JP2020537128A - トランスサイレチンを検出する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、米国特許法第119条(e)の35下、2017年10月6日に出願された米国仮特許出願第62/569,438号、2017年10月31日に出願された米国仮特許出願第62/579,817号および2018年3月23日に出願された米国仮特許出願第62/647,582号の利益を主張するものであり、上記出願はそれぞれ、その全体があらゆる目的において参照により組み込まれる。
ファイル516713SEQLST.txtに記載されている配列表は、61.8キロバイトであり、2018年9月20日に作成されたものであり、参照により本明細書に組み込まれる。
(a)生体試料を2部に分けることと;
(b)
(i)生体試料の第一の部分を、TTRの残基89〜97内のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体およびTTRの異なるエピトープに特異的に結合するレポーター抗体と接触させ;試料中にミスフォールドTTRが存在する場合、捕捉抗体およびレポーター抗体がミスフォールドTTRに結合してサンドイッチ複合体を形成すること;ならびに
(ii)段階(b)(i)でサンドイッチ複合体を形成するレポーター抗体が存在すればそれを検出して、ミスフォールドTTRの有無を示すこと によって、生体試料の第一の部分中の総ミスフォールドTTRを検出することと;
(c)
(i)生体試料の第二の部分を、残基89〜97内のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体およびTTRの残基89〜97内のエピトープに特異的に結合するレポーター抗体と接触させ;試料中に多量体ミスフォールドTTRが存在する場合、捕捉抗体およびレポーター抗体が多量体ミスフォールドTTRに結合してサンドイッチ複合体を形成すること;ならびに
(ii)段階(c)(i)でサンドイッチ複合体を形成するレポーター抗体が存在すればそれを検出して、多量体ミスフォールドTTRの有無を示すこと
によって、生体試料の第二の部分中の総多量体ミスフォールドTTRを検出することと、
(d)(c)の総多量体ミスフォールドTTRのレベル対(b)の総ミスフォールドTTRのレベルの比を算出すること
を含む、方法を提供する。
(a)生体試料を2部に分けることと;
(b)
(i)生体試料の第一の部分を、TTRの残基101〜109内のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体およびTTRの異なるエピトープに特異的に結合するレポーター抗体と接触させ;試料中にミスフォールドTTRが存在する場合、捕捉抗体およびレポーター抗体がミスフォールドTTRに結合してサンドイッチ複合体を形成すること;ならびに
(ii)(i)において、ミスフォールドTTRに結合したレポーター抗体が存在すればそれを検出して、ミスフォールドTTRの有無を示すこと
によって、生体試料の第一の部分中の総ミスフォールドTTRを検出することと;
(c)
(i)生体試料の第二の部分を、残基101〜109内のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体およびTTRの残基101〜109内のエピトープに特異的に結合するレポーター抗体と接触させ;試料中に多量体ミスフォールドTTRが存在する場合、捕捉抗体およびレポーター抗体が多量体ミスフォールドTTRに結合してサンドイッチ複合体を形成すること;ならびに
(ii)段階(a)で多量体ミスフォールドTTRに結合したレポーター抗体が存在すればそれを検出して、多量体ミスフォールドTTRの有無を示すこと
によって、生体試料の第二の部分中の総多量体ミスフォールドTTRを検出することと、
(d)(c)の総多量体ミスフォールドTTRのレベル対(b)の総ミスフォールドTTRのレベルの比を算出すること
を含む、方法を提供する。
(a)生体試料を2部に分けることと;
(b)
(i)生体試料の第一の部分を、TTRの残基101〜109内のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体およびTTRの異なるエピトープに特異的に結合するレポーター抗体と接触させ;試料中にミスフォールドTTRが存在する場合、捕捉抗体およびレポーター抗体がミスフォールドTTRに結合してサンドイッチ複合体を形成すること;ならびに
(ii)段階(i)でミスフォールドTTRに結合したレポーター抗体が存在すればそれを検出して、ミスフォールドTTRの有無を示すこと
によって、生体試料の第一の部分中の総ミスフォールドTTRを検出することと、
(d)
(i)生体試料の第二の部分を、残基101〜109内のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体およびTTRの残基101〜109内のエピトープに特異的に結合するレポーター抗体と接触させ;試料中に多量体ミスフォールドTTRが存在する場合、捕捉抗体およびレポーター抗体が多量体ミスフォールドTTRに結合してサンドイッチ複合体を形成すること;ならびに
(ii)段階(a)で多量体ミスフォールドTTRに結合したレポーター抗体が存在すればそれを検出して、多量体ミスフォールドTTRの有無を示すこと
によって、生体試料の第二の部分中の総多量体ミスフォールドTTRを検出することと、
(e)(c)の総多量体ミスフォールドTTRのレベル対(b)の総ミスフォールドTTRのレベルの比を算出すること
を含む、方法を提供する。
配列番号1は、シグナルペプチドを有するマウス18C5抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を表す。
モノクローナル抗体をはじめとする生物学的実体は通常、単離形態で提供される。このことは、抗体をはじめとする生物学的実体が通常、その作製または精製から生じる妨害タンパク質をはじめとする夾雑物に対し純度が少なくとも50重量%であることを意味するが、モノクローナル抗体が、その使用を容易にすることを目的とする過剰の薬学的に許容される担体(1つまたは複数)をはじめとする媒体と組み合わされる可能性を排除するものではない。モノクローナル抗体は場合によっては、作製または精製から生じる妨害タンパク質をはじめとする夾雑物に対し純度が少なくとも60重量%、70重量%、80重量%、90重量%、95重量%または99重量%である。多くの場合、単離されたモノクローナル抗体をはじめとする生物学的実体は、その精製後に残っている主要な高分子種である。
I.概略
本発明は、トランスサイレチン(TTR)の残基89〜97にまたは残基101〜109に特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの抗体は、天然の四量体形態のTTRよりも単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のTTRのうちのいずれかまたは全てと優先的に結合する。いくつかの抗体は、天然の四量体形態のTTRよりも単量体形態またはミスフォールド形態のTTRのうちの一方または両方と優先的に結合する。この抗体は、TTRの蓄積またはTTR沈着物の蓄積に関連する疾患または障害(例えば、TTRアミロイドーシス)を治療または予防するために使用できる。この抗体はまた、TTRアミロイドーシスを診断するため、およびTTRの凝集を阻害または軽減するために使用できる。これらの抗体はまた、諸用途のなかでもとりわけ、トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスに対する治療法の薬力学効果を示すために使用できる。優先的に結合することは、天然の四量体形態のTTRに対するより単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のTTRのいずれかまたは全てに対し少なくとも5倍高い結合定数を意味する。任意選択で、結合定数は、天然の四量体形態のTTRに対するよりミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のTTRのいずれかまたは全てに対し少なくとも10倍高い。任意選択で、9D5または18C5などの抗体は、例えば、天然の四量体形態のTTRに対する特異的結合を欠く。
トランスサイレチン(TTR)は、血清中および脳脊髄液中に存在する127アミノ酸、55kDaの輸送タンパク質であり、主に肝臓で合成される。それはまたプレアルブミン、チロキシン結合プレアルブミン、ATTR、およびTBPAとも呼ばれている。その天然の状態では、TTRは四量体として存在する。ホモ接合体では、四量体は同一の127アミノ酸ベータシートリッチサブユニットを含む。ヘテロ接合体では、TTR四量体は、通常は統計的に組み合わされるバリアントサブユニットおよび/または野生型サブユニットからなる。
トランスサイレチン(TTR)アミロイドーシスは、病原性のミスフォールドTTRおよびTTRからなるアミロイド原線維の細胞外沈着を特徴とする全身障害である。TTRアミロイドーシスは、天然のTTR四量体形態の不安定化(環境条件または遺伝条件による)により一般に引き起こされ、TTRの解離、ミスフォールディング、およびアミロイド原線維への凝集が起こり、これが様々な器官および組織に蓄積し、進行性の機能不全を引き起こす。例えば、AlmeidaおよびSaraiva,FEBS Letters 586:2891−2896(2012);Andoら,Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31(2013)を参照されたい。
A.結合特異性および機能的特性
本発明は、トランスサイレチン(TTR)タンパク質、より具体的には、TTRのアミノ酸残基89〜97(配列番号45)内のエピトープまたはアミノ酸残基101〜109(配列番号30)内のエピトープと結合する、モノクローナル抗体を提供する。このようなエピトープは、天然のTTR四量体では埋没しており、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のTTRでは露出している。
単量体TTRまたはそのフラグメント(例えば、アミノ酸残基89〜97またはアミノ酸残基101〜109)に対する他の非ヒト抗体、例えば、マウス抗体、モルモット抗体、霊長類抗体、ウサギ抗体またはラット抗体の作製は、例えば、動物をTTRまたはそのフラグメントで免疫することによって遂行できる。HarlowおよびLane,Antibodies,A Laboratory Manual(CSHP NY,1988)(あらゆる目的において参照により組み込まれる)を参照されたい。このような免疫原は、天然源から、ペプチド合成によって、または組換え発現によって得ることができる。任意選択で、融合をはじめとする方法で免疫原を担体タンパク質と複合体形成させて投与してもよい。任意選択で、免疫原をアジュバントとともに投与してもよい。のちに記載する通り、いくつかの種類のアジュバントを用いることができる。実験動物の免疫感作には、フロイント完全アジュバント、次いで不完全アジュバントが好ましい。ポリクローナル抗体の作製には通常、ウサギまたはモルモットを用いる。モノクローナル抗体の作製には通常、マウスを用いる。単量体TTRまたはTTR内のエピトープ(例えば、アミノ酸残基89〜97またはアミノ酸残基101〜109のうちの1つまたは複数のものを含むエピトープ)と特異的に結合する抗体をスクリーニングする。このようなスクリーニングは、単量体TTRバリアント、例えばアミノ酸残基89〜97、アミノ酸残基101〜109を有するかその残基内に変異を有するTTRバリアントなどの収集物への抗体の結合を決定し、その抗体にどのTTRバリアント抗体が結合するかを決定することによって遂行できる。結合は、例えば、ウエスタンブロット、FACSまたはELISAによって評価できる。
ヒト化抗体は、遺伝子操作によって非ヒト「ドナー」抗体のCDRをヒト「アクセプター」抗体配列内に移植した抗体である(例えば、Queen,米国特許第5,530,101号および同第5,585,089号;Winter,米国特許第5,225,539号;Carter,米国特許第6,407,213号;Adair,米国特許第5,859,205号;および米国特許第6,881,557号を参照されたい)。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、そのような配列の複合体、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、または生殖系列領域の配列であり得る。したがって、ヒト化抗体は、完全にまたは実質的にドナー抗体に由来するCDRを少なくとも3つ、4つ、5つまたは全部ならびに、存在する場合は、完全にまたは実質的にヒト抗体配列に由来する可変領域フレームワーク配列および定常領域を有する抗体である。同じように、ヒト化重鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体重鎖に由来するCDRを少なくとも1つ、2つ、通常は3つ全部ならびに、存在する場合は、実質的にヒト重鎖可変領域フレームワーク配列および定常領域配列に由来する重鎖可変領域フレームワーク配列および重鎖定常領域を有する。同じように、ヒト化軽鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体軽鎖に由来するCDRを少なくとも1つ、2つ、通常は3つ全部ならびに、存在する場合は、実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワーク配列および定常領域配列に由来する軽鎖可変領域フレームワーク配列および軽鎖定常領域を有する。ナノボディおよびdAb以外にも、ヒト化抗体はヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体のCDRは、各CDR間で対応する残基(任意の従来の定義、好ましくはKabatによって定義されるもの)の少なくとも85%、90%、95%または100%が一致する場合、非ヒト抗体での対応するCDRに実質的に由来する。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、任意の従来の定義、好ましくはKabatによって定義される対応する残基の少なくとも85%、90%、95%または100%が同一である場合、それぞれヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域に実質的に由来する。2014年の世界保健機関(WHO)国際一般名(INN)によるヒト化抗体の定義でヒト化に分類されるには、抗体は、成熟可変領域にヒト生殖系列抗体配列(すなわち、体細胞超変異のの前)と少なくとも85%の同一性を有するものでなければならない。混合抗体は、一方の抗体鎖(例えば、重鎖)は閾値を満たすが、他方の鎖(例えば、軽鎖)は閾値を満たさない抗体である。ある抗体は、鎖がいずれも閾値を満たさない場合、両鎖の可変フレームワーク領域がいくつかのマウス復帰変異を有して実質的にヒトであっても、キメラに分類される。Jonesら(2016)The INN and outs of antibody nonproprietary names,mAbs 8:1,1−9,DOI:10.1080/19420862.2015.1114320を参照されたい。http://www.who.int/medicines/services/inn/BioRev2014.pdf)から入手可能であり、参照により本明細書に組み込まれる「WHO−INN:International nonproprietary names(INN)for biological and biotechnological substances(a review)」(インターネット)2014も参照されたい。誤解を避けるため、本明細書で使用される「ヒト化」という用語は、2014年のWHO INNによるヒト化抗体の定義に限定されないものとする。本明細書に提供されるヒト化抗体のいくつかは、一方または両方の成熟可変領域にヒト生殖系列配列と少なくとも85%の配列同一性を有し、本明細書に提供されるヒト化抗体のいくつかは、一方または両方の成熟可変領域にヒト生殖系列配列と85%未満の配列同一性を有する。本明細書に提供されるヒト化抗体の成熟重鎖可変領域のいくつかは、例えば、約60%〜69%、70%〜79%、80%〜84%、または85%〜89%などの範囲でなどの、ヒト生殖系列配列と約60%〜100%の配列同一性を有する。成熟重鎖可変領域重鎖のいくつかは、2014年のWHO INNによる定義を下回り、例えば、ヒト生殖系列配列と約64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%または82%、83%または84%の配列同一性を有し、一方で他の成熟重鎖可変領域は、2014年のWHO INNによる定義を満たし、ヒト生殖系列配列と約85%、86%、87%、88%、89%、またはそれを超える配列同一性を有する。本明細書に提供されるヒト化抗体の成熟軽鎖可変領域のいくつかは、約80%〜84%または85%〜89%の範囲でなどの、ヒト生殖系列配列と約60%〜100%の配列同一性を有する。成熟軽鎖可変領域のいくつかは、2014年のWHO INNによる定義を下回り、例えば、ヒト生殖系列配列と約81%、82%、83%、または84%の配列同一性を有し、一方で他の成熟軽鎖可変領域は、2014年のWHO INNによる定義を満たし、ヒト生殖系列配列と約85%、86%、87%、88%、89%、またはそれを超える配列同一性を有する。2014年のWHO INNによる定義で「キメラ」である本明細書に提供されるいくつかのヒト化抗体は、ヒト生殖系列配列と85%未満の同一性を有する成熟軽鎖可変領域と対になったヒト生殖系列配列と85%未満の同一性を有する成熟重鎖可変領域を有する。本明細書に提供されるいくつかのヒト化抗体は、2014年のWHO INNによる定義で「混合」であり、例えば、ヒト生殖系列配列と85%未満の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域と対になったヒト生殖系列配列と少なくとも85%の配列同一性を有する成熟重鎖可変領域を有するか、またはその逆である。本明細書に提供されるいくつかのヒト化抗体は、2014年のWHO INNによる「ヒト化」の定義を満たし、ヒト生殖系列配列と少なくとも85%の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域と対になったヒト生殖系列配列と少なくとも85%の配列同一性を有する成熟重鎖可変領域を有する。2014年のWHO INNによる「ヒト化」の定義を満たす例示的18C5抗体としては、配列番号91または配列番号92のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域と対になった配列番号85または配列番号86のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域を有する抗体が挙げられる。
(1)直接抗原と非共有結合する;
(2)KabatではなくChothiaによって定義されるCDR領域に隣接するか、そのCDR内にある;
(3)別の方法でCDR領域(例えば、CDR領域の約6Å以内にある)、(例えば、相同な既知の免疫グロブリン鎖で明らかになった構造上で軽鎖もしくは重鎖をモデル化することによって同定される)と相互作用する;または
(4)VL−VH界面に関与する残基である
ことが合理的に予想される。
本発明はさらに、キメラ型およびベニヤ化(veneered)型の非ヒト抗体、具体的には実施例の9D5抗体または18C5抗体を提供する。
以下に記載する様々な技術によって、単量体TTRまたはそのフラグメント(例えば、TTRのアミノ酸残基89〜97(配列番号45)またはTTRのアミノ酸残基101〜109(配列番号30))に対するヒト抗体が得られる。いくつかのヒト抗体は、特定のマウス抗体、例えば実施例に記載されるマウスモノクローナル抗体の1つなどと同じエピトープ特異性を有するように、上記の競合結合実験により、Winterのファージディスプレイ法により選択される。ヒト抗体はまた、TTRのフラグメント、例えばTTRのアミノ酸残基89〜97またはアミノ酸残基101〜109のみを含むTTRバリアントなどのみを標的抗原として使用することによって、および/またはTTRバリアントの収集物、例えばTTRのアミノ酸残基89〜97またはアミノ酸残基101〜109内に様々な変異を有するTTRバリアントなどに対する抗体をスクリーニングすることによって、特定のエピトープ特異性に関してスクリーニングされ得る。
キメラ抗体、ベニヤ化(veneered)抗体またはヒト化抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部分に連結できる。定常領域の選択は部分的に、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性、抗体依存性細胞食作用および/または補体依存性細胞傷害を所望するかどうかに左右される。例えば、ヒトアイソタイプのIgG1およびIgG3には補体依存性細胞傷害性があり、ヒトアイソタイプのIgG2およびIgG4にはない。ヒトIgG1およびIgG3はまた、ヒトIgG2およびIgG4よりも強力な細胞仲介性エフェクター機能を誘導する。軽鎖定常領域はラムダまたはカッパであり得る。定常領域の番号付けの慣例としては、EU番号付け(Edelman,G.M.ら,Proc.Natl.Acad.USA,63,78−85(1969))、Kabat番号付け(Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、1991)、IMGT固有番号付け(Lefranc M.−P.ら,IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C−like domains,Dev.Comp.Immunol.,29,185−203(2005)、およびIMGTエクソン番号付け(Lefranc、上記)が挙げられる。
抗体発現細胞系(例えば、ハイブリドーマ)を用いてキメラ抗体およびヒト化抗体を作製する方法が多数知られている。例えば、周知の方法を用いて抗体の免疫グロブリン可変領域をクローン化し配列を決定できる。1つの方法では、ハイブリドーマ細胞から調製したmRNAを用いるRT−PCRにより重鎖可変VH領域をクローン化する。翻訳開始コドンを含むVH領域リーダーペプチドに対しては、5’プライマーおよびg2b定常領域特異的3’プライマーとしてコンセンサスプライマーを用いる。例示的なプライマーはSchenkによる米国特許公開第2005/0009150号(以下「Schenk」)に記載されている。別個に得た複数のクローンの配列を比較して、増幅の際に変化が導入されないことを確実にできる。VH領域の配列はまた、5’RACE RT−PCR法および3’g2b特異的プライマーによって得られるVHフラグメントの配列のシーケンシングによって、決定または確認することができる。
抗体に結合アッセイ、機能スクリーニング、TTR沈着物による疾患の動物モデルを用いるスクリーニング、および診療試験を含むいくつかのスクリーニングを実施できる。結合アッセイでは、単量体TTRまたはそのフラグメントに対する特異的結合ならびに、任意選択で親和性およびエピトープ特異性を試験する。例えば、結合アッセイによって、天然のTTR四量体では埋没しており単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のTTRでは露出しているエピトープである、TTRのアミノ酸残基89〜97(配列番号45)またはアミノ酸残基101〜109(配列番号30)と結合する抗体をスクリーニングできる。抗体はまた、天然のTTRの立体構造ではなく前原線維性の非天然の立体構造のTTRおよびTTRアミロイド原線維を結合する能力についてスクリーニングされる。例えば、抗体は、実施例その他に記載されるように、天然の四量体TTRの解離または脱凝集によって生じる単量体型TTRと結合する能力についてスクリーニングされ、かつ天然の四量体TTRに対してカウンタースクリーニングされる。同じように、抗体はまた、健常組織に対してではなくTTR媒介性アミロイドーシス組織に対するそれらの免疫反応性についてスクリーニングされる。このようなスクリーニングは場合によっては、9D5のまたは18C5あるいはIgG1カッパアイソタイプの可変領域を有する抗体などの例示的抗体と競合して実施する。このようなアッセイでは、任意選択で抗体またはTTR標的を固定化する。
本発明はさらに、上記の重鎖および軽鎖のいずれかをコードする核酸(例えば、配列番号2、4、18および20)を提供する。このような核酸は任意選択で、シグナルペプチドをさらにコードし、定常領域に連結されたシグナルペプチド(例えば、配列番号36(重鎖)および38(軽鎖)によってそれぞれコードされ得る配列番号35(重鎖)および配列番号37(軽鎖)のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド)とともに発現させることができる。コード配列を確実に発現させるため、核酸のコード配列はプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終止シグナルなどの制御配列と作動可能に連結され得る。重鎖および軽鎖をコードする核酸は、分離形態で存在しても、1つまたは複数のベクター中にクローン化されていてもよい。核酸は、例えば固相合成または重複するオリゴヌクレオチドのPCRによって合成できる。重鎖と軽鎖をコードする核酸は、例えば発現ベクター内で、1つの連続する核酸として連結されていてもよく、または例えばそれぞれの発現ベクター中にクローン化されて、分離していてもよい。
病原性形態のTTRでは露出しているが天然の四量体形態のTTRでは露出していない抗原、例えばTTRのアミノ酸残基89〜97(配列番号45)またはアミノ酸残基101〜109(配列番号30)と特異的に結合するコンジュゲート抗体は、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、もしくは原線維形態のTTRの有無の検出;TTRアミロイドーシスと診断された患者の治療に使用される治療剤の有効性のモニタリングおよび評価;TTRの凝集の阻害もしくは軽減;TTR原線維形成の阻害もしくは軽減;TTR沈着物の減少もしくは除去;TTRの非毒性立体構造の安定化;または患者のTTRアミロイドーシスの治療もしくは予防に有用である。例えば、このような抗体は別の治療部分、別のタンパク質、別の抗体、および/または検出可能な標識とコンジュゲートできる。国際公開第03/057838号;米国特許第8,455,622号を参照されたい。
上記の抗体は、トランスサイレチン(TTR)により少なくとも部分的に、および特に単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のTTRにより媒介される疾患を有するか、そのような疾患のリスクのある患者における疾患の治療または予防に使用できる。実施にあたって機序を理解する必要はないが、上記の抗体を用いるTTRアミロイドーシスの治療に以下の機序:TTR凝集および原線維形成の抗体介在性阻害、TTRの非毒性立体構造(例えば、テトラマー形態)の抗体介在性安定化、または凝集TTR、オリゴマーTTR、もしくは単量体TTRの抗体介在性除去のいずれかまたは全部が寄与するものと考えられる。抗体−薬物コンジュゲートは、コンジュゲート部分によって決まるさらなる作用機序を有し得る。
本明細書では、トランスサイレチン(TTR)により少なくとも部分的に、および特に単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のTTRにより媒介される疾患または病態(例えば、TTRアミロイドーシス)を診断、モニタリング、治療または予防するいくつかの方法が提供される。このような疾患の例としては、家族性アミロイド心筋症(FAC)、家族性アミロイドニューロパチー(FAP)、または中枢神経系選択性アミロイドーシス(CNSA)などの家族性TTRアミロイドーシス、および老人性全身性アミロイドーシス(SSA)または老人性心アミロイドーシス(SCA)などの孤発性TTRアミロイドーシスが挙げられる。上記の抗体は、このような方法で使用する医薬組成物中に組み込まれ得る。一般に、抗体または抗体を含有する医薬組成物が、それを必要とする対象に投与される。治療に適する患者としては、TTRアミロイドーシスのリスクはあるが症状を認めない個体ならびに、現時点で症状を呈する患者が挙げられる。患者によっては、TTRアミロイドーシスの前駆段階の間に治療され得る。
TTR沈着または病原性形態のTTR(例えば、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態または原線維形態のTTR)に関連する疾患に罹患しているか罹患しやすい患者中でTTRに対する免疫応答を検出する方法も提供される。この方法は、本明細書に提供される薬剤による治療的処置または予防的処置の経過をモニターするのに使用できる。受動免疫後の抗体プロファイルは通常、抗体濃度の直後のピークとそれに続く指数関数的減衰を示す。さらなる投与を実施しなければ、投与した抗体の半減期に応じて数日〜数か月以内に減衰が治療前のレベルに近づく。例えば、いくつかのヒト抗体の半減期は20日程度である。
本発明はさらに、本明細書に開示される9D5または18C5抗体と、それに関連する材料、例えば使用指示書(例えば、添付文書)とを含む、キット(例えば、容器)を提供する。使用指示書は、例えば、抗体および任意選択で1つまたは複数の追加の薬剤の投与に関する指示を含み得る。抗体の容器は、単位用量、バルク包装(例えば、複数用量包装)、または小単位用量であり得る。
抗体は、臨床診断、臨床治療または研究において単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、もしくは原線維形態のトランスサイレチン(TTR)またはそのフラグメントを検出するのに用いることができる。例えば、抗体を用いて、生体試料がTTRアミロイド沈着物を含むことの指標として生体試料中の単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のTTRの存在を検出できる。生体試料への抗体の結合を、対照試料への抗体の結合と比較できる。対照試料と生体試料は、同じ組織を起源とする細胞を含み得る。対照試料と生体試料は、同じ個体または異なる個体から同じ機会または異なる機会に採取され得る。必要に応じて、複数の生体試料と複数の対照試料を複数の機会に評価して、試料間の差とは無関係のランダムな変動から保護する。次いで、生体試料(1つまたは複数)と対照試料(1つまたは複数)とを直接比較して、生体試料(1つまたは複数)への抗体の結合(すなわち、単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のTTRの存在)が対照試料(1つまたは複数)への抗体の結合に比して増大しているのか、減少しているのか、同じであるのかを決定できる。生体試料(1つまたは複数)への抗体の結合が対照試料(1つまたは複数)に比して増大していることは、生体試料(1つまたは複数)中に単量体形態、ミスフォールド形態、凝集形態、または原線維形態のTTRが存在することを示す。いくつかの場合には、抗体結合の増大は統計的に有意である。任意選択で、生体試料への抗体の結合は、対照試料への抗体の結合より少なくとも1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、または100倍高い。
実施例1.材料および試薬調製
9D5のビオチン化:PBS中1mg/mLの9D5を、抗体に対して20M過剰の代わりに10M過剰のNHS−ビオチン(Thermo−Fisher社、カタログ番号21329)を用いた以外は製造業者の指示通りにビオチン化した。
単量体を含む遊離(未結合)ミスフォールドTTRを、定量的ECL(Meso Scale Discovery社;MSD)アッセイ試験法を用いてヒト血漿中で検出した。96ウェルMSDプレートを、1ウェル当たり30μLのPBS中4μg/mLのニュートラアビジンでコートし、4℃で一晩インキュベートし、0.05%Tween 20を含有するTBSで3回洗浄した。プレートの非特異的結合部位をPBS中3%のMSD Blocker A(MSD#:R93BA−4)で1時間、室温で振盪しながらブロックし、次いで、3回洗浄した。アッセイ緩衝液(1%MSD Blocker A/PBS+0.05%Tween−20)中1μg/mLのビオチン化9D5を各ウェルに30μL加え、室温で振盪しながら1時間インキュベートした。標準曲線を、Diluant 2(MSD#:R51BB−3)で希釈した6MグアニジンHCl TTRの新鮮なアリコートから作成した。標準曲線は、200ng/mLから始まり49pg/mLで終わる7つの4倍希釈物からなった。患者または対照の血漿をMSD Diluant 2で1:5に希釈した。標準品または希釈した血漿(30μL)をプレートに二重反復で加え、室温で振盪しながら2時間インキュベートし、次いで洗浄した。アッセイ緩衝液中1μg/mLのポリクローナル抗TTR SULFO−TAG標識(カタログ番号A000202−2、Dako、Agilent Technologies社、サンタクララ、カリフォルニア州)30μLを各ウェルに加え、振盪しながら1時間インキュベートし、次いで洗浄した。1×MSD Read Buffer T(MSD#:R92TC−1)を150μL/ウェルで各ウェルに加え、10分以内にMSD Sector Imager S600で読み取った。上下の標準品がアンカーポイントであり、曲線は、グアニジン−HCl TTR標準品に基づく未希釈血漿の1〜500ng/mL当量の定量範囲を有した。
2回のアッセイで得たTTRアミロイドーシス患者の血漿中および正常血漿中の遊離ミスフォールドTTRの個々のレベルおよび平均レベル(ng−eq/mL)を合わせたものを図1に示す。
asympt=無症候性;ATTR=アミロイドトランスサイレチン;eq=当量;GuHCL=塩酸グアニジン;h=遺伝性;mis=ミスフォールド;std=標準品;Tx=移植;wt=野生型
EC50=50%有効濃度(遊離/m14G8未結合);mis=ミスフォールド
方法:単量体を含む遊離(未結合)ミスフォールドTTRを、定量的ECL(Meso Scale Discovery社;MSD)アッセイ試験法を用いてヒト血漿中で検出した。96ウェルMSDプレートを、1ウェル当たり30μLのPBS中4μg/mLのニュートラアビジンでコートし、4℃で一晩インキュベートし、0.05%Tween 20を含有するTBSで3回洗浄した。プレートの非特異的結合部位を、PBS中3%のMSD Blocker Aで1時間、室温で振盪しながらブロックし、次いで、3回洗浄した。30μLのアッセイ緩衝液(1%MSD Blocker A/PBS+0.05%Tween−20)中1μg/mLの9D5−ビオチンを各ウェルに加え、室温で振盪しながら1時間インキュベートした。標準曲線を、アッセイ緩衝液で希釈した6MグアニジンHCl TTRの新鮮なアリコートから作成した。標準曲線は、1000ng/mLから始まり64pg/mLで終わる7つの5倍希釈物からなった。患者または対照の血漿をアッセイ緩衝液で1:5に希釈した。標準品または希釈した血漿(30μL)をプレートに二重反復で加え、室温で振盪しながら1時間インキュベートし、次いで洗浄した。30μLのアッセイ緩衝液中1μg/mLのSULFO−TAG標識18C5を各ウェルに加え、振盪しながら1時間インキュベートし、次いで洗浄した。150μL/ウェルの1×MSD Read Buffer Tを各ウェルに加え、10分以内にMSD Sector Imager S600で読み取った。上下の標準品がアンカーポイントであり、曲線は、グアニジン−HCl TTR標準品に基づく未希釈血漿の1.6〜1000ng/mL当量の定量範囲を有した。
asym=無症候性;ATTR=アミロイドトランスサイレチン;eq=当量;GuHCl=塩酸グアニジン;h=遺伝性;mis=ミスフォールド;std=標準品;Tx=移植;wt=野生型
BALB/cおよびC57BL/6の両雌マウスに、トランスサイレチン二重変異体(TTR−DM)と称するF87MおよびL110Mでの変異を有して設計されたトランスサイレチンを注射した。RIBIアジュバントに乳濁させたTTR−DMの腹腔内注射を、50μg/マウスで3回、次いで25μg/マウスで3回、次いで10μg/マウスで4回BALB/c5匹を用いて毎週実施し、さらにC57BL/6マウス5匹に、RIBIアジュバントに乳濁させた50μg/マウスで3回、25μg/マウスで3回、10μg/マウスで4回注射した。マウスの力価をTTR−DM、天然の四量体TTR、およびhis−MCAMに対して求めた。TTR−DMに対する力価が最も高いマウスと、天然の四量体TTRおよびhis−MCAMに対する力価が最も低いマウス(BALB/c番号1および5とC57BL/6番号4および5)を、ケーラーとミルスタインの改変法により融合した。得られたハイブリドーマをTTR−DM、天然の四量体TTR、およびhis−MCAMに対してスクリーニングした。TTR−DMに対して特異性を示すハイブリドーマをクローン化し、さらに特徴付けた。18C5を同定した。
Biacore T200を用いて解析を実施して6M塩酸グアニジンで変性させた組換えヒトTTR(Gu−hTTR)、6M塩酸グアニジンで変性させたカニクイザルTTR(Gu−cTTR)、および天然の四量体ヒトTTRに対するマウス抗体の結合親和性を比較した。抗マウス抗体をアミンカップリングによりセンサーチップCM3(GE Healthcare Life Sciences社)上に固定化し、マウス抗体(リガンド)を、50RUの分析物の最大結合(約250RUのリガンド結合)を確実にするレベルまで捕捉した。様々な濃度のGu−TTR(0.4nM〜100nMの範囲の)を、300秒の結合時間および900秒の解離時間にわたってランニング緩衝液(HBS+0.05%P−20、1mg/mL BSA、50mM Gu−HCl)中、50μL/分で、捕捉されたリガンドの上を通過させた。チップ表面の再生を、pH1.7の10mMグリシン−HClを2回、短時間注入することにより行った。使用したGu−cTTRの濃度は1〜1000nMの範囲であり、ヒトTTR四量体の濃度は10nM〜10,000nMの範囲であった。データは、リガンドを含まないセンサーおよび分析物濃度0nMの両方に対してブランクを減算した。解析を、Biacore Evaluationソフトウェア(v3.0)で全般的な1:1フィットを用い、バルク屈折率をゼロRUに設定して実施した。結合データを表6に示す。
解析を、Biacore T200を用いて実施して6M塩酸グアニジンで変性させた組換えヒトTTR(Gu−hTTR)に対するマウス抗体およびキメラ抗体の結合親和性を比較した。抗ヒト抗体をセンサーチップCM3(GE Healthcare Life Sciences社)上のフローセル1および2に、抗マウス抗体をフローセル3および4に、アミンカップリングにより固定化し、キメラ18C5抗体およびマウス18C5抗体(リガンド)を、50RUの分析物の最大結合(約250RUのリガンド結合)を確実にするレベルまで捕捉した。様々な濃度のGu−TTR(0.4nM〜100nMの範囲の)を、300秒の結合時間および900秒の解離時間にわたってランニング緩衝液(HBS+0.05%P−20、1mg/mL BSA、50mM Gu−HCl)中、50μL/分で、捕捉されたリガンドの上を通過させた。チップ表面の再生を、3M塩化マグネシウムを2回またはpH1.7の10mMグリシン−HClを2回、短時間注入することにより行った。データは、リガンドを含まないセンサーおよび分析物濃度0nMの両方に対してブランクを減算した。解析を、Biacore Evaluationソフトウェア(v3.0)で全般的な1:1フィットを用い、バルク屈折率をゼロRUに設定して実施した。結合データを表7に示す。
最初のマッピングは、18C5に対するエピトープが配列番号26の87〜127内にあることを示した。さらなるマッピングは、同エピトープが配列番号26の101〜109の間にあることを示した。ミスフォールドカニクイザルTTRに対する親和性がはるかに低いことは、アミノ酸104がヒトTTRとカニクイザルTTRの間にみられる唯一のアミノ酸置換であることから、同アミノ酸が重要であることを示唆する。
18C5ハイブリドーマクローンLA89 18C5.A1。A1凍結細胞ペレットをmRNAの抽出および精製に用いた。mRNAの単離および精製を、Oligotex direct mRNAミニキット(Qiagen社、カタログ番号72022)のプロトコルを用いて実施した。簡潔に述べれば、ハイブリドーマクローン細胞9×106個を、RNアーゼを不活化する変性力の高いグアニジン−イソチオシアナート緩衝液の存在下で溶解させ、ホモジナイズした。この溶解混合物にOligotex懸濁液を加え、oligotex粒子のオリゴdT30とmRNAのポリAテールの間でハイブリダイゼーションを生じさせた。夾雑物を次いで洗浄し、ポリ−A+RNAを溶離させた。mRNAを、Marathon cDNA増幅キット(Clontech社、カタログ番号634913)を用いてcDNAに逆転写した。cDNAの5’末端にアダプターをライゲートした。5’RACE法を用いてV領域を増幅した。PCRには5’V領域コンセンサスプライマーおよび定常領域特異的アンカープライマーを用いた。増幅したV領域をpTOPOクローニングベクターにクローン化し、Top10大腸菌(E.coli)に形質転換した。15〜20の個々のクローンを成長させ、精製したプラスミドを配列決定した。クローン配列は、以下の基準、すなわち、
Met領域とC領域の間に終止コドンがない
配列が抗体V領域の重要な特徴を含む
配列が定義可能なCDRを含む。
マッチするORFを有する最低3つの独立したクローン
を満たす場合、真のV領域配列とみなした。
18C5の非天然(変性)TTRに対する立体構造特異性を示すため、ウエスタンブロット解析を以下の通りに実施した:
SDS−ポリアクリルアミドゲル
天然TTR:LDS試料緩衝液(Life Technologies社)中の組換えヒトTTRの試料1.0μg、0.5μg、および0.1μgを10%NuPAGEビス‐トリスゲル(MES緩衝液;90V、105分)上で泳動させ、ニトロセルロース膜に転写して、ウエスタンブロット解析に供した。
SDS−PAGEゲルをニトロセルロース膜(iBlot、Life Technologies社)上にブロットし、ブロッキング緩衝液(LI−COR社、リンカーン、ネブラスカ州)で処理し、1.0μg/mLの一次抗体中でインキュベートし、1×TBSで洗浄し、1:20,000希釈のIRDye 800CWコンジュゲートヤギ抗マウスおよび抗ウサギ二次抗体(LI−COR社、リンカーン、ネブラスカ州)に入れ、次いで、Odyssey CLx赤外線撮像装置(LI−COR社、リンカーン、ネブラスカ州)で撮像した。
天然組換えTTR対変性TTRのウエスタンブロット(図4)は、18C5は天然TTR種に対する極めて弱い反応性を有した(レーン1〜3)が、変性TTR単量体(約15kDa)に対する極めて強い反応性および変性二量体(約30kDa)に対する弱い反応性を有した(レーン5〜7)ことを示した。レーン4は分子量マーカーを示す。
Meso Scale Discovery(MSD)電気化学発光プラットフォームを用いるサンドイッチイムノアッセイを用いて、患者血漿試料中の総ミスフォールドTTR(総misTTR)を検出した。試料は、正常患者およびトランスサイレトリン(transthyretrin)介在性のアミロイドーシス(ATTR)を有する患者由来であった。トランスサイレトリン(transthyretrin)介在性のアミロイドーシス(ATTR)を有する患者は、以下のようなTTR変異および治療を有した:肝移植を受けたATTR(V30M家族性アミロイドニューロパチー(FAP))、未治療のATTR(V30M家族性アミロイドニューロパチー(FAP))、タファミジスで治療したATTR(V30M家族性アミロイドニューロパチー(FAP))、タファミジスで治療したATTR(Y114C家族性アミロイドニューロパチー(FAP))、および未治療のATTR(S50I)。
Meso Scale Discovery(MSD)電気化学発光プラットフォームを用いるサンドイッチイムノアッセイを用いて、患者血漿試料中の総多量体ミスフォールドTTR(総多量体misTTR)を検出した。試料は、正常患者およびトランスサイレトリン(transthyretrin)介在性のアミロイドーシス(ATTR)を有する患者由来であった。トランスサイレトリン(transthyretrin)介在性のアミロイドーシス(ATTR)を有する患者は、以下のようなTTR変異および治療を有した:肝移植を受けたATTR(V30M家族性アミロイドニューロパチー(FAP))、未治療のATTR(V30M家族性アミロイドニューロパチー(FAP))、タファミジスで治療したATTR(V30M家族性アミロイドニューロパチー(FAP))、タファミジスで治療したATTR(Y114C家族性アミロイドニューロパチー(FAP))、および未治療のATTR(S50I)。
ATTR血漿および正常血漿の採取
遺伝性(h−ATTR)ATTRが陽性と診断されたおよび野生型ATTR(WT−ATTR)のATTR患者由来の血液を、7mlのVacutainer K2−EDTAチューブに採取し、遠心分離して細胞残屑を除去した。血漿画分を1.5mlのLoBind Eppendorfチューブに一定分量に分けて入れ、直ちに凍結させた。健常被験者の血漿試料を同じ方法で採取した。全ての試料を解凍後直ちに使用し、再凍結しなかった。試料は表5に記載した通りである。
血漿試料をドデシル硫酸リチウム試料緩衝液(Life Technologies社)に10倍希釈し、10%NuPAGEビス‐トリスゲル上に負荷し(12μL)、90Vで105分間、電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写し、1.0μg/mLのmis−TTR 9D5、次いで、1:20,000希釈のIRDye 800CWコンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体(LICOR社)でプローブした。次いで、ブロットをすすぎ、Odyssey CLx赤外線撮像装置(LI−COR社)で撮像した。結果を図8に示す。
一次mAb:1μg/ml 9D5;M、分子量マーカー(BioRad社);黒塗りの星、肝移植を受けていないTTR−V30M患者;斜線を施した星、(患者5、20)TTR−T114C;白塗りの星、(患者21、23)TTR−S50I;星無し、肝移植;1N−5N、正常(表5のPro ID N1〜N5に対応する)。
ATTR血漿および正常血漿の採取
遺伝性ATTR(h−ATTR)が陽性と診断されたおよび野生型ATTR(WT−ATTR)のATTR患者由来の血液を、7mlのVacutainer K2−EDTAチューブに採取し、遠心分離して細胞残屑を除去した。血漿画分を1.5mlのLoBind Eppendorfチューブに一定分量に分けて入れ、直ちに凍結させた。健常被験者の血漿試料を同じ方法で採取した。全ての試料を解凍後直ちに使用し、再凍結しなかった。試料は表5に記載した通りである。
h−ATTR、遺伝性ATTR;肝TX、肝移植。定量限界(BLQ)1.0ng/ml;バーはグループ平均値およびSDを表す;p値、マン・ホイットニーの検定。
ヒト化の出発点、つまりドナー抗体はマウス抗体18C5であった。成熟m18C5の重鎖可変アミノ酸配列を配列番号81として記載する。成熟m18C5の軽鎖可変アミノ酸配列を配列番号87として記載する。重鎖Kabat/Chothia複合体CDR1、CDR2、およびCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号5、7、および9として記載する。軽鎖Kabat CDR1、CDR2、およびCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号11、13、および15として記載する。全体を通じてKabat番号付けを用いる。
CDR−H1は、10個のアミノ酸からなり、Chothiaカノニカルクラス1と同様である。
CDR−H2は、17個のアミノ酸からなり、Chothiaカノニカルクラス3と同様である。
CDR−H3は、4個のアミノ酸からなり;CDR−H3のクラスは存在しない。
CDR−L1は、16個のアミノ酸からなり、Chothiaカノニカルクラス4と同様である。
CDR−L2は、7個のアミノ酸からなり、Chothiaカノニカルクラス1に属する。
CDR−L3は、9個のアミノ酸からなり、Chothiaカノニカルクラス1と同様である。
−カノニカルCDR立体構造を定める位置(Martin 2010に総括されている)、
−バーニアゾーン内にある位置(Foote JおよびWinter G.(1992).JMolBiol.224(2):487−99)、
−VH/VLドメイン界面にある位置(Leger OJPおよびSaldanha J.(2000)Preparation of recombinant antibodies from immune rodent spleens and the design of their humanization by CDR grafting.In:Shepherd P and Dean C(編).Monoclonal Antibodies:a Practical Approach.Oxford,UK:Oxford University Pressに総括されている)、
−グリコシル化もしくはピログルタミン化などの翻訳後修飾を受けやすい位置、
−クレネズマブFabのフレームワーク上に移植した18C5のCDRのモデルに従い、CDRと衝突することが予測される残基によって占められている位置、または
−配列決定されているヒト抗体にはまれであり、親マウス18C5残基もしくはいくつかの他の残基の方がはるかに高頻度にみられる残基によって占められている、位置。
I2VはChothiaカノニカル残基の復帰変異である。
Q45RはIGKV2−30*02生殖系列残基に対する変異である。Qは、ヒトでこの位置にあるのはまれである。Rはこの位置で頻繁にみられる。
hu18C5−VH_1(配列番号91)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVDSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKVEIK
hu18C5−VL_2(配列番号92)
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVDSNGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKVEIK
V37A:バーニアゾーン中の復帰変異である。ValはTrp47との反発相互作用を示す。
L45Q:Chothiaによるコア界面残基の復帰変異である。この位置のLeuは反発的なファンデルワールス相互作用を示す。
L47W:界面残基の復帰変異である。マウス18C5では、Trpが47位にあり、TrpがSer35と水素結合を形成し、それにより鎖間ベータシートを安定化する。Leuはいかなる残基とも界面を確立せず、立体構造を不安定化し得る。
V48I:バーニアゾーン残基と相互作用してこの相互作用を保存する、CDRの復帰変異である。
A49G:バーニアゾーン残基の復帰変異である。
S94R:CDR相互作用を保存する、バーニアゾーン残基の復帰変異である。
hu18C5−VH_1(配列番号85)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRFWMSWVRQAPGKGLELVAEINPGSSTINYTPSLKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLGYGNYGWALDYWGQGTTVTVSS
hu18C5−VH_2(配列番号86)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRFWMSWARQAPGKGQEWIGEINPGSSTINYTPSLKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGYGNYGWALDYWGQGTTVTVSS
配列表:
配列番号1
シグナルペプチドを有する18C5 VHアミノ酸配列
MDFGLIFFIVALLKGVQCEVKLLESGGGLVQPGGSLNLSCVASGFDFSRFWMSWARQAPGRGQEWIGEINPGSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLFLQMSKVRSEDSALYYCARLGYGNYGWALDYWGQGTSVTVSS
配列番号2
シグナルペプチドを有するマウス18C5 VHをコードするヌクレオチド配列
ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTCATTGTTGCCCTTTTAAAAGGGGTCCAGTGTGAGGTAAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGAATCTCTCCTGTGTAGCCTCAGGATTCGATTTTAGTAGATTCTGGATGAGTTGGGCTCGGCAGGCTCCAGGGAGAGGACAGGAATGGATTGGAGAGATTAATCCAGGAAGCAGTACGATAAACTATACGCCATCTCTGAAGGATAAATTCATCATCTCCAGAGACAACGCCAAAAATACGCTGTTCCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACTCAGCCCTTTATTACTGTGCAAGACTGGGGTATGGTAACTACGGATGGGCTCTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
配列番号3
シグナルペプチドを有する18C5 VLアミノ酸配列
MKLPVRLLVLMFWIPASRSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVDSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK
配列番号4
シグナルペプチドを有するマウス18C5 VLをコードするヌクレオチド配列
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGAAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTAGATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGTTGGAGCTGAAA
配列番号5
18C5 CDR−H1のアミノ酸配列
GFDFSRFWMS
配列番号6
18C5 CDR−H1をコードする核酸配列
GGATTCGATTTTAGTAGATTCTGGATGAGT
配列番号7
18C5 CDR−H2のアミノ酸配列
EINPGSSTINYTPSLKD
配列番号8
18C5 CDR−H2をコードする核酸配列
GAGATTAATCCAGGAAGCAGTACGATAAACTATACGCCATCTCTGAAGGAT
配列番号9
18C5 CDR−H3のアミノ酸配列
LGYGNYGWALDY
配列番号10
18C5 CDR−H3をコードする核酸配列
CTGGGGTATGGTAACTACGGATGGGCTCTGGACTAC
配列番号11
18C5 CDR−L1のアミノ酸配列
RSSQSIVDSNGNTYLE
配列番号12
18C5 CDR−L1をコードする核酸配列
AGATCTAGTCAGAGCATTGTAGATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAA
配列番号13
18C5 CDR−L2のアミノ酸配列
KVSNRFS
配列番号14
18C5 CDR−L2をコードする核酸配列
AAAGTTTCCAACCGATTTTCT
配列番号15
18C5 CDR−L3のアミノ酸配列
FQGSHVPLT
配列番号16
18C5 CDR−L3をコードする核酸配列
TTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACG
配列番号17
キメラ18C5重鎖定常領域(ヒトIgG1)のアミノ酸配列
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号18
キメラ18C5重鎖定常領域(ヒトIgG1)をコードする核酸
GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACGCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA
配列番号19
キメラ18C5軽鎖定常領域(ヒトカッパ)のアミノ酸配列
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号20
キメラ18C5軽鎖定常領域(ヒトカッパ)のアミノ酸配列をコードする核酸配列
CGGGGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
配列番号21
例示的IgG1重鎖定常領域のアミノ酸配列
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNVKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号22
例示的IgG1 G1m3重鎖定常領域のアミノ酸配列
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号23
例示的IgG1 G1m3重鎖定常領域のアミノ酸配列
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号24
N末端アルギニンを有する例示的軽鎖定常領域のアミノ酸配列
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号25
N末端アルギニンを有さない例示的軽鎖定常領域のアミノ酸配列
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号26
アクセッション番号P02766.1(UniProt)で表されるヒトトランスサイレチンのアミノ酸配列
MASHRLLLLCLAGLVFVSEAGPTGTGESKCPLMVKVLDAVRGSPAINVAVHVFRKAADDTWEPFASGKTSESGELHGLTTEEEFVEGIYKVEIDTKSYWKALGISPFHEHAEVVFTANDSGPRRYTIAALLSPYSYSTTAVVTNPKE
配列番号27
アクセッション番号AAB35639.1(GenBank)で表されるヒトトランスサイレチンのアミノ酸配列
GPTGTGESKCPLMVKVLDAVRGSPAINVAVHVFRKAADDTWEPFASGKTSESGELHGLTTEEQFVEGIYKVEIDTKSYWKALGISPFHEHAEVVFTANDSGPRRYTIAALLSPYSYSTTAVVTNPKE
配列番号28
アクセッション番号AAB35640.1(GenBank)で表されるヒトトランスサイレチンのアミノ酸配列
GPTGTGESKCPLMVKVLDAVRGSPAINVAVHVFRKAADDTWEPFASGKTSESGELHGLTTEEQFVEGIYKVEIDTKSYWKALGISPFHEHAEVVFTANDSGPRRYTIAALLSPYSYSTTAVVTNPKE
配列番号29
アクセッション番号およびABI63351.1(GenBank)で表されるヒトトランスサイレチンのアミノ酸配列
MASHRLLLLCLAGLVFVSEAGPTGTGESKCPLMVKVLDAVRGSPAINVAVHVFRKAADDTWEPFASGKTSESGELHGLTTEEEFVEGIYKVEIDTKSYWKALGISPFHEHAEVVFTANDSGPRRYSYSTTAVVTNPKE
配列番号30
ヒトトランスサイレチンの残基101〜109のアミノ酸配列
GPRRYTIAA
配列番号31
ヒトトランスサイレチンの残基87〜127のアミノ酸配列
FHEHAEVVFTANDSGPRRYTIAALLSPYSYSTTAVVTNPKE
配列番号32
例示的IgG1 G1m3重鎖定常領域をコードする核酸配列
GCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA
配列番号33
N末端アルギニンを有する例示的軽鎖定常領域をコードする核酸配列
CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
配列番号34
N末端アルギニンのない例示的軽鎖定常領域をコードする核酸配列
ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
配列番号35
重鎖定常領域シグナルペプチドのアミノ酸配列
MNFGLSLIFLVLVLKGVQC
配列番号36
重鎖定常領域シグナルペプチドをコードする核酸配列
ATGAACTTTGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGT
配列番号37
軽鎖定常領域シグナルペプチドのアミノ酸配列
MESHTQVFVFVFLWLSGVDG
配列番号38
軽鎖定常領域シグナルペプチドをコードする核酸配列
ATGGAGTCACATACTCAGGTCTTTGTATTCGTGTTTCTCTGGTTGTCTGGTGTTGACGGA
配列番号39
14G8のKabat CDR−H1のアミノ酸配列
SYTMS
配列番号40
14G8のKabat CDR−H2のアミノ酸配列
EINNSGDTTYYPDTVKG
配列番号41
14G8のKabat CDR−H3のアミノ酸配列
HYYYGGGYGGWFFDV
配列番号42
14G8のKabat CDR−L1のアミノ酸配列
RSNKSLLHSNGNTYLY
配列番号43
14G8のKabat CDR−L2のアミノ酸配列
RVSNLAS
配列番号44
14G8のKabat CDR−L3のアミノ酸配列
MQHLEYPLT
配列番号45
5A1のエピトープ
EHAEVVFTA
配列番号46
5A1のKabat CDR−H1のアミノ酸配列
NYAMS
配列番号47
5A1のKabat CDR−H2のアミノ酸配列
SISSGGSTYYPDSVKG
配列番号48
5A1のKabat CDR−H3のアミノ酸配列
YYYGQYFDF
配列番号49
5A1のKabat CDR−L1のアミノ酸配列
KASQDVSTTVA
配列番号50
5A1のKabat CDR−L2のアミノ酸配列
SASYRCT
配列番号51
5A1のKabat CDR−L3のアミノ酸配列
QQHYSTPLT
配列番号52
6C1のKabat CDR−H1のアミノ酸配列
NYYMS
配列番号53
6C1のKabat CDR−H2のアミノ酸配列
YISIDGNNIYHPDSVKG
配列番号54
6C1のKabat CDR−H3のアミノ酸配列
DSDYGYFDV
配列番号55
6C1のKabat CDR−L1のアミノ酸配列
RSSQSIVHSNGNTYLE
配列番号56
6C1のKabat CDR−L2のアミノ酸配列
KVSKRFS
配列番号57
6C1のKabat CDR−L3のアミノ酸配列
FQGSHVPLT
配列番号58
AD7F6のVH領域のアミノ酸配列
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYGMSWIRQTPDKRLEWVATISSSGTYTYYTESVKGRFTVSRDNAKNTLSLQMSNLKSDDTAMYYCTRQAYGREYFDVWGTGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAP NLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVRISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLDIKTSTVGENRFLLMQRETRGSEKLLPEEDHLPSPGK
配列番号59
AD7F6のVL領域のアミノ酸配列
DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLFDSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASNRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYFCKQSNYLRTFGGGTRVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
配列番号60
RT24のCDR−H1のアミノ酸配列
RYWIT
配列番号61
RT24のCDR−H2のアミノ酸配列
DIYPGSGRTNYNEKFKN
配列番号62
RT24のCDR−H3のアミノ酸配列
YYGSTYFYV
配列番号63
RT24のCDR−L1のアミノ酸配列
RSSKSLLYKDGKTYLN
配列番号64
RT24のCDR−L2のアミノ酸配列
LMSTRAS
配列番号65
RT24のCDR−L3のアミノ酸配列
QQLVEYPRT
配列番号66
NI−301.35G11のCDR−H1のアミノ酸配列
SYAMS
配列番号67
NI−301.35G11のCDR−H2のアミノ酸配列
SISGSGDTTKYTDSVKG
配列番号68
NI−301.35G11のCDR−H3のアミノ酸配列
DGSGRIDPFAL
配列番号69
NI−301.35G11のCDR−L1のアミノ酸配列
RSSRSLVYSDGNIYLN
配列番号70
NI−301.35G11のCDR−L2のアミノ酸配列
KVSNRDSG
配列番号71
NI−301.35G11のCDR−L3のアミノ酸配列
MQGTHWPRT
配列番号72
MFD101、MDF102、MFD103、MFD105のエピトープ
ADDTWEPFASGKT
配列番号73
MFD107、MFD108、MFD109、MFD111のエピトープ
TSESGELHGLTTE
配列番号74
MFD114のエピトープ
ALLSPYSYSTTAV
配列番号75
抗体9D5のKabat CDR−H1のアミノ酸配列
SYTMS
配列番号76
抗体9D5のKabat CDR−H2のアミノ酸配列
EISNSGDTTYYPDTVKG
配列番号77
抗体9D5のKabat CDR−H3のアミノ酸配列
HYYYGGGYGGWFFDV
配列番号78
抗体9D5のKabat CDR−L1のアミノ酸配列
RSSKSLLHSNGNTYLY
配列番号79
抗体9D5のKabat CDR−L2のアミノ酸配列
RVSNLAS
配列番号80
抗体9D5のKabat CDR−L3のアミノ酸配列
MQHLEYPLT
配列番号81
マウス18C5抗体の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列
EVKLLESGGGLVQPGGSLNLSCVASGFDFSRFWMSWARQAPGRGQEWIGEINPGSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLFLQMSKVRSEDSALYYCARLGYGNYGWALDYWGQGTSVTVSS
配列番号82
マウス抗ピログルタミン酸Aベータ抗体Fab c#17の重鎖可変領域のアミノ酸配列
EVKLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSDYGMAWVRQAPGKGPEWVAFISNLAYSIYYADTVTGRFTISRENAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCARYDYDNILDYVMDYWGQGTSVTVSS
配列番号83
ヒト化クレネズマブFab(CreneFab)PDB:5VZYの重鎖可変領域のアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSS
配列番号84
ヒト生殖系列配列IGHV3−48*01の重鎖可変領域のアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYFDYWGQGTLVTVSS
配列番号85
ヒト化18C5抗体hu18C5−VH_1の重鎖可変領域のアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRFWMSWVRQAPGKGLELVAEINPGSSTINYTPSLKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLGYGNYGWALDYWGQGTTVTVSS
配列番号86
ヒト化18C5抗体hu18C5−VH_2の重鎖可変領域のアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRFWMSWARQAPGKGQEWIGEINPGSSTINYTPSLKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGYGNYGWALDYWGQGTTVTVSS
配列番号87
マウス18C5抗体の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVDSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK
配列番号88
マウス抗ピログルタミン酸Aベータ抗体Fab c#17の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPTFGGGTKLEIK
配列番号89
ヒト化クレネズマブFab(CreneFab)PDB:5VZYの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIK
配列番号90
ヒト生殖系列配列IGKV2−30*2の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPWTFGQGTKVEIK
配列番号91
ヒト化18C5抗体hu18C5−VH_1の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVDSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKVEIK
配列番号92
ヒト化18C5抗体hu18C5−VL_2の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVDSNGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKVEIK
配列番号93
マウス18C5抗体のKabat CDR−H1のアミノ酸配列
RFWMS
配列番号94
マウス18C5抗体のChothia CDR−H1のアミノ酸配列
GFDFSRF
配列番号95
マウス18C5抗体のContact CDR−H1のアミノ酸配列
SRFWMS
配列番号96
マウス18C5抗体のChothia CDR−H2のアミノ酸配列
NPGSST
配列番号97
マウス18C5抗体のAbM CDR−H2のアミノ酸配列
EINPGSSTIN
配列番号98
マウス18C5抗体のContact CDR−H2のアミノ酸配列
WIGEINPGSSTIN
配列番号99
マウス18C5抗体のContact CDR−H3のアミノ酸配列
ARLGYGNYGWALD
配列番号100
マウス18C5抗体のContact CDR−L1のアミノ酸配列
NTYLEWY
配列番号101
マウス18C5抗体のContact CDR−L2のアミノ酸配列
LLIYKVSNRF
配列番号102
マウス18C5抗体のContact CDR−L3のアミノ酸配列
FQGSHVPL
配列番号103
9D5マウスVHアミノ酸配列
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLELVAEISNSGDTTYYPDTVKGRFTFSRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGTGTTVTVSS
配列番号104
9D5マウスVLアミノ酸配列
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPLTFGAGTKLELK
Claims (159)
- 生体試料中のミスフォールドトランスサイレチン(TTR)を検出する方法であって、
(a)生体試料をTTRの残基89〜97内のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体およびTTRの異なるエピトープに特異的に結合するレポーター抗体と接触させることであって;前記試料中にミスフォールドTTRが存在する場合、前記捕捉抗体および前記レポーター抗体が前記ミスフォールドTTRに結合してサンドイッチ複合体を形成する、接触させることと;
(b)段階(a)でサンドイッチ複合体を形成する前記レポーター抗体を、もしあれば検出して前記ミスフォールドTTRの有無を示すこと
を含む、方法。 - 前記生体試料が、遺伝性ATTR患者に由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記生体試料が、V30M、Y114C、G47R、S50I、T49S、F33V、A45T、E89K、E89Q、およびV122Iからなる群より選択される変異を有する遺伝性ATTR患者に由来する、請求項2に記載の方法。
- 前記変異が、V30M、Y114C、およびS50Iからなる群より選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記変異が、V30Mである、請求項3に記載の方法。
- 前記変異が、Y114Cである、請求項3に記載の方法。
- 前記変異が、S50Iである、請求項3に記載の方法。
- 前記変異が、E89Kである、請求項3に記載の方法。
- 前記変異が、E89Qである、請求項3に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5である、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、ポリクローナル抗TTR抗体である、請求項10に記載の方法。
- 前記レポーター抗体が、18C5、8C3、7G7、AD7F6、RT24、NI−301.35G11、MFD101、MDF102、MFD103、MFD105、MFD107、MFD108、MFD109、MFD111、MFD114、またはそのキメラ型もしくはヒト化型またはポリクローナル抗TTR抗体である、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、18C5、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、8C3、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、7G7、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、AD7F6、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、RT24、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、NI−301.35G11、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、MFD101、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、MDF102、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、MFD103、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、MFD105、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、MFD107、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、MFD108、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、MFD109、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、MFD111、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、MFD114、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項1に記載の方法。
- 前記レポーター抗体が、TTRの残基101〜109、118〜122、115〜124、53〜63、54〜61、36〜49、49〜61、109〜121、30〜66、70〜127、80〜127、90〜127、100〜127、110〜127、または115〜127内を結合する抗体である、請求項1〜10に記載の方法。
- 前記ミスフォールドTTRが、E89K置換を含む、請求項1〜28のいずれかに記載の方法。
- 前記ミスフォールドTTRが、E89Q置換を含む、請求項1〜29のいずれかに記載の方法。
- 前記生体試料が、収集試料の第一のアリコートでありかつ前記方法が、TTRへの結合に関して前記捕捉抗体と競合する被験抗体をさらに含む前記収集試料の第二のアリコートに対して段階(a)および(b)を繰り返すことをさらに含み、前記段階を繰り返すときに前記サンドイッチ複合体を形成する減少したレポーター抗体が、ミスフォールドTTRに結合する前記被験抗体の能力の兆候をもたらす、請求項1〜30に記載の方法。
- 前記被験抗体が、14G8またはそのキメラ型もしくはヒト化型であり、前記捕捉抗体が、9D5であり、かつ前記レポーター抗体が、ポリクローナル抗TTR抗体である、請求項31に記載の方法。
- 前記被験抗体が、ヒト化型の14G8である、請求項32に記載の方法。
- 被験抗体で治療された対象由来の生体試料中に残存するミスフォールドトランスサイレチン(mis−TTR)を検出することによる標的が前記mis−TTRの残基89〜97内のエピトープである、前記対象に投与された前記被験抗体のin vivo標的結合を決定する方法であって、
(a)前記生体試料を残基89〜97内のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体および前記捕捉抗体のものとは異なるTTR内のエピトープに特異的に結合するレポーター抗体と接触させることであって;ミスフォールドTTRが前記試料中に存在する場合、前記捕捉抗体および前記レポーター抗体が、前記ミスフォールドTTRに結合してサンドイッチ複合体を形成する、接触させることと;
(b)段階(a)でサンドイッチ複合体を形成する前記レポーター抗体を、もしあれば検出して前記ミスフォールドTTRの有無を示すこと
を含む、方法。 - 前記生体試料が、遺伝性ATTR患者に由来する、請求項34に記載の方法。
- 前記生体試料が、V30M、Y114C、G47R、S50I、T49S、F33V、A45T、E89K、E89Q、およびV122Iからなる群より選択される変異を有する遺伝性ATTR患者に由来する、請求項35に記載の方法。
- 前記変異が、V30M、Y114C、およびS50Iからなる群より選択される、請求項36に記載の方法。
- 前記変異が、V30Mである、請求項36に記載の方法。
- 前記変異が、Y114Cである、請求項36に記載の方法。
- 前記変異が、S50Iである、請求項36に記載の方法。
- 前記変異が、E89Kである、請求項36に記載の方法。
- 前記変異が、E89Qである、請求項36に記載の方法。
- 未治療対象由来の生体試料中のミスフォールドTTRの検出に比べた前記治療された対象中のミスフォールドTTRの検出の減少が、同量以下の前記被験抗体による正の標的結合および前記対象の治療と相関する、請求項34または35に記載の方法。
- 前記治療された対象と前記未治療対象が、同じ個体である、請求項35に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、9D5であり、前記捕捉抗体と前記レポーター抗体が、異なる標識を有する、請求項34に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、14G8である、請求項34に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、5A1である、請求項34に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、9D5でありかつ前記レポーター抗体が、6C1である、請求項34に記載の方法。
- 前記レポーター抗体が、多量体ミスフォールドトランスサイレチンを結合することに関して前記捕捉抗体と結合について競合する、請求項45に記載の方法。
- 前記レポーター抗体が、電気化学発光標識を有しかつ電気化学発光によって検出される、請求項1〜49のいずれかに記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、ビオチン標識を有する、請求項1〜50のいずれかに記載の方法。
- 定性的に実施される、請求項1〜51のいずれかに記載の方法。
- 定量的に実施されて前記ミスフォールドTTRの絶対量または相対量を示す、請求項1〜52のいずれかに記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、前記接触させる段階の前に固相に結合される、請求項1〜53のいずれかに記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、リンカーを介して前記固相に結合される、請求項54に記載の方法。
- 前記固相が、少なくとも1つの電極を含む、請求項54に記載の方法。
- レポーター抗体由来のシグナルを既知量のミスフォールドTTRを含有する対照試料中のレポーター抗体由来のシグナルと比較して前記試料中のミスフォールドTTRの量を決定することをさらに含む、請求項1〜56のいずれかに記載の方法。
- シグナルの検量曲線からのレポーター抗体由来のシグナル対ミスフォールドTTRの量を比較して前記試料中のミスフォールドTTRの量を決定することをさらに含む、請求項1〜57のいずれかに記載の方法。
- レポーター抗体由来のシグナルが、前記試料中のミスフォールドTTRの量に比例する、請求項1〜58のいずれかに記載の方法。
- 前記試料が、ヒト由来の試料である、請求項1〜59のいずれかに記載の方法。
- 前記試料が、体液である、請求項1〜60のいずれかに記載の方法。
- 前記試料が、ヒトの血漿である、請求項1〜61のいずれかに記載の方法。
- ミスフォールドTTRの存在が、前記試料が採取された対象がトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有すると診断するために用いられる、請求項1〜62のいずれかに記載の方法。
- 前記トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスが、家族性トランスサイレチンアミロイドーシスまたは孤発性野生型トランスサイレチンアミロイドーシスである、請求項63に記載の方法。
- 前記対象が、遺伝子検査に基づき家族性トランスサイレチンアミロイドーシスのリスクがあると確認されている、請求項64に記載の方法。
- 前記対象が、家族性トランスサイレチンアミロイドーシスの症状を示さない、請求項64に記載の方法。
- 前記対象が、多発性ニューロパチーまたは心筋症をもたない、請求項66に記載の方法。
- 前記家族性トランスサイレチンアミロイドーシスが、家族性アミロイド心筋症(FAC)、家族性アミロイドニューロパチー(FAP)、または中枢神経系選択性アミロイドーシス(CNSA)である、請求項64に記載の方法。
- 前記生体試料が、トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスのための治療を受けている患者に由来する、請求項1〜68のいずれかに記載の方法。
- トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有する対象の治療を調整する方法であって、
(a)以前にトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスのための治療を受けた対象由来の試料中に請求項34または35に記載の方法によって検出されたミスフォールドTTRの量を治療前または治療の初期段階の前記対象で検出されたミスフォールドTTRの量と比較することと;
(b)ミスフォールドTTRの量が以前に検出された量以上である場合に以前の治療の投与量もしくは投与頻度を増やすこと;または
(c)ミスフォールドTTRの量が以前に検出された量未満である場合に以前の治療の投与量もしくは投与頻度を減らすか以前の治療を中止すること
を含む、方法。 - 前記以前の治療が、抗TTR抗体の静脈内投与によるものでありかつミスフォールドTTRの量が以前に検出された量未満である場合、前記以前の治療が中止されかつTTR安定化剤での治療、アンチセンスオリゴヌクレオチドベースの治療法、RNA干渉療法またはドキシサイクリンとタウロウルソデオキシコール酸での併用療法と置き換えられる、請求項70に記載の方法。
- 前記対象が、前記抗TTR抗体による治療をもはや受けない、請求項71に記載の方法。
- 前記TTR四量体安定化剤が、タファミジスまたはジフルニサルである、請求項71に記載の方法。
- 前記TTR四量体安定化剤が、ジフルニサルである、請求項71に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドベースの治療法が、イノテルセンである、請求項71に記載の方法。
- 前記RNAiベースの治療法が、パチシランまたはレブシランである、請求項71に記載の方法。
- 前記抗TTR抗体が、14G8である、請求項71に記載の方法。
- 前記対象が、前記抗TTR抗体による治療をもはや受けない、請求項77に記載の方法。
- 前記TTR四量体安定化剤が、タファミジスまたはジフルニサルである、請求項77に記載の方法。
- 前記TTR四量体安定化剤が、ジフルニサルである、請求項77に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドベースの治療法が、イノテルセンである、請求項77に記載の方法。
- 前記RNAiベースの治療法が、パチシランまたはレブシランである、請求項77に記載の方法。
- トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有する対象の治療を調整する方法であって、
(a)トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスのための治療を開始する前の対象由来の試料中で請求項51に記載の方法によって検出されたレポーター抗体結合の量を治療開始後に前記対象で検出されたレポーター抗体結合の量と比較することと;
(b)レポーター抗体結合の量が以前に検出された量以上である場合に前記治療の投与量もしくは投与頻度を増やすこと;または
(c)レポーター抗体結合の量が以前に検出された量未満である場合に前記治療の投与量もしくは投与頻度を減らすか前記治療を中止すること
を含む、方法。 - トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスが、アミロイド軽鎖(AL)アミロイドーシスと鑑別される、請求項1〜69のいずれかに記載の方法。
- 前記試料が、ヒトTTRを発現する導入遺伝子を有するトランスジェニックマウスに由来する、請求項1〜54のいずれかに記載の方法。
- 生体試料中の総多量体ミスフォールドトランスサイレチン(TTR)のレベル対総ミスフォールドTTRのレベルの比を決定する方法であって、
(a)生体試料を2部に分けることと;
(b)
(i)前記生体試料の第一の部分をTTRの残基89〜97内のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体およびTTRの異なるエピトープに特異的に結合するレポーター抗体と接触させることであって;ミスフォールドTTRが前記試料中に存在する場合、前記捕捉抗体および前記レポーター抗体が前記ミスフォールドTTRに結合してサンドイッチ複合体を形成する、接触させること;ならびに
(ii)段階(b)(i)でサンドイッチ複合体を形成する前記レポーター抗体を、もしあれば検出して前記ミスフォールドTTRの有無を示すこと
によって前記生体試料の前記第一の部分中の総ミスフォールドTTRを検出することと;
(c)
(i)前記生体試料の第二の部分を残基89〜97内のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体およびTTRの残基89〜97内のエピトープに特異的に結合するレポーター抗体と接触させることであって;前記試料中に多量体ミスフォールドTTRが前記試料中に存在する場合、前記捕捉抗体および前記レポーター抗体が前記多量体ミスフォールドTTRに結合してサンドイッチ複合体を形成する、接触させることと;
(ii)段階(c)(i)でサンドイッチ複合体を形成する前記レポーター抗体を、もしあれば検出して前記多量体ミスフォールドTTRの有無を示すこと
(d)によって前記生体試料の前記第二の部分中の総多量体ミスフォールドTTRを検出することと、(c)の総多量体ミスフォールドTTRのレベル対(b)の総ミスフォールドTTRのレベルの比を算出すること
を含む、方法。 - 生体試料中のミスフォールドトランスサイレチン(TTR)を検出する方法であって、
(a)生体試料をTTRの残基101〜109内のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体およびTTRの異なるエピトープに特異的に結合するレポーター抗体と接触させることであって;ミスフォールドTTRが前記試料中に存在する場合、前記捕捉抗体および前記レポーター抗体が前記ミスフォールドTTRに結合してサンドイッチ複合体を形成する、接触させることと;
(b)段階(a)で前記ミスフォールドTTRに結合する前記レポーター抗体を、もしあれば検出して前記ミスフォールドTTRの有無を示すこと
を含む、方法。 - 前記生体試料が、遺伝性ATTR患者に由来する、請求項87に記載の方法。
- 前記生体試料が、V30M、Y114C、およびS50Lからなる群より選択される変異を有する遺伝性ATTR患者に由来する、請求項88に記載の方法。
- 前記変異が、V30Mである、請求項89に記載の方法。
- 前記変異が、Y114Cである、請求項89に記載の方法。
- 前記変異が、S50Iである、請求項89に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5である、請求項87に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5でありかつ前記レポーター抗体が、ポリクローナル抗TTR抗体である、請求項93に記載の方法。
- 前記レポーター抗体が、9D5、14G8、5A1、6C1、8C3、7G7、AD7F6、RT24、NI−301.35G11、MFD101、MDF102、MFD103、MFD105、MFD107、MFD108、MFD109、MFD111、MFD114、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項請求項87〜93のいずれか1項に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5でありかつ前記レポーター抗体が、9D5、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項87に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5でありかつ前記レポーター抗体が、14G8、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項87に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5でありかつ前記レポーター抗体が、5A87、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項87に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5でありかつ前記レポーター抗体が、6C87、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項87に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5でありかつ前記レポーター抗体が、8C3、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項87に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5でありかつ前記レポーター抗体が、7G7、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項87に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5でありかつ前記レポーター抗体が、AD7F6、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項87に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5でありかつ前記レポーター抗体が、RT24、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項87に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5でありかつ前記レポーター抗体が、NI−301.35G187、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項87に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5でありかつ前記レポーター抗体が、MFD1087、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項87に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5でありかつ前記レポーター抗体が、MDF102、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項87に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5でありかつ前記レポーター抗体が、MFD103、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項87に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5でありかつ前記レポーター抗体が、MFD105、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項87に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5でありかつ前記レポーター抗体が、MFD107、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項87に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5でありかつ前記レポーター抗体が、MFD108、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項87に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5でありかつ前記レポーター抗体が、MFD109、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項87に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5でありかつ前記レポーター抗体が、MFD1187、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項87に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5でありかつ前記レポーター抗体が、MFD114、またはそのキメラ型もしくはヒト化型である、請求項87に記載の方法。
- 前記レポーター抗体が、TTRの残基89〜97、118〜122、115〜124、53〜63、54〜61、36〜49、49〜61、109〜121、30〜66、70〜127、80〜127、90〜127、100〜127、110〜127、または115〜127内を結合する抗体である、請求項87〜93のいずれか1項に記載の方法。
- 被験抗体で治療された対象由来の生体試料中に残存するミスフォールドトランスサイレチン(mis−TTR)を検出することによる標的が前記mis−TTRの残基101〜109内のエピトープである、前記対象に投与された前記被験抗体のin vivo標的結合を決定する方法であって、
(a)前記生体試料を残基101〜109内のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体および前記捕捉抗体のものとは異なるTTR内のエピトープに特異的に結合するレポーター抗体と接触させることであって;ミスフォールドTTRが前記試料中に存在する場合、前記捕捉抗体および前記レポーター抗体が前記ミスフォールドTTRに結合してサンドイッチ複合体を形成する、接触させることと;
(b)段階(a)でサンドイッチ複合体を形成する前記レポーター抗体を、あるならば検出して前記ミスフォールドTTRの有無を示すこと
を含む、方法。 - 前記生体試料が、遺伝性ATTR患者に由来する、請求項115に記載の方法。
- 前記生体試料が、V30M、Y114C、およびS50Iからなる群より選択される変異を有する遺伝性ATTR患者に由来する、請求項116に記載の方法。
- 前記変異が、V30Mである、請求項117に記載の方法。
- 前記変異が、Y114Cである、請求項117に記載の方法。
- 前記変異が、S50Iである、請求項117に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、18C5であり、前記捕捉抗体と前記レポーター抗体が、異なる標識を有する、請求項115または116に記載の方法。
- 前記レポーター抗体が、多量体ミスフォールドトランスサイレチンを結合することに関して前記捕捉抗体と結合について競合する、請求項115に記載の方法。
- 前記レポーター抗体が、電気化学発光標識を有しかつ電気化学発光によって検出される、請求項1〜122のいずれかに記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、ビオチン標識を有する、請求項1〜123のいずれかに記載の方法。
- 定性的に実施される、請求項1〜124のいずれかに記載の方法。
- 定量的に実施されて前記ミスフォールドTTRの絶対量または相対量を示す、請求項1〜125のいずれかに記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、前記接触させる段階の前に固相に結合される、請求項1〜126のいずれかに記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、リンカーを介して前記固相に結合される、請求項127に記載の方法。
- 前記固相が、少なくとも1つの電極を含む、請求項127に記載の方法。
- レポーター抗体由来のシグナルを既知量のミスフォールドTTRを含有する対照試料中のレポーター抗体由来のシグナルと比較して前記試料中のミスフォールドTTRの量を決定することをさらに含む、請求項1〜129のいずれかに記載の方法。
- シグナルの検量曲線からのレポーター抗体由来のシグナル対ミスフォールドTTRの量を比較して前記試料中のミスフォールドTTRの量を決定することをさらに含む、請求項1〜130のいずれかに記載の方法。
- レポーター抗体由来のシグナルが、前記試料中のミスフォールドTTRの量に比例する、請求項1〜131のいずれかに記載の方法。
- 前記試料が、ヒト由来の試料である、請求項1〜132のいずれかに記載の方法。
- 前記試料が、体液である、請求項1〜133のいずれかに記載の方法。
- 前記試料が、ヒトの血漿である、請求項1〜134のいずれかに記載の方法。
- ミスフォールドTTRの存在が、前記試料が採取された対象がトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有すると診断するために用いられる、請求項1〜135のいずれかに記載の方法。
- 前記トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスが、家族性トランスサイレチンアミロイドーシスまたは孤発性野生型トランスサイレチンアミロイドーシスである方法。
- 前記対象が、遺伝子検査に基づき家族性トランスサイレチンアミロイドーシスのリスクがあると同定されている、請求項137に記載の方法。
- 前記対象が、家族性トランスサイレチンアミロイドーシスの症状を示さない、請求項137に記載の方法。
- 前記対象が、多発性ニューロパチーまたは心筋症をもたない、請求項139に記載の方法。
- 前記家族性トランスサイレチンアミロイドーシスが、家族性アミロイド心筋症(FAC)、家族性アミロイドニューロパチー(FAP)、または中枢神経系選択性アミロイドーシス(CNSA)である、請求項137に記載の方法。
- 前記生体試料が、トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスのための治療を受けている患者に由来する、請求項1〜141のいずれかに記載の方法。
- トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有する対象の治療を調整する方法であって、
(a)以前にトランスサイレチン介在性のアミロイドーシスのための治療を受けた対象由来の試料中で請求項25に記載の方法によって検出されたミスフォールドTTRの量を治療前または治療の初期段階の前記対象で検出されたミスフォールドTTRの量と比較することと;
(b)ミスフォールドTTRの量が以前に検出された量以上である場合に以前の治療の投与量もしくは投与頻度を増やすこと;または
(c)ミスフォールドTTRの量が以前に検出された量未満である場合に以前の治療の投与量もしくは投与頻度を減らすか以前の治療を中止すること
を含む、方法。 - 前記以前の治療が、抗TTR抗体の静脈内投与によるものでありかつミスフォールドTTRの量が以前に検出された量未満である場合、前記以前の治療が中止されかつTTR安定化剤での治療、アンチセンスオリゴヌクレオチドベースの治療法、RNA干渉療法またはドキシサイクリンとタウロウルソデオキシコール酸での併用療法と置き換えられる、請求項143に記載の方法。
- 前記対象が、前記抗TTR抗体による治療をもはや受けない、請求項144に記載の方法。
- 前記TTR四量体安定化剤が、タファミジスまたはジフルニサルである、請求項144に記載の方法。
- 前記TTR四量体安定化剤が、ジフルニサルである、請求項144に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドベースの治療法が、イノテルセンである、請求項144に記載の方法。
- 前記RNAiベースの治療法が、パチシランまたはレブシランである、請求項144に記載の方法。
- 前記抗TTR抗体が、14G8である、請求項144に記載の方法。
- 前記対象が、前記抗TTR抗体による治療をもはや受けない、請求項150に記載の方法。
- 前記TTR四量体安定化剤が、タファミジスまたはジフルニサルである、請求項150に記載の方法。
- 前記TTR四量体安定化剤が、ジフルニサルである、請求項150に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドベースの治療法が、イノテルセンである、請求項150に記載の方法。
- 前記RNAiベースの治療法が、パチシランまたはレブシランである、請求項150に記載の方法。
- トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスを有する対象の治療を調整する方法であって、
(a)トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスのための治療を開始する前の対象由来の試料中で請求項46に記載の方法によって検出されたレポーター抗体結合の量を治療開始後に前記対象で検出されたレポーター抗体結合の量と比較することと;
(b)レポーター抗体結合の量が以前に検出された量以上である場合に前記治療の投与量もしくは投与頻度を増やすこと;または
(c)レポーター抗体結合の量が以前に検出された量未満である場合に前記治療の投与量もしくは投与頻度を減らすか前記治療を中止すること
を含む、方法。 - トランスサイレチン介在性のアミロイドーシスが、アミロイド軽鎖(AL)アミロイドーシスと鑑別される、請求項87〜142のいずれかに記載の方法。
- 前記試料が、ヒトTTRを発現する導入遺伝子を有するトランスジェニックマウスに由来する、請求項87のいずれかに記載の方法。
- 生体試料中の総多量体ミスフォールドトランスサイレチン(TTR)のレベル対総ミスフォールドTTRのレベルの比を決定する方法であって、
(a)生体試料を2部に分けることと;
(b)
(i)前記生体試料の第一の部分をTTRの残基101〜109内のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体およびTTRの異なるエピトープに特異的に結合するレポーター抗体と接触させることであって;ミスフォールドTTRが前記試料中に存在する場合、前記捕捉抗体および前記レポーター抗体が前記ミスフォールドTTRに結合してサンドイッチ複合体を形成する、接触させること;ならびに
(ii)段階(i)で前記ミスフォールドTTRに結合した前記レポーター抗体を、あるならば検出して前記ミスフォールドTTRの有無を示すこと
によって前記生体試料の前記第一の部分中の総ミスフォールドTTRを検出することと、
(c)
(i)前記生体試料の第二の部分を残基101〜109内のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体およびTTRの残基101〜109内のエピトープに特異的に結合するレポーター抗体と接触させることであって;多量体ミスフォールドTTRが前記試料中に存在する場合、前記捕捉抗体および前記レポーター抗体が前記多量体ミスフォールドTTRに結合してサンドイッチ複合体を形成する、接触させること;ならびに
(ii)段階(a)で前記多量体ミスフォールドTTRに結合した前記レポーター抗体を、あるならば検出して前記多量体ミスフォールドTTRの有無を示すこと
によって前記生体試料の前記第二の部分中の総多量体ミスフォールドTTRを検出することと、
(d)(c)の総多量体ミスフォールドTTRのレベル対(b)の総ミスフォールドTTRのレベルの比を算出すること
を含む、方法。
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