TWI748954B

TWI748954B - Ｔａｕ結合抗體

Info

Publication number: TWI748954B
Application number: TW105121454A
Authority: TW
Inventors: 凱芮路易斯泰森; 泰倫斯西瓦德貝克; 科威樂喬治馬瑞德; 派翠克多尼; 大衛艾德華歐莫德奈特; 珍菲利普柯瑞德
Original assignee: 比利時商Ｕｃｂ生物製藥公司
Priority date: 2015-07-06
Filing date: 2016-07-06
Publication date: 2021-12-11
Also published as: IL256687A; IL256687B; CA2991264C; US20190375829A1; US11746145B2; ZA201708128B; CL2018000042A1; US20230331833A1; CN107849105A; AU2016289753C1; EP3319984A1; ECSP18000844A; MX2017015908A; CN107849105B; EA036821B1; TN2017000543A1; AU2016289753A1; PH12017502180A1; JP2018519833A; US10344081B2

Abstract

本發明係關於Tau結合抗體及其結合片段。

Description

TAU結合抗體

本發明尤其係關於治療性及診斷性Tau結合抗體及其結合片段、製備此類抗體之方法以及其用於治療及/或診斷Tau蛋白病的用途，諸如阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)；肌肉萎縮性側索硬化/巴金森氏症(parkinsonism)-癡呆綜合症；嗜銀顆粒疾病；慢性創傷性腦病變；皮質基底核退化症；彌漫性神經原纖維纏結伴鈣化；唐氏症候群(Down syndrome)；英國家族性癡呆症；丹麥家族性癡呆症；與MAPT突變所產生之染色體17關聯的額顳葉型癡呆症及巴金森氏症；格斯曼-斯陶思勒-謝恩克爾疾病(Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease)；瓜德羅普島巴金森氏症(Guadeloupean parkinsonism)；肌緊張性營養不良；神經退化伴腦鐵積聚；C型尼曼-匹克疾病(Niemann-Pick disease)；非關島運動神經元疾病(Non-Guamanian motor neuron disease)伴神經原纖維纏結；匹克疾病；腦炎後巴金森氏症；朊病毒蛋白質大腦澱粉樣蛋白血管病變；漸進性皮層下神經膠樣變性；進行性核上麻痺；SLC9A6相關智力遲鈍；亞急性硬化性全腦炎；唯纏結型癡呆症；出現球狀神經膠質包裹體的白質Tau蛋白病(Clavaguera等人，Brain Pathology 23(2013)342-349)。本發明亦關於治療罹患或懷疑易患上述Tau蛋白病(特定言之，諸如阿茲海默氏病及進行性核上麻痺之Tau蛋白病)之人類個體的方法。

阿茲海默氏病(AD)及漸進性核上麻痺(PSP)為醫學需要未得到高度滿足、對於社會健康系統而言成本較高且對所影響家庭之負擔較重的神經退化性疾病。AD臨床症狀包括記憶、認知、推理、判斷及情感穩定性的降低以及最終死亡。PSP包括嚴重及漸進性步態控制及平衡問題、摔倒、垂直眼球運動障礙、認知問題、抑鬱症、無表情及輕度癡呆症。後期症狀包括視力模糊、眼球運動不可控、言語不清、吞咽困難及死亡。

對於超過十年的AD疾病而言，改良規劃已經由各種機制靶向澱粉樣蛋白-β肽。相比之下，解決細胞內Tau病理學(AD之第二大標誌)的進展小得多。含有過磷酸化Tau聚集物的神經原纖維包裹體或纏結界定AD病理學特徵及其他Tau蛋白病種數，包括PSP。

在此等疾病中，症狀進展與神經內Tau聚集物含量及分佈之間存在強相關性。AD神經元Tau纏結首先出現於經內嗅皮層中，自經內嗅皮層散佈至海馬體及新皮層中。AD神經元中所觀測到的纏結係由過磷酸化的不溶性Tau聚集物組成。已提出病理性Tau物質的直接毒性作用及/或軸突傳輸損失(由於功能Tau螯合成過磷酸化之聚集形式，其不再能夠支持軸突傳輸)導致疾病。

Tau在其非病理性狀態下為高度可溶性細胞質微管結合蛋白，由於替代性拼接，因此其以長度範圍為352至441個胺基酸的6種主要同功異型物出現於人類中樞神經系統(CNS)中。此等同功異型物可具有零、一或二個N端插入序列(0N、1N、2N)，及三或四個C端「重複」序列(3R或4R)。此等30至32個胺基酸C端重複序列R1、R2、R3及R4一起構成Tau微管結合區(MTBR)。實際上，Tau的主要作用咸信為組裝及穩定化軸突微管。微管形成用於軸突傳輸之軌道及用於細胞生長之細胞骨架元件(Clavaguera等人，Brain Pathology 23(2013)342-349)。三種Tau同功異型物已證明含有三個微管結合區(MTBR)： - 同功異型物4，亦稱為3R0N，NCBI參考序列NP_058525.1(352個胺基酸)，- 同功異型物7，亦稱為3R1N，NCBI參考序列NP_001190180.1(381個胺基酸)- 同功異型物8，亦稱為3R2N，NCBI參考序列NP_001190181.1(410個胺基酸)。

而其他三種Tau同功異型物含有四個MTBR：- 同功異型物2，亦稱為4R2N，NCBI參考序列NP_005901.2(441個胺基酸)，- 同功異型物3，亦稱為4R0N，NCBI參考序列NP_058518.1(383個胺基酸)，及- 同功異型物5，亦稱為4R1N，NCBI參考序列NP_001116539.1(412個胺基酸)。

Tau含有85個潛在絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及酪胺酸(Y)磷酸化位點。在Tau之脯胺酸富集域(側接微管結合域)中發現Tau上之許多磷酸化殘基。所有六種Tau同功異型物均存在於人類正常成熟腦中，且在此階段，Tau磷酸化相對而言減少(Noble等人，2013 Front Neurol.2013；4：83)。在各種Tau蛋白病中，病理性病變中的沈積Tau總是高度磷酸化。磷酸化絲胺酸202及磷酸化蘇胺酸205已在得自PSP及AD患者之腦樣品及腦脊髓液的Tau聚集物中偵測到(Buée等人，Brain Research Reviews 33(2000)95-130；Wray等人，J Neurochem.2008年6月1日；105(6)：2343-52；Hanger等人，J Biol Chem.2007年8月10日；282(32)：23645-54；Maccioni等人，Neurobiol Aging.2006 Feb；27(2)：237-44)。

當前可用於此等疾病的唯一對症療法功效輕微或無功效。當前不存在可用於減緩或理想地中止疾病發展的療法。因此，此項技術中仍需要適用於治療Tau蛋白病的新穎化合物及組合物。

本發明之一目標尤其為提供用於治療或診斷Tau蛋白病(諸如阿茲海默氏病(AD)或進行性核上麻痺(PSP))的藥劑。另外，本發明之一目標尤其為提供治療或診斷Tau蛋白病(諸如阿茲海默氏病(AD)或進行性核上麻痺(PSP))的方法。

此等及其他目標(由隨之而來的下文描述，其將變得顯而易見)係藉由獨立請求項之標的物達到。本發明所涵蓋之一些特定態樣及其實施例形成附屬請求項之標的物。本發明所涵蓋之其他態樣及其實施例可自接下來的描述獲得。

在第一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含：輕鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：1或與其至少90%一致之序列的CDR1、選自SEQ ID No.：2或與其至少90%一致之序列的CDR2及選自SEQ ID No.：3或與其至少90%一致之序列的CDR3；及/或重鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：4或與其至少90%一致之序列的CDR1、選自SEQ ID No.：5或與其至少90%一致之序列的CDR2及選自SEQ ID No.：6或與其至少90%一致之序列的CDR3。

在第二態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含：輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：7或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID No.：8或與其至少80%一致之序列。

在第三態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含：輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：9或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID No.：10或與其至少80%一致之序列。

在第四態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含：輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：13或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID No.：16或與其至少80%一致之序列。

在第五態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至包含SEQ ID NO：55之胺基酸197至206的磷酸化Tau片段。

作為第一及第五態樣之一個實施例，本發明提供的抗體或其結合片段可為嵌合、人類化或完全人類抗體或其結合片段。

作為第二或第三態樣之一個實施例，本發明提供的抗體或其結合片段可為嵌合抗體或其結合片段。

作為第四態樣之一個實施例，本發明提供的抗體或其結合片段可為人類化抗體或其結合片段。

在第六態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與第一至第四態樣及其實施例中之任一者的Tau結合抗體或其結合片段競爭結合至Tau。

在第七態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與第一至第五態樣及其實施例中任一者之Tau結合抗體或其結合片段結合至大體上相同的Tau抗原決定基。

作為第六及第七態樣之一個實施例，本發明提供的單株抗體或其結合片段為人類化抗體或其結合片段。

第一至第七態樣及其實施例的抗體及其結合片段能夠結合至人類Tau的可溶形式、人類Tau的成對螺旋狀纖絲(paired helical filaments；PHF)，或結合至人類Tau之可溶形式與人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)，其包含SEQ ID NO：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域。

在第八態樣中，本發明提供包含核酸序列(諸如編碼第一至第七態樣及其實施例之抗體或結合片段之重鏈及/或輕鏈的DNA序列)的核酸分子。

在第九態樣中，本發明提供包含此等前述核酸分子的選殖或表現載體。

在第十態樣中，本發明提供包含此等前述核酸分子、選殖載體或表現載體的宿主細胞。

在第十一態樣中，本發明提供製造第一至第七態樣及其實施例之抗體及其結合片段的方法。

本發明之第十二態樣係關於第一至第七態樣及其實施例之抗體及其結合片段用於治療Tau蛋白病(特定而言，諸如AD及PSP)的用途。

本發明之另一態樣係關於第一至第七態樣及其實施例之抗體及其結合片段用於診斷Tau蛋白病(特定而言，諸如AD及PSP)的用途。

圖1：在實驗2.3之ELISA分析中，具有SEQ ID No.：7之兔VL序列(VL_AB1)及SEQ ID No.：8之兔VH序列(VH_AB1)的AB1對生物素化T197肽的結合相對於對生物素化肽T174、T211、T230及T396的結合。

圖2：圖說明實驗3.1之細胞聚集分析。

圖3：在使用自人類PSP患者回收之人類Tau病理性原纖維(PSP-PHF8)作為晶種的細胞Tau聚集分析中，具有SEQ ID No.：17之輕鏈及SEQ ID No.：20之重鏈之Tau結合抗體(A)及具有SEQ ID No.：17之輕鏈及SEQ ID No.：21之重鏈之Tau結合抗體(B)或陰性對照IgG4抗體A33(C)的功效。

圖4：西方墨點，其顯示具有SEQ ID No.：9之輕鏈及SEQ ID No.：10之重鏈之Tau結合抗體AB1針對得自人類AD或PSP之含Tau溶胞物的結合特性。

圖5：A)描繪SEQ ID No.：7之AB1之供體VL(VL_AB1)，其中CDR 1(SEQ ID No.：1)、CDR 2(SEQ ID No.：2)及CDR 3(SEQ ID No.：53)加有下劃線。B)描繪SEQ ID No.：44之人類受體區域IGKV1-39之VL序列，其中受體CDR 1、CDR 2及CDR 3加有下劃線。C)描繪SEQ No.：11之CDR移植序列gVL4_AB1，其中CDR 1(SEQ ID No.：1)、CDR 2(SEQ ID No.：2)及CDR 3(SEQ ID No.：53)加有下劃線。D)描繪SEQ No.：12之CDR移植序列gVL9_AB1，其中CDR 1(SEQ ID No.：1)、CDR 2(SEQ ID No.：2)及CDR 3(SEQ ID No.：54)加有下劃線；相較於VL_AB1，CDR3包含A91突變。

圖6：A)描繪SEQ ID No.：8之AB1之供體VH(VH_AB1)，其中CDR 1(SEQ ID No.：4)、CDR 2(SEQ ID No.：5)及CDR 3(SEQ ID No.：48)加有下劃線。B)描繪SEQ ID No.：45之人類受體區域IGHV4-39之VH序列，其中受體CDR 1、CDR 2及CDR 3加有下劃線。C)描繪SEQ No.：14之CDR移植序列gVH41_AB1，其中CDR 1(SEQ ID No.：4)、CDR 2(SEQ ID No.：5)及CDR 3(SEQ ID No.：49)加有下劃線。供體殘基係以斜體及粗體顯示：K71及V78。構架中的突變突出顯示(E1)。相較於VH_AB1，CDR3包含N100Q取代。D)描繪SEQ No.：15之CDR移植序列gVH49_AB1，其中CDR 1(SEQ ID No.：4)、CDR 2 (SEQ ID No.：5)及CDR 3(SEQ ID No.：50)加有下劃線。供體殘基係以斜體及粗體顯示(K71及V78)。構架中的突變突出顯示(E1)。相較於VH_AB1，CDR3包含N100A取代。

圖7：在使用自人類AD患者回收之人類Tau病理性原纖維作為晶種的細胞Tau聚集分析中，具有SEQ ID No.：9之輕鏈及SEQ ID No.：10之重鏈之Tau結合抗體，及文獻中所述之結合至包含SEQ ID NO：55之磷酸化殘基202及205之抗原決定基的Tau結合抗體AT8，或陰性對照抗體101.4的功效。

圖8：在使用自人類AD患者或人類PSP患者或人類FTD患者回收之人類Tau病理性原纖維作為晶種的細胞Tau聚集分析中，具有SEQ ID NO：17之輕鏈及SEQ ID NO：20之重鏈之Tau結合抗體的功效。

下文說明性描述之本發明可在本文未特定揭示之任一元件或多個元件、限制或多個限制缺乏之情況下適合地實施。

本發明將根據特定態樣及其實施例且參照某些圖式及實例來描述，但本發明不受其限制。

除非另外指明，否則技術術語係根據其常見含義使用。若向某些術語賦予特定含義，則下文在使用術語的上下文中提供術語定義。

若本發明說明書及申請專利範圍中使用術語「包含」，其不排除其他元件。出於本發明之目的，術語「由……組成(consisting of)」視為術語「包含(comprising of)」之較佳實施例。若下文中將群組定義為包含至少一定數目個實施例，則此亦理解為揭示較佳僅由此等實施例組成之群組。

出於本發明之目的，術語「獲得」視為術語「可獲得」之較佳實施例。若在下文中，例如抗體定義為可獲自特定來源，則此亦應理解為揭示抗體獲自此來源。

當提及單數名詞時，若使用不定冠詞或定冠詞，例如「一(a)」、「一(an)」或「該(the)」，則此包括複數個該名詞，除非具體陳述某物。術語「約」或「大約」表示熟習此項技術者理解仍確保相關特性之技術效果的準確度區間。該術語通常指示相對於指定數值偏離±10%，且較佳偏離±5%。

應瞭解，任何提及Tau結合抗體或其結合片段作為各種態樣之較佳實施例均涵蓋單株Tau結合抗體或其結合片段。

在各種態樣中，本發明提及包含相應輕鏈及/或重鏈區域之CDR及可變區的抗體及其結合片段。僅包含輕鏈可變區或重鏈可變區的抗體或其結合片段可適用於例如製造方法，或適用於例如篩選可有效地與相應其他可變區締合的可變區。然而，應瞭解，每當提及包含相應輕鏈及/或重鏈區域之CDR及可變區的抗體及其結合片段時，其總是考慮為包含相應輕鏈及重鏈區域之CDR及可變區的較佳實施例抗體及其結合片段。

如本文所用，術語「治療(treatment)」、「治療(treating)」及其類似術語係指獲得所要的藥理學及/或生理學效果。該效果就完全或部分預防疾病或其症狀而言可具預防性，且/或就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不良影響而言可具治療性。因此療法涵蓋哺乳動物、尤其人類之疾病的任何療法，且包括：(a)預防可能易患該疾病、但尚未診斷出患有該疾病之個體中出現該疾病；(b)抑制該疾病，亦即阻滯其發展；以及(c)緩解該疾病，亦即促使該疾病消退。

將Tau結合抗體或其結合片段稱為「治療活性劑」係指Tau結合抗體或其結合片段用於治療疾病的用途。

「治療有效量」係指Tau結合抗體或其結合片段的量，當投與哺乳動物或其他個體用於治療疾病時，該量足以對該疾病實施此類治療。治療有效量將視以下而變：Tau結合抗體或其結合片段、疾病及其嚴重度以及待治療個體的年齡、體重等。

將Tau結合抗體或其結合片段稱為「診斷活性劑」係指Tau結合抗體或其結合片段用於診斷疾病的用途。

「診斷有效量」係指Tau結合抗體或其結合片段的量，當用於對生物樣品進行診斷測試時，該量足以允許鑑別疾病或作為監測治療性干預之功效的手段來監測疾病組織之量。

本申請案部分地基於結合人類Tau之抗體(名稱為AB1)的鑑別。如本領域中所慣用，本文中的Tau殘基編號係指SEQ ID No.：55之Tau同功異型物2(NCBI參考序列：NP_005901.2)。如下文中所展示，AB1自免疫兔中分離且識別SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域。

實例確立，AB1能夠結合至人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)(參見實例2.4)且AB1能夠偵測人類樣品冷凍切片中之神經元內神經原纖維纏結(NFT)、神經元外NFT、神經炎斑樣結構及神經纖維網絲(參見實例3.2)。假定此行為至少部分地由AB1之輕鏈可變區(VL)及重鏈可變區(VH)中之互補決定區(CDR)介導似乎為合理的。

針對此背景，本發明提供包含AB1之VL區域之CDR或特異性決定殘基(SEQ ID No.：7)及/或AB1之VH區域之CDR(SEQ ID No.：8)的Tau結合抗體或其結合片段。

抗體可變域中之殘基習知地根據Kabat等人所設計的系統編號。此系統闡述於Kabat等人，1987,Sequences of Proteins of Immunological Interest，美國健康及人類服務部(US Department of Health and Human Services),NIH,USA(下文稱「Kabat等人(同上)」。本說明書中使用此編號系統，除非其中另有說明。

Kabat殘基名稱不總是直接與胺基酸殘基之線性編號對應。對應於基本可變域結構的縮短或插入結構組分、是否為構架或互補決定區 (CDR)，實際線性胺基酸序列含有的胺基酸可比嚴格Kabat編號少或含有其他胺基酸。就指定抗體而言，可藉由將抗體序列中之同源殘基與「標準」Kabat編號序列比對來確定殘基之正確Kabat編號。然而，根據Chothia(Chothia,C.及Lesk,A.M.J.Mol.Biol.,196,901-917(1987))，等效於CDR-H1的環自殘基26延伸至殘基32。

因此鑑別出AB1之VL中的CDR1、CDR2及CDR3分別對應於SEQ ID NO.：1、2及53。因此鑑別出AB1之VH中的CDR1、CDR2及CDR3分別對應於SEQ ID NO.：4、5及48。熟習此項技術者可容易測試胺基酸取代、添加及/或缺失對CDR的影響，例如藉由使用實例中所述的方法來測試。在VH之最初鑑別之CDR3(CDRH3)(亦即SEQ ID No.：48)中，鑑別例如潛在的天冬醯胺去醯胺化位點且藉由麩醯胺酸、丙胺酸、天冬胺酸或絲胺酸置換天冬醯胺殘基來修飾。CDRH3由此分別產生序列SEQ ID No.：49、50、51及52。為了簡潔起見，將CDRH3之三個序列(亦即SEQ ID NO.：48、49、50、51及52)組合為SEQ ID No.：6。類似地，在VL之CDR3(CDRL3)中，鑑別除潛在的麩醯胺酸去醯胺化位點且藉由丙胺酸置換鄰接甘胺酸來修飾。由此產生序列SEQ ID NO：54。為了簡潔起見，將CDRL3之兩個序列(亦即SEQ ID NO：53及54)組合為SEQ ID NO：3。

應瞭解，可進一步修飾CDR，諸如取代、添加及/或缺失，而不會實質性改變例如結合特性(相較於AB1)。此主要可藉由例如用相似胺基酸置換CDR中之胺基酸來達成。如本文所用，「相似性」表示在所比對序列中的任何特定位置，胺基酸殘基的類型在序列之間相似。舉例而言，可用白胺酸取代異白胺酸或纈胺酸。彼此間通常可取代之其他胺基酸包括(但不限於)：- 苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸(具有芳族側鏈之胺基酸)；- 離胺酸、精胺酸及組胺酸(具有鹼性側鏈之胺基酸)； - 天冬胺酸鹽及麩胺酸鹽(具有酸性側鏈之胺基酸)；- 天冬醯胺及麩醯胺酸(具有醯胺側鏈之胺基酸)；以及- 半胱胺酸及甲硫胺酸(具有含硫側鏈之胺基酸)。

針對此背景，本發明在一個態樣中提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含：輕鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：1或與其至少90%一致之序列的CDR1、選自SEQ ID No.：2或與其至少90%一致之序列的CDR2及選自SEQ ID No.：3或與其至少90%一致之序列的CDR3；及/或重鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：4或與其至少90%一致之序列的CDR1、選自SEQ ID No.：5或與其至少90%一致之序列的CDR2及/或選自SEQ ID No.：6或與其至少90%一致之序列的CDR3。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含：輕鏈，其包含選自SEQ ID No.：1或與其至少90%一致之序列的CDR1、選自SEQ ID No.：2或與其至少90%一致之序列的CDR2及選自SEQ ID No.：3或與其至少90%一致之序列的CDR3；及重鏈。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含：輕鏈；及重鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：4或與其至少90%一致之序列的CDR1、選自SEQ ID No.：5或與其至少90%一致之序列的CDR2及/或選自SEQ ID No.：6或與其至少90%一致之序列的CDR3。

如本文所用，「一致性」表示在所比對序列之任何特定位置，序列之間的胺基酸殘基一致。一致性程度可容易使用例如獲自NCBI的BLAST^TM軟體計算(Altschul,S.F.等人，1990,J.Mol.Biol.215：403- 410；Gish,W & States,D.J.1993,Nature Genet.3：266-272.Madden,T.L.等人，1996,Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul,S.F.等人，1997,Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang,J.k.Madden,T.L.1997,Genome Res.7：649-656)。

CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及CDRH3分別與SEQ ID NO.：1、2、3、4、5及6的一致性可為至少90%，但亦可為較高的，諸如至少95%、96%、97%、98%或99%，視情況優選較高一致性。不同的一致性位置可根據相似性考慮因素選擇。

在此上下文中，本發明特定地考慮Tau結合抗體或其結合片段，其包含具有分別為SEQ ID No：1、2、3之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及6之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH。本發明亦考慮包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、53之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及6之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH；包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、54之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及6之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH；包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、3之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及48之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH；包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、3之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及49之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH；包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、3之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及50之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH；包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、3之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及50之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH；包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、3之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及51之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH；及包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、3之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及52之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH。包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、53之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及48之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH；包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、53之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及49之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH；包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、53之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及50之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH；包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、53之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及51之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH；及包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、53之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及52之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH；包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、54之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及48之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH；包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、54之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及49之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH；包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、54之CDRL1、 CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及50之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH；包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、54之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及51之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH；及包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、54之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及52之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH。

該第一態樣所涵蓋之Tau結合抗體或其結合片段可包含嵌入不同來源之構架區中的此等CDR。因此，CDR可包含於AB1之原始構架區(亦即SEQ ID No.：7之兔VL區域及SEQ ID No.：8之兔VH區域)內。然而，CDR亦可嵌入不同物種來源之構架區(諸如小鼠或人類構架區)中。視可與此類構架區組合之構架區及恆定區之來源而定，可獲得嵌合、鼠類化或人類化Tau結合抗體或其結合片段。

嵌合Tau結合抗體或其結合片段將在與來自不同物種(諸如鼠類或人類來源)之恆定區組合之非人類來源之構架區內包含CDR。鼠類化Tau結合抗體或其結合片段將在與鼠類來源之恆定區組合之鼠類來源的構架區內包含CDR。人類化Tau結合抗體或其結合片段將在與人類來源之恆定區組合之人類來源的構架區內包含CDR。

針對此背景，本發明在另一個態樣中提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含：輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：7或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID No.：8或與其至少80%一致之序列。

VL及VH分別與SEQ ID No.：7及8的一致性可為至少80%，但亦可為較高的，諸如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%，視情況優選較高一致性。不同的一致性位置可根據相似性考慮因素選擇。應瞭解，就一致性而言，構架區相對於CDR可存在更大靈活性。

在此上下文中，本發明特定地考慮包含SEQ ID No.：7之VL及SEQ ID No.：8之VH的Tau結合抗體或其結合片段。

本發明尤其涵蓋人類化Tau結合抗體或其結合片段。

為此目的，可將CDR移植至人類構架區上。應瞭解，此類人類化CDR移植Tau結合抗體或其結合片段的鑑別可利用此項技術中已確立的方法達成。當移植CDR或特異性決定殘基時，可使用與CDR所來源之供體抗體類別/類型相關的任何適當受體人類可變區構架序列(參見例如Boss等人，美國專利第4,816,397號；Boss等人，歐洲專利第0,120,694 B1號；Neuberger,M.S.等人，WO 86/01533；Neuberger,M.S.等人，歐洲專利第0,194,276 B1號；Winter，美國專利第5,225,539號；Winter，歐洲專利第0,239,400 B1號；Padlan,E.A.等人，歐洲專利申請案第0,519,596 A1號)。

另外，在本發明之CDR移植抗體可變區中，構架區無需具有與受體抗體之序列完全相同的序列。從而可移植具有或不具有構架變化的CDR。根據供體可變區構架區與受體構架區之間的比較來引入構架變化可允許保持例如抗體親和力，否則作為人類化的結果，可能會使抗體親和力降低。舉例而言，可將異常殘基改變為受體鏈類別或類型中較頻繁存在的殘基。或者，可改變受體構架區中的所選殘基，使得其對應於供體抗體中之相同位置所發現的殘基(參見Riechmann等人，1998,Nature,332,323-324)。此類變化應減少至為恢復供體抗體親和力所必需的最小程度。可使用Adair等人(1991)(Humanised antibodies.WO91/09967)概述之方案選擇供改變之殘基。在本發明之CDR移植抗體中，受體重鏈及輕鏈不必定來源於相同抗體且必要時可包含具有來源於不同鏈之構架區的複合鏈。

可用於本發明之人類受體構架實例為KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY及POM(Kabat等人，同上)。舉例而言，KOL及NEWM可用於重鏈，REI可用於輕鏈且EU、LAY及POM可用於重鏈與輕鏈。或者，可使用人類生殖系序列；此等序列可獲得於：(http：//vbase.mrc-ce.cam.ac.uk/，或http：//www.imgt.org)。本發明特定地考慮使用人類V區IGKV1-39+JK4 J區SEQ ID No.：44(IMGT，http：//www.imgt.org/)作為輕鏈CDR的受體構架區及人類V區IGHV4-39+JH4 J區SEQ ID No.：45(IMGT，http：//www.imgt.org/)作為重鏈CDR之受體構架區。在SEQ ID No.：45中，可考慮例如位置1、73及80進行構架區中之殘基變化。位置1之麩醯胺酸殘基可變為麩胺酸鹽。位置73中之纈胺酸殘基可變為離胺酸。位置80之苯丙胺酸可變為纈胺酸。SEQ ID No.：45中之用於進行構架區中之殘基變化的其他位置可為位置39及/或75。舉例而言，SEQ ID NO：45之位置39的異白胺酸殘基可變為纈胺酸。位置75之蘇胺酸殘基可變為絲胺酸。SEQ ID No.：44中用於進行構架區中之殘基變化的位置可為位置2及/或63。舉例而言，SEQ ID No.：44之位置2中的異白胺酸殘基可變為纈胺酸。SEQ ID No.：44之位置63的絲胺酸殘基可變為離胺酸。

針對此背景，本發明在另一個態樣中提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含：輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：9或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID No.：10或與其至少80%一致之序列。

在另一態樣中，本發明進一步提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含：輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：13或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID No.：16或與其至少80%一致之序列。

此類經分離之Tau結合抗體或其結合片段可包含：輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：13或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID No.：14、15或與其至少80%一致之序列。

另外，此類經分離之Tau結合抗體或其結合片段可包含：輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：11、12或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID No.：16或與其至少80%一致之序列。

此類經分離之Tau結合抗體或其結合片段可包含：輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：11或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，包含SEQ ID No.：14、15或與其至少80%一致之序列。

此類經分離之Tau結合抗體或其結合片段可包含：輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：12或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID No.：14、15或與其至少80%一致之序列。

VL及VH分別與SEQ ID No.：13及16的一致性可為至少80%，但亦可為較高的，諸如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%，視情況優選較高一致性。不同的一致性位置可根據相似性考慮因素選擇。應瞭解，就一致性而言，構架區相對於CDR可存在更大靈活性。

在此上下文中，本申請案特定地考慮包含SEQ ID No.：11之VL及SEQ ID No.：14之VH的Tau結合抗體或其結合片段；包含SEQ ID No.：11之VL及SEQ ID No.：15之VH的Tau結合抗體或其結合片段；包含SEQ ID No.：12之VL及SEQ ID No.：14之VH的Tau結合抗體或其結合片段；以及包含SEQ ID No.：12之VL及SEQ ID No.：15之VH的Tau結合抗體或其結合片段。

人類化CDR移植Tau結合抗體或其結合片段可包含人類來源之恆定區。抗體或免疫球蛋白視其重鏈之恆定區胺基酸序列而定，分成以下類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干者可進一步分成亞類(亞型)，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4、IgA1及IgA2。特定而言，當抗體分子意欲用於治療用途且需要抗體效應功能時，可使用人類IgG恆定區結構域，尤其IgG1及IgG3同型。或者，當抗體分子意欲用於治療目的且不需要抗體效應功能時，可使用IgG2及IgG4同型。本發明特定地考慮IgG1及IgG4亞型之人類化抗體。

應瞭解亦可使用此等恆定區結構域之序列修飾。舉例而言，抗體恆定域中亦可進行一或多個胺基酸(諸如1或2個胺基酸)取代、添加及/或缺失，而不會顯著改變抗體結合至Tau的能力。亦可使用其中位置241之絲胺酸已變成脯胺酸的IgG4分子，如Angal等人，Molecular Immunology,1993,30(I),105-108中所述。

抗體效應功能包括ADCC及CDC。ADCC係指抗體依賴性細胞的細胞毒性。為了判定抗體原則上是否能夠介導ADDC，可藉由例如所謂的Cr⁵¹、Eu及S³⁵釋放分析來測量ADCC。含有所關注之抗原(亦即Tau)的靶細胞可用此等化合物標記。治療抗體結合之後，洗滌細胞且將表現Fc受體(諸如FcγRIII)的效應細胞與經抗體標記的靶細胞一起共培育且可根據標記的釋放來監測靶細胞的溶解。另一種方法係利用所謂的aCella TOX^TM分析。CDC係指補體依賴性細胞的細胞毒性。為了判定抗體原則上是否能夠介導CDC，可如例如以下文獻中所述來活體外測量CDC：Delobel A等人，Methods Mol Biol.(2013)；988：115-43或Current Protocols in Immunology，第13章Complement(Print ISSN：1934-3671)。

針對此背景，本發明在另一個態樣中提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含：輕鏈，其包含SEQ ID No.：19或與其至少70%一致的序列，及/或重鏈，其包含SEQ ID No.：22或與其至少70%一致的序列。

此類經分離之Tau結合抗體或其結合片段可包含：輕鏈，其包含SEQ ID No.：19或與其至少70%一致的序列，及/或重鏈，其包含SEQ ID No.：20、21或與其至少80%一致之序列。

此類經分離之Tau結合抗體或其結合片段可包含：輕鏈，其包含SEQ ID No.：17、18或與其至少70%一致的序列，及/或重鏈，其包含SEQ ID No.：22或與其至少80%一致之序列。

此類經分離之Tau結合抗體或其結合片段可包含：輕鏈，其包含SEQ ID No.：17、18或與其至少70%一致的序列，及/或重鏈，其包含SEQ ID No.：20、21或與其至少80%一致之序列。

輕鏈及重鏈分別與SEQ ID No.：19及22的一致性可為至少70%，但亦可為較高的，諸如至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%，視情況優選較高一致性。不同的一致性位置可根據相似性考慮因素選擇。應瞭解，就一致性而言，構架區相對於CDR可存在更多靈活性且恆定區可存在甚至更多的靈活性。

在此上下文中，本申請案特定地考慮包含SEQ ID No.：17之輕鏈及SEQ ID No.：20之重鏈的Tau結合抗體或其結合片段、包含SEQ ID No.：17之輕鏈及SEQ ID No.：21之重鏈的Tau結合抗體或其結合片段、包含SEQ ID No.：18之輕鏈及SEQ ID No.：20之重鏈的Tau結合抗體或其結合片段，及包含SEQ ID No.：18之輕鏈及SEQ ID No.：21之重鏈的Tau結合抗體或其結合片段。

另外，本發明在另一態樣中提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含：輕鏈，其包含SEQ ID No.：19或與其至少70%一致的序列，及/或重鏈，其包含SEQ ID No.：25或與其至少70%一致的序列。

此類經分離之Tau結合抗體或其結合片段可包含：輕鏈，其包含SEQ ID No.：19或與其至少70%一致的序列，及/或重鏈，其包含SEQ ID No.：23或SEQ ID No.：24或與其至少70%一致的序列。

此類經分離之Tau結合抗體或其結合片段可包含：輕鏈，其包含SEQ ID No.：19或與其至少70%一致的序列，及/或重鏈，其包含SEQ ID No.：23或SEQ ID No.：24或與其至少80%一致之序列。

此類經分離之Tau結合抗體或其結合片段可包含：輕鏈，其包含SEQ ID No.：17、18或與其至少70%一致的序列，及/或重鏈，其包含SEQ ID No.：23或SEQ ID No.：24或與其至少80%一致之序列。

在此上下文中，本申請案特定地考慮包含SEQ ID No.：17之輕鏈及SEQ ID No.：23之重鏈的Tau結合抗體或其結合片段、包含SEQ ID No.：17之輕鏈及SEQ ID No.：24之重鏈的Tau結合抗體或其結合片段、包含SEQ ID No.：18之輕鏈及SEQ ID No.：23之重鏈的Tau結合抗體或其結合片段，及包含SEQ ID No.：18之輕鏈及SEQ ID No.：24之重鏈的Tau結合抗體或其結合片段。

輕鏈及重鏈分別與SEQ ID No.：19及SEQ ID No.：23或24的一致性可為至少70%，但亦可為較高的，諸如至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%，視情況優選較高一致性。不同的一致性位置可根據相似性考慮因素選擇。應瞭解，就一致性而言，構架區相對於CDR可存在更多靈活性且恆定區可存在甚至更多的靈活性。

本發明亦提供人類Tau的特異性區域或抗原決定基，其被本發明所提供的抗體或其結合片段結合，特定而言，包含以下中之任一者的抗體或其結合片段：CDR-H1(SEQ ID No.：4)、CDR-H2(SEQ ID No.：5)、CDR-H3(SEQ ID No.：6)、CDR-L1(SEQ ID No.：1)、CDR-L2(SEQ ID No.：2)或CDR-L3(SEQ ID No.：3)，例如包含SEQ ID No.：7之VL及SEQ ID No.：8之VL的抗體。

本發明進一步提供人類Tau之特異性區域或抗原決定基，特定言之，SEQ ID No.：55之胺基酸197-206內的磷酸化Tau區域，其被本發明中所提供的抗體或其結合片段所結合，特定言之，包含SEQ ID No.：7之VL及SEQ ID No.：8之VH的抗體或其結合片段。

SEQ ID No.：55之197至206內的Tau區域包含四個可能的磷酸化位點，其對應於位置198(S198)、199(S199)、202(S202)的絲胺酸殘基及位置205的蘇胺酸殘基(T205)。

術語「SEQ ID No.：55之胺基酸197-206內的磷酸化Tau區域」係指SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的Tau區域，其包含選自S198、S199、S202及T205的至少一個磷酸化殘基。如熟習此項技術者所知，磷酸化殘基亦可稱為例如Ser(PO₃H₂)或Thr(PO₃H₂)。

Tau結合抗體對Tau之此特異性區域或抗原決定基的結合可藉由此項技術中已知的任何適合抗原決定基定位方法與本發明所提供之任一種抗體的組合來鑑別。此類方法之實例包括利用可特異性結合至含有由Tau結合抗體或其結合片段識別之抗原決定基之序列之抗體的最小片段篩選用於結合至本發明之Tau結合抗體或其結合片段的來源於SEQ ID No.：55之不同長度的肽。若中樞神經系統中存在不同的Tau同功異型物，則應瞭解本文詳述的方法中可使用任何此類同功異型物。在特定實例中，可使用Tau的最長同功異型物，亦即如SEQ ID No.：55中所定義的同功異型物2。SEQ ID No.：55之Tau肽可以重組方式、合成方式或藉由蛋白分解消化Tau多肽來產生。結合抗體的肽可藉由例如西方墨點或質譜分析來鑑別。在另一實例中，NMR光譜法或X射線結晶學可用於鑑別Tau結合抗體或其結合片段所結合之抗原決定基。一旦鑑別，結合本發明之抗體的抗原決定基片段必要時可用作免疫原以獲得結合相同抗原決定基之其他抗體。另外，結合本發明之抗體的抗原決定基片段可用於獲得結合至相同抗原決定基的蛋白質，且必要時至少抑制Tau聚集，諸如包含超過10個胺基酸之蛋白質或多肽化合物，該等胺基酸係基於來源於例如以下之蛋白質骨架：脂質運載蛋白(「抗運載蛋白」)、纖維結合蛋白(「阿德奈汀(adnectins)，特林奈汀(trinectins)」、昆尼茲域、C型凝集素、轉鐵蛋白、γ-結晶體、半胱胺酸-nots、錨蛋白重複(「DARPins」)或蛋白質A(「親和抗體」)，如此項技術中所知(Tomlinson,2004；Mosavi等人，2004；Gill及Damle,2006；Nilsson及Tolmachev,2007；Binz等人，2004)。另外，結合相同抗原決定基的分子包括其他有機分子，包括包含不超過10個胺基酸的肽及環肽，以及肽模擬物。肽模擬物為基於在蛋白質-蛋白質相互作用位點所發現之胺基酸序列且在此項技術中已知的化合物(Sillerud及Larson,2005)。

針對此背景，本發明在另一態樣中提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域。

此類抗體可為嵌合、鼠類化、人類化或完全人類單株抗體或可用於獲得嵌合、鼠類化、人類化或完全人類單株抗體。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少一個選自S198、S199、S202及T205的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少一個選自S198及S199的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少一個選自S202及T205的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少一個包含S198的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少一個包含S199的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少一個包含S202的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少一個包含T205的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少兩個選自S198、S199、S202及T205的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少兩個包含S198及S199之磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少兩個包含S199及S202的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少兩個包含S202及T205的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少兩個包含S198及T205的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少兩個包含S198及S202的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少兩個包含S199及T205的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少三個選自S198、S199、S202及T205的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少三個包含S198及S199的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少三個包含S199及S202的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少三個包含S202及T205的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少三個包含S198及T205的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少三個包含S198及S202的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含至少三個包含S199及T205的磷酸化殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域，其中該磷酸化Tau區域包含以下四個磷酸化殘基S198、S199、S202及T205。

在另一態樣中，本發明提供經分離之中和Tau結合抗體或其結合片段，其中該中和Tau結合抗體或其結合片段結合SEQ ID No.：35之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與上述Tau結合抗體或其結合片段結合至大體上相同的Tau抗原決定基。對抗原決定基的結合可如針對抗原決定基定位所述，使用例如包含SEQ ID No.：7之VL及SEQ ID No.：8之VH的Tau結合抗體或其結合片段作為參考物來測定。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與上述Tau結合抗體競爭結合至Tau。

在此上下文中，本發明特定地涵蓋經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與包含SEQ ID No.：7之VL及SEQ ID No.：8之VH的Tau結合抗體或其結合片段競爭結合至Tau。

對Tau的競爭結合可根據在可包含SEQ ID No.：7之VL及SEQ ID No.：8之VH或SEQ ID No.：9之VL及SEQ ID No.：10之VH的參考抗體或其結合片段存在下，抗體或其結合片段對Tau之結合減少至少約50%、或至少約70%、或至少約80%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約99%或約100%來確定。結合可使用表面電漿共振(使用BIAcore®設備)、各種螢光偵測技術(例如螢光相關光譜法、螢光交叉關聯法、螢光壽命量測等)或各種類型之放射免疫分析或用於追蹤結合至標靶分子之抗體的其他分析來量測。

術語「Tau結合抗體或其結合片段」意謂抗體或其結合片段藉助於其可變區特異性結合至Tau，亦即結合Tau抗原的親和力大於不為Tau同源物的其他抗原。「Tau結合抗體或其結合片段」藉助於其可變區結合至Tau的親和力是不為Tau同源物之其他抗原的至少兩倍、至少五倍、至少10、20、100、10³、10⁴、10⁵或至少10⁶倍。應瞭解，Tau結合抗體及其結合片段然而亦可經由與Tau結合抗體及其結合片段之可變區外部序列的相互作用而與其他蛋白質(例如金黃色葡萄球菌蛋白質A或ELISA技術中的其他抗體)發生相互作用。術語「Tau結合抗體或其結合片段」不意欲涵蓋此類後者結合特性，此等特性係由Tau結合抗體及其結合片段之可變區外部的序列介導且特定言之，係由Tau結合抗體及其結合片段之恆定區介導。測定抗體結合特異性的篩選分析已熟知且在此項技術中常規地實施。就抗體(或其結合片段)結合至其抗原的親和力而言，Tau結合抗體或其結合片段可具有奈莫耳濃度範圍內的平衡解離常數(K_D)。因此，K_D可低於約1*10^-6，例如低於約5*10^-7，諸如約2*10^-7或低於2*10^-7，且可可使用例如表面電漿共振及BIAcore裝置量測，如實例中所述。

如上所述，本發明提供Tau結合抗體或其結合片段。全長抗體包括恆定域及可變區。恆定區在抗體之抗原結合片段中可不一定以其全長形式存在。然而應瞭解，每當本申請案考慮使用抗體介導的ADCC及/或CDC時，結合片段必須包含長度仍足以能夠介導ADCC及/或CDC的恆定區。

如上所述，本發明亦關於人類Tau結合抗體或其結合片段，其可作為人類化的替代方案產生。舉例而言，免疫接種後能夠在不產生內源鼠類抗體的情況下產生人類抗體之完整譜系的轉殖基因動物(例如小鼠)在此項技術中已知。舉例而言，已描述嵌合及生殖系突變小鼠中之抗體重鏈接合區(JH)基因的同型接合子缺失導致內源抗體產生被完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至此類生殖系突變型小鼠中將產生特異性針對特定抗原的人類抗體(用該抗原免疫接種攜帶人類生殖系免疫球蛋白基因的轉殖基因動物後)。用於產生此類轉殖基因動物的技術及自此類轉殖基因動物中分離及產生人類抗體的技術在此項技術中已知(Lonberg,2005；Green,1999；Kellermann及Green,2002；Nicholson等人，1999)。或者，在轉殖基因動物(例如小鼠)中，唯編碼小鼠抗體之可變區的免疫球蛋白基因用相應的人類可變免疫球蛋白基因序列置換。編碼抗體恆定區的小鼠生殖系免疫球蛋白基因保持不變。以此方式，轉殖基因小鼠之免疫系統中的抗體效應功能及因此B細胞發育基本上不變，從而可在活體內抗原攻擊後使得抗體反應改良。一旦編碼所關注之特定抗體的基因已自此類轉殖基因動物中分離，則編碼恆定區的基因可用人類恆定區基因置換以便獲得完全人類抗體。用於活體外獲得人類抗體之抗體片段的其他方法係基於呈現技術，諸如噬菌體呈現或核糖體呈現技術，其中使用至少部分地以人工方式或自供體之免疫球蛋白可變(V)域基因譜系產生的重組DNA文庫。用於產生人類抗體的噬菌體及核糖體呈現技術在此項技術中已熟知(Winter等人，1994；Hoogenboom,2002；Kretzschmar及von Ruden,2002；Groves及Osbourn,2005；Dufner等人，2006)。

人類抗體亦可自經分離之人類B細胞中產生，該等人類B細胞用所關注之抗原離體免疫且隨後融合而產生融合瘤，接著可篩選此等融合瘤以產生最佳人類抗體(Grasso等人，2004；Li等人，2006)。

如本文所用，術語「中和Tau結合抗體」係指結合至Tau且抑制Tau之至少一種生物活性的抗體。在一個特定實施例中，如本文所用，「中和Tau結合抗體」係指活體外分析中，諸如下文實驗3.1所述的活體外分析中，結合Tau且抑制Tau聚集的抗體。

如本文所用，術語‘抗體’大體上係指完整(完全，全長)抗體，亦即包含兩條重鏈及兩條輕鏈的元件。抗體可包含其他結合域，例如WO 2007/024715中所揭示的分子DVD-Ig，或WO2011/030107中所述的所謂(FabFv)2Fc。因此，如本文所使用之抗體包括二價、三價或四價全長抗體。

抗體結合片段包括單鏈抗體(亦即全長重鏈及輕鏈)；Fab、經修飾之Fab、Fab'、經修飾之Fab'、F(ab')₂、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、Fab-scFv、Fab-scFc、二硫鍵穩定化Fab-scFv、單域抗體(例如VH或 VL或VHH)、scFv、scFv-scFc、dsscFv、dsscFv-scFc、二價、三價或四價抗體、雙scFv、雙功能抗體、三功能抗體、三功能抗體、四功能抗體；域抗體(dAbs)，諸如sdAb；VHH及VNAR片段，及上述任一者之抗原決定基結合片段(參見例如Holliger及Hudson,2005,Nature Biotech.23(9)：1126-1136；Adair及Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。用於產生及製造此等抗體片段之方法在此項技術中已熟知(參見例如Verma等人，1998,Journal of Immunological Methods,216,165-181)。Fab-Fv形式首次揭示於WO2009/040562中且其二硫化物穩定型Fab-dsFv首次揭示於WO2010/035012中。Fab-scFv之二硫化物穩定化形式描述於WO2013/068571中。包含scFc形式的抗體形式首次描述於WO2008/012543中。用於本發明中之其他抗體片段包括國際專利申請案WO2005/003169、WO2005/003170及WO2005/003171中所述的Fab及Fab'片段。

多價抗體可包含多特異性，例如雙特異性，或可具單特異性(參見例如WO92/22583及WO05/113605)。後者之一個此實例為如WO92/22583中所述之Tri-Fab(或TFM)。

在一個實施例中，提供Fab片段。

在一個實施例中，提供Fab'片段。

典型Fab'分子包含重鏈及輕鏈對，其中重鏈包含可變區VH、恆定域CH1及天然或經修飾之鉸鏈區且輕鏈包含可變區VL及恆定域CL。

在一個實施例中，提供根據本發明之Fab'的二聚物以產生F(ab')2，例如可經由鉸鏈發生二聚。

在一個實施例中，抗體或其結合片段包含結合域。結合域通常將包含6個CDR，三個來自重鏈且三個來自輕鏈。在一個實施例中，CDR位於一個構架中且一起形成可變區。因此，在一個實施例中，抗體或結合片段包含特異性針對包含輕鏈可變區及重鏈可變區之抗原的結合域。

應瞭解，本發明所提供之Tau結合抗體或其結合片段的親和力可使用此項技術中已知之適合方法改變。本發明因此亦關於本發明之抗體分子的變異體，其對Tau具有改良之親和力。此類變異體可藉由多種親和力成熟方案獲得，包括使CDR發生突變(Yang等人，J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)、鏈改組(Marks等人，Bio/Technology,10,779-783,1992)、使用大腸桿菌突變菌株(Low等人，J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)、DNA改組(Patten等人，Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌體呈現(Thompson等人，J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)及性PCR(Crameri等人，Nature,391,288-291,1998)。Vaughan等人(同上)論述此等親和力成熟方法。

Tau結合抗體及其結合片段因此亦可涵蓋例如具有一或多個保守取代(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個保守取代)的前文特定提及之輕鏈或重鏈胺基酸序列中之任一者。可確定胺基酸序列中的位置作為保守取代的候選位置，且可選擇合成及天然存在之胺基酸來實現任何特定胺基酸的保守取代。用於選擇保守取代的考慮因素包括產生任何特定胺基酸取代的背景、側鏈的疏水性或極性、側鏈的一般尺寸，及在生理學條件下具有酸性或鹼性特徵的側鏈之pK值。舉例而言，離胺酸、精胺酸及組胺酸彼此間取代通常為適合的。如此項技術中所知，此係因為全部三種胺基酸具有鹼性側鏈，然而與組胺酸(約6)相比，離胺酸及精胺酸之側鏈的pK值彼此間更接近(約10及12)。類似地，甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸彼此間的取代通常為適合的，其限制條件為甘胺酸不宜頻繁地取代群組中的其他成員。彼此間宜頻繁取代之其他胺基酸群組包括(但不限於)由麩胺酸及天冬胺酸組成之群；由苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸組成之群；及由絲胺酸、蘇胺酸及視情況存在之酪胺酸組成之群。

如在本發明之上下文中提及的Tau結合抗體及其結合片段可涵蓋本文揭示之例示性抗體、片段及序列的衍生物。「衍生物」包括已經化學修飾之Tau結合抗體及其結合片段。化學修飾之實例包括共價連接一或多個聚合物，諸如水溶性聚合物、N連接或O連接型碳水化合物、糖類、磷酸鹽及/或其他此類分子，諸如可偵測標記，諸如螢光團。

必要時，用於本發明中之Tau結合抗體或其結合片段因此可與一或多個效應分子結合。應瞭解效應分子可包含單個效應分子或兩個或多於兩個如此連接以形成可連接至本發明抗體之單一部分的此類分子。在需要獲得連接至效應分子之抗體片段的情況下，此可藉由其中抗體片段直接或經由偶合劑連接至效應分子之標準化學或重組DNA程序來製備。用於此類效應分子與抗體結合之技術在此項技術中已熟知(參見Hellstrom等人，Controlled Drug Delivery，第2版，Robinson等人編，1987，第623-53頁；Thorpe等人，1982,Immunol.Rev.,62：119-58及Dubowchik等人，1999,Pharmacology and Therapeutics,83,67-123)。用於結合效應分子的此等技術可包括位點特異性結合或非位點特異性或隨機結合。特定化學程序包括例如WO 93/06231、WO 92/22583、WO 89/00195、WO 89/01476及WO 03/031581中所述之程序。或者，在效應分子為蛋白質或多肽之情況下，可使用重組DNA程序，例如如WO 86/01533及EP0392745中所述來實現鍵聯。或者，效應分子中的特定連接位點可工程改造成本發明之抗體或其抗原結合片段，例如如WO 2008/038024中所述。另外，可利用偶合劑使效應分子與本發明之抗體或其抗原結合片段連接，例如如WO 2005/113605中所述。熟習此項技術者應瞭解，上述可能性可單獨或組合使用。

如本文所用，術語效應分子包括例如藥物、毒素、生物學活性蛋白質(例如酶)、其他抗體或抗體片段、合成或天然存在之聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)、放射性核素(尤其放射性碘)、放射性同位素、螯合金屬、奈米顆粒及報導基團，諸如螢光化合物或可藉由NMR或ESR光譜法偵測的化合物。如本文所用，效應分子亦包括治療劑，諸如化學治療劑、治療多肽、奈米顆粒、脂質體或治療核酸。

其他效應分子可包括螯合放射性核素，諸如¹¹¹In及⁹⁰Y、Lu¹⁷⁷、鉍²¹³、鐦²⁵²、銥¹⁹²及鎢¹⁵⁸/錸¹⁸⁸；或藥物，諸如(但不限於)烷基磷酸膽鹼、拓撲異構酶I抑制劑、類紫杉醇及蘇拉明(suramin)。

其他效應分子包括蛋白質、肽及酶。所關注之酶包括(但不限於)蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、異構酶、轉移酶。所關注之蛋白質、多肽及肽包括(但不限於)免疫球蛋白；毒素，諸如相思子毒素、蓖麻毒素A、綠膿桿菌外毒素或白喉毒素；蛋白質，諸如胰島素、腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板源生長因子或組織纖維蛋白溶酶原活化因子；血栓藥劑或抗血管生成劑，例如血管生長抑素或內皮生長抑素；或生物反應調節劑，諸如淋巴激素、介白素-1(IL-I)、介白素-2(IL-2)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞群落刺激因子(G-CSF)、神經生長因子(NGF)或其他生長因子及免疫球蛋白，或包含超過10個胺基酸的其他蛋白質或多肽化合物，該等胺基酸係基於來自例如以下的蛋白質骨架：脂質運載蛋白(「抗運載蛋白」)、纖維結合蛋白(「阿德奈汀」，特林奈汀)、昆尼茲域、C型凝集素、轉鐵蛋白、γ-結晶體、半胱胺酸-nots、錨蛋白重複(「DARPins」)、Fyn SH3域(「非諾莫(fynomers)」)或蛋白質A(「親和抗體」)，如此項技術中所知(Tomlinson,2004；Mosavi等人，2004；Gill及Damle,2006；Nilsson及Tolmachev,2007；Binz等人， 2004；Silacci等人，2014)。

其他效應分子包括增強或促進血腦障壁滲透的肽及蛋白質。舉例而言，WO2010/043047、WO2010/063122、WO2010/063123或WO2011/041897描述可充當能夠傳輸治療分子跨越血腦障壁之載體的肽或多肽及使其與治療分子結合的方法。在血腦障壁滲透之情形下，所關注之肽及蛋白質包括(但不限於)結合至血腦障壁受體(諸如轉鐵蛋白受體、葡萄糖受體、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體、低密度脂蛋白受體相關蛋白8、低密度脂蛋白受體相關蛋白1及肝素結合表皮生長因子樣生長因子)的肽及蛋白質。或者，效應分子為特異性結合至上述血腦障壁受體之一的抗體片段，諸如域抗體、駱駝科抗體或鯊魚源抗體(VNAR)。

其他效應分子可包括適用於例如診斷之可偵測物質。可偵測物質之實例包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質、放射性核素、正電子發射金屬(諸如可用於正電子發射斷層攝影術或單光子發射電腦化斷層攝影術中)及非放射性順磁金屬離子。關於適用於診斷學中之可與抗體結合的金屬離子，一般參見美國專利第4,741,900號。適合酶包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適合輔基包括抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白及生物素；適合螢光物質包括傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯及藻紅素；適合發光物質包括魯米諾(luminol)；適合生物發光物質包括螢光素酶、螢光素及水母素；且適合放射性核素包括¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁹Tc、⁸⁹Zr、⁹⁰Y、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga及¹⁸F。作為可偵測物質適用於診斷之效應分子的特定類型包括缺電子四嗪及反-環辛烯(TCO)，如Wyffels等人，2014,Nuclear Medicine and biology 41(2014)：513-523中所述，其中可投與連接至四嗪的本發明Tau結合抗體且使其達到最大吸收及自非標靶位點足夠清除，接著隨後投與經適合放射性核素標記的TCO或最佳化TCO類似物，使得TCO共價結合本發明之Tau結合抗體上的四嗪，且藉由例如正電子發射斷層攝影術或單光子發射電腦化斷層攝影術實現其偵測。

在一個實施例中，提供連接至放射性核素或連接至四嗪的Tau結合Fab、Fab'或scFv。連接至放射性核素或連接至四嗪可經由位於抗體片段中之任何可利用之胺基酸側鏈或末端胺基酸官能基(例如任何游離胺基、亞胺基、硫醇、羥基或羧基)、藉助於連接來達成。此類胺基酸可天然存在於抗體片段中或可使用重組DNA方法經工程改造至片段中(參見例如US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971、WO2008/038024)。在一個實例中，本發明之Tau結合抗體或其結合片段為經修飾之Fab片段，其中該修飾為向其重鏈的C末端添加一或多個胺基酸以實現效應分子的連接。適合的是，其他胺基酸形成經修飾之鉸鏈區，其含有一或多個可連接至效應分子之半胱胺酸殘基。在一個實施例中，若放射性核素為金屬離子，諸如¹¹¹In、⁹⁹Tc、⁸⁹Zr、⁹⁰Y、⁶⁴Cu或⁶⁸Ga，則其可被巨環螯合劑結合，例如如Turner等人(Br.J.Cancer,1994,70：35-41；Comparative biodistribution of indium-111-labelled macrocycle chimeric B72.3 antibody conjugates in tumour-bearing mice)所述，其中後者又共價連接至抗體或抗體片段的前述胺基酸側鏈或末端胺基酸官能基。在另一個實施例中，結合放射性核素的後者巨環螯合劑可為WO05/113605中所述的效應分子，該效應分子為連接兩個或超過兩個抗Tau抗體或其片段之交聯劑的一部分。

在另一實例中，效應分子可延長抗體的活體內半衰期，及/或降低抗體之免疫原性及/或增強抗體跨越上皮障壁傳送至免疫系統。適合的此類型效應分子之實例包括聚合物、白蛋白及白蛋白結合蛋白或白蛋白結合化合物，諸如WO05/117984中所述之彼等物。

在效應分子為聚合物之情況下，其一般可為合成或天然存在之聚合物，例如視情況經取代之直鏈或分支鏈聚伸烷基、聚伸烯基或聚氧伸烷基聚合物或分支鏈或非分支鏈多醣(例如均多醣或雜多醣)。

可視情況存在於上述合成聚合物上的特定取代基包括一或多個羥基、甲基或甲氧基。

合成聚合物之特定實例包括視情況經取代之直鏈或分支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其視情況經取代之聚(乙二醇)，諸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。

天然存在之特定聚合物包括乳糖、直鏈澱粉、聚葡萄糖、肝糖或其衍生物。

在一個實施例中，效應分子為白蛋白或其片段，諸如人類血清白蛋白或其片段。

聚合物尺寸可根據需要變化，但平均分子量通常在500Da至50000Da之範圍內，例如5000Da至40000Da，諸如20000Da至40000Da。聚合物尺寸尤其可基於產品之預定用途來選擇，例如局域化至某些組織(諸如腦)中或延長循環半衰期之能力(欲回顧，參見Chapman,2002,Advanced Drug Delivery Reviews,54,531-545)。因此，舉例而言，希望產物離開循環且滲入組織中。

適合聚合物包括聚伸烷基聚合物，諸如聚(乙二醇)或尤其甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且尤其分子量在約15000Da至約40000Da範圍內。

在一個實例中，用於本發明中之抗體連接至聚(乙二醇)(PEG)部分。在一個特定實例中，抗體為Tau結合抗體或其結合片段且PEG分子可經由位於抗體片段中之任何可利用之胺基酸側鏈或末端胺基酸官能基連接，例如任何游離胺基、亞胺基、硫醇、羥基或羧基。此類胺基酸可天然存在於抗體片段中或可使用重組DNA方法經工程改造至片段中(參見例如US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971、 WO2008/038024)。在一個實例中，本發明之Tau結合抗體或其結合片段為經修飾之Fab片段，其中該修飾為向其重鏈的C末端添加一或多個胺基酸以實現效應分子的連接。適合的是，其他胺基酸形成經修飾之鉸鏈區，其含有一或多個可連接至效應分子之半胱胺酸殘基。可利用多個位點連接兩個或超過兩個PEG分子。

PEG分子宜經由位於抗體片段中的至少一個半胱胺酸殘基之硫醇基共價連接。連接至經修飾之抗體片段的每個聚合物分子可共價連接至位於片段中之半胱胺酸殘基之硫原子。共價鍵一般為二硫鍵或尤其硫-碳鍵。在硫醇基用作連接點之情況下，可使用適當活化之效應分子，例如硫醇選擇性衍生物，諸如順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸衍生物。活化聚合物可用作起始物質來製備如上所述之經聚合物修飾之抗體片段。活化聚合物可為含有硫醇反應基之任何聚合物，諸如α-鹵基羧酸或酯，例如碘乙醯胺、醯亞胺(例如順丁烯二醯亞胺)、乙烯基碸或二硫化物。此類起始物質可市購(例如購自Nektar，前身為Shearwater Polymers Inc.,Huntsville,AL,USA)或可使用習知化學程序由市售起始物質製備。特定PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可獲自Nektar，前身為Shearwater；Rapp Polymere；以及SunBio)及M-PEG-SPA(可獲自Nektar，前身為Shearwater)。

在另一態樣中，本發明提供包含編碼Tau結合抗體及其結合片段之核酸序列的核酸分子；包含編碼其可變輕鏈及/或重鏈之核酸序列的核酸分子；及包含編碼其可變輕鏈及/或重鏈之CDR1、CDR2及/或CDR3之核酸序列的核酸分子。

舉例而言，AB1(SEQ ID No.：7)之VL可由SEQ ID No.：26)編碼。AB1(SEQ ID No.：8)之VH可由SEQ ID No.：27)編碼。

SEQ ID No.：11之人類化VL可由SEQ ID No.：30編碼。SEQ ID No.：12之人類化VL可由SEQ ID No.：31編碼。SEQ ID No.：14之人類化VH可由SEQ ID No.：32編碼且SEQ ID No.：15之人類化VH可由SEQ ID No.：33編碼。

SEQ ID No.：17之人類化輕鏈可由SEQ ID No.：34編碼。SEQ ID No.：18之人類化輕鏈可由SEQ ID No.：35編碼。SEQ ID No.：20之人類化重鏈可由SEQ ID No.：36編碼且SEQ ID No.：21之人類化重鏈可由SEQ ID No.：37編碼。SEQ ID No.：23之人類化重鏈可由SEQ ID No.：38編碼且SEQ ID No.：24之人類化重鏈可由SEQ ID No.：39編碼。

Tau結合抗體及其結合片段可由單一核酸(例如包含編碼抗體之輕鏈及重鏈多肽之核苷酸序列的單一核酸)編碼，或由兩個或超過兩個各別核酸編碼(各編碼抗體或抗體片段的不同部分)。就此而言，本發明提供一或多個編碼任一種前述抗體或結合片段的核酸。核酸分子可為DNA、cDNA、RNA及其類似物。

舉例而言，編碼抗體重鏈及輕鏈之一部分或全部的DNA序列可根據需要自經測定之DNA序列或基於相應胺基酸序列來合成。編碼受體構架序列之DNA可由熟習此項技術者廣泛獲得且容易基於其已知胺基酸序列合成。

可利用標準分子生物學技術製備編碼本發明之抗體分子的DNA序列。所要DNA序列可使用寡核苷酸合成技術完全或部分地合成。適當時可使用定點突變誘發及聚合酶鏈反應(PCR)技術。

較佳地，編碼核酸序列可操作地連接至表現控制序列，從而允許在原核或真核細胞中表現。該聚核苷酸之表現包含將聚核苷酸轉錄成可轉譯mRNA。確保在真核細胞(較佳為哺乳動物細胞)中達成表現的調控元件已為熟習此項技術者熟知。其通常包含確保轉錄起始的調控序列且視情況包含確保轉錄終止及轉錄物穩定化的聚A信號。其他調控元件可包括轉錄以及轉譯增強子，及/或天然相關的或異質啟動子區域。

因此，本發明在另一態樣中提供包含編碼Tau結合抗體及其結合片段之此類核酸序列的選殖或表現載體。

「載體」為能夠將核酸序列運載至適合宿主細胞(例如其中可發生所編碼多肽之合成)中的任何分子或組合物。通常且較佳地，載體為一種核酸，其已使用在此項技術中已知可併入所要核酸序列(例如本發明之核酸)的重組DNA技術經工程改造。表現載體通常含有以下組分中之一或多者(若其已不由核酸分子提供)：啟動子、一或多個增強子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供體及受體剪接位點的完整內含子序列、分泌用的前導序列、核糖體結合位點、聚腺苷酸化序列、用於插入編碼待表現之多肽之核酸的多酶切點接頭區域，及可選標記元件。

通常選擇在使用載體(該載體與宿主細胞機構相容，使得可發生基因擴增及/或基因表現)的宿主細胞中發揮作用的載體。

本發明因此在另一態樣中提供包含如上文所述之選殖或表現載體的宿主細胞及/或編碼如上文所述之Tau結合抗體及其結合片段的核酸序列。

宿主細胞可為能夠經核酸或載體轉型以便產生由其編碼之Tau結合抗體或其結合片段的任何細胞類型。包含核酸或載體的宿主細胞可用於產生Tau結合抗體或其結合片段，或其部分(例如由核酸或載體編碼的重鏈序列或輕鏈序列)。將核酸或載體引入細胞中之後，在適合於表現所編碼序列的條件下培養細胞。接著可自細胞中分離抗體、抗原結合片段或該抗體之一部分。

宿主細胞可為原核宿主細胞(諸如大腸桿菌)或真核宿主細胞(諸如酵母細胞、昆蟲細胞或脊椎動物細胞)。在適當條件培養下培養時，宿主細胞表現抗體或其結合片段，隨後可自培養基收集(若宿主細胞將抗體或其結合片段分泌至培養基中)或直接自產生抗體或其結合片段的宿主細胞收集(若不分泌抗體或其結合片段)。適當宿主細胞之選擇將視多種因素而定，諸如所需表現量、活性所需或必需之多肽修飾(諸如糖基化或磷酸化)及摺疊成生物學活性分子之容易性。宿主細胞之選擇部分地取決於抗體或其結合片段是否經轉錄後修飾(例如糖基化及/或磷酸化)。若如此，則酵母、昆蟲或哺乳動物宿主細胞較佳。

適合哺乳動物宿主細胞包括CHO、骨髓瘤或融合瘤細胞。適用於本發明中之中國倉鼠卵巢(CHO細胞)的類型可包括CHO及CHO-K1細胞，包括dhfr-CHO，諸如可結合DHFR可選標記使用的CHO-DG44細胞及CHODXB11細胞或可結合麩醯胺酸合成酶可選標記使用之CHOKI-SV細胞。多者獲自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC),Manassas,Va。實例包括哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)(ATCC第CCL61號)、人類胚腎(HEK)293或293T細胞(ATCC第CRL1573號)、3T3細胞(ATCC第CCL92號)或PER.C6細胞。用於表現抗體之其他細胞類型包括淋巴細胞性細胞株，例如NSO骨髓瘤細胞及SP2細胞、COS細胞。

本發明之另一態樣提供一種產生Tau結合抗體或其結合片段的方法，該方法包含在適合於自例如編碼Tau結合抗體或其結合片段之DNA表現Tau結合抗體或其結合片段的條件下培養含有例如載體的宿主細胞及分離抗體分子。

Tau結合抗體或其結合片段可僅包含重鏈或輕鏈多肽，在此情況下僅需使用重鏈或輕鏈多肽編碼序列轉染宿主細胞。為產生包含重鏈與輕鏈之產物，細胞株可經兩種載體轉染，第一載體編碼輕鏈多肽且第二載體編碼重鏈多肽。或者，可使用單一載體，載體包括編碼輕鏈及重鏈多肽之序列。

Tau結合抗體或其結合片段(根據本發明之抗體及片段)在宿主細胞中得到高量的表現。因此，抗體及/或片段的特性有助於商業加工。

因此，提供一種培養宿主細胞且表現Tau結合抗體或其結合片段、分離後者且視情況純化其以提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段的方法。在一個實施例中，該方法進一步包含使效應分子與經分離之抗體或片段結合(例如與尤其如本文所述之PEG聚合物結合)的步驟。

Tau結合抗體或其結合片段可調配成組合物，尤其醫藥或診斷組合物。醫藥組合物包含治療或預防有效量之Tau結合抗體或其結合片段與適合載劑(例如醫藥學上可接受之藥劑)的混合物。診斷組合物包含診斷有效量的Tau結合抗體或其結合片段與適合載劑(例如診斷學上可接受之藥劑)的混合物。

本發明醫藥組合物中使用之醫藥學上可接受之藥劑包括載劑、賦形劑、稀釋劑、抗氧化劑、防腐劑、著色劑、調味及稀釋劑、乳化劑、懸浮劑、溶劑、填充劑、增積劑、緩衝液、傳送媒劑、張力劑、共溶劑、濕潤劑、錯合劑、緩衝劑、抗微生物劑及界面活性劑。

組合物可呈液體形式或呈凍乾或冷凍乾燥形式且可包括一或多種凍乾保護劑、賦形劑、界面活性劑、高分子量結構添加劑及/或增積劑(參見例如美國專利6,685,940、6,566,329及6,372,716)。

組合物可適於非經腸投與。例示性組合物適合於藉由可供熟習此項技術者使用的任何路徑注射或輸注至動物中，諸如關節內、皮下、靜脈內、肌肉內、腹膜內、腦內(腦實質內)、腦室內、肌肉內、眼內、動脈內或病灶內途徑。非經腸調配物通常為無菌、無熱原質的等張水溶液，其視情況含有醫藥學上可接受之防腐劑。

非水性溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。水性載劑包括水、醇溶液/水溶液、乳液或懸浮液，包括生理鹽水及緩衝介質。非經腸媒劑包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖及氯化鈉、乳酸化林格氏液或不揮發性油。靜脈內媒劑包括流體及營養補充劑、電解質補充劑(諸如基於林格氏右旋糖的彼等物)，及其類似物。亦可存在防腐劑及其他添加劑，諸如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體及其類似物。一般參見Remington's Pharmaceutical Science，第16版，Mack編，1980，該文獻以引用的方式併入本文中。

本文所述之醫藥組合物可以在特定局部環境中提供產物(例如藥團、儲集式作用)的局域濃度及/或增加穩定性或半衰期的方式調配成供控制或維持傳送。組合物可包括本發明之抗體、結合片段、核酸或載體與以下之調配物：聚合物化合物(諸如聚乳酸、聚乙醇酸等)之微粒製劑，以及諸如以下之藥劑：生物可降解基質、可注射微球體、微膠囊顆粒、微膠囊、生物溶蝕性顆粒珠粒、脂質體，及提供活性劑之控制或持續釋放、接著可以儲槽式注射遞送的可植入傳送裝置。

或者或另外，組合物可藉助於植入已吸收或囊封有本發明之抗體、結合片段、核酸或載體的膜、海綿或其他適當材料之所影響區域中來局部投與。在使用植入裝置的情況下，可將裝置植入任何適合組織或器官中，且本發明之抗體、結合片段、核酸或載體可直接經由該裝置、藉助於藥團傳送，或藉助於連續投與或藉助於使用連續輸注的導管傳送。

包含Tau結合抗體或其結合片段的醫藥組合物可調配成用於吸入，諸如乾粉形式。吸入溶液亦可調配於液化推進劑中用於氣溶膠傳送。在又另一個調配物中，溶液可霧化。

本發明之一個態樣係關於Tau結合抗體及其結合片段作為治療活性劑治療疾病的用途。

本發明之另一態樣係關於Tau結合抗體及其結合片段用於治療Tau 蛋白病的用途。已描述含有Tau包裹體(Clavaguera等人，Brain Pathology 23(2013)342-349)的Tau蛋白病包括阿茲海默氏病(AD)；肌肉萎縮性側索硬化/巴金森氏症-癡呆綜合症；嗜銀顆粒疾病；慢性創傷性腦病變；皮質基底核退化症；彌漫性神經原纖維纏結伴鈣化；唐氏症候群；英國家族性癡呆症；丹麥家族性癡呆症；與MAPT突變所引起之染色體17關聯的額顳葉型癡呆症及巴金森氏症；格斯曼-斯陶思勒-謝恩克爾疾病；瓜德羅普島巴金森氏症；肌緊張性營養不良；出現腦鐵積聚的神經退化；C型尼曼-匹克疾病；非關島運動神經元疾病伴神經原纖維纏結；匹克疾病；腦炎後巴金森氏症；朊病毒蛋白大腦澱粉樣蛋白血管病變；漸進性皮層下神經膠樣變性；進行性核上麻痺(PSP)；SLC9A6相關智力遲鈍；亞急性硬化性全腦炎；僅纏結癡呆症；及出現球狀神經膠質包裹體的白質tau蛋白病。

本發明之另一態樣因此係關於Tau結合抗體及其結合片段用於治療阿茲海默氏病及/或進行性核上麻痺的用途。

相應地，本發明亦關於藉由向有需要的個體投與治療活性量之Tau結合抗體或其結合片段來治療Tau蛋白病(特定而言，阿茲海默氏病及/或進行性核上麻痺)的方法。

本發明亦關於Tau結合抗體或其結合片段用於製造供治療Tau蛋白病(特定言之，阿茲海默氏病及/或進行性核上麻痺)之藥劑的用途。

在本發明之另一態樣中，Tau結合抗體或其結合片段可單獨或與其他藥劑組合用於治療。舉例而言，Tau結合抗體或其結合片段可與至少一種其他治療劑共投與。在某些態樣中，其他治療劑為當正使用Tau結合抗體或其結合片段治療時有效治療相同或不同病症的治療劑。例示性其他治療劑包括(但不限於)：膽鹼酯酶抑制劑(諸如多奈哌齊(donepezil)、加蘭他敏(galantamine)、卡巴拉汀(rovastigmine)及他可林(tacrine))、NMDA受體拮抗劑(諸如美金剛(memantine))、澱粉樣蛋白β肽聚集抑制劑、抗氧化劑、γ分泌酶調節劑、神經生長因子(NGF)模擬物或NGF基因療法、PPARy促效劑、HMS-CoA還原酶抑制劑(抑制素)、安目帕克(ampakines)、鈣離子通道阻斷劑、GABA受體拮抗劑、肝糖合成酶激酶抑制劑、靜脈內免疫球蛋白、蕈毒鹼受體促效劑、菸鹼受體調節劑、主動或被動澱粉樣蛋白β肽免疫接種、磷酸二酯酶抑制劑、血清素受體拮抗劑及抗澱粉樣蛋白β肽抗體或其他抗Tau抗體。其他例示性神經學藥物可選自生長激素或神經營養因子；實例包括(但不限於)腦源性神經營養因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)、神經營養素-4/5、纖維母細胞生長因子(FGF)-2及其他FGF、神經營養素(NT)-3、紅血球生成素(EPO)、肝細胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、轉型生長因子(TGF)-α、TGF-β、血管內皮生長因子(VEGF)、介白素-1受體拮抗劑(IL-lra)、睫毛神經營養因子(CNTF)、神經膠質源神經營養因子(GDNF)、神經秩蛋白(neurturin)、血小板源生長因子(PDGF)、海瑞古林(heregulin)、神經調節蛋白、青蒿琥酯(artemin)、珀瑟芬(persephin)、介白素、神經膠質細胞株源神經營養因子(GFR)、顆粒球群落刺激因子(CSF)、顆粒球-巨噬細胞-CSF、軸突導向因子(netrins)、心營養素-1、刺蝟蛋白(hedgehogs)、白血病抑制因子(LIF)、中期因子(midkine)、多效生長因子(pleiotrophin)、骨形態發生蛋白(BMP)、軸突導向因子、皂角素(saposins)、信號素(semaphorins)及幹細胞因子(SCF)。在某些實施例中，選擇能夠緩解神經學藥物之一或多種副作用的至少一種其他治療劑。上文提及之此類組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或超過兩種治療劑包括於相同或各別調配物中)及各別投與，在此情況下，Tau結合抗體或其結合片段之投與可在其他治療劑及/或佐劑投與之前、同時及/或之後進行。Tau結合抗體或其結合片段亦可與其他干預療法組合使用，諸如(但不限於)輻射療法、行為療法，或此項技術中已知且適於治療或預防神經病症的其他療法。

本發明之另一態樣係關於Tau結合抗體及其結合片段用作診斷活性劑的用途。

本發明之一個態樣亦關於Tau結合抗體及其結合片段用於診斷Tau蛋白病(特定而言，阿茲海默氏病及/或進行性核上麻痺)的用途。

此類診斷測試較佳可針對生物樣品進行。「生物樣品」涵蓋獲自個體之多種樣品類型且可用於診斷或監測分析。定義涵蓋腦脊髓液、血液及生物學來源之其他液體樣品、實體組織樣品(諸如活檢試樣)或組織培養基或來源於其的細胞及其子代。定義亦包括在獲取之後已以任何方式操控的樣品，諸如藉由試劑處理、增溶，或富集某些組分，諸如聚核苷酸。術語「生物樣品」涵蓋臨床樣品且亦包括培養中之細胞、細胞上清液、細胞溶胞物、血清、血漿、生物體液及組織樣品。術語「生物樣品」包括尿液、唾液、腦脊髓液、血液部分(諸如血漿及血清)，及其類似物。

診斷測試較佳可針對不與人類或動物身體接觸的生物樣品進行。此類診斷測試亦稱為活體外測試。

活體外診斷測試可依賴於活體外偵測已獲自個體之生物樣品中之Tau的方法，該方法包含以下步驟：i)使生物樣品與如本文所述的Tau結合抗體或其結合片段接觸；及ii)偵測如本文所述之Tau結合抗體或其結合片段對Tau的結合。藉由比較所偵測之Tau含量與適合對照，接著可診斷tau蛋白病(諸如阿茲海默氏病及/或進行性核上麻痺)之存在或存在可能性。因此可使用此類偵測方法判定個體是否患有tau蛋白病(包括確定tau蛋白病之階段(嚴重度))或處於出現tau蛋白病的風險中。

本發明因此提供活體外診斷個體中之tau蛋白病(諸如阿茲海默氏病及/或進行性核上麻痺)的方法，該方法包含以下步驟：i)藉由使用如本文所述的Tau結合抗體或其結合片段評估自個體獲得之生物樣品中的Tau含量或狀態；及ii)將Tau含量或狀態與指示正常對照個體中之Tau含量或狀態的參考值、標準值或或正常對照值進行比較。生物樣品中之Tau多肽含量及/或狀態與正常對照值之間的顯著差異表示個體患有tau蛋白病，諸如阿茲海默氏病及/或進行性核上麻痺。

根據本文已描述之此等各種態樣及實施例，本發明尤其涵蓋：

1.一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含輕鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：1或與其至少90%一致之序列的CDR1、選自SEQ ID No.：2或與其至少90%一致之序列的CDR2及選自SEQ ID No.：3或與其至少90%一致之序列的CDR3；及/或重鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：4或與其至少90%一致之序列的CDR1、選自SEQ ID No.：5或與其至少90%一致之序列的CDR2及/或選自SEQ ID No.：6或與其至少90%一致之序列的CDR3。

2.如實施例1之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含輕鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：1之CDR1、選自SEQ ID No.：2之CDR2及選自SEQ ID No.：3之CDR3；及重鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：4之CDR1、選自SEQ ID No.：5之CDR2及/或選自SEQ ID No.：6之CDR3。

3.如實施例1或2之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：3中之X₁為A。

4.如實施例1或2之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：3中之X₁為G。

5.如實施例1或2之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：6中之X₂為A。

6.如實施例1或2之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：6中之X₂為Q。

7.如實施例1或2之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：6中之X₂為N。

8.如實施例1或2之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：6中之X₂為D。

9.如實施例1或2之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：6中之X₂為S。

10.如實施例1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為單株抗體。

11.如實施例10之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為嵌合、人類化或完全人類抗體。

12.如實施例11之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為IgG1或IgG4亞型之人類化抗體。

13.如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197-206內的磷酸化Tau區域。

14.如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類Tau之可溶形式、人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)，或結合至人類Tau之可溶形式與人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。

15.一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：7或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID No.：8或與其至少80%一致之序列。

16.如實施例15之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含包含SEQ ID NO：7之輕鏈可變區，及包含SEQ ID No.：8之重鏈可變區。

17.如實施例15或16之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：7中之X₁為A。

18.如實施例15或16之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：7中之X₁為G。

19.如實施例15或16之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：8中之X₂為A。

20.如實施例15或16之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：8中之X₂為Q。

21.如實施例15或16之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：8中之X₂為N。

22.如實施例15或16之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：8中之X₂為D。

23.如實施例15或16之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：8中之X₂為S。

24.如實施例15、16、17、18、19、20、21、22或23中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為單株抗體。

25.如實施例24之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為嵌合抗體。

26.如實施例15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域。

27.如實施例15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類Tau之可溶形式、人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)，或結合至人類Tau之可溶形式與人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。

28.一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：9或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID No.：10或與其至少80%一致之序列。

29.一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：13或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID No.：16或與其至少80%一致之序列。

30.如實施例29之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含包含SEQ ID NO：13之輕鏈可變區，及包含SEQ ID No.：16之重鏈可變區。

31.如實施例29或30之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：13中之X₁為A。

32.如實施例29或30之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：13中之X₁為G。

33.如實施例29或30之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：16中之X₂為A。

34.如實施例29或30之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：16中之X₂為Q。

35.如實施例29或30之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：16中之X₂為N。

36.如實施例29或30之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：16中之X₂為D。

37.如實施例29或30之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：16中之X₂為S。

38.如實施例29之Tau結合抗體或其結合片段，其中重鏈可變區包含SEQ ID No.：14或15。

39.如實施例29之Tau結合抗體或其結合片段，其中輕鏈可變區包含SEQ ID No.：11或12。

40.如實施例29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為單株抗體。

41.如實施例40之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為人類化抗體。

42.如實施例41之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段具有IgG1或IgG4亞型。

43.如實施例29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197-206內的磷酸化Tau區域。

44.如實施例29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類Tau之可溶形式、人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)，或結合至人類Tau之可溶形式與人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。

45.一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含輕鏈，其包含SEQ ID No.：19或與其至少70%一致的序列，及/或重鏈，其包含SEQ ID No.：22或與其至少70%一致的序列。

46.如實施例45之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含包含SEQ ID No.：19的輕鏈，及包含SEQ ID No.：22的重鏈。

47.如實施例45或46之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：19中之X₁為A。

48.如實施例45或46之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：19中之X₁為G。

49.如實施例45或46之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：22中之X₂為A。

50.如實施例45或46之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：22中之X₂為Q。

51.如實施例45或46之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：22中之X₂為N。

52.如實施例45或46之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：22中之X₂為D。

53.如實施例45或46之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：22中之X₂為S。

54.如實施例45之Tau結合抗體或其結合片段，其中重鏈可變區包含SEQ ID No.：14或15。

55.如實施例45之Tau結合抗體或其結合片段，其中輕鏈可變區包含SEQ ID No.：11或12。

56.如實施例45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為單株人類化抗體。

57.如實施例56之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段具有IgG1或IgG4亞型。

58.如實施例45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或57中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197-206內所含的磷酸化Tau區域。

59.如實施例45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類Tau之可溶形式、人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)，或結合至人類Tau之可溶形式與人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。

60.一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197-206內所含之磷酸化Tau區域。

61.如實施例60之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為單株抗體。

62.如實施例60或61之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為嵌合、人類化或完全人類抗體。

63.如實施例62之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為IgG1或IgG4亞型的單株人類化抗體或其結合片段。

64.如實施例60、61、62或63中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類Tau之可溶形式、人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)，或結合至人類Tau之可溶形式與人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。

65.一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64中任一例之Tau結合抗體或其結合片段競爭結合至Tau。

66.如實施例65之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與包含以下之Tau結合抗體或結合片段競爭結合至Tau：包含SEQ ID NO：11或12之輕鏈可變區，及包含SEQ ID No.：14或15之重鏈可變區。

67.一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66或67中任一例之Tau結合抗體或其結合片段競爭結合至大體上相同的Tau抗原決定基。

68.如實施例67之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與包含以下之Tau結合抗體或結合片段結合至大體上相同的Tau抗原決定基：包含SEQ ID NO：11或12之輕鏈可變區，及包含SEQ ID No.：14或15之重鏈可變區。

69.如實施例65、66、67或68中任一例之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為單株抗體。

70.如實施例69之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為嵌合、人類化或完全人類抗體。

71.如實施例70之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為IgG1或IgG4亞型之人類化抗體。

72.如實施例65、66、67、68、69、70或71中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197-206內的磷酸化Tau區域。

73.如實施例65、66、67、68、69、70、71或72中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類Tau之可溶形式、人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)，或結合至人類Tau之可溶形式與人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。

74.如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72或73中任一例之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd及Fv、scFv、Fab-Fv、Fab-scFv、Fab-dsFv、Fab-scFc、scFv-scFc、dsscFv、dsscFv-scFc、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、線抗體或含VHH抗體。

75.一種經分離之核酸分子，其編碼如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74中任一例之Tau結合抗體或其結合片段的輕鏈及/或重鏈。

76.一種選殖或表現載體，其包含一或多種如實施例75之核酸序列。

77.一種宿主細胞，其包含一或多種如實施例75之核酸序列或一或多種如實施例76之選殖或表現載體。

78.如實施例77之宿主細胞，其不為人類胚胎幹細胞。

79.一種製造如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74中任一例之Tau結合抗體或其結合片段的方法，該方法至少包含以下步驟：a)培養如實施例77或78之宿主細胞，及b)分離該Tau結合抗體或其結合片段。

80.如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74中任一例之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其適用作治療活性劑。

81.如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74中任一例之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其用於治療tau蛋白病。

82.如實施例81使用之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該tau蛋白病為阿茲海默氏病。

83.如實施例81使用之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該tau蛋白病為進行性核上麻痺。

84.一種治療tau蛋白病的方法，該方法包含向有需要的個體投與如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74中任一例之Tau結合抗體或其結合片段的步驟。

85.如實施例84之方法，其中該tau蛋白病為阿茲海默氏病。

86.如實施例85之方法，其中該tau蛋白病為進行性核上麻痺。

87.如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74中任一例之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其適用作診斷劑。

88.如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74中任一例之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其用於診斷tau蛋白病。

89.如實施例88使用之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該tau蛋白病為阿茲海默氏病。

90.如實施例88使用之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該tau蛋白病為進行性核上麻痺。

本發明現根據一些實例加以描述，然而，該等實例不應理解為具限制性。

實驗 實驗1-產生Tau結合抗體 1.1 Tau肽設計及產生

肽及免疫原係由Peptide Protein Research Ltd.,Bishop's Waltham,U.K.供應，且根據Atherton及Sheppard之方法、藉由Fmoc固相肽化學技術合成。(參考：Atherton,E.；Sheppard,R.C.(1989).Solid Phase peptide synthesis：a practical approach.Oxford,England：IRL Press)。使用經Fmoc保護的前驅物Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH、Fmoc-Thr(PO(OBzl)OH)-OH、Fmoc-Tyr(3-NO₂)-OH及Fmoc-Lys(Ac)-OH合成含有磷酸化絲胺酸(pSer)、磷酸化蘇胺酸(pThr)、3-硝基酪胺酸(nTyr)及N-ε-乙醯基離胺酸(aLys)的肽。

設計肽且用於產生識別所有Tau同功異型物的Tau結合抗體，該等Tau同功異型物經以下修飾：磷酸化絲胺酸(pSer)、磷酸化蘇胺酸 (pThr)及/或亞硝基酪胺酸(nTyr)；其表示殘基197至206，如與Tau同功異型物2(SEQ ID NO：55，Uniprot代碼：P10636-8，NCBI參考編號：NP_005901.2)所比對：N-acetyl-nTyr pSer pSer Pro Cys* pSer Pro Gly pThr Pro-醯胺

(肽稱為T197，且定義於SEQ ID NO：56中)。

N及C肽末端分別用乙醯基及醯胺基團封端且cys*表示半胱胺酸側鏈硫醇基為連接至載體蛋白質或生物素之結合點以便分別製備免疫原或分析試劑，如下詳述。用於監測抗血清效價的分析試劑係藉由相等質量之順丁烯二醯亞胺基-PEG-生物素與肽發生反應來製備。三種不同免疫原係藉由肽與ε-胺基離胺酸側鏈上已經順丁烯二醯亞胺基團取代之以下載體蛋白質之反應來製備：鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet haemocyanin；KLH)、鴿血清白蛋白(BSA)及卵白蛋白(OVA)。

1.2 免疫接種

使用注射器，將藉由劇烈混合所得之500μg於等體積之完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant；CFA)中乳化之總肽混合物(T197及T211)將2隻雌性紐西蘭(New Zealand)白兔(>2kg)皮下免疫。設計與KLH、OVA及BSA結合的肽且交替地免疫。使用不完全弗氏佐劑(IFA)，以21天時間間隔給予兔2次加打注射，免疫後第14天自耳放血。使用所製備且於10% DMSO/FCS中在-80℃冷凍之脾臟、骨髓及周邊血液單核細胞之單一細胞懸浮液最後加打之後的第14天終止。

1.3 B細胞培養

使用類似於Zubler等人(1985)所述的方法製備B細胞培養物。簡言之，來自免疫兔的PBMC源B細胞以每孔約3000個細胞的密度在條形碼編碼之96孔組織培養盤中、在37℃、在5% CO₂氛圍中培養七天，該等組織培養盤具有每孔200μl RPMI 1640培養基(Gibco BRL)，該培養基補充有10% FCS(PAA laboratories ltd)、2% HEPES(Sigma Aldrich)、1% L-麩醯胺酸(Gibco BRL)、1%青黴素/鏈黴素溶液(Gibco BRL)、0.1% β-巰基乙醇(Gibco BRL)、3%活化脾細胞培養物上清液及γ照射突變型EL4鼠類胸腺瘤細胞(5x10⁴/孔)。總共獲取約1.2×10⁷個B細胞樣品。

1.4 初始篩選

使用基於螢光之均質結合分析，使用塗有生物素化T197肽之Superavidin^TM珠粒(Bangs Laboratories)作為靶抗原來源，測定B細胞培養物上清液中之T197肽特異性抗體的存在。篩選包括使用Matrix Platemate液體處置器，自條形碼編碼的96孔組織培養盤轉移10ul上清液置於條形碼編碼的384孔黑壁分析盤中，該384孔分析盤含有固著於珠粒上的T197(10ul/孔)。結合經由山羊抗兔IgG Fcγ特異性Cy-5結合物(Jackson)展現。在Applied Biosystems 8200細胞偵測系統上讀盤。

1.5 二次篩選

初始篩選之後，使用Aviso Onyx揀選機器人將陽性上清液合併於條形碼編碼之96孔母液盤上且將細胞培養盤中的B細胞在-80℃冷凍。接著在ELISA分析中，針對T197肽以及單獨抗生蛋白鏈菌素篩選母液盤。此舉旨在測定各孔的肽特異性，及排除對Superavidin珠粒顯示非特異性結合的假陽性孔。ELISA分析包括將生物素化T197捕捉於384孔Maxisorp盤(ThermoScientific/Nunc)上，該等Maxisorp盤經含有抗生蛋白鏈菌素的碳酸鹽塗佈緩衝液(dH₂O+0.16% Na₂CO₃+0.3% NaHCO₃)塗佈。培養盤用1% w/v PEG/PBS阻斷且接著與每孔10ul B細胞培養物上清液(用阻斷緩衝液1：1稀釋)一起培育。向盤中添加二次HRP結合山羊抗兔IgG fc抗體(Stratech Scientific Ltd/Jackson ImmunoResearch)，隨後利用TMB受質(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺，得自EMD Millipore；10μl/孔)目測結合。使用BioTek Synergy 2微定量盤式讀取器，在630nM量測光密度。初始結合分析鑑別出880個成功結果且在ELISA篩選之後，其中406個顯示特異性結合至T197。選擇對T197展現特異性的B細胞上清液用於進一步藉由Biacore分析，以鑑別具有最佳親和力的彼等物。

1.6 可變區回收

為了允許經由選擇所關注之孔回收抗體可變區基因，必須進行解褶積步驟以能夠在含有異質B細胞群的指定孔中鑑別出抗原特異性B細胞。此係使用螢光焦點方法(Clargo等人，2014)達成。簡言之，將得自陽性孔之分泌免疫球蛋白之B細胞與塗有生物素化T197肽之抗生蛋白鏈菌素珠粒(New England Biolabs)及1：1200最後稀釋之山羊抗兔Fcγ片段特異性FITC結合物(Jackson)混合。在37℃靜態培育1小時之後，由於在該B細胞周圍存在螢光光環而可鑑別出抗原特異性B細胞。接著利用Eppendorf微操作器挑選多個使用Olympus顯微鏡所鑑別的此等個別B細胞純系且沈積至PCR管中。

使用重鏈及輕鏈可變區特異性引子，藉由逆轉錄(RT)-PCR自單細胞中回收抗體可變區基因。在Aviso Onyx液體處置機器人上進行兩輪PCR，其中2個巢式PCR合併限制位點位於3'端及5'端，從而將可變區選殖入兔IgG(VH)或兔κ(VL)哺乳動物表現載體中。將得自31個不同孔的抗T197抗體基因成功地選殖入表現載體中。使用Fectin 293(Invitrogen)將重鏈及輕鏈構築體共轉染至HEK-293細胞中且在125ml錐形瓶(Erlenmeyer flask)中以30ml體積表現重組抗體。5-7天表現之後，收集上清液且使用親和層析純化。

實驗2-進一步篩選所鑑別的抗體 2.1 在大腸桿菌中產生Tau

以合成方式產生編碼不同Tau同功異型物的基因且將密碼子最佳化以便在大腸桿菌中表現。使用標準分子生物學技術次選殖入經修飾之pET32載體中，該載體經工程改造以產生具有N端6His-TEV標記的 Tau。

大腸桿菌BL 21(DE3)細胞經上述載體轉型，且使用標準技術表現蛋白質。

接著藉由離心回收大腸桿菌細胞，溶解且藉由使用NiNTA(Qiagen)的親和層析自可溶溶離份中捕捉Tau蛋白。使用TEV蛋白酶移除6His標記，隨後進行第二NiNTA層析步驟。經純化之Tau於適合緩衝液中進行緩衝交換，此視應用而定。為了免疫而產生的樣品已使用Proteus NoEndo^TM管柱(Vivaproducts)移除內毒素。

產生同位素標記之Tau用於核磁共振(NMR)研究：如上文所述進行蛋白質表現，但其中使用最少培養基將¹⁵N、¹³C及²H併入蛋白質中。溶解大腸桿菌細胞集結粒且使用NiNTA(Qiagen)親和層析步驟純化Tau蛋白，利用TEV蛋白酶移除6His標記且接著藉由凝膠過濾、使用Superdex 200單元(GE-Healthcare)純化Tau蛋白。

2.2 在HEK293中產生Tau

使用野生型DNA序列，以合成方式產生編碼Tau同功異型物2的基因。使用標準分子生物學技術將其次選殖入表現載體pMV-10HisTEV(含有CMV啟動子)中，其經工程改造以產生具有N端10His-TEV標記的Tau。

所得載體係使用Expi293^TM表現系統(Invitrogen)、依據製造商方案轉染。此系統係使用來源於HEK293細胞株的Expi293F人類細胞。

Tau蛋白聚積於培養基中，使用固著金屬離子親和層析Ni Sepharose Excel(GE Healthcare)自其中回收。接著使用TEV蛋白酶移除10His標記，隨後再施加至Ni Sepharose管柱上且收集流過的裂解Tau。經純化之Tau於適合緩衝液中進行緩衝交換，此視應用而定。

2.3 利用人類腦樣品製備PHF Tau原纖維

根據Ksiezak-Reding及Wall公開的方案(Neurobiology of Aging 15, 11-19,1994)，自得自患有阿茲海默氏病(AD)或進行性核上麻痺(PSP)或額顳葉型癡呆症(FTD)之供者的腦樣品中純化成對螺旋狀纖絲(PHF)-Tau蛋白。回收先前已描述之PHF-Tau增濃之溶離份8(等效於此參考文獻中之蔗糖梯度離心之前的粗PHF-Tau)及溶離份11(等效於溶離份A2，如此參考文獻中所述的SDS可溶PHF)且用於實驗3之BIAcore分析及細胞分析。

2.4 ELISA篩選

接著藉由ELISA及藉由Biacore對純化抗體進行進一步篩選，以證實重組抗體之活性及選擇最高親和力及最具特異性的抗體。ELISA分析再次包括將生物素化T197捕捉於384孔Maxisorp盤(ThermoScientific/Nunc)上，該等Maxisorp盤經含有抗生蛋白鏈菌素的碳酸鹽塗佈緩衝液(dH₂O+0.16% Na₂CO₃+0.3% NaHCO₃)塗佈。各別盤亦塗有不同Tau肽，該等肽與Tau分子的替代區域映射以檢查僅結合至T197序列的特異性。盤用1% w/v PEG/PBS阻斷且接著與純化之短暫上清液之若干稀釋液一起培育。向盤中添加二次HRP結合山羊抗兔IgG fc抗體(Stratech Scientific Ltd/Jackson ImmunoResearch)，隨後利用TMB受質(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺，得自EMD Millipore；10μl/孔)目測結合。使用BioTek Synergy 2微定量盤式讀取器，在630nM量測光密度。所選抗體(具有SEQ ID No.：7之兔VL及SEQ ID No.：8之兔VH的AB1)的資料顯示於圖1中。如可見，AB1僅對T197顯示高度選擇性結合，而對對應於Tau分子之其他區域的四種肽未顯示高度選擇性結合：- T174 N-乙醯基-C*K pT P P A P K pT P P醯胺(SEQ ID No.：62)；- T211 N-乙醯基-R pT P pS L P pT P C*醯胺(SEQ ID No.：63)；- T230 N-乙醯基-R pT P P K pS P pS SC*醯胺(SEQ ID No.：57)；及- T396 N-乙醯基-C*pS P V V pS G D pT pS醯胺(SEQ ID No.：64)；*生物素結合之位置。

2.5 BIAcore篩選

短暫表現所選兔抗Tau IgG抗體純系，純化且使用SPR Biacore T200平台分析。首先使用固著的山羊F(ab')2抗兔Fcγ試劑將抗體捕捉於CM5感測晶片上。流動池2、3及4顯示5600-6100RU之間的固著量，而經阻斷的流動池1(僅聚葡萄糖)充當參考物。經純化之IgG於得自GE Healthcare的HBS-EP+緩衝液中稀釋至0.5μg/ml且以10μl/min之流速捕捉於晶片上。每個捕捉步驟之後，注射180秒具有肽/抗生蛋白鏈菌素複合物、緩衝對照物及去磷酸化肽/抗生蛋白鏈菌素複合物的分析物。使用10μl 100μM肽於含有3mM EDTA及1% DMSO之HBS-EP+中的溶液使肽發生去磷酸化，將其在含有0.3mM EDTA的HBS-N緩衝液(GE Healthcare)1：10稀釋且用2μl 0.5M MgCl₂在EDTA中達到飽和。添加2μl小牛腸鹼性磷酸酶(NEB，目錄號M0290S)1：10稀釋液(於HBS-N)中且在37℃培育一小時，接著在4℃儲存。藉由添加1μl 0.5M EDTA至混合物中來抑制磷酸酶反應。溶液用於製備去磷酸化肽/抗生蛋白鏈菌素複合物。對於具有SEQ ID No.：7之VL區域及SEQ ID No.：8之VH的兔抗體而言，使用得自具有胺基酸序列SEQ ID No.：57之Tau區域230-238的肽T230作為陰性對照物。用二價分析物模型擬合資料。

表1顯示此抗體當結合至T197及T230磷酸化及去磷酸化肽/抗生蛋白鏈菌素複合物時所量測的親和力值。

所選單株Fab片段(mFab)係使用Pierce Ficin裂解套組(目錄號44980，Thermo Scientific)、根據製造商方案，由具有SEQ ID No.：58之輕鏈及SEQ ID No.：59之重鏈的鼠類化mAB1抗體製備。在Biacore分析中使用280nm吸光度測定Fab儲備溶液之濃度。將得自阿茲海默氏病患者的不溶性Tau蛋白製劑(AD-PHF，溶離份11)、HEK源Tau同功異型物-2單體(胺基酸1-441)及大腸桿菌中所表現的同功異型物-2單體用胺固著至CM5晶片上，且使用Biacore T200儀器量測抗Tau mFab之結合。使用得自GE Healthcare的緩衝液HBS-EP進行固著，但其中AD-PHF使用10mM乙酸(pH 3.0)。HBS-EP+緩衝液補充有300mM NaCl及1.25% CM-Dextran(Sigma)且用作分析緩衝液。雖然使用流動池(Fc)1作為參考物，但針對Fc2-4獲得以下RU值：5ug/ml大腸桿菌Tau為44RU，5ug/ml HEK Tau為56RU，且AD-PHF物質之1：20稀釋溶液為500RU。使用兩個60秒10mM甘胺酸(pH1.7)循環進行再生。使用10ul/min流速進行固著及再生，而使用30ul/min流速進行分析物結合。對於AD-PHF而言，應用多次人工注射以達到500RU，包括EDC/NHS及EtoA封端。使用90ul分析物注射180秒或300秒用於解離，每個mFab樣品或緩衝液對照物應用五個啟動循環及12個循環。各mFab使用600nM溶液之11個1：3稀釋液與緩衝液。

2.6 藉由BIAcore進行的抗原決定基定位

使用Biacore 3000儀器及HBS-EP(GE Healthcare)作為操作緩衝液，將自HEK細胞表現及純化的重組Tau同功異型物-2單體(胺基酸1-441)及自阿茲海默氏病患者腦中分離之呈成對螺旋狀纖絲製劑形式的不溶性Tau蛋白(AD-PHF)經胺固著至CM5晶片上。藉由以10μl/min之流速注射50mM N-羥基丁二醯亞胺與200mM 1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亞胺之70μl新鮮混合物來活化此等流動池及參考流動池的羧甲基聚葡萄糖表面之後，前者分別與流動池2及流動池4發生胺偶合。藉由注射160μl 50μg/ml 10mM乙酸鹽pH 5.0緩衝液達成tau單體的固著，而藉由注射二十個160μl 2μg/ml等分試樣(於10mM乙酸中)(pH3.0)來使AD-PHF固著。使用50μl 1M乙醇胺.HCl pH 8.5之脈衝使測試及對照流動池表面不活化。

藉由具有SEQ ID NO：17之輕鏈及SEQ ID NO：20之重鏈的Tau結合人類化抗體(L17H20)的預培育溶液及測試肽或緩衝液對照物(於操作緩衝液中分別以200nM及5000nM製備)進行抗原決定基定位。藉由在參考池、tau單體及AD-PHF流動池上注射50μl，在10μl/min的恆定流速下，在一系列感測圖譜循環中分別測試此等物。在每次注射結束之後15秒所取的報導點記錄抗體結合的反應單位，作為測試流動池與參考流動池之差值。每一個循環結束時，藉由兩次注射20μl含有1.5M胍的磷酸鹽緩衝鹽水來使晶片再生。

根據結合至固著tau單體或結合至AD-PHF之抗體的百分比抑制程度(相對於根據對照循環所計算之平均抗體結合值)，抗體對所指定測試肽的反應性為明顯的。

基於含有Tau蛋白之殘基196至206的肽(SEQ ID NO：65)來製備且分析測試肽，且如表3所定義來分析磷酸化絲胺酸、磷酸化蘇胺酸及/或亞硝基酪胺酸的轉譯後修飾作用。

基於此分析，總結出最小抗原決定基為藉由SEQ ID NO：55之胺基酸201至206定義的磷酸化Tau區域(對應於基元Gly pSer Pro Gly pThr Pro)，且此抗原決定基對於SEQ ID NO：55之位置205存在磷酸化蘇胺酸及SEQ ID NO：55之位置202存在磷酸化絲胺酸具有絕對需要。

實驗3-所鑑別之抗體的進一步表徵 3.1 細胞分析 利用Tau轉殖基因小鼠製備粗可溶性及不溶性溶離份以誘導Tau聚集

在此等實驗中，使用表現人類Tau P301S(Allen等人，2002 J.Neurosci.22(21)：9340-51)及表現人類Tau P301L(Lewis等人，2000Nat Genet.(4)：402-5.；Götz J等人，2001 J Biol Chem.276(1)：529-34)的轉殖基因小鼠。

粗可溶性及不溶性溶離份係由P301S及P301L Tau轉殖基因小鼠之腦藉由差速離心來製備。簡言之，使用手持式均質器Pellet Pestle Motor(Kontes)，在1.5ml微量離心管中，在冰上，將得自P301S(脊髓及腦幹)及P301L(中腦及腦幹)Tau轉殖基因小鼠的腦組織在冰冷TBS(Fisher Scientific)中均質化。接著，使勻漿(H)在4℃下以4,000g離心10分鐘以移除組織殘渣。所得上清液(S0)在4℃下以20,000g離心20分鐘，以提供對應於粗可溶性溶離份(S1)的上清液。將剩餘集結粒(P1)再懸浮於1ml於TBS中製備的1%十二烷基肌酸鈉(sarkosyl)溶液中，在室溫下培育1小時，且接著在4℃下以100,000g離心1小時。捨棄上清液(S2)。集結粒(P2)用5ml冰冷TBS洗滌，且接著再懸浮於TBS中以提供粗不溶性溶離份(P2')。

製備表現具有P301S突變之人類Tau的HEK-293-F細胞

使用293fectin(Life Technologies)，根據製造商說明書，用表現具有P301S突變之人類Tau同功異型物2的pcDNA3.1(+)載體轉染HEK-293-F細胞(Life Technologies)。經轉染之細胞的等分試樣於液氮中儲存。

誘導Tau聚集

圖2說明用於表徵Tau治療抗體之活性之細胞聚集分析的不同步驟。第1天，使表現具有P301S突變之人類Tau同功異型物2(P301S-tau)的HEK-293-F細胞在37℃解凍且在含有10%胎牛血清及1%青黴素-鏈黴素(FFBS)的293表現培養基(Life Technologies)中稀釋。使用自動細胞計數器(Vi-CELL XR,Beckman Coulter)對細胞計數，且接著以每孔25,000個活細胞的密度塗鋪於聚-D-離胺酸預塗之96孔盤(Greiner Bio-One)中。使細胞在37℃、5% CO₂中維持。同日，在4℃下，在溫和攪拌下，將得自患有阿茲海默氏病(AD-PHF，溶離份8)或進行性核上麻痺(PSP-PHF，溶離份8)或額顳葉型癡呆症(FTD-PHF)之患者之經音波處理的人類不溶性Tau或得自P301S或P301L轉殖基因小鼠大腦的腦溶離份(作為晶種用於誘導Tau聚集)與抗Tau抗體一起或不與抗Tau抗體一起在FFBS培養基中培育隔夜。對於AD及PSP樣品而言，AD-PHF(溶離份8)分別在80ng/μl及60ng/μl使用；得自轉殖基因小鼠P301S及P301L的可溶性腦溶離份分別在0.1μg/μl及1.2μg/μl使用。第2天，將晶種或晶種/抗體混合物施加至細胞中維持24小時。第3天，培養基用含有抗體的新鮮FFBS培養基置換，且使細胞在培養物中再維持24小時。第4天，使用Tau聚集分析套組(Cisbio)，基於均質時差式螢光能量轉移(HTRF)，根據製造商說明書量測Tau聚集。利用SpectraMax Paradigm(Molecular Devices)量測螢光。聚集係作為相對於對照(-)的聚集百分比來報導，對照對應於缺乏抗體的情況下，外源性原纖維或溶離份所誘導的最大聚集反應。

測試AB1及先前技術之其他Tau結合抗體對所誘導之Tau聚集的影響。先前技術抗體為WO2014/028777A2之IPN002、WO2013/096380A2之PT3、WO2010/142423A2之mAb2.10.3及WO 2014/008404之HJ8.5。

此分析之結果概述於表3及圖3中。

表4概述具有SEQ ID NO：9之鼠類化VL及SEQ ID No.：10之鼠類化VH之AB1(VL9VH10)、具有SEQ ID No.：17之輕鏈及SEQ ID No.：23之重鏈之Tau結合抗體(L17H23)、具有SEQ ID No.：17之輕鏈及SEQ ID No.：24之重鏈之Tau結合抗體(L17H24)、具有SEQ ID No.：17之輕鏈及SEQ ID No.：20之重鏈之Tau結合抗體(L17H20)、具有SEQ ID No.：17之輕鏈及SEQ ID No.：21之重鏈之Tau結合抗體(L17H21)以及針對一系列得自各種腦萃取物之Tau晶種之競爭抗體的效力(IC₅₀)及最大功效(I_max，300nM)。而圖3顯示具有SEQ ID No.：17之輕鏈及SEQ ID No.： 20之重鏈之Tau結合抗體(L17H20)及具有SEQ ID No.：17之輕鏈及SEQ ID No.：21之重鏈之Tau結合抗體(L17H21)的功效(在使用得自人類PSP患者之人類Tau病理性原纖維的細胞聚集分析中)。

ND：未測定。

(*)100nM下之最大功效

在細胞分析中，使用得自P301L(n=2)、AD(n=3)及PSP(n=3)的Tau晶種進行進一步實驗以測定具有SEQ ID NO：9之鼠類化VL及SEQ ID No.：10之鼠類化VH之AB1(VL9VH10)的活性，得到的最終IC₅₀值分別為15nM、27nM及70nM；及I_max值分別為79%、68%及57%。

3.2 組織學分析

分析具有SEQ ID NO：7之兔VL及SEQ ID No.：8之兔VH的AB1、具有SEQ ID No.：11之VL及SEQ ID No.：14之VH(VL11VH14)或SEQ ID No.：11之VL及SEQ ID No.：15之VH(VL11VH15)的人類化AB1以及先前技術之抗體IPN002、PT3及Mab2.10.3，且使用得自患有阿茲海默氏病之供者之人類海馬體的冷凍切片測定最佳濃度，該供者先前已顯示含有病理性Tau結構(使用AT8免疫染色)(諸如以下文獻中所述：Braak及Braak,1995,Neurobiol Aging；16(3)：271-8；及Porzig等人，2007 Biochem Biophys Res Commun；358(2)：644-9)。除101.4(陰性對照抗體)之外，AB1及所有先前技術抗體展現特異性及濃度依賴性免疫反應性。根據此等資料，選擇單一、最佳濃度的抗體且用於篩選一組六個人類腦樣品。三個樣品來源於患有阿茲海默氏病的供者或來源於展現高程度Tau病理學(使用AT8免疫染色所偵測的陽性Tau病理學)的年邁供者，且三個樣品來源於無Tau病理學(使用AT8免疫染色偵測到陰性Tau病理學)之供者。

AB1、VL11VH14、VL11VH15、PT3及Mab2.10.3顯示AT8陽性樣品中存在相似的免疫染色圖案。在陽性Tau病理學樣品之海馬體及顳葉皮層內觀測到神經原纖維纏結(神經元內NFT)、細胞質Tau、神經炎斑樣結構及神經纖維網絲之特異性免疫染色。然而在AT8陰性組織中偵測到的免疫染色少得多。此結果表明相較於非病理性Tau，此等抗體優先識別病理性Tau。

IPN002提供陽性與陰性Tau病理學樣品中均存在相似信號。

3.3 西方墨點

使用化學發光讀出進行西方墨點法：將由人類AD、PSP製備的溶胞物負載至10%聚丙烯醯胺凝膠上(每個泳道20μg蛋白質)。藉由SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)分離蛋白質且電轉移至PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上。膜於含有4% BSA(牛血清白蛋白)的TBST(50mM Tris、150mM NaCl、0.05% Tween 20，pH經HCl調節至pH 7.6)中阻斷。膜在4℃與一級抗體或非免疫IgG對照抗體一起培育隔夜，用TBST沖洗，與二級抗體(小鼠抗生物素)一起培育1小時，用TBST沖洗，與三級抗體(抗小鼠IgG-過氧化酶)一起培育1小時，用TBST沖洗，且使用ECL(增強式化學發光)顯色。

具有SEQ ID NO：9之鼠類化VL及SEQ ID No.：10之鼠類化VH的mAB1結合至來自人類AD樣品的病理性Tau，但對PSP的結合弱。參見圖4。

實驗4-所鑑別抗體之人類化

具有SEQ ID No.：7之VL及SEQ ID No.：8之VH的AB1係藉由將來自兔抗體V區的CDR移植至人類生殖系抗體V區構架上來發生人類化。為恢復抗體活性，來自兔V區之許多構架殘基亦保留在人類化序列中。可使用Adair等人(1991)(Humanised antibodies.WO91/09967)概述之方案選擇此等殘基。兔抗體(供體)V區序列與人類生殖系(受體)V區序列的比對以及所設計的人類化序列顯示於圖5及圖6中。自供體移植至受體序列之CDR如Kabat(Kabat等人，1987)所定義，但其中使用組合之Chothia/Kabat定義之CDR-H1除外(參見Adair等人，1991 Humanised antibodies.WO91/09967)。

選擇人類V區IGKV1-39與JK4 J區(IMGT，http：//www.imgt.org/)作為抗體AB1輕鏈CDR的受體。移植物gL4及gL9中的輕鏈構架殘基皆來自人類生殖系基因。利用移植物gL9使CDRL3發生突變以修飾潛在去醯胺化位點。選擇人類V區IGHV4-39與JH4 J區(IMGT，http：//www.imgt.org/)作為抗體AB1之重鏈CDR的受體。與多種兔抗體共同的是，抗體AB1之VH基因比所選人類受體短。與人類受體序列比對時，抗體AB1之VH區中的構架1缺乏人類化抗體中所保留的N端殘基(圖6)。AB1兔VH區中之構架3亦缺乏位於β片股D與E之間之環中的兩個殘基(75及76)：在移植物gH41及gH49中，間隙填充有來自所選人類受體序列的相應殘基(離胺酸75，K75；天冬醯胺76，N76)(圖 6)。移植物gH41及gH49中的重鏈構架殘基皆來自人類生殖系基因，但其中一或多個殘基選自包含殘基71及78(Kabat編號)之群，其中分別保留供體殘基離胺酸(K71)及纈胺酸(V78)。殘基K71及V78之保留為實現人類化抗體之完全效力所必需的。人類構架位置1之麩醯胺酸殘基經麩胺酸(E1)置換，以提供均質產物之表現及純化：將抗體及抗體片段之N端的麩醯胺酸轉化成焦麩胺酸鹽已被廣泛報導。利用移植物gH41及gH49使CDRH3發生突變，以修飾潛在去醯胺化位點。

設計編碼各種抗體之許多變異體重鏈及輕鏈V區序列的基因且藉由DNA2.0 Inc的自動化合成方法構築。重鏈及輕鏈V區之其他變異體係藉由針對寡核苷酸之突變誘發(在一些情況下，包括CDR內之突變以修飾潛在去醯胺化位點)修飾VH及VK基因來產生。為了短暫表現，將人類化輕鏈V區基因選殖入UCB人類輕鏈表現載體pMhCK中，該表現載體含有編碼人類κ鏈恆定區的DNA(Km3異型)。將人類化重鏈V區基因選殖入UCB人類γ-4重鏈表現載體pMhγ4P FL中，該表現載體含有編碼具有鉸鏈穩定化突變S241P之人類γ-4重鏈恆定區的DNA(Angal等人，Mol Immunol.1993,30(1)：105-8)。或者，將人類化VH基因選殖入UCB γ-1重鏈表現載體pMhγ1FL中，該表現載體含有編碼人類γ-1恆定區的DNA(G1m17，1個異型)。為了評估人類化抗體的單價結合動力學，亦將人類化VH基因選殖入UCB人類Fab-HIS表現載體pMhFab10HIS中，該表現載體含有編碼人類γ-1 CH1-鉸鏈域的DNA，該域具有十個組胺酸殘基的C端標記：該組胺酸標記有助於親和層析純化所表現之Fabs。將所得重鏈及輕鏈載體共轉染至HEK293懸浮細胞中係使用293 Fectin(12347-019 Invitrogen)達成，且促使人類化重組抗體以人類IgG4P、IgG1或Fab-HIS形式表現。

使變異體人類化抗體鏈及其組合表現且評估其效力(相對於親本抗體)、其生物物理學特性及用於下游處理的適合性。

為了使哺乳動物細胞穩定表現人類化重組抗體，使人類化輕鏈V區基因與編碼人類C-κ恆定區的DNA序列(Km3異型)連接，以產生鄰接輕鏈基因。使人類化重鏈基因與編碼人類γ-4P重鏈恆定區或人類γ-1重鏈恆定區(G1m17，1個異型)的DNA連接，以產生鄰接重鏈基因。將重鏈及輕鏈基因選殖入哺乳動物表現載體中。

<110> 比利時商UCB生物製藥公司

<120> Tau結合抗體

<130> PF0031-EP-EPA

<160> 65

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-L1

<400> 1

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-L2

<400> 2

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-L3

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為A或G

<400> 3

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-H1

<400> 4

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-H2

<400> 5

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-H3

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可為A、Q、N、D或S

<400> 6

<210> 7

<211> 110

<212> PRT

<213> 兔

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (91)..(91)

<223> Xaa可為A或G

<400> 7

<210> 8

<211> 117

<212> PRT

<213> 兔

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (100)..(100)

<223> Xaa可為A、Q、N、D或S

<400> 8

<210> 9

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠類化

<400> 9

<210> 10

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠類化

<400> 10

<210> 11

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 11

<210> 12

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 12

<210> 13

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (91)..(91)

<223> Xaa可為A或G

<400> 13

<210> 14

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 14

<210> 15

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 15

<210> 16

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (103)..(103)

<223> Xaa可為A、Q、N、D或S

<400> 16

<210> 17

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 17

<210> 18

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 18

<210> 19

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (91)..(91)

<223> Xaa可為A或G

<400> 19

<210> 20

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 20

<210> 21

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 21

<210> 22

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (103)..(103)

<223> Xaa可為A、Q、N、D或S

<400> 22

<210> 23

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 23

<210> 24

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 24

<210> 25

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (103)..(103)

<223> Xaa可為A、Q、N、D或S

<400> 25

<210> 26

<211> 330

<212> DNA

<213> 兔

<400> 26

<210> 27

<211> 351

<212> DNA

<213> 兔

<400> 27

<210> 28

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠類化

<400> 28

<210> 29

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠類化

<400> 29

<210> 30

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 30

<210> 31

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 31

<210> 32

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 32

<210> 33

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 33

<210> 34

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 34

<210> 35

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 35

<210> 36

<211> 1341

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 36

<210> 37

<211> 1341

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 37

<210> 38

<211> 1350

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 38

<210> 39

<211> 1350

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 39

<210> 40

<211> 132

<212> PRT

<213> 兔

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(22)

<223> 信號序列

<400> 40

<210> 41

<211> 136

<212> PRT

<213> 兔

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(19)

<223> 信號序列

<400> 41

<210> 42

<211> 396

<212> DNA

<213> 兔

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(66)

<223> 信號序列

<400> 42

<210> 43

<211> 408

<212> DNA

<213> 兔

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(57)

<223> 信號序列

<400> 43

<210> 44

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 44

<210> 45

<211> 114

<212> PRT

<213> 智人

<400> 45

<210> 46

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人

<400> 46

<210> 47

<211> 342

<212> DNA

<213> 智人

<400> 47

<210> 48

<211> 12

<212> PRT

<213> 兔

<400> 48

<210> 49

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 49

<210> 50

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 50

<210> 51

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 51

<210> 52

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 52

<210> 53

<211> 12

<212> PRT

<213> 兔

<400> 53

<210> 54

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 54

<210> 55

<211> 441

<212> PRT

<213> 智人

<400> 55

<210> 56

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修飾

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> 乙醯化及亞硝基化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> 亞硝基化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> 磷酸化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> 磷酸化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(6)

<223> 生物素結合位置

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> 磷酸化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> 磷酸化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> 醯胺化

<400> 56

<210> 57

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修飾

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> 乙醯化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> 磷酸化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> 磷酸化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> 磷酸化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> 生物素結合位置

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> 醯胺化

<400> 57

<210> 58

<211> 217

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 58

<210> 59

<211> 442

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 59

<210> 60

<211> 651

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 60

<210> 61

<211> 1326

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 61

<210> 62

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修飾

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> 乙醯化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> 生物素結合位置

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> 磷酸化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> 磷酸化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> 醯胺化

<400> 62

<210> 63

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修飾

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> 乙醯化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> 磷酸化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> 磷酸化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> 磷酸化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> 生物素結合位置

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> 醯胺化

<400> 63

<210> 64

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修飾

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> 乙醯化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> 生物素結合位置

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> 磷酸化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> 磷酸化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> 磷酸化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> 磷酸化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> 醯胺化

<400> 64

<210> 65

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 65

Claims

一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含輕鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：1之CDR1、選自SEQ ID No.：2之CDR2及選自SEQ ID No.：53之CDR3；及重鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：4之CDR1、選自SEQ ID No.：5之CDR2及選自SEQ ID No.：6之CDR3，其中Xaa為Q。
一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含包含SEQ ID No.：11之輕鏈可變區，及包含SEQ ID No.：14之重鏈可變區。
如請求項2之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含SEQ ID No.：17之輕鏈，及SEQ ID No.：20之重鏈。
一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與如請求項1之Tau結合抗體或其結合片段競爭結合至Tau。
一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與如請求項1之Tau結合抗體或其結合片段結合至相同的Tau抗原決定基。
如請求項1、2、3、4或5中任一項之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為單株人類化抗體。
如請求項1、2、3、4或5中任一項之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至SEQ ID No.：55之胺基酸197至206內的磷酸化Tau區域。
如請求項1、2、3、4或5中任一項之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至人類Tau之可溶形式、人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)，或結合至人類Tau之可溶形式與人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。
一種經分離之核酸分子，其編碼如請求項1、2、3、4、5、6、7或8中任一項之Tau結合抗體或其結合片段的輕鏈及/或重鏈。
一種選殖或表現載體，其包含一或多種如請求項9之核酸分子。
一種宿主細胞，其包含一或多種如請求項9之核酸分子或一或多種如請求項10之選殖或表現載體。
一種製造如請求項1、2、3、4、5、6、7或8中任一項之Tau結合抗體或其結合片段的方法，該方法至少包含以下步驟：c)培養如請求項11之宿主細胞，及d)分離該Tau結合抗體或其結合片段。
一種如請求項1、2、3、4、5、6、7或8中任一項之Tau結合抗體或其結合片段之用途，其係用以製備治療tau蛋白病之藥物。
如請求項13之用途，其中該tau蛋白病為阿茲海默氏病或進行性核上麻痺。
一種如請求項1、2、3、4、5、6、7、或8中任一項之Tau結合抗體或其結合片段之用途，其係用以製備用於診斷之藥物。
如請求項15之用途，其中該藥物係用於診斷tau蛋白病。
如請求項16之用途，其中該tau蛋白病為阿茲海默氏病或進行性核上麻痺。