JP2013542720A - 抗エフリン−ｂ２抗体およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、新規の抗エフリン−Ｂ２抗体、ならびにこのタンパク質の検出用のその使用、および疾患の処置における血管新生およびリンパ管新生を阻害する医薬としてのその使用に関する。上記過程をともなっている当該疾患は、例えばがんである。

Description

発明の詳細な説明

本発明は、生物医学および生物工学の分野に属し、血管の形成（血管新生）およびリンパ管の形成（リンパ管新生）を遮断可能な、エフリン Ｂ２に特異的な新規の抗体に関する。さらに、本発明は、例えば医薬の調製のための、上記抗体の使用に関する。

〔最新技術〕
血管新生（すなわち、すでに存在している血管からの新たな血管の形成）は、胚発生および出生後の生活の間における多くの生理学的過程（生殖、瘢痕化および炎症）に重要な役割を果たしている。血管新生性の表現型への内皮細胞の移行を引き起こす分子機序は、完全には知られていないが、当該分子機序は、内皮細胞の増殖、遊走および集合（これらに続く血管周囲細胞（例えば、周皮細胞または筋細胞）のリクルートメントおよび細胞外マトリクスの再構築）に関与する複雑な過程である（Risau, W. Nature 1997, 386:671-674）。血管の無制御な成長は、多くの病態（例えば、リウマチ様関節炎もしくは糖尿病性網膜症、および特に腫瘍性の過程）における潜在的な異常である。腫瘍の成長は、新血管のネットワーク形成を介した酸素および栄養素の一定の供給に依存しているので、十分な血管新生の非存在下において、細胞は、腫瘍体積の増加を阻害するか、または抑制するネクローシスおよび／またはアポトーシスの過程を起こす。

血管に加えて、脊椎動物の循環系は、生物の発生および病理過程の間に重大な役割を果たすリンパ管を備えている。リンパ系は、（１）組織の間質液を流出させ、かつ血管系に間質液を送り込み、（２）また消化器系から脂質を吸収し、（３）免疫系の細胞を輸送する個体の免疫防御の一部であり、（３）例えば炎症および種々の病理的障害において、リンパ水腫、炎症性疾患を誘導し、（４）がん腫の浸潤および転移に関与している（Tammela, T. and Alitalo, K. Cell 2010, 140:460-76）。リンパ管新生（すなわち、すでに存在しているリンパ管からのリンパ管の形成）の研究は、数十年間、遅れたままであり、腫瘍の播種および転位を研究するために利用されている生体分子機序および特異的なマーカーについて説明されたのは、近年になってからである。

胚発生の間に、血管は、脈管形成と呼ばれる過程において、中胚葉に由来する内皮性の前駆体から生じ、リンパ管の形成は、頸部領域および中腎周辺からの静脈内皮細胞の集合から開始されると考えられている。それらの共通する胚性の起源のために、両方の脈管系は、それらの発達および成熟を調節する同様の分子機序を共有している。種々のシグナル伝達経路は、チロシンキナーゼ受容体が心脈管系の形成のそれらの機序において非常に重要な役割を果たしていると同定されている。当該シグナル伝達経路は、特に、アンジオポエチンによって制御されているＴｉｅ−１受容体およびＴｉｅ−２受容体の活性と共同している、それらの対応する受容体（ＶＥＧＦＲ）を介した血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達経路である（Thurston, G., Cell Tissue Res 2003; 314:61-68）。さらに、分子の他の群（対応するそれらの受容体（Ｅｐｈ）をともなったｅｐｈｒｉｎ（“producing hepatoma erythropoietin receptor interactors”の頭文字））はまた、血管系（Adams, RH and Klein, R. Trends Cardiovasc Med 2000, 10: 183-188）およびリンパ管系（Makinen, T et al. Genes Dev 2005, 19:397-410）の再構成に関与していると示されている。このファミリーは、１４の受容体および８のリガンドを有しているチロシンキナーゼの最大の公知のグループを含んでおり、それらの配列相同性および対応するリガンドの結合特性に基づいて、２つの受容体のカテゴリ（Ｅｐｈ ＡおよびＥｐｈ Ｂ）に細分される。Ｅｐｈ Ａ受容体は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）分子によって膜に固定されることによって特徴付けられているサブグループエフリン Ａのリガンドと結合する。Ｅｐｈ Ａ受容体は、細胞内ドメインがうしろに続いている膜貫通領域を介して膜に固定されているサブグループエフリン Ｂのリガンドと結合する。動脈は膜貫通型リガンドのエフリン Ｂ２を発現しており、静脈はエフリン Ｂ２４受容体を発現していると報告されている（Adams, RH and Alitalo K. Nat Rev Mol. Cell Biol 2007, 8: 464-478）。

このグループの分子は、種々の細胞機能を担っている。当該細胞機能は、例えば、細胞骨格の組織化を変更すること、ならびにインテグリンおよび他の細胞内の接着分子の活性に影響を及ぼすことによる、形態、遊走、反発、細胞接着および浸潤である（Pasquale, EB. Cell 2008, 133:38-52）。これらの活性は、ある細胞において発現されているＥｐｈ受容体の、他の細胞において発現されている対応するエフリンとの相互作用に依存しており、関与する各細胞に作用する２方向性のシグナルを生成する。Ｅｐｈ受容体によってもたらされるシグナル伝達は、“フォワード”と呼ばれ、その細胞内領域に位置しているチロシンキナーゼドメインに依存している。当該チロシンキナーゼドメインは、自己および他のタンパク質のリン酸化能、ならびに他のエフェクター分子との受容体の会合に関する能力を有している。この部分のために、リガンドであるエフリン Ｂは、“リバース”と呼ばれる他のシグナルを生成する。当該シグナルは、一方でＳｒｃファミリーキナーゼによって行われるその細胞内ドメインにおける種々のチロシンのリン酸化、および他方で他の関連タンパク質に依存している。さらに、Ｅｐｈ受容体およびエフリン Ｂのほとんどは、上記生理学的機能（特にエフリン Ｂの）を果たすために重要な、それらの細胞内ドメインにＰＤＺドメインに対する結合部位を有している（Makinen, T et al. Genes Dev 2005; 19:397-410）。

遺伝子導入マウスにおけるＥｐｈ Ｂ４をコードしている遺伝子の不活性化に関する研究は、脈管系の発生における両方のタンパク質の基本的な役割を示している。これらの遺伝子に関する欠損マウスは、胚形成期において致死的な、変化した血管新生を有しており（Wang, HU et al. Cell 1998, 93:741-753; Adams, RH et al. Genes Dev 1999, 13:295-306）、シグナル伝達の活性部位に変異を有しているエフリン Ｂ２を発現しているマウスの研究によって、このタンパク質は、ＶＥＧＦシグナル伝達経路の制御を介してリンパ管新生性および血管新生性の成長を制御していることが示された（Wang, Y et al. Nature 2010, 465: 483-6; Sawamiphak S et al. Nature 2010, 465:487-91）。

国際公開第２００７／１２７５０６号および国際公開第２０１０／０１９５６５号には、エフリン Ｂ２抗体について記載されている。国際公開第２００７／１２７５０６号には、上述の抗体は、エフリン Ｂ２およびＥｐｈ Ｂ４の間におけるシグナル伝達を遮断し、動物モデルにおける腫瘍体積を減少可能な、血管新生における阻害作用を有していることが示されている。

しかし、血管新生を制御可能な新規の治療薬に対する必要性は、存在し続けている。

〔発明の説明〕
本発明は、血管新生を制御可能な新規の治療薬を提供し、血管およびリンパ管の新たな形成を阻害可能であり、かつ腫瘍の増殖を著しく抑制する、エフリン Ｂ２に対する新規な抗体に関する。当該抗体は、これまでに説明されている抗体と異なる配列を有しており、高い特異性を有している。国際公開第２００７／１２７５０６号に記載のエフリン Ｂ２抗体は、血管新生を阻害可能であるが、抗リンパ管新生の阻害作用について説明されていない。

本発明は、エフリン Ｂ２を認識し、エフリン Ｂ２と特異的に結合する抗体に基づいており、エフリン Ｂ２と関連しているそれらの病状に対する診断または治療の重要なツールを構成する、上述の抗体および方法、ならびにそれらに基づく組成物を指す。

第１の局面において、本発明は、抗血管新生活性および抗リンパ管新生活性を有しており、固形腫瘍の増殖を抑制可能な、エフリン Ｂ２に対する新規抗体に関する。

本発明は、血管新生異常をともなう疾患（例えばがん）を制御する課題に対する新たな解決法をもたらす。

発明者らによって証明されている通り、本明細書に記載のＢ１１抗体は、Ｅｐｈ Ｂ４受容体との結合を阻害するように、エフリン Ｂ２を特異的に認識する。当該結合の阻害は、インビトロアッセイにおいて、細管形成および内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の遊走能を阻害し、膵臓がん、大腸がんおよび肺がんの細胞を用いたインビボアッセイにおいて、腫瘍における血管およびリンパ管の数を著しく低下させる。本発明者らは、本発明の抗体が腫瘍の増殖を著しく遅らせ、腫瘍のサイズを著しく低下させ得ることを、さらに見出した。本発明者らは、エフリン Ｂ２の、Ｅｐｈ Ｂ４に対する相互作用をＢ１１抗体が遮断したことを示しており、当該抗体がその受容体を介したエフリンシグナル伝達をどのように阻害可能であるかをも示している（本明細書における図５を参照）。

また、２Ｂ１抗体は、インビボアッセイにおいて、細管形成およびに内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の遊走能を阻害可能であり、腫瘍における血管およびリンパ管の数を低下させる。本明細書の図５に示されている通り、２Ｂ１抗体は、Ｅｐｈ Ｂ４遮断のBiacore（商標）アッセイおよび細胞性アッセイのいずれにおいても、Ｅｐｈ Ｂ４受容体と競合しない。

したがって、本発明の第１の局面は単離されたポリペプチドに関する。当該ポリペプチドは、ａ．配列番号１と少なくとも７６％の配列同一性のアミノ酸配列を含んでおり、ｂ．エフリン Ｂ２を特異的に認識し、エフリン Ｂ２と特異的に結合する。

上記ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９０％、９９％の配列同一性を有しているアミノ酸配列を含んでいることが好ましい。上記ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでいることがより好ましい。

本明細書に使用されるとき、ポリペプチドに言及している“単離された”という用語は、当該ポリペプチドが同定されており、かつ天然環境から分離されているか、および／または抽出されていることを意味する。

ポリペプチドに対する“％の配列同一性”という用語は、必要に応じて保存的置換を考慮せずに２つの配列の同一のパーセンテージを最大化するために、２つの配列を整列化し、かつ空白を導入した後に、比較されている配列のアミノ酸と同一であると説明されている配列のアミノ酸のパーセンテージを指す。整列化は、例えば一般のツール（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ））を用いた、当業者に公知の異なる方法において実施され得る。当業者は、整列化を評価するために適切なパラメータ（比較される配列の最大の整列化を達成するために必要とされる任意のアルゴリズムが挙げられる）を決定し得る。

本明細書に使用されるとき、“エフリン Ｂ２”という用語は、特に示されていないか、または文脈的に示されていない限り、エフリン Ｂ２タンパク質の任意の天然のポリペプチドまたは任意のバリアントを指す。このタンパク質の名称は、“erythropoietin producing hepatoma receptor interactors”についての頭文字であるが、エフリンとも呼ばれ得る。天然に存在するポリペプチドは、天然にトランケートされているか、もしくは分泌される形態（例えば、細胞外ドメイン）、または天然に存在する任意のバリアント（例えば、選択的な種々の“スプライシング”形態）もしくは対立形質の任意のバリアントであり得る。

上記ポリペプチドは抗体であることが好ましい。上記抗体はヒト型であることがより好ましい。ヒト型の上記抗体のアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＡであることが好ましい。

“抗体”または“免疫グロブリン”という用語は、広義に使用されており、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および多重特異性（所望の生物学的活性を示す限り）を包含しており、抗体断片を包含し得る。上記抗体は、ヒト型であるか、ヒト化されているか、および／または成熟された親和性であり得る。

“ヒト型の抗体”は、そのアミノ酸配列がヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列と一致している抗体である。

本発明の抗体は、短鎖の可変断片（ｓｃＦｖ、英語“single chain variable Fragment”）であり得る。“可変”という用語は、抗体の可変部のある部分がそれらの配列とまったく異なっており、その抗原に対する各抗体の特異的結合を担っている配列であることを指す。しかし、可変性は、上記抗体の可変領域の全体にわたって一様に配分されているわけではない。この可変性は、軽鎖および重鎖の両方の可変部に見られるＣＤＲ（英語“complementarity-determining regions”）または超可変部と呼ばれる３つの部分に集中させられている。可変領域の最も保存されている部分は、枠組み構造と呼ばれている。２つの鎖（軽鎖および重鎖）に由来するＣＤＲは、抗原結合部位の形成に寄与している。可変断片または“Ｆｖ”は、完全な抗原認識結合部位を含んでいる最小の抗体断片である。短鎖の可変断片は、重鎖および軽鎖が会合して抗原結合部位を形成し得ること許容するペプチドによって、共有結合的に連結されている重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域を有し得る。また、Ｆｖは２つの鎖によって形成され得る。任意の場合に、３つのＣＤＲのみを有している単一の可変領域でさえ、より低い親和性を有しているものの、抗原を認識し、当該抗原と特異的に結合するために十分である。

抗体または脊椎動物の免疫グロブリンの軽鎖は、それらの定常部のアミノ酸配列にしたがって、カッパおよびラムダと呼ばれる２つのタイプに属し得る。重鎖の定常部のアミノ酸配列にしたがって、免疫グロブリンは、異なるクラスまたはタイプに分類される。主要な５つのタイプまたはクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがある。さらに、それらの一部は、サブクラスまたはアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＧＡ２）に分けられる。さらに、免疫グロブリン、および異なるクラスの重鎖の定常部のそれぞれは、アルファ、ベータ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。

抗体断片は、抗体全体の機能を維持している抗体の任意の部分であり得る。抗体断片の例は、Ｆｖ、Ｆａｂ（抗原結合断片）、Ｆａｂ２（２つの抗原結合部位を有している断片）であり、すべて当業者にとって周知である。短鎖の可変断片（ｓｃＦｖ）は、単一のポリペプチド鎖におけるこれらのドメインであるＶ_Ｈドメイン（重鎖の可変領域）およびＶ_Ｌ（軽鎖の可変領域）抗体を含んでいる。本発明の抗体の他の形態は、（１）ｓｃＦｖとＣＨ３型の定常部とを含んでいる、ミニ抗体もしくは“ミニボディー”、または（２）ｓｃＦｖとＣＨ２およびＣＨ３の定常部とを含んでいるいわゆるｓｃＦｖ−Ｆｃとして知られている形態であり得る。これらの形態は、ｓｃＦｖの分子量を増大させ、腎臓による速やかな排除を回避し、画像化技術におけるｓｃＦｖの使用にとって非常に有用であり得る。

“抗原”という用語は、上記抗体が選択的に結合可能な所定の抗原を指す。抗原は、ポリペプチド、含水炭素、核酸、脂質、ハプテンまたは他の天然分子もしくは合成分子であり得る。

本発明の発明者らは、エフリン Ｂ２に対する抗体２Ｂ１およびＢ１１の親和性を調べ、Ｂ１１が、１１０ｎＭの結合定数（Ｋ_Ｄ）である、抗原に対する高い親和性を有しており、２Ｂ１が、６３０ｎＭのＫ_Ｄであるより低い親和性を有していることを見出している。抗体および抗原の認識部位および結合部位の間における結合の親和性は、両者間における非共有結合性相互作用の総和の強度である。これとは別に分子の親和性は、解離定数（Ｋ_Ｄ）とも呼ばれる親和性定数によって、一般的に表される。親和性は、周知されている方法（例えば、これらに限定されないが、本明細書に記載の方法）によって測定され得る。

抗体がその抗原に対する低い親和性を有している場合、当該抗体は、しばしば当該抗原と緩やかに結合し、容易に解離する。その抗原に対する抗体の親和性を向上させるために、文献に十分に説明されている手法は、“親和性を成熟させるために”採用され得る（Marks et al. BioTechnology 1992. 10:779:783；Barbas, CF et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994 26; 91:3809-13）。これらの手法は、なかでも、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインの“シャッフリング”、またはランダム変異生成である。

本発明の好ましい実施形態において、上記ポリペプチドはシグナルペプチドをさらに含んでいる。上記シグナルペプチドは、ｐｅｌＢとして公知のErwinia carotovoraの細菌ペクチン酸塩リアーゼのシグナルペプチドである、配列番号６であることが好ましい。このシグナルペプチドは、ｓｃＦｖが細胞周辺質に位置すことを可能にする。細胞周辺質は、酸化環境の結果としてｓｃＦｖが正しいフォールディングを受ける場所である。

シグナルペプチドは、特定の細胞内部位（例えば、小胞体、ミトコンドリアまたは核）へのポリペプチドまたはタンパク質の輸送に関する３〜６０アミノ酸の短い配列である。また、上記シグナルペプチドは、分泌、またはEscherichia coliといった細胞の場合における細胞周辺質と等価であり得るタンパク質の細胞外輸送に関し得る。ポリペプチドの分泌に関するシグナルペプチドのいくつかの例は、ｐｅｌＢ、ストリ（stli）、エコチナ（ecotina）、ｌａｍＢ、ヘルペスのＧＤ、１ｐｐ、アルカリホスファターゼ、転化酵素、アルファ因子、およびプロテインＡのリーダー配列である。

本発明の好ましい実施形態において、上記ポリペプチドは少なくとも１つのマーカーをさらに含んでいる。上記マーカーは、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ヒスチジン鎖、ＧＳＴ、ビオチン、ＶＳＶ−Ｇ、ＨＳＶｔｋ、Ｖ５、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、マルトース結合タンパク質および蛍光タンパク質を含んでいるリストから選択されることが好ましい。上記マーカーは、ヒスチジン、ｃ−ｍｙｃまたは両方の鎖であることがより好ましい。ヒスチジン鎖は４〜１２のヒスチジンを含んでいることが好ましい。ヒスチジン鎖は６のヒスチジンを含んでいることがより好ましい。本発明の好ましい実施形態において、上記ポリペプチドは、複数のマーカー（ヒスチジンの鎖およびｃ−ｍｙｃ）を含んでいる。本発明の好ましい実施形態において、上記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号７である。

本明細書に使用されるとき、“マーカー”という用語は、それらが融合タンパク質としてこのタンパク質とともに産生されている場合に、所望のタンパク質の同定を可能にするマーカーペプチドまたはマーカータンパク質を指す。上記マーカーペプチドまたはマーカータンパク質は、所望のタンパク質の同定および／または局在化のために使用される。これは、（１）そのようなマーカーが、特定の分子もしくは原子に対する結合部位に該当する（例えば、ヒスチジンの鎖、ＧＳＴ、アビジンもしくはストレプトアビジン）か、（２）それらが、免疫化学的手法によって容易に検出可能である（例えば、血球凝集素、ＶＳＶ−Ｇ、ＨＳＶｔｋ、ＦＬＡＧ、Ｖ５またはｍｙｃ）か、または（３）それらが容易に観察される（例えば、蛍光タンパク質）からである。

マーカーペプチドＶＳＶ−Ｇは、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質に属する。ＨＳＶｔｋマーカーペプチドは、単純ヘルペスウイルス１型のチミジンキナーゼに属する。ＦＬＡＧペプチドは、組換えタンパク質に対するマーカーとして特に設計された８アミノ酸のエピトープである。Ｖ５は、パラミクソウイルスのシミアンウイルス５（ＳＶ５）のＰタンパク質およびＶタンパク質に存在する小エピトープである。ｍｙｃエピトープは、１０アミノ酸を有しており、転写因子ヒトｃ−ｍｙｃの配列の一部である。

本発明の他の実施形態は、そのアミノ酸が本発明の第１の局面の上記ポリペプチドを含んでいる抗体である。

本発明の第２の局面は、本発明の第１の局面の上記ポリペプチドをコードしている核酸に関する。上記核酸はベクターであることが好ましい。上記ベクターは発現ベクターであることがより好ましい。

核酸またはポリヌクレオチドは、任意の長さのヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられる）の重合体である。上記ヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼ、または合成反応よって重合体に組み込まれ得るデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、または任意の基質であり得る。

“コードしている”という用語は、ヌクレオチド配列がどのようなポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるかを決定する遺伝暗号を指す。配列におけるヌクレオチドの順序は、ポリペプチドまたはタンパク質に沿ったアミノ酸の順序を決定する。

ベクターは、細胞に遺伝物質を運ぶために使用される核酸分子である。また、ベクターは、上述した遺伝物質の他に、種々の機能要素（転写を制御する要素（例えば、プロモータもしくはオペレータ、エンハンサまたは転写因子の結合のための領域、ならびに翻訳を開始させる制御エレメントおよび翻訳を終結させる制御エレメント）が挙げられる）を含み得る。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組換え発現カセットおよびトランスポゾンが挙げられるが、これらに限定されない。あるベクターは、いったんそれらが宿主細胞に導入されると、自発的に複製または分裂可能である（例えば、細菌の複製開始点を有している細菌ベクターまたはエピソームの哺乳類ベクター）。他のベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、細胞性のゲノムとともに複製され得る。発現ベクターは、作動可能に連結されている遺伝子の発現を導き得るベクターの１つである。発現ベクターは、所望の遺伝子の転写および翻訳に使用され、通常、プロモータに制御されている。プロモータは、所望の遺伝子の翻訳を制御するヌクレオチドの配列である。プロモータは、所望の遺伝子と作動可能に連結されている。“作動可能に連結されている”は、所望の遺伝子に関する、プロモータ配列の機能的な関連性および位置を指し、例えば、プロモータまたはエンハンサは、コード配列の転写に影響する場合に当該コード配列と作動可能に連結されている。一般的に、作動可能に連結されているプロモータは、所望の配列の直前にある。しかし、エンハンサは、その発現を制御するための所望の配列と近接している必要はない。

本明細書に使用されるとき、“複製開始点”という用語は、複製点が形成されており、ＤＮＡ複製が開始するヌクレオチド配列を指す。

本発明の第３の局面は、本発明の第２の局面の上記ベクターを含んでいる細胞に関する。上記細胞は、例えば、限定されることなく原核生物であり得、上記細胞は、本発明の上記抗体を生成するために使用される細菌（例えば、E. coli）であり得る。上記細胞は、本発明の上記抗体を生成するために使用される真核生物（例えば、限定されることなく酵母細胞または昆虫細胞）であり得る。真核細胞は、細胞療法に使用され得るか、または本発明の第２の局面の上記ベクターを遺伝子療法によって取り込んでいる細胞であり得る。本発明の好ましい実施形態において、上記細胞は哺乳類細胞である。哺乳類細胞は、その種が、動物界、脊索動物門、脊椎動物亜門、および哺乳類に属する任意の細胞である。

本発明の第４の局面は、本発明の第１の局面の上記ポリペプチドを入手する方法に関する。当該方法は、次の工程：（ａ）本発明の第２の局面の上記ベクターを細胞において発現させること、および（ｂ）工程（ａ）において発現されたポリペプチドを精製することを包含している。

本発明の第４の局面の好ましい実施形態において、上記細胞は原核生物である。本発明の第４の局面の好ましい他の実施形態において、上記細胞は真核生物である。

本発明の第５の局面は、エフリン Ｂ２の検出および／または定量化の方法に関する。当該方法は、次の工程：（ａ）単離された生物学的サンプルを、本発明の第１の局面のポリペプチドと接触させること、ならびに（ｂ）工程（ａ）において使用されたサンプルにおける、エフリン Ｂ２および上述したポリペプチドによって形成される複合体を検出するか、および／または定量化することを包含している。

本発明の第５の局面の好ましい実施形態は、エフリン Ｂ２の発現と関連している疾患を診断する方法である。当該方法は、次の工程：（ａ）単離された生物学的サンプルを、本発明の第１の局面の上記ポリペプチドと接触させること、（ｂ）工程（ａ）において使用されたサンプルにおける、エフリン Ｂ２と上述したポリペプチドとによって形成される複合体を検出するか、および／または定量化すること、（ｃ）検出されたエフリン Ｂ２のレベルをコントロールのレベルと比較すること、ならびに（ｄ）上述した比較の結果を、疾患の存在または非存在と関連付けることを包含している。

エフリン Ｂ２の発現と関連する疾患は、なかでも血管新生の脱調節をともなう任意の疾病（例えば、腫瘍性疾患および非腫瘍性疾患）であり得る。血管新生の調節不全を示す非腫瘍性疾患としては、異常な肥大、関節炎、リューマチ性関節炎、乾癬、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、増殖性網膜症、血管新生緑内障、加齢性黄斑変性症、糖尿病性黄斑変性症、糖尿病性黄斑水腫、角膜新血管新生、髄膜腫、血管腫、血管線維種、甲状腺過形成、慢性炎症、肺炎、敗血症、脳浮腫、滑膜炎、骨形成の異常発達、骨関節炎、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜症、クローン氏病、潰瘍性大腸炎、血友病性関節、瘢痕肥大、強皮症、トラコーマ、滑膜炎、皮膚炎、子癇前症が挙げられるが、これらに限定されない（国際公開第２００７／１２７５０６号）。

単離された生物学的サンプルは、身体（例えば、人体または動物体）から単離されたサンプルであり、生物の生理的液体および／または任意の細胞もしくは組織に由来し得る。生物学的サンプルは、組織（例えば、限定されることなく生検物または細針吸引物）であり得る。好ましい実施形態において、工程（ａ）における単離された生物学的サンプルは、生物学的な液体である。生物学的な液体は、身体から排泄されたか、または分泌された液体、ならびに通常ではみられない液体を包含し得る。生物学的な液体としては、胎児を囲んでいる羊水、眼房水、間質液、リンパ液、母乳、粘液（経鼻排液および痰が挙げられる）、唾液、皮脂（スキンオイル）、乳漿、汗、涙液、尿、心膜液、血液および血漿が挙げられるが、これらに限定されない。より好ましい実施形態において、生物学的な液体は、血液、血漿または血清である。本発明の方法の工程（ａ）における単離された生物学的サンプルは、例えば、限定されることなく、新鮮であるか、凍結されているか、固定されているか、またはパラフィンに包埋され得る。

本発明の第１の局面の上記ポリペプチド、およびエフリン Ｂ２によって形成される、単離された生物学的サンプルにおける複合体を“検出するか、および／または定量化する”という用語は、本明細書に使用されるとき、好ましくは半定量的または定量的な方法における、存在の検出および／または量もしくは濃度の測定を指す。測定は、直接的または間接的に実施され得る。直接の測定は、上記サンプルに存在する複合体分子の存在の数と直接に相関している上述した複合体から直接に得られるシグナルに基づいて、本発明の第１の局面の上記ポリペプチド、およびエフリン Ｂ２によって形成される複合体の量または濃度を測定することを指す。強度シグナルとも呼ばれ得るこのシグナルは、例えば上記複合体の物理特性または化学特性の強度値を測定することによって、入手され得る。間接の測定は、補助的な構成要素（例えば、上記複合体の異なる構成要素）または生物学的な測定系（例えば、細胞応答、リガンド、“タグ”、または酵素反応生成物）から得られる測定値を包含している。

“量”という用語は、特に限定されないが、本発明の第１の局面の上記ポリペプチド、およびエフリン Ｂ２によって形成される複合体の絶対量または相対量、ならびに上記複合体と関連するか、または当該複合体に由来し得る任意の他の値または変数を指す。そのような値または変数は、上記複合体の物理特性または化学特性のいずれかから得られ、かつ直接の測定によって得られるシグナルの強度値（例えば、質量分析または核磁気共鳴から得られる強度値）を包含している。さらに、これらの値または変数は、間接の測定によって得られる値または変数を包含する。

当業者によって理解される通り、検出は、分析されたサンプルの１００％において正確であると意図されていない。しかし、統計学的に有意な数のサンプルが正確に分類される必要がある。統計的に有意な量は、種々の統計学的なツール（例えば、信頼区間、ｐ値決定、ステューデントｔ検定、またはフィッシャーの差別関数）を用いて、当業者によって証明され得る。信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。ｐ値は、０．１、０．０５、０．０１、０．００５または０．０００１であることが好ましい。本発明は、分析される所定の群または集団のうち少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の対象における疾患を正確に検出し得ることが好ましい。

本明細書に使用されるとき、“比較すること”という用語は、分析されるべき生物学的サンプル（問題の生物学的サンプルとも呼ばれる）における、エフリン Ｂ２および本発明の第１の局面の上記ポリペプチドによって形成される複合体の量を、コントロールと呼ばれる基準サンプルの複合体の量と比較することを指すが、これに限定されない。基準サンプルは、例えば問題の生物学的サンプルと同時にか、または当該生物学的サンプルに続いて、分析され得る。比較は、手動においてか、またはコンピュータを利用して実施され得る。

本発明の第６の局面は、本発明の第１の局面の上記ポリペプチドの、医薬の調製のための使用に関する。本発明の好ましい実施形態において、上記医薬は、血管新生を阻害するために使用される。好ましくは、血管新生と関連する病理学的状態の治療処置または予防処置のため。より好ましくは、腫瘍またはがんの予防処置または治療処置のため。

血管新生と関連する病理学的状態は、任意の腫瘍形成、および非腫瘍性疾患（例えば、国際公開第２００７／１２７５０６号に記載の疾患）であり得る。

本発明の第６の局面の好ましい実施形態において、上記腫瘍またはがんは固形である。好ましくは膵臓がん、大腸がんまたは肺がん。腫瘍またはがんは、腔または液体を含んでいない組織の集団である場合に固形であると説明される。細胞腫に依存して、固形腫瘍は、異なる名称（例えば、肉腫、がん腫またはリンパ腫）を有している。

本発明の第７の局面は、本発明の第１の局面の上記ポリペプチド、本発明の第２の局面の上記核酸もしくはベクター、または本発明の第３の局面の上記細胞を含んでいる組成物に関する。本発明の第７の局面の好ましい実施形態において、上記組成物は薬学的組成物である。また、上記組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤を含んでいることによって特徴づけられていることが好ましい。さらに、上記賦形剤は薬理学的に許容可能である必要がある。

“賦形剤”は、活性成分ではなく、なかでも希釈剤、担体または充填剤である薬学的組成物の構成要素であり、安全であり、無毒であり、かつ副作用を有していない場合に“薬学的に許容可能”とみなされる。“賦形剤”という用語は、化合物の吸収を補助するか、当該化合物を安定化させるか、または堅さもしくはより好ましくさせる風味を付与する意味において医薬の調製に役立つ物質を指す。したがって、上記賦形剤は、この段落に挙げられていない他の種類の担体を除外することなく、成分をまとめる作用（例えば、スターチ、糖類またはセルロース）、甘味作用、着色作用、例えば空気および／または水分を隔離するための薬剤保護作用、錠剤、カプセル剤または他の提供形態の充填作用（例えば、二塩基性のリン酸カルシウム）、腸における化合物の溶解およびそれらの吸収を容易にする崩壊作用を有し得る。

“薬学的に許容可能”という賦形剤の用語は、担体が投与される生物に損傷を与えないと認められ、かつ評価されることを意味する。さらに、担体は、薬学的に好適である必要があり、薬学的組成物の化合物の活性を許容する（すなわちそれらの構成要素と適合する）必要がある。

“ビヒクル”または担体は、不活性な物質であることが好ましい。ビヒクルの機能は、他の化合物の導入を容易にすること、より良好な製剤および投与を可能にすること、または薬学的組成物に堅さおよび形態を与えることである。したがって、担体は、本発明の薬学的組成物の任意の構成要素を所定の体積または重量まで希釈するために使用される物質であるか、または希釈されていない構成要素は、より良好な製剤および投与を可能にし得るか、もしくは医薬に堅さおよび形状を付与し得る。提供形態が液体である場合に、薬学的に許容可能な担体は希釈剤である。

他のより好ましい実施形態において、薬学的組成物は他の活性物質をさらに含んでいる。他の治療薬の使用を必要とし得る治療有効性の要求の他に、本発明の化合物および他の治療薬の組合せの使用を強いるか、または強く推奨するさらなる論理的理由があり得る。“活性”という用語は、ヒト、動物、植物、化学または他の由来に関わらず、薬剤であるべき適切な活性を有している任意の材料を意味する。

本発明の第７の局面の好ましい実施形態において、薬学的組成物は抗血管新生剤をさらに含んでいる。抗血管新生剤は、血管新生、脈管形成、または所望されない血管透過性を、直接的または間接的に阻害可能な分子である。抗血管新生剤の例は、ある血管新生因子を遮断可能なこれらの分子（例えば、すべて十分に記述されている周知のＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦ受容体に対する抗体、またはＶＥＧＦ経路を遮断する小分子など）である。

本発明の第７の局面の好ましい実施形態において、薬学的組成物は化学療法薬をさらに含んでいる。化学療法薬はがんの処置に有用な化合物である。化学療法薬の例は、細胞障害性化合物（例えば、アントラシクリン、ダウノルビシン、アドリアマイシン、ドセタキセルの誘導体、ビンカアルカロイド、ビンクリスチン、カルムスチン、シスプラチン、フルオロウラシル）、細胞増殖抑制化合物（例えば、ポリアミン阻害剤、タモキシフェンまたはプロダゾンサンドスタチン）、またはアポトーシスを誘導する化合物（例えば、酪酸ナトリウムまたはマイトマイシンＣ）、抗生剤（例えば、ペニシリン、ベータラクタミン、セファロスポリン、サイクリン、アミノグリコシド、マクロライドまたはスルホンアミド）、または抗ウイルス剤（例えば、ＡＺＴ、プロテアーゼ阻害剤またはアシクロビル、レトロビルまたはフォスカーネット）である。

本発明の第８の局面は、本発明の第７の局面の組成物の、医薬の調製のための使用に関する。本発明のこの局面の好ましい実施形態において、医薬は血管新生を阻害するために使用される。好ましくは、血管新生と関連する病理学的状態の予防処置または治療処置のため。より好ましくは、腫瘍またはがんの予防処置または治療処置のため。好ましい実施形態において、上記腫瘍またはがんは固形である。上記がんは、膵臓がん、大腸がんまたは肺がんであることが好ましい。

本発明の第８の局面の好ましい実施形態において、治療有効量が投与される。“治療有効量”という用語は、必要とされるある投与量において必要な期間に投与される、所望の予防効果または治療効果の実現に有効な量を指す。本発明の上記ポリペプチドまたは薬学的組成物の“治療有効量”は、個体の疾患の段階、年齢、性別および体重にしたがって変化し得、所望の予防効果または治療効果を実現可能であり、かつ毒性または副作用を示さない量を指す。“個体”は脊椎動物である。脊椎動物は哺乳類であることが好ましい。哺乳類はヒトであることがより好ましい。なかでも、哺乳類としては、家畜（例えばウシ）、スポーツと関連する動物、ペット（例えば、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類、マウスおよびラットが挙げられるが、これらに限定されない。

薬剤の形態が使用される投与の種類に適合されている各場合において、本発明の組成物は、液剤の形態または臨床的に許容可能な投与の他の形態に基づいて、治療有効量において提供され得る。本発明の薬学的組成物は、固体、半固体、液体または気体（例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル、微粒子またはエアゾル剤）において製剤化され得る。本発明の好ましいさらなる実施形態によれば、薬学的組成物は経口投与または非経口投与に適合されている形態である。

経口投与に適合されている形態は、経口投与をおそらく許容する物理的な状態を指す。経口投与に適合されているそのような形態は、ドロップ剤、シロップ剤、吸引剤、エリキシル剤、懸濁剤、即時懸濁剤、飲用バイアル、錠剤、カプセル剤、粒剤、カチェット、丸薬、錠剤、トローチ剤、口内剤または凍結乾燥剤を含んでいるリストから選択される。

非経口投与のために適合されている形態は、注入投与をおそらく可能にする物理的な状態（好ましくは液体）を指す。非経口投与は、筋肉内、動脈内、静脈内、皮内、皮下または骨内を介して実施され得るが、非経口投与経路のこれらの種類のみに限定されない。

他の可能性は、薬学的組成物が、舌下投与、経鼻投与、くも膜下投与、気管支投与、直腸投与、経皮投与、または吸入投与に適合されている形態において存在していることである。

明細書および特許請求の範囲を通じて、“含んでいる”という単語およびその変化形は、他の技術的特徴、添加物、構成要素または工程を除外することを意図されていない。当業者にとって、本発明の他の目的、利点および特徴は、部分的に本明細書および部分的に本発明の実施から明らかになる。以下の実施例は、例示を目的として与えられており、本発明を限定することを意図されていない。

〔図面の説明〕
図１、選択されたクローンの、E. coliにおける発現。エフリン Ｂ２に対して選択されたｓｃＦｖ（２Ｂ１クローン、Ａ１、Ｂ１１およびＥ４）の発現（総抽出物）、および浸透圧ショックによって単離された対応する周辺質画分（周辺質）のアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびクーマシーブルー染色による分析。分子量は図面の左においてｋＤａを単位として示されている。

図２、クローン ２Ｂ１およびＢ１１は、大量に精製されている。エフリン Ｂ２のｓｃＦｖ Ａ１、Ｂ１１、Ｅ４および２Ｂ１特異物の、アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびクーマシーブルー染色による精製の分析。周辺質の抽出物のそれぞれに存在するｓｃＦｖは、固定化されたＮｉ^２＋に対する親和性クロマトグラフィーによって精製された。図面は、各ｓｃＦｖのクロマトグラフィー溶出の異なる画分を示している。分子量はｋＤａを単位として示されている。

図３、クローンＢ１１および２Ｂ１はより特異的である。異なるエフリン Ｂに対して免疫ブロットによって選択されたｓｃＦｖ抗エフリン Ｂ２の特異性の決定。市販の組換えタンパク質であるマウスのエフリン Ｂ１−Ｆｃ（ＥＢ１）、マウスのエフリン Ｂ２−Ｆｃ（ＥＢ２）およびヒトのエフリン Ｂ３−Ｆｃ（ＥＢ３）は、電気泳動によって分離され、ニトロセルロース膜に転写された。続いて、コントロール（Ｃ）としての市販の抗体である抗エフリン Ｂ２とともに、Ｂ１１および２Ｂ１クローンの反応性を分析した。分子量は図面の左においてｋＤａを単位として示されている。

図４、Biacore（商標）によるｓｃＦｖ抗エフリン Ｂ２の親和性の分析。センサグラムは、異なる４つの濃度（０．４、０．２、０．１、０．０５μＭ）を用いて固定化されたクローンＢ１１（Ａ）、ならびに３０、２０、１０および７．５μＭの濃度におけるクローン２Ｂ１（Ｂ）の、エフリン Ｂ２との結合曲線に対応する時間に対する応答を表しており、それぞれの親和性定数（ＫＤ）が、クローンＢ１１について１１０ｎＭおよびクローン２Ｂ１について６３０ｎＭと算出された。

図５、Ｅｐｈ Ｂ４に対するエフリン Ｂ２の結合を遮断する試験。Ａ．Ｅｐｈ Ｂ４に対するエフリン Ｂ２の結合のパーセンテージを示すグラフ。ｓｃＦｖ抗エフリン Ｂ２の存在下におけるＥｐｈ Ｂ４に対するエフリン Ｂ２の、表面プラズモン共鳴による結合阻害試験。ｓｃＦｖ Ｂ１１（●）または２Ｂ１（○）の系列希釈物は、エフリン Ｂ２と混合され、チップ上に固定化されたＥｐｈ Ｂ４の全体に注入された。Ｅｐｈ Ｂ４と結合したエフリン Ｂ２の相対量は、各サンプルの注入の直後に測定され、ｓｃＦｖの濃度に応じてプロットされた。図面は、標準偏差（ｎ＝３）を表すエラーバーとともに、ｓｃＦｖの各濃度についての平均値を示している。Ｂ．ｓｃＦｖ Ｂ１１は、細胞アッセイにおいてエフリン Ｂ２とＥｐｈ Ｂ４受容体との相互作用を遮断可能である。ＨＥＫ２９３細胞の表面上に過剰発現されたエフリン Ｂ２を用いた刺激に対する、ＨＵＶＥＣ細胞におけるＥｐｈ Ｂ４受容体のチロシンリン酸化の分析。エフリン Ｂ２を過剰発現するＨＵＶＥＣ細胞およびＨＥＫ２９３細胞は、抗エフリン Ｂ２ ｓｃＦｖの存在下または非存在下において２０分にわたって共培養された。Ｅｐｈ Ｂ４受容体の免疫沈降後に、このタンパク質の総量（下のパネル）およびそのリン酸化レベル（上のパネル）を免疫ブロットによって分析した。

図６、マトリゲルにおける内皮細胞ＨＵＶＥＣによるインビトロの管状構造形成に対するＢ１１および２Ｂ１の阻害作用。Ｂ１１、２Ｂ１またはネガティブコントロールとしての無関係なｓｃＦｖ（Ｃ−）の存在下におけるマトリゲル上のＨＵＶＥＣ細胞培養物の６時間における管形成の代表的な顕微鏡写真（倍率４倍）。ポジティブコントロールとしてＶＥＧＦを使用した。グラフは管形成の定量化を示している。各処理は、少なくとも３回にわたって繰り返され、対応する値（平均＋／−標準偏差）は、任意の処理なしのコントロールと比べて試験した抗体の存在下において形成形成された管のパーセンテージとしてプロットされている。

図７、インビトロの傷治癒アッセイによる細胞の側方遊走の分析。ＨＵＶＥＣ細胞を、コンフルエンスまで培養し、単層細胞に損傷を与えた。それから、遊走刺激としてのＶＥＧＦの非存在下（コントロール）または存在下の、無血清培地において細胞をインキュベートした。細胞の側方遊走を、ｓｃＦｖ Ｂ２、Ｂ１１もしくはＢ２、ネガティブコントロールとしての無関係なｓｃＦｖの存在下において２４時間にわたってモニターした。図面は、時間０における細胞のない初期の領域を破線によって示した傷領域の２４時間後における代表的な顕微鏡写真（倍率４倍）を示している。グラフは、２４時間における細胞の遊走を定量化している。各ｓｃＦｖを少なくとも３回にわたって試験し、対応する値（平均＋／−標準偏差）を、時間０に対して遊走を受けた領域のパーセンテージをプロットした。＊＝Ｐ＜０．００１。

図８、インビボにおける管状構造形成の阻害作用の分析。マトリゲル移植を胸腺欠損のｎｕ／ｎｕマウスにおいて実施し、内皮細胞およびヘモグロビンの定量化によって、移植の６日後に血管新生を評価した。Ａ．６日後に取り出し、内皮細胞マーカーＣＤ３４を用いて染色した対応する移植片の組織切片の代表的な顕微鏡写真（倍率４倍）。Ｂ．グラフは、マーカーＣＤ３４についてポジティブな領域のパーセンテージ、およびＶＥＧＦなしのコントロール移植片（右パネル）に対する上記移植片のヘモグロビン含量の変化率を示している。

図９、膵臓がん細胞（ＢｘＰＣ３）を用いて異種移植され、Ｂ１１または２Ｂ１を用いて処理したマウスにおける腫瘍成長の阻害。グラフは、２０ｍｇ／ｋｇのＢ１１（黒ぬりの三角）、２Ｂ１（黒塗りの四角）または未処理（Ｃ−）（◆）を用いて処理した各群についての、各点における平均の腫瘍体積および標準偏差を示している。

図１０、膵臓がん細胞（ＢｘＰＣ３）を異種移植し、Ｂ１１または２Ｂ１を用いて処理した腫瘍の組織病理学的な分析。移植の３８日後である抗体の最終投与の１日後に分析を実施した。対応する免疫組織化学染色を続いて実施するために、腫瘍を、ホルマリンにおいて固定し、パラフィンに包埋した。アポトーシスした細胞を、活性なカスパーゼ３を染色することによって検出し、増殖活性を、Ｋｉ６７染色によって分析し、血管分布を、ＣＤ３４染色によって標識し、リンパ管を、ＬＹＶＥ１染色することによって検出した。続いて、細胞をカウントするか、または陽性領域および平均値を、それぞれの標準偏差とともにカウントしたすべての視野についてプロットした。＊ｐ＝０．０００１、＊＊＝＜０．００１。

図１１、Ｂ１１は、大腸がん細胞（ＳＷ６２０）（Ａ）および肺がん細胞（Ｈ４６０）（Ｂ）を用いて異種移植したマウスにおける腫瘍成長を阻害可能である。グラフは、２０ｍｇ／ｋｇのＢ１１を用いて処理した群および処理したコントロール群における各点の、標準偏差をともなった腫瘍体積の平均（上パネル）および蛍光強度の平均（下パネル）を示している。

図１２、Ｂ１１および２Ｂ１の体内分布分析、ならびに腫瘍塊の位置。胸腺欠損のｎｕ／ｎｕマウスは、蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙを安定に発現している肺がんのＨ４６０細胞を用いて異種移植された。腫瘍が、肉眼で、かつ６１０ｎｍにおける蛍光強度を用いて検出可能なサイズに達したときに、蛍光色素を結合させた適切なｓｃＦｖ AlexaFluor（登録商標）を静脈内に投与した。Ａ．上記ｓｃＦｖの投与後の０．５、２、６、２４および４８時間における背側領域の画像。Ｂ．AlexaFluor（登録商標）を用いて標識したｓｃＦｖ Ｂ１１および２Ｂ１の投与、ならびにネガティブコントロール（Ｃ−）をＰＢＳ処理の６および４８時間後に励起された、腫瘍の７５０ｎｍにおける蛍光強度。

〔実施例〕
本発明は、発明者らによってなされた試験によって以下に例示される。当該試験は、エフリン Ｂ２に対する本発明の抗体の特異性、ならびに新たな血管およびリンパ管の形成の阻害におけるそれらの有効性を証明している。

（実施例１：エフリンＢ２に対する新規なヒト抗体の同定および性質決定）
哺乳類細胞において発現され、アフィニティークロマトグラフィーによって精製されたエフリン Ｂ２の細胞外ドメインに対する連続的な選択を介して、ファージＭ１３の表面上に発現されたヒト抗体のライブラリから、ＥＬＩＳＡによってＢ２抗原と陽性反応したファージクローンの収集物を得た。これらのクローンを、特異的なプライマーを用いて配列決定し、Ｖ_Ｈ（可変性の重鎖）およびＶ_Ｌ（可変性の軽鎖）の両方において成熟した異なる配列の４つの短鎖の可変断片（ｓｃＦｖ）と同定し、４つの短鎖の可変断片をＡ１、Ｂ１１、Ｅ４および２Ｂ１と呼ぶ。続いて、選択された各ｓｃＦｖの発現および精製の分析を実施した。この目的のために、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にするためのヒスチジンテイルを有している断片をもたらすために、これらを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモータに基づくベクターｐＥＴ２８ｂにサブクローニングした。組換えベクターを、生成し、E. coliのＢＬ２１株（ＤＥ３）に導入して、ＩＰＴＧを用いて発現を続いて誘導した。周辺質画分を、穏やかな浸透圧ショックによって調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるｓｃＦｖの存在について試験した（図１）。それから、ニッケルのアフィニティークロマトグラフィーを用いて周辺質画分に存在するｓｃＦｖの精製を行い、ゲル濾過によってＰＢＳに緩衝液を交換した（図２）。最大の収率は、クローン２Ｂ１（その配列は配列番号８である）の場合に得られ、次にクローンＢ１１（その配列は配列番号７である）であった。しかし、ｓｃＦｖ Ａ１およびＥ４の発現は、達した量がこれらの抗体のさらなる性質決定を行うには不十分なほど低かった（図２）。したがって、反応性を分析するために、クローンＢ１１および２Ｂ１を選択した。ＥＬＩＳＡによる機能的アッセイは、それらの抗体が、それらの標的抗原エフリン Ｂ２を特異的に認識するための機能的に活性な形態において発現されることを示した。

エフリン Ｂ２ファミリーの他の構成要素：市販の組換え形態におけるエフリン Ｂ１およびエフリン Ｂ３とのＢ１１および２Ｂ１の反応性を、エフリン Ｂ２との反応性と比較する免疫ブロット（ウエスタンブロット）分析およびＥＬＩＳＡ分析によって、２つの抗体の特異性を確認した（図３）。コントロールとして、市販の抗エフリン Ｂ２（R & D）を使用した。Ｂ１１および２Ｂ１の両方の抗体はエフリン Ｂ２のみを認識し、エフリン Ｂ１およびエフリン Ｂ３を認識する市販の抗体をはるかに超えた、このタンパク質に対する高い特異性を証明している。これらの結果をＥＬＩＳＡによって確認した。

ファージライブラリから得られた特異的なエフリンＢ２抗体由来の短鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の選択
非免疫化個体に由来する１．５×１０^１０のｓｃＦｖのヒト抗体のライブラリを用いた、ファージの表面に対するタンパク質ディスプレイ手法（ファージディスプレイ）を使用した。ヒトＩｇＧのＦｃドメインと融合されたエフリン Ｂ２の細胞外ドメインを、ＥＬＩＳＡプレート（酵素結合免疫吸着検定法、Maxisorp, Nunc）に固定化された抗原として用いて、１回目のパニングを実施した。当該細胞外ドメインは、哺乳類細胞から発現され、精製され、１６時間にわたって４℃において、１μｇ／ウェル、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）においてＥＬＩＳＡプレートに固定化された。ウェルの３回のＰＢＳ洗浄後に、ＰＢＳにおける２％のミルクを用いたブロッキングステップを、２時間にわたって３７℃において実施し、それから、２時間にわたって３７℃においてライブラリをインキュベーションした。非特異的に結合したファージを、ＰＢＳ−０．１％のＴｗｅｅｎを用いて連続する洗浄によって除去し、１００μｌのトリプシンを用いて、抗原特異的なファージを溶出させた。細胞を、対数増殖期（６００ｎｍ（ＯＤ_６００）の波長における、０．４の吸光度）にあるEscherichia coli株 ＴＧ１（MRC Geneservices）とともに、３０分にわたって３７℃において溶出させたファージに感染させた。感染させた細菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１％のグルコースを補ったＴＹＥプレート（ＴＹＥ、トリプトン酵母抽出物）に播き、１６時間にわたって３７℃において培養した。次に、細菌を、１５％のグリセロールを補った２×ＴＹ培地（１６ｇ／ｌのトリプトン、１０ｇ／ｌの酵母抽出物および５ｇ／ｌのＮａＣｌ）を用いてプレートから回収し、希釈した５０μｌの細菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１％のグルコースを補った５０ｍｌの２×ＴＹ培地に回収し、培養物を、対数増殖期に達するまでインキュベートし、細胞を、２．５×１０^１１のヘルパーファージＫＭ１３（MRC Geneservices）に感染させた。３７℃における３０分のインキュベーションの後に、培養物を遠心分離し、ペレットを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、５０μｇ／ｌのカナマイシンおよび１％のグルコースを補った同容積の２×ＴＹ培地に再懸濁させ、３０℃において一晩培養した。

各選択から得られたファージを、培養培地から沈殿させた。このために、培養物を１５分にわたって３３００×ｇにおいて遠心分離し、１０ｍｌのポリエチレングリコール／ＮａＣｌを加え、４０ｍｌの上清を１時間にわたって氷上に放置した。それから、それらを３０分にわたって３３００×ｇにおいて遠心分離し、上清を捨てた。沈殿物を、２ｍｌのＰＢＳに再懸濁させ、１０分にわたって１１０００×ｇにおいて遠心分離した。上清を回収し、ファージを、抗体の親和性を向上させるために使用される抗原の量を低下させる特異点をともなう、上述と同様の次の選択に使用した。第２の選択において結合したファージを、増幅させ、エフリン Ｂ２に対する反応性のｓｃＦｖを有しているファージの濃縮物を得るために、第３の選択に供した。

ファージに対するＥＬＩＳＡ
各選択から生成された、エフリン Ｂ２の特異的なファージの濃縮の程度を評価するために、ファージに対するＥＬＩＳＡを実施した。３μｇのエフリン−Ｂ２−Ｆｃおよびネガティブコントロールとしての無関係なタンパク質を用いて、１６時間にわたって４℃、ＰＢＳにおいて、柔軟なＥＬＩＳＡプレート（Falcon, BD Biosciences）を被覆した。ＰＢＳを用いた数回の洗浄後に、２時間にわたって室温、２％のミルクのＰＢＳにおいて、プレートをブロッキングし、１時間にわたる室温、ＰＢＳ−２％のミルクにおける各選択から得られたファージの異なる希釈物とともにインキュベートした。ウェルを、ＰＢＳ−０．１％のＴｗｅｅｎ２０を用いてふたたび洗浄し、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したモノクローナル抗−Ｍ１３抗体（１：５０００希釈）（GE Healthcare）とともに、１時間にわたって室温においてインキュベートした。ＰＢＳ−０．１％のＴｗｅｅｎ２０を用いた４回の洗浄後に、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）（Sigma）を用いて現像した。１Ｍの硫酸を用いて比色反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍにおいて測定した。

選択した２つのｓｃＦｖ（Ｂ１１および２Ｂ１）を、種々の手法を用いて性質決定した。まず、固定化したエフリン Ｂ２の細胞外ドメインおよび精製したｓｃＦｖの異なる希釈物を用いた、Biacore Xに対する表面プラズモン共鳴手法によって、エフリン Ｂ２に対する抗体の親和性定数を決定した。Ｂ１１クローンは、最も高い親和性定数（１１０ｎＭ）を示し、クローン２Ｂ１の親和性は、６３０ｍＭとより低かった（図４）。それから、エフリン Ｂ２の結合について天然の受容体Ｅｐｈ Ｂ４と競合する抗体の能力を、同じ手法を用いて分析した。この目的のために、Ｅｐｈ Ｂ４−Ｆｃをチップに固定化し、エフリン Ｂ２に対する結合を、異なる濃度のＢ１１または２Ｂ１の存在下において測定した。Ｂ１１の存在は、エフリン Ｂ２に対するＥｐｈ Ｂ４の結合を、０．３μＭのＩＣ_５０を有して濃度依存的に抑制し、これは、Ｂ１１がＥｐｈ Ｂ４受容体の同じ結合部位と競合することを示している。しかし、２Ｂ１抗体は遮断作用を示さない（図５）。

モノクローナルのファージのＥＬＩＳＡ
個々のコロニーを、３回目の選択から選び、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１％のグルコースを補った、９６ウェルプレート（Sarstedt）に入っている１００μｌの２×ＴＹ培地において、撹拌しながら３７℃において一晩培養した。翌日に、培養物を、同じ培地において１００倍に希釈し、２時間にわたって３７℃において撹拌しながらインキュベートした。次に、１０^９のＫＭ１３ヘルパーファージを有している２５μｌの培地を加え、１時間にわたって３７℃においてインキュベートした。細菌を遠心分離し、細胞ペレットを、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補った２×ＴＹに再懸濁させ、３０℃において一晩培養した。最後に、培養物を遠心分離し、５０μｌの上清を、上述した同じ条件におけるＥＬＩＳＡのために使用した。

配列分析
複数のオリゴヌクレオチド（すなわち、ｐｅｌＢＦｏｒｗａｒｄプライマー（5'-CATAATGAAATACCTATTGCCTA-3'：配列番号２）およびｃｍｙｃＲｅｖｅｒｓｅプライマー（5'-CTTATTAGCGTTTGCCATT-3'：配列番号３））を用いたＰＣＲによって、ｓｃＦｖ由来のコード配列を増幅させた。複数の酵素（使用されなかったオリゴヌクレオチドを除去するための、３０分にわたる３７℃におけるＥｘｏＩ（USB）、および残ったｄＮＴＰを除去するための、１５分にわたる８０℃におけるＳＡＰ（USB））を用いて、ＰＣＲ産物を処理し、そのような産物を、両方のオリゴヌクレオチドとともに配列決定した。配列を得た後に、互いを比較して、ClustalWプログラムおよび翻訳ツールExPASy Proteomics Serverを用いて固有の配列のクローン数を決定した。

ｓｃＦｖのｐＥＴ２８ｂへのサブクローニング
精製を容易にするヒスチジンテイルを選択されたｓｃＦｖに付加するために、ベクターｐＥＴ２８ｂ（Novagen）にクローニングした。それぞれが、ＸｈｏＩおよびＲｃａＩの２つの制限酵素部位を含んでいるプライマー、ｐＥＴ２８−ｓｃＦｖＭｅｈｔａ ５’（5'CAGTCATCATGAAATACCTATTGCCTAC3'：配列番号４）およびｐＥＴ２８−ｓｃＦｖＭｅｈｔａ ３’（5'CACCGGACTCGAGTGCGGCCCCATTCAG3'：配列番号５）を用いたＰＣＲによって、ｓｃＦｖを増幅させ、続いて、ＸｈｏＩおよびＲｃａＩと部位適合性のＮｃｏＩを用いてあらかじめ消化されているｐＥＴ２８ｂベクターにクローニングした。挿入物：ベクターのモル比を３：１に設定し、Ｔ４リガーゼ酵素（Roche）を用いた１６℃における一晩のインキュベーションによって、消化された挿入物およびベクターのライゲーションを実施した。E. coli株ＤＨ５ａライブラリコンピテント細胞を、ヒートショックによって形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを有しているLB-Agar（ＬＢ、“溶原性ブロス”）のプレート上において選択した。各コンストラクトのポジティブコロニーを、カナマイシンを補ったＬＢに植菌し、３７℃において一晩培養した。Wizardキット（Promega）を用いて組換えベクターを精製し、ＤＮＡ配列決定することによって配列を確認した。

ｓｃＦｖの発現および精製
E. coli株ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を、ヒートショックによって組換えプラスミドを用いて形質転換した。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを有しているＬＢプレート上において、形質転換体の細菌を選択した。培養物のＯＤ_６００が０．６になったときの、１ｍＭの最終濃度のＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を用いた誘導によって、ｓｃＦｖ発現を実施した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ドデシル硫酸ナトリウム）によってｓｃＦｖの発現レベルを分析し、クーマーシーブリリアントブルーを用いて染色した。機能的なｓｃＦｖは細胞周辺質領域に集中しているので、穏やかな浸透圧ショックによって細菌の外壁を溶解させ、２０μｇ／ｍｌのベンズアミジン（Sigma）および１０μｇ／ｍｌのダイズトリプシン阻害剤（Sigma）を補った１／５０倍体積のＴＥＳ緩衝液に、細胞を、再懸濁させ、続いて０．２×ＴＥＳ緩衝液において１．５倍に希釈した。溶菌液を、３０分にわたって氷上に放置し、１６２５０×ｇにおいて１０分にわたって遠心分離し、周辺質画分を含んでいる上清を回収した。

Ni²⁺ HisTrap（GE Healthcare）のカラムを用いた、固定化金属に対するアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって、ｓｃＦｖの精製を実施し、続いて、コンピュータAKTAxpressに対してタンデムに連結したゲル濾過HiPrep 26/10 Desalting （GE Healthcare）のカラム上において脱塩した。アフィニティーカラムの平衡緩衝液として、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾールを用い、０．３Ｍのイミダゾールの濃度を有している平行緩衝液と同じ緩衝液を、溶出緩衝液として用いた。ゲル濾過によってこの緩衝液をＰＢＳに交換した。

免疫ブロット（ウエスタンブロット）
マウスの組換えタンパク質エフリン Ｂ２−Ｆｃ、マウスのエフリン Ｂ２−Ｆｃおよびヒトのエフリン Ｂ３−Ｆｃ（R & D）を、１０％ゲルのＳＤＳポリアクリルアミドにおける電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜（GE Healthcare）に転写させた。３％のスキムミルク粉末のＰＢＳを用いて１時間にわたって膜をブロッキングした後に、３％の粉ミルクのＰＢＳにおいて１．５倍希釈した周辺質画分とともに、１６時間にわたって４℃においてインキュベートした。使用した２次抗体は、２時間にわたる室温における１：１０００倍希釈のｃ−Ｍｙｃ（Sigma）、および１時間にわたる室温における１：５０００倍希釈の抗マウスのペルオキシダーゼ結合物（Sigma）であった。ECL試薬（ECL、“Enhanced Chemiluminescence”）をともなったインキュベーションによって可視化した。

ｓｃＦｖの速度定数の分析
ｓｃＦｖの親和性定数を試験するために、BIAcore X装置（BIAcore）を用いた表面プラズモン共鳴の手法を用いた。１０μｌ／分の流量において７分にわたって、１：１の比における０．４ＭのＥＤＣ（１−エチル−３−（−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）および０．１ＭのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸塩）を用いたチップのデキストランマトリクスのカルボキシル基の活性化によって、エフリン Ｂ２−ＦｃをCM5チップ（GE Healthcare）の表面に共有結合させた。ｐＨ４の１０ｍＭの酢酸ナトリウムにおいてエフリン Ｂ２−Ｆｃタンパク質を１０μｇ／ｍｌまで希釈し、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０）（GE Healthcare）において、この溶液の３０μｌを、１０μｌ／分の流量においてチップ表面上を通過させた。過剰に活性化したエステル基を、７分にわたる１０μｌ／分の流量における１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）の注入によってブロックした。このプロトコルを用いて、約２０００応答ユニット（ＲＵ）のエフリン Ｂ２を固定化した。

ｓｃＦｖの親和性定数を決定するために、増加する順序において異なる濃度の抗体を、３０μｌ／分の流量において継続的に注入した。センサグラムを得た後に、ラングミュアの１：１モデルによる評価プログラムBIAsoftwareを用いて、親和性定数を算出した。

Ｅｐｈ Ｂ４との結合についての、競合の分析
表面プラズモン共鳴競合性結合アッセイによって、Ｅｐｈ Ｂ４受容体に対するエフリン Ｂ２の結合を阻害するｓｃＦｖの能力を分析した。上述した同じプロトコルを用いて、可溶性のＥｐｈ Ｂ４（R&D）をCM5チップ（GE Healthcare）に結合させた。各ｓｃＦｖの希釈系列を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液における定濃度（０．２μＭ）のエフリン Ｂ２と混合し、３０μｌの各混合物をＥｐｈ Ｂ４の被覆チップに対して２０μｌ／分の流量において注入した。Ｅｐｈ Ｂ４に結合したエフリン Ｂ２の相対量は、抗体の対応する濃度に応じて表されている。

ｓｃＦｖ Ｂ１１ 抗エフリン Ｂ２を用いたＥｐｈ Ｂ４シグナル伝達の阻害
エフリン Ｂ２に誘導されるリン酸化を介したＥｐｈ Ｂ４の活性化を遮断する抗エフリン Ｂ２ ｓｃＦｖの能力を試験するために、細胞アッセイを実施した。当該細胞アッセイでは、エフリン Ｂ２を一過性に発現しているＨＥＫ２９３細胞が、高レベルのＥｐｈ Ｂ４および低レベルのエフリン Ｂ２を発現することによって特徴づけられているＨＵＶＥＣ細胞を刺激するために使用された。結果を図５に示す。２０分にわたる２つの細胞のインキュベーションの後に、ＨＥＫ２９３細胞の表面に発現されているエフリン Ｂ２は、ＨＵＶＥＣ細胞におけるＥｐｈ ｂ４の効率的なリン酸化を誘導する。しかし、この過程におけるｓｃＦｖ Ｂ１１の存在は、Ｅｐｈ Ｂ４のリン酸化のほぼ完全な阻害をもたらし、ｓｃＦｖ Ｂ１１を用いた処理は、細胞間の直接的な接触と関連して、エフリン Ｂ２およびその受容体Ｅｐｈ Ｂ４の間における相互作用を遮断するということを示している。この作用は、ｓｃＦｖ ２Ｂ１を用いた処理を実施したときには、認められなかった。ｓｃＦｖ ２Ｂ１の場合、Ｅｐｈ Ｂ４のリン酸化レベルは、抗体の非存在下に認められるリン酸化レベルと同等であった。

Ｅｐｈ Ｂ４のリン酸化細胞アッセイ
５％のウシ胎児血清を補ったＲＰＭ１（Sigma）において培養したＨＥＫ２９３細胞を、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２を用いてトランスフェクトした。４．５×１０^６のＨＥＫ２９３細胞を、プラスチックボトルT-75（Nunc）に播種した。翌日に、１ｍｌのOPTIMEM培地（Invitrogen）における２０μｇのｐｃＤＮＡ３−ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２および６０μｌのFUGENEトランスフェクション試薬（Roche）を有している混合物を調製し、室温において３０分にわたってインキュベートした。無血清のOPTIMEM培地（Invitrogen）を用いて数回にわたって単層の細胞を洗浄し、ＤＮＡ−FUGENEの混合物を加えた。３７℃および５％のＣＯ_２における５時間にわたるインキュベーションの後に、培地を取り除き、５％のウシ胎児血清を含んでいるＲＰＭ１を加えた。４８時間目に、５ｍＭのＥＤＴＡ−ＰＢＳを用いてトランスフェクションした細胞を惹起させ、５×１０^６細胞をＨＵＶＥＣ細胞とともに、P100プレート（Falcon）に加えた。当該ＨＵＶＥＣ細胞は、１０％のウシ胎児血清を補ったEGM Bullet Kit培地（Lonza）において、２０μｇ／ｍｌのｓｃＦｖ 抗エフリン Ｂ２の存在下または非存在下でコンフルエントまで培養されていた。３７℃および５％のＣＯ_２における２０分にわたるインキュベーションの後に、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）およびホスファターゼ（Sigma）を補った溶解緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００）を用いて、細胞を溶解させた。１６０００×ｇおよび４℃において２５分にわたって溶解物を遠心分離し、それから、Ｅｐｈ Ｂ４に特異的な抗体（R&D）およびセファロースに結合されたＧタンパク質（GE Healthcare）を用いて、１６時間以上にわたって４℃においてあらかじめ形成された複合体とともに、上清を２時間にわたって４℃においてインキュベートした。最後に、溶解緩衝液を用いて２回にわたって免疫複合体を、洗浄し、７．５％のポリアクリルアミドゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて電気泳動した。

リン酸化されたＥｐｈ Ｂ４を免疫ブロットによって検出した。これを実施するために、抗Ｅｐｈ−Ｂ４によって免疫沈降され、電気泳動によって分離されたタンパク質を、ニトロセルロース膜Hybond-C（GE Healthcare）に転写し、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（Sigma）および３％のPhosphoblocker（登録商標）ブロッキング試薬（Cell Biolabs, Inc.）を補ったＰＢＳを用いて、１時間にわたって室温においてブロッキングした。それから、ペルオキシダーゼと結合されているモノクローナル抗体４Ｇ１０ 抗ホスホチロシン（Millipore）の１：２０００希釈物とともに、１６時間にわたって４℃において膜をインキュベートした。SuperSignal（登録商標） West Femto Substrate（Thermo Scientific）による化学発光検出を用いて可視化した。総Ｅｐｈ Ｂ４の検出のために、同じ膜を、Strong Plus ReBlot試薬（Chemicon）を用いて１５分にわたって室温において再生し、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０および５％のスキムミルクを有しているＰＢＳにおいて１：１０００に希釈した抗Ｅｐｈ Ｂ４抗体とともに、１６時間にわたって４℃においてインキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を有しているＰＢＳを用いた数回の洗浄後に、ペルオキシダーゼ結合抗ヤギ抗体（１：５００）（Dako）とともに、２時間にわたって室温において、膜をインキュベートし、ECL Plus試薬（GE Healthcare）を用いてバンドを可視化した。

（実施例２：ＨＵＶＥＣ細胞におけるＢ１１および２Ｂ１抗体の、インビボにおける抗血管新生活性）
血管新生能および内皮細胞の遊走に対するＢ１１および２Ｂ１抗体の作用を分析した。このために、ＨＵＶＥＣ細胞（臍静脈内皮細胞）を用いた、Matrigelにおける管形成およびインビトロの傷治癒アッセイの実験をそれぞれ行った。

Matrigelにおける管形成の実験において、１００μｇ／ｍｌのＢ１１抗体の存在下におけるＨＵＶＥＣ細胞は、抗体なしのコントロールまたは無関係なｓｃＦｖを用いたコントロールより２倍少ない管を構成する（図６）ことに加えて、処理の６時間において細管の数が減少しており、単層の細胞としてより多く堆積していることが分かった。これは、上記抗体の存在が管の形成を抑制していることを証明している。Ｂ１１と比べて低い阻害能（コントロールに対して４０％）を有していたが、同様の結果がクローン２Ｂ１を用いて得られた。

ＨＵＶＥＣ細胞の側方への遊走に対する作用を決定するために、遊走を刺激する因子としての血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の存在下において、単層の治癒における実験を実施した。傷をつけた２４時間後に、過程においてＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ＋無関係なｓｃＦｖが存在する場合に、６０％の単層細胞は空いた空間に遊走した。一方で、ＶＥＧＦおよびＢ１１もしくは２Ｂ１を用いて処理された傷には、それぞれ２５％または３０％の細胞が定着し、これらのデータは、遊走刺激なしのネガティブコントロールにおいて遊走した細胞の数（２０％）に匹敵した。

したがって、両方の実験から、エフリン Ｂ２に特異的なＢ１１および２Ｂ１抗体（特に前者）は、血管新生能を示し、インビトロにおける内皮細胞の遊走を阻害可能と結論づけられる。

マトリゲルにおける柱状構造の形成アッセイ
Matrigel（(BD Biosciences）を用いて２４ウェルプレートを被覆し、ゲル化のために２０分にわたって３７℃においてインキュベートした。それから、１０％のウシ胎児血清を補った１ｍｌの完全培地EGM-2 bullet Kit（Lonza）における５×１０^４のＨＵＶＥＣ細胞を播き、１００μｇ／ｍｌまでの異なる抗体の存在下において、６時間にわたって３７℃においてインキュベートした。カメラを備えている顕微鏡Axiovert 100（Zeiss）において得られたデジタル画像を解析することによって、６時間目に柱状構造の形成の程度を調べた。

インビトロの傷治癒試験
インビトロの傷治癒を利用して、細胞遊走アッセイを実施した。０．５％のウシ胎児血清を補ったEGM-2（Lonza）を用いた１時間のインキュベーション後に、２４ウェルプレートにおいてコンフルエントまでＨＵＶＥＣ細胞を増殖させ、ピペットのチップを用いて線状のひっかきを作り、その領域の画像を撮影した。遊走刺激剤としての１００μｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）および１００μｇ／ｍｌの対応する抗体の存在下または非存在下（コントロール条件）において、細胞をインキュベートした。上記領域の画像を撮影してから２４時間後に、ひっかきを実施した時点から、傷に向かって側方に遊走した細胞をカウントし、遊走した領域のパーセンテージを決定した。

（実施例３：マトリゲル移植片の血管新生に対するＢ１１および２Ｂ１抗体の作用）
２Ｂ１およびＢ１１がインビボの血管新生を直接的に阻害可能であることを証明するために、１群につき６匹の動物を用いて、胸腺欠損のｎｕ／ｎｕヌードマウスにおける、ＶＥＧＦ（Peprotech）を補ったMatrigel移植片の実験を実施した。取り出した移植片に存在するヘモグロビンの定量、およびＣＤ３４の免疫組織染色、これに続くこの血管マーカーのついての陽性領域の算出によって、柱状のネットワーク形成の評価を、対応するMatrigel移植の６日後に実施した。それぞれの抗体を用いた処理を、Matrigelの移植の直後に開始し、３００μｇ／マウスの最終投与量まで隔日に行った。ＶＥＧＦなしの移植片を、ネガティブコントロールとして使用し、当該移植片は、血管新生をまったく生じなかった（図８Ａ）。一方で、ＶＥＧＦ移植片、ならびにＶＥＧＦおよび無関係なｓｃＦｖを用いて処理した移植片は、顕著な血管新生を示し、実験のポジティブコントロールとみなされた。抗体Ｂ１１を用いて処理した動物は、成長因子なしのMatrigelを用いて移植した血管新生と匹敵する、ポジティブコントロールより９５％低い最小の血管新生を示し、ＣＤ３４についてポジティブな内皮細胞および移植片におけるヘモグロビンの欠如に反映されている（図８Ｂ）。２Ｂ１抗体を用いて処理したマウスの群は、ポジティブコントロールに対して、血管新生の５０％の阻害を示した。

インビボの管形成アッセイ
４〜６週齢の胸腺欠損のｎｕ／ｎｕマウス（Charles River）を使用した。コントロール群について、２％のイソフルレンを用いて麻酔したマウスに２００μｌのMatrigel（BD Biosciences）を注入した。他の群の動物の上腹部領域に、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦおよび３７５μｇ／ｍｌのヘパリン（Sigma）を補った２００μｌのMatrigelを注入した。血管内へのｓｃＦｖを用いた処理を、Matrigel移植の直後に開始し、３００μｌ／マウスの総投与量まで隔日に行った。６日後に移植片を取り出し、新たな血管の形成を、血管のマーカーである抗ＣＤ３４を用いて染色した組織切片に存在するヘモグロビンの濃度にしたがって決定した。ヘモグロビンを測定するために、Matrigel移植片の各部分を取り、各部分の重量を計り、各部分を３００μｌの蒸留水においてホモジナイズした。１６０００×ｇにおける５分にわたる遠心分離の後に、１００μｌの上清を取り、ＴＭＢ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）（Sigma）を用いて１：１に希釈した。１５分後に、６５０ｎｍにおける吸光度を測定することによって呈色反応を評価した。最後に、値を移植片の重量に対して標準化した。

免疫組織学分析のために、移植片の一部を、１０％の緩衝化したホルマリンにおいて固定し、パラフィンに包埋し、ミクロトームを用いて２．５μｍの厚さに薄片化した。Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｐＨ９．０）を用いて抗原性不活化処理を実施し、内皮細胞を、１：７５に希釈したラットのモノクローナル抗ＣＤ３４（Abcam）を用いて標識し、続いて、ペルオキシダーゼを用いて標識した抗ラットの２次抗体（Biocare Medical）を用いた。３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド プラス（DAKO）を用いて可視化し、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。ポジティブな細胞をAxioVision system（Zeiss）によってカウントした。

（実施例４：Ｂ１１および２Ｂ１抗体は、胸腺欠損マウスにおけるヒト腫瘍の発達を抑制する）
インビボおよびインビトロにおける血管新生に影響を与えるＢ１１および２Ｂ１抗体の証明された能力を考慮して、それらが腫瘍の発達のような、血管新生に強く依存する過程を阻害可能であるか否かを調べた。このために、膵臓がん細胞（ＢｘＰＣ３）、結腸（ＳＷ６２０）、および肺（Ｈ４６０）を用いた３つの異種移植片マウスモデルを使用した。結腸細胞および肺細胞は、発せられる蛍光を分析することによって腫瘍の進行を追跡するための蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙを恒常的に発現している。Ｂ１１および２Ｂ１の両方の抗体は、採用された３つの細胞株におけるインビトロの細胞生存能力に対して影響を生じないことを、あらかじめ確認された。

８匹のマウスの２群に対して、ＢｘＰＣ３細胞を皮下に移植し、腫瘍塊が肉眼によっていったん検出されると、Ｂ１１および２Ｂ１を用いた２０ｍｇ／ｋｇの総投与量まで隔日の皮下に対する処理、またはネガティブコントロールとしてのＰＢＳを用いた処理を開始した。腫瘍細胞の移植の６０日後に、Ｂ１１抗体を用いて処理したマウスの群が腫瘍サイズの有意な低下（コントロール群の平均の腫瘍サイズと比べて７０％の成長阻害）を示したことが、認められた（図９）。２Ｂ１処理マウスは、腫瘍成長の中程度の低下（約３５％）を示した。

腫瘍成長におけるこの阻害を担っている機序を調べるために、抗体を用いた処理の終了から１日においていくつかの腫瘍を取り出し、活性なカスパーゼ３、Ｋｉ６７、ＣＤ３４およびＬｙｖｅ１のそれぞれに対する抗体を用いて、アポトーシスの状態、増殖性、血管新生性およびリンパ管新生性を評価するために、免疫組織学的分析を実施した。Ｂ１１を用いて処理した腫瘍においてアポトーシスを起こした細胞の数は、コントロールと比べて５倍に増加していた。一方で、２Ｂ１を用いて処理した腫瘍およびコントロールの間におけるアポトーシスを起こした細胞の数における差は、有意ではなかった。

増殖マーカーＫｉ６７について、増殖性は、処理動物およびコントロール動物の間において差異がなく、３つのすべての群において約３０％のＫｉ６７ポジティブ細胞を示した。

腫瘍におけるＣＤ３４についてポジティブな領域を測定することによって血管の存在について分析したとき、Ｂ１１を用いて処理した腫瘍において、コントロールに対して８０％の低下、および２Ｂ１を用いて処理した腫瘍において、コントロールに対して５５％の低下が認められた。

最後に、Ｌｙｖｅマーカーによるリンパ管の存在を分析した。Ｂ１１を用いて処理した腫瘍において、リンパ管をほぼ完全に欠いていると観察された。また、２Ｂ１を用いて処理した腫瘍において、リンパ管の数の有意な減少が観察されたが、Ｂ１１の場合ほど顕著ではなかった。

それから、他の異種移植モデルにおけるＢ１１抗の抗血管新生能、抗リンパ管新生能、および腫瘍成長の阻害能を、上述した同じ手順にしたがって調べた。細胞株ＳＷ６２０結腸がんの場合、移植後の２３日に腫瘍サイズの９０％の低下が観察され（図１１Ａ）、肺細胞の場合、６５％の低下が観察された（図１１Ｂ）。それぞれのサイズにおけるこの低下は、腫瘍細胞に存在する蛍光発光ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の類似の減少を伴って確認された。膵臓がん細胞のモデルにおいて観察されている通り、免疫組織化学的分析によって、Ｂ１１を用いて処理した腫瘍における血管の数の減少およびリンパ管の非存在が確認された。

したがって、エフリン Ｂ２に特異的なＢ１１抗体は、強い抗血管新生能および抗リンパ管新生能を有しており、当該抗体を用いて処理した腫瘍の成長の低下または遅延を生じると結論付けられ得る。また、２Ｂ１抗体は良好な抗血管新生能および抗リンパ管新生能を有している。

異種移植片
３種類の異種移植片がある：膵臓がん細胞（ＢｘＰＣ３）、結腸（蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙを安定して発現しているＳＷ６２０（Clontech））、および肺（蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙを安定して発現しているＨ４６０）。３つの場合のすべてにおいて、同じプロトコルに基本的にしたがった。０．２ｍｌのＰＢＳの体積において百万〜５百万の腫瘍細胞を、免疫不全マウス（ヌードまたはＳＣＩＤ、“重症複合免疫不全”）の横腹の皮下に、肉眼によって腫瘍塊を確認できるまで（約３０ｍｍ^３）注入した。このときに、２週間にわたってか、または２０ｍｇ／ｋｇの最終投与量に達するまで隔日における、１００〜２００μｌのＰＢＳにおける対応する抗体の尾静脈を介した血管内投与による処理を開始した。コントロール動物は同じガイドラインにしたがってＰＢＳを受けた。１週間に２〜３回にわたってキャリパーを用いて腫瘍のサイズを測定し、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質によって標識された細胞を用いて移植されたマウスの場合、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の発光強度に応じた腫瘍成長を示すために、IVIS imaging System Spectrum 200（Caliper Life Sciences）において６１０ｎｍに対する蛍光発光強度も測定した（１秒および１平方センチメートル当たりの光子の数）。画像の最終的な処理は、残余のシグナルの減算（自己蛍光の排除）およびシグナル強度のプロファイルにしたがったカラースケールを包含している。腫瘍が１５００〜２０００ｍｍ^３の所定のサイズに達したとき、実験動物の使用に関する現行の法律にしたがってＣＯ_２を用いた窒息によって動物を屠殺した。ステューデントｔ検定を用いたパラメータ解析によって腫瘍成長を評価する統計解析を実施した。統計的な有意さの程度をＰ≦０．０５に設定した。

組織学的分析
異種移植したマウスから得られた腫瘍サンプルを、抗体を用いた処理の終了後の１日に屠殺した動物から摘出した。サンプルを、ホルマリンを用いて固定し、パラフィンに包埋した。各腫瘍から得られた組織学的切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色したか、または免疫組織化学的な性質決定のために調製した。ウサギ抗Ｋｉ６７（DAKO）のモノクローナル抗体を用いた染色によって、腫瘍細胞の増殖活性を分析し、ウサギのポリクローナル抗活性カスパーゼ３（R&D）を用いて、アポトーシスを起こした細胞を検出し、特異的なラットのモノクローナル抗体（Abcam）を用いた内皮細胞におけるＣＤ３４を染色することによって、新たな血管新生を測定し、ウサギのポリクローナル抗ＬＹＶＥ１（Abcam）を用いて染色することによって、リンパ管を標識した。３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライドｐｌｕｓ（DAKO）を用いて、すべての切片を可視化し、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。AxioVisionシステム（Zeiss）によって、ポジティブな細胞をカウントした。

（実施例５：インビボにおける腫瘍塊の生体分布および部位）
動物における抗体の分布を解析し、腫瘍進行の領域における局在を確認するために、腫瘍細胞（ここではＨ４６０肺がん細胞）を用いて異種移植したマウスを、近赤外発光する蛍光色素を標識した抗体AlexaFluor（登録商標）750（Molecular Probes）を用いて処理する実験を設計した。腫瘍塊の位置を確かめるために、蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙを発現している細胞を使用した。胸腺欠損のｎｕ／ｎｕマウスの背側領域の皮下にＨ４６０細胞を移植した。腫瘍が約０．３ｃｍ^３の体積に達したとき、AlexaFluor（登録商標）750と結合した抗体の１５μｌを血管内に投与した。投与の０．５、２、６、２４および４８時間後に、腹側領域および背側領域から画像を撮影した。マウスの腹側画像の調査は、投与の半時間後（図１２Ａ）から、６時間（図１２Ｂ）にピークを有している腫瘍塊における抗体の位置の確認に役立った。６時間に抗体Ｂ１１によって発せられている腫瘍における蛍光の強度は、抗体２Ｂ１によって示される強度より明らかに優れており、Ｂ１１が、２Ｂ１より効率的に、腫瘍に位置することを示していた。３０分後において、膀胱および腎臓におけるシグナルは非常に強く、抗体の腎への急速かつ能動的な排出を示していた。４８時間において、シグナルは、これらの領域において自己蛍光と近い値を有して非常に弱く、ほぼすべての抗体が完全に排出されていることを示していた。さらに、動物は、上腹部領域において最初の数時間の間に、肝胆道経路による抗体の一定の除去に起因する蛍光シグナルを示し、この事実は、臓器を分けて分析したときに証明され、６時間において肝臓は約１×１０^８ｐ／ｓ／ｃｍ^２／ｓｒ（光子／秒／平方センチメートル／エステルジアン（esterdian））の蛍光を示すことが分かった。

生体分布
ｓｃＦｖ分布の実験のために、蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙを安定して発現している肺がん細胞株Ｈ４６０を用いて異種移植されたヌードマウスを使用した。腫瘍における位置を確実に決定するために、蛍光マーカーを有している細胞を使用した。５×１０^６細胞を皮下に注入し、腫瘍塊が約５００ｍｍ^３のサイズに達するまで放置した。同様に、製造者の指示にしたがって、SAIVI（商標） Rapid Antibody Labeling Kit（Invitrogen）によって蛍光色素AlexaFluor（登録商標） 750にｓｃＦｖを結合させた。腫瘍が期待されるサイズに達すると、１５μｇの標識した抗体を各マウスに注入した。インビボ画像化システムIVIS Spectrum 200（Caliper Life Sciences）を用いて、標識したｓｃＦｖの投与後の０．５、２、６、２４および４８時間に、７４９ｎｍに対して蛍光色素を励起しながらインビボ蛍光画像を撮影した。自己蛍光を除いた後に、シグナル強度のプロファイルにしたがったカラースケールを示す処理を行った。

選択されたクローンの、E. coliにおける発現を示す図である。 クローン ２Ｂ１およびＢ１１が大量に精製されていることを示す図である。 クローンＢ１１および２Ｂ１がより特異的であることを示す図である。 Biacore（商標）によるｓｃＦｖ抗エフリン Ｂ２の親和性分析の結果を示す図である。 Ｅｐｈ Ｂ４に対するエフリン Ｂ２の結合を遮断する試験の結果を示す図である。 マトリゲルにおける内皮細胞ＨＵＶＥＣによるインビトロの管状構造形成に対するＢ１１および２Ｂ１の阻害作用を示す図である。 インビトロの傷治癒アッセイによる細胞の側方遊走の分析結果を示す図である。 インビボにおける管状構造形成の阻害作用の分析結果を示す図である。 膵臓がん細胞（ＢｘＰＣ３）を用いて異種移植片され、Ｂ１１または２Ｂ１を用いて処理したマウスにおける腫瘍成長の阻害を示す図である。 膵臓がん細胞（ＢｘＰＣ３）を異種移植し、Ｂ１１または２Ｂ１を用いて処理した腫瘍の組織病理学的な分析結果を示す図である。 Ｂ１１が、大腸がん細胞（ＳＷ６２０）（Ａ）および肺がん細胞（Ｈ４６０）（Ｂ）を用いて異種移植したマウスにおける腫瘍成長を阻害可能であることを示す図である。 Ｂ１１および２Ｂ１の体内分布分析、ならびに腫瘍塊の位置を示す図である。

発明者らによって証明されている通り、本明細書に記載のＢ１１抗体は、Ｅｐｈ Ｂ４受容体との結合を阻害するようにエフリン Ｂ２を特異的に認識する。当該結合の阻害は、インビトロアッセイにおいて、細管形成および内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の遊走能を阻害し、膵臓がん、大腸がんおよび肺がんの細胞を用いたインビボアッセイにおいて、腫瘍における血管およびリンパ管の数を著しく減少させる。本発明者らは、本発明の抗体が腫瘍の増殖を著しく遅らせ、腫瘍のサイズを著しく低下させ得ることを、さらに見出した。本発明者らは、エフリン Ｂ２の、Ｅｐｈ Ｂ４との相互作用をＢ１１抗体が遮断したことを示しており、当該抗体がその受容体を介したエフリンシグナル伝達をどのように阻害可能であるかをも示している（本明細書における図５を参照）。

ベクターは、細胞に遺伝物質を運ぶために使用される核酸分子である。また、ベクターは、上述した遺伝物質の他に、種々の機能要素（転写を制御する要素（例えば、プロモータもしくはオペレータ、エンハンサまたは転写因子の結合のための領域、ならびに翻訳を開始させる制御エレメントおよび翻訳を終結させる制御エレメント）が挙げられる）を含み得る。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組換え発現カセットおよびトランスポゾンが挙げられるが、これらに限定されない。あるベクターは、いったんそれらが宿主細胞に導入されると、自発的に複製または分裂可能である（例えば、細菌の複製開始点を有している細菌ベクターまたはエピソームの哺乳類ベクター）。他のベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、細胞性のゲノムとともに複製され得る。発現ベクターは、作動可能に連結されている遺伝子の発現を導き得るベクターの１つである。発現ベクターは、所望の遺伝子の転写および翻訳に使用され、通常、プロモータに制御されている。プロモータは、所望の遺伝子の転写を制御するヌクレオチドの配列である。プロモータは、所望の遺伝子と作動可能に連結されている。“作動可能に連結されている”は、所望の遺伝子に関する、プロモータ配列の機能的な関連性および位置を指し、例えば、プロモータまたはエンハンサは、コード配列の転写に影響する場合に当該コード配列と作動可能に連結されている。一般的に、作動可能に連結されているプロモータは、所望の配列の直前にある。しかし、エンハンサは、その発現を制御するための所望の配列と近接している必要はない。

Claims (41)

1. （ａ）配列番号１と少なくとも７６％の配列同一性のアミノ酸配列を含んでおり、
   （ｂ）エフリン Ｂ２を特異的に認識し、エフリン Ｂ２と特異的に結合することを特徴とする単離されているポリペプチド。
2. 上記アミノ酸配列は配列番号１である、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 抗体である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
4. 上記抗体はヒト型である、請求項３に記載のポリペプチド。
5. ヒト型の上記抗体のアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＡである、請求項４に記載のポリペプチド。
6. シグナルペプチドをさらに含んでいることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
7. 上記シグナルペプチドは配列番号６である、請求項６に記載のポリペプチド。
8. 少なくとも１つのマーカーをさらに含んでいることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
9. 上記マーカーは、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ヒスチジン鎖、ＧＳＴ、ビオチン、ＶＳＶ−Ｇ、ＨＳＶｔｋ、Ｖ５、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、マルトース結合タンパク質および蛍光タンパク質を含んでいるリストから選択される、請求項８に記載のポリペプチド。
10. 上記マーカーは、ヒスチジンの鎖、ｃ−ｍｙｃ、または両方である、請求項９に記載のポリペプチド。
11. 上記ポリペプチドの上記アミノ酸配列は配列番号７である、請求項１０に記載のポリペプチド。
12. エフリン Ｂ２に対する抗体であって、当該抗体のアミノ酸配列は、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチドを含んでいる、抗体。
13. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１２に記載の抗体をコードしている、核酸。
14. 請求項１３に記載の核酸を含んでいる、ベクター。
15. 発現ベクターである、請求項１４に記載のベクター。
16. 請求項１４または１５に記載のベクターを含んでいる、細胞。
17. 原核生物である、請求項１６に記載の細胞。
18. 真核生物である、請求項１６に記載の細胞。
19. 哺乳類細胞である、請求項１８に記載の細胞。
20. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１２に記載の抗体を得る方法であって、
    以下の工程：
    （ａ）細胞において請求項１５に記載のベクターを発現させること、および（ｂ）工程（ａ）において発現されたポリペプチドを精製することを包含している、方法。
21. 上記細胞は原核生物である、請求項２０に記載の方法。
22. 上記細胞は真核生物である、請求項２０に記載の方法。
23. エフリン Ｂ２の検出および/または定量化の方法であって、
    以下の工程：
    （ａ）単離された生物学的サンプルを、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１２に記載の抗体と接触させること、ならびに（ｂ）工程（ａ）において使用されたサンプルにおける、エフリン Ｂ２と上記ポリペプチドまたは抗体とによって形成された複合体を検出するか、および／または定量化することを包含している、方法。
24. エフリン Ｂ２の発現と関連付けられている疾患を診断する方法であって、
    以下の工程：
    （ａ）単離された生物学的サンプルを、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１２に記載の抗体と接触させること、（ｂ）工程（ａ）において使用されたサンプルにおける、エフリン Ｂ２と上記ポリペプチドまたは抗体とによって形成された複合体を検出するか、および／または定量化すること、（ｃ）検出されたエフリン Ｂ２レベルをコントロールのレベルと比較すること、ならびに（ｄ）この比較の結果を、疾患の存在または非存在と関連付けることを包含している、方法。
25. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１２に記載の抗体の、医薬の調製ための、使用。
26. 血管新生を阻害するための、請求項２５に記載の使用。
27. 血管新生と関連している病理学的状態の予防処置または治療処置のための、請求項２５または２６に記載の使用。
28. 腫瘍またはがんの予防処置または治療処置のための、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の使用。
29. 上記腫瘍またはがんは固形である、請求項２８に記載の使用。
30. 上記がんは、膵臓がん、大腸がんまたは肺がんである、請求項２９に記載の使用。
31. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１２に記載の抗体、請求項１３に記載の核酸、請求項１４もしくは１５に記載のベクター、または請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の細胞を含んでいる、組成物。
32. 薬学的組成物である、請求項３１に記載の組成物。
33. 薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでいることを特徴とする、請求項３２に記載の組成物。
34. 抗血管新生剤をさらに含んでいることを特徴とする、請求項３１または３２に記載の組成物。
35. 化学療法剤をさらに含んでいることを特徴とする、請求項３１または３２に記載の組成物。
36. 請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の組成物の、医薬の調製のための、使用。
37. 血管新生を阻害するための、請求項３６に記載の使用。
38. 血管新生と関連する病理学的状態の予防処置または治療処置のための、請求項３６または３７に記載の使用。
39. 腫瘍またはがんの予防処置または治療処置のための、請求項３８に記載の使用。
40. 上記腫瘍またはがんは固形である、請求項３９に記載の使用。
41. 上記がんは、膵臓がん、大腸がんまたは肺がんである、請求項４０に記載の使用。

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