BR112020006791A2 - métodos de detecção de transtirretina - Google Patents

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BR112020006791-1A
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Joshua Reginald SALMANS
Svetlana Alexander
Robin Barbour
Jianmin Li
Jeffrey N. Higaki
Tarlochan S. Nijjar
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Prothena Biosciences Limited
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Abstract

A invenção fornece métodos para detectar transtirretina (TTR) usando um anticorpo de captura e um anticorpo repórter. O anticorpo de captura liga-se preferencialmente à TTR mal dobrada em relação à forma tetramérica nativa da TTR. O anticorpo de captura se liga a um epítopo dentro dos resíduos de aminoácidos 89-97 da TTR ou a um epítopo dentro dos resíduos de aminoácidos 101-109 da TTR. 9D5 e 18C5 são exemplos de anticorpos de captura adequados. Os métodos podem ser usados para diagnosticar doenças ou distúrbios associados ao acúmulo de TTR ou acúmulo de depósitos de TTR (por exemplo, amiloidose por TTR) e para monitorar a eficácia das terapias com TTR, entre outras aplicações.

Description

MÉTODOS DE DETEÇÃO DE TRANSTIRRETINA REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício de acordo com 35 USC 119 (e) do Pedido Provisório US Nº 62/569,438, depositado em 6 de outubro de 2017, do Pedido Provisório US Nº 62/579,817, depositado em 31 de outubro de 2017 e Pedido Provisório US Nº 62/647,582, depositado em 23 de março de 2018, cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade para todos os fins.
REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0002] A Listagem de Sequências escrita no arquivo 516713SEQLST.txt tem 61,8 kilobytes, foi criada em 20 de setembro de 2018 e é incorporada a este documento por referência.
FUNDAMENTOS
[0003] Pensa-se que várias doenças são causadas pelo dobramento e agregação anormais de proteínas específicas da doença. Essas proteínas podem se acumular em acumulações patologicamente diagnósticas, conhecidas como amiloides, que são visualizadas por certas manchas histológicas. Pensa-se que os amiloides desencadeiam respostas inflamatórias e têm múltiplas consequências negativas para os tecidos envolvidos. Além disso, agregados menores de proteína dobrada anormalmente podem existir e exercer efeitos citotóxicos.
[0004] A Transtirretina (TTR) é uma das muitas proteínas que se sabe dobrar e agregar (por exemplo, sofrer amiloidogênese). A amiloidose mediada pela transtirretina (ATTR) engloba duas formas de doença: doença familiar decorrente do dobramento incorreto de uma TTR mutada ou variante e uma doença esporádica não genética causada pelo dobramento incorreto e agregação de TTR de tipo selvagem. O processo de amiloidogênese da TTR pode causar patologia no sistema nervoso e/ou no coração, assim como em outros tecidos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO REIVINDICADA
[0005] Em um aspecto, a invenção fornece um método para detectar transtirretina mal dobrada (TTR) em uma amostra biológica, o método compreendendo: (a) entrar em contato com uma amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente de TTR; em que se TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e (b) detectar o anticorpo repórter que forma um complexo sanduíche na etapa (a), se houver, para indicar presença ou ausência de TTR mal dobrada.
[0006] Em alguns desses métodos, a amostra biológica é de um paciente hereditário de ATTR. Em alguns desses métodos, a amostra biológica é de um paciente hereditário de ATTR portador de uma mutação selecionada do grupo que consiste em V30M, Y114C, G47R, S50I, T49S, F33V, A45T, E89K, E89Q e V122|. Em alguns desses métodos, a mutação é selecionada do grupo que consiste em V30M, Y114C e S50lI. Em alguns desses métodos, a mutação é V30M. Em alguns desses métodos, a mutação é Y114C. Em alguns desses métodos, a mutação é S50I. Em alguns desses métodos, a mutação é E89K. Em alguns desses métodos, a mutação é E89Q.
[0007] Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é um anticorpo policlonal anti-TTR. Em alguns desses métodos, o anticorpo repórter é 18C5, 8C3, 7G7, AD7F6, RT24, NI-301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD10S5, MFD107, MFD108, MFD109, MFD111, MFD114 ou uma versão quimérica ou humanizada, ou um anticorpo policlonal anti-TTR.
[0008] Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é 18C5, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é 8C3, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é 7G7, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
[0009] Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é AD7F6, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é RT24, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é NI-301.35G11, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
[0010] Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é MFD101, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é MDF102, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é MFD103. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é MFD 105, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é MFD 107, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é MFD 108, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é MFD 109, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é MFD111, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é MFD114, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
[0011] Em alguns desses métodos, o anticorpo repórter é um anticorpo que se liga nos resíduos 101-109, 118-122, 115-124, 53-63, 54-61, 36-49, 49-61, 109- 121, 30-66, 70-127, 80-127, 90-127, 100-127, 110-127 ou 115-127 de TTR.
[0012] Alguns desses métodos detectam TTR mal dobrada, incluindo uma substituição E89K. Alguns desses métodos detectam TTR mal dobrada, incluindo uma substituição E89Q.
[0013] Em alguns desses métodos, a amostra biológica é uma primeira alíquota de uma amostra coletada e o método compreende ainda a repetição das etapas (a) e (b) em uma segunda alíquota da amostra coletada, compreendendo ainda um anticorpo de teste que compete com o captura de anticorpo para ligação à TTR, em que o anticorpo repórter reduzido que forma o complexo sanduíche ao repetir as etapas fornece uma indicação da capacidade do anticorpo de teste de se ligar à TTR mal dobrada.
[0014] Em alguns desses métodos, o anticorpo de teste é 14G8 ou uma forma quimérica ou humanizada deste, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é um anticorpo policlonal anti-TTR. Em alguns desses métodos, o anticorpo de teste é uma forma humanizada de 14G8.
[0015] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para determinar o envolvimento in vivo do alvo de um anticorpo de teste administrado a um sujeito, cujo alvo é um epítopo dentro dos resíduos 89-97 da transtirretina mal dobrada (mis-TTR), detectando a TTR permanecendo em uma amostra biológica do sujeito tratado com o anticorpo de teste, o método compreendendo: (a) contatar a amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente dentro da TTR daquele do anticorpo de captura; em que se TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e (b) detectar o anticorpo repórter que forma um complexo sanduíche na etapa (a), se houver, para indicar presença ou ausência de TTR mal dobrada.
[0016] Em alguns desses métodos, a amostra biológica é de um paciente hereditário de ATTR. Em alguns desses métodos, a amostra biológica é de um paciente hereditário de ATTR portador de uma mutação selecionada do grupo que consiste em V30M, Y114C, G47R, S50I, T49S, F33V, A45T, E89K, E89Q e V1221. Em alguns desses métodos, a mutação é selecionada do grupo que consiste em V30M, Y114C e S50l. Em alguns desses métodos, a mutação é V30M. Em alguns desses métodos, a mutação é Y114C. Em alguns desses métodos, a mutação é S50I. Em alguns desses métodos, a mutação é E89K. Em alguns desses métodos, a mutação é E890Q.
[0017] Em alguns desses métodos, uma redução da detecção de TTR mal dobrada no sujeito tratado em relação à detecção de TTR mal dobrada em uma amostra biológica de um sujeito não tratado correlaciona-se com o engajamento positivo do alvo e o tratamento do sujeito com a mesma ou uma quantidade menor do anticorpo de teste. Em alguns desses métodos, o sujeito tratado e o sujeito não tratado são o mesmo indivíduo.
[0018] Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é 9D5, em que o anticorpo de captura e o anticorpo repórter têm marcadores diferentes. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é 14G8. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é 5A1. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é 6C1. Em alguns desses métodos, o anticorpo repórter compete pela ligação com o anticorpo de captura pela ligação da transtirretina multimérica mal dobrada.
[0019] Em algumas modalidades, o anticorpo repórter tem um marcador eletroquimioluminescente e é detectado por eletroquimioluminescência. Em alguns métodos da invenção, o anticorpo de captura tem um marcador de biotina.
[0020] Em uma modalidade, os métodos são realizados qualitativamente. Em uma modalidade, os métodos são realizados quantitativamente para indicar uma quantidade absoluta ou relativa de TTR mal dobrada.
[0021] Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é ligado a uma fase sólida antes da etapa de contato. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é anexado à fase sólida através de um ligante peptídico. Em alguns desses métodos, a fase sólida compreende pelo menos um eletrodo.
[0022] Alguns desses métodos compreendem ainda comparar um sinal do anticorpo repórter com um sinal do anticorpo repórter em uma amostra de controle contendo uma quantidade conhecida de TTR mal dobrada para determinar a quantidade de TTR mal dobrada na amostra.
[0023] Alguns desses métodos compreendem ainda comparar um sinal do anticorpo repórter a partir de uma curva de calibração do sinal versus quantidade de TTR mal dobrada para determinar a quantidade de TTR mal dobrada na amostra. Em alguns desses métodos, um sinal do anticorpo repórter é proporcional à quantidade de TTR mal dobrada na amostra.
[0024] Em alguns desses métodos, a amostra é uma amostra de um ser humano. Em alguns desses métodos, a amostra é um fluido corporal. Em alguns desses métodos, a amostra é plasma de um ser humano.
[0025] Em uma modalidade, a presença de TTR mal dobrada é usada para diagnosticar um sujeito de quem a amostra foi obtida com uma amiloidose mediada pela transtirretina. Numa modalidade, a amiloidose mediada pela transtirretina é uma amiloidose familiar por transtirretina ou uma amiloidose esporádica de transtirretina esporádica de tipo selvagem. Numa modalidade, o sujeito foi identificado como em risco de uma amiloidose transtirretina familiar com base em testes genéticos.
[0026] Em uma modalidade, o sujeito não mostra sintomas de uma amiloidose familiar por transtirretina. Numa modalidade, o sujeito não tem polineuropatia ou cardiomiopatia.
[0027] Em uma modalidade, a amiloidose familiar por transtirretina é cardiomiopatia amiloide familiar (FAC), polineuropatia amiloide familiar (FAP) ou amiloidose seletiva do sistema nervoso central (CNSA).
[0028] Em uma modalidade, a amostra biológica é de um paciente recebendo tratamento para uma amiloidose mediada pela transtirretina.
[0029] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para ajustar o tratamento de um sujeito com uma amiloidose mediada pela transtirretina, compreendendo a comparação da quantidade de TTR dobrada detectada no sujeito previamente tratado para amiloidose mediada pela transtirretina com a quantidade de TTR dobrada detectada no sujeito antes do tratamento ou durante uma fase anterior do tratamento; e (a) aumentar a dose ou a frequência da administração do tratamento anterior se a quantidade de TTR dobrada for igual ou superior à detectada anteriormente; ou (b) diminuir a dose ou a frequência da administração do tratamento anterior ou interromper o tratamento anterior se a quantidade de TTR dobrada for menor que a detectada anteriormente. Em uma modalidade, a TTR mal dobrada é detectada por um método que compreende o contato de uma amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 da TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente da TTR; em que se TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e detectar o anticorpo repórter que se liga à TTR mal dobrada na etapa (a), se houver, para indicar presença ou ausência de TTR mal dobrada.
[0030] Em alguns desses métodos, o tratamento anterior é feito pela administração intravenosa de um anticorpo anti-TTR e, se a quantidade de TTR dobrada for menor que a detectada anteriormente, o tratamento anterior será descontinuado e substituído pelo tratamento com um estabilizador de TTR, terapia baseada em oligonucleotídeo antisense, terapia de interferência de RNA ou terapia combinada com doxiciclina e ácido tauroursodeoxicólico. Em alguns desses métodos, o sujeito não recebe mais tratamento com o anticorpo anti-TTR. Em alguns desses métodos, o estabilizador de tetrâmero TTR é tafamidis ou diflunisal. Em alguns desses métodos, o estabilizador de tetrânero TTR é diflunisal. Em alguns desses métodos, o terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense é inotersen. Em alguns desses métodos, o terapêutico baseado em RNAi é patisiran ou revusiran.
[0031] Em alguns desses métodos, o anticorpo anti-TTR é 14G8. Em alguns desses métodos, o sujeito não recebe mais tratamento com o anticorpo anti-TTR. Em alguns desses métodos, o estabilizador de tetrânero TTR é tafamidis ou diflunisal. Em alguns desses métodos, o estabilizador de tetrâmero TTR é diflunisal. Em alguns desses métodos, o terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense é inotersen. Em alguns desses métodos, o terapêutico baseado em RNAi é patisiran ou revusiran.
[0032] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para ajustar o tratamento de um sujeito com uma amiloidose mediada pela transtirretina, compreendendo (a) comparar a quantidade de ligação de anticorpo repórter em uma amostra de um sujeito antes de iniciar o tratamento para amiloidose mediada pela transtirretina com a quantidade de ligação de anticorpo repórter detectada no sujeito após o início do tratamento; e (b) aumentar a dose ou frequência de administração do tratamento se a quantidade de ligação do anticorpo repórter for igual ou superior à detectada anteriormente; ou (c) diminuir a dose ou a frequência da administração do tratamento ou interromper o tratamento se a quantidade de ligação do anticorpo repórter for menor que a detectada anteriormente. Em uma modalidade, a ligação do anticorpo repórter é detectada por um método que compreende o contato de uma amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 da TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente da TTR; em que se TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e detectar o anticorpo repórter que se liga à TTR mal dobrada na etapa (a), se houver, para indicar presença ou ausência de TTR mal dobrada.
[0033] Em alguns métodos, uma amiloidose mediada pela transtirretina é diferenciada da amiloidose de cadeia leve amiloide (AL). Em alguns métodos, a amostra é de um camundongo transgênico com um transgene que expressa a TTR humana.
[0034] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para determinar uma razão entre o nível de transtirretina multimérica total dobrada (TTR) e o nível de TTR total dobrada em uma amostra biológica; o método compreendendo: (a) dividir uma amostra biológica em duas porções; (b) detectar a TTR total mal dobrada em uma primeira porção da amostra biológica por meio de () pôr em contato a primeira porção da amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente de TTR; em que se TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e (ii) detectar o anticorpo repórter formando um complexo sanduíche na etapa (b)(i) se houver, para indicar a presença ou ausência de TTR dobrada; (c) detectar a TTR multimérica total mal dobrada em uma segunda porção da amostra biológica por meio de () pôr em contato a segunda porção da amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 da TTR; em que se TTR dobrada multimérica está presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR dobrada multimérica, formando um complexo sanduíche; e (ii) detectar o anticorpo repórter formando um complexo sanduíche na etapa (c)(i) se houver, para indicar a presença ou ausência de TTR multimérica dobrada.
(d) calcular uma razão entre o nível de TTR multimérica total mal dobrada de (c) para o nível de TTR total mal dobrada de (b).
[0035] Em um aspecto, a invenção fornece um método para detectar transtirretina dobrada (TTR) em uma amostra biológica, o método compreendendo o contato de uma amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente de TTR; em que se TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e detectar o anticorpo repórter que se liga à TTR mal dobrada na etapa (a), se houver, para indicar presença ou ausência de TTR mal dobrada.
[0036] Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é um anticorpo policlonal anti-TTR. Em alguns desses métodos, o anticorpo repórter é 9D5, 14G8, 5A1, 6C1,8C3, 7G7, AD7F6, RT24, NI- 301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD107, MFD108, MFD109, MFD111, MFD 114 ou uma versão quimérica ou uma versão humanizada desta.
[0037] Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é 9D5, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é 14G8, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é 5A1, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é 6C1, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é 8C3, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5e o anticorpo repórter é 7G7, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
[0038] Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é AD7F6, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é RT24, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é NI-301.35G11, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
[0039] Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD101, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MDF102, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD103, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD 105, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD 107, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD 108, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD 109, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD111, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5e o anticorpo repórter é MFD114, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
[0040] Em alguns desses métodos, o anticorpo repórter é um anticorpo que se liga nos resíduos 89-97, 118-122, 115-124, 53-63, 54-61, 36-49, 49-61, 109-121, 30-66, 70-127, 80-127, 90-127, 100-127, 110-127 ou 115-127 de TTR.
[0041] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para detectar transtirretina dobrada multimérica (TTR) em uma amostra biológica, o método compreendendo o contato de uma amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 e um repórter anticorpo que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR; em que se TTR multimérica dobrada está presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR multimérica dobrada, formando um complexo sanduíche; e detectar o anticorpo repórter que se liga à TTR multimérica dobrada na etapa (a), se houver, para indicar a presença ou ausência de TTR multimérica dobrada.
[0042] Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é 18C5, em que o anticorpo de captura e o anticorpo repórter têm marcadores diferentes. Em alguns desses métodos, o anticorpo repórter compete pela ligação com o anticorpo de captura pela ligação da transtirretina multimérica mal dobrada.
[0043] Em algumas modalidades, o anticorpo repórter tem um marcador eletroquimioluminescente e é detectado por eletroquimioluminescência. Em alguns métodos da invenção, o anticorpo de captura tem um marcador de biotina.
[0044] Em uma modalidade, os métodos são realizados qualitativamente. Em uma modalidade, os métodos são realizados quantitativamente para indicar uma quantidade absoluta ou relativa de TTR mal dobrada.
[0045] Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é ligado a uma fase sólida antes da etapa de contato. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é anexado à fase sólida através de um ligante peptídico. Em alguns desses métodos, a fase sólida compreende pelo menos um eletrodo.
[0046] Alguns desses métodos compreendem ainda comparar um sinal do anticorpo repórter com um sinal do anticorpo repórter em uma amostra de controle contendo uma quantidade conhecida de TTR mal dobrada para determinar a quantidade de TTR mal dobrada na amostra.
[0047] Alguns desses métodos compreendem ainda comparar um sinal do anticorpo repórter a partir de uma curva de calibração do sinal versus quantidade de TTR mal dobrada para determinar a quantidade de TTR mal dobrada na amostra. Em alguns desses métodos, um sinal do anticorpo repórter é proporcional à quantidade de TTR mal dobrada na amostra.
[0048] Em alguns desses métodos, a amostra é de um ser humano. Em alguns desses métodos, a amostra é um fluido corporal. Em alguns desses métodos, a amostra é plasma de um ser humano.
[0049] Em uma modalidade, a presença de TTR dobrada é usada para diagnosticar um sujeito de quem a amostra foi obtida com uma amiloidose mediada pela transtirretina. Numa modalidade, a amiloidose mediada pela transtirretina é uma amiloidose familiar por transtirretina ou uma amiloidose esporádica de transtirretina esporádica de tipo selvagem. Numa modalidade, o sujeito foi identificado como em risco de uma amiloidose familiar por transtirretina com base em testes genéticos.
[0050] Em uma modalidade, o sujeito não mostra sintomas de uma amiloidose familiar por transtirretina. Numa modalidade, o sujeito não tem polineuropatia ou cardiomiopatia.
[0051] Em uma modalidade, a amiloidose familiar por transtirretina é cardiomiopatia amiloide familiar (FAC), polineuropatia amiloide familiar (FAP) ou amiloidose seletiva do sistema nervoso central (CNSA).
[0052] Em uma modalidade, a amostra biológica é de um paciente recebendo tratamento para uma amiloidose mediada pela transtirretina.
[0053] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para ajustar o tratamento de um sujeito com uma amiloidose mediada pela transtirretina, compreendendo a comparação da quantidade de TTR mal dobrada em uma amostra de um sujeito previamente tratado para amiloidose mediada pela transtirretina com a quantidade de TTR mal dobrada detectada no sujeito antes do tratamento ou durante um estágio anterior do tratamento; e aumento da dose ou frequência de administração do tratamento anterior, se a quantidade de TTR mal dobrada for igual ou superior à detectada anteriormente; ou diminuir a dose ou a frequência da administração do tratamento anterior ou descontinuar o tratamento anterior se a quantidade de TTR mal dobrada for menor do que a detectada anteriormente. Em uma modalidade, a TTR mal dobrada é detectada por um método que compreende o contato de uma amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 da TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente da TTR; em que se TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e detectar o anticorpo repórter que se liga à TTR mal dobrada na etapa (a), se houver, para indicar presença ou ausência de TTR mal dobrada.
[0054] Em alguns desses métodos, o tratamento anterior é pela administração intravenosa de um anticorpo anti-TTR e, se a quantidade de TTR mal dobrada for menor que a detectada anteriormente, o tratamento anterior será descontinuado e substituído pelo tratamento com um estabilizador de TTR, terapia baseada em oligonucleotídeo antisense, terapia de interferência de RNA ou terapia combinada com doxiciclina e ácido tauroursodeoxicólico. Em alguns desses métodos, o sujeito não recebe mais tratamento com o anticorpo anti-TTR. Em alguns desses métodos, o estabilizador de tetrâmero TTR é tafamidis ou diflunisal. Em alguns desses métodos, o estabilizador de tetrânero TTR é diflunisal. Em alguns desses métodos, o terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense é inotersen. Em alguns desses métodos, o terapêutico baseado em RNAi é patisiran ou revusiran.
[0055] Em alguns desses métodos, o anticorpo anti-TTR é 14G8. Em alguns desses métodos, o sujeito não recebe mais tratamento com o anticorpo anti-TTR. Em alguns desses métodos, o estabilizador de tetrânero TTR é tafamidis ou diflunisal. Em alguns desses métodos, o estabilizador de tetrâmero TTR é diflunisal.
Em alguns desses métodos, o terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense é inotersen. Em alguns desses métodos, o terapêutico baseado em RNAi é patisiran ou revusiran.
[0056] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para ajustar o tratamento de um sujeito com uma amiloidose mediada pela transtirretina, compreendendo (a) comparar a quantidade de ligação de anticorpo repórter em uma amostra de um sujeito antes de iniciar o tratamento para amiloidose mediada pela transtirretina com a quantidade de ligação de anticorpo repórter detectada no sujeito após o início do tratamento; e (b) aumentar a dose ou frequência de administração do tratamento se a quantidade de ligação do anticorpo repórter for igual ou superior à detectada anteriormente; ou (c) diminuir a dose ou a frequência da administração do tratamento ou interromper o tratamento se a quantidade de ligação do anticorpo repórter for menor que a detectada anteriormente. Em uma modalidade, a ligação do anticorpo repórter é detectada por um método que compreende o contato de uma amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 da TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente da TTR; em que se TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e detectar o anticorpo repórter que se liga à TTR mal dobrada na etapa (a), se houver, para indicar presença ou ausência de TTR mal dobrada.
[0057] Em alguns métodos, uma amiloidose mediada pela transtirretina é diferenciada da amiloidose de cadeia leve amiloide (AL). Em alguns métodos, a amostra é de um camundongo transgênico com um transgene que expressa a TTR humana.
[0058] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para determinar uma razão entre o nível de transtirretina multimérica total mal dobrada (TTR)e o nível de TTR total mal dobrada em uma amostra biológica; o método compreendendo: (a) dividir uma amostra biológica em duas porções; (b) detectar a TTR total mal dobrada em uma primeira porção da amostra biológica por meio de () pôr em contato a primeira porção da amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente de TTR; em que se TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e (ii) detectar o anticorpo repórter ligado à TTR mal dobrada na etapa (i), se houver, para indicar a presença ou ausência da TTR mal dobrada; (c) detectar a TTR multimérica total mal dobrada em uma segunda porção da amostra biológica por meio de (i) pôr em contato a segunda porção da amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 da TTR; em que se TTR multimérica mal dobrada está presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR multimérica mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e (ii) detectar o anticorpo repórter ligado ao dobrador multimérico mal dobrado na etapa TTR (a) se houver, para indicar a presença ou ausência de TTR multimérica mal dobrada.
(d) calcular uma razão entre o nível de TTR multimérica total mal dobrada de (c) para o nível de TTR total mal dobrada de (b).
[0059] Em um aspecto, a invenção fornece um método para detectar transtirretina mal dobrada (TTR) em uma amostra biológica o método compreendendo o contato de uma amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente de TTR; em que se TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e detectar o anticorpo repórter que se liga à TTR mal dobrada na etapa (a), se houver, para indicar presença ou ausência de TTR mal dobrada.
[0060] Em alguns desses métodos, a amostra biológica é de um paciente hereditário de ATTR. Em alguns desses métodos, a amostra biológica é de um paciente hereditário de ATTR portador de uma mutação selecionada do grupo que consiste em V30M, Y114C e S50I. Em alguns desses métodos, a mutação é V30M.
Em alguns desses métodos, a mutação é Y114C. Em alguns desses métodos, a mutação é S50l.
[0061] Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é um anticorpo policlonal anti-TTR. Em alguns desses métodos, o anticorpo repórter é 9D5, 14G8, 5A1, 6C1,8C3, 7G7, AD7F6, RT24, NI- 301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD107, MFD108, MFD109, MFD111, MFD 114 ou uma versão quimérica ou uma versão humanizada desta.
[0062] Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é 9D5, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é 14G8, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é 5A1, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é 6C1, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é 8C3, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5e o anticorpo repórter é 7G7, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
[0063] Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é AD7F6, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é RT24, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é NI-301.35G11, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
[0064] Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD101, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MDF102, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD103, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD 105, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD 107, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD 108, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD 109, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD111, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5e o anticorpo repórter é MFD114, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
[0065] Em alguns desses métodos, o anticorpo repórter é um anticorpo que se liga nos resíduos 89-97, 118-122, 115-124, 53-63, 54-61, 36-49, 49-61, 109-121, 30-66, 70-127, 80-127, 90-127, 100-127, 110-127 ou 115-127 de TTR.
[0066] Em um aspecto, a invenção fornece um método para determinar o envolvimento in vivo do alvo de um anticorpo de teste administrado a um sujeito, cujo alvo é um epítopo dentro dos resíduos 101-109 da transtirretina mal dobrada (mis-TTR), detectando a TTR permanecendo em uma amostra biológica do sujeito tratado com o anticorpo de teste, o método compreendendo: (a) contatar a amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente dentro da TTR daquele do anticorpo de captura; em que se TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e (b) detectar o anticorpo repórter que forma um complexo sanduíche na etapa (a), se houver, para indicar presença ou ausência de TTR mal dobrada.
[0067] Em alguns desses métodos, a amostra biológica é de um paciente hereditário de ATTR. Em alguns desses métodos, a amostra biológica é de um paciente hereditário de ATTR portador de uma mutação selecionada do grupo que consiste em V30M, Y114C e S50I. Em alguns desses métodos, a mutação é V30M. Em alguns desses métodos, a mutação é Y114C. Em alguns desses métodos, a mutação é S50l.
[0068] Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é 18C5, em que o anticorpo de captura e o anticorpo repórter têm marcadores diferentes. Em alguns desses métodos, o anticorpo repórter compete pela ligação com o anticorpo de captura pela ligação da transtirretina multimérica mal dobrada.
[0069] Em algumas modalidades, o anticorpo repórter tem um marcador eletroquimioluminescente e é detectado por eletroquimioluminescência. Em alguns métodos da invenção, o anticorpo de captura tem um marcador de biotina.
[0070] Em uma modalidade, os métodos são realizados qualitativamente. Em uma modalidade, os métodos são realizados quantitativamente para indicar uma quantidade absoluta ou relativa de TTR mal dobrada.
[0071] Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é ligado a uma fase sólida antes da etapa de contato. Em alguns desses métodos, o anticorpo de captura é anexado à fase sólida através de um ligante peptídico. Em alguns desses métodos, a fase sólida compreende pelo menos um eletrodo.
[0072] Alguns desses métodos compreendem ainda comparar um sinal do anticorpo repórter com um sinal do anticorpo repórter em uma amostra de controle contendo uma quantidade conhecida de TTR mal dobrada para determinar a quantidade de TTR mal dobrada na amostra.
[0073] Alguns desses métodos compreendem ainda comparar um sinal do anticorpo repórter a partir de uma curva de calibração do sinal versus quantidade de TTR mal dobrada para determinar a quantidade de TTR mal dobrada na amostra. Em alguns desses métodos, um sinal do anticorpo repórter é proporcional à quantidade de TTR mal dobrada na amostra.
[0074] Em alguns desses métodos, a amostra é de um ser humano. Em alguns desses métodos, a amostra é um fluido corporal. Em alguns desses métodos, a amostra é plasma de um ser humano.
[0075] Em uma modalidade, a presença de TTR mal dobrada é usada para diagnosticar um sujeito de quem a amostra foi obtida com uma amiloidose mediada pela transtirretina. Numa modalidade, a amiloidose mediada pela transtirretina é uma amiloidose familiar por transtirretina ou uma amiloidose esporádica de transtirretina esporádica de tipo selvagem. Numa modalidade, o sujeito foi identificado como em risco de uma amiloidose familiar por transtirretina com base em testes genéticos.
[0076] Em uma modalidade, o sujeito não mostra sintomas de uma amiloidose familiar por transtirretihna. Numa modalidade, o sujeito não tem polineuropatia ou cardiomiopatia.
[0077] Em uma modalidade, a amiloidose familiar por transtirretina é cardiomiopatia amiloide familiar (FAC), polineuropatia amiloide familiar (FAP) ou amiloidose seletiva do sistema nervoso central (CNSA).
[0078] Em uma modalidade, a amostra biológica é de um paciente recebendo tratamento para uma amiloidose mediada pela transtirretina.
[0079] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para ajustar o tratamento de um sujeito com uma amiloidose mediada pela transtirretina, compreendendo a comparação da quantidade de TTR mal dobrada em uma amostra de um sujeito previamente tratado para amiloidose mediada pela transtirretina com a quantidade de TTR mal dobrada detectada no sujeito antes do tratamento ou durante um estágio anterior do tratamento; e aumento da dose ou frequência de administração do tratamento anterior, se a quantidade de TTR mal dobrada for igual ou superior à detectada anteriormente; ou diminuir a dose ou a frequência da administração do tratamento anterior ou descontinuar o tratamento anterior se a quantidade de TTR mal dobrada for menor do que a detectada anteriormente. Em uma modalidade, a TTR mal dobrada é detectada por um método que compreende o contato de uma amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 da TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente da TTR; em que se TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e detectar o anticorpo repórter que se liga à TTR mal dobrada na etapa (a), se houver, para indicar presença ou ausência de TTR mal dobrada.
[0080] Em alguns desses métodos, o tratamento anterior é pela administração intravenosa de um anticorpo anti-TTR e, se a quantidade de TTR mal dobrada for menor que a detectada anteriormente, o tratamento anterior será descontinuado e substituído pelo tratamento com um estabilizador de TTR, terapia baseada em oligonucleotídeo antisense, terapia de interferência de RNA ou terapia combinada com doxiciclina e ácido tauroursodeoxicólico. Em alguns desses métodos, o sujeito não recebe mais tratamento com o anticorpo anti-TTR. Em alguns desses métodos, o estabilizador de tetrâmero TTR é tafamidis ou diflunisal. Em alguns desses métodos, o estabilizador de tetrânero TTR é diflunisal. Em alguns desses métodos, o terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense é inotersen. Em alguns desses métodos, o terapêutico baseado em RNAi é patisiran ou revusiran.
[0081] Em alguns desses métodos, o anticorpo anti-TTR é 14G8. Em alguns desses métodos, o sujeito não recebe mais tratamento com o anticorpo anti-TTR. Em alguns desses métodos, o estabilizador de tetrânero TTR é tafamidis ou diflunisal. Em alguns desses métodos, o estabilizador de tetrâmero TTR é diflunisal. Em alguns desses métodos, o terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense é inotersen. Em alguns desses métodos, o terapêutico baseado em RNAi é patisiran ou revusiran.
[0082] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para ajustar o tratamento de um sujeito com uma amiloidose mediada pela transtirretina, compreendendo comparar a quantidade de ligação a anticorpo repórter detectada pelo método da reivindicação 46 em uma amostra de um sujeito antes de iniciar o tratamento para amiloidose mediada pela transtirretina com a quantidade de ligação de anticorpo repórter detectada no sujeito após o início do tratamento; e aumento da dose ou frequência de administração do tratamento se a quantidade de ligação do anticorpo repórter for igual ou superior à detectada anteriormente; ou diminuir a dose ou a frequência de administração do tratamento ou interromper o tratamento se a quantidade de ligação do anticorpo repórter for menor que a detectada anteriormente. Em uma modalidade, a TTR mal dobrada é detectada por um método que compreende o contato de uma amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 da TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente da TTR; em que se TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e detectar o anticorpo repórter que se liga à TTR mal dobrada na etapa (a), se houver, para indicar presença ou ausência de TTR mal dobrada.
[0083] Em alguns métodos, uma amiloidose mediada pela transtirretina é diferenciada da amiloidose de cadeia leve amiloide (AL). Em alguns métodos, a amostra é de um camundongo transgênico com um transgene que expressa a TTR humana.
[0084] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para determinar uma razão entre o nível de transtirretina multimérica total mal dobrada (TTR)e o nível de TTR total mal dobrada em uma amostra biológica; o método compreendendo: (a) dividir uma amostra biológica em duas porções; (b) detectar a TTR total mal dobrada em uma primeira porção da amostra biológica por meio de (i) pôr em contato a primeira porção da amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente de TTR; em que se TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e (ii) detectar o anticorpo repórter ligado à TTR mal dobrada na etapa (i), se houver, para indicar a presença ou ausência da TTR mal dobrada; (d) detectar a TTR multimérica total mal dobrada em uma segunda porção da amostra biológica por meio de (i) pôr em contato a segunda porção da amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 da TTR; em que se TTR multimérica mal dobrada está presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR multimérica mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e (ii) detectar o anticorpo repórter ligado ao dobrador multimérico mal dobrado na etapa TTR (a) se houver, para indicar a presença ou ausência de TTR multimérica mal dobrada.
(e) calcular uma razão entre o nível de TTR multimérica total mal dobrada de (c) e o nível de TTR total mal dobrada de (b).
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0085] A FIG. 1 mostra os resultados de um imunoensaio em sanduíche utilizando a plataforma de eletroquimioluminescência Meso Scale Discovery (MSD), mostrando que o 9D5 detecta TTR elevada mal dobrada em amostras de plasma de pacientes com amiloidose mediada pela transtirretina (ATTR) que não foram submetidos a um transplante de fígado, em um ensaio usando um anticorpo policlonal repórter anti-TTR.
[0086] A FIG. 2 representa os resultados de um ensaio de engajamento alvo ex vivo, usando um anticorpo de captura 9D5 e um anticorpo repórter policlonal anti-TTR, mostrando que o mI4G8 reduz os níveis de TTR dobrada livre quando adicionado no plasma do paciente.
[0087] A FIG. 3 mostra os resultados de um imunoensaio em sanduíche utilizando a plataforma de eletroquimioluminescência Meso Scale Discovery (MSD), mostrando que o 9D5 detecta TTR elevada mal dobrada em amostras de plasma de pacientes com amiloidose mediada pela transtirretina (ATTR) que não foram submetidos a um transplante de fígado, em um ensaio usando um anticorpo repórter 18C5.
[0088] A FIG. 4 mostra os resultados de um experimento de Western blot mostrando que 18C5 tem forte reatividade em relação ao monômero TTR desnaturado, menor reatividade em relação ao dímero desnaturado e reatividade muito fraca em relação às espécies nativas de TTR.
[0089] A FIG. 5 mostra os resultados de um experimento de Western blot mostrando que um anticorpo TTR comercial não pode distinguir entre TTR nativa versus desnaturada e mostrou reatividade muito forte em relação à TTR nativa e desnaturada monomérica e dimérica.
[0090] A FIG. 6 mostra os resultados de um imunoensaio em sanduíche utilizando a plataforma de eletroquimioluminescência Meso Scale Discovery (MSD), mostrando que o 18C5 detecta TTR elevada mal dobrada em amostras de plasma de pacientes com amiloidose mediada pela transtirretina (ATTR) que não foram submetidos a um transplante de fígado.
[0091] A FIG. 7 mostra os resultados de um imunoensaio em sanduíche utilizando a plataforma de eletroquimioluminescência Meso Scale Discovery (MSD), mostrando que o 18C5 detecta TTR elevada multimérica mal dobrada em amostras de plasma de pacientes com amiloidose mediada pela transtirretina (ATTR) que não foram submetidos a um transplante de fígado.
[0092] A FIG. 8 mostra os resultados de um experimento de Western blot mostrando que 9D5 detecta níveis elevados de mis-TTR (monômeros e oligômeros de TTR mal dobrada) no plasma de pacientes hereditários com ATTR.
[0093] A FIG. 9 representa um diagrama de um ensaio farmacodinâmico para medir a ligação de um MAb mis-TTR (mM14G8) ao mis-TTR plasmático (engajamento alvo).
[0094] A FIG. 10 mostra os resultados de um imunoensaio em sanduíche utilizando a plataforma de eletroquimioluminescência Meso Scale Discovery (MSD), mostrando que o 9D5 detecta TTR elevada mal dobrada em amostras de plasma de pacientes com amiloidose mediada pela transtirretina (ATTR) que não foram submetidos a um transplante de fígado, em um ensaio usando um anticorpo policlonal repórter anti-TTR.
[0095] A FIG. 11 representa um alinhamento de regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo 18C5 de camundongo (SEQ ID NO: 81), sequência da linhagem germinativa humana IGHV3-48*01 (SEQ ID NO: 84), aceitador humano 5VZY-VH huFrwk (Crenefab-VH) (SEQ ID NO: 83) e versões humanizadas do anticorpo 18C5 (hu18C5 VH-vi e hu18C5 VH-v2, SEQ ID NOs: 84 e 85, respectivamente). As CDRs definidas de acordo com o composto Kabat/Chothia estão em negrito na sequência da região variável de cadeia pesada 18C5 do camundongo.
[0096] A FIG. 12 representa um alinhamento de regiões variáveis da cadeia leve do anticorpo 18C5 de camundongo (SEQ ID NO: 87), sequência de linhagem germinativa humana IGKV2-30*02 (SEQ ID NO: 90), aceitador humano 5VZY- VL huFrwk (Crenefab-VL) (SEQ ID NO: 89) e versões humanizadas do anticorpo 18C5 (hu18C5-VL-v1 e hu18C5-VL-v2, SEQ ID NOs: 91 e 92, respectivamente). As CDRs definidas de acordo com o composto Kabat/Chothia estão em negrito na sequência da região variável de cadeia leve 18C5 do camundongo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS
[0097] A SEQ ID NO: 1 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada do anticorpo 18C5 de camundongo com peptídeo sinal.
[0098] A SEQ ID NO: 2 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada do anticorpo 18C5 de camundongo com peptídeo sinal.
[0099] A SEQ ID NO: 3 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve do anticorpo 18C5 de camundongo com peptídeo sinal.
[0100] A SEQ ID NO: apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve do anticorpo 18C5 de camundongo com peptídeo sinal.
[0101] A SEQ ID NO: 5 apresenta a sequência de aminoácidos de um CDR- H1 do Composto Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0102] A SEQ ID NO:6 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-H1 do Composto de Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0103] A SEQ ID NO: 7 apresenta a sequência de aminoácidos de um CDR- H2 do Composto Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0104] A SEQ ID NO:8 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-H2 do Composto de Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0105] A SEQ ID NO: 9 apresenta a sequência de aminoácidos de um CDR- H3 do Composto Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0106] A SEQ ID NO: 10 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-H3 do Composto de Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0107] A SEQ ID NO: 11 apresenta uma sequência de ácido nucleico de uma CDR-L1 do Composto de Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0108] SEQ ID NO: 12 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-L1 do Composto de Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0109] A SEQ ID NO: 13 apresenta a sequência de aminoácidos de um CDR- L2 do Composto Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0110] A SEQ ID NO: 14 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-L2 do Composto de Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0111] A SEQ ID NO: 15 apresenta a sequência de aminoácidos de um CDR- L3 do Composto Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0112] A SEQ ID NO: 16 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-L3 do Composto de Kabat/Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0113] A SEQ ID NO: 17 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada 18C5 quimérica (I9G1 humana).
[0114] A SEQ ID NO: 18 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada de 18C5 quimérica (I9G1 humana).
[0115] A SEQ ID NO: 19 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia leve 18C5 quimérica (kappa humano).
[0116] A SEQ ID NO:20 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia leve 18C5 quimérica (kappa humano).
[0117] A SEQ ID NO:21 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia pesada humana IgG1 exemplificativa.
[0118] A SEQ ID NO:22 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada IgG1 G1m3 exemplar.
[0119] A SEQ ID NO: 23 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia pesada IgG1 G1m3.
[0120] A SEQ ID NO:24 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia leve exemplificativa com Arginina N-terminal.
[0121] A SEQ ID NO:25 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia leve de kappa humano exembplificativa sem Arginina N- terminal.
[0122] A SEQ ID NO:26 apresenta a sequência de aminoácidos de transtirretina humana apresentada no número de acesso P02766.1 (UniProt).
[0123] À SEQ ID NO:27 apresenta a sequência de aminoácidos da transtirretina humana apresentada no número de acesso AAB35639.1 (GenBank).
[0124] A SEQ ID NO:28 apresenta a sequência de aminoácidos da transtirretina humana apresentada no número de acesso AAB35640.1 (GenBank).
[0125] A SEQ ID NO:29 apresenta a sequência de aminoácidos da transtirretina humana apresentada no número de acesso e ABI63351.1 (GenBank).
[0126] A SEQ ID NO:30 apresenta a sequência de aminoácidos dos resíduos 101-109 da transtirretina humana.
[0127] A SEQ ID NO:31 apresenta a sequência de aminoácidos dos resíduos 87-127 da transtirretina humana.
[0128] À SEQ ID NO:32 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região constante da cadeia pesada de IgG1 G1m3 exemplar.
[0129] A SEQ ID NO:33 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região constante de cadeia leve exemplificativa com Arginina do C- terminal.
[0130] A SEQ ID NO:34 apresenta a sequência de ácidos nucleicos de uma região constante de cadeia leve de kappa humano exemplificativa sem Arginina do C-terminal.
[0131] A SEQ ID NO:35 apresenta a sequência de aminoácidos de um peptídeo sinal de região constante de cadeia pesada.
[0132] A SEQ ID NO:36 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo sinal de região constante de cadeia pesada.
[0133] A SEQ ID NO: 37 apresenta a sequência de aminoácidos de um peptídeo sinal da região constante da cadeia leve.
[0134] A SEQ ID NO: 38 apresenta uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo sinal da região constante da cadeia leve.
[0135] A SEQ ID NO: 39 apresenta a sequência de aminoácidos de um Kabat CDR-H1 do anticorpo 14G8.
[0136] A SEQ ID NO: 40 apresenta a sequência de aminoácidos de uma Kabat CDR-H2 do anticorpo 14G8.
[0137] A SEQ ID NO: 41 apresenta a sequência de aminoácidos de um Kabat CDR-H3 do anticorpo 14G8.
[0138] A SEQ ID NO: 42 apresenta a sequência de aminoácidos de um Kabat CDR-H1 do anticorpo 14G8.
[0139] A SEQ ID NO: 43 apresenta a sequência de aminoácidos de uma Kabat CDR-L2 do anticorpo 14G8.
[0140] A SEQ ID NO: 44 apresenta a sequência de aminoácidos de um KabatCDR-L3 do anticorpo 14G8.
[0141] A SEQ ID NO: 45 apresenta a sequência de aminoácidos de um epítopo do anticorpo 5 A1.
[0142] A SEQ ID NO: 46 apresenta a sequência de aminoácidos de um Kabat CDR-H1 do anticorpo 5A1.
[0143] A SEQ ID NO: 47 apresenta a sequência de aminoácidos de uma
Kabat CDR-H2 do anticorpo 5A1.
[0144] A SEQ ID NO: 48 apresenta a sequência de aminoácidos de um Kabat CDR-H3 do anticorpo 5A1.
[0145] A SEQ ID NO: 49 apresenta a sequência de aminoácidos de um Kabat CDR-L1 do anticorpo 5A1.
[0146] A SEQ ID NO: 50 apresenta a sequência de aminoácidos de um Kabat CDR-L2 do anticorpo 5 A1.
[0147] A SEQ ID NO: 51 apresenta a sequência de aminoácidos de um Kabat CDR-L3 do anticorpo 5 A1.
[0148] A SEQ ID NO: 52 apresenta a sequência de aminoácidos de um Kabat CDR-H1 do anticorpo 6C1.
[0149] A SEQ ID NO: 53 apresenta a sequência de aminoácidos de uma Kabat CDR-H2 do anticorpo 6C1.
[0150] A SEQ ID NO: 54 apresenta a sequência de aminoácidos de um Kabat CDR-H3 do anticorpo 6C1.
[0151] A SEQ ID NO: 55 apresenta a sequência de aminoácidos de um Kabat CDR-L1 do anticorpo 6C1.
[0152] A SEQ ID NO: 56 apresenta a sequência de aminoácidos de um Kabat CDR-L2 do anticorpo 6C1.
[0153] A SEQ ID NO: 57 apresenta a sequência de aminoácidos de um Kabat CDR-L3 do anticorpo 6C1.
[0154] A SEQ ID NO: 58 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região VH do anticorpo AD7F6.
[0155] A SEQ ID NO: 59 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região VL do anticorpo AD7F6.
[0156] A SEQ ID NO: 60 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-H1 do anticorpo RT24.
[0157] A SEQ ID NO: 61 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-H2 do anticorpo RT24.
[0158] A SEQ ID NO: 62 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-H3 do anticorpo RT24.
[0159] A SEQ ID NO: 63 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-L1 do anticorpo RT24.
[0160] A SEQ ID NO: 64 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-L?2 do anticorpo RT24.
[0161] A SEQ ID NO: 65 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-L3 do anticorpo RT24.
[0162] SEQ ID NO: 66 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR- H1 do anticorpo NI-301.35G11.
[0163] A SEQ ID NO: 67 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-H2 do anticorpo NI-301.35G11.
[0164] A SEQ ID NO: 68 apresenta a sequências de aminoácidos de uma CDR-H3 do anticorpo NI-301.35G11,
[0165] A SEQ ID NO: 69 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-L1 do anticorpo NI-301.35G11.
[0166] A SEQ ID NO: 70 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-L?2 do anticorpo NI- 301.35G11.
[0167] A SEQ ID NO: 71 apresenta a sequência de aminoácidos de uma CDR-L3 do anticorpo NI- 301.35G11.
[0168] A SEQ ID NO: 72 apresenta a sequência de aminoácidos de um epítopo dos anticorpos MFD101, MDF102, MFD 103, MFD 105.
[0169] A SEQ ID NO: 73 apresenta a sequência de aminoácidos de um epítopo dos anticorpos MFD107, MFD 108, MFD 109, MFD 111.
[0170] A SEQ ID NO: 74 apresenta a sequência de aminoácidos de um epítopo do anticorpo MFD114.
[0171] A SEQ ID NO: 75 apresenta a sequência de aminoácidos de um Kabat CDR-H1 do anticorpo 9D5.
[0172] A SEQ ID NO: 76 apresenta a sequência de aminoácidos de uma Kabat CDR-H2 do anticorpo 9D5.
[0173] A SEQ ID NO: 77 apresenta a sequência de aminoácidos de um Kabat CDR-H3 do anticorpo 9D5.
[0174] A SEQ ID NO: 78 apresenta a sequência de aminoácidos de um Kabat CDR-L1 do anticorpo 9D5.
[0175] A SEQ ID NO: 79 apresenta a sequência de aminoácidos de um Kabat CDR-L2 do anticorpo 9D5.
[0176] A SEQ ID NO: 80 apresenta a sequência de aminoácidos de um
Kabat CDR-L3 do anticorpo 9D5.
[0177] À SEQ ID NO:81 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada madura do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0178] A SEQ ID NO: 82 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada do anticorpo murino anti-piroglutamato-Abeta Fab c É 17, GenBank Acc. Nº. 1212215935.
[0179] A SEQ ID NO: 83 estabelece a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada de Fab humanizado de Crenezumab (CreneFab) PDB: 5VZY, GenBank Acc. Nº 1229749875.
[0180] A SEQ ID NO: 84 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada da sequência da linhagem germinativa humana IGHV3-48*01, GenBank Acc. Nº 1FN550289.1.
[0181] A SEQ ID NO: 85 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada do anticorpo 18C5 humanizado hul8C5-VH 1.
[0182] A SEQ ID NO: 86 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada do anticorpo 18C5 humanizado hul8gC5-VH 2.
[0183] A SEQ ID NO:87 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve madura do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0184] A SEQ ID NO: 88 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve do anticorpo murino anti-piroglutamato-Abeta Fab ctt17, GenBank Acc. Nº 1212215934.
[0185] A SEQ ID NO: 89 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve de Crenezumab Fab humanizado (CreneFab) PDB: 5VZY, GenBank Acc. Nº 1229749876.
[0186] A SEQ ID NO: 90 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve da sequência da linhagem germinativa humana IGKV2-30*2, GenBank Acc. Nº CAA77315.
[0187] A SEQ ID NO: 91 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve do anticorpo 18C5 humanizado hu18C5-VL 1.
[0188] A SEQ ID NO: 92 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve do anticorpo 18C5 humanizado hu18C5-VL 2.
[0189] A SEQ ID NO: 93 apresenta a sequência de aminoácidos de Kabat CDR-H1 do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0190] A SEQ ID NO: 94 apresenta a sequência de aminoácidos de Chothia CDR-H1 do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0192] A SEQ ID NO: 96 apresenta a sequência de aminoácidos de Chothia CDR-H2 do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0193] A SEQ ID NO: 97 apresenta a sequência de aminoácidos de ADM CDR-H2 do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0194] A SEQ ID NO: 98 apresenta a sequência de aminoácidos do CDR-H2 de contato do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0195] A SEQ ID NO: 98 apresenta a sequência de aminoácidos do CDR-H3 de contato do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0196] SEQ ID NO: 100 apresenta a sequência de aminoácidos do CDR-L1 de contato do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0197] A SEQ ID NO: 101 apresenta a sequência de aminoácidos do CDR- L2 de contato do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0198] A SEQ ID NO: 102 apresenta a sequência de aminoácidos do CDR- L3 de contato do anticorpo 18C5 de camundongo.
[0199] A SEQ ID NO: 103 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada do anticorpo 9D5 de camundongo.
[0200] A SEQ ID NO:104 apresenta a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve do anticorpo 9D5 de camundongo.
DEFINIÇÕES
[0201] Anticorpos monoclonais ou outras entidades biológicas são tipicamente fornecidos em forma isolada. Isto significa que um anticorpo ou outra entidade biológica é tipicamente pelo menos 50% peso/peso puro de proteínas interferentes e outros contaminantes decorrentes da sua produção ou purificação, mas isto não exclui a possibilidade de que o anticorpo monoclonal seja combinado com um excesso de carreador farmaceuticamente aceitável ou outro veículo destinado a facilitar o seu uso. Por vezes, os anticorpos monoclonais são, pelo menos, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% em peso/peso puros de proteínas e outras macromoléculas de produção ou purificação. Muitas vezes, um anticorpo monoclonal isolado ou outra entidade biológica é a espécie macromolecular predominante que permanece após a sua purificação.
[0202] A ligação específica de um anticorpo ao seu antígeno alvo significa uma afinidade de pelo menos 106, 107, 108, 10º, ou 10ºº M1. A ligação específica é detectavelmente maior em magnitude e distinta da ligação não específica que ocorre a pelo menos um alvo não relacionado. A ligação específica pode ser o resultado da formação de ligações entre grupos funcionais específicos ou ajuste espacial particular (por exemplo, tipo de fechadura e chave), enquanto a ligação não específica é geralmente o resultado de forças de van der Waals. No entanto, a ligação específica não implica necessariamente que um anticorpo se ligue a um e apenas um alvo.
[0203] A unidade estrutural básica do anticorpo é um tetrâmero de subunidades. Cada tetrâmero inclui dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa). A porção amino terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno. Esta região variável é inicialmente expressa ligada a um peptídeo sinal clivável. A região variável sem peptídeo sinal é por vezes referida como uma região variável madura. Assim, por exemplo, uma região variável madura da cadeia leve significa uma região variável de cadeia leve sem o peptídeo sinal da cadeia leve. A porção carboxi-terminal de cada cadeia define uma região constante essencialmente responsável pela função efetora.
[0204] As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon e definem o isotipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo também uma região "D" de cerca de 10 aminoácidos ou mais. Ver, em geral, Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2º ed. Raven Press, N.Y., 1989, Capítulo 7 (incorporado por referência na sua totalidade para todos os fins).
[0205] Uma região variável de cadeia leve ou pesada de imunoglobulina (também referidas neste documento como um "domínio variável de cadeia leve" ("domínio VL") ou "domínio variável de cadeia pesada" ("domínio VH"), respectivamente) consiste em uma região de "framework" interrompida por três “regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs.” As regiões de framework servem para alinhar as CDRs para ligação específica a um epítopo de um antígeno. As CDRs incluem os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são principalmente responsáveis pela ligação ao antígeno. Do terminal amino ao terminal carboxil, os domínios VL e VH compreendem as seguintes regiões framework (FR) e CDR: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As CDR 1, 2 e 3 de um domínio VL são também referidas neste documento, respectivamente, como CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3; As CDR 1, 2 e 3 de um domínio VH são também referidas neste documento, respectivamente, como CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3.
[0206] A atribuição de aminoácidos a cada domínio VL e VH está de acordo com qualquer definição convencional de CDRs. As definições convencionais incluem, a definição de Kabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, VID, 1987 e 1991), a definição de Chothia (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; et al., Nature 342:878- 883, 1989); um composto de CDR de Chothia Kabat em que CDR-H1 é um composto de CDRs de Chothia e Kabat; a definição de ADM usada pelo software de modelagem de anticorpos da Oxford Molecular; e a definição de contato de Martin et al (bioinfo.org.uk/abs) (vide Tabela 1). O Kabat fornece uma convenção de numeração amplamente usada (numeração de Kabat) na qual os resíduos correspondentes entre cadeias pesadas diferentes ou entre cadeias leves diferentes recebem o mesmo número. Quando se diz que um anticorpo compreende CDRs por uma certa definição de CDRs (por exemplo, Kabat), essa definição especifica o número mínimo de resíduos de CDR presentes no anticorpo (isto é, as CDRs de Kabat). Isto não exclui que outros resíduos que caem dentro de outra definição convencional de CDR, mas fora da definição especificada, também estejam presentes. Por exemplo, um anticorpo compreendendo CDRs definidas por Kabat inclui, entre outras possibilidades, um anticorpo no qual as CDRs contenham resíduos de CDR de Kabat e nenhum outro resíduo de CDR, e um anticorpo no qual CDR-H1 é uma CDR-H1 de Compósito de Chothia-Kabat e outras CDRs contenham resíduos de CDR de Kabat e nenhum resíduo adicional de CDR com base em outras definições.
Tabela 1 Definições convencionais de CDRs usando numeração de Kabat
Composto de Chothia Chothia & Contato Kabat *CDR-H1 por Chothia pode terminar em H32, H33 ou H34 (dependendo do comprimento da alça). Isto ocorre porque o esquema de numeração de Kabat coloca inserções de resíduos extras em 35A e 35B, enquanto a numeração de Chothia os coloca em 31A e 31B. Se nem H35A nem H35B (numeração de Kabat) estiverem presentes, a alça CDR-H1 de Chothia termina em H32. Se apenas H35A estiver presente, termina em H33. Se ambas H35A e H35B estiverem presentes, terminará em H34.
[0207] O termo "anticorpo" inclui anticorpos intactos e fragmentos de ligação do mesmo. Tipicamente, os fragmentos competem com o anticorpo intacto a partir do qual foram derivados para ligação específica ao alvo incluindo cadeias pesadas separadas, cadeias leves Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, Dabs, nanocorpos e Fv. Os fragmentos podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante, ou por separação enzimática ou química de imunoglobulinas intactas. O termo "anticorpo" também inclui um anticorpo biespecífico e/ou um anticorpo humanizado. Um anticorpo biespecífico ou bifuncional é um anticorpo híbrido artificial que tem dois diferentes pares de cadeia pesada/leve e dois locais de ligação diferentes (ver, por exemplo, Songsivilai e Lachmann, Clin Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelhy et al, J. Immunol., 148:1547-53 (1992)) Em alguns anticorpos biespecíficos, os dois pares de cadeia pesada/leves diferentes incluem um par de cadeia pesada/cadeia leve humanizada 9D5 e um par de cadeia de cadeia pesada/leve específico para um epítopo diferente em transtirretina daquele ligado por 9D5. Em alguns anticorpos biespecíficos, os dois pares de cadeia pesada/leves diferentes incluem um par de cadeia pesada/cadeia leve humanizada 18C5 e um par de cadeia de cadeia pesada/leve específico para um epítopo diferente em transtirretina daquele ligado por 18C5.
[0208] Em alguns anticorpos biespecíficos, um par de cadeia pesada/cadeia leve é um anticorpo 9D5 humanizado ou um anticorpo 18C5 humanizado como descrito adicionalmente abaixo e o outro par de cadeia pesada/cadeia leve é de um anticorpo que se liga a um receptor expresso na barreira hematoencefálica, tal como um receptor de insulina, uma insulina como receptora de fator de crescimento (IGF), um receptor de leptina, ou um receptor de lipoproteína, ou um receptor de transferrina (Friden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4771-4775, 1991; Friden et al, Science 259:373-377, 1993). Esse anticorpo não específico pode ser transferido através da barreira hematoencefálica por transcitose mediada pelo receptor. A captação cerebral do anticorpo biespecífico pode ser ainda melhorada através da manipulação do anticorpo biespecífico para reduzir sua afinidade com o receptor da barreira hematoencefálica no sangue. Afinidade reduzida para o receptor resultou numa distribuição mais ampla no cérebro (ver, por exemplo, Atwal et al., Sci. Trans. Med. 3, 84ra43, 2011; Yu et al., Sci. Trans. Med. 3, 84ra44, 2011).
[0209] Anticorpos biespecíficos exemplificativos também podem ser: (1) um anticorpo dual-variável-domínio (DVD- Ig), onde cada cadeia leve e pesada corrente contém dois domínios variáveis em conjunto através de uma ligação de peptídeo curta (Wu et a/, Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-lgTY) Molecule, Em: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (2) um Tandab, que é uma fusão de dois diacorpos de cadeia única, resultando em um anticorpo biespecífico tetravalente que possui dois sítios de ligação para cada um dos antígenos alvo; (3) um flexicorpo, que é uma combinação de scFvs com um diacorpo, resultando em uma molécula multivalente; (4) uma molécula chamada de "encaixar e travar", baseado na "dimerização e encaixe de domínio" na Proteína Quinase A, que, quando aplicado a Fabs, pode produzir uma proteína biespecífica trivalente consistindo de dois fragmentos Fab idênticos, ligados a um fragmento Fab diferente; ou (5) uma molécula chamada de Scorpion, compreendendo, por exemplo, dois scFvs fundidos para ambos terminais de uma região Fc humana. Exemplos de plataformas úteis para a preparação de anticorpos biespecíficos incluem BiTE (Micromet), DART (MacroGenics), Fcab e
Mab?2 (F-star), I9G1 manipulada por Fc (Xencor) ou DuoBody (baseado em troca de braços Fab, Genmab).
[0210] O termo "epítopo" se refere ao sítio em um antígeno ao qual um anticorpo se liga. Um epítopo pode ser formado a partir de aminoácidos contínuos ou aminoácidos não contínuos justapostos por dobragem terciária de uma ou mais proteínas. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos (também conhecidos como epítopos lineares) são tipicamente retidos por exposição a solventes desnaturantes enquanto que os epítopos formados por dobragem terciária (também conhecidos como epítopos conformacionais) são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3, e mais geralmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em uma única conformação espacial. Os métodos de determinação da conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, em Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996). O epítopo pode ser linear, como um epítopo de, por exemplo, 2-5, 3-5, 3-9 ou 5-9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 26, incluindo, por exemplo, dois ou mais aminoácidos contíguos ácidos dentro dos resíduos 89-97 da região madura de SEQ ID NO: 26. O epítopo também pode ser um epítopo conformacional incluindo, por exemplo, dois ou mais segmentos não contíguos de aminoácidos dentro dos resíduos 89-97 da região madura da SEQ ID NO: 26. Se diz que um anticorpo se liga a um epítopo dentro dos resíduos de aminoácidos 89-97 da transtirretina (TTR) (a região madura da SEQ ID NO: 26), por exemplo, o que se quer dizer é que o epítopo está dentro do intervalo recitado de aminoácidos, incluindo aqueles que definem os limites externos da faixa. Isso não significa necessariamente que todo aminoácido dentro da faixa constitui parte do epítopo. Assim, por exemplo, um epítopo dentro dos resíduos de aminoácidos 89-97 da TTR pode consistir nos aminoácidos 89-97, 89- 96, 90-97, 89-95, 90-96, 91-97, 89-94, 90 -95, 91-96, 92-97, 89-93, 90-94, 91-95, 92-96, 93-97, 89-92, 90-93, 91-94, 92-95, 93-96, 94-97, 89-91, 90-92, 91-93, 92-94, 93-95, 94-96, 95-97 da SEQ ID NO: 26, entre outros segmentos lineares da SEQ ID NO: 45, ou no caso de epítopos conformacionais, segmentos não contíguos de aminoácidos de SEQ ID NO: 45. Os epítopos podem incluir substituições E89K e E89Q, sendo E o resíduo do tipo selvagem).
O epítopo pode ser linear, como um epítopo de, por exemplo, 2-5, 3-5, 3-9 ou 5-9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 26, incluindo, por exemplo, dois ou mais aminoácidos contíguos ácidos dentro dos resíduos 101-109 da região madura de SEQ ID NO: 26. O epítopo também pode ser um epítopo conformacional incluindo, por exemplo, dois ou mais segmentos não contíguos de aminoácidos dentro dos resíduos 101-109 da região madura da SEQ ID NO: 26. Se diz que um anticorpo se liga a um epítopo dentro dos resíduos de aminoácidos 101-109 da transtirretina (TTR) (a região madura da SEQ ID NO: 26), por exemplo, o que se quer dizer é que o epítopo está dentro do intervalo recitado de aminoácidos, incluindo aqueles que definem os limites externos da faixa. Isso não significa necessariamente que todo aminoácido dentro da faixa constitui parte do epítopo. Assim, por exemplo, um epítopo dentro dos resíduos de aminoácidos 101-109 de TTR pode consistir nos aminoácidos 101-109, 101-108, 102-109, 101-107, 102- 108, 103-109, 101-106, 102 -107, 103-108, 104-109, 101-105, 102-106, 103-107, 104-108, 105-109, 101-104, 102-105, 103-106, 104-107, 105-108, 106-109, 101- 103, 102-104, 103 -105, 104-106, 105-107, 106-108, 107-109, 101-102, 102-103, 103-104, 104-105, 105-106, 106-107, 107-108 ou 108- 109 da SEQ ID NO: 26, entre outros segmentos lineares da SEQ ID NO: 30, ou no caso de epítopos conformacionais, segmentos não contíguos de aminoácidos da SEQ ID NO: 30.
[0211] Os anticorpos que reconhecem os epítopos iguais ou sobrepostos podem ser identificados num imunoensaio simples mostrando a capacidade de um anticorpo competir com a ligação de outro anticorpo a um antígeno alvo. O epítopo de um anticorpo pode também ser definido cristalografia por raios X do anticorpo ligado ao seu antígeno para identificar resíduos de contato. Alternativamente, considera-se que dois anticorpos têm o mesmo epítopo se todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzirem ou eliminarem a ligação do outro. Dois anticorpos têm epítopos sobrepostos se algumas mutações de aminoácidos que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro.
[0212] A competição entre anticorpos é determinada por um ensaio em que um anticorpo em teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum (ver, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990). Um anticorpo de teste compete com um anticorpo de referência se um excesso de um anticorpo de teste (por exemplo, pelo menos 2x, 5x, 10x, 20x ou 100x) inibe ou bloqueia a ligação do anticorpo de referência por, por exemplo, pelo menos 50% conforme medido em um ensaio de ligação competitiva. Alguns anticorpos de teste inibem a ligação do anticorpo de referência em pelo menos 75%, 90% ou 99%. Os anticorpos identificados pelo ensaio de competição (anticorpos de competição) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e anticorpos que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente próximo ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência para que o bloqueio estérico ocorra.
[0213] O termo "nativo" em relação à estrutura de transtirretina (TTR) refere- se à estrutura dobrada normal da TTR em seu estado de funcionamento adequado (isto é, um tetrâmero TTR). Como o TTR é um tetrâmero em sua forma dobrada de forma nativa, as formas não nativas de TTR incluem, por exemplo, tetrâmeros de TTR mal dobrados, monômeros de TTR, formas agregadas de TTR e formas fibrilas de TTR. As formas não nativas de TTR podem incluir moléculas compreendendo sequências ou mutações de aminoácidos de TTR do tipo selvagem.
[0214] O termo "mal dobrada" em relação à TTR refere-se à estrutura secundária e terciária de um monômero ou multímero de polipeptídeo TTR e indica que o polipeptídeo adotou uma conformação que não é normal para essa proteína em seu estado de funcionamento adequado. Embora a dobragem incorreta do TTR possa ser causada por mutações na proteína (por exemplo, deleção, substituição ou adição), as proteínas TTR do tipo selvagem também podem ser mal dobradas em doenças, expondo epítopos específicos.
[0215] O termo "farmaceuticamente aceitável" significa que o carreador, diluente, excipiente ou auxiliar compatível com os outros ingredientes da formulação e não substancialmente prejudicial para o receptor do mesmo.
[0216] O termo “paciente” inclui humanos e outros mamíferos que recebem tratamento profilático ou terapêutico.
[0217] Um indivíduo está em risco aumentado de uma doença se o sujeito tiver pelo menos um fator de risco conhecido (por exemplo, genética, bioquímica, história familiar e exposição situacional) colocando os indivíduos com esse fator de risco em um risco estatisticamente significativo maior de desenvolver a doença do que indivíduos sem o fator de risco.
[0218] O termo “amostra biológica” refere-se a uma amostra de material biológico dentro ou obtenível de uma fonte biológica, por exemplo, um sujeito humano ou mamífero. Tais amostras podem ser órgãos, organelas, tecidos, seções de tecidos, fluidos corporais, sangue periférico, plasma sanguíneo, soro sanguíneo, células, moléculas tais como proteínas e peptídeos, e quaisquer partes ou combinações derivadas dos mesmos. O termo amostra biológica também pode abranger qualquer material derivado do processamento da amostra. O material derivado pode incluir células ou sua progênie. O processamento da amostra biológica pode envolver uma ou mais filtrações, destilações, extrações, concentrações, fixação, inativação de componentes interferentes e semelhantes.
[0219] O termo "amostra de controle" refere-se a uma amostra biológica desconhecida ou suspeita de incluir formas monoméricas, dobradas, agregadas ou fibrilas de transtirretina (TTR), como em depósitos amiloides de TTR. As amostras de controle podem ser obtidas de indivíduos não afetados por uma amiloidose por TTR ou por um tipo de amiloidose por TTR especificamente escolhido. Alternativamente, podem ser obtidas amostras de controle de pacientes afetados com amiloidose por TTR ou um tipo de amiloidose por TTR especificamente escolhido. Essas amostras podem ser obtidas ao mesmo tempo que uma amostra biológica que se pensa compreender a amiloidose por TTR ou em uma ocasião diferente. Uma amostra biológica e uma amostra de controle podem ser obtidas do mesmo tecido (por exemplo, uma seção de tecido contendo depósitos de amiloide de TTR e tecido normal circundante). Preferencialmente, as amostras de controle consistem essencialmente ou inteiramente de tecido livre de depósitos amiloides TTR e podem ser usadas em comparação com uma amostra biológica que se pensa compreender depósitos amiloides de TTR. De preferência, o tecido na amostra de controle é do mesmo tipo que o tecido da amostra biológica (por exemplo, cardiomiócitos no coração).
[0220] O termo “doença” refere-se a qualquer condição anormal que prejudique a função fisiológica. O termo é usado amplamente para abranger qualquer distúrbio, doença, anormalidade, patologia, doença, condição ou síndrome em que a função fisiológica é prejudicada, independentemente da natureza da etiologia.
[0221] O termo "sintoma" refere-se a uma evidência subjetiva de uma doença, como marcha alterada, como perceptível por um sujeito. Um "sinal" refere- se à evidência objetiva de uma doença, conforme observado por um médico.
[0222] Para efeitos de classificação de substituições de aminoácidos como conservadoras ou não conservadoras, os aminoácidos são agrupados da seguinte forma: Grupo | (cadeias laterais hidrofóbicas): met, ala, val, leu, ile; Grupo |l (cadeias hidrofílicas laterais neutras): gln, his, cys, ser, thr; Grupo Ill (cadeias laterais ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadeias laterais básicas): asn, Iys, arg; Grupo V (resíduos que influenciam a orientação da cadeia): gly, pro; e Grupo VI (cadeias laterais aromáticas): trp, tyr, phe. As substituições conservadoras envolvem substituições entre aminoácidos na mesma classe. As substituições não conservadoras constituem a troca de um membro de uma destas classes por um membro de outra.
[0223] Identidades de sequência percentual são determinadas com sequências de anticorpo alinhadas ao máximo pela convenção de numeração de Kabat. Após o alinhamento, se uma região de anticorpo do sujeito (por exemplo, toda a região variável madura de uma cadeia pesada ou leve) está sendo comparada com a mesma região de um anticorpo de referência, a identidade de sequência percentual entre as regiões de anticorpos do sujeito e de referência é o número de posições ocupadas pelo mesmo aminoácido na região, tanto do sujeito quanto do anticorpo de referência, dividida pelo número total de posições alinhadas das duas regiões, com lacunas não contadas, multiplicado por 100 para converter em percentagem.
[0224] Composições ou métodos que "compreendem" ou "incluem" um ou mais elementos recitados podem incluir outros elementos não especificamente recitados. Por exemplo, uma composição que "compreende" ou "inclui" o anticorpo pode conter o anticorpo por si só ou em combinação com outros ingredientes.
[0225] A designação de um intervalo de valores inclui todos os inteiros dentro ou definindo o intervalo e todos os subintervalos definidos por números inteiros dentro do intervalo.
[0226] Salvo quando o contrário fica aparente pelo contexto, o termo "cerca de" inclui valores dentro de uma margem normal de erro de medida (por exemplo, SEM) de um valor declarado.
[0227] Significância estatística significa p < 0,05.
[0228] Os anticorpos da invenção podem ser administrados concomitantemente com outro tratamento para a mesma indicação que o anticorpo, o que significa que o outro tratamento é administrado pelo menos uma vez durante o período em que o anticorpo é administrado, período que começa um mês antes do primeiro dosagem e terminando um mês após a última dosagem do anticorpo. O outro tratamento pode ser administrado em intervalos recorrentes durante esse período, que pode ou não ser o mesmo que o intervalo em que o anticorpo é administrado. O outro tratamento pode ser um tratamento sintomático.
[0229] Um tratamento é sintomático se afetar apenas um ou mais sintomas de uma doença, não sua causa, ou seja, sua etiologia.
[0230] As formas singulares dos artigos “uma”, “um” e “a/0” incluem suas referências no plural, a menos que o contexto claramente dite de outra forma. Por exemplo, o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas dos mesmos.
DESCRIÇÃO DETALHADA LL Geral
[0231] A invenção fornece anticorpos que se ligam especificamente aos resíduos 89-97 ou aos resíduos 101-109 da transtirretina (TTR). Alguns anticorpos ligam-se a qualquer uma ou todas as formas monoméricas, dobradas, agregadas ou fibrilas de TTR, preferencialmente em relação à forma tetramérica nativa de TTR. Alguns anticorpos ligam-se a uma ou a ambas as formas monoméricas ou dobradas de TTR, preferencialmente em relação à forma tetramérica nativa de TTR. Os anticorpos podem ser utilizados para tratar ou efetuar a profilaxia de doenças ou distúrbios associados ao acúmulo de TTR ou acúmulo de depósitos de TTR (por exemplo, amiloidose por TTR). Os anticorpos também podem ser utilizados para diagnosticar amiloidose por TTR e inibir ou reduzir a agregação de TTR. Os anticorpos também podem ser utilizados para demonstrar os efeitos farmacodinâmicos de uma terapia de amiloidose mediada pela transtirretina, entre outros pedidos. Ligação preferencial significa uma constante de associação pelo menos cinco vezes mais alta para qualquer uma ou todas as formas monoméricas, dobradas, agregadas ou fibrilas de TTR do que para a forma tetramérica nativa de TTR. Opcionalmente, a constante de associação é pelo menos dez vezes maior para qualquer uma ou todas as formas monoméricas, dobradas, agregadas ou fibrilas de TTR do que para a forma tetramérica nativa de TTR. Opcionalmente, o anticorpo, como 9D5 ou 18C5, por exemplo, carece de ligação específica à forma tetramérica nativa de TTR.
1. Moléculas alvo
[0232] A Transtirretina (TTR) é uma proteína de transporte de 127 aminoácidos, soro de 55 kDa e líquido cefalorraquidiano sintetizada principalmente pelo fígado. Também foi referido como pré-albumina, pré-albumina de ligação à tiroxina, ATTR e TBPA. Em seu estado nativo, a TTR existe como um tetrâmero. Nos homozigotos, os tetrâmeros compreendem subunidades idênticas ricas em folhas beta de 127 aminoácidos. Nos heterozigotos, os tetrâneros TTR são compostos de subunidades variantes e/ou de tipo selvagem, tipicamente combinadas de maneira estatística.
[0233] A função estabelecida da TTR no sangue é transportar a proteína de ligação Ao/o-retinol. Embora a TTR seja o principal carreador de tiroxina (T4) no sangue de roedores, utilizando sítios de ligação ortogonais aos utilizados para a proteína de ligação holo-retinol, os sítios de ligação do Ta são efetivamente desocupados em humanos.
[0234] Pensa-se que a TTR é uma das pelo menos trinta proteínas humanas diferentes cuja dobra extracelular e/ou desmontagem (amiloidogênese) em um espectro de estruturas agregadas é pensada para causar doenças degenerativas referidas como doenças amiloides. A TTR sofre alterações conformacionais para se tornar amiloidogênico. A dissociação do tetrâmero TTR e o desdobramento parcial expõem expansões de resíduos hidrofóbicos em grande parte não carregados em uma conformação estendida que desmonta eficientemente em agregados esféricos em grande parte não estruturados que acabam por sofrer conversão de conformação em estruturas amiloides de folhas cruzadas.
[0235] Salvo indicação contrária do contexto, a referência à transtirretina (TTR) ou aos seus fragmentos ou domínios inclui as sequências naturais de aminoácidos humanos incluindo isoformas, mutantes (por exemplo, ES89K e E89Q), e variantes alélicas dos mesmos. As sequências de polipeptídeo TTR exemplares são designadas por Números de Acesso P02766.1 (UniProt) (SEQ ID NO: 26), AAB35639.1 (GenBank) (SEQ ID NO: 27), AAB35640.1 (GenBank) (SEQ ID NO: 28), e ABI63351.1 (GenBank) (SEQ ID NO: 29). Os resíduos são numerados de acordo com Swiss Prot PO02766.1, com o primeiro aminoácido da proteína madura (isto é, não incluindo a sequência sinal de 20 aminoácidos) designado resíduo 1. Em qualquer outra proteína TTR, os resíduos são numerados de acordo com os resíduos correspondentes em P02766.1 no alinhamento máximo.
"1. Amiloidose por Transtirretina
[0236] A amiloidose por transtirretina (TTR) é um distúrbio sistêmico caracterizado por TTR patogênica e mal dobrada e pela deposição extracelular de fibrilas amiloides compostas pela TTR. A amiloidose por TTR é geralmente causada pela desestabilização da forma nativa do tetrâmero de TTR (devido a condições ambientais ou genéticas), levando à dissociação, desdobramento e agregação da TTR em fibrilas amiloides que se acumulam em vários órgãos e tecidos, causando disfunção progressiva. Ver, por exemplo, Almeida e Saraiva, FEBSLetters 586: 2891-2896 (2012); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013).
[0237] Nos seres humanos, os tetrânmeros TTR do tipo selvagem e os tetrâmeros mistos compostos por subunidades mutantes e do tipo selvagem podem dissociar, dobrar e agregar, com o processo de amiloidogênese, levando à degeneração do tecido afetado. Assim, as amiloidoses por TTR abrangem doenças causadas pela TTR patogênica mal dobrada resultante de mutações na TTR ou resultantes de TTR mal dobrada e não mutada.
[0238] Por exemplo, amiloidose ATTR do tipo selvagem (também chamada amiloidose sistêmica senil ou SSA) e amiloidose cardíaca senil (SCA) são tipos de amiloidose relacionados à idade que resultam da deposição de amiloide de TTR do tipo selvagem fora e dentro dos cardiomiócitos do coração. A amiloidose por TTR também é a forma mais comum de amiloidose hereditária (familiar), causada por mutações que desestabilizam a proteína TTR. As amiloidose por TTR associadas a mutações pontuais no gene TTR incluem polineuropatia amiloide familiar (FAP), cardiomiopatia amiloide familiar (FAC) e a amiloidose seletiva rara do sistema nervoso central (CNSA). Pacientes com amiloidose por TTR hereditária (familiar) são quase sempre heterozigotos, o que significa que os tetrâneros TTR são compostos por subunidades TTR mutantes e/ou selvagens, geralmente distribuídas estatisticamente. As versões hereditárias (familiares) da amiloidose pela TTR são geralmente autossômicas dominantes e geralmente são mais precoces que as doenças esporádicas (SSA e SCA).
[0239] Existem mais de 100 mutações no gene que codifica TTR que foram implicadas nos distúrbios autossômicos dominantes FAP e FAC. Ver, por exemplo, US 2014/0056904; Saraiva, Hum. Mutat. 17(6):493-503 (2001); Damas e Saraiva, J. Struct. Biol. 130:290-299; Dwulet e Benson, Biochem. Biophys. Res. Commun. 114:657-662 (1983). Essas mutações causadoras de amiloide são distribuídas por toda a molécula de TTR. Geralmente, quanto mais desestabilizadoras forem as subunidades mutantes da estrutura do tetrâmero TTR, mais cedo será o início da doença amiloide. O potencial patogênico de uma variante de TTR é geralmente determinado por uma combinação de sua instabilidade e eficiência de secreção celular. A patologia inicial causada por algumas variantes do TTR provém da destruição seletiva do tecido cardíaco, enquanto a de outras variantes do TTR provém do comprometimento do sistema nervoso periférico e autônomo. O dano tecidual causado pela amiloidogênese do TTR parece originar-se amplamente da toxicidade de agregados pequenos e difusíveis de TTR, embora o acúmulo de amiloide extracelular possa contribuir e quase certamente comprometer a estrutura do órgão nos estágios finais da amiloidose por TTR. Mutações de TTR exemplificativas incluem V30M, Y114C, G47R, S50I, E61L, T49S, F33V, A45T, E89K, E89Q e V122|.
[0240] A amiloidose por TTR se apresenta de muitas formas diferentes, com considerável variação fenotípica entre indivíduos e localizações geográficas. Por exemplo, a amiloidose por TTR pode se apresentar como uma neuropatia autonômica e motora sensorial axonal progressiva. A amiloidose por TTR também pode se apresentar como cardiomiopatia infiltrativa.
[0241] A idade de início dos sintomas relacionados à doença varia entre a segunda e a nona décadas de vida, com grandes variações entre diferentes populações. O envolvimento multissistêmico da amiloidose por TTR é uma pista para seu diagnóstico. Por exemplo, o diagnóstico de amiloidose por TTR é considerado quando um ou vários dos seguintes estão presentes: (1) história familiar de doença neuropática, especialmente associada a insuficiência cardíaca; (2) dor neuropática ou distúrbios sensoriais progressivos de etiologia desconhecida; (3) síndrome do túnel do carpo sem causa óbvia, particularmente se for bilateral e requer liberação cirúrgica; (4) distúrbios da motilidade gastrointestinal ou disfunção do nervo autônomo de etiologia desconhecida (por exemplo, disfunção erétil,
hipotensão ortostática, bexiga neurogênica); (5) doença cardíaca caracterizada por paredes ventriculares engrossadas na ausência de hipertensão; (6) bloqueio atrioventricular avançado de origem desconhecida, particularmente quando acompanhado por um coração engrossado; e (6) inclusões do corpo vítreo do tipo algodão-lã. Ver Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). Outros sintomas podem incluir, por exemplo, polineuropatia, perda sensorial, dor, fraqueza nos membros inferiores, disidrose, diarreia, constipação, perda de peso e incontinência/retenção urinária.
[0242] O diagnóstico definitivo de amiloidose por TTR, geralmente depende de biópsias de órgãos alvo, seguido de coloração histológica do tecido excisado com corante específico de amiloide, vermelho Congo. Se for observado um teste positivo para amiloide, a coloração imuno-histoquímica e a identificação espectroscópica de massa para TTR são realizadas subsequentemente para garantir que a proteína precursora responsável pela formação de amiloide seja de fato TTR. Os anticorpos divulgados neste documento são úteis para distinguir a amiloidose por TTR de uma amiloidose não-TTR, por exemplo, amiloidose de cadeia leve (AL) amiloide, também conhecida como amiloidose sistêmica primária. Para as formas familiares das doenças, a demonstração de uma mutação no gene que codifica TTR é então necessária antes que um diagnóstico possa ser feito. Isso pode ser realizado, por exemplo, por meio de eletroforese de foco isoelétrico, reação em cadeia da polimerase ou espectrometria de massa em dissecção a laser/cromatografia líquida em tandem. Veja, por exemplo, US 2014/0056904; Ruberg e Berk, Circulation 126: 1286-1300 (2012); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013).
IV. — Anticorpos A. Especificidade de ligação e propriedades funcionais
[0243] A invenção fornece anticorpos monocionais que se ligam à proteína transtirretina (TTR), mais especificamente, a epítopos dentro dos resíduos de aminoácidos 89-97 (SEQ ID NO: 45) ou a epítopos dentro dos resíduos de aminoácidos 101-109 (SEQ ID NO: 30) de TTR. Tais epítopos são enterrados no tetrâmero TTR nativo e expostos em formas monoméricas, dobradas de maneira errada, agregadas ou de fibrilas de TTR.
[0244] Tais anticorpos incluem 9D5, 18C5 e suas formas quiméricas,
folheadas e humanizadas. 9D5 se liga especificamente aos resíduos de aminoácidos 89-97 (SEQ ID NO: 45) de TTR. 18C5 se liga especificamente aos resíduos de aminoácidos 101-109 (SEQ ID NO: 30) de TTR. Esses anticorpos são ainda caracterizados por sua capacidade de se ligar às formas monoméricas, dobradas, agregadas ou fibrilas de TTR, mas não à forma tetramérica nativa de TTR. A capacidade de se ligar a proteínas específicas ou fragmentos dos mesmos pode ser demonstrada usando formatos de ensaio exemplificativos fornecidos nos exemplos. A menos que seja de outro modo aparente no contexto, a referência a 9D5 ou 18C5 deve ser entendida como referente a qualquer uma das formas humanizadas de camundongo, quiméricas, folheadas. Uma linhagem celular de hibridoma que produz o anticorpo monoclional 9D5 foi depositada no depositário de patentes da American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia, 20110- 2209 em 4 de abril de 2017 e atribuída ao depósito de patente Nº PTA-124078. Uma linhagem celular de hibridoma que produz o anticorpo monoclonal 18C5 foi depositada no depositário de patentes da American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia, 20110-2209 em 31 de outubro de 2017 e atribuído ao depósito de patente Nº PTA-124570 .
[0245] Alguns anticorpos se ligam ao mesmo epítopo que se sobrepõe como um anticorpo designado como 9D5. As sequências das regiões variáveis maduras da cadeia pesada e leve de 9D5 são designadas SEQ ID NOs: 81 e 82, respectivamente. Outros anticorpos possuindo tal especificidade de ligação podem ser produzidos por imunização de camundongos com TTR, ou uma porção dele que inclui o epítopo desejado (por exemplo, SEQ ID NO: 45) e triagem de anticorpos resultantes para ligação à TTR monomérica ou a um peptídeo compreendendo SEQ ID NO: 45, opcionalmente em competição com um anticorpo possuindo as regiões variáveis de 18C5 de camundongo (I9G1 kappa). Fragmentos de TTR incluindo o epítopo desejado podem ser ligados a um transportador que ajuda a obter uma resposta de anticorpos ao fragmento e/ou ser combinado com um adjuvante que ajuda a provocar tal resposta. Tais anticorpos podem ser triados para ligação diferencial a versões monoméricas de tipo selvagem de TTR ou um fragmento do mesmo (por exemplo, SEQ ID NO: 26) em comparação com mutantes de resíduos especificados.
Alguns anticorpos se ligam ao mesmo epítopo que se sobrepõe como um anticorpo designado como 18C5. As sequências das regiões variáveis maduras da cadeia pesada e leve de 18C5 são designadas SEQ ID NOs: 1 e 3, respectivamente. Outros anticorpos possuindo tal especificidade de ligação podem ser produzidos por imunização de camundongos com TTR, ou uma porção dele que inclui o epítopo desejado (por exemplo, SEQ ID NO: 30) e triagem de anticorpos resultantes para ligação à TTR monomérica ou a um peptídeo compreendendo SEQ ID NO: 30, opcionalmente em competição com um anticorpo possuindo as regiões variáveis de 18C5 de camundongo (Ig9G1, kappa). Fragmentos de TTR incluindo o epítopo desejado podem ser ligados a um transportador que ajuda a obter uma resposta de anticorpos ao fragmento e/ou ser combinado com um adjuvante que ajuda a provocar tal resposta. Tais anticorpos podem ser triados para ligação diferencial a versões monoméricas de tipo selvagem de TTR ou um fragmento do mesmo (por exemplo, SEQ ID NO: 26) em comparação com mutantes de resíduos especificados.
A triagem contra tais mutantes define mais precisamente a especificidade de ligação para permitir a identificação de anticorpos cuja ligação é inibida por mutagênese de resíduos particulares e que são suscetíveis de compartilhar as propriedades funcionais de outros anticorpos exemplificados. As mutações podem ser substituição de substituição sistemática com alanina (ou serina ou glicina se já existe uma alanina) um resíduo por vez, ou intervalos mais amplamente espaçados, ao longo do alvo ou ao longo de uma seção dele, no qual um epítopo é conhecido por residir. Se o mesmo conjunto de mutações reduz significativamente a ligação de dois anticorpos, os dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo.
[0246] Os anticorpos tendo a especificidade de ligação de um anticorpo murino selecionado (por exemplo, 9D5 ou 18C5) também podem ser produzidos usando uma variante do método de exibição de fagos. Vide Winter, WO 92/20791. Este método é particularmente adequado para a produção de anticorpos humanos. Neste método, a região variável de cadeia pesada ou leve do anticorpo murino selecionado é usada como matéria-prima. Se, por exemplo, uma região variável de cadeia leve for selecionada como matéria-prima, é construída uma biblioteca de fagos em que os membros exibem a mesma região variável de cadeia leve (ou seja, a matéria-prima murino) e uma região variável de cadeia pesada diferente. As regiões variáveis da cadeia pesada podem, por exemplo, ser obtidas a partir de uma biblioteca de regiões variáveis de cadeia pesada humana rearranjadas. Um fago mostrando forte ligação específica (por exemplo, pelo menos 10º e preferencialmente pelo menos 10º M') para TTR monomérica ou um fragmento deste (por exemplo, resíduos de aminoácido 89-97 ou resíduos de aminoácido 101- 109) é selecionado. A região variável de cadeia pesada deste fago serve então como matéria prima para a construção de uma biblioteca de fagos adicional. Nesta biblioteca, cada fago exibe a mesma região variável de cadeia pesada (ou seja, a região identificada a partir da primeira biblioteca de exibição) e uma região variável de cadeia leve diferente. As regiões variáveis da cadeia leve podem ser obtidas, por exemplo, a partir de uma biblioteca de regiões de cadeia leve variável humana rearranjadas. Novamente, o fago mostrando ligação específica forte para TTR monomérica ou um fragmento do mesmo (por exemplo, resíduos de aminoácidos 89-97 ou resíduos de aminoácidos 101-109) são selecionados. Os anticorpos resultantes têm geralmente a mesma ou semelhante especificidade do epítopo que a matéria-prima murino.
[0247] Outros anticorpos podem ser obtidos por mutagênese de cDNA que codifica as cadeias pesada e leve de um anticorpo exemplificativo, como 9D5 ou 18C5. Os anticorpos monoclonais que são pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticos a 9D5 ou 18C5 na sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e/ou leve maduras e mantêm suas propriedades funcionais, e/ou que diferem do respectivo anticorpo por um pequeno número de substituições de aminoácidos funcionalmente inconsequentes (por exemplo, substituições conservadoras), deleções ou inserções também estão incluídas na invenção. Os anticorpos monoclonais que possuem pelo menos uma ou todas as seis CDR(s) como definido por qualquer definição convencional, mas preferencialmente Kabat, que são 90%, 95%, 99% ou 100% idênticos às CDRs correspondentes de 9D5 ou 18C5 também estão incluídos.
[0248] A invenção também fornece anticorpos que têm algumas ou todas (por exemplo, 3, 4, 5 e 6) as CDRs totalmente ou substancialmente a partir de 9D5 ou 18C5. Tais anticorpos podem incluir uma região variável de cadeia pesada que tenha pelo menos duas, e geralmente todas as três, CDRs inteiramente ou substancialmente da região variável de cadeia pesada de 9D5 ou 18C5 e/ou uma região variável de cadeia leve com pelo menos dois e geralmente todos três, CDRs inteiramente ou substancialmente da região variável de cadeia leve de 9D5 ou 18C5. Os anticorpos podem incluir tanto cadeias pesadas quanto cadeias leves. Uma CDR é substancialmente a partir de uma CDR de 9D5 ou 18C5 correspondente quando a mesma contém não mais do que 4, 3, 2 ou 1 substituições, inserções ou deleções, exceto que a CDR-H2 (quando definida por Kabat) pode ter não mais do que 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições, inserções ou deleções. Tais anticorpos podem ter pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade a 9D5 ou 18C5 na sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada madura e/ou regiões variáveis de cadeia leve madura e manter suas propriedades funcionais e/ou diferir do 9D5 ou 18C5 em um pequeno número de substituições de aminoácidos funcionalmente inconsequentes (por exemplo, substituições conservadoras), deleções ou inserções.
[0249] CDRs Kabat (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) da cadeia pesada de 9D5 são designadas SEQ ID NOs: 75, 76 e 77, respectivamente, e CDRs Kabat (CDR- L1, CDR-L2, CDR-L3) da cadeia leve de 9D5 são designadas SEQ ID NOs: 78, 79 e 80, respectivamente.
[0250] CDRs de compostos Kabat/Chothia (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) da cadeia pesada de 18C5 são designadas SEQ ID NOs: 5,7 e 9, respectivamente, e CDRs de compostos Kabat/Chothia (CDR -L1, CDR-L2, CDR-L3) da cadeia leve de 18C5 são designadas SEQ ID NOs: 11, 13 e 15, respectivamente.
[0251] A Tabela 2 indica as CDRs 18C5 como definidas por Kabat, Chothia, Composto de Chothia e Kabat (também referido neste documento como “Composto de Kabat/Chothia”), ADM e Contact.
Tabela 2 CDRs 18C5, conforme definido por Kabat, Chothia, composto de Chothia e Kabat, ADM e Contato, usando a numeração Kabat Composto de IAlçal Kabat Chothia Chothia ADM Contato & Kabat
L24-L34 L30-L36 L24-L34 L24-L34 L24-L34 L1 |ISEQID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: 11 |SEQ ID NO: 11)/SEQ ID NO: 11 1 100 L50-L56 L50-L56 L46-L55 L50-L56 L50-L56 L2| SEQID SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 13 NO:13 13 101 L89-L97 L89-L96 L89-L97 L89-L97 L89-L97 L3 |SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: 15 [SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 15 102 H31-H35B H30-H35B H26-H32 H26-H35B H26-H35B H1 |SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: 94 | SEQ ID NO:5 | SEQIDNO:5 93 95 H50-H65 H47-H58 H52-H56 H50-H65 H50-H58 H2 |SEQ ID NO: SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 96 | SEQ ID NO: 7 [SEQ ID NO: 97 o8 H95-H102 H93-H101 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H3| SEQID SEQ ID NO: SEQ ID NO:9 | SEQID NO: 9 | SEQ ID NO: 9 NO:9 99
[0252] Alguns anticorpos identificados por esses ensaios podem se ligar às formas monoméricas, dobradas, agregadas ou fibrilas de TTR, mas não à forma tetramérica nativa de TTR, conforme descrito nos exemplos ou de outra forma. Da mesma forma, alguns anticorpos são imunorreativos ao tecido de amiloidose mediada pela TTR, mas não ao tecido saudável.
[0253] Alguns anticorpos podem inibir ou reduzir a agregação de TTR, inibir ou reduzir a formação de fibrilas de TTR, reduzir ou limpar depósitos de TTR ou TTR agregada ou estabilizar conformações não tóxicas de TTR em um modelo animal ou ensaio clínico. Alguns anticorpos podem tratar, efetuar profilaxia ou retardar o início de uma amiloidose pela TTR, como mostrado em um modelo animal ou em um ensaio clínico. Modelos animais exemplares para testar a atividade contra uma amiloidose por TTR incluem aqueles descritos em Kohno et al., Am. J. Path. 150(4): 1497-1508 (1997); Teng et al., Laboratory Investigations 81:385-396 (2001); Wakasugi et al., Proc. Japan Acad. 63B:344-347 (1987); Shimada et al., Mol. Biol. Med. 6:333-343 (1989); Nagata et al., J. Biochem., 117:169-175 (1995); Sousa et al., Am. J. Path., 161:1935-1948 (2002); e Santos et al., Neurobiology of Aging 31:280-289 (2010).
[0254] Anticorpos anti-TTR incluindo versões quiméricas e humanizadas dos mesmos, são úteis em terapias combinadas, em anticorpos biespecíficos, em métodos de diagnóstico e/ou tratamento de distúrbios associados a TTR e em métodos de detecção de TTR. Tais anticorpos anti-TTR, podem incluir anticorpos como na Tabela 3 abaixo.
Tabela 3 Anticorpos anti-TTR. Epítopo na TTRVH/VL ou CDRs|Referência o Comamerataado — Eavementaado 9D5 EHAEVVFTA (89-97) CDRs da Kabat: WO 2016/120810) (SEQ ID NO:45) ICDR-H1 SEQ ID NO: 75|Nº de depósito Al ICDR-H2 SEQ ID NO: 76ATCCPTA- ICDR-H3 SEQ ID NO: 77/124078 Data: 4 de ICDR-L1 SEQ ID NO: 78/abril de 2017 ICDR-L2 SEQ ID NO: 79 ICDR-L3 SEQ ID NO: 80 14G8 ICDRs da Kabat WO 2016/120810)
ANA (SEQ ID NO:45) ATCC ICDR-H1 SEQ ID NO: 39 ICDR-H2 SEQ ID NO: 40PTA-124079 ICDR-H3 SEQ ID NO: 41)Data: 4 de abril de ICDR-L1 SEQ ID NO: 42/2017 5A1 ICDRs da Kabat WO 2016/120811
SAS (SEQ ID NO :45) ICDR-H2 SEQ ID NO: 47/ATCC PTA-
Bc1 ICDRs da Kabat WO 2016/120809)
TE TERRE (SEQ ID NO :45) ICDR-H2 SEQ ID NO: 53ATCC 18C5 CDRs de composto| Kabat/Chothia: CDR-H1 [1SEQ ID NO: 5 CDR-H2 ISEQ ID NO: 7 CDR-H3Pedido Provisório| ISEQ ID NO: 9 CDR-LIUS — 62/596,438, 1SEQ ID NO: 11 depositado em 6) GPRRYTIAA — (101-109)CDR-L2 SEQIDNO: [de outubro de (SEQ ID NO:30) 13 2017
NR IAD7F6 NVH SEQ ID NO: 58 IVL SEQ ID NO: 59 WO 2010/030203|
IA RT24 |CDR-H1 SEQ ID NO: 60 ICDR-H2 SEQ ID NO:61 CDR-H3 SEQ ID NO: 62 ICDR-L1 SEQ ID NO: 63 ICDR-L2 SEQ ID NO: 64 ICDR-L3 SEQ ID NO: 65 17118-122, 115-124 WO 2015/115331 NF CDR-H1 SEQ ID NO:
E 11 53-63, 54-61 cpDR-H2 seo D no!
IMFD101, IMDF102,ADDTWEPFASGKT MFD (resíduos 36-49) (SEQ ID) US 2016/0039916) 103, NO: 72) A1
MFD 107, TSESGELHGLTTE MFD (resíduos 49-61) (SEQ ID) US 2016/0039916) 108, NO: 73) AI IMFD114 |ALLSPYSYSTTAV (resíduos 109-121) (SEQ US 2016/0039916 ID NO: 74 M US 2016/0039916) 30-66 A US 2016/0039916) 70-127 A US 2016/0039916) 80-127 A US 2016/0039916) 90-127 A1 US 2016/0039916) 100-127 A1 US 2016/0039916) 110-127 A1 US 2016/0039916) 115-127 A B. Anticorpos não humanos
[0255] A produção de outros anticorpos não humanos, por exemplo, murino, cobaia, primata, coelho ou rato, contra a TTR monomérica ou um fragmento do mesmo (por exemplo, resíduos de aminoácidos 89-97 ou resíduos de aminoácidos 101-109) pode ser realizado, por exemplo, imunizando o animal com TTR ou um fragmento do mesmo. Vide Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988) (incorporado por referência para todos os fins). Um tal imunógeno pode ser obtido a partir de uma fonte natural, por síntese de peptídeos ou por expressão recombinante. Opcionalmente, o imunógeno pode ser administrado fundido ou de outro modo complexado com uma proteína carreadora. Opcionalmente, o imunógeno pode ser administrado com um adjuvante. Vários tipos de adjuvante podem ser usados conforme descrito abaixo. O adjuvante completo de Freund seguido de adjuvante incompleto é preferido para a imunização de animais de laboratório. Coelhos ou porquinhos-da-índia são tipicamente usados para produzir anticorpos policlonais. Os camundongos tipicamente usados para fabricar anticorpos monoclionais. Os anticorpos são pesquisados quanto à ligação específica à TTR monomérica ou a um epítopo dentro da TTR (por exemplo, um epítopo compreendendo um ou mais dos resíduos de aminoácidos 89-97 ou dos resíduos de aminoácidos 101-109). Essa triagem pode ser realizada determinando a ligação de um anticorpo a uma coleção de variantes de TTR monoméricas, como variantes de TTR contendo resíduos de aminoácidos 89-97 resíduos de aminoácidos 101-109 ou mutações dentro desses resíduos e determinando quais variantes de TTR se ligam ao anticorpo. A ligação pode ser avaliada, por exemplo, por Western blot, FACS ou ELISA.
C. Anticorpos Humanizados
[0256] Um anticorpo humanizado é um anticorpo geneticamente modificado em que as CDRs de um anticorpo "doador" não humano são enxertadas em sequências de anticorpo "aceitadoras" humanas (vide, por exemplo, Queen, US 5,530,101 e 5,585,089; Winter, US 5,225,539, Carter, US 6,407,213, Adair, US 5,859,205; e Foote, US 6,881,557). As sequências de anticorpo aceitador podem ser, por exemplo, uma sequência de anticorpo humana madura, um composto de tais sequências, uma sequência consenso de sequências de anticorpos humanos, ou uma sequência da região da linha germinal. Assim, um anticorpo humanizado é um anticorpo que possui pelo menos três, quatro, cinco ou todas as CDR total ou substancialmente de um anticorpo dador e sequências framework da região variável e das regiões constantes, se presentes, no todo ou substancialmente a partir de sequências de anticorpos humanos.
Da mesma forma uma cadeia pesada humanizada tem, pelo menos, uma, duas e, normalmente, todas as três CDR inteiramente, ou substancialmente, de uma cadeia pesada do anticorpo dador, e uma sequência framework da região variável de cadeia pesada e região constante de cadeia pesada, se presente, substancialmente a partir do framework da região variável de cadeia pesada humana e sequências da região constante.
Da mesma forma uma cadeia leve humanizada tem, pelo menos, uma, duas e, normalmente, todas as três CDRs inteiramente, ou substancialmente, de uma cadeia leve do anticorpo dador, e uma sequência framework da região de cadeia leve e região constante da cadeia leve, se presente, substancialmente a partir do framework da região variável de cadeia leve humana e das sequências da região constante.
Além de nanocorpos e dAbs, um anticorpo humanizado compreende uma cadeia pesada humanizada e uma cadeia leve humanizada.
Una CDR em um anticorpo humanizado é substancialmente de uma CDR correspondente num anticorpo não humano quando, pelo menos, 85%, 90%, 95% ou 100% dos resíduos correspondentes (conforme definido por qualquer definição convencional, mas preferencialmente definida por Kabat) são idênticos entre as respectivas CDRs.
As sequências framework de região variável de uma cadeia de anticorpo ou a região constante de uma cadeia de anticorpo são substancialmente de uma sequência framework de região variável humana ou região constante humana, respectivamente, quando, pelo menos, 85%, 90%, 95% ou 100% de resíduos definidos por qualquer definição convencional, mas de preferência definidos por Kabat são idênticos.
Para ser classificado como humanizado de acordo com a definição de anticorpos humanizados de nomes não proprietários internacionais (INN) da Organização Internacional de Saúde (OMS) de 2014, um anticorpo deve ter pelo menos 85% de identidade nas regiões variáveis maduras para sequências de anticorpos da linhagem germinativa humana (isto é, antes da hipermutação somática). Os anticorpos mistos são anticorpos para os quais uma cadeia de anticorpo (por exemplo, cadeia pesada) atende ao limite, mas a outra cadeia (por exemplo, cadeia leve) não atende ao limite.
Um anticorpo é classificado como quimérico se nenhuma das cadeias atender ao limite, mesmo que as regiões framework variáveis para ambas as cadeias tenham sido substancialmente humanas com algumas mutações reversas murinas.
Ver, Jones et al. (2016) Os
INNs e saídas de nomes não-proprietários de anticorpos, mAbs8: 1, 1-9, DOI:
10.1080/19420862.2015.1114320. Veja também “WHO-INN: International nonproprietary names (INN) for biological and biotechnological substances (a review)” (Internet) 2014. Disponível em: http:/AMWwww. who.int/medicines/services/inn/BioRev2014 pdf), incorporado neste documento por referência. Para evitar dúvidas, o termo “humanizado” como usado neste documento não se destina a ser limitado à definição de INN da OMS de 2014 de anticorpos humanizados. Alguns dos anticorpos humanizados fornecidos neste documento têm pelo menos 85% de identidade de sequência com as sequências da linhagem germinativa humana em uma ou ambas as regiões variáveis maduras e alguns dos anticorpos humanizados fornecidos neste documento têm menos de 85% de identidade de sequência com as sequências da linhagem germinativa humana em uma ou ambas as variáveis maduras regiões. Algumas das regiões variáveis da cadeia pesada maduras dos anticorpos humanizados fornecidos neste documento têm desde cerca de 60% a 100% de sequência de sequência até sequências da linhagem germinativa humana, tais como, por exemplo, na faixa de cerca de 60% a 69%, 70% a 79%, 80% a 84%, ou 85% a 89%. Algumas das regiões variáveis maduras das cadeias pesadas, as cadeias pesadas ficam abaixo da definição de INN da OMS de 2014 e têm, por exemplo, cerca de 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, ou 82%, 83% ou 84% de identidade sequencial com sequências da linhagem germinativa humana, enquanto outras regiões variáveis maduras de cadeia pesada atendem à definição de INN da OMS de 2014 e têm cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou mais de identidade de sequência com sequências da linhagem germinativa humana. Algumas das regiões variáveis maduras da cadeia leve dos anticorpos humanizados fornecidos neste documento têm cerca de 60% a 100% de identidade de sequência com sequências da linhagem germinativa humana, tais como, por exemplo, na gama de cerca de 80% a 84% ou 85% a 89%. Algumas regiões variáveis da cadeia leve maduras ficam abaixo da definição de INN da OMS de 2014e têm, por exemplo, cerca de 81%, 82%, 83% ou 84% de identidade sequencial com sequências da linhagem germinativa humana, enquanto outras regiões variáveis da cadeia leve maduras atendem à definição de INN da OMS de 2014 e têm cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou mais de identidade de sequência com sequências da linhagem germinativa humana. Alguns anticorpos humanizados fornecidos neste documento que são "quiméricos" na definição de INN da OMS de 2014têm regiões variáveis de cadeia pesada maduras com menos de 85% de identidade com sequências de linhas germinativas humanas emparelhadas com regiões variáveis da cadeia leve maduras com menos de 85% de identidade com a linhagem germinativa humana sequências. Alguns anticorpos humanizados fornecidos neste documento são "misturados" sob a definição de INN da OMS de 2014, por exemplo, tendo uma região variável madura de cadeia pesada com pelo menos 85% de identidade de sequência com sequências germinativas humanas pareadas com uma região variável de cadeia leve madura com menos de 85% de identidade de sequência ao germe humano sequências de linha, ou vice- versa. Alguns anticorpos humanizados fornecidos neste documento estão de acordo com a definição de INN da OMS de 2014 de "humanizado" e tem uma região variável de cadeia pesada madura com pelo menos 85% de identidade de sequência com as sequências germinativas pareadas com uma região variável de cadeia leve madura tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com as sequências germinativas humanas. Anticorpos 18C5 exemplares que atendem à definição de INN da OMS de 2014 "humanizado" incluem anticorpos com uma região variável de cadeia pesada madura com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 ou SEQ ID NO: 86 emparelhada com uma região variável de cadeia leve madura com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 ou SEQ ID NO: 92.
[0257] Embora os anticorpos humanizados muitas vezes incorporem todas as seis CDRs (preferencialmente tal como definido por Kabat) a partir de um anticorpo de camundongo, eles também pode ser feitos com menos do que todas as CDRs (por exemplo, pelo menos 3, 4, ou 5 CDRs) de um anticorpo de camundongo (por exemplo, Pascalis et a/., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., J. of Mol. Biol., 320: 415-428, 2002; Iwahashi et a/., Mol. Immunol. 36:1079- 1091, 1999; Tamura et al, J. Immunol., 164:1432-1441, 2000).
[0258] Em alguns anticorpos apenas uma parte das CDR, a saber, o subconjunto de resíduos de CDR necessários para a ligação, denominados os SDRs, é necessária para manter a ligação de um anticorpo humanizado. Resíduos de CDR não entram em contato com o antígeno e que não estão nas SDRs podem ser identificados com base em estudos anteriores (por exemplo, os resíduos H60- H65 em CDR H2 frequentemente não são necessários), a partir de regiões de CDR de Kabat que se encontram fora das alças hipervariáveis de Chothia (Chothia, J. Mol. Biol. 196: 901, 1987), por modelação molecular e/ou empiricamente, ou como descrito em Gonzales et al, Mol. Biol. Immunol. 41:863, 2004. Em tais anticorpos humanizados em posições nas quais um ou mais resíduos de CDR dadores estão ausentes ou em que todo um doador de CDR é omitido, o aminoácido que ocupa a posição pode ser um aminoácido que ocupa a posição correspondente (por numeração de Kabat) na sequência de anticorpo aceitador. O número de tais substituições de aceitador para aminoácidos doadores nas CDRs para incluir reflete um equilíbrio de considerações concorrentes. Tais substituições são potencialmente vantajosas na diminuição do número de aminoácidos do camundongo num anticorpo humanizado e, consequentemente, diminuição na imunogenicidade potencial. No entanto, as substituições também podem causar mudanças de afinidade e reduções significativas na afinidade são preferencialmente evitadas. Posições de substituição dentro de CDRs e aminoácidos a substituir também podem ser selecionadas empiricamente.
[0259] As sequências de anticorpo humano aceitador podem ser, opcionalmente, selecionadas de entre as muitas sequências de anticorpos humanos conhecidas por fornecer um elevado grau de identidade de sequência (por exemplo, 65-85% de identidade) entre frameworks de região variável de sequência aceitadora humana e as correspondentes frameworks da região variável de um doador da cadeia de anticorpo.
[0260] Um exemplo de uma sequência aceitadora para a cadeia pesada 18C5 é o VH humanizado Crenezumab Fab (CreneFab), com código de acesso PDB 5VZY (SEQ ID NO: 83). Um exemplo de uma sequência aceitadora para a cadeia leve 18C5 é o Crenezumab Fab (CreneFab) humanizado VL, com código de acesso PDB 5VZY (SEQ ID NO: 89). Outro exemplo de uma sequência aceitadora para a cadeia leve 18C5 é o gene da linhagem germinativa humana IGKV2-30*02 (SEQ ID NO:90).
[0261] Se mais de uma sequência de anticorpo aceitador humano for selecionada para uma cadeia (leve ou pesada), um composto ou híbrido desses aceitadores poderá ser usado para essa cadeia, e os aminoácidos utilizados diferentes poderão ser retirados de qualquer uma das sequências de anticorpos aceitadores humanos utilizados.
[0262] Certos aminoácidos dos resíduos do quadro de região variável humana são selecionados para substituição com base em sua possível influência na conformação e/ou ligação de CDR a antígeno. Investigação de tais possíveis influências é por modelação, análise das características dos aminoácidos em determinadas localizações ou observação empírica dos efeitos de substituição ou mutagênese de determinados aminoácidos.
[0263] Por exemplo, quando um aminoácido difere entre um resíduo framework de região variável de murino e um resíduo framework de região humana variável selecionado, o aminoácido de framework humana pode ser substituído pelo aminoácido framework equivalente do anticorpo de camundongo quando for razoavelmente esperado que o aminoácido: (1) ligue-se de forma não covalente ao antígeno diretamente; (2) seja adjacente a uma região CDR ou dentro de um CDR como definido por Chothia, mas não Kabat; (3) interaja de outra forma com uma região CDR (por exemplo, está dentro de cerca de 6 À de uma região CDR), (por exemplo, identificado por modelagem da cadeia leve ou pesada na estrutura resolvida de uma cadeia de imunoglobulina conhecida homóloga); ou (4) seja um resíduo que participa da interface VL-VH.
[0264] A invenção fornece formas humanizadas do anticorpo 18C5 de murino, incluindo 2 regiões variáveis maduras de cadeia pesada humanizada exemplificadas (hu18C5-VH v1i (SEQ ID NO: 85) e hu18C5-VH v2 (SEQ ID NO: 86)) e 2 regiões variáveis maduras da cadeia leve humanizada exemplificadas (hu18C5-VL v1 (SEQ ID NO:91) e hu18C5-VL v2(SEQ ID NO:92)).
[0265] Em uma modalidade, as sequências humanizadas são geradas usando um protocolo de PCR de dois estágios que permite a introdução de múltiplas mutações, deleções e inserções usando mutagênese dirigida ao sítio de QuikChange [Wang, W. e Malcolm, BA (1999) BioTechniques 26: 680-682.)] .
[0266] Resíduos da framework das classes (1) até (3) como definido por Queen, US 5,530,101, são algumas vezes alternadamente referidos como resíduos canônicos e de vernier. Os resíduos do framework que ajudam a definir a conformação de uma alça CDR são algumas vezes chamados de resíduos canônicos (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Thornton & Martin, J. Mol. Biol. 263:800- 815 (1996)). Os resíduos do framework que suportam conformações de alça de ligação ao antígeno e desempenham um papel no ajuste fino do ajuste de um anticorpo ao antígeno são algumas vezes chamados de resíduos vernier (Foote & Winter, J. Mol. Biol 224:487-499 (1992)).
[0267] Outros resíduos de framework que são candidatos à substituição são os resíduos que criam um sítio potencial de glicosilação. Ainda outros candidatos para substituição são aminoácidos framework humanos aceitadores que são incomuns para uma imunoglobulina humana nessa posição. Estes aminoácidos podem ser substituídos por aminoácidos da posição equivalente do anticorpo de camundongo doador ou a partir das posições equivalentes de imunoglobulinas humanas mais típicas.
[0268] Os resíduos framework que são candidatos à substituição são resíduos de ácido glutâmico N-terminal (E) que podem ser substituídos por glutamina (Q).
[0269] Anticorpos humanizados exemplares são formas humanizadas do camundongo 18C5, Hu18C5 designado.
[0270] O anticorpo de camundongo 18C5 compreende regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada maduras tendo sequências de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO:81 e SEQ ID NO:87, respectivamente. A invenção fornece 2 regiões variáveis de cadeia pesada madura humanizada exemplificadas: hu18C5-VH vi e hu18C5-VH v2. A invenção fornece ainda 2 regiões variáveis de cadeia leve madura humana exemplificadas: hu18C5-VL v1i e hu18C5-VL v2. Os alinhamentos do 18C5 murino e vários anticorpos humanizados são mostrados para as regiões variáveis da cadeia leve (Tabela 8 e Figura 12) e regiões variáveis da cadeia pesada (Tabela 9 e Figura 11).
[0271] Por razões como possível influência na conformação da CDR e/ou ligação ao antígeno, mediando a interação entre as cadeias pesada e leve, a interação com a região constante, sendo um sítio para modificações pós- traducionais desejadas ou indesejadas, sendo um resíduo incomum para sua posição em uma sequência de região variável humana e, portanto, potencialmente imunogênica, obtendo potencial de agregação e outras razões, as 8 posições de framework de região variável a seguir de 18C5 foram consideradas como candidatas a substituições nas 2 regiões variáveis humanas maduras da cadeia leve exemplificadas e nos 2 exemplificados regiões variáveis de cadeia pesada madura humana, conforme especificado no Exemplo 7: L2 (I2V), L45 (Q45R), H37 (V37A), H45 (L45Q), H47 (L47W), H48 (V481), H49 (A49G) e H94 (S94R).
[0272] Neste documento, como em qualquer outro, o resíduo mencionado em primeiro lugar é o resíduo de um anticorpo humanizado formado por enxertia de CDR de Kabat ou uma CDR de Composto de Chothia-Kabat no caso de CDR- H1 em uma framework aceitadora humana, e o segundo resíduo mencionado é um resíduo considerado para substituir este resíduo. Portanto, dentro das frameworks de regiões variáveis, o primeiro resíduo mencionado é humano, e dentro das CDRs, o primeiro resíduo mencionado é de camundongo.
[0273] Anticorpos exemplificados incluem quaisquer permutações ou combinações das regiões variáveis da cadeia pesada e leve maduras exemplificadas “de 18C5, por exemplo, hu18C5VH vi/hu18Cc5VL vi, hu18C5VH vi/hu18C5VL v2, hu18C5VH v2/hu18C5VL v1, ou hu18C5VH v2/hu18C5VL v2.
[0274] A invenção fornece variantes do anticorpo humanizado 18C5 no qual a região variável de cadeia pesada madura humanizada mostra pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade a qualquer um dos hu18C5-VH vi e hu18C5-VH v2. (SEQ ID NOs: 85-86) e a região variável de cadeia leve madura humanizada mostra pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para qualquer um dos hu18C5-VL vi e hu18C5- VL v2, (SEQ ID NOs: 91-92). Em alguns desses anticorpos, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todos os 8, das mutações reversas ou outras mutações encontradas nas SEQ ID NO: 86 e SEQ ID NO: 92 são retidas.
[0275] Em alguns anticorpos 18C5 humanizados, pelo menos uma das seguintes posições é ocupada pelo aminoácido especificado: H37 é ocupado por V. ou A, H45 é ocupado por L ou Q, H47 é ocupado por L ou W, H48 é ocupado por L ou |, H49 é ocupado por A ou G e H94 é ocupado por S ou R.
[0276] Em alguns anticorpos 18C5 humanizados, as posições H37, H45, H47, H48, H49 e H94 na região VH são ocupadas por A, Q, W, | Ge R, respectivamente, como em hu18C5-VH v2.
[0277] Em alguns anticorpos 18C5 humanizados, pelo menos uma das seguintes posições é ocupada pelo aminoácido especificado: L2 é ocupado por | ou V e L45 é ocupado por Q ou R.
[0278] Em alguns anticorpos 18C5 humanizados, as posições L2 e L45 na região VL são ocupadas por V e R, respectivamente, como em hu18C5-VL v2.
[0279] Em alguns anticorpos 18C5 humanizados, a cadeia pesada variável tem= 85% de identidade com a sequência humana. Em alguns anticorpos 18C5 humanizados, a cadeia leve variável tem 2 85% de identidade com a sequência humana. Em alguns anticorpos 18C5 humanizados, cada cadeia pesada variável e cadeia leve variável tem 2 85% de identidade de sequência com a sequência germinativa.
[0280] As regiões CDR de tais anticorpos humanizados podem ser idênticas ou substancialmente idênticas às regiões CDR do anticorpo doador de camundongo 9D5 ou 18C5. As regiõês CDR podem ser definidas por qualquer definição convencional, como as da Tabela 1, mas são preferencialmente como definidas pelo composto Kabat ou Kabat + Chothia.
[0281] As posições de framework das regiões variáveis estão de acordo com a numeração de Kabat, salvo indicação em contrário. Outras variantes tais tipicamente diferem das sequências das cadeias pesadas e leves Hu18C5 exemplificadas por um pequeno número (por exemplo, tipicamente não superior a 1, 2,3, 5, 10 ou 15) de substituições, deleções ou inserções.
[0282] Uma possibilidade de variação adicional em variantes humanizadas de 9D5 ou 18C5 é de mutações reversas adicionais nas framework da região variável. Muitos dos resíduos de framework que não estão em contato com as CDR no mAb humanizado podem acomodar substituições de aminoácidos das posições correspondentes do mAb de camundongo doador ou outros anticorpos de camundongo ou humanos, e mesmo muitos resíduos de contato CDR potenciais também são suscetíveis de substituição. Mesmo os aminoácidos dentro das CDRs podem ser alterados, por exemplo, com resíduos encontrados na posição correspondente da sequência aceitadora humana usada para fornecer framework de regiões variáveis. Além disso, podem ser utilizadas sequências aceitadoras humanas alternativas, por exemplo, para a cadeia pesada e/ou leve. Se diferentes sequências aceitadoras forem usadas, uma ou mais das mutações reversas recomendadas acima podem não ser realizadas porque os resíduos correspondentes do doador e do aceitador já são os mesmos sem mutações reversas.
[0283] Algumas substituições ou mutações reversas nas variantes HU9D5 ou Hu18C5 (conservadoras ou não) não têm efeito substancial na afinidade ou potência de ligação do mAb humanizado, ou seja, sua capacidade de se ligar à TTR monomérica (por exemplo, a potência em alguns ou todos os ensaios descritos nos presentes exemplos da variante de anticorpo 9D5 ou 18C5 humanizado são essencialmente os mesmos, isto é, dentro de um erro experimental, como o de 9D5 ou 18C5 de murino). Exemplos de variantes de 9D5 humanizadas são descritos em WO 2016/120810.
D. Anticorpos Quiméricos e Revestidos
[0284] A invenção proporciona ainda formas quiméricas e folheadas de anticorpos não humanos, particularmente os anticorpos 9D5 ou 18C5 dos exemplos.
[0285] Um anticorpo quimérico é um anticorpo em que as regiões variáveis de cadeia leve e pesada maduras de um anticorpo não-humano (por exemplo, um camundongo), são combinadas com as regiões constantes de cadeia leve e pesada humanas. Tais anticorpos substancialmente ou completamente mantém a especificidade de ligação do anticorpo de camundongo e possuem cerca de dois terços de sequência humana. Em uma modalidade, um anticorpo quimérico 18C5 tem uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada madura de SEQ ID NO: 81, uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve madura da SEQ ID NO: 87, uma sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada humana da SEQ ID NO: 17, e uma sequência de aminoácidos da região constante de cadeia leve humana da SEQ ID NO: 19. Um anticorpo quimérico 9D5 exemplar é descrito em WO 2016/120810,
[0286] Um anticorpo folheado é um tipo de anticorpo humanizado que retém algumas e, normalmente, todas as CDR e alguns dos resíduos framework de região variável não humana de um anticorpo não-humano, mas substitui outros resíduos framework de região variável que podem contribuir para epítopos de célula B- ou T, por exemplo, os resíduos expostos (Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991) com resíduos das posições correspondentes de uma sequência de anticorpo humano.
O resultado é um anticorpo em que as CDRs são totalmente ou substancialmente de um anticorpo não humano e as frameworks de região variável do anticorpo não humano são feitas mais humanas pelas substituições. As formas folheadas do anticorpo 9D5 ou 18C5 estão incluídas na invenção.
E. Anticorpos humanos
[0287] Anticorpos humanos contra TTR monomérica ou um fragmento do mesmo (por exemplo, resíduos de aminoácidos 89-97 (SEQ ID NO: 45) de TTR ou resíduos de aminoácidos 101-109 (SEQ ID NO: 30) de TTR) são fornecidos por uma variedade de técnicas descritas abaixo. Alguns anticorpos humanos são selecionados por experimentos de ligação competitiva, pelo método de Winter de exibição em fagos, acima ou de outro modo, tendo a mesma especificidade de epítopo que um anticorpo de camundongo em particular, tal como um dos anticorpos monocionais de camundongo descritos nos exemplos. Os anticorpos humanos também podem ser rastreados para especificidade do epítopo particular usando apenas um fragmento de TTR, tal como uma variante de TTR contendo apenas resíduos de aminoácidos 89-97 de TTR ou resíduos de aminoácido 101- 109 de TTR, como o antígeno alvo e/ou criando anticorpos contra uma coleção de variantes TTR, tais como variantes TTR contendo várias mutações nos resíduos de aminoácidos 89-97 de TTR ou resíduos de aminoácido 101-109 de TTR.
[0288] Os métodos para a produção de anticorpos humanos incluem o método de trioma de Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, Patente US Nº 4,634,664; e Engleman et a/., Patente US Nº 4,634,666, uso de camundongos transgênicos incluindo genes de imunoglobulina humana (veja, por exemplo, Lonberg et a/., WO93/12227 (1993); US 5,877,397; US 5,874,299; US 5,814,318; US 5,789,650; US 5,770,429; US 5,661,016; US 5,633,425; US 5,625,126; US 5,569,825; US 5,545,806; Neuberger, Nat. Biotechnol. 14:826 (1996); e Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)) e métodos de exibição de fagos (ver, por exemplo, Dower et al.,, WO 91/17271; McCafferty et al.,, WO 92/01047; US 5,877,218; US 5,871,907; US 5,858,657; US 5,837,242; US 5,733,743; e US 5,565,332).
F. Seleção da Região Constante
[0289] As regiões variáveis das cadeias pesada e leve de anticorpos quiméricos, folheados ou humanizados podem ser ligadas a pelo menos uma porção de uma região constante humana. A escolha de uma região constante depende, em parte, da citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos, fagocitose celular dependente de anticorpo e/ou citotoxicidade dependente de complemento serem desejadas. Por exemplo, os isotipos humanos IgG1 e IgG3 têm citotoxicidade dependente de complemento e os isotipos humanos IgG2 e IgG4 não. IgG1 e IgG3 humanos também induzem funções efetoras mediadas por células mais fortes do que IgG2 e IgG4 humanos. As regiões constantes de cadeia leve podem ser lambda ou kappa. As convenções de numeração para regiões constantes incluem a numeração da UE (Edelman, GM et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969)), numeração de Kabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, numeração exclusiva de IMGT (Lefranc M.-P. et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and lg superfamily C-like domains, Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005), e numeração IMGT de éxons (Lefranc, supra).
[0290] Um ou vários aminoácidos no terminal amino ou carboxi da cadeia leve e/ou cadeia pesada, tal como a lisina do C-terminal da cadeia pesada, podem estar faltando ou derivatizados em uma proporção ou na totalidade das moléculas. As substituições podem ser feitas nas regiões constantes para reduzir ou aumentar a função efetora, tais como citotoxicidade mediada pelo complemento ou ADCC (ver, por exemplo, Winter et al/., Patente US Nº 5,624,821; Tso et al., Patente US Nº 5,834,597; e Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), ou para prolongar a meia-vida em seres humanos (ver, por exemplo, Hinton et al., J. Biol. Chem. 279: 6213, 2004). As substituições exemplificativas incluem uma Gln na posição 250 e/ou uma Leu na posição 428 (numeração EU é usada neste parágrafo para a região constante) para aumentar a meia-vida de um anticorpo. A substituição em qualquer uma ou em todas as posições 234, 235, 236 e/ou 237 reduz a afinidade para os receptores Fcy, particularmente o receptor FcyRI (ver, por exemplo, US 6,624,821). Uma substituição de alanina nas posições 234, 235, e 237 da I1gG1 humana pode ser usada para reduzir as funções efetoras. Alguns anticorpos têm substituição de alanina nas posições 234, 235 e 237 da IgG1 humana para reduzir as funções efetoras. Opcionalmente, as posições 234, 236 e/ou 237 em I|gG2 humana são substituídas com alanina e a posição 235 com glutamina (ver, por exemplo, US 5,624,821). Em alguns anticorpos, uma mutação numa ou mais das posições 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329 e 331 por numeração EU de IgG1 humana é usada. Em alguns anticorpos, uma mutação numa ou mais das posições 318, 320, e 322 por numeração EU de IgG1 humana é usada. Em alguns anticorpos, as posições 234 e/ou 235 são substituídas com alanina e/ou a posição 329 é substituída por glicina. Em alguns anticorpos, as posições 234 e 235 são substituídas com alanina, tal como em SEQ ID NO: 23. Em alguns anticorpos, o isotipo é IgG2 ou IgG4 humanas.
[0291] Uma região constante de kappa de cadeia leve humana exemplar tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. A arginina de N-terminal da SEQ ID NO: 24 pode ser omitida, caso em que a região constante de kappa de cadeia leve tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25. Uma região constante de cadeia pesada de IgG1 humana exemplar possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 (com ou sem a lisina do C-terminal). Anticorpos podem ser expressos como tetrâmeros que contém duas cadeias leves e duas pesadas, como distintas cadeias pesadas, leves, como Fab, Fab', F(ab') 2 e Fv, ou como anticorpos de cadeia única, em que domínios variáveis de cadeia leve e pesada maduros são ligados através de um espaçador.
[0292] Regiões constantes humanas mostram uma variação alotípica e uma variação isoalotípica entre indivíduos diferentes, isto é, as regiões constantes podem diferir de indivíduo para indivíduo em uma ou mais posições polimórficas. Isoalotipos diferem dos alotipos em que os soros que reconhecem um isoalotipo se ligam a uma região não polimórfica de um ou mais outros isotipos. Assim, por exemplo, uma outra região constante de cadeia pesada é alotipo G1m3 de IgG1 e tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22. Outra região constante da cadeia pesada do alotipo G1m3 de IgG1 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23 (com ou sem a lisina do C-terminal). A referência a uma região constante humana inclui uma região constante com qualquer alótipo natural ou qualquer permutação de resíduos que ocupam posições em alotipos naturais.
G. Expressão de anticorpos recombinantes
[0293] São conhecidos vários métodos para produzir anticorpos quiméricos e humanizados utilizando uma linhagem celular que expressa anticorpo (por exemplo, hibridoma). Por exemplo, as regiões variáveis de imunoglobulina de anticorpos podem ser clonadas e sequenciadas utilizando métodos bem conhecidos. Em um método, a região VH variável da cadeia pesada é clonada por RT-PCR usando mRNA preparado a partir de células de hibridoma. Os primers de consenso são usados para o peptídeo líder da região VH abrangendo o códon de iniciação da tradução como o primer 5' e um primer 3' específico das regiões constantes de g2b. Os exemplos de primers são descritos na publicação de patente US 2005/0009150 de Schenk et a/ (a seguir “Schenk”). As sequências de múltiplos clones independentemente derivados podem ser comparadas para garantir que não sejam introduzidas alterações durante a amplificação. A sequência da região VH também pode ser determinada ou confirmada pelo sequenciamento de um fragmento VH obtido por metodologia 5' RACE RT-PCR e o primer específico 3' de g2b.
[0294] A região VL variável da cadeia leve pode ser clonada de maneira análoga. Em uma abordagem, um conjunto de primers de consenso é projetado para amplificação de regiões VL usando um primer 5' projetado para hibridar com a região VL abrangendo o códon de iniciação da tradução e um primer 3' específico para a região CKk a jusante da região de junção V-J. Em uma segunda abordagem, a metodologia "RACE RT-PCR é usada para clonar um cDNA codificador de VL. Os exemplos de primers são descritos em Schenk, supra. As sequências clonadas são então combinadas com sequências que codificam regiões constantes humanas (ou outras espécies não humanas). As sequências exemplificativas que codificam regiões constantes humanas incluem SEQ ID NO: 32, que codifica uma região constante de I9gG1 humana e SEQ ID NOs: 33 e 34, que codificam uma região constante de cadeia leve kappa humana.
[0295] Numa abordagem, as regiões variáveis da cadeia pesada e leve são reprojetadas para codificar as sequências de doadores de emenda a jusante das respectivas junções VDJ ou VJ e são clonadas em um vetor de expressão de mamífero, como pCMV-hy1 para a cadeia pesada e pCMV-Mc1 para a cadeia leve. Estes vetores codificam humanos y1 e Ck como fragmentos exônicos a jusante de cassete da região variável inserida. Seguindo a verificação da sequência, os vetores de expressão da cadeia pesada e da cadeia leve podem ser cotransfectados em células CHO para produzir anticorpos quiméricos. O meio condicionado é coletado 48 horas após a transfecção e ensaiado por análise
Western Blot para produção de anticorpos ou ELISA para ligação ao antígeno. Os anticorpos quiméricos são humanizados como descrito acima.
[0296] Os anticorpos quiméricos, folheados, humanizados e humanos são tipicamente produzidos por expressão recombinante. Os construtos de polinucleotídeos recombinantes tipicamente incluem uma sequência de controle de expressão ligada operacionalmente às sequências de codificação de cadeias de anticorpo, incluindo elementos de controle de expressão associados de forma natural ou heteróloga, tais como um promotor. As sequências de controle de expressão podem ser sistemas promotores em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas. Uma vez que o vetor for incorporado no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido em condições adequadas para expressão de um elevado nível de sequências de nucleotídeos e da coleta e purificação dos anticorpos de reação cruzada.
[0297] Estes vetores de expressão geralmente são replicáveis em organismos hospedeiros como epissomas ou como parte integral do DNA cromossômico hospedeiro. Normalmente, os vetores de expressão contêm marcadores de seleção, por exemplo, de resistência à ampicilina ou resistência à higromicina, para permitir a detecção das células transformadas com as sequências de DNA desejadas.
[0298] E. coli é um hospedeiro procariótico útil para a expressão de anticorpos, particularmente os fragmentos de anticorpo. Os micróbios, tais como levedura, também são úteis para expressão. Saccharomyces é um hospedeiro com vetores adequados tendo sequências de controle de expressão, uma origem de replicação, sequências de terminação e semelhantes, conforme desejado. Os promotores típicos incluem 3-fosfoglicerato quinase e outras enzimas glicolíticas. Os promotores de levedura induzíveis incluem, dentre outros, promotores de álcool desidrogenase, isocitocromo C e as enzimas responsáveis pela utilização da maltose e da galactose.
[0299] As células de mamíferos podem ser utilizadas para expressar os segmentos de nucleotídeos que codificam as imunoglobulinas ou seus fragmentos. Vide Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Uma variedade de linhagens celulares hospedeiras adequadas capazes de secretar proteínas heterólogas intactas foram desenvolvidas e incluem as linhagens de células CHO, várias linhagens celulares COS, células HeLa, células HEK293, células L e mielomas não produtores de anticorpos, incluindo SP2/0 e NSO0. As células podem ser não humanas. Vetores de expressão para essas células podem incluir sequências de controle de expressão, tais como uma origem de replicação, um promotor, um potencializador (Queen et al., Imnmunol. Rev. Rev. 89:49 (1986)) e locais de informação de processamento necessários, como locais de ligação de ribossomos, locais de divisão de RNA, locais de poliadenilação e sequências de terminação transcricional. As sequências de controle de expressão adequadas são os promotores derivados de genes endógenos, citomegalovírus, SV40, adenovírus, vírus do papiloma bovino e semelhantes. Ver Co et al., J. Immunol. 148:1149(1992).
[0300] Alternativamente, as sequências de codificação do anticorpo podem ser incorporadas em transgenes para introdução no genoma de um animal transgênico e subsequente expressão no leite do animal transgênico (ver, por exemplo, Pat. US Nº 5,741,957; Pat US Nº 5,304,489; e Pat. US Nº 5,849,992). Os transgenes adequados incluem sequências de codificação para cadeias leves e ou pesadas ligadas operativamente com um promotor e potenciador de um gene específico de glândula mamária, tal como caseína ou beta lactoglobulina.
[0301] Os vetores contendo os segmentos de DNA de interesse podem ser transferidos para a célula hospedeira por métodos dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção de cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, enquanto que o tratamento com fosfato de cálcio, eletroporação, lipofecção, biolítica ou transfecção baseada em vírus pode ser usado para outros hospedeiros celulares. Outros métodos utilizados para transformar células de mamíferos incluem o uso de polibreno, fusão de protoplastos, lipossomas, eletroporação e microinjeção. Para a produção de animais transgênicos, os transgenes podem ser microinjetados em oócitos fertilizados ou podem ser incorporados no genoma de células-tronco embrionárias e os núcleos dessas células são transferidos para oócitos enucleados.
[0302] Uma vez que vetor(es) e codifica(m) cadeias pesadas e leves de anticorpo sejam introduzidos em cultura de células, agrupamentos de células podem ser triados para uma produtividade de crescimento e qualidade do produto em meio isento de soro. Agrupamentos de células produtoras superiores podem então ser submetidos a uma clonagem de célula simples baseada em FACS para gerar linhagens monoclonais. Podem ser usadas produtividades específicas superiores a 50 pg ou 100 pg por célula por dia, que correspondem a títulos de produtos de maior do que 7,5 g/L de cultura. Os anticorpos produzidos por clones de células individuais também podem ser testados quanto às propriedades de turvação, de filtragem, PAGE, IEF, varredura UV, HP-SEC, o mapeamento de carboidrato-oligossacarídeo, espectrometria de massa e ensaio de Bining, como ELISA ou Biacore. Um clone selecionado pode então ser depositado em vários frascos e armazenado em congelamento para uso posterior.
[0303] Uma vez expressos, os anticorpos podem ser purificados de acordo com os procedimentos padrão da técnica, incluindo a captura da proteína A, purificação por HPLC, cromatografia em coluna, eletroforese em gel e semelhantes (Ver, em geral, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).
[0304] Podem ser utilizadas metodologias para a produção comercial de anticorpos, incluindo otimização de códons, seleção de promotores, seleção de elementos de transcrição, seleção de terminadores, clonagem de células isoladas isentas de soro, banco celular, uso de marcadores de seleção para amplificação do número de cópias, terminador CHO, ou melhoria dos títulos de proteínas (Ver, por exemplo, US 5,/86,464; US 6,114,148; US 6,063,598, US 7,569,339; WO02004/050884; WO02008/012142; WO02008/012142; WO02005/019442; WO02008/107388; WO02009/027471; e US 5,888,809).
H. Ensaios de Triagem de Anticorpos
[0305] Os anticorpos podem ser sujeitos a várias telas, incluindo ensaios de ligação, telas funcionais, telas em modelos animais de doenças associadas a depósitos de TTR e ensaios clínicos. Ensaio de ensaios de ligação para ligação específica e, opcionalmente, especificidade de afinidade e epítopo a TTR monomérica ou um fragmento deste. Por exemplo, os ensaios de ligação podem triar anticorpos que se ligam aos resíduos de aminoácidos 89-97 (SEQ ID NO: 45) ou resíduos de aminoácidos 101-109 (SEQ ID NO: 30) de TTR, que são epítopos enterrados no tetrâmero de TTR nativa e exposta nas formas monoméricas, dobradas, agregadas ou fibrilas de TTR. Os anticorpos também podem ser rastreados quanto à capacidade de se ligar a conformações pré-fibrilares e não nativas das fibrilas amiloides de TTR e TTR, mas não as conformações de TTR nativas. Por exemplo, os anticorpos podem ser rastreados quanto à capacidade de se ligar a formas monoméricas de TTR criadas por dissociação ou desagregação de TTR tetrarmônica nativa e podem ser contra-triadas contra TTR tetrarmônica nativa, conforme descrito nos exemplos ou de outra forma. Da mesma forma, os anticorpos também podem ser triados quanto à sua imunorreatividade em tecido de amiloidose mediada pela TTR, mas não em tecido saudável. Essas telas são, por vezes, realizadas em competição com um anticorpo exemplar, como um anticorpo com as regiões variáveis de 9D5 ou 18C5 ou de isotipo kappa de I1gG1. Opcionalmente, o alvo de anticorpo ou TTR é imobilizado nesse ensaio.
[0306] Os ensaios funcionais podem ser realizados em modelos celulares incluindo células que expressam naturalmente TTR ou transfectadas com DNA que codifica TTR ou um fragmento deste. As células adequadas incluem células derivadas de tecido cardíaco ou outros tecidos afetados pela amiloidogênese de TTR. As células podem ser triadas quanto aos níveis reduzidos de formas monoméricas, dobradas, agregadas ou fibrilas de TTR (por exemplo, por Western blotting ou imunoprecipitação de extratos ou sobrenadantes de células) ou toxicidade reduzida atribuível a formas monoméricas, dobradas, agregadas ou fibrilas de TTR. Por exemplo, os anticorpos podem testar a capacidade de inibir ou reduzir a agregação de TTR, inibir ou reduzir a formação de fibrila de TTR, reduzir os depósitos de TTR, TTR agregada clara ou estabilizar conformações não tóxicas de TTR.
[0307] Outros ensaios funcionais podem ser realizados em solução, tais como testar se um anticorpo é capaz de interromper ou reduzir a formação de fibrila de TTR quando TTR monomérica ou TTR intermediária mal dobrada em solução são postas em contato com o anticorpo. A extensão da formação de fibrila pode ser avaliada por medições de turvação, por exemplo, a 400 nm num espectrômetro UV- visível equipado com uma unidade de controle de temperatura. Tioflavina-T também pode ser usada para avaliar a extensão da formação de fibrilas amiloides. Por exemplo, um excesso molar de cinco vezes de Tioflavina-T pode ser adicionado às amostras de TTR e deixado à temperatura ambiente durante 30 minutos antes das medidas serem tomadas. A fluorescência de tioflavina-T pode ser monitorada usando um espectrofluorímetro. Vide US 2014/0056904.
[0308] As triagens de modelos de animais testam a capacidade do anticorpo para tratar sinais terapêuticos ou profiláticos ou sintomas em um modelo animal simulando uma doença humana associada à acumulação de depósitos de TTR ou TTR. Tais doenças incluem tipos de amiloidose por TTR, como a amiloidose por ATTR de tipo selvagem (também chamada amiloidose sistêmica senil SSA), amiloidose cardíaca senil! (SCA), polineuropatia amiloide familiar (FAP), miocardiopatia amiloide familiar (FAC) e amiloidose seletiva do sistema nervoso central (CNSA). Sinais ou sintomas adequados que podem ser monitorados incluem a presença e extensão de depósitos amiloides em vários tecidos, como o trato gastrointestinal ou coração. A extensão da redução dos depósitos amiloides pode ser determinada por comparação com um controle apropriado, como o nível de depósitos de amiloides de TTR em animais de controle que receberam um anticorpo de controle (por exemplo, um anticorpo de controle pareado com isotipo), um placebo ou nenhum tratamento. Um exemplar modelo animal para testar a atividade contra uma amiloidose por TTR é um modelo de camundongo com uma mutação nula no lócus de TTR endógeno de camundongo e o gene mutante humano de TTR que compreende uma mutação V30M que está associada à polineuropatia amiloidíaca familiar. Ver, por exemplo, Kohno et al., Am. J. Path. 150(4): 1497-1508 (1997); Cardoso e Saraiva, FASEB J 20(2):234-239 (2006). Existem modelos semelhantes, incluindo outros modelos para versões familiares da amiloidose por TTR e modelos para versões esporádicas da amiloidose por TTR. Ver, por exemplo, Teng et al/., Lab. Invest. 81(3): 385-396 (2001); lto e Maeda, Mouse Models of Transthyretin Amyloidosis, em Recent Advances in Transthyretin Evolution, Structure, and Biological Functions, pp. 261-280 (2009) (Springer Berlin Heidelberg). Os animais transgênicos podem incluir um transgene de TTR humano, como um transgene de TTR com mutação associada à amiloidose por TTR ou um transgene de TTR de tipo selvagem. Para facilitar o teste em modelos animais, podem ser utilizados anticorpos quiméricos com uma região constante apropriada para o modelo animal (por exemplo, quimeras camundongo-rato poderiam ser usadas para testar anticorpos em camundongos). Pode concluir-se que uma versão humanizada de um anticorpo será eficaz se o anticorpo de camundongo ou o anticorpo quimérico correspondente for eficaz num modelo animal apropriado e o anticorpo humanizado tenha afinidade de ligação semelhante (por exemplo, dentro de um erro experimental, como por um fator de 1,5, 20u 3).
[0309] Teste de ensaios clínicos para segurança e eficácia em um ser humano com uma doença associada à amiloidose TTR.
1 Ácidos Nucleicos
[0310] A invenção também fornece ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das cadeias pesada e leve descritas acima (por exemplo, SEQ ID NOs: 2,4, 18 e 20). Opcionalmente, esses ácidos nucleicos codificam ainda um peptídeo sinal e podem ser expressos com o peptídeo de sinal ligado à região constante (por exemplo, peptídeos de sinal tendo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: (cadeia pesada) e 37 (cadeia leve) que podem ser codificados pelas SEQ ID NOs: 36 (cadeia pesada) e 38 (cadeia leve), respectivamente. As sequências de codificação dos ácidos nucleicos podem estar ligadas operacionalmente com sequências reguladoras para assegurar a expressão das sequências de codificação, tais como um promotor, intensificador, sítio de ligação ao ribossoma, sinal de terminação da transcrição e semelhantes. Os ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesada e leve podem ocorrer na forma isolada ou podem ser clonados em um ou mais vetores. Os ácidos nucleicos podem ser sintetizados, por exemplo, pela síntese de estado sólido ou por PCR de oligonucleotídeos sobrepostos. Ácidos nucleicos codificando cadeias leves e pesadas podem ser juntados como um ácido nucleico contíguo, por exemplo, dentro de um vetor de expressão, ou podem ser separados, por exemplo, cada um clonado em seu próprio vetor de expressão.
J Anticorpos Conjugados
[0311] Anticorpos conjugados que se ligam especificamente a antígenos expostos em formas patôgenicas de TTR mas não em forma tetramética nativa de TTR, como resíduos de aminoácido 89-97 (SEQ ID NO: 45) ou resíduos de aminoácido 101-109 (SEQ ID NO: 30) de TTR são úteis na detecção de presença de formas de fibrila, agregadas, mal dobradas, monoméricas, de TTR; no monitoramento e avaliação de eficiência de agentes terapêuticas usados para tratar pacientes diagnosticados com uma amiloidose por TTR; na inibição ou redução de agregação de TTR; na inibição ou redução de formação de fibrila de TTR; na redução ou depuração de depósitos de TTR; na estabilização de conformações não tóxicas de TTR; ou no tratamento ou efetuação de profilaxia de uma amiloidose por TTR em um paciente. Por exemplo, tais anticorpos podem ser conjugados com outras frações terapêuticas, outras proteínas, outros anticorpos e/ou marcadores detectáveis. Ver WO 03/057838; US 8,455,622.
[0312] As frações terapêuticas conjugadas podem ser qualquer agente que possa ser usado para tratar, combater, melhorar, prevenir ou melhorar uma condição ou doença indesejada em um paciente, como uma amiloidose por TTR. As frações terapêuticas podem incluir, por exemplo, imunomoduladores ou quaisquer agentes biologicamente ativos que facilitem ou potencializem a atividade do anticorpo. Um imunomodulador pode ser qualquer agente que estimula ou inibe o desenvolvimento ou a manutenção de uma resposta imunológica. Se tais frações terapêuticas estiverem acopladas a um anticorpo específico para formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR, tais como os anticorpos descritos neste documento, as frações terapêuticas acopladas terão uma afinidade específica para formas patogênicas não nativas de TTR sobre formas tetraméricas nativas de TTR. Consequentemente, a administração dos anticorpos conjugados direciona diretamente tecidos que compreendem formas patogênicas de TTR com danos mínimos ao tecido normal e saudável circundante. Isso pode ser particularmente útil para frações terapêuticas que são demasiado tóxicas para serem administradas isoladamente. Além disso, podem-se utilizar quantidades menores das frações terapêuticas.
[0313] Exemplos de frações terapêuticas adequadas incluem drogas que reduzem os níveis de TTR, estabilizam a estrutura tetramérica nativa de TTR, inibem a agregação da TTR, interrompem a formação de fibrila ou amiloide da TTR ou neutralizam a toxicidade celular. Ver, por exemplo, Almeida e Saraiva, FEBSLetters 586:2891-2896 (2012); Saraiva, FEBSLetters 498:201-203 (2001); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013); Ruberg and Berk, Circulation 126:1286-1300 (2012); Johnson et al., J. Mol. Biol. 421(2-3): 185-203 (2012, Ueda e Ando, Translational Neurodegeneration 3:19 (2014), e Hawkins et al. Annals of Medicine 47:625-638 (2015)). Por exemplo, os anticorpos podem ser conjugados com tafamidis, diflunisal AG10, ALN-TTRO1, ALNTTRO?, oligonucleotídeos antisense, como IONIS TTRRx (inotersen), siRNAs como patisiran ou revusiran, doxiciclina (doxy), ácido tauroursodeoxicólico (TUDCA), Doxy- TUDCA, ciclodextrina (CyD), 4'-iodo-4'-desoxidoxorrubicina (IDOX), galato de epigalocatequina (EGCG), curcumina, resveratrol (3,5,4'-trihidroxiestilbeno) ou anticorpos para o componente P amiloide sérico (SAP). Outras frações terapêuticas representativas incluem outros agentes que se sabe serem úteis para o tratamento, gestão ou melhoria de uma amiloidose por TTR ou sintomas de uma amiloidose por TTR. Ver, exemplo, Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013) para sintomas clínicos comuns de amiloidose por TTR e agentes típicos usados para tratar esses sintomas.
[0314] Os anticorpos também podem ser acoplados com outras proteínas. Por exemplo, os anticorpos podem ser acoplados com Fynomers. Fynomers são pequenas proteínas de ligação (por exemplo 7 kDa) derivadas do domínio SH3 Fyn humano. Elas podem ser estáveis e solúveis e podem não ter resíduos de cisteína e ligações dissulfeto. Os Fynomers podem ser manipulados para se ligarem a moléculas alvo com a mesma afinidade e especificidade de anticorpos. Eles são apropriados para a criação de proteínas de fusão multi-específicas com base em anticorpos. Por exemplo, os Fynomers pode ser fundidos com as extremidades N- terminal e/ou C-terminal dos anticorpos para criar FynomAbs bi e triespecíficos com arquiteturas diferentes. Os Fynomers podem ser selecionados utilizando-se bibliotecas de Fynomers através de tecnologias de triagem que usam FACS, Biacore e ensaios baseados em células que permitem a seleção eficiente dos Fynomers com propriedades ideais. Exemplos de Fynomers são divulgados em Grabulovski et al., J. Biol. Chem. 282:3196-3204 (2007); Bertschinger et al., Protein Eng. Des. Sei. 20:57-68 (2007); Schlatter et al., MAbs. 4:497-508 (2011); Banner et al., Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 69(Pt6): 1124-1137 (2013); e Brack et al., Mol. Cancer Ther. 13:2030-2039 (2014).
[0315] Os anticorpos divulgados neste documento também podem ser acoplados ou conjugados com um ou mais outros anticorpos (por exemplo, para formar anticorpos heteroconjugados). Estes outros anticorpos podem ligar-se a epítopos diferentes dentro de TTR ou uma parte dele ou podem ligar-se a um antígeno alvo diferente. Tais anticorpos anti-TTR que se ligam a epítopos de TTR diferentes dos de 9D5 ou 18C5, podem incluir anticorpos como na Tabela 3.
[0316] Os anticorpos também podem ser acoplados com um marcador detectável. Tais anticorpos podem ser usados, por exemplo, para diagnosticar uma amiloidose por TTR, para monitorar a progressão de uma amiloidose por TTR e/ou para avaliar a eficácia do tratamento. Tais anticorpos são particularmente úteis para realizar tais determinações em sujeitos que têm ou são suscetíveis a uma amiloidose por TTR, ou em amostras biológicas apropriadas obtidas a partir de tais sujeitos. Os marcadores detectáveis representativos que podem ser acoplados ou ligados a um anticorpo incluem várias enzimas, tais como a peroxidase de rabanete, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou acetilcolinesterase; grupos prostéticos, tal como estreptavidina, avidina ou biotina; materiais fluorescentes, como umbeliferona, fluores Dylight, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína diclorotriazinilamina, cloreto de dansyl ou ficoeritrina; materiais luminescentes, tais como o luminol; materiais bioluminescentes, como luciferase, luciferina e aequorina; materiais radioativos, tais como ítrioºº (90Y), radioisótopo de prata-111, radioisótopo de prata-199, Bismuto?'3, jodo (131, 1251, 1231, 1211,), carbono (ºC), enxofre (5S), trítio (H), índio (In, Sn, 12In, Mln,), tecnécio (To), tálio (2º Ti), gálio (ººGa, Ga), paládio (Pd), molibdênio (**Mo), xenônio (Xe), flúor (* PF), 13Sm, Vu, 15ºGqd, 149Pm, 140, a, 175Yb, 166Ho, 2OY, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, Ru, Ge, STCO,., s57n, 85Sr, 32P, 13Gd, 169Yb, SICr, sMn, 75Se, 113Sn, e "Tinestanho; metais que emitem pósitron, utilizando-se várias tomografias de emissão de pósitron; íons de metal paramagnético não-radioativos; e moléculas que são radiomarcadas ou conjugadas a radioisótopos específicos. Marcadores detectáveis representativos que podem ser acoplados ou ligados a um anticorpo divulgado neste documento incluem marcadores eletroquiomioluminescentes, por exemplo MSD GOLD SULFOTAG NHS-Ester (SULFO-TAG) (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD).
[0317] A ligação dos radioisótopos aos anticorpos pode ser realizada com quelatos bifuncionais convencionais. Para a ligação dos radioisótopos de prata-111 e dos radioisótopos de prata-199, podem ser usados ligantes à base de enxofre. Ver Hazra et al., Cell Biophys. 24-25:1-7 (1994). A ligação de radioisótopos de prata pode envolver a redução da imunoglobulina com ácido ascórbico. Para radioisótopos, tais como 111lh e 90Y, ibibritumomab tiuxetano pode ser usado e reagirá com esses isótopos para formar 111ln-ibritumomab tiuxetano e 90Y- ibritumomab tiuxetano, respectivamente. Ver Witzigg Cancer Chemother. Pharmacol., 48 Suppl 1:891-S95 (2001).
[0318] Frações terapêuticas, outras proteínas, outros anticorpos, e/ou marcadores detectáveis podem ser acoplados ou conjugados, direta ou indiretamente através de um intermediário (por exemplo, um ligante), a um anticorpo murino, quimérico, folheado ou humanizado 9D5 ou 18C5, usando-se técnicas conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," em Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et a/. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et a/., "Antibodies For Drug Delivery," em Controlled Drug Delivery (2º Ed.), Robinson et a/. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," em Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," em Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et a/. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985); e Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982). Os ligantes adequados incluem, por exemplo, ligantes cliváveis e não cliváveis. Diferentes ligantes que liberam frações terapêuticas acopladas, proteínas, anticorpos e/ou marcadores detectáveis em condições acídicas ou de redução, quando exposto às proteases específicas ou sob outras condições definidas, podem ser empregados.
Vv. Aplicações Terapêuticas
[0319] Os anticorpos acima podem ser utilizados para tratar ou efetuar a profilaxia de uma doença em um paciente que tenha ou esteja em risco da doença mediada pelo menos em parte por transtirretina (TTR) e particularmente por formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR. Embora não seja necessária uma compreensão do mecanismo para a prática, acredita-se que qualquer um ou todos os seguintes mecanismos possam contribuir para o tratamento da amiloidose por TTR usando os anticorpos acima: inibição mediada por anticorpos da agregação de TTR e formação de fibrilas, estabilização mediada por anticorpos de conformações não tóxicas de TTR (por exemplo, formas tetraméricas) ou depuração mediada por anticorpos de TTR agregada, TTR oligomérica ou TTR monomérica. Os conjugados anticorpo-droga podem ter mecanismos de ação adicionais determinados pela fração conjugada.
[0320] Os anticorpos são administrados num regime eficaz, o que significa que uma dosagem, via de administração e frequência de administração que atrasa o início, reduz a gravidade, inibe a continuação da degradação e/ou melhora, pelo menos, um sinal ou sintoma de um distúrbio sendo tratado. Se um paciente já sofre de uma doença, o regime pode ser referido como um regime terapeuticamente eficaz. Se o paciente está em risco elevado da doença em relação à população em geral, mas ainda não sente os sintomas, o regime pode ser referido como um regime profilaticamente eficaz. Em alguns casos, a eficácia terapêutica ou profilática pode ser observada em um paciente individual em relação aos controles históricos ou a experiências anteriores no mesmo paciente. Em outros casos, a eficácia terapêutica ou profilática pode ser demonstrada em um ensaio pré-clínico ou clínico em uma população de pacientes tratados em relação a uma população de pacientes não tratados de controle.
[0321] A frequência de administração depende da meia-vida do anticorpo na circulação, a condição do paciente e da via de administração, entre outros fatores. A frequência pode ser diária, semanal, mensal, trimestral ou em intervalos irregulares em resposta a mudanças na condição ou a progressão do distúrbio do paciente sendo tratado. Uma frequência exemplificativa para a administração intravenosa é entre semanal e trimestral por uma causa contínua de tratamento, embora uma dosagem mais ou menos frequente também seja possível. Para administração subcutânea, uma frequência de dosagem exemplificativa é diária a mensal, embora uma dosagem mais ou menos frequente também seja possível.
[0322] O número de doses administradas depende do fato de o distúrbio ser agudo ou crônico e da resposta do distúrbio ao tratamento. Para distúrbios agudos ou exacerbações agudas de um distúrbio crônico, entre 1 e 10 doses muitas vezes basta. Por vezes, uma única dose bolus, opcionalmente dividida, é suficiente para uma doença aguda ou exacerbação aguda de uma doença crônica. O tratamento pode ser repetido para a recorrência de um distúrbio agudo ou uma exacerbação aguda. Para distúrbios crônicos, um anticorpo pode ser administrado em intervalos regulares, por exemplo, semanal, quinzenal, mensal, trimestral, de seis em seis meses durante pelo menos 1, 5 ou 10 anos, ou por toda a vida do paciente.
Vl. “Composições Farmacêuticas e Métodos de Uso
[0323] São fornecidos neste documento vários métodos de diagnóstico, monitorização, tratamento ou realização de profilaxia de doenças ou condições mediadas, pelo menos em parte, pela transtirretina (TTR) e, em particular, por formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR (por exemplo,
amiloidose por TTR). Exemplos de tais doenças incluem amiloidose familiar por TTR, como a miocardiopatia amiloide familiar (FAC), polineuropatia amiloide familiar (FAP), ou amiloidose seletiva do sistema nervoso central (CNSA) e amiloidose por TTR esporádica, como a amiloidose sistêmica senil (SSA) ou amiloidose cardíaca senil (SCA). Os anticorpos descritos acima podem ser incorporados numa composição farmacêutica para utilização em tais métodos. Em geral, um anticorpo ou composição farmacêutica contendo um anticorpo é administrado a um sujeito em necessidade deste. Os pacientes que são passíveis de tratamento incluem indivíduos em risco de amiloidose por TTR, mas não apresentam sintomas, bem como pacientes que apresentam sintomas. Alguns pacientes podem ser tratados durante o estágio prodrômico da amiloidose por TTR.
[0324] As composições farmacêuticas podem ser administradas de forma profilática a indivíduos com risco genético conhecido de amiloidose por TTR. Tais indivíduos incluem aqueles que têm parentes que experimentaram tal doença e aqueles cujo risco é determinado pela análise de marcadores genéticos ou bioquímicos (por exemplo, mutações na TTR associadas à amiloidose por TTR), incluindo o uso dos métodos de diagnóstico fornecidos neste documento. Por exemplo, existem mais de 100 mutações no gene que codifica a TTR que foram implicadas na amiloidose por TTR. Ver, por exemplo, US 2014/0056904; Saraiva, Hum. Mutat. 17(6):493-503 (2001); Damas e Saraiva, J. Struct. Biol. 130:290-299; Dwulet e Benson, Biochem. Biophys. Res. Commun. 114:657-662 (1983).
[0325] Os indivíduos que sofrem de amiloidose por TTR às vezes podem ser reconhecidos a partir das manifestações clínicas da amiloidose por TTR, incluindo um ou mais dos seguintes: (1) história familiar de doença neuropática, especialmente associada a insuficiência cardíaca; (2) dor neuropática ou distúrbios sensoriais progressivos de etiologia desconhecida; (3) síndrome do túnel do carpo sem causa óbvia, particularmente se for bilateral e requer alívio cirúrgico; (4) distúrbios da motilidade gastrointestinal ou disfunção do nervo autônomo de etiologia desconhecida (por exemplo, disfunção erétil, hipotensão ortostática, bexiga neurogênica); (5) doença cardíaca caracterizada por paredes ventriculares engrossadas na ausência de hipertensão; (6) bloqueio átrio-ventricular avançado de origem desconhecida, particularmente quando acompanhado por um coração espessado; e (6) inclusões do corpo vítreo do tipo algodão-lã. Ver Ando et al,
Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). O diagnóstico definitivo de amiloidose por TTR, contudo, geralmente depende de biópsias de órgãos alvo, seguido de coloração histológica do tecido excisado com corante específico de amiloide, vermelho Congo. Se for observado um teste positivo para amiloide, a coloração imuno-histoquímica e a identificação espectroscópica de massa para TTR são realizadas subsequentemente para garantir que a proteína precursora responsável pela formação de amiloide seja de fato TTR. Para as formas familiares das doenças, a demonstração de uma mutação no gene que codifica TTR é então necessária antes que um diagnóstico definitivo possa ser feito.
[0326] A identificação do sujeito pode ocorrer em uma configuração clínica, ou em outro lugar, como na casa do sujeito, por exemplo, através do próprio uso do sujeito de um kit de autoteste. Por exemplo, o sujeito pode ser identificado com base em vários sintomas como neuropatia periférica (sensorial e motor), neuropatia autônoma, comprometimento gastrointestinal, cardiomiopatia, nefropatia ou deposição ocular. Ver Ando et a/., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). O sujeito também pode ser identificado por níveis aumentados de formas não- nativas de TTR em amostras de plasma do sujeito em comparação com amostras de controle, conforme divulgado nos exemplos.
[0327] Conforme garantido pelo histórico familiar, teste genético ou triagem médica para amiloidose por TTR, o tratamento pode começar em qualquer idade (por exemplo, 20, 30, 40, 50, 60 ou 70 anos de idade). O tratamento tipicamente envolve doses múltiplas ao longo de um período de tempo e pode ser monitorizado por análise de anticorpos ou respostas de células T ativadas ou de células B a um agente terapêutico (por exemplo, uma forma truncada de TTR compreendendo os resíduos de aminoácidos 89-97 ou compreendendo os resíduos de aminoácidos 101-109) ao longo do tempo. Se a resposta cai, uma dose de reforço é indicada.
[0328] Em aplicações profiláticas, um anticorpo ou uma composição farmacêutica do mesmo é administrado a um sujeito suscetível ou de qualquer outra forma em risco de uma doença (por exemplo, amiloidose por TTR) num regime (dose, frequência e via de administração) eficaz para reduzir o risco, diminuir a gravidade ou retardar o aparecimento de pelo menos um sinal ou sintoma da doença. Em aplicações terapêuticas, um anticorpo ou um imunógeno para induzir um anticorpo é administrado a um sujeito suspeito, ou que já sofre de uma doença
(por exemplo, amiloidose por TTR) num regime (dose, frequência e via de administração) eficaz para melhorar ou pelo menos inibir a deterioração adicional de pelo menos um sinal ou sintoma da doença.
[0329] Um regime é considerado terapeuticamente ou profilaxicamente eficaz se um sujeito tratado individualmente atingir um resultado mais favorável do que o resultado médio em uma população de controle de sujeitos comparáveis não tratados pelos métodos descritos neste documento, ou se um resultado mais favorável for demonstrado para um regime em sujeitos tratados versus sujeitos de controle em um ensaio clínico controlado (por exemplo, um ensaio de fase |l, fase IWI ou fase Ill) ou um modelo animal no nível p < 0,05 ou 0,01 ou mesmo em 0,001.
[0330] Um regime eficaz de um anticorpo pode ser usado para, por exemplo, inibir ou reduzir a agregação de TTR em um sujeito que tenha ou esteja em risco de uma condição associada à acumulação de TTR; inibir ou reduzir a formação de fibrila de TTR em um sujeito que tenha ou esteja em risco de uma condição associada à acumulação de TTR; reduzir ou depurar depósitos de TTR ou TTR agregados em um sujeito que tenha ou esteja em risco de uma condição associada à acumulação de TTR; estabilizar conformações não tóxicas de TTR em um sujeito que tenha ou esteja em risco de uma condição associada à acumulação de TTR; inibir os efeitos tóxicos dos agregados de TTR, fibrilas ou depósitos em um sujeito que tenha ou esteja em risco de uma condição associada à acumulação de TTR; diagnosticar a presença ou ausência de acumulação de amiloide TTR em um tecido suspeito de compreender o acúmulo de amiloide; determinar um nível de depósitos de TTR num sujeito por detecção da presença de anticorpo ligado no sujeito após a administração do anticorpo; detectar a presença de formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR em um sujeito; monitorar e avaliar a eficácia de agentes terapêuticos utilizados para tratar pacientes diagnosticados com amiloidose por TTR; induzir uma resposta imune compreendendo anticorpos para TTR em um sujeito; atrasar o início de uma condição associada à acumulação de amiloide TTR em um sujeito; ou tratar ou realizar profilaxia de uma amiloidose por TTR em um paciente.
[0331] As doses efetivas variam dependendo de muitos fatores diferentes, como meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do sujeito, se o sujeito é humano ou animal, outros medicamentos administrados e se o tratamento é profilático ou terapêutico.
[0332] Uma faixa de dose exemplificativa para anticorpos pode ser de cerca de 0,1-20 ou 0,5-5 mg/kg de peso corporal (por exemplo, 0,5, 1, 2, 3, 4 ou 5 mg/kg) ou 10-1500 mg como uma dosagem fixa. A dosagem depende da condição do paciente e da resposta ao tratamento prévio, se houver, se o tratamento é profilático ou terapêutico e se a doença é aguda ou crônica, entre outros fatores.
[0333] O anticorpo pode ser administrado em tais doses diariamente, em dias alternados, semanalmente, quinzenalmente, mensalmente, trimestralmente ou de acordo com qualquer outro agendamento determinado por análise empírica. Um tratamento exemplificativo envolve a administração de doses múltiplas durante um período prolongado, por exemplo, de pelo menos seis meses. Exemplos adicionais de regimes de tratamento implicam a administração uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês ou uma vez a cada 3 até 6 meses.
[0334] Os anticorpos podem ser administrados através de uma via periférica. As vias de administração incluem tópica, intravenosa, oral, subcutânea, intra- arterial, intracraniana, intratecal, intraperitoneal, intranasal ou intramuscular. As vias para administração de anticorpos podem ser intravenosas ou subcutâneas. À administração intravenosa pode ser, por exemplo, por infusão ao longo de um período tal como 30-90 min. Esse tipo de injeção é feito com mais frequência nos músculos do braço ou da perna. Em alguns métodos, os agentes são injetados diretamente em um tecido em particular onde se acumularam os depósitos, por exemplo, por injeção intracraniana.
[0335] As composições farmacêuticas para administração parentérica podem ser estéreis e substancialmente isotônicas (250-350 mOsm/kg de água) e fabricadas sob condições GMP. As composições farmacêuticas podem ser fornecidas na forma de dose unitária (ou seja, a dose para uma única administração). As composições farmacêuticas podem ser formuladas utilizando- se um ou mais carreadores fisiologicamente aceitáveis, diluentes, excipientes ou auxiliares. A formulação depende da via de administração escolhida. Para injeção, os anticorpos podem ser formulados em soluções aquosas, por exemplo, em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer ou solução salina fisiológica ou tampão de acetato (para reduzir o desconforto no sítio da injeção). A solução pode conter agentes de formulação,
como suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, os anticorpos podem estar na forma liofilizada para constituição com um veículo adequado, por exemplo água estéril isenta de pirogênios, antes da utilização.
[0336] Os regimes podem ser administrados em combinação com, concomitantemente ou sequencialmente com outro agente eficaz no tratamento ou profilaxia da doença a ser tratada. Tais agentes podem incluir siRNA para inibir a expressão de TTR ou Vyndagel, um estabilizador de TTR na formação de tetrâmeros. Tais agentes podem incluir estabilizadores de tetrânero TTR, como tafamidis ou diflunisal (ver, por exemplo, WO2011116123, Patente U.S. Nº 9,150,489), terapias genéticas para suprimir a expressão de TTR, como oligonucleotídeos antisense, como IONIS-TTRRx (inotersen) (ver, por exemplo, Patentes U.S. Nº 8,101,743, 8,697,860, 9,061,044 e 9,399,774; Patente Japonesa Nº JP5896175) ou siRNAs como patisiran ou revusiran (ver, por exemplo, WO2016033326), compostos degradadores de amiloides, como doxiciclina (doxy), ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA), Doxi-TUDCA, ciclodextrina (CyD), 4" -iodo- 4'-desoxidoxorrubicina (IDOX) ou anticorpos para o componente P amiloide sérico (SAP).
[0337] Outro agente eficaz no tratamento ou profilaxia da doença a ser tratada pode ser administrado a um sujeito que foi tratado anteriormente com um anticorpo divulgado neste documento. O sujeito tratado com outro agente eficaz no tratamento ou profilaxia da doença a ser tratada pode não estar mais recebendo tratamento com um anticorpo divulgado neste documento.
[0338] O tratamento com anticorpos divulgados neste documento pode ser combinado com outros tratamentos eficazes contra o distúrbio a ser tratado. Tratamentos de combinação podem ser formulados em conjunto para administração em separado. Alguns exemplos de tratamentos úteis para terapias combinadas incluem um segundo anticorpo anti-TTR que se liga a um epítopo diferente daquele de 9D5 ou 18C5, por exemplo, um anticorpo conforme descrito na Tabela 3.
[0339] Após o tratamento, a condição do sujeito pode ser avaliada para determinar o progresso ou a eficácia desse tratamento. Tais métodos preferencialmente testam alterações nos níveis de amiloide TTR ou níveis de formas não-nativas de TTR. Por exemplo, os níveis de amiloide TTR podem ser avaliados para determinar a melhoria em relação aos níveis de amiloide TTR do sujeito em circunstâncias comparáveis antes do tratamento. Os níveis de amiloide TTR do sujeito também podem ser comparados com populações de controle em circunstâncias comparáveis, As populações de controle podem ser afligidas de forma semelhante, sujeitos não tratados ou sujeitos normais não tratados (entre outros sujeitos de controle).
A melhoria em relação aos sujeitos ou níveis não tratados ou atingindo os níveis em sujeitos normais não tratados indica uma resposta positiva ao tratamento.
[0340] Os níveis de amiloide TTR podem ser medidos por uma série de métodos, incluindo técnicas de imagem. Exemplos de técnicas de imagem adequadas incluem a varredura de PET com TTR radiomarcado de fragmentos deste, anticorpos TTR ou fragmentos deste, agentes de imagem amiloide com base em vermelho Congo, tais como, por exemplo PIB (US 2011/0008255), peptídeo de imagem amiloide p31 (Biodistribuição do peptídeo de imagem amiloide, p31, correlaciona-se com a quantificação amiloide com base na coloração do tecido vermelho Congo, Wall et a/., Abstract No. 1573, 2011 ISNM Annual Meeting), e outros marcadores PET. Os níveis de formas não nativas de TTR podem ser medidos, por exemplo, realizando ensaios de placas SDS-PAGE/Western blot ou Meso Scale Discovery com os anticorpos divulgados neste documento em amostras de plasma ou amostras de biópsia de um sujeito e comparando com amostras de controle, conforme descrito nos exemplos.
A, Métodos de diagnóstico e monitoramento
[0341] Também são fornecidos métodos para detectar uma resposta imune contra TTR em um paciente que sofre ou é suscetível a doenças associadas à deposição de TTR ou formas patogênicas de TTR (por exemplo, formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou fibrilas de TTR). Os métodos podem ser utilizados para monitorar um curso de tratamento terapêutico e profilático com os agentes fornecidos neste documento. O perfil de anticorpos após imunização passiva mostra tipicamente um pico imediato na concentração de anticorpos seguido por uma decomposição exponencial. Sem uma dose adicional, a decadência se aproxima dos níveis de pré-tratamento dentro de um período de dias a meses, dependendo da meia-vida do anticorpo administrado. Por exemplo, a meia-vida de alguns anticorpos humanos é da ordem de 20 dias.
[0342] Em alguns métodos, uma medida de linha de base do anticorpo para TTR no sujeito é feita antes da administração, uma segunda medida é feita logo depois para determinar o pico de anticorpos e uma ou mais medições adicionais são feitas em intervalos para monitorar a deterioração dos níveis de anticorpos. Quando o nível de anticorpo diminuiu para a linha de base ou uma porcentagem predeterminada do pico menos a linha de base (por exemplo, 50%, 25% ou 10%), a administração de uma outra dose de anticorpo é administrada. Em alguns métodos, os níveis de pico ou subsequentes medidos, menos fundo são comparados com níveis de referência previamente determinados para constituir um regime de tratamento profilático ou terapêutico benéfico em outros sujeitos. Se o nível de anticorpos medido for significativamente menor do que um nível de referência (por exemplo, inferior à média menos uma ou, de preferência, dois desvios-padrão do valor de referência em uma população de sujeitos que se beneficiam do tratamento) é indicada a administração de uma dose adicional de anticorpo.
[0343] Também são fornecidos métodos de detecção de formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR em um sujeito, por exemplo, medindo formas de TTR amiloide ou patogênicas de TTR (por exemplo, formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR) em uma amostra de um sujeito ou por imagem in vivo de TTR em um sujeito. Tais métodos são úteis para diagnosticar ou confirmar o diagnóstico de doenças associadas a tais formas patogênicas de TTR (por exemplo, amiloidose por TTR), ou suscetibilidade a ela. Os métodos também podem ser usados em sujeitos assintomáticos. A presença de formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR indica suscetibilidade a futuras doenças sintomáticas. Os métodos também são úteis para monitorar a progressão da doença e/ou resposta ao tratamento em sujeitos que tenham sido diagnosticados anteriormente com amiloidose por TTR.
[0344] As amostras biológicas obtidas de um sujeito que tem suspeita de ter ou que em risco de ter uma amiloidose por TTR podem ser contatadas com os anticorpos divulgados neste documento para avaliar a presença de formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR. Por exemplo, os níveis de formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR em tais sujeitos podem ser comparados aos presentes em sujeitos saudáveis. Alternativamente, os níveis de amiloide TTR ou formas patogênicas de TTR (por exemplo, formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR) em tais sujeitos que recebem tratamento para a doença podem ser comparados com os de sujeitos que não foram tratados para uma amiloidose por TTR. Alguns desses testes envolvem uma biópsia de tecido obtida a partir desses sujeitos. Os ensaios ELISA também podem ser usados, por exemplo, para avaliar níveis de formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR em amostras de fluidos. Alguns desses ensaios ELISA envolvem anticorpos anti-TTR que se ligam preferencialmente a formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR em relação às formas tetraméricas nativas de TTR.
[0345] Alguns desses testes são imunoensaios em sanduíche. Alguns desses imunoensaios empregam a plataforma de eletroquimioluminescência Meso Scale Discovery (MSD) (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD). Alguns desses imunoensaios usam marcadores eletroquimioluminescentes nos anticorpos repórteres, por exemplo, Ensaios MSD (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD). Por exemplo, o anticorpo repórter pode ser marcado com um marcador SULFO- TAG ((Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD). Placas úteis em ensaios eletroquimioluminescentes podem incorporar eletrodos (por exemplo, placas MSD (Meso Scale Diagnostics, Rockvilleº MD). Placas úteis em ensaios eletroquimioluminescentes podem incorporar eletrodos no fundo de cada poço (por exemplo, placas MSD, (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD). Alguns ensaios empregam um anticorpo de captura marcado. Por exemplo, o anticorpo de captura marcado pode ser 9D5 ou 18C5 ou uma variante humanizada, quimérica ou folheada deste. Alguns ensaios empregam um anticorpo repórter marcado. Por exemplo, o anticorpo repórter marcado pode ser 9D5 ou 18C5 ou uma variante humanizada, quimérica ou folheada deste. O anticorpo repórter marcado também pode ser um anticorpo da Tabela 3, ou uma variante humanizada, quimérica ou folheada deste. O anticorpo repórter marcado pode ser um anticorpo que se liga à TTR sem especificidade conformacional. Em uma modalidade, o anticorpo que se liga à TTR sem especificidade conformacional pode ser 803 ou 7G7 ou uma variante humanizada, quimérica ou folheada deste (Ver, por exemplo, WO 2016/120811). Numa modalidade, o anticorpo que se liga à TTR sem especificidade conformacional pode ser um anticorpo policlonal. Em uma modalidade, o anticorpo policlonal é uma pré-albumina policlonal de coelho anti-humana (Cat. Nº A000202- 2, Dako, Agilent Technologies, Inc, Santa Clara, CA). Em uma modalidade, o anticorpo policlonal de coelho anti-TTR é Sigma, Nº de Catálogo. HPA002550 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO),
[0346] Alguns ensaios detectam todas as TTR mal dobradas em uma amostra (ou seja, todas as formas mal dobradas de TTR incluindo monômeros e multímeros). Outros ensaios detectam especificamente TTR monomérica mal dobrada ou TTR multimérica mal dobrada. Outros ensaios detectam todas as formas de TTR (formas mal dobradas e forma tetramérica nativa). Alguns desses ensaios empregam um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 de TTR ou a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente de TTR; em que se TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e em que a detecção do anticorpo repórter que se liga à TTR mal dobrada, se houver, indica presença ou ausência de todas as formas mal dobradas de TTR presentes na amostra. Alguns desses anticorpos repórter podem incluir 18C5, 9D5, 14G8, 5A1, 6C1, AD7F6, RT24, NI-301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD107, MFD108, MFD109, MFD111, MFD 114, ou uma versão quimérica ou uma versão humanizada deste. Tais anticorpos repórter podem incluir um anticorpo que se liga aos resíduos 89-97, 101-109, 118-122, 115- 124, 53-63, 54-61, 36-49, 49-61, 109-121, 30-66, 70-127, 80-127, 90-127, 100-127, 110-127 ou 115-127 de TTR. Tais anticorpos repórter podem incluir 8C3 ou 767 (ver, por exemplo, WO 2016/120811). Tais anticorpos repórter podem incluir uma pré-albumina policlonal de coelho anti-humana (Cat. Nº AO000202-2, Dako, Agilent Technologies, Inc, Santa Clara, CA) ou um anticorpo policlonal de coelho anti-TTR (Sigma, Nº de Catálogo HPA002550, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Alguns desses ensaios detectam formas mal dobradas de TTR em uma amostra biológica de pacientes com amiloidose hereditária por TTR carreando uma mutação na posição 89 dentro do epítopo 9D5 de TTR. Mutações exemplificativas são ES9K TTR e E89Q TTR. Alguns desses ensaios empregam um anticorpo de captura 9D5 e um anticorpo repórter anti-TTR policlonal ou um anticorpo repórter 18C5.
[0347] Alguns ensaios detectam formas multiméricas de TTR mal dobrada em uma amostra. Tais ensaios podem ser configurados para detectar TTR multimérica mal dobrada preferencialmente ou exclusivamente sobre TTR monomérica mal dobrada. Alguns desses ensaios empregam um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 ou 101-109 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 ou 101-109 de TTR. Tal combinação de anticorpos de captura e repórter pode se ligar preferencialmente ou exclusivamente a TTR multimérica sobre monomérica, porque as múltiplas cópias de TTR fornecem múltiplos epítopos para ligação de anticorpos. A detecção da ligação do anticorpo repórter à TTR multimérica mal dobrada, se houver, indica presença ou ausência da TTR multimérica mal dobrada. Em alguns desses ensaios, o anticorpo repórter compete pela ligação à TTR com o anticorpo de captura e/ou o repórter e o anticorpo de captura se ligam ao mesmo ou epítopo de sobreposição de TTR. Em alguns desses ensaios, o anticorpo de captura liga uma primeira molécula de TTR mal dobrada na TTR multimérica mal dobrada e o anticorpo repórter liga uma segunda molécula de TTR mal dobrada na TTR multimérica mal dobrada. À competição pela ligação entre os anticorpos de captura e repórter impede ou pelo menos reduz (dependendo se a competição é o resultado de epítopos sobrepostos ou impedimento estérico) a ligação e a detecção simultâneas de TTR monomérica mal dobrada. Em alguns desses ensaios, a detecção da ligação do anticorpo repórter que se liga à segunda molécula de TTR mal dobrada na TTR multimérica indica presença ou ausência de TTR multimérica mal dobrada.
[0348] Os anticorpos divulgados neste documento podem ser utilizados em um método para determinar uma razão entre o nível de transtirretina multimérica mal dobrada total (TTR) e o nível de TTR mal dobrada total em uma amostra biológica. Uma primeira porção de uma amostra biológica pode ser ensaiada para todos as TTR mal dobradas numa amostra (ou seja, todas as formas TTR mal dobradas incluindo monômeros e multímeros) em um primeiro ensaio em que são detectadas TTR monoméricas mal dobradas e multiméricas mal dobradas. O primeiro ensaio pode empregar um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 ou 101-109 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente de TTR. Se a TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche. A detecção do anticorpo repórter que se liga à TTR mal dobrada, se houver, indica presença ou ausência da TTR mal dobrada na amostra. Uma segunda porção de uma amostra biológica pode ser ensaiada para formas multiméricas de TTR mal dobrada. Uma amostra biológica em um segundo ensaio que detecta TTR multimérica mal dobrada preferencialmente sobre TTR monomérica mal dobrada. O segundo ensaio pode empregar um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 ou 101-109 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 ou 101-109 de TTR. Se a TTR multimérica mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR multimérica mal dobrada, formando um complexo sanduíche. A captura e o anticorpo repórter podem se ligar simultaneamente preferencialmente ou exclusivamente à TTR multimérica mal dobrada, se houver, para indicar a presença ou ausência da TTR multimérica mal dobrada. Em alguns desses ensaios, o anticorpo repórter compete pela ligação da TTR com o anticorpo de captura ou liga-se ao mesmo ou ao epítopo de sobreposição do anticorpo de captura. Em alguns desses ensaios, o anticorpo de captura liga uma primeira molécula de TTR mal dobrada na TTR multimérica mal dobrada e o anticorpo repórter liga uma segunda molécula de TTR mal dobrada na TTR multimérica mal dobrada. A competição pela ligação entre os anticorpos de captura e repórter impede ou pelo menos reduz (dependendo se a competição é o resultado de epítopos sobrepostos ou impedimento estérico) a ligação e a detecção simultâneas de TTR monomérica mal dobrada. Em alguns desses ensaios, a detecção da ligação do anticorpo repórter que se liga à segunda molécula de TTR mal dobrada na TTR multimérica indica presença ou ausência de TTR multimérica mal dobrada. Em alguns ensaios, é calculada uma proporção de TTR multimérica mal dobrada para toda TTR mal dobrada.
[0349] Os anticorpos divulgados neste documento também podem ser utilizados em um método para determinar uma proporção do nível de toda a TTR mal dobrada para a TTR total (formas mal dobradas e forma tetramérica nativa) em uma amostra biológica. Uma primeira porção de uma amostra biológica pode ser ensaiada para todas as TTR mal dobradas em uma amostra (ou seja, todas as formas de TTR mal dobradas incluindo monômeros e multímeros) em um primeiro ensaio em que são detectadas TTR monoméricas mal dobradas e multiméricas mal dobradas. O primeiro ensaio pode empregar um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 ou 101-109 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente de TTR. Se a TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche. A detecção do anticorpo repórter que se liga à TTR mal dobrada, se houver, indica presença ou ausência da TTR mal dobrada na amostra. Uma segunda porção de uma amostra biológica pode ser ensaiada para a TTR total (formas mal dobradas e forma tetramérica nativa) em um segundo ensaio em que a TTR total é detectada. O segundo ensaio pode empregar um anticorpo de captura que se liga à TTR sem especificidade conformacional e um anticorpo repórter que se liga à TTR sem especificidade conformacional. Se a TTR estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR formando um complexo sanduíche. A detecção do anticorpo repórter que se liga à TTR, se houver, indica presença ou ausência da TTR presente na amostra. Pode-se calcular uma proporção de toda a TTR mal dobrada para a TTR total (formas mal dobradas e forma tetramérica nativa).
[0350] Os métodos de imagem in vivo podem funcionar através da administração de um reagente, tal como anticorpo que se liga a formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR no sujeito, e depois detecta o reagente depois de se ligar. Tais anticorpos normalmente se ligam a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 ou 101-109 de TTR. Se desejado, a resposta de depuração pode ser evitada usando fragmentos de anticorpos que não possuem uma região constante de comprimento completo, como Fabs. Em alguns métodos, o mesmo anticorpo pode servir como um tratamento e um reagente de diagnóstico.
[0351] Os reagentes de diagnóstico podem ser administrados por injeção intravenosa no corpo do sujeito, ou através de outras vias consideradas razoáveis. A dose de reagente deve estar dentro dos mesmos intervalos que para os métodos de tratamento. Tipicamente, o reagente é marcado, embora em alguns métodos, o reagente primário com afinidade para formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR não está marcado e é utilizado um agente de marcação secundário para se ligar ao reagente primário. A escolha do marcador depende dos meios de detecção. Por exemplo, um marcador fluorescente é adequado para a detecção ótica. O uso de marcadores paramagnéticos é adequado para detecção tomográfica sem intervenção cirúrgica. Marcadores radioativos também podem ser detectados usando PET ou SPECT.
[0352] O diagnóstico é realizado comparando o número, o tamanho e/ou a intensidade dos loci marcados com os valores correspondentes da linha de base. Os valores da linha de base podem representar os níveis médios em uma população de indivíduos sem doença. Os valores da linha base também podem representar os níveis anteriores determinados no mesmo sujeito. Por exemplo, os valores da linha de base podem ser determinados em um sujeito antes do início do tratamento, e os valores medidos depois comparados com os valores da linha de base. Uma diminuição nos valores em relação à linha de base geralmente sinaliza uma resposta positiva ao tratamento.
[0353] O monitoramento de alterações na quantidade de TTR mal dobrada, TTR multimérica mal dobrada, depósitos de transtirretina, ligação de anticorpo anti- TTR ou similar permite o ajuste de um regime de tratamento em resposta ao tratamento. Então, a determinação pode ser feita no que diz respeito a se deve ajustar o tratamento e se o tratamento desejado pode ser ajustado em resposta ao monitoramento. Uma mudança significativa significa que a comparação do valor de um parâmetro após o tratamento em relação à base fornece alguma evidência de que o tratamento resultou ou não em um efeito benéfico. Em alguns casos, uma mudança de valores de um parâmetro em um paciente em si fornece evidências de que o tratamento resultou ou não em um efeito benéfico. Em outros casos, a mudança de valores, se houver, em um paciente, é comparada com a mudança de valores, se houver, em uma população de controle representativa de pacientes que não foram submetidos a tratamento. Uma diferença na resposta de um paciente em particular da resposta normal no paciente de controle (por exemplo, média mais variância de um desvio padrão) também pode fornecer evidências de que um regime de tratamento está ou não alcançando um efeito benéfico em um paciente. Alterações nos parâmetros de TTR acima também podem ser combinadas com outras alterações nos sinais ou sintomas, como efeitos colaterais na determinação de se e como ajustar o tratamento.
[0354] Em alguns pacientes, o monitoramento indica que a quantidade de TTR mal dobrada, TTR multimérica mal dobrada, depósitos de transtirretina ou ligação de anticorpo anti-TTR é igual ou superior ao detectado anteriormente. Nestes pacientes, se não houver efeitos colaterais inaceitáveis, o regime de tratamento pode ser continuado como está ou mesmo aumentado na frequência de administração e/ou dose, se ainda não estiver na dose máxima recomendada.
[0355] Em alguns pacientes, o monitoramento indica um declínio detectável na quantidade de TTR mal dobrada, TTR multimérica mal dobrada, depósitos de transtirretina, ligação de anticorpo anti-TTR ou similar, mas essa quantidade de TTR mal dobrada, TTR multimérica mal dobrada, depósitos de transtirretina ou ligação de anticorpo anti-TTR permanece acima do normal. Nestes pacientes, se não houver efeitos colaterais inaceitáveis, o regime de tratamento pode ser continuado como está ou mesmo aumentado na frequência de administração e/ou dose, se ainda não estiver na dose máxima recomendada. Alternativamente, em alguns desses pacientes, o regime de tratamento pode ser descontinuado e substituído pelo tratamento com outros agentes, como um estabilizador de tetrâmero de TTR, um terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense, um terapêutico à base de interferência de RNA (RNAi) ou doxiciclina mais ácido tauroursodesoxicólico.
[0356] Se o monitoramento indicar uma quantidade de TTR mal dobrada, TTR multimérica mal dobrada, depósitos de transtirretina, ligação de anticorpo anti- TTR ou semelhante em um paciente, já foi reduzido para um nível normal próximo do normal de quantidade de TTR mal dobrada, TTR multimérica mal dobrada, depósitos de transtirretina ou quantidade de ligação ao anticorpo anti-TTR, o regime de tratamento pode ser ajustado a partir de uma indução (ou seja, que reduz o nível de quantidade de TTR mal dobrada, TTR multimérica mal dobrada, depósitos de transtirretina ou ligação de anticorpos anti-TTR) para uma manutenção (ou seja, que mantém a quantidade de TTR mal dobrada, TTR multimérica mal dobrada, depósitos de transtirretina ou ligação de anticorpos anticTTR a um nível aproximadamente constante). Esse regime pode ser efetuado reduzindo a dose e/ou a frequência da administração do tratamento. Alternativamente, em alguns desses pacientes, o regime de tratamento pode ser descontinuado e substituído pelo tratamento com outros agentes, como um estabilizador de tetrâmero de TTR,
um terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense, um terapêutico à base de interferência de RNA (RNAi) ou doxiciclina mais ácido tauroursodesoxicólico.
[0357] Em outros pacientes, o monitoramento pode indicar que o regime de tratamento está tendo algum efeito benéfico, mas um efeito abaixo do ideal. Um efeito ideal pode ser definido como uma redução percentual na quantidade de TTR mal dobrada, TTR multimérica mal dobrada, depósitos de transtirretina ou ligação de anticorpos anti-TTR na metade ou quartil superior da alteração na quantidade de TTR mal dobrada, TTR multimérica mal dobrada, depósitos de transtirretina, ou quantidade de ligação ao anticorpo anti-TTR) experimentada por uma amostra representativa de pacientes submetidos ao regime de tratamento em um determinado momento após o início da terapia. Um paciente com um declínio menor ou um paciente cuja quantidade de TTR mal dobrada, TTR multimérica mal dobrada, depósitos de transtirretina ou ligação de anticorpos anti-TTR permanece constante ou até aumenta, mas em menor grau do que o esperado na ausência do regime de tratamento (por exemplo, como inferido de um grupo controle de pacientes que não administraram o regime de tratamento) pode ser classificado como experimentando uma resposta positiva, porém abaixo do ideal. Esses pacientes podem opcionalmente submeter-se a um ajuste do regime no qual a dose e/ou a frequência da administração de um agente aumentam. Alternativamente, ou adicionalmente se o ajuste para cima não resultar em uma resposta melhorada, em alguns desses pacientes, o regime de tratamento pode ser descontinuado e substituído pelo tratamento com outros agentes, como um estabilizador de tetrâmero de TTR, um terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense, um terapêutico à base de interferência de RNA (RNAi) ou doxiciclina mais ácido tauroursodesoxicólico.
[0358] Em alguns pacientes, a quantidade de TTR mal dobrada, TTR multimérica mal dobrada, depósitos de transtirretina ou ligação de anticorpo anti- TTR pode aumentar de maneira semelhante ou maior à TTR mal dobrada, TTR multimérica mal dobrada, depósitos de transtirretina ou ligação de anticorpos anti- TTR em pacientes que não recebem tratamento. Se esses aumentos persistirem por um período de tempo, o tratamento pode, se desejado, ser descontinuado em favor do tratamento com um ou mais outros agentes.
[0359] Os métodos de diagnóstico com anticorpos divulgados neste documento podem ser realizados em combinação com um segundo anticorpo anti- TTR que se liga a um epítopo diferente daquele de 9D5 ou 18C5, por exemplo, um anticorpo conforme divulgado na Tabela 3.
[0360] Os ensaios divulgados neste documento também podem ser usados para avaliar o engajamento alvo (efeitos farmacodinâmicos) de TTR mal dobrada não ligada (livre) em uma amostra biológica de um sujeito por um anticorpo sendo usado ou testado para uso em tratamento. Um tal anticorpo é referido no presente ensaio como sendo um anticorpo de teste porque está sendo testado quanto ao seu engajamento alvo. No presente ensaio, a amostra biológica pode ser uma alíquota de uma amostra maior, referida como amostra coletada, de modo que o ensaio possa ser executado de maneira paralela de várias alíquotas da amostra coletada. O anticorpo de teste compete com o anticorpo de captura (ou alternativamente o anticorpo repórter) pela ligação à TTR. O anticorpo de teste pode se ligar ao mesmo epítopo que o anticorpo de captura (ou o anticorpo repórter). O ensaio em sanduíche descrito acima pode ser executado em paralelo para a primeira e a segunda alíquotas de uma amostra coletada, que geralmente são do mesmo volume. Uma alíquota é suplementada com o anticorpo de teste e as duas alíquotas são suplementadas com anticorpos de captura e repórter. Na alíquota sem o anticorpo de teste, a detecção do anticorpo repórter como parte de um sanduíche fornece uma indicação da presença e quantidade de TTR mal dobrada em uma amostra. Na alíquota com o anticorpo de teste, a detecção de uma quantidade reduzida de anticorpo repórter como parte de um sanduíche em relação à alíquota sem o anticorpo de teste fornece uma indicação de que o anticorpo de teste está se ligando à TTR mal dobrada e, assim, competindo com o anticorpo de captura ou repórter e reduzindo a formação de um sanduíche entre o anticorpo de captura, TTR mal dobrada e o anticorpo repórter. Esse ensaio pode ser realizado em alíquotas adicionais contendo quantidades crescentes do anticorpo de teste (bem como anticorpo de captura) para caracterizar ainda mais a ligação do anticorpo de teste à TTR mal dobrada. A amostra pode ser de um sujeito com amiloidose por TTR. A amostra pode ser de um sujeito com uma amiloidose hereditária por TTR. O sujeito com uma amiloidose hereditária por TTR pode apresentar uma mutação selecionada do grupo que consiste em V30M, Y114C, G47R, S50I, E61L, T49S, F33V, A45T, ES9K, E89Q e V1221. Em alguns desses ensaios, a amostra biológica é uma amostra de plasma. Em alguns desses ensaios, o ensaio é realizado com um anticorpo de captura 9D5 ou 18C5 e um anticorpo policlonal anti-TTR repórter. Tal ensaio pode ser usado para informar sobre o engajamento alvo em ensaios clínicos de um anticorpo pretendido ao uso terapêutico, conforme divulgado neste documento. Em alguns desses ensaios, o anticorpo de teste é 14G8 e o ensaio é realizado com um anticorpo de captura 9D5 ou 18C5 e um anticorpo policlonal anti-TTR repórter.
[0361] Os ensaios divulgados neste documento podem ser usados para medir efeitos farmacodinâmicos de terapias direcionadas a formas de TTR mal dobradas. Em alguns desses ensaios, o engajamento alvo de mis-TTR não ligada (livre) em uma amostra biológica é medido após tratamento ex vivo (adição) de uma amostra biológica com um anticorpo de teste. Os ensaios divulgados neste documento também podem ser usados para medir a eficácia de um anticorpo de teste em um paciente. As amostras biológicas são coletadas de um paciente antes e após o tratamento com um anticorpo de teste. Em alguns desses ensaios, o engajamento alvo de mis-TTR não ligada (livre) em uma amostra biológica é medido após tratamento in vivo de uma amostra biológica com um anticorpo de teste. Em alguns ensaios, o alvo do anticorpo de teste é um epítopo dentro dos resíduos 89-97 de TTR. Em alguns ensaios, o alvo do anticorpo de teste é um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR.
[0362] Os métodos presentes também permitem a distinção de uma amiloidose mediada por transtirretina de uma amiloidose não-TTR, por exemplo, amiloidose amiloide de cadeia leve (AL), também conhecida como amiloidose sistêmica primária.
IX. Kits
[0363] A invenção fornece adicionalmente kits (por exemplo, recipientes) compreendendo os anticorpos 9D5 ou 18C5 divulgados neste documento e materiais relacionados, tais como instruções para uso (por exemplo, bula). As instruções para uso podem conter, por exemplo, instruções para administração dos anticorpos e, opcionalmente, um ou mais agentes adicionais. Os recipientes de anticorpos podem ser doses unitárias, embalagens em lote (por exemplo, embalagens multidose) ou doses de subunidade.
[0364] Bula se refere às instruções habitualmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contraindicações e/ou avisos quanto ao uso de tais produtos terapêuticos
[0365] Os kits também podem incluir um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), soro fisiológico tamponado com fosfato, solução de dextrose e solução de Ringer. Eles podem incluir também outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
X. Outras Aplicações
[0366] Os anticorpos podem ser usados para detectar formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de transtirretina (TTR), ou fragmentos destes, no contexto de diagnóstico ou tratamento clínico ou em pesquisa. Por exemplo, os anticorpos podem ser usados para detectar a presença de formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR em uma amostra biológica como indicação de que a amostra biológica compreende depósitos de amiloides TTR. A ligação dos anticorpos à amostra biológica pode ser comparada à ligação dos anticorpos a uma amostra de controle. A amostra de controle e a amostra biológica podem compreender células da mesma origem do tecido. Amostras de controle e amostras biológicas podem ser obtidas a partir do mesmo indivíduo ou indivíduos diferentes e na mesma ocasião ou em ocasiões diferentes. Caso desejado, múltiplas amostras biológicas e múltiplas amostras de controle são avaliadas em várias ocasiões para proteger contra variações aleatórias, independentemente das diferenças entre as amostras. Uma comparação direta pode ser feita entre a(s) amostra(s) biológica(s) e a(s) amostra(s) de controle para determinar se a ligação do anticorpo (ou seja, a presença de formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrlas de TTR) nas amostras biológicas é aumentada, diminuída ou a mesma em relação à ligação do anticorpo às amostras de controle. O aumento da ligação do anticorpo à(s) amostra(s) biológica(s) em relação à(s) amostra(s) de controle indica a presença de formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR na(s) amostra(s) biológica(s). Em alguns casos, o aumento da ligação do anticorpo é estatisticamente significativo. Opcionalmente, a ligação do anticorpo à amostra biológica é pelo menos 1,5 vezes,
2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes ou 100 vezes superior à ligação do anticorpo à amostra de controle.
[0367] Além disso, os anticorpos podem ser usados para detectar a presença de formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR em uma amostra biológica para monitorar e avaliar a eficácia de um agente terapêutico que é usado para tratar um paciente diagnosticado com amiloidose por TTR. Uma amostra biológica de um paciente diagnosticado com uma amiloidose por TTR é avaliada para estabelecer uma linha de base para a ligação dos anticorpos à amostra (ou seja, uma linha de base para a presença das formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR na amostra) antes de iniciar a terapia com o agente terapêutico. Em alguns casos, várias amostras biológicas do paciente são avaliadas em múltiplas ocasiões para estabelecer uma linha de base e uma medida de variação aleatória independente do tratamento. Um agente terapêutico é então administrado em regime. O regime pode incluir várias administrações do agente durante um período de tempo. Opcionalmente, a ligação dos anticorpos (ou seja, presença de formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR) é avaliada em múltiplas ocasiões em múltiplas amostras biológicas do paciente, tanto para estabelecer uma medida de variação aleatória quanto para mostrar uma tendência em resposta à imunoterapia. As várias avaliações da ligação do anticorpo às amostras biológicas são então comparadas. Se apenas forem feitas duas avaliações, pode-se fazer uma comparação direta entre as duas avaliações para determinar se a ligação do anticorpo (ou seja, a presença de formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR) aumentou, diminuiu ou permaneceu igual entre as duas avaliações. Se mais de duas medidas forem feitas, as medidas podem ser analisadas como um curso de tempo que começa antes do tratamento com o agente terapêutico e após o curso da terapia. Em pacientes para os quais a ligação de anticorpos a amostras biológicas diminuiu (ou seja, a presença de formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR), pode-se concluir que o agente terapêutico foi eficaz no tratamento da amiloidose por TTR no paciente. A diminuição na ligação do anticorpo pode ser estatisticamente significativa. Opcionalmente, a ligação diminui em pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%. A avaliação da ligação do anticorpo pode ser feita em conjunto com a avaliação de outros sinais e sintomas de amiloidose por TTR.
[0368] Os anticorpos também podem ser usados como reagentes de pesquisa para pesquisas laboratoriais na detecção de formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR, ou fragmentos destes. Em tais usos, os anticorpos podem ser marcados com moléculas fluorescentes, moléculas, enzimas ou radioisótopos marcados por rotação e podem ser fornecidos na forma de kit com todos os reagentes necessários para realizar o ensaio de detecção. Os anticorpos também podem ser usados para purificar formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR, ou parceiros de ligação de formas monoméricas, mal dobradas, agregadas ou de fibrilas de TTR, por exemplo, por cromatografia de afinidade.
[0369] Os anticorpos também podem ser usados para inibir ou reduzir a agregação de TTR, inibir ou reduzir a formação de fibrilas de TTR, reduzir ou depurar depósitos de TTR ou agregados de TTR ou estabilizar conformações não tóxicas de TTR em uma amostra biológica. A amostra biológica pode compreender, por exemplo, sangue, soro, plasma ou tecido (por exemplo, tecido do coração, sistema nervoso periférico, sistema nervoso autônomo, rins, olhos, gordura abdominal ou trato gastrointestinal). Em alguns casos, a agregação de TTR, a formação de fibrila de TTR ou os depósitos de TTR são inibidos ou reduzidos em pelo menos 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou 75%, (por exemplo, 10% -75% ou 30% -70%). Os ensaios para detectar a formação de fibrilas são descritos em outro lugar neste documento. Ver também US 2014/0056904.
[0370] Todos os pedidos de patentes, sites, outras publicações, números de acesso e semelhantes citados acima ou abaixo são incorporados a este documento por referência na sua totalidade para todos os fins na mesma medida como se cada item individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser assim incorporado por referência. Se diferentes versões de uma sequência estão associadas com um número de acesso em momentos diferentes, a versão associada com o número de acesso na data de depósito efetiva do presente pedido é a que vale. A data de arquivamento eficaz significa a mais cedo dentre a data de depósito real ou de data de depósito de um pedido de prioridade referindo-se ao número de acesso, se aplicável. Da mesma forma se versões diferentes de uma publicação, website ou semelhantes são publicadas em momentos diferentes, a versão mais recentemente publicada na data do depósito efetivo da aplicação é a referida, salvo indicação em contrário. Qualquer característica, etapa, elemento, modalidade ou aspecto da invenção pode ser utilizado em combinação com qualquer outro, a menos que indicado especificamente de outra forma. Embora a invenção presente tenha sido descrita com certos detalhes por meio de ilustração e exemplo para fins de esclarecimento e clareza, ficará visível que certas alterações e modificações podem ser feitas dentro do escopo das reivindicações em anexo.
EXEMPLOS Exemplo 1. Preparação de materiais e reagentes Tabela 4 Materiais e reagentes para ensaios | aca assmantonvees| rece | manera 14G8 2,95 mg/ml em 1xPBS PB-0334 Prothena IgG anti- IRDye 800CW conjugado, Cat. 925-32210 LI-CCOR lcamundongo de |reconstituído com 0,5 mL cabra de HO h14G8 49,4 mg/mL em tampão | PNA PRX004 MSRO1 | Rentschler de formulação (25 mM de DS02 histidina, 230 mM de trealose, 0,02% de polissorbato 20, pH 6,5) Neutravidina Frasco de 10 mg Cat. 31000 ThermoFish reconstituído em er água então diluído para 1 Scientific mg/mL em PBS Padrão mis-TTR| 1 mg/mL de TTR de tipo PB-0216 Prothena da guanidina | selvagem em Guanidina HCI 6M 1x PBS MAb 9D5 anti- 1 mg/ml PS021017D Prothena TTR-biotina mal dobrada
Ab policlonal de 1 mg/ml PS022317A Prothena coelho anti-Hu TTR- SULFO- TAG (Dako) Mede a TTR humana Cat. AB 108895 Abeam Kit ELISA para total pré-albumina SULFO-T AG- PB-0386, Conjugado | Prothena camundongo- Lote nº 01302017ST- anti- TTR mal JML dobrada, Clone 18C5 Cat = catálogo; Hu = humano; mAb = anticorpo monoclonal; MSD = Meso Scale Discovery; TTR = transtirretina; mis-TTR = TTR mal dobrada; ST SULFO- TAG; PBS Solução Salina Tamponada com Fosfato pH 7,4.
[0371] Preparação de reagente
[0372] A biotinilação de 9D5: 1 mg/ml. de 9D5 em PBS foi biotinilada seguindo as instruções do fabricante, com exceção de um excesso de 10M de NHS- biotina (Thermo-Fisher Cat. 21329) ao anticorpo que foi utilizado em vez de um excesso de 20M.
[0373] SULFO-TAG de coelho anti-TTR pAb: Anticorpo (Cat. Nº AO00202-2, Dako, Agilent Technologies, Inc, Santa Clara, CA) foi diluído para 1 mg/mL em PBS e depois dessalinizado usando uma coluna de rotação Zeba (ThermoFisher Scientific). Foram adicionados 50 ul. de H2O fria ao SULFO-TAG para reconstituir e depois o material foi submetido a vórtice. 2,2 ul de SULFO-TAG reconstituído foram adicionados a 50 ul de anticorpo diluído, agitados em vórtice, incubados 2 horas a RT e armazenados no escuro a 4C.
[0374] Preparação do padrão de TTR mal dobrada de Guanidina HCl: A TTR humana desnaturada foi preparada incubando 1 mg/ml de TTR recombinante humana purificada de tipo selvagem em 1xPBS contendo cloridrato de guanidina 6M por 24 horas a 4ºC, depois aliquotada e congelada a -70ºC.
Exemplo 2. Método ECL para determinação de TTR mal dobrada livre no plasma
[0375] TTR mal dobrada (não ligada) livre, incluindo monômero, foi detectada no plasma humano usando um método quantitativo de pesquisa ECL (Meso Scale Discovery; MSD). Uma placa MSD de 96 poços foi revestida com 30 uL por poço de 4 ug/mL de neutravidina em PBS, incubada durante a noite a 4ºC e lavada três vezes em TBS contendo 0,05% de Tween 20. As placas tinham sítios de ligação não específicos bloqueados com MSD Blocker A a 3% (MSD nº: R93BA- 4) em PBS durante 1 hora a temperatura ambiente com agitação e depois lavados três vezes. Adicionaram-se 30 ul de 9D5 biotinilado a 1 ug/mlL em tampão de ensaio (1% MSD Blocker A/PBS +0,05% Tween-20) a cada poço e incubou-se 1 hora à temperatura ambiente com agitação. A curva padrão foi preparada a partir de uma alíquota fresca de TTR em guanidina HCI 6M diluída em Diluente 2 (MSD nº: R51BB-3). A Curva Padrão consistiu em sete diluições de 4 vezes, começando em 200 ng/mL, terminando em 49 pg/mL. O plasma do paciente ou controle foi diluído 1:5 no Diluente MSD 2. Foi adicionado plasma padrão ou diluído (30 ul) às placas em duplicado, incubado à temperatura ambiente com agitação durante 2 horas e depois lavado. 30 ul do marcador policlonal anti-TTR SULFO-TAG ((Cat. Nº AOO0202-2, Dako, Agilent Technologies, Inc, Santa Clara, CA) a 1 ug/ml em tampão de ensaio foi adicionado a cada poço, incubado durante 1 hora com agitação e depois lavado. Foram adicionados 150 yl/poço de 1X MSD Read Buffer T (MSD nº: R92TC-1) a cada poço e lidos dentro de 10 minutos em um MSD Sector Imager S600. O padrão superior e inferior eram pontos de ancoragem e a curva tinha um intervalo quantitativo no plasma puro de 1 a 500 ng/mL equivalentes com base no padrão guanidina-HCI TTR.
Exemplo 3. Bioanálise de TTR mal dobrada livre em paciente com amiloidose por TTR PLASMA
[0376] Os níveis individuais e médios de TTR mal dobrada livre (ng-eq/mL) em paciente com amiloidose por TTR e plasma normal combinado de duas ocasiões de ensaio são mostrados na Figura 1.
[0377] Resultados são mostrados na Figura 1. A primeira coluna (marcada como "h-ATTR assintomática”) mostra resultados para pacientes assintomáticos com amiloidose hereditária por TTR. A segunda coluna (marcada como "h-ATTR- taf") mostra os resultados para pacientes com amiloidose hereditária por TTR tratados com tafamidis. A terceira coluna (marcada como "h-ATTR-sem tratamento”) mostra os resultados de pacientes não tratados com amiloidose hereditária por TTR. A quarta coluna (marcada como "h-ATTR fígado TX") mostra os resultados para pacientes com amiloidose hereditária por TTR com transplante de fígado. A quinta coluna (marcada como "WT-ATTR") mostra os resultados para pacientes com amiloidose por ATTR do tipo selvagem. A sexta coluna (marcada como "Normal") mostra os resultados para voluntários saudáveis. Os pontos são dados individuais e as barras são médias e SD. * 0,01-0,05, ** 0,0005-0,0099, ***0,0001-0,005 e **** < 0,0001 em comparação ao controle normal (teste não paramétrico de Kruskal-Wallis com ajuste de multiplicidade de Dunn).
[0378] Abreviações usadas na Figura 1: assintomático = assintomático; ATTR = transtirretina amiloide; eq = equivalentes; GuHCL = cloridrato de guanidina; h = hereditário; mis = mal dobrada; std = padrão; Tx = transplante; wt = tipo selvagem
[0379] Entre pacientes com amiloidose hereditária por TTR, houve níveis médios significativamente mais altos de TTR mal dobrada em pacientes não tratados, incluindo a exibição de carreadores assintomáticos mostrando a TTR mal dobrada antes dos sintomas da doença e os pacientes tratados com tafamidis ainda mostram TTR mal dobrada circulante, no entanto no fígado os níveis de pacientes transplantados foram semelhantes aos controles normais, com pouca ou nenhuma TTR mal dobrada detectável. As concentrações médias de TTR mal dobrada nas amostras de pacientes com amiloidose hereditária por TTR com níveis elevados variaram de 32 a 59 ng-eq/ml em comparação com 4 ng-eq/mlL em controles normais. Os pacientes com transplante hepático com amiloidose hereditária por TTR produzem TTR normalmente dobrada, resultando em níveis de TTR mal dobrada, semelhantes aos sujeitos normais e saudáveis. As amostras de pacientes com amiloidose por ATTR do tipo selvagem, com exceção de um único aberrante, também apresentaram pouca ou quase nenhuma TTR mal dobrada detectável semelhante ao plasma normal, sugerindo que a má dobradura da TTR pode ocorrer localmente no tecido afetado e a TTR mal dobrada não circula facilmente neste subconjunto de pacientes com amiloidose por ATTR do tipo selvagem.
[0380] Entre os valores aberrantes observados nas amostras de pacientes tratados com tafamidis (1 TTR baixa mal dobrada) e amiloidose por ATTR do tipo selvagem (1 TTR alta mal dobrada), não está claro se os valores divergentes representam variação normal do paciente ou foram devidos a erro processual (ou seja, marcação errada inadvertida de amostras). Como resultado, todos os valores relatados foram incluídos nas avaliações de dados.
[0381] Além disso, o ensaio é capaz de detectar TTR mal dobrada no plasma de pacientes com amiloidose hereditária por TTR carreando mutações na posição 89 dentro do epítopo 9D5 da TTR. Duas mutações (E89K e E89Q) que se enquadram no epítopo 9D5 (resíduos de aminoácidos 89-97) não afetaram a ligação de 9D5 no ensaio. Enquanto o mapeamento de alanina do epítopo mostrou que esse resíduo era menos importante para a ligação de anticorpos, não se sabia se as substituições que não eram conservadas, por exemplo, aminoácido de ácido a básico (E89K) ou carregados a não carregados (E89Q) afetariam a ligação de anticorpos. As setas na Figura 1 indicam essas substituições e a adequação do ensaio para mutações nesse aminoácido. A Tabela 5 mostra todas as amostras testadas e os resultados no ensaio policlonal 9D5-Dako.
Tabela 5 Amostras testadas e os resultados do ensaio 9D5-Dako TTR mal Colaborador Mutação de dobrada ID Idade TTR Tratamento | (ng-eq/mL) 1 8120326 B7 M 30M Fígado TX jd 2 16091078 67 F 30M Não tratadas /24 4 3098983 144 M 30M Fígado TX Hd 98084122 144 F N114C ITafamidis 26 6 1051830 45 F 30M Fígado TX BB 7 12004496 44 M 30M Fígado TX BB 8 16032804 74 M 30M Não tratadas (27 13097486 39 M NV30M ITafamidis 26 1 11017266 Bo F 30M Fígado TX BB 12 14094510 72 M 30M ITafamidis 27 13 14053483 66 M 30M ITafamidis 29 14 96038112 53 F NV30M Fígado TX PR 11019596 48 M NV30M ITafamidis B3
16 8099635 44 F 30M Fígado TX
17 8110529 41 F 30M ITafamidis 5 18 16015447 52 M G47R Fígado TX
19 95023663 54 F NV30M Fígado TX BB 120 4080271 B8 M 114C ITafamidis 29 21 16012192 B4 M S50!1 Assintomático/19 22 84041739 54 F NV30M Fígado TX BB 23 98063581 38 F 18501 Assintomático/24 24 16123223 24 M 30M Não tratadas 35 15085485 B5 F NV30M ITafamidis 30 126 5069417 B7 F NV30M Fígado TX Po pes E E or re E
TTR mal Colaborador TTR dobrada
ID Idade Mutação [Tratamento |(ng-eq/mL) 28 8099602 7O F V30M [Tafamidis 37 29 16050297 27 F G47R —jAssintomático 48 80 16013388 68 F V30M ITafamidis 63 B1 94045408 63 F V30M |FígadoTX 5 32 9105775 48 M V30M |FígadoTX 8 33 8127510 42 F V30M Assintomático 66 34 16129566 62 M E61L ITafamidis 4 B5 9007376 34 F V30M Assintomático 88 36 98029314 41 F V30M Assintomático T7 B7 15030924 | 26 M | V30M A Ssmtomátco 80 | 38 15030913 27 F V30M Assintomático 90 39 17032391 39 M T49S —jAssintomático 15 40 12120567 64 M V30M ITafamidis 56 E sem Ta ve a es Te vv Wo ps er 7a o ve E TRAS [5] E eee 7 rosas aa | rag SSA-1 [15090038 81 M Wwt-ATTR |Não tratadas 6 ISSA-2 j85017908 84 F Wwt-ATTR |Não tratadas 6 SSA-3 16023646 78 M Wwt-ATTR |Não tratadas 6 N1 n/a 38 M Normal n/a 7 N2 n/a 22 F Normal n/a 3 N3 n/a | 24 | F | Normal na 4 N4 n/a 42 M Normal n/a 4 N5 n/a 29 F Normal n/a 3 N6 n/a 34 F Normal n/a 3 N7 n/a 51 M Normal n/a 3 N8 n/a 30 M Normal n/a 4
Nº n/a 28 M Normal n/a 6 103PA17002004 1 001 n/a M A45T — Assintomático 50 2 557722 n/a M E89K Assintomático 96 B 913320 n/a F ES89Q Não tratadas 32 4 03PA17000804| n/a F V122l Nãotratadas 18 03PA17002702| n/a M V30M Não tratadas 76 6 03PA17001104| n/a M Wwt-ATTR Não tratadas 96 7 103PA17001904| n/a M Wwt-ATTR Não tratadas 7 8 /|03PA17000704| n/a M Wwt-ATTR Não tratadas 7 Assintomático = assintomático; ATTR = transtirretina amiloide; eq = equivalentes; mis = mal dobrada; n/a = não aplicável; wt = tipo selvagem Exemplo 4. Ensaio de acoplamento ao alvo ex vivo em amostras de pacientes com amiloidose por TTR selecionadas com níveis elevados de TTR mal dobrada
[0382] Para medir a capacidade de um potencial anticorpo terapêutico mis- TTR (mM14G8, camundongo 14G8) de se ligar à mis-TTR plasmática (engajamento alvo), o plasma ATTR (V30M) com altos níveis de mis-TTR foi tratado ex vivo com quantidade crescente de m14G8. A ligação do m14G8 à mis-TTR plasmática (alvo) deve diminuir a quantidade de mis-TTR restante (livre) não ligada, pois os sítios de ligação ficam ocupados com o m14G8, resultando em uma diminuição dependente da concentração no sinal MSD e evidência de engajamento alvo por este mAb mis- TTR. A Figura 9 representa um diagrama desse ensaio de engajamento alvo.
[0383] Amostras de plasma de 12 pacientes com níveis elevados de TTR mal dobrada, conforme medido no ensaio de TTR mal dobrada, foram selecionadas para análise em um experimento de engajamento alvo, para mostrar que m14G8 (camundongo 14G8) reduz os níveis de TTR mal dobrada quando adicionada em plasma do paciente. Como o 9D5 (ligante da placa MSD) e o m14G8 se ligam ao mesmo epítopo e competem pela TTR mal dobrada livre, o ensaio quantifica efetivamente a TTR mal dobrada livre não ligada a m14G8 (ou seja, ligada ao 9D5), resultando em uma redução na detecção do sinal ECL quando competido contra m14G8 ligado a TTR mal dobrada. O plasma puro do paciente com amiloidose por TTR foi aumentado com um cravado de concentrações de m14G8 (0, 12, 40, 120,
400 ou 1200 ug/mL) e incubado por 30 minutos em temperatura ambiente. As amostras foram diluídas 1:5 e o ensaio e as curvas padrão foram executadas conforme descrito no Exemplo 2.
[0384] A Figura 2 mostra a curva de competição de anticorpos para amostras de plasma de pacientes com amiloidose por TTR exemplificativas com níveis elevados de TTR mal dobrada indicando níveis livres de TTR mal dobrada (%) na presença de concentrações crescentes de m14G8.
[0385] Abreviações usadas na Figura 2: EC50 = concentração efetiva de 50% (livre/não ligada a m14G8); mis = mal dobrada
[0386] Média (ponto) e SD (bar) de 12 amostras individuais de plasma h- ATTR (cada valor de pico da amostra normalizado ao seu sinal ECL pré-pico em O NM m14G8 no plasma, isto é, 100% de TTR mal dobrada não ligada). Linha representa ajuste de curva não-linear sigmoidal assimétrica dos dados.
[0387] O fundo alto foi compensado subtraindo o sinal de fundo na competição máxima. Uma vez que o bioensaio apenas detecta TTR mal dobrada não ligada a m14G8 (TTR mal dobrada livre), a ligação de TTR mal dobrada a m14G8 resulta em sinal ECL diminuído com m14G8 aumentado no plasma. Consequentemente, foi observada uma redução dependente da concentração de m14G8 nos níveis de TTR mal dobrada livre (%), confirmando que o m14G8 foi capaz de direcionar (ligar) a TTR mal dobrada (incluindo monômero) no plasma h- ATTR do paciente a um EC50 estimado de 343 nM (-50 pg/mL). Este ensaio é usado para informar sobre o engajamento alvo em ensaios 14G8.
Exemplo 5: Método ECL para determinação de TTR mal dobrada livre no plasma (9D5/18C5)
[0388] Método: TTR mal dobrada livre (não ligada), incluindo monômero, foi detectada no plasma humano usando um método de pesquisa de ensaio ECL quantitativo (Meso Scale Discovery; MSD). Uma placa MSD de 96 poços foi revestida com 30 uL por poço de 4 ug/mL de neutravidina em PBS, incubada durante a noite a 4ºC e lavada três vezes em TBS contendo 0,05% de Tween 20. As placas tiveram sítios de ligação não específicos bloqueados com 3% de MSD Blocker A em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação e depois lavados três vezes. Foram adicionados 30 ul de 9D5 biotinilado a 1 ug/ml em tampão de ensaio (1% MSD Blocker A/PBS +0,05% Tween-20) a cada poço e incubados durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação. A curva padrão foi preparada a partir de uma alíquota fresca de TTR em guanidina HCI 6M diluída em Tampão de Ensaio. A Curva Padrão consistiu em sete diluições de 5 vezes, começando em 1000 ng/mL, terminando em 64 pg/mL. O plasma do paciente ou controle foi diluído 1:5 em Tampão de Ensaio. Foi adicionado plasma padrão ou diluído (30 ul) às placas em duplicado, incubado à temperatura ambiente com agitação durante 1 hora e depois lavado. Foram adicionados 30 ul do 18C5 marcado com SULFO-TAG a 1 ug/iml em tampão de ensaio a cada poço, incubados durante 1 hora com agitação e depois lavados. Foi adicionado 150 ul/poço de 1X MSD Read Buffer T a cada poço e lido dentro de 10 minutos em um MSD Sector Imager S600. O padrão superior e inferior eram pontos de ancoragem e a curva tinha um intervalo quantitativo no plasma puro de 1,6 a 1000 ng/ml equivalentes com base no padrão guanidina-HCI TTR.
[0389] Os resultados são mostrados na Figura 3. A primeira coluna (marcada como "h-ATTR assintomático”) mostra resultados para pacientes assintomáticos com amiloidose hereditária por TTR. A segunda coluna (marcada como "h-ATTR- taf") mostra os resultados para pacientes com amiloidose hereditária por TTR tratados com tafamidis. A terceira coluna (marcada como "h-ATTR-sem tratamento”) mostra os resultados de pacientes não tratados com amiloidose hereditária por TTR. A quarta coluna (marcada como "h-ATTR fígado TX") mostra os resultados para pacientes com amiloidose hereditária por TTR com transplante de fígado. A quinta coluna (marcada como "Normal") mostra os resultados para pacientes normais.
[0390] Os pontos são dados individuais e as barras são médias e SD. * 0,01- 0,05, ** 0,0005-0,0099, ***0,0001-0,005 e **** < 0,0001 em comparação ao controle Normal (teste não paramétrico de Kruskal-Wallis com ajuste de multiplicidade de Dunn).
[0391] Abreviações usadas na Figura 3: assintomático = assintomático; ATTR = transtirretina amiloide; eq = equivalentes; GuHCI = cloridrato de guanidina; h = hereditário; mis = mal dobrada; std = padrão; Tx = transplante; wt = tipo selvagem Exemplo 6. Preparação do imunógeno e imunização ou camundongos para 18C5
[0392] Os camundongos BALB/c e C57BL/6 fêmeas foram injetados com transtirretina manipulada com uma mutação em F87M e L110M, denominada mutante transtirretina dupla (TTR-DM). Injeção intraperitoneal! de 50 pg/camundongo por três injeções, seguida de 25 ug/camundongo por 3 injeções e ug/camundongo por 4 injeções de TTR-DM emulsionada em adjuvante RIBI foram injetadas semanalmente usando 5 BALB/c, adicionalmente 5 C57BL/6 camundongos foram injetados por 3 injeções a 50 ug/camundongo, 3 injeções a 25 upg/camundongo e 4 injeções a 10 ug/icamundongo emulsionados em adjuvante RIBI. Os camundongos foram titulados contra a TTR-DM, TTR tetramérica nativa e his-MCAM. Camundongos com os títulos mais altos para TTR-DM e títulos mais baixos para TTR tetramérica nativa e his-MCAM (BALB/c nº1 e 5 e C57BL/6 nº4 e 5) foram fundidos por uma modificação de Kohler e Milstein. Os hibridomas resultantes foram triados contra TTR-DM, TTR tetramérica nativa e his-MCAM. Os hibridomas mostrando especificidade à TTR-DM foram clonados e posteriormente caracterizados. 18C5 foi identificado.
Exemplo 7. Caracterização de 18C5 pelo BlAcore
[0393] A análise foi realizada usando um Biacore T200 para comparar a afinidade de ligação de anticorpos murinos à TTR humana recombinante desnaturada em Cloridrato de Guanidina 6M (Gu-hTTR), TTR Cynomolgus desnaturada em Cloridrato de Guanidina 6M (Gu-cTTR) e TTR tetramérica humana nativa. O anticorpo anti-ccamundongo foi imobilizado no chip sensor CM3 (GE Healthcare Life Sciences) via acoplamento de amina e os anticorpos murinos (ligante) foram capturados a um nível para garantir uma ligação máxima do analito de 50 RU (aproximadamente 250 RU de ligação ao ligante). Várias concentrações de Gu-TTR (variando de 0,4 nM a 100 nM) foram passadas sobre o ligante capturado a 50 uL/min em tampão de execução (HBS + 0,05% P-20, 1 mg/mL BSA, 50 mM Gu-HCl) para tempo de associação de 300s e tempo de dissociação de 900s. A regeneração da superfície do chip foi realizada por 2 injeções curtas de glicina-HCI 10 mM a pH 1,7. As concentrações de GucTTR utilizadas variaram de 1-1000 nM, enquanto as concentrações de tetrâmero de TTR humana variaram de 10 nM a 10.000 nM. Os dados foram subtraídos em branco para um sensor que não continha ligante e concentração de analito O nM. A análise foi realizada usando um ajuste global 1:1 com o software Biacore Evaluation (v3.0) com índice de refração em massa definido como zero RU. Os dados de ligação são apresentados na Tabela 6. Tabela 6 Dados de ligação de 18C5 em relação à TTR humana mal dobrada e TTR de Cynomolgus mal dobrada e o tetrâmero de TTR humana. TTR humana mal | 1,4X105º | 6,2X10º 5,9 nM me TTR Cynomolgus | 1,0X10º | 9,2XK10º Ligação mínima na concentração EIS e e meçaao Tetrâmero de TTR | 2,2X10º | 2,2XK10º [Ligação mínima na concentração
ESA Exemplo 8. Caracterização de 18C5 quimérica pelo BIAcore
[0394] A análise foi realizada usando um Biacore T200 para comparar a afinidade de ligação de anticorpos murinos e quiméricos à TTR humana recombinante desnaturada em Cloridrato de Guanidina 6M (Gu-hTTR). O anticorpo anti-humano foi imobilizado nas células de fluxo 1 e 2, o anticorpo anti-ccamundongo foi imobilizado nas células de fluxo 3 e 4 no chip sensor CM3 (GE Healthcare Life Sciences) via acoplamento de amina, os anticorpos quiméricos e murinos 18C5 (ligante) foram capturados para um nível para garantir uma ligação máxima do analito de 50 RU (aproximadamente 250RU de ligação ao ligante). Várias concentrações de Gu-TTR (variando de 0,4 nM a 100 nM) foram passadas sobre o ligante capturado a 50 ul/min em tampão de execução (HBS + 0,05% P-20, 1 mg/ml BSA, 50 mM Gu-HCl) para tempo de associação de 300s e tempo de dissociação de 900s. A regeneração da superfície do chip foi realizada através de 2 injeções curtas de cloreto de magnésio 3M ou 2 injeções curtas de glicina-HCI 10 mM a pH 1,7. Os dados foram subtraídos em branco para um sensor que não continha ligante e concentração de analito O nM. A análise foi realizada usando um ajuste global 1:1 com o software Biacore Evaluation (v3.0) com índice de refração em massa definido como zero RU. Os dados de ligação são apresentados na Tabela 7.
[0395] Uma sequência de aminoácidos da região variável madura da cadeia pesada de um anticorpo 18C5 quimérico é fornecida como SEQ ID NO: 81, uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve madura de um anticorpo quimérico 18C5 é fornecida como SEQ ID NO: 87, uma sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada humana de SEQ ID NO: 17 e uma sequência de aminoácidos da região constante da cadeia leve humana de SEQ ID NO: 19.
[0396] Tabela 7. Dados de ligação de anticorpos murinos e quiméricos à TTR humana recombinante desnaturada em Cloridrato de Guanidina 6M (Gu-hTTR).
Exemplo 9. Mapeamento de epítopo de 18C5
[0397] O mapeamento inicial mostrou que o epítopo para 18C5 está dentro de 87-127 da SEQ ID NO: 26. Mapeamento adicional mostrou que o epítopo estava entre 101-109 da SEQ ID NO: 26. A afinidade muito mais baixa à TTR de Cynomolgus mal dobrada sugere que o aminoácido 104 é importante, pois esta é a única substituição de aminoácido entre a TTR humana e de Cynomolgus.
Exemplo 10. Sequência de 18C5
[0398] Clone de hibridoma 18C5 LA89 18C5. Utilizou-se o sedimento de células congeladas A1.A1 para extração e purificação de MRNA. O isolamento e a purificação do mRNA foram realizados usando o protocolo mini kit Oligotex MRNA direto (Qiagen, cat nº 72022). Resumidamente, as 9x10º células do clone de hibridoma foram lisadas e homogeneizadas na presença de tampão guanidina- isotiocianato altamente desnaturante, que inativa RNases. A suspensão de oligotex foi adicionada à mistura de lise, foi permitida a hibridação entre o oligo dT30 das partículas de oligotex e a cauda poli-A do MRNA. As contaminações foram então lavadas e o RNA poli-At foi eluído. O MRNA foi transcrito reversamente para CDONA usando o kit de amplificação de cDNA Marathon (Clontech, cat nº 634913). Um adaptador foi ligado ao terminal 5' do CDNA. O método RACE 5' foi utilizado para amplificar as regiões V. Iniciadores de consenso da região 5' V e iniciadores de ancoragem específicos da região constante foram utilizados para PCR. As regiões V amplificadas foram clonadas no vetor de clonagem de pTOPO e transformadas em Top10 E. coli. Foram criadas 15 a 20 colônias individuais e o plasmídeo purificado foi sequenciado. Uma sequência de clones era considerada uma sequência genuína da região V se atendesse aos seguintes critérios Sem códon de parada entre a região Met e C A sequência contém características principais das regiões do anticorpo V A sequência contém CDRs definíveis.
Mínimo de três clones independentes com ORF correspondente
[0399] As sequências de regiões variáveis determinadas foram clonadas em vetores de expressão e transfectadas em células CHOs. O anticorpo quimérico purificado foi caracterizado para ligação usando 18C5 murino como anticorpo de controle.
[0400] A sequência de aminoácidos variáveis da cadeia pesada madura de 18C5 é fornecida como SEQ ID NO: 81 e a sequência de aminoácidos variáveis da cadeia leve madura de 18C5 é fornecida como SEQ ID NO: 87. As sequências de aminoácidos CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da cadeia pesada composta de Kabat/Chothia são fornecidas como SEQ ID NOs 5,7 e 9, respectivamente. As sequências de aminoácidos CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da cadeia leve composta de Kabat/Chothia são fornecidas como SEQ ID NOs 11, 13 e 15, respectivamente.
Exemplo 11. Especificidade de 18C5 demonstrada por Análise de Western Blot
[0401] Para demonstrar a especificidade conformacional de 18C5 em relação à TTR não nativa (desnaturada), uma análise de Western blot foi realizada da seguinte maneira: Procedimento:
[0402] Géis SDS-poliacrilamida
[0403] TTR nativa: uma amostra de 1,0, 0,5 e 0,1 ug de TTR humana recombinante em tampão de amostra LDS (Life Technologies) foi executada em um gel NuPAGE bis-tris a 10% (tampão MES; 90 V, 105 min) e transferida para membranas de nitrocelulose para análise de Western blot.
[0404] TTR desnaturada: TTR humana recombinante foi preparada conforme descrito acima para a TTR nativa, exceto que o tampão de amostra de LDS continha agente redutor e as amostras foram desnaturadas por ebulição antes de SDS-PAGE.
[0405] Análise de Western blot
[0406] Os géis de SDS-PAGE foram transferidos para as membranas de nitrocelulose (iBlot, Life Technologies), tratados com tampão de bloqueio (LI-COR, Lincoln, NE) e incubados em anticorpo primário de 1,0 ug/mL, lavados com 1x TBS e colocados em 1:20.000 de diluição de anticorpo secundário de cabra-anti- camundongo ou anti-coelho conjugado com IRDye 800CW (LI-COR, Lincoln, NE), em seguida, fotografados em um gerador de imagens por infravermelho Odyssey CLx (LI-CCOR, Lincoln, NE).
[0407] Resultados e Conclusões:
[0408] O Western blot de TTR recombinante nativa vs. desnaturada (Figura 4) mostrou que 18C5 tinha reatividade muito fraca em relação a espécies nativas de TTR (Pistas 1-3), mas reatividade muito forte em relação ao monômero de TTR desnaturada (-15kDa) com menor reatividade em relação a dímero desnaturado (-30KkDa) (Pistas 5-7). A pista 4 mostra marcadores de peso molecular.
[0409] Em contraste, um anticorpo comercial TTR (Sigma, Nº de Catálogo HPAO002550), que não é conformacionalmente específico, não distinguiu entre TTR nativa versus TTR desnaturada e mostrou reatividade muito forte em relação à TTR nativa e desnaturada monomérica e dimérica (Figura 5). As pistas 1-3 mostram resultados para a TTR nativa; a pista 4 mostra marcadores de peso molecular e as pistas 5-7 mostram resultados para TTR desnaturada.
Exemplo 12. Uso de 18C5 em um potencial diagnóstico de amiloidose por
TTR
[0410] Um imunoensaio em sanduíche utilizando a plataforma de eletroquimioluminescência Meso Scale Discovery (MSD) foi usado para detectar TTR mal dobrada total (misTTR total) em amostras de plasma de pacientes. As amostras eram de pacientes normais e pacientes com amiloidose mediada por transtirretrina (ATTR). Pacientes com amiloidose mediada por transtirretrina (ATTR) apresentaram as seguintes mutações e tratamentos de TTR: ATTR (polineuropatia amiloide familiar V30M (FAP)) com transplante de fígado, ATTR (polineuropatia amiloide familiar V30M (FAP)) Sem tratamento, ATTR (polineuropatia amiloide familiar V30M) (FAP)) com Tafamidis, ATTR (polineuropatia amiloide familiar Y114C (FAP)) com Tafamidis e ATTR (S50I) sem tratamento.
[0411] Resumidamente, a placa padrão de MSD de 96 poços foi primeiro revestida com NeutrAvidin Protein (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), seguida de bloqueio com 3% de bloqueador A em PBS (MSD, Rockville, MD). 18C5 biotinilado foi então adicionado a cada poço a 0,5 ug/mL para capturar TTR mal dobrada. As amostras de plasma foram diluídas 5 vezes em bloqueador A com 1%/PBS antes de transferidas para a placa MSD, juntamente com a TTR desnaturada por guanidina como padrão de referência. Após incubação de 1 hora, a TTR mal dobrada ligada aos poços foi detectada com a TTR anti-humana de coelho policlonal marcada com SULFO-TAGTY (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Os sinais de quimiluminescência proporcionais à quantidade de TTR mal dobrada foram gerados pela adição de 1X MSD Read Buffer e capturados em um leitor de placas MESO SECTOR S 600.
[0412] Os resultados são mostrados na Figura 6. A primeira coluna (marcada como “ATTR”) mostra resultados para pacientes com amiloidose mediada por transtirretrina (ATTR) sem tratamento ou com tafamidis. A segunda coluna (marcada como "ATTR (fígado TX)" mostra resultados para pacientes com amiloidose mediada por transtirretrina (ATTR) com um transplante de fígado. À terceira coluna (marcada como "Normal") mostra os resultados para pacientes normais. 18C5 detectou TTR mal dobrada elevada em todos os pacientes, exceto um dos pacientes com amiloidose mediada por transtirretrina (ATTR) que não havia sido submetido a um transplante de fígado. Pacientes com amiloidose mediada por transtirretrina (ATTR) submetidos a um transplante de fígado e pacientes normais apresentaram baixos níveis de TTR mal dobrada, com uma exceção no grupo de transplante de fígado. Deve-se notar que os níveis são ng/ml equivalentes com base em uma curva padrão de TTR desnaturada por guanidina. Os dois pacientes com resultados anômalos foram coletados no mesmo dia e é possível que as amostras tenham sido trocadas quando distribuídas em alíquotas.
Exemplo 13. 18C5-18C5 para determinação de TTR multimérica mal dobrada
[0413] Um imunoensaio em sanduíche utilizando a plataforma de eletroquimioluminescência Meso Scale Discovery (MSD) foi usado para detectar
TTR multimérica mal dobrada total (misTTR multimérica total) em amostras de plasma de pacientes. As amostras eram de pacientes normais e pacientes com amiloidose mediada por transtirretrina (ATTR). Pacientes com amiloidose mediada por transtirretrina (ATTR) apresentaram as seguintes mutações e tratamentos de TTR: ATTR (polineuropatia amiloide familiar V30M (FAP)) com transplante de fígado, ATTR (polineuropatia amiloide familiar V380M (FAP)) Sem tratamento, ATTR (polineuropatia amiloide familiar V30M) (FAP)) com Tafamidis, ATTR (polineuropatia amiloide familiar Y114C (FAP)) com Tafamidis e ATTR (S50I) sem tratamento.
[0414] Placas MSD foram revestidas durante a noite com 4ug/ml de NeutrAvidin. As placas foram bloqueadas durante 1 hora com 3% de MSD Blocker A, depois lavadas 3x com solução salina tamponada com Tris com 0,1% de Tween- (TBS-T). Foi adicionado 1 ug/mL de 18C5 biotinilado por 1 hora, seguido de 3x lavagem com TBS-T. As amostras foram diluídas 5 vezes no diluente da amostra (PBS + BSA a 0,1% + Triton X-100 a 0,05%) e depois foram adicionadas à placa em duplicado. Uma curva padrão de TTR-DM foi utilizada variando na concentração de 64pg/mL a 1 ug/mL, com um branco de Oug/mL. As placas foram lavadas 3x com TBS-T, seguido de uma adição de 1 ug/umlL 18C5 marcado com MSD Sulfo- tag, no diluente da amostra e incubado por 1 hora. Finalmente, as placas foram lavadas 3x com TBS-T, e foram adicionados 150 ul de MSD Read Buffer Te as placas foram lidas no leitor de placas MESO SECTOR S 600. As amostras foram analisadas usando o MSD Discovery Workbench 4.0.
[0415] Os resultados são mostrados na Figura 7. A primeira coluna (marcada como “ATTR”) mostra resultados para pacientes com amiloidose mediada por transtirretrina (ATTR) sem tratamento ou com tafamidis. A segunda coluna (marcada como "ATTR (fígado TX)" mostra resultados para pacientes com amiloidose mediada por transtirretrina (ATTR) com um transplante de fígado. À terceira coluna (marcada como "Normal") mostra os resultados para pacientes normais. Embora poucas amostras fossem positivas para TTR multimérica, todos os positivos estavam nas amostras de pacientes com TTR, houve uma diferença estatística usando o teste de Kruskal Wallis com correção de Dunn de P = 0,04 com amostras de pacientes para pacientes com transplante de fígado e P = 0,004 entre pacientes e controles normais. Não houve significância entre os controles normais e os pacientes tratados com transplante de fígado.
Exemplo 14. 9D5 detecta níveis elevados de mis-TTR (monômeros e oligômeros de TTR mal dobrada) no plasma de pacientes com ATTR hereditária
[0416] Coleta de ATTR e plasma normal O sangue de pacientes com ATTR com diagnóstico positivo de ATTR hereditária (h-ATTR) e de tipo selvagem (WT-ATTR) foi coletado em tubos Vacutainer K2-EDTA de 7 ml e centrifugado para remover detritos celulares. As frações de plasma foram divididas em alíquotas em tubos de 1,5 ml LoBind Eppendorf e imediatamente congeladas. Amostras de plasma de voluntários normais saudáveis foram coletadas da mesma maneira. Todas as amostras foram usadas imediatamente após o descongelamento e não foram recongeladas. As amostras são como descritas na Tabela 5.
[0417] Análise do plasma ATTR por Western blot As amostras de plasma foram diluídas 10 vezes em tampão de amostra de dodecilsulfato de lítio (Life Technologies), carregadas (12 uL) em um gel NUPAGE bis-tris a 10%, submetidas a eletroforese a 90V por 105min., transferidas para uma membrana de nitrocelulose e sondadas com 1,0 ug/mlL mis-TTR 9D5 seguido de diluição 1:20.000 de anticorpo secundário de cabra-anti-camundongo conjugado com IRDye 800CW (LICOR). A mancha foi então lavada e fotografada em um gerador de imagens infravermelho Odyssey CLx (LI-COR). Os resultados são mostrados na Figura 8.
[0418] Legenda da Figura 8: MAb primário: 1 ug/ml 9D5; M, marcadores de peso molecular (BioRad); estrela negra sólida, pacientes com TTR-V30M transplantados não hepáticos; estrela hachurada, (Pacientes 5, 20) TTR-T114C; estrela aberta, (Pacientes 21,23) TTR-S50I; nenhuma estrela, transplante de fígado; 1IN-SN, normal (corresponde aos Pro IDs N1I-N5 na Tabela 5).
[0419] O anticorpo mis-TTR 9D5 específico da conformação detecta níveis elevados de espécies mis-TTR (monômeros e oligômeros) no plasma derivado de pacientes com ATTR hereditária. Por outro lado, o plasma de pacientes com ATTR hereditária submetidos à terapia de transplante de fígado apresentava níveis mal detectáveis de mis-TTR semelhantes aos do plasma de indivíduos normais.
Exemplo 15. Níveis elevados de mis-TTR no plasma de pacientes com ATTR hereditária
[0420] Coleta de ATTR e plasma normal
[0421] O sangue de pacientes com ATTR com diagnóstico positivo de ATTR hereditária (h-ATTR) e de tipo selvagem (WT-ATTR) foi coletado em tubos Vacutainer K2-EDTA de 7 ml e centrifugado para remover detritos celulares. As frações de plasma foram divididas em alíquotas em tubos de 1,5 ml LoBind Eppendorf e imediatamente congeladas. Amostras de plasma de voluntários normais saudáveis foram coletadas da mesma maneira. Todas as amostras foram usadas imediatamente após o descongelamento e não foram recongeladas. As amostras são como descritas na Tabela 5.
[0422] A mis-TTR total no plasma humano foi detectada usando um ensaio qualitativo de eletroquimioluminescência Meso Scale Discovery (MSD). As placas de MSD foram revestidas durante a noite com 4 ug/mL de NeutrAvidin, seguidas por 1 ug/mL de mis-TTR 9D5 biotinilado. As amostras de plasma foram diluídas 5 vezes no diluente da amostra (PBS + BSA a 0,1% + Tween-20 a 0,05%) antes da adição à placa. As placas foram lavadas com TBS-T, seguido pela adição de 1 ug/mL de anticorpo policlonal anti-TTR (Dako) marcado com MSD Sulfo-tag. As placas foram lavadas com TBS-T e lidas em um MSD Sector S 600 após a adição de 150uL/poço de MSD Read Buffer T diluído. As amostras foram analisadas usando o MSD Discovery Workbench 4.0.
[0423] Os resultados são mostrados na Figura 10.
[0424] Legenda da Figura 10: h-ATTR, ATTR hereditária; TX do fígado, transplante de fígado. Limites de quantificação (BLQ) de 1,0 ng/ml; Barras representam médias de grupo e SD; valores de p, teste de Mann-Whitney.
[0425] Os níveis de mis-TTR no plasma de pacientes com ATTR hereditária estão significativamente elevados em relação aos controles normais. Níveis elevados de mis-TTR também foram observados em indivíduos assintomáticos, genotipados positivamente para mutações na TTR. Níveis normais baixos (<10 ng/ml a BLQ) de mis-TTR foram observados no plasma de pacientes com ATTR hereditária que foram submetidos a tratamento de transplante de fígado.
Exemplo 7. Projeto de anticorpos 18C5 humanizados
[0426] O ponto de partida ou o anticorpo doador para humanização foi o anticorpo 18C5 de camundongo. A sequência de aminoácidos variável de cadeia pesada de m18C5 maduro é fornecida como a SEQ ID NO: 81. A sequência de aminoácidos variável de cadeia leve de m18C5 maduro é fornecida como a SEQ ID NO: 87. As sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada composta de Kabat/Chothia são fornecidas como as SEQ ID NOs: 5,7 e 9, respectivamente. As sequências de aminoácidos de Kabat de cadeia leve CDR1, CDR?2 e CDR3 são fornecidas como as SEQ ID NOs: 11, 13 e 15, respectivamente. A numeração de Kabat é usada ao longo de todo o documento.
[0427] Alinhamento das sequências de regiões variáveis de 18C5 com as sequências de consenso das regiões variáveis de anticorpos de Kabat, et al. indica que a região variável de cadeia pesada (VH) de 18C5 pertence ao subgrupo VH de camundongo 3b, que corresponde ao subgrupo VH humano 3. A região variável de cadeia leve kappa (VL) de 18C5 pertence ao subgrupo VKk de camundongo 2, que corresponde ao subgrupo VKk humano 2. [Kabat E.A,, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição. Publicação NIH Nº 91-3242.].
[0428] Os resíduos na interface entre os domínios Vk e Vh são os comumente encontrados, exceto que Ala está na posição 37 na cadeia pesada, enquanto tipicamente Val ou Ile está nessa posição. Leu na posição 95 em Vh é tipicamente Asp, Gly ou Ser. Essas posições são candidatas a mutações reversas. Para a cadeia Vk, Glu 34 é tipicamente Ala, His, Asn ou Ser, e essas posições são candidatas a mutações reversas.
[0429] As CDRs VH e VL de 18C5 foram identificadas usando as regras de identificação de CDRs baseadas em sequência de Martin. As CDRs foram então atribuídas às classes canônicas de Chothia usando o resumo dos principais resíduos apresentados na Tabela 3.5 de Martin (Martin ACR. (2010). In: Kontermann R e Dúbel S (eds). Antibody Engineering. Heidelberg, Germany: Springer International Publishing AG.): CDR-H1 consiste em 10 aminoácidos e é semelhante à classe canônica 1 de Chothia.
CDR-H2 consiste em 17 aminoácidos e é semelhante à classe canônica 3 de Chothia.
CDR-H3 consiste em 4 aminoácidos; não há classes para CDR-H3.
CDR-L1 consiste em 16 aminoácidos e é semelhante à classe canônica 4 de
Chothia.
CDR-L?2 consiste em 7 aminoácidos e é de classe canônica 1 de Chothia.
CDR-L3 consiste em 9 aminoácidos e é semelhante à classe canônica 1 de Chothia.
[0430] Uma pesquisa foi feita sobre as sequências de proteínas no banco de dados PDB [Deshpande et al, 2005, Nucleic Acids Research 33:D233-D237] para encontrar estruturas que forneceriam um modelo estrutural aproximado de 18C5. A estrutura cristalina do anticorpo murino anti-piroglutamato-Abeta Fab c nº 17 (código PDB 5MYK) [Piechotta, A. et al. (2017) J. Biol. Chem. 292: 12713-12724) foi usada para a estrutura Vh e Vk, uma vez que possuía boa resolução (1,6º) e semelhança geral da sequência com Vh e Vk de 18C5, mantendo as mesmas estruturas canônicas para as alças. O software Bioluminate foi usado para modelar uma estrutura aproximada de 18C5. Este software é licenciado pela Schrodinger Inc.
[0431] As frameworks VH e VL de 18C5 compartilham um alto grau de similaridade de sequência com as regiões correspondentes do Crenezumab Fab humanizado (CreneFab) PDB: 5VZY, projetado por Ultsch M, et al. ((2016) Sci Rep.6:39374) Os domínios variáveis de 18C5 e CreneFab também compartilham comprimentos idênticos para as alças CDR-H1, H2, L1, L2 e L3. As regiões de framework do CreneFab VH (5VZY-VH) e VL (5VZY-VL) foram escolhidas como sequências aceitadoras para as CDRs de 18C5. O software de Bioluminate foi utilizado para modelar a estrutura. Este software é licenciado pela Schrodinger Inc.
[0432] As sequências de variantes de cadeia pesada e leve resultantes do processo de humanização de anticorpos foram posteriormente alinhadas com as sequências de linhagem germinativa humana usando a ferramenta IMGT Domain GapAlign para avaliar a integridade humana das cadeias pesada e leve, conforme descrito pelas diretrizes do comitê WHO INN. (WHO-INN: International nonproprietary names (INN) for biological and biotechnological substances (a review) (Internet) 2014. Disponível em: http://www.who.int/medicines/services/inn/BioRev2014.pdf) Os resíduos foram alterados para se alinharem com a sequência da linhagem germinativa humana correspondente, quando possível, para aprimorar a integridade humana. Para a variante VL v2 humanizada, foi introduzida uma mutação Q45R para tornar a sequência mais semelhante ao gene da linhagem germinativa humana IGKV2- 30*02 (GenBank acc. Nº. CAA77315; SEQ ID NO:90). As sequências de aminoácidos que consistem nas frameworks CreneFab e CDRs 18C5 são designadas hu18C5-VH vi e hu18C5-VL v1.
[0433] Versões adicionais de hu18C5-VH e hu18C5-VL foram projetadas para permitir a avaliação de vários resíduos de framework por suas contribuições à ligação e imunogenicidade do antígeno. As posições consideradas para mutação incluem aquelas que: -definem as conformações canônicas de CDR (resumidas em Martin 2010), -estão dentro da zona Vernier (Foote J e Winter G. (1992). J Mol Biol. 224(2):487-99), -estão localizadas na interface do domínio VH/VL (resumida em Leger OJP e Saldanha J. (2000). Preparation of recombinant antibodies from immune rodent spleens and the design of their humanization by CDR grafting. In: Pastor P e Dean C (eds). Monoclonal Antibodies: a Practical Approach. Oxford, Reino Unido: Oxford University Press), - são suscetíveis a modificações pós-traducionais, como glicosilação ou piroglutaminação, - são ocupadas por resíduos que se chocam com CDRs, de acordo com o modelo de CDRs 18C5 enxertados em frameworks de Crenezumab Fab, ou - são ocupados por resíduos que são raros entre os anticorpos humanos sequenciados, nos quais o resíduo 18C5 do camundongo de origem ou algum outro resíduo é muito mais prevalente.
[0434] Foram construídas 2 variantes de região variável de cadeia pesada humanizada e 2 variantes de região variável de cadeia leve humanizada contendo diferentes permutações de substituições: hu18C5-VH vi e hu18C5-VH v2 (SEQ ID NOs: 85-86, respectivamente) e hu18C5-VL vi e hu18C5-VL v2 v6 (SEQ ID NOs: 91-92, respectivamente). (Tabelas 8 e 9). Os projetos exemplificativos de Vk e Vh humanizados, com mutações reversas e outras mutações baseadas em frameworks humanas selecionadas, são mostrados nas Tabelas 8 e 9, respectivamente. As áreas em negrito nas Tabelas 8 e 9 indicam as CDRs conforme definido pelo Composto de Kabat/Chothia. A “-” indica nenhum aminoácido na posição indicada. SEQ ID NOs: 86 e 92 contêm mutações reversas e outras mutações, como mostrado na Tabela 10. Os aminoácidos nas posições em hu18C5-VH vi e hu18C5-VH v2 estão listados na Tabela 11. Os aminoácidos nas posições em hu18C5-VL vi e hu18C5-VL v2 estão listados na Tabela 12. À porcentagem de integridade humana para as cadeias de VH humanizadas hu18C5- VH v1 e hu18C5- VH v2 (SEQ ID NOs: 85-86, respectivamente) com relação ao gene IGHV3-48*01 da linhagem germinativa humana mais semelhante e para as cadeias VL humanizadas hu18C5-VL vi e hu18C5-VL v2 (SEQ ID NOs: 91-92, respectivamente) em relação ao gene IGKV2-30*02 da linhagem germinativa humana mais semelhante, é mostrado na Tabela 13. Tabela 8: Regiões humanizadas de 18C5 VL Rr fa) S q ss õ cs " Zz x 2 o O o z > Z Z = x ds o o 2 26 | o E D 2 nu U = 3 3 3 COMO cs o > O — S Ç E N ã& - W, 2 o x 2 s rr a = = | SIE |5 3/3 o o O TE o o 3 | 318 | E 88) 8| & $ 8 e 5 [8 8S|s3| 5 % |X uu < 2 >) 0X X 1) 1Eo [Do | p | pjiop| La amo voa a V | L al aE |M|M |M|[M| 6 6a | 8 s8FEto |P| Pp | Pp] aa e E LL 12] Be Pe e 15) 15 Je 16 16 |Fr1 G G G G
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751 70 | 76) 7 FB |R| R |[R|R| | 7) rm | D| pD |DjoD| | 78 7a | N | N |N)N) | 8 753 | K| K |K| K| | 81 76 | N| N |NN)
84| 79 | 85] som | 61 | rt |L|t)| | 86 af [o | o jo o) | 87 8 | M | M |M|M) | e8B2A o | s | N [NAN
89/82B |Fr3 K Ss SIS
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[3] she [RR | RR [RIR [users o | o (pio) [ss] es a [A ada Lar Dr vv [ss so o ae oa 100] 2 nose [RR] ss (sr [o] osorH Lc | e [0/0 [io] askcprH= e [| ele) [Fo] rot Tr Do NT [os] oskcorH= e | ele) [Gon] sore NOLL NT [Go] oferta Do NT 109 tokcprH E | —[6/G| of fofepRHa WWW [mp oofeorH A LD [AA [Roe rt TITE [An] oofenre Do [a] ofepr DE
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[19] ofeora
[120] TofcprH3] D p “bj op) [AN] ofeora y o y y [12x of jap jaja) [fa vTr [Tv Farma TV TA
Tabela 10 Mutações reversas de VH, VL e outras mutações para 18C5 humanizado VARIANTE VH ou VL | Sequência Aceitadora de Éxon Mudanças dos VH ou VL Resíduos de Framework Aceitadora (com base nas CDRs do composto de Kabat/Chothia) Hu18C5-VH v1 (SEQ Aceitador 5VZY-VH huFrwk Nenhuma
ESC ID NO: 83) Hu18C5-VH v2(SEQ| Aceitador 5SVZY-VH huFrwk H37, H45, H47, H48, ID NO: 86) (CreneFab) Acc. Nº 5VZY (SEQ H49, H94 ID NO: 83) Hu18C5-VL vi (SEQ Aceitador 5VZY-VL huFrwk Nenhuma ID (CreneFab) Acc. Nº 5VZY (SEQ NO: 91) ID NO: 89) Hu18C5-VL v2 (SEQ Aceitador 5VZY-VL huFrwk L2, L45 ID (CreneFab) Acc. Nº 5VZY (SEQ NO: 92) ID NO: 89) Tabela 11 Numeração de Kabat dos Resíduos de framework (com base nos CDRs do Composto de Kabat/Chothia) para Mutações reversas e outras mutações em cadeias pesadas de anticorpos 18C5 humanizados
9 sl ele w Sl xs Ojo | e Z2/2/2 3 ER Sjeloa EE Siglo XX 8 / nl wu o HH TT EF ST / Ojo vNçtol elx se é E Z / E/5)S Fa 3 / XX 38 E 3/3 2 | E e jo o X 5 uu | /0lo 88 [2/2 < o T 3/5 o >= IX ims rr joalr/o) [mB] vo a via
[94] Ss |R|S|R| Tabela 12 Numeração de Kabat dos Resíduos de Framework (com base nos CDRs do Composto de Kabat/Chothia) para Mutações Reversas e outras mutações em Cadeias Leves de anticorpos 18C5 humanizados qo = = 2 DN = x O eo o S m õ cs cs Ê o Zz 2 2 E 2 & a o o & 2 > o o o 8 26 Sg | q q < dE? E e o o ; = = 3 8 2 > > W 7 5 4 e = = É vv 3a = > > ses 2 o e) ET 5 = O O 2 ce fe) co co <<. Q Ss Ss o Z2 X X
EH A A Rs A a NR
Tabela 13 Percentual de Integridade Humana e Cadeias Leves de Anticorpos 18C5 Humanizados
[0435] As posições em que os resíduos canônicos, vernier ou de interface/empacotamento de classe de Chothia diferem entre as sequências de aceitador de camundongo e humanas são candidatas à substituição. Exemplos de resíduos canônicos da classe Chothia incluem o resíduo de Kabat H48 nas Tabelas 8 e 9. Exemplos de resíduos de interface/empacotamento (VH+VL) incluem os resíduos de Kabat H35, H37, H39, H45, H47, H91, H93, H95, H103, L34, L36, L38, L44, L46, L87, L89, L91, LO6, e LO8 nas Tabelas 8 e 9.
[0436] As razões para a seleção das posições indicadas na Tabela 8 na região variável de cadeia leve como candidatos à substituição são as seguintes. 12V é uma mutação reversa de um resíduo canônico de Chothia.
Q45R é uma mutação para o resíduo da linhagem germinativa IGKV2-30*02. Q é raro em humanos nesta posição. R é frequente nesta posição.
[0437] hu18C5-VL v1: CDR-L1, L2 e L3 alças de 18C5-VL enxertadas na framework do CreneFab (5VZY-VL).
[0438] hu18C5-VL v2. reverte todas as substituições de framework em posições chave para definir as classes canônicas de Chothia, faz parte da zona Vernier ou localiza na interface de domínio VH/VL; O hu18C5-VL v2 incorpora mutações reversas |2V e aceitador humano da mutação da linhagem germinativa Q45R, para permitir a avaliação das contribuições dessas posições para a afinidade e imunogenicidade de ligação ao antígeno.
[0439] Regiões variáveis de cadeia leve:
[0440] hu18C5-VL 1(SEQ ID NO: 91)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVDSNGNTYLEWYLQKPGOQSPQLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKVE IK
[0441] hu18C5-VL 2 (SEQ ID NO: 92)
DVVMTOQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVDSNGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYK VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKV EIK
[0442] As razões para a seleção das posições indicadas na Tabela 9 na região variável de cadeia pesada como candidatos à substituição são as seguintes.
V37A: é uma mutação reversa na zona vernier. Val mostra interação repulsiva com Trp47.
L45Q: é uma mutação reversa de um resíduo da interface principal por Chothia. Leu nesta posição tem interações repulsivas de Van der Waals.
L47W: é uma mutação reversa de um resíduo de interface. Em 18C5 murino, Trp está na posição 47 e Trp faz a ligação de hidrogênio com Ser 35, estabilizando assim as folhas beta intracadeia. Leu não estabelece nenhuma interface com nenhum resíduo e pode desestabilizar a conformação.
VA48I é uma mutação reversa de um resíduo da zona Vernier interagindo com CDR para preservar essa interação.
A49G é uma mutação reversa de um resíduo de Vernier.
S94R: é uma mutação reversa de um resíduo da zona Vernier, para preservar a interação da CDR.
[0443] hu18C5-VH v1: alças de CDR-H1, H2 e H3 de 18C5-VH enxertados na framework do CreneFab VH (5VZY-VH).
[0444] Hu18C5-VH v2: reverte todas as substituições de framework em posições essenciais para definir as classes canônicas de Chothia, fazem parte da zona Vernier ou estão localizadas na interface de domínio VH/VL. 18C5-VH v2 incorpora mutações reversas V37A, L45Q, L47W, V481, A49G e S94R, para permitir a avaliação das contribuições dessas posições para a afinidade e imunogenicidade de ligação ao antígeno.
[0445] Regiões variáveis de cadeia pesada:
[0446] hu18C5-VH 1(SEQ ID NO: 85)
EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRFWMSWVRQAPGKGLELVAEINP GSSTINYTPSLKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLGYGNYGWAL DYWGQGTT VTVSS
[0447] hu18C5-VH 2(SEQ ID NO: 86)
EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRFWMSWARQAPGKGQEWIGEIN PGSSTINYTPSLKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGYGNYGW
ALDYWGQGTT VTVSS Listagem de Sequências: SEQ ID NO: 1 Sequência de aminoácidos VH de 18C5 com peptídeo sinal
MDFGLIFFIVALLKGVQCEVKLLESGGGLVQPGGSLNLSCVASGFDFSRFWMSW ARQAPGRGQEWIGEINPGSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLFLQOMSKVRSEDSA
LYYCARLGY GNYGWALDYWGQGTS VTVSS SEQ ID NO: 2 sequência de nucleotídeos que codifica VH de 18C5 de camundongo com peptídeo sinal
ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTCATTGTTGCCCTTTTAMAAGGGGTCCAGTGT GAGGTAAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCC CTGAATCTCTCCTGTGTAGCCTCAGGATTCGATTTTAGTAGATTCTGGATGAG TTGGGCTCGGCAGGCTCCAGGGAGAGGACAGGAATGGATTGGAGAGATTAA TCCAGGAAGCAGTACGATAAACTATACGCCATCTCTGAAGGATAAATTCATCA TCTCCAGAGACAACGCCAAAAATACGCTGTTCCTGCAAATGAGCAAAGTGAG ATCTGAGGACTCAGCCCTTTATTACTGTGCAAGACTGGGGTATGGTAACTAC
GGATGGGCTCTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO: 3 Sequência de aminoácidos VL de 18C5 com peptídeo sinal
MKLPVRLLVLMFWIPASRSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVDSNGNT YLEWYLQKPGQSPKLLIYKVYSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIY
YCFQGSHVPLT FGAGTKLELK SEQ ID NO: 4 sequência de nucleotídeos que codifica VL de 18C5 de camundongo com peptídeo sinal
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAG AAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAG ATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTAGATAGTAATGGA AACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCT GATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGC AGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAG GATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGG
TGCTGGGACCAAGTTGGAGCTGAAA SEQ ID NO: 5 sequência de aminoácidos de um CDR-H1 de 18C5
GFDFSRFWMS SEQ ID NO: 6 sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-H1 de 18C5
GGATTCGATTTTAGTAGATTCTGGATGAGT SEQ ID NO: 7 sequência de aminoácidos de uma CDR-H2 de 18C5
EINPGSSTINYTPSLKD SEQ ID NO: 8 sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-H2 de 18C5
GAGATTAATCCAGGAAGCAGTACGATAAACTATACGCCATCTCTGAAGGAT SEQ ID NO: 9 sequência de aminoácidos de uma CDR-H3 de 18C5
LGYGNYGWALDY SEQ ID NO: 10 sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-H3 de 18C5
CTGGGGTATGGTAACTACGGATGGGCTCTGGACTAC SEQ ID NO: 11 sequência de aminoácidos de uma CDR-L1 de 18C5
RSSQSIVDSNGNTYLE SEQ ID NO: 12 sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-L1 de 18C5
AGATCTAGTCAGAGCATTGTAGATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAA SEQ ID NO: 13 sequência de aminoácidos de uma CDR-L2 de 18C5
KVSNRFS SEQ ID NO: 14 sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-L2 de 18C5
AAAGTTTCCAACCGATTTTCT
SEQ ID NO: 15 sequência de aminoácidos de uma CDR-L3 de 18C5
FQGSHVPLT SEQ ID NO: 16 sequência de ácido nucleico que codifica uma CDR-L3 de 18C5
TTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACG SEQ ID NO: 17 sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada 18C5 quimérica (I9G1 humana)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVWNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK SEQ ID NO: 18 ácido nucleico que codifica uma região constante da cadeia pesada 18C5 quimérica (I9G1 humana) GCCTCCACCAAGGGCCCATCEGGTCTTCCCCoTGGCACCCTCCTCCAAGAGC
ACCTCTGGGGGCACAGCGGCCETGGGCTECCTGEGTCAAGGACTACTTCCCC GAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCEGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGG TGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAA TCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGT
GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGA CCGTCAGTCTTCCTCTTCCcCcCoCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCC
GGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTEGACGTGAGCCACGAAGACCCTG AGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGA CAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCC TCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGG TCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATEGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAA AGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACGCTGCCCCCATCCCGGGAGGA GATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCC AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTAC AAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCA AGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCT CCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT
GTCCCCGGGTAAATGA SEQ ID NO: 19 sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia leve 18C5 quimérica (kappa humano)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE
SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 20 sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia leve 18C5 quimérica (kappa humano)
CGGGGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCEGCCATCTGATGAGC AGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCC AGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACT CCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCA GCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGC CTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAAC
AGGGGAGAGTGTTAG SEQ ID NO: 21 sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia pesada de I9G1 exemplificativa
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVWNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNVKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 22 sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia pesada IgG1
G1m3 exemplificativa
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVWNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 23 sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia pesada I9G1 G1m3 exemplificativa
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVWNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC PPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 24 sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia leve exemplificativa com arginina N terminal
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE
SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 25 sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia leve exemplificativa sem arginina N-terminal
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES
VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 26 sequência de aminoácidos da transtirretina humana estabelecida no número de acesso P02766.1 (UniProt)
MASHRLLLLCLAGLVFVSEAGPTGTGESKCPLMVKVLDAVRGSPAINVAVHVFRK AADDTWEPFASGKTSESGELHGLTTEEEFVEGIYKVEIDTKSYWKALGISPFHEH
AEVVFTANDS GPRRYTIAALLSPYSYSTTAVVTNPKE SEQ ID NO: 27 sequência de aminoácidos da transtirretina humana estabelecida no número de acesso AAB35639.1 (GenBank)
GPTGTGESKCPLMVKVLDAVRGSPAINVAVHVFRKAADDTWEPFASGKTSESGE LHGLTTEEQFVEGIYKVEIDTKSYWKALGISPFHEHAEVVFTANDSGPRRYTIAAL
LSPYSYSTTA VVTNPKE SEQ ID NO: 28 sequência de aminoácidos da transtirretina humana estabelecida no número de acesso AAB3 5640.1 (GenBank)
GPTGTGESKCPLMVKVLDAVRGSPAINVAVHVFRKAADDTWEPFASGKTSESGE LHGLTTEEQFVEGIYKVEIDTKSYWKALGISPFHEHAEVVFTANDSGPRRYTIAAL
LSPYSYSTTA VVTNPKE SEQ ID NO: 29 sequência de aminoácidos da transtirretina humana apresentada no número de acesso e ABI63351.1 (GenBank)
MASHRLLLLCLAGLVFVSEAGPTGTGESKCPLMVKVLDAVRGSPAINVAVHVFRK AADDTWEPFASGKTSESGELHGLTTEEEFVEGIYKVEIDTKSYWKALGISPFHEH
AEVVFTANDS GPRRYSYSTTAVVTNPKE SEQ ID NO: 30 sequência de aminoácidos dos resíduos 101-109 da transtirretina humana
GPRRYTIAA SEQ ID NO: 31 sequência de aminoácidos dos resíduos 87-127 da transtirretina humana
FHEHAEVVFTANDSGPRRYTIAALLSPYSYSTTAVVTNPKE SEQ ID NO: 32 sequência de ácido nucleico que codifica uma região constante de cadeia pesada IgG1 G1m3 exemplificativa GCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCeTGGCACCCTCCTCCAAGAGCA
CCTCTGGGGGCACAGCEGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCG AACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACA CCTTCCEGGCTETCETACAGTCCOTCAGGACTCTACTCCOTCAGCAGCGTGGT GACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAT CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTG ACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC CGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAMAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCG GACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGA GGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGAC AAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCT CACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGT CTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCEGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGA GATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCC AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTAC AAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTC CGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACC
ACTACACGCA GAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA SEQ ID NO: 33 sequência de ácido nucleico que codifica uma região constante de cadeia leve exemplificativa com arginina N-terminal
CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTT GAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAG CACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGC GAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGG
GGAGAGTGT SEQ ID NO: 34 sequência de ácidos nucleicos que codifica uma região constante de cadeia leve exemplificativa sem arginina N-terminal
ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGG CCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGA GAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCAC CCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGA
GAGTGT SEQ ID NO: 35 sequência de aminoácidos de um peptídeo sinal da região constante de cadeia pesada
MNFGLSLIFLVLVLKGVQC SEQ ID NO: 36 sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo sinal da região constante de cadeia pesada
ATGAACTTTGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAMAAGGTGTCCA
GTGT SEQ ID NO: 37 sequência de aminoácidos de um peptídeo sinal da região constante de cadeia leve
MESHTQVFVFVFLWLSGVDG SEQ ID NO: 38 sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo sinal da região constante de cadeia leve
ATGGAGTCACATACTCAGGTCTTTGTATTCGTGTTTCTCTGGTTGTCTGGTGT
TGACGGA SEQ ID NO: 39 sequência de aminoácidos de uma CDR-H1 de Kabat de 14G8
SYTMS SEQ ID NO: 40 sequência de aminoácidos de uma CDR-H2 de Kabat de 14G8
EINNSGDTTYYPDTVKG SEQ ID NO: 41 sequência de aminoácidos de uma CDR-H3 de Kabat de 14G8
HYYYGGGYGGWFFDV SEQ ID NO: 42 sequência de aminoácidos de uma CDR-L1 de Kabat de 14G8
RSNKSLLHSNGNTYLY SEQ ID NO: 43 sequência de aminoácidos de uma CDR-L2 de Kabat de 14G8
RVSNLAS SEQ ID NO: 44 sequência de aminoácidos de uma CDR-L3 de Kabat de 14G8
MQHLEYPLT SEQ ID NO: 45 epítopo de 5A1
EHAEVVFTA SEQ ID NO: 46 sequência de aminoácidos de uma CDR-H1 de Kabat de 5SA1
NYAMS SEQ ID NO: 47 sequência de aminoácidos de uma CDR-H2 de Kabat de 5A1
SISSGGSTYYPDSVKG SEQ ID NO: 48 sequência de aminoácidos de uma CDR-H3 de Kabat de 5A1
YYYGQYFDF SEQ ID NO: 49 sequência de aminoácidos de uma CDR-L1 de Kabat de 5 A1
KASQDVSTTVA SEQ ID NO: 50 sequência de aminoácidos de uma CDR-L2 de Kabat de SA1
SASYRCT SEQ ID NO: 51 sequência de aminoácidos de uma CDR-L3 de Kabat de 5A1
QQHYSTPLT SEQ ID NO: 52 sequência de aminoácidos de uma CDR-H1 de Kabat de 6C1
NYYMS SEQ ID NO: 53 sequência de aminoácidos de uma CDR-H2 de Kabat de 6C1
YISIDGNNIYHPDSVKG SEQ ID NO: 54 sequência de aminoácidos de uma CDR-H3 de Kabat de 6C1
DSDYGYFDV SEQ ID NO: 55 sequência de aminoácidos de uma CDR-L1 de Kabat de 6C1
RSSQSIVHSNGNTYLE SEQ ID NO: 56 sequência de aminoácidos de uma CDR-L2 de Kabat de 6C1
KVSKRFS SEQ ID NO: 57 sequência de aminoácidos de uma CDR-L3 de Kabat de 6C1
FQGSHVPLT SEQ ID NO: 58 sequência de aminoácidos da região VH de AD7F6
EVOLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYGMSWIRQTPDKRLEWVATISSS GTYTYYTESVKGRFTVSRDNAKNTLSLQMSNLKSDDTAMYYCTRQAYGREYFD VWGTGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWN SGSLSSSVHTFPALLOSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKK LEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVWV DVSEDDPDVRISWFVNNVEVHTAQTQAQTHREDYNSTIRVVSALPIQHQDWMSGKE FKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNP GDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLDIKTSTVGENRFLLMQRET
RGSEKLLPEEDHLPSPGK SEQ ID NO: 59 sequência de aminoácidos da região VL de AD7F6
DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLFDSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLI YWASNRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYFCKQSNYLRTFGGGTR VEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNG VLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRN
EC SEQ ID NO: 60 sequência de aminoácidos de CDR-H1 de RT24
RYWIT SEQ ID NO: 61 sequência de aminoácidos de CDR-H2 de RT24
DIYPGSGRTNYNEKFKN SEQ ID NO: 62 sequência de aminoácidos de CDR-H3 de RT24
YYGSTYFYV SEQ ID NO: 63 sequência de aminoácidos de CDR-L1 de RT24
RSSKSLLYKDGKTYLN SEQ ID NO: 64 sequência de aminoácidos de CDR-L2 de RT24
LMSTRAS SEQ ID NO: 65 sequência de aminoácidos de CDR-L3 de RT24
QQLVEYPRT SEQ ID NO: 66 sequência de aminoácidos de CDR-H1 de NI-301.35G11
SYAMS SEQ ID NO: 67 sequência de aminoácidos de CDR-H2 de NI-301.35G11
SISGSGDTTKYTDSVKG SEQ ID NO: 68 sequência de aminoácidos de CDR-H3 de NI-301.35G11
DGSGRIDPFAL SEQ ID NO: 69 sequência de aminoácidos de CDR-L1 de NI-301.35G11
RSSRSLVYSDGNIYLN SEQ ID NO: 70 sequência de aminoácidos de CDR-L2 de NI-301.35G11
KVSNRDSG SEQ ID NO: 71 sequência de aminoácidos de CDR-L3 de NI-301.35G11
MQGTHWPRT SEQ ID NO: 72 epítopo de MFD 101, MDF102, MFD 103, MFD 105,
ADDTWEPFASGKT SEQ ID NO: 73 epítopo de MFD 107, MFD 108, MFD 109, MFD111
TSESGELHGLTTE SEQ ID NO: 74 epítopo de MFD 114
ALLSPYSYSTTAV SEQ ID NO: 75 sequência de aminoácidos de uma CDR-H1 de Kabat de anticorpo 9D5
SYTMS SEQ ID NO: 76 sequência de aminoácidos de uma CDR-H2 de Kabat de anticorpo 9D5
EISNSGDTTYYPDTVKG SEQ ID NO: 77 sequência de aminoácidos de uma CDR-H3 de Kabat de anticorpo 9D5
HYYYGGGYGGWFFDV SEQ ID NO: 78 sequência de aminoácidos de uma CDR-L1 de Kabat de anticorpo 9D5
RSSKSLLHSNGNTYL Y SEQ ID NO: 79 sequência de aminoácidos de uma CDR-L2 de Kabat de anticorpo 9D5
RVSNLAS SEQ ID NO: 80 sequência de aminoácidos de uma CDR-L3 de Kabat de anticorpo 9D5
MQHLEYPLT SEQ ID NO: 81 sequência de aminoácidos de uma região variável madura de cadeia pesada do anticorpo 18C5 de camundongo
EVKLLESGGGLVQPGGSLNLSCVASGFDFSRFWMSWARQAPGRGQEWIGEINP GSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLFLQOMSKVRSEDSALYYCARLGYGNYGWAL
DYWGQGTSV TVSS SEQ ID NO: 82 sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada do anticorpo murino anti-piroglutamato- Abeta Fab ctt17
EVKLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSDYGMAWVRQAPGKGPEWVAFISN LAYSIYYADTVTGRFTISRENAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCARYDYDNILDYVM
DYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO: 83 sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada de Fab de Crenezumab humanizado (CreneFab) PDB: 5VZY
EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINS NGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQOGT
TVTVSS SEQ ID NO: 84 sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada da sequência da linhagem germinativa humana IGHV3-48*01
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYSMNWVRQAPGKGLEWVS YISSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYFDYWGQ
GTL VTVSS SEQ ID NO: 85 sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada do anticorpo 18C5 humanizado hu18C5-VH 1
EVOQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRFWMSWVRQAPGKGLELVAEINP GSSTINYTPSLKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLGYGNYGWAL
DYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 86 sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada do anticorpo 18C5 humanizado hu18C5-VH 2
EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRFWMSWARQAPGKGQEWIGEIN PGSSTINYTPSLKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGYGNYGW
ALDYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 87 sequência de aminoácidos de uma região variável madura de cadeia leve do anticorpo 18C5 de camundongo
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVDSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYK VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPLTFGAGTKLE
LK SEQ ID NO: 88 sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve do anticorpo murino anti-piroglutamato- Abeta Fab ct 17
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSOSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYK VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPTFGGGTKL
EIK SEQ ID NO: 89 sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve de Fab de Crenezumab humanizado (CreneFab) PDB: 5VZY
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQOSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPAQLLIYK VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGAGTK
VEIK SEQ ID NO: 90 sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve da sequência da linhagem germinativa humana IGKV2-30*2
DVVMTOQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIY KVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPWTFGQOG
TKVEIK SEQ ID NO: 91 sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve do anticorpo 18C5 humanizado hu18C5-VL 1
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVDSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFOQGSHVPLTFGQGTKVE
IK SEQ ID NO: 92 sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve do anticorpo 18C5 humanizado hu18C5-VL 2
DVVMTOQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQOSIVDSNGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYK VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKV
EIK SEQ ID NO: 93 sequência de aminoácidos de CDR-H1 de Kabat do anticorpo 18C5 de camundongo
RFWMS SEQ ID NO: 94 sequência de aminoácidos de CDR-H1 de Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo
GFDFSRF SEQ ID NO: 95 sequência de aminoácidos de CDR-H1 de Contact do anticorpo 18C5 de camundongo
SRFWMS SEQ ID NO: 96 sequência de aminoácidos de CDR-H2 de Chothia do anticorpo 18C5 de camundongo
NPGSST SEQ ID NO: 97 sequência de aminoácidos de CDR-H2 de ADM do anticorpo 18C5 de camundongo
EINPGSSTIN SEQ ID NO: 98 sequência de aminoácidos de CDR-H2 de Contact do anticorpo 18C5 de camundongo WIGEINPGSSTIN SEQ ID NO: 99 sequência de aminoácidos de CDR-H3 de Contact do anticorpo 18C5 de camundongo
ARLGYGNYGWALD SEQ ID NO: 100 sequência de aminoácidos de CDR-L1 de Contact do anticorpo 18C5 de camundongo
NTYLEWY SEQ ID NO: 101 sequência de aminoácidos CDR-L2 de Contact do anticorpo 18C5 de camundongo
LLIYKVSNRF SEQ ID NO: 102 sequência de aminoácidos de CDR-L3 de Contact do anticorpo 18C5 de camundongo
FQOGSHVPL SEQ ID NO: 103 Sequência de aminoácidos VH do 9D5 de camundongo
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLELVAEISNS GDTTYYPDTVKGRFTFSRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYC
ARHYYYGGGYGGWFFD VWG TGTTVTVSS SEQ ID NO: 104 Sequência de aminoácidos VL do 9D5 de camundongo
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGOSPQLLIYR VSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPLTFGAGTKL ELK

Claims (159)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para detectar transtirretina mal dobrada (TTR) em uma amostra biológica, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) pôr em contato uma amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente de TTR; em que se TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e (b) detectar o anticorpo repórter que forma um complexo sanduíche na etapa (a), se houver, para indicar presença ou ausência da TTR mal dobrada.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é de um paciente com ATTR hereditária.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é de um paciente com ATTR hereditária carreando uma mutação selecionada do grupo que consiste em V30M, Y114C, G47R, S50l|, T49S, F33V, A45T, E89K, E89Q e V1221.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a mutação é selecionada do grupo que consiste em V30M, Y114C e S50I.
5. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a mutação é V30M.
6. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a mutação é Y114C.
7. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a mutação é S50I.
8. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a mutação é E89K.
9. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a mutação é E89Q.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é um anticorpo policlonal anti-TTR.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo repórter é 18C5, 8C3, 7G7, AD7F6, RT24, NI-301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD107, MFD 108, MFD 109, MFD111, MFD 114, ou uma versão quimérica ou uma versão humanizada deste ou um anticorpo policlonal anti-TTR.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é 18C5, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é 8C3, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é 7G7, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é AD7F6, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é RT24, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é NI-301.35G11, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é MFD101, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
20. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é MDF102, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
21. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é MFD103, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
22. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é MFD 105, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
23. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é MFD 107, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
24. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é MFD 108, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
25. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é MFD 109, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
26. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é MFD111, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
27. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é MFD114, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
28. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo repórter é um anticorpo que se liga nos resíduos 101-109, 118-122, 115-124, 53-63, 54-61, 36-49, 49-61, 109-121, 30- 66, 70-127, 80-127, 90-127, 100-127, 110-127 ou 115-127 de TTR.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a TTR mal dobrada inclui uma substituição de E89K.
30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a TTR mal dobrada inclui uma substituição de E89Q.
31. Método de acordo com as reivindicações 1-30, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma primeira alíquota de uma amostra coletada e o método compreende ainda a repetição das etapas (a) e (b) em uma segunda alíquota da amostra coletada, compreendendo ainda um anticorpo de teste que compete com o captura de anticorpo para ligação à TTR, em que o anticorpo repórter reduzido que forma o complexo sanduíche ao repetir as etapas fornece uma indicação da capacidade do anticorpo de teste de se ligar à TTR mal dobrada.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de teste é 14G8 ou uma forma quimérica ou humanizada deste, o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é um anticorpo policlonal anti- TTR.
33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de teste é uma forma humanizada de 14G8.
34. Método para determinar o engajamento alvo in vivo de um anticorpo de teste administrado a um sujeito, cujo alvo é um epítopo dentro dos resíduos 89-97 da transtirretina mal dobrada (mis-TTR) detectando a mis-TTR restante em uma amostra biológica do sujeito tratado com o anticorpo de teste, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) pôr em contato uma amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente na TTR do que o do anticorpo de captura; em que se a TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e (b) detectar o anticorpo repórter formando um complexo sanduíche na etapa (a), se houver, para indicar presença ou ausência da TTR mal dobrada.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é de um paciente com ATTR hereditária.
36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é de um paciente com ATTR hereditária carreando uma mutação selecionada do grupo que consiste em V30M, Y114C, G47R, S50I, T49S, F33V, A45T, E89K, E89Q e V122|.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a mutação é selecionada do grupo que consiste em V30M, Y114C e S50I.
38. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a mutação é V30M.
39. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a mutação é Y114C.
40. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a mutação é S50I.
41. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a mutação é E89K.
42. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a mutação é E89Q.
43. Método, de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que uma redução da detecção de TTR mal dobrada no sujeito tratado em relação à detecção de TTR mal dobrada em uma amostra biológica de um sujeito não tratado se correlaciona com o engajamento alvo positivo e o tratamento do sujeito com o mesmo ou com uma menor quantidade do anticorpo de teste.
44. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o sujeito tratado e o sujeito não tratado são o mesmo indivíduo.
45. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é 9D5, em que o anticorpo de captura e o anticorpo repórter têm marcadores diferentes.
46. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é 14G8.
47. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é 5Al.
48. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 9D5 e o anticorpo repórter é 6C1.
49. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o anticorpo repórter compete pela ligação com o anticorpo de captura pela ligação transtirretina multimérica mal dobrada.
50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo repórter tem um marcador eletroquimioluminescente e é detectado por eletroquimioluminescência.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura tem um marcador de biotina.
52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é realizado qualitativamente.
53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é realizado quantitativamente para indicar uma quantidade absoluta ou relativa de TTR mal dobrada.
54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura está ligado a uma fase sólida antes da etapa de contato.
55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura está ligado à fase sólida por meio de um ligante.
56. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a fase sólida compreende pelo menos um eletrodo.
57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: comparar um sinal do anticorpo repórter com um sinal do anticorpo repórter em uma amostra de controle contendo uma quantidade conhecida de TTR mal dobrada para determinar a quantidade de TTR mal dobrada na amostra.
58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda comparar um sinal do anticorpo repórter a partir de uma curva de calibração do sinal versus quantidade de TTR mal dobrada para determinar a quantidade de TTR mal dobrada na amostra.
59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que um sinal do anticorpo repórter é proporcional à quantidade de TTR mal dobrada na amostra.
60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra de um ser humano.
61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a amostra é um fluido corporal.
62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a amostra é plasma de um ser humano.
63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a presença de TTR mal dobrada é usada para diagnosticar um sujeito de quem a amostra foi obtida com uma amiloidose mediada por transtirretina.
64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que a amiloidose mediada por transtirretina é uma amiloidose familiar por transtirretina ou uma amiloidose esporádica por transtirretina do tipo selvagem.
65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o sujeito foi identificado como em risco de uma amiloidose familiar por transtirretina com base em testes genéticos.
66. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o sujeito não mostra sintomas de uma amiloidose familiar por transtirretina.
67. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o sujeito não tem polineuropatia ou cardiomiopatia.
68. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a amiloidose familiar por transtirretina é a miocardiopatia amiloide familiar (FAC), polineuropatia amiloide familiar (FAP) ou amiloidose seletiva do sistema nervoso central (CNSA).
69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é de um paciente que está recebendo tratamento para uma amiloidose mediada por transtirretina.
70. Método para ajustar o tratamento de um sujeito com amiloidose mediada por transtirretina, caracterizado pelo fato de que compreende (a) comparar a quantidade de TTR mal dobrada detectada pelo método da reivindicação 34 ou 35 em uma amostra de um sujeito previamente tratado para amiloidose mediada por transtirretina com a quantidade de TTR mal dobrada detectada no sujeito antes do tratamento ou durante um estágio anterior do tratamento; e (b) aumentar a dose ou a frequência da administração do tratamento anterior se a quantidade de TTR mal dobrada for igual ou superior à detectada anteriormente; ou (c) diminuir a dose ou a frequência da administração do tratamento anterior ou interromper o tratamento anterior se a quantidade de TTR mal dobrada for menor que a detectada anteriormente.
71. Método de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o tratamento anterior é por administração intravenosa de um anticorpo anti- TTR e, se a quantidade de TTR mal dobrada for menor que a detectada anteriormente, o tratamento anterior será interrompido e substituído pelo tratamento com um estabilizador de TTR, terapia baseada em oligonucleotídeo antisense, terapia de interferência de RNA ou terapia combinada com doxiciclina e ácido tauroursodesoxicólico.
72. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que o sujeito não recebe mais tratamento com o anticorpo anti-TTR.
73. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que o estabilizador de tetrâmero TTR é tafamidis ou diflunisal.
74. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que o estabilizador de tetrâmero TTR é diflunisal.
75. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que o terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense é inotersen.
76. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que o terapêutico baseado em RNAi é patisiran ou revusiran.
77. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-TTR é o 14G8.
78. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que o sujeito não recebe mais tratamento com o anticorpo anti-TTR.
79. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que o estabilizador de tetrâmero TTR é tafamidis ou diflunisal.
80. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que o estabilizador de tetrâmero TTR é diflunisal.
81. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que o terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense é inotersen.
82. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que o terapêutico baseado em RNAi é patisiran ou revusiran.
83. Método para ajustar o tratamento de um sujeito com amiloidose mediada por transtirretina, caracterizado pelo fato de que compreende (a) comparar a quantidade de ligação de anticorpo repórter detectada pelo método de acordo com a reivindicação 51 em uma amostra de um sujeito antes de iniciar o tratamento para amiloidose mediada por transtirretina com a quantidade de ligação de anticorpo repórter detectada no sujeito após o início do tratamento; e
(b) aumentar a dose ou a frequência da administração do tratamento se a quantidade de ligação de anticorpo repórter for igual ou superior à detectada anteriormente; ou (c) diminuir a dose ou a frequência da administração do tratamento ou descontinuar o tratamento se a quantidade de ligação do anticorpo repórter for menor que a detectada anteriormente.
84. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 69, caracterizado pelo fato de que uma amiloidose mediada por transtirretina é diferenciada da amiloidose de cadeia leve amiloide (AL).
85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 54, caracterizado pelo fato de que a amostra é de um camundongo transgênico com um transgene que expressa TTR humana.
86. Método para determinar uma razão entre o nível de transtirretina multimérica mal dobrada total (TTR) e o nível de TTR mal dobrada total em uma amostra biológica; o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) dividir uma amostra biológica em duas porções; (b) detectar a TTR mal dobrada total em uma primeira porção da amostra biológica por (1) pôr em contato a primeira porção da amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente de TTR; em que se TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e (ii) detectar o anticorpo repórter formando um complexo sanduíche na etapa (b)(i), se houver, para indicar presença ou ausência de TTR mal dobrada; (c) detectar a TTR multimérica mal dobrada total em uma segunda porção da amostra biológica por (i) pôr em contato a segunda porção da amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 89-97 da TTR; em que se TTR multimérica mal dobrada está presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR multimérica mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e (ii) detectar o anticorpo repórter formando um complexo sanduíche na etapa (c), se houver, para indicar presença ou ausência da TTR multimérica mal dobrada.
(d) calcular uma razão entre o nível de TTR multimérica mal dobrada total de (c) para o nível de TTR mal dobrada total de (b).
87. Método para detectar transtirretina mal dobrada (TTR) em uma amostra biológica, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) pôr em contato uma amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente de TTR; em que se TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e (b) detectar o anticorpo repórter que se liga à TTR mal dobrada na etapa (a), se houver, para indicar a presença ou ausência da TTR mal dobrada.
88. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é de um paciente com ATTR hereditária.
89. Método de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é de um paciente com ATTR hereditária carreando uma mutação selecionada do grupo que consiste em V30M, Y114C e S50I.
90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que a mutação é V30M.
91. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que a mutação é Y114C.
92. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que a mutação é S50I.
93. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5.
94. Método, de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é um anticorpo policlonal anti-TTR.
95. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 93, caracterizado pelo fato de que o anticorpo repórter é 9D5, 14G8, 5A1, 6C1, 8C3,
7G7, AD7F6, RT24, NI- 301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD107, MFD108, MFD109, MFD111, MFD114 ou uma versão quimérica ou uma versão humanizada desta.
96. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é 9D5, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
97. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é 14G8, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
98. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é 5A87, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
99. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é 6087, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
100. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é 8C3, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
101. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é 7G7, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
102. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é AD7F6, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
103. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é RT 24, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
104. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é NI-301.35G187, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
105. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD 1087, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
106. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MDF102, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
107. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD103, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
108. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD 105, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
109. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD 107, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
110. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD 108, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
111. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD 109, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
112. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD 1187, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
113. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5 e o anticorpo repórter é MFD114, ou uma versão quimérica ou versão humanizada deste.
114. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 93, caracterizado pelo fato de que o anticorpo repórter é um anticorpo que se liga nos resíduos 89-97, 118-122, 115-124, 53-63, 54-61, 36-49, 49-61, 109-121, 30- 66, 70- 127, 80-127, 90-127, 100-127, 110-127 ou 115-127 de TTR.
115. Método para determinar o engajamento alvo in vivo de um anticorpo de teste administrado a um sujeito, o alvo é um epítopo dentro dos resíduos 101- 109 da transtirretina mal dobrada (mis-TTR) detectando a mis-TTR restante em uma amostra biológica do sujeito tratado com o anticorpo de teste, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
(a) pôr em contato uma amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente na TTR do que o do anticorpo de captura; em que se a TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e (b) detectar o anticorpo repórter formando um complexo sanduíche na etapa (a), se houver, para indicar presença ou ausência da TTR mal dobrada.
116. Método, de acordo com a reivindicação 115, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é de um paciente com ATTR hereditária.
117. Método de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é de um paciente com ATTR hereditária carreando uma mutação selecionada do grupo que consiste em V30M, Y114C e S50I.
118. Método, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que a mutação é V30M.
119. Método, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que a mutação é Y114C.
120. Método, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que a mutação é S50I.
121. Método, de acordo com a reivindicação 115 ou 116, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é 18C5, em que o anticorpo de captura e o anticorpo repórter têm marcadores diferentes.
122. Método, de acordo com a reivindicação 115, caracterizado pelo fato de que o anticorpo repórter compete pela ligação com o anticorpo de captura pela ligação a transtirretina multimérica mal dobrada.
123. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo repórter tem um marcador eletroquimioluminescente e é detectado por eletroquimioluminescência.
124. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura tem um marcador de biotina.
125. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é realizado qualitativamente.
126. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é realizado quantitativamente para indicar uma quantidade absoluta ou relativa da TTR mal dobrada.
127. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura está ligado a uma fase sólida antes da etapa de contato.
128. Método, de acordo com a reivindicação 127, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura está ligado à fase sólida por meio de um ligante.
129. Método, de acordo com a reivindicação 127, caracterizado pelo fato de que a fase sólida compreende pelo menos um eletrodo.
130. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: comparar um sinal do anticorpo repórter com um sinal do anticorpo repórter em uma amostra de controle contendo uma quantidade conhecida de TTR mal dobrada para determinar a quantidade de TTR mal dobrada na amostra.
131. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda comparar um sinal do anticorpo repórter a partir de uma curva de calibração do sinal versus quantidade de TTR mal dobrada para determinar a quantidade de TTR mal dobrada na amostra.
132. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que um sinal do anticorpo repórter é proporcional à quantidade de TTR mal dobrada na amostra.
133. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra de um ser humano.
134. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a amostra é um fluido corporal.
135. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a amostra é plasma de um ser humano.
136. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a presença de TTR mal dobrada é usada para diagnosticar um sujeito de quem a amostra foi obtida com uma amiloidose mediada por transtirretina.
137. Método, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de que a amiloidose mediada por transtirretina é uma amiloidose familiar por transtirretina ou uma amiloidose esporádica por transtirretina do tipo selvagem.
138. Método, de acordo com a reivindicação 137, caracterizado pelo fato de que o sujeito foi identificado como em risco de uma amiloidose familiar por transtirretina com base em testes genéticos.
139. Método, de acordo com a reivindicação 137, caracterizado pelo fato de que o sujeito não mostra sintomas de uma amiloidose familiar por transtirretina.
140. Método, de acordo com a reivindicação 139, caracterizado pelo fato de que o sujeito não tem polineuropatia ou cardiomiopatia.
141. Método, de acordo com a reivindicação 137, caracterizado pelo fato de que a amiloidose familiar por transtirretina é a miocardiopatia amiloide familiar (FAC), polineuropatia amiloide familiar (FAP) ou amiloidose seletiva do sistema nervoso central (CNSA).
142. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é de um paciente que está recebendo tratamento para uma amiloidose mediada por transtirretina.
143. Método para ajustar o tratamento de um sujeito com amiloidose mediada por transtirretina, caracterizado pelo fato de que compreende (a) comparar a quantidade de TTR mal dobrada detectada pelo método da reivindicação 25 em uma amostra de um sujeito previamente tratado para amiloidose mediada por transtirretina com a quantidade de TTR mal dobrada detectada no sujeito antes do tratamento ou durante um estágio anterior do tratamento; e (b) aumentar a dose ou a frequência da administração do tratamento anterior se a quantidade de TTR mal dobrada for igual ou superior à detectada anteriormente; ou (c) diminuir a dose ou a frequência da administração do tratamento anterior ou interromper o tratamento anterior se a quantidade de TTR mal dobrada for menor que a detectada anteriormente.
144. Método de acordo com a reivindicação 143, caracterizado pelo fato de que o tratamento anterior é por administração intravenosa de um anticorpo anti- TTR e, se a quantidade de TTR mal dobrada for menor que a detectada anteriormente, o tratamento anterior será interrompido e substituído pelo tratamento com um estabilizador de TTR, terapia baseada em oligonucleotídeo antisense, terapia de interferência de RNA ou terapia combinada com doxiciclina e ácido tauroursodesoxicólico.
145. Método, de acordo com a reivindicação 144, caracterizado pelo fato de que o sujeito não recebe mais tratamento com o anticorpo anti-TTR.
146. Método, de acordo com a reivindicação 144, caracterizado pelo fato de que o estabilizador de tetrâmero TTR é tafamidis ou diflunisal.
147. Método, de acordo com a reivindicação 144, caracterizado pelo fato de que o estabilizador de tetrâmero TTR é diflunisal.
148. Método, de acordo com a reivindicação 144, caracterizado pelo fato de que o terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense é inotersen.
149. Método, de acordo com a reivindicação 144, caracterizado pelo fato de que o terapêutico baseado em RNAi é patisiran ou revusiran.
150. Método, de acordo com a reivindicação 144, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-TTR é o 14G8.
151. Método, de acordo com a reivindicação 150, caracterizado pelo fato de que o sujeito não recebe mais tratamento com o anticorpo anti-TTR.
152. Método, de acordo com a reivindicação 150, caracterizado pelo fato de que o estabilizador de tetrâmero TTR é tafamidis ou diflunisal.
153. Método, de acordo com a reivindicação 150, caracterizado pelo fato de que o estabilizador de tetrâmero TTR é diflunisal.
154. Método, de acordo com a reivindicação 150, caracterizado pelo fato de que o terapêutico à base de oligonucleotídeo antisense é inotersen.
155. Método, de acordo com a reivindicação 150, caracterizado pelo fato de que o terapêutico baseado em RNAi é patisiran ou revusiran.
156. Método para ajustar o tratamento de um sujeito com amiloidose mediada por transtirretina, caracterizado pelo fato de que compreende (a) comparar a quantidade de ligação de anticorpo repórter detectada pelo método de acordo com a reivindicação 46 em uma amostra de um sujeito antes de iniciar o tratamento para amiloidose mediada por transtirretina com a quantidade de ligação de anticorpo repórter detectada no sujeito após o início do tratamento; e (b) aumentar a dose ou a frequência da administração do tratamento se a quantidade de ligação de anticorpo repórter for igual ou superior à detectada anteriormente; ou (c) diminuir a dose ou a frequência da administração do tratamento ou descontinuar o tratamento se a quantidade de ligação do anticorpo repórter for menor que a detectada anteriormente.
157. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 142, caracterizado pelo fato de que uma amiloidose mediada por transtirretina é diferenciada da amiloidose de cadeia leve amiloide (AL).
158. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87, caracterizado pelo fato de que a amostra é de um camundongo transgênico com um transgene que expressa TTR humana.
159. Método para determinar uma razão entre o nível de transtirretina multimérica mal dobrada total (TTR) e o nível de TTR mal dobrada total em uma amostra biológica; o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) dividir uma amostra biológica em duas porções; (b) detectar a TTR mal dobrada total em uma primeira porção da amostra biológica por (i) pôr em contato a primeira porção da amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 de TTR e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo diferente de TTR; em que se TTR mal dobrada estiver presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e (ii) detectar o anticorpo repórter ligado à TTR mal dobrada na etapa (i), se houver, para indicar a presença ou ausência da TTR mal dobrada; (c) detectar a TTR multimérica mal dobrada total em uma segunda porção da amostra biológica por () pôr em contato a segunda porção da amostra biológica com um anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 e um anticorpo repórter que se liga especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 101-109 da TTR; em que se TTR multimérica mal dobrada está presente na amostra, o anticorpo de captura e o anticorpo repórter se ligam à TTR multimérica mal dobrada, formando um complexo sanduíche; e (ii) detectar o anticorpo repórter ligado à TTR multimérica mal dobrada na etapa (a), se houver, para indicar a presença ou ausência da TTR multimérica mal dobrada. (d) calcular uma razão entre o nível de TTR multimérica mal dobrada total de (c) para o nível de TTR mal dobrada total de (b).
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