфа-синуклеину) при 4°С в течение ночи. Альтернативно, срезы анализировали на предмет GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок) (АВ5804, Millipore) для анализа степени активности астроцитов или инкубировали с антителом к IL-1 β (ab9722, Abcam) для анализа степени нейровоспаления, соответственно. Альтернативно, проводили обработку антителом против NeuN (Chemicon, #MAB377) для анализа степени гибели нейронов в гиппокампе. После инкубации с первичным антителом проводили обработку козьим антителом против кроличьего IgG, связанным с биотином (1:100, Vector Laboratories), и авидином D с пероксидазой хрена (1:200, ABC Elite, Vector Laboratories) и выявление диаминобензидином (DAB). Проводили микроскопию каждого иммуногистохимически окрашенного среза в светлом поле, измеряя оптическую плотность. Полученные результаты показаны на фиг. 21а-21е.
25-1. Анализ способности химерного антитела и биспецифичного антитела к уменьшению количества альфа-синуклеина.
На фиг. 21а показаны результаты окрашивания и оценки коры и гиппокампа в ткани головного мозга мышей с использованием антитела к р-129 α-syn после введения мышам антител для оценки способности химерного антитела 11F11 и бивалентного биспецифичного антитела, содержащего клон 1564 и химерное антитело 11F11, к устранению агрегатов альфа-синуклеина в модели на (трансгенных) мышах, сверхэкспрессирующих человеческий альфа-синуклеин. р-129 α-syn представляет собой форму, фосфорилированную по 129-му остатку, являясь маркером агрегатов, и представлен темно-коричневыми пятнами или агрегатами в окрашенной ткани.
Согласно фиг. 21а, группа введения IgG продемонстрировала более высокую степень окрашивания р-129 α-syn, чем нетрансгенная контрольная группа (# -однофакторный ANOVA, р \u003c0.01). В противоположность этому, в группе введения одиночных антител или биспецифичных антител степень окрашивания р-129 α-syn или агрегатов была существенно снижена. В частности, в гиппокампе степень этого снижения в группе введения биспецифичных антител была больше, чем в группе химерного антитела 11F11 (* - однофакторный ANOVA, р \u003c0.05). На фиг. 21b показаны результаты такого же экспери
- 105 045348 мента, как на фиг. 21а, за исключением окрашивания антителом к полноразмерному альфа-синуклеину в качестве маркера. Выявление всего альфа-синуклеина указывает на то, что антитело по настоящему изобретению обладает способностью к устранению альфа-синуклеина самого по себе и ингибировать его передачу от клетки к клетке. В других аспектах это можно также интерпретировать как ингибирование образования агрегатов из мономеров или удаление всех мономеров. Введение одиночных антител и биспецифичных антител уменьшает степень повышения человеческого альфа-синуклеина у трансгенных мышей по сравнению с группой введения IgG. В частности, в гиппокампе биспецифичные антитела были эффективнее одиночных антител.
Полученные результаты показывают, что химерное антитело 11F11 и биспецифичное антитело эффективно снижают уровни альфа-синуклеина и его агрегатов в моделях болезни Паркинсона на животных даже в низкой дозе 2,5 мг/кг. В частности, биспецифичное антитело превосходит одиночное антитело, позволяя предположить, что биспецифичное антитело может достигать головного мозга в большем количестве, чем одиночное антитело, и обеспечивать более эффективное лечение заболевания, благодаря большей способности к проникновению через ГЭБ. 25-2. Анализ способности химерного антитела и специфичного антитела к уменьшению астроглиоза и снижению уровня воспалительных цитокинов.
Глиоз является неспецифической реакцией, которая возникает в глиальных клетках в ответ на повреждение центральной нервной системы и запускается повреждением ГЭБ или такими веществами, как TGF-бета и интерлейкин. В типичных случаях он включает астроглиоз, и в качестве его маркера используют белок GFAP. Поэтому анализировали эффект уменьшения астроцитоза и высвобождения воспалительных цитокинов, запускающих астроцитоз, при введении химерного антитела 11F11 и биспецифичного антитела, содержащего клон 1564 и указанное химерное антитело. Результаты анализа показаны на фиг. 21с и 21d.
На фиг. 21с показаны результаты окрашивания и оценки ткани головного мозга мышей с использованием GFAP (астроглиоз) в качестве маркера после введения антител для оценки способности химерного антитела 11F11 и биспецифичного антитела, содержащего клон 1564 и указанное химерное антитело, полученных в одном примере настоящего изобретения, к уменьшению астроглиоза in vivo. Одиночное антитело и биспецифичное антитело ингибировали астроглиоз по сравнению с контрольной группой IgG. В частности, было подтверждено, что в полосатом теле эффективность биспецифичного антитела была выше эффективности одиночного антитела.
На фиг. 21d показаны результаты окрашивания и оценки ткани головного мозга мышей с использованием антитела к IL-1-бета в качестве маркера после введения антител для оценки способности химерного антитела 11F11 и биспецифичного антитела, содержащего клон 1564 и указанное химерное антитело, полученных в одном примере настоящего изобретения, к снижению воспалительных цитокинов in vivo. IL-1-бета вызывает воспаление, приводя к гибели и воспалительному ответу различных нейронов. В гиппокампе крыс, которым вводили антитела по настоящему изобретению, IL-1-бета был снижен в группах введения одиночных антител и биспецифичных антител по сравнению с контрольной группой IgG, и, в частности, у биспецифичного антитела способность к такому снижению была значительно выше, чем у одиночного антитела (##- однофакторный ANOVA, р \u003c0.005; * - однофакторный ANOVA, р \u003c0.05).
Как показано в графических материалах, было продемонстрировано, что антитело по настоящему изобретению уменьшает астроглиоз и высвобождение воспалительного цитокина IL-1-бета, запускающего астроглиоз, по сравнению с контролем.
25-3. Анализ способности химерного антитела и биспецифичного антитела к уменьшению нейродегенерации.
В опубликованной ранее литературе подтверждено, что гибель клеток головного мозга происходит из-за нейротоксичности и воспалительного ответа на альфа-синуклеин. Анализировали способность одиночных антител и биспецифичных антител по настоящему изобретению к ингибированию гибели клеток головного мозга, вызванной альфа-синуклеином, in vivo.
В результате окрашивания NeuN, являющимся маркером нейронов коры и гиппокампа, было обнаружено, что как одиночное антитело, так и биспецифичное антитело снижали степень гибели клеток головного мозга по сравнению с контрольной группой IgG. В частности, было подтверждено, что в коре биспецифичное антитело обладало большей способностью к ингибированию гибели клеток головного мозга, чем одиночное антитело. Полученные результаты показаны на фиг. 21е.
Пример 26. Увеличение периода полувыведения конструированием Fc и повышение способности к проникновению через ГЭБ благодаря увеличенному периоду полувыведения.
FcRn является важным рецептором на мембране клеток, который увеличивает период полувыведения, улавливая и направляя антитело внутрь клеток, ингибируя распад антитела, происходящий во время его циркуляции в кровеносных сосудах. Способность к проникновению через ГЭБ также важна для трансцитозной активности антитела, но хорошо известно, что трансцитозная активность антитела важна при его способности к проникновению через ГЭБ, однако антитела проходят через ГЭБ в зависимости от концентрации антител в кровеносных сосудах. По этой причине для увеличения периода полувыведения биспецифичного антитела получали биспецифичные антитела, повышая аффинность связывания с FcRn
- 106 -
Claims (2)
- заменой метионина (Met) на лейцин (Leu) в 428-м аминокислотном положении Fc-области. В результате сравнения периода полувыведения при введении биспецифичного антитела дикого типа и биспецифичного антитела M428L в концентрации 10 мг/кг трансгенным мышам, экспрессировавшим человеческий FcRn, было подтверждено увеличение периода полувыведения приблизительно на 50%, как показано на фиг. 22. Для подтверждения увеличения периода полувыведения анализировали ФК-профили при введении биспецифичного антитела дикого типа, бивалентного биспецифичного антитела M428L и моновалентного биспецифичного антитела M428L обезьянам. В случае биспецифичного антитела дикого типа, как показано на фиг. 22а, его концентрация в крови быстро снижалась после 168 часов, в то время как биспецифичные антитела M428L с высокой аффинностью связывания с FcRn сохраняли более высокую концентрацию в крови по сравнению с диким типом. Было подтверждено, что у биспецифичного антитела M428L период полувыведения был приблизительно на 1,5 суток больше, чем у биспецифичного антитела дикого типа. В частности, применительно к клиренсу, наилучший клиренс имело моновалентное биспецифичное антитело M428L, а биспецифичное антитело дикого типа продемонстрировало самый быстрый клиренс (фиг. 22b).Для подтверждения улучшенного прохождения через ГЭБ благодаря эффекту увеличения периода полувыведения через 24 часа после введения антител проводили забор СМЖ и анализировали количество антител в СМЖ. После сорбции 100 нг/мл IGF1R в охлажденном состоянии на протяжении 18 часов вносили СМЖ, выявляя антитела, связывавшиеся с IGF1R. Как видно на фиг. 22с, были подтверждены прохождение большого количества биспецифичных антител, присутствовавших в большом количестве в крови, через ГЭБ и отличная способность моновалентного биспецифичного антитела M428L к проникновению через ГЭБ, более высокая по сравнению с бивалентным биспецифичным антителом M428L.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Биспецифичное антитело против a-syn/против IGF1R, содержащее:а) антитело против альфа-синуклеина (α-syn) или его антигенсвязывающий фрагмент иб) антитело против IGF1R или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее:1) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область (CDR) 1 тяжелой цепи (H-CDR1), содержащую SEQ ID NO:1,H-CDR2, содержащую SEQ ID NO:13, иH-CDR3, содержащую SEQ ID NO:52, и
- 2) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1 легкой цепи (L-CDR1), содержащую SEQ ID NO:98,L-CDR2, содержащую SEQ ID NO:117, иL-CDR3, содержащую SEQ ID NO:152.2. Биспецифичное антитело по п.1, где:а) VH антитела против IGF1R или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (H-FR1) 1, содержащую SEQ ID NO:81, H-FR2, содержащую SEQ ID NO:86, H-FR3, содержащую SEQ ID NO:88, иH-FR4, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:92, илиб) VL антитела против IGF1R или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (L-FR) 1, содержащую SEQ ID NO:162, L-FR2, содержащую SEQ ID NO:165, L-FR3, содержащую SEQ ID NO:166, иL-FR4, содержащую SEQ ID NO:170.3. Биспецифичное антитело по п.1, где VH и VL антитела против IGF1R или его антигенсвязывающего фрагмента содержат SEQ ID NO:222 и 341 соответственно.4. Биспецифичное антитело против a-syn/против IGF1R, содержащее:а) антитело против альфа-синуклеина (a-syn) или его антигенсвязывающий фрагмент иб) антитело против IGF1R или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий:1) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область (CDR) 1 тяжелой цепи (H-CDR1), содержащую SEQ ID NO:1,H-CDR2, содержащую SEQ ID NO:12, иH-CDR3, содержащую SEQ ID NO:52, и2) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1 легкой цепи (L-CDR1), содержащую SEQ ID nO:98, L-CDR2, содержащую SEQ ID NO:116, иL-CDR3, содержащую SEQ ID NO:135.- 107 0453485. Биспецифичное антитело по п.4, где:а) VH антитела против IGF1R или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (H-FR) 1, содержащую SEQ ID NO:81,H-FR2, содержащую SEQ ID NO:86,H-FR3, содержащую SEQ ID NO:88, иH-FR4, содержащую SEQ ID NO:92, илиб) VL антитела против IGF1R или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (L-FR) 1, содержащую SEQ ID NO:162,L-FR2, содержащую SEQ ID NO:165,L-FR3, содержащую SEQ ID NO:167, иL-FR4, содержащую SEQ ID NO:170.6. Биспецифичное антитело по п.4, где VH и VL антитела против IGF1R или его антигенсвязывающего фрагмента содержат SEQ ID NO:177 и 296 соответственно.7. Биспецифичное антитело против a-syn/против IGF1R, содержащее:а) антитело против альфа-синуклеина (α-syn) или его антигенсвязывающий фрагмент иб) антитело против IGF1R или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий:1) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область (CDR) 1 тяжелой цепи (H-CDR1), содержащую SEQ ID NO:1,H-CDR2, содержащую SEQ ID NO:12, иH-CDR3, содержащую SEQ ID NO:52, и2) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1 легкой цепи (L-CDR1), содержащую SEQ ID nO:98, L-CDR2, содержащую SEQ ID NO:116, иL-CDR3, содержащую SEQ ID NO:151.8. Биспецифичное антитело по п.7, где:а) VH антитела против IGF1R или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (H-FR) 1, содержащую SEQ ID NO:81,H-FR2, содержащую SEQ ID NO:86,H-FR3, расположенную между H-CDR2 и H-CDR3, содержащую SEQ ID NO:88, иH-FR4, содержащую SEQ ID NO:92, илиб) VL антитела против IGF1R или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (L-FR) 1, содержащую SEQ ID NO:162,L-FR2, содержащую SEQ ID NO:165,L-FR3, содержащую SEQ ID NO:167, иL-FR4, содержащую SEQ ID NO:170.9. Биспецифичное антитело по п.7, где VH и VL антитела против IGF1R или его антигенсвязывающего фрагмента содержат SEQ ID NO:219 и 338 соответственно.10. Биспецифичное антитело по любому из пп.1-9, где антитело против IGF1R или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связываются с белком IGF1R млекопитающих, включая IGF1R человека, IGF1R обезьяны, IGF1R крысы и IGF1R мыши.11. Биспецифичное антитело по любому из пп.1-10, где сайт связывания антитела против IGF1R или его антигенсвязывающего фрагмента содержит по меньшей мере одно из V397, W434, D435, Y460, С488, L641, R650, Y775, Р776, F778, Е779, S791, L798, Н808, Е809 и L813 в белке, содержащем SEQ ID NO:410.12. Биспецифичное антитело по п.11, где антитело против IGF1R или его антигенсвязывающий фрагмент связываются по меньшей мере с одним сайтом связывания, выбранным из сайтов связывания 1-3 в белке, содержащем SEQ ID NO:410, где сайт связывания 1 содержит по меньшей мере одно из R650, Y775, Р776, F778, Е779, S791 и L798, сайт связывания 2 содержит по меньшей мере одно из L641, Н808, Е809 и L813, и сайт связывания 3 содержит по меньшей мере одно из V397, W434, D435, Y460 и С488.13. Биспецифичное антитело по любому из пп.1-12, где антигенсвязывающий фрагмент антитела против IGF1R представляет собой scFv.14. Биспецифичное антитело по п.13, содержащее scFv против IGF1R, содержащий, от N-конца к С-концу, SEQ ID NO:341, SEQ ID NO:411 и SEQ ID NO:222.15. Биспецифичное антитело по любому из пп.1-14, где антитело против α-syn или его антигенсвязывающий фрагмент содержитH-CDR1, содержащую SEQ ID NO:434,H-CDR2, содержащую SEQ ID NO:435 или 436,H-CDR3, содержащую SEQ ID NO:438,L-CDR1, содержащую SEQ ID NO:443,L-CDR2, содержащую SEQ ID NO:444, и- 108 -
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2017-0172205 | 2017-12-14 | ||
US62/693,474 | 2018-07-03 | ||
US62/734,388 | 2018-09-21 | ||
US62/734,391 | 2018-09-21 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA045348B1 true EA045348B1 (ru) | 2023-11-17 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2018370279B2 (en) | Antibodies to a-synuclein and uses thereof | |
US20240101687A1 (en) | Bispecific Antibody to A-Syn/IGF1R and Use Thereof | |
CA2921639A1 (en) | Cd70-binding peptides and method, process and use relating thereto | |
TWI821699B (zh) | 抗b7h4抗體及其雙抗和應用 | |
US20230357412A1 (en) | Bispecific antibody against alpha-syn/igf1r and use thereof | |
EA045348B1 (ru) | БИСПЕЦИФИЧНОЕ АНТИТЕЛО К α-SYN/IGF1R И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ |