KR20200067144A - 트랜스타이레틴의 검출 방법 - Google Patents

트랜스타이레틴의 검출 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20200067144A
KR20200067144A KR1020207010132A KR20207010132A KR20200067144A KR 20200067144 A KR20200067144 A KR 20200067144A KR 1020207010132 A KR1020207010132 A KR 1020207010132A KR 20207010132 A KR20207010132 A KR 20207010132A KR 20200067144 A KR20200067144 A KR 20200067144A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ttr
antibody
misfolded
reporter
reporter antibody
Prior art date
Application number
KR1020207010132A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102581734B1 (ko
Inventor
조슈아 레지날드 살만스
스베틀라나 알렉산더
로빈 바버
지엔민 리
제프리 엔. 히가키
탈로칸 에스. 니자르
Original Assignee
프로테나 바이오사이언시즈 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 filed Critical 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드
Publication of KR20200067144A publication Critical patent/KR20200067144A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102581734B1 publication Critical patent/KR102581734B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/575—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of three or more carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, ergosterol, sitosterol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/42—Oxazoles
    • A61K31/423—Oxazoles condensed with carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/60—Salicylic acid; Derivatives thereof
    • A61K31/603—Salicylic acid; Derivatives thereof having further aromatic rings, e.g. diflunisal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/65—Tetracyclines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/66—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light electrically excited, e.g. electroluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4728—Details alpha-Glycoproteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/30—Electrochemically active labels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/325—Heart failure or cardiac arrest, e.g. cardiomyopathy, congestive heart failure
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)

Abstract

본 발명은 포획 항체 및 리포터 항체를 이용하여 트랜스타이레틴(TTR)을 검출하는 방법을 제공한다. 포획 항체는 TTR의 천연 사량체 형태 이상으로 미스폴딩된 TTR에 우선적으로 결합한다. 포획 항체는 TTR의 아미노산 잔기 89 내지 97 내의 에피토프에 또는 TTR의 아미노산 잔기 101 내지 109 내의 에피토프에 결합한다. 9D5 및 18C5는 적합한 포획 항체의 예이다. 상기 방법은 TTR 축적 또는 TTR 침착물의 축적과 연관된 질환 또는 장애(예를 들어, TTR 아밀로이드증)을 진단하기 위해 그리고, 특히, TTR 요법의 효능을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.

Description

트랜스타이레틴의 검출 방법
관련출원에 대한 상호참조
본 출원은 미국 특허법(35 USC 119(e)) 하에서 2017년 10월 6일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/569,438호 및 2017년 10월 31일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/579,817호 및 2018년 3월 23일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/647,582호의 유익을 주장하며, 이들 기초출원 각각은 이들의 전문이 모든 목적을 위하여 참조에 의해 포함된다.
서열목록에 대한 참조
파일명 516713SEQLST.txt로 기재된 서열목록은 61.8 킬로바이트이며, 2018년 9월 20일자로 생성되었고, 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
몇몇 질환은 질환-특정 단백질의 비정상적 폴딩 및 응집에 의해 야기되는 것으로 생각된다. 이들 단백질은 특정 조직학적 균주에 의해 시각화되는 아밀로이드로서 알려진 병리적으로 진단된 축적물 내로 축적될 수 있다. 아밀로이드는 염증 반응을 유발하는 것으로 생각되고, 연루된 조직에 대한 다중 음성 결과를 가진다. 추가로, 비정상적으로 폴딩된 단백질의 더 작은 응집물이 존재하고, 세포독성 효과를 발휘할 수 있다.
트랜스타이레틴(transthyretin: TTR)은 미스폴딩되고 응집되는 것으로 알려진 다수의 단백질 중 하나이다(예를 들어, 아밀로이드 생성(아밀로이드 생성)을 겪음). 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증(transthyretin-mediated amyloidosis: ATTR)은 2가지 형태의 질환을 포함한다: 돌연변이 또는 변이체 TTR의 미스폴딩으로부터 생기는 가족성 질환, 및 야생형 TTR의 미스폴딩 및 응집에 의해 야기되는 산발적인, 비유전적 질환. TTR 아밀로이드 생성 과정은 신경계 및/또는 심장에서뿐만 아니라 다른 조직에서의 병리를 야기할 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 미스폴딩된 트랜스타이레틴(TTR)을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 생물학적 샘플을 TTR의 잔기 89 내지 97 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체(capture antibody) 및 TTR의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체(reporter antibody)와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 샘플에 존재한다면, 상기 포획 항체 및 리포터 항체는 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체(sandwich complex)를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 샌드위치 복합체를 형성하는 상기 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 상기 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계를 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 생물학적 샘플은 유전성 ATTR 환자로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 생물학적 샘플은 V30M, Y114C, G47R, S50I, T49S, F33V, A45T, E89K, E89Q 및 V122I로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 운반하는 유전성 ATTR 환자로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 돌연변이는 V30M, Y114C 및 S50I로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 이러한 방법에서, 돌연변이는 V30M이다. 일부 이러한 방법에서, 돌연변이는 Y114C이다. 일부 이러한 방법에서, 돌연변이는 S50I이다. 일부 이러한 방법에서, 돌연변이는 E89K이다. 일부 이러한 방법에서, 돌연변이는 E89Q이다.
일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 다클론성 항-TTR 항체이다. 일부 이러한 방법에서, 리포터 항체는 18C5, 8C3, 7G7, AD7F6, RT24, NI-301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD107, MFD108, MFD109, MFD111, MFD114, 또는 이들의 키메라 형태 또는 인간화된 형태, 또는 다클론성 항-TTR 항체이다.
일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 18C5, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 8C3, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 7G7, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다.
일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 AD7F6, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 RT24, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 NI-301.35G11, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다.
일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 MFD101, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 MDF102, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 MFD103이며, 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 MFD105, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 MFD107, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 MFD108, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 MFD109, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 MFD111, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 is MFD114, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태.
일부 이러한 방법에서, 리포터 항체는 TTR의 잔기 101 내지 109, 118 내지 122, 115 내지 124, 53 내지 63, 54 내지 61, 36 내지 49, 49 내지 61, 109 내지 121, 30 내지 66, 70 내지 127, 80 내지 127, 90- 127, 100 내지 127, 110 내지 127, 또는 115 내지 127 내에서 결합하는 항체이다.
일부 이러한 방법은 E89K 치환을 포함하는 미스폴딩된 TTR을 검출한다. 일부 이러한 방법은 E89Q 치환을 포함하는 미스폴딩된 TTR을 검출한다.
일부 이러한 방법에서, 생물학적 샘플은 수집된 샘플의 제1 분취액이고, 상기 방법은 TTR에 대한 결합을 위해 상기 포획 항체와 경쟁하는 시험 항체를 더 포함하는 상기 수집된 샘플의 제2 분취액에 대해 단계 (a)와 (b)를 반복하는 단계를 더 포함하되, 상기 단계를 반복함에 있어서 상기 샌드위치 복합체를 형성하는 감소된 리포터 항체는 미스폴딩된 TTR에 결합하는 상기 시험 항체의 능력의 표시를 제공한다.
일부 이러한 방법에서, 시험 항체는 14G8 또는 이의 키메라 또는 인간화된 형태이고, 포획 항체는 9D5이며, 리포터 항체는 다클론성 항-TTR 항체이다. 일부 이러한 방법에서, 시험 항체는 14G8의 인간화된 형태이다.
다른 양상에서, 본 발명은 시험 항체로 치료된 대상체로부터의 생물학적 샘플에 남아있는 미스폴딩된 트랜스타이레틴(mis-TTR)을 검출함으로써, 대상체에게 투여되는 시험 항체의 생체내 표적 맞물림(in vivo target engagement)을 결정하는 방법으로서, 표적은 mis-TTR의 잔기 89 내지 97 내의 에피토프이되, 상기 방법은 (a) 상기 생물학적 샘플을 잔기 89 내지 97 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 상기 포획 항체의 에피토프와 상이한 TTR 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 포획 항체 및 리포터 항체는 샌드위치 복합체를 형성하는 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하는, 상기 접촉시키는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 샌드위치 복합체를 형성하는 상기 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 상기 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계를 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 생물학적 샘플은 유전성 ATTR 환자로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 생물학적 샘플은 V30M, Y114C, G47R, S50I, T49S, F33V, A45T, E89K, E89Q 및 V122I로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 운반하는 유전성 ATTR 환자로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 돌연변이는 V30M, Y114C 및 S50I로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 이러한 방법에서, 돌연변이는 V30M이다. 일부 이러한 방법에서, 돌연변이는 Y114C이다. 일부 이러한 방법에서, 돌연변이는 S50I이다. 일부 이러한 방법에서, 돌연변이는 E89K이다. 일부 이러한 방법에서, 돌연변이는 E89Q이다.
일부 이러한 방법에서, 비치료 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 미스폴딩된 TTR의 검출에 비해 상기 치료된 대상체에서의 미스폴딩된 TTR의 검출 감소는 양성 표적 맞물림, 및 동일하거나 또는 더 적은 양의 상기 시험 항체로 상기 대상체를 치료하는 것과 상관관계가 있다. 일부 이러한 방법에서, 치료된 대상체와 비치료된 대상체는 동일한 개체이다.
일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 9D5이되, 포획 항체와 리포터 항체는 상이한 표지를 가진다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 14G8이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 5A1이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 9D5이고, 리포터 항체는 6C1이다. 일부 이러한 방법에서, 리포터 항체는 다량체 미스폴딩된 트랜스타이레틴에 대한 결합을 위해 포획 항체와 결합에 대해 경쟁한다.
일부 실시형태에서, 리포터 항체는 전기화학발광 표지를 가지고, 전기화학발광에 의해 검출된다. 본 발명의 일부 방법에서, 포획 항체는 바이오틴 표지를 가진다.
실시형태에서, 상기 방법은 정량적으로 수행된다. 실시형태에서, 상기 방법은 미스폴딩된 TTR의 절대적 또는 상대적 양을 나타내기 위해 정량적으로 수행된다.
일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 접촉시키는 단계 전에 고체상에 결합된다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 링커를 통해 고체상에 부착된다. 일부 이러한 방법에서, 고체상은 적어도 하나의 전극을 포함한다.
일부 이러한 방법은 리포터 항체로부터의 신호를 알려진 양의 미스폴딩된 TTR을 함유하는 대조군 샘플에서의 리포터 항체로부터의 신호와 비교하여 상기 샘플에서의 미스폴딩된 TTR의 양을 결정하는 단계를 더 포함한다.
일부 이러한 방법은 신호의 교정 곡선으로부터의 리포터 항체로부터의 신호를 미스폴딩된 TTR의 양에 비교하여 샘플에서의 미스폴딩된 TTR의 양을 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 리포터 항체로부터의 신호는 샘플에서의 미스폴딩된 TTR의 양에 비례한다.
일부 이러한 방법에서, 샘플은 인간으로부터의 샘플이다. 일부 이러한 방법에서, 샘플은 체액이다. 일부 이러한 방법에서, 샘플은 인간의 혈장이다.
실시형태에서, 미스폴딩된 TTR의 존재는 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증을 가진 대상체로부터의 샘플을 얻은 대상체를 진단하기 위해 사용된다. 실시형태에서, 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증은 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증 또는 산발적 야생형 트랜스타이레틴 아밀로이드증이다. 실시형태에서, 대상체는 유전자 검사에 기반하여 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증의 위험에 있는 것으로 확인되었다.
실시형태에서, 대상체는 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증의 증상을 나타내지 않는다. 실시형태에서, 대상체는 다발성 신경병증 또는 심장근육병증을 갖지 않는다.
실시형태에서, 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증은 가족성 아밀로이드 심장근육병증(FAC), 가족성 아밀로이드 다발성 신경병증(FAP), 또는 중추 신경계 선택적 아밀로이드증(CNSA)이다.
실시형태에서, 생물학적 샘플은 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증에 대한 치료를 받고 있는 환자로부터 유래된다.
다른 양상에서, 본 발명은 트랜스타이레틴 매개된 아밀로이드증에 대해 이전에 치료된 대상체에서 검출된 미스폴딩된 TTR의 양을 치료 전에 또는 치료 초기 동안에 대상체에서 검출된 미스폴딩된 TTR의 양과 비교하는 단계; 및 (a) 미스폴딩된 TTR의 상기 양이 이전에 검출된 것과 동일하거나 또는 더 크다면, 이전 치료의 투여 용량 또는 빈도를 증가시키는 단계; 또는 (b) 미스폴딩된 TTR의 양이 이전에 검출된 것보다 적다면, 사전 치료의 투여 용량 또는 빈도를 감소시키거나 또는 사전 치료를 중단시키는 단계를 포함하는, 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증을 가진 대상체의 치료를 조절하는 방법을 제공한다. 실시형태에서, 미스폴딩된 TTR은 생물학적 샘플을 TTR의 잔기 89 내지 97 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 샘플에 존재한다면, 포획 항체 및 리포터 항체는 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및 단계 (a)에서 미스폴딩된 TTR에 결합하는 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계를 포함하는 방법에 의해 검출된다.
일부 이러한 방법에서, 사전 치료는 항-TTR 항체의 정맥내 투여에 의하며, 미스폴딩된 TTR의 양이 이전에 검출된 것보다 적다면, 사전 치료는 중단되고, TTR 안정제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 요법, RNA 간섭 요법 또는 독시사이클린 및 타우로우루소데옥시콜산과의 병용 요법에 의한 치료로 대체된다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 더 이상 항-TTR 항체에 의한 치료를 받지 않는다. 일부 이러한 방법에서, TTR 사량체 안정제는 타파미디스(tafamidis) 또는 디플루니살(diflunisal)이다. 일부 이러한 방법에서, TTR 사량체 안정제는 디플루니살이다. 일부 이러한 방법에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 치료제는 이노테센이다. 일부 이러한 방법에서, RNAi 기반 치료제는 파티시란(patisiran) 또는 레부시란(revusiran)이다.
일부 이러한 방법에서, 항-TTR 항체는 14G8이다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 더 이상 항-TTR 항체에 의한 치료를 받지 않는다. 일부 이러한 방법에서, TTR 사량체 안정제는 타파미디스 또는 디플루니살이다. 일부 이러한 방법에서, TTR 사량체 안정제는 디플루니살이다. 일부 이러한 방법에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 치료제는 이노테센이다. 일부 이러한 방법에서, RNAi 기반 치료제는 파티시란 또는 레부시란이다.
다른 양상에서, 본 발명은 (a) 트랜스타이레틴 매개된 아밀로이드증에 대해 치료를 개시하기 전의 대상체로부터의 샘플에서의 리포터 항체 결합의 양을 치료를 개시한 후에 대상체에서 검출된 리포터 항체 결합의 양과 비교하는 단계; 및 (b) 리포터 항체 결합의 양이 이전에 검출된 것과 동일하거나 또는 더 크다면, 상기 치료의 투여 용량 또는 빈도를 증가시키는 단계; 또는 (c) 리포터 항체 결합의 양이 이전에 검출된 것보다 적다면, 상기 치료의 투여 용량 또는 빈도를 감소시키거나 또는 상기 치료를 중단시키는 단계를 포함하는, 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증을 가진 대상체의 치료를 조절하는 방법을 제공한다. 실시형태에서, 리포터 항체 결합은 생물학적 샘플을 TTR의 잔기 89 내지 97 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 샘플에 존재한다면, 포획 항체 및 리포터 항체는 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및 단계 (a)에서 미스폴딩된 TTR에 결합하는 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계를 포함하는 방법에 의해 검출된다.
일부 방법에서, 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증은 아밀로이드 경쇄(AL) 아밀로이드증과 구별된다. 일부 방법에서, 상기 샘플은 인간 TTR을 발현시키는 이식유전자를 갖는 유전자이식 마우스로부터 유래된다.
다른 양상에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서의 총 다량체 미스폴딩된 트랜스타이레틴(TTR)의 수준 대 총 미스폴딩된 TTR 수준의 비를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(a) 생물학적 샘플을 두 부분으로 나누는 단계;
(b) 하기 (i) 및 (ii)에 의해 상기 생물학적 샘플의 제1 부분에서의 총 미스폴딩된 TTR을 검출하는 단계
(i) 상기 생물학적 샘플의 제1 부분을 TTR의 잔기 89 내지 97 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 리포터 항체는 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및
(ii) 단계 (b)(i)에서 샌드위치 복합체를 형성하는 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계;
(c) 하기 (i) 및 (ii)에 의해 상기 생물학적 샘플의 제2 부분에서의 총 다량체 미스폴딩된 TTR을 검출하는 단계
(i) 상기 생물학적 샘플의 상기 제2 부분을 잔기 89 내지 97 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 잔기 89 내지 97 내에서 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 다량체 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 포획 항체 및 리포터 항체는 상기 다량체 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및
(ii) 단계 (c)(i)에서 샌드위치 복합체를 형성하는 상기 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 상기 다량체 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계,
(d) (c)의 총 다량체 미스폴딩된 TTR 수준 대 (b)의 총 미스폴딩된 TTR 수준의 비를 계산하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 미스폴딩된 트랜스타이레틴(TTR)을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 생물학적 샘플을 TTR의 잔기 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 포획 항체 및 리포터 항체는 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및 단계 (a)에서 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하는 상기 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 상기 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계를 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 18C5이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 18C5이고, 리포터 항체는 다클론성 항-TTR 항체이다. 일부 이러한 방법에서, 리포터 항체는 9D5, 14G8, 5A1, 6C1, 8C3, 7G7, AD7F6, RT24, NI-301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD107, MFD108, MFD109, MFD111, MFD114, 또는 이들의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다.
일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 18C5이고, 리포터 항체는 9D5, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 14G8, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 5A1, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 6C1, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 8C3, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 7G7, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다.
일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 18C5이고, 리포터 항체는 AD7F6, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 RT24, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 NI-301.35G11, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다.
일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 18C5이고, 리포터 항체는 MFD101, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 MDF102, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 MFD103, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 MFD105, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 MFD107, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 MFD108, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 MFD109, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 MFD111, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 MFD114, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다.
일부 이러한 방법에서, 리포터 항체는 TTR의 잔기 89 내지 97, 118 내지 122, 115 내지 124, 53 내지 63, 54 내지 61, 36 내지 49, 49 내지 61, 109 내지 121, 30 내지 66, 70 내지 127, 80 내지 127, 90 내지 127, 100 내지 127, 110 내지 127 또는 115 내지 127 내에서 결합하는 항체이다.
다른 양상에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 미스폴딩된 트랜스타이레틴(TTR)을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 생물학적 샘플을 TTR의 잔기 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 잔기 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 다량체 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 포획 항체 및 리포터 항체는 다량체 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및 단계 (a)에서 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하는 상기 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 다량체 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계를 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 18C5이고, 리포터 항체는 18C5이되, 포획 항체와 리포터 항체는 상이한 표지를 가진다. 일부 이러한 방법에서, 리포터 항체는 다량체 미스폴딩된 트랜스타이레틴에 대한 결합을 위해 포획 항체와 결합에 대해 경쟁한다.
일부 실시형태에서, 리포터 항체는 전기화학발광 표지를 가지고, 전기화학발광에 의해 검출된다. 본 발명의 일부 방법에서, 포획 항체는 바이오틴 표지를 가진다.
실시형태에서, 상기 방법은 정량적으로 수행된다. 실시형태에서, 상기 방법은 상기 미스폴딩된 TTR의 절대적 또는 상대적 양을 나타내기 위해 정량적으로 수행된다.
일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 접촉시키는 단계 전에 고체상에 결합된다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 링커를 통해 고체상에 부착된다. 일부 이러한 방법에서, 고체상은 적어도 하나의 전극을 포함한다.
일부 이러한 방법은 리포터 항체로부터의 신호를 알려진 양의 미스폴딩된 TTR을 함유하는 대조군 샘플에서의 리포터 항체로부터의 신호와 비교하여 상기 샘플에서의 미스폴딩된 TTR의 양을 결정하는 단계를 더 포함한다.
일부 이러한 방법은 신호의 교정 곡선으로부터의 리포터 항체로부터의 신호를 미스폴딩된 TTR의 양에 비교하여 샘플에서의 미스폴딩된 TTR의 양을 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 리포터 항체로부터의 신호는 샘플에서의 미스폴딩된 TTR의 양에 비례한다.
일부 이러한 방법에서, 샘플은 인간으로부터의 샘플이다. 일부 이러한 방법에서, 샘플은 체액이다. 일부 이러한 방법에서, 샘플은 인간의 혈장이다.
실시형태에서, 미스폴딩된 TTR의 존재는 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증을 가진 대상체로부터의 샘플을 얻은 대상체를 진단하기 위해 사용된다. 실시형태에서, 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증은 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증 또는 산발적 야생형 트랜스타이레틴 아밀로이드증이다. 실시형태에서, 대상체는 유전자 검사에 기반하여 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증의 위험에 있는 것으로 확인되었다.
실시형태에서, 대상체는 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증의 증상을 나타내지 않는다. 실시형태에서, 대상체는 다발성 신경병증 또는 심장근육병증을 갖지 않는다.
실시형태에서, 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증은 가족성 아밀로이드 심장근육병증(FAC), 가족성 아밀로이드 다발성 신경병증(FAP), 또는 중추 신경계 선택적 아밀로이드증(CNSA)이다.
실시형태에서, 생물학적 샘플은 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증에 대한 치료를 받고 있는 환자로부터 유래된다.
다른 양상에서, 본 발명은 트랜스타이레틴 매개된 아밀로이드증에 대해 이전에 치료된 대상체로부터의 샘플에서 미스폴딩된 TTR의 양을 치료 전에 또는 치료 초기 동안에 상기 대상체에서 검출된 미스폴딩된 TTR의 양과 비교하는 단계; 및 미스폴딩된 TTR의 상기 양이 이전에 검출된 것과 동일하거나 또는 더 크다면, 이전 치료의 투여 용량 또는 빈도를 증가시키는 단계; 또는 미스폴딩된 TTR의 양이 이전에 검출된 것보다 적다면, 사전 치료의 투여 용량 또는 빈도를 감소시키거나 또는 사전 치료를 중단시키는 단계를 포함하는, 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증을 가진 대상체의 치료를 조절하는 방법을 제공한다. 실시형태에서, 미스폴딩된 TTR은 생물학적 샘플을 TTR의 잔기 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 포획 항체 및 리포터 항체는 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및 단계 (a)에서 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하는 상기 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 상기 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계를 포함하는 방법에 의해 검출된다.
일부 이러한 방법에서, 사전 치료는 항-TTR 항체의 정맥내 투여에 의하고, 미스폴딩된 TTR의 상기 양이 이전에 검출된 양보다 적다면, 상기 사전 치료는 중단되며, TTR 안정제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 요법, RNA 간섭 요법 또는 독시사이클린 및 타우로우루소데옥시콜산과의 병용 요법에 의한 치료로 대체된다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 더 이상 항-TTR 항체에 의한 치료를 받지 않는다. 일부 이러한 방법에서, TTR 사량체 안정제는 타파미디스 또는 디플루니살이다. 일부 이러한 방법에서, TTR 사량체 안정제는 디플루니살이다. 일부 이러한 방법에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 치료제는 이노테센이다. 일부 이러한 방법에서, RNAi 기반 치료제는 파티시란 또는 레부시란이다.
일부 이러한 방법에서, 항-TTR 항체는 14G8이다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 더 이상 항-TTR 항체에 의한 치료를 받지 않는다. 일부 이러한 방법에서, TTR 사량체 안정제는 타파미디스 또는 디플루니살이다. 일부 이러한 방법에서, TTR 사량체 안정제는 디플루니살이다. 일부 이러한 방법에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 치료제는 이노테센이다. 일부 이러한 방법에서, RNAi 기반 치료제는 파티시란 또는 레부시란이다.
다른 양상에서, 본 발명은 (a) 트랜스타이레틴 매개된 아밀로이드증에 대해 치료를 개시하기 전의 대상체로부터의 샘플에서 리포터 항체 결합의 양을 치료를 개시한 후에 대상체에서 검출된 리포터 항체 결합의 양과 비교하는 단계; 및 (b) 리포터 항체 결합의 양이 이전에 검출된 것과 동일하거나 또는 더 크다면, 상기 치료의 투여 용량 또는 빈도를 증가시키는 단계; 또는 (c) 리포터 항체 결합의 양이 이전에 검출된 것보다 적다면, 상기 치료의 투여 용량 또는 빈도를 감소시키거나 또는 상기 치료를 중단시키는 단계를 포함하는, 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증을 가진 대상체의 치료를 조절하는 방법을 제공한다. 실시형태에서, 리포터 항체 결합은 생물학적 샘플을 TTR의 잔기 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 포획 항체 및 리포터 항체는 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및 단계 (a)에서 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하는 상기 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 상기 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계를 포함하는 방법에 의해 검출된다.
일부 방법에서, 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증은 아밀로이드 경쇄(AL) 아밀로이드증과 구별된다. 일부 방법에서, 상기 샘플은 인간 TTR을 발현시키는 이식유전자를 갖는 유전자이식 마우스로부터 유래된다.
다른 양상에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서의 총 다량체 미스폴딩된 트랜스타이레틴(TTR)의 수준 대 총 미스폴딩된 TTR 수준의 비를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(a) 생물학적 샘플을 두 부분으로 나누는 단계;
(b) 하기 (i) 및 (ii)에 의해 상기 생물학적 샘플의 제1 부분에서의 총 미스폴딩된 TTR을 검출하는 단계
(i) 상기 생물학적 샘플의 제1 부분을 TTR의 잔기 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 리포터 항체는 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및
(ii) 단계 (i)에서 미스폴딩된 TTR에 결합된 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계;
(c) 하기 (i) 및 (ii)에 의해 상기 생물학적 샘플의 제2 부분에서의 총 다량체 미스폴딩된 TTR을 검출하는 단계
(i) 상기 생물학적 샘플의 상기 제2 부분을 잔기 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 잔기 101 내지 109 내에서 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 다량체 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 포획 항체 및 리포터 항체는 상기 다량체 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및
(ii) 단계 (a)에서 다량체 미스폴딩된 TTR에 결합된 상기 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 상기 다량체 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계,
(d) (c)의 총 다량체 미스폴딩된 TTR 수준 대 (b)의 총 미스폴딩된 TTR 수준의 비를 계산하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 미스폴딩된 트랜스타이레틴 (TTR)을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 생물학적 샘플을 TTR의 잔기 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 포획 항체 및 리포터 항체는 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및 단계 (a)에서 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하는 상기 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 상기 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계를 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 생물학적 샘플은 유전성 ATTR 환자로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 생물학적 샘플은 V30M, Y114C 및 S50I로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 운반하는 유전성 ATTR 환자로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 돌연변이는 V30M이다. 일부 이러한 방법에서, 돌연변이는 Y114C이다. 일부 이러한 방법에서, 돌연변이는 S50I이다.
일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 18C5이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 18C5이고, 리포터 항체는 다클론성 항-TTR 항체이다. 일부 이러한 방법에서, 리포터 항체는 9D5, 14G8, 5A1, 6C1, 8C3, 7G7, AD7F6, RT24, NI- 301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD107, MFD108, MFD109, MFD111, MFD114, 또는 이들의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다.
일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 18C5이고, 리포터 항체는 9D5, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 14G8, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 5A1, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 6C1, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 8C3, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 7G7, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다.
일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 18C5이고, 리포터 항체는 AD7F6, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 RT24, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 NI-301.35G11, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다.
일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 18C5이고, 리포터 항체는 MFD101, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 MDF102, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 MFD103, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 MFD105, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 MFD107, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 MFD108, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 MFD109, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 MFD111, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체 18C5이고, 리포터 항체는 MFD114, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태이다.
일부 이러한 방법에서, 리포터 항체는 TTR의 잔기 89 내지 97, 118 내지 122, 115 내지 124, 53 내지 63, 54 내지 61, 36 내지 49, 49 내지 61, 109 내지 121, 30 내지 66, 70 내지 127, 80 내지 127, 90 내지 127, 100 내지 127, 110 내지 127, 또는 115 내지 127 내에서 결합하는 항체이다.
일 양상에서, 본 발명은 시험 항체로 치료된 대상체로부터의 생물학적 샘플에 남아있는 미스폴딩된 트랜스타이레틴(mis-TTR)을 검출함으로써, 대상체에게 투여되는 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법으로서, 표적은 mis-TTR의 잔기 101 내지 109 내의 에피토프이되, 상기 방법은 (a) 상기 생물학적 샘플을 잔기 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 상기 포획 항체의 에피토프와 상이한 TTR 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 포획 항체 및 리포터 항체는 샌드위치 복합체를 형성하는 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하는, 상기 접촉시키는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 샌드위치 복합체를 형성하는 상기 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 상기 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계를 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 생물학적 샘플은 유전성 ATTR 환자로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 생물학적 샘플은 V30M, Y114C 및 S50I로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 운반하는 유전성 ATTR 환자로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 돌연변이는 V30M이다. 일부 이러한 방법에서, 돌연변이는 Y114C이다. 일부 이러한 방법에서, 돌연변이는 S50I이다.
일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 18C5이되, 포획 항체와 리포터 항체는 상이한 표지를 가진다. 일부 이러한 방법에서, 리포터 항체는 다량체 미스폴딩된 트랜스타이레틴에 대한 결합을 위해 포획 항체와 결합에 대해 경쟁한다.
일부 실시형태에서, 리포터 항체는 전기화학발광 표지를 가지고, 전기화학발광에 의해 검출된다. 본 발명의 일부 방법에서, 포획 항체는 바이오틴 표지를 가진다.
실시형태에서, 상기 방법은 정량적으로 수행된다. 실시형태에서, 상기 방법은 상기 미스폴딩된 TTR의 절대적 또는 상대적 양을 나타내기 위해 정량적으로 수행된다.
일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 접촉시키는 단계 전에 고체상에 결합된다. 일부 이러한 방법에서, 포획 항체는 링커를 통해 고체상에 부착된다. 일부 이러한 방법에서, 고체상은 적어도 하나의 전극을 포함한다.
일부 이러한 방법은 리포터 항체로부터의 신호를 알려진 양의 미스폴딩된 TTR을 함유하는 대조군 샘플에서의 리포터 항체로부터의 신호와 비교하여 상기 샘플에서의 미스폴딩된 TTR의 양을 결정하는 단계를 더 포함한다.
일부 이러한 방법은 신호의 교정 곡선으로부터의 리포터 항체로부터의 신호를 미스폴딩된 TTR의 양에 비교하여 샘플에서의 미스폴딩된 TTR의 양을 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 리포터 항체로부터의 신호는 샘플에서의 미스폴딩된 TTR의 양에 비례한다.
일부 이러한 방법에서, 샘플은 인간으로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 샘플은 체액이다. 일부 이러한 방법에서, 샘플은 인간의 혈장이다.
실시형태에서, 미스폴딩된 TTR의 존재는 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증을 가진 대상체로부터의 샘플을 얻은 대상체를 진단하기 위해 사용된다. 실시형태에서, 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증은 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증 또는 산발적 야생형 트랜스타이레틴 아밀로이드증이다. 실시형태에서, 대상체는 유전자 검사에 기반하여 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증의 위험에 있는 것으로 확인되었다.
실시형태에서, 대상체는 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증의 증상을 나타내지 않는다. 실시형태에서, 대상체는 다발성 신경병증 또는 심장근육병증을 갖지 않는다.
실시형태에서, 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증은 가족성 아밀로이드 심장근육병증(FAC), 가족성 아밀로이드 다발성 신경병증(FAP), 또는 중추 신경계 선택적 아밀로이드증(CNSA)이다.
실시형태에서, 생물학적 샘플은 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증에 대한 치료를 받고 있는 환자로부터 유래된다.
다른 양상에서, 본 발명은 트랜스타이레틴 매개된 아밀로이드증에 대해 이전에 치료된 대상체로부터의 샘플에서 미스폴딩된 TTR의 양을 치료 전에 또는 치료 초기 동안에 상기 대상체에서 검출된 미스폴딩된 TTR의 양과 비교하는 단계; 및 미스폴딩된 TTR의 상기 양이 이전에 검출된 것과 동일하거나 또는 더 크다면, 이전 치료의 투여 용량 또는 빈도를 증가시키는 단계; 또는 미스폴딩된 TTR의 양이 이전에 검출된 것보다 적다면, 사전 치료의 투여 용량 또는 빈도를 감소시키거나 또는 사전 치료를 중단시키는 단계를 포함하는, 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증을 가진 대상체의 치료를 조절하는 방법을 제공한다. 실시형태에서, 미스폴딩된 TTR은 생물학적 샘플을 TTR의 잔기 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 포획 항체 및 리포터 항체는 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및 단계 (a)에서 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하는 상기 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 상기 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계를 포함하는 방법에 의해 검출된다.
일부 이러한 방법에서, 사전 치료는 항-TTR 항체의 정맥내 투여에 의하고, 미스폴딩된 TTR의 상기 양이 이전에 검출된 양보다 적다면, 상기 사전 치료는 중단되며, TTR 안정제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 요법, RNA 간섭 요법 또는 독시사이클린 및 타우로우루소데옥시콜산과의 병용 요법에 의한 치료로 대체된다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 더 이상 항-TTR 항체에 의한 치료를 받지 않는다. 일부 이러한 방법에서, TTR 사량체 안정제는 타파미디스 또는 디플루니살이다. 일부 이러한 방법에서, TTR 사량체 안정제는 디플루니살이다. 일부 이러한 방법에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 치료제는 이노테센이다. 일부 이러한 방법에서, RNAi 기반 치료제는 파티시란 또는 레부시란이다.
일부 이러한 방법에서, 항-TTR 항체는 14G8이다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 더 이상 항-TTR 항체에 의한 치료를 받지 않는다. 일부 이러한 방법에서, TTR 사량체 안정제는 타파미디스 또는 디플루니살이다. 일부 이러한 방법에서, TTR 사량체 안정제는 디플루니살이다. 일부 이러한 방법에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 치료제는 이노테센이다. 일부 이러한 방법에서, RNAi 기반 치료제는 파티시란 또는 레부시란이다.
다른 양상에서, 본 발명은 트랜스타이레틴 매개된 아밀로이드증에 대해 치료를 개시하기 전의 대상체로부터의 샘플에서 제46항의 방법에 의해 검출되는 리포터 항체 결합의 양을 치료를 개시한 후에 대상체에서 검출된 리포터 항체 결합의 양과 비교하는 단계; 및 리포터 항체 결합의 양이 이전에 검출된 것과 동일하거나 또는 더 크다면, 상기 치료의 투여 용량 또는 빈도를 증가시키는 단계; 또는 리포터 항체 결합의 양이 이전에 검출된 것보다 적다면, 상기 치료의 투여 용량 또는 빈도를 감소시키거나 또는 상기 치료를 중단시키는 단계를 포함하는 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증을 가진 대상체의 치료를 조절하는 방법을 제공한다. 실시형태에서, 미스폴딩된 TTR은 생물학적 샘플을 TTR의 잔기 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 포획 항체 및 리포터 항체는 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및 단계 (a)에서 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하는 상기 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 상기 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계를 포함하는 방법에 의해 검출된다.
일부 방법에서, 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증은 아밀로이드 경쇄(AL) 아밀로이드증과 구별된다. 일부 방법에서, 상기 샘플은 인간 TTR을 발현시키는 이식유전자를 갖는 유전자이식 마우스로부터 유래된다.
다른 양상에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서의 총 다량체 미스폴딩된 트랜스타이레틴(TTR)의 수준 대 총 미스폴딩된 TTR 수준의 비를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(a) 생물학적 샘플을 두 부분으로 나누는 단계;
(b) 하기 (i) 및 (ii)에 의해 상기 생물학적 샘플의 제1 부분에서의 총 미스폴딩된 TTR을 검출하는 단계
(i) 상기 생물학적 샘플의 제1 부분을 TTR의 잔기 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 리포터 항체는 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및
(ii) 단계 (i)에서 미스폴딩된 TTR에 결합된 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계;
(d) 하기 (i) 및 (ii)에 의해 상기 생물학적 샘플의 제2 부분에서의 총 다량체 미스폴딩된 TTR을 검출하는 단계
(i) 상기 생물학적 샘플의 상기 제2 부분을 잔기 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 잔기 101 내지 109 내에서 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 다량체 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 포획 항체 및 리포터 항체는 상기 다량체 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및
(ii) 단계 (a)에서 다량체 미스폴딩된 TTR에 결합된 상기 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 상기 다량체 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계,
(e) (c)의 총 다량체 미스폴딩된 TTR 수준 대 (b)의 총 미스폴딩된 TTR 수준의 비를 계산하는 단계를 포함한다.
도 1은 다클론성 항-TTR 리포터 항체를 이용하는 분석에서, 9D5가 간 이식을 받지 않은 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증(ATTR) 환자로부터의 혈장 샘플에서 상승된 미스폴딩된 TTR을 검출한다는 것을 나타내는 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery: MSD)를 사용하는 샌드위치 면역분석 결과를 도시한 도면.
도 2는 m14G8이 환자 혈장에 섞일 때 유리 미스폴딩 TTR의 수준을 감소시킨다는 것을 나타내는, 9D5 포획 항체 및 다클론성 항-TTR 리포터 항체를 이용하는 생체외 표적 맞물림 분석 결과를 도시한 도면.
도 3은 18C5 리포터 항체를 이용하는 분석에서, 9D5가 간 이식을 받지 않은 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증(ATTR) 환자로부터의 혈장 샘플에서 미스폴딩된 TTR을 상승시켰다는 것을 나타내는 메소 스케일 디스커버리(MSD) 전기화학발광 플랫폼을 사용하는 샌드위치 면역분석 결과를 도시한 도면.
도 4는 18C5가 변성된 TTR 단량체에 대해 강한 반응성, 변성된 이량체에 대해 부수적 반응성, 및 천연 TTR 종에 대해 매우 약한 반응성을 가진다는 것을 나타내는 웨스턴 블롯 실험 결과를 도시한 도면.
도 5는 상업적 TTR 항체가 천연과 변성된 TTR을 구별할 수 없다는 것을 나타내고 단량체뿐만 아니라 이량체 천연 및 변성 TTR에 대해 강한 반응성을 나타내는 웨스턴 블롯 실험 결과를 도시한 도면.
도 6은 간 이식을 받지 않은 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증(ATTR) 환자로부터의 혈장 샘플에서 18C5가 상승된 미스폴딩된 TTR을 검출한다는 것을 나타내는 메소 스케일 디스커버리(MSD) 전기화학발광 플랫폼을 사용하는 샌드위치 면역분석 결과를 도시한 도면.
도 7은 간 이식을 받지 않은 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증(ATTR) 환자로부터의 혈장 샘플에서 18C5가 상승된 다량체 미스폴딩된 TTR을 검출한다는 것을 나타내는 메소 스케일 디스커버리(MSD) 전기화학발광 플랫폼을 사용하는 샌드위치 면역분석 결과를 도시한 도면.
도 8은 9D5가 유전성 ATTR 환자로부터의 혈장에서 mis-TTR(미스폴딩된 TTR 단량체 및 올리고머)의 상승된 수준을 검출한다는 것을 나타내는 웨스턴 블롯 실험 결과를 도시한 도면.
도 9는 혈장 mis-TTR에 대한 mis-TTR mAb(m14G8)의 결합(표적 맞물림)을 측정하는 약력학 분석의 다이어그램을 도시한 도면.
도 10은 다클론성 항-TTR 리포터 항체를 이용하는 분석에서 간 이식을 받지 않은 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증(ATTR)으로부터의 혈장 샘플에서 9D5가 상승된 미스폴딩된 TTR을 검출한다는 것을 나타내는 메소 스케일 디스커버리(MSD) 전기화학발광 플랫폼을 사용하는 샌드위치 면역분석 결과를 도시한 도면.
도 11은 마우스 18C5 항체의 중쇄 가변 영역(서열번호 81), 인간 생식계열 서열 IGHV3-48*01(서열번호 84), 인간 수용자 5VZY-VH_huFrwk(Crenefab-VH)(서열번호 83), 및 18C5 항체의 인간화된 형태(hu18C5_VH-v1 및 hu18C5_VH-v2, 각각 서열번호 84 및 85)의 정렬을 도시한 도면. 카바트/코티아 복합에 따라 정해진 CDR은 마우스 18C5 중쇄 가변 영역 서열에서 볼드체로 표시한다.
도 12는 마우스 18C5 항체의 경쇄 가변 영역(서열번호 87), 인간 생식계열 서열 IGKV2-30*02(서열번호 90), 인간 수용자 5VZY-VL_huFrwk (Crenefab-VL)(서열번호 89), 및 18C5 항체의 인간화된 형태(hu18C5-VL-v1 및 hu18C5-VL-v2, 각각 서열번호 91 및 92)의 정렬을 도시한 도면. 카바트/코티아 복합에 따라 정해지는 CDR은 마우스 18C5 경쇄 가변 영역 서열에서 볼드체로 표시한다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 신호 펩타이드를 갖는 마우스 18C5 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 2는 신호 펩타이드를 갖는 마우스 18C5 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열을 제시한다.
서열번호 3은 신호 펩타이드를 갖는 마우스 18C5 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 4는 신호 펩타이드를 갖는 마우스 18C5 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열을 제시한다.
서열번호 5는 마우스 18C5 항체의 카바트/코티아 복합 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 6은 마우스 18C5 항체의 카바트/코티아 복합 CDR-H1을 암호화하는 핵산 서열을 제시한다.
서열번호 7은 마우스 18C5 항체의 카바트/코티아 복합 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 8은 마우스 18C5 항체의 카바트/코티아 복합 CDR-H2를 암호화하는 핵산 서열을 제시한다.
서열번호 9는 마우스 18C5 항체의 카바트/코티아 복합 CDR-H3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 10은 마우스 18C5 항체의 카바트/코티아 복합 CDR-H3을 암호화하는 핵산 서열을 제시한다.
서열번호 11은 마우스 18C5 항체의 카바트/코티아 복합 CDR-L1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 12는 마우스 18C5 항체의 카바트/코티아 복합 CDR-L1을 암호화하는 핵산 서열을 제시한다.
서열번호 13은 마우스 18C5 항체의 카바트/코티아 복합 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 14는 마우스 18C5 항체의 카바트/코티아 복합 CDR-L2를 암호화하는 핵산 서열을 제시한다.
서열번호 15는 마우스 18C5 항체의 카바트/코티아 복합 CDR-L3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 16은 마우스 18C5 항체의 카바트/코티아 복합 CDR-L3을 암호화하는 핵산 서열을 제시한다.
서열번호 17은 키메라 18C5 중쇄 불변 영역(인간 IgG1)의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 18은 키메라 18C5 중쇄 불변 영역(인간 IgG1)의 핵산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 제시한다.
서열번호 19는 키메라 18C5 경쇄 불변 영역(인간 카파)의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 20은 키메라 18C5 경쇄 불변 영역(인간 카파)의 핵산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 제시한다.
서열번호 21은 예시적인 IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 22는 예시적인 IgG1 Glm3 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 23은 예시적인 IgG1 Glm3 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 24는 N-말단의 알기닌을 갖는 예시적인 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 25는 N-말단의 알기닌이 없는 예시적인 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 26은 수탁 번호 P02766.1(유니프롯(UniProt))에 제시된 인간 트랜스타이레틴의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 27은 수탁 번호 AAB35639.1(젠뱅크(GenBank))에 제시된 인간 트랜스타이레틴의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 28은 수탁 번호 AAB3 5640.1(젠뱅크)에 제시된 인간 트랜스타이레틴의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 29는 수탁 번호 및 ABI63351.1(젠뱅크)에 제시된 인간 트랜스타이레틴의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 30은 인간 트랜스타이레틴의 잔기 101 내지 109의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 31은 인간 트랜스타이레틴의 잔기 87 내지 127의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 32는 예시적인 IgG1 Glm3 중쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 제시한다.
서열번호 33은 C-말단의 알기닌을 갖는 예시적인 경쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 제시한다.
서열번호 34는 C-말단의 알기닌이 없는 예시적인 경쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 제시한다.
서열번호 35는 중쇄 불변 영역 신호 펩타이드의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 36은 중쇄 불변 영역 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 제시한다.
서열번호 37은 경쇄 불변 영역 신호 펩타이드의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 38은 경쇄 불변 영역 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 제시한다.
서열번호 39는 항체 14G8의 카바트 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 40은 항체 14G8의 카바트 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 41은 항체 14G8의 카바트 CDR-H3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 42는 항체 14G8의 카바트 CDR-L1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 43은 항체 14G8의 카바트 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 44는 항체 14G8의 카바트 CDR-L3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 45는 항체 5A1의 에피토프의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 46은 항체 5A1의 카바트 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 47은 항체 5A1의 카바트 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 48은 항체 5A1의 카바트 CDR-H3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 49는 항체 5A1의 카바트 CDR-L1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 50은 항체 5A1의 카바트 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 51 은 항체 5A1의 카바트 CDR-L3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 52는 항체 6C1의 카바트 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 53은 항체 6C1의 카바트 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 54는 항체 6C1의 카바트 CDR-H3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 55는 항체 6C1의 카바트 CDR-L1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 56은 항체 6C1의 카바트 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 57은 항체 6C1의 카바트 CDR-L3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 58은 항체 AD7F6의 VH 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 59는 항체 AD7F6의 VL 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 60은 항체 RT24의 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 61은 항체 RT24의 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 62은 항체 RT24의 CDR-H3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 63은 항체 RT24의 CDR-L1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 64는 항체 RT24의 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 65는 항체 RT24의 CDR-L3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 66은 항체 NI-301.35G11의 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 67은 항체 NI-301.35G11의 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 68은 항체 NI-301.35G11의 CDR-H3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 69는 항체 NI-301.35G11의 CDR-L1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 70은 항체 NI-301.35G11의 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 71은 항체 NI-301.35G11의 CDR-L3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 72는 항체 MFD101, MDF102, MFD 103, MFD105의 에피토프의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 73은 항체 MFD107, MFD108, MFD109, MFD 111의 에피토프의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 74는 항체 MFD114의 에피토프의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 75는 항체 9D5의 카바트 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 76은 항체 9D5의 카바트 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 77은 항체 9D5의 카바트 CDR-H3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 78은 항체 9D5의 카바트 CDR-L1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 79는 항체 9D5의 카바트 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 80은 항체 9D5의 카바트 CDR-L3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 81은 마우스 18C5 항체의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 82는 뮤린 항-파이로글루타메이트-Ab eta 항체 Fab c#17, 젠뱅크 수탁 번호 1212215935의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 83은 인간화된 크레네주맙 Fab(CreneFab) PDB: 5VZY, 젠뱅크 수탁 번호 1229749875의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 84는 인간 생식계열 서열 IGHV3-48*01, 젠뱅크 수탁 번호 1FN550289.1의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 85는 인간화된 18C5 항체 hu18C5-VH_1의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 86은 인간화된 18C5 항체 hu18C5-VH_2의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 87은 마우스 18C5 항체의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 88은 뮤린 항-파이로글루타메이트-Abeta 항체 Fab c#17, 젠뱅크 수탁 번호 1212215934의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 89는 인간화된 크레네주맙(Crenezumab) Fab(CreneFab) PDB: 5VZY, 젠뱅크 수탁 번호 1229749876의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 90은 인간 생식계열 서열 IGKV2-30*2, 젠뱅크 수탁 번호 CAA77315의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 91은 인간화된 18C5 항체 hu18C5-VL_1의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 92는 인간화된 18C5 항체 hu18C5-VL_2의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 93은 마우스 18C5 항체의 카바트 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 94는 마우스 18C5 항체의 코티아 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 95는 마우스 18C5 항체의 접촉 CDR-H1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 96은 마우스 18C5 항체의 코티아 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 97은 마우스 18C5 항체의 AbM CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 98은 마우스 18C5 항체의 접촉 CDR-H2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 99는 마우스 18C5 항체의 접촉 CDR-H3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 100은 마우스 18C5 항체의 접촉 CDR-L1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 101은 마우스 18C5 항체의 접촉 CDR-L2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 102는 마우스 18C5 항체의 접촉 CDR-L3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 103은 마우스 9D5 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 104는 마우스 9D5 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
정의
단클론성 항체 또는 다른 생물학적 독립체는 전형적으로 단리된 형태로 제공된다. 이는 항체 또는 다른 생물학적 독립체가 전형적으로 이의 생성 또는 정제에서 발생하는 간섭 단백질 및 다른 오염물질의 적어도 50% w/w 순도라는 것을 의미하지만, 단클론성 항체가 과량의 약제학적으로 허용 가능한 담체(들) 또는 그의 사용을 용이하게 하기 위한 것으로 의도되는 다른 비히클과 조합되는 가능성을 제외하지는 않는다. 때때로 단클론성 항체는 생성 또는 정제로부터의 간섭 단백질 및 오염물질의 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% w/w 순도이다. 종종 단리된 단클론성 항체 또는 다른 생물학적 독립체는 그의 정제 후에 남아있는 우세한 거대분자 종이다.
항체의 그의 표적 항원에 대한 특이적 결합은 적어도 106, 107, 108, 109 또는 1010M-1의 친화도를 의미한다. 특이적 결합은 검출 가능하게 큰 규모이며, 적어도 하나의 관련없는 표적에 대해 생기는 비특이적 결합과 구별 가능하다. 특이적 결합은 특정 작용기 또는 특정 공간적 맞춤(예를 들어, 자물쇠와 열쇠 유형) 사이의 결합의 형성을 초래할 수 있는 반면, 비특이적 결합은 보통 반데르 발스힘의 결과이다. 특이적 결합은 반드시 항체가 한 사람 및 하나의 표적에만 결합한다는 것을 의미하는 것은 아니다.
기본적 항체 구조 단위는 서브유닛의 사량체이다. 각각의 사량체는 폴리펩타이드 쇄의 2개의 동일한 쌍을 포함하고, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50 내지 70kDa)를 가진다. 각각의 쇄의 아미노 말단 부분은 주로 항원 인식을 초래하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 절단 가능한 신호 펩타이드에 연결된 이 가변 영역은 초기에 발현된다. 신호 펩타이드가 없는 가변 영역은 때때로 성숙 가변 영역으로서 지칭된다. 따라서, 예를 들어, 경쇄 성숙 가변 영역은 경쇄 신호 펩타이드가 없는 경쇄 가변 영역을 의미한다. 각각의 쇄의 카복시-말단 부분은 주로 효과기 기능을 초래하는 불변 영역을 정한다.
경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류되고, 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로서 항체의 아이소타입을 정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12가지 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 결합되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌[Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7] 참조(본 명세서에 그의 전문이 참고로 포함됨).
면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역(또한 각각 본 명세서에서 "경쇄 가변 도메인"("VL 도메인") 또는 "중쇄 가변 도메인"("VH 도메인")으로서 지칭됨)은 3개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"에 의해 방해되는 "프레임워크" 영역으로 이루어진다. 프레임워크 영역은 항원의 에피토프에 대한 특이적 결합을 위해 CDR을 정렬시키는 역할을 한다. CDR은 주로 항원 결합을 초래하는 항체의 아미노산 잔기를 포함한다. 아미노-말단으로부터 카복실-말단까지, VL과 VH 도메인은 둘 다 다음의 프레임워크(FR) 및 CDR 영역을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. VL 도메인의 CDR 1, 2 및 3은 본 명세서에서 각각 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3으로서 지칭되며; VH 도메인의 CDR 1, 2 및 3은 또한 본 명세서에서 각각 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로서 지칭된다.
각각의 VL 및 VH 도메인에 대한 아미노산의 정렬은 CDR의 임의의 통상적인 정의에 따른다. 통상적인 정의는 카바트 정의(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991), 코티아 정의(Chothia & Lesk, J. Mol . Biol. 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342:878-883, 1989); CDR-H1이 코티아 및 카바트 CDR의 복합인 코티아 카바트 CDR의 복합; 옥스포드 몰레큘러 항체 모델링 소프트웨어(Oxford Molecular's 항체 modelling software)에 의해 사용되는 AbM 정의; 및 마틴(Martin) 등의 접촉 정의(bioinfo.org.uk/abs)(표 1 참조)를 포함한다. 카바트는 상이한 중쇄 사이의 또는 상이한 경쇄 사이의 대응하는 잔기가 동일한 수로 정렬되는 널리 사용되는 넘버링 규약(카바트 넘버링)을 제공한다. 항체가 CDR의 특정 정의(예를 들어, 카바트)에 의해 CDR을 포함하는 것으로 언급될 때, 정의는 항체에 존재하는 CDR 잔기(즉, 카바트 CDR)의 최소 수를 구체화한다. 이는 다른 통상적인 CDR 정의에 속하지만, 구체화된 정의 밖에서 또한 존재하는 다른 잔기를 제외하지 않는다. 예를 들어, 카바트에 의해 정의되는 CDR을 포함하는 항체는 특히, CDR이 카바트 CDR 잔기를 함유하고, 다른 CDR 잔기를 함유하지 않는 항체, 및 CDR H1이 복합 코티아-카바트 CDR H1이고, 다른 CDR은 카바트 CDR 잔기를 함유하며, 다른 정의에 기반한 추가적인 CDR 잔기는 없는 항체를 포함한다.
카바트 넘버링을 이용하는 CDR의 통상적인 정의를 이용하는 CDR의 통상적인 정의
루프 카바트 코티아 코티아와

카바트의 복합 		AbM 접촉
L1 L24--L34 L24--L34 L24--L34 L24--L34 L30--L36
L2 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L46--L55
L3 L89--L97 L89--L97 L89--L97 L89--L97 L89--L96
H1 H31--H35B H26--H32..H34* H26--H35B* H26--H35B H30--H35B
H2 H50--H65 H52--H56 H50--H65 H50--H58 H47--H58
H3 H95--H102 H95--H102 H95--H102 H95--H102 H93--H101
*코티아에 의한 CDR-H1은 (루프 길이에 따라서) H32, H33 또는 H34에서 말단일 수 있다. 이는 카바트 넘버링 계획이 35A 및 35B에서 추가 잔기의 삽입을 위치시키기 때문이지만, 코티아 넘버링은 그들을 31A 및 31B에 위치시킨다. H35A도 또는 H35B(카바트 넘버링)도 존재하지 않는다면, 코티아 CDR-H1 루프는 H32에서 끝난다. H35A만이 존재한다면, 이는 H33에서 끝난다. H35A와 H35B가 둘 다 존재한다면, 이는 H34에서 끝난다.
용어 "항체"는 무손상 항체 및 이의 결합 단편을 포함한다. 전형적으로, 단편은 별개의 중쇄, 경쇄 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, Dab, 나노바디 및 Fv를 포함하는 표적에 대한 특이적 결합에 유래된 무손상 항체와 경쟁한다. 단편은 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 무손상 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 분리에 의해 생성될 수 있다. 용어 "항체"는 또한 이중특이성 항체 및/또는 인간화 항체를 포함한다. 이중특이성 또는 이작용성 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 혼성체 항체이다(예를 들어, 문헌[Songsivilai and Lachmann, Clin . Exp . Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)] 참조). 일부 이중특이성 항체에서, 2개의 상이한 중쇄/경쇄쌍은 9D5에 의해 결합된 것보다 트랜스타이레틴 상의 상이한 에피토프에 대해 특이적인 인간화된 9D5 중쇄/경쇄 쌍 및 중쇄/경쇄 쌍을 포함한다. 일부 이중특이성 항체에서, 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍은 18C5에 의해 결합된 것보다 트랜스타이레틴 상의 상이한 에피토프에 대해 특이적인 인간화된 18C5 중쇄/경쇄쌍 및 중쇄/경쇄쌍을 포함한다.
일부 이중특이성 항체에서, 하나의 중쇄/경쇄 쌍은 이하에 추가로 개시되는 바와 같은 인간화된 9D5 항체 또는 인간화된 18C5 항체이고, 다른 중쇄/경쇄 쌍은 혈액뇌 장벽, 예컨대 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장 인자(IGF) 수용체, 렙틴 수용체, 또는 리포단백질 수용체, 또는 트랜스페린 수용체 상에서 발현된 수용체에 결합하는 항체로부터 유래된다(Friden et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:4771-4775, 1991; Friden et al., Science 259:373-377, 1993). 이러한 이중특이성 항체는 수용체-매개 통과세포외 배출에 의해 혈액뇌 장벽을 가로질러 전달될 수 있다. 이중특이성 항체의 뇌 흡수는 혈액뇌 장벽 수용체에 대한 그의 친화도를 감소시키기 위해 이중특이성 항체를 조작함으로써 추가로 향상될 수 있다. 수용체에 대해 감소된 친화도는 뇌에서 더 넓은 분포를 야기하였다(예를 들어, 문헌[Atwal et al., Sci. Trans. Med. 3, 84ra43, 2011; Yu et al., Sci . Trans. Med. 3, 84ra44, 2011] 참조).
예시적인 이중특이성 항체는 또한 다음과 같을 수 있다: (1) 이중-가변-도메인 항체(DVD-Ig), 여기서 각각의 경쇄 및 중쇄는 짧은 펩타이드 결합을 통해 동시에 2개의 가변 도메인을 함유한다(Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (2) Tandab, 이는 각각의 표적 항원에 대해 2개의 결합 부위를 갖는 4가 이중특이성 항체를 초래하는 2개의 단일쇄 다이어바디(diabody)의 융합임; (3) 플렉시바디(flexibody), 이는 다가 분자를 초래하는 다이어바디와 scFv의 조합임; (4) 단백질 키나제 A에서의 "이량체화 및 도킹 도메인"에 기반한 소위 "도킹과 잠금", 이는 Fab에 적용될 때, 상이한 Fab 단편에 연결된 2개의 동일한 Fab 단편으로 이루어진 3가 이중특이성 결합 단백질을 수득할 수 있음; 또는 (5) 소위 스콜피온(Scorpion) 분자, 예를 들어, 인간 Fc-영역의 말단 둘 다에 융합된 2개의 scFv를 포함함. 이중특이성 항체를 제조하는 데 유용한 플랫폼의 예는 BiTE(마이크로메트(Micromet)), DART(마크로제닉스(MacroGenics)), Fcab 및 Mab2(F-스타(F-star)), Fc-조작된 IgG1(젠코(Xencor)) 또는 듀오바디(DuoBody)(Fab 아암 교환에 기반함, 겐맙(Genmab))을 포함한다.
용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 하나 이상의 단백질의 3차 폴딩에 의해 접합된 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프(또한 선형 에피토프로서 알려짐)는 전형적으로 변성 용매에 대한 노출 시 남아있는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프(또한 입체배좌 에피토프로서 알려짐)는 전형적으로 변성 용매에 의한 처리 시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 입체배좌에서 적어도 3, 더 보통으로는, 적어도 5 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간적 입체배좌를 결정하는 방법은, 예를 들어, x-선 결정학 및 2-차원 핵 자기 공명을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)] 참조. 에피토프는, 예를 들어, 서열번호 26으로부터의 2 내지 5, 3 내지 5, 3 내지 9 또는 5 내지 9개의 인접 아미노산, 예를 들어, 서열번호 26의 성숙 영역의 잔기 89 내지 97 내에서 2개 이상의 인접 아미노산의 에피토프와 같이 선형일 수 있다. 에피토프는 또한, 예를 들어, 서열번호 26의 성숙 영역의 잔기 89 내지 97 내에서 아미노산의 2개 이상의 비인접 세그먼트를 포함하는 입체배좌 에피토프일 수 있다. 항체가 트랜스타이레틴(TTR)의 아미노산 잔기 89 내지 97(서열번호 26의 성숙 영역) 내에서 에피토프에 결합하는 것으로 언급된다면, 예를 들어, 에피토프는 범위의 외부 제한을 정하는 것을 포함하여 인용된 범위의 아미노산 내에 있다는 것을 의미한다. 범위 내의 모든 아미노산이 에피토프의 부분을 구성한다는 것을 반드시 의미하지는 않는다. 따라서, 예를 들어, TTR의 아미노산 잔기 89 내지 97 내의 에피토프는 서열번호 45의 선형 세그먼트 중에서, 또는 서열번호 45의 아미노산 서열의 입체배좌 에피토프, 비인접 세그먼트의 경우에, 서열번호 26의 아미노산 89 내지 97, 89 내지 96, 90 내지 97, 89 내지 95, 90 내지 96, 91 내지 97, 89 내지 94, 90 내지 95, 91 내지 96, 92 내지 97, 89 내지 93, 90 내지 94, 91 내지 95, 92 내지 96, 93 내지 97, 89 내지 92, 90 내지 93, 91 내지 94, 92 내지 95, 93 내지 96, 94 내지 97, 89 내지 91, 90 내지 92, 91 내지 93, 92 내지 94, 93 내지 95, 94 내지 96, 95 내지 97로 이루어질 수 있다. 에피토프는 E89K 및 E89Q 치환을 포함할 수 있으며, E는 야생형 잔기이다.
에피토프는, 예를 들어, 서열번호 26로부터의 2 내지 5, 3 내지 5, 3 내지 9 또는 5 내지 9개의 인접한 아미노산, 예를 들어, 서열번호 26의 성숙 영역의 잔기 101 내지 109 내의 2개 이상의 인접한 아미노산의 에피토프와 같이 선형일 수 있다. 에피토프는 또한, 예를 들어, 서열번호 26의 잔기 101 내지 109 내의 아미노산의 2개 이상의 비인접 세그먼트를 포함하는, 입체배좌 에피토프일 수 있다. 항체가 트랜스타이레틴(TTR)의 아미노산 잔기 101 내지 109 내의 에피토프(서열번호 26의 성숙 영역)에 결합하는 것으로 언급된다면, 예를 들어, 에피토프가 범위의 바깥 경계를 정해는 것을 포함하는 아미노산의 열거된 범위 내에 있다는 것을 의미한다. 이는 범위 내의 모든 아미노산이 에피토프의 부분을 구성한다는 것을 반드시 의미하지는 않는다. 따라서, 예를 들어, TTR의 아미노산 잔기 101 내지 109 내의 에피토프는 서열번호 30의 선형 세그먼트 중에서, 또는 서열번호 30의 아미노산 서열의 입체배좌 에피토프, 비인접 세그먼트의 경우에, 서열번호 26의 아미노산 101 내지 109, 101 내지 108, 102 내지 109, 101 내지 107, 102 내지 108, 103 내지 109, 101 내지 106, 102 내지 107, 103 내지 108, 104 내지 109, 101 내지 105, 102 내지 106, 103 내지 107, 104 내지 108, 105 내지 109, 101 내지 104, 102 내지 105, 103 내지 106,104 내지 107, 105 내지 108, 106 내지 109, 101 내지 103, 102 내지 104, 103 내지 105, 104 내지 106, 105 내지 107, 106 내지 108, 107 내지 109, 101 내지 102, 102 내지 103, 103 내지 104, 104 내지 105, 105 내지 106, 106 내지 107, 107 내지 108 또는 108 내지 109로 이루어질 수 있다.
동일한 또는 중복되는 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 대한 다른 항원의 결합과 경쟁하는 하나의 항체의 능력을 나타내는 단순한 면역분석에서 확인될 수 있다. 항체의 에피토프는 또한 접촉 잔기를 확인하기 위해 항원에 결합된 항체의 X-선 결정학에 의해 정해질 수 있다. 대안적으로, 하나의 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 항원에서의 모든 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합을 감소 또는 제거한다면, 2개의 항체는 동일한 에피토프를 가진다. 하나의 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합을 감소 또는 제거한다면, 2개의 항체는 중복 에피토프를 가진다.
항체 사이의 경쟁은 시험 하의 항체가 통상적인 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 저해하는 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 문헌[Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990] 참조). 경쟁적 결합 분석에서 측정하여, 과량의 시험 항체(즉, 적어도 2x, 5x, 10x, 20x 또는 100x)가 적어도 50%만큼 기준 항체의 결합을 저해한다면 시험 항체는 기준 항체와 경쟁한다. 일부 시험 항체는 적어도 75%, 90% 또는 99%만큼 기준 항체의 결합을 저해한다. 경쟁 분석에 의해 확인된 항체(경쟁 항체)는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 입체 장애가 일어나도록 기준 항체에 의해 결합되는 에피토프에 충분히 근위인 인접한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
구조 트랜스타이레틴(TTR)에 대해 용어 "천연"은 적절하게 기능성인 상태로 TTR의 정상 폴딩된 구조(즉, TTR 사량체)를 지칭한다. TTR은 그의 천연으로 폴딩된 형태로 사량체이기 때문에, TTR의 비천연 형태는, 예를 들어, 미스폴딩된 TTR 사량체, TTR 단량체, TTR의 응집 형태, 및 TTR의 피브릴 형태를 포함한다. TTR의 비천연 형태는 야생형 TTR 아미노산 서열 또는 돌연변이를 포함하는 분자를 포함할 수 있다.
TTR에 대해 용어 "미스폴딩된"은 TTR 폴리펩타이드 단량체 또는 다량체의 2차 및 3차 구조를 지칭하고, 폴리펩타이드는 그의 적절하게 기능성인 상태로 해당 단백질에 대해 정상이 아닌 입체배좌를 채택한다는 것을 나타낸다. TTR 미스폴딩은 단백질의 돌연변이(예를 들어, 결실, 치환 또는 첨가)에 의해 야기될 수 있지만, 야생형 TTR 단백질은 또한 질환에서 미스폴딩되어 특정 에피토프를 노출시킬 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제가 제형의 다른 성분과 양립 가능하고, 이의 수용인에 대해 실질적으로 유해하지 않다는 것을 의미한다.
용어 "환자"는 예방적 또는 치료적 치료 중 하나를 받는 인간 및 다른 포유류 대상체를 포함한다.
위험 인자가 없는 개체보다 질환이 발생할 통계학적으로 유의한 더 큰 위험에 위험 인자를 갖는 개체를 위치시키는 적어도 하나의 공지된 위험 인자(예를 들어, 유전자, 생화학, 가족력 및 상황적 노출)를 갖는다면, 개체는 질환의 증가된 위험에 있다.
용어 "생물학적 샘플"은 생물학적 공급원, 예를 들어 인간 또는 포유류 대상체 내의 또는 이들로부터 얻을 수 있는 생물학적 물질의 샘플을 지칭한다. 이러한 샘플은 기관, 세포 소기관, 조직, 조직의 부문, 체액, 말초 혈액, 혈장, 혈액 혈청, 세포, 분자, 예컨대 단백질 및 펩타이드, 및 이들로부터 유래된 임의의 부분 또는 조합물일 수 있다. 용어 생물학적 샘플은 또한 샘플을 가공하는 것에 의해 유도된 임의의 물질을 포함할 수 있다. 유도된 물질은 세포 또는 그들의 자손을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플의 가공은 여과, 증류, 추출, 농도, 고정, 간섭 성분의 비활성화 등 중 하나 이상을 수반할 수 있다.
용어 "대조군 샘플"은 트랜스타이레틴(TTR), 예컨대 TTR 아밀로이드 침착물 중의 트랜스타이레틴(TTR)의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태를 포함하는 것으로 알려져 있지 않은 또는 의심되지 않는 생물학적 샘플을 지칭한다. 대조군 샘플은 TTR 아밀로이드증 또는 TTR 아밀로이드증의 구체적으로 선택된 유형으로 고통받지 않는 개체로부터 얻을 수 있다. 대안적으로, 대조군 샘플은 TTR 아밀로이드증 또는 TTR 아밀로이드증의 구체적으로 선택된 유형으로 고통받는 환자로부터 얻을 수 있다. 이러한 샘플은 TTR 아밀로이드증을 포함하는 것으로 생각되는 생물학적 샘플과 동시에 또는 상이한 경우에 얻을 수 있다. 생물학적 샘플과 대조군 샘플은 둘 다 동일한 조직(예를 들어, TTR 아밀로이드 침착물과 주위의 정상 조직을 둘 다 함유하는 조직 부문)으로부터 얻을 수 있다. 바람직하게는, 대조군 샘플은 본질적으로 또는 전체적으로 TTR 아밀로이드 침착물이 없는 조직으로 이루어지고, TTR 아밀로이드 침착물을 포함하는 것으로 생각되는 생물학적 샘플에 비교하여 사용될 수 있다. 바람직하게는, 대조군 샘플 내 조직은 생물학적 샘플 중의 조직(예를 들어, 심장 내 심장 근육 세포)과 동일한 유형이다.
용어 "질환"은 생리적 기능을 손상시키는 임의의 비정상적 병태를 지칭한다. 상기 용어는 병인의 특성과 관계없이 생리적 기능이 손상된 임의의 장애, 질병, 이상, 병리, 병, 병태 또는 증후군을 포함하도록 광범위하게 사용된다.
용어 "증상"은 대상체에 의해 인식되는 바와 같이 질환의 주관적 증거, 예컨대 변경된 보행을 지칭한다. "징후"는 의사에 의해 관찰되는 바와 같은 질환의 객관적 증거를 지칭한다.
아미노산 치환을 보존적 또는 비보존적으로 분류하는 목적을 위해, 아미노산은 다음과 같이 그룹화된다: 그룹 I(소수성 측쇄): met, ala, val, leu, ile; 그룹 II(중성 친수성 측쇄): asn, gln, cys, ser, thr; 그룹 III(산성 측쇄): asp, glu; 그룹 IV(염기성 측쇄): his, lys, arg; 그룹 V(쇄 배향에 영향을 미치는 잔기): gly, pro; 및 그룹 VI(방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 동일한 부류에서의 아미노산 간의 치환을 수반한다. 비보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 것의 구성원으로 교환하는 것으로 구성된다.
서열 동일성 백분율은 카바트 넘버링 관례에 의해 최대로 정렬되는 항체 서열에 의해 결정된다. 정렬 후에, 대상 항체 영역(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙 가변 영역)이 기준 항체의 동일한 영역과 비교된다면, 대상과 기준 항체 영역 사이의 서열 동일성 백분율은 대상과 기준 항체 영역 둘 다에서의 동일한 아미노산에 의해 점유되는 위치의 수를 두 영역의 정렬된 위치의 총 수로 나누고(갭은 계수화하지 않음), 100을 곱하여서 백분율로 전환한다.
하나 이상의 인용된 요소를 "포함하는(comprising)" 또는 "포함하는(including) 조성물 또는 방법은 구체적으로 인용되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체를 "포함하는(comprise)" 또는 "포함하는(include)" 조성물은 단독으로 또는 다른 성분과 조합하여 항체를 함유할 수 있다.
값의 범위의 표기는 범위 내의 또는 범위를 정하는 모든 정수, 및 범위 내의 정수에 의해 정해지는 모든 하위범위를 포함한다.
문맥으로부터 달리 명확하지 않다면, 용어 "약"은 언급된 값의 측정 오차(예를 들어, SEM)의 표준 차이 내의 값을 포함한다.
통계학적 유의도는 p≤0.05를 의미한다.
본 발명의 항체는 항체와 동일한 적응증에 대해 다른 치료와 동시에 투여될 수 있는데, 이는 항체가 투여되는 기간 동안에 적어도 1회 다른 치료가 투여된다는 것을 의미하며, 이러한 기간은 제1 투약의 1개월 전에 시작되고, 항체의 마지막 투약의 1개월 후에 종료된다. 다른 치료는 이 기간 동안 반복적 간격으로 투여될 수 있으며, 이는 항체가 투여되는 간격과 동일할 수도 있고 동일하지 않을 수도 있다. 다른 치료는 대증 치료일 수 있다.
질환의 하나 이상의 증상에만 영향을 미치고, 그의 원인, 즉, 병인이 아니라면, 치료는 대증적이다.
항목의 단수 형태는 달리 분명하게 표시되지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "적어도 1종의 화합물"은 이들의 혼합물을 포함하는 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
I. 일반
본 발명은 잔기 89 내지 97에 또는 트랜스타이레틴(TTR)의 잔기 101 내지 109에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 일부 항체는 TTR의 천연 천연 사량체 형태에 비해 TTR의 임의의 또는 모든 단량체, 미스폴딩된, 응집된 또는 피브릴 형태에 우선적으로 결합한다. 일부 항체는 TTR의 천연 사량체 형태에 비해 TTR의 단량체 또는 미스폴딩된 형태에 우선적으로 결합한다. 항체는 TTR 축적 또는 TTR 침착물의 축적과 관련된 질환 또는 장애(예를 들어, TTR 아밀로이드증)를 치료하거나 또는 예방을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 항체는 또한 용도 중에서도 TTR 아밀로이드증을 진단하고, TTR의 응집을 저해 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 항체는 또한, 특히, 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증 요법의 약력학적 효과를 입증하기 위해 사용될 수 있다. 우선적인 결합은 TTR의 천연 사량체 형태보다 TTR의 임의의 또는 모든 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태에 대해 적어도 5배 더 높은 결합 상수를 의미한다. 선택적으로, 결합 상수는 TTR의 천연 사량체 형태보다 TTR의 임의의 또는 모든 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태에 대해 적어도 10배 더 높다. 선택적으로, 항체, 예컨대 9D5 또는 18C5는, 예를 들어, TTR의 천연 사량체 형태에 대한 특이적 결합을 결여한다.
II. 표적 분자
트랜스타이레틴(TTR)은 주로 간에 의해 합성되는 127-아미노산, 55kDa 혈청 및 뇌척수액 수송 단백질이다. 이는 또한 프레알부민, 티록신 결합 프레알부민, ATTR 및 TBPA로서 지칭되었다. 그의 천연 상태에서, TTR은 사량체로서 존재한다. 동형접합체에서, 사량체는 동일한 127-아미노산 베타-시트-풍부 서브유닛을 포함한다. 이형접합체에서, TTR 사량체는 전형적으로 통계학적 방식과 조합된 변이체 및/또는 야생형 서브유닛으로 이루어진다.
혈액 중의 TTR의 확립된 작용은 홀로-레티놀 결합 단백질을 수송하는 것이다. TTR은 설치류 혈액 중의 티록신(T4)의 주요 운반체이지만, 홀로(holo)-레티놀 결합 단백질에 대해 사용되는 것과 직각인 결합 부위를 이용하여, T4 결합 부위는 인간에서 효과적으로 점유되지 않는다.
TTR은 적어도 30종의 상이한 인간 단백질 중 하나인데, 응집 구조의 범위 내로의 세포외 미스폴딩 및/또는 미스어셈블리(아밀로이드 생성)는 아밀로이드 질환으로서 지칭되는 퇴행성 질환을 야기하는 것으로 생각된다. TTR은 아밀로이드가 생성되도록 입체배좌 변화를 겪는다. TTR 사량체 및 부분적 비폴딩의 해리는 궁극적으로 교차-베타 시트 아밀로이드 구조로의 입체배좌 전환을 겪는 대체로 비구조화된 구체 응집물로 효율적으로 미스어셈블링된 연장된 입체배좌에서 대부분 비변화된 소수성 잔기의 신장을 노출시킨다.
문맥에서 달리 명확하지 않다면, 트랜스타이레틴(TTR) 또는 그의 단편 또는 도메인에 대한 언급은 동형단백질, 돌연변이체(예를 들어, E89K 및 E89Q) 및 대립형질 변이체를 포함하는 천연 인간 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 TTR 폴리펩타이드 서열은 등록 번호 P02766.1(유니프롯)(서열번호 26), AAB35639.1(젠뱅크)(서열번호 27), AAB35640.1(젠뱅크)(서열번호 28) 및 ABI63351.1(젠뱅크)(서열번호 29)로 표기된다. 잔기는 스위스 프롯(Swiss Prot) P02766.1에 따라 넘버링되며, 성숙 단백질의 제1 아미노산(즉, 20개의 아미노산 신호 서열을 포함하지 않음)은 잔기 1로 표기된다. 임의의 다른 TTR 단백질에서, 잔기는 최대 정렬에 대해 P02766.1에서 대응하는 잔기에 따라 넘버링된다.
III. 트랜스타이레틴 아밀로이드증
트랜스타이레틴(TTR) 아밀로이드증은 병원성, 미스폴딩된 TTR 및 TTR로 구성된 아밀로이드 피브릴의 세포외 침착을 특징으로 하는 전신 장애이다. TTR 아밀로이드증은 일반적으로 (환경적 또는 유전적 병태에 기인하여) 천연 TTR 사량체의 탈안정화에 이해 야기되어, 다양한 기관 및 조직에서 축적되는 아밀로이드 피브릴로의 TTR의 해리, 미스폴딩 및 응집을 유발하여, 진행성 기능장애를 야기한다. 예를 들어, 문헌[Almeida and Saraiva, FEBS Letters 586:2891-2896 (2012); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013)] 참조.
인간에서, 돌연변이체 및 야생형 서브유닛을 포함하는 야생형 TTR 사량체와 혼합된 사량체는 둘 다 해리, 미스폴딩 및 응집되어서, 아밀로이드 생성 과정은 영향받은 조직의 퇴행을 야기할 수 있다. 따라서, TTR 아밀로이드증은 TTR에서의 돌연변이로부터 초래되거나 또는 비돌연변이, 미스폴딩된 TTR로부터 초래되는 병원성 미스폴딩 TTR에 의해 야기되는 질환을 포함한다.
예를 들어, 야생형 ATTR 아밀로이드증(노인성 전신 아밀로이드증 또는 SSA로도 불림) 및 노인성 심장 아밀로이드증(SCA)은 심장의 심장 근육 세포 외에서 그리고 내에서 야생형 TTR 아밀로이드의 분해로부터 초래되는 노화관련 아밀로이드증이다. TTR 아밀로이드증은 또한 TTR 단백질을 탈안정화시키는 돌연변이에 이해 야기되는 유전적(가족성) 아밀로이드증의 가장 통상적인 형태이다. TTR 유전자에서 점 돌연변이와 관련된 TTR 아밀로이드증은 가족성 아밀로이드성 다발신경병증(FAP), 가족성 아밀로이드 심근증(FAC), 및 희귀 중추 신경계 선택적 아밀로이드증(CNSA)을 포함한다. 유전적(가족성) TTR 아밀로이드증을 지니는 환자는 거의 항상 이형접합체인데, 이는 TTR 사량체가 일반적으로 통계학적으로 분포되는 돌연변이체 및/또는 야생형 TTR 서브유닛으로 구성된다는 것을 의미한다. TTR 아밀로이드증의 유전적(가족성) 형태는 일반적으로 상염색체 우세이며, 전형적으로 산발적 질환(SSA 및 SCA)보다 더 조기에 개시된다.
상염색체 우세 장애 FAP 및 FAC에 연루된 TTR을 암호화하는 유전자에서 100개 초과의 돌연변이가 있다. 예를 들어, 미국 특허 제2014/0056904호; 문헌[Saraiva, Hum. Mutat . 17(6):493-503 (2001); Damas and Saraiva, J. Struct. Biol . 130:290-299; Dwulet and Benson, Biochem . Biophys . Res. Commun . 114:657-662 (1983)] 참조. 이들 아밀로이드-유발 돌연변이는 TTR의 전체 분자 전체적으로 분포된다. 일반적으로, 돌연변이체 서브유닛을 더욱 탈안정화시키는 것은 TTR 사량체 구조에 대해서이며, 아밀로이드 질환의 더 빠르게 개시한다. TTR 변이체의 병원성 가능성은 일반적으로 그의 불안정성과 그의 세포 분비 효율의 조합에 의해 결정된다. 일부 TTR 변이체에 의해 야기되는 초기 병리는 심장 조직의 그들의 선택적 파괴로부터 초래되는 반면, 다른 TTR 변이체로부터의 병리는 말초 및 자율신경계의 손상으로부터 유래된다. 세포외 아밀로이드의 축적은 TTR 아밀로이드증의 후기 단계에서 기관 구조에 기여하고, 거의 분명히 손상시킬 수 있지만, TTR 아밀로이드 생성에 의해 야기되는 조직 손상은 대부분 작은 확산성 TTR 응집물의 독성으로부터 기인하는 것으로 나타난다. 예시적인 TTR 돌연변이는 V30M, Y114C, G47R, S50I, E61L, T49S, F33V, A45T, E89K, E89Q 및 V122I를 포함한다.
TTR 아밀로이드증은 개체 및 지리학적 위치에 따라 상당한 표현형 변이와 함께 다수의 상이한 형태로 존재한다. 예를 들어, TTR 아밀로이드증은 진행성, 신경돌기 감각 자율신경 및 운동신경병증으로서 존재할 수 있다. TTR 아밀로이드증은 또한 침윤성 심근병증으로서 존재할 수 있다.
질환-관련 증상의 개시 시 연령은 생애의 20년 내지 90년 사이에서 변하며, 상이한 집단에 걸쳐 큰 변화가 있다. TTR 아밀로이드증의 다중시스템 연루는 그의 진단에 대한 단서이다. 예를 들어, TTR 아밀로이드증 진단은 다음 중 하나 또는 몇몇이 존재할 때 고려된다: (1) 특히 심부전과 관련된 신경병 질환의 가족력; (2) 알려지지 않은 병인의 신경병 통증 또는 진행성 감각 장애; (3) 분명한 원인이 없는 손목 터널 증후군(특히 그것이 양쪽성이며 수술적 복구를 필요로 한다면); (4) 알려지지 않은 병인의 위장 운동성 장애 또는 자율성 신경 기능장애(예를 들어, 발기성 기능장애, 기립성 저혈압, 신경인성 방광); (5) 고혈압 없이 두꺼워진 심실벽을 특징으로 하는 심장 질환; (6) 특히 두꺼워진 심장을 수반할 때 알려지지 않은 유래의 진행된 방실계 차단; 및 (6) 솜털 유형의 유리체 포함. 문헌[Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013)] 참조. 다른 증상은, 예를 들어, 말초신경병증, 감각소실, 통증, 다리의 약화, 발한 이상증, 설사, 변비, 체중 감소 및 요실금/정체를 포함할 수 있다.
TTR 아밀로이드증의 진단은 전형적으로 표적 기관 생검, 다음에 아밀로이드-특이적 염료, 콩고 레드(Congo red)에 의한 절단 조직의 조직학적 염색에 의존한다. 아밀로이드에 대한 양성 검사가 관찰된다면, 아밀로이드 형성을 초래하는 전구체 단백질이 사실 TTR이라는 것을 보장하기 위해 TTR에 대한 면역조직학적 염색 및 질량 분광학적 확인이 후속적으로 수행된다. 본 명세서에 개시된 항체는 1차 전신 아밀로이드증으로도 알려진 비-TTR 아밀로이드증, 예를 들어, 아밀로이드 경쇄(AL) 아밀로이드증과 TTR 아밀로이드증을 구별하는 데 유용하다. 질환의 가족성 형태에 대해, 이어서, 진단이 이루어질 수 있기 전에 TTR을 암호화하는 유전자에서 돌연변이의 입증이 필요하다. 이는, 예를 들어, 등전점 전기영동, 중합효소 연쇄 반응, 또는 레이저 절개/액체 크로마토그래피-이중질량분석법을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제2014/0056904호; 문헌[Ruberg and Berk, Circulation 126:1286-1300 (2012); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013)] 참조.
IV. 항체
A. 결합 특이성 및 기능성 특성
본 발명은 트랜스타이레틴(TTR) 단백질에 대해, 더 구체적으로는, TTR의 아미노산 잔기 89 내지 97(서열번호 45) 내의 에피토프에 또는 아미노산 잔기 101 내지 109(서열번호 30) 내의 에피토프에 결합하는 단클론성 항체를 제공한다. 이러한 에피토프는 천연 TTR 사량체에 묻혀 있으며, TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태로 노출된다.
이러한 항체는 9D5, 18C5, 및 이들의 키메라, 베니어(veneered) 및 인간화된 형태를 포함한다. 9D5는 TTR의 아미노산 잔기 89 내지 97(서열번호 45) 내에서 특이적으로 결합한다. 18C5는 TTR의 아미노산 잔기 101 내지 109(서열번호 30) 내에서 특이적으로 결합한다. 이들 항체는 추가로 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태에 대해 결합하지만, TTR의 천연 사량체 형태에 대해서는 결합하지 않는 그들의 능력을 특징으로 한다. 특정 단백질 또는 이들의 단편에 결합하는 능력은 실시예에 제공되는 예시적인 분석 형식을 이용하여 입증될 수 있다. 문맥으로부터 달리 분명하지 않다면, 9D5 또는 18C5에 대한 언급은 마우스, 키메라, 베니어 또는 인간화된 형태 중 어느 것을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 단클론성 항체 9D5를 생성하는 혼성 세포주는 2017년 4월 4일자로 버지니아주 매너서스에 소재된 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection: ATCC)에 특허 기탁증과 함께 기탁되고, 특허 기탁 번호 PTA-124078가 부여되었다. 단클론성 항체 18C5를 생성하는 혼성 세포주는 2017년 10월 31일자로 버지니아주 20110-2209 매너서스에 소재된 미국 미생물 보존센터(ATCC)의 특허 기탁증과 함께 기탁되었고, 특허 기탁 번호 PTA-124570가 부여되었다.
일부 항체는 9D5로 표기된 항체와 동일하거나 또는 중복되는 에피토프에 결합한다. 9D5의 중쇄 및 경쇄 성숙 가변 영역의 서열은 각각 서열번호 81 및 82로 표기된다. 이러한 결합 특이성을 갖는 다른 항체는 TTR, 또는 목적으로 하는 에피토프를 포함하는 이의 일부(예를 들어, 서열번호 45)를 이용하여 마우스를 면역화함으로써, 그리고 선택적으로 마우스 18C5의 가변 영역(IgG1, 카파)을 갖는 항체와 경쟁하여, 얻어진 항체를 단량체 TTR 또는 서열번호 45를 포함하는 펩타이드에 대한 결합을 위해 선별함으로써 생성될 수 있다. 목적하는 에피토프를 포함하는 TTR의 단편은 단편에 대한 항체의 반응을 유발하게 하는 운반체에 연결될 수 있고/있거나 이러한 반응을 유발하게 하는 애주번트와 조합될 수 있다. 이러한 항체는 구체화된 잔기의 돌연변이체에 비해 TTR 또는 이의 단편(예를 들어, 서열번호 26)의 야생형, 단량체 형태에 대한 차별적인 결합을 위해 선별될 수 있다.
일부 항체는 18C5로 표기되는 항체와 동일하거나 중복되는 에피토프에 결합된다. 18C5의 중쇄 및 경쇄 성숙 가변 영역 서열은 각각 서열번호 1 및 3으로 표기된다. 이러한 결합 특이성을 갖는 다른 항체는 목적하는 에피토프(예를 들어, 서열번호 30)를 포함하는 TTR 또는 이의 일부를 갖는 마우스를 면역화시키고, 선택적으로 마우스 18C5의 가변 영역(IgG1, 카파)을 갖는 항체와 경쟁하는, 서열번호 30을 포함하는 단량체 TTR 또는 펩타이드에 대해 얻어진 항체를 선별함으로써 생성될 수 있다. 목적으로 하는 에피토프를 포함하는 TTR의 단편은 단편에 대해 항체 반응을 유발하게 하는 담체에 연결될 수 있고/있거나 이러한 반응을 유발하게 하는 애주번트와 조합될 수 있다. 이러한 항체는 구체화된 잔기의 돌연변이체에 비해 TTR 또는 이의 단편(예를 들어, 서열번호 26)의 야생형, 단량체 형태에 대한 차별적인 결합을 위해 선별될 수 있다. 이러한 돌연변이체에 대한 선별은 더 정확하게는 결합이 특정 잔기의 돌연변이유발에 의해 저해되고, 다른 예시된 항체의 기능적 특성을 공유할 가능성이 있는 항체의 확인을 가능하게 하는 결합 특이성을 정한다. 돌연변이는 표적 전체적으로 또는 에피토프가 존재하는 것으로 알려진 부문 전체적으로 한 번에 또는 더 크게 떨어진 간격으로 알라닌(또는 알라닌이 이미 존재한다면 세린 또는 글리신)의 하나의 잔기로의 전체적인 대체적 치환일 수 있다. 돌연변이의 동일한 세트가 두 항체의 결합을 상당히 감소시킨다면, 두 항체는 동일한 에피토프에 결합한다.
선택된 뮤린 항체(예를 들어, 9D5 또는 18C5)의 결합 특이성을 갖는 항체는 또한 파지 디스플레이 방법의 변이체를 이용하여 생성될 수 있다. 윈터(Winter)의 WO 92/20791 참조. 이 방법은 인간 항체를 생성하는 데 특히 적합하다. 이 방법에서, 선택된 뮤린 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 중 하나는 출발 물질로서 사용된다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역이 출발 물질로서 선택된다면, 구성원이 동일한 경쇄 가변 영역(즉, 뮤린 출발 물질) 및 상이한 중쇄 가변 영역을 나타내는 파지 디스플레이가 구성된다. 중쇄 가변 영역은, 예를 들어, 재배열된 인간 중쇄 가변 영역의 라이브러리로부터 얻어질 수 있다. 단량체 TTR 또는 이의 단편(예를 들어, 아미노산 잔기 89 내지 97 또는 아미노산 잔기 101 내지 109)에 대해 강한 특이적 결합(예를 들어, 적어도 108 및 바람직하게는 적어도 109M- 1)을 나타내는 파지가 선택된다. 이어서, 이 파지로부터의 중쇄 가변 영역은 추가적인 파지 라이브러리를 구성하기 위한 출발 물질로서 작용한다. 이 라이브러리에서, 각각의 파지는 동일한 중쇄 가변 영역(즉, 제1 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리된 영역) 및 상이한 경쇄 가변 영역을 나타낸다. 경쇄 가변 영역은, 예를 들어 재배열된 인간 가변 경쇄 영역의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 또한, 단량체 TTR 또는 이의 단편(예를 들어, 아미노산 잔기 89 내지 97 또는 아미노산 잔기 101 내지 109)에 대해 강한 특이적 결합을 나타내는 파지가 선택된다. 얻어진 항체는 보통 뮤린 출발 물질과 동일 또는 유사한 에피토프 특이성을 가진다.
다른 항체는 예시적인 항체 항체, 예컨대 9D5 또는 18C5의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA의 돌연변이유발에 의해 얻을 수 있다. 성숙 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 내 9D5 또는 18C5에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하고, 그의 기능적 특성을 유지하고/하거나 소수의 기능적으로 중요하지 않은 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 치환), 결실 또는 삽입에 의해 각각의 항체와 다른 단클론성 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 9D5 또는 18C5의 대응하는 CDR에 대해 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 통상적인 정의(그러나 바람직하게는 카바트)에 의해 정해지는 적어도 하나 또는 모두 6개의 CDR(들)을 갖는 단클론성 항체가 또한 포함된다.
본 발명은 또한 9D5 또는 18C5로부터 전체적으로 또는 실질적으로 일부 또는 모든(예를 들어, 3, 4, 5 및 6개의) CDR을 갖는 항체를 제공한다. 이러한 항체는 9D5 또는 18C5의 중쇄 가변 영역으로부터 전체적으로 또는 실질적으로 적어도 2, 보통은 모두 3개의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 9D5 또는 18C5의 경쇄 가변 영역으로부터 전체적으로 또는 실질적으로 적어도 2, 보통은 모두 3개의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체는 중쇄와 경쇄를 둘 다 포함할 수 있다. CDR은, CDR-H2(카바트에 의해 정해질 때)가 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 치환, 삽입 또는 결실을 가질 수 있다는 것을 제외하고, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 치환, 삽입 또는 결실을 함유할 때, 대응하는 9D5 또는 18C5 CDR로부터 실질적으로 유래된다. 이러한 항체는 성숙 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 내 9D5 또는 18C5에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가질 수 있고, 그들의 기능적 특성을 유지하고/하거나 소수의 기능적으로 중요하지 않은 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 치환), 결실 또는 삽입에 의해 9D5 또는 18C5와 다르다.
9D5의 중쇄의 카바트 CDR(CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)는 각각 서열번호 75, 76 및 77로 표기되고, 9D5의 경쇄의 카바트 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)은 각각 서열번호 78, 79 및 80으로 표기된다.
18C5의 중쇄의 카바트/코티아 복합 CDR(CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)은 각각 서열번호 서열번호 5, 7 및 9로 표기되고, 18C5의 경쇄의 카바트/코티아 복합 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)은 각각 서열번호 11, 13 및 15로 표기된다.
표 2는 카바트, 코티아, 코티아와 카바트의 복합(본 명세서에서 "카바트/코티아 복합"으로도 지칭됨), AbM, 및 접촉에 의해 정해지는 18C5 CDR을 나타낸다.
Figure pct00001
이러한 분석에 의해 동정되는 일부 항체는 실시예 또는 다른 것에 기재하는 바와 같이, TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태에 결합할 수 있지만, TTR의 천연 사량체 형태에 결합되지 않는다. 마찬가지로, 일부 항체는 TTR-매개 아밀로이드증 조직에 대해 면역반응성이지만, 건강한 조직에 대해서는 그렇지 않다.
일부 항체는 동물 모델 또는 임상 시험에서 TTR의 응집을 저해 또는 감소시킬 수 있거나, TTR 피브릴 형성을 저해 또는 감소시킬 수 있거나, TTR 침착 또는 응집된 TTR을 감소시키거나 또는 클리어런스하거나, 또는 TTR의 비독성 입체배좌를 안정화시킨다. 일부 항체는 동물 모델 또는 임상 시험에서 나타낸 바와 같이 TTR 아밀로이드증을 치료하거나, 예방을 달성하거나 또는 개시를 지연시킬 수 있다. TTR 아밀로이드증에 대한 활성을 시험하기 위한 예시적인 동물 모델은 문헌[Kohno et al., Am. J. Path. 150(4):1497-1508 (1997); Teng et al., Laboratory Investigations 81:385-396 (2001); Wakasugi et al., Proc . Japan Acad. 63B:344-347 (1987); Shimada et al., Mol . Biol . Med . 6:333-343 (1989); Nagata et al., J. Biochem . 117:169-175 (1995); Sousa et al., Am. J. Path. 161:1935-1948 (2002); 및 Santos et al., Neurobiology of Aging 31:280-289 (2010)]에 기재된 것을 포함한다.
키메라 및 인간화된 형태를 포함하는 항-TTR 항체는 병용 요법에서, 이중특이성 항체에서, TTR 관련 장애의 진단 및/또는 치료 방법에서 그리고 TTR을 검출하는 방법에서 유용하다. 이러한 항-TTR 항체는 이하의 표 3에서와 같이 항체를 포함할 수 있다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
B. 비인간 항체
단량체 TTR 또는 이의 단편(예를 들어, 아미노산 잔기 89 내지 97 또는 아미노산 101 내지 109)에 대한 다른 비인간 항체의 생성, 예를 들어, 뮤린, 기니픽, 영장류, 토끼 또는 래트는, 예를 들어, TTR 또는 이의 단편을 이용하여 동물을 면역화함으로써 달성될 수 있다. 문헌[Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988)] 참조(모든 목적을 위해 참고로 포함됨). 이러한 면역원은 천연 공급원으로부터, 펩타이드 합성에 의해 또는 재조합 발현에 의해 얻을 수 있다. 선택적으로, 운반체 단백질과 융합 또는 달리 복합체화된 면역원이 투여될 수 있다. 선택적으로, 면역원은 애주번트와 함께 투여될 수 있다. 몇몇 유형의 애주번트는 이하에 기재되는 바와 같이 사용될 수 있다. 완전 프로인트 애주번트 다음에 불완전 애주번트는 실험실 동물의 면역화를 위해 바람직하다. 토끼 또는 기니픽은 전형적으로 다클론성 항체를 제조하기 위해 사용된다. 마우스는 전형적으로 단클론성 항체를 제조하기 위해 사용된다. 항체는 단량체 TTR 또는 TTR 내의 에피토프(예를 들어, 아미노산 잔기 89 내지 97 또는 아미노산 101 내지 109 중 하나 이상을 포함하는 에피토프)에 대한 특이적 결합을 위해 선별된다. 이러한 선별은 아미노산 잔기 89 내지 97, 아미노산 101 내지 109 또는 이들 잔기 내에서 돌연변이를 함유하는 단량체 TTR 변이체, 예컨대 TTR 변이체의 수집물에 대한 항체의 결합을 결정하고, TTR 변이체가 항체에 결합하는 것을 결정함으로써 달성될 수 있다. 결합은, 예를 들어, 웨스턴 블롯, FACS 또는 ELISA에 의해 평가될 수 있다.
C. 인간화 항체
인간화 항체는 비인간 "공여자(donor)" 항체로부터의 CDR이 인간 "수용자" 항체 서열에 접합된 유전자 조작된 항체이다(예를 들어, 퀸(Queen)의 미국 특허 제5,530,101호 및 제5,585,089호; 윈터(Winter)의 미국 특허 제5,225,539호; 카터(Carter)의 미국 특허 제6,407,213호; 아다이르(Adair)의 미국 특허 제5,859,205호; 및 푸트(Foote)의 미국 특허 제 6,881,557호 참조). 수용자 항체 서열은, 예를 들어, 성숙 인간 항체 서열, 이러한 서열의 복합체, 인간 항체 서열의 공통 서열 또는 생식계열 서열일 수 있다. 따라서, 인간화 항체는 공여자 항체 및 가변 영역 프레임워크 서열 및 불변 영역으로부터 전체적으로 또는 실질적으로, 존재한다면 인간 항체 서열로부터 전체적으로 또는 실질적으로 적어도 3, 4, 5 또는 모든 CDR을 갖는 항체이다. 유사하게, 인간화된 중쇄는 공여자 항체 중쇄, 및 중쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 중쇄 불변 영역으로부터 전체적으로 또는 실질적으로, 존재한다면, 인간 중쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터 실질적으로 적어도 1, 2 및 보통으로는 모두 3개의 CDR을 가진다. 유사하게, 인간화된 경쇄는 공여자 항체 경쇄, 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 경쇄 불변 영역으로부터 전체적으로 또는 실질적으로, 존재한다면, 인간 경쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터 실질적으로 적어도 1, 2 및 보통으로는 모두 3개의 CDR을 가진다. 나노바디 및 dAb 이외에, 인간화 항체는 인간화된 중쇄 및 인간화된 경쇄를 포함한다. 인간화 항체 내 CDR은 대응하는 잔기의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%(임의의 통상적인 정의에 의해 정하지만, 바람직하게는 카바트에 의해 정함)가 각각의 CDR 사이에서 동일할 때, 비인간 항체 내 대응하는 CDR로부터 실질적으로 유래된다. 항체 쇄의 가변 영역 프레임워크 서열 또는 항체 쇄의 불변 영역은 임의의 통상적인 정의에 의해 정해지는(그러나 바람직하게는 카바트에 의해 정해지는) 대응하는 잔기의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%가 동일할 때 인간 가변 영역 프레임워크 서열 또는 인간 불변 영역으로부터 각각 실질적으로 유래된다. 인간화된 항체의 문헌[2014 World Health Organization (WHO) International nonproprietary names (INN)] 정의 하에서 인간화된 것으로 분류하기 위해, 항체는 인간 생식계열 항체 서열에 대해(즉, 체세포 초돌연변이 전에) 성숙 가변 영역에서 적어도 85% 동일성을 가져야 한다. 혼합된 항체는 하나의 항체 쇄(예를 들어, 중쇄)가 역치를 충족시키지만 다른 쇄(예를 들어, 경쇄)는 역치를 충족시키지 않는 항체이다. 쇄 둘 다에 대한 가변 프레임워크 영역이 실질적으로 일부 뮤린 역돌연변이를 갖는 인간이라고 해도, 쇄 중 어떤 것도 역치를 충족시키지 않는다면, 항체는 키메라로서 분류된다. 문헌[Jones et al. (2016) The INNs and outs of antibody nonproprietary names, mAbs8:1, 1-9, DOI: 10.1080/19420862.2015.1114320]. 또한 문헌["WHO-INN: International nonproprietary names (INN) for biological and biotechnological substances (a review)" (Internet) 2014] 참조. 본 명세서에 참고로 포함된 http://www. who.int/medicines/services/inn/BioRev2014.pdf로부터 이용 가능. 의심을 피하기 위해, 본 명세서에서 사용되는 용어 "인간화된"은 인간화된 항체의 2014 WHO INN 정의로 제하되는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에 제공된 인간화된 항체의 일부는 성숙 가변 영역 중 하나 둘 다에서 인간 생식계열 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 가지고, 본 명세서에 제공된 인간화된 항체의 일부는 성숙 가변 영역 중 하나 또는 둘 다에서 인간 생식계열 서열에 대해 85% 미만의 서열 동일성을 가진다. 본 명세서에 제공된 인간화된 항체의 성숙 중쇄 가변 영역의 일부는 인간 생식계열 서열에 대해 약 60% 내지 100%, 예를 들어, 약 60% 내지 69%, 70% 내지 79%, 80% 내지 84%, 또는 85% 내지 89%의 범위에서 의 서열 동일성을 가진다. 성숙 중쇄 가변 영역 중쇄의 일부는 2014 WHO INN 정의 미만으로 떨어지며, 예를 들어, 인간 생식계열 서열에 대해 약 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 또는 82%, 83%, 또는 84% 서열 동일성을 갖는 반면, 다른 성숙 중쇄 가변 영역은 2014 WHO INN 정의를 충족시키고, 인간 생식계열 서열에 대해 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 이상의 서열 동일성을 가진다. 본 명세서에 제공된 인간화된 항체의 성숙 경쇄 가변 영역의 일부는 인간 생식계열 서열에 대해 약 60% 내지 100%, 예를 들어, 약 80% 내지 84% 또는 85% 내지 89% 범위에서 서열 동일성을 가진다. 성숙 경쇄 가변 영역의 일부는 2014 WHO INN 정의 정의 미만으로 떨어지며, 예를 들어, 인간 생식계열 서열에 대해 약 81%, 82%, 83% 또는 84%의 서열 동일성을 갖는 한편, 다른 성숙 경쇄 가변 영역은 2014 WHO INN 정의를 충족시키고 인간 생식계열 서열에 대해 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 이상의 서열 동일성을 가진다. 2014 WHO INN 정의 하에서 "키메라"인 본 명세서에 제공된 일부 인간화된 항체는 인간 생식계열 서열에 대해 85% 미만의 동일성을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역과 짝지어진 인간 생식계열 서열에 대해 85% 미만의 동일성을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역을 가진다. 예를 들어, 인간 생식계열 서열에 대해 85% 미만의 서열 동일성을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역과 짝지어진 인간 생식계열 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역을 갖거나, 또는 그 반대인, 본 명세서에 제공된 일반 인간화된 항체는 2014 WHO INN 정의 하에서 "혼합된다". 본 명세서에 제공된 일부 인간화된 항체는 "인간화된"의 2014 WHO INN 정의를 충족시키고 인간 생식계열 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역과 짝지어진 인간 생식계열 서열에 대해 85% 미만의 동일성을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역을 가진다. "인간화된"의 2014 WHO INN 정의를 충족시키는 예시적인 18C5 항체는 서열번호 91 또는 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역과 짝지어진 서열번호 85 또는 서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다.
인간화 항체는 종종 마우스 항체로부터 모두 6개의 CDR(바람직하게는 카바트에 의해 정해짐)을 편입하지만, 그들은 또한 마우스 항체로부터 모든 CDR 미만으로(예를 들어, 적어도 3, 4 또는 5개의 CDR) 이루어질 수 있다(예를 들어, 문헌[Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., J. of Mol . Biol., 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol . Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, J. Immunol., 164:1432-1441, 2000] 참조).
일부 항체에서, CDR의 단지 일부, 즉, SDR로 칭해지는 결합에 필요한 CDR 잔기의 서브세트가 인간화 항체에서 결합을 보유하는 데 필요하다. 항원과 접촉하지 않고 SDR과 접촉하지 않는 CDR 잔기는 분자 모델링에 의해 그리고/또는 경험적으로, 또는 문헌[Gonzales et al., Mol . Immunol. 41: 863, 2004]에 기재된 바와 같이 코티아 초가변 루프 밖에 놓인 카바트 CDR의 영역으로부터 이전의 연구(예를 들어, CDR H2 내 잔기 H60 내지 H65는 종종 필요하지 않음)에 기반하여 확인될 수 있다(Chothia, J. Mol . Biol. 196:901, 1987). 하나 이상의 공여자 CDR 잔기가 없거나 또는 전체 공여자 CDR이 생략되는 위치에서의 이러한 인간화 항체에서, 위치를 점유하는 아미노산은 수용자 항체 서열에서 대응하는 위치(카바트 넘버링에 의함)를 점유하는 아미노산일 수 있다. 포함되는 CDR 내 공여자 아미노산에 대한 수용자의 이러한 치환의 수는 경쟁적 사항의 균형을 반영한다. 이러한 치환은 인간화 항체 내 마우스 아미노산의 수를 감소시키고, 결과적으로 잠재적 면역원성을 감소시킴에 있어서 잠재적으로 유리하다. 그러나, 치환은 또한 친화도의 변화를 야기할 수 있고, 친화도의 상당한 감소는 바람직하게는 회피된다. 치환을 위한 CDR 및 아미노산 내의 치환에 대한 위치는 또한 경험적으로 선택될 수 있다.
인간 수용자 항체 서열은 선택적으로 인간 수용자 서열 가변 영역 프레임워크와 공여자 항체 쇄의 대응하는 가변 영역 프레임워크 사이의 높은 정도의 서열 동일성(예를 들어, 65 내지 85% 동일성)을 제공하기 위해 다수의 공지된 인간 항체 서열 중에서 선택될 수 있다.
18C5 중쇄에 대한 수용자 서열의 예는 PDB 수탁 코드가 5VZY(서열번호 83)인 인간화된 크레네주맙 Fab(CreneFab) VH이다. 18C5 경쇄에 대한 수용자 서열의 예는 PDB 수탁 번호가 5VZY(서열번호 89)인 인간화된 크레네주맙 Fab(CreneFab) VL이다. 18C5 경쇄에 대한 수용자 서열의 다른 예는 인간 생식계열 유전자 IGKV2-30*02(서열번호 90)이다.
쇄(경쇄 또는 중쇄)에 대해 하나 초과의 인간 수용자 항체 서열이 선택된다면, 당 수용자의 복합체 또는 혼성체가 해당 쇄에 대해 사용되며, 상이하게 사용되는 아미노산은 사용되는 임의의 인간 수용자 항체 서열로부터 취해질 수 있다.
인간 가변 영역 프레임워크 잔기로부터의 특정 아미노산은 CDR 입체배좌 및/또는 항원에 대한 결합에 대한 그들의 가능한 영향에 기반하여 치환을 위해 선택될 수 있다. 이러한 가능한 영향의 연구는 특정 위치에서 아미노산의 특징의 시험, 또는 특정 아미노산의 치환 또는 돌연변이유발 효과의 경험적 관찰을 모델링하는 것에 의한다.
예를 들어, 아미노산이 뮤린 가변 영역 프레임워크 잔기와 선택된 인간 가변 영역 프레임워크 잔기 사이에서 다를 때, 인간 프레임워크 아미노산은 그것이 아미노산에 대해 합리적으로 예상될 때에 마우스 항체와 동등한 프레임워크 아미노산에 의해 치환될 수 있다:
(1) 비공유적으로 항원에 직접 결합함;
(2) 코티아(그러나 카바트는 아님)에 의해 나타내는 바와 같은 CDR 영역에 인접하거나 또는 CDR 내임;
(3) CDR 영역(예를 들어, CDR 영역의 약 6Å 내임)과 달리 상호작용함, (예를 들어, 상동성의 알려진 면역글로불린 쇄의 풀어진 구조에 대해 경쇄 또는 중쇄를 모델링하는 것에 의해 동정됨); 또는
(4) VL-VH 계면에 참여하는 잔기임.
본 발명은 2가지의 예시된 인간화된 중쇄 성숙 가변 영역(hu18C5-VH_v1(서열번호 85), 및 hu18C5-VH_v2(서열번호 86)), 및 2가지의 예시된 인간화된 경쇄 성숙 가변 영역(hu18C5-VL_v1(서열번호 91) 및 hu18C5-VL_v2(서열번호 92))을 포함하는 뮤린 18C5 항체의 인간화된 형태를 제공한다.
실시형태에서, 퀵체인지(QuikChange) 부위-지정 돌연변이유발을 이용하여 다중 돌연변이의 도입, 결실 및 삽입을 허용하는 2단계 PCR 프로토콜을 이용하여 인간화된 서열이 생성된다[Wang, W. and Malcolm, B.A. (1999) BioTechniques 26:680-682)].
퀸의 미국 특허 제5,530,101호에 의해 정의되는 바와 같은 부류 (1) 내지 (3)으로부터의 프레임워크 잔기는 때때로 정규 및 버니어(vernier) 잔기로서 대안적으로 지칭된다. CDR 루프의 입체배좌를 정하게 하는 프레임워크 잔기는 때때로 정규 잔기로서 지칭된다(Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Thornton & Martin, J. Mol . Biol. 263:800-815 (1996)). 항원-결합 루프 입체배좌를 지지하고, 항원에 대한 항체의 맞춤을 미세하게 조율하는 역할을 하는 프레임워크 잔기는 때때로 베니어 잔기로서 지칭된다(Foote & Winter, J. Mol . Biol 224:487-499 (1992)).
치환을 위한 후보인 다른 프레임워크 잔기는 잠재적 글리코실화 부위를 생성하는 잔기이다. 치환을 위한 또 다른 후보는 해당 위치에서 인간 면역글로불린에 대해 보통인 수용자 인간 프레임워크 아미노산이다. 이들 아미노산은 마우스 공여자 항체의 동등한 위치로부터 또는 더 전형적인 인간 면역글로불린의 동등한 위치로부터 아미노산으로 치환될 수 있다.
치환에 대한 후보인 다른 프레임워크 잔기는 글루타민(Q)로 대체될 수 있는 N-말단의 글루탐산 잔기(E)이다.
예시적인 인간화 항체는 Hu18C5로 표기되는 마우스 18C5 항체의 인간화된 형태이다.
마우스 항체 18C5는 서열번호 81 및 서열번호 87을 각각 포함하는 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 본 발명은 2개의 예시된 인간화된 성숙 중쇄 가변 영역을 제공한다: hu18C5-VH_v1 및 hu18C5-VH_v2. 본 발명은 추가로 2개의 예시화된 인간 성숙 경쇄 가변 영역을 제공한다: hu18C5-VL_v1 및 hu18C5-VL_v2. 경쇄 가변 영역(표 8 및 도 12) 및 중쇄 가변 영역(표 9 및 도 11)에 대해 뮤린 18C5 및 다양한 인간화 항체의 정렬을 나타낸다.
CDR 입체배좌 및/또는 항원에 대한 결합에 대한 가능한 영향과 같은 이유로, 중쇄와 경쇄 사이의 상호작용의 매개, 불변 영역과의 상호작용, 목적으로 하는 또는 목적으로 하지 않는 번역 후 변형을 위한 부위가 되는 것, 인간 가변 영역 서열에서 그의 위치를 위한 보통이 아닌 잔기가 되는 것 및 따라서 잠재적으로 면역원성인, 응집 퍼텐셜을 얻는 것, 및 다른 이유로 18C5의 다음의 8개의 가변 영역 프레임워크 위치를 실시예 7에서 추가로 구체화하는 바와 같이 2개의 예시된 인간 성숙 경쇄 가변 영역 및 2개의 예시된 인간 성숙 중쇄 가변 영역에서 치환을 위한 후보로서 고려하였다: L2 (I2V), L45 (Q45R), H37 (V37A), H45 (L45Q), H47 (L47W), H48 (V48I), H49 (A49G) 및 H94(S94R).
여기서, 다른 곳에서와 같이, 처음 언급된 잔기는 인간 수용자 프레임워크 내로 CDR-H1의 경우에 카바트 CDR 또는 복합 코티아-카바트 CDR을 접합함으로써 형성된 인간화 항체의 잔기이며, 두번째로 언급된 잔기는 이러한 잔기를 대체하기 위한 것으로 고려된다. 따라서, 가변 영역 프레임워크 내에서, 처음 언급된 잔기는 인간이고, CDR 내에서, 처음 언급된 잔기는 마우스이다.
예시된 항체는 18C5, 예를 들어, hu18C5VH_v1/hu18C5VL_v1, hu18C5VH_v1/ hu18C5VL_v2, hu18C5VH_v2/ hu18C5VL_v1, 또는 hu18C5VH_v2/ hu18C5VL_v2의 예시된 성숙 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 임의의 순열 또는 조합을 포함한다.
본 발명은 인간화된 성숙 중쇄 가변 영역이 hu18C5-VH_v1 및 hu18C5-VH_v2 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 나타내는 18C5 인간화된항체의 변이체를 제공한다. (서열번호 85 내지 86) 및 인간화된 성숙 경쇄 가변 영역은 hu18C5-VL_v1, 및 hu18C5-VL_v2 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 나타낸다(서열번호 91 내지 92). 일부 이러한 항체에서, 서열번호 86 및 서열번호 92에서 발견되는 역돌연변이 또는 다른 돌연변이 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 모두 8가지가 유지된다.
일부 인간화된 18C5 항체에서, 다음의 위치 중 적어도 하나는 구체화되는 아미노산에 의해 점유된다: H37은 V 또는 A에 의해 점유되고, H45는 L 또는 Q에 의해 점유되며, H47은 L 또는 W에 의해 점유되고, H48은 L 또는 I에 의해 점유되며, H49는 A 또는 G에 의해 점유되고, H94는 S 또는 R에 의해 점유된다.
일부 인간화된 18C5 항체에서, VH 영역에서 위치 H37, H45, H47, H48, H49 및 H94는 hu18C5-VH_v2에서와 같이 각각 A, Q, W, I, G 및 R에 의해 점유된다.
일부 인간화된 18C5 항체에서, 다음의 위치 중 적어도 하나는 구체화된 바와 같이 아미노산에 의해 점유된다: L2는 I 또는 V에 의해 점유되고, L45는 Q 또는 R에 의해 점유된다.
일부 인간화된 18C5 항체에서, VL 영역에서 위치 L2 및 L45는 hu18C5-VL_v2에서와 같이 각각 V 및 R에 의해 점유된다.
일부 인간화된 18C5 항체에서, 가변 중쇄는 인간 서열에 대해 85% 초과의 동일성을 가진다. 일부 인간화된 18C5 항체에서, 가변 경쇄는 인간 서열에 대해 85% 초과의 동일성을 가진다. 일부 인간화된 18C5 항체에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 각각은 인간 생식계열 서열에 대해 85% 초과의 동일성을 가진다.
이러한 인간화 항체의 CDR 영역은 9D5 또는 18C5 마우스 공여자 항체의 CDR 영역에 대해 동일하거나 또는 실질적으로 동일할 수 있다. CDR 영역은 임의의 통상적인 정의, 예컨대 표 1의 정의에 의해 정해질 수 있지만, 바람직하게는 카바트 또는 카바트+코티아 복합에 의해 정해진다.
가변 영역 프레임워크 위치는 달리 언급되지 않는 한 카바트 넘버링에 따른다. 다른 이러한 변이체는 전형적으로 소수의(예를 들어, 전형적으로 1, 2, 3, 5, 10 또는 15개 이하) 대체, 결실 또는 삽입에 의해 예시된 Hu18C5 중쇄 및 경쇄 서열과 다르다.
인간화된 9D5 또는 18C5 변이체에서 추가적인 변이에 대한 가능성은 가변 영역 프레임워크 내 추가적인 복귀돌연변이이다. 인간화된 mAb 내 CDR과 접촉되지 않는 다수의 프레임워크 잔기는 공여자 마우스 mAb 또는 다른 마우스 또는 인간 항체의 대응하는 위치로부터의 아미노산의 치환을 수용할 수 있으며, 훨씬 다수의 잠재적 CDR-접촉 잔기는 또한 치환될 수 있다. 심지어 CDR 내의 아미노산은, 예를 들어, 가변 영역 프레임워크를 공급하기 위해 사용되는 인간 수용자 서열의 대응하는 위치에서 발견되는 잔기에 의해 변경될 수 있다. 추가로, 대안의 인간 수용자 서열은, 예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄에 대해 사용될 수 있다. 상이한 수용자 서열이 사용된다면, 대응하는 공여자 및 수용자 잔기가 이미 복귀돌연변이 없이 동일하기 때문에, 상기 권장된 복귀돌연변이 중 하나 이상은 수행되지 않을 수도 있다.
Hu9D5 또는 Hu18C5 변이체에서의 일부 대체 또는 복귀돌연변이는 (보존적이든 아니든) 인간화된 mAb의 결합 친화도 또는 효능, 즉, 단량체 TTR에 결합하는 그의 능력에 대해 실질적인 효과가 없다(예를 들어, 변이체 인간화된 9D5 또는 18C5 항체의 본 실시예에 기재된 일부 또는 모든 분석에서의 효능은 뮤린 9D5 또는 뮤린 18C5 항체의 효능과 같이 본질적으로 동일하며, 즉, 실험 오차 내이다). 예시적인 인간화된 9D5 변이체는 WO 2016/120810에 기재되어 있다.
D. 키메라 및 베니어 항체
본 발명은 추가로 비인간 항체, 특히 실시예의 9D5 또는 18C5 항체 키메라 및 베니어 형태를 제공한다.
키메라 항체는 비-인간 항체(예를 들어, 마우스)의 경쇄 및 중쇄의 성숙 가변 영역이 인간 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 조합되는 항체이다. 이러한 항체는 마우스 항체의 결합 특이성을 실질적으로 또는 전체적으로 보유하고, 인간 서열의 약 2/3이다. 실시형태에서, 키메라 18C5 항체는 서열번호 81의 성숙 중쇄 가변 영역 아미노산 서열, 서열번호 87의 성숙 경쇄 가변 영역 아미노산 서열, 서열번호 17의 인간 중쇄 불변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 19의 인간 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 가진다. 예시적인 키메라 9D5 항체는 WO 2016/120810에 기재되어 있다,
베니어 항체는 CDR의 일부, 보통은 모두 및 비-인간 항체의 비-인간 가변 영역 프레임워크 잔기의 일부를 보유하지만, B- 또는 T-세포 에피토프에 기여할 수 있는 다른 가변 영역 프레임워크 잔기, 예를 들어 노출된 잔기(Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991)를 인간 항체 서열의 대응하는 위치로부터의 잔기로 대체하는 인간화 항체의 유형이다. 결과는 CDR이 비-인간 항체로부터 전체적으로 또는 실질적으로 유래되고, 비인간 항체의 가변 영역 프레임워크는 치환에 의해 더 인간 유사로 만들어지는 항체이다. 9D5 또는 18C5 항체의 베니어 형태는 본 발명에 포함된다.
E. 인간 항체
단량체 TTR 또는 이의 단편(예를 들어, TTR의 아미노산 잔기 89 내지 97(서열번호 45) 또는 TTR의 아미노산 잔기 101 내지 109(서열번호 30))에 대한 인간 항체는 이하에 기재한 다양한 기법에 의해 제공된다. 일부 인간 항체는 특정 마우스 항체, 예컨대 실시예에 기재된 마우스 단클론성 항체 중 하나와 동일한 에피토프 특이성을 갖도록 상기 또는 다른 곳에서 경쟁적 결합 실험에 의해, 윈터의 파지 디스플레이 방법에 의해 선택된다. 인간 항체는 또한 표적 항원으로서 단지 TTR의 단편, 예컨대 단지 TTR의 아미노산 잔기 89 내지 97 또는 아미노산 잔기 101 내지 109를 함유하는 TTR 변이체를 이용함으로써, 및/또는 TTR 변이체, 예컨대 TTR의 아미노산 잔기 89 내지 97 또는 아미노산 잔기 101 내지 109 내에서 다양한 돌연변이를 함유하는 TTR 변이체의 수집물에 대해 항체를 선별함으로써 특정 에피토프에 대해 선별될 수 있다.
인간 항체를 생성하기 위한 방법은 문헌[Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983)]; 외스트베르크(Oestberg)의 미국 특허 제4,634,664호; 및 인글먼(Engleman) 등의 미국 특허 제4,634,666호의 트라이오마 방법, 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 유전자이식 마우스의 용도(예를 들어, 론버그(Lonberg) 등의 WO93/12227(1993); 미국 특허 제5,877,397; 미국 특허 제5,874,299; 미국 특허 제5,814,318; 미국 특허 제5,789,650호; 미국 특허 제5,770,429호; 미국 특허 제5,661,016호; 미국 특허 제5,633,425호; 미국 특허 제5,625,126호; 미국 특허 제5,569,825호; 미국 특허 제5,545,806호; 문헌[Neuberger, Nat. Biotechnol . 14:826 (1996)]; 및 쿠체라파티(Kucherlapati)의 WO 91/10741 (1991) 참조) 및 파지 디스플레이 방법(예를 들어, 다워(Dower) 등의 WO 91/17271; 맥커티(McCafferty) 등의 WO 92/01047; 미국 특허 제5,877,218호; 미국 특허 제5,871,907호; 미국 특허 제5,858,657호; 미국 특허 제5,837,242호; 미국 특허 제5,733,743호; 및 미국 특허 제5,565,332호)을 포함한다.
F. 불변 영역의 선택
키메라, 베니어 또는 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 인간 불변 영역의 적어도 일부에 연결될 수 있다. 불변 영역의 선택은 항체-의존적 세포-매개 세포독성, 항체 의존적 세포의 식세포작용 및/또는 상보체 의존적 세포독성이 요망되는지의 여부에 부분적으로 의존한다. 예를 들어, 인간 아이소토프 IgG1 및 IgG3은 상보체-의존적 세포독성을 가지고, 인간 아이소타입 IgG2 및 IgG4는 그렇지 않다. 인간 IgG1 및 IgG3은 인간 IgG2 및 IgG4보다 더 강한 세포 매개 효과기 기능을 유도한다. 경쇄 불변 영역은 람다 또는 카파일 수 있다. 불변 영역에 대한 넘버링 규약은 EU 넘버링(Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969)), 카바트 넘버링(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, IMGT 고유 넘버링(Lefranc M.-P. et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains, Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005), 및 IMGT 엑손 넘버링(Lefranc, 상기 참조)을 포함한다.
경쇄 및/또는 중쇄의 아미노 또는 카복시 말단에서 하나 또는 몇몇 아미노산, 예컨대 중쇄의 C-말단의 라이신은 분자의 부분 또는 모두에서 상실되거나 또는 유도체화될 수 있다. 치환은 효과기 기능, 예컨대 상보체-매개 세포독성 또는 ADCC를 감소 또는 증가시키기 위해(예를 들어, 윈터 등의 미국 특허 제5,624,821호; 트소(Tso) 등의 미국 특허 제5,834,597호; 및 문헌[Lazar et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 103:4005, 2006]), 또는 인간에서 반감기를 연장시키기 위해(예를 들어, 인간[Hinton et al., J. Biol . Chem. 279:6213, 2004]) 불변 영역에서 이루어질 수 있다. 예시적인 치환은 항체의 반감기를 증가시키기 위해 위치 250에서 Gln 및/또는 위치 428에서 Leu(EU 넘버링은 이 단락에서 불변 영역에 대해 사용됨)을 포함한다. 임의의 또는 모든 위치 234, 235, 236 및/또는 237에서 치환은 Fcγ 수용체, 특히 FcγRI 수용체에 대해 친화도를 감소시킨다(예를 들어, 미국 특허 제6,624,821호). 인간 IgG1의 위치 234, 235 및 237에서 알라닌 치환은 효과기 기능을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 항체는 효과기 기능을 감소시키기 위해 인간 IgG1의 위치 234, 235 및 237에서 알라닌 치환을 가진다. 선택적으로, 인간 IgG2에서 위치 234, 236 및/또는 237은 알라닌으로 치환되고, 위치 235에서 글루타민으로 치환된다(예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호). 일부 항체에서, 인간 IgG1의 EU 넘버링에 의해 위치 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329 및 331 중 하나 이상에서의 돌연변이가 사용된다. 일부 항체에서, 인간 IgG1의 EU 넘버링에 의해 위치 318, 320 및 322 중 하나 이상에서의 돌연변이가 사용된다. 일부 항체에서, 위치 234 및/또는 235는 알라닌으로 치환되고/되거나 위치 329는 글리신으로 치환된다. 일부 항체에서, 위치 234 및 235는 서열번호 23에서와 같이 알라닌으로 치환된다. 일부 항체에서, 아이소타입은 인간 IgG2 또는 IgG4이다.
예시적인 인간 경쇄 카파 불변 영역은 서열번호 24의 아미노산 서열을 가진다. 서열번호 24의 N-말단의 알기닌은 생략될 수 있으며, 이 경우에 경쇄 카파 불변 영역은 서열번호 25의 아미노산 서열을 가진다. 예시적인 인간 IgG1 중쇄 불변 영역은 (C-말단의 라이신이 있는 또는 없는) 서열번호 21의 아미노산 서열을 가진다. 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 함유하는 사량체로서, 별개의 중쇄, 경쇄로서, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv로서, 또는 중쇄 및 경쇄 성숙 가변 도메인이 스페이서를 통해 연결되는 단일쇄 항체로서 발현될 수 있다.
인간 불변 영역은 상이한 개체 사이의 동종이인자형 변이 및 동종동질이인자형 변이를 나타내며, 즉, 불변 영역은 하나 이상의 다형체 위치에서 상이한 개체에서 상이할 수 있다. 동종동질이인자형은 동종이인자형과 다르며, 즉, 동종동질이인자형을 인식하는 혈청은 하나 이상의 다른 아이소타입의 비다형성 영역(non-polymorphic region)에 결합한다. 따라서, 예를 들어, 다른 중쇄 불변 영역은 IgG1 G1m3 동종이인자형을 가지며, 서열번호 22의 아미노산 서열을 가진다. IgG1 G1m3 동종이인자형의 다른 중쇄 불변 영역은 (C-말단의 라이신이 있는 또는 없는) 서열번호 23의 아미노산 서열을 가진다. 인간 불변 영역에 대한 언급은 임의의 천연 동종이인자형 또는 천연 동종이인자형에서 위치를 점유하는 잔기의 임의의 순열을 지니는 불변 영역을 포함한다.
G. 재조합 항체의 발현
항체-발현 세포주(예를 들어, 하이브리도마)를 이용하여 키메라 및 인간화 항체를 생성하기 위한 다수의 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, 항체의 면역글로불린 가변 영역은 잘 공지된 방법을 이용하여 클로닝 및 시퀀싱될 수 있다. 일 방법에서, 중쇄 가변 VH 영역은 하이브리도마 세포로부터 제조된 mRNA를 이용하여 RT-PCR에 의해 클로닝된다. 5' 프라이머 및 g2b 불변 영역 특이적 3' 프라이머로서 번역 개시 코돈을 포함하는 VH 영역 리더 펩타이드에 대해 공통 프라이머가 사용된다. 예시적인 프라이머는 쉥크(Schenk) 등(본 명세서에서 이후에 "쉥크")에 의해 미국 특허 공개 제2005/0009150호에 기재된다. 다중의 독립적으로 유래된 클론으로부터의 서열은 증폭 동안 도입된 변화가 없다는 것을 보장하기 위해 비교될 수 있다. VH 영역의 서열은 또한 5' RACE RT-PCR 방법 및 3' g2b 특이적 프라이머에 의해 얻어지는 VH 단편을 시퀀싱함으로써 결정 또는 확인될 수 있다.
경쇄 가변 VL 영역은 유사한 방식으로 클로닝될 수 있다. 일 접근에서, 공통 프라이머 세트는 번역 개시 코돈을 포함하는 VL 영역에 혼성화하도록 설계된 5' 프라이머 및 V-J 결합 영역 하류의 Ck 영역에 특이적인 3' 프라이머를 이용하여 VL 영역의 증폭을 위해 설계된다. 두 번째 접근에서, 5'RACE RT-PCR 방법은 VL 암호화 cDNA를 클로닝하기 위해 사용된다. 예시적인 프라이머는 상기의 쉥크에 기재되어 있다. 이어서, 클로닝된 서열은 인간(또는 다른 비인간 종) 불변 영역을 암호화하는 서열과 조합된다. 인간 불변 영역을 암호화하는 예시적인 서열은 인간 IgG1 불변 영역을 암호화하는 서열번호 32, 및 인간 카파 경쇄 불변 영역을 암호화하는 서열번호 33 및 34을 포함한다.
일 접근에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각의 VDJ 또는 VJ 접합 하류의 스플라이스 공여자 서열을 암호화하도록 재조작되고, 포유류 발현 벡터, 예컨대 중쇄에 대해 pCMV-hγ1 및 경쇄에 대해 pCMV-Mcl 내로 클로닝된다. 이들 벡터는 삽입된 가변 영역 카세트 하류의 엑손 단편으로서 인간 γ1 및 Ck 불변 영역을 암호화한다. 서열 확인 후에, 중쇄 및 경쇄 발현 벡터는 키메라 항체를 생성하기 위해 CHO 세포 내로 공동형질감염될 수 있다. 조건화 배지를 형질감염 후 48시간에 수집하고 나서, 항원 결합에 대해 웨스턴 블롯 분석 또는 항원 결합에 대해 ELISA에 의해 수집한다. 키메라 항체는 상기 기재한 바와 같이 인간화된다.
키메라, 베니어, 인간화 및 인간 항체는 전형적으로 재조합 발현에 의해 생성된다. 재조합 폴리뉴클레오타이드 작제물은 전형적으로 자연적으로 관련된 또는 이종성 발현 제어 요소, 예컨대 프로모터를 포함하는 항체쇄의 암호 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함한다. 발현 제어 서열은 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터 내 프로모터 시스템일 수 있다. 일단, 벡터가 적절한 숙주 내로 혼입되었다면, 숙주는 뉴클레오타이드 서열의 고수준 발현 및 교차반응 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에 유지된다.
이들 발현 벡터는 전형적으로 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합 부분으로서 숙주 유기체에서 복제 가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 목적으로 하는 DNA 서열을 이용하여 형질전환된 해당 세포의 검출을 허용하기 위해 선택 마커, 예를 들어, 암피실린 내성 또는 하이그로마이신 내성을 함유한다.
이콜라이(E. coli)는 발현 항체, 특히 항체 단편에 유용한 하나의 원핵 숙주이다. 미생물, 예컨대 효모는 또한 발현에 유용하다. 사카로마이세스(Saccharomyces)는 원한다면 발현 제어 서열, 복제 기점, 종결 서열 등을 갖는 적합한 벡터를 지니는 효모 숙주이다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다른 글당분해 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 특히 알코올 탈수소효소, 아이소사이토크롬 C 및 말토스 및 갈락토스 효용을 초래하는 효소를 포함한다.
포유류 세포는 면역글로불린 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 세그먼트에 대해 사용될 수 있다. 문헌[Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)] 참조. 무손상 이종성 단백질을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 개발되었고, CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, HEK293 세포, L 세포 및 Sp2/0 및 NS0를 포함하는 비항체 생성 골수종을 포함한다. 세포는 비인간일 수 있다. 이들 세포에 대한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제기점, 프로모터, 인핸서(Queen et al., Immunol . Rev. 89:49 (1986)), 및 필수적인 가공 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 발현 제어 서열은 내인성 유전자, 사이토메갈로바이러스, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스 등으로부터 유래된 프로모터를 포함할 수 있다. 문헌[Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992)] 참조.
대안적으로, 항체 암호 서열은 유전자 이식 동물의 게놈 내로 도입 및 유전자 이식 동물의 모유에서의 후속적 발현을 위해 이식유전자에 도입될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,741,957호; 미국 특허 제5,304,489호; 및 미국 특허 제5,849,992호 참조). 적합한 이식유전자는 유선 특이적 유전자로부터의 프로모터 및 인핸서, 예컨대 카제인 또는 베타 락토글로불린과 작동 가능하게 연결된 경쇄 및/또는 중쇄에 대한 암호 서열을 포함한다.
관심 대상의 DNA 세그먼트를 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따르는 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염은 통상적으로 원핵 세포에 대해 이용되는 반면, 인산칼슘 처리, 전기천공법, 리포펙션, 바이오리스틱스 또는 바이러스 기반 형질감염은 다른 세포 숙주에 대해 사용될 수 있다. 포유류 세포를 형질감염하기 위해 사용되는 다른 방법은 폴리브렌, 원형질체 융합, 리포좀, 전기천공법 및 미세주입법의 사용을 포함한다. 유전자 이식 동물의 생성을 위해, 이식 유전자는 수정된 난모세포 내로 미세주사될 수 있거나, 또는 배아 줄기 세포의 게놈 내로 혼입될 수 있고, 이러한 세포의 핵은 제핵 난모세포에 전달된다.
세포 배양물 내로 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 벡터(들)를 도입하여, 세포 풀은 무 혈청 배지에서의 성장 생산성 및 제품 품질에 대해 선별될 수 있다. 이어서, 단클론성 계통을 생성하기 위해 상부 생성 세포풀에 FACS-기반 단일 세포 클로닝이 실시될 수 있다. 7.5g/ℓ 배양물 초과의 생성물 역가에 대응하는 50pg 또는 100pg/세포/일 초과의 구체적 생산성이 사용될 수 있다. 단일 세포 클론에 의해 생성된 항체는 또한 탁도, 여과 특성, PAGE, IEF, UV 스캔, HP-SEC, 탄수화물-올리고당 맵핑, 질량 스펙트럼 및 결합 분석, 예컨대 ELISA 또는 바이어코어(Biacore)에 대해 시험될 수 있다. 이어서, 선택된 클론은 다중 바이알에 저장되고, 후속 사용을 위해 냉동저장될 수 있다.
일단 발현되면, 항체는 단백질 A 포획, HPLC 정제, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 당업계의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다(일반적으로, 문헌[Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)] 참조).
코돈 최적화, 프로모터의 선택, 전사 요소의 선택, 종결자의 선택, 무혈청 단일 세포 클로닝, 세포 저장, 복제 수의 증폭을 위한 선택 마커의 사용, CHO 종결자, 또는 단백질 역가의 개선을 포함하는 항체의 상업적 생산을 위한 방법이 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,786,464호; 미국 특허 제6,114,148호; 미국 특허 제6,063,598호; 미국 특허 제7,569,339호; W02004/050884; W02008/012142; W02008/012142; W02005/019442; W02008/107388; W02009/027471; 및 미국 특허 제5,888,809호 참조).
H. 항체 선별 분석
항체는 결합 분석, 기능적 선별, TTR 침착과 관련된 질환의 동물 모델에서의 선별 및 임상 시험을 포함하는 몇몇 선별이 실시될 수 있다. 결합 분석은 특이적 결합 및 선택적으로, 단량체 TTR 또는 이의 단편에 대한 친화도 및 에피토프 특이성에 대해 시험한다. 예를 들어, 결합 분석은 천연 TTR 사량체에 묻히고, TTR 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태로 노출된 에피토프인, TTR의 아미노산 잔기 89 내지 97(서열번호 45) 또는 아미노산 잔기 101 내지 109(서열번호 30)에 결합하는 항체를 선별할 수 있다. 항체는 또한 TTR 및 TTR 아밀로이드 피브릴의 프레-피브릴, 비천연 입체배좌에 결합하지만, 천연 TTR 입체배좌에 결합하지 않는 능력에 대해 선별될 수 있다. 예를 들어, 항체는 천연 사량체 TTR의 해리 또는 분리에 의해 생성된 TTR의 단량체 형태에 결합하는 능력에 대해 선별될 수 있고, 실시예 또는 다른 곳에 기재된 천연 사량체 TTR에 대해 반대선별(counter-screened)될 수 있다. 마찬가지로, 항체는 또한 TTR-매개 아밀로이드증 조직에 대한 그들의 면역반응성에 대해 선별될 수 있지만, 건강한 조직에 대해서는 그렇지 않다. 이러한 선별은 때때로 예시적인 항체, 예컨대 9D5 또는 18C5의 가변 영역 또는 IgG1 카파 아이소타입을 갖는 항체와 경쟁적으로 수행된다. 선택적으로, 항체 또는 TTR 표적은 이러한 분석에서 고정된다.
기능성 분석은 TTR을 자연적으로 발현시키는 세포를 포함하는 세포 모델에서 수행될 수 있거나 또는 TTR 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA로 형질감염된다. 적합한 세포는 TTR 아밀로이드 생성에 의해 영향받는 심장 조직 또는 다른 조직으로부터 유래된 세포를 포함한다. 세포는 피브릴 감소된 수준의 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태(예를 들어, 세포 추출물 또는 상청액의 웨스턴 블롯팅 또는 면역침전법에 의해) 또는 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태에 기인할 수 있는 감소된 독성에 의해 선별될 수 있다. 예를 들어, 항체는 TTR의 응집을 저해 또는 감소시킬 수 있거나, TTR 피브릴 형성을 저해 또는 감소시킬 수 있거나, TTR 침착을 감소시키거나, 응집된 TTR을 클리어런스하거나, 또는 TTR의 비독성 입체배좌를 안정화시키는 능력에 대해 시험될 수 있다.
항체가 용액 중의 단량체 TTR 또는 미스폴딩된 TTR 중간체가 항체와 접촉될 때 항체가 TTR 피브릴 형성을 방해 또는 감소시킬 수 있는지 여부를 시험하는 것과 같은 다른 기능성 분석이 용액 중에서 수행될 수 있다. 피브릴 형성 정도는, 예를 들어, 온도 제어 유닛을 구비한 UV-가시광선 분광계 상의 400㎚에서 탁도 측정에 의해 프로빙될 수 있다. 티오플라빈-T는 또한 아밀로이드 피브릴 형성 정도를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 5배 몰 과량의 티오플라빈-T는 TTR 샘플에 첨가될 수 있고, 측정하기 전 30분 동안 실온에 남겨둔다. 티오플라빈-T 형광은 분광 형광계를 이용하여 모니터링될 수 있다. 미국 특허 제2014/0056904호 참조.
동물 모델은 TTR 또는 TTR 침착물의 축적과 관련된 인간 질환을 시뮬레이션하는 동물 모델에서 징후 또는 증상을 치료적 또는 예방적으로 치료하는 항체의 능력을 선별 시험한다. 이러한 질환은 TTR 아밀로이드증의 유형, 예컨대 야생형 ATTR 아밀로이드증(노인성 전신 아밀로이드증, SSA으로도 불림), 노인성 심장 아밀로이드증(SCA), 가족성 아밀로이드성 다발신경병증(FAP), 가족성 아밀로이드 심근증(FAC) 및 중추 신경계 선택적 아밀로이드증(CNSA)을 포함한다. 모니터링될 수 있는 적합한 징후 또는 증상은 다양한 조직, 예컨대 위장관 또는 심장에서 아밀로이드 침착물의 존재 또는 정도를 포함한다. 아밀로이드 침착물의 감소 정도는 적절한 대조군, 예컨대 대조군 항체(예를 들어, 아이소타입 매칭 대조군 항체), 위약 또는 전혀 처리 없음을 받은 대조군 동물에서의 TTR 아밀로이드 침착물의 수준에 비교하여 결정될 수 있다. TTR 아밀로이드증에 대한 활성을 시험하기 위한 예시적인 동물 모델은 가족성 아밀로이드성 말초신경병증과 관련된 V30M 돌연변이를 포함하는 내인성 마우스 Ttr 좌위 및 인간 돌연변이체 TTR 유전자에서 삭제 돌연변이를 운반하는 마우스 모델이다. 예를 들어, 문헌[Kohno et al., Am. J. Path. 150(4):1497-1508 (1997); Cardoso and Saraiva, FASEB J 20(2):234-239 (2006)] 참조. TTR 아밀로이드증의 가족성 형태에 대한 다른 모델 및 TTR 아밀로이드증의 산발적 형태에 대한 모델을 포함하는 유사한 모델이 또한 존재한다. 예를 들어, 문헌[Teng et al., Lab. Invest. 81(3): 385-396 (2001); Ito and Maeda, Mouse Models of Transthyretin Amyloidosis, in Recent Advances in Transthyretin Evolution, Structure, and Biological Functions, pp. 261-280 (2009) (Springer Berlin Heidelberg)] 참조. 유전자 이식 동물은 인간 TTR 이식유전자, 예컨대 TTR 아밀로이드증과 관련된 돌연변이를 갖는 TTR 이식유전자 또는 야생형 TTR 이식유전자를 포함할 수 있다. 동물 모델에서의 시험을 용이하게 하기 위해, 동물 모델에 적절한 불변 영역을 갖는 키메라 항체가 사용될 수 있다(예를 들어, 마우스-래트 키메라는 래트에서 항체를 시험하기 위해 사용될 수 있었다). 대응하는 마우스 항체 또는 키메라 항체가 적절한 동물 모델에서 효과적이고, 인간화 항체가 유사한 결합 친화도를 가진다면 항체의 인간화된 형태는 (예를 들어, 실험 오차 내에서, 예컨대 1.5, 2 또는 3배만큼)효과적일 것이라는 결론을 내릴 수 있다.
임상 시험은 TTR 아밀로이드증과 관련된 질환을 갖는 인간에서의 안전성 및 효능에 대해 시험한다.
I. 핵산
본 발명은 추가로 상기 기재한 임의의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산(예를 들어, 서열번호 2, 4, 18 및 20)을 제공한다. 선택적으로, 이러한 핵산은 추가로 신호 펩타이드를 암호화하고, 불변 영역에 연결된 신호 펩타이드(예를 들어, 서열번호 36(중쇄) 및 38(경쇄)에 의해 각각 암호화될 수 있는 서열번호 35(중쇄) 및 37(경쇄)의 아미노산 서열을 갖는 신호 펩타이드)에 의해 발현될 수 있다. 핵산의 암호 서열은 암호 서열의 발현을 보장하기 위해 조절 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 신호 등과 작동 가능하게 연결될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산은 단리된 형태로 생길 수 있거나 또는 하나 이상의 벡터로 클로닝될 수 있다. 핵산은, 예를 들어, 중첩 올리고뉴클레오타이드의 고체상 합성 또는 PCR에 의해 합성될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산은 하나의 인접한 핵산으로서, 예를 들어 발현 벡터 내에 결합될 수 있거나, 또는 예를 들어 각각 그 자신의 발현 벡터로 분리될 수 있다.
J. 접합 된 항체
TTR의 병원성 형태로 노출되지만 TTR의 천연 사량체 형태, 예컨대 TTR의 아미노산 잔기 89 내지 97(서열번호 45) 또는 아미노산 잔기 101 내지 109(서열번호 30)에는 노출되지 않은 항원에 특이적으로 결합하는 접합된 항체는 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태의 존재를 검출하거나; TTR 아밀로이드증으로 진단된 환자를 치료하기 위해 사용 중인 치료제의 효능을 모니터링 및 평가하거나; TTR의 응집을 저해 또는 감소시키거나; TTR 피브릴 형성을 저해 또는 감소시키거나; TTR 침착을 감소 또는 클리어런스하거나; TTR의 비독성 입체배좌를 안정화시키거나; 또는 환자에서 TTR 아밀로이드증을 치료하거나 또는 예방을 달성하는 데 유용하다. 예를 들어, 이러한 항체는 다른 치료적 모이어티, 다른 단백질, 다른 항체 및/또는 검출 가능한 표지와 접합될 수 있다. WO 03/057838; 미국 특허 제8,455,622호.
접합된 치료적 모이어티는 환자에서의 원치않는 병태 또는 질환, 예컨대 TTR 아밀로이드증을 치료하거나, 방지하거나, 좋아지게 하거나 또는 개선시키기 위해 사용될 수 있는 임의의 제제일 수 있다. 치료적 모이어티는, 예를 들어, 항체의 활성을 용이하게 하거나 또는 향상시키는 면역조절제 또는 임의의 생물학적 활성제를 포함할 수 있다. 면역조절제는 면역학적 반응의 발생 또는 유지를 자극하거나 또는 저해하는 임의의 제제일 수 있다. 이러한 치료적 모이어티가 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태에 대해 특이적인 항체, 예컨대 본 명세서에 기재된 항체에 결합된다면, 결합된 치료적 모이어티는 TTR의 천연 사량체 형태 이상으로 TTR의 비천연, 병원성 형태에 대해 특이적인 친화도를 가질 것이다. 결과적으로, 접합된 항체의 투여는 주위의 정상, 건강한 조직에 대해 최소의 손상과 함께 TTR의 병원성 형태를 포함하는 조직을 직접 표적화한다. 이는 그들 자신에 대해 투여되기에 너무 독성인 치료적 모이어티에 대해 특히 유용할 수 있다. 추가로, 더 소량의 치료적 모이어티가 사용될 수 있다.
적합한 치료적 모이어티의 예는 TTR 수준을 감소시키거나, TTR의 천연 사량체 구조를 안정화시키거나, TTR의 응집을 저해하거나, TTR 피브릴 또는 아밀로이드 형성을 방해하거나, 또는 세포 독성을 없애는 약물을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Almeida and Saraiva, FEBS Letters 586:2891-2896 (2012); Saraiva, FEBS Letters 498:201-203 (2001); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013); Ruberg and Berk, Circulation 126:1286-1300 (2012); Johnson et al., J. Mol . Biol . 421(2-3):185-203 (2012, Ueda and Ando, Translational Neurodegeneration 3:19 (2014), 및 Hawkins et al. Annals of Medicine 47:625-638 (2015))] 참조. 예를 들어, 항체는 타파미디스, 디플루니살, AG10, ALN-TTR01, ALNTTR02, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 IONIS TTRRx(이노테센), siRNA, 예컨대 파티시란 또는 레부시란, 독시사이클린(독시), 타우로우르소데옥시콜산(TUDCA), 독시-TUDCA, 사이클로덱신(CyD), 4'-아이오도-4'-데옥시독소루비신(IDOX), 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG), 쿠르쿠민 또는 레스베라트롤(3,5,4'-트라이하이드록시스틸벤) 또는 혈청 아밀로이드 P 성분(SAP)에 대한 항체에 접합될 수 있다. 다른 대표적인 치료적 모이어티는 TTR 아밀로이드증 또는 TTR 아밀로이드증의 증상의 치료, 관리 또는 개선에 유용한 것으로 알려진 다른 제제를 포함한다. 예를 들어, TTR 아밀로이드증의 통상적인 임상적 증상 및 해당 증상을 치료하기 위해 사용되는 전형적인 제제에 대해 문헌[Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013)] 참조.
항체는 또한 다른 단백질과 결합될 수 있다. 예를 들어, 항체는 파이노머(Fynomer)와 결합될 수 있다. 파이노머는 인간 Fyn SH3 도메인으로부터 유래된 작은 결합 단백질(예를 들어, 7kDa)이다. 그들은 안정하고 가용성일 수 있고, 그들은 시스테인 잔기 및 이황화 결합이 없을 수 있다. 파이노머는 항체와 동일한 친화도 및 특이성을 지니는 표적 분자에 결합하도록 조작될 수 있다. 그들은 항체에 기반하여 다중 특이적 융합 단백질을 생성하는 데 적합하다. 예를 들어, 파이노머는 상이한 구조를 지니는 이중 및 삼중 특이성 FynomAb를 생성하기 위해 항체의 N-말단 및/또는 C-말단 끝에 융합될 수 있다. 파이노머는 최적의 특성을 지니는 파이노머의 효율적인 선택을 허용하는 FACS, 바이어코어 및 세포 기반 분석을 이용하는 선별 기법을 통해 파이노머 라이브러리를 이용하여 선택될 수 있다. 파이노머의 예는 문헌[Grabulovski et al., J. Biol . Chem . 282:3196-3204 (2007); Bertschinger et al., Protein Eng . Des. Sel . 20:57-68 (2007); Schlatter et al., MAbs . 4:497-508 (2011); Banner et al., Acta . Crystallogr . D. Biol . Crystallogr . 69(Pt6):1124-1137 (2013); 및 Brack et al., Mol . Cancer Ther. 13:2030-2039 (2014)]에 개시되어 있다.
본 명세서에 개시된 항체는 또한 (예를 들어, 항체 헤테로컨쥬게이트를 형성하기 위해) 하나 이상의 다른 항체에 결합 또는 접합될 수 있다. 이러한 다른 항체는 TTR 또는 이의 일부 내에서 상이한 에피토프에 결합될 수 있거나 또는 상이한 표적 항원에 결합할 수 있다. 9D5 또는 18C5와 상이한 TTR 에피토프에 대한 이러한 항-TTR 항체 결합은 표 3에서와 같은 항체를 포함할 수 있다.
항체는 또한 검출 가능한 표지와 결합될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어, TTR 아밀로이드증을 진단하기 위해, TTR 아밀로이드증의 진행을 모니터링하기 위해, 그리고/또는 치료 효능을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 항체는 TTR 아밀로이드증을 갖거나 또는 여지가 있는 대상체에서, 또는 이러한 대상체로부터 얻은 적절한 생물학적 샘플에서 이러한 결정을 수행하는 데 특히 유용하다. 본 명세서에 개시된 항체에 결합되거나 또는 연결될 수 있는 대표적인 검출 가능한 표지는 다양한 효소, 예컨대 겨자무과산화효소, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스터라제; 보결분자단, 예컨대 스트렙타비딘, 아비딘 또는 바이오틴; 형광 물질, 예컨대 움벨리페론, DyLight 플루오르, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 로다민, 다이클로로트라이아진일아민 플루오레세인, 염화단실 또는 피코에리트린; 발광 물질, 예컨대 루미놀; 생발광 물질, 예컨대 루시퍼라제, 루시페린 및 아에쿠오린; 방사성 물질, 예컨대 이트륨90(90Y), 방사성 은-111, 방사성 은-199, 비스무트213, 아이오딘(131I, 125I, 123I, 121I,), 탄소(14C), 황(5S), 삼중수소(3H), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In,), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브데넘(99Mo), 제논(133Xe), 플루오린(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn 및 117Tin; 다양한 양전자 방출 단층촬영을 이용하는 양전자 방출 물질; 비방사성 상자성 금속 이온; 및 방사성표지되거나 또는 특정 방사성동위원소에 접합된 분자를 포함한다. 본 명세서에 개시된 항체에 결합되거나 또는 연결될 수 있는 대표적인 검출 가능한 표지는 전기화학발광 표지, 예를 들어, MSD GOLD SULFOTAG NHS-에스터(설포-태그)(메릴랜드주 락빌에 소재한 메소 스케일 다이아그노스틱스(메릴랜드주 락빌에 소재한 메소 스케일 다이아그노스틱스)를 포함한다.
항체에 대한 방사성동위원소의 결합은 통상적인 2작용성 킬레이트에 의해 수행될 수 있다. 방사성 은-111 및 방사성 은-199 결합을 위해, 황 기반 링커가 사용될 수 있다. 문헌[Hazra et al., Cell Biophys. 24-25:1-7 (1994)] 참조. 은 방사성동위원소의 결합은 아스코르브산을 이용하여 면역글로불린을 감소시키는 단계를 수반할 수 있다. 방사성동위원소, 예컨대 111In 및 90Y에 대해, 이브리투모맙 튜세탄이 사용될 수 있고, 각각 111In-이브리투모맙 튜세탄 및 90Y-이브리투모맙 튜세탄을 형성하기 위해 이러한 동위원소와 반응할 것이다. 문헌[Witzig, Cancer Chemother . Pharmacol., 48 Suppl 1:S91-S95 (2001)] 참조.
치료적 모이어티, 다른 단백질, 다른 항체 및/또는 검출 가능한 표지는 당업계에 공지되어 있는 기법을 이용하여 뮤린, 키메라, 베니어 또는 인간화된 9D5 또는 18C5 항체에 직접적으로 또는 중간체(예를 들어, 링커)를 통해 간접적으로 결합되거나 또는 접합될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985); 및 Thorpe et al., Immunol . Rev., 62:119-58 (1982)] 참조. 적합한 링커는, 예를 들어, 절단 가능한 및 비-절단 가능한 링커를 포함한다. 산성 또는 환원성 조건 하에서, 특정 프로테아제에 대한 노출 시 또는 다른 정해진 조건 하에서 결합된 치료적 모이어티, 단백질, 항체 및/또는 검출 가능한 표지를 방출하는 상이한 링커가 사용될 수 있다.
V. 치료적 용도
상기 항체는 트랜스타이레틴(TTR)에 의해, 특히 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태에 의해 적어도 부분적으로 매개된 질환을 갖거나 또는 질환에 대한 위험에 있는 환자에서 질환을 치료하거나 또는 예방을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 메커니즘의 이해가 실행을 위해 필요하지는 않지만, 임의의 또는 모든 다음의 메커니즘은 상기 항체를 이용하는 TTR 아밀로이드증의 치료에 기여할 수 있는 것으로 여겨진다: TTR 응집 및 피브릴 형성의 항체-매개 저해, TTR의 비독성 입체배좌의 항체-매개 안정화(예를 들어, 사량체 형태), 또는 응집된 TTR, 올리고머 TTR 또는 단량체 TTR의 항체-매개 클리어런스. 항체-약물 컨쥬게이트는 접합된 모이어티에 의해 결정되는 추가적인 작용 메커니즘을 가질 수 있다.
항체는 개시를 지연시키고/시키거나 중증도를 감소시키고/시키거나, 추가적인 악화를 저해하고/하거나 치료 중인 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 개선시키는 투약량, 투여 경로 및 투여 빈도를 의미하는 유효한 요법으로 투여된다. 환자가 이미 장애로 고통받고 있다면, 요법은 치료적으로 유효한 요법으로서 지칭될 수 있다. 환자가 아직 증상을 경험하지는 않았지만 일반적인 집단에 비해 장애의 상승된 위험에 있다면, 요법은 예방적으로 유효한 요법으로서 지칭될 수 있다. 일부 예에서, 치료적 또는 예방적 효능은 동일한 환자에서의 이력 조절 또는 과거의 경험에 비교하여 개개 환자에서 관찰될 수 있다. 다른 예에서, 치료적 또는 예방적 효능은 비치료 환자의 대조군 집단에 비해 처리 환자의 집단에서의 전임상 또는 임상 시험에서 입증될 수 있다.
투여 빈도는 인자들 중에서도 순환 시 항체의 반감기, 환자의 병태 및 투여 경로에 의존한다. 빈도는 환자의 병태 또는 치료 중인 장애의 진행에 반응하여 매일, 매주, 매달, 분기별, 또는 비정기적 간격일 수 있다. 정맥내 투여의 예시적인 빈도는 다수 빈번한 투약이 또한 가능하지만, 치료의 지속적 원인에 따라 매주와 분기별 사이이다. 피하 투여를 위해, 예시적인 투약 빈도는 다소 빈번한 투약이 또한 가능하지만, 매일 내지 매달이다.
투여되는 투약량의 수는 장애가 급성 또는 만성인지의 여부, 치료에 대한 장애의 반응에 의존한다. 급성 장애 또는 만성 장애의 급성 악화에 대해, 1 내지 10회의 용량이 종종 충분하다. 때때로 선택적으로 분할된 형태의 단일 볼루스 용량은 급성 장애 또는 만성 장애의 급성 악화에 충분하다. 치료는 급성 장애 또는 급성 악화의 재발을 위해 반복될 수 있다. 만성 장애에 대해, 항체는 정기적 간격으로, 예를 들어, 적어도 1, 5 또는 10년 동안, 또는 환자의 수명 동안 매주, 40일마다, 매달, 분기별로, 6개월마다 투여될 수 있다.
VI. 약제학적 조성물 및 사용 방법
본 명세서에서 트랜스타이레틴(TTR)에 의해, 특히 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태(예를 들어, TTR 아밀로이드증)에 의해 적어도 부분적으로 매개된 질환 또는 병태를 진단, 모니터링, 치료하거나 또는 예방을 달성하는 몇몇 방법이 제공된다. 이러한 질환의 예는 가족성 TTR 아밀로이드증, 예컨대 가족성 아밀로이드 심근증(FAC), 가족성 아밀로이드성 다발신경병증(FAP) 또는 중추 신경계 선택적 아밀로이드증(CNSA) 및 산발적 TTR 아밀로이드증, 예컨대 노인성 전신 아밀로이드증(SSA) 또는 노인성 심장 아밀로이드증(SCA)을 포함한다. 상기 기재한 항체는 이러한 방법에서 사용하기 위해 약제학적 조성물 내로 혼입될 수 있다. 일반적으로, 항체 또는 항체를 함유하는 약제학적 조성물은 이들의 투여가 필요한 대상체에게 투여된다. 치료받을 수 있는 환자는 TTR 아밀로이드증의 위험에 있지만, 증상을 나타내지 않는 개체뿐만 아니라 현재 증상을 나타내는 환자를 포함한다. 일부 환자는 TTR 아밀로이드증의 전구증상 단계 동안 치료될 수 있다.
약제학적 조성물은 TTR 아밀로이드증의 알려진 유전적 위험을 갖는 개체에 대해 예방적으로 투여될 수 있다. 이러한 개체는 이러한 질환을 경험한 친척이 있는 개체, 및 위험이 본 명세서에 제공된 진단 방법을 이용하는 것을 포함하는 유전적 또는 생화학적 마커(예를 들어, TTR 아밀로이드증과 관련된 TTR의 돌연변이)의 분석에 의해 결정되는 개체를 포함한다. 예를 들어, TTR 아밀로이드증에 연루된 TTR을 암호화하는 유전자에서 100개 초과의 돌연변이가 있다. 예를 들어, 미국 특허 제2014/0056904호; 문헌[Saraiva, Hum. Mutat . 17(6):493-503 (2001); Damas and Saraiva, J. Struct . Biol . 130:290-299; Dwulet and Benson, Biochem. Biophys . Res. Commun . 114:657-662 (1983)] 참조.
TTR 아밀로이드증으로 고통받고 있는 개체는 때때로 다음 중 하나 이상을 포함하는 TTR 아밀로이드증의 임상 징후로부터 인식될 수 있다: (1) 특히 심부전과 관련된 신경병 질환의 가족력; (2) 알려지지 않은 병인의 신경병 통증 또는 진행성 감각 장애; (3) 분명한 원인이 없는 손목 터널 증후군(특히 그것이 양쪽성이며 수술적 복구를 필요로 한다면); (4) 알려지지 않은 병인의 위장 운동성 장애 또는 자율성 신경 기능장애(예를 들어, 발기성 기능장애, 기립성 저혈압, 신경인성 방광); (5) 고혈압 없이 두꺼워진 심실벽을 특징으로 하는 심장 질환; (6) 특히 두꺼워진 심장을 수반할 때 알려지지 않은 유래의 진행된 방실계 차단; 및 (6) 솜털 유형의 유리체 포함. 문헌[Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013)] 참조. 그러나, TTR 아밀로이드증의 최종적 진단은 전형적으로 표적 기관 생검, 다음에 아밀로이드-특이적 염료, 콩고 레드에 의한 절단 조직의 조직학적 염색에 의존한다. 아밀로이드에 대한 양성 검사가 관찰된다면, 아밀로이드 형성을 초래하는 전구체 단백질이 사실 TTR이라는 것을 보장하기 위해 TTR의 면역조직학적 염색 및 질량 분광학적 확인이 후속적으로 수행된다. 질환의 가족성 형태에 대해, 이어서, 최종적 진단이 이루어질 수 있기 전에 TTR을 암호화하는 유전자에서 돌연변이의 입증이 필요하다.
대상체의 동정은 임상 환경에서, 또는 그 밖에, 예컨대 대상체의 집에서, 예를 들어, 대상체 자신의 자가 시험 키트의 사용을 통해 일어날 수 있다. 예를 들어, 대상체는 다양한 증상, 예컨대 말초신경병증(감각 및 운동), 자율 신경병증, 위장관 장애, 심근병증, 신경병증 또는 안구 침착에 기반하여 동정될 수 있다. 문헌[Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013)] 참조. 대상체는 또한 실시예에 개시하는 바와 같이 대조군 샘플에 비해 대상체로부터의 혈장 샘플에서 TTR의 비천연 형태의 증가된 수준에 의해 동정될 수 있다.
가족력, 유전자 검사, 또는 TTR 아밀로이드증에 대한 의학적 선별에 의해 보장되는 바와 같이, 치료는 임의의 연령에 시작할 수 있다(예를 들어, 20, 30, 40, 50, 60 또는 70세). 치료는 전형적으로 시간 기간에 걸쳐 다회 투약량을 수반하고, 시간에 따라 치료제(예를 들어, 아미노산 잔기 89 내지 97을 포함하거나 또는 아미노산 잔기 101 내지 109를 포함하는 TTR의 절단된 형태)에 대한 항체 또는 활성화된 T-세포 또는 B-세포를 분석함으로써 모니터링될 수 있다. 반응이 떨어진다면, 부스터 투약량이 표시된다.
예방적 용도에서, 항체 또는 이의 약제학적 조성물은 위험을 감소시키거나, 중증도를 줄이거나 또는 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 개시를 지연시키는 데 유효한 요법(투여 용량, 빈도 및 경로)에서 질환(예를 들어, TTR 아밀로이드증)에 걸리기 쉽거나 또는 달리 위험에 있는 대상체에게 투여된다. 치료적 용도에서, 항체 또는 항체를 유도하기 위한 면역원은 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 개선시키거나 또는 징후 또는 증상의 추가적인 악화를 저해하는 데 유효한 요법(투여 용량, 빈도 및 경로)에서 질환(예를 들어, TTR 아밀로이드증)의 여지가 있거나, 또는 이미 질환으로 고통받고 있는 대상체에게 투여된다.
요법은 개개의 치료되는 대상체가 본 명세서에 개시된 방법에 의해 치료되지 않은 비슷한 대상체의 대조군 집단에서의 평균 결과보다 더 바람직한 결과를 달성한다면, 또는 더 바람직한 결과가 통제 임상 시험에서의 대조군 대상체(예를 들어, II상, II/III 상 또는 III 상 시험) 또는 p < 0.05 또는 0.01 또는 심지어 0.001 수준에서의 동물 모델에 비교한 처리 대상체에서의 요법에 대해 입증된다면 치료적 또는 예방적으로 유효한 것으로 고려된다.
항체의 유효 요법은, 예를 들어, TTR 축적과 관련된 병태가 있거나 또는 병태의 위험에 있는 대상체에서 TTR의 응집을 저해 또는 감소시키기 위해; TTR 축적과 관련된 병태가 있거나 또는 병태의 위험에 있는 대상체에서 TTR 피브릴 형성을 저해 또는 감소시키기 위해; TTR 축적과 관련된 병태가 있거나 또는 병태의 위험을 갖는 대상체에서 TTR 침착물 또는 응집된 TTR을 감소 또는 클리어런스하기 위해; TTR 축적과 관련된 병태가 있거나 또는 또는 병태의 위험을 갖는 대상체에서 TTR의 비독성 입체배좌를 안정화시키기 위해; TTR 축적과 관련된 병태가 있거나 또는 또는 병태의 위험을 갖는 대상체에서 TTR 응집, 피브릴 또는 침착물의 독성 효과를 저해하기 위해; 아밀로이드 축적을 포함하는 것으로 의심되는 조직에서 TTR 아밀로이드 축적의 존재 또는 부재를 진단하기 위해; 항체의 투여 후 대상체에서 결합된 항체의 존재를 검출함으로써 대상체에서 TTR 침착물의 수준을 결정하기 위해; 대상체에서 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태의 존재를 검출하기 위해; TTR 아밀로이드증으로 진단된 환자를 치료하기 위해 사용 중인 치료제의 효능을 모니터링 및 평가하기 위해; 대상체에서 TTR에 대한 항체를 포함하는 면역반응을 유발하기 위해; 대상체에서 TTR 아밀로이드 축적과 관련된 병태의 개시를 지연시키기 위해; 또는 환자에서 TTR 아밀로이드증을 치료하거나 또는 예방을 달성하기 위해 사용될 수 있다.
유효 용량은 다수의 상이한 인자, 예컨대 투여 수단, 표적 부위, 대상체의 생리학적 상태, 대상체가 인간 또는 동물인지의 여부, 투여되는 다른 의약, 및 치료가 예방적 또는 치료적인지의 여부에 따라 다르다.
항체에 대한 예시적인 용량 범위는 고정된 투약량으로서 약 0.1 내지 20, 또는 0.5 내지 5㎎/㎏ 체중(예를 들어, 0.5, 1, 2, 3, 4 또는 5㎎/㎏) 또는 10 내지 1500㎎일 수 있다. 투약량은 인자들 중에서도 환자의 병태 및 선행 치료에 대한 반응, 만약에 있다면, 치료가 예방적인지 또는 치료적인지의 여부 및 장애가 급성 또는 만성인지의 여부에 의존한다.
항체는 매일, 격일로, 매주, 격주, 매달, 분기별로 또는 경험적 분석에 의해 결정되는 임의의 다른 스케줄에 따라 이러한 용량이 투여될 수 있다. 예시적인 치료는 장기간, 예를 들어, 적어도 6개월에 걸쳐 다회 용량으로의 투여를 수반한다. 추가적인 예시적인 치료 요법은 2주마다 1회 또는 1개월에 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다.
항체는 주변 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여 경로는 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 척추강내, 복강내, 비강내 또는 근육내를 포함한다. 항체의 투여를 위한 경로는 정맥내 또는 피하일 수 있다. 정맥내 투여는, 예를 들어, 30 내지 90분과 같은 기간에 걸친 주입에 의할 수 있다. 이 주사 유형은 가장 전형적으로는 팔 또는 다린 근육에서 수행된다. 일부 방법에서, 제제는 침착물이 축적되는 특정 조직 내로 직접적으로 주사된다(예를 들어 두개내 주사).
비경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 멸균 및 실질적으로 등장성(250 내지 350mOsm/㎏ 물)이고, GMP 조건 하에 제조된다. 약제학적 조성물은 단위 용량 형태로(즉, 단일 투여를 위한 용량) 제공될 수 있다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 생리적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 이용하여 제형화될 수 있다. 제형은 선택된 투여 경로에 의존한다. 주사를 위해, 항체는 (주사 부위에서 불편함을 감소시키기 위해) 수용액 중에서, 예를 들어 생리적으로 적합한 완충제, 예컨대 행크스 용액, 링거 용액 또는 생리 식염수 또는 아세트산염 완충제 중에서 제형화될 수 있다. 용액은 제형화제, 예컨대 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로 항체는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 무발열원 수를 이용하는 구성을 위해 동결건조 형태일 수 있다.
요법은 치료 중인 질환의 치료 또는 예방에서 유효한 다른 제제와 동시에 또는 순차적으로, 병용하여 투여될 수 있다. 이러한 제제는 TTR의 발현을 저해하기 위한 siRNA 또는 빈다켈(Vyndaqel), 사량체 형성에서 TTR의 안정제를 포함할 수 있다. 이러한 제제는 TTR 사량체 안정제, 예컨대 타파미디스 또는 디플루니살(예를 들어, WO2011116123, 미국 특허 제9,150,489호 참조), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 IONIS-TTRRx(이노테센)과 같은 TTR 발현을 억제하기 위한 유전자 요법(예를 들어, 미국 특허 제8,101,743호, 제8,697,860호, 제9,061,044호, 및 제 9,399,774호; 일본 특허 제5896175호) 또는 siRNA, 예컨대 파티시란 또는 레부시란(예를 들어, WO2016033326 참조), 아밀로이드 분해 화합물, 예컨대 독시사이클린(doxy), 타우로우루소데옥시콜산(TUDCA), Doxy-TUDCA, 사이클로덱스트린(CyD), 4'-아이오도-4'-데옥시독소루비신(IDOX), 또는 혈청 아밀로이드 P 성분(SAP)에 대한 항체를 포함할 수 있다.
치료 중인 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 다른 제제는 본 명세서에 개시된 항체로 이전에 치료된 대상체에게 투여될 수 있다. 치료 주인 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 다른 제제로 치료된 대상체는 더 이상 본 명세서에 개시된 항체에 의한 치료를 받지 않을 수도 있다.
본 명세서에 개시된 항체에 의한 치료는 치료 중인 장애에 대해 유효한 다른 치료와 병용될 수 있다. 병용 치료는 함께 제형화되거나 또는 별개로 투여될 수 있다. 병용 치료에 유용한 치료의 일부 예는 9D5 또는 18C5와 상이한 에피토프에 결합하는 제2 항-TTR 항체, 예를 들어, 표 3에 개시된 바와 같은 항체를 포함한다.
치료 후에, 대상체의 병태는 이러한 치료의 진행 또는 효능을 결정하기 위해 평가될 수 있다. 이러한 방법은 바람직하게는 TTR 아밀로이드 수준 또는 TTR의 비천연 형태의 수준의 변화에 대해 시험한다. 예를 들어, TTR 아밀로이드 수준은 치료 전에 비슷한 환경 하의 대상체의 TTR 아밀로이드 수준에 대한 개선을 결정하기 위해 평가될 수 있다. 대상체의 TTR 아밀로이드 수준은 또한 비슷한 환경 하의 대조군 집단에 비교될 수 있다. 대조군 집단은 비치료 대상체 또는 정상 비치료 대상체(특히 대조군 대상체)와 유사하게 병으로 고생할 수 있다. 유사하게 병에 걸린, 비치료 대상체에 대한 개선 또는 비치료 정상 대상체의 수준에 접근 또는 도달하는 수준은 치료에 대한 양성 반응을 나타낸다.
TTR 아밀로이드 수준은 영상화 기법을 포함하는 다수의 방법에 의해 측정될 수 있다. 적합한 영상화 기법의 예는 방사성 표지된 TTR 또는 이의 단편을 이용하는 PET 스캐닝, TTR 항체 또는 이의 단편, 콩고-레드-기반 아밀로이드 영상화제, 예컨대, PIB(미국 특허 제2011/0008255호), 아밀로이드-영상화 펩타이드 p31(아밀로이드-영상화 펩타이드인 p31의 생체 분포는 콩고 레드 조직 염색에 기반한 아밀로이드 정량화와 상관 관계가 있다, 문헌[Wall et al., Abstract No. 1573, 2011 ISNM Annual Meeting]), 및 기타 PET 표지를 포함한다. TTR의 비천연 형태 수준은, 예를 들어, 대상체로부터의 혈장 샘플 또는 생검 샘플에 대해 본 명세서에 개시된 항체를 이용하는 SDS-PAGE/웨스턴 블롯 또는 메소 스케일 디스커버리 플레이트 분석을 수행하고, 실시예에 기재된 바와 같은 대조군 샘플을 비교함으로써 측정될 수 있다.
A. 진단 및 모니터링 방법
또한 TTR 침착 또는 TTR의 병원성 형태(예를 들어, TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태)와 관련된 질환을 앓고 있거나 또는 질환에 걸리기 쉬운 환자에서 TTR에 대한 면역 반응을 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본 명세서에 제공된 제제를 이용하여 치료적 및 예방적 치료 과정을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 수동 면역화 후에 항체 프로파일은 전형적으로 항체 농도에서 즉각적인 피크 다음에 지수함수형 붕괴를 나타낸다. 추가적인 용량 없이, 붕괴는 투여되는 항체의 반감기에 따라서 며칠 내지 몇 개월의 기간 내에 전처리 수준에 접근한다. 예를 들어, 일부 인간 항체의 반감기는 대략 20일이다.
일부 방법에서, 대상체에서 TTR에 대한 항체의 기준 측정은 투여 전에 이루어지고, 제2 측정은 최대 항체 수준을 결정하기 위해 이후에 곧 이루어지며, 1회 이상의 추가적인 측정이 항체 수준의 붕괴를 모니터링하기 위한 간격으로 이루어진다. 항체 수준이 기준 또는 기준 미만의 피크의 사전결정된 백분율(예를 들어, 50%, 25% 또는 10%)로 감소될 때, 항체의 추가적인 용량의 투여가 투여된다. 일부 방법에서, 피크 또는 배경 미만의 후속적인 측정 수준은 다른 대상체에서 유리한 예방적 또는 치료적 치료 요법을 구성하기 위해 이전에 결정된 기준 수준과 비교된다. 측정된 항체 수준이 기준 수준보다 상당히 더 적다면(예를 들어, 치료가 유리한 대상체 집단에서 기준 값의 평균 - 하나 또는 바람직하게는 두 표준 편차보다 적다면) 항체의 추가적인 용량의 투여가 표시된다.
또한, 예를 들어, 대상체로부터의 샘플에서 TTR 아밀로이드 또는 TTR의 병원성 형태(예를 들어, TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태)를 측정함으로써 또는 대상체에서 TTR의 생체내 영상화에 의해 대상체에서 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태를 검출하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 TTR의 이러한 병원성 형태와 관련된 질환(예를 들어, TTR 아밀로이드증)의 진단, 또는 그에 대한 감수성을 진단하거나 또는 확인하는 데 유용하다. 상기 방법은 또한 무증상 대상체에 대해 사용될 수 있다. TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태의 존재는 장래의 증상이 있는 질환에 대한 감수성을 나타낸다. 상기 방법은 또한 TTR 아밀로이드증으로 이미 진단된 대상체에서 질환 진행 및/또는 치료에 대한 반응을 모니터링하는 데 유용하다.
TTR 아밀로이드증을 갖거나, 갖는 것으로 의심되거나 또는 가질 위험에 있는 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플은 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태의 존재를 평가하기 위해 본 명세서에 개시된 항체와 접촉될 수 있다. 예를 들어, 이러한 대상체에서 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태의 수준은 건강한 대상체에서 존재하는 것에 비교될 수 있다. 대안적으로, 질환에 대한 치료를 받는 이러한 대상체에서 TTR 아밀로이드 또는 TTR의 병원성 형태(예를 들어, TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태) 수준은 TTR 아밀로이드증에 대해 치료되지 않은 대상체의 수준에 비교될 수 있다. 일부 이러한 시험은 이러한 대상체로부터 얻은 조직의 생검을 수반한다. ELISA 분석은 또한, 예를 들어, 유체 샘플에서 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태의 수준을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 일부 이러한 ELISA 분석은 TTR의 천연 사량체 형태에 비해 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태에 우선적으로 결합하는 항-TTR 항체를 수반한다.
일부 이러한 검사는 샌드위치 면역분석이다. 일부 이러한 면역분석은 메소 스케일 디스커버리(MSD) 전기화학발광 플랫폼(메릴랜드주 락빌에 소재한 메소 스케일 다이아그노스틱스)을 사용한다. 일부 이러한 면역분석, 예를 들어, MSD 분석(메릴랜드주 락빌에 소재한 메소 스케일 다이아그노스틱스)은 리포터 항체에 전기화학발광 표지를 사용한다. 예를 들어, 리포터 항체는 설포-태그 표지(메릴랜드주 락빌에 소재한 메소 스케일 다이아그노스틱스)로 표지될 수 있다. 전기화학발광 분석에서 유용한 플레이트는 전극(예를 들어, MSD 플레이트(메릴랜드주 락빌에 소재한 메소 스케일 다이아그노스틱스)을 혼입시킬 수 있다. 전기화학발광 분석에서 유용한 플레이트는 각각의 웰(예를 들어, MSD 플레이트(메릴랜드주 락빌에 소재한 메소 스케일 다이아그노스틱스))의 바닥에 전극을 혼입시킬 수 있다. 일부 분석은 표지된 포획 항체를 사용한다. 예를 들어, 표지된 포획 항체는 9D5 또는 18C5 또는 이의 인간화된, 키메라, 또는 베니어 변이체일 수 있다. 일부 분석은 표지된 리포터 항체를 사용한다. 예를 들어, 표지된 리포터 항체는 9D5 또는 18C5 또는 이의 인간화된, 키메라, 또는 베니어 변이체일 수 있다. 표지된 리포터 항체는 또한 표 3의 항체, 또는 인간화된, 키메라, 또는 베니어 변이체일 수 있다. 표지된 리포터 항체는 입체배좌 특이성 없이 TTR에 결합하는 항체일 수 있다. 실시형태에서, 입체배좌 특이성 없이 TTR에 결합하는 항체는 8C3 또는 7G7 또는 이의 인간화된, 키메라, 또는 베니어 변이체일 수 있다(예를 들어, WO 2016/120811). 실시형태에서, 입체배좌 특이성 없이 TTR에 결합하는 항체는 다클론성 항체일 수 있다. 실시형태에서, 다클론성 항체는 다클론성 토끼 항-인간 프레알부민이다(카탈로그 번호 A000202-2, 다코(Dako), 캘리포니아주 산타 클라라에 소재한 애질런트 테크놀로지즈 인코포레이티드(Agilent Technologies, Inc)). 실시형태에서, 다클론성 토끼 항-TTR 항체는 시그마(Sigma), 카탈로그 번호 HPA002550(미주리주 세인트루이스에 소재한 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich))이다.
일부 분석은 샘플에서 모든 미스폴딩된 TTR을 검출한다(즉, 단량체 및 다량체를 포함하는 TTR의 모든 미스폴딩 형태). 다른 분석은 단량체 미스폴딩된 TTR 또는 다량체 미스폴딩된 TTR을 특이적으로 검출한다. 다른 분석은 TTR의 모든 형태(미스폴딩된 형태 및 천연 사량체 형태)를 검출한다. 일부 이러한 분석은 TTR의 잔기 89 내지 97 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 또는 TTR의 잔기 101 내지 109 내의 에피토프 및 TTR의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체를 사용하되; 미스폴딩된 TTR이 샘플에 존재한다면, 포획 항체 및 리포터 항체는 샌드위치 복합체를 형성하는 미스폴딩된 TTR에 결합하고; 미스폴딩된 TTR에 결합하는 리포터 항체의 검출은, 만약에 있다면, 샘플에 존재하는 TTR의 모든 미스폴딩된 형태의 존재 또는 부재를 나타낸다. 이러한 리포터 항체는 18C5, 9D5, 14G8, 5A1, 6C1, AD7F6, RT24, NI-301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD107, MFD108, MFD109, MFD111, MFD114, 또는 이들의 키메라 형태 또는 인간화된 형태를 포함할 수 있다. 이러한 리포터 항체는 TTR의 잔기 89 내지 97, 101 내지 109, 118 내지 122, 115- 124, 53 내지 63, 54 내지 61, 36 내지 49, 49 내지 61, 109 내지 121, 30 내지 66, 70 내지 127, 80 내지 127, 90 내지 127, 100 내지 127, 110 내지 127 또는 115 내지 127 내에서 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 이러한 리포터 항체는 8C3 또는 7G7을 포함할 수 있다(예를 들어, WO 2016/120811 참조). 이러한 리포터 항체는 다클론성 토끼 항-인간 프레알부민(카탈로그 번호 A000202-2, 다코, 캘리포니아주 산타 클라라에 소재한 애질런트 테크놀로지즈 인코포레이티드) 또는 다클론성 토끼 항-TTR 항체(시그마(Sigma), 카탈로그 번호 HPA002550, 미주리주 세인트루이스에 소재한 시그마-알드리치)를 포함할 수 있다. 일부 이러한 분석은 TTR의 9D5 에피토프 내의 위치 89에서 돌연변이를 운반하는 유전성 TTR 아밀로이드증 환자로부터의 생물학적 샘플에서 TTR의 미스폴딩된 형태를 검출한다. 예시적인 돌연변이는 E89K TTR 및 E89Q TTR이다. 일부 이러한 분석은 9D5 포획 항체 및 다클론성 항-TTR 리포터 항체 또는 18C5 리포터 항체를 사용한다.
일부 분석은 샘플에서 미스폴딩된 TTR의 다량체 형태를 검출한다. 이러한 분석은 단량체 미스폴딩된 TTR 이상으로 우선적으로 또는 배타적으로 다량체 미스폴딩된 TTR을 검출하도록 배치될 수 있다. 일부 이러한 분석은 TTR의 잔기 89 내지 97 또는 101 내지 109내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 잔기 89 내지 97 또는 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체를 사용한다. 포획 항체와 리포터 항체의 이러한 조합은 단량체 이상으로 다량체 TTR에 대해 우선적으로 또는 배타적으로 결합할 수 있는데, TTR의 다중 복제물이 항체 결합에 대한 다중 에피토프를 제공하기 때문이다. 다량체 미스폴딩된 TTR에 대한 리포터 항체 결합의 검출은, 만약에 있다면, 다량체 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타낸다. 일부 이러한 분석에서, 리포터 항체는 TTR에 대한 결합에 대해 포획 항체와 경쟁하고/하거나 리포터 항체 및 포획 항체는 TTR의 동일 또는 중복되는 에피토프에 결합한다. 일부 이러한 분석에서, 포획 항체는 다량체 미스폴딩된 TTR에서 제1 미스폴딩된 TTR 분자에 결합하고, 리포터 항체는 다량체 미스폴딩된 TTR에서 제2 미스폴딩된 TTR 분자에 결합한다. 포획 항체와 리포터 항체 간의 결합에 대한 경쟁은 (경쟁이 중복 에피토프 또는 입체장애의 결과인지의 여부에 따라서) 단량체 미스폴딩된 TTR의 동시 결합 및 검출을 불가능하게 하거나 또는 적어도 감소시킨다. 일부 이러한 분석에서, 다량체 TTR에서 제2 미스폴딩된 TTR 분자에 결합하는 리포터 항체 결합의 검출은 다량체 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타낸다.
본 명세서에 개시된 항체는 생물학적 샘플에서 총 다량체 미스폴딩된 트랜스타이레틴(TTR) 수준 대 총 미스폴딩된 TTR 수준의 비를 결정하는 방법에서 사용될 수 있다. 생물학적 샘플의 제1 부분은 제1 분석에서 샘플에서의 모든 미스폴딩된 TTR(즉, 단량체 및 다량체를 포함하는 TTR의 모든 미스폴딩된 형태)에 대해 분석될 수 있되, 단량체 미스폴딩 및 다량체 미스폴딩된 TTR이 검출된다. 제1 분석은 TTR의 잔기 89 내지 97 또는 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체를 사용할 수 있다. 미스폴딩된 TTR이 샘플에 존재한다면, 포획 항체 및 리포터 항체는 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성한다. 미스폴딩된 TTR에 결합하는 리포터 항체의 검출은, 만약에 있다면, 샘플에서 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타낸다. 생물학적 샘플의 제2 부분은 단량체 미스폴딩된 TTR 이상으로 다량체 미스폴딩된 TTR을 우선적으로 검출하는 제2 분석에서 생물학적 샘플에서 미스폴딩된 TTR의 다량체 형태에 대해 분석될 수 있다. 제2 분석은 TTR의 잔기 89 내지 97 또는 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 잔기 89 내지 97 또는 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체를 사용할 수 있다. 다량체 미스폴딩된 TTR이 샘플에 존재한다면, 포획 항체 및 리포터 항체는 다량체 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성한다. 포획 및 리포터 항체는 동시에 다량체 미스폴딩된 TTR에 우선적으로 또는 배타적으로 결합하여, 만약에 있다면, 다량체 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타낼 수 있다. 일부 이러한 분석에서, 리포터 항체는 TTR에 대한 결합에 대해 포획 항체와 경쟁하거나 또는 포획 항체와 동일하거나 또는 중복되는 에피토프에 결합한다. 일부 이러한 분석에서, 포획 항체는 다량체 미스폴딩된 TTR에서 제1 미스폴딩된 TTR 분자에 결합하고, 리포터 항체는 다량체 미스폴딩된 TTR에서 제2 미스폴딩된 TTR 분자에 결합한다. 포획 항체와 리포터 항체 사이의 결합에 대한 경쟁은 (경쟁이 중복 에피토프 또는 입체장애의 결과인지의 여부에 따라서) 단량체 미스폴딩 TTR의 동시 결합 및 검출을 불가능하게 하거나 또는 적어도 감소시킨다. 일부 이러한 분석에서, 다량체 TTR에서 제2 미스폴딩된 TTR 분자에 결합하는 리포터 항체 결합의 검출은 다량체 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타낸다. 일부 분석에서, 다량체 미스폴딩된 TTR 대 모든 미스폴딩된 TTR의 비가 계산된다.
본 명세서에 개시된 항체는 또한 생물학적 샘플에서 모든 미스폴딩된 TTR 대 총 TTR(미스폴딩된 형태 및 천연 사량체 형태) 수준의 비를 결정하는 방법에서 사용될 수 있다. 생물학적 샘플의 제1 부분은 제1 분석에서 샘플에서 모든 미스폴딩된 TTR(즉, 단량체 및 다량체를 포함하는 TTR의 모든 미스폴딩된 형태)에 대해 분석될 수 있되, 단량체 미스폴딩 및 다량체 미스폴딩 TTR이 검출된다. 제1 분석은 TTR의 잔기 89 내지 97 또는 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체를 사용할 수 있다. 미스폴딩된 TTR이 샘플에 존재한다면, 포획 항체 및 리포터 항체는 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성한다. 미스폴딩된 TTR에 대한 리포터 항체 결합의 검출은, 만약에 있다면, 샘플에서의 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타낸다. 생물학적 샘플의 제2 부분은 제2 분석에서 총 TTR (미스폴딩된 형태 및 천연 사량체 형태)에 대해 분석될 수 있되, 총 TTR은 검출된다. 제2 분석은 입체배좌 특이성 없이 TTR에 결합하는 포획 항체 및 입체배좌 특이성 없이 TTR에 결합하는 리포터 항체를 사용할 수 있다. TTR이 샘플에 존재한다면, 포획 항체 및 리포터 항체는 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성한다. TTR에 대한 리포터 항체의 검출은, 만약에 있다면, 샘플에 존재하는 TTR의 존재 또는 부재를 나타낸다. 모든 미스폴딩된 TTR 대 총 TTR (미스폴딩된 형태 및 천연 사량체 형태)의 비가 계산될 수 있다.
생체내 영상화 방법은 시약, 예컨대 대상체에서 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태에 결합하는 항체를 투여하고, 이어서, 그것이 결합된 후에 시약을 검출함으로써 작업할 수 있다. 이러한 항체는 전형적으로 TTR의 잔기 89 내지 97 또는 101 내지 109 내의 에피토프에 결합한다. 원한다면, 클리어런스 반응은 전장 불변 영역, 예컨대 Fab가 없는 항체 단편을 이용함으로써 회피될 수 있다. 일부 방법에서, 동일한 항체는 치료와 진단 시약 둘 다로서 작용할 수 있다.
진단 시약은 대상체의 신체 내로 정맥내 주사에 의해 또는 합리적인 것으로 여겨지는 다른 경로를 통해 투여될 수 있다. 시약의 용량은 치료 방법과 동일한 범위 내이어야 한다. 전형적으로, 일부 방법에서, TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태에 대한 친화도를 지니는 1차 시약은 비표지이며, 2차 표지 시약은 1차 시약에 결합하기 위해 사용되지만, 시약은 표지된다. 표지의 선택은 검출 수단에 따른다. 예를 들어, 형광 표지는 광학 검출에 적합하다. 상자성 표지의 사용은 수술적 개입이 없는 단층 촬영 검출에 적합하다. 방사성 표지는 또한 PET 또는 SPECT를 이용하여 검출될 수 있다.
진단은 표지된 좌위의 수, 크기 및/또는 강도를 대응하는 기초선 값과 비교함으로써 수행된다. 기초선 값은 병이 없는 개체 집단에서의 평균값을 나타낸다. 기초선 값은 또한 동일한 대상체에서 결정된 이전의 수준을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 기초선 값은 치료를 시작하기 전에 대상체에서 결정될 수 있고, 기초선 값과 비교하여 이후에 값이 측정될 수 있다. 기초선에 대한 값의 감소는 일반적으로 치료에 대한 긍정적 반응을 암시한다.
미스폴딩된 TTR, 다량체 미스폴딩된 TTR, 트랜스타이레틴 침착물, 항-TTR 항체 결합 등 등의 양 변화의 모니터링은 치료에 반응한 치료 요법의 조절을 가능하게 한다. 이어서, 결정은 치료를 조절하는지의 여부 및 목적하는 치료가 모니터링에 반응하여 조절될 수 있는지의 여부로 이루어질 수 있다. 상당한 변화는 치료가 유리한 효과를 초래하거나 초래하지 않았다는 일부 증거를 기저값에 대한 치료 후 매개변수 값의 비교로 제공한다는 것을 의미한다. 일부 예에서, 환자 자신에서 매개변수 값의 변화는 치료가 유리한 효과를 초래하거나 초래하지 않는다는 증거를 제공한다. 다른 예에서, 환자에서의 값의 변화는, 만약에 있다면, 치료를 받지 않은 대표적인 대조군 환자 집단에서의, 만약에 있다면, 값의 변화와 비교된다. 대조군 환자에서 정상으로부터 특정 환자에서의 반응 차이(예를 들어, 평균 + 표준 편차의 분산)는 또한 치료 요법이 환자에서 유리한 효과를 달성하거나 달성하지 않는다는 증거를 제공할 수 있다. 상기 TTR 매개변수의 변화는 또한 치료를 조절하는지의 여부 및 조절하는 방법을 결정함에 있어서 징후 또는 증상의 다른 변화(들), 예컨대 부작용과 조합될 수 있다.
일부 환자에서, 모니터링은 미스폴딩된 TTR, 다량체 미스폴딩된 TTR, 트랜스타이레틴 침착물 또는 항-TTR 항체 결합의 양이 앞서 검출된 것과 동일하거나 더 크다는 것을 나타낸다. 이러한 환자에서, 허용 가능하지 않은 부작용이 있다면, 치료 요법은 있는 그대로 계속될 수 있거나 또는 이미 최대 권장 용량이 아니라면, 투여 빈도 및/또는 용량이 심지어 증가될 수 있다.
일부 환자에서, 모니터링은 미스폴딩된 TTR, 미스폴딩된 다량체 TTR, 트랜스타이레틴 침착물, 항-TTR 항체 결합 등의 양에서 검출 가능한 감소를 나타내지만, 미스폴딩된 TTR, 다량체 미스폴딩된 TTR, 트랜스타이레틴 침착물 또는 항-TTR 항체 결합의 양은 정상 초과로 남아있다. 이러한 환자에서, 허용 가능하지 않은 부작용이 없다면, 치료 요법은 있는 그대로 계속될 수 있거나 또는 이미 최대 권장 용량이 아니라면, 투여 빈도 및/또는 용량이 심지어 증가될 수 있다. 대안적으로 일부 이러한 환자에서, 치료 요법은 중단되고 다른 제제, 예컨대 TTR 사량체 안정제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 치료제, RNA 간섭(RNAi) 기반 치료제 또는 독시사이클린 + 타우로우루소데옥시콜산에 의한 치료로 대체될 수 있다.
환자에서 미스폴딩된 TTR, 다량체 미스폴딩된 TTR, 트랜스타이레틴 침착물, 항-TTR 항체 결합 등의 양이 미스폴딩된 TTR, 다량체 미스폴딩된 TTR, 트랜스타이레틴 침착물의 양, 또는 항-TTR 항체 결합의 양의 정상 수준에서 또는 근처에서 이미 감소되었다는 것을 모니터링이 나타낸다면, 치료 요법은 유도 중 하나(즉, 미스폴딩된 TTR, 다량체 미스폴딩된 TTR, 트랜스타이레틴 침착물, 또는 항-TTR 항체 결합의 양 수준을 감소시킴)로부터 유지 중 하나(즉, 미스폴딩된 TTR, 다량체 미스폴딩된 TTR, 트랜스타이레틴 침착물, 또는 항-TTR 항체 결합의 양을 거의 일정한 수준으로 유지함)까지 조절될 수 있다. 이러한 요법은 치료 투여의 용량 및 또는 빈도를 감소시킴으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 일부 이러한 환자에서, 치료 요법은 다른 제제, 예컨대 TTR 사량체 안정제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 치료제, RNA 간섭(RNAi) 기반 치료제 또는 독시사이클린 + 타우로우루소데옥시콜산에 의한 치료로 대체될 수 있다.
다른 환자에서, 모니터링은 치료 요법이 일부 유리한 효과를 갖지만 차선의 효과라는 것을 나타낼 수 있다. 최적의 효과는 요법을 시작한 후에 주어진 시간에 치료 요법을 받고 있는 환자의 대표적인 샘플에 의해 경험되는 미스폴딩된 TTR, 다량체 미스폴딩된 TTR, 트랜스타이레틴 침착물의 양, 또는 항-TTR 항체 결합의 양 변화의 상위 1/2 또는 1/4 내에서 미스폴딩된 TTR, 다량체 미스폴딩된 TTR, 트랜스타이레틴 침착물, 또는 항-TTR 항체 결합 양의 감소 백분율로서 정의될 수 있다. 더 적은 감소를 경험하는 환자 또는 미스폴딩된 TTR, 다량체 미스폴딩된 TTR, 트랜스타이레틴 침착물, 또는 항-TTR 항체 결합 양이 일정하게 남아있거나 또는 심지어 증가되지만, 치료 요법의 부재(예를 들어, 치료 요법을 투여하지 않은 대조군 환자로부터 추론되는 바와 같음)에서 예상되는 것보다 더 적은 환자는 양성이지만 차선의 반응을 경험하는 것으로 분류될 수 있다. 이러한 환자는 선택적으로 제제의 투여 용량 및 또는 빈도가 증가되는 요법의 조절에 대한 대상체일 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로 상향 조절이 개선된 반응을 초래하지 않는다면, 일부 이러한 환자에서, 치료 요법은 중단될 수 있고, 다른 제제, 예컨대 TTR 사량체 안정제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 치료제, RNA 간섭(RNAi) 기반 치료제 또는 독시사이클린 + 타우로우루소데옥시콜산에 의한 치료로 대체될 수 있다.
일부 환자에서, 미스폴딩된 TTR, 다량체 미스폴딩된 TTR, 트랜스타이레틴 침착물, 또는 항-TTR 항체 결합의 양은 치료를 받지 않는 환자에서의 미스폴딩된 TTR, 다량체 미스폴딩된 TTR, 트랜스타이레틴 침착물, 또는 항-TTR 항체 결합에 유사하거나 또는 더 큰 방식으로 증가할 수 있다. 이러한 증가가 일정 시간에 걸쳐 지속된다면, 1종 이상의 다른 제제에 의한 치료가 바람직한 경우에 치료는 중단될 수 있다.
본 명세서에 개시된 항체에 의한 진단 방법은 9D5 또는 18C5와 상이한 에피토프에 결합하는 제2 항-TTR 항체, 예를 들어, 표 3에 개시된 항체와 조합하여 수행될 수 있다.
본 명세서에 개시된 분석은 또한 치료에서 사용 중이거나 또는 치료에서 사용하기 위해 시험되는 항체에 의해 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 비결합(유리) 미스폴딩된-TTR의 표적 맞물림(약력학 효과)을 평가하는 데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 이의 표적 맞물림에 대해 시험되고 있기 때문에 시험 항체로서 본 분석에서 언급된다. 본 분석에서, 수집된 샘플의 다중 분취액의 병행 방식에서 분석이 실행될 수 있도록 생물학적 샘플은 수집된 샘플로서 지칭되는 더 큰 샘플의 분취액일 수 있다. 시험 항체는 TTR에 대한 결합을 위해 포획 항체(또는 대안적으로 리포터 항체)와 경쟁한다. 시험 항체는 포획 항체(또는 리포터 항체)와 동일한 에피트포에 결합할 수 있다. 상기 기재한 샌드위치 분석은 보통 동일한 용적을 갖는, 수집 샘플의 제1 분취액과 제2 분취액에 병행하여 실행될 수 있다. 하나의 분취액은 시험 항체로 보충되고, 분취액 둘 다 포획 항체와 리포터 항체로 보충된다. 시험 항체가 없는 분취액에서, 샌드위치의 부분으로서 리포터 항체의 검출은 샘플에서 미스폴딩된 TTR의 존재 및 양의 표시를 제공한다. 시험 항체가 있는 분취액에서, 시험 항체가 없는 분취액에 비해 샌드위치의 부분으로서 감소된 양의 리포터 항체 검출은 시험 항체의 표시가 미스폴딩된 TTR에 대한 결합이고, 이에 의해 포획 항체 또는 리포터 항체와 경쟁하며, 포획 항체, 미스폴딩된 TTR과 리포터 항체 사이의 샌드위치 형성을 감소시킨다는 표시를 제공한다. 이러한 분석은 미스폴딩된 TTR에 대한 시험 항체의 결합을 추가로 특성규명하기 위해 증가된 양의 시험 항체(뿐만 아니라 포획 항체)를 함유하는 추가적인 분취액 상에서 수행될 수 있다. 샘플은 TTR 아밀로이드증을 갖는 대상체로부터 유래될 수 있다. 샘플은 유전성 TTR 아밀로이드증을 갖는 대상체로부터 유래될 수 있다. 유전성 TTR 아밀로이드증을 갖는 대상체는 V30M, Y114C, G47R, S50I, E61L, T49S, F33V, A45T, E89K, E89Q 및 V122I로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 운반할 수 있다. 일부 이러한 분석에서, 생물학적 샘플은 혈장 샘플이다. 일부 이러한 분석에서, 분석은 9D5 또는 18C5 포획 항체 및 다클론성 항-TTR 리포터 항체를 이용하여 수행된다. 이러한 분석은 본 명세서에 개시된 바와 같은 치료적 사용을 위해 의도되는 항체의 임상 시험에서 표적 맞물림을 알아내는 데 사용될 수 있다. 일부 이러한 분석에서, 시험 항체는 14G8이고, 분석은 9D5 또는 18C5 포획 항체 및 다클론성 항-TTR 리포터 항체에 의해 수행된다.
본 명세서에 개시된 분석은 TTR의 미스폴딩된 형태를 표적화하는 요법의 약력학적 효과를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 이러한 분석에서, 생물학적 샘플에서 비결합(유리) mis-TTR의 표적 맞물림은 시험 항체를 갖는 생물학적 샘플의 생체외 치료(섞임) 후에 측정된다. 본 명세서에 개시된 분석은 또한 환자에서 시험 항체의 효능을 측정하는 데 사용될 수 있다. 생물학적 샘플은 시험 항체에 의한 치료 전에 그리고 후에 환자로부터 수집된다. 일부 이러한 분석에서, 생물학적 샘플에서 비결합(유리) mis-TTR의 표적 맞물림은 시험 항체를 이용하는 환자의 생체내 치료 전에 그리고 후에 측정된다. 일부 분석에서, 시험 항체의 표적은 TTR의 잔기 89 내지 97 내의 에피토프이다. 일부 분석에서, 시험 항체의 표적은 TTR의 잔기 101 내지 109 내의 에피토프이다.
본 방법은 또한 비-TTR 아밀로이드증, 예를 들어, 1차 전신성 아밀로이드증으로도 알려진 아밀로이드 경쇄(AL) 아밀로이드증과 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증의 구별을 가능하게 한다.
IX. 키트
본 발명은 추가로 본 명세서에 개시된 9D5 또는 18C5 항체 및 관련된 물질, 예컨대 사용을 위한 설명서(예를 들어, 패키지 삽입물)을 포함하는 키트(예를 들어, 용기)를 제공한다. 사용을 위한 설명서는, 예를 들어, 항체 및 선택적으로 1종 이상의 추가적인 제제의 투여를 위한 설명서를 포함할 수 있다. 항체의 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다회 용량 패키지) 또는 하위 단위 용량일 수 있다.
패키지 삽입물은 이러한 치료적 제품의 지시사항, 용법, 투약량, 투여, 사용 금지 사유 및/또는 사용에 관한 경고에 대한 정보를 포함하는 치료적 제품의 상업적 패키지에 관례적으로 포함되는 설명서를 지칭한다.
키트는 또한 약제학적으로-허용 가능한 완충제, 예컨대 주사용 정균수(BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 이는 또한 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 포함하는 상업적 및 사용자 견지로부터 바람직한 다른 물질을 포함한다.
X. 다른 용도
항체는 연구에서 임상 진단 또는 치료와 관련하여 트랜스타이레틴(TTR), 또는 이의 단편의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 생물학적 샘플이 TTR 아밀로이드 침착물을 포함한다는 표시로서 생물학적 샘플 중의 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 생물학적 샘플에 대한 항체의 결합은 대조군 샘플에 대한 항체의 결합에 비교될 수 있다. 대조군 샘플 및 생물학적 샘플은 동일한 조직 유래의 세포를 포함할 수 있다. 대조군 샘플 및 생물학적 샘플은 동일한 개체 또는 상이한 개체로부터 그리고 동일한 경우에 또는 상이한 경우에 얻을 수 있다. 원한다면, 다중 생물학적 샘플 및 다중 대조군 샘플은 샘플 간의 차이와 독립적인 무작위 변이에 대한 보호를 위해 다수의 경우에 대해 평가된다. 이어서, 생물학적 샘플(들)에 대한 항체 결합(즉, TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태의 존재)이 대조군 샘플(들)에 대한 항체 결합과 비교하여 증가되거나, 감소되거나 또는 동일한지의 여부를 결정하기 위해 생물학적 샘플(들)과 대조군 샘플(들) 간에 직접적인 비교가 이루어질 수 있다. 대조군 샘플(들)에 비해 증가된 생물학적 샘플에 대한 항체의 결합(들)은 생물학적 샘플(들) 중에서 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태의 존재를 나타낸다. 일부 예에서, 증가된 항체 결합은 통계적으로 유의하다. 선택적으로, 생물학적 샘플에 대한 항체 결합은 대조군 샘플에 대한 항체 결합보다 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배 또는 100배 더 높다.
추가로, 항체는 TTR 아밀로이드증으로 진단된 환자를 치료하기 위해 사용 중인 치료제의 효능을 모니터링 및 평가하기 위해 생물학적 샘플 중의 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다. TTR 아밀로이드증으로 진단된 환자로부터의 생물학적 샘플은 치료제에 대한 요법을 시작하기 전에 샘플에 대한 항체의 결합에 대한 기준(즉, 샘플 중의 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태의 존재에 대한 기준)을 확립하기 위해 평가된다. 일부 예에서, 환자로부터의 다중 생물학적 샘플은 치료와 독립적인 기준과 무작위 변이의 측정을 둘 다 확립하기 위해 다수의 경우에 대해 평가된다. 이어서, 치료제는 요법에서 투여된다. 요법은 시간 기간에 걸쳐서 제제의 다회 투여를 포함할 수 있다. 선택적으로, 항체의 결합(즉, TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태의 존재)은 무작위 변이의 측정을 확립하기 위해 그리고 면역요법에 반응하는 경향을 나타내기 위해 환자로부터의 다중 생물학적 샘플에서 다수의 경우에 대해 평가한다. 이어서, 생물학적 샘플에 대한 항체 결합의 다양한 평가를 비교한다. 단지 2회의 평가가 이루어지면, 항체 결합(즉, TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태의 존재)이 두 평가 사이에서 증가되거나, 감소되거나 또는 동일하게 남아있는지의 여부를 결정하기 위해 두 평가 사이의 직접적인 비교가 이루어질 수 있다. 2회 초과의 측정이 이루어지면, 측정은 치료제에 의한 치료 전에 시작하고 요법 과정을 통해 진행되는 시간 과정으로서 분석될 수 있다. 생물학적 샘플에 대한 항체 결합이 감소된 환자에서(즉, TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태의 존재), 치료제는 환자에서의 TTR 아밀로이드증을 치료하는 데 효과적이라는 결론을 내릴 수 있다. 항체 결합의 감소는 통계적으로 유의할 수 있다. 선택적으로, 결합은 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 감소한다. 항체 결합의 평가는 TTR 아밀로이드증의 다른 징후 및 증상을 평가하는 것과 함께 이루어질 수 있다.
항체는 또한 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태 또는 이의 단편을 검출함에 있어서 실험실 연구를 위한 연구 시약으로서 사용될 수 있다. 이러한 용도에서, 항체는 형광 분자, 스핀 표지 분자, 효소 또는 방사성 동위원소로 표지될 수 있고, 검출 분석을 수행하기 위한 모든 필요한 시약과 함께 키트의 형태로 제공될 수 있다. 항체는 또한 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태, 또는 TTR의 단량체, 미스폴딩, 응집 또는 피브릴 형태의 결합 상대를, 예를 들어, 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하기 위해 사용될 수 있다.
항체는 또한 생물학적 샘플에서 TTR의 응집을 저해 또는 감소시키거나, TTR 피브릴 형성을 저해 또는 감소시키거나, TTR 침착 또는 TTR 응집을 감소 또는 클리어런스하거나, 또는 TTR의 비독성 입체배좌를 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 생물학적 샘플은, 예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장 또는 조직(예를 들어, 심장, 말초신경계, 자율신경계, 신장, 눈, 복부 지방 또는 위장관으로부터의 조직)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, TTR 응집, TTR 피브릴 형성 또는 TTR 침착물은 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% 또는 75%(예를 들어, 10% 내지 75% 또는 30% 내지 70%)만큼 저해 또는 감소된다. 피브릴 형성을 검출하기 위한 분석은 본 명세서의 다른 곳에 기재되어 있다. 또한 미국 특허 제2014/0056904호 참조.
상기 또는 이하에 인용되는 모든 특허 출원, 웹사이트, 다른 간행물, 수탁번호 등은 각각의 개개 항목이 참조로 포함되기 위해 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그들의 전문이 참고로 포함된다. 서열의 상이한 형태가 상이한 시간의 수탁 번호와 관련된다면, 본 출원의 유효한 출원일의 수탁 번호와 관련된 형태를 의미한다. 유효한 출원일은 적용 가능하다면 수탁 번호에 관한 실제 출원일 또는 우선권 출원의 출원일 중 빠른 것을 의미한다. 마찬가지로, 상이한 형태의 간행물, 웹사이드 등이 상이한 시간에 공개된다면, 달리 표시되지 않는 한, 본 출원의 유효한 출원일에 가장 최근에 발행된 형태를 의미한다. 본 발명의 임의의 특징, 단계, 요소, 실시형태 또는 양상은 달리 구체적으로 표시되지 않는 한 임의의 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명은 분명함 및 이해의 목적을 위해 예시 및 실시예에 의해 일부 상세하게 기재되었지만, 특정 변화 및 변형이 첨부하는 청구범위의 범주 내에서 실행될 수 있다는 것은 분명할 것이다.
실시예
실시예 1. 물질 및 시약 제조
Figure pct00006
시약 제제
20M 과량 대신 사용한 항체에 대해 10M 과량의 NHS-바이오틴(써모-피셔(Thermo-Fisher) 카탈로그 21329)을 제외하고, 제조업자의 설명서에 따라 PBS 중에서 9D5: 1㎎/㎖ 9D5의 바이오틴일화로 바이오틴일화시켰다.
토끼 항-TTR pAb: 항체(카탈로그 번호 A000202-2, 다코, 캘리포니아주 산타 클라라에 소재한 애질런트 테크놀로지즈, 인코포레이티드)의 설포-태그를 PBS에서 1㎎/㎖로 희석시키고, 이어서, 제바(Zeba) 스핀 칼럼(써모피셔 사이언티픽)을 이용하여 탈염시켰다. 50㎕의 차가운 H2O를 설포-태그에 첨가하여 재구성하고, 이어서, 물질을 교반시켰다. 2.2㎕의 재구성된 설포-태그를 50㎕의 희석 항체에 첨가하고 나서, 교반시키고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시키고 나서, 4℃의 암실에서 저장하였다.
구아니딘 HCl 미스폴딩된-TTR 표준의 제조: 24시간 동안 4℃에서 6M 구아니딘 염산염을 함유하는 1× PBS에서 1㎎/㎖의 정제된 재조합 인간 야생형 TTR을 인큐베이션시킴으로써 변성된 인간 TTR을 제조하였고, 이어서, 분취시키고 나서, -70℃에서 냉동시켰다.
실시예 2. 혈장에서 유리 미스폴딩-TTR의 변성을 위한 ECL 방법
단량체를 포함하는 유리(비결합) 미스폴딩된-TTR을 정량적 ECL(메소 스케일 디스커버리: MSD) 분석 연구 방법을 이용하여 인간 혈장에서 검출하였다. 96-웰 MSD 플레이트를 PBS에서 4㎍/㎖ 뉴트라비딘의 웰당 30㎕로 코팅시키고 나서, 밤새 4℃에서 인큐베이션시키고, 0.05% 트윈(Tween) 20을 함유하는 TBS에서 3회 세척하였다. 플레이트는 실온에서 1시간 동안 진탕시키면서 PBS에서 3% MSD 차단제 A(MSD#: R93BA-4)로 차단시킨 비특이적 결합 부위를 가졌고, 이어서, 3회 세척하였다. 분석 완충제(1% MSD 차단제 A/PBS+0.05% 트윈-20)에서 1㎍/㎖ 바이오틴일화된 9D5의 30㎕를 각각의 웰에 첨가하고 나서, 1시간 동안 실온에서 진탕시키면서 인큐베이션시켰다. 희석제 2(MSD#: R51BB-3)에 희석시킨 6M 구아니딘 HCl에서 TTR의 신선한 분취액으로부터 표준 곡선을 만들었다. 표준 곡선은 200 ng/㎖에서 시작해서 49 pg/㎖에서 끝나는 7가지 4배 희석물로 이루어졌다. 환자 또는 대조군 혈장을 MSD 희석제 2에서 1:5로 희석시켰다. 표준 또는 희석 혈장(30㎕)을 2회 중복하여 플레이트에 첨가하였고, 2시간 동안 진탕시키면서 실온에서 인큐베이션시키고, 이어서 세척하였다. 30㎕의 다클론성 항-TTR 설포-태그 표지((카탈로그 번호 A000202-2, 다코, 캘리포니아주 산타 클라라에 소재한 애질런트 테크놀로지즈, 인코포레이티드)를 분석 완충제에서 1㎍/㎖로 각각의 웰에 첨가하고 나서, 진탕시키면서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 이어서, 세척하였다. 150㎕/웰의 1X MSD 판독 완충제 T(MSD#: R92TC-1)를 각각의 웰에 첨가하고 나서, MSD 섹터 이미저(Sector Imager) S600 상에서 10분 내에 판독하였다. 상부 및 하부 표준은 고정점이었고, 곡선은 구아니딘-HCl TTR 표준에 기반하여 1 내지 500 ng/㎖의 등가물의 순수한 혈장에서 정량적 범위를 가졌다.
실시예 3. TTR 아밀로이드증 환자 혈장에서 유리 미스폴딩-TTR의 생체분석
두 분석 상황으로부터 조합한 TTR 아밀로이드증 환자 및 정상 혈장 중의 개개 및 평균 유리 미스폴딩된-TTR 수준(ng-eq/㎖)을 도 1에 나타낸다.
결과를 도 1에 나타낸다. 첫 번째 열("h-ATTR 무증상"으로 표지)은 유전성 TTR 아밀로이드증을 가진 무증상 환자에 대한 결과를 도시한다. 두 번째 열("h-ATTR-taf"로 표지)은 타파미디스로 치료된 유전성 TTR 아밀로이드증을 가진 환자에 대한 결과를 도시한다. 세번째 열("h-ATTR-치료 없음"으로 표지)은 유전성 TTR 아밀로이드증을 가진 비치료 환자에 대한 결과를 도시한다. 네번째 열("h-ATTR 간 TX"로 표지)은 간 이식된 유전성 TTR 아밀로이드증을 가진 환자에 대한 결과를 도시한다. 다섯째 열("WT-ATTR"로 표지)은 야생형 ATTR 아밀로이드증을 가진 환자에 대한 결과를 도시한다. 여섯째 열("정상"으로 표지)은 건강한 지원자에 대한 결과를 도시한다. 점은 개개 데이터이며, 막대는 평균 및 SD이다. 정상 대조군에 비해 * 0.01-0.05, ** 0.0005-0.0099, ***0.0001-0.005, 및 ****<0.0001(던의 다중도(Dunn's multiplicity) 조절을 이용하는 비모수 크러스칼-왈리스 검정(non-parametric Kruskal-Wallis test)).
도 1에서 사용되는 약어:
asympt = 무증상; ATTR = 아밀로이드 트랜스타이레틴; eq = 등가물; GuHCL = 구아니딘 염산염; h = 유전성; mis = 미스폴딩된; std = 표준; Tx = 이식; wt = 야생형
유전성 TTR 아밀로이드증 환자 중에서, 비치료 환자에서 미스폴딩된-TTR의 상당히 더 높은 평균 수준이 있었고, 무증상 운반체를 나타내는 것을 포함하는 것은 질환 증상 전에 미스폴딩된-TTR, 및 타파미디스-치료 환자는 여전히 순환성의 미스폴딩된-TTR을 나타내지만, 그러나 간 이식 환자에서 수준은 검출 가능한 미스폴딩된 TTR이 거의 없거나 전혀 없이 정상 대조군과 유사하였다. 정상 대조군에서의 4 ng-eq/㎖에 비해 상승된 수준을 갖는 유전성 TTR 아밀로이드증 환자 샘플에서 평균 미스폴딩된-TTR 농도는 32 내지 59 ng-eq/㎖의 범위였다. 유전성 TTR 아밀로이드증 간 이식 환자는 정상적으로 폴딩된 TTR을 생성하여, 정상의, 건강한 대상체와 유사한 미스폴딩된-TTR 수준을 초래한다. 단일 이상점을 제외하고 야생형 ATTR 아밀로이드증 환자 샘플은 또한 정상 혈장과 유사하게 검출 가능한 미스폴딩된-TTR이 거의 없거나 전혀 없었는데, 이는 TTR의 미스폴딩이 영향받은 조직 내에서 국소로 일어날 수 있고, 미스폴딩된-TTR이 이런 야생형 ATTR 아밀로이드증 환자 소집단에서 용이하게 순환되지 않는다는 것을 시사한다.
타파미디스-치료(1개의 낮은 미스폴딩된-TTR), 및 야생형 ATTR 아밀로이드증(1개의 높은 미스폴딩된-TTR) 환자 샘플에서 주목되는 이상점 중에서, 다른 값이 정상 환자 변화를 나타내거나 절차적 오류에 기인(즉, 샘플의 부적절한 오표지)하는지의 여부는 분명하지 않다. 그 결과, 모든 보고된 값을 데이터 평가에 포함시켰다.
추가적으로, 분석은 TTR의 9D5 에피토프 내의 위치 89에서 돌연변이를 운반하는 유전성 TTR 아밀로이드증 환자로부터의 혈장에서 미스폴딩된 TTR을 검출할 수 있다. 9D5 에피토프(아미노산 잔기 89 내지 97) 내에 속하는 2개의 돌연변이(E89K 및 E89Q)는 분석에서 9D5 결합에 영향을 미치지 않았다. 에피토프의 알라닌 맵핑은 이 잔기가 항체 결합에 덜 중요하다는 것을 나타내었지만, 예를 들어, 산성 아미노산이 염기성 아미노산으로(E89K) 또는 하전에서 비하전으로(E89Q) 보존되지 않는 치환이 항체 결합에 영향을 미치는지는 알려지지 않았다. 도 1의 화살표는 이들 치환 및 이 아미노산에서 돌연변이에 대한 분석의 적합성을 나타낸다. 표 5는 시험한 모든 샘플 및 9D5-Dako 다클론성 분석에서의 결과를 나타낸다.
Figure pct00007
Figure pct00008
실시예 4. 상승된 미스폴딩-TTR 수준을 갖는 선택된 TTR 아밀로이드증 환자 샘플에서의 생체외 표적 맞물림 분석
혈장 mis-TTR에 결합하는 잠재적 mis-TTR 치료적 항체(m14G8, 마우스 14G8)의 능력(표적 맞물림)을 측정하기 위해, m14G8 양을 증가시키면서 고수준의 mis-TTR을 갖는 ATTR 혈장(V30M)을 생체외에서 처리하였다. 혈장 mis-TTR(표적)에 대한 m14G8의 결합은 남아있는 비결합(유리) mis-TTR의 양을 감소시켜야 하는데, 결합 부위는 m14G8로 점유되어 MSD 신호의 농도-의존적 감소 및 이런 mis-TTR mAb에 의한 표적 맞물림의 증가를 야기하기 때문이다. 도 9는 이러한 표적 맞물림 분석의 다이어그램을 도시한다.
m14G8(마우스 14G8)이 환자 혈장에 섞일 때 유리 미스폴딩된-TTR 수준을 감소시킨다는 것을 나타내기 위해 유리 미스폴딩된-TTR 분석에서 측정된 바와 같은 미스폴딩된-TTR의 상승된 수준을 갖는 12명의 환자로부터의 혈장 샘플을 표적 맞물림 실험에서의 분석을 위해 선택하였다. 9D5(MSD 플레이트 리간드) 및 m14G8이 동일한 에피토프에 결합하고 유리 미스폴딩된-TTR에 대해 경쟁하기 때문에, 분석은 m14G8에 비결합된 유리 미스폴딩-TTR(즉, 9D5에 결합됨)을 효과적으로 보장하여, 미스폴딩된-TTR에 결합된 m14G8에 의해 중단될 때 ECL 신호 검출의 감소를 야기하였다. 니트상(Neat) TTR 아밀로이드증 환자 혈장을 다양한 m14G8 농도(0, 12, 40, 120, 400 또는 1200㎍/㎖)로 섞고 나서, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 샘플을 1:5로 희석시키고, 분석 및 표준 곡선을 실시예 2에 기재한 바와 같이 실행하였다.
도 2는 상승된 미스폴딩된-TTR 수준을 가진 예시적인 TTR 아밀로이드증 환자 혈장 샘플에 대한 항체 경쟁 곡선을 나타내는데, 이는 증가된 농도의 m14G8의 존재 하에서 유리 미스폴딩된-TTR(%) 수준을 나타낸다.
도 2에서 사용되는 약어:
EC50 = 유효 농도 50%(유리/m14G8에 비결합); mis = 미스폴딩
12개의 개개 h-ATTR 혈장 샘플의 평균(점) 및 SD(막대)(각각의 섞은 샘플 값을 혈장 중의 0nM m14G8, 즉, 100% 비결합 미스폴딩-TTR에서 그의 사전에 섞은 ECL 신호에 대해 정규화함). 선은 데이터의 무증상 S자형 비선형 곡선 적합도를 나타낸다.
최대 경쟁에서 배경 신호를 차감함으로써 고배경을 보상하였다. 생체분석은 m14G8에 결합되지 않은 미스폴딩된-TTR(유리 미스폴딩된-TTR)만을 검출하기 때문에, m14G8에 의한 미스폴딩된-TTR의 결합은 혈장에서 m14G8이 증가함에 따라 감소된 ECL 신호를 야기하였다. 따라서, 유리 미스폴딩된-TTR 수준(%)에서 m14G8 농도-의존적 감소가 관찰되었고, 343 nM(대략 50㎍/㎖)의 추정된 EC50으로 h-ATTR 환자 혈장에서 m14G8이 미스폴딩된-TTR(단량체를 포함)을 표적화(결합)할 수 있다는 것을 확인하였다. 이 분석을 사용하여 14G8 시험에서 표적 맞물림을 알아낸다.
실시예 5: 혈장(9D5/18C5)에서 유리 미스폴딩-TTR의 결정을 위한 ECL 방법
방법: 단량체를 포함하는 유리(비결합) 미스폴딩된-TTR을 정량적 ECL(메소 스케일 디스커버리; MSD) 분석 연구 방법을 이용하여 인간 혈장에서 검출하였다. 96-웰 MSD 플레이트를 PBS에서 4㎍/㎖ 뉴트라비딘의 웰당 30㎕로 코팅시키고 나서, 밤새 4℃에서 인큐베이션시키고, 0.05% 트윈(Tween) 20을 함유하는 TBS에서 3회 세척하였다. 플레이트는 실온에서 1시간 동안 진탕시키면서 PBS에서 3% MSD 차단제 A로 차단시킨 비특이적 결합 부위를 가졌고, 이어서, 3회 세척하였다. 분석 완충제(1% MSD 차단제 A/PBS+0.05% 트윈-20)에서 1㎍/㎖ 바이오틴일화된 9D5의 30㎕를 각각의 웰에 첨가하고 나서, 1시간 동안 실온에서 진탕시키면서 인큐베이션시켰다. 분석 완충제에 희석시킨 6M 구아니딘 HCl에서 TTR의 신선한 분취액으로부터 표준 곡선을 만들었다. 표준 곡선은 1000 ng/㎖에서 시작해서 64 pg/㎖에서 끝나는 7가지 5배 희석물로 이루어졌다. 환자 또는 대조군 혈장을 분석 완충제에서 1:5로 희석시켰다. 표준 또는 희석 혈장(30㎕)을 2회 중복하여 플레이트에 첨가하였고, 1시간 동안 진탕시키면서 실온에서 인큐베이션시키고, 이어서 세척하였다. 30㎕의 설포-태그 표지된 18C5를 분석 완충제에서 1㎍/㎖로 각각의 웰에 첨가하고 나서, 진탕시키면서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 이어서, 세척하였다. 150㎕/웰의 1X MSD 판독 완충제 T를 각각의 웰에 첨가하고 나서, MSD 섹터 이미저 S600 상에서 10분 내에 판독하였다. 상부 및 하부 표준은 고정점이었고, 곡선은 구아니딘-HCl TTR 표준에 기반하여 1.6 내지 1000 ng/㎖ 등가물의 순수한 혈장에서 정량적 범위를 가졌다.
결과를 도 3에 나타낸다. 첫 번째 열("h-ATTR 무증상"으로 표지)은 유전성 TTR 아밀로이드증을 가진 무증상 환자에 대한 결과를 도시한다. 두 번째 열("h-ATTR-taf"로 표지)은 타파미디스로 치료된 유전성 TTR 아밀로이드증을 가진 환자에 대한 결과를 도시한다. 세번째 열("h-ATTR-치료 없음"으로 표지)은 유전성 TTR 아밀로이드증을 가진 비치료 환자에 대한 결과를 도시한다. 네번째 열("h-ATTR 간 TX"로 표지)은 간 이식된 유전성 TTR 아밀로이드증을 가진 환자에 대한 결과를 도시한다. 다섯째 열("정상"으로 표지)은 건강한 지원자에 대한 결과를 도시한다.
점은 개개 데이터이며, 막대는 평균 및 SD이다. 정상 대조군에 비해 * 0.01-0.05, ** 0.0005-0.0099, ***0.0001-0.005, 및 ****<0.0001(던의 다중도 조절을 이용하는 비모수 크러스칼-왈리스 검정).
도 3에서 사용되는 약어:
asympt = 무증상; ATTR = 아밀로이드 트랜스타이레틴; eq = 등가물; GuHCL = 구아니딘 염산염; h = 유전성; mis = 미스폴딩된; std = 표준; Tx = 이식; wt = 야생형
실시예 6. 18C5에 대한 면역원 및 면역화 또는 마우스의 준비
BALB/c와 C57BL/6 암컷 마우스 둘 다에 트랜스타이레틴-이중 돌연변이체(TTR-DM)로서 지칭되는 F87M 및 L110M에서의 돌연변이로 조작한 트랜스타이레틴을 주사하였다. 3회의 주사에 대해 50㎍/마우스의 복강내 주사 다음에 3회 주사에 대해 25㎍/마우스 및 RIBI 애주번트에서 유화시킨 TTR-DM의 4회 주사에 대해 10㎍/마우스를 5 BALB/c를 이용하여 매주 주사하였고, 추가적으로 5 C57BL/6 마우스에 RIBI 애주번트에서 유화시킨 50㎍/마우스로 3회 주사, 25㎍/마우스로 3회 주사 및 10㎍/마우스로 4회 주사에 대해 주사하였다. 마우스를 TTR-DM, 천연 사량체 TTR 및 his-MCAM에 대해 적정하였다. TTR-DM에 대해 가장 높은 역가 및 천연 사량체 TTR 및 his-MCAM에 대해 가장 낮은 역가를 갖는 마우스(BALB/c#1 및 5 및 C57BL/6 #4 및 5)를 콜러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein)의 변형에 의해 융합시켰다. 얻어진 혼성체를 TTR-DM, 천연 사량체 TTR 및 his-MCAM에 대해 선별하였다. TTR-DM에 대해 특이성을 나타내는 혼성체를 클로닝시키고, 추가로 특성규명하였다. 18C5를 확인하였다.
실시예 7. 비아코어(BIAcore)에 의한 18C5의 특성규명
6M 구아니딘 염산염(Gu-hTTR)에서 변성된 재조합 인간 TTR, 6M 구아니딘 염산염(Gu-cTTR)에서 변성된 사이노몰거스 TTR 및 천연 사량체 인간 TTR에 대한 뮤린 항체의 결합 친화도를 비교하기 위해 비아코어 T200을 이용하여 분석을 수행하였다. 항-마우스 항체를 아민 결합을 통해 센서 칩 CM3(GE 헬스케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences)) 상에 고정시키고, 50 RU(대략 250RU의 리간드 결합) 분석물의 최대 결합을 보장하는 수준으로 뮤린 항체(리간드)를 포획하였다. 300s 결합 시간 및 900s 해리 시간 동안 실행 완충제(HBS + 0.05% P-20, 1㎎/㎖ BSA, 50mM Gu-HCl)에서 다양한 농도의 Gu-TTR(0.4nM 내지 100nM의 범위)을 50㎕/분으로 포획 리간드에 대해 통과시켰다. pH 1.7에서 10mM 글리신-HCl의 2회의 짧은 주사에 의해 칩 표면의 재생을 달성하였다. 사용한 Gu-cTTR의 농도는 1 내지 1000nM의 범위인 한편, 인간 TTR 사량체의 농도는 10nM 내지 10,000 nM의 범위였다. 데이터는 리간드를 함유하지 않는 센서와 0nM 분석물 농도 둘 다에 대해 블랭크 차감되었다. 벌크 굴절률을 0 RU로 설정한 비아코어 평가 소프트웨어(v3.0)와 함께 글로벌 1:1 적합도를 이용하여 분석을 수행하였다. 결합 데이터를 표 6에 나타낸다.
Figure pct00009
실시예 8. 비아코어에 의한 키메라 18C5의 특성규명
6M 구아니딘 염산염(Gu-hTTR)에서 변성된 재조합 인간 TTR에 대한 뮤린 및 키메라 항체의 결합 친화도를 비교하기 위해 비아코어 T200을 이용하여 분석을 수행하였다. 항-인간 항체를 유동셀 1 및 2 상에 고정시켰고, 항-마우스 항체를 아민 결합을 통해 센서 칩 CM3(GE 헬스케어 라이프 사이언시즈) 상의 유동셀 3 및 4에 고정시키고, 50 RU(대략 250RU의 리간드 결합)의 분석물의 최대 결합을 보장하는 수준으로 키메라 및 뮤린 18C5 항체(리간드)를 포획하였다. 300s 결합 시간 및 900s 해리 시간 동안 실행 완충제(HBS + 0.05% P-20, 1㎎/㎖ BSA, 50mM Gu-HCl)에서 다양한 농도의 Gu-TTR(0.4nM 내지 100nM의 범위)을 50㎕/분으로 포획 리간드에 대해 통과시켰다. pH 1.7에서 3M 염화마그네슘의 2회의 짧은 주사 및 10mM 글리신-HCl의 2회의 짧은 주사에 의해 칩 표면의 재생을 달성하였다. 데이터는 리간드를 함유하지 않는 센서와 0nM 분석물 농도 둘 다에 대해 블랭크 차감되었다. 벌크 굴절률을 0 RU로 설정한 비아코어 평가 소프트웨어(v3.0)와 함께 글로벌 1:1 적합도를 이용하여 분석을 수행하였다. 결합 데이터를 표 7에 나타낸다.
키메라 18C5 항체의 성숙 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 서열번호 81로서 제공하고, 키메라 18C5 항체의 성숙 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 서열번호 87로서 제공하며, 인간 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 서열번호 17로서 제공하고, 인간 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 서열번호 19로서 제공하였다.
Figure pct00010
실시예 9. 18C5의 에피토프 맵핑
초기 맵핑은 서열번호 26의 87 내지 127 내에 있는 18C5에 대한 에피토프를 나타내었다. 추가적인 맵핑은 서열번호 26의 101 내지 109에 놓여있는 에피토프를 나타내었다. 미스폴딩된 사이노몰거스 TTR에 대한 훨씬 더 낮은 친화도는 아미노산 104가 인간과 사이노몰거스 TTR 사이의 유일한 아미노산 치환이기 때문에 중요하다는 것을 시사한다.
실시예 10. 18C5의 서열
mRNA 추출 및 정제를 위해 18C5 혼성체 클론 LA89 18C5. A1.A1 냉동 세포 펠릿을 사용하였다. 올리고텍스(Oligotex) 간접 mRNA 미니 키트(퀴아젠(Qiagen), 카탈로그 번호 72022) 프로토콜을 이용하여 mRNA 단리 및 정제를 수행하였다. 간략하게, 9×106개의 혼성체 클론 세포를 용해시키고, RNase를 비활성화시키는 고도로 변성되는 구아니딘-아이소티오사이아네이트 완충제의 존재 하에 균질화시켰다. 올리고텍스 현탁액을 용해 혼합물에 첨가하였고, 올리고텍스 입자의 올리고 dT30과 mRNA의 폴리-A 꼬리 사이에 혼성화가 일어나도록 하였다. 이어서, 오염을 세척하고, 폴리-A+ RNA를 용리시켰다. 마라톤(Marathon) cDNA 증폭 키트(클론테크(Clontech), 카탈로그 번호 634913)를 이용하여 mRNA를 cDNA로 역전사시켰다. 어댑터를 cDNA의 5' 말단에 결찰시켰다. 5' RACE 방법을 사용하여 V 영역을 증폭시켰다. PCR을 위해 5' V 영역 공통 프라이머 및 불변 영역 특이적 앵커 프라이머를 사용하였다. 증폭시킨 V 영역을 pTOPO 클로닝 벡터에 클로닝시키고, 상위 10개의 이콜라이(E. coli)에 형질전환시켰다. 15 내지 20개의 개개 콜로니를 성장시키고, 정제된 플라스미드를 서열분석하였다. 다음의 기준을 충족시킨다면, 클론 서열은 진정한 V 영역 서열로 고려하였다.
Met와 C 영역 사이에 정지 코돈 없음
서열은 항체 V 영역의 중요한 특징을 함유함
서열은 정할 수 있는 CDR을 함유함.
매칭 ORF를 갖는 최소 3개의 독립적 클론
결정한 가변 영역 서열을 발현 벡터에 클로닝시키고, CHO 세포에 형질감염시켰다. 대조군 항체로서 뮤린 18C5를 이용하여 정제된 키메라 항체를 결합에 대해 특성규명하였다.
18C5의 성숙 중쇄 가변 아미노산 서열을 서열번호 81로서 제공하고, 18C5의 성숙 경쇄 가변 아미노산 서열을 서열번호 87로서 제공한다. 카바트/코티아 복합 중쇄 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 아미노산 서열을 각각 서열번호 5, 7 및 9로서 제공한다. 카바트/코티아 복합 경쇄 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 아미노산 서열을 각각 서열번호 11, 13 및 15로서 제공한다.
실시예 11. 웨스턴 블롯 분석에 의해 입증된 18C5의 특이성
비천연(변성) TTR에 대한 18C5의 입체배좌 특이성을 입증하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 다음과 같이 수행하였다:
절차:
SDS-폴리아크릴아마이드 겔
천연 TTR: LDS 샘플 완충제(라이프 테크놀로지즈)에서 재조합 인간 TTR의 1.0, 0.5 및 0.1㎍ 샘플을 웨스턴 블롯 분석을 위해 10% NuPAGE 비스-트리스 겔(MES 완충제; 90 V, 105분) 상에서 실행하였고, 웨스턴 블롯 분석을 위해 나이트로셀룰로스 막에 옮겼다.
변성된 TTR: LDS 샘플 완충제가 환원제를 함유하고 SDS-PAGE 전에 샘플을 비등시킴으로써 변성시켰다는 것을 제외하고 재조합 인간 TTR을 천연 TTR에 대해 상기 기재한 바와 같이 준비하였다.
웨스턴 블롯 분석
SDS-PAGE 겔을 나이트로셀룰로스 막(iBlot, 라이프 테크놀로지즈) 상에 블롯팅하고 나서, 차단 완충제(LI-COR, 미국 네브래스카주에 소재한 링컨(Lincoln))로 처리하고, 1.0-㎍/㎖ 1차 항체에서 인큐베이션시키고 나서, 1× TBS로 세척하고, IRDye 800CW-접합된 염소-항-마우스 또는 항-토끼 2차 항체(LI-COR, 미국 네브래스카주에 소재한 링컨)의 1:20,000 희석물에 넣고, 이어서, 오디세이(Odyssey) CLx 적외선 영상화기)infrared imager)(LI-COR, 미국 네브래스카주에 소재한 링컨) 상에서 영상화하였다.
결과 및 결론:
천연 대 변성된 재조합 TTR의 웨스턴 블롯(도 4)은 18C5가 천연 TTR 종에 대해 매우 약한 반응성을 갖지만(레인 1 내지 3), 변성된 TTR 단량체(대략 15kDa)에 대해 매우 강한 반응성을 갖고, 변성된 이량체(대략 30kDa)에 대해 약간의 반응성을 가진다(레인 5 내지 7)는 것을 나타내었다. 레인 4는 분자량 마커를 나타낸다.
대조적으로, 입체배좌적으로 특이적이지 않은 상업적 TTR 항체(시그마, 카탈로그 번호 HPA002550)는 천연과 변성 TTR을 구별하지 못하였고, 단량체뿐만 아니라 이량체 천연 및 변성된 TTR에 대해 매우 강한 반응성을 나타내었다(도 5). 레인 1 내지 3은 천연 TTR에 대한 결과를 나타내고; 레인 4는 분자량 마커를 나타내며, 레인 5 내지 7은 변성 TTR에 대한 결과를 나타낸다.
실시예 12 TTR 아밀로이드증에 대한 잠재적 진단에서의 18C5 사용
메소 스케일 디스커버리(MSD) 전기화학발광 플랫폼을 사용하는 샌드위치 면역분석을 사용하여 환자 혈장 샘플에서의 총 미스폴딩 TTR(총 misTTR)을 검출하였다. 샘플은 정상 환자 및 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증(ATTR)을 가진 환자로부터 유래되었다. 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증(ATTR)을 가진 환자는 다음의 TTR 돌연변이 및 치료를 가졌다: 간 이식과 함께 ATTR(V30M 가족성 아밀로이드 다발성 신경병증(FAP)), ATTR(V30M 가족성 아밀로이드 다발성 신경병증(FAP)) 치료 없음, 타파미디스와 함께 ATTR(V30M 가족성 아밀로이드 다발성 신경병증(FAP)), 타파미디스와 함께 ATTR(Y114C 가족성 아밀로이드 다발성 신경병증(FAP)), 및 ATTR(S50I) 치료 없음.
간략하게, 96-웰 MSD 표준 플레이트를 뉴트라비딘 단백질(NeutrAvidin Protein)(매사추세츠주 월섬에 소재한 써모 피셔 사이언티픽)로 처음 코팅시키고, 이어서, PBS(MSD, 매릴랜드주 락빌에 소재)에서 3% 차단제 A를 이용하여 차단시켰다. 이어서, 바이오틴일화된 18C5를 0.5㎍/㎖으로 각각의 웰에 첨가하여 미스폴딩된 TTR을 포획하였다. 혈장 샘플을 1% 차단제 A/PBS에서 5배로 희석시킨 후에 참조 표준으로서 구아니딘 변성 TTR과 함께 MSD 플레이트에 옮겼다. 1시간 인큐베이션 후에, 웰에 결합된 미스폴딩된 TTR을 설포-태그(상표명)-표지된 다클론성 토끼 항-인간 TTR(캘리포니아주 산타 클라라에 소재한 애질런트 테크놀로지즈)로 검출하였다. 1X MSD 판독 완충제의 첨가에 의해 미스폴딩된 TTR의 양에 비례하는 화학발광 신호를 생성하였고, 메소 섹터 S 600 플레이트 판독기 상에서 포획하였다.
결과를 도 6에 나타낸다. 첫 번째 열("ATTR"으로 표지)은 치료 없음 또는 타파미디스를 이용한 트랜스페린-매개 아밀로이드증(ATTR)을 가진 환자에 대한 결과를 도시한다. 두 번째 열("ATTR(간 TX)"로 표지)은 간 이식과 함께 트랜스페린-매개 아밀로이드증을 가진 환자에 대한 결과를 도시한다. 세번째 열("정상"으로 표지)은 정상 환자에 대한 결과를 도시한다. 18C5는 간 이식을 받지 않은 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증(ATTR) 환자 중 한 명을 제외한 모두에서 상승된 미스폴딩된 TTR을 검출하였다. 간 이식을 받은 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증(ATTR) 환자 및 정상 환자는 간 이식 그룹에서의 한 가지를 제외하고 낮은 수준의 미스폴딩된 TTR을 나타내었다. 수준이 구아니딘 변성된 TTR 표준 곡선에 기반하지 않은 ng/㎖의 등가물이라는 것을 주목하여야 한다. 이례적인 결과를 갖는 2명의 환자를 동일한 날에 수집하였고, 분취하였을 때 샘플을 전환시키는 것이 가능하다.
실시예 13. 다량체 미스폴딩된 TTR의 결정을 위한 18C5 내지 18C5
메소 스케일 디스커버리(MSD) 전기화학발광 플랫폼을 사용하는 샌드위치 면역분석을 사용하여 환자 혈장 샘플에서의 총 다량체 미스폴딩 TTR(총 다량체 misTTR)을 검출하였다. 샘플은 정상 환자 및 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증(ATTR)을 가진 환자로부터 유래되었다. 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증(ATTR)을 가진 환자는 다음의 TTR 돌연변이 및 치료를 가졌다: 간 이식과 함께 ATTR(V30M 가족성 아밀로이드 다발성 신경병증(FAP)), ATTR(V30M 가족성 아밀로이드 다발성 신경병증(FAP)) 치료 없음, 타파미디스와 함께 ATTR(V30M 가족성 아밀로이드 다발성 신경병증(FAP)), 타파미디스와 함께 ATTR(Y114C 가족성 아밀로이드 다발성 신경병증(FAP)), 및 ATTR(S50I) 치료 없음.
MSD 플레이트를 4㎍/㎖의 뉴트라비딘과 함께 밤새 코팅시켰다. 플레이트를 3% MSD 차단제 A로 1시간 동안 차단시키고, 이어서, 0.1% 트윈-20(TBS-T)과 함께 트리스 완충 식염수로 3× 세척하였다. 1㎍/㎖ 바이오틴일화된 18C5를 1시간 동안 첨가한 후에, TBS-T로 3× 세척하였다. 샘플을 샘플 희석제(PBS + 0.1% BSA + 0.05% 트리톤 X-100) 중에서 5배 희석시키고, 이어서, 플레이트에 2회 중복하여 첨가하였다. 64pg/㎖ 내지 1㎍/㎖ 농도 범위에서 TTR-DM의 표준 곡선을 사용하였고, 0㎍/㎖은 블랭크이다. 플레이트를 TBS-T로 3× 세척하고 나서, 샘플 희석제에서 MSD 설포-태그로 표지한 1㎍/㎖ 18C5를 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 최종적으로, 플레이트를 TBS-T로 3× 세척하고 나서, 150㎕의 MSD 판독 완충제 T를 첨가하고, 플레이트를 메소 섹터 S 600 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. MSD 디스커버리 워크벤치(Discovery Workbench) 4.0을 이용하여 샘플을 분석하였다.
결과를 도 7에 나타낸다. 첫 번째 열("ATTR"으로 표지)은 치료 없음 또는 타파미디스를 이용한 트랜스페린-매개 아밀로이드증을 가진 환자에 대한 결과를 도시한다. 두 번째 열("ATTR"(간 TX)로 표지)은 간 이식과 함께 트랜스페린-매개 아밀로이드증을 가진 환자에 대한 결과를 도시한다. 세번째 열("정상"으로 표지)은 정상 환자에 대한 결과를 도시한다. 샘플 중 다수가 다량체 TTR에 대해 양성은 아니었지만, TTR 환자 샘플에서 모두 양성이었고, 간 이식된 환자에 대한 환자 샘플에 의해 P= 0.04 및 환자와 정상 대조군 사이에 P=0.004의 던 보정(Dunn correction)과 함께 크러스칼 왈리스 검정을 이용하는 통계학적 차이가 있었다. 정상 대조군과 간 이식된 환자 간의 의미는 없었다.
실시예 14. 9D5는 유전성 ATTR 환자로부터의 혈장에서 상승된 수준의 mis-TTR(미스폴딩된 TTR 단량체 및 올리고머)을 검출한다
ATTR 및 정상 혈장의 수집
유전성(h-ATTR) 및 야생형 ATTR(WT-ATTR)의 양성 진단을 갖는 ATTR 환자로부터의 혈액을 7ml 진공 채혈기 K2-EDTA 관에 수집하고, 원심분리시켜 세포 파편을 제거하였다. 혈장 분획을 1.5ml LoBind 에펜도르프관에 분취시키고 나서, 즉시 냉동시켰다. 건강한 정상 지원자로부터의 혈장 샘플을 동일한 방식으로 수집하였다. 모든 샘플을 해동 직후에 사용하였고, 재냉동시키지 않았다. 샘플은 표 5에 기재한 바와 같다.
웨스턴 블롯에 의한 ATTR 혈장의 분석
혈장 샘플을 도데실황산리튬 샘플 완충제(라이프 테크놀로지즈)에 10배로 희석시키고, 10% NuPAGE 비스-트리스 겔 상에 부하하고(12㎕), 90V에서 105분 동안 전기 이동시키고 나서, 나이트로셀룰로스 막에 옮기고, 1.0㎍/㎖ mis-TTR 9D5로 프로빙한 다음 IRDye 800CW-접합된 염소-항-마우스 2차 항체(LICOR)를 1:20,000로 희석시켰다. 이어서, 블롯을 린스하고 나서, 오디세이 CLx 적외선 영상화기(LI-COR) 상에서 영상화하였다. 결과를 도 8에 나타낸다.
도 8의 범례:
1차 mAb: 1㎍/㎖ 9D5; M, 분자량 마커(바이오래드(BioRad)); 속이 찬 검정 별, 비-간 이식 TTR-V30M 환자; 빗금 친 별, (환자 5, 20) TTR-T114C; 속이 빈, (환자 21, 23) TTR-S50I; 별 없음, 간 이식; 1N-5N, 정상(표 5의 단백질 ID N1 내지 N5에 대응함).
입체배좌-특이적 mis-TTR 항체 9D5는 유전성 ATTR 환자로부터 유래된 혈장에서 상승된 수준의 mis-TTR 종(단량체 및 올리고머)을 검출하였다. 대조적으로, 간 이식 요법을 받지 않은 유전성 ATTR 환자로부터의 혈장은 정상 개체로부터의 혈장과 유사한 mis-TTR의 간신히 검출 가능한 수준을 가졌다.
실시예 15. 유전성 ATTR 환자로부터의 혈장에서의 상승된 수준의 mis-TTR
ATTR 및 정상 혈장의 수집
유전성(h-ATTR) 및 야생형 ATTR(WT-ATTR)의 양성 진단을 갖는 ATTR 환자로부터의 혈액을 7ml 진공 채혈기 K2-EDTA 관에 수집하고, 원심분리시켜 세포 파편을 제거하였다. 혈장 분획을 1.5ml LoBind 에펜도르프관에 분취시키고 나서, 즉시 냉동시켰다. 건강한 정상 지원자로부터의 혈장 샘플을 동일한 방식으로 수집하였다. 모든 샘플을 해동 직후에 사용하였고, 재냉동시키지 않았다. 샘플은 표 5에 기재한 바와 같다.
메소 스케일 디스커버리(MSD) 정량적 전기화학발광 분석을 이용하여 인간 혈장에서의 총 mis-TTR을 검출하였다. MSD 플레이트를 4㎍/㎖의 뉴크라비딘 다음에 1㎍/㎖의 바이오틴일화된 mis-TTR 9D5로 밤새 코팅시켰다. 플레이트에 첨가하기 전에 혈장 샘플을 샘플 희석제(PBS + 0.1% BSA + 0.05% 트윈-20) 중에서 5배 희석시켰다. 플레이트를 TBS-T로 세척한 다음에, MSD 설포-태그로 표지한 1㎍/㎖의 항-TTR 다클론성 항체(Dako)를 첨가하였다. 플레이트를 TBS-T로 세척하고 나서, 150㎕/웰의 희석시킨 MSD 판독 완충제 T의 첨가 후에 MSD 섹터 S 600 상에서 판독하였다. MSD 디스커버리 워크벤치 4.0을 이용하여 샘플을 분석하였다.
결과를 도 10에 나타낸다.
도 10의 범례:
h-ATTR, 유전성 ATTR; 간 TX, 간 이식. 1.0 ng/㎖의 정량한계(BLQ); 막대는 그룹 평균 및 SD를 나타냄; p 값, 맨-휘트니 검정(Mann-Whitney test).
유전성 ATTR 환자로부터의 혈장 중의 mis-TTR 수준은 정상 대조군에 비해 유의하게 상승된다. TTR 돌연변이에 대해 양성 유전자형을 나타낸 무증상 개체에서 상승된 수준의 mis-TTR이 또한 관찰되었다. 정상의, 간 이식 치료를 받은 유전성 ATTR 환자로부터의 혈장에서 저수준(BLQ에 대해 10 ng/㎖ 미만)의 mis-TTR이 관찰되었다.
실시예 7. 인간화된 18C5 항체의 설계
인간화를 위한 시작점 또는 공여자 항체는 마우스 항체 18C5였다. 성숙 m18C5의 중쇄 가변 아미노산 서열을 서열번호 81로서 제공한다. 성숙 m18C5의 경쇄 가변 아미노산 서열을 서열번호 87로서 제공한다. 중쇄 카바트/코티아 복합 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 각각 서열번호 5, 7 및 9로서 제공한다. 경쇄 카바트 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 각각 서열번호 11, 13 및 15로서 제공한다. 전체적으로 카바트 넘버링을 사용한다.
문헌[Kabat, et al.]으로부터의 항체 가변 영역의 공통 서열을 갖는 18C5의 가변 영역 서열의 정렬은 18C5의 중쇄 가변 영역(VH)이 인간 VH 하위그룹 3에 대응하는 마우스 VH 하위그룹 3b에 속한다는 것을 나타낸다. 18C5의 카파 경쇄 가변 영역(VL)은 인간 Vk 하위그룹 2에 대응하는 마우스 Vk 하위그룹 2에 속한다. 문헌[Kabat E.A., et al, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242.].
중쇄에서 37번 위치의 Ala을 제외하고 Vk와 Vh 도메인 사이의 계면에서 잔기는 통상적으로 발견되는 것인 한편, 전형적으로 Val 또는 Ile이 이 위치에 있다. Vh에서 95번 위치의 Leu은 전형적으로 Asp, Gly 또는 Ser이다. 이들 위치는 역 돌연변이에 대한 후보이다. Vk 쇄에 대해, Glu 34는 전형적으로 Ala, His, Asn 또는 Ser이고, 이들 위치는 역돌연변이에 대한 후보이다.
마틴의 서열 기반 CDR-확인 법칙(Martin's sequence-based CDR-identification rule)을 이용하여 18C5 VH 및 VL의 CDR을 확인하였다. 이어서, 문헌[Martin (Martin ACR. (2010). In: Kontermann R and Diibel S (eds). Antibody Engineering. Heidelberg, Germany: Springer International Publishing AG.)]의 표 3.5에 제시된 중요한 잔기의 요약을 이용하여 코티아 정규 분류에 CDR을 부여하였다:
CDR-H1은 10개의 아미노산으로 이루어지며, 코티아 정규 분류 1과 유사하다.
CDR-H2는 17개의 아미노산으로 이루어지며, 코티아 정규 분류 3과 유사하다.
CDR-H3은 4개의 아미노산으로 이루어지며; CDR-H3에 대한 분류는 없다.
CDR-L1은 16개의 아미노산으로 이루어지며, 코티아 정규 분류 4와 유사하다.
CDR-L2는 7개의 아미노산으로 이루어지며, 코티아 정규 분류 1을 가진다.
CDR-L3은 9개의 아미노산으로 이루어지고, 코티아 정규 분류 1과 유사하다.
PDB 데이터베이스[Deshpande et al, 2005, Nucleic Acids Research 33:D233-D237]의 단백질 서열에 대한 검색을 하여 18C5의 개략적인 구조적 모델을 제공하는 구조를 발견하였다. Vh와 Vk 구조 둘 다에 대해 뮤린 항-파이로글루타메이트-Abeta 항체 Fab c#17(PDB 암호 5MYK)[Piechotta, A. etal. f(2017) J. Biol. Chem. 292: 12713-12724)의 결정 구조를 사용하였는데, 이것이 양호한 해상도(1.6Å) 및 18C5 Vh 및 Vk에 대한 전반적 서열 유사성을 갖고, 루프에 대해 동일한 정규 구조를 보유하기 때문이다. 바이오루미네이트(Bioluminate) 소프트웨어를 사용하여 18C5의 개략적인 구조를 모델링하였다. 이 소프트웨어는 슈뢰딩거 인코포레이티드(Schrodinger Inc)로부터 허가받았다.
18C5 VH 및 VL의 프레임워크는 문헌[Ultsch M, et al. ((2016) Sci Rep.6:39374)]에 의해 설계되는 인간화된 크레네주맙 Fab(CreneFab) PDB: 5VZY의 대응하는 영역과 높은 정도의 서열 유사성을 공유한다. 18C5 및 CreneFab의 가변 도메인은 또한 CDR-H1, H2, LI, L2 및 L3 루프에 대해 동일한 길이를 공유한다. CreneFab VH(5VZY-VH) 및 VL(5VZY-VL)의 프레임워크 영역을 18C5의 CDR에 대한 수용자 서열로서 선택하였다. 바이오루미네이트 소프트웨어를 사용하여 구조를 모델링하였다. 이 소프트웨어는 슈뢰딩거 인코포레이티드로부터 허가받았다.
WHO INN 위원회 가이드라인에 의해 약술되는 바와 같이 중쇄 및 경쇄의 인간성을 평가하기 위해 IMGT 도메인 갭얼라인(Domain GapAlign) 툴을 이용하여 항체 인간화 과정으로부터 초래된 중쇄 및 경쇄 변이체 서열을 인간 생식계열 서열에 추가로 부여하였다. (WHO-INN: International nonproprietary names (INN) for biological and biotechnological substances (a review)" (Internet) 2014. http://www.who.int/medicines/services/inn/BioRev2014.pdf로부터 입수 가능). 잔기를 대응하는 인간 생식계열에 따라 정렬되도록 변화시켜, 가능한 경우, 인간성을 향상시켰다. 인간화된 VL_v2 변이체에 대해, 인간 생식계열 유전자 IGKV2-30*02(젠뱅크 수탁번호 CAA77315; 서열번호 90)와 더 유사한 서열을 제공하기 위해 Q45R 돌연변이를 도입하였다. 아미노산 서열은 CreneFab 프레임워크로 이루어지며, 18C5 CDR을 hu18C5-VH_v1 및 hu18C5-VL_v1로 표기한다.
추가적인 형태의 hu18C5-VH 및 hu18C5-VL을 설계하여 다양한 프레임워크 잔기가 항원 결합 및 면역원성에 기여하는 것을 가능하게 하였다. 돌연변이에 고려되는 위치는 하기를 포함한다:
- 정규 CDR 입체배좌를 정함(문헌[Martin 2010]에 요약됨),
- 문헌[Vernier zone (Foote J and Winter G. (1992). J Mol Biol. 224(2):487-99)] 내임,
- VH/VL 도메인 계면으로 국소화됨(문헌[Leger OJP and Saldanha J. (2000) Preparation of recombinant antibodies from immune rodent spleens and the design of their humanization by CDR grafting. In: Shepherd P and Dean C (eds). Monoclonal Antibodies: a Practical Approach. Oxford, UK: Oxford University Press]에 요약됨),
- 번역 후 변형, 예컨대 글리코실화 또는 파이로글루타민화의 여지가 있음,
- 크레네주맙 Fab 프레임워크에 접합된 18C5 CDR의 모델에 따라 CDR과 충돌되는 것으로 예측되는 잔기에 의해 점유됨, 또는
- 모 마우스 18C5 잔기 또는 일부 다른 잔기가 훨씬 더 우세한 경우, 서열분석된 인간 항체 중에서 희귀한 잔기로 점유됨.
상이한 순열의 치환을 함유하는 2개의 인간화된 중쇄 가변 영역 변이체 및 2개의 인간화된 경쇄 가변 영역 변이체를 작제하였다: hu18C5-VH v1 및 hu18C5-VH_v2(각각 서열번호 85 내지 86) 및 hu18C5-VH_v1 및 hu18C5-VL_v2_v6(각각 서열번호 91 내지 92). (표 8 및 표 9). 역돌연변이 및 선택된 인간 프레임워크에 기반한 다른 돌연변이를 갖는 예시적인 인간화된 Vk 및 Vh 설계를 각각 표 8 및 표 9에 나타낸다. 표 8 및 표 9의 볼드체 영역은 카바트/코티아 복합에 의해 정해지는 CDR을 나타낸다. A는 표시된 위치에 아미노산이 없다는 것을 나타낸다. 서열번호 86 및 92는 표 10에 나타내는 바와 같이 역돌연변이 및 다른 돌연변이를 함유한다. hu18C5-VH_v1 및 hu18C5-VH_v2의 위치에서의 아미노산을 표 11에 열거한다. hu18C5-VL_v1 및 hu18C5-VL_v2의 위치에서의 아미노산을 표 12에 열거한다. 가장 유사한 인간 생식계열 유전자 IGHV3-48*01에 대해 인간화된 VH 쇄 hu18C5-VH_v1 및 hu18C5- VH_v2(각각 서열번호 85 내지 86)에 대한, 그리고 가장 유사한 인간 생식계열 유전자 IGKV2-30*02에 대해 인간화된 VL 쇄 hu18C5-VL_v1 및 hu18C5-VL_v2(각각 서열번호 91 내지 92)에 대한 인간성 백분율을 표 13에 나타낸다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
코티아 분류 정규, 버니어(vernier) 또는 계면/패킹 잔기가 마우스와 인간 수용자 서열 간에 다른 위치는 치환에 대한 후보이다. 코티아 분류 정규 잔기의 예는 표 8 및 표 9에서 카바트 잔기 H48을 포함한다. 계면/패킹(VH+VL) 잔기의 예는 표 8 및 표 9에서 카바트 잔기 H35, H37, H39, H45, H47, H91, H93, H95, H103, L34, L36, L38, L44, L46, L87, L89, L91, L96 및 L98을 포함한다.
치환에 대한 후보로서 경쇄 가변 영역에서 표 8에 나타낸 위치의 선택에 대한 이유는 다음과 같다.
I2V는 코티아 정규 잔기의 역돌연변이이다.
Q45R은 IGKV2-30*02 생식계열 잔기에 대한 돌연변이이다. Q는 인간에서는 이 위치에서 드물다. R은 이 위치에서 빈번하다.
hu18C5-VL v1: CreneFab의 프레임워크 상에 접합된 18C5-VL의 CDR-L1, L2 및 L3 루프(5VZY-VL).
hu18C5-VL_v2는 코티아 정규 분류를 정하는데 중요하며 버니어 구역의 부분이거나, VH/VL 도메인 계면에 위치되는 위치에서 모든 프레임워크 치환을 되돌리고, hu18C5-VL_v2는 역돌연변이 I2V 및 인간 수용자를 생식계열 돌연변이 Q45R에 편입시켜 항원-결합 친화도 및 면역원성에 대한 이들 위치 기여의 평가를 가능하게 한다.
경쇄 가변 영역:
Figure pct00023
치환에 대한 후보로서 중쇄 가변 영역에서 표 9에 나타낸 위치의 선택에 대한 이유는 다음과 같다.
V37A는 버니어 구역에서의 역돌연변이이다. Val은 Trp47과의 반발 상호작용을 나타낸다.
L45Q는 코티아 당 코어 계면 잔기의 역돌연변이이다. 이 위치에서의 Leu은 반발성 반데르 발스 상호작용을 가진다.
L47W는 계면 잔기의 역돌연변이이다. 뮤린 18C5에서 Trp은 47번 위치이며, Trp은 Ser 35와의 수소 결합을 생성함으로써, 쇄내 베타-시트를 안정화시킨다. Leu은 임의의 잔기와의 임의의 계면을 확립하지 않으며, 입체배좌를 탈안정화시킬 수 있다.
V48I은 이 상호작용을 보존하기 위해 버니어 구역 잔기와 상호작용하는 CDR의 역돌연변이이다.
A49G는 버니어 구역 잔기의 역돌연변이이다.
S94R은 CDR 상호작용을 보존하기 위한 버니어 구역 잔기의 역돌연변이이다.
hu 18C5-VH v1: CreneFab VH의 프레임워크 상에 접합된 18C5-VH의 CDR-H1, H2 및 H3 루프(5VZY-VH).
Hu18C5-VH v2는 코티아 정규 분류를 정하는데 중요하며, 버니어 구역의 부분이거나, VH/VL 도메인 계면에 위치되는 위치에서 모든 프레임워크 치환을 되돌린다. 18C5-VH_v2는 역돌연변이 V37A, L45Q, L47W, V48I, A49G 및 S94R을 편입시켜 항원-결합 친화도 및 면역원성에 대한 이들 위치 기여의 평가를 가능하게 한다.
중쇄 가변 영역:
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
SEQUENCE LISTING <110> PROTHENA BIOSCIENCES, INC. <120> METHODS OF DETECTING TRANSTHYRETIN <130> WO/2019/071206 <140> PCT/US2018/054723 <141> 2018-10-05 <150> US 62/569,438 <151> 2017-10-06 <150> US 62/579,817 <151> 2017-10-31 <150> US 62/647,582 <151> 2018-03-23 <160> 104 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 1 Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val 1 5 10 15 Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 20 25 30 Gly Gly Ser Leu Asn Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser 35 40 45 Arg Phe Trp Met Ser Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Gln Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Gly Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 85 90 95 Leu Phe Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Trp Ala Leu Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 2 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 2 atggattttg ggctgatttt tttcattgtt gcccttttaa aaggggtcca gtgtgaggta 60 aagcttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa tctctcctgt 120 gtagcctcag gattcgattt tagtagattc tggatgagtt gggctcggca ggctccaggg 180 agaggacagg aatggattgg agagattaat ccaggaagca gtacgataaa ctatacgcca 240 tctctgaagg ataaattcat catctccaga gacaacgcca aaaatacgct gttcctgcaa 300 atgagcaaag tgagatctga ggactcagcc ctttattact gtgcaagact ggggtatggt 360 aactacggat gggctctgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 417 <210> 3 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 3 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Val Asp Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Leu Lys 130 <210> 4 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 4 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagaagtgat 60 gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 tcttgcagat ctagtcagag cattgtagat agtaatggaa acacctattt agaatggtac 180 ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggaatttat tactgctttc aaggttcaca tgttccgctc 360 acgttcggtg ctgggaccaa gttggagctg aaa 393 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 5 Gly Phe Asp Phe Ser Arg Phe Trp Met Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 6 ggattcgatt ttagtagatt ctggatgagt 30 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 7 Glu Ile Asn Pro Gly Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Asp <210> 8 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 8 gagattaatc caggaagcag tacgataaac tatacgccat ctctgaagga t 51 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 9 Leu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Trp Ala Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 10 ctggggtatg gtaactacgg atgggctctg gactac 36 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 11 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Asp Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 12 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 12 agatctagtc agagcattgt agatagtaat ggaaacacct atttagaa 48 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 13 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 14 aaagtttcca accgattttc t 21 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 15 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 16 tttcaaggtt cacatgttcc gctcacg 27 <210> 17 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 17 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 18 <211> 993 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 18 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacacgc tgcccccatc ccgggaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa tga 993 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 19 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 20 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 20 cggggaactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa 60 tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta 120 cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag 180 gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa agcagactac 240 gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca 300 aagagcttca acaggggaga gtgttag 327 <210> 21 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 21 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Val Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 22 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 22 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 23 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 23 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 24 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 24 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 25 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 25 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 26 <211> 147 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Met Ala Ser His Arg Leu Leu Leu Leu Cys Leu Ala Gly Leu Val Phe 1 5 10 15 Val Ser Glu Ala Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu 20 25 30 Met Val Lys Val Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val 35 40 45 Ala Val His Val Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe 50 55 60 Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr 65 70 75 80 Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu 100 105 110 Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Ile Ala 115 120 125 Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Thr Asn 130 135 140 Pro Lys Glu 145 <210> 27 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu Met Val Lys Val 1 5 10 15 Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val Ala Val His Val 20 25 30 Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys 35 40 45 Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Glu Glu Gln Phe 50 55 60 Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys 65 70 75 80 Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr 85 90 95 Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser 100 105 110 Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Thr Asn Pro Lys Glu 115 120 125 <210> 28 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu Met Val Lys Val 1 5 10 15 Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val Ala Val His Val 20 25 30 Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys 35 40 45 Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Glu Glu Gln Phe 50 55 60 Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys 65 70 75 80 Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr 85 90 95 Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser 100 105 110 Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Thr Asn Pro Lys Glu 115 120 125 <210> 29 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Met Ala Ser His Arg Leu Leu Leu Leu Cys Leu Ala Gly Leu Val Phe 1 5 10 15 Val Ser Glu Ala Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu 20 25 30 Met Val Lys Val Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val 35 40 45 Ala Val His Val Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe 50 55 60 Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr 65 70 75 80 Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu 100 105 110 Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Ser Tyr Ser 115 120 125 Thr Thr Ala Val Val Thr Asn Pro Lys Glu 130 135 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Ile Ala Ala 1 5 <210> 31 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Phe His Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly Pro 1 5 10 15 Arg Arg Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr 20 25 30 Thr Ala Val Val Thr Asn Pro Lys Glu 35 40 <210> 32 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 32 gcctccacca agggtccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa 990 <210> 33 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 33 cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg t 321 <210> 34 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 34 actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60 actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120 aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180 aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240 cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300 ttcaacaggg gagagtgt 318 <210> 35 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 35 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys <210> 36 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 36 atgaactttg ggctcagctt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt ccagtgt 57 <210> 37 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 37 Met Glu Ser His Thr Gln Val Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Val Asp Gly 20 <210> 38 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 38 atggagtcac atactcaggt ctttgtattc gtgtttctct ggttgtctgg tgttgacgga 60 <210> 39 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 39 Ser Tyr Thr Met Ser 1 5 <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 40 Glu Ile Asn Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 41 His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp Phe Phe Asp Val 1 5 10 15 <210> 42 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 42 Arg Ser Asn Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 43 Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 44 Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 45 Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr Ala 1 5 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 46 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 47 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 47 Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 48 Tyr Tyr Tyr Gly Gln Tyr Phe Asp Phe 1 5 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 49 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Thr Val Ala 1 5 10 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 50 Ser Ala Ser Tyr Arg Cys Thr 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 51 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 52 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 52 Asn Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 53 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 53 Tyr Ile Ser Ile Asp Gly Asn Asn Ile Tyr His Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 54 Asp Ser Asp Tyr Gly Tyr Phe Asp Val 1 5 <210> 55 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 55 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 56 Lys Val Ser Lys Arg Phe Ser 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 57 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 58 <211> 455 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 58 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Ser Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Ser 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Asn Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gln Ala Tyr Gly Arg Glu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser 195 200 205 Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr 210 215 220 Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys 245 250 255 Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Arg Ile Ser Trp Phe Val Asn 275 280 285 Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu 325 330 335 Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg 340 345 350 Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg 355 360 365 Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp 370 375 380 Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser 405 410 415 Lys Leu Asp Ile Lys Thr Ser Thr Val Gly Glu Asn Arg Phe Leu Leu 420 425 430 Met Gln Arg Glu Thr Arg Gly Ser Glu Lys Leu Leu Pro Glu Glu Asp 435 440 445 His Leu Pro Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 59 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 59 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Asn Tyr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 60 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 60 Arg Tyr Trp Ile Thr 1 5 <210> 61 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 61 Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asn <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 62 Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Phe Tyr Val 1 5 <210> 63 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 63 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 64 Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 65 Gln Gln Leu Val Glu Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 66 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 67 Ser Ile Ser Gly Ser Gly Asp Thr Thr Lys Tyr Thr Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 68 Asp Gly Ser Gly Arg Ile Asp Pro Phe Ala Leu 1 5 10 <210> 69 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 69 Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ile Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 70 Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 71 Met Gln Gly Thr His Trp Pro Arg Thr 1 5 <210> 72 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 72 Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys Thr 1 5 10 <210> 73 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 73 Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Glu 1 5 10 <210> 74 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 74 Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val 1 5 10 <210> 75 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 75 Ser Tyr Thr Met Ser 1 5 <210> 76 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 76 Glu Ile Ser Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 77 His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp Phe Phe Asp Val 1 5 10 15 <210> 78 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 78 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 79 Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 80 Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 81 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 81 Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Asn Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Phe 20 25 30 Trp Met Ser Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Gln Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Gly Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Trp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 82 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 82 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asp Tyr Asp Asn Ile Leu Asp Tyr Val Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 83 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 83 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 84 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 85 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 85 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Phe 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Glu Ile Asn Pro Gly Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Trp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 86 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 86 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Phe 20 25 30 Trp Met Ser Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Gln Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Gly Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Trp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 87 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 87 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Asp Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 88 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 88 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 89 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 89 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 90 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 91 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 91 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Asp Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 92 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 92 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Asp Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 93 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 93 Arg Phe Trp Met Ser 1 5 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 94 Gly Phe Asp Phe Ser Arg Phe 1 5 <210> 95 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 95 Ser Arg Phe Trp Met Ser 1 5 <210> 96 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 96 Asn Pro Gly Ser Ser Thr 1 5 <210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 97 Glu Ile Asn Pro Gly Ser Ser Thr Ile Asn 1 5 10 <210> 98 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 98 Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Gly Ser Ser Thr Ile Asn 1 5 10 <210> 99 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 99 Ala Arg Leu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Trp Ala Leu Asp 1 5 10 <210> 100 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 100 Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr 1 5 <210> 101 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 101 Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 1 5 10 <210> 102 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 102 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu 1 5 <210> 103 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 103 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Glu Ile Ser Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp Phe Phe Asp 100 105 110 Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 104 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 104 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110

Claims (159)

  1. 생물학적 샘플에서 미스폴딩된 트랜스타이레틴(transthyretin: TTR)을 검출하는 방법으로서,
    (a) 생물학적 샘플을 TTR의 잔기 89 내지 97 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체(capture antibody) 및 TTR의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체(reporter antibody)와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 샘플에 존재한다면, 상기 포획 항체 및 리포터 항체는 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체(sandwich complex)를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 샌드위치 복합체를 형성하는 상기 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 상기 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계
    를 포함하는, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 유전성 ATTR(transthyretin-mediated amyloidosis) 환자로부터 유래된, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 V30M, Y114C, G47R, S50I, T49S, F33V, A45T, E89K, E89Q 및 V122I로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 운반하는 유전성 ATTR 환자로부터 유래된, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 돌연변이는 V30M, Y114C S50I로 이루어진 군으로부터 선택되는, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 돌연변이는 V30M인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 돌연변이는 Y114C인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 돌연변이는 S50I인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  8. 제3항에 있어서, 상기 돌연변이는 E89K인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  9. 제3항에 있어서, 상기 돌연변이는 E89Q인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이는 9D5인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 다클론성 항-TTR 항체인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터 항체는 18C5, 8C3, 7G7, AD7F6, RT24, NI-301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD107, MFD108, MFD109, MFD111, MFD114, 또는 이들의 키메라 형태 또는 인간화된 형태 또는 다클론성 항-TTR 항체인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 18C5 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 8C3 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 7G7 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 AD7F6 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 RT24, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 NI-301.35G11 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 MFD101, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 MDF102, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 MFD103 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 MFD105 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 MFD107, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 MFD108 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 MFD109, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 MFD111 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  27. 제1항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 MFD114 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  28. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터 항체는 TTR의 잔기 101 내지 109, 118 내지 122, 115 내지 124, 53 내지 63, 54 내지 61, 36 내지 49, 49 내지 61, 109 내지 121, 30 내지 66, 70 내지 127, 80 내지 127, 90 내지 127, 100 내지 127, 110 내지 127, 또는 115 내지 127 내에서 결합하는 항체인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미스폴딩된 TTR은 E89K 치환을 포함하는, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미스폴딩된 TTR은 E89Q 치환을 포함하는, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 수집된 샘플의 제1 분취액이고, 상기 방법은 TTR에 대한 결합을 위해 상기 포획 항체와 경쟁하는 시험 항체를 더 포함하는 상기 수집된 샘플의 제2 분취액에 대해 단계 (a)와 (b)를 반복하는 단계를 더 포함하되, 상기 단계를 반복함에 있어서 상기 샌드위치 복합체를 형성하는 감소된 리포터 항체는 미스폴딩된 TTR에 결합하는 상기 시험 항체의 능력의 표시를 제공하는, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 시험 항체는 14G8 또는 이의 키메라 또는 인간화된 형태이고, 상기 포획 항체는 9D5이며, 상기 리포터 항체는 다클론성 항-TTR 항체인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 시험 항체는 14G8의 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  34. 시험 항체로 치료된 대상체로부터의 생물학적 샘플에 남아있는 미스폴딩된 트랜스타이레틴(mis-TTR)을 검출함으로써, 대상체에게 투여되는 시험 항체의 생체내 표적 맞물림(in vivo target engagement)을 결정하는 방법으로서,
    표적은 mis-TTR의 잔기 89 내지 97 내의 에피토프이되,
    (a) 상기 생물학적 샘플을 잔기 89 내지 97 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 상기 포획 항체의 에피토프와 상이한 TTR 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 포획 항체 및 리포터 항체는 샌드위치 복합체를 형성하는 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하는, 상기 접촉시키는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 샌드위치 복합체를 형성하는 상기 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 상기 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계
    를 포함하는, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 유전성 ATTR 환자로부터 유래되는, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 V30M, Y114C, G47R, S50I, T49S, F33V, A45T, E89K, E89Q 및 V122I로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 운반하는 유전성 ATTR 환자로부터 유래되는, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 돌연변이는 V30M, Y114C 및 S50I로 이루어진 군으로부터 선택되는, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  38. 제36항에 있어서, 상기 돌연변이는 V30M인, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  39. 제36항에 있어서, 상기 돌연변이는 Y114C인, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  40. 제36항에 있어서, 상기 돌연변이는 S50I인, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  41. 제36항에 있어서, 상기 돌연변이는 E89K인, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  42. 제36항에 있어서, 상기 돌연변이는 E89Q인, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  43. 제34항 또는 제35항에 있어서, 비치료 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 미스폴딩된 TTR의 검출에 비해 상기 치료된 대상체에서의 미스폴딩된 TTR의 검출 감소는 양성 표적 맞물림, 및 동일하거나 또는 더 적은 양의 상기 시험 항체로 상기 대상체를 치료하는 것과 상관관계가 있는, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  44. 제35항에 있어서, 상기 치료된 대상체와 상기 비치료된 대상체는 동일한 개체인, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  45. 제34항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 9D5이되, 상기 포획 항체 및 상기 리포터 항체는 상이한 수준을 갖는, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  46. 제34항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 14G8인, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  47. 제34항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 5A1인, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  48. 제34항에 있어서, 상기 포획 항체는 9D5이고, 상기 리포터 항체는 6C1인, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  49. 제45항에 있어서, 상기 리포터 항체는 다량체 미스폴딩된 트랜스타이레틴에 대한 결합을 위해 포획항체와 결합에 대해 경쟁하는, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터 항체는 전기화학발광 표지를 가지고, 전기화학발광에 의해 검출되는, 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 항체는 바이오틴 표지를 갖는, 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 정량적으로 수행되는, 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미스폴딩된 TTR의 절대적 또는 상대적 양을 나타내기 위해 정량적으로 수행되는, 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 항체는 상기 접촉시키는 단계 전에 고체상에 결합되는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 포획 항체는 링커를 통해 상기 고체상에 부착되는, 방법.
  56. 제54항에 있어서, 상기 고체상은 적어도 하나의 전극을 포함하는, 방법.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터 항체로부터의 신호를 알려진 양의 미스폴딩된 TTR을 함유하는 대조군 샘플에서의 리포터 항체로부터의 신호와 비교하여 상기 샘플에서의 미스폴딩된 TTR의 양을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 신호의 교정 곡선으로부터의 리포터 항체로부터의 신호를 미스폴딩된 TTR의 양에 비교하여 샘플에서의 미스폴딩된 TTR의 양을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터 항체로부터의 신호는 상기 샘플에서의 미스폴딩된 TTR의 양에 비례하는, 방법.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 인간으로부터의 샘플인, 방법.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 체액인, 방법.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 인간의 혈장인, 방법.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 미스폴딩된 TTR의 존재는 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증을 가진 대상체로부터의 샘플을 얻은 대상체를 진단하기 위해 사용되는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증은 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증 또는 산발적 야생형 트랜스타이레틴 아밀로이드증인, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 대상체는 유전자 검사에 기반하여 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증의 위험에 있는 것으로 확인된, 방법.
  66. 제64항에 있어서, 상기 대상체는 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증의 증상을 나타내지 않는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 대상체는 다발성 신경병증 또는 심장근육병증을 갖지 않는, 방법.
  68. 제64항에 있어서, 상기 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증은 가족성 아밀로이드 심장근육병증(familial amyloid cardiomyopathy: FAC), 가족성 아밀로이드 다발성 신경병증(familial amyloid polyneuropathy: FAP), 또는 중추 신경계 선택적 아밀로이드증(central nervous system selective amyloidosis: CNSA)인, 방법.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증에 대한 치료를 받는 환자로부터 유래된, 방법.
  70. 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증을 가진 대상체의 치료를 조절하는 방법으로서,
    (a) 트랜스타이레틴 매개된 아밀로이드증에 대해 이전에 치료된 대상체로부터의 샘플에서 제34항 또는 제35항의 방법에 의해 검출된 미스폴딩된 TTR의 양을 치료 전에 또는 치료 초기 동안에 상기 대상체에서 검출된 미스폴딩된 TTR의 양과 비교하는 단계; 및
    (b) 미스폴딩된 TTR의 상기 양이 이전에 검출된 것과 동일하거나 또는 더 크다면, 이전 치료의 투여 용량 또는 빈도를 증가시키는 단계; 또는
    (c) 미스폴딩된 TTR의 양이 이전에 검출된 것보다 적다면, 사전 치료의 투여 용량 또는 빈도를 감소시키거나 또는 사전 치료를 중단시키는 단계
    를 포함하는, 치료를 조절하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 사전 치료는 항-TTR 항체의 정맥내 투여에 의하고, 미스폴딩된 TTR의 상기 양이 이전에 검출된 양보다 적다면, 상기 사전 치료는 중단되며, TTR 안정제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 요법, RNA 간섭 요법 또는 독시사이클린 및 타우로우루소데옥시콜산과의 병용 요법에 의한 치료로 대체되는, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 대상체는 더 이상 상기 항-TTR 항체에 의한 치료를 받지 않는, 방법.
  73. 제71항에 있어서, 상기 TTR 사량체 안정제는 타파미디스(tafamidis) 또는 디플루니살(diflunisal)인, 방법.
  74. 제71항에 있어서, 상기 TTR 사량체 안정제는 디플루니살인, 방법.
  75. 제71항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 치료제는 이노테센(inotersen)인, 방법.
  76. 제71항에 있어서, 상기 RNAi 기반 치료제는 파티시란(patisiran) 또는 레부시란(revusiran)인, 방법.
  77. 제71항에 있어서, 상기 항-TTR 항체는 14G8인, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 대상체는 더 이상 상기 항-TTR 항체에 의한 치료를 받지 않는, 방법.
  79. 제77항에 있어서, 상기 TTR 사량체 안정제는 타파미디스 또는 디플루니살인, 방법.
  80. 제77항에 있어서, 상기 TTR 사량체 안정제는 디플루니살인, 방법.
  81. 제77항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 치료제는 이노테센인, 방법.
  82. 제77항에 있어서, 상기 RNAi 기반 치료제는 파티시란 또는 레부시란인, 방법.
  83. 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증을 가진 대상체의 치료를 조절하는 방법으로서,
    (a) 트랜스타이레틴 매개된 아밀로이드증에 대해 치료를 개시하기 전의 대상체로부터의 샘플에서 제51항의 방법에 의해 검출된 리포터 항체 결합의 양을 치료를 개시한 후에 대상체에서 검출된 리포터 항체 결합의 양과 비교하는 단계; 및
    (b) 리포터 항체 결합의 양이 이전에 검출된 것과 동일하거나 또는 더 크다면, 상기 치료의 투여 용량 또는 빈도를 증가시키는 단계; 또는
    (c) 리포터 항체 결합의 양이 이전에 검출된 것보다 적다면, 상기 치료의 투여 용량 또는 빈도를 감소시키거나 또는 상기 치료를 중단시키는 단계
    를 포함하는, 치료를 조절하는 방법.
  84. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증은 아밀로이드 경쇄(AL) 아밀로이드증과 구별되는, 방법.
  85. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 인간 TTR을 발현시키는 이식유전자를 가진 유전자이식 마우스로부터 유래된, 방법.
  86. 생물학적 샘플에서의 총 다량체 미스폴딩된 트랜스타이레틴(TTR)의 수준 대 총 미스폴딩된 TTR 수준의 비를 결정하는 방법으로서,
    (a) 생물학적 샘플을 두 부분으로 나누는 단계;
    (b) 하기 (i) 및 (ii)에 의해 상기 생물학적 샘플의 제1 부분에서의 총 미스폴딩된 TTR을 검출하는 단계
    (i) 상기 생물학적 샘플의 제1 부분을 TTR의 잔기 89 내지 97 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 리포터 항체는 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및
    (ii) 단계 (b)(i)에서 샌드위치 복합체를 형성하는 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계;
    (c) 하기 (i) 및 (ii)에 의해 상기 생물학적 샘플의 제2 부분에서의 총 다량체 미스폴딩된 TTR을 검출하는 단계
    (i) 상기 생물학적 샘플의 상기 제2 부분을 잔기 89 내지 97 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 잔기 89 내지 97 내에서 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 다량체 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 포획 항체 및 리포터 항체는 상기 다량체 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및
    (ii) 단계 (c)(i)에서 샌드위치 복합체를 형성하는 상기 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 상기 다량체 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계,
    (d) (c)의 총 다량체 미스폴딩된 TTR 수준 대 (b)의 총 미스폴딩된 TTR 수준의 비를 계산하는 단계
    를 포함하는, 생물학적 샘플에서의 총 다량체 미스폴딩된 트랜스타이레틴의 수준 대 총 미스폴딩된 TTR 수준의 비를 결정하는 방법.
  87. 생물학적 샘플에서 미스폴딩된 트랜스타이레틴(TTR)을 검출하는 방법으로서,
    (a) 생물학적 샘플을 TTR의 잔기 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 포획 항체 및 리포터 항체는 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하는 상기 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 상기 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계
    를 포함하는, 생물학적 샘플에서의 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 유전성 ATTR 환자로부터 유래된, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 V30M, Y114C 및 S50I로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 운반하는 유전성 ATTR 환자로부터 유래된, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 돌연변이는 V30M인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  91. 제89항에 있어서, 상기 돌연변이는 Y114C인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  92. 제89항에 있어서, 상기 돌연변이는 S50I인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  93. 제87항에 있어서, 상기 돌연변이는 18C5인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이고, 상기 리포터 항체는 다클론성 항-TTR 항체인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  95. 제87항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터 항체는 9D5, 14G8, 5A1, 6C1, 8C3, 7G7, AD7F6, RT24, NI-301.35G11, MFD101, MDF102, MFD103, MFD105, MFD107, MFD108, MFD109, MFD111, MFD114, 또는 이들의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  96. 제87항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이고, 상기 리포터 항체는 9D5 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  97. 제87항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이고, 상기 리포터 항체는 14G8 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  98. 제87항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이고, 상기 리포터 항체는 5A87 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  99. 제87항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이고, 상기 리포터 항체는 6C87 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  100. 제87항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이고, 상기 리포터 항체는 8C3 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  101. 제87항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이고, 상기 리포터 항체는 7G7 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  102. 제87항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이고, 상기 리포터 항체는 AD7F6 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  103. 제87항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이고, 상기 리포터 항체는 RT24 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  104. 제87항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이고, 상기 리포터 항체는 NI-301.35G187, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  105. 제87항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이고, 상기 리포터 항체는 MFD1087 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  106. 제87항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이고, 상기 리포터 항체는 MDF102 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  107. 제87항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이고, 상기 리포터 항체는 MDF103 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  108. 제87항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이고, 상기 리포터 항체는 MDF105 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  109. 제87항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이고, 상기 리포터 항체는 MDF107 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  110. 제87항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이고, 상기 리포터 항체는 MDF108 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  111. 제87항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이고, 상기 리포터 항체는 MDF109, 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  112. 제87항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이고, 상기 리포터 항체는 MFD 1187 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  113. 제87항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이고, 상기 리포터 항체는 MFD114 또는 이의 키메라 형태 또는 인간화된 형태인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  114. 제87항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터 항체는 TTR의 잔기 89 내지 97, 118 내지 122, 115 내지 124, 53 내지 63, 54 내지 61, 36 내지 49, 49 내지 61, 109 내지 121, 30 내지 66, 70 내지 127, 80 내지 127, 90 내지 127, 100 내지 127, 110 내지 127 또는 115 내지 127 내에서 결합하는 항체인, 미스폴딩된 트랜스타이레틴을 검출하는 방법.
  115. 시험 항체로 치료된 대상체로부터의 생물학적 샘플에 남아있는 미스폴딩된 트랜스타이레틴(mis-TTR)을 검출함으로써, 대상체에게 투여되는 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법으로서, 표적은 mis-TTR의 잔기 101 내지 109 내의 에피토프이되,
    (a) 상기 생물학적 샘플을 잔기 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 상기 포획 항체의 에피토프와 상이한 TTR 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 포획 항체 및 리포터 항체는 샌드위치 복합체를 형성하는 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하는, 상기 접촉시키는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 샌드위치 복합체를 형성하는 상기 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 상기 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계
    를 포함하는, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  116. 제115항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 유전성 ATTR 환자로부터 유래된, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  117. 제116항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 V30M, Y114C 및 S50I로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 운반하는 유전성 ATTR 환자로부터 유래된, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  118. 제117항에 있어서, 상기 돌연변이는 V30M인, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  119. 제117항에 있어서, 상기 돌연변이는 Y114C인, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  120. 제117항에 있어서, 상기 돌연변이는 S50I인, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  121. 제115항 또는 제116항에 있어서, 상기 포획 항체는 18C5이되, 상기 포획 항체 및 상기 리포터 항체는 상이한 표지를 갖는, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  122. 제115항에 있어서, 상기 리포터 항체는 다량체 미스폴딩된 트랜스타이레틴에 대한 결합을 위해 상기 포획 항체와 결합에 대해 경쟁하는, 시험 항체의 생체내 표적 맞물림을 결정하는 방법.
  123. 제1항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터 항체는 전기화학발광 표지이고, 전기화학발광에 의해 검출되는, 방법.
  124. 제1항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 항체는 바이오틴 표지를 가진, 방법.
  125. 제1항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 정량적으로 수행되는, 방법.
  126. 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미스폴딩된 TTR의 절대적 또는 상대적 양을 나타내기 위해 정량적으로 수행되는, 방법.
  127. 제1항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 항체는 상기 접촉시키는 단계 전에 고체상에 결합되는, 방법.
  128. 제127항에 있어서, 상기 포획 항체는 링커를 통해 상기 고체상에 부착되는, 방법.
  129. 제127항에 있어서, 상기 고체상은 적어도 하나의 전극을 포함하는, 방법.
  130. 제1항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터 항체로부터의 신호를 알려진 양의 미스폴딩된 TTR을 함유하는 대조군 샘플에서의 리포터 항체로부터의 신호와 비교하여 상기 샘플에서의 미스폴딩된 TTR의 양을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  131. 제1항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 신호의 교정 곡선으로부터의 리포터 항체로부터의 신호를 미스폴딩된 TTR의 양에 비교하여 샘플에서의 미스폴딩된 TTR의 양을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  132. 제1항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터 항체로부터의 신호는 상기 샘플에서의 미스폴딩된 TTR의 양에 비례하는, 방법.
  133. 제1항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 인간으로부터의 샘플인, 방법.
  134. 제1항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 체액인, 방법.
  135. 제1항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 인간의 혈장인, 방법.
  136. 제1항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 미스폴딩된 TTR의 존재는 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증을 가진 대상체로부터의 샘플을 얻은 대상체를 진단하기 위해 사용되는, 방법.
  137. 제136항에 있어서, 상기 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증은 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증 또는 산발적 야생형 트랜스타이레틴 아밀로이드증인, 방법.
  138. 제137항에 있어서, 상기 대상체는 유전자 검사에 기반하여 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증의 위험에 있는 것으로 확인된, 방법.
  139. 제137항에 있어서, 상기 대상체는 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증의 증상을 나타내지 않는, 방법.
  140. 제139항에 있어서, 상기 대상체는 다발성 신경병증 또는 심장근육병증을 갖지 않는, 방법.
  141. 제137항에 있어서, 상기 가족성 트랜스타이레틴 아밀로이드증은 가족성 아밀로이드 심장근육병증(FAC), 가족성 아밀로이드 다발성 신경병증(FAP), 또는 중추 신경계 선택적 아밀로이드증(CNSA)인, 방법.
  142. 제1항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증에 대한 치료를 받는 환자로부터 유래된, 방법.
  143. 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증을 가진 대상체의 치료를 조절하는 방법으로서,
    (a) 트랜스타이레틴 매개된 아밀로이드증에 대해 이전에 치료된 대상체로부터의 샘플에서 제25항의 방법에 의해 검출된 미스폴딩된 TTR의 양을 치료 전에 또는 치료 초기 동안에 상기 대상체에서 검출된 미스폴딩된 TTR의 양과 비교하는 단계; 및
    (b) 미스폴딩된 TTR의 상기 양이 이전에 검출된 것과 동일하거나 또는 더 크다면, 이전 치료의 투여 용량 또는 빈도를 증가시키는 단계; 또는
    (c) 미스폴딩된 TTR의 양이 이전에 검출된 것보다 적다면, 사전 치료의 투여 용량 또는 빈도를 감소시키거나 또는 사전 치료를 중단시키는 단계
    를 포함하는, 치료를 조절하는 방법.
  144. 제143항에 있어서, 상기 사전 치료는 항-TTR 항체의 정맥내 투여에 의하고, 미스폴딩된 TTR의 상기 양이 이전에 검출된 양보다 적다면, 상기 사전 치료는 중단되며, TTR 안정제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 요법, RNA 간섭 요법 또는 독시사이클린 및 타우로우루소데옥시콜산과의 병용 요법에 의한 치료로 대체되는, 방법.
  145. 제144항에 있어서, 상기 대상체는 더 이상 상기 항-TTR 항체에 의한 치료를 받지 않는, 방법.
  146. 제144항에 있어서, 상기 TTR 사량체 안정제는 타파미디스 또는 디플루니살인, 방법.
  147. 제144항에 있어서, 상기 TTR 사량체 안정제는 디플루니살인, 방법.
  148. 제144항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 치료제는 이노테센인, 방법.
  149. 제144항에 있어서, 상기 RNAi 기반 치료제는 파티시란 또는 레부시란인, 방법.
  150. 제144항에 있어서, 상기 항-TTR 항체는 14G8인, 방법.
  151. 제150항에 있어서, 상기 대상체는 더 이상 상기 항-TTR 항체에 의한 치료를 받지 않는, 방법.
  152. 제150항에 있어서, 상기 TTR 사량체 안정제는 타파미디스 또는 디플루니살인, 방법.
  153. 제150항에 있어서, 상기 TTR 사량체 안정제는 디플루니살인, 방법.
  154. 제150항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 치료제는 이노테센인, 방법.
  155. 제150항에 있어서, 상기 RNAi 기반 치료제는 파티시란 또는 레부시란인, 방법.
  156. 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증을 가진 대상체의 치료를 조절하는 방법으로서,
    (a) 트랜스타이레틴 매개된 아밀로이드증에 대해 치료를 개시하기 전의 대상체로부터의 샘플에서 제46항의 방법에 의해 검출된 리포터 항체 결합의 양을 치료를 개시한 후에 상기 대상체에서 검출된 리포터 항체 결합의 양과 비교하는 단계; 및
    (b) 리포터 항체 결합의 양이 이전에 검출된 것과 동일하거나 또는 더 크다면, 상기 치료의 투여 용량 또는 빈도를 증가시키는 단계; 또는
    (c) 리포터 항체 결합의 양이 이전에 검출된 것보다 적다면, 상기 치료의 투여 용량 또는 빈도를 감소시키거나 또는 상기 치료를 중단시키는 단계
    를 포함하는, 치료를 조절하는 방법.
  157. 제87항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스타이레틴-매개 아밀로이드증은 아밀로이드 경쇄(AL) 아밀로이드증과 구별되는, 치료를 조절하는 방법.
  158. 제87항에 있어서, 상기 샘플은 인간 TTR을 발현시키는 이식유전자를 가진 이식유전자 마우스로부터 유래된, 치료를 조절하는 방법.
  159. 생물학적 샘플에서의 총 다량체 미스폴딩된 트랜스타이레틴(TTR)의 수준 대 총 미스폴딩된 TTR 수준의 비를 결정하는 방법으로서,
    (a) 생물학적 샘플을 두 부분으로 나누는 단계;
    (b) 하기 (i) 및 (ii)에 의해 상기 생물학적 샘플의 제1 부분에서의 총 미스폴딩된 TTR을 검출하는 단계
    (i) 상기 생물학적 샘플의 제1 부분을 TTR의 잔기 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 리포터 항체는 상기 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및
    (ii) 단계 (i)에서 상기 미스폴딩된 TTR에 결합된 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 상기 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계;
    (c) 하기 (i) 및 (ii)에 의해 상기 생물학적 샘플의 제2 부분에서의 총 다량체 미스폴딩된 TTR을 검출하는 단계
    (i) 상기 생물학적 샘플의 상기 제2 부분을 잔기 101 내지 109 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 TTR의 잔기 101 내지 109 내에서 에피토프에 특이적으로 결합하는 리포터 항체와 접촉시키는 단계로서; 다량체 미스폴딩된 TTR이 상기 샘플에 존재한다면, 상기 포획 항체 및 리포터 항체는 상기 다량체 미스폴딩된 TTR에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하는, 상기 접촉시키는 단계; 및
    (ii) 단계 (a)에서 총 다량체 미스폴딩된 TTR에 결합된 상기 리포터 항체를 검출하여, 만약에 있다면, 상기 다량체 미스폴딩된 TTR의 존재 또는 부재를 나타내는 단계,
    (d) (c)의 총 다량체 미스폴딩된 TTR 수준 대 (b)의 총 미스폴딩된 TTR 수준의 비를 계산하는 단계
    를 포함하는, 생물학적 샘플에서의 총 다량체 미스폴딩된 트랜스타이레틴의 수준 대 총 미스폴딩된 TTR 수준의 비를 결정하는 방법.
KR1020207010132A 2017-10-06 2018-10-05 트랜스타이레틴의 검출 방법 KR102581734B1 (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762569438P 2017-10-06 2017-10-06
US62/569,438 2017-10-06
US201762579817P 2017-10-31 2017-10-31
US62/579,817 2017-10-31
US201862647582P 2018-03-23 2018-03-23
US62/647,582 2018-03-23
PCT/US2018/054723 WO2019071206A1 (en) 2017-10-06 2018-10-05 METHODS OF DETECTING TRANSTHYRETIN

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200067144A true KR20200067144A (ko) 2020-06-11
KR102581734B1 KR102581734B1 (ko) 2023-09-22

Family

ID=65995330

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207010132A KR102581734B1 (ko) 2017-10-06 2018-10-05 트랜스타이레틴의 검출 방법

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20200249244A1 (ko)
EP (1) EP3691626A4 (ko)
JP (1) JP7292569B2 (ko)
KR (1) KR102581734B1 (ko)
CN (1) CN111757730A (ko)
AU (1) AU2018345807A1 (ko)
BR (1) BR112020006791A2 (ko)
CA (1) CA3077353A1 (ko)
CU (1) CU20200022A7 (ko)
MX (1) MX2020003043A (ko)
PE (1) PE20210042A1 (ko)
SG (1) SG11202002490UA (ko)
WO (1) WO2019071206A1 (ko)
ZA (1) ZA202002137B (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10464999B2 (en) 2015-01-28 2019-11-05 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
US10633433B2 (en) 2015-01-28 2020-04-28 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
TWI786505B (zh) 2015-01-28 2022-12-11 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 抗甲狀腺素運送蛋白抗體
US9879080B2 (en) 2015-01-28 2018-01-30 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
CU20200021A7 (es) 2017-10-06 2021-01-12 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos anti-transtiretina
PE20211453A1 (es) 2017-11-29 2021-08-05 Prothena Biosciences Ltd Formulacion liofilizada de un anticuerpo monoclonal contra transtirretina
US20220283185A1 (en) * 2019-08-27 2022-09-08 University Of Southern California Assays for detecting and quantifying a biomarker of pericyte injury
WO2023087016A1 (en) * 2021-11-15 2023-05-19 Ascendo Biotechnology, Inc. Methods to reverse treml1-induced immune suppression
WO2023099788A1 (en) 2021-12-03 2023-06-08 Neurimmune Ag Novel potency assay for antibody-based drugs and useful means therefor
WO2023192161A2 (en) * 2022-03-28 2023-10-05 Intrinsic Medicine, Inc. Methods and compositions for attenuating immune response associated with rna therapeutics

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160039916A1 (en) * 2013-02-08 2016-02-11 Misfolding Diagnostics, Inc. Transthyretin antibodies and uses thereof
US20160257736A1 (en) * 2015-01-28 2016-09-08 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
US20170058023A1 (en) * 2015-01-28 2017-03-02 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008046930A1 (en) * 2006-10-20 2008-04-24 Clondiag Gmbh Assay devices and methods for the detection of analytes
US9534048B2 (en) * 2012-08-24 2017-01-03 University Health Network Antibodies to TTR and methods of use
US20140329721A1 (en) * 2013-01-03 2014-11-06 Meso Scale Technologies, Llc Assay panels
CN106255702B (zh) * 2013-12-20 2020-03-24 生物控股有限公司 基于抗体的对转甲状腺素蛋白(ttr)淀粉样变性的疗法及其人源抗体
KR102538555B1 (ko) * 2014-01-29 2023-05-30 케이엠 바이올로직스 가부시키가이샤 항-트랜스티레틴 인간화 항체
WO2015115332A1 (ja) * 2014-01-29 2015-08-06 一般財団法人化学及血清療法研究所 抗トランスサイレチンヒト抗体
ES2928500T3 (es) * 2014-08-29 2022-11-18 Alnylam Pharmaceuticals Inc Patisirán para su uso en el tratamiento de amiloidosis mediada por transtiretina
TWI786505B (zh) * 2015-01-28 2022-12-11 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 抗甲狀腺素運送蛋白抗體
US9879080B2 (en) * 2015-01-28 2018-01-30 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160039916A1 (en) * 2013-02-08 2016-02-11 Misfolding Diagnostics, Inc. Transthyretin antibodies and uses thereof
US20160257736A1 (en) * 2015-01-28 2016-09-08 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
US20170058023A1 (en) * 2015-01-28 2017-03-02 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Gertz, Morie A. et al., Journal of the American College of Cardiology, 2015, Vol. 66, pp 2451-2466. 1부.* *
Martinez-Naharro Ana, et al., Journal of the American College of Cardiology, 2017, Vol. 70, pp 466-477. 1부.* *

Also Published As

Publication number Publication date
CU20200022A7 (es) 2021-01-12
CN111757730A (zh) 2020-10-09
JP2020537128A (ja) 2020-12-17
WO2019071206A1 (en) 2019-04-11
JP7292569B2 (ja) 2023-06-19
MX2020003043A (es) 2020-10-05
EP3691626A1 (en) 2020-08-12
ZA202002137B (en) 2023-07-26
CA3077353A1 (en) 2019-04-11
SG11202002490UA (en) 2020-04-29
BR112020006791A2 (pt) 2020-12-01
KR102581734B1 (ko) 2023-09-22
AU2018345807A1 (en) 2020-03-12
PE20210042A1 (es) 2021-01-08
EP3691626A4 (en) 2021-06-30
US20200249244A1 (en) 2020-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102581734B1 (ko) 트랜스타이레틴의 검출 방법
AU2019203976B2 (en) TAU Immunotherapy
KR102598180B1 (ko) 항-트랜스타이레틴 항체
KR102619359B1 (ko) 항-트랜스타이레틴 항체
CN111315213B (zh) 抗甲状腺素运载蛋白抗体
KR102649788B1 (ko) 항-트랜스타이레틴 항체
CN109415432B (zh) Tau免疫疗法
CN111433223A (zh) 抗甲状腺素运载蛋白单克隆抗体的冻干制剂
KR20210090184A (ko) 타우 인식 항체
CN106795223B (zh) 针对Fcγ受体IIB及Fcε受体的抗体
KR20160131073A (ko) Lg4-5에 대해 특이적인 항-라미닌4 항체
CN112638932A (zh) 人源性抗(聚-ga)二肽重复序列(dpr)抗体
KR20160131082A (ko) Lg1-3에 특이적인 항-라미닌4 항체
KR20180093068A (ko) Pcsk9 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 적용
JP2023533458A (ja) ソルチリンを認識する抗体
EA046080B1 (ru) Способы обнаружения транстиретина
EA043913B1 (ru) Анти-транстиретиновые антитела

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant