ES2933491T3 - Inmunoterapia tau - Google Patents

Abstract

La invención proporciona anticuerpos contra tau. Los anticuerpos inhiben o retrasan las patologías asociadas a tau y el deterioro sintomático asociado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunoterapia tau

Antecedentes

Tau es una proteína humana bien conocida que puede existir en formas fosforiladas (véase, p. ej., Goedert, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:4051-4055 (1988); Goedert, EMBO J. 8:393-399 (1989); Lee, Neuron 2:1615-1624 (1989); Goedert, Neuron 3:519-526 (1989); Andreadis, Biochemistry 31:10626-10633 (1992). Se ha descrito que Tau tiene un papel en la estabilización de los microtúbulos, particularmente en el sistema nervioso central. El cerebro libera tau total (t-tau, es decir, formas fosforiladas y no fosforiladas) y fosfo-tau (p-tau, es decir, tau fosforilada) en respuesta a una lesión neuronal y neurodegeneración y se ha descrito que aparece en niveles elevados en el CSF de los pacientes de Alzheimer en relación con la población general (Jack et al., Lancet Neurol 9: 119-28 (2010)).

Tau es el componente principal de los ovillos neurofibrilares, que junto con las placas son un sello característico de la enfermedad de Alzheimer. Los ovillos constituyen fibrillas anormales que miden 10 nm de diámetro y que se presentan en pares enrollados en forma helicoidal con una periodicidad regular de 80 nm. La tau dentro de los ovillos neurofibrilares está anormalmente fosforilada (hiperfosforilada) con grupos fosfato unidos a sitios específicos de la molécula. Se observa una implicación grave de los ovillos neurofibrilares en las neuronas de la capa II de la corteza entorrinal, las regiones CA1 y subiculares del hipocampo, la amígdala y las capas más profundas (capas III, V y VI superficial) de la neocorteza en la enfermedad de Alzheimer. También se ha descrito que la tau hiperfosforilada interfiere con el ensamblaje de los microtúbulos, lo que puede promover la rotura de la red neuronal.

Las inclusiones de tau son parte de la neuropatología que define varias enfermedades neurodegenerativas, incluidas la enfermedad de Alzheimer, la degeneración del lóbulo frontotemporal, la parálisis supranuclear progresiva y la enfermedad de Pick.

La publicación internacional WO 2014165271 analiza anticuerpos monoclonales que compiten por la unión a tau con el anticuerpo 16B5. Se describe que los anticuerpos inhiben o retrasan las patologías asociadas a tau y el deterioro sintomático asociado.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN REIVINDICADA

La invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada madura que ^{tiene una secuencia de aminoácidos de s} E^{q ID NO: 15 y una región variable de cadena ligera madura de SEQ} ID NO: 36. Las posiciones H13, H28, H48 y H91 están ocupadas por K, P, M y F respectivamente, y las ^{posiciones L1, l} 4, ^{L36 y L43 están ocupadas por N, L, F y S respectivamente.}

En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura está fusionada a una región constante de cadena pesada y la región variable de cadena ligera madura está fusionada a una región constante de cadena ligera. Opcionalmente, la región constante de cadena pesada es una forma mutante de la región ^{constante humana natural que tiene una unión reducida a un receptor} F^{cy en relación con la región constante} humana natural. Opcionalmente, la región constante de cadena pesada es de isotipo IgG1, opcionalmente la SEQ ID NO: 29, con la condición de que pueda faltar la lisina C-terminal y la región constante de cadena ligera es kappa, preferiblemente la SEQ ID NO: 32.

Algunos anticuerpos se conjugan con un agente citotóxico o citostático. Algunos anticuerpos son fragmentos Fab.

La invención proporciona además un ácido nucleico que codifica las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo como se describe en cualquiera de los anticuerpos anteriores.

La invención proporciona además un anticuerpo para usar en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, comprendiendo el uso administrar un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos anteriores y así tratar o efectuar la profilaxis de la enfermedad de Alzheimer. Opcionalmente, el paciente es un portador de ApoE4.

La invención proporciona además un anticuerpo para usar en el tratamiento de una enfermedad asociada con tau que incluye la enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, deterioro cognitivo leve, tauopatía primaria relacionada con la edad, parkinsonismo postencefalítico, demencia postraumática o demencia pugilística, enfermedad de Pick, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, parálisis supranuclear, demencia frontotemporal, degeneración lobular frontotemporal, enfermedad de granos argirófilos, tauopatía globular glial, complejo de esclerosis lateral amiotrófica/parkinsonismo-demencia de Guam, degeneración corticobasal (CBD), demencia con cuerpos de Lewy, variante con cuerpos de Lewy de la enfermedad de Alzheimer (LBVAD), parálisis supranuclear progresiva (PSP), comprendiendo el uso administrar un régimen eficaz de un anticuerpo como se define en cualquiera de los anticuerpos anteriores. Opcionalmente, la enfermedad es una enfermedad neurológica.

La invención puede ser útil para reducir la transmisión aberrante de tau, comprendiendo administrar un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos anteriores y así reducir la transmisión de tau.

La invención puede ser útil para inducir la fagocitosis de tau, comprendiendo administrar un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos anteriores y así inducir la fagocitosis de tau. Opcionalmente, la enfermedad es una enfermedad neurológica.

La invención puede ser útil para inhibir la agregación o depósito de tau, comprendiendo administrar un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos anteriores inhibiendo así la agregación o depósito de tau. Opcionalmente, la enfermedad es una enfermedad neurológica.

La invención puede ser útil para inhibir la formación de ovillos de tau, comprendiendo administrar un régimen eficaz de un anticuerpo de cualquiera de los anticuerpos anteriores. Opcionalmente, la enfermedad es una enfermedad neurológica.

La invención proporciona además un ácido nucleico o ácidos nucleicos que comprenden un segmento que codifica una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 15 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de s Eq ID NO: 36. Opcionalmente, el ácido nucleico comprende además un segmento que codifica una región constante de IgG1. Opcionalmente, la región constante de IgG1 es una región constante de IgG1 humana. Opcionalmente, la región constante de IgG1 tiene una secuencia de SEQ ID NO: 29 con la condición de que se pueda omitir la lisina C-terminal. Opcionalmente, el segmento que codifica la región constante de IgG1 tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 30. Opcionalmente, el ácido nucleico comprende además un intrón que une los segmentos que codifican la región variable de cadena pesada y la región constante de IgG1. Opcionalmente, el segmento que codifica la región constante de IgG1 tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 31. Opcionalmente, el ácido nucleico comprende además un segmento que codifica una región constante kappa. Opcionalmente, la región constante kappa es una región constante kappa humana. Opcionalmente, la región constante kappa tiene la secuencia de SEQ ID NO: 32. Opcionalmente, el ácido nucleico que codifica la región constante kappa tiene la secuencia de SEQ ID NO: 33. Opcionalmente, el ácido nucleico comprende además un intrón que une el segmento que codifica la región variable de cadena ligera con el segmento que codifica la región constante kappa. Opcionalmente, el segmento que codifica la región constante kappa tiene la secuencia de SEQ ID NO: 34.

La invención proporciona además ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 15 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 36.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa los resultados de los experimentos diseñados para mapear el(los) epítopo(s) unido(s) por el anticuerpo monoclonal 16B5. Las transferencias Western que contenían Tau de longitud completa o mutantes de deleción de Tau (A5-24 o A25-44) se tiñeron con anticuerpos 16B5 (panel izquierdo) o anticuerpos Tau46 (panel derecho). El anticuerpo Tau46 se une al epítopo C-terminal de Tau.

La Figura 2 representa los resultados de los experimentos diseñados para mapear el(los) epítopo(s) unido(s) por el anticuerpo monoclonal 16B5. Las transferencias Western que contenían Tau de longitud completa o mutantes de deleción de Tau se tiñeron con anticuerpos 16B5 (panel izquierdo superior) o anticuerpos Tau46 (panel derecho). En el panel inferior izquierdo se muestra una exposición más larga de la transferencia teñida con anticuerpos 16B5. Los mutantes de deleción de Tau analizados en este experimento incluyen A25-44, A5-24, A23-32, A30-39 y A37-46.

La Figura 3 representa los resultados de un experimento de barrido de alanina diseñado para mapear el(los) epítopo(s) unido(s) por el anticuerpo monoclonal 16B5. Las transferencias Western que contenían Tau de tipo natural (WT) o mutantes puntuales de alanina de Tau se tiñeron con anticuerpos 16B5 (panel izquierdo) o anticuerpos Tau46 (panel derecho). Los mutantes de alanina de Tau analizados en este experimento incluyen T30A, M31A, H32A, Q33A, D34A, Q35A, E36A, G37A, D38A, T39A, D40A, A41L y G42A.

La Figura 4 muestra las cantidades relativas de proteína tau detectadas en una fracción insoluble de sarkosyl del tronco encefálico de ratones transgénicos que expresan la proteína tau.P301L humana. Los ratones se inmunizaron pasivamente con el anticuerpo 16B5 o el anticuerpo 6F10, un control de isotipo de IgG1 no inmune. Las muestras se analizaron mediante transferencia Western, tinción de anticuerpos y cuantificación de la señal resultante. Los anticuerpos utilizados para detectar tau incluían anticuerpos específicos anti-fosfo-tau (AT8, panel superior izquierdo; AT100, panel inferior izquierdo; o 1F5, panel superior derecho) y un anticuerpo pantau (HT7, panel inferior derecho).

La Figura 5 muestra la proporción de fosfo-tau a proteína tau total (panel izquierdo) y una cantidad normalizada de tau total (panel derecho) detectada en homogeneizados de tronco encefálico total de ratones transgénicos que expresan la proteína tau.P301L humana. Los ratones se inmunizaron pasivamente con el anticuerpo 16B5 o el anticuerpo 6F10, un control de isotipo de IgG1 no inmune. Las muestras se analizaron mediante transferencia Western, tinción de anticuerpos y cuantificación de la señal resultante. El anticuerpo AT8 se usó para detectar fosfo-tau y el anticuerpo HT7 se usó para detectar tau total. Se usó un anticuerpo anti-GAPDH para normalizar la cantidad de tau detectada en ratones tratados con el anticuerpo 16B5 frente al anticuerpo 6F10 de control.

La Figura 6 representa secciones de núcleos cerebelosos de ratones transgénicos que expresan la proteína tau.P301L humana, teñida inmunohistoquímicamente usando el anticuerpo anti-fosfo-tau a T8. Los ratones se inmunizaron pasivamente con el anticuerpo 16B5 (panel superior izquierdo) o el anticuerpo 6F10 (panel inferior izquierdo), un control de isotipo de IgG1 no inmune. La cuantificación de la cantidad de tinción de tau detectada con el anticuerpo AT8 en el núcleo interpuesto del cerebelo, parte anterior y posterior, núcleo cerebeloso lateral anexo (IntA/P/LAT) y el núcleo subtalámico anexo zona incerta (STH/ZI) de ratones inmunizados pasivamente con anticuerpos 16B5 o 6F10 se muestra en los paneles de gráficos de barras superiores. La cuantificación de la cantidad de tinción de fosfo-tau detectada usando el anticuerpo anti-fosfo-tau AT100 en las secciones IntA/P/LAT y STH/ZI de ratones inmunizados pasivamente con anticuerpos 16B5 o 6F10 se muestra en los paneles de gráficos de barras inferiores. La significación estadística se evaluó usando la prueba t de Student, p<0.05.

La Figura 7 representa los resultados de inmunoprecipitación de tau obtenidos con anticuerpos 16B5 quiméricos y anticuerpos 16B5 humanizados (versiones H1L2 y H1L3). Tau inmunoprecipitó de fracciones tanto solubles como insolubles de muestras de corteza frontal post mortem obtenidas de un paciente con enfermedad de Alzheimer. La tau presente en los inmunoprecipitados transferidos se detectó usando un anticuerpo anti-tau policlonal (pAb tau).

La Figura 8 representa el alineamiento de secuencias de la cadena pesada H1, H2 humanizada y 16B5 quimérica y el alineamiento de secuencias de la cadena ligera L2, L4 humanizada y 16B5 quimérica.

La Figura 9 muestra el análisis de termoestabilidad de H1L2, H1L4 y H2L4. La termoestabilidad se analizó usando calorimetría diferencial de barrido (DSC).

Definiciones

Los anticuerpos monoclonales y otros agentes terapéuticos se proporcionan típicamente de forma aislada. Esto significa que el agente está típicamente al menos 50% en p/p puro de proteínas que interfieren y otros contaminantes que proceden de su producción o purificación, pero no se excluye la posibilidad de que el agente esté combinado con un exceso de excipiente(s) farmacéutico(s) aceptable(s) u otro vehículo previsto para facilitar su uso. En ocasiones, los anticuerpos monoclonales (u otros agentes terapéuticos) están al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% en p/p puros de proteínas que interfieren y contaminantes derivados de la producción o purificación.

Los anticuerpos de la invención típicamente se unen a su objetivo designado con una constante de asociación de al menos 106, 107, 108, 109 o 1010 M-1. Dicha unión es unión específica en cuanto que es detectablemente mayor en magnitud y se distingue de la unión no específica que se produce a al menos un objetivo no relacionado. La unión específica puede ser el resultado de la formación de enlaces entre grupos funcionales particulares o ajuste espacial particular (p. ej., tipo llave y cerradura), mientras que la unión no específica es normalmente el resultado de fuerzas de van der Waals. La unión específica, sin embargo, no implica necesariamente que un anticuerpo monoclonal se une a uno y solamente un objetivo.

La unidad estructural básica del anticuerpo es un tetrámero de subunidades. Cada tetrámero incluye dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, teniendo cada par una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa). La parte amino terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento de antígenos. Esta región variable se expresa inicialmente unida a un péptido señal escindible. La región variable sin el péptido señal a veces se denomina región variable madura. Así, por ejemplo, una región variable madura de cadena ligera significa una región variable de cadena ligera sin el péptido señal de la cadena ligera. La parte carboxi terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Una región constante puede incluir cualquiera o todas de una región CH1, región de bisagra, región CH2 y región CH3.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones constantes y variables están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. (Véase en general, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7) (incorporado por referencia en su totalidad para todos los fines).

Las regiones variables maduras de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo. Por lo tanto, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son iguales. Todas las cadenas presentan la misma estructura general de regiones armazón (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par están alineadas por las regiones armazón, lo cual permite la unión a un epítopo específico. Desde el extremo N al extremo C, tanto la cadena pesada como la ligera comprende los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es según las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, 1987 y 1991), o Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989). Kabat también proporciona una convención de numeración ampliamente utilizada (numeración de Kabat) en la cual a los restos correspondientes entre las diferentes cadenas pesadas o entre las diferentes cadenas ligeras se les asigna el mismo número.

El término "anticuerpo" incluye anticuerpos intactos y fragmentos de unión de los mismos. Típicamente, los fragmentos compiten con el anticuerpo intacto a partir del cual derivaron por la unión específica al objetivo. Los fragmentos incluyen cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, Fv y anticuerpos de dominio único. Los anticuerpos de dominio único (variable) incluyen regiones VH separadas de sus parejas VL (o viceversa) en anticuerpos convencionales (Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546), así como regiones VH (a veces conocidas como VHH) de especies tales como Camelidae o peces cartilaginosos (p ej., un tiburón nodriza) en los que las regiones VH no están asociadas con las regiones VL (véase, p. ej., la publicación internacional WO 9404678). Los anticuerpos de dominio único en los que una cadena está separada de sus parejas naturales a veces se conocen como Dab y los anticuerpos de dominio único de Camelidae o peces cartilaginosos a veces se conocen como nanocuerpos. Las regiones constantes o partes de las regiones constantes pueden o no estar presentes en anticuerpos de dominio único. Por ejemplo, los anticuerpos naturales de una sola región variable de Camelidae incluyen una región variable VHH y regiones constantes CH2 y CH3. Los anticuerpos de dominio único se pueden someter a humanización mediante enfoques análogos a los anticuerpos convencionales. Los tipos Dab de anticuerpos normalmente se obtienen a partir de anticuerpos de origen humano. Los tipos de anticuerpos NANOCUERPOS son de origen Camelidae o tiburón y se pueden someter a humanización. Se pueden producir fragmentos por técnicas de ADN recombinante o por separación química o enzimática de inmunoglobulinas intactas. El término "anticuerpo" también incluye un anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes (véase, p. ej., Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (199o); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)).

El término "epítopo" se refiere a un sitio en un antígeno al cual se une un anticuerpo. Un epítopo puede estar formado de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una o más proteínas. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos típicamente son retenidos tras exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario típicamente se pierden tras el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo típicamente incluye al menos 3, y más normalmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Cuando se dice que un epítopo está dentro de un intervalo de restos de aminoácidos en una proteína (p. ej., dentro de los restos 25 a 44 de tau), el intervalo incluye los restos que definen sus límites. Ciertos restos dentro del intervalo contribuyen al epítopo, mientras que otros pueden no hacerlo. Los restos que forman el epítopo pueden o no ser contiguos entre sí. De manera similar, cuando un anticuerpo se une a un epítopo que se encuentra dentro de un intervalo particular de aminoácidos, no es necesario que el anticuerpo esté en contacto con todos los restos de aminoácidos dentro del intervalo, y los restos del epítopo que están en contacto con el anticuerpo pueden o no ser contiguos entre sí. Los métodos para determinar la conformación espacial de epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, p. ej., Epitope Mapping Protocols, en Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996).

Pueden identificarse anticuerpos que reconocen el mismo epítopo o epítopos que se superponen en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para competir con la unión de otro anticuerpo a un antígeno objetivo. El epítopo de un anticuerpo también se puede definir por cristalografía de rayos X del anticuerpo unido a su antígeno para identificar los restos de contacto. De manera alternativa, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos tienen epítopos que se superponen si algunas mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. La invención incluye anticuerpos que compiten con 16B5 y/o que se unen al mismo epítopo en tau que 16B5.

La competencia entre anticuerpos se determina por un ensayo en el que un anticuerpo que se está analizando inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia (p. ej., 16B5) a un antígeno común (véase, p. ej., Junghans et al., Cáncer Res. 50:1495, 1990). Un anticuerpo de ensayo compite con un anticuerpo de referencia si un exceso de un anticuerpo de ensayo, (p. ej., al menos 2x, 5x, 10x, 20x o 100x) inhibe la unión del anticuerpo de referencia en al menos 50%, pero preferiblemente 75%, 90% o 99%, medido en un ensayo de unión competitiva. Los anticuerpos identificados por el ensayo de competencia (anticuerpos que compiten) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente lo suficientemente cercano al epítopo unido por el anticuerpo de referencia para que se produzca impedimento estérico.

El término "paciente" incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.

Para los fines de clasificar las sustituciones de aminoácidos como conservadoras o no conservadoras, los aminoácidos se agrupan de la siguiente manera: Grupo I (cadenas laterales hidrófobas): met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrófilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (restos que influyen en la orientación de la cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservadoras implican sustituciones entre aminoácidos de la misma clase. Las sustituciones no conservadoras constituyen un intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra.

El porcentaje de identidad de secuencias se determina con las secuencias de anticuerpos alineadas de manera máxima por la convención de numeración de Kabat. Después del alineamiento, si una región del anticuerpo objeto (p. ej., la totalidad de la región variable madura de una cadena pesada o ligera) se compara con la misma región de un anticuerpo de referencia, el porcentaje de identidad de secuencias entre las regiones del anticuerpo objeto y de referencia es el número de posiciones ocupadas por el mismo aminoácido tanto en la región del anticuerpo objeto como de referencia, dividido por el número total de posiciones alineadas de las dos regiones, sin contar los huecos, multiplicado por 100 para la conversión a porcentaje.

El término "adyuvante" se refiere a un compuesto que, cuando se administra junto con un antígeno, aumenta y/o redirige la respuesta inmunitaria al antígeno, pero cuando se administra solo no genera una respuesta inmunitaria al antígeno. Los adyuvantes pueden aumentar una respuesta inmunitaria por varios mecanismos que incluyen el reclutamiento de linfocitos, estimulación de células B y/o T y estimulación de macrófagos.

Una enfermedad está asociada con tau si una población de pacientes con la enfermedad tiene niveles mayores de tau en el cerebro, o mayor depósito o inclusiones de tau, o presencia de ovillos de tau en el cerebro, o mayor fosforilación de tau en el cerebro (número promedio de grupos fosfato por molécula tau), o transmisión intercelular o intracelular aberrante de tau en comparación con una población de sujetos que no se sabe que tengan una enfermedad neurológica. Una enfermedad también está asociada con tau si los pacientes con una forma variante de un gen de tau tienen un mayor riesgo de desarrollar la enfermedad en relación con los pacientes con un gen de tau de tipo natural (variante que ocurre con mayor frecuencia en una población humana).

Un individuo presenta mayor riesgo de padecer una enfermedad si el sujeto tiene al menos un factor de riesgo conocido (p. ej., genético, bioquímico, antecedentes familiares y exposición circunstancial) que pone a los individuos con este factor de riesgo en un riesgo mayor estadísticamente significativo de desarrollar la enfermedad que los individuos sin el factor de riesgo.

El término “síntoma” se refiere a una prueba subjetiva de una enfermedad, tal como alteración de la marcha, según lo percibido por el paciente. Un "signo" se refiere a una prueba objetiva de una enfermedad, según lo observado por un médico.

Significación estadística significa p<0.05.

Descripción detallada

I. General

La descripción proporciona anticuerpos que se unen a tau. Algunos anticuerpos se unen específicamente a un epítopo dentro de los restos 23-46 de la SEQ ID NO: 1. Algunos anticuerpos se unen a tau independientemente del estado de fosforilación. Algunos anticuerpos de la invención sirven para inhibir o retrasar patologías asociadas a tau y el deterioro sintomático asociado. Aunque no se requiere una comprensión del mecanismo para la práctica de la invención, puede producirse una reducción de la toxicidad como resultado de que el anticuerpo induzca la fagocitosis de tau, inhiba la agregación intermolecular o intramolecular de tau, bloquee la transmisión de célula a célula, bloquee la unión de tau a las células, bloquee la absorción de tau, o la unión a otras moléculas, por estabilización de una conformación no tóxica, o inhibición de la transmisión intercelular o intracelular de formas patógenas de tau, entre otros mecanismos. Los anticuerpos de la invención o agentes que inducen dichos anticuerpos se pueden usar para tratar la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades asociadas con tau que incluyen la enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, deterioro cognitivo leve, tauopatía primaria relacionada con la edad, parkinsonismo postencefalítico, demencia postraumática o demencia pugilística, enfermedad de Pick, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, parálisis supranuclear, demencia frontotemporal, degeneración lobular frontotemporal, enfermedad de granos argirófilos, tauopatía globular glial, complejo de esclerosis lateral amiotrófica/parkinsonismo-demencia de Guam, degeneración corticobasal (CBD), demencia con cuerpos de Lewy, variante con cuerpos de Lewy de la enfermedad de Alzheimer (LBVAD), parálisis supranuclear progresiva (PSP).

II. Tau

A menos que se desprenda lo contrario del contexto, la referencia a tau significa una forma humana natural de tau que incluye todas las isoformas independientemente de si está presente una modificación postraduccional (p. ej., fosforilación, glicación o acetilación). Hay seis isoformas principales (variantes de empalme) de tau que se encuentran en el cerebro humano. La más larga de estas variantes tiene 441 aminoácidos, de los cuales se escinde el resto met inicial. Los restos se numeran de acuerdo con la isoforma 441. Así, por ejemplo, la referencia a una fosforilación en la posición 404 significa la posición 404 de la isoforma 441, o la posición correspondiente de cualquier otra isoforma cuando está alineada al máximo con la isoforma 441. Las secuencias de aminoácidos de las isoformas y los números de Swiss-Prot se indican a continuación.

P10636-8 (SEQ ID NO: 1)

¹⁰ zc ^{30 4C 50 50}

Í4AEPRQEFEV KEDHAG7Y3- CDRKDQGGYZ MHQDQEGD7D ACLXZSPL2T PTE3CSEEPC

70 SO 90 10C 510 120

SE7SDAK3TP ZAÉZVTAPLV DEGAPGX2AA ÁQ'6KZZIPZC rTAEZ/iGZSD TPÍLEAEAAG

1 -O 4 £ 150 hC 70 VoO

HV . QARMVSK S-KIX-l GSI7I7K KARGAIX-K' O ATPRGAAPP GCKSQANA1R 1 PARTE'PARK

100 2C0 333 ; -2C 230 i 40

r r r s s G b o r K ^{s c o p s g y s s p g s p g t p g} &^{r s iv}-^{t p} . : r p p r ^{p z p x x v a v v r z p f k s p s s a k}

: 5 ü : 60 2 0 23C :90 300

o k i g i A t vt'M ^{p d} I ^{á m v k k k} . y s ^zwzkhq"? jGGGKvgi.NK ^{k í d} _;;^{m v q s k} CG^{o k d n i k h v}

310 .350 33 0 34 C 3 S £ 330

PC3C3VGIVY KPVZL:5KVT3 KCC31CN1HH KPC3CCVEVK 3ZK1DFKDRV -'CSKICSIDNI

370 380 393 40C 4Zi_ 420

THVPGGGNKK IZTHKZZZF.E NAXAK7DHGA ECVYKoPVVS CD71PF.H3SN VSSZCS3DMV

■ . ¿ 30 44 £ .

,; ; ;^{p q i a} ■. ,^ap. -'^{v s a} .-'.^{la x ik} -; i

P10636-7 (SEQ ID NO: 2)

: -.10 : o 70 4 £ 30 O

MARRPgh EV t-' 7 IAÓOYG ,

HHQDQKyil" O AO .KESPI 3>T 'O'K XOKKPG

7Q3 80 93 i ó b 370 120

SETSDAKSTP 7AEAEEAGIG DZrSZZDEAA GHVTC'AP.MVS ' X3KCGT7-3DD KKAKGAGCKZ

170 240 Í 50 O ' 70 . 130

KIAZPF. 3AAP PGQXGQAHAZ R3PAK7PFA? K7?F:?S:5E?F 7X33DRSCY3G PG3PGTPG3R

700 ■210 ^{_ _ 0} 223 230 A 240

:-:^{k pó i f i p p} ' KEPKKVAvV R 'L'-<S OSA l-.O Q'IAPVP F > ' OIV:\SK ÍGSI'ÉN^KHQ

230 730 770 28:8 : 290 780

Í'GOGZVCÍIN X.tJ J t Í5. \y 2 S F.CSCKDH 1KH yíGGGov'QZV 7EPVL03ÁV5 SKCGSZGM1H

310 323 330 343 350 350

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370 380 .793 408 410

P10636-6 (SEQ ID NO: 3)

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P10636-5 (SEQ ID NO: 4)

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P10636-4 (SEQ ID NO: 5)

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P10636-2 (SEQ ID NO: 6)

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La referencia a tau incluye variaciones naturales conocidas, aproximadamente 30 de las cuales se indican en la base de datos Swiss-Pro y permutaciones de las mismas, así como mutaciones asociadas con patologías de tau, tales como demencia, enfermedad de Pick, parálisis supranuclear, etc. (véase, p. ej., Base de datos Swiss-Pro y Poorkaj, et al., Ann Neurol. 43:815-825 (1998)). Algunos ejemplos de mutaciones de tau numeradas por la isoforma 441 son una mutación de lisina a treonina en el resto de aminoácido 257 (K257T), una mutación de isoleucina a valina en la posición de aminoácido 260 (I260V); una mutación de glicina a valina en la posición de aminoácido 272 (G272V); una mutación de asparagina a lisina en la posición de aminoácido 279 (N279K); una mutación de asparagina a histidina en la posición de aminoácido 296 (N296H); una mutación de prolina a serina en la posición de aminoácido 301 (P301S); una mutación de glicina a valina en la posición de aminoácido 303 (G303V); una mutación de serina a asparagina en la posición 305 (S305N); una mutación de glicina a serina en la posición de aminoácido 335 (G335S); una mutación de valina a metionina en la posición 337 (V337M); una mutación de ácido glutámico a valina en la posición 342 (E342V); una mutación de lisina a isoleucina en la posición de aminoácido 369 (K3691); una mutación de glicina a arginina en la posición de aminoácido 389 (G389R); y una mutación de arginina a triptófano en la posición de aminoácido 406 (R406W).

Tau se puede fosforilar en uno o más restos de aminoácidos, incluyendo la tirosina en las posiciones de aminoácidos 18, 29, 97, 310 y 394, la serina en las posiciones de aminoácidos 184, 185, 198, 199, 202, 208, 214, 235, 237, 238, 262, 293, 324, 356, 396, 400, 404, 409, 412, 413 y 422; y la treonina en las posiciones de aminoácidos 175, 181, 205, 212, 217, 231 y 403.

III. Anticuerpos

A. Especificidad de unión y propiedades funcionales

La descripción proporciona anticuerpos que se unen a tau. Algunos anticuerpos se unen específicamente a un epítopo dentro de los restos 23-46 de la SEQ ID NO: 1. Algunos anticuerpos se unen específicamente a un epítopo dentro de los restos 25-44 de la SEQ ID NO: 1. Algunos anticuerpos se unen específicamente a un epítopo dentro de 28-41 de la SEQ ID NO: 1. Algunos anticuerpos se unen específicamente a un epítopo dentro de los restos 30-39 de la SEQ ID NO: 1. Algunos anticuerpos se unen específicamente a un epítopo dentro de los restos 30-36 de la SEQ ID NO: 1. Algunos anticuerpos se unen específicamente a un epítopo dentro de los restos 33-39 de la SEQ ID NO: 1. Algunos anticuerpos se unen específicamente a un epítopo dentro de los restos 33-36 de la SEQ ID NO: 1. Algunos anticuerpos se unen específicamente a un epítopo que incluye los restos 28-30, 28-31, 28-32, 28-33, 28-34, 28-35, 28-36, 28-37, 28-38, 28-39, 28-40, 28-41, 29-31, 29-32, 29­ 33, 29-34, 29-35, 29-36, 29-37, 29-38, 29-39, 29-40, 29-41, 30-32, 30-33, 30-34, 30-35, 30-36, 30-37, 30-38, 30-39, 30-40, 30-41, 31-33, 31-34, 31-35, 31-36, 31-37, 31-38, 31-39, 31-40, 31-41, 32-34, 32-35, 32-36, 32­ 37, 32-38, 32-39, 32-40, 32-41, 33-35, 33-36, 33-37, 33-38, 33-39, 33-40, 33-41, 34-36, 34-37, 34-38, 34-39, 34-40, 34-41, 35-37, 35-38, 35-39, 35-40, 35-41, 36-38, 36-39, 36-40, 36-41 de la SEQ ID NO: 1. Algunos anticuerpos se unen a tau independientemente del estado de fosforilación. Algunos anticuerpos se unen a un epítopo que no incluye un resto sujeto a fosforilación. Estos anticuerpos se pueden obtener por inmunización con un polipéptido tau purificado de una fuente natural o expresado de forma recombinante. Los anticuerpos pueden seleccionarse por la unión a tau en forma no fosforilada, así como en una forma en la que están fosforilados uno o más restos susceptibles de fosforilación. Dichos anticuerpos se unen preferiblemente con afinidades indistinguibles o al menos dentro de un factor de 1.5, 2 o 3 veces a tau fosforilada en comparación con tau no fosforilada (es decir, son "específicos de pan"). 16B5 es un ejemplo de un anticuerpo monoclonal específico de pan. La invención también proporciona anticuerpos que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos anteriores, tal como, por ejemplo, el epítopo de 16B5. También se incluyen anticuerpos que compiten por la unión a tau con cualquiera de los anticuerpos anteriores, tales como, por ejemplo, los que compiten con 16B5.

Otros anticuerpos que no forman parte de la invención pueden obtenerse por mutagénesis de ADNc que codifica las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo de ejemplo, tal como 16B5, por ejemplo, anticuerpos monoclonales que son al menos 90%, 95% o 99% idénticos a 16B5 en la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesada y/o ligera maduras y mantienen sus propiedades funcionales, y/o que se diferencian del anticuerpo respectivo por un pequeño número de sustituciones de aminoácidos funcionalmente intrascendentes (p. ej., sustituciones conservadoras), deleciones o inserciones, por ejemplo, anticuerpos monoclonales que tienen al menos una y preferiblemente las seis CDR definidas por Kabat que son 90%, 95%, 99% o 100% idénticas a las CDR correspondientes de 16B5.

C. Anticuerpos humanizados

Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo genéticamente modificado en el que las CDR de un anticuerpo "donador" no humano (p. ej., 16B5) se injertan en secuencias de anticuerpo "aceptor" humano (véase, p. ej., Queen, US 5,530,101 y 5,585,089; Winter, US 5,225,539, Carter, US 6,407,213, Adair, US 5,859,205 6,881,557, Foote, US 6,881,557). Las secuencias del anticuerpo aceptor pueden ser, por ejemplo, una secuencia de anticuerpo humano maduro, una combinación de dichas secuencias, una secuencia de consenso de secuencias de anticuerpo humano o una secuencia de la región de línea germinal. Por lo tanto, un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que tiene algunas o todas las CDR total o sustancialmente de un anticuerpo donador y secuencias de armazón de la región variable y regiones constantes, si están presentes, total o sustancialmente de secuencias de anticuerpo humano. De manera similar, una cadena pesada humanizada tiene al menos una, dos y generalmente las tres CDR total o sustancialmente de una cadena pesada del anticuerpo donador, y una secuencia de armazón de la región variable de cadena pesada y una región constante de cadena pesada, si está presente, sustancialmente de las secuencias de armazón de la región variable de cadena pesada y la región constante humanas. De manera similar, una cadena ligera humanizada tiene al menos una, dos y generalmente las tres CDR total o sustancialmente de una cadena ligera de anticuerpo donador, y una secuencia de armazón de la región variable de cadena ligera y región constante de cadena ligera, si está presente, sustancialmente de las secuencias de armazón de la región variable de cadena ligera y la región constante humanas. Aparte de los nanocuerpos y los dAb, un anticuerpo humanizado comprende una cadena pesada humanizada y una cadena ligera humanizada. Una CDR en un anticuerpo humanizado es sustancialmente de una CDR correspondiente en un anticuerpo no humano cuando al menos 85%, 90%, 95% o 100% de los restos correspondientes (definido por Kabat) son idénticos entre las CDR respectivas. Las secuencias de armazón de la región variable de una cadena de anticuerpo o la región constante de una cadena de anticuerpo son sustancialmente de una secuencia de armazón de región variable humana o región constante humana, respectivamente, cuando al menos 85, 90, 95 o 100% de los restos correspondientes, definidos por Kabat, son idénticos.

Aunque los anticuerpos humanizados a menudo incorporan las seis CDR (preferiblemente como se define por Kabat) de un anticuerpo de ratón, también se pueden hacer con menos que todas las CDR (p. ej., al menos 3, 4 o 5) CDR de un anticuerpo de ratón (p. ej., Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al., Journal of Immunology, 164:1432-1441, 2000).

En algunos anticuerpos, únicamente es necesaria una parte de las CDR, a saber, el subconjunto de restos de CDR necesario para la unión, denominado SDR, para retener la unión en un anticuerpo humanizado. Los restos de las CDR que no entran en contacto con el antígeno y que no están en las SDR pueden identificarse basándose en estudios anteriores (por ejemplo, los restos H60-H65 en la CDR H2 a menudo no son necesarios), de regiones de CDR de Kabat que se encuentran fuera de los bucles hipervariables de Chothia (Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987), por modelización molecular y/o de forma empírica, o como se describe en Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863, 2004. En dichos anticuerpos humanizados en posiciones en las que uno o más restos de la CDR del donador están ausentes o en las que se omite una CR del donador completa, el aminoácido que ocupa la posición puede ser un aminoácido que ocupa la posición correspondiente (por numeración de Kabat) en la secuencia del anticuerpo aceptor. El número de dichas sustituciones de aminoácidos de donadores por aceptores en las CDR para incluir refleja un equilibrio de consideraciones opuestas. Dichas sustituciones son potencialmente ventajosas para disminuir el número de aminoácidos de ratón en un anticuerpo humanizado y, en consecuencia, disminuir la inmunogenicidad potencial. Sin embargo, las sustituciones también pueden provocar cambios de afinidad, y preferiblemente se evitan reducciones significativas en la afinidad. Las posiciones para la sustitución dentro de las CDR y los aminoácidos para sustituir también pueden seleccionarse empíricamente.

Las secuencias de anticuerpos aceptores humanos pueden seleccionarse de manera opcional de entre las múltiples secuencias de anticuerpos humanos conocidas para proporcionar un alto grado de identidad de secuencia (p. ej., 65-85% de identidad) entre armazones de región variable de secuencia de aceptor humano y armazones correspondientes de región variable de una cadena de anticuerpo donador.

Determinados aminoácidos de los restos del armazón de la región variable humana pueden seleccionarse para la sustitución basándose en su posible influencia sobre la conformación de las CDR y/o la unión al antígeno. La investigación de tales posibles influencias se hace por modelización, examen de las características de los aminoácidos en ubicaciones particulares o la observación empírica de los efectos de la sustitución o mutagénesis de aminoácidos particulares.

Por ejemplo, cuando un aminoácido difiere entre un resto de armazón de región variable murina y un resto de armazón de región variable humana seleccionado, el aminoácido del armazón humano puede sustituirse por el aminoácido del armazón equivalente del anticuerpo de ratón cuando se espera de manera razonable que el aminoácido:

(1) se una de manera no covalente directamente al antígeno;

(2) sea adyacente a una región CDR,

(3) interactúe de otro modo con una región CDR (p. ej., se encuentre en el espacio de aproximadamente 6 A de una región CDR), (p. ej., identificada por modelización de la cadena ligera o pesada en la estructura resuelta de una cadena de inmunoglobulina conocida homóloga); y

(4) un resto que participa en la interfase VL-VH.

Los restos de armazón de las clases (1)-(3) definidas por Queen, documento US 5,530,101 a veces se denominan de forma alternativa restos canónicos y vernier. Los restos de armazón que definen la clase canónica de los bucles de CDR del donador que determinan la conformación de un bucle de CDR a veces se denominan restos canónicos (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987), Thornton y Martín J. Mol. Biol., 263, 800-815, 1996). Una capa de restos de armazón que soportan las conformaciones del bucle de unión al antígeno tiene una función en el ajuste de la acomodación de un anticuerpo en el antígeno, a veces denominados restos vernier (Foote y Winter, 1992, J Mol Bio. 224, 487-499). Otros candidatos para la sustitución son restos que crean un sitio de glicosilación potencial. Otros candidatos para la sustitución son aminoácidos de armazón humano del aceptor que no son habituales para una inmunoglobulina humana en esa posición. Estos aminoácidos pueden sustituirse con aminoácidos de la posición equivalente del anticuerpo donador de ratón o de las posiciones equivalentes de las inmunoglobulinas humanas más típicas. Otros candidatos para la sustitución son aminoácidos de armazón humano del aceptor que no son habituales para una inmunoglobulina humana en esa posición.

La invención proporciona formas humanizadas del anticuerpo 16B5 de ratón. El anticuerpo de ratón comprende regiones variables de cadena pesada y ligera maduras que tienen secuencias de aminoácidos que comprenden las SEQ ID NO: 10 y 16, respectivamente. La descripción describe dos ejemplos de regiones variables de cadena pesada madura humanizada (H1 y H2) y cinco ejemplos de regiones variables de cadena ligera madura humanizada (L1, L2, L3, L4 y L5). H1 incluye cuatro retromutaciones. H2 incluye las mismas cuatro retromutaciones más una mutación Q1E adicional (no una retromutación) para mejorar la estabilidad. L1 tiene 3 retromutaciones, L2 cuatro retromutaciones, L3 tiene tres retromutaciones, L4 tiene cinco retromutaciones (lo mismo que L2 más D9S para eliminar un sitio proteolítico) y L5 tiene las mismas retromutaciones que L4 excepto que la posición L1 está ocupada por D. La variante H1L2 tiene la misma o mejor afinidad que un 16B5 quimérico y ocho retromutaciones. H1L1 y H1L3 tienen una afinidad similar al 16B5 quimérico y siete retromutaciones. La variante H1L4, la variante H2L4 y las variantes H2L2 tienen afinidades dentro de un factor de 2 de 16B5 y nueve, diez u ocho mutaciones respectivamente (todas las cuales son retromutaciones excepto Q1E en H2). Estas variantes tienen el beneficio de una estabilidad mejorada (a partir de Q1E en H2) o la eliminación del sitio proteolítico en L4 o ambos. Todas las cadenas humanizadas tienen al menos 85% de identidad de secuencia con las secuencias de la línea germinal humana y, por lo tanto, cumplen los criterios de INN para la designación como anticuerpos humanizados.

No forman parte de la invención las variantes del anticuerpo 16B5 humanizado H1L2 en las que la región variable de cadena pesada madura humanizada muestra al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la SEQ ID NO: 15 y la región variable madura de cadena ligera madura humanizada muestra al menos 90%, 95%, 96%, 97% 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 22. Preferiblemente, en dichos anticuerpos se retienen algunas o todas las retromutaciones en H1L2. En otras palabras, al menos 1, 2, 3 o 4 de las posiciones, la posición H13 está ocupada por K, la posición H28 ocupada por la posición H48 está ocupada por M y la posición H91 está ocupada por F. Preferiblemente, al menos, 1, 2, 3 o las cuatro posiciones, la posición L1 está ocupada por N, la posición L4 está ocupada por L, la posición L36 está ocupada por F y la posición L43 está ocupada por S. Las regiones CDR de tales anticuerpos humanizados son preferiblemente idénticas o sustancialmente idénticas a las regiones CDR de H1L2, que son las mismas que las del anticuerpo donador de ratón. Las regiones CDR se pueden definir por cualquier definición convencional (p. ej., Chothia), pero se definen preferiblemente por Kabat.

La invención proporciona el anticuerpo 16B5 humanizado H1L4 en el que la región variable de cadena pesada madura humanizada muestra identidad con la SEQ ID NO: 15 y la región variable madura de cadena ligera madura humanizada muestra identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 36. En dichos anticuerpos se retienen todas las retromutaciones en H1L4. En otras palabras, las siguientes posiciones están ocupadas de la siguiente manera: la posición H13 está ocupada por K, la posición H28 está ocupada por P, la posición H48 está ocupada por M y la posición H91 está ocupada por F. La posición L1 está ocupada por N, la posición L4 está ocupada por L, la posición L9 está ocupada por S, la posición L36 está ocupada por F y la posición L43 está ocupada por S. Las regiones CDR de dichos anticuerpos humanizados son idénticas o a las regiones CDR de H1L4, que son las mismas que las del anticuerpo donador de ratón. Las regiones CDR se pueden definir por cualquier definición convencional (p. ej., Chothia), pero se definen preferiblemente por Kabat.

No forman parte de la invención las variantes del anticuerpo 16B5 humanizado H2L2 en las que la región variable de cadena pesada madura humanizada muestra al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la SEQ ID NO: 35 y la región variable madura de cadena ligera madura humanizada muestra al menos 90%, 95%, 96%, 97% 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 22. Preferiblemente, en dichos anticuerpos se retienen algunas o todas las mutaciones en H2L4. En otras palabras, al menos 1, 2, 3, 4 o 5 de las siguientes posiciones están ocupadas como sigue: la posición H1 está ocupada por E, la posición H13 está ocupada por K, la posición H28 ocupada por P, la posición H48 está ocupada por M y la posición H91 está ocupada por F. Preferiblemente, al menos 1, 2, 3 o las 4 de las siguientes posiciones están ocupadas como sigue: la posición L1 está ocupada por N, la posición L4 está ocupada por L, la posición L36 está ocupada por F y la posición L43 está ocupada por S. Las regiones CDR de dichos anticuerpos humanizados son preferiblemente idénticas o sustancialmente idénticas a las regiones CDR de H2L3, que son las mismas que las del anticuerpo donador de ratón. Las regiones CDR se pueden definir por cualquier definición convencional (p. ej., Chothia), pero se definen preferiblemente por Kabat.

No forman parte de la invención las variantes del anticuerpo 16B5 humanizado H2L4 en las que la región variable de cadena pesada madura humanizada muestra al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la SEQ ID NO: 35 y la región variable madura de la cadena ligera madura humanizada muestra al menos 90%, 95%, 96%, 97% 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 36. Preferiblemente, en dichos anticuerpos se retienen algunas o todas las retromutaciones y otras mutaciones en H2L4. En otras palabras, al menos 1, 2, 3, 4 o 5 de las siguientes posiciones están ocupadas como sigue: la posición H1 está ocupada por E, la posición H13 está ocupada por K, la posición H28 ocupada por P, la posición H48 está ocupada por M y la posición H91 está ocupada por F. Preferiblemente, al menos 1, 2, 3, 4 o las cinco de las siguientes posiciones están ocupadas como sigue: la posición L1 está ocupada por N, la posición L4 está ocupada por L, la posición L9 está ocupada por S, la posición L36 está ocupada por F y la posición L43 está ocupada por S. Las regiones CDR de dichos anticuerpos humanizados son preferiblemente idénticas o sustancialmente idénticas a las regiones CDR de H1L4, que son las mismas que las del anticuerpo donador de ratón. Las regiones CDR se pueden definir por cualquier definición convencional (p. ej., Chothia), pero se definen preferiblemente por Kabat.

Una posibilidad para la variación adicional en las variantes de 16B5 son las retromutaciones adicionales en los armazones de la región variable. Muchos de los restos del armazón que no están en contacto con las CDR en el mAb humanizado pueden acomodar sustituciones de aminoácidos de las posiciones correspondientes del mAb de ratón donador u otros anticuerpos humanos o de ratón, e incluso muchos restos potenciales en contacto con CDR también son susceptibles de sustitución o incluso los aminoácidos dentro de las CDR pueden ser alterados, por ejemplo, con restos encontrados en la posición correspondiente de la secuencia del aceptor humano utilizada para suministrar armazones de región variable. Además, se pueden utilizar secuencias del aceptor humano alternativas, por ejemplo, para la cadena pesada y/o ligera. Si se utilizan secuencias del aceptor diferentes, es posible que no se pueda realizar una o más de las retromutaciones recomendadas antes debido a que los restos del donador y aceptor correspondientes ya son los mismos sin retromutación. Por ejemplo, cuando se usa una secuencia de cadena pesada del aceptor en la que la posición H13 ya está ocupada por K, no es necesaria la retromutación.

No forman parte de la invención los anticuerpos humanizados en los que las regiones variables de cadena ligera y pesada maduras muestran al menos 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad de secuencia con las regiones variables de cadena ligera y pesada maduras del anticuerpo 16B5 humanizado H1L1. (SEQ ID NO: 15 y 21, respectivamente) o el anticuerpo 16B5 humanizado H1L3 (SEQ ID NO: 15 y 23, respectivamente).

No forman parte de la invención los anticuerpos humanizados en los que las regiones variables de cadena ligera y pesada maduras muestran al menos 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad de secuencia con las regiones variables de cadena ligera y pesada maduras del anticuerpo 16B5 humanizado H2L1 (SEQ ID NO: X y 21, respectivamente), el anticuerpo 16B5 humanizado H2L2 (SEQ ID NO: X y 22, respectivamente), o el anticuerpo 16B5 humanizado H2L3 (SEQ ID NO: X y 23, respectivamente).

F. Selección de la región constante

Las regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos quiméricos, humanizados (incluyendo de superficie modificada) o humanos pueden estar unidas a al menos una parte de una región constante humana.

La elección de la región constante depende, en parte, de si se desea citotoxicidad mediada por el complemento y/o por células dependiente de anticuerpos. Por ejemplo, los isotipos humanos IgG1 e IgG3 tienen citotoxicidad mediada por el complemento, mientras que los isotipos humanos IgG2 e IgG4 tienen poca o ninguna citotoxicidad mediada por el complemento. Las regiones constantes de cadena ligera pueden ser lambda o kappa. Los anticuerpos se pueden expresar como tetrámeros que contienen dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, como cadenas pesadas, cadenas ligeras separadas, como Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, o como anticuerpos de cadena sencilla en los que las regiones variables de cadena pesada y ligera están unidas a través de un espaciador.

Las regiones constantes humanas muestran variación alotípica y variación isoalotípica entre diferentes individuos, es decir, las regiones constantes pueden diferir en individuos diferentes en una o más posiciones polimórficas. Los isoalotipos difieren de los alotipos en que los sueros que reconocen un isoalotipo se unen a una región no polimórfica de uno o más de otros isotipos. La referencia a una región constante humana incluye una región constante con cualquier alotipo natural o cualquier permutación de restos que ocupan posiciones polimórficas en alotipos naturales o hasta 3, 5 o 10 sustituciones para reducir o aumentar la función efectora como se describe a continuación.

Uno o varios aminoácidos en los extremos amino o carboxi de la cadena ligera y/o pesada, tal como la lisina C terminal de la cadena pesada, pueden estar ausentes o derivatizados en una proporción o en todas las moléculas. Las sustituciones se pueden hacer en las regiones constantes para reducir o aumentar la función efectora, tal como la citotoxicidad mediada por el complemento o ADCC (véase, p. ej., Winter et al., patente de EE.UU. n.° 5,624,821; Tso et al., patente de EE.UU. n.° 5,834,597; y Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), o para prolongar la semivida en seres humanos, p. ej., Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004). Las sustituciones de ejemplo incluyen una Gln en la posición 250 y/o una Leu en la posición 428 (se usa la numeración EU en este párrafo para la región constante) para aumentar la semivida de un anticuerpo. La sustitución en cualquiera o todas las posiciones 234, 235, 236 y/o 237 reduce la afinidad por los receptores Fcy, particularmente el receptor FcyRI (véase, p. ej., el documento US 6,624,821). Se prefiere una sustitución de alanina en las posiciones 234, 235 y 237 de la IgG1 humana para reducir las funciones efectoras. Opcionalmente, las posiciones 234, 236 y/o 237 en la IgG2 humana se sustituyen con alanina y la posición 235 con glutamina (véase, p. ej., documento US 5,624,821).

G. Expresión de anticuerpos recombinantes

Los anticuerpos quiméricos, humanizados (incluyendo de superficie modificada) y humanos se producen típicamente por expresión recombinante. Los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos se pueden optimizar por codones para la expresión en el tipo de célula deseado (p. ej., CHO o Sp2/0). Los ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera de 16B5 humanizado descritas en el presente documento tienen secuencias que comprenden o consisten en, por ejemplo, SEQ ID NO: 25 (que codifica Hu16B5 H1). Para regiones variables que incluyen péptidos señal tales como SEQ ID NO: 10 y 16, el ácido nucleico puede codificar la región variable con o sin el péptido señal. Los segmentos de ácido nucleico que codifican la cadena pesada y ligera pueden estar presentes en la misma molécula de ácido nucleico contiguos o en moléculas separadas. Las cadenas pesada y ligera pueden expresarse a partir del mismo vector o de diferentes vectores. Los ácidos nucleicos normalmente se proporcionan en forma aislada.

Los ácidos nucleicos que codifican una región variable de cadena pesada de 16B5 humanizado se pueden unir a un segmento de ácido nucleico que codifica una región constante de IgG1 humana, p. ej., que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 30. Dichos ácidos nucleicos también pueden incluir un intrón situado entre los segmentos que codifican la región variable de cadena pesada y la región constante de IgG1, es decir, 5' con respecto al segmento que codifica la región constante. Una secuencia de ácido nucleico de ejemplo que codifica una región constante de IgG1 humana y que tiene un intrón de ratón en su extremo 5' se muestra en la SEQ ID NO: 31.

Los ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadena ligera de 16B5 humanizado se pueden unir a un segmento de ácido nucleico que codifica una región constante kappa humana, p. ej., que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 33. Dichos ácidos nucleicos también pueden incluir un intrón entre los segmentos que codifican la región variable de cadena ligera y la región constante kappa (es decir, 5' con respecto a la región constante kappa). Una secuencia de ácido nucleico de ejemplo que codifica una región constante kappa humana y que tiene un intrón humano en su extremo 5' se muestra en la SEQ ID NO: 34.

Las construcciones de polinucleótidos recombinantes típicamente incluyen una secuencia de control de la expresión operativamente unida a las secuencias codificantes de cadenas de anticuerpos, incluyendo regiones de promotores asociadas de forma natural o heterólogas. Preferiblemente, las secuencias de control de la expresión son sistemas de promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células hospedantes eucariotas. Una vez que se ha incorporado el vector en el hospedante adecuado, el hospedante se mantiene en condiciones adecuadas para la expresión de nivel alto de las secuencias de nucleótidos, y la recolección y purificación de los anticuerpos con reactividad cruzada. El vector o vectores que codifican las cadenas de anticuerpos también pueden contener un gen seleccionable, tal como dihidrofolato reductasa o glutamina sintasa, para permitir la amplificación del número de copias de los ácidos nucleicos que codifican las cadenas de anticuerpos.

E. coli es un hospedante procariota particularmente útil para expresar anticuerpos, particularmente fragmentos de anticuerpo. Los microbios, tales como levaduras, también son útiles para la expresión. Saccharomyces es un hospedante de levadura preferido, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de la expresión, un origen de replicación, secuencias de terminación y similares, si se desea. Los promotores típicos incluyen 3-fosfoglicerato quinasa y otras enzimas glicolíticas. Los promotores inducibles de levadura incluyen, entre otros, promotores de alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C y enzimas responsables de utilizaciones de maltosa y galactosa.

Las células de mamífero son un hospedante preferido para la expresión de segmentos de nucleótidos que codifican inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas. Véase Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Se ha desarrollado en la técnica una serie de líneas celulares hospedantes capaces de secretar proteínas heterólogas intactas, e incluyen las líneas celulares CHO, varias líneas celulares COS, células HeLa, células HEK293, células L y mielomas que no producen anticuerpos incluyendo Sp2/0 y NS0. Preferiblemente, las células no son humanas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un potenciador (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión al ribosoma, sitios de empalme del ARN, sitios de poliadenilación y secuencias de terminación transcripcional. Las secuencias de control de la expresión preferidas son promotores derivados de genes endógenos, citomegalovirus, SV40, adenovirus, papilomavirus bovino y similares. Véase Co et al., J. Immunol.

148:1149 (1992).

Una vez se ha(n) introducido vector(es) que codifica(n) cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos en cultivos celulares, se pueden seleccionar grupos de células por la productividad de cultivo y la calidad de producto en medio exento de suero. Los grupos de células de mayor producción después pueden someterse a clonación de una sola célula basada en FACS para generar líneas monoclonales. Se prefieren productividades específicas por encima de 50 pg o 100 pg por célula por día, que corresponden a títulos de producto mayores que 7.5 g/L de cultivo. También se puede analizar en los anticuerpos producidos por clones de una sola célula la turbidez, propiedades de filtración, PAGE, IEF, barrido UV, HP-SEC, mapeo de carbohidratos-oligosacáridos, espectrometría de masas y ensayo de unión, tales como ELISA o Biacore. Luego, un clon seleccionado puede depositarse en múltiples viales y almacenarse congelado para su uso posterior.

Una vez expresados, los anticuerpos pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, que incluyen captura de proteína A, cromatografía en columna (p. ej., interacción hidrófoba o intercambio iónico), pH bajo para inactivación viral y similares (véase en general, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).

Se puede utilizar la metodología para la producción comercial de anticuerpos que incluye optimización de codones, selección de promotores, elementos de transcripción y terminadores, clonación de una sola célula sin suero, depósito en banco de células, uso de marcadores de selección para la amplificación del número de copias, terminador CHO, clonación de una sola célula sin suero, mejora de títulos de proteínas (véase, p. ej., los documentos US 5,786,464, US 6,114,148, US 6,063,598, US 7,569,339, WO2004/050884, WO2008/012142, WO2008/012142, WO2005/019442, WO2008/107388, y WO2009/027471 y US 5,888,809).

IV. Inmunógenos activos

Un agente utilizado para la inmunización activa sirve para inducir en un paciente los mismos tipos de anticuerpos descritos anteriormente en relación con la inmunización pasiva. Los agentes usados para la inmunización activa pueden ser los mismos tipos de inmunógenos usados para generar anticuerpos monoclonales en animales de laboratorio, p. ej., un péptido de 3-15 o 3-12 o 5-12, o 5-8 aminoácidos contiguos de una región de tau correspondiente a los restos 23-46, 25-44, 28-41 o 30-39 de SEQ ID NO: 1, tal como, por ejemplo, un péptido que incluye los restos 28-30, 28-31, 28-32, 28-33, 28-34, 28-35, 28-36, 28-37, 28-38, 28­ 39, 28-40, 28-41, 29-31, 29-32, 29-33, 29-34, 29-35, 29-36, 29-37, 29-38, 29-39, 29-40, 29-41, 30-32, 30-33, 30-34, 30-35, 30-36, 30-37, 30-38, 30-39, 30-40, 30-41, 31-33, 31-34, 31-35, 31-36, 31-37, 31-38, 31-39, 31­ 40, 31-41, 32-34, 32-35, 32-36, 32-37, 32-38, 32-39, 32-40, 32-41, 33-35, 33-36, 33-37, 33-38, 33-39, 33-40, 33-41, 34-36, 34-37, 34-38, 34-39, 34-40, 34-41, 35-37, 35-38, 35-39, 35-40, 35-41, 36-38, 36-39, 36-40, 36­ 41 de la SEQ ID NO: 1. Para inducir la unión de anticuerpos al mismo epítopo o superpuesto que 16B5, la especificidad del epítopo de estos anticuerpos se puede mapear (p. ej., ensayando la unión a una serie de péptidos que se superponen que abarcan tau). Entonces puede usarse como inmunógeno un fragmento de tau que consiste en o incluye o se superpone con el epítopo. Dichos fragmentos se utilizan normalmente en forma no fosforilada.

El portador heterólogo y el adyuvante, si se usan, pueden ser los mismos que se usaron para generar el anticuerpo monoclonal, pero también se pueden seleccionar para una mejor idoneidad farmacéutica para usar en seres humanos. Los portadores adecuados incluyen albúminas séricas, hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbúmina, toxoide tetánico o un toxoide de otras bacterias patógenas, tales como la difteria (p. ej., CRM197), E. coli, cólera o H. pylori, o un derivado de toxina atenuada. Los epítopos de células T también son moléculas portadoras adecuadas. Algunos conjugados pueden formarse mediante la unión de agentes de la invención a una molécula polimérica inmunoestimuladora (p. ej., tripalmitoil-S-glicerina cisteína (Pam3Cys), manano (un polímero de manosa) o glucano (un polímero p 1^-2)), citoquinas (p. ej., IL-1, péptidos alfa y p de IL-1, IL-2, y-INF, IL-10, GM-CSF) y quimioquinas (p. ej., MIP1-a y p, y RANTES). Los inmunógenos pueden unirse a los portadores con o sin aminoácidos espaciadores (p. ej., gly-gly). Los portadores adicionales incluyen partículas similares a virus. Las partículas similares a virus (VLP), también llamadas pseudoviriones o partículas derivadas de virus, representan estructuras de subunidades compuestas de múltiples copias de una cápside y/o proteína de envoltura viral capaz de autoensamblarse en las VLP de simetría esférica definida in vivo. (Powilleit, et al., (2007) PLoS ONE 2(5):e415). Alternativamente, los inmunógenos peptídicos se pueden unir a al menos un epítopo de células T artificial capaz de unirse a una gran proporción de moléculas MHC de clase II, tal como el epítopo pan DR ("PADRE"). PADRE se describe en los documentos US 5,736,142, WO 95/07707, y Alexander J et al., Immunity, 1:751-761 (1994). Los inmunógenos activos pueden presentarse en forma multimérica en la que múltiples copias de un inmunógeno y/o su portador se presentan como una sola molécula covalente.

Los fragmentos a menudo se administran con adyuvantes farmacéuticamente aceptables. El adyuvante aumenta el título de anticuerpos inducidos y/o la afinidad de unión de los anticuerpos inducidos en relación con la situación si el péptido se usara solo. Se puede usar una variedad de adyuvantes en combinación con un fragmento inmunogénico de tau para provocar una respuesta inmunitaria. Los adyuvantes preferidos aumentan la respuesta intrínseca a un inmunógeno sin causar cambios conformacionales en el inmunógeno que afecten a la forma cualitativa de la respuesta. Los adyuvantes preferidos incluyen sales de aluminio, tales como hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (MPL™) (véase documento GB 2220211 (RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, ahora parte de Corixa). Stimulon™ QS-21 es un glucósido triterpénico o saponina aislado de la corteza del árbol Quillaja Saponaria Molina que se encuentra en América del Sur (véase Kensil et al., en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell y Newman, Plenum Press, Nueva York, 1995); documento US 5,057,540), (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA; ahora Antigenics, Inc., Nueva York, NY). Otros adyuvantes son emulsiones de aceite en agua (tales como escualeno o aceite de cacahuete), opcionalmente en combinación con estimulantes inmunitarios, tales como monofosforil-lípido A (véase, p. ej., Stoute et al., N. Engl. J. Med.

336, 86-91 (1997)), polímeros plurónicos y micobacterias muertas. Los adyuvantes de Ribi son emulsiones de aceite en agua. Ribi contiene un aceite metabolizable (escualeno) emulsionado con solución salina que contiene Tween 80. Ribi también contiene productos micobacterianos refinados que actúan como inmunoestimuladores y monofosforil-lípido A bacteriano. Otro adyuvante es CpG (documento WO 98/40100). Los adyuvantes se pueden administrar como un componente de una composición terapéutica con un agente activo o se pueden administrar por separado, antes, simultáneamente o después de la administración del agente terapéutico.

También se pueden usar análogos de fragmentos naturales de tau que inducen anticuerpos contra tau. Por ejemplo, uno o más o todos los L-aminoácidos pueden sustituirse con D-aminoácidos en dichos péptidos. También se puede invertir el orden de los aminoácidos (péptido retro). Opcionalmente, un péptido incluye todos los D-aminoácidos en orden inverso (péptido retro-inverso). Péptidos y otros compuestos que no tienen necesariamente una similitud de secuencia de aminoácidos significativa con péptidos tau pero que, sin embargo, sirven como miméticos de péptidos tau e inducen una respuesta inmunitaria similar. También se pueden usar anticuerpos antiidiotípicos contra anticuerpos monoclonales contra tau como se describe anteriormente. Dichos anticuerpos anti-Id imitan al antígeno y generan una respuesta inmunitaria contra él (véase Essential Immunology, Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, CA 6a ed., pág. 181).

Los péptidos (y opcionalmente un portador fusionado con el péptido) también se pueden administrar en forma de un ácido nucleico que codifica el péptido y expresar in situ en un paciente. Un segmento de ácido nucleico que codifica un inmunógeno normalmente está unido a elementos reguladores, tales como un promotor y potenciador que permiten la expresión del segmento de ADN en las células diana previstas de un paciente. Para la expresión en células sanguíneas, como es deseable para la inducción de una respuesta inmunitaria, los elementos promotores y potenciadores de genes de inmunoglobulina de la cadena ligera o pesada o el promotor y potenciador temprano intermedio principal de CMV son adecuados para la expresión directa. Los elementos reguladores y las secuencias codificantes unidos a menudo se clonan en un vector. Los anticuerpos también se pueden administrar en forma de ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesadas y/o ligeras de los anticuerpos. Si están presentes tanto las cadenas pesadas como las ligeras, las cadenas se unen preferiblemente como un anticuerpo de cadena sencilla. También se pueden preparar anticuerpos para administración pasiva, p. ej., mediante cromatografía de afinidad a partir de sueros de pacientes tratados con inmunógenos peptídicos.

El ADN se puede administrar en forma desnuda (es decir, sin materiales coloidales o encapsulantes).

Alternativamente, se puede usar una serie de sistemas de vectores virales, incluidos sistemas retrovirales (véase, p. ej., Lawrie y Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)); vectores de adenovirus {véase, p. ej., Bett et al., J. Virol. 67, 591 1 (1993)); vectores de virus adenoasociados {véase, p. ej., Zhou et al., J. Exp. Med. 179, 1867 (1994)), vectores virales de la familia de la viruela, incluidos el virus vaccinia y los virus de la viruela aviar, vectores virales del género de alfavirus tales como los derivados de los virus Sindbis y del bosque Semliki (véase, p. ej., Dubensky et al., J. Virol. 70, 508-519 (1996)), virus de la encefalitis equina venezolana (véase el documento US 5,643,576) y rabdovirus, tal como el virus de la estomatitis vesicular (véase el documento WO 96/34625) y papilomavirus (Ohe et al., Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995); Woo et al, WO 94/12629 y Xiao y Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)).

El ADN que codifica un inmunógeno, o un vector que contiene el mismo, se puede empaquetar en liposomas. Los lípidos adecuados y análogos relacionados se describen en los documentos US 5,208,036, US 5,264,618, US 5,279,833 y US 5,283,185. Los vectores y el ADN que codifican un inmunógeno también pueden adsorberse o asociarse con portadores de partículas, ejemplos de los cuales incluyen polímeros de poli(metacrilato de metilo) y polilactidas y poli(lactida-co-glicólidos), (véase, p. ej., McGee et al., J. Micro Encap. 1996).

V. Métodos de cribado

Los anticuerpos se pueden cribar inicialmente según la especificidad de unión pretendida como se describe anteriormente. Los inmunógenos activos también pueden cribarse según su capacidad para inducir anticuerpos con dicha especificidad de unión. En este caso, se utiliza un inmunógeno activo para inmunizar a un animal de laboratorio y se analizan los sueros resultantes para determinar la especificidad de unión apropiada.

A continuación, los anticuerpos que tienen la especificidad de unión deseada se pueden ensayar en modelos celulares y animales. Las células utilizadas para dicho cribado son preferiblemente células neuronales. Se ha descrito un modelo celular de patología tau en el que células de neuroblastoma se transfectan con un dominio de tau de cuatro repeticiones, opcionalmente con una mutación asociada con la patología tau (p. ej., delta K280, véase Khlistunova, Current Alzheimer Research 4, 544- 546 (2007)). En otro modelo, tau se induce en la línea celular de neuroblastoma N2a mediante la adición de doxiciclina. Los modelos celulares permiten estudiar la toxicidad de tau para las células en estado soluble o agregado, la aparición de agregados de tau después de activar la expresión del gen tau, la disolución de los agregados de tau después de desactivar nuevamente la expresión del gen y la eficacia de los anticuerpos inhibiendo la formación de agregados de tau o desagregándolos.

Los anticuerpos o los inmunógenos activos también se pueden cribar en modelos de animales transgénicos de enfermedades asociadas con tau. Dichos animales transgénicos pueden incluir un transgén de tau (p. ej., cualquiera de las isoformas humanas) y opcionalmente un transgén de APP humana entre otros, tal como una quinasa que fosforila tau, ApoE, presenilina o alfa sinucleína. Dichos animales transgénicos están predispuestos para desarrollar al menos un signo o síntoma de una enfermedad asociada con tau.

Un animal transgénico de ejemplo es la línea K3 de ratones (Itner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(41):15997-6002 (2008)). Estos ratones tienen un transgén tau humano con una mutación K 369 I (la mutación está asociada con la enfermedad de Pick) y un promotor Thy 1.2. Este modelo muestra una evolución rápida de neurodegeneración, deficiencia motora y degeneración de fibras aferentes y células granulosas del cerebelo. Otro animal de ejemplo es la línea de ratones pR5. Estos ratones tienen un transgén tau humano con una mutación P301L (la mutación está asociada con la demencia frontotemporal) y un promotor Thy 1.2 (Taconic, Germantown, NY, Lewis, et al., Nat Genet. 25:402-405 (2000)). Estos ratones tienen una evolución más gradual de neurodegeneración. Los ratones desarrollan ovillos neurofibrilares en varias regiones del cerebro y la médula espinal, que se incorpora en el presente documento en su totalidad por referencia). Este es un excelente modelo para estudiar las consecuencias del desarrollo de ovillos y para cribar terapias que puedan inhibir la generación de estos agregados. Otra ventaja de estos animales es el inicio relativamente temprano de la patología. En la línea homocigota, las anomalías de comportamiento asociadas con la patología tau se pueden observar al menos tan pronto como a los 3 meses, pero los animales permanecen relativamente sanos al menos hasta los 8 meses de edad. En otras palabras, a los 8 meses, los animales deambulan, se alimentan por sí mismos y pueden realizar las tareas de comportamiento lo suficientemente bien como para permitir el seguimiento del efecto del tratamiento. La inmunización activa de estos ratones durante 6-13 meses con -AI wI KLH-PHF-1 generó títulos de aproximadamente 1000 y mostró menos ovillos neurofibrilares, menos pSer422 y una pérdida de peso reducida en relación con los de control no tratados.

La actividad de los anticuerpos o agentes activos puede evaluarse mediante varios criterios que incluyen la reducción de la cantidad de tau total o tau fosforilada, la reducción de otras características patológicas, tales como los depósitos de amiloide de Ap, y la inhibición o el retraso o las deficiencias conductuales. También se puede ensayar en los inmunógenos activos la inducción de anticuerpos en los sueros. Tanto los inmunógenos pasivos como activos se pueden ensayar para el paso de anticuerpos a través de la barrera hematoencefálica al cerebro de un animal transgénico. Los anticuerpos o fragmentos que inducen un anticuerpo también se pueden ensayar en primates no humanos que naturalmente o por inducción desarrollan síntomas de enfermedades caracterizadas por tau. Los ensayos en un anticuerpo o agente activo generalmente se realizan junto con un control en el que se lleva a cabo un experimento paralelo, excepto que el anticuerpo o el agente activo están ausentes (p. ej., reemplazados por vehículo). Después se puede ensayar la reducción, el retraso o la inhibición de los signos o síntomas de la enfermedad atribuibles a un anticuerpo o agente activo que se está ensayando, en relación con el control.

VI. Pacientes susceptibles de tratamiento

La presencia de ovillos neurofibrilares se ha encontrado en varias enfermedades, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, deterioro cognitivo leve, tauopatía primaria relacionada con la edad, parkinsonismo postencefálico, demencia postraumática o demencia pugilística, enfermedad de Pick, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, parálisis supranuclear, demencia frontotemporal, degeneración del lóbulo frontotemporal, enfermedad de los granos argirófilos, tauopatía glial globular, complejo de esclerosis lateral amiotrófica/parkinsonismo-demencia de Guam, degeneración corticobasal (CBD), demencia con cuerpos de Lewy, variante con cuerpos de Lewy de la enfermedad de Alzheimer (LBVAD), parálisis supranuclear progresiva (PSP). Los presentes regímenes también se pueden usar en el tratamiento de cualquiera de estas enfermedades. Debido a la amplia asociación entre enfermedades y afecciones neurológicas y tau, los presentes regímenes pueden usarse en el tratamiento de cualquier sujeto que muestre niveles elevados de tau o tau fosforilada (p. ej., en el CSF) en comparación con un valor medio en individuos sin enfermedad neurológica. Los presentes regímenes también se pueden usar en el tratamiento o profilaxis de enfermedad neurológica en individuos que tienen una mutación en tau asociada con enfermedad neurológica. Los presentes anticuerpos son particularmente adecuados para usar en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, y especialmente en pacientes.

Los pacientes susceptibles de tratamiento incluyen individuos en riesgo de enfermedad, pero que no muestran síntomas, así como pacientes que actualmente muestran síntomas. Los pacientes en riesgo de enfermedad incluyen aquellos que tienen un riesgo genético conocido de enfermedad. Dichos individuos incluyen aquellos que tienen familiares que han sufrido esta enfermedad y aquellos cuyo riesgo está determinado por el análisis de marcadores genéticos o bioquímicos. Los marcadores genéticos de riesgo incluyen mutaciones en tau, tales como las analizadas anteriormente, así como mutaciones en otros genes asociados con enfermedad neurológica. Por ejemplo, el alelo ApoE4 en forma heterocigota y más aún en homocigota se asocia con riesgo de enfermedad de Alzheimer. Otros marcadores de riesgo de enfermedad de Alzheimer incluyen mutaciones en el gen de APP, particularmente mutaciones en la posición 717 y las posiciones 670 y 671 denominadas mutaciones Hardy y Swedish respectivamente, mutaciones en los genes de presenilina, PS1 y PS2, antecedentes familiares de AD, hipercolesterolemia o aterosclerosis. Los individuos que padecen actualmente la enfermedad de Alzheimer se pueden reconocer mediante imágenes PET, por la demencia característica, así como por la presencia de los factores de riesgo descritos anteriormente. Además, hay una serie de pruebas de diagnóstico disponibles para identificar los individuos que tienen AD. Estas incluyen la medición de los niveles de tau o fosfo-tau y Ap42 en el CSF. Los niveles elevados de tau o fosfo-tau y reducidos de Ap42 significan la presencia de AD. Algunas mutaciones asociadas a la enfermedad de Parkinson. Ala30Pro o Ala53, o mutaciones en otros genes asociados con la enfermedad de Parkinson tales como la quinasa con repeticiones ricas en leucina, PARK8. Los individuos también pueden tener un diagnóstico de cualquiera de las enfermedades neurológicas mencionadas anteriormente según los criterios del DSM IV TR.

En pacientes asintomáticos, el tratamiento puede comenzar a cualquier edad (p. ej., 10, 20, 30). Sin embargo, normalmente no es necesario comenzar el tratamiento hasta que el paciente alcanza los 40, 50, 60 o 70 años de edad. El tratamiento generalmente implica múltiples dosis a lo largo de un período de tiempo. El tratamiento se puede vigilar analizando los niveles de anticuerpos a lo largo del tiempo. Si la respuesta cae, está indicada una dosis de refuerzo. En el caso de potenciales pacientes con síndrome de Down, el tratamiento puede comenzar antes del parto administrando el agente terapéutico a la madre o poco después del nacimiento.

VII. Composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento

En aplicaciones profilácticas, se administra un anticuerpo o agente para inducir un anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo a un paciente susceptible o de otra forma en riesgo de padecer una enfermedad (p. ej., la enfermedad de Alzheimer) con una pauta (dosis, frecuencia y vía de administración) eficaz para reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retrasar la aparición de al menos un signo o síntoma de la enfermedad. En particular, la pauta es preferiblemente eficaz para inhibir o retrasar tau o fosfo-tau y los filamentos emparejados formados a partir de esta en el cerebro y/o inhibir o retrasar sus efectos tóxicos y/o inhibir/o retrasar el desarrollo de las deficiencias de comportamiento. En las aplicaciones terapéuticas, se administra un anticuerpo o agente para inducir un anticuerpo a un paciente que se sospecha o que ya sufre una enfermedad (p. ej., enfermedad de Alzheimer) en una pauta (dosis, frecuencia y vía de administración) eficaz para mejorar o al menos inhibir el mayor deterioro de al menos un signo o síntoma de la enfermedad. En particular, la pauta es preferiblemente eficaz para reducir o al menos inhibir el aumento adicional de los niveles de tau, fósforo-tau o filamentos emparejados formados a partir de esta, toxicidades asociadas y/o deficiencias de comportamiento.

Una pauta se considera terapéutica o profilácticamente eficaz si un paciente individual tratado alcanza un resultado más favorable que el resultado medio en una población de control de pacientes comparables no tratados por los métodos de la invención, o si se demuestra un resultado más favorable en pacientes tratados frente a pacientes de control en un ensayo clínico controlado (p. ej., un ensayo de fase II, fase II/IN o fase III) en el nivel de p<0.05 o 0.01 o incluso 0.001.

Las dosis eficaces varían dependiendo de muchos factores diferentes, tales como los medios de administración, sitio objetivo, estado fisiológico del paciente, si el paciente es un portador de ApoE, si el pacientes es ser humano o un animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico.

Un intervalo de dosis de ejemplo para anticuerpos es de aproximadamente 0.01 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0.01 a 5 mg/kg o de 0.1 a 3 mg/kg o 0.15-2 mg/kg o 0.15-1.5 mg/kg de peso corporal del paciente. El anticuerpo se puede administrar en dichas dosis diariamente, en días alternos, semanalmente, quincenalmente, mensualmente, trimestralmente o de acuerdo con cualquier otro plan determinado por análisis empíricos. Un tratamiento de ejemplo implica la administración en múltiples dosis durante un período prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Las pautas de tratamiento de ejemplo adicionales implican la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses.

La cantidad de un agente para administración activa varía de 0.1-500 |jg por paciente y, más habitualmente, de 1-100 o 1-10 jg por inyección para administración humana. El momento de las inyecciones puede variar significativamente desde una vez al día, a una vez al año, a una vez por década. Una pauta típica consiste en una inmunización seguida de inyecciones de refuerzo a intervalos de tiempo, tales como intervalos de 6 semanas o dos meses. Otra pauta consiste en una inmunización seguida de inyecciones de refuerzo 1,2 y 12 meses después. Otra pauta implica una inyección cada dos meses de por vida. Alternativamente, las inyecciones de refuerzo pueden ser irregulares según lo indique la vigilancia de la respuesta inmunitaria.

Los anticuerpos o agentes para inducir anticuerpos se administran preferiblemente por una vía periférica (es decir, una en la que un anticuerpo administrado o inducido cruza la barrera hematoencefálica para llegar a un sitio pretendido en el cerebro). Las vías de administración incluyen la tópica, intravenosa, oral, subcutánea, intraarterial, intracraneal, intratecal, intraperitoneal, intranasal, intraocular, intratecal o intramuscular. Las vías preferidas para la administración de anticuerpos son la intravenosa y subcutánea. Las vías preferidas para la inmunización activa son la subcutánea y la intramuscular. Este tipo de inyección se aplica más típicamente en los músculos del brazo o pierna. En algunos métodos, los agentes se inyectan directamente en un tejido particular donde se han acumulado depósitos, por ejemplo, inyección intracraneal.

Las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral son preferiblemente estériles y sustancialmente isotónicas y fabricadas en condiciones de GMP. Las composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar en forma de dosis unitaria (es decir, la dosis para una única administración). Las composiciones farmacéuticas se pueden formular usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o auxiliares fisiológicamente aceptables. La formulación depende de la vía de administración seleccionada. Para la inyección, los anticuerpos se pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o solución salina fisiológica o tampón de acetato (para reducir molestias en el sitio de inyección). La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. De manera alternativa, los anticuerpos pueden estar en forma liofilizada para la constitución antes de usar con un vehículo adecuado, p. ej., agua estéril sin pirógenos.

Las presentes pautas se pueden administrar en combinación con otro agente eficaz en el tratamiento o la profilaxis de la enfermedad que se está tratando. Por ejemplo, en el caso de la enfermedad de Alzheimer, las presentes pautas pueden combinarse con inmunoterapia contra Ap (documento W0/2000/072880), inhibidores de colinesterasa o memantina o, en el caso de la enfermedad de Parkinson, inmunoterapia contra la alfa sinucleína WO/2008/103472, levodopa, agonistas de dopamina, inhibidores de COMT, inhibidores de MAO-B, amantadina o agentes anticolinérgicos.

VIII. Imágenes in vivo, métodos de diagnóstico e inmunoterapia de optimización

La invención puede ser útil para la formación de imágenes de depósitos de proteína tau (p. ej., ovillos neurofibrilares e inclusiones de tau) en un paciente. Los métodos funcionan mediante la administración de un reactivo, tal como un anticuerpo que se une a tau (p. ej., un anticuerpo 16B5 de ratón, humanizado, quimérico o de superficie modificada), al paciente y luego detectando el agente después de que se haya unido. Se prefieren los anticuerpos que se unen a un epítopo de tau dentro de los aminoácidos 24 a 46. En algunos métodos, el anticuerpo se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 25 a 44, o dentro de los aminoácidos 30 a 39. Se puede evitar o reducir una respuesta de depuración para los anticuerpos administrados usando fragmentos de anticuerpos que carecen de la región constante de longitud completa, tales como Fab. En algunos métodos, el mismo anticuerpo puede servir tanto como un reactivo de tratamiento como de diagnóstico.

Los reactivos de diagnóstico pueden administrarse por inyección intravenosa en el cuerpo del paciente, o directamente en el cerebro por inyección intracraneal o perforando un agujero a través del cráneo. La dosis de reactivo debe estar dentro de los mismos intervalos que para los métodos de tratamiento. Típicamente, el reactivo está marcado, aunque en algunos métodos, el reactivo primario con afinidad por tau no está marcado y se utiliza un agente de marcado secundario para unirse al reactivo primario. La elección del marcador depende del medio de detección. Por ejemplo, un marcador fluorescente es adecuado para la detección óptica. El uso de marcadores paramagnéticos es adecuado para la detección tomográfica sin intervención quirúrgica. Los marcadores radiactivos también se pueden detectar utilizando PET o SPECT.

Los métodos de formación de imágenes in vivo de los depósitos de proteína tau son útiles para diagnosticar o confirmar el diagnóstico de una tauopatía, tal como la enfermedad de Alzheimer, la degeneración del lóbulo frontotemporal, la parálisis supranuclear progresiva y la enfermedad de Pick, o la susceptibilidad a dicha enfermedad. Por ejemplo, los métodos pueden usarse en un paciente que presenta síntomas de demencia. Si el paciente tiene ovillos neurofibrilares anormales, entonces es probable que el paciente padezca la enfermedad de Alzheimer. Alternativamente, si el paciente tiene inclusiones de tau anormales, entonces dependiendo de la situación de las inclusiones, el paciente puede estar padeciendo degeneración del lóbulo frontotemporal. Los métodos también se pueden utilizar en pacientes asintomáticos. La presencia de depósitos anormales de proteína tau indica susceptibilidad a una futura enfermedad sintomática. Los métodos también son útiles para vigilar la evolución de la enfermedad y/o la respuesta al tratamiento en pacientes a los que se les diagnosticó previamente una enfermedad relacionada con tau.

El diagnóstico se puede hacer por comparación del número, tamaño y/o intensidad de los locus marcados con los valores de referencia correspondientes. Los valores de referencia pueden representar los niveles medios en una población de individuos no enfermos. Los valores de referencia también pueden representar niveles previos determinados en el mismo paciente. Por ejemplo, se pueden determinar los valores de referencia en un paciente antes de iniciar el tratamiento de inmunoterapia tau y comparar los valores medidos en lo sucesivo con los valores de referencia. Una disminución de los valores con respecto a la referencia indica una respuesta positiva al tratamiento.

En algunos pacientes, se puede ayudar al diagnóstico de una tauopatía llevando a cabo una exploración PET. Se puede llevar a cabo una exploración PET utilizando, por ejemplo, un generador de imágenes PET convencional y un equipo auxiliar. La exploración típicamente incluye una o más regiones del cerebro que en general se sabe que están asociadas con depósitos de proteína tau y una o más regiones en las que generalmente hay pocos depósitos, si es que hay alguno, para servir como controles.

La señal detectada en una exploración PET se puede representar como una imagen multidimensional. La imagen multidimensional puede ser en dos dimensiones que representa una sección transversal a través del cerebro, en tres dimensiones, que representa el cerebro tridimensional, o en cuatro dimensiones que representa los cambios en el cerebro tridimensional a lo largo del tiempo. Se puede usar una escala de colores con diferentes colores que indican diferentes cantidades de marcador y, por inferencia, el depósito de proteína tau detectado. Los resultados de la exploración también se pueden presentar numéricamente, con números relacionados con la cantidad de marcador detectada y, en consecuencia, la cantidad de depósitos de proteína tau. El marcador presente en una región del cerebro que se sabe que está asociada con depósitos para una tauopatía particular (p. ej., enfermedad de Alzheimer) puede compararse con el marcador presente en una región que se sabe que no está asociada con depósitos para proporcionar una relación indicativa de la extensión de los depósitos dentro de la primera región. Para el mismo ligando radiomarcado, dichas relaciones proporcionan una medida comparable de los depósitos de proteína tau y sus cambios entre diferentes pacientes.

En algunos métodos, una exploración PET se realiza al mismo tiempo o en la misma visita del paciente que una MRI o exploración CAT. Una MRI o exploración CAT proporcionan más detalles anatómicos del cerebro que una exploración PET. Sin embargo, la imagen de una exploración PET se puede superponer a una imagen de MRI o exploración CAT indicando con mayor precisión la ubicación del ligando de PET y por inferencia los depósitos de tau en relación con las estructuras anatómicas del cerebro. Algunas máquinas pueden realizar tanto exploraciones PET como MRI o exploraciones CAT sin que el paciente cambie de posición entre las exploraciones, lo que facilita la superposición de imágenes.

Los ligandos de PET adecuados incluyen anticuerpos radiomarcados de la invención. El radioisótopo utilizado puede ser, por ejemplo, C11, N13, O15, F18 o I123. El intervalo entre la administración del ligando de PET y la realización de la exploración puede depender del ligando de PET y, en particular, de su tasa de captación y depuración en el cerebro, y de la semivida de su radiomarcador.

Las exploraciones PET también se pueden realizar como medida profiláctica en pacientes asintomáticos o en pacientes que tienen síntomas de deterioro cognitivo leve pero todavía no se les ha diagnosticado una tauopatía, pero tienen un riesgo elevado de desarrollar una tauopatía. Para los pacientes asintomáticos, las exploraciones son particularmente útiles para los individuos consideradas con un riesgo elevado de tauopatía debido a antecedentes familiares, factores de riesgo genéticos o bioquímicos o edad madura. Las exploraciones profilácticas pueden comenzar, por ejemplo, a una edad del paciente entre 45 y 75 años. En algunos pacientes, se realiza una primera exploración a los 50 años.

Las exploraciones profilácticas se pueden realizar a intervalos de, por ejemplo, entre seis meses y diez años, preferiblemente entre 1-5 años. En algunos pacientes, las exploraciones profilácticas se realizan anualmente. Si una exploración PET realizada como medida profiláctica indica niveles anormalmente altos de depósitos de proteína tau, se puede iniciar la inmunoterapia y realizar exploraciones PET posteriores como en pacientes con diagnóstico de una tauopatía. Si una exploración PET realizada como medida profiláctica indica niveles de depósitos de proteína tau dentro de los niveles normales, se pueden realizar más exploraciones PET a intervalos de entre seis meses y 10 años, y preferiblemente de 1-5 años, como antes, o en respuesta a la aparición de signos y síntomas de una tauopatía o deterioro cognitivo leve. Combinando exploraciones profilácticas con la administración de inmunoterapia dirigida a tau, si y cuando se detecta un nivel superior a lo normal de depósitos de proteína tau, los niveles de depósitos de proteína tau pueden reducirse hasta o acercarse a los niveles normales, o al menos inhibir que aumenten más, y el paciente puede permanecer sin la tauopatía durante un período más largo que si no recibe exploraciones profilácticas e inmunoterapia dirigida a tau (p. ej., al menos 5, 10, 15 o 20 años, o durante el resto de la vida del paciente).

Los niveles normales de depósitos de proteína tau pueden determinarse por la cantidad de ovillos neurofibrilares o inclusiones de tau en los cerebros de una muestra representativa de individuos de la población general a los que no se les ha diagnosticado una tauopatía en particular (p. ej., enfermedad de Alzheimer) y no se considera que tengan riesgo elevado de desarrollar dicha enfermedad (p. ej., una muestra representativa de individuos sin enfermedad menores de 50 años). Alternativamente, se puede reconocer un nivel normal en un paciente individual si la señal PET según los presentes métodos en una región del cerebro en la que se sabe que se desarrollan depósitos de proteína tau no es diferente (dentro de la precisión de la medición) de la señal de una región del cerebro en la que se sabe que tales depósitos normalmente no se desarrollan. Un nivel elevado en un individuo puede reconocerse por comparación con los niveles normales (p. ej., fuera de la media y la varianza de una desviación estándar) o simplemente por una señal elevada más allá del error experimental en una región del cerebro asociada con depósitos de proteína tau en comparación con una región que no se sabe que esté asociada con depósitos. Con el fin de comparar los niveles de depósitos de proteína tau en un individuo y una población, los depósitos de proteína tau deben determinarse preferiblemente en la(s) misma(s) región(es) del cerebro, incluyendo estas regiones al menos una región en la que se sabe que se forman depósitos de proteína tau asociados con una tauopatía particular (p. ej., enfermedad de Alzheimer). Un paciente que tiene un nivel elevado de depósitos de proteína tau es candidato para comenzar la inmunoterapia.

Después de comenzar la inmunoterapia, una disminución en el nivel de los depósitos de proteína tau puede verse primero como una indicación de que el tratamiento está teniendo el efecto deseado. La disminución observada puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 1-100%, 1 -50% o 1 -25% del valor de referencia. Dichos efectos pueden medirse en una o más regiones del cerebro en las que se sabe que se forman depósitos o pueden medirse a partir de un promedio de tales regiones. El efecto total del tratamiento se puede aproximar añadiendo el porcentaje de reducción con respecto al valor de referencia al aumento en los depósitos de proteína tau que de otro modo ocurriría en un paciente promedio no tratado.

El mantenimiento de los depósitos de proteína tau a un nivel aproximadamente constante o incluso un pequeño aumento en los depósitos de proteína tau también puede ser una indicación de la respuesta al tratamiento, aunque sea una respuesta subóptima. Dichas respuestas se pueden comparar con una evolución temporal de los niveles de depósitos de proteína tau en pacientes con una tauopatía particular (p. ej., enfermedad de Alzheimer) que no recibieron tratamiento, para determinar si la inmunoterapia está teniendo un efecto inhibiendo aumentos adicionales de depósitos de proteína tau.

El seguimiento de los cambios en los depósitos de proteína tau permite el ajuste de la inmunoterapia u otro régimen de tratamiento en respuesta al tratamiento. El seguimiento por PET proporciona una indicación de la naturaleza y el alcance de la respuesta al tratamiento. Luego, se puede determinar si se debe ajustar el tratamiento y, si se desea, se puede ajustar el tratamiento en respuesta al seguimiento por PET. Por lo tanto, el seguimiento por PET permite que la inmunoterapia dirigida a tau u otro régimen de tratamiento se ajuste antes de que otros biomarcadores, MRI o medidas cognitivas hayan respondido de manera detectable. Un cambio significativo significa que la comparación del valor de un parámetro después del tratamiento en relación con el valor base proporciona alguna evidencia de que el tratamiento ha tenido o no un efecto beneficioso. En algunos casos, un cambio de valores de un parámetro en el propio paciente proporciona evidencia de que el tratamiento ha dado como resultado o no un efecto beneficioso. En otros casos, el cambio de valores, si lo hay, en un paciente, se compara con el cambio de valores, si lo hay, en una población de control representativa de pacientes que no reciben inmunoterapia. Una diferencia en la respuesta en un paciente particular respecto de la respuesta normal en el paciente de control (p. ej., la media más la varianza de una desviación estándar) también puede proporcionar evidencia de que un régimen de inmunoterapia está consiguiendo o no un efecto beneficioso en un paciente.

En algunos pacientes, el seguimiento indica una disminución detectable en los depósitos de proteína tau pero que el nivel de depósitos de proteína tau permanece por encima de lo normal. En tales pacientes, si no hay efectos secundarios inaceptables, el régimen de tratamiento puede continuarse tal cual o incluso aumentar la frecuencia de administración y/o la dosis si no está ya en la dosis máxima recomendada.

Si el seguimiento indica que los niveles de depósitos de proteína tau en un paciente ya se han reducido a niveles normales, o casi normales, de depósitos de proteína tau, el régimen de inmunoterapia se puede ajustar desde uno de inducción (es decir, que reduce el nivel de depósitos de proteína tau) a uno de mantenimiento (es decir, que mantiene los depósitos de proteína tau en un nivel aproximadamente constante). Dicho régimen puede verse afectado por la reducción de la dosis y/o la frecuencia de administración de la inmunoterapia.

En otros pacientes, el seguimiento puede indicar que la inmunoterapia está teniendo algún efecto beneficioso pero un efecto subóptimo. Un efecto óptimo puede definirse como un porcentaje de reducción en el nivel de depósitos de proteína tau dentro de la mitad superior o cuartil de cambio en los depósitos de proteína tau (medido o calculado en todo el cerebro o región(es) representativa(s) del mismo en la(s) que se sabe que se forman depósitos de proteína tau) experimentado por una muestra representativa de pacientes con tauopatía que reciben inmunoterapia en un tiempo de medición dado después de comenzar la terapia. Un paciente que experimente una disminución más pequeña o un paciente cuyos depósitos de proteína tau permanezcan constantes o incluso aumenten, pero en menor medida de lo esperado en ausencia de inmunoterapia (p. ej., como se deduce de un grupo de control de pacientes a los que no se les administró inmunoterapia) puede clasificarse como que experimenta una respuesta positiva pero subóptima. Dichos pacientes pueden someterse opcionalmente a un ajuste de la pauta en el que se aumenta la dosis y/o la frecuencia de administración de un agente.

En algunos pacientes, los depósitos de proteína tau pueden aumentar de manera similar o mayor que los depósitos de tau en pacientes que no reciben inmunoterapia. Si tales aumentos persisten durante un período de tiempo, tal como 18 meses o 2 años, incluso después de cualquier aumento en la frecuencia o la dosis de los agentes, la inmunoterapia puede suspenderse si se desea en favor de otros tratamientos.

La descripción anterior del diagnóstico, seguimiento y ajuste del tratamiento para las tauopatías se ha centrado en gran medida en el uso de exploraciones PET. Sin embargo, cualquier otra técnica para visualizar y/o medir depósitos de proteína tau que sea sensible al uso de anticuerpos tau de la invención puede usarse en lugar de exploraciones PET para llevar a cabo tales métodos.

Ejemplos

Ejemplo 1. Generación del anticuerpo 16B5

El anticuerpo Pan 16B5, que reconoce tau esté o no fosforilada, se generó contra tau purificada y se seleccionó en función de sus propiedades de captura de alta afinidad en un ensayo ELISA.

Ejemplo 2. Clonación y secuenciación del anticuerpo 16B5

Se extrajo el ARN de células sedimentadas que expresaban el anticuerpo 16B5 utilizando Trizol LS (Invitrogen). Las concentraciones de ARN se midieron utilizando el kit Quant-IT (Invitrogen).

Se usó 5'-RACE para amplificar el extremo 5' del ARNm de IgG usando el kit Smart RACE (Clontech). Se usó aproximadamente 1 |jg de ARN para la reacción de RT y los grupos de ADNc se amplificaron aún más usando el cebador Universal proporcionado con el kit Smart RACE y los cebadores específicos de genes (GSP) diseñados en ExonBIO.

Secuencias de cebadores:

Cebador universal: CTAATACGACTCACTATAGGGC (SEQ ID NO: 7)

GSP:

IgG1 e IgG2a: CTC AAT TTT CTT GTC CAC CTT GGT GC (SEQ ID NO: 8)

IgG2b: CTC AAG TTT TTT GTC CAC CGT GGT GC (SEQ ID NO: 9)

Los productos de PCR se purificaron en gel y se clonaron en el vector pSUPER-blunt (Adexon, www.adexonbiotech.com). Para la cadena pesada, se miniprepararon y secuenciaron 15 colonias. Para la cadena ligera, se llevó a cabo la PCR de colonias para distinguir la cadena ligera aberrante endógena, y solo se secuenciaron los clones que no se amplificaron de la PCR de colonias. Los resultados de la secuenciación se analizaron en el vector NTI. Las secuencias del adaptador y cebador GSP se marcaron en el mapa. Las regiones entre las secuencias del adaptador y GSP son secuencias de cadena pesada de IgG que incluyen líder, péptido señal y región V, y parte de la región constante. Los ORF se marcaron en el mapa.

Ejemplo 3. Mapeo del epítopo del anticuerpo 16B5

Identificación del epítopo por análisis de fragmentos peptídicos. La secuencia de tau humana con 4 repeticiones de unión a microtúbulos y sin insertos N-terminales, y que contenía una mutación P301L (rTau), se expresó en E. coli y se purificó. Esta forma de tau tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3, con la sustitución de prolina por leucina en la posición 243 (que corresponde a P301L usando la convención de numeración basada en la isoforma más larga de tau). Se llevaron a cabo digestiones enzimáticas de 200 ug de tau con una de cuatro proteasas diferentes: tripsina (que escinde en el extremo carboxilo de arginina y lisina), quimotripsina (que escinde principalmente en el extremo carboxilo de tirosina, triptófano, fenilalanina y leucina), LysC (que escinde en el extremo carboxilo de lisina), o GluC (que escinde después de restos de glutamato y rara vez después de restos de aspartato). Todas las proteasas se obtuvieron de Thermo Scientific y las digestiones se realizaron durante 16 horas a 37°C. Los fragmentos peptídicos resultantes se incubaron con 10 |jg de 16B5 y se precipitaron utilizando perlas magnéticas de Proteína G (NEB). Los precipitados se lavaron exhaustivamente en PBS que contenía NaCl 300 mM y NP-40 al 0.5%, luego se eluyeron con NaCl 1 M en glicina 100 mM, pH 2.8. Los eluatos se secaron al vacío y se resuspendieron en ácido trifluoroacético (TFA) al 0.1%. Los eluatos resuspendidos se cargaron en una columna C18 de 4.6 x 50 mm y luego se fraccionaron por HPLC (sistema Agilent 1260 Infinity) utilizando un gradiente lineal de acetonitrilo con TFA al 0.075%. Las fracciones de los picos se recogieron, secaron y resuspendieron en agua destilada. Las masas e identidades de los péptidos se determinaron por MALDI-TOF/TOF. Se identificó un pico correspondiente a los restos 25-44 de la SEQ ID NO: 1 en el espectro de MS de LysC. Se identificaron los picos correspondientes a los restos 25-44 de la SEQ ID NO: 1 y 24-44 en el espectro de MS de tripsina. No se obtuvo señal a partir de las digestiones con quimotripsina y GluC, lo que sugiere que algunos epítopos pueden comprender el resto 29 de la SEQ ID NO: 1 y/o el resto 37 de la SEQ ID NO: 1.

Identificación del epítopo por análisis de mutaciones. Usando los resultados determinados por el análisis de fragmentos de péptidos (descrito anteriormente), se llevó a cabo la mutagénesis por deleción de rTau mediante la amplificación del plásmido completo usando métodos estándar de biología molecular. La proteína se expresó en pequeños volúmenes de cultivo bacteriano y volúmenes iguales de lisado bacteriano clarificado se sometieron a electroforesis, transferencia y tinción con el anticuerpo 16B5. Para controlar la carga de muestra, se usó Tau46, un anticuerpo con especificidad para la región C-terminal de tau (epítopo C-terminal), para teñir transferencias duplicadas. Ambos anticuerpos se utilizaron en una concentración de 0.2 jg/mL. Las imágenes se capturaron utilizando un escáner de fluorescencia Licor Odyssey. Los siguientes mutantes por deleción de tau se prepararon y analizaron de esta manera: A5-24, A23-32, ^a25-44, A30-39 y A37-46. Como se muestra en las Figuras 1 y 2, los mutantes por deleción A25-44 y A30-39 de tau no fueron detectados por el anticuerpo 16B5, lo que proporciona evidencia de que un epítopo reconocido por 16B5 se encuentra dentro de esos restos. El mutante por deleción A37-46 de tau era solo ligeramente detectable con 16B5, proporcionando evidencia de que algunos de los restos dentro de 37-46 (p. ej., el resto 37) pueden desempeñar un papel en la unión de 16B5 a tau. El anticuerpo 16B5 tiñó el mutante por deleción A23-32 de tau en menor medida que A5-24 y en mayor medida que los mutantes por deleción A25-44 y A30-39, proporcionando evidencia de que 16B5 también puede unirse a un péptido que comprende los restos 33-36, 30-36, 33-37, 30-37 o 33-39. Tomados en su conjunto, los datos obtenidos de los mutantes por deleción de tau sugieren que un epítopo reconocido por 16B5 puede comprender algunos o todos los restos 23-32 de la SEQ ID NO: 1 y algunos o todos los restos 37­ 46 de la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, 16B5 puede reconocer un epítopo dentro de los restos 32-38 o 28-41 de la SEQ ID NO: 1.

Identificación del epítopo por barrido de alanina. Los restos individuales dentro de la región de tau que abarca los restos 30-42 se mutaron a continuación a alanina usando mutagénesis por PCR. Las proteínas mutadas se expresaron y los lisados se resolvieron por electroforesis y se transfirieron con el anticuerpo 16B5 o el anticuerpo Tau46, como se describe anteriormente. Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 3. Los mutantes puntuales específicos analizados, incluidos T30A, M31A, H32A, Q33A, D34A, Q35A, E36A, G37A, D38A, T39A, D40A, ^a 41L y G42A, se enumeran encima de las transferencias. Los restos de interés particular están encerrados en recuadros en cada transferencia. La unión detectable de 16B5 fue completamente eliminada por el mutante de tau Q33A y reducida sustancialmente por el mutante de tau G37A, proporcionando evidencia de que el resto 33, y en menor medida el resto 37, pueden ser componentes importantes de un epítopo reconocido por 16B5. Otros restos pueden ser componentes importantes de un epítopo reconocido por 16B5 en un análisis Biacore.

Ejemplo 4. Inmunización pasiva en el modelo de ratón transgénico hTau.P301 L de tauopatía

Inmunización. Para este estudio se usaron ratones hembra hTau.P301L-Tg de 3 meses de edad en el fondo genético FVB/N. La administración de 10 mg/kg de anticuerpos de ensayo y de control se realizó por vía intraperitoneal, una vez por semana. La duración del tratamiento era de aproximadamente 5 meses. Después de 23 inyecciones, el estudio finalizó con el sacrificio de los ratones. La Tabla 1 describe los anticuerpos de ensayo y de control administrados en este estudio.

Tabla 1

La muerte prematura es un fenotipo observado en modelos de tauopatía murina transgénica. El modelo particular utilizado en este estudio desarrolla Tau hiperfosforilada a la edad de 6 meses, aunque con una alta variabilidad de inicio. Los ratones también sufren defectos motores, como recogimiento de las extremidades traseras (clasping) y movilidad general reducida, y mueren prematuramente a la edad de 8-11 meses (reMYND, datos no publicados, Terwel et al., 2005). Se sacrificaron los ratones que desarrollaron síntomas de la enfermedad en etapa terminal, caracterizados por la presencia del fenotipo de recogimiento de patas y pérdida de peso. Un número inesperadamente alto de ratones murió prematuramente sin la presencia de estos síntomas. Se considera que la causa de la muerte en tales casos no está relacionada con la tauopatía en etapa tardía o con el anticuerpo de ensayo y, en cambio, se cree que está relacionada con el fondo FVB/N innato.

La Tabla 2 muestra una visión de conjunto de la supervivencia general de todos los ratones durante el curso del estudio.

Tabla 2

*Un ratón del Grupo K tuvo que ser reemplazado al comienzo del estudio. Los datos se pueden analizar con o sin este ratón de reemplazo.

Después del sacrificio, los ratones se diseccionaron y los troncos encefálicos y los mesencéfalos se homogeneizaron utilizando un homogeneizador mecánico tipo Potter (VOS 14 S40, velocidad 750 rpm; VWR) en 10 volúmenes en peso de tampón Tris-inhibidor de proteinasa-fosfatasa enfriado con hielo (tampón TPPI) ^{que contiene: Tris-HCl 20 mM (pH 8.1); NaCl 150 Mm; ácido etilendiaminotetraacético 1 mM} (E^dtA, ^Merck); ácido etilenglicol-tetraacético 1 mM (EGTA, Sigma-Aldrich); pirofosfato de sodio 5 mM (Sigma); fluoruro de sodio 30 mM (Sigma-Aldrich); PMSF 1 mM (Sigma); vanadato de sodio 2 mM (Sigma); monohidrato de 1,10-orto-fenantrolina 10 mM (Sigma-Aldrich); inhibidor de tripsina de soja 5 pg/ml; pepstatina 5 pg/ml; y un cóctel de inhibidores de proteinasa (CPI, Roche Diagnostics GmbH, Alemania). Se centrifugaron volúmenes fijos de 140 pl y 100 pl de los homogeneizados de troncos encefálicos y mesencéfalos (TotH), respectivamente (aproximadamente la mitad de los volúmenes totales) a 136 000xg, durante 60 min a 4°C (rotor TLA-55, ultracentrífuga OptimaTMTLX, Beckman Coulter) para generar una fracción soluble en Tris (SF), almacenándose el resto de los homogeneizados totales a -80°C. Debido a un número limitado de soportes de centrífugas (N=12), las muestras se aleatorizaron para equilibrar la centrífuga y dividir los diferentes grupos de tratamiento en las diferentes sesiones de centrifugación.

El líquido sobrenadante (S1, también denominado "fracción soluble" o "SF") se separó del sedimento (PI), se dividió en partes alícuotas y se almacenó a -80°C. El sedimento P1 se solubilizó en 10 volúmenes en peso de una solución con alto contenido de sal (NaCl 0.85 M que contenía tampón TPPI) y se centrifugó a 20 000xg, durante 30 min a 4°C. El sedimento con alto contenido de sal resultante (P2) se almacenó a -80°C. El líquido sobrenadante (S2) se llevó hasta sarkosyl al 1% con una décima parte de sarkosyl al 10% y se incubó a temperatura ambiente durante 60 min en un vaso giratorio superior, luego se centrifugó a 136000xg, durante 60 min a 4°C. El líquido sobrenadante soluble en sarkosyl (S3) se almacenó a -80°C y el sedimento insoluble en sarkosyl (P3, también denominado "fracción insoluble" o "IF") se resuspendió en 30 pl de tampón TPPI y se dividió en partes alícuotas. Las fracciones de homogeneizado total (TotH), troncos encefálicos solubles en Tris (SF) e insolubles en sarkosyl (IF) generadas por el protocolo de fraccionamiento descrito anteriormente se usaron en la posterior electroforesis en gel de poliacrilamida y análisis de transferencia Western.

Electroforesis en gel de poliacrilamida y transferencia Western. Para la aplicación de SDS-PAGE convencional y transferencia Western, las muestras se desnaturalizaron y se redujeron mediante incubación a 95°C durante 10 min, luego se separaron en geles con Tris-HCl al 7.5 % (gel premoldeado Criterion XT, peine de 26 pocillos, 15 |jl, 1.0 mm; Biorad). Después de la electrotransferencia en seco (iBlot™ Invitrogen) a membranas de PVDF (iBlot™Gel Transfer Stacks, PVDF, Regular, Invitrogen), las membranas se lavaron en PFA al 0.4 % durante 30 min y luego se lavaron en solución salina tamponada con Tris. A continuación, las membranas se incubaron en solución salina tamponada con Tris (TBS, pH 7.6) que contenía 5% (p/v) de leche descremada en polvo y 0.1 % (v/v) de Tween-20 durante 1 hora. Las transferencias se incubaron con varios anticuerpos primarios antitau durante la noche, a las concentraciones de trabajo que se muestran en la Tabla 3. Después de lavar e incubar con un anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-ratón o anti-conejo (IgG de cabra anti-ratón o de cabra anti-conejo, DAKO), las transferencias se revelaron por el sistema de detección ECL (SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate, producto 34096, Thermo Scientific). Las imágenes se registraron digitalmente (VisionWorks Acquisition, UVP) con diferentes tiempos de exposición y se utilizó un software especializado (VisionWorks Analysis, UVP) para el análisis de las transferencias. Para comparar, se analizó con un gel de referencia intergel con partes alícuotas de cuatro fracciones que se analizaron en cada gel que se iba comparar. Los anticuerpos monoclonales primarios anti-tau utilizados para la detección incluyeron AT100 (fosfo-Tau, Thermo Scientific; dilución 1:250), AT8 (fosfo-Tau, Thermo Scientific; dilución 1:500), HT7 (pan Tau, Pierce; dilución 1:1000), y 1F5 (epítopo desconocido para el centro de ensayo, neotopo, dilución 3:500). Las transferencias se volvieron a detectar con anti-GAPDH (Abcam 9485; dilución 1:2500) como control de carga. Los anticuerpos pan Tau no son específicos para fosfo-Tau.

Tabla 3

Como se muestra en la Figura 4, se observó una reducción estadísticamente significativa en la cantidad de tau en fracciones de tronco encefálico insolubles en sarkosyl de animales tratados con el anticuerpo 16B5, en comparación con animales tratados con el anticuerpo de control 6F10. La significación estadística se evaluó usando la prueba t de Student, p<0.05. Esta reducción se observó tanto con anticuerpos específicos de fosfotau (AT8, panel superior izquierdo; AT100, panel inferior izquierdo; 1F5, panel superior derecho) como con anticuerpos pan-tau (HT7, panel inferior derecho). Las transferencias Western del homogeneizado total también indicaban una reducción significativa en la relación de fósforo-tau a tau total en los animales tratados con 16B5 en relación con los animales de control tratados con el anticuerpo 6F10, cuando se detectó con un anticuerpo fosfo-específico. Véase la Figura 5, panel izquierdo (que muestra la señal detectada con el anticuerpo anti-fosfo-tau AT8 dividida por la señal detectada con el anticuerpo pan tau HT7). Por el contrario, no hubo cambios significativos en la relación de los niveles de tau total a GAPDH en los homogeneizados totales de los animales tratados con 16B5 en comparación con los animales de control tratados con el anticuerpo 6F10. Véase la Figura 5, panel derecho (que muestra la señal detectada con el anticuerpo pan tau HT7 dividida por la señal detectada con el anticuerpo GAPDH). Estos datos proporcionan evidencia de que el nivel de fosfo-tau pero no de tau total se redujo en los homogeneizados.

Análisis histológico. Se realizó análisis inmunohistoquímico utilizando anticuerpos anti-fosfo-tau en el núcleo subtalámico anexo zona incerta (STH/ZI) y el núcleo interpuesto del cerebelo, parte anterior y posterior, núcleo cerebeloso lateral anexo (IntA/P/LAT). Las secciones de vibratomo sagital (40 jm ) se almacenaron en PBS con azida de sodio al 0.1% a 4°C hasta su uso. Ocho secciones por ratón, en el bregma indicado, se tiñeron con flotación libre con los mAb AT8, AT100 o 1F5. Se seleccionaron secciones para tinción con los anticuerpos indicados como se enumeran en la Tabla 4 a continuación. Las secciones de todos los animales seleccionadas según una tinción particular se aleatorizaron para la tinción y cuantificación con ocultación.

Las secciones de libre flotación se incubaron en Netwells™. Luego, las secciones se lavaron dos veces en PBS y se incubaron durante 20 minutos en peróxido de hidrógeno al 1.5% en PBS y metanol (1:1) para eliminar la actividad de la peroxidasa endógena. Después de lavar las secciones tres veces en PBS que contenía Triton X100 al 0.1 % (PBST), las secciones se bloquearon durante 30 min en suero fetal de ternero (FCS) al 10% en PBST seguido de una incubación durante la noche con anticuerpos primarios AT8, AT100 (Thermo Scientific), usando una concentración de 0.4 jg/m l y 0.05 jg/ml, respectivamente, en PBST con FCS al 10%. Después de enjuagar, las secciones se incubaron con anticuerpo secundario de cabra anti-ratón marcado con peroxidasa (GAMPO) (DAKO, 1/500 en PBST, FCS al 10%) y la señal se reveló con tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (DAB, 1 comprimido por 10 ml de Tris-HCl con 3 j l de H2O2 por 10 ml). Las secciones se contratiñeron con hematoxilina de Mayer, se deshidrataron en cinco etapas (50, 70, 95 y 2x100%) en etanol y xileno (Merck Eurolab) y se montaron en Depex (medio de montaje Depex, Laboratorio BDH).

Tabla 4

Las imágenes se adquirieron con un microscopio Olympus BX41 equipado con una cámara Color view II Olympus y se analizaron con un ordenador usando el software AnalySIS Five - CellAD. La configuración de la intensidad de la luz y del condensador para el microscopio se mantuvieron constantes durante todo el proceso de adquisición de imágenes. Todas las imágenes adquiridas se sometieron a las mismas subrutinas informáticas para minimizar el sesgo del investigador. El umbral de corte de densidad se aplicó uniformemente a lo largo del análisis.

Se seleccionó la región de interés, tal como se define a continuación, para la cuantificación automática de la(s) señal(es) de tinción. El núcleo subtalámico y la zona incerta estaban delimitados por el pedúnculo cerebral ventralmente y por la sustancia blanca dorsalmente, respectivamente, así como basándose en diferencias en la densidad celular (secciones sagitales del cerebelo bregma 1.32-1.92). Los núcleos interpuestos del cerebelo, la parte anterior y posterior y el núcleo cerebeloso lateral estaban delimitados por la sustancia blanca y los cambios en la densidad celular y el tercer ventrículo (secciones sagitales del cerebelo, bregma 1.92-2.64 para LAT y 0.84-1.8 para IntA/P). Para cada tinción, se incluyeron en el análisis 6 secciones de cerebro que contenían el STH/ZI y 16 secciones que contienen la IntA/P/LAT por ratón.

Como se muestra en la Fig. 6, la cantidad de fosfo-tau detectada en los núcleos del cerebelo y la región subtalámica de los animales tratados con el anticuerpo 16B5 se redujo significativamente en comparación con la cantidad de fosfo-tau detectada en las mismas estructuras en animales de control tratados con el anticuerpo 6F10. La significación estadística se evaluó usando la prueba t de Student, p<0.05.

Ejemplo 5. Humanización de 16B5

El análisis de secuencias muestra que el anticuerpo 16B5 tiene un dominio kappa variable (Vk) que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 16, que pertenece al subgrupo 1 de Kabat de ratón y corresponde al subgrupo 4 de Kabat humano. Las CDR de Kabat están subrayadas. El dominio pesado variable (Vh) del anticuerpo 16B5 tiene la secuencia de SEQ ID NO: 10, que pertenece al subgrupo 2b de Kabat de ratón, y corresponde al subgrupo 1 de Kabat humano (Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición; Publicación NIH n.° 91-3242). Las CDR de Kabat están subrayadas.

El dominio Vk de 16B5 incluye una secuencia de CDR-L1 de 17 restos (KSSQSLLNSRTRKNYLA, SEQ ID NO: 17), una secuencia de CDR-L2 de 7 restos (WASTRES, SEQ ID NO: 18), y una CDR-L3 de 8 restos (KQSYTLRT, SEQ ID NO: 19). La secuencia de CDR-L1 pertenece a la clase canónica 3, y las secuencias de CDR-L2 y CDR-L3 pertenecen a la clase 1 (Martin y Thornton (1996), J. Mol. Biol. 263:800-15).

El dominio Vh de 16B5 incluye una secuencia de CDR-H1 de 5 restos (YHGMD, SEQ ID NO: 11) basada en la numeración de Kabat o una secuencia de CDR-H1 de 10 restos (GYPFTYHGMD, SEQ ID NO: 24) basada en la numeración combinada de Kabat y Chothia, una secuencia de CDR-H2 de 17 restos (WINTYSGVPTYADDFKG, SEQ ID NO: 12) y una secuencia CDR-H3 de 8 restos (RRDFTMDF, SEQ ID NO: 13). La secuencia de CDR-H1 pertenece a la clase canónica 1 y la secuencia de CDR-H2 pertenece a la clase 2 (Martin y Thornton (1996), J. Mol. Biol. 263:800-15). La secuencia de CDR-H3 no tiene clase canónica, pero probablemente tiene una base deformada según las reglas de Shirai et al. (1999), FEBS Lett. 455:188-97.

Los restos en la interfase entre los dominios Vk y Vh son restos habituales para estas posiciones en ratones.

Se realizó una búsqueda sobre las secuencias de proteínas en la base de datos PDB (Deshpande et al. (2011), J. Virol. 85:1820-33) para encontrar estructuras que proporcionen un modelo estructural aproximado del anticuerpo 16B5. La estructura del fragmento Fab del anticuerpo anti-toxina del cólera Te33 (código pdb 1ZEA_H) se utilizó para el VL con una resolución de 1.78 A. Conservaba la misma estructura canónica para los bucles que 16B5. La estructura cristalina de Fab en el complejo Dsbb-Fab (código pdb 2ZUQ_B) se utilizó para modelizar el dominio VH de 16B5. Se resolvió en una resolución de 3.3 A y contenía las mismas estructuras canónicas para CDR-H1 y CDR-H2, y también la misma longitud de CDR-H3 con una base deformada. El programa BioLuminate se utilizó para modelizar una estructura aproximada de Fv de 16B5.

Una búsqueda en la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes del NCBI con una secuencia de Fv de 16B5 CDR"X"ed permitió la selección de armazones humanos adecuados en los que injertar las CDR murinas. Para Vk, se eligió una cadena ligera kappa humana con el código de acceso a NCBI ACJ71718.pro (SEQ ID NO: 20). Esta secuencia de cadena ligera kappa humana tiene las mismas clases canónicas para CDR-L2 y L3. Para Vh, se eligió la cadena pesada de Ig humana BAC02002.1 (SEQ ID NO: 14). Comparte la forma canónica de CDR-H1 y H2 de 16B5, y H3 tiene 8 restos de longitud con una base deformada prevista

Los diseños de cadena pesada y cadena ligera humanizadas y las retromutaciones basados en estos armazones humanos se muestran en las Tablas 5 y 6, respectivamente.

Se diseñó una cadena pesada variable (H1) de 16B5 humanizada que tenía la secuencia de SEQ ID NO: 15. El diseño incluye cuatro retromutaciones: R13K; S28P, V48M; y Y91F. Se seleccionó la K en la posición 13 porque es más frecuente que la R en seres humanos. Se seleccionó la P en la posición S28 porque se encuentra dentro de la región CDR de Chothia. Se seleccionó la M en la posición 48 porque es más frecuente que la V en seres humanos. Se seleccionó la F en la posición 98 porque está situada en una interfase, por lo que es deseable mantener el resto de ratón.

Se diseñó una cadena pesada variable (H2) de 16B5 humanizada que tenía la secuencia de SEQ ID NO: 35. El diseño incluye cuatro retromutaciones: R13K; S28P, V48M; e Y91F. La justificación de cada una de estas mutaciones es la misma que para H1. El diseño también incluye una mutación Q1E para la potencial estabilidad mejorada.

Se diseñaron cuatro secuencias de cadena ligera variable de 16B5 humanizada: la versión 1 (L1) tiene la secuencia de SEQ ID NO: 21 e incluye tres retromutaciones: D1N; M4L; e Y36F. Se seleccionó la N en la posición 1 porque forma un potencial enlace de hidrógeno con N61 en HCDR2. Se seleccionó la L en la posición 4 porque hace contacto con K96, Q97 y S98 en LCDR3; también hace contacto con F104, un resto de la interfase. Se seleccionó la F en la posición 36 porque Y puede formar enlaces de hidrógeno con D106 en HCDR3, mientras que F no puede. El enlace de hidrógeno constituiría una interacción adicional que puede afectar a la función de HCDR3 y, por lo tanto, preferiblemente se evita.

La versión 2 (L2) tiene la secuencia de SEQ ID NO: 22 e incluye cuatro retromutaciones: D1N; M4L; Y36F; y P43S. La justificación para D1N, M4L e Y36F es la misma que para la Versión 1. Se seleccionó la S en la posición 43 porque S forma un enlace de hidrógeno con Q110 en VH, que está cerca de HCDR3.

La versión 3 (L3) tiene la secuencia de SEQ ID NO: 23 e incluye tres retromutaciones: M4L; Y36F; y P43S. La justificación para cada una de estas mutaciones es la misma que para las Versiones 1 y 2.

La versión 4 (L4) tiene la secuencia de SEQ ID NO: 36 e incluye las cuatro retromutaciones de la versión 2, más D9S. D9S se incluyó para eliminar un sitio proteolítico.

La versión 5 (L5) tiene la secuencia de SEQ ID NO: 39 e incluye las retromutaciones de la versión 4, excepto que la posición L1 está ocupada por D.

Tabla 5

Secuencias para la humanización de la cadena pesada de 16B5

Tabla 5

Secuencias para la humanización de la cadena pesada de 16B5

Tabla 5

Secuencias para la humanización de la cadena pesada de 16B5

Tabla 5

Secuencias para la humanización de la cadena pesada de 16B5

Tabla 5

Secuencias para la humanización de la cadena pesada de 16B5

Tabla 6

Secuencias de regiones variables de cadena ligera de 16B5 humanizado

Tabla 6

Secuencias de regiones variables de cadena ligera de 16B5 humanizado

Tabla 6

Secuencias de regiones variables de cadena ligera de 16B5 humanizado

Tabla 6

Secuencias de regiones variables de cadena ligera de 16B5 humanizado

Ejemplo 6. Afinidad por tau de anticuerpos 16B5 humanizados

Los datos de unión para anticuerpos 16B5 humanizados que tienen un diseño H1L2, H1L4, H2L2, H2L4 se muestran en la Tabla 7 a continuación. A modo de comparación, también se muestran los datos de unión para 16B5 quimérico. Los datos se generaron utilizando un instrumento Biacore.

Las mediciones de resonancia de plasmón superficial se realizaron utilizando un Biacore T200 (GE Lifesciences). Todos los experimentos se realizaron utilizando una fase móvil de HEPES 10 mM pH 7.4, NaCl 150 mM y Tween-20 al 0.05% a 30 pl/min, sobre un chip sensor CM5 preparado por acoplamiento de amina con un anticuerpo de captura anti-ratón o anti-humano. Se unió 16B5 (forma quimérica o humanizada) al anticuerpo de captura inmovilizado, y se aplicaron concentraciones variadas de hTau-P301L recombinante purificada al complejo de anticuerpo en iteraciones sucesivas. Las etapas iterativas se separaron con etapas de regeneración con alto contenido de sal o pH bajo. Los experimentos se repitieron con diferentes preparaciones de anticuerpo y antígeno. El análisis se realizó con el software integrado Biacore. La forma H1L1 tenía una constante de disociación de aproximadamente 1/3 del anticuerpo quimérico. Otras formas tenían constantes de disociación comparables o al menos dentro de un factor de 2 del anticuerpo quimérico como se muestra en la Tabla 7.

Tabla 7

ka (M -V ) Kd (s-1) K^d (M)

H1L2 4.47E7 1.31E-4 2.94E-12

Ejemplo 7. Detección por inmunoprecipitación de Tau con anticuerpos 16B5 humanizados

Se extrajo una muestra post mortem de la corteza frontal de un paciente con enfermedad de Alzheimer con una puntuación de Braak de 6, secuencialmente en tampones de fuerza de solubilización creciente, en el siguiente orden: (i) tampón con alto contenido de sal (Tris 20 mM, EDTA 5 mM, DTT 1 mM , sacarosa al 10%, NaCl 7500 mM pH 7.4), (ii) tampón Triton (Tris 20 mM, EDTA 5 mM, DTT 1 mM, sacarosa al 10%, Triton X100 al 1%, NaCl 500 mM pH 7.4) y (iii) Tampón de sarkosyl (Tris 10 mM, EDTA 5 mM, DTT 1 mM, sacarosa al 10%, NaCl 500 mM, sarkosyl al 1%, pH 7.4).

Para cada muestra, se diluyeron 200 microgramos de las fracciones solubles en alto contenido de sal o 20 microgramos de las insolubles en sarkosyl en 400 microlitros de tampón de inmunoprecipitación (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, Triton X100 al 0.5 %, EGt A 1 mM, EDTA 1 mM, pH 7.4). Las muestras se aclararon previamente con perlas magnéticas de proteína G (New England Biolabs) y se añadieron 5 microgramos de anticuerpo a cada tubo. Los anticuerpos usados incluyeron: 1) anticuerpo IgG no inmune de ratón (mIgG), como control; 2) anticuerpo IgG no inmune humano (hIgG), como control; 3) anticuerpo quimérico 16B5 (Chi16B5); 4) 16B5 humanizado, versión H1L2 (h16B6-H1L2); y 16B5 humanizado, versión H1L3 (h16B6-H1L3). Los lisados y anticuerpos previamente aclarados se incubaron durante 2 horas a 4°C. Los complejos anticuerpo/antígeno se hicieron precipitar utilizando perlas magnéticas de proteína G, y los precipitados se lavaron exhaustivamente con PBS/NaCl 350 mM. Después de la elución con tampón Laemmli, los eluatos se resolvieron por SDS-PAGE y se transfirieron usando un anticuerpo policlonal tau (DAKO).

Como se muestra en la Fig. 7, H1L2 y H1L3 de 16B5 quimérico y 16B5 humanizado reconocieron tau tanto en fracciones solubles como insolubles del cerebro con Alzheimer.

Ejemplo 8. Caracterización inmunohistoquímica de anticuerpos contra tau 16B5 murino y humanizado en el cerebro de la enfermedad de Alzheimer

El anticuerpo monoclonal murino anti-tau 16B5 y sus dos variantes humanizadas, h16B5-H1L2 y h16B5-N1D, también se analizaron inmunohistoquímicamente en secciones congeladas recientes de la corteza cerebral humana de donantes con enfermedad de Alzheimer y controles de ancianos no enfermos.

Métodos:

Tejido cerebral humano

Las cortezas frontales se obtuvieron del Sun Health Research Institute. Los casos incluyeron seis pacientes (edad media 86.8 ± 0.40 SEM) con diagnóstico de enfermedad de Alzheimer y confirmado tras evaluación neuropatológica post mortem, y tres controles de ancianos sin enfermedad (edad media 77 ± 9.7 SEM). Los datos demográficos de los casos se enumeran en la Tabla 8, a continuación. Se realizó la inmunohistoquímica en criosecciones montadas en portaobjetos de 10 um fijadas ligeramente con acetona.

Tabla 8

Inmunohistoquímica

El método de inmunoperoxidasa fue el principal sistema de detección, que consistía en un polímero marcado con peroxidasa conjugado con inmunoglobulinas de cabra anti-ratón (EnVision+System Polímero marcado con HRP; Dako K4001) o un sistema de amplificación Vector ABC para anticuerpos humanizados biotinilados directamente (ABC Elite Standard; PK-6100; Vector Laboratories). La tinción se visualizó con un cromógeno DAB (DAB líquido Sistema cromógeno de sustrato; Dako K3468), que producía un depósito marrón.

El control negativo consistía en realizar el procedimiento inmunohistoquímico completo en las secciones adyacentes con un anticuerpo de control de isotipo de IgG o con omisión del anticuerpo primario.

Marcado inmunofluorescente

Se llevó a cabo la tinción inmunofluorescente doble para determinar la relación entre las variantes murina y humanizada del anticuerpo, otros anticuerpos tau que reconocen varios epítopos fosforilados y beta amiloide. Las secciones de tejido se tiñeron en paralelo con un cóctel de anticuerpos que contenía variantes humanizadas de 16B5 biotiniladas o marcadas con FITC (1 ug/mL) y un anticuerpo murino (ya sea monoclonal 16B5 (1 ug/mL), AT8 (1:1000), AT100 (1:1000) o 3D6 (1 ug/mL). Los anticuerpos murinos se detectaron con uno secundario anti-ratón de cabra conjugado con un fluoróforo 488 o 635 (Invitrogen). Los anticuerpos humanizados biotinilados se detectaron con una estreptavidina 635.

Preabsorciones

Para evaluar la especificidad de los anticuerpos contra sus antígenos diana, se preabsorbió 1 ug/mL de anticuerpos 16B5 con 50 ug/mL de tau P301L humana purificada o sinucleína de tipo natural (una proteína irrelevante) durante la noche a 4°C. A continuación, se aplicaron los anticuerpos al tejido y se llevó a cabo el procedimiento de inmunohistoquímica como se describe anteriormente.

Análisis de imágenes

Se formaron imágenes de los portaobjetos con el microscopio Olympus BX61, Olympus Nanozoomer 2.0HT, o un sistema confocal espectral Leica SPE. Las imágenes se recogieron como archivos TIFF.

Resultados

Como se muestra en la Tabla 9, a continuación, el anticuerpo monoclonal de ratón 16B5 y ambas variantes humanizadas mostraron reactividad en el tejido de la enfermedad de Alzheimer, tiñendo de forma destacada los hilos del neurópilo, algunos ovillos neurofibrilares (en su mayoría globosos) y algunas placas neuríticas positivas para tau. La mayor parte de la patología fibrilar de AD 16B5 estaba limitada a la sustancia gris, pero también se detectó cierta reactividad en la blanca. El tejido de control no enfermo, por el contrario, mostró una reactividad de fondo difusa, pero fue negativo para cualquier patología encontrada en el tejido AD.

Se realizaron experimentos de doble marcado con la versión monoclonal murina de 16B5 y con (1) ambas variantes humanizadas, (2) anticuerpos que reconocen tau en varios epítopos fosforilados y (3) beta amiloide para caracterizar aún más las patologías reconocidas por las variantes de anticuerpos.

Tanto h16B5-H1L2 como h16B5-N1D se colocalizaron con anticuerpo monoclonal 16B5 con alta congruencia en estructuras patológicas fibrilares de AD. H16B5-H1L2 también detectó patologías que mostraron ser inmunorreactivas para varios epítopos de tau fosforilados, incluidos serina202 y treonina205 (AT8), serina212 y treonina214 (AT100) y serina396 (anticuerpo patentado interno, 20H1). Finalmente, el doble marcado con un anticuerpo para beta amiloide que reconoce la secuencia de aminoácidos N-terminal (3D6; aa 1-5) y 16B5 mostró muy poca colocalización entre las estructuras inmunorreactivas Ap y 16B5 en las placas amiloides. Cuando se comparó la inmunorreactividad de 16B5 con un anticuerpo anti-tau monoclonal comercialmente disponible bien caracterizado (Dako), ambos tiñeron la patología fibrilar de AD que incluía placas neuríticas positivas para tau, hilos de neurópilos y ovillos neurofibrilares.

La especificidad del anticuerpo se evaluó mediante preabsorciones con tau P301L recombinante purificada. Se observó una disminución en la tinción cuando se preabsorbió 16B5 con tau P301L, pero la tinción no se vio afectada cuando los anticuerpos se preabsorbieron con una proteína irrelevante (sinucleína de tipo natural) en las mismas concentraciones molares.

Tanto las secciones de omisión del anticuerpo primario como del anticuerpo de control de isotipo de IgG fueron negativas para la tinción en todos los tejidos evaluados.

Tabla 9

Anticuerpos 16B5 caracterizados inmunohistoquímicamente

Tabla 9

Ejemplo 9. Análisis de termoestabilidad

La alta termoestabilidad es un factor importante para saber si las moléculas terapéuticas, tales como los anticuerpos, son útiles in vivo. Por lo tanto, la termoestabilidad de H1L2, H1L4 y H2L4 se analizó usando calorimetría diferencial de barrido (DSC).

Como se muestra en la Figura 9 y la Tabla 10 a continuación, H1L2, H1L4 y H2L4 muestran todos una estabilidad térmica adecuada, siendo H1L4 la más alta (es decir, >75°C).

Tabla 10

Variante__________________ Tm inicio (°C)__________________________ Tm 1 (°C)____________________ H1L2 64.49 74.49

H1L4 64.81 75.15

H2L4 64.55 74.56

Ejemplo 10. Análisis de la potencial agregación

La agregación es un problema para la estabilidad de almacenamiento a largo plazo de los anticuerpos terapéuticos. Por lo tanto, la potencial agregación de H1L2, H2L2, H1L4 y H2L4 se analizó usando dispersión de luz dinámica (DLS). Como se muestra en la Tabla 11, a continuación, la potencial agregación de H1L2, H2L2, H1L4 y H2L4 no es significativamente diferente.

Tabla 11

Variante Radio (nm) Polidispersidad (%) Contenido de monómero (%)

H1L2 5.91 ± 0.17 16.6 ± 5.27 99.9 ± 0.17

H2L2 6.05 ± 0.25 20.8 ± 4.28 99.9 ± 0.1

H1L4 6.32 ± 0.15 24.7 ± 2.98 100 ± 0

H2L4 6.12 ± 0.52 23.63 ± 9.05 99.9 ± 0.1

En caso de cualquier variación en las secuencias asociadas con los números de acceso de Genbank y UniProtKB/Swiss-Prot y similares, la solicitud se refiere a las secuencias asociadas con los números de acceso citados a partir de la fecha de presentación efectiva de la solicitud, lo que significa la fecha de presentación real o una fecha anterior de una solicitud prioritaria que revela el número de acceso relevante.

Lista de secuencias

SEQ ID NO: 1 TAU P10636-8

M AEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSEEPG

SE T SD A K ST P T A E D V T A P L V D E G A P G K Q A A A Q P H T E IP E G T T A E E A G IG D T P SL E D E A A G

HVTQ ARM VSKSKDG TG SD DKKAKG ADG KTK IATPRG AAPPG Q KG Q A NATR IPAKTPPA PK

T P P S S G E P P K S G D R S G Y S S P G S P G T P G S R S R T P S L P T P P T R E P K K V A V V R T P P K S P S S A K

S R L Q T A P V P M P D L K N V K S K IG S T E N L K H Q P G G G K V Q I IN K K L D L S N V Q S K C G SK D N IK H V

P G G G SV Q IV Y K P V D L S K V T S K C G SL G N IH H K P G G G Q V E V K S E K L D F K D R V Q S K IG S L D N I

T H V P G G G N K K IE T H K L T F R E N A K A K T D H G A E IV Y K SP V V SG D T SP R H L SN V SST G S ID M V

D SP Q L A T L A D E V SA SL A K Q G L

S E Q ID NO: 2 T A U P 10636- 7

M AEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSEEPG SE T SD A K ST P T A EA EEA G IG D T P SLE D EA A G H VT Q A R M V SK SK D G T G SD D K K A K G A D G K T K IA T P R G A A P P G Q K G Q A N A T R IP A K T P P A P K T P P SSG E P P K SG D R SG Y SSP G SP G T P G SR S R T P S L P T P P T R E P K K V A V V R T P P K S P S SA K SR L Q T A P V P M P D L K N V K S K IG S T E N L K H Q P G G G K V Q I IN K K L D L SN V Q SK C G S K D N IK H V P G G G S V Q IV Y K P V D L SK V T S K C G S L G N IH H K P G G G Q V EV K SEK LD F KD R V Q SK IG SLD N IT H V P G G G N K K IET H K LT FR EN A K A K T D H G A E IV Y K S P V V S G D T S P R H L S N V S S T G S ID M V D SP Q L A T L A D E V SA SL A K Q G L SEQ ID NO: 3 TAU P10636-6

M AEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKAEEAG IGDTPSLEDEA AG H VTQ ARM VSKSKDG TG SDDKKAKG ADG KTK IATPRG AAPFG Q KG Q AN ATR IPAKTPPA P K T P P S S G E P P K S G D R S G Y S S P G S P G T P G S R S R T P S L P T P P T R E P K K V A V V R T P P K S P S S A K SR L Q T A P V P M P D L K N V K S K IG S T E N L K H Q P G G G K V Q I IN K K L D L SN V Q SK C G S K D N IK H V P G G G SV Q IV Y K P V D L SK V T SK C G SL G N IH H K P G G G Q V E V K SE K L D F K D R V Q SK IG SL D N IT H V P G G G N K K IE T H K L T F R E N A K A K T D H G A E IV Y K S P W S G D T S P R H L S N V S S T G S ID M V D SP Q LA T LA D E V SA SLA K Q G L SEQ ID NO: 4 TAU P10636-5

M AEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSEEPG S E T SD A K ST P T A E D V T A P L V D E G A P G K Q A A A Q P H T E IP E G T T A E E A G IG D T P SL E D E A A G H VTQ ARM VSKSKD G TG SD D KKAKG AD G KTK IATPRG AAPPG Q KG Q A NATR IPAKTPPA PK T P P S S G E P P K S G D R S G Y S S P G S P G T P G S R S R T P S L P T P P T R E P K K V A V V R T P P K S P S S A K SR LQ T A PV P M P D L K N V K SK IG ST E N L K H Q P G G G K V Q IV Y K P V D L SK V T SK C G SL G N IH H K P G G G Q V E V K SE K LD FK D R V Q SK IG SLD N IT H V P G G G N K K IE T H K LT FR E N A K A K T D H G A E IV Y K S P V V S G D T S P R H L S N V S S T G S ID M V D S P Q L A T L A D E V S A S L A K Q G L SEQ ID NO: 5 TAU P10636-4

M AEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSEEPG SE T SD A K ST P T A EA EEA G IG D T P SLE D EA A G H VT Q A R M V SK SK D G T G SD D K K A K G A D G K T K IA T P R G A A P P G Q K G Q A N A T R IP A K T P P A P K T P P SSG E P P K SG D R SG Y SSP G SP G T P G SR S R T P S L P T P P T R E P K K V A V V R T P P K S P S S A K S R L Q T A P V P M P D L K N V K S K IG S IE N L K H Q P G G G K V Q IV Y K P V D L SK V T SK C G SL G N IH H K P G G G Q V E V K SE K L D F K D R V Q SK IG SL D N I T H V P G G G N K K IE T H K L T F R E N A K A K T D H G A E IV Y K SP V V SG D T SP R H L SN V SST G S ID M V D SP Q L A T L A D E V SA SL A K Q G L SEQ ID NO: 6 TAU P10636-2

M AEPRQ EFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD A G L K A E E A G I G D TPSLED E AAGHVTQARM VSKSKDG TG S DDKKAKGADG K T K IA T P R G A APPGQKGQAN A T R IP A K T P P A P K T P P SSG EP PKSG D RSG Y SSP G SP G TP G S R SR T P S L P T P P T R E P K K V AV V R T PPK S P S SA K S R L Q T APVPMPDLKN V K S K IG S T E N LKHQPGGGKV Q IV Y K P V D L S K V T SK C G SL GNIHHKPGGG Q V EV K SEK LD F K D R V Q S K IG S LD N IT H V P G G G NKK IETH K L T FREN ARA K T D H G A E IV Y K SPV V SG D T S P R H L S N V S S T G S ID M V D SP Q L A T L A D E V SA SLAKQGL SEQ ID NO: 7

CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C SEQ ID NO: 8

CTC AAT TTT CTT GTC CAC CTT GGT GC SEQ ID NO: 9

CTC AAG TTT TTT GTC CAC CGT GGT GC SEQ ID NO: 10 - 16B5-HC

MDW VW NLLFLM AAAQSIQAQ IQLVQSGPELKKPGETVK ISCKASGYPFTYHGM DW VKQAPW GGL EWMGWIN T Y SG V P T Y A D D F K G R F A F SL E T S V G T A Y L Q IN N L K N E D T A T Y F C A R RRDFTM DFWGQ G T SV T V SSA K TT P PSV Y P LA P G SA A Q T N SM V TLG C LV K G Y FP EP VT V T W N SG SLSSG V H T FP A V L Q S D L Y T L S S SVTVP SSTW PSETVTCNVAHPAS SEQ ID NO: 11 - 16B5 CDR-H1 (numeración de Kabat)

YHGMD SEQ ID NO: 12 - 16B5 CDR-H2

WINTYSGVPTYADDFKG SEQ ID NO: 13 - 16B5 CDR-H3

RRDFTMDF SEQ ID NO: 14 - FR Aceptor VH Hu (n.° Acc. BAC02002.1) QVQLVQSGSELKRPGASVKVSCKASGYSFTSYAVNW VRQAPGQGLEW VGW INTNTGNPTYAQGF T G R FV FSLD TSVSTAYLQ ISSLKAAD TA VYYC ARARG Q N G M D VW G Q G TTVTVSS SEQ ID NO: 15 - Diseño humanizado de cadena pesada de 16B5 v1 (R13K, S28P, V48M, Y91F) QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYPFTYHGMDW VRQAPGQGLEW MGW INTYSGVPTYADDF K G R F V F SLD T SV ST A Y LQ IS S LK A E D T A V Y F C A R R R D F T M D F W G Q G T T V T V SS SEQ ID NO: 16 - 16B5-LC

M D S Q A Q V L IL L L L W V S G T C G N IV L S Q S P S SL A V SP G E K V T M S C K S S Q S L L M S R T R K N Y L A WFQQ K P G Q S P K L L IY W A ST R E SG V P D R F T G SG SG T D F T L T IS SV Q A E D L A V Y Y C K Q SY T L R T FGGGTN L E IK R A D A A P T V S IF P P SSE Q L T SG G A SV V C F L N N F Y P K D IN V K W K ID G SE R Q N G V L N SW T D Q D S K D S T Y S M S S T L T L T K D E Y E R H N S Y T C E A T H K T S T SP I SEQ ID NO: 17 - 16B5-LC CDR-L1

KSSQSLLNSRTRKNYLA SEQ ID NO: 18 - 16B5-LC CDR-L2

WASTRES SEQ ID NO: 19 - 16B5-LC CDR-L3

KQSYTLRT SEQ ID NO: 20 - Fr aceptor VL Hu (Acc. n.° ACJ71718.1)

D IV M T Q SP D SL A V SL G E R A T IN C K SSQ SV L Y SSN N K N Y L A W Y Q Q K P G Q P P K L L IY W A ST R E SG V P D R F SG SG SG T D F T L T IS S L Q A E D V A V Y Y C Q Q Y Y ST P Q T F G G G T K V E IK R

SEQ ID NO: 21 - Diseño de cadena ligera humanizada de 16B5 v i (D1N, M4L, Y36F)

N IV L T Q SP D S L A V S L G E R A T IN C K S S Q SL L N S R T R K N Y L A W F Q Q K P G Q P P K L L IY W A S T R E S G V P D R F SG SG SG T D F T L T IS S L Q A E D V A V Y Y C K Q S Y T L R T F G G G T K V E IK R

SEQ ID NO: 22 - Diseño de cadena ligera humanizada de 16B5 v2 (DIN, M4L, Y36F, P43S)

N IV L T Q S F D SL ñ V S L G E R A T IN C K S S Q SL L N S R T R K N Y L A W F Q Q K P G Q S P K L L IY W A S T R E S G V P D R F SG SG SG T D F T L T IS S L Q A E D V A V Y Y C K Q S Y T L R T F G G G T K V E IK R

SEQ ID NO: 23 - Diseño de cadena ligera humanizada de 16B5 v3 (M4L, Y36F, P43S)

D IV L T Q S P D S L A V S L G E R A T IN C K S S Q S L L N S R T R K N Y L A W F Q Q K P G Q S P K L L IY W A S T R E SG V P D R F S G S G SG T D F T L T IS S L Q A E D V A V Y Y C K Q S Y T L R T F G G G T K V E IK R

SEQ ID NO: 24 - CDR-H1 de 16B5 (numeración combinada de Kabat y Chothia)

GYPFTYHGMD

SEQ ID NO: 25 - Ácido nucleico que codifica el diseño humanizado de cadena pesada de 16B5 v i

CAGgTCCAGTTGGTGCAGTCTGGATCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGCCTCCGTCAAGgtgTCCT G CAAG G CT ICTG G G TA ICCCTTCACATACCATG G AATG G ACTG G G TG cgtCAG G CTCCTggtca GGGTttaGAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACTCTGGAGTGCCAACATATGCTGATGACTTC A A G G G A C G A TT T G tgT T C TC T TT G G A cA C C T C T G T C tc tA C T G C C T A T T TG C A G A TC tc t tc tC TCAAAgccGAGGACacgGCCgtgTATTTTTGTGCAAGACGGCGTGATTTTACAATGGACTTCTG GGGTCAAGGAACCACCGTGACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO: 26 - Ácido nucleico que codifica el diseño humanizado de cadena ligera de 16B5 v i

AACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGAGCCACCATCA ACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCAGGACCAGGAAGAACTACCTGGCCTGGTTCCA GCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTG CCCGATAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGG CCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGCAAGCAGAGCTACACCCTGAGAACCTTCGGCGGCGGCAC CAAGGTG GAAATTAAACG T

SEQ ID NO: 27 - Ácido nucleico que codifica el diseño humanizado de cadena ligera de 16B5 v2

AACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGAGCCACCATCA ACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCAGGACCAGGAAGAACTACCTGGCCTGGTTCCA GCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTG CCCGATAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGG CCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGCAAGCAGAGCTACACCCTGAGAACCTTCGGCGGCGGCAC CAAGGT G GAAATTAAAC G T

SEQ ID NO: 28 - Ácido nucleico que codifica el diseño humanizado de cadena ligera de 16B5 v3

GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGAGCCACCATCA ACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCAGGACCAGGAAGAACTACCTGGCCTGGTTCCA GCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTG CCCGATAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGG CCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGCAAGCAGAGCTACACCCTGAGAACCTTCGGCGGCGGCAC CAAGGT G GAAATTAAAC G T

SEQ ID NO: 29 - Región constante de IgGi humana (se puede omitir la lisina C-terminal) A ST K G P SV F P L A P SSK ST SG G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V SW N SG A L T SG V H T F P A V L Q SSG L Y S L S S V V T V P SS S L G T Q T Y IC N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M ISR T P EV TC V V V D V SH ED P EV K FN W Y V D G V EV H N V KT K P R EEQ Y N ST Y R VV SV LT VL H Q D W LN G K E Y K C K V SN K A LP A P IE KT ISK A K G Q P R E P Q V Y T LP P SR E E M T K N Q V SLT C LV K G FY P SD IAVEW ESNG Q PEN NYKTTPPVLD SD G SFFLYSKLTVD KSRW Q Q G N VFSC SVM H EALH N H YT Q K S L S L S P G K

SEQ ID NO: 30 - ADNc de la región constante de IgG1 humana

GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCA CAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTC AGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCC CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGA ATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCA CACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCA AAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA GCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA GACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG CACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCC

CCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCC CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTAT CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGC CTCCCGTGCTGGAC_1-CCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAG GTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACG CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

SEQ ID NO: 31 - ADNc de la región constante de IgG1 humana con intrón 5'

GGTGAGTGGATCCGCGGCCGCTAAACTCTGAGGGGGTCGGATGACGTGGCCATTCTTTGCCTAA AGCATTGAGTTTACTGCAAGGTCAGAAAAGCATGCAAAGCCCTCAGAATGGCTGCAAAGAGCTC CAACAAAACAATTTAGAACTTTATTAAGGAATAGGGGGAAGCTAGGAAGAAACTCAAAACATCA AGATTTTAAATACGCTTCTTGGTCTCCTTGCTATAATTATCTGGGATAAGCATGCTGTTTTCTG TCTGTCCCTAACATGCCCTGTGATTAICCGCAAACAACACACCCAAGGGCAGAACTTTGTTACT TAAACACCATCCTGTTTGCTTCTTTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGG CACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT CCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCG GCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCT TGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAG AGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC CTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTA CGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG TACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGT GCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCA GCCCCGAGAACCACAGGTGTACACGCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTG ATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO: 32 - Región constante kappa humana

T V A A P S V F IF P P S D E Q L K S G T A S W C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N SQ E S V T E Q D S K D ST Y S L S ST L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L SS P V T K S F N R G E C

S E Q ID NO: 33 - A D N c de la región c on st an t e k ap pa h u m a n a

ACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTG CCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGA TAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACC TACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCT GCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT SEQ ID NO: 34 - ADNc de la región constante kappa humana con intrón 5' CGTGAGTGGATCCGCGGCCGCTAAACTCTGAGGGGGTCGGATGACGTGGCCATTCTTTGCCTAA AGCATTGAGTTTACTGCAAGGTCAGAAAAGCATGCAAAGCCCTCAGAATGGCTGCAAAGAGCTC CAACAAAACAAT T TAGAAC T T TAT T AAG GAAT AG GGGGAAGC TAGGAAGAAAC T C AAAACAT C A AGATTTTAAATACGCTTCTTGGTCTCCTTGCTATAATTATCTGGGATAAGCATGCTGTTTTCTG TCTGTCCCTAACATGCCCTGTGATTATCCGCAAACAACACACCCAAGGGCAGAACTTTGTTACT TAAACACCATCCTGTTTGCTTCTTTCCTCAGGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCC CGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTA TCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAG AGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCA AAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCC C GT CACAAAGAG C TTCAACAGGGGAGAGTGT SEQ ID NO: 35 - Diseño humanizado de cadena pesada de 16B5 v2 EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYPFTYHGMDWVRQAPGQGLEWMGWINTYSG VPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARRRDFTMDFWGQGTTVT vss

SEQ ID NO: 36 - Diseño humanizado de cadena ligera de 16B5 v4

NIVLTQ SPSSLAVSLG ERATINCKSSQ SLLNSRTRKNYLAW FQ Q KPG Q SPKLLIYW ASTR ESG VPDRFSG SG SG TDFTLTISSLQ AEDVAVYYCKQ SYTLRTFG G G TKVEIKR

SEQ ID NO: 37: Ácido nucleico que codifica el diseño humanizado de cadena pesada de 16B5 v2

g a g g t c c a g t t g g t g c a g t c t g g a t c t g a g c t g a a g a a g c c t g g a g c c t c c g t c a a GGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATCCCTTCACATACCATGGAATGGACTGGGTGCG TCAGGCTCCTG GTCAGGG TTTAGAGTGG ATGGG CTGG ATAAACACCTACTCTGG AGT G CCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGATTTGTGTTCTCTTTGGACACCTCTGTC TCTACTG CCTATTTGCAG ATCTCTTCTCTCAAAGCCGAG GACACGG CCGTG TATTTTT GTGCAAGACGG CG TGATTTTACAATG GACTTCTGG GGTCAAGGAACCACCGTG ACC GTCTCCTCA SEQ ID NO: 38 - Ácido nucleico que codifica el diseño humanizado de cadena ligera de 16B5 v4 AACATTGTTTTGaCGCAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCACtAGGAGAGAgGGcCAC T A T c AaCTGC A AATCC AGTC AG AGTCTGCTC A AT AGT AG A ACCCG A A AG A ATT ACTT GGCTTGGTTT C AGC AG A AGCC AGGGC AGT CTCCTA A ATTG TT G ATCT ACTGGGC ATC C ACT AG G G A ATCTGGGGTCCCTGATCGCTTC AgcGGCAGT GG AT CTGGGAC AG ATTT

CACTCTC ACC ATC AG CAG TcTG C AG G CTG AAG AC gTG G C AG TTTATTAC TG CAAG C A ATC TT ATACTCTTCG G AC GTT CGGTGGAGGC ACC AAggTG G A A A T C A A A C G T

S E Q ID NO: 39 - D i seño h u m a n i z a d o de c a d en a l igera de 16B5 v5

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo antiproteína tau que comprende una región variable de cadena pesada madura de SEQ ID NO: 15 y una región variable de cadena ligera madura de SEQ ID NO: 36.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la región variable de cadena pesada madura está fusionada a una región constante de cadena pesada y la región variable de cadena ligera madura está fusionada a una región constante de cadena ligera, opcionalmente en donde la región constante de cadena pesada es una forma mutante de la región constante humana natural que tiene una unión reducida a un receptor Fcy en relación con la región constante humana natural.

3. El anticuerpo de la reivindicación 2, en donde la región constante de cadena pesada es de isotipo IgG1, preferiblemente la SEQ ID NO: 29 con o sin la lisina C-terminal, y la región constante de cadena ligera es una cadena ligera kappa, preferiblemente la SEQ ID NO: 32.

4. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde el anticuerpo está conjugado con un agente citotóxico o citostático.

5. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un fragmento Fab.

6. Un ácido nucleico o ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. El ácido nucleico o ácidos nucleicos de la reivindicación 6, en donde el ácido nucleico que codifica la cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 25 y el ácido nucleico que codifica la cadena ligera comprende la SEQ ID NO: 38.

8. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. Un anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para usar en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un paciente que es portador de ApoE4.

10. Un anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para usar en el tratamiento de una enfermedad que incluye la enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, deterioro cognitivo leve, tauopatía primaria relacionada con la edad, parkinsonismo postencefálico, demencia postraumática o demencia pugilística, enfermedad de Pick, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, parálisis supranuclear, demencia frontotemporal, degeneración del lóbulo frontotemporal, enfermedad de los granos argirófilos, tauopatía glial globular, complejo de esclerosis lateral amiotrófica/parkinsonismo-demencia de Guam, degeneración corticobasal (CBD), demencia con cuerpos de Lewy, variante con cuerpos de Lewy de la enfermedad de Alzheimer (LBVAD), parálisis supranuclear progresiva (PSP).

11. Un anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para usar como un medicamento.