CN103237812A - Ephrin B2抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的抗-ephrin-B2抗体并且涉及其用于检测这种蛋白的应用以及作为在治疗涉及所述过程的疾病，例如癌症，中用于抑制血管生成和淋巴管生成的药物。

Description

Ephrin B2抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医学和生物技术领域并且涉及能够阻止血管（血管发生）和淋巴管（淋巴管生成）形成的一种新的ephrin B2特异性抗体。此外，本发明涉及提到的抗体的应用，例如，用于制备药物。 
背景技术
血管发生，或由已经存在的血管形成新血管在胚胎发育和出生后的生命期间在许多生理过程中（繁殖，结瘢和发炎）起到重要作用。尽管将内皮细胞转变成血管原性表型的分子机制还不完全知道，但是它是一种复杂过程，涉及内皮细胞的增殖、迁移和装配，随后募集其他血管周细胞（例如周细胞或肌肉细胞）以及细胞外基质的重塑（Risau,W.Nature1997,386:671-674）。在很多病症中血管不受控制的增长是一种潜在的紊乱，例如类风湿性关节炎或糖尿病性视网膜病变，并且特别是肿瘤过程。肿瘤生长依赖于通过形成新血管网来连续供应氧气和营养物，从而在缺乏足够的血管形成时，细胞经历坏死和/或凋亡过程，这抑制或减缓肿瘤体积的增加。 
除了血管以外，脊椎动物的循环系统包含淋巴管，它们在生物体发育和病理期间也起到关键作用。淋巴系统引流组织的间隙液并将其运输到血液系统中，还从消化系统中吸收脂类，淋巴系统是免疫系统的单独的免疫防御运输细胞的一部分，例如在炎症中，以及在各种病理状态诱导多种类型的淋巴水肿，炎性疾病，并且涉及癌症的侵入和转移（Tammela,T.and Alitalo,K.Cell2010,140:460-76）。由以前存在的淋巴管的淋巴管生成或形成淋巴管的研究依然落后了几十年，并且直到最近几年才描述了生物分子机制和特异性标记，最近使用它们来研究肿瘤传播和转移过程。 
在胚胎发育期间，血管源于由中胚层衍生的内皮前体（在称为血管发生的过程中），然而淋巴管的形成似乎起始于来自颈部区域和中肾周围的一组静脉内皮细胞。因为它们的共同胚胎来源，两种维管系统具有调节其 发育和成熟的相似的分子机制。已经鉴定了数种信号通路，其中酪氨酸激酶受体在形成心血管系统的这些机制中起到非常重要的作用，尤其是，通过其相应的受体（VEGFR）与通过血管生成素调节的Tie-1和Tie-2受体的活性结合的血管内皮生长因子（VEGF）信号通路（Thurston,G.,Cell Tissue Res2003;314:61-68）。此外，已经显示出另一组分子，ephrins（是“producing hepatoma erythropoietin receptor interactors”（“产生肝细胞瘤的促红细胞生成素受体相互作用因子”）的首字母简称）连同它们相应的受体（Eph）一起，还涉及血管系统（Adams,RH and Klein,R.Trends Cardiovasc Med2000,10:183-188）和淋巴系统（
Figure BDA00003147771500021
,T et al.Genes Dev2005,19:397-410）的重塑。该家族包含已知最大组的酪氨酸激酶（含有14个受体及8个配体），并且根据它们的序列同源性以及与相应配体的结合特性再细分成两种受体类型（Eph A和Eph B）。Eph A受体结合亚组ephrin A的配体（其特征在于通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）分子将其锚定在膜上），而Eph B受体结合亚组ephrin B的配体（其通过跨膜区域紧接着胞质区域将其锚定在膜上）。已有报道动脉表达跨膜配体ephrin B2而静脉表达Eph B4受体（Adams,RH and Alitalo K.Nat Rev Mol.Cell Biol2007,8:464-478）。 
该组分子通过改变细胞骨架的组织及影响整联蛋白和其他胞内粘附分子的活性来负责调控各种细胞功能，例如形态、迁移、排斥、细胞粘附和侵入。（Pasquale,EB.Cell2008,133:38-52）。这些活性依赖于细胞内表达的Eph受体与在其他细胞内表达的相应ephrin的相互作用，从而产生影响所涉及的每个细胞的双向信号。来自Eph受体的信号称为“正向”（“forward”）并依赖于位于其胞质区内的酪氨酸激酶结构域（它能够磷酸化自身并且能够磷酸化其他蛋白），并且依赖于受体与其他效应分子的结合。对于配体ephrin B的部分，它产生另一个信号（称为“反向”（“reverse”）），一方面其依赖于磷酸化其胞质区中的数个酪氨酸（通过Src家族激酶和其他酪氨酸激酶受体来进行），并且另一方面依赖于其他相关蛋白。此外，大多Eph受体和ephrins B在它们的胞质区中具有与PDZ结构域的结合位点，其对于进行生理功能是很重要的，尤其是ephrins B（,T et al.Genes Dev2005;19:397-410）。 
在转基因小鼠中对编码Eph B4和ephrin B2的基因失活的研究显示两种蛋白在管道系统的发育中起重要作用。这些基因的缺陷小鼠具有改变的 血管生成，在胚胎期这是致死的（Wang,HU et al.Cell1998,93:741-753;Adams,RH et al.Genes Dev1999,13:295-306），然而表达在信号活性位点中具有突变的ephrin B2的小鼠的研究，显示该蛋白通过调节VEGF信号通路来控制淋巴管和血管的生长（Wang,Y et al.Nature2010,465:483-6;Sawamiphak S et al.Nature2010,465:487-91）。 
在WO2007/127506和WO2010/019565中描述了ephrin B2抗体。在WO2007/127506中显示了描述的抗体阻断ephrin B2和Eph B4之间的信号传导并且在血管生成中具有抑制作用，能够减小动物模型中肿瘤体积。 
然而，始终存在对于能够控制血管生成的新型治疗剂的需要。 
发明内容
本发明提供能够控制血管生成的新型治疗剂并且涉及抗ephrin B2的新型抗体，具有与迄今为止所描述的抗体不同的序列并且具有高特异性，能够抑制新血管和淋巴管的形成以及显著地阻止肿瘤的生长。WO2007/127506中描述的ephrin B2抗体能够抑制血管生成但是它没有描述对淋巴管生成的抑制作用。 
本发明基于识别并且特异性地结合ephrin B2的抗体并且涉及基于它们的所述抗体、方法和组合物，它们组成了针对与ephrin B2相关的那些病症的重要的诊断和治疗工具。 
在第一个方面中，本发明涉及抗ephrin B2的新型抗体，该抗体具有抗血管生成和抗淋巴管生成的活性并且能够抑制实体肿瘤的生长。 
本发明提供控制疾病（包括血管生成失调，例如，癌症）问题的新解决方案。 
如本发明人所证明的，本文中描述的B11抗体特异性地识别ephrin B2从而抑制它结合至Eph B4受体，在体外测定中，其抑制小管形成和内皮细胞（HUVEC）的迁移能力并且，在体内测定中，使用胰脏癌细胞、肺癌细胞和结肠癌细胞，引起了肿瘤中血管和淋巴管数量的显著减少。此外，本发明人发现本发明的抗体能够显著地延迟肿瘤生长并且诱导其尺寸减小。本发明人已经显示在体外和培养的细胞中B11抗体阻断ephrin B2与 Eph B4的相互作用，还显示了抗体如何通过其受体能够抑制ephrin信号传导（参见本文中图5）。 
在体内测定中2B1抗体还能够抑制小管形成和内皮细胞（HUVEC）的迁移能力并且减少肿瘤中血管和淋巴管的数量。如本文中图5所示，在BiacoreTM测定中2B1抗体并不与Eph B4受体竞争并且在Eph B4阻断的细胞测定中也并不竞争。 
因此，本发明的第一个方面涉及分离的多肽，即： 
a.包含与SEQ ID NO:1具有至少76%序列一致性的氨基酸序列，以及 
b.特异性地识别并结合至ephrin B2。 
优选地，该多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80%，85%，90%，95%，99%一致性的氨基酸序列。更优选地，该多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。 
如本说明书中使用的，术语“分离的”是指一种多肽，该多肽是指已经从自然环境中鉴定和分离和/或提取的多肽。 
术语相对于多肽的“%序列一致性”是指所讨论的氨基酸序列与比较的氨基酸序列相一致的百分比，如果需要，在比对序列并且导入间隔后，用来获得序列一致性的最大百分比，而不必考虑保守性替换。比对能够以本领域技术人员已知的不同方法进行，例如使用公共工具例如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign（DNASTAR）。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括用于获得所比较的序列的最大比对的任何需要的算法。 
如本说明书中使用的术语“ephrin B2”，除非另外地明确地或在上下文中指出，是指ephrin B2蛋白的任何天然多肽或任何变体。该蛋白的名字是“erythropoietin producing hepatoma receptor interactors（产生肝细胞瘤的红细胞生成素受体相互作用因子）”的首字母缩写，但还可以称为ephrin。天然出现的多肽可以是天然截短形式或分泌形式，例如胞外域，或任何天然出现的变体例如各种可替换的“剪接”形式或任何等位变体。 
优选地，该多肽是抗体。更优选地，该抗体是人类的。优选地，该人类抗体同种型是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，或IgA。 
术语“抗体”或“免疫球蛋白”以其最广泛的含义使用并且包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性（只要它们显示出希望的生物学活性）并且可以包括抗体片段。抗体可以是人类的、人源化的和/或亲和性成熟的。“人类抗体”是指其氨基酸序列相应于人类生产的抗体序列的抗体。 
本发明的抗体可以是单链可变片段（scFv，英语是“single chain variable Fragment”）。术语“可变”是指以下事实，即抗体可变区的某些部分在其序列上是相当不同的，并且是负责每种抗体特异性结合其抗原的序列。然而，该可变性并不沿着抗体的整个可变区域均匀地分布。这种可变性集中在称为CDR（互补决定区，英语是“complementarity-determining regions”）的三个片段或高变区（存在于轻链和重链的可变区中）中。可变区的最保守部分称为框架（framework）。来自两个链（重链和轻链）的CDR促成了抗原结合位点的形成。可变片段或“Fv”是包含完全的抗原识别和结合位点的最小的抗体片段。单链可变片段可以具有通过肽共价连接的重链可变区和轻链可变区，上述肽允许重链和轻链结合以形成抗原结合位点的结构。Fv还可以由两个链形成。在任何情况下，即使仅具有三个CDR的单个可变区也足以识别和特异性结合抗原，虽然具有较低的亲和性。 
抗体或脊椎动物免疫球蛋白的轻链根据它们恒定区的氨基酸序列可以具有两种类型，称为κ和λ。根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白被分成不同的组或类型。存在五种主要的类型或组：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM。此外，它们中的一些被分成多个亚组或亚类型，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgGA2。另外，不同组和免疫球蛋白的重链的恒定区分别称为α（alpha），δ（delta），ε（epsilon），γ（gamma）和μ（mu）。 
抗体片段可以是保持了整个抗体功能的抗体的任何部分。抗体片段的例子是Fv，Fab（抗原结合片段），Fab2（具有两个抗原结合位点的片段）（都是本领域技术人员已知的）。单链可变片段（scFv）包括VH区（重链的可变区）和VL（轻链的可变区）抗体，这些区域都在单个多肽链中。本发明抗体的其他形式可以是包含scFv和CH3型恒定区的称为微型抗体 或“微抗体”的那些，或包含scFv以及CH2和CH3恒定区的所谓的scFv-Fc。这些形式提高了scFv分子量，避免了被肾脏快速清除并且在成像技术中可以特别地用于scFv的应用。 
术语“抗原”是指抗体能够选择性地结合到其上的预定的抗原。抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然的或合成的分子。优选地，抗原是多肽。 
本发明的发明人还研究了抗体2B1和B11与ephrinB2的亲和力，发现B11具有较高的抗原亲和力，亲和常数（KD）为110nM，而2B1具有较低的亲和力，其KD为630nM。在抗体和其抗原的识别位点和结合位点之间结合的亲和力涉及两者之间非共价相互作用的总和的强度总和。分子与其他分子的亲和力通常由亲和常数表示，也称为解离常数（KD）。可以通过通常已知的方法来测定亲和力，例如，但是并不限于本文描述的方法。 
当抗体针对其抗原具有较低亲和力时，抗体通常缓慢地结合到抗原上并且很容易解离。为了提高抗体针对其抗原的亲和力，可以使用文献中已经很好描述的技术用于“使亲和力成熟”（Marks et al.BioTechnology1992.10:779:783;Barbas,CF et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.199426;91:3809-13）。除了别的以外，这些技术可以是VH区和VL区的“重排”（“shuffling”），或随机诱变。本发明的一个优选实施方式中，多肽还包括信号肽。优选地，该信号肽是SEQ ID NO:6，称作pelB的胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora）的细菌果胶酸裂解酶的信号肽。该信号肽允许scFv位于胞质中，在胞质中由于氧化环境scFv正确地折叠。 
信号肽是3至60个氨基酸的短序列，其引导将多肽或蛋白运输至特定的亚细胞位置，例如内质网、线粒体或细胞核。在细胞（如大肠杆菌（Escherichia coli））的情况下，信号肽还可以引导蛋白运输到细胞外，这与将其分泌或将其细胞运输至胞质中是等价的。信号肽引导多肽分泌的一些例子是pelB，stli，ecotina，lamB，疱疹GD，1pp，碱性磷酸酶，转化酶，α因子和蛋白A的前导序列。 
在本发明的一个优选实施方式中，多肽还包括至少一个标记（marker）。优选地，该标记选自以下列表，包括：c-myc，FLAG,，HA，组氨酸链，GST，生物素，VSV-G，HSVtk，V5，生物素、亲和素，链霉 亲和素，麦芽糖结合蛋白和荧光蛋白。更优选地，标记是组氨酸链，c-myc或两者。优选地，组氨酸链包含4至12个组氨酸。更优选地，组氨酸链包含6个组氨酸。在本发明的一个优选实施方式中，该多肽包含标记c-myc和组氨酸链。在本发明的一个优选实施方式中，该多肽氨基酸序列是SEQ ID NO:7。 
如在本说明书中使用的术语“标记”是指标记肽或标记蛋白，当它们与感兴趣的蛋白一起产生为融合蛋白时，它们可以鉴别该蛋白。使用标记多肽或标记蛋白来鉴定和/或定位感兴趣的蛋白，因为这类标记相应于特异性分子或原子的结合位点（例如组氨酸链、GST、亲和素或链霉亲和素），或者因为这些标记可以很容易通过免疫化学技术检测（例如血球凝集素、VSV-G、HSVtk、FLAG、V5或myc），或因为它们很容易观察到（例如荧光蛋白）。 
标记肽VSV-G属于水泡性口膜炎病毒糖蛋白。HSVtk标记肽属于单纯疱疹病毒1的胸苷激酶。FLAG肽是针对重组蛋白专门设计为标记的8氨基酸表位（epitope）。V5是存在于副粘病毒猿猴病毒5（SV5）的P和V蛋白中小表位（epitope）。myc表位具有10个氨基酸并且是人类c-myc转录因子序列的一部分。 
本发明的另一个实施方式是其氨基酸序列包含本发明第一方面多肽的抗体。 
本发明的第二个方面涉及编码本发明第一个方面的多肽的核酸。优选地，核酸是载体。更优选地，该载体是表达载体。 
核酸或多核苷酸是任何长度的核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应结合到多聚体中的任何物质。 
术语“编码”是指决定如何将核苷酸序列翻译成多肽或蛋白的遗传密码。在序列中的核苷酸顺序决定了沿着多肽或蛋白的氨基酸的顺序。 
载体是用于将基因物质转移至细胞中的核酸分子。除了提及的遗传物质，载体还可以包含不同的功能元件包括控制转录的元件，例如启动子或操纵子，增强子或用于结合转录因子的区域，以及开始和结束翻译的控制 元件。所述载体包括但并不限于：质粒、粘粒、病毒、噬菌体、重组表达盒和转座子。一旦将其导入宿主细胞中，某些载体就能够自主地复制或分裂，例如具有细菌复制起始位点的细菌载体或游离型哺乳动物载体。其他载体可以整合入宿主细胞基因组中并且与细胞基因组一起复制。表达载体是能够指导所述表达载体可操作地连接到其上的基因表达的载体。表达载体用于转录和翻译感兴趣的基因（通常由启动子控制）。启动子是控制感兴趣的基因转录的核苷酸序列。启动子可操作地连接到感兴趣的基因上。“可操作地连接”是指功能性关系，以及启动子序列关于感兴趣基因的定位，例如，启动子或增强子可操作地连接至编码序列（如果它影响了序列的转录）。通常，可操作地连接的启动子与感兴趣的序列相邻。然而，增强子不需要与感兴趣序列相邻以控制其表达。 
如本说明书中使用的，术语“复制起点”是指其中形成复制叉以及其中开始DNA复制的核苷酸序列。 
本发明的第三个方面涉及包含本发明第二个方面的载体的细胞。该细胞可以是原核的，例如，但并非限制性地，该细胞可以是细菌例如用于生产本发明抗体的大肠杆菌。该细胞可以是真核的，例如，但并非限制性地，用于生产本发明抗体的酵母或昆虫细胞。真核细胞可以用于细胞治疗，或可以是通过基因治疗结合本发明第二个方面的载体的细胞。在本发明的一个优选实施方式中，该细胞是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞是其种类属于动物界、脊索动物门、脊椎动物亚门和哺乳动物纲的任何细胞。 
本发明的第四个方面涉及获得本发明第一个方面的多肽的方法，包括以下步骤： 
（a）在细胞中表达本发明第二个方面的载体以及（b）纯化步骤（a）中表达的多肽。 
在本发明第四个方面的一个优选实施方式中，该细胞是原核的。在本发明第四个方面的另一个优选实施方式中，该细胞是真核的。 
本发明的第五个方面涉及用于检测和/或定量ephrin B2的方法，包括以下步骤： 
（a）将分离的生物样品与本发明第一个方面的多肽接触，以及（b）检测和/或定量由ephrin B2与在步骤（a）使用的样品中的所述多肽形成的复合物。 
本发明的第五个方面的优选实施方式是诊断与ephrin B2的表达相关疾病的方法，包括以下步骤： 
（a）将分离的生物样品与本发明第一个方面的多肽接触，（b）检测和/或定量由ephrin B2与在步骤（a）使用的样品中所述多肽形成的复合物，（c）将检测到的ephrin B2水平与对照水平比较，以及（d）将所述比较结果与疾病的存在或不存在相关联。 
与ephrin B2的表达相关的疾病可以是，除了其他的以外，具有血管生成反常的任何疾病，例如肿瘤和非肿瘤疾病。显示血管生成失调的非肿瘤疾病包括但不限于：异常性营养过剩、关节炎、类风湿性关节炎、银屑病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病变、增殖性视网膜病变、新生血管性青光眼、老年性黄斑退化症、糖尿病黄斑水肿、角膜新生血管化、脑膜瘤、血管瘤、血管纤维瘤、甲状腺过度增生、慢性炎症、肺部炎症、败血症、脑水肿、滑液发炎、骨形成营养过剩、骨关节炎、多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、出血性关节、肥厚性瘢痕、硬皮病、沙眼、滑膜炎、皮炎、先兆子痫（WO2007/127506）。 
分离的生物样品是由身体（例如人体或动物体）分离的样品并且可以来自生物体的生理液体和/或任何细胞或组织。生物样品可以是组织，例如，但不限于，生检（活检，biopsy）或细针抽吸活检。在一个优选实施方式中，在步骤（a）中分离的生物样品是生物液体。生物液体可以包括由生物体排出或分泌的液体，以及并非正常的液体。生物液体可以包含，但不限于，胎儿周围的羊膜液、眼房水、间隙液、淋巴液、母乳、粘液（包括鼻涕和痰液）、唾液、脂肪（皮肤油）、乳清、汗液、泪液、尿液、心包液、血液和血浆。在一个更优选的实施方式中，生物液体是血液、血浆或血清。在本发明方法的步骤（a）中分离的生物样品可以是，例如，但不限于，新鲜的、冷冻的、固定的或包埋在石蜡中。 
如在本说明书中使用的，术语“检测和/或定量”由ephrin B2和在分离生物样品中的本发明第一个方面的多肽形成的复合物，是指检测存在和 /或测量数量或浓度，优选以半定量或定量方式。该测量可以直接地或间接地进行。直接测量是指测量由ephrin B2和本发明第一个方面的多肽形成的复合物的量或浓度（基于从所述复合物直接获得的信号并且将其与样品中存在的复合物分子的数量直接相关联）。这种信号（其还可以称为强度信号）例如，可以通过测量复合物的物理或化学特性的强度值来获得。间接测量包括从次级组分（例如，复合物的不同组分）或生物测量系统（例如，测量细胞反应、配体、“标签”或酶反应产物）中获得的测量值。 
术语“量”是指，但不限于，由ephrin B2和本发明第一个方面的多肽形成的复合物的绝对量或相对量以及与复合物相关的任何其他值或参数，或可由其得到的值或参数。这类值或参数包括通过直接测量获得的由复合物的任何物理或化学特性获得的信号的强度值，例如，来自质谱或核磁共振的强度值。另外地，这些值或参数包括通过间接测量获得的那些值或参数。 
如本领域技术人员应当理解的，该检测并不旨在分析样品是100%正确。然而，需要将统计显著数量的分析样品正确地分类。统计显著的数量可以由本领域技术人员使用不同的统计工具来建立，例如，但不限于，置信区间的确定、p值确定、Student's t检验或Fisher判别函数。优选地，置信区间为至少90%，至少95%，至少97%，至少98%或至少99%。优选地，p值少于0.1，0.05，0.01，0.005或0.0001。优选地，本发明可以至少60%、至少70%、至少80%或至少90%正确地检测所分析的给定组或人群的受试者的疾病。 
如在本说明书中使用的，术语“比较”是指，但不限于，将通过ephrin B2与有待分析的生物样品（也称为生物样品问题）的本发明第一个方面的多肽形成的复合物的量与参比试样（称为对照）的复合物的量比较。例如，参比样品与生物样品问题可以同时地或连续地进行分析。可以手工地或计算机辅助地进行比较。 
本发明第六个方面涉及本发明第一个方面的多肽用于制备药剂的用途。在本发明的一个优选实施方式中，使用该药剂来抑制血管生成。优选地，用于治疗性或预防性治疗与血管生成相关的病症。更优选地，用于预防性或治疗性治疗肿瘤或癌症。 
与血管生成有关的病症可以是任何肿瘤以及其他非肿瘤疾病，例如，但不限于，在WO2007/127506中描述的那些。 
在本发明第六个方面的优选实施方式中，肿瘤或癌症是实体的。优选地，是胰脏癌、结肠癌或肺癌。当是不包含空腔或液体的大量组织时，肿瘤或癌症被说成是实体的。根据细胞类型，实体肿瘤具有不同的名称，例如肉瘤、恶性肿瘤（carcinoma）或淋巴瘤。 
本发明第七个方面涉及包含本发明第一个方面的多肽、本发明第二个方面的核酸或载体、或本发明第三个方面的细胞的组合物。在本发明第七个方面的优选实施方式中，该组合物是药物组合物。优选地，其特征还在于包含药用赋形剂。此外，该赋形剂必须是药理学可接受的。 
“赋形剂”是药物组合物的成分，其不是活性化合物而是稀释剂、载体或填充物，等等，当它是安全的、无毒的并且无不良反应时，其被认为是“药用的”。术语“赋形剂”是指一种物质，其有助于化合物的吸收、稳定该化合物或在给予一致性或提供气味（这使其更加令人愉快）方面有助于制备药物。因此，赋形剂可以具有使多种组分（例如淀粉、糖类或纤维素）保持在一起的功能，增甜功能，染色功能，药物保护功能例如隔离空气和/或水分，片剂、胶囊或其他形式制剂例如磷酸氢钙的填充功能，有助于组分溶解及其在肠道内吸收的崩解功能，而并不排除本文中未列出的其他类型载体。 
赋形剂术语“药用的”是指该载体是可接受的和可评价的从而并不对所述载体施用到其上的有机体造成损害。此外，该载体必须是药学上适合的，它必须允许药物组合物的化合物的活性，即必须和那些组分相兼容。 
优选地“运载体”或载体是惰性物质。该载体的功能是有助于其他化合物的结合、允许更好地给药和给予或为药物组合物提供一致性和形状。因此，载体是用于药物中从而将本发明药物组合物的任何组分稀释成给定体积或重量的物质，或甚至使用非稀释组分可以允许更好地给药和给予或为药物提供一致性和形状。当该制备是液体时，该药用载体是稀释剂。 
在另一个甚至更优选的实施方式中，药物组合物还包括其他活性物质。除了治疗效果的要求以外（它可能需要使用其他治疗剂，）可能存在强迫或强烈地推荐使用本发明的化合物和其他治疗剂的组合的另外的基 本原理。术语“活性”是指具有作为药物的适当活性的任何物质，而不考虑人类的、动物的、植物的、化学的或其他来源。 
在本发明第七个方面的优选实施方式中，该药物组合物还包括抗血管生成剂。抗血管生成剂是能够直接地或间接地抑制血管生成、血管发生或不希望的血管通透性的分子。抗血管生成剂的例子是能够阻断一种血管生成剂的那些分子，像例如抗VEGF的抗体、VEGF受体或阻断VEGF通路的小分子（所有分子都被很好地描述并且是已知的）。 
在本发明第七个方面的优选实施方式中，该药物组合物还包括化疗剂。化疗剂是在治疗癌症中有用的化合物。化疗药物的例子是细胞毒性化合物例如蒽环类药物（antraciclines）、柔红霉素、亚德里亚霉素、多西紫杉醇衍生物、长春花生物碱类、长春新碱、卡莫司汀、顺铂、氟尿嘧啶、细胞生长抑制剂化合物例如多胺抑制剂、他莫昔芬或甲羟孕酮奥曲肽、或诱导凋亡的化合物例如丁酸钠或丝裂霉素C、抗生素（例如青霉素、β内酰胺类、头孢菌素、细胞周期蛋白类、氨基糖苷类、大环内酯类、或磺胺类）、或抗病毒剂例如AZT、蛋白酶抑制剂或阿昔洛韦、叠氮胸苷或膦甲酸。 
本发明第八个方面涉及本发明第七个方面的组合物用于制备药剂的用途。在本发明这个方面的优选实施方式中，使用药剂来抑制血管生成。优选地，用于治疗性或预防性治疗与血管生成有关的病症。更优选地，用于预防性或治疗性治疗肿瘤或癌症。在一个优选实施方式中，该肿瘤或癌症是实体的。优选地，该癌症是胰脏癌、结肠癌或肺癌。 
在本发明的第八个方面的优选实施方式中，给予治疗有效量。术语“治疗有效量”是指以一定剂量以及在需要的时期给药的量，其有效地实现了所期望的预防性或治疗性结果。“治疗有效量”的本发明的多肽或药物组合物可以随着个体的疾病阶段、年龄、性别及重量而改变，并且是指没有毒性或副作用并且能够实现所期望的预防性或治疗性效果的量。“个体”是脊椎动物。优选地，该脊椎动物是哺乳动物。更优选地，该哺乳动物是人类。哺乳动物中包括，但不限于，农场动物（例如母牛）、参与体育运动的动物、宠物（例如猫、狗和马）、灵长类、小鼠和大鼠。 
在每种情况下，药物的形式适合于所使用的给药类型，因此，本发明的组合物能够以溶液形式或临床允许给药的任何其他形式并且以治疗有效量来提供。本发明的药物组合物能够以固体、半固体、液体或气体形式配制，例如片剂、胶囊、粉剂、颗粒、药膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球体或气溶胶。根据本发明的另外的优选实施方式，药物组合物处于适合口服或肠胃外给药的形式。 
适合口服给药的形式是指能够允许口服给药的物理状态。适合口服给药的这种形式选自下面列表，包括但不限于滴剂、糖浆剂、茶剂、酏剂、悬浮剂、临时悬浮剂、可饮用小瓶、片剂、胶囊剂、颗粒剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂、含片或冻干剂。 
适合肠胃外给药的形式是指能够允许注射给药的物理状态，优选液体状态。肠胃外给药可以通过肌肉内、动脉内、静脉内、真皮内、皮下或骨内进行，但是并不单独地限于这些类型的肠胃外给药途径。 
另一种可能性是药物组合物以适合舌下、鼻内、鞘内、支气管、淋巴管、直肠、经皮（transdermal）或吸入给药的形式存在。 
贯穿整个说明书和权力要求，词语“包括”及其变体并不旨在排除其他技术特征、添加物、组分或步骤。对于本领域技术人员，部分地由说明书以及部分地由本发明的实践可以清楚本发明的其他目标、优点和特征。下面的实施例以说明的方式提供并且并不旨在限制本发明。 
附图说明
图1.在大肠杆菌（E.coli）中选择克隆的表达。通过丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝染色分析在大肠杆菌中（全部提取物）针对ephrin B2选择的scFv表达（2B1克隆，A1，B11和E4）以及通过温和的渗透休克（胞质）分离的相应的胞质部分。分子量以kDa显示在图的左侧。 
图2.大量纯化克隆2B1和B11。通过丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝染色分析ephrin B2的scFv A1、B11、E4和2B1特异性物质的纯化。在固定的Ni2+上通过亲和色谱纯化相应的胞质提取物中存在的scFv。该图示出每种scFv的洗脱层析图的不同部分。分子量以kDa显示。 
图3.克隆B11和2B1是更特异性的物质。通过免疫印迹测定针对不同ephrin B选择的scFv抗-ephrin B2的特异性。商业重组蛋白ephrin B1-Fc（EB1）（小鼠）、小鼠的ephrin B2-Fc（EB2）和ephrin B3-Fc（EB3）（人类）被电泳分离并且转移至硝酸纤维素膜。随后，分析B11和2B1克隆连同商业抗体抗-ephrin B2（作为对照（C））一起的反应性。分子量以kDa显示在图的左侧。 
图4.通过BiacoreTM分析scFv抗-ephrin B2的亲和性。感应图表示针对对应于克隆B11（A）与使用四种不同浓度（0.4，0.2，0.1，0.05μM）固定的ephrin B2的结合曲线以及在30，20，10和7.5μM浓度下的克隆2B1（B）的结合曲线的时间（s）的反应，由此计算出相应的亲和常数（KD），对于克隆B11，KD值是110nM而对于克隆2B1，KD值是630nM。 
图5.阻断ephrin B2与Eph B4结合的研究。A.该图示出ephrin B2与Eph B4的结合百分比。在scFv抗-ephrin B2存在下通过表面等离子体共振进行ephrin B2与Eph B4的结合抑制试验。scFv B11(●)或2B1(○)的连续稀释物与ephrin B2混合并且注射在固定在芯片上的Eph B4上。在注射每种样品后立即测量结合至Eph B4的ephrin B2的相对量并且作为scFv浓度的函数制图。该图显示scFv的每个浓度的平均值，其中误差棒指示标准误差（n=3）。B.在细胞测定中scFv B11能够阻断ephrin B2与Eph B4受体之间的相互作用。分析了响应于使用在HEK293细胞表面上过表达的ephrin B2进行刺激，在HUVEC细胞中Eph B4受体的酪氨酸磷酸化。将过表达ephrin B2的HUVEC和HEK293细胞在抗-ephrin B2scFv存在或不存在下共培养20分钟。在Eph B4受体免疫沉淀后，通过免疫印迹分析蛋白的总量（下图）及其磷酸化水平（上图）。 
图6.通过基质胶中内皮细胞HUVEC在体外在管状结构形成上B11和2B1的抑制作用。显微照片（4x放大倍数）代表在B11、2B1或无关的scFv（作为负对照（C-））存在下在基质胶上培养HUVEC细胞6小时形成小管。关于正对照，我们使用VEGF。该图示出小管形成的定量。每种处理重复至少三次并且将对应的值（均值+/-标准误差）绘图为相对于无任何处理的对照，在检测的抗体存在下形成的小管的百分比。*=p<0.0001。 
图7.通过体外伤口愈合测定分析细胞侧向迁移抑制。HUVEC细胞生长至汇合并且在细胞单层中形成创伤。然后，在不存在（对照）或存在 VEGF（作为迁移刺激物）下在无血清培养基中孵育细胞。在scFv抗-ephrin B2、B11或2B1或无关的scFv（作为阴性对照）存在下监控细胞的侧向迁移持续24小时。该图示出在其上用虚线标记的创伤区域（在时间为0时无细胞的起始区域）之后24小时代表性的显微照片（4x放大倍数）。该图定量了24小时处细胞迁移。每种scFv测试至少三次，并且将相应的值（均值+/-标准误差）针对相对于时间0的迁移面积的百分比绘图。*=p<0.001。 
图8.分析体内管状结构形成的抑制作用。在无胸腺nu/nu小鼠中进行基质胶植入并且通过定量内皮细胞和血红蛋白在植入6天后评价管道形成。A.6天后移除的并且用内皮细胞标记物CD34染色的对应植入物的组织切片的代表性显微照片（40x放大倍数）。B.该图示出标记物CD34的阳性区域的百分比（左图）以及相对于不含VEGF的对照植入物，在植入物中血红蛋白含量的相对改变（右图）。 
图9.具有胰腺癌细胞（BxPC3）以及用B11或2B1治疗的小鼠异种移植物中抑制肿瘤生长。该图示出在用20mg/kg的B11(▲)、2B1(■)处理或未处理(C-)
Figure BDA00003147771500151
的每个组（n=8）的每个点的平均肿瘤体积和标准差。 
图10.胰腺癌细胞（BxPC3）以及用B11或2B1治疗的异种移植肿瘤的组织病理学分析。在植入后38天以及最后剂量的抗体后1天进行分析。在福尔马林中固定肿瘤并将其包埋在石蜡中用于随后进行相应的免疫组织化学染色。通过活性半胱天冬酶3（caspase3）染色来检测凋亡细胞，通过Ki67染色来分析增殖活性，通过CD34染色来标记血管分布以及通过LYVE1染色来检测淋巴管。随后计数细胞或将阳性区域和平均值针对连同它们相应的标准差一起计数的所有域作图。*=p<0.0001**=<0.001。 
图11.B11能够抑制异种移植有结肠癌细胞（SW620）（A）和肺癌细胞（H460）（B）的小鼠体内的肿瘤生长。该图显示平均肿瘤体积（上图）和平均荧光强度（下图），具有在用20mg/kg的B11治疗组和对照治疗组中的每个点处的标准误差。 
图12.B11及2B1的生物分布分析和肿瘤块定位。无胸腺nu/nu小鼠异种移植有稳定表达荧光蛋白mCherry的肺癌的H460细胞。当肿瘤达到肉眼可观察的尺寸并且在610nm处具有荧光强度时，静脉内给予适当的荧 光染料连接的scFv
Figure BDA00003147771500161
750。A.在给予scFv后0.5，2，6，24和48小时的背部区域图像。肿瘤的位置由箭头指示。B.在给予标记有 
Figure BDA00003147771500162
750的scFv B11和2B1以及用PBS处理的负对照（C-）之后6小时和48小时切除在750nm处具有荧光强度的肿瘤。 
具体实施方式
下面将通过发明人所做的实验来说明本发明，其证明了本发明的抗ephrin B2抗体特异性及其抑制新血管和淋巴管形成的功效。 
实施例1：鉴定和表征抗ephrin B2的新型人类抗体。 
从在噬菌体M13的表面上表达的人类抗体库并通过针对在哺乳动物细胞中表达并通过亲和色谱纯化的ephrin B2的胞外区域的连续多轮的选择，通过ELISA获得与ephrin B2抗原阳性反应的噬菌体克隆集合。用特异性引物测序这些克隆并鉴定VH（可变重链）和VL（可变轻链）中互相不同序列的4个单链可变片段（scFv），称为A1，B11，E4和2B1。随后，对每种选择的scFv的表达和纯化进行分析。为此，将它们亚克隆至T7RNA聚合酶启动子下的载体pET28b中，从而提供具有组氨酸尾部的片段，以便于通过亲和色谱将其纯化。产生重组载体并且将其转化入E.coli BL21（DE3）的菌株中以便随后使用IPTG诱导其表达。通过温和的渗压休克制备胞质部分并且通过SDS-PAGE测试scFv的存在（图1）。然后，使用镍亲和色谱，紧接着通过凝胶过滤将缓冲溶液更换成PBS对存在于胞质部分中的scFv进行纯化（图2）。在克隆2B1（其序列是SEQ ID NO:8）的情况下获得最大产率，紧接着是克隆B11（其序列是SEQ ID NO:7）。然而，scFv A1和E4的表达很低，使得所获得的量不足以获得这些抗体的进一步表征（图2）。因此，最终选择B11和2B1克隆来分析其反应性。通过ELISA的功能性测定显示抗体以功能性活性形式表达从而特异性地识别它们的靶抗原，ephrin B2。 
通过免疫印迹（蛋白质印迹）和B11和2B1与ephrins B家族的其他组分的反应性的ELISA分析确认两个抗体的特异性：ephrin B1和ephrin B3，处于商业重组形式，与同ephrin B2的反应性比较（图3）。作为对照，我们使用anti-ephrin B2Commercial（R&D）。两种抗体，B11和2B1，仅 识别ephrin B2，显示了其对该蛋白的高特异性，甚至超过还识别ephrins B1和B3的商业抗体。这些结果通过ELISA确认。 
由噬菌体库选择来自特异性ephrin B2抗体的单链可变区片段（svFv） 
使用来自未用1.5x1010scFv免疫的个体的人类抗体库在噬菌体表面上使用蛋白展示技术（噬菌体展示）。使用由哺乳动物细胞表达和纯化的融合到人类IgG的Fc结构域上的ephrin B2胞外区域作为在4℃下在PBS（磷酸盐缓冲液）中以1μg/孔在ELISA板上（酶联免疫吸附测定，Enzyme-linked immunosorbent assay,Maxisorp,Nunc）固定16小时的抗原进行第一轮筛选。在PBS三次冲洗孔之后，进行使用处于PBS中2%牛奶在37℃下封闭2小时的步骤，随后在37℃下孵育该文库两个小时。非特异性结合的噬菌体通过用PBS-0.1%吐温连续清洗而去除，而抗原特异性噬菌体用100ul胰蛋白酶洗脱。使用洗脱的噬菌体在37℃下使用处于指数生长（在600nm波长下的光密度（OD600）是0.4）的大肠杆菌菌株TG1（MRC Geneservices）感染细胞持续30分钟。将感染的细菌涂布在补充有100ug/ml氨苄青霉素和1%葡萄糖（v/v）的TYE平板上（TYE，胰蛋白胨酵母抽提物，Tryptone Yeast Extract），并且在37℃下生长16小时。接着，由具有补充有15%甘油的2xTY培养基（16g/l胰蛋白胨，10g/l酵母抽提物和5g/l NaCl）平板上收集细菌并且将50ul稀释的细菌收集到50ml补充有100ug/ml氨苄青霉素和1%葡萄糖的2xTY培养基中，孵育培养物直到达到指数期并且用2.5×1011个辅助噬菌体KM13（MRC Geneservices）感染细胞。在37℃下孵育30分钟后，离心培养物，将球粒重悬于补充有100ug/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素和0.1%葡萄糖的相同量的2xTY培养基中，并在30℃下生长过夜。 
将来自每轮选择的噬菌体从培养基中沉淀。为此，在3,300x g下离心培养物15分钟并且添加10ml的聚乙二醇（PEG）/NaCl并且将40ml上清液放置冰上1小时。然后，在3,300x g下离心30分钟并弃掉上清。将沉淀物重悬在2ml PBS中并在11,600x g下离心10分钟。回收上清液并将噬菌体用于下一轮选择，与上述相似，尤其是使用了降低量的抗原以提高抗体的亲和性。将第二轮中结合的噬菌体扩增并将其再提交至第三轮选择从而得到携带抗ephrin B2的反应性scFv的那些的富集。 
用于噬菌体的ELISA 
进行了用于噬菌体的ELISA用于评估由每轮选择得到的ephrin B2的特异性噬菌体的富集程度。在4℃下用处于PBS中的0.3ug的ephrin-B2-Fc和不相关的蛋白（作为负对照）来包被柔韧的ELISA平板（Falcon,BD Biosciences），持续16小时。在使用PBS清洗几次后，在室温下使用处于PBS中的2%牛奶封闭平板持续2小时，紧接着在室温下用处于PBS-2%牛奶中来自每轮选择的不同稀释度的噬菌体孵育1小时。用PBS-吐温20（0.1%）再次清洗这些孔并且在室温下使用1:5000稀释度的连接至过氧化物酶（HRP）（GE Healthcare）的单克隆抗-M13抗体孵育1小时。在用PBS-吐温20（0.1%）清洗4次后，使用TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）（Sigma）显影。使用1M硫酸终止显色反应并在450nm下测量吸光度。 
使用各种技术来表征两种选择的scFv，B11和2B1。首先，使用固定的ephrin B2的胞外区域和纯化的scFv的不同稀释度，通过在Biacore X上的表面等离子体共振技术我们测量了针对ephrin B2的抗体亲和常数。B11克隆显示了最高的亲和常数，为110nM，而克隆2B1的亲和性较低，为630nM（图4）。然后，使用相同技术分析了抗体竞争ephrin B2与其天然受体Eph B4结合的能力。为此，将Eph B4-Fc固定在芯片上并且在不同浓度B11或2B1存在下测量其与ephrin B2的结合。B11的存在以浓度依赖方式阻止ephrin B2与Eph B4结合，IC50为0.3μM（图5），表明B11竞争Eph B4受体相同的结合位点。然而，2B1抗体没有阻断作用（图5）。 
单克隆噬菌体的ELISA 
由第三轮选择中挑出单个克隆并且在37℃下在搅拌下在96孔板（Sarstedt）中在补充有100μg/ml氨苄青霉素和1%葡萄糖的100μl的2xTY培养基中生长过夜。第二天该培养物在相同的培养基中稀释100倍并在37℃下在搅拌下孵育2小时。下一步，添加含有109个KM13辅助噬菌体的25ul培养基并在37°C下孵育1小时。将细菌离心并且将细胞球粒重悬在补充有50μg/ml卡那霉素的2xTY中并在30℃下生长过夜。最后，离心培养物并使用50ul的上清液用于在上述相同条件下进行ELISA。 
序列分析 
使用寡核苷酸或pelB正向引物（SEQ ID NO:2）5'-CATAATGAAATACCTATTGCCTA-3’和cmyc反向引物（SEQ ID NO:3） 5'-CTTATTAGCGTTTGCCATT-3'，通过PCR来扩增来自scFv阳性的编码序列。使用酶ExoI（USB）处理PCR产物以移除未使用的寡核苷酸，以及SAP（USB）以移除剩下的dNTP（在37℃下持续30分钟而在80℃下持续15分钟），并且使用两种寡核苷酸将这些产物测序。一旦获得序列，使用ClustalW软件以及翻译工具ExPASy Proteomics Server将这些序列彼此进行对比以便确定单一序列克隆的数量。 
将scFv亚克隆至pET28b 
为了向选择的scFv提供有助于其纯化的组氨酸尾部，将它们克隆到载体pET28b（Novagen）中。通过PCR使用分别含有两个限制位点XhoI和RcaI的引物pET28-scFvMehta5'（SEQ ID NO:4）5'CAGTCATCATGAAATACCTATTGCCTAC3'和pET28-scFvMehta3’（SEQ ID NO:5）5'CACCGGACTCGAGTGCGGCCCCATTCAG3'来扩增scFv，用于随后克隆至pET28b载体中（预先用NcoI消化，位点与RcaI和XhoI相容）。在16℃下使用T4连接酶（Roche）设置插入序列：载体摩尔比3:1通过过夜孵育来连接消化的插入序列和载体。通过热休克转化大肠杆菌菌株DH5a文库感受态细胞（Invitrogen）并且在含有50μg/ml卡那霉素的LB-琼脂（LB，“溶原性肉汤”）平板上筛选。将每个构建的阳性克隆接种在补充有卡那霉素的LB中并且在37℃下培养过夜。使用Wizard kit(Promega)来纯化重组载体并且通过DNA测序来验证其序列。 
scFv的表达和纯化 
通过热休克用pET28重组质粒转化大肠杆菌菌株BL21（DE3）感受态细胞。在含有50μg/ml卡那霉素的LB平板上筛选转化的细菌。当培养物的OD600是0.6时使用IPTG（异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside））诱导来引导scFv的表达至最终浓度为1mM。我们通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶（十二烷基硫酸钠），紧接着用考马斯亮蓝染色来分析scFv的表达水平。由于功能性的scFv集中在细胞胞质区域，通过温和的渗透冲击有效地裂解细菌外壁，将细胞重悬在补充有20μg/ml苯甲脒（Sigma）和10μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂（Sigma）的1/50体积的TES缓冲液（200mM Tris-HCl pH8.0，0.5mM EDTA，0.5M蔗糖）中并且随后在0.2x TES缓冲液中稀释1.5倍。将裂解物放置冰上30分钟，在16,250x g下离心10分钟并且收集含有胞质部分的上清液。 
使用Ni2+HisTrap（GE Healthcare）柱通过在固定的金属（IMAC）上的亲和色谱进行scFv的纯化，随后在计算机
Figure BDA00003147771500201
上串联偶联的凝胶过滤HiPrep26/10Desalting（GE Healthcare）柱上脱盐。关于亲和柱的平衡缓冲液，使用20mM pH7.4的磷酸钠、0.5M NaCl、20mM咪唑，而关于洗脱液，为余量为0.3M浓度咪唑的上述缓冲液。通过凝胶过滤将该缓冲液换成PBS。 
免疫印迹（蛋白质印迹） 
在聚丙烯酰胺-SDS10%凝胶中电泳分离重组小鼠蛋白ephrin B1-Fc、小鼠ephrin B2-Fc以及人类B3-Fc（R&D）并且将它们转移至硝酸纤维素膜上（GE Healthcare）。在用PBS-3%脱脂奶粉封闭该膜1小时后，在4℃下用处于PBS-3%奶粉中的1:5稀释的胞质部分孵育16小时。使用的二抗是1:1000稀释的抗c-Myc(Sigma)在室温下持续2小时以及1:5000稀释的抗小鼠过氧化物酶结合物（Sigma）在室温下持续1小时。通过用ECL试剂（ECL，“增强化学发光”（“Enhanced Chemiluminescence”））（GE Healthcare）孵育来进行可视化。 
scFv的动力学常数分析 
为了研究scFv的亲和常数，使用BIAcore X仪器（BIAcore）的表面等离子体共振技术。通过用1:1比率的0.4M EDC（1-乙基-3-(-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺）和0.1M NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）在10μl/分钟的流速下将芯片的葡聚糖基质的羧基活化7分钟，将ephrin B2-Fc共价结合至CM5芯片表面（GE Healthcare）。将ephrin B2-Fc蛋白稀释至处于10mM醋酸钠中（pH4）10ug/ml并且以处于HBS-EP缓冲液（10mM HEPES pH7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005%表面活性剂P20）（GE Healthcare）中10μl/min的流速将30ul该溶液通过芯片表面。通过以10μl/分钟的流速注入1M pH8.5的乙醇胺持续7分钟来封闭过量活化的酯基。使用该方案，固定了ephrin B2的大致2,000个反应单元（RU）。 
为了确定scFv的亲和常数，在30ul/分钟的流速下以递增次序连续地注入不同稀释度的抗体。在获得感应图（sensorgram）后，通过Langmuir1:1模型使用评估程序BIAsoftware来计算亲和常数。 
结合至Eph B4的竞争性分析 
通过表面等离子体共振竞争性结合测定来分析scFv抑制ephrin B2结合至其EphB4受体的能力。使用上述相同实验方案将溶解的Eph B4（R&D）结合至CM5芯片（GE Healthcare）。将每种scFv的连续稀释物与处于HBS-EP缓冲液中恒定浓度（0.2μM）的ephrin B2-Fc混合并且将30ul的每种混合物以20μl/分钟的流速注入Eph B4的包被芯片上。结合至Eph B4上的ephrin B2的相对量代表了抗体相应浓度的函数。 
使用scFv B11抗-ephrin B2阻断Eph B4信号 
为了通过ephrin B2诱导的磷酸化来测试抗-ephrin B2scFv阻断Eph B4活性的能力，进行了细胞测定，其中使用HEK293细胞短暂过表达ephrin B2来刺激HUVEC细胞（其特征是表达高水平的Eph B4但是低水平的ephrin B2）。结果显示在图5B中。在孵育两种细胞类型20分钟后，在HEK293细胞表面上表达的ephrin B2诱导了HUVEC细胞中Eph B4的高效磷酸化。然而，在该过程中scFv B11的存在导致几乎完全抑制Eph B4的磷酸化，表明在细胞间直接接触的背景下使用scFv B11的处理阻断了ephrin B2与其受体Eph B4之间的相互作用。当使用scFv2B1进行处理时观察不到这种效果。在scFv2B1的情况下，Eph B4磷酸化水平与在缺乏抗体下观察到的那些是相似的。 
Eph B4磷酸化细胞实验 
用质粒pcDNA3-ephrin B2转染在补充有5%胎牛血清的RPM1（Sigma）中生长的HEK-293细胞。在塑料瓶T-75（Nunc）中以4.5x106接种HEK-293细胞。第二天，使用处于1ml OPTIMEM培养基（Invitrogen）中的20ug pcDNA3-ephrinB2和60ul FUGENE转染液（Roche）来制备混合物并且在室温下孵育30分钟。使用不含血清的OPTIMEM培养基（Invitrogen）洗涤细胞单层数次并添加DNA-FUGENE混合物。在37℃和5%CO2下孵育5小时后，移除该培养基并且添加含有5%胎牛血清的RPM1。在48小时，使用PBS-5mM EDTA来培养转染的细胞并将5x106个细胞添加至P100平板（Falcon），在存在或不存在20ug/ml的scFv抗-ephrin B2下在补充有10%胎牛血清的EGM Bullet Kit培养基（Lonza）中使HUVEC细胞生长至汇合。在37℃和5%CO2下孵育20分钟后，使用补充有蛋白酶抑制剂混合物（Roche）和磷酸酶（Sigma）的裂解缓冲液（100mM Tris HCl pH8.0，150mM NaCl，1mM EDTA，5mM DTT，0.5%Triton  X100）来裂解细胞。在4℃下在16,000xg下离心裂解物25分钟然后将上清液在4℃下孵育2小时，在4℃下经过16小时与抗Eph B4（R&D）的特异性抗体和偶联到Sepharose（GE Healthcare）上的G蛋白形成复合物。最后，使用裂解缓冲溶液清洗免疫复合物两次并且在7.5%聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE上电泳。 
通过免疫印迹进行磷酸化的Eph B4的检测。为此，将通过抗-Eph B4免疫沉淀的并且通过电泳分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜Hybond-C（GE Healthcare）并且在室温下用补充有0.05%的吐温20（Sigma）和3% 
Figure BDA00003147771500221
封闭剂（Cell Biolabs,Inc.）的PBS封闭1小时。然后，在4℃下用1:2000稀释的连接到过氧化物酶（Millipore）上的单克隆抗体4G10抗磷酸酪氨酸孵育该膜16小时。通过
Figure BDA00003147771500222
West Femto Substrate（Thermo Scientific）使用化学发光检测来进行可视化。为了检测全部Eph B4，在室温下使用Strong Plus ReBlot试剂（Chemicon）再生该膜15分钟并且在4℃下用在PBS（含有0.05%吐温20和5%脱脂奶）中1:1000稀释的抗-Eph B4抗体（R&D）孵育16小时。使用含有0.05%吐温20的PBS清洗数次后，在室温下用过氧化物酶连接的抗山羊抗体（1:5000）（Dako）孵育该膜2小时并且使用ECL Plus试剂（GE Healthcare）来使条带可视化。 
实施例2：在体外在HUVEC细胞中B11与2B1抗体的抗血管生成活性 
分析了B11和2B1抗体在血管生成能力及内皮细胞迁移上的作用。为此，分别进行了在基质胶中管道形成实验以及使用HUVEC细胞（人脐静脉内皮细胞）的体外伤口愈合实验。 
在基质胶上的管道形成实验中，发现在100ug/ml的B11抗体存在下HUVEC细胞构成小管的数量比不使用抗体或使用不相关的scFv的对照低2倍（图6）并且，除了在处理6小时下小管数量减少之外，还有更多细胞排列成单层，证明抗体的存在阻止管道的形成。使用克隆2B1获得了相似的结果，但是与B11相比具有更低的抑制能力，与对照相比较为40%。 
为了测定对HUVEC细胞水平迁移的影响，在作为刺激迁移试剂的血管内皮细胞生长因子（VEGF）存在下进行单层愈合实验。在形成伤口24 小时后，在该过程中如果存在VEGF或VEGF及不相关抗体，60%的单层细胞迁移到自由空间中。相比之下，用VEGF和B11或2B1处理的那些伤口，分别通过仅25%或30%的细胞克隆，这些数据可与无迁移刺激物的负对照（20%）中迁移细胞的数量相比（图7）。 
因此，可以从两个实验中得出，B11和2B1抗体，并且尤其是第一个（对于ephrin B2具有特异性），显示抗血管生成能力并且能够在体外抑制内皮细胞迁移。 
在基质胶中毛细管形（Capillary-shape）结构形成测试 
使用基质胶（BD Biosciences）包被24孔板并且在37℃下孵育20分钟进行胶凝化。然后，在处于补充有10%胎牛血清的1ml完全培养基EGM-2bullet Kit（Lonza）中的基质胶层上涂布5x104HUVEC细胞，并且在不同抗生素存在下在37℃下孵育6小时至100μg/ml。在6小时时，通过分析在装备有照相机的显微镜Axiovert100（Zeiss）中获得的数字图像来研究管状结构的形成程度。 
体外创伤愈合实验 
使用体外伤口愈合来进行细胞迁移实验。在用补充有0.5%胎牛血清的EGM-2（Lonza）孵育1小时后，在24孔板中使HUVEC细胞生长至汇合，使用吸管尖端开始制造线性刮擦（scraping）并且拍摄该区域照片。在不存在（对照条件）或存在作为迁移刺激物的100ug/ml VEGF（血管内皮细胞生长因子，Peprotech）和100ug/ml相应的抗体下孵育细胞。在24小时后拍摄该区域照片，将水平迁移至创伤区域的细胞计数并且由进行刮擦的时间来测定迁移面积的百分比。 
实施例3：B11和2B1抗体对体内基质胶植入物的血管生成的作用 
为了证明抗体2B1和B11能够直接抑制体内血管生成，在每组六个动物的无胸腺裸nu/nu小鼠中进行补充有VEGF（Peprotech）的基质胶植入物的实验。在植入相应的基质胶6天后，通过对存在于移开的植入物中的血红蛋白定量以及通过CD34的免疫组织学染色，紧接着通过针对血管标记计算阳性区域，来估计毛细血管网的形成。在植入基质胶后（隔天）立即静脉内开始用相应的抗体进行治疗，直到最终剂量为300ug/小鼠。不 使用VEGF的植入物用作阴性对照，其中并没有产生任何血管生成（图8A）。作为对比，VEGF植入物以及用VEGF和不相关的scFv处理的植入物显示显著的血管生成（视为本实验的阳性对照）。使用抗体B11处理的动物显示最小的血管生成，比阳性对照低95%，可与植入不含生长因子的基质胶的动物体内存在的那些相比较，这反映在植入物中缺乏针对CD34和血红蛋白阳性的内皮细胞（图8B）。使用2B1抗体处理的这组小鼠对于阳性对照显示50%的血管形成抑制。 
体内管道形成测试 
使用4至6周龄的无胸腺nu/nu小鼠（Charles River）。对于对照组，用2%异氟烷麻醉的小鼠被注入200ul基质胶（BD Biosciences）。另一组动物在上腹部区域注入补充有50ng/ml VEGF和375μg/ml肝素（Sigma）的200ul基质胶。植入基质胶后，立即开始每隔一天静脉内用scFv来治疗，直到总剂量为300μl/小鼠。6天后，移除植入物并且根据存在的血红蛋白的浓度以及用抗-CD34（一种血管标记物）染色的组织切片来测定新血管的形成。为了测量血红蛋白，取得每个基质胶植入物的一部分，称重并在300ul蒸馏水中匀化。在16,000x g下离心5分钟后，取出100ul上清液并用TMB底物（3,3',5-5'-四甲基联苯胺）（Sigma）1:1稀释。15分钟后，通过在650nm下测量光密度来评估颜色反应。最后，将这些数值标准化成植入物的重量。 
对于免疫组织化学分析，植入物的部分固定在10%福尔马林缓冲液中，包埋在石蜡中并且用切片机切成2.5um厚度。使用Tris-EDTA pH9.0来进行抗原性恢复并且用1:75稀释的大鼠单克隆抗-CD34（Abcam）来标记内皮细胞，随后是标记有过氧化物酶（Biocare Medical）的抗大鼠二抗。使用3,3-二氨基联苯胺四氢氯化合物plus（DAKO）进行可视化并且使用苏木精复染。通过AxioVision系统（Zeiss）对阳性细胞计数。 
实施例4：B11和2B1抗体在无胸腺小鼠中抑制人类肿瘤的生长。 
假定证明的B11和2B1抗体在体内和体外影响血管生成的能力，还研究了它们是否也能够抑制随着肿瘤生长高度依赖血管生成的过程。为此，使用具有胰腺癌细胞（BxPC3）、结肠直肠（癌细胞）（SW620）和肺（癌细胞）（H460）的三种小鼠异种移植模型。结肠和肺细胞组成性地表 达荧光蛋白mCherry，以便通过分析发出的荧光来跟踪肿瘤的进展。在前面，发现抗体B11和2B1在体外在所应用的三个细胞系中对细胞存活性都没有产生影响。 
将BxPC3细胞皮下植入2组8只小鼠中并且一旦检测到肉眼可见的肿瘤块，就隔天静脉内用B11和2B1开始治疗，直到完成剂量为20mg/kg或PBS作为负对照。在植入肿瘤细胞60天后观察到使用B11抗体处理的该组小鼠显示肿瘤尺寸明显减小，与对照组的平均肿瘤尺寸相比显示了70%的生长抑制（图9）。2B1处理的小鼠在肿瘤生长中显示适中的减少，为大约35%。 
为了研究负责抑制肿瘤生长的机制，在用抗体治疗完成后一天将几个肿瘤移除并且分别使用抗半胱天冬酶3（caspase3）活性、Ki67、CD34和Lyve1的抗体进行了免疫组织化学分析以便评估凋亡状态、增殖、血管生成和淋巴管生成（图10）。与对照相比，使用B11处理的肿瘤中凋亡细胞的数量增加了5倍。通过对比，在使用2B1和对照处理的肿瘤之间凋亡细胞的数量之间没有显著差异。 
关于增殖标记物Ki67，处理的和对照动物的肿瘤之间没有典型的差异，在所有三个组中均显示约30%的Ki67阳性细胞。 
当通过测量肿瘤中针对CD34阳性的区域来分析血管的存在时，相对于对照，使用B11处理的肿瘤中有80%的减少并且相对于对照组，使用2B1处理的肿瘤有55%的减少。 
最后，通过Lyve1标记分析了淋巴管的存在，在使用B11处理的那些肿瘤中几乎完全观察不到淋巴管。在使用2B1处理的肿瘤中也观察到了淋巴管数量显著地减少，但是没有在B11的情况中的显著。 
然后，使用上述相同步骤在其他异种移植模型中来研究B11抗体的抗血管生成能力和抗淋巴管生成能力以及肿瘤生长抑制能力。在细胞系SW620结肠癌的情况中，在植入后23天以后观察到肿瘤尺寸90%的减小（图11A），而在肺细胞的情况中有65%的减小（图11B）。使用肿瘤细胞中存在的荧光发光mCherry蛋白的类似降低来证明相应尺寸的减小。免疫组织化学分析证实在使用B11治疗的肿瘤中血管数量的减少以及淋巴管的缺乏（如在胰腺癌细胞的模型中所观察到的）。 
因此，可以得出结论：ephrin B2特异性的B11抗体具有潜在的抗血管生成能力和抗淋巴管生成能力，这将导致使用该抗体治疗的那些肿瘤的生长的降低或延迟。2B1抗体还具有良好的抗血管生成能力和抗淋巴管生成能力。 
异种移植 
存在三种类型的异种移植：使用胰腺癌细胞（BxPC3）、结肠直肠（癌细胞）（SW620，稳定地表达荧光蛋白mCherry（Clontech））和肺（癌细胞）（H460，稳定地表达荧光蛋白mCherry）。在所有三种情况中，本质上使用相同的实验方案。将处于0.2ml PBS体积中的1至5百万人类肿瘤细胞皮下注入免疫缺陷小鼠的侧面（nude或SCID，“重度联合免疫缺陷病”）直到观察到肉眼可见的肿瘤块（大致30mm3）。此时，隔天通过尾部静脉经静脉给予处于100-200ul PBS中的相应抗体持续两周或直到达到20mg/kg的最终剂量来开始治疗。使用相同的方案对照动物接受PBS。每周2-3次使用卡尺来测量肿瘤的尺寸并且，在异种移植有mCherry荧光蛋白标记细胞的小鼠情况中，在IVIS imaging System Spectrum200（Caliper Life Sciences）中在610nm下测量荧光发射强度（每秒及每平方厘米的光子数）以便以mCherry蛋白发射强度的函数形式来显示肿瘤生长。图像的最终处理包括残留信号扣除（移除自发荧光）及色标（colour scale）随后是信号强度曲线。根据与使用实验动物相关的现存法律，当肿瘤达到1500-2000mm3的预设尺寸时，通过CO2窒息来处死动物。使用Student t-检验通过参数分析来进行肿瘤生长测量的统计分析。统计显著性水平设置在p≤0.05。 
组织学分析 
在用抗体治疗完成后一天由处死的动物中提取来自异种移植的小鼠的肿瘤样品。样品用福尔马林固定并且包埋在石蜡中。将来自每个肿瘤的组织切片用苏木精及曙红染色或制备用于免疫组织化学表征。通过用兔抗Ki67（DAKO）的单克隆抗体染色来分析肿瘤细胞的增殖活性，使用兔多克隆抗-活性半胱天冬酶3（R&D）来检测凋亡细胞的存在，通过使用特异性的大鼠单克隆抗体（Abcam）在内皮细胞上针对CD34染色来测量新血管形成并且通过用兔多克隆抗-LYVE1（Abcam）染色来标记淋巴管。使用 3,3-二氨基联苯胺四氢氯化物plus（DAKO）来进行所有切片的可视化并且用苏木精复染。通过AxioVision系统（(Zeiss）对阳性细胞计数。 
实施例5：体内肿瘤块的生物分布及定位 
为了分析动物中抗体的分布及证实其在肿瘤生长区域中的定位，设计了一个实验，其中具有肿瘤细胞系的异种移植小鼠，在H460肺癌的情况中，使用荧光染料标记的
Figure BDA00003147771500271
AlexaFluor750（Molecular Probes，分子探针）（其是近红外发射）进行治疗。为了确认肿瘤块的位置，使用了表达荧光蛋白mCherry的细胞。将H460细胞皮下植入无胸腺裸nu/nu小鼠的背部区域中。当肿瘤达到约0.3cm3的体积时，将15ug结合有
Figure BDA00003147771500275
Figure BDA00003147771500273
的抗体静脉内给药。在给药后0.5，2，6，24和48小时，由腹部和背部区域拍摄图像。小鼠背部图像的研究用于定位肿瘤块中抗体的位置（给药半小时（图12A）和在6小时处的峰值（图12B））。在6小时处在肿瘤中通过抗体B11发射的荧光强度明显超过通过抗体2B1显示的荧光强度，表明与2B1相比，B11在肿瘤区域中更有效地定位。半小时后，膀胱和肾中的信号非常强烈，表明通过肾脏抗体快速地并且积极地消除。在48小时，在这些区域中信号非常弱，其值接近于自发荧光，表明几乎所有抗体都被完全消除。另外，在上腹部区域中在第一小时期间动物显示荧光信号（可归因于通过肝胆途径消除抗体的程度），当单独地分析器官时可以证明该事实并且发现在6小时处肝脏显示了大致1x108p/s/cm2/sr（光子/秒/平方厘米/立体角）的荧光。 
生物分布 
对于scFv分布的实验，使用具有稳定表达mCherry荧光蛋白的H460肺癌细胞系的异种移植裸小鼠。进行具有荧光标记的细胞的应用以明确地定位肿瘤。皮下注入5x106个细胞并且允许生长直到肿瘤块达到约500mm3的尺寸。类似地，根据制造商的说明通过SAIVITM快速抗体标记试剂盒(Invitrogen)将scFv连接至荧光染料
Figure BDA00003147771500274
。一旦肿瘤达到预期的尺寸，每只小鼠静脉注入15ug的标记抗体。在给予标记scFv的药物后，使用体内成像系统IVIS Spectrum200（Caliper Life Sciences）在749nm下激发荧光染料，在0.5，2，6，24和48小时处拍摄体内荧光图像。在移除自发荧光后，我们根据信号强度曲线给出色标（colour scale）。 
Figure IDA00003147771900011
Figure IDA00003147771900021
Figure IDA00003147771900031
Figure IDA00003147771900041
Figure IDA00003147771900051

Claims (41)

1.一种分离的多肽，其特征在于：
（a）包含与SEQ ID NO:1至少76%序列一致性的氨基酸序列并且
（b）特异性地识别并结合至ephrin B2。
2.根据前面权利要求所述的多肽，其中所述氨基酸序列是SEQ ID NO:1。
3.根据前面权利要求任一项所述的多肽，其中所述多肽是抗体。
4.根据前一权利要求所述的多肽，其中所述抗体是人类的。
5.根据前一权利要求所述的多肽，其中所述人类抗体的同种型是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，或IgA。
6.根据前面权利要求任一项所述的多肽，其特征在于还包含信号肽。
7.根据前一权利要求所述的多肽，其中所述信号肽是SEQ ID NO:6。
8.根据前面权利要求任一项所述的多肽，其特征在于还包含至少一个标记。
9.根据前一权利要求所述的多肽，其中所述标记选自以下列表，包括：c-myc、FLAG、HA、组氨酸链、GST、生物素、VSV-G、HSVtk、V5、生物素、亲和素、链霉亲和素、麦芽糖结合蛋白和荧光蛋白。
10.根据前一权利要求所述的多肽，其中所述标记是组氨酸链，c-mvc或两者。
11.根据前一权利要求所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列是SEQID NO:7。
12.一种抗ephrin B2抗体，其氨基酸序列包含根据前面权利要求任一项所述的多肽。
13.一种核酸，编码根据权利要求1至11中任一项所述的多肽或根据权利要求12所述的抗体。
14.一种载体，包含根据前一权利要求所述的核酸。
15.根据前一权利要求所述的载体，其中所述载体是表达载体。
16.一种细胞，包含根据权利要求14或15中任一项所述的载体。
17.根据前一权利要求所述的细胞，其中所述细胞是原核的。
18.根据权利要求16所述的细胞，其中所述细胞是真核的。
19.根据前一权利要求所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
20.一种用于获得根据权利要求1至11中任一项所述的多肽或根据权利要求12所述的抗体的方法，包括以下步骤：（a）在细胞中表达根据权利要求15描述的所述载体，以及（b）纯化步骤（a）中表达的所述多肽。
21.根据前一权利要求所述的方法，其中所述细胞是原核的。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞是真核的。
23.一种检测和/或定量ephrin B2的方法，包括如下步骤：（a）将分离的生物样品与根据权利要求1至11中任一项所述的多肽或与根据权利要求12所述的抗体接触，以及（b）检测和/或定量通过所述ephrinB2与（a）中使用的样品中的所述多肽或所述抗体形成的复合物。
24.一种诊断与ephrin B2表达相关疾病的方法，包括如下步骤：（a）将分离的生物样品与根据权利要求1至11中任一项所述的多肽或与根据权利要求12所述的抗体接触，（b）检测和/或定量通过所述ephrinB2与（a）使用的样品中的所述多肽或所述抗体形成的复合物，（c）将检测到的ephrin B2水平与对照水平进行比较，并且（d）将这种比较结果与疾病的存在或不存在相关联。
25.根据权利要求1至11中任一项所述的多肽或根据权利要求12所述的抗体用于制备药物的应用。
26.根据前一权利要求所述的应用，用于抑制血管生成。
27.根据前面两项权利要求中任一项所述的应用，用于预防性或治疗性治疗与血管生成相关的病理状态。
28.根据前面三项权利要求中任一项所述的应用，用于预防性或治疗性治疗肿瘤或癌症。
29.根据前一权利要求所述的应用，其中所述肿瘤或癌症是实体的。
30.根据前一权利要求所述的应用，其中所述癌症是胰腺癌、结肠癌或肺癌。
31.一种组合物，包含根据权利要求1至11中任一项所述的多肽、根据权利要求12所述的抗体、根据权利要求13所述的核酸、根据权利要求14或15所述的载体或根据权利要求17至19中任一项所述的细胞。
32.根据前一权利要求所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
33.根据前一权利要求所述的组合物，其特征在于还包括药用赋形剂。
34.根据权利要求31或32中任一项所述的组合物，其特征在于还包括抗血管生成剂。
35.根据权利要求31或32中任一项所述的组合物，其特征在于还包括化疗剂。
36.根据前面五项权利要求中任一项所述的组合物用于制备药物的应用。
37.根据前一权利要求所述的应用，用于抑制血管生成。
38.根据前面两项权利要求中任一项所述的应用，用于预防性或治疗性治疗与血管生成相关的病理状态
39.根据前一权利要求所述的应用，用于预防性或治疗性治疗肿瘤或癌症。
40.根据前一权利要求所述的应用，其中所述肿瘤或癌症是实体的。
41.根据前一权利要求所述的应用，其中所述癌症是胰腺癌、结肠癌或肺癌。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104694477A (zh) * 2015-03-03 2015-06-10 西安交通大学 一种EphrinB2高表达的重组HEK293细胞及其应用
CN113825770A (zh) * 2019-05-14 2021-12-21 善福德健康 抗人肝配蛋白b1抗体及其用途

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3902460A4 (en) * 2018-12-28 2023-01-11 The General Hospital Corporation ANTI-EPHRINE B2 BLOCKING ANTIBODY FOR THE TREATMENT OF FIBROUS DISEASES
WO2020242910A1 (en) * 2019-05-24 2020-12-03 The Regents Of The University Ofcalifornia Compositions and methods for treating cancer

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101410413A (zh) * 2006-01-20 2009-04-15 健泰科生物技术公司 抗ephrinb2抗体及其使用方法
WO2010019565A2 (en) * 2008-08-12 2010-02-18 Medlmmune, Llc Anti-ephrin b2 antibodies and their use in treatment of disease

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101206206B1 (ko) * 2003-07-22 2012-11-29 크루셀 홀란드 비.브이. 사스-코로나바이러스에 대한 결합분자 및 그것의 용도
JP2007320850A (ja) * 2004-08-24 2007-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 抗エフリンｂ２抗体
AU2006308648A1 (en) * 2005-10-31 2007-05-10 Duke University Antibodies and immunotoxins that target human glycoprotein NMB
ES2368764T3 (es) * 2007-03-19 2011-11-22 Universität Stuttgart ANTAGONISTAS SELECTIVOS DE huTNFR1.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101410413A (zh) * 2006-01-20 2009-04-15 健泰科生物技术公司 抗ephrinb2抗体及其使用方法
WO2010019565A2 (en) * 2008-08-12 2010-02-18 Medlmmune, Llc Anti-ephrin b2 antibodies and their use in treatment of disease

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104694477A (zh) * 2015-03-03 2015-06-10 西安交通大学 一种EphrinB2高表达的重组HEK293细胞及其应用
CN104694477B (zh) * 2015-03-03 2018-04-17 西安交通大学 一种EphrinB2高表达的重组HEK293细胞及其应用
CN113825770A (zh) * 2019-05-14 2021-12-21 善福德健康 抗人肝配蛋白b1抗体及其用途

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