CN106459956B - 抗-运甲状腺素蛋白人抗体 - Google Patents

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Abstract

包括包含SEQ ID NO:1‑3所示的氨基酸序列的H链互补决定区和包含SEQ ID NO:4‑6所示的氨基酸序列的L链互补决定区的人抗体。该人抗体适合于在人中使用，并显示特异性结合已经历结构变化的运甲状腺素蛋白(TTR)的活性，和抑制TTR纤维化的活性。

Description

抗-运甲状腺素蛋白人抗体
技术领域
本发明提供有效地抑制淀粉样蛋白原纤维的形成和其通过运甲状腺素蛋白(TTR)沉积至组织的抗体，以及使用所述抗体的治疗方法。该抗体疗法基于正常TTR不受影响，但仅异常TTR的淀粉样蛋白发生受到抑制的新治疗策略，并预期是在安全性方面出色的新治疗方法。
背景技术
淀粉样变是其中形成纤维结构的蛋白在全身器官中沉积以诱导功能紊乱的一系列疾病，并包括各种疾病例如阿尔茨海默痴呆和朊病毒病(非专利文献1)。
家族性淀粉样蛋白多神经病(FAP)是由TTR、载脂蛋白A1、凝溶胶蛋白等的基因的点突变或缺失引起的常染色体显性的遗传性系统淀粉样变(非专利文献2)。在这些当中，由TTR的遗传突变引起的FAP是最常见的。已知突变体TTR形成淀粉样蛋白原纤维，在中年后其通常沉积在全身几乎所有的组织中，例如周围神经、心、肾、消化道、眼、脑和脑膜。它是一种顽固性疾病，表现出极差的患者康复和在疾病发生后大约10年内致死。
到目前为止，已经报道了超过100种TTR基因的点突变和缺失。特别是，其中TTR的第30位缬氨酸被突变为甲硫氨酸的Val30Met突变(后文称为"V30M")是最常见的。在葡萄牙、瑞典和日本存在许多患者。因为在葡萄牙已经确认超过6,000例FAP患者，FAP尚未被调查的区域并非少数并且预期世界范围FAP患者的发现将会持续，因此猜测在整个世界范围内存在超过10,000名患者。从最近的研究得知，FAP的临床特征(发生的年龄、沉积器官特异性等)极大地受TTR基因的突变类型的影响(非专利文献3)。例如，关于FAP的发生年龄，L55P突变显示疾病在十几岁发生的急性临床特征，而关于V122I突变，疾病在60岁和以后发生。另一方面，已知V30M突变显示其中疾病在较小年龄和在较大年龄发生的两种类型的疾病。关于沉积器官特异性，D18G突变导致在脑和脑膜中沉积，引起中枢神经紊乱，而V30M突变导致在全身组织中沉积，引起周围神经紊乱和心肌紊乱(非专利文献3和4)。
TTR是由127个氨基酸残基组成的蛋白，其分子量为14 kDa并具有内部存在的8个β-链形成2个反向平行的β-片的结构(非专利文献5)。TTR主要在肝中产生，但也在心室脉络丛、视网膜的视网膜色素上皮细胞、脾等中产生。TTR通常通过在血液中形成分子量为55kDa的四聚体而形成稳定结构，并且主要在血液和脑脊液中作为维生素A/视黄醇-结合蛋白复合物和甲状腺激素T4的载体发挥作用。其血液水平高达200-400 μg/mL，但其半寿期短至2天(非专利文献2-6)。已知在TTR四聚体的中心存在两个同源T4-结合位点，T4与其结合以稳定四聚体结构(非专利文献3)。存在关于TTR的另一种功能的各种报道，例如胰岛素分泌促进活性、脑神经保护活性和关于脂质代谢的活性(非专利文献2。另一方面，尽管视黄醇和甲状腺激素的血液水平在TTR基因敲除小鼠中降低，但未能见到在表型(例如存活率和生育力性质)上的显著改变(非专利文献7)，因此仍然未知TTR对于维持实际的生物学活性是否是直接必需的。
对于TTR导致的淀粉样蛋白发生，从四聚体离解成单体和单体的结构变化是非常重要的步骤(非专利文献3)。在这些当中，已经显示从四聚体离解成单体是反应的速率决定步骤。另一方面，在其中TTR形成在组织中沉积和损坏全身器官的淀粉样蛋白的过程中，对组织产生毒性的分子形式尚未完全阐明。据报道，单体和低分子量寡聚体例如二聚体显示细胞毒性，而100 kDa或更大的TTR淀粉样蛋白并非如此(非专利文献5)，因此希望未来的研究将澄清毒性和分子形式之间的关联。
对起源于TTR的遗传异常的FAP的治疗策略主要分为以下四类。
(1) 抑制变体TTR的产生水平
(2) 稳定包含变体TTR的TTR四聚体结构
(3) 防止从四聚体离解的TTR的淀粉样蛋白形成
(4) 除去组织中沉积的TTR淀粉样蛋白
因为在血液中几乎所有的TTR在肝中产生(非专利文献2)，目前最常见的疗法是归类为上文(1)的肝移植。尽管通过肝移植观察到疾病进展延迟，但对于患者而言，整个生命中使用免疫抑制剂是不可避免的，其对捐赠者和患者是极大的手术负担。此外，在数种器官(包括眼和心)中沉积仍继续，因此在不少病例中可见到在这些器官中症状恶化(非专利文献8)。因此，这是有问题的，由此开发有效的治疗方法是迫切需要的。
对于肝移植以外的其它治疗方法，在策略(1)的情况下使用siRNA或反义寡核苷酸的治疗方法处于临床开发阶段。然而，对于所有这些方法，不仅变体TTR而且野生型TTR的产生受到抑制，因此当长期使用时应仔细进行它们的安全性评价。关于策略(2)，已经开发与TTR四聚体的T4-结合位点结合从而稳定四聚体结构的药物。根据该策略开发的新药VyndaqelR已在2011年在欧盟和2013年在日本获得批准。作为长达30个月的临床试验的结果，VyndaqelR显示在FAP患者中延迟周围神经病的作用，但不能完全抑制症状的进展(非专利文献9)。并且对于策略(3)和(4)，尽管多种药物处于临床开发阶段，现状是无一疗法可为根治疗法。
专利文献
专利文献1: WO 2010030203
专利文献2: JP 2010-195710
非专利文献
非专利文献1: Glenner, G.G.: Amyloid deposits and amyloidosis: thebeta-fibrilloses (second of two parts).: N Engl J Med, 302:1333-1343, 1980
非专利文献2: Ando, Y. & Jono, H.: Pathogenesis and therapy fortransthyretin related amyloidosis.: Rinsho Byori, 56:114-120, 2008
非专利文献3: Yoshiki Sekijima: Molecular mechanism of TTR amyloiddeposition and its control: Igaku-No-Ayumi, 229:349-356, 2009
非专利文献4: Yuko Motozaki, Shoji Yamada: Molecular epidemiology offamilial amyloidotic polyneuropathy (FAP): Igaku-No-Ayumi, 229:357-362, 2009
非专利文献5: Hou, X., Aguilar, M.I. & Small, D.H.: Transthyretin andfamilial amyloidotic polyneuropathy. Recent progress in understanding themolecular mechanism of neurodegeneration.: FEBS J, 274:1637-1650, 2007
非专利文献6: Araki, S. & Ando, Y.: Transthyretin-related familialamyloidotic polyneuropathy -Progress in Kumamoto, Japan （1967-2012)-.: ProcJpn Acad Ser B Phys Biol Sci, 86:694-706, 2010
非专利文献7: Episkopou, V., Maeda, S., Nishiguchi, S., Shimada, K.,Gaitanaris, G.A., Gottesman, M.E. & Robertson, E.J.: Disruption of thetransthyretin gene results in mice with depressed levels of plasma retinoland thyroid hormone.: Proc Natl Acad Sci U S A, 90:2375-2379, 1993
非专利文献8: Yukio Ando: Liver transplantation and other treatmentsfor familial amyloidotic polyneuropathy (FAP): Igaku-No-Ayumi, 229:363-368,2009
非专利文献9: Said, G., Grippon, S. & Kirkpatrick, P.: Tafamidis.: NatRev Drug Discov, 11:185-186, 2012
非专利文献10: Goldsteins, G., Persson, H., Andersson, K., Olofsson,A., Dacklin, I., Edvinsson, A., Saraiva, M.J. & Lundgren, E.: Exposure ofcryptic epitopes on transthyretin only in amyloid and in amyloidogenicmutants.: Proc Natl Acad Sci U S A, 96:3108-3113, 1999
非专利文献11: Terazaki, H., Ando, Y., Fernandes, R., Yamamura, K.,Maeda, S. & Saraiva, M.J.: Immunization in familial amyloidoticpolyneuropathy: counteracting deposition by immunization with a Y78F TTRmutant.: Lab Invest, 86:23-31, 2006
非专利文献12: Bergstroem, J., Engstroem, U., Yamashita, T., Ando, Y.& Westermark, P.: Surface exposed epitopes and structural heterogeneity of invivo formed transthyretin amyloid fibrils.: Biochem Biophys Res Commun, 348:532-539, 2006
非专利文献13: Matsubara, K., Mizuguchi, M. & Kawano, K.: Expressionof a synthetic gene encoding human transthyretin in Escherichia coli.:Protein Expr Purif, 30:55-61, 2003.
非专利文献14: Ueda, M., Ando, Y., Hakamata, Y., Nakamura, M.,Yamashita, T., Obayashi, K., Himeno, S., Inoue, S., Sato, Y., Kaneko, T.,Takamune, N., Misumi, S., Shoji, S., Uchino, M. & Kobayashi, E.: A transgenicrat with the human ATTR V30M: a novel tool for analyses of ATTR metabolisms.:Biochem Biophys Res Commun, 352:299-304, 2007.
非专利文献15: Matsubara, K., Mizuguchi, M., Igarashi, K., Shinohara,Y., Takeuchi, M., Matsuura, A., Saitoh, T., Mori, Y., Shinoda, H. & Kawano,K.: Dimeric transthyretin variant assembles into spherical neurotoxins.:Biochemistry, 44:3280-3288, 2005.
非专利文献16: Senju, S., Haruta, M., Matsumura, K., Matsunaga, Y.,Fukushima, S., Ikeda, T., Takamatsu, K., Irie, A. & Nishimura, Y.: Generationof dendritic cells and macrophages from human induced pluripotent stem cellsaiming at cell therapy.: Gene Ther, 18:874-883, 2011。
发明内容
(本发明要解决的技术问题)
近些年来，通过免疫疗法的FAP治疗引人关注。显然的是，在形成TTR淀粉样蛋白的过程中，与TTR的结构改变有关的新的表位(隐蔽表位)暴露在分子表面上(非专利文献10)。
在这样的情况下，Terazaki等用TTR Y78F变体(已知暴露隐蔽表位的变体)免疫人TTR V30M转基因小鼠(hTTR Tg小鼠)，一种FAP模型动物，和评价其对小鼠组织中TTR淀粉样蛋白沉积的影响(非专利文献11)。结果是，在用TTR Y78F变体免疫的小鼠组中证实了抗-TTR抗体的抗体滴度显著增加，并且与这一起的是，可见到TTR在食管、胃和肠中的沉积量降低。同样，在用已经显示TTR沉积的18月龄的hTTR Tg小鼠的类似试验中，在Y78F免疫组中可见到TTR沉积量显著降低。这些结果表明了以下可能性：用暴露隐蔽表位的TTR变体免疫小鼠在小鼠体内诱导针对TTR的抗体产生和结果是TTR淀粉样蛋白沉积受到抑制。
另一方面，Bergstroem等用TTR 115-124肽(隐蔽表位之一)免疫兔以制备抗-TTR115-124多克隆抗体(非专利文献12)。将该多克隆抗体给予hTTR V30M转基因大鼠以评价对在大鼠组织中TTR沉积的影响。结果是，发现在给予多克隆抗体的组中，在大鼠肠道中TTR沉积量显著降低(非专利文献13)。
根据这些结果，可存在以下可能性：特异性识别TTR的隐蔽表位的抗体与TTR淀粉样蛋白(或者具有构成TTR淀粉样蛋白的结构改变的TTR)特异性结合，从而促进TTR淀粉样蛋白形成的抑制或TTR淀粉样蛋白的去除。即，表明了特异性识别TTR的隐蔽表位的抗体可能是新的FAP治疗剂的可能性。
BIOCODEX报道了基于这一概念的抗-TTR抗体研究。BIOCODEX使用TTR敲除小鼠制备了小鼠单克隆抗体AD7F6，其对淀粉样蛋白起源的TTR是特异性的，和使用Tg小鼠(ATTRV30M)，一种FAP疾病模型，表明该单克隆抗体抑制TTR组织沉积(专利文献1)。BIOCODEX专利要求保护小鼠抗体的氨基酸序列，因此其难以将该抗体给予人。关于该抗体与具有四聚体结构的V30M变体的反应性，未清楚描述。在具有V30M突变的FAP患者中，认为在血液中具有四聚体结构的V30M变体离解成单体，其一部分导致结构改变以形成淀粉样蛋白。因此，不与具有四聚体结构的V30M变体反应而是仅与形成淀粉样蛋白的所述V30M变体反应(或者在淀粉样蛋白发生当中)的抗体是实现更加有效和更安全的抗体疗法的必需条件。关于该抗体的反应性，因为仅V30M载体的血清用作临床样品，其与患者体内的组织沉积的淀粉样蛋白的反应性尚不清楚。
葡萄牙波尔图大学的小组报道了基于相同概念的抗-TTR抗体研究(非专利文献10)。据报道，制备了小鼠单克隆抗体mAb 39-44和mAb 56-61，其对具有结构改变的TTR是特异性的，和这些抗体与源自活体的V30M变体的淀粉样蛋白反应。然而，清楚说明的是，这些抗体未显示对淀粉样蛋白发生的抑制活性，仅涉及它们用于FAP诊断的可能性。
如上所述，尽管报道了通过用TTR的隐蔽表位免疫小鼠(或大鼠)获得的多克隆抗体或单克隆抗体抑制TTR沉积，但具有特异性结合具有结构改变的TTR的活性或抑制TTR-原纤维化的活性的抗体和适合给予人的人源化抗体或人抗体尚未报道。
(解决问题的方式)
本发明人认识到，在TTR淀粉样变中四聚体TTR的一部分离解成单体TTR，其经过结构改变以形成淀粉样蛋白，但另一方面仍存在正常发挥功能的四聚体TTR。因此，本发明人研究了特异性结合具有结构改变的TTR和具有抑制TTR-原纤维化的活性的抗体。以实现对TTR淀粉样变的抗体疗法作为最终目标，本发明人努力研究具有上述活性的人抗体以完成本发明。
即，本发明涉及以下内容：
(1) 具有抑制运甲状腺素蛋白(下文称为“TTR”)的原纤维化的活性的人抗体；
(2) (1)的人抗体，其特异性识别具有结构改变的TTR；
(3) (1)或(2)的人抗体，其特异性结合TTR淀粉样蛋白；
(4) (1)-(3)中任一项的人抗体，其结合源自两种或更多种变体TTR的TTR淀粉样蛋白；
(5) (4)的人抗体，其中变体TTR是具有选自D18G, V30M, E54K, L55P, Y114C,Y116S和V122I的突变的TTR；
(6) (1)-(5)中任一项的人抗体，其促进TTR淀粉样蛋白的去除；
(7) (1)-(6)中任一项的人抗体，其促进巨噬细胞对TTR淀粉样蛋白的吞噬能力；
(8) (1)-(7)中任一项的人抗体，其中表位是包含TTR的位置79至位置89的序列；
(9) (8)的人抗体，其中表位是TTR的位置79至位置89；
(10) (1)-(9)中任一项的人抗体，其对TTR淀粉样变具有治疗作用和/或预防作用；
(11) (10)的人抗体，其中TTR淀粉样变是家族性淀粉样蛋白多神经病(下文称为“FAP”)；
(12) (10)的人抗体，其中TTR淀粉样变是老年系统性淀粉样变(下文称为“SSA”)；
(13) (1)-(12)中任一项的人抗体，其是通过噬菌体展示获得的抗体；
(14) (1)-(13)中任一项的人抗体，其包含由下文(a)或(b)的多肽组成的H链互补决定区和由下文(c)或(d)的多肽组成的L链互补决定区：
(a) 由SEQ ID NO: 1-3所示的氨基酸序列组成的多肽；
(b) 由SEQ ID NO: 1-3所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的H链互补决定区；
(c) 由SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列组成的多肽；
(d) 由SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的L链互补决定区；
(15) (1)-(13)中任一项的人抗体，其包含由下文(e)或(f)的多肽组成的H链互补决定区和由下文(g)或(h)的多肽组成的L链互补决定区：
(e) 由SEQ ID NO: 7-9所示的氨基酸序列组成的多肽；
(f) 由SEQ ID NO: 7-9所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的H链互补决定区；
(g) 由SEQ ID NO: 10-12所示的氨基酸序列组成的多肽；
(h) 由SEQ ID NO: 10-12所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的L链互补决定区；
(16) (1)-(13)中任一项的人抗体，其包含由下文(i)或(j)的多肽组成的H链可变区和由下文(k)或(l)的多肽组成的L链可变区：
(i) 由SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列组成的多肽；
(j) 由SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的H链可变区；
(k) 由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列组成的多肽；
(l) 由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的L链可变区；
(17) (1)-(13)中任一项的人抗体，其包含由下文(m)或(n)的多肽组成的H链可变区和由下文(o)或(p)的多肽组成的L链可变区：
(m) 由SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列组成的多肽；
(n) 由SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的H链可变区；
(o) 由SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列组成的多肽；
(p) 由SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的L链可变区；
(18) 包含由下文(a)或(b)的多肽组成的H链互补决定区的H链可变区片段：
(a) 由SEQ ID NO: 1-3所示的氨基酸序列组成的多肽；
(b) 由SEQ ID NO: 1-3所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的H链互补决定区；
(19) 包含由下文(c)或(d)的多肽组成的L链互补决定区的L链可变区片段：
(c) 由SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列组成的多肽；
(d) 由SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的L链互补决定区；
(20) 由下文(i)或(j)的多肽组成的H链可变区片段：
(i) 由SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列组成的多肽；
(j) 由SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的H链可变区；
(21) 由下文(k)或(l)的多肽组成的L链可变区片段：
(k) 由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列组成的多肽；
(l) 由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的L链可变区；
(22) 包含由下文(e)或(f)的多肽组成的H链互补决定区的H链可变区片段：
(e) 由SEQ ID NO: 7-9所示的氨基酸序列组成的多肽；
(f) 由SEQ ID NO: 7-9所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的H链互补决定区；
(23) 包含由下文(g)或(h)的多肽组成的L链互补决定区的L链可变区片段：
(g) 由SEQ ID NO: 10-12所示的氨基酸序列组成的多肽；
(h) 由SEQ ID NO: 10-12所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的L链互补决定区；
(24) 由下文(m)或(n)的多肽组成的H链可变区片段：
(m) 由SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列组成的多肽；
(n) 由SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的H链可变区；
(25) 由下文(o)或(p)的多肽组成的L链可变区片段：
(o) 由SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列组成的多肽；
(p) 由SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的L链可变区；
(26) TTR的抗体的单链可变区片段，其通过连接(18)的包含H链互补决定区的H链可变区片段或(20)的H链可变区片段和(19)的包含L链互补决定区的L链可变区片段或(21)的L链可变区片段形成；
(27) (1)-(13)中任一项的人抗体或其片段，其通过连接人-来源的恒定区与(18)的包含H链互补决定区的H链可变区片段或(20)的H链可变区片段和/或与(19)的包含L链互补决定区的L链可变区片段或(21)的L链可变区片段形成；
(28) TTR的抗体的单链可变区片段，其通过将(22)的包含H链互补决定区的H链可变区片段或(24)的H链可变区片段和(23)的包含L链互补决定区的L链可变区片段或(25)的L链可变区片段连接形成；
(29) (1)-(13)中任一项的人抗体或其片段，其通过将人来源的恒定区与(22)的包含H链互补决定区的H链可变区片段或(24)的H链可变区片段和/或与(23)的包含L链互补决定区的L链可变区片段或(25)的L链可变区片段连接形成；
(30) 编码(1)-(29)中任一项的抗体或其片段的基因；
(31) 包含(30)的基因的重组表达载体；
(32) 转化体，其中引入了(30)的基因或(31)的表达载体；
(33) 用于检测TTR淀粉样蛋白的装置，其包含(1)-(29)中任一项的抗体或其片段；
(34) 用于检测TTR淀粉样蛋白的试剂，其包含(1)-(29)中任一项的抗体或其片段；
(35) 用于除去TTR淀粉样蛋白的载体，其包含(1)-(29)中任一项的抗体或其片段；
(36) 用于TTR淀粉样变的诊断剂，其包含(1)-(29)中任一项的抗体或其片段；
(37) (36)的诊断剂，其中TTR淀粉样变是FAP；
(38) (36)的诊断剂，其中TTR淀粉样变是SSA；
(39) TTR-原纤维化抑制剂，其包含(1)-(29)中任一项的抗体或其片段；
(40) 用于预防和/或治疗TTR淀粉样变的药物组合物，其包含(1)-(29)中任一项的抗体或其片段；
(41) (40)的药物组合物，其中TTR淀粉样变是FAP；
(42) (40)的药物组合物，其中TTR淀粉样变是SSA；
(43) 用于测量抑制TTR-原纤维化的活性的方法，包括在去氧胆酸钠存在的情况下使变体TTR与待测试的样品反应的步骤；
(44) (43)的方法，其中使原纤维化在中性条件下进行；
(45) (43)或(44)的方法，其中去氧胆酸钠的浓度为0.1%至1%；
(46) (43)-(45)中任一项的方法，其中待测试的样品是TTR的抗体；
(47) (43)-(46)中任一项的方法，其中变体TTR是V30M TTR。
发明效果
本发明人已经产生了特异性识别具有结构改变的TTR的单克隆抗体，并且成功开辟了开发能够治疗FAP的抗体药物的途径。本发明的抗体有效地抑制淀粉样蛋白原纤维的形成和其通过TTR沉积到组织，但不与在血液中发挥功能的正常TTR反应。因此，本发明的抗体预期为安全性方面优良的抗体药物。此外，作为作用机制，可预期两种不同的效果：(1)淀粉样蛋白的形成和其通过TTR沉积至组织受到抑制；和(2) 沉积至组织的TTR淀粉样蛋白也受到影响以加速其清除，即累积的淀粉样蛋白减少。这些效果完全不能够通过现有技术或之前的进展论文获得。因此，本发明的抗体疗法极大预期为对TTR淀粉样变的新的治疗策略。
如上所述，本发明的抗体不仅预期对FAP提供并非肝移植的新的治疗方法，而且具有用作老年系统性淀粉样变(SSA)的治疗剂的可能性。对于TTR淀粉样变，不仅由TTR的遗传突变引起的FAP而且由主要在心脏中通过野生型TTR形成的淀粉样蛋白沉积引起的SSA是已知的。其被认为是心脏中的阿尔茨海默病。淀粉样蛋白沉积还在肺、血管壁、肾髓质等中见到。患者往往诉说心脏中没有一种或多种症状(无痛心力衰竭)并且有时腕管综合征。从60岁以后观察到该疾病发生，认为在大约1/4的80岁以后中观察到发生。仅在美国，报道了患者数估计超过400,000。对该疾病尚未建立有效的治疗方法。本发明的抗体，因为具有抑制野生型TTR的原纤维化的活性，而被预期适用于SSA。
预期本发明抗体产品不仅适用于FAP，而且适用于由TTR引起的各种器官的淀粉样蛋白发生疾病，因此预期促进其中直至当前治疗方法尚未建立的这些许多疾病的患者的疗法。
附图简述
图1显示(a) 嵌合371抗体H链表达载体pKMA010-371-mCg1，(b) 嵌合371抗体L链表达载体pKMA009-371-mCλ，(c) 嵌合313抗体H链表达载体pKMA010-313-mCg1，和(d) 嵌合313抗体L链表达载体pKMA009-313-mCλ的图谱。
图2显示分别对于(a) TTR的位置76-85，和(b) TTR的位置84-93的表位分析结果。
图3显示分别对于(a) 371M抗体，(b) 313M抗体，(c) 通过Dako制备的多克隆抗体，和(d) 阴性对照抗体，使用表面等离子共振的反应特异性分析结果。
图4显示分别对于(a) 371抗体，和(b) 313抗体，对患者血清的反应性分析结果。
图5(a)显示对患者组织(石蜡切片)的反应性分析的结果。
图5(b)显示对患者组织(冷冻切片)的反应性分析的结果。
图6显示分别对于(a) 银染，(b) 用371M抗体的蛋白质印迹，和(c) 用313M抗体的蛋白质印迹，对TTR原纤维的反应性分析的结果。
图7显示TTR-原纤维化抑制试验的初步检查结果。
图8显示TTR-原纤维化抑制试验的初步检查结果。
图9显示分别对于(a) 371抗体和313抗体，和(b) 371M抗体和313M抗体的TTR-原纤维化抑制试验的结果。
图10显示分别对于(a) 未处理的纯化的V30M，和(b) TTR原纤维的巨噬细胞吞噬能力试验的结果。
图11显示使用V30M Tg大鼠进行药效评价试验的结果。
实施本发明的最佳方式
下文解释了本发明的具体实施方案。本发明不解释为局限于这些实施方案。
1. 本发明的重组人抗体和其片段
根据本发明，为获得特异性结合具有结构改变的TTR和抑制TTR-原纤维化的人抗体，关注于经历结构改变和以二聚体存在的TTR S112I，选择S112I作为抗原用于制备抗体和使用噬菌体展示以制备人抗体。用噬菌体展示制备抗体的技术包括"Brian K. Kay等编辑的Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual"，"J.McCAFFERTY等编辑的Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH"和"Carl A. K.BORREBAECK编辑的ANTIBODY ENGINEERING，第二版"。根据本发明，将通过酸处理原纤维化的S112I固定至用于淘选的板上，然后与噬菌体文库反应。对于酸处理，可合适地选择用于S112I的原纤维化的温度、时间和pH。原纤维化的存在与否可通过硫磺素T测定法检查。例如，S112I可在pH 3.0至pH 4.4的条件下在37°C处理16小时。将板洗涤以除去未结合的噬菌体，然后收集与靶分子结合的噬菌体和感染大肠杆菌。在大肠杆菌培养后，收集噬菌体和再次与板反应。在进行这样的一系列淘选循环3-5次后，通过ELISA试验选择显示与S112I优良反应性的那些噬菌体。
从产生选择的噬菌体的大肠杆菌，收集来自噬菌体的质粒DNA，和分析VH区(或VL区)的核苷酸序列。VH区或VL区的核苷酸序列插入含有编码H链或L链恒定区的核苷酸序列的表达载体以制备H链或L链的表达载体。将得到的表达载体引入合适的宿主(动物细胞)和使用该宿主表达人抗体。
根据本发明，获得具有不同的CDR氨基酸序列的两种人抗体，和这些抗体的框架区的氨基酸序列经突变以制备改进的人抗体(371M、313M)。
例示了用于分析人抗体的表位的方法。用其中一个氨基酸残基改变为丙氨酸(位置91的氨基酸残基为丙氨酸，因此改变为丝氨酸)的人TTR的位置76-93的氨基酸序列的肽，制备修饰的人TTR。常规的定点诱变用于制备修饰的TTR的基因。将基因插入至表达载体，然后用合适的宿主(优选大肠杆菌)表达和纯化。用常规的蛋白质印迹，将修饰TTR在SDS-PAGE上电泳分离和与分析对象的抗体反应以检测变体和抗体之间的反应性。当发现修饰的TTR与抗体的结合降低时，修饰的部分可被认为是表位。本发明的抗体具有位置78-89的表位，推断其存在于野生型TTR四聚体的隐藏部分中。该表位是一种新的表位。
可测试上述人抗体对具有结构改变的TTR的特异反应性，与原纤维化TTR的反应性，对源自于TTR患者的组织的免疫染色，对通过变体TTR的原纤维化的抑制活性，对巨噬细胞对TTR淀粉样蛋白的吞噬能力的促进活性，和使用FAP动物模型的药效评价。
用于分析对具有结构改变的TTR的特异反应性的方法包括使用表面等离子共振的方法。制备野生型TTR四聚体、变体TTR (V30M等)四聚体或变体TTR淀粉样蛋白。用于制备野生型TTR四聚体和变体TTR四聚体的方法包括Matsubara等(非专利文献13)的方法。用于制备变体TTR淀粉样蛋白的方法包括上述的酸处理。接下来，使这些制备物与传感器芯片结合，向其中加入分析对象的抗体，以与传感器芯片反应，从而以反应单位(RU)指示TTR与抗体的结合。此处，对于变体TTR淀粉样蛋白的RU显著高于对于野生型TTR四聚体和变体TTR四聚体的RU的那些抗体被认为特异性识别具有结构改变的TTR。与所述四聚体TTR相比，特异性识别具有比四聚体更大尺寸的分子结构(例如TTR淀粉样蛋白)的TTR的抗体也可被视为特异性识别具有结构改变的TTR的抗体。
下文例示了用于分析抑制TTR原纤维化的活性的方法。包含TTR的溶液和待评价的抗体与终浓度0.01-1%的表面活性剂混合，和在一定温度下静置一段时间，其允许TTR形成原纤维。通过硫磺素T测定法测量荧光强度(激发波长440 nm，荧光波长480 nm)以评价TTR-原纤维化的程度。表面活性剂包括苯扎氯铵、去氧胆酸钠、Zwittergent3-16和NP-40。最优选去氧胆酸盐。终浓度包括0.01-1%，和最优选是0.1%。时间和温度包括在37°C下3-4天，但可合适地安排它们的组合。该分析方法是优秀的评价系统，其中可阻止待评价的抗体的变性，这是因为分析可在接近中性的pH下进行。
下文例示了用于分析巨噬细胞对TTR淀粉样蛋白的吞噬能力的方法。人iPS细胞自健康成人的皮肤组织通过常规方法制备和通过常规方法进一步分化成巨噬细胞。TTR原纤维和分化的巨噬细胞的5 × 104个细胞一起混合。加入待评价的抗体，将混合物培养固定的一段时间(例如3天)。培养后残留量的TTR通过ELISA测量，以评价巨噬细胞的吞噬能力。
下文例示了用于分析本发明的人抗体和TTR淀粉样蛋白之间的反应性的方法。野生型TTR和变体TTR在酸性条件下处理足以TTR-原纤维化的一段时间以制备TTR原纤维。用于原纤维化的时间可根据pH或TTR的类型而合适地选择。酸处理后的样品在非变性PAGE上经电泳分离和进行银染。在高于60kDa的位置处的宽条带可指示TTR-原纤维化。使用常规的蛋白质印迹，TTR淀粉样蛋白在SDS-PAGE上电泳分离和分析对象的抗体与其反应用于检测。与未用酸处理的TTR (未经历原纤维化的TTR)相比，与TTR淀粉样蛋白具有更高反应性的抗体可视为具有与TTR淀粉样蛋白的结合活性的抗体。
下文例示了用于使用FAP动物模型进行药效评价的方法。使用V30M Tg大鼠(非专利文献14; 其中引入了TTR的氨基酸序列中位置30的缬氨酸突变为甲硫氨酸的人TTR的基因的转基因大鼠)，固定量(例如10 mg/kg)的待评价抗体以固定的频率(例如一周一次)给予固定的一段时间(例如6个月)。在给予后，通过尸检获取大肠和进行福尔马林固定。固定的大肠组织在石蜡块中包埋，以制备组织切片。组织切片使用多克隆兔抗-人前白蛋白(Dako)、HRP标记的山羊抗-兔IgG (Dako)进行免疫染色，和将大肠肌肉层中TTR沉积的程度数字化和在各组之间比较。
本发明的人抗体具有对TTR-原纤维化的抑制活性，对具有结构改变的TTR的特异性结合活性，促进巨噬细胞对TTR淀粉样蛋白的吞噬能力的作用，对TTR淀粉样蛋白的结合活性，和对FAP动物模型的作用。对本发明的抗体表位分析的结果是，其存在于TTR78-89。因此，本发明包括如下的人抗体：
(1) 具有抑制TTR的原纤维化的活性的人抗体；
(2) 特异性识别具有结构改变的TTR和不识别四聚体功能TTR的人抗体；
(3) 特异性结合TTR淀粉样蛋白的人抗体；
(4) 促进TTR淀粉样蛋白的除去的人抗体；
(5) 促进巨噬细胞对TTR淀粉样蛋白的吞噬能力的人抗体；
(6) 对TTR淀粉样变具有治疗作用和/或预防作用的人抗体；
(7) 具有TTR78-89的表位的人抗体。
上文(1)-(7)的抗体可具有(1)-(7)的每一个所示的一个特征性特征或可具有(1)-(7)所示的特征性特征的组合。
对于本发明的人抗体(371M)，VH区或VL区的CDR 1-3的氨基酸和核苷酸序列显示在下表中。
表1
因此，本发明包括具有以下氨基酸序列的特征性特征的人抗体：
(8) 包含由下文(a)或(b)的多肽组成的H链互补决定区和由下文(c)或(d)的多肽组成的L链互补决定区的人抗体：
(a) 由SEQ ID NO: 1-3所示的氨基酸序列组成的多肽；
(b) 由SEQ ID NO: 1-3所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的H链互补决定区；
(c) 由SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列组成的多肽；
(d) 由SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的L链互补决定区。
上述抗体还可具有(1)-(7)的每一个所示的特征性特征。
对于本发明的人抗体(313M)，VH区或VL区的CDR 1-3的氨基酸和核苷酸序列显示在下表中。
表2
因此，本发明包括具有以下氨基酸序列特征性特征的人抗体：
(9) 包含由下文(e)或(f)的多肽组成的H链互补决定区和由下文(g)或(h)的多肽组成的L链互补决定区的人抗体：
(e) 由SEQ ID NO: 7-9所示的氨基酸序列组成的多肽；
(f) 由SEQ ID NO: 7-9所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的H链互补决定区；
(g) 由SEQ ID NO: 10-12所示的氨基酸序列组成的多肽；
(h) 由SEQ ID NO: 10-12所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的L链互补决定区。
上述抗体也可具有(1)-(7)的每一个所示的特征性特征。
对于人抗体(371M)，VH区或VL区的氨基酸和核苷酸序列显示于下表中。
表3
因此，本发明包括具有以下氨基酸序列特征性特征的人抗体：
(10) 包含由下文(i)或(j)的多肽组成的H链可变区和由下文(k)或(l)的多肽组成的L链可变区的人抗体：
(i) 由SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列组成的多肽；
(j) 由SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的H链互补决定区；
(k) 由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列组成的多肽；
(l) 由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的L链互补决定区。
上述抗体也可具有(1)-(7)的每一个所示的特征性特征。
对于人抗体(313M)，VH区或VL区的氨基酸和核苷酸序列显示于下表中。
表4
因此，本发明包括具有以下氨基酸序列特征性特征的人抗体：
(11) 包含由下文(m)或(n)的多肽组成的H链可变区和由下文(o)或(p)的多肽组成的L链可变区的人抗体：
(m) 由SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列组成的多肽；
(n) 由SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的H链互补决定区；
(o) 由SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列组成的多肽；
(p) 由SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的L链互补决定区。
上述抗体也可具有(1)-(7)的每一个所示的特征性特征。
本发明包括包含以下H链的CDR的H链可变区片段：
(12) 包含由下文(a)或(b)的多肽组成的H链互补决定区的H链可变区片段：
(a) 由SEQ ID NO: 1-3所示的氨基酸序列组成的多肽；
(b) 由SEQ ID NO: 1-3所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的H链互补决定区。
(13) 包含由下文(e)或(f)的多肽组成的H链互补决定区的H链可变区片段：
(e) 由SEQ ID NO: 7-9所示的氨基酸序列组成的多肽；
(f) 由SEQ ID NO: 7-9所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的H链互补决定区。
本发明包括包含以下L链的CDR的L链可变区片段：
(14) 包含由下文(c)或(d)的多肽组成的L链互补决定区的L链可变区片段：
(c) 由SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列组成的多肽；
(d) 由SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的L链互补决定区。
(15) 包含由下文(g)或(h)的多肽组成的L链互补决定区的L链可变区片段：
(g) 由SEQ ID NO: 10-12所示的氨基酸序列组成的多肽；
(h) 由SEQ ID NO: 10-12所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的L链互补决定区。
本发明包括以下H链可变区片段：
(16) 由下文(i)或(j)的多肽组成的H链可变区片段：
(i) 由SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列组成的多肽；
(j) 由SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的H链互补决定区。
(17) 由下文(m)或(n)的多肽组成的H链可变区片段：
(m) 由SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列组成的多肽；
(n) 由SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的H链互补决定区。
本发明包括以下L链可变区片段：
(18) 由下文(k)或(l)的多肽组成的L链可变区片段：
(k) 由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列组成的多肽；
(l) 由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的L链互补决定区。
(19) 由下文(o)或(p)的多肽组成的L链可变区片段：
(o) 由SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列组成的多肽；
(p) 由SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加，所述多肽可为TTR的L链互补决定区。
本发明包括以下单链可变区片段：
(20) TTR的抗体的单链可变区片段，其通过将(12)的包含H链互补决定区的H链可变区片段或(16)的H链可变区片段和(14)的包含L链互补决定区的L链可变区片段或(18)的L链可变区片段连接形成。
(21) TTR的抗体的单链可变区片段，其通过将(13)的包含H链互补决定区的H链可变区片段或(17)的H链可变区片段和(15)的包含L链互补决定区的L链可变区片段或(19)的L链可变区片段连接形成。
对于单链可变区片段，H链可变区片段和L链可变区片段通常通过合适的肽接头等彼此连接。对于肽接头，使用由例如10-25个氨基酸残基组成的任何单链肽。
本发明包括以下抗体或其片段，其通过连接人来源的恒定区与H链可变区片段和/或L链可变区片段形成：
(22) 人抗体或其片段，其通过连接人来源的恒定区与(12)的包含H链互补决定区的H链可变区片段或(16)的H链可变区片段和/或(14)的包含L链互补决定区的L链可变区片段或(18)的L链可变区片段形成。
(23) 人抗体或其片段，其通过连接人来源的恒定区与(13)的包含H链互补决定区的H链可变区片段或(17)的H链可变区片段和/或(15)的包含L链互补决定区的L链可变区片段或(19)的L链可变区片段形成。
其中结合人来源的恒定区的上述抗体或其片段可以是Fab、Fab’、F(ab’)2、具有至少部分的Fc区的scAb或scFvFc，或甚至完整抗体。如本文所用的，scAb是通过连接L链或H链恒定区的结构域(c结构域)的一部分与scFv而形成的，而scFvFc是通过连接H链的恒定区(Fc区)的一部分与scFv而形成的。
上述抗体还包括在结构上与抗体相关的蛋白，和称为免疫球蛋白。此外，本发明的抗体可具有IgA, IgD, IgE, IgG或IgM的任何类型。换句话说，本发明的抗体可以是单体或多聚体，例如二聚体、三聚体、四聚体或五聚体。
如本文所用的，短语"其中一个或几个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加"意指可提供取代、缺失、插入和/或添加的所述数量的氨基酸残基通过用于制备突变体蛋白的已知方法例如定点诱变被取代、缺失、插入和/或添加。因此，例如，上述多肽(b)是上述多肽(a)的突变体肽。如本文所用的，术语"突变"主要是指通过用于制备突变体蛋白的已知方法人工引入的突变，但也可以是天然存在(例如人)和分离和纯化的类似突变体蛋白。
当本发明的抗体或其片段用作药物组合物(即给予人)时，"突变"在人来源的结构或人不诱导免疫反应的范围内进行，和当本发明的抗体或其片段用作检测装置或诊断剂(即非给予人)时，不特别受到限制。此外，当本发明的抗体或其片段给予人时，突变优选地在识别抗原的CDR的高级结构得到保持的范围内进行。
本发明的抗体或其片段可包含另外的多肽。这样的多肽添加包括本发明的蛋白用例如His、Myc、Flag等进行表位标记。
此外，本发明的抗体或其片段可与修饰物结合以改进其稳定性或抗体滴度。即，本发明的抗体或其片段可以是修饰的抗体。修饰物包括例如，糖链、大分子等。当用糖链进行修饰时，糖链可能具有某种生理活性。然而，当用单一的大分子例如聚乙二醇(PEG)进行修饰时，分子本身不显示生理活性。此外，可能的是，PEG化抑制在肝中的吸收或改进在血液中的稳定性。因此，修饰物优选地是单一的大分子例如PEG。
在制备突变体肽的情况下，用修饰物修饰本发明的抗体或其片段，当本发明的抗体或其片段用作治疗剂时，在人不诱导免疫反应的范围内进行，和当本发明的抗体或其片段用作检测装置或诊断剂时，不特别受到限制。此外，当本发明的抗体或其片段给予人时，优选地在识别抗原的CDR的高级结构得到保持的范围内进行修饰。
2. 本发明的基因
本发明包括编码上述第1项的抗体或其片段的基因。例如，本发明包括包含以下核苷酸序列作为开放读码框(ORF)区的基因和具有部分修饰的这些核苷酸序列的修饰的基因：
(1) 包含SEQ ID NO:1-3和/或SEQ ID NO:4-6的核苷酸序列；
(2) 包含SEQ ID NO:7-9和/或SEQ ID NO:10-12的核苷酸序列；
(3) 包含 SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的核苷酸序列；
(4) 包含SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16的核苷酸序列。
编码本发明的抗体或其片段的上述基因可引入合适的宿主(例如细菌、酵母)以表达本发明的抗体或其片段。
此外，除了编码所述抗体或其片段的核苷酸序列之外，上述基因可为进一步包含非翻译区(UTR)或载体序列(包括表达载体)的基因。例如，SEQ ID NO: 13或14的序列与载体的序列连接，以形成本发明的基因。得到的基因然后可按需要在合适的宿主中扩增，以扩增本发明的基因。此外，本发明的基因的一部分可用作探针。
本发明的基因可在与TTR淀粉样蛋白有关的疾病中用作基因治疗剂。基因治疗剂可经设计以在其给予后在活体内表达本发明的抗体或其片段，使得本发明的抗体或其片段在其摄入后在活体内形成，从而显示与上述抑制剂类似的效果。
3. 本发明的重组表达载体
本发明包括包含上述第2项的基因，即编码上述第1项的抗体或其片段的基因的重组表达载体。例如，本发明的重组表达载体包括其中插入具有SEQ ID NO: 13或14的核苷酸序列的cDNA的表达载体。重组表达载体可用质粒、噬菌体、粘粒等制备，但不特别限于此。
具体的载体类型不特别受到限制，但可适当地选择允许在宿主细胞中表达的载体。即，可根据宿主细胞的类型适当地选择启动子序列以确保基因表达，和启动子和本发明的基因插入的各种质粒等可用作表达载体。
各种标志物可用于确认本发明的基因是否被引入宿主细胞中或本发明的基因是否的确在宿主细胞中表达。例如，在宿主细胞中缺陷的基因用作标志物，和包含标志物和本发明的基因的质粒等作为表达载体被引入宿主细胞。从而，本发明的基因的引入可通过标志物基因的表达得到证实。或者，本发明的抗体或其片段和标志物蛋白可作为融合蛋白表达。例如，源自维多利亚水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白(GFP)可用作标志物，并且本发明的抗体或其片段可作为GFP融合蛋白表达。
上述宿主细胞不特别受到限制，但可合适地使用各种已知的细胞。具体而言，宿主细胞包括但不限于动物细胞，包括来自人或小鼠的细胞，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)，爪蟾(Xenopas laevis)的卵母细胞，各种哺乳动物(大鼠、兔、猪、猴等)的培养细胞，昆虫例如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)或蚕蛾的培养细胞，细菌例如大肠杆菌、酵母(芽殖酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和裂殖酵母(粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)))等。
用于引入重组表达载体至宿主细胞的方法，即用于转染的方法，不特别受到限制，但可合适地使用常规的已知方法例如电穿孔、磷酸钙方法、脂质体方法和DEAE-葡聚糖方法。
本发明的转化体是其中引入上述第2项的基因，即编码上述第1项的抗体或其片段的基因的转化体。如本文所用的，"引入基因"意指通过已知的基因工程技术(基因操作技术)将基因可表达地引入目的细胞(宿主细胞)。术语"转化体"不仅指细胞、组织或器官，而且指动物个体。目的动物不特别受到限制，但包括哺乳动物，例如奶牛、猪、绵羊、山羊、兔、狗、猫、豚鼠、仓鼠、小鼠和大鼠。特别是，啮齿动物例如小鼠和大鼠广泛用作实验动物和疾病动物模型。在它们之中，小鼠作为实验动物和疾病动物模型是优选的，因为许多近交系已经建立，并且培养受精卵和体外受精的技术已经完成。
上述第1项的抗体或其片段可用本发明的转化体制备，所述转化体使用本发明的表达载体制备。
4. 本发明的人抗体或其片段的应用
本发明的人抗体特异性识别具有结构改变的TTR (例如TTR淀粉样蛋白)，抑制TTR的原纤维化和发挥针对FAP的预防作用。因此，本发明包括用于检测TTR的结构改变的装置，用于TTR淀粉样变(特别是FAP)的诊断剂，用于抑制TTR的原纤维化的药物，和用于预防和/或治疗TTR淀粉样变(特别是FAP)的药物组合物。
本发明包括用于检测TTR的结构改变的装置，其包含(1)的抗体或其片段(用于TTR淀粉样蛋白的检测装置)。本发明的检测装置包括例如，抗体芯片或抗体柱等，其中特异性结合具有结构改变的TTR的抗体或其片段固定于基底(载体)上。本发明的检测装置，例如可用于检测样品例如血液或尿液中包含的具有结构改变的TTR(例如TTR淀粉样蛋白)。此外，本发明的检测装置还可用于诊断或治疗应用，用于确定与具有结构改变的TTR (例如TTR淀粉样蛋白)相关的疾病或用于评估治疗作用。
本发明进一步包括用于除去TTR淀粉样蛋白的载体，其包含(1)的抗体或其片段(用于除去TTR淀粉样蛋白的载体)。用于除去的该载体可通过常用方法将抗体等与通常用于色谱法的载体结合来制备。上述用于除去的载体以这样的方式使用，即自患有由TTR淀粉样蛋白引起的淀粉样变的患者获取血液和通过填装有用于除去的载体的柱，从而除去血液中的TTR淀粉样蛋白。
此外，本发明包括用于检测TTR淀粉样蛋白的试剂，其包含上述第1项的抗体或其片段(用于检测TTR淀粉样蛋白的试剂)。因此，当应用标记免疫测定法例如放射免疫测定法、酶免疫测定法和荧光免疫测定法时，可以快速和准确的方式定量或定性地分析试验样品中的TTR。在标记免疫测定法中，上述抗体或其片段与标记一起使用，例如放射性物质、酶和/或荧光物质。此外，抗体或其片段与TTR淀粉样蛋白特异性反应，以显示免疫反应，因此用标记物质作为指示测量免疫反应允许以高准确度检测试验样品中存在的少量的TTR淀粉样蛋白。与生物测定法相比，标记免疫测定法的特征为可同时分析大量的试验样品，分析的时间和劳力少，并且分析是高度准确的。
本发明包括用于TTR淀粉样变的诊断剂，其包含上述第1项的抗体或其片段。用于诊断本发明的疾病的方法包括在试验样品(血液、体液、组织等)中测量TTR淀粉样蛋白的量和根据测量结果诊断疾病。目的疾病包括由TTR淀粉样蛋白引起的疾病，包括老年系统性淀粉样变(SSA)和家族性淀粉样蛋白多神经病(FAP)。
本发明的抗体证明显示抑制TTR的原纤维化的作用。因此，本发明包括用于抑制TTR的原纤维化的药物，其包含上述第1项的抗体或其片段(原纤维化抑制剂)。原纤维化抑制剂可包含药学上可接受的添加剂，例如一种或多种类型的赋形剂、一种或多种类型的结合剂、一种或多种类型的崩解剂、一种或多种类型的润滑剂和一种或多种类型的缓冲剂。
本发明的人抗体当给予TTR淀粉样变模型动物时证明显示所述作用。因此，本发明包括用于预防和/或治疗TTR淀粉样变的药物组合物，其包含上述第1项的抗体或其片段。药物组合物可包含药学上可接受的添加剂，例如一种或多种类型的赋形剂、一种或多种类型的结合剂、一种或多种类型的崩解剂、一种或多种类型的润滑剂和一种或多种类型的缓冲剂。
本发明通过以下实施例进一步更详细说明，但不解释为局限于此。当使用市售可得的试剂盒或试剂时，按照其随附的方案进行实验，除非另外说明。
实施例1
纯化的重组S112I TTR的制备
参考Matsubara等(非专利文献13和非专利文献15)，制备纯化的重组TTR。大肠杆菌菌株M15用S112I TTR (突变体人TTR，其中位置112的丝氨酸改变为异亮氨酸)表达载体pQE30-hTTR(S112I)-His转染，和用20 mL的LB/氨苄西林(50 μg/mL)/卡那霉素(25 μg/mL)在37°C培养。在O.D.600nm=0.5时，加入终浓度10 mM的IPTG和继续培养过夜。从培养物中通过离心收集细胞和悬浮于缓冲液A (50 mM PB + 0.3 M NaCl + 10 mM咪唑 + 20 mM 2-巯基乙醇)。超声处理悬浮液15分钟，然后离心以收集上清液。上清液用Ni-NTA Agarose(QIAGEN)进行His-标签纯化，和包含重组TTR的洗脱部分针对20 mM NaHCO3透析。透析后的重组TTR用Superdex 75 (GE Healthcare)使用10 mM PB (pH7.5)通过凝胶过滤纯化，和二聚体TTR部分用作纯化的重组TTR S112I。
实施例2
人TTR基因的克隆
为构建人TTR表达载体，进行人TTR基因的克隆。使用人肝脏Marathon-Ready cDNA(Clontech)作为模板，使用在成熟TTR的5'-端和3'-端上设计的引物(TTR-F2: SEQ ID NO:17和TTR-R: SEQ ID NO:18)和Ex-Taq (Takara)进行PCR。在PCR产物经TA克隆进入pCR2.1-TOPO后，人TTR基因的核苷酸序列通过序列分析证实。在证实序列正确后，其中插入TTR基因的pCR2.1-TOPO用BamHI和HindIII处理，以裂解含有编码TTR基因的序列的区域。裂解的序列引入至之前用BamHI和HindIII处理的pQE-30 (QIAGEN)，以构建野生型人TTR表达载体。
实施例3
人TTR突变体表达载体的构建
使用实施例2构建的人TTR表达载体作为模板，使用定点诱变引入氨基酸的点突变。对24种突变D18G, V30M, E54K, L55P, Y114C, V122I, K76A, S77A, Y78A, W79A,K80A, A81S, L82A, G83A, I84A, S85A, P86A, F87A, H88A, E89A, H90A, A91A, E92A和V93A的每一种，进行氨基酸的点突变。将编码上述24种TTR突变体的序列引入至pQE-30。
实施例4
纯化的重组TTR的制备
大肠杆菌菌株M15用实施例2和3构建的表达野生型TTR或D18G, V30M, E54K,L55P, Y114C, Y116S或V122I TTR突变体的表达载体转染，和纯化的重组TTR通过实施例的程序制备。对于上述TTR突变体，四聚体TTR部分用作纯化的重组TTR。
实施例5
抗-人TTR抗体的分离
具有结构改变的人TTR的抗体通过筛选用来自人B细胞(例如淋巴结和脾脏)的mRNA的人VH和VL cDNA制备的scFv噬菌体展示文库进行分离。使用的抗体文库是包含超过1011种不同的抗体分子的优良文库。
实施例1制备的纯化的S112I TTR突变体用10 mM PB (pH 7.5)稀释至3 mg/mL和与等量的200 mM乙酸盐缓冲液 + 100 mM NaCl (pH 4.4)混合至浓度1.5 mg/mL。将混合物在孵育器中在37°C反应16小时，以制备S112I TTR原纤维。对于反应后的TTR，通过硫磺素T测定法测量荧光强度以证实原纤维化进展。通过用50 mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.5)稀释混合物使得硫磺素T为20 μM和TTR为30-60 μg/mL，并用荧光分光光度计FP-6500 (JASCO)(激发波长440 nm，荧光波长480 nm)测量荧光强度，进行硫磺素T测定法。
使用常规程序将S112I TTR原纤维固定至Maxisorp板(Nunc)，和特异性结合S112ITTR原纤维的scFv噬菌体使用常规程序获得(Antibody Phage Display Methods andprotocols，Philippa M. O'Brien和Robert Aitken编辑)。获得的scFv-噬菌体的克隆称为"371"和"313"。获得的scFv噬菌体的结合活性通过下文所述的方法评价。
实施例6
重组TTR原纤维的制备
实施例4制备的7种纯化的突变体TTR D18G, V30M, E54K, L55P, Y114C, Y116S和V122I和纯化的野生型TTR用10 mM PB (pH 7.5)稀释至3 mg/mL，和与等量的200 mM乙酸盐缓冲液+ 100 mM NaCl (pH 3.0)混合至浓度1.5 mg/mL。将混合物在孵育器中在37°C反应过夜，以制备TTR原纤维。对于反应后的TTR，通过硫磺素T测定法证实原纤维化。
实施例7
抗-TTR抗体的结合活性测试
获得的scFv噬菌体的抗体结合活性通过ELISA评价。实施例5制备的S112I TTR原纤维和实施例6制备的V30M TTR原纤维用PBS (SIGMA)稀释至10 μg/mL。将各自50 μL/孔的稀释液加入至Maxisorp板(Nunc)和在室温下孵育1小时以固定TTR。各自300 μL/孔的1%BSA-PBS加入至固定的板，和在室温下孵育1小时以封闭板。将获得的scFv噬菌体的各自100μL的培养物上清液加入至板的各孔，和在37°C下孵育。1小时后，用PBST洗涤孔和将各自100μL用1% BSA-PBS稀释5000倍的检测抗体抗-M13/HRP (GE Healthcare)加入至板的各孔，和在37°C下孵育。1小时后，用PBST洗涤孔和将各自100 μL的TMB (SIGMA)加入至板的各孔，用于显色。30分钟后，用1N硫酸淬灭反应和用微板阅读器(Molecular Devices)测量显色值(O.D. 450 nm/650 nm)。
结果是，发现scFv371和scFv313对S112I TTR原纤维和V30M TTR原纤维具有优良的结合活性。
实施例8
scFv371和scFv313的序列分析
验证获得的scFv371和scFv313的VH区或VL区的核苷酸序列。两种噬菌体中包含的DNA核苷酸序列用Big Dye Terminator v3.1 Cycle测序试剂盒(Applied Biosystems)测定。
分别设计和构建其中VH区或VL区的几个氨基酸残基被修饰的ScFv371和scFv313，并称为371M抗体和313M抗体。371M和313M的VH区或VL区的CDR1-3通过Kabat命名确定。所述CDR1-3的氨基酸序列和核苷酸序列显示于SEQ ID NO: 1-12。VH区或VL区的氨基酸序列和核苷酸序列显示于SEQ ID NO: 13-16。
实施例9
嵌合371抗体和嵌合313抗体的表达
将获得的scFv371和scFv313的V区序列引入至小鼠IgG1λ表达载体和进行具有小鼠恒定区的这些抗体(后文称为"嵌合371抗体"和"嵌合313抗体")的表达。使用实施例5获得的scFv371和scFv313噬菌体中包含的质粒作为模板，包含下表所示的scFv371和scFv313的VH和VL的组合的区域通过PCR扩增。表5显示引物和SEQ ID NO的组合。
表5
使用In-fusion酶(Clontech)，将VH区的扩增序列引入至表达小鼠Cγ1恒定区的载体pKMA010-mCg1 (之前用XhoI和NruI处理)和将VL区的扩增序列引入至表达小鼠Cλ恒定区的载体pKMA009-mCλ (之前用XhoI和BamHI处理) (图1)。pKMA010-371/313-mCg1载体为scFv371或scFv313的VH区和小鼠Cγ1恒定区插入在CAG启动子下游和具有DHFR基因作为抗药性基因的载体。pKMA009-371/313-mCλ载体为scFv371或scFv313的VL区和小鼠Cλ恒定区插入在CAG启动子下游的载体。pKMA010-371-mCg1和pKMA009-371-mCλ载体作为整体称为嵌合371抗体表达载体。pKMA010-313-mCg1和pKMA009-313-mCλ载体作为整体称为嵌合313抗体表达载体。
使用scFv371和scFv313的VH区或VL区作为模板，使用定点诱变引入突变以制备实施例8设计的371M抗体和313M抗体的VH区和VL区。以如上所述相同的方式，构建具有小鼠恒定区的这些抗体(后文称为"嵌合371M抗体"和"嵌合313M抗体")的表达载体。pKMA010-371M/313M-mCg1载体是371M或313M的VH区和小鼠Cγ1恒定区插入在CAG启动子下游的载体。pKMA009-371M/313M-mCλ载体是371M或313M的VL区和小鼠Cλ恒定区插入在CAG启动子下游的载体。pKMA010-371M-mCg1和pKMA009-371M-mCλ作为整体称为嵌合371M抗体表达载体。pKMA010-313M-mCg1和pKMA009-313M-mCλ作为整体称为嵌合313M抗体表达载体。
接下来，按下文所述构建表达具有人恒定区的371M抗体和313M抗体(后文分别称为"人371M抗体"和"人313M抗体")的载体。使用上文构建的嵌合371M抗体表达载体和嵌合313M抗体表达载体作为模板，包含下表中所示的371M和313M的VH和VL的组合的区域通过PCR扩增。表6显示了引物和SEQ ID NO的组合。
表6
使用In-fusion酶(Clontech)，将VH区的扩增序列引入至表达人Cγ1恒定区的载体pKMA010-hCg1 (之前用XhoI和BamHI处理)和将VL区的扩增序列引入至表达人Cλ恒定区的载体pKMA009-hCL (之前用XhoI和BamHI处理)。pKMA010-371/313-hCg1载体为371M或313M抗体的H链序列插入在CAG启动子下游和具有Dhfr基因作为抗药性基因的载体。pKMA009-371/313-hCL载体是371M或313M抗体的L链序列插入在CAG启动子下游的载体。pKMA010-371-hCg1和pKMA009-371-hCL作为整体称为人371M抗体表达载体。pKMA010-313-hCg1和pKMA009-313-hCL作为整体称为人313M抗体表达载体。各种载体和插入的序列之间的关系显示在下表中。
表7
Freestyle293F细胞(Invitrogen)用表达嵌合371, 313, 371M和313M抗体和人371M和313M抗体的H链和L链的载体使用Neofection (ASTEC Co., Ltd.)转染，和在37°C在8% CO2环境条件下以125 rpm进行摇动培养，以表达各种抗体。在培养的第5天，收集培养上清液，和通过色谱使用HiTrap rProteinA FF (GE Healthcare)纯化。包含各种抗体的洗脱部分针对PBS (SIGMA)透析，以分别提供纯化形式的嵌合371抗体、嵌合313抗体、嵌合371M抗体、嵌合313M抗体、人371M抗体和人313M抗体。
实施例10
371M抗体的表位分析
为更全面分析371M抗体的表位，使用实施例3构建的TTR丙氨酸置换变体进行371M抗体的反应性分析。大肠杆菌菌株M15用实施例3构建的TTR变体表达载体转染和在20 mLLB/氨苄西林(50 μg/mL)/卡那霉素(25 μg/mL)中在37°C下培养。在O.D.600nm=0.5时，加入终浓度1 mM的IPTG，和继续培养过夜。将培养物离心，和用Bugbuster (Merck)溶解沉淀部分。将溶解的细胞悬浮液在8-16% SDS-PAGE凝胶上电泳分离，和从凝胶转移至Immobilon-P(Millipore)。向转移的膜加入2%脱脂乳-PBST和室温摇动1小时以封闭膜。嵌合371M抗体用2%脱脂乳-PBST稀释至浓度1 μg/mL和向膜加入10 mL的稀释液和室温摇动1小时。膜用PBST洗涤，加入之前用2%脱脂乳-PBST稀释5000倍的检测抗体HRP-标记的抗-小鼠IgG(H+L)(AMERICAN QUALEX INTERNATIONAL)，和室温摇动1小时。用PBST洗涤后，用Ez West Blue(ATTO)进行显色。
结果是，如图2所示，发现371M抗体具有人TTR的位置78-89的表位。
实施例11
371M抗体和313M抗体的反应特异性分析
为分析371M抗体和313M抗体与TTR四聚体的反应性，使用表面等离子共振进行反应特异性分析。使用Biacore2000 (GE Healthcare)，大约各自1,000 RU的WT TTR四聚体、V30M TTR四聚体和V30M TTR原纤维(在实施例4和6中制备；重组体)固定至Sensorchip CM5(GE Healthcare)。配体的固定用10 mM乙酸盐缓冲液(pH 6.0)进行。多克隆兔抗-人前白蛋白(Dako)、嵌合371M抗体、嵌合313M抗体和阴性对照抗体，其用HBS-EP Buffer稀释至10 μg/mL，以20 μL/min移动2分钟。移动后，进行离解60分钟和用10 mM Gly-NaOH (pH 9.0)进行再生30秒。
结果是，如图3所示，揭示371M抗体和313M抗体不与WT TTR和V30M四聚体TTR反应，但特异性识别V30M原纤维((a)和(b))。由Dako制备的多克隆抗体与WT TTR和V30M TTR强烈反应，和与V30M TTR原纤维弱反应(c)。阴性对照抗体不与任何TTR反应(d)。
实施例12
371抗体和313抗体与患者血清的反应性分析
进行分析以研究371抗体和313抗体是否显示与FAP患者血清的反应性。对于FAP疗法，给予的抗体不识别患者血清中的人TTR是抗体的优选性质。来自健康成人的血清和来自FAP患者的具有2 μg/mL V30M TTR变体的血清和来自按实施例6用酸处理的血清的野生型TTR的原纤维和约4 μg/mL从FAP患者的脾提取的TTR淀粉样蛋白以100 μL/孔加入至Maxisorp板(Nunc)以固定抗原。各自300 μL/孔的1% BSA-PBS加入至固定的板和室温孵育1小时以封闭板。嵌合371抗体和嵌合313抗体用1% BSA-PBS连续稀释，和将各自100 μL的稀释液加入至板的各孔和在37°C下孵育。1小时后，用PBST洗涤孔和将各自100 μL的检测抗体抗-小鼠IgG(H+L)/HRP (Zymed)加入至板的各孔，和在37°C下孵育。1小时后，用PBST洗涤孔和将各自100 μL的TMB (SIGMA)加入至板的各孔，用于显色。30分钟后，用1N硫酸淬灭反应和用微板阅读器(Molecular Devices)测量显色值(O.D. 450 nm)。
结果是，如图4所示，371抗体(a)和313抗体(b)清楚表明以浓度依赖性方式与来自FAP患者的TTR淀粉样蛋白和通过酸处理来自血清的野生型TTR形成的淀粉样蛋白的反应性，但与来自健康成人和FAP患者的血清无反应性。
实施例13
371M抗体和313M抗体与患者组织的反应性分析
从具有V30M TTR的FAP患者去除心脏，经福尔马林固定。将固定的心脏组织在石蜡块中包埋，以制备组织切片。在组织切片被切成厚4 μm并附着至载玻片后，进行去石蜡处理。用PBS洗涤后，将组织切片浸入0.1%高碘酸二水合物10分钟和进一步用PBS洗涤。组织切片浸入用0.5% BSA-PBS稀释50倍的兔血清(Dako) 1小时以封闭。用PBS洗涤后，组织切片在4°C浸入作为第一抗体的嵌合371抗体/嵌合313抗体/嵌合371M抗体/嵌合313M抗体/阴性对照抗体过夜，所述抗体用0.5% BSA-PBS稀释至10 μg/mL。组织切片然后在室温下浸入作为第二抗体的HRP-标记的兔抗-小鼠IgG (Dako) 1小时，其用0.5% BSA-PBS稀释100倍。用PBS洗涤后，用DAB进行显色。还进行苏木精染色。对于阳性对照，使用多克隆兔抗-人前白蛋白(Dako)作为第一抗体和HRP-标记的山羊抗-兔IgG (Dako)作为第二抗体，进行相同的程序。此外，考虑到TTR通过福尔马林固定变性从而改变其空间结构的可能性，具有V30M TTR的FAP患者心脏的冷冻组织切片也以类似方式进行免疫染色。此外，为证实淀粉样蛋白原纤维的存在，还进行刚果红染色。已知刚果红结合淀粉样蛋白原纤维从而导致短波长迁移。
结果是，如图5所示，在石蜡切片(图5a)和冷冻切片(图5b)两者中证实371抗体/313抗体/371M抗体/313M抗体特异性识别在FAP患者心脏中沉积的TTR。
实施例14
371M抗体和313M抗体与TTR原纤维的反应性分析
实施例6制备的各自1.5 μg的7种TTR原纤维和纯化的野生型TTR在8-16% SDS-PAGE凝胶上电泳分离和从凝胶转移至Immobilon-P (Millipore)。向转移的膜加入2%脱脂乳-PBST和室温摇动1小时以封闭膜。嵌合371M抗体或嵌合313M抗体用2%脱脂乳-PBST稀释至浓度1 μg/mL和向膜加入10 mL的稀释液和室温摇动1小时。膜用PBST洗涤，加入之前用2%脱脂乳-PBST稀释5000倍的检测抗体抗-小鼠IgG(H+L)，和室温摇动1小时。用PBST洗涤后，用Ez West Blue (ATTO)进行显色。
结果是，如图6所示，发现371M抗体和313M抗体识别各种TTR原纤维，但另一方面，不识别纯化的野生型TTR。
实施例15
对V30M TTR-原纤维化的抑制活性的测量系统的构建
重组V30M TTR用PBS(-)稀释至375 μg/mL和与终浓度0.1%、0.01%和0.001%的四种表面活性剂混合。使用的表面活性剂是(1) 苯扎氯铵(Yamazen Corporation)；(2) 去氧胆酸钠(Nacalai Tesque)；(3) Zwittergent3-16 (Carbiochem)；和(4) NP-40 (Wako)。将混合物于37°C静置4天和通过硫磺素T测定法测量荧光强度(激发波长440 nm，荧光波长480nm)以评价TTR-原纤维化的程度。
硫磺素T测定法的结果显示于图7。对于任何表面活性剂，当以浓度0.1%使用时，TTR-原纤维化有进展。尤其发现当使用去氧胆酸钠时TTR-原纤维化进展最快。接下来，研究去氧胆酸钠的最佳浓度。重组V30M TTR用PBS(-)稀释至375 μg/mL和与浓度1%, 0.5%,0.2%, 0.1%和0.01%的去氧胆酸钠混合。将混合物在37°C下静置，4天和7天后，进行硫磺素T测定法，以评价TTR-原纤维化的程度。
结果显示于图8。在1%浓度的去氧胆酸钠的条件下观察到最显著的原纤维化。然而，因为甚至在0小时(加入后立刻)观察到原纤维化，认为原纤维化进程太快。相反的是，与0.5%、0.2%和0.01%的条件相比，在0.1%的条件下，在混合物静置过夜或较长的一段时间后观察到原纤维化，和观察到最依赖于处理时间的原纤维化的显著进展。根据这些，发现去氧胆酸钠的最佳浓度是0.1%。直至现在，V30M TTR的原纤维化在中性pH环境下有进展的条件尚未报道，因此TTR的原纤维化通过将TTR置于酸性pH条件例如pH 3.0下而进展。另一方面，因为当暴露于酸性环境时抗体变性和失去其活性，难以评价抗-TTR抗体对TTR-原纤维化的抑制能力。根据本发明，最新发现V30M TTR的原纤维化甚至在中性环境下通过引入去氧胆酸钠至系统中有进展，从而成功地构建允许评价抗-TTR抗体对原纤维化的抑制能力的系统。
实施例16
371M抗体和313M抗体的V30M TTR-原纤维化抑制试验
纯化的V30M TTR和371抗体、313抗体、371M抗体、313M抗体或阴性对照抗体以摩尔比10 μM:0.01至2 μM (TTR: 550 μg/mL，抗体: 1.5至300 μg/mL)混合在一起，和混合物在37°C置于PBS + 0.1%去氧胆酸钠下3天。使用静置后的样品，进行硫磺素T测定法(激发波长440 nm，荧光波长480 nm)以测量荧光强度。
结果是，如图9所示，发现371、313、371M和313M抗体具有以抗体浓度依赖性方式抑制V30M TTR的原纤维化的活性。
实施例17
巨噬细胞吞噬能力试验
为了研究371M抗体和313M抗体是否促进巨噬细胞吞噬TTR原纤维的能力，进行巨噬细胞吞噬能力试验。该试验模拟巨噬细胞除去在TTR患者组织中沉积的TTR的过程。如果巨噬细胞的吞噬能力通过加入这些抗体而升高，则预期这些抗体具有促进人组织中的TTR沉积的除去的活性。
根据描述于非专利文献16的方法，人iPS细胞自健康成人的皮肤组织制备，和进一步分化为巨噬细胞(iPS-MP)。iPS-MPs (1-2 × 106细胞)在存在50 ng/mL hGM-SCF和25pg/mL M-CSF的情况下在10 cm培养皿中培养24小时。iPS-MPs用PBS洗涤，然后在含20 μg/mL的丝裂霉素C的培养基中在37°C孵育10分钟，以中止细胞增殖能力，和以5 × 104细胞/100 μL/孔加入至96-孔板。未处理或酸处理24小时的V30M TTR用培养基稀释至3.2 μg/mL和各自加入50 μL的稀释液。此外，将PBS /人371M抗体/人313M抗体/阴性对照抗体稀释至40 μg/mL和各自加入50 μL。在37°C在5% CO2下继续培养2天，之后收集培养物上清液。
培养后残留量的TTR按下所述通过ELISA定量，以评价巨噬细胞的吞噬能力。向96-孔板加入各自5 μL的培养上清液和100 μL的包被溶液(25 mM碳酸钠缓冲液)和之后4°C静置过夜。用PBST洗涤后，加入250 μL的封闭溶液(溶于包被溶液的0.5%明胶溶液)，将板在室温下孵育1小时。用PBST洗涤后，多克隆兔抗-人前白蛋白(Dako)用0.05%明胶-PBST稀释1,000倍，各自加入100 μL的稀释液，和将板在室温下孵育1小时。用PBST洗涤后，HRP-标记的山羊抗-兔IgG (Dako)用0.05%明胶-PBST稀释5,000倍，各自加入100 μL的稀释液，和将板在室温下孵育1小时。用PBST洗涤后，用100 μL的SureBlue (KPL)进行显色5分钟和用100 μL的1 M盐酸终止。用xMARK微板阅读器(Bio-Rad Laboratories)测量450 nm波长。
结果示于图10。对于未处理的纯化的V30M，在样品之间未观察到残留量的TTR的统计学显著的差异。相反的是，对于TTR原纤维发现，观察到对于371M抗体和313M抗体，与PBS(无)相比残留量的TTR的统计学显著降低(b)，证实了371M抗体和313M抗体具有促进iPS细胞分化的巨噬细胞对TTR原纤维的吞噬活性的活性。
实施例18
使用V30M Tg大鼠的药效评价试验
使用V30M Tg大鼠(非专利文献14；其中引入具有在TTR的氨基酸序列中位置30的缬氨酸突变为甲硫氨酸的人TTR的基因的转基因大鼠)，给予各自10 mg/kg的嵌合371抗体和嵌合313抗体或PBS，持续6个月，从3月龄至9月龄，各组由7或8只大鼠组成，每周一次，共26次。在给予后，通过尸检获取大肠，和福尔马林固定。固定的大肠组织在石蜡块中包埋，以制备组织切片。组织切片使用多克隆兔抗-人前白蛋白(Dako)作为第一抗体和HRP-标记的山羊抗-兔IgG (Dako)作为第二抗体进行免疫染色，和将大肠肌肉层中TTR沉积的程度数字化，并在各组之间比较。
结果是，如图11所示，与PBS给予组相比，在371抗体给予组和313抗体给予组中TTR沉积显著受到抑制。
工业适用性
本发明的重组人抗-运甲状腺素蛋白抗体，因为在其活性(对TTR原纤维化的抑制活性、促进巨噬细胞的吞噬能力的活性等)和/或特异性(特异性识别具有结构改变的TTR和TTR原纤维)方面是优良的，可用作与TTR的结构改变或原纤维化有关的各种疾病的有效药物。

Claims (32)

1.具有抑制运甲状腺素蛋白(下文称为“TTR”)的原纤维化的活性的人抗体，其中所述人抗体包含由下文(a)的多肽组成的H链互补决定区和由下文(c)的多肽组成的L链互补决定区：
(a) 由SEQ ID NO: 1-3所示的氨基酸序列组成的多肽；
(c) 由SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列组成的多肽；或者
所述人抗体包含由下文(e)的多肽组成的H链互补决定区和由下文(g)的多肽组成的L链互补决定区：
(e) 由SEQ ID NO: 7-9所示的氨基酸序列组成的多肽；
(g) 由SEQ ID NO: 10-12所示的氨基酸序列组成的多肽。
2.权利要求1的人抗体，其特异性识别具有结构改变的TTR。
3.权利要求1或2的人抗体，其特异性结合TTR淀粉样蛋白。
4.权利要求1或2的人抗体，其结合自两种或更多种变体TTR衍生的TTR淀粉样蛋白。
5.权利要求4的人抗体，其中变体TTR是具有选自D18G、V30M、E54K、L55P、Y114C、Y116S和V122I的突变的TTR。
6.权利要求1-2和5中任一项的人抗体，其促进TTR淀粉样蛋白的去除。
7.权利要求1-2和5中任一项的人抗体，其促进巨噬细胞对TTR淀粉样蛋白的吞噬能力。
8.权利要求1-2和5中任一项的人抗体，其中表位是包含TTR的位置79至位置89的序列。
9.权利要求8的人抗体，其中表位是TTR的位置79至位置89。
10.权利要求1-2、5和9中任一项的人抗体，其对TTR淀粉样变具有治疗作用和/或预防作用。
11.权利要求10的人抗体，其中所述TTR淀粉样变是家族性淀粉样蛋白多神经病(下文称为“FAP”)。
12.权利要求10的人抗体，其中所述TTR淀粉样变是老年系统性淀粉样变(下文称为“SSA”)。
13.权利要求1-2、5、9和11-12中任一项的人抗体，其是通过噬菌体展示获得的抗体。
14.权利要求1-2、5、9和11-12中任一项的人抗体，其包含由下文(i)的多肽组成的H链可变区和由下文(k)的多肽组成的L链可变区：
(i) 由SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列组成的多肽；
(k) 由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列组成的多肽。
15.权利要求1-2、5、9和11-12中任一项的人抗体，其包含由下文(m)的多肽组成的H链可变区和由下文(o)的多肽组成的L链可变区：
(m) 由SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列组成的多肽；
(o) 由SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列组成的多肽。
16.TTR的抗体的单链可变区片段，其通过连接1) H链可变区片段和2) L链可变区片段形成，所述H链可变区片段i) 包含由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列组成的H链CDR1、由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列组成的H链CDR2和由SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列组成的H链CDR3，或ii) 由以下多肽组成，所述多肽由SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列组成；所述L链可变区片段i) 包含由SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列组成的L链CDR1、由SEQ IDNO: 5所示的氨基酸序列组成的L链CDR2和由SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列组成的L链CDR3，或ii) 由以下多肽组成，所述多肽由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列组成。
17.权利要求1-2、5、9和11-12中任一项的人抗体或其片段，其通过将人来源的恒定区1) 与H链可变区片段和/或2) 与L链可变区片段连接形成，所述H链可变区片段i) 包含由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列组成的H链CDR1、由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列组成的H链CDR2和由SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列组成的H链CDR3，或ii) 由以下多肽组成，所述多肽由SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列组成；所述L链可变区片段i) 包含由SEQ IDNO: 4所示的氨基酸序列组成的L链CDR1、由SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列组成的L链CDR2和由SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列组成的L链CDR3，或ii) 由以下多肽组成，所述多肽由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列组成。
18.TTR的抗体的单链可变区片段，其通过将1) H链可变区片段和2) L链可变区片段连接形成，所述H链可变区片段i) 包含由SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列组成的H链CDR1、由SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列组成的H链CDR2和由SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列组成的H链CDR3，或ii) 由以下多肽组成，所述多肽由SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列组成；所述L链可变区片段i) 包含由SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列组成的L链CDR1、由SEQ IDNO: 11所示的氨基酸序列组成的L链CDR2和由SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列组成的L链CDR3，或ii) 由以下多肽组成，所述多肽由SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列组成。
19.权利要求1-2、5、9和11-12中任一项的人抗体或其片段，其通过将人来源的恒定区1) 与H链可变区片段和/或2) 与L链可变区片段连接形成，所述H链可变区片段i) 包含由SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列组成的H链CDR1、由SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列组成的H链CDR2和由SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列组成的H链CDR3，或ii) 由以下多肽组成，所述多肽由SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列组成；所述L链可变区片段i) 包含由SEQ IDNO: 10所示的氨基酸序列组成的L链CDR1、由SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列组成的L链CDR2和由SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列组成的L链CDR3，或ii) 由以下多肽组成，所述多肽由SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列组成。
20.编码权利要求1-15中任一项的抗体、权利要求16或18的片段或权利要求17或19的抗体或其片段的基因。
21.包含权利要求20的基因的重组表达载体。
22.转化体，其中引入了权利要求20的基因或权利要求21的表达载体。
23.用于检测TTR淀粉样蛋白的装置，其包含权利要求1-15中任一项的抗体、权利要求16或18的片段或权利要求17或19的抗体或其片段。
24.用于检测TTR淀粉样蛋白的试剂，其包含权利要求1-15中任一项的抗体、权利要求16或18的片段或权利要求17或19的抗体或其片段。
25.用于除去TTR淀粉样蛋白的载体，其包含权利要求1-15中任一项的抗体、权利要求16或18的片段或权利要求17或19的抗体或其片段。
26.用于TTR淀粉样变的诊断剂，其包含权利要求1-15中任一项的抗体、权利要求16或18的片段或权利要求17或19的抗体或其片段。
27.权利要求26的诊断剂，其中TTR淀粉样变是FAP。
28.权利要求26的诊断剂，其中TTR淀粉样变是SSA。
29.TTR-原纤维化抑制剂，其包含权利要求1-15中任一项的抗体、权利要求16或18的片段或权利要求17或19的抗体或其片段。
30.用于预防和/或治疗TTR淀粉样变的药物组合物，其包含权利要求1-15中任一项的抗体、权利要求16或18的片段或权利要求17或19的抗体或其片段。
31.权利要求30的药物组合物，其中TTR淀粉样变是FAP。
32.权利要求30的药物组合物，其中TTR淀粉样变是SSA。
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