UA122142C2 - Антитіло до транстиретину - Google Patents

Abstract

Винахід стосується антитіла, яке специфічно зв'язує транстиретин (TTR). Антитіло може бути використаним для лікування, або здійснення профілактики захворювань або розладів, пов'язаних з накопиченням TTR або накопиченням відкладень TTR (наприклад, TTR-амілоїдозу). Антитіло також може бути використане для діагностики TTR-амілоїдозу та інгібування, або зменшення агрегації TTR, серед інших застосувань.

Description

Винахід стосується антитіла, яке специфічно зв'язує транстиретин (ТТРА). Антитіло може бути використаним для лікування, або здійснення профілактики захворювань або розладів, пов'язаних з накопиченням ТІВ або накопиченням відкладень ТА (наприклад, ТТВ- амілоїдозу). Антитіло також може бути використане для діагностики ТТВ-амілоїдозу та інгібування, або зменшення агрегації ТТЕ, серед інших застосувань.

ПЕРЕХРЕСНІ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ

0001) Ця заявка відноситься до попередньої заявки США Ме 62/109002, поданої 28 січня 2015 року, і попередньої заявки США Мо 62/266556, поданої 11 грудня 2015 року, кожна з яких включена в повному обсязі за допомогою посилання.

ПОСИЛАННЯ НА ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

І0002| Ця заявка включає електронний варіант списку послідовностей в файлі з ім'ям 473373 5ЕОЇІ 5Т.ТХТ, створеному 28 січня 2016 року, що містить 135083 байт, і який повністю включений в повному обсязі за допомогою посилання для всіх цілей.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

0003) Вважається, що деякі захворювання викликані аномальним згортанням і агрегацією специфічних для хвороби білків. Ці білки можуть збиратися в патологічні діагностичні накопичення, відомі як амілоїди, які візуалізують деякими гістологічними барвниками.

Вважається, що амілоїди викликають запальні реакції і є причиною безлічі негативних наслідків для залучених тканин. Крім того, можуть існувати і виявляти цитотоксичну дію менші агрегати аномально згорнутого білка. 00041 Транстиретин (ТТЕ) є одним з багатьох білків, які, як відомо, можуть неправильно згортатися і агрегувати (наприклад, зазнають амілоїдогенезу). Пов'язаний з транстиретином амілоїдоз включає дві форми захворювання: сімейне захворювання, що виникає через неправильне згортання мутованого ТТК або варіанта ТТЕ, а також спорадичне, негенетичне захворювання, викликане неправильним агрегуванням ТТК дикого типу. Процес ТТК- амілоїдогенезу може викликати патологію в нервовій системі і/або серці, а також в інших тканинах.

СУТЬ ВИНАХОДУ

0005) Винахід відноситься до антитіл, які зв'язуються з транстиретином і містять три СОВ важкого ланцюга і три СОМ легкого ланцюга в основному з антитіла 1428. Деякі антитіла містять три СОВА важкого ланцюга по Кабату і три СОВ легкого ланцюга по Кабату антитіла 1428, за винятком того, що кожна з позицій Н5Ба і 126 може бути М або 5. Деякі антитіла містять три СОВ важкого ланцюга по Кабату і три СОМ легкого ланцюга по Кабату антитіла 1428.

Необов'язково, СОВ-НІ є суміщеним СОВ по Кабату-Чотіа (Кабаї-Споїніа) антитіла 14238. Деякі

Зо антитіла містять три СОК важкого ланцюга по Кабату антитіла 905. Необов'язково, СОБ-НІ є суміщеним СОК по Кабату-Чотіа антитіла 905.

ІО0Об| Деякі антитіла зв'язуються з тим самим епітопом на транстиретині що і 905 або 1408, і містять три СОК легкого ланцюга і три СОК важкого ланцюга, причому: а) кожна СОК має щонайменше 9095 ідентичності послідовності з відповідною СОМ з варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів 905; або б) кожна СОК має щонайменше 9095 ідентичності послідовності з відповідною СОР. з варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів 14058, за винятком того, що в позиції І 26 може бути М або 5. Деякі антитіла містять: а) три СОК важкого ланцюга і три СОК легкого ланцюга 905; або б) три СОК важкого ланцюга і три СОК легкого ланцюга антитіла 14058, за винятком того, що в позиції 126 може бути М або 5. У деяких антитілах три СОК важкого ланцюга і три СОК легкого ланцюга 905 представляють собою 5ЕО

ІО МО: 13-15 і 24-26 відповідно. У деяких антитілах, три СОК важкого ланцюга і три СОК легкого ланцюга антитіла 1458 представляють собою ЗЕО ІЮО МО: 67-69 і 77-79 відповідно, за винятком того, що в позиції І 26 може бути М або 5.

Ї0О007| Будь-яке з вищевказаних антитіл може бути моноклональним антитілом. Будь-яке з вищевказаних антитіл може бути химерним, гуманізованим, венированим або людським антитілом. Будь-яке з вищевказаних антитіл може мати ізотип ДО1 людини, ізотип Їд2 людини або ізотип ЇдДс4 людини.

ІО00О8І Винахід додатково відноситься до гуманізованих або химерних антитіл антитіла миші, які специфічно зв'язуються з транстиретином, причому антитіло миші характеризується варіабельною областю зрілого важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 61 і варіабельною областю зрілого легкого ланцюга 5ЕО ІЮО МО: 70, за винятком того, що в позиції Н52 може бути 5 або М, в позиції

НбУО може бути Е або І, в позиції І 26 може бути 5 або М, а К в позиції 107 є необов'язковим.

Необов'язково, антитіла являють собою гуманізоване або химерне антитіло 905 або 1408, яке специфічно зв'язується з транстиретином, причому 905 є мишачим антитілом, яке характеризується варіабельною областю зрілого важкого ланцюга 5ЕО ІЮО МО: 1 і варіабельною областю зрілого легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 16, і 14058 є мишачим антитілом, яке характеризується варіабельною областю зрілого важкого ланцюга 5ЕО ІЮО МО: 61 і варіабельною областю зрілого легсого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 70. Необов'язково, гуманізовані антитіла містять: а) варіабельну область гуманізованого зрілого важкого ланцюга, що містить бо три СОК важкого ланцюга антитіла 905 і варіабельну область гуманізованого зрілого легкого ланцюга, що містить три СОК легкого ланцюга антитіла 905; або б) варіабельну область гуманізованого зрілого важкого ланцюга, що містить три СОК важкого ланцюга антитіла 1408 і варіабельну область гуманізованого зрілого легкого ланцюга, що містить три СОК легкого ланцюга антитіла 14058, за винятком того, що в позиції І 26 може бути М або 5. Необов'язково, три СОК важкого ланцюга і три СОК легкого ланцюга антитіла 905 представляють собою 5ЕО

ІО МО: 13-15 і 24-26 відповідно. Необов'язково, три СОК важкого ланцюга і три СОК легкого ланцюга антитіла 1458 представляють собою ЗЕО ІЮО МО: 67-69 і 77-79 відповідно, за винятком того, що в позиції 26 може бути М або 5. Необов'язково, будь-які відмінності в СОК варіабельної області зрілого важкого ланцюга і варіабельної області зрілого легкого ланцюга з

ЗБЕО ІО МО: 1 ї 16, відповідно, знаходяться в позиціях НбО-Нб5. Необов'язково, будь-які відмінності в СОК варіабельної області зрілого важкого ланцюга і варіабельної області зрілого легкого ланцюга з БЕО ІЮО МО: 61 і 70, відповідно, знаходяться в позиціях НбО-Нб5, за винятком того, що в позиції І 26 може бути М або 5. 0009 Необов'язково, гуманізоване антитіло містить варіабельну область гуманізованого зрілого важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше, на 9095 ідентичну будь-якій з зЗЕО ІЮ МО: 5-12, і варіабельну область гуманізованого зрілого легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше, на 9095 ідентичну будь-якій з 5ЕО ІЮ МО: 19-23, за винятком того, що в позиції НІ9 може бути Є або К, в позиції Н4О може бути А або Т, в позиції Н44 може бути С або ЕК, в позиції Н49 може бути 5 або А, в позиції ІН77 може бути 5 або

Т, в позиції Нв2а може бути М або 5, в позиції Н8ВЗ3 може бути К або К, в позиції Н8ВА4 може бути

А або 5, а в позиції НВО може бути М або М. Необов'язково, щонайменше, одна з таких позицій зайнята амінокислотою як зазначено далі: позиція Н42 зайнята Е, позиція Н4і7 зайнята Ї, позиція НбеУ зайнята Е, позиція Н8В2 зайнята 5, позиція Н8В2Б зайнята І, позиція НІ108 зайнята І, позиція І 8 зайнята А, позиція 9 зайнята Р, позиція І 18 зайнята 5, позиція І 19 зайнята М, позиція І 36 зайнята РЕ, позиція І 39 зайнята ЕК, позиція І 60 зайнята 5, позиція І 70 зайнята А, а позиція І 74 зайнята К. Необов'язково, позиції Н47, НбОУ і Нв2 зайняті |, РЕ, ї 5 відповідно.

Необов'язково, позиції Н4А7, Нб9О, Н8В2 і Н8В2Б зайняті І, Е, 5 і Ї відповідно. Необов'язково, позиції

Не2, На47 і НІ108 зайняті Е, І. і Ї. відповідно. Необов'язково, позиції НбЄ9, Н8В2 і Н8В25 зайняті Е, 5 і

Ї відповідно. Необов'язково, позиції Н47 і НІ108 зайняті І. Необов'язково, позиції Н8В2 і Н8В26 зайняті З і Ї відповідно. Необов'язково, позиції Н42, Н4і7 і Н8В25 зайняті Е, І і Ї відповідно.

Необов'язково, позиція І! 36 зайнята Р. Необов'язково, позиція 60 зайнята 5. Необов'язково, позиції 18,19, 119, 136, 139, 160, 170 ї І 74 зайняті А, Р, М, Е, ЕК, 5, А ї К відповідно.

Необов'язково, позиції !/8,19,118,119,136,139,160, 170 ї І 74 зайняті А, Р, 5, М, Е, Кк, 5, АК відповідно. 00101 Необов'язково, гуманізоване антитіло містить варіабельну область зрілого важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше, на 9595 ідентичну будь-якій з БХЕО

ІЮ МО: 5-12, і варіабельну область зрілого легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше, на 9595 ідентичну будь-якій з «ЕО ІЮ МО: 19-23, за винятком того, що в позиції Н19 може бути КЕ або К, в позиції Н4О може бути А або Т, в позиції Н44 може бути С або РЕ, в позиції Н49 може бути 5 або А, в позиції Н77 може бути 5 або Т, в позиції Нв2а може бути М або 5, в позиції Н8ВЗ може бути Е або К, в позиції Н84 може бути А або 5, а в позиції НВО може бути М або М. Необов'язково, гуманізоване антитіло містить варіабельну область зрілого важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше, на 9895 ідентичну будь- якій з зЗЕО ІО МО: 5-12, і варіабельну область зрілого легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше, на 9895 ідентичну будь-якій з «ЕО ІЮ МО: 19-23, за винятком того, що в позиції Н19 може бути КЕ або К, в позиції Н4О може бути А або Т, в позиції Н44 може бути С або ЕК, в позиції Н.4-Я9 може бути 5 або А, в позиції Н77 може бути 5 або Т, в позиції Нв2а може бути М або 5, в позиції Н8З може бути К або К, в позиції Н8а4 може бути А або 5, і в позиції НВО може бути М або М. Необов'язково, варіабельна область зрілого важкого ланцюга має амінокислотну послідовність будь-якої з БЕО ІЮ МО: 5-12, і варіабельна область зрілого легкого ланцюга має амінокислотну послідовність будь-якої з 5ЕО ІЮ МО: 19-23. В деяких антитілах варіабельна область зрілого важкого ланцюга має амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 11, а варіабельна область зрілого легкого ланцюга має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 19.

Ї00111| Необов'язково, гуманізоване антитіло містить варіабельну область гуманізованого зрілого важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше, на 9095 ідентичну будь-якій з ЗЕО ІЮ МО: 64-66, і варіабельну область гуманізованого зрілого легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше, на 9095 ідентичну будь-якій з 5ЕО ІЮ МО: 74-76, за винятком того, що в позиції Нв2а може бути М або 5, в позиції НВ3 може бути К або К, в позиції Н8А може бути А або 5, в позиції НВО може бути М або М, і в позиції І 18 може бути 5 або 60 Р. Необов'язково, щонайменше, одна з таких позицій зайнята амінокислотою як зазначено далі:

позиція НІ зайнята Е, позиція Н4і7 зайнята І, а позиція І 36 зайнята Р. Необов'язково, позиції Н1 і Н47 зайняті Е і Ї відповідно. Необов'язково, позиція / 36 зайнята Р. Необов'язково, щонайменше, одна з таких позицій зайнята амінокислотою як зазначено далі: позиція НЗ зайнята К, позиція НІ105 зайнята Т, позиція І 8 зайнята А, позиція І 9 зайнята Р, позиція І 19 зайнята М, позиція 126 зайнята 5, позиція 160 зайнята 5, а позиція /70 зайнята А.

Необов'язково, позиції НЗ і НІ105 зайняті К і Т відповідно. Необов'язково, позиції /8,19,1191170 зайняті А, Р, М і А відповідно. Необов'язково, кожна з позицій І 26 і І 60 зайнята 5. 00121 Необов'язково, гуманізоване антитіло містить варіабельну область зрілого важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше, на 9595 ідентичну будь-якій з БХЕО

І МО: 64-66, і варіабельну область зрілого легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше, на 9595 ідентичну будь-якій з ЗЕО ІЮ МО: 74-76, за винятком того, що в позиції Нв2а може бути М або 5, в позиції Н8ВЗ може бути Е або К, в позиції Н8в4 може бути

А або 5, в позиції НВО може бути М або М, а в позиції 18 може бути 5 або Р. Необов'язково, гуманізоване антитіло містить варіабельну область зрілого важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше, на 9895 ідентичну будь-якій з ЗЕО ІЮ МО: 64-66, і варіабельну область зрілого легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше, на 9895 ідентичну будь-якій з БЕО ІЮО МО: 74-76, за винятком того, що в позиції

Невага може бути М або 5, в позиції Н8З3 може бути Е або К, в позиції Н8В4 може бути А або 5, в позиції НВО може бути М або М, а в позиції І 18 може бути 5 або Р. Необов'язково, варіабельна область зрілого важкого ланцюга має амінокислотну послідовність будь-якої з 5ЕО ІЮ МО: 64- 66, і варіабельна область зрілого легкого ланцюга має амінокислотну послідовність будь-якої з

ЗЕО І МО: 74-76. В деяких антитілах варіабельна область зрілого важкого ланцюга має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 65, а варіабельна область зрілого легкого ланцюга має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 76.

ЇО0О13| Будь-яке з вищевказаних антитіл може бути інтактним антитілом, зв'язуючим фрагментом, одноланцюговим антитілом, фрагментом Бар або РБар2. У будь-якому з вищевказаних антитіл варіабельна область зрілого легкого ланцюга може бути поєднана з константною областю легкого ланцюга, а варіабельна область зрілого важкого ланцюга може бути поєднана з константною областю важкого ланцюга. Необов'язково, константна область

Зо важкого ланцюга являє собою мутантну форму природної константної області важкого ланцюга людини, яка має ослаблене зв'язування з рецептором Есу відносно природної константної області важкого ланцюга людини. Необов'язково, константна область важкого ланцюга є такою ізотипу ІЇД1. Необов'язково, варіабельна область зрілого важкого ланцюга злита з константною областю важкого ланцюга, що має послідовність 5ЕО ІЮО МО: 103, і/або варіабельна область зрілого легкого ланцюга злита з константною областю легкого ланцюга, що має послідовність

ЗЕО ІЮ МО: 104 або 105. 00141 Винахід додатково відноситься до фармацевтичних композицій, які містять будь-яке з вищевказаних антитіл, і фармацевтично прийнятний носій. 0015) Винахід додатково відноситься до нуклеїнових кислот, які кодують важкий ланцюг і/або легкий ланцюг будь-якого з вищевказаних антитіл, таких як будь-яка з ЗЕО ІО МО: 40, 42, 44-56, 87, 89, 91-96 і 106-108. 0016) У винаході додатково запропонований рекомбінантний вектор експресії, який містить нуклеїнову кислоту, як описано вище, і запропонована клітина-господар, трансформована рекомбінантним вектором експресії.

Ї0О017|, У винаході додатково запропонований спосіб гуманізації антитіла, який включає: а) вибір одного або декількох акцепторних антитіл; б) ідентифікацію амінокислотних залишків мишачого антитіла, які підлягають збереженню; в) синтез нуклеїнової кислоти, яка кодує гуманізований важкий ланцюг, який містить СОК важкого ланцюга антитіла мишії, і нуклеїнової кислоти, яка кодує гуманізований легкий ланцюг, який містить СОК легкого ланцюга антитіла миші; і г)у експресію нуклеїнових кислот в клітині-хазяїні, щоб продукувати гуманізоване антитіло; причому мишаче антитіло являє собою 905 або 14058, при цьому 905 характеризується варіабельною областю зрілого важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 1 і варіабельною областю зрілого легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 16, а 14058 характеризується варіабельною областю зрілого важкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО: 61 і варіабельною областю зрілого легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 70.

ЇО0О18|У винаході додатково запропонований спосіб продукування гуманізованого, химерного або венированого антитіла, який включає: а) культивування клітин, трансформованих нуклеїновими кислотами, які кодують важкий і легкий ланцюги антитіла, так що клітини секретують антитіло; і б) очищення антитіла від клітинного культурального бо середовища; причому антитіло являє собою гуманізовану, химерну або венировану форму 905 або 1408.

Ї0О019| У винаході додатково запропонований спосіб отримання клітинної лінії, яка продукує гуманізоване, химерне або венироване антитіло, який включає: а) введення вектора, який кодує важкий і легкий ланцюги антитіла, і селективний маркер, в клітини; б) розмноження клітин в умовах, що дозволяють проводити відбір клітин, які мають збільшену кількість копій вектора; в) виділення окремих клітин з обраних клітин; і г) створення банку клітин, клонованих з однієї клітини, обраної на основі виходу антитіла; причому антитіло являє собою гуманізовану, химерну або венировану форму 905 або 14058. Необов'язково, спосіб додатково включає розмноження клітин в селективних умовах і відбір ліній клітин, які природно експресують і секретують щонайменше 100 мг/л/105 клітин/24 год.

І0О2О|У винаході додатково запропонований спосіб інгібування або зниження агрегації транстиретина у суб'єкта, який має транстиретин-опосередкований амілоїдоз або знаходиться під ризиком його розвитку, що включає введення суб'єкту будь-якого з вищевказаних антитіл ефективною схемою, тим самим пригнічуючи або зменшуючи агрегацію транстиретина у суб'єкта. 00211 У винаході додатково запропонований спосіб інгібування або зменшення формування фібрил транстиретина у суб'єкта, який має транстиретин-опосередкований амілоїдоз або знаходиться під ризиком його розвитку, що включає введення суб'єкту будь-якого з вищевказаних антитіл ефективною схемою, тим самим пригнічуючи або зменшуючи накопичення транстиретина у суб'єкта.

ІЇ0022|У винаході додатково запропонований спосіб зменшення кількості відкладень транстиретина у суб'єкта, що має транстиретин-опосередкований амілоїдоз або знаходиться під ризиком його розвитку, що включає введення суб'єкту будь-якого з вищевказаних антитіл ефективною схемою, тим самим зменшуючи кількість відкладень транстиретина у суб'єкта.

ІЇ00О23| У винаході додатково запропоновано спосіб усунення агрегатів транстиретина у суб'єкта, який має транстиретин-опосередкований амілоїдоз або знаходиться під ризиком його розвитку, що включає введення суб'єкту будь-якого з вищевказаних антитіл ефективною схемою, тим самим усуваючи агрегати транстиретина у суб'єкта в порівнянні з суб'єктом, який має транстиретин-опосередкований амілоїдоз або перебуває під ризиком його розвитку, і який

Зо не отримував антитіла.

ІЇОО024|У винаході додатково запропоновано спосіб стабілізації нетоксичної форми транстиретина у суб'єкта, який має транстиретин-опосередкований амілоїдоз або знаходиться під ризиком його розвитку, що включає введення суб'єкту будь-якого з вищевказаних антитіл ефективною схемою, тим самим стабілізуючи нетоксичну форму транстиретина у суб'єкта. 0025 У винаході додатково запропоновано спосіб лікування або здійснення профілактики транстиретин-опосередкованого амілоїдозу у суб'єкта, що включає введення суб'єкту будь-якого з вищевказаних антитілефективною схемою.

ІЇО02б|У винаході додатково запропоновано спосіб уповільнення початку прояву транстиретин-опосередкованого амілоїдозу у суб'єкта, що включає введення суб'єкту будь-якого з вищевказаних антитіл ефективною схемою.

ЇОО27|У винаході додатково запропоновано спосіб діагностування транстиретин- опосередкованого амілоїдозу у суб'єкта, що включає приведення в контакт біологічного зразка з суб'єкта з ефективною кількістю будь-якого з вищевказаних антитіл. Необов'язково, спосіб додатково включає виявлення зв'язування антитіла з транстиретином, причому присутність зв'язаного антитіла вказує на те, що суб'єкт має транстиретин-опосередкований амілоїдоз.

Необов'язково, спосіб додатково включає порівняння зв'язування антитіла з біологічним зразком зі зв'язуванням антитіла з контрольним зразком, при цьому підвищене зв'язування антитіла з біологічним зразком відносно контрольного зразка вказує на те, що суб'єкт має транстиретин-опосередкований амілоїдоз. Необов'язково, біологічний зразок і контрольний зразок містять клітини того ж самого тканинного походження. Необов'язково, біологічний зразок іМабо контрольний зразок являють собою кров, сироватку, плазму або тверду тканину.

Необов'язково, тверда тканина являє собою тканину з серця, периферичної нервової системи, вегетативної нервової системи, нирок, очей або шлунково-кишкового тракту.

І0028| У будь-якому з вищевказаних способів, транстиретин-опосередкований амілоїдоз, може необов'язково бути сімейним транстиретиновим амілоїдозом або спорадичним транстиретиновим амілоїдозом. Необов'язково, сімейний транстиретиновий амілоїдоз являє собою сімейну амілоїдну кардіоміопатію (БАС), сімейну амілоїдну поліневропатію (БАР) або селективний амілоїдоз центральної нервової системи (СМ5ЗА). Необов'язково, спорадичний транстиретиновий амілоїдоз являє собою старечий системний амілоїдоз (55А) або старечий бо серцевий амілоїдоз (ЗСА). У будь-якому з вищевказаних способів, транстиретин-

опосередкований амілоїдоз може необов'язково бути пов'язаний з накопиченням амілоїдів в серці, периферичній нервовій системі, вегетативній нервовій системі, нирках, очах або шлунково-кишковому тракті суб'єкта.

І0029| У винаході додатково запропоновано спосіб виявлення присутності або відсутності відкладень транстиретина у суб'єкта, що включає приведення в контакт біологічного зразка з суб'єкта, підозрюваного в наявності амілоїдного скупчення, з ефективною кількістю будь-якого з вищевказаних антитіл. Необов'язково, спосіб додатково включає виявлення зв'язування антитіла з транстиретином, причому виявлення зв'язаного антитіла вказує на наявність відкладень транстиретина. Необов'язково, спосіб додатково включає порівняння зв'язування антитіла з біологічним зразком зі зв'язуванням антитіла з контрольним зразком, при цьому підвищене зв'язування антитіла з біологічним зразком відносно контрольного зразка вказує на те, що суб'єкт має транстиретин-опосередкований амілоїдоз. Необов'язково, біологічний зразок і контрольний зразок містять клітини того ж самого тканинного походження. Необов'язково, біологічний зразок і/або контрольний зразок являють собою кров, сироватку, плазму або тверду тканину. Необов'язково, тверда тканина являє собою тканину з серця, периферичної нервової системи, вегетативної нервової системи, нирок, очей або шлунково-кишкового тракту.

ЇООЗО|ЇУ винаході додатково запропоновано спосіб виявлення кількості відкладень транстиретина у суб'єкта, що включає введення будь-якого з антитіл і виявлення присутності зв'язаного антитіла у суб'єкта. Необов'язково, присутність зв'язаного антитіла визначається позитронно-емісійною томографією (ПЕТ).

КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ

І0ОЗ11| Фіг. ТА ілюструє вирівнювання варіабельних областей важкого ланцюга антитіла 905 миші, модельних антитіл миші, акцепторних антитіл людини і гуманізованих варіантів антитіла 905. Послідовності СОР, як визначено по Кабату, охоплені рамками, за винятком того, що перша охоплююча рамка являється поєднанням СОВ-НІ по Чотіа і СОВ-НІ по Кабату, з підкресленим і виділеним напівжирним шрифтом СОВ-НІ по Кабату.

І0ОЗ21 Фіг. 18 ілюструє вирівнювання варіабельних областей легкого ланцюга антитіла 905 миші, модельного антитіла миші, акцепторного антитіла людини і гуманізованих варіантів антитіла 905. Послідовності СОЕК, як визначено по Кабату, охоплені рамками.

Зо ІООЗЗІ Фіг. 2А ілюструє вирівнювання варіабельних областей важкого ланцюга антитіла 1458 миші, модельного антитіла миші, акцепторних антитіл людини і гуманізованих варіантів антитіла 1458. Послідовності СОК, як визначено по Кабату, охоплені рамками, за винятком того, що перша охоплююча рамка являється поєднанням СОБ-НІ1 по Чотіа і СОВ-НІ1 по Кабату, з підкресленим і виділеним напівжирним шрифтом СОБ-НІ1 по Кабату.

І0ОЗ41| Фіг. 28 ілюструє вирівнювання варіабельних областей легкого ланцюга антитіла 14058 миші, модельного антитіла миші, акцепторних антитіл людини і гуманізованих варіантів антитіла 1408. Послідовності СОК, як визначено по Кабату, охоплені рамками.

І0ОЗ5) Фіг. ЗА і ЗВ: Фіг. ЗА ілюструє криві зв'язування антитіл 5А1, 6С1, 905 і 1458 миші з

ТТЕ, обробленим рная. Фіг. ЗВ ілюструє криві зв'язування антитіл 5А1, 6С1, 905 і 1458 миші з нативним ТТЕК.

ІООЗбЇ| Фіг. 4А, 4В і 4С: Фіг. 4А ілюструє інгібування утворення фібрил ТТЕ-М78Е за допомогою антитіл до Іпіб-ТТК. Фіг. 48 ілюструє інгібування утворення фібрил ТТК-М122І за допомогою антитіла 1408. фіг. 4С ілюструє інгібування утворення фібрил ТТЕ-М122І за допомогою контрольного антитіла.

І0ООЗ7| Фіг. 5А і 58: Фіг. 5А ілюструє аналіз оптичної щільності Вестерн-блот аналізу зразків плазми від пацієнтів, для яких підтверджений МЗОМ АТТЕ (зразок Мо 11, Мо 12, Мо 15, Мо 18, Мо 19, Мо 20), і зразків від суб'єктів з нормальним станом (зразок Мо 21, 22, Мо 23, Мо 24, Мо 25, Мо 277), із застосуванням антитіла 905 ті5-ТТК. Фіг. 58 ілюструє аналіз оптичної щільності Вестерн- блот аналізу тих же зразків із застосуванням антитіла 5А1 ті5-ТТ А.

І0ОЗ8)| Фіг. 6 ілюструє плашковий аналіз МезозсаІе Оізсомегу (М50О) зразків плазми від пацієнтів з підтвердженим МЗОМ АТТЕК (зразок Мо 11, Мо 12, Мо 15, Мо 18, Мо 19, Мо 20) ї зразків від суб'єктів з нормальним станом (Мо 21, Мо 22, Мо 23, Мо 24, Мо 25, Мо 27), із застосуванням антитіла 6С1. 0039) Фіг. 7А і 7В: Фіг. 7А ілюструє ефект антитіла 1458 на поглинання ТТК з Е87М/Л 110М клітинами ТНР-1. Фіг. 7В ілюструє ефект кожного антитіла до ті5-ТТК на поглинання ТТК з

МЗОМ клітинами ТНР-1.

КОРОТКИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

0040) 5ЕО ІО МО: 1 вказана як амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга антитіла 905 миші. 60 Ї0041| 5ЕО ІО МО: 2 вказана як амінокислотна послідовність 15ЕО Н шаблону структури мишачої варіабельної області важкого ланцюга.

І0042|5ЕО ІО МО: З вказана як амінокислотна послідовність варіабельного акцептора важкого ланцюга АСС Мо ВАСО2114. 0043 ЗЕО ІО МО: 4 вказана як амінокислотна послідовність варіабельного акцептора важкого ланцюга АСС Мо ДАХ82494.1. 00441 5ЕО ІЮ МО: 5 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 1 варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (НиОЗО5МУНМІ1). 00451) 5ЕО ІЮ МО: 6 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 2 варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (НОЗО5УНУ). 0046 5ЕО 10 МО: 7 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 25 варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (НОЗО5УНМмагб).

Ї0047| 5ЕО ІЮ МО: 8 вказана як амінокислотна послідовність варіанта З варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (НиОЗО5МУНУЗ). 0048 5ЕО 10 МО: 9 вказана як амінокислотна послідовність варіанта ЗЬ варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (НиЗО5МУНуЗб). 00491 5ЕО ІО МО: 10 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 4 варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (Ни9О5МУНма). 0050 БЕО ІО МО: 11 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 45 варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (НиЗО5МУ Нуар).

І0051|5ЕО ІО МО: 12 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 5 варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (НиЗО5МУНум5). 0052) 5ЕО ІО МО: 13 вказана як амінокислотна послідовність СОВ-НІ по Кабату антитіла 905 миші.

Ї00О53| 5ЕО ІЮО МО: 14 вказана як амінокислотна послідовність СОВ-Н2 по Кабату антитіла 905 миші. 00541 5ЕО ІО МО: 15 вказана як амінокислотна послідовність СОВ-НЗ по Кабату антитіла 905 миші. 0055) 5ЕО І МО: 16 вказана як амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга антитіла 905 миші.

Зо Ї0056| БЕО ІО МО: 17 вказана як амінокислотна послідовність МУ | шаблону структури варіабельної області легкого ланцюга миші. 0057 ЗЕО І МО: 18 вказана як амінокислотна послідовність варіабельного акцептора легкого ланцюга АСС Мо АВСб66952. 0058 5ЕО 10 МО: 19 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 1 варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (НиЗО5МІм1).

ІЇ0059|5ЕО 10 МО: 20 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 2 варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (НиЗО5МІ мг).

ІЇ0О6О|Ї БЕО 10 МО: 21 вказана як амінокислотна послідовність варіанта З варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (НиЗО5МІ м3).

І0061|5ЕО 10 МО: 22 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 4 варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (Ни9О5МІ ма).

І0062| 5ЕО 10 МО: 23 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 5 варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (НиЗ9О5МІ м5).

Ї0О6З| 5ЕО І МО: 24 вказана як амінокислотна послідовність СОВ-1І1 по Кабату антитіла 905 миші.

Ї0064| 5ЕО І МО: 25 вказана як амінокислотна послідовність СОВ-12 по Кабату антитіла 905 миші.

Ї0065| 5ЕО ІЮ МО: 26 вказана як амінокислотна послідовність СОВ-І З по Кабату антитіла 905 миші.

Ї0О66| 5ЕО ІО МО: 27 вказана як амінокислотна послідовність варіанта ї важкого ланцюга гуманізованого 905.

Ї00О67| 5ЕО ІО МО: 28 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 2 важкого ланцюга гуманізованого 905. 0068) 5ЕО ІО МО: 29 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 25 важкого ланцюга гуманізованого 905.

Ї0069| БЕО ІО МО: 30 вказана як амінокислотна послідовність варіанта З важкого ланцюга гуманізованого 905.

Ї0070| 5ЕО ІО МО: 31 вказана як амінокислотна послідовність варіанта ЗО важкого ланцюга гуманізованого 905. 60 Ї0071| БЕО ІО МО: 32 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 4 важкого ланцюга гуманізованого 905.

І0072| ЗЕО ІО МО: 33 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 45 важкого ланцюга гуманізованого 905.

Ї0073| 5ЕО ІО МО: 34 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 5 важкого ланцюга гуманізованого 905.

Ї0074| 5ЕО І МО: 35 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 1 легкого ланцюга гуманізованого 905.

Ї0075| 5ЕО ІЮ МО: 36 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 2 легкого ланцюга гуманізованого 905.

Ї0076| БЕО ІЮ МО: 37 вказана як амінокислотна послідовність варіанта З легкого ланцюга гуманізованого 905.

Ї0077| 5ЕО І МО: 38 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 4 легкого ланцюга гуманізованого 905.

І0078| 5ЕО І МО: 39 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 5 легкого ланцюга гуманізованого 905.

Ї0079| 5ЕО І МО: 40 вказана як нуклеотидна послідовність варіабельної області важкого ланцюга антитіла 905 миші з сигнальним пептидом. 0080 5ЕО ІО МО: 41 вказана як амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга антитіла 905 миші з сигнальним пептидом.

І0081| БЕО ІО МО: 42 вказана як нуклеотидна послідовність варіабельної області легкого ланцюга антитіла 905 миші з сигнальним пептидом.

І0082| 5ЕО ІЮ МО: 43 вказана як амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга антитіла 905 миші з сигнальним пептидом. 0083) ЗЕО ІО МО: 44 вказана як нуклеотидна послідовність варіанта 1 варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (НиОЗО5МУНМІ1). 00841 5ЕО ІО МО: 45 вказана як нуклеотидна послідовність варіанта 2 варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (НОЗО5УНУ). 0085 5ЕО ІО МО: 46 вказана як нуклеотидна послідовність варіанта 25 варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (НОЗО5УНМмагб).

Зо 0086) 5ЕО ІО МО: 47 вказана як нуклеотидна послідовність варіанта З варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (НиОЗО5МУНУЗ). 00871 5ЕО ІО МО: 48 вказана як нуклеотидна послідовність варіанта ЗО варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (НиЗО5МУНуЗб). 0088) 5ЕО ІО МО: 49 вказана як нуклеотидна послідовність варіанта 4 варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (НОЗО5УНМа4). 00891 5ЕО ІО МО: 50 вказана як нуклеотидна послідовність варіанта 45 варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (НиЗО5МУ Нуар).

Ї0090І| 5ЕО ІО МО: 51 вказана як нуклеотидна послідовність варіанта 5 варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (НиОЗО5МУНМУ5).

Ї00911| 5ЕО ІО МО: 52 вказана як нуклеотидна послідовність варіанта 1 варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (Ни9О5МІ м1).

І00921| 5ЕО ІО МО: 53 вказана як нуклеотидна послідовність варіанта 2 варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (Ни9О5МІ мг).

Ї0093| 5ЕО ІО МО: 54 вказана як нуклеотидна послідовність варіанта З варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (Ни90О5МІ м3). 00941 5ЕО ІО МО: 55 вказана як нуклеотидна послідовність варіанта 4 варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (Ни9О5МІ ма).

Ї0095| 5ЕО ІО МО: 56 вказана як нуклеотидна послідовність варіанта 5 варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла 905 (Ни9О5МІ м). 0096 ЗЕО 10 МО: 57 вказана як амінокислотна послідовність сигнального пептиду варіабельної області важкого ланцюга 905 миші.

Ї00975ЕО 10 МО: 58 вказана як нуклеотидна послідовність сигнального пептиду варіабельної області важкого ланцюга 905 миші. 0098 5ЕО 10 МО: 59 вказана як амінокислотна послідовність сигнального пептиду варіабельної області легкого ланцюга 905 миші.

Ї009915ЕО 10 МО: 60 вказана як нуклеотидна послідовність сигнального пептиду варіабельної області легкого ланцюга 905 миші. 00100) 5ЕО ІО МО: 61 вказана як амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга антитіла 14238 миші. бо Ї00101)| 5ЕО ІО МО: 62 вказана як амінокислотна послідовність ІМОК Н шаблону структури варіабельної області важкого ланцюга миші.

І00102| 5ЕО ІО МО: 63 вказана як амінокислотна послідовність варіабельного акцептора важкого ланцюга АССМо ААЮЗ30410.1.

І00103| БЕО ІО МО: 64 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 1 варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 1428 (Нит1428МНм1).

І0010415ЄО ІО МО: 65 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 2 варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 1448 (Ни14с8УНуг). 00105 5ЕО ІО МО: 66 вказана як амінокислотна послідовність варіанта З варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 1448 (Ни14с48УНуЗ). 00106) 5ЕО ІО МО: 67 вказана як амінокислотна послідовність СОВ-НІ по Кабату антитіла 1428 миші.

Ї00107| 5ЕО ІО МО: 68 вказана як амінокислотна послідовність СОВ-Н2 по Кабату антитіла 1428 миші. 00108) 5ЕО ІО МО: 69 вказана як амінокислотна послідовність СОВ-НЗ по Кабату антитіла 1428 миші.

Ї00109| 5ЕО ІЮ МО: 70 вказана як амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга антитіла 14238 миші. 00110) 5ЕО ІО МО: 71 вказана як амінокислотна послідовність МУ | шаблону структури варіабельної області легкого ланцюга миші. 001111 5ЄО ІО МО: 72 вказана як амінокислотна послідовність варіабельного акцептора легкого ланцюга АСС Мо АВА71374.1. 001121 5ЕО ІО МО: 73 вказана як амінокислотна послідовність варіабельного акцептора легкого ланцюга АСС Мо АВС66952.1. 00113 БЕО 10 МО: 74 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 1 варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла 1428 (Ни14Сс8МІ м1).

ІЇ0011415ЄО ІО МО: 75 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 2 варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла 1428 (Ни14С8МІ мг). 00115 5ЄО ІО МО: 76 вказана як амінокислотна послідовність варіанта З варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла 1428 (Ни14С8МІ м3).

Зо Ї00116| БЕО І МО: 77 вказана як амінокислотна послідовність СОВ-І 1 по Кабату антитіла 1428 миші.

Ї00117| 5ЕО ІЮ МО: 78 вказана як амінокислотна послідовність СОВ-12 по Кабату антитіла 1428 миші. 00118) 5ЕО ІЮ МО: 79 вказана як амінокислотна послідовність СОВ-І З по Кабату антитіла 1428 миші.

Ї00119| 5ЕО ІО МО: 80 вказана як амінокислотна послідовність варіанта З СОВ-Ї 1 по Кабату гуманізованого антитіла 1428 миші (Ни14с8МІ м3).

І00120| 5ЕО ІО МО: 81 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 1 важкого ланцюга гуманізованого 1428.

І00121| 5ЕО ІО МО: 82 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 2 важкого ланцюга гуманізованого 1428. (00122) 5ЕО ІО МО: 83 вказана як амінокислотна послідовність варіанта З важкого ланцюга гуманізованого 1428. 00123) 5ЕО ІЮО МО: 84 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 1 легкого ланцюга гуманізованого 1428. 00124) 5ЕО ІЮО МО: 85 вказана як амінокислотна послідовність варіанта 2 легкого ланцюга гуманізованого 1428. 00125) 5ЕО ІО МО: 86 вказана як амінокислотна послідовність варіанта З легкого ланцюга гуманізованого 1428. 00126) 5ЕО І МО: 87 вказана як нуклеотидна послідовність варіабельної області важкого ланцюга антитіла 14238 миші з сигнальним пептидом.

І00127| 5ЕО ІО МО: 88 вказана як амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга антитіла 14238 миші з сигнальним пептидом. 00128) 5ЕО ІО МО: 89 вказана як нуклеотидна послідовність варіабельної області легкого ланцюга антитіла 14238 миші з сигнальним пептидом.

І00129| 5ЕО ІЮ МО: 90 вказана як амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга антитіла 14238 миші з сигнальним пептидом.

І00130|5БЕО 10 МО: 91 вказана як нуклеотидна послідовність варіанта 1 варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 1448 (Ни14048УНм1). бо Ї0013115БЕО 10 МО: 92 вказана як нуклеотидна послідовність варіанта 2 варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 1448 (Ни14с8УНуг).

І0013215ЕО ІО МО: 93 вказана як нуклеотидна послідовність варіанта З варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 1448 (Ни14с48УНуЗ).

І00133|5ЕО 10 МО: 94 вказана як нуклеотидна послідовність варіанта 1 варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла 1428 (Ни14Сс8МІ м1).

І0013415БО 10 МО: 95 вказана як нуклеотидна послідовність варіанта 2 варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла 1428 (Ни14С8МІ мг). 001351 5БЕО 10 МО: 96 вказана як нуклеотидна послідовність варіанта З варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла 1428 (Ни14С8МІ м3).

І00136|5ЕО 10 МО: 97 вказана як амінокислотна послідовність сигнального пептиду варіабельної області важкого ланцюга антитіла 1428 миші.

Ї00137|5БЕО 10 МО: 98 вказана як нуклеотидна послідовність сигнального пептиду варіабельної області важкого ланцюга антитіла 1428 миші.

І001385ЕО 10 МО: 99 вказана як амінокислотна послідовність сигнального пептиду варіабельної області легкого ланцюга антитіла 1428 миші.

І0013915БЕО 10 МО: 100 вказана як нуклеотидна послідовність сигнального пептиду варіабельної області легкого ланцюга антитіла 1428 миші. 00140) БЕО 10 МО: 101 вказана як амінокислотна послідовність типової константної області важкого ланцюга ІДС людини. 00141) 5ЕО ІЮ МО: 102 вказана як амінокислотна послідовність типової константної області важкого ланцюга ІДС людини аллотипу С1тЗ імуноглобуліну ІДИ.

І00142| БЕО ІО МО: 103 вказана як амінокислотна послідовність типової константної області важкого ланцюга ІДС людини аллотипу С1тЗ імуноглобуліну ІДИ. 00143) 5ЕО 10 МО: 104 викладена амінокислотна послідовність типової константної області каппа легкого ланцюга людини, що має М-кінцевий аргінін.

І00144| БЕО ІО МО: 105 викладена амінокислотна послідовність типової константної області каппа легкого ланцюга людини без М-кінцевого аргініну.

Ї00145| 5ЕО ІЮ МО: 106 вказана як нуклеотидна послідовність типової константної області важкого ланцюга аллотипу С т3.

Зо Ї00146| БЕО ІЮ МО: 107 вказана як нуклеотидна послідовність типової константної області легкого ланцюга, що має М-кінцевий аргінін.

Ї00147| 5ЕО ІЮО МО: 108 вказана як нуклеотидна послідовність типової константної області легкого ланцюга без М-кінцевого аргініну. 00148) 5ЕО ІЮ МО: 109 вказана як амінокислотна послідовність транстиретина людини, яка представлена під ідентифікаційним номером РО2766.1 (ОпіРгою.

Ї00149| 5ЕО ІЮ МО: 110 вказана як амінокислотна послідовність транстиретина людини, яка представлена під ідентифікаційним номером ААВЗ35639.1 (СепВапк). 00150) 5ЕО ІЮО МО: 111 вказана як амінокислотна послідовність транстиретина людини, яка представлена під ідентифікаційним номером ААВЗ35640.1 (СепВапк).

Ї00151| 5ЕО ІЮО МО: 112 вказана як амінокислотна послідовність транстиретина людини, яка представлена під ідентифікаційним номером АВІбЄЗ351.1 (СсепВапк).

І00152|5БЕО 10 МО: 113 вказана як амінокислотна послідовність залишків 89-97 транстиретина людини.

І00153|5БЕО 1О МО: 0114 вказана як амінокислотна послідовність потенційного транстиретинового іммуногена.

І00154|5БО 10 МО: 115 вказана як амінокислотна послідовність потенційного транстиретинового іммуногена.

І00155|5БО 10 МО: 0116 вказана як амінокислотна послідовність потенційного транстиретинового іммуногена.

БО 00156) ЗЕО ІЮ МО: 117 вказана як амінокислотна послідовність комбінованого СОК-НІ по

Чотіа-Кабату антитіла 905 миші.

Ї00157| ЗЕО ІЮО МО: 118 вказана як амінокислотна послідовність комбінованого СОК-НІ по

Чотіа-Кабату антитіла 1408 миші.

ВИЗНАЧЕННЯ

Ї0О0158) Моноклональні антитіла або інші біологічні об'єкти зазвичай надаються у виділеній формі. Це означає, що антитіло або інший біологічний об'єкт зазвичай є щонайменше на 5095 мас./мас. чистим від заважаючих білків та інших забруднювачів, що виникають в результаті його отримання або очищення, але це не виключає можливості змішування моноклонального антитіла з надмірною кількістю фармацевтично-прийнятного носія(-іїїв) або іншого переносника, бо призначеного для полегшення його застосування. Іноді моноклональні антитіла є щонайменше на 6095, 7095, 8095, 9095, 9590 або 9995 мас./мас. чистими від заважаючих білків і забруднюючих речовин, які виникають в результаті виробництва або очищення. Часто, виділене моноклональне антитіло або інший біологічний об'єкт є переважаючим макромолекулярним видом, який залишився після його очищення.

Ї00159| Специфічне зв'язування антитіла з його цільовим антигеном означає афінність, яка складає щонайменше 105, 107, 108, 109, або 109 М". Специфічне зв'язування в більшій мірі виявляється і відрізняється від неспецифічного зв'язування, яке трапляється, щонайменше, з однією сторонньою мішенню. Специфічне зв'язування може бути результатом формування зв'язків між конкретними функціональними групами, або конкретною просторовою підгонкою (наприклад, тип «замок і ключ»), тоді як неспецифічне зв'язування зазвичай є результатом Ван дер Ваальсових сил. Однак, специфічне зв'язування не обов'язково означає те, що антитіло зв'язує одну і тільки одну мішень.

ІЇ00160| Основна структурна одиниця антитіла являє собою тетрамер субодиниць. Кожен тетрамер містить дві ідентичні пари поліпептидних ланцюгів, причому кожна пара має один «легкий» (близько 25 кДа) і один «важкий» ланцюг (близько 50-70 кДа). Амінокінцева частина кожного ланцюга містить варіабельну область довжиною близько від 100 до 110 або більше амінокислот, які в основному відповідають за розпізнавання антигену. Ця варіабельна область в первісному експресованому вигляді зв'язана з сигнальним пептидом який відщеплюється.

Варіабельна область без сигнального пептиду іноді згадується як зріла варіабельна область.

Так, наприклад, зріла варіабельна область легкого ланцюга позначає варіабельну область легкого ланцюга без сигнального пептиду легкого ланцюга. Карбоксикінцева частина кожного ланцюга визначає константну область, яка головним чином відповідає за ефекторну функцію. 00161) Легкі ланцюги ділять на каппа і лямбда. Важкі ланцюги поділяють на гамма, мю, альфа, дельта або епсилон, і виділяють такі ізотипи антитіла як: Ідс, ІЮМ, ІдЧА, дО ії ю4Е відповідно. В межах легкого і важкого ланцюгів варіабельна і константна області з'єднуються областю «о», довжиною близько 12 або більше амінокислот, причому важкий ланцюг також містить область «Ю», яка включає близько 10 або більше амінокислот. Дивіться в цілому,

Еипдатепіа! Іттипоіоду, Раці, МУ., ед., 2па ед. Камеп Ргез5, М.У., 1989, Сп. 7 (включене в повному обсязі за допомогою посилання для всіх цілей).

Зо 00162) Варіабельна область легкого або важкого ланцюга імуноглобуліну (також позначена в даному документі як «варіабельний домен легкого ланцюга» («домен Мі») або «варіабельний домен важкого ланцюга» («домен МН»), відповідно) складається з «каркасної» області, яка розмежовується трьома «областями, які визначають комплементарність» або «СОК». Каркасні області використовують для вирівнювання СОМ відповідно до специфічного зв'язування з епітопом антигена. СОК містять амінокислотні залишки антитіла, які в першу чергу відповідають за зв'язування антигена. Від амінокінця до карбоксикінця обидва домени МІ. і МН містять такі каркасні (ЕЕ. - їтатемогк) і СОЄ області: ЕК!1, СОКІ, ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОКЗ і ЕК4. СОК 1,213 домену МІ. також згадуються в даному документі відповідно як СОК-11, СОВ-12 і СОК-І 3; СОВ 1,2 їі З домену МН також згадуються в даному документі відповідно як СОБК-НІ, СОВ-Н2 і СОК-

НЗ.

Ї00163| Позначення амінокислот для кожного з доменів МІ і МН відповідає будь-якому звичайному визначенню СОВ. Загальноприйняті визначення включають визначення по Кабату

Зедиєпсевз ої Ргоївїп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві (Маїйопаї! Іпвійшевз ої Неайй, Веїйезаа, МО, 1987 апа 1991), визначення по Чотіа (Споїніа 8. І ев5К, У. Мої. 196: 901-917, 1987; Споїпіа вї аї., Майшге 342: 878-883, 1989); поєднане визначення для СОВА по Чотіа-Кабату, в якому СОВ-НІ є суміщеними СОВА по Чотіа і Кабату; визначення АБМ, яке використовується програмним забезпеченням для моделювання антитіл Охіогі Моїіесціаг; і контактне визначення Мартіна та співавторів (Біоіїпто.ога.иК/арв) (див. Таблицю 1). Кабат пропонує широко застосовувану угоду про нумерацію (нумерація Кабата), в якій відповідним залишкам між різними важкими ланцюгами або між різними легкими ланцюгами надається однакове число. Коли вказується, що антитіло містить СОВ за деякими визначеннями СОВА (наприклад, Кабата), це визначення вказує мінімальну кількість залишків СОВА, присутніх в антитілі (тобто СОВА по Кабату). Це не виключає того, що також присутні інші залишки, які потрапляють в інше загальноприйняте визначення СОВ, але вони виходять за межі вказаного визначення. Наприклад, антитіло, яке містить СОВ, визначені по Кабату, включає серед інших варіантів, антитіло, в якому СОВ містять залишки СОВ по Кабату і не містять інших залишків СОН, і антитіло, в якому СОВ НІ являє собою комбіновану СОВ НІ по Чотіа-Кабату, та інші СОВ містять залишки СОВ по Кабату, і жодних додаткових залишків СОВ на основі інших визначень. (516)

00164)

Таблиця 1

Загальноприйняті визначення СОК з використанням нумерації Кабата

Чотіа і Кабату «"СОВ-НІ по Чотіа може закінчуватися на НЗ2, НЗЗ або НЗА4 (в залежності від довжини петлі).

Це пов'язано з тим, що в схемі нумерації Кабата розміщують вставки додаткових залишків в З5А і 358, тоді як в нумерації Чотіа їх розміщують в З1А їі 318. Якщо не представлено ні НЗБ5А, ні

НЗ5ОВ (нумерація Кабата), петля СОК-НІ по Чотіа закінчується на НЗ2. Якщо є тільки НЗ5БА, вона закінчується на НЗ3З. Якщо присутні і НЗ5БА і НЗ5В, вона закінчується на НЗА4. 00165) Термін «антитіло» включає інтактні антитіла та їх зв'язуючі фрагменти. Як правило, фрагменти конкурують з інтактним антитілом, з якого вони були отримані, за специфічне зв'язування з мішенню, включаючи окремі важкі ланцюги, легкі ланцюги Раб, Раб", Е(ар)», Е(ар)с,

Бар», нанотіла і Ем. Фрагменти можуть бути продуковані за допомогою методів рекомбінантної

ДНК, або шляхом ферментативного або хімічного розділення інтактних імуноглобулінів. Термін «антитіло» також включає біспецифічне антитіло і/або гуманізоване антитіло. Біспецифічне або біфункціональне антитіло являє собою штучне гібридне антитіло, яке має дві різні пари важких/легких ланцюгів і два різних сайти зв'язування (див., наприклад, Зоповзіміаії апа

Гасптапп, Сіїп. Ехр. Іттипої., 79:315-321 (1990); Ковівїпу еї аї., У. Іттипої., 148:1547-53 (1992)).

У деяких біспецифічних антитіл дві різні пари важких/ легких ланцюгів включають пару важкий ланцюг/легкий ланцюг гуманізованого 905, і пару важкий ланцюг/легкий ланцюг, специфічну до іншого епітопа на транстиретині, ніж той, що зв'язаний антитілом 905. У деяких біспецифічних антитіл дві різні пари важких/ легких ланцюгів включають пару важкий ланцюг/легкий ланцюг гуманізованого 14058, і пару важкий ланцюг/легкий ланцюг, специфічну до іншого епітопа на транстиретині, ніж той, що зв'язаний антитілом 1468.

ЇО0166| У деяких біспецифічних антитіл одна пара важкий ланцюг/легкий ланцюг являє собою гуманізоване антитіло 905 або 1408 , як додатково описано нижче, а інша пара важкий ланцюг/легкий ланцюг з антитіла, яке зв'язується з рецептором, що експресується на гематоенцефалічному бар'єрі, таким як рецептор інсуліну, рецептор інсулін-подібного фактора (СЕ - іпзцй-йКе дгоул Тасіог), рецептор лептину або рецептор ліпопротеїнів або рецептор трансферину (Ргідеп еї аї., Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 88:4771-4775, 1991; Еіїдеп еї аї., Зсівєпсе 259:373-377, 1993). Таке біспецифічне антитіло може бути перенесене через

Зо гематоенцефалічний бар'єр за допомогою рецептор-опосередкованого трансцитозу.

Поглинання мозком біспецифічного антитіла може бути додатково посилене шляхом проектування біспецифічного антитіла для зниження його афінності до рецептора гематоенцефалічного бар'єру. Знижена афінність до рецептора призводить до більш широкого поширення в мозку (див., наприклад, Аїмаї єї аї., сі. Тгап5. Мед. 3, 84га43, 2011; Ми єї аї., осі.

Тгап5. Меа. 3, в4га44, 2011).

Ї00167| Прикладами біспецифічних антитіл також можуть бути: 1) антитіло з подвійним варіабельним доменом (0МО-І4), в якому кожний легкий ланцюг і важкий ланцюг містять два варіабельних домени в тандемі, об'єднаних коротким пептидним сполученням (УУи еї аї.,

Сепегайоп апа Спагасієгігайноп ої а ЮОца! Магаріє Оотаїп Іттиподіобиїїп (0МО-Ід "м) Моїесшіе, Іп:

Апіїбоду Епадіпеегіпд, Зргіпдег Вепіп Неїдеїбегу (2010)); (2) тандаб (Тапаабр), яке представляє собою гібрид двох одноланцюгових диатіл, що утворюють чотирьохвалентне біспецифічне антитіло, яке має два сайти зв'язування для кожного з цільових антигенів; З) флекситіло, яке представляє собою поєднання 5сЕм5 з диатілом, що призводить до утворення багатовалентної молекули; 4) так звана молекула «досК апа ІосК», створена на основі «домену димеризації і докінгу» протеїнкінази А, застосування якого з Гаю призводить до отримання біспецифічного тривалентного зв'язуючого білка, що складається з двох ідентичних Рар-фрагментів, приєднаних до іншого Рар-фрагмента; (5) так звана молекула бсогріоп, яка містить, наприклад,

два 5сЕм, злитих з обома кінцями Ес-області антитіла людини. Приклади платформ, корисних для приготування біспецифічних антитіл, включають: ВІТЕ (Містготе)), АВТ (Масгосзепісв),

Есаб і Мара (Р-віаї), Ес-спроектований да (Хепсог) або ОиоВоаду (на основі обміну плечей Раб,

Септарб). 00168) Термін «епітоп» відноситься до сайту на антигені, з яким зв'язується антитіло. Епітоп може бути сформований з суміжних амінокислот або несуміжних амінокислот, що зближуються за допомогою третинного згортання одного або декількох білків. Епітопи, сформовані з суміжних амінокислот (також відомі як лінійні епітопи), зазвичай зберігаються при впливі денатуруючих розчинників, тоді як епітопи, сформовані шляхом третинного згортання (також відомі як конформаційні епітопи), зазвичай втрачаються при обробці денатуруючими розчинниками.

Епітоп зазвичай включає щонайменше 3, але як правило - щонайменше 5 або 8-10 амінокислот в унікальній просторової конформації. Способи визначення просторової конформації епітопів включають, наприклад, рентгенівську кристалографії та двовимірний ядерний магнітний резонанс. Дивіться, наприклад, Ерібре Марріпд Ргоїосоїв5, іп Меїйоа5 іп Моїіесшіаг Віоіоду, Мої. 66, Сієпп Е. Моїтіз, Ед. (1996). Епітоп може бути лінійним, таким як епітоп, наприклад, 2-5, 3-5, 3-9 або 5-9 суміжних амінокислот з БЕО ІЮ МО: 109. Епітоп також може бути конформаційним епітопом, який містить, наприклад, два або більше несуміжних сегмента амінокислот в межах залишків 89-97 5ЕО І МО: 109.

ІЇ00169| Якщо говорять, що антитіло зв'язується з епітопом в межах амінокислот 89-97 транстиретина (ТТК), наприклад, то мається на увазі, що епітоп знаходиться в межах описаного проміжку амінокислот, включаючи ті, які визначають зовнішні межі проміжку. Це не обов'язково означає, що кожна амінокислота в межах проміжку становить частину епітопа. Так, наприклад, епітоп в межах амінокислот 89-97 ТТК може складатися з амінокислот 89-97, 89-96, 90-96, 91- 96, 92-96, 93-96, 94-96, 89-96, 89-95, 89-94, 89-93, 89-92 або 89-93 серед інших лінійних сегментів 5ЕО ІО МО: 113, або в разі конформаційних епітопів, несуміжних сегментів амінокислот 5ЕО ІО МО: 113. 00170) Антитіла, які розпізнають одні й ті ж епітопи, або епітопи які перекриваються, можуть бути ідентифіковані в простому імуноаналізі який показує здатність одного антитіла конкурувати з іншим антитілом за зв'язування з цільовим антигеном. Епітоп антитіла також може

Зо бути визначений рентгенівською кристалографією антитіла, зв'язаного з його антигеном, для ідентифікації контактуючих залишків. В альтернативному варіанті, два антитіла мають один і той же епітоп, якщо всі амінокислотні мутації в антигені, які зменшують або усувають зв'язування одного антитіла, також зменшують або усувають зв'язування іншого антитіла. Два антитіла мають епітопи які перекриваються, якщо деякі амінокислотні мутації, які зменшують або усувають зв'язування одного антитіла, також зменшують або усувають зв'язування іншого антитіла.

Ї00171| Конкуренція між антитілами визначається аналізом, в якому антитіло яке тестують, інгібує специфічне зв'язування еталонного антитіла з спільним антигеном (див., наприклад,

Уипдпапе5 єї аї., Сапсег Ве5. 50:1495, 1990). Антитіло, яке тестують, конкурує з еталонним антитілом, якщо надлишок антитіла, яке тестують (наприклад, щонайменше, 2х, 5х, 10х, 20х або 100х), інгібує зв'язування еталонного антитіла щонайменше на 5095, як виміряно при аналізі конкурентного зв'язування. Деякі антитіла, які тестують, інгібують зв'язування еталонних антитіл щонайменше на 7595, 9095 або 9995. Антитіла, ідентифіковані конкурентним аналізом (конкуруючі антитіла), включають антитіла, які зв'язуються з тим самим епітопом, що і еталонне антитіло, і антитіла, які зв'язуються з сусіднім епітопом, який знаходяться доволі проксимально по відношенню до епітопа, зв'язаного еталонним антитілом для створення стеричної перешкоди. 00172) Термін «нативний» по відношенню до структури транстиретина (ТТЕ) відноситься до нормально згорнутої структури ТТК в його правильно функціонуючому стані (тобто тетрамер

ТТК). Оскільки ТТК є тетрамером в його початковій згорнутій формі, ненативні форми ТТК включають, наприклад, неправильно згорнуті тетрамери ТТЕ, мономери ТТЕ, агреговані форми

ТТЕ, Її ТТК в формі фібрил. Ненативні форми ТТК можуть включати молекули, які містять амінокислотні послідовності ТТЕ дикого типу або мутації. 00173) Термін «неправильно згорнутий» по відношенню до ТТЕ відноситься до вторинної і третинної структури поліпептидного мономера або мультимера ТТК, і вказує на те, що поліпептид прийняв конформацію, яка не є нормальною для цього білка в його правильно функціонуючому стані. Хоча неправильне згортання ТТ може бути викликане мутаціями в білку (наприклад, делецією, заміною або інсерцією), білюи ТТЕК дикого типу також можуть бути неправильно згорнуті при захворюваннях, експонуючи специфічні епітопи. бо 00174) Термін «фармацевтично прийнятний» означає, що носій, розчинник, ексципієнт або допоміжна речовина є сумісними з іншими інгредієнтами складу і не є по суті шкідливими для його реципієнта. 00175) Термін «пацієнт» включає людей та інших суб'єктів-ссавців, які отримують або профілактичне, або терапевтичне лікування. 00176) Людина є схильною до підвищеного ризику захворювання, якщо у суб'єкта є хоча б один відомий фактор ризику (наприклад, генетичний, біохімічний, сімейний анамнез і ситуаційний ризик), в результаті чого люди з цим фактором ризику мають статистично значимий більший ризик розвитку захворювання ніж люди без фактора ризику.

Ї00177| Термін «біологічний зразок» відноситься до зразка біологічного матеріалу всередині біологічного джерела або який може бути отриманий з джерела, наприклад людини або ссавця.

Такі зразки можуть бути органами, органеллами, тканинами, зрізами тканин, фізіологічними рідинами, периферичної кров'ю, плазмою крові, сироваткою крові, клітинами, молекулами, такими як білки і пептиди, і будь-якими отриманими з них частинами або комбінаціями. Термін «біологічний зразок» може також охоплювати будь-який матеріал, отриманий шляхом обробки зразка. Похідний матеріал може включати клітини або їх потомство. Обробка біологічного зразка може включати одну або декілька фільтрацій, дистиляцій, екстракцій, концентрацій, фіксацій, інактивацій компонентів, які заважають, і тому подібного. 00178) Термін «контрольний зразок» відноситься до біологічного зразка, для якого не є відомими чи для якого не підозрюють наявності мономерних, неправильно згорнутих, агрегованих або фібрильних форм транстиретина (ТТК), наприклад, таких як в амілоїдних відкладеннях ТТК. Контрольні зразки можуть бути отримані в осіб, які не страждають ТТК амілоїдозом або специфічно обраним типом ТТК амілоїдозу. Альтернативно, контрольні зразки можуть бути отримані у пацієнтів, які страждають ТТК амілоїдозом або специфічно обраним типом ТТЕ амілоїдозу. Такі зразки можуть бути отримані в той же час, що і біологічний зразок, який, як вважається, містить ТІК амілоїдоз, або в іншому випадку. Біологічний зразок і контрольний зразок можна отримати з однієї і тієї ж тканини (наприклад, зріз тканини, що містить як відкладення ТТК амілоїду, так і навколишні нормальні тканини). Бажано, контрольні зразки складаються в основному або повністю з тканини, вільної від амілоїдних відкладень ТТЕ, і можуть бути використані для порівняння з біологічним зразком, який, як вважається, містить амілоїдні відкладення ТТК. Бажано, тканина в контрольному зразку має той самий тип, що і тканина в біологічному зразку (наприклад, кардіоміоцити в серці).

Ї00179| Термін «хвороба» відноситься до будь-якого аномального стану, який погіршує фізіологічну функцію. Цей термін широко використовується для охоплення будь-якого розладу, хвороби, аномалії, патології, недугу, стану або синдрому, при яких порушується фізіологічна функція, незалежно від характеру етіології. 00180) Термін «симптом» відноситься до суб'єктивних свідчень захворювання, таких як змінена хода, як це сприймається суб'єктом. «Ознака» відноситься до об'єктивних свідчень хвороби, які спостерігаються лікарем.

Ї0О0181| Для класифікації амінокислотних замін на консервативні або неконсервативні, амінокислоти згруповані таким чином: група І! (гідрофобні бічні ланцюги): тпеї, аїа, маї, Іеи, Пе; група ІІ (нейтральні гідрофільні бічні ланцюги): суб, 5ег, Ійг; група ІІ (кислотні бічні ланцюги): азр, дій; група ІМ (основні бічні ланцюги): азп, діп, пів, Іує5, агу; група М (залишки, що впливають на орієнтацію ланцюгів): діУ, рго; і група МІ (ароматичні бічні ланцюги): ігр, їуг, рпе. Під консервативними замінами мають на увазі заміни між амінокислотами в одному клавбі.

Неконсервативні заміни полягають в обміні члена одного з цих класів на член іншого. 00182) Ідентичність послідовності у відсотках визначається за допомогою послідовностей антитіл, максимально вирівняних відповідно до угоди нумерації Кабата. Після вирівнювання, якщо область антитіла суб'єкта (наприклад, вся зріла варіабельна область важкого або легкого ланцюга) порівнюють з тією ж областю еталонного антитіла, то ідентичність послідовності у відсотках між областями антитіла суб'єкта і еталонного антитіла являє собою число позицій, зайнятих такою ж амінокислотою як в області суб'єкта, так і в області еталонного антитіла, розділене на загальну кількість вирівняних позицій двох областей, причому проміжки не враховуються, помножене на 100 для перетворення у відсотки. 00183) Композиції або способи, «які містять» або «які включають» один або кілька розглянутих елементів, можуть включати інші елементи, що не були точно вказані. Наприклад, композиція, яка «містить» або «включає» антитіло, може містити антитіло окремо або в комбінації з іншими складовими. 00184) Позначення діапазону значень включає всі цілі числа в межах діапазону або які задають діапазон, і всі піддіапазони, задані цілими числами в межах діапазону. 60 00185) Якщо інше не випливає з контексту, термін «близько» охоплює значення в межах стандартної похибки вимірювання (наприклад, ЕМ) вказаного значення. 00186) Статистична значимість означає рерівне 0,05.

Ї00187| Форми іменників в однині включать також форми в множині, до тих пір, поки інше чітко не випливає з контексту. Наприклад, термін «сполука» або «щонайменше одна сполука» може включати в себе безліч сполук, включаючи їх суміші.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС СУТІ ВИНАХОДУ

Ї. Загальні положення 00188) У винаході запропоновані антитіла, які специфічно зв'язуються з залишками 89-97 транстиретина (ТТК). Антитіла мають здатність зв'язуватися з мономерними, неправильно згорнутими, агрегованими або фібрильними формами ТТК. Антитіла можуть бути використані для лікування, або здійснення профілактики захворювань або розладів, пов'язаних з накопиченням ТТК або накопиченням відкладень ТТК (наприклад, ТТК амілоїдозу). Антитіла також можуть бути використані для діагностики ТТК амілоїдозу і пригнічення, або зменшення агрегації ТТК, серед інших застосувань.

ІЇ. Молекули-мішені

Ї00189| Транстиретин (ТТА) являє собою сироватковий білок і транспортний білок спинномозкової рідини, має довжину 127 амінокислот, масу 55 кДа і синтезується в основному печінкою. Він також згадується як преальбумін, тироксинзв'язуючий преальбумін, АТТА (ТА ату!оідовів) і ТВРА (ІНугохіпе-рбіпаіпу ргеаіритіп - тироксинзв'язуючий преальбумін). У своєму нативному стані ТТА існує як тетрамер. У гомозигот тетрамери містять ідентичні 127- амінокислотні субодиниці, багаті на бета-шари. У гетерозигот тетрамери ТТК складаються з різних субодиниць і/або субодиниць дикого типу, які зазвичай об'єднуються статистичними способом.

Ї00190| Встановлена функція ТТК в крові полягає в транспорті поІо-ретинолзв'язуючого білка. Хоча ТТК є основним переносником тироксину (Та) в крові гризунів, задіюючи сайти зв'язування, які ортогональні до сайтів, що використовуються для ПпПоіо-ретинолзв'язуючого білка, сайти зв'язування Та фактично незайняті у людей.

ЇО0О191| ТТК є одним з, щонайменше, тридцять різноманітних людських білків, чиє позаклітинне неправильне згортання і/або неправильна збірка (амілоїдогенез) в різноманіття

Зо агрегатних структур, як вважають, викликають дегенеративні захворювання, названі амілоїдними захворюваннями. ТТК повинний зазнати конформаційних змін, щоб стати амілоїдогенним. Часткове розгортання розкриває ділянки майже незаряджених гідрофобних залишків в розгорнутій конформації, які успішно неправильно збираються в майже повністю неструктуровані сферичні агрегати, які в кінцевому підсумку зазнають конформаційного перетворення в амілоїдні структури з бета-листами. 00192) Якщо інше не очевидно з контексту, відсилання до транстиретина (ТТК), або його фрагментів, або доменів, включає природні амінокислотні послідовності людини, включаючи їх ізоформи, мутантні і алельні варіанти. Ілюстративні поліпептидні послідовності ТК позначаються ідентифікаційними номерами РО2766.1 (ОпіРго), ААВЗ5639.1 (СепВапкК), ААВЗ5640.1 (СепВапк) і АВІБЄЗ3351.1 (СепВапк) (ЗЕО ІЮ МО5: 109-112, відповідно). Залишки нумеруються відповідно до РО2766.1 Зм/із5 Ргої, з першою амінокислотою зрілого білка (тобто, не включаючи 20-амінокислотну сигнальну послідовність), позначеною залишком 1. У будь- якому іншому білку ТТЕ залишки нумеруються згідно з відповідними залишками в РО2766.1 при максимальному вирівнюванні.

І. Транстиретиновий амілоїдоз 00193) Транстиретиновий (ТТА) амілоїдоз являє собою системний розлад, який характеризується патогенним, неправильно згорнутим ТТА і позаклітинним відкладенням амілоїдних фібрил, які складаються з ТТЕА. ТТА амілоїдоз зазвичай викликаний дестабілізацією нативної тетрамерної форми ТТА (через умови середовища або генетичних патологій), що призводить до дисоціації, неправильного згортання і агрегації ТТА в амілоїдні фібрили, які накопичуються в різних органах і тканинах, викликаючи прогресуючу дисфункцію. Дивіться, наприклад, АІтеїда апа Загаїма, РЕВ5 І ейегз 586:2891-2896 (2012); Апао єї аї!., Отгрпапеї доитаї ої Наге Оізеазез 8:31 (2013). 00194) У людей, як тетрамери ТТА дикого типу, так і змішані тетрамери, які складаються з субодиниць мутантного і дикого типу, можуть дисоціювати, неправильно згортатись і агрегувати, причому процес амілоїдогенезу призводить до дегенерації постмітотичної тканини. Таким чином, ТТК амілоїдози включають захворювання, викликані патогенним неправильно згорнутим

ТТЕ, який виникає в результаті мутацій в ТТК, або виникає з немутованого, неправильно згорнутого ТТК. бо Ї00195| Наприклад, старечий системний амілоїдоз (55А - зепійе 5узіветіс аптуїоідовів) і старечий серцевий амілоїдоз (ЗСА - зепііе сагаіас атуїіоідозі5) представляють собою вікові типи амілоїдозу, які виникають в результаті відкладення ТТК амілоїду дикого типу за межами і всередині кардіоміоцитів серця. ТТЕК амілоїдоз також є найбільш поширеною формою спадкового (сімейного) амілоїдозу, який викликаний мутаціями, які дестабілізують білок ТТ.

ТТК амілоїдози, які пов'язані з точковими мутаціями в гені ТТК, включають сімейну амілоїдну поліневропатію (ЕАР - Татіїа! атуїоід роіупеигораївпу), сімейну амілоїдну кардіоміопатію (БАС -

Татіїйа! атуоідй сагаіотуораїну) і рідкісний вибірковий амілоїдоз центральної нервової системи (СМ5ЗА - сепіга!І пегмои5 5узіет 5еїесіїме атуїоідові5). Пацієнти зі спадковим (сімейним) ТТ амілоїдозом майже завжди є гетерозиготами, що означає, що тетрамери ТТК складаються з субодиниць ТТЕ мутантного і/або дикого типу, в цілому, як правило, статистично розподілених.

Спадкові (сімейні) форми ТТЕК амілоїдозу, як правило, є аутосомно-домінантними і, як правило, мають більш ранній прояв перших симптомів, ніж спорадичні захворювання (55А і ЗСА). 00196) У гені, який кодує ТТЕК, більше 100 мутацій які пов'язують з аутосомно-домінантними розладами ЕАР і ГАС. Дивіться, наприклад, 05 2014/0056904; Загаїма, Нит. Мшаї. 17(6):493- 503 (2001); Сатавз апа Загаїма, у. Бігисі. Віо!. 130:290-299; Ом/цеї апа Вепзоп, Віоспет. Віорпувз.

Вез. боттип. 114:657-662 (1983). Ці мутації, які викликають утворення амілоїду, розподілені по всій молекулі ТТЕ. Як правило, чим більш дестабілізуючими для тетрамерної структури ТТЕК є мутантні субодиниці, тим раніше виявляються перші симптоми амілоїдного захворювання.

Патогенний потенціал варіанта ТТК в цілому, як правило, визначається комбінацією його нестабільності та ефективності його клітинної секреції. Первісна патологія, спричинена деякими варіантами ТТК, є результатом їх вибіркового руйнування серцевої тканини, тоді як інші варіанти ТТК призводять до порушень в периферичній і вегетативній нервових системах.

Пошкодження тканини, викликане ТТК амілоїдогенезом, швидше за все, обумовлене головним чином токсичністю невеликих, дифундуючих агрегатів ТТК, хоча накопичення позаклітинного амілоїду може сприяти і майже напевно призводить до зміни структури органу на пізніх стадіях

ТТК амілоїдозу.

Ї00197| ТТК амілоїдоз представлений багатьма різними формами, зі значними фенотиповими відмінностями між індивідами і географічними регіонами. Наприклад, ТК амілоїдоз може являти собою прогресуючу, аксональну сенсорну вегетативну і моторну

Зо невропатію. ТТЕ амілоїдоз може також являти собою проникаючу кардіоміопатію. 00198) Вік прояву перших симптомів, пов'язаних з хворобою, коливається між другим і дев'ятим десятиліттями життя з великими варіаціями в різних популяціях. Мультисистемне враження ТТЕК амілоїдозом є ключем до його діагностики. Наприклад, діагноз ТТК амілоїдозу розглядається при наявності одного або декількох наступних факторів: 1) сімейний анамнез невропатичного захворювання, особливо пов'язаного з серцевою недостатністю; 2) невропатична біль або прогресуючі сенсорні порушення невідомої етіології; 3) синдром кистьового тунелю без очевидної причини, особливо якщо він двосторонній і вимагає хірургічного усунення; 4) порушення моторики шлунково-кишкового тракту або дисфункція автономної нервової системи невідомої етіології (наприклад, еректильна дисфункція, ортостатична гіпотензія, неврогенний голод); 5) серцева хвороба, яка характеризується потовщеними стінками шлуночків за відсутності гіпертонії; 6) розширений з невідомих причин атрио-вентрикулярний блок, особливо коли він супроводжується потовщеним серцем; і 6) включення в склоподібному тілі за типом вати. Дивіться Апдо еї аї., Огрпапеї доштпаї ої Раге

ОРівеазе5 8:31 (2013). Інші симптоми можуть включати, наприклад, поліневропатію, втрату чутливості, біль, слабкість нижніх кінцівок, дисгідроз, діарею, запор, втрату ваги і нетримання/утримання сечі. 00199) Діагностика ТТ амілоїдозу зазвичай спирається на біопсію органів-мішеней з наступним гістологічним фарбуванням вирізаної тканини за допомогою специфічного до амілоїду барвника Сопдо гед. Якщо спостерігається позитивний результат на амілоїд, згодом проводиться імуногістохімічне фарбування для ТТЕ, щоб гарантувати, що білок-попередник, відповідальний за утворення амілоїду, дійсно є ТТК. Для сімейних форм захворювань необхідно продемонструвати мутацію в гені, який кодує ТТК, до постановки діагнозу. Це може бути досягнуто, наприклад, за допомогою ізоелектричного фокусуючого електрофорезу, полімеразної ланцюгової реакції або лазерної диссекції/ рідинної хроматографії в тандемі з мас- спектрометрією. Дивитись, наприклад, О5 2014/0056904; Вибрего апа Веїк, Сігсцайоп 126:1286- 1300 (2012); Апао евї аі., Огтрнапеї доштаї ої ВРаге Різєеавзез 8:31 (2013).

ІМ. Антитіла

А. Специфічність зв'язування і функціональні властивості

І00О20О0| У винаході запропоновані моноклональні антитіла, які зв'язуються з білком бо транстиретином (ТТЕК), більш конкретно, з епітопами в межах амінокислотних залишків 89-97

(ЗЕБЕО ІО МО: 113) білка ТТ. Такі епітопи є прихованими в нативному тетрамері ТТЕ, і експоновані в мономерних, неправильно згорнутих, агрегованих або фібрильних формах ТТЕ. 00201) Антитіла, позначені як 905 і 14058, являють собою два таких ілюстративних антитіла миші. Якщо не очевидно з контексту, відсилання до 905 або 1468 слід розуміти, як відсилання до будь-якої з мишачих, химерних, венированих і гуманізованих форм цих антитіл. Ці антитіла специфічно зв'язуються в межах амінокислотних залишків 89-97 (5ЕО ІО МО: 113) білка ТТЕ. Ці антитіла додатково характеризуються їх здатністю зв'язуватися з мономерними, неправильно згорнутими, агрегованими або фібрильними формами ТТЕ, але не з нативними тетрамерними формами ТТ. Крім того, ці антитіла характеризуються імунореактивністю до серцевої тканини, схильної до ТТК-опосередкованого амілоїдозу, але не до здорової серцевої тканини. Здатність зв'язуватися з конкретними білками або їх фрагментами може бути продемонстрована з використанням ілюстративних форматів аналізу, представлених в прикладах. (00202) Деякі антитіла зв'язуються з тим же епітопом або епітопом який перекривається, що і антитіла, позначені як 905 або 1408. Послідовності зрілих варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів цих антитіл позначені як БЗЕО ІО МО: 1 і 16 (905), і, 61 ї 70 (1408) відповідно.

Інші антитіла, які володіють такою специфічністю зв'язування, можуть бути отримані шляхом імунізації мишей за допомогою ТТЕ. або його частини, включаючи бажаний епітоп (наприклад,

ЗЕО ІО МО: 113), і шляхом скринінгу отриманих антитіл на зв'язування з мономерним ТТЕ або пептидом, який містить ЗЕО ІЮО МО: 113, необов'язково в конкуренції з антитілом, яке має варіабельні області антитіла миші 905 або 1458 (19051 каппа). Фрагменти ТТЕ, включаючи бажаний епітоп, можуть бути зв'язані з носієм, який допомагає викликати гуморальну відповідь на фрагмент, і/або змішані з ад'ювантом, який допомагає викликати таку відповідь. Такі антитіла можуть бути перевірені на відмінність в зв'язуванні з мономерним варіантом ТТЕ, варіантом дикого типу або фрагментом ТТЕК (наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 113) в порівнянні з мутантами за вказаними залишкам. Скринінг при порівнянні з такими мутантами більш точно визначає специфічність зв'язування, що дозволяє ідентифікувати антитіла, зв'язування яких інгібується мутагенезом певних залишків і які, ймовірно, будуть володіти функціональними властивостями інших ілюстративних антитіл. Мутації можуть бути систематичною заміщаючою заміною аланіном (або серином, якщо вже присутній аланін), по одному залишку за раз, або заміною більш широкими інтервалами по всій мішені або по всій її ділянці, в якій, як відомо, знаходиться епітоп. Якщо один і той же набір мутацій значно знижує зв'язування двох антитіл, обидва антитіла зв'язують один і той самий епітоп. (00203) Антитіла, які володіють специфічністю зв'язування обраного антитіла миші (наприклад, 905 або 1408), також можуть бути отримані з використанням варіанту способу фагового дисплея. Див. УмМіпіег, МО 92/20791. Цей спосіб особливо підходить для продукування людських антитіл. У цьому способі в якості вихідного матеріалу використовують варіабельну область або важкого, або легкого ланцюга обраного антитіла миші. Якщо, наприклад, в якості вихідного матеріалу обрана варіабельна область легкого ланцюга, то створюють бібліотеку фагів, в якій елементи відображають одну і ту ж варіабельну область легкого ланцюга (тобто вихідний матеріал миші) та іншу варіабельну область важкого ланцюга. Варіабельні області важкого ланцюга можна, наприклад, отримати з бібліотеки перегрупованих варіабельних областей важкого ланцюга людини. Відбирається фаг, який демонструє сильне специфічне зв'язування (наприклад, щонайменше 108, а більш бажано, щонайменше, 109 М") для мономера

ТТК або його фрагмента (наприклад, амінокислотних залишків 89-97). Варіабельна область важкого ланцюга з цього фага потім служить в якості вихідного матеріалу для конструювання додаткової бібліотеки фагів. У цій бібліотеці кожен фаг відображає ту ж саму варіабельну область важкого ланцюга (тобто область, ідентифіковану з першої дисплей-бібліотеки), та іншу варіабельну область легкого ланцюга. Варіабельні області легкого ланцюга можуть бути отримані, наприклад, з бібліотеки перегрупованих варіабельних областей легкого ланцюга людини. Знову ж, вибирають фаг, який демонструє сильне специфічне зв'язування для мономерного ТТК або його фрагмента (наприклад, амінокислотних залишків 89-97). Отримані антитіла зазвичай мають таку ж або подібну специфічність до епітопів, що і вихідний матеріал миші. СОК по Кабату важкого ланцюга 905 позначені ЗЕО ІЮ МО: 13-15 відповідно, а СОК по

Кабату легкого ланцюга 905 позначені ЗЕО ІЮ МО: 24-26, відповідно. Комбінована СОК-НІ по

Чотіа-Кабату антитіла 905 позначена як 5ЕО ІЮ МО: 117. СОК по Кабату важкого ланцюга 14658 позначені 5ЕО ІЮ МО: 67-69 відповідно, а СОК по Кабату легкого ланцюга 1408 позначені 5ЕО

ІЮ МО: 77-79, відповідно. Комбінована СОБК-НІ по Чотіа-Кабату антитіла 1458 позначена як

ЗЕО ІЮ МО: 118. Варіант СОК-І 1 антитіла 1458 позначений як ЗЕО ІЮ МО: 80. (00204) Інші антитіла можуть бути отримані шляхом мутагенезу кДНК, яке кодує важкий і 60 легкий ланцюги ілюстративного антитіла, такого як 905 або 1408. У винахід також включені моноклональні антитіла, які щонайменше на 7095, 8095, 9095, 9595, 9695, 9795, 9895 або 9995 ідентичні антитілу 905 або 14058 за амінокислотною послідовністю варіабельних областей зрілого важкого і/або легкого ланцюга, і зберігають його функціональні властивості, і/або які відрізняються від відповідного антитіла невеликим числом функціонально несуттєвих амінокислотних замін (наприклад, консервативних замін), делецій або вставок. Також включені моноклональні антитіла, які мають щонайменше одну або всі шість СОК, як визначено відповідно до будь-якої загальноприйнятої угоди, але бажано по Кабату, які є на 9095, 9595, 9995 або 10095 ідентичними відповідним СОР. антитіла 905 або 1408. 00205) У винаході також запропоновані антитіла, які мають деякі або всі (наприклад, 3,4, 5 і 6) СОК повністю або майже повністю з 905 або 1468. Такі антитіла можуть містити варіабельну область важкого ланцюга, яка має щонайменше дві і, як правило, всі три СОК повністю або майже повністю з варіабельної області важкого ланцюга антитіла 905 або 1408, і/або варіабельну область легкого ланцюга, яка має щонайменше дві і, як правило, всі три СОК повністю або майже повністю з варіабельної області легкого ланцюга антитіла 905 або 1468.

Антитіла можуть також включати як важкі, так і легкі ланцюги. СОК є майже повністю взятою з відповідної СОР. антитіла 905 або 1408, коли вона містить не більше 4, 3, 2 або 1 замін, вставок або делецій, за винятком того, що СОК-Н2 (коли визначено по Кабату) може мати не більше 6, 5, 4, 3, 2 або 1 замін, вставок або делецій. Такі антитіла можуть мати щонайменше 7095, 8095, 9095, 9595, 9695, 9795, 9895 або 9995 ідентичності з антитілом 905 або 1408 за амінокислотною послідовністю варіабельного зрілого важкого і/або легкого ланцюга (-ів), і зберігають його функціональні властивості, і/або які відрізняються від антитіла 905 або 1458 невеликим числом функціонально несуттєвих амінокислотних замін (наприклад, консервативних замін), делецій або вставок. (00206) Деякі антитіла, ідентифіковані за допомогою таких аналізів, можуть зв'язуватися з мономерними, неправильно згорнутими, агрегованими або фібрильними формами ТТЕ, але не з нативними тетрамерними формами ТТК, як описано в прикладах або де-небудь ще.

Аналогічно, деякі антитіла є імунореактивними до тканини, схильної до ТТК-опосередкованого амілоїдозу, але не до здорової тканини.

І00207| Деякі антитіла можуть пригнічувати або зменшувати агрегацію ТТЕ, пригнічувати або

Зо зменшувати утворення фібрил ТТК, зменшувати або видаляти відкладення ТТК або агрегований ТТЕК, або стабілізувати нетоксичні конформації ТТК в тваринній моделі або клінічних випробуваннях. Деякі антитіла можуть лікувати, надавати профілактичну дію або сповільнювати початок прояву перших симптомів ТТК амілоїдозу, як показано в тваринній моделі або клінічних випробуваннях. Ілюстративні моделі тварин для тестування активності проти ТТК амілоїдозу включають ті, які описані в Коппо еї аї., Ат. У. Раїй. 150(4):1497-1508 (1997); Тепо еї а!., І арогаїогу Іпмевіїдайоп5 81:385-396 (2001); УУаКкавзиді еї а!., Ргос. дхарап Асад. 638:344-347 (1987); Зпітада єї аї., Мої. Віої. Мед. 6:333-343 (1989); Мадаїа еї аї., 9. Віоснет. 117:169-175 (1995); бо!йза єї а!., Ат. У. Раїн. 161:1935-1948 (2002); і Запіоз єї а)., Меитобіоіоду ої

Адіпа 31:280-289 (2010).

В. Нелюдські антитіла 00208) Виробництво інших нелюдських антитіл, наприклад, антитіл миші, морської свинки, приматів, кроликів або щурів, до мономерного ТТЕК або його фрагменту (наприклад, амінокислотних залишків 89-97) може бути здійснено, наприклад, шляхом імунізації тварини білююм ТТК або його фрагментом. Дивіться Нагом/ 85 І апе, Апііїродієз, А І арогаюгту Мапиаї (СЗНР МУ, 1988) (включене за допомогою посилання для всіх цілей). Такий імуноген може бути отриманий з природного джерела, шляхом пептидного синтезу або експресією рекомбінантного пептиду. Необов'язково, імуноген можна вводити злитим або іншим чином поєднаним з білком- носієм. Необов'язково, імуноген можна вводити з ад'ювантом. Можуть бути використані декілька типів ад'ювантів, як описано нижче. Для імунізації лабораторних тварин бажаним є повний ад'ювант Фрейнда, після якого застосовують неповний ад'ювант. Кролики або морські свинки зазвичай використовуються для отримання поліклональних антитіл. Мишей зазвичай використовують для продукування моноклональних антитіл. Антитіла піддають скринінгу на специфічне зв'язування з мономерним ТТК або епітопом в ТТЕ (наприклад, епітопом, який містить один або декілька амінокислотних залишків 89-97). Такий скринінг може бути здійснений шляхом визначення зв'язування антитіла з набором мономерних варіантів ТТК, таких як варіанти ТТЕ, які містять амінокислотні залишки 89-97 або мутації в межах цих залишків, і шляхом визначення того, які варіанти ТТК зв'язуються з антитілом. Зв'язування може бути оцінене, наприклад, Вестерн-блоттингом, БАС (Біом/ Сутеїгу Зіаїпіпуд Ргоїосої) або твердофазним імуноферментним аналізом (ЕГІЗА). бо С. Гуманізовані антитіла

00209) Гуманізоване антитіло являє собою генетично модифіковане антитіло, в якому СОК з нелюдського «донорного» антитіла переносять в послідовності «акцепторного» антитіла людини (див., наприклад, СОцееп, О5 5530101 і 5585089; Уміптег, О5 5225539; Сапег, 05 6407213; Адаї, 05 5859205; і Бооїе, 5 6881557). Послідовності акцепторних антитіл можуть являти собою, наприклад, зрілу послідовність антитіла людини, комбіновану послідовність з таких послідовностей, консенсусну послідовність послідовностей антитіла людини, або послідовність з клітин зародкової лінії. Таким чином, гуманізоване антитіло являє собою антитіло, яке має щонайменше три, чотири, п'ять або всі СОК повністю або майже повністю з донорних антитіл, і каркасні послідовності варіабельної області, і константні області, якщо вони присутні, повністю або майже повністю з послідовностей антитіла людини. Аналогічно, гуманізований важкий ланцюг має щонайменше одну, дві і зазвичай всі три СОК повністю або майже повністю з важкого ланцюга донорного антитіла, і каркасну послідовність варіабельної області важкого ланцюга, і константну область важкого ланцюга, якщо вона присутня, майже повністю з каркаса варіабельної області важкого ланцюга людини і послідовностей константної області. Схожим чином, гуманізований легкий ланцюг має щонайменше одну, дві і зазвичай всі три СОК повністю або майже повністю з легкого ланцюга донорного антитіла, і каркасну послідовність варіабельної області легкого ланцюга, і константну область легкого ланцюга, якщо вона присутня, майже повністю з каркаса варіабельної області легкого ланцюга людини і послідовностей константної області. На відміну від нанотіл і аАбБ5, гуманізоване антитіло містить гуманізований важкий ланцюг і гуманізований легкий ланцюг. СОК в гуманізованому антитілі являється майже повністю з відповідної СОК в нелюдському антитілі, коли щонайменше 85965, 9095, 9595 або 10095 відповідних залишків (як визначено за загальноприйнятою угодою, але переважно визначено по Кабату) є ідентичними між відповідними СОЕ. Каркасні послідовності варіабельної області ланцюга антитіла або константної області ланцюга антитіла являються майже повністю з каркасної послідовності варіабельної області людини або константної області людини відповідно, коли щонайменше 8595, 9095, 9595 або 10095 відповідних залишків, визначених згідно із загальноприйнятою угодою, але бажано визначені по Кабату, є ідентичними. (002101) Хоча гуманізовані антитіла часто містять всі шість СОК (визначені згідно будь-якої загальноприйнятої домовленості, але бажано визначені по Кабату) з антитіла миші, вони також можуть бути зроблені з меншою, ніж всі СОК, кількістю (наприклад, щонайменше трьома, чотирма або п'ятьма СОК) з антитіла миші (наприклад, Разсаїїв єї аї., ). Іттипої. 169:3076, 2002; Ма|доз еї аї., у. ої Мої. Віо!., 320: 415-428, 2002; Іманабвні еї аї., Мої. Іттипої. 36:1079-1091, 1999; Татитга еї аї, 9. Іттипої!., 164:1432-1441, 2000).

ІО0211) У деяких антитілах для збереження зв'язування в гуманізованому антитілі необхідна лише частина СОН, а саме підгрупа залишків СОН, необхідних для зв'язування, названих 50.

Залишки СОН, які не контактують з антигеном і не входять в 5ОВ, можуть бути ідентифіковані на основі попередніх досліджень (наприклад, залишки НбО-Нб5 в СОВА Н2 часто не є потрібними), на основі областей СОВ по Кабату, розташованих поза гіперваріабельними петлями по Чотіа (Споїйіа, у. Мої. Віої. 196:901, 1987), за допомогою молекулярного моделювання та/або емпірично, або як описано в Соплаїез єї а!., Мої. Іттипої. 41: 863, 2004. У таких гуманізованих антитілах в позиціях, в яких відсутній один або кілька донорних СОК- залишків, або в яких відсутня вся донорна СОК, амінокислота, яка займає позицію, може бути амінокислотою, що займає відповідну позицію (за нумерацією Кабата) в послідовності акцепторного антитіла. Кількість таких замін акцептора для донорних амінокислот в СОК, що повинні бути включені, відображають баланс конкуруючих переваг. Такі заміни потенційно вигідні для зменшення кількості амінокислот миші в гуманізованому антитілі і, як наслідок, зменшення потенційної імуногенності. Однак заміни можуть також викликати зміни афінності, і бажано уникати значного зниження афінності. Також можуть бути обрані емпірично позиції для заміни в межах СОК, і амінокислоти для заміни. (00212) Послідовності акцепторного антитіла людини можуть бути необов'язково обрані з багатьох відомих послідовностей антитіл людини для того, щоб забезпечити високу ступінь ідентичності послідовності (наприклад, ідентичність 65-8595) між каркасами варіабельної області послідовності акцептора людини і відповідними каркасами варіабельної області ланцюга донорного антитіла. (00213) Прикладами послідовностей акцептора для важкого ланцюга є варіабельні області зрілого важкого ланцюга людини з ідентифікаційними номерами МСВІ - ВАСО2114 і ААХ82494 1 (ЗЕО ІЮ МОБ: З і 4), і варіабельні області важкого ланцюга людини підгрупи З по Кабату.

ВАСО2114 розділяє ту ж традиційну форму, що і важкий ланцюг 905 миші. Іншими прикладами бо послідовностей акцептора для важкого ланцюга є варіабельні області зрілого важкого ланцюга людини з ідентифікаційними номерами МСВІ - ААЮЗ30410.1 і ААХ82494.1 (5ЕО ІО МОБ: 63 і 4), і варіабельні області важкого ланцюга людини підгрупи 1 по Кабату. ААЮЗ30410.1 і ААХ82494.1 включають дві СОК, які мають ту ж традиційну форму, що і важкий ланцюг 1458 миші.

Прикладами послідовностей акцептора для легкого ланцюга є варіабельна область зрілого легкого ланцюга людини з ідентифікаційним номером МСВІ - АВС66952 (5БО ІО МО: 18) і варіабельні області легкого ланцюга людини підгрупи З по Кабату. АВС66952 включає дві СОК, які мають ту ж традиційну форму, що і легкий ланцюг 905 миші. Іншими прикладами послідовностей акцептора для легкого ланцюга є варіабельні області зрілого легкого ланцюга людини з ідентифікаційними номерами МСВІ - АВА71374.1 і АВС66952.1 (5ЕО ІЮО МО: 72 і 73 відповідно), і варіабельні області легкого ланцюга людини підгрупи 2 по Кабату. АВА713741 і

АВСб66952.1 мають ту ж традиційну форму, що і легкий ланцюг 1458 миші. (00214) Якщо вибрано більше однієї послідовності акцепторного антитіла людини, може бути використаний композит або гібрид цих акцепторів, і амінокислоти, які використовуються в різних позиціях в варіабельних областях гуманізованого легкого ланцюга і гуманізованого важкого ланцюга, можуть бути взяті з будь-яких використовуваних послідовностей акцепторного антитіла людини. Наприклад, варіабельні області зрілого важкого ланцюга людини, з ідентифікаційними номерами МСВІ - ВАСО2114 і ААХ82494.1 (5БЕО ІЮО МО: З їі 4), використовувалися в якості послідовностей акцептора для гуманізації варіабельної області зрілого важкого ланцюга 905. Приклади позицій, в яких ці два акцептора розрізняються, включають позиції НІ19 (К або К), Н40О (А або Т), Н44 (С або КЕ), Н4і9 (5 або А), Н77 (5 або Т),

НеВвг2а (М або 5), Не3 (БК або К), Н8В4 (А або 5) і НВО (М або М). Гуманізовані варіанти варіабельної області важкого ланцюга 905 можуть містити одну з двох таких амінокислот в будь-якій з цих позицій. Аналогічно, варіабельні області зрілого важкого ланцюга людини з ідентифікаційними номерами МСВІ - ААЮОЗ30410.1 ії ААХ82494.1 (5ЕО ІЮО МО: 63 ії 4 відповідно) використовували в якості послідовностей акцептора для гуманізації варіабельної області зрілого важкого ланцюга 14058. Приклади позицій, в яких ці два акцептора розрізняються, включають позиції Н8ва2а (М або 5), Н8ВЗ (ЕК або К), Н8ВА4 (А або 5) і НВО (М або М). Гуманізовані варіанти варіабельної області важкого ланцюга 14058 можуть містити одну з двох таких амінокислот в будь-якій з цих позицій. Аналогічно, варіабельні області зрілого легкого ланцюга

Зо людини з ідентифікаційними номерами МСВІ - АВА71374.1 і АВС66952.1 (5ЕО ІЮ МОБ: 72 і 73 відповідно) використовували в якості послідовностей акцептора для гуманізації варіабельної області зрілого легкого ланцюга 1408. Прикладом позиції, в якій ці два акцептора відрізняються, є позиція І 18 (5 або Р). Гуманізовані варіанти варіабельної області легкого ланцюга 14058 можуть містити одну з двох таких амінокислот в цій позиції. (00215) Можуть бути обрані певні амінокислоти із залишків в каркасі варіабельної області людини для заміни, виходячи з їх можливого впливу на конформацію СОР і/або зв'язування з антигеном. Дослідження таких можливих впливів полягає в моделюванні, вивченні характеристик амінокислот в певних місцях, або емпіричному спостереженні ефектів заміни або мутагенезу певних амінокислот. (00216) Наприклад, коли амінокислота відрізняться між каркасним залишком варіабельної області миші і обраним каркасним залишком варіабельної області людини, амінокислота в людському каркасі може бути заміщена еквівалентною каркасною амінокислотою з мишачого антитіла, якщо розумно очікувати, що амінокислота: 1) нековалентно прямо зв'язується з антигеном; 2) є суміжною з областю СОК або знаходиться всередині СОР, як визначено по Чотіа, але не по Кабату; 3) в іншому випадку взаємодіє з областю СОВ. (наприклад, знаходиться в межах близько 6 А області СОК) (наприклад, ідентифікується шляхом моделювання легкого або важкого ланцюга на вирішеній структурі гомологічного відомого ланцюга імуноглобуліну); або 4) представляє собою залишок, розміщений в інтерфейсі МІ -УН.

І00217| Амінокислотні залишки каркаса з класів 1) - 3), як визначено Оцееп, О5 5530101, іноді по черзі згадуються як канонічні і верніальні (мегпіег)у залишки. Амінокислотні залишки каркаса, які допомагають визначити конформацію петлі СОК, іноді згадуються як канонічні залишки (Споїйіа 8. І ез5кК, у). Мої. Віо!. 196:901-917 (1987); Тпогпіоп 8 Мапіп, 9. Мої. Віо!. 263:800- 815 (1996)). Амінокислотні залишки каркаса, які підтримують конформацію антигензв'язуючої петлі і відіграють певну роль в тонкій підгонці антитіла до антигена, іноді згадуються як верніальні залишки (мегпіег гезідцевз) (Бооїе 5 Уміпіег, У. Мої. Віо! 224:487-499 (1992)).

І00218)| Іншими залишками каркаса, які представляють собою кандидати на заміну, є залишки, які створюють потенційний сайт глікозилювання. Іншими кандидатами на заміщення є бо каркасні амінокислоти акцептора людини, які є незвичайними для імуноглобуліну людини в цьому положенні. Ці амінокислоти можуть бути замінені амінокислотами з еквівалентної позиції донорного антитіла миші, або з еквівалентних позицій більш типових людських імуноглобулінів.

І00219| Ілюстративні гуманізовані антитіла представляють собою гуманізовані форми мишачих антитіл 905 або 1408, позначених відповідно Ни905 або Ни1408. Антитіло 905 миші містить варіабельні області зрілого важкого і легкого ланцюгів, які мають амінокислотні послідовності, що включають 5ЕО І МО: 1 і 5ЕБО ІЮ МО: 16, відповідно. У винаході запропоновано вісім ілюстративних варіабельних областей гуманізованого зрілого важкого ланцюга: Ни905УНм!, Ни9О05УНми2, Ни905УНми2р, Ни9О5УНуЗз, Ни9О5УНуЗЬ, Ни9О5МУНма4,

Ни905УНма4Б ї Ни9О5МУНм5 (ЗЕО ІЮ МО: 5-12, відповідно). У винаході додатково запропоновано п'ять ілюстративних варіабельних областей зрілого легкого ланцюга людини: Ни9О5Мі м,

Ни9О5МІ м2, Ни905МІ м3, Ни90О5МІ м4 і Ни905МІ м5 (5ЕО ІС МО5: 19-23, відповідно). Фіг. 1 ілюструє вирівнювання 905, модельних антитіл миші, акцепторних антитіл людини і різних гуманізованих антитіл. (00220) Антитіло 1458 миші містить варіабельні області важкого і легкого зрілих ланцюгів, які мають амінокислотні послідовності, що включають 5ЕО ІЮ МО: 61 і 5БО ІЮ МО: 70 відповідно. У винаході запропоновано три ілюстративних варіабельних області гуманізованого зрілого важкого ланцюга: Ни1458МНм1, Ни14058УНм2 і Ни1458МНмуиз (5БО ІЮ МО: 64-66, відповідно). У винаході додатково запропоновано три ілюстративних варіабельних області зрілого легкого ланцюга людини: Ни148МІ мі, Ни148МІ м2 і Ни14О8МІ м3 (ЗЕО ІЮ МО: 74-76, відповідно). Фіг. 2 ілюструє вирівнювання 1408, модельних антитіл миші, акцепторних антитіл людини і різних гуманізованих антитіл.

І00221| З причин, таких як: можливий вплив на конформацію СОР і/або зв'язування з антигеном, опосередкування взаємодії між важкими і легкими ланцюгами, взаємодія з константної областю, є сайтом для бажаної чи небажаної посттрансляційної модифікації, є незвичайним залишком для своєї позиції в послідовності варіабельної області людини і, отже, потенційно імуногенний, підвищує потенціал до агрегування, та інших причин, наступні 15позицій в каркасі варіабельної області були розглянуті як кандидати на заміщення в восьми ілюстративних варіабельних областях зрілого важкого ланцюга Ни905, і в п'яти ілюстративних варіабельних областях зрілого легкого ланцюга Ни905, як зазначено далі в прикладах: Н4і2

Зо (с42Е), Н47 (МУ471), НбЗ (Іб9Е), НВ2 (М825), НВ2Ь (582(6)), НІ1О8 (1108), 18 (РВА), 19 (І ОР),

Ї718 (РІ1І85), 119 (А19М), 136 (УЗб6Р), 139 (К39К), 160 (0605), 170 (070А), і 174 (К74К).

Аналогічним чином, наступні 11 позицій каркаса варіабельної області розглядалися як кандидати на заміну в трьох ілюстративних варіабельних областях зрілого важкого ланцюга

Ни1408 і трьох ілюстративних варіабельних областях зрілого легкого ланцюга Ни1408, як

З5 додатково зазначено в прикладах: НІ (С1Е), НЗ (ОЗК), Н4і7 (УМА71), Н105 (01057), І 8 (РВА), 1 9 (ГОР), 119 (А19М), І 26 (М265), І 36 (УЗ6Р), І 60 (0605) і І 70 (070А). (00222) Тут, як і в інших місцях, перший згаданий залишок являє собою залишок гуманізованого антитіла, утвореного шляхом вставки СОК по Кабату або комбінованого СОК по

Чотіа-Кабату у випадку СОК-НІ, в каркас акцептора людини (наприклад, комбінований або гіоридний каркас акцептора людини), а другий згаданий залишок являє собою залишок, який розглядається як залишок, що заміняє такий залишок. Таким чином, в межах каркасів варіабельної області, перший згаданий залишок є людським, а в межах СОК, перший згаданий залишок є мишачим. (00223) Ілюстративні антитіла Ни9О5 включають будь-які перестановки або комбінації ілюстративних варіабельних областей важкого і легкого зрілих ланцюгів (наприклад, МНм1/Л/І м1 або НІІ1, МНм1///м2 або НІ1І12, МНмМ1/М/м3 або НІТІ3, МНмМ1//І м4 або НІ114, МНМ1/Мі м5 або

НІТІ5, МНУ2//м1 або Н2І1, МНуи2/МІ м2 або Н2І2, УНу2//Ім3 або Н2гІ 3, МНуи2/МІ м4 або НІ14,

МНм2//І м5 або Н2гІ 5, МНуи2Б6/М1мМ1 або Н2ЬІ 1, МНуи2Б/МИІ м2 або Н2рІ2, МНУ2Б//І 3 або Н2БІ З,

МНм2Б//Ім4 або Н2БІ 4, МНУу2Б/И/м5 або Н2БІ 5, МНУуЗ/// м або НЗІ1, МНуЗ/М м2 або НЗІ2,

МНУЗ/и//м3 або НЗІ 3, МНуУЗ///м4 або НЗІ4, МНУЗ///м5 або НЗІ5, МНУЗБ/М мі або НЗБІ1,

МНУЗБЛЛ м2 або НЗБІ 2, МНУЗБЛЛ уЗ або НЗБІ 3, МНУЗБЛЛ м4 або НЗБІ 4, МНУЗБЛ/І м5 або НЗБІ 5,

МНу4///м1 або Н4іІ1, МНу4///м2 або Н412, МНу4//Л/ УЗ або Н4іІ3, МНу4/Мі м4 або НАї14,

МНу4/МІ м5 або Н4І 5, МНм4р//Ім1 або Н4БІ 1, МНмуи4Б/Л/Ім2 або Н4іБбІ2, МНму4Б/М УЗ або НАУбІ З,

МНу4Б/Л/І м4 або Н4іБІ 4, УНмуи4р//І м5 або Н4іБІ 5, МНу5/М мі або Н5бІ 1, МНу5/Л/І м2 або Н5БІ2,

МНУ5БЛМ УЗ або Н5І 3, МНу5Л/І м4 або Н5І 4, ії МНуУ5/Л му5 або НІ 5). (00224) У винаході запропоновані варіанти гуманізованих антитіл 905, в яких варіабельна область гуманізованого зрілого важкого ланцюга показує щонайменше 9095, 9595, 9695, 97905, 9895 або 9995 ідентичності з гуманізованою Ни905УНм4Б (ЗЕО ІЮО МО: 11), і варіабельна область гуманізованого зрілого легкого ланцюга показує щонайменше 9095, 9595, 9695, 9795, 9895 або 60 9995 ідентичності з Ни9О5МІ мі! (ЗЕО ІЮ МО: 19). У деяких таких антитілах зберігаються щонайменше 1, 2 або всі З зворотні мутації або інші мутації в Ни905 НАБІ 1. У винаході також запропоновані варіанти інших ілюстративних гуманізованих антитіл 905. Такі варіанти мають варіабельні області легкого і важкого зрілих ланцюгів, які показують щонайменше 9095, 9595, 9695, 9795, 9895 або 9995 ідентичності послідовностей з варіабельними областями легкого і важкого зрілих ланцюгів ілюстративних гуманізованих антитіл 905 НІ11, НІТ12, НІ13, НІ1 4,

НІ15, Н2І 1, Н2гІ2, Н2І3, Н2І 4, Н2гІ 5, Н2БІ 1, Н2БІ2, Н2БІ 3, Н2БІ 4, Н2БІ 5, НЗІ 1, НЗІ 2, НЗІ З,

НЗГ 4, НЗІ 5, НЗБІ 1, НЬЗІ 2, НЗБІ З, НЬЗІ 4, НЗБІ 5, НА 1, Н41І2, НА 3, НА 4, НА 5, НЯбІ 1, НабІ2,

Н4ібБі 3, Н4бБІ 4, Н4БІ 5, Н5БІ 1, Н5БІ 2, НІ З, Н5І 4 або Н5БІ 5. (00225) У деяких антитілах щонайменше одна з позицій Н42, Н4і7, Нбе, Н8г2, Н8В2Б і НІ1О8 в області Ми зайнята Е, Ї, РЕ, 5, Ї і Ї, відповідно. У деяких антитілах позиції Н47, НбЯ і Н82 в області Ми зайняті відповідно Ї, Е і 5, як в Ни9О5МНМ1. У деяких антитілах позиції Н47, Нбе,

Н8В2 ї НВ26 в області Мп зайняті відповідно І, Е, З і Її, як в Ни9О5МНУ2. У деяких антитілах позиції Н42, Н47 і НІ108 в області МА зайняті Е, І і Г відповідно, як в Ни90О5МНм2б. У деяких антитілах позиції Нб9, Н8В2, і Н8В2Б5 в області МА зайняті відповідно РЕ, 5 і Ї, як в НиИЗО5МНУЗ. У деяких антитілах позиції ЩН47 і НІО8 в області Ми кожна зайнята Ї, як в Ни90О5МУНУЗЬ і

Ни9О5МПпма4р. У деяких антитілах позиції Н82, і Н8В2БЬ в області МА зайняті відповідно З ії, як в

Ни9О5УНума. У деяких антитілах позиції Н42, Н4А7 і Н8В2Б в області МЕП зайняті Е, Г. і Ї. відповідно, як в НиЗО5МУНУм»5. У деяких антитілах щонайменше одна з позицій! 8,19,118,119,136,139,1 60,

Ї70 ї І74 в області МУК зайнята А, Р, 5, М, Е, Е, 5, А, і К, відповідно. У деяких антитілах позиція

Ї36 в області МК зайнята Е, як в Ни9О5МІ м1. У деяких антитілах позиція 60 в області МК зайнята 5, як в Ни9О5МІ м3. У деяких антитілах позиції /8,19,119,136,139,160,170 11174 в області МУК зайняті А, Р, М, Е, ЕК, 5, А і К відповідно, як в Ни9О5Мі м4. У деяких антитілах позиції

ЇІ8,19,118,119,136,1 39,1 60, 1 70 і І 74 в області МК зайняті А, Р, 5, М, Е, К, 5, А і КЕ відповідно, як в Ни9О5МІ м5. Області СОЕК таких гуманізованих антитіл можуть бути ідентичними або майже повністю ідентичними областям СОК мишачого донорного антитіла 905 або будь-якого з вищевказаних гуманізованих антитіл 905. Області СОК можуть бути визначені відповідно до будь-якої загальноприйнятої домовленості (наприклад, по Чотіа, або комбіновано по Чотіа і

Кабату), але бажано, як визначено по Кабату. (00226) Каркасні позиції варіабельних областей відповідають нумерації Кабата, якщо не вказано інше. Інші такі варіанти зазвичай відрізняються від послідовностей ілюстративних важкого і легкого ланцюгів Ни905 невеликим числом (наприклад, зазвичай не більше 1, 2, 3, 5, 10 або 15) замін, делецій або інсерцій. Такі відмінності зазвичай припадають на каркас, але можуть також зустрічатися в СОК. (00227| Ілюстративні антитіла Ни14058 включають будь-які перестановки або комбінації ілюстративних варіабельних областей важкого і легкого зрілих ланцюгів (наприклад, УНм1//І мі або НІІ1, МНм1//ЛІ/м2 або НІ112, МНМ1//Л/м3 або НІІЗ3, МНми2//Л/.мМ1 або Н2гІ1, МНуи2///м2 або

НгІ2, МНу2/Л м3 або Н2І 3, МНУЗЛЛ/І м! або НЗІ1, МНуЗ/М ма2 або НЗІ2, і МНуЗ//Л уз або НЗІ 3). 00228) У винаході запропоновані варіанти гуманізованих антитіл 1408, в яких варіабельна область гуманізованого зрілого важкого ланцюга показує щонайменше 9095, 9595, 9695, 9790, 9895 або 9995 ідентичності з Ни14о8УНм2 (Ни1408 Н2) (ЗЕО ІО МО: 65), і варіабельна область гуманізованого зрілого легкого ланцюга показує щонайменше 9095, 9595, 9695, 9795, 9895 або 9995 ідентичності з Ни1408МІм3 (Ни1408 13) (5БО ІО МО: 76). У деяких таких антитілах зберігаються щонайменше 1, 2, 3, 4 або всі 5 зворотних мутацій або інших мутацій в Ни1458

Н2гІ3. У винаході також запропоновані варіанти інших ілюстративних гуманізованих антитіл 1408. Такі варіанти мають варіабельні області легкого і важкого зрілих ланцюгів, які показують щонайменше 9095, 95905, 9695, 9795, 9895 або 9995 ідентичності послідовностей з варіабельними областями легкого і важкого зрілих ланцюгів ілюстративних гуманізованих антитіл 14058 НІ111,

НІТІ2, НІ1І-3, Н2І1, Н2гІ2, Н2І3, НІГ 1, НЗІ2, або НЗІ З. 002291) У деяких антитілах щонайменше одна з позицій НІ, і Н4-7 в області Ми зайнята єЄ ії, відповідно. У деяких антитілах позиції Ні і Н4-7 в області Ми зайняті Е і І відповідно, як в

Ни1428УНм2 і Ни14058УНмУу3. У деяких антитілах щонайменше одна з позицій НЗ і НІ105 в області Ми зайнята відповідно К і Т. У деяких антитілах позиції НЗ і НІ105 в області МА зайняті відповідно К і Т, як в Ни1458МУНМ!І. У деяких антитілах позиція І 36 в області МК зайнята РЕ, як в

Ни1408М| М2. У деяких антитілах щонайменше одна з позицій 18,19,119,126,16011170 в області УК зайнята відповідно А, Р, М, 5, 5 і А. У деяких антитілах позиції І 8,19,1191170 в області МК зайняті відповідно А, Р, М і А, як в Ни148МІ мі. У деяких антитілах позиції / 261160 в області МК зайняті 5, як в Ни14О8МІ м3. Області СОК таких гуманізованих антитіл можуть бути ідентичними або майже повністю ідентичними областям СОК мишачого донорного антитіла 14058. Області СОМК можуть бути визначені відповідно до будь-якої загальноприйнятої 60 домовленості (наприклад, по Чотіа, або комбіновано по Чотіа і Кабату), але бажано, як визначено по Кабату. 002301 Каркасні позиції варіабельних областей відповідають нумерації Кабата, якщо не вказано інше. Інші такі варіанти зазвичай відрізняються від послідовностей ілюстративних важкого і легкого ланцюгів Ни14058 невеликим числом (наприклад, зазвичай не більше 1, 2, 3, 5, або 15) замін, делецій або інсерцій. Такі відмінності зазвичай припадають на каркас, але можуть також зустрічатися в СОК.

І00231| Можливістю для додаткових варіацій в гуманізованих варіантах 905 або 14058 є додаткові зворотні мутації в каркасах варіабельної області. Багато із залишків каркаса, які не контактують з СОК в гуманізованому тАбр, можуть вміщати заміни амінокислот з відповідних 10 позицій донорного тАб миші, або інших антитіл миші або людини, і навіть багато потенційних контактних залишків в СОК також піддаються заміні. Навіть амінокислоти в СОК можуть бути замінені, наприклад, на залишки, виявлені у відповідній позиції послідовності акцептора людини, яка використовується для надання каркасів варіабельної області. Крім того, альтернативні послідовності акцептора людини можуть бути використані, наприклад, для важкого і/або легкого ланцюгів. Якщо застосовуються різні акцепторні послідовності, одна або кілька рекомендованих вище зворотних мутацій можуть не виконуватися, оскільки відповідні донорні і акцепторні залишки вже є однаковими без зворотних мутацій.

І00232| Бажано заміни або зворотні мутації в гуманізованих варіантах 905 або 14058 (незалежно від того, консервативні вони чи ні) не здійснюють істотного впливу на афінність зв'язування або активність гуманізованого тАБб, тобто його здатність зв'язуватися з мономерним

ТТЕ (наприклад, активність в деяких або всіх аналізах, які описані в справжніх прикладах, варіанта гуманізованого антитіла 905 або 1408, є по суті, такою ж, тобто в межах експериментальної похибки, як і у антитіла 905 або 1458 миші). р. Химерні і венировані антитіла

І00233| У винаході додатково запропоновані химерні і венировані форми нелюдських антитіл, зокрема антитіла 905 або 1408 прикладів. 00234) Химерне антитіло являє собою антитіло, в якому варіабельні області легких і важких зрілих ланцюгів нелюдського антитіла (наприклад, миші), об'єднані з константними областями легкого і важкого ланцюгів людини. Такі антитіла майже повністю або повністю зберігають специфічність зв'язування мишачого антитіла, і складають близько двох третин людської послідовності. 00235) Венироване антитіло є типом гуманізованого антитіла, яке зберігає деякі і, як правило, всі СОМ, і деякі залишки каркаса нелюдської варіабельної області нелюдського антитіла, але в якому заміняють інші каркасні залишки варіабельної області, які можуть робити внесок у В- або Т-клітинні епітопи, наприклад, експоновані залишки (Радіап, Мої. Іттипої. 28: 489, 1991) на залишки з відповідних позицій послідовності людського антитіла. Результатом є антитіло, в якому СОК взяті повністю або майже повністю з нелюдського антитіла, і каркаси варіабельної області нелюдського антитіла роблять більш подібними таким людини за допомогою замін. Венировані форми антитіл 905 або 1408 включені у винахід.

Е. Антитіла людини

І00236| Людські антитіла до мономерного ТТК або його фрагменту (наприклад, амінокислотним залишкам 89-97 (ЗЕО ІЮО МО: 113) білка ТТК) виготовляють за допомогою різних методів, описаних нижче. Деякі антитіла людини вибирають за допомогою експериментів з конкурентного зв'язування, за допомогою способу Вінтера - фагового дисплея, описаного вище, або іншим чином, щоб отримати антитіло з такою ж специфічністю до епітопів, як і в конкретному антитілі миші, такому як одне з моноклональних антитіл миші, які описані прикладах. Також для людських антитіл може бути проведено скринінг на специфічність до певного епітопу, використовуючи лише фрагмент ТТЕ, такий як варіант ТТЕ, який містить лише амінокислотні залишки 89-97 ТТЕ, в якості цільового антигена, і/або скринінг антитіл проти набору варіантів ТТЕ, таких як варіанти ТТЕ, які містять різні мутації в амінокислотних залишках 89-97 ТТ.

І00237| Способи отримання людських антитіл включають: спосіб тріоми Оевхірегд еї аї.,

Нубгідота 2:361-367 (1983); Оезірего, патент США Мо 4634664; і Епдієтап єї аї., патент США Мо 4634666, використання трансгенної миші, яка містить гени імуноглобулінів людини (див., наприклад, ІГопрега еї аї., МУ093/12227 (1993); 05 5877397; 005 5874299; 5 5814318; 05 5789650; 0055770429; 05 5661016; 05 5633425; 5 5625126; 05 5569825; ОБ 5545806;

Мешбегаоег, Маї. Віоїесппо!ї. 14: 826 (1996); і КиспепараїЇ, УУО 91/10741 (1991)) та способи фагового дисплея (див. наприклад Юомег єї аї!., МО 91/17271; МсСанепу єї а!І., МО 92/01047; 005 5877218; 005 5871907; 5 5858657; 05 5837242; 005 5733743; і 5 5565332). 60 Е. Вибір константної області

00238) Варіабельні області важкого і легкого ланцюгів химерних, венированих або гуманізованих антитіл можуть бути з'єднані, щонайменше, з частиною константної області антитіла людини. Вибір константної області залежить від бажаного ефекту будь-то антитілозалежна клітинно-опосередкована цитотоксичність (АЗКЦ), антитілозалежний клітинний фагоцитоз і/або залежна від комплементу цитотоксичність. Наприклад, ізотипи ІДС1 і Ідсз людини можуть викликати залежну від комплементу цитотоксичність, а ізотипи Ідс2 і Ідс4 людини - не можуть. ЇдО1 і (953 людини також індукують сильніші клітинно-опосередковані ефекторні функції, ніж Ідс2 і (3054 людини. Константними областями легкого ланцюга можуть бути лямбда або каппа.

І0О0239| Одна або декілька амінокислот на аміно- або карбоксикінці легкого і/або важкого ланцюга, така як С-кінцевий лізин важкого ланцюга, може бути відсутньою, або може утворювати похідне в пропорції, або бути у всіх молекулах. Заміни можуть бути зроблені в константних областях для зниження або посилення ефекторної функції, такої як комплемент- опосередкована цитотоксичність або АЗКЦ (див., наприклад, УмМіпіег єї аЇ., патент США Мо 5624821, Т5о вї аІ., патент США Мо 5834597 та І агаг єї аї!., Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 103: 4005, 2006), або для збільшення періоду напіввиведення в людині (див., наприклад, Ніпіоп 6ї аї.,.

ВіоІ. Спет. 279: 6213, 2004). Типові заміни включають сСіп в позиції 250 і/або І еи у позиції 428 (нумерація ЄС використовується в цьому параграфі для константної області) для збільшення періоду напіввиведення антитіла. Заміни в будь-якій або у всіх позиціях 234, 235, 236 і/або 237 зменшують спорідненість до рецепторів Есу, зокрема рецептора ЕсукКіІ (див., наприклад, 05 6624821). Може бути використана аланінова заміна в позиціях 234, 235 і 237 людського ІдДС1 для зниження ефекторних функцій. Деякі антитіла мають заміни на аланін в позиціях 234, 235 і 237 Ід01 людини для зниження ефекторних функцій. Необов'язково, амінокислоти в позиціях 234, 236 і/або 237 в ІдД02 людини замінені на аланін, а в позиції 235 - на глутамін (див., наприклад, 05 5624821). У деяких антитілах використовується мутація в одній або декількох позиціях 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329 і 331 за нумерацією ЄС Ід1 людини. У деяких антитілах використовується мутація в одній або декількох позиціях 318, 320 і 322 за нумерацією

ЄС Ідс1 людини. У деяких антитілах в позиціях 234 і/або 235 амінокислота заміщена аланіном, іабо в позиції 329 заміщена гліцином. У деяких антитілах, в позиціях 234 і 235 амінокислоти

Ко) заміщені на аланін, наприклад, в ХЕО ІЮ МО: 102. У деяких антитілах, ізотипом є Ідс2 або Ідс4 людини. (00240) Ілюстративна константна область каппа-легкого ланцюга людини має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 104. М-кінцевий аргінін ЗЕО ІЮО МО: 104 може бути опущений, і в цьому випадку константна область каппа-легкого ланцюга має амінокислотну послідовність ЗЕО

ІО МО: 105. Ілюстративна константна область важкого ланцюга ІдДО1 людини має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 101 (з або без С-кінцевого лізину). Антитіла можуть бути експресовані у вигляді тетрамерів, які містять два легких і два важких ланцюги, у вигляді окремих важких ланцюгів, легких ланцюгів, у вигляді Бар, Рар', Е(ар)2 і Ем, або у вигляді одноланцюгових антитіл, в яких зрілі варіабельні домени важкого і легкого ланцюгів сполучені спейсером. (00241) Константні області антитіла людини показують аллотипічну варіацію і ізоаллотипічну варіацію у різних індивідів, тобто константні області можуть відрізнятися у різних людей в одній або більше поліморфних позиціях. Ізоаллотипи відрізняються від аллотипів тим, що сироватки, які розпізнають ізоаллотип, зв'язуються з неполіморфною областю одного або декількох інших ізотипів. Так, наприклад, інша константна область важкого ланцюга відноситься до аллотипу

С1т3 ІДС і має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮО МО: 103. Інша константна область важкого ланцюга аллотипу С1т3 ІдС1 має амінокислотну послідовність «ЕС ІЮ МО: 102 (з або без С- кінцевого лізину). Відсилання до константної області антитіла людини включає константну область з будь-яким природним аллотипом або будь-якою перестановкою залишків, які займають позиції в природних аллотипах. б. Експресія рекомбінантних антитіл

І00242| Відомий ряд способів продукування химерних і гуманізованих антитіл з використанням клітинної лінії, яка експресує антитіла (наприклад, гібридоми). Наприклад, імуноглобулінові варіабельні області антитіл можуть бути клоновані і секвеновані з використанням добре відомих способів. В одному способі, варіабельну область МН важкого ланцюга клонують за допомогою КТ-РСЕ, з використанням мРНК, отриманої з клітин гібридоми.

Консенсусні праймери застосовують до лідерного пептиду МН-області, охоплюючи кодон ініціації трансляції за допомогою 5'-праймера, і константні області д25 за допомогою 3'- праймера. Ілюстративні праймери описані в публікації патента США 2005/0009150 Шенком і співавторами (далі «Шенк»). Послідовності з декількох незалежно отриманих клонів можна бо порівняти для того, щоб гарантувати, що під час ампліфікації не будуть внесені зміни.

Послідовність області МН також може бути визначена або підтверджена шляхом секвенування фрагмента МН, отриманого за допомогою 5-ВАСЕ ВТ-РСВ-методики і 3'-д2б-специфічного праймера. (00243) Аналогічним чином можна клонувати варіабельну область МІ легкого ланцюга. В одному підході, набір консенсусних праймерів призначений для ампліфікації областей МІ використовуючи 5'-праймер, спроектований для гібридизації з областю Мі, яка включає кодон ініціації трансляції, і використовуючи 3'-праймер, специфічний до області СК нижче від МУ-/ об'єднуючої області. В іншому підході, використовується 5КАСЕ КТ-РСК методика для клонування кодуючої МІ кДНК. Ілюстративні праймери описані в Шенк, див. вище. Згодом клоновані послідовності об'єднують з послідовностями, які кодують константні області людини (або інших нелюдських видів). ілюстративні послідовності, які кодують константні області антитіла людини, включають 5ЕО ІЮ МО: 106, яка кодує константну область (ДС1 людини (ЗЕО

ІЮО МО: 103) ії 5ЕО ІО МО: 107 і 108, які кодують константні області каппа-легкого ланцюга людини (ЗЕО ІЮ МО: 104 і 105 відповідно). (00244) В одному з підходів, варіабельні області важкого і легкого ланцюгів реконструюють для того, щоб вони кодували з'єднані донорні послідовності після відповідних з'єднань МО) або

МУ, і клонують у вектор для експресії в клітинах ссавців, такий як рРСММУ-пуї! для важкого ланцюга, і рРСМУ-Мсі для легкого ланцюга. Ці вектори кодують константні області у! і СК людини як екзонні фрагменти після вставленої касети з варіабельною областю. Після перевірки послідовності, вектори експресії з важким ланцюгом і легеим ланцюгом можуть бути спільно трансфіковані в клітини СНО для того, щоб продукувати химерні антитіла. Середовище, частково використане клітинами, збирають через 48 годин після трансфекції і аналізують

Вестерн-блот-аналізом на продукування антитіл, або ЕГІ5А на зв'язування антигену. Химерні антитіла гуманізовані, як описано вище. (00245) Химерні, венировані, гуманізовані і людські антитіла зазвичай продукують за допомогою рекомбінантної експресії. Рекомбінантні полінуклеотидні конструкції зазвичай містять послідовність контролю експресії, функціонально зв'язану з послідовностями, які кодують ланцюги антитіла, включаючи природні або гетерологічні елементи контролю експресії, такі як промотор. Послідовності контролю експресії можуть бути промоторними системами у

Зо векторах, здатних трансформувати або трансфікувати еукаріотичні або прокаріотичні клітини- господарі. Одразу як вектор був поміщений у відповідного господаря, господаря підтримують в умовах, які є підходящими для експресії нуклеотидних послідовностей на високому рівні, і збору, і очищення перехресно-реактивних антитіл. (00246) Ці вектори експресії зазвичай реплікуються в організмах-господарях або у вигляді епісом, або як невід'ємна частина хромосомної ДНК господаря. Зазвичай вектори експресії містять маркери селекції, наприклад, резистентність до ампіциліну або стійкість до гігроміціну для того, щоб можна було виявити ті клітини, які були трансформовані бажаними послідовностями ДНК. (00247 Е. соїї є одним прокаріотичним господаром, корисним для експресії антитіл, зокрема фрагментів антитіл. Мікроби, такі як дріжджі, також корисні для експресії. Засспаготусев5 є дріжджовим господарем з відповідними векторами, які мають послідовності контролю експресії, точку початку реплікації, послідовності термінації транскрипції тощо за бажанням. Типові промотори включають З3-фосфогліцераткіназу та інші гліколітичні ферменти. Індуцибельні дріжджові промотори включають, серед інших, промотори з алкогольдегідрогенази, ізоцитохрома С і ферментів, відповідальних за використання мальтози і галактози. 00248) Клітини ссавців можуть бути використані для експресії нуклеотидних сегментів, які кодують імуноглобуліни або їх фрагменти. Див. М/УіппасКег, Егот Сепе5 їо Сіопев, (МОН

Рибіїзпегв, Нью-Йорк, 1987). Був створений ряд відповідних ліній клітин-господарів, здатних секретувати інтактні гетерологічні білки, і вони включають клітинні лінії СНО, різні клітинні лінії

СО5, клітини НегГа, клітини НЕК293, І -клітини і клітини мієломи, які не продукують антитіла, включаючи 5раг/0 і М50. Клітини можуть бути нелюдськими. Експресуючі вектори для цих клітин можуть містити послідовності контролю експресії, такі як точку початку реплікації, промотор, енхансер (Оцееєп евї аї., Іттипої!. Вем. 89:49 (1986)) та необхідні сайти обробки інформації, такі як сайти зв'язування рибосом, сайти сплайсингу РНК, сайти поліаденілювання, і послідовності які термінують транскрипцію. Послідовності, які контролюють експресію, можуть включати промотори, отримані з: ендогенних генів, цитомегаловірусу, 5М40, аденовірусу, бичачого папіломавірусу і тому подібних. Дивіться Со вї аї., У. Іттипої. 148:1149 (1992).

І00249| Альтернативно, послідовності, які кодують антитіла, можуть бути внесені в трансгени для введення в геном трансгенної тварини і наступної експресії в молоці трансгенної тварини 60 (див., наприклад, патент США Мо 5741957; США Мо 5304489; ії США Мо 5849992). Відповідні трансгени містять кодуючі послідовності легких і/або важких ланцюгів, функціонально зв'язані з промотором і енхансером зі специфічного гена молочної залози, такого як казеїн або бета- лактоглобулін. (00250) Вектори, які містять сегменти ДНК інтересу, можуть бути перенесені в клітину- господаря способами, які залежать від типу клітинного господаря. Наприклад, трансфекція за допомогою хлориду кальцію зазвичай використовується для прокаріотичних клітин, тоді як обробка фосфатом кальцію, електропорація, ліпофекція, біолістіка або трансфекція на основі вірусів можуть застосовуватися до інших клітинних господарів. Інші способи, які використовуються для трансформації клітин ссавців, включають використання полібрена, злиття протопластів, ліпосоми, електропорації і мікроін'єкції. Для отримання трансгенних тварин, трансгени можуть бути внесені мікроін'єкцією в запліднені ооцити, або можуть бути внесені в геном ембріональних стовбурових клітин, а ядра таких клітин перенесені в позбавлені від ядер ооцити.

І00251| Після введення векторас(с-ів), який кодує важкі і легкі ланцюги антитіла, в культуру клітин, клітинні пули можна перевірити на зростання продуктивності і якість продукту в безсироватковому середовищі. Топ-продукуючі пули клітин потім можуть бути піддані поклітинному клонуванню на основі БАСЗ для створення моноклональних ліній. Можуть використовуватися специфічні врожайності вище 50 пг або 100 пг на клітину в день, які відповідають титрам продукту більше 7,5 г на л культури. Антитіла, продуковані клонами однієї клітини, також можуть бути протестовані на мутність, фільтраційні властивості, можуть бути проведені РАСЕ, ІЕБ, УФ сканування, НР-5ЕС, картування вуглеводів-олігосахаридів, мас- спектрометрія та аналіз зв'язування, такий як ЕГІЗА або Віасоге. Обраний клон згодом може бути перенесений в кілька флаконів і збережений в замороженому вигляді для подальшого використання. (002521 Після експресії, антитіла можуть бути очищені відповідно до стандартних процедур в даній області технікию, включаючи захоплення білком А, очищення ВЕРХ, колонкову хроматографію, гель-електрофорез, тощо (див., в цілому, Зсорев5, Ргоївеіп Ригіїсайоп (Зргіпдег-

Мепад, Нью-Йорк, 1982).

І00253| Може бути використана методика комерційного виробництва антитіл, включаючи

Зо оптимізацію кодонів, підбір промоторів, вибір елементів транскрипції, вибір термінаторів, клонування з однієї клітини без сироватки, створення стоку клітин, використання маркерів відбору для ампліфікації кількості копій, термінатора СНО, або поліпшення титрів білка (див., наприклад, И5 5786464, И5 6114148, 5 6063598, 05 7569339, У02004/050884,

УМОо2008/012142, УМО2008/012442, УМО2005/019442, УМО2008/107388, УМО2009/027471 ії 5 5888809).

Н. Скринінгові дослідження антитіла

І00254| Антитіла можуть піддаватися декільком дослідженням, включаючи дослідження зв'язування, дослідження функціональності, дослідження на тваринах моделях захворювань, пов'язаних з відкладеннями ТТК, і клінічні випробування. Дослідження зв'язування тестують специфічне зв'язування і, необов'язково, аффінність і специфічність до епітопів, з мономерним

ТТК або його фрагментом. Наприклад, в аналізах зв'язування можуть піддавати скринінгу антитіла, які зв'язуються з амінокислотними залишками 89-97 (5ЕО ІЮ МО: 113) ТТЕ, які є епітопом, що занурений в нативному тетрамері ТТК, і є експонованим в мономерній, неправильно згорнутій, агрегованій або фібрильній формах ТТЕ. Антитіла також можуть бути піддані скринінгу на здатність зв'язувати пре-фібрилярні, ненативні конформації ТТЕ і амілоїдні фібрили ТТЕК, але не нативні конформації ТТ. Наприклад, антитіла можуть бути піддані скринінгу на здатність зв'язуватися з мономерними формами ТТК, створеними шляхом дисоціації або дезагрегації нативного тетрамерного ТТК, і можуть бути в той же час піддані скринінгу проти нативного тетрамерного ТТЕ, як описано в прикладах, або іншим чином.

Аналогічно, антитіла також можуть бути піддані скринінгу на їх імунореактивність до тканини, схильної до ТТК-опосередкованого амілоїдозу, але не до здорової тканини. Такі дослідження іноді проводять разом конкурентним ілюстративним антитілом, таким як антитіло, яке має варіабельні області 905 або 14058 (ізотип каппа Ідс1). Необов'язково, в такому аналізі іммобілізують або антитіло, або ТТЕ-мішень.

І00255| Дослідження функціональності можуть бути виконані в клітинних моделях, включаючи клітини, які природно експресують ТТЕК, або клітини трансфіковані ДНК, що кодує

ТТЕ або його фрагмент. Відповідні клітини включають клітини, отримані з серцевої тканини або інших тканин, уражених ТТЕ амілоїдогенезом. Клітини можуть бути піддані скринінгу на знижені рівні мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм ТТК (наприклад, бо шляхом Вестерн-блоттингу, або шляхом іммунопреципітації клітинних екстрактів або супернатантів) або на знижену токсичність, приписувану мономерній, неправильно згорнутій, агрегованій або фібрильній формам ТТЕ. Наприклад, антитіла можуть бути протестовані на здатність пригнічувати або зменшувати агрегацію ТТЕ, пригнічувати або зменшувати утворення фібрил ТТК, зменшувати відкладення ТТЕ, видаляти агрегований ТІК або стабілізувати нетоксичні конформації ТТ. (00256) Можуть бути виконані в розчині інші функціональні аналізи, такі як перевірка того, чи здатне антитіло порушувати або зменшувати утворення фібрил ТТЕ, коли мономерний ТТК або проміжні форми неправильно згорнутого ТТК в розчині контактують з антитілом. Ступінь утворення фібрил може бути досліджений вимірами каламутності, наприклад, при 400 нм на

УФ -детектуючому спектрометрі, який оснащений блоком управління температурою. Також може бути використаний тіофлавін-Т для оцінки ступеня формування амілоїдних фібрил. Наприклад, п'ятикратний молярний надлишок тіофлавіна-Т можна додати до зразків ТТЕК і залишити їх при кімнатній температурі на 30 хвилин перед проведенням вимірювань. Флюоресценцію тіофлавіна-Т можна спостерігати за допомогою спектрофлуориметра. Дивіться 5 2014/0056904.

І00257| Дослідження із застосуванням тваринних моделей тестують спроможність антитіла до терапевтичного або профілактичного лікування ознак або симптомів на тваринній моделі, яка моделює хворобу людини, пов'язану з накопиченням ТТК або відкладеннями ТТ. До таких захворювань належать типи ТТЕК амілоїдозу, такі як старечий системний амілоїдоз (55А - 5епі!є зузіетіс атуїіоідовзі5), старечий серцевий амілоїдоз (СА - зепіїе сагаїас аптуїоідовів), сімейна амілоїдна поліневропатія (БАР - Татіїйа! атуоідй роїупеигораїйу), сімейна амілоїдна кардіоміопатія (БАС - Татіїйа! атуїоїй сагаітуораїйу) і селективний амілоїдоз центральної нервової системи (СМ5А - сепіга! пегуои5 зузіет 5еїІесіїме атуїіоідовзі5). Відповідними ознаками або симптомами, які можна спостерігати, є присутність і кількість амілоїдних відкладень в різних тканинах, таких як шлунково-кишковий тракт або серце. Ступінь зниження кількості амілоїдних відкладень можна визначити порівнянням з відповідним контролем, таким як рівень відкладень

ТТК амілоїду у контрольних тварин, які отримали контрольне антитіло (наприклад, контрольне антитіло з підібраним ізотипом), плацебо або зовсім не отримували лікування. Ілюстративна тваринна модель для тестування активності проти ТТ амілоїдозу являє собою мишачу

Зо модель, яка несе нуль-мутацію в ендогенному локусі Тіг миші і людський мутантний ген ТК, який містить мутацію МЗОМ, яка пов'язана з сімейною амілоїдною поліневропатією. Дивіться, наприклад, Конпо єї аї., Ат. У. Рай. 150(4):1497-1508 (1997); Сагдозо апа Загаїма, ЕАБЗЕВ У 29(2):234-239 (2006). Також існують подібні моделі, які включають інші моделі сімейних варіантів

ТТА амілоїдозу і моделі для спорадичних варіантів ТТА амілоїдозу. Див., наприклад, Тепо еї аї.,

І аб. Іпмеві. 81(3): 385-396 (2001); Мо апа Маєда, Моизе Моде!5 ої Ткгапзіпугеїп Атуїоідовів, іп

Весепі Адуапсез іп Тгапвіпугеїйп ЕмоіЇшіоп, бігисішиге, апа Віоіодіса! Гипсійопв, рр. 261-280 (2009) (Зргіпдег Вепіп Неїдеїрега). Трансгенні тварини можуть містити людський трансген ТТЕ, такий як трансген ТТК з мутацією, асоційованою з ТТЕ амілоїдозом, або трансгени ТТЕ дикого типу. Для того, щоб полегшити тестування на тваринних моделях, можна використовувати химерні антитіла, які мають константну область, яка підходить для тваринної моделі (наприклад, химерні антитіла миша-щур можна використовувати для тестування антитіл на щурах). Можна зробити висновок, що гуманізована версія антитіла буде ефективною, якщо відповідне антитіло миші або химерне антитіло буде ефективним у відповідній тваринній моделі, і гуманізоване антитіло має подібну афінність зв'язування (наприклад, в межах експериментальної похибки, наприклад, при коефіцієнті 1,5, 2 або 3). 00258) Клінічні випробування досліджують безпеку і ефективність для людини, яка має захворювання, яке пов'язане з ТТК амілоїдозом.

Ї. Нуклеїнові кислоти

І00259| У винаході додатково запропоновані нуклеїнові кислоти, які кодують будь-який з важких і легких ланцюгів, описаних вище (наприклад, ЗЕО ІЮО МО: 40, 42, 44-56, 87, 89, 91-96 і 106-108). Необов'язково, такі нуклеїнові кислоти додатково кодують сигнальний пептид і можуть бути експресовані з сигнальним пептидом, сполученим з константної областю (наприклад, сигнальні пептиди, які мають амінокислотні послідовності зБЕО ІЮО МО: 41 і 88 (важкий ланцюг) і 43 і 90 (легкий ланцюг), які можуть кодуватися відповідно 5ЕО ІЮ МОБ: 40 і 87 (важкий ланцюг) і відповідно 42 і 89 (легкий ланцюг). Кодуючі нуклеотидні послідовності можуть бути функціонально зв'язані з регуляторними послідовностями для забезпечення експресії кодуючих послідовностей, такими як промотор, енхансер, сайт зв'язування рибосом, сигнал термінації транскрипції тощо. Нуклеїнові кислоти, які кодують важкі і легкі ланцюги, можуть бути у виділеній формі або можуть бути клоновані в один або кілька векторів. Нуклеїнові кислоти бо можуть бути синтезовані, наприклад, шляхом твердофазного синтезу або ПЛР з олігонуклеотидами які перекриваються. Нуклеїнові кислоти, які кодують важкі і легкі ланцюги, можуть бути з'єднані у вигляді однієї суцільної нуклеїнової кислоти, наприклад, всередині вектора експресії або можуть бути роздільними, наприклад, кожна клонована в свій власний вектор експресії.

У). Кон'юговані антитіла (00260) Кон'юговані антитіла, які специфічно зв'язуються з антигенами, експонованими в патогенних формах ТТЕ, але не в нативних тетрамерних формах ТТЕ, такими як амінокислотні залишки 89-97 (5ЕБО ІЮ МО: 113) ТТК, корисні для: виявлення присутності мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм ТТК; спостереження і оцінки ефективності терапевтичних засобів, які використовуються для лікування пацієнтів з діагнозом

ТТЕ амілоїдоз; інгібування або зниження агрегації ТТЕ; інгібування або зменшення формування фібрил ТТЕК; зменшення кількості або видалення відкладень ТТЕК; стабілізації нетоксичних конформацій ТТЕК; або лікування або здійснення профілактики ТТК амілоїдозу у пацієнта.

Наприклад, такі антитіла можуть бути кон'юговані з іншими терапевтичними фрагментами, іншими білками, іншими антитілами і/або мітками, які можна виявити. Дивіться М/УО 03/057838; 5 8455622.

І00261| Кон'югованими терапевтичними фрагментами можуть бути будь-які речовини, які можуть бути використані для лікування, боротьби, поліпшення, запобігання або поліпшення небажаного стану або перебігу захворювання у пацієнта, наприклад, ТТК амілоїдозу.

Терапевтичні речовини можуть включати, наприклад, імуномодулятори або будь-які біологічно активні речовини, які стимулюють або посилюють активність антитіла. Імуномодулятором може бути будь-яка речовина, яка стимулює або пригнічує розвиток або підтримку імунологічної відповіді. Якщо такі терапевтичні фрагменти з'єднані з антитілом, специфічним до мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм ТТК, таким як описані в цьому документі антитіла, то приєднані терапевтичні фрагменти матимуть специфічну афінність до чужорідних патогенних форм ТТЕ в порівнянні з нативними тетрамерними формами ТТЕК. Отже, введення кон'югованих антитіл безпосередньо впливає на тканини, які містять патогенні форми

ТТЕ, з мінімальним пошкодженням навколишньої нормальної здорової тканини. Це може бути особливо корисно для терапевтичних компонентів, які є занадто токсичними для введення

Зо самих по собі. Крім того, можна використовувати меншу кількість терапевтичних речовин. (00262) Приклади відповідних терапевтичних фрагментів включають лікарські засоби, які знижують рівні ТТЕК, стабілізують нативну тетрамерну структуру ТТЕ, інгібують агрегацію ТТ, руйнують фібрили ТТК або заважають утворенню амілоїду, або протидіють токсичності для клітини. Дивіться, наприклад, АІтеєїда апа Загаїма, РЕВ5 І ейего 586:2891-2896 (2012); Загаїма,

ЕЕВ5 І ейеге 498:201-203 (2001); Апао еї аї., Огрпапеї доштаї ої Ваге Оівєазев 8:31 (2013);

Вибега апа ВеїкКк, Сіксцайноп 126:1286-1300 (2012); ії донпз5оп еї аї., У. Мої. Віої. 421(2-3):185-203 (2012). Наприклад, антитіла можуть бути кон'юговані з тафамідом, діфлуніазом, А М-ТТВО1,

АІ МТТРОг, ІБІЗ-ТТЕЕХ, доксицикліном (доху), таурорсодезоксихолевою кислотою (ТООСА),

Боху-ТООСА, галлатом епігаллокатехіна (ЕССО), куркуміном або ресвератролом (3,5, 4- тригідроксистільбеном). Інші репрезентативні терапевтичні фрагменти включають інші речовини, які, як відомо, корисні для лікування, контролю або поліпшення ТТЕ амілоїдозу або симптомів ТТЕ амілоїдозу. Див., наприклад, Апдо еї а!., Огтрпапеї Удошигпаї ої Раге Оізєазез 8:31 (2013) для загальновідомих клінічних симптомів ТТК амілоїдозу і типових речовин, які використовуються для лікування таких симптомів. (00263) Антитіла також можуть бути з'єднані з іншими білками. Наприклад, антитіла можуть бути з'єднані з файномерами (Рупотег5). Файномери представляють собою невеликі зв'язуючі білки (наприклад, 7 кДа), отримані з людського домену Руп 5НІЗ. Вони можуть бути стабільними і розчинними, і вони можуть бути позбавлені цистеїнових залишків і дисульфідних зв'язків.

Файномери можуть бути сконструйовані для зв'язування з молекулами-мішенями з тієї ж афінністью і специфічністю, що й антитіла. Вони підходять для створення мультиспецифічних гібридних білків на основі антитіл. Наприклад, файномери можуть бути злиті з М-кінцевими і/або

С-кінцевими кінцями антитіл для створення бі- і триспецифічних файномерних антитіл (ГупотАБ) з різними структурами. Файномери можуть бути підібрані з використанням бібліотек файномерів, за допомогою технології скринінгу із застосуванням ЕБАС5, Віасоге і клітинних аналізів, які дозволяють ефективно вибирати файномери з оптимальними властивостями.

Приклади файномерів описані в (СзгаришіомеКі еї аї., у. Віої. Спет. 282:3196-3204 (2007);

Вепізспіпдег евї аї., Ргоївіп Епа. Оев. 5еї. 20:57-68 (2007); ЗсНіацег єї а)І., МАБ5. 4:497-508 (2011);

Ваппег еї аї!., Асіа. СтувзіаПйодг. О. Віої. Стувіаодг. 69(РІбЄ)1124-1137 (2013); і Вгаск еї аї., Мої.

Сапсег Тнег. 13:2030-2039 (2014). бо (00264) Зазначені в цьому документі антитіла також можуть бути з'єднані або кон'юговані з одним або декількома іншими антитілами (наприклад, для утворення гетерокон'югатів антитіл).

Такі інші антитіла можуть зв'язуватися з різними епітопами в межах ТТЕ або його частини, або можуть зв'язуватися з іншим цільовим антигеном. (00265) Антитіла також можуть бути з'єднані з міткою, яку можна виявити. Такі антитіла можуть бути використані, наприклад, для діагностики ТТК амілоїдозу, для моніторингу прогресування ТТЕ амілоїдозу і/або для оцінки ефективності лікування. Такі антитіла особливо корисні для виконання таких визначень у суб'єктів, які схильні до або можуть бути схильні до

ТТЕ амілоїдозу, або у відповідних біологічних зразках, отриманих від таких суб'єктів. Типові мітки детекції, які можуть бути приєднані або причеплені до антитіла, включають: різні ферменти, такі як пероксидаза хрону, лужна фосфатаза, бета-галактозидаза або ацетилхолінестераза; протезні групи, такі як стрептавідин/біотин і авідин/біотин; флуоресцентні матеріали, такі як зонтілліферон, флуоресцеїн, ізотіоціанат флуоресцеїну, родамін, дихлортриазініламін флуоресцеїн, дансілхлорид або фікоеритрин; люмінесцентні матеріали, такі як люмінол; біолюмінесцентні матеріали, такі як люцифераза, люциферин і аекорін; радіоактивні матеріали, такі як іттрій?о (90), радіосрібло-111, радіосрібло-199, вісмут-"З, йод (91, 1251, 125), 1711), вуглець (77С), сірка (5), тритій (ЗН), індій (9и, 79, 7211, 77Іп,), технецій (Тс), талій (21Ті), галій (88Са, 6/За), паладій (ра), молібден (Мо), ксенон (33Хе), фтор (Б), 153557, 177| уц, 159(30, 149рт, 140, а, 175ур, 166Но, 90у, 4756, 186Де, 188Д6, 142ру, 105ДН, 97Ву, в8(3е, 570о, 652п, 855, гр, 153, 69уУр, Ст, Мп, 56, "7 35пП, и "Тіп; позитрон-випромінюючі метали з використанням різних позитронно-емісійних томографій; нерадіоактивні парамагнітні іони металів; і молекули, які радіоактивно мічені або кон'юговані з певними радіоіїзотопами. (00266) Зв'язування радіоїзотопів з антитілами може бути виконано з використанням звичайних біфункціональних хелатів. Для приєднання радіосрібла-111 і радіосрібла-199 можна використовувати лінкери на основі сірки. Дивіться На?гга еї аї., Сеї!Ї Віорпув5. 24-25: 1-7 (1994).

Приєднання радіоізотопів срібла може включати відновлення імуноглобуліну за допомогою аскорбінової кислоти. Для радіоіїзотопів, таких як 111Іп ії 90М, можна використовувати іритрімомаб-тіуксетан, і воно буде реагувати з такими ізотопами з утворенням 1111п- іритрімомаб-тіуксетана і 90У-іритрімомаб-тіуксетана, відповідно. Дивіться Умігід, Сапсег

СпетоїНег. Рнаптасої., 48 Зиррі 1:591-595 (2001).

Зо І00267| Терапевтичні фрагменти, інші білки, інші антитіла і/або мітки детекції можуть бути з'єднані або кон'юговані, прямо, або непрямо через посередник (наприклад, лінкер) з антитілом за цим винаходом. Дивіться, наприклад, Атоп еї а!., "Мопосіопаї! Апіїбодіє5 Рог Іттипоїагдеїіпд

ОЇ Огидзв Іп Сапсег Тнегару," іп Мопосіопа! Апіїбодієз Апа Сапсег ТНегару, Неївтєвїа еї аї. (едв.), рр. 243-56 (Агап В. І і55, Іпс. 1985); НеїЇвігот еї аї., "Апіїродієв Рог Огид Оеєїїмегу," іп СопігоїПеа

Огчд Оеєїїмегу (2па Еа.), Робіпзоп еї аї. (ед5.), рр. 6293-53 (Магсе! ОеккКег, Іпс. 1987); Тногре, "Апіїбоду Сатієтз ОЇ Суююхіс Адепів Іп Сапсег Пегару: А Веміем," іп Мопосіопа! Апііродієз 84:

Віоіодіса! Апа Сіїпіса! Арріїсайопв5, Ріпснега еї аї. (єдв.), рр. 475-506 (1985); "Апаїузів, Везиїв,

Апа Ешиге Ргозресіїме ОЇ Те Тнегарешііс Ове ОГ Вадіоїареївд Апіїбоду Іп Сапсег Тегару," іп

Мопосіопа! Апіїбодієє Рог Сапсег Оеїєесіоп Ап Тпегару, ВаїЇдміп еї аїЇ. (єдв.), рр. 303-16 (Асадетіс Ргез5 1985); і Тпогре еї аї., ІттипоїЇ. Нем., 62:119-58 (1982). Придатні лінкери включають, наприклад, лінкери які відщеплюються і невідщеплюються. Можна застосовувати різні лінкери, які вивільняють приєднані терапевтичні фрагменти, білки, антитіла і/або мітки детекції в кислотних або відновлювальних умовах, при впливі специфічних протеаз або в інших певних умовах.

М. Терапевтичні застосування 00268) Вищевказані антитіла можуть бути використані для лікування або здійснення профілактики захворювання у пацієнта, який має або схильного до ризику захворювання, опосередкованого, щонайменше частково, транстиретином (ТТА) і, зокрема, мономерною, неправильно згорнутою, агрегованою або фібрильною формами ТТА. Хоча розуміння механізмів не є потрібним для практики, вважається, що будь-який або всі з наступних механізмів можуть сприяти лікуванню ТТК амілоїдозу з використанням вищевказаних антитіл: опосередковане антитілом інгібування агрегації і утворення фібрил ТТЕ, опосередкована антитілом стабілізація нетоксичних конформацій ТТК (наприклад, тетрамерних форм), або опосередкований антитілом кліренс агрегованого ТТЕ, олігомерного ТТК або мономерного ТТЕ.

Антитіло-лікарські кон'югати можуть мати додаткові механізми дії, обумовлені кон'югованим фрагментом.

І00269| Антитіла вводять ефективною схемою, яка позначає дозування, спосіб введення та частоту введення, яка затримує початок прояву симптомів, зменшує тяжкість захворювання, уповільнює подальше погіршення і/або покращує щонайменше одну ознака або симптом бо розладу, що піддається лікуванню. Якщо пацієнт вже страждає від розладу, схему можна позначити як терапевтично-ефективна схема. Якщо пацієнт піддається підвищеному ризику захворювання в порівнянні із загальною популяцією, але ще не відчуває симптомів, схему можна назвати профілактично-ефективною схемою. У деяких випадках можна спостерігати терапевтичну або профілактичну ефективність у окремого пацієнта в порівнянні з історичними контролями або минулим досвідом у того ж пацієнта. В інших випадках терапевтична або профілактична ефективність може бути продемонстрована в доклінічному або клінічному дослідженні на популяції пацієнтів, які отримували лікування, в порівнянні з контрольною популяцією необроблених пацієнтів. (00270) Частота введення залежить від періоду напіввиведення антитіла з кровообігу, стану пацієнта і шляху введення серед інших чинників. Частота може бути щоденною, щотижневою, щомісячною, щоквартальною або з нерегулярними інтервалами у відповідь на зміни стану пацієнта або прогресування розладу, який лікується. Ілюстративна частота внутрішньовенного введення знаходиться між щотижневою і щоквартальною при безперервному курсі лікування, хоча також можливе більш або менш часте дозування. Для підшкірного введення ілюстративна частота дозування становить від щоденної до щомісячної, хоча можливе більш або менш часте дозування. (00271) Кількість доз які вводяться залежить від того, чи є захворювання гострим або хронічним, а також відповіді розладу на лікування. При гострих розладах або гострих загостреннях хронічного розладу часто буває досить від 1 до 10 доз. Іноді однієї болюсної дози, необов'язково у вигляді розділеної дози, досить для гострого розладу або гострого загострення хронічного розладу. Лікування може повторюватися для рецидивів гострого розладу або гострого загострення. При хронічних захворюваннях антитіло можна вводити через регулярні проміжки часу, наприклад, щотижня, раз на два тижні, щомісяця, щокварталу, кожні шість місяців впродовж щонайменше 1, 5 або 10 років, або впродовж життя пацієнта.

МІ. Фармацевтичні композиції і способи їх застосування (00272) В цьому документі наведено кілька способів діагностики, моніторингу, лікування або здійснення профілактики захворювань або станів, опосередкованих, щонайменше частково, транстиретином (ТТК) і, зокрема, мономерною, неправильно згорнутою, агрегованою або фібрильною формами ТТК (наприклад, ТТК амілоїдоз). Приклади таких захворювань включають сімейні ТТК амілоїдози, такі як сімейна амілоїдна кардіоміопатія (БАС), сімейна амілоїдна поліневропатія (БАР), або селективний амілоїдоз центральної нервової системи (СМЗА), і спорадичні амілоїдози ТТЕ, такі як старечий системний амілоїдоз (З55А) або старечий серцевий амілоїдоз (СА). Антитіла, описані вище, можуть бути включені в фармацевтичну композицію для використання в таких способах. В цілому, як правило, антитіло або фармацевтичну композицію, яка містить антитіло, вводять суб'єкту, який цього потребує.

Пацієнти, які піддаються лікуванню, включають індивідів з ризиком ТТК амілоїдозу, але не проявляють симптомів, а також пацієнтів, які в цей час проявляють симптоми. Деяких пацієнтів можна лікувати під час продромальної стадії ТТЕК амілоїдозу. (00273) Фармацевтичні композиції можна вводити профілактично особам, які мають відомий генетичний ризик ТТК амілоїдозу. До таких осіб належать ті, у кого є родичі, які зазнали такого захворювання, і ті, чий ризик визначається аналізом генетичних або біохімічних маркерів (наприклад, мутацій в ТТК, пов'язаних з ТТК амілоїдозом), включаючи використання діагностичних методів, представлених в цьому документі. Наприклад, в гені, який кодує ТТЕ, є більше 100 мутацій, які залучені до ТТК амілоїдозу. Дивіться, наприклад, 5 2014/0056904; Загаїма, Нит. Миїаї. 17(6):493-503 (2001); Сатаз апа Загаїма, 9. Бігисі. Вісі. 130:290-299; Ом/шеї апа Вепзоп, Віоспет. Віорпувз. Не5. Соттип. 114:657-662 (1983).

І00274| Індивіди, які страждають від ТТК амілоїдозу можуть іноді бути розпізнані за клінічними проявами ТТК амілоїдозу, включаючи один або декілька з наступних: 1) сімейний анамнез невропатичного захворювання, особливо пов'язаного з серцевою недостатністю; 2) невропатична біль або прогресуючі сенсорні порушення невідомої етіології; 3) синдром кистьового тунелю без очевидної причини, особливо якщо він двосторонній і вимагає хірургічного усунення; 4) порушення моторики шлунково-кишкового тракту або дисфункція автономної нервової системи невідомої етіології (наприклад, еректильна дисфункція, ортостатична гіпотензія, нейрогенний голод);5) серцева хвороба, яка характеризується потовщеними стінками шлуночків за відсутності гіпертонії; 6) розширений з невідомих причин атрио-вентрикулярний блок, особливо коли він супроводжується потовщеним серцем; іб) включення в склоподібному тілі за типом вати. Дивіться Апдо еї аї., Огрпапеї доштпаї ої Раге

ОРізєазе5 8:31 (2013). Остаточний діагноз ТТ амілоїдозу зазвичай опирається на біопсію органів-мішеней з наступним гістологічним фарбуванням вирізаної тканини за допомогою бо специфічного до амілоїду барвника Сопдо гед. Якщо спостерігається позитивний результат на амілоїд, згодом проводиться імуногістохімічне фарбування для ТТЕ, щоб гарантувати, що білок- попередник, відповідальний за утворення амілоїду, дійсно є ТТК. Для сімейних форм захворювань, необхідно продемонструвати мутацію в гені, який кодує ТТЕ, до постановки остаточного діагнозу. (00275) Ідентифікація суб'єкта може відбуватися в клінічній обстановці або в іншому місці, такому як будинок суб'єкта, наприклад, за допомогою використання суб'єктом власного набору для самоперевірки. Наприклад, суб'єкт може бути ідентифікований на основі різних симптомів, таких як периферична невропатія (сенсорна і моторна), вегетативна невропатія, шлунково- кишкові порушення, кардіоміопатія, нефропатія або відкладення в очах. Дивіться Апоо ебї аї.,

Огрпапеї Чдоштпа! ої Ваге ОРізєазе5 8:31 (2013). Суб'єкт також може бути ідентифікований за підвищеними рівнями ненативних форм ТТЕК в зразках плазми, отриманих від суб'єкта, в порівнянні з контрольними зразками, як описано в прикладах. (00276) Згідно з сімейною історією, генетичним тестуванням або медичним скринінгом на

ТТЕ амілоїдоз, лікування може бути розпочато в будь-якому віці (наприклад, 20, 30, 40, 50, 60 або 70 років). Лікування зазвичай тягне за собою багаторазове дозування впродовж певного періоду часу і може контролюватися шляхом аналізу антитіл, або активованих відповідей Т- клітин або В-клітин на терапевтичну речовину (наприклад, усічену форму ТТЕ, яка містить амінокислотні залишки 89-97) з плином часу. Якщо відповідь спадає, є потрібною підсилююча її доза.

І00277| У профілактичних цілях антитіло або його фармацевтичну композицію вводять суб'єкту, сприйнятливому до захворювання або схильному до ризику захворювання (наприклад,

ТТЕ амілоїдозу), схемою (доза, частота і спосіб введення), ефективною для того, щоб зменшити ризик, знизити тяжкість або затримати початок прояву щонайменше однієї ознаки або симптому захворювання. У терапевтичних цілях антитіло, або імуноген для індукції антитіла, вводять суб'єкту, який підозрюється в наявності хвороби або вже страждає від хвороби (наприклад, ТТЕ амілоїдозу), схемою (доза, частота і спосіб введення), ефективною для того, щоб поліпшити або, щонайменше, перешкодити подальшому погіршенню, щонайменше, однієї ознаки або симптому захворювання.

І00278| Схема вважається терапевтично або профілактично ефективною, якщо окремий

Зо суб'єкт, який пройшов лікування, досягає більш успішного результату, ніж середній результат в контрольній популяції порівнюваних суб'єктів, які не пройшли лікування описаними в цьому документі способами, або якщо демонструється більш успішний результат для схеми у суб'єктів, які пройшли лікування, у порівнянні з контрольними суб'єктами в контрольованому клінічному дослідженні (наприклад, фаза ЇЇ, фаза ПЛІЇ або фаза ІІІ дослідження), або у тваринній моделі на рівні р«0,05 або 0,01, або навіть 0,001.

І00279| Ефективна схема лікування антитілом може бути використана, наприклад, для: пригнічення або зменшення агрегації ТТЕ у суб'єкта, який має або який знаходиться під ризиком набути стан, пов'язаний з накопиченням ТТЕ; інгібування або зменшення утворення фібрил ТТК у суб'єкта, який має або який знаходиться під ризиком набути стан, пов'язаний з накопиченням

ТТЕ; зменшення кількості або видалення відкладень ТТКЕ, або агрегованого ТТЕ у суб'єкта, який має або який знаходиться під ризиком набути стан, пов'язаний з накопиченням ТТЕ; стабілізації нетоксичних конформацій ТТ у суб'єкта, який має або який знаходиться під ризиком набути стан, пов'язаний з накопиченням ТТЕ; інгібування токсичних ефектів агрегатів, фібрил або відкладень ТТЕ у суб'єкта, який має або який знаходиться під ризиком набути стан, пов'язаний з накопиченням ТТК; діагностування наявності або відсутності накопичення ТТЕК амілоїдів в тканині, яка ймовірно містить накопичення амілоїду; визначення кількості відкладень ТТК у суб'єкта шляхом виявлення наявності зв'язаного антитіла у суб'єкта після введення антитіла; виявлення присутності мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм

ТТЕ у суб'єкта; моніторингу та оцінки ефективності терапевтичних засобів, які використовуються для лікування пацієнтів з діагнозом ТТЕК амілоїдоз; індукування імунної відповіді, яка включає антитіла до ТТК у суб'єкта; затримки початку стану, пов'язаного з накопиченням ТТК амілоїду у суб'єкта; або лікування, або здійснення профілактики ТТЕ амілоїдозу у пацієнта. (00280) Ефективні дози варіюють в залежності від багатьох різних факторів, таких як спосіб введення, цільова локалізація, фізіологічний стан суб'єкта, незалежно від того, чи є суб'єкт людиною або твариною, інших ліків які вводяться, і чи є лікування профілактичним або терапевтичним.

І00281| Ілюстративний діапазон доз для антитіл може становити близько 0,1-20, або 0,5-5 мг/кг маси тіла (наприклад, 0,5, 1, 2, 3, 4 або 5 мг/кг) або 10-1500 мг у вигляді фіксованої дози.

Дозування залежить від стану пацієнта і реакції на попередній курс лікування, якщо такий є, чи є бо лікування профілактичним або терапевтичним і чи є захворювання гострим або хронічним,

Зо серед інших чинників. (00282) Антитіло можна вводити в таких дозах щодня, в дні які чергуються, щотижня, раз в два тижні, щомісяця, щокварталу або відповідно до будь-якого іншого графіка, який визначається емпіричним аналізом. Ілюстративне лікування тягне за собою введення декількома дозами впродовж тривалого періоду, наприклад, щонайменше, впродовж шести місяців. Додаткові ілюстративні схеми лікування пов'язані з введенням один раз в два тижні або один раз в місяць або один раз кожні 3-6 місяців.

І00283| Антитіла можуть вводитися периферичним шляхом. Шляхи введення включають місцевий, внутрішньовенний, оральний, підшкірний, внутрішньоартеріальний, внутрішньочерепний, інтратекальний, внутрішньочеревний, інтраназальний або внутрішньом'язовий. Шляхи для введення антитіл можуть бути внутрішньовенними або підшкірними. Внутрішньовенне введення може бути реалізовано, наприклад, шляхом інфузії впродовж періоду, такого як 30-90 хв. Цей тип ін'єкцій найчастіше виконується в м'язи рук або ніг. У деяких способах речовини вводять безпосередньо в певну тканину, де накопичуються відкладення, наприклад, шляхом внутрішньочерепної ін'єкції. (00284) Фармацевтичні композиції для парентерального введення можуть бути стерильними і, по суті, ізотонічними (250-350 мОсм/кг води), і виготовлятися в умовах ХПВ (хорошої практики виробництва, СМР - доой тапиїасіигіпуд ргасіїсе). Фармацевтичні композиції можуть бути представлені у вигляді одиничної дозованої форми (тобто дози для одного введення).

Фармацевтичні композиції можуть бути складені з використанням одного або декількох фізіологічно прийнятних носіїв, розріджувачів, наповнювачів або допоміжних речовин. Склад залежить від обраного шляху введення. Для ін'єкцій, антитіла можуть бути приготовані у вигляді водних розчинів, наприклад, в фізіологічно сумісних буферах, таких як розчин Хенкса, розчин

Рінгера, або фізіологічному сольовому розчині, або ацетатному буфері (щоб зменшити дискомфорт в місці ін'єкції). Розчин може містити допоміжні речовини, такі як суспендуючі, стабілізуючі і/або диспергуючі речовини. Альтернативно, антитіла можуть бути в ліофілізованій формі, для розведення перед використанням відповідним носієм, наприклад, стерильною апірогенною водою.

І00285| Схеми введення можуть бути скомбіновані зі схемами прийому інших засобів,

Зо ефективних при лікуванні або профілактиці захворювання, яке підлягає лікуванню. Такі речовини можуть включати 5ікМА для пригнічення експресії ТТЕ, або Мупаадеї, стабілізатора

ТТК в тетрамерній формі. (00286) Після лікування, стан суб'єкта може бути оцінений для визначення прогресу або ефективності такого лікування. Такі способи бажано перевіряють зміну кількості ТТК амілоїду або кількості ненативних форм ТТЕ. Наприклад, кількість ТТЕ амілоїду може бути оцінена для визначення поліпшення, в порівнянні з кількостями ТТ амілоїду у суб'єкта за таких же обставин до лікування. Кількості ТТЕК амілоїду у суб'єкта також можуть порівнюватися з контрольними популяціями в співставних умовах. Контрольні популяції можуть складатися з однаково уражених суб'єктів, яких не лікували, або звичайних суб'єктів, яких не лікували (серед інших контрольних суб'єктів). Поліпшення в порівнянні з однаково ураженими суб'єктами, яких не лікували, або кількостями, які досягають або наближаються до таких звичайних суб'єктів, яких не лікували, вказує на позитивну відповідь на лікування.

І00287| Кількості ТТК амілоїду можуть бути виміряні за допомогою ряду способів, включаючи методи візуалізації. Приклади придатних методів візуалізації включають ПЕТ- сканування за допомогою радіоактивно міченого ТТК або його фрагментів, антитіл до ТТК або їх фрагментів, речовин, які візуалізують амілоїд, в основі яких барвник Сопдо-гей, таких як, наприклад, РІВ (05 2011/0008255), амілоїд-візуалізуючий пептид р3З31 (біорозподіл амілоїд- візуалізуючого пептиду р31, корелює з кількісною оцінкою амілоїду на основі фарбування тканини Сопдо-гейд, УМаї! еї аї., Абвігасі Мо. 1573, 2011 ІЗММ Аппиаї! Мееїїпод) та інших міток ПЕТ.

Рівні ненативних форм ТТЕК можуть бути виміряні, наприклад, шляхом аналізу ДСН-ПААГ- електрофорезу/Вестерн-блоттингу або плашковим аналізом Мехо 5саїе Оізсомегу з антитілами, описаними в цьому документі, на зразках плазми або зразках біопсії з суб'єкта, при порівнянні з контрольними зразками, як описано в прикладах.

А. Способи діагностики та моніторингу 00288) Також запропоновані способи виявлення імунної відповіді проти ТТЕ у пацієнта, який страждає на або схильний до захворювань, пов'язаних з відкладеннями ТТК або патогенними формами ТТК (наприклад, мономерними, неправильно згорнутими, агрегованими або фібрильними формами ТТК). Способи можуть використовуватися для контролю курсу терапевтичного і профілактичного лікування за допомогою запропонованих тут речовин. бо Профіль антитіл після пасивної імунізації зазвичай показує безпосередній пік концентрації антитіл з наступним експоненціальним руйнуванням. Без додаткової дози розпад наближається до рівнів які передували лікуванню, в межах періоду від кількох днів до кількох місяців в залежності від періоду напіввиведення введеного антитіла. Наприклад, період напіввиведення деяких антитіл людини становить близько 20 днів.

І00289| У деяких способах перед введенням проводять вимір вихідного рівня антитіла до

ТТЕ у суб'єкта, незабаром після цього проводиться другий вимір для визначення пікового рівня антитіла, і проводять один або кілька додаткових вимірів з інтервалами, для моніторингу зменшення кількості антитіла. Коли рівень антитіла знизився до вихідного рівня або заданого відсотка від піку менше базового рівня (наприклад, 5095, 2595 або 1095), приписують введення додаткової дози антитіла. У деяких способах, пікові рівні або виміряні після них рівні менше базового, порівнюють з еталонними рівнями, визначеними до цього, щоб скласти доцільну профілактичну або терапевтичну схему лікування для інших пацієнтів. Якщо виміряний рівень антитіл значно менше еталонного рівня (наприклад, менше середнього мінус одне або, бажано, два стандартних відхилення еталонного значення в популяції суб'єктів, які отримують користь від лікування), приписують введення додаткової дози антитіла.

І00290| Також запропоновані способи виявлення мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої, або фібрильної форм ТТК у суб'єкта, наприклад, шляхом вимірювання ТТ амілоїду або патогенних форм ТТ (наприклад, мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм ТТК). Такі способи корисні для діагностики або підтвердження діагнозу захворювань, пов'язаних з такими патогенними формами ТТК (наприклад, ТА амілоїдозу) або сприйнятливістю до них. Також можуть бути використані способи для безсимптомних суб'єктів. Наявність мономерних, неправильно згорнутих, агрегованих або фібрильних форм ТТК вказує на сприйнятливість до майбутнього симптоматичного захворювання. Ці способи також корисні для спостереження за прогресуванням захворювання і/або відповіддю на лікування у пацієнтів, для яких раніше був діагностований ТТЕ амілоїдоз. 00291 Біологічні зразки, отримані від суб'єкта, підозрюваного в наявності або знаходженні під ризиком наявності ТТЕК амілоїдозу, можуть бути приведені в контакт з антитілами, розкритими в цьому документі, для оцінки присутності мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм ТТК. Наприклад, рівні мономерної, неправильно згорнутої,

Зо агрегованої або фібрильної форм ТТК у таких суб'єктів можна порівняти з рівнями, характерними для здорових людей. Альтернативно, рівні ТТ амілоїду або патогенних форм

ТТЕ (наприклад, мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм ТТЕ) у таких суб'єктів, які отримують лікування через хворобу, можна порівняти з такими пацієнтів, які не лікувалися від ТТЕ амілоїдозу. Деякі такі тести включають біопсію тканини, отриману від таких суб'єктів. Аналізи ЕГІЗА також можуть бути корисними способами, наприклад, для оцінки рівнів мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм ТТЕ в зразках рідини. Деякі такі аналізи ЕГІЗБА включають застосування антитіл проти ТТЕ, які бажано зв'язують мономерну, неправильно згорнуту, агреговану або фібрильну форми ТТЕК відносно нормальних тетрамерних форм ТТК. 002921 Способи візуалізації іп мімо можуть працювати шляхом введення реагенту, такого як антитіло, яке зв'язується з мономерною, неправильно згорнутою, агрегованою або фібрильною формами ТТК в суб'єкті, а потім виявлення реагенту після того, як він зв'язався. Такі антитіла зазвичай зв'язуються з епітопом в межах залишків 89-97 ТТК. При бажанні, реакції усунення можна уникнути використанням фрагментів антитіл, які не мають повнорозмірної константної області, таких як Бар. У деяких способах, одне і те ж антитіло може слугувати у якості як лікувального, так і діагностичного реагенту. 00293) Діагностичні реагенти можуть бути введені в організм суб'єкта шляхом внутрішньовенної ін'єкції або іншими шляхами, які вважаються розумними. Доза реагенту повинна бути в тих же межах, що і для способів лікування. Як правило, реагент мітять, хоча в деяких способах первинний реагент з афінністю до мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм ТТК є неміченим, а вторинний мічений реагент використовується для зв'язування з первинним реагентом. Вибір мітки залежить від способу виявлення. Наприклад, флуоресцентна мітка підходить для оптичного виявлення. Використання парамагнітних міток підходить для томографічного виявлення без хірургічного втручання.

Радіоактивні мітки також можуть бути виявлені з використанням ПЕТ або ОФЕКТ (однофотонної емісійної комп'ютерної томографії). (00294) Діагностика виконується шляхом порівняння кількості, розміру і/або інтенсивності помічених локусів з відповідними значеннями базової лінії. Значення базової лінії можуть являти собою середні рівні в популяції індивідів без захворювання. Значення базової лінії також бо можуть являти собою попередні рівні, визначені в одному і тому ж самому суб'єкті. Наприклад,

значення базової лінії можуть бути визначені у суб'єкта до початку лікування, а потім виміряні значення порівнюють зі значеннями базової лінії. Зниження значень відносно базової лінії зазвичай сигналізує про позитивну відповіді на лікування.

ЇХ. Набори 00295) У винаході додатково запропоновані набори (наприклад, контейнери), які містять антитіло, розкрите в цьому документі, і пов'язані з ним матеріали, такі як інструкції для використання (наприклад, вкладиш в упаковці). Інструкції щодо застосування можуть містити, наприклад, інструкції для введення антитіла, і, необов'язково, одну або кілька додаткових речовин. Контейнери з антитілом можуть бути в формі одиночних доз, багаторазових упаковок (наприклад, упаковок з кількома дозами) або суб-одиничних доз.

І00296)| Вкладиш упаковки відноситься до інструкцій, які зазвичай включають в комерційні упаковки терапевтичних продуктів, які містять інформацію про показання, використання, дозування, призначення, протипоказання і/або попередження щодо використання таких терапевтичних продуктів.

І00297| Набори можуть також містити другий контейнер, який містить фармацевтично- прийнятний буфер, такий як бактеріостатична вода для ін'єкцій (ВУМЕІ - Басієтіовіайіс уаїег ог іпіесспоп), забуферений фосфатом фізіологічний розчин, розчин Рінгера та розчин глюкози. Він також може містити інші матеріали, бажані з комерційної точки зору та точки зору користувача, включаючи інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки і шприци.

Х. Інші застосування

І00298| Антитіла можуть бути використані для виявлення мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм транстиретина (ТТВ) або їх фрагментів, в контексті клінічної діагностики або лікування, або в дослідженнях. Наприклад, антитіла можуть бути використані для виявлення присутності мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм ТТ в біологічному зразку як індикатор того, що біологічний зразок містить відкладення ТТА амілоїду. Зв'язування антитіл з біологічним зразком можна порівняти зі зв'язуванням антитіл з контрольним зразком. Контрольний зразок і біологічний зразок можуть містити клітини того ж самого тканинного походження. Контрольні зразки і біологічні зразки можуть бути отримані від тих же або різних осіб, і в тому ж відборі проб або в різних відборах

Зо проб. При бажанні безліч біологічних зразків і безліч контрольних зразків оцінюють при численних відборах проб, щоб уникнути випадкового відхилення, незалежного від відмінностей між зразками. Потім може бути проведено пряме порівняння між біологічним зразком(-ами) і контрольним зразком(-ами), щоб визначити, чи збільшується, чи зменшується, чи залишається таким же зв'язування антитіла (тобто присутність мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм ТТК) з біологічним зразком(-ами) відносно зв'язування антитіла з контрольним зразком(-ами). Підвищене зв'язування антитіла з біологічним зразком в порівнянні з контрольним зразком вказує на присутність мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм ТТК в біологічному зразку. У деяких випадках підвищене зв'язування антитіла є статистично значущим. Необов'язково, зв'язування антитіла з біологічним зразком є щонайменше в 1,5 рази, в 2 рази, в З рази, в 4 рази, в 5 разів, в 10 разів, в 20 разів або в 100 разів сильнішим, ніж зв'язування антитіла з контрольним зразком. 002991 Крім того, антитіла можуть бути використані для виявлення присутності мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм ТТК в біологічному зразку для спостереження і оцінки ефективності лікарського засобу, який застосовується для лікування пацієнта з діагностованим ТТЕ амілоїдозом. Оцінюють біологічний зразок з пацієнта з діагнозом

ТТЕ амілоїдоз, щоб встановити вихідний рівень зв'язування антитіл з зразком (тобто вихідний рівень наявності мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм ТТЕК в зразку) перед початком терапії лікарським препаратом. У деяких випадках, безліч біологічних зразків з пацієнта оцінюють при безлічі відборів проб, щоб встановити початкове значення, і міру випадкового відхилення, яка не залежить від лікування. Згодом лікарський препарат вводять схемою прийому ліків. Схема може включати безліч введень речовини впродовж певного періоду часу. Необов'язково, зв'язування антитіл (тобто наявність мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм ТТ) оцінюється при множинному відборі проб по безлічі біологічних зразків з пацієнта, як для визначення міри випадкового відхилення, так і для демонстрації тенденції у відповідь на імунотерапію. Потім порівнюють різні оцінки зв'язування антитіла з біологічними зразками. Якщо будуть виконані лише два оцінювання, можна провести пряме порівняння між двома оцінюванням для того, щоб визначити, чи збільшилося, зменшилося або залишалося незмінним зв'язування антитіла між двома оцінювання (тобто наявність мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або 60 фібрильної форм ТТК). Якщо проведено більше двох вимірів, вимірювання можуть бути проаналізовані як часовий курс, що починається до лікування лікарським препаратом, і триває весь час терапії. Для пацієнтів, у яких зменшилося зв'язування антитіл з біологічними зразками (тобто наявність мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм ТТК), можна зробити висновок, що лікарський препарат був ефективним при лікуванні ТТЕК амілоїдозу у пацієнта. Зниження зв'язування антитіл може бути статистично значущим. Необов'язково, зв'язування зменшується щонайменше на 1905, 295, 390, 4905, 5905, 10905, 1590, 2095, 3090, 4095, 5090, бою, 7095, 8095, 9095 або 10095. Оцінка зв'язування антитіла може бути проведена в поєднанні з оцінкою інших ознак і симптомів ТТЕ амілоїдозу.

ЇООЗО0| Антитіла також можуть бути використані в якості дослідних реагентів для лабораторних досліджень, для виявлення мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм ТТК або їх фрагментів. У таких застосуваннях антитіла можуть бути помічені флуоресцентними молекулами, спін-міченими молекулами, ферментами або радіоізотопами, і можуть бути надані у вигляді набору з усіма необхідними реагентами для проведення аналізу детекції. Антитіла також можуть бути використані для очищення мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм ТТЕ, або партнерів по зв'язуванню мономерної, неправильно згорнутої, агрегованої або фібрильної форм ТТК, наприклад, за допомогою афінної хроматографії.

І0ОЗО1| Антитіла також можуть бути використані для інгібування або зменшення агрегації

ТТЕ, пригнічення або зменшення формування фібрил ТТЕ, зменшення або усунення відкладень

ТТК або агрегатів ТТЕ, або стабілізації нетоксичних конформацій ТТЕ в біологічному зразку.

Біологічний зразок може містити, наприклад, кров, сироватку, плазму або тканину (наприклад, тканину з серця, периферичної нервової системи, вегетативної нервової системи, нирки, ока або шлунково-кишкового тракту). У деяких випадках агрегація ТТЕ, утворення фібрил ТТК, або відкладення ТТЕ обмежуються або знижуються, щонайменше, на 1095, 2095, 2595, 30905, 4095, 5095 або 7595 (наприклад, 1095 -7595 або 3095-7095). Аналізи для виявлення утворення фібрил описані в іншому місці в цьому документі. Дивитись також 05 2014/0056904.

І0ООЗО2| Всі патентні заявки, веб-сайти, інші публікації, ідентифікаційні номери тощо, згадані вище або нижче, включені за допомогою посилання в повному обсязі для всіх цілей в тій же мірі, як якби кожен окремий елемент був спеціально і індивідуально вказаний, щоб бути

Зо включеним за допомогою посилання. Якщо в різний час з ідентифікаційним номером асоційовані різні варіанти послідовності, то під цим ідентифікаційним номером мається на увазі варіант, асоційований з ним на момент фактичної дати подання цієї заявки. Дійсна дата подачі означає найбільш ранню дійсну дату подачі або дату подачі пріоритетної заявки з посиланням на ідентифікаційний номер при необхідності. Подібним чином, якщо різні варіанти публікації, веб-сайту тощо опубліковані в різний час, мається на увазі варіант, опублікований раніше всього на дійсну дату подачі, якщо не вказано інше. Будь-яка властивість, етап, елемент, варіант реалізації винаходу, або аспект винаходу можуть використовуватися в поєднанні з будь- яким іншим, якщо спеціально не вказано інше. Хоча цей винахід був описаний більш детально за допомогою ілюстрації та прикладу для ясності і розуміння, буде очевидно, що певні зміни і модифікації можуть бути реалізовані в рамках доданої формули винаходу.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1. Ідентифікація моноклональних антитіл до ті5- ТВ

І00303| Конформаційно-специфічні моноклональні антитіла проти мономерної, неправильно згорнутої, фібрильної або агрегованої форм ТТЕК (тібз-ТТК) створювали, піддавали скринінгу, експресували і очищували, як описано в «Матеріали і способи» (а-4). Для створення моноклональних антитіл до ітпіє-ТТЕ. була досліджена кристалічна структура тетрамерного ТТК людини для того, щоб знайти області білка, які занурені в тетрамері, але стають експонованими при дисоціації тетрамера на його мономерні субодиниці. В ідентифікованій області були залишки 89-97 (ЕНАЄЕММЕТА) (5ЕО ІО МО: 113), розташовані в межах Е-ланцюга ТТ і розділені на межі поділу димера тетрамерного білка. Пошук ВГ АЗТ в білкової базі даних не виявив будь- яких інших людських білків, які мають цю послідовністю. 00304) Був синтезований пептид, який містить цю послідовність (ФІЧФЕНАЕММЕТАдЧака) (ЗЕО

ІЮО МО: 114). Великі літери позначають залишки 89-97 ТТК. Маленькі літери позначають додаткові лінкерні залишки, які додають для збільшення розчинності антигенного пептиду, і для створення 9 амінокислотного фрагмента в якості внутрішньої послідовності. Цей пептид був приєднаний до полілізінового розгалуженого ядра, утворюючи багатоскладовий антигенний пептидний імуноген (ТТК-МАР), який містить ядро з лізінових залишків з декількома відгалуженнями, приєднане до пептиду 89-97 ТТЕ. Антитіла, перераховані в Таблиці 2, були отримані проти ТТК-МАР. 60 ЇООЗО5І На додаток до цього багатоскладового антигенного пептида, два інших імуногена, які містять один і той же фрагмент ТТК, були отримані шляхом ковалентного приєднання аналогічних пептидів 89-97 ТА (Ас-сдФЕНАЕММЕТА-амід (ЗЕБЕО ОО МО: 115) ї Ас-

ЕНАЄЕММЕТАсодад-амід (5ЕО ІЮО МО: 116)) через М- ії С-кінцеві цистеїнові залишки до гемоціаніну фіссурелли (ТТК89-97-М-КІ Н і ТТК89-97-О-КІ Н).

І0ОЗО6) Після створення, скринінгу, експресії і очищення антитіл були визначені детальні кінетичні параметри зв'язування (швидкість асоціації (Ка), швидкість дисоціації (Ка) ії константа афінності зв'язування (Ко)) для «лідируючих» тіз-ТТК антитіл за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (5РК - зигасе ріазхтоп гезопапсе) в парі з рекомбінантним людським

ТТ Е87М/ 110М, як показано в Таблиці 2. Антимишачий до (СЕ Неайвсаге) був імобілізований на сенсорному чіпі С5 (без ланцюгів декстрану) через амінове з'єднання відповідно до інструкцій, наданих в антимишачому наборі СЕ Неайксаге, а тіє-ТТК тАБ (мишачі антитіла до ненативних форм ТТЕ) були захоплені до рівня, достатнього щоб забезпечити максимальне зв'язування аналіту до 30-50 ВИ (тезопапсе ипіїбє - резонансних одиниць). Різні концентрації аналіту (рекомбінантний людський ТТК Е87М/110М) пропускали через захоплений ліганд при 30 мкл/хв в рухомому буфері (НВ я 0,0595 Р-20, 1 мг/мл БСА) в 3-кратних розведеннях. Для кожної концентрації реакція протікала впродовж часу, що дозволяє більш високим концентраціям аналіту досягти рівноваги під час асоціації, а також, щонайменше, 1095 сигналу до розпаду під час дисоціації. Щонайменше одна концентрація (не найвища або найнижча) була проаналізована з дублюючої пробою. Діапазони концентрацій аналіту були обрані на основі попередніх експериментів, щоб охопити межі вимірювань щонайменше від в 10 разів вище Ко до в 10 разів нижче Ко.

Ї00307| Результати аналізу ЗРК «лідируючих» ітіз-ТТЕ тАб наведені в Таблиці 2 нижче.

Таблиця 2

ОРЕ аналіз зв'язування антитіл до тіб-ТТА з людським ТТА (Е87М/ 110ОМ)

Приклад 2. Зв'язування антитіл до ті5-ТТК з антигеном ТТК

Ї0ООЗО8)| Чотири «лідируючих» ті--ТТКЕ тАБ (905, 1408, 6С1 і 5А1) аналізували за допомогою ЕЇГ ІЗА в концентраціях від 0,31 до 2,5 мкг/мл, використовуючи як рН4,О-оброблений

ТА (рна-ТТК), так і нативний ТІК як покриваючий антиген. Підготовка антигену ТТК і протоколи ЕГ ІЗА описані в інших місцях, в «Матеріали і способи» (е-9).

Зо Ї0ООЗО9І| Отримані криві зв'язування і зведені значення Ка і Втлах показані на Фіг. З і в таблиці

З нижче. Результати на Фіг. З представлені в довільних одиницях (д. 0.) по осі у. Всі тАр показали значне зв'язування з рН4-ТтТЕК з величинами Ка в діапазоні від 16 нМ (6С1) до 282 НМ (905). Значення Втлах для зв'язування з рН4і-тТтТЕК варіювали від мінімуму 0,65 д. о. (1408) до максимуму 2,02 (905). На відміну від зв'язування з рН4-ТТК, жодне з антитіл не показало значного зв'язування з нативним ТТК, що вказує на те, що всі отримані антитіла проти ТТК були специфічними до ненативних форм ТТЕ.

Таблиця З

Аналіз ЕГ І5А зв'язування антитіл до ті5-ТТА з рнН4-ттА

Приклад 3. Аналіз антитіл до тіб-ТТА за допомогою ДСН-ПААГ-електрофорезу і нативного

ПААГ-електрофорезу 003101 905 ї 1458 були проаналізовані за допомогою ДСН-ПААГ-електрофорезу/Вестерн- блоттингу, щоб продемонструвати специфічність зв'язування з мономерними/денатурованими формами ТТК в порівнянні з нативним, неденатурованим ТТК. Протоколи ДСН-ПААГ- електрофорезу, нативного ПААГ-електрофорезу і Вестерн блоттингу описані в інших місцях, в «Матеріли та способи» (Пп-Ї).

Ї00311| Неденатурований ТТК або рН4і-ТТК піддавали електрофорезу в гелі ДСН-ПААГ поряд з термічно денатурованим ТТЕ, і термічно денатурованим рнН4.і-тТтТЕК. Після електрофорезу з гелем проводили Вестерн-блоттинг, переносячи білки на нітроцеллюлозу і фарбуючи тАБ 905 і 1458 до ТТК. Обидва антитіла розпізнавали лише ТТК, коли він був оброблений при рнНа4, або, коли ТТЕ або рн4а-тТтТЕ спочатку піддавали термічній денатурації перед виконанням ДСН-ПААГ- електрофорезу. Ці 905 і 1408, таким чином, демонструють специфічність до конформерів ТТЕ, отриманих або денатурацією ТТЕ, або обробкою ТТЕК при рн 4.

І00312|6С1 ї 5А1 разом із загальними тАб (757, 8С3) до ТТК і комерційно доступним поліклональним антитілом Зідта також аналізували за допомогою ДСН-ПААГ- електрофорезу/Вестерн-блоттингу. Кожен блот містив пофарбовані маркери молекулярної маси, неденатурований ТТЕК і рН4-тТтв.

Ї00313| Пофарбований гель ДСН-ПААГ показав, що основними видами, присутніми в неденатурований зразку ТТК, був димер близько 38 кДа. Навпаки, основний компонент, присутній в зразку рН4і-ТТЕ, був димером близько 35 кДа, з невеликою частиною димера як мономера близько 15 кДа. Цей димер проходив як трохи менший білок, ніж димер, присутній в неденатурований зразку ТТК, що вказує на конформаційну різницю між цими двома видами димерів ТТ. 00314) Вестерн-блоттинг зразків ТТЕ і рН4-тТТЕ з використанням чотирьох антитіл до пів-

ТТК показав, що ці тАб не розпізнають неденатурований ТТЕ, але зв'язують як денатурований мономер, так і димер, присутній в зразку рН4і-тТК. Таким чином, чотири тАб до тіб5-ТТА (905, 1468, 6С1 ї 5А1) показують подібну специфічність для неспоріднених конформацій ТТК при аналізі ДСН-ПААГ-електрофорезом/Вестерн-блоттингом. 00315) На відміну від чотирьох тАб до ті5-ТТК, два контрольних ТТК тАБб, 707 і 8С3, які були отримані шляхом імунізації мишей з інтактним ТТЕ, розпізнавали всі види ТТК, присутні в зразках ТТЕК і рнН4-тТЕ, включаючи види тетрамерного ТТЕК. Таким чином, на відміну від тАБб до тіб8-ТТЕК, ці контрольні тАр зв'язують ТТК, але без конформаційної специфічності.

Зо Поліклональні антитіла Зідта поводяться аналогічно контрольним тАб - 7057 і 8С3. 00316) ТТЕК ї рН4і--тТК також піддавали електрофорезу в нативному гелі для того, щоб побачити, чи здатні чотири тАб до іпіЗ-ТТК проявляти конформаційну специфічність в умовах неденатуруючого гелю. На пофарбованому нативном гелі ПААГ після електрофорезу, ТТК виглядав як нативний димер близько 35 кДа з невеликою кількістю тетрамера. На відміну від цього, РН4--ТТК виглядав в основному як високомолекулярна розмазана пляма з невеликою кількістю димера близько 35 кДа. Неспецифічне поліклональне антитіло бідта розпізнавало всі форми ТТЕ, присутні як в ТТЕ, так і в зразку рН4і-ТТЕК. На противагу цьому, 905 розпізнає лише високомолекулярні види ТТЕ, присутні в зразку рН4і-ТТК. Як зазначалося в дослідженні ДСН-

ПААГ-електрофорез/Вестерн-блоттинг, 905 не розпізнає жодного з нативних видів ТТЕ.

І00317| Всі чотири тАБ до ті5-ТТК згодом аналізували за допомогою нативного ДСН-ПААГ- електрофорезу/Вестерн-блоттингу. Як і очікувалося, і аналогічно 905, інші тАб до тів-ТТА, 1408, 6С1 і 5А1, специфічно зв'язуються з високомолекулярними ненативним формами ТТЕ, присутніми в зразку рН4і-ТТЕК. Жодне з цих антитіл не розпізнавало нативний димер ТТЕК 35 кДа.

Ці результати вказують на те, що чотири тАБб до ті5-ТТК поводяться однаково і розпізнають лише ненативні види ТТКЕ, які конформаційно відрізняються від нативного ТТ.

Приклад 4. Інгібування утворення фібрил ТТА за допомогою антитіл до тіб-ТТА 00318) ТТА-М/8Е є варіантом ТТК, який містить точкову мутацію в позиції 78, яка дестабілізує тетрамер ТТК. Згодом і в м'яких кислотних умовах цей варіант ТТК дисоціює на його мономерні субодиниці, які потім можуть зближуватися і утворювати фібрили, здатні зв'язуватися з тіофлавіном-Т. Таким чином, масштаб формування фібрил може спостерігатися шляхом вимірювання флуоресценції тіофлавіна-Т при 480 нм. Введення антитіла до ті5-ТТА, специфічного до дисоційованих мономерів або агрегатів ТТК, запобігає об'єднанню фібрил

ТТЕК, що призводить до зменшення флуоресценції тіофлавіна-Т відносно реакції контролю за відсутності антитіла. Протоколи для оцінювання інгібування формування фібрил ТТЕ описані в інших місцях, в «Матеріали і способи» (К).

Ї0ОО319| Всі чотири антитіла до тіб-ТТК сильно інгібували формування тіофлавін-Т- реакційноздатних ТТК-У78Е-фібрил в порівнянні з ізотипічним контролем. Результати показані на Фіг. 4А і представлені в довільних одиницях (д. 0.) на осі у. Антитіло 5А1 до ті5-ТТК майже повністю інгібує утворення фібрил. Ці результати узгоджуються з думкою про те, що антитіла до бо тіб-ТТЕ зв'язують мономерні і/або агреговані форми ТТЕК, тим самим запобігаючи утворенню фібрил ТТ.

І0ОЗ20)| В Таблиці 4 наведені характеристики, отримані для набору з 4 антитіл до ті5-ТТА (905, 14058, 6С1 і 5А1), які показали хорошу конформаційну селективність до ненативних форм

ТК. Ці антитіла мали афінності (Ко) до рН4-тТтТК в діапазоні від 14,5 нМ (6С1) до 257 нМ (905) і значення В лах від 0,65 д. о. (1408) до 2,02 (905). Жодне з цих антитіл не розпізнавало нативний

ТТК, але насправді вони зв'язувалися з рНі--їТтКк при ДСН-ПААГ-електрофорезу/Вестерн- блоттингу, і з високомолекулярними агрегатами ТТК при нативному /ПААГ- електрофорезу/Вестерн-блоттингу. Ці антитіла також інгібували формування фібрил ТТК в аналізі формування фібрил з використанням Тпіо-Т для зчитування даних.

Таблиця 4

Таблиця результатів аналізу характеристик тАБб до ті5-ГТВ8-М78Е

Вестерн-блоттинг

Ідентифіка- (рна-ттв й 95 Інгібування тор клону К в ДСН-ПААГ Нативний Фібрил в) тах : : електрофорез (Тіофлавін-Т) (НМ) (ООзвод. о.) (рна-ттА (НММУ-ТТЕ) 905 | 257 | 202 | - | ян | ч- | 83 ж юКю ї4а8 | 987. | 065 | - | зн. | ч | 65 вс1 | 146 | 707. | - | ян | чен | 72 2 -ЮВ/

БА | 213 | 61 | - | ян | я | лоб

І00321| ТТА-М122І є варіантом ТТК, який містить в позиції 122 точкову мутацію, яка дестабілізує тетрамер. Формування фібрил пов'язане зі збільшенням флуоресценції тіофлавіна-

Т. Збільшення концентрацій тАбБ 14058 викликало монотонне зниження флуоресценції тіофлавіна-Т, яке вказує на субстехіометричне інгібування формування фібрил ТТК (ІСво - 0,028 ж 0,009 мг/мл, п - 3, Фіг. 48 і Таблиця 4а). Ізотипне контрольне тАб не викликало інгібування формування фібрил ТТК (Фіг. 4С), тим самим демонструючи специфічність опосередкованого 148 інгібування.

І0ОЗ22| Співставні субстехіометричні значення ІСво, визначені для 5А1 і 6С1 (Таблиця 4а), припускали аналогічні механізми інгібування формування фібрил для кожного з цих тАБ до тпів-

ТТЕК. На противагу цьому, 905 несподівано не зміг інгібувати формування фібрил ТТК-М1221, незважаючи на те, що виявляв подібну специфічність і спорідненість до ненативного ТТК.

Залишається вивчити, чи є 905 більш чутливим до використовуваних умов аналізу.

Таблиця 4а

Таблиця результатів аналізу характеристик тАБ до іпібз- ТП. В-М1221 11111111 Антитіло//////////////7/ Ово ж середнє-квадратичне відхилення (мг/мл) 1408 0,028 х 0,009 0,048 ж 0,059 0,015 ж 0,02

ЕС 27/1

Приклад 5. Імуногістохімічне визначення характеристик тканини, схильної до АТТЕК, з використанням тАб до ті5- ПП В 00323) «Лідируючі» тАбБ до ті5-ТТК, створені до фрагменту білка транстиретина 89-97

ТТЕ, були імуногістохімічно протестовані на свіжозамороженій і обробленій парафіном тканині,

Зо взятій у пацієнтів з підтвердженим серцевим ТТК амілоїдозом. Протоколи для отримання і підготовки зразків серцевої тканини, імуногістохімії (НС - іттипопів(оспетівігу) та аналізу зображень наведені в інших місцях, в «Матеріали і способи» (І-0). Антитіла, які використовуються для ІНС, описані в Таблиці 5.

Таблиця 5

Антитіла, застосовані для імуногістохімічного визначення характеристик серцевої тканини контроль дог

ОО) | ее оюютьня! ною ланцюги ЛЦ-каппа рако Моппи Атегіса Ні 1:8000

АО191

Лямбда-легкі

АО193 003241 Зразки серцевої тканини були отримані у пацієнтів з підтвердженими діагнозами мутацій АТТК. Демографія для досліджуваних імуногістохімічно випадків була наступною і представлена в Таблиці 6: РАС - сімейна амілоїдна кардіоміопатія; РАР - сімейна амілоїдна поліневропатія; 12 АЇ - амілоїдоз легкого ланцюга; АТТК - транстиретин-опосередкований амілоїдоз; ОпК - Невідомо

Таблиця 6

Імуногістохімічне фарбування зразків серцевої тканини за допомогою антитіл до піз-ТТА . . м Чи забарвлювалося

Пацієнт» | 7771 ЛеАЄ 17777111 - 0 | Заморожений | З Ні 7

Пацієнтб | 77 ЛеАЄ 17777711 - 0 | Заморожений | З Ні ЗУ 00325) Мишачі моноклональні антитіла (птАбБ до ті5-ТТК), створені до фрагменту білка транстиретина 89-97 ТТК, були |імуногістохімічно протестовані на свіжозамороженій і обробленій парафіном тканині, взятій у пацієнтів з підтвердженим серцевим ТТЕ амілоїдозом.

Кожне антитіло до ті5-ТТК проявляло сильну імунореактивність на серцевій тканині з АТТЕК.

Темне забарвлення спостерігалося у відкладеннях у всьому міокарді і судинній мережі. Коли імунореактивність порівнювали по фарбуванню Сопдо Кей і тіофлавіном-Т, більша частина імунореактивності на тканині показала високу відповідність між двопроменезаломленням Сопдо геа ії Т-позитивним фарбуванням тіофлавіном. Це підтверджує бета-складчату природу листа

ТТК амілоїду, відкладеного в цій тканині. 14658, 905, 6С1 і 5А1ї також виявляли перед- амілоїдний ТТЕ, присутній в областях міокарда, які були ТТЕ-імунопозитивними, проте Сопдо геа або тіофлавін-Т негативними. Пропущені області як контрольним антитілом ізотипу Ідс, такі первинним антитілом були негативними для фарбування у всіх тестованих тканинах. Антитіла, реакційноздатні по відношенню до інших амілоїдогенних білків (легкі ланцюги лямбда і каппа, або амілоїд А), були нереакційноздатними на серцевій тканині з АТТЕ, яка була використана в цьому аналізі, який вказує на те, що відкладення були специфічно характерні для ТТ.

І00326| Шаблони фарбування антитілами до тієЄ-ТТК порівнювали з фарбуванням, отриманим з допомогою добре охарактеризованого комерційного еталонного антитіла до ТТ (преальбумін, АОО02; бакКо; Карпінтерія, Каліфорнія). Контрольне антитіло ПОАКО фарбувало уражений захворюванням міокард в тих же областях, що й антитіла до тіб5-ТТК, але продукувало більш дифузний шаблон фарбування. Контрольне антитіло ПОАКО не фарбувало відкладення амілоїду ТТЕ в судинній мережі, які забарвлюються Сопдо Кей, так само сильно, як антитіла до ті5-ТТВ.

І00327| Антитіла до ті5-ТТЕК не фарбували нормальну, неуражену захворюванням тканину.

Крім того, як і очікувалося, фарбування ізотипним контрольним антитілом, бЕ10, також було негативним.

І0ООЗ28) Для того, щоб визначити, чи є реакційна здатність антитіл до тіє-ТТК специфічною відносно відкладень ТТК, була проаналізована крос-реакційна здатність цих антитіл до серцевої тканини, отриманої від пацієнтів з діагнозом первинного амілоїдозу АГ (Прпі-спаїп атуїоідовів). Як і очікувалося, жодного фарбування АЇ -амілоїдної тканини не спостерігалося, підтверджуючи, що антитіла до ТТК специфічно реагують на уражену АТТЕ тканину.

І00329| Серцева тканина пацієнтів з підтвердженими діагнозами старечого системного амілоїдозу або пацієнтів з підтвердженим БАС або ЕАР, які викликані точковими мутаціями в гені ТТЕ, також позитивно забарвлюється 1408, 905, 6С1 і 5А1. Ці результати показують, що антитіла до ТТК мають здатність розпізнавати відкладення ТТК в серцевій тканині незалежно від генотипу АТТЕК.

І00ЗЗ0| Інші несерцеві тканини, які, як відомо, експресують ТТК, також досліджували на фарбування антитілами до тів5-ТТК, і порівнювали з фарбуванням, отриманим з використанням еталонного антитіла САКО. Як і очікувалося, печінка, підшлункова залоза і судинне сплетіння фарбувались позитивно на ТТК з використанням еталонного антитіла ЮБако. На противагу цьому, 1458 фарбувало лише альфа-клітини підшлункової залози, розташовані в острівцях

Лангерганса, і судинне сплетіння, що вказує на те, що деякі з ТТЕ, локалізовані в цих органах, конформаційно відрізняються від ТТК, які оекспресуються в печінці. Відсутність імунореактивності у тАБб до ті5-ТТК в печінці свідчить про те, що велика кількість ТЕ, експресованого в ній, є, в основному, тетрамерним, нативним ТТК, і не має експонованого епітопу тіб5-ТТЕ. Аналогічні результати були отримані, коли одні і ті ж тканини забарвлювалися 905, 6С1 і 5А1.

Приклад 6. Аналіз АТТВ в порівнянні з плазмою звичайної людини за допомогою ДСН-ПААГ- електрофорезу/Вестерн-блоттингу і плашкового аналізу Мезо 5саїе бізсомегу (МО)

Ї00331| Шість зразків плазми від пацієнтів, з підтвердженим УЗОМ АТТК (зразок Мо 11, Мо 12,

Мо 15, Мо 18, Мо 19, Мо 20) і шість зразків від звичайних суб'єктів (Мо 21, Мо 22, Мо 23, Мо 24, Мо 25,

Мо 27) були отримані від М. Сарайва (Університет Порту, Португалія). Зразок Мо Сб був звичайним зразком людської сироватки, отриманим з комерційного джерела (ВіогесіатайопіМТ).

Зразки аналізували за допомогою ДСН-ПААГ-електрофорезу і Вестерн-блоттингу або за допомогою плашкового тесту Мезозсаїе Оізсомегу (М50). Протоколи для цих аналізів описані в інших місцях, в «Матеріали і способи» (р-г). Стандартна крива була згенерована для плашкового аналізу М5О з використанням 6С1. 00332) В отриманих Вестерн-блотах з використанням тАБ до тпі5-ТТА - 905 і 5А1Т, можна виявити відмінності в шаблонах смуг між нормальними зразками плазми і з ТТК-МЗОМ. Всі зразки плазми містили смугу ТТК близько 14 кДа, яка рухалася разом з ненативним ТТЕ- мономером, присутнім в еталонному зразку рНі-ТтТК. Загалом, зразки плазми, отримані від пацієнтів з ТТК-МЗОМ (Мо 21, 22, 23, 24, 25 і 27), мали більше видів цих мономерних тпів5-Т В.

Кроті того, зразки плазми, отримані від пацієнтів з МЗОМ, також містили смугу близько 30 кДа, яка рухалася разом з ненативним димером ТТЕК, присутнім в еталонному зразку рН4-тТтК. За винятком зразків Мо 12 і Мо 18, зразки плазми, отримані від звичайних особин, володіли меншою кількістю цих димерних видів. 00333) Вищевказані Вестерн-блоти були відскановані, а інтенсивності комбінованого 905- або 5А1-реакційноздатного ТТК-димера і смуг мономерів були нанесені на графік для кожного бо зразка. Результати показані на Фіг. 5А (905) і 58 (5А1) і представлені в довільних одиницях (д.

о.) по осі у. За винятком зразків плазми Мо 15 і Мо 18, зразки плазми, отримані від звичайних індивідів (11, 12, 19 їі 20), містили менше 905- і 5А1-реакційноздатних димерних і мономерних видів, ніж зразки, отримані від пацієнтів з МЗОМ (21-25 і 27). 00334112 зразків сироватки, проаналізовані Вестерн-блоттингом з 905 і 5А1, також аналізували за допомогою плашкового аналізу М5О з використанням 6С1 як антитіла для захоплення ті5-ТТЕ, і антитіла бако-ЗиМоТад як антитіла детектування. Результати цих М5О- аналізів показані на Фіг. 6 і представлені в довільних одиницях (д. о.) по осі у. Зразки 11, 12, 15, 18, 19 і 20 являють собою звичайну плазму. Зразки 21-25 і 27 являють собою плазму хворих з

УЗОМ.

ЇООЗЗ35| За винятком зразків плазми Мо 15 і Мо 18, кількість 6С1-реакційноздатного ТТК, присутнього в зразках плазми, отриманих від звичайних індивідів, була нижчою, ніж в плазмі у індивідів 3 ТТК-УЗОМ. Рівні реакційної здатності 6С1, виміряні за допомогою аналізу М5О, дуже добре корелювали з кількістю 905-реакційноздатного димера і мономера, які спостерігались вище за допомогою ДСН-ПААГ-електрофорезу/Вестерн-блоттингу.

Ї0ОЗЗ6)| Для того, щоб визначити концентрацію реакційноздатних видів ТТЕ, які присутні в зразках плазми, ті ж зразки повторно аналізували з використанням 6С1 як антитіла захоплення і 8С3-5йЩІю ад в якості детектуючого антитіла. Сигнали М5О перетворювали в концентрації нг/мл реакційноздатних видів ТТК, використовуючи стандартну криву ТТК Е87М//110М, створену вище. На підставі цього аналізу середня концентрація 6С1-реакційноздатного ТТЕК, присутнього в контрольних зразках, становила 271 185 нг/мл. На противагу цьому, середня концентрація реакційноздатного ТТЕ, присутнього в зразках плазми УЗОМ, була вищою - на рівні 331 ж/- 95 нг/мл. Взяті разом, ці результати аналізу М5О показують, що антитіла до ті5-ТТК здатні розрізняти зразки з АТТК і зразки звичайної плазми. Це гарантує подальше поліпшення антитіл до ті5-ТТК для використання в діагностичних тестах захворювання АТТЕК.

Приклад 7. Дизайн гуманізованих антитіл 905

Ї00337| Відправною точкою або донорським антитілом для гуманізації було мишаче антитіло 905. Амінокислотна послідовність важкого ланцюга зрілого тоО05 представлена як 5ЕО ІЮО МО: 1. Амінокислотна послідовність легкого ланцюга зрілого т9О5 представлена як БЕО ІЮ МО: 16.

Амінокислотні послідовності СОКІ, СОК2 ії СОКЗ важкого ланцюга представлені як ХЕО ІЮО МО:

Зо 13-15 відповідно (як визначено по Кабату). Комбінована по Чотіа-Кабату СОБ-НІ представлена як ЗЕБЕО ІЮ МО: 117. Амінокислотні послідовності СОКІ, СОК2 і СОКЗ легкого ланцюга представлені як ЗЕО І МО: 24-26 відповідно (як визначено по Кабату). У цьому прикладі використовується нумерація Кабата. 00338) Варіабельна каппа (УК) антитіла т90О5 відноситься до підгрупи 2 миші по Кабату, що відповідає підгрупі З людини по Кабату. Варіабельна важка (МП) антитіла т9О5 відноситься до підгрупи За миші по Кабату, що відповідає підгрупі З по Кабату. Дивіться КаБбаї єї а. Зедоепсев5 ої Ргоївіп5 ої Іттипоіодісаї! Іпієгеві, Ей Еайіоп. МІН Рибіїсайоп Мо. 91-3242, 1991. СОВ-1І1 з 16 залишків відноситься до традиційного класу 4, СОК-12 з 7 залишків відноситься до традиційного класу 1, а СОК-ІЗ з 9 залишків відноситься до традиційного класу 1 в МК. Дивіться Магпіп 5

Тпотпіоп, у. Мої. Віої. 263:800-15, 1996. Комбінована по Чотіа-Кабату СОВК-НІ з 10 залишків відноситься до традиційного класу 1, і СОК-Н2 з 17 залишків відноситься до традиційного класу 1. Дивіться Мапіп 8. Тпогпіоп, У Мої. Віої. 253:800-15, 1996. СОВ-НЗ не має традиційних класів. 00339) Залишки в зоні взаємодії доменів УК і МП є такими, які зазвичай можна спостерігати, за винятком Геи у позиції 47 в важкому ланцюзі, оскільки зазвичай в цій позиції зустрічається

Туг. Ця позиція є кандидатом на зворотнє мутування.

Ї00340| Було проведено пошук по білковим послідовностям в базі даних РОВ (Оезпрапае еї аІ,, Мисівіїс Асідє Ве5. 33: Ю233-7, 2005) щоб знайти структури, які б надали грубу структурну модель для 905. Кристалічна структура Таб антитіла (код рар 1МУ)) (КигПеїпіком еї аї., У). Мо.

Вісі. 332 (2): 423-435, 2003) була використана для структури МК, так як вона мала гарну роздільну здатність (1,22 А) і загальну подібність послідовностей з УК антитіла 905, зберігаючи ту ж традиційну структуру для петлі як і в 905. Для структури Ми використовували мономерне антитіло з кодом раб 15ЕО (Сомасеи57асі еї аї., Асіа СтузіаНодг. О Віої. СтувіаІоаг. 57 (РТ 9), 1307-1309, 2001), оскільки воно мало гарну схожість послідовності і роздільну здатність (2,0 А), і воно має ті ж традиційні структури СОК-НІ і СОБК-НЕІ, як ті ж МН антитіла 905. Ми моделювали ланцюг МП антитіла 905 також застосовуючи структуру ТМОЖК, так як вона має кращу роздільну здатність 1,28 А (О5іегтеїєег еї аїЇ., Ргоївіп5 21 (1):74-77, 1995). Програмне забезпечення

ВіоїЇ итіпаїе (ліцензія від Зспгодіпдег Іпс.) використовувалося для моделювання грубої структури 905.

Ї00341| Пошук по базі даних з МОВІ, яка не містить надлишкових білкових послідовностей, 60 дозволив вибрати відповідні каркаси антитіла людини для перенесення СОК миші. Для МА був обраний важкий ланцюг Їд людини ВАСО2114 (СІ: 21670209) (5ЕО ІО МО: 3) (АКаногі еї аї.,

Сопвігисійп апа сНагасіевгігайноп ої апіїрбоду Ігагієв: ізоЇайоп ої Тегарешііс питап апіїбодієв апа арріїсайоп о Гипсійопа! депотісв, Рігесї Зиртіввіоп, шу 25, 2001). Він має традиційну форму, як і в 905. Він є членом важкої підгрупи 1 людини по Кабату. МП з 905 має деякі унікальні залишки каркаса, і будь-який людський акцептор каркаса не показував дуже високої гомології. Тому ми також використовували другий каркас, ААХ82494 (СІ: 62421461) (ЗЕО ІЮ МО: 4) (І ипадиіві еї аї.,

Іптесії. Іттип. 74(6), 3222-3231, 2006) щоб створити гібридний каркас акцептора. Для МК був обраний каппа-легкий ланцюг людини з ідентифікаційним номером МСВІ АВСб6б6952 (01: 84798006) (5Нгіпег єї а!., Массіпе 24(49-50):7159-7166, 2006) (ЗЕО ІО МО: 18). Традиційні класи його СОК-1 1 і 12 такі ж як і в батьківському МУК. Він є членом каппа-підгрупи 2 людини по Кабату.

І00342| Були сконструйовані вісім варіантів варіабельної області гуманізованого важкого ланцюга і п'ять варіантів варіабельної області гуманізованого легкого ланцюга, які містять різні перестановки замін (Ни9О5МУНм1, 2, 265, 3, 30, 4, 456 ї 5 (ЗЕО І МО5: 5-12 відповідно) і

Ни9О5МІм1-5 (5ЕО І МО5: 19-23, відповідно)) (Таблиці 7 і 8). Ілюстративні гуманізовані конструкції Мп ії МК із зворотними мутаціями та іншими мутаціями, на основі вибраних людських каркасів показані в Таблицях 7 і 8 відповідно. Заштриховані сірим області в першому стовпчику в Таблицях 7 і 8 позначають СОК, як визначено по Чотіа, а заштриховані сірим в інших стовпчиках в Таблицях 7 і 8 позначають СОК, як визначено по Кабату. 5ЕО І МО: 5-12 їі 19-23 містять зворотні мутації та інші мутації, як показано в Таблиці 9. Амінокислоти в позиціях Н42,

Н47, Не, Не82, Н8З2(Б), НІТ08,18,19,118,119,136,1 39, 1 60, 1 70 і І 74 в Ни9О5УНмІ, 2, 26, 3, ЗБ, 4, 465 і 5 і Ни9О5МІ м1-5 наведені в Таблицях 10 та 11.

Таблиця 7 1уманізовані облаєті У Ох т а | вв || м - - - її У: й - в т й - ни и нн р нн нн чн нн т. візаві ве в ак іван і: о - ї о песто Ме чу ях як -к | ту | т "т р Т У шко чу . на ж ее -ї - я

Е чо Е - я Он го; Ф 25 І ПЗ Зк -- ; ш вш щ щі ті р туї -т- ж, Ії тк уз г як са Е ух вові о ішщ о |що |що в т - А що М | шБ Ж й Б - Ід - | Бех) з | 8 Ех 185 555 8 |в ши ши ще 2 в | т 5 51515155. У т то рі У оо-х ОО ме - - ме -

М т А З ву 5 що |З ее |що | |що ще щ

В В З ща пам мо не НИ ос НИ Не о хе рей Ух т ї-я ш х щш г т е- - чт м з Фо мі іт ; ча з ши и не: В НИ ПИ Пес Поч Нео ИН еВ НН Ви а ДЕ Я п ШОЕ, ж А || ш 1» шШ ж |Щ ж | Ш | щЩ | ж що |З ЩОБ с прорнев ре пон кв в 6555 55

БЛШЕЛИ ЕЛ СБ НО БИ КПИНН БВ БНО БО ББЖ БИ ПБС яд Ще се є є ЕЕ потр в гг пові 1 1 95 РО Р у - тих р д- ге сте меч т Е

Фо» в'за|заА авіа ків ав 'ів

Ж ш їд" жк, т й с . сні ок т но -й-к ее ; мк "в я | Б код ПЕ ДИ ПЕК М М оо ДИ Нео ДВ МИ хо о ДИ ОЗ ВН По ДН г с рей 5 шЕ щі -щ Су -- НК тії т - т: їк «Ж ТО ту з т ПО її - р З- з- - т- «о Х-е Я ле х ВИ й й вве те аа | я у ох ш щ КУ о- по Не й -д к- й «о а х Ж - - х 2 З хх я віх ря Кк ші мк в щ ях ша ме «о «В як Ук У ри Ук У Ук

А | 6 |а|ш ях щЩ З В || дів вв

Я | Я воім є | ВІ |В ЕЕ, г з -«Е пе щи шо Шо й ш ш в ш шодо щу ж | АХ Кк щ - |Щ ж |щЩ ж | щ ш щ Е ш Б ЩІ

ОЙ ОТСсрЕ- І Й й І й Й Й або ге 26 с б с с |б | |в оо оо с я ні

З Щі -СБЕ-

МО ША 27 Е ЕК Е Е Е Е Е Е Е Е ЕТ я ні 5 Щі СОК- 1128 т |1 ї ши пи п п о пн по У я ні о сон-

Ем 29 2 т Е Е Е Е Е ЕК ЕК Е Е т Е о СоЕ-

Я ЗО 30 5 5 5 ве З 5 ві 5 Не З 5 с. НІ а

ЕВ 151

ЕЕ

Й. 5

Ес щі. 5 Іа

НЕ є аа 33 с 33 11

ЕН т т- |. -е | Ж - | КЕ з а з а1:8 жи иа ВЕ т т е зе о «ях сна щі щшщ пу КУ я- о дк кВ | б |в о ве в об в ре р я кеш ши сти ПЕ СИ ПЕСНИ М ЕЕ М ПС як Є.

В В хм де в ся - - і т ге те Б :: з м щі ; Гу мот Можу сх м я дк шх ох Ка хе в ж | |З | Б|ВІЕ ВА ЕЕ в щ с са Ор г п ук г дх дб в в | 8 а |В іш |в |в ше ше я | ще я |в |В ВІК 2 «в -- са щ- ро - ре «: Сас ре ЩЕ рес - Сас оон хо т Кк и ме ш ху |що щ що рев щі І щ до - ще ни 0 3 ,ІІ,ХНХІУЬаМЦНІІО СО

МБ

З З : З З З: З З 5: ши І кто

ОО а. м а Іо

Б о а 5 и ВА 3333

Б 1515

Б

5 З ЇЇ З З : З З З З з: 3

БО

3 ве а ММ ОО

МБ а ІІІ а а я

Б М

У АЕН вон и І М с 5 Іс вон и І М

Ін М М МІ ММ вон А І М в І Іі 2:23 а 8 Ви.

Б І

« жд ов Є |в 510.15 их 1554 «| Б» зе 248 віх авг а

ЕЕ й ї о ЗИ ПИ НИ ПО як І ПРИ ПО Во ДИ ПО По в Па о о - -- - ж ре - я - з- з- «5 з- я ле ін З-е

С Е в , те вони п: м Мо ПЕКИ ПИ НІ с ИН М с че ве І | Ж 05 8 ЕЕ |З || ||| - х х їй а в | |в а |в ве ш

В Ее ке що ти о ш «о Ук пе Як Ук ше Як т

Ж - я о го! --ко щ ик м чл Га що чл з т ча

З | а Б | я || 5 |В вів в ваг и ше св Р Мо Ен МН пок: и ос НИ МЕН По НН МО МИ он ШК

ЦЕ 1 Шо р й | ЩО | що Шо 00 що шо оо |що доні о шо» або св в ЕВ ВВ 5. 2 ВЕ ВН В 5.

Й; 53 ва В

Б. ши я 1. шо 1 85 реа В 5. 818 51575 555555 реп кг

ВЕЛИ БИ Сол НО БЛННЯ ЗНННЯ БО БНО НН Б ЗНЗ ПАНИ ПЕНЯ їе я |д |в || ІВ

У 7 р зе г. -ї- ще їй хе НИ - |. в'за зав нів а а ма рх - ок ко інт щ й інт щі в х м - Кн ТІ Х

Ж р ш шт шо щої Ф -6 15 - | І || - нини Еш о те чен ХВ ЕН ВЕх ЕНИ МАКЯ: ча ие ши: ние ши ен НЕ: НИ СИ МЕ ПО ПЕС ПОС ПЛ Я МО сн Сн вчи ох З по ПО ок НИ ПО о М Мо Но НН НО се сн ся

Га щ же щ «т меш «ос ях шк ях - мк ях й не я - ш 2 ик моя ми т Ух їту ме ай т у їт 8 | | я || 5 5 аа ва а св км пон мин о М І Пак в Мн пос: М с п НИ о ПОС НИ МО І Шин Я - ж |В | ш в ЩщЩ ж |що хх | ЩО шШ ШО | 8 ж Б п рів 18 8 855 с

НН

3. сг в г

НН

33333 о а.с 5533 с я вн г

ВЕН

ТТН. со 333333. с о

В щі д жд в | Хв є є 5 85|5 515155 - - З пава ки ш З Зав Мо - щ ЗА -- ее В МЕС щш кл Не ре ши щи ях й В х г окон || я || СУ ; 5 | Б ш (ЕЕ ОД що що! що фр ЗОЇ оо щ о тп й -ї от В с-е он ря - е У | т,

Бра | шо |В ВА ВВІВ І ж | ЕЕ 12 В 8558 щі Б Б ЕЕ БЕ є

Б Бе ще те Фе -о «о шк у о Ух як вк Ух я ву ш 2 їн - м щі Ре з кез зх їт кез зх ; мет їй ми ИН ПОРО пес НН ПН т ПОВ ПН С Пс ПН ВК М - а. 55 З З З З З З З З З З З. с 5 5 5 5 5 55 5 5 5 5 5 55 5 5 55 5 5 55 5 5 З 5 З З З З З З З З 5 З З. 5 НН В

ЕЕ г

НН, с 5 5 З 5 З З З З З З З З З. 5 5553. 00 5. 5 З З 5 З З З З 5 З З З 5 З 6 М М 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 перерв т3195719 19519199 51995

Таблиця 8

Гуманізовані області ХЕ ЗТ оч з ш ща н й

ЖІ ш Е ФО ш ся - - до Фо ее || 8 - 8 - їх щ не не

З В М дор У НИЙ шої. вро д | якх мо що |що. г ще щи ее ся -8ж ОЖ | н ж ші ж -щ Ж в |в | 5 че - пк Ева "в'в|" ват" ш до Б Ф гаше: ро чу ха мо Ше го хх щу ж чУ ж я ш хх че то су 0 су що осу 88 су | о су | су | 3 ОсУ -- | жк | щ к Є |щ - | Щ 5 ш іш б шо

ЕОМЕлН НЕСЛИ ИН СП Мо СО в п Б НЯ 55 19 39779555 59

БАН СЛ ЕЛ СОНЯ Є УНН Є ЗОН Є ВАННЯ ЕН ЕНН Є НАННЯ ЕЗАНННЯ

ОМЕЛИ СЛ СС УНН НН ЕН СОН Є УНН Є ЗНННЯ с 55 я сг с а - 55

С

С є нх

СС з й З

З 5 м -

Гз че я Кз я С ш сте Мо нщ сте том | 5 ж | к в Ж ш ш я са

Фо ш х "«- т Ка т т т й г Шо Б дк. км | щ шо я З осевоож -щ-й ж т й | тк я є - а вва тла гав а "аа | мо про - що чо во | ож А ху чо 5 || в хо» БУ остов ин ОН ще - Б шо В то в |В в тон та В

С: с

НН. с

Й. а 5 с

Й. 5 г г г г 5

Й. о ши НН ЕН НН

Й.

Вс а г 53535335 5555555. я.

З З З 8 З З З З З Її З З З 3.

Й. сс 5.

НН. г а. г яр 57757 15755 151 рр тт ра 2 «з - їй -

ЕЕ р. В щі

Яся «З Ж -- - п сн тн сн р я- ні ни ш че - с с шо - їх га г 5 З до Е - - 2 т «1 т нн і й од -щщ- ж - ж се стро Фо мож й й ки - щ- ФО У че т хо щи ом ше ши 555 ве 5 вв: вв що | шк й де ну НИ ШИНУ; шоООбе се ШИ ШУ І С: ШУ ОТ ж | | к що х 5 |Щ й б | щ й

ЛЕ ЛСЛслЕ НИНІ НИМИ СЛИНИ С ПНО Є: НН Є ТАН ННЯ яв от 15775779. 95151 3555

Би

ВО и М В и, я

ВОМ В ВО В ВОК п п п ОО В В ХХ с;

Б во м ОВО сс з оо її 55 о в в В В Ов г і.

В а МК, с а п и є г

Б 3 ОО

ОМ в В

Це у п - Я х ж х шІ ее В Ще -ш- Ф до -ш 2 ду о о х ут о - - - т-5т54 -т с- -3 ч й тт - "зх Є т а - ех е- р т ах - У Й ж я ою || ж | 55 55 | 8 | 5

М о в ож | ше в НН нн Не НН НЕ НН я я Ес пе Бо - Вр ж В "й в |" ватага шини шик ни хни и Мен ЛИ МН НН ДИ ПИ АЛ НИ МЕН з і не дк Ід В що шо ооо Ох ож ж ко К Б ко Же | ЩО ху - щ ще що - | що Є |що що

ВОЛІ БСлИ Бони Ес СНО Є: НН ЄП БО Сл УНН УНН яв 1 плед кю пк сет 18 18717558 8

І

Я ЕН ЕЕ с

НК НЕ МО я я я ВО я я я г с

НЕ 360 00 6 ДФ ФДФй 6 Ф ФА її ФДї й щ-

Б

ЕК и, 5;

« ро її -к С в я | а

Я 5 | - - - й я

Га їх т се - щ - - тії т-а сеї - я я 15:55 вата сеса се с:аа я | я 0 ія БВ во аву вах ж | - | Б і шо Ж Ж о | ШІ Я шо с а В ВЕ ВО г с 55.

НЕ. г ну г с г 5 З 35 5 5 З 5 З 5 її 5 5 55333 5; 5 5 3 З З 5 З 5 З З її 5 5

НН с зерен ля 1679 319399

Б2

Таблиня 5 зворотні мутації та інші мутанії Уд. У,

Послідовність гкзона акнептора Ун або

Варіант Ун або У У Заліки каркаса донора.

Й І Ідентифікаційні номери МСВІ пПизрУуУнУї І й ШИ

Щ Що ВАСОЯ БААХМВОЇ на, нео, НЕ:

ГЕО МО: 5 | шо І (ББЕО Ю МО: 3 1 3 відповідної

Й Ідентифіканійні номерн МОВІ пПибруУнуг І й ШИ

ВАСОЯ БААХМВОЇ нНаг,нНео, НЕ, НЕ (ЗБО ПМС | Й шо (ЗБОЮ МО: 4 1 3 відповідної

Ідентифікаційні номери МСВІ

Нни9ЮУУНУгЬ І й Що ВАСОЯ БААХМВОЇ На. нат, нів

ГЕО МО: 7 | шо І (5БЕО МО: 5 1 З відповідної

Й Ідентифіканійні номерн МОВІ

НПибруУнуз І й й І й ДИ ВАСОЯ БААХМВОЇ не, Не, НЕгв

Ї5ББО ТО МО: 8) | шо (БО ПО МО: 3 1 3 відповідної

Ідентифікаційні номери МСВІ

НнІюрьуУНУЗЬ

Щ Що ВАСОЯ БААХМВОЇ наніс

ГЕО МО: | шо (БО У МО: 5 з З відповідної

Ідентифікаційні номери МСВІ

НиврзуУнуй І й Й

ВАСОЯ БААХМВОЇ Не. Не

БО МО: 10 | шк (БО ОО МО: 3 з З відповідної ідентифікашійні номери Меві нНюрУнучь | І Ш

Щ ДІ ВАСОЯ БААХМВОЇ наніс

БО ПМО І, | шк І (ЗБОЮ МО: 3 з З відповідної

Ідентифікаційні номерн МОВІ пирУуЄНнуХ І й й й ШИ ВАСОЯ БААХМВОЇ Нана, НнЕгв

БО МО: 12, (5БО МО: 3 1 4 відповідної

Ідентифікаційний камер МСВІ нНизрруті хі

АВСевВО5І 16

СББЕО ТО МО 19, (БЕ УМО ІК дими О ІЛЕНТНіКаННННя Номер хе: ни ! дани ем о. щ МД !

ШИ 0 БАВОбБОВУ) їі Ні :

ОБО МО МВ Ру ! ! і ОС БЕСТЕ МО 1 Е !

ШИ | "Ідентифікаційний номер МС

НИЗУ Код т. !

ШИ . АВСОВЗІ ЕФ :

БЕКОН жк у ни ИН | Е ! ! ВЖК О МО: 15 Е !

ШИ о Ілентифікаційний о номев о МОВ.

ІОНИ кі ся ї пики и , й І : : ПаВСеа Бреда ЛО ке ОІВ ке не п ПИ : :

ОБО МО: 18) ! нин пн нн вв

Б. Ідентифікаційний номер МС нер яУТхя ННЯ БЕБІ г Бл г Бе т, ії. САВСеВБОЗІ Е З

ОЗЕОПМОКІМ І 1 : ! ОБЕСНЕ МОК ТК Е !

Таблиця 10

Нумерація залишків каркаса нео Кабату для зворетних мутаній та інших мутацій в областях УВ гуманізованого знтитіла 915 пен ние ие и г х Е ря г ря х дк з ЖІ о | ш ка В ш щ Е

Ж соте - щ я їк в їх г п Юе се д я |ІшШ в 5 м Уз ФУ за м м сл ме - 8 Б КІ в оМ| З в ві а З З а ак я й ЕЕ шк ЕЕ | Е т В 5 5 5 5 І - геї д | - йо щ -- а З її - а я а т : щ Вр ко ше щЩщ яд кам щ щЩщ Щщ У 5 не 5 5 5 1 5 ї 5 Ії 5 ії ь нів І т т т т т і. т І ІН І т 5

Таблиця Зі

Нумеранія залишків каркаса но Кайату для зверотних мутацій та їніних мутацій в областях УК гуманізованого антитіл ЧИХ

Леткнії ланцюг | 905 Пио5 Ні НиіюОра пІзЗОХ нНизО5

Залишок і. І

АВСвеЗІ2 МІ КУНКУ УЇА Утті чім Бо: 00343) Вирівнювання послідовності Ми 905 миші (ЗЕБЕО І0О МО: 1) з модельними послідовностями миші (15ЕО Н ії 1МОК Н, 5ЕО ІО МО: 2 ії 62 відповідно), послідовностями акцептора людини (ВАСО2114 і АДАХ82494; 5ЕО ІЮ МО: З і 4 відповідно), і послідовностями

Ни9Оо5УНмІ, Нидр5УНм2, Низр5МНмг2Ь, Ни905УНуиуз, Ни905УНуиузЬ, Ни905УНм4, НиЗОр5УНмуаЬ і

Ни9О5УНУм5 (ЗЕО І МО: 5-12 відповідно) показане на Фіг. ТА. Послідовності СОВА, як визначено по Кабату, охоплені рамками, за винятком того, що перша охоплююча рамка являється поєднанням СОВ-НІ по Чотіа і СОВ-НІ по Кабату, з підкресленим і виділеним напівжирним шрифтом СОВ-НІ по Кабату. Позиції, в яких канонічні, верніальні або інтерфейсні залишки розрізняються між послідовностями акцепторів миші і людини, є кандидатами на заміщення.

Приклади верніальних/СОВ-основних залишків включають залишки 2, 49, 69, 71, 75, 80 і 94 за нумерацією Кабата в Таблиці 7. Приклади традиційних/СОВ-взаємодіючих залишків включають залишки 24, 48 і 73 за нумерацією Кабата в Таблиці 7. Приклади залишків інтерфейсу/упаковки (МН ях М) включають залишки 37, 39, 44, 47, 91, 93 і 103 за нумерацією Кабата в Таблиці 7. 00344) Вирівнювання послідовності МК 905 миші (5ЕБЕО ІО МО: 16) з модельною послідовністю миші (1МУО Її, 5ЕО ІО МО: 17), послідовністю акцептора людини (АВСб6952,

ЗБО ІЮ МО: 18) і послідовностями Ни9О5МІм1, Ни9О5МІм2, Ни9О5МІм3, Ни9О5Ммі мА і

Ни9О5МІм5 (5ЕБО 10 МО: 19-23, відповідно) показане на Фіг. 18. Послідовності СОМ, як визначено по Кабату, охоплені рамками, за винятком того, що перша охоплююча рамка являється поєднанням СОМК-НІ по Чотіа і СОВ-НІ по Кабату, з підкресленим і виділеним напівжирним шрифтом СОМК-НІі по Кабату. Позиції, в яких традиційні, верніальні або інтерфейсні залишки розрізняються між послідовностями акцепторів миші і людини, є кандидатами на заміщення. Приклади верніальних/СОК-основних залишків включають залишки 4, 35, 46, 49, 66, 68 і 69 за нумерацією Кабата в Таблиці 8. Приклади традиційних/СОК- взаємодіючих залишків включають залишки 2, 48, 64 і 71 за нумерацією Кабата в Таблиці 8.

Приклади залишків інтерфейсу/упаковки (МН «х- МІ) включають залишки 36, 38, 44, 47, 87, і 98 за нумерацією Кабата в Таблиці 8. 00345) Обгрунтування вибору позицій, вказаних в Таблицях 9 і 11, у варіабельній області легкого ланцюга в якості кандидатів для заміни, такі. 00346) РВА: модель показує вигин в петлі в цій позиції, тому була випробувана зворотна мутація на А для пом'якшення цього.

Ї00347|Г9Р: модель показує вигин в петлі в цій позиції, тому була випробувана зворотна мутація на Р для пом'якшення цього. 003481) Р185: Р в цій позиції зустрічається рідше. Була випробувана мутація на 5 для того, щоб знизити викривлення петлі. 003491 А19У: А і М в цій позиції зустрічаються однаково часто. Була випробувана мутація на

М для того, щоб знизити викривлення петлі. 00350) УЗ6Е: Це залишок інтерфейсу, і зазвичай він являє собою У або Р. У має додаткову гідроксильну групу, яка може потенційно впливати на упаковку ЇС ї- НС. Полярність У36 може потенційно перешкодити розміщенню залишку НО5 важкого ланцюга СКО-НЗ. Гомологічна модель показує, що У в цьому положенні буде формувати Н-зв'язок з Е100 (д) в НЗ ае-помо, що може привести до обмеження рухливості НЗ. Як РЕ, так і М використовувалися в окремих версіях.

І00351| КЗОК: К формує Н-зв'язки з сусідніми залишками в цій петлі на відміну від К. Щоб виключити будь-який вплив на стабільність петлі, була випробувана мутація на К. (00352) 0605: присутність О в цьому залишку показує високий ступінь ризику протеолізу. У деяких версіях він був замінений на 5-залишок, який найбільш часто зустрічається в цій позиції в клітинах зародкової лінії людини. Це, як передбачено, підвищує стабільність. 00353) О70А: О має потенціал протеолізу, тому була випробувана мутація на А.

І00354|К74К: К, здається, стабілізує петлю в порівнянні з К в цій позиції, тому була випробувана зворотна мутація на К. 00355) Обгрунтування вибору позицій, вказаних в Таблицях 9 і 10, у варіабельній області важкого ланцюга в якості кандидатів для заміни, такі. 00356) 542Е: Е має іонні взаємодії з К в позиції 44. Щоб виключити будь-який вплив, який можуть мати ці взаємодії, в деяких версіях була розглянута зворотна мутація на Е.

І00357| ММ47!: Це залишок інтерфейсу, зазвичай МУ. У важкому ланцюзі 905 миші це Г, тоді як в каркасі антитіла людини в цій позиції знаходиться М/. Хоча І. і М/ є неполярними, фенольне кільце в М/ може потенційно впливати на упаковку легкий ланцюг:важкий ланцюг. УМ і Ї. були включені в окремі варіанти.

І00358| 169: Це залишок Верн'є, частина основи СОМК-Н2. Відповідно до гомологічної моделі, ароматичне кільце Е в мишачих послідовностях являє собою стек з ароматичним кільцем залишку 759 СКО-Н2. Залишок І в цій позиції порушує цю укладку. І і Е були включені в окремі варіанти.

ІЇ00359| М825: М в цій позиції дуже рідко зустрічається в каркасі антитіла людини. Більш поширеними є А або М. Зміна залишку на більш поширений 5 може зменшити імуногенність, яка може бути пов'язана з рідкісним М в цій позиції. Грунтуючись на модельних спостереженнях, існує ймовірність того, що М взаємодіє з Геи80, який є залишком зони Верн'є. М і 5 були включені в окремі варіанти.

І00360| 582(6)/: 5 присутній в цій позиції як в мишачих, так і в людських каркасних послідовностях, але 5 в цій позиції є менш частим. Судячи з того, де цей залишок знаходиться в моделі, він, можливо, може вступити в контакт з антигеном. Відомо, що залишки в каркасній області З важкого ланцюга зрідка вносять вклад в зв'язування. 5 і Ї були включені в окремі варіанти.

І0ОЗ61| Т1081Г:: | є найбільш частим залишком в людських каркасах в цій позиції, тому Г. був випробуваний в деяких варіантах. 003621 Оскільки для гуманізації варіабельної області важкого ланцюга 905 використовували два акцепторних каркаса людини (ВАСО2114 і ДАХ82494.1 (5ЕО ІЮО МОЗ: З і 4)), існують певні позиції каркаса, які мають різні амінокислоти в двох акцепторних каркасах. Гуманізовані варіанти варіабельної області важкого ланцюга 905 можуть містити кожну з двох амінокислот в цих залишках. Приклади позицій, в яких ці два акцептора розрізняються, включають позиції НІ19 (К або К), Н4О (А або Т), Н4і4 (С або К), Н49 (5 або А), Н77 (5 або Т), Нвга (М або 5), Н8ВЗЗ (ЕК або

К), Н8В4 (А або 5) і НВО (М або М) за нумерацією Кабата. Обгрунтування вибору однієї амінокислоти або іншої в цих позиціях полягають в наступному. 00363) НІ19 (РЕ або К): К і К присутні в двох розглянутих каркасах, тому кожний залишок був випробуваний в окремих випадках. 00364) Н4О (А або Т): А і Т присутні в двох розглянутих каркасах, тому кожний залишок був випробуваний в окремих випадках. 00365) Н44 (С або К): С і К присутні в двох розглянутих каркасах, тому кожний залишок був випробуваний в окремих випадках. 00366) Н49 (5 або А): це залишок Верн'є, який упаковується під СОК-Н2. У послідовності миші це А. Невелика різниця розмірів і гідрофільний характер 5 можуть потенційно порушити основу СОК. 5 і А були включені в окремі версії.

Ї00367| Н77 (5 або Т): 5 і Т присутні в двох розглянутих каркасах акцептора людини, тому кожний залишок був випробуваний в окремих випадках. 00368) Нвга (М або 5): М в цій позиції зустрічається набагато рідше, ніж 5. Більш того, 5, швидше за все, сприяє зв'язуванню антигена. Мутація в 5 була випробувана в деяких варіантах.

Ї0ОЗ69| НВЗ (К або К): К в каркасній області З знаходиться близько до поверхні області зв'язування СОМ. Заміна його на К, який є більш громіздким ніж К, може перешкоджати розміщенню антигена. К зустрічається найбільш часто, і К є третім за частотою в людських бо каркасах в цій позиції. Е і К були включені в окремі варіанти.

00370 НВ8ЗА (А або 5): 5 і А присутні в двох розглянутих каркасах, тому кожний залишок був випробуваний в окремих випадках. 00371) Н89 (М або М): М і М присутні в двох розглянутих каркасах, тому кожний залишок був випробуваний в окремих випадках. 00372 П'ять варіантів варіабельної області гуманізованого легкого ланцюга і п'ять варіантів варіабельної області гуманізованого важкого ланцюга:

І00373| Ни905М/ї. варіант 1 (заміна УЗ6Е показана нижнім регістром):

РІММТО5РІ БІ РУТРОЕРАБІЗСНЗОКОІИЇ НЗМОаМТМІ МУЛ ОКРЕООБРОЇ ІМАМ5МІ АБаМРОВ

ЕзаБаватовгТКкІЗАМЕАЕОМамУУСМОнНІ ЕМРІ ТРИОСТКІ БІК (ЗЕО 1О МО: 19)

І00374| Ни9О5Мі. варіант 2 (без замін):

РІММТО5РІ БІ РУТРОЕРАБІЗСНАЗОКОІИЇ НЗМОаМ МІ ММ/М ОКРИОБРОЇ МАУ ЗМІ АБаМРО вЕЗаЗОаБатОвЕТІКкІЗАМЕАЕОМаМУУУСМОНГЕМРІТРООСТКІ БІК (5ЕО ІО МО: 20)

І00375| Ни905М/ї. варіант З (заміна 0605 показана нижнім регістром):

РІММТО5РІ БІ РУТРОЕРАБІЗСНАЗОКОІ ЇЇ НОМОМТМІ ММ ОКРИОБРОЇ МАУ ЗМІ АБамУрРзА

ЕзавБаватовгТКкІЗАМЕАЕОМамУУСМОнНІ ЕМРІ ТРИОСТКІ БІК (ЗЕО 1 МО: 21)

І00376| Ни905М/ї. варіант 4 (РВА, Г9Р, АТ9М, УЗбЕ, КЗОК, 0605, О70А і К74К показані нижнім регістром):

РІУМТО5Зароі РУТРИЕРУБІЗСВНОЗОКОЇ І НЗМОаМТМІ МЛ ОгТРООБРОЦП ІМАУЗМІ АБаМРЗАЕ завзавзатагті"ЗАУЕАЕОМаТмУУСМОнНІ ЕМРІ ТЕРСОСТКІ ЕК (5ЕО І МО: 22)

І00377| Ни90О5М/ї. варіант 5 (РВА, Г9Р, РТ85, АТ9М, УЗбЕ, КЗ, 0605, О7ОА, і К74К показані нижнім регістром):

РІУМТО5Зароі РУТРаЕзУБІЗСНЗОКОІЇ НЗМОаМТ МІ МУЛ ОгТРИОБРОЦП ІМАУЗМІ АБаМуРЗВЕ азавзатангті"ЗВвВМЕАЕОМамММУСМОнНІ ЕМРІ ТЕСОСТКІ ЕК (ЗЕО ІЮ МО: 23)

І00378| Ни905МН варіант 1 (заміни УМА71,, ІЄ9Е ії М825 показані нижнім регістром):

ЕМОЇ МЕЗО, МОРОИБІ ВІ БСААЗОЕТЕЗЗУТМЗУУВОАРИаКаї ЕІМАБІЗМЗИаОТТ МУРОМ

КавеЕТтЗВОМАКМ5І М О5М5І КАЕОТАУУУСАВНУУУСсССОСИ!ТУССЕУЕЕрУМУСОаТТУТМУ55 (5ЕО І

МО: 5)

І00379| Ни905МН варіант 2 (471, ІЄ9Е, М825 і 582(0)Ї. показані нижнім регістром):

ЕМОЇ МЕЗО, МОРОИБІ ВІ БСААЗОЕТЕЗЗУТМЗУУВОАРИаКаї ЕІМАБІЗМЗИаОТТ МУРОМ

Коо) КавеЕТтЗАОМАКМ5БІ МІ О5МІ ВАЕОТАУУУСАВНУУУасаУваМмЕЕрумаоаттМТУ55 (5ЕО Ір

МО: 6)

І00380| Ни905МН варіант 25 (заміни 542Е, УМА71. і Т108І. показані нижнім регістром):

ЕМО МЕЗОСИЇ МОРОСБІ КІ БСААЗИаєТЕЗЗУ ГТМБУУУВОТРЕеЕКВІ ЕІМАЄІ ЗМОВ ТУМРОТУК

САЕТІЗВОМАКМТІ МІ ОМ55І КЗЕОТАМУУСАВНУУУСсС,СаУаамЕЕруУумаостІМтУ5 (5ЕО Ір

МО: 7)

І00381| Ни905МН варіант З (заміни Іб9Е, М825, М825 і 582(Б)!. показані нижнім регістром):

ЕМОЇ МЕЗО МОРОИБІ ВІ БСААБОЕТЕЗЗУТМЗУМУВОАРИаКаИї еЕМУУ5ЗЕІЗМЗаОТТУМРОТ

УКавВЕТІЗВОМАКМ5І МІ О5МІ ВАЕОТАУУУСАВНнУУУасаУааМмЕЕрУмсОоатТМТУ5 (5ЕО

ІО МО: 8)

І00382| Ни905МН варіант ЗБ (заміни УМА7І. і Т108І. показані нижнім регістром):

ЕМОЇ МЕЗО МОРОСБІ КІ БСААЗИаЄТЕЗЗУ ГТМОУУУВОТРОКВІ ЕІМАБІЗМЗИаЮТТтУМРОТМ

КавеЕтІЗВОМАКМТІ М ОМ55І КЗЕОТАМУУСАВНУУаСвСамУаам гЕруУмуаоатіМТмМ55 (5ЕО І

МО: 9)

І00383| Ни905МН варіант 4 (заміни М825 і 582(Б)!. показані нижнім регістром):

ЕМОЇ МЕЗОСИЇ МОРО,БІ ВІ БСААЗОЕТЕЗЗУТМЗУМУВОАРОаКагЕММУЗЕІЗМЗарТттуУМРОТ

УКОаВЕТІЗВОМАКМ5І МІ О5МІ ВАЕОТАУУМСАВНнУУУасаУааМмЕЕрУмсОоатТМТУ55 (5ЕО

ІО МО: 10) (00384) Ни905МН варіант 46 (заміни УМА7І. і Т108І!. показані нижнім регістром):

ЕМОЇ МЕЗО, МОРОСБІ КІ БСААЗИаЄТЕЗЗУ ГТМОУУУВОАРОКВІ ЕІМАБІЗМЗИаОТТУУРОТМ

КавеЕтІЗВОМАКМТІ М ОМ55І КЗЕОТАМУУСАВНУУУасамасаМ єЕрумаоОстіМТУ55 (5ЕО І

МО: 11)

І00385| Ни905МН варіант 5 (заміни 542Е, УМ471 і 582 (Б) І. показані нижнім регістром):

ЕМОЇ МЕЗО МОРОИБІ ВІ БСААБОЕТЕЗБУТМЗУУВОТРеКВІ ЕІМАБІЗМЗИаВЮТТУУРОТУК

САЕТІЗВОМАКМТІ М ОММІ ВАЕОТАУУМСАВНнУУУасаУваМЕЕруУумаоаттМТУ55 (5ЕБЕО І

МО: 12) 00386) Аналіз якості білка разом з аналізом потенціалу до агрегації не виявив явних кластерів, які пов'язані з агрегацією залишків, представлених в каркасних областях або СО легкого ланцюга або важкого ланцюга антитіла 905 (Умапод еї аІ., МАБ51 (3): 254-267, 2009).

Приклад 8. Кінетичний аналіз зв'язування гуманізованого антитіла 905 бо І00387| Кінетику зв'язування всіх гуманізованих варіантів 905, 905 миші і химерного 905 з рекомбінантним людським ТТК Е87М//110М визначали за допомогою Віасоге, як показано в

Таблиці 12. Анти-людський (ЗЕ Неаййсаге) був імобілізований на сенсорному чіпі С5 (без ланцюгів декстрану) через амінове з'єднання відповідно до інструкцій, представлених в анти- людському наборі СЕ Неайвсаге, а тАб були захоплені до рівня, щоб забезпечити максимальне зв'язування аналіту до 30-50 КО. Різні концентрації аналіту (рекомбінантний людський ТТ

Е87М/Л.110М) пропускали через захоплений ліганд при 50 мкл/хв в рухомому буфері (НВ Ж 00590 Р-20, 1 мг/мл БСА) в 3-кратних розведеннях. Для кожної концентрації реакція протікала впродовж часу, що дозволяє більш високим концентраціям аналіту досягти рівноваги під час асоціації, а також, щонайменше, 1095 сигналу до розпаду під час дисоціації. Щонайменше одна концентрація (не найвища або найнижча) була проаналізована з дублюючої пробою. Діапазони концентрацій аналіту були обрані на основі попередніх експериментів, щоб охопити межі вимірювань щонайменше від в 10 разів вище Ко до в 10 разів нижче Ко. 00388) В Таблиці 12 наведені швидкість асоціації (Ка), швидкість дисоціації (Ка) і константа афінності зв'язування (Ко) по Віасоге мишачих, химерних і гуманізованих варіантів 905 для рекомбінантного людського ТТК Е87М/110М.

Таблиця 12

Афінність зв'язування антигена антитілами 905 до ТТК людини (Е87М/110М) 00389) Ці результати показують, що афінність 905 миші до ТТК-Е87М/11ОМ (КО - 1,82Е-

О8М) була трохи поліпшена в химерному варіанті 905 (КО - 1,35Е-09М). Крім того, повністю гуманізовані варіанти 905 мають подібні значення афінності у вузькому нМ діапазоні. Ни905

Н4іЇ1 володіє найсильнішою афінністю (Ко - 2,09Е-09) серед гуманізованих варіантів 905.

Приклад 9. Дизайн гуманізованих антитіл 14058 003901 Відправною точкою або донорським антитілом для гуманізації було мишаче антитіло 1408. Амінокислотна послідовність важкого ланцюга зрілого ті1458 представлена як 5ЕО ІЮ

МО: 61. Амінокислотна послідовність легкого ланцюга зрілого т!4(038 представлена як 5ЕО ІЮ

МО: 70. Амінокислотні послідовності СОК1, СОКО2 ії СОКЗ важкого ланцюга представлені як ХЕО

ІЮО МО: 67-69 відповідно (як визначено по Кабату). Комбінована по Чотіа-Кабату СОБ-НІ представлена як 5ЕО ІЮ МО: 118. Амінокислотні послідовності СОКІ, СОК2 і СОКЗ легкого ланцюга представлені як ЗЕО ІЮ МО: 77-79 відповідно (як визначено по Кабату). Варіантна

Зо версія СОКІ надана як ЗЕО ІЮ МО: 80. У цьому прикладі використовується нумерація Кабата.

І00391| Варіабельна каппа (УК) антитіла т1408 відноситься до підгрупи 2 миші по Кабату, що відповідає підгрупі 2 людини по Кабату. Варіабельна важка (УП) антитіла т1408 відноситься до підгрупи ЗА миші по Кабату, що відповідає підгрупі 17 по Кабату. Дивіться Кабаї еї аї.

Зедиеєпсев ої Ргоївїпв ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, БІЩА Еайіоп. МІН Рибіїсайоп Мо. 91-3242, 1991.

СОВ-Ї1 з 16 залишків відноситься до традиційного класу 3, СОК-1 2 з 7 залишків відноситься до традиційного класу 1, а СОК-Ї З з 9 залишків відноситься до традиційного класу 1 в МК. Дивіться

Мапіп а Трогпіоп, у. Мої. Віої. 263:800-15, 1996. Комбінована по Чотіа-Кабату СОБ-НІ з 10 залишків відноситься до традиційного класу 1, Її СОК-Н2 з 17 залишків відноситься до традиційного класу 1. Дивіться Магіїп 5 Тпогпіоп, У Мої. Віої. 263:800-15, 1996. СОВ-НЗ не має традиційних класів, але петля з 15 залишків, ймовірно, має вигнуту основу відповідно до правил

ЗПігаї ега!., РЕВЗ І ей. 455:188-97 (1999).

І00392| Залишки в зоні взаємодії доменів УК і МП є такими, які зазвичай можна спостерігати, за винятком І 47, оскільки зазвичай в цій позиції зустрічається МУ.

Ї00393| Було проведено пошук по білковим послідовностям в базі даних РОВ (Оезпрапае еї а!І., Мисієїс Асідх Вев. 33: 0233-7, 2005), щоб знайти структури, які надали б грубу структурну модель 1408. Кристалічна структура Раб з активністю естерази (раб 1МУ)) використовувалася в якості моделі для структури МК. Вона була побудована з роздільною здатністю 1,22 А, і містить ті ж традиційні структури для СОК-НІ і СОК-На2, і також містить СОК-НЗ такої ж довжини, із зігнутою основою. Для структури Ми використовували Ем-фрагмент антитіла 7Е2 - антитіла до цитохром-С оксидази (код раб ТМОК Н). Вона має роздільну здатність 1,28 А і зберігає ту ж традиційну структуру для петель, як і в 148. Програмне забезпечення Віої иптіпагїе (ліцензія від

Зепгодіпдег Іпс.) використовувалося для моделювання грубої структури 1408. 00394) Пошук по базі даних з МОВІ, яка не містить надлишкових білкових послідовностей, дозволив вибрати відповідні каркаси антитіла людини для перенесення СОК миші. Для Ми були обрані важкі ланцюги людського Ід з ідентифікаційними номерами МСВІ ААОБЗ0410.1 і

ААХ82494.1. Вони мають загальні традиційні форми з доменами СОК-НІ і Н2 антитіла 14058, а

НЗ ААЮЗО410.1 має довжину 15 залишків з передбаченою вигнутою основою. Для МК були обрані два людські каппа-легкі ланцюги з ідентифікаційними номерами МСВІ АВА?71374.1 і

АВСб66952.1. Вони мають однакові традиційні класи для СО.

ЇОО395| Були сконструйовані три гуманізовані варіанти варіабельної області важкого ланцюга і три гуманізовані варіанти варіабельної області легкого ланцюга, які містять різні перестановки замін (Ни1458МНм1-3 (5ЕО 10 МО: 64-66 відповідно) і Ни148МІ м1-3 (ЗЕО І МО: 74-76, відповідно)) (Таблиці 13 та 14). Ілюстративні гуманізовані конструкції МИ і МК із зворотними мутаціями та іншими мутаціями, на основі вибраних людських каркасів показані в

Таблицях 13 та 14 відповідно. Заштриховані сірим області в першому стовпчику в Таблицях 13 і 14 позначають СОК, як визначено по Чотіа, а заштриховані сірим в інших стовпчиках в

Таблицях 13 і 14 позначають СОК, як визначено по Кабату. ЗЕО ІЮ МО: 64-66 і 74-76 містять зворотні мутації та інші мутації, як показано в Таблиці 15. Амінокислоти в позиціях НІ, НЗ, Н47,

НІТО5,18,19,119,126, 136, 160 і 170 в Ни14058УНм1-3, і в Ни1408МІ м1-3 перераховані в

Таблицях 16 та 17.

Таблиця 13

Туманізевані області У АС м | жи и МР Ф ж Ф а - я со в г Еш КО - се ог су

ІБ || 5 БЕ 5| 85 |в а вої - ат ва ста »за за»

ВИМ ЕлМИ Бл С ПЕ ПНЯ ПЕ КО ПО НИ ум Й шо ня В нт М НУ одно що Фе ви 2 2 З о З доз ЕФ - ее З то чи: щ 55 85515 2:5 |: БО | о

СІ Ши: ШИ НЯМ - ром и я СУЯ кош кож кожи в в | і тва || г З г З о в | 2 ЗУ вів м |В ше пе а а ще Х бу ва ша ОО гу що щоогу Ж су

Ж БО бй шо МО | ю - - - я - -- рос що -ш гі ни ш - А Ох Ох Я -- | ж | й шо й щі ж б | Щ ж що що ж що є10)

х М х що о 2 Е -Е - ж йо йо | |В 5 я жом | Фів оті хо. А Ф Ф Ф 5 | 8 | ож | що шо що - сросе тож шк » в ра-й щ ; ? о 2 ев що що що 1515 5 ЗвіІ:В8В8-ш-нхВ'еа ша в щ Б я ча жи п зу КО жу шо ож шо ож Ж ж

ОВО ій и ваш неви Ма НН М ж Є 7-2 пн г г

Ся || ко Кк кК КК м ря га . о С, в: ри що - - о | Е Ж ж х Ж ш до в

В |5| | 5 Ба 55 5 5 | Е5

Б | З зага ив'іівв | ва за | 5 Не А пе пива М "НИ а шт що ж що 5 | | Е - ш|х шЖ ш | хх о | Я | с 5

М й Щ -й щш щ ; - щ : - то щі т що зро кпк кк т 1 т о 52

А | Я | г Б М 5 5 Б М

А в 52 ва | Вб ОО) РІЗ і ї 1 і. 1. НИ

С зв в 8 8 55 8 з - гяу -- - - 55 ВВ тт З З я

З | 8 |5 вм и нвОН ни Б ВАНИ шечее до тої : : з я о 8585 шо що що 8 | ща ща ща | тм з й хх й о т в | В | Ф я В о шо мВ по пу пу ях

Я по хо хо | її У їх ше Х ге шо жов 8 В | оо сш я що ш Фі КЕ хх й | ж | й шщ ш я щ 33333533 с с 33335: с с н.с єс 5 5 З З З З 5 5 5 З 5 З З З - 35-51 с

НН

КЕ. с

ПТН ЕНН ЕС с

КОЛЕЗІ ЕС ПН НИ Є: ХНН КЗ НАННЯ Є: З С-ЗННЯ рей ча - пе це г : х щ рн ше що о - 5Б| Б - . ї а ж ши ши А ж 5 ш 5 з -щЩ | д в бе йо ою ш Є ш Є шо їЕ х й ав щ Ж З Б Ж 8 ее ше Ж шк по Ж

Б Бе ГУ р 5 ввп'іігавстма оо З оо З оо З

ШЕ ше р по яв но її ло - щі «В - ЩІ ово шо 8 еШУ: еШУ: шо Я - -- ку : --- ще |що б їх щ ж її. У ще У ще щу щ-Ь2е

Таблиця 14

Гуманізевані області УК 14058 іч ща - р г и о я ре Ж - -

КЕ чо в - -

Не хе жк ше ооо Ж оон т ч- зе ка е Ф З о ї 0» пн зах я-ко 0 КУ та їе тт ш во ве й ж й -т ж я в Ж |» х ож ож в во |В що я г в «а юю ВЗ м пз хе З хх ре р т- - - « - - МЕ тай ск щ ко

В т Те і Йо, - ; - ДВ ол, Яосі Ж ; шо : я й пики пани в а НИ Пре Я По Оля

ЕОМ ЛИН ЗВ зн о ЕН ПНЯ Со Ел

ЛИН КЛИН ЛО Є ЗА БОНН Є ТОНЯ БОНН Є ЗОНА Є-ЗННЯ м З В - в шк | В пе - р ш- 15:15:15: 58|І75:8 558 Ваз

Е ще В и и с - - - на дян, нь сн реч сн ск

ШО а в ж ин з ПИ - ФУ Ф а Ф 5 нь Фо шо» якої я: ШИ «рої» нн ши ние ше и мини сим Вс з М НИ В рок у у є ння г жен - ш- : с

Еш щак - сш ни Не ее и с и В п В НН Я

З Ше - За хзшйа ха |на | ха т Е щ Ф що І й зо щ- їв хи тр та» ж

Б Б Ка м й ; шо ; ФВ о що Ж он Ж я я тв |» жо» У шо хо «і щі -Е да т Ффо- З - що Ід ОІД дося 2, я (| Б ги 2ІНЬ-ЕШИ ШЕсЯШ В-Е НИ НЕО Яні З Є ЗИ Не НА С Не ША ев 5 18717755 р 5

БЕЛЛ БоЛІ СНІ СНИ СЛОНИ ЕНН ЕНН СЛИНИ С: ор по пов кп

НЕ: ВВ сс СЛИНИ СЛОН С: ЛАН САН СН ННЯ

Ех ух ш - м т я : - В 5-8 5 - В щ с с т зі 8 ОО - 8Вахтс ва |в | са |:а

В БО Фе я ж до що дод

В я | 5 ж В ж В

Таблиця 15

Зворотні мутанії таїний мутанії У. КІ,

Варіант Ун або | Послідовність екзона акнептора Ун | Залишки каркаса Залишки СБК о по

НІЯЗОЖУ НУ Ідентифікаційні намери МСВІ

БЕО ШО МО: | ААБЛОЯЧІОЛ 1 ААХхВОЯОЯІ Ні НІ НЯ, ніх а (ЖЕО ПУ МО: 63 14 вілповілно)

ПІНАОСВУНУг ідентифікаційні номери 0 МСВІ

СББО ШО МО: | ААПМЯІО1 А АХКЗОЯ І ніна (БЕО ПЗ МО: 53 14 відповілНнО)

БНасВУНУЗ ідентифікаційні о номерно МОВІ

СББО ШО ОМО: | ААПІЯІО1 Б ААХЕЗЯОЯІ ні НЯ? бе (ЗБОЮ МО 63 14 вілповілної на сСВУї хі ідентнфікаційні номерно МСВІ

СБС ІБ МОХ | АНАТІЗ741 1 АВСевої1 Те ра то зв Ел та ІЗБО НУ МО: 72173 відповідної

БнпізОсВУтх2 Ідентифікаційні номери МСВІ

ЄС5БЕС Б) СХ) АВАТІЗ7Я1 1 АВСвБОХІ 36 75) ІЗБСО НО МО: 72175 відповідно)

ЕН КУНА: їдентнЧнкаційні о немени 0 МСВІ

БО Б) ОХ) АВАТІЗТЯ 1 Б АВСвОКТІ Бл. ге 126 76) (БЕСО ПО МО: 72 1 75 відповідної

Таблиня 16

Нумерація залишків каркася СВК но Кабату длязноротних мутаній та інших мутацій в гуманізованинх вбластях УН антитіла 14058 пт ж

Залищшо 14С Нтабх ПчіЯсх На

Важкий Важкий й

Кк МН МНК УНУу2 УНХХ ланцюг ланнюг

НН СПОН Є: ПОЛОН Я НЄ ОН Е ЗННН НННЯ

СЛИНИ Б: ПОН. НН. ЗА Є: НН Б: ПНЯ

Таблиня 17

Нумерація залишків каркаса І СОВ по Кабату для зворотних мутанії та інших мутацій в гуманізованих областях Хі, антитіла ІС пр м

Званща 15 НвіЗбе НвіЗбе ННЯ

Легкий Легкий | й

КЕ мА УїТмі КУМ Ух ланинкт ланнюг

ЕССЛИНИ СЛИНННЯ ПЛ ЛЯ Є: ВОНННННЯ К:ВНННННЯ ННННННЯ тов 26 21 6 6 ло

Ї00396| Вирівнювання послідовності Ми 14028 миші (ЗЕБО ІЮО МО: 61) з модельною послідовністю миші (1МОК Н, 5ЕО ІО МО: 62), послідовностями акцептора людини (ААОЗО410.1 і ААХ82494.1; 5ЕО ІО МО: 63 і 4, відповідно) і послідовностями Ни14а8МУ Нм,

Ни14с8УНмг, ії Ниї14208УНУЗ (5ЕО І МО: 64-66, відповідно) показані на Фіг. 2А. Послідовності

СОН, як визначено по Кабату, охоплені рамками, за винятком того, що перша охоплююча рамка являється поєднанням СОВ-НІ по Чотіа і СОВ-НІ по Кабату, з підкресленим і виділеним напівжирним шрифтом СОВ-НІ по Кабату. Позиції, в яких канонічні, верніальні або інтерфейсні залишки розрізняються між послідовностями акцепторів миші і людини, є кандидатами на заміщення. Приклади верніальних/СОК-основних залишків включають залишки 2, 49, 69, 71, 75, 80 і 94 за нумерацією Кабата в Таблиці 13. Приклади традиційних/СОК-взаємодіючих залишків включають залишки 24, 48 і 73 за нумерацією Кабата в Таблиці 13. Приклади залишків інтерфейсу/упаковки (МН ж М) включають залишки 37, 39, 44, 47, 91, 93 і 103 за нумерацією

Кабата в Таблиці 13.

І00397| Вирівнювання мишачого 905 МУК 1408 (З5ЕО ІО МО: 70) з модельною послідовністю миші (МУ С, 5ЕО ІЮ МО: 71), послідовностями акцептора людини (АВА71374.1 і АВС66952.1;

ЗБЕО ІЮ МО: 72 і 73, відповідно), і послідовностями Ни148МІ мі, Ни1408М| м2, Ни14О8МІ м3 (ЗЕО ІО МО: 74-76, відповідно) показані на Фіг. 28. Послідовності СОК, як визначено по Кабату, охоплені рамками, за винятком того, що перша охоплююча рамка являється поєднанням СОК-

НІ по Чотіа і СОВ-НІ по Кабату, з підкресленим і виділеним напівжирним шрифтом СОБК-НІ по

Кабату. Позиції, в яких канонічні, верніальні або інтерфейсні залишки розрізняються між послідовностями акцепторів миші і людини, є кандидатами на заміщення. Приклади верніальних/СЮОК-основних залишків включають залишки 4, 35, 46, 49, 66, 68 і 69 за нумерацією

Кабата в Таблиці 14. Приклади традиційних/СОм-взаємодіючих залишків включають залишки 2, 48, 64 і 71 за нумерацією Кабата в Таблиці 14. Приклади залишків інтерфейсу/упаковки (МН їж

МУ) включають залишки 36, 38, 44, 47, 87, і 98 за нумерацією Кабата в Таблиці 14. 00398) Обгрунтування вибору позицій, вказаних в Таблицях 15 та 17, у варіабельній області легкого ланцюга в якості кандидатів для заміни, такі.

Ї00399| РВА: пролін має вирішальне значення для формування структури, а втрата або додавання проліну може впливати на структуру. Були розроблені зворотні мутації для того, щоб уникнути «додавання проліну». Проте, оскільки А в цій позиції рідко зустрічається в каркасах

Ід людини, Р був включений в деякі варіанти. 0040011 9Р: пролін має вирішальне значення для формування структури, а втрата або додавання проліну може впливати на структуру. Були розроблені зворотні мутації для того, щоб уникнути «втрати проліну». Проте, оскільки Р в цій позиції рідко зустрічається в каркасах Іо людини, І. був включений в деякі варіанти. 00401) А19У: А і М мають аналогічні частоти в каркасах людини. Обидва залишки були включені в окремі варіанти. 00402) М265: І 26 являє собою сайт М-глікозилювання в СОКІ1 легкого ланцюга. Мутація в 5 зменшує М-глікозилювання і дає більш гетерогенний продукт.

00403) УЗ6бЕ: Це інтерфейсний залишок. У деяких варіантах була зроблена заміна для того, щоб зберегти залишок миші в цьому залишку інтерфейсу. 004041 0605: 0 і 5 подібні за частотою в каркасах ІДС людини. З застосовується більшістю комерційно доступних терапевтичних антитіл, тому О був замінений на 5 в деяких варіантах.

Ї00405| Ю70А: О зустрічається набагато частіше, ніж А в каркасах (4 людини. Проте О утворює іонний зв'язок з К24 в СОКІ1 легкого ланцюга, тому як А, так і О включені в окремі варіанти. 00406) Обгрунтування вибору позицій, вказаних в Таблицях 15 і 16, у варіабельній області важкого ланцюга в якості кандидатів для заміни, такі.

Ї00407| О1Е: Перетворення глутамату (Е) в піроглутамат (рЕ) відбувається повільніше, ніж з глютаміну (0). Антитіла стають більш кислотними через втрату первинного аміну глютаміном при перетворенні в рЕ. Неповне перетворення створює гетерогенність в антитілі, яку можна спостерігати як множинні піки, використовуючи аналітичні методи на основі заряду. Відмінності в гетерогенності можуть вказувати на відсутність контролю процесу.

І00408| ОЗК: СО) частіше зустрічається в каркасах ІДС людини. К рідше, але не є рідкісним.

Обидва залишки були включені в окремі варіанти. 00409) Му471: Це інтерфейсний залишок. У деяких варіантах була зроблена заміна для того, щоб зберегти залишок миші в цьому залишку інтерфейсу. 004101 9105Т1: Т може утворювати водневий зв'язок з КЗ, тому Т був включений в деякі варіанти для підтримки конформаційної структури МН.

Ї00411| Оскільки для гуманізації варіабельної області легкого ланцюга 14058 використовувалися два акцепторних каркаса людини (АВА71374.1 і АВСб66952.1 (ЗЕО ІО МО: 72 і 73, відповідно)), існують певні позиції каркаса, які мають різні амінокислоти в двох акцепторних каркасах. Гуманізовані варіанти варіабельної області легкого ланцюга 14058 можуть містити одну з двох таких амінокислот в цій позиції. Прикладом залишку, в якому ці два акцептора відрізняються, є позиція 18 (5 або Р) за нумерацією Кабата. Обгрунтування вибору однієї амінокислоти або іншої в цій позиції полягає в наступному.

І004121118 (5 або Р): Р в цій позиції зустрічається рідше. Була випробувана мутація на 5 для того, щоб знизити викривлення петлі.

Зо Ї00413| Оскільки для гуманізації варіабельної області зрілого важкого ланцюга 14058 використовувалися два акцепторних каркаса людини (ААЮЗ30410.1 ї ААХ82494.1 (ЗЕО ІЮО МО: 63 і 4, відповідно)), існують певні позиції каркаса, які мають різні амінокислоти в двох акцепторних каркасах. Гуманізовані варіанти варіабельної області важкого ланцюга 14058 можуть містити будь-яку з таких амінокислот в цій позиції. Приклади залишків, в яких ці два акцептора розрізняються, включають позиції Н8вга (М або 5), Н8З (К або К), Н8В4 (А або 5) і НВО (М або М) за нумерацією Кабата. Обгрунтування вибору однієї амінокислоти або іншої в цих позиціях полягають в наступному.

І00414| Нв2а (М або 5): М ї 5 мають аналогічну частоту в 82а. Вони також є людськими залишками в двох шаблонах УН людини. 5 і М були включені в окремі варіанти.

Ї00415| НВ (К або К): К в каркасній області З знаходиться близько до поверхні області зв'язування СОК. Заміна його на К може перешкоджати розміщенню антигена. К зустрічається найбільш часто, і К є третім за частотою в людських каркасах в цій позиції. Е і К були включені в окремі варіанти. 00416) НВ8А (А або 5): 5 і А присутні в двох розглянутих каркасах, тому кожний залишок був випробуваний в окремих випадках. 00417) Н89 (М або М): М і М присутні в двох розглянутих каркасах, тому кожний залишок був випробуваний в окремих випадках. 00418) Три варіанти варіабельної області гуманізованого легкого ланцюга і три варіанти варіабельної області гуманізованого важкого ланцюга є наступними:

І00419| Ни14О8М1. варіант 1 (РВА, І 9Р, АТОМ, УЗбЕ, О070А заміни показані нижнім регістром):

РІУМТО5Зароі РУТРЕЕБУБІЗСВОЗМКОІ І НЗМОаМТ МІ МУЛ ОКРЕООБРОГ ІМАУЗМІ АБаМРОВ

ЕзазавзатангтІіКІБАМЕАЕОМамУУСМОНГЕМРІ ТРООСТКІ БІКА (ЗЕО ІО МО: 74) 00420) Ни14С8МІ. варіант 2 (заміна І З6Е показана нижнім регістром):

РІММТО5РІ БІ РУТРЕОЕРАБІЗСАЗМКОЗИЇ НЗМОаМТ МІ МУ ОКРООБРОЇГ ІМАУЗМІ АБИОМРОВ

ЕзаБавзатовТКкІЗАМЕАЕОМамуУУуСМОнНІ ЕМРІ ТРООСИТКІ БІКА (ЗЕО ІО МО: 75) 004211) Ни14С8МІ. варіант З (заміни М265, І З6Е і 0605 показані нижнім регістром):

РІММТО5РІ БІ РУТРОЕРАБІЗСАОЗКОИЇ НОМОаМ МІ МУ ОКРООБРОЦП ІМАУЗМІ АБаМРЗАВЕ зававзаторЕТтІіКІЗАМЕАЕОМаУУУСМОонНІ ЕМРІ ТРИОСТКІ ЕІКА (ЗЕО ІО МО: 76) (00422) Ни14С48МН варіант 1 (заміни ОТЕ, ОЗК, М/471 і О105Т показані нижнім регістром): (510) еукі МЕЗСаСИаї МОРОСБІ КІ ЗСААЗОаЕТЕЗ5УТМЗУМВОТРЕКВІ ЕІМАЄІММЗИОТТУМРОТУК

САЕТІЗВОМАКМТІ МІ ОМ55І КЗЕОТАМУУСАВНУУУСсСИаУааУМ ЕОМ МТУ (5ЕО Ір

МО: 64) 00423) Ни1428МН варіант 2 (заміни О1Е і М/471. показані нижнім регістром): емо! МЕЗОаСОаЇ МОРОСБІ КІ БСААЗСОаЕТЕЗЗ5У ГТМЗУУУВОТРЕКВІ ЕІМАЄІММЗИОЮО ТТ УМРОТУК авЕТтІЗАОМАКМТІ М ОМ55І КЗЕОТАМУУСАВНнУУУасе,имасцуУвруУмаостІ МТУ55 (5ЕО І

МО: 65) (00424) Ни1428МН варіант З (заміни О1Е і М/471. показані нижнім регістром): емо! МЕЗОаСОаЇ МОРОСБІ КІ БСААЗСОаЕТЕЗЗ5У ГТМЗУУУВОТРЕКВІ ЕІМАЄІММЗИОЮО ТТ УМРОТУК

САЕТІЗВОМАКМТІ М ОММ5І ВАЕОТАУУУСАВНнУУУасаУаамМгЕруУмаоОстІ МТМ55 (5ЕО Ір

МО: 66)

Приклад 10. Кінетичний аналіз зв'язування гуманізованих антитіл 14058

І00425| Кінетику зв'язування трьох гуманізованих варіантів 14058 і 14058 миші з рекомбінантним людським ТТК Е87М/110М досліджували за допомогою Віасоге, як показано в

Таблиці 18. Анти-людський (ЗЕ Неаййсаге) був імобілізований на сенсорному чіпі С5 (без ланцюгів декстрану) через амінове з'єднання відповідно до інструкцій, представлених в анти- людському наборі СЕ Неайвсаге, а тАбБ були захоплені до рівня, щоб забезпечити максимальне зв'язування аналіту до 30-50 КИ. Різні концентрації аналіту (рекомбінантний людський ТК

Е87М/.110М) пропускали через захоплений ліганд при 5Омкл/хв в рухомому буфері (НВ їх 00590 Р-20, 1 мг/мл БСА) в 3-кратних розведеннях. Для кожної концентрації реакція протікала впродовж часу, що дозволяє більш високим концентраціям аналіту досягти рівноваги під час асоціації, а також, щонайменше, 1095 сигналу до розпаду під час дисоціації. Щонайменше одна концентрація (не найвища або найнижча) була проаналізована з дублюючої пробою. Діапазони концентрацій аналіту були обрані на основі попередніх експериментів, щоб охопити межі вимірювань щонайменше від в 10 разів вище Ко до в 10 разів нижче Ко. 00426) В Таблиці 18 наведені швидкість асоціації (Ка), швидкість дисоціації (Ка) ії константа афінності зв'язування (Ко) мишачого 1458, химерного 1408, Ни1408 Н2І1, Ни1408 НІ2І2,

Ни1408Н213, і Ни14058 НЗІ1 з рекомбінантним ТК Е87М//110М людини. Як показано в

Таблиці 18, антитіла Ни1468 і 1458 миші мають подібні афінності зв'язування ТТЕ.

Таблиця І

Афінність зв'язування антигену антитілями 14078 ло ТЕК людини СЕЗ ЛО

Химерне 2,51 5 заяв РТ 3ББ-ю хв іс

НпіяЕ 30О7Б 05 5.95Б-04 2265-09 32,03 ні

Нвів

З26БЕ ох о.3Б-0Я 2Л1аБ-09 5143

Нвів

ЗБ 05 З 18Б-0 124Б-09 Я

Нла нас

ЗвОБ 0 ат БА їтавБ-ю ау ня

Зо

І00427|1408 миші, химерне 1408 та інша гуманізована версія 14058 без змін в !СОК1 показали наявність додаткових легких ланцюгів на ДСН-ПААГ за відновлюючих умов. Аналіз послідовності показав, що в ЇСОЖКІ є сайт М-глікозилювання в залишку 26 за нумерацією

Кабата. Цей сайт М-глікозилювання може викликати потенційні проблеми гетерогенності при виробництві. Мутація М в залишку 26 в Ни14058МЇм2 давала Ни140О8Мі м3. Гуманізовані антитіла, які мають Ни1408М| 3, показують лише один легкий ланцюг при ДСН-ПААГ в відновлюючих умовах, тим самим усуваючи потенційну проблему гетерогенності. Афінність зв'язування антигена антитілом Ни1408 Н2ІЗ аналогічна такій батьківського антитіла миші і химерного антитіла.

Приклад 11. Матеріали та способи а. Протокол створення антитіл

І00428| Мишей імунізували щотижня антигенними пептидами ТТК-МАР, ТТАВ89-97-М-КІН або ТТК89-97-0-КІ Н в ад'юванті КІВІ, або щомісячно в ад'юванті ТіегМах. За три-чотири дні до гібридизації, імунітет обраних мишей стимулювали четвертий раз імуногеном в фізіологічному розчині. Селезінку гомогенізували для отримання спленоцитів, і їх гібридизували з клітинами мієломи 5Р2/0 з використанням стандартного протоколу електрогібридизації. Гібридні клітини в селективному середовищі висівали в 96-лункові плашки і піддавали скринінгу через 7-10 днів. р. Протокол скринінгу антитіл 004291 Відбір гібридоми грунтувався на наступному скринінгу за допомогою ЕГІЗА: 96- лункові плашки ЕГІЗА покривали курячим анти-Ніх, 1 мкг/мл ФСБ та інкубували впродовж 1 години. Плашки блокували 195 розчином БСА/ФСБ, 200 мкл/лунка впродовж 15 хвилин, потім додавали 0,5 мкг/мл рнН4а-ТТЕ, 50 мкл/лунка та інкубували впродовж 1 години. рН4-ТтТК являє собою ТТЕ який піддали дії низького рН (50 мМ ацетату натрію, рН 4,0) для того, щоб дисоціювати/агрегувати ТТК з метою експонувати епітоп ТТК89-97. Плашки двічі промивали

ТВ5-Т. Додавали супернатант з плашок гібридизації, 50 мкл/лунка та інкубували впродовж 1 години. Плашки двічі промивали ТВ5-Т. Додавали антитіло виявлення, козяче-антимишине (ІДС1, 2а, 2р, З специфічне)-НЕР, розбавлене 1:5000 в 0,595 БСА/ФСБ/ТВ5-Т, 50 мкл/лунка, та інкубували впродовж 1 години. Нарешті, плашки промивали п'ять разів субстратом ТВ5-Т і ТМВ, додавали 100 мкл/лунка. Через 15 хвилин прояв субстрату зупиняли 2М сірчаною кислотою, 50 мкл/лунка. Плашки зчитували при 450 нм. Були обрані лунки з 00»1,0, і клітини переносили в 24-пункову плашку. Через З дні вирощування клони піддавали вторинному (сошпіег) скринінгу за допомогою вищевказаного аналізу для підтвердження зв'язування, і замінюючи нативний ТТК на рнаі-ТТК в якості негативного вторинного скринінгу, що дозволяє вибирати клони, які продукують ІтАБ до ТТЕ, специфічні до ненативних форм ТТ. с. Протоколи експресії антитіл

Ї00430| Плазміди з легсим ланцюгом і важким ланцюгом, під контролем СМУ, які несуть гуманізовані послідовності моноклональних антитіл, трансфікували в клітини СНО-51 (І їє

Тесппоіоду). Був застосований подвійний відбір, щоб створити вибірковий пул. Частково

Зо використане клітинами середовище аналізували за титром, зв'язували та аналізували з допомогою ДСН-ПААГ-електрофорезу/Вестерн-блоттингу. Вибрані пули використовували для створення клонів із застосуванням системи Сіоперіх (МоЇІесшаг Оемісе5). Клони були ранжовані на основі титру антитіл. Вибрані клони були розмножені, і були створені їх стоки.

Ї00431| Найбільш високопродуктивний клон розмножували у струшуючих колбах, і культуру використовували для інокуляції 10-25-літрових одноразових біореаторів (УМАМЕ Віоїесі). Суміш середовищ експресії Егеезіує-СНО, СО ОрІісСноО і ЕгеебБ(ує Е17, доповнених Сішатах (середовище і Сішатах від І йе ТесппоЇоду), використовували в струшуючих колбах, а також для культур в одноразових біореакторах. Одноразову (раїсп) культуру отримували з використанням одноразового біореактора (СЕ Неайрсаге) при 37 " С, 795 СО» при постійному перемішуванні. Зразки періодично відбирали для контролю кількості клітин, життєздатності та продукування антитіл. За необхідності вносили добавку СеїЇ Воо5і (НуСіопе). Одноразову культуру збирали, коли життєздатність клітин починала ставати нижчою 9095 (5-7 днів). а. Протокол очищення антитіл 00432) Культуру клітин збирали після того, як спершу дозволяли клітинам в суспензії осідати на дно одноразового біореактора під дією сили тяжіння при 4 " С. Зібране середовище очищували через поровий фільтр (Мій5сак Роа СОНС, Міїїїроге), концентрували 10-кратно за допомогою фільтрування тангенціальним потоком (Реїїсоп 2РІС зЗОК, Мійіроге) і стерильно фільтрували через фільтр 0,2 мкм (Оріісар ХІ., Мійроге). Концентроване, частково використане клітинами середовище потім завантажували в колонку Ргоївіп З Зерпагозе Равзі БІом/ (СЕ

І їезсіепсе5), попередньо врівноважену в їхФеБ, рН 7,4, використовуючи ЕРІ С (АКіа Амапі, СЕ

І їезсіепсе5). Незв'язані білюи змивали з колонки 5-10 об'ємами колонки їхФСБ, рН 7,4 до досягнення ОЮгво вихідного рівня. Зв'язане антитіло елюювали з колонки 2 об'ємами колонки

Іо ЕІшіоп Вибйег (Тпегто 5сіепійіс). Фракції елюата збирали, і робили рН нейтральним за допомогою 2М-ного Тгі5, рН 9,0 (60 мкл на 1 мл елюата). 00433) Антитіловмістні фракції об'єднували і діалізували впродовж ночі при 4 " С проти

ТхФоБ, рН 74. Потім діалізований зразок стерилізували ультрафільтрацією через 0,2 мкм РЕ5- фільтр і зберігали при 4 "С. Кінцеву концентрацію білка визначали біцинхоніновою кислотою (ВСА - Бісіпспопіпіс) з використанням бичачого гамма-глобуліну в якості стандарту білка (Тнегто зсієпійіс). бо е. Протоколи експресії та очищення рекомбінантного ТТА

00434) Клітини Е. соїї (В21-А1Т) трансформували плазмідою рЕТ21а(т), яка містить вставку тА (Меї-нТТВ-(Ніз)є або варіант ТТЕ, який містить подвійну мутацію Е87М/ 110М. Клітини вирощували в бульйоні 2УТ, який містить 100 мкг/мл ампіциліну. Експресію ТТК індукували впродовж ночі при 20 "С в присутності 1 мМ ІРТО і 00595 арабінози. 00435) Клітини збирали центрифугуванням при 4000х9 впродовж 10 хв. і зберігали при -80 "Сб до використання. Давали відтанути 10-15 г клітинних гранул і лізували їх в 50 мл буфера А (ІхФеБ, який містить 500 мМ Масі, 20 мМ імідазолу) шляхом використання високошвидкісного приладу подрібнення І М-1 (Місгойчпідісв, Іпс.). Лізовані клітини центрифугували при 12,000 х д впродовж 15 хв, фільтрували через 0,2 мкм РЕ5-фільтр перед очищенням на колонці Нівз- Ттар

НР (СЕ І Пезсіепсе5). Після завантаження, колонку промивали 10 об'ємами колонки буфером А та елюювали буфером В (1хФСоБ 500 мМ Масі, 500 мМ імідазол). Пікові фракції, які відповідали

ТТЕ, збирали, діалізували проти 1їхФОБ і зберігали при -80 "С до використання.

Ї. Приготування антигену ТТК

ІЇ00436| Нативний антиген ТТК готували шляхом розведення концентрованого стоку рекомбінантного ТТЕ-6НІі5х до кінцевої концентрації 2,5 мкг/мл буфером 1їхФоСБ. Оброблений рНні4 ТТе отримували шляхом інкубації рекомбінантного ТТК в 50 мМ ацетаті натрію в концентрації 0,2 мг/мл, рН 3,95, впродовж 72 годин при кімнатній температурі. В цих умовах ТТК дисоціює на суміш мономерів і агрегованих форм ТТК, які структурно відрізняються від нативного ТТ. рнН4і-ТТЕ потім розбавляли до кінцевої концентрації 2,5 мкг/мл в їхФОоБ безпосередньо перед використанням в аналізі. 96-лункові плашки (Собіаг Мо 3690) покривали курячим анти-пі5 поліклональним антитілом при кімнатній температурі 50 мкл на лунку 1,0 мкг/мл (Абсат Ме АБО107) в ТІхХРВ5 впродовж 1 години. Розчин для покриття відкидали і плашку блокували 250 мкл на об'єм лунки їхБСА-вмістного блок-буфера, розведеного в їхФоБ (6-

Віозсіепсе5 Мо 786-193) впродовж 1 години. 9. Протокол ЕГІЗА

Ї00437| Покриті і блоковані 96-лункові плашки обробляли ТТК-антигеном 50 мкл/лунка 2,5 мкг/мл (або нативний ТТК, або рнН4а-тТтТЕ) впродовж 1 години при кімнатній температурі. Плашки потім двічі промивали 250 мкл/лунка промивного буфера (ІхТріс-буферний сольовий розчин, який містить 0,0595 Тм'ееп-20). Потім промиті плашки обробляли 50 мкл/лунка відповідного моноклонального антитіла проти ТТЕ в концентраціях від 0,31 до 2,5 мкг/мл впродовж 1 години.

Ї00438| Оброблені плашки промивали З рази 250 мкл/лунка промивного буфера. Після промивання, плашки обробляли впродовж 1 години 50 мкл/лунка детектуючого антитіла, яке містить розведене 1:5000 в їхФОСБ пероксид-кон'юговане антитіло козел-анти-миша (даск5оп

ІттипоКезеагсп Мо 115-035-164). Потім плашки промивали З рази перед додаванням 100 мкл субстрату ТМВ/лунка (КосКіапіа). Реакції НКР дозволяли продовжуватись при кімнатній температурі впродовж 15 хв. до гасіння (доепсйпіпу) 50 мкл 1М Н»25О:; на об'єм лунки.

Спектроскопічна абсорбція вимірювалася при довжині хвилі рівній 450 нм. п. ДСН-ПААГ електрофорез

І00439| Електрофорез в ДСН-поліакриламідних гелях проводили наступним чином. 0,1-1 мкг

ТТК або рН 4,0-ТТЕ в буфері для зразків 1хі О5 (І їе ТесппоЇодієх) завантажували на 1095-ий гель Ми5Раде бів-їгі5 і піддавали електрофорезу в буфері МЕ5 при постійних 90 В впродовж 105 хвилин. Після електрофорезу гель або фарбували в Іпеїапі Віце (Ехредеоп), або переносили на нітроцелюлозні фільтри для Вестерн-блоттингу. і. Нативний ПААГ електрофорез

І00440| Електрофорез на нативних Тріс-гліцинового гелях проводили наступним чином. 0,1- 1 мкг ТТК або рн 4,0 ТТК в 1хТріс-гліциновому (Ге Тесппоодіеє) буфері для зразків завантажували в 10-2095 Тріс-гліциновий-гель і проводили електрофорез в 1х нативному Тріс- гліциновому буфері пробігу при постійних 1208 впродовж 105 хвилин. Після електрофорезу гель або фарбували в Іпзіапі Вісе (Ехредеоп), або переносили на нітроцелюлозні фільтри для

Вестерн-блоттингу. . Вестерн-блоттинг 00441) ДСН- або нативний ПААГ гелі були блоттовані на нітроцелюлозний фільтрувальний папір (ІВіої, програма Р7) і заблоковані буфером для блокування (Гісог) впродовж 30 хвилин.

Потім фільтри інкубували в 0,5 мкг/мл первинного антитіла в блокуючому буфері впродовж 1 години при кімнатній температурі (або впродовж ночі при 4 7" С), а потім слідували три промивання 1хТВ5, кожне по 10 хвилин. Фільтри поміщали в ІКОуеє 8В00СМУ-кон'юговане коза- анти-миша вторинне антитіло, розбавлене 1:20000 в буфері для блокування. Після інкубації фільтрів в розчині вторинних антитіл впродовж 1 години при кімнатній температурі фільтри промивали і відображали на інфрачервоному тепловізорі Одувхзеу Сі х (Гісог). бо К. Протокол аналізу формування фібрил ТТ

00442 Розчин 3,6 мкМ (0,2 мг/мл) ТТЕ-У78Е в 50 мМ ацетаті натрію, рН 4,8, інкубували при 37 "С впродовж 72 годин в присутності 1,4 мкМ (0,2 мг/мл) антитіла до тіб5-ТТЕ, або з ізотипним контролем. Після інкубації до суміші додавали 5Х молярний надлишок тіофлавіна-Т і залишали зв'язуватися впродовж 30 хвилин. Флуорометричне вимірювання проводили при довжині хвилі випромінювання яка дорівнювала 480 нм з довжиною хвилі збудження, встановленої на 440 нм.

Інгібування рівне 095 встановлювали, як інтенсивність флуоресценції в присутності ізотипних контрольного антитіла (83 д. 0.) і точку 10095-вого інгібування встановлювали, як флуоресценцию за відсутності білка ТТК-У78Е (38 д. о0.). 00443) Стоковий розчин ТТВ-М122І (близько 5 мг/мл) розбавляли в буфері з кінцевими концентраціями ТТА 0,2 мг/мл, 30 мМ ацетату натрію, 5 мМ фосфату натрію, 100 мМ КС, 1 мМ

ЕДТА, 0,0295 азиду натрію, і різними концентраціями моноклонального антитіла при рН 7,2. Цей зразок діалізували проти того ж буфера при рН 4,5 впродовж З годин при кімнатній температурі.

Зразки потім інкубували при 37 "С впродовж 72 годин. Після інкубації до суміші додавали 5Х молярний надлишок тіофлавіна-Т і залишали зв'язуватися впродовж 30 хвилин. Спостереження флуоресценції тіофлавіна-Т здійснювали з використанням спектрофлуориметра Рпоїп

Тесппоіоду Іпіегпаййопа! С60. Варіювали коефіцієнт посилення фотомножника, а ширину вхідної щілини збудження і випромінювання встановлювали в межах 2-4 нм, щоб максимізувати сигнал по відношенню до шуму. Вимірювання флуоресценції проводили з використанням 430 нм і 480 нм в якості довжин хвиль збудження і випромінювання, відповідно. (00444)

І. Зразки серцевої тканини 00445) Свіжозаморожені і оброблені парафіном блоки серцевої тканини з підтвердженими діагнозами мутацій АТТК були отримані від доктора Меррілл Бенсона в Університеті Індіани.

Зразки включали вісім свіжих заморожених зразків і шість зразків ЕЕРЕ, і для кожного зразка був поставлений діагноз АТТЕ або будь-який інший серцевий амілоїдоз. Діагноз для тканини був додатково підтверджений в Ргоїйепа за допомогою фарбування ІНС антитілами до каппа і лямбда-легких ланцюгів і амілоїду А перед дослідженням антитіл до ТТ. т. Імуногістохімія 00446) Імуногістохімія була виконана на злегка закріплених параформальдегідом, 10 мкм

Зо кріозрізах і на 5 мкм парафінових зрізах. Спосіб з імунопероксидазою був основною системою детектування, яке було виконано на / віса Вопа Ех (І еіса Віозуєіет5, Буффало-Гроув, Іллінойс) з використанням набору для визначення Кеїїпе Вопа РоїЇутег Кеїпе Оеїесійоп Кії (05980, І віса

Віозузіетв5). Первинні антитіла інкубували впродовж однієї години (відповідно до концентрацій в

Таблиці 2) з подальшою інкубацією з кон'югатами антитіл анти-миша і анти-кролик з полімерним

НАР-лінкером. Фарбування візуалізували за допомогою хромогену ЮБАВ, який продукував коричневий осад. Мікропрепарати дофарбовували гематоксиліном, зневоднювали у висхідній серії спиртів, очищали в ксилолах і накривали покривним склом Суїозеаї! 60 (Кіспага АйПеп зсіепійіс, Каламазу, Мічиган). Негативний контроль полягав у проведенні всієї імуногістохімічної процедури на зрізах сусідніх ділянок тканини з неїімунним ізотипним контролем Ідс або за відсутності первинного антитіла. п. Виявлення амілоїду: фарбування Соподо Кеа і тіофлавіном-Т

Ї00447| Фарбування Сопдо гей проводили для виявлення ТІК амілоїду в тканині застосовуючи набір від Атегісап МабхіегТесп (Лоді, Каліфорнія). Фарбування проводили відповідно до процедури рекомендованої виробником. Мікропрепарати фарбували розчином

Сопдо Кей впродовж 1 години з наступною диференціацією в 195 -вому гідроксиді натрію впродовж близько 15 секунд. Потім мікропрепарати ополіскували в проточній воді, зневоднювали за допомогою серії спиртів із зростаючими концентраціями, і очищали за допомогою трьох змін ксилолів, і накривали покривним склом Суїовзеаї 60. (00448) Для визначення присутності ТТК амілоїду в тканині використовували модифікований протокол фарбування тіофлавіном-Т (Зсптіді еї аїЇ.,, 1995). Якщо коротко, мікропрепарати дофарбовували за допомогою гематоксиліна Маєра, промивали проточною водою і фарбували відфільтрованим 0,01595 розчином тіофлавіна-Т (Т3516-252, 5ідта-Аїагісй, Сент-Луїс, Міссурі) в 5095 етанолі впродовж десяти хвилин. Потім мікропрепарати промивали в проточній воді і диференціювали в 195 (об./06.) оцтовій кислоті впродовж 10 хвилин і промивали три рази в воді.

Мікропрепаратам дозволяли висохнути на повітрі до того, як вони були покриті РгоЇопд соїй (Пе Тесппоіодієв). о. Аналіз зображень 00449) Мікропрепарати візуалізували або за допомогою мікроскопа Оіутрих5 ВХ6Є1, або за допомогою цифрового сканера мікропрепаратів Нататаїбви Маполоотег 2.О0НТ, або 60 спектральної конфокальної системи Іеіса ЗРЕ. Зображення збирали і зберігали у вигляді файлів ТІЕР. р. Аналіз зразків плазми людини за допомогою ДСН-ПААГ-електрофорезу/Вестерн- блоттингу 00450) Шість зразків плазми від пацієнтів, з підтвердженим УЗОМ АТТЕ (зразок Мо 11, Мо 12,

Мо 15, Мо 18, Мо 19, Мо 20) і шість зразків від звичайних суб'єктів (Мо 21, Мо 22, Мо 23, Мо 24, Мо 25,

Мо 27) були отримані від М. Сарайва (Університет Порту, Португалія). Зразок Мо Сб був звичайним зразком людської сироватки, отриманим з комерційного джерела (ВіогесіатайопіМТ).

Ці зразки плазми розділяли за допомогою ДСН-ПААГ електрофорезу, і проводили Вестерн- блоттинг з 905 або 5А1 наступним чином. Об'єм плазми рівний 1,4 мкл розбавляли 1:8 в 1хі 05 буфера для зразка за відсутності відновника (І Те Тесппоіодіеєв5). Зразки розділяли за допомогою

ДСН-ПААГ електрофорезу, і Вестерн-блоттингу з використанням 0,5 мкг/мл 905 або 5А1, як описано раніше. а. Аналіз зразків плазми людини за допомогою плашкового аналізу Мезобсаїіє Різсомегу (М50)

І00451| 96-лункові плашки М5О покривали моноклональним антитілом 6С1 в концентрації 4 мкг/мл в ФСБ та інкубували впродовж 2 годин при кімнатній температурі зі струшуванням, або впродовж ночі при 4 "С. Плашки промивали три рази їх ТВ5Т перед блокуванням 395 розчином

М5О ВіоскКег А, 150 мкл/лунка впродовж 1 години струшування. До заблокованих плашок М5О додавали 30 мкл на об'єм лунки зразків людської плазми, розведених 1:10 в буфері для зразків, що складається з 0,695 бичачого сироваткового альбуміну без глобулінів, 1,5 мМ одноосновного фосфату натрію, 8 мМ двоосновного фосфату натрію, 145 мМ хлориду натрію, 0,0595 Т/йоп Х- 405 і 0,0595 тімеросала, на 1 годину. Плашки промивали З рази 1хТВ5Т. На 1 годину додавали 50 мкл на об'єм лунки 1 мкг/мл сульфоміченого детектуючого антитіла (або антитіло 8С3 до всіх

ТТЕ, або поліклональне антитіло Юако) в буфері для зразків при кімнатній температурі зі струшуванням. Плашки промивали три рази ї1хТВ5Т з подальшим додаванням 150 мкл/лунка розчину 1Х Кеай Випйег Т (Мезо зсаїе бізсомегу). Плашки потім зчитували пристроєм візуалізації

М5оО 5есюг. г. Побудова стандартної кривої МБО 004521 Для того, щоб кількісно визначити кількість ненативного 6С1-реакційноздатного ТТК-

Зо білка, присутнього в зразках плазми людини, стандартну криву М5О будували з використанням рекомбінантного ТТК-Е87М/Л110М як 6С1-реакційноздатного стандарту ТТК. Цей варіант ТТК містить дві амінокислотні заміни, які перешкоджають утворенню тетрамерів і утримують білок в мономерному стані (Лапо еї аї. (2001) Віоспетівігу 40, 11442-11452). Таким чином, цей варіант

ТТЕК розпізнається усіма тАбБ до тіз-ТТЕ і тому добре підходить для використання в якості еталонного стандарту в аналізі М5О. 00453) Для того, щоб отримати стандартну криву 96-лункові плашки М5О покривали пів-

ТТЕ антитілом 6С1 в концентрації 4 мкг/мл в ФСБ та інкубували впродовж 2 годин при кімнатній температурі зі струшуванням, або впродовж ночі при 4 "С. Плашки промивали три рази їх ТВ5Т перед блокуванням 395 розчином МБО ВіосКег А, 150 мкл/лунка впродовж 1 години струшування. Заблоковані плашки потім обробляли впродовж 1 години 50 мкл/лунка 25 мкг/мл

ТТВ8-Е87М//110М, серійно розведеного 1:5, причому останнє розведення було буферним контролем. Плашки промивали З рази їхТВ5Т перед додаванням 50 мкл/об'єм лунки 1мкг/мл антитіла ЗиМоТад-виявлення (8С3-5й0й0Тад або Бако рдАБбБ-5ийоТад) впродовж 1 години при кімнатній температурі при струшуванні. Як тА 8С3, так і бако були з приєднаною З!иотТаоб, і могли бути використані в якості детектуючого антитіла, оскільки вони зв'язуються з будь-яким

ТТ і не є конформаційно специфічними. 00454) Після обробки детектуючим антитілом плашки тричі промивали 150 мкл 1хТВ5Т на об'єм лунки, з подальшим додаванням 150 мкл/лунка їх Кеай Виїег Т (М50). Плашки зчитували в засобі візуалізації зображень М50О, і будували калібрувальну криву ТТК Е87М/Л110М. 5. Аналіз фагоцитозу

Ї00455)| 1 мг/мл зразка ТТК-Е87М/ 110М, нативного ТТЕ або агрегованого низьким рН ТТЕ-

МЗОМ, зв'язували через амін з барвником рНгодо впродовж 15 хв при 37"С у співвідношенні білок:"барвник близько 15:4 відповідно до специфікації виробника (Тпегто Зсіепійіс). Надлишок рНгодо-мітки видаляли діафільтрацією в спін-концентраторі з відсіканням по молекулярній масі 1ОК (Рієгсе Тпегто), і рНгодо-ТТК ресуспендували в їхФоБ.

Ї00456| Моноцити людини ТНР-1 культивували в середовищі для культивування клітин (АМРІ, 1095-ва сироватка Ідс, пеніцилін/стрептоміцин). Аліквота 20 мкг/мл міченого рНгодо ТТК була окремо попередньо проінкубована з 40 мкг/мл антитіла при 37 "С в клітинному культуральному середовищі впродовж 30 хв перед додаванням 5Е-04 ТНР-1 клітин в 1:1 бо об'ємному співвідношенні. Після інкубації тканинної культури (3 години) клітини промивали середовищем для культивування клітин три рази, інкубували в середовищі впродовж 10 хв, потім двічі промивали і ресуспендували в РЕАС5-буфері (195 ФБС (фетальна бичача сироватка) в ФСБ). Інтенсивність флуоресценції червоного рНгодо детектували з використанням фільтрів червоного каналу Теха5 Кей. Епіфлюоресцентна мікроскопія була виконана аналогічним чином.

Після аналізу РГАС5, переносили клітини які залишилися на предметне скло з лунками, і візуалізували за допомогою інвертованої мікроскопії. Середня інтенсивність флуоресценції автоматично розраховувалася шляхом усереднення відносних інтенсивностей флуоресценції кожної окремої клітини.

Приклад 12. Антитіло-залежне поглинання ТТЕ клітинами ТНР-1

І00457| ТТА-Е87М/Л 110М ковалентно маркували флуоресцентним рН-чутливим барвником рНгодо. Мітка рНгодо має мінімальну флуоресценцію при фізіологічному рН, але флуоресценція посилюється при поглинанні в середовищах з низьким рН ендоцитарних везикул і, таким чином, позначає клітинне поглинання мічених частинок. Моноцити ТНР-1 додавали до рНгодо-міченого

ТТА (нативний або ненативний, ГТТВ-Е87М/110М) після обробки або 1428, або ізотипним контрольним антитілом. Низькі рівні флуоресценції спостерігалися з кожним антитілом, яке інкубували з нативним ТТН, і після інкубації контрольного антитіла з ненативним ТТВ. Проте, флуоресценція була збільшена після інкубації 14548 з ненативним ТТ (Фіг. 7А), що вказує на те, що ненативний ТТА не фагоцитується ефективно в базових умовах, проте додавання антитіл до ті5-ТТА специфічно викликає фагоцитоз ненативного ТТН. 00458) Також був продемонстрований дозозалежний фагоцитоз великих, мічених рНгодо, агрегованих фібрилярних частинок ТТА для кожного з тАБ до тів-ТТЕ (Фіг. 78). Максимальне антитіло-залежне поглинання відрізнялося для кожного тАБб до тіб-ТТА (601259052-14(028»5А1), досягаючи плато при концентраціях тАБр між 5-10 мкг/мл. Різні можливості антитіл можуть відображати ізотипні відмінності і пов'язані з ними зміни в ефекторній функції між чотирма тАр до тіб8-ТТВА. Контролі, включаючи необроблені клітини або ті, які були оброблені ізотипним контрольним 401, не демонстрували спостережуваної або посиленої флуоресценції, відповідно.

Приклад 13. Оцінка антитіл до тіб5-ТТЕ в моделі трансгенних мишей 00459) Дослідження іп мімо проводяться на модельній гуманізованій трансгенній миші УЗОМ

Зо НТ (Іпоце еї аї., (2008) бресіїс раїйодеп їтєє сопайопв ргемепі ігапзіпугеїп ату/оідовів іп тоибе тоде!5. Тгтапедепіс Незеатсп 17:817-826) для оцінки ефективності зв'язування і видалення агрегованого ПТТЕК анти-Т В-антитілами.

І00460| Трансгенних мишей розводять з використанням стандартних процедур, і рівні їх циркулюючого ПТТК оцінюють за допомогою ЕГІЗА. Для подальших досліджень ефективності використовують мишей з кількістю ЯТТК в сироватці рівною 200-400 мкг/мл. У першому блоці досліджень вивчають природне відкладення ПТК у трансгенних мишей. Виявлення відкладень

ТК починають у віці 12 місяців і повторюють кожні 3-6 місяців після цього. Дослідження ефективності починають коли у трансгенних мишей спостерігається прийнятна кількість агрегатів. Тварин ділять на три групи лікування (п-10/група) і обробляють щотижня впродовж чотирьох тижнів внутрішньочеревною дозою переносника, контрольного антитіла (ізотипний контроль, 10 мг/кг тіла) або антитіла проти НТР (10 мг/кг тіла). Через тиждень після останньої обробки мишей піддають евтаназії, тканини збирають і обробляють, а потім забарвлюють для того, щоб оцінити кількість і розмір відкладень ТТК які залишились. Використовують кількісні методи і статистику для визначення рівня кліренсу, що спостерігається між групами.

І00461| В альтернативному підході агрегати ПТТК готують іп міо і потім вводять в нирку трансгенних мишей для затравки відкладення нових агрегатів. Заявник визначив, що ін'єкція цих препаратів може прискорити відкладення нових агрегатів передбачуваним чином. Грунтуючись на цих висновках, тварин присипляють, оголюють ліву нирку, і вводять в кіркову речовину нирки попередньо агрегований пТТЕК-матеріал. Після відповідного періоду відновлення, мишей ділять на три групи лікування (п-10/група), і обробляють щотижня впродовж чотирьох-восьми тижнів внутрішньочеревною дозою переносника, контрольного антитіла (ізотипний контроль, 10 мг/кг тіла) або антитіла проти ПТК (10 мг/кг тіла). Через тиждень після останньої обробки мишей піддають евтаназії, нирки збирають і обробляють, а потім забарвлюють для того, щоб оцінити кількість і розмір відкладень ТТК. Застосовують кількісні методи і статистику для визначення рівня змін, що спостерігаються між групами.

Приклад 14. Оцінювання антитіл до тів-Т ТА в моделі імплантату Маїгіде! 00462) Заявник визначив, що попередньо агрегований ЯТТК може бути суспендований в

Маїгіде! (ВО Віозсіепсе, каталожний Мо 354263), якому дають можливість затвердіти, і який потім можна помістити підшкірно мишам. Через чотири тижні після імплантації, імплантат Маїгідеї бо зберіг свою структуру, і агрегований ПТТК все ще був присутній в імплантаті. Крім того,

імплантат добре переносився мишами, і антитіла проти ПТТК були здатні проникати і зв'язуватися з агрегатами, суспендованими в МаїгідеІ. Виходячи з цих відомостей, проводиться дослідження ефективності антитіл. Тварин присипляють, і імплантат, який містить попередньо агрегований ПТТЕК, суспендований в Маїгіде!І, підшкірно поміщають мишам. Після відповідного періоду відновлення, мишей ділять на три групи лікування (п-10/група), і обробляють щотижня впродовж від двох до чотирьох тижнів внутрішньочеревною дозою переносника, контрольного антитіла (ізотипний контроль, 10 мг/кг тіла) або антитіла проти ПЯТЕК (10 мг/кг тіла). Після останньої обробки, мишей піддають евтаназії, шкіру, яка містить імплантат, збирають і обробляють, а потім кількість відкладень ТТЕ яка залишилась оцінюють за допомогою гістологічних та/або біохімічних методів. Використовують кількісний аналіз і статистику для визначення рівня кліренсу, що спостерігається між групами.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 лю, Юе

НІДЖДЖАР, Тарлохан с.

ЧАКРАБАРТТІ, АвідДЖжіт

ХІГАКІ, Джеффрі Н. «1205 АНТИТІЛА ДО ТРАНСТИРЕТИНУ «1305» 057450/473373 «1505» 62/109,002 «1515 2015-01-28 «150» 62/266,556 «1515 2015-12-11 «160» 118 «1705 газІб5ЕО для мМіпаом5 версії 4.0 «21051 «211» 124 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» то9о5мн «4005 1 сіи ма! Гуз Ге ма! сій 5ег сіу сіу сіу Ге маїЇ сіп Рго сІу с1У 1 5 10 15 5ег їеи Гуз Гей 5ег Су5з АЇа АЇа 5ег сІіу Ре Тйг Ре 5ег 5ег туг 20 25 30

Тк Мет б5ег о Тгр ма! Агуд сп тйг Рго сій Гуз Аго Гей сіи Геи ма! 35 40 45

Аїа сій Іїе 5ег А5п б5ег с1у А5р Тийг о тТйг туго туго Рго Азр Тег маї 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе Тийг Ре 5ег Агуд Азр Азп АЇа Гуз А5зп тТиг о Геи туг 65 70 75 80 ей сіп Мес 5ег 5ег гей Гуз б5ег сі Азр ТИг АїТа Мет Туг туг су 85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг Ттуг сіу сїу сіу туг сіу сІу Тер Ре РПе дА5р 100 105 110 ма! тер сіу тик сіу тТийг о твйг ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «210» 2 «211» 123 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» 15ЕО Н «400» 2 сіи ма! Гуз Ге ма! сій 5ег сіу сіу сіу Ге маїЇ сіп Рго сІу с1У 1 5 10 15 60 зег Гей Гуз Гей 5ег Суз АЇа Аїа 5ег сіу Ре Тйг РПе 5ег Ттиг туг 20 25 30

Тк Меєт 5ег Тер Аїа Агуд сіп тйг Рго сій Гуз Гуз Геи сіи Тгр ма! 35 40 45

Аїа туг ІчІІе 5ег уз сіу сіу сіу бек Тиг о тТуг туг РгОо А5Зр тиг маї 65 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд А5р Азп АЇа Гуз А5зп тТиг о Геи туг 65 70 75 80 ей сіп Меїс 5ег 5ег ей Гуз б5ег сі Азр ТИг АЇїа ге Туг туг су

85 90 95

АТїа Агуд с1у АТа Меєт РПе сіу А5п дор Ре Гуз туг Рго Мет дор Агд 100 105 110

Тер с1у сіп сіу Тс о5ег ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «210» З «2115» 124 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» ВАСО2114 «400» З сіи ма! сіп ге ма! сій 5ег сіу сіу сіу Ге ма!ї сіп Рго сІу с1Уу 1 5 10 15 зег їеи Агуд Гей 5ег Суз АЇа Аїа б5ег сіу Ре ТНг РМБе 5ег 5ег туг си мет Ап Тгр ма! Агд сіп АїЇа Рго су Гуз с1у гГеи си Тгр маї 20 5зег туг ІІе тиг 5ег б5ег сіу 5ег Тйг ІЇе туг туг АїЇа А5р 5ег ма! 60

Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд Азр Азп АЇа губ Азп 5ег Геи туг 65 70 75 80

Ге сіп Меє Азп 5ег Ге Аг АїЇа сі Азр Тйг АЇїа ма! туг туг суз 25 85 90 95

Аїа Агуд сї1у с1у сіп сіу бек Агд Туг Туг Туг туг туг сіу мех дор 100 105 110 ма! тер сіу сіп сіу тТийг тис ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120

Зо «210» 4 «2115» 120 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність 35 «220» «223» ААХ82494 «400» 4 сіп ма! сіп ге сіп сій 5ег сіу сіу сіу Ге маїЇ Гуз Рго сІу сі1у 1 5 10 15 40 зег Гей Гуз Гей 5ег Суз АЇа Аїа 5ег сіу Ре ТНг РМБе 5ег 5ег туг 20 25 30 сІ1у Мет бек Тгр ма! Агд сіп Тис Рго А5р Гуз Агд Гей сіи Тгр ма! 35 40 45

АТїа тик ІЇе б5ег 5ег сіу сіу б5ег Туг ТиИг о туг Ттуг Рго А5р 5ег маї 45 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд А5р Азп АЇа Гуз Ап ТИг Ге туг 65 70 75 80 ей сіп Мес 5ег 5ег гей Гуз б5ег сі Азр ТИг АїТа Мет Туг туг су 85 90 95 50 Аїа Агуд Геи Туг Туг сіу туг Агд Туг Туг Рпе д5р Туг Тер с1у сп 100 105 110 сіу тийг Мет ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 55 «210» 5 «2115» 124 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» бо «223» Ни9р5МнНмМ1 «400» 5 сіи ма! сіп ге ма! сіи 5ег сіу сІу сіу Гей маїЇ сіп Рго сІу СсС1У 1 5 10 15 зег їеи Агуд Гей 5ег Суз АЇа Аїа б5ег сіу Ре ТНг РМБе 5ег 5ег туг 65 20 25 30

Тк Мет 5ег Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу їу5 Ос1у Геи си Геи ма! 35 40 45

Аїа сіи І1Ї1е 5ег А5п о б5ег сіу А5р Тис о тТиготуг туг Рго А5Зр тег маї 50 55 60 70 Гуз с1у Агуд Рпе Тийг РПе 5ег Агуд Ар Азп АЇа Гуз Азп 5ег Геи туг

65 70 75 80

Гей сіп 5ег А5Зп 5ег ей Гуз АЇа сі Азр Тйг АїТа ма! Ттуг туг су 85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг туг сіу сїу сіу туг сіу сіу Тер Ре РПе дА5р 100 105 110 ма! тер сіу сіп сіу тТийг тис ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «2105» 6 «2115» 124 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» НнНи905МНмМ2 «4005 6 сіи ма! сіп ге ма! сій 5ег сіу сіу сіу Ге ма!ї сіп Рго сІу с1Уу 1 5 10 15 зег їеи Агуд Гей 5ег Суз АЇа Аїа б5ег сіу Ре ТНг РМБе 5ег 5ег туг 20 Тис мес 5ег Тер маї Агу сіп Аїа Рго сіу Гуз су Геи сіи гГеи ма!

Аїа сіи І1Ї1е 5ег А5п о б5ег сіу А5р Тис о тТиготуг туг Рго А5Зр тег маї 60

Гуз с1у Агуд Рпе Тийг Ре 5ег Агуд Ар Азп АЇа губ Азп 5ег Геи туг 25 5655 70 75 80

Гей сіп 5ег А5п Гей Ге Аг АїЇа сі А5р Тйг АЇїа ма! туг туг суз 85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг Ттуг сіу сїу сіу туг сіу сІу Тер Ре РПе дА5р 100 105 110 30 ма! тер с1у сіп сіу тТийг о тйг ма! Тис ма! 5ег 5ег 115 120 «210» 7 «2115» 124 35 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни9о5МНмМ2Б «400» 7 40 сіи ма! сіп Геи маїЇ сіи 5ег с1у сіу сіу Геи ма! сіп Рго сіу Ос1у 1 5 10 15 5ег їеи Гуз Гей 5ег Су5 АЇа АЇа 5ег сіу Ре Тиг РПе 5ег 5ег туг 20 25 30

Тк Мет б5ег о Тгр ма! Агуд сп тйг Рго сій Гуз Аго Гей сіи Геи ма! 45 35 40 45

Аїа сіи І1Ї1е 5ег А5п о б5ег сіу А5р ТИйг о тТиг отуг туг Рго Азр тег маї 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд А5р Азп АЇа Гуз А5зп тТиг о Геи туг 65 70 75 80 50 ей сіп Меє бег 5ег Ге Гуз бег сій А5р ТиПг АЇїа мес туг туг су 85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг Ттуг сіу сїу сіу туг сіу сІу Тер Ре РПе дА5р 100 105 110 ма! тер сіу сіп сіу тик о їеи ма! тийг ма! 5ег 5ег 55 115 120 «210» 8 «2115» 124 «2125 РЕТ 60 «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни905МНмЗ3 «400» 8 сіи ма! сіп ге ма! сій 5ег сіу сіу сіу Ге ма!ї сіп Рго сІу с1Уу 65 1 5 10 15 зег їеи Агуд Гей 5ег Суз АЇа Аїа б5ег сіу Ре ТНг РМБе 5ег 5ег туг 20 25 30

Тк Мет 5ег Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу Гуз су Геи сіи тТгр ма! 35 40 45 70 5зег сі Іїе 5ег А5п бег сіу А5р Тйг о тТийг тує туг Рго А5р тег ма!

50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе Тийг Ре 5ег Агуд Ар Азп діа Гуз Азп 5ег Геи туг 65 70 75 80

Гей сіп б5ег А5п Гей Ге Аг АїЇа сі Азр Тйг АЇїа ма! туг туг суз 85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг Ттуг сіу сїу сіу туг сіу сІу Тер Ре РПе дА5р 100 105 110 ма! тер сіу сіп сіу Ттийг тис ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «2105» 9 «2115» 124 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни9о5МНМЗЬ «400» 9 сіи ма! сіп ге ма! сій 5ег сіу сІу сіу Гей маїЇ сіп Рго сІу СсС1У 1 5 10 15 зег Гей Гуз Гей 5ег Суз АЇа Аїа 5ег сіу Ре ТНг РМБе 5ег 5ег туг 20 25 30

Тк Мет б5ег о Тгр ма! Агуд сіп тйг Рго с1у Гуз Агоа Геи си Геи ма! 35 40 45

Аїа сіи І1Ї1е 5ег А5п о б5ег сіу А5р Тис о тТиготуг туг Рго А5Зр тег маї 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе Тийг ІЇе 5ег Агуд Ар Ап АЇа Гуз Ап тиг о Геи туг 65 70 75 80 ей сіп Мес 5ег 5ег гей Гуз б5ег сі Азр ТИг АїТа Мет Туг туг су 85 90 95

Аїа Агуд Ні Туг Туг Туг сЇу сіу сіу Ттуг сіу сїу Тер Ре РПе дзр 100 105 110 ма! тер сіу сіп сіу Ттийг о їеи ма! тис ма! 5ег 5ег 115 120 «210» 10 «2115» 124 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни905МНм4 «400» 10 сіи ма! сіп ге ма! сій 5ег сіу сіу сіу Ге ма!ї сіп Рго сІу с1Уу 1 5 10 15 зег їеи Агуд Гей 5ег Суз АЇа Аїа б5ег сіу Ре ТНг РМБе 5ег 5ег туг 20 25 30

Тк Мет 5ег Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу Гуз су Геи сіи тТгр ма! 35 40 45 5зег сі ІІе 5ег А5п о б5ег сіу А5р ТИйг о тТиг отуг туг РгГо А5Зр тег маї 60 50 Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд А5р Азп АЇа губ Азп 5ег Геи туг 65 70 75 80

Гей сіп б5ег А5п Гей Ге Аг АїЇа сі Азр Тйг АЇїа ма! туг туг суз 85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг Ттуг сіу сїу сіу туг сіу сІу Тер Ре РПе дА5р 55 100 105 110 ма! тер сіу сіп сіу Ттийг тис ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «210» 11 60 «211» 124 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни9о5мМНм4Б 65 «4005» 11 сіи ма! сіп ге ма! сій 5ег сіу сіу сіу Ге ма!ї сіп Рго сІу с1Уу 1 5 10 15 5ег їеи Гуз Гей 5ег сСу5з АЇа АЇа 5ег сіу Ре Тиг РПе 5ег 5ег туг 20 25 30 70 тиг мес 5ег Тер ма! Агд сіп Аїа Рго ОсТУу Гуз Агд Гей си Геи маї

35 40 45

Аїа сіи І1Ї1е 5ег А5п о б5ег сіу А5р Тйг о тТиг отуг туг Рго А5Зр тег маї 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд А5р Азп АЇа Гуз А5зп тТиг о Геи туг 65 70 75 80 ей сіп Мес 5ег б5ег о їеу Гуз б5ег сій Азр ТИг Аїа Мет Туг туг су 85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг Ттуг сіу сїу сіу туг сіу сІу Тер Ре РПе дА5р 100 105 110 ма! тер с1у сЇп сіу тТйг оїеи Ма! тиг ма! 5ег 5ег 115 120 «210» 12 «2115» 124 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни905МНмМ5 «400» 12 сіи ма! сіп Геи маїЇ сіи 5ег с1у сіу сіу Геи ма! сіп Рго сіу с1у 1 5 10 15 зег їеи Агуд Гей 5ег Суз АЇа Аїа б5ег сіу Ре ТНг РМБе 5ег 5ег туг 20 25 30

Тк Мет б5ег о Тгр ма! Агуд сп тйг Рго сій Гуз Аго Гей сіи Геи ма! 35 40 45

Аїа сіи І1Ї1е 5ег А5п о б5ег сіу А5р Тис о тТиготуг туг Рго А5Зр тег маї 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд А5р Азп АЇа Гуз А5зп тТиг о Геи туг 65 70 75 80

Ге сіп Меє Абп Гей Ге Агд АїЇа сі Азр Тйг АЇїа ма! туг туг суз 85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг Ттуг сіу сїу сіу туг сіу сІу Тер Ре РПе дА5р 100 105 110 ма! тер сіу сіп сіу тТийг тис ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «210» 13 «2115» 5 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» 905 СОКНІ - Ккабат «400» 13 5зег Туг ТтТиг Мет 5ег 1 5 «210» 14 «2115» 17 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» 905 СОКН2 - Кабат «400» 14 сі т1Іе б5ег А5п о б5ег сіу А5р Тис Тис отТуг туг Рго А5Зр тег о маї Гуз 1 5 10 15 с1у «210» 15 бо «211» 15 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» 905 СОКНЗ - Кабат 65 «400» 15

Ні Ттуг туг туг сіу сіу сіу туг сіу сІіу Тгр Ре РПе А5р маї 1 5 10 15 «210» 16 70 «2115» 112

«2125 РЕТ «2135» Штучна послідовність «220» «223» то9ор5мМІ «400» 16

Азр ІІе ма! мес тйг сіп АЇїа діа Рго 5ег ма!Ї Рго ма! тйг Рго сІу 1 5 10 15 сі 5ег ма! бек ІЇе 5ег сСуз5з Агуд 5ег 5ег Гуз бег їеи Ге Ні 5ег 20 25 30

А5п с1у А5п о Тиг туго Гей Туг Тер Рпе Гей сп Аг Рго сіу сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей ІїІе туг Агд ма! 5ег Азп Ге АЇа б5ег су ма! Рго 50 55 60

А5Зр Агу Ре 5ег сіу бек сіу 5ег сіу Ттйг АїЇа Ре тНг гГеи Ага ІїЇе 65 70 75 80 5зег Агуд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Меє сіп Ні 85 90 95

Гей сім туг Рго Гей Тийг Ріе Ссіу АЇа сіу тйг Гуз їеи си Геи Гуз 100 105 110 «210» 17 «2115» 112 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» 100 «400» 17

Азр ІІе ма! мес тйг сіп АЇїа діа Рго 5ег ма!Ї Рго ма! тйг Рго сІу 1 5 10 15 сі бег ма! 5ег І1е б5ег сСу5 Агд 5ег 5ег Гуз 5ег Гей їеи Ні 5ег 20 25 30

Азп сіу Азп Ттиг о туго гей Туг Тер Ре Геи сіп Агу Рго сІу сіп 5ег

Рго сіп Гей Гей Іїе туг Агд Меє 5ег Азп Ге АЇа б5ег су ма! Рго 35 50 55 60

А5Зр Агу Ре 5ег сіу бек сіу 5ег сіу Ттйг Аїа Ре тНг гГеи Агд ІїЇе 65 70 75 80 5зег Агуд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг суз Геи сіп Ні 85 90 95 40 Гей сіи Туг Рго Ре Тйг Ре Ссіу АТа су тйг їу5 їеи си Геи Гуз 100 105 110 «210» 18 «2115» 112 45 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» АВСб6952 «400» 18 А5зр ІчІЇе ма! Мет тиск сіп б5ег Рго Ге б5ег Гей Рго Ма! Тиг Рго О1У 1 5 10 15 си Рго АЇїа бек ІЇе 5ег сСуз5з Агуд 5ег Азп сіп б5ег їеи Ге Туг 5ег 20 25 30

Азп сіу Ттуг Азп Туг Гей А5Зр Тер Туг Гей сіп Гуз Рго сіу сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей ІїІе туг 5ег сіу 5ег АЗзп Агуд АЇа б5ег су ма! Рго 50 55 60

А5Зр Агу Ре 5ег сіу 5ег сіу 5ег сіу Тйг А5зр Ре тНг Геи Гуз Пе 65 70 75 80 60 5зег Агд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Меє сіп Аїа 85 90 95

Гей сіп 5ег Рго Туг Тйг Ре сіу сіп сіу тйг Гуз Ге сіи ІЇе Гуз 100 105 110 65 «210» 19 «2115» 112 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» 70 «223» Ни9р5мМІм1

«400» 19

Азр ІІе ма! Меє тйг о сіп 5ег Рго Гей 5ег Гей Рго Ма! Тиг Рго СсС1У 1 5 10 15 си Рго АЇїа бек ІЇе 5ег сСуз5з Агуд 5ег 5ег Гуз бег їеи Ге Ні 5ег 20 25 30

Азп с1у А5зп о Тйг туго Гей Туг Тер Ре Гей сіп Гуз Рго су сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей ІїІе туг Агд ма! 5ег Азп Ге АЇа б5ег су ма! Рго 50 55 60

А5р Агу Ре 5ег сіу б5ег сіу б5ег сіу ТПг А5Зр РІПе тйг Геи Гуз Іе 65 70 75 80 5зег Агуд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Меє сіп Ні 85 90 95

Гей сім тТуг Рго Гей Тийг Ріе сіу сіп сіу тНг Гуз Ге сіи ІЇе Гуз 100 105 110 «210» 20 «2115» 112 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни9р5МІм2 «400» 20

Азр ІІе ма! Меє тйг о сіп 5ег Рго Гей 5ег Гей Рго Ма! Ттйг Рго сІу 1 5 10 15 си Рго АЇїа бек ІЇе 5ег сСуз5з Агуд 5ег 5ег Гуз бег їеи Ге Ні 5ег 20 25 30

Азп с1у А5зп о Тйг туго Гей Туг Тер Ттуг Гей сіп Гуз Рго сіу сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей ІїІе туг Агд ма! 5ег Азп Ге АЇа б5ег су ма! Рго 50 55 60

А5Зр Агу Ре 5ег сіу бек сіу 5ег сіу Тйг А5Зр Ре тНг гГеи Гуз Пе 65 70 75 80 5зег Агуд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Меє сіп Ні 85 90 95

Гей сім тТуг Рго Гей Тийг Ріе сіу сіп сіу тйг Гуз Ге сіи ІЇе Гуз 100 105 110 «210» 21 «2115» 112 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни9Ор5МіІ м3 «400» 21

Азр ІІе ма! Меє тйг о сіп 5ег Рго Гей 5ег Гей Рго Ма! Ттйг Рго сІу 1 5 10 15 си Рго АЇїа бек ІЇе 5ег сСуз5з Агуд 5ег 5ег Гуз бег їеи Ге Ні 5ег 20 25 30 А5зп с1у А5п Тиг туго Гей Туг Тер Туг Гей сп Гуз Рго сіу сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей ІїІе туг Агд ма! 5ег Азп Ге АЇа б5ег су ма! Рго 50 55 60 зег Агуд Ре 5ег сіу бег сіу 5ег сіу Тйг А5зр Ре тНг Геи Гуз ІПе 565 70 75 80 5зег Агуд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Меє сіп Ні 85 90 95

Гей сім тТуг Рго Гей Тийг Ріе сіу сіп сіу тйг Гуз Ге сіи ІЇе Гуз 100 105 110 (516) «2105» 22 «2115» 112 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність 65 «220» «223» Ни9О5МіІ м4 «4005» 22

Азр ІІе ма! Ммеє тйг сіп 5ег АЇа Рго 5ег Гей Рго Ма! Ттйг Рго сІу 1 5 10 15 70 си Рго маї 5екг ІЇе 5ег суз5 Агд 5ег 5ег Гуз бег їеи Геу Ні5 5ег

20 25 30

Азп сіу Азп Ттиг о туго гей Туг Тер Ре Геи сіп Агу Рго сІу сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей Іїе туг Агд ма! 5ег Азп Ге АЇа б5ег су ма! Рго 50 55 60 зег Агуд Ре 5ег сіу бег сіу 5ег сіу Тйг Аїа Ре тНг гГеми Ага ІїЇе 65 70 75 80 5зег Агуд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Меє сіп Ні 85 90 95

Гей сіи Туг Рго Гей Тйг Ре сіу сіп су тйг їуз їеи си Те Гуз 100 105 110 «210» 23 «2115» 112 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни905МіІм5 «400» 23

Азр ІчІІе ма! Меє тиск сіп б5ег діа Рго б5ег Гей Рго Ма! Тиг Рго О1У 1 5 10 15 сі 5ег ма! бек ІЇе 5ег сСуз5з Агуд 5ег 5ег Гуз бег їеи їеи Ні 5ег 20 25 30

Азп сіу Азп Ттиг о туго гей Туг Тер Ре Геи сіп Агу Рго сІу сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей ІїІе туг Агд ма! 5ег Азп Ге АЇа б5ег сіу ма! Рго 50 55 60 зег Агуд Ре 5ег сіу бег сіу 5ег сіу Тйг Аїа Ре тНг гГеми Ага ІїЇе 65 70 75 80 5зег Агд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Мет сіп Ні 85 90 95

Гей сім тТуг Рго Гей Тийг Ріе сіу сіп сіу тйг Гуз Ге сіи ІЇе Гуз 100 105 110 «210» 24 «2115» 16 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» 905 СОКІ1 - Кабат «400» 24

Аг бег б5ег Гуз 5ег їеи їеи Ні 5ег А5п сіу А5п Ттиг Ттуг Гей туг 1 5 10 15 «210» 25 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» 905 СОКІ2 - Кабат «400» 25

Агд ма! 5ег Азп Геи АїЇа 5ег 1 5 «210» 26 «2115» 9 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» 60 «2235» 905 СОКІЗ3 - Кабат «400» 26 мес сіп нНі5 Ге сіи Ттуг Рго Гей Тег 1 5 65 «210» 27 «2115» 454 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» 70 «223» Ни905 НІ важкий ланцюг

«400» 27 сіи ма! сіп ге ма! сій 5ег сіу сіу сіу Ге ма!ї сіп Рго сІу с1Уу 1 5 10 15 зег їеи Агуд Гей 5ег Суз АїЇа Аїа 5ег сіу Ре Тийг РМБе 5ег 5ег туг 20 25 30

Тк Мет 5ег Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу Гуз СсІТу Геи си Геи ма! 35 40 45

Аїа сіи І1Ї1е 5ег А5п о б5ег сіу А5р ТИйг о тТиг отуг туг Рго А5Зр тег маї 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе Тийг Ре 5ег Агуд Ар Азп АЇа губ Азп 5ег Геи туг 65 70 75 80

Гей сіп 5ег А5Зп 5ег ей Гу5 АЇа сій Азр ТИг АЇїа ма! Ттуг туг су 85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг Ттуг сіу сїу сіу туг сіу сІу Тер Ре РПе дА5р 100 105 110 ма! тер сіу сіп сіу тТийг тис ма! тиг ма! 5ег б5ег АЇа 5ег Тиг Гуз 115 120 125 с1Уу Рго 5ег ма! Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег Тиг 5ег С1У 130 135 140 сіу тйг АТа Аїа гей сіу сСу5х Геи Ма! Гуз Азр Туг Ре Рго си РГгО 145 150 155 160 ма! тик ма! бек Тер АЗп 5ег сІу АЇа Ге Тийг о 5ег сіу ма! ні тег 165 170 175

Ре Рго Аїа ма!Ї Гей сіп 5ег б5ег сІу Гей Ттуг 5ег Ге 5ег 5ег Ммаї 180 185 190 ма! тик ма! Рго 5ег 5ег 5ег їец сіу Тиг о сіп тйг тує т11е сСу5 д5п 195 200 205 ма! Азп Ні Гуз Рго 5ег Ап ТИг о Гуз ма! Азр Гуз Агд ма! сіи Рго 210 215 220

Гуз 5ег Суз Азр Гуз ТИйг Ні Тк о сСуз Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго си 225 230 235 240

Гей їеи сіу сіу Рго 5ег ма! Ре Ге Ре РгОо РГО Гуз Рго Гуз д5р 245 250 255

Тк Се Мет ІЇе бек Агуд Тийг оРго сіи ма! тийг Суз ма! ма! ма! др 260 265 270 ма! бек Ні сій А5р Рго сіи маї Гуз Ре Азп Тгр Туг ма! Азр су 275 280 285 ма! сіи ма! Ні5 А5п АЇа Гуз тТиг Гуз Рго Агу соЇи сЇи сіп тТуг Абп 290 295 з00 5зег Тиг отуг Агуд Ма! ма! бек маїЇ Ге тйг маї гей ніх сіп А5р тгр 305 310 315 320

Гей АЗзп сіу Гуз сі Туг Гуз Суб5 Гуз МаЇ 5ег АЗп Гуз АЇа Геи РгОо 325 330 335

АЇїа Рго Іїе сЇи Гуз Тйг ІЇе 5ег ї1у5 АЇа їу5 ОЇУу сп Рго Ага си 340 345 350

Рго сіп ма! Тукг тТийг Ге Рго Рго 5ег Агд сім сіи мес тиг Гуз А5п 355 360 365 сіп ма! б5ег ге Ттиг о сСу5з Ге маїЇ Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр Пе 370 375 380 Аїа ма! сіи Тер сіи б5ег Азп сіу сіп Рго сЇи А5п Ад5п Туг Гуз Тег 385 390 395 400

ТИг оРгО Рго маЇ Гей А5р 5ег А5Зр сіу 5ег Ре РПе Гей Туг 5ег Гуз 405 410 415

Гей тТийг омаї А5р Гуз 5ег Аг Тгр сЇп сЇп сіу Азп ма! Ріе 5ег су 420 425 430 5зег ма! мет Ні сі Аїа ге Ні5 Ап Ні5 Туг ТИйг сп Гуз 5ег ге 435 440 445 5зег Гей 5ег Рго сІу Гуз 450 (516) «210» 28 «2115» 454 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність 65 «220» «223» Ни905 Н2 важкий ланцюг «400» 28 сіи ма! сіп ге ма! сій 5ег сіу сіу сіу Ге ма!ї сіп Рго сІу с1Уу 1 5 10 15 70 зег їеи Агуд Гей 5ег Суз АЇа Аїа б5ег сіу Ре ТНг РМБе 5ег 5ег туг

20 25 30

Тк Мет 5ег Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу Гуз СсІТу Геи си Геи ма! 35 40 45

Аїа сіи І1Ї1е 5ег А5п о б5ег сіу А5р Тис о тТиготуг туг Рго А5Зр тег маї 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе Тийг Ре 5ег Агуд Ар Азп АЇа губ Азп 5ег Геи туг 65 70 75 80

Гей сіп 5ег А5п Гей Ге Аг АїЇа сі А5р Тйг АЇїа ма! туг туг суз 85 90 95

Аїа Агуд Ні Туг Туг туг сїу сіу сіу Ттуг сїу сіу Тер Ре РПе дор 100 105 110 ма! тер сіу сіп сіу тТийг тс ма! тис ма! б5ег б5ег АїЇа 5ег тТиг Гуз 115 120 125 с1Уу Рго 5ег ма! Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег Тиг 5ег С1У 130 135 140 сіу тйг АТа АЇїа гей сіу Суз Гей ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сіи РгО 145 150 155 160 ма! тик ма! бек Тер АЗп 5ег сІу АЇа Ге Тийг о 5ег сіу ма! ні тег 165 170 175

Ре Рго Аїа ма! Ге сіп 5ег бек сІу Ге Туг 5ег їеи 5ег 5ег маї 180 185 190 ма! тик ма! Рго 5ег 5ег 5ег ее сіу Тиг о сіп тйг тує т11е сСу5 д5п 195 200 205 ма! Азп Ні Гуз Рго бег Ап ТИг о Гуз ма! Азр Гуз Агд ма! сіи Рго 210 215 220

Гуз 5ег Су А5Зр Гуз Тк Ні Тйг оСуз Рго Рго Су5 Рго АЇа Рго си 225 230 235 240

Гей їеи сіу сіу Рго б5ег ма! Ре Ге Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз д5р 245 250 255

Тис огеи Мет ІЇе 5ег Агуд Тийг оРго сіи ма! тийг Суз ма! ма! маї дз5р 260 265 270 ма! бек нів сій А5р Рго сіи ма! Гуз Ре Азп Тгр Туг ма! Азр су 275 280 285 ма! сіи ма! Ні5 А5п АЇа Гуз тТиг Гуз Рго Агу сої сЇи сіп тТуг Абп 290 295 з00 5зег Тиг отуг Агуд Ма! ма! бек маїЇ Ге тйг ма! гей ніх сіп А5р тгр 305 310 315 320

Гей АЗп сіу Гуз сі Туг Гуз Суб5 Гуз МмаЇ 5ег АЗп Гуз АЇа Геи РгОо 325 330 335

Аїа Рго Іе сіи Гу5 Тиг ІЇе 5ег ї1у5 АїЇа Гуз сІЇу сіп Рго Аг си 340 345 350

Рго сіп ма! Тукг тТийг Ге Рго Рго 5ег Агд сім сіи мес тиг Гуз А5п 355 360 365 сіп ма! б5ег ге Ттиг о Су5з Гей маїЇ Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр Пе 370 375 380

Аїа ма! сіи тер сіи 5ег А5Зп сіу сіп Рго сЇи АбЗп Ап о Туг Гуз ТАг 385 390 395 400

ТИг оРгО Рго маЇ Гей А5р 5ег А5Зр сіу 5ег Ре РПе Гей Туг 5ег Гуз 405 410 415

Гей тТийг омаї Ар Гуз 5ег Аг Тгр сп сЇп сіу Азп ма! РНе 5ег су 420 425 430 5зег ма! мет Ні сі Аїа ге Ні5 Ап Ні5 Туг ТИйг сіп Гуз 5ег ге 435 440 445 5зег Гей 5ег Рго сІу Гуз 450 «210» 29 «2115» 454 «2125 РЕТ 60 «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни905 Н2Ь важкий ланцюг «400» 29 сіи ма! сіп ге ма! сій 5ег сіу сіу сіу Ге ма!їЇ сіп Рго сІу сі1у 65 1 5 10 15 5ег їеи Гуз Гей 5ег Су5з АЇа АЇа 5ег сІіу Ре Тйг Ре 5ег 5ег туг 20 25 30

Тк Мет б5ег о Тгр ма! Агуд сп тйг Рго сій Гуз Аго Гей сіи Геи ма! 35 40 45 70 Аїа сіи І1е 5ег Азп 5ег сіу А5р Тийг о тТиг тує туг Рго А5Зр тег маї

50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд А5р Азп АЇа Гуз Ап тТиг о Геи туг 65 70 75 80 ей сіп Мес 5ег 5ег гей Гуз б5ег сі Азр ТИг АїТа Мет Туг туг су 85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг Ттуг сіу сїу сіу Ттуг сіу сІЇу Тер РМПе РПе дор 100 105 110 ма! тер сіу сіп сіу Ттийгоїеи ма! тис ма! б5ег б5ег Аа 5ег Тис Гуз 115 120 125 с1у Рго 5ег ма! РПпе Рго Гей АЇа Рго б5ег 5ег Гуз 5ег Тиг 5ег су 130 135 140 сіу тйг АТа АЇїа гей сіу Суз Гей ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сіи РгО 145 150 155 160 ма! тик ма! бек Тер АЗп 5ег сІу АЇа Ге Тийг о 5ег сіу ма! ні тНг 165 170 175

Ре Рго Аїа ма!Ї Гей сіп б5ег б5ег сіу Гей Туг 5ег їеу 5ег 5ег Ммаї 180 185 190 ма! тик ма! Рго 5ег 5ег 5ег їеи сіу Ттийг о сіп тйг тує те сСуз дп 195 200 205

МмаїЇ Азп Ні Гуз Рго бег Азп ТИг Гуз ма! Азр Гуз Агд ма! си Рго 210 215 220

Гуз 5ег Суз А5Зр Гуз ТИйг о Ні Тйг оСуз Рго Рго Суб Рго АЇа Рго си 225 230 235 240

Гей їеи сіу сіу Рго б5ег ма! Ре Ге Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз д5р 245 250 255

Тк Се Мет ІЇе бек Агу Тийг оРго сіи ма! тик сСуз ма! ма! ма! д5р 260 265 270 ма! бек Ні сій А5р Рго сіи ма! Гуз Ре Азп Тгр Туг ма! Азр су 275 280 285 ма! сіи ма! ніх А5п АїТа Гу5 ТиИг губ Рго Агу сЇми сій сіп туг Абп 290 295 з00 5зег Тиг отуг Агуд ма! ма! бек маїЇ Ге тйг ма! гей ніх сіп А5р тгр 305 310 315 320

Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Су5з Гуз Маї 5ег Азп Гуз АЇа Ге РгОо 325 330 335

АЇїа Рго Іїе сЇи Гуз Тк ІЇе 5ег 1у5 АЇа їу5 ОЇУу сп Рго Ага си 340 345 350

Рго сіп ма! Тукг тТийг Ге Рго Рго 5ег Агуд сім сіи Меє Ттиг Гуз Азбп 355 360 365 сіп ма! 5ег Ге Тк сСу5х Гей ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег Азр Пе 370 375 380

Аїа ма! сіи тер сіи 5ег А5Зп сІіу сіп Рго сі АЗп Ап о Туг Гуз Тег 385 390 395 400

ТИг оРгО Рго маЇ Гей А5р 5ег А5Зр сіу 5ег Ре РПе Гей Туг 5ег Гуз 405 410 415

Гей тТийг омаї Ар Гуз 5ег Аг Тгр сіп сЇп с1у А5п ма! РПе 5ег су 420 425 430 5зег ма! мет Ні сі Аїа ге Ні5 Ап Ні5 Туг ТИйг сіп Гуз 5ег ге 435 440 445 зег їеи 5ег Рго сІу Гуз 450 «2105» 30 «2115» 454 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни905 НЗ3 важкий ланцюг «4005» 30 60 сіи ма! сіп Гей ма! сіи б5ег сіу сїу су Геи ма! сіп Рго осТу сІу 1 5 10 15 зег їеи Агуд Гей 5ег Суз АЇа Аїа б5ег сіу Ре ТНг РМБе 5ег 5ег туг 20 25 30

Тк Мет 5ег Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу Гуз су Геи сіи тТгр ма! 65 35 40 45 5зег сі ІІе 5ег А5п о б5ег сіу А5р ТИйг о тТиг отуг туг РгГо А5Зр тег маї 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе Тийг Ре 5ег Агуд Ар Азп АЇа Гуз Азп 5ег Геи туг 65 70 75 80 70 ем сіп б5ег А5п Гей Ге Аг АїЇа сі Азр Тйг АЇїа ма! туг туг суз

85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг Ттуг сіу сїу сіу туг сіу сІу Тер Ре РПе дА5р 100 105 110 ма! тер сіу сіп сіу тТийг тс ма! тис ма! б5ег б5ег АїЇа 5ег тТиг Гуз 115 120 125 с1Уу Рго 5ег ма! Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег Тиг 5ег С1У 130 135 140 сіу тйг АТа АЇїа гей сіу Суз Гей ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сіи РгО 145 150 155 160 ма! тийг маї 5ег Тер Азп 5ег с1у Аїа Гей Ттийг 5ег сіу ма! ніх тНг 165 170 175

Ре Рго Аїа ма!Ї Гей сіп б5ег б5ег сіу Гей Туг 5ег їеу 5ег 5ег Ммаї 180 185 190 ма! тик ма! Рго 5ег 5ег 5ег їец сіу Тиг о сіп тйг тує т11е сСу5 д5п 195 200 205 ма! Азп Ні Гуз Рго бег Ап ТИг о Гуз ма! Азр Гуз Агд ма! сіи Рго 210 215 220

Гуз 5ег Су А5Зр Гуз ТИйг о Ні Тйг оСуз Рго Рго Су5 Рго АЇа Рго сій 225 230 235 240

Гей Геи сіу сіу Рго б5ег ма! Ре Ге РМПе Рго РгОо Гу5 Рго Гуз д5р 245 250 255

Тк Се Мет ІЇе бек Агуд Тийг оРго сіи ма! тийг Суз ма! ма! ма! др 260 265 270 ма! бек Ні сій А5р Рго сіи ма! Гуз Ре Азп Тгр Туг ма! Азр су 275 280 285 ма! сіи ма! Ні5 А5п АЇа Гуз тТиг Гуз Рго Агу соЇи сЇи сіп тТуг Абп 290 295 з00 5зег Тиг отуг Агуд Ма! ма! бек маїЇ Ге тйг маї гей ніх сіп А5р тгр 305 310 315 320

Гей А5п сіу Гуз сі Ттуг Гуз Суз Гуз ма! 5ег Ап Гу5 АЇТа Геи Рго 325 330 335

АЇїа Рго Іїе сЇи Гуз Тк ІЇе 5ег 1у5 АЇа їу5 ОЇУу сп Рго Ага си 340 345 350

Рго сіп ма! Тукг тТийг Ге Рго Рго 5ег Агд сім сіи мес тиг Гуз А5п 355 360 365 сіп ма! б5ег ге Ттиг о сСу5з Ге маїЇ Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр Пе 370 375 380

Аїа ма! сіи тер сіи 5ег А5Зп сіу сіп Рго си АбЗп Ап о Туг Гуз Тег 385 390 395 400

Тс о РгОо Рго Ма!Ї Гей Азр 5ег д5р сіу бек Ре Ре Геи Туг 5ег Гуз 405 410 415

Гей тТийг омаї А5р Гуз 5ег Аг Тгр сЇп сЇп сіу Азп ма! Ріе 5ег су 420 425 430 5зег ма! мет Ні сі Аїа ге Ні5 Ап Ні5 Туг ТИйг сп Гуз 5ег ге 435 440 445 5зег Гей 5ег Рго сІу Гуз 450 «210» 31 «211» 454 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни905 НЗЬ важкий ланцюг «400» 31 сіи ма! сіп ге ма! сій 5ег сіу сіу сіу Ге ма!ї сіп Рго сІу с1Уу 1 5 10 15 5ег їеи Гуз Гей 5ег Су5з АЇа АЇа 5ег сІіу Ре Тйг Ре 5ег 5ег туг 20 25 30 60 тс о Мес 5ег Тер ма! Агд сіп Тйг Рго сТУу Гуз Агд Гей си Геи маї 35 40 45

Аїа сіи І1Ї1е 5ег А5п о б5ег сіу А5р Тис о тТиготуг Ттуг Рго А5Зр тег маї 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд А5р Азп АЇа Гуз А5зп тТиг о Геи туг 65 65 70 75 80 ей сіп Мес 5ег 5ег гей Гуз б5ег сі Азр ТИг АїТа Мет Туг туг су 85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг Ттуг сіу сїу сіу туг сіу сІу Тер Ре РПе дА5р 100 105 110 70 ма! тер сі1у сіп сіу ТтийгогГеи ма! тиг ма! 5ег б5ег АЇа 5ег тНг Гуз

115 120 125 с1Уу Рго 5ег ма! Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег Тиг 5ег С1У 130 135 140 сіу тйг АТа АЇїа гей сіу Суз Гей ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сіи РгО 145 150 155 160 ма! тик ма! бек Тер АЗп 5ег сІу АЇа Ге Тийг о 5ег сіу ма! ні тег 165 170 175

Ре Рго Аїа ма!Ї Гей сіп б5ег б5ег сіу Гей Туг 5ег їеу 5ег 5ег Ммаї 180 185 190 ма! тийг Ма! Рго 5ег 5ег 5ег Ге сіу Тс о сіп Ттйг о туг ІТе су А5п 195 200 205 ма! Азп Ні Гуз Рго бег Ап ТИг о Гуз ма! Азр Гуз Агд ма! сіи Рго 210 215 220

Гуз 5ег Су А5Зр Гуз Тк Ні Тйг оСуз Рго Рго Су5 Рго АЇа Рго си 15. (225 230 235 240

Гей їеи сіу сіу Рго б5ег ма! Ре Ге Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз д5р 245 250 255

Тк Се Мет ІЇе бек Агуд Тийг оРго сіи ма! тийг Суз ма! ма! ма! др 260 265 270 ма! бек Ні сім А5р Рго сіи ма! Гуз Рпе Азп Тгр Туг ма! Аз5р О1У 275 280 285 ма! сіи ма! Ні5 А5п АЇа Гуз тТиг Гуз Рго Агу сої сЇи сіп тТуг Абп 290 295 з00 5зег Тиг отуг Агуд Ма! ма! бек маїЇ Ге тйг маї гей ніх сіп А5р тгр 305 310 315 320

Гей АЗп сіу Гуз сі Туг Гуз Суб5 Гуз МмаЇ 5ег АЗп Гуз АЇа Геи РгОо 325 330 335

АЇїа Рго Іїе сЇи Гуз Тк ІЇе 5ег уз АЇа їу5 ОЇУу сп Рго Ага си 340 345 350

Рго сіп ма! Тукг тТийг Ге Рго Рго 5ег Агд сім сіи мес тиг Гуз А5п 355 360 365 сіп ма! б5ег ге тТиг о Су5з Ге маїЇ Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5р ІЇе 370 375 380

Аїа ма! сіи тер сіи 5ег А5Зп сіу сіп Рго сЇи АбЗп Ап о Туг Гуз ТАг 385 390 395 400

ТИг оРгО Рго маЇ Гей А5р 5ег А5Зр сіу 5ег Ре РПе Гей Туг 5ег Гуз 405 410 415

Гей тТийг омаї Ар Гуз 5ег Аг Тгр сп сЇп сіу Азп ма! РНе 5ег су 420 425 430 5зег ма! Мет Ні5 сім Аїа Гей Ні5 А5п Ні Туг ТНг сп Гуз 5ег Геи 435 440 445 5зег Гей 5ег Рго сІу Гуз 450 «2105» 32 «2115» 454 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни905 Ні важкий ланцюг «4005» 32 сіи ма! сіп ге ма! сій 5ег сіу сІу сіу Гей маїЇ сіп Рго сІу сі1у 1 5 10 15 зег їеи Агуд Гей 5ег Суз АЇа Аїа б5ег сіу Ре ТНг РМБе 5ег 5ег туг 20 25 30

Тк Мет 5ег Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу їу5 Ос1у гГеи сіи Тгр ма! 35 40 45 5зег сі ІІе 5ег А5п о б5ег сіу А5р ТИйг о тТиг отуг туг РгГо А5Зр тег маї 50 55 60 60 Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд Ар Азп АЇа Гуз Азп 5ег Геи туг 65 70 75 80

Гей сіп 5ег А5п Гей Ге Аг АїЇа сі А5р Тйг АЇїа ма! туг туг суз 85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг Ттуг сіу сїу сІу туг сіу сіу тер Ре РПе д5р 65 100 105 110 ма! тер сіу сіп сіу тТийг тс ма! тис ма! б5ег б5ег АїЇа 5ег тТиг Гуз 115 120 125 с1Уу Рго 5ег ма! Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег Тиг 5ег С1У 130 135 140 70 с1у тНг АТа Аїа гей сіу Суз Гей ма! Гуз А5зр Туг Ре Рго си РгОо

145 150 155 160 ма! тик ма! бек Тер АЗзп 5ег с1у АЇїа Ге Тйг о б5ег сіу ма! ні тег 165 170 175

Ре Рго Аїа ма!Ї Гей сіп б5ег б5ег сіу Гей Туг 5ег їеу 5ег 5ег Ммаї 180 185 190 ма! тик ма! Рго 5ег 5ег 5ег їеи сіу Тийг о сіп Тийг тує те сСуз д5п 195 200 205 ма! Азп Ні Гуз Рго бег Ап ТИг о Гуз ма! Азр Гуз Агд ма! сіи Рго 210 215 220

Гуз 5ег Суз Азр Гуз ТИг Ні Тк о сСу5 Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго си 225 230 235 240

Гей їеи сіу сіу Рго б5ег ма! Ре Ге Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз д5р 245 250 255

Тк Се Мет ІЇе бек Агуд Тийг о Рго сіи ма! тиг Суз ма! ма! ма! дз5р 260 265 270 ма! бек Ні сій А5р Рго сіи ма! Гуз Ре Азп Тгр Туг ма! Азр су 275 280 285 ма! сіи ма! Ні5 А5п АЇїа Гуз Тиг Гуз Рго Агу соЇи сЇи сіп тТуг Абп 290 295 з00 5зег Тиг отуг Агуд ма! ма! бек маїЇ Ге тйг ма! гей ніх сіп А5р тгр 305 310 315 320

Гей АЗзп сіу Гуз сі Туг Гуз Су5з Гуз МаЇ 5ег АЗп Гуз АЇа Геи РгОо 325 330 335

АЇїа Рго Іїе сЇи Гуз Тк ІЇе 5ег 1у5 АЇа їу5 ОЇУу сп Рго Ага си 340 345 350

Рго сіп ма! Тукг тТийг Ге Рго Рго 5ег Агд сім сіи мес тиг Гуз А5п 355 360 365 сіп ма! б5ег ге Ттиг о сСу5з Ге маїЇ Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр Пе 370 375 380

Аїа ма! сіи Тер сіи б5ег Азп сіу сіп Рго сЇи А5п Ад5п Туг Гуз Тег 385 390 395 400

ТИг оРгО Рго маЇ Гей А5р 5ег А5Зр сіу 5ег Ре РПе Гей Туг 5ег Гуз 405 410 415

Гей тТийг омаї А5р Гуз 5ег Аг Тгр сЇп сЇп сіу Азп ма! Ріе 5ег су 420 425 430 5зег ма! мет Ні сі Аїа ге Ні5 Ап Ні5 Туг ТИйг сіп Гуз 5ег ге 435 440 445 5зег Гей 5ег Рго сІу Гуз 450 «2105» 33 «2115» 454 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни905 Н4.Ь важкий ланцюг «4005» 33 сіи ма! сіп ге ма! сій 5ег сіу сіу сіу Ге ма!ї сіп Рго сІу с1Уу 1 5 10 15 зег Гей Гуз Гей 5ег Суз АЇа Аїа 5ег сіу Ре ТНг РМБе 5ег 5ег туг 20 25 30

Тк Мет 5ег Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сІіу Гуз Агд Гей сіи Геи ма! 35 40 45

Аїа сіи І1Ї1е 5ег А5п о б5ег сіу А5р Тис о тТиготуг туг Рго А5Зр тег маї 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд А5р Азп АЇа Гуз А5зп тТиг о Геи туг 65 70 75 80 ей сіп Мес 5ег 5ег гей Гуз б5ег сі Азр ТИг АїТа Мет Туг туг су 85 90 95 60 АїЇа Ага Ні Туг туг туг сіу сіу сІїу туг сіу сіу Тер Ре РНе дзр 100 105 110 ма! тер сіу сіп сіу Ттийгоїеи ма! тис ма! б5ег б5ег Аа 5ег Тис Гуз 115 120 125 с1Уу Рго 5ег ма! Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег Тиг 5ег С1У 65 130 135 140 сіу тйг АТа АЇїа гей сіу Суз Гей ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сіи РгО 145 150 155 160 ма! тик ма! бек Тер АЗп 5ег сІу АїЇа Ге Тийг о 5ег сіу ма! ні тег 165 170 175 70 Ре Рго Аїа ма! Ге сіп 5ег бек сІу Ге Туг 5ег їеи 5ег 5ег маї

180 185 190 ма! тик ма! Рго 5ег 5ег 5ег їец сіу Тиг о сіп тйг тує т11е сСу5 д5п 195 200 205 ма! Азп Ні Гуз Рго бег Ап ТИг о Гуз ма! Азр Гуз Агд ма! сіи Рго 210 215 220

Гуз 5ег Су А5Зр Гуз ТИйг о Ні Тйг оСуз Рго Рго Су5 Рго АЇа Рго сій 225 230 235 240

Гей їеи сіу сіу Рго б5ег ма! Ре Ге Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз д5р 245 250 255

Тс їеи Мет ІЇїе 5ег Агуд Тийг оРго сіи ма! тийг Суз ма! ма! маї дор 260 265 270 ма! бек Ні сій А5р Рго сіи ма! Гуз Ре Азп Тгр Туг ма! Азр су 275 280 285 ма! сіи ма! Ні5 А5п АЇа Гуз тТиг Гуз Рго Агу соЇи сЇи сіп тТуг Абп 290 295 з00 5зег Тиг отуг Агуд Ма! ма! бек маїЇ Ге тйг маї гей ніх сіп А5р тгр 305 310 315 320

Гей АЗзп сіу Гуз сі Туг Гуз Суб5 Гуз МаЇ 5ег АЗп Гуз АЇа Геи РгОо 325 330 335

Аїа Рго Іе сіи Гу5 Тиг ІЇе 5ег ї1у5 АїЇа Гуз сІЇу сіп Рго Аг си 340 345 350

Рго сіп ма! Тукг тТийг Ге Рго Рго 5ег Агд сім сіи мес тиг Гуз А5п 355 360 365 сіп ма! б5ег ге Ттиг о сСу5з Ге маїЇ Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр Пе 370 375 380

Аїа ма! сіи тер сіи 5ег А5Зп сіу сіп Рго сЇи АбЗп Ап о Туг Гуз Тег 385 390 395 400

ТИг оРгО Рго маЇ Гей А5р 5ег А5Зр сіу 5ег Ре РПе Гей Туг 5ег Гуз 405 410 415

Гей тТийг омаї А5р Гуз 5ег Аг Тгр сЇп сЇп сіу Азп ма! Ріе 5ег су 420 425 430 5зег ма! мет Ні сі Аїа ге Ні5 Ап Ні5 Туг ТИйг сп Гуз 5ег ге 435 440 445 5зег Гей 5ег Рго сІу Гуз 450 «210» 34 «2115» 454 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни905 Н5 важкий ланцюг «4005» 34 сіи ма! сіп ге ма! сій 5ег сіу сіу сіу Ге ма!ї сіп Рго сІу с1Уу 1 5 10 15 зег їеи Агуд Гей 5ег Суз АїЇа Аїа б5ег сіу Ре ТНг РМБе 5ег 5ег туг 20 25 30

Тк Мет б5ег о Тгр ма! Агуд сп тйг Рго сій Гуз Аго Гей сіи Геи ма! 35 40 45 Аїа сім ІІе 5ег А5п б5ег с1у А5р Тис тис туго туг Рго Азр Тег ма! 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд А5р Азп АЇа Гуз А5зп тТиг о Геи туг 65 70 75 80

Гей сіп Меє Абп Гей Ге Аг АїЇа сій Ар Тйг АЇїа ма! туг туг су 85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг Ттуг сіу сїу сіу туг сіу сІу Тер Ре РПе дА5р 100 105 110 ма! тер сіу сіп сіу тТийг тс ма! тис ма! б5ег б5ег Аа б5ег тиг Гуз 115 120 125 60 с1у Рго 5ег маїЇ Ре Рго Ге АЇїа Рго 5ег 5ег Гуз бег Тиг 5ег су 130 135 140 сіу тйг АТа Аїа ге сіу Суз Гей ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сіи РгО 145 150 155 160 ма! тик ма! бек Тер АЗп 5ег сІу АЇа Ге Тийг о 5ег сіу ма! ні тег 65 165 170 175

Ре Рго Аїа ма! Гей сіп 5ег б5ег сіу Гей Туг 5ег їеу 5ег 5ег Ммаї 180 185 190 ма! тик ма! Рго 5ег 5ег 5ег їец сіу Тиг о сіп тйг тує т11е сСу5 д5п 195 200 205 70 ма! Ап Ніб5 Гуз Рго 5ег А5п ТИг огГуз ма! А5зр Гуз Агуд ма! си Рго

210 215 220

Гуз 5ег Су А5Зр Гуз Тк Ні Тйг оСуз Рго Рго Су5 Рго АЇа Рго си 225 230 235 240

Гей їеи сіу сіу Рго 5ег ма! Ре Ге Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз А5р 245 250 255

Тк Се Мет ІЇе бек Агуд Тийг оРго сіи ма! тийг Суз ма! ма! ма! др 260 265 270 ма! бек Ні сій А5р Рго сіи ма! Гуз Ре А5Зп Тгр Ттуг ма! Азр СсС1У 275 280 285 ма! сіи ма! ніх А5п Аїа гГу5 ТиИг губ Рго Агу сім сій сіп туг А5бп 290 295 з00 5зег Тийг отуг Агд ма! ма! бек маїЇ Ге тйг ма! гей ніх сп д5р Тер 305 310 315 320

Гей АЗп сіу Гуз сі Туг Гуз Суб5 Гуз МмаЇ 5ег АЗп Гуз АЇа Геи РгОо 325 330 335

АЇїа Рго Іїе сЇи Гуз Тк ІЇе 5ег уз АїЇа Гуз с1у сп Рго Ага си 340 345 350

Рго сіп ма! Тукг тТийг Ге Рго Рго 5ег Агд сім сіи мес тиг Гуз А5п 355 360 365 сіп ма! 5ег Ге Тк сСу5 Гей ма! Гуз сіу Рпе туг Рго 5ег А5р ІїЇе 370 375 380

Аїа ма! сіи тер сіи 5ег А5Зп сіу сіп Рго сЇи АбЗп Ап о Туг Гуз ТАг 385 390 395 400

ТИг оРгО Рго маЇ Гей А5р 5ег А5р сіу 5ег Ре Ре Геи Туг 5ег Гуз 405 410 415

Гей тТийг омаї Ар Гуз 5ег Аг Тгр сп сЇп сіу Азп ма! РНе 5ег су 420 425 430 5зег ма! мет Ні сі Аїа ге Ні5 А5п Ні5 Туг Тиг сіп Гуз 5ег ге 435 440 445 зег Гей 5ег Рго сІу Гуз 450 «2105» 35 «2115» 219 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни905 11 легкий ланцюг «4005 35

А5зр ІчІЇе ма! Мес тис сіп 5ег Рго Гей бег Гей Рго Ма! Тиг Рго О1У 1 5 10 15 си Рго АЇїа бек ІЇе 5ег сСуз5з Агуд 5ег 5ег Гуз бег їеи Ге Ні 5ег 20 25 30

Азп с1у А5зп о Тйг туго Гей Туг Тер Ре Гей сіп Гуз Рго сіу сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей ІїІе туг Агд ма! 5ег Азп Ге АЇа б5ег су ма! Рго 60

А5Зр Агу Ре 5ег сіу бек сіу 5ег сіу Тйг А5зр Ре тНг Геи Гуз Пе 65 70 75 80 50 5зег Агуд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Меє сіп Ні 85 90 95

Гей сім тТуг Рго Гей Тийг Ріе сіу сіп сіу тйг Гуз Ге сіи ІЇе Гуз 100 105 110

Агд Тис ома!ї АТа діа Рго бек ма! Ре ІЇе РПе Рго РгОо 5ег А5р си 55 115 120 125 сіп ге Гуз 5ег сіу Тйг АТа 5ег ма! маї Суз Ге Ге А5Зп А5п Ре 130 135 140 туг Рго Агуд сім АЇїа Гуз ма! сіп Тер Гуз маї д5р доп АїЇа гей сп 145 150 155 160 60 5зег сіу Азп 5ег сіп сій бек ма! тйг сіи сіп А5р 5ег Гуз дА5р 5ег 165 170 175

Тиг о туг б5ег Ге б5ег б5ег ТИг о їГеи Тиг Ге 5ег Гуз АЇа Азр Туг си 180 185 190

Гуз Ніз Гуз ма! туг Аїа Су5 сіи ма! тийг ніх сіп сіу Гей 5ег 5ег 65 195 200 205

Рго ма! Тиск Гуз 5ег Ре А5п Агуд су си сСуз 210 215 «2105» 36 70 «2115» 219

«2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни905 12 легкий ланцюг хаб» 36

Азр ІІе ма! Меє тйг о сіп 5ег Рго Гей 5ег Гей Рго Ма! Ттйг Рго сІу 1 5 10 15 си Рго АЇїа бек ІЇе 5ег сСуз5з Агуд 5ег 5ег Гуз бег їеи Ге Ні 5ег 20 25 30

А5п с1у А5п о Тиг туго Гей Туг Тер Туг Гей сп Гуз Рго сіу сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей ІїІе туг Агд ма! 5ег Азп Ге АЇа б5ег су ма! Рго 50 55 60

А5Зр Агу Ре 5ег сіу бек сіу 5ег сіу Тйг А5Зр Ре тНг гГеи Гуз Пе 65 70 75 80 5зег Агд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Мет сіп нів 85 90 95

Гей сім тТуг Рго Гей Тийг Ріе сіу сіп сіу тйг Гуз Ге сіи ІЇе Гуз 100 105 110 Агд Тк ма! Аїа Аїа Рго 5ег ма! Ріпе ІїЇе РПе Рго Рго 5ег А5р си 115 120 125 сіп ге Гуз 5ег сіу Тйг АТа 5ег ма! маї Суз Гей Ге А5Зп А5п Ре 130 135 140 туг Рго Агуд сім АЇїа Гуз ма! сіп Тер Гуз маї д5р доп Аа гей сіп 145 150 155 160 5ег с1у А5п 5ег сіп сій 5ег ма! тийг си сіп д5р 5ег уз Азр 5ег 165 170 175

Тиг о туг б5ег Ге б5ег б5ег ТИг о їеи Тиг Ге 5ег Гуз АЇа А5р Ттуг сим 180 185 190

Гуз Ні Гуз ма! туг Аїа Суз сіи ма! тиг ніх сіп сіу Ге 5ег 5ег 195 200 205

Рго ма! Тиск Гуз 5ег Ре А5п Агуд су си сСуз 210 215 «210» 37 «2115» 219 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни905 ІЗ легкий ланцюг «4005» 37

Азр ІІе ма! Меє тйг о сіп 5ег Рго Гей 5ег Гей Рго Ма! Ттйг Рго сІу 1 5 10 15 си Рго АЇїа бек ІЇе 5ег сСуз5з Агуд 5ег 5ег Гуз бег їеи Ге Ні 5ег 20 25 30

Азп с1у А5зп о Тйг туго Гей Туг Тер Ттуг Гей сіп Гуз Рго сіу сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей ІїІе туг Агд ма! 5ег Азп Ге АЇа б5ег су ма! Рго 60 50 зег Агуд Ре 5ег сіу б5ег сіу 5ег сіу Тйг А5Зр Ре тНг Геи Гуз Іе 65 70 75 80 5зег Агуд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Меє сіп Ні 85 90 95

Гей сім тТуг Рго Гей Тийг Ріе сіу сіп сіу тйг Гуз Ге сіи ІЇе Гуз 55 100 105 110

Агд Тис ома!ї АТа діа Рго бек ма! Ре ІЇе РПе Рго Рго 5ег А5р си 115 120 125 сіп ге Гуз 5ег сіу Тйг АТа 5ег ма! маї Суз Гей Ге А5Зп А5п Ре 130 135 140 60 туг Рго Агуд сій Аїа Гуз ма! сіп тгр Гуз ма! Азр А5Зп Аїа гГеи сіІп 145 150 155 160 5ег с1у А5п 5ег сіп сій 5ег ма! тийг си сіп д5р 5ег уз Азр 5ег 165 170 175

Тиг о туг б5ег Ге б5ег б5ег ТИг о їГеи Тиг Ге 5ег Гуз АЇа Азр Туг си 65 180 185 190

Гуз Ніз Гуз ма! туг Аїа Су5 сіи ма! тийг ніх сіп сіу Гей 5ег 5ег 195 200 205

Рго ма! Тиск Гуз 5ег Ре А5п Агуд су си сСуз 210 215 70

«2105» 38 «2115» 219 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни905 14 легкий ланцюг «4005» 38

Азр ІчІІе ма! мес тйг сіп 5ег АЇа Рго 5ег Ге Рго Ма!ї Тиг Рго СсІУуУ 1 5 10 15 си Рго Ма! 5ег ІЇе б5ег суб Агд б5ег 5ег Гуз 5ег Гей їеи Ні 5ег 20 25 30

Азп сіу Азп Ттиг о туго гей Туг Тер Ре Геи сіп Агуд Рго су сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей ІїІе туг Агд ма! 5ег Азп Ге АЇа б5ег су ма! Рго 50 55 60 зег Агуд Ре 5ег сіу бег сіу 5ег сІ1у Тйг АїТа Ре тНг Ггеи Ага ІїЇе 65 70 75 80 5зег Агуд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Меє сіп Ні 85 90 95

Гей сіи Туг Рго Гей Тйг Ре сіу сіп сЇу тиг Гуз Гей сіи Пе Гуз 100 105 110

Агд Тис ома!ї АТа діа Рго бек ма! Ре ІЇе РПе Рго РгОо 5ег А5р си 115 120 125 сіп ге Гуз 5ег сіу Тйг АТа 5ег ма! маї сут Гей Ге АЗзп А5Зп РНе 130 135 140 туг Рго Агуд сім АЇїа Гуз ма! сіп Тер Гуз маї д5р доп АїЇа гей сп 145 150 155 160 5ег с1у А5п 5ег сіп сій 5ег ма! тйг си сіп др 5ег Гуз Азр 5ег 165 170 175 тис тує б5ег Ге 5ег б5ег ТИг Ге Тиг Гей 5ег Гуз АЇїа Азр Туг сЇи 180 185 190

Гуз Ніз Гуз ма! туг Аїа Су5 сіи ма! тийг ні5 сіп сіу Гей 5ег 5ег 195 200 205

Рго ма! Тиск Гуз 5ег Ре А5п Агуд су си сСуз 210 215 «2105» 39 «2115» 219 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни905 15 легкий ланцюг «4005» 39

Азр ІІе ма! Ммеє тйг сіп 5ег АЇа Рго 5ег Гей Рго Ма! Ттйг Рго сІу 1 5 10 15 сі 5ег ма! бек ІЇе 5ег сСуз5з Агуд 5ег 5ег Гуз бег їеи Ге Ні 5ег 20 25 30

Азп сіу Азп Ттиг о туго гей Туг Тер Ре Геи сіп Агу Рго сІу сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей ІїІе туг Агд ма! 5ег Азп Ге АЇа б5ег су ма! Рго 50 55 60 зег Агуд Ре 5ег сіу бег сіу 5ег сіу Тйг Аїа Ре тНг гГеми Ага ІїЇе 65 70 75 80 5зег Агуд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Меє сіп Ні 85 90 95

Гей сім тТуг Рго Гей Тийг Ріе сіу сіп сіу тйг Гуз Ге сіи ІЇе Гуз 100 105 110

Агд Тис ома!ї АТа діа Рго бек ма! Ре ІЇе РПе Рго РгОо 5ег А5р си 115 120 125 60 сій Ге Гуз 5ег сіу Тиг Аіа б5ег ма! ма! су5з ге Гей Ап АЗп РІПе 130 135 140 туг Рго Агуд сім АЇїа Гуз ма! сіп Тер Гуз маї д5р доп АїЇа гей сп 145 150 155 160 5ег с1у А5п 5ег сіп сій 5ег ма! тпг си сіп дор 5ег уз Азр 5ег 65 165 170 175

Тиг о туг б5ег Ге б5ег б5ег ТИг о їГеи Тиг Ге 5ег Гуз АЇа Азр Туг си 180 185 190

Гуз Ніз Гуз ма! туг Аїа Су5 сіи ма! тийг ніх сіп сіу Гей 5ег 5ег 195 200 205 70 Рго ма! Тиск Гуз 5ег Ре А5п Агуд су си сСуз

210 215 «210» 40 «2115» 429 «2125» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» т9О05УН з сигнальним пептидом «400» 40 акддасьстд ддстсадсте дастеессте деіссттдДЕ сааааддтді сстдтдсдаа 60 дедаадстда хддадестад дададдаєєса адасдсадсстд дадддессст дааастстсс 120 тасдсадсст стддаєсссас тЕЕсадсадс татассатає сетдддаєєсд ссадастсса 180 даааададдс хддадесддає содасадаааєії адсаасадстд дсдасассас стастатсса 240 дасастдстаа адддссдаєе сасстстсс ададасаатд ссаадаасас сстдтасста 300 сааасдадса дЕстдаадсс сдаддасасд дссаєдтаєі астдсдсаад асаєтаєтас 360 тасддєдасд астасдаддд дкдадесстес датдаєстддод дсасадддас сасддесасс 420 дЕстсстса 429 «210» 41 «2115» 143 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» т9О05УН з сигнальним пептидом «400» 41

Мет Азр Ре сіу Гей 5ег Гей ІІе Рпе Геи маї Геи ма! гей Гуз с1у 1 5 10 15

Уа! Гей сСуз сіи ма! Гуз Ге ма! сіи 5ег сіу сіу сіу гГеи маїЇ сіп 20 25 30

Рго сіу сІу 5ег їеи губ Ге б5ег Суз АЇа Аіїа б5ег сіу Ре Ттйг РНе

Ко) 35 40 45 5зег бег Ттуг тТиг Мет б5ег Тгр ма! Агд сіп Ттйг Рго си Гуз Ага гГеи 50 55 60 сій їеи ма! Аїа сій ІЇе б5ег А5п 5ег сіу А5р Ттиг о тТиг туго туг РгОо 65 70 75 80

А5р о твйг ма! Гуз сіу Агуд Ре ТИг РПе 5ег Аг А5р А5п АїЇа Гу Авп 85 90 95

ТИг Се туг Ге сіп Мет 5ег 5ег їеци їуз 5ег си АЗр ТИг АїТа Меєс 100 105 110 туг туг суз Аїа Агуд Ні Туг Туг Туг сіу су сіу туг сіу су тер 115 120 125

Рпе Ре Азр ма! Тер сіу тийг о сіу тис оте ма! тег ма! 5ег 5ег 130 135 140 «210» 42 «2115» 396 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» т9р5МмІ з сигнальним пептидом «400» 42 аскдаддєдсес хтадстдадеє сстддддстд сттддсЕсе ддаєссстдд адссаєссдда 60 дастаєсдєда сдастсаддс тодсассстст дстасстдєса стсстддада деЕсадтатсс 120 асстсстдса ддасстадсаа дадестсстд сасадсаатд дсаасастта сттдтаєсдаоа 180 тЕсстдсада ддссаддсса дістсстсаа стсстдатат ассдддкаєс саассттдсс 240 хсаддадесс садасаддесї садсддсаді ддассаддаа стдстттсас астдадаатс 300 адсададсда адастдадда тасдддатаєе тастастдста судсаасаєсє адаастаєсся 360 стісасдетсд деЕдстддаас саадстддад стдааа 396 «210» 43 «2115» 132 бо «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» т9р5МІ з сигнальним пептидом «400» 43 65 мес Ага Ссуз Гей АїЇа сіи РПе Гей сіу Гей Гей ма! Гей Тер ІЇе Рго 1 5 10 15 сСІУу АїЇа ІІе сіу А5р ІЇе ма! мес тйг сіп АЇа АЇїа Рго 5ег ма! Рго 20 25 30 ма! Тис о Рго сІ1у сі бек ма! 5ег ІІе 5ег сСу5 Агуд 5ег 5ег Гуз 5ег 70 35 40 45

Гей Семи Ні бек АЗп сіу А5п Тийг туго Ге Туг Тер Ре Гей сп Ага 50 55 60

Рго сіу сіп б5ег Рго сіп Геи гей ІЇІе туг Агд ма! 5ег Азп Геи АїЇа 65 70 75 80 бБег сіу ма! Рго Ад5р Агуд Рпе 5ег сіу 5ег сіу бег сЇ1у ТтНг АЇїа РПе 85 90 95

Тк Гей Агуд Іїе 5ег Агуд ма! сім Аїа сій А5р ма! сіу ма! туг туг 100 105 110

Суз мет сіп Ніз Гей сіи Ттуг Рго Гей Тийг Ріе Ссіу АЇа сіу тег Гуз 115 120 125 ем сіи Геи Гуз 130 «210» 44 «2115» 372 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни9р5МнНмМ1 «400» 44 дадасдсадс хтдасддадіс сддсддсдас стдудедсадс ссддсдастс сстдсдсста 60 тсстдсдссу сстссддсте сассетстсс тсстасасса тдхсстддає дсдссаддсес 120 сссддсаада дсстддадсї дасддссдад асстссааст ссддсдасас сасстастас 180 сссдасасса хдаадддсесд стісассттс хсссдсдаса асдссаадаа стссстдтас 240 стдсадесса астссстідаа ддссдаддас ассдссдіді астастдсдс ссдссастас 300 тастасддсд дсддстасдда сддастадЕс тЕсдасдєді ддддассаддд сассассдта 360 ассудєдєсст са 372 «210» 45 «2115» 372 «2125» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни905МНм2 «400» 45 даддсдсадс хтддсддадіс сдасддсдас стдудєдсадс ссддсдасес сстдсдсстд 60 тсстдсдссу сстссддсте сассетстсс тсстасасса тдхсстддадає дсдссаддсес 120 сссддсаада дсстддадсї дасддссдад асстссааст ссддсдасас сасстастас 180 сссдасасса хдаадддсесд сттсасстсс тсссдсдаса асдссаадаа стссстдтас 240 стдсадтсса асстдстдсд сдссдаддас ассдссасдє астастдсдс ссдссастас 300 хастасддсд дсдастасда сдастддЕсс еЕсдасдтас ддддссаддд сассассоатд 360 ассдєдєсст са 372 «210» 46 «2115» 372 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни9о5МНм2Б «400» 46 дадасдсаас хдасддадіс хддсддсдас тдудхдсаас стддсдастс сстдаадстд 60 жсстасдссд сстссудсее сассттсадс адстатасса тдІсттдадЕ дсдссааасс 120 сссдадаада ддстддадеї дасддстдад ассадсааса дсддсдастас сасстастат 180 сссдатассд хдаадддсесд стісассаєі хссададаєта асдстаадаа тассстутає 240 стдсаааєда дсадсстдаа дістдаддає ассдстасує астаєссосудс тадасаєтає 300 тассаєдоасдуд асддстаєсдд сддастадЕс сесдасуєду ддддссаадд сассстддес 360 ассдєдєсст са 372 «210» 47 «2115» 372 «212» ДНК «213» Штучна послідовність бо «220» «223» Ни905МНмЗ3 «400» 47 дадасдсадс хтдасддадіс сддсддсдас стдудкдсадс ссддсдастс сстдсдсстд 60 тсстдсдссу сстссддсте сассетстсс тсстасасса хдІсстддаєЄ дсдссаддсес 120 65 сссддсаадд дсстддадсд ддкдіссдад асстссааст ссддсдасас сасстастас 180 сссдасасса хдаадддсесд стісассттс хсссдсдаса асдссаадаа стссстдтас 240 стдсадтсса асстдстдсд сдассдаддас ассдссасдє астастдсдс ссдссастас 300 тастасддсд дсддстасдд сддастадЕс тЕсдасдєді ддддассаддд сассассдта 360 ассудєдєсст са 372 70 «210» 48

«2115» 372 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» НиИ905МНМ3Б «400» 48 дадасдсаас хдасддадіс хддсддсдас ссддедсаас стддсдастс сстдаадста 60 тсстдтдссу сстссддсте сассттсадс адстастасса тдусттдддає дсдссааасс 120 сссадддаада ддстддадиї дасддстдад ассадсааса дсддсдастас сасстастат 180 сссдастассд даадддсесд сттсассаєі сссададаста асдстаадаа тассстоатає 240 стдсаааєда дсадсстдаа дістдаддає ассдстасує астаєссосудс тадасаєтає 300 тассаєдоасдуд асддстаєсдд сддастадЕс сесдасуєду ддддссаадд сассстддес 360 ассдєдєсст са 372 «210» 49 «2115» 372 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни905МНм4 «400» 49 дадасдсадс хтдасддадіс сддсддсдас стдудкдсадс ссддсдастс сстдсдсстд 60 тсстдсдссу сстссддсте сассетстсс тсстасасса тдхсстддає дсдссаддсес 120 сссддсаада дсстддадсд дасдессдад асстссааст ссддсдасас сасстастас 180 сссдасасса хдаадддсесд стісассаєс хсссдсдаса асдссаадаа стссстдтас 240 стдсадесса асстдстдса сдссдаддас ассдссдіді астастдсдс ссдссастас 300 тастасддсд дсддстасдд сддастадЕс тЕсдасдєді ддддассаддд сассассдта 360 ассудєдєсст са 372 «2105» 50 «2115» 372 «2125» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни9о5мМНм4Б «4005 50 даддсдсаас тддсддадіс сдасддсдас Етдутдсаас стддсдадстс сстдаадстд 60 тсстдтдссу сстссддсте сассттсадс адстастасса тдустсддадає дсдссаадсс 120 сссадддаада ддстддадеє дасддстдад ассадсааста дсддсдастас сасстастат 180 сссдастассд хдаадддсесд стісассаєі хссададаєта асдстаадаа тассстутає 240 стдсаааєда дсадсстдаа дістдаддає ассдстасує астаєссосудс тадасаєтає 300 хаєтасддсд дсдастаєда сдастддеЕсс еЕсдаєсдтає ддддссаадд сассстддєс 360 ассдєдкєсст са 372 «2105» 51 «2115» 372 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни905МНмМ5 «4005» 51 дадасдсадс хтдасддадіс сддсддсдас стдудкдсадс ссддсдастс сстдсдсстд 60 жсстдсдссд сстссудсеЕ сассттстсс хсстасасса татсстдддє дсдссадасс 120 сссдадаадс дсстддадсї дасддссдад асстссааст ссддсдасас сасстастас 180 сссдасассд хдаадддсесд стісассаєс хсссдсдаса асдссаадаа сассстдтас 240 стдсадаєда асстдстдсд содссдаддас ассдссасдє астастдсдс ссдссастас 300 тастасддсд дсддстасдд сддастадЕс тЕсдасдєді ддддссаадд сассассдта 360 ассдєдксст са 372 «2105» 52 «211» 336 «212» ДНК «213» Штучна послідовність бо «220» «223» Ни9р5мМІм1 «4005» 52 дасаєссдіда сдасссадес ссссстдссс стдсссдіда сссссдодсда дсссдестсс 60 акстсстдсс дстсстссаа діссстдстд састссаасуд дсаасасста сстдтастдд 120 65 теЕсстдсада адсссддсса деіссссссад стдстдаєст ассдсутдіс саасстддес 180 тссддсдсдс ссдассасте стссдадстсс ддстссддса ссдасттсас сстдаадатс 240 тсссдсдс99 аддссдадда сасддасуєтд тастастдса стдсадсасст ддадсасссс 300 стдасстссд дссадддсас саадстддад ассааа 336 «2105» 53 70 «2115» 336

«212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни9р5МіІм2 хаб» 53 дасаєссдтда сдасссадес ссссстдссс стдсссдіда сссссдадсда дсссдестсс 60 акстсстдсс дстсстссаа діссстдстд састссаасуд дсаасасста сстдтастдд 120 тасстдсада адсссддсса діссссссад стдстдаєст ассдсуєдіс саасстддсес 180 тссддсдсдс ссдассасте стссдадстсс ддстссддса ссдасттсас сстдаадатс 240 хсссодсуєдд аддссдадда сдсдддсдсд тастастдса тдсадсасстї ддадстасссс 300 стдасстссд дссадддсас саадстддад ассааа 336 «2105» 54 «211» 336 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни9Ор5мМіІ м3 «4005» 54 дасаєссдіда сдасссадес ссссстдссс стдсссдіда сссссдадсда дсссдсстсс 60 акстсстдсс дстсстссаа діссстдстд састссаасуд дсаасасста сстдтастддуд 120 тасстдсада адсссддсса діссссссад стдстдаєст ассдсуєдіс саасстддсес 180 тссддсдсдс сстсссастЕ стссдодстсс дудстссддса ссдасттсас сстдаадатс 240 тсссдсдс9у аддссдадда сдсддасуєтд тастастдса стдсадсасст ддадсасссс 300 стдассттсд дссадддсас саадстддад ассааа 336 «2105» 55 «211» 336 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220»

Зо «223» Ни9О5МіІ м4 «4005» 55 дасаєссдіда сдасссадсс сдссссстсс стдсссдіда сссссдадасда дсссдідтсс 60 акстсстдсс дстсстссаа діссстдстд састссаасуд дсаасасста сстдтастдд 120 тЕсстдсадс дссссддсса діссссссад стдстдаєст ассдсуєдіс саасстддсес 180 хссдасукдс сстсссдстЕ стссудстсс ддстссддса ссдссттсас сстдсдсаєс 240 тсссдсдс9у аддссдадда сдєддасуєта тастастдса тдсадсасст ддадсасссс 300 стдасстссд дссааддсас саадстддад ассааа 336 «2105» 56 «211» 336 «2125» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни905МіІм5 «4005 56 дасаєссдєда єдасссадес сдссссстсс стдсссдіда сссссддсда діссдідтсс 60 акстсстдсс дстсстссаа діссстдстд састссаасуд дсаасасста сстдтастдд 120 тЕсстдсадс дссссддсса діссссссад стдстдаєст ассдсуєдіс саасстддсес 180 тссддсдсдс сстсссастЕ стссдодстсс дудстссддса ссдесттсас сстдсдсатс 240 тсссдсдс9у аддссдадда сдєддасута тастастдса тдсадсасст ддадсасссс 300 стдасстссуд дссааддсас саадстддад ассааа 336 «2105» 57 «211» 19 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» 905МнН Сигнальний пептид «4005» 57

Мет А5р Ре СсСІу Гей 5ег ей ІЇе Ріе Геи маї Ггеи маїЇ Гей Гуз сі1у 1 5 10 15 60 ма! Ггеи су «2105» 58 «2115» 57 65 «2125» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» 905МнН Сигнальний пептид «4005 58 70 акдддасссд ддсесадсее даєстесстє деЕссттд тааааддтдє сстотатс 57

«2105» 59 «2115» 20 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» 905МІ Сигнальний пептид «4005 59 мес Агд Суз Гей Аїа сіи Ре їеи сІу Ге Ге ма!ї Гей Тер Іе Рго 1 5 10 15 с1у Аїа Пе Сс1У 20 «210» 60 «2115» 60 «2125» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» 905МІ Сигнальний пептид «4005» 60 атдаддєдсс тадстдадес сстддддста сЕсдтдстсе ддаєссстдд адссаєсддд 60 «2105» 61 «2115» 124 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» т1і4о8МУн «400» 61 сіи ма! Гуз Ге ма! сій 5ег сіу сіу сіу Ге маї сіп Рго сІу с1Уу 1 5 10 15 5ег їеи Гуз Гей 5ег Су5з АЇа АЇа 5ег сІіу Ре Тйг Ре 5ег 5ег туг 20 25 30

Тк Мет б5ег о Тгр ма! Агуд сп тйг Рго сій Гуз Аго Гей сіи Геи ма! 35 АЇїа сій ІЇїе А5п А5п о б5ег с1у А5р Тис тс отуг туго Рго Азр Тег маї 60

Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд А5р Азп АЇа Гуз А5зп тТиг о Геи туг 65 70 75 80 ей сіп Мес 5ег 5ег гей Гуз б5ег сі Азр ТИг АїТа Мет Туг туг су 40 85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг Ттуг сіу сїу сіу туг сіу сІу Тер Ре РПе дА5р 100 105 110 ма! тер сіу тик сіу тТийг о твйг ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 45 «2105» 62 «2115» 118 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність 50 «220» «223» 1МОК Н «4005» 62 сіи ма! Гуз Ге сіп сій 5ег сіу сіу Азхр Ге ма!Ї сіп Рго сІу сС1У 1 5 10 15 55 зег Гей Гуз Гей 5ег Суз АЇа Аїа 5ег сіу Ре Тийг РМБе 5ег 5ег туг 20 25 30

Тк Мет б5ег о Тгр ма! Агуд сп тйг Рго сій Гуз Агод Геи сіи тТгр ма! 35 40 45

Аїа бек ІЇе А5п А5п сіу сіу с1у Аг Тйг отТуг туг Рго А5р тег ма! бо 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд А5р Азп АЇа Гуз А5зп тТиг о Геи туг 65 70 75 80 ей сіп Меїс 5ег 5ег гей Гуз б5ег сій А5зр ТИг Аїа Мет Туг туг су 85 90 95 65 ма! Ага ні сій туг туг туг Аїа Мет А5р Туг Тгр сіу сЇп су тЕг 100 105 110

Тк ма! тиг ма! 5ег 5ег 115 70 «210» 63

«2115» 124 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» ААЮЗ30410 «4005» 63 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу сіу сіу Ге ма!ї сіп Рго сІу с1Уу 1 5 10 15 зег Агд Гуз Гей 5ег Суз АЇа Аїа 5ег сіу Ре ТНг РМБе 5ег 5ег туг 20 25 30

АТа мес б5ег Тгр ма! Агуд сіп тиг Рго сіи Гу5 Агу Геи сій Тер ма! 35 40 45

Аїа Аїа ч1І1е 5ег Тиг А5р сіу 5ег Ре ІІе Ттуг туг АЇїа А5зр тиг маї 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе Ттийг ІЇе 5ег сіу А5р Азп 5ег уз АЗзп Тиг Геи туг 65 70 75 80

Ге сіп Меє Абзп 5ег Ге Аг АїЇа сі А5р Тйг АЇїа ма! туг туг суз 85 90 95

Аїа гГу5 А5р Агу с1у ІчІЇе А5р Аїа Ттйг АЇїа сіп ма! сІу Аг9 РПе А5р 100 105 110

Рго Тер сІ1у сіп сіу тТйг оїеи ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «210» 64 «2115» 124 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни14с8УНнмМ1 «400» 64 сіи ма! Гуз Ге ма! сій 5ег сіу сіу сіу Ге маїЇ сіп Рго сІу с1У 1 5 10 15 5ег їеи Гуз Гей 5ег Су5з АЇа АЇа 5ег сІіу Ре Тйг Ре 5ег 5ег туг 20 25 30

Тс Меє б5екг Тгр ма! Агд сіп Ттйг Рго си Гуз Агд Геи сіи Геи ма! 35 40 45

Аїа сіи ч1Ї1е А5п А5п о бег сіу А5р Тис о тТиг тує туг Рго А5Зр тег маї 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд А5р Азп АЇа Гуз А5зп тТиг о Геи туг 4065 70 75 80 ей сіп Мес 5ег 5ег гей Гуз б5ег сі Азр ТИг АїТа Мет Туг туг су 85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг Ттуг сіу сїу сіу туг сіу сІу Тер Ре РПе дА5р 100 105 110 ма! тгр с1у тиг сіу тТийг о ге ма! Тиг ма! 5ег 5ег 115 120 «2105» 65 «2115» 124 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни14с8УНмМ2 «4005» 65 сіи ма! сіп Геи маїЇ сіи 5ег с1у сіу сіу Геи ма! сіп Рго сіу Ос1у 1 5 10 15 5ег їеи Гуз Гей 5ег Су5з АЇа АЇа 5ег сІіу Ре Тйг Ре 5ег 5ег туг 20 25 30

Тк Мет б5ег о Тгр ма! Агуд сп тйг Рго сій Гуз Аго Гей сіи Геи ма! бо 35 40 45

Аїа сіи ч1Ї1е А5п А5п о бег сіу А5р Тис о тТиг тує туг Рго А5Зр тег маї 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд А5р Азп АЇа Гуз А5зп тТиг о Геи туг 65 70 75 80 65 ей сіп Меє бег б5ег Ге Гуз бек сі А5р Тйг АїЇа мес туг туг су 85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг Ттуг сіу сїу сіу туг сіу сІу Тер Ре РПе дА5р 100 105 110 ма! тер сіу сіп сіу Ттийг о їеи ма! тис ма! 5ег 5ег 70 115 120

«210» 66 «2115» 124 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни14с8УНмЗ3 «4005» 66 сіи ма! сіп ге ма! сій 5ег сіу сіу сіу Ге ма!ї сіп Рго сІу с1Уу 1 5 10 15 5ег їеи Гуз Гей 5ег Су5з АЇа АЇа 5ег сІіу Ре Тйг Ре 5ег 5ег туг 20 25 30

Тк Мет б5ег о Тгр ма! Агуд сп тйг Рго сій Гуз Аго Гей сіи Геи ма! 35 40 45 Аїа сій ІЇе А5п А5п о б5ег с1у А5р Тис тс туго туг Рго Азр Тег маї 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд А5р Азп АЇа Гуз А5зп тТиг о Геи туг 65 70 75 80

Ге сіп Меє Азп 5ег Ге Аг АїЇа сі Азр Тйг АЇїа ма! туг туг суз 85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг Ттуг сіу сїу сіу туг сіу сІу Тер Ре РПе дА5р 100 105 110 ма! тер сіу сіп сіу Ттийг о їеи ма! тис ма! 5ег 5ег 115 120 «2105» 67 «2115» 5 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність

Зо «220» «223» 1408 сСоКнНІ1 - Кабат «400» 67 5зег Туг ТтТиг Мет 5ег 1 5 «2105» 68 «2115» 17 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» 1408 сСоКкнН2 - Кабат «4005» 68 сі т11е А5п о А5п обег сіу А5р тс Тс тус туг Рго А5Зр тег о маї Гуз 1 5 10 15 «Му «2105» 69 «211» 15 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» 1408 сСОоКнНЗ - Кабат «4005» 69

Ні туг туг туг сіу сіу сіу туг сіу сіу Тер Ре РіНе д5р маї 1 5 10 15 «210» 70 «2115» 113 бо «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» ті4о8МмІ «4005» 70 65 Ар ІчІІе ма! Меє тийг сіп діа Аїа Рго 5ег ма! Рго ма! тНг Рго Ос1У 1 5 10 15 сі 5ег ма! бек ІЇе 5ег сСуз5з Агуд 5ег Азп Гуз бег їеи Ге Ні 5ег 20 25 30

Азп сіу Азп Ттиг о туго гей Туг Тер Ре Геи сіп Агу Рго сІу сіп 5ег 70 35 40 45

Рго сіп Гей Гей ІїІе туг Агд ма! 5ег Азп Ге АЇа б5ег су ма! Рго 50 55 60

А5Зр Агу Ре 5ег сіу бек сіу 5ег сіу Ттйг Аїа Ре тНг гГеи Ага Іе 65 70 75 80 5ег Агд ма! сЇи Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Меє сіп Ні 85 90 95

Гей сім туг Рго Гей Тийг Ріе Ссіу АЇа сіу тйг Гуз їеи сіи гГеи Гуз 100 105 110

Ага «210» 71 «2115» 113 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М «4005» 71

Азр ІІе ма! мес тйг сіп АЇїа діа Рго 5ег ма!Ї Рго ма! тйг Рго сІу 1 5 10 15 сі 5ег ма! бек ІЇе 5ег сСуз5з Агуд 5ег 5ег Гуз бег їеи Ге Ні 5ег 20 25 30

Азп сіу Азп Ттиг о туго гей Туг Тер Ре Геи сіп Агу Рго сІу сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей Іїе туг Агд Меє 5ег Азп Ге АЇа б5ег су ма! Рго 50 55 60

А5Зр Агу Ре 5ег сіу бек сіу 5ег сіу Ттйг Аїа Ре тНг гГеи Агд ІїЇе 65 70 75 80 5зег Агуд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг суз Геи сіп Ні

Ко) 85 90 95

Гей сіи тТуг Рго Ре Тийг Ріє Ссіу АЇа сіу тйг Гуз їеи си Геи Гуз 100 105 110

Ага «2105» 72 «2115» 113 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» АВА71374 «4005 72

Азр ІІе ма! мес тийг осіп Тйг о РгОоО Гей 5ег Гей Рго Ма! Ттйг Рго сІу 1 5 10 15 сі 5ег Аїа б5ег ІІе б5ег сСу5з Агуд 5ег 5ег сіп 5ег Гей Агд Ні Ттуг 20 25 30 5ег сіу туг тТйг туг те Ад5р Тер Ттуг Гей сіп Гу5 Рго сіу сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп ма! Гей ІїТе туг Ге сіу 5ег Азп Агуд АЇа б5ег су ма! Рго 50 55 60

А5Зр Агу Ре 5ег сіу бек сіу 5ег сіу Тйг А5зр Ре тНг Геи Гуз Пе 65 70 75 80 5зег Агд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Меє сіп Аїа 85 90 95

Гей сіп Тс ма! Суз 5ег Ре сіу сіп су тйг їуз їеи си ІПе Гуз 100 105 110

Ага 60 «210» 73 «2115» 113 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» 65 «223» АВС66952 «4005» 73

Азр ІІе ма! Меє тйг о сіп 5ег Рго Гей 5ег Гей Рго Ма! Ттйг Рго сІу 1 5 10 15 си Рго АЇїа бек ІЇе 5ег сСуз5з Агуд 5ег Азп сіп б5ег їеи Ге Туг 5ег 70 20 25 30

Азп сіу туг Азп Туг Гей А5Зр Тер Туг Гей сіп Гуз Рго сіу сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей ІїІе туг 5ег сіу 5ег АЗзп Агуд АЇа б5ег су ма! Рго 50 55 60 А5Зр Агу Ре 5ег сіу б5ег сіу 5ег сіу Тйг А5Зр Ре тиг гГеи Гуз Пе 65 70 75 80 5зег Агд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Меє сіп Аїа 85 90 95

Гей сіп 5ег Рго Туг Тйг Ре сіу сіп сіу тйг Гуз Ге сіи ІЇе Гуз 100 105 110

Ага «210» 74 «2115» 113 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни14с8МІм1 «400» 74

Азр ІІе ма! мес тийг сіп 5ег АЇа Рго 5ег Гей Рго Ма! Ттйг Рго сІу 1 5 10 15 сі 5ег ма! бек ІЇе 5ег сСуз Агуд бег Азп Гуз 5ег їеи Гей Ні 5ег 20 25 30 А5зп с1у А5п Тиг туго Гей Туг Тер Рпе Гей сп Гуз Рго сіу сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей ІїІе туг Агд ма! бег Азп Ге АЇа б5ег сіу ма! Рго 50 55 60

А5Зр Агу Ре 5ег сіу бек сіу 5ег сіу Ттйг АЇїа Ре тНг гГеи Гуз Пе 65 70 75 80 5зег Агуд ма! си Аїа сіи Азр ма! сІу ма! туг туг Суз Мет сіп Ні 85 90 95

Гей сім тТуг Рго Гей Тийг Ріе сіу сіп сіу тйг Гуз Ге сіи ІЇе Гуз 100 105 110

З5 Ага «210» 75 «2115» 113 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни14с8МІ м2 «4005» 75 А5зр ІчІІе ма! Мес тис сіп 5ег Рго Гей бег Гей Рго Ма! Тиг Рго О1У 1 5 10 15 си Рго АЇїа бек ІЇе 5ег сСуз5 Агуд 5ег Азп Гуз бег їеи їеи Ні 5ег 20 25 30

Азп с1у А5зп о Тйг туго Гей Туг Тер Ре Гей сіп Гуз Рго сіу сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей ІїІе туг Агд ма! 5ег Азп Ге АЇа б5ег сіу ма! Рго 50 55 60

А5Зр Агу Ре 5ег сіу бек сіу 5ег сіу Тйг А5Зр Ре тНг гГеи Гуз Пе 65 70 75 80 5зег Агд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Мет сіп Ні 85 90 95

Гей сім тТуг Рго Гей Тийг Ріе сіу сіп сіу тйг Гуз Ге сіи ІЇе Гуз 100 105 110

Ага (516) «210» 76 «2115» 113 «2125 РЕТ 65 «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни14с8МІ м3 «4005» 76

Азр ІІе ма! Меє тйг о сіп 5ег Рго Гей 5ег Гей Рго Ма! Ттйг Рго сІу 70 1 5 10 15 си Рго АЇїа бек ІЇе 5ег сСуз5з Агуд 5ег 5ег Гуз бег їеи Ге Ні 5ег 20 25 30

Азп с1у А5зп о Тйг туго Гей Туг Тер Ре Гей сіп Гуз Рго сіу сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей ІїІе туг Агд ма! 5ег Азп Ге АЇа б5ег су ма! Рго 50 55 60 зег Агуд Ре 5ег сіу бег сіу 5ег сіу Тйг А5зр Ре тНг Геи Гуз Пе 65 70 75 80 5зег Агуд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Меє сіп Ні 85 90 95

Гей сім тТуг Рго Гей Тийг Ріе сіу сіп сіу тйг Гуз Ге сіи ІЇе Гуз 100 105 110

Ага «210» 77 «2115» 16 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» 14068 СОКІ1 (миша, Нимімі, Ним м2) - Кабат «400» 77

Аг бег Ап Гуз 5ег їеи їеи Ні 5ег А5п сіу АЗп Ттиг Ттуг Гей туг 1 5 10 15 «210» 78 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність

Зо «220» «223» 1408 СОКІ2 - Кабат «400» 78

Агд ма! 5ег Азп Геи АїЇа 5ег 1 5 «210» 79 «2115» 9 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» 1408 СОКІЗ3 - Кабат «4005» 79 мес сіп нНі5 Ге сі Ттуг Рго Гей Тег 1 5 «210» 80 «2115» 16 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» 14068 СОКІ1 (Нимім3) - Кабат «4005» 80

Аг бег б5ег Гуз 5ег їеи їеи Ні 5ег А5п сіу АЗп Ттиг Ттуг Гей туг 1 5 10 15 «210» 81 «2115» 454 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність бо «220» «223» Ни1408 НІ важкий ланцюг «4005» 81 сіи ма! Гуз Ге ма! сій 5ег сіу сіу сіу Ге маїЇ сіп Рго сІу с1У 1 5 10 15 65 зег Гей Гуз Ге 5ег Суз АїЇа Аїа 5ег сіу Ре Тийг РМБе 5ег 5ег туг 20 25 30

Тк Мет б5ег о Тгр ма! Агуд сп тйг Рго сій Гуз Аго Гей сіи Геи ма! 35 40 45

АТїа сіи ч1Ї1е А5п А5п о бег сіу А5р Тис о тТиг отуг туг РгОо А5Зр тег маї 70 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд А5р Азп АЇа Гуз А5зп тТиг о Геи туг 65 70 75 80 ей сіп Мес 5ег 5ег гей Гуз б5ег сі Азр ТИг Аїа Мет Туг туг су 85 90 95 АЇа Агд Ні Туг Туг Туг сіу сІу сіу туг сіу сІЇу Тер Ре РПе дА5р 100 105 110 ма! тер сіу тик сіу тТийгоїеи ма! тиг ма! 5ег б5ег АЇїа 5ег тТНг Гуз 115 120 125 с1Уу Рго 5ег ма! Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег Тиг 5ег С1У 130 135 140 сіу тйг АТа АїЇа ге сіу Су5 Ге ма! Гуз А5зр Туг Ре Рго сіЇи РгОо 145 150 155 160 ма! тик ма! бек Тер АЗп 5ег сІу АЇа Ге Тийг о 5ег сіу ма! ні тег 165 170 175

Ре Рго Аїа ма! Ге сіп 5ег бег сіу Ге туг 5ег їеи 5ег 5ег маї 180 185 190 ма! тик ма! Рго 5ег 5ег 5ег їец сіу Тиг о сіп тйг тує т11е сСу5 д5п 195 200 205 ма! Азп Ні Гуз Рго бег Ап ТИг о Гуз ма! А5зр Гуз Агд ма! сіи Рго 210 215 220

Гуз 5ег Су А5Зр Гуз ТИйг о Ні Тйг оСуз Рго Рго Су5 Рго АЇа Рго сій 225 230 235 240

Гей їеи сіу сіу Рго б5ег ма! Ре Ге Ре РгОо РГО Гуз РгО Гуз А5р 245 250 255

Тис Гей Мет ІЇе 5ег Агуд Тийг оРго сіи ма! тийг сСуз ма! ма! маї дзр 260 265 270 ма! бек Ні сій А5р Рго сіи ма! Гуз Ре А5Зп Тгр Туг ма! Азр су 275 280 285 ма! сіи ма! Ні5 А5п АЇа Гуз тТиг Гуз Рго Агу соЇи сЇи сіп тТуг Абп 290 295 з00 5зег Тиг отуг Агуд Ма! ма! бек маї Ге тйг ма! гей ніх сіп д5р тгр 305 310 315 320

Гей АЗзп сіу Гуз сі Туг Гуз Суб5 Гуз МаЇ 5ег АЗп Гуз АЇа Геи РгОо 325 330 335 АїЇа Рго ІІе сіи Гу5 ТПг ІЇе 5ег Гуз АїЇа Гуз ОоТу сіп Рго Аг си 340 345 350

Рго сіп ма! Тукг тТийг Ге Рго Рго 5ег Агд сім сіи мес тиг Гуз А5п 355 360 365 сіп ма! б5ег ге Ттиг о Суз Ге мМмаїЇ Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр Пе 370 375 380

Аїа ма! сіи тер сіи 5ег А5Зп сіу сіп Рго си АбЗп Ап о Туг Гуз Тег 385 390 395 400

ТИг оРгО Рго маЇ Гей А5р б5ег А5р сіу 5ег Ре Ре Гей Туг 5ег Гуз 405 410 415

Гей тТийг омаї А5р Гуз 5ег Аг Тгр сЇп сЇп сіу Азп ма! Ріе 5ег су 420 425 430 5зег ма! мет ні сі АїЇа Ге Ні5 Ап Ні5 Туг ТИг сп Гуз 5ег ге 435 440 445 5зег Гей 5ег Рго сІу Гуз 450 «2105» 82 «2115» 454 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни1408 Н2 важкий ланцюг «4005» 82 сіи ма! сіп ге ма! сій 5ег сіу сіу сіу Ге ма!ї сіп Рго сІу с1Уу бо 1 5 10 15 5ег їеи Гуз Гей 5ег Су5з АЇа АЇа 5ег сІіу Ре Тйг Ре 5ег 5ег туг 20 25 30

Тк Мет б5ег о Тгр ма! Агуд сп тйг Рго сій Гуз Аго Гей сіи Геи ма! 35 40 45 65 АїЇа сім І1е А5п А5зп о б5ег о сіу А5р Тийг о тТиг отТугс туг Рго А5Зр о тег маї 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд А5р Азп АЇа Гуз А5зп тТиг о Геи туг 65 70 75 80 ей сіп Мес 5ег 5ег гей Гуз б5ег сі Азр ТИг АїТа Мет Туг туг су 70 85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг Ттуг сіу сїу сіу туг сіу сІу Тер Ре РПе дА5р 100 105 110 ма! тер сіу сіп сіу Ттийгоїеи ма! тис ма! б5ег б5ег АїЇа 5ег тТиг Гуз 115 120 125 с1у Рго б5ег ма! Ре Рго Гей АЇїа Рго 5ег б5ег Гуз 5ег Тиг 5ег су 130 135 140 сіу тйг АТа АЇїа гей сіу Суз Гей ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сіи РгО 145 150 155 160 ма! тик ма! бек Тер АЗп 5ег сІу АЇа Ге Тийг о 5ег сіу ма! ні тег 165 170 175

Ре Рго Аїа ма!Ї Гей сіп б5ег б5ег сіу Гей Туг 5ег їеу 5ег 5ег Ммаї 180 185 190 ма! тик ма! Рго 5ег 5ег 5ег ее сіу Тиг о сіп тйг тує т11е сСу5 д5п 195 200 205 Ммаї Азп Ні Гуз Рго бег Азп ТиИг о Гуз ма! Азр Гуз Агд ма! си Рго 210 215 220

Гуз 5ег Су А5Зр Гуз Тк Ні Тйг оСуз Рго Рго Су5 Рго АЇа Рго си 225 230 235 240

Гей їеи сіу сіу Рго б5ег ма! Ре Ге Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз д5р 245 250 255

Тк Се Мет ІЇе бек Агуд Тийг оРго сіи ма! тийг Суз ма! ма! ма! др 260 265 270 ма! бек нів сій А5р Рго сіи ма! Гуз Ре Азп Тгр Туг ма! Азр су 275 280 285 ма! сіи ма! ніх А5п Аїа Гу5 ТиИг губ Рго Агу сім сім сіп туг А5бп 290 295 з00 5зег Тиг отуг Агуд Ма! ма! бек маїЇ Ге тйг ма! гей ніх сіп А5р тгр 305 310 315 320

Гей АЗп сіу Гуз сі Туг Гуз Суб5 Гуз МмаЇ 5ег АЗп Гуз АЇа Геи РгОо 325 330 335

АЇїа Рго Іїе сЇи Гуз Тк ІЇе 5ег ї1у5 АЇа їу5 ОЇУу сп Рго Ага си 340 345 350

Рго сіп ма! Тукг тТийг Ге Рго Рго 5ег Агд сім сіи мес тиг Гуз А5п 355 360 365 сіп ма! 5ег Ге Тк о сСу5з Гей ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег Азр Пе 370 375 380

Аїа ма! сіи тер сіи 5ег А5Зп сіу сіп Рго сЇи АбЗп Ап о Туг Гуз ТАг 385 390 395 400

ТИг оРгО Рго маЇ Гей А5р 5ег А5Зр сіу 5ег Ре РПе Гей Туг 5ег Гуз 405 410 415

Гей тТийг омаї Ар Гуз 5ег Аг Тгр сп сЇп сіу Азп ма! РНе 5ег су 420 425 430 5зег ма! мет Ні сі Аїа ге Ні5 Ап Ні5 Туг ТИйг сіп Гуз 5ег ге 435 440 445 зег Гей 5ег Рго сІу Гуз 450 «2105» 83 «2115» 454 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни1408 НЗ3 важкий ланцюг «4005» 83 сіи ма! сіп Геи маїЇ сіи 5ег с1у сіу сіу Геи ма! сіп Рго сіу Ос1у 1 5 10 15 5ег їеи Гуз Гей 5ег Су5з АЇа АЇа 5ег сІіу Ре Тйг Ре 5ег 5ег туг 20 25 30

Тк Мет б5ег о Тгр ма! Агуд сп тйг Рго сій Гуз Аго Гей сіи Геи ма! бо 35 40 45

Аїа сіи ч1Ї1е А5п А5п о бег сіу А5р Тис о тТиг тує туг Рго А5Зр тег маї 50 55 60

Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд Азр Азп АЇа Гуз Азп тТиг о Геи туг 65 70 75 80 65 Ге сіп Меє Абзп 5ег Ге Аг АїЇа сі А5р Тйг АЇїа ма! туг туг суз 85 90 95

АТїа Агд Ні Туг Туг Ттуг сіу сїу сіу Ттуг сіу сІу Тер Ре РПе дзр 100 105 110 ма! тер сіу сіп сіу Ттийгоїеи ма! тис ма! б5ег б5ег АїЇа 5ег тТиг Гуз 70 115 120 125 с1у Рго 5ег ма! Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег Тиг 5ег су 130 135 140 сіу тйг АТа АЇїа гей сіу Суз Гей ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сіи РгО 145 150 155 160

Ма! тик ма! б5ег Тер А5п бек с1у Аїа Ге Тийг о 5ег су ма! ніх тЕг 165 170 175

Ре Рго Аїа ма!Ї Гей сіп б5ег б5ег сіу Гей Туг 5ег їеу 5ег 5ег Ммаї 180 185 190 ма! тик ма! Рго 5ег 5ег 5ег їеи сіу Ттийг о сіп тйг тує т1ТІе Су5 дп 195 200 205 ма! Азп Ні Гуз Рго бег Ап ТИг о Гуз ма! Азр Гуз Агд ма! сіи Рго 210 215 220

Гуз 5ег Суз А5Зр Гуз ТИйг о Ні Тйг оСуз Рго Рго Су5 Рго АЇа Рго си 225 230 235 240

Гей Геи сіу сіу Рго б5ег ма! Ре Ге РМПе Рго РгОо Гу5 Рго Гуз д5р 245 250 255

Тк Се Мет ІЇе бек Агу Тийг оРго сіи ма! тийг Суз ма! ма! ма! дз5р 260 265 270 ма! бек Ні сій А5р Рго сіи ма! Гуз Ре Азп Тгр Туг ма! Азр су 275 280 285 ма! сіи ма! Ні5 А5п АЇа Гуз тТиг Гуз Рго Агу сої сЇи сіп туг дп 290 295 з00 5зег Тиг отуг Агуд ма! ма! бек маїЇ Ге тйг ма! гей ніх сіп А5р тгр 305 310 315 320

Гей А5п сіу Гуз сі Ттуг Гуз Суз Гуз ма! 5ег А5зп їу5 АїЇа Геи Рго 325 330 335

АЇїа Рго Іїе сЇи Гуз Тк ІЇе 5ег 1у5 АЇа їу5 ОЇУу сп Рго Ага си 340 345 350

Рго сіп ма! Тукг тТийг Ге Рго Рго 5ег Агуд сім сім Меє Ттиг Гуз Азбп

Ко) 355 360 365 сіп ма! б5ег ге Ттиг о сСу5з Ге маїЇ Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр Пе 370 375 380

Аїа ма! сіи тер сіи 5ег А5Зп сІіу сіп Рго сі АЗп Ап о Туг Гуз Тиг 385 390 395 400 0 тб о РгОо Рго Ма!Ї Геи Азр 5ег д5р сіу бек РіПе Ре Геи Туг 5ег Гуз 405 410 415

Гей тТийг омаї Ар Гуз 5ег Аг Тгр сЇп сЇп с1у Аб5п ма! РПе 5ег су» 420 425 430 5зег ма! мет Ні сі Аїа ге Ні5 Ап Ні5 Туг ТИйг сіп Гуз 5ег ге 435 440 445 5зег Гей 5ег Рго сІу Гуз 450 «210» 84 «2115» 219 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни1408 11 легкий ланцюг «400» 84

Азр ІІе ма! мес тийг сіп 5ег АЇа Рго 5ег Гей Рго Ма! Ттйг Рго сІу 1 5 10 15 сі 5ег ма! бек ІЇе 5ег сСуз5 Агуд 5ег Азп Гуз бег їеи Ге Ні 5ег 20 25 30 А5зп с1у А5п Тиг туго Гей Туг Тер Рпе Гей сп Гуз Рго сіу сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей ІїІе туг Агд ма! 5ег Азп Ге АЇа б5ег су ма! Рго 50 55 60

А5Зр Агу Ре 5ег сіу бек сіу 5ег сіу Ттйг АЇїа Ре тНг гГеи Гуз Пе 6065 70 75 80 5зег Агуд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Меє сіп Ні 85 90 95

Гей сім тТуг Рго Гей Тийг Ріе сіу сіп сіу тйг Гуз Ге сіи ІЇе Гуз 100 105 110 65 Агуд Тйгомаї Аїа діа Рго б5ег ма! Ріе ІЇе РПе Рго Рго 5ег А5зр Си 115 120 125 сіп ге Гуз 5ег сіу Тйг АТа 5ег ма! маї Суз Гей Ге А5Зп А5п Ре 130 135 140 туг Рго Агуд сім АЇїа Гуз ма! сіп Тер Гуз маї д5р доп АїЇа гей сп 70 145 150 155 160

5ег с1у А5п 5ег сіп сій 5ег ма! тпг си сіп дор 5ег уз Азр 5ег 165 170 175

Тиг о туг б5ег Ге б5ег б5ег ТИг о їГеи Тиг Ге 5ег Гуз АЇа Азр Туг си 180 185 190

Гуз Ні Гуз ма! туг Аїа Суз сіи ма! тиг ніх сіп сіу Ге 5ег 5ег 195 200 205

Рго ма! Тиск Гуз 5ег Ре А5п Агуд су си сСуз 210 215 «210» 85 «2115» 219 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни1408 12 легкий ланцюг «4005» 85

Азр ІІе ма! Меє тйг о сіп 5ег Рго Гей 5ег Гей Рго Ма! Ттйг Рго сІу 1 5 10 15 си Рго АЇїа бек ІЇе 5ег сСуз5з Агуд 5ег Азп Гуз бег їеи Ге Ні 5ег 20 25 30

Азп с1у А5зп о Тйг туго Гей Туг Тер Ре Гей сіп Гуз Рго сіу сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей ІїІе туг Агд ма! 5ег Азп Ге АЇа б5ег су ма! Рго 50 55 60 А5зр Агу Ре 5ег сіу б5ег сіу б5ег сіу Тис А5Зр Ре тТйг гей Гуз Іе 65 70 75 80 5зег Агуд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Меє сіп Ні 85 90 95

Гей сім тТуг Рго Гей Тийг Ріе сіу сіп сіу тйг Гуз Ге сіи ІЇе Гуз 100 105 110

Агд Тис ома!ї АТа діа Рго бек ма! Ре ІЇе РПе Рго РгОо 5ег А5р си 115 120 125 сіп ге Гуз 5ег сіу Тйг АТа 5ег ма! маї Суз Гей Ге А5Зп А5Зп Ре 130 135 140 Туг РгОо Ага сЇм Аїа Гу5 ма! сіп Тер Гуз маї д5р д5п Аїа гей сп 145 150 155 160 5ег с1у А5п 5ег сіп сій 5ег ма! тпг си сіп дор 5ег уз Азр 5ег 165 170 175

Тиг о туг б5ег Ге б5ег б5ег ТИг о їГеи Тиг Ге 5ег Гуз АЇа Азр Туг си 180 185 190

Гуз Ніз Гуз ма! туг Аїа Су5 сіи ма! тийг ніх сіп сіу Гей 5ег 5ег 195 200 205

Рго ма! Тиск Гуз 5ег Ре А5п Агуд су си сСуз 210 215 «210» 86 «2115» 219 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни1408 ІЗ легкий ланцюг «4005» 86

Азр ІІе ма! Меє тйг о сіп 5ег Рго Гей 5ег Гей Рго Ма! Ттйг Рго сІу 1 5 10 15 си Рго Аїа 5ег ІЇе б5ег сСу5 Агд 5ег 5ег Гуз 5ег Гей їеи Ні 5ег 20 25 30

Азп с1у А5зп о Тйг туго Гей Туг Тер Ре Гей сіп Гуз Рго сіу сіп 5ег 35 40 45

Рго сіп Гей Гей ІїІе туг Агд ма! 5ег Азп Ге АЇа б5ег су ма! Рго бо 50 55 60 зег Агуд Ре 5ег сіу бег сіу 5ег сіу Тйг А5зр Ре тНг Геи Гуз Пе 65 70 75 80 5зег Агуд ма! си Аїа сій Азр ма! сіу ма! туг туг Суз Меє сіп Ні 85 90 95 65 Гей сіи Туг Рго Гей Тйг Ре сіу сіп су тйг їуз їеи си Іе Гуз 100 105 110

Агд Тис ома!ї АТа діа Рго бек ма! Ре ІЇе РПе Рго РгОо 5ег А5р си 115 120 125 сіп ге Гуз 5ег сіу Тйг АТа 5ег ма! маї Суз Гей Ге А5Зп А5п Ре 70 130 135 140 туг Рго Агуд сім АЇїа Гуз ма! сіп Тер Гуз маї д5р доп АїЇа гей сп 145 150 155 160 5ег с1у А5п 5ег сіп сій 5ег ма! тпг си сіп дор 5ег уз Азр 5ег 165 170 175 ТВиг о Туг б5ег Ге 5ег бек ТИг Ге Тийг Гей б5ег Гуз АТа А5р Туг си 180 185 190

Гуз Ніз Гуз ма! туг Аїа Су5 сіи ма! тийг ніх сіп сіу Гей 5ег 5ег 195 200 205

Рго ма! Тиск Гуз 5ег Ре А5п Агуд су си сСуз 210 215 «210» 87 «2115» 429 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» ті408УнН з сигнальним пептидом «400» 87 асдааєнсса ддстсадсте дастеесст діссттдДЕ саааададатду сстдтдсдаа 60 дедаадстдд хддадестду дддаддаеєса дсдсадсстд дадддессся дааастстсс 120 тасдсадссї ссудаєтсас тЕЕсадсадс татассатає сетдддаєєсд ссадастсса 180 даааададдс хддадесддає содсадааасії аасаасадстд дсдасассас стастатсса 240 дасастдстаа адддссдаєе сассаєстсс ададасаатд ссаадаасас сстдтасста 300 саааєсдадса дістдаадсс сдаддасасд дссатдтаєс астдстдсаад асастаттас 360 хаткдасддсд дстасддддд дедасстсс дасуєстдуддд дсасадддас сасддісасс 420 деЕстсстса 429 «2105» 88 «2115» 143 «2125 РЕТ «2135» Штучна послідовність «220» «223» ті408УнН з сигнальним пептидом «4005» 88

Мес Аб5п РіПе СсІу Гей 5ег ей ІЇе Ре Геци маїЇ Геци маїЇ Гей Гуз С1У 1 5 10 15

Уа! Гей сСуз сіи ма! Гуз Ге ма! сіи 5ег сіу сіу сіу гГеи маїЇ сіп 20 25 30

Рго сіу сІу 5ег їеи губ Ге б5ег Суз АЇа Аіїа б5ег сіу Ре Ттйг РНе 35 40 45 5зег бег Ттуг тТиг Мет б5ег Тгр ма! Агд сіп Ттйг Рго си Гуз Ага гГеи 50 55 60 сій Ге ма! Аїа сій ІЇе А5п Ап 5ег сіу А5р Ттиг о тТВг туго туг РгО 65 70 75 80

Азр Тис ома!ї Гуз сІіу Агуд Ре тиг ІЇе 5ег Агу А5р А5п АїЇа Гуз А5Пп 85 90 95

ТИг Се туг Ге сіп Мет 5ег 5ег їеци їуз 5ег си АЗр ТИг АїТа Меєс 100 105 110 туг туг суз Аїа Агуд Ні Туг Туг Туг сіу су сіу туг сіу су тер 115 120 125

Ре Ре Ар ма! Ттгр сіу тйг сіу тийг отигома! тс ма! 5ег 5ег 130 135 140 «210» 89 «2115» 399 «2125» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» ті408МмІ з сигнальним пептидом «4005» 89 60 асдаддсдсс тадстдадес сстдаддста сЕтасдстст ддаєссстдд адссаєсддаоа 60 дастаєсдєда сдастсаддс тодсассстст дстасстдєса стсстддада деЕсадтатсс 120 асстсстдса ддістаатаа дадестсстд сасадсаатд дсаасастта сттдтаєсдаоа 180 тЕсстдсада ддссаддсса дістсстсаа стсстдатат ассдддкаєс саассттдсс 240 тІсаддадсісс садасаддус садсддсаді дддісаддаа стдстттсас астдадаатс 300 65 адксададасдд аддстдадда сдахдадкдс таєссастдса єдсаасаєстсї адаасаєссдуд 360 стісасдтсд діЕдстдддаас саадстддаад стдааасє 399 «2105» 90 «2115» 133 «2125 РЕТ 70 «2135» Штучна послідовність

«223» ті408МмІ з сигнальним пептидом «4005» 90 мес Агд Суз Гей АТа сЇи Ре їеи сіу Ге Ге ма!ї Гей Тгр Іе Рго 1 5 10 15 сСІУ АїЇа ІІе сіу А5р ІЇе ма! мес тйг сіп діа Аїа Рго 5ег ма! Рго 20 25 30 ма! Тис о Рго сІ1у сі бек ма! 5ег ІЇІе 5ег сСу5 Агуд 5ег А5зп Гуз 5ег 35 40 45

Гей Семи Ні бек А5п сіу А5п Тийг туго Ге Туг Тер Ре Геи сп Ага 50 55 60

Рго сіу сіп б5ег Рго сіп Геи гей ІЇІе туг Агд ма! 5ег Азп Геи АїЇа 65 70 75 80 5зег сіу ма! Рго А5р Агуд Рпе 5ег сіу 5ег сіу 5ег сЇу Ттйг Аїа РПе 85 90 95

Тк Гей Агуд Іїе 5ег Агуд ма! сім Аїа сій А5р ма! сіу ма! туг туг 100 105 110

Суз мет сіп Ніз Гей сіи Ттуг Рго Ге Тйг Ре СІУ АЇїа сІу тег Гуз 115 120 125 ем сім Геи Гуз Ага 130 «210» 91 «2115» 372 «2125» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни14с8УНнмМ1 «400» 91 даддсдаадс хтддсоддадіс сдасддсдас Етдутдсаас стддсдадстс сстдаадста 60 тсстдтдссу сстссддсте сассттсадс адстастасса тдусттдддає дсдссааасс 120 сссдадаада ддстддадиї дасддстдад ассаасааса дсддсдастас сасстастат 180 сссдастассд хдаадддесд стісассаєі єссададаєта асдстаадаа тассстутає 240 стдсаааєда дсадсстдаа дістдаддає ассдстасдє аскстаєссдєдс тадасаєтат 300 хаєтасддсд дсдастаєтда сдастддеЕсс еЕсдаєдтає ддоддсассдд сассстддєс 360 ассудєдєсст са 372 «2105» 92 «2115» 372 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни14с8УНмМ2 «4005» 92 дадасдсаас хдасддадіс хддсддсдас тдудхдсаас стддсдастс сстдаадстд 60 жсстасудссд сстссудсее сассттсадс адстатасса тдІсттдадЕ дсдссааасс 120 сссдадаада ддстддадиї дасддстдад ассаасааса дсддсдастас сасстастат 180 сссдатассд хдаадддсесд стісассаєі хссададата асдсстаадаа тассстдтаєт 240 стдсаааєда дсадсстдаа дістдаддає ассдстасує астаєссосудс тадасаєтає 300 тассаєдодасдуд асддстаєсдд сддастадЕс стесдасуєду ддддссаадд сассстддес 360 ассдєдєсст са 372 «2105» 93 «2115» 372 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Ни14с8УНмЗ3 «4005» 93 дадасдсаас хдасддадіс хддсддсдас тдудхдсаас стддсдастс сстдаадстд 60 тсстдтдссу сстссддсте сассттсадс адстастасса тдусттдддає дсдссааасс 120 60 сссдадаада ддстддадї ддєдоассдад ассаасааса дсддсдатас сасстастат 180 сссдатассд хдаадддсесд стісассаєі хссададаєта асдстаадаа тассстутає 240 стдсаааєда астадсстдад дастдаддає ассдстасує астаєссосудс тадасаєтає 300 тассаєдоасдуд дсддстасдд сддстадЕс сесдасуєду ддддссаадд сассстддес 360 ассудєдєсст са 372 65 «210» 94 «2115» 339 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» 70 «223» Ни14с8МІм1

«400» 94 дастаєсдєда сдасссадес хдссссстсс стдсстдсда сссстддсда діссдтдЕсс 60 асстсстдсс ддіссаасаа дадсстдстд сасадсаасд дсаасасста сстдтастда 120 тЕсстдсааа адсссддсса ассссстісаа стдстдаєст ассдддкдес саасстддсес 180 жхссоддсудкдс ссдастаддеє стссуддаадс ддстссддса ссдссттсас сстдаадаєт 240 адсададссд аддссдадда тасдддсатд тастастдсра стдсаасастї ддадсасссс 300 стдасдессд дссааддсас саадстддад ахсаадс 339 «210» 95 «2115» 339 «2125» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Ни14с8МІ м2 «400» 95 датассдєда єдасссадес тсссстдстсс стдсстдсда сссстддсда дсссдестсс 60 асстсстдсс ддіссаасаа дадсстдстд сасадсаасд дсаасасста сстдтастда 120 тЕсстдсааа адсссддсса ассссстісаа стдстдаєст ассдддкдес саасстддсес 180 тссддсдсдс ссдатаддеє стіссддаадс ддстссддса ссдасттсас сстдаадаєт 240 адсададссд аддссдадда тасдддсату тастастдта стдсаасастї ддадсасссс 300 стдасдеєсд дссааддсас саадстддад ассаадс 339 «210» 96 «2115» 339 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Ни14с8МІ м3 «400» 96 дастаєсдєда сдасссадес хсссстдссс стдсстдсда сссстддсда дсссдестсс 60 асстсстдсс ддіссадсаа дадсстдстд сасадсаасд дсаасасста сстдтастда 120 т еЕсстдсааа адсссудсса ахссссстсаа стдстдаєстї ассудддатаєс саасстддсс 180 тссддсдсдс ссадтаддеє стіссддаадс ддстссддса ссдастесас сстдаадаєт 240 адсададссд аддссдадда тасдддсатд тастастдта стдсаасастї ддадсасссс 300 стдасдессд дссааддсас саадстддаад ассаадс 339 «210» 97 «211» 19 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Сигнальний пептид 14Оо8МНн «400» 97

Мес А5п РіПе СІу Гей 5ег ей ІЇе Ре Геци маїЇ Геци маїЇ Гей Гуз С1У 1 5 10 15

Уа! гГеи су «210» 98 «2115» 57 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Сигнальний пептид 14Оо8МНн «400» 98 аскдааєнсса дсстдадсес дасьсстоу деЕдстдасаєЄ єдааддасає дстдтатс 57 «210» 99 «2115» 20 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Сигнальний пептид 1408МІ. (510) «400» 99 мес Агд Суз Гей АТа сіи Ре їеи сІ1у Ге Ге ма!ї гей Тер Іе Рго 1 5 10 15 сС1У АїТа Пе сС1у 20 65 «210» 100 «2115» 60 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність 70 «220»

«223» Сигнальний пептид 1408МІ. «4005» 100 аскдаддєдсес хддассдадес сстдддсстд стдуєдстдє ддаєссстдд сдссатсддс 60 «210» 101 «2115» 330 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Константна область важкого ланцюга Ідс1 людини «4005» 101

АТїа бек ТтиИг Гуз сіу Рго 5ег ма! Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег Тиг 5ег сіу сіу ТНг АїЇа Аїа гей сІу Су5 Гей маїЇ Гуз Азр туг

Ре Рго сій Рго ма! тик ма! бек Тер Азп 5ег С1Уу АЇа Гей тЕг 5ег сіу ма! ні Тийг РМПе Рго АЇїа маЇ Ге сіп 5ег б5ег сіу Геи Туг 5ег 60 20 ей б5ег бег ма! Ма! тийг ма! Рго 5ег 5ег 5ег їеи сіу тНг сп тЕг 65 70 75 80 тукг шІІе Суб Азп мМаЇ А5зп Ні Гуз Рго 5ег АЗзп ТИг Гуз маї А5р Гуз 85 90 95

Агд ма! си Рго Гуз бек Су5з А5р Гуз ТИг Ні тиг осСуз Рго Рго су 25 100 105 110

Рго АЇа Рго сіи Гей Гей сіу сіу Рго 5ег ма! Ре Геи Ре Рго РгО 115 120 125

Гуз Рго Гуз Азр ТИг о Геи Мет ІЇе 5ег Аг Тйг о Рго сіи Ма! тНг су 130 135 140 30 ма! ма! ма! А5р ма!їЇ 5екг Ні сім А5р Рго сіи ма! Гуз РПе А5п Тгр 145 150 155 160 тукг ма! А5зр сіу ма! сЇи ма! ні Ап ма! Гуз тТийг Гуз Рго Аг си 165 170 175 сі сіп тТуг АЗп о б5ег Тйг о тТуг Агуд ма! Ма! 5ег ма! гей тиг маї геи 35 180 185 190

Ні5 сіп А5р тер ге АбЗп сіу Гуз сій Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дп 195 200 205

Гуз АЇа Гей Рго АЇа Рго ІЇе сій Гуз Тийг ІЇе 5ег уз АїЇа Гуз СсС1У 210 215 220 40 сіп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тйг о Гей Рго Рго 5ег Агд си си 225 230 235 240

Ммеє тийг Гуз АЗзп о сіп мМмаї 5ег гей Тйг о Суз Ге маїЇ Гуз сІіу Ре туг 245 250 255

Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇа ма!їЇ сіи тер сіи 5ег А5Зп СІу сіп Рго Си А5ПпП 45 260 265 270

Азпотуг Гуз Тс Тс о Рго Рго ма Гей А5р б5ег Ар сіу 5ег РПе РІе 275 280 285

Гей туг бек Гуз Ге Тийг ма! Азр Гуз 5ег Агд Тер сіп сп с1У А5П 290 295 300 50 ма! Ре 5ег Су5 5ег ма! Мес ніх сій Аїа Гей Ні А5п Ні туг тНг 305 310 315 320 сіп Гуз 5ег їеу б5ег Гей б5ег Рго СсіІу Гуз 325 330 55 «210» 102 «2115» 330 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» бо «223» Константна область важкого ланцюга Іч19с01 людини аллотипу с173 Ідс1 «4005» 102

АТїа бек ТтиИг Гуз сіу Рго 5ег ма! Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 65 5ег Тиг о б5ег сТу сіу Ттйг Аїа АТа ге сіу Су5з Гей ма! Гуз А5р туг 20 25 30

Ре Рго сій Рго ма! тик ма! бек Тер Азп 5ег С1Уу АЇа Гей тЕг 5ег 35 40 45 сіу ма! ні Тийг РМПе Рго АЇїа маЇ Ге сіп 5ег б5ег сіу Геи Туг 5ег 70 50 55 60

Гей 5ег б5ег ма! ма! тис о ма!їЇ Рго 5ег 5ег 5ег Ге сіу Ттиг сіп тНг 65 70 75 80 тукг шІІе Суб Азп мМаЇ А5зп Ні Гуз Рго 5ег АЗзп ТИг Гуз маї А5р Гуз 85 90 95 Агд ма! сЇи Рго Гуз бек Су5 А5р Гуз ТИг Ні тиг осСуз Рго Рго су 100 105 110

Рго АЇа Рго сі АЇїа Аїа сіу сіу Рго 5ег ма! Ре Ге Ре Рго РгО 115 120 125

Гуз Рго Гуз Азр ТИг о Геи Мет ІЇе 5ег Аг Тйг о Рго сіи Ма! тНг су 130 135 140 ма! ма! ма! Азр ма! 5екг Ні сій Ар Рго сіи ма! Гуз Ре Азп Тгр 145 150 155 160 тукг ма! А5зр сіу ма! си ма! ніх А5п АЇа Гуз Тийг Гуз Рго Аг си 165 170 175 сім сіп туг А5п о 5ег Тиг о туг Агуд маї ма! 5ег ма! Ге тик маї Ге 180 185 190

Ні5 сіп Ар тер ге АбЗп сіу Гуз сій Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дп 195 200 205

Гуз АЇа Гей Рго АЇа Рго ІЇІе сій Гуз Тийг ІЇе 5ег уз АїЇа Гуз СсС1У 210 215 220 сій Рго Агуд сій Рго сіп Ма! Тук тигогГеиу Рго Рго 5ег Ага соми си 225 230 235 240

Ммеє тийг Гуз АЗзп о сіп мМмаї 5ег гей Тйг о Суз Ге маїЇ Гуз сІіу Ре туг 245 250 255

Рго 5ег Азр ІЇе АТа ма! сіи Тер сЇи 5ег А5п сіу сіп Рго си А5П 260 265 270

Азпотуг Гуз Тс Тс о Рго Рго ма Гей А5р б5ег Ар сіу 5ег РПе РІе 275 280 285

Гей туг бек Гуз Ге Тийг ма! Азр Гуз 5ег Агд Тер сіп сп с1У А5П 290 295 300 ма! Ре 5ег Су5 5ег ма! мет нНі5 сій АТа гей Ні Азп Ніз Туг тег 305 310 315 320 сіп Гуз 5ег їеу б5ег Гей б5ег Рго СсіІу Гуз 325 330 «210» 103 «2115» 330 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Константна область важкого ланцюга Іч19с01 людини аллотипу с173 Ідс1 «4005» 103

АТїа бек ТтиИг Гуз сіу Рго 5ег ма! Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег Тиг о б5ег сТу сіу Ттйг Аїа АТа ге сіу Су5з Гей ма! Гуз А5р туг 20 25 30

Ре Рго сій Рго ма! тик ма! бек Тер Азп 5ег С1Уу АЇа Гей тЕг 5ег 35 40 45 сіу ма! ні Тийг РМПе Рго АЇїа маЇ Ге сіп 5ег б5ег сіу Геи Туг 5ег 50 55 60

Гей 5ег б5ег ма! ма! тис о ма!їЇ Рго 5ег 5ег 5ег Ге сіу Ттиг сіп тНг 65 70 75 80 тукг шІІе Суб Азп мМмаЇ А5зп Ні Гуз Рго 5ег АЗзп ТИг Гуз маї А5р Гуз 85 90 95 Агд ма! сі Рго Гу5 бег Суб А5р Гуз ТИг Ні Тйг о сСуз Рго Рго сСуз 100 105 110

Рго АЇа Рго сіи Гей Гей сіу сіу Рго 5ег ма! Ре Ге Ре Рго РгО 115 120 125

Гуз Рго Гуз Азр ТИг о Геи Мет ІчІЇе 5ег Аг Тйг о Рго сіи Ма! тНг су бо 130 135 140 ма! ма! ма! Азр ма! 5ег Ні сій Ар Рго сіи ма! Гуз Ре Азп Тгр 145 150 155 160 тукг ма! А5зр сіу ма! си ма! ніх А5п АЇа Гуз Тийг Гуз Рго Аг си 165 170 175 65 сій сіп Туг А5Зп о б5ег Тиг отуг Агдуд ма! ма! 5ег ма! Гей тиг маї геи 180 185 190

Ні5 сіп А5р тер ге АбЗп сіу Гуз сій Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дп 195 200 205

Гуз АЇа Гей Рго АЇа Рго ІЇІе сій Гуз Тийг ІЇе 5ег уз АїЇа Гуз СсС1У 70 210 215 220 сій Рго Агуд сій Рго сіп Ма! Тук тигогГеиу Рго Рго 5ег Ага соми си 225 230 235 240

Ммеє тийг Гуз АЗзп о сіп мМмаї 5ег гей Тйг о Суз Ге маїЇ Гуз сІіу Ре туг 245 250 255

Рго 5ег Азр ІЇе АТа ма! сіи Тер соЇи 5ег А5п сіу сіп Рго си А5П 260 265 270

Азпотуг Гуз Тс Тс о Рго Рго ма Гей А5р б5ег Ар сіу 5ег РПе РІе 275 280 285

Гей туг бек Гуз Ге Тийг ма! Азр Гуз 5ег Агд Тер сіп сп с1У А5П 290 295 300 ма! Ре 5ег Су5 5ег ма! мет ні5 сій АТа гей Ні Азп Ніз Туг тег 305 310 315 320 сіп Гуз 5ег їеу б5ег Гей б5ег Рго СсіІу Гуз 325 330 «2105» 104 «2115» 107 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Константна область каппа легкого ланцюга людини «4005» 104

Агд Тис ома!ї АТа діа Рго бек ма! РПе ІЇе Ре Рго Рго 5ег А5р си 1 5 10 15 сіп Гей Гуз 5ег сіу Тиг Аїа 5ег ма! ма! су5з Ге Геи А5п АЗп РНе 20 25 30 туг Рго Агуд сім Аїа Гуз ма! сіп Тер Гуз ма! А5р доп АїЇа гей сп 5ег с1у А5п 5ег сіп сій 5ег ма! тпг си сіп д5р 5ег уз Азр 5ег

Ко) 50 55 60

Тиг о туг б5ег Ге б5ег б5ег ТИг Ге Типг Ге 5ег уз АЇа Азр Туг си 65 70 75 80

Гуз Ніз Гуз ма! туг Аїа Су5 сіи ма! тийг ніх сіп сіу Гей 5ег 5ег 85 90 95 35 Рго ма! Тиск Гуз 5ег РМПе дА5п Агуд сіу сЇи сСуз 100 105 «210» 105 «2115» 106 40 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Константна область каппа легкого ланцюга людини «4005» 105 45 Тис ма! АТа діа Рго 5ег ма! Ре ІЇе РПе Рго Рго 5ег А5р си сп 1 5 10 15

Гей Гуз б5ег сіу ТиПг Аїа б5ег ма!ї ма! Суб Ге Гей А5Зп АЗп РПе Ттуг 20 25 30

Рго Агд сій Аїа Гуз ма! сіп Тер Гуз ма! д5р А5Зп АїЇа Гей сп 5ег 35 40 45 с1у А5п о б5ег сіп сій б5ег ма! тик сіи сіп др б5ег уз А5Зр 5ег Тиг 50 55 60 туг 5ег Гей б5ег б5ег ТИг Гей Тиг Гей 5ег Гуз АЇа А5Зр Туг Си Гуз 65 70 75 80

Ні Гуз ма! туг Аїа Су5з сіи ма! тйг ніх сіп сЇу Ге 5ег 5ег РгГО 85 90 95 ма! Тк Гуз 5ег Ре А5зп Агуд су сім сСуз 100 105 60 «210» 106 «2115» 990 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» 65 «223» Константна область важкого ланцюга Іч19с01 людини аллотипу с173 Ідс1 «400» 106 дсстссасса адддіссаєс дассттсссс стдуддсассся сстіссаадад сасстстддао 60 ддсасадсда ссстдддстд сстддеісаад дастасттсс ссдаассдді дасддаєдеса 120 тадаастсад дсдссстдас садсддасдка сасассттсс сддстдЕсст асадісстса 180 70 адасестаст ссстІсадсад сдхдасдасс дідссстсса дсадсттддуд сасссадасс 240 тасаєстдса асдєдааєса саадсссадс аасассаадд хтддасаадад адссдадссс 300 ааассттдсд асаааастса сасаєдссса ссдідсссад сасстдааст сстдддддда 360 ссдссадест єсстстЕссс сссаааассс ааддасассс тсаєдаєстс ссддасссст 420 даддісасає дсасудсдає ддасдєдадс сасдаадасс стдаддссаа деЕссаастда 480 Жжасасдудасд дсастдуддаддає дсасаасдсс аадасааадс сдсдддадда дсадсасаас 540 адсасдстасс діасудесад сассстсасс дісстдсасс аддастддст даасддсаад 600 дадсасаадї дсааддєссс саасааадсс стсссадссс ссатсдадаа аассаєстсс 660 ааадссааад ддсадссссд адаассасад дідтасассс тдсссссатс ссдддаддад 720 асдассаада ассаддісад сстдасстдс стддісааад дстестатсс садсдасатс 780 дссдсддаді дддададсаа сдддсадссу дадаасаастї асаадассас дсстсссдта 840 стддастсса асадсесст стЕссестаїєї адсаадстса ссдіддасаа дадсаддсда 900 садсадддда асасстестс асдсессастд асдсаєдадд сістдсасаа ссастасаса 960 садаададсс хстссстасс сссдадсааа 990 «2105» 107 «2115» 321 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Константна область каппа легкого ланцюга людини «400» 107 сдаастдєда стдсассаєс тасстесаєс тссссдссає стдаєдадса дЕсдааатст 60 ддаастдсст стассдтдасо сстдстдаає аастстаєс ссадададдс сааадтасад 120 тадааддсдд асаасдссст ссаатсдудду аастсссадд ададсдісас ададсаддас 180 адсааддаса дсасстасад ссісадсадс ассстдасдс сдадсааадс адастасдад 240 ааасасааад їстасудсстд сдаадісасс сассадддсс тдадстсудсс сдісасааад 300 адстссааса ддадададта т 321 «210» 108 «2115» 318 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Константна область каппа легкого ланцюга людини «400» 108 астасддста сассаєстає стссаєстсс ссдссаєстд асдадсадеє дааасстдда 60 астдсстстд хдсдсдсст дстдаастаас сЕстатссса дададдссаа адсасадсдд 120 ааддасддата асдссстсса ассдддсраас ссссаддада дідісасада дсаддасадс 180 ааддасадса сстасадссї садсадсасс стдасдстда дсааадсада стасдадааа 240 сасааадесї асдсстдсда адссасссає садддсстда дстсдсссдІ сасааададс 300 т Есаасадда адададсах 318 «210» 109 «2115» 147 «2125 РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 «400» 109 Мес АїЇа 5ег Ні5 Агд Гей Гей Ге Гей Су5з Гей АТа сіу Ге ма! РНе 1 5 10 15 ма! 5екг сі Аїа сіу Рго Тйг сіу тйг сІу сі 5ег Гуз Суз Рго Ге 20 25 30 мес ма! Гуз ма!ї Гей Ад5р АЇа ма! Агд су 5ег Рго АїЇа ІїЇе А5п маї 35 40 45

АТа ма! нНі5 ма! Ре Агуд Гуз АЇїа АЇа д5р А5р Ттиг Тер сій Рго РВе 50 55 60

АТїа б5екг сіу Гуз ТиИг 5ег сіи 5ег сіу сій Ге Ні5 сіу Гей Ттпг тег 65 70 75 80 сім сій сій Рбе ма!Ї сім сіу Іч1ІІе туг Гуз ма! сім ІЇе А5зр тТиг Гуз 85 90 95 5ег Туг Тгр Гуз АЇа Гей сіу ІІе 5ег Рго Ре НІі5 СсЇи НІі5 АїЇа сій 100 105 110 ма! ма! Ре тиг Аа А5п А5р б5ег сіу Рго Агуд Агуд туг Тйг Те Аїа бо 115 120 125

Аїа гей їеи бек Рго Туг 5ег Туг 5ег ТИг тТиг АТа маї ма! Тег деп 130 135 140

Рго Гуз СЇи 145 65 «2105» 110 «2115» 127 «2125 РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 70 «400» 110 с1у Рго Тийг сіу Ттийг сіу сій б5ег о їуз Су5 Рго Ге Мет маї Гуз ма! 1 5 10 15

Гей А5р АїЇа ма! Агуд сіу 5ег Рго АЇїа ІЇе А5п ма! АїЇа маї ніх маї 20 25 30

Ре Агд Гуз АЇїа АТа д5р д5р Тйг Тер сої Рго Ре АЇа 5ег СТУ Гуз 35 40 45

Тиг 5ег сій б5ег сіу сіи Гей Ні сіу Ге Ттйг тпг сій сій сіп Ре 50 55 60 ма! сіи сіу ІчІЇе туг Гуз ма! сій ІЇе д5р ТтПг Гуз 5ег Туг Тер Гуз 1065 70 75 80

Аїа гей сіу ІЇе 5ег Рго Ре Ні5 сіи Ні5 АЇа сій мМма!Ї ма! Ре тег 85 90 95

АТа А5п Ар 5ег с1у Рго Агуд Агд Туг ТАйг чІЇе АТа Аїа геи гГеи 5ег 100 105 110

Рго туг бек Туг 5ег Тийг о тТийг Аїа маї ма! тйг А5Зп РГгГО Гуз ОЇ 115 120 125 «2105» 111 «2115» 127 «2125 РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 «4005» 111 с1у Рго Тийг сіу Ттийг сіу сі б5ег Гуз Су5 Рго Ге Мет маї Гуз ма! 1 5 10 15

Гей А5р АїЇа ма! Агуд сіу 5ег Рго АЇїа ІЇе А5п ма! АїЇа маї ніх маї 20 25 30

Ре Агд Гуз Аїа АТа А5р д5р Тийг Тер сої Рго Ре АЇа 5ег СТУ Гуз

Тиг 5ег сій б5ег сіу сіи Гей Ні сіу Ге Ттйг тийг сій сій сіп Ре

Ко) 50 55 60 ма! сіи сіу ІчІЇе туг Гу5 ма! сій ІЇе д5р ТтПг Гуз 5ег Туг Тер Гуз 65 70 75 80

Аїа гей сіу ІЇе 5ег Рго Ре Ні5 сіи Ні5 АЇа сій мМма!Ї ма! Ріпе тег 85 90 95 35 Аїа А5зп Ар б5ег сіу Рго Агуд Агдуд Туг Тйг че АїЇа Аїа гей геи 5ег 100 105 110

Рго Туг б5ег Туг б5ег о Тийг о Тиг о Аїа ма! маї Ттйг А5Зп Рго Гуз Си 115 120 125 40 «2105» 112 «2115» 138 «2125 РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 «4005» 112 45 Мет АїЇа 5ег Ні5 Агд Гей Гей Ге Гей Су5з Гей АЇїа сіу Гей ма! РНе 1 5 10 15 ма! 5екг сі Аїа сіу Рго Ттйг сіу тйг сІу сі 5ег Гуз Суз Рго Ге 20 25 30 мес ма! Гуз ма! Гей д5р АЇа ма! Агд су 5ег Рго АЇа ІЇе А5п маї 35 40 45

АТа ма! нНі5 ма! Ре Агуд Гуз АЇїа АЇа д5р А5р Ттиг Тер сій Рго РВе 50 55 60

АТїа 5екг сіу Гуз ТиИг 5ег сіи 5ег сіу сій Гей Ні сіу Ге Ттиг тег 65 70 75 80 сім сій сій Рбе ма!Ї сім сіу Іч1ІІе туг Гуз ма! сім ІЇе А5зр тТиг Гуз 85 90 95 5ег Туг Тгр Гуз АЇа Гей сіу ІІе 5ег Рго РПе Ні с1Їи Ні АїЇа сіи 100 105 110 ма! ма! Ре тийг Аа А5п А5р б5ег сіу Рго Агуд Агу туг 5ег Туг 5ег бо 115 120 125

Тис тб АїТа ма! маї тис А5Зп Рго Гуз Си 130 135 «2105» 113 65 «2115» 9 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Залишки транстиретина 89-97 70 «400» 113 сій ні Аїа сіи ма! ма! Ре тНг Аїа 1 5 «2105» 114 «211» 15 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Потенціальний імуноген транстиретина «400» 114 сіу сіу сій Ні Аїа сій ма! ма!ї Ре тпг АїЇа сІу сІу Гуз СсС1У 1 5 10 15 «2105» 115 «2115» 12 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Потенціальний імуноген транстиретина «400» 115

Суз сіу сІ1у сіи Ні5 АїЇа сій мМаїЇ ма! Ре тйг Аїа 1 5 10 «2105» 116 «2115» 12 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Потенціальний імуноген транстиретина «400» 116 сій ніх Аїа сіи ма! маї Ре тпг АїЇа су5 сіу С1У 1 5 10 «2105» 117 «2115» 10 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Комбінована СОКНІ по Чотіа-Кабату антитіла 905 «4005» 117 с1Уу Ре Тиг о РМПе 5ег б5ег Туг тиг Мет 5ег 1 5 10 «2105» 118 «2115» 10 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Комбінована СОКНІ по Чотіа-Кабату антитіла 1408 «400» 118 с1Уу Ре Тиг о РМПе 5ег б5ег Туг тиг Мет 5ег

Claims (33)

1 5 10 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Антитіло, яке зв'язується з транстиретином і містить три СОК важкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО: 61 і три СОК легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 70, за винятком того, що кожна позиція Н52 і 126 є незалежно М або 5.

2. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що воно містить три СОК важкого ланцюга по Кабату бо ЗЕО І МО: 67-69, відповідно, і три СОК легкого ланцюга по Кабату 5ЕБЕО ІЮ МО: 77-79, відповідно, антитіла 1408, за винятком того, що кожна позиція Н5Б2 і І 26 є незалежно М або 5.

3. Антитіло за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що СОВ-НІ1 являє собою комбіновану СОЕ по Кабату-Чотіа антитіла 1408.

4. Антитіло за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що воно містить три СОК важкого ланцюга по 65 Кабату 5ЕО ІЮО МО: 13-15, відповідно, антитіла 905.

5. Антитіло за пп. 1, 2 або 4, яке відрізняється тим, що СОВ-НІ1 являє собою комбіновану СОК по Кабату-Чотіа антитіла 905.

6. Антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що воно являє собою химерне, гуманізоване, венироване або людське антитіло.

7. Антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що воно має ізотип досі людини.

8. Антитіло за будь-яким з пп. 1-6, яке відрізняється тим, що воно має ізотип ІдДс2 або Ід804 людини.

9. Гуманізоване антитіло за будь-яким з пп. 6-8, яке відрізняється тим, що воно містить варіабельну область гуманізованого зрілого важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 95 ідентичну будь-якій з 5ЗЕО ІЮ МО: 5-12, і варіабельну область гуманізованого зрілого легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 95 ідентичну будь-якій з зЗЕО ІО МО: 19-23, за винятком того, що позиція Н19 являє собою К або К, позиція Н4О являє собою А або Т, позиція Н44 являє собою с або ЕК, позиція Н49 являє собою 5 або А, позиція Н77 являє собою 5 або Т, позиція Нв2а являє собою М або 5, позиція НВЗ являє собою К або К, позиція Н8Ві4 являє собою А або 5 і позиція НВО являє собою М або М.

10. Гуманізоване антитіло за п. 9, яке відрізняється тим, що всі з наступних позицій зайняті амінокислотою, як зазначено: в позиції Н47 знаходиться Г, в позиції НІ108 знаходиться І.

11. Гуманізоване антитіло за п. 9, яке відрізняється тим, що воно містить варіабельну область зрілого важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше на 98 95 ідентичну будь-якій з ЗЕО ІЮ МО: 5-12, і варіабельну область зрілого легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше на 98 95 ідентичну будь-якій з ЗЕО ІЮ МО: 19-23, за винятком того, що позиція Н19 являє собою К або К, позиція Н40 являє собою А або Т, позиція Н44 являє собою с або К, позиція Н49 являє собою 5 або А, позиція Н77 являє собою 5 або Т, позиція Нвг2а являє собою М або 5, позиція Н8В3 являє собою К або К, позиція Н8Ві4 являє собою А або 5 і позиція НВО являє собою М або М.

12. Гуманізоване антитіло за п. 11, яке відрізняється тим, що варіабельна область зрілого важкого ланцюга має амінокислотну послідовність будь-якої з 5ХЕО ІЮ МО: 5-12, а варіабельна область зрілого легкого ланцюга має амінокислотну послідовність будь-якої з зЗЕО ІЮ МО: 19-23.

13. Гуманізоване антитіло за п. 12, яке відрізняється тим, що варіабельна область зрілого Зо важкого ланцюга має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 11, а варіабельна область зрілого легкого ланцюга має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 19.

14. Гуманізоване антитіло за будь-яким з пп. 6-8, яке відрізняється тим, що воно містить варіабельну область гуманізованого зрілого важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 95 ідентичну будь-якій з 5ЕО ІЮО МО: 64-66, і варіабельну область гуманізованого зрілого легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше, на 90 95 ідентичну будь-якій з 5ЕО ІЮ МО: 74-76, за винятком того, що позиція Н8вага являє собою М або 5, позиція Н8ЗЗ являє собою К або К, позиція Н8ВА являє собою А або 5, позиція НВО являє собою У або М і позиція І 18 являє собою 5 або Р.

15. Гуманізоване антитіло за п. 14, яке відрізняється тим, що всі з наступних позицій зайняті вказаною амінокислотою: в позиції НІ знаходиться Е, в позиції Ні47 знаходиться І, в позиції І 26 знаходиться 5, в позиції І 36 знаходиться Е, а в позиції І 60 знаходиться 5.

16. Гуманізоване антитіло за п. 14, яке відрізняється тим, що воно містить варіабельну область зрілого важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше на 98 95 ідентичну будь-якій з БЕО ІЮ МО: 64-66, і варіабельну область зрілого легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше на 98 95 ідентичну будь-якій з ХЕО ІЮ МО: 74-76, за винятком того, що позиція Н8в2а являє собою М або 5, позиція Н8ВЗ являє собою ЕК або К, позиція Н8В4 являє собою А або 5, позиція НВО являє собою У або М і позиція І 18 являє собою 5 або Р.

17. Гуманізоване антитіло за п. 16, яке відрізняється тим, що варіабельна область зрілого важкого ланцюга має амінокислотну послідовність будь-якої з ФЕО ІЮ МО: 64-66, а варіабельна область зрілого легкого ланцюга має амінокислотну послідовність будь-якої з зЗЕО ІЮ МО: 74-76.

18. Гуманізоване антитіло за п. 17, яке відрізняється тим, що варіабельна область зрілого важкого ланцюга має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 65, а варіабельна область зрілого легкого ланцюга має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 76.

19. Антитіло за будь-яким з пп. 1-18, яке відрізняється тим, що воно являє собою зв'язуючий фрагмент.

20. Антитіло за п. 19, яке відрізняється тим, що зв'язуючий фрагмент являє собою одноланцюгове антитіло, Раб або Рар'?-фрагмент.

21. Гуманізоване антитіло за будь-яким з пп. 6-18, яке відрізняється тим, що варіабельна область зрілого легкого ланцюга злита з константною областю легкого ланцюга, а варіабельна 60 область зрілого важкого ланцюга злита з константною областю важкого ланцюга.

22. Гуманізоване антитіло за п. 21, яке відрізняється тим, що константна область важкого ланцюга являє собою мутантну форму природної константної області важкого ланцюга людини, яка має ослаблене зв'язування з рецептором Есу в порівнянні з природною константною областю важкого ланцюга людини.

23. Гуманізоване антитіло за п. 21 або 22, яке відрізняється тим, що константна область важкого ланцюга є такою ізотипу досі.

24. Гуманізоване антитіло за п. 21, яке відрізняється тим, що варіабельна область зрілого важкого ланцюга злита з константною областю важкого ланцюга, що має послідовність ЗЕО ІЮ МО: 103 з або без С-кінцевого лізину, та/або варіабельна область зрілого легкого ланцюга злита з константною областю легкого ланцюга, що має послідовність 5ЕО ІЮ МО: 104 або 105.

25. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло за будь-яким з попередніх пунктів і фармацевтично прийнятний носій.

26. Нуклеїнова кислота, яка кодує важкий ланцюг і/або легкий ланцюг антитіла за будь-яким з пп. 1-24.

27. Рекомбінантний вектор експресії, який містить нуклеїнову кислоту за п. 26.

28. Клітина-хазяїн, трансформована рекомбінантним вектором експресії за п. 27.

29. Спосіб гуманізації антитіла, який включає: а) вибір одного або більше акцепторних антитіл; б) ідентифікацію амінокислотних залишків мишачого антитіла, які підлягають збереженню; в) синтез нуклеїнової кислоти, яка кодує гуманізований важкий ланцюг, який містить СОК важкого ланцюга антитіла миші, і нуклеїнової кислоти, яка кодує гуманізований легкий ланцюг, який містить СОК легкого ланцюга антитіла миші; і г) експресію нуклеїнових кислот в клітині-хазяїні для продукування гуманізованого антитіла; причому антитіло миші являє собою 905 або 1408, при цьому 905 характеризується варіабельною областю зрілого важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 1 і варіабельною областю зрілого легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 16, а 14058 характеризується варіабельною областю зрілого важкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО: 61 і варіабельною областю зрілого легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:

70.

30. Спосіб інгібування або зниження агрегації транстиретину, інгібування або зниження Зо формування фібрил-транстиретину, зменшення кількості відкладень транстиретину, усунення агрегатів транстиретину, стабілізації нетоксичної форми транстиретину, лікування або здійснення профілактики транстиретин-опосередкованого амілоїдозу, або затримки початку прояву симптомів транстиретин-опосередкованого амілоїдозу у суб'єкта, який має транстиретин-опосередкований амілоїдоз або знаходиться під ризиком його розвитку, що включає введення суб'єкту антитіла за будь-яким з пп. 1-24 ефективною схемою, тим самим пригнічуючи або зменшуючи агрегацію транстиретину, пригнічуючи або зменшуючи накопичення транстиретину в суб'єкта, зменшуючи кількість відкладень транстиретину в суб'єкта, усуваючи агрегати транстиретину у суб'єкта в порівнянні з суб'єктом, який має транстиретин- опосередкований амілоїдоз або перебуває під ризиком його розвитку, який не отримував антитіла, або стабілізуючи нетоксичну форму транстиретину у суб'єкта.

31. Спосіб діагностування транстиретин-опосередкованого амілоїдозу у суб'єкта, що включає приведення в контакт біологічного зразка з суб'єкта за ефективною кількістю антитіла за будь- яким з пп. 1-24.

32. Спосіб за п. 31, який відрізняється тим, що біологічний зразок являє собою кров, сироватку, плазму або тверду тканину.

33. Спосіб за п. 32, який відрізняється тим, що тверда тканина являє собою тканину з серця, периферичної нервової системи, вегетативної нервової системи, нирок, очей або шлунково- кишкового тракту.

пиві пові віп, ПММ В Відвар З ВйВев 80 а йо топрвум Ма НН МУКОТРИ 45 Межиина модельЇЗЕО. Н БУКТАЕБОСогуОРССБІКЬОСААВ ЗЕТЕБТІТНЕ. АнОотТвЕ 45 Мишина модель ММОК. ЕУКООКВОСПІОВОсСНІКІНОоВАВОоКтТРЕВУТМЕНтНОотТеК 42 Людський зкцепторАСОгІ4 00 БУОБУЮВОВОБУ РОВНО САЛОсЕТУвК КН оВОвО 45 Пюдеський акцептов ДАХВза пеомонвосогукрОВЕЬКІВСААВ ЕТ ЕВ нот 42 наорБуУнУє піс тех усну ну кте тей ст еко 42 незоБуУнеа ЕТОБУКВОСССТОРОСОВІКЬВСААеЦКТЕВВЕТМинКуВОАвО 32 неазО5унеєв вУСЕУнЕоссгуорооВКЬОсААВ ЗРТЕВОІ ТК МВОГЕ 45 НезоБУней кшлИлЛЕВОсСОБУОРОскІВЬсААвоКТтеВНуТММУвВоАРа 82 ниЗОБуУНеЮ БУОСБУКОСООССУОВОСКІКІ САНИ ТРЕВУТМОМУВОТРИ 43 НизО5унУя КУТУ ВВС ОРОС сРттОвКти НУ ово 45 незоБунуаь кУусСУЮОСОСЬУЮРОСВІЖЬЕСААСОРТРаВУТМаХУНОВРО 47 навобунхя ЕУОБУВВСОСІЛЮРОСНІ ОСА ЕОКТКоВУТМОНУВОТРИ 42 нн нн «о 79 во тапеУн КАТЕБУДКІВНОСЮТТКУРОТУКОНЕУОВОМАКМНОСЖБОМЕ 84 Мишина модель 15БО Н кЕтжвУДУТЕКОСОсЕТУтвОТУКОВКТІВВОМАКЧСЬУСОМО Ва Мишина модель МОМ. М кисБиноаІннОосодухувОогуконетІВНЮМАКМТЬЬОМВ ВО Людський акцентор ВАСОХН КОЖНУ ВУТТВВОВТІУТАнВУКОСВКТІЛВОМАКМЕОХСОММ й Людський акцептор ДАХВ2434 ХВ ЕКУАТІВВОСяХУТУХРОВУКОВЕТІЕНОМАЮНТЬКООМВ 83 мавОБУНУя КОТНЛБУДЕІВНЕСЮТТУТРОТУКСВЕТЕдВоМАКнОСУСОММ 8а навовунух кОсКрУВЕІВМОсОСТУУрОгУксакткВиОМмакниоивоОкМ 4 Нав унись кинув сОотТтуУрОогУковетІннНоМАКитТЬьКЬОМя 84 Нав уна касЕМУВЕІВМОсотТУУрРОТУКОВеТЕВВомаАкнавУуьОВМ пе НизовУНУЗЬ КВЕМСУВВІяМВОрТТХуУВОгТуКснеТІВНИМАКНТІ ОМ ВА Незобунуя коспенУЕІОМисоттУУвОогУкоВетІчвоМАКкМавтТьояМ 84 НезоБунеь КВБЕСУДЕІШМОСОТТУЖРОТУКСВКТІВЗВОМАКМТСУСОМЕ ВА НниВОоБунех КВІтьоднІЗнасрттХУвОогУКСЮІКТІЦНОМАКМТМЬОММ 84

Фіг. 1А пн пи і ві пи ів пенні спини зо 150 119 ї25 во и НВ ПО А В В плж тару РІКБЕОТАМІХСАВНУУТСССІСсНЕвМУМСТСТТУТУВЬ 154 (КО Ю МОЛІ Машина модепь 13 В ЗОКЕЕоТАоХусАВнОвМиМОВКУрМОоКисОоВтнУТУвО 123 (ББОНОЮ МОХ Мищшива мадень ЗМО Н БІЖИ ТАМУХСУВНЕХХ сн ХАМОУНОСВОТІУ ТУ 319 КО Ю Мода Людський акцептор НАЄВ14 пОЖаБОТАУХУсСАввООсвиХУ Усова ТУ ТУВе 154 ЗБОЮ МО Пкдський зковптор ДАХВОЯ9Я ВІДНО ТАМУУСАНЬУХСТАУХК нн» МсОоТМУТИВО 120 ГЕО ЮКОЯ нУузОоБУнУї ВОЖАБОТАУХУСсАКНУХУС ССО МККрУМоОвІТУ УВО 154 (ВЕС МОВ нарвуУНУХ ІРВАЖОТАСТУХСАВНУХУВССХОСМУ КА нот туту 174 (ЗО ІН МОВ назрвУнкоь КВОТ сАК ТУ посиОаНоувот УТУ ВЕ 134 (ВБОНОКОЛЙ НіЗОБУНУЗ ХЕВАЕСТАСХХСАВНУХ УВС ИНА ОКУ ТИВ 174 КО ІН МОВ низремнУЗе ВІКожптвАтхсаАннУууусосусситРОУнОрОоВтивя 134 ШЕЦНОВО Нозовунуй кій сі кот ян вві несті с Ккнн 324 БО МОЛ НевоБУнучь ВЕКВЕОТАнтУсья НТУСОСтВон и кода ВЯ їх ЕМО НизОБУнУх ПІЖАЕОТАЧУУСАВНУХУОСУССНЕКОИ Ост ТУ 2 КО ЯМ Фіг, 1А,2

ПЕК я 29 36 40 тару. БІЧМЕИДАРНУРІКРСВНУКІВИ ВВЕ НеМОН КИТ 7 40 Мищшина модель ТММ пІУМТОАвРетьуТьСВВУвТвСВЕБКВСТя Мом тя И 40 Людський акцептор АВОББЗ52 ПОУКТОВРІВБРУТРОВРАОІВСНЯМОВІСХВМОУМУООМ 40 Наомі ПІУМТОБРОВЬЕУТРСВРАВІВСКВЯКВІСНОМОМТИТА М 40 НиврБуїм2 РІМТОВРЬБЕВУТРОНРАВІВСАЯВКБІТНЕНОМеТ МИ 40 низом му ОВІУМТОБРЕНОРУТРОКРАВІВО ввквилнЕнонттвУю 40 низом ма рІУмтовараБрУТРСЕКУВВЛІНСВВЕКНІЬНяМОМТУСУМ 40 нич яв ПІТМТОБАРЕБРУТРСКВУВІНСНЯВКВІОНЕМОМТХЬМИ аг мимо ов заново опором ново промов провина попе оипніов вив ивв ав і 5о о то о терем, КЕОВРООБРОБОІУКУЄМОЛОУРОВСОВовсТаЕтТЬнІ о Мишина модель ТМЦ 1. кронрРООБрРОпІУВМЕМІ:АВСУуРОКиВОоВоястаЕтТінНІ ВО Пюдський акцептор АНСВбЯ5а УІакрРООБВОБЬ»ІШВОВИНАВОУРЮВЕБОопОоВОТОЕТЬКХ Во НиЗОБУл ЕЕОКРООБРОСБОІУВУВМЬВЕОЗУРОВКВОВОоБОТОКТЬКІ йо Незрбувм? УпОоКРООВРВОКЬІУВУЯМАНОУРОВЕЗсВсВотОовтТЬКІ 8 НеазО5уУсуа чІОоКкРООБРОБІІМНУВнЬацсУравенВоВавотоК КІ БО НиЗОБУє мА кове оовтОогоІУВУЄМоВНОоУувЕКНсВоВствЕтТЬьнІ Я Низ умо кіспеоозрРОБоТнумоАвоУвовЕивовОоВОотАРтТІВвІ ВО пеня не нення ни рент ення ТЕТ чх ння нн ння ння г) А 186 110 тар. ВКУБАКВОУСУУ УНІ МНЕВТТе ЗВЕТКТКТК 119 (ВЕС МОВ Мишина модель ЗМ БВУБАНОТСЧХУСТЬОВІЕХветвсвотТкКІвВОК 12 (ЗБОЮ МОЛІ Людський зкцептор АВСеБОВ БВУШАКОУСУТУСМОАрОВРУТЕСОсСТКТНІК 112 (ЗЕО МОВ) МиЗОБмУЇ мі КоКАНОСУТСМОНт ТУТ РСОСТКЬКТИ 3112 (ЗБОЮ МОВІ Низку? вИУБАЕСУСУУХОМОВЬЕУРІТКЦОСТКБЕІК 112 ЗБОЮ МО) НаЗО5мУЗ БВУКАБОУСУТУСМОНЬЕУРОТЕсОшТКОКІК 152 ЗБОЮ МО Навовуєеа ЗВУ ЕАБОУЄУУТОМОНІКУВЕТЕСОЄТК ВТК 112 БЕ ОЮМО2И Нивоемі ув БАУЕАЕОТОСУХОМОВСВУРЬТКОСятТКоЮІК 112 (ЗБОЮ МОЯ)

Фіг. 1 19 20 30 49 Мишина модель МОЖ, Н БОКІОМЕСОрТВРОСНІКЬОСАВІЦЕТР ВЕУ МОНО ТЬВ 42 Дюдський акцептов ДАВЗО410 оузвуовоссьсовсссвкв сао тиаахамВкувотьЕ 4 Людський акцептар ДАХВРА9а соУусіашавсосьерссисвеноавсЕткЕВУсМВиУвОоОТео 45 нНит4а8УнУї шЖукигтУчвосс уроки ТЕХНО 44 нитесиУунуЗ ЕЧОСБУЮВОСССсСЬУСВОоБІКиВОслАНОКТЕБвИЖрМаНУКОКРЕ 42 Нит3іБ8уУНмУЗ БУ Висока КТК У ноткв 4и пон пні ин пивні МНН нн нія фон -О й ТО во ті«овУН ва Мишина модель ІМОК КВІЖНУВБІННОСОКТТУРОТУКОВ нтІБКИЧАКМІВИСОМЕ Ва Людський акцептор ДАГІЗОХ1О КВІЖНОВЛІЕТОСВКІУУВОТуКСВе ТІ ВСОМаКМТЬУЄОММ 84 Людський зкцептор ДАХ82454 КЕН УАТІВВсСоХУТХурОВУКсВиТІВНОМАКМТЬМ ОМ 84 НиатесаУнхї КНІЖОИАЕТМ ПОТУ ТЕТУ тоном 84 НитаовуНУ? КАТА УвЕТНИв от РУ РОТКе ттІвдоМАкнтоУроМма 84 Ниву КиБНІАЄ ІНМЕсСОТТХуРОТОКОВИТІ швочаАкМтоисьоМмМ 54 пн НН ШТ оон 39 109 119 129 тпічавун БЕЖЕКРТАМІУСАННІУ ТОСТИ НСТстТтТУТУВИ 124 (ЗБОЮ МОВІ Мищина модель МОМ. Н чІЖЕЕОТАМУХСУВНИХУ нене УвМОУМОСОЦТТУтУВи 118 (ЗБОЮ МОВ Людський акцептор АВПЗО410 ВОВАБОТАТТУСАКОВОТОАТВОсВЕ Орос 124 (ЗВОО МОВІ) Людський акуцептор ДАХВ2494 ВЬЕБЕОТАМУУСАНІЯХОХКУУ ен УМ МутУви 120 (ЗО МОЯ) На14о8Уняї БтКВКртАнуу сут ува НЕТ МА ТУ ВВ 1724 І8БО Ю НО ни ОоВУНнУг ЗБЕВЕОТАМУТСАВНУУУСОСТОСНЕвОЧИсОЄЮТІАрУВЕ 124 (ЗЕСНО МОВ НизаваунуЗ ВІНАЕрТАУТусСАННутусссТосиККрумсоєтьтУвЕ 124 (ВБОО МОВ Фіг, 2А пе и о о з оо опо ЗИ о коп ов рео во пасив й 19 20 30 40 ур УК коту кет тен нетто умо д нених у фкдАКНи нн КК Аннкн лиж кни,

тім. ОІУМТОААРВУРУТРСЕВУВІВСНВМЕКСЬВОМоМКьиМ 80 Мишина модель ТММ | ПІУМТОАВРЯУВУТРОКНВУВІВСВВНКВІЛНВМОМТУСУЮ 40 Людський акцептов АВА?71а74 рІУМТОТеЬОБРУТРСЮИВАВІВСВЕВОВСВНУВСТТУІОХ 40 Дюдський акцептор ДВСВКЗНО ОІУМТОолРОЕВБРУТВОВРАВІВСВОМОВІСУВМОоУМЕОМ 40 Натаавуєм ОІУМтТОВАРОБитТтТРОКОУВІВСВВМЕЕсОНИМОМОХеК 40 Нит408у хе отУМТОоВвІЬвУТРОКеВоІВснЕМКВеоНЯМоМтУру М ай Назв отУМмтоВвовБвУТВОКРАВІБСВЕВКЕСЬКНЕМОМТУВУХ 40 о Бо Я о она их с иа пн их п Т4О8у. КОН РОООРОЦЬТУКОВНОАОСУВОКРЕОВСВСТАЄНЧАХ 80 Минива модель ТОМИ 1 кІФВеОоОВРОСЬтУиМЕМНОВВсУРОВенОвВсВстактЬьиІ ВО Людвький зкцептор АВА?1З7Я ХІОКРООВРОУБІУООВМВАВОСТврЕКВоВоВоторЕтТОКІ ВО Людський акцепторю ДВСеВО52 чрикесеввомноІхоовннаАвиУвоиЕВасоВатоК КІ ВО Нез14о8ум ЖООККОсОЯРОБОХУВУВМЬАЕСУВОВИВОовІвОгаАитКІ 80 Нав Уа ЕІОКРООБРОБЬТУКУЄМОАВОУВОВКВОВСООТЮРТЬКІ во надам хз ЕІДЖРООВРОБСІУКУОНЕОЮОТКЕКРВИвОВОТОрЕТОКХ 80 зо 100 мае татамі. ЕВУКАКБУСУУУСМОНСКУРО КОДОМ КЬКИ 313 (ЗБОЮ МОЛ Мишина модель ТМЦ ввУКАЖОУЄУТУСЬОНЬМУВЕТесВОоТКоЕрКИ 113 (ЗБОЮ МОУ Подський акцентор АВАТІЗ74 явУМАВОУСУХУСМОДлОВУСВКООсСТКОВІХВ 133 БО МОЯ Людський акцентор АНСОВБОВІ БВУКАКВОССУЄЖСМОАЬОВиЕТЕвОСТЕвКІКВ 13 ЗБОЮ ЖК Нечая ВЕУКАЕОТСУУУСМОНЬКУвотКоМстюриуКИ 113 (ЗБОЮ МОЯ Натасвуємо шВУВАНОМОУХУСМОВОКУВО КСО ТКОвІКВ 113 (БОЮ НО Натавауьхз БиХЕАКОУСУХУСМОНЬКУРеТЕсОстЕожІЖН 115 (ЗБОЮ МОВ

Фіг. 28 рНа-оброблений ТІВ і до - | Ян во о 155 г уд ; : і дет рон Б в Е е і 2 Н же і г ї фа 1 е 104 о: дню 1468 Н ех Н ; Га і ок |ож--енн БД Шк у -к 0,54 ОА і ОК я і вон пн ; і сення ніс» ї

0.о і ВЕ пнтечнвчнинтетчитнния 00903 оо 01001 та 100 ТпАВ (мкм Фіг, ЗА Нативний ТІК - 2 с ї роя ЗАВ - 15 ї во" Іон ВС я ї і З Їж БД о 10 і ро 905

0,5. 0 К вжи: шана жи; МВ не: МЕ пече сао і боб 0010 0100 3 о о ПВ (магімл)

Фіг. ЗВ інгібування формування фібрни ТТК-ЖУВЕ ї ла Ех. ск сек В моря нн Інпбування що Пд, Я се ї й ї в. КЕН ЩО й 7 ! фон І мети ж КВ Ж С ко ШЕ 25 ШО БЖ ня Б хе ОЙ ой М е Же МИ ИИ МН і ке п ша до ; я амо у ХХ д и щи НК Синя Мити ХМ ХХ Я лляякю ТІВ РУ Ну ЗВ шо а. А ЕВ ин МОЮ інгібування БМ 3468 БС1 5АЇ Контроль Антитіпо до ті ТА

Фіг. 4А 2 пен нин нн рек нннененннннн ненням нтнннтнтнюннненся оо | - й в вк | НУ | і Ж ож г вовчі і щозЗ 8: і НЕ Е я і В а 7 ге ми ин

ЯК. І Ж ке 05 і таб» з со і І ж Н Н я я, ее і а і вх Я ке 04 Е пе 5 Н Ки і Х Фе мя ! 5 па Й гЯв ще і 3. ре ря : самнажеюкоктисьнА Ж 5 оо оовютони й ! з Н обДококеожаек око Й

БК. Дрердеемекнеететежано де хе и июююаненні | ЖЕО ! я М уннненннніннню інтере нісніюреннінннннер ФО дня 0 боб б лог о бо 0 0 МЯОВІ (мимлі Контрольна тАВІ спмгляпт -« з Я

Фіг. 48 Фіг. 4С ЗО5 Мономер ж Смуги димера | 5БА1 Мономевя Смуги димера 5 | пити я 55 й о т і я м шк Ко о | і о 5й вчене З їй КРОК 5 С, Н ЗКУ і З я та ТІК х мав Е пн в уж ОК і ВН Ж М рити Н 1ОБОЯЕ м іде: То дну Я, НЯ ВІ З жо я ГА ля ЕНН і: Яся й ра я ши рив сф ше: вий КН З кс се й ре ЕКи КІ іх З БЕЖ НАЧКУ 0,5 а ги Н Мих ЕС їв з і ще ії а | А: НО ЗВ З У и я Я 8 ЕЕ УДЕНВН: Ж ДИНЯ ШК А ШК ВЕС Зразок МЕ Зразок Ме

Фіг. 5А Фіг. 58

Датекція МБО 503-бако 20000 7 Й зБЖюЮ о І чт 10000 ооо ж - М Ж й і ну в- с ЕЕ в. з М 25181901 32232425 Зразок Ме

Фіг. 6 44 Я Ізотипний контроль З КМ 1408 в ее 2поя мя Е вхя се Її т з | | ї Нор її пк ТАКЕ МИТОМ

Фіг. 7А «8 40 птн 2 Ме се КД к Х в Ж дренннк | чен ВС "а с А : 5 З я | «ее Дище клітини ж нич ше те ІЗОТИПНИЙ КОНТРОЛЬ 0 т «х я 0 2 4 6 8 о ІОАБІ (мкг/мл

Фіг. 78