ES2934656T3 - Anticuerpos antitranstiretina - Google Patents

Abstract

La invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a la transtiretina (TTR). Los anticuerpos se pueden usar para tratar o efectuar la profilaxis de enfermedades o trastornos asociados con la acumulación de TTR o la acumulación de depósitos de TTR (p. ej., amiloidosis por TTR). Los anticuerpos también se pueden usar para diagnosticar amiloidosis TTR e inhibir o reducir la agregación de TTR, entre otras aplicaciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos antitranstiretina

Referencia a un listado de secuencias

Esta solicitud incluye un listado de secuencias electrónica en un archivo llamado 473373_SEQLST.TXT, creado el 28 de enero de 2016, y que contiene 135083 bytes, que se incorpora en su totalidad en el presente documento por referencia para todos los efectos.

Antecedentes

Se cree que varias enfermedades son causadas por el plegamiento anormal y la agregación de proteínas específicas de la enfermedad. Estas proteínas pueden acumularse en acumulaciones de diagnóstico patológico, conocidas como amiloides, que son visualizadas mediante ciertas tinciones histológicas. Se piensa que los amiloides provocan respuestas inflamatorias y tienen múltiples consecuencias negativas para los tejidos implicados. Además, pueden existir agregados más pequeños de proteína anormalmente plegada y ejercer efectos citotóxicos.

La transtiretina (TTR) es una de las muchas proteínas que se sabe que se pliegan erróneamente y se agregan (p. ej., sufren amiloidogénesis). La amiloidosis relacionada con la transtiretina abarca dos formas de enfermedad: la enfermedad familiar que se origina por el plegamiento erróneo de una TTR mutada o variante y una enfermedad no genética esporádica causada por la desagregación de la TTR de tipo natural. El proceso de amiloidogénesis de TTR puede causar patología en el sistema nervioso y/o en el corazón, así como en otros tejidos.

El documento US2014056904 describe anticuerpos que se unen a la TTR mal plegada, incluyendo un anticuerpo policlonal generado contra los restos 89-97 de la TTR, y aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas.

El documento WO2014124334 describe anticuerpos que se unen selectivamente a TTR no nativa y usos diagnósticos de los mismos.

El documento WO2015010118 describe el aislamiento de anticuerpos humanos con actividad catalítica en la disolución de TTR mal plegada.

Phay et al. (Rejuvenation Research, 2014, 17, 97-104) describen anticuerpos que se unen a los depósitos amiloides de transtiretina en secciones del tejido cardiaco de dos pacientes de polineuropatía amiloidótica familiar.

Goldsteins et al. (PNAS, 1999, 96, 3108-3113) describe la formación de varios anticuerpos monoclonales contra un mutante de TTR con potencial de formación de amiloide. Se describió que los anticuerpos no eran capaces de inhibir la formación de amiloide.

Sumario

En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a la transtiretina y comprende una región variable de cadena pesada madura de SEQ ID NO: 11 y una región variable de cadena ligera madura de SEQ ID NO: 19, o una región variable de cadena pesada madura de SEQ ID NO: 65 y una región variable de cadena ligera madura de SEQ ID NO: 76, como se expone en las reivindicaciones.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo y un ácido nucleico o ácidos nucleicos que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de dicho anticuerpo, como se expone en las reivindicaciones.

Un aspecto adicional de la presente invención es un vector de expresión recombinante que comprende dicho ácido nucleico como se expone en las reivindicaciones, y una célula hospedante transformada con dicho vector de expresión recombinante como se expone en las reivindicaciones.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un anticuerpo como se expone en las reivindicaciones, comprendiendo el método: cultivar células transformadas con ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, de modo que las células secreten el anticuerpo; y purificar el anticuerpo del medio de cultivo celular.

En un aspecto adicional más, la presente invención proporciona un anticuerpo como se expone en las reivindicaciones, para usar en el tratamiento o efectuar la profilaxis de una amiloidosis mediada por transtiretina, o para retrasar la aparición de una amiloidosis mediada por transtiretina en el sujeto.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un método in vitro para diagnosticar una amiloidosis mediada por transtiretina en un sujeto, que comprende poner en contacto una muestra biológica del sujeto con una cantidad eficaz de un anticuerpo como se expone en las reivindicaciones.

Se describen en el presente documento anticuerpos que se unen a transtiretina y comprenden tres CDR de cadena pesada y tres CDR de cadena ligera sustancialmente del anticuerpo 14G8. Algunos anticuerpos comprenden tres CDR de cadena pesada de Kabat y tres CDR de cadena ligera de Kabat del anticuerpo 14G8, excepto que las posiciones H52 y L26 pueden ser cada una N o S. Algunos anticuerpos comprenden tres CDR de cadena pesada de Kabat y tres c Dr de cadena ligera de Kabat del anticuerpo 14G8. Opcionalmente, la CDR-H1 es una CDR compuesta de Kabat-Chothia del anticuerpo 14G8. Algunos anticuerpos comprenden tres CDR de cadena pesada de Kabat del anticuerpo 9D5. Opcionalmente, la CDR-H1 es una CDR compuesta de Kabat-Chothia del anticuerpo 9D5.

Algunos anticuerpos se unen al mismo epítopo en la transtiretina que 9D5 o 14G8 y comprenden tres CDR de cadena ligera y tres CDR de cadena pesada, en donde: (a) cada CDR tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una CDR correspondiente de las regiones variables de cadena pesada y ligera de 9D5; o (b) cada CDR tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una CDR correspondiente de las regiones variables de cadena pesada y ligera de 14G8, excepto que la posición L26 puede ser N o S. Algunos anticuerpos comprenden: (a) las tres CDR de cadena pesada y las tres CDR de cadena ligera de 9D5; o (b) las tres CDR de cadena pesada y las tres CDR de cadena ligera de 14G8, excepto que la posición L26 puede ser N o S. En algunos anticuerpos, las tres CDR de cadena pesada y las tres CDR de cadena ligera de 9D5 son las SEQ ID NOS: 13-15 y 24-26, respectivamente. En algunos anticuerpos, las tres CDR de cadena pesada y las tres CDR de cadena ligera de 14G8 son las SEQ ID NOD: 67-69 y 77-79, respectivamente, excepto que la posición L26 puede ser N o S.

Cualquiera de los anticuerpos anteriores puede ser un anticuerpo monoclonal. Cualquiera de los anticuerpos anteriores puede ser un anticuerpo quimérico, humanizado, de superficie modificada o humano. Cualquiera de los anticuerpos anteriores puede tener isotipo IgG1 humano, isotipo IgG2 humano o isotipo IgG4 humano.

Otro aspecto de la descripción proporciona anticuerpos humanizados o quiméricos de anticuerpo de ratón que se unen específicamente a transtiretina, en donde el anticuerpo de ratón se caracteriza por una región variable de cadena pesada madura de SEQ ID NO: 61 y una región variable de cadena ligera madura de SEQ ID NO: 70, excepto que la posición H52 puede ser S o N, la posición H69 puede ser F o I, la posición L26 puede ser S o N, y la R en la posición L107 es opcional. Opcionalmente, los anticuerpos son un anticuerpo 9D5 o 14G8 humanizado o quimérico que se une específicamente a transtiretina, en donde 9D5 es un anticuerpo de ratón caracterizado por una región variable de cadena pesada madura de SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera madura de SEQ ID NO: 16, y 14G8 es un anticuerpo de ratón caracterizado por una región variable de cadena pesada madura de SEQ ID NO: 61 y una región variable de cadena ligera madura de SEQ ID NO: 70. Opcionalmente, los anticuerpos humanizados comprenden: (a) una región variable de cadena pesada madura humanizada que comprende las tres CDR de cadena pesada de 9D5 y una región variable de cadena ligera madura humanizada que comprende las tres CDR de cadena ligera de 9D5; o (b) una región variable de cadena pesada madura humanizada que comprende las tres CDR de cadena pesada de 14G8 y una región variable de cadena ligera madura humanizada que comprende las tres CDR de cadena ligera de 14G8, excepto que la posición L26 puede ser N o S. Opcionalmente, las tres CDR de cadena pesada y las tres CDR de cadena ligera de 9D5 son las SEQ ID NOS: 13-15 y 24-26, respectivamente. Opcionalmente, las tres CDR de cadena pesada y las tres CDR de cadena ligera de 14G8 son las SEQ ID NOS: 67-69 y 77-79, respectivamente, excepto que la posición L26 puede ser N o S. Opcionalmente, cualquier diferencia en las CDR de la región variable de cadena pesada madura y la región variable de cadena ligera madura de las SEQ ID NOS: 1 y 16, respectivamente, se encuentran en las posiciones H60-H65. Opcionalmente, cualquier diferencia en las CDR de la región variable de cadena pesada madura y la región variable de cadena ligera madura de las SEQ ID NOS: 61 y 70, respectivamente, reside en las posiciones H60-H65, excepto que la posición L26 puede ser N o S.

Opcionalmente, el anticuerpo humanizado comprende una región variable de cadena pesada madura humanizada con una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NOS: 5-12 y una región variable de cadena ligera madura humanizada con una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NOS: 19-23, excepto que la posición H19 puede ser R o K, la posición H40 puede ser A o T, la posición H44 puede ser G o R, la posición H49 puede ser S o A, la posición H77 puede ser S o T, la posición H82a puede ser N o S, la posición H83 puede ser R o K, la posición H84 puede ser A o S y la posición H89 pueden ser V o M. Opcionalmente, al menos una de las siguientes posiciones está ocupada por el aminoácido como se especifica: la posición H42 está ocupada por E, la posición H47 está ocupada por L, la posición H69 está ocupada por F, la posición H82 está ocupada por S, la posición H82b está ocupada por L, la posición H108 está ocupada por L, la posición L8 está ocupada por A, la posición L9 está ocupada por P, la posición L18 está ocupada por S, la posición L19 está ocupada por V, la posición L36 está ocupada por F, la posición L39 está ocupada por R, la posición L60 está ocupada por S, la posición L70 está ocupada por A, y la posición L74 está ocupada por R. Opcionalmente, las posiciones H47, H69 y H82 están ocupadas por L, F y S, respectivamente. Opcionalmente, las posiciones H47, H69, H82 y H82b están ocupadas por L, F, S y L, respectivamente. Opcionalmente, las posiciones H42, H47 y H108 están ocupadas por E, L y L, respectivamente. Opcionalmente, las posiciones H69, H82 y H82b están ocupadas por F, S y L, respectivamente. Opcionalmente, las posiciones H47 y H108 están cada una ocupadas por L. Opcionalmente, las posiciones H82 y H82b están ocupadas por S y L, respectivamente. Opcionalmente, las posiciones H42, H47 y H82b están ocupadas por E, L y L, respectivamente. Opcionalmente, la posición L36 está ocupada por F. Opcionalmente, la posición L60 está ocupada por S. Opcionalmente, las posiciones L8, L9, L19, L36, L39, L60, L70 y L74 están ocupadas por A, P, V, F, R, S, A y R, respectivamente. Opcionalmente, las posiciones L8, L9, L18, L19, L36, L39, L60, L70 y L74 están ocupadas por A, P, S, V, F, R, S, A y R, respectivamente.

Opcionalmente, el anticuerpo humanizado comprende una región variable de cadena pesada madura con una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NOS: 5-12 y una región variable de cadena ligera madura que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NOS: 19-23, excepto que la posición H19 puede ser R o K, la posición H40 puede ser A o T, la posición H44 puede ser G o R, la posición H49 puede ser S o A, la posición H77 puede ser S o T, la posición H82a puede ser N o S, la posición H83 puede ser R o K, la posición H84 puede ser A o S, y la posición H89 pueden ser V o M. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado comprende una región variable de cadena pesada madura con una secuencia de aminoácidos al menos 98% idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NOS: 5-12 y una región variable de cadena ligera madura con una secuencia de aminoácidos al menos 98% idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NOS: 19-23, excepto que la posición H19 puede ser R o K, la posición H40 puede ser A o T, la posición H44 puede ser G o R, la posición H49 puede ser S o A, la posición H77 puede ser S o T, la posición H82a puede ser N o S, la posición H83 puede ser R o K, la posición H84 puede ser A o S y la posición H89 pueden ser V o M. Opcionalmente, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOS: 5-12 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las ^s E^q ID NOS: 19-23. En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 y la región variable de la cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

Opcionalmente, el anticuerpo humanizado comprende una región variable de cadena pesada madura humanizada con una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NOS: 64-66 y una región variable de cadena ligera madura humanizada con una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NOS: 74-76, excepto que la posición H82a puede ser N o S, la posición H83 puede ser R o K, la posición H84 puede ser A o S, la posición H89 puede ser V o M, y la posición L18 puede ser S o P. Opcionalmente, al menos uno de las siguientes posiciones está ocupada por el aminoácido como se especifica: la posición H1 está ocupada por E, la posición H47 está ocupada por L y la posición L36 está ocupada por F. Opcionalmente, las posiciones H1 y H47 están ocupadas por E y L, respectivamente. Opcionalmente, la posición L36 está ocupada por F. Opcionalmente, al menos una de las siguientes posiciones está ocupada por el aminoácido como se especifica: la posición H3 está ocupado por K, la posición H105 está ocupada por T, la posición L8 está ocupada por A, la posición L9 está ocupada por P, la posición L19 está ocupada por V, la posición L26 está ocupada por S, la posición L60 está ocupada por S y posición L70 está ocupada por A. Opcionalmente, las posiciones H3 y H105 están ocupadas por K y T, respectivamente. Opcionalmente, las posiciones L8, L9, L19 y L70 están ocupadas por A, P, V y A, respectivamente. Opcionalmente, las posiciones L26 y L60 cada una está ocupada por S.

Opcionalmente, el anticuerpo humanizado comprende una región variable de cadena pesada madura con una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NOS: 64-66 y una región variable de cadena ligera madura con una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NOS: 74-76, excepto que la posición H82a puede ser N o S, la posición H83 puede ser R o K, la posición H84 puede ser A o S, la posición H89 puede ser V o M y la posición L18 puede ser S o P. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado comprende una región variable de cadena pesada madura con una secuencia de aminoácidos al menos 98% idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NOS: 64-66 y una región variable de cadena ligera madura con una secuencia de aminoácidos al menos 98% idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NOS: 74-76, excepto que la posición H82a puede ser N o S, la posición H83 puede ser R o K, la posición H84 puede ser A o S, la posición H89 puede ser V o M, y la posición L18 puede ser S o P. Opcionalmente, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOS: 64-66 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las s Eq ID NO: 74-76. En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 65 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76.

Cualquiera de los anticuerpos anteriores puede ser un anticuerpo intacto, un fragmento de unión, un anticuerpo de cadena simple, un Fab o un fragmento Fab'2. En cualquiera de los anticuerpos anteriores, la región variable de cadena ligera madura se puede fusionar a una región constante de cadena ligera y la región variable de cadena pesada madura se puede fusionar a una región constante de cadena pesada. Opcionalmente, la región constante de cadena pesada es una forma mutante de una región constante de cadena pesada humana natural que ha reducido la unión a un receptor F^cy en relación con la región constante de cadena pesada humana natural. Opcionalmente, la región constante de cadena pesada es de isotipo IgG1. Opcionalmente, la región variable de cadena pesada madura está fusionada a una región constante de cadena pesada con la secuencia SEQ ID NO: 103 y/o la región variable de cadena ligera madura está fusionada a una región constante de cadena ligera con la secuencia SEQ ID NO: 104 o 105.

También se describen en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto adicional de la descripción, se proporcionan en el presente documento ácidos nucleicos que codifican la cadena pesada y/o la cadena ligera de cualesquiera de los anticuerpos anteriores, tal como uno cualquiera de las SEQ ID NOS: 40, 42, 44-56, 87, 89, 91-96 y 106-108.

También se describe un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico como se ha descrito anteriormente, y una célula hospedante transformada con el vector de expresión recombinante.

La descripción proporciona además un método de humanización de un anticuerpo, comprendiendo el método: (a) seleccionar uno o más anticuerpos aceptores; (b) Identificar los restos de aminoácidos del anticuerpo de ratón a retener; (c) sintetizar un ácido nucleico que codifica una cadena pesada humanizada que comprende las CDR de la cadena pesada del anticuerpo de ratón y un ácido nucleico que codifica una cadena ligera humanizada que comprende las CDR de la cadena ligera del anticuerpo de ratón; y (d) expresar los ácidos nucleicos en una célula hospedante para producir un anticuerpo humanizado; en donde el anticuerpo de ratón es 9D5 o 14G8, en donde 9D5 se caracteriza por una región variable de cadena pesada madura de SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera madura de SEQ ID NO: 16, y 14G8 se caracteriza por una región variable de cadena pesada madura de SEQ ID NO: 61 y una región variable de cadena ligera madura de SEQ ID NO: 70.

La descripción proporciona además un método para producir un anticuerpo humanizado, quimérico o de superficie modificada, comprendiendo el método: (a) células de cultivo transformadas con ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, de manera que las células segregan el anticuerpo; y (b) purificar el anticuerpo de los medios de cultivo celular; en donde el anticuerpo es una forma humanizada, quimérica o de superficie modificada de 9D5 o 14G8.

La descripción proporciona además un método para producir una línea celular que produce un anticuerpo humanizado, quimérico o de superficie modificada, comprendiendo el método: (a) introducir un vector que codifica cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo y un marcador seleccionable en células; (b) propagar las células bajo condiciones para seleccionar las células que tengan un número de copias aumentado del vector; (c) aislar células individuales de las células seleccionadas; y (d) depositar en banco las células clonadas a partir de una única célula seleccionada basándose en la producción de anticuerpo; en donde el anticuerpo es una forma humanizada, quimérica o de superficie modificada de 9D5 o 14G8. Opcionalmente, el método además comprende propagar las células bajo condiciones selectivas y cribar las líneas celulares que expresan y secretan naturalmente al menos 100 mg/L/106 células/24 h.

La descripción proporciona además un método de inhibir o reducir la agregación de transtiretina en un sujeto con o en riesgo de desarrollar una amiloidosis mediada por transtiretina, que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos anteriores, inhibiendo o reduciendo así la agregación de transtiretina en el sujeto.

La descripción proporciona además un método de inhibir o reducir la formación de fibrillas de transtiretina en un sujeto con o en riesgo de desarrollar una amiloidosis mediada por transtiretina, que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos anteriores, inhibiendo o reduciendo así la acumulación de transtiretina en el sujeto.

La descripción proporciona además un método para reducir los depósitos de transtiretina en un sujeto con o en riesgo de desarrollar una amiloidosis mediada por transtiretina, que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos anteriores, reduciendo así los depósitos de transtiretina en el sujeto.

La descripción proporciona además un método para eliminar la transtiretina agregada en un sujeto con o en riesgo de desarrollar una amiloidosis mediada por transtiretina, que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos anteriores, con lo que se elimina la transtiretina agregada del sujeto respecto a un sujeto con o en riesgo de desarrollar una amiloidosis mediada por transtiretina que no ha recibido el anticuerpo.

La descripción proporciona además un método para estabilizar una conformación no tóxica de transtiretina en un sujeto con o en riesgo de desarrollar una amiloidosis mediada por transtiretina, que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos anteriores, estabilizando así una conformación no tóxica de transtiretina en el sujeto.

La descripción proporciona además un método de tratamiento o de efectuar profilaxis de una amiloidosis mediada por transtiretina en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos anteriores.

La descripción proporciona además un método para retrasar el inicio de una amiloidosis mediada por transtiretina en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos anteriores.

La descripción proporciona además un método de diagnóstico de una amiloidosis mediada por transtiretina en un sujeto, que comprende poner en contacto una muestra biológica del sujeto con una cantidad eficaz de cualquiera de los anticuerpos anteriores. Opcionalmente, el método comprende además detectar la unión de anticuerpo a transtiretina, en donde la presencia del anticuerpo unido indica que el sujeto tiene una amiloidosis mediada por transtiretina. Opcionalmente, el método comprende además comparar la unión del anticuerpo a la muestra biológica con la unión del anticuerpo a una muestra de control, con lo que la unión aumentada del anticuerpo a la muestra biológica con respecto a la muestra de control indica que el sujeto tiene una amiloidosis mediada por transtiretina. Opcionalmente, la muestra biológica y la muestra de control comprenden células del mismo origen tisular. Opcionalmente, la muestra biológica y/o la muestra de control es sangre, suero, plasma o tejidos sólidos. Opcionalmente, el tejido sólido es del corazón, sistema nervioso periférico, sistema nervioso autónomo, riñones, ojos o tracto gastrointestinal.

En cualquiera de los métodos anteriores, la amiloidosis mediada por transtiretina puede ser opcionalmente una amiloidosis por transtiretina familiar o una amiloidosis por transtiretina esporádica. Opcionalmente, la amiloidosis por transtiretina familiar es la miocardiopatía amiloide familiar (FAC), polineuropatía amiloide familiar (FAP) o amiloidosis selectiva del sistema nervioso central (CNSA). Opcionalmente, la amiloidosis por transtiretina esporádica es amiloidosis sistémica senil (SSA) o amiloidosis cardíaca senil (SCA). En cualquiera de los métodos anteriores, la amiloidosis mediada por transtiretina puede asociarse opcionalmente con la acumulación de amiloide en el corazón, el sistema nervioso periférico, el sistema nervioso autónomo, los riñones, los ojos o el tracto gastrointestinal del sujeto.

La descripción proporciona además un método para detectar la presencia o ausencia de depósitos de transtiretina en un sujeto, que comprende poner en contacto una muestra biológica del sujeto que se sospecha que comprende la acumulación de amiloide con una cantidad eficaz de cualquiera de los anticuerpos anteriores. Opcionalmente, el método comprende además detectar la unión del anticuerpo a la transtiretina, en donde la detección del anticuerpo unido indica la presencia de depósitos de transtiretina. Opcionalmente, el método comprende además comparar la unión del anticuerpo a la muestra biológica con la unión del anticuerpo a una muestra de control, con lo que la unión aumentada del anticuerpo a la muestra biológica con respecto a la muestra de control indica que el sujeto tiene una amiloidosis mediada por transtiretina. Opcionalmente, la muestra biológica y la muestra de control comprenden células del mismo origen tisular. Opcionalmente, la muestra biológica y/o la muestra de control es sangre, suero, plasma o tejidos sólidos. Opcionalmente, el tejido sólido es del corazón, sistema nervioso periférico, sistema nervioso autónomo, riñones, ojos o tracto gastrointestinal.

La descripción proporciona además un método para determinar un nivel de depósitos de transtiretina en un sujeto que comprende administrar cualquiera de los anticuerpos anteriores y detectar la presencia de anticuerpo unido en el sujeto. Opcionalmente, la presencia de anticuerpo unido se determina por la tomografía por emisión de positrones (PET).

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1A representa una alineación de regiones variables de cadena pesada del anticuerpo de ratón 9D5, anticuerpos de modelo de ratón, anticuerpos aceptores humanos y versiones humanizadas del anticuerpo 9D5. Las CDR, tal como se definen por Kabat, están encerradas en recuadros, excepto que el primer recuadro es una combinación de la CDR-H1 de Chothia y la CDR-H1 de Kabat, con la CDR-H1 de Kabat subrayada y en negrilla.

La FIG. 1B representa una alineación de regiones variables de cadena ligera del anticuerpo 9D5 de ratón, un anticuerpo de modelo de ratón, un anticuerpo aceptor humano y versiones humanizadas del anticuerpo 9D5. Las CDR, tal como se definen por Kabat, están encerradas en recuadros.

La FIG. 2A representa una alineación de regiones variables de cadena pesada del anticuerpo 14G8 de ratón, un anticuerpo de modelo de ratón, anticuerpos aceptores humanos y versiones humanizadas del anticuerpo 14G8. Las CDR, tal como se definen por Kabat, están encerradas en recuadros, excepto que el primer recuadro cerrado es una combinación de la CDR-H1 de Chothia y la CDR-H1 de Kabat, con la CDR-H1 de Kabat subrayada y en negrilla.

La FIG. 2B representa una alineación de regiones variables de la cadena ligera del anticuerpo 14G8 de ratón, un anticuerpo de modelo de ratón, anticuerpos aceptores humanos y versiones humanizadas del anticuerpo 14G8. Las CDR, tal como se definen por Kabat, están encerradas en recuadros.

FIGS. 3A y 3B. La FIG. 3A representa las curvas de unión de los anticuerpos 5A1, 6C1, 9D5 y 14G8 murinos a TTR tratada a pH4. La FIG. 3B representa las curvas de unión de los anticuerpos murinos 5A1, 6C1, 9D5 y 14G8 a TTR nativa.

FIGS. 4A, 4B y 4C: La FIG. 4A representa la inhibición de la formación de la fibra de TTR-Y78F por anticuerpos mis-TTR. La FiG. 4B representa la inhibición de la formación de la fibra de TTR-V122I por 14G8. La FIG. 4C representa la inhibición de la formación de la fibra de TTR-V122I por un anticuerpo de control.

FIGS. 5A y 5B. La FIG. 5A representa un análisis de densitometría de un análisis de transferencia Western de las muestras de plasma de pacientes confirmados para V30M ATTR (muestra n.° 21, n.° 22, n.° 23, n.° 24, n.° 25, n.° 27) y las muestras de sujetos normales (muestra n.° 11, n.° 12, n.° 15, n.° 18, n.° 19, n.° 20) usando el anticuerpo 9D5 mis-TTR. La FiG. 5B representa un análisis de densitometría de un análisis de transferencia Western de las mismas muestras utilizando el anticuerpo 5A1 mis-TTR.

La FIG. 6 representa un ensayo de placa de MesoScale Discovery (MSD) de las muestras de plasma de pacientes confirmados para V30M ATTR (muestra n.° 21, n.° 22, n.° 23, n.° 24, n.° 25, n.° 27) y las muestras de sujetos normales (muestra n.° 11, n.° 12, n.° 15, n.° 18, n.° 19, n.° 20) utilizando el anticuerpo 6C1.

FIGS. 7A y 7B. La FIG. 7A representa el efecto del anticuerpo 14G8 en la captación de F87M/L110M TTR por células THP-1. La FIG. 7B representa el efecto de cada uno de los anticuerpos mis-TTR en la captación de V30M TTR por células THP-1.

Breve descripción de las secuencias

SEQ ID NO: 1 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 9D5 de ratón.

SEQ ID NO: 2 establece la secuencia de aminoácidos de la plantilla de la estructura de región variable de cadena pesada de ratón 1SEQ_H.

SEQ ID NO: 3 establece la secuencia de aminoácidos del aceptor variable de cadena pesada n.° ACC BAC02114.

SEQ ID NO: 4 establece la secuencia de aminoácidos del aceptor variable de cadena pesada n.° ACC AAX82494.1.

SEQ ID NO: 5 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 9D5 humanizado versión 1 (Hu9D5VHv1).

SEQ ID NO: 6 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 9D5 humanizado versión 2 (Hu9D5VHv2).

SEQ ID NO: 7 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 9D5 humanizado versión 2b (Hu9D5VHv2b).

SEQ ID NO: 8 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 9D5 humanizado versión 3 (Hu9D5VHv3).

SEQ ID NO: 9 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 9D5 humanizado versión 3b (Hu9D5VHv3b).

SEQ ID NO: 10 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 9D5 humanizado versión 4 (Hu9D5VHv4).

SEQ ID NO: 11 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 9D5 humanizado versión 4b (Hu9D5VHv4b).

SEQ ID NO: 12 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 9D5 humanizado versión 5 (Hu9D5VHv5).

SEQ ID NO: 13 establece la secuencia de aminoácidos de CDR-H1 de Kabat del anticuerpo 9D5 de ratón. SEQ ID NO: 14 establece la secuencia de aminoácidos de CDR-H2 de Kabat del anticuerpo 9D5 de ratón SEQ ID NO: 15 establece la secuencia de aminoácidos de CDR-H3 de Kabat del anticuerpo de 9D5 de ratón. SEQ ID NO: 16 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 9D5 de ratón.

SEQ ID NO: 17 establece la secuencia de aminoácidos de la plantilla de la estructura de región variable de cadena ligera de ratón 1MJU_L.

SEQ ID NO: 18 establece la secuencia de aminoácidos variable de cadena ligera del aceptor n.° ACC ABC66952.

SEQ ID NO: 19 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 9D5 humanizado versión 1 (Hu9D5VLv1).

SEQ ID NO: 20 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 9D5 humanizado versión 2 (Hu9D5VLv2).

SEQ ID NO: 21 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 9D5 humanizado versión 3 (Hu9D5VLv3).

SEQ ID NO: 22 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 9D5 humanizado versión 4 (Hu9D5VLv4).

SEQ ID NO: 23 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 9D5 humanizado versión 5 (Hu9D5VLv5).

SEQ ID NO: 24 establece la secuencia de aminoácidos de Kabat CDR-L1 del anticuerpo 9D5 de ratón. SEQ ID NO: 25 establece la secuencia de aminoácidos de Kabat CDR-L2 del anticuerpo 9D5 de ratón. SEQ ID NO: 26 establece la secuencia de aminoácidos de Kabat CDR-L3 del anticuerpo 9D5 de ratón. SEQ ID NO: 27 establece la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 9D5 humanizada versión 1. SEQ ID NO: 28 establece la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 9D5 humanizado versión 2. SEQ ID NO: 29 establece la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 9D5 humanizado versión 2b SEQ ID NO: 30 establece la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 9D5 humanizado versión 3. SEQ ID NO: 31 establece la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 9D5 humanizado versión 3b SEQ ID NO: 32 establece la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 9D5 humanizado versión 4. SEQ ID NO: 33 establece la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 9D5 humanizado versión 4b SEQ ID NO: 34 establece la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 9D5 humanizado versión 5. SEQ ID NO: 35 establece la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de 9D5 humanizado versión 1 SEQ ID NO: 36 establece la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de 9D5 humanizado versión 2 SEQ ID NO: 37 establece la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de 9D5 humanizado versión 3 SEQ ID NO: 38 establece la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de 9D5 humanizado versión 4 SEQ ID NO: 39 establece la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de 9D5 humanizado versión 5 SEQ ID NO: 40 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 9D5 de ratón con péptido de señalización.

SEQ ID NO: 41 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 9D5 de ratón con péptido de señalización.

SEQ ID NO: 42 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 9D5 de ratón con péptido de señalización.

SEQ ID NO: 43 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 9D5 de ratón con péptido de señalización.

SEQ ID NO: 44 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 9D5 humanizado versión 1 (Hu9D5VHv1).

SEQ ID NO: 45 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 9D5 humanizado versión 2 (Hu9D5VHv2).

SEQ ID NO: 46 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 9D5 humanizado versión 2b (Hu9D5VHv2b).

SEQ ID NO: 47 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 9D5 humanizado versión 3 (Hu9D5VHv3).

SEQ ID NO: 48 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 9D5 humanizado versión 3b (Hu9D5VHv3b).

SEQ ID NO: 49 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 9D5 humanizado versión 4 (Hu9D5VHv4).

SEQ ID NO: 50 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 9D5 humanizado versión 4b (Hu9D5VHv4b).

SEQ ID NO: 51 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 9D5 humanizado versión 5 (Hu9D5VHv5).

SEQ ID NO: 52 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 9D5 humanizado versión 1 (Hu9D5VLv1).

SEQ ID NO: 53 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 9D5 humanizado versión 2 (Hu9D5VLv2).

SEQ ID NO: 54 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 9D5 humanizado versión 3 (Hu9D5VLv3).

SEQ ID NO: 55 se establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 9D5 humanizado versión 4 (Hu9D5VLv4).

SEQ ID NO: 56 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 9D5 humanizado versión 5 (Hu9D5VLv5).

SEQ ID NO: 57 establece la secuencia de aminoácidos del péptido de señalización de la región variable de la cadena pesada de 9D5 de ratón.

SEQ ID NO: 58 establece la secuencia de ácido nucleico del péptido de señalización de la región variable de la cadena pesada de 9D5 de ratón.

SEQ ID NO: 59 establece la secuencia de aminoácidos del péptido de señalización de la región variable de la cadena ligera de 9D5 de ratón.

SEQ ID NO: 60 establece la secuencia de ácido nucleico del péptido de señalización de la región variable de la cadena ligera de 9D5 de ratón.

SEQ ID NO: 61 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14G8 de ratón.

SEQ ID NO: 62 establece la secuencia de aminoácidos de la plantilla de la estructura de región variable de cadena pesada de ratón 1MQK_H.

SEQ ID NO: 63 establece la secuencia de aminoácidos de variable de cadena pesada del aceptor n.° ACC AAD30410.1.

SEQ ID NO: 64 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14G8 humanizado versión 1 (Hu14G8VHv1).

SEQ ID NO: 65 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14G8 humanizado versión 2 (Hu14G8VHv2).

SEQ ID NO: 66 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14G8 humanizado versión 3 (Hu14G8VHv3).

SEQ ID NO: 67 establece la secuencia de aminoácidos de CDR-H1 de Kabat del anticuerpo 14G8 de ratón. SEQ ID NO: 68 establece la secuencia de aminoácidos de CDR-H2 de Kabat del anticuerpo 14G8 de ratón. SEQ ID NO: 69 establece la secuencia de aminoácidos de CDR-H3 de Kabat del anticuerpo 14G8 de ratón. SEQ ID NO: 70 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14G8 de ratón.

SEQ ID NO: 71 establece la secuencia de aminoácidos de la plantilla de la estructura de región variable de cadena ligera de ratón 1MJU_L.

SEQ ID NO: 72 establece la secuencia de aminoácidos de variable de cadena ligera del aceptor n.° ACC ABA71374.1.

SEQ ID NO: 73 establece la secuencia de aminoácidos de variable de cadena ligera del aceptor n.° ACC ABC66952.1.

SEQ ID NO: 74 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14G8 humanizado versión 1 (Hu14G8VLv1).

SEQ ID NO: 75 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14G8 humanizado versión 2 (Hu14G8VLv2).

SEQ ID NO: 76 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14G8 humanizado versión 3 (Hu14G8VLv3).

SEQ ID NO: 77 establece la secuencia de aminoácidos de CDR-L1 de Kabat del anticuerpo 14G8 de ratón. SEQ ID NO: 78 establece la secuencia de aminoácidos de CDR-L2 de Kabat del anticuerpo 14G8 de ratón. SEQ ID NO: 79 establece la secuencia de aminoácidos de CDR-L3 de Kabat del anticuerpo 14G8 de ratón. SEQ ID NO: 80 establece la secuencia de aminoácidos de CDR-L1 de Kabat del anticuerpo 14G8 humanizado versión 3 (Hu14G8VLv3).

SEQ ID NO: 81 establece la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 14G8 humanizado versión 1. SEQ ID NO: 82 establece la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 14G8 humanizado versión 2. SEQ ID NO: 83 establece la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 14G8 humanizado versión 3. SEQ ID NO: 84 establece la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de 14G8 humanizado versión 1. SEQ ID NO: 85 establece la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de 14G8 humanizado versión 2. SEQ ID NO: 86 establece la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de 14G8 humanizado versión 3. SEQ ID NO: 87 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14G8 de ratón con péptido de señalización.

SEQ ID NO: 88 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14G8 de ratón con péptido de señalización.

SEQ ID NO: 89 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14G8 de ratón con péptido de señalización.

SEQ ID NO: 90 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14G8 de ratón con péptido de señalización.

SEQ ID NO: 91 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14G8 humanizado versión 1 (Hu14G8VHv1).

SEQ ID NO: 92 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14G8 humanizado versión 2 (Hu14G8VHv2).

SEQ ID NO: 93 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14G8 humanizado versión 3 (Hu14G8VHv3).

SEQ ID NO: 94 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14G8 humanizado versión 1 (Hu14G8VLv1).

SEQ ID NO: 95 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14G8 humanizado versión 2 (Hu14G8VLv2).

SEQ ID NO: 96 establece la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14G8 humanizado versión 3 (Hu14G8VLv3).

SEQ ID NO: 97 establece la secuencia de aminoácidos del péptido de señalización de la región variable de cadena pesada de 14G8 de ratón.

SEQ ID NO: 98 establece la secuencia de ácido nucleico del péptido de señalización de la región variable de cadena pesada de 14G8 de ratón.

SEQ ID NO: 99 establece la secuencia de aminoácidos del péptido de señalización de la región variable de cadena ligera de 14G8 de ratón.

SEQ ID NO: 100 establece la secuencia de ácido nucleico del péptido de señalización de la región variable de cadena ligera de 14G8 de ratón.

SEQ ID NO: 101 establece la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena pesada de IgG1 humana de ejemplo.

SEQ ID NO: 102 establece la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena pesada de IgG1 humana de ejemplo del alotipo G1m3 de IgG1.

SEQ ID NO: 103 establece la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena pesada de IgG1 humana de ejemplo del alotipo G1m3 de IgG1.

SEQ ID NO: 104 establece la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera kappa humana de ejemplo que tiene una arginina N terminal.

SEQ ID NO: 105 establece la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera kappa humana de ejemplo sin una arginina N terminal.

SEQ ID NO: 106 establece la secuencia de ácido nucleico de una región constante de cadena pesada de ejemplo del alotipo de G1m3.

SEQ ID NO: 107 establece la secuencia de ácido nucleico de una región constante de cadena ligera de ejemplo que tiene una arginina N terminal.

SEQ ID NO: 108 establece la secuencia de ácido nucleico de una región constante de cadena ligera de ejemplo sin una arginina N terminal.

SEQ ID NO: 109 establece la secuencia de aminoácidos de transtiretina humana establecida en el número de acceso P02766.1 (UniProt).

SEQ ID NO: 110 establece la secuencia de aminoácidos de transtiretina humana establecida en el número de acceso AAB35639.1 (GenBank).

SEQ ID NO: 111 establece la secuencia de aminoácidos de transtiretina humana establecida en el número de

acceso AAB35640.1 (GenBank).

SEQ ID NO: 112 establece la secuencia de aminoácidos de transtiretina humana establecida en el número de

acceso y ABI63351.1 (GenBank).

SEQ ID NO: 113 establece la secuencia de aminoácidos de

los restos 89-97 de la transtiretina human

SEQ ID NO: 114 establece la secuencia de aminoácidos de

inmunógeno potencial de la transtiretin

SEQ ID NO: 115 establece la secuencia de aminoácidos de

inmunógeno potencial de la transtiretin

SEQ ID NO: 116 establece la secuencia de aminoácidos de

inmunógeno potencial de la transtiretin

SEQ ID NO: 117 establece la secuencia de aminoácidos de la CDR-H1 combinación de Chothia-Kabat del anticuerpo 9D5 de ratón.

SEQ ID NO: 118 establece la secuencia de aminoácidos de la CDR-H1 combinación de Chothia-Kabat del anticuerpo 14G8 de ratón.

Definiciones

Los anticuerpos monoclonales u otras entidades biológicas normalmente se proporcionan en forma aislada.

Esto significa que un anticuerpo u otra entidad biológica está normalmente al menos 50% en p/p puro de

proteínas que interfieren y otros contaminantes que proceden de su producción o purificación, pero no excluye

la posibilidad de que el anticuerpo monoclonal se combine con un exceso de potador(es) farmacéuticamente aceptable(s) u otro vehículo destinado a facilitar su uso. A veces los anticuerpos monoclonales están al menos

60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% en peso/peso puros de proteínas que interfieren y contaminantes de la producción o purificación. A menudo un anticuerpo monoclonal aislado u otra entidad biológica es la especie macromolecular predominante que queda después de su purificación

La unión específica de un anticuerpo a su antígeno objetivo significa una afinidad de al menos 106, 107, 108,

109 o 1010 M-1. La unión específica es detectablemente mayor en magnitud y distinguible de la unión no

específica que se produce a al menos un objetivo no relacionado. La unión específica puede ser el resultado

de la formación de enlaces entre grupos funcionales particulares o ajuste espacial particular (p. ej., de tipo

cerradura y llave) mientras que la unión no específica es generalmente el resultado de fuerzas de van der

Waals. Sin embargo, la unión específica no necesariamente implica que un anticuerpo se une a uno y sólo un

objetivo.

La unidad estructural del anticuerpo básico es un tetrámero de subunidades. Cada tetrámero se compone de

dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente de 25

kDa) y una "pesada"(aproximadamente de 50-70 kDa). La porción de amino terminal de cada cadena incluye

una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. Esta región variable se expresa inicialmente ligada a un péptido de señalización escindible. La región variable sin el péptido de señalización se denomina a veces como una región variable

madura. Así, por ejemplo, una región variable madura de cadena ligera significa una región variable de cadena

ligera sin el péptido de señalización de la cadena ligera. La porción carboxi-terminal de cada cadena define

una región constante principalmente responsable de la función efectora.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu,

alfa, delta o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro

de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes se unen por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. Véase en general, Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2a ed.

Raven Press, N.Y., 1989, Cap. 7.

Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina (también denominada en el presente documento "dominio variable de cadena ligera" ("dominio VL") o "dominio variable de cadena pesada" ("dominio

VH") respectivamente), consiste en una región "armazón" Interrumpida por tres "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR". Las regiones armazón sirven para alinear las CDR para la unión específica a un

epítopo de un antígeno. Las CDR incluyen los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son principalmente responsables de la unión del antígeno. Del extremo amino al extremo carboxilo, los dominios tanto VL como

VH comprenden las siguientes regiones armazón (FR) y CDR: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4.

Las CDR 1, 2 y 3 de un dominio VL también se denominan en el presente documento, respectivamente, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3; las CDR 1, 2 y 3 de un dominio VH también se denominan en el presente documento, respectivamente, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3.

La asignación de aminoácidos para cada dominio VL y VH es de acuerdo con cualquier definición convencional de CDR. Las definiciones convencionales incluyen, la definición de Kabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991), la definición de Chothia (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342:878-883, 1989); una combinación de las CDR de Chothia-Kabat en la que la CDR-H1 es una combinación de CDR de Chothia y Kabat; la definición de AbM usada por el software de modelización de anticuerpos de Oxford Molecular; y la definición de contacto de Martin et al. (bioinfo.org.uk/abs) (véase la Tabla 1). Kabat proporciona una convención de numeración ampliamente utilizada (numeración de Kabat) en la cual se asignan a los restos correspondientes entre diferentes cadenas pesadas o entre diferentes cadenas ligeras el mismo número. Cuando se dice que un anticuerpo comprende CDR por una cierta definición de CDR (p. ej., Kabat) esa definición especifica el número mínimo de restos de CDR presentes en el anticuerpo (es decir, las CDR de Kabat). No excluye que también estén presentes otros restos que están dentro de otra definición de CDR convencional, pero que están fuera de la definición especificada. Por ejemplo, un anticuerpo que comprende CDR definidas por Kabat incluye entre otras posibilidades, un anticuerpo en el que las CDR contienen restos de CDR de Kabat y ningún otro resto de CDR y un anticuerpo en el cual la CDR H1 es una combinación de CDR H1 de Chothia Kabat y otras CDR contienen restos de CDR de Kabat y ningún resto de CDR adicional basado en otras definiciones.

Tabla 1

El término "anticuerpo" incluye anticuerpos intactos y sus fragmentos de unión. Por lo general, los fragmentos compiten con el anticuerpo intacto del cual se derivaron por la unión específica al objetivo incluyendo cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, Dabs, nanocuerpos y Fv. Los fragmentos pueden producirse por técnicas de ADN recombinante, o por separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. El término "anticuerpo" incluye también un anticuerpo biespecífico y/o un anticuerpo humanizado. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares diferentes de cadena pesada/ligera y dos sitios de unión diferentes (véase, p. ej., Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)). En algunos anticuerpos biespecíficos, los dos pares diferentes de cadena pesada/ligera incluyen un par de cadena pesada/cadena ligera de 9D5 humanizado y un par de cadena pesada/cadena ligera específico para un epítopo diferente en la transtiretina que al que se une 9D5. En algunos anticuerpos biespecíficos, los dos pares diferentes de cadenas pesada/ligera incluyen un par de cadena pesada/cadena ligera de 14G8 humanizado y un par de cadena pesada/cadena ligera específico para un epítopo diferente en la transtiretina que al que se une 14G8.

En algunos anticuerpos biespecíficos, un par de cadena pesada/cadena ligera es un anticuerpo 9D5 o 14G8 humanizado como se describe más adelante y el otro par de cadena pesada/cadena ligera es de un anticuerpo que se une a un receptor expresado en la barrera hematoencefálica, tal como un receptor de insulina, un receptor de factor de crecimiento similar a insulina (IGF), un receptor de leptina, o un receptor de lipoproteína, o un receptor de transferrina (Friden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4771-4775, 1991; Friden et al., Science 259:373-377, 1993). Tal anticuerpo biespecífico puede ser transferido a través de la barrera hematoencefálica por transcitosis mediada por receptor. La captación cerebral del anticuerpo biespecífico puede potenciarse adicionalmente mediante la modificación del anticuerpo biespecífico para reducir su afinidad al receptor de la barrera hematoencefálica. La afinidad reducida por el receptor daba como resultado una distribución más amplia en el cerebro (véase, p. ej., Atwal et al., Sci. Trans. Med. 3, 84ra43, 2011; Yu et al., Sci. Trans. Med. 3, 84ra44, 2011).

Anticuerpos biespecíficos de ejemplo también pueden ser: (1) un anticuerpo de dominio variable dual (DVD-Ig), donde cada cadena pesada y cadena ligera contienen dos dominios variables en tándem a través de un ligamiento de péptido corto (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, en: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (2) un Tandab, que es una fusión de dos diacuerpos de cadena sencilla que da como resultado un anticuerpo biespecífico tetravalente que tiene dos sitios de unión para cada uno de los antígenos objetivo; (3) un flexibody, que es una combinación de scFv con un diacuerpo que da como resultado una molécula polivalente; (4) una molécula llamada de "acoplamiento y bloqueo" (Dock and Lock), basada en el "dominio de dimerización y acoplamiento" en la proteína quinasa A, la cual, cuando se aplica a los Fab, puede producir una proteína de unión biespecífica trivalente que consiste en dos fragmentos Fab idénticos unidos a un fragmento Fab diferente; o (5) una molécula llamada Escorpión, que comprende, p. ej., dos scFv fusionados a ambos extremos de una región Fc humana. Ejemplos de plataformas útiles para preparar anticuerpos biespecíficos incluyen BiTE (Micromet), DART (MacroGenics), Fcab y Mab2 (F-star), IgG1 modificada con Fc (Xencor) o DuoBody (basado en el intercambio de brazo Fab, Genmab).

El término "epítopo" se refiere a un sitio en un antígeno al que se une un anticuerpo. Un epítopo puede estar formado a partir de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una o más proteínas. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos (también conocidos como epítopos lineales) normalmente son retenidos tras exposición a disolventes desnaturalizantes mientras que los epítopos formados por plegado terciario (también conocidos como epítopos conformacionales) se pierden normalmente en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo por lo general comprende al menos 3 y más generalmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Por ejemplo, métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, p. ej., Epitope Mapping Protocols, en Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996). El epítopo puede ser lineal, tal como un epítopo de, por ejemplo, 2-5, 3-5, 3-9, o 5-9 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 109. El epítopo puede ser también un epítopo conformacional que incluye, por ejemplo, dos o más segmentos no contiguos de aminoácidos dentro de los restos 89-97 de la s Eq ID n O: 109.

Si un anticuerpo se dice que se une a un epítopo en los aminoácidos 89-97 de la transtiretina (TTR), por ejemplo, lo que se quiere decir es que el epítopo está dentro del intervalo citado de aminoácidos incluyendo los que definen los límites exteriores del intervalo. Esto no significa necesariamente que cada aminoácido dentro del intervalo forma parte del epítopo. Así, por ejemplo, un epítopo dentro de los aminoácidos 89-97 de TTR puede consistir en los aminoácidos 89-97, 89-96, 90-96, 91-96, 92-96, 93-96, 94-96, 89-96, 89-95, 89-94, 89-93, 89-92 o 89-93, entre otros segmentos lineales de la SEQ ID NO: 113, o en el caso de epítopos conformacionales, segmentos no contiguos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 113.

Los anticuerpos que reconocen los mismos epítopos o que se solapan se pueden identificar en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para competir con la unión de otro anticuerpo a un antígeno objetivo. El epítopo de un anticuerpo puede también definirse por cristalografía de rayos X del anticuerpo unido a su antígeno para identificar los restos de contacto. Alternativamente, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos tienen epítopos que se solapan si algunas mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro

La competición entre anticuerpos se determina mediante un ensayo en el cual un anticuerpo sometido a ensayo inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común (véase, p. ej, Junghans et al., Cáncer Res. 50:1495, 1990). Un anticuerpo de ensayo compite con un anticuerpo de referencia si un exceso de un anticuerpo de ensayo (p. ej., al menos 2x, 5x, 10x, 20x o 100x) inhibe la unión del anticuerpo de referencia en al menos 50% como se mide en un ensayo de unión competitiva. Algunos anticuerpos de ensayo inhiben la unión del anticuerpo de referencia en al menos 75%, 90% o 99%. Los anticuerpos identificados mediante ensayo de competición (anticuerpos competidores) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo unido por el anticuerpo de referencia para que se produzca impedimento estérico.

El término "nativa" con respecto a la estructura de la transtiretina (TTR) se refiere a la estructura plegada normal de TTR en su estado de funcionamiento correcto (es decir, un tetrámero de TTR). Ya que la TTR es un tetrámero en su forma plegada nativa, las formas no nativas de TTR incluyen, por ejemplo, tetrámeros de TTR mal plegados, monómeros de TTR, formas agregadas de TTR y formas de fibrillas de TTR. Las formas no nativas de TTR pueden incluir moléculas que comprenden secuencias de aminoácidos de TTR de tipo natural o mutaciones.

La expresión "mal plegada" con respecto a la TTR se refiere a la estructura secundaria y terciaria de un monómero o multímero de polipéptido TTR, e indica que el polipéptido ha adoptado una conformación que no es normal para esa proteína en su estado de funcionamiento correcto. Aunque el mal plegamiento de la TTR puede ser causado por mutaciones en la proteína (p. ej., eliminación, sustitución o adición), proteínas de TTR de tipo natural también pueden estar mal plegadas en enfermedades, exponiendo epítopos específicos.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que el vehículo, diluyente, excipiente o auxiliar es compatible con los demás ingredientes de la formulación y no es sustancialmente perjudicial para el receptor del mismo.

El término "paciente" incluye seres humanos y otros sujetos mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.

Un individuo está en mayor riesgo de una enfermedad si el sujeto tiene al menos un factor de riesgo conocido (p. ej., genético, bioquímico, antecedentes familiares y exposición situacional) que pone a los individuos con ese factor de riesgo en un mayor riesgo estadísticamente significativo de desarrollar la enfermedad que los individuos sin el factor de riesgo.

La expresión "muestra biológica" se refiere a una muestra de material biológico dentro o que puede obtenerse a partir de una fuente biológica, por ejemplo, un sujeto humano o mamífero. Tales muestras pueden ser órganos, orgánulos, tejidos, secciones de tejidos, fluidos corporales, sangre periférica, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, células, moléculas tales como proteínas y péptidos, y cualquier parte o combinación derivada de los mismos. La expresión muestra biológica también puede abarcar cualquier material derivado por procesamiento de la muestra. El material derivado puede incluir células o su progenie. El procesamiento de la muestra biológica puede implicar uno o más de filtración, destilación, extracción, concentración, fijación, inactivación de componentes que interfieren y similares.

La expresión "muestra de control" se refiere a una muestra biológica que no se sabe o sospecha que incluya formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o de fibrillas de transtiretina (TTR), tal como en los depósitos de amiloide TTR. Las muestras de control pueden obtenerse de individuos no afectados con una amiloidosis TTR o un tipo específicamente elegido de amiloidosis TTR. Alternativamente, se pueden obtener muestras de control de pacientes afectados con amiloidosis TTR o un tipo específicamente elegido de amiloidosis TTR. Dichas muestras pueden obtenerse al mismo tiempo que una muestra biológica que se cree que comprende la amiloidosis TTR o en una ocasión diferente. Tanto una muestra biológica como una muestra de control se pueden obtener del mismo tejido (p. ej., una sección de tejido que contiene tanto depósitos de amiloide TTR como tejido normal circundante). Preferiblemente, las muestras de control consisten esencial o exclusivamente en tejido libre de depósitos de amiloide TTR y se puede utilizar en la comparación con una muestra biológica que se cree que comprende depósitos de amiloide TTR. Preferiblemente, el tejido de la muestra de control es del mismo tipo que el tejido de la muestra biológica (p. ej., cardiomiocitos en el corazón).

El término "enfermedad" se refiere a cualquier condición anormal que deteriora la función fisiológica. El término se utiliza ampliamente para abarcar cualquier trastorno, enfermedad, anomalía, patología, enfermedad, afección o síndrome en el cual se vea afectada la función fisiológica, independientemente de la naturaleza de la etiología.

El término "síntoma" se refiere a una evidencia subjetiva de una enfermedad, tal como la marcha alterada, percibida por el sujeto. Un "signo" se refiere a evidencia objetiva de una enfermedad según lo observado por un médico.

Con el fin de clasificar las sustituciones de aminoácidos como conservadoras o no conservadoras, los aminoácidos se agrupan de la siguiente manera: Grupo I (cadenas laterales hidrofóbicas): met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrofílicas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (restos que influyen en la orientación de la cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservadoras implican sustituciones entre los aminoácidos en la misma clase. Sustituciones no conservadoras constituyen el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra.

Las identidades de secuencias porcentuales se determinan con secuencias de anticuerpos alineadas al máximo por la convención de numeración de Kabat. Después de la alineación, si se compara una región de anticuerpo objeto (p. ej., toda la región variable madura de una cadena pesada o ligera) con la misma región de un anticuerpo de referencia, el porcentaje de identidad de secuencia entre las regiones del anticuerpo objeto y de referencia es el número de posiciones ocupadas por el mismo aminoácido tanto en la región del anticuerpo objeto como en la de referencia dividido por el número total de posiciones alineadas de las dos regiones, con huecos no contabilizados, multiplicado por 100 para convertir en porcentaje.

Las composiciones o métodos "que comprenden" o "que incluyen" uno o más elementos citados pueden incluir otros elementos no citados. Por ejemplo, una composición que "comprende" o "incluye" un anticuerpo puede contener el anticuerpo solo o en combinación con otros ingredientes.

La designación de un intervalo de valores incluye todos los números enteros dentro de o que definen el intervalo, y todos los subintervalos definidos por números enteros dentro del intervalo.

A menos que esté claro de otro modo a partir del contexto, el término "aproximadamente" abarca valores dentro de un margen de error estándar de medición (p. ej., SEM) de un valor establecido.

La significación estadística significa p<0.05.

Las formas singulares "un", "uno", "una", y, "el" y "la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

Descripción detallada

I. General

La descripción proporciona anticuerpos que se unen específicamente a los restos 89-97 de la transtiretina (TTR). Los anticuerpos tienen la capacidad de unirse a formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR. Los anticuerpos pueden usarse para tratar o efectuar la profilaxis de enfermedades o trastornos asociados con acumulación de TTR o acumulación de depósitos de TTR (p. ej., amiloidosis TTR). Los anticuerpos también pueden usarse para diagnosticar la amiloidosis TTR e inhibir o reducir la agregación de TTR, entre otras aplicaciones.

II. Moléculas Objetivo

La transtiretina (TTR) es una proteína de transporte en el suero y el líquido cefalorraquídeo de 127 aminoácidos, 55 kDa, principalmente sintetizada por el hígado. También se ha denominado prealbúmina, prealbúmina de unión a tiroxina, ATTR y TBPA. En su estado nativo, la TTR existe como un tetrámero. En los homocigotos, los tetrámeros comprenden subunidades ricas en hoja beta de 127 aminoácidos idénticas. En los heterocigotos, los tetrámeros de TTR se componen de subunidades variantes y/o de tipo natural, normalmente combinadas de una manera estadística.

La función establecida de la TTR en la sangre es transportar la proteína de unión al holo-retinol. Aunque la TTR es el principal portador de tiroxina (T4) en la sangre de los roedores, utilizando sitios de unión que son ortogonales a los usados para la proteína de unión al holo-retinol, los sitios de unión de T4 están efectivamente desocupados en los seres humanos.

La TTR es una de al menos treinta proteínas humanas diferentes cuyo mal plegamiento y/o mal ensamblaje extracelular (amiloidogénesis) en un espectro de estructuras de agregados se cree que causa enfermedades degenerativas denominadas enfermedades amiloides. La TTR sufre cambios conformacionales para convertirse en amiloidogénica. El desplegado parcial expone tramos de restos hidrofóbicos en gran parte no cargados en una conformación extendida que se desmontan eficientemente en agregados esféricos en gran parte no estructurados que finalmente sufren conversión de conformación en estructuras amiloides de hoja beta cruzada.

A menos que sea evidente otra cosa a partir del contexto, la referencia a transtiretina (TTR) o sus fragmentos o dominios incluye las secuencias de aminoácidos naturales humanas incluyendo isoformas, mutantes y variantes alélicas de los mismos. Las secuencias de polipéptido TTR de ejemplo se designan mediante los números de acceso P02766.1 (UniProt), AAB35639.1 (GenBank), AAB35640.1 (GenBank) y AB163351.1 (GenBank) (SEQ ID NOS: 109-112, respectivamente). Los restos se numeran de acuerdo con Swiss Prot P02766.1, con el primer aminoácido de la proteína madura (es decir, sin incluir la secuencia señal de 20 aminoácidos) denominado resto 1. En cualquier otra proteína TTR, los restos están numerados según los restos correspondientes en P02766.1 en alineación máxima.

III. Amiloidosis por transtiretina

La amiloidosis por transtiretina (TTR) es un trastorno sistémico caracterizado por TTR mal plegada, patogénica y la deposición extracelular de fibrillas amiloides compuestas de TTR. La amiloidosis TTR es generalmente causada por la desestabilización de la forma de tetrámero nativa de la TTR (debido a condiciones ambientales o genéticas), que lleva a la disociación, mal plegado y agregación de TTR en fibrillas amiloides que se acumulan en diversos órganos y tejidos, causando disfunción progresiva. Véase, p. ej., Almeida y Saraiva, FEBS Letters 586:2891-2896 (2012); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013).

En seres humanos, los tetrámeros de TTR de tipo natural y los tetrámeros mixtos compuestos por subunidades mutantes y de tipo natural pueden disociarse, plegarse mal y agregarse, conduciendo el proceso de amiloidogénesis a la degeneración del tejido post-mitótico. De este modo, las amiloidosis de TTR abarcan enfermedades causadas por TTR mal plegada patogénica resultante de mutaciones en TTR o resultante de TTR no mutada, mal plegada.

Por ejemplo, la amiloidosis sistémica senil (SSA) y la amiloidosis cardíaca senil (SCA) son tipos de amiloidosis relacionadas con la edad que resultan de la deposición de amiloide TTR de tipo natural fuera y dentro de los cardiomiocitos del corazón. La amiloidosis TTR es también la forma más común de amiloidosis hereditaria (familiar), causada por mutaciones que desestabilizan la proteína TTR. Las amiloidosis TTR asociadas con mutaciones puntuales en el gen de la TTR incluyen polineuropatía amiloide familiar (FAP), miocardiopatía amiloide familiar (FAC) y la rara amiloidosis selectiva del sistema nervioso central (CNSA). Los pacientes con amiloidosis TTR hereditaria (familiar) son casi siempre heterocigotos, lo que significa que los tetrámeros de TTR están compuestos de subunidades de TTR mutantes y/o de tipo natural, generalmente distribuidas estadísticamente. Las versiones hereditarias (familiares) de la amiloidosis TTR son generalmente autosómicas dominantes y suelen ser de inicio más temprano que las enfermedades esporádicas (SSA y SCA).

Hay más de 100 mutaciones en el gen que codifica la TTR que se han implicado en los trastornos autosómicos dominantes FAP y FAC. Véase, p. ej., documento US 2014/0056904; Saraiva, Hum. Mutat. 17(6):493-503 (2001); Damas y Saraiva, J. Struct. Biol. 130:290-299; Dwulet y Benson, Biochem. Biophys. Res. Commun.

114:657-662 (1983). Estas mutaciones causantes de amiloide están distribuidas a lo largo de toda la molécula de TTR. Generalmente, cuanto más desestabilizantes son las subunidades mutantes para la estructura del tetrámero de TTR, más temprano se inicia la enfermedad amiloide. El potencial patógeno de una variante de TTR generalmente está determinado por una combinación de su inestabilidad y su eficiencia de secreción celular. La patología inicial causada por algunas variantes de TTR viene de su destrucción selectiva del tejido cardiaco, mientras que a partir de otras variantes de TTR viene de comprometer el sistema nervioso periférico y autónomo. El daño tisular causado por la amiloidogénesis TTR parece derivar en gran medida de la toxicidad de pequeños agregados de TTR difusibles, aunque la acumulación de amiloide extracelular puede contribuir y casi ciertamente compromete la estructura del órgano en las últimas etapas de la amiloidosis TTR.

La amiloidosis TTR se presenta de muchas formas diferentes, con una considerable variación fenotípica entre individuos y localizaciones geográficas. Por ejemplo, la amiloidosis TTR puede presentarse como una neuropatía sensorial autonómica y motora progresiva, axonal. La amiloidosis TTR también puede presentarse como miocardiopatía infiltrativa.

La edad de inicio de los síntomas relacionados con la enfermedad varía entre la segunda y la novena década de vida, con grandes variaciones entre diferentes poblaciones. La implicación multisistémica de la amiloidosis TTR es una clave para su diagnóstico. Por ejemplo, se considera el diagnóstico de amiloidosis TTR cuando uno o varios de los siguientes están presentes: (1) antecedentes familiares de enfermedad neuropática, especialmente asociada con insuficiencia cardíaca; (2) dolor neuropático o alteraciones sensoriales progresivas de etiología desconocida; (3) síndrome del túnel carpiano sin causa obvia, particularmente si es bilateral y requiere liberación quirúrgica; (4) trastornos de la motilidad gastrointestinal o disfunción del nervio autonómico de etiología desconocida (p. ej., disfunción eréctil, hipotensión ortostática, vejiga neurogénica); (5) enfermedad cardiaca caracterizada por paredes ventriculares engrosadas en ausencia de hipertensión; (6) bloqueo auriculoventricular avanzado de origen desconocido, particularmente cuando está acompañado de un corazón engrosado; y (6) inclusiones del cuerpo vítreo del tipo algodón-lana. Véase Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). Otros síntomas pueden incluir, por ejemplo, polineuropatía, pérdida sensorial, dolor, debilidad en miembros inferiores, dishidrosis, diarrea, estreñimiento, pérdida de peso e incontinencia/retención urinaria.

El diagnóstico de amiloidosis TTR se basa normalmente en biopsias de órganos objetivo, seguido de tinción histológica del tejido extirpado con el colorante específico de amiloide, rojo Congo. Si se observa una prueba positiva para amiloide, se realiza posteriormente tinción inmunohistoquímica para TTR para asegurar que la proteína precursora responsable de la formación de amiloide es realmente TTR. Para las formas familiares de las enfermedades, la demostración de una mutación en el gen que codifica la TTR es entonces necesaria antes de que se pueda hacer el diagnóstico. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante electroforesis de enfoque isoeléctrico, reacción en cadena de la polimerasa o disección láser/cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem. Véase, p. ej, US 2014/0056904; Ruberg y Berk, Circulation 126:1286-1300 (2012); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013).

IV. Anticuerpos

A. Especificidad de unión y propiedades funcionales

La descripción proporciona anticuerpos monoclonales que se unen a la proteína transtiretina (TTR), más específicamente, a epítopos dentro de los restos de aminoácidos 89-97 (SEQ ID NO: 113) de la TTR. Tales epítopos están enterrados en el tetrámero de TTR nativo y expuestos en formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR.

Los anticuerpos designados 9D5 y 14G8 son dos de tales anticuerpos de ratón de ejemplo. A menos que sea de otro modo evidente a partir del contexto, la referencia a 9D5 o 14G8 debe entenderse que se refiere a cualesquiera de las formas de ratón, quiméricas, de superficie modificada y humanizadas de estos anticuerpos. Estos anticuerpos se unen específicamente dentro de los restos de aminoácidos 89-97 (SEQ ID NO: 113) de TTR. Estos anticuerpos se caracterizan adicionalmente por su capacidad para unirse a formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR, pero no a formas tetraméricas nativas de TTR. Además, estos anticuerpos se caracterizan por su inmunorreactividad en el tejido cardíaco de la amiloidosis mediada por TTR, pero no en el tejido cardíaco sano. La capacidad de unirse a proteínas específicas o fragmentos de las mismas puede demostrarse utilizando formatos de ensayo de ejemplo proporcionados en los ejemplos.

Algunos anticuerpos se unen al mismo epítopo o epítopo que solapa como un anticuerpo designado 9D5 o 14G8. Las secuencias de las regiones variables de cadenas pesada y ligera maduras de estos anticuerpos se designan SEQ ID NOS: 1 y 16 (9D5) y 61 y 70 (14G8), respectivamente. Otros anticuerpos que tienen tal especificidad de unión pueden producirse por inmunización de ratones con TTR, o una porción de la misma que incluye el epítopo deseado (p. ej., SEQ ID NO: 113) y cribado de anticuerpos resultantes según la unión a la TTR monomérica o un péptido que comprende la SEQ ID NO: 113, opcionalmente en competencia con un anticuerpo que tiene las regiones variables 9D5 y 14G8 de ratón (kappa IgG1). Los fragmentos de TTR que incluyen el epítopo deseado pueden unirse a un portador que ayuda a producir una respuesta de anticuerpos contra el fragmento y/o combinarse con un adyuvante que ayuda a producir dicha respuesta. Tales anticuerpos se pueden cribar según la unión diferencial a versiones monoméricas, de TTR tipo natural o un fragmento de la misma (p. ej., SEQ ID NO: 113) en comparación con mutantes de restos especificados. El cribado frente a tales mutantes define más precisamente la especificidad de unión para permitir la identificación de anticuerpos cuya unión es inhibida por mutagénesis de restos particulares y que es probable que compartan las propiedades funcionales de otros anticuerpos ejemplificados. Las mutaciones pueden ser una sustitución sistemática de sustitución con alanina (o serina si ya está presente una alanina) un resto cada vez, o intervalos más ampliamente espaciados, a lo largo del objetivo o a lo largo de una sección del mismo en la cual se sabe que reside un epítopo. Si el mismo conjunto de mutaciones reduce significativamente la unión de dos anticuerpos, los dos anticuerpos se unen al mismo epítopo.

Los anticuerpos que tienen la especificidad de unión de un anticuerpo murino seleccionado (p. ej., 9D5 o 14G8) también pueden producirse usando una variante del método de presentación en fagos. Véase Winter, WO 92/20791. Este método es particularmente conveniente para la producción de anticuerpos humanos. En este método, se utiliza ya sea la región variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo murino seleccionado como material de partida. Si, por ejemplo, una región variable de cadena ligera es seleccionada como material de partida, se construye una biblioteca de fagos en la que los miembros presentan la misma región variable de cadena ligera (es decir, el material de partida murino) y una región variable de cadena pesada diferente. Las regiones variables de cadena pesada pueden obtenerse, por ejemplo, de una biblioteca de regiones variables de cadena pesada humanas reordenadas. Se selecciona un fago que muestra fuerte unión específica (p. ej., al menos 108 y preferiblemente al menos 109 M-1) a la TTR monomérica o un fragmento de la misma (p. ej., restos de aminoácidos 89-97). La región variable de cadena pesada de este fago sirve entonces como un material de partida para construir una biblioteca de fagos adicional. En esta biblioteca, cada fago presenta la misma región variable de cadena pesada (es decir, la región identificada a partir de la primera biblioteca de presentación) y una región variable de cadena ligera diferente. Las regiones variables de cadena ligera se pueden obtener, por ejemplo, de una biblioteca de regiones de cadena ligera variable humanas reordenadas. Otra vez, se selecciona un fago que muestra unión fuerte específica para la TTR monomérica o un fragmento de la misma (p. ej., restos de aminoácidos 89-97). Los anticuerpos resultantes tienen generalmente la misma o similar especificidad del epítopo que el material de partida murino. Las CDR de Kabat de cadena pesada de 9D5 se designan SEQ ID NOS: 13-15, respectivamente, y las CDR de Kabat de la cadena ligera de 9D5 se designan SEQ ID NO: 24-26, respectivamente. Una CDR-H1 combinación de Chothia-Kabat de 9D5 se designa SEQ ID NO: 117. Las CDR de Kabat de la cadena pesada de 14G8 se designan SEQ ID NOS: 67-69, respectivamente, y las CDR de Kabat de la cadena ligera de 14G8 se designan SEQ ID NO: 77-79, respectivamente. Una CDR-H1 combinación de Chothia-Kabat de 14G8 se designa SEQ ID NO: 118. Una variante de CDR-L1 de 14G8 se designa SEQ ID NO: 80.

Otros anticuerpos pueden obtenerse mediante mutagénesis del ADNc que codifica las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo de ejemplo, tal como 9D5 o 14G8. Lo anticuerpos monoclonales que son al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticos a 9D5 o 14G8 en la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadenas pesada y/o ligera maduras y mantienen sus propiedades funcionales, y/o que difieren del anticuerpo respectivo por un pequeño número de sustituciones (p. ej., sustituciones conservadoras), deleciones o inserciones de aminoácidos funcionalmente insignificantes también se incluyen en la invención. También se incluyen los anticuerpos monoclonales que tienen al menos una o las seis ^c D^r como se define por cualquier definición convencional, pero preferiblemente Kabat, que son 90%, 95%, 99% o 100% idénticas a las CDR correspondientes de 9D5 o 14G8.

La descripción también proporciona anticuerpos que tienen algunas o todas (p. ej., 3, 4, 5, y 6) las CDR total o sustancialmente de 9D5 o 14G8. Dichos anticuerpos pueden incluir una región variable de cadena pesada que tiene al menos dos, y habitualmente las tres, CDR total o sustancialmente de la región variable de cadena pesada de 9D5 o 14G8 y/o una región variable de cadena ligera que tiene al menos dos, y habitualmente la tres, CDR total o sustancialmente de la región variable de cadena ligera de 9D5 o 14G8. Los anticuerpos pueden incluir tanto cadenas pesadas como ligeras. Una CDR es substancialmente de una CDR de 9D5 o 14G8 correspondiente cuando contiene no más de 4, 3, 2 o 1 sustituciones, inserciones o deleciones, excepto que CDR-H2 (cuando se define por Kabat) no puede tener más de 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones, inserciones o deleciones. Tales anticuerpos pueden tener una identidad de al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con 9D5 o 14G8 en la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera maduras y mantienen sus propiedades funcionales, y/o se diferencian de 9D5 o 14G8 por un pequeño número de sustituciones (p. ej., sustituciones conservadoras), deleciones o inserciones de aminoácidos funcionalmente insignificantes.

Algunos anticuerpos identificados mediante tales ensayos pueden unirse a formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR, pero no a formas tetraméricas nativas de TTR, como se describe en los ejemplos o de otro modo. Del mismo modo, algunos anticuerpos son inmunorreactivos en el tejido amiloideo mediado por TTR, pero no en tejido sano.

Algunos anticuerpos pueden inhibir o reducir la agregación de TTR, inhibir o reducir la formación de fibrillas de TTR, reducir o eliminar depósitos de TTR o TTR agregada, o estabilizar conformaciones no tóxicas de TTR en un modelo animal o ensayo clínico. Algunos anticuerpos pueden tratar, realizar profilaxis de o retrasar la aparición de una amiloidosis TTR como se muestra en un modelo animal o ensayo clínico. Los modelos animales de ejemplo para el ensayo de actividad contra una amiloidosis TTR incluyen los descritos en Kohno et al., Am. J. Path. 150(4):1497-1508 (1997); Teng et al., Laboratory Investigations 81:385-396 (2001); Wakasugi et al., Proc. Japan Acad. 63B:344-347 (1987); Shimada et al., Mol. Biol. Med. 6:333-343 (1989); Nagata et al., J. Biochem. 117:169-175 (1995); Sousa et al., Am. J. Path. 161:1935-1948 (2002); y Santos et al., Neurobiology of Aging 31:280-289 (2010).

B. Anticuerpos no humanos

La producción de otros anticuerpos no humanos, p. ej., murino, de cobayo, primate, conejo o rata, contra TTR monomérica o un fragmento de la misma (p. ej., restos de aminoácidos 89-97) se puede lograr mediante, por ejemplo, la inmunización del animal con t Tr o un fragmento de la misma. Véase Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988). Dicho inmunógeno puede obtenerse a partir de una fuente natural, por síntesis peptídica, o por expresión recombinante. Opcionalmente, el inmunógeno se puede administrar fusionado o complejado de otro modo con una proteína portadora. Opcionalmente, el inmunógeno se puede administrar con un adyuvante. Pueden utilizarse varios tipos de adyuvante como se describe a continuación. Se prefiere el adyuvante de Freund completo seguido de adyuvante incompleto para la inmunización de animales de laboratorio. Los conejos o cobayos normalmente se utilizan para la fabricación de anticuerpos policlonales. Los ratones se suelen utilizar para la fabricación de anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos se criban por la unión específica a la TTR monomérica o un epítopo dentro de la TTR (p. ej., un epítopo que comprende uno o más restos de aminoácidos 89-97). Dicho cribado se puede conseguir determinando la unión de un anticuerpo a una colección de variantes de TTR monoméricas, tales como variantes de TTR que contienen los restos de aminoácidos 89-97 o mutaciones dentro de estos restos, y determinando qué variantes de TTR se unen al anticuerpo. La unión puede evaluarse, por ejemplo, por transferencia Western, FACS o ELISA.

C. Anticuerpos Humanizados

Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo genéticamente modificado en el que las CDR de un anticuerpo “donador” no humano se injertan en secuencias del anticuerpo “aceptor” humano (véase, p. ej., Queen, US 5,530,101 y 5,585,089; Winter, US 5,225,539; Carter, US 6,407,213; Adair, US 5,859,205; y Foote, US 6,881,557). Las secuencias de anticuerpo aceptor pueden ser, por ejemplo, una secuencia de anticuerpo humano madura, una combinación de tales secuencias, una secuencia de consenso de secuencias de anticuerpos humanos o una secuencia de la región de la línea germinal. Por lo tanto, un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que tiene al menos tres, cuatro, cinco o todas las CDR entera o sustancialmente de un anticuerpo donador y secuencias de regiones armazón de regiones variables y regiones constantes, si están presentes, entera o sustancialmente de secuencias de anticuerpos humanos. De forma similar, una cadena pesada humanizada tiene al menos una, dos y normalmente las tres CDR entera o sustancialmente de una cadena pesada de anticuerpo donador, y una secuencia de región armazón de región variable de cadena pesada y región constante de cadena pesada, si está presente, sustancialmente de secuencias de regiones armazón de región variable de cadena pesada y de regiones constantes humanas. Asimismo, una cadena ligera humanizada tiene al menos una, dos y generalmente las tres CDR entera o sustancialmente de una cadena ligera del anticuerpo donador y una secuencia de región armazón de región variable de cadena ligera y región constante de cadena ligera, si está presente, sustancialmente de secuencias de regiones armazón de región variable de cadena ligera y de región constante humanas. Aparte de los nanocuerpos y dAb, un anticuerpo humanizado comprende una cadena pesada humanizada y una cadena ligera humanizada. Una CDR en un anticuerpo humanizado es sustancialmente de una CDR correspondiente en un anticuerpo no humano cuando al menos 85%, 90%, 95% o 100% de restos correspondientes (como se define por cualquier definición convencional, pero preferiblemente definidos por Kabat) son idénticos entre las respectivas CDR. Las secuencias de regiones armazón de región variable de una cadena de anticuerpo o de región constante de una cadena de anticuerpo son sustancialmente de una secuencia de región armazón de región variable humana o región constante humana respectivamente cuando al menos 85%, 90%, 95% o 100% de restos correspondientes definidos por cualquier definición convencional, pero preferiblemente definidos por Kabat son idénticos.

Aunque los anticuerpos humanizados a menudo incorporan las seis CDR (definidas por cualquier definición convencional, pero preferiblemente como se define por Kabat) de un anticuerpo de ratón, también pueden hacerse con menos de todas las CDR (p. ej., al menos 3, 4, o 5 CDR) de un anticuerpo de ratón (p. ej., Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., J. of Mol. Biol., 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al., J. Immunol., 164:1432-1441, 2000).

En algunos anticuerpos sólo se necesita una parte de las CDR, es decir, el subconjunto de restos de CDR requeridos para la unión, denominados SDR, son necesarios para retener la unión en un anticuerpo humanizado. Los restos de CDR que no entran en contacto con el antígeno y no están en las SDR pueden ser identificados basándose en estudios previos (por ejemplo, los restos H60-H65 en CDR H2 a menudo no son requeridos), de regiones de CDR de Kabat situadas fuera de los bucles hipervariables de Chothia (Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987), por modelización molecular y/o empírica, o como se describe en Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863, 2004. En tales anticuerpos humanizados en posiciones en las que están ausentes uno o más restos de CDR de donador o en los que se omite una CDR de donador entera, el aminoácido que ocupa la posición puede ser un aminoácido que ocupa la posición correspondiente (por numeración de Kabat) en la secuencia del anticuerpo aceptor. El número de tales sustituciones de aminoácidos del donador por aceptor en las CDR para incluir refleja un equilibrio de consideraciones que compiten. Tales sustituciones son potencialmente ventajosas para disminuir el número de aminoácidos de ratón en un anticuerpo humanizado y, por consiguiente, disminuir la posible inmunogenicidad. Sin embargo, las sustituciones también pueden causar cambios de afinidad, y preferiblemente se evitan reducciones significativas en la afinidad. Las posiciones de sustitución dentro de las CDR y aminoácidos para sustituir también se pueden seleccionar empíricamente.

Las secuencias de anticuerpos aceptores humanos pueden seleccionarse opcionalmente de entre las muchas secuencias de anticuerpos humanos conocidas para proporcionar un alto grado de identidad de secuencia (p. ej., 65-85% de identidad) entre una región armazón de región variable de una secuencia de aceptor humano y regiones armazón de regiones variables correspondientes de una cadena de anticuerpo donador.

Ejemplos de secuencias de aceptor para la cadena pesada son las regiones variables de cadenas pesadas maduras humanas con códigos de acceso en NCBI BAC02114 y AAX82494.1 (SEQ ID NOS: 3 y 4) y regiones variables de cadena pesada del subgrupo 3 humano de Kabat. BAC02114 comparte la misma forma canónica que la cadena pesada de 9D5 de ratón. Otros ejemplos de secuencias de aceptor para la cadena pesada son las regiones variables de cadena pesada madura humana con códigos de acceso en NCBI AAD30410.1 y AAX82494.1 (SEQ ID NOS: 63 y 4, respectivamente) y regiones variables de cadena pesada del subgrupo 1 humano de Kabat. AAD30410.1 y AAX82494.1 incluyen dos CDR con la misma forma canónica que la cadena pesada de 14G8 de ratón. Ejemplos de secuencias de aceptor de la cadena ligera son la región variable de cadena ligera madura humana con código de acceso en NCBi ABC66952 (SEQ ID NO: 18) y regiones variables de cadena ligera del subgrupo 3 de Kabat humano. ABC66952 incluye dos CDR con la misma forma canónica que la cadena ligera de 9D5 de ratón. Otros ejemplos de secuencias de aceptor de la cadena ligera son las regiones variables de cadena ligera madura humana con códigos de acceso en NCBI ABA71374.1 y ABC66952.1 (SEQ ID NOS: 72 y 73, respectivamente) y regiones variables de cadena ligera del subgrupo 2 humano de Kabat. ABA71374.1 y ABC66952.1 tienen la misma forma canónica que la cadena ligera de 14G8 de ratón.

Si se selecciona más de una secuencia de anticuerpo aceptor humano, se puede usar un compuesto o híbrido de esos aceptores, y los aminoácidos usados en diferentes posiciones en la cadena ligera humanizada y en las regiones variables de cadena pesada pueden tomarse de cualesquiera de las secuencias de anticuerpos aceptores humanos utilizados. Por ejemplo, las regiones variables de cadena pesada madura humana con códigos de acceso en NCBI BAC02114 y AAX82494.1 (SEQ ID NOS: 3 y 4) se utilizaron como secuencias de aceptor para humanización de la región variable de cadena pesada madura de 9D5. Ejemplos de las posiciones en las que estos dos aceptores difieren incluyen las posiciones H19 (R o K), H40 (A o T), H44 (G o R), H49 (S o A), H77 (S o T), H82a (N o S), H83 (R o K), H84 (A o S) y H89 (V o M). Las versiones humanizadas de la región variable de cadena pesada de 9D5 pueden incluir cualquier aminoácido en cualquiera de estas posiciones. Del mismo modo, las regiones variables de cadena pesada madura humana con códigos de acceso en NCBI AAD30410.1 y AAX82494.1 (SEQ ID NOS: 63 y 4, respectivamente) se utilizaron como secuencias aceptoras para la humanización de la región variable de cadena pesada madura de 14G8. Ejemplos de las posiciones en que estos dos aceptores difieren incluyen las posiciones H82a (N o S), H83 (R o K), H84 (A o S) y H89 (V o M). Las versiones humanizadas de la región variable de cadena pesada de 14G8 pueden incluir cualquier aminoácido en cualquiera de estas posiciones. Del mismo modo, las regiones variables de cadena ligera madura humana con códigos de acceso en NCBI ABA71374.1 y ABC66952.1 (SEQ ID NOS: 72 y 73, respectivamente) se utilizaron como secuencias aceptoras para la humanización de la región variable de cadena ligera madura de 14G8. Un ejemplo de una posición en la cual difieren estos dos aceptores es la posición L18 (S o P). Las versiones humanizadas de la región variable de cadena ligera de 14G8 pueden incluir cualquier aminoácido en esta posición.

Ciertos aminoácidos de los restos de la región armazón de la región variable humana pueden seleccionarse para la sustitución basándose en su posible influencia en la conformación de las CDR y/o la unión al antígeno. La investigación de tales posibles influencias es por modelización, examen de las características de los aminoácidos en localizaciones particulares, u observación empírica de los efectos de la sustitución o mutagénesis de aminoácidos particulares.

Por ejemplo, cuando un aminoácido difiere entre un resto de la región armazón de región variable murina y un resto de región armazón de región variable humana seleccionado, el aminoácido de región armazón humano puede ser sustituido por el aminoácido de región armazón equivalente del anticuerpo de ratón cuando se espera razonablemente que el aminoácido:

(1) se une no covalentemente al antígeno de manera directa;

(2) es adyacente a una región CDR o está dentro de una CDR definida por Chothia, pero no Kabat;

(3) de otro modo interactúa con una región CDR (p. ej., está dentro de aproximadamente 6 A de una región CDR), (p. ej., identificada por modelización de la cadena ligera o pesada sobre la estructura resuelta de una cadena de inmunoglobulina conocida homóloga); o

(4) es un resto que participa en la interfase VL-VH.

Los restos de región armazón de las clases (1) a (3) según se define por Queen, US 5,530,101, se denominan a veces alternativamente restos canónicos y vernier. Los restos de región armazón que ayudan a definir la conformación de un bucle de CDR se denominan a veces restos canónicos (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol.

196:901-917 (1987); Thornton y Martin, J. Mol. Biol. 263:800-815 (1996)). Los restos de región armazón que soportan las conformaciones de bucle de unión al antígeno y juegan un papel en la precisión del ajuste de un anticuerpo al antígeno se denominan a veces restos vernier (Foote y Winter, J. Mol. Biol. 224:487-499 (1992)).

Otros restos de región armazón que son candidatos para sustitución son restos que crean un sitio potencial de glicosilación. Sin embargo, otros candidatos para la sustitución son aminoácidos de la región armazón humana del aceptor que son inusuales para una inmunoglobulina humana en esa posición. Estos aminoácidos pueden ser sustituidos con aminoácidos de la posición equivalente del anticuerpo de ratón donador o de las posiciones equivalentes de las inmunoglobulinas humanas más típicas.

Los anticuerpos humanizados de ejemplo son formas humanizadas de los anticuerpos 9D5 o 14G8 de ratón, designados Hu9D5 o Hu14G8, respectivamente. El anticuerpo 9D5 de ratón comprende regiones variables de cadena pesada y ligera maduras que tienen secuencias de aminoácidos que comprenden las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. La descripción proporciona ocho regiones variables de cadenas pesadas maduras humanizadas ejemplificadas: Hu9D5VHvl, Hu9D5VHv2, Hu9D5VHv2b, Hu9D5VHv3, Hu9D5VHv3b, Hu9D5VHv4, Hu9D5VHv4b y Hu9D5VHv5 (SEQ ID NOS: 5-12, respectivamente. La descripción proporciona además cinco regiones variables de cadenas ligeras maduras humanas ejemplificadas: Hu9D5VLvl, Hu9D5VLv2, Hu9D5VLv3, Hu9D5VLv4 y Hu9D5VLv5 (SEQ ID NOS: 19-23, respectivamente). La Figura 1 muestra alineaciones de 9D5, anticuerpos de modelo de ratón, anticuerpos aceptores humanos y diversos anticuerpos humanizados.

El anticuerpo 14G8 de ratón comprende regiones variables de cadenas pesada y ligera maduras que tienen secuencias de aminoácidos que comprenden la SEQ ID NO: 61 y la SEQ ID NO: 70, respectivamente. La descripción proporciona tres regiones variables de cadena pesada madura humanizada ejemplificada: Hu14G8VHv1, Hu14G8VHv2 y Hu14G8VHv3 (SEQ ID NOS: 64-66, respectivamente). La descripción además proporciona tres regiones variables de cadena ligera madura humana ejemplificada: Hu14G8VLvl, Hu14G8VLv2 y Hu14G8VLv3 (SEQ ID NOS: 74-76, respectivamente). La figura 2 muestra alineaciones de 14G8, anticuerpos de modelo de ratón, anticuerpos aceptores humanos y diversos anticuerpos humanizados.

Por razones tales como la posible influencia sobre la conformación de las CDR y/o la unión al antígeno, la interacción mediadora entre las cadenas pesada y ligera, la interacción con la región constante, que es un sitio para la modificación postraduccional deseada o indeseada, que es un resto inusual para su posición en una secuencia de región variable humana y, por tanto, potencialmente inmunogénica, que se obtiene el potencial de agregación, y otras razones, se consideraron las siguientes 15 posiciones de regiones armazón de regiones variables como candidatas para sustituciones en las ocho regiones variables de cadenas pesadas maduras de Hu9D5 ejemplificadas y las cinco regiones variables de cadenas ligeras maduras de Hu9D5 ejemplificadas, como se especifica adicionalmente en los ejemplos: H42 (G42E), H47 (W47L), H69 (I69F), H82 (M82s ), H82b (S82(b)L), H108 (T108L), L8 (P8A), L9 (L9P), L18 (P18S), L19 (A19V), L36 (Y36F), L39 (K39R), L60 (D60S), L70 (D70A) y L74 (K74R). Igualmente, se consideraron las siguientes 11 posiciones de regiones armazón de regiones variables como candidatas para sustituciones en las tres regiones variables de la cadena pesada madura de Hu14G8 ejemplificadas y las tres regiones variables de la cadena ligera madura de Hu14G8 ejemplificadas, como se especifica adicionalmente en los ejemplos: H1 (Q1E), H3 (Q3K), H47 (W47L), H105 (Q105T), L8 (P8A), L9 (L9P), L19 (A19V), L26 (N26S), L36 (Y36F), L60 (D60S) y L70 (D70A).

Aquí, como en otras partes, el resto mencionado en primer lugar es el resto de un anticuerpo humanizado formado por injerto de CDR de Kabat o una CDR combinada de Chothia-Kabat en el caso de CDR-H1 en una región armazón de aceptor humano (p. ej., una región armazón de aceptor humano combinada o híbrida) y el segundo resto mencionado es un resto que se considera para reemplazar dicho resto. Así, dentro de las regiones armazones de la región variable, el primer resto mencionado es humano, y dentro de las CDR, el primer resto mencionado es de ratón.

Los anticuerpos Hu9D5 ejemplificados incluyen cualquier permutación o combinación de las regiones variables de cadenas pesadas y ligeras maduras ejemplificadas (p. ej., VHv1/VLv1 o H1L1, VHvl/VLv2 o H1L2, VHv1/VLv3 o H1L3, VHv1/VLv4 o H1L4, VHv1/VLv5 o H1L5, VHv2/VLvl o H2L1, VHv2/VLv2 o H2L2, VHv2/VLv3 o H2L3, VHv2/VLv4 o H2L4, VHv2/VLv5 o H2L5, VHv2b/VLv1 o H2bLl, VHv2b/VLv2 o H2bL2, VHv2b/VLv3 o H2bL3, VHv2b/VLv4 o H2bL4, VHv2b/VLv5 o H2bL5, VHv3/VLvl o H3L1, VHv3/VLv2 o H3L2, VHv3/VLv3 o H3L3, VHv3/VLv4 o H3L4, VHv3/VLv5 o H3L5,VHv3b/VLv1 o H3bLl, VHv3b/VLv2 o H3bL2, VHv3b/VLv3 o H3bL3, VHv3b/VLv4 o H3bL4, VHv3b/VLv5 o H3bL5,VHv4/VLvl o H4L1, VHv4/VLv2 o H4L2, VHv4/VLv3 o H4L3, VHv4/VLv4 o H4L4, VHv4/VLv5 o H4L5, VHv4b/VLv1 o H4bLl, VHv4b/VLv2 o H4bL2, VHv4b/VLv3 o H4bL3, VHv4b/VLv4 o H4bL4, VHv4b/VLv5 o H4bL5, VHv5NLv1 o H5L1, VHv5/VLv2 o H5L2, VHv5/VLv3 o H5L3, VHv5/VLv4 o H5L4, y VHv5/VLv5 o H5L5).

La descripción proporciona variantes de anticuerpos 9D5 humanizados en los cuales la región variable de cadena pesada humanizada madura muestra al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con un Hu9D5VHv4b humanizado (SEQ ID NO: 11) y la región variable de cadena ligera madura humanizada muestra al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con un Hu9D5VLv1 (SEQ ID NO: 19). En algunos de estos anticuerpos, se retienen al menos 1, 2 o las 3 de las retromutaciones u otras mutaciones en Hu9D5 H4bL1. La descripción también proporciona variantes de los otros anticuerpos 9D5 humanizados ejemplificado. Dichas variantes tienen regiones variables de cadenas ligera y pesada maduras que muestran al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las regiones variables de cadenas ligera y pesada maduras de las regiones de los anticuerpos 9D5 humanizados ejemplificados H1L1, H1L2, H1L3, H1L4, H1L5, H2L1, H2L2, H2L3, H2L4, H2L5, H2bLl, H2bL2, H2bL3, H2bL4, H2bL5, H3L1, H3L2, H3L3, H3L4, H3L5, H3bLl, Hb3L2, H3bL3, Hb3L4, H3bL5, H4L1, H4L2, H4L3, H4L4, H4L5, H4bLl, H4bL2, H4bL3, H4bL4, H4bL5, H5L1, H5L2, H5L3, H5L4 o H5L5.

En algunos anticuerpos, al menos una de las posiciones H42, H47, H69, H82, H82b y H108 en la región Vh está ocupada por E, L, F, S, L y L, respectivamente. En algunos anticuerpos, las posiciones H47, H69 y H82 en la región Vh están ocupadas por L, F y S, respectivamente, como en Hu9D5VHv1. En algunos anticuerpos, las posiciones H47, H69,H82 y H82b en la región Vh están ocupadas por L, F, S y L, respectivamente, como en Hu9D5VHv2. En algunos anticuerpos, las posiciones H42, ^h 47 y H108 en la región Vh están ocupadas por E, L y L, respectivamente, como en Hu9D5VHv2b. En algunos anticuerpos, las posiciones H69, h 82 y H82b en la región Vh están ocupadas por F, S y L, respectivamente, como en Hu9D5VHv3. En algunos anticuerpos, las posiciones H47 y H108 en la región Vh están cada una ocupadas por L, como en Hu9D5VHv3b y Hu9D5Vhv4b. En algunos anticuerpos, las posiciones H82 y H82b en la región Vh están ocupadas por S y L, respectivamente, como en Hu9D5VHv4. En algunos anticuerpos, las posiciones H42, H47 y H82b en la región Vh están ocupadas por E, L y L, respectivamente, como en Hu9D5VHv5. En algunos anticuerpos, al menos una de las posiciones L8, L9, L18, L19, L36, L39, L60, L70 y L74 en la región Vk está ocupada por A, P, S, V, F, R, S, A y R, respectivamente. En algunos anticuerpos, la posición L36 en la región Vk está ocupadas por F, como en Hu9D5VLvI. En algunos anticuerpos, la posición L60 en la región Vk está ocupada por S, como en Hu9D5VLv3. En algunos anticuerpos, las posiciones L8, L9, L19, L36, L39, L60, L70 y L74 en la región Vk están ocupadas por A, P, V, F, R, S, A y R, respectivamente, como en Hu9D5VLv4. En algunos anticuerpos, las posiciones L8, L9, L18, L19, L36, L39, L60, L70 y L74 en la región Vk están ocupadas por A, P, S, V, F, R, S, A y R, respectivamente, como en Hu9D5VLv5. Las regiones CDR de tales anticuerpos humanizados pueden ser iguales o sustancialmente iguales a las regiones CDR del anticuerpo 9D5 de ratón donador o cualquiera de los anteriores anticuerpos 9D5 humanizados ejemplificados. Las regiones CDR se pueden definir por cualquier definición convencional (p. ej., Chothia, o combinación de Chothia y Kabat), pero se definen preferiblemente por Kabat.

Las posiciones de las regiones armazón de regiones variables son según la numeración de Kabat, a menos que se indique lo contrario. Otras variantes de este tipo difieren normalmente de las secuencias de las cadenas pesadas y ligeras de Hu9D5 ejemplificadas, en un número pequeño (p. ej., normalmente no más de 1, 2, 3, 5, 10 o 15) de sustituciones, deleciones o inserciones. Tales diferencias están generalmente en el armazón, pero también pueden ocurrir en las CDR.

Los anticuerpos Hu14G8 ejemplificados incluyen cualquier permutación o combinación de las regiones variables de cadenas pesada y ligera maduras ejemplificadas (p. ej., VHv1/VLv1 o H1L1, VHvl/VLv2 o H1L2, VHvl/VLv3 o H1L3, VHv2/VLvl o H2L1, VHv2/VLv2 o H2L2, VHv2/VLv3 o H2L3, VHv3/VLv1 o H3L1, VHv3/VLv2 o H3L2 y VHv3/VLv3 o H3L3).

La descripción proporciona variantes de anticuerpos 14G8 humanizados en los que la región variable de cadena pesada madura humanizada muestra al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con Hu14G8VHv2 (Hu14G8 H2) (SEQ ID NO: 65) y la región variable de cadena ligera madura humanizada muestra al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con Hu14G8VLv3 (Hu14G8 L3) (SEQ ID NO: 76). En algunos de los anticuerpos, al menos 1,2, 3, 4 o las 5 de las retromutaciones o de otras mutaciones en Hu14G8 H2L3 se conservan. La descripción también proporciona variantes de los otros anticuerpos 14G8 humanizados ejemplificados. Estas variantes tienen regiones variables de cadena ligera y pesada maduras que muestran al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las regiones variables de cadenas ligera y pesada maduras de los anticuerpos 14G8 humanizados ejemplificados H1L1, H1L2, H1L3, H2L1, H2L2, H2L3, H3L1, H3L2 o H3L3.

En algunos anticuerpos, al menos una de las posiciones H1 y H47 en la región Vh está ocupada por E y L, respectivamente. En algunos anticuerpos, las posiciones H1 y H47 en la región Vh están ocupadas por E y L, respectivamente, como en Hu14G8VHv2 y Hu14G8VHv3. En algunos anticuerpos, al menos una de las posiciones H3 y H105 en la región Vh está ocupada por K y T, respectivamente. En algunos anticuerpos, las posiciones H3 y H105 en la región Vh están ocupadas por K y T, respectivamente, como en Hu14G8VHv1. En algunos anticuerpos, la posición L36 en la región Vk está ocupada por F, como en Hu14G8VLv2. En algunos anticuerpos, al menos una de las posiciones L8, L9, L19, L26, L60 y L70 en la región Vk está ocupada por A, P, V, S, S y A, respectivamente. En algunos anticuerpos, las posiciones L8, L9, L19 y L70 en la región Vk están ocupadas por A, P, V y A, respectivamente, como en Hu14G8VLvI. En algunos anticuerpos, las posiciones L26 y L60 en la región Vk están cada una ocupadas por S, como en Hu14G8VLv3. Las regiones CDR de tales anticuerpos humanizados pueden ser iguales o sustancialmente iguales a las regiones CDR del anticuerpo donador 14G8 de ratón. Las regiones CDR se pueden definir por cualquier definición convencional (p. ej., Chothia, o combinación de Chothia y Kabat), pero preferiblemente se definen por Kabat.

Las posiciones de región armazón de las regiones variables son según la numeración de Kabat, a menos que se indique lo contrario. Otras variantes de este tipo difieren normalmente de las secuencias de las cadenas pesada y ligera de Hu14G8 ejemplificadas, en un número pequeño (p. ej., normalmente no más de 1, 2, 3, 5, 10 o 15) de sustituciones, deleciones o inserciones. Tales diferencias están generalmente en la región armazón, pero también pueden ocurrir en las CDR.

Una posibilidad de variación adicional en las variantes de 9D5 o 14G8 humanizadas son las retromutaciones adicionales en las regiones armazón de la región variable. Muchos de los restos de armazón que no están en contacto con las CDR en el mAb humanizado pueden acomodar sustituciones de aminoácidos de las posiciones correspondientes del mAb de ratón donador u otros anticuerpos de ratón o humanos, e incluso muchos restos potenciales de contacto con CDR también son susceptibles de sustitución. Incluso los aminoácidos dentro de las CDR pueden estar alterados, por ejemplo, con restos que se encuentran en la posición correspondiente de la secuencia de aceptor humano usada para suministrar armazones de región variable. Además, se pueden usar secuencias de aceptor humano alternativas, por ejemplo, para la cadena pesada y/o ligera. Si se utilizan diferentes secuencias de aceptor, puede que no se realice una o más de las retromutaciones recomendadas anteriormente debido a que los restos de donador y aceptor correspondientes ya son los mismos sin retromutaciones.

Preferiblemente, las sustituciones o las retromutaciones en las variantes de 9D5 o 14G8 humanizadas (conservadoras o no) no tienen un efecto sustancial sobre la afinidad de unión o potencia del mAb humanizado, es decir, su capacidad para unirse a TTR monomérica (p. ej., la potencia en algunos o todos los ensayos descritos en los presentes ejemplos del anticuerpo 9D5 o 14G8 humanizado es esencialmente la misma, es decir, dentro del error experimental, como la del anticuerpo 9D5 o 14G8 murino).

D. Anticuerpos quiméricos y de superficie modificada

La descripción proporciona además formas quiméricas y de superficie modificada de anticuerpos no humanos, especialmente los anticuerpos 9D5 o 14G8 de los ejemplos.

Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo en el que las regiones variables de cadena ligera y pesada maduras de un anticuerpo no humano (p. ej., un ratón) se combinan con regiones constantes de cadena ligera y pesada humanas. Dichos anticuerpos conservan sustancial o totalmente la especificidad de unión del anticuerpo de ratón, y son aproximadamente dos tercios de la secuencia humana.

Un anticuerpo de superficie modificada es un tipo de anticuerpo humanizado que retiene algunas y normalmente todas las CDR y algunos de los restos de región armazón de la región variable no humana de un anticuerpo no humano, pero reemplaza otros restos de región armazón de la región variable que pueden contribuir a epítopos de células B o T, por ejemplo, restos expuestos (Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991) con restos de las posiciones correspondientes de la secuencia de un anticuerpo humano. El resultado es un anticuerpo en el que las CDR son total o sustancialmente de un anticuerpo no humano y los armazones de regiones variables del anticuerpo no humano se hacen más similares a los humanos mediante las sustituciones. En la descripción se incluyen formas de superficie modificada del anticuerpo 9D5 o 14G8.

E. Anticuerpos humanos

Los anticuerpos humanos contra la TTR monomérica o un fragmento de la misma (p. ej., los restos de aminoácidos 89-97 (SEQ ID NO: 113) de TTR) se proporcionan por una variedad de técnicas que se describen a continuación. Algunos anticuerpos humanos se seleccionan mediante experimentos de unión competitiva, mediante el método de presentación en fagos de Winter, arriba, o de otro modo, para tener la misma especificidad de epítopo que un anticuerpo de ratón particular, tal como uno de los anticuerpos monoclonales de ratón descritos en los ejemplos. Los anticuerpos humanos también se pueden cribar según la especificidad del epítopo particular utilizando sólo un fragmento de TTR, tal como una variante de TTR que contiene sólo los restos de aminoácidos 89-97 de TTR, como antígeno objetivo y/o cribando anticuerpos contra una colección de variantes de TTR, tales como variantes de TTR que contienen diversas mutaciones dentro de los restos de aminoácidos 89-97 de TTR.

Los métodos para producir anticuerpos humanos incluyen el método trioma de Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, Patente de EE. UU. N.° 4,634,664; y Engleman et al., Patente de EE. UU.

4,634,666, uso de ratones transgénicos que incluyen genes de inmunoglobulina humana (véase, p. ej., Lonberg et al., WO93/12227 (1993); US 5,877,397; US 5,874,299; US 5,814,318; US 5,789,650; US 5,770,429; US 5,661,016; US 5,633,425; US 5,625,126; US 5,569,825; US 5,545,806; Neuberger, Nat. Biotechnol. 14:826 (1996); y Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)) y métodos de presentación en fagos (véase, p. ej., Dower et al., WO 91/17271; McCafferty et al., WO 92/01047; US 5,877,218; US 5,871,907; US 5,858,657; US 5,837,242; US 5,733,743; y US 5,565,332).

F. Selección de la región constante

Las regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos quiméricos, de superficie modificada o humanizados pueden unirse a al menos una parte de una región constante humana. La elección de una región constante depende, en parte, de si se desea citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos y/o citotoxicidad dependiente del complemento. Por ejemplo, los isotipos humanos IgG1 e IgG3 tienen citotoxicidad dependiente del complemento y los isotipos humanos IgG2 e IgG4 no. Las IgG1 e IgG3 humanas también inducen funciones efectoras mediadas por células más fuertes que las IgG2 e IgG4 humanas. Las regiones constantes de la cadena ligera pueden ser lambda o kappa.

Uno o varios aminoácidos en el extremo amino o carboxi de la cadena ligera y/o pesada, tal como la lisina C terminal de la cadena pesada, pueden faltar o derivatizarse en una proporción o en todas las moléculas. Se pueden hacer sustituciones en las regiones constantes para reducir o aumentar la función efectora tal como la citotoxicidad mediada por el complemento o ADCC (véase, p. ej., Winter et al., Patente de EE. UU. N.° 5,624,821, Tso et al., Patente de EE. UU. N.° 5,834,597; Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), o para prolongar la semivida en seres humanos (véase, p. ej., Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004). Las sustituciones de ejemplo incluyen una Gln en la posición 250 y/o una Leu en la posición 428 (se usa la numeración EU en este párrafo para la región constante) para aumentar la semivida de un anticuerpo. La sustitución en cualquiera o en todas las posiciones 234, 235, 236 y/o 237 reduce la afinidad por los receptores Fcy, en particular el receptor FcyRI (véase, p. ej., US 6,624,821). Una sustitución de alanina en las posiciones 234, 235 y 237 de la IgG1 humana puede utilizarse para reducir funciones efectoras. Algunos anticuerpos tienen sustitución de alanina en las posiciones 234, 235 y 237 de la IgG1 humana para reducir funciones efectoras. Opcionalmente, las posiciones 234, 236 y/o 237 de IgG2 humana son sustituidas con alanina y la posición 235 con glutamina (véase, p. ej., US 5,624,821). En algunos anticuerpos, se usa una mutación en una o más de las posiciones 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329 y 331 por la numeración EU de IgG1 humana. En algunos anticuerpos, se usa una mutación en una o más de las posiciones 318, 320 y 322 por la numeración EU de IgG1 humana. En algunos anticuerpos, las posiciones 234 o 235 son sustituidas con alanina y/o la posición 329 se sustituye con glicina. En algunos anticuerpos, las posiciones 234 y 235 se sustituyen con alanina, tal como en la s Eq ID NO: 102. En algunos anticuerpos, el isotipo es IgG2 o IgG4 humana.

Una región constante kappa de cadena ligera humana de ejemplo tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104. La arginina N terminal de la SEQ ID NO: 104 se puede omitir, en cuyo caso la región constante kappa de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105. Una región constante de cadena pesada de IgG1 humana de ejemplo tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101 (con o sin la lisina C terminal). Los anticuerpos pueden expresarse como tetrámeros que contienen dos cadenas ligeras y dos pesadas, como cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, como Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, o como anticuerpos de cadena sencilla en los que los dominios variables de cadena pesada y ligera maduras están unidos a través de un espaciador.

Las regiones constantes humanas muestran variación alotípica y variación isoalotípica entre diferentes individuos, es decir, las regiones constantes pueden diferir en diferentes individuos en una o más posiciones polimórficas. Los isoalotipos difieren de los alotipos en que los sueros que reconocen un isoalotipo se unen a una región no polimórfica de uno o más isotipos. Así, por ejemplo, otra región constante de cadena pesada es del alotipo G1m3 de IgG1 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 103. Otra región constante de cadena pesada del alotipo G1m3 de IgG1 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 102 (con o sin la lisina C terminal). La referencia a una región constante humana incluye una región constante con cualquier alotipo natural o cualquier permutación de restos que ocupan las posiciones en alotipos naturales.

G. Expresión de anticuerpos recombinantes

Se conocen varios métodos para producir anticuerpos quiméricos y humanizados usando una línea celular que expresa un anticuerpo (p. ej., un hibridoma). Por ejemplo, las regiones variables de inmunoglobulina de anticuerpos pueden clonarse y secuenciarse usando métodos bien conocidos. En un método, la región VH variable de cadena pesada se clona por RT-PCR usando ARNm preparado a partir de células de hibridoma. Se emplean cebadores de consenso para el péptido líder de la región VH que abarca el codón de inicio de la traducción como el cebador 5' y un cebador 3' específico de las regiones constantes g2b. Los cebadores de ejemplo se describen en la publicación de patente de EE. UU. 2005/0009150 de Schenk et al. (en adelante "Schenk"). Las secuencias de múltiples clones obtenidos independientemente se pueden comparar para asegurar que no se introduzcan cambios durante la amplificación. La secuencia de la región VH también puede determinarse o confirmarse secuenciando un fragmento VH obtenido por la metodología 5' RACE RT-PCR y el cebador 3' específico de g2b.

La región VL variable de la cadena ligera puede clonarse de una manera análoga. En un enfoque, un conjunto de cebadores de consenso está diseñado para la amplificación de regiones VL usando un cebador 5' diseñado para hibridarse con la región VL que abarca el codón de inicio de la traducción y un cebador 3' específico para la región Ck secuencia abajo de la región de unión V-J. En un segundo enfoque, se emplea la metodología 5'RACE RT-PCR para clonar un ADNc de codificación de VL. Los cebadores de ejemplo se describen en Schenk, véase antes. Las secuencias clonadas se combinan entonces con secuencias que codifican regiones constantes humanas (u otras especies no humanas). Las secuencias de ejemplo que codifican regiones constantes humanas incluyen la SEQ ID NO: 106, que codifica una región constante de IgG1 humana (SEQ ID NO: 103) y las SEQ ID NOS: 107 y 108, que codifican regiones constantes de cadena ligera kappa humanas (SEQ ID NOS: 104 y 105, respectivamente).

En un enfoque, las regiones variables de cadena pesada y ligera se modifican de nuevo para codificar secuencias donadoras de empalme secuencia abajo de las respectivas uniones VDJ o VJ y se clonan en un vector de expresión de mamífero, tal como pCMV-hyl para la cadena pesada y pCMV-Mcl para la cadena ligera. Estos vectores codifican las regiones constantes humanas y1 y Ck como fragmentos exónicos secuencia abajo del casete de región variable insertado. Después de la verificación de la secuencia, los vectores de expresión de la cadena pesada y cadena ligera pueden co-transfectarse en células CHO para producir anticuerpos quiméricos. Los medios acondicionados se recogen 48 horas después de la transfección y se analiza mediante análisis de transferencia Western la producción de anticuerpos o ELISA para la unión al antígeno. Los anticuerpos quiméricos se humanizan como se describió anteriormente.

Los anticuerpos quiméricos, de superficie modificada, humanizados y humanos se producen normalmente mediante expresión recombinante. Las construcciones de polinucleótidos recombinantes incluyen normalmente una secuencia de control de expresión unida operativamente a las secuencias codificantes de cadenas de anticuerpos, incluyendo elementos de control de expresión naturalmente asociados o heterólogos, tales como un promotor. Las secuencias de control de expresión pueden ser sistemas promotores en vectores capaces de transformar o transfectar células hospedantes eucariotas o procariotas. Una vez que el vector se ha incorporado en el hospedante apropiado, el hospedante se mantiene en condiciones adecuadas para la expresión de alto nivel de las secuencias de nucleótidos y la recolección y purificación de los anticuerpos de reacción cruzada.

Estos vectores de expresión son normalmente replicables en los organismos hospedantes, bien como episomas o como parte integral del ADN cromosómico del hospedante. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección, p. ej., resistencia a ampicilina o resistencia a higromicina, para permitir la detección de las células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.

E. coli es un hospedante procariota útil para expresar anticuerpos, particularmente fragmentos de anticuerpos. Los microbios, tales como la levadura, también son útiles para la expresión. Saccharomyces es un hospedante de levadura con vectores adecuados que tienen secuencias de control de expresión, un origen de replicación, secuencias de terminación y similares como se desee. Los promotores típicos incluyen 3-fosfoglicerato quinasa y otras enzimas glicolíticas. Los promotores de levadura inducibles incluyen, entre otros, promotores de alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa.

Las células de mamífero pueden usarse para expresar segmentos de nucleótidos que codifican inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas. Véase, Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Se han desarrollado varias líneas de células hospedantes adecuadas capaces de segregar proteínas heterólogas intactas, e incluyen líneas celulares CHO, diversas líneas celulares COS, células HeLa, células HEK293, células L y mielomas que no producen anticuerpos, incluyendo Sp2/0 y NS0. Las células pueden ser no humanas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un potenciador (Queen et al., Immunol. Rev.

89:49 (1986)), y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias de terminador transcripcional. Las secuencias de control de expresión pueden incluir promotores derivados de genes endógenos, citomegalovirus, SV40, adenovirus, papilomavirus bovino, y similares. Véase, Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992).

Alternativamente, las secuencias codificadoras de anticuerpos pueden incorporarse en transgenes para su introducción en el genoma de un animal transgénico y su posterior expresión en la leche del animal transgénico (véase, p. ej., patente de EE. UU. N.° 5,741,957; patente de EE. UU. N.° 5,304,489; y patente de EE. UU. N.°.

5,849,992). Los transgenes adecuados incluyen secuencias de codificación para cadenas ligera y/o pesada ligadas operativamente con un promotor y potenciador de un gen específico de glándula mamaria, tal como caseína o beta lactoglobulina.

Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interés pueden transferirse a la célula hospedante por métodos que dependen del tipo de hospedante celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro cálcico se utiliza comúnmente para células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato cálcico, electroporación, lipofección, biolística o transfección basada en virus se pueden utilizar para otros hospedantes celulares. Otros métodos utilizados para transformar las células mamíferas incluyen el uso de polibreno, fusión de protoplasto, liposomas, electroporación y microinyección. Para la producción de animales transgénicos, los transgenes pueden ser microinyectados en ovocitos fertilizados o puede ser incorporados en el genoma de células madre embrionarias, y los núcleos de estas células se transfieren a ovocitos enucleados.

Habiendo introducido vector(es) que codifica(n) cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo en el cultivo celular, las agrupaciones de células pueden ser cribadas para determinar la productividad del crecimiento y la calidad del producto en medios libres de suero. Las principales agrupaciones productoras de células pueden someterse a continuación a clonación de una célula basada en FACS para generar líneas monoclonales. Pueden usarse productividades específicas por encima de 50 pg o 100 pg por célula al día, que corresponden a títulos de producto de más de 7.5 g/l de cultivo. Los anticuerpos producidos por clones de células individuales también pueden ensayarse en cuanto a la turbidez, propiedades de filtración, PAGE, IEF, barrido UV, HP-SEC, mapeo de carbohidratos-oligosacáridos, espectrometría de masas y ensayo de unión, tales como ELISA o Biacore. Un clon seleccionado puede entonces ser depositado en múltiples viales y almacenado congelado para uso posterior.

Una vez expresados, los anticuerpos pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, incluyendo la captura de proteína A, purificación por HPLC, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares (véase, en general, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982).

La metodología puede emplearse para la producción comercial de anticuerpos, incluyendo la optimización de codones, selección de promotores, selección de elementos de transcripción, selección de terminadores, clonación de célula única sin suero, depósito de célula, uso de marcadores de selección para la amplificación del número de copias, terminador CHO o mejora de los títulos de proteína (véase, p. ej., US 5,786,464; US 6,114,148; US 6,063,598; US 7,569,339; WO2004/050884; WO2008/012142; WO2008/012142; WO2005/019442; WO2008/107388; WO2009/027471; y US 5,888,809).

H. Ensayos de cribado de anticuerpos

Los anticuerpos pueden someterse a varios cribados que incluyen ensayos de unión, cribados funcionales, cribados en modelos animales de enfermedades asociadas con depósitos de TTR y ensayos clínicos. Los ensayos de unión prueban la unión específica y, opcionalmente, la afinidad y especificidad de epítopo para TTR monomérica o un fragmento de la misma. Por ejemplo, los ensayos de unión pueden cribar anticuerpos que se unen a los restos de aminoácidos 89-97 (SEQ ID NO: 113) de TTR, que es un epítopo que está enterrado en el tetrámero de TTR nativo y expuesto en formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de la TTR. Los anticuerpos también se pueden cribar en cuanto a la capacidad de unir conformaciones pre-fibrilares no nativas de TTR y de fibrillas amiloides de TTR, pero no conformaciones de TTR nativas. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden cribar por la capacidad de unirse a formas monoméricas de TTR creadas por disociación o desagregación de la t Tr tetramérica nativa, y se pueden contra-cribar frente a la TTR tetramérica nativa, como se describe en los ejemplos o de otro modo. Asimismo, los anticuerpos también se pueden cribar por su inmunorreactividad en tejido amiloidótico mediado por TTR, pero no en tejido sano. Tales cribados se realizan a veces en competición con un anticuerpo de ejemplo, tal como un anticuerpo que tiene las regiones variables de 9D5 o 14G8 (isotipo kappa de IgG1). Opcionalmente, el anticuerpo o el objetivo de TTR está inmovilizado en dicho ensayo.

Los ensayos funcionales se pueden realizar en modelos celulares incluyendo células que expresan TTR de forma natural o transfectadas con ADN que codifica TTR o un fragmento de la misma. Las células adecuadas incluyen células derivadas de tejido cardíaco u otros tejidos afectados por la amiloidogénesis TTR. Las células se pueden cribar en cuanto a los niveles reducidos de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR (p. ej., mediante transferencia Western o inmunoprecipitación de extractos celulares o líquidos sobrenadantes) o toxicidad reducida atribuible a formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden ensayar por la capacidad de inhibir o reducir la agregación de TTR, inhibir o reducir la formación de fibrillas de TTR, reducir los depósitos de TTR, eliminar TTR agregada o estabilizar las conformaciones no tóxicas de TTR.

Otros ensayos funcionales se pueden llevar a cabo en solución, tales como probar si un anticuerpo es capaz de interrumpir o reducir la formación de fibrillas de TTR cuando la TTR monomérica o los productos intermedios de TTR mal plegados en solución se ponen en contacto con el anticuerpo. El grado de formación de fibrillas se puede examinar por mediciones de turbidez, por ejemplo, a 400 nm en un espectrómetro UV visible equipado con una unidad de control de temperatura. La Tioflavina-T también puede usarse para evaluar la extensión de la formación de fibrillas amiloides. Por ejemplo, se puede añadir un exceso molar de cinco veces de Tioflavina-T a muestras de TTR y dejarlas a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de llevar a cabo las mediciones. La fluorescencia de la Tioflavina-T se puede monitorear usando un espectrofluorímetro. Véase el documento US 2014/0056904.

Los cribados de modelos animales prueban la capacidad del anticuerpo para tratar terapéutica o profilácticamente señales o síntomas en un modelo animal que simula una enfermedad humana asociada con la acumulación de TTR o depósitos de TTR. Tales enfermedades incluyen tipos de amiloidosis TTR, tales como la amiloidosis sistémica senil (SSA), amiloidosis cardíaca senil (SCA), polineuropatía amiloide familiar (FAP), miocardiopatía amiloide familiar (FAC) y amiloidosis selectiva del sistema nervioso central (CNSA). Los signos o síntomas adecuados que pueden vigilarse incluyen la presencia y la extensión de depósitos de amiloide en diversos tejidos, tales como el tracto gastrointestinal o el corazón. El grado de reducción de los depósitos amiloides puede determinarse por comparación con un control apropiado, tal como el nivel de depósitos amiloides TTR en animales de control que han recibido un anticuerpo de control (p. ej., un anticuerpo de control de isotipo coincidente), un placebo o sin tratamiento alguno. Un modelo animal de ejemplo para probar la actividad contra una amiloidosis TTR es un modelo de ratón que tiene una mutación nula en el locus Ttr de ratón endógeno y el gen TTR mutante humano que comprende una mutación V30M que está asociada con la polineuropatía amiloidea familiar. Véase, p. ej., Kohno et al., Am. J. Path. 150(4):1497-1508 (1997); Cardoso y Saraiva, FASEB J 20(2):234-239 (2006). También existen modelos similares, incluyendo otros modelos para las versiones familiares de amiloidosis TTR y versiones esporádicas de amiloidosis TTR. Véase, p. ej., Teng et al., Lab. Invest. 81(3): 385-396 (2001); Ito y Maeda, Mouse Models of Transthyretin Amyloidosis, en Recent Advances in Transthyretin Evolution, Structure, and Biological Functions, pág. 261-280 (2009) (Springer Berlin Heidelberg). Los animales transgénicos pueden incluir un transgén de TTR humano, tal como un transgén de TTR con una mutación asociada con amiloidosis TTR o un transgén de TTR de tipo natural. Para facilitar la prueba en modelos animales, pueden usarse anticuerpos quiméricos que tienen una región constante apropiada para el modelo animal (p. ej., podrían usarse quimeras de rata-ratón para analizar los anticuerpos en ratas). Se puede concluir que una versión humanizada de un anticuerpo será efectiva si el anticuerpo de ratón o anticuerpo quimérico correspondiente es eficaz en un modelo animal apropiado y el anticuerpo humanizado tiene afinidad de unión similar (p. ej., dentro del error experimental, tal como en un factor de 1.5, 2 o 3).

Los ensayos clínicos prueban la seguridad y eficacia en un ser humano que tiene una enfermedad asociada con amiloidosis TTR.

I. Ácidos nucleicos

La descripción proporciona además ácidos nucleicos que codifican cualesquiera de las cadenas pesadas y ligeras descritas anteriormente (p. ej., SEQ ID NOS: 40, 42, 44-56, 87, 89, 91-96 y 106-108). Opcionalmente, dichos ácidos nucleicos codifican además un péptido de señalización y pueden expresarse con el péptido de señalización unido a la región constante (p. ej., péptidos de señalización que tienen secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 41 y 88 (cadena pesada) y 43 y 90 (cadena ligera) que pueden estar codificadas por las SEQ ID NOS: 40 y 87, respectivamente (cadena pesada) y 42 y 89, respectivamente (cadena ligera)). Las secuencias de codificación de ácidos nucleicos pueden estar unidas operativamente con secuencias reguladoras para asegurar la expresión de las secuencias de codificación, tales como un promotor, potenciador, sitio de unión al ribosoma, señal de terminación de la transcripción, y similares. Los ácidos nucleicos que codifican cadenas pesadas y ligeras pueden ocurrir en forma aislada o pueden clonarse en uno o más vectores. Los ácidos nucleicos se pueden sintetizar, por ejemplo, mediante síntesis en estado sólido o PCR de oligonucleótidos que solapan. Los ácidos nucleicos que codifican cadenas pesadas y ligeras pueden unirse como un ácido nucleico contiguo, p. ej., dentro de un vector de expresión, o pueden estar separados, p. ej., cada uno clonado en su propio vector de expresión.

J. Anticuerpos Conjugados

Los anticuerpos conjugados que se unen específicamente a antígenos expuestos en formas patógenas de TTR, pero no en formas tetraméricas de TTR nativa, tales como los restos de aminoácidos 89-97 (SEQ ID NO: 113) de TTR, son útiles en la detección de la presencia de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR; vigilando y evaluando la eficacia de agentes terapéuticos que se están utilizando para tratar a pacientes diagnosticados de una amiloidosis TTR; inhibiendo o reduciendo la agregación de TTR; inhibiendo o reduciendo la formación de fibrillas de TTR; reduciendo o eliminando los depósitos de TTR; estabilizando las conformaciones de TTR no tóxicas; o tratando o efectuando profilaxis de una amiloidosis TTR en un paciente. Por ejemplo, dichos anticuerpos pueden conjugarse con otras fracciones terapéuticas, otras proteínas, otros anticuerpos y/o marcadores detectables. Véase los documentos WO 03/057838; US 8,455,622.

Las fracciones terapéuticas conjugadas pueden ser cualesquiera agentes que puedan usarse para tratar, combatir, aliviar, prevenir o mejorar una afección o enfermedad no deseada en un paciente, tal como una amiloidosis TTR. Grupos terapéuticos pueden incluir, por ejemplo, inmunomoduladores o agentes biológicamente activos que facilitan o mejoran la actividad del anticuerpo. Un inmunomodulador puede ser cualquier agente que estimule o inhiba el desarrollo o mantenimiento de una respuesta inmunológica. Si tales fracciones terapéuticas están acopladas a un anticuerpo específico para las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o de fibrillas de TTR, tales como los anticuerpos descritos en el presente documento, las fracciones terapéuticas acopladas tendrán una afinidad específica por formas patógenas no nativas de TTR frente a las formas tetraméricas nativas de TTR. Por lo tanto, la administración de los anticuerpos conjugados se dirige directamente a tejidos que comprenden formas patógenas de TTR con un daño mínimo al tejido sano normal circundante. Esto puede ser particularmente útil para las fracciones terapéuticas que son demasiado tóxicas para ser administradas por su propia cuenta. Además, pueden utilizarse cantidades más pequeñas de las fracciones terapéuticas.

Ejemplos de grupos terapéuticos adecuados incluyen fármacos que reducen los niveles de TTR, estabilizan la estructura tetramérica de TTR nativa, inhiben la agregación de ^t T^r , alteran la formación de fibrillas o amiloide de TTR, o contrarrestan la toxicidad celular. Véase, p. ej., Almeida y Saraiva, FEBS Letters 586:2891-2896 (2012); Saraiva, FEBS Letters 498:201-203 (2001); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013); Ruberg y Berk, Circulation 126:1286-1300 (2012); y Johnson et al., J. Mol. Biol. 421(2-3):185-203 (2012). Por ejemplo, los anticuerpos pueden conjugarse con tafamidis, diflunisal, ALN-TTR01, ALNTTR02, ISIS-TTRRx, doxiciclina (doxi), ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA), Dosxi-TUDCA, galato de epigalocatequina (EGCG), curcumina o resveratrol (3,5,4'- trihidroxiestilbeno). Otras fracciones terapéuticas representativas incluyen otros agentes conocidos por ser útiles para el tratamiento, el manejo o la mejora de una amiloidosis TTR o los síntomas de una amiloidosis TTR. Véase, p. ej., Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013) para síntomas clínicos comunes de amiloidosis TTR y agentes típicos utilizados para tratar esos síntomas.

Los anticuerpos también se pueden acoplar con otras proteínas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden acoplarse con Fynomers. Los Fynomers son proteínas de unión pequeñas (p. ej., 7 kDa) derivadas del dominio Fyn SH3 humano. Pueden ser estables y solubles, y pueden carecer de restos cisteína y enlaces disulfuro. Los Fynomers pueden diseñarse para unirse a las moléculas objetivo con la misma afinidad y especificidad que los anticuerpos. Son adecuados para crear proteínas de fusión multi-específicas basadas en anticuerpos. Por ejemplo, los Fynomers pueden fusionarse a extremos N terminales y/o C terminales de anticuerpos para crear FynomAb bi y triespecíficos con diferentes arquitecturas. Los Fynomers pueden seleccionarse utilizando las bibliotecas de Fynomer mediante tecnologías de cribado usando FACS, Biacore y ensayos basados en células que permiten una selección eficiente de Fynomers con propiedades óptimas. Se describen ejemplos de Fynomers en Grabulovski et al., J. Biol. Chem. 282:3196-3204 (2007); Bertschinger et al., Protein Eng. Des. Sel 20:57-68 (2007); Schlatter et al., MAbs. 4:497-508 (2011); Banner et al., Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 69 (Pt6): 1124-1137 (2013); y Brack et al., Mol. Cancer Ther. 13:2030-2039 (2014).

Los anticuerpos descritos en el presente documento también pueden acoplarse o conjugarse con uno o más de otros anticuerpos (p. ej., para formar heteroconjugados de anticuerpos). Tales otros anticuerpos pueden unirse a diferentes epítopos dentro de la TTR o una porción de la misma o pueden unirse a un antígeno objetivo diferente.

Los anticuerpos también se pueden acoplar con un marcador detectable. Tales anticuerpos se pueden utilizar, por ejemplo, para diagnosticar una amiloidosis TTR, para vigilar la progresión de una amiloidosis TTR y/o para evaluar la eficacia del tratamiento. Tales anticuerpos son particularmente útiles para llevar a cabo tales determinaciones en sujetos que tienen o son susceptibles a una amiloidosis TTR, o en muestras biológicas apropiadas obtenidas a partir de dichos sujetos. Los marcadores detectables representativos que se pueden acoplar o unir a un anticuerpo incluyen varias enzimas, tales como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos, tales como estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, didorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como luminol; materiales bioluminiscentes, tales como luciferasa, luciferina y aequorina; materiales radioactivos, tales como itrio90 (90Y), plata radiactiva-111, plata radiactiva-199, Bismuto213, yodo (131I, 125I, 123I, 121I), carbono (14C), azufre (5S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In, 111In), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn y 117Tin; metales emisores de positrones utilizando diversas tomografías por emisión de positrones; iones metálicos paramagnéticos no radiactivos; y moléculas que están radiomarcadas o conjugadas con radioisótopos específicos.

La unión de los radioisótopos a los anticuerpos puede realizarse con quelatos bifuncionales convencionales. Para la unión de plata radioactiva-111 y plata radioactiva-199, se pueden usar uniones basadas en azufre. Véase, Hazra et al., Cell Biophys. 24-25: 1-7 (1994). La unión de los radioisótopos de plata puede implicar la reducción de la inmunoglobulina con ácido ascórbico. Para los radioisótopos tales como 111In y 90Y, se puede usar ibritumomab tiuxetan y reaccionará con dichos isótopos para formar 111In-ibritumomab tiuxetan y 90Y-ibritumomab tiuxetan, respectivamente. Véase, Witzig, Cáncer Chemother. Pharmacol., 48 Suppl 1: S91-S95 (2001).

Fracciones terapéuticas, otras proteínas, otros anticuerpos y/o marcadores detectables se pueden acoplar o conjugar, directa o indirectamente a través de un intermediario (p. ej., un conector), a un anticuerpo de la descripción. Véase, p. ej., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, en Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985); y Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982). Los conectores adecuados incluyen, por ejemplo, conectores escindibles y no escindibles. Pueden emplearse diferentes conectores que liberan las fracciones terapéuticas acopladas, proteínas, anticuerpos y/o marcadores detectables en condiciones ácidas o de reducción, tras la exposición a las proteasas específicas, o bajo otras condiciones definidas.

V. Aplicaciones Terapéuticas

Los anticuerpos anteriores pueden usarse para tratar o efectuar profilaxis de una enfermedad en un paciente que tiene o está en riesgo de contraer la enfermedad mediada al menos en parte por transtiretina (TTR), y particularmente por formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR. Aunque no se requiere una comprensión del mecanismo para la práctica, se cree que cualquiera o todos los siguientes mecanismos pueden contribuir al tratamiento de la amiloidosis TTR usando los anticuerpos anteriores: inhibición mediada por anticuerpos de agregación de TTR y formación de fibrillas, estabilización mediada por anticuerpos de conformaciones no tóxicas de TTR (p. ej., formas tetraméricas) o eliminación mediada por anticuerpos de agregados de TTR, TTR oligoméricas o TTR monoméricas. Los conjugados anticuerpo-fármaco pueden tener mecanismos de acción adicionales determinados por la fracción conjugada.

Los anticuerpos se administran en un régimen eficaz que significa una dosis, vía de administración y frecuencia de administración que retrasa la aparición, reduce la gravedad, inhibe el deterioro adicional y/o alivia al menos un signo o síntoma de un trastorno que se está tratando. Si un paciente ya padece un trastorno, el régimen puede denominarse un régimen terapéuticamente eficaz. Si el paciente está en alto riesgo de contraer el trastorno en relación con la población general, pero aún no está experimentando los síntomas, el régimen puede denominarse un régimen profilácticamente eficaz. En algunos casos, la eficacia terapéutica o profiláctica puede observarse en un paciente individual respecto a controles históricos o la experiencia anterior en el mismo paciente. En otros casos, la eficacia terapéutica o profiláctica puede demostrarse en un ensayo preclínico o clínico en una población de pacientes tratados en relación con una población control de pacientes no tratados.

La frecuencia de administración depende de la semivida del anticuerpo en la circulación, la afección del paciente y la vía de administración entre otros factores. La frecuencia puede ser diaria, semanal, mensual, trimestral o a intervalos irregulares en respuesta a cambios en la afección del paciente o el progreso del trastorno que se está tratando. Una frecuencia de ejemplo para la administración intravenosa es entre semanal y trimestral durante una causa continua de tratamiento, aunque también es posible una administración más o menos frecuente. Para la administración subcutánea, una frecuencia de administración de ejemplo es de diaria a mensual, aunque también es posible una administración más o menos frecuente.

El número de dosis administradas depende de si el trastorno es agudo o crónico y de la respuesta del trastorno al tratamiento. Para trastornos agudos o exacerbaciones agudas de un trastorno crónico, entre 1 y 10 dosis son a menudo suficientes. A veces, una sola dosis en bolo, opcionalmente en forma dividida, es suficiente para un trastorno agudo o exacerbación aguda de un trastorno crónico. El tratamiento puede repetirse para la recurrencia de un trastorno agudo o exacerbación aguda. Para los trastornos crónicos, un anticuerpo puede ser administrado a intervalos regulares, p. ej., semanal, quincenal, mensual, trimestralmente, semestral durante al menos 1, 5 o 10 años, o de por vida del paciente.

VI. Composiciones farmacéuticas y métodos de uso

Se proporcionan en el presente documento varios métodos para diagnosticar, vigilar, tratar o efectuar profilaxis de enfermedades o afecciones mediadas, al menos en parte, por transtiretina (TTR), y particularmente por formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR (p. ej., amiloidosis TTR). Ejemplos de tales enfermedades incluyen amiloidosis TTR familiar, tales como la miocardiopatía amiloide familiar (FAC), polineuropatía amiloide familiar (FAP) o amiloidosis selectiva del sistema nervioso central (CNSA), y amiloidosis TTR esporádicas, tales como amiloidosis sistémica senil (SSA) o amiloidosis cardiaca senil (SCA). Los anticuerpos descritos anteriormente pueden incorporarse en una composición farmacéutica para su uso en tales métodos. En general, un anticuerpo o una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo se administra a un sujeto que lo necesite. Los pacientes susceptibles de tratamiento incluyen individuos en riesgo de amiloidosis TTR, pero que no muestran síntomas, así como pacientes que actualmente muestran síntomas. Algunos pacientes pueden ser tratados durante la fase prodrómica de amiloidosis TTR.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse profilácticamente a individuos que tienen riesgo genético conocido de amiloidosis TTR. Tales individuos incluyen aquellos que tienen parientes que han experimentado tal enfermedad y aquellos cuyo riesgo se determina mediante el análisis de marcadores genéticos o bioquímicos (p. ej., mutaciones en TTR asociadas con amiloidosis TTR), incluyendo el uso de los métodos de diagnóstico proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, hay más de 100 mutaciones en el gen que codifica la TTR que han estado implicadas en la amiloidosis TTR. Véase, p. ej., US 2014/0056904; Saraiva, Hum. Mutat. 17(6):493-503 (2001); Damas y Saraiva, J. Struct. Biol. 130:290-299; Dwulet y Benson, Biochem. Biophys. Res. Commun. 114:657-662 (1983).

Los individuos que padecen amiloidosis TTR pueden reconocerse algunas veces por las manifestaciones clínicas de la amiloidosis TTR, incluyendo una o más de las siguientes: (1) antecedentes familiares de enfermedad neuropática, especialmente asociada con insuficiencia cardíaca; (2) dolor neuropático o alteraciones sensoriales progresivas de etiología desconocida; (3) síndrome del túnel carpiano sin causa obvia, particularmente si es bilateral y requiere liberación quirúrgica; (4) trastornos de la motilidad gastrointestinal o disfunción del sistema nervioso autónomo de etiología desconocida (p. ej., disfunción eréctil, hipotensión ortostática, vejiga neurogénica); (5) enfermedad cardiaca caracterizada por paredes ventriculares engrosadas en ausencia de hipertensión; (6) bloqueo auriculoventricular avanzado de origen desconocido, particularmente cuando está acompañado de un corazón engrosado; y (6) inclusiones del cuerpo vítreo del tipo algodón-lana. Véase, Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). Sin embargo, el diagnóstico definitivo de amiloidosis TTR se basa normalmente en biopsias de órganos objetivo, seguido de tinción histológica del tejido extirpado con el colorante específico de amiloide, rojo Congo. Si se observa una prueba positiva para amiloide, se realiza posteriormente tinción inmunohistoquímica para TTR para asegurar que la proteína precursora responsable de la formación de amiloide es realmente TTR. Para las formas familiares de las enfermedades, la demostración de una mutación en el gen que codifica TTR es entonces necesaria antes de que se pueda hacer el diagnóstico.

La identificación del sujeto puede ocurrir en un entorno clínico, o en otros lugares, tales como la casa del sujeto, por ejemplo, mediante el uso de un kit de auto-prueba por el propio del sujeto. Por ejemplo, el sujeto se puede identificar basándose en diversos síntomas tales como neuropatía periférica (sensorial y motora), neuropatía autonómica, deterioro gastrointestinal, miocardiopatía, nefropatía o deposición ocular. Véase, Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). El sujeto se puede también identificar por los niveles aumentados de formas no nativas de TTR en muestras de plasma del sujeto en comparación con muestras de control, como se describe en los ejemplos.

Según lo justifique la historia familiar, las pruebas genéticas o el cribado médico de la amiloidosis TTR, el tratamiento puede comenzar a cualquier edad (p. ej., a los 20, 30, 40, 50, 60 o 70 años de edad). El tratamiento normalmente implica dosis múltiples durante un periodo y se puede vigilar por el análisis del anticuerpo o respuestas de células T o de células B activadas a un agente terapéutico (p. ej., una forma truncada de TTR que comprende los restos de aminoácidos 89-97) a lo largo del tiempo. Si la respuesta cae, está indicada una dosis de refuerzo.

En aplicaciones profilácticas, se administra un anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo a un sujeto susceptible de, o de otro modo, en riesgo de contraer una enfermedad (p. ej., amiloidosis TTR) en un régimen (dosis, frecuencia y vía de administración) eficaz para reducir el riesgo, disminuir la gravedad, o retrasar la aparición de al menos un signo o síntoma de la enfermedad. En aplicaciones terapéuticas, se administra un anticuerpo o inmunógeno para inducir un anticuerpo a un sujeto que se sospecha o ya padece una enfermedad (p. ej., amiloidosis TTR) en un régimen (dosis, frecuencia y vía de administración) eficaz para aliviar o al menos inhibir el deterioro adicional de al menos un signo o síntoma de la enfermedad.

Un régimen se considera terapéutica o profilácticamente eficaz si un sujeto tratado individualmente logra un resultado más favorable que el resultado promedio en una población de control de sujetos comparables no tratados por métodos descritos en el presente documento, o si se demuestra un resultado más favorable para un régimen en sujetos tratados frente a los sujetos de control en un ensayo clínico controlado (p. ej., un ensayo fase II, fase M/MI o fase III) o un modelo animal en el nivel p <0.05 o 0.01 o incluso 0.001.

Puede utilizarse un régimen eficaz de un anticuerpo para, p. ej., inhibir o reducir la agregación de TTR en un sujeto que tiene o está en riesgo de contraer una afección asociada con la acumulación de TTR; inhibir o reducir la formación de fibrillas de TTR en un sujeto que tiene o está en riesgo de contraer una afección asociada con la acumulación de TTR; reducir o eliminar depósitos de TTR o agregados de TTR en un sujeto que tiene o está en riesgo de contraer una afección asociada con la acumulación de TTR; estabilizar las conformaciones no tóxicas de TTR en un sujeto que tiene o está en riesgo de contraer una afección asociada con la acumulación de TTR; inhibir los efectos tóxicos de los agregados, fibrillas o depósitos de TTR en un sujeto que tiene o está en riesgo de contraer una afección asociada con la acumulación de TTR; diagnosticar la presencia o ausencia de acumulación de amiloide TTR en un tejido que se sospecha que comprende la acumulación de amiloide; determinar un nivel de depósitos de TTR en un sujeto detectando la presencia de anticuerpo unido en el sujeto después de la administración del anticuerpo; detectar la presencia de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o de fibrillas de TTR en un sujeto; vigilar y evaluar la eficacia de los agentes terapéuticos que se utilizan para tratar pacientes con diagnóstico de una amiloidosis TTR; inducir una respuesta inmunitaria que comprende anticuerpos contra TTR en un sujeto; retrasar el inicio de una afección asociada con la acumulación de amiloide TTR en un sujeto; o tratar o efectuar la profilaxis de una amiloidosis TTR en un paciente.

Las dosis eficaces varían dependiendo de muchos factores diferentes, tales como medios de administración, sitio objetivo, estado fisiológico del sujeto, si el sujeto es humano o animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico.

Un intervalo de dosis de ejemplo para anticuerpos puede ser de aproximadamente de 0.1-20 o de 0.5-5 mg/kg de peso corporal (p. ej., 0.5, 1,2, 3, 4 o 5 mg/kg) o 10-1500 mg como dosis fija. La dosis depende de la afección del paciente y respuesta al tratamiento previo, si los hubiere, si el tratamiento es profiláctico o terapéutico y si el trastorno es agudo o crónico, entre otros factores.

El anticuerpo puede administrarse en tales dosis diariamente, en días alternados, semanal, quincenal, mensual, trimestralmente o de acuerdo con cualquier otra pauta determinada mediante análisis empírico. Un tratamiento de ejemplo implica la administración de dosis múltiples durante un período prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Pautas de tratamiento de ejemplo adicionales implican administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses.

Los anticuerpos pueden administrarse por una vía periférica. Las vías de administración incluyen tópica, intravenosa, oral, subcutánea, intraarterial, intracraneal, intratecal, intraperitoneal, intranasal o intramuscular. Las vías para la administración de anticuerpos pueden ser intravenosa o subcutánea. La administración intravenosa puede ser, por ejemplo, por infusión durante un periodo tal como 30-90 min. Este tipo de inyección se realiza más normalmente en los músculos del brazo o de las piernas. En algunos métodos, los agentes se inyectan directamente en un tejido particular donde los depósitos se han acumulado, por ejemplo, inyección intracraneal.

Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral pueden ser estériles y sustancialmente isotónicas (250-350 mOsm/kg de agua) y fabricadas de conformidad con las condiciones GMP. Las composiciones farmacéuticas pueden suministrarse en forma de dosis unitaria (es decir, la dosis para una sola administración). Las composiciones farmacéuticas se pueden formular utilizando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o auxiliares fisiológicamente aceptables. La formulación depende de la vía de administración elegida. Para la inyección, los anticuerpos pueden formularse en soluciones acuosas, p. ej., en tampones fisiológicamente compatibles tales como la solución de Hank, la solución de Ringer o solución salina fisiológica o tampón de acetato (para reducir las molestias en el sitio de inyección). La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, los anticuerpos pueden estar en forma liofilizada para su constitución con un vehículo adecuado, p. ej., agua estéril exenta de pirógenos, antes de su uso.

Los regímenes pueden administrarse en combinación con otro agente eficaz en el tratamiento o profilaxis de la enfermedad que se está tratando. Tales agentes pueden incluir ARNip para inhibir la expresión de TTR o Vyndaqel, un estabilizador de TTR en la formación de tetrámeros.

Después del tratamiento, la afección del sujeto puede evaluarse para determinar el progreso o la eficacia de tal tratamiento. Tales métodos examinan preferiblemente cambios en los niveles de amiloide TTR o niveles de formas no nativas de TTR. Por ejemplo, los niveles de amiloide TTR pueden evaluarse para determinar la mejora en relación con los niveles de amiloide TTR del sujeto bajo circunstancias comparables antes del tratamiento. Los niveles de amiloide TTR del sujeto pueden compararse también con poblaciones de control en circunstancias comparables. Las poblaciones de control pueden ser sujetos igualmente afectados, no tratados o sujetos normales no tratados (entre otros sujetos de control). La mejora con respecto a sujetos igualmente afectados no tratados o niveles que se acercan o alcanzan los niveles en sujetos normales no tratados indica una respuesta positiva al tratamiento.

Los niveles de amiloide TTR se pueden medir mediante una serie de métodos, incluyendo técnicas de formación de imágenes. Ejemplos de técnicas de formación de imágenes adecuadas incluyen la exploración PET con TTR o fragmentos de la misma radiomarcados, con anticuerpos para TTR o fragmentos de la misma, con agentes de formación de imágenes amiloides basados en rojo Congo, tales como, p. ej., PIB (US 2011/0008255), péptido p31 de imagen amiloide (la biodistribución del péptido de formación de imágenes amiloides, p31, se correlaciona con la cuantificación de amiloide basada en tinción de tejido con rojo Congo, Wall et al., Abstract N.° 1573, 2011 ISNM Annual Meeting) y otros marcadores de PET. Los niveles de formas no nativas de TTR se pueden medir, por ejemplo, realizando ensayos en placas de SDS-PAGE/transferencia Western o Meso Scale Discovery con los anticuerpos descritos en el presente documento en muestras de plasma o muestras de biopsia de un sujeto y comparándolas con muestras de control, descritas en los ejemplos.

A. Diagnóstico y métodos de vigilancia

También se proporcionan métodos para detectar una respuesta inmunitaria contra TTR en un paciente que sufre o es susceptible a enfermedades asociadas con la deposición de TTR o formas patógenas de TTR (p. ej., formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR). Los métodos se pueden utilizar para vigilar un curso de tratamiento terapéutico y profiláctico con los agentes proporcionados en el presente documento. El perfil de anticuerpos tras inmunización pasiva por lo general muestra un pico inmediato en la concentración de anticuerpos seguida de una disminución exponencial. Sin una dosis adicional, la disminución se acerca a niveles previos al tratamiento en un período de días a meses, según la semivida de los anticuerpos administrados. Por ejemplo, la semivida de algunos anticuerpos humanos es del orden de 20 días.

En algunos métodos, se realiza una medición basal del anticuerpo para TTR en el sujeto antes de la administración, se hace una segunda medición poco después para determinar el nivel máximo de anticuerpo y se hacen una o más mediciones adicionales a intervalos para vigilar la disminución de los niveles de anticuerpos. Cuando el nivel de anticuerpo ha disminuido al nivel basal o a un porcentaje predeterminado del máximo menos el nivel basal (p. ej., 50%, 25% o 10%), se administra una dosis adicional de anticuerpo. En algunos métodos, los niveles máximos o posteriores medidos menos el valor de fondo se comparan con niveles de referencia previamente determinados para constituir un régimen de tratamiento profiláctico o terapéutico beneficioso en otros sujetos. Si el nivel de anticuerpos medido es significativamente menor que un nivel de referencia (p. ej., menor que la media menos uno o, preferiblemente, dos desviaciones estándar del valor de referencia en una población de sujetos que se benefician de tratamiento) está indicada la administración de una dosis adicional del anticuerpo.

También se proporcionan métodos para detectar formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR en un sujeto, por ejemplo, midiendo formas amiloides de TTR o patógenas de TTR (p. ej., formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o de fibrillas de TTR) en una muestra de un sujeto o por formación de imágenes in vivo de TTR en un sujeto. Estos métodos son útiles para diagnosticar o confirmar el diagnóstico de enfermedades asociadas a dichas formas patógenas de TTR (p. ej., amiloidosis TTR) o susceptibilidad a las mismas. Los métodos también pueden utilizarse en sujetos asintomáticos. La presencia de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrilla de TTR indican susceptibilidad a la enfermedad sintomática futura. Los métodos también son útiles para vigilar la progresión de la enfermedad y/o la respuesta al tratamiento en sujetos que a los que se les ha diagnosticado previamente una amiloidosis TTR.

Las muestras biológicas obtenidas de un sujeto que tiene, o se sospecha que tiene, o en riesgo de tener una amiloidosis TTR se pueden poner en contacto con los anticuerpos descritos en el presente documento para evaluar la presencia de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR. Por ejemplo, los niveles de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR en dichos sujetos pueden compararse con los presentes en sujetos sanos. Por otra parte, los niveles de amiloide TTR o formas patógenas de TTR (p. ej., formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR) en sujetos que reciben tratamiento para la enfermedad pueden compararse con los de sujetos que no han sido tratados para una amiloidosis TTR. Algunas de estas pruebas implican una biopsia de tejido obtenido de estos sujetos. Los ensayos de ELISA también pueden ser métodos útiles, por ejemplo, para evaluar niveles de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR en muestras líquidas. Algunos de tales ensayos ELISA incluyen anticuerpos anti-TTR que preferiblemente se unen a formas monoméricas, mal plegadas, agregada o fibrillas de TTR con respecto a las formas tetraméricas normales de TTR.

Los métodos de formación de imágenes in vivo pueden funcionar mediante la administración de un reactivo, tal como un anticuerpo que se une a formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR en el sujeto, y después la detección del reactivo después de que se ha unido. Tales anticuerpos se unen normalmente a un epítopo dentro de los restos 89-97 de TTR. Si se desea, la respuesta de eliminación puede evitarse mediante el uso de fragmentos de anticuerpos que carezcan de una región constante de la longitud entera, tales como Fab. En algunos métodos, puede servir el mismo anticuerpo como reactivo de diagnóstico y tratamiento.

Los reactivos de diagnóstico se pueden administrar por inyección intravenosa en el cuerpo del sujeto, o por otras vías consideradas razonables. La dosis del reactivo debe estar dentro de los mismos intervalos que para los métodos de tratamiento. Por lo general, el reactivo está marcado, aunque en algunos métodos, el reactivo principal con afinidad por formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrilla de TTR no está marcado y se utiliza un agente de marcado secundario para unirse al reactivo principal. La elección del marcador depende de los medios de detección. Por ejemplo, un marcador fluorescente es adecuado para la detección óptica. El uso de marcadores paramagnéticos es adecuado para detección por tomografía sin intervención quirúrgica. Los marcadores radiactivos también se pueden detectar usando ^p E^t o SPECT.

El diagnóstico se realiza comparando el número, tamaño y/o intensidad de los locus marcados respecto a los valores basales correspondientes. Los valores basales pueden representar niveles medios en una población de individuos no afectados. Los valores basales también pueden representar los niveles anteriores en el mismo sujeto. Por ejemplo, los valores basales pueden determinarse en un sujeto antes de empezar el tratamiento y los valores medidos posteriormente se pueden comparar con los valores basales. Una disminución en los valores en relación con el basal generalmente indica una respuesta positiva al tratamiento.

IX. Kits

La descripción proporciona además kits (p. ej., recipientes) que comprenden un anticuerpo descrito en el presente documento y materiales relacionados, tales como instrucciones de uso (p. ej., prospecto). Las instrucciones de uso pueden contener, por ejemplo, las instrucciones para la administración de los anticuerpos y opcionalmente uno o más agentes adicionales. Los recipientes del anticuerpo pueden ser dosis unitaria, envases a granel (p. ej., envases de dosis múltiples) o dosis subunitarias.

El prospecto se refiere a instrucciones que se incluyen habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosis, administración, contraindicaciones y/o advertencias sobre el uso de estos productos terapéuticos

Los kits también pueden incluir un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. También puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

X. Otras aplicaciones

Los anticuerpos pueden usarse para detectar formas monoméricas, mal plegadas, agregadas, o de fibrillas de transtiretina (TTR), o fragmentos de las mismas, en el contexto del diagnóstico o tratamiento clínico o en la investigación. Por ejemplo, los anticuerpos pueden utilizarse para detectar la presencia de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR en una muestra biológica como una indicación de que la muestra biológica comprende depósitos amiloides de TTR. La unión de los anticuerpos a la muestra biológica puede compararse con la unión de los anticuerpos a una muestra de control. La muestra biológica y la muestra de control pueden comprender células del mismo origen tisular. Las muestras de control y las muestras biológicas se pueden obtener del mismo individuo o de diferentes individuos y en la misma ocasión o en diferentes ocasiones. Si se desea, se evalúan múltiples muestras biológicas y múltiples muestras de control en múltiples ocasiones para protegerse de la variación aleatoria independiente de las diferencias entre las muestras. Entonces se puede hacer una comparación directa entre la(s) muestra(s) biológica(s) y la(s) muestra(s) de control para determinar si la unión del anticuerpo (es decir, la presencia de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR) a la(s) muestra(s) biológica(s) aumenta, disminuye o permanece igual en relación con la unión del anticuerpo a la(s) muestra(s) de control. El aumento de la unión del anticuerpo a la(s) muestra(s) biológica(s) con respecto a la(s) muestra(s) de control indica la presencia de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR en la(s) muestra(s) biológica(s). En algunos casos, el aumento en la unión de anticuerpos es estadísticamente significativa. Opcionalmente, la unión de anticuerpos a la muestra biológica es al menos 1.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces o 100 veces mayor que la unión de anticuerpos a la muestra de control.

Además, los anticuerpos pueden utilizarse para detectar la presencia de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de t Tr en una muestra biológica para vigilar y evaluar la eficacia de un agente terapéutico que se está utilizando para tratar a un paciente al que se le ha diagnosticado una amiloidosis TTR. Una muestra biológica de un paciente con diagnóstico de una amiloidosis TTR se evalúa para establecer un valor basal para la unión de los anticuerpos a la muestra (es decir, un valor basal para la presencia de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR en la muestra) antes de iniciar la terapia con el agente terapéutico. En algunos casos, se evalúan múltiples muestras biológicas del paciente en múltiples ocasiones para establecer tanto un valor basal como la medida de variación aleatoria independiente de tratamiento. Entonces se administra un agente terapéutico en un régimen. El régimen puede incluir múltiples administraciones del agente durante un período. Opcionalmente, la unión de los anticuerpos (es decir, presencia de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR) se evalúa en múltiples ocasiones en múltiples muestras biológicas del paciente, para establecer una medida de variación aleatoria y mostrar una tendencia en respuesta a la inmunoterapia. Después se comparan las diversas evaluaciones de la unión de anticuerpos a las muestras biológicas. Si sólo se realizan dos evaluaciones, es posible hacer una comparación directa entre las dos evaluaciones para determinar si la unión de anticuerpos (es decir, la presencia de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR) ha aumentado, disminuido o sigue siendo la misma entre las dos evaluaciones. Si se realizan más de dos mediciones, las mediciones se pueden analizar en una evolución temporal comenzando antes del tratamiento con el agente terapéutico y procediendo a lo largo del curso de la terapia. En pacientes para los cuales se ha reducido la unión de anticuerpos a muestras biológicas (es decir, la presencia de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR), puede concluirse que el agente terapéutico era eficaz en el tratamiento de la amiloidosis TTR en el paciente. La disminución de la unión de anticuerpos puede ser estadísticamente significativa. Opcionalmente, la unión disminuye al menos en 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%. La evaluación de la unión de anticuerpos puede realizarse conjuntamente con la evaluación de otros signos y síntomas de amiloidosis TTR.

Los anticuerpos pueden utilizarse también como reactivos de investigación para la investigación de laboratorio en la detección de formas monoméricas mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR, o fragmentos de las mismas. En tales usos, los anticuerpos pueden marcarse con moléculas fluorescentes, moléculas marcadas con espín, enzimas o radioisótopos, y pueden proporcionarse en forma de kit con todos los reactivos necesarios para realizar el ensayo de detección. Los anticuerpos pueden también utilizarse para purificar las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas, o fibrillas de ^t T^r , o parejas de unión de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos también pueden usarse para inhibir o reducir la agregación de TTR, inhibir o reducir la formación de fibrillas de TTR, reducir o eliminar los depósitos de TTR o los agregados de TTR, o estabilizar las conformaciones no tóxicas de TTR en una muestra biológica. La muestra biológica puede comprender, por ejemplo, sangre, suero, plasma o tejido (p. ej., tejido del corazón, sistema nervioso periférico, sistema nervioso autónomo, riñones, ojos o tracto gastrointestinal). En algunos casos, la agregación de TTR, la formación de fibrillas de TTR o los depósitos de TTR son inhibidos o reducidos en al menos 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% o 75%, (p. ej., 10%-75% o 30%-70%). Ensayos para la detección de formación de fibrillas se describen en otras partes en el presente documento. Véase también el documento US 2014/0056904.

Si se asocian diferentes versiones de una secuencia con un número de acceso en momentos diferentes, se entiende la versión asociada con el número de acceso en la fecha de presentación efectiva de esta solicitud. La fecha de presentación efectiva significa la fecha de presentación o la fecha de presentación de una solicitud de prioridad que se refiere al número de acceso, si es aplicable. Del mismo modo, si se publican diferentes versiones de una publicación, sitio web o similar en diferentes momentos, se entiende la versión publicada más recientemente a la fecha de presentación efectiva de la solicitud a menos que se indique lo contrario. Cualquier característica, paso, elemento, modalidad o aspecto de la invención puede utilizarse en combinación con cualquier otro a menos que se indique específicamente lo contrario. Si bien la presente invención se ha descrito con cierto grado de detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad y comprensión, será obvio que se pueden introducir ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención, la cual se encuentra limitada solamente por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1. Identificación de anticuerpos monoclonales de mis-TTR

Los anticuerpos monoclonales conformacionalmente específicos contra formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o fibrillas de TTR (mis-TTR) se generaron, cribaron, expresaron y purificaron como se describe en Materiales y Métodos (a-d). Para generar anticuerpos monoclonales mis-TTR, la estructura cristalina de la TTR tetramérica humana se examinó para encontrar regiones de la proteína que están enterradas en el tetrámero, pero expuestas tras la disociación del tetrámero en sus subunidades monoméricas. La región identificada fueron los restos 89-97 (EHAEVVFTA) (SEQ ID NO: 113) situada dentro de la cadena F de la TTR y secuestrada en la interfase del dímero de la proteína tetramérica. Una búsqueda por BLAST de la base de datos de proteínas no puso de manifiesto ninguna otra proteína humana que posea esta secuencia.

Se sintetizó un péptido que comprende esta secuencia (ggEHAEWFTAggkg) (SEQ ID NO: 114). Las letras mayúsculas representan los restos 89-97 de la TTR. Las letras minúsculas representan restos de conector adicionales añadidos para aumentar la solubilidad de los péptidos antigénicos y para establecer el fragmento de 9 aminoácidos como una secuencia interna. Este péptido se ligó a un núcleo dendrítico de polilisina, generando un inmunógeno de péptido antigénico múltiple (TTR-MAP) que comprende un núcleo de restos de lisina con múltiples ramas ligado al péptido de TTR 89-97. Los anticuerpos que aparecen en la Tabla 2 se generaron contra TTR-MAP.

Además de este péptido antigénico múltiple, se generaron otros dos inmunógenos que contenían el mismo fragmento de TTR mediante el ligado covalente de péptidos TTR 89-97 similares (AccggEHAEWFTA-amida (SEQ ID NO: 115) y Ac-EHAEWFTAcgg-amida (SEQ ID NO: 116)) a través de los restos de cisteína N y C terminales a la hemocianina de lapa californiana (TTR89-97-N-KLH y TTR89-97-C-KLH).

Después de la generación, cribado, expresión y purificación de anticuerpos, se determinaron los parámetros cinéticos de la unión detallados (velocidad de asociación (ka), velocidad de disociación (kd) y constante de afinidad de la unión (K^d)) para los anticuerpos mis-TTR candidatos por resonancia de plasmones superficiales (SPR) para la TTR F87M/L110M recombinante humana, como se muestra en la Tabla 2. El anti-IgG de ratón (GE Healthcare) se inmovilizó en un chip sensor C5 (que carece de cadenas de dextrano) por medio de acoplamiento de amina siguiendo las instrucciones proporcionadas en el kit anti-ratón de GE Healthcare y los mAb mis-TTR se capturaron a un nivel para asegurar una máxima unión del analito de 30-50 RU. Se pasaron diferentes concentraciones de analito (TTR F87M/L110M recombinante humana) por el ligando capturado a 30 pl/min en tampón de análisis (HBS P-20 al 0.05%, BSA 1 mg/ml) en diluciones de 3 veces. Para cada concentración, la reacción procedió durante un periodo de tiempo para dejar que las mayores concentraciones de analito alcanzaran el equilibrio durante la asociación, así como que al menos 10% de la señal decayera durante la disociación. Al menos una concentración (no la mayor o la menor) se analizó por duplicado. Los intervalos de concentración de analito se seleccionaron basándose en la experimentación preliminar para abarcar por lo menos 10 veces por encima de la K^d a 10 veces por debajo de la K^d.

Los resultados del análisis de SPR de mAb mis-TTR candidatos se muestran en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2

Ejemplo 2. Unión de anticuerpos mis-TTR al antígeno TTR

Se ensayaron cuatro mAb mis-TTR candidatos (9D5, 14G8, 6C1 y 5A1) mediante ELISA en concentraciones que oscilaban de 0.31 a 2.5 pg/ml usando tanto TTR tratada a pH 4.0 (pH4-TTR) como TTR nativa como el antígeno de recubrimiento. La preparación del antígeno de la ^t T^r y los protocolos de ELISA se describe en otra parte en Materiales y Métodos (e-g).

Las curvas de unión resultantes y los valores Kd y Bmáx tabulados se muestran en la Figura 3 y Tabla 3 a continuación. Los resultados en la figura 3 se presentan en unidades arbitrarias (a.u.) en el eje y. Todos los mAb mostraron unión significativa a pH-4-TTR con valores de Kd en el intervalo de 16 nM (6c 1) a 282 nM (9D5). Los valores de Bmáx para la unión a pH4-TTR oscilaron desde un valor bajo de 0.65 a.u. (14G8) hasta un valor alto de 2.02 (9D5). En contraste con la unión a pH4-TTR, ninguno de los anticuerpos mostró una unión significativa a la TTR nativa, lo que indica que todos los anticuerpos para TTR generados eran específicos para formas de TTR no nativas.

Tabla 3

Ejemplo 3. Análisis de los anticuerpos mis-TTR por SDS-PAGE y PAGE-Nativa.

9D5 y 14G8 se analizaron por SDS-PAGE/Western para demostrar la especificidad de unión hacia formas monoméricas/desnaturalizadas de TTR frente a TTR no desnaturalizada, nativa. Los protocolos de SDS-PAGE, PAGE-nativa y transferencia Western se describen en otra parte en Métodos y Materiales (h-j).

La TTR no desnaturalizada o pH4-TTR se analizó en un gel de SDS-PAGE junto a TTR desnaturalizada por calor y pH4-TTR desnaturalizada por calor. Después de la electroforesis, el gel se inmunotransfirió sobre nitrocelulosa y se tiñó con los mAb para TTR 9D5 y 14G8. Ambos anticuerpos reconocieron sólo la TTR cuando se trató a pH4 o cuando la TTR o pH4-TTR primero se desnaturalizó con calor antes de SDS-PAGE. Estos 9D5 y 14G8 muestran así una especificidad para los confórmeros de la TTR generados ya sea por desnaturalización de la TTR o por tratamiento de la TTR a pH4.

6C1 y 5A1 junto con los mAb para TTR total (7G7, 8C3) y el anticuerpo policlonal comercialmente disponible de Sigma también se analizaron por SDS-PAGE/Western. Cada transferencia contenía marcadores de peso molecular teñidos, TTR no desnaturalizada y pH4-TTR.

El gel de SDS-PAGE teñido mostró que la especie principal presente en la muestra de TTR no desnaturalizada eran un dímero de ~38 kDa. Por el contrario, el componente principal presente en la muestra de pH4-TTR migraba como un dímero de ~35 kDa con una pequeña cantidad de dímero de un monómero de ~15 kDa. Este dímero migraba como una proteína ligeramente más pequeña que el dímero presente en la muestra de TTR no desnaturalizada, indicando una diferencia conformacional entre estas dos especies de dímero de TTR.

Las transferencias Western de TTR y pH4-TTR usando los cuatro anticuerpos mis-TTR mostraron que estos mAb no reconocen la TTR no desnaturalizada, pero se unen tanto al monómero como al dímero desnaturalizados presentes en la muestra de pH4-TTR. De este modo, los cuatro mAb mis-TTR (9D5, 14G8, 6C1 y 5A1) muestran especificidades similares para conformaciones no nativas de TTR cuando se analizan mediante SDS-PAGE/Western.

En contraste con los cuatro mAb mis-TTR, los dos mAb de control para TTR, 7G7 y 8C3, generados a través de la inmunización de ratones con TTR intacto, reconocieron todas las especies de TTR presentes en las muestras de TTR y pH4-TTR, incluyendo las especies de TTR tetraméricas. Así, a diferencia de los mAb mis-TTR, estos mAb de control se unen a TTR, pero sin especificidad conformacional. El anticuerpo policlonal de Sigma se comportó de forma similar a los mAb de control 7G7 y 8C3.

La TTR y pH4-TTR también se analizaron en un gel nativo para ver si los cuatro mAb mis-TTR eran capaces de mostrar especificidad conformacional en condiciones de gel no desnaturalizantes. En un gel de PAGE nativa teñido, la TTR migraba como un dímero nativo ~35 kDa con una pequeña cantidad de tetrámero. Por el contrario, pH4-TTR migraba principalmente como una mancha de peso molecular alto con una cantidad en trazas del dímero de ~35 kDa. El anticuerpo policlonal no específico de Sigma reconoció todas las especies de TTR presentes en la muestra de TTR y de pH4-TTR. En contraste, el 9D5 sólo reconoció las especies de TTR de alto peso molecular presentes en la muestra de pH4-TTR Como se observa en el estudio de SDS-PAGE/Western, 9D5 no reconoció ninguna de las especies de TTR nativas.

Los cuatro mAb mis-TTR se analizaron posteriormente por PAGE-nativa/transferencia Western. Como se esperaba y similar a 9D5, los otros mAb mis-TTR, 14G8, 6C1 y 5A1, se unieron específicamente a las formas no nativas de alto peso molecular de la TTR presentes en la muestra de pH4-TTR. Ninguno de estos anticuerpos reconoció el dímero de TTR nativo de ~35 kDa. Estos resultados indican que los cuatro mAb mis-TTR se comportaban de manera similar y reconocían sólo las especies de TTR no nativas que son conformacionalmente distintas de la TTR nativa.

Ejemplo 4. Inhibición de la formación de fibra de TTR por los anticuerpos mis-TTR

TTR-Y78F es una variante de la TTR que contiene una mutación puntual en la posición 78 en la secuencia de la proteína que desestabiliza el tetrámero de TTR. Con el tiempo y bajo condiciones ligeramente ácidas, esta variante de la TTR se disocia en sus subunidades monoméricas que luego pueden pasar a agregado y formar fibras capaces de unirse a la tioflavina T. Así, el grado de formación de la fibra puede supervisarse midiendo la fluorescencia de la tioflavina T a 480 nm. La introducción de un anticuerpo mis-TTR específico para monómeros o agregados de TTR disociada impediría que el conjunto de fibras de TTR produjera una disminución de la fluorescencia de tioflavina T en relación a una reacción de control sin anticuerpo. Los protocolos para examinar la inhibición de la formación de fibras de TTR se describen además en Materiales y Métodos (k).

Los cuatro anticuerpos mis-TTR inhibieron fuertemente la formación de fibras de TTR-Y78F reactivas a la tioflavina-T con relación al control del isotipo. Los resultados se muestran en la Figura 4A se presentan en unidades arbitrarias (a.u.) en el eje y. El anticuerpo mis-TTR 5A1 inhibió casi por completo la formación de fibras. Estos resultados son consistentes con la idea de que los anticuerpos mis-TTR se unen a formas monoméricas y/o agregadas de TTR, impidiendo así la formación de fibras de TTR.

La Tabla 4 sintetiza los datos de caracterización obtenidos para el conjunto de 4 anticuerpos mis-TTR (9D5, 14G8, 6C1 y 5A1) que mostraban buena selectividad conformacional para formas no nativas de TTR. Estos anticuerpos tenían afinidades (K^d) para pH4-TTR en el intervalo de 14.5 nM (6C1) a 257 nM (9D5) y valores Bmáx en el intervalo de 0.65 u.a. (14G8) a 2.02 (9D5). Ninguno de estos anticuerpos reconocía una TTR nativa, pero se unían a pH4-TTR en una SDS-PAGE/Western y a los agregados de TTR de alto peso molecular en una PAGE-nativa/Western. Estos anticuerpos también inhibieron la formación de fibrillas de TTR en el ensayo de formación de fibrillas utilizando Tio-T como la lectura.

Tabla 4

TTR-V122I es una variante de la TTR que contiene una sola mutación puntual en la posición 122 que desestabiliza el tetrámero. La formación de fibrillas se asoció con un aumento en la fluorescencia de ThT. Las concentraciones crecientes del mAb de 14G8 producían una disminución monotónica en la fluorescencia de ThT indicando una inhibición subestequiométrica de la fibrilación de TTR (IC50 = 0.028 ± 0.009 mg/ml, n=3, Figura 4B y Tabla 4a) El mAb de control de isotipo no produjo ninguna inhibición de la fibrilación de TTR (Figura 4C), demostrando así la especificidad de la inhibición mediada por 14G8.

Los valores de IC50 subestequiométricos comparables determinados para 5A1 y 6C1 (Tabla 4a) sugirieron mecanismos análogos de inhibición de fibrillas para cada uno de estos mAb mis-TTR. En contraste, 9D5 inesperadamente falló en la inhibición de la formación de fibrillas de TTR-V122I, a pesar de mostrar una especificidad y afinidad similares con TTR no nativa. Queda por explorar si 9D5 es más sensible a las condiciones de ensayo utilizadas.

Tabla 4a

Tabla resumen de la caracterización de mAb mis-TTR-V122I

Ejemplo 5. Caracterización Inmunohistoquímica (IHC) del tejido de ATTR utilizando mAb mis-TTR

Los mAb mis-TTR candidatos generados contra el fragmento TTR 89-97 de la proteína transtiretina se analizaron inmunohistoquímicamente en tejido fresco congelado y procesado en parafina de pacientes con amiloidosis TTR cardíaca confirmada. Los protocolos para obtener y preparar muestras de tejido cardiaco, inmunohistoquímica (IHC), y análisis de imágenes, se proporcionan en otra parte en Materiales y Métodos (l­ o). Los anticuerpos utilizados para la IHC se describen en la Tabla 5.

Tabla 5

Las muestras de tejido cardíaco se obtuvieron de pacientes con diagnóstico confirmado de mutaciones de ATTR. Los datos demográficos para los casos inmunohistoquímicamente examinados fueron los siguientes y se resumen en la Tabla 6: FAC = miocardiopatía amiloidea familiar; FAP = polineuropatía amiloidea familiar; 1° AL = amiloidosis de cadena ligera; ATTR = amiloidosis mediada por transtiretina; Desc. = Desconocido

Tabla 6

Los anticuerpos monoclonales de ratón (mAb mis-TTR) generados contra el fragmento 89-97 de la proteína transtiretina se analizaron inmunohistoquímicamente en tejido fresco congelado y procesado en parafina de pacientes con amiloidosis cardíaca TTR confirmada. Cada anticuerpo mis-TTR mostró una fuerte inmunorreactividad en el tejido cardiaco con ATTR. La tinción oscura se observó en depósitos en el miocardio y la vasculatura. Cuando se comparó la inmunorreactividad con la tinción con rojo Congo de Tioflavina T, la mayoría de la inmunorreactividad en el tejido mostró alta congruencia con birrefringencia de rojo Congo y tinción positiva de Tioflavina-T. Esto confirma la naturaleza de la hoja plegada beta del amiloide TTR depositado en este tejido. 14G8, 9D5, 6C1 y 5A1 también detectaron pre-amiloide TTR en áreas del miocardio que eran TTR-inmunopositivas, pero negativas para rojo Congo o Tioflavina-T. Las secciones de omisión tanto del anticuerpo primario como del anticuerpo de control de isotipo-IgG fueron negativas para la tinción a través de todos los tejidos analizados. Los anticuerpos reactivos hacia otras proteínas amiloidogénicas (cadenas ligeras lambda y kappa o amiloide A) no eran reactivos hacia el tejido cardíaco con ATTR utilizado en este análisis, indicando que los depósitos eran específicamente de naturaleza TTR.

Los patrones de tinción de los anticuerpos mis-TTR se compararon con los obtenidos con un anticuerpo de referencia TTR comercial bien caracterizado (prealbúmina, A0002, Dako, Carpinteria, CA). El anticuerpo de referencia DAKO tiñó el miocardio enfermo en las mismas áreas que los anticuerpos mis-TTR, pero produjo un patrón de tinción más difuso. El anticuerpo de referencia DAKo no tiñó los depósitos amiloides de TTR congofílicos presentes en la vasculatura tan fuertemente como los anticuerpos mis-TTR.

Los anticuerpos mis-TTR no tiñeron el tejido normal, sin enfermedad. Además, como era de esperar, la tinción con un anticuerpo de control de isotipo, 6F10 también era negativa.

Para determinar si la reactividad de los anticuerpos mis-TTR era específica para los depósitos de TTR, se examinó la reactividad cruzada de estos anticuerpos hacia el tejido cardíaco derivado de pacientes con diagnóstico de amiloidosis AL primaria. Como se esperaba, no se observó tinción del tejido amiloide AL, lo que confirma que los anticuerpos para TTR reaccionan específicamente hacia el tejido enfermo por ATTR.

El tejido cardíaco de los pacientes con un diagnóstico confirmado de amiloidosis sistémica senil o de pacientes con FAC, o FAP confirmadas producidas por mutaciones puntuales en el gen de TTR también se tiñó positivamente con 14G8, 9D5, 6C1 y 5A1. Estos resultados indican que los anticuerpos mis-TTR tienen la capacidad de reconocer los depósitos de TTR en tejido cardíaco sin importar el genotipo de ATTR.

Otros tejidos no cardíacos que se sabe que expresan TTR también se examinaron para determinar la tinción de anticuerpos mis-TTR y se compararon con la tinción obtenida usando el anticuerpo de referencia DAKO. Como era de esperar, el hígado, páncreas y plexo coroideo dieron todos tinción positiva para TTR usando el anticuerpo de referencia Dako. Por el contrario, 14G8 sólo tiñó las células pancreáticas alfa en los islotes de Langerhans y el plexo coroideo, sugiriendo que algo de la TTR localizada para estos órganos es conformacionalmente distinta de la TTR expresada en el hígado. La falta de inmunorreactividad del mAb mis-TTR en el hígado sugiere que la gran cantidad de TTR expresada allí es principalmente TTR nativa, tetramérica y no tiene el epítopo de mis-TTR expuesto. Se obtuvieron resultados similares cuando los mismos tejidos se tiñeron con 9D5, 6C1 y 5A1.

Ejemplo 6. Análisis de ATTR vs plasma humano normal por SDS-PAGE/transferencia Western y análisis de placa de Meso Scale Discovery (MSD)

Seis muestras de plasma de pacientes con confirmación de ATTR V30M (n.° 21, n.° 22, n.° 23, n.° 24, n.° 25, n.° 27) y 6 muestras (muestra n.° 11, n.° 12, n.° 15, n.° 18, n.° 19, n.° 20) de sujetos normales se obtuvieron de M. Saraiva (Universidad de Porto, Portugal). La muestra n.° C6 era una muestra de suero humano normal obtenida de una fuente comercial (BioreclamationlVT). Las muestras se analizaron por SDS-PAGE y transferencia Western, o por ensayo de placa de Meso Scale Discovery (MSD). Los protocolos para estos ensayos se describen en otra parte en Materiales y Métodos (p-r). Se generó una curva de calibración para el ensayo de placa de MSD utilizando 6C1.

En las transferencias Western resultantes usando los mAb mis-TTR 9D5 o 5A1, las diferencias entre los patrones de bandas entre muestras de plasma enfermas de TTR-V30M y normales eran evidentes. Todas las muestras de plasma contienen una banda de TTR ~14 kDa que migraba conjuntamente con el monómero de TTR no nativo presente en la muestra de referencia pH4-TTR. En general, las muestras de plasma derivadas de los pacientes con TTR-V30M (n.° 21,22, 23, 24, 25 y 27) tenían más de esta especie mis-TTR monomérica. Además, las muestras de plasma derivadas de pacientes con V30M también contenían una banda de ~30kDa que migraba conjuntamente con el dímero de la TTR no nativo presente en la muestra de referencia pH4-TTR. Con excepción de las muestras n.° 12 y n.° 18, las muestras de plasma derivadas de individuos normales tenían menos de esta especie de dímero.

Las transferencias Western anteriores se escanearon y se representaron gráficamente las intensidades de las bandas combinadas de dímero y monómero de TTR reactivo con 9D5 o 5A1 para cada muestra. Los resultados se muestran en la Figura 5A (9D5) y 5B (5A1) y se presentan en unidades arbitrarias (a.u.) en el eje y. Con la excepción de las muestras de plasma n.° 15 y n.° 18, las muestras de plasma derivadas de individuos normales (11, 12, 19 y 20) contenían menos especies dímeras y monómeras reactivas con 9D5 y 5A1 que las muestras derivadas de pacientes V30M (21-25 y 27).

Las 12 muestras de suero analizadas por transferencia Western con 9D5 y 5A1 también se analizaron por ensayo de placa de MSD usando 6C1 como el anticuerpo de captura de mis-TTR y el anticuerpo Dako-SulfoTag como el anticuerpo de detección. Los resultados para estos ensayos de MSD se muestran en la Figura 6 y se presentan en unidades arbitrarias (a.u.) en el eje y. Las muestras de 11, 12, 15, 18, 19 y 20 representan el plasma normal. Las muestras 21-25 y 27 representan plasma enfermo con V30M.

Con la excepción de las muestras de plasma n.° 15 y n.° 18, la cantidad de TTR reactiva con 6C1 en las muestras de plasma derivadas de los individuos normales fue menor que la observada en el plasma de individuos enfermos con TTR-V30M. Los niveles de reactividad de 6C1 medidos por ensayo MSD se correlacionaban muy bien con la cantidad de monómero y dímero reactivo con 9D5 observado antes por SDS-PAGE/Western.

Con el fin de determinar la concentración de las especies reactivas de TTR presentes en las muestras de plasma, las mismas muestras fueron nuevamente probadas usando 6C1 como el anticuerpo de captura y 8C3-SulfoTag como el anticuerpo de detección. Las señales de MSD se convirtieron a concentraciones en ng/ml de las especies de TTR reactivas usando la curva de calibración de TTR F87M/L110M generada anteriormente. Basándose en este análisis, el promedio de concentración de TTR reactiva con 6C1 presente en las muestras de control fue de 271 /- 185 ng/ml. En contraste, el promedio de concentración de TTR reactiva presente en las muestras de plasma enfermo por V30M fue mayor, en 331 /- 95 ng/ml. En conjunto, estos resultados de MSD indican que los anticuerpos mis-TTR son capaces de distinguir entre el plasma enfermo por ATTR y el normal. Esto garantiza el desarrollo adicional de anticuerpos mis-TTR para el uso en ensayos de diagnóstico de la enfermedad de ATTR.

Ejemplo 7. Diseño de anticuerpos 9D5 humanizados

El punto de partida o anticuerpo donador para la humanización fue el anticuerpo de ratón 9D5. La secuencia de aminoácidos variable de la cadena pesada de m9D5 maduro se proporciona como SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos variable de la cadena ligera de m9D5 maduro se proporciona como SEQ ID NO: 16. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada se proporcionan como SEQ ID NOS: 13-15, respectivamente (según se define por Kabat). Una CDR-H1 Chothia-Kabat combinada se proporciona como SEQ ID NO: 117. Las secuencias de aminoácido de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera se proporcionan como SEQ ID NOS: 24-26, respectivamente (según se define por Kabat). La numeración de Kabat se utiliza en todo este ejemplo.

La kappa variable (Vk) de m9D5 pertenece al subgrupo 2 de Kabat de ratón, que corresponde al subgrupo 3 de Kabat humano. La pesada variable (Vh) de m9D5 pertenece al subgrupo 3d de Kabat de ratón, que corresponde al subgrupo 3 de Kabat humano. Véase Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición. NIH Publicación No. 91-3242, 1991. La CDR-L1 de 16 restos pertenece a la clase canónica 4, la CDR-L2 de 7 restos pertenece a la clase canónica 1 y la CDR-L3 de 9 restos pertenece a la clase canónica 1 en Vk. Véase Martin y Thornton, J. Mol. Biol. 263:800-15, 1996. La CDR-H1 de Chothia-Kabat combinada de 10 restos pertenece a la clase canónica 1, y la CDR-H2 de 17 restos pertenece a la clase canónica 1. Véase Martin y Thornton, J Mol. Biol. 263:800-15, 1996. La CDR-H3 no tiene clases canónicas.

Los restos en la interfase entre los dominios de Vk y Vh son los que se encuentran comúnmente, excepto que la Leu está en la posición 47 en la cadena pesada, mientras que la Tyr está normalmente en esta posición. Esta posición es un candidato para retromutación.

Se realizó una búsqueda en las secuencias de proteínas en la base de datos PDB (Deshpande et al., Nucleic Acids Res. 33: D233-7, 2005) para encontrar estructuras que proporcionen un modelo estructural aproximado de 9D5. La estructura cristalina de fab del anticuerpo (pdb código 1MJU) (Ruzheinikov et al., J. Mol. Biol. 332 (2): 423-435, 2003) se utilizó para la estructura de Vk, puesto que tenía buena resolución (1.22 A) y similitud de secuencia total con Vk de 9D5, conservando la misma estructura canónica para el bucle que 9D5. Un anticuerpo monomérico con el código pdb 1SEQ (Covaceuszach et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 57 (PT 9), 1307-1309, 2001) se utilizó para la estructura de Vh, puesto que tenía buena similitud de secuencia y resolución (2.0 A) y tiene las mismas estructuras canónicas para CDR-H1 y CDR-H2 que la de VH de 9D5. Se modelizó la cadena Vh de 9D5 utilizando también la estructura 1MQK, puesto que tiene una mejor resolución de 1.28 A (Ostermeier et al., Proteins 21 (1): 74-77, 1995). Se utilizó el software BioLuminate (bajo licenciada de Schrodinger Inc.) para modelizar una estructura aproximada de 9D5.

Una búsqueda de las bases de datos de secuencias de proteínas no redundantes de NCBI permitió la selección de regiones armazón humanas adecuadas en los que injertar las CDR murinas. Para Vh, se eligió la cadena pesada de Ig humana BAC02114 (GI: 21670209) (SEQ ID NO: 3) (Akahori et al., Construction and characterization of antibody libraries: isolation of therapeutic human antibodies and application to functional genomics, Presentación directa, 25 de julio de 2001). Comparte las formas canónicas de 9D5. Es un miembro del subgrupo 1 humano pesado de Kabat. Vh de 9D5 tiene algún resto de región armazón único y ningún aceptor de región armazón humana mostró homología muy alta. Por lo tanto, se utilizó una segunda región armazón, AAX82494 (GI: 62421461) (SEQ ID NO: 4) (Lundquist et al., Infect. Immun. 74(6), 3222-3231, 2006) así como para hacer una región armazón híbrida de aceptor. Para Vk, se eligió una cadena ligera kappa humana con código de acceso en NCBI ABC66952 (GI: 84798006) (Shriner et al., Vaccine 24(49-50):7159-7166, 2006) (SEQ ID NO: 18). Tiene las mismas clases canónicas para la CDR-L1 y L2 que las del Vk parental. Es miembro del subgrupo 2 de kappa humano de Kabat.

Se construyeron ocho variantes de la región variable de cadena pesada humanizada y cinco variantes de la región variable de cadena ligera humanizada que contenían diferentes permutaciones de sustituciones (Hu9D5VHv1, 2, 2b, 3, 3b, 4, 4b y 5 (SEQ ID NOS: 5-12, respectivamente) y Hu9D5VLv1-5 (SEQ ID NOS: 19­ 23, respectivamente)) (Tablas 7 y 8). Los diseños de Vh y Vk humanizados de ejemplo, con retromutaciones y otras mutaciones basadas en los armazones humanos seleccionados, se muestran en las Tablas 7 y 8, respectivamente. Las áreas sombreadas de gris en la primera columna en las Tablas 7 y 8 indican las CDR definidas por Chothia, y las áreas sombreadas de gris en las columnas restantes en las Tablas 7 y 8 indican las CDR definidas por Kabat. Las SEQ ID NOS: 5-12 y 19-23 contienen retromutaciones y otras mutaciones como se muestra en la Tabla 9. Los aminoácidos en las posiciones H42, H47, H69, H82, H82(b), H108, L8, L9, L18, L19, L36, L39, L60, L70, y L74 en Hu9D5VHv1, 2, 2b, 3, 3b, 4, 4b y 5 y Hu9D5VLv1-5 se enumeran en las Tablas 10 y 11.

Tabla 7

Re iones Vh de 9D5 humanizado

Tabla 7

Re iones Vh de 9D5 humanizado

Tabla 7

Regiones Vh de 9D5 humanizado

Tabla 7

Re iones Vh de 9D5 humanizado

Tabla 7

Regiones Vh de 9D5 humanizado

Tabla 7

Regiones Vh de 9D5 humanizado

Tabla 8

Regiones Vk de 9D5 humanizado

Tabla 8

Regiones Vk de 9D5 humanizado

Tabla 8

Regiones Vk de 9D5 humanizado

Tabla 8

Regiones Vk de 9D5 humanizado

Tabla 8

Regiones Vk de 9D5 humanizado

Tabla 9

Tabla 10

Numeración de Kabat de los restos de región armazón para retromutaciones y otras mutaciones en regiones Vh de anticuerpos 9D5 humanizados

Tabla 11

Una alineación de la secuencia Vh de 9D5 murino (SEQ ID NO: 1) con las secuencias de modelo de ratón (1SEQ_H y 1MQK_H; SEQ ID NOS: 2 y 62, respectivamente), las secuencias de aceptor humanas (BAC02114 y AAX82494; SEQ ID NOS: 3 y 4 respectivamente), y las secuencias Hu9D5VHv1, Hu9D5VHv2, Hu9D5VHv2b, Hu9D5VHv3, Hu9D5VHv3b, Hu9D5VHv4, Hu9D5VHv4b y Hu9D5VHv5 (SEQ ID NOS: 5-12, respectivamente), se muestra en la figura 1A. Las CDR, tal como se definen por Kabat, están encerradas en recuadros, excepto que el primer recuadro es una combinación de la CDR-H1 de Chothia y la CDR-H1 de Kabat, con la CDR-H1 de Kabat subrayada y en negrilla. Las posiciones en que los restos canónicos, vernier o interfase difieren entre las secuencias de aceptor de ratón y humano son candidatas para la sustitución. Ejemplos de restos base de vernier/CDR incluyen los restos 2, 49, 69, 71, 75, 80 y 94 por numeración de Kabat en la Tabla 7. Ejemplos de restos de interacción canónicos/CDR incluyen los restos 24, 48 y 73 por numeración de Kabat en la Tabla 7. Ejemplos de restos de interfase/empaquetamiento (VH VL) incluyen los restos 37, 39, 44, 47, 91, 93 y 103 por numeración de Kabat en la Tabla 7.

Una alineación de la secuencia Vk de 9D5 murino (SEQ ID NO: 16) con la secuencia del modelo de ratón (1MJU L; SEQ ID NO: 17), la secuencia de aceptor humana (ABC66952; SEQ ID NO: 18), y las secuencias Hu9D5VLv1, Hu9D5VLv2, Hu9D5VLv3, Hu9D5VLv4 y Hu9D5VLv5 (SEQ ID NOS: 19-23, respectivamente), se muestra en la FIG. 1B. Las CDR, tal como se definen por Kabat, están encerradas en recuadros, excepto que el primer recuadro es una combinación de la CDR-H1 de Chothia y la CDR-H1 de Kabat, con la Kabat CDR-H1 subrayada y en negrilla. Las posiciones en que los restos canónicos, vernier o de interfase difieren entre las secuencias de aceptor de ratón y humano son candidatas para la sustitución. Ejemplos de los restos base de vernier/CDR incluyen los restos 4, 35, 46, 49, 66, 68 y 69 por numeración de Kabat en la Tabla 8. Ejemplos de restos de interacción canónicos/CDR incluyen los restos 2, 48, 64 y 71 por numeración de Kabat en la Tabla 8. Ejemplos de restos de interfase/empaquetamiento (VH VL) incluyen los restos 36,38, 44, 47, 87 y 98 por numeración de Kabat en la Tabla 8.

Los fundamentos para la selección de las posiciones indicadas en las Tablas 9 y 11 en la región variable de cadena ligera como candidatas para sustitución son los siguientes.

P8A: El modelo muestra una deformación en el bucle en esta posición, por lo que se probó una retromutación a A para remediar esto.

L9P: El modelo muestra una deformación en el bucle en esta posición, por lo que se probó una retromutación a P para aliviar esto.

P18S: P en esta posición es menos frecuente. Se probó la mutación a S para aliviar la distorsión del bucle. A19V: A y V en esta posición son igualmente frecuentes. Se probó la mutación a V para aliviar la distorsión del bucle.

Y36F: Este es un resto de interfase, y típicamente Y o F. Y tiene un grupo hidroxilo adicional que podría afectar potencialmente el empaquetamiento de LC+HC. La polaridad de la Y36 podría potencialmente interferir con la colocación del resto H95 de CRD-H3 en la cadena pesada. Un modelo de homología muestra que Y en esta posición formará un enlace de H de nuevo con F100(g) en H3 que puede dar como resultado la restricción de movilidad de H3. Tanto F como Y se utilizaron en versiones separadas.

K39R: R forma enlaces de H con restos adyacentes en este bucle en comparación con K. Para descartar cualquier efecto sobre la estabilidad del bucle, se probó la mutación a R.

D60S: La presencia de D en este resto muestra alta exposición por proteólisis. En algunas versiones se reemplazó con S, un resto más frecuente en la línea germinal humana en esta posición. Esto se prevé para mejorar la estabilidad.

D70A: D tiene potencial de proteólisis, por lo que se probó la mutación A.

K74R: R parece estabilizar el bucle en comparación con K en esta posición, por lo que se probó la retromutación a R.

Los fundamentos para la selección de las posiciones indicadas en las Tablas 9 y 10 en la región variable de cadena pesada como candidatas para la sustitución son los siguientes.

G42E: E tiene interacciones iónicas con R en la posición 44. Para descartar cualquier efecto que pudieran tener estas interacciones, se probó la retromutación a E en algunas versiones

W47L: Se trata de un resto de la interfase, por lo general W. En la cadena pesada de 9D5 murino, es L, mientras que en la región armazón de aceptor humano hay W en esta posición. Aunque L y W son ambos no polares, el anillo fenólico en W podría afectar potencialmente a la cadena ligera: empaquetamiento de la cadena pesada. W y L se incluyeron en versiones separadas.

I69F: Este es un resto vernier, parte de la base de CDR-H2. De acuerdo con el modelo de homología, el anillo aromático de F en secuencias murinas se apila con el anillo aromático del resto Y59 de CRD-H2. Un resto I en esta posición perturba ese apilamiento. I y F se incluyeron en versiones separadas.

M82S: Es inusual encontrar a M en esta posición en las regiones armazón humanas. A o N son más comunes. Cambiar el resto al más común S podría reducir la inmunogenicidad que podría estar asociada con la rara posición de M. Basándose en las observaciones del modelo, existe la posibilidad de que M interactúe con la Leu80, que es un resto de la zona vernier. M y S se incluyeron en versiones separadas.

S82(b)L: S está presente en esta posición tanto en las secuencias de región armazón murina como humana, pero S en esta posición es menos frecuente. A juzgar por la posición donde este resto se encuentra en el modelo, posiblemente podría hacer contacto con el antígeno. Se sabe que los restos en la región armazón 3 de la cadena pesada contribuyen ocasionalmente a la unión. S y L se incluyeron en versiones separadas. T108L: L es el resto más frecuente en las regiones armazón humanas en esta posición, por lo que L se probó en algunas versiones.

Debido a que se utilizaron dos regiones armazón de aceptor humanas (BAC02114 y AAX82494.1 (SEQ ID NOS: 3 y 4)) para la humanización de la región variable de cadena pesada de 9D5, hay ciertas posiciones en la región armazón que tienen diferentes aminoácidos en las dos regiones armazón del aceptor. Las versiones humanizadas de la región variable de cadena pesada de 9D5 pueden incluir cualquier aminoácido en estos restos. Ejemplos de restos en los que estos dos aceptores difieren incluyen las posiciones H19 (R o K), H40 (A o T), H44 (G o R), H49 (S o A), H77 (S o T), H82a (N o S), H83 (R o K), H84 (A o S) y H89 (V o M) por numeración de Kabat. Las razones para elegir un aminoácido u otro en estas posiciones son las siguientes. H19 (R o K): R y K están presentes en las dos regiones armazón consideradas, por lo que se probó cada resto en versiones separadas.

H40 (A o T): A y T están presentes en las dos regiones armazón consideradas, por lo que se probó cada resto en versiones separadas.

H44 (G o R): G y R están presentes en las dos regiones armazón consideradas, por lo que se probó cada resto en versiones separadas.

H49 (S o A): Este es un resto vernier que se empaqueta bajo CDR-H2. En la secuencia murina, es A. La ligera diferencia de tamaño y la naturaleza hidrófila de S podrían perturbar potencialmente la base de la CDR. S y A se incluyeron en versiones separadas.

H77 (S o T): S y T están presentes en las dos regiones armazón de aceptor humanas consideradas, por lo que cada uno se probó en versiones separadas.

H82a (N o S): N en esta posición es mucho menos frecuente que S. Por otra parte, S parece contribuir a la unión al antígeno. La mutación a S se probó en algunas versiones

H83 (R o K): K en la región armazón 3 está próxima a la superficie de unión de la CDR. Sustituirlo por R, que es más voluminoso que K, podría obstruir la colocación del antígeno. R es más frecuente y K es el tercero en frecuencia en las regiones armazón humanas en esta posición. R y K se incluyeron en versiones separadas. H84 (A o S): S y A están presentes en las dos regiones armazón consideradas, por lo que cada resto se probó en versiones separadas.

H89 (V o M): V y M están presentes en las dos regiones armazón consideradas, por lo que cada una se probó en versiones separadas.

Las cinco variantes de región variable de cadena ligera humanizada y cinco variantes de región variable de cadena pesada humanizadas son los siguientes:

Hu9D5VL versión 1 (sustitución Y36F en minúsculas):

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGNTYLYWfLQKPGQSPQLLIYRVSNLAS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 19)

Hu9D5VL versión 2 (sin sustituciones):

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGNTYLYWYLQKPGQSPQLLIYRVSNLAS GVPDRF S GS GS GTDFTLKI S RVE AED V GV Y Y CMQHLE YPLTF GQGTKLEIK (SEQ ID NO: 20⁾

Hu9D5VL versión 3 (sustitución D60S en minúsculas):

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGNTYLYWYLQKPGQSPQLL1YRVSNLAS GVPsRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 21)

Hu9D5VL versión 4 (sustituciones P8A, L9P, A19V, Y36F, K39R, D60S, D70A y K74R en minúsculas): DI VMT Q S apS LPVTPGEPvS IS CRS SKSLLHS N GNTYL YWfLQrPGQSPQLLI YR V SNL ASG VPsRF S GS GSGT aFTLrl SRVE AEDV GV Y Y CMQHLE YPLTF GQ GTKLEIK (SEQ ID NO: 22) Hu9D5VL versión 5 (sustituciones P8A, L9P, P18S, A19V, Y36F, K39R, D60S, D70A y K74R en minúsculas): DIVMTQSapSLPVTPGEsvSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWfLQrPGQSPQLLIYRVSNLASGV PsRFSGSGSGTaFTLrISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 23) Hu9D5VH versión 1 (sustituciones W47L, I69F y M82S en minúsculas):

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLE1VAEISNSGDTTY YPDTVKGRFTfSRDNAKNSLYLQsNSLKAEDTAVYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGQ GTTVTVSS (SEQ ID NO: 5)

Hu9D5VH versión 2 (sustituciones W47L, I69F, M82S y S82(b)L en minúsculas):

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEIVAEISNSGDTTY Y PDT VKGRFT fSRDN AXN SL YLQsN 1LRAEDT AV YY C ARH Y Y Y GGG Y GG WFFD V WGQ GTTVTVSS (SEQ ID NO: 6)

Hu9D5VH versión 2b (sustituciones G42E, W47L y T108L en minúsculas):

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPeKRLElVAEISNSGDTTYY PDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGQ GT1VTVSS (SEQ ID NO: 7)

Hu9D5VH versión 3 (sustituciones I69F, M82S y S82(b)L en minúsculas):

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSEISNSGDTTY YPDTVKGRFTfSRDNAKNSLYLQsNILRAEDTAVYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGQ GTTVTVSS (SEQ ID NO: 8)

Hu9D5VH versión 3b (sustituciones W47L y T108L en minúsculas):

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPGKRLE1VAEISNSGDTTY YPDTVKGRFTISRDN AKNTL YLQMSSLKSEDT AMY YC ARFIYYY GGGYGGWFFD V WG QGT1VTVSS (SEQ ID NO: 9)

Hu9D5VH versión 4 (sustituciones M82S y S82(b)L en minúsculas):

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSEISNSGDTTY YPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQsNILRAEDTAVYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGQ GTTVTVSS (SEQ ID NO: 10)

Hu9D5VH versión 4b (sustituciones W47L y T108L en minúsculas):

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKRLEIVAEISNSGDTTY YPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWG QGT1VTVSS (SEQ ID NO: 11)

Hu9D5VH versión 5 (sustituciones G42E, W47L y S82(b)L en minúsculas):

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPeKRLElVAEISNSGDTTYY PDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMN1LRAEDTAVYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGQG TTVTVSS (SEQ ID NO: 12)

El análisis de la calidad de la proteína junto con los análisis de potencial de agregación no mostró grupos obvios de restos propensos a la agregación presentes en las regiones armazón o CDR de la cadena ligera o de la cadena pesada de 9D5 (Wang et al., mAbs 1 (3): 254-267, 2009).

Ejemplo 8. Análisis cinético de unión de los anticuerpos 9D5 humanizados

Las cinéticas de unión de la unión de todas las variantes de 9D5 humanizadas, 9D5 murino y 9D5 quimérico a TTR F87M/L110M humana recombinante se caracterizaron por Biacore, como se muestra en la Tabla 12. El anti-IgG humana (GE Healthcare) se inmovilizó en un chip sensor C5 (carece de cadenas de dextrano) por medio de un acoplamiento de amina siguiendo las instrucciones proporcionadas en el kit anti-IgG humana de GE Healthcare y los mAb se capturaron a un nivel para asegurar una máxima unión del analito de 30-50 RU. Las diferentes concentraciones de analito (TTR F87M/L110M recombinante humana) pasaron sobre el ligando capturado a 50 pl/min en tampón de análisis (HBS P-20 al 0.05%, BSA 1 mg/ml) en diluciones de 3 veces. Para cada concentración, la reacción procedió durante un periodo de tiempo para dejar que las mayores concentraciones de analito alcanzaran el equilibrio durante la asociación, así como que al menos 10% de la señal decayera durante la disociación. Al menos una concentración (no la mayor o la menor) se analizó por duplicado. Los intervalos de concentración de analito se seleccionaron basándose en la experimentación preliminar para abarcar al menos 10 veces por encima de la K^d a 10 veces por debajo de la K^d.

La Tabla 12 resume la velocidad de asociación Biacore (ka), la velocidad de disociación (kd) y la constante de afinidad de unión (K^d) de las variantes de 9D5 murina, quimérica y humanizada para la TTR F87M/L110M recombinante humana.

Tabla 12

Estos resultados indican que la afinidad de 9D5 murino por TTR-F87M/L110M (K^d = 1.82E-08 M) ha mejorado ligeramente en la variante de 9D5 quimérica (K^d=1.35^e -09 M). Además, las variantes de 9D5 totalmente humanizadas tienen todas afinidades similares en el intervalo nM bajo. Hu9D5 H4L1 tiene la mayor afinidad (K^d=2.09E-09) de las variantes de 9D5 humanizadas probadas.

Ejemplo 9. Diseño de anticuerpos 14G8 humanizados

El punto de partida o anticuerpo donador para la humanización fue el anticuerpo de ratón 14G8. La secuencia de aminoácidos variable de cadena pesada de m14G8 maduro se proporciona como SEQ ID NO: 61. La secuencia de aminoácidos variable de cadena ligera de m14G8 maduro se proporciona como SEQ ID NO: 70. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada se proporcionan como SEQ ID NOS: 67-69, respectivamente (según se define por Kabat). Una CDR-H1 combinada de Chothia Kabat se proporciona como la SEQ ID NO: 118. Las secuencias de aminoácido de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera se proporcionan como SEQ ID NOS: 77-79, respectivamente (según se define por Kabat). Se proporciona una versión variante de CDR1 como es la SEQ ID NO: 80. La numeración de Kabat se utiliza en todo este ejemplo.

El dominio variable de kappa (Vk) de m14G8 pertenece al subgrupo 2 de Kabat de ratón, que corresponde al subgrupo 2 de Kabat humano. El dominio variable pesado (Vh) de m14G8 pertenece al subgrupo 3d de Kabat de ratón, que corresponde al subgrupo 1 de Kabat humano. Véase Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición. NIH Publicación No. 91-3242, 1991. La CDR-L1 de 16 restos pertenece a la clase canónica 3, la CDR-L2 de 7 restos pertenece a la clase canónica 1 y la CDR-L3 de 9 restos pertenece a la clase canónica 1 en Vk. Véase Martin y Thornton, J. Mol. Biol. 263:800-15, 1996. La CDR-H1 combinada de Chothia-Kabat de 10 restos pertenece a la clase canónica 1, y la CDR-H2 de 17 restos pertenece a la clase canónica 1. Véase Martin y Thornton, J Mol. Biol. 263:800-15, 1996. La CDR-H3 no tiene clases canónicas, pero el bucle de 15 restos probablemente tiene una base deformada según las reglas de Shirai et al., FEBS Lett. 455:188-97 (1999).

Los restos en la interfase entre los dominios Vk y Vh son los que se encuentran comúnmente, excepto L47, en cuya posición el principal aminoácido es generalmente W.

Se realizó una búsqueda en las secuencias de proteínas en la base de datos PDB (Deshpande et al., Nucleic Acids Res. 33: D233-7, 2005) para encontrar estructuras que proporcionen un modelo estructural aproximado de 14G8. La estructura cristalina de Fab con actividad de esterasa (pdb 1MJU) se utilizó como modelo para la estructura de Vk. Se resolvió con una resolución de 1.22 A y contiene las mismas estructuras canónicas para CDR-H1 y CDR-H2, y también contiene la misma longitud de CDR-H3 con una base deformada. Para la estructura de Vh se utilizó un fragmento Fv de anticuerpo anti-citocromo C oxidasa 7E2 (código pdb 1MQK_H). Tiene una resolución de 1.28 A y conserva la misma estructura canónica para los bucles que 14G8. Se usó el software BioLuminate (bajo licenciada de Schrodinger Inc.) para modelizar una estructura aproximada de 14G8.

Una búsqueda de las bases de datos de secuencias de proteínas no redundantes de NCBI permitió la selección de regiones armazón humanas adecuadas en la que se injertaron las CDR murinas. Para Vh, se eligieron cadenas pesadas de Ig humana con los códigos de acceso de NCBI AAD30410.1 y AAX82494.1. Estas comparten las formas canónicas de CDR-H1 y H2 de 14G8, y H3 de AAD30410.1 tienen una longitud de 15 restos con una base deformada prevista. Para Vk, se eligieron dos cadenas ligeras kappa humanas con códigos de acceso a NCBI ABA71374.1 y ABC66952.1 Tienen las mismas clases canónicas para LCDR.

Se construyeron tres variantes de la región variable de cadena pesada humanizada y tres variantes de la región variable de cadena ligera humanizada que contenían diferentes permutaciones de sustituciones (Hu14G8VHv1 -3 (SEQ ID NOS: 64-66, respectivamente) y Hu14G8VLv1-3 (SEQ ID NOS: 74-76, respectivamente)) (Tablas 13 y 14). Los diseños de Vh y Vk humanizados de ejemplo, con retromutaciones y otras mutaciones basadas en las regiones armazón humanas seleccionadas, se muestra en las Tablas 13 y 14, respectivamente. Las áreas sombreadas de gris en la primera columna en las Tablas 13 y 14 indican las CDR definidas por Chothia, y las áreas sombreadas de gris en las columnas restantes en las Tablas 13 y 14 indican las CDR definidas por Kabat. Las SEQ ID NOS: 64-66 y 74-76 contienen retromutaciones y otras mutaciones como se muestra en la Tabla 15. Los aminoácidos en las posiciones H1, H3, H47, H105, L8, L9, L19, L26, L36, L60 y L70 en Hu14G8VHv1-3 y Hu14G8VLv1-3 se enumeran en las Tablas 16 y 17.

Tabla 13

Re iones Vh de 14G8 humanizado

Tabla 13

Reiones Vh de 14G8 humanizado

Tabla 13

Reiones Vh de 14G8 humanizado

Tabla 13

Reiones Vh de 14G8 humanizado

Tabla 13

Reiones Vh de 14G8 humanizado

Tabla 14

Regiones Vk de 14G8 humanizado

Tabla 14

Regiones Vk de 14G8 humanizado

Tabla 14

Regiones Vk de 14G8 humanizado

Tabla 14

Regiones Vk de 14G8 humanizado

Table 15

Table 16

Table 17

Una alineación de la secuencia Vh de 14G8 murina (SEQ ID NO: 61) con la secuencia del modelo de ratón (1MQK_H; SEQ ID NO: 62), las secuencias de aceptor humanas (AAD30410.1 y AAX82494.1; SEQ ID NOS: 63 y 4, respectivamente) y las secuencias Hu14G8VHv1, Hu14G8VHv2 y Hu14G8VHv3 (SEQ ID NOS: 64-66, respectivamente), se muestra en la figura 2A. Las CDR, tal como se definen por Kabat, están encerradas en recuadros, excepto que el primer recuadro es una combinación de la CDR-H1 de Chothia y la CDR-H1 de Kabat, con la CDR-H1 de Kabat subrayada y en negrilla. Las posiciones en que los restos canónicos, vernier o de interfase difieren entre las secuencias de aceptor de ratón y humana son candidatas para la sustitución. Ejemplos de restos base vernier/CDR incluyen los restos 2, 49, 69, 71, 75, 80 y 94 por numeración de Kabat en la Tabla 13. Ejemplos de restos de interacción canónicos/CDR incluyen los restos 24, 48 y 73 por numeración de Kabat en la Tabla 13. Ejemplos de restos de interfase/empaquetamiento (VH+VL) incluyen los restos 37, 39, 44, 47, 91, 93 y 103 por numeración Kabat en la Tabla 13.

Una alineación de la secuencia Vk de 9D5 murina 14G8 (SEQ ID NO: 70) con la secuencia del modelo de ratón (1MJU_L; SEQ ID NO: 71), las secuencias de aceptor humanas (ABA71374.1 y ABC66952.1; SEQ ID NOS: 72 y 73, respectivamente) y las secuencias Hu14G8VLv1, Hu14G8VLv2, Hu14G8VLv3 (SEQ ID NOS: 74-76, respectivamente), se muestra en la Figura 2B. Las CDR, tal como se definen por Kabat, están encerradas en recuadros, excepto que el primer recuadro es una combinación de la CDR-H1 de Chothia y la CDR-H1 de Kabat, con la CDR-H1 de Kabat subrayada y en negrilla. Las posiciones en que los restos canónicos, vernier o de interfase difieren entre las secuencias de aceptor de ratón y humanas son candidatas para la sustitución. Ejemplos de los restos base de vernier/CDR incluyen los restos 4, 35, 46, 49, 66, 68 y 69 por numeración de Kabat en la Tabla 14. Ejemplos de restos de interacción canónicos/CDR incluyen los restos 2, 48, 64 y 71 por numeración de Kabat en la Tabla 14. Ejemplos de restos de interfase/empaquetamiento (VH VL) incluyen los restos 36, 38, 44, 47, 87 y 98 por numeración de Kabat en la Tabla 14.

Los fundamentos para la selección de las posiciones indicadas en las Tablas 15 y 17 en la región variable de cadena ligera como candidatas para sustitución son los siguientes.

P8A: La prolina es fundamental para la conformación estructural, y la pérdida o ganancia de prolina puede afectar a la estructura. Las retromutaciones se diseñaron para evitar la "ganancia de prolina". Sin embargo, dado que A en esta posición es poco frecuente en las regiones armazón de IgG humana, se incluyó P en alguna versión

L9P: La prolina es fundamental para la conformación estructural, y la pérdida o ganancia de prolina puede afectar a la estructura. Las retromutaciones se diseñaron para evitar la “pérdida de prolina". Sin embargo, dado que P en esta posición es poco frecuente en las regiones armazón de IgG humana, se incluyó L en alguna versión.

A19V: A y V tienen frecuencias similares en regiones armazón humanas. Ambos restos se incluyeron en versiones separadas.

N26S: L26 representa un sitio de N-glicosilación en CDR1 de la cadena ligera. La mutación a S reduce la N-glicosilación y produce un producto más heterogéneo.

Y36F: Se trata de un resto de la interfase. Se hace la sustitución en algunas versiones para mantener el resto murino en este resto de interfase.

D60S: D y S tienen frecuencias similares en regiones armazón de IgG humana. Se aplica S por la mayoría de los anticuerpos terapéuticos comercialmente disponibles, por lo que D se reemplazó con S en algunas versiones.

D70A: D es mucho más frecuente que A en las regiones armazón de IgG humana. Sin embargo, D formará un enlace iónico con R24 en la CDR1 de la cadena ligera, así que tanto A como D se incluyeron en versiones separadas.

Los fundamentos para la selección de las posiciones indicadas en las Tablas 15 y 16 en la región variable de cadena pesada como candidatas para la sustitución son los siguientes.

Q1E: La conversión de glutamato (E) en piroglutamato (pE) ocurre más lentamente que de glutamina (Q). Debido a la pérdida de una amina primaria en la conversión de glutamina a pE, los anticuerpos se vuelven más ácidos. La conversión incompleta produce heterogeneidad en el anticuerpo que se puede observar como picos múltiples utilizando métodos analíticos basados en la carga. Las diferencias de heterogeneidad pueden indicar una falta de control del proceso.

Q3K: Q es más frecuente en las regiones armazón de IgG humana. K es menos frecuente, pero no inusual. Ambos restos se incluyeron en versiones separadas.

W47L: Se trata de un resto de la interfase. Se hizo la sustitución en algunas versiones para mantener el resto murino en este resto de interfase.

Q105T: T puede formar un enlace del hidrógeno con K3, así que T se incluyó en algunas versiones para mantener la estructura conformacional de VH.

Debido a que se utilizaron dos regiones armazón del aceptor humanas (ABA71374.1 y ABC66952.1 (SEQ ID NOS: 72 y 73, respectivamente)) para la humanización de la región variable de cadena ligera de 14G8, hay ciertas posiciones de región armazón que tienen diferentes aminoácidos en las dos regiones armazón del aceptor. Las versiones humanizadas de la región variable de cadena ligera de 14G8 pueden incluir cualquier aminoácido en estos restos. Un ejemplo de un resto en el que difieren estos dos aceptores es la posición L18 (S o P) por numeración de Kabat. Los fundamentos para elegir un aminoácido o el otro en esta posición es el siguiente.

L18 (S o P): P en esta posición es menos frecuente. La mutación a S se probó en algunas versiones

Debido a que se utilizaron dos regiones armazón del aceptor humanas (AAD30410.1 y AAX82494.1 (SEQ ID NO: 63 y 4, respectivamente)) también como secuencias de aceptor para la humanización de la región variable de la cadena pesada de 14G8 maduro, hay ciertas posiciones de la región armazón que tienen diferentes aminoácidos en las dos regiones armazón del aceptor. Las versiones humanizadas de la región variable de cadena pesada de 14G8 pueden incluir cualquier aminoácido en estos restos. Ejemplos de restos en que estos dos aceptores difieren incluyen las posiciones H82a (N o S), H83 (R o K), H84 (^a o S) y H89 (V o M) por numeración de Kabat. Los fundamentos para elegir un aminoácido o el otro en estas posiciones son los siguientes.

H82a (N o S): N y S tienen frecuencia similar en la 82a. También son restos humanos en dos plantillas VH humanas. S y N se incluyeron en versiones separadas.

H83 (R o K): K en la región armazón 3 está próxima a la superficie de unión de CDR. Sustituirla por R podría obstruir la colocación del antígeno. R es más frecuente y K es el tercero en frecuencia en las regiones armazón humanas en esta posición. R y K se incluyeron en versiones separadas.

H84 (A o S): S y A están presentes en las dos regiones armazón consideradas, por lo que cada resto se probó en versiones separadas.

H89 (V o M): V y M están presentes en las dos regiones armazón consideradas, por lo que cada una se probó en versiones separadas.

Las tres variantes de región variable de cadena ligera humanizada y tres variantes de región variable de cadena pesada humanizadas son las siguientes:

Hu14G8VL versión 1 (sustituciones P8A, L9P, A19V, Y36F, D70A en minúsculas):

DIVMTQSapSLPVTPGESvSISCRSNKSLLHSNGNTYLYWfLQKPGQSPQLLIYRVSNLASG VPDRFSGSGSGTaFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPLTFGQGTKLEIKR (SEQ ID NO: 74)

Hu14G8VL versión 2 (sustitución L36F en minúsculas):

DI VMTQ SPLS LP VTPGEPASIS CRS NKS LLHSN GNTYL Y W fLQKPGQ SPQLLIYRV SNL AS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPLTFGQGTKLEIKR (SEQ ID NO: 75)

Hu14G8VL versión 3 (sustituciones N26S, L36F y D60S en minúsculas):

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSsKSLLHSNGNTYLYWfLQKPGQSPQLLIYRVSNLAS GVPsRFS GSGS GTDF TLKISRVE AEDV GV Y Y CMQHLE YPLT FGQGTKLEIKR (SEQ ID NO: 76)

Hu14G8VH versión 1 (sustituciones Q1E, Q3K, W47L y Q105T en minúsculas):

eVkLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLElVAEINNSGDTTYY PDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGtG TLVTVSS (SEQ: 64)

Hu14G8VH versión 2 (sustituciones Q1E y W47L en minúsculas):

eV QLVE S GGGL V Q PGGSLKLS C AAS GFTF SS YTMS WVRQTPEKRLE1V AEINN S GD TT YY PDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)

Hu14G8VH versión 3 (sustituciones Q1E y W47L en minúsculas):

eVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLElVAEINNSGDTTYY PDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO: 66)

Ejemplo 10. Análisis Cinético de unión de los anticuerpos 14G8 humanizados

Las cinéticas de unión de la unión de tres variantes de 14G8 humanizadas y 14G8 murina a TTR F87M/L110M recombinante humana se caracterizaron por Biacore, como se muestra en la Tabla 18. El anti-IgG humana (GE Healthcare) se inmovilizó en un chip sensor C5 (que carece de cadenas de dextrano) por medio de acoplamiento de amina siguiendo las instrucciones proporcionadas en el kit de anti-IgG humana de GE Healthcare y los mAb se capturaron a un nivel para asegurar una máxima unión de analito de 30-50 RU. Las diferentes concentraciones de analito (TTR F87M/L110M recombinante humana) se hicieron pasar sobre el ligando capturado a 50 pl/min en tampón de análisis (HBS P-20 al 0.05%, BSA 1 mg/ml) en diluciones de 3 veces. Para cada concentración, la reacción procedió durante un periodo de tiempo para dejar que las mayores concentraciones de analito alcanzaran el equilibrio durante la asociación, así como que al menos 10% de señal decayera durante la disociación. Al menos una concentración (no la mayor o la menor) se analizó por duplicado. Los intervalos de concentración de analito se seleccionaron basándose en la experimentación preliminar para abarcar al menos 10 veces por encima de K^d a 10 veces por debajo de K^d.

La Tabla 18 resume la velocidad de asociación (ka), velocidad de disociación (kd) y constante de la afinidad de la unión (K^d) del 14G8 de ratón, 14G8 quimérico, Hu14G8 H2L1, Hu14G8 H2L2, Hu14G8H2L3 y Hu14G8 H3L1 a la TTR F87M/L110M recombinante humana. Como se muestra en la Tabla 18, los anticuerpos Hu14G8 y 14G8 de ratón tienen similares afinidades de unión a TTR.

Tabla 18

14G8 murino, 14G8 quimérico y otra versión humanizada de 14G8 sin cambios en LCDR1 mostraron cadenas ligeras adicionales cuando se analizaron en SDS-PAGE bajo condiciones de reducción. El análisis de secuencias puso de manifiesto que hay un sitio de N-glicosilación en LCDR1 en el resto 26 por numeración de Kabat. Este sitio de N-glicosilación puede provocar posibles problemas de heterogeneidad durante la fabricación. La mutación de la N en el resto L26 en Hu14G8VLv2 produjo Hu14G8VLv3. Los anticuerpos humanizados que tienen Hu14G8VLv3 muestran una sola cadena ligera cuando se analizan por SDS-PAGE bajo condiciones de reducción, eliminando, de este modo, el posible problema de heterogeneidad. La afinidad de unión al antígeno de Hu14G8 H2L3 es similar a la del anticuerpo murino parental y el anticuerpo quimérico.

Ejemplo 11. Materiales y Métodos

a. Protocolo de generación de anticuerpos

Los ratones fueron inmunizados semanalmente con los péptidos antigénicos TTR-MAP, TTR89-97-N-KLH o TTR89-97-C-KLH en adyuvante RIBI o mensualmente en adyuvante TiterMax. Tres o cuatro días antes de la fusión, los ratones seleccionados recibieron un refuerzo IV final con inmunógeno en solución salina. Los bazos se homogeneizaron para preparar esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma SP2/0 usando un protocolo estándar de electrofusión. Las células fusionadas en los medios de selección se pusieron en placas de 96 pocillos y se cribaron después de 7-10 días.

b. Protocolo de cribado de anticuerpos

La selección de hibridomas se basó en el siguiente cribado de ELISA: se recubrieron placas de 96 pocillos ELISA con anti-His de pollo, PBS 1 pg/ml y se incubaron durante 1 hora. Las placas se bloquearon con solución de BSA/PBS al 1%, 2O0 ul/pocillo durante 15 minutos y después se añadió pH4-TTR 0.5 pg/ml, 50 pl/pocillo y se incubó durante 1 hora. pH4-TTR es TTR que ha sido sometida a pH bajo (acetato de sodio 50 mM, pH 4.0) con el fin de disociar/agregar la TTR, exponiendo el epítopo TTR89-97. Las placas se lavaron dos veces con TBS-T. Se añadió el líquido sobrenadante de las placas de fusión, 50 pl/pocillo y se incubó durante 1 hora. Las placas se lavaron dos veces con TBS-T. El anticuerpo de detección, anti-ratón-HRP-(específico para IgG1,2a, 2b, 3) de cabra se diluyó 1: 5000 en BSA/PBS/TBS-T al 0.5%, se añadieron 50 pl/pocillo y se incubó durante 1 hora. Por último, las placas se lavaron cinco veces con TBS-T y sustrato de TMB, se añadieron 100 pl/pocillo. Después de 15 minutos, se detuvo el desarrollo del sustrato con ácido sulfúrico 2 N, 50 pl/pocillo. Las placas se leyeron a 450 nm. Los pocillos con un O.D. > 1.0 se seleccionaron y las células se transfirieron a una placa de 24 pocillos. Después de 3 días de crecimiento, los clones se cribaron a la inversa con el ensayo anterior para confirmar la unión y sustituyendo la pH4-TTR por TTR nativa como un cribado inverso negativo, permitiendo la selección de los clones productores de mAb de TTR específicos para las formas no nativas de TTR.

c. Protocolos de expresión de anticuerpos

Los plásmidos de cadena ligera y de cadena pesada dirigidos por CMV que llevaban secuencias de anticuerpos monoclonales humanizados se transfectaron en células CHO-S1 (Life Technology). Se aplicó la selección doble para hacer un grupo seleccionado. Se probaron medios condicionados para la titulación, unión y se analizaron por medio de SDS-PAGE/transferencia Western. Los grupos seleccionados se utilizaron para la generación de clones usando el sistema Clonepix (Molecular Devices). Los clones fueron clasificados basándose en los títulos de anticuerpos. Los clones seleccionados se ampliaron y se depositaron.

El clon de producción más alta se expandió en matraces de agitación y se utilizó el cultivo para inocular cultivos en bolsas Wave de 10-25 L. Se utilizó una mezcla de medios de expresión FreeStyle-CHO, CD OptiCHO y FreeStyle F17 suplementado con Glutamax (medios y Glutamax de Life Technology) para los matraces de agitación, así como para los cultivos en bolsas Wave. El cultivo discontinuo se realizó usando un Biorreactor Wave (GE Healthcare) a 37°C, 7% de CO2 con agitación constante. Las muestras se sacaron periódicamente para supervisar el número de células, viabilidad y producción de anticuerpos. Se realizó suplementación con Cell Boost (HyClone) si era necesaria. El cultivo discontinuo se recogió cuando la viabilidad celular empieza a disminuir por debajo del 90% (5-7 días).

d. Protocolo de purificación de anticuerpos

El cultivo celular se cosechó después de, primero permitir que las células en suspensión se asentaran en la parte inferior de la bolsa Wave por gravedad a 4°C. Los medios de cosecha se aclararon a través de un filtro profundo (Millistak Pod COHC, Millipore), se concentraron 10 veces por filtración de flujo tangencial (Pelicon 2PLC 30K, Millipore) y se esterilizaron por filtración a través de filtro de 0.2 pm (Opticap XL Millipore). Los medios condicionados concentrados después se cargaron en una columna de Flujo Rápido de Proteína G Sepharosre (GE Lifesciences) previamente equilibrada en IxPBS, pH 7.4 con un FPLC (Akta Avant, GE Lifesciences). Las proteínas no unidas se separaron por lavado de la columna con 5-10 volúmenes de columna de IxPBS, pH 7.4 hasta que la OD280 alcanzó el valor basal. El anticuerpo unido se eluyó de la columna con 2 volúmenes de columna de tampón de elución de IgG (Thermo Scientific). Se recolectaron fracciones de elución y el pH se neutralizó con Tris 2 M, pH 9.0 (60 pl por 1 ml de elución).

Las fracciones que contienen anticuerpos se agruparon y dializaron toda la noche a 4°C contra IxPBS, pH 7.4. La muestra dializada después se esterilizó por ultrafiltración a través de un filtro de 0.2 pm de PES y se almacenó a 4°C. Se determinó la concentración final de proteína mediante ácido bicinconínico (BCA) usando gamma-globulina bovina como la proteína de referencia (Thermo Scientific).

e. Protocolos de purificación y expresión de la TTR recombinante

Las células de E. coli (BL21-A1) se transformaron con un plásmido pET21a(+) que contenía un inserto de TTR (Met-hTTR-(His)⁶ o una variante de la TTR que contiene una doble mutación F87M/L110M. Las células se cultivaron en caldo 2YT que contenía 100 pg/ml de ampicilina. La expresión de TTR se indujo durante la noche a 20°C en presencia de IPTG 1 mM y arabinosa al 005%.

Las células se recolectaron mediante centrifugación a 4000 x g durante 10 min y se almacenaron a -80°C hasta su uso. Se descongelaron 10-15 g de sedimentos de células y se lisaron en 50 ml de tampón A (1xPBS que contiene NaCl 500 mM, imidazol 20 mM) por procesamiento a través de un procesador de alto cizallamiento LV-1 (Microfluidics, Inc.). Las células lisadas se centrifugaron a 12000 x g durante 15 min, se filtraron a través de un filtro PES de 0.2 pm antes de la purificación en una columna His-Trap HP (GE Lifesciences). Después de la carga, la columna se lavó con 10 v.c. de tampón A y se eluyó con tampón B (1xPBS con NaCl 500 mM, imidazol 500 mM). Se recolectaron las fracciones de los picos correspondientes a la TTR, se dializaron contra 1xPBS y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

f. Preparación de antígeno TTR

El antígeno TTR nativo se preparó diluyendo una solución madre concentrada de TTR-6His recombinante a una concentración final de 2.5 pg/ml en 1xPBS. La TTR tratada a pH4 se generó por incubación de TTR recombinante en una concentración de 0.2 mg/ml en acetato de sodio 50 mM, pH 3.95 durante 72 horas a temperatura ambiente. Bajo estas condiciones, la TTR se disocia en una mezcla de monómeros de TTR y formas agregadas que son estructuralmente distintos de la TTR nativa. La pH4-TTR luego se diluyó a una concentración final de 2.5 pg/ml en 1xPBS inmediatamente antes de su uso en el ensayo. Las placas de 96 pocillos (Costar n.° 3690) se recubrieron a temperatura ambiente con 50 pl por pocillo de anticuerpo policlonal anti-his de pollo (Abcam n.° Ab9107) 1.0 pg/ml en 1xPBS durante 1 hora. La solución de recubrimiento se desechó y la placa se bloqueó con 250 pl por volumen de pocillo de 1x BSA que contenía tampón de bloqueo diluido en 1xPBS (G-Biosciences n.°# 786-193) durante 1 h.

g. Protocolo ELISA

Las placas de 96 pocillos recubiertas y bloqueadas se trataron con 50 pl por pocillo de antígeno de TTR 2.5 pg/ml (ya sea TTR nativa o pH4-TTR) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas entonces se lavaron dos veces con 250 pl por pocillo del tampón de lavado (1x solución salina tamponada con Tris que contiene Tween-20 al 0.05%). Las placas lavadas después se trataron con 50 pl por pocillo del anticuerpo monoclonal anti-TTR apropiado en concentraciones que oscilan de 0.31 a 2.5 pg/ml, durante 1 h.

Las placas tratadas se lavaron 3 veces con 250 pl por pocillo del tampón de lavado. Después del lavado, las placas se trataron durante 1 h con 50 pl por pocillo del anticuerpo de detección que comprende una dilución de 1: 5000 de anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con peróxido (Jackson ImmunoResearch n.° 115-035­ 164) en 1xPBS. La placa entonces se lavó 3 veces antes de la adición de 100 pl por pocillo de sustrato de TMB (Rockland). Se permitió que la reacción de HRP procediera a temperatura ambiente durante 15 min antes de inactivación con un volumen por pocilio de 50 |jl de H2SO41 N. La absorbancia espectroscópica se midió a una longitud de onda de 450 nm.

h. SDS-PAGE

Se realizó la electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS de la siguiente manera. 0.1-1 jg de TTR o de pH 4.0-TTR en tampón de muestra 1xLDS (Life Technologies) se cargó en un gel NuPAGE 10% bis-tris y se sometió a electroforesis en tampón MES a un voltaje constante de 90 V durante 105 minutos. Después de la electroforesis, el gel se tiñó en azul Instantáneo (Expedeon) o se transfirió a filtros de nitrocelulosa para el análisis de transferencia Western.

i. PAGE nativa

Se realizó la electroforesis en geles de Tris-glicina nativa de la siguiente manera. 0.1-1 jg de TTR o de pH 4.0-TTR en tampón de muestra 1xTris-glicina (Life Technologies) se cargó en un gel de Tris-glicina 10-20% y se sometió a electroforesis en 1x tampón de análisis de Tris-glicina nativa a un voltaje constante de 120 V durante 105 minutos. Después de la electroforesis, el gel se tiñó en azul instantáneo (Expedeon) o se transfirió a filtros de nitrocelulosa para el análisis de transferencia Western.

j. Transferencia Western

Los geles de SDS-PAGE o PAGE nativa se transfirieron sobre papel de filtro de nitrocelulosa (iBlot, programa P7) y se bloquearon con tampón de bloqueo (Licor) durante 30 minutos. Los filtros después se incubaron en 0.5 jg/m l de anticuerpo primario en tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente (o durante la noche a 4°C), seguido por tres lavados de 10 minutos con 1xTBS. Los filtros se pusieron en anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con IRDye 800CW diluido 1:20000 en tampón de bloqueo. Después de incubar los filtros en la solución de anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente, los filtros se lavaron y se formaron imágenes en un generador de imágenes infrarrojo Odyssey CLx (Licor).

k. Protocolo de ensayo de formación de fibra de TTR

Una solución de TTR-Y78F 3.6 jM (0.2 mg/ml) en acetato de sodio 50 mM, pH 4.8 se incubó a 37°C durante 72 horas en presencia de anticuerpo mis-TTR 1.4 jM (0.2 mg/ml) o de un control de isotipo. Después de la incubación, un exceso molar de 5X de tioflavina-T se añadió a la mezcla y se permitió la unión durante 30 minutos. Las mediciones fluorométricas se midieron en una longitud de onda de emisión de 480 nm con una longitud de onda de excitación establecida en 440 nm. La inhibición del 0% se estableció como la intensidad de fluorescencia en presencia de un anticuerpo de control de isotipo (83 a.u.) y el punto de inhibición del 100% fue establecido como la fluorescencia en ausencia de la proteína TTR-Y78F (38 a.u.).

Una solución madre de TTR-V122I (aproximadamente 5 mg/ml) se diluyó en tampón con concentraciones finales de TTR 0.2 mg/ml, acetato de sodio 30 mM, fosfato de sodio 5 mM, KCl 100 mM, EDTA 1 mM, azida de sodio al 0.02% y diversas concentraciones de anticuerpo monoclonal a pH 7.2. Esta muestra se dializó contra el mismo tampón a pH 4.5 durante 3 h a temperatura ambiente. Las muestras después se incubaron a 37°C durante 72 horas. Después de la incubación, se añadió un exceso molar de 5X de tioflavina-T a la mezcla y se permitió la unión durante 30 minutos. La fluorescencia de tioflavina T se vigiló con un espectrofluorímetro Photon Technology International C60. La ganancia del fotomultiplicador se varió y las anchuras de la ranura de excitación y emisión se fijaron a 2-4 nm para maximizar la señal frente al ruido. Se realizaron mediciones de la fluorescencia usando 430 nm y 480 nm como longitudes de onda de excitación y emisión, respectivamente.

l. Muestras de tejido cardíaco

Los bloques frescos congelados y procesados con parafina de tejido cardíaco con diagnóstico confirmado de mutaciones de ATTR se obtuvieron del Dr. Merrill Benson en la Universidad de Indiana. Las muestras incluyeron ocho muestras frescas congeladas y seis muestras de FFPE y se diagnosticó ATTR o alguna otra amiloidosis cardíaca en cada muestra. El diagnóstico del tejido se confirmó además en Prothena por medio de la tinción IHC con anticuerpos contra las cadenas ligeras kappa y lambda y amiloide A antes de la caracterización con los anticuerpos de TTR.

m. Inmunohistoquímica

La inmunohistoquímica se realizó en criosecciones montadas en portaobjetos de 10 jm ligeramente fijadas en paraformaldehído y en secciones de 5 jm de parafina. El método de inmunoperoxidasa era el principal sistema de detección, que se realizó en el Leica Bond Rx (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL) usando el Kit de Bond Polymer Refine Detection (DS980, Leica Biosystems). Los anticuerpos primarios se incubaron durante una hora (de acuerdo con las concentraciones en la Tabla 2) seguido de la incubación con conjugados de anticuerpo de conector de HRP polimérico anti-conejo y anti-ratón. La tinción se visualizó con un cromógeno DAB, que produjo un depósito marrón. Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina, se deshidrataron en una serie ascendente de alcoholes, se aclararon en xilenos y se cubrieron con CytoSeal 60 (Richard Allen Scientific, Kalamazoo, MI). El control negativo consistió en realizar todo el procedimiento inmunohistoquímico en secciones adyacentes con un control de isotipo de IgG no inmune o una omisión del anticuerpo primario.

n. Demostración de amiloide: método de tinción con rojo Congo

Se realizó la tinción con rojo Congo para demostrar el amiloide de TTR en el tejido usando un kit de American MasterTech (Lodi, California). La tinción se realizó de acuerdo con el procedimiento del fabricante. Se tiñeron los portaobjetos en la solución de Rojo Congo durante 1 hora seguida de la diferenciación en hidróxido de sodio al 1% durante aproximadamente 15 segundos. Después se enjuagaron los portaobjetos en agua corriente, se deshidrataron a través de una serie de alcohol de concentraciones crecientes, y se aclaró a través de tres cambios de xilenos, y se cubrieron con CytoSeal 60.

Se empleó un protocolo de tinción con Tioflavina T modificado (Schmidt et al. 1995) para determinar la presencia de amiloide de TTR en el tejido. Brevemente, los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina de Mayers, se enjuagaron en agua corriente y se tiñeron con una solución filtrada de Tioflavina T al 0.015% (T3516-25G; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en etanol al 50% durante diez minutos. Los portaobjetos entonces se enjuagaron en agua corriente y se diferenciaron en ácido acético al 1% (v/v) durante 10 minutos y se enjuagaron tres veces en agua. Se dejó que los portaobjetos se secaran al aire siendo cubiertos con ProLong Gold (Life Technologies).

o. Análisis de la imagen

Se generaron imágenes de los portaobjetos con un microscopio Olympus BX61, escáner de portaobjetos digital Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT, o un sistema confocal espectral Leica SPE. Las imágenes se recogieron y almacenaron como archivos de TIFF.

p. Análisis de las muestras de plasma humano por SDS-PAGE/transferencia Western

Seis muestras de plasma de pacientes confirmados con V30M ATTR (n.° 21, n.° 22, n.° 23, n.° 24, n.° 25, n.° 27) y 6 muestras (muestra n.° 11, n.° 12, n.° 15, n.° 18, n.° 19, n.° 20) de sujetos normales se obtuvieron de M. Saraiva (Universidad de Porto, Portugal). La muestra n.° C6 era una muestra de suero humano normal obtenida de una fuente comercial (BioreclamationlVT). Estas muestras de plasma se separaron por SDS-PAGE y se sometió a transferencia Western con 9D5 o 5A1 de la siguiente manera. Un volumen de 1.4 pl de plasma se diluyó 1:8 en 1x tampón de muestra LDS en ausencia del agente reductor (Life Technologies). Las muestras se sometieron a la separación por SDS-PAGE y a transferencia Western con 9D5 o 5A1 0.5 pg/ml como se describe anteriormente.

q. Análisis de muestras de plasma humano por ensayo de placa MesoScale Discovery (MSD)

Se recubrieron las placas de 96 pocillos de MSD con anticuerpo monoclonal 6C1 en una concentración de 4 pg/ml en PBS y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación, o durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron tres veces con 1xTBST antes de bloquearlas con solución A bloqueadora de MSD al 3%, 150 pl por pocillo durante 1 hora con agitación. Se añadió un volumen de 30 pl por pocillo de muestras de plasma humano diluidas 1:10 en un tampón de muestra que comprende albúmina sérica bovina libre de globulina al 0.6%, fosfato de sodio monobásico 1.5 mM, fosfato de sodio dibásico 8 mM, cloruro de sodio 145 mM, Tritón X-405 al 0.05% y timerosal al 0.05%, a las placas de MSD bloqueadas durante 1 hora. Las placas se lavaron 3 veces con 1xTBST. Se añadió un volumen de 50 pl por pocillo de anticuerpo de detección sulfomarcado 1 pg/ml (ya sea el anticuerpo de TTR total 8C3 del anticuerpo monoclonal Dako) en el tampón de muestra durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. Las placas se lavaron tres veces con 1xTBST seguido por la adición de 150 pl por pocillo de la solución T de tampón de lectura 1X (Meso Scale Discovery). Después se leyeron las placas en el generador de imágenes de Sector MSD.

r. Generación de una curva de calibración de MSD

Con el fin de cuantificar la cantidad de proteína TTR reactiva con 6C1, no nativa presente en las muestras de plasma humano, se generó una curva de calibración de MSD usando TTR-F87M/L110M recombinante como un patrón de TTR reactivo con 6C1. Esta variante de TTR contiene dos sustituciones de aminoácidos que previenen la formación de tetrámero y mantienen la proteína en el estado de monómero (Jiang et al. (2001) Biochemistry 40, 11442-11452). Como tal, esta variante de TTR es reconocida por todos los mAbs mis-TTR y por lo tanto es adecuada para uso como un patrón de referencia en el ensayo de MSD.

Para generar la curva de calibración, se recubrieron las placas de MSD de 96 pocillos con anticuerpo mis-TTR 6C1 en una concentración de 4 |jg/ml en PBS y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación, o durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron tres veces con 1xTBST antes de bloquearlas con solución A bloqueadora de MSD al 3%, 150 j l por pocillo durante 1 hora con agitación. Las placas bloqueadas se trataron luego durante 1 hora con 50 j l por pocillo de TTR-F87M/L110M 25 jg/m l diluida en serie 1:5 siendo la última dilución un blanco de tampón. Las placas se lavaron 3 veces con 1xTBST antes de la adición de un volumen de 50 j l por pocillo de anticuerpo de detección-SulfoTag 1 jg/m l (8C3-SulfoTag o pAb-SulfoTag) durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Tanto el anticuerpo mAb 8C3 como el Dako se acoplaron al SulfoTag y podrían utilizarse en el anticuerpo de detección ya que se unían a la TTR total y no eran específicos de conformación.

Después del tratamiento con el anticuerpo de detección, las placas se lavaron tres veces con un volumen de 150 j l por pocillo de 1xTBST, seguido por la adición de 150 j l por pocillo de 1x tampón de Lectura T (MSD). Las placas se leyeron en el generador de imágenes Sector MSD y se generó una curva de calibración de TTR F87M/L110M resultante.

s. Ensayo de fagocitosis

Una muestra de 1 mg/ml de TTR-F87M/L110M, TTR nativa o TTR-V30M agregada a bajo pH se acopló con amina junto con un colorante pHrodo durante 15 min a 37°C con una relación proteína:colorante de ~15:4 de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Thermo Scientific). Se eliminó el exceso de marcador pHrodo por diafiltración en un concentrador de centrifugación con un corte de peso molecular 10 K (Pierce Thermo) y la pHrodo-TTR se resuspendió en 1x PBS.

Los monocitos humanos THP-1 se cultivaron en medio de cultivo celular (RPMI, suero bajo en IgG al 10%, pen/estrep). Una parte alícuota de 20 jg/m l de TTR marcada con pHrodo se preincubó por separado con 40 |jg/ml de anticuerpo a 37°C en medio de cultivo celular durante 30 min antes de la adición de 5E+04 células THP-1 en una proporción volumétrica 1:1. Después de la incubación del cultivo de tejidos (3 h), las células se lavaron con medio de cultivo celular tres veces, se incubaron en medio durante 10 min, luego se lavaron dos veces y se resuspendieron en tampón FACS (FBS al 1% en PBS). La intensidad de fluorescencia de pHrodo rojo se detectó usando filtros de canal Texas Red. La microscopía de epifluorescencia se llevó a cabo de una manera similar. Después del análisis por FACS, las células restantes se transfirieron a portaobjetos de cámara de vidrio y se formaron imágenes mediante microscopía invertida. Las intensidades de fluorescencia media se calcularon automáticamente promediando las intensidades de fluorescencia relativas de cada célula individual.

Ejemplo 12. Absorción dependiente de anticuerpos de TTR por células THP-1

TTR-F87M/L110M se marcó covalentemente con el colorante fluorescente sensible al pH pHrodo. El marcador pHrodo tiene fluorescencia mínima bajo pH fisiológico, pero la fluorescencia se incrementa tras inmersión en los entornos de bajo pH de las vesículas endocíticas y, por lo tanto, indica la captación celular de las partículas marcadas. Se añadieron monocitos THP-1 a la TTR marcada con pHrodo (TTR-F87M/L110M, nativa o no nativa) después del tratamiento con 14G8 o el anticuerpo de control de isotipo. Se observaron bajos niveles de fluorescencia con cualquiera de los anticuerpos que se incubaron con TTR nativa y después de la incubación del anticuerpo control con TTR no nativa. Sin embargo, la fluorescencia, aumentó después de la incubación de 14G8 con TTR no nativa (Figura 7A), sugiriendo que la TTR no nativa no es fagocitada eficientemente bajo condiciones basales, sin embargo, la adición de anticuerpos mis-TTR específicamente provoca la fagocitosis de TTR no nativa.

También se demostró la fagocitosis dependiente de la dosis de partículas fibrilares agregadas grandes de TTR, marcadas con pHrodo, para cada uno de los mAb mis-TTR (Figura 7B). La captación máxima dependiente de anticuerpos era variable para cada mAb mis-TTR (6C1>9D5= 14G8> 5A1), alcanzando un nivel de meseta a concentraciones de mAb entre 5-10 jg/ml. Las potencias de anticuerpos variables pueden reflejar diferencias de isotipo y cambios asociados en la función efectora entre los cuatro mAb mis-TTR. Los controles, incluidas las células no tratadas o las tratadas con un control de isotipo de IgG1, no demostraron fluorescencia detectable o mejorada, respectivamente.

Ejemplo 13. Evaluación de los anticuerpos mis-TTR en un modelo de ratón transgénico.

Se llevan a cabo estudios in vivo en un modelo de ratón transgénico humanizado V30M hTTR (Inoue et al., (2008). Specific pathogen free conditions prevent transthyretin amyloidosis in mouse models. Transgenic Research 17:817-826) para evaluar la eficacia de anticuerpos anti-TTR en la unión y eliminación de hTTR agregada.

Se crían los ratones transgénicos empleando los procedimientos estándar y sus niveles de hTTR circulante se evaluaron por ELISA. Los ratones con un nivel en suero de 200-400 jg/m l de hTTR se utilizan para estudios de eficacia posteriores. El primer conjunto de estudios examina la deposición natural de hTTR en ratones transgénicos. La detección de depósitos de hTTR comienza a los 12 meses de edad y se repite cada 3-6 meses en lo sucesivo. Una vez que se ve un nivel aceptable de agregados en ratones transgénicos, se inician los estudios de eficacia. Los animales se dividen en tres grupos de tratamiento (n=10/grupo) y se tratan semanalmente durante cuatro semanas con una dosis IP de vehículo, anticuerpo de control (control de isotipo, 10 mg/kg) o un anticuerpo anti-hTRR (10 mg/kg). Una semana después del último tratamiento los ratones son sacrificados, se recolectan los tejidos y se procesan, y luego se tiñen para evaluar el número y tamaño de los depósitos de TTR restantes. Se utilizan métodos cuantitativos y estadísticos para determinar el grado de aclaramiento visto entre los grupos.

En un enfoque alternativo, se preparan los agregados de hTTR in vitro y luego se inyectan en los riñones de los ratones transgénicos para sembrar la deposición de nuevos agregados. Los autores de la invención han determinado que la inyección de estas preparaciones puede acelerar la deposición de nuevos agregados de manera predecible. Basándose en estos hallazgos, los animales son sedados, se expone el riñón izquierdo y se inyecta material de hTTR pre-agregado en la corteza del riñón. Después de un periodo de recuperación adecuado, los ratones se dividen en tres grupos de tratamiento (n=10/grupo) y se tratan semanalmente durante cuatro-ocho semanas con una dosis IP de vehículo, anticuerpo de control (control de isotipo, 10 mg/kg) o un anticuerpo anti-hTRR (10 mg/kg). Una semana después del último tratamiento los ratones son sacrificados, se recogen los riñones y se procesan, y luego se tiñen para evaluar el número y tamaño de los depósitos de TTR. Se utilizan los métodos cuantitativos y estadísticos para determinar el grado de cambio visto entre los grupos.

Ejemplo 14. Evaluación de los anticuerpos mis-TTR en un modelo de implante de Matrigel

Los autores de la invención han determinado que hTTR pre-agregada se puede suspender en Matrigel (BD Bioscience, Cat. n.° 354263), dejar solidificar y luego poner por vía subcutánea en ratones. A las cuatro semanas después del implante, el implante de Matrigel mantuvo su estructura y la hTTR agregada estaba todavía presente dentro del implante. Además, el implante fue bien tolerado por los ratones y los anticuerpos anti-hTTR eran capaces de penetrar y unirse a los agregados suspendidos en el Matrigel. Basándose en estos resultados, se lleva a cabo un estudio de eficacia de anticuerpo. Los animales son sedados y se coloca por vía subcutánea en ratones un implante que contiene hTTR previamente agregada suspendida en Matrigel. Después de un periodo de recuperación adecuado, los ratones se dividen en tres grupos de tratamiento (n=10/grupo) y se tratan semanalmente durante dos-cuatro semanas con una dosis IP de vehículo, anticuerpo de control (control de isotipo, 10 mg/kg) o un anticuerpo anti-hTRR (10 mg/kg). Después del último tratamiento, los ratones son sacrificados, se recolecta la piel que contiene el implante y se procesa, y luego la cantidad de depósitos de TTR restantes se evalúan usando métodos histológicos y/o bioquímicos. Se utilizan análisis cuantitativos y estadísticos para determinar el grado de limpieza visto entre los grupos.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo humanizado que se une a la transtiretina y comprende una región variable de cadena pesada madura de s Eq ID NO: 11 y una región variable de cadena ligera madura de SEQ ID NO: 19, o una región variable de cadena pesada madura de SEQ ID NO: 65 y una región variable de cadena ligera madura de SEQ ID NO: 76.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que tiene el isotipo IgG1 humano.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, que tiene el isotipo IgG2 o IgG4 humano.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1, que es un fragmento de unión, opcionalmente en donde el fragmento de unión es un anticuerpo monocatenario, fragmento Fab o F(ab')2.

5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la región variable de cadena ligera madura está fusionada con una región constante de cadena ligera y la región variable de cadena pesada madura está fusionada con una región constante de cadena pesada.

6. El anticuerpo de la reivindicación 5, en donde la región constante de cadena pesada es una forma mutante de una región constante de cadena pesada humana natural que tiene unión reducida a un receptor Fc y en relación con la región constante de cadena pesada humana natural.

7. El anticuerpo de la reivindicación 5, en donde la región constante de cadena pesada es de isotipo IgG1, opcionalmente en donde la región variable de cadena pesada madura está fusionada con una región constante de cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 103 con o sin la lisina C terminal y/o la región variable de cadena ligera madura está fusionada con una región constante de cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NOS: 104 o 105.

8. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende una cadena pesada madura que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 82 con o sin la lisina C terminal y una cadena ligera madura que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 86.

9. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquier reivindicación precedente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. Un ácido nucleico o ácidos nucleicos que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que tiene opcionalmente una secuencia que comprende una cualquiera de las SEQ ID NOS: 50, 52, 92 y 96.

11. Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 10 o vectores de expresión recombinantes que comprenden los ácidos nucleicos de la reivindicación 10.

12. Una célula hospedante transformada con el(los) vector(es) de expresión recombinante(s) de la reivindicación 11.

13. Un método para producir un anticuerpo según la reivindicación 1, comprendiendo el método:

(a) cultivar células transformadas con ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, de modo que las células secreten el anticuerpo; y

(b) purificar el anticuerpo del medio de cultivo celular.

14. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para usar en el tratamiento o efectuar la profilaxis de una amiloidosis mediada por transtiretina, o retrasar la aparición de una amiloidosis mediada por transtiretina en un sujeto.

15. Un método de diagnóstico in vitro de una amiloidosis mediada por transtiretina en un sujeto, que comprende poner en contacto una muestra biológica del sujeto con una cantidad eficaz del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, opcionalmente en donde la muestra biológica y/o una muestra de control es sangre, suero, plasma o tejido sólido; opcionalmente en donde el tejido sólido es del corazón, sistema nervioso periférico, sistema nervioso autónomo, riñones, ojos o tracto gastrointestinal.