BR112020006434A2 - anticorpos anti-transtirretina - Google Patents

Abstract

A presente invenção fornece anticorpos que se ligam especificamente à transtirretina (TTR). Os anticorpos podem ser utilizados para tratar ou efetuar a profilaxia de doenças ou distúrbios associados ao acúmulo de TTR ou acúmulo de depósitos de TTR (por exemplo, amiloidose de TTR). Os anticorpos também podem ser utilizados para diagnosticar amiloidose de TTR e inibir ou reduzir a agregação de TTR, e para monitorar a eficácia de terapias de TTR, entre outras aplicações.

Description

ANTICORPOS ANTI-TRANSTIRRETINA REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício de acordo com 35 USC 119 (e) do Pedido Provisório US Nº 62/569.436 depositado em 6 de outubro de 2017 e do Pedido Provisório US Nº 62/598.965, depositado em 14 de dezembro de 2017, cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade para todos os fins.

REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] A Listagem de Sequência escrita no arquivo 516711SEQLST.txt tem 59,6 kilobytes, foi criada em 20 de setembro de 2018 e é incorporada a este documento por referência.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0003] Pensa-se que várias doenças são causadas pelo dobramento e agregação anormais de proteínas específicas da doença. Essas proteínas podem se acumular em acumulações patologicamente diagnósticas, conhecidas como amiloides, que são visualizadas por certas manchas histológicas. Pensa-se que os amiloides desencadeiam respostas inflamatórias e têm múltiplas consequências negativas para os tecidos envolvidos. Além disso, agregados menores de proteína dobrada anormalmente podem existir e exercer efeitos citotóxicos.

[0004] A Transtirretina (TTR) é uma das muitas proteínas que são conhecidas por se desdobrar e agregar (por exemplo, sofrer amiloidogênese). A amiloidose mediada por transtirretina (ATTR) engloba duas formas de doença: doença familiar decorrente do desdobramento de uma TTR mutada ou variante e uma doença esporádica não genética causada pelo desdobramento e agregação da TTR de tipo selvagem. O processo de amiloidogênese da TTR pode causar patologia no sistema nervoso e/ou no coração, assim como em outros tecidos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO REIVINDICADA

[0005] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente a TTR dobrada incorretamente e não à forma nativa da proteína. Exemplos de tais anticorpos se ligam a um epítopo dentro dos resíduos de aminoácidos 101-109 da região madura da SEQ ID NO:26.

[0006] Alguns desses anticorpos competem pela ligação da TTR humana dobrada incorretamente com o anticorpo 18C5. Alguns destes anticorpos se ligam ao mesmo epítopo na transtirretina humana como 18C5.

[0007] Alguns anticorpos compreendem três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada do anticorpo monoclonal 18C5, em que 18C5 é um anticorpo de camundongo caracterizado por uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 81 e uma região variável de cadeia leve madura com uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 87.

[0008] Alguns desses anticorpos compreendem três CDRs de cadeia pesada, conforme definido pelo Composto de Kabat/Chothia (SEQ ID NOs: 5, 7 e 9) e as três CDRs de cadeia leve, conforme definido pelo Composto de Kabat/Chothia (SEQ ID NOs: 11, 13 e 15).

[0009] Alguns desses anticorpos são 18C5 ou sua forma quimérica, com superfície modificada ou humanizada. Alguns desses anticorpos se ligam a um epítopo dentro das posições 101-109 na região madura da SEQ ID NO:26. Alguns desses anticorpos são anticorpos monoclonais. Alguns desses anticorpos são anticorpos quiméricos, humanizados, com superfície modificada ou humanos. Em alguns desses anticorpos, a região variável da cadeia pesada madura tem≥ 85% de identidade com a sequência humana. Em alguns desses anticorpos, a região variável da cadeia leve madura possui ≥ 85% de identidade com a sequência humana. Em alguns desses anticorpos, cada uma das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve da natureza tem ≥ 85% de identidade com a sequência da linhagem germinativa humana. Alguns destes anticorpos são anticorpos humanizados. Alguns desses anticorpos possuem isotipo IgG1 humano. Alguns desses anticorpos possuem isotipo IgG2 ou IgG4 humano.

[0010] Alguns desses anticorpos são anticorpos 18C5 humanizados ou quiméricos que se ligam especificamente à transtirretina, em que 18C5 é um anticorpo de camundongo caracterizado por uma região variável de cadeia pesada madura de SEQ ID NO:81 e uma região variável de cadeia leve madura de SEQ ID NO:87. Em alguns anticorpos, a região variável da cadeia pesada madura humanizada compreende as três CDRs de cadeia pesada de 18C5 e a região variável da cadeia leve madura humanizada compreende as três CDRs de cadeia leve de 18C5.

[0011] Em alguns anticorpos, as CDRs são de uma definição selecionada do grupo de Kabat, Chothia, Composto Kabat/Chothia, AbM e Contact. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada madura humanizada compreende as três CDRs da cadeia pesada do Composto Kabat/Chothia de 18C5 (SEQ ID NOs: 5, 7 e 9) e a região variável da cadeia leve madura humanizada compreende as três CDRs de cadeia leve do Composto Kabat/Chothia de 18C5 (SEQ ID NOs: 11, 13 e 15). Em alguns anticorpos, a região variável da cadeia pesada madura humanizada compreende as três CDRs de cadeia pesada Kabat de 18C5 (SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:9) e a região variável da cadeia leve madura humanizada compreende as três CDRs de cadeia leve Kabat de 18C5 (SEQ ID NO:11. SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:15). Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura humanizada compreende as três CDRs de cadeia pesada Chothia de 18C5 (SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96 e SEQ ID NO:9) e a região variável de cadeia leve madura humanizada compreende as três CDRs de cadeia leve Chothia de 18C5 (SEQ ID NO:11. SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:15). Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada madura humanizada compreende as três CDRs de cadeia pesada AbM de 18C5 (SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:97 e SEQ ID NO:9) e a região variável da cadeia leve madura humanizada compreende as três CDRs de cadeia leve AbM de 18C5 (SEQ ID NO: 11. SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:15. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada madura humanizada compreende as três CDRs da cadeia pesada de Contact de 18C5 (SEQ ID NOs 100-102) e a região variável da cadeia leve madura humanizada compreende as três CDRs da cadeia leve de Contact de 18C5 (SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:98 e SEQ ID NO:99).

[0012] Alguns anticorpos compreendem uma região variável de cadeia pesada madura humanizada com uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a qualquer dentre SEQ ID NOs:85-86 e uma região variável de cadeia leve humanizada com uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 91-92.

[0013] Em alguns anticorpos, pelo menos uma das seguintes posições é ocupada pelo aminoácido especificado: H37 é ocupado por V ou A, H45 é ocupado por L ou Q, H47 é ocupado por L ou W, H48 é ocupado por L ou I, H49 é ocupado por A ou G e H94 é ocupado por S ou R. Em alguns anticorpos, as posições H37, H45, H47, H48, H49 e H94 na região VH são ocupadas por A, Q, W, I, G e R, respectivamente.

[0014] Em alguns anticorpos, pelo menos uma das seguintes posições é ocupada pelo aminoácido especificado: L2 é ocupado por I ou V e L45 é ocupado por Q ou R. Em alguns anticorpos, as posições L2 e L45 na região VL são ocupadas por V e R, respectivamente.

[0015] Alguns anticorpos compreendem uma região variável de cadeia pesada madura com uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NO: 85-86 e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NO: 91-92. Alguns anticorpos compreendem uma região variável de cadeia pesada madura com uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NO: 85-86 e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NO: 91-92.

[0016] Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 85-86 e a região variável da cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 91-92.

[0017] Em alguns anticorpos, a região variável da cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:85 e a região variável da cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:91. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:85 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:92. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:86 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:91. Em alguns anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:86 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID

NO:92.

[0018] Em alguns anticorpos, o anticorpo é um anticorpo intacto. Em alguns anticorpos, o anticorpo é um fragmento de ligação. Em alguns desses anticorpos, o fragmento de ligação é um anticorpo de cadeia simples, Fab ou fragmento Fab'2.

[0019] Em alguns anticorpos, a região variável da cadeia leve madura é fundida em uma região constante da cadeia leve e a região variável de cadeia pesada madura é fundida em uma região constante de cadeia pesada. Em alguns desses anticorpos, a região constante de cadeia pesada é uma forma mutante de uma região constante de cadeia pesada humana natural que tem ligação reduzida a um receptor de Fcγ em relação à região constante de cadeia pesada humana natural. Em alguns desses anticorpos, a região constante da cadeia pesada é do isotipo IgG1. Em alguns desses anticorpos, a região variável de cadeia pesada madura é fundida a uma região constante de cadeia pesada tendo a sequência de SEQ ID NO: 22 e/ou a região variável de cadeia leve madura é fundida a uma região constante de cadeia leve tendo a sequência de SEQ ID NO: 24.

[0020] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um primeiro anticorpo de qualquer uma das reivindicações anteriores, um segundo anticorpo que se liga a um epítopo diferente de TTR daquele ligado por 18C5 e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em algumas dessas composições farmacêuticas, o segundo anticorpo é 9D5, 14G8, 5A1, 6C1, AD7F6, RT24, NI-301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD107, MFD108, MFD109, MFD111, MFD114 ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em algumas composições farmacêuticas, o segundo anticorpo é um anticorpo que se liga nos resíduos 89-97, 118-122, 115-124, 53-63, 54-61, 36-49, 49-61, 109-121, 30-66, 70-127, 80-127, 90-127, 100-127, 110-127 ou 115- 127 de TTR.

[0021] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo biespecífico que compreende duas regiões de ligação ao antígeno, um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a 101-109 de TTR e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a outra região de TTR. Em alguns desses anticorpos biespecíficos, o segundo domínio de ligação ao antígeno é um domínio de ligação ao antígeno de 9D5, 14G8, 5A1, 6C1, AD7F6, RT24, NI-

301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD107, MFD108, MFD109, MFD111, MFD114 ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns anticorpos biespecíficos, o segundo domínio de ligação ao antígeno se liga aos resíduos 89-97, 118-122, 115-124, 53-63, 54-61, 36-49, 49-61, 109-121, 30 - 66, 70-127, 80-127, 90-127, 100-127, 110-127 ou 115-127 de TTR.

[0022] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anticorpos acima mencionados e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0023] Em outro aspecto, a invenção fornece um ácido nucleico que codifica a cadeia pesada e/ou a cadeia leve de qualquer um dos anticorpos acima mencionados. Em outro aspecto, a invenção fornece um vetor de expressão recombinante compreendendo tal ácido nucleico. Em outro aspecto, a invenção fornece uma célula hospedeira transformada com tal vetor de expressão recombinante.

[0024] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de humanização de um anticorpo, o método compreendendo: (a) selecionar um anticorpo aceitador humano; (b) identificar os resíduos de aminoácidos do anticorpo de camundongo a serem mantidos; (c) sintetizar um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada humanizada compreendendo as CDRs da cadeia pesada do anticorpo de camundongo e um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve humanizada compreendendo as CDRs da cadeia leve do anticorpo de camundongo; e (d) expressar os ácidos nucleicos em uma célula hospedeira para produzir um anticorpo humanizado; em que o anticorpo de camundongo compreende uma região variável de cadeia pesada madura com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81 e uma região variável de cadeia leve madura com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 87.

[0025] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para produzir um anticorpo humanizado, quimérico ou com superfície modificada, o método compreendendo:

(a) cultivar células transformadas com ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo de modo que as células secretem o anticorpo; e (b) purificar o anticorpo a partir de meios de cultura celular; em que o anticorpo é uma forma humanizada, quimérica ou de superfície modificada do 18C5.

[0026] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para produzir uma linha celular produzindo um anticorpo humanizado, quimérico ou com superfície modificada, o método compreendendo: (a) introduzir um vetor que codifica cadeias pesadas e leves de um anticorpo e um marcador selecionável nas células; (b) propagar as células em condições para selecionar células que tenham maior número de cópias do vetor; (c) isolar células únicas a partir das células selecionadas; e (d) armazenar as células clonadas a partir de uma única célula selecionada com base na produção do anticorpo; em que o anticorpo é uma forma humanizada, quimérica ou de superfície modificada do 18C5.

[0027] Alguns desses métodos compreendem ainda a propagação das células em condições seletivas e o rastreio de linhas celulares que expressam naturalmente e secretam pelo menos 100 mg/L/106 células/24h.

[0028] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para inibir ou reduzir a agregação de transtirretina num indivíduo que tem ou está em risco de desenvolver uma amiloidose mediada por transtirretina, compreendendo administrar ao indivíduo um regime eficaz de qualquer um dos novos anticorpos mencionados acima, inibindo ou reduzindo a agregação de transtirretina no sujeito.

[0029] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para inibir ou reduzir a formação de fibrilas de transtirretina em um sujeito que tem ou está em risco de desenvolver uma amiloidose mediada por transtirretina, compreendendo administrar ao sujeito um regime eficaz de qualquer um dos novos anticorpos mencionados acima, inibindo ou reduzindo assim a acumulação de transtirretina no sujeito.

[0030] Em outro aspecto, a invenção fornece ainda um método para reduzir os depósitos e agregados de transtirretina em um sujeito que tem ou está em risco de desenvolver uma amiloidose mediada por transtirretina, compreendendo a administração ao sujeito de um regime eficaz de qualquer um dos novos anticorpos mencionados acima, reduzindo assim os depósitos de transtirretina no sujeito.

[0031] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para eliminar a transtirretina amiloide em um sujeito que tem ou está em risco de desenvolver uma amiloidose mediada por transtirretina, compreendendo a administração ao sujeito de um regime eficaz do anticorpo de qualquer um dos novos anticorpos mencionados acima, desse modo, eliminando a transtirretina amiloide do sujeito em relação a um sujeito que tem ou está em risco de desenvolver uma amiloidose mediada por transtirretina que não recebeu o anticorpo.

[0032] Em outro aspecto, invenção fornece um método para tratar ou efetuar a profilaxia de uma amiloidose mediada por transtirretina em um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito um regime eficaz de qualquer um dos novos anticorpos mencionados acima.

[0033] Em outro aspecto, invenção fornece um método para retardar o aparecimento de uma amiloidose mediada por transtirretina em um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito um regime eficaz de qualquer dos novos anticorpos mencionados acima.

[0034] Em alguns desses métodos, a amiloidose mediada por transtirretina está associada a uma condição selecionada dentre cardiomiopatia ou hipertrofia, polineuropatia amiloide familiar, amiloidose seletiva do sistema nervoso central (Central Nervous System Selective Amyloidosis - CNSA), amiloidose seletiva do sistema nervoso central, amiloidose sistêmica senil, amiloidose cardíaca senil, estenose espinal, osteoartrite, artrite reumatoide, artrite idiopática juvenil, degeneração macular relacionada à idade e distúrbio do ligamento ou tendão.

[0035] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para tratar um sujeito com ou em risco de qualquer uma dentre cardiomiopatia ou hipertrofia, polineuropatia amiloide familiar, amiloidose seletiva do sistema nervoso central (CNSA), amiloidose sistêmica senil, amiloidose cardíaca senil, estenose espinal, osteoartrite, artrite reumatoide, artrite idiopática juvenil degeneração macular relacionada à idade e um distúrbio do ligamento ou tendão, o método compreendendo a administração ao sujeito de um regime eficaz do anticorpo de qualquer um dos novos anticorpos acima mencionados.

[0036] Em alguns desses métodos, o anticorpo é administrado em combinação com um segundo anticorpo que se liga a um epítopo diferente de TTR daquele ligado por 18C5. Em alguns desses métodos, o segundo anticorpo é 9D5, 14G8, 5A1, 6C1, AD7F6, RT24, NI-301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD107, MFD108, MFD109, MFD111, MFD114 ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em algumas composições farmacêuticas, o segundo anticorpo é um anticorpo que se liga nos resíduos 89-97, 118-122, 115- 124, 53-63, 54-61, 36-49, 49-61, 109-121, 30-66, 70-127, 80-127, 90-127, 100-127, 110-127 ou 115-127 de TTR.

[0037] Em outro aspecto, o anticorpo é administrado como uma monoterapia.

[0038] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de diagnóstico de uma amiloidose mediada por transtirretina em um sujeito, compreendendo o contato de uma amostra biológica do sujeito com uma quantidade eficaz de qualquer um dos novos anticorpos mencionados acima. Alguns desses métodos compreendem ainda o contato da amostra biológica do sujeito com uma quantidade eficaz de um segundo anticorpo que se liga a um epítopo diferente de TTR daquele ligado por 18C5. Em alguns desses métodos, o segundo anticorpo é 9D5, 14G8, 5A1, 6C1, 8C3, 7G7, AD7F6, RT24, NI-301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD107, MFD108, MFD109, MFD111, MFD114 ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em algumas composições farmacêuticas, o segundo anticorpo é um anticorpo que se liga nos resíduos 89-97, 118-122, 115- 124, 53-63, 54-61, 36-49, 49-61, 109-121, 30-66, 70-127, 80-127, 90-127, 100-127, 110-127 ou 115-127 de TTR.

[0039] Alguns desses métodos compreendem ainda a detecção da ligação do anticorpo à transtirretina, em que a presença de anticorpo ligado indica que o indivíduo tem uma amiloidose mediada por transtirretina.

[0040] Alguns destes métodos compreendem ainda a comparação da ligação do anticorpo à amostra biológica com a ligação do anticorpo a uma amostra de controle, por meio de qual uma ligação aumentada do anticorpo à amostra biológica relativamente à amostra de controle indica que o indivíduo tem uma amiloidose mediada por transtirretina.

[0041] Em alguns destes métodos, a amostra biológica e a amostra de controle compreendem células da mesma origem tecidual. Em alguns destes métodos, a amostra biológica e/ou a amostra de controle são sangue, soro, plasma ou tecido sólido. Em alguns desses métodos, o tecido sólido é do coração, sistema nervoso periférico, sistema nervoso autônomo, rins, olhos, gordura abdominal ou trato gastrointestinal.

[0042] Em alguns desses métodos, a amiloidose mediada por transtiretina é uma amiloidose familiar por transtiretina ou uma amiloidose esporádica por transtiretinina. Em alguns destes métodos, a amiloidose familiar por transtirretina é a miocardiopatia amiloide familiar (FAC), polineuropatia amiloide familiar (FAP) ou amiloidose seletiva do sistema nervoso central (CNSA). Em alguns destes métodos, a amiloidose esporádica por transtirretina é amiloidose sistêmica senil (Senile Systemic Amyloidosis - SSA) ou amiloidose cardíaca senil (Senile Cardiac Amyloidosis - SCA).

[0043] Em alguns desses métodos, a amiloidose mediada por transtirretina é associada ao acúmulo de amiloide no coração, sistema nervoso periférico, sistema nervoso autônomo, rins, olhos, gordura abdominal ou trato gastrointestinal do sujeito.

[0044] Em outro aspecto, a invenção fornece ainda um método para detectar a presença ou ausência de depósitos de transtirretina em um sujeito, compreendendo o contato de uma amostra biológica do sujeito suspeito de compreender o acúmulo de amiloide com uma quantidade eficaz de qualquer um dos novos anticorpos mencionados acima.

[0045] Alguns desses métodos compreendem ainda a detecção da ligação do anticorpo à transtiretina, em que a detecção de anticorpo ligado indica a presença de depósitos de transtiretina.

[0046] Alguns destes métodos compreendem ainda a comparação da ligação do anticorpo à amostra biológica com a ligação do anticorpo a uma amostra de controle, por meio de qual uma ligação aumentada do anticorpo à amostra biológica relativamente à amostra de controle indica que o indivíduo tem uma amiloidose mediada por transtirretina.

[0047] Em alguns destes métodos, a amostra biológica e a amostra de controle compreendem células da mesma origem tecidual. Em alguns destes métodos, a amostra biológica e/ou a amostra de controle são sangue, soro, plasma ou tecido sólido. Em alguns desses métodos, em que o tecido sólido é do coração, sistema nervoso periférico, sistema nervoso autônomo, rins, olhos, gordura abdominal ou trato gastrointestinal.

[0048] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para determinar um nível de depósitos de transtirretina em um sujeito, compreendendo administrar qualquer um dos anticorpos mencionados acima e detectar a presença de anticorpo ligado no sujeito. Em alguns desses métodos, a presença de anticorpo ligado é determinada por tomografia por emissão de pósitrons (PET).

[0049] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para tratar ou efetuar profilaxia de uma amiloidose mediada por transtirretina em um sujeito, compreendendo a administração de um regime eficaz de um estabilizador de tetrâmero de TTR, um terapêutico baseado em oligonucleotídeo antisense, um terapêutico baseado em interferência por RNA (RNAi) ou doxiciclina mais ácido tauroursodeoxicólico, em que o sujeito foi tratado anteriormente com qualquer um dos novos anticorpos mencionados acima. Em alguns desses métodos, o sujeito não recebe mais tratamento com o anticorpo. Em alguns desses métodos, o estabilizador de tetrâmero de TTR é tafamidis ou diflunisal. Em alguns desses métodos, o terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense é inotersen. Em alguns desses métodos, o terapêutico baseado em RNAi é patisiran ou revusiran.

[0050] Em alguns métodos, o anticorpo é administrado em combinação com um estabilizador de tetrâmero de TTR, um terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense, um terapêutico à base de interferência por RNA (RNAi) ou doxiciclina mais ácido tauroursodeoxicólico. Em alguns desses métodos, o estabilizador de tetrâmero de TTR é tafamidis ou diflunisal. Em alguns desses métodos, o terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense é inotersen. Em alguns desses métodos, o terapêutico baseado em RNAi é patisiran ou revusiran.

[0051] Em alguns métodos, o anticorpo é administrado simultaneamente com um estabilizador de tetrâmero de TTR, um terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense, um terapêutico à base de interferência por RNA (RNAi) ou doxiciclina mais ácido tauroursodeoxicólico. Em alguns desses métodos, o estabilizador de tetrâmero de TTR é tafamidis ou diflunisal. Em alguns desses métodos, o estabilizador de tetrâmero TTR é diflunisal. Em alguns desses métodos, o terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense é inotersen. Em alguns desses métodos, o terapêutico baseado em RNAi é patisiran ou revusiran.

[0052] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para identificar um anticorpo que se liga a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR, compreendendo: (a) imunizar um animal com TTR ou um fragmento deste; e (b) rastrear anticorpos induzidos para identificar uma ligação de anticorpo dentro dos resíduos 101-109 de TTR. Em alguns métodos, a imunização é realizada com um fragmento de não mais do que 25 resíduos contíguos de TTR, incluindo pelo menos 3 resíduos contíguos nos resíduos 101-109 de TTR. Em alguns métodos, o fragmento consiste nos resíduos 101-109 de TTR, opcionalmente ligados a um carreador. Em alguns métodos, a triagem é realizada determinando a ligação dos anticorpos a um fragmento de TTR que consiste nos resíduos 101-109 de TTR.

[0053] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para identificar um anticorpo que se liga a um epítopo nos resíduos 101-109 de TTR: compreendendo: fornecer uma biblioteca de exibição de anticorpos; e triar a biblioteca de exibição para identificar uma ligação de anticorpo nos resíduos 101-109 de TTR. Em alguns métodos, a biblioteca de exibição exibe anticorpos como fragmentos de Fv. Em alguns métodos, a biblioteca de exibição é uma biblioteca de exibição não exposta. Em alguns métodos, a biblioteca de exibição é produzida imunizando um roedor com TTR ou um fragmento deste e clonando ácidos nucleicos que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpos em um vetor de exibição. Em alguns métodos, a triagem é realizada determinando a ligação dos anticorpos a um fragmento de TTR que consiste nos resíduos 101-109 de TTR. Em alguns métodos, a triagem é realizada determinando a ligação dos membros da biblioteca ao TTR na presença de um anticorpo de referência, que se liga a um epítopo nos resíduos 101-109 de TTR. Em alguns métodos, o anticorpo de referência é 18C5.

[0054] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para identificar um anticorpo que compete pela ligação com o anticorpo 18C5 pela ligação ao TTR, compreendendo o contato de TTR com o anticorpo na presença e ausência do anticorpo 18C5 e a determinação da ligação do anticorpo a TTR, em que a diminuição da ligação na presença do anticorpo 18C5 indica que o anticorpo compete com o anticorpo 18C5 pela ligação a TTR.

[0055] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para identificar um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo 18C5 em TTR, compreendendo: (a) determinar o epítopo ligado pelo anticorpo 18C5 em TTR; (b) imunizar um animal com TTR ou um fragmento deste; e (c) triar anticorpos induzidos para identificar um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo 18C5. Em alguns métodos, o epítopo ligado ao anticorpo 18C5 na TTR é determinado pela mutagênese da TTR. Em alguns métodos, o epítopo ligado ao anticorpo 18C5 em TTR é determinado por cristalografia de raios-X.

[0056] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para identificar um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo 18C5 em TTR, compreendendo: (a) determinar o epítopo ligado pelo anticorpo 18C5 em TTR; (b) fornecer uma biblioteca de exibição de anticorpos; e (c) triar a biblioteca de exibição para identificar um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo 18C5. Em alguns métodos, o epítopo ligado ao anticorpo 18C5 na TTR é determinado pela mutagênese da TTR. Em alguns métodos, o epítopo ligado ao anticorpo 18C5 em TTR é determinado por cristalografia de raios-X. Em alguns métodos, a biblioteca de exibição exibe anticorpos como fragmentos de Fv. Em alguns métodos, a biblioteca de exibição é uma biblioteca de exibição não exposta. Em alguns métodos, a biblioteca de exibição é produzida imunizando um roedor com TTR ou um fragmento deste e clonando ácidos nucleicos que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpos em um vetor de exibição. Em alguns métodos, a triagem é realizada determinando a ligação dos anticorpos a um fragmento de TTR que consiste nos resíduos 101-109. Em alguns métodos, a triagem é realizada determinando a ligação dos membros da biblioteca ao TTR na presença de um anticorpo de referência, que se liga a um epítopo nos resíduos 101-109 de TTR. Em alguns métodos, o anticorpo de referência é 18C5. Em alguns métodos, cada membro da biblioteca de exibição exibe a mesma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada diferente. Em alguns métodos, a região variável da cadeia leve é a região variável de cadeia leve do anticorpo 18C5. Em alguns métodos, a região variável da cadeia pesada é obtida a partir de uma biblioteca de regiões variáveis da cadeia pesada humana reorganizadas. Em alguns métodos, cada membro da biblioteca de exibição exibe a mesma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve diferente. Em alguns métodos, a região variável de cadeia pesada é a região variável de cadeia pesada do anticorpo 18C5. Em alguns métodos, a região variável de cadeia leve é obtida a partir de uma biblioteca de regiões variáveis de cadeia leve humana reorganizadas.

[0057] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para tratar ou efetuar a profilaxia de uma amiloidose mediada por transtirretina em um sujeito, compreendendo a administração de um imunógeno compreendendo um peptídeo da TTR de até 20 aminoácidos contíguos da TTR aos quais o anticorpo 18C5 se liga especificamente, em que o peptídeo, isolado e/ou quando ligado a um carreador heterólogo, induz a formação de anticorpos que se ligam especificamente a TTR no sujeito.

[0058] Em alguns métodos, o imunógeno compreende um epítopo ao qual o anticorpo 18C5 se liga especificamente. Em alguns métodos, o imunógeno compreende um peptídeo TTR de até 20 aminoácidos contíguos dos resíduos 89- 127 de TTR. Em alguns métodos, o imunógeno compreende um peptídeo TTR de até 11 aminoácidos contíguos dos resíduos 100-110 de TTR. Em alguns métodos, o imunógeno compreende um peptídeo de TTR de até 9 aminoácidos contíguos dos resíduos 101-109 de TTR.

[0059] Em alguns métodos, o epítopo peptídico da TTR consiste em 4-11 aminoácidos contíguos dos resíduos 89-127 de TTR. Em alguns métodos, o epítopo peptídico de TTR consiste em 4-11 aminoácidos contíguos dos resíduos 100-110 de TTR. Em alguns métodos, o epítopo peptídico de TTR consiste em 4-9 aminoácidos contíguos dos resíduos 101-109 de TTR.

[0060] Em outro aspecto, a invenção fornece um imunógeno compreendendo um peptídeo da TTR de até 20 aminoácidos contíguos dos resíduos 89-127 da TTR ligados a um carreador heterólogo que ajuda a extrair anticorpos contra o peptídeo da TTR.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0061] A FIG. 1 mostra os resultados de um experimento de Western blot mostrando que 18C5 tem forte reatividade em relação ao monômero TTR desnaturado, menor reatividade em relação ao dímero desnaturado e reatividade muito fraca em relação às espécies nativas de TTR.

[0062] A FIG. 2 mostra os resultados de um experimento de Western blot mostrando que um anticorpo TTR comercial não pode distinguir entre TTR nativo versus desnaturado e mostrou reatividade muito forte em relação à TTR nativa e desnaturada monomérica e dimérica.

[0063] A FIG. 3 representa um alinhamento de regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo 18C5 de camundongo (SEQ ID NO: 81), sequência da linhagem germinativa humana IGHV3-48*01 (SEQ ID NO:84), aceitador humano 5VZY-VH_huFrwk (Crenefab-VH) (SEQ ID NO:83) e versões humanizadas do anticorpo 18C5 (hu18C5_VH-v1 and hu18C5_VH-v2, SEQ ID NOs: 84 e 85, respectivamente). As CDRs definidas de acordo com o composto Kabat/Chothia estão em negrito na sequência da região variável da cadeia pesada 18C5 do camundongo.

[0064] A FIG. 4 representa um alinhamento de regiões variáveis da cadeia leve do anticorpo 18C5 de camundongo (SEQ ID NO:87), sequência de linhagem germinativa humana IGKV2-30*02 (SEQ ID NO:90), aceitador humano 5VZY- VL_huFrwk (Crenefab-VL) (SEQ ID NO:89)e versões humanizadas do anticorpo 18C5 (hu18C5-VL-v1 e hu18C5-VL-v2, SEQ ID NOs: 91 e 92, respectivamente). As CDRs definidas de acordo com o composto Kabat/Chothia estão em negrito na sequência da região variável da cadeia leve 18C5 do camundongo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[0065] A SEQ ID NO:1 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada do anticorpo 18C5 de camundongo com peptídeo sinal.

[0066] A SEQ ID NO: 2 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região variável da cadeia pesada do anticorpo 18C5 de camundongo com peptídeo sinal.

[0067] A SEQ ID NO: 3 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia leve do anticorpo 18C5 de camundongo com peptídeo sinal.

[0068] A SEQ ID NO:4 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região variável da cadeia leve do anticorpo 18C5 de camundongo com peptídeo sinal.

[0069] A SEQ ID NO:5 apresenta a sequência de aminoácidos de um CDR- H1 do Composto Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0070] A SEQ ID NO:6 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-H1 do Composto de Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0071] A SEQ ID NO:7 apresenta a sequência de aminoácidos de um CDR- H2 do Composto Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0072] A SEQ ID NO:8 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-H2 do Composto de Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0073] A SEQ ID NO:9 apresenta a sequência de aminoácidos de um CDR- H3 do Composto Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0074] A SEQ ID NO:10 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-H3 do Composto de Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0075] A SEQ ID NO:11 apresenta a sequência de aminoácidos de um CDR-L1 do Composto Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0076] A SEQ ID NO:12 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-L1 do Composto de Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0077] A SEQ ID NO:13 apresenta a sequência de aminoácidos de um CDR-L2 do Composto Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0078] A SEQ ID NO:14 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-L2 do Composto de Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0079] A SEQ ID NO:15 apresenta a sequência de aminoácidos de um

CDR-L3 do Composto Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0080] A SEQ ID NO:16 apresenta a sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-L3 do Composto de Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0081] A SEQ ID NO:17 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada de 18C5 quimérica (IgG1 humana).

[0082] A SEQ ID NO:18 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada de 18C5 quimérica (IgG1 humana).

[0083] A SEQ ID NO:19 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia leve de 18C5 quimérica (kappa humana).

[0084] A SEQ ID NO:20 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia leve de 18C5 quimérica (kappa humana).

[0085] A SEQ ID NO: 21 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia pesada humana de IgG1 exemplificativa.

[0086] A SEQ ID NO:22 estabelece a sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia pesada humana de IgG1 G1m3 exemplificativa.

[0087] A SEQ ID NO:23 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia pesada humana de IgG1 G1m3 exemplificativa.

[0088] A SEQ ID NO:24 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia leve exemplificativa com Arginina N-terminal.

[0089] A SEQ ID NO: 25 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia leve de kappa humana exemplificativa sem Arginina N- terminal.

[0090] A SEQ ID NO:26 apresenta a sequência de aminoácidos da transtirretina humana estabelecida no número de acesso P02766.1 (UniProt).

[0091] A SEQ ID NO:27 apresenta a sequência de aminoácidos da transtirretina humana estabelecida no número de acesso AAB35639.1 (GenBank).

[0092] A SEQ ID NO:28 apresenta a sequência de aminoácidos da transtirretina humana estabelecida no número de acesso AAB35640.1 (GenBank).

[0093] A SEQ ID NO: 29 apresenta a sequência de aminoácidos da transtirretina humana estabelecida no número de acesso e ABI63351.1 (GenBank).

[0094] A SEQ ID NO:30 apresenta a sequência de aminoácidos dos resíduos 101-109 da transtirretina humana.

[0095] A SEQ ID NO:31 apresenta a sequência de aminoácidos dos resíduos 87-127 da transtirretina humana.

[0096] A SEQ ID NO: 32 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região constante de cadeia pesada de IgG1 G1m3 exemplificativa.

[0097] A SEQ ID NO:33 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região constante de cadeia leve exemplificativa com Arginina C- terminal.

[0098] A SEQ ID NO:34 apresenta a sequência de ácidos nucleicos de uma região constante de cadeia leve de kappa humana exemplificativa sem Arginina C- terminal.

[0099] A SEQ ID NO:35 apresenta a sequência de aminoácidos de um peptídeo sinal de região constante de cadeia pesada.

[0100] A SEQ ID NO: 36 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo sinal de região constante de cadeia pesada.

[0101] A SEQ ID NO: 37 apresenta a sequência de aminoácidos de um peptídeo sinal de região constante de cadeia leve.

[0102] A SEQ ID NO: 38 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo sinal de região constante de cadeia leve.

[0103] A SEQ ID NO: 39 apresenta a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-H1 do anticorpo 14G8.

[0104] A SEQ ID NO: 40 apresenta a sequência de aminoácidos de uma Kabat CDR- H2 do anticorpo 14G8.

[0105] A SEQ ID NO: 41 apresenta a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-H 3 do anticorpo 14G8.

[0106] A SEQ ID NO: 42 apresenta a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-L1 do anticorpo 14G8.

[0107] A SEQ ID NO: 43 apresenta a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-L2 do anticorpo 14G8.

[0108] A SEQ ID NO: 44 apresenta a sequência de aminoácidos de Kabat

CDR-L3 do anticorpo 14G8.

[0109] ASEQ ID NO: 45 apresenta a sequência de aminoácidos de um epítopo do anticorpo 5A1.

[0110] A SEQ ID NO: 46 apresentaa sequência de aminoácidos de Kabat CDR-H1 do anticorpo 5A1.

[0111] A SEQ ID NO: 47 apresenta a sequência de aminoácidos de uma Kabat CDR- H2 do anticorpo 5A1.

[0112] A SEQ ID NO: 48 apresenta a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-H3 do anticorpo 5A1.

[0113] A SEQ ID NO: 49 apresentaa sequência de aminoácidos de Kabat CDR-L1 do anticorpo 5A1.

[0114] A SEQ ID NO: 50 apresentaa sequência de aminoácidos de Kabat CDR-L2 do anticorpo 5A1.

[0115] A SEQ ID NO: 51 apresenta a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-L3 do anticorpo 5A1.

[0116] A SEQ ID NO: 52 apresentaa sequência de aminoácidos de Kabat CDR-H1 do anticorpo 6C1.

[0117] A SEQ ID NO: 53 apresenta a sequência de aminoácidos de Kabat CDR- H2 do anticorpo 6C1.

[0118] A SEQ ID NO: 54 apresenta a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-H3 do anticorpo 6C1.

[0119] A SEQ ID NO: 55 apresenta a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-L1 do anticorpo 6C1.

[0120] A SEQ ID NO: 56 apresenta a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-L2 do anticorpo 6C1.

[0121] A SEQ ID NO: 57 apresenta a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-L3 do anticorpo 6C1.

[0122] A SEQ ID NO: 58 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região VH do anticorpo AD7F6.

[0123] A SEQ ID NO: 59 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região VL do anticorpo AD7F6.

[0124] A SEQ ID NO: 60 apresenta a sequência de aminoácidos de uma

CDR-H1 do anticorpo RT24.

[0125] A SEQ ID NO: 61 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-H2 do anticorpo RT24.

[0126] A SEQ ID NO: 62 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-H3 do anticorpo RT24.

[0127] A SEQ ID NO: 63 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-L1 do anticorpo RT24.

[0128] A SEQ ID NO: 64 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-L2 do anticorpo RT24.

[0129] A SEQ ID NO: 65 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-L3 do anticorpo RT24.

[0130] A SEQ ID NO: 66 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-H1 do anticorpo NI-301.35G11.

[0131] A SEQ ID NO: 67 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-H2 do anticorpo NI-301.35G11.

[0132] A SEQ ID NO: 68 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-H3 do anticorpo NI-301.35G11.

[0133] A SEQ ID NO: 69 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-L1 do anticorpo NI- 301.35G11.

[0134] A SEQ ID NO: 70 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-L2 do anticorpo NI-301.35G11.

[0135] A SEQ ID NO: 71 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-L3 do anticorpo NI-301.35G11.

[0136] A SEQ ID NO: 72 apresenta a sequência de aminoácidos de um epítopo dos anticorpos MFD101, MDF102, MFD103, MFD105.

[0137] A SEQ ID NO: 73 apresenta a sequência de aminoácidos de um epítopo dos anticorpos MFD107, MFD108, MFD109, MFD111.

[0138] A SEQ ID NO: 74 apresenta a sequência de aminoácidos de um epítopo do anticorpo MFD114.

[0139] A SEQ ID NO: 75 apresentaa sequência de aminoácidos de Kabat CDR-H1 do anticorpo 9D5.

[0140] A SEQ ID NO: 76 apresenta a sequência de aminoácidos de Kabat

CDR-H2 do anticorpo 9D5.

[0141] A SEQ ID NO: 77 apresenta a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-H3 do anticorpo 9D5.

[0142] A SEQ ID NO: 78 apresentaa sequência de aminoácidos de Kabat CDR-L1 do anticorpo 9D5.

[0143] A SEQ ID NO: 79 apresentaa sequência de aminoácidos de Kabat CDR-L2 do anticorpo 9D5.

[0144] A SEQ ID NO: 80 apresenta a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-L3 do anticorpo 9D5.

[0145] A SEQ ID NO:81 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada madura do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0146] A SEQ ID NO: 82 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada do anticorpo murino anti-piroglutamato-Abeta Fab c#17, Acesso GenBank 1212215935.

[0147] A SEQ ID NO: 83 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada de Crenezumab Fab (CreneFab) humanizado PDB: 5VZY, Acesso GenBank 1229749875.

[0148] A SEQ ID NO: 84 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada da sequência da linhagem germinativa humana IGHV3-48*01, Acesso GenBank Nº 1FN550289.1.

[0149] A SEQ ID NO: 85 apresenta a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado 18C5 hu18C5-VH_1.

[0150] A SEQ ID NO: 86 apresenta a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado 18C5 hu18C5-VH_2.

[0151] A SEQ ID NO:87 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia leve madura do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0152] A SEQ ID NO: 88 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia leve do anticorpo murino anti-piroglutamato-Abeta Fab c#17, Acesso GenBank Nº 1212215934.

[0153] A SEQ ID NO: 89 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia leve de Crenezumab Fab humanizado (CreneFab) PDB: 5VZY, Acesso GenBank Nº 1229749876.

[0154] A SEQ ID NO: 90 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia leve da sequência da linhagem germinativa humana IGKV2-30*2, Acesso GenBank Nº CAA77315.

[0155] A SEQ ID NO: 91 apresenta a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo humanizado 18C5 hu18C5-VL_1.

[0156] A SEQ ID NO: 92 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia leve do anticorpo humanizado 18C5 hu18C5-VL_2.

[0157] A SEQ ID NO: 93 apresenta a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-H1 do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0158] A SEQ ID NO: 94 apresenta a sequência de aminoácidos de Chothia CDR-H1 do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0159] A SEQ ID NO: 95 apresenta a sequência de aminoácidos de Contact CDR-H1 do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0160] A SEQ ID NO: 96 apresenta a sequência de aminoácidos de Chothia CDR-H2 do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0161] A SEQ ID NO: 97 apresenta a sequência de aminoácidos de AbM CDR-H2 do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0162] A SEQ ID NO: 98 apresenta a sequência de aminoácidos de Contact CDR-H2 do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0163] A SEQ ID NO: 99 apresenta a sequência de aminoácidos de Contact CDR-H3 do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0164] A SEQ ID NO: 100 apresenta a sequência de aminoácidos de Contact CDR-L1 do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0165] A SEQ ID NO: 101 apresenta a sequência de aminoácidos de Contact CDR-L2 do anticorpo 18C5 de camundongo.

[0166] A SEQ ID NO: 102 apresenta a sequência de aminoácidos de Contact CDR-L3 do anticorpo 18C5 de camundongo.

DEFINIÇÕES

[0167] Anticorpos monoclonais ou outras entidades biológicas são tipicamente fornecidos em forma isolada. Isto significa que um anticorpo ou outra entidade biológica é tipicamente pelo menos 50% peso/peso puro de proteínas interferentes e outros contaminantes decorrentes da sua produção ou purificação,

mas isto não exclui a possibilidade de que o anticorpo monoclonal seja combinado com um excesso de carreador farmaceuticamente aceitável ou outro veículo destinado a facilitar o seu uso. Por vezes, os anticorpos monoclonais são, pelo menos, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% em peso/peso puros de proteínas e outras macromoléculas de produção ou purificação. Muitas vezes, um anticorpo monoclonal isolado ou outra entidade biológica é a espécie macromolecular predominante que permanece após a sua purificação.

[0168] A ligação específica de um anticorpo monoclonal ao seu antígeno alvo significa uma afinidade de pelo menos 106, 107, 108, 109 ou 1010 M-1. A ligação específica é detectavelmente maior em magnitude e distinta da ligação não específica que ocorre a pelo menos um alvo não relacionado. A ligação específica pode ser o resultado da formação de ligações entre grupos funcionais específicos ou ajuste espacial particular (por exemplo, tipo de fechadura e chave), enquanto a ligação não específica é geralmente o resultado de forças de van der Waals. No entanto, a ligação específica não implica necessariamente que um anticorpo se ligue a um e apenas um alvo.

[0169] A unidade estrutural básica do anticorpo é um tetrâmero de subunidades. Cada tetrâmero inclui dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa). A porção amino terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno. Esta região variável é inicialmente expressa ligada a um peptídeo sinal clivável. A região variável sem peptídeo sinal é por vezes referida como uma região variável madura. Assim, por exemplo, uma região variável madura da cadeia leve significa uma região variável da cadeia leve sem o peptídeo sinal da cadeia leve. A porção carboxi-terminal de cada cadeia define uma região constante essencialmente responsável pela função efetora.

[0170] As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon e definem o isotipo do anticorpo como IgG como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo também uma região "D" de cerca de 10 aminoácidos ou mais. Ver, em geral, Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2ª ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7 (incorporado por referência na sua totalidade para todos os fins).

[0171] Uma região variável de cadeia leve ou pesada de imunoglobulina (também referida neste documento como um "domínio variável de cadeia leve" ("domínio VL"), respectivamente) consiste em uma região de "framework" interrompida por três “regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs”. As regiões de framework servem para alinhar as CDRs para ligação específica a um epítopo de um antígeno. As CDRs incluem os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são principalmente responsáveis pela ligação ao antígeno. Do terminal amino ao terminal carboxil, os domínios VL e VH compreendem as seguintes regiões de framework (FR) e CDR: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As CDRs 1, 2 e 3 de um domínio VL são também referidas neste documento, respectivamente, como CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3; As CDR 1, 2 e 3 de um domínio VH são também referidas neste documento, respectivamente, como CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3.

[0172] A atribuição de aminoácidos a cada domínio VL e VH está de acordo com qualquer definição convencional de CDRs. As definições convencionais incluem, a definição de Kabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 e 1991), a definição de Chothia (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; et al., Nature 342:878- 883, 1989); um composto de CDR de Chothia Kabat em que CDR-H1 é um composto de CDRs de Chothia e Kabat; a definição de AbM usada pelo software de modelagem de anticorpos da Oxford Molecular; e a definição de Contact de Martin et al (bioinfo.org.uk/abs) (vide Tabela 1). O Kabat fornece uma convenção de numeração amplamente usada (numeração de Kabat) na qual os resíduos correspondentes entre cadeias pesadas diferentes ou entre cadeias leves diferentes recebem o mesmo número. Quando se diz que um anticorpo compreende CDRs por uma certa definição de CDRs (por exemplo, Kabat), essa definição especifica o número mínimo de resíduos de CDR presentes no anticorpo (isto é, as CDRs de Kabat). Isto não exclui que outros resíduos que caem dentro de outra definição convencional de CDR, mas fora da definição especificada,

também estejam presentes. Por exemplo, um anticorpo compreendendo CDRs definidas por Kabat inclui, entre outras possibilidades, um anticorpo no qual as CDRs contenham resíduos de CDR de Kabat e nenhum outro resíduo de CDR, e um anticorpo no qual CDR-H1 é uma CDR-H1 de Compósito de Chothia-Kabat e outras CDRs contenham resíduos de CDR de Kabat e nenhum resíduo adicional de CDR com base em outras definições.

Tabela 1 Definições convencionais de CDRs usando numeração de Kabat Composto de Chothia Alça Kabat Chothia AbM Contact & Kabat L1 L24--L34 L24--L34 L24--L34 L24--L34 L30--L36 L2 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L46--L55 L3 L89--L97 L89--L97 L89--L97 L89--L97 L89--L96 H26-- H1 H31--H35B H26--H35B* H26--H35B H30--H35B H32..H34* H2 H50--H65 H52--H56 H50--H65 H50--H58 H47--H58 H3 H95--H102 H95--H102 H95--H102 H95--H102 H93--H101 *CDR-H1 por Chothia pode terminar em H32, H33 ou H34 (dependendo do comprimento da alça). Isto ocorre porque o esquema de numeração de Kabat coloca inserções de resíduos extras em 35A e 35B, enquanto a numeração de Chothia os coloca em 31A e 31B. Se nem H35A nem H35B (numeração de Kabat) estiverem presentes, a alça CDR-H1 de Chothia termina em H32. Se apenas H35A estiver presente, termina em H33. Se ambas H35A e H35B estiverem presentes, terminará em H34.

[0173] O termo "anticorpo" inclui anticorpos intactos e fragmentos de ligação do mesmo. Tipicamente, os fragmentos competem com o anticorpo intacto a partir do qual foram derivados para ligação específica ao alvo incluindo cadeias pesadas separadas, cadeias leves Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, Dabs, nanocorpos e Fv. Os fragmentos podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante, ou por separação enzimática ou química de imunoglobulinas intactas. O termo "anticorpo" também inclui um anticorpo biespecífico e/ou um anticorpo humanizado. Um anticorpo bi-específico ou bi-funcional é um anticorpo híbrido artificial que tem dois diferentes pares de cadeia pesada/leve e dois sítios de ligação diferentes (ver por exemplo, Songsivilai e Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)). Em alguns anticorpos biespecíficos, os dois pares de cadeia pesada/leves diferentes incluem um par de cadeia pesada/cadeia leve humanizada 18C5 e um par de cadeia de cadeia pesada/leve específico para um epítopo diferente em transtirretina daquele ligado por 18C5.

[0174] Em alguns anticorpos biespecíficos, um par de cadeia pesada/cadeia leve é um anticorpo 18C5 humanizado como descrito adicionalmente abaixo e o outro par de cadeia pesada/cadeia leve é de um anticorpo que se liga a um receptor expresso na barreira hematoencefálica, tal como um receptor de insulina, um receptor de fator de crescimento semelhante a insulina(IGF), um receptor de leptina, ou um receptor de lipoproteína, ou um receptor de transferrina (Friden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4771-4775, 1991; Friden et al., Science 259:373- 377, 1993). Tal anticorpo biespecífico pode ser transferido através da barreira sanguínea do cérebro por transcitose mediada por receptor. A captação cerebral do anticorpo biespecífico pode ser ainda melhorada através da manipulação do anticorpo biespecífico para reduzir sua afinidade com o receptor da barreira hematoencefálica no sangue. Afinidade reduzida para o receptor resultou numa distribuição mais ampla no cérebro (ver por exemplo, Atwal et al., Sci. Trans. Med. 3, 84ra43, 2011; Yu et al., Sci. Trans. Med. 3, 84ra44, 2011).

[0175] Anticorpos bispecíficos exemplificativos também podem ser: (1) um anticorpo dual-variável-domínio (DVD-Ig), onde cada cadeia leve e pesada corrente contém dois domínios variáveis em conjunto através de uma ligação de peptídeo curta (Wu et al, Generation and Characterization of a Dual Variable Domain

Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (2) um Tandab, que é uma fusão de dois diacorpos de cadeia única, resultando em um anticorpo bispecífico tetravalente que possui dois sítios de ligação para cada um dos antígenos alvo; (3) um flexicorpo, que é uma combinação de scFvs com um diacorpo, resultando em uma molécula multivalente; (4) uma molécula chamada de "encaixar e travar", baseado na "dimerização e encaixe de domínio" na Proteína Quinase A, que, quando aplicado a Fabs, pode produzir uma proteína bispecífica trivalente consistindo de dois fragmentos Fab idênticos, ligados a um fragmento Fab diferente; ou (5) uma molécula chamada de Scorpion, compreendendo, por exemplo, dois scFvs fundidos para ambos terminais de uma região Fc humana. Exemplos de plataformas úteis para a preparação de anticorpos biespecíficos incluem BiTE (Micromet), DART (MacroGenics), Fcab e Mab2 (F- star), IgGl manipulada por Fc (Xencor) ou DuoBody (baseado em troca de braços Fab, Genmab).

[0176] O termo "epítopo" se refere ao sítio em um antígeno ao qual um anticorpo se liga. Um epítopo pode ser formado a partir de aminoácidos contínuos ou aminoácidos não contínuos justapostos por dobragem terciária de uma ou mais proteínas. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos (também conhecidos como epítopos lineares) são tipicamente retidos por exposição a solventes desnaturantes enquanto que os epítopos formados por dobragem terciária (também conhecidos como epítopos conformacionais) são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3, e mais geralmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em uma única conformação espacial. Os métodos de determinação da conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear bidimensional. Verpor exemplo, Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996). O epítopo pode ser linear, como um epítopo de, por exemplo, 2-5, 3-5, 3-9 ou 5-9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 26, incluindo, por exemplo, dois ou mais aminoácidos contíguos ácidos dentro dos resíduos 101-109 da região madura de SEQ ID NO:

26. O epítopo também pode ser um epítopo conformacional incluindo, por exemplo, dois ou mais segmentos não contíguos de aminoácidos dentro dos resíduos 101-

109 da região madura da SEQ ID NO: 26. Se diz que um anticorpo se liga a um epítopo dentro dos resíduos de aminoácidos 101-109 da transtirretina (TTR) (a região madura da SEQ ID NO: 26), por exemplo, o que se quer dizer é que o epítopo está dentro do intervalo recitado de aminoácidos, incluindo aqueles que definem os limites externos da faixa. Isso não significa necessariamente que todo aminoácido dentro da faixa constitui parte do epítopo. Assim, por exemplo, um epítopo dentro dos resíduos de aminoácidos 101-109 de TTR pode consistir nos aminoácidos 101- 109, 101-108, 102-109, 101-107, 102-108, 103-109, 101-106, 102-107, 103-108, 104-109, 101-105, 102-106, 103-107, 104-108, 105-109, 101-104, 102-105, 103- 106, 104-107, 105-108, 106-109, 101-103, 102-104, 103-105, 104-106, 105-107, 106-108, 107-109, 101-102, 102-103, 103-104, 104-105, 105-106, 106-107, 107- 108 ou 108-109 da SEQ ID NO:26, entre outros segmentos lineares da SEQ ID NO:30, ou no caso de epítopos conformacionais, segmentos contíguos de aminoácidos de SEQ ID NO:30.

[0177] Os anticorpos que reconhecem os epítopos iguais ou sobrepostos podem ser identificados num imunoensaio simples mostrando a capacidade de um anticorpo competir com a ligação de outro anticorpo a um antígeno alvo. O epítopo de um anticorpo pode também ser definido cristalografia por raios X do anticorpo ligado ao seu antígeno para identificar resíduos de contato. Alternativamente, considera-se que dois anticorpos têm o mesmo epítopo se todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzirem ou eliminarem a ligação do outro. Dois anticorpos têm epítopos sobrepostos se algumas mutações de aminoácidos que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro.

[0178] A competição entre anticorpos é determinada por um ensaio em que um anticorpo em teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum (ver, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990). Um anticorpo de teste compete com um anticorpo de referência se um excesso de um anticorpo de teste (por exemplo, pelo menos 2x, 5x, 10x, 20x, ou 100x) inibe ou bloqueia a ligação do anticorpo de referência por, por exemplo, pelo menos 50% como medido em um ensaio de ligação competitiva. Alguns anticorpos de teste inibem a ligação do anticorpo de referência em pelo menos 75%, 90% ou

99%. Os anticorpos identificados pelo ensaio de competição (anticorpos de competição) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e anticorpos que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente próximo ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência para que o bloqueio estérico ocorra.

[0179] O termo "nativo" em relação à estrutura transtirretina (TTR) refere-se à estrutura dobrada normal da TTR em seu estado de funcionamento adequado (isto é, um tetrâmero TTR). Como a TTR é um tetrâmero em sua forma dobrada de forma nativa, as formas não nativas de TTR incluem, por exemplo, tetrâmeros de TTR dobrados incorretamente, monômeros de TTR, formas agregadas de TTR e formas fibrilas de TTR. As formas não nativas de TTR podem incluir moléculas compreendendo sequências ou mutações de aminoácidos de TTR do tipo selvagem.

[0180] O termo "dobrado incorretamente" em relação à TTR refere-se à estrutura secundária e terciária de um monômero ou multímero de polipeptídeo TTR e indica que o polipeptídeo adotou uma conformação que não é normal para essa proteína em seu estado de funcionamento adequado. Embora a dobragem incorreta da TTR possa ser causada por mutações na proteína (por exemplo, deleção, substituição ou adição), as proteínas TTR do tipo selvagem também podem ser dobradas incorretamente em doenças, expondo epítopos específicos.

[0181] O termo "farmaceuticamente aceitável" significa que o carreador, diluente, excipiente ou auxiliar compatível com os outros ingredientes da formulação e não substancialmente prejudicial para o receptor do mesmo.

[0182] O termo “paciente” inclui humanos e outros mamíferos que recebem tratamento profilático ou terapêutico.

[0183] Um indivíduo está em risco aumentado de uma doença se o indivíduo tiver pelo menos um fator de risco conhecido (por exemplo, genética, bioquímica, história familiar e exposição situacional) colocando os indivíduos com esse fator de risco em um risco estatisticamente significativo maior de desenvolver a doença do que indivíduos sem o fator de risco.

[0184] O termo “amostra biológica” refere-se a uma amostra de material biológico dentro ou obtenível de uma fonte biológica, por exemplo, um sujeito humano ou mamífero. Tais amostras podem ser órgãos, organelas, tecidos, seções de tecidos, fluidos corporais, sangue periférico, plasma sanguíneo, soro sanguíneo, células, moléculas tais como proteínas e peptídeos, e quaisquer partes ou combinações derivadas dos mesmos. O termo amostra biológica também pode abranger qualquer material derivado do processamento da amostra. O material derivado pode incluir células ou sua progênie. O processamento da amostra biológica pode envolver uma ou mais filtrações, destilações, extrações, concentrações, fixação, inativação de componentes interferentes e semelhantes.

[0185] O termo "amostra de controle" refere-se a uma amostra biológica desconhecida ou suspeita de incluir formas monoméricas, dobradas, agregadas ou fibrilas de transtirretina (TTR), como em depósitos amiloides de TTR. As amostras de controle podem ser obtidas de indivíduos não afetados por uma amiloidose por TTR ou por um tipo de amiloidose por TTR especificamente escolhido. Alternativamente, podem ser obtidas amostras de controle de pacientes afetados com amiloidose por TTR ou um tipo de amiloidose por TTR especificamente escolhido. Essas amostras podem ser obtidas ao mesmo tempo que uma amostra biológica que se pensa compreender a amiloidose de TTR ou em uma ocasião diferente. Uma amostra biológica e uma amostra de controle podem ser obtidas do mesmo tecido (por exemplo, uma seção de tecido contendo depósitos de amiloide de TTR e tecido normal circundante). Preferencialmente, as amostras de controle consistem essencialmente ou inteiramente de tecido livre de depósitos amiloides TTR e podem ser usadas em comparação com uma amostra biológica que se pensa compreender depósitos amiloides de TTR. Preferencialmente, o tecido na amostra de controle é do mesmo tipo que o tecido da amostra biológica (por exemplo, cardiomiócitos no coração).

[0186] O termo “doença” refere-se a qualquer condição anormal que prejudique a função fisiológica. O termo é usado amplamente para abranger qualquer distúrbio, doença, anormalidade, patologia, doença, condição ou síndrome em que a função fisiológica é prejudicada, independentemente da natureza da etiologia.

[0187] O termo "sintoma" refere-se a uma evidência subjetiva de uma doença, como marcha alterada, como perceptível por um sujeito. Um "sinal" refere-

se à evidência objetiva de uma doença, conforme observado por um médico.

[0188] Para efeitos de classificação de substituições de aminoácidos como conservadoras ou não conservadoras, os aminoácidos são agrupados da seguinte forma: Grupo I (cadeias laterais hidrofóbicas): met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadeias hidrofílicas laterais neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadeias laterais ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadeias laterais básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (resíduos que influenciam a orientação da cadeia): gly, pro; e Grupo VI (cadeias laterais aromáticas): trp, tyr, phe. As substituições conservadoras envolvem substituições entre aminoácidos na mesma classe. As substituições não conservadoras constituem a troca de um membro de uma destas classes por um membro de outra.

[0189] Identidades de sequência percentual são determinadas com sequências de anticorpo alinhadas ao máximo pela convenção de numeração de Kabat. Após o alinhamento, se uma região de anticorpo do sujeito (por exemplo, toda a região variável madura de uma cadeia pesada ou leve) está sendo comparada com a mesma região de um anticorpo de referência, a identidade de sequência percentual entre as regiões de anticorpos do sujeito e de referência é o número de posições ocupadas pelo mesmo aminoácido na região, tanto do sujeito quanto do anticorpo de referência, dividida pelo número total de posições alinhadas das duas regiões, com lacunas não contadas, multiplicado por 100 para converter em percentagem.

[0190] Composições ou métodos que "compreendem" ou "incluem" um ou mais elementos recitados podem incluir outros elementos não especificamente recitados. Por exemplo, uma composição que "compreende" ou "inclui" o anticorpo pode conter o anticorpo por si só ou em combinação com outros ingredientes.

[0191] A designação de um intervalo de valores inclui todos os inteiros dentro ou definindo o intervalo e todos os sub-intervalos definidos por números inteiros dentro do intervalo.

[0192] Salvo quando o contrário fica aparente pelo contexto, o termo "cerca de" inclui valores dentro de uma margem normal de erro de medida ( por exemplo, SEM) de um valor declarado.

[0193] A significância estatística significa p0,05.

[0194] Os anticorpos da invenção podem ser administrados concomitantemente com outro tratamento para a mesma indicação que o anticorpo, o que significa que o outro tratamento é administrado pelo menos uma vez durante o período em que o anticorpo é administrado, período que começa um mês antes do primeiro dosagem e terminando um mês após a última dosagem do anticorpo. O outro tratamento pode ser administrado em intervalos recorrentes durante esse período, que pode ou não ser o mesmo que o intervalo em que o anticorpo é administrado. O outro tratamento pode ser um tratamento sintomático.

[0195] Um tratamento é sintomático se afetar apenas um ou mais sintomas de uma doença, não sua causa, ou seja, sua etiologia.

[0196] As formas singulares dos artigos “uma”, “um” e “a/o” incluem suas referências no plural, a menos que o contexto claramente dite de outra forma. Por exemplo, o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas dos mesmos. Salvo disposição em contrário do contexto quando o relatório descritivo divulga que um produto ou método compreende um determinado recurso ou combinação de recursos, deve ser entendido que o relatório descritivo está divulgando, de maneira alternativa, o produto ou método que consiste ou consiste essencialmente no recurso ou combinação de recursos.

DESCRIÇÃO DETALHADA I. Geral

[0197] A invenção fornece anticorpos que se ligam especificamente aos resíduos 101-109 de transtiretina (TTR). Alguns anticorpos ligam-se a qualquer uma ou todas as formas monoméricas, dobradas, agregadas ou fibrilas de TTR, preferencialmente em relação à forma tetramérica nativa de TTR. Alguns anticorpos ligam-se a uma ou a ambas as formas monoméricas ou dobradas de TTR, preferencialmente em relação à forma tetramérica nativa de TTR. Os anticorpos podem ser utilizados para tratar ou efetuar a profilaxia de doenças ou distúrbios associados ao acúmulo de TTR ou acúmulo de depósitos de TTR (por exemplo, amiloidose por TTR). Os anticorpos também podem ser utilizados para diagnosticar amiloidose por TTR e inibir ou reduzir a agregação de TTR. Os anticorpos também podem ser utilizados para demonstrar os efeitos farmacodinâmicos de uma terapia de amiloidose mediada por transtirretina, entre outros pedidos. Ligação preferencial significa uma constante de associação pelo menos cinco vezes mais alta para qualquer uma ou todas as formas monoméricas, dobradas, agregadas ou fibrilas de TTR do que para a forma tetramérica nativa de TTR. Opcionalmente, a constante de associação é pelo menos dez vezes maior para qualquer uma ou todas as formas monoméricas, dobradas, agregadas ou fibrilas de TTR do que para a forma tetramérica nativa de TTR. Opcionalmente, o anticorpo, como 18C5, por exemplo, carece de ligação específica à forma tetramérica nativa de TTR. II. Moléculas Alvo

[0198] A Transtirretina (TTR) é uma proteína de transporte de 127 aminoácidos, soro de 55 kDa e líquido cefalorraquidiano sintetizada principalmente pelo fígado. Também foi referido como pré-albumina, pré-albumina de ligação à tiroxina, ATTR e TBPA. Em seu estado nativo, o TTR existe como um tetrâmero. Nos homozigotos, os tetrâmeros compreendem subunidades idênticas ricas em folhas beta de 127 aminoácidos. Nos heterozigotos, os tetrâmeros TTR são compostos de subunidades variantes e/ou de tipo selvagem, tipicamente combinadas de maneira estatística.

[0199] A função estabelecida da TTR no sangue é transportar a proteína de ligação ao holo -retinol. Embora a TTR seja o principal carreador de tiroxina (T4) no sangue de roedores, ao utilizar sítios de ligação ortogonais aos usados para a proteína de ligação ao holo-retinol, os sítios de ligação de T4 são efetivamente desocupados em humanos.

[0200] Pensa-se que a TTR é uma das pelo menos trinta proteínas humanas diferentes cuja dobra extracelular e/ou desmontagem (amiloidogênese) em um espectro de estruturas agregadas é pensada para causar doenças degenerativas referidas como doenças amiloides. A TTR sofre alterações conformacionais para se tornar amiloidogênico. A dissociação do tetrâmero TTR e o desdobramento parcial expõem expansões de resíduos hidrofóbicos em grande parte não carregados em uma conformação estendida que desmonta eficientemente em agregados esféricos em grande parte não estruturados que acabam por sofrer conversão de conformação em estruturas amiloides de folhas cruzadas.

[0201] Salvo indicação contrária do contexto, a referência à transtirretina

(TTR) ou aos seus fragmentos ou domínios inclui as sequências naturais de aminoácidos humanos incluindo isoformas, mutantes e variantes alélicas dos mesmos. As sequências de polipeptídeo TTR exemplares são designadas por Números de Acesso P02766.1 (UniProt) (SEQ ID NO: 26), AAB35639.1 (GenBank) (SEQ ID NO: 27), AAB35640.1 (GenBank) (SEQ ID NO: 28), e ABI63351.1 (GenBank) (SEQ ID NO: 29). Os resíduos são numerados de acordo com Swiss Prot P02766.1, com o primeiro aminoácido da proteína madura (ou seja, não incluindo a sequência sinal de 20 aminoácidos) designada como resíduo 1. Em qualquer outra proteína TTR, os resíduos são numerados de acordo com os resíduos correspondentes em P02766.1 no alinhamento máximo. III. Amiloidose por Transtirretina

[0202] A amiloidose por transtirretina (TTR) é um distúrbio sistêmico caracterizado por TTR patogênica e dobrada incorretamente e pela deposição extracelular de fibrilas amiloides compostas pela TTR. A amiloidose por TTR é geralmente causada pela desestabilização da forma nativa do tetrâmero de TTR (devido a condições ambientais ou genéticas), levando à dissociação, desdobramento e agregação da TTR em fibrilas amiloides que se acumulam em vários órgãos e tecidos, causando disfunção progressiva. Ver, por exemplo, Almeida e Saraiva, FEBS Letters 586:2891-2896 (2012); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013).

[0203] Nos seres humanos, os tetrâmeros TTR do tipo selvagem e os tetrâmeros mistos compostos por subunidades mutantes e do tipo selvagem podem dissociar, dobrar e agregar, com o processo de amiloidogênese, levando à degeneração do tecido afetado. Assim, as amiloidoses de TTR abrangem doenças causadas pela TTR patogênica dobrada incorretamente resultante de mutações na TTR ou resultantes de TTR dobrada incorretamente e não-mutada.

[0204] Por exemplo, amiloidose ATTR do tipo selvagem (também chamada amiloidose sistêmica senil ou SSA) e amiloidose cardíaca senil (SCA) são tipos de amiloidose relacionados à idade que resultam da deposição de amiloide TTR do tipo selvagem fora e dentro dos cardiomiócitos do coração. A amiloidose por TTR também é a forma mais comum de amiloidose hereditária (familiar), causada por mutações que desestabilizam a proteína TTR. As amiloidose TTR associadas a mutações pontuais no gene TTR incluem polineuropatia amiloide familiar (FAP), cardiomiopatia amiloide familiar (FAC) e a amiloidose seletiva rara do sistema nervoso central (CNSA). Pacientes com amiloidose de TTR hereditária (familiar) são quase sempre heterozigotos, o que significa que os tetrâmeros TTR são compostos por subunidades TTR mutantes e/ou selvagens, geralmente distribuídas estatisticamente. As versões hereditárias (familiares) da amiloidose pela TTR são geralmente autossômicas dominantes e geralmente são mais precoces que as doenças esporádicas (SSA e SCA).

[0205] Existem mais de 100 mutações no gene que codifica TTR que foram implicadas nos distúrbios autossômicos dominantes FAP e FAC. Ver, por exemplo,, US 2014/0056904; Saraiva, Hum. Mutat. 17(6):493-503 (2001); Damas e Saraiva, J. Struct. Biol. 130:290-299; Dwulet e Benson, Biochem. Biophys. Res. Commun. 114:657-662 (1983). Essas mutações causadoras de amiloide são distribuídas por toda a molécula de TTR. Geralmente, quanto mais desestabilizadoras forem as subunidades mutantes da estrutura do tetrâmero TTR, mais cedo será o início da doença amiloide. O potencial patogênico de uma variante de TTR é geralmente determinado por uma combinação de sua instabilidade e eficiência de secreção celular. A patologia inicial causada por algumas variantes do TTR provém da destruição seletiva do tecido cardíaco, enquanto a de outras variantes do TTR provém do comprometimento do sistema nervoso periférico e autônomo. O dano tecidual causado pela amiloidogênese do TTR parece originar-se amplamente da toxicidade de agregados pequenos e difusíveis de TTR, embora o acúmulo de amiloide extracelular possa contribuir e quase certamente comprometer a estrutura do órgão nos estágios finais da amiloidose de TTR.

[0206] A amiloidose de TTR se apresenta de muitas formas diferentes, com considerável variação fenotípica entre indivíduos e localizações geográficas. Por exemplo, a amiloidose de TTR pode se apresentar como uma neuropatia autonômica e motora sensorial axonal progressiva. A amiloidose por TTR também pode se apresentar como cardiomiopatia infiltrativa.

[0207] A idade de início dos sintomas relacionados à doença varia entre a segunda e a nona décadas de vida, com grandes variações entre diferentes populações. O envolvimento multissistêmico da amiloidose de TTR é uma pista para seu diagnóstico. Por exemplo, o diagnóstico de amiloidose de TTR é considerado quando um ou vários dos seguintes estão presentes: (1) história familiar de doença neuropática, especialmente associada a insuficiência cardíaca; (2) dor neuropática ou distúrbios sensoriais progressivos de etiologia desconhecida; (3) síndrome do túnel do carpo sem causa óbvia, particularmente se for bilateral e requer liberação cirúrgica; (4) distúrbios da motilidade gastrointestinal ou disfunção do nervo autônomo de etiologia desconhecida (por exemplo, disfunção erétil, hipotensão ortostática, bexiga neurogênica); (5) doença cardíaca caracterizada por paredes ventriculares engrossadas na ausência de hipertensão; (6) bloqueio atrioventricular avançado de origem desconhecida, particularmente quando acompanhado por um coração engrossado; e (6) inclusões do corpo vítreo do tipo algodão-lã. Ver Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). Outros sintomas podem incluir, por exemplo, polineuropatia, perda sensorial, dor, fraqueza nos membros inferiores, disidrose, diarreia, constipação, perda de peso e incontinência/retenção urinária.

[0208] O diagnóstico de amiloidose por TTR depende, geralmente, de biópsias de órgãos alvo, seguido de coloração histológica do tecido excisado com corante específico de amiloide, vermelho Congo. Se for observado um teste positivo para amiloide, a coloração imuno-histoquímica e a identificação espectroscópica de massa para TTR são realizadas subsequentemente para garantir que a proteína precursora responsável pela formação de amiloide seja de fato TTR. Os anticorpos divulgados neste documento são úteis para distinguir a amiloidose de TTR de uma amiloidose não-TTR, por exemplo, amiloidose de cadeia leve (AL) amiloide, também conhecida como amiloidose sistêmica primária. Para as formas familiares das doenças, a demonstração de uma mutação no gene que codifica TTR é então necessária antes que um diagnóstico possa ser feito. Isso pode ser realizado, por exemplo, por meio de eletroforese de foco isoelétrico, reação em cadeia da polimerase ou espectrometria de massa em dissecção a laser/cromatografia líquida em tandem. Ver, por exemplo, US 2014/0056904; Ruberg and Berk, Circulation 126:1286-1300 (2012); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). IV. Anticorpos A. Especificidade de Ligação e Propriedades Funcionais

[0209] A invenção fornece anticorpos monoclonais que se ligam à proteína transtirretina (TTR), mais especificamente, aos epítopos dentro dos resíduos de aminoácidos 101-109 (SEQ ID NO: 30) de TTR. Tais epítopos são enterrados no tetrâmero TTR nativo e expostos em formas monoméricas, dobradas de maneira errada, agregadas ou de fibrilas de TTR.

[0210] Um desses anticorpos é 18C5 e suas formas quiméricas, com superfície modificada e humanizadas. O anticorpo se liga especificamente aos resíduos de aminoácidos 101-109 (SEQ ID NO: 30) de TTR. Este anticorpo é adicionalmente caracterizado pela sua capacidade de se ligar a formas monoméricas, dobradas de maneira errada, agregadas ou de fibrilas de TTR, mas não a forma tetramérica nativa de TTR. A capacidade de se ligar a proteínas específicas ou fragmentos dos mesmos pode ser demonstrada usando formatos de ensaio exemplificativos fornecidos nos exemplos. A menos que seja de outro modo aparente no contexto, a referência a 18C5 deve ser entendida como referente a qualquer uma das formas humanizadas de camundongo, quiméricas, com superfície modificada. Uma linhagem celular de hibridoma que produz o anticorpo monoclonal 18C5 foi depositada no depositário de patentes da American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia, 20110-2209 em 31 de outubro de 2017 e atribuída ao depósito de patente Nº PTA-124570.

[0211] Alguns anticorpos se ligam ao mesmo epítopo que se sobrepõe como um anticorpo designado como 18C5. As sequências das regiões variáveis maduras da cadeia pesada e leve de 18C5 são designadas SEQ ID NOs: 1 e 3, respectivamente. Outros anticorpos possuindo tal especificidade de ligação podem ser produzidos por imunização de camundongos com TTR, ou uma porção dele que inclui o epítopo desejado (por exemplo, SEQ ID NO: 30) e triagem de anticorpos resultantes para ligação à TTR monomérica ou a um peptídeo compreendendo SEQ ID NO: 30, opcionalmente em competição com um anticorpo possuindo as regiões variáveis de 18C5 de camundongo (IgG1, kappa). Fragmentos de TTR incluindo o epítopo desejado podem ser ligados a um transportador que ajuda a obter uma resposta de anticorpos ao fragmento e/ou ser combinado com um adjuvante que ajuda a provocar tal resposta. Tais anticorpos podem ser triados para ligação diferencial a versões monoméricas de tipo selvagem de TTR ou um fragmento do mesmo (por exemploSEQ ID NO: 26) em comparação com mutantes de resíduos especificados. A triagem contra tais mutantes define mais precisamente a especificidade de ligação para permitir a identificação de anticorpos cuja ligação é inibida por mutagênese de resíduos particulares e que são suscetíveis de compartilhar as propriedades funcionais de outros anticorpos exemplificados. As mutações podem ser substituição de substituição sistemática com alanina (ou serina ou glicina se já existe uma alanina) um resíduo por vez, ou intervalos mais amplamente espaçados, ao longo do alvo ou ao longo de uma seção dele, no qual um epítopo é conhecido por residir. Se o mesmo conjunto de mutações reduz significativamente a ligação de dois anticorpos, os dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo.

[0212] Os anticorpos tendo a especificidade de ligação de um anticorpo murino selecionado (por exemplo, 18C5) também podem ser produzidos usando uma variante do método de exibição de fagos. Vide Winter, WO 92/20791. Este método é particularmente adequado para a produção de anticorpos humanos. Neste método, a região variável da cadeia pesada ou leve do anticorpo murino selecionado é usada como matéria-prima. Se, por exemplo, uma região variável de cadeia leve for selecionada como matéria-prima, é construída uma biblioteca de fagos em que os membros exibem a mesma região variável da cadeia leve (ou seja, a matéria-prima murino) e uma região variável de cadeia pesada diferente. As regiões variáveis da cadeia pesada podem, por exemplo, ser obtidas a partir de uma biblioteca de regiões variáveis de cadeia pesada humana rearranjadas. Um fago mostrando forte ligação específica (por exemplo, pelo menos 10 8 e de preferência pelo menos 109 M-1) para TTR monomérica ou um fragmento do mesmo (por exemplo, resíduos de aminoácidos 101-109) é selecionado. A região variável da cadeia pesada deste fago serve então como matéria prima para a construção de uma biblioteca de fagos adicional. Nesta biblioteca, cada fago exibe a mesma região variável da cadeia pesada (ou seja, a região identificada a partir da primeira biblioteca de exibição) e uma região variável de cadeia leve diferente. As regiões variáveis da cadeia leve podem ser obtidas, por exemplo, a partir de uma biblioteca de regiões de cadeia leve variável humana rearranjadas. Novamente, o fago mostrando ligação específica forte para TTR monomérica ou um fragmento do mesmo (por exemplo, resíduos de aminoácidos 101-109) são selecionados. Os anticorpos resultantes têm geralmente a mesma ou semelhante especificidade do epítopo que a matéria-prima murino.

[0213] Outros anticorpos podem ser obtidos por mutagênese de cDNA que codifica as cadeias pesada e leve de um anticorpo exemplificativo, como 18C5. Os anticorpos monoclonais que são pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticos a 18C5 na sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e/ou leve maduras e mantêm suas propriedades funcionais, e/ou que diferem do respectivo anticorpo por um pequeno número de substituições de aminoácidos funcionalmente inconsequentes (por exemplo, substituições conservativas), deleções ou inserções também estão incluídas na invenção. Os anticorpos monoclonais que possuem pelo menos uma ou todas as seis CDR (s) como definido por qualquer definição convencional, mas preferencialmente Kabat, que são 90%, 95%, 99% ou 100% idênticos às CDRs correspondentes de 18C5 também estão incluídos.

[0214] A invenção também fornece anticorpos que têm algumas ou todas (por exemplo, 3, 4, 5 e 6) as CDRs totalmente ou substancialmente a partir de 18C5. Tais anticorpos podem incluir uma região variável de cadeia pesada que tenha pelo menos duas, e geralmente todas as três, CDRs inteiramente ou substancialmente da região variável de cadeia pesada de 18C5 e/ou uuma região variável de cadeia leve com pelo menos dois e geralmente todos três, CDRs inteiramente ou substancialmente da região variável da cadeia leve de 18C5. Os anticorpos podem incluir tanto cadeias pesadas quanto cadeias leves. Uma CDR é substancialmente a partir de uma CDR de 18C5 correspondente quando a mesma contém não mais do que 4, 3, 2 ou 1 substituições, inserções ou deleções, exceto que a CDR-H2 (quando definida por Kabat) pode ter não mais do que 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições, inserções ou deleções. Tais anticorpos podem ter pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com 18C5 na sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada madura e/ou regiões variáveis de cadeia leve madura e manter suas propriedades funcionais e/ou diferir de 18C5 em um pequeno número de substituições de aminoácidos funcionalmente inconsequentes (por exemplo, substituições conservadoras), deleções ou inserções.

[0215] CDRs do Composto Kabat/Chothia (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) da cadeia pesada de 18C5 são designadas SEQ ID NOs: 5, 7 e 9, respectivamente, e CDRs de compostos Kabat/Chothia (CDR -L1, CDR-L2, CDR-L3) da cadeia leve de 18C5 são designadas SEQ ID NOs: 11, 13 e 15, respectivamente.

[0216] A Tabela 2 indica as CDRs de 18C5 como definidas por Kabat, Chothia, Composto de Chothia e Kabat (também referido neste documento como “Composto de Kabat/Chothia”), AbM e Contact.

Tabela 2 CDRs de 18C5 como definidas por Kabat, Chothia, Composto de Chothia e Kabat, AbM e Contact usando a numeração Kabat Composto Alça Kabat Chothia de Chothia AbM Contact & Kabat L24--L34 L24--L34 L24--L34 L30--L36 L24--L34 L1 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO:11 NO:11 NO:11 NO:11 100 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L46--L55 L2 SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO:13 13 13 13 101 L89--L97 L89--L97 L89--L97 L89--L96 L89--L97 L3 SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:15 NO: 15 15 15 102 H31--H35B H26--H32 H26--H35B H26--H35B H30--H35B H1 SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: NO: 93 94 NO:5 NO:5 95 H50--H65 H52--H56 H50--H65 H50--H58 H47--H58 H2 SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:

Tabela 2 CDRs de 18C5 como definidas por Kabat, Chothia, Composto de Chothia e Kabat, AbM e Contact usando a numeração Kabat Composto Alça Kabat Chothia de Chothia AbM Contact & Kabat NO: 7 96 7 97 98 H95--H102 H95--H102 H95--H102 H93--H101 H95--H102 H3 SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:9 NO:9 9 9 99

[0217] Alguns anticorpos identificados por esses ensaios podem se ligar às formas monoméricas, dobradas, agregadas ou fibrilas de TTR, mas não à forma tetramérica nativa de TTR, conforme descrito nos exemplos ou de outra forma. Da mesma forma, alguns anticorpos são imunorreativos ao tecido de amiloidose mediada pela TTR, mas não ao tecido saudável.

[0218] Alguns anticorpos podem inibir ou reduzir a agregação de TTR, inibir ou reduzir a formação de fibrilas de TTR, reduzir ou limpar depósitos de TTR ou TTR agregado ou estabilizar conformações não tóxicas de TTR em um modelo animal ou ensaio clínico. Alguns anticorpos podem tratar, efetuar profilaxia ou retardar o início de uma amiloidose pela TTR, como mostrado em um modelo animal ou em um ensaio clínico. Modelos animais exemplares para testar a atividade contra uma amiloidose de TTR incluem aqueles descritos em Kohno et al., Am. J. Path. 150(4):1497-1508 (1997); Teng et al., Laboratory Investigations 81:385-396 (2001); Wakasugi et al., Proc. Japan Acad. 63B:344-347 (1987); Shimada et al., Mol. Biol. Med. 6:333-343 (1989); Nagata et al., J. Biochem. 117:169-175 (1995); Sousa et al., Am. J. Path. 161:1935-1948 (2002); and Santos et al., Neurobiology of Aging 31:280-289 (2010).

[0219] Um anticorpo que se liga a um epítopo nos resíduos 101-109 de TTR pode ser identificado imunizando um animal com TTR ou um fragmento desta e triando anticorpos induzidos para identificar uma ligação de anticorpo nos resíduos

101-109 de TTR. O animal pode ser, por exemplo, um roedor, como um rato, coelho ou rato. O animal pode ser transgênico, como um roedor modificado para ter genes de imunoglobulina humana. Um fragmento usado para imunização pode ser um fragmento de não mais que 25 resíduos contíguos de TTR, incluindo pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 resíduos contíguos nos resíduos 101-109 de TTR. Um fragmento utilizado para imunização pode consistir nos resíduos 101-109 de TTR. Um fragmento usado para imunização pode ser ligado a um transportador para ajudar a induzir a indução de anticorpos. O anticorpo pode ser triado determinando se o anticorpo se liga a um fragmento de TTR que consiste nos resíduos 101-109. Opcionalmente, o anticorpo também pode ser triado quanto à ligação a TTR de tamanho total.

[0220] Um anticorpo que se liga a um epítopo nos resíduos 101-109 de TTR pode ser identificado fornecendo uma biblioteca de exibição de anticorpos e triando a biblioteca de exibição para identificar uma ligação de anticorpo nos resíduos 101- 109 de TTR. A biblioteca de exibição pode ser uma biblioteca de exibição de fagos, biblioteca de exibição de leveduras, biblioteca de exibição de ribossomo entre outras. A biblioteca de exibição pode, por exemplo, exibir anticorpos como fragmentos de Fv ou Fabs. A biblioteca de exibição pode ser uma biblioteca de exibição sem exposição. Métodos de isolamento de anticorpos de bibliotecas de exibição de fagos são divulgados, por exemplo, no documento WO 2017/207739. Alternativamente, a biblioteca de exibição pode ser produzida imunizando um roedor com TTR ou um fragmento deste e clonando ácidos nucleicos que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpos em um vetor de exibição. O roedor pode ser, por exemplo, um rato, coelho ou rato. Um fragmento usado para imunização pode ser um fragmento de não mais que 25 resíduos contíguos de TTR, incluindo pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 resíduos contíguos nos resíduos 101-109 de TTR. Um fragmento utilizado para imunização pode consistir nos resíduos 101-109 de TTR. Um fragmento usado para imunização pode ser ligado a um transportador para ajudar a induzir a indução de anticorpos. Os membros da biblioteca podem ser triados quanto à ligação a um fragmento de TTR que consiste nos resíduos 101-

109. Opcionalmente, os membros da biblioteca também podem ser rastreados quanto à ligação ao TTR completo. Os membros da biblioteca podem ser rastreados na presença de um anticorpo de referência que se liga a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR. O anticorpo de referência pode ser o anticorpo 18C5.

[0221] Um anticorpo de teste que compete pela ligação com o anticorpo 18C5 pela ligação à TTR pode ser identificado pelo contato da TTR com o anticorpo de teste na presença e ausência do anticorpo 18C5 e determinando a ligação do anticorpo à TTR. A diminuição da ligação do anticorpo na presença do anticorpo 18C5 indica que o anticorpo compete com o anticorpo 18C5 pela ligação à TTR. Alternativa ou adicionalmente, o ensaio pode ser realizado pelo contato da TTR com o anticorpo 18C5 na presença de ausência de um anticorpo de teste, caso em que a ligação reduzida de 18C5 à TTR na presença do anticorpo de teste indica competição.

[0222] Um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo 18C5 na TTR pode ser identificado determinando o epítopo ligado ao anticorpo 18C5 na TTR, imunizando um animal com TTR ou um fragmento desta e triando anticorpos induzidos para identificar um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo como anticorpo 18C5. O animal pode ser, por exemplo, um roedor, como um rato, coelho ou rato. O animal pode ser transgênico, como um roedor modificado para ter genes de imunoglobulina humana.

[0223] Um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo 18C5 na TTR pode ser identificado determinando o epítopo ligado pelo anticorpo 18C5 na TTR, fornecendo uma biblioteca de exibição de anticorpos e triando a biblioteca de exibição para identificar um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo 18C5. A biblioteca de exibição pode ser uma biblioteca de exibição de fagos, exibição de levedura ou exibição de ribossomo. A biblioteca de exibição pode, por exemplo, exibir anticorpos como fragmentos de Fv ou fragmentos de Fabs. A biblioteca de exibição pode ser uma biblioteca de exibição sem exposição. Métodos de isolamento de anticorpos de bibliotecas de exibição de fagos são divulgados, por exemplo, no documento WO 2017/207739.

[0224] Os anticorpos também podem ser produzidos por um método de exibição de fagos para ter a especificidade de ligação de um anticorpo murino selecionado (por exemplo, 18C5). Neste método, a região variável da cadeia pesada ou leve do anticorpo murino selecionado é usada como matéria-prima. Se, por exemplo, uma região variável de cadeia leve for selecionada como matéria- prima, é construída uma biblioteca de fagos em que os membros exibem a mesma região variável da cadeia leve (ou seja, a matéria-prima murino) e uma região variável de cadeia pesada diferente. As regiões variáveis da cadeia pesada podem, por exemplo, ser obtidas a partir de uma biblioteca de regiões variáveis de cadeia pesada humana rearranjadas. Um fago mostrando forte ligação específica (por exemplo, pelo menos 108 e de preferência pelo menos 109 M-1) para TTR monomérica ou um fragmento do mesmo (por exemplo, resíduos de aminoácidos 101-109) é selecionado. A região variável da cadeia pesada deste fago serve então como matéria prima para a construção de uma biblioteca de fagos adicional. Nesta biblioteca, cada fago exibe a mesma região variável da cadeia pesada (ou seja, a região identificada a partir da primeira biblioteca de exibição) e uma região variável de cadeia leve diferente. As regiões variáveis da cadeia leve podem ser obtidas, por exemplo, a partir de uma biblioteca de regiões de cadeia leve variável humana rearranjadas. Novamente, o fago mostrando ligação específica forte para TTR monomérica ou um fragmento do mesmo (por exemplo, resíduos de aminoácidos 101-109) são selecionados. Os anticorpos resultantes têm geralmente a mesma ou semelhante especificidade do epítopo que a matéria-prima murino.

[0225] Uma biblioteca de exibição para produzir um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo 18C5 na TTR pode ser produzida imunizando um roedor com TTR ou um fragmento desta e clonando ácidos nucleicos que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpos em um vetor de exibição. O roedor pode ser, por exemplo, um rato, coelho ou rato. Um fragmento usado para imunização pode ser um fragmento de não mais que 25 resíduos contíguos de TTR, incluindo pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 resíduos contíguos nos resíduos 101-109 de TTR. Um fragmento utilizado para imunização pode consistir nos resíduos 101-109 de TTR. Um fragmento usado para imunização pode ser ligado a um transportador para ajudar a induzir a indução de anticorpos.

[0226] Os membros da biblioteca de exibição podem ser triados quanto à ligação a um fragmento de TTR que consiste nos resíduos 101-109. Opcionalmente, os membros da biblioteca também podem ser rastreados quanto à ligação ao TTR completo. Os membros da biblioteca podem ser rastreados na presença de um anticorpo de referência que se liga a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR. O anticorpo de referência pode ser o anticorpo 18C5.

[0227] O epítopo ligado pelo anticorpo 18C5 na TTR pode ser determinado, por exemplo, medindo a ligação de 18C5 a versões monoméricas de TTR de tipo selvagem ou um fragmento desta em comparação com mutantes de resíduos especificados. As mutações podem ser substituição de substituição sistemática com alanina (ou serina ou glicina se já existe uma alanina) um resíduo por vez, ou intervalos mais amplamente espaçados, ao longo do alvo ou ao longo de uma seção dele, no qual um epítopo é conhecido por residir. Dois anticorpos têm o mesmo epítopo se todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzirem ou eliminarem a ligação do outro. O epítopo ligado pelo anticorpo 18C5 na TTR também pode ser determinado por cristalografia de raios-X do anticorpo ligado ao seu antígeno para identificar resíduos de contato. Dois anticorpos ligam o mesmo epítopo se eles tiverem os mesmos resíduos de contato.

[0228] Os anticorpos anti-TTR que se ligam a epítopos de TTR diferentes dos de 18C5, incluindo versões quiméricas e humanizadas destes, são úteis em terapias combinadas, em anticorpos biespecíficos, em métodos de diagnóstico e/ou tratamento de distúrbios associados a TTR e em métodos de detecção de TTR, com anticorpos 18C5 da invenção. Tais anticorpos anti-TTR que se ligam a epítopos de TTR diferentes dos de 18C5, podem incluir anticorpos como na Tabela 3 abaixo.

[0229] Tabela 3: Anticorpos anti-TTR. Nome Epítopo na TTR VH/VL ou CDRs Referência conforme relatado conforme relatado 9D5 EHAEVVFTA (89-97) CDRs da Kabat: WO 2016/120810 (SEQ ID NO: 45) CDR-H1 SEQ ID A1 NO:75 Número do depósito CDR-H2 SEQ ID ATCC PTA-124078 NO:76 Data: 4 de abril de

Nome Epítopo na TTR VH/VL ou CDRs Referência conforme relatado conforme relatado CDR-H3 SEQ ID 2017 NO:77 CDR-L1 SEQ ID NO: 78 CDR-L2 SEQ ID NO: 79 CDR-L3 SEQ ID NO: 80 14G8 EHAEVVFTA (89-97) CDRs da Kabat WO 2016/120810 (SEQ ID NO: 45) CDR-H1 SEQ ID A1 NO:39 Número do CDR-H2 SEQ ID Depósito ATCC NO:40 PTA-124079 CDR-H3 SEQ ID Data: 4 de abril de NO:41 2017 CDR-L1 SEQ ID NO:42 CDR-L2 SEQ ID NO:43 CDR-L3 SEQ ID NO:44 5A1 EHAEVVFTA (89-97) CDRs da Kabat WO 2016/120811 (SEQ ID NO: 45) CDR-H1 SEQ ID Número do NO:46 Depósito ATCC CDR-H2 SEQ ID PTA-124080 NO:47 Data: 4 de abril de CDR-H3 SEQ ID 2017 NO:48 CDR-L1 SEQ ID

Nome Epítopo na TTR VH/VL ou CDRs Referência conforme relatado conforme relatado NO 49 CDR-L2 SEQ ID NO: 50 CDR-L3 SEQ ID NO: 51

6C1 EHAEVVFTA (89-97) CDRs da Kabat WO 2016/120809 (SEQ ID NO: 45) CDR-H1 SEQ ID Número do NO:52 Depósito ATCC CDR-H2 SEQ ID PTA-124077 NO:53 Data: 4 de abril de CDR-H3 SEQ ID 2017 NO: 54 CDR-L1 SEQ ID NO: 55 CDR-L2 SEQ ID NO:56 CDR-L3 SEQ ID NO: 57

AD7F6 VH SEQ ID NO: 58 WO 2010/030203 VL SEQ ID NO: 59 A1 RT24 118-122, 115-124 CDR-H1 SEQ ID WO 2015/115331 NO:60 CDR-H2 SEQ ID NO:61 CDR-H3 SEQ ID NO: 62 CDR-L1 SEQ ID

Nome Epítopo na TTR VH/VL ou CDRs Referência conforme relatado conforme relatado NO: 63 CDR-L2 SEQ ID NO: 64 CDR-L3 SEQ ID NO: 65 NI- 53-63, 54-61 CDR-H1 SEQ ID US 2016/0355576

301.35G11 NO: 66 A1 CDR-H2 SEQ ID NO: 67 CDR-H3 SEQ ID NO:68 CDR-L1 SEQ ID NO: 69 CDR-L2 SEQ ID NO: 70 CDR-L3 SEQ ID NO:71 MFD101, ADDTWEPFASGKT US 2016/0039916 MDF102, (resíduos 36-49) (SEQ A1 MFD103, ID NO: 72) MFD105 MFD107, TSESGELHGLTTE US 2016/0039916 MFD108, (resíduos 49-61) (SEQ A1 MFD109, ID NO: 73) MFD111 MFD114 ALLSPYSYSTTAV US 2016/0039916 (resíduos 109-121) A1

Nome Epítopo na TTR VH/VL ou CDRs Referência conforme relatado conforme relatado (SEQ ID NO: 74) 30-66 US 2016/0039916 A1 70-127 US 2016/0039916 A1 80-127 US 2016/0039916 A1 90-127 US 2016/0039916 A1 100-127 US 2016/0039916 A1 110-127 US 2016/0039916 A1 115-127 US 2016/0039916 A1 B. Anticorpos Não Humanos

[0230] A produção de outros anticorpos não humanos, por exemplo , murino, cobaia, primata, coelho ou rato, contra a TTR monomérica ou um fragmento desta (por exemplo , resíduos de aminoácidos 101-109) pode ser realizado, por exemplo, imunizando o animal com TTR ou um fragmento do mesmo. Vide Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988) (incorporado por referência para todos os fins). Um tal imunógeno pode ser obtido a partir de uma fonte natural, por síntese de peptídeos ou por expressão recombinante. Opcionalmente, o imunógeno pode ser administrado fundido ou de outro modo complexado com uma proteína carreadora. Opcionalmente, o imunógeno pode ser administrado com um adjuvante. Vários tipos de adjuvante podem ser usados conforme descrito abaixo. O adjuvante completo de Freund seguido de adjuvante incompleto é preferido para a imunização de animais de laboratório. Coelhos ou porquinhos-da-índia são tipicamente usados para produzir anticorpos policlonais.

Os camundongos tipicamente usados para fabricar anticorpos monoclonais. Os anticorpos são pesquisados quanto à ligação específica à TTR monomérica ou a um epítopo dentro da TTR ( por exemplo , um epítopo compreendendo um ou mais dos resíduos de aminoácidos 101-109). Essa triagem pode ser realizada determinando a ligação de um anticorpo a uma coleção de variantes de TTR monoméricas, como variantes de TTR contendo resíduos de aminoácidos 101-109 ou mutações dentro desses resíduos e determinando quais variantes de TTR se ligam ao anticorpo. A ligação pode ser avaliada, por exemplo, por Western blot, FACS ou ELISA. C. Anticorpos Humanizados

[0231] Um anticorpo humanizado é um anticorpo geneticamente modificado em que as CDRs de um anticorpo "doador" não humano são enxertadas em sequências de anticorpo "aceitadoras" humanas (vide, por exemplo, Queen, US

5.530.101 e 5.585.089; Winter, US 5.225.539, Carter, US 6.407.213, Adair, US

5.859.205; e Foote, US 6.881.557). As sequências de anticorpo aceitadora podem ser, por exemplo, uma sequência de anticorpo humana madura, um composto de tais sequências, uma sequência consenso de sequências de anticorpos humanos ou uma sequência da região da linhagem germinativa. Assim, um anticorpo humanizado é um anticorpo que possui pelo menos três, quatro, cinco ou todas as CDR total ou substancialmente de um anticorpo dador e sequências de framework da região variável e das regiões constantes, se presentes, no todo ou substancialmente a partir de sequências de anticorpos humanos. Da mesma forma uma cadeia pesada humanizada tem, pelo menos, uma, duas e, normalmente, todas as três CDR inteiramente, ou substancialmente, de uma cadeia pesada do anticorpo dador, e uma sequência de framework da região variável de cadeia pesada e região constante de cadeia pesada, se presente, substancialmente a partir da estrutura da região variável de cadeia pesada humana e sequências da região constante. Da mesma forma uma cadeia leve humanizada tem, pelo menos, uma, duas e, normalmente, todas as três CDRs inteiramente, ou substancialmente, de uma cadeia leve do anticorpo dador, e uma sequência de framework da região de cadeia leve e região constante da cadeia leve, se presente, substancialmente a partir da estrutura da região variável de cadeia leve humana e das sequências da região constante.

Além de nanocorpos e dAbs, um anticorpo humanizado compreende uma cadeia pesada humanizada e uma cadeia leve humanizada.

Uma CDR em um anticorpo humanizado é substancialmente de uma CDR correspondente num anticorpo não humano quando, pelo menos, 85%, 90%, 95% ou 100% dos resíduos correspondentes (conforme definido por qualquer definição convencional, mas preferencialmente definida por Kabat) são idênticos entre as respectivas CDRs.

As sequências do framework da região variável de uma cadeia de anticorpo ou a região constante de uma cadeia de anticorpo são substancialmente de uma sequência do framework da região variável humana ou região constante humana, respectivamente, quando, pelo menos, 85%, 90%, 95% ou 100% de resíduos definidos por qualquer definição convencional, mas preferencialmente por Kabat, são idênticos.

Para ser classificado como humanizado de acordo com a definição de anticorpos humanizados da Organização Mundial de Saúde (OMS) de 2014, um anticorpo deve ter pelo menos 85% de identidade nas regiões variáveis maduras com sequências de anticorpos da linhagem germinativa humana (isto é, antes da hipermutação somática). Os anticorpos mistos são anticorpos para os quais uma cadeia de anticorpo (por exemplo, cadeia pesada) atende ao limite, mas a outra cadeia (por exemplo, cadeia leve) não atende ao limite.

Um anticorpo é classificado como quimérico se nenhuma das cadeias atender ao limite, mesmo que as regiões framework variáveis para ambas as cadeias tenham sido substancialmente humanas com algumas mutações reversas murinas.

Ver, Jones et al. (2016) The INNs and outs of antibody nonproprietary names, mAbs 8:1, 1-9, DOI: 10.1080/19420862.2015.1114320. Ver também “OMS-INN: International nonproprietary names (INN) for biological and biotechnological substances (a review)” (Internet) 2014. Disponível em: http://www. who.int/medicines/services/inn/BioRev2014.pdf), incorporado neste documento por referência.

Para evitar dúvidas, o termo “humanizado” como usado neste documento não se destina a ser limitado à definição da OMS INN de 2014 de anticorpos humanizados.

Alguns dos anticorpos humanizados fornecidos neste documento têm pelo menos 85% de identidade de sequência com as sequências da linhagem germinativa humana em uma ou ambas as regiões variáveis maduras e alguns dos anticorpos humanizados fornecidos neste documento têm menos de

85% de identidade de sequência com as sequências da linhagem germinativa humana em uma ou ambas as variáveis maduras regiões.

Algumas das regiões variáveis da cadeia pesada maduras dos anticorpos humanizados fornecidos neste documento têm desde cerca de 60% a 100% de sequência de sequência até sequências da linhagem germinativa humana, tais como, por exemplo, no intervalo de cerca de 60% a 69%, 70% a 79%, 80% a 84%, ou 85% a 89%. Algumas das regiões variáveis maduras das cadeias pesadas, as cadeias pesadas ficam abaixo da definição da OMS de 2014 e têm, por exemplo, cerca de 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, ou 82%, 83% ou 84% de identidade sequencial com sequências da linhagem germinativa humana, enquanto outras regiões variáveis maduras de cadeia pesada atendem à definição de 2014 OMS INN e têm cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou mais de identidade de sequência com sequências da linhagem germinativa humana.

Algumas das regiões variáveis maduras da cadeia leve dos anticorpos humanizados fornecidos neste documento têm cerca de 60% a 100% de identidade de sequência com sequências da linhagem germinativa humana, tais como, por exemplo, na gama de cerca de 80% a 84% ou 85% a 89%. Algumas regiões variáveis da cadeia leve maduras ficam abaixo da definição da 2014 OMS INN e têm, por exemplo, cerca de 81%, 82%, 83% ou 84% de identidade sequencial com sequências da linhagem germinativa humana, enquanto outras regiões variáveis da cadeia leve maduras atendem à definição OMS INN 2014 e têm cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou mais de identidade de sequência com sequências da linhagem germinativa humana.

Alguns anticorpos humanizados fornecidos neste documento que são "quiméricos" na definição da 2014 OMS INN têm regiões variáveis de cadeia pesada maduras com menos de 85% de identidade com sequências de linhas germinativas humanas emparelhadas com regiões variáveis da cadeia leve maduras com menos de 85% de identidade com a linhagem germinativa humana sequências.

Alguns anticorpos humanizados fornecidos neste documento são "misturados" sob a definição 2014 OMS INN, por exemplo, tendo uma região variável madura de cadeia pesada com pelo menos 85% de identidade de sequência com sequências germinativas humanas pareadas com uma região variável da cadeia leve madura com menos de 85% de identidade de sequência ao germe humano sequências de linha, ou vice-versa. Alguns anticorpos humanizados fornecidos neste documento estão de acordo com a definição de 2014 OMS INN de "humanizado" e tem uma região variável da cadeia pesada madura com pelo menos 85% de identidade de sequência com as sequências germinativas pareadas com uma região variável da cadeia leve madura tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com as sequências da linhagem germinativa humana. Anticorpos 18C5 exemplares que atendem à definição de 2014 OMS INN "humanizado" incluem anticorpos com uma região variável da cadeia pesada madura com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 ou SEQ ID NO: 86 emparelhada com uma região variável da cadeia leve madura com um sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 ou SEQ ID NO: 92.

[0232] Embora os anticorpos humanizados muitas vezes incorporem todas as seis CDRs (preferencialmente tal como definido por Kabat) a partir de um anticorpo de camundongo, eles também pode ser feitos com menos do que todas as CDRs ( por exemplo , pelo menos 3, 4, ou 5 CDRs) de um anticorpo de camundongo (por exemplo, Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., J. of Mol. Biol., 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079- 1091, 1999; Tamura et al, J. Immunol., 164:1432-1441, 2000).

[0233] Em alguns anticorpos apenas uma parte das CDR, a saber, o subconjunto de resíduos de CDR necessários para a ligação, denominados os SDRs, é necessária para manter a ligação de um anticorpo humanizado. Resíduos de CDR não entram em contato com o antígeno e que não estão nas SDRs podem ser identificados com base em estudos anteriores (por exemplo, os resíduos H60- H65 em CDR-H2 frequentemente não são necessários), a partir de regiões de CDR de Kabats que se encontram fora das alças hipervariáveis de Chothia (Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987), por modelação molecular e/ou empiricamente, ou como descrito em Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863, 2004. Em tais anticorpos humanizados em posições nas quais um ou mais resíduos de CDR dadores estão ausentes ou em que todo um doador de CDR é omitido, o aminoácido que ocupa a posição pode ser um aminoácido que ocupa a posição correspondente (por numeração de Kabat) na sequência de anticorpo aceitador. O número de tais substituições de aceitador para aminoácidos doadores nas CDRs para incluir reflete um equilíbrio de considerações concorrentes. Tais substituições são potencialmente vantajosas na diminuição do número de aminoácidos do camundongo num anticorpo humanizado e, consequentemente, diminuição na imunogenicidade potencial. No entanto, as substituições também podem causar mudanças de afinidade e reduções significativas na afinidade são preferencialmente evitadas. Posições de substituição dentro de CDRs e aminoácidos a substituir também podem ser selecionadas empiricamente.

[0234] As sequências de anticorpo humano aceitador podem ser, opcionalmente, selecionadas de entre as muitas sequências de anticorpos humanos conhecidas por fornecer um elevado grau de identidade de sequência (por exemplo, 65-85% de identidade) entre estruturas de região variável de sequência aceitadora humana e as correspondentes estruturas da região variável de um doador da cadeia de anticorpo.

[0235] Um exemplo de uma sequência aceitadora para a cadeia pesada 18C5 é o VH humanizado Crenezumab Fab (CreneFab), com código de acesso PDB 5VZY (SEQ ID NO: 83). Um exemplo de uma sequência aceitadora para a cadeia leve 18C5 é o Crenezumab Fab (CreneFab) humanizado VL, com código de acesso PDB 5VZY (SEQ ID NO: 89). Outro exemplo de uma sequência aceitadora para a cadeia leve 18C5 é o gene da linhagem germinativa humana IGKV2-30*02 (SEQ ID NO:90).

[0236] Se mais de uma sequência de anticorpo aceitador humano for selecionada para uma cadeia (leve ou pesada), um composto ou híbrido desses aceitadores poderá ser usado para essa cadeia, e os aminoácidos utilizados diferentes poderão ser retirados de qualquer uma das sequências de anticorpos aceitadores humanos utilizados.

[0237] Certos aminoácidos dos resíduos do quadro de região variável humana são selecionados para substituição com base em sua possível influência na conformação e/ou ligação de CDR a antígeno. Investigação de tais possíveis influências é por modelação, análise das características dos aminoácidos em determinadas localizações ou observação empírica dos efeitos de substituição ou mutagênese de determinados aminoácidos.

[0238] Por exemplo, quando um aminoácido difere entre um resíduo de framework de região variável de murino e um resíduo de framework de região humana variável selecionado, o aminoácido de estrutura humana pode ser substituído pelo aminoácido de framework equivalente do anticorpo de camundongo quando for razoavelmente esperado que o aminoácido: (1) liga de maneira não covalente o antígeno diretamente; (2) está adjacente a uma região CDR ou dentro de um CDR como definido por Chothia, mas não Kabat; (3) interage de outra forma com uma região CDR (por exemplo, está dentro de cerca de 6 Å de uma região CDR), (por exemplo, identificado por modelagem da cadeia leve ou pesada na estrutura resolvida de uma cadeia de imunoglobulina conhecida homóloga); ou (4) é um resíduo que participa na interface VL-VH.

[0239] A invenção fornece formas humanizadas do anticorpo 18C5 de murino, incluindo 2 regiões variáveis maduras de cadeia pesada humanizada exemplificadas (hu18C5-VH_v1 (SEQ ID NO: 85) e hu18C5-VH_v2 (SEQ ID NO: 86)) e 2 regiões variáveis maduras de cadeia leve humanizada exemplificadas (hu18C5-VL_v1 (SEQ ID NO: 91) e hu18C5-VL_v2 (SEQ ID NO: 92)).

[0240] Em uma modalidade, as sequências humanizadas são geradas usando um protocolo de PCR de dois estágios que permite a introdução de múltiplas mutações, deleções e inserções usando mutagênese dirigida ao sítio de QuikChange [Wang, W. e Malcolm, BA (1999) BioTechniques 26: 680-682.)].

[0241] Resíduos de framework das classes (1) até (3) como definido por Queen, US 5.530.101, são algumas vezes alternadamente referidos como resíduos canônicos e de vernier. Os resíduos de framework que ajudam a definir a conformação de uma alça de CDR são por vezes referidos como resíduos canônicos (Chothia & Lesk, J. Mol. Chem. Biol. 196:901-917 (1987); Thornton & Martin, J. Mol. Biol. 263:800-815 (1996)). Os resíduos de framework que suportam conformações de alça de ligação ao antígeno e desempenham um papel no ajuste do ajuste de um anticorpo contra o antígeno são por vezes referidos como resíduos de vernier (Foote & Winter, J. Mol. Biol 224:487-499 (1992)).

[0242] Outros resíduos de framework que são candidatos à substituição são os resíduos que criam um sítio potencial de glicosilação. Ainda outros candidatos para substituição são aminoácidos de framework humanos aceitadores que são incomuns para uma imunoglobulina humana nessa posição. Estes aminoácidos podem ser substituídos por aminoácidos da posição equivalente do anticorpo de camundongo doador ou a partir das posições equivalentes de imunoglobulinas humanas mais típicas.

[0243] Os resíduos de framework que são candidatos à substituição são resíduos de ácido glutâmico N-terminal (E) que podem ser substituídos por glutamina (Q).

[0244] Anticorpos humanizados exemplificativos são formas humanizadas do 18C5 de camundongo, designado como Hu18C5.

[0245] O anticorpo de camundongo 18C5 compreende regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada maduras tendo sequências de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 81 e SEQ ID NO: 87, respectivamente. A invenção fornece 2 regiões variáveis da cadeia pesada madura humanizada exemplificadas: hu18C5-VH_v1 e hu18C5-VH_v2. A invenção fornece ainda 2 regiões variáveis de cadeia leve madura humana exemplificadas: hu18C5-VL_v1 e hu18C5-VL_v2. Os alinhamentos do 18C5 murino e vários anticorpos humanizados são mostrados para as regiões variáveis da cadeia leve (Tabela 6 e Figura 4) e regiões variáveis da cadeia pesada (Tabela 7 e Figura 3).

[0246] Por razões como possível influência na conformação da CDR e/ou ligação ao antígeno, mediando a interação entre as cadeias pesada e leve, a interação com a região constante, sendo um sítio para modificações pós- traducionais desejadas ou indesejadas, sendo um resíduo incomum para sua posição em uma sequência de região variável humana e, portanto, potencialmente imunogênica, obtendo potencial de agregação e outras razões, as 8 posições de estrutura de região variável a seguir de 18C5 foram consideradas como candidatas a substituições nas 2 regiões variáveis humanas maduras da cadeia leve exemplificadas e nos 2 exemplificados regiões variáveis de cadeia pesada madura humana, conforme especificado no Exemplo 7: L2 (I2V), L45 (Q45R), H37 (V37A), H45 (L45Q), H47 (L47W), H48 (V48I), H49 (A49G) e H94 (S94R).

[0247] Aqui, como em qualquer outro lugar, o primeiro resíduo mencionado é o resíduo de um anticorpo humanizado formado pelo enxerto de CDR de Kabat ou uma CDR do composto Chothia-Kabat no caso de CDR-H1 em framework aceitador humano e o segundo resíduo mencionado é um resíduo considerado para substituir tal resíduo. Portanto, dentro dos frameworks de regiões variáveis, o primeiro resíduo mencionado é humano, e dentro das CDRs, o primeiro resíduo mencionado é de camundongo.

[0248] As regiões CDR de tais anticorpos humanizados podem ser idênticas ou substancialmente idênticas às regiões CDR do anticorpo doador de camundongo 18C5. As regiões CDR podem ser definidas por qualquer definição convencional, como as da Tabela 1, mas são preferencialmente como definidas pelo composto Kabat ou Kabat + Chothia.

[0249] As posições do framework das regiões variáveis estão de acordo com a numeração de Kabat, salvo indicação em contrário.

[0250] Uma possibilidade de variação adicional em variantes humanizadas de 18C5 é de mutações reversas (backmutations) adicionais nos frameworks da região variável. Muitos dos resíduos de estrutura que não estão em contato com as CDR no mAb humanizado podem acomodar substituições de aminoácidos das posições correspondentes do mAb de camundongo doador ou outros anticorpos de camundongo ou humanos, e mesmo muitos resíduos de contato CDR potenciais também são suscetíveis de substituição. Mesmo os aminoácidos dentro das CDRs podem ser alterados, por exemplo, com resíduos encontrados na posição correspondente da sequência aceitadora humana usada para fornecer estrutura de regiões variáveis. Além disso, podem ser utilizadas sequências aceitadoras humanas alternativas, por exemplo, para a cadeia pesada e/ou leve. Se diferentes sequências aceitadoras forem usadas, uma ou mais das mutações reversas recomendadas acima podem não ser realizadas porque os resíduos correspondentes do doador e do aceitador já são os mesmos sem mutações reversas.

[0251] Algumas substituições ou alterações reversas em variantes humanizadas de Hu18C5 (conservadoras ou não conservadoras) não têm um efeito substancial sobre a afinidade ou potência de ligação do mAb humanizado, isto é, a sua capacidade de se ligar a TTR monomérica (por exemplo, a potência em alguns ou todos os ensaios descritos nos presentes exemplos da variante de anticorpo

18C5 humanizado é essencialmente o mesmo, isto é, dentro do erro experimental, como o anticorpo murino 18C5). D. Anticorpos Quiméricos e com Superfície Modificada

[0252] A invenção fornece ainda formas quiméricas e com superfície modificada de anticorpos não humanos, particularmente os anticorpos 18C5 dos exemplos.

[0253] Um anticorpo quimérico é um anticorpo em que as regiões variáveis de cadeia leve e pesada maduras de um anticorpo não-humano (por exemplo, um camundongo), são combinadas com as regiões constantes de cadeia leve e pesada humanas. Tais anticorpos substancialmente ou completamente mantém a especificidade de ligação do anticorpo de camundongo e possuem cerca de dois terços de sequência humana. Em uma modalidade, um anticorpo quimérico 18C5 tem uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada madura de SEQ ID NO: 81, uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve madura da SEQ ID NO: 87, uma sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada humana da SEQ ID NO: 17, e uma sequência de aminoácidos da região constante de cadeia leve humana da SEQ ID NO: 19.

[0254] Um anticorpo com superfície modificada é um tipo de anticorpo humanizado que retém algumas e, normalmente, todas as CDR e alguns dos resíduos de framework de região variável não humana de um anticorpo não- humano, mas substitui outros resíduos de framework de região variável que podem contribuir para epítopos de célula B- ou T, por exemplo, os resíduos expostos (Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991) com resíduos das posições correspondentes de uma sequência de anticorpo humano. O resultado é um anticorpo em que as CDRs são totalmente ou substancialmente de um anticorpo não humano e as estruturas de região variável do anticorpo não humano são feitas mais humanas pelas substituições. As formas com superfície modificada do anticorpo 18C5 estão incluídas na invenção. E. Anticorpos Humanos

[0255] Anticorpos humanos contra a TTR monomérico ou um seu fragmento (por exemplo, os resíduos de aminoácidos 101-109 (SEQ ID NO: 30) de TTR) são proporcionados por uma variedade de técnicas descritas abaixo. Alguns anticorpos humanos são selecionados por experimentos de ligação competitiva, pelo método de Winter de exibição em fagos, acima ou de outro modo, tendo a mesma especificidade de epítopo que um anticorpo de camundongo em particular, tal como um dos anticorpos monoclonais de camundongo descritos nos exemplos. Os anticorpos humanos também podem ser rastreados para especificidade do epítopo particular usando apenas um fragmento de TTR, tal como uma variante de TTR contendo apenas resíduos de aminoácidos 101-109 de TTR, como o antígeno alvo e/ou criando anticorpos contra uma coleção de variantes TTR, tais como variantes TTR contendo várias mutações nos resíduos de aminoácidos 101-109 de TTR.

[0256] Os métodos para a produção de anticorpos humanos incluem o método de trioma de Oestberg et al., Hibridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, Patente US Nº 4.634.664; e Engleman et al., Patente US 4.634.666, uso de camundongos transgênicos incluindo genes de imunoglobulina humana (vide, por exemplo,., Lonberg et al., WO93/12227 (1993); US 5.877.397; US 5.874.299; US

5.814.318; US 5.789.650; US 5.770.429; US 5.661.016; US 5.633.425; US

5.625.126; US 5.569.825; US 5.545.806; Neuberger, Nat. Biotechnol. 14:826 (1996); e Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)) e métodos de exibição de fagos (veja, por exemplo, Dower et al., WO 91/17271; McCafferty et al., WO 92/01047; US

5.877.218; US 5.871.907; US 5.858.657; US 5.837.242; US 5.733.743; e US

5.565.332). F. Seleção da Região Constante

[0257] As regiões variáveis das cadeias pesada e leve de anticorpos quiméricos, com superfície modificada ou humanizados podem ser ligadas a pelo menos uma porção de uma região constante humana. A escolha de uma região constante depende, em parte, da citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos, fagocitose celular dependente de anticorpo e/ou citotoxicidade dependente de complemento serem desejadas. Por exemplo, os isotipos humanos IgG1 e IgG3 têm citotoxicidade dependente de complemento e os isotipos humanos IgG2 e IgG4 não. IgG1 e IgG3 humanos também induzem funções efetoras mediadas por células mais fortes do que IgG2 e IgG4 humanos. As regiões constantes de cadeia leve podem ser lambda ou kappa. As convenções de numeração para regiões constantes incluem a numeração da UE (Edelman, GM et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969)), numeração de Kabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, numeração exclusiva de IMGT (Lefranc M.-P. et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains, Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005), e numeração IMGT de exons (Lefranc, supra).

[0258] Um ou vários aminoácidos no terminal amino ou carboxi da cadeia leve e/ou cadeia pesada, tal como a lisina do terminal C da cadeia pesada, podem estar faltando ou derivatizados em uma proporção ou na totalidade das moléculas. As substituições podem ser feitas nas regiões constantes para reduzir ou aumentar a função efetora, tais como citotoxicidade mediada pelo complemento ou ADCC (ver, por exemplo, Winter et al., Patente US Nº. 5.624.821; Tso et al., Patente US Nº 5.834.597; e Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006) ou para prolongar a meia-vida em humanos (vide, por exemplo, Hinton et al., J. Bol. Chem. 279:6213, 2004). As substituições exemplificativas incluem uma Gln na posição 250 e/ou uma Leu na posição 428 (numeração da UE é usada neste parágrafo para a região constante) para aumentar a meia-vida de um anticorpo. A substituição em qualquer ou todas as posições 234, 235, 236 e/ou 237reduz a afinidade para os receptores Fcy, particularmente o receptor FcyRI ( vide , por exemplo , US

6.624.821). Uma substituição de alanina nas posições 234, 235, e 237 da IgG1 humana pode ser usada para reduzir as funções efetoras. Alguns anticorpos têm substituição de alanina nas posições 234, 235 e 237 da IgG1 humana para reduzir as funções efetoras. Opcionalmente, as posições 234, 236 e/ou 237 em IgG2 humana são substituídas com alanina e a posição 235 com glutamina (vide, por exemplo, US 5.624.821). Em alguns anticorpos, uma mutação numa ou mais das posições 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329 e 331 por numeração EU de IgG1 humana é usada. Em alguns anticorpos, uma mutação numa ou mais das posições 318, 320, e 322 por numeração EU de IgG1 humana é usada. Em alguns anticorpos, as posições 234 e/ou 235 são substituídas com alanina e/ou a posição 329 é substituída por glicina. Em alguns anticorpos, as posições 234 e 235 são substituídas com alanina, tal como em SEQ ID NO: 27. Em alguns anticorpos, o isotipo é IgG2 ou IgG4 humanas.

[0259] Uma região constante de kappa de cadeia leve humana exemplar tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. A arginina N-terminal da SEQ ID NO: 24 pode ser omitida, caso em que a região constante de kappa de cadeia leve tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25. Uma região constante de cadeia pesada de IgG1 humana exemplar possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 (com ou sem a lisina C-terminal). Anticorpos podem ser expressos como tetrâmeros que contém duas cadeias leves e duas pesadas, como distintas cadeias pesadas, leves, como Fab, Fab', F(ab') 2 e Fv, ou como anticorpos de cadeia única, em que domínios variáveis de cadeia leve e pesada maduros são ligados através de um espaçador.

[0260] Regiões constantes humanas mostram uma variação alotípica e uma variação isoalotípica entre indivíduos diferentes, isto é, as regiões constantes podem diferir de indivíduo para indivíduo em uma ou mais posições polimórficas. Isoaolotipos diferem dos alotipos em que os soros que reconhecem um isoalotipo se ligam a uma região não polimórfica de um ou mais outros isótipos. Assim, por exemplo, uma outra região constante de cadeia pesada é alotipo G1m3 de IgG1 e tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22. Outra região constante da cadeia pesada do alotipo IgG1 G1m3 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23 (com ou sem a lisina C-terminal). A referência a uma região constante humana inclui uma região constante com qualquer alótipo natural ou qualquer permutação de resíduos que ocupam posições em alotipos naturais. G. Expressão de anticorpos recombinantes

[0261] São conhecidos vários métodos para produzir anticorpos quiméricos e humanizados utilizando uma linha celular que expressa anticorpo (por exemplo, hibridoma). Por exemplo, as regiões variáveis de imunoglobulina de anticorpos podem ser clonadas e sequenciadas utilizando métodos bem conhecidos. Em um método, a região VH variável da cadeia pesada é clonada por RT-PCR usando mRNA preparado a partir de células de hibridoma. Os primers de consenso são usados para o peptídeo líder da região VH abrangendo o códon de iniciação da tradução como o primer 5' e um primer 3' específico das regiões constantes de g2b. Os exemplos de iniciadores são descritos na publicação de patente US 2005/0009150 de Schenk et al. (a seguir "Schenk"). As sequências de múltiplos clones independentemente derivados podem ser comparadas para garantir que não sejam introduzidas alterações durante a amplificação. A sequência da região VH também pode ser determinada ou confirmada pelo sequenciamento de um fragmento VH obtido por metodologia 5' RACE RT-PCR e o primer específico 3' de g2b.

[0262] A região VL variável da cadeia leve pode ser clonada de maneira análoga. Em uma abordagem, um conjunto de primers de consenso é projetado para amplificação de regiões VL usando um primer 5' projetado para hibridar com a região VL abrangendo o códon de iniciação da tradução e um primer 3' específico para a região Ck a jusante da região de junção V-J. Em uma segunda abordagem, a metodologia 5'RACE RT-PCR é usada para clonar um cDNA codificador de VL. Os exemplos de iniciadores são descritos em Schenk, supra. As sequências clonadas são então combinadas com sequências que codificam regiões constantes humanas (ou outras espécies não humanas). As sequências exemplificativas que codificam regiões constantes humanas incluem SEQ ID NO: 32, que codifica uma região constante de IgG1 humana e SEQ ID NOs: 33 e 34, que codificam uma região constante de cadeia leve kappa humana.

[0263] Em uma abordagem, as regiões variáveis da cadeia pesada e leve são re-manipuladas para codificar as sequências de doadores de emenda a jusante das respectivas junções VDJ ou VJ e são clonadas em um vetor de expressão de mamífero, como pCMV-hγ1 para a cadeia pesada e pCMV-Mcl para a cadeia leve. Estes vetores codificam humanos γ1 e Ck como fragmentos exônicos a jusante de cassete da região variável inserida. Seguindo a verificação da sequência, os vetores de expressão da cadeia pesada e da cadeia leve podem ser cotransfectados em células CHO para produzir anticorpos quiméricos. O meio condicionado é coletado 48 horas após a transfecção e ensaiado por análise Western Blot para produção de anticorpos ou ELISA para ligação ao antígeno. Os anticorpos quiméricos são humanizados como descrito acima.

[0264] Os anticorpos quiméricos, com superfície modificada, humanizados e humanos são tipicamente produzidos por expressão recombinante. Os construtos de polinucleotídeos recombinantes tipicamente incluem uma sequência de controle de expressão ligada operacionalmente às sequências de codificação de cadeias de anticorpo, incluindo elementos de controle de expressão associados de forma natural ou heteróloga, tais como um promotor. As sequências de controle de expressão podem ser sistemas promotores em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas. Uma vez que o vetor for incorporado no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido em condições adequadas para expressão de um elevado nível de sequências de nucleotídeos e da coleta e purificação dos anticorpos de reação cruzada.

[0265] Estes vetores de expressão geralmente são replicáveis em organismos hospedeiros como epissomas ou como parte integral do NHA cromossômico hospedeiro. Normalmente, os vetores de expressão contêm marcadores de seleção, por exemplo, de resistência à ampicilina ou resistência à higromicina, para permitir a detecção das células transformadas com as sequências de DNA desejadas.

[0266] E. coli é um hospedeiro procariótico útil para a expressão de anticorpos, particularmente os fragmentos de anticorpo. Os micróbios, tais como levedura, também são úteis para expressão. Saccharomyces é um hospedeiro com vetores adequados tendo sequências de controle de expressão, uma origem de replicação, sequências de terminação e semelhantes, conforme desejado. Os promotores típicos incluem 3-fosfoglicerato quinase e outras enzimas glicolíticas. Os promotores de levedura induzíveis incluem, dentre outros, promotores de álcool desidrogenase, isocitocromo C e as enzimas responsáveis pela utilização da maltose e da galactose.

[0267] As células de mamíferos podem ser utilizadas para expressar os segmentos de nucleotídeos que codificam as imunoglobulinas ou seus fragmentos. Vide Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Uma variedade de linhagens celulares hospedeiras adequadas capazes de secretar proteínas heterólogas intactas foram desenvolvidas e incluem as linhagens de células CHO, várias linhagens celulares COS, células HeLa, células HEK293, células L e mielomas não-produtores de anticorpos, incluindo SP2/0 e NS0. As células podem ser não-humanas. Os vetores de expressão para essas células podem incluir sequências de controle de expressão, tais como uma origem de replicação, um promotor, um potencializador (Queen et al., Immunol. Rev. Rev.

89:49 (1986)) e locais de informação de processamento necessários, como locais de ligação de ribossomos, locais de divisão de RNA, locais de poliadenilação e sequências de terminação transcricional. As sequências de controle de expressão adequadas são os promotores derivados de genes endógenos, citomegalovírus, SV40, adenovírus, vírus do papiloma bovino e semelhantes. Vide Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992).

[0268] Alternativamente, as sequências de codificação do anticorpo podem ser incorporadas em transgenes para introdução no genoma de um animal transgênico e subsequente expressão no leite do animal transgênico (ver, por exemplo,, Pat. US Nº 5.741.957; Pat US Nº 5.304.489; e Pat. US Nº 5.849.992). Os transgenes adequados incluem sequências de codificação para cadeias leves e ou pesadas ligadas operativamente com um promotor e potenciador de um gene específico de glândula mamária, tal como caseína ou beta lactoglobulina.

[0269] Os vetores contendo os segmentos de DNA de interesse podem ser transferidos para a célula hospedeira por métodos dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção de cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, enquanto que o tratamento com fosfato de cálcio, eletroporação, lipofecção, biolítica ou transfecção baseada em vírus pode ser usado para outros hospedeiros celulares. Outros métodos utilizados para transformar células de mamíferos incluem o uso de polibreno, fusão de protoplastos, lipossomas, eletroporação e microinjeção. Para a produção de animais transgênicos, os transgenes podem ser microinjetados em oócitos fertilizados ou podem ser incorporados no genoma de células-tronco embrionárias e os núcleos dessas células são transferidos para oócitos enucleados.

[0270] Uma vez que vetor(es) que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpo sejam introduzidos em cultura de células, agrupamentos de células podem ser triados para uma produtividade de crescimento e qualidade do produto em meio isento de soro. Agrupamentos de células produtoras superiores podem então ser submetidos a uma clonagem de célula simples baseada em FACS para gerar linhagens monoclonais. Podem ser usadas produtividades específicas superiores a 50 pg ou 100 pg por célula por dia, que correspondem a títulos de produtos de maior do que 7,5 g/L de cultura. Os anticorpos produzidos por clones de células individuais também podem ser testados quanto às propriedades de turvação, de filtragem, PAGE, IEF, varredura UV, HP-SEC, o mapeamento de carboidrato-oligossacarídeo, espectrometria de massa e ensaio de Bining, como ELISA ou Biacore. Um clone selecionado pode então ser depositado em vários frascos e armazenado em congelamento para uso posterior.

[0271] Uma vez expressos, os anticorpos podem ser purificados de acordo com os procedimentos padrão da técnica, incluindo a captura da proteína A, purificação por HPLC, cromatografia em coluna, eletroforese em gel e semelhantes (ver geralmente, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).

[0272] Podem ser utilizadas metodologias para a produção comercial de anticorpos, incluindo otimização de códons, seleção de promotores, seleção de elementos de transcrição, seleção de terminadores, clonagem de células isoladas isentas de soro, banco celular, uso de marcadores de seleção para amplificação do número de cópias, terminador CHO, ou melhoria dos títulos de proteínas (ver, por exemplo,., US 5.786.464; US 6.114.148; US 6.063.598; US 7.569.339; W02004/050884; W02008/012142; W02008/012142; W02005/019442; W02008/107388; W02009/027471; e US 5.888.809). IV. Imunógenos ativos

[0273] A invenção também fornece métodos para tratar ou efetuar profilaxia de uma amiloidose mediada por transtiretina em um sujeito, compreendendo a administração de um agente indutor de uma resposta imune compreendendo anticorpos contra TTR. O agente pode induzir anticorpos por si só e/ou quando ligado a um carreador e/ou na presença de um adjuvante. Tal agente usado para imunização ativa serve para induzir em um paciente os mesmos tipos de anticorpos descritos em ligação com a imunização passiva acima. Alguns desses métodos incluem a administração a um sujeito de um imunógeno compreendendo um epítopo ao qual o anticorpo 18C5 se liga especificamente em um regime eficaz para gerar anticorpos para a TTR. Em alguns métodos, um imunógeno compreende um peptídeo de TTR de até 20 aminoácidos contíguos ao qual o anticorpo 18C5 se liga especificamente em TTR. Em alguns métodos, o imunógeno compreende um peptídeo TTR de até 20 aminoácidos contíguos dos resíduos 89-127 de TTR. Em alguns métodos, o imunógeno compreende um peptídeo TTR de até 11 aminoácidos contíguos dos resíduos 100-110 de TTR. Em alguns métodos, o imunógeno compreende um peptídeo de TTR de até 9 aminoácidos contíguos dos resíduos 101-109 de TTR. Em alguns métodos, o epítopo peptídico da TTR consiste em 4-11 aminoácidos contíguos dos resíduos 89-127 de TTR. Em alguns métodos, o epítopo peptídico de TTR consiste em 4-11 aminoácidos contíguos dos resíduos 100-110 de TTR. Em alguns métodos, o epítopo peptídico de TTR consiste em 4-9 aminoácidos contíguos dos resíduos 101-109 de TTR. Alguns peptídeos de TTR usados como imunógenos não possuem um epítopo de célula T. Tais peptídeos estão ligados a um carreador heterólogo para fornecer um epítopo de célula T.

[0274] Para induzir anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo ou sobrepondo-se a 18C5, a especificidade do epítopo destes anticorpos pode ser mapeada (por exemplo, testando-se a ligação a uma série de peptídeos sobrepostos que atravessam a TTR). Um fragmento de TTR que consiste em ou inclui o ou se sobrepõe ao epítopo pode então ser usado como imunógeno.

[0275] Opcionalmente, os peptídeos de TTR estão ligados a um carreador heterólogo e/ou administrado em combinação com um adjuvante para ajudar a obter anticorpos. O carreador heterólogo e o adjuvante, se utilizados, podem ser os mesmos utilizados para gerar anticorpos monoclonais, mas também podem ser selecionados para uma melhor adequação farmacêutica para uso em humanos. Os carreadores adequados incluem albuminas de soro, hemocianina de lapa californiana, moléculas de imunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina, toxoide do tétano ou um toxoide de outras bactérias patogênicas, tais como difteria (por exemplo, CRM197), E. coli, cholera ou H. pylori, ou um derivado atenuado da toxina. Os epítopos de células T também são moléculas carreadoras adequadas. Alguns conjugados podem ser formados ligando-se agentes da invenção a uma molécula polimérica imunoestimuladora ( por exemplo , cisteína tripalmitoil-S- glicerina (Pam3Cys), manana (um polímero de manose), ou glucano (um polímero β1→ 2)), citocinas ( por exemplo , IL-1, IL-1 alfa e peptídeos β, IL-2, γ-INF, IL-10, GM-CSF) e quimiocinas ( por exemplo , MIP1-α e β e RANTES). Os imunógenos podem estar ligados aos portadores com ou sem espaçadores de aminoácidos (por exemplo, gly-gly). Portadores adicionais incluem partículas semelhantes a um vírus. As partículas semelhantes a um vírus (VLPs), também denominadas pseudovírus ou partículas derivadas de vírus, representam estruturas de subunidades compostas por várias cópias de um capsídeo viral e/ou de uma proteína de envelope capaz de se automontar nas VLPs de uma simetria esférica definida in vivo. (Powilleit, et al., (2007) PLoS ONE 2(5):e415.) Em alternativa, as células T de peptídeos podem ser ligados a pelo menos um epítopo celular capaz de se ligar a uma grande proporção das moléculas de MHC de classe II, como o epítopo pan DR ("PADRE"). O PADRE é descrito nos documentos: US 5.736.142, WO 95/07707 e Alexander J et al, Immunity, 1: 751-761 (1994). Os imunógenos ativos podem ser apresentados na forma multimérica em que várias cópias de um imunógeno e/ou o seu transportador são apresentados como uma molécula covalente simples.

[0276] Os fragmentos normalmente são administrados com adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. O adjuvante aumenta o título dos anticorpos induzidos e/ou a afinidade de ligação dos anticorpos induzidos em relação à situação, se o péptido for utilizado sozinho. Uma variedade de adjuvantes pode ser usada em combinação com um fragmento imunogênico de TTR para induzir uma resposta imune. Os adjuvantes preferidos para aumentar a resposta intrínseca a um imunógeno sem causar mudanças conformacionais do imunógeno que afetam a forma qualitativa da resposta. Exemplos de adjuvantes incluem sais de alumínio, como hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, lipídio de 3-De-O-acilado monofosforil A (MPLTM) (vide GB 2220211 (RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, agora parte de Corixa). StimulonTM QS-21 é um glicosídeo triterpeno ou saponina isolada da casca da árvore Quillaja Saponaria Molina encontrada na América do Sul (vide Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, Nova Iorque, 1995); US 5057540), (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA; agora Antigenics , Inc., Nova York, NY). Outros adjuvantes são óleo em emulsões de água (como esqualeno ou óleo de amendoim), opcionalmente, em combinação com estimulantes imunes, tais como monofosforil lipídio A (vide Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)), polímeros plurônicos e micobactérias mortas. Os adjuvantes de Ribi são emulsões de óleo em água. Ribi contém um óleo metabolizável (esqualeno) emulsionado com solução salina contendo Tween 80. Ribi também contém produtos micobacterianos refinados que agem como imunoestimulantes e monofosforil-lipídio bacteriano A. Outro adjuvante é o CpG (documento WO 98/40100). Os adjuvantes podem ser administrados na forma de um componente de uma composição terapêutica com agente ativo ou podem ser administrados separadamente, antes, concorrentemente com ou após a administração do agente terapêutico.

[0277] Análogos de fragmentos naturais d TTR que induzem anticorpos contra TTR também podem ser usados. Por exemplo, um ou mais ou todos os L- aminoácidos podem ser substituídos por aminoácidos D nesses peptídeos. A ordem dos aminoácidos também pode ser invertida (retro peptídeo). Opcionalmente, um peptídeo inclui todos os aminoácidos D na ordem inversa (peptídeo retro-inverso). Os peptídeos e outros compostos que não têm necessariamente uma semelhança de sequência de aminoácidos significativa com os peptídeos de TTR , porém servem como miméticos dos peptídeos de TTR e induzem uma resposta imune similar. Também podem ser usados anticorpos anti-idiotípicos contra os anticorpos monoclonais para TTR, como descrito acima. Esses anticorpos anti-Id mimetizam o antígeno e geram uma resposta imunológica para ele (ver Essential Immunology, Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, CA, 6ª ed., p. 181).

[0278] Os peptídeos (e opcionalmente um transportador fundido ao peptídeo) também podem ser administrados na forma de um ácido nucleico que codifica o peptídeo e é expressado in sito em um paciente. Um segmento de ácido nucleico que codifica um imunógeno normalmente está ligado a elementos reguladores, como um promotor e um intensificador, que permitem a expressão do segmento de DNA nas células alvo desejadas em um paciente. Para expressão em células sanguíneas, como é desejável para indução de uma resposta imunológica, os elementos promotores e intensificadores dos genes de imunoglobulina de cadeia leve ou pesada, ou o promotor e o intensificador iniciais do intermediário principal de CMV, são adequados para direcionar a expressão. Os elementos reguladores ligados e as sequências de codificação normalmente são clonados em um vetor. Os anticorpos também podem ser administrados na forma de ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesada e/ou leve do anticorpo. Se ambas as cadeias, pesada e leve, estiverem presentes, as cadeias estão preferencialmente ligadas na forma de um anticorpo de cadeia simples. Os anticorpos para administração passiva também podem ser preparados, por exemplo, por cromatografia de afinidade sérica de pacientes tratados com imunógenos peptídicos.

[0279] O DNA pode ser administrado na forma pura (isto é, sem materiais coloidais ou encapsulantes). Em alternativa, podem ser utilizados vários sistemas de vetores virais, incluindo sistemas retrovirais (vide, por exemplo, Lawrie e Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)); vetores adenovirais (ver, por exemplo, Bett et al., J. Virol. 67, 591 1 (1993)); vetores de vírus adeno-associados (ver, por exemplo, Zhou et al., J. Exp. Med. 179, 1867 (1994)), vetores virais da família da varíola, incluindo o vírus vaccinia e os vírus da varíola aviária, vetores virais do gênero alfa vírus, como os derivados dos vírus da floresta de Sindbis e Semliki (ver, por exemplo, Dubensky et al., J. Virol. 70, 508-519 (1996)), vírus da encefalite equina venezuelana (ver US 5.643.576) e rabdovírus, como vírus da estomatite vesicular (ver WO 96/34625) e papilomavírus (Ohe et al., Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995), Woo et al., WO 94/12629 e Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)).

[0280] O DNA que codifica um imunógeno, ou um vetor que o contém, pode ser empacotado em lipossomas. Os lipídios adequados e análogos relacionados são descritos nos documentos US 5.208.036, US 5.264.618, US 5.279.833 e US

5.283.185. Os vetores e o DNA que codifica um imunógeno também podem ser adsorvidos ou associados a carreadores particulados, cujos exemplos incluem polímeros de polimetilmetacrilato, polilactidas e poli(lactida-co-glicólidos) (ver, por exemplo, McGee et al., J. Micro Encap. 1996). H. Ensaios de Triagem de Anticorpos

[0281] Os anticorpos podem ser sujeitos a várias triagens, incluindo ensaios de ligação, triagens funcionais, triagens em modelos animais de doenças associadas a depósitos de TTR e ensaios clínicos. Os ensaios de ligação testam quanto à ligação específica e, opcionalmente, afinidade e especificidade do epítopo em relação à TTR monomérica ou um fragmento desta. Por exemplo, os ensaios de ligação podem triar anticorpos que se ligam aos resíduos de aminoácidos 101- 109 (SEQ ID NO: 30) de TTR, que é um epítopo que está oculto no tetrâmero TTR nativo e exposto em formas de fibrila de TTR monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas. Os imunógenos ativos também podem ser selecionados quanto à capacidade de induzir anticorpos com essa especificidade de ligação. Neste caso, um imunógeno ativo é utilizado para imunizar um animal de laboratório e o soro resultante é testado quanto à especificidade de ligação apropriada. Os anticorpos também podem ser triados quanto à capacidade de se ligar a conformações pré-fibrilares e não nativas das fibrilas amiloides TTR e TTR, mas não as conformações TTR nativas. Por exemplo, os anticorpos podem ser triados quanto à capacidade de se ligar a formas monoméricas de TTR criadas por dissociação ou desagregação de TTR tetramérica nativa e podem ser contra-triados em relação à TTR tetramérica nativa, conforme descrito nos exemplos ou de outra forma. Da mesma forma, os anticorpos também podem ser triados quanto à sua imunorreatividade em tecido de amiloidose mediada por TTR, mas não em tecido saudável. Essas triagens são, por vezes, realizadas em competição com um anticorpo exemplificativo, como um anticorpo com as regiões variáveis de 18C5 ou isotipo de kappa de IgG1. Opcionalmente, o anticorpo ou a TTR alvo é imobilizada nesse ensaio.

[0282] Os ensaios funcionais podem ser realizados em modelos celulares incluindo células que expressam naturalmente TTR ou transfectadas com DNA que codifica TTR ou um fragmento desta. As células adequadas incluem células derivadas de tecido cardíaco ou outros tecidos afetados pela amiloidogênese TTR. As células podem ser triadas quanto aos níveis reduzidos de formas monoméricas, dobradas, agregadas ou fibrilas de TTR ( por exemplo, por Western blotting ou imunoprecipitação de extratos ou sobrenadantes de células) ou toxicidade reduzida atribuível a formas monoméricas, dobradas, agregadas ou fibrilas de TTR. Por exemplo, os anticorpos podem ser testados quanto à capacidade de inibir ou reduzir a agregação de TTR, inibir ou reduzir a formação de fibrila TTR, reduzir os depósitos de TTR, TTR agregado claro ou estabilizar conformações não tóxicas de TTR.

[0283] Outros ensaios funcionais podem ser realizados em solução, tais como testar se um anticorpo é capaz de interromper ou reduzir a formação de fibrila de TTR quando a TTR monomérica ou intermediários da TTR dobrada incorretamente em solução são postos em contato com o anticorpo. A extensão da formação de fibrila pode ser avaliada por medições de turvação, por exemplo, a 400 nm num espectrômetro UV-visível equipado com uma unidade de controle de temperatura. Tioflavina-T também pode ser usada para avaliar a extensão da formação de fibrilas amiloides. Por exemplo, um excesso molar de cinco vezes de Thioflavin-T pode ser adicionado às amostras de TTR e deixado à temperatura ambiente durante 30 minutos antes das medidas serem tomadas. A fluorescência de tioflavina-T pode ser monitorada usando um espectrofluorímetro. Ver US 2014/0056904.

[0284] As triagens de modelos de animais testam a capacidade do anticorpo ou imunógenos ativos para tratar, de forma terapêutica ou profilática, sinais ou sintomas em um modelo animal simulando uma doença humana associada ao acúmulo de TTR ou depósitos de TTR. Tais doenças incluem tipos de amiloidose TTR, como a amiloidose ATTR de tipo selvagem (também chamada amiloidose sistêmica senil SSA), amiloidose cardíaca senil (SCA), polineuropatia amiloide familiar (FAP), miocardiopatia amiloide familiar (FAC) e amiloidose seletiva do sistema nervoso central (CNSA). Sinais ou sintomas adequados que podem ser monitorados incluem a presença e extensão de depósitos amiloides em vários tecidos, como o trato gastrointestinal ou coração. Os imunógenos ativos também podem ser testados quanto à indução de anticorpos no soro. A extensão da redução dos depósitos de amiloides pode ser determinada pela comparação com um controle apropriado, como o nível de depósitos de amiloides de TTR em animais de controle que receberam um anticorpo de controle (por exemplo, um anticorpo de controle pareado com isotipo) ou imunógeno de controle, um placebo ou nenhum tratamento. Um modelo de animal exemplificativo para testar a atividade contra uma amiloidose TTR é um modelo de camundongo portanto uma mutação nula no locus de Ttr de camundongo endógeno e o gene TTR mutante humano que compreende uma mutação V30M que está associada à polineuropatia amiloidótica familiar. Ver, por exemplo, Kohno et al., Am. J. Path. 150(4):1497-1508 (1997); Cardoso e Saraiva, FASEB J 20(2):234-239 (2006). Existem modelos semelhantes, incluindo outros modelos para versões familiares da amiloidose TTR e modelos para versões esporádicas da amiloidose TTR. Ver, por exemplo, Teng et al., Lab. Invest. 81(3): 385-396 (2001); Ito and Maeda, Mouse Models of Transthyretin Amyloidosis, in Recent Advances in Transthyretin Evolution, Structure, and Biological Functions,

pp. 261-280 (2009) (Springer Berlin Heidelberg). Os animais transgênicos podem incluir um transgene de TTR humana, como um transgene de TTR com mutação associada à amiloidose TTR ou um transgene de TTR de tipo selvagem. Para facilitar o teste em modelos animais, podem ser utilizados anticorpos quiméricos com uma região constante apropriada para o modelo animal (por exemplo, quimeras camundongo-rato poderiam ser usadas para testar anticorpos em ratos). Pode concluir-se que uma versão humanizada de um anticorpo será eficaz se o anticorpo de camundongo ou o anticorpo quimérico correspondente for eficaz num modelo animal apropriado e o anticorpo humanizado tenha afinidade de ligação semelhante (por exemplo, dentro de um erro experimental, como por um fator de 1,5, 2 ou 3).

[0285] Teste de ensaios clínicos para segurança e eficácia em um ser humano com uma doença associada à amiloidose TTR. I. Ácidos Nucleicos

[0286] A invenção também fornece ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das cadeias pesada e leve descritas acima (por exemplo, SEQ ID NOs: 2, 4, 18 e 20). Opcionalmente, esses ácidos nucleicos codificam ainda um peptídeo sinal e podem ser expressos com o peptídeo de sinal ligado à região constante (por exemplo, peptídeos de sinal tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 35 (cadeia pesada) e 37 (cadeia leve) que podem ser codificado pelas SEQ ID NOs: 36 (cadeia pesada) e 38 (cadeia leve), respectivamente. As sequências de codificação dos ácidos nucleicos podem estar ligadas operacionalmente com sequências reguladoras para assegurar a expressão das sequências de codificação, tais como um promotor, intensificador, sítio de ligação ao ribossoma, sinal de terminação da transcrição e semelhantes. Os ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesada e leve podem ocorrer na forma isolada ou podem ser clonados em um ou mais vetores. Os ácidos nucleicos podem ser sintetizados, por exemplo, pela síntese de estado sólido ou por PCR de oligonucleotídeos sobrepostos. Os ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesadas e leves podem ser unidos como um ácido nucleico contíguo, por exemplo, dentro de um vetor de expressão, ou podem ser separados, por exemplo, cada um clonado no seu próprio vetor de expressão.

J. Anticorpos Conjugados

[0287] Os anticorpos conjugados que se ligam especificamente aos antígenos expostos em formas patogênicas de TTR, mas não nas formas tetraméricas nativas de TTR, tais como os resíduos de aminoácidos 101-109 (SEQ ID NO: 30) de TTR, são úteis na detecção da presença de monomérica, misfolded, agregados, ou formas de fibrilas de TTR; monitorando e avaliando a eficácia de agentes terapêuticos utilizados para tratar pacientes diagnosticados com amiloidose TTR; inibir ou reduzir agregação de TTR; inibindo ou reduzindo a formação de fibrilas TTR; reduzindo ou eliminando depósitos de TTR; estabilização de conformação não tóxica de TTR; ou tratamento ou realização de profilaxia de uma amiloidose TTR em um paciente. Por exemplo, estes anticorpos podem ser conjugados com outras frações terapêuticas, outras proteínas, outros anticorpos e/ou marcadores detectáveis. Ver WO 03/057838; US 8.455.622.

[0288] As frações terapêuticas conjugadas podem ser qualquer agente que possa ser usado para tratar, combater, melhorar, prevenir ou melhorar uma condição ou doença indesejada em um paciente, como uma amiloidose TTR. As frações terapêuticas podem incluir, por exemplo, imunomoduladores ou quaisquer agentes biologicamente ativos que facilitem ou potencializem a atividade do anticorpo. Um imunomodulador pode ser qualquer agente que estimula ou inibe o desenvolvimento ou a manutenção de uma resposta imunológica. Se tais frações terapêuticas estiverem acopladas a um anticorpo específico para formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR, tais como os anticorpos descritos neste documento, as frações terapêuticas acopladas terão uma afinidade específica para formas patogênicas não nativas de TTR sobre formas tetraméricas nativas de TTR. Consequentemente, a administração dos anticorpos conjugados direciona diretamente tecidos que compreendem formas patogênicas de TTR com danos mínimos ao tecido normal e saudável circundante. Isso pode ser particularmente útil para frações terapêuticas que são demasiado tóxicas para serem administradas isoladamente. Além disso, podem-se utilizar quantidades menores das frações terapêuticas.

[0289] Exemplos de frações terapêuticas adequadas incluem drogas que reduzem os níveis de TTR, estabilizam a estrutura tetramérica nativa de TTR,

inibem a agregação da TTR, interrompem a formação de fibrila ou amiloide da TTR ou neutralizam a toxicidade celular. Ver, por exemplo, Almeida e Saraiva, FEBS Letters 586:2891-2896 (2012); Saraiva, FEBS Letters 498:201-203 (2001); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013); Ruberg and Berk, Circulation 126:1286-1300 (2012); Johnson et al., J. Mol. Biol. 421(2-3):185-203 (2012, Ueda and Ando, Translational Neurodegeneration 3:19 (2014), and Hawkins et al. Annals of Medicine 47:625-638 (2015)). Por exemplo, os anticorpos podem ser conjugados com tafamidis, diflunisal, AGIO, ALN-TTR01, ALNTTR02, oligonucleotídeos antisense, como IONIS TTRRx (inotersen), siRNAs como patisiran ou revusiran, doxiciclina (doxy), ácido tauroursodeoxicólico (TUDCA), Doxy- TUDCA, ciclodextrina (CyD), 4'-iodo-4'-desoxidoxorrubicina (IDOX), galato de epigalocatequina (EGCG), curcumina, resveratrol (3,5,4'-tri-hidroxiestilbeno) ou anticorpos para o componente P amiloide sérico (SAP). Outras frações terapêuticas representativas incluem outros agentes que se sabe serem úteis para o tratamento, controle ou melhoria de uma amiloidose por TTR ou sintomas de uma amiloidose por TTR. Ver, por exemplo, Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013) for common clinical symptoms of TTR amyloidosis and typical agents used to treat those symptoms.

[0290] Os anticorpos também podem ser acoplados com outras proteínas. Por exemplo, os anticorpos podem ser acoplados com Fynomers. Fynomers são pequenas proteínas de ligação (por exemplo, 7 kDa) derivadas do domínio SH3 Fyn humano. Elas podem ser estáveis e solúveis e podem não ter resíduos de cisteína e ligações dissulfureto. Os Fynomers podem ser manipulados para se ligarem a moléculas alvo com a mesma afinidade e especificidade de anticorpos. Eles são apropriados para a criação de proteínas de fusão multiespecíficas com base em anticorpos. Por exemplo, os Fynomers pode ser fundidos com as extremidades N- terminal e/ou C-terminal dos anticorpos para criar FynomAbs bi e triespecíficos com arquiteturas diferentes. Os Fynomers podem ser selecionados utilizando-se bibliotecas de Fynomers através de tecnologias de triagem que usam FACS, Biacore e ensaios baseados em células que permitem a seleção eficiente dos Fynomers com propriedades ideais. Exemplos de Fynomers são divulgados em Grabulovski et al., J. Biol. Chem. 282:3196-3204 (2007); Bertschinger et al., Protein

Eng. Des. Sel. 20:57-68 (2007); Schlatter et al., MAbs. 4:497-508 (2011); Banner et al., Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 69(Pt6):1124-1137 (2013); e Brack et al., Mol. Cancer Ther. 13: 2030-2039 (2014).

[0291] Os anticorpos divulgados neste documento também podem ser acoplados ou conjugados com um ou mais outros anticorpos (por exemplo, para formar anticorpos heteroconjugados). Estes outros anticorpos podem ligar-se a epítopos diferentes dentro de TTR ou uma parte dele ou podem ligar-se a um antígeno alvo diferente. Tais anticorpos anti-TTR que se ligam a epítopos de TTR diferentes dos de 18C5, podem incluir anticorpos como na Tabela 3.

[0292] Os anticorpos também podem ser acoplados com um marcador detectável. Tais anticorpos podem ser usados, por exemplo, para diagnosticar uma amiloidose por TTR, para monitorar a progressão de uma amiloidose por TTR e/ou para avaliar a eficácia do tratamento. Tais anticorpos são particularmente úteis para realizar tais determinações em sujeitos que têm ou são suscetíveis a uma amiloidose por TTR, ou em amostras biológicas apropriadas obtidas a partir de tais sujeitos. Os marcadores detectáveis representativos que podem ser acoplados ou ligados a um anticorpo incluem várias enzimas, tais como a peroxidase de rabanete, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou acetilcolinesterase; grupos prostéticos, tal como estreptavidina, avidina ou biotina; materiais fluorescentes, como umbeliferona, fluores Dylight, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína diclorotriazinilamina, cloreto de dansila ou ficoeritrina; materiais luminescentes, tais como o luminol; materiais bioluminescentes, como luciferase, luciferina e aequorina; materiais radioativos, tais como ítrio 90 (90Y), radioisótopo da prata 111, radioisótopo da prata 199, Bismuto213, iodo (131I, 125I, 123I, 121I,), carbono (14C), enxofre (5S), trítio (3H), índio (115In, 113In, 112In, 111In,), tecnécio (99Tc), tálio (201Ti), gálio (68Ga, 67Ga), paládio (103Pd), molibdênio (99Mo), xenônio (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn e 117Estanho; metais que emitem pósitron, utilizando-se várias tomografias de emissão de pósitron; íons de metal paramagnético não-radioativos; e moléculas que são radiomarcadas ou conjugadas a radioisótopos específicos. Marcadores detectáveis representativos que podem ser acoplados ou ligados a um anticorpo divulgado neste documento incluem marcadores eletroquiomiluminescentes, por exemplo MSD GOLD SULFOTAG NHS-Ester (SULFO-TAG) (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD).

[0293] A ligação dos radioisótopos aos anticorpos pode ser realizada com quelatos bifuncionais convencionais. Para a ligação dos radioisótopos de prata-111 e dos radioisótopos de prata-199, podem ser usados ligantes à base de enxofre. Vide Hazra et al., Cell Biophys. 24-25:1-7 (1994). A ligação de radioisótopos de prata pode envolver a redução da imunoglobulina com ácido ascórbico. Para radioisótopos, tais como 111In e 90Y, ibibritumomab tiuxetano pode ser usado e reagirá com esses isótopos para formar 111In-ibritumomab tiuxetano e 90Y- ibritumomab tiuxetano, respectivamente. Vide Witzig, Cancer Chemother. Pharmacol., 48 Suppl 1:S91-S95 (2001).

[0294] Agentes terapêuticos, outras proteínas, outros anticorpos, e/ou marcadores detectáveis podem ser acoplados ou conjugado, direta ou indiretamente através de um intermediário (por exemplo, um ligante), a um anticorpo 18C5 murino, quimérico, com superfície modificada ou humanizado, usando-se técnicas conhecidas na técnica. Vide por exemplo., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," In: Controlled Drug Delivery (2ª Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," In Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985); e Thorpe et al., Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982). Os ligantes adequados incluem, por exemplo, ligantes cliváveis e não-cliváveis. Diferentes ligantes que liberam frações terapêuticas acopladas, proteínas, anticorpos e/ou marcadores detectáveis em condições acídicas ou de redução, quando exposto às proteases específicas ou sob outras condições definidas, podem ser empregados.

V. Aplicações Terapêuticas

[0295] Os anticorpos acima podem ser utilizados para tratar ou efetuar a profilaxia de uma doença em um paciente que tenha ou esteja em risco para a doença mediada pelo menos em parte por transtirretina (TTR) e particularmente por formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR. Embora não seja necessária uma compreensão do mecanismo para a prática, acredita-se que qualquer um ou todos os seguintes mecanismos possam contribuir para o tratamento da amiloidose por TTR usando os anticorpos acima: inibição mediada por anticorpos da agregação de TTR e formação de fibrilas, estabilização mediada por anticorpos de conformações não tóxicas de TTR (por exemplo, formas tetraméricas) ou depuração mediada por anticorpos de TTR agregada, TTR oligomérica ou TTR monomérica. Os conjugados anticorpo-droga podem ter mecanismos de ação adicionais determinados pela fração conjugada.

[0296] Os anticorpos são administrados num regime eficaz, o que significa que uma dosagem, via de administração e frequência de administração que atrasa o início, reduz a gravidade, inibe a continuação da degradação e/ou melhora, pelo menos, um sinal ou sintoma de um distúrbio a ser tratado. Se um paciente já sofre de uma doença, o regime pode ser referido como um regime terapeuticamente eficaz. Se o paciente está em risco elevado da doença em relação à população em geral, mas ainda não sente os sintomas, o regime pode ser referido como um regime profilaticamente eficaz. Em alguns casos, a eficácia terapêutica ou profilática pode ser observada em um paciente individual em relação aos controles históricos ou a experiências anteriores no mesmo paciente. Em outros casos, a eficácia terapêutica ou profilática pode ser demonstrada em um ensaio pré-clínico ou clínico em uma população de pacientes tratados em relação a uma população de pacientes não-tratados de controle.

[0297] A frequência de administração depende da meia-vida do anticorpo na circulação, a condição do paciente e da via de administração, entre outros fatores. A frequência pode ser diária, semanal, mensal, trimestral ou em intervalos irregulares em resposta a mudanças na condição ou a progressão do distúrbio do paciente sendo tratado. Uma frequência exemplificativa para a administração intravenosa é entre semanal e trimestral por uma causa contínua de tratamento,

embora uma dosagem mais ou menos frequente também seja possível. Para administração subcutânea, uma frequência de dosagem exemplificativa é diária a mensal, embora uma dosagem mais ou menos frequente também seja possível.

[0298] O número de doses administradas depende do fato de o distúrbio ser agudo ou crônico e da resposta do distúrbio ao tratamento. Para distúrbios agudos ou exacerbações agudas de um distúrbio crônico, entre 1 e 10 doses muitas vezes basta. Por vezes, uma única dose bolus, opcionalmente dividida, é suficiente para uma doença aguda ou exacerbação aguda de uma doença crônica. O tratamento pode ser repetido para a recorrência de um distúrbio agudo ou uma exacerbação aguda. Para doenças crônicas, um anticorpo pode ser administrado em intervalos regulares, por exemplo, semanal, quinzenal, mensal, trimestral, de seis em seis meses durante pelo menos 1, 5 ou 10 anos, ou por toda a vida do paciente. VI. Composições Farmacêuticas e Métodos de Uso

[0299] São fornecidos neste documento vários métodos de diagnóstico, monitorização, tratamento ou realização de profilaxia de doenças ou condições mediadas, pelo menos em parte, pela transtirretina (TTR) e, em particular, por formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR (por exemplo, amiloidose TTR). Exemplos de tais doenças incluem amiloidose familiar por TTR, como cardiomiopatia amiloide familiar (FAC) ou cardiomiopatia ou hipertrofia em atletas ou outros submetidos a exercícios aeróbicos extremos, polineuropatia amiloide familiar (FAP) ou amiloidose seletiva do sistema nervoso central (CNSA) e amiloidose esporádica por TTR, como amiloidose sistêmica senil (SSA) ou amiloidose cardíaca senil (SCA). A amiloidose por TTR também pode ser associada como causa ou resultado de várias doenças e condições caracterizadas por degeneração ou trauma de tecido ou órgão. O acúmulo de depósitos de TTR contribui para a disfunção de órgãos ou tecidos associada à doença ou condição. Um exemplo de tal condição passível de tratamento ou profilaxia com os agentes e métodos presentes é a estenose espinhal (Westermark et al., Upsala J. Medical Sciences 119, 223-238 (2014) e Yanagisawa et al., Modern Pathology 28, 201 -207 (2015). Outra doença igualmente passível de tratamento ou profilaxia é a osteoartrite (Takanashi et al., Amyloid 20, 151-155 (2013), Gu et al., Biomed & Biotechnol. 15, 92-99; Takinami et al., Biomarker Insights 8, 85-95 (2014); Akasaki et al., Arthritis Rheumatol. 67, 2097-2107 (2015). Outra doença igualmente passível de tratamento ou profilaxia é a artrite reumatoide (Clement et al., JCI Insight 1 epublish (2016)). Outra doença passível de tratamento ou profilaxia é a artrite idiopática juvenil (Sharma et al., PLoS One 9, e93905; 1-12 (2014). Outra doença passível de tratamento ou profilaxia é a degeneração macular relacionada à idade (úmida ou seca). Outra classe de condições igualmente passíveis de tratamento ou profilaxia são distúrbios dos ligamentos e tendões, como distúrbios do manguito rotador (Sueyoshi et al., Human Pathol. 42, 1259-64 (2011).

[0300] Os anticorpos descritos acima podem ser incorporados em uma composição farmacêutica para uso no tratamento ou profilaxia de qualquer uma das doenças e condições acima. Em geral, um anticorpo ou composição farmacêutica contendo um anticorpo é administrado a um sujeito em necessidade deste. Os pacientes que são passíveis de tratamento incluem indivíduos em risco de amiloidose por TTR, mas não apresentam sintomas, bem como pacientes que apresentam sintomas. Alguns pacientes podem ser tratados durante o estágio prodrômico da amiloidose por TTR.

[0301] As composições farmacêuticas podem ser administradas de forma profilática a indivíduos com risco genético conhecido de amiloidose TTR. Tais indivíduos incluem aqueles que têm parentes que experimentaram tal doença e aqueles cujo risco é determinado pela análise de marcadores genéticos ou bioquímicos (por exemplo, mutações na TTR associadas à amiloidose por TTR), incluindo o uso dos métodos de diagnóstico fornecidos neste documento. Por exemplo, existem mais de 100 mutações no gene que codifica a TTR que foram implicadas na amiloidose por TTR. Ver, por exemplo, US 2014/0056904; Saraiva, Hum. Mutat. 17(6):493-503 (2001); Damas e Saraiva, J. Struct. Biol. 130:290-299; Dwulet e Benson, Biochem. Biophys. Res. Commun. 114:657-662 (1983).

[0302] Os indivíduos que sofrem de amiloidose TTR às vezes podem ser reconhecidos a partir das manifestações clínicas da amiloidose TTR, incluindo um ou mais dos seguintes:(1) história familiar de doença neuropática, especialmente associada a insuficiência cardíaca; (2) dor neuropática ou distúrbios sensoriais progressivos de etiologia desconhecida; (3) síndrome do túnel do carpo sem causa óbvia, particularmente se for bilateral e requer liberação cirúrgica; (4) distúrbios da motilidade gastrointestinal ou disfunção do nervo autônomo de etiologia desconhecida (por exemplo, disfunção erétil, hipotensão ortostática, bexiga neurogênica); (5) doença cardíaca caracterizada por paredes ventriculares engrossadas na ausência de hipertensão; (6) bloqueio atrioventricular avançado de origem desconhecida, particularmente quando acompanhado por um coração engrossado; e (6) inclusões do corpo vítreo do tipo algodão-lã. Ver Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). O diagnóstico definitivo de amiloidose por TTR, contudo, geralmente depende de biópsias de órgãos alvo, seguido de coloração histológica do tecido excisado com corante específico de amiloide, vermelho Congo. Se for observado um teste positivo para amiloide, a coloração imunohistoquímica e a identificação espectroscópica de massa para TTR são realizadas subsequentemente para garantir que a proteína precursora responsável pela formação de amiloide seja de fato TTR. Para as formas familiares das doenças, a demonstração de uma mutação no gene que codifica TTR é então necessária antes que um diagnóstico definitivo possa ser feito.

[0303] A identificação do sujeito pode ocorrer em uma configuração clínica, ou em outro lugar, como na casa do sujeito, por exemplo, através do próprio uso do sujeito de um kit de autoteste. Por exemplo, o sujeito pode ser identificado com base em vários sintomas como neuropatia periférica (sensorial e motor), neuropatia autônoma, comprometimento gastrointestinal, cardiomiopatia, nefropatia ou deposição ocular. Ver Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). O sujeito também pode ser identificado por níveis aumentados de formas não- nativas de TTR em amostras de plasma do sujeito em comparação com amostras de controle, conforme divulgado nos exemplos.

[0304] Conforme garantido pelo histórico familiar, teste genético ou triagem médica para amiloidose por TTR, o tratamento pode começar em qualquer idade ( por exemplo, 20, 30, 40, 50, 60 ou 70 anos de idade). O tratamento tipicamente envolve doses múltiplas ao longo de um período de tempo e pode ser monitorizado por análise de anticorpos ou respostas de células T ativadas ou de células B a um agente terapêutico (por exemplo, uma forma truncada de TTR compreendendo os resíduos de aminoácidos 101-109) ao longo do tempo. Se a resposta cai, uma dose de reforço é indicada.

[0305] Em aplicações profiláticas, um anticorpo ou agente para induzir um anticorpo ou uma composição farmacêutica do mesmo é administrado a um sujeito suscetível ou de qualquer outra forma em risco de uma doença ( por exemplo, amiloidose TTR ) num regime (dose, frequência e via de administração) eficaz para reduzir o risco, diminuir a gravidade ou retardar o aparecimento de pelo menos um sinal ou sintoma da doença. Em aplicações terapêuticas, um anticorpo ou um imunógeno para induzir um anticorpo é administrado a um sujeito suspeito, ou que já sofre de uma doença ( por exemplo, amiloidose por TTR) num regime (dose, frequência e via de administração) eficaz para melhorar ou pelo menos inibir a deterioração adicional de pelo menos um sinal ou sintoma da doença.

[0306] Um regime é considerado terapeuticamente ou profilaxicamente eficaz se um sujeito tratado individual atingir um resultado mais favorável do que o resultado médio em uma população de controle de indivíduos comparáveis não tratados pelos métodos aqui descritos, ou se um resultado mais favorável for demonstrado para um regime em indivíduos tratados versus indivíduos de controle em um ensaio clínico controlado (por exemplo, uma fase II, fase II/III ou fase III) ou um modelo animal no p <0,05 ou 0,01 ou mesmo 0,001 nível.

[0307] Um regime eficaz de um anticorpo pode ser usado para, por exemplo, inibir ou reduzir a agregação de TTR em um sujeito que tenha ou esteja em risco de uma condição associada à acumulação de TTR; inibir ou reduzir a formação de fibrila TTR em um indivíduo que tenha ou esteja em risco de uma condição associada à acumulação de TTR; reduzir ou eliminar depósitos TTR ou TTR agregados em um sujeito que tenha ou esteja em risco de uma condição associada à acumulação de TTR; estabilizando conformações não tóxicas de TTR em um sujeito que tenha ou esteja em risco de uma condição associada à acumulação de TTR; inibindo os efeitos tóxicos dos agregados TTR, fibrilas ou depósitos em um sujeito que tenha ou esteja em risco de uma condição associada à acumulação de TTR; diagnosticar a presença ou ausência de acumulação de amiloide TTR em um tecido suspeitado de compreender o acúmulo amiloide; determinar um nível de depósitos de TTR num sujeito por detecção da presença de anticorpo ligado no sujeito após a administração do anticorpo; detectar a presença de formas monoméricas, misfolded, agregadas ou de fibrilas de TTR em um sujeito;

monitorar e avaliar a eficácia de agentes terapêuticos utilizados para tratar pacientes diagnosticados com amiloidose TTR; induzir uma resposta imune compreendendo anticorpos contra TTR em um indivíduo; atrasar o início de uma condição associada à acumulação de amiloide TTR em um sujeito; ou tratamento ou realização de profilaxia de uma amiloidose TTR em um paciente.

[0308] As doses efetivas variam dependendo de muitos fatores diferentes, como meios de administração, local alvo, estado fisiológico do sujeito, se o sujeito é humano ou animal, outros medicamentos administrados e se o tratamento é profilático ou terapêutico.

[0309] Um intervalo de dose exemplificativa para anticorpos pode ser de cerca de 0,1-20 ou 0,5-5 mg/kg de peso corporal (por exemplo, 0,5, 1, 2, 3, 4 ou 5 mg/kg) ou 10-1500 mg como uma dosagem fixa. A dosagem depende da condição do paciente e da resposta ao tratamento prévio, se houver, se o tratamento é profilático ou terapêutico e se a doença é aguda ou crônica, entre outros fatores.

[0310] O anticorpo pode ser administrado em tais doses diariamente, em dias alternados, semanalmente, quinzenalmente, mensalmente, trimestralmente ou de acordo com qualquer outro agendamento determinado por análise empírica. Um tratamento exemplificativo envolve a administração de doses múltiplas durante um período prolongado, por exemplo, de pelo menos seis meses. Exemplos adicionais de regimes de tratamento implicam a administração uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês ou uma vez a cada 3 até 6 meses.

[0311] A quantidade de um agente para administração ativa varia entre 0,1- 500 µg por paciente e, com mais frequência, de 1-100 ou 1-10 µg por injeção para administração a humanos. A dosagem refere-se ao peso do agente ativo para imunização que não inclui nenhum carreador ao qual está ligado para ajudar a provocar uma resposta imune. O momento das injeções pode variar significativamente de uma vez por dia a uma vez por ano ou a uma vez por década. Um regime típico compreende uma imunização seguida de injeções de reforço em intervalos de tempo, como intervalos de 6 semanas ou dois meses. Outro regime compreende uma imunização seguida de injeções de reforço 1, 2 e 12 meses depois. Outro regime compreende uma injeção a cada dois meses por toda a vida. Em alternativa, as injeções de reforço podem ocorrer de forma irregular, conforme indicado pelo monitoramento da resposta imune.

[0312] Os anticorpos ou agentes para indução de anticorpos podem ser administrados por uma via periférica. As vias de administração incluem tópica, intravenosa, oral, subcutânea, intra-arterial, intracraniana, intratecal, intraperitoneal, intranasal ou intramuscular. As vias para administração de anticorpos exemplificativas podem ser intravenosas ou subcutâneas. As vias exemplificativas para imunização ativa são as vias subcutânea e intramuscular. A administração intravenosa pode ser, por exemplo, por infusão ao longo de um período tal como 30-90 min. Esse tipo de injeção é feito com mais frequência nos músculos do braço ou da perna. Em alguns métodos, os agentes são injetados diretamente em um tecido em particular onde se acumularam os depósitos, por exemplo, por injeção intracraniana.

[0313] As composições farmacêuticas para administração parentérica podem ser estéreis e substancialmente isotônicas (250-350 mOsm/kg de água) e fabricadas sob condições GMP. As composições farmacêuticas podem ser fornecidas na forma de dose unitária (isto é, a dose para uma única administração). As composições farmacêuticas podem ser formuladas utilizando-se um ou mais carreadores fisiologicamente aceitáveis, diluentes, excipientes ou auxiliares. A formulação depende da via de administração escolhida. Para injeção, os anticorpos podem ser formulados em soluções aquosas, por exemplo, em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer ou solução salina fisiológica ou tampão de acetato (para reduzir o desconforto no local da injeção). A solução pode conter agentes de formulação, como suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, os anticorpos podem estar na forma liofilizada para reconstituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril isenta de pirogênios, antes da utilização.

[0314] Os regimes podem ser administrados em combinação com, concomitantemente ou sequencialmente com outro agente eficaz no tratamento ou profilaxia da doença a ser tratada. Tais agentes podem incluir siRNA para inibir a expressão de TTR ou Vyndaqel, um estabilizador de TTR na formação de tetrâmeros. Tais agentes podem incluir estabilizadores de tetrâmero TTR, como tafamidis ou diflunisal (ver, por exemplo, WO2011116123, Patente US Nº

9.150.489), terapias genéticas para suprimir a expressão de TTR, como oligonucleotídeos antisense, como IONIS-TTRRx (inotersen) (ver, por exemplo, Patentes US Nº 8.101.743, 8.697.860, 9.061.044 e 9.399.774; Patente Japonesa Nº JP5896175) ou siRNAs como patisiran ou revusiran (ver, por exemplo, WO2016033326), compostos degradadores de amiloides, como doxiciclina (doxi), ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA), Doxi-TUDCA, ciclodextrina (CyD), 4'-iodo- 4'- desoxidoxorrubicina (IDOX) ou anticorpos para o componente P amiloide sérico (SAP).

[0315] Outro agente eficaz no tratamento ou profilaxia da doença a ser tratada pode ser administrado a um sujeito que foi tratado anteriormente com um anticorpo divulgado neste documento. O sujeito tratado com outro agente eficaz no tratamento ou profilaxia da doença a ser tratada pode não estar mais recebendo tratamento com um anticorpo divulgado neste documento.

[0316] O tratamento com anticorpos divulgados neste documento pode ser combinado com outros tratamentos eficazes contra o distúrbio a ser tratado. Tratamentos de combinação podem ser formulados em conjunto para administração em separado. Alguns exemplos de tratamentos úteis para terapias combinadas incluem um segundo anticorpo anti-TTR que se liga a um epítopo diferente daquele de 18C5, por exemplo, um anticorpo conforme descrito na Tabela

3.

[0317] Após o tratamento, a condição do sujeito pode ser avaliada para determinar o progresso ou a eficácia desse tratamento. Tais métodos preferencialmente testam alterações nos níveis de amiloide TTR ou níveis de formas não-nativas de TTR. Por exemplo, os níveis de amiloide TTR podem ser avaliados para determinar a melhoria em relação aos níveis de amiloide TTR do sujeito em circunstâncias comparáveis antes do tratamento. Os níveis de amiloide TTR do sujeito também podem ser comparados com populações de controle em circunstâncias comparáveis. As populações de controle podem ser afligidas de forma semelhante, sujeitos não tratados ou sujeitos normais não tratados (entre outros sujeitos de controle). A melhoria em relação aos sujeitos ou níveis não tratados ou atingindo os níveis em sujeitos normais não tratados indica uma resposta positiva ao tratamento.

[0318] Os níveis de amiloide TTR podem ser medidos por uma série de métodos, incluindo técnicas de imagem. Exemplos de técnicas de imagem adequadas incluem a varredura de PET com TTR radiomarcado de fragmentos deste, anticorpos TTR ou fragmentos deste, agentes de imagem amiloide com base em vermelho Congo, tais como, por exemplo PIB (US 2011/0008255), peptídeo de imagem amiloide p31 (Biodistribuição do peptídeo de imagem amiloide, p31, correlaciona-se com a quantificação amiloide com base na coloração do tecido vermelho Congo, Wall et al., Abstract No. 1573, 2011 ISNM Annual Meeting), e outros marcadores PET. Os níveis de formas não nativas de TTR podem ser medidos, por exemplo, realizando ensaios de placas SDS-PAGE/Western blot ou Meso Scale Discovery com os anticorpos divulgados neste documento em amostras de plasma ou amostras de biópsia de um sujeito e comparando com amostras de controle, conforme descrito nos exemplos. A. Diagnóstico e Métodos de Monitoramento

[0319] Também são fornecidos métodos para detectar uma resposta imune contra TTR em um paciente que sofre ou é suscetível a doenças associadas à deposição de TTR ou formas patogênicas de TTR (por exemplo, formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou fibrilas de TTR). Os métodos podem ser utilizados para monitorar um curso de tratamento terapêutico e profilático com os agentes fornecidos neste documento. O perfil de anticorpos após imunização passiva mostra tipicamente um pico imediato na concentração de anticorpos seguido por uma decomposição exponencial. Sem uma dose adicional, a decadência se aproxima dos níveis de pré-tratamento dentro de um período de dias a meses, dependendo da meia-vida do anticorpo administrado. Por exemplo, a meia-vida de alguns anticorpos humanos é da ordem de 20 dias.

[0320] Em alguns métodos, uma medida de linha de base do anticorpo para TTR no sujeito é feita antes da administração, uma segunda medida é feita logo depois para determinar o nível máximo de anticorpos e uma ou mais medições adicionais são feitas em intervalos para monitorar a deterioração dos níveis de anticorpos. Quando o nível de anticorpo diminuiu para a linha de base ou uma porcentagem predeterminada do pico menos a linha de base ( por exemplo , 50%, 25% ou 10%), a administração de uma outra dose de anticorpo é administrada. Em alguns métodos, os níveis de pico ou subsequentes medidos, menos fundo são comparados com níveis de referência previamente determinados para constituir um regime de tratamento profilático ou terapêutico benéfico em outros sujeitos. Se o nível de anticorpos medido for significativamente menor do que um nível de referência (por exemplo, inferior à média menos uma ou, de preferência, dois desvios-padrão do valor de referência em uma população de indivíduos que se beneficiam do tratamento) é indicada a administração de uma dose adicional de anticorpo.

[0321] Também são fornecidos métodos de detecção de formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR em um sujeito, por exemplo, medindo formas TTR amiloide ou patogênicas de TTR (por exemploformas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR) em uma amostra de um sujeito ou por imagem in vivo de TTR em um sujeito. Tais métodos são úteis para diagnosticar ou confirmar o diagnóstico de doenças associadas a tais formas patogênicas de TTR (por exemplo, amiloidose por TTR), ou suscetibilidade a ela. Os métodos também podem ser usados em sujeitos assintomáticos. A presença de formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR indica suscetibilidade a futuras doenças sintomáticas. Os métodos também são úteis para monitorar a progressão da doença e/ou resposta ao tratamento em sujeitos que tenham sido diagnosticados anteriormente com amiloidose por TTR.

[0322] As amostras biológicas obtidas de um sujeito com suspeita de ter ou que está em risco de ter uma amiloidose por TTR podem ser postas em contato com os anticorpos divulgados neste documento para avaliar a presença de formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR. Por exemplo, os níveis de formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR em tais sujeitos podem ser comparados aos presentes em sujeitos saudáveis. Alternativamente, os níveis de TTR amiloide ou formas patogênicas de TTR (por exemplo, formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR) em tais sujeitos que recebem tratamento para a doença podem ser comparados com os de sujeitos que não foram tratados para uma amiloidose por TTR. Alguns desses testes envolvem uma biópsia de tecido obtida a partir desses sujeitos. Os ensaios ELISA também podem ser usados, por exemplo, para avaliar níveis de formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR em amostras de fluidos. Alguns desses ensaios ELISA envolvem anticorpos anti-TTR que se ligam preferencialmente a formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR em relação às formas tetraméricas nativas de TTR.

[0323] Alguns desses testes são imunoensaios em sanduíche. Alguns desses imunoensaios empregam a plataforma de eletroquimiluminescência Meso Scale Discovery (MSD) (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD). Alguns desses imunoensaios usam marcadores eletroquimiluminescentes nos anticorpos repórteres, por exemplo, Ensaios MSD (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD). Por exemplo, o anticorpo repórter pode ser marcado com um marcador SULFO- TAG ((Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD). Placas úteis em ensaios eletroquimiluminescentes podem incorporar eletrodos (por exemplo, placas MSD (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD). Placas úteis em ensaios eletroquimiluminescentes podem incorporar eletrodos no fundo de cada poço (por exemplo, placas MSD, (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD). Alguns ensaios empregam um anticorpo de captura marcado. Por exemplo, o anticorpo de captura marcado pode ser 18C5 ou uma variante humanizada, quimérica ou com superfície modificada deste. Alguns ensaios empregam um anticorpo repórter marcado. Por exemplo, o anticorpo repórter marcado pode ser 18C5 ou uma variante humanizada, quimérica ou com superfície modificada deste. O anticorpo repórter marcado também pode ser um anticorpo da Tabela 3, ou uma variante humanizada, quimérica ou com superfície modificada deste. O anticorpo repórter marcado pode ser um anticorpo que se liga à TTR sem especificidade conformacional. Em uma modalidade, o anticorpo que se liga à TTR sem especificidade conformacional pode ser 8C3 ou 7G7 ou uma variante humanizada, quimérica ou com superfície modificada deste (Ver, por exemplo, WO 2016/120811). Numa modalidade, o anticorpo que se liga à TTR sem especificidade conformacional pode ser um anticorpo policlonal. Em uma modalidade, o anticorpo policlonal é uma pré- albumina policlonal de coelho anti-humana (Cat. Nº A000202-2, Dako, Agilent Technologies, Inc, Santa Clara, CA). Em uma modalidade, o anticorpo policlonal de coelho anti-TTR é Sigma, Nº de Catálogo. HPA002550 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

[0324] Alguns ensaios detectam todas as TTR dobradas incorretamente em uma amostra (ou seja, todas as formas dobradas incorretamente de TTR incluindo monômeros e multímeros). Outros ensaios detectam especificamente TTR monomérica dobrada incorretamente ou TTR multimérica dobrada incorretamente. Outros ensaios detectam todas as formas de TTR (formas dobradas incorretamente e forma tetramérica nativa). Alguns desses ensaios empregam um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente de TTR; em que se TTR dobrada incorretamente estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR dobrada incorretamente, formando um complexo sanduíche; e em que a detecção do anticorpo repórter que se liga à TTR dobrada incorretamente, se houver, indica presença ou ausência de todas as formas dobradas incorretamente de TTR presentes na amostra. Alguns desses anticorpos repórter podem incluir 9D5, 14G8, 5A1, 6C1, AD7F6, RT24, NI-

301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD107, MFD108, MFD109, MFD111, MFD 114, ou uma versão quimérica ou uma versão humanizada deste. Tais anticorpos repórter podem incluir um anticorpo que se liga aos resíduos 89-97, 118-122, 115-124, 53-63, 54-61, 36-49, 49-61, 109-121, 30-66, 70-127, 80-127, 90- 127, 100-127, 110-127 ou 115-127 de TTR. Tais anticorpos repórter podem incluir 8C3 ou 7G7 (ver, por exemplo, WO 2016/120811). Tais anticorpos repórter podem incluir uma pré-albumina policlonal de coelho anti-humana (Cat. Nº A000202-2, Dako, Agilent Technologies, Inc, Santa Clara, CA) ou um anticorpo policlonal de coelho anti-TTR ( Sigma, Nº de Catálogo HPA002550, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO),

[0325] Alguns ensaios detectam formas multiméricas de TTR dobrada incorretamente em uma amostra. Tais ensaios podem ser configurados para detectar TTR multimérica dobrada incorretamente preferencialmente ou exclusivamente sobre TTR monomérica dobrada incorretamente. Alguns desses ensaios empregam um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR. Tal combinação de anticorpos de captura e repórter pode se ligar preferencialmente ou exclusivamente a TTR multimérica sobre monomérica, porque as múltiplas cópias de TTR fornecem múltiplos epítopos para ligação de anticorpos. A detecção da ligação do anticorpo repórter à TTR multimérica dobrada incorretamente, se houver, indica presença ou ausência da TTR multimérica dobrada incorretamente. Em alguns desses ensaios, o anticorpo repórter compete pela ligação à TTR com o anticorpo de captura e/ou o repórter e o anticorpo de captura se ligam ao mesmo ou epítopo de sobreposição de TTR. Em alguns desses ensaios, o anticorpo de captura liga uma primeira molécula de TTR dobrada incorretamente na TTR multimérica dobrada incorretamente e o anticorpo repórter liga uma segunda molécula de TTR dobrada incorretamente na TTR multimérica dobrada incorretamente. A competição pela ligação entre os anticorpos de captura e repórter impede ou pelo menos reduz (dependendo se a competição é o resultado de epítopos sobrepostos ou impedimento estérico) a ligação e a detecção simultâneas de TTR monomérica dobrada incorretamente. Em alguns desses ensaios, a detecção da ligação do anticorpo repórter que se liga à segunda molécula de TTR dobrada incorretamente na TTR multimérica indica presença ou ausência de TTR multimérica dobrada incorretamente.

[0326] Os anticorpos divulgados neste documento podem ser utilizados em um método para determinar uma razão entre o nível de transtirretina multimérica dobrada incorretamente total (TTR) e o nível de TTR dobrada incorretamente total em uma amostra biológica. Uma primeira porção de uma amostra biológica pode ser ensaiada para todos as TTR dobradas incorretamente numa amostra (ou seja, todas as formas TTR dobradas incorretamente incluindo monômeros e multímeros) em um primeiro ensaio em que são detectadas TTR monoméricas dobradas incorretamente e multiméricas dobradas incorretamente. O primeiro ensaio pode empregar um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente de TTR. Se a TTR dobrada incorretamente estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR dobrada incorretamente, formando um complexo sanduíche. A detecção do anticorpo repórter que se liga à TTR dobrada incorretamente, se houver, indica presença ou ausência da TTR dobrada incorretamente na amostra. Uma segunda porção de uma amostra biológica pode ser ensaiada para formas multiméricas de TTR dobrada incorretamente . Uma amostra biológica em um segundo ensaio que detecta TTR multimérica dobrada incorretamente preferencialmente sobre TTR monomérica dobrada incorretamente. O segundo ensaio pode empregar um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR . Se a TTR multimérica dobrada incorretamente estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR multimérica dobrada incorretamente, formando um complexo sanduíche. A captura e o anticorpo repórter podem se ligar simultaneamente preferencialmente ou exclusivamente à TTR multimérica dobrada incorretamente, se houver, para indicar a presença ou ausência da TTR multimérica dobrada incorretamente. Em alguns desses ensaios, o anticorpo repórter compete pela ligação da TTR com o anticorpo de captura ou liga-se ao mesmo ou ao epítopo de sobreposição do anticorpo de captura. Em alguns desses ensaios, o anticorpo de captura liga uma primeira molécula de TTR dobrada incorretamente na TTR multimérica dobrada incorretamente e o anticorpo repórter liga uma segunda molécula de TTR dobrada incorretamente na TTR multimérica dobrada incorretamente. A competição pela ligação entre os anticorpos de captura e repórter impede ou pelo menos reduz (dependendo se a competição é o resultado de epítopos sobrepostos ou impedimento estérico) a ligação e a detecção simultâneas de TTR monomérica dobrada incorretamente. Em alguns desses ensaios, a detecção da ligação do anticorpo repórter que se liga à segunda molécula de TTR dobrada incorretamente na TTR multimérica indica presença ou ausência de TTR multimérica dobrada incorretamente. Em alguns ensaios, é calculada uma proporção de TTR multimérica dobrada incorretamente para toda TTR dobrada incorretamente.

[0327] Os anticorpos divulgados neste documento também podem ser utilizados em um método para determinar uma proporção do nível de toda a TTR dobrada incorretamente para a TTR total (formas dobradas incorretamente e forma tetramérica nativa) em uma amostra biológica. Uma primeira porção de uma amostra biológica pode ser ensaiada para todas as TTR dobradas incorretamente em uma amostra (ou seja, todas as formas de TTR dobradas incorretamente incluindo monômeros e multímeros) em um primeiro ensaio em que são detectadas TTR monoméricas dobradas incorretamente e multiméricas dobradas incorretamente. O primeiro ensaio pode empregar um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente de TTR. Se a TTR dobrada incorretamente estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR dobrada incorretamente, formando um complexo sanduíche. A detecção do anticorpo repórter que se liga à TTR dobrada incorretamente, se houver, indica presença ou ausência da TTR dobrada incorretamente na amostra. Uma segunda porção de uma amostra biológica pode ser ensaiada para a TTR total (formas dobradas incorretamente e forma tetramérica nativa) em um segundo ensaio em que a TTR total é detectada. O segundo ensaio pode empregar um anticorpo de captura que se liga à TTR sem especificidade conformacional e um anticorpo repórter que se liga à TTR sem especificidade conformacional . Se a TTR estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR formando um complexo sanduíche. A detecção do anticorpo repórter que se liga à TTR, se houver, indica presença ou ausência da TTR presente na amostra. Pode-se calcular uma proporção de toda a TTR dobrada incorretamente para a TTR total (formas dobradas incorretamente e forma tetramérica nativa) .

[0328] Os métodos de imagem in vivo podem funcionar através da administração de um reagente, tal como anticorpo que se liga a formas monoméricas, misfolded, agregadas ou de fibrilas de TTR no indivíduo, e depois detecta o reagente depois de se ligar. Tais anticorpos normalmente se ligam a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR. Se desejado, a resposta de depuração pode ser evitada usando fragmentos de anticorpos que não possuem uma região constante de comprimento completo, como Fabs. Em alguns métodos, o mesmo anticorpo pode servir como um tratamento e um reagente de diagnóstico.

[0329] Os reagentes de diagnóstico podem ser administrados por injeção intravenosa no corpo do indivíduo, ou através de outras rotas consideradas razoáveis. A dose de reagente deve estar dentro dos mesmos intervalos que para os métodos de tratamento. Tipicamente, o reagente é marcado, embora em alguns métodos, o reagente primário com afinidade para formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR não está marcado e é utilizado um agente de marcação secundário para se ligar ao reagente primário. A escolha do marcador depende dos meios de detecção. Por exemplo, um marcador fluorescente é adequado para a detecção ótica. O uso de marcadores paramagnéticos é adequado para detecção tomográfica sem intervenção cirúrgica. Marcadores radioativos também podem ser detectados usando PET ou SPECT.

[0330] O diagnóstico é realizado comparando o número, o tamanho e/ou a intensidade dos loci etiquetados com os valores correspondentes da linha de base. Os valores da linha de base podem representar os níveis médios em uma população de indivíduos sem doença. Os valores da linha base também podem representar os níveis anteriores determinados no mesmo sujeito. Por exemplo, os valores da linha de base podem ser determinados em um sujeito antes do início do tratamento, e os valores medidos depois comparados com os valores da linha de base. Uma diminuição nos valores em relação à linha de base geralmente sinaliza uma resposta positiva ao tratamento.

[0331] O monitoramento de alterações na quantidade de TTR dobrada incorretamente, TTR multimérica dobrada incorretamente, depósitos de transtirretina, ligação de anticorpo anti-TTR ou similar permite o ajuste de um regime de tratamento em resposta ao tratamento. Então, a determinação pode ser feita no que diz respeito a se deve ajustar o tratamento e se o tratamento desejado pode ser ajustado em resposta ao monitoramento. Uma mudança significativa significa que a comparação do valor de um parâmetro após o tratamento em relação à base fornece alguma evidência de que o tratamento resultou ou não em um efeito benéfico. Em alguns casos, uma mudança de valores de um parâmetro em um paciente em si fornece evidências de que o tratamento resultou ou não em um efeito benéfico. Em outros casos, a mudança de valores, se houver, em um paciente, é comparada com a mudança de valores, se houver, em uma população de controle representativa de pacientes que não foram submetidos a tratamento. Uma diferença na resposta de um paciente em particular da resposta normal no paciente de controle (por exemplo, média mais variância de um desvio padrão) também pode fornecer evidências de que um regime de tratamento está ou não alcançando um efeito benéfico em um paciente. Alterações nos parâmetros de TTR acima também podem ser combinadas com outras alterações nos sinais ou sintomas, como efeitos colaterais na determinação de se e como ajustar o tratamento.

[0332] Em alguns pacientes, o monitoramento indica que a quantidade de TTR dobrada incorretamente, TTR multimérica dobrada incorretamente, depósitos de transtirretina ou ligação de anticorpo anti-TTR é igual ou superior ao detectado anteriormente. Nestes pacientes, se não houver efeitos colaterais inaceitáveis, o regime de tratamento pode ser continuado como está ou mesmo aumentado na frequência de administração e/ou dose, se ainda não estiver na dose máxima recomendada.

[0333] Em alguns pacientes, o monitoramento indica um declínio detectável na quantidade de TTR dobrada incorretamente, TTR multimérica dobrada incorretamente, depósitos de transtirretina, ligação de anticorpo anti-TTR ou similar, mas essa quantidade de TTR dobrada incorretamente, TTR multimérica dobrada incorretamente, depósitos de transtirretina ou ligação de anticorpo anti-TTR permanece acima do normal. Nestes pacientes, se não houver efeitos colaterais inaceitáveis, o regime de tratamento pode ser continuado como está ou mesmo aumentado na frequência de administração e/ou dose, se ainda não estiver na dose máxima recomendada. Alternativamente, em alguns desses pacientes, o regime de tratamento pode ser descontinuado e substituído pelo tratamento com outros agentes, como um estabilizador de tetrâmero de TTR, um terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense, um terapêutico à base de interferência de RNA (RNAi) ou doxiciclina mais ácido tauroursodesoxicólico.

[0334] Se o monitoramento indicar uma quantidade de TTR dobrada incorretamente, TTR multimérica dobrada incorretamente, depósitos de transtirretina, ligação de anticorpo anti-TTR ou semelhante em um paciente, já foi reduzido para um nível normal próximo do normal de quantidade de TTR dobrada incorretamente, TTR multimérica dobrada incorretamente, depósitos de transtirretina ou quantidade de ligação ao anticorpo anti-TTR, o regime de tratamento pode ser ajustado a partir de uma indução (ou seja, que reduz o nível de quantidade de TTR dobrada incorretamente, TTR multimérica dobrada incorretamente, depósitos de transtirretina ou ligação de anticorpos anti-TTR) para uma manutenção (ou seja, que mantém a quantidade de TTR dobrada incorretamente, TTR multimérica dobrada incorretamente, depósitos de transtirretina ou ligação de anticorpos anti-TTR a um nível aproximadamente constante). Esse regime pode ser efetuado reduzindo a dose e/ou a frequência da administração do tratamento. Alternativamente, em alguns desses pacientes, o regime de tratamento pode ser descontinuado e substituído pelo tratamento com outros agentes, como um estabilizador de tetrâmero de TTR, um terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense, um terapêutico à base de interferência de RNA (RNAi) ou doxiciclina mais ácido tauroursodesoxicólico.

[0335] Em outros pacientes, o monitoramento pode indicar que o regime de tratamento está tendo algum efeito benéfico, mas um efeito abaixo do ideal. Um efeito ideal pode ser definido como uma redução percentual na quantidade de TTR dobrada incorretamente, TTR multimérica dobrada incorretamente, depósitos de transtirretina ou ligação de anticorpos anti-TTR na metade ou quartil superior da alteração na quantidade de TTR dobrada incorretamente, TTR multimérica dobrada incorretamente, depósitos de transtirretina, ou quantidade de ligação ao anticorpo anti-TTR) experimentada por uma amostra representativa de pacientes submetidos ao regime de tratamento em um determinado momento após o início da terapia. Um paciente com um declínio menor ou um paciente cuja quantidade de TTR dobrada incorretamente, TTR multimérica dobrada incorretamente, depósitos de transtirretina ou ligação de anticorpos anti-TTR permanece constante ou até aumenta, mas em menor grau do que o esperado na ausência do regime de tratamento (por exemplo, como inferido de um grupo controle de pacientes que não administraram o regime de tratamento) pode ser classificado como experimentando uma resposta positiva, porém abaixo do ideal. Esses pacientes podem opcionalmente submeter-se a um ajuste do regime no qual a dose e/ou a frequência da administração de um agente aumentam. Alternativamente, ou adicionalmente se o ajuste para cima não resultar em uma resposta melhorada, em alguns desses pacientes, o regime de tratamento pode ser descontinuado e substituído pelo tratamento com outros agentes, como um estabilizador de tetrâmero de TTR, um terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense, um terapêutico à base de interferência de RNA (RNAi) ou doxiciclina mais ácido tauroursodesoxicólico.

[0336] Em alguns pacientes, a quantidade de TTR dobrada incorretamente, TTR multimérica dobrada incorretamente, depósitos de transtirretina ou ligação de anticorpo anti-TTR pode aumentar de maneira semelhante ou maior à TTR dobrada incorretamente, TTR multimérica dobrada incorretamente, depósitos de transtirretina ou ligação de anticorpos anti-TTR em pacientes que não recebem tratamento. Se esses aumentos persistirem por um período de tempo, o tratamento pode, se desejado, ser descontinuado em favor do tratamento com um ou mais outros agentes.

[0337] Os métodos de diagnóstico com anticorpos divulgados neste documento podem ser realizados em combinação com um segundo anticorpo anti- TTR que se liga a um epítopo diferente daquele de 18C5, por exemplo, um anticorpo conforme divulgado na Tabela 3.

[0338] Também são fornecidos métodos para distinguir uma amiloidose mediada por transtiretina de uma amiloidose não mediada por TTR, por exemplo, amiloidose de cadeia leve (AL) da amiloide, também conhecida como amiloidose sistêmica primária. IX. Kits

[0339] A invenção fornece adicionalmente kits (por exemplo, recipientes) compreendendo um anticorpo 18C5 divulgado neste documento e materiais relacionados, tais como instruções para uso (por exemplo, inserção da embalagem). As instruções para uso podem conter, por exemplo, instruções para administração dos anticorpos e, opcionalmente, um ou mais agentes adicionais. Os recipientes de anticorpos podem ser doses unitárias, embalagens em lote (por exemplo, embalagens multi-dose) ou doses de subunidade.

[0340] Bula se refere às instruções habitualmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contraindicações e/ou avisos quanto ao uso de tais produtos terapêuticos

[0341] Os kits também podem incluir um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injecção (BWFI), soro fisiológico tamponado com fosfato, solução de dextrose e solução de Ringer. Eles podem incluir também outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas. X. Outras Aplicações

[0342] Os anticorpos podem ser usados para detectar formas monoméricas, dobrada incorretamente , agregadas ou de fibrilas de transtirretina (TTR), ou fragmentos dela, no contexto de diagnóstico ou tratamento clínico ou em pesquisa. Por exemplo, os anticorpos podem ser usados para detectar a presença de formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR em uma amostra biológica como indicação de que a amostra biológica compreende depósitos de amiloides TTR. A ligação dos anticorpos à amostra biológica pode ser comparada à ligação dos anticorpos a uma amostra de controle. A amostra de controle e a amostra biológica podem compreender células da mesma origem do tecido. Amostras de controle e amostras biológicas podem ser obtidas a partir do mesmo indivíduo ou indivíduos diferentes e na mesma ocasião ou em ocasiões diferentes. Caso desejado, múltiplas amostras biológicas e múltiplas amostras de controle são avaliadas em várias ocasiões para proteger contra variações aleatórias, independentemente das diferenças entre as amostras. Uma comparação direta pode então ser feita entre a (s) amostra (s) biológica (s) e a (s) amostra (s) de controle para determinar se a ligação do anticorpo (isto é, a presença de formas monoméricas, misfolded, agregadas ou de fibrilas de TTR) para a (s) amostra (s) biológica é aumentada, diminuída ou a mesma relativa à ligação do anticorpo à (s) amostra (s) de controle. O aumento da ligação do anticorpo à (s) amostra (s) biológica (s) em relação à (s) amostra (s) de controle indica a presença de formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR na (s) amostra (s) biológica (s). Em alguns casos, o aumento da ligação do anticorpo é estatisticamente significativo. Opcionalmente, a ligação do anticorpo à amostra biológica é pelo menos 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes ou 100 vezes superior à ligação do anticorpo à amostra de controle.

[0343] Além disso, os anticorpos podem ser usados para detectar a presença de formas monoméricas, misfolded, agregadas ou de fibrilas de TTR em uma amostra biológica para monitorar e avaliar a eficácia de um agente terapêutico que é usado para tratar um paciente diagnosticado com amiloidose TTR.

Uma amostra biológica de um paciente diagnosticado com uma amiloidose por TTR é avaliada para estabelecer uma linha de base para a ligação dos anticorpos à amostra (ou seja, uma linha de base para a presença das formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR na amostra) antes de iniciar a terapia com o agente terapêutico.

Em alguns casos, várias amostras biológicas do paciente são avaliadas em múltiplas ocasiões para estabelecer uma linha de base e uma medida de variação aleatória independente do tratamento.

Um agente terapêutico é então administrado em regime.

O regime pode incluir várias administrações do agente durante um período de tempo.

Opcionalmente, a ligação dos anticorpos (ou seja, presença de formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR) é avaliada em múltiplas ocasiões em múltiplas amostras biológicas do paciente, tanto para estabelecer uma medida de variação aleatória quanto para mostrar uma tendência em resposta à imunoterapia.

As várias avaliações da ligação do anticorpo às amostras biológicas são então comparadas.

Se apenas forem feitas duas avaliações, pode-se fazer uma comparação direta entre as duas avaliações para determinar se a ligação do anticorpo (ou seja, a presença de formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR) aumentou, diminuiu ou permaneceu igual entre as duas avaliações.

Se mais de duas medidas forem feitas, as medidas podem ser analisadas como um curso de tempo que começa antes do tratamento com o agente terapêutico e após o curso da terapia.

Em pacientes para os quais a ligação de anticorpos a amostras biológicas diminuiu (ou seja, a presença de formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR), pode- se concluir que o agente terapêutico foi eficaz no tratamento da amiloidose por TTR no paciente.

A diminuição na ligação do anticorpo pode ser estatisticamente significativa.

Opcionalmente, a ligação diminui em pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%. A avaliação da ligação do anticorpo pode ser feita em conjunto com a avaliação de outros sinais e sintomas de amiloidose por TTR.

[0344] Os anticorpos também podem ser usados como reagentes de pesquisa para pesquisas laboratoriais na detecção de formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR, ou seus fragmentos. Em tais usos, os anticorpos podem ser marcados com moléculas fluorescentes, moléculas, enzimas ou radioisótopos marcados por rotação e podem ser fornecidos na forma de kit com todos os reagentes necessários para realizar o ensaio de detecção. Os anticorpos também podem ser usados para purificar formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR, ou parceiros de ligação de formas monoméricas, dobradas incorretamente, agregadas ou de fibrilas de TTR, por exemplo, por cromatografia de afinidade.

[0345] Os anticorpos também podem ser usados para inibir ou reduzir a agregação de TTR, inibindo ou reduzindo a formação de fibrilas TTR, reduzindo ou eliminando depósitos de TTR ou agregados de TTR ou estabilizando conformações não tóxicas de TTR em uma amostra biológica. A amostra biológica pode compreender, por exemplo, sangue, soro, plasma ou tecido (por exemplo, tecido do coração, sistema nervoso periférico, sistema nervoso autônomo, rins, olhos, gordura abdominal ou trato gastrointestinal). Em alguns casos, a agregação de TTR, a formação de fibrila de TTR ou os depósitos de TTR são inibidos ou reduzidos em pelo menos 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou 75%, (por exemplo, 10% -75% ou 30% -70%). Os ensaios para detectar a formação de fibrilas são descritos em outro lugar neste documento. Ver também US 2014/0056904.

[0346] Todos os pedidos de patentes, sites, outras publicações, números de adesão e semelhantes citados acima ou abaixo são incorporados a este documento por referência na sua totalidade para todos os fins na mesma medida como se cada item individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser assim incorporado por referência. Se diferentes versões de uma sequência estão associadas com um número de acesso em momentos diferentes, a versão associada com o número de acesso na data de depósito efetiva do presente pedido é a que vale. A data de depósito eficaz significa a mais cedo dentre a data de depósito real ou data de depósito de um pedido de prioridade referindo-se ao número de acesso, se for o caso. Da mesma forma se versões diferentes de uma publicação, website ou semelhantes são publicadas em momentos diferentes, a versão mais recentemente publicada na data do depósito efetivo da aplicação é a referida, salvo indicação em contrário. Qualquer característica, etapa, elemento, modalidade ou aspecto da invenção pode ser utilizado em combinação com qualquer outro, a menos que indicado especificamente de outra forma. Embora a invenção presente tenha sido descrita com certos detalhes por meio de ilustração e exemplo para fins de esclarecimento e clareza, ficará visível que certas alterações e modificações podem ser feitas dentro do escopo das reivindicações em anexo.

EXEMPLOS Exemplo 1. Preparação do imunógeno e imunização ou camundongos para 18C5

[0347] Os camundongos BALB/c e C57BL/6 fêmeas foram injetados com transtirretina manipulada com uma mutação em F87M e L110M, denominada mutante transtirretina dupla (TTR-DM). Injeção intraperitoneal de 50 µg/camundongo por três injeções, seguida de 25 µg/camundongo por 3 injeções e 10 µg/camundongo por 4 injeções de TTR-DM emulsionada em adjuvante RIBI foram injetadas semanalmente usando 5 BALB/c, adicionalmente 5 C57BL/6 camundongos foram injetados por 3 injeções a 50 µg/camundongo, 3 injeções a 25 µg/camundongo e 4 injeções a 10 µg/camundongo emulsionados em adjuvante RIBI. Os camundongos foram titulados contra a TTR-DM, TTR tetramérica nativa e his-MCAM. Camundongos com os títulos mais altos para TTR-DM e títulos mais baixos para TTR tetramérica nativa e his-MCAM (BALB/c nº1 e 5 e C57BL/6 nº4 e 5) foram fundidos por uma modificação de Kohler e Milstein. Os hibridomas resultantes foram triados contra TTR-DM, TTR tetramérica nativa e his-MCAM. Os hibridomas mostrando especificidade à TTR-DM foram clonados e posteriormente caracterizados. 18C5 foi identificado. Exemplo 2. Caracterização de 18C5 pelo BIAcore

[0348] A análise foi realizada usando um Biacore T200 para comparar a afinidade de ligação de anticorpos murinos à TTR humana recombinante desnaturada em Cloridrato de Guanidina 6M (Gu-hTTR), TTR de Cynomolgus desnaturada em Cloridrato de Guanidina 6M (Gu-cTTR) e TTR tetramérica humana nativa . O anticorpo anti-camundongo foi imobilizado no chip sensor CM3 (GE Healthcare Life Sciences) via acoplamento de amina e os anticorpos murinos

(ligante) foram capturados a um nível para garantir uma ligação máxima do analito de 50 RU (aproximadamente 250 RU de ligação ao ligante). Várias concentrações de Gu- TTR (variando de 0,4 nM a 100 nM) foram passadas sobre o ligante capturado a 50 μL/min em tampão de execução (HBS + 0,05% P-20, 1 mg/mL BSA, 50 mM Gu-HCl) para tempo de associação de 300s e tempo de dissociação de 900s. A regeneração da superfície do chip foi realizada por 2 injeções curtas de glicina-HCl 10 mM a pH 1,7. As concentrações de GucTTR utilizadas variaram de 1-1000 nM, enquanto as concentrações de tetrâmero de TTR humana variaram de 10 nM a 10.000 nM. Os dados foram subtraídos em branco para um sensor que não continha ligante e concentração de analito de 0 nM. A análise foi realizada usando um ajuste global 1:1 com o software Biacore Evaluation (v3.0) com índice de refração em massa definido como zero RU. Os dados de ligação são apresentados na Tabela 4.

[0349] Tabela 4. Os dados de ligação de 18C5 em relação à TTR humana dobrada incorretamente e TTR dobrada incorretamente de Cynomolgus e o tetrâmero de TTR humana. TTR ka 1/Ms kd 1/s KD (nM) TTR humana 1,1X105 6,2X10-4 5,9 nM dobrada incorretamente TTR dobrada 1,0X105 9,2X10-4 Ligação mínima na incorretamente concentração mais de Cynomolgus alta, KD difícil de estimar Tetrâmero de TTR 2,2X103 2,2X10-4 Ligação mínima na humana concentração mais alta, KD difícil de estimar Exemplo 3: Caracterização do 18C5 quimérico por BIAcore

[0350] A análise foi realizada usando um Biacore T200 para comparar a afinidade de ligação de anticorpos murinos e quiméricos à TTR humana recombinante desnaturada em Cloridrato de Guanidina 6M (Gu-hTTR) . O anticorpo anti-humano foi imobilizado nas células de fluxo 1 e 2, o anticorpo anti-camundongo foi imobilizado nas células de fluxo 3 e 4 no chip sensor CM3 (GE Healthcare Life Sciences) via acoplamento de amina, os anticorpos quiméricos e murinos 18C5 (ligante) foram capturados para um nível para garantir uma ligação máxima do analito de 50 RU (aproximadamente 250RU de ligação ao ligante). Várias concentrações de Gu- TTR (variando de 0,4 nM a 100 nM) foram passadas sobre o ligante capturado a 50 μL/min em tampão de execução (HBS + 0,05% P-20, 1 mg/mL BSA, 50 mM Gu-HCl) para tempo de associação de 300s e tempo de dissociação de 900s. A regeneração da superfície do chip foi realizada através de 2 injeções curtas de cloreto de magnésio 3M ou 2 injeções curtas de glicina-HCl 10 mM a pH 1,7. Os dados foram subtraídos em branco para um sensor que não continha ligante e concentração de analito de 0 nM. A análise foi realizada usando um ajuste global 1:1 com o software Biacore Evaluation (v3.0) com índice de refração em massa definido como zero RU. Os dados de ligação são apresentados na Tabela 5.

[0351] Uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada madura de um anticorpo 18C5 quimérico é fornecida como SEQ ID NO: 81, uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada madura de um anticorpo 18C5 quimérico é fornecida como SEQ ID NO: 87, uma sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada humana da SEQ ID NO: 17 e uma sequência de aminoácidos da região constante da cadeia leve humana da SEQ ID NO: 19.

[0352] Tabela 5. Dados de ligação de anticorpos murinos e quiméricos à TTR humana recombinante desnaturada em Cloridrato de Guanidina 6M (Gu-hTTR). TTR ka 1/Ms kd 1/s KD (nM) 18C5 quimérico 1,3X105 1,6X10-4 1,8 nM 18C5 murino 9,9X104 2,1X10-4 2,2 nM Exemplo 4. Mapeamento do Epítopo de 18C5

[0353] O mapeamento inicial mostrou que o epítopo para 18C5 está dentro de 87-127 da SEQ ID NO: 26. Mapeamento adicional mostrou que o epítopo estava entre 101-109 da SEQ ID NO: 26. A afinidade muito mais baixa à TTR de

Cynomolgus dobrada incorretamente sugere que o aminoácido 104 é importante, pois esta é a única substituição de aminoácido entre a TTR humana e de Cynomolgus. Exemplo 5. Sequência de 18C5

[0354] Clone de hibridoma 18C5 LA89 18C5. A1.A1 utilizou-se o sedimento de células congeladas A1 para extração e purificação de mRNA. O isolamento e a purificação do mRNA foram realizados usando o protocolo mini kit Oligotex mRNA direto (Qiagen, cat nº 72022). Resumidamente, as 9x10 6 células do clone de hibridoma foram lisadas e homogeneizadas na presença de tampão guanidina- isotiocianato altamente desnaturante, que inativa RNases. A suspensão de oligotex foi adicionada à mistura de lise, foi permitida a hibridação entre o oligo dT30 das partículas de oligotex e a cauda poli-A do mRNA. As contaminações foram então lavadas e o RNA poli-A+ foi eluído. O mRNA foi transcrito reversamente para cDNA usando o kit de amplificação de cDNA Marathon (Clontech, cat nº 634913). Um adaptador foi ligado ao terminal 5' do cDNA. O método RACE 5' foi utilizado para amplificar as regiões V. Primers consenso da região 5' V e primers de ancoragem específicos da região constante foram utilizados para PCR. As regiões V amplificadas foram clonadas no vetor de clonagem de pTOPO e transformadas em Top10 E. coli. Foram criadas 15 a 20 colônias individuais e o plasmídeo purificado foi sequenciado. Uma sequência de clones era considerada uma sequência genuína da região V se atendesse aos seguintes critérios Sem códon de parada entre a região Met e C A sequência contém características principais das regiões do anticorpo V A sequência contém CDRs definíveis. Mínimo de três clones independentes com ORF correspondente

[0355] As sequências de regiões variáveis determinadas foram clonadas em vetores de expressão e transfectadas em células CHOs. O anticorpo quimérico purificado foi caracterizado para ligação usando 18C5 murino como anticorpo de controle.

[0356] A sequência de aminoácidos variáveis da cadeia pesada madura de 18C5 é fornecida como SEQ ID NO: 81 e a sequência de aminoácidos variáveis da cadeia leve madura de 18C5 é fornecida como SEQ ID NO: 87. As sequências de aminoácidos CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da cadeia pesada do Composto Kabat/Chothia são fornecidas como SEQ ID NOs 5, 7 e 9, respectivamente. As sequências de aminoácidos CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da cadeia leve do Composto Kabat/Chothia são fornecidas como SEQ ID NOs 11, 13 e 15, respectivamente. Exemplo 6. Especificidade de 18C5 demonstrada por Análise de Western Blot

[0357] Para demonstrar a especificidade conformacional de 18C5 em relação à TTR não nativa (desnaturada), uma análise de Western blot foi realizada da seguinte maneira: Procedimento:

[0358] Géis de SDS-poliacrilamida

[0359] TTR nativa: uma amostra de 1,0, 0,5, e 0,1 µg de TTR humana recombinante em tampão de amostra LDS (Life Technologies) foi executada em um gel NuPAGE bis-tris a 10% (tampão MES; 90 V, 105 min) e transferida para membranas de nitrocelulose para análise de Western blot.

[0360] TTR desnaturada: TTR humana recombinante foi preparada conforme descrito acima para a TTR nativa, exceto que o tampão de amostra de LDS continha agente redutor e as amostras foram desnaturadas por ebulição antes de SDS-PAGE.

[0361] Análise Western Blot

[0362] Os géis de SDS-PAGE foram transferidos para as membranas de nitrocelulose (iBlot, Life Technologies), tratados com tampão de bloqueio (LI-COR, Lincoln, NE) e incubados em anticorpo primário de 1, 0- g/mL, lavados com 1x TBS e colocados em 1:20.000 de diluição de anticorpo secundário de cabra-anti- camundongo ou anti-coelho conjugado com IRDye 800CW (LI-COR, Lincoln, NE), em seguida, fotografados em um gerador de imagens por infravermelho Odyssey CLx (LI-COR, Lincoln, NE).

[0363] Resultados e Conclusões:

[0364] O Western blot de TTR recombinante nativa vs desnaturada (Figura 1) mostrou que 18C5 tinha reatividade muito fraca em relação a espécies nativas de TTR (Pistas 1-3), mas reatividade muito forte em relação ao monômero de TTR desnaturada (~15kDa) com menor reatividade em relação a dímero desnaturado (~30kDa) (Pistas 5-7). A pista 4 mostra marcadores de peso molecular.

[0365] Em contraste, um anticorpo comercial TTR (Sigma, Nº de Catálogo HPA002550), que não é conformacionalmente específico, não distinguiu entre TTR nativa versus TTR desnaturada e mostrou reatividade muito forte em relação à TTR monomérica e dimérica nativa e desnaturada (Figura 2). As faixas 1-3 mostram resultados para a TTR nativa; A faixa 4 mostra marcadores de peso molecular e as faixas 5-7 mostram resultados para TTR desnaturada. Exemplo 7. Concepção de Anticorpos 18C5 Humanizados

[0366] O ponto de partida ou o anticorpo doador para humanização foi o anticorpo 18C5 de camundongo. A sequência de aminoácidos variável de cadeia pesada madura de m18C5 é fornecida como a SEQ ID NO:81. A sequência de aminoácidos variável de cadeia leve madura de m18C5 é fornecida como a SEQ ID NO:87. As sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada do Composto Kabat/Chothia são fornecidas como as SEQ ID NOs: 5, 7 e 9, respectivamente. As sequências de aminoácidos de Kabat de cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 são fornecidas como as SEQ ID NOs: 11, 13 e 15, respectivamente. A numeração de Kabat é usada ao longo de todo o documento.

[0367] Alinhamento das sequências de regiões variáveis de 18C5 com as sequências de consenso das regiões variáveis de anticorpos de Kabat, et al. indica que a região variável da cadeia pesada (VH) de 18C5 pertence ao subgrupo VH de camundongo 3b, que corresponde ao subgrupo VH humano 3. A região variável da cadeia leve kappa (VL) de 18C5 pertence ao subgrupo Vk de camundongo 2, que corresponde ao subgrupo Vk humano 2. [Kabat EA, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição. Publicação NIH Nº 91-3242.].

[0368] Os resíduos na interface entre os domínios Vk e Vh são os comumente encontrados, exceto que Ala está na posição 37 na cadeia pesada, enquanto tipicamente Val ou Ile está nessa posição. Leu na posição 95 em Vh é tipicamente Asp, Gly ou Ser. Essas posições são candidatas a mutações reversas. Para a cadeia Vk, Glu 34 é tipicamente Ala, His, Asn ou Ser, e essas posições são candidatas a mutações reversas.

[0369] As CDRs VH e VL de 18C5 foram identificadas usando as regras de identificação de CDRs baseadas em sequência de Martin. As CDRs foram então atribuídas às classes canônicas de Chothia usando o resumo dos principais resíduos apresentados na Tabela 3.5 de Martin (Martin ACR. (2010). In: Kontermann R e Dübel S (eds). Antibody Engineering. Heidelberg, Germany: Springer International Publishing AG.): CDR-H1 consiste em 10 aminoácidos e é semelhante à classe canônica 1 de Chothia. CDR-H2 consiste em 17 aminoácidos e é semelhante à classe canônica 3 de Chothia. CDR-H3 consiste em 4 aminoácidos; não há classes para CDR-H3. CDR-L1 consiste em 16 aminoácidos e é semelhante à classe canônica 4 de Chothia. CDR-L2 consiste em 7 aminoácidos e é de classe canônica 1 de Chothia. CDR-L3 consiste em 9 aminoácidos e é semelhante à classe canônica 1 de Chothia.

[0370] Uma pesquisa foi feita sobre as sequências de proteínas no banco de dados PDB [Deshpande et al, 2005, Nucleic Acids Research 33:D233-D237] para encontrar estruturas que forneceriam um modelo estrutural aproximado de 18C5. A estrutura cristalina do anticorpo anti-piroglutamato-Abeta murino Fab c # 17 (código PDB 5MYK) [Piechotta, A. et al. ((2017) J. Biol. Chem. 292: 12713- 12724) foi usada para a estrutura Vh e Vk, uma vez que possuía boa resolução (1,6Aº) e semelhança geral da sequência com Vh e Vk de 18C5, mantendo as mesmas estruturas canônicas para as alças. O software Bioluminate foi usado para modelar uma estrutura aproximada de 18C5. Este software é licenciado pela Schrodinger Inc.

[0371] Os frameworks VH e VL de 18C5 compartilham um alto grau de similaridade de sequência com as regiões correspondentes do Crenezumab Fab humanizado (CreneFab) PDB: 5VZY, projetado por Ultsch M, et al. ((2016) Sci Rep.6:39374) Os domínios variáveis de 18C5 e CreneFab também compartilham comprimentos idênticos para as alças CDR-H1, H2, L1, L2 e L3. As regiões de framework do CreneFab VH (5VZY-VH) e VL (5VZY-VL) foram escolhidas como sequências aceitadoras para as CDRs de 18C5. O software de Bioluminate foi utilizado para modelar a estrutura. Este software é licenciado pela Schrodinger Inc.

[0372] As sequências de variantes de cadeia pesada e leve resultantes do processo de humanização de anticorpos foram posteriormente alinhadas com as sequências de linhagem germinativa humana usando a ferramenta IMGT Domain GapAlign para avaliar a humanização das cadeias pesada e leve, conforme descrito pelas diretrizes do comitê OMS INN. (OMS-INN: International nonproprietary names (INN) for biological and biotechnological substances (a review) (Internet) 2014. Disponível em: http://www. who.int/medicines/services/inn/BioRev2014.pdf) Os resíduos foram alterados para se alinharem com a sequência da linhagem germinativa humana correspondente, quando possível, para melhorar a humanização. Para a variante VL_v2 humanizada, foi introduzida uma mutação Q45R para tornar a sequência mais semelhante ao gene da linhagem germinativa humana IGKV2-30*02 (GenBank acc. Nº CAA77315; SEQ ID NO: 90). As sequências de aminoácidos que consistem em frameworks de CreneFab e CDRs de 18C5 são designadas hu18C5-VH_v1 e hu18C5-VL_v1.

[0373] Versões adicionais de hu18C5-VH e hu18C5-VL foram projetadas para permitir a avaliação de vários resíduos de framework por suas contribuições à ligação e imunogenicidade do antígeno. As posições consideradas para mutação incluem aquelas que: - definem as conformações canônicas de CDR (resumidas em Martin 2010), - estão dentro da zona Vernier (Foote J e Winter G. (1992). J Mol Biol. 224(2):487-99), - estão localizadas na interface do domínio VH/VL (resumida em Léger OJP e Saldanha J. (2000). Preparação de anticorpos recombinantes a partir de baços de roedores imunes e a concepção de sua humanização por enxerto de CDR. In: Shepherd P and Dean C (eds). Monoclonal Antibodies: a Practical Approach. Oxford, Reino Unido: Oxford University Press), - são suscetíveis a modificações pós-traducionais, como glicosilação ou piroglutaminação, - são ocupadas por resíduos que se chocam com CDRs, de acordo com o modelo de CDRs 18C5 enxertados em frameworks de Crenezumab Fab, ou - são ocupadas por resíduos que são raros entre os anticorpos humanos sequenciados, nos quais o resíduo 18C5 do camundongo de origem ou algum outro resíduo é muito mais prevalente.

[0374] Foram construídas 2 variantes de região variável de cadeia pesada humanizada e 2 variantes de região variável de cadeia leve humanizada contendo diferentes permutações de substituições: hu18C5-VH_v1 e hu18C5-VH_v2 (SEQ ID NOs: 85-86, respectivamente) e hu18C5-VL_v1 e hu18C5-VL_v2_v6 (SEQ ID NOs: 91-92, respectivamente). (Tabelas 6 e 7). Os modelos exemplificados de Vh e Vk humanizados, com mutações reversas e outras mutações baseadas em estruturas humanas selecionadas, são mostrados nas Tabelas 6 e 7, respectivamente. As áreas em negrito nas Tabelas 6 e 7 indicam as CDRs conforme definido pelo Compósito de Kabat/Chothia. “–“ indica que não há nenhum aminoácido na posição indicada. SEQ ID NOs: 86 e 92 contêm mutações reversas e outras mutações, como mostrado na Tabela 8. Os aminoácidos nas posições em hu18C5-VH_v1 e hu18C5-VH_v2 estão listados na Tabela 9. Os aminoácidos nas posições em hu18C5-VL_v1 e hu18C5-VL_v2 estão listados na Tabela 10. A porcentagem de humanização para as cadeias VH humanizadas hu18C5-VH_v1 e hu18C5-VH_v2 (SEQ ID NOs: 85-86, respectivamente) em relação ao gene da linhagem germinativa humana mais semelhante IGHV3-48*01 e para as cadeias VL humanizadas hu18C5-VL_v1 e hu18C5 -VL_v2 (SEQ ID NOs: 91-92, respectivamente) em relação ao gene da linhagem germinativa humana mais semelhante IGKV2-30*02 é mostrada na Tabela 11. Tabela 7: Regiões de VL de 18C5 Humanizado

5VZY-VL_huFrwk Aceitadora (CreneFab) VL de 18C5 de Murino (SEQ ID NO:87)

Acesso Nº 5VZY (SEQ ID NO: 89)

hu18C5-VL_v1 (SEQ ID NO:91)

hu18C5-VL_v2 (SEQ ID NO:92) Resíduo Linear Nº

Resíduo Kabat Nº

FR ou CDR

1 1 Fr1 D D D D 2 2 Fr1 V I I V 3 3 Fr1 L V V V 4 4 Fr1 M M M M 5 5 Fr1 T T T T 6 6 Fr1 Q Q Q Q 7 7 Fr1 T S S S 8 8 Fr1 P P P P 9 9 Fr1 L L L L 10 10 Fr1 S S S S 11 11 Fr1 L L L L 12 12 Fr1 P P P P 13 13 Fr1 V V V V 14 14 Fr1 S T T T 15 15 Fr1 L P P P 16 16 Fr1 G G G G 17 17 Fr1 D E E E 18 18 Fr1 Q P P P 19 19 Fr1 A A A A 20 20 Fr1 S S S S

21 21 Fr1 I I I I 22 22 Fr1 S S S S 23 23 Fr1 C C C C CDR- 24 24 R R R R L1 CDR- 25 25 S S S S L1 CDR- 26 26 S S S S L1 CDR- 27 27 Q Q Q Q L1 CDR- 28 27A S S S S L1 CDR- 29 27B I L I I L1 CDR- 30 27C V V V V L1 CDR- 31 27D D Y D D L1 CDR- 32 27E S S S S L1 CDR- 33 27F _ _ _ L1 CDR- 34 28 N N N N L1 CDR- 35 29 G G G G L1 CDR- 36 30 N D N N L1 CDR- 37 31 T T T T L1 38 32 CDR- Y Y Y Y

L1 CDR- 39 33 L L L L L1 CDR- 40 34 E H E E L1 41 35 Fr2 W W W W 42 36 Fr2 Y Y Y Y 43 37 Fr2 L L L L 44 38 Fr2 Q Q Q Q 45 39 Fr2 K K K K 46 40 Fr2 P P P P 47 41 Fr2 G G G G 48 42 Fr2 Q Q Q Q 49 43 Fr2 S S S S 50 44 Fr2 P P P P 51 45 Fr2 K Q Q R 52 46 Fr2 L L L L 53 47 Fr2 L L L L 54 48 Fr2 I I I I 55 49 Fr2 Y Y Y Y CDR- 56 50 K K K K L2 CDR- 57 51 V V V V L2 CDR- 58 52 S S S S L2 CDR- 59 53 N N N N L2 CDR- 60 54 R R R R L2 61 55 CDR- F F F F

L2 CDR- 62 56 S S S S L2 63 57 Fr3 G G G G 64 58 Fr3 V V V V 65 59 Fr3 P P P P 66 60 Fr3 D D D D 67 61 Fr3 R R R R 68 62 Fr3 F F F F 69 63 Fr3 S S S S 70 64 Fr3 G G G G 71 65 Fr3 S S S S 72 66 Fr3 G G G G 73 67 Fr3 S S S S 74 68 Fr3 G G G G 75 69 Fr3 T T T T 76 70 Fr3 D D D D 77 71 Fr3 F F F F 78 72 Fr3 T T T T 79 73 Fr3 L L L L 80 74 Fr3 K K K K 81 75 Fr3 I I I I 82 76 Fr3 S S S S 83 77 Fr3 R R R R 84 78 Fr3 V V V V 85 79 Fr3 E E E E 86 80 Fr3 A A A A 87 81 Fr3 E E E E 88 82 Fr3 D D D D 89 83 Fr3 L V V V 90 84 Fr3 G G G G

91 85 Fr3 I V V V 92 86 Fr3 Y Y Y Y 93 87 Fr3 Y Y Y Y 94 88 Fr3 C C C C CDR- 95 89 F S F F L3 CDR- 96 90 Q Q Q Q L3 CDR- 97 91 G S G G L3 CDR- 98 92 S T S S L3 CDR- 99 93 H H H H L3 CDR- 100 94 V V V V L3 CDR- 101 95 P P P P L3 CDR- 102 95A _ _ _ _ L3 CDR- 103 95B _ _ _ _ L3 CDR- 104 95C _ _ _ _ L3 CDR- 105 95D _ _ _ _ L3 CDR- 106 95E _ _ _ _ L3 CDR- 107 95F _ _ _ _ L3 CDR- 108 96 L W L L L3

CDR- 109 97 T T T T L3 110 98 Fr4 F F F F 111 99 Fr4 G G G G 112 100 Fr4 A Q Q Q 113 101 Fr4 G G G G 114 102 Fr4 T T T T 115 103 Fr4 K K K K 116 104 Fr4 L V V V 117 105 Fr4 E E E E 118 106 Fr4 L I I I 119 106A Fr4 _ _ _ _ 120 107 Fr4 K K K K Tabela 7: Regiões de VH de 18C5 Humanizado 5VZY-VH_huFrwk Aceitadora (CreneFab) VH de 18C5 de Murino (SEQ ID NO: 81)

Acesso Nº 5VZY (SEQ ID NO:83)

hu18C5-VH_v1 (SEQ ID NO:85)

hu18C5-VH_v2 (SEQ ID NO:86) Resíduo Linear Nº

Resíduo Kabat Nº

FR ou CDR

1 1 Fr1 E E E E 2 2 Fr1 V V V V 3 3 Fr1 K Q Q Q 4 4 Fr1 L L L L 5 5 Fr1 L V V V

6 6 Fr1 E E E E 7 7 Fr1 S S S S 8 8 Fr1 G G G G 9 9 Fr1 G G G G 10 10 Fr1 G G G G 11 11 Fr1 L L L L 12 12 Fr1 V V V V 13 13 Fr1 Q Q Q Q 14 14 Fr1 P P P P 15 15 Fr1 G G G G 16 16 Fr1 G G G G 17 17 Fr1 S S S S 18 18 Fr1 L L L L 19 19 Fr1 N R R R 20 20 Fr1 L L L L 21 21 Fr1 S S S S 22 22 Fr1 C C C C 23 23 Fr1 V A A A 24 24 Fr1 A A A A 25 25 Fr1 S S S S CDR- 26 26 G G G G H1 CDR- 27 27 F F F F H1 CDR- 28 28 D T D D H1 CDR- 29 29 F F F F H1 CDR- 30 30 S S S S H1 31 31 CDR- R S R R

H1 CDR- 32 32 F Y F F H1 CDR- 33 33 W G W W H1 CDR- 34 34 M M M M H1 CDR- 35 35 S S S S H1 CDR- 36 35A _ _ _ _ H1 CDR- 37 35B _ _ _ _ H1 38 36 Fr2 W W W W 39 37 Fr2 A V V A 40 38 Fr2 R R R R 41 39 Fr2 Q Q Q Q 42 40 Fr2 A A A A 43 41 Fr2 P P P P 44 42 Fr2 G G G G 45 43 Fr2 R K K K 46 44 Fr2 G G G G 47 45 Fr2 Q L L Q 48 46 Fr2 E E E E 49 47 Fr2 W L L W 50 48 Fr2 I V V I 51 49 Fr2 G A A G CDR- 52 50 E S E E H2 CDR- 53 51 I I I I H2

CDR- 54 52 N N N N H2 CDR- 55 52A P S P P H2 CDR- 56 52B _ _ _ _ H2 CDR- 57 52C _ _ _ _ H2 CDR- 58 53 G N G G H2 CDR- 59 54 S G S S H2 CDR- 60 55 S G S S H2 CDR- 61 56 T S T T H2 CDR- 62 57 I T I I H2 CDR- 63 58 N Y N N H2 CDR- 64 59 Y Y Y Y H2 CDR- 65 60 T P T T H2 CDR- 66 61 P D P P H2 CDR- 67 62 S S S S H2 CDR- 68 63 L V L L H2 CDR- 69 64 K K K K H2

CDR- 70 65 D G D D H2 71 66 Fr3 K R R R 72 67 Fr3 F F F F 73 68 Fr3 I T T T 74 69 Fr3 I I I I 75 70 Fr3 S S S S 76 71 Fr3 R R R R 77 72 Fr3 D D D D 78 73 Fr3 N N N N 79 74 Fr3 A A A A 80 75 Fr3 K K K K 81 76 Fr3 N N N N 82 77 Fr3 T S S S 83 78 Fr3 L L L L 84 79 Fr3 F Y Y Y 85 80 Fr3 L L L L 86 81 Fr3 Q Q Q Q 87 82 Fr3 M M M M 88 82A Fr3 S N N N 89 82B Fr3 K S S S 90 82C Fr3 V L L L 91 83 Fr3 R R R R 92 84 Fr3 S A A A 93 85 Fr3 E E E E 94 86 Fr3 D D D D 95 87 Fr3 S T T T 96 88 Fr3 A A A A 97 89 Fr3 L V V V 98 90 Fr3 Y Y Y Y 99 91 Fr3 Y Y Y Y

100 92 Fr3 C C C C 101 93 Fr3 A A A A 102 94 Fr3 R S S R CDR- 103 95 L G L L H3 CDR- 104 96 G _ G G H3 CDR- 105 97 Y _ Y Y H3 CDR- 106 98 G _ G G H3 CDR- 107 99 N _ N N H3 CDR- 108 100 Y _ Y Y H3 CDR- 109 100A G _ G G H3 CDR- 110 100B W _ W W H3 CDR- 111 100C A _ A A H3 CDR- 112 100D L _ L L H3 CDR- 113 100E _ _ _ _ H3 CDR- 114 100F _ _ _ _ H3 CDR- 115 100G _ _ _ _ H3 CDR- 116 100H _ _ _ _ H3 117 100I CDR- _ _ _ _

H3 CDR- 118 100J _ _ _ _ H3 CDR- 119 100K _ _ _ _ H3 CDR- 120 101 D D D D H3 CDR- 121 102 Y Y Y Y H3 122 103 Fr4 W W W W 123 104 Fr4 G G G G 124 105 Fr4 Q Q Q Q 125 106 Fr4 G G G G 126 107 Fr4 T T T T 127 108 Fr4 S T T T 128 109 Fr4 V V V V 129 110 Fr4 T T T T 130 111 Fr4 V V V V 131 112 Fr4 S S S S 132 113 Fr4 S S S S Tabela 8 Mutações Reversas de VH, VL e Outras Mutações para 18C5 Humanizado Variante de VH Sequência aceitadora de Mudanças dos Resíduos ou VL éxons de VH ou V L de Framework Aceitador (com base nas CDRs do Composto Kabat/Chothia) hu18C5-VH_v1 5VZY-VH_huFrwk Nenhum (SEQ ID NO: 85) (CreneFab) Aceitadora Acesso Nº5VZY (SEQ ID NO:83)

Variante de VH Sequência aceitadora de Mudanças dos Resíduos ou VL éxons de VH ou V L de Framework Aceitador (com base nas CDRs do Composto Kabat/Chothia) hu18C5-VH_v2 5VZY-VH_huFrwk H37, H45, H47, H48, H49, (SEQ ID NO: 86) (CreneFab) Aceitadora H94 Acesso Nº5VZY (SEQ ID NO:83) hu18C5-VL_v1 5VZY-VL_huFrwk nenhum (SEQ ID NO: 91) (CreneFab) Aceitadora Acesso Nº5VZY (SEQ ID NO: 89) hu18C5-VL_v2 5VZY-VL_huFrwk L2, L45 (SEQ ID NO: 92) (CreneFab) Aceitadora Acesso Nº5VZY (SEQ ID NO: 89) Tabela 9 Numeração de Kabat dos Resíduos de Framework (com base nas CDRs do Composto Kabat/Chothia) para Mutações Reversas e Outras Mutações em Cadeias Pesadas de Anticorpos 18C5 Humanizados

5VZY-VH_huFrwk (CreneFab) Aceitadora

VH de 18C5 murino (SEQ ID NO: 81) Acesso Nº5VZY (SEQ ID NO:83)

hu18C5-VH_v1 (SEQ ID NO: 85)

hu18C5-VH_v2 (SEQ ID NO: 86) Resíduo de Kabat Nº

H37 V A V A H45 L Q L Q H47 L W L W H48 V I V I H49 A G A G H94 S R S R Tabela 10 Numeração de Kabat dos Resíduos de Framework (com base nas CDRs do Composto Kabat/Chothia) para Mutações Reversas e Outras Mutações em Cadeias Leves de Anticorpos 18C5 Humanizados

5VZY-VL_huFrwk (CreneFab) Aceitadora VL de 18C5 murino (SEO ID NO: 87) hu18C5-VL_v1 (SEQ ID NO: 91) hu18C5-VL_v2 (SEQ ID NO: 92) Acesso Nº5VZY (SEQ ID NO: 89) Resíduo de Kabat Nº L2 I V I V L45 Q K Q R Tabela 11 Porcentagem de Humanização das Cadeias Pesadas e Leves de Anticorpos 18C5 Humanizados Variante de VH ou VL % de Humanização hu18C5-VH_v1 (SEQ ID NO: 85) 96,2% hu18C5-VH_v2 (SEQ ID NO: 86) 93,8% hu18C5-VL_v1 (SEQ ID NO: 91) 88,6% hu18C5-VL_v2 (SEQ ID NO: 92) 92,4%

[0375] As posições em que os resíduos canônicos, vernier ou de interface/empacotamento de classe de Chothia diferem entre as sequências aceitadoras de camundongo e humanas são candidatas à substituição. Exemplos de resíduos canônicos da classe Chothia incluem o resíduo de Kabat L48 nas Tabelas 6 e 7. Exemplos de resíduos de interface/empacotamento (VH+VL) incluem os resíduos de Kabat H35, H37, H39, H45, H47, H91, H93, H95, H103, L34, L36, L38, L44, L46, L87, L89, L91, L96, and L98 nas Tabelas 6 e 7.

[0376] As razões para a seleção das posições indicadas na Tabela 6 na região variável da cadeia leve como candidatas à substituição são as seguintes. I2V é uma mutação reversa de um resíduo canônico de Chothia.

Q45R é uma mutação para o resíduo da linhagem germinativa IGKV2-30*02. Q é raro em humanos nesta posição. R é frequente nesta posição.

[0377] hu18C5-VL_v1: Alças de CDR-L1, L2 e L3 de 18C5-VL enxertadas no framework de CreneFab (5VZY-VL).

[0378] hu18C5-VL_v2: reverte todas as substituições do framework em posições essenciais para definir as classes canônicas de Chothia, fazem parte da zona Vernier ou se localizam na interface de domínio VH/VL; hu18C5-VL_v2 incorpora mutações reversas I2V, um aceitador humano da mutação Q45R da linhagem germinativa, para permitir a avaliação das contribuições dessas posições para a afinidade de ligação ao antígeno e imunogenicidade.

[0379] Regiões variáveis da cadeia leve:

[0380] hu18C5-VL_1 (SEQ ID NO: 91)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVDSNGNTYLEWYLQKPGQSPQ LLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQ GTKVEIK

[0381] hu18C5-VL_2 (SEQ ID NO: 92)

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVDSNGNTYLEWYLQKPGQSPR LLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQ GTKVEIK

[0382] As razões para a seleção das posições indicadas na Tabela 7 na região variável de cadeia pesada como candidatas à substituição são as seguintes. V37A: é uma mutação reversa na zona vernier. Val mostra interação repulsiva com Trp47. L45Q: é uma mutação reversa de um resíduo da interface principal por Chothia. Leu nesta posição tem interações repulsivas de Van der Waals. L47W: é uma mutação reversa de um resíduo de interface. Em 18C5 murino, Trp está na posição 47 e Trp faz a ligação de hidrogênio com Ser 35, estabilizando assim as folhas beta intra-cadeia. Leu não estabelece nenhuma interface com nenhum resíduo e pode desestabilizar a conformação. V48I: é uma mutação reversa de um resíduo da zona Vernier interagindo com CDR para preservar essa interação. A49G: é uma mutação reversa de um resíduo de Vernier.

S94R: é uma mutação reversa de um resíduo da zona Vernier, para preservar a interação da CDR.

[0383] hu18C5-VH_v1: alças de CDR-H1, H2 e H3 de 18C5-VH enxertadas no framework de CreneFab VH (5VZY-VH).

[0384] Hu18C5-VL_v2: reverte todas as substituições do framework em posições essenciais para definir as classes canônicas de Chothia, fazem parte da zona Vernier ou estão localizadas na interface de domínio VH/VL. 18C5-VH_v2 incorpora mutações reversas V37A, L45Q, L47W, V48I, A49G e S94R, para permitir a avaliação das contribuições dessas posições para a afinidade de ligação ao antígeno e imunogenicidade.

[0385] Regiões variáveis da cadeia pesada:

[0386] hu18C5-VH_1 (SEQ ID NO: 85)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRFWMSWVRQAPGKGLELV AEINPGSSTINYTPSLKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLGYGN YGWALDYWGQGTTVTVSS

[0387] hu18C5-VH_2 (SEQ ID NO: 86)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRFWMSWARQAPGKGQEWI GEINPGSSTINYTPSLKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGYGN

YGWALDYWGQGTTVTVSS Listagem de Sequências: SEQ ID NO:1 Sequência de aminoácidos de VH de 18C5 com peptídeo sinal

MDFGLIFFIVALLKGVQCEVKLLESGGGLVQPGGSLNLSCVASGFDFSRF WMSWARQAPGRGQEWIGEINPGSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLFLQMSKVR

SEDSALYYCARLGYGNYGWALDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO:2 Sequência nucleotídica que codifica VH de 18C5 de camundongo com peptídeo sinal

ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTCATTGTTGCCCTTTTAAAAGGGGTCCA GTGTGAGGTAAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGG ATCCCTGAATCTCTCCTGTGTAGCCTCAGGATTCGATTTTAGTAGATTCTGGAT GAGTTGGGCTCGGCAGGCTCCAGGGAGAGGACAGGAATGGATTGGAGAGAT TAATCCAGGAAGCAGTACGATAAACTATACGCCATCTCTGAAGGATAAATTCAT CATCTCCAGAGACAACGCCAAAAATACGCTGTTCCTGCAAATGAGCAAAGTGA GATCTGAGGACTCAGCCCTTTATTACTGTGCAAGACTGGGGTATGGTAACTAC

GGATGGGCTCTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO:3 Sequência de aminoácidos de VL de 18C5 com peptídeo sinal

MKLPVRLLVLMFWIPASRSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVDS NGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE

DLGIYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK SEQ ID NO:4 Sequência nucleotídica que codifica VL de 18C5 de camundongo com peptídeo sinal

ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTT CCAGAAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTT GGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTAGATAGTAAT GGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCT CCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTG GCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGA GGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGG

TGCTGGGACCAAGTTGGAGCTGAAA SEQ ID NO: 5 Sequência de aminoácidos de uma CDR-H1 de 18C5

GFDFSRFWMS SEQ ID NO: 6 Sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-H1 de 18C5

GGATTCGATTTTAGTAGATTCTGGATGAGT SEQ ID NO: 7 Sequência de aminoácidos de uma CDR-H2 de 18C5

EINPGSSTINYTPSLKD SEQ ID NO: 8 Sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-H2 de 18C5

GAGATTAATCCAGGAAGCAGTACGATAAACTATACGCCATCTCTGAAGG

AT SEQ ID NO: 9 Sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-H3 de 18C5

LGYGNYGWALDY SEQ ID NO: 10 Sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-H3 de 18C5

CTGGGGTATGGTAACTACGGATGGGCTCTGGACTAC SEQ ID NO: 11 Sequência de aminoácidos de uma CDR-L1 DE 18C5

RSSQSIVDSNGNTYLE SEQ ID NO: 12 Sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-L1 de 18C5

AGATCTAGTCAGAGCATTGTAGATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAA SEQ ID NO: 13 Sequência de aminoácido que de uma CDR-L2 de 18C5

KVSNRFS SEQ ID NO: 14 Sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-L2 de 18C5

AAAGTTTCCAACCGATTTTCT SEQ ID NO: 15 Sequência de aminoácido de uma CDR-L3 de 18C5

FQGSHVPLT SEQ ID NO: 16 Sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-L3 de 18C5

TTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACG SEQ ID NO: 17 Sequência de aminoácido de uma região constante de cadeia pesada de 18C5 quimérica (IgG1 humana)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK

SLSLSPGK SEQ ID NO: 18 Sequência de ácido nucleico que codifica uma região constante de cadeia pesada de 18C5 quimérica (IgG1 humana)

GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAA GAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT CCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGT GCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGC GTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAAT CTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGG GGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC CCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCG TCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC AAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACGCTGCCCCCATCCCGGGAG GAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATC CCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACT ACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAG CAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATG CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCC

CTGTCCCCGGGTAAATGA SEQ ID NO: 19 Sequência de aminoácido que codifica uma região constante de cadeia leve de 18C5 quimérica (kappa humana)

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC

SEQ ID NO: 20 Sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido de uma região constante de cadeia leve de 18C5 quimérica (kappa humana)

CGGGGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTA TCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGT AACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGC CTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCT ACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCT

TCAACAGGGGAGAGTGTTAG SEQ ID NO:21 Sequência de aminoácido de uma região constante de cadeia pesada de IgG1 exemplificativa

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNVKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK

SLSLSPGK SEQ ID NO:22 Sequência de aminoácido de uma região constante de cadeia pesada de IgG1 G1m3 exemplificativa

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK

SLSLSPGK SEQ ID NO:23 Sequência de aminoácido de uma região constante de cadeia pesada de

IgG1 G1m3 exemplificativa

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK THTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT

QKSLSLSPGK SEQ ID NO:24 Sequência de aminoácido de uma região constante de cadeia leve com Arginina N-terminal

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR

GEC SEQ ID NO:25 Sequência de aminoácido de uma região constante de cadeia leve sem Arginina N-terminal

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG

EC SEQ ID NO:26 Sequência de aminoácido de transtirretina humana estabelecida no número de acesso P02766.1 (UniProt)

MASHRLLLLCLAGLVFVSEAGPTGTGESKCPLMVKVLDAVRGSPAINVAVH VFRKAADDTWEPFASGKTSESGELHGLTTEEEFVEGIYKVEIDTKSYWKALGISPF

HEHAEVVFTANDSGPRRYTIAALLSPYSYSTTAVVTNPKE SEQ ID NO:27 Sequência de aminoácido de transtirretina humana estabelecida no número de acesso AAB35639.1 (GenBank)

GPTGTGESKCPLMVKVLDAVRGSPAINVAVHVFRKAADDTWEPFASGKTS ESGELHGLTTEEQFVEGIYKVEIDTKSYWKALGISPFHEHAEVVFTANDSGPRRY TIAALLSPYSYSTTAVVTNPKE

SEQ ID NO:28 Sequência de aminoácido de transtirretina humana estabelecida no número de acesso AAB35640.1 (GenBank)

GPTGTGESKCPLMVKVLDAVRGSPAINVAVHVFRKAADDTWEPFASGKTS ESGELHGLTTEEQFVEGIYKVEIDTKSYWKALGISPFHEHAEVVFTANDSGPRRY

TIAALLSPYSYSTTAVVTNPKE SEQ ID NO:29 Sequência de aminoácido de transtirretina humana estabelecida no número de acesso e ABI63351.1 (GenBank)

MASHRLLLLCLAGLVFVSEAGPTGTGESKCPLMVKVLDAVRGSPAINVAVH VFRKAADDTWEPFASGKTSESGELHGLTTEEEFVEGIYKVEIDTKSYWKALGISPF

HEHAEVVFTANDSGPRRYSYSTTAVVTNPKE SEQ ID NO:30 Sequência de aminoácido dos resíduos 101-109 da transtirretina humana

GPRRYTIAA SEQ ID NO:31 Sequência de aminoácido dos resíduos 87-127 da transtirretina humana

FHEHAEVVFTANDSGPRRYTIAALLSPYSYSTTAVVTNPKE SEQ ID NO:32 Sequência de ácido nucleico que codifica uma região constante de cadeia pesada de IgG1 G1m3 exemplificativa

GCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAA GAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT CCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGT GCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGC GTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAAT CTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGG GGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC CCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCG TCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC AAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAG GAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATC CCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACT ACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAG CAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATG CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCC

CTGTCCCCGGGTAAA SEQ ID NO:33 Sequência de ácido nucleico que codifica uma região constante de cadeia leve exemplificativa com Arginina N-terminal

CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGC AGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCA GAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTC CCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAG CAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCC TGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACA

GGGGAGAGTGT SEQ ID NO:34 Sequência de ácido nucleico que codifica uma região constante de cadeia leve exemplificativa sem Arginina N-terminal

ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGT TGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCC AGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCA GCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTG CGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAG

GGGAGAGTGT SEQ ID NO:35 Sequência de aminoácido de um peptídeo sinal da região constante de cadeia pesada

MNFGLSLIFLVLVLKGVQC SEQ ID NO:36 Sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo sinal da região constante de cadeia pesada

ATGAACTTTGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGT

CCAGTGT SEQ ID NO:37 Sequência de aminoácido de um peptídeo sinal da região constante de cadeia leve

MESHTQVFVFVFLWLSGVDG SEQ ID NO:38 Sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo sinal da região constante de cadeia leve

ATGGAGTCACATACTCAGGTCTTTGTATTCGTGTTTCTCTGGTTGTCTG

GTGTTGACGGA SEQ ID NO: 39 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-H1 de 14G8

SYTMS SEQ ID NO: 40 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-H2 de 14G8

EINNSGDTTYYPDTVKG SEQ ID NO: 41 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-H3 de 14G8

HYYYGGGYGGWFFDV SEQ ID NO: 42 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-L1 de 14G8

RSNKSLLHSNGNTYLY SEQ ID NO: 43 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-L2 de 14G8

RVSNLAS SEQ ID NO: 44 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-L3 de 14G8

MQHLEYPLT SEQ ID NO: 45 epitope de 5A1

EHAEVVFTA SEQ ID NO: 46 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-H1 de 5A1

NYAMS SEQ ID NO: 47 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-H2 de 5A1

SISSGGSTYYPDSVKG SEQ ID NO: 48 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-H3 de 5A1

YYYGQYFDF SEQ ID NO: 49 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-L1 de 5A1

KASQDVSTTVA SEQ ID NO: 50 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-L2 de 5A1

SASYRCT SEQ ID NO: 51 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-L3 de 5A1

QQHYSTPLT SEQ ID NO: 52 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-H1 de 6C1

NYYMS SEQ ID NO: 53 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-H2 de 6C1

YISIDGNNIYHPDSVKG SEQ ID NO: 54 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-H3 de 6C1

DSDYGYFDV SEQ ID NO: 55

Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-L1 de 6C1

RSSQSIVHSNGNTYLE SEQ ID NO: 56 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-L2 de 6C1

KVSKRFS SEQ ID NO: 57 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-L3of 6C1

FQGSHVPLT SEQ ID NO: 58 Sequência de aminoácido de região de VH de AD7F6

EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYGMSWIRQTPDKRLEWVA TISSSGTYTYYTESVKGRFTVSRDNAKNTLSLQMSNLKSDDTAMYYCTRQAYGR EYFDVWGTGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVT VTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTT VDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVT CVVVDVSEDDPDVRISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSALPIQHQDWM SGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVG FNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLDIKTSTVGENRFLLMQ

RETRGSEKLLPEEDHLPSPGK SEQ ID NO: 59 Sequência de aminoácido de região de VL de AD7F6

DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLFDSRTRKNYLAWYQQKPGQS PKLLIYWASNRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYFCKQSNYLRTFG GGTRVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSE RQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSF

NRNEC SEQ ID NO: 60 Sequência de aminoácido de CDR-H1 de RT24

RYWIT SEQ ID NO: 61 Sequência de aminoácido de CDR-H2 de RT24

DIYPGSGRTNYNEKFKN

SEQ ID NO: 62 Sequência de aminoácido de CDR-H3 de RT24

YYGSTYFYV SEQ ID NO:63 Sequência de aminoácido de CDR-L1 de RT24

RSSKSLLYKDGKTYLN SEQ ID NO: 64 Sequência de aminoácido de CDR-L2 de RT24

LMSTRAS SEQ ID NO: 65 Sequência de aminoácido de CDR-L3 de RT24

QQLVEYPRT SEQ ID NO: 66 Sequência de aminoácido de CDR-H1 de NI-301.35G11

SYAMS SEQ ID NO:67 Sequência de aminoácido de CDR-H2 de NI-301.35G11

SISGSGDTTKYTDSVKG SEQ ID NO: 68 Sequência de aminoácido de CDR-H3 de NI-301.35G11

DGSGRIDPFAL SEQ ID NO: 69 Sequência de aminoácido de CDR-L1 de NI-301.35G11

RSSRSLVYSDGNIYLN SEQ ID NO: 70 Sequência de aminoácido de CDR-L2 de NI-301.35G11

KVSNRDSG SEQ ID NO: 71 Sequência de aminoácido de CDR-L3 de NI-301.35G11

MQGTHWPRT SEQ ID NO: 72 Epítopo de MFD101, MDF102, MFD103, MFD105,

ADDTWEPFASGKT SEQ ID NO: 73 Epítopo de MFD107, MFD108, MFD109, MFD111

TSESGELHGLTTE SEQ ID NO: 74 Epítopo de MFD114

ALLSPYSYSTTAV SEQ ID NO: 75 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-H1 de anticorpo 9D5

SYTMS SEQ ID NO: 76 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-H2 de anticorpo 9D5

EISNSGDTTYYPDTVKG SEQ ID NO: 77 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-H3 de anticorpo 9D5

HYYYGGGYGGWFFDV SEQ ID NO: 78 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-L1 de anticorpo 9D5

RSSKSLLHSNGNTYLY SEQ ID NO: 79 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-L2 de anticorpo 9D5

RVSNLAS SEQ ID NO: 80 Sequência de aminoácido de uma Kabat CDR-L3 de anticorpo 9D5

MQHLEYPLT SEQ ID NO:81 Sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia pesada madura do anticorpo 18C5 de camundongo

EVKLLESGGGLVQPGGSLNLSCVASGFDFSRFWMSWARQAPGRGQEWI GEINPGSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLFLQMSKVRSEDSALYYCARLGYGNY

GWALDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO: 82

Sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia pesada de anticorpo Fab c#17 anti-piroglutamato-Abeta de murino

EVKLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSDYGMAWVRQAPGKGPEW VAFISNLAYSIYYADTVTGRFTISRENAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCARYDYDN

ILDYVMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO: 83 Sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia pesada de Fac de Crenezumabe humanizado (CreneFab) PDB: 5VZY

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELV ASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYW

GQGTTVTVSS SEQ ID NO: 84 Sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia pesada da sequência da linhagem germinativa humana IGHV3-48*01

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWV SYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYFDYW

GQGTLVTVSS SEQ ID NO: 85 Sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia pesada de anticorpo 18C5 humanizado hu18C5-VH_1

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRFWMSWVRQAPGKGLELV AEINPGSSTINYTPSLKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLGYGN

YGWALDYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 86 Sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia pesada de anticorpo 18C5 humanizado hu18C5-VH_2

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRFWMSWARQAPGKGQEWI GEINPGSSTINYTPSLKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGYGN

YGWALDYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO:87 Sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve madura de anticorpo 18C5 de camundongo

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVDSNGNTYLEWYLQKPGQSPK LLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPLTFGA

GTKLELK SEQ ID NO: 88 Sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve de anticorpo anti-piroglutamato-Abeta de murinho Fab c#17

DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSP KLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPTFG

GGTKLEIK SEQ ID NO: 89 Sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve de Fab de Crenezumabe humanizado (CreneFab) PDB: 5VZY

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQ LLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFG

QGTKVEIK SEQ ID NO: 90 Sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve de sequência da linhagem germinativa humana IGKV2-30*2

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSDGNTYLNWFQQRPGQSP RRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPWT

FGQGTKVEIK SEQ ID NO: 91 Sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve de anticorpo 18C5 humanizado hu18C5-VL_1

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVDSNGNTYLEWYLQKPGQSPQ LLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQ

GTKVEIK SEQ ID NO: 92 Sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve de anticorpo 18C5 humanizado hu18C5-VL_2

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVDSNGNTYLEWYLQKPGQSPR LLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQ

GTKVEIK SEQ ID NO: 93 Sequência de aminoácido de Kabat CDR-H1 de anticorpo 18C5 de camundongo

RFWMS SEQ ID NO: 94 Sequência de aminoácido de Chothia CDR-H1 de anticorpo 18C5 de camundongo

GFDFSRF SEQ ID NO: 95 Sequência de aminoácido de Contact CDR-H1 de anticorpo 18C5 de camundongo

SRFWMS SEQ ID NO: 96 Sequência de aminoácido de Chothia CDR-H2 de anticorpo 18C5 de camundongo

NPGSST SEQ ID NO: 97 Sequência de aminoácido de uma AbM CDR-H2 de anticorpo 18C5 de camundongo

EINPGSSTIN SEQ ID NO: 98 Sequência de aminoácido de Contact CDR-H2 de anticorpo 18C5 de camundongo

WIGEINPGSSTIN SEQ ID NO: 99 Sequência de aminoácido de Contact CDR-H3 de anticorpo 18C5 de camundongo

ARLGYGNYGWALD SEQ ID NO: 100 Sequência de aminoácido de Contact CDR-L1 de anticorpo 18C5 de camundongo

NTYLEWY SEQ ID NO: 101 Sequência de aminoácido de Contact CDR-L2 de anticorpo 18C5 de camundongo

LLIYKVSNRF SEQ ID NO: 102 Sequência de aminoácido de Contact CDR-L3 de anticorpo 18C5 de camundongo

FQGSHVPL

Claims (141)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal isolado caracterizado pelo fato de que compete pela ligação à transtirretina humana (TTR) com o anticorpo monoclonal 18C5.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se liga ao mesmo epítopo na TTR humano que um anticorpo monoclonal 18C5.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada do anticorpo monoclonal 18C5, em que o 18C5 é um anticorpo de camundongo caracterizado por uma região variável de cadeia pesada madura tendo uma sequência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO:81 e uma região variável de cadeia leve madura tendo uma sequência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO:87.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as três CDRs de cadeia pesada são conforme definido pelo Composto de Kabat/Chothia (SEQ ID NOs: 5, 7, e 9) e as três CDRs de cadeia leve são conforme definido pelo Composto de Kabat/Chothia (SEQ ID NOs: 11, 13, e 15).

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 18C5 ou sua forma quimérica, com superfície modificada ou humanizada.

6. Anticorpo monoclonal isolado caracterizado pelo fato de que se liga a um epítopo dentro das posições 101-109 na região madura da SEQ ID NO:26.

7. Anticorpo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo monoclonal.

8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo quimérico, humanizado, com superfície modificada ou humano.

9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada madura tem 85% de identidade com a sequência humana.

10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia leve madura tem 85% de identidade com a sequência humana.

11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que cada região variável da cadeia pesada madura e região variável da cadeia leve madura tem 85% de identidade com a sequência da linhagem germinativa humana.

12. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado.

13. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que possui um isótipo de IgG1 humano.

14. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-13, caracterizado pelo fato de que possui um isótipo de IgG2 ou IgG4 humano.

15. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo 18C5 humanizado ou quimérico que se liga especificamente à transtirretina, em que 18C5 é um anticorpo de camundongo caracterizado por uma região variável de cadeia pesada madura da SEQ ID NO:81 e uma região variável de cadeia leve madura da SEQ ID NO:87.

16. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada madura humanizada compreendendo as três CDRs de cadeia pesada do 18C5 e uma região variável de cadeia leve madura humanizada compreendendo as três CDRs de cadeia leve do 18C5.

17. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que as CDRs são de uma definição selecionada a partir grupo consistindo de Kabat, Chothia, composto de Kabat/Chothia, definições AbM e Contact.

18. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada madura humanizada compreende as três CDRs da cadeia pesada do composto Kabat/Chothia de 18C5 (SEQ ID NOs: 5, 7 e 9) e a região variável da cadeia leve madura humanizada compreende as três CDRs de cadeia leve do composto Kabat/Chothia de 18C5 (SEQ ID NOs: 11, 13 e 15).

19. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura humanizada compreende as três CDRs de cadeia pesada de Kabat do 18C5 (SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:9) e a região variável de cadeia leve madura humanizada compreende as três CDRs de cadeia leve de Kabat do 18C5 (SEQ ID

NO: 11, SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO: 15).

20. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura humanizada compreende as três CDRs de cadeia pesada de Chothia do 18C5 (SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO:96 e SEQ ID NO:9) e a região variável de cadeia leve madura humanizada compreende as três CDRs de cadeia leve de Chothia do 18C5 (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO: 15).

21. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura humanizada compreende as três CDRs de cadeia pesada de AbM do 18C5 (SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:97 e SEQ ID NO:9) e a região variável de cadeia leve madura humanizada compreende as três CDRs de cadeia leve de AbM do 18C5 (SEQ ID NO: 11. SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 15.

22. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada madura humanizada compreende as três CDRs da cadeia pesada de contato do 18C5 (SEQ ID NOs 100-102) e a região variável da cadeia leve madura humanizada compreende as três CDRs da cadeia leve de contato do 18C5 (SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 98 e SEQ ID NO: 99).

23. Anticorpo humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15-22, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada madura humanizada que possui uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO:85-86 e uma região variável de cadeia leve madura humanizada que possui uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 91-92.

24. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das seguintes posições é ocupada pelo aminoácido, conforme especificado: H37 é ocupado por V ou A, H45 é ocupado por L ou Q, H47 é ocupado por L ou W, H48 é ocupado por L ou I, H49 é ocupado por A ou G, e H94 é ocupado por S ou R.

25. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que as posições H37, H45, H47, H48, H49 e H94 na região VH sejam ocupadas por A, Q, W, I, G e R, respectivamente.

26. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das seguintes posições seja ocupada pelo aminoácido, conforme especificado: L2 é ocupado por I ou V e L45 é ocupado por Q ou R.

27. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que as posições L2 e L45 na região VL sejam ocupadas por V e R, respectivamente.

28. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada madura que possui uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO: 85-86 e uma região variável de cadeia leve madura que possui uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO: 91-92.

29. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada madura que possui uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO: 85-86 e uma região variável de cadeia leve madura que tem possui uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO: 91-92.

30. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura possui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:85-86 e a região variável de cadeia leve madura possui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:91-92.

31. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura possui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:85 e a região variável de cadeia leve madura possui em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:91.

32. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada madura possui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:85 e a região variável da cadeia leve madura possui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:92.

33. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura possui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:86 e a região variável de cadeia leve madura possui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:91.

34. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura possui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:86 e a região variável de cadeia leve madura possui em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:92.

35. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-34, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo intacto.

36. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-34, caracterizado pelo fato de que é um fragmento de ligação.

37. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação é um anticorpo de cadeia única, fragmento Fab ou Fab'2.

38. Anticorpo humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15-35, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeias leve madura é fundida a uma região constante de cadeia leve e a região variável de cadeia pesada madura é fundida a uma região constante de cadeia pesada.

39. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada é uma forma mutante de uma região constante de cadeia pesada humana natural que tem ligação reduzida a um

40. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada é do isótipo IgG1.

41. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura é fundida a uma região constante de cadeia pesada possuindo a sequência da SEQ ID NO:22 e/ou a região variável de cadeia leve madura é fundida a uma região constante de cadeia leve possuindo a sequência de SEQ ID NO:24.

42. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um primeiro anticorpo de qualquer uma das reivindicações anteriores, um segundo anticorpo que se liga a um epítopo diferente de TTR daquele ligado por 18C5 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

43. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o segundo anticorpo é 9D5, 14G8, 5A1, 6C1, AD7F6, RT24, NI-301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD 107, MFD 108, MFD 109, MFD111, MFD 114, ou uma versão quimérica ou uma versão humanizada deste.

44. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o segundo anticorpo é um anticorpo que se liga nos resíduos 89-97, 118-122, 115-124, 53-63, 54-61, 36-49, 49-61, 109-121, 30-66, 70- 127, 80-127, 90-127, 100-127, 110-127 ou 115-127 de TTR.

45. Anticorpo biespecífico caracterizado pelo fato de que compreende duas regiões de ligação ao antígeno, um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a 101-109 de TTR e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a outra região de TTR.

46. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de ligação ao antígeno é um domínio de ligação ao antígeno de 9D5, 14G8, 5A1, 6C1, AD7F6, RT24, NI- 301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD107, MFD108, MFD109, MFD111, MFD 114 ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.

47. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de ligação ao antígeno se liga aos resíduos 89-97, 118-122, 115-124, 53-63, 54-61, 36-49, 49-61, 109-121, 30 - 66, 70-127, 80- 127, 90-127, 100-127, 110-127 ou 115-127 de TTR.

48. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-41 e 45-47, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

49. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que codifica a cadeia pesada e/ou a cadeia leve de um anticorpo, conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1-41 e/ou 45/47.

50. Vetor de expressão recombinante caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 49.

51. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que é transformada com o vetor de expressão recombinante, de acordo com a reivindicação 50.

52. Método de humanização de um anticorpo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) selecionar um anticorpo aceitador humano; (b) identificar os resíduos de aminoácidos do anticorpo de camundongo a serem mantidos; (c) sintetizar um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada humanizada compreendendo as CDRs da cadeia pesada do anticorpo de camundongo e um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve humanizada compreendendo as CDRs da cadeia leve do anticorpo de camundongo; e (d) expressar os ácidos nucleicos em uma célula hospedeira para produzir um anticorpo humanizado; em que o anticorpo de camundongo compreende uma região variável de cadeia pesada madura com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81 e uma região variável de cadeia leve madura com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 87.

53. Método de produção de um anticorpo humanizado, quimérico ou de superfície modificada, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar células transformadas com ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo de modo que as células secretem o anticorpo; e (b) purificar o anticorpo a partir de meios de cultura celular; em que o anticorpo é uma forma humanizada, quimérica ou de superfície modificada do 18G5.

54. Método de produção de uma linhagem celular que produz um anticorpo humanizado, quimérico ou de superfície modificada, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) introduzir um vetor que codifica cadeias pesadas e leves de um anticorpo e um marcador selecionável nas células; (b) propagar as células em condições para selecionar células que tenham maior número de cópias do vetor; (c) isolar células únicas a partir das células selecionadas; e (d) armazenar as células clonadas a partir de uma única célula selecionada com base na produção do anticorpo; em que o anticorpo é uma forma humanizada, quimérica ou de superfície modificada do 18C5.

55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, a propagação das células em condições seletivas e a triagem de linhagens celulares que expressam e secretam naturalmente pelo menos 100 mg/L/106 células/24h.

56. Método para inibir ou reduzir a agregação de transtirretina em um sujeito que tem ou está em risco de desenvolver uma amiloidose mediada por transtirretina, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito um regime efetivo do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-41 e 45-47, inibindo ou reduzindo deste modo a agregação de transtirretina no sujeito.

57. Método para inibir ou reduzir a formação de fibrilas de transtirretina em um sujeito que tem ou está em risco de desenvolver uma amiloidose mediada por transtirretina, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito um regime efetivo do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-41 e 45-47, inibindo ou reduzindo deste modo a acumulação de transtirretina no sujeito.

58. Método para reduzir os depósitos e agregados de transtirretina em um sujeito que tem ou está em risco de desenvolver uma amiloidose mediada por transtirretina, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito um regime efetivo do anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-41 e 45-47, reduzindo desse modo os depósitos de transtirretina no sujeito.

59. Método para depuração da transtirretina amiloide em um sujeito que tem ou está em risco de desenvolver uma amiloidose mediada por transtirretina, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao sujeito de um regime eficaz do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1- 41 ou 45-47, depurando deste modo a transtirretina amiloide do sujeito em relação a um sujeito que tem ou está em risco de desenvolver uma amiloidose mediada por transtirretina que não recebeu o anticorpo.

60. Método para tratar ou efetuar a profilaxia de uma amiloidose mediada por transtirretina em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito um regime efetivo do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-41 e 45-47.

61. Método para retardar o início de uma amiloidose mediada por transtirretina em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito um regime eficaz do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-41 e 45-47.

62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 61, caracterizado pelo fato de que a amiloidose mediada por transtirretina está associada a uma condição selecionada de qualquer cardiomiopatia ou hipertrofia, polineuropatia amiloide familiar, amiloidose seletiva do sistema nervoso central (CNSA), amiloidose seletiva do sistema nervoso central, amiloidose sistêmica senil, amiloidose cardíaca senil, estenose espinal, osteoartrite, artrite reumatoide, artrite idiopática juvenil, degeneração macular relacionada à idade e distúrbio do ligamento ou tendão.

63. Método para tratar um sujeito com ou em risco de qualquer um dentre cardiomiopatia ou hipertrofia, polineuropatia amiloide familiar, amiloidose seletiva do sistema nervoso central (CNSA), amiloidose sistêmica senil, amiloidose cardíaca senil, estenose espinal, osteoartrite, artrite reumatoide, artrite idiopática juvenil degeneração macular relacionada à idade e um distúrbio do ligamento ou tendão, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao sujeito de um regime eficaz do anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-41 e 45-

47.

64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 63, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado em combinação com um segundo anticorpo que se liga um epítopo diferente de TTR daquele ligado a 18C5.

65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo é 9D5, 14G8, 5A1, 6C1, AD7F6, RT24, NI-301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD107, MFD 108, MFD 109, MFD111, MFD 114 ou uma forma quimérica ou humanizada deste.

66. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo se liga nos resíduos 89-97, 118-122, 115-124, 53-63, 54- 61, 36-49, 49-61, 109-121, 30-66, 70-127, 80-127, 90-127, 100-127, 110-127 ou 115-127 de TTR.

67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 63, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado como uma monoterapia.

68. Método para diagnosticar uma amiloidose mediada por transtirretina em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato uma amostra biológica do sujeito com uma quantidade eficaz do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-41.

69. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de compreender ainda o contato da amostra biológica do sujeito com uma quantidade eficaz de um segundo anticorpo que se liga a um epítopo diferente de TTR daquele ligado a 18C5.

70. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo é 9D5, 14G8, 5A1, 6C1, 8C3, 7G7, AD7F6, RT24, NI-

301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD 107, MFD 108, MFD 109, MFD111, MFD 114, ou uma versão quimérica ou uma versão humanizada deste.

71. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo se liga nos resíduos 89-97, 118-122, 115-124, 53-63, 54- 61, 36-49, 49-61, 109-121, 30-66, 70-127, 80-127, 90-127, 100-127, 110-127 ou 115-127 de TTR.

72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 68-71, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, a detecção da ligação do anticorpo à transtirretina, em que a presença de anticorpo ligado indica que o sujeito tem uma amiloidose mediada por transtirretina.

73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 68-71, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, a comparação da ligação do anticorpo à amostra biológica com a ligação do anticorpo a uma amostra de controle, pelo que uma ligação aumentada do anticorpo à amostra biológica em relação à amostra de controle indica que o sujeito tem uma amiloidose mediada por transtirretina.

74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica e a amostra de controle compreendem células da mesma origem de tecido.

75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 68-74, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica e/ou a amostra de controle são sangue, soro, plasma ou tecido sólido.

76. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que o tecido sólido é proveniente do coração, sistema nervoso periférico, sistema nervoso autônomo, rins, olhos, gordura abdominal ou trato gastrointestinal.

77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 56-76, caracterizado pelo fato de que a amiloidose mediada por transtirretina é uma amiloidose familiar de transtirretina ou uma amiloidose esporádica de transtirretina.

78. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que a amiloidose familiar por transtirretina é a cardiomiopatia amiloide familiar (FAC), polineuropatia amiloide familiar (FAP) ou amiloidose seletiva do sistema nervoso central (CNSA).

79. Método de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que a amiloidose esporádica de transtirretina é amiloidose sistêmica senil (SSA) ou amiloidose cardíaca senil (SCA).

80. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 56-79, caracterizado pelo fato de que a amiloidose mediada por transtirretina está associada ao acúmulo amiloide no coração, sistema nervoso periférico, sistema nervoso autônomo, rins, olhos, gordura abdominal ou trato gastrointestinal do sujeito.

81. Método para detectar a presença ou ausência de depósitos de transtirretina em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato uma amostra biológica do sujeito suspeito de apresentar o acúmulo amiloide com uma quantidade eficaz do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-41.

82. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, a detecção da ligação do anticorpo à transtirretina, em que a detecção de anticorpo ligado indica a presença de depósitos de transtirretina.

83. Método, de acordo com a reivindicação 81 ou 82, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, a comparação da ligação do anticorpo à amostra biológica com a ligação do anticorpo a uma amostra de controle, pelo qual uma ligação aumentada do anticorpo à amostra biológica em relação à amostra de controle indica que o sujeito tem uma amiloidose mediada por transtirretina.

84. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica e a amostra de controle compreendem células da mesma origem de tecido.

85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 81-83, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica e/ou a amostra de controle são sangue, soro, plasma ou tecido sólido.

86. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que o tecido sólido é proveniente do coração, sistema nervoso periférico, sistema nervoso autônomo, rins, olhos, gordura abdominal ou trato gastrointestinal.

87. Método para determinar um nível de depósitos de transtirretina em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende administrar o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-48 e detectar a presença de anticorpo ligado no sujeito.

88. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que a presença de anticorpo ligado é determinada por tomografia por emissão de pósitrons (PET).

89. Método para tratar ou efetuar profilaxia de uma amiloidose mediada por transtirretina em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de um regime eficaz de um estabilizador de tetrâmero TTR, um terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense, um terapêutico à base de interferência por RNA (RNAi) ou doxiciclina mais tauroursodesoxicólico, em que o sujeito foi tratado anteriormente com o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-41 e 45-47.

90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o sujeito não recebe mais tratamento com o anticorpo anti-TTR.

91. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o estabilizador de tetrâmero TTR é tafamidis ou diflunisal.

92. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense é inotersen.

93. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o terapêutico à base de RNAi é patisiran ou revusiran.

94. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 63, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado em combinação com um estabilizador de tetrâmero TTR, um terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense, um terapêutico à base de interferência por RNA (RNAi) ou doxiciclina mais ácido tauroursodeoxicólico.

95. Método, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que o estabilizador de tetrâmero TTR é tafamidis ou diflunisal.

96. Método, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que o terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense é inotersen.

97. Método, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que o terapêutico à base de RNAi é patisiran ou revusiran.

98. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 63, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado concomitantemente com um estabilizador de tetrâmero TTR, um terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense, um terapêutico à base de interferência por RNA (RNAi) ou doxiciclina mais ácido tauroursodeoxicólico.

99. Método, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que o estabilizador de tetrâmero TTR é tafamidis ou diflunisal.

100. Método, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que o estabilizador de tetrâmero TTR é diflunisal.

101. Método, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que o terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense é inotersen.

102. Método, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que o terapêutico à base de RNAi é patisiran ou revusiran.

103. Método para identificar um anticorpo que se liga a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) imunizar um animal com TTR ou um fragmento deste; e (b) triar anticorpos induzidos para identificar uma ligação de anticorpo nos resíduos 101-109 de TTR.

104. Método, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que a imunização é realizada com um fragmento de não mais do que 25 resíduos contíguos de TTR, incluindo pelo menos 3 resíduos contíguos nos resíduos 101- 109 de TTR.

105. Método, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que o fragmento consiste nos resíduos 101 a 109 de TTR, opcionalmente ligados a um carreador.

106. Método, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que a triagem é realizada determinando a ligação dos anticorpos a um fragmento de TTR que consiste nos resíduos 101-109 de TTR.

107. Método para identificar um anticorpo que se liga a um epítopo nos resíduos 101-109 de TTR, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma biblioteca de exibição de anticorpos; e (b) triar a biblioteca de exibição para identificar uma ligação de anticorpo nos resíduos 101 a 109 de TTR.

108. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo fato de que a biblioteca de exibição exibe anticorpos como fragmentos de Fv.

109. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo fato de que a biblioteca de exibição é uma biblioteca de exibição não exposta.

110. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo fato de que a biblioteca de exibição é produzida imunizando um roedor com TTR ou um fragmento deste e clonando ácidos nucleicos que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpos em um vetor de exibição.

111. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo fato de que a triagem é realizada determinando a ligação dos membros da biblioteca a um fragmento de TTR que consiste nos resíduos 101-109.

112. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo fato de que a triagem é realizada determinando a ligação dos membros da biblioteca a TTR na presença de um anticorpo de referência, que se liga a um epítopo nos resíduos 101-109 de TTR.

113. Método, de acordo com a reivindicação 112, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de referência é 18C5.

114. Método para identificar um anticorpo que compete pela ligação com o anticorpo 18C5 pela ligação a TTR, caracterizado pelo fato de que compreende (a) colocar a TTR em contato com o anticorpo na presença e na ausência do anticorpo 18C5 e determinar a ligação do anticorpo a TTR, em que a ligação reduzida na presença do anticorpo 18C5 indica que o anticorpo compete com o anticorpo 18C5 pela ligação a TTR.

115. Método para identificar um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo 18C5 na TTR, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) determinar o epítopo ligado pelo anticorpo 18C5 na TTR; (b) imunizar um animal com TTR ou um fragmento deste; e

(c) triar anticorpos induzidos para identificar um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo 18C5.

116. Método, de acordo com a reivindicação 115, caracterizado pelo fato de que o epítopo ligado ao anticorpo 18C5 na TTR é determinado pela mutagênese de TTR.

117. Método, de acordo com a reivindicação 115, caracterizado pelo fato de que o epítopo ligado ao anticorpo 18C5 na TTR é determinado por cristalografia de raios-X.

118. Método para identificar um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo 18C5 na TTR, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) determinar o epítopo ligado pelo anticorpo 18C5 na TTR; (b) fornecer uma biblioteca de exibição de anticorpos; e (c) triar a biblioteca de exibição para identificar um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo 18C5.

119. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracterizado pelo fato de que o epítopo ligado ao anticorpo 18C5 na TTR é determinado pela mutagênese de TTR.

120. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracterizado pelo fato de que o epítopo ligado ao anticorpo 18C5 na TTR é determinado por cristalografia de raios-X.

121. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracterizado pelo fato de que a biblioteca de exibição exibe anticorpos como fragmentos de Fv.

122. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracterizado pelo fato de que a biblioteca de exibição é uma biblioteca de exibição não exposta.

123. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracterizado pelo fato de que a biblioteca de exibição é produzida imunizando um roedor com TTR ou um fragmento desta e clonando ácidos nucleicos que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpos em um vetor de exibição.

124. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracterizado pelo fato de que a triagem é realizada determinando a ligação dos membros da biblioteca a um fragmento de TTR que consiste nos resíduos 101-109.

125. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracterizado pelo fato de que a triagem é realizada determinando a ligação dos membros da biblioteca a TTR na presença de um anticorpo de referência, que se liga a um epítopo nos resíduos 101-109 de TTR.

126. Método, de acordo com a reivindicação 125, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de referência é 18C5.

127. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracterizado pelo fato de que cada membro da biblioteca de exibição exibe a mesma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada diferente.

128. Método, de acordo com a reivindicação 127, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia leve é a região variável da cadeia leve do anticorpo 18C5.

129. Método, de acordo com a reivindicação 127, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada é obtida a partir de uma biblioteca de regiões variáveis da cadeia pesada humana reorganizadas.

130. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracterizado pelo fato de que cada membro da biblioteca de exibição exibe a mesma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve diferente.

131. Método, de acordo com a reivindicação 130, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada é a região variável da cadeia pesada do anticorpo 18C5.

132. Método, de acordo com a reivindicação 131, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia leve é obtida a partir de uma biblioteca de regiões variáveis da cadeia leve humana rearranjadas.

133. Método para tratar ou efetuar a profilaxia de uma amiloidose mediada por transtirretina em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de um imunógeno compreendendo um peptídeo de TTR de até 20 aminoácidos contíguos de TTR aos quais o anticorpo 18C5 se liga especificamente, em que o peptídeo, isolado e/ou quando ligado a um carreador heterólogo, induz a formação de anticorpos que se ligam especificamente a TTR no sujeito.

134. Método, de acordo com a reivindicação 133, caracterizado pelo fato de que o imunógeno compreende um epítopo ao qual o anticorpo 18C5 se liga especificamente.

135. Método, de acordo com a reivindicação 133, caracterizado pelo fato de que o imunógeno compreende um peptídeo de TTR de até 20 aminoácidos contíguos dos resíduos 89-127 de TTR.

136. Método, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado pelo fato de que o imunógeno compreende um peptídeo de TTR de até 11 aminoácidos contíguos dos resíduos 100-110 de TTR.

137. Método, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de que o imunógeno compreende um peptídeo TTR de até 9 aminoácidos contíguos dos resíduos 101-109 de TTR.

138. Método, de acordo com a reivindicação 134, caracterizado pelo fato de que o epítopo peptídico de TTR consiste em 4-11 aminoácidos contíguos dos resíduos 89-127 de TTR.

139. Método, de acordo com a reivindicação 138, caracterizado pelo fato de que o epítopo peptídico de TTR consiste em 4-11 aminoácidos contíguos dos resíduos 100-110 de TTR.

140. Método, de acordo com a reivindicação 139, caracterizado pelo fato de que o epítopo peptídico de TTR consiste em 4-9 aminoácidos contíguos dos resíduos 101-109 de TTR.

141. Imunógeno caracterizado pelo fato de que compreende um peptídeo de TTR de até 20 aminoácidos contíguos dos resíduos 89-127 de TTR ligados a um carreador heterólogo que ajuda a extrair anticorpos contra o peptídeo de TTR.