ES2925716T3 - Anticuerpos anti-transtiretina - Google Patents

Abstract

La invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a la transtiretina (TTR). Los anticuerpos se pueden usar para tratar o efectuar la profilaxis de enfermedades o trastornos asociados con la acumulación de TTR o la acumulación de depósitos de TTR (p. ej., amiloidosis por TTR). Los anticuerpos también se pueden usar para diagnosticar amiloidosis TTR e inhibir o reducir la agregación de TTR, entre otras aplicaciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-transtiretina

Antecedentes

Se cree que varias enfermedades están causadas por el plegamiento anormal y la agregación de proteínas específicas de la enfermedad. Estas proteínas pueden acumularse en acumulaciones patológicas de diagnóstico, conocidas como amiloides, que son visualizadas por ciertas manchas histológicas. Se piensa que los amiloides provocan respuestas inflamatorias y tienen múltiples consecuencias negativas para los tejidos implicados. Además, pueden existir agregados más pequeños de proteína anormalmente plegada y ejercer efectos citotóxicos.

La transtiretina (TTR) es una de las muchas proteínas que se sabe que se pliegan erróneamente y se agregan (por ejemplo, experimentan amiloidogénesis). La amiloidosis relacionada con la transtiretina abarca dos formas de enfermedad: la enfermedad familiar que se origina por el plegamiento erróneo de una TTR mutada o variante y una enfermedad no genética esporádica causada por la desagregación de la TTR de tipo salvaje. El proceso de amiloidogénesis de TTR puede causar patología en el sistema nervioso y/o en el corazón, así como en otros tejidos. US2014056904 describe anticuerpos y fragmentos de unión de los mismos que se unen específicamente a todo o parte de EHAE-VVFTA; y péptidos aislados, ácidos nucleicos aislados, inmunógenos, composiciones, inmunoensayos y kits y método para usar dichos reactivos para detectar la TTR plegada erróneamente.

Resumen de la invención reivindicada

En la presente memoria se describen anticuerpos que se unen específicamente a transtiretina y que comprenden tres CDR de cadena pesada y tres CDR de cadena ligera substancialmente del anticuerpo 5A1. Algunos de estos anticuerpos comprenden tres CDR de la cadena pesada de Kabat (SEQ ID NOs: 6-8, respectivamente) y tres CDR ligeras (SEQ ID NOs: 14, 15 y 17, respectivamente) del anticuerpo 5A1. En algunos anticuerpos, CDR-H1 de cadena pesada es una CDR-H1 compuesta de Kabat-Chothia (SEQ ID NO: 52). Algunos de estos anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Algunos de estos anticuerpos son quiméricos, humanizados, modificados en superficie, o anticuerpos humanos. Algunos de estos anticuerpos tienen un isotipo IgG1 humano. Algunos de estos anticuerpos tienen un isotipo IgG2 o IgG4 humano.

Algunos de dichos anticuerpos descritos son anticuerpos 5A1 quiméricos o humanizados que se unen específicamente a transtiretina, en donde 5A1 es un anticuerpo de ratón caracterizado por una región variable de cadena pesada madura de la SEQ ID NO:1 y una región de cadena ligera madura de la SEQ ID NO: 9.

En algunos anticuerpos descritos, la región variable de cadena pesada madura humanizada comprende las tres CDR de cadena pesada de 5A1 y la región variable de cadena ligera madura humanizada comprende las tres CDR de cadena ligera de 5A1, excepto que la posición L55 puede ser C o S. En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura humanizada comprende tres CDR de cadena pesada de Kabat de 5A1 (SEQ ID NO: 6-8) y la región variable de cadena ligera madura humanizada comprende tres CDR de cadena ligera de Kabat de 5A1 (SEQ ID NO: 14, 15 y 17) excepto que la posición L55 puede ser C o S.

La invención proporciona anticuerpos que comprenden una región variable de cadena pesada madura que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 y una región variable de cadena ligera madura que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13.

En algunos de estos anticuerpos, al menos una de las siguientes posiciones está ocupada por el aminoácido como se especifica: la posición H29 está ocupada por F, la posición H93 está ocupada por V, la posición L55 está ocupada por S, y la posición L85 está ocupada por V. En algunos de estos anticuerpos, al menos dos de las siguientes posiciones están ocupadas por el aminoácido como se especifica: la posición H29 está ocupada por F, la posición H93 está ocupada por V, la posición L55 está ocupada por S, y la posición L85 está ocupada por V. En algunos de estos anticuerpos, al menos tres de las siguientes posiciones están ocupadas por el aminoácido como se especifica: la posición H29 está ocupada por F, la posición H93 está ocupada por V, la posición L55 está ocupada por S, y la posición L85 está ocupada por V. En algunos de estos anticuerpos, todas las siguientes posiciones están ocupadas por el aminoácido como se especifica: la posición H29 está ocupada por F, la posición H93 está ocupada por V, la posición L55 está ocupada por S, y la posición L85 está ocupada por V.

La invención proporciona anticuerpos que comprenden una región variable de cadena pesada madura que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 5 y una región variable de cadena ligera madura que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 13.

Tales anticuerpos comprenden una región variable de cadena pesada madura de SEQ ID NO: 5 y una región variable de cadena ligera madura de SEQ ID NO: 13.

En algunos anticuerpos de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo intacto. En algunos anticuerpos de la invención, el anticuerpo es un fragmento de unión. En algunos de estos anticuerpos, el fragmento de unión es un anticuerpo de cadena única, Fab o fragmento Fab'2.

En algunos anticuerpos de la invención, la región variable de cadena ligera madura se fusiona a una región constante de cadena ligera y la región variable de cadena pesada madura se fusiona a una región constante de cadena pesada. En algunos de estos anticuerpos, la región constante de cadena pesada es una forma mutante de una región constante de cadena pesada humana natural que tiene una unión reducida a un receptor Fcy en relación con la región constante de cadena pesada humana natural. En algunos de estos anticuerpos, la región constante de cadena pesada es de isotipo IgG1. En algunos de estos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura está fusionada a una región constante de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 23 y/o la región variable de cadena ligera madura está fusionada a una región constante de cadena ligera que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 25.

En algunos anticuerpos descritos, cualquier diferencia en las CDR de la región variable de cadena pesada madura y la región variable de cadena ligera madura de las SEQ ID NO: 1 y 9, respectivamente, reside en las posiciones H60-H65.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica la cadena pesada y la cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente de la invención. En otro aspecto, la invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende dicho ácido nucleico. En otro aspecto, la invención proporciona una célula huésped transformada con dicho vector de expresión recombinante.

También se describe un método de humanización de un anticuerpo, método que comprende:

(a) seleccionar un anticuerpo aceptor;

(b) identificar los residuos del aminoácido del anticuerpo de ratón para ser retenidos;

(c) sintetizar un ácido nucleico que codifica una cadena pesada humanizada que comprende CDR de la cadena pesada del anticuerpo de ratón y un ácido nucleico que codifica una cadena ligera humanizada que comprende CDR de la cadena ligera del anticuerpo de ratón; y

(d) expresar los ácidos nucleicos en una célula huésped para producir un anticuerpo humanizado; en donde el anticuerpo de ratón comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9.

También se describe un método para producir un anticuerpo humanizado, quimérico o modificado en superficie, método que comprende:

(a) cultivar las células transformadas con ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, de manera que las células secretan el anticuerpo; y

(b) purificar el anticuerpo de medios de cultivo celular;

en donde el anticuerpo es una forma humanizada, quimérica o modificada en superficie de 5A1.

También se describe un método para producir una línea celular que produce un anticuerpo humanizado, quimérico o modificado en superficie, método que comprende:

(a) introducir un vector que codifica las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo y un marcador seleccionable en las células;

(b) propagar las células bajo condiciones para seleccionar las células que tienen un número de copias del vector incrementado;

(c) aislar las células individuales de las células seleccionadas; y

(d) depositar las células clonadas de una célula individual seleccionada sobre la base del rendimiento del anticuerpo;

en donde el anticuerpo es una forma humanizada, quimérica o modificada en superficie de 5A1.

Algunos de estos métodos comprenden además propagar las células bajo condiciones selectivas y cribar para detectar líneas celulares que expresan y secretan naturalmente al menos 100 mg/L/106 células/24h.

También se describe un método para inhibir o reducir la agregación de transtiretina en un sujeto con o en riesgo de desarrollar una amiloidosis mediada por transtiretina, que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente, inhibiendo o reduciendo así la agregación de transtiretina en el sujeto.

También se describe un método para inhibir o reducir la formación de fibrillas de transtiretina en un sujeto con o en riesgo de desarrollar una amiloidosis mediada por transtiretina, que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente, inhibiendo o reduciendo así la acumulación de transtiretina en el sujeto.

También se describe un método para reducir los depósitos de transtiretina en un sujeto con o en riesgo de desarrollar una amiloidosis mediada por transtiretina, que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos anteriores, reduciendo así los depósitos de transtiretina en el sujeto.

También se describe un método para limpiar la transtiretina agregada en un sujeto con o en riesgo de desarrollar una amiloidosis mediada por transtiretina, que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente, eliminando así la transtiretina agregada del sujeto con relación a un sujeto con o en riesgo de desarrollar una amiloidosis mediada por transtiretina que no ha recibido el anticuerpo. También se describe un método para estabilizar una conformación no tóxica de transtiretina en un sujeto con o en riesgo de desarrollar una amiloidosis mediada por transtiretina, que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente, estabilizando así una conformación no tóxica de transtiretina en el sujeto.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de la invención para su uso en el tratamiento o efectuar la profilaxis de una amiloidosis mediada por transtiretina en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de la invención para su uso para retrasar el inicio de una amiloidosis mediada por transtiretina en un sujeto, uso que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de los anticuerpos de la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona un método in vitro de diagnóstico de una amiloidosis mediada por transtiretina en un sujeto, que comprende poner en contacto una muestra biológica del sujeto con una cantidad eficaz de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente de la invención. Algunos de estos métodos comprenden además detectar la unión de anticuerpo a transtiretina, en donde la presencia del anticuerpo unido indica que el sujeto tiene una amiloidosis mediada por transtiretina. Algunos de estos métodos comprenden además comparar la unión del anticuerpo a la muestra biológica con la unión del anticuerpo a una muestra de control, con lo que la unión aumentada del anticuerpo a la muestra biológica en relación a la muestra de control indica que el sujeto tiene una amiloidosis mediada por transtiretina.

En algunos de estos métodos, la muestra biológica y la muestra de control comprenden células del mismo origen tisular. En algunos de estos métodos, la muestra biológica y/la muestra de control es sangre, suero, plasma o tejidos sólidos. En algunos de estos métodos, el tejido sólido es del corazón, sistema nervioso periférico, sistema nervioso autónomo, riñones, ojos o tracto gastrointestinal.

En algunos usos, la amiloidosis mediada por transtiretina es una amiloidosis de transtiretina familiar o una amiloidosis de transtiretina esporádica. En algunos de estos usos, la amiloidosis de transtiretina familiar es la miocardiopatía amiloide familiar (FAC), la polineuropatía amiloide familiar (FAP) o la amiloidosis selectiva del sistema nervioso central (CNSA). En algunos de estos usos, la amiloidosis de transtiretina esporádica es amiloidosis sistémica senil (SSA) o amiloidosis cardíaca senil (SCA).

En algunos usos, la amiloidosis mediada por transtiretina se asocia con la acumulación de amiloide en el corazón, sistema nervioso periférico, sistema nervioso autónomo, riñones, ojos o tracto gastrointestinal del sujeto.

También se describe un método para detectar la presencia o ausencia de depósitos de transtiretina en un sujeto, que comprende poner en contacto una muestra biológica del sujeto que se sospecha que comprende la acumulación de amiloide con una cantidad eficaz de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente. Algunos de estos métodos comprenden además detectar la unión del anticuerpo a la transtirretina, en donde la detección del anticuerpo unido indica la presencia de depósitos de transtirretina. Algunos de estos métodos comprenden además comparar la unión del anticuerpo a la muestra biológica con la unión del anticuerpo a una muestra de control, con lo que la unión aumentada del anticuerpo a la muestra biológica en relación a la muestra de control indica que el sujeto tiene una amiloidosis mediada por transtiretina. En algunos de estos métodos, la muestra biológica y la muestra de control comprenden células del mismo origen tisular. En algunos de estos métodos, la muestra biológica y/o la muestra de control es sangre, suero, plasma o tejidos sólidos. En algunos de estos métodos, el tejido sólido es del corazón, sistema nervioso periférico, sistema nervioso autónomo, riñones, ojos o tracto gastrointestinal.

También se describe un método para determinar un nivel de depósitos de transtiretina en un sujeto, que comprende administrar cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente y detectar la presencia de anticuerpo unido en el sujeto. En algunos de estos métodos, la presencia de anticuerpo unido se determina por tomografía de emisión de positrones (PET).

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 representa una alineación de regiones variables de cadena pesada del anticuerpo 5A1 de ratón, anticuerpos del modelo de ratón, anticuerpos aceptores humanos y versiones humanizadas del anticuerpo 5A1. Las CDR, tal como se definen por Kabat, están encuadradas en cajas, excepto que la primera caja encuadrada es una CDR-H1 compuesta de Chothia y la CDR-H1 de Kabat, con la CDR-H1 de Kabat subrayada y en negrita.

La FIG. 2 representa una alineación de regiones variables de cadena ligera del anticuerpo 5A1 de ratón, anticuerpos del modelo de ratón, anticuerpos aceptores humanos y versiones humanizadas del anticuerpo 5A1. Las CDR, tal como se definen por Kabat, están encuadradas.

FIG. 3A y 3B: la FIG. 3A representa la curva de unión de los anticuerpos murinos 5A1, 6C1, 9D5 y 14G8 a TTR tratada con ph4. La FIG. 3B representa la curva de unión de los anticuerpos murinos 5A1, 6C1, 9D5 y 14G8 a TTR tratada con ph4 o nativo.

FIG. 4A, 4B y 4C: la FIG. 4A representa la inhibición de la formación de la fibra TTR-Y78F por anticuerpos mis-TTR. La FIG. 4B representa la inhibición de la formación de la fibra de TTR-V122I por 14G8. La FIG. 4C representa la inhibición de la formación de la fibra de TTR-V122I por un anticuerpo de control.

FIG. 5A y 5B: la FIG. 5A representa un análisis de densitometría de un análisis de Transferencia Western de las muestras de plasma de pacientes confirmados para V30M ATTR (Muestra no. 21, no. 22, no. 23, no. 24, no. 25, y no. 27) y las muestras de sujetos normales (Muestra no. 11, no. 12, no. 15, no. 18, no. 19, no. 20) usando el anticuerpo 9D5 mis-TTR. La FIG. 5B representa un análisis de densitometría de un análisis de transferencia Western de las mismas muestras utilizando el anticuerpo 5A1 mis-TTR.

La FIG. 6 representa un ensayo de placa de MesoScale Discovery (MSD) de las muestras de plasma de pacientes confirmados para V30M ATTR (Muestra no. 21, no. 22, no. 23, no. 24, no. 25, no. 27) y las muestras de sujetos normales (Muestra no. 11, no. 12, no. 15, no. 18, no. 19, no. 20) utilizando el anticuerpo 6C1.

FIG. 7A y 7B: la FIG. 7A representa el efecto del anticuerpo 14G8 en la captación de F87M/L110M TTR por células THP-1. La FIG. 7B representa el efecto de cada uno de los anticuerpos mis-TTR en la captación de V30M TTR por células THP-1.

Breve descripción de las secuencias

La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5A1 de ratón.

La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de aminoácidos del molde de estructura de región variable de cadena pesada de ratón.

La SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de aminoácidos del aceptor variable de cadena pesada número de acceso AGP01680.

La SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5A1 humanizado versión 1 (Hu5A1VHv1).

La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5A1 humanizado versión 2 (Hu5A1VHv2).

La SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRH1 de

Kabat del anticuerpo 5A1 de ratón. La SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRH2 de Kabat del anticuerpo 5A1 de ratón. La SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRH3 de Kabat del anticuerpo 5A1 de ratón.

La SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5A1 de ratón.

La SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia de aminoácidos del molde de estructura de región variable de cadena ligera de ratón.

La SEQ ID NO: 11 muestra la secuencia de aminoácidos del aceptor variable de cadena ligera número de acceso BAH04766.

La SEQ ID NO: 12 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5A1 humanizado versión 1 (Hu5A1VLv1).

La SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5A1 humanizado versión 2 (Hu5A1VLv2).

La SEQ ID NO: 14 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRL1 de Kabat del anticuerpo 5A1 de ratón.

La SEQ ID NO: 15 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRL2 de Kabat del anticuerpo 5A1 de ratón.

La SEQ ID NO: 16 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRL2 de Kabat versión 2 del anticuerpo 5A1 humanizado de ratón.

La SEQ ID NO: 17 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRL3 de Kabat del anticuerpo 5A1 de ratón.

La SEQ ID NO: 18 muestra la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5A1 de ratón con péptido señal.

La SEQ ID NO: 19 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5A1 de ratón con péptido señal.

La SEQ ID NO: 20 muestra la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5A1 de ratón con péptido señal.

La SEQ ID NO: 21 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5A1 de ratón con péptido señal.

La SEQ ID NO: 22 muestra la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena pesada de IgG1. La SEQ ID NO: 23 muestra la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena pesada de IgG1 G1m3 ejemplar.

La SEQ ID NO: 24 muestra la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena pesada de IgG1 G1m3. La SEQ ID NO: 25 muestra la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera ejemplar con arginina N-terminal.

La SEQ ID NO: 26 muestra la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera sin arginina N-terminal.

La SEQ ID NO: 27 muestra la secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada del anticuerpo 5A1 humanizado versión 1.

La SEQ ID NO: 28 muestra la secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada del anticuerpo 5A1 humanizado versión 2.

La SEQ ID NO: 29 muestra la secuencia de aminoácidos de la región de cadena ligera del anticuerpo 5A1 humanizado versión 1.

La SEQ ID NO: 30 muestra la secuencia de aminoácidos de la región de cadena ligera del anticuerpo 5A1 humanizado versión 2.

La SEQ ID NO: 31 muestra la secuencia de aminoácidos de transtiretina humana mostrada en el número de acceso P02766.1 (UniProt).

La SEQ ID NO: 32 muestra la secuencia de aminoácidos de transtiretina humana mostrada en el número de acceso AAB35639.1 (GenBank).

La SEQ ID NO: 33 muestra la secuencia de aminoácidos de transtiretina humana mostrada en el número de acceso AAB35640.1 (GenBank).

La SEQ ID NO: 34 muestra la secuencia de aminoácidos de transtiretina humana mostrada en el número de acceso ABI63351.1 (GenBank).

La SEQ ID NO: 35 muestra la secuencia de aminoácidos de un epítopo de transtiretina humana de los residuos de 89-97.

La SEQ ID NO: 36 muestra la secuencia de aminoácidos de un inmunógeno potencial de la transtiretina. La SEQ ID NO: 37 muestra la secuencia de aminoácidos de un inmunógeno potencial de la transtiretina. La SEQ ID NO: 38 muestra la secuencia de aminoácidos de un inmunógeno potencial de la transtiretina. La SEQ ID NO: 39 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena pesada de IgG1 G1m3.

La SEQ ID NO: 40 muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena ligera con arginina N-terminal.

La SEQ ID NO: 41 muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena ligera sin arginina N-terminal.

La SEQ ID NO: 42 muestra la secuencia de aminoácidos de un péptido señal de región constante de cadena pesada.

La SEQ ID NO: 43 muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de región constante de cadena pesada.

La SEQ ID NO: 44 muestra la secuencia de aminoácidos de un péptido señal de región constante de cadena ligera. La SEQ ID NO: 45 muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de región constante de cadena ligera.

La SEQ ID NO: 46 muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica una región de cadena ligera variable de 5A1 de ratón.

La SEQ ID NO: 47 muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica una región de cadena pesada variable de 5A1 de ratón.

La SEQ ID NO: 48 muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada del anticuerpo 5A1 humanizado versión 1 (Hu5A1VHv1).

La SEQ ID NO: 49 muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada del anticuerpo 5A1 humanizado versión 2 (Hu5A1VHv2).

La SEQ ID NO: 50 muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera del anticuerpo 5A1 humanizado versión 1 (Hu5A1VLv1).

La SEQ ID NO: 51 muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera del anticuerpo 5A1 humanizado versión 2 (Hu5A1VLv2).

La SEQ ID NO: 52 muestra la secuencia de aminoácidos de una CDR-H1 compuesta (residuos 26-35) del anticuerpo 5A1 de ratón.

Definiciones

Los anticuerpos monoclonales u otras entidades biológicas normalmente se proporcionan en una forma aislada. Esto significa que un anticuerpo u otra entidad biológica es normalmente al menos un 50% p/p puro de proteínas que interfieren y otros contaminantes derivados de su producción o purificación, pero no excluye la posibilidad de que el anticuerpo monoclonal se combine con un exceso de vehículo(s) farmacéuticamente aceptable(s) u otro vehículo destinado a facilitar su uso. A veces, los anticuerpos monoclonales son al menos un 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% p/p puros de proteínas que interfieren y contaminantes de la producción o purificación. A menudo, un anticuerpo monoclonal aislado u otra entidad biológica es la especie macromolecular predominante que permanece después de su purificación.

La unión específica de un anticuerpo a su antígeno diana significa una afinidad de al menos 106, 107, 108, 109, o 1010 M-1. La unión específica es detectablemente mayor en magnitud y distinguible de la unión no específica que ocurre a al menos una diana no relacionada. La unión específica puede ser el resultado de la formación de enlaces entre grupos funcionales particulares o un ajuste espacial particular (p. ej., tipo cerradura y llave) mientras que la unión no específica es generalmente el resultado de fuerzas de van der Waals. Sin embargo, la unión específica no implica necesariamente que un anticuerpo se una a una y solo una diana.

La unidad estructural básica de los anticuerpos es un tetrámero de subunidades. Cada tetrámero incluye dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. Esta región variable se expresa inicialmente ligada a un péptido señal escindible. La región variable sin el péptido señal se refiere a veces como una región variable madura. Así, por ejemplo, una región variable madura de cadena ligera significa una región variable de cadena ligera sin el péptido señal de cadena ligera. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes se unen por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que también incluye una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. Véase, generalmente, Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y., 1989, Capítulo 7.

Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina (también denominada en la presente memoria un "dominio variable de cadena ligera" ("dominio VL") o "dominio variable de cadena pesada" ("dominio VH"), respectivamente) consiste en una región "marco" interrumpida por tres "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". Las regiones marco sirven para alinear las CDR para la unión específica a un epítopo de un antígeno. Las CDR incluyen los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son principalmente responsables de la unión al antígeno. Del extremo amino al extremo carboxilo, los dominios VL y VH comprenden las siguientes regiones marco (FR) y CDR: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las ^c D^r 1, 2 y 3 de un dominio VL también se denominan en la presente memoria, respectivamente, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3; las CDR 1, 2 y 3 de un dominio VH también se denominan en la presente memoria, respectivamente, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3.

La asignación de aminoácidos para cada dominio VL y VH es de acuerdo con cualquier definición convencional de CDR. Las definiciones convencionales incluyen, la definición de Kabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991), La definición de Chothia (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342:878-883, 1989); un compuesto de CDR de Chothia Kabat en el que CDR-H1 es un compuesto de CDR de Chothia y Kabat; la definición de AbM usada por el software de modelado de anticuerpos de Oxford Molecular; y la definición de contacto de Martin et al (bioinfo.org.uk/abs) (véase la Tabla 1). Kabat proporciona una convención de numeración ampliamente utilizada (numeración de Kabat) en la que los correspondientes residuos entre diferentes cadenas pesadas o entre diferentes cadenas ligeras se asignan al mismo número. Cuando un anticuerpo se dice que comprende CDR por una cierta definición de CDR (p. ej., Kabat) esa definición especifica el número mínimo de residuos de CDR presentes en el anticuerpo (es decir, las CDR de Kabat). Esto no excluye que también estén presentes otros residuos que estén dentro de otra definición de CDR convencional pero fuera de la definición especificada. Por ejemplo, un anticuerpo que comprende CDR definidas por Kabat incluye entre otras posibilidades, un anticuerpo en el que las CDR contienen residuos de CDR de Kabat y no otros residuos de CDR, y un anticuerpo en el que CDR H1 es una CDR H1 Chothia Kabat compuesta y otras CDR contienen residuos de CDR de Kabat y no residuos de CDR adicionales basados en otras definiciones.

Tabla 1

El término "anticuerpo" incluye anticuerpos intactos y los fragmentos de unión de los mismos. Típicamente, los fragmentos compiten con el anticuerpo intacto del que se derivaron para la unión específica a la diana que incluye cadenas pesadas, cadenas ligeras, Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, Dab, nanocuerpos y Fv separados. Los fragmentos pueden ser producidos por técnicas de ADN recombinante, o por separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. El término "anticuerpo" incluye también un anticuerpo biespecífico y/o anticuerpo humanizado. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes (véase, p. ej., Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)). En algunos anticuerpos biespecíficos, los dos pares de cadena pesada/ligera diferentes incluyen un par de cadena pesada/cadena ligera de 5A1 humanizado y un par de cadena ligera/cadena pesada específico para un epítopo diferente en transtiretina que el unido por 5A1.

En algunos anticuerpos biespecíficos, un par de cadena pesada/cadena ligera es un anticuerpo 5A1 humanizado como se divulga adicionalmente más adelante y el otro par de cadena pesada/cadena ligera es de un anticuerpo que se une al receptor expresado en la barrera hematoencefálica, como un receptor de la insulina, un receptor de factor de crecimiento semejante a la insulina (IGF), un receptor de la leptina o un receptor de la lipoproteína, o un receptor de la transferrina (Friden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4771-4775, 1991; Friden et al., Science 259:373-377, 1993). Dicho anticuerpo biespecífico puede ser transferido a través de la barrera hematoencefálica por transcitosis mediada por receptor. La captación cerebral del anticuerpo biespecífico puede mejorarse además por la modificación por ingeniería del anticuerpo biespecífico para reducir su afinidad para el receptor de la barrera hematoencefálica. La afinidad reducida por el receptor dio lugar a una distribución más amplia en el cerebro (véase, por ejemplo, Atwal et al., Sci. Trans. Med. 3, 84ra43, 2011; Yu et al., Sci. Trans. Med. 3, 84ra44, 2011).

Los anticuerpos biespecíficos ejemplares también pueden ser: (1) un anticuerpo de dominio-variable-doble (DVD-Ig), donde cada cadena pesada y cadena ligera contiene dos dominios variables en tándem a través de una unión con un péptido corto (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, en: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (2) un Tandab, que es una fusión de dos diacuerpos de cadena única que resulta en un anticuerpo biespecífico tratavalente que tiene dos sitios de unión para cada uno de los antígenos diana; (3) un flexicuerpo, que es una combinación de scFv con un diacuerpo que resulta en una molécula multivalente; (4) una molécula denominada "dock and lock", basada en el "dominio de acoplamiento y dimerización" en la proteína quinasa A, que, cuando se aplica a los Fab, puede producir una proteína de unión biespecífica trivalente que consiste en dos fragmentos Fab idénticos enlazados a un fragmento Fab diferente; o (5) una molécula denominada Scorpion, que comprende, p. ej., dos scFv fusionados a ambos extremos de una región Fc humana. Los ejemplos de plataformas útiles para preparar anticuerpos biespecíficos incluyen BiTE (Micromet), DART (MacroGenics), Fcab y Mab2 (F-star), IgGl modificada con Fc (Xencor) o DuoBody (basada en intercambio de brazos Fab, Genmab).

El término "epítopo" se refiere a un sitio en un antígeno al que se une un anticuerpo. Un epítopo se puede formar a partir de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegado terciario de una o más proteínas. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos (también conocidos como epítopos lineales) normalmente se mantienen en exposición a disolventes desnaturalizantes mientras que los epítopos formados por plegado terciario (también conocidos como epítopos conformacionales) normalmente se pierden con el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo por lo general incluye al menos 3 y más generalmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial de epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, p. ej., Epitope Mapping Protocols, en Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996). El epítopo puede ser lineal, tal como un epítopo de, por ejemplo, 2-5, 3-5, 3-9, o 5-9 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 31. El epítopo puede ser también un epítopo conformacional que incluye, por ejemplo, dos o más segmentos no contiguos de aminoácidos dentro de los residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 31. Si un anticuerpo se dice que se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 89-97 de transtiretina (TTR), por ejemplo, lo que significa es que el epítopo está dentro del rango indicado de aminoácidos que incluyen aquellos que definen los límites exteriores del rango. Esto no significa necesariamente que cada aminoácido dentro del rango forme parte del epítopo. Así, por ejemplo, un epítopo dentro de aminoácidos 89-97 de TTR puede consistir en los aminoácidos 89-97, 89-96, 90-96, 91-96, 92-96, 93-96, 94-96, 89-96, 89-95, 89-94, 89-93, 89-92 o 89-93, entre otros segmentos lineales de la SEQ ID NO: 35, o en el caso de epítopos conformacionales, segmentos no contiguos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35.

Los anticuerpos que reconocen los mismos epítopos o epítopos superpuestos pueden identificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para competir con la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana. El epítopo de un anticuerpo puede también ser definido por cristalografía de rayos X del anticuerpo unido a su antígeno para identificar los residuos de contacto. Alternativamente, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos tienen los epítopos superpuestos si algunas de las mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.

La competición entre anticuerpos se determina por un ensayo en el que un anticuerpo en ensayo inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común (véase, p. ej., Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990). Un anticuerpo de ensayo compite con un anticuerpo de referencia si un exceso de un anticuerpo de ensayo (p. ej., al menos 2x, 5x, 10x, 20x o 100x) inhibe la unión del anticuerpo de referencia al menos un 50% como se mide en un ensayo de unión competitiva. Algunos anticuerpos de ensayo inhiben la unión de los anticuerpos de referencia al menos un 75%, 90% o 99%. Los anticuerpos identificados por el ensayo de competición (anticuerpos que compiten) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y los anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo unido por el anticuerpo de referencia para que se produzca el impedimento estérico.

El término "nativo" con respecto a la estructura de transtiretina (TTR) se refiere a la estructura plegada normal de TTR en su estado de funcionamiento adecuado (es decir, un tetrámero de TTR). Como la TTR es un tetrámero en su forma nativamente plegada, las formas no nativas de TTR incluyen, por ejemplo, tetrámeros de TTR mal plegados, monómeros de TTR, formas agregadas de TTR, y formas de fibrilla de TTR. Las formas no nativas de TTR pueden incluir moléculas que comprenden secuencias o mutaciones de aminoácidos de TTR de tipo salvaje.

El término "plegado erróneamente" con respecto a TTR se refiere a la estructura secundaria y terciaria de un monómero o multímero de polipéptido de TTR, e indica que el polipéptido ha adoptado una conformación que no es normal para esa proteína en su estado de funcionamiento adecuado. Aunque el plegamiento erróneo de la TTR se puede producir por mutaciones en la proteína (p. ej., deleción, sustitución o adición), las proteínas TTR de tipo salvaje también pueden estar plegadas erróneamente en enfermedades, exponiendo epítopos específicos.

El término "farmacéuticamente aceptable" significa que el vehículo, diluyente, excipiente o auxiliar es compatible con los otros ingredientes de la formulación y no es sustancialmente perjudicial para el receptor del mismo.

El término "paciente" incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.

Un individuo presenta un mayor riesgo de una enfermedad si el sujeto tiene al menos un factor de riesgo conocido (p. ej., genético, bioquímico, historial familiar y la exposición situacional) que coloca a los individuos con ese factor de riesgo en mayor riesgo estadísticamente significativo de desarrollar la enfermedad que los individuos sin el factor de riesgo.

El término "muestra biológica" se refiere a una muestra de material biológico en o que se puede obtener de una fuente biológica, por ejemplo, un sujeto humano o mamífero. Dichas muestras pueden ser órganos, tejidos, orgánulos, secciones de tejidos, fluidos corporales, sangre periférica, plasma sanguínea, suero sanguíneo, células, moléculas como las proteínas y péptidos y cualesquiera partes o combinaciones derivadas de los mismos. El término muestra biológica también puede abarcar cualquier material derivado del procesamiento de la muestra. El material derivado puede incluir células o su progenie. El procesamiento de la muestra biológica puede implicar uno o más de la filtración, destilación, extracción, concentración, fijación, inactivación de componentes que interfieren y similares.

El término "muestra de control" se refiere a una muestra biológica que se sabe o sospecha que no incluye formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas, o de fibrilla de transtiretina (TTR), como en depósitos de amiloide de TTR. Las muestras de control pueden obtenerse de individuos no afectados con una amiloidosis de TTR o un tipo específicamente elegido de amiloidosis de TTR. Alternativamente, las muestras de control pueden obtenerse de pacientes afectados con amiloidosis de TTR o un tipo específicamente elegido de amiloidosis de TTR. Dichas muestras pueden obtenerse al mismo tiempo que una muestra biológica que se piensa que comprende la amiloidosis de TTR o en una ocasión diferente. Una muestra biológica y una muestra de control pueden ser obtenidas del mismo tejido (por ejemplo, una sección de tejido que contiene tanto depósitos de amiloide de TTR como tejido normal circundante). Preferiblemente, las muestras de control consisten esencialmente o exclusivamente en tejido libre de depósitos de amiloide de TTR y pueden utilizarse en comparación con una muestra biológica que se piensa que comprende depósitos de amiloide de TTR. Preferiblemente, el tejido en la muestra de control es del mismo tipo que el tejido en la muestra biológica (p. ej., cardiomiocitos en el corazón).

El término "enfermedad" se refiere a cualquier afección anormal que deteriora la función fisiológica. El término se utiliza ampliamente para abarcar cualquier trastorno, malestar, anormalidad, patología, enfermedad, afección o síndrome en el que la función fisiológica está deteriorada, independientemente de la naturaleza de la etiología. El término "síntoma" se refiere a una evidencia subjetiva de una enfermedad, como la marcha alterada, percibida por el sujeto. Un "signo" se refiere a la evidencia objetiva de una enfermedad como se observa por un médico.

Para efectos de la clasificación de sustituciones de aminoácidos como conservativas o no conservativas, los aminoácidos se agrupan como sigue: Grupo I (cadenas laterales hidrófobas): met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrófilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influyen en la orientación de la cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones de conservativas implican sustituciones entre aminoácidos en la misma clase. Las sustituciones no conservativas constituyen el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra.

El porcentaje de las identidades de secuencia se determinan con secuencias de anticuerpo alineadas al máximo por la convención de la numeración de Kabat. Después de la alineación, si una región de anticuerpo objeto (p. ej., toda la región variable madura de una cadena pesada o ligera) se está comparando con la misma región de un anticuerpo de referencia, el porcentaje de identidad de secuencia entre las regiones del anticuerpo objeto y de referencia es el número de posiciones ocupadas por el mismo aminoácido en la región del anticuerpo objeto y de referencia dividido por el número total de posiciones alineadas de las dos regiones, sin contar los huecos, multiplicado por 100 para convertirlo en porcentaje.

Las composiciones o métodos "que comprenden" o "que incluyen" uno o más elementos recitados pueden incluir otros elementos no recitados específicamente. Por ejemplo, una composición que "comprende" o "incluye" un anticuerpo puede contener el anticuerpo solo o en combinación con otros ingredientes.

La designación de un rango de valores incluye todos los números enteros dentro de o que definen el rango y todos los subrangos definidos por números enteros dentro del rango.

A no ser que sea evidente a partir del contexto, el término "aproximadamente" abarca valores dentro de un margen de error estándar de medición (p. ej., SEM) de un valor establecido.

La significancia estadística significa p<0,05.

Las formas singulares "u", "uno", "una", y, "el" y "la" incluyen referencias plurales a no ser que el contexto dicte claramente otra cosa. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

Descripción detallada

I. General

La invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a los residuos 89-97 de la transtiretina (TTR). Los anticuerpos tienen la capacidad de unirse a formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o fibrillas de TTR. Los anticuerpos pueden usarse para tratar o efectuar la profilaxis de enfermedades o trastornos asociados con la acumulación de TTR o la acumulación de depósitos de TTR (p. ej., amiloidosis de TTR). Los anticuerpos también pueden usarse para diagnosticar la amiloidosis de TTR e inhibir o reducir la agregación de TTR, entre otras aplicaciones.

II. Moléculas Diana

La transtiretina (TTR) es una proteína de transporte de 55 kDa de 127 aminoácidos en suero y líquido cefalorraquídeo principalmente sintetizada por el hígado. También se ha denominado prealbúmina, prealbúmina de unión a tiroxina, ATTR y TBPA. En su estado nativo, la TTR existe como un tetrámero. En los homocigotos, los tetrámeros comprenden subunidades idénticas ricas en lámina beta de 127 aminoácidos. En los heterocigotos, los tetrámeros de TTR se componen de subunidades variantes y/o de tipo salvaje, normalmente combinadas de una manera estadística.

La función establecida de la TTR en la sangre es transportar la proteína de unión al ho/o-retinol. Aunque la TTR es el principal portador de la tiroxina (T4) en la sangre de los roedores, utilizando sitios de unión que son ortogonales a los que se utilizan para la proteína de unión a ho/o-retinol, los sitios de unión de T4 están efectivamente desocupados en los seres humanos.

La TTR es una de al menos treinta proteínas humanas diferentes, cuyo plegamiento erróneo y/o ensamblaje erróneo extracelular (amiloidogénesis) en un espectro de estructuras de agregados se cree que causa enfermedades degenerativas denominadas enfermedades amiloides. La TTR sufre cambios conformacionales con el fin de convertirse en amiloidogénica. El despliegue parcial expone cadenas de residuos hidrófobos en gran parte no cargados en una conformación extendida que se ensamblan erróneamente de manera eficiente en agregados esféricos en gran parte no estructurados que finalmente sufren conversión de conformación en estructuras amiloides de lámina beta cruzada.

A no ser que sea evidente otra cosa a partir del contexto, la referencia a transtiretina (TTR) o sus fragmentos o dominios incluye las secuencias de aminoácidos naturales humanas incluyendo isoformas, mutantes y variantes alélicas de las mismas. Las secuencias polipeptídicas de TTR ejemplares se designan mediante los Números de Acceso P02766.1 (UniProt) (SEQ ID NO: 31), AAB35639.1 (GenBank) (SEQ ID NO: 32), AAB35640.1 (GenBank) (SEQ ID NO: 33) y ABI63351.1 (GenBank) (SEQ ID NO: 34). Los residuos se numeran de acuerdo con Swiss Prot P02766.1, con el primer aminoácido de la proteína madura (es decir, sin incluir la secuencia señal de 20 aminoácidos) designado como residuo 1. En cualquier otra proteína TTR, los residuos se numeran de acuerdo con los residuos correspondientes en P02766.1 en alineación máxima.

III. Amiloidosis de Transtiretina

La amiloidosis de transtiretina (TTR) es un trastorno sistémico caracterizado por TTR patogénica, con plegamiento erróneo y la deposición extracelular de fibrillas amiloides compuestas por TTR. La amiloidosis de TTR está generalmente causada por la desestabilización de la forma tetramérica nativa de TTR (debido a condiciones ambientales o genéticas), dando lugar a la disociación, plegamiento erróneo y agregación de TTR en fibrillas amiloides que se acumulan en diversos órganos y tejidos, causando una disfunción progresiva. Véase, p. ej., Almeida y Saraiva, FEBS Letters 586:2891-2896 (2012); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013).

En los seres humanos, los tetrámeros de TTR de tipo salvaje y los tetrámeros mixtos compuestos por subunidades mutantes y de tipo salvaje pueden disociarse, plegarse erróneamente y agregarse, con el proceso de amiloidogénesis dando lugar a la degeneración del tejido post-mitótico. De este modo, las amiloidosis de TTR abarcan enfermedades causadas por TTR plegada erróneamente patogénica resultante de mutaciones en TTR o resultantes de TTR plegada erróneamente, no mutada.

Por ejemplo, la amiloidosis sistémica senil (SSA) y la amiloidosis cardíaca senil (SCA) son tipos de amiloidosis relacionadas con la edad que resultan de la deposición de amiloide de TTR de tipo salvaje fuera y dentro de los cardiomiocitos del corazón. La amiloidosis de TTR es también la forma más común de amiloidosis hereditaria (familiar), que está causada por mutaciones que desestabilizan la proteína TTR. Las amiloidosis de TTR asociadas con mutaciones puntuales en el gen de TTR incluyen polineuropatía amiloide familiar (FAP), miocardiopatía amiloide familiar (FAC) y la rara amiloidosis selectiva del sistema nervioso central (CNSA). Los pacientes con amiloidosis de TTR hereditaria (familiar) son casi siempre heterocigotos, lo que significa que los tetrámeros de TTR están compuestos por subunidades de TTR mutantes y/o de tipo salvaje, generalmente distribuidas estadísticamente. Las versiones hereditarias (familiares) de la amiloidosis de TTR son generalmente autosómicas dominantes y suelen ser de inicio más temprano que las enfermedades esporádicas (SSA y SCA).

Hay más de 100 mutaciones en el gen que codifica TTR que se han implicado en los trastornos autosómicos dominantes FAP y FAC. Véase, p. ej., uS 2014/0056904; Saraiva, Hum. Mutat. 17(6):493-503 (2001); Damas y Saraiva, J. Struct. Biol. 130:290-299; Dwulet y Benson, Biochem. Biophys. Res. Commun. 114:657-662 (1983). Estas mutaciones causantes de amiloide están distribuidas a lo largo de toda la molécula de TTR. Generalmente, cuanto más desestabilizantes son las subunidades mutantes para la estructura del tetrámero de TTR, más temprano se inicia la enfermedad amiloide. El potencial patógeno de una variante de la TTR se determina generalmente por una combinación de su inestabilidad y su eficiencia de secreción celular. La patología inicial causada por algunas variantes de TTR viene de su destrucción selectiva del tejido cardiaco, mientras que de otras variantes TTR viene de comprometer el sistema nervioso periférico y autónomo. El daño tisular causado por la amiloidogénesis de TTR parece derivar en gran medida de la toxicidad de pequeños agregados de TTR que difunden, aunque la acumulación de amiloide extracelular puede contribuir y casi ciertamente compromete la estructura del órgano en los últimos estadios de la amiloidosis de TTR.

La amiloidosis de TTR se presenta de muchas formas diferentes, con una considerable variación fenotípica entre individuos y localizaciones geográficas. Por ejemplo, la amiloidosis de TTR puede presentarse como una neuropatía sensorial autonómica y motora progresiva, axonal. La amiloidosis de TTR también puede presentarse como miocardiopatía infiltrativa.

La edad de inicio de los síntomas relacionados con la enfermedad varía entre la segunda y la novena década de vida, con grandes variaciones entre diferentes poblaciones. La implicación multisistémica de la amiloidosis de TTR es una clave para su diagnóstico. Por ejemplo, el diagnóstico de amiloidosis de TTR se considera cuando uno o varios de los siguientes están presentes: (1) historial familiar de enfermedad neuropática, especialmente asociada con insuficiencia cardíaca; (2) dolor neuropático o alteraciones sensoriales progresivas de etiología desconocida; (3) síndrome del túnel carpiano sin causa obvia, particularmente si es bilateral y requiere liberación quirúrgica; (4) trastornos de la motilidad gastrointestinal o disfunción del nervio autonómico de etiología desconocida (p. ej., disfunción eréctil, hipotensión ortostática, vejiga neurogénica); (5) enfermedad cardiaca caracterizada por paredes ventriculares engrosadas en ausencia de hipertensión; (6) bloqueo atrioventricular avanzado de origen desconocido, particularmente cuando está acompañado de un corazón engrosado; y (6) inclusiones del cuerpo vítreo del tipo algodón-lana. Véase, Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). Otros síntomas pueden incluir, por ejemplo, polineuropatía, pérdida sensorial, dolor, debilidad en miembros inferiores, dishidrosis, diarrea, estreñimiento, pérdida de peso e incontinencia/retención urinaria.

El diagnóstico de amiloidosis de TTR se basa normalmente en biopsias de órganos diana, seguido de tinción histológica del tejido extirpado con el colorante específico de amiloide, rojo Congo. Si se observa un ensayo positivo para amiloide, se realiza posteriormente tinción inmunohistoquímica para TTR para asegurar que la proteína precursora responsable de la formación de amiloide es realmente TTR. Para las formas familiares de las enfermedades, la demostración de una mutación en el gen que codifica TTR es entonces necesaria antes de que se pueda hacer el diagnóstico. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante electroforesis de enfoque isoeléctrico, reacción en cadena de la polimerasa o disección láser/cromatografía líquida - espectrometría de masas en tándem. Véase, p. ej., US 2014/0056904; Ruberg y Berk, Circulation 126:1286-1300 (2012); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013).

IV. Anticuerpos

A. Especificidad de Unión y Propiedades Funcionales

La invención proporciona anticuerpos monoclonales como se definen en las reivindicaciones, que se unen a la proteína transtirretina (TTR), más específicamente, a epítopos dentro de los residuos de aminoácidos 89-97 (SEQ ID NO: 35) de TTR. Tales epítopos están enterrados en el tetrámero de TTR nativo y expuestos en formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o fibrillas de TTR.

Un anticuerpo designado 5A1 es un anticuerpo de ratón. Este anticuerpo se une específicamente dentro de los residuos de aminoácidos 89-97 (SEQ ID NO: 35) de TTR. Este anticuerpo se caracteriza adicionalmente por su capacidad para unirse a formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o de fibrillas de TTR, pero no a formas tetraméricas nativas de TTR. Además, este anticuerpo se caracteriza por su immunoreactividad en el tejido cardíaco de la amiloidosis mediada por TTR, pero no en el tejido cardíaco sano. La capacidad de unirse a proteínas específicas o fragmentos de las mismas puede demostrarse utilizando formatos de ensayo ejemplares proporcionados en los ejemplos.

Algunos anticuerpos unen al mismo epítopo o superpuesto que un anticuerpo designado 5A1. Las secuencias de las regiones variables maduras de cadenas pesada y ligera de 5A1 se designan SEQ ID NO: 1 y 9, respectivamente. Otros anticuerpos que tienen dicha especificidad de unión pueden producirse inmunizando ratones con TTR, o una porción de la misma, que incluye el epítopo deseado (p. ej., SEQ ID NO: 35), y cribando los anticuerpos resultantes para determinar la unión a TTR monomérica o un péptido que comprende la SEQ ID NO: 35, opcionalmente en competición con un anticuerpo que tiene las regiones variables de 5A1 de ratón (IgG1, kappa). Los fragmentos de TTR que incluyen el epítopo deseado pueden unirse a un vehículo que ayuda a incitar una respuesta de anticuerpos frente al fragmento y/o combinarse con un adyuvante que ayuda a incitar dicha respuesta. Tales anticuerpos pueden cribarse para determinar la unión diferencial a versiones monoméricas, de tipo salvaje de TTR o un fragmento de la misma (p. ej., SEQ ID NO: 31) en comparación con los mutantes de residuos especificados. El cribado frente a tales mutantes define más precisamente la especificidad de unión para permitir la identificación de anticuerpos cuya unión es inhibida por mutagénesis de residuos particulares y que puedan compartir probablemente las propiedades funcionales de otros anticuerpos ejemplificadas. Las mutaciones pueden ser una sustitución de reemplazo sistemático con alanina (o serina si ya está presente una alanina) un residuo a la vez, o intervalos más ampliamente espaciados, a lo largo de la diana o a lo largo de una sección de la misma en la que se sabe que reside un epítopo. Si el mismo conjunto de mutaciones reduce significativamente la unión de dos anticuerpos, los dos se unen al mismo epítopo.

Los anticuerpos que tienen la especificidad de unión de un anticuerpo murino seleccionado (p. ej., 5A1) también pueden producirse usando una variante del método de exposición en fagos. Véase, Winter, WO 92/20791. Este método es particularmente conveniente para la producción de anticuerpos humanos. En este método, ya sea la región variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo murino seleccionado se utiliza como material de partida. Si, por ejemplo, una región variable de cadena ligera es seleccionada como material de partida, se construye una biblioteca de fagos en la que los miembros muestran la misma región variable de cadena ligera (es decir, el material de partida murino) y una región variable de cadena pesada diferente. Las regiones variables de cadena pesada pueden obtenerse, por ejemplo, de una biblioteca de regiones variables de cadena pesada humana reconfigurada. Se selecciona un fago que muestra una fuerte unión específica (p. ej., al menos 108 y preferiblemente al menos 109 M-1) para la TTR monomérica o un fragmento de la misma (p. ej., residuos de aminoácidos 89-97). La región variable de cadena pesada de este fago sirve entonces como un material de partida para construir una biblioteca de fagos adicional. En esta biblioteca, cada fago muestra la misma región variable de cadena pesada (es decir, la región identificada a partir de la primera biblioteca de exposición) y una región variable de cadena ligera diferente. Las regiones variables de cadena ligera se pueden obtener, por ejemplo, a partir de una biblioteca de las regiones de la cadena ligera variable humana reconfigurada. De nuevo, se selecciona un fago que muestra una fuerte unión específica para la TTR monomérica o un fragmento de la misma (p. ej., residuos de aminoácidos 89-97). Los anticuerpos resultantes tienen generalmente especificidad del epítopo idéntica o similar que el material de partida murino.

Otros anticuerpos pueden obtenerse mediante mutagénesis del ADNc que codifica las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo ejemplar, como 5A1. También se describen anticuerpos monoclonales que son al menos un 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticos a 5A1 en la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera maduras y mantienen sus propiedades funcionales, y/o que difieren del anticuerpo respectivo por un pequeño número de sustituciones de aminoácidos funcionalmente insignificantes (p. ej., sustituciones conservativas), deleciones o inserciones. También se describen anticuerpos monoclonales que tienen al menos uno o todas las seis CDR como se define por la definición convencional, pero preferiblemente Kabat, que son un 90%, 95%, 99% o 100% idénticas a las CDR correspondientes de 5A1.

También se describen anticuerpos que tienen algunas o todas (p. ej., 3, 4, 5, y 6) las CDR total o sustancialmente de 5A1. Dichos anticuerpos pueden incluir una región variable de cadena pesada que tiene al menos dos, y usualmente las tres, CDR total o sustancialmente de la región variable de cadena pesada de 5A1 y/o una región variable de cadena ligera que tiene al menos dos y usualmente las tres, CDR total o sustancialmente de la región variable de cadena ligera de 5A1. Los anticuerpos pueden incluir tanto cadenas pesadas como ligeras. Una CDR es substancialmente de una CDR de 5A1 correspondiente cuando contiene no más de 4, 3, 2, o 1 sustituciones, inserciones o deleciones, excepto que CDRH2 (cuando se define por Kabat) no puede tener más de 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones, inserciones o deleciones. Tales anticuerpos pueden tener una identidad de al menos un 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con 5A1 en la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadenas pesadas y/o ligeras maduras y mantienen sus propiedades funcionales, y/o se diferencian de 5A1 por un pequeño número de sustituciones de aminoácidos funcionalmente insignificantes (p. ej., sustituciones conservativas), deleciones o inserciones.

Algunos anticuerpos identificados mediante tales ensayos pueden unirse a formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o de fibrillas de TTR, pero no a formas tetraméricas nativas de TTR, como se describe en los ejemplos o de otro modo. Del mismo modo, algunos anticuerpos son inmunorreactivos sobre el tejido de amiloidosis mediado por TTR, pero no sobre tejido sano.

Algunos anticuerpos pueden usarse para inhibir o reducir la agregación de TTR, inhibir o reducir la formación de fibrillas de TTR, reducir o eliminar depósitos de TTR o TTR agregada o estabilizar conformaciones no tóxicas de TTR en un modelo animal o ensayo clínico. Algunos anticuerpos pueden usarse para tratar, efectuar profilaxis de o retrasar el inicio de una amiloidosis de TTR como se muestra en un modelo animal o ensayo clínico. Los modelos animales ejemplares para el ensayo de la actividad frente una amiloidosis de TTR incluyen los descritos en Kohno et al., Am. J. Path. 150(4):1497-1508 (1997); Teng et al., Laboratory Investigations 81:385-396 (2001); Wakasugi et al., Proc. Japan Acad. 63B:344-347 (1987); Shimada et al., Mol. Biol. Med. 6:333-343 (1989); Nagata et al., J. Biochem.

117:169-175 (1995); Sousa et al., Am. J. Path. 161:1935-1948 (2002); y Santos et al., Neurobiology of Aging 31:280-289 (2010).

B. Anticuerpos No Humanos

La producción de otros anticuerpos no humanos, p. ej., murino, conejillo de Indias, primate, conejo o rata, contra TTR monomérica o un fragmento de la misma (p. ej., residuos de aminoácidos 89-97) se puede lograr mediante, por ejemplo, la inmunización del animal con TTR o un fragmento de la misma. Véase, Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988). Dicho inmunógeno puede obtenerse a partir de una fuente natural, por síntesis peptídica, o por expresión recombinante. Opcionalmente, el inmunógeno se puede administrar fusionado o formando un complejo de otro modo con una proteína portadora. Opcionalmente, el inmunógeno se puede administrar con un adyuvante. Pueden utilizarse varios tipos de adyuvante como se describe a continuación. Se prefiere el adyuvante de Freund completo seguido de adyuvante incompleto para la inmunización de animales de laboratorio. Los conejos o conejillos de Indias se usan normalmente para la preparación de anticuerpos policlonales. Los ratones se suelen utilizar para la preparación de anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos se criban para determinar la unión específica a la TTR monomérica o un epítopo dentro de TTR (p. ej., un epítopo que comprende uno o más de los residuos de aminoácidos 89-97). Dicho cribado se puede conseguir determinando la unión de un anticuerpo a una colección de variantes de TTR monoméricas, tales como variantes de TTR que contienen los residuos de aminoácidos 89-97 o mutaciones dentro de estos residuos, y determinando qué variantes de TTR se unen al anticuerpo. La unión puede evaluarse, por ejemplo, por transferencia Western, FACS o ELISA.

C. Anticuerpos Humanizados

Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo modificado por ingeniería genética en el que las CDR de un anticuerpo "donante" no humano se injertan en secuencias de anticuerpo "aceptor" humanas (véase, p. ej., Queen, U^s 5.530.101 y 5.585.089; Winter, US 5.225.539; Carter, US 6.407.213; Adair, US 5.859.205; y Foote, US 6.881.557). Las secuencias de anticuerpos aceptor pueden ser, por ejemplo, una secuencia de anticuerpo humano maduro, un compuesto de tales secuencias, una secuencia de consenso de secuencias de anticuerpos humanos o una secuencia de la región de la línea germinal. Por lo tanto, un anticuerpo humanizado es un anticuerpo tiene al menos tres, cuatro, cinco o todas las CDR entera o substancialmente de un anticuerpo donante y secuencias de marco de regiones variables y regiones constantes, si están presentes, entera o sustancialmente de secuencias de anticuerpos humanos. De forma similar, una cadena pesada humanizada tiene al menos una, dos y usualmente las tres CDR entera o sustancialmente de una cadena pesada de anticuerpo donante, y una secuencia marco de región variable de cadena pesada y región constante de cadena pesada, si está presente, sustancialmente de secuencias marco de región variable de cadena pesada humana y regiones constantes. De forma similar, una cadena ligera humanizada tiene al menos uno, dos y generalmente las tres CDR entera o substancialmente de una cadena ligera del anticuerpo donante y una secuencia de marco de región variable de cadena ligera y región constante de cadena ligera, si está presente, substancialmente de secuencias marco de región variable de cadena ligera humana y región constante. Aparte de los nanocuerpos y dAb, un anticuerpo humanizado comprende una cadena pesada humanizada y una cadena ligera humanizada. Una CDR en un anticuerpo humanizado es sustancialmente de una CDR correspondiente en un anticuerpo no humano cuando al menos un 85%, 90%, 95% o 100% de residuos correspondientes (como se define por cualquier definición convencional, pero preferiblemente definida por Kabat) son idénticos entre las respectivas CDR. Las secuencias marco de región variable de una cadena de anticuerpo o la región constante de una cadena de anticuerpo son sustancialmente de una secuencia marco de región variable humana o región constante humana respectivamente cuando al menos un 85%, 90%, 95% o 100% de residuos correspondientes definidos por cualquier definición convencional, pero preferiblemente definida por Kabat, son idénticos.

Aunque los anticuerpos humanizados a menudo incorporan las seis CDR (preferiblemente como se define por Kabat) de un anticuerpo de ratón, también pueden prepararse con menos de todas las CDR (p. ej., al menos 3, 4, o 5 CDR) de un anticuerpo de ratón (p. ej., Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., J. of Mol. Biol, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, J. Immunol., 164:1432-1441, 2000).

En algunos anticuerpos solo se necesita una parte de las CDR, concretamente el subconjunto de residuos CDR requeridos para la unión, denominados SDR, para retener la unión en un anticuerpo humanizado. Los residuos de CDR que no entran en contacto con el antígeno y no forman parte de los SDR pueden identificarse sobre la base de estudios previos (por ejemplo, los residuos H60-H65 en CDR H2 a menudo no son requeridos), de regiones de CDR de Kabat situadas fuera de los bucles hipervariables de Chothia (Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987), por modelado molecular y/o empíricamente, o como se describe en Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863, 2004. En tales anticuerpos humanizados en posiciones en las que está ausente uno o más residuos de CDR donante o en los que se omite una CDR donante entera, el aminoácido que ocupa la posición puede ser un aminoácido que ocupa la posición correspondiente (por numeración de Kabat) en la secuencia de anticuerpos aceptor. El número de tales sustituciones del aceptor para los aminoácidos donantes a incluir en las CDR refleja un equilibrio de consideraciones competitivas. Tales sustituciones son potencialmente ventajosas para disminuir el número de aminoácidos de ratón en un anticuerpo humanizado y, por consiguiente, disminuir la inmunogenicidad potencial. Sin embargo, las sustituciones también pueden causar cambios de afinidad, y preferiblemente se evitan reducciones significativas en la afinidad. Las posiciones para la sustitución dentro de las CDR y los aminoácidos a sustituir también se pueden seleccionar empíricamente.

Las secuencias de anticuerpos aceptores humanos pueden seleccionarse opcionalmente de entre las muchas secuencias de anticuerpos humanos conocidas para proporcionar un alto grado de identidad de secuencia (p. ej., un 65-85% de identidad) entre marcos de región variable de secuencia aceptora humana y marcos de regiones variables correspondientes de una cadena de anticuerpo donante.

Los ejemplos de las secuencias aceptoras para la cadena pesada son la región variable de cadena pesada madura humana AGP01689 (SEQ ID NO:3) u otro subgrupo de cadena pesada humana 1. La SEQ ID NO: 3 de secuencia aceptora incluye dos CDR que tienen la misma forma canónica que la cadena pesada 5A1 de ratón. Los ejemplos de secuencias aceptoras para la cadena ligera son las regiones variables de cadena ligera madura humana con código de acceso NCBⁱ BAH04766 (SEQ ID NO:11) y otras regiones variables de cadena ligera del subgrupo kappa humano 2.

Ciertos aminoácidos de los residuos marco de la región variable humana pueden seleccionarse para la sustitución sobre la base de su posible influencia en la conformación de las CDR y/o la unión al antígeno. La investigación de tales posibles influencias es por modelado, examen de las características de los aminoácidos en localizaciones particulares, u observación empírica de los efectos de la sustitución o mutagénesis de aminoácidos particulares. Por ejemplo, cuando un aminoácido difiere entre un residuo marco de región variable murina y un residuo marco de región variable humana seleccionado, el aminoácido marco humano puede sustituirse por el aminoácido marco equivalente del anticuerpo de ratón cuando se espera razonablemente que el aminoácido:

(1) se une no covalentemente al antígeno de manera directa;

(2) es adyacente a una región de CDR o dentro de una CDR definida por Chothia, pero no Kabat;

(3) interacciona de otro modo con una región CDR (p. ej., está dentro de aproximadamente 6 A de una región CDR), (p. ej., identificado por modelado de la cadena ligera o pesada sobre la estructura resuelta de una cadena de inmunoglobulina conocida homóloga); o

(4) es un residuo que participa en la interfaz VL-VH.

Los residuos marco de las clases (1) a (3) según se define por Queen, US 5.530.101, se denominan a veces alternativamente residuos canónicos y vernier. Los residuos marco que ayudan a definir la conformación de un bucle de CDR se denominan a veces residuos canónicos (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Thornton y Martin, J. Mol. Biol. 263:800-815 (1996)). Los residuos marco que soportan las conformaciones de bucle de unión al antígeno y juegan un papel en el ajuste fino del ajuste de un anticuerpo al antígeno se denominan a veces residuos de vernier (Foote y Winter, J. Mol. Biol 224:487-499 (1992)).

Otros residuos marco que son candidatos para sustitución son residuos que crean un sitio potencial de glicosilación. Sin embargo, otros candidatos para la sustitución son los aminoácidos marco humanos aceptores que son inusuales para una inmunoglobulina humana en esa posición. Estos aminoácidos pueden ser sustituidos con los aminoácidos de la posición equivalente del anticuerpo del ratón donante o de las posiciones equivalentes de las inmunoglobulinas humanas más típicas.

Los anticuerpos humanizados ejemplares son formas humanizadas del anticuerpo 5A1 de ratón, que comprende regiones variables de cadenas pesada y ligera maduras que tienen secuencias de aminoácidos que comprenden las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 9, respectivamente. La invención proporciona una región variable de cadena pesada madura humanizada ejemplificada: Hu5A1VHv2 (SEQ ID NO: 5). La invención proporciona además una región variable de cadena ligera madura humana ejemplificada: Hu5A1VLv2 (SEQ ID NO: 13).

Las Figuras 1 y 2 muestran alineaciones de región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera, respectivamente, de 5A1, anticuerpos de modelo de ratón, anticuerpos aceptores humanos, y versiones de anticuerpo humanizado de 5A1. Las figuras también muestran posiciones de CDR, residuos canónicos, residuos de Vernier, y residuos de interfaz. Las posiciones en las que los residuos canónicos, de Vernier, o interfaz difieren entre las secuencias aceptoras de ratón y humanas que son candidatas para la sustitución. Sin embargo, aquí las Figuras muestran que pocos de dichos residuos se diferencian entre las secuencias aceptoras de ratón y humanas. Las posiciones 29 y 93 de la cadena pesada se consideraron para sustitución, porque los residuos de ratón y humanos difieren en estas posiciones. La posición 29 está dentro de la región CDRH1 Chothia y la posición 93 es un residuo que contribuye a la interfaz VH-VL. Las posiciones 85 (en el marco de la región variable) y 55 (en CDRL2) de cadena ligera se consideraron para la sustitución sobre la base de que los residuos que ocupan esta posición en un injerto de CDR lineal eran inusuales para las posiciones en los anticuerpos humanos. En la posición 85, el residuo T aceptor humano se reemplazó con el residuo V de ratón. En la posición 55, el residuo de cisteína de ratón se reemplazó con un residuo de serina. La serina no está presente en el aceptor humano, por lo que esta substitución no es ni una retromutación ni mutación hacia adelante. Tres otras posiciones de Vernier de marco de región variable en las que los residuos aceptores de ratón y humanos difieren son H49, H75 y L69. Estas posiciones pueden opcionalmente retromutarse (S49A, K75R y T69A, respectivamente).

Aquí, como en otras partes, el residuo mencionado en primer lugar es el residuo de un anticuerpo humanizado formado por injerto de CDR de Kabat o una CDR compuesta de Chothia-Kabat en el caso de CDR-H1 en un marco aceptor humano y el residuo mencionado en segundo lugar es un residuo que se considera para reemplazar dicho residuo. Así, dentro de los marcos de la región variable, el residuo mencionado en primer lugar es humano (T85V, V29F, y A93H), y dentro de las CDR, el residuo mencionado en primer lugar es de ratón (C55S).

Los anticuerpos ejemplificados incluyen las regiones variables de cadena pesada y ligera maduras ejemplificadas VHv2/VLv2 o H2L2). En algunos de dichos anticuerpos, se retienen al menos 1, 2, 3 o las 4 mutaciones presentes en cualquiera de las SEQ ID NO: 5 o 13. En algunos anticuerpos, una o ambas posiciones 29 y 93 de V^h están ocupadas por F y V respectivamente. En algunos anticuerpos, una o ambas posiciones 55 y 85 de VL están ocupadas por S y V respectivamente. Las regiones de CDR de tales anticuerpos humanizados pueden ser idénticas o substancialmente idénticas a las regiones de CDR del anticuerpo 5A1 donante de ratón. Las regiones de CDR pueden definirse por cualquier definición convencional (p. ej., Chothia, o compuesto de Chothia y Kabat), pero son como se definen preferiblemente por Kabat.

Las posiciones marco de las regiones variables son según la numeración de Kabat, a no ser que se indique otra cosa. Otras variantes de este tipo difieren normalmente de las secuencias de las cadenas pesada y ligera de Hu5A1 ejemplificadas por un número pequeño (p. ej., normalmente no más de 1, 2, 3, 5, 10 o 15) de reemplazos, deleciones o inserciones. Tales diferencias están generalmente en el marco, pero también pueden ocurrir en las CDR.

Una posibilidad de variación adicional en las variantes de 5A1 humanizadas es la retromutación adicional en los marcos de región variable. Muchos de los residuos marco que no están en contacto con las CDR en el mAb humanizado pueden acomodar sustituciones de aminoácidos de las posiciones correspondientes del mAb de ratón donante u otros anticuerpos de ratón o humanos e incluso muchos residuos potenciales de contacto de CDR también son susceptibles de sustitución. Incluso los aminoácidos dentro de las CDR pueden estar alterados, por ejemplo, con residuos que se encuentran en la posición correspondiente de la secuencia aceptora humana usada para suministrar marcos de región variable. Además, se pueden usar secuencias aceptoras humanas alternativas, por ejemplo, para la cadena pesada y/o ligera. Si se utilizan diferentes secuencias aceptoras, puede que no se realice una o más de las retromutaciones recomendadas anteriormente debido a que los residuos donantes y aceptores correspondientes ya son los mismos sin retromutación.

Preferiblemente, los reemplazos o las retromutaciones en las variantes de Hu5A1 (ya sean o no conservativas) no tienen un efecto sustancial sobre la afinidad o potencia de unión del mAb humanizado, es decir, su capacidad para unirse a TTR monomérica (p. ej., la potencia en algunos o todos los ensayos descritos en los presentes ejemplos del anticuerpo 5A1 humanizado variante es esencialmente la misma, es decir, dentro del error experimental, que la del 5A1 murino).

D. Anticuerpos Quiméricos y Modificados en Superficie

La descripción proporciona además formas quiméricas y modificadas en superficie de anticuerpos no humanos. Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo en el que las regiones variables maduras de cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo no humano (p. ej., un ratón) se combinan con regiones constantes de cadena ligera y pesada humanas. Dichos anticuerpos retienen sustancial o totalmente la especificidad de unión del anticuerpo de ratón, y son aproximadamente dos tercios de la secuencia humana.

Un anticuerpo modificado en superficie es un tipo de anticuerpo humanizado que retiene algunas y usualmente todas las CDR y algunos de los residuos marco no humanos de la región variable de un anticuerpo no humano, pero reemplaza otros residuos marco de la región variable que pueden contribuir a epítopos de células B o T, por ejemplo, residuos expuestos (Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991) con residuos de las posiciones correspondientes de la secuencia de un anticuerpo humano. El resultado es un anticuerpo en el que las CDR son total o sustancialmente de un anticuerpo no humano y los marcos de regiones variables del anticuerpo no humano se hacen más similares a los humanos mediante las sustituciones. En la invención se incluyen formas modificadas en superficie del anticuerpo reivindicado.

E. Anticuerpos Humanos

Los anticuerpos humanos frente a TTR monomérica o un fragmento de la misma (p. ej., residuos de aminoácidos 89­ 97 (SEQ ID NO: 35) de TTR) son proporcionados por una variedad de técnicas que se describen a continuación. Algunos anticuerpos humanos se seleccionan mediante experimentos de unión competitiva, mediante el método de exposición en fagos de Winter, arriba, o de otro modo, para tener la misma especificidad de epítopo que un anticuerpo de ratón particular, tal como uno de los anticuerpos monoclonales de ratón descritos en los ejemplos. Los anticuerpos humanos también pueden cribarse para determinar la especificidad para un epítopo particular utilizando solo un fragmento de TTR, tal como una variante de TTR que contiene solo los residuos de aminoácidos 89-97 de TTR, como el antígeno diana, y/o por cribado de anticuerpos frente a una colección de variantes de TTR, tales como variantes de TTR que contienen diversas mutaciones en los residuos de aminoácidos 89-97 de TTR.

Los métodos para producir anticuerpos humanos incluyen el método de trioma de Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, Patente de EE. UU. No. 4.634.664; y Engleman et al., Patente de EE. UU. 4.634.666, uso de ratones transgénicos que incluyen genes de inmunoglobulina humana (véase, p. ej., Lonberg et al., WO93/12227 (1993); US 5.877.397; US 5.874.299; US 5.814.318; US 5.789.650; US 5.770.429; US 5.661.016; US 5.633.425; US 5.625.126; US 5.569.825; US 5.545.806; Neuberger, Nat. Biotechnol. 14:826 (1996); y Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)) y métodos de exposición en fagos (véase, p. ej., Dower et al., WO 91/17271; McCafferty et al., WO 92/01047; US 5.877.218; US 5.871.907; US 5.858.657; US 5.837.242; US 5.733.743; y US 5.565.332).

F. Selección de la Región Constante

Las regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos quiméricos, modificados en superficie o humanizados pueden unirse con al menos una parte de una región constante humana. La elección de la región constante depende, en parte, de si se desea una citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo, una fagocitosis celular dependiente de anticuerpo y/o una citotoxicidad dependiente del complemento. Por ejemplo, los isotipos humanos IgG1 e IgG3 tienen citotoxicidad dependiente del complemento y los isotipos humanos IgG2 e IgG4 no. Las IgG1 e IgG3 humanas también inducen funciones efectoras mediadas por células más fuertes que las IgG2 e IgG4 humanas. Las regiones constantes de la cadena ligera pueden ser lambda o kappa.

Uno o varios aminoácidos en el extremo amino o carboxi de la cadena ligera y/o pesada, tal como la lisina C-terminal de la cadena pesada, pueden faltar o derivatizarse en una proporción o en todas las moléculas. Se pueden hacer sustituciones en las regiones constantes para reducir o aumentar la función efectora tal como la citotoxicidad mediada por el complemento o ADCC (véase, p. ej., Winter et al., Patente de EE. UU. No. 5.624.821, Tso et al., Patente de EE. UU. No. 5.834.597; y Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), o para prolongar la semivida en los seres humanos (véase, p. ej., Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004). Las sustituciones ejemplares incluyen una Gln en la posición 250 y/o una Leu en la posición 428 (la numeración EU se usa en este párrafo para la región constante) para aumentar la semivida de un anticuerpo. La sustitución en cualquiera o en todas las posiciones 234, 235, 236 y/o 237 reduce la afinidad por los receptores Fcy, en particular el receptor FcyRI (véase, p. ej., US 6.624.821). Una sustitución de alanina en las posiciones 234, 235 y 237 de la IgG1 humana puede utilizarse para reducir funciones efectoras. Algunos anticuerpos tienen sustitución de alanina en las posiciones 234, 235 y 237 de la IgG1 humana para reducir funciones efectoras. Opcionalmente, las posiciones 234, 236 y 237 de la IgG2 humana son sustituidas con alanina y la posición 235 con glutamina (véase, p. ej., US 5.624.821). En algunos anticuerpos, se utiliza una mutación en una o más de las posiciones 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329 y 331 por la numeración EU de la IgG1 humana. En algunos anticuerpos, se utiliza una mutación en una o más de las posiciones 318, 320 y 322 por la numeración EU de la IgG1 humana. En algunos anticuerpos, las posiciones 234 y/o 235 son sustituidas con alanina y/o la posición 329 se sustituye con glicina. En algunos anticuerpos, el isotipo es IgG2 o IgG4 humano.

Una región constante kappa de cadena ligera humana ejemplar tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25. Los anticuerpos pueden expresarse como tetrámeros que contienen dos cadenas ligeras y dos pesadas, como cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, como Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, o como anticuerpos de cadena única en los que los dominios variables de cadena pesada y ligera madura están unidos a través de un espaciador.

Las regiones constantes humanas muestran variación alotípica y variación isoalotípica entre diferentes individuos, es decir, las regiones constantes pueden diferir en diferentes individuos en una o más posiciones polimórficas. Los isoalotipos se diferencian de los alotipos en que los sueros que reconocen un isoalotipo se unen a una región no polimórfica de uno o más otros isotipos. Así, por ejemplo, otra región constante de cadena pesada es del alotipo IgG1 G1m3 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23. La referencia a una región constante humana incluye una región constante con cualquier alotipo natural o cualquier permutación de residuos que ocupan las posiciones en alotipos naturales.

G. Expresión de Anticuerpos Recombinantes

Se conocen varios métodos para producir anticuerpos quiméricos y humanizados usando una línea celular que expresa un anticuerpo (p. ej., un hibridoma). Por ejemplo, las regiones variables de inmunoglobulina de anticuerpos pueden clonarse y secuenciarse usando métodos bien conocidos. En un método, la región VH variable de cadena pesada se clona mediante RT-PCR usando ARNm preparado a partir de células de hibridoma. Se emplean cebadores de consenso al péptido líder de la región VH que abarca el codón de inicio de la traducción como el cebador 5' y un cebador 3' específico de las regiones constantes g2b. Los cebadores ejemplares se describen en la publicación de patente de EE. UU. US 2005/0009150 de Schenk et al. (de aquí en adelante "Schenk"). Las secuencias de múltiples clones obtenidos independientemente se pueden comparar para asegurar que no se introduzcan cambios durante la amplificación. La secuencia de la región VH también puede determinarse o confirmarse secuenciando un fragmento de VH obtenido por la metodología 5' RACE RT-PCR y el cebador específico 3' g2b.

La región VL variable de la cadena ligera puede clonarse de una manera análoga. En un enfoque, un conjunto de cebadores de consenso se diseña para la amplificación de regiones VL usando un cebador 5' diseñado para hibridar con la región VL que abarca el codón de inicio de la traducción y un cebador 3' específico para la región Ck de la región de unión V-J. En un segundo enfoque, se emplea la metodología 5' RACE ^rT-PCR para clonar un ADNc que codifica VL. Los cebadores ejemplares se describen en Schenk, supra. Las secuencias clonadas se combinan entonces con secuencias que codifican regiones constantes humanas (u otras especies no humanas).

En un enfoque, las regiones variables de cadena pesada y ligera se diseñan de nuevo por ingeniería para codificar secuencias donantes de corte y empalme en 3' de las respectivas uniones VDJ o VJ y se clonan en un vector de expresión de mamífero, tal como pCMV-hY1 para la cadena pesada y pCMV-Mcl para la cadena ligera. Estos vectores codifican regiones constantes humanas ^y1 y Ck como fragmentos exónicos en 3' del casete de región variable insertado. Después de la verificación de la secuencia, los vectores de expresión de cadena pesada y cadena ligera pueden cotransfectarse en células CHO para producir anticuerpos quiméricos. Los medios condicionados se recogen 48 horas después de la transfección y se ensayan mediante análisis de transferencia western para determinar la producción de anticuerpos o ELISA para la unión al antígeno. Los anticuerpos quiméricos se humanizan como se describió anteriormente.

Los anticuerpos quiméricos, modificados en superficie, humanizados y humanos se producen normalmente mediante expresión recombinante. Las construcciones de polinucleótidos recombinantes incluyen normalmente una secuencia de control de la expresión unida operativamente a las secuencias codificantes de cadenas de anticuerpos, incluyendo elementos de control de la expresión naturalmente asociados o heterólogos, tales como un promotor. Las secuencias de control de la expresión pueden ser sistemas promotores en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucariotas o procariotas. Una vez que el vector se ha incorporado en el huésped apropiado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para la expresión de alto nivel de las secuencias de nucleótidos y la recogida y purificación de los anticuerpos de reacción cruzada.

Estos vectores de expresión son normalmente replicables en los organismos huésped, bien como episomas o como parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección, p. ej., resistencia a ampicilina o resistencia a higromicina, para permitir la detección de las células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.

E. coli es un huésped procariota útil para expresar anticuerpos, particularmente fragmentos de anticuerpos. Los microbios, tales como la levadura, también son útiles para la expresión. Saccharomyces es un huésped de levadura con vectores adecuados que tienen secuencias de control de la expresión, un origen de replicación, secuencias de terminación y similares como se desee. Los promotores típicos incluyen 3-fosfoglicerato quinasa y otras enzimas glicolíticas. Los promotores de levadura inducibles incluyen, entre otros, promotores de alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa.

Las células de mamífero pueden usarse para expresar segmentos de nucleótidos que codifican inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas. Véase, Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Se han desarrollado varias líneas de células huésped adecuadas capaces de secretar proteínas heterólogas intactas, e incluyen líneas celulares CHO, diversas líneas celulares COS, células HeLa, células HEK293, células L y mielomas que no producen anticuerpos, incluyendo Sp2/0 y NS0. Las células pueden ser no humanas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un potenciador (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias de terminación transcripcional. Las secuencias de control de la expresión pueden incluir promotores derivados de genes endógenos, citomegalovirus, SV40, adenovirus, papilomavirus bovino, y similares. Véase, Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992).

Alternativamente, las secuencias codificadoras de anticuerpos pueden incorporarse en transgenes para su introducción en el genoma de un animal transgénico no humano y su posterior expresión en la leche del animal transgénico (véase, p. ej., la Patente de EE. UU. No. 5.741.957; Patente de EE. _uU. No. 5.304.489; y Patente de EE. UU. No. 5.849.992). Los transgenes adecuados incluyen secuencias de codificación para cadenas ligera y/o pesada unidas operativamente con un promotor y potenciador de un gen específico de glándula mamaria, tal como caseína o beta lactoglobulina.

Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interés pueden transferirse a la célula huésped por métodos que dependen del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro cálcico se utiliza comúnmente para células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato cálcico, electroporación, lipofección, biolística o transfección basada en virus se puede utilizar para otros huéspedes celulares. Otros métodos utilizados para transformar las células de mamíferos incluyen el uso de polibreno, fusión de protoplastos, liposomas, electroporación y microinyección. Para la producción de animales transgénicos no humanos, los transgenes pueden microinyectarse en ovocitos fertilizados o pueden incorporarse en el genoma de las células madre embrionarias no humanas, y los núcleos de estas células se transfieren a ovocitos enucleados.

Habiendo introducido el o los vectores que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo en el cultivo celular, las combinaciones de células pueden cribarse para determinar la productividad del crecimiento y la calidad del producto en medios libres de suero. Las combinaciones de células con una mayor producción pueden someterse a continuación a la clonación de células individuales basada en FACS para generar líneas monoclonales. Pueden usarse productividades específicas por encima de 50 pg o 100 pg por célula al día, que corresponden a titulaciones de producto de más de 7,5 g/L de cultivo. Los anticuerpos producidos por clones de células individuales también pueden ensayarse en cuanto a turbidez, propiedades de filtración, PAGE, IEF, barrido UV, HP-SEC, mapeo de carbohidratos-oligosacáridos, espectrometría de masas y ensayo de unión, tales como ELISA o Biacore. Un clon seleccionado puede entonces ser depositado en múltiples viales y almacenado congelado para uso posterior.

Una vez expresados, los anticuerpos pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, incluyendo la captura de proteína A, purificación por HPLC, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares (véase, en general, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982).

Puede emplearse metodología para la producción comercial de anticuerpos, incluyendo optimización de codones, selección de promotores, selección de elementos de transcripción, selección de terminadores, clonación de células individuales libre de suero, depósito de células, uso de marcadores de selección para la amplificación del número de copias, terminador CHO o mejora de las titulaciones de proteína (véase, p. ej., US 5.786.464; US 6.114.148; US 6.063.598; US 7.569.339; WO2004/050884; WO2008/012142; WO2008/012142; WO2005/019442; WO2008/107388; WO2009/027471; y US 5.888.809).

H. Ensayos de Cribado de Anticuerpos

Los anticuerpos pueden someterse a varios cribados que incluyen ensayos de unión, cribados funcionales, cribados en modelos animales de enfermedades asociadas con depósitos de TTR y ensayos clínicos. Los ensayos de unión ensayan la unión específica y, opcionalmente, la afinidad y especificidad de epítopo para TTR monomérica o un fragmento de la misma. Por ejemplo, los ensayos de unión pueden cribar anticuerpos que se unen a los residuos de aminoácidos 89-97 (SEQ ID NO: 35) de la TTR, que es un epítopo que está enterrado en el tetrámero de TTR nativa y expuesto en formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas, o de fibrilla de TTR. Los anticuerpos también pueden cribarse para determinar la capacidad de unirse a conformaciones pre-fibrilares no nativas de TTR y de fibrillas amiloides de TTR, pero no a conformaciones de TTR nativas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden cribarse para determinar su capacidad de unirse a formas monoméricas de TTR creadas por disociación o desagregación de la TTR tetramérica nativa, y pueden contra-cribarse frente a TTR tetramérica nativo, como se describe en los ejemplos o de otro modo. Del mismo modo, los anticuerpos también pueden cribarse para determinar su inmunorreactividad en tejido de amiloidosis mediado por TTR, pero no en tejido sano. Tales cribados se realizan a veces en competición con un anticuerpo ejemplar, tal como un anticuerpo que tiene las regiones variables de 5A1 o isótopo kappa IgG1. Opcionalmente, el anticuerpo o la diana TTR se inmoviliza en dicho ensayo.

Los ensayos funcionales se pueden realizar en modelos celulares incluyendo células que expresan TTR de forma natural o transfectadas con ADN que codifica TTR o un fragmento de la misma. Las células adecuadas incluyen células derivadas de tejido cardíaco u otros tejidos afectados por la amiloidogénesis de TTR. Las células pueden cribarse para determinar niveles reducidos de formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o en fibrillas de TTR (p. ej., mediante transferencia Western o inmunoprecipitación de extractos celulares o sobrenadantes) o toxicidad reducida atribuible a formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o de fibrillas de TTR. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ensayarse para determinar su capacidad de inhibir o reducir la agregación de TTR, inhibir o reducir la formación de fibrillas de TTR, reducir los depósitos de TTR, eliminar TTR agregada o estabilizar las conformaciones no tóxicas de TTR.

Otros ensayos funcionales se pueden llevar a cabo en solución, tales como el ensayo de si un anticuerpo es capaz de interrumpir o reducir la formación de fibrillas de TTR cuando la TTR monomérica o los intermedios de TTR plegados erróneamente en solución se ponen en contacto con el anticuerpo. El grado de formación de fibrillas puede ser ensayado por mediciones de turbidez, por ejemplo, a 400 nm en un espectrómetro UV-visible equipado con una unidad de control de la temperatura. La Tioflavina-T también puede usarse para evaluar el grado de la formación de fibrillas amiloides. Por ejemplo, se puede añadir un exceso molar de cinco veces de Tioflavina-T a muestras de TTR y dejarlo a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de tomar las mediciones. La fluorescencia de la Tioflavina-T se puede monitorizar usando un espectrofluorímetro. Véase, US 2014/0056904.

Los cribados en modelos animales ensayan la capacidad del anticuerpo para tratar terapéutica o profilácticamente signos o síntomas en un modelo animal que simula una enfermedad humana asociada con la acumulación de TTR o depósitos de TTR. Tales enfermedades incluyen tipos de amiloidosis de TTR, como amiloidosis sistémica senil (SSA), amiloidosis cardíaca senil (SCA), polineuropatía amiloide familiar (FAP), miocardiopatía amiloide familiar (FAC) y amiloidosis selectiva del sistema nervioso central (CNSA). Los signos o síntomas adecuados que pueden monitorizarse incluyen la presencia y el grado de depósitos de amiloide en diversos tejidos, tales como el tracto gastrointestinal o el corazón. El grado de reducción de los depósitos amiloides puede determinarse por comparación con un control apropiado, tal como el nivel de depósitos amiloides de TTR en animales de control que han recibido un anticuerpo de control (p. ej., un anticuerpo de control con isotipo concordante), un placebo o sin tratamiento alguno. Un modelo animal ejemplar para ensayar la actividad contra una amiloidosis de TTR es un modelo de ratón que tiene una mutación nula en el locus Ttr de ratón endógeno y el gen TTR mutante humano que comprende una mutación V30M que está asociada con polineuropatía amiloidea familiar. Véase, p. ej., Kohno et al., Am. J. Path.

150(4):1497-1508 (1997); Cardoso y Saraiva, F^a S^e B J 20(2):234-239 (2006). También existen modelos similares, incluyendo otros modelos para las versiones familiares de amiloidosis de TTR y modelos para las versiones esporádicas de amiloidosis de TTR. Véase, p. ej., Teng et al., Lab. Invest. 81(3): 385-396 (2001); Ito y Maeda, Mouse Models of Transthyretin Amyloidosis, en Recent Advances in Transthyretin Evolution, Structure, and Biological Functions, p. 261-280 (2009) (Springer Berlin Heidelberg). Los animales transgénicos pueden incluir un transgén de TTR humano, como un transgén de TTR con una mutación asociada con amiloidosis de TTR o un transgén de TTR de tipo salvaje. Para facilitar el ensayo en modelos animales, pueden usarse anticuerpos quiméricos que tienen una región constante apropiada para el modelo animal (p. ej., podrían usarse quimeras de rata-ratón para ensayar los anticuerpos en ratas). Se puede concluir que una versión humanizada de un anticuerpo será efectiva si el anticuerpo de ratón o anticuerpo quimérico correspondiente es eficaz en un modelo animal apropiado y el anticuerpo humanizado tiene una afinidad de unión similar (p. ej., dentro del error experimental, tal como por un factor de 1,5, 2 o 3).

Los ensayos clínicos ensayan la seguridad y eficacia en un ser humano que tiene una enfermedad asociada con amiloidosis de TTR.

I. Ácidos Nucleicos

La invención proporciona además ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las cadenas pesadas y ligeras descritas anteriormente (p. ej., las SEQ ID NO: 5 y 13). Opcionalmente, dichos ácidos nucleicos codifican además un péptido señal y pueden expresarse con el péptido señal unido a la región constante (p. ej., péptidos señal que tienen secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 42 (cadena pesada) y 44 (cadena ligera) que pueden ser codificados por las SEQ ID NO: 43, respectivamente (cadena pesada) y 45, respectivamente (cadena ligera)). Las secuencias de codificación de ácidos nucleicos pueden estar unidas operativamente con secuencias reguladoras para asegurar la expresión de las secuencias de codificación, tales como un promotor, potenciador, sitio de unión al ribosoma, señal de terminación de la transcripción, y similares. Los ácidos nucleicos que codifican cadenas pesadas y ligeras pueden ocurrir en forma aislada o pueden clonarse en uno o más vectores. Los ácidos nucleicos se pueden sintetizar, por ejemplo, mediante síntesis en estado sólido o PCR de oligonucleótidos superpuestos. Los ácidos nucleicos que codifican cadenas pesadas y ligeras pueden unirse como un ácido nucleico contiguo, p. ej., dentro de un vector de expresión, o pueden estar separados, p. ej., cada uno clonado en su propio vector de expresión.

J. Anticuerpos Conjugados

Los anticuerpos conjugados que se unen específicamente a antígenos expuestos en formas patogénicas de TTR, pero no en formas tetraméricas nativas de TTR, tal como los residuos de aminoácidos 89-97 (SEQ ID NO: 35) de TTR, son útiles en la detección de la presencia de formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas, o de fibrillas de TTR; monitorización y evaluación de la eficacia de agentes terapéuticos que se están utilizando para tratar a pacientes diagnosticados con una amiloidosis de TTR; inhibición o reducción de la agregación de TTR; inhibición o reducción de la formación de fibrillas de TTR; reducción o eliminación de los depósitos de TTR; estabilización de las conformaciones no tóxicas de TTR; o tratamiento o realización de profilaxis de una amiloidosis de TTR en un paciente. Por ejemplo, dichos anticuerpos pueden conjugarse con otros restos terapéuticos, otras proteínas, otros anticuerpos y/o marcadores detectables. Véase, WO 03/057838; US 8.455.622.

Los restos terapéuticos conjugados pueden ser cualquier agente que pueda usarse para tratar, combatir, aliviar, prevenir o mejorar una afección o enfermedad no deseada en un paciente, tal como una amiloidosis de TTR. Los restos terapéuticos pueden incluir, por ejemplo, inmunomoduladores o cualesquiera agentes biológicamente activos que facilitan o mejoran la actividad del anticuerpo. Un inmunomodulador puede ser cualquier agente que estimule o inhiba el desarrollo o mantenimiento de una respuesta inmunológica. Si tales restos terapéuticos están acoplados a un anticuerpo específico para las formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o fibrillas de ^tT^r , tales como los anticuerpos descritos en la presente memoria, los restos terapéuticos acoplados tendrán una afinidad específica para formas patógenas no nativas de TTR sobre las formas tetraméricas nativas de TTR. Por consiguiente, la administración de los anticuerpos conjugados se dirige directamente a tejidos que comprenden formas patógenas de TTR con un daño mínimo al tejido sano normal circundante. Esto puede ser particularmente útil para los restos terapéuticos que son demasiado tóxicos para ser administradas por su propia cuenta. Además, pueden utilizarse cantidades más pequeñas de los restos terapéuticos.

Los ejemplos de restos terapéuticos adecuados incluyen fármacos que reducen los niveles de TTR, estabilizan la estructura tetramérica nativa de TTR, inhiben la agregación de TTR, alteran la formación de fibrillas o amiloide de TTR, o contrarrestan la toxicidad celular. Véase, p. ej., Almeida y Saraiva, FEBS Letters 586:2891-2896 (2012); Saraiva, FEBS Letters 498:201-203 (2001); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013); Ruberg y Berk, Circulation 126:1286-1300 (2012); y Johnson et al., J. Mol. Biol. 421(2-3):185-203 (2012). Por ejemplo, los anticuerpos pueden conjugarse con tafamidis, diflunisal, ALN-TTR01, ALNTTR02, ISIS-TTRRx, doxiciclina (doxi), ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA), Doxi-TUDCA, galato de epigalocatequina (EGCG), curcumina o resveratrol (3,5,4'-trihidroxiestilbeno). Otros restos terapéuticos representativos incluyen otros agentes conocidos por ser útiles para el tratamiento, el manejo o la mejora de una amiloidosis de TTR o los síntomas de una amiloidosis de TTR. Véase, p. ej., Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013) para síntomas clínicos comunes de amiloidosis de TTR y agentes típicos utilizados para tratar los síntomas.

Los anticuerpos también pueden acoplarse con otras proteínas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden acoplarse con Fynomers. Los Fynomers son proteínas de unión pequeñas (p. ej., 7 kDa) derivadas del dominio s H3 de Fyn humano. Pueden ser estables y solubles, y pueden carecer de residuos de cisteína y enlaces disulfuro. Los Fynomers pueden diseñarse por ingeniería para unirse a las moléculas diana con la misma afinidad y especificidad que los anticuerpos. Son adecuados para crear proteínas de fusión multiespecíficas basadas en anticuerpos. Por ejemplo, los Fynomers pueden fusionarse a los extremos N-terminal y/o C-terminal de anticuerpos para crear FynomAb bi y triespecíficos con diferentes arquitecturas. Los Fynomers pueden seleccionarse utilizando las bibliotecas de Fynomer a través de tecnologías de cribado usando ^fA^c S, Biacore y ensayos basados en células que permiten una selección eficiente de Fynomers con propiedades óptimas. Los ejemplos de Fynomers son divulgados en Grabulovski et al., J. Biol. Chem. 282:3196-3204 (2007); Bertschinger et al., Protein Eng. Des. Sel. 20:57-68 (2007); Schlatter et al., MAbs. 4:497-508 (2011); Banner et al., Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 69 (Pt6): 1124­

1137 (2013); y Brack et al., Mol. Cancer Ther. 13:2030-2039 (2014).

Los anticuerpos divulgados en la presente memoria también pueden acoplarse o conjugarse con uno o más de otros anticuerpos (p. ej., para formar heteroconjugados de anticuerpos). Tales otros anticuerpos pueden unirse a diferentes epítopos dentro de TTR o una porción de la misma o pueden unirse a un antígeno diana diferente.

Los anticuerpos también pueden acoplarse con una etiqueta detectable. Tales anticuerpos se pueden utilizar, por ejemplo, para diagnosticar una amiloidosis de TTR, para monitorizar la progresión de una amiloidosis de TTR y/o para evaluar la eficacia del tratamiento. Tales anticuerpos son particularmente útiles para llevar a cabo tales determinaciones en sujetos que tienen o son susceptibles de una amiloidosis de TTR, o en muestras biológicas apropiadas obtenidas a partir de dichos sujetos. Las etiquetas detectables representativas que pueden acoplarse o unirse a un anticuerpo 5A1 humanizado incluyen varias enzimas, tal como peroxidasa del rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos, como biotina/estreptavidina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, como umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, como luminol; materiales bioluminiscentes como luciferasa, luciferina y acuorina; materiales radiactivos, tales como itrio90 (90Y), plata radioactiva-111, plata radioactiva-199, Bismuto213, yodo (131I, 125I, 123I, 121I,), carbono (14C), azufre (5S), tritio (3H), indio (115In 113In 112In 111In,), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F) , 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, y 117Tin; metales emisores de positrones que usan varias tomografías de emisión de positrones; iones metálicos paramagnéticos no radioactivos; y moléculas que son radiomarcadas o conjugadas a radioisótopos específicos.

La unión de los radioisótopos a los anticuerpos puede realizarse con quelatos de bifunción convencionales. Para la unión de plata radioactiva-111 y plata radioactiva-199, se pueden usar conectores basados en azufre. Véase, Hazra et al., Cell Biophys. 24-25:1-7 (1994). La unión de los radioisótopos de plata puede implicar la reducción de la inmunoglobulina con ácido ascórbico. Para los radioisótopos tales como 111In y 90Y, se puede usar ibritumomab tiuxetano y reaccionará con dichos isótopos para formar 111In-ibritumomab tiuxetano y 90Y-ibritumomab tiuxetano, respectivamente. Véase, Witzig, Cancer Chemother. Pharmacol., 48 Supl 1:S91-S95 (2001).

Los restos terapéuticos, otras proteínas, otros anticuerpos y/o etiquetas detectables pueden acoplarse o conjugarse, directa o indirectamente a través de un intermediario (p. ej., un conector), a un anticuerpo 5A1 murino, quimérico, modificado en superficie o humanizado usando técnicas conocidas en la técnica. Véase, p. ej., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), p. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), p. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," en Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), p. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), p. 303-16 (Academic Press 1985); y Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).

Los conectores adecuados incluyen, por ejemplo, conectores escindibles y no escindibles. Pueden emplearse diferentes conectores que liberan los restos terapéuticos acoplados, proteínas, anticuerpos y/o etiquetas detectables en condiciones ácidas o reductoras, después de la exposición a las proteasas específicas, o bajo otras condiciones definidas.

V. Aplicaciones Terapéuticas

Los anticuerpos anteriores pueden usarse para tratar o efectuar profilaxis de una enfermedad en un paciente que tiene o presenta riesgo de la enfermedad mediada al menos en parte por transtiretina (TTR), y particularmente por formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o de fibrillas de TTR. Aunque no se requiera un entendimiento del mecanismo para la práctica, se cree que ninguno o todos de los siguientes mecanismos pueden contribuir al tratamiento de la amiloidosis de TTR usando los anticuerpos anteriores: inhibición mediada por anticuerpo de la formación de fibrilla y agregación de TTR, estabilización mediada por anticuerpo de conformaciones no tóxicas de TTR (p. ej., formas tetraméricas), o eliminación mediada por anticuerpo de TTR agregada, TTR oligomérica, o TTR monomérica. Los conjugados anticuerpo-fármaco pueden tener mecanismos de acción adicionales determinados por el resto conjugado.

Los anticuerpos se administran en un régimen eficaz que significa una dosificación, vía de administración y frecuencia de administración que retrasa la aparición, reduce la gravedad, inhibe el deterioro adicional y/o mejora al menos un signo o síntoma de un trastorno que se está tratando. Si un paciente ya está sufriendo de un trastorno, el régimen puede referirse como un régimen terapéutico eficaz. Si el paciente está en alto riesgo de contraer el trastorno en relación con la población general, pero aún no está experimentando los síntomas, el régimen puede referirse como un régimen profiláctico eficaz. En algunos casos, la eficacia terapéutica o profiláctica puede observarse en un paciente individual en relación con controles históricos o la experiencia pasada en el mismo paciente. En otros casos, la eficacia terapéutica o profiláctica puede demostrarse en un ensayo preclínico o clínico en una población de pacientes tratados en relación con una población control de pacientes no tratados.

La frecuencia de la administración depende de la semivida del anticuerpo en la circulación, la condición del paciente y la vía de administración entre otros factores. La frecuencia puede ser diaria, semanal, mensual, trimestral o a intervalos irregulares en respuesta a cambios en la condición del paciente o el progreso del trastorno que se está tratando. Una frecuencia ejemplar para la administración intravenosa es entre semanal y trimestral sobre una causa continua de tratamiento, aunque también es posible una dosificación más o menos frecuente. Para la administración subcutánea, una frecuencia de dosificación ejemplar es de diaria a mensual, aunque también es posible una dosificación más o menos frecuente.

El número de dosificaciones administradas depende de si el trastorno es agudo o crónico y de la respuesta del trastorno al tratamiento. Para trastornos agudos o exacerbaciones agudas de un trastorno crónico, entre 1 y 10 dosis son a menudo suficientes. A veces, una sola dosis en bolo, opcionalmente en forma dividida, es suficiente para un trastorno agudo o exacerbación aguda de un trastorno crónico. El tratamiento puede repetirse para la recurrencia de un trastorno agudo o exacerbación aguda. Para los trastornos crónicos, un anticuerpo puede administrarse a intervalos regulares, p. ej., semanal, quincenal, mensual, trimestralmente, cada seis meses durante al menos 1, 5 o 10 años, o durante toda la vida del paciente.

VI. Composiciones Farmacéuticas y Métodos de Uso

En la presente memoria se proporcionan varios usos para diagnosticar, monitorizar, tratar o efectuar profilaxis de enfermedades o afecciones mediadas, al menos en parte, por transtiretina (TTR), y particularmente por formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o de fibrillas de TTR (p. ej., amiloidosis de TTR). Los ejemplos de tales enfermedades incluyen amiloidosis de TTR familiar, tales como la miocardiopatía amiloide familiar (FAC), polineuropatía amiloide familiar (FAP) o amiloidosis selectiva del sistema nervioso central (CNSA), y amiloidosis de TTR esporádicas, tales como amiloidosis sistémica senil (SSA) o amiloidosis cardiaca senil (SCA). Los anticuerpos descritos anteriormente pueden incorporarse en una composición farmacéutica para su uso en tales métodos. En general, un anticuerpo o una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo se administra a un sujeto que lo necesita. Los pacientes susceptibles al tratamiento incluyen individuos en riesgo de amiloidosis de TTR, pero que no muestran síntomas, así como pacientes que actualmente muestran síntomas. Algunos pacientes pueden ser tratados durante el estadio prodrómico de amiloidosis de TTR.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse profilácticamente a individuos que tienen riesgo genético conocido de amiloidosis de TTR. Tales individuos incluyen aquellos que tienen parientes que han experimentado tal enfermedad y aquellos cuyo riesgo se determina mediante el análisis de marcadores genéticos o bioquímicos (p. ej., mutaciones en TTR asociadas con amiloidosis de TTR), incluyendo el uso de los métodos de diagnóstico proporcionados en la presente memoria. Por ejemplo, hay más de 100 mutaciones en el gen que codifica TTR que se han implicado en la amiloidosis de TTR. Véase, p. ej., US 2014/0056904; Saraiva, Hum. Mutat. 17(6):493-503 (2001); Damas y Saraiva, J. Struct. Biol. 130:290-299; Dwulet y Benson, Biochem. Biophys. Res. Commun. 114:657-662 (1983).

Los individuos que padecen amiloidosis de TTR pueden reconocerse algunas veces a partir de las manifestaciones clínicas de amiloidosis de TTR, incluyendo uno o más de los siguientes: (1) historial familiar de enfermedad neuropática, especialmente asociada con insuficiencia cardíaca; (2) dolor neuropático o alteraciones sensoriales progresivas de etiología desconocida; (3) síndrome del túnel carpiano sin causa obvia, particularmente si es bilateral y requiere liberación quirúrgica; (4) trastornos de la motilidad gastrointestinal o disfunción del nervio autonómico de etiología desconocida (p. ej., disfunción eréctil, hipotensión ortostática, vejiga neurogénica); (5) enfermedad cardiaca caracterizada por paredes ventriculares engrosadas en ausencia de hipertensión; (6) bloqueo atrioventricular avanzado de origen desconocido, particularmente cuando está acompañado de un corazón engrosado; y (6) inclusiones del cuerpo vítreo del tipo algodón-lana. Véase, Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). Sin embargo, el diagnóstico definitivo de amiloidosis de TTR se basa normalmente en biopsias de órganos diana, seguido de tinción histológica del tejido extirpado con el colorante específico de amiloide, rojo Congo. Si se observa un ensayo positivo para amiloide, se realiza posteriormente tinción inmunohistoquímica para TTR para asegurar que la proteína precursora responsable de la formación de amiloide es realmente TTR. Para las formas familiares de las enfermedades, la demostración de una mutación en el gen que codifica TTR es entonces necesaria antes de que se pueda hacer el diagnóstico definitivo.

La identificación del sujeto puede ocurrir en un entorno clínico, o en otros lugares, como la casa del sujeto, por ejemplo, mediante el uso de un kit de auto-ensayo propio del sujeto. Por ejemplo, el sujeto puede identificarse sobre la base de diversos síntomas tales como neuropatía periférica (sensorial y motora), neuropatía autonómica, deterioro gastrointestinal, miocardiopatía, nefropatía o deposición ocular. Véase, Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). El sujeto puede también identificarse por los niveles crecientes de formas de TTR no nativas en muestras de plasma del sujeto en comparación con muestras de control, como se describe en los ejemplos.

Según lo justifique el historial familiar, el ensayo genético, o el cribado médico de la amiloidosis de TTR, el tratamiento puede comenzar a cualquier edad (p. ej., 20, 30, 40, 50, 60, o 70 años de edad). El tratamiento normalmente implica dosificaciones múltiples durante un periodo de tiempo y puede monitorizarse por el análisis de las respuestas del anticuerpo o de células T o células B activadas frente a un agente terapéutico (p. ej., una forma truncada de TTR que comprende los residuos de aminoácido 89-97) en el tiempo. Si la respuesta cae, se indica una dosificación de refuerzo.

En las aplicaciones profilácticas, se administra un anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo a un sujeto susceptible de, o de otro modo, en riesgo de contraer una enfermedad (p. ej., amiloidosis de TTR) en un régimen (dosis, frecuencia y vía de administración) eficaz para reducir el riesgo, disminuir la gravedad, o retrasar la aparición de al menos un signo o síntoma de la enfermedad. En las aplicaciones terapéuticas, se administra un anticuerpo o inmunógeno para inducir un anticuerpo a un sujeto que se sospecha que padece, o ya padece, de una enfermedad (p. ej., amiloidosis de TTR) en un régimen (dosis, frecuencia y vía de administración) eficaz para mejorar o al menos inhibir el deterioro adicional de al menos un signo o síntoma de la enfermedad.

Un régimen se considera terapéutica o profilácticamente eficaz si un sujeto tratado individualmente logra un resultado más favorable que el resultado medio en una población de control de sujetos comparables no tratados por métodos descritos en la presente memoria, o si se demuestra un resultado más favorable para un régimen en sujetos tratados frente a los sujetos de control en un ensayo clínico controlado (p. ej., un ensayo fase II, fase II/IN o fase III) o un modelo animal en el nivel p < 0,05 o 0,01 o incluso 0,001.

Puede utilizarse un régimen eficaz de un anticuerpo para, p. ej., inhibir o reducir la agregación de TTR en un sujeto que tiene o está en riesgo de contraer una afección asociada con la acumulación de TTR; inhibir o reducir la formación de fibrillas de TTR en un sujeto que tiene o está en riesgo de contraer una afección asociada con la acumulación de TTR; reducir o eliminar depósitos de TTR o agregados de TTR en un sujeto que tiene o está en riesgo de contraer una afección asociada con la acumulación de TTR; estabilizar las conformaciones no tóxicas de TTR en un sujeto que tiene o está en riesgo de contraer una afección asociada con la acumulación de TTR; inhibir los efectos tóxicos de los agregados, fibrillas o depósitos de TTR en un sujeto que tiene o está en riesgo de contraer una afección asociada con la acumulación de TTR; diagnosticar la presencia o ausencia de acumulación de amiloide de TTR en un tejido que se sospecha que comprende la acumulación de amiloide; determinar un nivel de depósitos de TTR en un sujeto detectando la presencia de anticuerpo unido en el sujeto después de la administración del anticuerpo; detectar la presencia de formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o de fibrillas de TTR en un sujeto; monitorizar y evaluar la eficacia de los agentes terapéuticos que se están utilizando para tratar pacientes diagnosticados con una amiloidosis de TTR; inducir una respuesta inmune que comprende anticuerpos contra TTR en un sujeto; retrasar el inicio de una afección asociada con la acumulación de amiloide de TTR en un sujeto; o tratar o efectuar la profilaxis de una amiloidosis de TTR en un paciente.

Las dosis eficaces varían dependiendo de muchos factores diferentes, tales como medios de administración, sitio diana, estado fisiológico del sujeto, si el sujeto es humano o animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico.

Un rango de dosis ejemplar para anticuerpos puede ser de aproximadamente 0,1-20 o 0,5-5 mg/kg de peso corporal (p. ej., 0,5, 1, 2, 3, 4 o 5 mg/kg) o 10-1.500 mg como dosificación fija. La dosificación depende de la afección del paciente y respuesta al tratamiento previo, si los hubiere, si el tratamiento es profiláctico o terapéutico y si el trastorno es agudo o crónico, entre otros factores.

El anticuerpo puede administrarse en tales dosis diariamente, en días alternados, semanal, quincenal, mensual, trimestralmente o de acuerdo con cualquier otro esquema determinado mediante análisis empírico. Un tratamiento ejemplar implica la administración de dosis múltiples durante un período prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Los regímenes de tratamiento adicionales ejemplares implican la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses.

Los anticuerpos pueden administrarse por una vía periférica. Las vías de administración incluyen tópica, intravenosa, oral, subcutánea, intraarterial, intracraneal, intratecal, intraperitoneal, intranasal o intramuscular. Las vías para la administración de anticuerpos pueden ser intravenosa o subcutánea. La administración intravenosa puede ser, por ejemplo, por infusión durante un periodo tal como 30-90 min. Este tipo de inyección se realiza más normalmente en los músculos del brazo o de las piernas. En algunos usos, los agentes se inyectan directamente en un tejido particular donde los depósitos se han acumulado, por ejemplo, inyección intracraneal.

Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral pueden ser estériles y sustancialmente isotónicas (250-350 mOsm/kg de agua) y fabricadas según las condiciones GMP. Las composiciones farmacéuticas pueden proporcionarse en forma de dosis unitaria (es decir, la dosis para una sola administración). Las composiciones farmacéuticas pueden estar formuladas utilizando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o auxiliares fisiológicamente aceptables. La formulación depende de la vía de administración elegida. Para la inyección, los anticuerpos pueden formularse en soluciones acuosas, p. ej., en tampones fisiológicamente compatibles como la solución de Hank, la solución de Ringer o solución salina fisiológica o tampón de acetato (para reducir las molestias en el sitio de inyección). La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, los anticuerpos pueden estar en forma liofilizada para su constitución con un vehículo adecuado, p. ej., agua estéril exenta de pirógenos, antes de su uso.

Los regímenes pueden administrarse en combinación con otro agente eficaz en el tratamiento o profilaxis de la enfermedad que se está tratando. Tales agentes pueden incluir ARNsi para inhibir la expresión de TTR o Vyndaqel, un estabilizador de TTR en la formación de tetrámero.

Después del tratamiento, la afección del sujeto puede evaluarse para determinar el progreso o la eficacia de tal tratamiento. Tales métodos ensayan preferiblemente los cambios en los niveles de amiloide de TTR o niveles de formas de TTR no nativas. Por ejemplo, los niveles de amiloide de TTR pueden evaluarse para determinar la mejora en relación con los niveles de amiloide de TTR del sujeto en circunstancias comparables antes del tratamiento. Los niveles de amiloide de TTR del sujeto también pueden compararse con poblaciones de control en circunstancias comparables. Las poblaciones de control pueden ser sujetos afectados de forma similar, no tratados o sujetos normales no tratados (entre otros sujetos de control). La mejora con respecto a sujetos afectados de forma similar, no tratados o niveles que se acercan o alcanzan los niveles en sujetos normales no tratados indica una respuesta positiva al tratamiento.

Los niveles de amiloide de TTR se pueden medir mediante una serie de métodos, incluyendo técnicas de imagenología. Los ejemplos de técnicas de imagenología adecuadas incluyen el escaneo PET con TTR o fragmentos de la misma radiomarcados, anticuerpos frente a TTR o fragmentos de la misma, agentes de imagenología amiloides con base en rojo Congo, tales como, p. ej., PIB (US 2011/0008255), péptido p31 de imagenología amiloide (Biodistribution of amyloid-imaging peptide, p31, correlates with amyloid quantitation based on Congo red tissue staining, Wall et al., No. de Resumen 1573, 2011 ISNM Annual Meeting) y otras etiquetas de PET. Los niveles de formas de TTR no nativas se pueden medir, por ejemplo, realizando ensayos de SDS-PAGE/transferencia Western o placas de Meso Scale Discovery con los anticuerpos descritos en la presente memoria en muestras de plasma o muestras de biopsia de un sujeto y comparándolas con muestras de control, como se describe en los ejemplos.

A. Métodos de Diagnóstico y Monitorización

También se proporcionan métodos in vitro para detectar una respuesta inmune contra TTR en un paciente que sufre de o es susceptible de contraer enfermedades asociadas con la deposición de TTR o formas patógenas de TTR (p. ej., formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o de fibrillas de TTR). Los métodos se pueden utilizar para monitorizar un curso de tratamiento terapéutico y profiláctico con los agentes proporcionados en la presente memoria. El perfil de anticuerpos tras la inmunización pasiva por lo general muestra un pico inmediato en la concentración de anticuerpos seguido de un decaimiento exponencial. Sin una dosis adicional, el decaimiento se acerca a loa niveles antes del tratamiento dentro de un período de días a meses, dependiendo de la semivida del anticuerpo administrado. Por ejemplo, la semivida de algunos anticuerpos humanos es del orden de 20 días.

En algunos métodos, se realiza una medición en la línea base del anticuerpo frente a TTR en el sujeto antes de la administración, se hace una segunda medición poco después para determinar el nivel máximo de anticuerpo y se hacen una o más mediciones adicionales a intervalos para monitorizar el decaimiento de los niveles de anticuerpos. Cuando el nivel de anticuerpo ha disminuido hasta la línea de base o un porcentaje predeterminado de del máximo menos la línea base (p. ej., 50%, 25% o 10%), se administra una administración de una dosis adicional de anticuerpo. En algunos métodos, los niveles máximos o posteriores medidos menos el fondo se comparan con los niveles de referencia previamente determinados para constituir un régimen de tratamiento profiláctico o terapéutico beneficioso en otros sujetos. Si el nivel de anticuerpo medido es significativamente menor que un nivel de referencia (p. ej., menor que la media menos una o, preferiblemente, dos desviaciones estándar del valor de referencia en una población de sujetos que se benefician del tratamiento) está indicada la administración de una dosis adicional del anticuerpo.

También se proporcionan métodos in vitro para detectar formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o de fibrillas de TTR en un sujeto, por ejemplo, midiendo amiloide de TTR o formas patógenas de TTR (p. ej., formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o de fibrillas de TTR) en una muestra de un sujeto. Estos métodos son útiles para diagnosticar o confirmar el diagnóstico de enfermedades asociadas a esas formas patógenas de TTR (p. ej., amiloidosis de TTR) o susceptibilidad a las mismas. Los métodos también pueden utilizarse en sujetos asintomáticos. La presencia de formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregada o de fibrillas de TTR indica susceptibilidad a la enfermedad sintomática futura. Los métodos también son útiles para monitorizar la progresión de la enfermedad y/o la respuesta al tratamiento en sujetos que han sido previamente diagnosticados con una amiloidosis de TTR.

Las muestras biológicas obtenidas de un sujeto que tiene, o se sospecha que tiene, o está en riesgo de tener una amiloidosis de TTR pueden ponerse en contacto con los anticuerpos divulgados en la presente memoria para evaluar la presencia de formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas, o de fibrillas de TTR. Por ejemplo, los niveles de formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o de fibrillas de TTR en dichos sujetos pueden compararse con los presentes en sujetos sanos. Alternativamente, los niveles de amiloide TTR o formas patógenas de TTR (p. ej., formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o de fibrillas de TTR) en dichos sujetos que reciben tratamiento para la enfermedad pueden compararse con los de sujetos que no han sido tratados para una amiloidosis de TTR. Algunos de estos ensayos implican una biopsia de tejido obtenida de estos sujetos. Los ensayos de ELISA también pueden ser métodos útiles, por ejemplo, para evaluar niveles de formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas, de fibrillas de TTR en muestras de fluido. Algunos de dichos ensayos ELISA implican anticuerpos anti-TTR que preferiblemente unen formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregada, o de fibrillas de TTR con respecto a las formas tetraméricas de TTR normales.

Los métodos de imagenología in vivo descritos pueden funcionar mediante la administración de un reactivo, tal como un anticuerpo que se une a formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o de fibrillas de TTR en el sujeto, y después detectar el reactivo después de que se haya unido. Tales anticuerpos se unen normalmente a un epítopo en los residuos 89-97 de TTR. Si se desea, la respuesta de eliminación puede evitarse mediante el uso de fragmentos de anticuerpos que carezcan de una región constante de la longitud completa, como Fab. En algunos métodos, puede servir el mismo anticuerpo como reactivo de diagnóstico y tratamiento.

Los reactivos de diagnóstico pueden administrarse por inyección intravenosa en el cuerpo del sujeto, o por otras vías consideradas razonables. La dosis del reactivo debe estar dentro de los mismos rangos que para los métodos de tratamiento. Típicamente, el reactivo está marcado, aunque en algunos métodos, el reactivo principal con afinidad para formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas, o de fibrilla de TTR no está marcado y se utiliza un agente de marcado secundario para unirse al reactivo principal. La elección del marcaje depende de los medios de detección. Por ejemplo, un marcador fluorescente es adecuado para la detección óptica. El uso de marcajes paramagnéticos es adecuado para la detección tomográfica sin intervención quirúrgica. Los marcajes radiactivos también pueden detectarse mediante PET o SPECT.

El diagnóstico se realiza comparando el número, tamaño y/o intensidad de los lugares marcados con los valores línea de base correspondientes. Los valores de línea de base pueden representar los niveles medios en una población de individuos no enfermos. Los valores de línea de base también pueden representar los niveles previos determinados en el mismo sujeto. Por ejemplo, los valores de línea de base pueden determinarse en un sujeto antes del inicio del tratamiento y los valores medidos posteriormente compararse con los valores de línea de base. Una disminución en los valores en relación con la línea de base generalmente indica una respuesta positiva al tratamiento.

IX. Kits

También se describen kits (p. ej., contenedores) que comprenden los anticuerpos 5A1 humanizados divulgados en la presente memoria y materiales relacionados, tales como instrucciones de uso (p. ej., prospecto). Las instrucciones de uso pueden contener, por ejemplo, las instrucciones para la administración de los anticuerpos y opcionalmente uno o más agentes adicionales. Los contenedores de los anticuerpos pueden ser dosis unitarias, envases a granel (p. ej., envases de dosis múltiples) o dosis subunitarias.

El prospecto se refiere a instrucciones que se incluyen habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso de estos productos terapéuticos.

Los kits también pueden incluir un segundo contenedor que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. También puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

X. Otras Aplicaciones

Los anticuerpos pueden usarse para detectar formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas, o de fibrillas de transtiretina (TTR), o fragmentos de la misma, en el contexto del diagnóstico o tratamiento clínico o en la investigación. Por ejemplo, los anticuerpos pueden utilizarse para detectar la presencia de formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas, o de fibrillas de TTR en una muestra biológica como una indicación de que la muestra biológica comprende depósitos amiloides de TTR. La unión de los anticuerpos a la muestra biológica puede compararse a la unión de los anticuerpos a una muestra de control. La muestra biológica y la muestra de control pueden comprender células del mismo origen tisular. Las muestras de control y las muestras biológicas se pueden obtener del mismo individuo o de diferentes individuos y en la misma ocasión o en diferentes ocasiones. Si se desea, múltiples muestras biológicas y múltiples muestras de control se evalúan en múltiples ocasiones para protegerse de la variación aleatoria independiente de las diferencias entre las muestras. Entonces se puede hacer una comparación directa entre la o las muestras biológicas y la o las muestras de control para determinar si la unión del anticuerpo (es decir, la presencia de formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o de fibrillas de TTR) a la o las muestras biológicas aumenta, disminuye o permanece igual en relación con la unión del anticuerpo a lao las muestras de control. El aumento de la unión del anticuerpo a la o las muestras biológicas con respecto a la o las muestras de control indica la presencia de formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o de fibrillas de TTR en la o las muestras biológicas. En algunos casos, el aumento en la unión del anticuerpo es estadísticamente significativa. Opcionalmente, la unión del anticuerpo a la muestra biológica es al menos 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces o 100 veces mayor que la unión del anticuerpo a la muestra de control.

Además, los anticuerpos pueden utilizarse para detectar la presencia de formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas, o de fibrillas de TTR en una muestra biológica para monitorizar y evaluar la eficacia de un agente terapéutico que se está utilizando para tratar a un paciente diagnosticado con una amiloidosis de TTR. Una muestra biológica de un paciente diagnosticado con una amiloidosis de TTR se evalúa para establecer una línea base para la unión de los anticuerpos a la muestra (es decir, una línea de base para la presencia de formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas, o de fibrillas de TTR en la muestra) antes de iniciar la terapia con el agente terapéutico. En algunos casos, se evalúan múltiples muestras biológicas del paciente en múltiples ocasiones para establecer tanto una línea de base como la medida de variación aleatoria independiente de tratamiento. Entonces se administra un agente terapéutico en un régimen. El régimen puede incluir múltiples administraciones del agente durante un período de tiempo. Opcionalmente, la unión de los anticuerpos (es decir, presencia de formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas, o de fibrillas de TTR) se evalúa en múltiples ocasiones en múltiples muestras biológicas del paciente, tanto para establecer una medida de variación aleatoria como para mostrar una tendencia en respuesta a la inmunoterapia. Después, se comparan las diversas evaluaciones de la unión del anticuerpo a las muestras biológicas. Si sólo se realizan dos evaluaciones, es posible hacer una comparación directa entre las dos evaluaciones para determinar si la unión del anticuerpo (es decir, la presencia de formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas, o de fibrillas de TTR) ha aumentado, disminuido o sigue siendo la misma entre las dos evaluaciones. Si se realizan más de dos mediciones, las mediciones se pueden analizar en un curso de tiempo comenzando antes del tratamiento con el agente terapéutico y procediendo a través del curso de la terapia. En pacientes para los cuales se ha reducido la unión del anticuerpo a muestras biológicas (es decir, la presencia de formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o de fibrillas de TTR), puede concluirse que el agente terapéutico era eficaz en el tratamiento de la amiloidosis de TTR en el paciente. La disminución de la unión del anticuerpo puede ser estadísticamente significativa. Opcionalmente, la unión disminuye al menos en un 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%. La evaluación de la unión del anticuerpo puede realizarse conjuntamente con la evaluación de otros signos y síntomas de amiloidosis de TTR.

Los anticuerpos también pueden utilizarse como reactivos de investigación para la investigación de laboratorio en la detección de formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o de fibrillas de TTR, o fragmentos de las mismas. En tales usos, los anticuerpos pueden marcarse con moléculas fluorescentes, moléculas marcadas con espín, enzimas o radioisótopos, y pueden proporcionarse en forma de kit con todos los reactivos necesarios para realizar el ensayo de detección. Los anticuerpos también pueden utilizarse para purificar las formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas, o de fibrillas de TTR, o los compañeros de unión de formas monoméricas, plegadas erróneamente, agregadas o de fibrillas de TTR, p. ej., mediante cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos también pueden utilizarse para inhibir o reducir la agregación de TTR, inhibir o reducir la formación de fibrillas de TTR, reducir o eliminar los depósitos de TTR o agregados de TTR o estabilizar las conformaciones no tóxicas de TTR en una muestra biológica. La muestra biológica puede comprender, por ejemplo, sangre, suero, plasma o tejido (p. ej., tejido de corazón, sistema nervioso periférico, sistema nervioso autónomo, riñones, ojos o tracto gastrointestinal). En algunos casos, la agregación de TTR, formación de fibrillas de TTR o depósitos de TTR son inhibidos o reducidos al menos en un 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% o 75%, (p. ej., un 10% - 75% o 30% -70%). Los ensayos para la detección de la formación de fibrillas se describen en otra parte en la presente memoria. Véase también US 2014/0056904.

Si se asocian diferentes versiones de una secuencia con un número de acceso en diferentes momentos, se quiere decir la versión asociada con el número de acceso en la fecha de presentación efectiva de esta solicitud. La fecha de presentación efectiva significa lo que ocurra antes de la fecha de presentación real o la fecha de presentación de una solicitud de prioridad que se refiere al número de acceso si es aplicable. Asimismo, si se publican diferentes versiones de una publicación, sitio web o similares en diferentes momentos, se quiere decir la versión publicada más recientemente en la fecha de presentación efectiva de la solicitud a menos que se indique lo contrario. Cualquier característica, etapa, elemento, realización o aspecto de la invención puede utilizarse en combinación con cualquier otro a menos que se indique específicamente lo contrario. Aunque la presente invención se ha descrito con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad y comprensión, será evidente que se pueden llevar a la práctica ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1. Identificación de los Anticuerpos Monoclonales mis-TTR

Los anticuerpos monoclonales específicos de conformación contra formas monoméricas, plegadas erróneamente, de fibrilla, o agregadas de TTR (mis-TTR) fueron generados, cribados, expresados, y purificados como se describe en Materiales y Métodos (a-d). Con el fin de generar anticuerpos monoclonales mis-TTR, la estructura de cristal de TTR tetramérica humana fue examinada para encontrar regiones de la proteína que están enterradas en el tetrámero, pero expuestas después de la disociación del tetrámero en sus subunidades monoméricas. La región identificada fueron los residuos 89-97 (EHAEVVFTA) (SEQ ID NO: 35) ubicada dentro de la cadena F de TTR y secuestrados en la interfaz del dímero de la proteína tetramérica. Una búsqueda BLAST de la base de datos de proteínas no reveló ninguna otra proteína humana que posea esta secuencia.

Se sintetizó un péptido que comprende esta secuencia (ggEHAEVVFTAggkg) (SEQ ID NO: 36). Las letras mayúsculas representan los residuos 89-97 de TTR. Las letras minúsculas representan residuos de conector adicionales añadidos para aumentar la solubilidad del péptido antigénico y para establecer el fragmento de 9 aminoácidos como una secuencia interna. Este péptido se unió a un núcleo dendrítico poli-lisina, generando un inmunógeno de péptido antigénico múltiple (TTR-MAP) que comprende un núcleo de residuos de lisina con múltiples ramas unidas al péptido de TTR 89-97. Los anticuerpos enumerados en la Tabla 2 se generaron contra TTR-MAP. Además de este péptido antigénico múltiple, se generaron otros dos inmunógenos que contienen el mismo fragmento de TTR mediante la unión covalente de péptidos similares 89-97 de TTR (AccggEHAEVVFTA-amida (SEQ ID NO: 37) y Ac-EHAEVVFTAcgg-amida) (SEQ ID NO: 38) a través de los residuos de cisteína N y C-terminales a hemocianina de lapa (TTR89-97-N-KLH y TTR89-97-C-KLH).

Después de la generación, cribado, expresión y purificación de los anticuerpos, se determinaron los parámetros cinéticos de la unión detallados (tasa de asociación (ka), tasa de disociación (kd) y constante de la afinidad de unión (KD)) para los anticuerpos mis-TTR principales por Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) para TTR F87M/L110M recombinante humano, como se muestra en la Tabla 2. Se inmovilizó anti-IgG de ratón (GE Healthcare) en un chip sensor C5 (falta de cadenas de dextrano) por medio de un acoplamiento de amina siguiendo las instrucciones proporcionadas en el kit anti-ratón de GE Healthcare y los mAb mis-TTR se capturaron a un nivel para asegurar una máxima unión de analito de 30-50 RU. Las diferentes concentraciones de analito (TTR F87M/L110M recombinante humano) se pasaron por el ligando capturado a 30 pl/min en tampón de operación (HBS P-20 al 0,05%, 1 mg/mL de BSA) en diluciones de 3 veces. Para cada concentración, la reacción procedió durante un marco de tiempo para las mayores concentraciones de analito para alcanzar el equilibrio durante la asociación, así como al menos un 10% de descomposición de la señal durante la disociación. Al menos una concentración (no la mayor ni la menor) se ejecutó en duplicado. Los rangos de concentración del analito se seleccionaron sobre la base de la experimentación preliminar para abarcar al menos 10 veces por encima de la K^d a 10 veces por debajo de la K^d.

Los resultados del análisis de SPR de los mAb mis-TTR principales se muestra en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2

Análisis de SPR de Anticuerpos mis-TTR Principales que se Unen a TTR Humana (F87M/L110M)

Ejemplo 2. Unión de anticuerpos mis-TTR al antígeno de TTR

Se ensayaron cuatro mAb mis-TTR principales (9D5, 14G8, 6C1, y 5A1) por ELISA a concentraciones que iban de 0,31 a 2,5 pg/ml usando tanto la TTR tratada a pH 4,0 (pH4-TTR) y TTR nativa como el antígeno de recubrimiento. La preparación del antígeno de TTR y los protocolos de ELISA se describen en otra parte en Materiales y Métodos (e-g).

Las curvas de unión resultantes y los valores de Kd y Bmáx tabulados se muestran en la Figura 3 y la Tabla 3 a continuación. Los resultados en la Figura 3 se presentan en unidades arbitrarias (u.a.) en el eje y. Todos los mAb mostraron una unión significativa a pH4-TTR con valores de Kd que iban de 16 nM (6C1) a 282 nM (9D5). Los valores de Bmáx para la unión a pH4-TTR variaron de tan bajo como 0,65 u.a. (14G8) a tan alto como 2,02 (9D5). En contraste con la unión a pH4-TTR, ninguno de los anticuerpos mostró una unión significativa a TTR nativa, lo que indica que todos los anticuerpos de TTR generados fueron específicos para formas no nativas de TTR.

Tabla 3

Análisis por ELISA de los Anticuerpos mis-TTR Principales que se Unen a pH4-TTR

Ejemplo 3. Análisis de los Anticuerpos mis-TTR por SDS-PAGE y PAGE Nativa

Se analizaron 9D5 y 14G8 por SDS-PAGE/Western para demostrar la especificidad de unión hacia formas monoméricas/desnaturalizadas de TTR frente a TTR nativa, no desnaturalizada. Los protocolos de SDS-PAGE, PAGE Nativa y Transferencia Western se describen en otra parte en los Métodos y Materiales (h-j).

La TTR no desnaturalizada o pH4-TTR se corrió en un gel de SDS-PAGE junto a TTR desnaturalizada por calor y pH4-TTR desnaturalizada por calor. Después de la electroforesis, el gel se sometió a transferencia Western en nitrocelulosa y se tiñó con mAb de TTR 9D5 y 14G8. Ambos anticuerpos solo reconocieron TTR cuando se trató a pH4 o cuando TTR o pH4-TTR se desnaturalizaron primero por calor antes de la SDS-PAGE. Estos 9D5 y 14G8 por lo tanto muestran una especificidad para los confórmeros de TTR generados ya sea por la desnaturalización de TTR o por el tratamiento de tTr a pH4.

También se analizaron 6C1 y 5A1 junto con el total de mAb de TTR (7G7, 8C3) y el anticuerpo policlonal comercialmente disponible en Sigma por SDS-PAGE/Western. Cada transferencia contenía marcadores de peso molecular teñidos, TTR no desnaturalizada, y pH4-TTR.

El gel de SDS-PAGE teñido mostró que las principales especies presentes en la muestra de TTR no desnaturalizada fue un dímero de ~38 kDa. En contraste, el principal componente presente en la muestra de pH4-TTR funcionó como un dímero de ~35kDa con una pequeña cantidad de dímero de un monómero de ~15kDa. Este dímero se comportó como una proteína ligeramente más pequeña que el dímero presente en la muestra de TTR no desnaturalizada, lo que indica una diferencia conformacional entre estas dos especies de dímero de TTR.

Las transferencias western de TTR y pH4-TTR usando los cuatro anticuerpos de mis-TTR mostraron que estos mAb no reconocían la TTR no desnaturalizada, pero se unían tanto al monómero desnaturalizado como al dímero presente en la muestra de pH4-TTR. De este modo, los cuatro mAb mis-TTR (9D5, 14G8, 6C1 y 5A1) muestran especificidades similares para las conformaciones no nativas de TTR cuando se analizan mediante SDS-PAGE/Western.

En contraste con los cuatro mAb mis-TTR, los dos mAb de control de TTR, 7G7 y 8C3 generados a través de la inmunización de ratones con TTR intacta, reconocieron todas las especies de TTR presentes en las muestras de TTR y pH4-TTR, incluyendo especies de TTR tetraméricas. Así, a diferencia de los mAb mis-TTR, estos mAb de control se unen a TTR, pero sin ninguna especificidad conformacional. El anticuerpo policlonal de Sigma se comportó de manera similar a los mAb de control 7G7 y 8C3.

La TTR y pH4-TTR también se operaron en un gel nativo para ver si los cuatro mAb de mis-TTR eran capaces de mostrar la especificidad de la conformación bajo condiciones de gel no desnaturalizantes. En gel de PAG^e nativo teñido, la TTR se comportó como un dímero nativo de ~35 kDa con una pequeña cantidad de tetrámero. Por el contrario, pH4-TTR se comportó principalmente como una muestra de alto peso molecular con una cantidad traza del dímero de ~35 kDa. El anticuerpo policlonal no específico de Sigma reconoció todas las especies de TTR presentes tanto la muestra de TTR como de pH4-TTR. En contraste, 9D5 sólo reconoció las especies de TTR de alto peso molecular presentes en la muestra de pH4-TTR. Como se observa en el estudio de SDS-PAGE/Western, 9D5 no reconoció ninguna de las especies de TTR nativas.

Los cuatro mAb mis-TTR fueron analizados posteriormente por PAGE nativa/transferencia Western. Como se esperaba y de manera similar a 9D5, los otros mAb de mis-TTR, 14G8, 6C1, y 5A1, se unieron específicamente a las formas no nativas de alto peso molecular de la TTR presentes en la muestra de pH4-TTR. Ninguno de estos anticuerpos reconoció el dímero de TTR nativo de ~35 kDa. Estos resultados indican que los cuatro mAb de mis-TTR se comportaron de manera similar y reconocieron sólo las especies de TTR no nativas que son conformacionalmente distintas de la TTR nativa.

Ejemplo 4. Inhibición de la Formación de Fibras de TTR por los Anticuerpos de mis-TTR

TTR-Y78F es una variante de la TTR que contiene una mutación puntual en la posición 78 en la secuencia de la proteína que desestabiliza el tetrámero de TTR. Con el tiempo y bajo condiciones ligeramente ácidas, esta variante de la TTR se disocia en sus subunidades monoméricas que luego pueden pasar a agregado y formar fibras capaces de unirse a tioflavina-T. Así, el grado de formación de fibras puede monitorizarse midiendo la fluorescencia de la tioflavina-T a 480nm. La introducción de un anticuerpo de mis-TTR específico de los monómeros o agregados de TTR disociados impediría que el ensamblaje de fibras de TTR diera lugar a una disminución de la fluorescencia de tioflavina-T en relación a una reacción de control sin anticuerpo. Los protocolos para examinar la inhibición de la formación fibras de TTR se describen en otra parte en los Materiales y Métodos (k).

Los cuatro anticuerpos mis-TTR inhibieron fuertemente la formación de fibras de TTR-Y78F reactivas con tioflavina-T con respecto al control de isotipo (los resultados se muestran en la Figura 4 y se presentan en unidades arbitrarias (u.a.) en el eje y). El anticuerpo 5A1 de mis-TTR inhibió casi por completo la formación de fibras. Estos resultados son consistentes con la idea de que los anticuerpos de mis-TTR se unen a formas monoméricas y/o agregadas de TTR, impidiendo así la formación de fibras de TTR.

La Tabla 4 resume los datos de caracterización obtenidos para el conjunto de 4 anticuerpos de mis-TTR (9D5, 14G8, 6C1, y 5A1) que mostraron una buena selectividad conformacional para formas no nativas de TTR. Estos anticuerpos tuvieron afinidades (K^d) para pH4-TTR que iban de 14,5 nM (6C1) a 257 nM (9D5) y valores de Bmáx que iban de 0,65 u.a. (14G8) a 2,02 (9D5). Ninguno de estos anticuerpos reconoció la TTR nativa, pero se unieron a pH4-TTR en un SDS-PAGE/Western y a los agregados de TTR de alto peso molecular en una PAGE nativa/Western. Estos anticuerpos también inhibieron la formación de fibrillas de ^tT^r en el ensayo de formación de fibrillas utilizando Tio-T como la lectura.

Tabla 4

TTR-V122I es una variante de la TTR que contiene una sola mutación puntual en la posición 122 que desestabiliza el tetrámero. La formación de fibrillas se asoció con un aumento fluorescencia de ThT. El incremento de las concentraciones del mAb 14G8 causó una disminución monotónica en la fluorescencia de ThT lo que indica una inhibición subestequiométrica de la fibrilación de TTR (CI⁵⁰=0,028±0,009 mg/mL; n=3; Figura 4B y Tabla 4a). El mAb de control de isotipo no causó ninguna inhibición de la fibrilación de TTR (Figura 4C), demostrando así la especificidad de la inhibición mediada por 14G8.

Los valores de CI⁵⁰ subestequiométricos comparables determinados para 5A1 y 6C1 (Tabla 4a) sugirieron mecanismos análogos de la inhibición de fibrillas para cada uno de estos mAb de mis-TTR. En contraste, 9D5 inesperadamente no inhibió la formación de fibrillas de TTR-V122I, a pesar de que muestra una especificidad y afinidad similares para TTR no nativa. Queda por explorar si 9D5 es más sensible a las condiciones de ensayo utilizadas.

Tabla 4a

Ejemplo 5. Caracterización Inmunohistoquímica (IHC) del tejido de ATTR Tisular Usando mAb de mis-TTR

Los mAb de mis-TTR principales incitados frente al fragmento de TTR 89-97 de la proteína de transtiretina fueron ensayados inmunohistoquímicamente en tejido fresco congelado y tejido procesado con parafina de pacientes confirmados con amiloidosis cardíaca de TTR. Los protocolos para obtener y preparar las muestras de tejido cardíaco, inmunohistoquímica (IHC) y análisis de imagen, se proporcionan en otro lugar en los Materiales y Métodos (l-o). Los anticuerpos utilizados para IHC se describen en la Tabla 5.

Tabla 5

Anticuerpos Utilizados para la Caracterización por Inmunohistoquímica

Se obtuvieron muestras de tejido cardíaco de pacientes con diagnóstico confirmado de mutaciones de ATTR. Las características demográficas de casos examinados inmunohistoquímicamente fueron como sigue y se resumen en la Tabla 6: FAC = cardiomiopatía amiloidótica familiar; FAP = polineuropatía amiloidótica familiar; 1o AL = amiloidosis de cadena ligera; ATTR = amiloidosis mediada por transtiretina; Desc. = desconocido.

Tabla 6

Tinción Inmunohistoquímica de las Muestras de Tejido Cardíaco con Anticuerpos mis-TTR

Los anticuerpos monoclonales de ratón (mAb de mis-TTR) incitados frente al fragmento 89-97 de la proteína transtiretina fueron ensayados inmunohistoquímicamente en tejido fresco congelado y procesado con parafina de pacientes con amiloidosis cardíaca de TTR confirmada. Cada anticuerpo mis-TTR mostró inmunorreactividad en el tejido cardiaco ATTR. La tinción obscura se observó en depósitos a lo largo del miocardio y la vasculatura. Cuando se comparó la inmunorreactividad con la tinción con rojo Congo de Tioflavina-T, la mayoría de la inmunorreactividad en el tejido mostró alta congruencia con birrefringencia de rojo Congo y tinción positiva de Tioflavina-T. Esto confirma la naturaleza de lámina beta plisada del amiloide de TTR depositado en este tejido. Estos anticuerpos mis-TTR también detectaron TTR pre-amiloide, que se localizó en áreas del miocardio que eran inmunopositivas para TTR, pero negativas para rojo Congo o Tioflavina-T. Tanto las secciones de omisión del anticuerpo primario como el anticuerpo de control de isotipo IgG fueron negativas para la tinción a lo largo de todos los tejidos ensayados. Los anticuerpos reactivos hacia otras proteínas amiloidogénicas (cadenas ligeras lambda y kappa o amiloide A) no fueron reactivos hacia el tejido cardíaco ATTR utilizado en este análisis, indicando que los depósitos tenían una naturaleza específicamente de TTR.

El patrón de tinción de anticuerpos de mis-TTR se comparó con el obtenido con un anticuerpo de referencia comercial bien caracterizado de TTR (prealbúmina, A0002; Dako; Carpinteria, CA). El anticuerpo de referencia DAKO tiñó el miocardio enfermo en las mismas áreas que los anticuerpos de mis-TTR, pero produjo un patrón de tinción más difuso. El anticuerpo de referencia DAKO no tiñó los depósitos de amiloide de TTR congofílicos presentes en la vasculatura tan fuertemente como los anticuerpos de mis-TTR.

Los anticuerpos de mis-TTR no tiñeron el tejido normal, sin enfermedad. Además, como era de esperar, la tinción con un anticuerpo de control de isotipo, 6F10 también fue negativa.

Para determinar si la reactividad de los anticuerpos de mis-TTR era específica para los depósitos de TTR, se examinó la reactividad cruzada de estos anticuerpos hacia el tejido cardíaco derivado de pacientes diagnosticados con amiloidosis AL primaria. Como se esperaba, no se observó ninguna tinción de tejido amiloide de AL, confirmando que los anticuerpos de TTR reaccionan específicamente hacia tejidos enfermos por ATTR.

El tejido cardíaco de los pacientes con un diagnóstico confirmado de amiloidosis sistémica senil o de pacientes con FAC, o FAP confirmado provocado por mutaciones puntuales en el gen de TTR también se tiñó positivamente con 14G8, 9D5, 6C1, y 5A1. Estos resultados indican que los anticuerpos de mis-TTR tienen la capacidad de reconocer los depósitos de TTR en tejido cardíaco sin importar el genotipo de ATTR.

Otros tejidos no cardíacos conocidos por expresar TTR también fueron examinados para determinar la tinción por 14G8, 9D5, 6C1, y 5A1 y se compararon con la tinción obtenida usando el anticuerpo de referencia DAKO. Como era de esperar, el hígado, páncreas y plexo coroideo se tiñeron positivamente para TTR usando el anticuerpo de referencia Dako. Por el contrario, los anticuerpos de mis-TTR sólo tiñeron las células pancreáticas alfa localizadas en los islotes de Langerhans y el plexo coroideo, sugiriendo que algo de la TTR localizada en estos órganos es conformacionalmente distinta de la TTR expresada en el hígado. La carencia de inmunorreactividad del mAb de mis-TTR en el hígado sugiere que la gran cantidad de TTR expresada allí es principalmente TTR nativa, tetramérica y no tiene el epítopo de mis-TTR expuesto.

Ejemplo 6. Análisis de ATTR frente a Plasma Humano Normal por SDS-PAGE/Transferencia Western y por Ensayo en Placa de Meso Scale Discovery (MSD)

Se obtuvieron seis muestras de plasma de pacientes confirmados para V30M ATTR (Muestra no. 21, no. 22, no. 23, no. 24, no. 25, no. 27) y 6 muestras (Muestra no. 11, no. 12, no. 15, no. 18, no. 19, no. 20) de sujetos normales de M. Saraiva (Universidad de Porto, Portugal). La muestra no. C6 fue una muestra de suero humano normal obtenida de una fuente comercial (BioreclamationIVT). Las muestras se analizaron por SDS-PAGE y transferencia Western, o por ensayo en Placa MesoScale Discovery (MSD). Los protocolos para estos ensayos se describen en otra parte en los Materiales y Métodos (p-r). Se generó una curva estándar para el Ensayo en Placa de MSD usando 6C1.

En las transferencias Western resultantes usando los mAb de mis-TTR 9D5 o 5A1, las diferencias entre las muestras de plasma enfermas de TTR-V30M y normales eran evidentes. Todas las muestras de plasma contenían una banda de TTR de ~14 kDa que migró conjuntamente con el monómero de TTR no nativo presente en la muestra de referencia de pH4-TTR. En general, las muestras de plasma derivadas de los pacientes con TTR-V30M (no. 21, 22, 23, 24, 25, y 27) tenían más de esta especie de mis-TTR. Además, las muestras de plasma derivadas de pacientes con V30M también contenían una banda de ~30kDa que migró conjuntamente con el dímero de la TTR no nativo presente en la muestra de referencia. Con la excepción de las muestras no. 12 y no. 18, las muestras de plasma derivadas de individuos normales poseían menos de esta especie de dímero.

Las transferencias Western resultantes se escanearon y las intensidades de las bandas de monómero y dímero de TTR reactivas con 5A1 o 9D5 se representaron gráficamente para cada muestra (los resultados se muestran en la Figura 5A (9D5) y 5B (5A1) y se presentaron en unidades arbitrarias (u.a.) en el eje y). Con la excepción de las muestras de plasma no. 15 y no. 18, las muestras de plasma derivadas de individuos normales (11, 12, 19 y 20) contenían menos monómeros y dímeros reactivos con 9D5 que las muestras derivadas de pacientes con V30M (21­ 25 y 27).

Las 12 muestras de suero analizadas por transferencia Western con 9D5 y 5A1 también fueron analizadas por ensayo en placa MSD usando 6C1 como el anticuerpo de captura de mis-TTR y el anticuerpo Dako con etiqueta sulfo como el anticuerpo de detección. Los resultados para estos ensayos de MSD se muestran en la Figura 6 y se presentan en unidades arbitrarias (u.a.) en el eje y. Las muestras 11, 12, 15, 18, 19 y 20 representan el plasma normal. Las muestras 21-25 y 27 representan plasma enfermo con V30M. Con la excepción de las muestras de plasma no. 15 y no. 18, la cantidad de TTR reactiva con 6C1 presente en las muestras de plasma derivadas de los individuos normales fue menor que la observada en el plasma de individuos enfermos con TTR-V30M. Los niveles de la reactividad de 6C1 medidos por ensayo MSD se correlacionaron muy bien con la cantidad de dímero y monómero reactivo con 9D5 observada anteriormente por SDS-PAGE/Western.

Con el fin de determinar la concentración de las especies de TTR reactivas presentes en las muestras de plasma, las mismas muestras fueron nuevamente ensayadas usando 6C1 como el anticuerpo de captura y 8C3 con etiqueta Sulfo como el anticuerpo de detección. Las señales de MSD fueron convertidas a concentraciones en ng/ml de las especies de TTR reactivas usando la curva estándar de TTR F87M/L110M generada anteriormente. Sobre la base de este análisis, el promedio de concentración de TTR reactiva con 6C1 presente en las muestras de control fue de 271 /- 185 ng/ml. En contraste, el promedio de concentración de TTR reactiva presente en las muestras de plasma enfermo con V30M fue mayor, a 331 /- 95 ng/ml. En conjunto, estos resultados de MSD sugieren que los anticuerpos de mis-TTR son capaces de distinguir entre el plasma normal frente a con enfermedad ATTR. Esto garantiza el desarrollo adicional de anticuerpos de mis-TTR para su uso en ensayos de diagnóstico de la enfermedad ATTR.

Ejemplo 7. Diseño de Anticuerpos 5A1 Humanizados

El punto de partida o anticuerpo donante para la humanización fue el anticuerpo de ratón 5A1. La secuencia de aminoácidos variable de cadena pesada de m5A1 maduro se proporciona como SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos variable de cadena ligera de m5A1 maduro se proporciona como SEQ ID NO: 9. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada se proporcionan como SEQ ID NO: 6, 7 y 8 respectivamente (como se define por Kabat). Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera se proporcionan como SEQ ID NO: 14, 15 y 17, respectivamente (como se define por Kabat). La numeración de Kabat se utiliza en todo este Ejemplo.

La kappa variable (Vk) de m5A1 pertenece al subgrupo 1 de Kabat de ratón, que corresponde al subgrupo 4 de Kabat humano. La cadena variable (Vh) de m5A1 pertenece al subgrupo 3d de Kabat de ratón, que corresponde al subgrupo 3 de Kabat. Véase, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición.

Publicación del NIH No. 91-3242, 1991. La CDR-L1 de 11 residuos pertenece a la clase canónica 2, la CDR-L2 de 7 residuos pertenece a la clase canónica 1 y la CDR-L3 de 9 residuos pertenece a la clase canónica 1 en Vk. Véase, Martin y Thornton, J. Mol. Biol. 263:800-15, 1996. La CDR-H1 de 10 residuos (compuesto de CDR-H1 de Chothia y Kabat, residuos 26-35 de la Tabla 7) pertenece a la clase canónica 1, y la CDR-H2 de 17 residuos pertenece a la clase canónica 1. Véase, Martin y Thornton, J Mol. Biol. 263:800-15, 1996. La CDR-H3 no tiene clases canónicas.

Los residuos en el interfaz entre los dominios Vk y Vh son los que se encuentran comúnmente, excepto que 93V en la cadena pesada normalmente es una alanina.

Se realizó una búsqueda sobre las secuencias de la proteína en la base de datos de PDB (Deshpande et al., Nucleic Acids Res. 33: D233-7, 2005) para encontrar estructuras que proporcionarían un modelo estructural aproximado de 5A1. La estructura cristalina del fab de anticuerpo (pdb código 3IU4) (Talavera et al, 2002) fue utilizada para la estructura de Vk puesto que tenía buena resolución (1,75A), similitud de secuencia total con Vk de 5A1 y retenía la misma estructura canónica para el bucle como 5A1. Un anticuerpo dimérico (pdb código 3LS4) (Niemi et al, 2003) se usó para la estructura de Vh ya que tenía buena similitud y resolución (2,0A) y contenía las mismas estructuras canónicas para CDR-H1 y CDR-H2 como la de VH de 5A1. Se usó el software BioLuminate (bajo licencia de Schrodinger Inc.) para modelar una estructura aproximada de 5A1.

Una búsqueda de las bases de datos de la secuencia de proteína no redundante de NCBI permitió la selección de marcos humanos adecuados en los que injertar las CDR murinas. Para Vh, se eligió AGP01680.1 de cadena pesada de Ig humana (GI: 519674190) (SEQ ID NO: 3) (Bowers et al, 2013). Comparte las formas canónicas de 5A1. Para Vk, se eligió una cadena ligera kappa humana con código de acceso de ⁿC^b I BAH04766 (GI: 219566573) (SEQ ID NO: 11) (Kurosawa et al, 2007). Tiene las mismas clases canónicas para CDR-L1 y L2 que el Vk parental.

Se construyeron dos variantes de región variable de cadena pesada humanizada y dos variantes de región variable de cadena ligera humanizada que contenían diferentes permutaciones de sustituciones (Hu5A1VHv1-2 (SEQ ID NOs: 4 y 5, respectivamente) y Hu5A1VLv1-2 (SEQ ID NOs: 12 y 13, respectivamente)) (Tablas 7 y 8). Los diseños de Vh y Vk humanizados ejemplares, con retromutaciones y otras mutaciones basadas en marcos humanos seleccionados, se muestran en las Tablas 7 y 8, respectivamente. Las áreas sombreadas de gris en la primera columna en las Tablas 7 y 8 indican las CDR definidas por Chothia, y las áreas sombreadas de gris en las columnas restantes en las Tablas 7 y 8 indican las CDR definidas por Kabat. Las SEQ ID NO: 4, 5, 12 y 13 contienen retromutaciones y otras mutaciones como se muestra en la Tabla 9. Los aminoácidos en las posiciones L55, L85, H29 y H93 en Hu5A1VHv1-2 y Hu5A1VLv1-2 se enumeran en la Tabla 10.

Tabla 7

Regiones Vh de 5A1 Humanizadas

Tabla 7

Regiones Vh de 5A1 Humanizadas

Tabla 7

R e g io ne s Vh de 5A1 H u m an izad as

______________ ______ _______ _____________ Tabla 7

R e g io ne s Vh de 5A1 H u m an izad as

Tabla 8

Regiones Vk de 5A1 Humanizadas

Tabla 8

R e g io ne s V k de 5A1 H u m an izad as

Tabla 8

R e g io ne s V k de 5A1 H u m a n iza d a s

Tabla 8

R e g io ne s V k de 5A1 H u m an izad as

Tabla 9

Tabla 10

Numeración de Kabat de Residuos Marco y de CDR de Kabat para Retromutaciones y Otras Mutaciones en Anticuerpos 5A1 Humanizados

Una alineación de la secuencia de Vh de 5A1 murino (SEQ ID NO: 1) con la secuencia del modelo de ratón (3LS4_H_St.pro; SEQ ID NO: 2), la secuencia aceptora humana (AGP01680; SEQ ID NO: 3) y las secuencias de Hu5A1VHv1 y Hu5A1VHv2 (SeQ ID NOs: 4 y 5, respectivamente), se muestra en la Figura 1. Las regiones de CDR, tal como se definen por Kabat, están sombreadas. Las posiciones en las que los residuos canónicos, vernier, o interfaz difieren entre las secuencias aceptoras de ratón y humanas son candidatas para la sustitución. Los ejemplos de residuos de cimentación de vernier/CDR incluyen los residuos de Kabat 2, 49, 69, 71, 75, 78 y 94 en la Tabla 7. Los ejemplos de residuos de interacción canónica/CDR incluyen los residuos de Kabat 24, 48 y 73 en la Tabla 7. Los ejemplos de residuos de interfaz/empaquetamiento (VH VL) incluyen los residuos de Kabat 37, 39, 45, 47, 91, 93 y 103 en la Tabla 7.

Una alineación de la secuencia de Vk de 5A1 murino (SEQ ID NO: 9) con la secuencia del modelo de ratón (3IU4_L_St.pro; SEQ ID NO: 10), la secuencia aceptora humana (BAH04766; SEQ ID NO: 11) y las secuencias de Hu5A1VLv1 y Hu5A1VLv2 (S^eQ ID NOs: 12 y 13, respectivamente), se muestra en la Figura 2. Las regiones de CDR, tal como se definen por Kabat, están sombreadas. Las posiciones en las que los residuos canónicos, vernier, o interfaz difieren entre las secuencias aceptoras de ratón y humanas son candidatas para la sustitución. Los ejemplos de residuos de cimentación de vernier/CDR incluyen los residuos de Kabat 4, 35, 46, 49, 66, 68 y 69 en la Tabla 8. Los ejemplos de residuos de interacción canónica/CDR incluyen los residuos de Kabat 2, 48, 64 y 71 en la Tabla 8. Los ejemplos de residuos de interfaz/empaquetamiento (VH VL) incluyen los residuos de Kabat 39, 44, 47, 87 y 98 en la Tabla 8.

Las bases racionales para la selección de las posiciones anteriores como candidatas para la sustitución son las siguientes.

C55S: Cys es inusual en esta posición en anticuerpos humanos. Ser puede retener la afinidad de unión con potencial reducido de inmunogenicidad. Esta sustitución no es una retromutación sino más bien una sustitución de un residuo humano raro en una posición por uno más común.

T85V: Aunque no se espera que la posición 85 sea importante para la unión, Thr en esta posición es menos común que el residuo de ratón Val en anticuerpos humanos, por lo que la sustitución de T por V debería disminuir el potencial de inmunogenicidad sin afectar la unión.

V29F: Este residuo fue retromutado porque reside en la CDR de Chothia.

A93V: Este residuo contribuye a la interfaz de VH-VL. Debido a que los residuos aceptores y donantes difieren en esta posición, se realizó una retromutación A V en el diseño humanizado de VHv1.

Las dos variantes de región variable de cadena ligera humanizada y dos variantes de región variable de cadena pesada humanizadas son las siguientes:

Hu5A1VL versión 1 (substitución T85V en minúsculas):

D I V M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C K A S Q D V S T T V A W Y Q Q K P G K A P K L L I Y S A S Y R C T G V P S R F S G S G S G T D F T L T IS S L Q P E D F A v Y Y C Q Q H Y S T P L T F G G G T K V E IK (S E Q ID NO: 12) Hu5A1VL versión 2 (substituciones C55S y T85V en minúsculas):

D IV M T Q S P S S L S A S V G D R V T IT C K A S Q D V S T T V A W Y Q Q K P G K A P K L L IY S A S Y R sT G V P S R F S G S G S G T D F T L T IS S L O P E D F A v Y Y C O O H Y S T P L T F G G G T K V E IK (S E O ID NO: 13) Hu5A1VH versión 1 (retromutaciones V29F y A93V en minúsculas):

E V Q L V E S G G G L I Q P G G S L R L S C A A S G F T fS N Y A M S W V R Q A P G K G L E W V S S I S S G G S T Y Y P D S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C v R Y Y Y G Q Y F D F W G Q G T L V T V S S (S E Q ID N O :4)

Hu5A1VH versión 2 (retromutación V29F en minúsculas):

E V Q L V E S G G G L IQ P G G S L R L S C A A S G F T fS N Y A M S W V R Q A P G K G L E W V S S IS S G G S T Y Y

P D S V K G R F T IS R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A R Y Y Y G Q Y F D F W G Q G T L V T V S S

(SE O ID N O :5)

Ejemplo 8. Análisis Cinético de Unión de los Anticuerpos 5A1 Humanizados

La cinética de unión de los anticuerpos 5A1 humanizados que comprenden una cadena pesada seleccionada de la versión 2 y una cadena ligera seleccionada de la versión 2 se caracterizaron por Biacore.

Ejemplo 9. Materiales y Métodos

a. Protocolo de Generación de Anticuerpos

Los ratones fueron inmunizados semanalmente con los péptidos antigénicos TTR-MAP, TTR89-97-N-KLH o TTR89-97-C-KLH en adyuvante RIBI o mensualmente en adyuvante TiterMax. Tres o cuatro días antes de la fusión, los ratones seleccionados recibieron un refuerzo IV final con inmunógeno en solución salina. Los bazos fueron homogeneizados para preparar esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma SP2/0 usando un protocolo estándar de electrofusión. Las células fusionadas en los medios de selección se sembraron en placas de 96 pocillos y se cribaron después de 7-10 días.

b. Protocolo de Cribado de Anticuerpos

La selección de hibridomas se basó en el siguiente cribado por ELISA: se recubrieron placas ELISA de 96 pocillos con anti-His de pollo, 1 pg/mL de PBS y se incubó durante 1 hora. Las placas fueron bloqueadas con solución de BSA/PBS al 1%, 200 uL/pocillo durante 15 minutos luego se añadieron 0,5 pg/mL de pH4-TTR, 50 pL/pocillo y se incubó durante 1 hora. pH4-TTR es TTR que ha sido sometida a pH bajo (acetato de sodio 50 mM, pH 4,0) con el fin de disociar/agregar la TTR, exponiendo el epítopo TTR89-97. Las placas se lavaron dos veces con TBS-T. Se añadió el sobrenadante de las placas de fusión, 50 pL/pocillo y se incubó durante 1 hora. Las placas se lavaron dos veces con TBS-T. El anticuerpo de detección, anti-ratón de cabra (específico de IgG1, 2a, 2b, 3)-HRP se diluyó 1:5.000 en BSA/PBS/TBS-T al 0,5%, se añadieron 50 pL/pocillo y se incubó durante 1 hora. Finalmente, las placas se lavaron cinco veces con TBS-T y substrato TMB, se añadieron 100 pL/pocillo. Después de 15 minutos, se detuvo el desarrollo del substrato con Ácido Sulfúrico 2N, 50 pL/pocillo. Las placas se leyeron a 450 nm. Los pocillos con una D.O. > 1,0 se seleccionaron y las células se transfirieron a una placa de 24 pocillos. Después de 3 días de crecimiento, los clones se contra cribaron con el ensayo anterior para confirmar la unión y substitución de TTR nativa por pH4-TTR como un contra cribado negativo, permitiendo la selección de los clones productores de mAb de TTR específicos para las formas no nativas de TTR.

c. Protocolos de Expresión de Anticuerpos

Se transfectaron plásmidos CMV con dirección de cadena pesada y cadena ligera que portaban las secuencias de anticuerpo monoclonal humanizado en células CHO-S1 (Life Technology). Se aplicó la selección doble para hacer una combinación seleccionada. Los medios condicionados se ensayaron para determinar la titulación, unión y se analizaron por SDS-PAGE/transferencia Western. Las combinaciones seleccionadas se utilizaron para la generación de clones usando el sistema Clonepix (Molecular Devices). Los clones fueron clasificados sobre la base de la titulación de anticuerpos. Los clones seleccionados se expandieron y se depositaron.

El clon con la producción más alta se expandió en matraces de agitación y se utilizó el cultivo para inocular las bolsas de cultivo Wave de 10-25L. Se utilizó una mezcla de medios de expresión FreeStyle-CHO, Cd OptiCHO and FreeStyle F17 suplementados con Glutamax (medios y Glutamax de Life Technology) para los matraces de agitación, así como para las bolsas de cultivo Wave. El cultivo por lote se realizó usando un biorreactor Wave (GE Healthcare) a 37 °C, 7% de CO2 con agitación constante. Se tomaron muestras periódicamente para monitorizar el número de células, viabilidad y producción de anticuerpos. Se realizó la suplementación con Cell Boost (HyClone) si fue necesario. El cultivo por lote se recogió cuando la viabilidad celular empieza a disminuir por debajo del 90% (5-7 días).

d. Protocolo de Purificación de Anticuerpos

El cultivo celular se recogió después de permitir en primer lugar que las células en suspensión se asentaran en la parte inferior de la bolsa Wave por medio de la gravedad a 4 °C. Los medios recogidos se aclararon a través de un filtro profundo (Millistak Pod COHC, Millipore), se concentraron 10 veces por filtración de flujo tangencial (Pelicon 2PLC 30K, Millipore) y se esterilizaron por filtración a través de un filtro de 0,2 pm (Opticap XL Millipore). Los medios condicionados concentrados se cargaron entonces en una columna de flujo rápido de Proteína G Sefarosa (GE Lifesciences) preequilibrada en 1xPBS, pH 7,4 usando un FPLC (Akta Avant, GE Lifesciences). Las proteínas no unidas se retiraron por lavado de la columna con 5-10 volúmenes de columna de 1xPBS, pH 7,4 hasta que la DO280 alcanzó la línea basal. El anticuerpo unido se eluyó de la columna con 2 volúmenes de columna de Tampón de Elución de IgG (Thermo Scientific). Se recogieron fracciones de elución y el pH se neutralizó con Tris 2M, pH 9,0 (60 pL por 1ml de elución).

Las fracciones que contenían anticuerpos se combinaron y dializaron toda la noche a 4 °C contra 1xPBS, pH 7,4. La muestra dializada se esterilizó entonces por ultrafiltración a través de un filtro PES de 0.2 pm y se almacenó a 4 °C.

La concentración final de proteínas se determinó con ácido bicinconínico (BCA) usando gamma-globulina bovina como el estándar de proteína (Thermo Scientific).

e. Protocolos de Purificación y Expresión de la TTR Recombinante

Las células de E. coli (BL21-A1) fueron transformadas con un plásmido pET21a(+) que contenía un inserto de TTR (Met-hTTR-(His)6 o una variante de TTR que contenía una mutación doble F87M/L110M. Las células fueron cultivadas en caldo 2YT que contenía 100 pg/ml de ampicilina. La expresión de TTR fue inducida toda la noche a 20 °C en presencia de IPTG 1 mM y arabinosa al 005%.

Las células se recogieron mediante centrifugación a 4.000 x g durante 10 min. y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Los sedimentos celulares de 10-15g se descongelaron y se lisaron en 50ml de Tampón A (1xPBS que contenía NaCl 500 mM, imidazol 20 mM) por procesamiento a través de un procesador de alta cizalla LV-1 (Microfluidics, Inc.). Las células lisadas se centrifugaron a 12.000 x g durante 15 min, se filtraron a través de un filtro PES de 0,2 pm antes de la purificación en una columna HP His-Trap (GE Lifesciences). Después de la carga, la columna se lavó con 10 c.v. de Tampón A y se eluyó con Tampón B (1xPBS con NaCl 500 mM, imidazol 500 mM). Las fracciones de los picos correspondientes a TTR se recogieron, se dializaron frente a 1xPBS y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

f. Preparación de Antígeno de TTR

El antígeno de TTR nativa se preparó diluyendo una preparación madre concentrada de TTR-6His recombinante a una concentración final de 2,5 pg/ml en 1xPBS. La TTR tratada a pH4 se generó por incubación de TTR recombinante a una concentración de 0,2 mg/ml en acetato de sodio 50 mM, pH 3,95 durante 72 horas a temperatura ambiente. Bajo estas condiciones, la TTR se disocia en la mezcla de monómeros de TTR y formas agregadas que son estructuralmente distintas de la TTR nativa. La pH4-TTR se diluyó entonces a una concentración final de 2,5 pg/ml en 1xPBS inmediatamente antes de su uso en el ensayo. Las placas de 96 pocillos (Costar #3690) se recubrieron a temperatura ambiente con 50 pl por pocillo de 1,0 pg/ml de anticuerpo policlonal anti-his de pollo (Abcam #Ab9107) en 1xPBS durante 1 hora. Se descartó la solución de recubrimiento y la placa fue bloqueada con un volumen de 250 pl/pocillo 1x de tampón de bloqueo que contenía BSA diluido en 1xPBS (G-Biosciences #786-193) durante 1 hora.

g. Protocolo de ELISA

Las placas de 96 pocillos recubiertas y bloqueadas fueron tratadas con 50 pl por pocillo de 2,5 pg/ml de antígeno de TTR (ya sea TTR nativa o pH4-TTR) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron entonces dos veces con 250 pl por pocillo del tampón de lavado (1 x de Solución Salina Tamponada con Tris que contenía Tween-20 al 0,05%). Las placas lavadas se trataron entonces con 50 pl por pocillo del anticuerpo monoclonal anti-TTR apropiado en concentraciones que iban de 0,31 a 2,5 pg/ml, durante 1 hora.

Las placas tratadas se lavaron 3 veces con 250 pl por pocillo de tampón de lavado. Después del lavado, las placas se trataron durante 1 hora con 50 pl por pocillo de anticuerpo de detección que comprendía una dilución de 1:5.000 de anti-ratón de cabra conjugado con peróxido (Jackson ImmunoResearch #115-035-164) en 1xPBS. La placa se lavó entonces 3 veces antes de la adición de 100 pl por pocillo de substrato TMB (Rockland). Se permitió que la reacción de HRP procediera a temperatura ambiente durante 15 min. antes de inactivarla con un volumen de 50 pl por pocillo de H2SO4 IN. La absorbancia espectroscópica se midió a una longitud de onda de 450nm.

h. SDS-PAGE

Se realizó la electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS como sigue. Se cargaron 0,1-1 pg de TTR o pH 4,0-TTR en tampón de muestra 1xLDS (Life Technologies) en un gel NuPAGE bis-tris al 10% y se sometió a electroforesis en tampón MES a 90V constante durante 105 minutos. Después de la electroforesis, el gel fue teñido en Azul Instantáneo (Expedeon) o transferido a filtros de nitrocelulosa para el análisis por transferencia Western. i. PAGE Nativa

Se realizó la electroforesis en geles de Tris-glicina nativa como sigue. Se cargaron 0,1-1 pg de TTR o pH 4,0-TTR en tampón de muestra 1 xTris-glicina (Life Technologies) en un gel Tris-glicina al 10-20% y se sometió a electroforesis en 1x tampón de ejecución de Tris-glicina nativa a 120V constante durante 105 minutos. Después de la electroforesis, el gel fue teñido en Azul Instantáneo (Expedeon) o transferido a filtros de nitrocelulosa para el análisis por transferencia Western.

j. Transferencia Western

Los geles de PAGE SDS o Nativa se transfirieron a papel de filtro de nitrocelulosa (iBlot, programa P7) y bloqueados con tampón de bloqueo (Licor) durante 30 minutos. Los filtros se incubaron entonces en 0,5 pg/ml de anticuerpo primario en tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente (o durante la noche a 4 °C), seguido por tres lavados de 10 minutos con 1xTBS. Los filtros se colocaron en anticuerpo secundario -anti-ratón de cabra conjugado con IRDye 800CW diluido 1:20.000 en tampón de bloqueo. Después de incubar los filtros en la solución de anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente, los filtros se lavaron y se formaron imágenes en un generador de imágenes infrarrojo Odyssey CLx (Licor).

k. Protocolo del Ensayo de Formación de Fibras de TTR

Una solución de TTR-Y78F 3,6 pM (0,2 mg/ml) en acetato de sodio 50 mM, pH 4,8 se incubó a 37 °C durante 72 horas en presencia de anticuerpo de mis-TTR 1,4 pM (0,2 mg/ml) o de un control de isotipo. Después de la incubación, se añadió un exceso molar de 5X de tioflavina-T a la mezcla y se le permitió unirse durante 30 minutos. Las mediciones fluorométricas se midieron en una longitud de onda de emisiones de 480nm con una longitud de onda de excitación establecida en 440nm. La inhibición del 0% se estableció como la intensidad de fluorescencia en presencia de un anticuerpo de control de isotipo (83 u.a.) y el punto de inhibición del 100% se estableció como la fluorescencia en ausencia de la proteína TTR-Y78F (38 u.a.).

l. Muestras de Tejido Cardíaco

Los bloques frescos congelados y procesados con parafina de tejido cardíaco con diagnóstico confirmado de mutaciones de ATTR fueron obtenidos del Dr. Merrill Benson en la Universidad de Indiana. Las muestras incluyeron ocho muestras frescas congeladas y seis muestras de FFPE y cada muestra fue diagnosticada con ATTR o alguna otra amiloidosis cardíaca. El diagnóstico del tejido se confirmó además en Prothena por medio de la tinción de IHC con anticuerpos frente a las cadenas ligeras kappa y lambda y amiloide A antes de la caracterización con los anticuerpos de TTR.

m. Inmunohistoquímica

La inmunohistoquímica se realizó en criosecciones ligeramente fijadas en paraformaldehído, de 10 pm montadas en portaobjetos y en secciones de 5 pm de parafina. El método de la inmunoperoxidasa fue el principal sistema de detección, que se realizó en el Leica Bond Rx (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL) usando el Kit de Detección de Refino de Polímero Unido (DS980, Leica Biosystems). Los anticuerpos primarios se incubaron durante una hora (de acuerdo con las concentraciones en la Tabla 2) seguido de la incubación con conjugados de anticuerpo con conector de HRP polimérico anti-conejo y anti-ratón. La tinción fue visualizada con un cromógeno DAB, que produjo un depósito marrón. Los portaobjetos fueron contrateñidos con hematoxilina, deshidratados en una serie ascendente de alcoholes, limpiados en xilenos y cubiertos con CytoSeal 60 (Richard Allen Scientific; Kalamazoo, MI). El control negativo consistió en realizar todo el procedimiento inmunohistoquímico en secciones adyacentes con un control de isotipo IgG no inmune o una omisión del anticuerpo primario.

n. Demostración de amiloide: Tinción con Rojo Congo y Tioflavina T

Se realizó la tinción con rojo Congo para demostrar el amiloide de TTR en el tejido usando un kit de American MasterTech (Lodi, California). Se realizó la tinción de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se tiñeron los portaobjetos en la solución de Rojo Congo durante 1 hora seguida de la diferenciación en hidróxido de sodio al 1% durante aproximadamente 15 segundos. Los portaobjetos se lavaron entonces en agua corriente, se deshidrataron a través de una serie de alcohol de concentraciones crecientes, y se limpiaron a través de tres cambios de xilenos, y se cubrieron con CytoSeal 60.

Se empleó un protocolo de tinción con Tioflavina T modificado (Schmidt et al 1995) para determinar la presencia de amiloide de TTR en el tejido. Brevemente, los portaobjetos fueron contrateñidos con hematoxilina de Mayers, se lavaron en agua corriente y se tiñeron con una solución filtrada de Tioflavina T al 0,015% (T3516 - 25G; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en etanol al 50% durante diez minutos. Los portaobjetos se lavaron entonces en agua corriente y se diferenciaron en ácido acético al 1% (v/v) durante 10 minutos y se lavaron tres veces en agua. Los portaobjetos se dejaron secar al aire antes de cubrirlos con ProLong Gold (Life Technologies).

o. Análisis de la Imágenes

Los portaobjetos se sometieron a imagenología con un microscopio Olympus BX61, escáner de diapositiva digital Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT, o un sistema confocal espectral Leica SPE. Las imágenes se recogieron y almacenaron como archivos TIFF.

p. Análisis de las muestras de plasma humano por SDS-PAGE/Western

Se obtuvieron seis muestras de plasma de pacientes confirmados para V30M ATTR (Muestra no. 21, no. 22, no. 23, no. 24, no. 25, no. 27) y 6 muestras (Muestra no. 11, no. 12, no. 15, no. 18, no. 19, no. 20) de sujetos normales de M. Saraiva (Universidad de Porto, Portugal). La muestra no. C6 fue una muestra de suero humano normal obtenida de una fuente comercial (BioreclamationIVT). Estas muestras de plasma se separaron por SDS-PAGE y se sometió a transferencia Western con 9D5 como sigue. Un volumen de 1,4 |jl de plasma se diluyó 1:8 en tampón de muestra IxLDS en ausencia del agente reductor (Life Technologies). Las muestras se sometieron a separación por SDS-PAGE y a transferencia Western con 0,5 jg/ml de 9D5 como se ha descrito anteriormente.

q. Análisis de muestras de plasma humano por Ensayo en Placa MesoScale Discovery (MSD)

Se recubrieron las placas de MSD de 96 pocillos con anticuerpo monoclonal 6C1 a una concentración de 4 jg/mL en PBS y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación, o toda la noche a 4 °C. Las placas se lavaron tres veces con 1xTBST antes de ser bloqueadas con Solución A de Bloqueo de MSD al 3%, 150 jL por pocillo durante 1 hora con agitación. Un volumen de 30 j l por pocillo de muestras de plasma humano diluidas 1:10 en un tampón de muestra que comprendía albúmina sérica bovina libre de globulina al 0,6%, fosfato de sodio monobásico 1,5 mM, fosfato de sodio dibásico 8 mM, cloruro de sodio 145 mM, Triton X-405 al 0,05%, y timerosal al 0,05% se añadió a las placas de MSD bloqueadas durante 1 hora. Las placas se lavaron 3 veces con 1xTBST. Un volumen de 50 j l por pocillo de 1 jg/ml de anticuerpo de detección etiquetado con sulfo (ya sea el anticuerpo de TTR total 8C3 del anticuerpo monoclonal Dako) en el tampón de muestra se añadió durante 1 hr. a temperatura ambiente con agitación. Las placas se lavaron tres veces con 1xTBST seguido por la adición de 150 j l por pocillo de la solución T de Tampón de Lectura 1X (Meso Scale Discovery). Las placas se leyeron entonces en el generador de imágenes Sector MSD.

r. Generación de una Curva Estándar de MSD

Con el fin de cuantificar la cantidad de proteína TTR reactiva con 6C1, no nativa presente en las muestras de plasma humano, se generó una curva estándar de MSD usando TTR-F87M/L110M recombinante como un estándar de TTR reactivo con 6Cl. Esta variante de TTR contiene dos substituciones de aminoácidos que previenen la formación de tetrámero y mantienen a la proteína en el estado de monómero (Jiang et al. (2001) Biochemistry 40, 11442-11452). Como tal, esta variante de TTR es reconocida por todos los mAb de mis-TTR y por lo tanto es adecuada para su uso como un estándar de referencia en el ensayo de MSD.

Para generar la curva estándar, se recubrieron las placas de MSD de 96 pocillos con anticuerpo de mis-TTR 6C1 a una concentración de 4 jg/mL en PBS y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación, o toda la noche a 4 °C. Las placas se lavaron tres veces con 1xTBST antes de ser bloqueadas con solución A de Bloqueo de MSD al 3%, 150 jL por pocillo durante 1 hora con agitación. Las placas bloqueadas se trataron entonces durante 1 hora con 50 j l por pocillo de 25 jg/mL de TTR-F87M/L110M diluida en serie 1:5 con la última dilución siendo un blanco de tampón. Las placas se lavaron 3 veces con 1xTBST antes de la adición de un volumen de 50 j l por pocillo de 1jg/ml de anticuerpo de detección con etiqueta Sulfo (8C3-Etiqueta Sulfo o pAb-Etiqueta Sulfo de Dako) durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Tanto el mAb 8C3 como el anticuerpo de Dako se acoplaron a la Etiqueta Sulfo y podrían utilizarse en el anticuerpo de detección ya que se unen a TTR total y no eran específicos a conformación.

Después del tratamiento con el anticuerpo de detección, las placas se lavaron tres veces con un volumen de 150 j l por pocillo de 1xTBST, seguido por la adición de 150 j l por pocillo de Tampón de Lectura T 1x (MSD). Las placas se leyeron en el generador de imágenes Sector MSD y se generó una curva de calibración TTR F87M/L110M resultante.

Ejemplo 10. Evaluación de los Anticuerpos mis-TTR en un Modelo de Ratón Transgénico

Los estudios in vivo se llevan a cabo en un modelo de ratón transgénico humanizado V30M hTTR (Inoue et al., (2008) Specific pathogen free conditions prevent transthyretin amyloidosis in mouse models. Transgenic Research 17:817-826) para evaluar la eficacia de los anticuerpos anti-TTR en la unión y eliminación de hTTR agregada.

Los ratones transgénicos se crían usando los procedimientos estándar y sus niveles circulantes de hTTR se evalúan por ELISA. Los ratones con un nivel en suero de 200-400 jg/ml de hTTR se utilizan para estudios de eficacia subsecuentes. El primer conjunto de estudios examina la deposición natural de hTTR en ratones transgénicos. La detección de depósitos de hTTR comienza a los 12 meses de edad y se repite cada 3-6 meses posteriormente. Una vez que se ve un nivel aceptable de agregados en ratones transgénicos, se inician los estudios de eficacia. Los animales se dividen en tres grupos de tratamiento (n=10/grupo) y se tratan semanalmente durante cuatro semanas con una dosis IP de vehículo, anticuerpo de control (control de isotipo, 10 mpk) o un anticuerpo anti-hTRR (10 mpk). Una semana después del último tratamiento los ratones son sacrificados, se recogen los tejidos y se procesan, y luego se tiñen para evaluar el número y tamaño de los depósitos de TTR remanentes. Se emplean métodos cuantitativos y estadísticos para determinar el grado de aclaramiento observado entre los grupos.

En un enfoque alternativo, se preparan los agregados de hTTR in vitro y luego se inyectan en el riñón de los ratones transgénicos para sembrar la deposición de nuevos agregados. El solicitante ha determinado que la inyección de estas preparaciones puede acelerar la deposición de nuevos agregados de manera predecible. Con base en estos hallazgos, los animales son sedados, se expone el riñón izquierdo y se inyecta material de hTTR pre-agregado en la corteza del riñón. Después de un periodo de recuperación adecuado, los animales se dividen en tres grupos de tratamiento (n=10/grupo) y se tratan semanalmente durante cuatro-ocho semanas con una dosis IP de vehículo, anticuerpo de control (control de isotipo, 10 mpk) o un anticuerpo anti-hTRR (10 mpk). Una semana después del último tratamiento los ratones son sacrificados, se recogen los riñones y se procesan, y luego se tiñen para evaluar el número y tamaño de los depósitos de TTR. Se emplean métodos cuantitativos y estadísticos para determinar el grado de cambio observado entre los grupos.

Ejemplo 11. Evaluación de los Anticuerpos mis-TTR en un Modelo de Implante de Matrigel

El solicitante ha determinado que hTTR pre-agregada puede suspenderse en Matrigel (BD Bioscience, No. Cat 354263), dejar que solidifique y ponerse entonces por vía subcutánea en ratones. A las cuatro semanas después del implante, el implante de Matrigel mantuvo su estructura y la hTTR agregada estaba todavía presente dentro del implante. Además, el implante fue bien tolerado por los ratones y los anticuerpos anti-hTTR fueron capaces de penetrar y unirse a los agregados suspendidos en el Matrigel. Con base en estos hallazgos, se realizó un estudio de eficacia del anticuerpo. Los animales son sedados y se coloca subcutáneamente en los ratones un implante que contiene hTTR pre-agregada suspendida en Matrigel. Después de un periodo de recuperación adecuado, los ratones se dividen en tres grupos de tratamiento (n=10/grupo) y se tratan semanalmente durante dos-cuatro semanas con una dosis IP de vehículo, anticuerpo de control (control de isotipo, 10 mpk) o un anticuerpo anti-hTRR (10 mpk). Después del último tratamiento, los ratones son sacrificados, se recoge la piel que contiene el implante y se procesa, y se evalúa entonces la cantidad de depósitos de TTR remanentes usando métodos histológicos y/o bioquímicos. Se emplean análisis cuantitativos y estadísticos para determinar el grado de aclaramiento observad entre los grupos.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une específicamente a transtiretina que comprende una región variable de cadena pesada madura de la SEQ ID NO: 5 y una región variable de cadena ligera madura de la SEQ ID NO: 13.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que tiene un isotipo IgG1 humano.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, que tiene un isotipo IgG2 o IgG4 humano.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1 que es un fragmento de unión; opcionalmente, en donde el fragmento de unión es un anticuerpo de cadena única, fragmento Fab, o F(ab')2.

5. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la región variable de cadena ligera madura se fusiona a una región constante de cadena ligera y la región variable de cadena pesada madura se fusiona a una región constante de cadena pesada.

6. El anticuerpo de la reivindicación 5, en donde la región constante de cadena pesada es una forma mutante de una región constante de cadena pesada humana natural que tiene una unión reducida a un receptor Fcy en relación con la región constante de cadena pesada humana natural.

7. El anticuerpo de la reivindicación 5, en donde la región constante de cadena pesada

del isotipo IgG1.

8. El anticuerpo de la reivindicación 5, en donde la región variable de cadena pesada madura se fusiona a una región constante de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 23 con o sin la lisina C-terminal y/o la región variable de cadena ligera madura se fusiona a una región constante de cadena ligera que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 25.

9. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquier reivindicación precedente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. Un ácido nucleico que codifica la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo, o ácidos nucleicos que codifican respectivamente la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo, en donde el anticuerpo es como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

11. Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 10 o vectores de expresión recombinantes que comprenden los ácidos nucleicos de la reivindicación 10.

12. Una célula huésped transformada con el o los vectores de expresión recombinantes de la reivindicación 11.

13. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso en tratar o efectuar la profilaxis de una amiloidosis mediada por transtiretina, o retrasar el inicio de una amiloidosis mediada por transtiretina en un sujeto, comprendiendo el uso administrar al sujeto un régimen efectivo del anticuerpo.

14. Un método in vitro para diagnosticar una amiloidosis mediada por transtiretina en un sujeto, que comprende poner en contacto una muestra biológica del sujeto con una cantidad efectiva del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

15. El método in vitro de la reivindicación 14, en donde la muestra bilógica es sangre, suero, plasma, o tejido sólido; opcionalmente, del corazón, sistema nervioso periférico, sistema nervioso autónomo, riñones, ojos, o tracto gastrointestinal.