CN108602888A - 抑制癌症生长的结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于抑制癌症的生长的装置和方法。在一些实施方案中，所述装置包括蛋白质和抗体，所述蛋白质和抗体结合表皮生长因子(EGF)受体家族的膜缔合成员的细胞外部分和WNT信号传导途径的膜缔合成员的细胞外部分。本发明还提供有助于制备蛋白质、抗体和细胞的各种细胞和测定。

Description

抑制癌症生长的结合分子
本发明涉及结合分子领域。具体地讲，其涉及用于治疗涉及变异细胞的疾病的治疗性结合分子领域。更具体地，其涉及结合分子，所述结合分子结合表皮生长因子(EGF)受体家族的膜缔合成员的细胞外部分和WNT信号传导途径的膜缔合成员的细胞外部分。
尽管在治疗疾病方面已经取得了许多进展并且关于导致癌症的分子事件的知识增加，但癌症仍然是世界上死亡的主要原因。例如，结肠直肠癌(CRC)是全球第三大常见癌症。在2008年，123万人被诊断患有该疾病。其是欧洲第二大常见癌症，在2012年诊断出约447,000新病例(总数的13％)。结肠直肠癌是癌症死亡的第四大常见原因，据估计每年导致608,000(EU 148,000)人死亡。虽然CRC方面的一些新疗法已经取得了进展，但许多在临床试验上失败了；转移性CRC在很大程度上仍然不可治愈。
传统上，大多数癌症药物发现聚焦于阻断基本细胞功能和杀死分裂细胞的药物。然而，在晚期癌症的情况下，无论多么具有攻击性地施用，甚至是到患者因治疗遭受危及生命的副作用的程度，化学疗法也很难实现完全治愈。在大多数情况下，患者的肿瘤停止生长或暂时萎缩(称为缓解)仅仅是为了再次开始增殖，有时更快增殖(称为复发)，并且变得越来越难以治疗。最近，癌症药物开发的焦点已经从广泛细胞毒性的化学疗法转向具有较低毒性的靶向细胞抑制疗法。用特异性抑制信号传导途径组分的靶向疗法治疗晚期癌症已经在白血病的临床上得到验证。然而，在大多数癌症的情况下，靶向方法仍然证明是无效的。在结肠直肠癌中，超过80％的患者过表达受体酪氨酸激酶EGFR，但用EGFR阻断疗法治疗导致～10％的应答率，并且如化学疗法一样，这些应答不持久。虽然在一些患者中，较差应答率可能与阻断剂下游的激活突变相关，但是越来越多的科学证据表明，特定类型的自我更新癌细胞可解释癌症药物在许多情况下的有限活性。
癌症干细胞是与正常干细胞共享特征的肿瘤细胞，最重要的是具有长期自我更新的能力并且在给定的癌症中产生许多细胞类型。最近的证据表明，虽然常规化学疗法和当前靶向疗法杀死形成大部分肿瘤的分化和正在分化的细胞，但自我更新的癌症干细胞对这些治疗方案较不敏感。因此，通常在肿瘤内形成小细胞亚群的癌症干细胞可能对治疗后疾病再生和形成癌细胞转移起作用。认为肿瘤干细胞由已经积聚了一个或多个引发癌症发育的突变的成体干细胞产生。在正常干细胞中，增殖通过在其直接环境中传递的信号在空间和时间上严格控制。相比之下，癌症干细胞在正常干细胞隔室外以较少受控的方式增殖和分化，其中它们依赖于癌基因和肿瘤抑制子基因的突变。
不受理论的束缚，认为已经开发了靶向癌症干细胞并关闭这些细胞的重要生长和分化途径的装置和方法。靶向通过使用具有对干细胞靶的特异性的结合臂和特异性阻断生长因子受体途径的另一结合臂的蛋白质来实现。
发明内容
在一个方面，本发明涉及一种蛋白质，所述蛋白质结合表皮生长因子(EGF)受体家族的膜缔合成员的细胞外部分和WNT信号传导途径的膜缔合成员的细胞外部分。蛋白质优选为抗体，优选为双特异性抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物。
本发明还提供了双特异性抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其结合表皮生长因子(EGF)受体家族的膜缔合成员的细胞外部分和WNT信号传导途径的膜缔合成员的细胞外部分。
本发明还提供了用于治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括向对其有需要的个体施用本发明的蛋白质或本发明的双特异性抗体。
本发明还提供了本发明的蛋白质或本发明的双特异性抗体在治疗患有癌症的个体方面的用途。
在一个实施方案中，癌症为表达WNT途径的膜缔合成员的EGF-受体配体响应性癌症。
本发明还提供了一种细胞体系，其包括本发明的蛋白质或本发明的双特异性抗体，以及表达表皮生长因子(EGF)受体家族的膜缔合成员和表达WNT途径的膜缔合成员的细胞。细胞优选为表达WNT途径的膜缔合成员的EGF-受体配体响应性细胞。
本发明还提供一种用于在允许细胞生长的体系中抑制细胞生长的方法，所述细胞表达表皮生长因子(EGF)受体家族的膜缔合成员并表达WNT途径的膜缔合成员，所述方法包括提供具有本发明的蛋白质或本发明的双特异性抗体的体系。细胞优选为表达WNT途径的膜缔合成员的EGF-受体配体响应性细胞。
本发明提供一种抗体，其包含可结合LGR5的细胞外部分上的表位的可变结构域，所述表位位于图39所示的SEQ ID NO：1的氨基酸残基21-118内，其中氨基酸残基D43、G44、M46、F67、G90和F91参与抗体对表位的结合。
所述抗体优选为其中D43A、G44A、M46A、F67A、G90A和F91A的氨基酸残基取代中的一种或多种减少LGR5的抗体结合的抗体。
本发明还提供一种抗体，其包含可结合LGR5的细胞外部分上的表位的可变结构域，所述表位位于图39所示的SEQ ID NO：1的氨基酸残基21-118内，并且其中抗体对LGR5的结合通过以下氨基酸残基取代中的一种或多种减少：D43A、G44A、M46A、F67A、G90A和F91A。
所述抗体优选为其中抗体与LGR5-表达细胞上的LGR5相互作用抑制Rspondin 1(RSPO 1)与LGR5的结合不超过20％的抗体。优选在抗体和RSPO以0.1或更小的摩尔比；优选地以介于0.1至0.001之间的摩尔比(包括端值在内)，优选地0.1至0.01的摩尔比(包括端值在内)存在时，测量抗体与LGR5的结合的抑制。
本发明还提供一种抗体，其包含可结合LGR5上的表位的可变结构域，所述LGR5位于图39所示的SEQ ID NO：1的氨基酸残基21-118内，并且其中当抗体与RSPO以0.1或更小的摩尔比；优选地以介于0.1至0.001之间的摩尔比(包括端值在内)，优选地0.1至0.01的摩尔比(包括端值在内)存在时，抗体与LGR5-表达细胞上的LGR5的相互作用抑制RSPO与LGR5的结合不超过20％。
表位优选为构象表位。表位优选位于图39所示的SEQ ID NO：1的氨基酸残基40-95内。抗体与LGR5的结合优选由以下氨基酸残基取代中的一种或多种减少：D43A、G44A、M46A、F67A、G90A和F91A。抗体优选还包含可结合其它蛋白质的其它可变结构域。其它蛋白质优选为包括细胞外部分的膜蛋白。其它蛋白质优选为表皮生长因子(EGF)受体家族或cMET的膜缔合成员。
在一个特别优选的实施方案中，抗体为双特异性抗体。
双特异性抗体优选包含可结合LGR5的细胞外部分上的所述表位的可变结构域和可结合其它蛋白质的可变结构域。如本文所提及的，其它蛋白质优选为EGFR受体家族或cMET的膜缔合成员。结合这种其它蛋白质的可变结构域优选结合所述其它蛋白质的细胞外部分。
本发明还提供一种双特异性抗体，其包含可结合LGR5的细胞外部分上的表位的可变结构域和可结合其它蛋白质的可变结构域，其中所述LGR5表位位于图39所示的SEQ IDNO：1的氨基酸残基21-118内，其中氨基酸残基D43、G44、M46、F67、G90和F91参与抗体的结合。可变结构域与LGR5的结合优选由以下氨基酸残基取代中的一种或多种减少：D43A、G44A、M46A、F67A、G90A和F91A。其它蛋白质优选为包括细胞外部分的膜蛋白。其它蛋白质优选为EGF受体家族或cMET的膜缔合成员。
(双)特异性抗体与EGF受体家族或cMET的膜缔合成员的结合优选减少包括所述EGF受体家族或cMET的膜缔合成员的细胞中的配体诱导的信号传导。
本发明还提供一种抗体，其包含可结合LGR5的细胞外部分上的表位的可变结构域，所述表位位于图39所示的SEQ ID NO：1的氨基酸残基21-118内，并且其中蛋白质对LGR5的结合由以下氨基酸残基取代中的一种或多种减少：D43A、G44A、M46A、F67A、G90A和F91A。
不受理论的束缚，据信图39中所示的LGR5的M46、F67、G90和F91接触可变结构域的残基，即，可结合LGR表位的可变结构域的抗原结合位点。该氨基酸残基取代D43A和G44A减少抗体的结合可能是由于这些是接触残基的事实，然而，这些氨基酸残基取代还可能诱导具有其它接触残基中的一个或多个(即，在46位、67位、90位或91位处)的LGR部分的构象的(轻微)修饰，并且该构象变化使得抗体结合减少。表位的特征在于提及的氨基酸取代。抗体是否结合相同表位可以各种方式来测定。在实施例中描述了优选的方法。所述方法利用CHO细胞。CHO细胞在细胞膜上，或丙氨酸取代突变体上，优选包含取代M46A、F67A、G90A或F91A中一个或多个的突变体上表达LGR5。使测试抗体与CHO细胞接触，并且比较抗体与细胞的结合。测试抗体在其结合LGR5时结合表位，并且在较低程度上结合具有M46A、F67A、G90A或F91A取代的LGR5。优选比较与一组各自包括一个丙氨酸残基取代的突变体的结合。此类结合研究在本领域中是人们所熟知的。通常所述组包括覆盖基本上全部氨基酸残基的单一丙氨酸取代突变体。就LGR5而言，所述组仅需要覆盖蛋白质的细胞外部分。特定突变体的表达可受损，但这容易由结合不同区域的一个或多个LGT5抗体检测到。如果表达对于这些对照抗体也减少，则对于该特定突变体，膜上的蛋白质的含量和折叠也受损。测试抗体对该组的结合特性容易鉴定测试抗体是否表现出对具有M46A、F67A、G90A或F91A取代的突变体的减少的结合，并因此鉴定测试抗体是否是本发明的抗体。对具有M46A、F67A、G90A或F91A取代的突变体的结合减少也鉴定出位于图39所示的SEQ ID NO：1的氨基酸残基21-118内的表位，这同样适用于图39所示的SEQ ID NO：1的氨基酸残基40-95内的位置。在一个优选的实施方案中，所述组包括D43A取代突变体；两者的G44A取代突变体。具有MF5816的VH的VH序列的抗体表现出对这些取代突变体的结合减少。
在一个优选的实施方案中，RSPO 1与LGR5-表达细胞上的LGR5的相互作用抑制抗体与LGR5的结合不超过20％。优选在其中抗体和RSPO 1以0.1或更小的摩尔比；优选地以介于0.1至0.001之间的摩尔比(包括端值在内)，优选地0.1至0.01的摩尔比(包括端值在内)存在的条件下，测量抗体对LGR5的结合的抑制。
优选在抗体和RSPO 1以0.1或更小的摩尔比；优选地以介于0.1至0.01之间的摩尔比(包括端值在内)存在时，测量结合的抑制。据发现小于0.001的抗体与RSPO的摩尔比有时可减少抗体对LGR5的结合。
当本文提及抗体与RSPO的摩尔比时，优选抗体以产生当存在饱和量抗体时所实现的结合的40％-80％的量存在。
本发明还提供一种抗体，其包含可变结构域，所述可变结构域可结合人EGFR的细胞外部分上的表位，其中氨基酸残基I462；G465；K489；I491；N493；和C499参与抗体对表位的结合。优选抗体为特征在于抗体对EGFR的结合由EGFR减少的抗体，其中已经引入选自I462A；G465A；K489A；I491A；N493A；和C499A中的氨基酸残基取代中的一种或多种。
本发明还提供一种抗体，其包含可结合人EGFR的细胞外部分上的表位的可变结构域，所述表位位于图40所示的SEQ ID NO：2的氨基酸残基420-480内，并且其中抗体对LGR5的结合通过以下氨基酸残基取代中的一种或多种减少：I462A；G465A；K489A；I491A；N493A；和C499A。抗体对人EGFR的结合干扰EGF对受体的结合。EGFR上的表位为构象表位。
表位位于图40所示的SEQ ID NO：2的氨基酸残基420-480内，优选地位于图40所示的SEQ ID NO：2的氨基酸残基430-480内；优选地位于图40所示的SEQ ID NO：2的438-469内。
抗体优选包含其它可变结构域，所述其它可变结构域可结合其它蛋白质。其它蛋白质优选为包括细胞外部分的膜蛋白。其它蛋白质优选为WNT-途径的膜缔合成员。
抗体通常为双特异性抗体。
结合人EGFR的可变结构域优选为具有重链可变区的可变结构域，所述重链可变区至少包含如图1所示的MF3755的VH的CDR3序列，或与如图1所示的MF3755的VH的CDR3序列在最多三个、优选地最多两个、优选地不超过一个氨基酸上不同的CDR3序列。
结合人EGFR的可变结构域优选为具有重链可变区的可变结构域，所述重链可变区至少包含如图1所示的MF3755的VH的CDR1、CDR2和CDR3序列；或者，具有最多三个、优选地最多两个、优选地最多一个氨基酸取代的如图1所示的MF3755的VH的CDR1、CDR2和CDR3序列。
结合人EGFR的可变结构域优选为具有重链可变区的可变结构域，所述重链可变区包含如图1所示的MF3755的VH链的序列；或者如图1所述的VH链MF5816的氨基酸序列，所述氨基酸序列关于MF3755的VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
其它蛋白质优选为LGR4；LGR5；LGR6；RNF43或ZNRF3，优选地LGR5。
本发明还提供一种双特异性抗体，其包含可结合EGFR的细胞外部分上的表位的可变结构域和可结合其它蛋白质的可变结构域，其中所述EGFR表位位于图40所示的SEQ IDNO：2的氨基酸残基420-480内，所述氨基酸残基I462；G465；K489；I491；N493；和C499参与抗体对表位的结合。可变结构域与EGFR的结合优选由以下氨基酸残基取代中的一种或多种减少：I462A、G465A；K489A；I491A；N493A；和C499A。其它蛋白质优选为包括细胞外部分的膜蛋白，优选为WNT-途径的膜缔合成员，优选为LGR5。
不受理论的约束，据信表位的接触残基，即可变结构域接触人EGFR的位置可能是I462；K489；I491；和N493。氨基酸残基G465和C499可能间接参与抗体与EGFR的结合，可能因为通过取代进入丙氨酸中的突变诱导表位的(轻微)构象改变，从而导致与表位的结合减少。
已经示出当用于抑制EGFR配体响应性癌症或细胞的生长时，包含结合具有提及的表位的EGFR的一个或多个可变结构域的抗体具有更好的功效。在双特异性抗体的情况下，包括具有提及的表位的EGFR结合可变结构域的抗体臂与包含结合其它细胞表面蛋白的细胞外部分的可变结构域的多种其它臂更好地组合。
具体实施方式
本发明公开了一种蛋白质，所述蛋白质结合表皮生长因子(EGF)受体家族的膜缔合成员的细胞外部分和WNT信号传导途径的膜缔合成员的细胞外部分。此类蛋白质也被称为“本发明的蛋白质”。
在一个优选的实施方案中，本发明的蛋白质为抗体(或抗体部分、衍生物或类似物，如本申请的其它地方所述的)、抗体模拟物、多肽、核酸配体或它们的组合。这些蛋白质或核酸配体通常结合到一个靶上。本发明的蛋白质结合两个靶。应当理解这些抗体、抗体模拟物、多肽和核酸配体的任何组合可通过本领域已知的方法连接在一起。例如，在一些实施方案中，本发明的蛋白质为缀合物或融合蛋白。就抗体而言，制备多特异性抗体的技术已经进展到还包括双特异性抗体，其具有与正常单特异性抗体相同的总体结构，但其中抗体的两个臂各自结合不同的靶。
抗体模拟物为多肽，与抗体相同，其可特异性结合抗原，但在结构上与抗体不相关。抗体模拟物通常为人工肽或蛋白质，摩尔质量为约3kDa至20kDa。优于抗体的共同优点是更好的溶解度、组织渗透、针对热和酶的稳定性、以及相对低生产成本。抗体模拟物的非限制性示例为亲和分子(通常基于蛋白质A的Z结构域)；亲和素(通常基于γ-B结晶或泛素)；affimer(通常基于半胱氨酸蛋白酶抑制剂)；affitin(通常基于来自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的Sac7d)；α体(通常基于三重螺旋卷曲螺旋)；anticalin(通常基于脂质运载蛋白)；avimer(通常基于各种膜受体的A结构域)DARPin(通常基于锚蛋白重复基序)；fynomer(通常基于Fyn 7的SH3结构域)；kunitz结构域肽(通常基于各种蛋白酶抑制剂的Kunitz结构域)；和单体(通常基于纤粘蛋白的III型结构域)。
单体是合成的结合蛋白，其使用纤连蛋白III型结构域(FN3)作为分子支架来构造。单体是用于形成靶向结合蛋白质的抗体的简单且稳健的替代形式。术语“单体”由Koide集团于1998年创造出来，其发表了使用人纤粘蛋白的第十FN3结构域证明单体概念的第一篇论文。
单体和其它抗体模拟物通常由组合库形成，其中使用分子展示和定向进化技术(例如噬菌体展示、mRNA展示和酵母表面展示)使支架的部分多样化。大量抗体模拟物具有对其相应靶的高亲和力和高特异性。
核酸配体是与特定靶分子结合的寡核苷酸或肽分子。核酸配体通常通过从大随机序列库中选择它们而形成，但天然的核酸配体也存在于核糖开关中。核酸配体可以大分子形式用于基础研究和临床目的。
如本文所用，术语“缀合物”是指已经任选地通过连接区共价接合的两个或更多个分子。例如，在一些实施方案中，缀合物是通过连接区连接至第二蛋白质或非蛋白质部分的第一蛋白质或非蛋白质部分。例如，在本发明蛋白质的一些实施方案中，其包括或由两种或更多种已经共价接合的抗体组成。缀合物不限于第一部分和第二部分，但在一些实施方案中，也可具有通过其它连接区接合的第三、第四或更多部分。如本专利申请的其它地方所述，蛋白质部分的示例包括但不限于：多肽、拟肽或抗体(或如本专利申请的其它地方所述的抗体部分、衍生物或类似物)。非蛋白质部分的示例包括但不限于核酸配体。可使用多种类型的连接子，并且根据缀合物中的分子类型和连接子的期望特性(长度、柔性、对蛋白酶活性的抗性和其它类似特性)，连接子将被选择为合适的。此类连接子可包括核苷酸、多肽、或适宜的合成材料。例如，连接子可以为柔性肽连接子。在某些实施方案中，连接子可以为可裂解连接子，其使得缀合物的部分彼此分离。在其它实施方案中，肽连接子可以为螺旋连接子。用于连接蛋白质和其它分子的各种示例和试剂盒在本领域中为人们所熟知。如本文所用，术语“融合蛋白”是指包括两个或更多个多肽的蛋白质，或者通过重组在DNA水平上连接并且作为单个多肽一起表达的蛋白质。融合蛋白还可包括肽连接区，其也由DNA编码并且与融合蛋白一起表达。作为融合蛋白的一部分的肽连接子可被设计成具有特定特性，诸如柔性、亲水性、蛋白酶抗性、可裂解性等。所有这些性质均可设计在DNA序列中，并且设计连接子的方法在本领域中为人们所熟知。例如，抗体可通过本领域中熟知的方法连接在一起，并且如本文所述，形成双特异性抗体或多靶向抗体。另外，双特异性抗体可通过本领域已知的各种方法构造，例如通过使用诸如的技术。双特异性单克隆抗体(BsMAb、BsAb)通常包括两种不同单克隆抗体的结合结构域，并且因此结合两个不同的表位。分子，而且另外其它全长IgG双特异性抗体具有两种不同的抗原结合特异性，所述结合特异性由scFv的Fab的全长IgG分子的两个不同可变区编码。可通过用编码两个不同的共同轻链(cLC)抗体的基因构建体共转染个体细胞来产生，如本文其它地方详述的。CH3工程化确保有效的异源二聚反应和基本上纯的特异性抗体的形成。在一些实施方案中，本发明的蛋白质抑制细胞、细胞组、组织或肿瘤中信号传导的量为可用于本发明的蛋白质的预期目的的量，例如，如本领域已知的测定中所测量的，相比于由中性物质或阴性对照诱导的信号传导，可将这些应答中的任一个或多个的诱导减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、优选地40％、45％、50％、55％、60％、更优选地70％、80％、85％、并且最优选地90％、95％、99％或100％。
本发明的蛋白质优选包含抗体或其部分、衍生物或类似物。本发明的蛋白质优选为双特异性抗体。
抗体通常通过所谓的抗原结合位点结合其靶。未修饰的抗原结合位点通常由抗体的可变结构域形成并存在于抗体的可变结构域中。可变结构域包含所述抗原结合位点。结合抗原的可变结构域为包含结合抗原的抗原结合位点的可变结构域。
在一个实施方案中，抗体可变结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。抗原结合位点可以存在于组合的VH/VL可变结构域中，或仅存在于VH区域中或仅存在于VL区域中。当抗原结合位点仅存在于可变结构域的两个区域中的一个中时，对应的可变区可有助于结合可变区的折叠和/或稳定性，但不显著有利于抗原本身的结合。
如本文所用，抗原结合是指抗体与其抗原的典型结合能力。抗体与抗原的结合可以各种方式评估。一种方式是将抗体与抗原(优选地表达抗原的细胞)一起温育，去除未结合的抗体(优选通过洗涤步骤)，并使用结合经结合抗体的标记抗体检测经结合的抗体。
通过抗体结合抗原通常通过抗体的互补决定区(CDR)来介导，并且抗原和可变结构域两者的特异性三维结构允许这两种结构精确地结合在一起(类似于锁和钥匙的相互作用)，与蛋白质的随机、非特异性粘附相反。因为抗体通常识别被称为抗原表位的抗原部分，并且因为此类表位也可存在于其它化合物中，所以如果此类其它化合物含有相同的表位，则根据本发明的抗体也可识别其它蛋白质。因此，术语“结合”不排除抗体与另一种或多种包含相同表位的蛋白质的结合。此类一种或多种其它蛋白质优选不是人蛋白质。
本发明的蛋白质诸如抗体通常不与除了出生后，优选地成人细胞膜上的特异性靶蛋白之外的其它蛋白质结合。
包含结合到表皮生长因子(EGF)受体家族的一个膜缔合成员的细胞外部分的抗原结合位点的本发明抗体结合到特异性膜，并且在其它相同条件下，是相同物种的EGF受体家族的另一个成员的细胞外部分的至少1/100。例如，包含结合ErbB-1的抗原结合位点的抗体结合ErbB-1，并且在其它相同的条件下，是相同物种的同源受体ErbB-2(HER2)、ErbB-3(HER3)和ErbB-4(HER4)的至少1/100。包含结合ErbB-2的抗原结合位点的抗体结合ErbB-2，并且在其它相同的条件下，是相同物种的同源受体ErbB-1、ErbB-3和ErbB-4的至少1/100。包含结合ErbB-3的抗原结合位点的抗体结合ErbB-3，并且在其它相同的条件下，是相同物种的同源受体ErbB-1、ErbB-2和ErbB-4的至少1/100。包含结合ErbB-4的抗原结合位点的抗体结合ErbB-4，并且在其它相同的条件下，是相同物种的同源受体ErbB-1、ErbB-2和ErbB-3的至少1/100。当然，当抗体被设计成结合到家族的两个或更多个成员时，对两个或更多个成员的结合可以基本上相同。在本发明中，优选相应的抗体各自结合到家族的仅一个成员。考虑到ErbB-家族是细胞表面受体的家族，结合通常在表达其细胞表面上的受体的细胞上评估。
本发明的抗体优选干扰EGF受体家族的成员的配体的结合。如本文所用，术语“干扰结合”是指抗体与EGF受体家族成员的结合竞争配体对EGF受体家族成员的结合，抗体和减弱配体结合，当其已经结合到EGF受体家族的成员时置换配体，或其可例如通过空间位阻，至少部分地阻止配体能够结合到EGF受体家族的成员。
本发明的EGFR(ErbB1)或HER3(ErbB3)结合蛋白，优选地本发明的抗体优选分别抑制EGFR配体或HER3配体诱导的信号传导，如BxPC3细胞(ATCC CRL-1687)或BxPC3-luc2细胞(Perkin Elmer 125058)的配体诱导的生长或A431细胞(ATCC CRL-1555)的配体诱导的细胞死亡所测量的。相比于在中性物质或阴性对照的存在下的配体诱导效应，提及的EGFR或HER3结合蛋白可将配体诱导的信号传导减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、优选地40％、45％、50％、55％、60％、更优选地70％、80％、85％、并且最优选地90％、95％、99％，或100％，如本领域已知的测定中所测量的。EGFR和ErbB-3各自可结合多个配体并刺激所提及的BxPC3细胞或BxPC3-luc2细胞的生长。在一个或两个受体的配体的存在下，刺激BxPC3或BxPC3-luc2细胞的生长。BxPC3细胞的EGFR和/或ErbB-3配体诱导的生长可通过比较配体不存在或存在的情况下细胞的生长来测量。用于测量BxPC3或BxPC3-luc2细胞的EGFR配体诱导生长的优选的EGFR配体是EGF。用于测量BxPC3或BxPC3-luc2细胞的ErbB-3配体诱导生长的优选的ErbB-3配体是NRG1。配体诱导的生长优选使用饱和量的配体来测量。在一个优选的实施方案中，EGF的用量为100ng/ml培养基。NRG1优选以10ng/ml培养基使用。EGF和NRG1优选为R&D体系的EGF和NRG1，目录号396-HB和236-EG，如实施例中所述。测定本发明的蛋白质或抗体是否以二价形式抑制信号传导，优选如本文所述的方法利用单特异性一价或二价型式的蛋白质或抗体进行。换句话讲，只有具有信号传导的受体的结合位点的蛋白质或抗体待测定。就抗体而言，其可以为二价单特异性抗体，其中抗原结合可变结构域由结合EGF-受体家族成员的可变结构域组成。
本发明的EGFR或HER3结合蛋白，优选地本发明的抗体优选分别抑制EGFR配体或HER3配体，诱导BxPC3细胞(ATCC CRL-1687)或BxPC3-luc2细胞(Perkin Elmer 125058)的生长。相比于由中性物质或阴性对照诱导的配体诱导生长，提及的EGFR或HER3结合蛋白可将配体诱导的生长信号传导减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、优选地40％、45％、50％、55％、60％、更优选地70％、80％、85％、并且最优选地90％、95％、99％，或100％，如本领域已知的测定中所测量的。EGFR和ErbB-3各自可结合多个配体并刺激所提及的BxPC3细胞或BxPC3-luc2细胞的生长。在一个或两个受体的配体的存在下，刺激BxPC3或BxPC3-luc2细胞的生长。BxPC3细胞的EGFR和/或ErbB-3配体诱导的生长可通过比较配体不存在或存在的情况下细胞的生长来测量。用于测量BxPC3或BxPC3-luc2细胞的EGFR配体诱导生长的优选的EGFR配体是EGF。用于测量BxPC3或BxPC3-luc2细胞的ErbB-3配体诱导生长的优选的ErbB-3配体是NRG1。配体诱导的生长优选使用饱和量的配体来测量。在一个优选的实施方案中，EGF的用量为100ng/ml的培养基。NRG1优选以10ng/ml培养基使用。EGF和NRG1优选为R&D体系的EGF和NRG1，登录号396-HB和236-EG，如实施例中所述。
EGF-受体家族配体优选为EGFR或HER3受体配体。如本文所用，“HER3或ErbB-3配体”是指结合并激活ErbB-3的多肽。ErbB-3配体的示例包括但不限于神经调节蛋白1(NRG1)和神经调节蛋白2(NRG2)(参见Olayioye MA等人；EMBO J(2000)，第19卷：第3159-3167页)。该术语优选包括天然存在的多肽的生物活性片段和/或变体。如本文所用，“HER3或ErbB-1配体”是指结合并激活EGFR的多肽。EGFR配体的示例包括但不限于EGF、TGF-α、HB-EGF、双调蛋白、β细胞素和上皮调节蛋白(参见Olayioye MA等人；EMBO J(2000)，第19卷：第3159-3167页)。该术语优选包括天然存在的多肽的生物活性片段和/或变体。
包含结合到WNT信号传导途径的膜缔合成员的细胞外部分的抗原结合位点的本发明抗体结合到特异性膜，并且在其它相同条件下，是不为相同物种(诸如胰岛素样生长因子1(IGF-1)受体)的WNT信号传导途径的成员的另一膜相关蛋白的细胞外部分的至少1/100。包含结合LGR5的抗原结合位点的抗体结合LGR5，并且在其它相同的条件下，是相同物种的IGF-1受体的细胞外部分的至少1/100。。包含结合LGR4的抗原结合位点的抗体结合LGR4，并且在其它相同的条件下，是相同物种的IGF-1受体的至少1/100。包含结合RNF43的抗原结合位点的抗体结合RNF43，并且在其它相同的条件下，是相同物种的IGF-1受体，LGR4或LGR5的至少1/100。包含结合ZNRF3的抗原结合位点的抗体结合ZNRF3，并且在其它相同的条件下，是相同物种的IGF-1受体或RNF43的至少1/100。当然，当抗体被设计成结合到家族的两个或更多个成员时，对两个或更多个成员的结合可以基本上相同。例如，结合LGR5的抗体中的一些可结合相同物种的LGR4，并且反之亦然。在一个优选的实施方案中，包含结合到WNT信号传导途径的膜缔合成员的细胞外部分的抗原结合位点的本发明抗体结合到特异性膜，并且在其它相同条件下，是不为相同物种的家族的另一膜缔合的细胞外部分的至少1/100。包含结合LGR5的抗原结合位点的抗体结合LGR5，并且在其它相同的条件下，是结合相同物种的LGR4的至少1/10，并且优选地至少1/100。包含结合LGR4的抗原结合位点的抗体结合LGR4，并且在其它相同的条件下，是结合相同物种的LGR5的至少1/10，并且优选地至少1/100。在本发明中，优选的是相应抗体各自结合到家族的仅一个成员。在本发明的上下文中，优选的WNT信号传导途径的成员为LRP5、LRP6、LGR4、LGR5、LGR6、FRZ1、FRZ2、FRZ3、FRZ4、FRZ5、FRZ6、FRZ7、FRZ8、FRZ9、FRZ10、ZNRF3、RNF43、N-钙黏蛋白、Kremen1和Kremen2、ROR2/RYK)。考虑到该列表的成员是细胞表面受体，结合通常在表达其细胞表面上的受体的细胞上评估。
如本文所用，术语“抗体”是指蛋白质分子，优选地属于蛋白质的免疫球蛋白类别，其包含结合抗原上的表位的一个或多个可变结构域，其中此类结构域衍生自抗体的可变结构域或共享与抗体的可变结构域的序列同源性。用于治疗应用的抗体优选尽可能地接近待治疗的受试者的天然抗体(例如，对于人受试者而言，人抗体)。可根据特异性和亲和性来表达抗体结合。特异性决定哪个抗原或其表位被结合结构域特异性结合。亲和性是对特定抗原或表位的结合强度的量度。特异性结合被定义为以1x10e-6 M，更优选1x10e-7 M的亲和力，更优选以高于1x10e-9 M的亲和力(KD)结合。通常，用于治疗应用的抗体具有最高至1x10e-10 M或更高的亲和力。诸如本发明的双特异性抗体的抗体通常包含天然抗体的恒定结构域(Fc部分)。本发明的抗体通常是双特异性全长抗体，优选地人IgG亚类。本发明的抗体优选为人IgG1亚类。本发明的此类抗体具有良好的ADCC特性，如果需要，其可通过本领域已知技术增强，在体内施用给人时具有有利的半衰期，并且现有CH3工程化技术可提供在克隆细胞中共表达时比同源二聚体优先形成异源二聚体的经修饰的重链。
本发明的抗体优选为“全长”抗体。根据本发明的术语“全长”定义为包含基本上完整的抗体，然而其不一定具有完整抗体的全部功能。为避免疑义，全长抗体包含两条重链和两条轻链。每条链包含恒定(C)和可变(V)区域，其可分解为命名为CH1、CH2、CH3和VH的重链结构域和命名为CL、VL的轻链结构域。抗体经由包含在Fab片段部分中的可变结构域结合到抗原。抗体可通过恒定结构域，主要通过Fc部分与免疫系统的分子和细胞相互作用。
术语“可变结构域”、“VH/VL对”、“VH/VL”在本文互换使用。根据本发明的全长抗体包括其中可存在突变的抗体，所述突变提供所需特性或仅是原始链中的突变的替代物。此类突变应当不是任何区域的大部分的缺失。然而，其中一个或多个氨基酸残基缺失，但基本上不改变所得抗体的结合特性的抗体涵盖在术语“全长抗体”内。例如，IgG抗体在恒定区中可具有1-20个氨基酸残基插入、缺失或它们的组合。例如，当抗体本身具有低ADCC活性时，通过稍微修饰抗体的恒定区可改善抗体的ADCC活性(Junttila，T.T.，K.等人(2010).Cancer Research 70：4481-4489)。有时也进行改变以改善储存或生产或去除C-端赖氨酸(Engineered therapeutic antibodies with improved effector functions.Kubota T，Niwa R，Satoh M，Akinaga S，Shitara K，Hanai N)。改善抗体的ADCC活性的另一种方式是通过酶促干扰糖基化途径从而导致岩藻糖减少(Von Horsten等人，(2010).Glycobiology20：1607-1618)。存在多种用于测定抗体或效应细胞在引发ADCC方面的功效的体外方法。这些方法中为铬-51[Cr51]释放测定、铕[Eu]释放测定和硫-35[S35]释放测定。通常，将表达某种表面暴露抗原的标记靶细胞系与对该抗原特异性的抗体一起温育。洗涤后，将表达Fc受体CD16的效应细胞与抗体标记的靶细胞共温育。随后通过闪烁计数器或分光光度计通过释放细胞内标记来测量靶细胞裂解。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体可以是无岩藻糖基化的。当与正常CHO细胞中产生的相同抗体相比时，本发明的双特异性抗体优选在Fc区中包含含量减少的N-键合的碳水化合物结构的岩藻糖基化。
全长IgG抗体是优选的，因为它们具有有利的半衰期并且由于免疫原性的原因需要保持接近全自体同源的(人)分子。本发明的抗体优选为双特异性IgG抗体，优选地双特异性全长IgG1抗体。基于其在人类中的长循环半衰期，IgG1是有利的。为了防止人类的任何免疫原性，优选根据本发明的双特异性IgG抗体是人IgG1。
术语“双特异性”(bs)意指抗体的一部分(如上所定义)结合抗原上的一个表位，而第二部分结合相同抗原或不同抗原上的不同表位。不同的表位通常存在于不同的抗原上。然而，不同的表位也可以存在于相同的抗原上。根据本发明，所述第一抗原和第二抗原实际上是两种不同的蛋白质。优选的双特异性抗体是包含两种不同单克隆抗体的部分并因此可以结合两种不同类型的抗原的抗体。取决于由双特异性抗体识别的两种抗原的表达水平，(亚)细胞定位和化学计量，抗体的两个Fab臂可以或不可以同时结合其表位。双特异性抗体的一个臂通常包含一个抗体的可变结构域，并且另一个臂包含另一个抗体的可变结构域(即，双特异性抗体的一个臂由与一个轻链配对的一个重链形成，然而其它臂由与轻链配对的不同重链形成)。本发明的双特异性抗体的重链可变区通常彼此不同，然而轻链可变区优选在本发明的双特异性抗体中相同。其中不同重链可变区与相同或共同轻链缔合的双特异性抗体也被称为具有共同轻链(cLC)的双特异性抗体。因此，本发明还提供根据本发明的双特异性抗体，其中两个臂均包含共同的轻链。
优选的双特异性抗体可以通过在单个细胞中共表达两个不同的重链和共同的轻链来获得。当使用野生型CH3结构域时，两种不同重链(A和B)和共同轻链的共表达将产生三种不同的抗体物质AA、AB和BB。AA和BB是两种单特异性二价抗体的命名，AB是双特异性抗体的命名。为增加期望的双特异性产物(AB)的百分比，可以使用CH3工程化，或换句话讲，可使用具有相容的异源二聚化结构域的重链，如下文所定义的。
如本文所用，术语“相容性异源二聚化结构域”是指被工程化使得工程化结构域A’将优先与工程化结构域B’形成异源二聚体，反之亦然，然而A’-A’与B’-B’之间的同源二聚化减少的蛋白质结构域。
如本文所述，双特异性抗体优选包含共同的轻链。根据本发明的术语“共同轻链”是指可以一致的或具有一些氨基酸序列差异然而全长抗体的结合特异性不受影响的轻链。例如，在如本文所用的共同轻链的定义范围内可能的是，例如通过引入和测试保守性氨基酸改变，制备或找到不一致但仍然在功能上等同的轻链，当与重链配对时区域中氨基酸改变不有助于或仅部分有助于结合特异性等。在添加或不添加术语“重排”的情况下，术语“共同轻链”、“共同VL”、“单个轻链”、“单个VL”均可在本文中互换使用。本发明的一个方面是将人轻链用作共用轻链，所述人轻链可与不同重链组合以形成具有功能性抗原结合结构域的抗体(WO2004/009618、WO2009/157771，Merchant等人，1998和Nissim等人，1994)。优选地，共同轻链具有种系序列。优选的种系序列是经常用于人类库中的轻链可变区，并且具有良好的热力学稳定性、产量和溶解度。优选的种系轻链是O12，优选地重排种系人类k轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01(图3)或其片段或功能等同物(即相同的IgVκ1-39基因链段但不同的IGJκ基因链段)(根据imgt.org的IMGT数据库全球网站命名)。然而，相同的原理也适用于λ轻链，并且因此也在本发明的上下文中提供。因此，本发明还提供根据本发明的双特异性抗体，其中所述共同轻链为种系轻链，优选地重排的种系人类κ轻链，其包含IgVK1-39基因链段，最优选地重排的种系人类κ轻链IgVK1-39*01/IGJK1*01(图3)。术语重排的种系人类κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01、IGKV1-39/IGKJ1、huVκ1-39轻链或简称huVκ1-39、或简称1-39在整个申请中可互换使用。显然，本领域技术人员将认识到“共同”还是指氨基酸序列不一致的轻链的功能性等同物。存在所述轻链的许多变体，其中存在不实质上影响功能性结合区形成的突变(缺失、取代、添加)。本发明的轻链也可以是如上文规定的轻链，其具有1-20个，优选地1-5个氨基酸的插入、缺失、取代或它们的组合。
另外设想其中VH能够特异性识别第一抗原，并且与免疫球蛋白可变结构域中的VH配对的VL能够特异性识别第二抗原的抗体。所得的VH/VL对将结合抗原1或抗原2。在例如WO2008/027236、WO2010/108127和Schaefer等人(2011 Cancer Cell 20，472-486)中所述的此类所谓的“二合一抗体”不同于本发明的双特异性抗体并且进一步被称为“二合一”抗体。
抗体的一部分是抗原结合部分，并且通常包含抗体的可变结构域。部分也可以是所谓的单结构域抗体片段。单结构域抗体片段(sdAb，被开发者Ablynx称为纳米抗体)是具有单个单体可变抗体结构域的抗体片段。如同整个抗体，其能够选择性结合特异性抗原。在分子量仅12kDa-15kDa的情况下，单结构域抗体片段比由两条重蛋白链和两条轻链构成的常见抗体(150kDa-160kDa)小得多，并且甚至小于Fab片段(～50kDa，一条轻链和半条重链)和单链可变片段(～25kDa，两个可变结构域，一个来自轻链且另一个来自重链)。单结构域抗体本身并不比正常抗体(通常为90kDa-100kDa)小得多。单结构域抗体片段大部分由存在于骆驼科中的重链抗体工程化；这些被称为VHH片段。某些鱼类也具有仅重链的抗体(IgNAR，“免疫球蛋白新抗原受体”)，由此可获得被称为VNAR片段的单结构域抗体片段。另一种方法是使来自人类或小鼠的常见免疫球蛋白G(IgG)的二聚体可变结构域分裂成单体。尽管目前大部分对单结构域抗体的研究均基于重链可变结构域，但是来源于轻链的纳米抗体也示出与靶表位特异性结合。抗体部分的非限制性示例包含抗体或其等同物的重链和/或轻链的可变结构域。此类部分的非限制性示例是VHH、人结构域抗体(dAbs)和Unibodies。优选的抗体部分或衍生物至少具有抗体或其等同物的重链和轻链的可变结构域。此类结合分子的非限制性示例是F(ab)-片段和单链Fv片段。双特异性抗体的功能部分包含双特异性抗体的抗原结合部分，或所述结合部分的衍生物和/或类似物。如上所述，抗体的结合部分包含于可变结构域中。
抗体的衍生物是一种蛋白质，但CDR区域的最多20个氨基酸偏离天然抗体的氨基酸序列。如本文所公开的抗体的衍生物是最多20个氨基酸偏离所述氨基酸序列的抗体。
本发明的蛋白质所结合的优选的WNT途径的膜缔合成员为LRP5、LRP6、LGR4、LGR5、LGR6、FRZ1、FRZ2、FRZ3、FRZ4、FRZ5、FRZ6、FRZ7、FRZ8、FRZ9、FRZ10、ZNRF3、RNF43、N-钙黏蛋白、Kremen1和Kremen2、ROR2、RYK。从该列表中，优选在WNT途径中具有活性的LGR家族的膜缔合成员，具体地讲LGR4、LGR5和LGR6。在一个优选的实施方案中，LGR家族的膜缔合成员是LGR4或LGR5，具体地讲LGR5。经典WNT途径的其它优选的膜缔合成员为ZNRF3和RNF43。
已经证实小鼠Lgr4、Lgr5和Lgr6是R-脊椎蛋白(R-s脊椎1-4)的高亲和力受体，从而导致Wnt受体Lrp5/6的磷酸化增加以及b-连环蛋白的稳定化但不涉及G-蛋白信号传导(Carmon，K.S.等人，(2011).Proc Natl Acad Sci USA 108，11452-11457；de Lau，W.等人，(2011)Nature 476，293-297)。R-脊椎蛋白是更大的蛋白质家族的成员，其特征在于存在血小板反应蛋白重复序列(TSR)。R-脊椎蛋白还包含N-端富含半胱氨酸的弗林蛋白酶重复序列，其需要运用Wnt-增强活性，如通过b-连环蛋白稳定化和Wnt/卷曲蛋白共受体Lrp6的磷酸化所测量的(Kim等人，(2005))。在人结肠癌症的子集中已经报道了增加功能性R-脊椎蛋白表达水平的基因融合(Seshagiri，S.等人，(2012).Nature 488，660-664)。虽然Lgr-R-脊椎蛋白复合物的感知到的作用是调节通过Lrp-卷曲蛋白-wnt受体复合物的信号传导，但目前的模型表明Igr-R-脊椎蛋白复合物本身通过高度同源的E3连接酶Rnf43和ZNRF3经受调节。具体地，Lgr4、Lgr5和Lgr6受体用于有效地募集R-脊椎蛋白配体并将其带到与Rnf43/Znrf3相互作用的位置中，其还包含R-脊椎蛋白结合位点(de Lau，W.，等人(2014).GenesDev 28，305-316)。该相互作用导致Rnf43或Znrf3的膜清除，从而导致表面卷曲蛋白受体的持久性，并且增加wnt信号强度(de Lau等人(2014).Genes Dev 28，305-316)并且富集于结肠癌症中(Hao，H.-X.等人，(2012)Nature 485，195-200)。
WNT途径的膜缔合成员在经典途径中是活性的，取决于具体的成员，其在非经典途径中也可以是活性的，反之亦然。
人表皮生长因子(EGF)受体家族(HER)具有四个成员：ErbB(成红细胞瘤)-1、ErbB-2、ErbB-3和ErbB-4。表皮生长因子(EGF)受体(EGFR、ErbB1或HER1)是四种受体酪氨酸激酶(RTK)家族的成员，称为Her-或cErbB-1、-2、-3和-4。ErbB-1也以各种同义词已知，其中最常见的是EGFR。EGFR具有由四个亚结构域构成的细胞外结构域(ECD)，其中两个参与配体结合，并且其中两个参与同源二聚化和异源二聚化。EGFR整合来自各种配体的细胞外信号以产生各种不同的细胞内应答。由EGFR激活的主要信号转导途径由Ras-分裂素活化蛋白激酶(MAPK)有丝分裂信号级联构成。该途径的激活通过将Grb2募集到酪氨酸磷酰化的EGFR来引发。这导致Ras通过Grb2结合的Ras-鸟嘌呤核苷酸交换因子(SOS)激活。此外，PI3-激酶-Akt信号转导途径也通过EGFR激活，但该激活在存在ErbB-3(HER3)共表达的情况下更强。EGFR涉及多种人类上皮恶性肿瘤，值得注意的是乳腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、头颈癌和脑癌。已经发现激活基因中的突变以及受体及其配体的过表达，产生自分泌激活循环。该RTK因此广泛用作癌症治疗的靶标。已经开发了靶向RTK的小分子抑制剂和针对细胞外配体结合结构域的单克隆抗体(mAb)并且迄今为止已经示出多项临床成功，虽然大部分针对一组选择的患者。人EGFR蛋白和编码其的基因的数据库登录号是(基因库NM_005228.3)。该登录号主要用于提供鉴定作为靶标的EGFR蛋白质的其它方法，由抗体结合的EGFR蛋白质的实际序列可有所不同，例如由于编码基因中的突变，例如在一些癌症中发生的那些等。词语癌症和肿瘤在本文中使用并且除非另外特别说明，两者通常均指癌症。
在本文提及EGFR时，除非另行指出，否则该提及是指人EGFR。结合EGFR的抗原结合位点，结合EGFR及其多种变体，诸如在一些EGFR阳性肿瘤上表达的那些。
如本文所用，术语“ErbB-3”是指在人类中由ERBB3基因编码的蛋白质。基因或蛋白质的替代名称为：HER3；LCCS2；MDA-BF-1；c-ErbB-3；c-ErbB3；ErbB3-S；p180-ErbB3；p45-sErbB3；和p85-sErbB3。在本文提及ErbB-3时，所述提及是指人ErbB-3。包含结合ErbB-3的抗原结合位点的抗体结合人ErbB-3。由于人和其它哺乳动物直系同源物之间的序列和三级结构相似性，ErbB-3抗原结合位点也可结合此类直系同源物，但不一定如此。人ErbB-3蛋白质和编码它的基因的数据库登录号为(NP_001005915.1、NP_001973.2、NC_000012.11、NC_018923.2、NT_029419.12)。所述登录号主要用于提供鉴定作为靶标的ErbB-3的其它方法，由抗体结合的ErbB-3蛋白质的实际序列可有所不同，例如由于编码基因中的突变，例如在一些癌症中发生的那些等。ErbB-3抗原结合位点结合ErbB-3及其多种变体，诸如由一些ErbB-3阳性肿瘤细胞表达的变体。结合ErbB-3的抗原结合位点优选结合ErbB-3的结构域III。如本文提及的，作为本发明蛋白质或本发明双特异性抗体的靶的EGF受体家族成员优选为表皮生长因子受体Erbb-1(EGFR)、ErbB-3或ErbB-4。在一个优选的实施方案中，EGF受体家族成员为ErbB-1或ErbB-3。
术语“LGR”是指被称为含富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体的蛋白质家族。已知该家族的多个成员参与WNT信号传导途径，值得注意的是LGR4；LGR5和LGR6。
LGR4为含富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4，基因或蛋白质的另选的名字为：GPR48；G-蛋白偶联受体48；BNMD17；含富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4；含富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4；G-蛋白偶联受体48；
结合LGR4的本发明蛋白质或抗体结合人LGR4。由于人和其它哺乳动物直系同源物之间的序列和三级结构相似性，本发明的LGR4结合蛋白质或抗体也结合此类直系同源物，但不一定如此。人LGR4蛋白质和编码其的基因的数据库登录号为(NC_000011.10；NC_018922.2；NT_009237.19；NP_060960.2)。所述登录号主要用于提供鉴定作为靶标的LGR4的其它方法，被结合的LGR4蛋白质的实际序列可有所不同，例如由于编码基因中的突变，例如在一些癌症中发生的那些等。LGR4抗原结合位点结合LGR4及其多种变体，诸如由一些LGR4阳性肿瘤细胞表达的变体。
LGR5为含富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5，基因或蛋白质的另选的名字为含富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5；含富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5；G-蛋白偶联受体HG38；G-蛋白偶联受体49；G-蛋白偶联受体67；GPR67；GPR49；孤儿G蛋白偶联受体HG38；G-蛋白偶联受体49；GPR49；HG38和FEX。
结合LGR5的本发明蛋白质或抗体结合人LGR5。由于人和其它哺乳动物直系同源物之间的序列和三级结构相似性，本发明的LGR5结合蛋白质或抗体也结合此类直系同源物，但不一定如此。人LGR5蛋白质和编码它的基因的数据库登录号为(NC_000012.12；NT_029419.13；NC_018923.2；NP_001264155.1；NP_001264156.1；NP_003658.1)。所述登录号主要用于提供鉴定作为靶标的LGR5的其它方法，被结合的LGR5蛋白质的实际序列可有所不同，例如由于编码基因中的突变，例如在一些癌症中发生的那些等。LGR5抗原结合位点结合LGR5及其多种变体，诸如由一些LGR5阳性肿瘤细胞表达的变体。
ZNRF3为锌环状指样蛋白3。基因或蛋白质的另选的名字为锌环状指样蛋白3；锌/环状指样蛋白3；环状指样蛋白203；KIAA1133；RNF203；新型C3HC4型锌指样蛋白(环指样蛋白)；E3泛素-蛋白质连接酶ZNRF3；CTA-292E10.6；EC 6.3.2.；和BK747E2.3 3。
结合ZNRF3的本发明蛋白质或抗体结合人ZNRF3。由于人和其它哺乳动物直系同源物之间的序列和三级结构相似性，本发明的ZNRF3结合蛋白质或抗体也结合此类直系同源物，但不一定如此。人ZNRF3蛋白质和编码其的基因的数据库登录号为(NC_000022.11；NT_011520.13；NC_018933.2；NP_001193927.1；NP_115549.2)。所述登录号主要用于提供鉴定作为靶标的ZNRF3的其它方法，被结合的ZNRF3蛋白质的实际序列可有所不同，例如由于编码基因中的突变，例如在一些癌症中发生的那些等。ZNRF3抗原结合位点结合ZNRF3及其多种变体，诸如由一些ZNRF3阳性肿瘤细胞表达的变体。
RNF43为环状指样蛋白43。基因或蛋白质的另选的名字为环状指样蛋白43；RNF124；E3泛素-蛋白质连接酶RNF43；环状指样蛋白43；EC 6.3.2.；URCC。
结合RNF43的本发明蛋白质或抗体结合人RNF43。由于人和其它哺乳动物直系同源物之间的序列和三级结构相似性，本发明的RNF43结合蛋白质或抗体也结合此类直系同源物，但不一定如此。人RNF43蛋白质和编码它的基因的数据库登录号为(NC_000017.11；NT_010783.16；NC_018928.2；NP_001292473.1；NP_001292474.1；NP_060233.3)。所述登录号主要用于提供鉴定作为靶标的RNF43的其它方法，被结合的RNF43蛋白质的实际序列可有所不同，例如由于编码基因中的突变，例如在一些癌症中发生的那些等。NRF43抗原结合位点结合RNF43及其多种变体，诸如由一些RNF43阳性肿瘤细胞表达的变体。
胰岛素样生长因子1(IGF-1)受体以高亲和力结合胰岛素样生长因子。受体具有酪氨酸激酶活性。胰岛素样生长因子I受体在转化事件中起关键作用。前体的裂解产生α和β亚基。其在大多数恶性组织中过表达，其中通过增强细胞存活而用作抗凋亡剂。该蛋白以多个不同的名称已知，诸如IGF-I受体；EC 2.7.10.1；胰岛素样生长因子I受体；可溶性IGF1R；变体1；可溶性IGF1R变体2；CD221抗原；EC 2.7.10；CD221；IGFIR；JTK13；和IGFR。IGF1R的外部标识为HGNC：5465；Entrez基因：3480；Ensembl：NSG00000140443；OMIM：147370和UniprotKB：P08069。
本发明还提供一种用于抑制细胞生长的方法，所述细胞在允许细胞生长的系统中抑制表达表皮生长因子(EGF)受体家族的膜缔合成员和表达WNT途径的膜缔合成员，所述方法包括提供具有本发明的蛋白质或本发明的双特异性抗体的系统。细胞优选为表达WNT途径的膜缔合成员的EGF-受体配体响应性细胞。该系统优选为培养系统。所述方法优选包括在所述系统中培养所述细胞。
在本发明的上下文中，如果细胞包含编码WNT途径的膜缔合成员的可检测RNA，则认为细胞表达WNT途径的膜缔合成员。表达通常还可通过将细胞与结合到WNT途径的膜缔合成员的抗体一起温育来检测。然而，一些成员表达不足够高用于此类抗体测试，或对于一些成员，没有可用的特异性抗体。在这种情况下，优选mRNA检测。
在本文给出蛋白质/基因的登陆号或替代的名称的情况下，其主要用于提供鉴定作为靶标的所述蛋白质的其它方法，由抗体结合的靶蛋白的实际序列可有所不同，例如由于编码基因中的突变和/或可变剪接，诸如在一些癌症中发生的那些等。
本发明还提供了用于治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括向对其有需要的个体施用本发明的蛋白质或本发明的双特异性抗体。个体优选为患有癌症的个体。癌症优选为腺癌。优选的癌症为结肠直肠癌；胰腺癌；肺癌；乳腺癌；肝癌；前列腺癌；卵巢癌；宫颈癌；子宫内膜癌；头颈癌；黑色素瘤；睾丸癌；尿路上皮癌；肾癌；胃癌；或者良性肿瘤癌。在一个优选的实施方案中，癌症为结肠直肠癌；胰腺癌；肺癌；乳腺癌；肝癌；前列腺癌；卵巢癌；宫颈癌；子宫内膜癌；头颈癌；或黑色素瘤。在一个特别优选的实施方案中，癌症为结肠直肠癌；胰腺癌；肺癌；乳腺癌；或肝癌。在一个特别优选的实施方案中，癌症为胃肠癌。在一个优选的实施方案中，癌症为结肠直肠癌。
癌症优选为但不限于在当提供有EGF受体家族成员配体时展现生长响应的癌症。本发明的蛋白质优选为与癌症对此表现出生长响应的EGF受体家族成员结合的蛋白质。在一个优选的实施方案中，癌症在培养基中响应EGF家族成员而表现出体外生长响应。所述体外优选为如实验部分中对于类器官详述的培养物。癌症优选为表达本发明蛋白质所结合的WNT途径的膜缔合成员的癌症。
本发明还提供了一种细胞体系，其包括本发明的蛋白质或本发明的双特异性抗体，以及表达表皮生长因子(EGF)受体家族的膜缔合成员和表达WNT途径的膜缔合成员的细胞。细胞优选为表达WNT途径的膜缔合成员的EGF-受体配体响应性细胞。
如本文所述的体系或细胞体系优选为体外培养体系。所述体系可用于检测细胞的生长响应。在一个优选的实施方案中，EGF-受体配体为如本文其它地方所定义的优选的EGF受体家族成员的配体。在一个优选的实施方案中，WNT途径的膜缔合成员为如本文其它地方所定义的优选的WNT途径的膜缔合成员。
EGF-受体配体响应性的癌症或细胞表现出对EGF受体配体的生长(增殖)响应。用于测定细胞或癌症是否是EGF-受体配体响应的一种优选的方法是如实施例中所述在类器官培养测定中测定细胞的生长因子应答性。一种方法是在存在或不存在生长因子诸如(EGF(5ng/ml)或NRG(5ng/ml))的情况下将一个或多个癌症细胞接种在类器官细胞体系中，并且然后培养5天。随后可以使用Cell Titer Glo细胞活力测定法(Promega，目录号G7571)测定活细胞数。然后可将使用经生长因子刺激的细胞的发光读数与使用未经刺激的细胞(不存在生长因子)获得的发光读数进行比较。
本发明还提供一种用于抑制细胞生长的方法，所述细胞在允许细胞生长的系统中抑制EGF受体家族的膜缔合成员和表达WNT途径的膜缔合成员，所述方法包括提供具有本发明的蛋白质或本发明的双特异性抗体的系统。细胞优选为表达WNT途径的膜缔合成员的EGF-受体配体响应性细胞。当与在其它条件相似但存在本发明的蛋白质或双特异性抗体的情况下产生的细胞数相比，该抑制优选为细胞数或细胞数的衍生物测量，诸如肿瘤尺寸，减少至少10％。所述抑制优选为细胞数减少至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％当与在其它条件相似但存在本发明的蛋白质或双特异性抗体的情况下产生的管腔数相比，该抑制也可以为与肿瘤恶性肿瘤或发育异常相关的其它参数，诸如每类器官的管腔数减少至少10％。所述抑制优选为每类器官的管腔数减少至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％
为了避免疑惑，如本文所用，提及的细胞生长是指细胞数的变化。生长抑制是指否则可获得的细胞数的减少。生长增加是指否则可获得的细胞数的增加。细胞的生长通常是指细胞的增殖。
本发明的蛋白质或双特异性抗体与包含表皮生长因子(EGF)受体家族或cMET的所述膜缔合成员；和/或所述膜上的WNT信号传导途径的所述膜缔合成员的细胞的结合在所述表皮生长因子(EGF)受体家族或cMET的一种生长因子和/或Rspondin的存在下减少所述细胞的生长/增殖。该减少是与在其它条件相同下在不存在本发明的蛋白质或双特异性抗体的情况下相同细胞的生长/增殖进行比较。
本发明的蛋白质或双特异性抗体、或其功能部分、衍生物和/或类似物优选选自结合下列的本发明的蛋白质或双特异性抗体、或其功能部分、衍生物和/或类似物：ErbB-1和LGR4；ErbB-1和LGR5；ErbB-1和LGR6；ErbB-1和ZNRF3；ErbB-1和RNF43；ErbB-2和LGR4；ErbB-2和LGR5；ErbB-2和LGR6；ErbB-2和ZNRF3；ErbB-2和RNF43；ErbB-3和LGR4；ErbB-3和LGR5；ErbB-3和LGR6；ErbB-3和ZNRF3；ErbB-3和RNF43；ErbB-4和LGR4；ErbB-4和LGR5；ErbB-4和LGR6；ErbB-4和ZNRF3；以及ErbB-4和RNF43。
在一个优选的实施方案中，其选自：ErbB-1和LGR4；ErbB-1和LGR5；ErbB-1和ZNRF3；ErbB-1和RNF43；ErbB-3和LGR4；ErbB-3和LGR5；ErbB-3和ZNRF3；ErbB-3和RNF43；ErbB-4和LGR4；ErbB-4和LGR5；ErbB-4和ZNRF3；以及ErbB-4和RNF43。在一个优选的实施方案中，其选自：ErbB-1和LGR4；ErbB-1和LGR5；ErbB-1和ZNRF3；ErbB-1和RNF43；ErbB-3和LGR4；ErbB-3和LGR5；ErbB-3和ZNRF3；ErbB-3和RNF43。优选地，其选自：ErbB-1和LGR5；ErbB-1和ZNRF3；ErbB-1和RNF43；ErbB-3和LGR5；ErbB-3和ZNRF3；以及ErbB-3和RNF43。在特别优选的实施方案中，本发明的蛋白质或双特异性抗体、或其功能部分、衍生物和/或类似物选自结合下列的本发明的蛋白质或双特异性抗体、或其功能部分、衍生物和/或类似物：ErbB-1和LGR5以及ErbB-3和LGR5。
抗体或双特异性抗体优选包含两个可变结构域，其中一个可变结构域结合一个蛋白质的细胞胞外部分，并且另一个可变结构域结合其它蛋白质的细胞外部分。
在一个实施方案中，本发明提供了包含结合ErbB-1的可变结构域的双特异性抗体，其中所述可变结构域的重链可变区至少包含如图1所示的选自下列的ErbB-1特异性重链可变区的CDR3序列：MF3370；MF3755；MF4280或MF4289，或者其中所述可变结构域的重链可变区包含如图1所示，与选自下列的VH的CDR3序列在最多三个，优选地最多两个，优选地不超过一个氨基酸上不同的重链CDR3序列：MF3370；MF3755；MF4280或MF4289。所述可变结构域优选包含重链可变区，所述重链可变区至少包含如图1所示的MF3370；MF3755；MF4280或MF4289的CDR3序列。
所述可变结构域优选包含重链可变区，所述重链可变区至少包含如图1所示，选自下列的ErbB-1特异性重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列：MF3370；MF3755；MF4280或MF4289，或者如图1所示，与选自下列的ErbB-1特异性重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列在最多三个、优选地最多两个，优选地最多一个氨基酸上不同的重链CDR1、CDR2和CDR3序列：MF3370；MF3755；MF4280或MF4289。所述可变结构域优选包含重链可变区，所述重链可变区至少包含如图1所示的MF3370；MF3755；MF4280或MF4289的CDR1、CDR2和CDR3序列。优选的重链可变区为MF3755。另一优选的重链可变区为MF4280。
已经示出当用于抑制EGFR配体响应性癌症或细胞的生长时，包括具有重链可变区MF3755的一个或多个可变结构域的抗体具有更好的功效。在双特异性抗体的情况下，包括具有重链可变区MF3755的可变结构域的抗体臂与包含结合其它细胞表面蛋白的细胞外部分的可变结构域的多种其它臂更好地组合。包括具有重链可变区MF4280的可变结构域的抗体也与结合LGR4、LGR5、LGR6、ZNRF3或RNF43的可变结构域一起良好地起作用。
在一个实施方案中，本发明提供了包含结合ErbB-3的可变结构域的双特异性抗体，其中所述可变结构域的重链可变区至少包含如图1所示，选自下列的ErbB-3特异性重链可变区的CDR3序列：MF3125；MF3176；MF3178；或MF4863，或者其中所述可变结构域的重链可变区包含如图1所示，与选自下列的VH的CDR3序列在最多三个，优选地最多两个，优选地不超过一个氨基酸上不同的重链CDR3序列：MF3125；MF3176；MF3178；或MF4863。所述可变结构域优选包含重链可变区，所述重链可变区至少包含如图1所示，MF3125；MF3176；MF3178；或MF4863的CDR3序列。
所述可变结构域优选包含重链可变区，所述重链可变区至少包含如图1所示，选自下列的ErbB-3特异性重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列：MF3125；MF3176；MF3178；或MF4863，或者如图1所示，与选自下列的ErbB-3特异性重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列在最多三个、优选地最多两个，优选地最多一个氨基酸上不同的重链CDR1、CDR2和CDR3序列：MF3125；MF3176；MF3178；或MF4863。可变结构域优选包含重链可变区，所述重链可变区至少包含如图1所示，MF3125；MF3176；MF3178；或MF4863的CDR1、CDR2和CDR3序列。优选的重链可变区为MF3178。
在一个实施方案中，本发明提供了包含结合LGR4的可变结构域的双特异性抗体，其中所述可变结构域的重链可变区至少包含如图1所示，选自下列的LGR4特异性重链可变区的CDR3序列：MF5777；或MF5781，或者其中所述可变结构域的重链可变区包含如图1所示，与选自下列的VH的CDR3序列在最多三个，优选地最多两个，优选地不超过一个氨基酸上不同的重链CDR3序列：MF5777；或MF5781。所述可变结构域优选包含重链可变区，所述重链可变区至少包含如图1所示，MF5777；或MF5781的CDR3序列。
所述可变结构域优选包含重链可变区，所述重链可变区至少包含如图1所示，选自下列的LGR4特异性重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列：MF5777；或MF5781，或者如图1所示，与选自下列的LGR4特异性重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列在最多三个、优选地最多两个，优选地最多一个氨基酸上不同的重链CDR1、CDR2和CDR3序列：MF5777；或MF5781。所述可变结构域优选包含重链可变区，所述重链可变区至少包含如图1所示，MF5777；或MF5781的CDR1、CDR2和CDR3序列。优选的重链可变区为MF5781。
在一个实施方案中，本发明提供了包含结合LGR5的可变结构域的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体的重链可变区至少包含如图1所示，选自下列的LGR5特异性重链可变区的CDR3序列：MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818，或者其中可变结构域的重链可变区包含如图1所示，与选自下列的VH的CDR3序列在最多三个，优选地最多两个，优选地不超过一个氨基酸上不同的重链CDR3序列：MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818。所述可变结构域优选包含重链可变区，所述重链可变区至少包含如图1所示，MF5790；MF5803；MF 5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818的CDR3序列。
所述可变结构域优选包含重链可变区，所述重链可变区至少包含如图1所示，选自下列的LGR5特异性重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列：MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818，或者如图1所示，与选自下列的LGR5特异性重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列在最多三个、优选地最多两个，优选地最多一个氨基酸上不同的重链CDR1、CDR2和CDR3序列：MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818。所述可变结构域优选包含重链可变区，所述重链可变区至少包含如图1所示，下列的CDR1、CDR2和CDR3序列：MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818。优选的重链可变区为MF5790；MF5803；MF5814；MF5816；MF5817；MF5818。特别优选的重链可变区为MF5790；MF5814；MF5816；和MF5818；优选MF5814、MF5818和MF5816，特别优选重链可变区MF5816。另一优选的重链可变区为MF5818。
在一个实施方案中，本发明提供了包含结合RNF43的可变结构域的双特异性抗体，其中所述可变结构域的重链可变区至少包含如图1所示，选自下列的RNF43特异性重链可变区的CDR3序列：MF5832；MF5836；或MF5839，或者其中所述可变结构域的重链可变区包括包含如图1所示，与选自下列的VH的CDR3序列在最多三个，优选地最多两个，优选地不超过一个氨基酸上不同的重链CDR3序列的重链可变区：MF5832；MF5836；或MF5839。所述可变结构域优选包含重链可变区，所述重链可变区至少包含如图1所示，MF5832；MF5836；或MF5839的CDR3序列。
所述可变结构域优选包含重链可变区，所述重链可变区至少包含如图1所示，选自下列的RNF43特异性重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列：MF5832；MF5836；或MF5839，或者如图1所示，与选自下列的RNF43特异性重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列在最多三个、优选地最多两个，优选地最多一个氨基酸上不同的重链CDR1、CDR2和CDR3序列：MF5832；MF5836；或MF5839。所述可变结构域优选包含重链可变区，所述重链可变区至少包含如图1所示，MF5832；MF5836；或MF5839的CDR1、CDR2和CDR3序列。优选的重链为MF5832；MF5836。优选的重链可变区为MF5836。
在一个实施方案中，本发明提供了包含结合ZNRF3的可变结构域的双特异性抗体，其中所述可变结构域的重链可变区至少包含如图1所示，选自下列的ZNRF3特异性重链可变区的CDR3序列：MF5850；MF5853；MF5855；MF5862；MF5882；MF5884；MF5887；或MF5888，或者其中所述可变结构域的重链可变区包含如图1所示，与选自下列的VH的CDR3序列在最多三个，优选地最多两个，优选地不超过一个氨基酸上不同的重链CDR3序列：MF5850；MF5853；MF5855；MF5862；MF5882；MF5884；MF5887；或MF5888。所述可变结构域优选包含重链可变区，所述重链可变区至少包含如图1所示，MF5850；MF5853；MF5855；MF5862；MF5882；MF5884；MF5887；或MF5888的CDR3序列。
所述可变结构域优选包含重链可变区，所述重链可变区至少包含如图1所示，选自下列的ZNRF3特异性重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列：MF5850；MF5853；MF5855；MF5862；MF5882；MF5884；MF5887；或MF5888，或者如图1所示，与选自下列的ZNRF3特异性重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列在最多三个、优选地最多两个，优选地最多一个氨基酸上不同的重链CDR1、CDR2和CDR3序列：MF5850；MF5853；MF5855；MF5862；MF5882；MF5884；MF5887；或MF5888。所述可变结构域优选包含重链可变区，所述重链可变区至少包含如图1所示，MF5850；MF5853；MF5855；MF5862；MF5882；MF5884；MF5887；或MF5888的CDR1、CDR2和CDR3序列。优选的重链可变区为MF5850；MF5853；MF5855；MF5884；或MF5888。优选的重链可变区为MF5888和MF5850，优选MF5850。
出于优化的目的，优选地为了改善抗体的结合强度或稳定性，例如改变CDR序列。优化例如通过诱变规程进行，随后优选测试所得抗体的稳定性和/或结合亲和力并优选选择修饰的EGFR或ErbB-3特异性CDR序列。根据本发明，技术人员能够生成包含至少一个的改变的CDR序列的抗体变体。例如，可以应用保守氨基酸取代。保守氨基酸取代的示例包括用一个疏水残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个疏水残基，并且用一个极性残基取代另一个极性残基，例如用精氨酸取代赖氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，或用谷氨酰胺取代天冬酰胺。
包含结合EGFR的可变结构域，优选地包含所述可变结构域的VH链的本发明的双特异性抗体包含如图1所示，以下VH链的氨基酸序列：MF3370；MF3755；MF4280或MF4289，；或者如图1所示，以下VH链的氨基酸序列：MF3370；MF3755；MF4280或MF4289，所述氨基酸序列关于图1的VH链序列具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。本发明的双特异性抗体包含结合EGFR的可变结构域，优选地包含所述可变结构域的VH链并且优选地包含VH链MF3755的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，该双特异性抗体包含结合WNT途径的膜缔合成员的可变结构域，如本文其它地方所定义的。在一个优选的实施方案中，WNT途径的膜缔合成员为LGR4、LGR5、RNF43或ZNRF3。
包含结合HER3的可变结构域，优选地包含所述可变结构域的VH链的本发明的双特异性抗体包含以下VH链的氨基酸序列：MF3125；MF3176；MF3178；或MF4863，如图1所示；或者以下VH链的氨基酸序列：MF3125；MF3176；MF3178；或MF4863，如图1所示，所述氨基酸序列关于图1的VH链序列具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。优选的重链为MF3178。在一个优选的实施方案中，该双特异性抗体包含结合WNT途径的膜缔合成员的可变结构域，如本文其它地方所定义的。在一个优选的实施方案中，WNT途径的膜缔合成员为LGR4、LGR5、RNF43或ZNRF3。
包含结合LGR4的可变结构域，优选地包含所述可变结构域的VH链的本发明的双特异性抗体包含以下VH链的氨基酸序列：MF5777；或MF5781，如图1所示；或者以下VH链的氨基酸序列：MF5777；或MF5781，如图1所示，所述氨基酸序列关于图1的VH链序列具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。在一个优选的实施方案中，该双特异性抗体包含结合EGFR家族的膜缔合成员的细胞外部分的可变结构域，如本文其它地方所定义的。在一个优选的实施方案中，EGFR家族的膜缔合成员是EGFR或HER3，优选地EGFR。优选的重链为MF3755。
包含结合LGR5的可变结构域，优选地包含所述可变结构域的VH链的本发明的双特异性抗体包含以下VH链的氨基酸序列：MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818，如图1所示；或者以下VH链的氨基酸序列：MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818，如图1所示，所述氨基酸序列关于图1的VH链序列具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。在一个优选的实施方案中，该双特异性抗体包含结合EGFR家族的膜缔合成员的细胞外部分的可变结构域，如本文其它地方所定义的。在一个优选的实施方案中，EGFR家族的膜缔合成员是EGFR或HER3，优选地EGFR。优选的重链为MF3755。
包含结合RNF43的可变结构域，优选地包含所述可变结构域的VH链的本发明的双特异性抗体包含以下VH链的氨基酸序列：MF5832；MF5836；或MF5839，如图1所示；或者以下VH链的氨基酸序列：MF5832；MF5836；或MF5839，如图1所示，所述氨基酸序列关于图1的VH链序列具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。在一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含结合EGFR家族的膜缔合成员的细胞外部分的可变结构域，如本文其它地方所定义的。在一个优选的实施方案中，EGFR家族的膜缔合成员是EGFR或HER3，优选地EGFR。优选的重链为MF3755。
包含结合ZNRF3的可变结构域，优选地包含所述可变结构域的VH链的本发明的双特异性抗体包含以下VH链的氨基酸序列：MF5850；MF5853；MF5855；MF5862；MF5882；MF5884；MF5887；或MF5888，如图1所示；或者以下VH链的氨基酸序列：MF5850；MF5853；MF5855；MF5862；MF5882；MF5884；MF5887；或MF5888，如图1所示，所述氨基酸序列关于图1的VH链序列具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。在一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含结合EGFR家族的膜缔合成员的细胞外部分的可变结构域，如本文其它地方所定义的。在一个优选的实施方案中，EGFR家族的膜缔合成员是EGFR或HER3，优选地EGFR。优选的重链为MF3755。
优选地，如本文所规定的VH或VL中的提及的氨基酸插入、缺失和取代不存在于CDR3区中。提及的氨基酸插入、缺失和取代也优选不存在于CDR1和CDR2区域中。提及的氨基酸插入、缺失和取代也优选不存在于FR4区域中。
本发明还提供了包含结合EGFR的可变结构域和结合LGR4的可变结构域的抗体，其中结合EGFR的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合LGR4的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5777的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5777的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合EGFR的可变结构域和结合LGR4的可变结构域的抗体，其中结合EGFR的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合LGR4的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5781的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5781的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合EGFR的可变结构域和结合LGR5的可变结构域的抗体，其中结合EGFR的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合LGR5的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5790的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5790的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合EGFR的可变结构域和结合LGR5的可变结构域的抗体，其中结合EGFR的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合LGR5的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5803的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5803的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合EGFR的可变结构域和结合LGR5的可变结构域的抗体，其中结合EGFR的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合LGR5的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5814的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5814的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合EGFR的可变结构域和结合LGR5的可变结构域的抗体，其中结合EGFR的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合LGR5的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5816的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5816的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合EGFR的可变结构域和结合LGR5的可变结构域的抗体，其中结合EGFR的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合LGR5的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5817的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5817的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合EGFR的可变结构域和结合LGR5的可变结构域的抗体，其中结合EGFR的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示，或者
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合LGR5的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5818的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5818的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合EGFR的可变结构域和结合RNF43的可变结构域的抗体，其中结合EGFR的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合RNF43的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5832的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5832的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合EGFR的可变结构域和结合RNF43的可变结构域的抗体，其中结合EGFR的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合RNF43的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5836的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5836的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合EGFR的可变结构域和结合ZNRF3的可变结构域的抗体，其中结合EGFR的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示，或者
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合ZNRF3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5850的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5850的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合EGFR的可变结构域和结合ZNRF3的可变结构域的抗体，其中结合EGFR的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合ZNRF3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5853的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5853的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合EGFR的可变结构域和结合ZNRF3的可变结构域的抗体，其中结合EGFR的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合ZNRF3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5855的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5855的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合EGFR的可变结构域和结合ZNRF3的可变结构域的抗体，其中结合EGFR的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合ZNRF3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5884的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5884的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合EGFR的可变结构域和结合ZNRF3的可变结构域的抗体，其中结合EGFR的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合ZNRF3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5888的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5888的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合HER3的可变结构域和结合LGR4的可变结构域的抗体，其中结合HER3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合LGR4的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5777的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5777的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合EGFR的可变结构域和结合HER3的可变结构域的抗体，其中结合HER3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合LGR4的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5781的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5781的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合HER3的可变结构域和结合LGR5的可变结构域的抗体，其中结合HER3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合LGR5的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5790的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5790的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合HER3的可变结构域和结合LGR5的可变结构域的抗体，其中结合HER3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合LGR5的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5803的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5803的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合HER3的可变结构域和结合LGR5的可变结构域的抗体，其中结合HER3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合LGR5的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5814的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5814的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合HER3的可变结构域和结合LGR5的可变结构域的抗体，其中结合HER3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合LGR5的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5816的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5816的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合HER3的可变结构域和结合LGR5的可变结构域的抗体，其中结合HER3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合LGR5的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5817的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5817的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合HER3的可变结构域和结合LGR5的可变结构域的抗体，其中结合HER3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合LGR5的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5818的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5818的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合HER3的可变结构域和结合RNF43的可变结构域的抗体，其中结合HER3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合RNF43的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5836的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5836的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合HER3的可变结构域和结合ZNRF3的可变结构域的抗体，其中结合HER3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合ZNRF3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5850的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5850的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合HER3的可变结构域和结合ZNRF3的可变结构域的抗体，其中结合HER3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合ZNRF3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5853的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5853的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合HER3的可变结构域和结合ZNRF3的可变结构域的抗体，其中结合HER3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合ZNRF3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5855的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5855的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合HER3的可变结构域和结合ZNRF3的可变结构域的抗体，其中结合HER3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合ZNRF3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5884的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5884的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供了包含结合HER3的可变结构域和结合ZNRF3的可变结构域的抗体，其中结合HER3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3178的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
其中结合ZNRF3的可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5888的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5888的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明的蛋白质或双特异性抗体优选用于人。为此，本发明的抗体优选是人或人源化抗体。人类对多肽的耐受性受许多不同方面的支配。免疫力，无论是T细胞介导的、B细胞介导的还是其它介导的均是涵盖于人类对多肽的耐受性中的变量之一。本发明的双特异性抗体的恒定区优选为人恒定区(图4)。恒定区可包含与天然存在的人抗体的恒定区的一个或多个，优选不超过10个，优选不超过5个氨基酸差异。优选恒定部分完全来源于天然存在的人抗体。本文产生的各种抗体来源于用相应靶免疫的普通轻链小鼠，如WO2009/157771中所述。本文产生的各种抗体来源于人抗体可变结构域库。因此，这些可变结构域是人可变结构域。独特的CDR区域可来源于人，是合成的或来源于另一种生物体。当其除了CDR区域，具有与天然存在的人抗体可变区的氨基酸序列一致的氨基酸序列时，认为该可变区是人可变区。结合EGFR家族成员或WNT途径的膜缔合成员的抗体的VH的可变区，或本发明抗体中的轻链可包含与天然存在的人抗体的可变区的一个或多个，优选不超过10个，优选不超过5个氨基酸差异，不计数CDR区的氨基酸序列的可能差异。在体细胞超突变的情况下，此类突变也天然存在。
至少就重链可变区而言，抗体可来源于各种动物物种。其是人源化诸如鼠重链可变区的常见操作。存在可实现这种人源化的各种方式，其中存在嫁接到人重链可变区中的CDR，其具有匹配小鼠重链可变区的3D结构的3D结构；将小鼠重链可变区去免疫，优选地通过从小鼠重链可变区去除已知或可疑的T细胞或B细胞表位进行。该去除通常是通过将表位中的一个或多个氨基酸取代另一(通常保守性)氨基酸，使得表位的序列被修饰，使得其不再是T-细胞或B-细胞表位。
去免疫的鼠重链可变区比初始鼠重链可变区在人类中具有更少的免疫原性。优选地，本发明的可变区或结构域进一步人源化，例如镶饰。通过使用镶饰技术，容易被免疫系统遇到的外部残基选择性地用人残基取代，以提供包含弱免疫原性或基本上非免疫原性的镶面表面的杂交分子。如用于本发明的动物优选哺乳动物，更优选灵长类，最优选地人。
根据本发明的蛋白质或双特异性抗体优选包含人抗体的恒定区域。根据其重链恒定结构域的差异，将抗体分组成五类或同种型：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。这些类或同种型包含所述重链中的至少一个，其用相应的希腊字母命名。在一个优选的实施方案中，本发明提供了根据本发明的抗体，其中所述恒定区选自IgG、IgA、IgM、IgD和IgE恒定区，更优选所述恒定区包含IgG恒定区，更优选地IgG1恒定区(图4)，优选地突变的IgG1恒定区。IgG1恒定区中的一些变化在自然界中发生和/或在不改变所得抗体的免疫学特性的情况下获得。通常在恒定区中获得介于约1-10个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
合理的方法已朝向使人类环境下的非人类残基含量最小化演变。各种方法可用于成功地将抗体的抗原结合特性嫁接到另一种抗体上。抗体的结合特性主要位于CDR3区的适当序列中，通常由可变结构域中的CDR1和CDR2区的序列与可变结构域的适当结构的组合作为整体支持。目前各种方法适用于将CDR区嫁接到另一抗体的适宜可变结构域上。这些方法中的一些在J.C.Almagro1和J.Fransson(2008)Frontiers in Bioscience 13，1619-1633中综述，其以引用方式包括在本文中。
提及的最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代优选为保守氨基酸取代，所述插入、缺失、取代或它们的组合优选不在VH链的CDR3区中，优选地不在VH链的CDR1、CDR2或CDR3区中，并且优选地不在FR4区中。
包含如图3所示的可变重链序列的可变结构域的轻链优选为O12或基于O12的种系轻链，优选为重排的种系人κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或其片段或功能性衍生物(根据imgt.org处的IMGT数据库全球网站命名)。使用术语重排的种系人κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01、IGKV1-39/IGKJ1、huVκ1-39轻链或简称huVκ1-39。轻链可具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。提及的1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代优选为保守氨基酸取代，所述插入、缺失、取代或它们的组合优选不在VL链的CDR3区中，优选地不在VL链的CDR1、CDR2或CDR3区中或VL链的FR4区中。
各种方法可用于产生双特异性抗体。一种方法涉及两个不同重链和两个不同轻链在细胞中的表达，并且收集由细胞产生的抗体。以这种方式产生的抗体将通常包含具有重链和轻链的不同组合的抗体的集合，其中一些是期望的双特异性抗体。双特异性抗体随后可以从该集合中纯化。由细胞产生的双特异性抗体与其它抗体的比率可以各种方式增加。在本发明的优选实施方案中，通过在细胞中不表达两种不同的轻链而是两种基本上相同的轻链来增加该比率。这种概念在本领域中也被称为“共同轻链”方法。当基本上相同的轻链与两个不同的重链一起工作从而允许形成具有不同抗原结合位点和伴随的不同结合特性的可变结构域时，由细胞产生的双特异性抗体与其它抗体的比率相比于两种不同轻链的表达显著改善。与两个相同重链的配对相比，由细胞产生的双特异性抗体的比率可通过刺激两个不同重链的彼此配对进一步改善。现有技术描述了其中可实现重链的此类异源二聚化的各种方式。一种方式是产生“杵臼结构”双特异性抗体。参见美国专利申请20030078385(Arathoon等人-Genentech)。另一种方法是通过使用如Gunasekaran(JBC 2010，第285卷，第19637-19646页)中所述的电荷工程化。另一优选的方法在美国临时申请61/635,935中有所描述，其由美国常规申请13/866,747和PCT专利申请PCT/NL2013/050294(WO 2013/157954 A1)进行了追踪，所述专利文献以引用方式并入本文。公开了用于产生双特异性抗体(由单一细胞)的方法和装置，由此提供与形成单特异性抗体相比，有利于形成双特异性抗体的装置。这些方法还可有利地用于本发明。因此，本发明提供了一种用于制备根据本发明的双特异性抗体(由单一细胞)的方法，其中所述双特异性抗体包含能够形成界面的两个CH3结构域，所述方法包括在所述细胞中提供：a)编码包含重链的第一CH3结构域的第一核酸分子，b)编码包含重链的第二CH3结构域的第二核酸分子，其中所述核酸分子设置有用于优先将包含重链的所述第一CH3结构域和第二CH3结构域配对的装置，所述方法还包括以下步骤：培养所述宿主细胞并且允许所述两种核酸分子表达并且从培养物中收获所述双特异性抗体。所述第一核酸分子和第二核酸分子可以为相同的核酸分子、载体或基因递送载体的一部分，并可以整合在宿主细胞的基因组的相同位点处。另选地，所述第一核酸分子和第二核酸分子独立地向所述细胞提供。
一个优选的实施方案提供了用于由单一细胞产生根据本发明的双特异性抗体的方法，其中所述双特异性抗体包含能够形成界面的两个CH3结构域，所述方法包括提供：
-细胞，其具有：a)编码重链的第一核酸分子，所述重链包含结合EGFR家族的膜缔合成员的细胞外部分并包含第一CH3结构域的抗原结合位点，b)编码重链的第二核酸分子，所述重链包含结合WNT信号传导途径的膜缔合成员的细胞外部分并且包含第二CH3结构域的抗原结合位点，其中所述核酸分子具有用于优先将所述第一CH3结构域和第二CH3结构域配对的装置，
所述方法还包括以下步骤：培养所述细胞并允许表达由所述两种核酸分子编码的蛋白质并从培养物中收获所述双特异性IgG抗体。在一个特别优选的实施方案中，所述细胞还具有编码共用轻链的第三核酸分子。所述第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子可以为相同的核酸分子、载体或基因递送载体的一部分，并可以整合在宿主细胞的基因组的相同位点处。另选地，所述第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子独立地向所述细胞提供。优选的共同轻链基于O12，优选地其为重排种系人k轻链IgVκ139*01/IGJκ1*01，如上所述。优先配对所述第一CH3结构域和所述第二CH3结构域的装置优选为重链编码区的CH3结构域中的相应突变。用于基本上仅产生双特异性抗体的优选的突变是第一CH3结构域中的氨基酸取代L351K和T366K(根据EU编号进行编号)以及第二CH3结构域中的氨基酸取代L351D和L368E，或反之亦然。因此，本发明还提供了根据本发明用于产生双特异性抗体的方法，其中所述第一CH3结构域包含氨基酸取代L351K和T366K(根据EU编号进行编号)，并且其中所述第二CH3结构域包含氨基酸取代L351D和L368E，所述方法还包括以下步骤：培养所述细胞并允许表达由所述核酸分子编码的蛋白质并从培养物中收获所述双特异性抗体。本发明还提供了根据本发明用于产生双特异性抗体的方法，其中所述第一CH3结构域包含氨基酸取代L351D和L368E(根据EU编号进行编号)，并且其中所述第二CH3结构域包含氨基酸取代L351K和T366K，所述方法还包括以下步骤：培养所述细胞并允许表达由所述核酸分子并从培养物中收获所述双特异性抗体。可由这些方法产生的抗体也是本发明的一部分。CH3异源二聚化结构域优选为IgG1异源二聚化结构域。包含CH3异源二聚化结构域的重链恒定区优选为IgG1恒定区。
在一个实施方案中，本发明提供编码根据本发明的抗体重链可变区的核酸分子。核酸分子(通常体外、分离或重组核酸分子)优选编码如图1所示的重链可变区，或具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合的如图1所示的重链可变区。在一个优选的实施方案中，核酸分子包含如图2所示的序列。在另一个优选的实施方案中，核酸分子编码与图2所示的核酸相同的氨基酸序列，但具有不同的序列，因为其编码一个或多个不同的密码子。本发明还提供了编码图1的重链的核酸序列。
如本发明所用的核酸分子典型地但非排他性地为核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。对于本领域技术人员而言，另选的核酸是可用的。根据本发明的核酸例如包含在细胞中。当所述核酸在所述细胞中表达时，所述细胞可产生根据本发明的抗体。因此，在一个实施方案中，本发明提供包含根据本发明的抗体和/或根据本发明的核酸的细胞。所述细胞优选为动物细胞，更优选地哺乳动物细胞，更优选地灵长类细胞，最优选地人类细胞。出于本发明的目的，合适的细胞是能够包含并优选生产根据本发明的抗体和/或根据本发明的核酸的任何细胞。
本发明还提供包含根据本发明的抗体的细胞。优选地，所述细胞(通常为体外、分离或重组细胞)产生所述抗体。在一个优选的实施方案中，所述细胞是杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO细胞或PER-C6TM细胞。在一个特别优选的实施方案中，所述细胞为CHO细胞。还提供细胞培养物，其包含根据本发明的细胞。各种机构和公司已经开发了用于大规模生产抗体的细胞系，例如用于临床应用。此类细胞系的非限制性示例为CHO细胞、NSO细胞或PER.C6细胞。这些细胞也用于其它目的，诸如蛋白质的生产。被开发用于工业规模生产蛋白质和抗体的细胞系在本文中还被称为工业细胞系。因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供了被开发用于大规模生产抗体的细胞系用于生产本发明的抗体的用途。本发明还提供了一种细胞，其用于产生包含编码如图1所示的VH、VL和/或重链的核酸分子的抗体。优选地，所述核酸分子包含如图2所示的序列。
本发明还提供了一种生产抗体的方法，所述方法包括培养本发明的细胞并从所述培养物中收获所述抗体。优选地，所述细胞在无血清培养基中培养。优选地，所述细胞适于悬浮生长。本发明还提供了可通过用于生产根据本发明的抗体的方法获得的抗体。所述抗体优选由培养物的培养基中纯化。优选所述抗体经亲和纯化。
本发明的细胞例如为杂交瘤细胞系、CHO细胞、293F细胞、NSO细胞或另一种已知其适用于抗体生产以用于临床目的细胞类型。在一个特别优选的实施方案中，所述细胞为人细胞。优选地细胞通过腺病毒E1区或其功能等同物转化。此类细胞系的优选示例为PER.C6细胞系或其等同物。在一个特别优选的实施方案中，所述细胞为CHO细胞或其变体。优选地，变体利用谷氨酰胺合成酶(GS)载体体系表达抗体。
本发明还提供包含根据本发明的抗体的药物组合物。所述药物组合物优选包含优选药学上可接受的赋形剂或载体。在一个优选的实施方案中，药物组合物包含5mM-50mM组氨酸、100mM-300mM海藻糖、0.1g/L-03g/L聚山梨酸酯20或它们的组合。pH优选设定为pH＝5.5-6.5。在一个优选的实施方案中，药物组合物包含25mM组氨酸、220mM海藻糖、0.2g/L聚山梨酸酯20或它们的组合。pH优选设定为pH＝5.5-6.5，最优选地设定为pH＝6。
本发明的抗体优选还包含标记，优选用于体内成像的标记。此类标记对于治疗应用而言通常不是必要的。在例如诊断装置中，标记可能是有帮助的。例如，体内的可视化靶细胞中。各种标签是适合的，并且许多在本领域为人们所熟知。在一个优选的实施方案中，标记是用于检测的放射性标记。在另一个优选的实施方案中，标记是红外标记。优选地，红外标记适用于体内成像。对于本领域技术人员而言，各种红外标记是可用的。优选的红外标记例如为：IRDye 800；IRDye 680RD；IRDye 680LT；IRDye 750；IRDye 700DX；IRDye 800RSIRDye 650；IRDye 700亚磷酰胺；IRDye 800亚磷酰胺(LI-COR USA；4647 SuperiorStreet；Lincoln，Nebraska)。
为了测定当提供EGF受体家族成员配体时癌症是否表现出生长响应，技术人员可以例如测定EGFR扩增和/或免疫组织化学染色(用于EGF-响应)。肿瘤样本中至少10％的肿瘤细胞应当是阳性的。肿瘤样本可包含20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多阳性细胞。为了确定癌症是否表现出对HER3配体的生长响应，技术人员可以例如测定HER3扩增和/或免疫组织化学染色。肿瘤样本中至少10％的肿瘤细胞应当是阳性的。样品可包含20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多阳性细胞。为了确定癌症是否表现出对Wnt(LGR5、LGR4、ZNRF3、RNF43)受体靶向的敏感性，技术人员可例如测定Wnt靶扩增和/或免疫组织化学染色。肿瘤样本中至少1％的肿瘤细胞应当是阳性的。样品可包含5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多阳性细胞。
待施用于患者的根据本发明的抗体量通常在治疗窗口内，这是指为获得治疗效果使用足够的量，然而该量不超过阈值从而导致不可接受的程度的副作用。为获得期望的治疗效果所需的抗体量越低，则治疗窗口通常将越大。因此，优选在低剂量下发挥足够治疗效果的根据本发明的抗体。剂量可以在西妥昔单抗的给药方案的范围内。剂量也可以更低。
当然，在其它相似的条件下，与西妥昔单抗相比，根据本发明的双特异性抗体优选引起更小的皮肤毒性。当然，在其它相似的条件下，与西妥昔单抗相比，根据本发明的双特异性抗体产生更少的促炎性趋化因子，优选CXCL14的促炎性趋化因子。当然，在其它相似的条件下，与西妥昔单抗相比，根据本发明的双特异性抗体引起更少的抗微生物RNA酶，优选地RNA酶7的损伤。
本发明描述了抗体，所述抗体靶向EGF受体家族的膜缔合成员的细胞外部分和WNT信号传导途径的膜缔合成员的细胞外部分并导致体内癌细胞系的有效增殖抑制和体内肿瘤生长抑制。通过将抗体克隆到互补表达载体中产生双特异性抗体形式的抗体，所述互补表达载体包含在CH3区中的突变，所述突变驱动重链的异源二聚化。许多双特异性抗体以较小规模生产并在结合和功能测定中对癌细胞系进行测试。本发明的抗体，具体地讲本发明的双特异性抗体可将低毒性分布与高功效组合。本发明的抗体可用于各种类型和系列的EGFR家族成员靶向治疗。但与两个臂结合相同抗原的抗体相比，本发明的抗体可具有增加的治疗窗口。当与MEHD7945A抗体相比时，本发明的双特异性抗体在体外、体内或它们的组合中可表现出更好的生长抑制效果。
还提供了用于抵抗患有表达EGF受体家族成员并表达WNT途径的膜缔合成员的癌症的受试者中癌细胞转移形成的方法。癌症优选为EGF-受体配体响应性癌症。在癌细胞转移的形成期间(即肿瘤细胞或肿瘤起始细胞的迁移、侵入、生长和/或分化)，通常存在高Her配体(例如EGF、Heregulin)含量。通常，基于干细胞标记物诸如CD44鉴定肿瘤起始细胞。因此这些过程几乎不与当前已知的疗法如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗相互抵消。因为根据本发明的抗体能够抵抗肿瘤细胞或肿瘤起始细胞例如癌症干细胞的生长和/或分化，所以根据本发明的此类抗体也特别适用于抵抗癌细胞转移的形成。因此，本发明还提供一种抵抗在患有EGFR、ErbB-3或EGFR/ErbB-3阳性肿瘤的受试者中癌细胞转移形成的方法，其中所述EGFR、ErbB-3或EGFR/ErbB-3阳性肿瘤细胞和/或周围基质组织细胞(例如成纤维细胞，白细胞诸如巨噬细胞和单核细胞、内皮素等)具有的her配体表达水平为BXPC3或MCF7细胞的her配体表达水平的至少60％，优选地至少70％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％或95％，所述方法包括向受试者施用结合EGFR或HER3的细胞外部分、WNT信号传导途径的膜缔合成员的细胞外部分的双特异性抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物。本发明还提供了结合EGFR或HER3的细胞外部分、WNT信号传导途径的膜缔合成员的细胞外部分的双特异性抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物用于治疗或预防癌细胞转移形成的用途。所述癌细胞转移来源的肿瘤优选为ErbB-3或EGFR/ErbB-3阳性肿瘤。肿瘤和/或周围基质组织细胞优选具有的her配体表达水平为BXPC3或MCF7细胞的heregulin表达水平的至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％或95％。
本发明还提供根据本发明的双特异性抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物用于制备治疗或预防癌细胞转移形成的药物的用途。所述癌细胞转移来源的肿瘤优选为ErbB-3或EGFR/ErbB-3阳性肿瘤。肿瘤和/或周围基质组织细胞优选具有的her配体表达水平为BXPC3或MCF7细胞的heregulin表达水平的至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％或95％。
本发明的抗体可在悬浮293F细胞中瞬时转染之后以＞50mg/L的含量制备。可纯化双特异性抗体至大于98％的纯度，收率＞70％。分析表征研究示出与二价单特异性IgG1相当的双特异性IgG1抗体特征。
出于清楚和简要描述的目的，本文将特征结构描述为相同或独立实施方案的一部分，然而，应该理解，本发明的范围可包括具有所述特征的全部或一些的组合的实施方案。
在数学上，欧几里得距离或欧几里德度量是欧几里德空间中两点之间的“普通”(即直线)距离。在该距离下，欧几里得空间成为度量空间。相关的范数被称为欧几里得范数。
受体酪氨酸激酶(RTK)是许多多肽生长因子、细胞因子和激素的高亲和力细胞表面受体。目前已知的在人类基因组中鉴定出的90种独特的酪氨酸激酶基因中，58种编码受体酪氨酸激酶蛋白。受体酪氨酸激酶已经示出与正常细胞过程相关，但也在癌症的发展和进展中起作用。受体酪氨酸激酶包含至少一个细胞外结构域。
在一个方面，本发明涉及一种蛋白质，所述蛋白质结合RTK受体家族的膜缔合成员的细胞外部分和WNT信号传导途径的膜缔合成员的细胞外部分。蛋白质优选为抗体，优选为双特异性抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物。
本发明还提供了双特异性抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其结合RTK受体家族的膜缔合成员的细胞外部分和WNT信号传导途径的膜缔合成员的细胞外部分。
本发明还提供了用于治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括向对其有需要的个体施用本发明的蛋白质或本发明的双特异性抗体。
本发明还提供了本发明的蛋白质或本发明的双特异性抗体在治疗患有癌症的个体方面的用途。
在一个实施方案中，癌症为响应RTK受体家族的相应成员的配体的癌症和表达WNT途径的膜缔合成员的癌症。
本发明还提供了一种细胞体系，其包含本发明的蛋白质或本发明的双特异性抗体，以及表达RTK受体家族的膜缔合成员和表达WNT途径的膜缔合成员的细胞。细胞体系优选为如下细胞体系，其包含本发明的蛋白质或本发明的双特异性抗体，以及表达RTK受体家族的膜缔合成员和表达WNT途径的膜缔合成员的细胞。
本发明还提供了一种允许抑制细胞生长/增殖的体系，所述方法包括提供具有本发明的蛋白质或本发明的双特异性抗体的体系。细胞优选为RTK-受体配体响应性细胞，其在允许细胞生长的体系中表达WNT途径的膜缔合成员，所述方法包括提供具有本发明的蛋白质或本发明的双特异性抗体的体系。细胞优选为表达WNT途径的膜缔合成员的RTK-受体配体响应性细胞。
RTK受体家族的优选的成员为提及的EGF-受体家族和c-MET；Axl和MST1R。
MET或C-MET是与胚胎发育、器官发生和伤口愈合有关的单程酪氨酸激酶受体。肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)及其剪接异构体(NK1、NK2)是目前已知的MET受体的配体。MET通常由上皮来源的细胞表达，然而在间充质源的细胞中观察到HGF/SF的表达。当HGF/SF结合其同源受体MET时，其诱导活化。Met也称为MET原致肿瘤基因，受体酪氨酸激酶；肝细胞生长因子受体；酪氨酸蛋白激酶Met；分散因子受体；原致肿瘤基因C-Met；HGF/SF受体；HGF受体；SF受体；EC 2.7.10.1；Met原致肿瘤基因酪氨酸激酶；Met原致肿瘤基因；EC2.7.10；AUTS9；RCCP2；C-Met；和HGFR 3。基因和蛋白质的登录号为：NC_000007.14；NT_007933.16；NC_018918.2；NP_000236.2；NP_001120972.1。所述登录号主要用于提供鉴定作为靶标的C-MET的其它方法，被抗体结合的C-MET蛋白质的实际序列可有所不同，例如由于编码基因中的突变，诸如在一些癌症中发生的那些等。C-MET抗原结合位点结合C-MET及其多种变体，诸如由一些C-MET阳性肿瘤细胞表达的那些变体。
AXL或AXL受体酪氨酸激酶编码酪氨酸蛋白激酶受体UFO，其为在人类中由AXL基因编码的酶。AXL的其它名称是AXL受体酪氨酸激酶；AXL癌基因；EC 2.7.10.1；UFO；酪氨酸-蛋白激酶受体UFO；AXL转化序列/基因；EC 2.7.10；JTK11；Tyro7；和ARK 3。基因或蛋白质的登录号为：NC_000019.10；NC_018930.2；NT_011109.17；NP_001265528.1；NP_001690.2；NP_068713.2)。所述登录号主要用于提供鉴定作为靶标的AXL的其它方法，被抗体结合的AXL蛋白质的实际序列可有所不同，例如由于编码基因中的突变，诸如在一些癌症中发生的那些等。AXL抗原结合位点结合AXL及其多种变体，诸如由一些AXL阳性肿瘤细胞表达的那些变体。
MST1R或巨噬细胞刺激1受体或RON。MST1R的其它名称为巨噬细胞刺激1受体；RON；PTK8蛋白质酪氨酸激酶8；C-Met-相关的酪氨酸激酶；MSP受体；EC 2.7.10.1；P185-Ron；CDw136；PTK8；巨噬细胞刺激1受体(C-Met-相关酪氨酸激酶)3；巨噬细胞刺激蛋白质受体；蛋白质酪氨酸激酶8；MST1R变体RON30；MST1R变体RON62；RON变体E2E3；RON变体21；CD136抗原；EC 2.7.10；CD136，其全部呈膜结合的形式。基因和蛋白质的登录号为：NC_000003.12；NT_022517.19；NC_018914.2；NP_001231866.1；NP_002438.2。所述登录号主要用于提供鉴定作为靶标的MST1R的其它方法，被抗体结合的MST1R蛋白质的实际序列可有所不同，例如由于编码基因中的突变，诸如在一些癌症中发生的那些等。MST1R抗原结合位点结合MST1R及其多种变体，诸如由一些MST1R阳性肿瘤细胞表达的变体。
本发明还提供单特异性抗体，其包含结合LGR4的可变结构域，其中可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5777的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5777的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供单特异性抗体，其包含结合LGR4的可变结构域，其中可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5781的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5781的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供单特异性抗体，其包含结合LGR5的可变结构域，其中可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5790的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5790的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供单特异性抗体，其包含结合LGR5的可变结构域，其中可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5803的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5803的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供单特异性抗体，其包含结合LGR5的可变结构域，其中可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5814的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5814的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供单特异性抗体，其包含结合LGR5的可变结构域，其中可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5816的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5816的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供单特异性抗体，其包含结合LGR5的可变结构域，其中可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5817的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5817的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供单特异性抗体，其包含结合LGR5的可变结构域，其中可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5818的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5818的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供单特异性抗体，其包含结合RNF43的可变结构域，其中可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5832的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5832的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供单特异性抗体，其包含结合RNF43的可变结构域，其中可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5836的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5836的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供单特异性抗体，其包含结合ZNRF3的可变结构域，其中可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5850的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5850的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供单特异性抗体，其包含结合ZNRF3的可变结构域，其中可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5853的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5853的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供单特异性抗体，其包含结合ZNRF3的可变结构域，其中可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5855的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5855的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供单特异性抗体，其包含结合ZNRF3的可变结构域，其中可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5884的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5884的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明还提供单特异性抗体，其包含结合ZNRF3的可变结构域，其中可变结构域的VH链包含：
-VH链MF5888的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF5888的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
在本发明的一个实施方案中，单特异性抗体包含结合EGFR的可变结构域，其中可变结构域的VH链包含：
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示；或者
-VH链MF3755的氨基酸序列，如图1所示，所述氨基酸序列关于所述VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
本发明涉及一种抗体，其包含可结合LGR5的细胞外部分上的表位的可变结构域，所述表位位于图39所示的SEQ ID NO：1的氨基酸残基21-118内。其示出氨基酸残基D43、G44、M46、F67、G90和F91参与抗体的结合。参与并不一定是指所有残基确实与抗体接触。不受理论束缚，据信取代D43A或G44A导致表位中(轻微)构象变化，并且该构象变化导致抗体与表位的结合减少。
抗体与LGR5的相互作用不抑制RSPO 1与在LGR5表达细胞的膜上表达的LGR5的结合。抗体与RSPO 1的相互作用不抑制抗体与在LGR5表达细胞的膜上表达的LGR5的结合。这是指抗体与RSPO1不为了与LGR5结合而彼此竞争。至少不在本文指示的摩尔比范围内。抗体与RSPO 1的摩尔比通常为0.1至0.001(包括端值在内)，优选地以0.1至0.01(包括端值在内)的摩尔比。在该范围内，抗体与LGR5的结合不抑制(阻断)RSPO 1与LGR5的结合。
当提及本文的抗体与RSPO的摩尔比时，优选抗体的含量产生存在饱和量抗体时所实现的结合的40％-80％。
已经描述了与LGR5结合的各种抗体。抗体与LGR5的结合可阻断或不阻断Rspondin与LGR5的结合。已经发现，阻断Rspondin 1配体与LGR5结合的抗体与包含蛋白质的N-端区域、富含亮氨酸重复序列(LRR)区域1和LRR2的区域结合(Lau等人，2011；Nature，第476卷；第293-297页，以及其中描述的补充信息)。该元件包含于如图39所示的SEQ ID NO：1所示的LGR5蛋白质序列的氨基酸21-118(包括端值在内)中；其中氨基酸21-70构成N-端区域，氨基酸71-94(包括端值在内)构成LRR1并且95-118构成LRR2。本领域中已经报道了仅少量抗体不阻断LGR5与Rspondin 1的相互作用，并且据发明人所知，这些抗体均不与LGR5的N-端区域结合。
本发明现在提供一种蛋白质，其结合图39中所示的SEQ ID NO：1的LGR5序列的氨基酸残基21-118内的表位并且该蛋白质不阻断Rspondin 1与LGR5的结合。
测定抗体阻断还是不阻断Rspondin与LGR5的结合的测试优选包含在细胞膜上表达LGR5的CHO细胞。将抗体和待分析的Rspondin混合在一起并加入到细胞中，由此测定抗体与细胞的结合。在存在过量Rspondin的情况下，抗体与LGR5表达细胞的结合量指示抗体不阻断Rspondin与LGR5的结合。所述测试还优选包含结合LGR5并阻断Rspondin与LGR5结合的对照抗体。对照抗体优选为如实施例中所述的抗体PB10261或OMP88R20。蛋白质不阻断Rspondin 1与LGR5的结合，当与对照抗体相比时，如果在其它相同的条件下，更多蛋白质能够结合LGR5表达细胞。优选在其中蛋白质或对照抗体与Rspondin的摩尔比为1∶10或更少，即0.1或更少；优选地以介于0.1至0.001之间的摩尔比(包括端值在内)，优选地0.1至0.01的摩尔比(包括端值在内)的条件下，对其进行评估。蛋白质还优选结合其它膜相关蛋白质的细胞外部分。在一个优选的实施方案中，其它膜相关蛋白质为EGF-受体家族或cMET的膜缔合成员。
本发明还提供一种蛋白质，其可结合LGR5的细胞外部分上的表位，所述表位位于图39所示的SEQ ID NO：1的氨基酸残基21-118内，并且其中蛋白质对LGR5的结合由以下氨基酸残基取代中的一种或多种减少：D43A、G44A、M46A、F67A、G90A和F91A。在一个优选的实施方案中，Rspondin(RSPO)1与LGR5-表达细胞上的LGR5的相互作用抑制抗体与LGR5的结合不超过20％。优选在蛋白质和RSPO 1、2、3或4以0.1或更小的摩尔比；优选地以介于0.1至0.001之间的摩尔比(包括端值在内)，优选地0.1至0.01的摩尔比(包括端值在内)存在时，测量蛋白质与LGR5的结合的抑制(蛋白质：RSPO)。
本发明还提供一种蛋白质，其可结合LGR5上的表位，所述LGR5位于图39所示的SEQID NO：1的氨基酸残基21-118内，并且其中当蛋白质与RSPO 1以0.1或更小的摩尔比；优选地以介于0.1至0.001之间的摩尔比(包括端值在内)，优选地0.1至0.01的摩尔比(包括端值在内)存在时，RSPO 1与LGR5表达细胞上的LGR5的相互作用抑制蛋白质与LGR5的结合不超过20％。表位优选位于图39所示的SEQ ID NO：1的氨基酸残基40-95内。蛋白质与LGR5的结合优选由以下氨基酸残基取代中的一种或多种减少：D43A、G44A、M46A、F67A、G90A和F91A。这通常指示蛋白质与这些提及的氨基酸相互作用。改变这些氨基酸改变蛋白与LGR5的结合。因此，这些氨基酸可能是用于结合蛋白质的LGR5中的接触残基。在这种情况下，发明人认为残基M46、F67、G90A和F91为接触残基。D43和G44也可以为接触残基，但也可以是改变其它残基的特定构象，使得它们不再能够被蛋白质结合的残基。蛋白质优选可结合其它蛋白质。其它蛋白质优选为包含细胞外部分的膜蛋白。其它蛋白质优选为表皮生长因子(EGF)受体家族或cMET的膜缔合成员。如本文所讨论的LGR5结合蛋白优选为抗体，优选双特异性抗体。
本发明还提供一种双特异性抗体，其包含可结合LGR5的细胞外部分上的表位的可变结构域，所述表位位于图39所示的SEQ ID NO：1的氨基酸残基21-118内，并且其中可变结构域对LGR5的结合由以下氨基酸残基取代中的一种或多种减少：D43A、G44A、M46A、F67A、G90A和F91A；双特异性抗体还包含可结合其它蛋白质的可变结构域。其它蛋白质优选为包括细胞外部分的膜蛋白。其它蛋白质为EGF受体家族或cMET的膜缔合成员。
如本文提及的蛋白质或双特异性抗体与EGF受体家族或cMET的膜缔合成员的结合优选减少包括所述EGF受体家族或cMET的膜缔合成员的细胞中的配体诱导的信号传导。
本发明提供一种抗体，其包含可结合LGR5的细胞外部分上的表位的可变结构域，所述表位位于图39所示的SEQ ID NO：1的氨基酸残基21-118内。
本发明还提供一种抗体，其结合LGR5的细胞外部分上的表位，其中氨基酸残基I462；G44、M46、F67、G90和F91参与抗体对表位的结合。
本发明还提供一种抗体，其结合LGR5的细胞外部分上的表位，其中以下氨基酸残基取代中的一种或多种减少抗体与表位的结合：D43A、G44A、M46A、F67A、G90A和F91A。
本发明还提供一种抗体，其包含可结合LGR5的细胞外部分上的表位的可变结构域，所述表位位于图39所示的SEQ ID NO：1的氨基酸残基21-118内，并且其中抗体对表位的结合通过以下氨基酸残基取代中的一种或多种减少：D43A、G44A、M46A、F67A、G90A和F91A。
如本文所用，膜蛋白为细胞膜蛋白，即，在细胞的外膜中的蛋白质，所述膜将细胞与外部环境隔开。膜蛋白具有细胞外部分。如果膜蛋白包含细胞的细胞膜中的跨膜区，则膜蛋白至少在细胞上。
抗体优选还包含可结合其它蛋白质的其它可变结构域。其它蛋白质优选为包含细胞外部分的膜蛋白。其它蛋白质优选为表皮生长因子(EGF)受体家族或cMET的膜缔合成员。抗体为双特异性抗体。
出于清楚和简要描述的目的，本文将特征结构描述为相同或独立实施方案的一部分，然而，应该理解，本发明的范围可包括具有所述特征的全部或一些的组合的实施方案。
附图说明
图1：本专利申请中所述的VH片段的氨基酸序列。指示了CDR1、CDR2和CDR3区域，以及FR1、FR2、FR3和FR4区域。
图2：本专利申请中所述的选定的VH编码cDNA的核苷酸序列。
图3：共同轻链的注释序列(cLC)。
图4：本专利申请中测试的抗体的注释的Fc(CH1-CH3)区氨基酸序列。
图5：生长因子EGF和HRG对类肿瘤P14T和P18T的类肿瘤形态的影响。
生长因子EGF和HRG对类肿瘤P14T和P18T的类肿瘤形态的影响的示例。生长因子诱导肿瘤尺寸、管腔尺寸和管腔分布的同时变化。这三种形态学参数的组合将观察到的类器官定位在独特的特征空间中。可基于这三个特征的组合并且在没有生长因子(无GF)作为参考点的情况下计算欧几里德距离。于是欧几里德距离为由治疗引起的X、Y和Z方向上的变化。
图6：在第35天获得的与稳定过表达抗原的Freestyle 293F细胞结合的ZNRF3免疫动物的血清的FACS分析。
与第0天(免疫前)血清比较，测试血清与稳定表达ZNRF3的ECD的293F Freestyle细胞系的结合。每个图示出对照(未染色)细胞(填充灰色)与用相应血清染色的细胞(无填充)的重叠。小鼠编号为L19-L24；对照染色在图的右侧示出，n.c.：阴性对照。
图7：使用选择的单克隆噬菌体克隆体的制剂对DiD标记的ZNRF3过表达细胞和未标记(亲本)293F freestyle细胞的混合物进行FACS染色的示例。
每个点图都是未染色细胞和用选择的在噬菌体上表达的Fab染色的细胞的重叠。每个图的上半部分示出DiD-标记的抗原阳性细胞，并且图的下半部分示出未标记的抗原阴性293F freestyle细胞。在图中所示的六个克隆体中(标记为1-6)，四个为抗原特异性的(1、3、4和6)并且两个(2和5)为非反应性的。用针对cMyc源表位标签的抗体染色用于表达蛋白质的对照，并且仅用二抗(抗-M13和Strep-PE)染色阴性对照。
图8：在过表达hLGR5的Freestyle 293F细胞的细胞表面上一价IgG针对hLGR5的亲和力评级(全部均与破伤风类毒素Fab片段组合)。
示出整个组的代表性示例。对于稳定表达hLGR5的固定数的细胞(5x105个细胞/孔)，测试IgG的两倍稀释系列(5μg/ml-0,08μg/ml)。测量每个数据点的平均荧光强度(MFI)，并针对用于染色的IgG的增加量作图。由每个IgG，基于独立的曲线计算曲线下面积(AUC)并用于评级。表(右图)示出图(左图)中所示的双特异性IG的AUC值。基于AUC值，对IgG对其相应靶的结合亲和力进行评级。
图9：在R-Spondin阻断ELISA中测试hLGR5一价结合IgG的rhR-Spondin3阻断能力(全部均与TT Fab片段组合)。
示出LGR5组的代表性示例。通过使用0,031μg/ml rhLGR5-Fc未抑制地结合2μg/ml包被的rhR-Spondin3建立最大结合(归一化至0％)，并用抗-Fc抗体检测。最大结合的OD450nm值设定为100％。R-Spondin3剩余指示添加过量的R-Spondin3(15μg/ml)以用作用于竞争的阳性对照。以15μg/ml测试双特异性IgG，基于最大信号对OD450nm值进行归一化，并由蓝色条表示。当百分比低于80％时认为克隆体是部分阻断的，并且当百分比低于50％时认为是阻断的。该示例示出靶向LGR5/TT IgG片段的LGR5的代表性组。
图10：在培养基在5ng/ml EGF的存在下，参考抗体PG3755(EGFR二价，单特异性)和PB10651(EGFR/LGR5双特异性)对类肿瘤细胞系P18T的生长抑制作用。
抗体将EGF诱导的类肿瘤表型恢复成无生长因子刺激的表型(第一列)。在比EGFR双特异性参考抗体PG3755低的剂量下，PB10651作为生长抑制剂是有活性的。
图11：对于暴露于EGFR/WNT靶向双特异性抗体和对照治疗的一种结肠类肿瘤的验证筛选结果的示例。
欧几里德距离越小，治疗效果越有效；1等于正常生长。PB10651(具有MF3755xMF5816的EGFR/LGR5抗体)在所测试的剂量(2μg/ml)下示出完全的生长抑制，并且优于西妥昔单抗。
图12：用125I标记后，PB10651保留免疫反应性。
放射活性标记的蛋白质的免疫反应性。A：PB10651中抗-EGFR Fab臂的Lindmo测定；B：PB10651中抗-EGFR Fab臂的Lindmo测定。用125I标记蛋白质后，存在非常少的免疫反应性损失。
图13：PB10651以次纳摩尔的亲和力与EGFR和LGR5二者结合。
PB10651与LGR5和EGFR结合的亲和力分析。A：PB10651与CHO-LGR5细胞结合的分析；B：PB10651与CHO-EGFR细胞结合的分析，并且C：PB10651与DLD-1细胞结合的亲和力分析。
图14：如通过鸟枪诱变分析测定的，PB10651中的抗-EGFR Fab臂与EGFR的结构域III中的残基结合。
示出由存在于PB10651中的抗-EGFR Fab臂识别的EGFR上的表位，其模拟了EGFR的结构(Li等人，2005；pdb参考1YY9)。结构中突出了发现与PB10651的结合相关的残基。
图15：如通过鸟枪诱变分析测定的，PB10651中的抗-LGR5Fab臂与存在于N-CAP结构域中的残基和LGR5的第一富亮氨酸重复序列结合。
所述图示出由PB10651识别的LGR5上的表位，其模拟与RSPO1复合的LGR5的结构(Peng等，2013：pdb参考4BSR)。识别的残基在二聚体的左(浅灰色)LGR5分子中以黑色表示。RSPO1用球和棒形式表示。
图16：通过配体R-spondin1结合LGR5，剂量依赖性地抑制了OMP88R20抗-LGR5抗体的复制型式。
测试OMP88R20(PG7711)的复制型式在EC50(50ng/ml)下的结合，并测试在增加量的R-spondin1存在下与LGR5过表达细胞的结合。将获得的MFI值归一化成对照(无R-spondin1)值。
图17：在配体R-spondin1大摩尔过量时，存在于PB10651中的抗-LGR5Fab MF5816不抑制结合LGR5。
测试OMP88R20(PG7711)的复制型式在50ng/ml下的结合，并且测试双特异性抗体在100ng/ml下，在增加浓度的R-spondin1或大鼠抗体1D9存在下对LGR5过表达细胞的结合。用PE标记的抗-人IgG二抗检测所示抗体的结合。对于曲线中的每个点，将获得的MFI值归一化为(除以)在对照(无R-spondin1)情况下发现的值。
图18：二价、单特异性PG3755有效抑制EGFR介导的信号传导。
在存在62.5ng/ml人EGF和增加量的所示抗-EGFR抗体的情况下，测量A431细胞的增殖(将阿尔玛蓝加入细胞中之后，测量为荧光计数：Y轴)。PG1337用作未结合(阴性)对照。增加的计数表示增加的细胞数并由此表明阻断EGFR介导的信号传导。
图19：无岩藻糖基化的PB10651以相当的亲和力与EGFR和LGR5两者的食蟹猴直系同源物结合。
在FACS中以指定浓度用指定抗体染色后获得的MFI值作为所用抗体浓度的函数作图。对于EGFR，将西妥昔单抗用作食蟹猴EGFR结合的阳性对照。对于LGR5，将得自Genentech的hu8E11v2(PG7543)的复制型式用作食蟹猴LGR5结合的阳性对照。
图20：使用前导抗-LGR5/EGFR双特异性抗体在FACS中将来源于患者的类器官染色来可视化LGR5表达。
使用两种不同的抗-LGR5抗体(MF5816和MF5814)和识别破伤风毒素(TT)的阴性对照对来源于结肠直肠癌患者(P18)的类器官样本进行染色。TT抗体的染色用于设定两种抗-LGR5抗体的染色阈值。TT染色设定为0.8％时，MF5816和MF5814抗体示出相当的染色水平，其中53.6％和52.7％的细胞的LGR5表达评级为阳性。
图21：使用对LGR5表达(癌症干细胞)细胞富集的前导双特异性抗-LGR5/EGFR双特异性抗体对来源于患者的类器官进行染色和分选。
将结肠直肠癌类器官系(P18T)用于FACS染色，并分选上(阳性)和下(阴性)，15％的染色细胞由抗-LGR5抗体MF5814和MF5816识别。对每个群体分选2000个单细胞并用于产生用于定量PCR的cDNA。将B2M的表达用作内源性对照，并且使用2-ΔΔCT方法和StepOne2.2 plus软件相对于阴性级分表示LGR5 mRNA在阳性级分中的表达。对于每个抗体，实验分两次运行(实施例1和实施例2)，并且实验重复，显示出相对于阴性，阳性级分中的LGR5mRNA增加。误差条表示相对量化最大值，其使用StepOne 2.2 plus软件作为分析的一部分产生。
图22：使用对于肿瘤起始细胞富集的前导抗-LGR5/EGFR双特异性抗体，对LGR5表达细胞的来源于患者的类器官进行分选。
左图：类器官的照片示出一个BME液滴，并使用Olympus MVX10 MacroView显微镜拍摄。MF5816照片上的插图显示出液滴中的一个类器官的更近视图。右图：示出在LGR5阳性细胞群体和LGR5阴性细胞群体中发现生长两周后计数的类器官数的条形图。
图23：利用前导抗-LGR5/EGFR双特异性抗体治疗来源于患者的类器官有效抑制类器官生长。
左图：条形图，示出在利用所示抗体(在图下方示出)进行不同治疗后发现的平均类器官数(上)和类器官尺寸(下)。右图：在不同治疗后由类器官获得的图像的代表性示例。将单个细胞接种并保留以构建类器官并持续三天。在第三天去除培养基并用包含浓度为2μg/mL的抗体的培养基替代。将类器官进一步培养另外7天。在第7天，使用Olympus ScanR使用x4光物镜扫描类器官，并使用运行内部设计的宏的ImageJ来量化类器官数。数据相对于TT对照示出，并且运行双侧配对样本T-检验以评估治疗之间的显著差异。误差条表示标准偏差。*＝p≤0.05(相对于TT)，**＝p≤0.001(相对于TT)。#＝p≤0.05(相对于EGFR-TT)，##＝p≤0.001(相对于EGFR-TT)。
图24：LGR5xEGFR双特异性使未分化细胞群的减少增强。
将单个细胞接种并生长三天，然后用抗体治疗。七天后，提取总RNA并用于定量实时PCR分析以检测LGR5和CK20(分化标记物)的mRNA含量。使用2-ΔΔCT方法检测表达差异。数据是相对于阴性对照(TT-TT)示出。实验分两次进行，并示出两次实验的平均值。误差条表示两个实验的标准偏差。
图25：示出在本发明的VH和/或CDR中耐受但不丧失结合特异性的氨基酸变化的超级簇的示例。
图26：PB10651相对于西妥昔单抗在体外抑制来源于患者的类肿瘤和来源于正常组织的类器官的生长方面的功效的比较结果。
利用各浓度范围的PB10651和西妥昔单抗治疗对来源于正常组织和癌变组织(A和B)的类器官的类器官培养物的影响的示例。图26C：使用来源于患者的类肿瘤和来源于正常组织的类器官获得的生长抑制的IC50值。第三栏中的比例示出比率IC50(西妥昔单抗)/IC50(PB10651)。
图27：PB10651比单特异性抗-EGFR和抗-LGR5抗体在体外抑制类器官生长方面显著更有效。
用指示的抗体以3D形式体外治疗p18T(A)和C1M(B)类器官培养物。根据所用抗体的浓度对类器官尺寸作图。抗-LGR5抗体不示出对类器官生长的任何影响；
图28：与亲本二价单特异性抗体的混合物相比，PB10651在体外减少类器官生长方面更有效。
该图显示在存在EGF的情况下，参考抗体PG3755(EGFR二价单特异性抗体)，PG5816(LGR5二价单特异性抗体)或其等摩尔组合和PB10651(EGFR/LGR5双特异性抗体)对类肿瘤系P18T的生长抑制作用。A.P18T类器官尺寸根据用于治疗的抗体浓度进行描述。用PG5816治疗的类器官未示出生长抑制；PG3755显著减少生长，但与PB10651的程度不同。PG3755和PG5816的组合在抑制P18T类肿瘤生长方面也显著低于PB10651。B.用所示抗体(左图)治疗所示类器官(上)发现的生长抑制的IC50值的比较结构。对于PB10651发现的IC50值始终低于对于亲本抗体混合物发现的那些IC50值。
图29：用PB10651体外类器官治疗导致抗体的细胞内定位，这在涉及LGR5或EGFR的单特异性二价抗体的情况下未观察到。
在抗体处理24小时后，将类器官固定、透性化并用人IgG染色以示出抗体的(亚)细胞定位。仅在PB10651的情况下，观察到在用二价单特异性抗体处理的类器官中不存在点状细胞内染色。在后一种情况下，抗体被浓缩并定位在细胞膜上。
图30：响应于利用PB10651的治疗的细胞示出抗体的细胞内定位，这在对治疗无响应的类器官治疗后未观察到。
在抗体处理24小时后，将类器官固定、透性化并用人TgG染色以示出抗体的(亚)细胞定位。响应于利用PB10651(COM、C55T、P18T、C31M)治疗的不同类器官示出抗体的细胞内染色，而未响应的类器官示出PB10651(C28T、P19Tb、P8T、C51N)细胞表面定位。
图31：MV1453和MV1626质粒的矢量图。
图32：MV1622(RMD表达载体)的矢量图。
图33：无岩藻糖基化的PB10651的CEX-HPLC谱图。
图34：与PB10651(未增强的)和PG1337(对照)相比，PB10651(ADCC增强的)的ADCC报告基因测定的结果。
图35：EGFR和LGR5在来源于患者的异种移植(PDX)模型中的表达。
通过TaqMan实时PCR测量EGFR和LGR5基因在活体研究和冷冻瘤株中的表达。表达表示为用2-ΔΔCT方法获得的对数转换值，其使用GAPDH作为持家基因。从活体动物提取的肿瘤呈现出类似于参考瘤株相似的基因表达值。
图36：PB10651抑制PDX的体内生长。
用PB10651或西妥昔单抗或PBS每周(箭头)治疗结肠直肠PDX模型。在停止治疗期间和之后接着肿瘤生长(以mm3指示)。响应于西妥昔单抗(一个WT和一个KRAS G13D突变体)的模型也响应于PB10651。三种不响应西妥昔单抗的KRAS G12V/D突变体模型中的一种显示出利用PB10651的显著肿瘤生长抑制。
图37：利用PB10651治疗导致肿瘤中增殖细胞数的显著减少。
治疗48小时后(2μg/mL)，P18类肿瘤的免疫组织化学染色。上图示出增殖的标记物(ki67)，并且下图示出细胞凋亡的标记物(裂解的半胱天冬酶-3)。使用x20物镜拍摄图像，棕色染色指示表达，其中计核器使用苏木精染色。
图38：PB10651比西妥昔单抗在抑制体内类器官生长方面显著更有效。
A.周抗体给药对P18异种移植物生长的影响。
一旦肿瘤达到50mm3的平均尺寸，就开始抗体治疗(第0天)，并将体积的相对变化作图。小鼠每周处理一次(由箭头表示)。将治疗组内的所有肿瘤体积平均并作图；表中表示出每个时间点的异种移植物数。误差条表示平均值的标准误差。*＝P＜0.01(相比于PBS)，#＝P＜0.01(相比于西妥昔单抗)，如通过配对t检验分析测定的。
B.周抗体给药对C31M异种移植物生长的影响。
一旦肿瘤达到30mm3的平均尺寸，就开始抗体治疗(第0天)，并将体积的相对变化作图。小鼠每周处理一次(由箭头表示)。将治疗组内的所有肿瘤体积平均并作图；表中表示出每个时间点的异种移植物数。误差条表示平均值的标准误差。*＝P＜0.01(相比于PBS)，#＝P＜0.05(相比于西妥昔单抗)，如通过配对t检验分析测定的。
图39：人LGR5的注释氨基酸序列。
前导序列指示从成熟蛋白质切割的氨基酸序列，N-区跨氨基酸21-70(包括端值在内)；LRR代表富含亮氨酸重复序列，LLR1代表富含亮氨酸重复序列区1；LRR2是富含亮氨酸重复序列区2等。LLR1起始于氨基酸71并终止于氨基酸94(包括端值在内)；LLR2起始于95并结束于118。CRL是富含半胱氨酸的连接子区。TM表示各种跨膜区域，并且C-TERM表示蛋白质的C-端端部。注释部分一起形成一个命名为SEQ ID NO：1的连续序列。该完整序列是SEQ IDNO：1，即使出于某种原因，另一个序列也列为SEQ ID NO：1，但该编号仍占主导地位。
图40：野生型人类EGFR(基因库NM_005228)的注释氨基酸序列。
信号肽、细胞外部分、预测的跨膜螺旋和包含C-端尾部的细胞内酪氨酸激酶均被示出。注释部分一起形成一个命名为SEQ ID NO：2的连续序列。该完整序列是SEQ ID NO：2，即使出于某种原因，另一个序列也列为SEQ ID NO：2，但该编号仍占主导地位。
实施例
如本文所用，其中X独立地为数字0-9的“MFXXXX”是指包含可变结构域的Fab，其中VH具有由4位数字标识的氨基酸序列。除非另外指明，否则可变结构域的轻链可变区通常具有图3的序列。轻链具有如图3所示的序列。“MFXXXX VH”是指由4位数字标识的VH的氨基酸序列。MF还包含轻链恒定区和通常与轻链恒定区相互作用的重链恒定区。PG是指包含相同重链和轻链的单特异性抗体。PB是指具有两个不同重链的双特异性抗体。重链的VH/可变区不同且通常还具有CH3区，其中重链中的一条具有其CH3结构域的KK突变，另一条具有其CH3结构域的互补DE突变(参见PCT/NL2013/050294(公布为WO2013/157954))。在PB、PG和其它代码中，数字指示有时跟随生产批次的指示。例如，PB10651p06是指PB10651第6批。
实施例：1
方法、材料和抗体的筛选
细胞系：
Freestyle 293F细胞(目录号p/n51-0029)购自Invitrogen并常规保存在293FreeStyle培养基中。HEK293T(ATCC-CRL-11268)和CHO-K1(DSMZ ACC110)细胞系购自ATCC并且常规保存在补充有L-谷氨酰胺(Gibco)和FBS(Lonza)的DMEM/F12(Gibco)中。
产生重组人和小鼠LGR4、LGR5、ZNRF3和RNF43表达载体
人LGR4全长人(h)LGR4存在于载体pEF1_Myc/His(Invitrogen)中，其包含2个FLAG标签和2个HA标签(pEF1_hLGR4-FLAG-HA)，并克隆到pVax1(Invitrogen)中，产生pVax1_hLGR4-FLAG-HA。插入序列通过与NCBI参考序列NM_018490比较来验证。该序列包含氨基酸水平上的以下偏差：信号肽中的P2A。将来自构建体pEF1_hLGR4-FLAG-HA的插入序列重新克隆到pVax1中。另选地，pVax1中的全长hLGR4由hLGR4；hLGR4(ECD)-GPA33(TM)-FLAG的截短型式取代，从而产生pVax1_hLGR4(ECD)-GPA33(TM)-FLAG。
用于在细胞表面上表达的氨基酸序列全长hLGR4-FLAG-HA插入序列(两者均在pEF1_Myc/His和pVax1中)
其中：
用于在细胞表面上表达的pVax1中的氨基酸序列hLGR4(ECD)-GPA33-FLAG插入序 列：
其中：
人LGR5
人LGR4全长人(h)LGR5存在于载体pEF1_Myc/His(pEF1_hLGR5-FLAG-HA)中，其包含2个FLAG标签和2个HA标签，并克隆到pVax1(Invitrogen)中，产生pVax1_hLGR5-FLAG-HA。该序列通过与NCBI参考序列NM_003667.3比较来验证。将来自构建体pEF1_hLGR5-FLAG-HA的插入序列重新克隆到pVax1中，产生pVax1_hLGR5-FLAG-HA。另选地，pVax1中的全长hLGR5由hLGR5；hLGR5(ECD)-GPA33(TM)-FLAG的截短型式取代，从而产生pVax1_hLGR5(ECD)-GPA33(TM)-FLAG。
用于在细胞表面上表达的氨基酸序列全长hLGR5-FLAG-HA插入序列(两者均在 pEF1_Myc/His和pVax1中)
其中：
用于在细胞表面上表达的pVax1中的氨基酸序列hLGR5(ECD)-GPA33(TM)-FLAG插 入序列：
其中：
小鼠LGR5
编码全长(FL)小鼠(m)LGR5的cDNA存在于pEF1_Myc/His(Invitrogen)中，其包含cMyc和HIS标签(pEF1_mLgr5-Myc-HIS)。mLgr5 cDNA序列通过与NCBI参考序列NM_010195.2比较来验证。
用于在细胞表面上表达的pEF1_Myc/His中的氨基酸全长小鼠(m)Lgr5-Myc-HIS插 入序列：
其中：
克隆编码人ZNRF3的cDNA
编码人(h)ZNRF3(基因库NM_001206998.1)的cDNA用作模板以扩增cDNA的特异性部分(细胞外结构域(ECD)：氨基酸1-219，或ECD-TM部分(截短突变体)：氨基酸1-256)。为了能够在抗原阴性细胞的表面上表达靶蛋白并且能够生成稳定的细胞克隆体，将编码hZNRF3的ECD克隆到pDisplay中(pDisplay_hZNRF3(ECD)-cMyc-PDGFR(TM))并且将截短突变体(具有自体同源TM区的ECD)克隆到pcDNA3.1中(pcDNA3.1_hZNRF3(ECD-TM))。pDisplay构建体允许经由细胞外cMyc源表位标签确认蛋白质表面表达。涉及特异性引物，合成并用于扩增hZNRF3的特异性部分。然后将这些克隆到pDisplay中(仅ECD)，产生pDisplay_hZNRF3(ECD)-cMyc-PDGFR(TM)，和克隆到pcDNA3.1中(具有TM区的ECD)，产生pcDNA3.1_hZNRF3(ECD-TM)，用于在(抗原阴性)细胞中表达。
克隆编码小鼠ZNRF3 ECD和人RNF43 ECD的cDNA并制备重组蛋白质
编码小鼠(m)ZNRF3(基因库NM_001080924.2，氨基酸53-205，所用信号肽来源于半胱氨酸蛋白酶抑制剂)的ECD的cDNA和人RNF43(基因库NM_017763，氨基酸24-109，包含半胱氨酸蛋白酶抑制剂前导序列)的ECD的cDNA用于在载体pUPE(U-Protein Express BV)中生成重组纯化的his标记蛋白，其由靶的ECD组成。简而言之：构建体(Peng等人，2013 PlosONE 8：2-10)转染到Hek293E细胞(293c18 ATCC，CRL-10852)中，并且在制备一周后，收获含蛋白质的上清液。使用IMAC(固定金属离子亲和层析)和凝胶过滤纯化hexa HIS-标记蛋白质。编码小鼠ZNRF3的(密码子优化的)ECD的另一cDNA合成制备，并与cMyc源表位标签和来源于血小板的生长因子受体(PDGFR)的跨膜区一起克隆到pDisplay中用于在细胞表面上表达(pDisplay_mZnrf3-cMyc-PDGFR(TM))。
克隆编码人RNF3的cDNA
编码人(h)RNF43(基因库NM_017763)的cDNA用作模板以扩增cDNA的特异性部分(细胞外结构域(ECD)：氨基酸1-199，或ECD-TM部分(截短突变体)：氨基酸1-222)。为了能够在抗原阴性细胞的表面上表达靶蛋白并且能够生成稳定的细胞克隆体，将编码hRNF43的ECD克隆到pDisplay中(pDisplay_hRNF43(ECD)-cMyc-PDGFR(TM))并且将hRNF43的截短突变体(具有自体同源TM区的ECD)克隆到pcDNA3.1中(pcDNA3.1_hRNF43(ECD-TM))。pDisplay构建体允许经由细胞外cMyc源表位标签确认蛋白质表面表达。涉及特异性引物，合成并用于扩增hZNRF3的特异性部分。然后克隆到pDisplay(仅ECD，用于免疫目的)和pCDNA3.1(具有TM区的ECD)中用于在(抗原阴性)细胞上中的表达，并生成稳定表达靶的细胞克隆体。
克隆编码小鼠RNF3的cDNA
编码小鼠(m)RNF43(基因库NM_172448.3，氨基酸1-199)的ECD的cDNA作为合成基因订购，并与cMyc源表位标签和来源于血小板的生长因子受体(PDGFR)的跨膜区一起克隆到pDisplay中用于在细胞表面上表达(pDisplay_mRnf43-cMyc-PDGFR(TM))。
用于在细胞表面上表达的pDisplay氨基酸序列中的人ZNRF3(ECD)：
其中：
用于在细胞表面上表达的人ZNRF3截短突变体氨基酸序列：
其中：
用于表达可溶性蛋白的pUPE可溶性氨基酸序列中的小鼠ZNRF3ECD-His：
其中：
用于在细胞表面上表达的pDisplay氨基酸序列中的小鼠(m)ZNRF3序列：
其中：
用于在细胞表面上表达的pDisplay氨基酸序列中的人RNF43：
其中：
用于在细胞表面上表达的pDlsplay氨基酸序列中的小鼠RNF43：
其中：
克隆LGR5和EGFR的食蟹猴和大鼠直系同源物
使用人特异性引物(Cyno-LGR5-FOR：5’-CCAGCAGGATCCGCCGCCACCATGGACACCTCCCGGCTCGGTG-3’和Cyno-LGR5-REV：5’-CCAGCAGCGGCCGCTTAGAGACATGGGACAAATGCCAC-3’)由食蟹猴结肠和肝cDNA扩增编码食蟹猴LGR5的cDNA。向反应中加入DMSO可能改善PCR反应的产率和特异性。肝和结肠cDNA两者均允许扩增预期的2.7kb带，并且然后将得自结肠cDNA的PCR产物用于克隆。将获得的cDNA克隆到pcDNA3.1(BamH1-Not1)中并测序。编码由偶联到人跨膜和细胞内部分的食蟹猴细胞外结构域构成的嵌合EGF受体的序列(也描述于WO2010/022736-A2中)得自专利US2010/0183615-A1(第79页)，并且将编码cDNA进行密码子优化用于在人细胞中表达，由GeneArt命令并克隆。然后使用Nhe1和Not1将该cDNA重新克隆到pcDNA3.1中。编码大鼠EGFR和大鼠LGR5的cDNA购自Sino Biological(编码大鼠EGFR的cDNA：目录号RG80100-UT；基因库参考HMS01041.1)和Origene(编码大鼠LGR5的cDNA：目录号RN202738；基因库参考NM_001106784)。使用Kpn1和Not1将两种cDNA重新克隆到pcDNA3.1中。对所有cDNA测序并示出是正确的。
全长野生型食蟹猴LGR5氨基酸序列
其中：
生成LGR4、LGR5、ZNRF3和RNF43过表达细胞系
将表达hLGR4(pEF1_hLGR4-FLAG-HA)、hLGR5(pEF1_hLGR5-FLAG-HA)、hZRNF3(ECD)(pcDNA3.1_hZNRF3(ECD)和pDisplay_hZNRF3(ECD)-Myc-PDGFR(TM))以及hRNF43(ECD)(pDisplay_hRNF43-(ECD)-Myc-PDGFR(TM))的构建体用于生成稳定表达相应蛋白质的Freestyle 293F和CHO-K1克隆体。使用PEI(Freestyle 293F细胞)或阳离子脂质体(CHO细胞)转染将构建体瞬时转染到Freestyle 293F和CHO-K1细胞中，并使用与相应靶反应的抗体通过FACS进行筛选。在成功转染后，将Freestyle 293F和CHO-K1细胞以有限稀释度接种并在0.5mg/ml G418选择压力下培养以获得稳定的细胞克隆体。在选择的2-3周之后，通过FACS筛选克隆体。所选的克隆体通过连续传代扩增，在FACS中重新检测并冷冻至-150℃。
用于免疫的小鼠
为了生成结合到LGR4、LGR5的人抗体，用编码蛋白质的DNA或重组DNA将对于人VK1-39轻链(共用轻链小鼠，参见WO2009/157771)和人重链(HC)微小基因(包含人V基因片段、全部人Ds和全部人Js的选择)转基因的ZNRF3和RNF43小鼠进行免疫，如下文简要描述的。这些小鼠被称为小鼠。
免疫
hLGR4/hLGR5 DNA免疫
18只小鼠用各自表达全长hLGR4和hLGR5的20μg质粒DNA(pVax1_hLGR4-FLAG-HA和pVax1_hLGR5-FLAG-HA)进行免疫。此外，12只小鼠用20μg融合到GPA33跨膜结构域和Flag标签(pVax1_hLGR4(ECD)-GPA33-FLAG和pVax1_hLGR5(ECD)-GPA33-FLAG)的hLGR4和hLGR5胞外结构域的质粒DNA进行免疫。在第0天、第3天、第6天、第14天、第17天、第28天、第31天、第49天、第63天、第70天、第84天和第91天给小鼠接种疫苗。
LGR4、LGR5、ZNRF3、RNF43蛋白质免疫
六只小鼠用溶于PBS，并补充有40μl Gerbu助剂MM(Gerbu Biotechnik)的40μg重组人(rh)LGR4-Fc(RND系统目录号7750-GP)、rhLGR5-Fc(RND系统目录号8078-GP)、rhZNRF3-Fc(RND系统目录号7994-RF)或rhRNF43-Fc(RND系统目录号7964-RN)蛋白质进行免疫。随后，在第14天和第28天用20μg重组蛋白(+20μl Gerbu助剂MM)对小鼠加强免疫，之后用20μg重组蛋白进一步加强，直至观察到血清滴度或免疫期大于三个月。
测定抗体滴度
来自免疫小鼠的血清中的抗-hLGR4、hLGR5、hZNRF3或hRNF43滴度对于过表达相应靶的Freestyle 293F细胞通过FACS测定。
回收淋巴组织
从成功免疫的所有小鼠去除脾并引流淋巴结(参见表1)。由脾和腹股沟淋巴结两者产生单细胞悬液，并且随后在Trizol试剂中裂解这些组织并储存在-80℃直至使用。
通过VH基因的RT-PCR克隆形成“免疫”噬菌体抗体库
从成功免疫的小鼠，将腹股沟淋巴结用于构建“免疫”噬菌体抗体库。使用Trizol从淋巴组织中提取RNA，将1μg的总RNA用于使用IgG-CH1特异性引物的RT反应中。然后，将所得cDNA用于扩增VH编码cDNA的多克隆库，其使用内部开发的VH特异性引物，基本上如Marks等人所述(J Mol Biol.1991年12月5日；222(3)：581-97)。然后将所得PCR产物克隆到噬菌体载体中以在噬菌体上展示Fab片段，如de Haard等人所述(J Biol Chem.1999年6月25日；274(26)：18218-30)，不同的是轻链对于每个抗体相同，并且由载体编码。连接后，将噬菌粒用于转化大肠杆菌TG1细菌，并将转化的细菌接种到包含氨苄青霉素和葡萄糖的LB-琼脂板上。所有噬菌体文库均包含＞106个转化体，并且具有＞80％的插入序列频率。在过夜生长之后收集细菌并且经构建方案用于制备噬菌体(de Haard等人，J Biol Chem.1999年6月25日；274(26)：18218-30)。
从合成或“免疫”噬菌体抗体库中选择携带特异性结合到LGR4、LGR5、ZNRF3和 RNF43的Fab片段的噬菌体
根据标准化规程拯救噬菌体文库(J Mol Biol.1991年12月5日；222(3)：581-97；JBiol Chem.1999年6月25日；274(26)：18218-30)，并且在内部生成的合成库的情况下选择噬菌体并进行两轮选择，在免疫噬菌体抗体库的情况下选择噬菌体并进行一轮选择。在第一轮中，将重组蛋白质涂布到MAXISORPTMELISA板的孔上或NUNC免疫管上，然而在第二轮中，使用重组蛋白质或过表达靶的细胞。MAXISORPTM ELISA板或免疫管用4％ELK封闭。在将噬菌体库加入经涂覆抗原中之前，噬菌体抗体库也用4％ELK和过量人IgG封闭以消耗Fc区结合物。
在室温和振摇条件下，噬菌体库与经涂布蛋白质温育进行2小时。然后板和试管用0.05％Tween-20的PBS溶液洗涤五至十次，之后用PBS洗涤5至10次。结合的噬菌体使用50mM甘氨酸(pH 2.2)洗脱并加入大肠杆菌TG-1中并在37℃下温育以用于噬菌体感染。随后将感染的细菌铺在包含氨苄青霉素和葡萄糖的琼脂板上，并在37℃下温育过夜。在第一轮选择后，将菌落从板上刮下并合并，然后拯救并扩增以准备富集的第一轮噬菌体库用于合成库。对于“免疫”库，在第一轮噬菌体选择后，针对靶结合筛选单克隆体。
对于合成库，然后使用上文所述的方案在重组人(rh)蛋白(rhLGR4-Fc、rmLgr4-Fc、rhLGR5-Fc、rhZNRF3-Fc或rhRNF43-Fc、RND体系、可溶性rhRNF-43-HIS、rmZnrf3-HIS(内部制备))上选择富集库，或者在稳定过表达hLGR4(FL)、hLGR5(FL)、hZNRF3(ECD)或hRNF43(ECD)的Freestyle 293F细胞上选择富集库。对于细胞选择，拯救的噬菌体和细胞用4％ELK封闭。封闭后，将拯救的噬菌体与5^106个亲本Freestyle293F细胞温育用于消减并持续1小时。消减之后，将细胞离心并将噬菌体上清液转移到表达hLGR4、hLGR5、hZNRF3或hRNF43的Freestyle 293F细胞。在2℃-8℃下将细胞加噬菌体温育2小时。使用5ml 0.5％BSA的PBS溶液洗涤细胞(5-10次)。结合的噬菌体使用200mM TEA洗脱并用Tris(pH8)中和，并加入大肠杆菌TG-1中，在37℃下温育以用于噬菌体感染。随后将感染的细菌铺在包含氨苄青霉素和葡萄糖的琼脂板上，并在30℃或37℃下温育过夜。
在第二轮选择之后，收集单个克隆体并测试靶反应性。然后在FACS中鉴定结合hLGR4、hLGR5、hZNRF3或hRNF43的阳性噬菌体克隆体对稳定过表达相应靶的Freestyle293F的结合(参见下文)。
细胞的DiD标记以及DiD阳性和阴性细胞的混合物的FACS染色
稳定过表达相应靶的Freestyle 293F细胞克隆体内部生成。使用标准化规程培养这些细胞并收集。然后在37℃下，在1ml体积的细胞培养基中用1μl DiD(Invitrogen，目录号V22889)标记约2千万个抗原表达细胞并持续20分钟。在FACS中检查细胞的一小部分等分试样的DiD标记，并一致地发现超过90％。然后细胞用20ml细胞培养基洗涤两次，并随后用于FACS染色。为此，制备抗原阴性(亲本)Freestyle 293F细胞和DiD标记的抗原阳性细胞的1∶1混合物并将其以每孔200,000个细胞等分到圆底96孔FACS微量滴定板中。如下所述，使用单克隆噬菌体进行染色。
使用单克隆噬菌体对靶阳性和阴性细胞的混合物进行FACS染色
制备被选择用于结合相应靶的单克隆体的单克隆噬菌体，如(J Mol Biol.1991年12月5日；222(3)：581-97；J Biol Chem.1999年6月25日；274(26)：18218-30)所述。通过在总共100μl的包含4％牛奶的FACS缓冲液(PBS，包含0.5％BSA和0.5mM EDTA)中，与噬菌体(30μl)一起温育，在FACS中测试这些细胞对(DiD标记的)抗原阳性和(未标记的)阴性细胞系的混合物的结合。在洗涤三次后，通过用生物素酰化的抗-M13抗体(Fitzgerald，目录号61R-M101ABTB62-FEZ，在FACS缓冲液中1∶125，冰上30分钟)和PE标记的链霉抗生物素蛋白(Invitrogen，目录号SA1004-4；在FACS缓冲液中1∶400，冰上15分钟)染色，来检测结合的噬菌体。使用FACS Canto(Becton and Dickinson)分析染色的细胞。
RTK靶向抗体
使用前述方法(J Mol Biol.1991年12月5日；222(3)：581-97；J Biol Chem.1999年6月25日；274(26)：18218-30)，由内部生产的大合成噬菌体抗体库(HER3)，或由通过成功靶向免疫MeMo小鼠生成的噬菌体抗体库(EGFR)获得EGFR-和HER3-靶向cLC抗体。用于生成对EGFR和HER3的抗体以及相应的EGFR和HER3抗体的抗体可变结构域VH链的方法已经描述于以下通过引用并入本文的待审申请中：WO 2015/130173 A1和WO 2015/130172 A1。
VH-编码cDNA从噬菌体载体重新克隆到IgG-表达载体
对所有靶特异性克隆体的VH编码cDNA进行测序。然后使用Sfi1-BstEII或SfiI/XhoI消化将基于序列同一性和集分析(图25)的一批独特克隆体重新克隆到不同的IgG表达载体中，并根据标准化分子生物技术将经消化的cDNA库其连接到IgG表达质粒中。
生成双特异性抗体
通过使用专有CH3工程化技术瞬时共转染编码具有不同VH结构域的IgG的两种质粒来生成双特异性抗体，以确保有效异源二聚化和双特异性抗体的形成。共同轻链也被共转染到同一细胞中，在同一质粒上或者在另一质粒上。在共同未决的专利申请中(例如，WO2013/157954和WO2013/157953；以引用方式并入本文)，公开了用于由单个细胞产生双特异性抗体的方法和装置，由此提供与形成单特异性抗体相比，有利于形成双特异性抗体的装置。这些方法还可有利地用于本发明。具体地讲，基本上仅产生双特异性全长IgG分子的优选突变是在351位和366位处的氨基酸取代，例如，在第一CH3结构域(“KK-变体”重链)中的L351K和T366K(根据EU编号法进行编号)和在351位和368位处的氨基酸取代，例如第二CH3结构域(“DE-变体”重链)中的L351D和L368E，反之亦然。先前在共同未决的专利申请中展示，带负电的DE-变体重链和带正电的KK-变体重链优先配对以形成异源二聚体(所谓的“DEKK”双特异性分子)。几乎不进行DE-变体重链(DE-DE同源二聚体)或KK-变体重链(KK-KK同源二聚体)的同源二聚化，这是因为相同重链之间的CH3-CH3界面中带电残基之间的强相斥。
将编码结合上述LGR4、LGR5、ZNRF3和RNF43的抗体的VH基因克隆到编码带正电的CH3结构域的载体中，并且将如先前所述并在WO 2015/130172(以引用方式并入本文)中公开的RTK(EGFR-或HER3-)靶向抗体克隆到编码带负电的CH3结构域的载体中。将悬浮生长调节的293F Freestyle细胞在摇动器平台上于T125烧瓶中培养直至密度为3.0×106个细胞/ml。细胞以0.3-0.5×106个活细胞/ml的密度接种在24深孔板的每个孔中。细胞用编码不同抗体的两种质粒的混合物瞬时转染，克隆到专有载体体系中。在转染后7天，收集细胞上清液并通过0.22μM过滤器(Sartorius)过滤。将无菌上清液储存在4℃直至纯化抗体。
生成单克隆抗体
选择的VH序列也被重新克隆到编码单特异性二价IgG的IgG1表达载体中。将悬浮调节的293F Freestyle细胞在摇动器平台上于T125烧瓶中培养直至密度为3.0×106个细胞/ml。细胞以0.3-0.5×106个活细胞/ml的密度接种在24深孔板的每个孔中。根据标准化规程用单独的无菌DNA：PE1混合物瞬时转染细胞并进一步培养。在转染后7天，收集上清液并通过0.22μM过滤器(Sartorius)过滤。将无菌上清液储存于4℃直至使用蛋白质A亲和层析法纯化抗体。
靶向LGR5、FZD7和R-spondin3的比较抗体的克隆和表达。
特异性识别EGFR、FZD、RSPO3或LGR5的抗体在本领域中是已知的。根据公开的信息构建比较抗体：编码VH-和VL的cDNA序列来源于公布的专利并克隆到编码全长人IgG1分子的表达载体中。随后通过瞬时转染，并根据标准化规程使用蛋白质-A亲和层析从培养物上清液中纯化，使抗体在293F Freestyle细胞中表达。hu8E11v2(抗-LGR5)抗体根据专利US2013/0336885 A1(Genentech)复制。BNC101抗体(抗-LGR5)的序列信息得自专利US2016/0031984 A1(Bionomics Inc.)。编码OMP18R5抗体(抗-FZD)的序列根据专利AU2014/212081A1(Oncomed Pharmaceuticals Inc.)复制。OMP18R20和OMP18R21抗体序列(抗-LGR5)存在于并根据专利US 8,628,774 B2(Oncomed Pharmaceuticals Inc.)复制。编码OMP131R10(抗-RSPO3)的序列根据专利WO 2016/090024 A2(Oncomed Pharmaceuticals Inc.)复制。使用西妥昔单抗的临床批次。表7中给出了复制的抗体以及对这些型式给定的内部编号的列表。
IgG纯化用于功能性筛选
使用蛋白质-A亲和层析进行小规模(＜500μg)、中等规模(＜10mg)和大规模(＞10mg)的IgG纯化。使用过滤在24孔过滤板中在无菌条件下进行小规模纯化。首先，将培养基的pH调节至pH 8.0，并且随后在振摇平台上在25℃下以600rpm将含IgG的上清液与蛋白ASepharose CL-4B珠(50体积/体积％)(Pierce)温育2小时。接着，通过过滤收集所述珠。用pH 7.4的PBS将珠洗涤两次。然后在pH 3.0下用0.1M柠檬酸盐缓冲液将结合的IgG洗脱，并且洗脱液立即使用Tris pH 8.0进行中和。通过使用多屏Ultracel 10多重板(Millipore)离心进行缓冲液交换。最终在PBS pH7.4中收集样品。使用Octet测量IgG浓度。蛋白质样品储存在4℃。
使用Octet量化IgG
为测定纯化的IgG的量，将总人IgG(Sigma Aldrich，目录号I4506)用作标准物，使用蛋白质-A生物传感器(Forte-Bio，根据供应商的建议)通过Octet分析来测定抗体的浓度。
LGR4/LGR5/ZNRF3/RNF43特异性IgG的结合的表征
首先将靶向LGR4、LGR5、ZNRF3或RNF43的抗体表达为具有识别非相关(对照)抗原：破伤风类毒素的第二Fab臂的双特异性共同轻链抗体。测试抗体在FACS中对过表达hLGR4、hLGR5、hZNR3或hRNF43的Freestyle293F细胞的结合。因此，收集细胞并在FACS缓冲液(PBS/0.5％BSA/0.5mM EDTA)中稀释至106个细胞/ml。在U形底96孔板的每个孔中加入1-2×105个细胞。在4℃以300g将细胞离心2分钟。通过倒置板丢弃上清液。添加50μl的每种IgG样品(为筛选，稀释成在FACS缓冲液中浓度为5μg/ml)并在冰上温育1H。将细胞离心一次，去除上清液并用150μl的FACS缓冲液将细胞洗涤两次。添加50μl稀释的1∶400山羊抗人IgG PE(Invitrogen)并在黑暗中在冰上温育30分钟。在添加FACS缓冲液之后，将细胞离心一次，去除上清液并用FACS缓冲液将细胞洗涤两次。在HTS装置中，在FACSCanto流式细胞仪(Becton和Dickinson)上分析细胞。通过测量染色细胞群的平均荧光强度(MFI)来评估抗体对细胞的结合。当MFI为用(阴性对照)非结合抗体(针对破伤风类毒素)染色的相同细胞群的至少5倍时，认为抗体结合其靶。
未测试结合反应性，还使用ELISA测定。测试LGR4和LGR5靶向双特异性IgG对抗原rhLGR4-Fc、rhLGR5-Fc和破伤风类毒素的反应性。测试ZNRF3和RNF43抗体对抗原rhZNRF3-Fc、rhRNF43-Fc和破伤风类毒素的反应性。将抗原涂布到MAXISORPTM ELISA板上过夜。ELISA板的孔用包含5％BSA的PBS(pH 7.2)封闭1小时。所选抗体以在PBS-5％BSA中稀释的5μg/ml的浓度进行测试，并允许在25℃下结合1小时。另选地，当滴定双特异性IgG时，以5μg/ml或8μg/ml开始制备七步二倍稀释系列。作为对照，该规程利用对涂布的抗原具有特异性的可商购获得的抗体或抗破伤风类毒素对照抗体同时进行。ELISA板用PBS-T(PBS-0.05体积/体积％Tween 20)洗涤3次。用1∶2000稀释的HRP缀合物(山羊抗-人IgG Becton Dickinson)检测结合的IgG，并使其在25℃下结合1小时。ELISA板用PBS-T(PBS-0.05％Tween 20)洗涤3次，并通过TMB/H2O2染色使结合的IgG可视化，并且使用OD 450nm测量量化染色。
FACS中LGR4/LGR5/ZNRF3/RNF43特异性IgG的亲和力评级
收集细胞并在FACS缓冲液(PBS/0.5％BSA/0.5mM EDTA)中稀释至106个细胞/ml。在U形底96孔FACS板的每个孔中加入1-2×105个细胞。在4℃以300g将细胞离心2分钟。通过倒置各板丢弃上清液。以5μg/ml开始，以七步二倍系列稀释形式添加50μl的每种IgG样品并在冰上温育1小时。将细胞离心一次，去除上清液并用150μl的FACS缓冲液将细胞洗涤两次。添加50μl 1∶400稀释的小鼠抗人IgG PF(Invitrogen)并在黑暗中在冰上温育30分钟。在添加FACS缓冲液之后，将细胞离心一次，去除上清液并用FACS缓冲液将细胞洗涤两次。在HTS装置中，在FACSCanto流式细胞仪上分析细胞。通过测量平均荧光强度(MFI)并计算曲线下面积(AUC)来量化抗体对细胞的结合，所述曲线下面积得自根据用于染色的抗体浓度所得的MFI曲线图。
IgG纯化用于功能研究
使用HiTrap MabSelect Sure色谱柱和HiTrap脱盐色谱柱在100系统上进行中等规模纯化。样品以5ml/min加载。所述色谱柱用2倍柱体积的PBS洗涤。IgG用0.1M柠檬酸盐缓冲液在pH 3.0下洗脱。接着，将样品脱盐并在PBS pH 7.4的最终缓冲液中终止。通过0.45μM过滤器(Sartorius)过滤IgG。使用OD280测量IgG浓度。蛋白质样品储存在-80℃。
检测抗体与靶的小鼠直系同源物的反应性。
为了测试mLgr4结合反应性，使用ELISA测定。对LGR4-和LGR5-靶向抗体两者均测试针对重组mLgr4-Fc(RND体系，目录号8077-GP)蛋白质的反应性。将mLgr4-Fc涂布到MAXISORPTM ELISA板并过夜。ELISA板的孔用包含5％BSA的PBS(pH 7.2)封闭1小时。所选抗体以在PBS-5％BSA中稀释的5μg/ml的单一浓度进行测试，并允许在25℃下结合1小时。作为对照，该规程利用对涂布的抗原具有特异性的可商购获得的抗体和对照(抗-TTcLC)抗体同时进行。ELISA板用PBS-T(PBS-0.05体积/体积％Tween20)洗涤3次。用1∶2000稀释的HRP缀合物(山羊抗-人IgG；Becton Dickinson)检测结合的IgG，并允许其在25℃下结合1小时。ELISA板用PBS-T(PBS-0.05％Tween 20)洗涤3次，并通过TMB/H2O2染色使结合的IgG可视化；并且使用OD 450nm测量量化染色。
测试双特异性IgG在FACS中对瞬时表达mLgr5、mZnr3或mRnf43的Freestyle 293F细胞的结合。因此，细胞使用阳离子脂质体用mLgr5、mZnrf3或mRnf43-编码构建体(pEF1_mLgr5-Myc-HIS、pDisplay_mZnrf3-Myc-PDGFR(TM)、pDisplay_mRnf43-Myc-PDGFR(TM))瞬时转染，并且收集并在FACS缓冲液(PBS/0.5％BSA/0.5mM EDTA)中稀释至106个细胞/ml。在U形底96孔板的每个孔中加入1-2×105个细胞。在4℃以300g将细胞离心2分钟。通过倒置各板丢弃上清液。以5μg/ml的浓度添加50μl的每种IgG样品并在冰上温育1小时。将细胞离心一次，去除上清液并用FACS缓冲液将细胞洗涤两次。添加50μl的1∶400稀释的小鼠抗人IgGPE(Invitrogen)并在黑暗中在冰上温育30-60分钟。在添加FACS缓冲液之后，将细胞离心一次，去除上清液并用FACS缓冲液将细胞洗涤两次。在HTS装置中，在FACSCanto流式细胞仪上分析细胞。通过测量转染细胞群的平均荧光强度(MFI)来量化抗体对细胞的结合。
R-Spondin3阻断ELISA测定
所有四个WNT靶均具有R-Spondin作为其配体(Prog Biophys Mol Biol.2015年9月；118(3)∶112-8；J Struct Biol.2015年8月；191(2)：149-55)。对于每个靶，开发配体阻断测定以测试靶(LGR4、LGR5、ZNRF3或RNF43)特异性抗体干扰R-Spondin3对靶的结合的能力。在针对LGR4、LGR5、ZNRF3或RNF43的过量cLC IgG的存在下，测试相应靶的ECD的Fc融合蛋白对涂布的R-Spondin3的结合。在cLCIgG结合到R-Spondin3结合位点的情况下，Fc融合蛋白将不再能够结合到涂布的R-Spondin3，并且ELISA信号将丧失。将重组R-Spondin3(RND体系)涂布到MAXISORPTM ELISA板的孔上。ELISA板的孔用包含5％BSA的PBS(pH 7.2)封闭1小时。在重组人类靶蛋白(rhLGR4-Fc、rhLGR5-Fc、rhZNRF3-Fc或rhRNF43-Fc)的存在下，以PBS-5％BSA中稀释的15μg/ml浓度测试所选的抗体。将IgG/重组人靶蛋白络合物预温育10分钟，然后加入到涂布R-Spondin3的板中并持续10分钟-2小时。作为用于阻断的对照，该规程通过添加过量的(15μg/ml)rhR-Spondin3代替IgG来同时进行。ELISA板用PBS-T(PBS-0.05体积/体积％Tween 20)洗涤3次。用1∶2000稀释的抗-人IgG HRP缀合物(山羊抗-人IgGBethyl labs)检测结合的Fc-蛋白，并使其在25℃下结合1小时。ELISA板用PBS-T(PBS-0.05％Tween 20)洗涤3次，并通过用TMB/H2O2染色检测结合的络合物；并且使用OD 450nm测量量化染色。
双特异性抗体与细胞表面表达的抗原结合的亲和力测量。
根据van Uhm等人所述的方案，使用IODO-GEN，利用125I放射性标记无岩藻糖基化PB10651。用Lindmo等人描述的方法研究放射性标记之后抗体的免疫反应性。利用表达EGFR或LRG5的CHO细胞进行125I-PB10651的稳态细胞亲和力测量，以分别研究针对EGFR和LGR5的亲和力。另外，还测定了针对内源性表达EGFR但不具有可检测的LGR5的DLD-1细胞系的亲和力。所述测定使用恒定浓度的靶(细胞)并且在不违反支持稳态条件下亲和力测量的假设的情况下，滴定放射性配体的量。非特异性结合(NSB)通过在平行系列中100倍摩尔过量未标记的PB10651的存在来进行评估。测定重复两次，并且估计的KD值记录为三次独立实验的平均值。KD值的估计使用GraphPad Prism v 6.0h非线性回归进行，一位点-在KD值必须大于0的限制下的总结合和非特异性结合。
参考文献：
Lindmo T，Boven E，Cuttitta F，Fedorko J，Bunn PA.Determination of theimmunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linearextrapolation to binding at infinite antigen excess.J Immunol Methods.1984；72：77-89。
van Uhm JI，Visser GW，van der Schans MJ，Geldof AA，Meuleman EJ，Nieuwenhuijzen JA.The ultimate radiochemical nightmare：upon radio-iodinationof Botul ihum neurotoxin A，the introduced iodine atom itself seems to befatal for the bioactivity of this macromolecule.EJNMMI Res.2015；5：5。
通过鸟枪诱变分析进行表位作图
根据Davidson等人(2014)所述的方法，通过鸟枪法诱变分析测定由PB10651识别的EGFR和LGR5上的表位。由两种抗原制备两种突变库：一个库包括人EGFR(基因库参考序列NP_005219.2)的a.a.300-520(配体结合结构域L2或结构域III)和人LGR5(基因库参考序列AAH96324.1)的其它a.a.22-560(为直到第一个跨膜螺旋的N-端结构域)。LGR5表达构建体在a.a.834处截短以增加受体的细胞表面表达。将靶向不同表位的内部开发的抗体用作用于突变体表达的对照抗体。
参考文献：
Davidson，E.和Doranz，B.J.(2014)A high-throughput shotgun mutagenesisapproach to mapping B-cell antibody epitope.Immunology 143，13-20。
使用基于细胞的测定竞争PB10651中的LGR5 Fab臂与配体R-spondin1之间的LGR5 结合。
将专利US 8,628,774B2中所述的抗体OMP88R20(被称为PG7711)的文献复制型式用作配体阻断对照来设置测定以展示抗-LGR5 Fab臂的配体阻断能力。通过利用编码LGR5的表达构建体瞬时转染CHO-K1细胞，然后通过限制性稀释选择抗生素(G418)抗性克隆体，生成过表达人LGR5的来源于CHO-K1的细胞克隆体。然后以抗体的稀释系列测试OMP88R20的复制型式对该细胞系的结合，并测定结合的EC50。接着，在含量逐渐增加的配体R-spondin1的(R&D Systems，目录号4645-RF/CF)的存在下，在FACS中测量EC50浓度下抗体对表达CHO细胞克隆体的LGR5的结合。为测试PB10651的抗-LGR5Fab(MF5816)对LGR5的结合是否可通过配体的结合来抑制，在含量逐渐增加的配体R-spondin1存在下，在100ng/ml下测试抗体对LGR5的结合。使用已报道与LGR5的近膜区结合的大鼠抗-LGR5抗体1D9(de Lau等人，2011)进行类似测定以显示相互作用的特异性。
PB10651中抗-EGFR Fab臂的配体阻断能力
为了测试抗-EGFR IgG对EGF诱导的信号传导的作用，测试其已知A431细胞的EGF诱导的细胞凋亡性细胞死亡的能力。简而言之，高浓度(10nM)的EGF诱导A431细胞的(细胞凋亡)细胞死亡(Gulli等，1996)。这种作用可通过添加配体阻断的抗-EGFR抗体，诸如西妥昔单抗(小鼠225抗体是西妥昔单抗的小鼠等同物)而剂量依赖性地恢复。将A431细胞以1500个细胞/孔接种在96孔组织培养板中并生长过夜。第二天，抗体以指定浓度连同62.5ng/ml(10nM)重组人EGF(R&D Systems，目录号236-EG)一起添加，并使细胞生长三天。三天后，通过添加阿拉玛兰蓝(Invitrogen，目录号DAL1100)，并在以560nm激发的590nm射线下测量荧光来测定代谢活性细胞数在该测定中测试了所有抗-EGFR IgG与西妥昔单抗相比的EGF阻断效果。
参考文献：
Gulli，L.F.等人，Epidermal growth fac tor-induced apop tosis in A431cells can be reversed by reducing the tyrosine kinase activity.Cell GrowthDiffer，1996，7(2)：第173-178页。
热稳定性测定
为了获得关于双特异性IgG的稳定性的指示，将所有IgG在40℃下在含血清培养基(DMEM，高葡萄糖(Gibco，目录号41966-029)，补充有9％胎牛血清(Thermo Scientific，目录号SV30180))中温育，并且然后在结合ELISA中测试结合(基本上如上所述)。该ELISA由涂布2μg/ml抗原(rhLGR4-Fc、rhLGR5-Fc、rhZNRF3-Fc或rhRNF43-Fc)，使用100μl的5μg/mlIgG，并在5％BSA的PBS溶液中封闭构成。在该测试中，将保持在2℃-8℃(冰箱)的相同IgG(在含血清的培养基中)对抗原的结合与保持在40℃的IgG对抗原的结合进行比较。计算在40℃下温育1周之后的结合的损失百分比。
结肠直肠癌(CRC)类器官培养物
CRC类器官如(Van de Wetering等人，2015 Cell 161：933-45)所述制备，作为工作细胞库并以冷冻小瓶形式运送用于在干冰上进行筛选测定，其密度为每1ml冷冻培养基(包含10％DMSO作为冷冻保护剂的胎牛血清)1,500,000个细胞。低温管储存在-80℃，3个月内使用，或在-150℃长期储存。
培养基
通过富集具有5ml 100x青霉素-链霉素(Thermo Fisher 15140-122)、5ml 100xGlutamax(Thermo Fisher 35050-038)和5ml 1M Hepes(Thermo Fisher 15630-056)的500ml Advanced DMEM(hermo Fisher 12491-023)制备类肿瘤扩增培养基。向70ml的富集的Advanced DMEM中，添加20ml R-spondin 1条件培养基和10ml的Noggin-条件培养基(Vande Wetering等人，2015 Cell 161：933-45)，以制备100ml类肿瘤扩增培养基，其另外补充有2ml 50x B27补充剂(Thermo Fisher 17504-044)、1ml 1M烟酰胺(Sigma-AldrichN0636)、250μl 500mM N-乙酰半胱氨酸(Sigma-Aldrich A9165)、10μl 5mM A83-01(TGFβ抑制剂，Tocris 2939)和33μl 30mM SB202190(p38抑制剂，Sigma Aldrich S7067)。在人EGF(Peprotech AF-100-15)或人NRG-1/HRG(ImmunoTools 11343047)的存在下，新鲜接种结肠类肿瘤时，该类肿瘤扩增培养基还补充有100μl 10mM Y27632(Rho激酶抑制剂，Abmole Y-27632二盐酸盐)。EGF和HRG是刺激类器官扩增的生长因子，并且其剂量决定了筛选测定的灵敏度。EGF在筛选期间以2.5ng/ml、5ng/ml或10ng/ml的剂量添加，或者在扩增期间以10ng/ml或50ng/ml的剂量添加。HRG仅以5ng/ml使用。
野生型类器官扩增培养基等同于类肿瘤扩增培养基，其具有一个替换：将70ml富集的Advanced DMEM替换为20ml富集的Advanced DMEM和50ml WNT3A条件培养基的组合(Van de Wetering等人，2015 Cell 161：933-45)。来源于正常组织的结肠类器官和具有野生型APC的结肠类肿瘤是WNT依赖性的，并且因此需要WNT存在用于扩增。
凝胶组合物
将冷冻的结肠类肿瘤迅速在37℃的水浴中融化并收集于5ml富集的AdvancedDMEM中。通过在4℃以1000rpm离心5分钟使类器官粒化。去除上清液，并且在不具有生长因子的类肿瘤扩增培养基中吸收类器官。将该类器官悬浮液与Cultrex生长因子减少基底膜提取物，2型，PathClear(Amsbio 3533-010-02)混合。最终的Cultrex凝胶百分比为60％，并且每毫升细胞数为100,000。
测定来源于患者的类器官的生长因子反应性
为了测定来源于患者的类器官是否响应于生长因子治疗，将其如上所述，在存在或不存在生长因子(EGF(5ng/ml)或NRG(5ng/ml))的情况下接种，然后培养5天。然后使用Cell Titer Glo细胞活力测定法(Promega，目录号G7571)测定活细胞数。然后可将使用经生长因子刺激的细胞的发光读数与使用未经刺激的细胞获得的发光读数进行比较。
制备培养板
胶凝在预热的培养板中更加快速。因此，在细胞接种前一天，所有培养板均置于37℃下的潮湿的CO2培养箱(Eppendorf)中。
为了扩增结肠类肿瘤，使用24孔或6孔板(Greiner Bio-One)，并且每孔以3滴或10滴的15μl凝胶/类器官悬浮液以固定距离点样。在37℃下30分钟的胶凝时间后，添加包含10ng/ml至50ng/ml EGF的类肿瘤扩增培养基(0.5ml或2ml)。在接种的第1天，类肿瘤扩增培养基包含10μM Y27632。扩增期间，利用不含Y27632的含EGF类肿瘤扩增培养基替换培养基。
为进行筛选，使用384孔μclear板(Greiner Bio-One 781091)。每个孔，使用自动液体处理分配15μl的凝胶/类器官混合物。在37℃下胶凝30分钟后，将45μl类肿瘤扩增培养基(或适当的类器官扩增培养基)添加到每个孔的凝胶顶部上。培养基补充有或不补充生长因子，并且将(参考)抗体和化合物与v形底96孔板中的培养基混合，然后适用于具有固化凝胶的384孔板。
制备抗体母板
运输参考抗体(西妥昔单抗(4℃)、阴性对照抗体、单臂HER3或EGFR靶向抗体和HER3/EGFR抗体(在干冰上))并储存在4℃用于筛选。在4℃下密封并运输的深孔96孔板中递送双特异性和单特异性抗体。一般来讲，整个实施例中的单特异性cLC抗体的符号通过前缀“PG”识别，而双特异性cLC抗体的符号通过前缀“PB”识别。为了避免疑义，cLC抗体的Fab片段的符号通过前缀“MF”识别。抗体手动地转移至四个v形底96孔板(Greiner Bio-One 736-0118)中，在从孔B02至孔G11范围内的随机位置中(内部60个孔)。参考抗体也以相等的浓度以随机位置加入板中。将这些抗体母板用于制备PBS中的1∶10稀释板。主板和稀释板在4℃下密封保存。
为验证筛选结果，在带螺旋盖的微量试管中装运主要为双特异性IgG(浓度为0.5mg/ml的46种抗体)的组，以使抗体在筛选板中容易随机化并防止交叉污染和蒸发。在每次实验运行之前，将双特异性IgG与0.1mg/ml的参考抗体通过将它们在PBS中稀释而一起置于一个v形底96孔板中(内部60个孔)。将该板在PBS中再次以1∶5稀释以获得含有20μg/ml抗体的第二母板。使用Felix液体处理器进行稀释和板暴露。
暴露方案
高剂量和低剂量v形底96孔抗体母板在培养基中以1∶10稀释，然后暴露。在初筛时施加的抗体浓度为10μg/ml和1μg/ml或者40μg/ml和4μg/ml；并且在验证筛选时，抗体剂量为10μg/ml和2μg/ml。在接种后30分钟，将抗体加入类器官中。在板固定之前，抗体暴露最少7天且最多9天。
固定和成像
为制备暴露的类肿瘤板用于成像，如前所述，将类器官固定并染色以使细胞核和肌动蛋白细胞骨架分别可视化(Di等人，PlosOne 2014，PMID 25289886)。如先前所述，使用连接到Twister II机器人臂的Molecular Devices ImageXpress Micro XLS对板进行成像(Sandercock等，Molecular Cancer2015，PMID26227951)。简而言之，使用4倍镜头捕获384孔板中每个孔的z-堆栈，z步长为50μm。每个孔的部分数在20部分至24部分的范围内，以覆盖每个孔中凝胶的整体深度范围。
图像分析
捕获的图像存储在中央数据服务器上，其可通过OcellO OminerTM3D图像分析平台进行访问，该平台允许通过分布式计算设计直接对3D图像堆栈进行平行分析。该软件分析每个孔中检测到的对象(细胞核和细胞骨架)的结构以及它们的相对位置。在分析时，检查输出以检测原始图像和分析方法的质量。软件产生的每个对象的测量值(对于细胞核、类器官、类器官内的核、管腔、管腔在类器官内的相对位置和整个结构(类器官、细胞核和管腔))随后按孔聚合，并且数据与板布局信息(细胞系、生长因子条件、处理等)偶合。在数据聚合时，检查数据在对照处理中的一致性，不存在边缘效应，平行测定之间的一致性以及阳性和阴性对照之间的z’因子。接着，将数据进行z分数归一化并通过将数据加载到TIBCO中清除附加异常值进行检测。收集500种不同的形态学特征；然后，对数据进行一系列统计，所述统计基于这组特征结构区分参考处理效果与阴性对照形态的能力，进行从z-堆栈图像收集的～500个特征结构中的3至20个的子选择。从参考和阴性对照之间的距离按照欧几里得距离测量值计算(图5)并且在零和一之间缩放。这种形态变化的统一评分用于区分化合物筛选中的命中。个体选择特征测量值连同由图像确证一起被用于证实和验证命中化合物治疗对类器官的影响。
Z’因子：Z’因子是高通量筛选测定的质量的统计学量度，并指示阳性对照和阴性对照之间的分离窗口。Z’-因子被定义为1减去3乘以阳性对照和阴性对照的标准偏差总和除以阳性对照和阴性对照平均值之间的绝对差。Z’值小于0指示阴性对照和阳性对照之间存在太多重叠，0和0.5之间的值指示有用的但是勉强合格的筛选窗口，并且0.5和1.0之间的值指示优良的测定，其具有阳性对照和阴性对照之间的强分离。
使用选择的抗-LGR5 cLC抗体由类器官P18T获得的细胞的FACS染色
来源于结肠直肠癌样品的类器官在37℃和5％CO2下，在100％基底膜提取物(BME，Amsbio)中培养，其中培养基由Advanced DMEM/F12(Invitrogen)构成，其补充有：2mMGlutaMax(Invitrogen)、10mM HEPES(Invitrogen)、1x B27游离视黄酸(Invitrogen)、50ng/mL EGF(Peprotech)、0.1μg/mL Noggin(Peprotech)、Rock抑制剂Y-27632(Sigma-Aldrich)、10nM PGE2(Sigma-Aldrich)、3μm SB202190(Sigma-Aldrich)、10nM胃泌素(Tocris)、1μg/ml R-SPO1(自制)、10mM烟酰胺(Sigma-Aldrich)、1.25mM N-乙酰半胱氨酸Sigma-Aldrich)、0.5μM A83-01(Tocris)。分析前一天，类器官被分解成单个细胞。为此目，首先通过去除培养基从BME中释放类器官，并将BME重新悬浮于细胞回收溶液(BDBiosciences)中，并在冰上温育1小时。随后，将类器官离心(所有离心步骤在4℃下以200g持续5分钟)。将粒料重新悬浮于1mL 50％胰蛋白酶/EDTA溶液(TE)中；50％PBS，并上下移取，并定期目视评估，直至获得单细胞悬液。TE在10mL PBS中稀释并离心。细胞在10mL的PBS中洗涤两次，然后重新悬浮于BME中，并等分成50μL，滴到预热板(37℃)上。将BME液滴静置15分钟，然后按滴添加500μL培养基。12小时后，使用细胞回收溶液从BME中分离细胞。在冰上1小时后，将细胞离心，并在10mL包含0.5％BSA和0.5mM EDTA的PBS(染色缓冲液)中洗涤一次。然后使粒料重新悬浮于染色缓冲液中并计数。使用最多100,000个细胞/100μL抗体。对适当数的细胞计数后，将其离心并重新悬浮于100μL包含稀释至10μg/mL的第一抗体(单克隆和双特异性IgG)的染色缓冲液中。细胞在冰上温育45分钟，并且定期倒转试管以确保均匀染色。温育后，将细胞在1mL的染色缓冲液中洗涤并离心。细胞再次在1mL的染色缓冲液中洗涤，然后与包含缀合至以1∶400稀释的R-PE(Invitrogen，H10104)的抗-人IgG抗体的100μL染色缓冲液一起温育。将细胞在冰上温育20分钟，避光。温育后，细胞在1mL的染色缓冲液中洗涤两次，然后将其重新悬浮于包含0.1μM DAPI(Sigma-Aldrich)的染色缓冲液中。将细胞保留在冰上，避光，并立即分析。使用SSC-W对SSC-A排除双峰，使用DAPI排除死细胞。基于针对破伤风毒素(MF1337)而产生的阴性对照抗体的染色来设定LGR5抗体的选通。使用BD FACS Aria Fusion检测荧光，其使用针对DAPI的UV激光器和450/50滤波器组，并且使用具有582/15滤波器的绿色激光器来检测R-PE荧光。
分选之后的LGR5 mRNA富集
为评估LGR5FACS染色是否对于表达LGR5的细胞富集，将细胞用分选门集进行分选，以便分离出最高和最低15％的染色细胞。将总共2000个细胞分选到picrofrofiling缓冲液中(由IRB基因组学工具提供)，然后将经分选的细胞通过IRB基因组学工具处理以用于RNA提取和cDNA合成。使用TaqMan探针和TaqMan Universal PCR Master Mix(两者均来自Applied Biosystems)，使用定量的PCR评估LGR5表达。按照制造商的说明，使用StepOnePlus实时PCR仪(Applied Biosystems)在具有光罩的透明光学96孔反应板中运行反应。使用LGR5探针(Hs00173664_m1)评估阴性和阳性LGR5级分之间的表达，并使用内源性对照基因B2M(Hs99999907_m1)的表达进行归一化。使用StepOne 2.2 plus软件测定靶基因表达的差异。
LGR5的P18染色和LGR5阳性和阴性群的分选以及这两者之间的生长差异
如先前所述对细胞染色，并设定分选门使得最高和最低15％的染色细胞分选到200μL包含Primocin(Invitrogen)的培养基中。基于FACS分选事件的数量测定分选细胞的数量。分选后，将细胞离心并以2000个细胞/25μL BME的密度铺板。使用倒置光学显微镜手动计数两周后形成的类器官的数量。
用EGFRxLGR5双特异性抗体处理P18T类器官
对于抗体处理实验，培养基被修改，并且不含胃泌素或PGE2，并且具有降低浓度的EGF(2.5ng/mL)。在类器官解聚之后，使用Tryphan蓝染色(Sigma-Aldrich)来测定活细胞数，并将5000个细胞/25μL BME铺在48孔组织培养板中。每种处理具有8个技术平行测定，并以250μL培养基/孔进行培养。接种单一细胞三天后，去除培养基并用包含抗体处理物的培养基(2μg/mL)替换。自添加抗体7天后，使用Olympus ScanR，使用4倍光学物镜对板进行扫描，并使用运行由IRB显微工具设计的宏的ImageJ来量化类器官数。分三次重复试样，并且运行双尾配对样本T检验以评估处理之间的显著差异。
RNA分离以及LGR5和CK20 mRNA含量的Q-PCR分析
将经处理的类肿瘤的组织培养板扫描用于计数之后，使用细胞回收溶液分离类肿瘤并在冰上温育1小时。然后将类肿瘤离心并重新悬浮于1mL的TRIzol Plus RNA纯化试剂盒(Life Technologies)中，并提取总RNA。用氯仿进行相分离后，将上层水相与70％乙醇混合并根据由制造商提供的方案通过RNA柱(PureLinkTM RNA Mini试剂盒，LifeTechnologies)进行洗涤。
使用Nanodrop分光光度计量化RNA。
然后使用高容量cDNA试剂盒(Applied Biosystems)将RNA逆转录成cDNA。将使用TaqMan探针和TaqMan Universal PCR Master Mix(两者均来自Applied Biosystems)的定量实时PCR用于量化mRNA的LGR5(Hs00173664_m1)和CK20(Hs00300643_m1)含量。使用2-ΔΔCT方法和StepOne 2.2 plus软件检测表达差异。
体外测量不同指征的PDX模型中的LGR5和EGFR的mRNA和蛋白质水平
使用从体内生长的PDX肿瘤提取的mRNA通过RNA测序(RNAseq)来分析LGR5和EGFR基因的表达水平。将来自Crown Bioscience数据库(http：//hubase2.crownbio.com)的数据表示为每百万每千碱基(FKPM)的片段的log 2转换：表9。此外，用15μg/ml的PG5816(抗-LGR5)、PG3755(抗-EGFR)和(对照)PG1337对从体内生长的不同PDX肿瘤提取的肿瘤细胞进行染色，并且随后用PE标记的抗-人IgG检测结合的抗体。表10示出多种癌症指征中所有染色抗体的平均荧光强度。
实施例2：使用噬菌体抗体选择生成针对WNT途径靶的抗体组
用四种不同的WNT靶免疫 小鼠。
用编码全长人LGR4和LGR5(pVax1_hLGR4-FLAG-HA和pVax1_hLGR5-FLAG-HA)的任一表达构建体免疫小鼠，其具有LGR4或LGR5的细胞外结构域(pVax1_hLGR4(ECD)-GPA33-FLAG和pVax1_hLGR5(ECD)-GPA33-FLAG)或具有重组蛋白质rhLGR4-Fc、rhLGR5-Fc、rhZNRF3-Fc或rhRNF43-Fc(RND体系)。使用稳定过表达相应抗原的内部生成的Freestyle293F细胞系，对于基于FACS的测定中针对体液免疫应答的证据来筛选小鼠血清。图6示出数据的示例。表1示出了利用四种WNT靶成功免疫的小鼠的血清IgG滴度(定义为最高血清稀释度，其产生至少三倍于免疫前收集的血清的MFI的稳定表达靶的Freestyle 293F细胞系的染色)。然后从研究中获取示出已经对相应抗原产生显著和特异性免疫应答的小鼠，并收集这些小鼠(腹股沟淋巴结和脾脏)的淋巴组织。从获得的淋巴结中，通过RT-PCR使用IgG-和VH-特异性引物，并克隆噬菌粒中VH编码cDNA的多克隆库以在非溶解性噬菌体的表面上表达Fab片段，生成“免疫”噬菌体抗体库。生成的所有库具有多于10^6个克隆体的大小(独立的转化体)并且插入序列频率超过80％。
噬菌体选择以生成靶特异性cLC抗体
为了生成针对靶hLGR4、hLGR5、hZNRF3和hRNF43、rhLGR4-Fc、rhLGR5-Fc、rhZNRF3-Fc、rhRNF43-Fc(RND体系)的cLC抗体组，将hRNF43或mZNRF3的可溶性ECD(内部制备)涂布到固体载体上，并且在过量人IgG存在下(以防止选择Fc结合噬菌体)，针对与涂布抗原的结合来淘洗内部生成的合成cLC噬菌体抗体库，其基本上如Marks等人所述(J.Mol.Biol.1991年12月5日；222(3)：581-97)。同时，由成功靶向免疫的动物制成的“免疫”噬菌体抗体库也被用于选择。在微量滴定板(NUNC，maxisorp)中进行对包被蛋白的选择，并在溶液中进行对过表达相应靶的Freestyle 293F细胞的选择；通过使用100mM甘氨酸(pH2)或100mM TEA(pH12)的pH冲击来进行结合的噬菌体的洗脱。在使用合成噬菌体抗体库进行第一轮选择之后，再次使用所选克隆体的多克隆库制备噬菌体，并且噬菌体针对与相同抗原的结合淘洗，或者对于稳定过表达相应抗原的内部生成的Freestyle 293F细胞进行选择。在一轮(免疫库)或两轮(合成库)选择后，选取单克隆体并用于制备单克隆噬菌体，使用两个细胞系(亲本(抗原阴性)Freestyle 293F细胞系和稳定过表达WNT靶的DiD标记的293F Freestyle细胞)的混合物，在FACS中测试所述单克隆噬菌体对相应靶的结合。识别(DiD标记的)抗原阳性细胞群而不是抗原阴性细胞的噬菌体克隆被认为是抗原特异性的，并且因此被进一步表征。
图7示出通过FACS来测试所选克隆体的对表达靶的细胞的抗原特异性结合的实验。
然后对示出靶特异性的克隆体进行测序并基于其序列同一性进行分组：抗体克隆体的“簇”被定义为共享相同VH V-基因用途并具有相同HCDR3序列和HCDR3长度的一组抗体(图17)。这些克隆体全部来源于MeMo小鼠的体内免疫应答过程中多样化的单个祖先克隆体。“超级簇”被定义为共享相同VH V-基因用途并且具有HCDR3的至少70％序列同一性和相同HCDR3长度的一组克隆体。虽然这个定义是任意的，但可能(但没有证明)的是这些克隆体也是由在体内体液免疫应答期间选择、激活和多样化的单一B细胞前体产生。实际上，尽管具有不同的亲和力和/或不同的表位上的位置，但预期超级簇中的克隆体结合相同的表位。每个超级簇(如上所述定义)，然后选择至少两个克隆体进入克隆验证过程，在此期间确认对靶的特异性结合并验证克隆体的序列。这些数字基于Fab克隆体，其中VH具有不同的种系基因用途和/或HCDR3序列。然后将通过克隆验证过程的克隆体(即，确认其对靶的结合和特异性并且验证序列)用于将VH基因重新克隆到表达载体中以产生和表征相应的IgG。总共鉴定出667种不同的抗体，其特异性识别四个靶LGR4、LGR5、ZNRF3或RNF43中的一个，其中288种被进一步表征(表2)。随后将所有这些克隆体用“假”(即非相关的，抗-TT)Fab臂重新克隆成双特异性cLC IgG形式，以能够表征针对WNT靶的Fab臂与其靶的一价相互作用。
实施例3：抗体组表征。
将从噬菌体展示分离的所选Fab片段(用编码MFnnnn命名)重新克隆到含DEKK突变的IgG1表达载体中。为此，从用于选择抗体片段的噬菌粒载体中切下VH编码cDNA并重新克隆到含(KK)DEKK突变的IgG表达载体中。通过与含互补(DE)DEKK突变的表达构建体共转染并编码针对非结合对照抗原破伤风类毒素(TT：MF1337)的Fab片段，获得双特异性抗-WNTxTT IgG(WNT是指LGR4、LGR5、ZNRF3或RNF43)。然后产生具有对WNT靶的一价结合活性的双特异性IgG1组，将其纯化，并关于其生产力和特异性进行表征。
通过将在带正电荷的KK载体中结合WNT靶向臂(hLGR4、hLGR5、hZNRF3或hRNF43)的不同Fab片段与在带负电的DE双特异性载体中针对破伤风类毒素的对照Fab片段进行组合，通过在Freestyle 293F细胞中瞬时共转染编码两种Fab片段的质粒，小规模制备双特异性IgG。制备之后，通过蛋白质-A亲和层析纯化双特异性IgG，并将缓冲液更换为PBS。成功的制备以最低浓度0.1mg/ml产生IgG1全长抗体，其分配独特的编码(PBnnnnn；其中nnnnn表示随机产生的数字)以鉴定2种不同靶结合Fab片段的特定组合。
在ELISA和FACS中测试成功产生的双特异性IgG与其相应靶的结合。使用2μg/ml的rhLGR4-Fc、rhLGR5-Fc、rhZNRF3-Fc或rhRNF43-Fc或2.5μg/ml的破伤风类毒素作为包衣进行ELISA。IgG以5μg/ml的单一浓度进行测试。当观察到的OD450nm信号5倍于背景(阴性对照抗体的OD450nm信号)时，认为IgG与rhLGR4-Fc、rhLGFR5-Fc、rhZNRF3-Fc或rhRNF43-Fc结合。另外，进行针对TT和四个WNT靶(hLGR4、hLGR5、hZNRF3或hRNF43)之一的双特异性IgG的FACS分析以测定对其相应WNT靶的特异性结合。通过使用DiD染色，将未标记的Freestyle 239F细胞(DiD-)和标记的抗原阳性(表达hLGR4、hLGR5、hZRNF3或hRNF43的)Freestyle 293F细胞(DiD+)混合，来进行FACS分析。双特异性IgG通常对于细胞的两种混合物针对特异性进行平行测试。对于过表达hLGR4和hLGR5的Freestyle 293F细胞(与抗原阴性Freestyle 293F细胞混合)测试包含针对LGR4或LGR5的Fab片段的双特异性IgG，并且对于过表达hZNRF3和hRNF43两者的Freestyle 293F细胞(与抗原阴性Freestyle 293F细胞混合)测试ZNRF3和RNF43结合抗体。当抗原阳性群(稳定表达hLGR4、hLGR5、hZRNF3或hRNF43的Freestyle 293F细胞)的MFI比抗原阴性群(Freestyle 293F细胞)的MFI高5倍时，认为双特异性IgG与hLGR4、hLGFR5、hZNRF3或hRNF43特异性结合。
在FACS和ELISA中，或者在少数情况下仅在FACS中(结合hLGR4的Fab片段)，发现66个LGR4 Fab片段中的41个，84个LGR5 Fab片段中的69个，105个ZNRF3 Fab片段中的92个和33个RNF43 Fab片段中的29个以双特异性形式特异性结合其相应靶(hLGR4、hLGR5、hZNRF3或hRNF43)。
双特异性抗体组的表征
对于确认为特异性结合人LGR4、LGR5、ZNRF3或RNF43的双特异性一价IgG的亲和力、稳定性、R-Spondin3阻断能力以及小鼠直系同源物交叉反应性进行进一步表征，之后进行进一步子选择。
亲和滴定FACS分析
在有限抗体FACS中滴定结合抗体，以便关于其亲和力进行评定。一价IgG针对过表达hLGR4、hLGR5、hZNRF3或hRNF43的Freestyle 293F细胞的细胞表面上的hLGR4、hLGR5、hZNRF3或hRNF43(全部均与破伤风类毒素Fab片段组合)。每种IgG对于其相应的过表达Freestyle 293F细胞系进行测试。对于稳定表达WNT靶的固定数的细胞(5×105个细胞/孔)，测试IgG的两倍稀释系列(5μg/ml-0,08μg/ml)。通过FlowJo(FACS分析软件BD)测定来自每次单独测量的平均荧光强度(MFI)。对于每种IgG，将MFI值针对抗体浓度作图，并由这些曲线计算曲线下面积(AUC)。基于AUC值，按照靶对双特异性IgG进行评定。图8给出了用于亲和力评定的数据的示例。
所选抗体的小鼠直系同源物交叉反应性
为了进一步定义双特异性IgG的结合特性，测定小鼠直系同源物交叉反应性。表达mLgr5、mZNRF3和mRNF43的小鼠直系同源物(pEF1_mLgr5-Myc-HIS、pDisplay_mZnrf3-Myc-PDGFR(TM)、pDisplay_mRnf43-Myc-PDGFR(TM))的构建体在HEK293T细胞中瞬时转染。使用浓度为5μg/ml的一价IgG进行染色，并通过FACS分析IgG的结合。如果平均荧光强度(MFI)相比于未转染的Freestyle 293F细胞增加两倍，则认为双特异性IgG是小鼠交叉反应性的。92个抗-ZNRF3 IgG中的92个与mZnrf3交叉反应；29个抗-RNF43IgG中的9个与mRnf43交叉反应，69个抗-LGR5 IgG中的18个与小鼠Lgr5直系同源物交叉反应。对于rmLgr4-Fc(RND系统)蛋白质，在ELISA中测试mLgr4交叉反应性。在OD450nm为背景的5倍(阴性对照抗体的OD450nm信号)的情况下，认为双特异性是mLgr4交叉反应的。以5μg/ml的单一浓度测试IgG对rmLgr4-Fc的结合并检查交叉反应性。测试的41个抗-LGR4 IgG中的36个对于mLgr4交叉反应性呈阳性。
R-Spondin阻断
所有双特异性IgG均在配体阻断ELISA中测试，以便能够测试LGR4、LGR5、ZNRF3或RNF43靶向抗体是否能够干扰R-Spondin3结合。在针对LGR4、LGR5、ZNRF3或RNF43的过量双特异性IgG的存在下，测试四个WNT靶的细胞外结构域的Fc融合蛋白对涂布的R-Spondin3的结合。为了测试针对不同靶的双特异性IgG阻断相应Fc融合蛋白与rhR-Spondin3的相互作用的能力，在阻断ELISA中对其进行测试。使用15μg/ml的单一IgG浓度测试IgG。在两次独立的测定中，至少50％的OD450nm信号减少时，认为克隆体是阻断的。当仅20％-50％的OD450nm信号减少时，认为这些克隆体是部分阻断的。测试靶向ZNRF3(48)和RNF43(10)以及完整LGR4(41)和Lgr5(69)组的IgG的子集的R-Spondin阻断能力。对于LGR4、LGR3是阻断的并且对于LGR5是部分阻断的。对于ZNRF3，鉴定出1个阻断剂和1个部分阻断剂。对于RNF43，鉴定出3个阻断剂和2个部分阻断剂，全部均属于2个不同的超级簇。对于LGR5组，鉴定出部分阻断R-Spondin3的结合的10个IgG。图9给出了在R-Spondin3结合测定中产生的数据的示例。
测量40℃下的抗体稳定性
为了获得双特异性IgG的稳定性的指示，将所有IgG在40℃下在含血清的培养基中温育1周，然后将其在ELISA中的结合与在4℃下于相同培养基中温育的双特异性抗体的结合进行比较。1周后，将IgG用于ELISA筛选以测定其是否保持与其靶的结合。相比于在4℃下温育一周，通过在40℃下温育一周后残留的OD450nm信号百分比测定结合。大部分IgG测试两次；当IgG在两次独立测定中保留其结合的至少50％时，认为其是稳定的。当在两次实验中，稳定性变化时，认为这些IgG是部分稳定的，并且当IgG保留为50％结合的二分之一时，认为其是不稳定的。对于LGR4，41个IgG中的12个保留结合(7个部分稳定，2个未确定；在ELISA中不结合)；对于LGR5，69个IgG中38个保留结合(7个部分稳定)，对于ZNRF3，92个IgG中的28个保留结合(10个部分稳定)，并且对于RNF43，29个IgG中的10个保留稳定(9个部分稳定)。
双特异性IgG的评定和选择
完成表征之后，收集数据并根据获得的所有数据进行评定。以如下方式进行Wnt靶向Fab片段的选择用于后续功能性筛选：选择在40℃下保留至少50％的结合的双特异性IgG。然后选择最高亲和力结合剂。该选择包含具有不同特性，例如小鼠直系同源交叉反应性或R-Spondin阻断能力的阻断剂。对于功能性筛选，总共筛选针对四种不同WNT靶的54个双特异性Fab片段；对于LGR4，从41个Fab片段中选出10个，对于LGR5，从69个Fab片段中选出17个，对于ZNRF3，从92个Fab片段中选出18个，并且对于RNF43，从29个Fab片段中选出9个。
形成用于功能性筛选的组
选择的针对hLGR4、hLGR5、hZNRF3或hRNF43的WNT靶向Fab片段用于生成双特异性抗体大组(＞500个双特异性抗体)。将选择的WNT靶向Fab片段与受体酪氨酸激酶(RTK)结合Fab片段组合成一组双特异性IgG并制备且纯化。在基于细胞的测定中选择的阻断受体激活的对EGFR和HER3具有特异性的Fab片段在以双特异性形式组合时不干扰其它Fab片段的功能。将四种EGFR Fab片段MF3755、MF4280、MF3370和MF4289以及四种HER3Fab片段MF3178、MF3176、MF3125和MF4863与选择的WNT靶向Fab片段组合使用(参见表5，用于产生组的子选择)。
双特异性抗体通过IgG载体的共表达产生，其中WNT臂在含带正电的KK突变的重链上表达，并且RTK臂在含带负电的DE突变的重链上表达，将其纯化并验证其靶结合、特异性和稳定性。通过结合和稳定性质量控制(QC)的双特异性抗体组用于功能性筛选(54个WNT靶向Fab片段中的53个通过QC)。在下文所述的功能筛选测定中，靶向四个WNT靶(hLGR4、hLGR5、hZNRF3或hRNF43)之一的＞500个经纯化和经验证的双特异性抗体的组，以及EGFP或HER3Fab片段或破伤风类毒素作为模拟阴性对照Fab片段对照关于其针对来源于患者的类器官的活性进行筛选。
实施例4：结肠类器官中双特异性抗体的功能性筛选
结肠类器官来源于在含生长因子的扩增培养基中生长的LGR5阳性(癌症)干细胞，所述扩增培养基允许形成上皮结肠结构，所述上皮结肠结构形成功能性腔管腔(Sato等人，2011 Gastroenterology 141：1762-1772)。类器官的生长、发育和管腔形成取决于结肠直肠癌细胞的遗传背景以及对生长刺激生长因子、表皮生长因子(EGF)或神经调节蛋白-1(NRG)/调蛋白(HRG)的应答。尽管来自不同患者的CRC类肿瘤的形态差异很大，但相同来源的类肿瘤之间的形态特征图是一致的，并且它们在遗传上与它们来源的原始肿瘤几乎相同。因此，对培养的CRC类器官的图像的高含量定量分析可区分来自不同患者的CRC类器官，并且还可以用于测量与信号传导途径的激活相关的形态变化-例如，受HER受体的配体(例如EGF和HRG)驱动。类似地，可以测量功能阻断抗体或其它治疗分子对这些应答的抑制。
基于图像的分析允许待测量的形态的变化，其可能独立于细胞增殖，从而向得自常规增殖测定的信息提供化合物活性的附加信息。因此化合物诱导的表型变化形成CRC类器官中抗体功能筛选的基础。
已开发的双特异性抗体靶向EGFR或HER3与靶向WNT信号传导相关细胞表面表达的蛋白LGR4、LGR5、RNF43或ZNRF3的组合。筛选体系被设计用于监测由于双特异性抗体的活性而对类肿瘤生长的抑制。这可以用于选择对特定途径的靶向抑制敏感的类器官(和相关的分子谱)以及用于选择在类器官中具有活性的新型分子。
结肠类肿瘤模型的选择
用于筛选的结肠类肿瘤模型基于响应于EGF、HRG或WNT3A的形态改变的展示来选择。对这些因子的形态响应在一组不同患者来源的20种类肿瘤中研究(Van de Wetering等人，2015 Cell 161：933-45)。首先，将类肿瘤扩大、分裂并重新接种到384孔板中以分析并记录生长1周后的基本形态。接下来，测试相同的20种类肿瘤对生长因子的响应，所述生长因子为EGF或HRG，或对扩增培养基中不存在生长因子的响应。为此，分析所有500个形态学特征并测量可溶性因子诱导的变化。对于每个类器官选择一组稳健的特征结果，使得能够测量生长因子响应并区分生长因子依赖性类肿瘤培养物和不依赖于生长因子的类生长因子培养物(参见表4)。这展示单一特征结构不足以最佳量化不同CRC类器官中的响应。基于这些数据，选择以下类肿瘤细胞系：P18T(APCmut)，其对于类肿瘤内分支管腔结构的生长和形成是严重EGFR信号传导依赖性的；P14T(APCmut，SMAD4mut)示出在EGFR和HER3信号传导和抑制时明显的形态改变效果；P19Tb(APCwt，但PIK3CA、TP53、BRAF、ARID1A、ARID2、ERBB3、POLE和RNF43突变体)作为缺乏APC突变并因此依赖于WNT3A进行扩增的类肿瘤模型；最后，将P26T(APCmut、KRASmut、TP53mut和CTNNB1mut)作为不依赖于生长因子存在而进行扩增的模型。在双特异性抗体的初步筛选中，P26T不示出任何生长因子依赖性，并且对生长因子受体靶向抗体不具有敏感性，并且从进一步抗体筛选中丢弃。
双特异性抗体中功能性Fab片段的鉴定
为了鉴定能够改变结肠类肿瘤的形态学特性的功能性双特异性抗体，将其与不具有EGF刺激的生长条件和EGFR/MAPK信号传导在EGF生长条件下抑制化合物(例如西妥昔单抗和Trametinib)的效应进行比较。功能性双特异性抗体通过其在形态学特征方向上在EGF条件下限制类肿瘤扩增的能力来定义，所述形态学特征通过EGFR/MAPK信号传导抑制剂和/或从培养基中省去EGF来获得。增强EGFR靶向臂作用的WNT靶向Fab片段是相比于等同的一价(双特异性EGFRxTT)靶向Fab片段示出芯显著增强的生长抑制能力的那些。
将仅靶向LGR4、LGR5、ZNRF3或RNF43(与非靶向破伤风类毒素(TT)-Fab片段组合)的双特异性抗体与不含生长因子的培养基(P19Tb)或者含EGF或HRG的培养基(P18T和P14T)中的阴性对照形态学进行比较以寻求单独的靶向WNT信号传导受体的可能影响。
携带HER3靶向Fab片段的双特异性抗体与不具有HRG刺激的生长条件或者与HRG条件下HER3靶向抗体和PI3K抑制剂的效应进行功能性比较；功能性HER3抑制性双特异性抗体被定义为在欧几里得空间中在与MEK激酶抑制剂，Trametinib、无HRG培养条件和/或HER3靶向参考抗体相同的方向上，抑制HRG刺激的生长响应的那些抗体。与等同的一价HER3双特异性抗体相比，在生长抑制效果方面增强HER3靶向臂效应的WNT靶向Fab片段被认为是候选靶向Fab片段。
初筛时双特异性抗体候选物的选择
双特异性抗体在存在EGF的情况下，诱导P14T和P18T结肠肿类瘤的形态学的变化接近、匹配或超过在不存在生长因子的情况下或在存在参考EGFR/MAPK抑制剂的情况下的表型，这些抗体被鉴定为潜在的候选。类似于EGF条件，如果效果接近、匹配或超过无生长因子条件和/或参考HER3/PI3K抑制剂的阴性对照距离，则将在HRG培养条件下测试的抗体进行标记用于跟进。对于对生长因子治疗相对不敏感的P19Tb，功能性抗体选择基于通过由Trametinib和PI3K抑制剂CH5132799诱导的形态学特征图计算与标记的阴性对照的距离。
双特异性组在3种不同结肠类肿瘤(P18T、P14T和P19Tb)中筛选。筛选的抗体组测试四种不同的EGFR靶向Fab片段、四种不同的HER3靶向Fab片段和一种抗破伤风类毒素(阴性对照)Fab片段的组合与53种不同的WNT靶向Fab片段和一种TT靶向Fab片段的组合。每种双特异性抗体均针对其抑制类肿瘤生长的能力进行评分。TT/WNT片段组合均不抑制类肿瘤生长(0/53)。在EGFR靶向Fab片段组中，MF3755Fab片段是最有效的：22/53双特异性MF3755/WNT Fab片段组合抑制类肿瘤发展。亚军EGFR靶向片段是具有4/53活性抑制EGFR/WNT Fab片段组合的MF4280。一种(1/53)EGFR靶向双特异性MF3370/WNT Fab片段组合示出抑制活性，并且EGFR靶向双特异性MF4289/WNT Fab片段组合中没有一种(0/53)显著限制类肿瘤生长。在含HER3-靶向Fab片段的双特异性抗体组中，MF3178Fab片段与WNT-靶向Fab片段的组合是最有效的：19/52MF3178/WNT组合抑制类肿瘤生长。亚军HER3靶向Fab片段是6/53活性MF4863/WNT双特异性抗体情况下的MF4863。含HER3靶向Fab片段MF3125(0/53)和MF3176(0/52)的双特异性抗体不示出显著的类肿瘤生长抑制。
在评定中，以具有WNT靶向Fab片段的双特异性IgG形式最有效地组合的RTK-靶向Fab片段是MF3755作为EGFR靶向Fab片段和MF3178作为HER3靶向Fab片段。LGR4靶向Fab片段MF5777和MF5781，LGR5靶向Fab片段MF5790、MF5803、MF5814、MF5816、MF5817和MF5818，RNF43Fab片段MF5832和MF5836以及ZNRF3靶向Fab片段MF5850、MF5853、MF5855、MF5884和MF5888被鉴定为潜在候选者，以基于在其以双特异性IgG形式与RTK靶向Fab片段组合时，其对P18T、P14T和P19Tb类肿瘤形态学的功能性影响而继续进行验证筛选。将LGR4、LGR5、RNF43和ZNRF3靶向Fab片段与EGFR靶向Fab片段MF3755、HER3靶向Fab片段MF3178或非靶向TT Fab片段MF1337组合并且以新批次生产以确认它们在随后的验证筛选中的活性。
双特异性RTK/WNT抗体验证筛选
因为RTK/WNT双特异性抗体候选物在EGF和HRG两种培养条件下均示出潜在的治疗相关活性，所以双特异性候选抗体的验证筛选也在两种生长因子条件下进行：5ng/ml EGF或5ng/ml HRG。对照包括接受不具有EGF或HRG的培养基的孔。用于生长因子条件的其它对照：西妥昔单抗(EGFR)、PG3755(EGFR/EGFR)、Trametinib(MEK)、CH5132799(PI3K)、PG3178(HER3/HER3)、PG2863(HER3/HER3)、PG3794(HER3/EGFR)和PB4522(HER3/EGFR)。将PG1337(TT/TT)用作阴性对照抗体，并称为阴性对照，连同接受等体积的DMSO或PBS的孔分别作为化合物或抗体处理的孔。
46种双特异性抗体的抗体验证筛选在不同患者来源的24个结肠类肿瘤中以一式两份或一式四份进行。测试的结肠类肿瘤组由Van de Wetering等人(2015Cell 161：933-45)描述的3种生长因子依赖性患者样本：P18T、P14T和P8T，以及2种不依赖于生长因子的患者样本P19Tb和P28N构成。筛选出一组新的19个结肠类肿瘤：10个为生长因子依赖性原发性结肠类肿瘤系，5个为不依赖于生长因子的原发性结肠类肿瘤并且4个为(生长因子依赖性)转移性结肠类肿瘤系。在24个不同的来源于患者的结肠类肿瘤系的组中筛选双特异性抗体候选者示出，对于类肿瘤生长的生长因子依赖性能够鉴定RTK靶向Fab片段介导的肿瘤抑制。
通过对于0(表型等于完全生长抑制轮廓)和1(表型与阴性对照相似)的尺度将形态学特征归一化来计算在双特异性抗体验证筛选中鉴定功能性结肠肿瘤抑制性抗体的截止值。每次，单个抗体在特定剂量下在特定类肿瘤系中被评分为小于0.5时，该抗体治疗被标记为示出对肿瘤发展的抑制。在EGF或HRG培养条件下，抗体在特定剂量下示出抑制的次数被评分并表示为对于该条件的经处理孔数的百分比。计算所有24个筛选的结肠类肿瘤系中的该百分比。
24个结肠类肿瘤中的验证筛选鉴定出增强RTK-Fab片段介导的肿瘤发展抑制：4个LGR5靶向Fab片段和2个靶向Fab片段：MF5816、MF5814、MF5818和MF5790作为LGR5靶向抗体Fab片段，并且MF5832和MF5836作为RNF43靶向Fab片段。最高评分抗体是由靶向Fab片段MF3755和MF5816构成的EGFR/LGR5双特异性抗体PB10651：图10。在HRG条件下，最高评分抗体是由靶向Fab片段MF3178和MF5816构成的HER3/LGR5双特异性抗体PB10748。这示出，在两种独立的生长因子条件下并且与两种不同的RTK靶向Fab片段组合，LGR5靶向Fab片段MF5816是增强RTK靶向的最有效的WNT靶向Fab片段。PB10651中MF5816与MF3755的组合，通过有效减少类肿瘤生长和发育增加了另一肿瘤抑制水平，其可通过进一步的管腔形成损失、细胞收缩和细胞核聚拢观察到。这些形态学发现指示，EGFR/LGR5抗体PB10651在生长受损的类肿瘤细胞中主动阻断表皮生长因子信号传导并诱导细胞死亡应答：图11。这种形态学表型在EGFR靶向抗体西妥昔单抗的情况下没有观察到，在将MF3755格式化作为常规IgG时也没有观察到。
前导候选抗体的选择
针对以下特征，在5ng/ml EGF条件下，将PB10651(EGFR/LGR5双特异性抗体(由Fab片段MF3755和MF5816构成))选择作为初始前导候选抗体：PB10651在10μg/ml测试剂量下在75％的24种不同的结肠类肿瘤模型中示出有效的抑制作用；2)用10μg/ml PB10651处理的孔的67％(40/60)示出超过50％的生长减少；3)52％(59个孔中31个)在以2μg/ml用Pb10651处理时示出超过50％的生长减少；4)PB10651优于西妥昔单抗(在10μg/ml下47％(56/119)并且在2μg/ml下29％(35/119))和EGFR/TT参考抗体PB9919(在10μg/ml下(27％(16/60)并且在2μg/ml下5％(3/60))。
PB10647(EGFR/LGR5MF3755xMF5814)是第二候选抗体，其在10μg/ml下抑制24种不同类肿瘤模型制的54％(13/24)，并且在10μg/ml下在暴露孔的52％(31/60)中并且在2μg/ml下在暴露孔的37％(22/60)中发现超过50％的生长减少。
其它EGFR/LGR5抗体是PB10659(MF3755xMF5818)，其在24个类肿瘤模型的50％(12/24)中有效，暴露于10μg/ml的PB10659的孔中50％(30/60)示出抑制作用并且在2μg/ml下32％(19/60)示出抑制作用。PB10627(MF3755xMF5790)在42％的类肿瘤(10/24)中具有活性，并且在10μg/ml下在39％的孔(23/59)中示出减少，并且在2μg/ml下在33％的孔(20/60)中示出减少。PB10631(MF3755xMF5803)在33％的类肿瘤(8/24)中具有活性，并且在10μg/ml下在34％的孔(20/59)中示出抑制性，并且在2μg/ml下在12％的孔(7/59)中示出抑制性。PB10655(MF3755xMF5817)在24个类肿瘤模型的20％(5)中具有活性，并且在10μg/ml下在25％的孔(15/60)中示出抑制，并且在2μg/ml下为6/60(10％)。
EGFR/LGR4抗体PB10619(MF3755xMF5777)在29％(7/24)类肿瘤模型中具有活性，并且在10μg/ml下在28％(17/60)孔中导致类肿瘤抑制，并且在2μg/ml下在15％(9/60)孔中导致肿瘤抑制。EGFR/LGR4抗体PB10623(MF3755xMF5781)在24个肿瘤模型中的8个(33％)中具有活性，并且在10μg/ml下在30％的孔(18/60)中抑制，并且2μg/ml下在10％孔(6/60)中抑制。
EGFR/RNF43抗体PB10661(MF3755xMF5832)在24个类肿瘤模型的13个(54％)中具有活性，并且在10μg/ml下在42％的孔(25/60)中示出抑制，并且在2μg/ml测试剂量下在22％的孔(13/60)中示出抑制。EGFR/RNF43抗体PB10667(MF3755xMF5836)在13/24类肿瘤(54％)中具有活性，并且在10μg/ml下在35％的孔(21/60)中示出抑制，并且在2μg/ml下在20％的孔(12/60)中示出抑制。
EGFR/ZNRF3抗体为PB10675(MF3755xMF5850)，其在8/24个类肿瘤模型(33％)中具有活性，其中在10μg/ml下35％的测试孔(21/60)示出超过50％抑制，并且在2μg/ml下为15％(9/60)；PB10695(MF3755xMF5884)在37％的类肿瘤(9/24)中具有活性，并且在10μg/ml下有34％(20/59)示出抑制，并且在2μg/ml下有12％(7/59)示出抑制。PB10679(MF3755xMF5853)在21％的类肿瘤模型(5/24)中抑制类肿瘤发育，在10μg/ml下，20％的孔(12/60)抑制类肿瘤发育；PB10703(MF3755xMF5888)在24个类肿瘤模型中的5个(21％)中具有活性，并且在10μg/ml下在22％的孔(13/60)中抑制，并且在2μg/ml下在12％的孔(7/59)中抑制。
PB10748，由Fab片段MF3178和MF5816构成的HER3/LGR5抗体，作为HRG刺激的肿瘤抑制抗体在62％的测试结肠类肿瘤模型(15/24)中具有活性，在56％的经暴露孔(67/120)中示出抑制。PB10748优于HER3/TT参考抗体PB9215(MF3178xMF1337)，其在34％(41/120)经暴露孔中抑制超过50％的HRG刺激的类肿瘤发育。
其它HER3/LGR5抗体为：PB10735(MF3178xMF5814)，在11/24类肿瘤模型(46％)中具有活性，并且在43％的经暴露孔(51/118)中具有抑制性；PB10756(MF3178xMF5818)在8/24(33％)的类肿瘤模型中具有活性，并且在37％的暴露孔(44/119)中具有抑制性。PB10715(MF3178xMF5790)在12/24(50％)的类肿瘤模型中具有活性，并且在42％的孔(49/117)中具有抑制性。PB10719(MF3178xMF5803)在7/24(29％)的类肿瘤模型中具有活性，并且在34％的暴露孔(40/119)中具有抑制性。PB10752(MF3178xMF5817)在12/24(50％)的类肿瘤模型中具有活性，并且在28％的孔(33/120)中具有抑制性。
两个HER3/RNF43抗体为：PB10764(MF3178xMF5836)，其在17/24类肿瘤模型(71％)中具有活性，并且在38％的暴露孔(46/120)中具有抑制性，和PB12336(MF3178xMF5832)，其在11/24类肿瘤模型(46％)中具有活性，并且在41％的暴露孔(49/120)中具有抑制性。
两个HER3/LGR4抗体为：PB10711(MF3178xMF5781)，其在62％的类肿瘤模型(15/24)中具有活性，并且在50％的暴露孔(59/119)中具有抑制性，和PB10707(MF3178xMF5777)，其在24个测试类肿瘤模型的13个(54％)中具有活性，并且在120个暴露孔的41(34％)中具有抑制性。
靶向HER3和ZNRF3两者的双特异性抗体为：PB10776(MF3178xMF5853)，其在11/24(46％)的暴露于HRG的类肿瘤模型中具有活性，并且在40％的暴露孔(48/120)中具有抑制性；PB10772(MF3178xMF5850)，其在12/24(50％)的模型中具有活性，并且在39％的暴露孔(46/119)中具有抑制性；PB10780(MF3178xMF5855)，其在8/24(33％)的结肠类肿瘤模型中具有活性，并且在31％的暴露孔(37/119)中具有抑制性；PB10800(MF3178xMF5888)，其在12/24的类肿瘤模型中具有活性(50％)，并且在29％(34/119)的暴露孔中具有抑制性。
实施例5：前导候选抗体的表征
使用基于细胞的测定来对双特异性抗体结合进行亲和力测量。
在碘化方案的优化后，获得具有40GBq/μmol比放射性的标记的PB10651蛋白质。如通过蛋白质沉淀分析的，放射化学纯度＞99％。在Lindmo测定中，仅观察到免疫反应性的轻微降低。使用表达EGFR或LRG5的CHO细胞，125I-PB10651正对EGFR和LGR5的免疫反应性评价为＞89％。Lindmo测定的结果如图12所示。使用稳态亲和力测量，125I-PB10651针对CHO-LGR5细胞的KD测量为0.86±0.13nM，并且发现125I-PB10651针对CHO-EGFR细胞的KD为0.22±0.086nM，125I-PB10651针对DLD-1细胞的KD评价为0.18±0.024nM。数据的示例如图13所示。
通过鸟枪诱变分析对Pb10651进行表位作图
为了绘制分别被存在于PB10651中的两个Fab臂识别的EGFR和LGR5上的表位，使用鸟枪法诱变方法。与Fab臂对其相应抗原的结合相关的残基可明确地确定。表8中示出了取消PB10651对EGFR或LGR5的结合并且不抑制对照抗体的结合(鉴定相关残基)的突变。这些数据示出抗-EGFR Fab臂识别在与正常接触配体EGF的位点部分重叠的区域上的结构域III(Ogiso等人，2002)。这指示PB10651可直接阻断配体-EGFR相互作用。该表位在图14中在EGFR(pdb参考1YY9)的结构中示出。识别LGR5的Fab臂示出识别位于N-CAP结构域和第一富含亮氨酸重复序列(LRR)中的残基。残基在图15中在与RSPO1络合的LGR5结构中示出(pdb参考4BSR，Peng等人，2013)。
参考文献：
Li S，Schmitz KR等人，(2005)Structural basis for inhibition of theepidermal growth factor receptor by cetuximab.Cancer Cell.4月，7(4)：301-11。
Ogiso，H.Ishitani，R.等人，(2002)Crystal structure of the complex ofhuman epidermal growth factor and receptor extracellular domains.Cell，第110卷，775-787。
Peng，W.C.de Lau W.等人，(2013)Struc ture of Stem Cell Growth Factor R-spondin 1 in Complex with the Ectodomain of Its Receptor LGR5.Cell Rep 27；3(6)：1885-1892。
使用基于细胞的测定由配体R-spondin1竞争PB10651中的抗-LGR5Fab臂的结合
为了能够测定在配体R-spondin1存在下，PB10651中的抗-LGR5 Fab臂结合LGR5的能力，设置基于细胞的测定。配体阻断-LGR5抗体OMP88R20(PG7711)与表达LGR5的细胞克隆体的结合的EC50测定为50ng/ml(333pM)，然后将该浓度用于测定配体R-spondin1对于LGR5结合的竞争。图16示出作为添加的R-spondin1浓度的函数，在FACS中测量的结合到表达LGR5的CHO-K1细胞结合的OMP88R20的MFI信号(归一化为在不存在R-spondin1的情况下获得的MFI信号)。然后测试双特异性抗-(TTxLGR5)抗体在浓度逐渐增加的R-spondin1存在下结合表达LGR5的CHO细胞克隆体的能力。包含50ng/ml的PG7711作为阳性对照。首先测试双特异性抗体在一定浓度范围内对表达LGR5的CHO细胞克隆体的结合，以在FACS中测定结合的EC50。发现对于包含前导Fab MF5816的PB10286，EC50为156ng/ml，并且对于包含MF5790的PB10261，EC50为200ng/ml。然而，在100ng/ml下测试双特异性抗体，以比较相同浓度的测定中所用的抗原特异性Fab或PG7711，并且甚至可能增加测定的灵敏度。图17示出即使存在大(120倍)摩尔过量的配体的情况下，前导抗-LGR5 Fab MF5816也不抑制与LGR5的结合，然而在相同测定中，OMP88R20的复制型式的结合被完全抑制。此外，观察到PB10261(包含LGR5靶向臂MF5790)的结合减少，这展示该测定能够区分配体阻断以及配体非阻断抗-LGR5Fab。在阻断测定中使用1D9大鼠抗-LGR5抗体时没有观察到差异和竞争(图17)，这展示了相互作用的特异性。
参考文献：
de Lau W，Barker N等人，Lgr5 homologues associate with Wnt receptorsand mediate R-spondin signalling.Nature.2011年7月4日；476(7360)：293-7。
使用基于细胞的测定，PB10651的抗-EGFR Fab臂的配体阻断能力。
为了测试PB10651的抗-EGFR Fab阻断EGF介导的信号传导的能力，使用基于细胞的测定法。图18示出与西妥昔单抗相比，PG3755在A431细胞中阻断EGF介导的细胞死亡的功效(根据Gulli等人所述的方法测试)。抗体阻断EGF介导的信号传导，其具有至少等同于西妥昔单抗的功效。
参考文献：
Gulli，L.F.等人，Epidermal growth factor-induced apoptosis in A431cells can be reversed by reducing the tyrosine kinase activity.Cell GrowthDiffer，1996，7(2)：第173-178页。
PB10651的物种交叉反应性。
测试PB10651与两种靶(EGFR和LGR5)的大鼠和食蟹猴直系同源物的交叉反应性。通过RT-PCR从食蟹猴cDNA获得的食蟹猴LGR5的cDNA序列匹配来自基因库的预测序列(参考XM_005571542)。人以及大鼠和食蟹猴-编码构建体都用于CHO-K1细胞的瞬时转染。然后在FACS中测试抗体与瞬时表达人、大鼠或食蟹猴直系同源物的细胞的结合。图19示出根据用于染色的抗体浓度，染色后在FACS中获得的平均荧光强度(MFI)的图。发现识别EGFR的Fab臂以及识别LGR5的Fab臂与靶的食蟹猴直向同源物完全交叉反应：对于人或食蟹猴直系同源物而言，结合的EC50值没有显著差异。在类似实验中，评估了两个臂与大鼠直系同源物的交叉反应性。发现PB10651与LGR5的大鼠直系同源物良好地结合，但与结合人LGR5的值相比，EC50偏移约一个对数值。然而，抗-EGFR Fab臂几乎不与EGFR的大鼠直系同源物交叉反应(EC50的两个对数差)，使得该抗体不适用于大鼠体内模型或大鼠中的毒性研究。作为食蟹猴LGR5交叉反应性的阳性对照，使用hu8E11v2(PG7543)的复制型式。西妥昔单抗用作食蟹猴EGFR交叉反应性的对照。
来源于患者的类器官上的特异性LGR5靶向
为了展示Fab片段MF5816和MF5814与在来源于患者的类器官表面上表达的LGR5结合，使用含Fab片段MF5816或MF5814的PG5816和PG5814(二价、单克隆IgG)来染色来源于类器官P18T的单独的细胞。与使用针对TT的阴性对照抗体的染色相比，使用PG5816导致53.6％的来源于P18T肿瘤的细胞染色，并且PG5814导致52.5％的来源于P18T肿瘤的细胞染色(图20)。
LGR5分选富集表达LGR5的细胞和引发肿瘤的细胞
此外，为示出双特异性形式的LGR5靶向Fab片段实际上结合P18T类肿瘤细胞上的LGR5，用包含Fab片段MF5814或MF5816与抗-TTFab片段的组合的双特异性抗体PB10284和PB10286来染色细胞。染色后，使用FACS分选细胞，并通过Q-PCR分析染色的和未染色的细胞群的LGR5mRNA水平。与LGR5阴性细胞级分相比，使用包含LGR5Fab臂MF5816或MF5814的双特异性抗体染色来源于P18T的类肿瘤细胞导致分选的LGR5阳性细胞级分中LGR5 mRNA表达水平的6-14倍富集：图21。
此外，这些富含表达LGR5的P18T类肿瘤细胞群允许菌落形成能力增加4倍：P18T用于FACS染色，并筛选上(阳性)和下(阴性)15％的由抗-LGR5抗体鉴定的染色细胞：MF5814-TT、MF5816-TT和MF5790-TT。将2000个细胞一式两份以接种在25μL的BME中(技术平行测定)。生长两周后，使用倒置光学显微镜手动计数类器官。结果展示MF5814-TT、MF5790-TT和MF5816-TT抗体平均富集用于类器官生长，其中阳性级分分别形成的类器官为阴性级分的4.5倍、3.7倍和7.1倍：图22。这些数据展示在从来源于患者的类器官分选LGR5阳性细胞后，引发肿瘤的细胞明显富集。
LGR5xEGFR双特异性抗体抑制来源于患者的类器官生长
作为测量在3-D筛选中鉴定的前导双特异性抗-LGR5xEGFR抗体的治疗功效的独立方式，利用不同的双特异性抗体处理类器官，并在7天后在标准菌落形成测定中评估类器官生长：图23。图右侧示出的图像是由宏分析产生的图像的示例，并描绘了包含类器官的一个液滴(黑色圆圈)。将试样分三次重复，并将实验之间的类器官数和尺寸进行平均。这些数据展示使用抗体验证筛选获得的数据，并示出前导双特异性LGR5xEGFR抗体是来源于患者的类器官生长的有效抑制剂。
用LGR5xEGFR双特异性抗体治疗患者衍生的类器官强烈减少未分化的细胞群。
在用前导双特异性LGR5/EGFR双特异性抗体处理类肿瘤7天后，使用定量实时PCR分析评估抗体对LGR5和CK20(分化标记)表达的影响(图24)。结果展示用EGFRxTT(MF3755xMF1337；PB9919)抗体治疗导致LGR5mRNA含量增加0.5倍，同时相对于TTxTT，CK20含量降低4倍。LGR5抗体MF5814xTT(MF5814xMF1337；PB10284)和MF5816-TT(MF5816xMF1337；Pb10286)示出很少影响。然而，当用EGFR臂代替TT臂时，在用MF5814xEGFR(MF5814xMF3755；LGR5xEGFR；PB10647)和MF5816-EGFR(MF5816xMF3755；LGR5xEGFR；PB10651)抗体处理后，LGR5含量分别减少5.9倍和7.2倍。CK20表达也被PB10647(EGFR/LGR5，MF5814xMF3755)和PB10651(EGFR/LGR5，MF5816xMF3755)抗体减少10.4倍和13.7倍。这些数据表面，在该类肿瘤系中，通过添加LGR5靶向臂，可以消除由EGFR抑制引起的LGR5mRNA含量的相对增加，同时也增强EGFR抑制的原始效应(CK20mRNA减少)。
用PB10651处理来自肿瘤(类肿瘤)的类器官和来自正常组织的类器官。
为了证明PB10651选择性靶向来源于结肠癌的类肿瘤而不是来源于正常结肠组织的类器官，将类器官培养物与无岩藻糖基化的PB10651或西妥昔单抗一起温育。图26示出在各自剂量的所示抗体下的类器官(类肿瘤)尺寸。C51N是来自正常结肠组织的类器官。C1M是来自癌组织的类器官(类肿瘤)(图26B)。图26A示出来自同一患者的正常组织(C55N)和癌组织(C55T)的类器官的结果。图26C示出了5种正常组织类器官、3种原发性结肠癌类肿瘤和3种转移性结肠癌类肿瘤中的西妥昔单抗和PB10651的IC50-表。西妥昔单抗IC50：PB10651IC50比率在图26C的最后一栏中给出。这示出PB10651在类肿瘤中比西妥昔单抗有效20-200倍以上，然而PB10651在正常类器官中的作用比西妥昔单抗弱。附加测试展示在培养基中存在WNT或R-Spondin对西妥昔单抗或PB10651的抑制类肿瘤生长(未示出)的功效没有影响。
靶向LGR5的抗体不抑制结肠类肿瘤生长
为验证实现肿瘤抑制能力需要PB10651的双特异性方面，将PB10651与由Genentech、Bionomics或OncoMed生产的其它WNT-靶向抗体进行比较(表7)。在图27中，将LGR5靶向抗体(PG7709、PG7711、PG7712和PG7543)对类器官生长的作用与类肿瘤模型P18T和C1M中由PB10651和西妥昔单抗介导的那些作用进行比较。结果示出比较抗体均不抑制结肠类肿瘤生长。
双特异性PB10651在抑制类肿瘤生长方面比二价单特异性抗体的混合物更有效
双特异性抗体PB10651由EGFR靶向臂(MF3755)和LGR5靶向臂(MF5816)构成。为了示出为实现结肠类肿瘤的有效抑制作用需要两个Fab臂之间的实际物理相互作用，将这些与剂量增加的下列物质一起温育：PB10651(MF3755xMF5816；EGFRxLGR5)、西妥昔单抗、PG3755(MF3755xMF3755；EGFRxEGFR)、PG5816(MF5816xMF5816；LGR5xLGR5)、PG1337(MF1337xMF1337；TTxTT)和PG3755与PG5816的1∶1混合物。图28A示出与用双特异性抗体PB10651治疗相比，用抗-LGR5和抗-EGFR抗体的混合物治疗导致对类肿瘤的较不有效的生长抑制。有趣的是，抗-EGFR和抗-LGR5抗体的混合物比双特异性抗体更有效地抑制正常类器官的生长。这些效应汇总于在图28B中的其它类肿瘤和正常类器官模型的IC50-表中。
PB10651在结肠类肿瘤中的定位研究揭示特异性细胞内染色模式
为了示出抗体在接种于BME2RGF水凝胶中时到达类肿瘤，用所示抗体(2μg/ml)处理7天龄P18T类肿瘤24小时，并且然后固定(15分钟，4％多聚甲醛)和透化(0.1％Triton-X100和0.5％BSA的PBS溶液)。随后，用山羊抗-人-FITC(Thermo Scientific，1∶3000)对类器官进行复染。如(Di等人，PlosOne 2014，PMID 25289886)中所述染色细胞核和肌动蛋白。图29示出所有抗体均能够穿透凝胶并结合类肿瘤中的所有细胞。靶向EGFR的抗体西妥昔单抗和PG3755位于质膜，然而PB10651示出细胞内斑点状染色模式，这在任何比较LGR5抗体(PG7709、PG7711或PG7712)中均未观察到。
PB10651在结肠类肿瘤中的定位研究揭示了与类肿瘤敏感性相关的近核细胞内点 状染色模式
在PB10651复染和成像测定中包括更多的结肠类肿瘤和类器官模型(参见上文)。图30示出在P18T、COM、C55T(对PB10651高度敏感，IC50＜1μg/ml)中，在一些C31M的类肿瘤(对PB10651中等敏感)中，观察到PB10651的细胞内染色模式，但在PB10651不敏感(IC50＞10μg/ml)的C28T、P8T或P19Tb类肿瘤或C51N正常结肠类器官中未观察到。不依赖于抗体温育时间(24小时或7天)，在低抗体浓度(50ng/ml PB10651)和Alexa-488缀合形式下，一致地发现PB10651的近核细胞内斑点。
实施例6：PB10651的制备和生物化学表征
质粒生成
用于转染的质粒由质粒MV1453和MV162生成，参见图31。用SfiI和BstEII限制性酶(MV1453)和SfiI和XhoI限制性酶(MV1626)消化这些质粒，此后连接VHs MF3755(经消化SfiI和BstEII)和MF5816(经消化SfiI和XhoI)以形成构建体MG3755C453和MG5816C626。MV1622编码Flag-标记的RMD酶(图32)。
抗体制备
蛋白质制备通过瞬时转染在补充有2mM L-谷氨酰胺(Gibco，目录号25030-024)的FreeStyle 293表达培养基(Gibco，目录号12338-018)中培养的Freestyle 293-F悬浮细胞(Invitrogen目录号R79007)来进行，所述细胞在岩藻糖残基连接到抗体尾部时被抑制[Henning von Horsten等人，Glycobiology，第20卷，第12期，第1607-1618页，2010]。转染前一天，将细胞以5.0×105个细胞/mL的密度接种并在37℃，8％CO2下以155rpm的轨道振荡速度进行o/n温育。就转染而言，制备质粒DNA和聚乙烯亚胺(PEI，MW 25,000Da，Polysciences Inc.，目录号23966)在培养基中的混合物。就25mL转染体积而言，将25μg不含内毒素的质粒DNA与62.5μg PEI和2.5mL培养基混合。然后将混合物涡旋，在室温温育20分钟并加入细胞中。将细胞在37℃，8％CO2下以155rpm的轨道振荡速度温育6天。收集细胞悬浮液，以1000g离心10分钟，并收集上清液，以4000g离心10分钟。
抗体纯化
抗体纯化通过在室温下将抗体分批结合至MabSelectSure LX(GE Healthcare)并持续数小时来进行。然后将含有结合的抗体的MabSelectSure LX琼脂糖转移到重力流动柱。用PBS洗涤柱，用pH 3.0的100mM柠檬酸盐缓冲液洗脱抗体，并且使用1M Tris pH 8.0将pH中和至7.0。样品使用Vivaspin20(Sartorius)10kDa旋转过滤器浓缩，并使用用PBS缓冲液预平衡的Superdex200 26/600柱(GE Healthcare)通过凝胶过滤进一步纯化。
阳离子交换HPLC
使用阳离子交换层析(CEX-HPLC)来解决抗体样品的电荷异质性以及测定产物相关的杂质(同源二聚体和半体)的存在和量。实验在环境温度下在配备有SP STAT 7μm柱(Tosoh Biosciences)和UV-vis检测器的Dionex HPLC系统上进行。每次运行中注射10μg的样品。施加NaCl浓度从0增加至1M的25mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)梯度以分离抗体。使用Chromeleon软件分析数据。
ACDD报告基因测定
对于包含V158(高亲和力)FcγRIIIa受体变体或F158(低亲和力)FcγRIIIa受体变体(Promega)的ADCC报告基因细胞测试无岩藻糖基化抗体PB10651(MV1622)的活性。与包含高和低亲和力FcγRIIIa变体的ADCC报告基因细胞组合，将连续滴定抗体，即无岩藻糖基化的PB10651(PB10651-MV1622)、非无岩藻糖基化PB10651和非靶向IgG1(PG1337)[Cartron等人，Blood，第99卷，第3期，第754-758页，2002；]Musolino等人，Journal of ClinicalOncology，第26卷，第11期，第1789-1796页]加入A431细胞、A549细胞和BxPC3细胞中。通过测量荧光素酶活性来检测ADCC活性。
实验
用MG3755C453、MG5816C626和MV1622转染Freestyle 293-F细胞，产生IgGPb10651p10。纯化后，通过OD280测量测定PB10651(MV1622)的收率为每升生产体积29mg。对纯化的蛋白进行CEX-HPLC分析(图33)，示出15分钟的保留时间下一些酸性电荷变体的主峰，其表示双特异性PB10651(MV1622)分子。表示MF3755xMF3755DEDE同源二聚体的小峰(＜5％)在约11分钟时可见。
另外，进行了ADCC报告基因测定。数据示出，无岩藻糖基化PB10651(MV1622)显示对于与高(V158)和低(F15DEDE8)FcγRIIIa受体变体组合的所有细胞系的显著增加的ADCC活性。对照，在与高亲和力FcγRIIIa受体变体效应子细胞组合的A431细胞中，非无岩藻糖基化PB10651示出一些ADCC活性，但是信号显著低于PB10651(MV1622)信号。对于其它细胞系/效应子细胞组合，PB10651为阴性，然而PB10651(MV1622)示出强ADCC活性。PG1337(抗破伤风类毒素)是非结合对照IgG，其在所有实验中都为阴性(图34)。
实施例7：前导抗体的体内功效
动物模型选择
在患有来自结肠直肠患者的肿瘤的免疫受损小鼠(称为来源于患者的异种移植物(PDX)模型)中评估无岩藻糖基化PB10651(MV1622)的治疗功效。如通过RNA测序(RNAseq)分析，基于LGR5和EGFR基因的表达，选择PDX模型CR2519、CR2161、CR2501、CR0150和CR0193(Crown Biosciences数据库，http：//hubase2.crownbio.com)。模型呈现出不同的KRAS基因状态。即，CR2519和CR2161是KRAS的野生型，然而CR2501、CR0150是KRAS G12V，并且CR0193是KRAS，其为G13D突变体。CR0231和CR2501对西妥昔单抗敏感，然而CR0150对西妥昔单抗具有低反应性。
基因表达分析
为验证PDX模型用于功效研究的动物中保留了所示LGR5和EGFR mRNA表达水平，将活肿瘤中的表达与PDX瘤株中的表达进行比较。从瘤株(冷冻材料)和活肿瘤(研究动物)中提取RNA，用TRIzol(Ambiom 15596-018)和Tissue Lyser II(Qiagen 85300)匀化。然后，用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen 74106)和不含RNA的DNA酶组(Qiagen 76254)纯化RNA。RNA质量通过NanoDropTM分光光度计确认。通过逆转录制备cDNA(ABI4374966)。分别使用TaqMan探针Hs00969422_m1和Hs01076090_m1，通过实时RT-PCR反应测量LGR5和EGFR的表达，并使用TaqMan探针Hs02758991_g1针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)表达进行归一化。通过计算感兴趣的基因与GAPDH之间的Ct值的差并将其转化为2的幂来分析数据。图35示出用于功效研究的所有六种PDX模型均呈现与原始冷冻PDX瘤株相当的EGFR和LGR5表达。这六种模型中的LGR5表达是PDX模型中的表达(表示来自可获得的137种结肠直肠癌PDX模型集的最低LGR5表达(CR01560))的1000倍以上。所选的6个模型中的EGFR mRNA表达低于表示整个CRCPDX集中的最高的EGFR表达的CR1197。
PDX的功效研究
BALB/c裸鼠在右侧皮下接种源自五种结直肠癌PDX肿瘤模型(CR2519、CR2161、CR2501、CR0150和CR0193)中的一种的PDX肿瘤片段(直径2-3mm)。允许肿瘤生长至100mm3-200mm3的体积。然后以每周四次腹膜内注射(i.p.)剂量的PBS(200μl)或无岩藻糖基化PB10651(在PBS中每只动物0.5mg)处理小鼠。通过测厚仪每两周测量肿瘤，并且使用公式TTV＝0.5×a×b2计算肿瘤体积(TV)，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。无岩藻糖基化PB10651在CR2519和CR0193 PDX模型中呈现出强肿瘤抑制活性，并且该活性与西妥昔单抗的活性类似(图36)。无岩藻糖基化PB10651在CR2501 PDX模型中呈现出有限但显著的抗肿瘤活性，然而西妥昔单抗不能显著减少肿瘤生长。PDX模型CR2161和CR0150不强响应于西妥昔单抗或无岩藻糖基化PB10651，并且仅示出无岩藻糖基化PB10651的抗肿瘤活性的趋势(图36)。
实施例8：P18T和C31M异种移植物研究
材料和方法
P18类肿瘤的免疫组织化学
自添加抗体48小时后，去除培养基，并在室温下，将48孔板上的BME液滴在300μL福尔马林中固定2小时。然后使用移液管手动破碎BME液滴，造粒，并置于新鲜的福尔马林中但不破坏粒料。将粒料在室温下保留过夜，然后在PBS中洗涤三次。然后将粒料轻轻地重新悬浮于PBS中并置于微型盒中以通过IRB(生物医学研究所)组织学工具进行处理，用于形成石蜡包埋切片。
使用Autostainer Plus(Dako-Agilent)通过IRB组织学工具进行Ki67和裂解的半胱天冬酶-3染色。在染色之前，使用PT Link(Dako-Agilent)，在97℃下使用低pH值EnVisionTMFLEX靶回收溶液(Dako，Burlington)，作为抗原回收过程的一部分，将切片脱蜡20分钟。使用过氧化物酶阻断溶液(Dako REAL S2023)使内源性过氧化物酶猝灭10分钟。兔多克隆抗-Ki67(ab15580，Abcam公司)和兔多克隆抗半胱天冬酶3(细胞信号传导，9661S)以1∶1000和1∶500稀释，并且分别在室温下温育60分钟和120分钟。使用不含生物素的BrightVision聚-HRP-抗兔IgG用于二抗(Immunologic，DPVR-110HRP)，并在室温下温育30分钟。使用3-3’-二氨基联苯胺(K3468，Dako)使染色显露5分钟。切片用苏木精(Dako，S202084)复染，并使用Dako CoverStainer用不含甲苯的固定介质(CS705，Dako)固定。通过省略一级抗体来确认染色的特异性。使用连接到尼康DS-Ri1相机的Nikon Eclipse E600拍摄图像。
P18T和C31M类器官异种移植物的治疗
所有小鼠实验均以协议号DAAM7329由巴塞罗那科学园动物护理和使用委员会(CEEA-PCB)和加泰罗尼亚政府批准。肿瘤生长7天，然后解聚成单一细胞悬浮液用于注射。形成单一细胞的培养条件和方法在“使用选择的5种抗-LGR5cLC抗体由类器官P18T获得的细胞的FACS染色”部分中描述。对于所有小鼠研究，使用6-8周龄之间的雌性NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj小鼠(Janvier Labs)。通过皮下注射100μL包含200,000个P18T细胞 或1,000,000个C31M细胞的BME∶PBS(50∶50)溶液开始异种移植。一旦肿瘤体积达到300mm3，处死小鼠并收集肿瘤。将一个肿瘤手动切割成约0.5mm×0.5mm×0.5mm(宽×长×高)的切片。然后使用一个切片/侧腹，将切片置于受体NOD-SCID小鼠的四个侧腹中。使用trocker将这些切片植入小鼠体内，所述trocker是将肿瘤切片推到皮肤下面的装置。总共30只小鼠用于植入。一旦小鼠的肿瘤体积达到平均50mm 3，就将小鼠随机分配到治疗组。用200μL的PBS(pH 7.4 Gibco Ref 10010-015)，西妥昔单抗(临床批次，5mg/ml)或无岩藻糖基化 PB10651(2.5mg/ml)每周一次对小鼠进行注射并持续四周。不考虑小鼠重量，以0.5mg/小鼠的剂量注射西妥昔单抗和无岩藻糖基化PB10651。使用手动卡尺，每周三次获取测量值，并使用公式：(长度×宽度×高度)/2来计算肿瘤体积。当肿瘤体积超过300mm3，肿瘤溃烂或已达到研究终点时；自第一次抗体注射后28天，处死小鼠。如果由于尺寸限制/溃烂，仅需要采用一只小鼠中的单个肿瘤，则将其切除，将剩余部分保留在适当位置用于进一步研究。如果需要收集附加的切除部分或多个肿瘤，则挑出小鼠并且同时采集所有样本。数据相对于第0天(治疗的第一天)表示，并且使用GraphPad Prism在每个治疗组之间进行配对样本t检验分析。
结果
Ki67染色是细胞增殖的指标，并用于测定对于由抗体治疗导致的生长的作用是否由于增殖减少。在固定之前将类肿瘤体外处理48小时(2μg/mL)。与其它治疗组相比，用无岩藻糖基化PB10651治疗类肿瘤导致阳性细胞数和染色强度的减少(图37)。相对于TT-TT对照治疗，西妥昔单抗和EGFR-TT抗体导致阳性细胞数少量的适度减少。还进行裂解的半胱天冬酶-3染色以评估抗体是否促进细胞凋亡。在TT对照、EGFR-TT和西妥昔单抗治疗组中观察到低水平的细胞凋亡，其中三组之间观察到相当的染色。在无岩藻糖基化PB10651处理组中，阳性细胞数增加。这些结果表明无岩藻糖基化PB10651双特异性抗体在减少增殖和诱导细胞凋亡方面优于西妥昔单抗和单一抗-EGFR臂。
在NOD-SICD小鼠中建立异种移植物并且每周一次用无岩藻糖基化PB10651(0.5mg/小鼠/周)、西妥昔单抗(0.5mg/小鼠/周)或PBS处理并持续四周。为了评估抗体响应，对肿瘤体积进行追踪并在组间进行比较。自第2天起，对于P18T和C31M异种移植物模型两者，相比于PBS和西妥昔单抗两者，用无岩藻糖基化PB10651治疗导致平均肿瘤体积增加显著减少(对于所有时间点，P＝＜0.01，图38)。在P18T异种移植模型中，经西妥昔单抗处理的小鼠显示出与经PBS处理的小鼠相似的生长动力学，并且由于大肿瘤体积，PBS和西妥昔单抗组中的大部分小鼠需要在第16天从研究中移除。到第20天，PBS和西妥昔单抗的肿瘤体积的平均倍数变化分别为15.2(±5.3)和14.2(±9.9)，然而无岩藻糖基化PB10651组的值为4.5(±0.59)。通过指数生长方程的非线性曲线拟合测定的肿瘤倍增时间，计算为对于PBS和西妥昔单抗组为9天，对于无岩藻糖基化PB10651治疗组为6天，肿瘤倍增时间减少30％。类似地，在C31M异种移植模型中，与PBS和西妥昔单抗治疗臂相比，PB1065显著减少肿瘤生长(图38)。
实施例8：使用重复剂量的PB10651的非GLP食蟹猴毒性研究。
为了评估PB10651的可能毒性，对食蟹猴进行非GLP重复剂量毒性研究。根据存在于PB10651中的EGFR Fab臂，可预计皮肤和胃肠(GI)道毒性。在抗-EGFR抗体西妥昔单抗(Erbitux)的情况下，由于严重的皮肤毒性，在每周75mg/kg的剂量下，在猴中观察到死亡，其中24mg/kg/周的剂量是慢性猴毒性研究中的最高耐受剂量。在帕尼单抗(Vectibix)的情况下，在4周的研究中在仅治疗三周后，在30mg/kg/周的剂量下，在猴中观察到死亡，其中在13周的IV毒性研究中在较低剂量下(7.5mg/kg/周和15mg/kg/周)偶尔死亡。基于这些信息，对于PB10651选择25mg/kg的剂量水平作为本研究中的最高剂量。每组使用一只雄性和一只雌性动物，并指定四组：每组给予对照(仅赋形剂)、2.5mg/kg/周、7.5mg/kg/周和25mg/kg/周、和每周四次剂量。在一小时内经由静脉内输注对动物施用抗体。
结果
利用西妥昔单抗和帕尼单抗在食蟹猴中的毒性研究揭示表皮毒性(红斑、干/片状剥落皮肤/毛发损失)和胃肠道(GI)效应(软粪便/腹泻、脱水)为剂量限制性毒性(EMA-EPAR2004西妥昔单抗，EMA-EPAR 2007帕尼单抗)，这与测试项目的抗-EGFR活性一致。然而，对于PB10651，即使在本研究中以最高剂量使用，重复施用后也未观察到皮肤毒性和胃肠道毒性。在活性组和对照组中同样观察到临床症状，如皮毛变薄、瘀伤和稀便出现，因此这些临床征象不被认为与药物有关。不认为器官重量和/或器官重量比例变化与施用PB10651有关。此外，不认为宏观或微观结果与施用PB10651有关。总之，对食蟹猴每周一次静脉内(输注)给药PB10651并持续4周不导致器官重量或器官重量比的变化，认为宏观或微观结果与施用PB10651有关。
导致本发明的工作已经根据赠款协议n°[601876].14从[欧盟][欧洲原子能共同体]第七框架计划([FP7/2007-2013][FP7/2007-2011])接受经费。
表1：成功免疫的小鼠的滴度。
表2：从噬菌体抗体库生成的针对不同WNT靶的抗体组的概述。
表3：包含选定的一组针对LGR4、LGR5、ZNRF3和RNF43的Wnt靶向Fab片段与破伤风类毒素Fab片段的组合的双特异性IgG的特征。
示出FACS亲和滴定、R-Spondin3阻断ELISA和40℃稳定ELISA。对于FACS亲和滴定，示出曲线下面积(AUC)值。对于R-Spondin阻断ELISA，示出与最大结合值(设定为100％结合)相比，每个IgG保留的结合百分比，以及来自2次独立实验的最终结论。显示了40℃稳定ELISA。表中示出在4℃和40℃下一周后的OD450nm值。表中示出了4℃相对于40℃的OD450nm比率(百分比)。将最终结论插入右栏，无论在OD信号低于0.1时IgG被认为是稳定的、部分稳定的还是NA的。
表4：不同特征的Z’因子分数和不同类器官中的多参数分数，比较在具有和不具有EGF的情况下EGF依赖性类肿瘤的生长。
多参数Z’因子分数与单独特征分数相似或高于单独特征分数，这展示使用此类分数是灵敏的并且可施用于在生长因子治疗后经历不同表型响应的多种不同类器官中。
表5：结合下列的双特异性抗体的优选的重链组合：LGR4/EGFR；LGR4/HER3；LGR5/EGFR；LGR5/HER3；RNF43/EGFR；RNF43/HER3；和ZNRF3/EGFR；ZNRF3/HER3。TT为破伤风类毒素的重链，并且仅用于参考。
表5续
表6：结合下列的双特异性抗体的优选的重链组合：LGR4/EGFR；LGR4/HER3；LGR5/ EGFR；LGR5/HER3；RNF43/EGFR；RNF43/HER3；和ZNRF3/EGFR；ZNRF3/HER3。TT为破伤风类毒素 的重链，并且仅用于参考。
表7|根据文献复制的比较抗体的列表及其内部编号。
抗体VH-序列和VL-序列根据专利复制，以合成cDNA形式制备，然后克隆到用于表达人IgG1的表达载体中。
使用标准化规程表达和纯化抗体。
表8|发现EGFR和LGR5中的残基与鸟枪诱变分析中PB10651与相应靶的结合相关。
表9|用于体外FACS染色的PDX肿瘤中的EGFR和LGR5 mRNA表达水平。
表10：在不同指征的来源于患者的异种移植物的体外染色后获得的平均荧光强度 (MFI)值。
本发明提供以下方面(等等)。
方面1：一种抗体，其包含可变结构域，所述可变结构域可结合人EGFR的细胞外部分上的表位，其中氨基酸残基I462；G465；K489；I491；N493；和C499参与抗体对表位的结合。
方面2：根据方面1所述的抗体，其中选自I462A；G465A；K489A；I491A；N493A；和C499A的氨基酸残基取代中的一种或多种减少抗体对人EGFR的结合。
方面3：一种抗体，其包含可结合人EGFR的细胞外部分上的表位的可变结构域，所述表位位于图40所示的SEQ ID NO：2的氨基酸残基420-480内，并且其中抗体对LGR5的结合通过以下氨基酸残基取代中的一种或多种减少：I462A；G465A；K489A；I491A；N493A；和C499A。
方面4：根据方面1至3中任一项所述的抗体，其中抗体对人EGFR的结合干扰EGF对受体的结合。
方面5：根据方面1至4中任一项所述的抗体，其中所述表位为构象表位。
方面6：根据方面1至5中任一项所述的抗体，其中表位位于图40所示的SEQ ID NO：2的氨基酸残基420-480内，优选地图40所示的SEQ ID NO：2的氨基酸残基430-480内；优选地图40所示的SEQ ID NO：2的438-469内。
方面7：根据方面1至6中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含其它可变结构域，所述其它可变结构域可结合其它蛋白质。
方面8：根据方面7所述的抗体，其中所述其它蛋白质为包含细胞外部分的膜蛋白。
方面9：根据方面7或方面8所述的抗体，其中所述其它蛋白质为膜缔合成员WNI-途径。
方面10：根据方面1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体为双特异性抗体，其包含结合人EGFR的可变结构域和结合其它蛋白质的可变结构域。
方面11：根据方面1至10中任一项所述的抗体，其中可变结构域结合人EGFR，其中所述可变结构域的重链可变区至少包含如图1所示的MF3755的VH的CDR3序列，或其中所述可变结构域的重链可变区包含重链CDR3序列，其与如图1所示的MF3755的VH的CDR3序列在最多三个、优选地最多两个、优选地不超过一个氨基酸上不同。
方面12：根据方面10或方面11所述的抗体，其中所述可变结构域包含重链可变区，所述重链可变区至少包含如图1所示的MF3755的VH的CDR1、CDR2和CDR3序列；或者，具有最多三个、优选地最多两个、优选地最多一个氨基酸取代的如图1所示的MF3755的VH的CDR1、CDR2和CDR3序列。
方面13：根据方面11或方面12所述的抗体，其中结合EGFR的可变结构域包含如图1所示的MF3755的VH链的序列；或者如图1所述的VH链MF5816的氨基酸序列，其关于MF3755的VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
方面14：根据方面7至13中任一项所述的抗体，其中所述其它蛋白质为LGR4；LGR5；LGR6；RNF43或ZNRF3。
方面15：根据方面14所述的抗体，其中所述其它蛋白质为LGR5。
方面16：一种双特异性抗体，其包含可结合EGFR的细胞外部分上的表位的可变结构域和可结合其它蛋白质的可变结构域，其中所述EGFR表位位于图40所示的SEQ ID NO：2的氨基酸残基420-480内，所述氨基酸残基I462；G465；K489；I491；N493；和C499参与抗体对表位的结合。
方面17：根据方面16所述的双特异性抗体，其中所述可变结构域与EGFR的结合由以下氨基酸残基取代中的一种或多种减少：I462A、G465A；K489A；I491A；N493A；和C499A。
方面18：根据方面16或方面17所述的双特异性抗体，其中所述其它蛋白质为包含细胞外部分的膜蛋白。
方面19：根据方面16至18中任一项所述的双特异性抗体，其中所述其它蛋白质为WNI-途径的膜缔合成员，优选地LGR5。
已经示出当用于抑制EGFR配体响应性癌症或细胞的生长时，包含结合具有提及的表位的EGFR的一个或多个可变结构域的抗体具有更好的功效。在双特异性抗体的情况下，包含具有提及的表位的EGFR结合可变结构域的抗体臂与包含结合其它细胞表面蛋白的细胞外部分的可变结构域的多种其它臂更好地组合。

Claims (28)

1.一种蛋白质，其结合表皮生长因子(EGF)受体家族或cMET的膜缔合成员的细胞外部分；和WNT信号传导途径的膜缔合成员的细胞外部分。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述蛋白质为抗体，优选地双特异性抗体。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的蛋白质或抗体，其中所述WNT途径为经典WNT途径。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白质或抗体，其中所述EGF受体家族成员为表皮生长因子受体(EGFR或Erbb-1)或Erbb-3。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白质或抗体，其中所述WNI信号传导途径的膜缔合成员包括LRP5、LRP6、LGR4、LGR5、LGR6、FRZ1、FRZ2、FRZ3、FRZ4、FRZ5、FRZ6、FRZ7、FRZ8、FRZ9、FRZ10、ZNRF3、RNF43、N-钙黏蛋白、Kremen1和Kremen2、ROR2、或RYK。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的蛋白质或抗体，其中所述WNT信号传导途径的膜缔合成员包括参与WNT信号传导的LGR家族的成员，优选地LGR4、或LGR5；或者ZNRF3、或RNF43。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的蛋白质或抗体，其中所述蛋白质为双特异性抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物。
8.一种双特异性抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其包含结合表皮生长因子(EGF)受体家族或cMET的膜缔合成员的细胞外部分的可变结构域，和结合WNT信号传导途径的膜缔合成员的细胞外部分的可变结构域。
9.根据权利要求8所述的双特异性抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其包含结合下列的可变结构域：EGFR和LGR4；EGFR和LGR5；EGFR和ZNRF3；EGFR和RNF43；HER3和LGR4；HER3和LGR5；HER3和ZNRF3；或者HER3和RNF43。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的双特异性抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其包含结合EGFR的可变结构域和结合LGR5的可变结构域，
-其中结合EGFR的可变结构域的VH链包含：如图1所述的VH链MF3755的氨基酸序列；或者如图1所述的VH链MF3755的氨基酸序列，所述氨基酸序列关于所述VH具有最多15个，优选地具有不超过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、1个，并且优选地具有不超过5个、4个、3个、2个或1个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且
-其中结合LGR5的可变结构域的VH链包含如图1所述的VH链MF5816的氨基酸序列；或者如图1所述的VH链MF5816的氨基酸序列，所述氨基酸序列关于所述VH具有最多15个，优选地不超过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、1个，并且优选地具有不超过5个、4个、3个、2个或1个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。
11.根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白质或抗体或者根据权利要求8至10中任一项所述的双特异性抗体，其用于治疗患有癌症的个体的用途。
12.根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白质或抗体或者根据权利要求8至10中任一项所述的双特异性抗体，其用于根据权利要求11所述的用途，其中所述癌症为腺癌。
13.根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白质或抗体或者根据权利要求8至10中任一项所述的双特异性抗体，其用于根据权利要求11或权利要求12所述的用途，其中所述癌症为结肠直肠癌；胰腺癌；肺癌；乳腺癌；肝癌；前列腺癌；卵巢癌；宫颈癌；子宫内膜癌；头颈癌；黑色素瘤；睾丸癌；尿路上皮癌；肾癌；胃癌；或者良性肿瘤癌。
14.根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白质或抗体或者根据权利要求8至10中任一项所述的双特异性抗体，其用于根据权利要求11至13中任一项所述的用途，其中所述癌症为结肠直肠癌。
15.一种用于治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括向对其有需要的个体施用根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白质或抗体或者根据权利要求8至10中任一项所述的双特异性抗体，或所述抗体的功能部分、衍生物和/或类似物。
16.一种细胞体系，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白质或抗体或者根据权利要求8至10中任一项所述的双特异性抗体，以及表达表皮生长因子(EGF)受体家族的膜缔合成员的细胞和表达WNT途径的膜缔合成员的细胞。
17.一种用于在允许细胞增殖的体系中抑制细胞增殖的方法，所述细胞表达表皮生长因子(EGF)受体家族的膜缔合成员并且表达WNT途径的膜缔合成员，所述方法包括提供具有根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白质或抗体或者根据权利要求8至10中任一项所述的双特异性抗体的体系。
18.一种抗体，其包含可结合LGR5的细胞外部分上的表位的可变结构域，所述表位位于图39所示的SEQ ID NO：1的氨基酸残基21-118内，其中氨基酸残基D43、G44、M46、F67、G90和F91参与所述抗体对所述表位的结合。
19.根据权利要求18所述的抗体，其中D43A、G44A、M46A、F67A、G90A和F91A的氨基酸残基取代中的一种或多种减少LGR5的抗体的结合。
20.一种抗体，其包含可结合LGR5的细胞外部分上的表位的可变结构域，所述表位位于图39所示的SEQ ID NO：1的氨基酸残基21-118内，并且其中所述抗体对LGR5的结合通过以下氨基酸残基取代中的一种或多种减少：D43A、G44A、M46A、F67A、G90A和F91A。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的抗体，其中所述抗体与LGR5-表达细胞上的LGR5的相互作用抑制Rspondin(RSPO)与LGR5的结合不超过20％。
22.根据权利要求21所述的抗体，其中当所述抗体和所述RSPO以0.1或更小的摩尔比；优选地以介于0.1至0.001之间的摩尔比(包括端值在内)，优选地0.1至0.01的摩尔比(包括端值在内)存在时，测量所述抗体与LGR5的结合的抑制。
23.一种抗体，其包含可结合LGR5上的表位的可变结构域，所述LGR5位于图39所示的SEQ ID NO：1的氨基酸残基21-118内，并且其中当所述抗体和所述RSPO以0.1或更小的摩尔比；优选地以介于0.1至0.001之间的摩尔比(包括端值在内)，优选地0.1至0.01的摩尔比(包括端值在内)存在时，所述抗体与LGR5-表达细胞上的LGR5的相互作用抑制RSPO与LGR5的结合不超过20％。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的抗体，其中所述表位为构象表位。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的抗体，其为双特异性抗体，其还包含可结合表皮生长因子(EGF)受体家族或cMET的膜缔合成员的可变结构域。
26.一种抗体，其包含可变结构域，所述可变结构域可结合人EGFR的细胞外部分上的表位，其中氨基酸残基I462；G465；K489；I491；N493；和C499参与所述抗体对所述表位的结合。
27.根据权利要求26所述的抗体，其中选自I462A；G465A；K489A；I491A；N493A；和C499A的氨基酸残基取代中的一种或多种减少所述抗体对人EGFR的结合。
28.一种抗体，其包含可结合人EGFR的细胞外部分上的表位的可变结构域，所述表位位于图40所示的SEQ ID NO：2的氨基酸残基420-480内，并且其中所述抗体对LGR5的结合通过以下氨基酸残基取代中的一种或多种减少：I462A；G465A；K489A；I491A；N493A；和C499A。
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