CN110462038A - 抗gprc5d抗体和包含所述抗体的分子 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了结合人GPRC5D的新型抗体和包含所述抗体且能够结合抗原的分子。提供了：结合人GPRC5D的新型抗体；包含所述抗体且能够结合抗原的分子；包含所述抗体或所述分子作为活性成分的抗肿瘤药物组合物，等。
Description
[技术领域]
本发明涉及新型抗GPRC5D抗体和包含所述抗体的分子。
[背景技术]
G蛋白偶联受体家族C组5成员D(GPRC5D)是使用一系列人GPCR的氨基酸序列通过EST数据库的同源性搜索发现的G蛋白偶联受体之一(非专利文献1)。GPCR家族C组5受体(GPRC5受体)具有4种亚型(GPRC5A、GPRC5B、GPRC5C和GPRC5D)，并且也称为视黄酸诱导的孤儿G蛋白偶联受体(RAIG)，因为它们的表达由视黄酸刺激诱导(非专利文献2)。然而，尚未揭示GPRC5D的生物学功能或生物学配体，与其偶联的G蛋白的亚型等。
关于GPRC5D基因与癌症的关联，已知GPRC5D在多发性骨髓瘤中高度表达。具体而言，已知例如：GPRC5D的过表达与多发性骨髓瘤患者的预后不良相关(非专利文献3)；并且通过多发性骨髓瘤患者的药物治疗，表达GPRC5D的细胞的比例降低(非专利文献4)。GPRC5D的过表达与癌症的这种关联表明GPRC5D充当癌症的优异治疗靶标的可能性。此外，还存在关于抗GPRC5D抗体和双特异性抗体的报道，所述双特异性抗体包含所述抗体和抗CD3抗体，其外源地表现出对表达GPRC5D的3T3细胞的结合性质(专利文献1)。然而，尚未开发出靶向GPRC5D的医药产品。
[现有技术文献]
[专利文献]
[专利文献1]国际公开号WO2016/090329
[非专利文献]
[非专利文献1] H Brauner-Osborne, 等人, Biochim Biophys Acta., 2001年4月出版, Vol. 1518 (No. 3), p. 237-248
[非专利文献2] S Inoue, 等人, Journal of Investigative Dermatology, 2004年3月出版, Vol. 122 (No. 3), p. 565-573
[非专利文献3] J Atamaniuk, 等人, European Journal of ClinicalInvestigation, 2012年5月出版, Vol. 42 (No. 9), p. 953-960
[非专利文献4] Y Cohen, 等人, Hematology), 2013年11月出版, Vol. 18 (No.6), p. 348-351。
[发明概述]
[技术问题]
本发明的一个目的是提供具有抗癌作用的抗GPRC5D抗体、所述抗体的抗原结合片段和包含所述抗体或所述抗体的抗原结合片段的分子。
本发明的另一个目的是提供包含所述抗体，所述抗体的抗原结合片段或所述分子的药物组合物等。
本发明的一个替代目的是提供包含编码所述抗体，所述抗体的抗原结合片段或所述分子的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，具有所述多核苷酸的插入物的载体，用所述多核苷酸或载体转染的细胞，以及产生所述抗体或所述抗体的抗原结合片段或所述分子的方法，所述方法包括培养所述细胞的步骤。本发明的一个进一步替代目的是提供使用所述抗体，所述抗体的抗原结合片段或所述分子治疗癌症的方法。
[问题的解决方式]
本发明人已进行深入研究以达到上述目的，并已通过开发新型抗GPRC5D抗体和发现所述抗体具有抗癌作用而完成本发明。
本发明提供了：
(1)抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含根据以下(I)至(III)中任一项所述的重链可变区和轻链可变区并且结合人GPRC5D：
(II)
重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:48代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:49代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:50代表的氨基酸序列组成的重链CDR3，
和
轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:57代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:58代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:59代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3，
(I)
重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:45代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:46代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:47代表的氨基酸序列组成的重链CDR3，
和
轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:54代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:55代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:56代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3，
和
(III)
重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:51代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:52代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:53代表的氨基酸序列组成的重链CDR3，
和
轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:60代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:61代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:62代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3；
(2)根据(1)所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述重链可变区和所述轻链可变区是根据(II)所述的重链可变区和轻链可变区；
(3)根据(1)所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述重链可变区和所述轻链可变区是根据(I)所述的重链可变区和轻链可变区；
(4)根据(1)所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述重链可变区和所述轻链可变区是根据(III)所述的重链可变区和轻链可变区；
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是嵌合抗体或所述抗体的抗原结合片段；
(6)根据(1)至(4)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人源化抗体或所述抗体的抗原结合片段；
(7)根据(1)至(4)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人抗体或所述抗体的抗原结合片段；
(8)根据(1)、(2)和(6)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含：
轻链可变区，其包含由以下代表的任一氨基酸序列：
SEQ ID NO:64代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127，
SEQ ID NO:66代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127，
SEQ ID NO:68代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127，
SEQ ID NO:70代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127，和
SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127，和
重链可变区，其包含由以下代表的任一氨基酸序列：
SEQ ID NO:74代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142，
SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142，
SEQ ID NO:78代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142，和
SEQ ID NO:80代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142；
(9)根据(1)、(2)、(6)和(8)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含以下的重链可变区和轻链可变区的任一组合：
・包含SEQ ID NO:74代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:64代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:74代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:66代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:66代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:68代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:70代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:78代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:68代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:78代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:70代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:78代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:80代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:64代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:80代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:68代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:80代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:70代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，或
・包含SEQ ID NO:80代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区；
(10)根据(1)、(2)和(6)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含：
轻链可变区，其包含由以下代表的氨基酸序列：
SEQ ID NO:82代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126，或
SEQ ID NO:84代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126，和
重链可变区，其包含由以下代表的任一氨基酸序列：
SEQ ID NO:86代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142，
SEQ ID NO:88代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142，
SEQ ID NO:90代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142，和
SEQ ID NO:92代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142；
(11)根据(1)、(4)、(6)和(10)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含以下的重链可变区和轻链可变区的任一组合：
・包含SEQ ID NO:86代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:84代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:88代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:84代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:90代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:82代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:90代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:84代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126代表的氨基酸序列的轻链可变区，或
・包含SEQ ID NO:92代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:82代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126代表的氨基酸序列的轻链可变区；
(12)根据(1)至(11)中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含Fc；
(13)抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体结合人GPRC5D且包含根据以下①至④中任一项所述的重链可变区和轻链可变区：
①
重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:111代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:112代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:113代表的氨基酸序列组成的重链CDR3，
和
轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:114代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:115代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:116代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3，
②
重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:117代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:118代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:119代表的氨基酸序列组成的重链CDR3，
和
轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:120代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:121代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:122代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3，
③
重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:123代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:124代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:125代表的氨基酸序列组成的重链CDR3，
和
轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:126代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:127代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:128代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3，和
④
重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:129代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:130代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:131代表的氨基酸序列组成的重链CDR3，
和
轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:132代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:133代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:134代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3；
(14)根据(13)所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述重链可变区和所述轻链可变区是根据①所述的重链可变区和轻链可变区；
(15)根据(13)所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述重链可变区和所述轻链可变区是根据②所述的重链可变区和轻链可变区；
(16)根据(13)所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述重链可变区和所述轻链可变区是根据③所述的重链可变区和轻链可变区；
(17)根据(13)所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述重链可变区和所述轻链可变区是根据④所述的重链可变区和轻链可变区；
(18)根据(13)至(17)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含：
重链可变区，其包含以下中的任一者：
SEQ ID NO:97代表的氨基酸序列，
SEQ ID NO:101代表的氨基酸序列，
SEQ ID NO:105代表的氨基酸序列，和
SEQ ID NO:109代表的氨基酸序列，
和
轻链可变区，其包含以下中的任一者：
SEQ ID NO:99代表的氨基酸序列，
SEQ ID NO:103代表的氨基酸序列，
SEQ ID NO:107代表的氨基酸序列，和
SEQ ID NO:135代表的氨基酸序列；
(19)根据(13)至(18)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含以下的重链可变区和轻链可变区的任一组合：
・包含SEQ ID NO:97代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:99代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:101代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:103代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:105代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:107代表的氨基酸序列的轻链可变区，和
・包含SEQ ID NO:109代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:135代表的氨基酸序列的轻链可变区；
(20)抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含以下的重链和轻链的任一组合：
包含SEQ ID NO:144代表的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:145代表的氨基酸序列的轻链，
包含SEQ ID NO:146代表的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:147代表的氨基酸序列的轻链，
包含SEQ ID NO:148代表的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:149代表的氨基酸序列的轻链，或
包含SEQ ID NO:150代表的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:151代表的氨基酸序列的轻链；
(21)抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含由多核苷酸中所含的核苷酸序列编码的氨基酸序列且结合人GPRC5D，所述多核苷酸在严格条件下与包含编码根据(8)至(12)和(18)至(20)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段中所含的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的互补链杂交；
(22)抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列且结合人GPRC5D，所述氨基酸序列与根据(8)至(12)和(18)至(20)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段中所含的氨基酸序列具有90%或更高同一性；
(23)抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列且结合人GPRC5D，所述氨基酸序列通过1至几个氨基酸的取代、缺失或添加而衍生自根据(8)至(12)和18至20中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段中所含的氨基酸序列；
(24)抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合人GPRC5D上由根据(1)至(20)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段结合的位点；
(25)抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与根据(1)至(20)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段竞争结合人GPRC5D；
(26)根据权利要求(1)至(25)中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合食蟹猴GPRC5D；
(27)根据(1)至(26)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab)'、Fv、scFv或sdAb；
(28)抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体结合人GPRC5D，包含根据(2)、(8)或(9)所述的重链可变区和轻链可变区，并且
i)包含SEQ ID NO:199代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:203代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
ii)包含SEQ ID NO:201代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:205代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
iii)包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
或
iv)包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至476代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区；
(29)抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体结合人GPRC5D，含有包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，并且
i)包含SEQ ID NO:199代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:203代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
ii)包含SEQ ID NO:201代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:205代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
iii)包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
或
iv)包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区；
(30)抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体结合人GPRC5D，包含根据(2)、(8)或(9)所述的重链可变区和轻链可变区，和Fc突变；
(31)抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体结合人GPRC5D，含有包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，和Fc突变；
(32)多核苷酸，其编码根据(1)至(31)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段；
(33)载体，其包含根据(32)所述的多核苷酸中的任一种；
(34)细胞，其包含根据(32)所述的多核苷酸或根据(33)所述的载体中的任一种，或者用于产生根据(1)至(31)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段；
(35)人工免疫细胞，其包含根据(32)所述的多核苷酸或根据(33)所述的载体中的任一种，或者用于在细胞表面上表达根据(1)至(31)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段；
(36)用于产生结合人GPRC5D的抗体或抗体的抗原结合片段的方法，其包括以下步骤：培养根据(34)所述的细胞；和从培养物回收结合人GPRC5D的抗体或抗体的抗原结合片段；
(37)结合人GPRC5D的抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段通过根据(36)所述的方法获得；
(38)用于治疗和/或预防的药物组合物，其包含根据(1)至(31)和(37)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段、根据(32)所述的多核苷酸、根据(33)所述的载体、或根据(35)所述的人工免疫细胞作为有效成分；
(39)根据(38)所述的药物组合物，其中所述药物组合物用于治疗和/或预防癌症；
(40)根据(39)所述的药物组合物，其中所述癌症是表达GPRC5D蛋白的乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、结肠直肠癌、食道癌、膀胱癌、子宫颈癌、血液癌、淋巴瘤或恶性黑色素瘤；
(41)根据(40)所述的药物组合物，其中所述癌症是表达GPRC5D蛋白的多发性骨髓瘤；
(42)具有抗原结合活性的分子，其包含根据(1)至(31)和(37)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段；
(43)根据(42)所述的分子，其中所述分子是多特异性的；
(44)根据(42)或(43)所述的分子，其中所述分子包含根据(1)至(31)和(37)中任一项所述的结合人GPRC5D的抗体或抗体的抗原结合片段，和
包含以下且结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或抗体的抗原结合片段：
重链可变区，其包含：
包含SEQ ID NO:183代表的氨基酸序列的重链CDR1，
包含SEQ ID NO:238代表的氨基酸序列的重链CDR2，和
包含SEQ ID NO:185代表的氨基酸序列的重链CDR3，和
轻链可变区，其包含：
包含SEQ ID NO:186代表的氨基酸序列的轻链CDR1，
包含SEQ ID NO:239代表的氨基酸序列的轻链CDR2，和
包含SEQ ID NO:188代表的氨基酸序列的轻链CDR3；
(45)根据(44)所述的分子，其中，在重链CDR2中，第一个Xaa选自(A、E、G、H、I、L、T、V、R和S)，且
第二个Xaa是S；或者
第一个Xaa是N，且
第二个Xaa选自(E、R、F、Y、L、V、I、K和T)，且
在轻链CDR2中，Xaa选自(Q、A、G、S、N和D)，且
所述分子结合人CD3和食蟹猴CD3；
(46)根据(44)或(45)所述的分子，其中，在重链CDR2中，第一个Xaa选自(R和S)，且第二个Xaa是S，且
在轻链CDR2中，Xaa选自(Q、A、G、S、N和D)，且
所述分子结合人CD3和食蟹猴CD3；
(47)根据(42)至(45)中任一项所述的分子，其含有包含SEQ ID NO:240代表的氨基酸序列的重链可变区和
包含SEQ ID NO:241、242和243中任一个代表的氨基酸序列的轻链可变区；其中
在SEQ ID NO:240代表的氨基酸序列中，第一个Xaa选自(A、E、G、H、I、L、T、V、R和S)，且第二个Xaa是S；或者
第一个Xaa是N，且
第二个Xaa选自(E、R、F、Y、L、V、I、K和T)，且
在SEQ ID NO:241、242和243中任一个代表的氨基酸序列中，
Xaa选自(Q、A、G、S、N和D)；
(48)根据(47)所述的分子，其中
在SEQ ID NO:240中，第一个Xaa选自(R和S)，且
第二个Xaa是S，且
在SEQ ID NO:241、242和243中任一个代表的氨基酸序列中，
Xaa选自(Q、A、G、S、N和D)；
(49)根据(42)至(44)中任一项所述的分子，其中所述分子包含根据(1)至(31)和(37)中任一项所述的结合人GPRC5D的抗体或抗体的抗原结合片段，和
包含以下且结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或抗体的抗原结合片段：
重链可变区，其包含：
SEQ ID NO:183代表的重链CDR1的氨基酸序列，
SEQ ID NO:184代表的重链CDR2的氨基酸序列，和
SEQ ID NO:185代表的重链CDR3的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含：
SEQ ID NO:186代表的轻链CDR1的氨基酸序列，
SEQ ID NO:187代表的轻链CDR2的氨基酸序列，和
SEQ ID NO:188代表的轻链CDR3的氨基酸序列；
(50)根据(49)所述的分子，其中所述结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段是这样的抗体或抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:155代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:156、158和160中任一个代表的氨基酸序列的轻链可变区；
(51)根据(44)至(50)中任一项所述的分子，其中结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体的抗原结合片段是Fab、F(ab)'、Fv、scFv或sdAb；
(52)根据(44)至(51)中任一项所述的分子，其中结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体是包含人免疫球蛋白恒定区、或Fc或Fc突变的人源化抗体或人抗体；
(53)根据(44)至(52)中任一项所述的分子，其中所述结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段是这样的抗体或抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:180、181和182中任一个代表的氨基酸序列；
(54)根据(40)至(44)中任一项所述的分子，其中所述结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段经由接头或不经接头与根据(1)至(31)和(37)中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段结合；
(55)根据(42)至(44)中任一项所述的分子，其中所述分子包含根据(2)、(8)和(9)所述的结合人GPRC5D的抗体或抗体的抗原结合片段，和
结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含
・包含SEQ ID NO:207代表的氨基酸序列的氨基酸残基25至142代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:209代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至132代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:211代表的氨基酸序列的氨基酸残基25至142代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:213代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至130代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:244的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:244的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:245的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:245序列的氨基酸残基135至241代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:246的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:246的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:247的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:247的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:248的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:248的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:249的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:249的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:250的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:250的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:251的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:251的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:252的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:252的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:253的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:253的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:254的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:254的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，或
・包含SEQ ID NO:255的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:255的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区；并且包括
结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段；
(56)根据(55)所述的分子，其中结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，且
i)包含SEQ ID NO:199代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:203代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
ii)包含SEQ ID NO:201代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:205代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
iii)包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
或
iv)包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至476代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
且
结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段进一步包含Fc突变。适用的形式含有杂合型的双特异性分子；
(57)根据(55)所述的分子，其中结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，且
iii)包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
或
iv)包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
且
结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段进一步包含Fc突变。适用的形式含有杂合型的双特异性分子；
(58)根据(55)所述的分子，其包含：结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链；和
结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:219代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:221代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至264代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:225代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至264代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:227代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:229代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至476代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:231代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至264代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至476代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:233代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变；或
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至476代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:235代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变；
(59)根据(55)所述的分子，其包含：
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:225代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至264代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:227代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:229代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至476代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:231代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至264代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至476代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:233代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变；或
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至476代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:235代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变。适用的形式含有杂合型的双特异性分子；
(60)根据(55)所述的分子，其中结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，且
i)包含SEQ ID NO:199代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:203代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
ii)包含SEQ ID NO:201代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:205代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
iii)包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
或
iv)包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至476代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，且
结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段进一步包含：
v)包含SEQ ID NO:207代表的氨基酸序列的氨基酸残基143至471代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:209代表的氨基酸序列的氨基酸残基133至238代表的氨基酸序列的轻链恒定区，或
vi)包含SEQ ID NO:211代表的氨基酸序列的氨基酸残基143至471代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:213代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至236代表的氨基酸序列的轻链恒定区。适用的形式含有FSA型的双特异性分子；
(61)根据权利要求55所述的分子，其中结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，和
iii) 包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区；或
iv) 包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至476代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区；和
结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段进一步包含
v)包含SEQ ID NO:207代表的氨基酸序列的氨基酸残基143至471代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:209代表的氨基酸序列的氨基酸残基133至238代表的氨基酸序列的轻链恒定区，或
vi)包含SEQ ID NO:211代表的氨基酸序列的氨基酸残基143至471代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:213代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至236代表的氨基酸序列的轻链恒定区。适用的形式含有FSA型的双特异性分子；
(62)根据(55)所述的分子，其包含：
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:199代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:203代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:207代表的氨基酸序列的氨基酸残基25至471代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:209代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至238代表的氨基酸序列的轻链，或
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:201代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:205代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:211代表的氨基酸序列的氨基酸残基25至471代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:213代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至236代表的氨基酸序列的轻链。适用的形式含有FSA型的双特异性分子；
(63)根据(55)所述的分子，其中结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，其进一步包含Fc突变，且结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段进一步包含Fc突变。适用的形式含有双重型的双特异性分子；
(64)根据(55)所述的分子，其包含：
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:223代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至271代表的氨基酸序列和Fc突变，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:219代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变，或
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:223代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至271代表的氨基酸序列和Fc突变，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:221代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至264代表的氨基酸序列和Fc突变。适用的形式含有双重型的双特异性分子；
(65)根据(53)所述的分子，其中所述结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段经由接头或不经接头与根据(19)所述的抗体或抗体的抗原结合片段结合；
(66)根据(54)或(65)所述的分子，其结合人CD3和食蟹猴CD3并且还结合人GPRC5D，其中所述分子具有SEQ ID NO:171至179中任一个代表的氨基酸序列；
(67)分子，其包含由多核苷酸中所含的核苷酸序列编码的氨基酸序列且结合人CD3和食蟹猴CD3并且还结合人GPRC5D，所述多核苷酸在严格条件下与包含编码根据(50)、(53)、(58)、(59)、(62)、(64)、(65)和(66)中任一项所述的分子中所含的结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段中所含的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的互补链杂交；
(68)分子，其包含氨基酸序列且结合人CD3和食蟹猴CD3并且还结合人GPRC5D，所述氨基酸序列与根据(50)、(53)、(58)、(59)、(62)、(64)、(65)和(66)中任一项所述的结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段中所含的氨基酸序列具有90%或更高同一性；
(69)分子，其包含氨基酸序列且结合人CD3和食蟹猴CD3并且还结合人GPRC5D，所述氨基酸序列通过1至几个氨基酸的取代、缺失或添加而衍生自根据(50)、(53)、(58)、(59)、(62)、(64)、(65)和(66)中任一项所述的分子中所含的结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段中所含的氨基酸序列；
(70)根据(42)至(69)中任一项所述的分子，其中所述分子结合食蟹猴GPRC5D；
(71)根据(43)至(70)中任一项所述的分子，其中所述分子是双特异性的；
(72)根据(42)至(71)中任一项所述的分子，其中所述分子是多肽；
(73)多核苷酸，其包含编码根据(72)所述的分子的氨基酸序列的核苷酸序列；
(74)载体，其包含根据(73)所述的多核苷酸；
(75)细胞，其产生根据(73)所述的多核苷酸或根据(74)所述的载体，或根据(71)所述的分子；
(76)产生结合人CD3和食蟹猴CD3并且还结合人GPRC5D的分子的方法，其包括以下步骤：培养根据(75)所述的细胞；和从培养物回收结合人CD3和食蟹猴CD3和/或人GPRC5D的分子；
(77)结合人CD3和食蟹猴CD3并且还结合人GPRC5D的分子，所述分子通过根据(76)所述的方法获得；
(78)根据(77)所述的分子，其中所述分子结合食蟹猴GPRC5D；
(79)用于治疗和/或预防的药物组合物，其包含根据(42)至(72)、(77)和(78)中任一项所述的分子，根据(73)所述的多核苷酸，或根据(74)所述的载体作为活性成分；
(80)根据(79)所述的药物组合物，其中所述药物组合物用于治疗和/或预防癌症；
(81)根据(80)所述的药物组合物，其中所述癌症是表达GPRC5D蛋白的乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、结肠直肠癌、食道癌、膀胱癌、子宫颈癌、血液癌、淋巴瘤或恶性黑色素瘤；
(82)根据(79)或(80)所述的药物组合物，其中所述癌症是表达GPRC5D蛋白的多发性骨髓瘤；
(83)用于治疗和/或预防癌症的方法，其包括施用根据(42)至(72)、(77)和(78)中任一项所述的分子或根据(79)至(82)中任一项所述的药物组合物；
(84)根据权利要求(79)至(82)中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物通过将T细胞重新引导至表达GPRC5D的细胞而诱导对所述细胞的细胞毒性；
(85)根据(83)所述的方法，其中所述方法通过将T细胞重新引导至表达GPRC5D的细胞而诱导对所述细胞的细胞毒性；
(86)用于通过将T细胞重新引导至表达GPRC5D的细胞而诱导对所述细胞的细胞毒性的方法，其包括施用根据(42)至(72)、(77)和(78)中任一项所述的分子或根据(79)至(82)中任一项所述的药物组合物的步骤；和
(87)用于将T细胞重新引导至表达GPRC5D的细胞的方法，其包括施用根据(42)至(72)、(77)和(78)中任一项所述的分子或根据(79)至(82)中任一项所述的药物组合物的步骤。
[本发明的有利效果]
根据本发明，获得了结合人GPRC5D的新型抗GPRC5D抗体或所述抗体的抗原结合片段，以及包含所述抗体或所述抗体的抗原结合片段且具有抗原结合活性的新型分子。所述分子可以包含抗CD3抗体。
由本发明提供的所述抗体或所述抗体的抗原结合片段和所述分子的使用允许治疗或预防表达GPRC5D蛋白的各种癌症，优选多发性骨髓瘤。
[附图简述]
[图1]图1是显示通过流式细胞术测试大鼠抗GPRC5D抗体(2A4、2B1和7B4)针对人GPRC5D的结合性质的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度的相对值。
[图2]图2是显示人GPRC5D的氨基末端氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO:1)的图。
[图3]图3是显示人GPRC5D的氨基末端氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO:2)的图。
[图4]图4是显示使用流式细胞仪(FACS)测试大鼠抗GPRC5D抗体(2A4、2B1和7B4)针对人GPRC5D的结合性质的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度的相对值。肽的分子内二硫键存在(A)或不存在(B)。
[图5]图5是显示大鼠抗GPRC5D抗体(2A4、2B1和7B4)具有ADCC活性的图。
[图6]图6是显示用于PCR扩增2A4的重链基因的可变区cDNA的引物的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:3)的图。
[图7]图7是显示用于PCR扩增2A4的轻链基因的可变区cDNA的引物的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:10)的图。
[图8]图8是显示编码2A4的重链可变区的cDNA的核苷酸序列(序列表的SEQ IDNO:4)的图。
[图9]图9是显示2A4的重链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO:5)的图。
[图10]图10是显示编码2B1的重链可变区的cDNA的核苷酸序列(序列表的SEQ IDNO:6)的图。
[图11]图11是显示2B1的重链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO:7)的图。
[图12]图12是显示编码7B4的重链可变区的cDNA的核苷酸序列(序列表的SEQ IDNO:8)的图。
[图13]图13是显示7B4的重链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO:9)的图。
[图14]图14是显示编码2A4的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列(序列表的SEQ IDNO:11)的图。
[图15]图15是显示2A4的轻链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO:12)的图。
[图16]图16是显示编码2B1的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列(序列表的SEQ IDNO:13)的图。
[图17]图17是显示2B1的轻链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO:14)的图。
[图18]图18是显示编码7B4的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列(序列表的SEQ IDNO:15)的图。
[图19]图19是显示7B4的轻链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO:16)的图。
[图20]图20是显示包含编码人κ链分泌信号序列和人κ链恒定区的氨基酸的DNA序列的DNA片段的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:17)的图。
[图21]图21是显示轻链表达载体的引物F的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:18)的图。
[图22]图22是显示轻链表达载体的引物R的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:19)的图。
[图23]图23是显示包含编码人重链信号序列和人IgG1恒定区的氨基酸的DNA序列的DNA片段的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:20)的图。
[图24]图24是显示人嵌合2A4 (c2A4)的轻链的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:21)的图。
[图25]图25是显示人嵌合2A4 (c2A4)的轻链的氨基酸序列(信号序列(1至20)，可变区(21至127)，和恒定区(128至234))(序列表的SEQ ID NO:22)的图。
[图26]图26是显示人嵌合2A4 (c2A4)的轻链的引物组F的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:23)的图。
[图27]图27是显示人嵌合2A4 (c2A4)的轻链的引物组R的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:24)的图。
[图28]图28是显示人嵌合2A4 (c2A4)的重链的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:25)的图。
[图29]图29是显示人嵌合2A4 (c2A4)的重链的氨基酸序列(信号序列(1至19)，可变区(20至141)，和恒定区(142至471))(序列表的SEQ ID NO:26)的图。
[图30]图30是显示人嵌合2A4 (c2A4)的重链的引物组F的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:27)的图。
[图31]图31是显示人嵌合2A4 (c2A4)的重链的引物组R的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:28)的图。
[图32]图32是显示人嵌合2B1 (c2B1)的轻链的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:29)的图。
[图33]图33是显示人嵌合2B1 (c2B1)的轻链的氨基酸序列(信号序列(1至20)，可变区(21至127)，和恒定区(128至234))(序列表的SEQ ID NO:30))的图。
[图34]图34是显示人嵌合2B1 (c2B1)的轻链的引物组F的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:31)的图。
[图35]图35是显示人嵌合2B1 (c2B1)的轻链的引物组R的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:32)的图。
[图36]图36是显示人嵌合2B1 (c2B1)的重链的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:33)的图。
[图37]图37是显示人嵌合2B1 (c2B1)的重链的氨基酸序列(信号序列(1至19)，可变区(20至142)，和恒定区(143至472))(序列表的SEQ ID NO:34))的图。
[图38]图38是显示人嵌合2B1 (c2B1)的重链的引物组F的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:35)的图。
[图39]图39是显示人嵌合2B1 (c2B1)的重链的引物组R的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:36)的图。
[图40]图40是显示人嵌合7B4 (c7B4)的轻链的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:37)的图。
[图41]图41是显示人嵌合7B4 (c7B4)的轻链的氨基酸序列(信号序列(1至20)，可变区(21至126)，和恒定区(127至233))(序列表的SEQ ID NO:38))的图。
[图42]图42是显示人嵌合7B4 (c7B4)的轻链的引物组F的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:39)的图。
[图43]图43是显示人嵌合7B4 (c7B4)的轻链的引物组R的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:40)的图。
[图44]图44是显示人嵌合7B4 (c7B4)的重链的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:41)的图。
[图45]图45是显示人嵌合7B4 (c7B4)的重链的氨基酸序列(信号序列(1至19)，可变区(20至142)，和恒定区(143至472))(序列表的SEQ ID NO:42))的图。
[图46]图46是显示人嵌合7B4 (c7B4)的重链的引物组F的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:43)的图。
[图47]图47是显示人嵌合7B4 (c7B4)的重链的引物组R的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:44)的图。
[图48]图48是显示使用流式细胞仪(FACS)测试人嵌合抗体(c2A4、c2B1和c7B4)针对人GPRC5D的结合性质的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度的相对值。
[图49]图49是显示使用流式细胞仪(FACS)测试人嵌合抗体(c2A4、c2B1和c7B4)针对食蟹猴GPRC5D的结合性质的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度的相对值。
[图50]图50是显示人嵌合抗体(c2A4、c2B1和c7B4)具有针对人GPRC5D的ADCC活性的图。
[图51]图51是显示人嵌合2A4 (c2A4)在表达GPRC5D的人多发性骨髓瘤细胞系KHM-1B-移植的BALB/c-nu/nu小鼠中的体内肿瘤生长抑制活性的图。
[图52]图52是显示人嵌合2B1 (c2B1)在表达GPRC5D的人多发性骨髓瘤细胞系KHM-1B-移植的BALB/c-nu/nu小鼠中的体内肿瘤生长抑制活性的图。
[图53]图53是显示人嵌合7B4 (c7B4)在表达GPRC5D的人多发性骨髓瘤细胞系KHM-1B-移植的BALB/c-nu/nu小鼠中的体内肿瘤生长抑制活性的图。
[图54]图54是显示大鼠抗GPRC5D抗体2A4的重链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQID NO:45)的图。
[图55]图55是显示大鼠抗GPRC5D抗体2A4的重链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQID NO:46)的图。
[图56]图56是显示大鼠抗GPRC5D抗体2A4的重链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQID NO:47)的图。
[图57]图57是显示大鼠抗GPRC5D抗体2B1的重链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQID NO:48)的图。
[图58]图58是显示大鼠抗GPRC5D抗体2B1的重链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQID NO:49)的图。
[图59]图59是显示大鼠抗GPRC5D抗体2B1的重链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQID NO:50)的图。
[图60]图60是显示大鼠抗GPRC5D抗体7B4的重链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQID NO:51)的图。
[图61]图61是显示大鼠抗GPRC5D抗体7B4的重链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQID NO:52)的图。
[图62]图62是显示大鼠抗GPRC5D抗体7B4的重链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQID NO:53)的图。
[图63]图63是显示大鼠抗GPRC5D抗体2A4的轻链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQID NO:54)的图。
[图64]图64是显示大鼠抗GPRC5D抗体2A4的轻链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQID NO:55)的图。
[图65]图65是显示大鼠抗GPRC5D抗体2A4的轻链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQID NO:56)的图。
[图66]图66是显示大鼠抗GPRC5D抗体2B1的轻链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQID NO:57)的图。
[图67]图67是显示大鼠抗GPRC5D抗体2B1的轻链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQID NO:58)的图。
[图68]图68是显示大鼠抗GPRC5D抗体2B1的轻链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQID NO:59)的图。
[图69]图69是显示大鼠抗GPRC5D抗体7B4的轻链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQID NO:60)的图。
[图70]图70是显示大鼠抗GPRC5D抗体7B4的轻链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQID NO:61)的图。
[图71]图71是显示大鼠抗GPRC5D抗体7B4的轻链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQID NO:62)的图。
[图72]图72是显示人源化2B1轻链(h2B1_L1)的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:63)的图。
[图73]图73是显示人源化2B1轻链(h2B1_L1)的氨基酸序列(信号序列(1至20)，可变区(21至127)，和恒定区(128至234))(序列表的SEQ ID NO:64))的图。
[图74]图74是显示人源化2B1轻链(h2B1_L2)的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:65)的图。
[图75]图75是显示人源化2B1轻链(h2B1_L2)的氨基酸序列(信号序列(1至20)，可变区(21至127)，和恒定区(128至234))(序列表的SEQ ID NO:66))的图。
[图76]图76是显示人源化2B1轻链(h2B1_L3)的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:67)的图。
[图77]图77是显示人源化2B1轻链(h2B1_L3)的氨基酸序列(信号序列(1至20)，可变区(21至127)，和恒定区(128至234))(序列表的SEQ ID NO:68))的图。
[图78]图78是显示人源化2B1轻链(h2B1_L4)的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:69)的图。
[图79]图79是显示人源化2B1轻链(h2B1_L4)的氨基酸序列(信号序列(1至20)，可变区(21至127)，和恒定区(128至234))(序列表的SEQ ID NO:70))的图。
[图80]图80是显示人源化2B1轻链(h2B1_L5)的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:71)的图。
[图81]图81是显示人源化2B1轻链(h2B1_L5)的氨基酸序列(信号序列(1至20)，可变区(21至127)，和恒定区(128至234))(序列表的SEQ ID NO:72))的图。
[图82]图82是显示人源化2B1重链(h2B1_H1)的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:73)的图。
[图83]图83是显示人源化2B1重链(h2B1_H1)的氨基酸序列(信号序列(1至19)，可变区(20至142)，和恒定区(143至472))(序列表的SEQ ID NO:74))的图。
[图84]图84是显示人源化2B1重链(h2B1_H2)的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:75)的图。
[图85]图85是显示人源化2B1重链(h2B1_H2)的氨基酸序列(信号序列(1至19)，可变区(20至142)，和恒定区(143至472))(序列表的SEQ ID NO:76))的图。
[图86]图86是显示人源化2B1重链(h2B1_H3)的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:77)的图。
[图87]图87是显示人源化2B1重链(h2B1_H3)的氨基酸序列(信号序列(1至19)，可变区(20至142)，和恒定区(143至472))(序列表的SEQ ID NO:78))的图。
[图88]图88是显示人源化2B1重链(h2B1_H4)的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:79)的图。
[图89]图89是显示人源化2B1重链(h2B1_H4)的氨基酸序列(信号序列(1至19)，可变区(20至142)，和恒定区(143至472))(序列表的SEQ ID NO:80))的图。
[图90]图90是显示人源化7B4轻链(h7B4_L1)的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:81)的图。
[图91]图91是显示人源化7B4轻链(h7B4_L1)的氨基酸序列(信号序列(1至20)，可变区(21至126)，和恒定区(127至233))(序列表的SEQ ID NO:82))的图。
[图92]图92是显示人源化7B4轻链(h7B4_L2)的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:83)的图。
[图93]图93是显示人源化7B4轻链(h7B4_L2)的氨基酸序列(信号序列(1至20)，可变区(21至126)，和恒定区(127至233))(序列表的SEQ ID NO:84))的图。
[图94]图94是显示人源化7B4重链(h7B4_H1)的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:85)的图。
[图95]图95是显示人源化7B4重链(h7B4_H1)的氨基酸序列(信号序列(1至19)，可变区(20至142)，和恒定区(143至472))(序列表的SEQ ID NO:86))的图。
[图96]图96是显示人源化7B4重链(h7B4_H2)的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:87)的图。
[图97]图97是显示人源化7B4重链(h7B4_H2)的氨基酸序列(信号序列(1至19)，可变区(20至142)，和恒定区(143至472))(序列表的SEQ ID NO:88))的图。
[图98]图98是显示人源化7B4重链(h7B4_H3)的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:89)的图。
[图99]图99是显示人源化7B4重链(h7B4_H3)的氨基酸序列(信号序列(1至19)，可变区(20至142)，和恒定区(143至472))(序列表的SEQ ID NO:90))的图。
[图100]图100是显示人源化7B4重链(h7B4_H5)的核苷酸序列(序列表的SEQ IDNO:91)的图。
[图101]图101是显示人源化7B4重链(h7B4_H5)的氨基酸序列(信号序列(1至19)，可变区(20至142)，和恒定区(143至472))(序列表的SEQ ID NO:92))的图。
[图102]图102是显示使用流式细胞仪(FACS)测试人源化2B1针对人GPRC5D的结合性质的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度的相对值。
[图103]图103是显示使用流式细胞仪(FACS)测试人源化7B4针对人GPRC5D的结合性质的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度的相对值。
[图104]图104是显示人源化2B1和人源化7B4具有ADCC活性的图。
[图105]图105是显示食蟹猴GPRC5D的氨基末端肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:93)的图。
[图106]图106是显示scFv的序列分析中使用的引物A的核苷酸序列(SEQ ID NO:94)的图。
[图107]图107是显示scFv的序列分析中使用的引物B的核苷酸序列(SEQ ID NO:95)的图。
[图108]图108是显示人抗体C2037的重链可变区的核苷酸序列(序列表的SEQ IDNO:96)的图。
[图109]图109是显示人抗体C2037的重链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:97)的图。
[图110]图110是显示人抗体C2037的轻链可变区的核苷酸序列(序列表的SEQ IDNO:98)的图。
[图111]图111是显示人抗体C2037的轻链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:99)的图。
[图112]图112是显示人抗体C3048的重链可变区的核苷酸序列(序列表的SEQ IDNO:100)的图。
[图113]图113是显示人抗体C3048的重链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:101)的图。
[图114]图114是显示人抗体C3048的轻链可变区的核苷酸序列(序列表的SEQ IDNO:102)的图。
[图115]图115是显示人抗体C3048的轻链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:103)的图。
[图116]图116是显示人抗体C3015的重链可变区的核苷酸序列(序列表的SEQ IDNO:104)的图。
[图117]图117是显示人抗体C3015的重链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:105)的图。
[图118]图118是显示人抗体C3015的轻链可变区的核苷酸序列(序列表的SEQ IDNO:106)的图。
[图119]图119是显示人抗体C3015的轻链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:107)的图。
[图120]图120是显示人抗体C3022的重链可变区的核苷酸序列(序列表的SEQ IDNO:108)的图。
[图121]图121是显示人抗体C3022的重链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:109)的图。
[图122]图122是显示人抗体C3022的轻链可变区的核苷酸序列(序列表的SEQ IDNO:110)的图。
[图123]图123是显示人抗体C3022的轻链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:135)的图。
[图124]图124是显示人抗体C2037的重链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:111)的图。
[图125]图125是显示人抗体C2037的重链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:112)的图。
[图126]图126是显示人抗体C2037的重链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:113)的图。
[图127]图127是显示人抗体C2037的轻链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:114)的图。
[图128]图128是显示人抗体C2037的轻链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:115)的图。
[图129]图129是显示人抗体C2037的轻链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:116)的图。
[图130]图130是显示人抗体C3048的重链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:117)的图。
[图131]图131是显示人抗体C3048的重链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:118)的图。
[图132]图132是显示人抗体C3048的重链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:119)的图。
[图133]图133是显示人抗体C3048的轻链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:120)的图。
[图134]图134是显示人抗体C3048的轻链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:121)的图。
[图135]图135是显示人抗体C3048的轻链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:122)的图。
[图136]图136是显示人抗体C3015的重链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:123)的图。
[图137]图137是显示人抗体C3015的重链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:124)的图。
[图138]图138是显示人抗体C3015的重链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:125)的图。
[图139]图139是显示人抗体C3015的轻链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:126)的图。
[图140]图140是显示人抗体C3015的轻链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:127)的图。
[图141]图141是显示人抗体C3015的轻链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:128)的图。
[图142]图142是显示人抗体C3022的重链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:129)的图。
[图143]图143是显示人抗体C3022的重链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:130)的图。
[图144]图144是显示人抗体C3022的重链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:131)的图。
[图145]图145是显示人抗体C3022的轻链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:132)的图。
[图146]图146是显示人抗体C3022的轻链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:133)的图。
[图147]图147是显示人抗体C3022的轻链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQ IDNO:134)的图。
[图148]图148是显示人抗体C2037的IgG形式的重链的核苷酸序列(序列表的SEQID NO:136)的图。
[图149]图149是显示人抗体C2037的IgG形式的轻链的核苷酸序列(序列表的SEQID NO:137)的图。
[图150]图150是显示人抗体C3048的IgG形式的重链的核苷酸序列(序列表的SEQID NO:138)的图。
[图151]图151是显示人抗体C3048的IgG形式的轻链的核苷酸序列(序列表的SEQID NO:139)的图。
[图152]图152是显示人抗体C3015的IgG形式的重链的核苷酸序列(序列表的SEQID NO:140)的图。
[图153]图153是显示人抗体C3015的IgG形式的轻链的核苷酸序列(序列表的SEQID NO:141)的图。
[图154]图154是显示人抗体C3022的IgG形式的重链的核苷酸序列(序列表的SEQID NO:142)的图。
[图155]图155是显示人抗体C3022的IgG形式的轻链的核苷酸序列(序列表的SEQID NO:143)的图。
[图156]图156是显示人抗体C2037的IgG形式的重链的氨基酸序列(信号序列(1至19)，可变区(20至134)，和恒定区(135至464))(序列表的SEQ ID NO:144))的图。
[图157]图157是显示人抗体C2037的IgG形式的轻链的氨基酸序列(信号序列(1至20)，可变区(21至130)，和恒定区(131至236))(序列表的SEQ ID NO:145))的图。
[图158]图158是显示人抗体C3048的IgG形式的重链的氨基酸序列(信号序列(1至19)，可变区(20至142)，和恒定区(143至472))(序列表的SEQ ID NO:146))的图。
[图159]图159是显示人抗体C3048的IgG形式的轻链的氨基酸序列(信号序列(1至20)，可变区(21至130)，和恒定区(131至236))(序列表的SEQ ID NO:147))的图。
[图160]图160是显示人抗体C3015的IgG形式的重链的氨基酸序列(信号序列(1至19)，可变区(20至140)，和恒定区(141至470))(序列表的SEQ ID NO:148))的图。
[图161]图161是显示人抗体C3015的IgG形式的轻链的氨基酸序列(信号序列(1至20)，可变区(21至126)，和恒定区(127至232))(序列表的SEQ ID NO:149))的图。
[图162]图162是显示人抗体C3022的IgG形式的重链的氨基酸序列(信号序列(1至19)，可变区(20至134)，和恒定区(135至464))(序列表的SEQ ID NO:150))的图。
[图163]图163是显示人抗体C3022的IgG形式的轻链的氨基酸序列(信号序列(1至20)，可变区(21至130)，和恒定区(131至236))(序列表的SEQ ID NO:151))的图。
[图164]图164是显示通过ELISA测试人抗体scFv针对生物素化的人(A)或食蟹猴(B) GPRC5D的氨基末端的结合性质的结果的图。纵轴代表通过ELISA测定的发射强度。
[图165]图165是显示通过ELISA测试人抗体的IgG形式针对生物素化的人或食蟹猴GPRC5D的氨基末端的结合性质的结果的图。纵轴代表通过ELISA测定的发射强度。
[图166]图166是显示使用流式细胞仪(FACS)测试人抗体scFv针对表达人GPRC5D的癌细胞系的结合性质的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度的相对值。
[图167]图167是显示使用流式细胞仪(FACS)测试人抗体的IgG形式针对表达人GPRC5D的癌细胞系的结合活性的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度的相对值。
[图168]图168是显示编码大鼠抗CD3抗体C3-147的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO:152)的图。
[图169]图169是显示编码大鼠抗CD3抗体C3-147的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO:153)的图。
[图170]图170是显示编码C3E-7000 (58至867)的核苷酸序列(信号序列(1至57)，scFv (58至783)，和FLAG-His标签(793至867))(SEQ ID NO:154)的图。
[图171]图171是显示C3E-7034的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:155)的图。
[图172]图172是显示C3E-7034的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:156)的图。
[图173]图173是显示编码C3E-7034 (58至864)的核苷酸序列(信号序列(1至57)，scFv (61至786)，和FLAG-His标签(790至864))(SEQ ID NO:157)的图。
[图174]图174是显示C3E-7035的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:158)的图。
[图175]图175是显示编码C3E-7035(58至864)的核苷酸序列(信号序列(1至57)，scFv (61至786)，和FLAG-His标签(790至864))(SEQ ID NO:159)的图。
[图176]图176是显示C3E-7036的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:160)的图。
[图177]图177是显示编码C3E-7036 (58至858)的核苷酸序列(信号序列(1至57)，scFv (61至780)，和FLAG-His标签(784至858))(SEQ ID NO:161)的图。
[图178]图178是显示编码表达载体pC2037-C3E-7034的ORF的核苷酸序列(SEQ IDNO:162)的图。
[图179]图179是显示编码表达载体pC3048-C3E-7034的ORF的核苷酸序列(SEQ IDNO:163)的图。
[图180]图180是显示编码表达载体pC3022-C3E-7034的ORF的核苷酸序列(SEQ IDNO:164)的图。
[图181]图181是显示编码表达载体pC2037-C3E-7035的ORF的核苷酸序列(SEQ IDNO:165)的图。
[图182]图182是显示编码表达载体pC3048-C3E-7035的ORF的核苷酸序列(SEQ IDNO:166)的图。
[图183]图183是显示编码表达载体pC3022-C3E-7035的ORF的核苷酸序列(SEQ IDNO:167)的图。
[图184]图184是显示编码表达载体pC2037-C3E-7036的ORF的核苷酸序列(SEQ IDNO:168)的图。
[图185]图185是显示编码表达载体pC3048-C3E-7036的ORF的核苷酸序列(SEQ IDNO:169)的图。
[图186]图186是显示编码表达载体pC3022-C3E-7036的ORF的核苷酸序列(SEQ IDNO:170)的图。
[图187]图187是显示C2037-C3E-7034的氨基酸序列(信号序列(1至19)，C2037(21至260)，和C3E-7034 (266至507))(SEQ ID NO:171)的图。
[图188]图188是显示C3048-C3E-7034的氨基酸序列(信号序列(1至19)，C3048(21至268)，和C3E-7034 (274至515))(SEQ ID NO:172)的图。
[图189]图189是显示C3022-C3E-7034的氨基酸序列(信号序列(1至19)，C3022(21至260)，和C3E-7034 (266至507))(SEQ ID NO:173)的图。
[图190]图190是显示C2037-C3E-7035的氨基酸序列(信号序列(1至19)，C2037(21至260)，和C3E-7035 (266至507))(SEQ ID NO:174)的图。
[图191]图191是显示C3048-C3E-7035的氨基酸序列(信号序列(1至19)，C3048(21至268)，和C3E-7035 (274至515))(SEQ ID NO:175)的图。
[图192]图192是显示C3022-C3E-7035的氨基酸序列(信号序列(1至19)，C3022(21至260)，和C3E-7035 (266至507))(SEQ ID NO:176)的图。
[图193]图193是显示C2037-C3E-7036的氨基酸序列(信号序列(1至19)，C2037(21至260)，和C3E-7036 (266至505))(SEQ ID NO:177)的图。
[图194]图194是显示C3048-C3E-7036的氨基酸序列(信号序列(1至19)，C3048(21至268)，和C3E-7036 (274至513))(SEQ ID NO:178)的图。
[图195]图195是显示C3022-C3E-7036的氨基酸序列(信号序列(1至19)，C3022(21至260)，和C3E-7036 (266至505))(SEQ ID NO:179)的图。
[图196]图196是显示使用流式细胞仪(FACS)测试抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子针对表达內源人GPRC5D的细胞(人淋巴瘤细胞系A4/FuK细胞)的结合性质的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度的相对值。
[图197]图197是显示使用流式细胞仪(FACS)测试抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子针对表达食蟹猴GPRC5D的细胞的结合性质的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度的相对值。
[图198]图198是显示使用流式细胞仪(FACS)测试抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子针对人CD3 (PBMC)的结合性质的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度的相对值。
[图199]图199是显示使用流式细胞仪(FACS)测试抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子针对食蟹猴CD3 (PBMC)的结合性质的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度的相对值。
[图200]图200是显示抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子具有针对表达內源人GPRC5D的细胞(人淋巴瘤细胞系A4/FuK细胞)的细胞毒性活性的图。
[图201]图201是显示使用流式细胞仪(FACS)测试人源化2B1针对食蟹猴GPRC5D的结合性质的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度的相对值。
[图202]图202是显示使用流式细胞仪(FACS)测试人源化7B4针对食蟹猴GPRC5D的结合性质的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度的相对值。
[图203]图203是显示C3E-7034的氨基酸序列(1至269) (VH (2至119)、VL (135至243)、和FLAG-His标签(244至269)) (SEQ ID NO:180)的图。
[图204]图204是显示C3E-7035的氨基酸序列(1至269) (VH (2至119)、VL(135至243)、和FLAG-His标签(244至269)) (SEQ ID NO:181)的图。
[图205]图205是显示C3E-7036的氨基酸序列(1至267) (VH (2至119)、VL(135至241)、和FLAG-His标签(242至267)) (SEQ ID NO:182)的图。
[图206]图206是显示C3E-7000的重链CDR1的氨基酸序列(SEQ ID NO:183)的图。
[图207]图207是显示C3E-7000的重链CDR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:184)的图。
[图208]图208是显示C3E-7000的重链CDR3的氨基酸序列(SEQ ID NO:185)的图。
[图209]图209是显示C3E-7000的轻链CDR1的氨基酸序列(SEQ ID NO:186)的图。
[图210]图210是显示C3E-7000的轻链CDR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:187)的图。
[图211]图211是显示C3E-7000的轻链CDR3的氨基酸序列(SEQ ID NO:188)的图。
[图212]图212是显示人CD3ε的氨基酸序列(SEQ ID NO:189)的图。
[图213]图213是显示E1018的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:190)的图。
[图214]图214是显示E1018的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:191)的图。
[图215]图215是显示E1018的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:192)的图。
[图216]图216是显示E1018的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:193)的图。
[图217]图217是显示D1012的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:194)的图。
[图218]图218是显示D1012的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:195)的图。
[图219]图219是显示D1012的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:196)的图。
[图220]图220是显示D1012的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:197)的图。
[图221]图221是显示通过经由SPR测定抗GPRC5D抗体(C3022、E1018、C3048和D1012)针对人GPRC5D的结合性质测定的结合解离常数的图。
[图222]图222是显示h2B1_Fab_HC_1的核苷酸序列(SEQ ID NO:198)的图。
[图223]图223是显示h2B1_Fab_HC_1的氨基酸序列(信号序列(1至23)，可变区(24至146)，和恒定区(147至475))(SEQ ID NO:199)的图。
[图224]图224是显示h2B1_Fab_HC_2的核苷酸序列(SEQ ID NO:200)的图。
[图225]图225是显示h2B1_Fab_HC_2的氨基酸序列(信号序列(1至23)，可变区(24至146)，和恒定区(147至475))(SEQ ID NO:201)的图。
[图226]图226是显示h2B1_Fab_LC_1的核苷酸序列(SEQ ID NO:202)的图。
[图227]图227是显示h2B1_Fab_LC_1的氨基酸序列(信号序列(1至23)，可变区(24至130)，和恒定区(131至237))(SEQ ID NO:203)的图。
[图228]图228是显示h2B1_Fab_LC_2的核苷酸序列(SEQ ID NO:204)的图。
[图229]图229是显示h2B1_Fab_LC_2的氨基酸序列(信号序列(1至23)，可变区(24至130)，和恒定区(131至237))(SEQ ID NO:205)的图。
[图230]图230是显示C3E-7034_Fab_HC的核苷酸序列(SEQ ID NO:206)的图。
[图231]图231是显示C3E-7034_Fab_HC的氨基酸序列(信号序列(1至23)，可变区(25至142)，和恒定区(143至471))(SEQ ID NO:207)的图。
[图232]图232是显示C3E-7034_Fab_LC的核苷酸序列(SEQ ID NO:208)的图。
[图233]图233是显示C3E-7034_Fab_LC的氨基酸序列(信号序列(1至23)，可变区(24至132)，和恒定区(133至238))(SEQ ID NO:209)的图。
[图234]图234是显示C3E-7036_Fab_HC的核苷酸序列(SEQ ID NO:210)的图。
[图235]图235是显示C3E-7036_Fab_HC的氨基酸序列(信号序列(1至23)，可变区(25至142)，和恒定区(143至471))(SEQ ID NO:211)的图。
[图236]图236是显示C3E-7036_Fab_LC的核苷酸序列(SEQ ID NO:212)的图。
[图237]图237是显示C3E-7036_Fab_LC的氨基酸序列(信号序列(1至23)，可变区(24至130)，和恒定区(131至236))(SEQ ID NO:213)的图。
[图238]图238是显示h2B1_Fab_HC_3的核苷酸序列(SEQ ID NO:214)的图。
[图239]图239是显示h2B1_Fab_HC_3的氨基酸序列(信号序列(1至23)，可变区(24至146)，和恒定区(147至475))(SEQ ID NO:215)的图。
[图240]图240是显示h2B1_Fab_LC_3的核苷酸序列(SEQ ID NO:216)的图。
[图241]图241是显示h2B1_Fab_LC_3的氨基酸序列(信号序列(1至23)，可变区(24至130)，和恒定区(131至237))(SEQ ID NO:217)的图。
[图242]图242是显示C3E-7034_scFv_Fc的核苷酸序列(SEQ ID NO:218)的图。
[图243]图243是显示C3E-7034_scFv_Fc的氨基酸序列(信号序列(1至23)，和scFv(24至266))(SEQ ID NO:219)的图。
[图244]图234是显示C3E-7036_scFv_Fc的核苷酸序列(SEQ ID NO:220)的图。
[图245]图245是显示C3E-7036_scFv_Fc的氨基酸序列(信号序列(1至23)，和scFv(24至264))(SEQ ID NO:221)的图。
[图246]图246是显示人源化2B1_scFv_Fc (h2B1_scFv_Fc)的核苷酸序列(SEQ IDNO:222)的图。
[图247]图247是显示人源化_2B1_scFv_Fc (h2B1_scFv_Fc)的氨基酸序列(信号序列(1至23)，和scFv (24至271))(SEQ ID NO:223)的图。
[图248]图248是显示通过流式细胞术测试含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子针对表达内源性人GPRC5D的细胞的结合性质的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度。A、B和C分别是显示测试FSA型、杂合型和双重型的双特异性分子的结合性质的结果的图。
[图249]图249是显示通过流式细胞术测试含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子针对表达食蟹猴GPRC5D的细胞的结合活性的性质的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度。A、B和C分别是显示测试FSA型、杂合型和双重型的双特异性分子的结合性质的结果的图。
[图250]图250是显示通过流式细胞术测试含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子针对表达人CD3的细胞的结合性质的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度。A、B和C分别是显示测试FSA型、杂合型和双重型的双特异性分子的结合性质的结果的图。
[图251]图251是显示通过流式细胞术测试含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子针对表达食蟹猴CD3的细胞的结合性质的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度。A、B和C分别是显示测试FSA型、杂合型和双重型的双特异性分子的结合性质的结果的图。
[图252-1]图252是显示含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的细胞毒性活性的图。A和B分别是显示FSA型和杂合型的双特异性分子的杀细胞活性的图。
[图252-2]图252是显示含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的细胞毒性活性的图。C是显示双重型的双特异性分子的杀细胞活性的结果的图。
[图253]图253是显示含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子在人PBMC和癌细胞的共移植模型中的抗肿瘤活性的图。
[图254]图254是显示含有Fc的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子在人PBMC和癌细胞的共移植模型中的抗肿瘤活性的图。
[图255]图255是显示C3E-8015的核苷酸序列(SEQ ID NO:224)的图。
[图256]图256是显示C3E-8015的氨基酸序列(信号序列(1至23)，和scFv (24至264))(SEQ ID NO:225)的图。
[图257]图257是显示C3E-8017的核苷酸序列(SEQ ID NO:226)的图。
[图258]图258是显示C3E-8017的氨基酸序列(信号序列(1至23)，和scFv (24至266))(SEQ ID NO:227)的图。
[图259]图259是显示C3E-8018的核苷酸序列(SEQ ID NO:228)的图。
[图260]图260是显示C3E-8018的氨基酸序列(信号序列(1至23)，和scFv (24至266))(SEQ ID NO:229)的图。
[图261]图261是显示C3E-8025的核苷酸序列(SEQ ID NO:230)的图。
[图262]图262是显示C3E-8025的氨基酸序列(信号序列(1至23)，和scFv (24至264))(SEQ ID NO:231)的图。
[图263]图263是显示C3E-8027的核苷酸序列(SEQ ID NO:232)的图。
[图264]图264是显示C3E-8027的氨基酸序列(信号序列(1至23)，和scFv (24至266))(SEQ ID NO:233)的图。
[图265]图265是显示C3E-8028的核苷酸序列(SEQ ID NO:234)的图。
[图266]图266是显示C3E-8028的氨基酸序列(信号序列(1至23)，和scFv (24至266))(SEQ ID NO:235)的图。
[图267]图267是显示h2B1_Fab_HC_4的核苷酸序列(SEQ ID NO:236)的图。
[图268]图268是显示h2B1_Fab_HC_4的氨基酸序列(信号序列(1至23)，和可变区(24至146)，恒定区(147至476))(SEQ ID NO:237)的图。
[图269]图269包括显示通过流式细胞术测试C末端添加Lys的CDR修饰的杂合型和CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子针对表达内源性人GPRC5D的细胞的结合性质的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度。A、B和C分别是显示(C5D-0004和C5D-0014)、(C5D-0005和C5D-0015)和(C5D-0006和C5D-0016)的结合性质的图。
[图270]图270包括显示通过流式细胞术测试C末端添加Lys的CDR修饰的杂合型和CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子针对表达食蟹猴GPRC5D的细胞的结合性质的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度。A、B和C分别是显示(C5D-0004和C5D-0014)、(C5D-0005和C5D-0015)和(C5D-0006和C5D-0016)的结合性质的图。
[图271]图271包括显示通过流式细胞术测试C末端添加Lys的CDR修饰的杂合型和CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子针对表达人CD3的细胞的结合活性的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度。A、B和C分别是显示(C5D-0004和C5D-0014)、(C5D-0005和C5D-0015)和(C5D-0006和C5D-0016)的结合性质的图。
[图272]图272包括显示通过流式细胞术测试C末端添加Lys的CDR修饰的杂合型和CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子针对表达食蟹猴CD3的细胞的结合性质的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度。A、B和C分别是显示(C5D-0004和C5D-0014)、(C5D-0005和C5D-0015)和(C5D-0006和C5D-0016)的结合性质的图。
[图273-1]图273-1包括显示C末端添加Lys的CDR修饰的杂合型和CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的细胞毒性活性的图。A和B分别是显示C5D-0004和C5D-0014的杀细胞活性的图。
[图273-2]图273-2包括显示C末端添加Lys的CDR修饰的杂合型和CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的细胞毒性活性的图。C和D分别是显示C5D-0005和C5D-0015的杀细胞活性的图。
[图273-3]图273-3包括显示C末端添加Lys的CDR修饰的杂合型和CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的细胞毒性活性的图。E和F分别是显示C5D-0006和C5D-0016的杀细胞活性的图。
[图274]图274包括显示CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子在人PBMC和癌细胞共移植模型中的抗肿瘤活性的图。
[图275]图275包括显示C末端添加Lys的CDR修饰的杂合型和CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子在人PBMC-转移模型中的抗肿瘤活性的图。A和B分别是显示C5D-0004和C5D-0014的肿瘤消退活性的图。
[图276]图276显示CDR修饰的重链CDR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:238)。
[图277]图277显示CDR修饰的轻链CDR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:239)。
[图278]图278显示C3E-7034的CDR修饰的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:240)。
[图279]图279显示C3E-7034的CDR修饰的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:241)。
[图280]图280显示C3E-7035的CDR修饰的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:242)。
[图281]图281显示C3E-7036的CDR修饰的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:243)。
[图282]图282显示C3E-7078 (1至269)的氨基酸序列(VH (2至119)，VL (135至243)，和FLAG-His标签(244至269)) (SEQ ID NO:244)。
[图283]图283显示C3E-7085 (1至267)的氨基酸序列(VH (2至119)，V L(135至241)，和FLAG-His标签(242至267)) (SEQ ID NO:245)。
[图284]图284显示C3E-7086 (1至269)的氨基酸序列(VH (2至119)，VL (135至243)，和FLAG-His标签(244至269)) (SEQ ID NO:246)。
[图285]图285显示C3E-7087 (1至269)的氨基酸序列(VH (2至119)，VL (135至243)，和FLAG-His标签(244至269)) (SEQ ID NO:247)。
[图286]图286显示C3E-7088 (1至269)的氨基酸序列(VH (2至119)，VL (135至243)，和FLAG-His标签(244至269)) (SEQ ID NO:248)。
[图287]图287显示C3E-7089 (1至269)的氨基酸序列(VH (2至119)，VL (135至243)，和FLAG-His标签(244至269)) (SEQ ID NO:249)。
[图288]图288显示C3E-7090 (1至269)的氨基酸序列(VH (2至119)，VL (135至243)，和FLAG-His标签(244至269)) (SEQ ID NO:250)。
[图289]图289显示C3E-7091 (1至269)的氨基酸序列(VH (2至119)，VL (135至243)，和FLAG-His标签(244-269)) (SEQ ID NO:251)。
[图290]图290显示C3E-7092 (1至269)的氨基酸序列(VH (2至-119)，VL (135至243)，和FLAG-His标签(244至269)) (SEQ ID NO:252)。
[图291]图291显示C3E-7093 (1至269)的氨基酸序列(VH (2至119)，VL (135至243)，和FLAG-His标签(244至269)) (SEQ ID NO:253)。
[图292]图292显示C3E-7094 (1至269)的氨基酸序列(VH (2至119)，VL (135至243)，和FLAG-His标签(244至269)) (SEQ ID NO:254)。
[图293]图293显示C3E-7095 (1至269)的氨基酸序列(VH (2至119)，VL (135至243)，和FLAG-His标签(244至269)) (SEQ ID NO:255)。
[实施方案的描述]
1. 定义
在本发明中，术语“基因”意指包括编码蛋白的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸或其互补链。“基因”的含义包括，例如，多核苷酸，寡核苷酸，DNA，mRNA，cDNA和cRNA，作为多核苷酸包括编码蛋白的氨基酸的核苷酸序列，或其互补链。这种基因是单链、双链或三链或更多链的核苷酸。“基因”的含义包括DNA和RNA链的缔合物，核糖核苷酸(RNA)和脱氧核糖核苷酸(DNA)在一条核苷酸链上的混合物，以及包含这种核苷酸链的双链或三链或更多链的核苷酸。在本发明中，碱基序列具有与核苷酸序列相同的含义。
在本发明中，术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”具有相同的含义，并且“多核苷酸”的含义还包括例如DNA、RNA、探针、寡核苷酸和引物。这种多核苷酸是单链、双链或三链或更多链的多核苷酸。“核苷酸”的含义还包括DNA和RNA链的缔合物，核糖核苷酸(RNA)和脱氧核糖核苷酸(DNA)在一条多核苷酸链上的混合物，以及包含这种多核苷酸链的两条链或三条或更多条链的缔合物。
在本发明中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”具有相同的含义。
在本发明中，术语“抗原”用于意指“免疫原”。
在本发明中，术语“细胞”还包括，例如，衍生自个体动物、亚培养的细胞、原代培养的细胞、细胞系、重组细胞和微生物细胞的各种细胞。
在本发明中，术语“抗体”具有与免疫球蛋白相同的含义。然而，用于本发明的抗GPRC5D抗体或本发明的抗CD3抗体的“抗体”意指具有恒定区和可变区的免疫球蛋白。抗体没有特别限制并且可以是天然免疫球蛋白或可以是通过部分或完全合成产生的免疫球蛋白。本发明的抗GPRC5D抗体和/或抗CD3抗体作为后述的“分子”的一部分而被包含。
四级抗体的基本结构由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接。根据重链的同种型，两条重链通过一个或多个二硫键与彼此连接。轻链和重链各自具有规则间隔的链内二硫键。重链和轻链各自含有表现出非常高程度的氨基酸序列相似性的恒定区和表现出低程度的氨基酸序列相似性的可变区。轻链在氨基末端具有可变区(VL)，随后是恒定区(CL)。重链在氨基末端具有可变区(VH)，随后是三个恒定区(CH1、CH2和CH3)。VL和VH与彼此配对，并且CL与重链的第一恒定区(CH1)对齐。该对VL和VH形成单个抗原结合位点。
Fab由重链CH1和随后的VH以及轻链CL和随后的VL构成。VH和VL各自含有互补决定区(CDR)。
Fc由重链恒定区的羧基末端区域构成，并且是含有CH2和CH3的二聚体。本发明的Fc可以是具有天然序列的Fc (称作天然形式Fc)，或者可以是其中已经向天然序列应用突变(称作Fc突变)的Fc的突变形式。
“Fc突变”的实例可以包括但不限于在WO2013/063702中公开的异多聚体(包含异二聚体Fc区)中包含的具有增加的稳定性的修饰的Fc区；包含衍生自具有“突起”和“空腔”的IgG抗体且包含在WO96/27011中公开的异多聚体中的免疫球蛋白的CH3结构域的Fc；包含在WO2009/089004中公开的通过用带电荷氨基酸替代一个或多个氨基酸残基而实现的静电有利的异二聚体中的包含CH3结构域的Fc；在WO2014/110601中公开的使用构象变体和/或pI (等电点)变体的异二聚体中包含的异二聚体Fe区；或在WO2010/151792中公开的包含CH3结构域的异二聚体Fc，其包含修饰以消除或减少其与蛋白A的结合。
可变区由具有极端可变性的被称为高变区(HVR)的区域和被称为框架区(FR)的相对不变区域构成，所述框架区(FR)被高变区间断。天然重链和轻链可变区各自含有由三个高变区连接的四个FR。每条链的高变区通过FR与另一链的高变区保持紧密接近，并有助于在抗体中形成抗原结合位点。
已知抗体分子的重链和轻链各自具有三个互补决定区(CDR)。互补决定区也称为高变区。这些区域位于抗体重链和轻链的可变区中。这些位点具有特别高度可变的一级结构，并且通常在重链和轻链多肽链的相应一级结构上的三个位置处分开。在本发明中，对于重链的互补决定区，抗体的互补决定区从重链氨基酸序列的氨基末端起被称为重链CDR1(CDRH1)、重链CDR2 (CDRH2)和重链CDR3 (CDRH3)，并且对于轻链的互补决定区，抗体的互补决定区从轻链氨基酸序列的氨基末端起被称为轻链CDR1 (CDRL1)、轻链CDR2 (CDRL2)和轻链CDR3 (CDRL3)。这些位点在三维结构上与彼此接近，并且决定对待结合的抗原的特异性。
在本发明中，CDR的位置和长度根据IMGT (Developmental and ComparativeImmunology 27 (2003) 55-77)的定义进行确定。
框架区(FR)是除了CDR残基以外的可变区。每个可变区通常具有四个FR：FR1、FR2、FR3和FR4。重链和轻链FR分别被称为FRH1、FRH2、FRH3和FRH4，以及FRL1、FRL2、FRL3和FRL4。
重链和轻链中含有的CDR和FR作为FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4和FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4定位，该顺序为从氨基末端朝向羧基末端。
除了IMGT以外，CDR和FR的位置也可以根据本领域中众所周知的各种定义，例如，Kabat、Chothia、AbM等的定义，来确定。
在本发明中，术语“抗体的抗原结合片段”意指由重链和轻链可变区构成的，具有抗原结合活性的抗体的部分片段。“抗体的抗原结合片段”的实例可以包括但不限于抗原结合片段，诸如Fab、F(ab')2、scFv、Fab'、Fv和单结构域抗体(sdAb)。这种抗体的抗原结合片段可以通过用酶诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体蛋白的全长分子来获得，或者可以是使用重组基因在适当的宿主细胞中产生的重组蛋白。
在本发明中，抗体结合的“位点”，即由抗体识别的“位点”，意指抗体结合或识别的抗原上的部分肽或部分更高级的结构。
在本发明中，这种位点也称为表位或抗体结合位点。
在本发明中，术语“抗体突变体”意指具有通过一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或添加(所述添加包括插入)(下文被统称为“突变”)衍生自原始抗体的氨基酸序列的氨基酸序列且结合抗原的多肽。这种抗体突变体中突变氨基酸的数量是1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40或50。本发明的“抗体”也涵盖这种抗体突变体。
在本发明中，“1至几个”中的术语“几个”是指2至10个。
在本说明书中，术语“分子”是包含上述抗体或所述抗体的抗原结合片段的分子，并且可以是由抗体或由其衍生的多个抗原结合片段形成的多特异性的分子。
在本说明书中，术语“多特异性的分子”与“多特异性分子”具有相同的含义。这种多特异性分子没有特别限制，只要该分子能够结合一个分子上与彼此不同的多个表位和/或两个或更多个分子上与彼此不同的表位即可。多特异性的分子还包含包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体。这种多特异性分子的实例包括但不限于具有两种或更多种不同类型的重链和轻链的全长抗体分子，即IgG型多特异性分子，和由两种或更多种类型的具有VL和VH的抗原结合片段组成的分子，即通过组合Fab、Fab'、Fv、scFv、sdAb等衍生的分子(即，串联scFv、双抗体、单链双抗体和三抗体)。此外，多特异性分子中还包括通过将具有抗原的蛋白遗传或化学连接至抗原结合片段而形成的分子，其结合抗原结合片段而不具有免疫球蛋白骨架。
由本发明的抗CD3抗体或所述抗体的抗原结合片段或本发明的多特异性分子发挥的活性或特性的实例可以包括生物活性和物理化学特性，并且可以具体包括各种生物活性、针对抗原或表位的结合活性、生产或储存期间的稳定性以及热稳定性。
在本发明中，短语“在严格条件下杂交”意指在这样的条件下杂交，所述条件涉及在65℃下在含有5 × SSC的溶液中杂交，随后在65℃下在含有2 × SSC-0.1% SDS的水溶液中洗涤20分钟，在65℃下在含有0.5 × SSC-0.1% SDS的水溶液中洗涤20分钟，和在65℃下在含有0.2 × SSC-0.1% SDS的水溶液中洗涤20分钟，或在与之等效的条件下杂交。SSC意指150 mM NaCl-15 mM柠檬酸钠的水溶液，且n × SSC意指具有n倍浓度的SSC。
在本发明中，术语“细胞毒性”是指以某种方式给细胞带来的一些病理变化，并且不仅意指直接创伤，而且意指对细胞的每个结构或功能损伤，包括DNA切割，碱基二聚体的形成，染色体断裂，对有丝分裂装置的损害，以及各种酶活性的降低。
在本发明中，术语“细胞毒性活性”意指引起上述细胞损伤的活性。
在本发明中，术语“抗体依赖性细胞的细胞毒性活性”，也称为“ADCC活性”，意指NK细胞经由抗体破坏靶细胞诸如肿瘤细胞的作用或活性。
在本发明中，术语“通过重新引导T细胞的细胞毒性活性”意味着细胞损伤经由包含抗靶抗原抗体诸如抗肿瘤抗原和抗CD3抗体的多特异性分子引起。理想地，该术语意味着抗肿瘤抗原抗体结合靶肿瘤细胞，而抗CD3抗体结合T细胞，使得靶肿瘤细胞和T细胞与彼此接近以诱导T细胞活化介导的细胞损伤。该分子可以包含在药物组合物中。
在本发明中，术语“天然存在的氨基酸”和“天然存在的氨基酸残基”意指Ala (A)、Arg (R)、Asn (N)、Asp (D)、Cys (C)、Gln (Q)、Glu (E)、Gly (G)、His (H)、Ile (I)、Leu(L)、Lys (K)、Met (M)、Phe (F)、Pro (P)、Ser (S)、Thr (T)、Trp (W)、Tyr (Y)和Val (V)及其残基，并且也称为“天然氨基酸”或“天然氨基酸残基”。
2. 抗原性蛋白
2-1. GPRC5D抗原
在本发明中，术语“GPRC5D”具有与GPRC5D蛋白相同的含义。
GPRC5D被分类至G蛋白偶联受体家族C的组5，并且是使用一系列人GPCR的氨基酸序列通过EST数据库的同源性搜索新发现的人GPCR蛋白之一(非专利文献1)。该蛋白已在GenBank登录号：AF209923、NM_018654和NP_0611124下登记。然而，尚未揭示GPRC5D的生理功能或生理配体，与其偶联的G蛋白(α亚基)的亚型等。
2-2. CD3抗原
在本发明中，术语“CD3”具有与CD3蛋白相同的含义。
CD3在T细胞上表达为多分子T细胞受体复合物的一部分，并且是5种类型的多肽(γ、δ、ε、ζ和η链；分子量分别为：25000至28000、21000、20000、16000和22000)的复合物。
CD3复合物的实例包括γ、δ、ε、ζ和η链。这些也称为亚基。抗CD3抗体结合T细胞以诱导T细胞活化介导的细胞损伤。许多抗CD3抗体结合CD3ε。
编码人CD3ε的cDNA的核苷酸序列在登录号NM_000733.3下登记在GenBank中。编码食蟹猴CD3的cDNA的核苷酸序列在登录号NM_001283615.1下登记在GenBank中。人CD3ε的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:189中。
2-3. 抗原性蛋白的制备
本发明中使用的每种前述抗原性蛋白(GPRC5D或CD3(下文中，GPRC5D和CD3也统称为抗原性蛋白))可以通过从动物组织(包括体液)、衍生自组织的细胞或细胞的培养物中纯化和分离、基因重组、体外翻译、化学合成等来制备。
抗原性蛋白的cDNA可以通过例如进行聚合酶链式反应的所谓PCR方法(以下称为“PCR”)(Saiki, R.K., 等人, Science (1988) 239, 487-489)来获得，所述PCR方法使用表达抗原性蛋白的mRNA的器官的cDNA文库作为模板且使用能够特异性扩增抗原性蛋白的cDNA的引物。
在抗原性蛋白的cDNA中还包括由编码在人或大鼠中表达的抗原性蛋白的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成，与编码具有等同于抗原性蛋白的生物活性的蛋白的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。
此外，在抗原性蛋白的cDNA中还包括从在人或大鼠中表达的抗原性蛋白的基因座转录的剪接变体或在严格条件下杂交且编码具有与抗原性蛋白等同的生物活性的蛋白的多核苷酸。
在抗原性蛋白基因的核苷酸序列中还包括编码由通过取代、缺失或添加1至几个氨基酸衍生自人或大鼠抗原性蛋白的氨基酸序列或其除了信号序列以外的氨基酸序列的氨基酸序列组成且具有与抗原性蛋白等同的生物活性的蛋白的核苷酸序列。
在抗原性蛋白中还包括由从人或大鼠抗原性蛋白的基因座转录的剪接变体编码的氨基酸序列或通过取代、缺失或添加1至几个氨基酸衍生自所述氨基酸序列的氨基酸序列组成且具有与抗原性蛋白等同的生物活性的蛋白。
2-4对抗原性蛋白的结合特异性
本发明的抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段等识别人GPRC5D。换言之，本发明的抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段等结合GPRC5D抗原，且优选结合人GPRC5D和猴GPRC5D，更优选人GPRC5D和食蟹猴GPRC5D。除了人GPRC5D以外，后面描述的本发明的人源化抗GPRC5D抗体h2B1抗体和人抗体C3048进一步结合食蟹猴GPRC5D。
本发明的多特异性分子中包含的抗CD3抗体或其抗原结合片段等识别CD3抗原，即与其结合。本发明的多特异性分子中包含的抗CD3抗体或其抗原结合片段等优选结合人CD3、猴CD3等，且更优选结合人CD3和食蟹猴CD3。
结合人和食蟹猴抗原性蛋白的抗体或其抗原结合片段可以使用对于药物产品的非临床开发(临床前开发)有用的灵长类动物、特别是食蟹猴进行对效力或安全性的各种测试，并且因此是优选的。
同时，优选地，本发明的抗GPRC5D抗体不结合小鼠和/或大鼠GPRC5D。因此，例如，可以实施使用人GPRC5D基因转染的小鼠细胞、组织或个体(包括转基因动物、敲除动物和敲入动物)和本发明的抗体或多特异性分子等的各种测定或免疫组织化学测试，而不受宿主小鼠和/或大鼠的GPRC5D的影响。因此，本发明的抗体或多特异性分子等优选用于使用小鼠研究和非临床开发药物、动物药物或诊断药物等，包括本发明的抗体或多特异性分子等。
同样，优选地，本发明的多特异性分子中包含的抗CD3抗体不结合小鼠和/或大鼠CD3。因此，例如，可以实施使用人CD3基因转染的小鼠细胞、组织或个体(包括转基因动物、敲除动物和敲入动物)和本发明的抗体或多特异性分子等的各种测定或免疫组织化学测试，而不受宿主小鼠和/或大鼠的CD3的影响。因此，本发明的抗体或多特异性分子等优选用于使用小鼠研究和非临床开发药物、动物药物或诊断药物等，包括本发明的抗体或多特异性分子等。
在本发明中，术语“识别”，即“结合”，意指不是非特异性吸附的结合。用于确定是否实现识别(即，是否实现结合)的标准的实例可以包括解离常数(下文中，称为“KD”)。优选地，本发明的抗体等对于CD3具有1 × 10-5 M或更低、5 × 10-6 M或更低、2 × 10-6 M或更低、或1 × 10-6 M或更低的的KD值。
在本发明中，可以使用生物分子相互作用分析系统(例如，SPR或BLI)、ELISA或RIA等来测定或确定抗体与抗原的结合。可以通过流式细胞术等测定抗体与细胞表面上表达的抗原的结合。
SPR(表面等离子体共振分析)方法用作通过经由动力学分析测量缔合速率常数(Ka值)和解离速率常数(Kd值)确定解离常数(KD值)等作为亲和力指数的分析方法。SPR分析中使用的设备的实例可以包括BIAcore(TM)(由GE Healthcare Bio-Sciences Corp.制造)，ProteOn(TM) (由Bio-Rad Laboratories, Inc.制造)，SPR-Navi(TM) (由BioNavisOy Ltd.制造), Spreeta(TM) (由Texas Instruments Inc.制造)，SPRi-Plex II(TM) (由Horiba, Ltd.制造)和Autolab SPR(TM) (由Metrohm Japan Ltd.制造)。
BLI(生物层干涉测量法)是一种涉及使用生物层干扰测量生物分子相互作用的方法。BLI相互作用分析中使用的设备的实例包括Octet系统(由Pall ForteBio Corp.制造)。
ELISA是一种方法，其涉及使用特异性抗体或抗原捕获样品溶液中包含的目标抗原或抗体，同时通过使用酶促反应检测和定量目标抗原或抗体。将酶标记的抗原或抗体并入反应系统中，并检测酶活性。对于酶活性检测，使用通过反应改变吸收光谱的底物，并通过吸光度测量将吸收光谱数字化。
Cell-ELISA是一种方法，其涉及在细胞基础上捕获细胞表面上的分析物，同时通过使用酶促反应来检测和定量分析物。
RIA(放射免疫测定)可以通过用放射性物质标记抗体并测量来自抗体的放射性来定量抗体。
流式细胞术是通过将细胞分散至流体中并使细流体流流动来光学分析单个细胞的方法。荧光染料标记的抗体通过抗原-抗体反应结合细胞表面抗原，并测量来自与细胞结合的标记抗体的荧光强度，以定量抗体的抗原结合活性。
3. 抗GPRC5D抗体
3-1. 抗GPRC5D抗体的类型
本发明的抗GPRC5D抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。多克隆抗体的实例可以包括CDR组的一部分或全部不同的多种抗体的混合物。单克隆抗体的实例可以包括非人动物来源的抗体(非人动物抗体)、人抗体、嵌合抗体和人源化抗体等。
非人动物抗体的实例可以包括源自脊椎动物诸如哺乳动物和禽类的抗体。哺乳动物来源的抗体的实例可以包括啮齿动物来源的抗体，诸如小鼠抗体和大鼠抗体。禽类来源的抗体的实例可以包括鸡抗体。抗人GPRC5D大鼠单克隆抗体的实例可以包括本发明的2A4、2B1和7B4(实施例1)。
2A4的重链可变区的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:5中。2B1的重链可变区的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:7中。7B4的重链可变区的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:9中。
2A4的轻链可变区的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:12中。2B1的轻链可变区的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:14中。7B4的轻链可变区的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:16中。
2A4、2B1和7B4具有ADCC活性(实施例2)。
嵌合抗体的实例可以包括抗体，其包含与人抗体(人免疫球蛋白)恒定区结合的非人动物抗体来源的可变区。
衍生自大鼠抗人GPRC5D抗体2A4的嵌合抗体的实例可以包括由轻链和重链组成的抗体，所述轻链包含由SEQ ID NO:22的氨基酸残基21至127组成的轻链可变区，且所述重链包含由SEQ ID NO:26的氨基酸残基20至141组成的重链可变区。这种2A4衍生的嵌合抗体的一个实例可以包括由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:22的氨基酸残基21至234组成，且所述重链由SEQ ID NO:26的氨基酸残基20至471组成。在本说明书中，所述抗体被称为c2A4。
衍生自大鼠抗人GPRC5D抗体2B1的嵌合抗体的实例可以包括由轻链和重链组成的抗体，所述轻链包含由SEQ ID NO:30的氨基酸残基21至127组成的轻链可变区，且所述重链包含由SEQ ID NO:34的氨基酸残基20至142组成的重链可变区。这种2B1衍生的嵌合抗体的一个实例可以包括由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:30的氨基酸残基21至234组成，且所述重链由SEQ ID NO:34的氨基酸残基20至472组成。在本说明书中，所述抗体被称为c2B1。
衍生自大鼠抗人GPRC5D抗体7B4的嵌合抗体的实例可以包括由轻链和重链组成的抗体，所述轻链包含由SEQ ID NO:38的氨基酸残基21至127组成的轻链可变区，且所述重链包含由SEQ ID NO:42的氨基酸残基20至142组成的重链可变区。这种7B4衍生的嵌合抗体的一个实例可以包括由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:38的氨基酸残基21至233组成，且所述重链由SEQ ID NO:42的氨基酸残基20至472组成。在本说明书中，所述抗体被称为c7B4。
人源化抗体的实例可以包括仅含有互补决定区(CDR)的人来源的抗体(Nature(1986) 321, 522-525)，通过CDR移植用CDR序列和框架区的一些氨基酸残基移植的人抗体(国际公开号WO1990/007861))，和人抗体氨基酸替换任何这些人源化抗体中的一个或两个或更多个非人动物抗体衍生的氨基酸的抗体。
衍生自上述每种嵌合抗体的人源化抗体维持衍生自上述嵌合抗体和(引申开来)大鼠抗体的所有6个CDR序列，并且具有ADCC活性。因此，维持下文所示的所有6个CDR序列的抗体的实例包括大鼠抗体、嵌合抗体和人源化抗体。
衍生自上述2A4的人源化抗体的重链可变区维持
由SEQ ID NO:45 (GYTFTSYY)代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:46 (VYPGYGGT)代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:47 (ARRKGIIRGPGYFDY)代表的氨基酸序列组成的重链CDR3。
其轻链可变区维持
由SEQ ID NO:54 (EGISNS)代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:55 (GAS)代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:56 (QQGYKYPPT)代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
衍生自上述2B1的人源化抗体的重链可变区维持
由SEQ ID NO:48 (GFSLNTYDMG)代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:49 (IWWDDDK)代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:50 (ARIETVRVSRKGFAH)代表的氨基酸序列组成的重链CDR3。
其轻链可变区维持
由SEQ ID NO:57 (QSVGIN)代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:58 (GAS)代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:59 (LQHGSIPPT)代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
衍生自上述7B4的人源化抗体的重链可变区维持
由SEQ ID NO:51 (GYTITSGYD)代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:52 (MSYRGST)代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:53 (ALTRTYWYNYYYVLDA)代表的氨基酸序列组成的重链CDR3。
其轻链可变区维持
由SEQ ID NO:60 (QNINKY)代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:61 (NTN)代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:62 (LQRNSWYT)代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
上述CDR的氨基酸序列也描述于图54至71中。
在本发明中，CDR的位置和长度根据IMGT (Developmental and ComparativeImmunology 27 (2003) 55-77)的定义进行确定。
人源化抗体的优选实例可以包括包含以下的抗体：
轻链可变区，其包含由以下代表的任一氨基酸序列：
SEQ ID NO:64代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127，
SEQ ID NO:66代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127，
SEQ ID NO:68代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127，
SEQ ID NO:70代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127，和
SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127，和
重链可变区，其包含由以下代表的任一氨基酸序列：
SEQ ID NO:74代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至142，
SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至142，
SEQ ID NO:78代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至142，和
SEQ ID NO:80代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至142。
人源化抗体的替代优选实例可以包括包含以下的抗体：
轻链可变区，其包含由以下代表的氨基酸序列：
SEQ ID NO:82代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126，或
SEQ ID NO:84代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126，和
重链可变区，其包含由以下代表的任一氨基酸序列：
SEQ ID NO:86代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142，
SEQ ID NO:88代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142，
SEQ ID NO:90代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142，和
SEQ ID NO:92代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142。
人源化抗体的具体优选实例可以包括包含以下的重链可变区和轻链可变区的任一组合的抗体：
・包含SEQ ID NO:74代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:64代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:74代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:66代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:66代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:68代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:70代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:78代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:68代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:78代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:70代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:78代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:80代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:64代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:80代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:68代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:80代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:70代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，或
・包含SEQ ID NO:80代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区。
人源化抗体的替代具体优选实例可以包括包含以下的重链可变区和轻链可变区的任一组合的抗体：
・包含SEQ ID NO:86代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:84代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:88代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:84代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:90代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:82代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:90代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:84代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126代表的氨基酸序列的轻链可变区，或
・包含SEQ ID NO:92代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:82代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126代表的氨基酸序列的轻链可变区。
人源化抗体的更优选特定实例可以包括包含以下的重链和轻链的任一组合的抗体：
・包含SEQ ID NO:74代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至472的重链，和包含SEQ IDNO:64代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至234的轻链，
・包含SEQ ID NO:74代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至472的重链，和包含SEQ IDNO:66代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至234的轻链，
・包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至472的重链，和包含SEQ IDNO:66代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至234的轻链，
・包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至472的重链，和包含SEQ IDNO:68代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至234的轻链，
・包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至472的重链，和包含SEQ IDNO:70代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至234的轻链，
・包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至472的重链，和包含SEQ IDNO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至234的轻链，
・包含SEQ ID NO:78代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至472的重链，和包含SEQ IDNO:68代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至234的轻链，
・包含SEQ ID NO:78代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至472的重链，和包含SEQ IDNO:70代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至234的轻链，
・包含SEQ ID NO:78代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至472的重链，和包含SEQ IDNO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至234的轻链，
・包含SEQ ID NO:80代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至472的重链，和包含SEQ IDNO:64代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至234的轻链，
・包含SEQ ID NO:80代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至472的重链，和包含SEQ IDNO:68代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至234的轻链，
・包含SEQ ID NO:80代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至472的重链，和包含SEQ IDNO:70代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至234的轻链，和
・包含SEQ ID NO:80代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至472的重链，和包含SEQ IDNO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至234的轻链。
人源化抗体的替代更优选特定实例可以包括包含以下的重链和轻链的任一组合的抗体：
・包含SEQ ID NO:86代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至472的重链，和包含SEQ IDNO:84代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至233的轻链，
・包含SEQ ID NO:88代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至472的重链，和包含SEQ IDNO:84代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至233的轻链，
・包含SEQ ID NO:90代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至472的重链，和包含SEQ IDNO:82代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至233的轻链，
・包含SEQ ID NO:90代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至472的重链，和包含SEQ IDNO:84代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至233的轻链，或
・包含SEQ ID NO:92代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至472的重链，和包含SEQ IDNO:82代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至233的轻链。
上述大鼠抗体、嵌合抗体和人源化抗体可以各自含有Fc。
而且，上述大鼠抗体、嵌合抗体和人源化抗体可以各自含有人免疫球蛋白重链恒定区。
人源化抗体的进一步更优选的实例可以包括这样的抗体，其包含前述重链可变区和轻链可变区、优选衍生自2B1的人源化抗体的重链可变区和轻链可变区，和
i)包含SEQ ID NO:199代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:203代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
ii)包含SEQ ID NO:201代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:205代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
iii)包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
或
iv)包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区。
人源化抗体的特别优选的实例包括这样的抗体，其含有包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，和
i)包含SEQ ID NO:199代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:203代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
ii)包含SEQ ID NO:201代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:205代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
iii)包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
或
iv)包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至476代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区。
这些中，更优选的抗体可以包括这样的抗体，其含有包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，和
iii)包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
或
iv)包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至476代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区。
此类抗体的具体实例可以包括这样的抗体，其包含
包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，
或
包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至476代表的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链。
人源化抗体的替代的进一步更优选的实例可以包括这样的抗体，其包含前述重链可变区和轻链可变区、优选衍生自2B1的人源化抗体的重链可变区和轻链可变区，并且其也结合人GPRC5D，其包含天然或Fc突变。
此类抗体的特别优选的实例可以包括这样的抗体，其含有包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，并且包含天然或Fc突变。这些的更具体实例可以包括这样的抗体，其包含SEQ ID NO:223代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至271代表的氨基酸序列，和天然或Fc突变。
人抗体没有特别限制，只要抗体结合人GPRC5D即可。其实例还可以包括与本发明的人源化抗体结合相同位点的人抗体。其实例包括与h2B1H2L5结合相同位点的人抗体。
本发明的人抗体的实例包括包含以下(①至④)中任一者中所述的重链可变区和轻链可变区的抗体：
①
重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:111代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:112代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:113代表的氨基酸序列组成的重链CDR3，
和
轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:114代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:115代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:116代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3，
②
重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:117代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:118代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:119代表的氨基酸序列组成的重链CDR3，
和
轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:120代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:121代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:122代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3，
③
重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:123代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:124代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:125代表的氨基酸序列组成的重链CDR3，
和
轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:126代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:127代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:128代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3，和
④
重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:129代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:130代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:131代表的氨基酸序列组成的重链CDR3，和
轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:132代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:133代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:134代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
上述CDR的氨基酸序列也描述于图124至147中。
人抗体的优选实例可以包括包含以下的抗体：
重链可变区，其包含以下中的任一者：
SEQ ID NO:97代表的氨基酸序列，
SEQ ID NO:101代表的氨基酸序列，
SEQ ID NO:105代表的氨基酸序列，和
SEQ ID NO:109代表的氨基酸序列，
和
轻链可变区，其包含以下中的任一者：
SEQ ID NO:99代表的氨基酸序列，
SEQ ID NO:103代表的氨基酸序列，
SEQ ID NO:107代表的氨基酸序列，和
SEQ ID NO:135代表的氨基酸序列，
或所述抗体的抗原结合片段。
人抗体的具体优选实例可以包括包含以下的重链可变区和轻链可变区的任一组合的抗体：
・包含SEQ ID NO:97代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:99代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:101代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:103代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:105代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:107代表的氨基酸序列的轻链可变区，或
・包含SEQ ID NO:109代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:135代表的氨基酸序列的轻链可变区。
这种抗体包括单链抗体(也称为scFv)(实施例10)-4)。
人抗体的另一个实例包括IgG型抗体，其包含通过人免疫球蛋白重链恒定区(CH1和Fc)或人免疫球蛋白轻链恒定区(CL)连接的上述轻链和重链可变区。这种IgG型人抗体的实例包括包含以下的重链和轻链的任一组合的抗体：
・包含SEQ ID NO:144代表的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:145代表的氨基酸序列的轻链，
・包含SEQ ID NO:146代表的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:147代表的氨基酸序列的轻链，
・包含SEQ ID NO:148代表的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:149代表的氨基酸序列的轻链，或
・包含SEQ ID NO:150代表的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:151代表的氨基酸序列的轻链。
本发明的抗GPRC5D抗体可以是由衍生自多种不同抗体的部分构成的抗体，只要所述抗体结合人GPRC5D即可。这种抗体的实例可以包括包含在多种不同抗体间交换的重链和/或轻链的抗体，包含在其间交换的全长重链和/或轻链的抗体，包含在其间交换的仅可变区或仅恒定区的抗体，和包含其间交换的全部或一些CDR的抗体。嵌合抗体的重链和轻链可变区可以衍生自本发明的不同抗GPRC5D抗体。人源化抗体的重链和轻链可变区中的重链CDR1至CDR3和轻链CDR1至CDR3可以衍生自本发明的两种或更多种不同的抗GPRC5D抗体。人抗体的重链和轻链可变区中的重链CDR1至CDR3和轻链CDR1至CDR3可以是由本发明的两种或更多种不同的抗GPRC5D抗体携带的CDR的组合。
本发明的抗GPRC5D抗体包括单链免疫球蛋白，其包含经由适当接头连接的抗体的全长重链和轻链序列(Lee, H-S, 等人, Molecular Immunology (1999) 36, 61-71; 和Shirrmann, T. 等人, mAbs (2010), 2 (1), 1-4)。这种单链免疫球蛋白可以二聚化，由此维持与最初为四聚体的抗体的结构和活性相似的结构和活性。
本发明的抗GPRC5D抗体或所述抗体的抗原结合片段还包括这样的抗体或抗体的抗原结合片段，其包含由在严格条件下与包含编码本发明的抗GPRC5D抗体或所述抗体的抗原结合片段中包含的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸中包含的核苷酸序列编码的氨基酸序列，并且结合人GPRC5D。
本发明的抗GPRC5D抗体或所述抗体的抗原结合片段可以是这样的抗体或抗体的抗原结合片段，其包含与根据(8)至(12)和(18)至(20)中任一项的前述抗体或抗体的抗原结合片段中含有的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高同一性的重链可变区的氨基酸序列和/或轻链可变区的氨基酸序列，并且结合人GPRC5D。
与根据IMGT的定义确定轻链可变区的位置和长度时相比，使用不同于IMGT的定义确定轻链可变区的位置和长度时，可以在根据IMGT的定义确定的轻链可变区的氨基酸序列的羧基末端含有一个或两个或更多个氨基酸，例如精氨酸(R)和/或甘氨酸(G)。在本发明的抗体或其抗原结合片段中还包括具有这种轻链可变区的抗体或其抗原结合片段。
可以通过将突变引入本发明的抗GPRC5D抗体的抗原结合片段来优化本发明的抗体等结合GPRC5D、特别是人和/或食蟹猴GPRC5D的能力。用于引入突变的方法的具体实例可以包括使用易错PCR的随机诱变，使用NNK文库的定点氨基酸诱变，使用结构信息的定点诱变，及其组合。
3-2. 抗GPRC5D抗体的抗体突变体
本发明的抗GPRC5D抗体的抗体突变体可以优选地表现出，例如，降低的对蛋白降解或氧化的敏感性，保存或改善的生物活性或功能或抑制的生物活性或功能的减少或改变，改善或调节的结合抗原的能力，或赋予其的物理化学或功能特性。已知蛋白的功能或活性由于其表面上存在的特定氨基酸侧链的变化而变化。此类实例包括天冬酰胺侧链的脱酰胺和天冬氨酸侧链的异构化。在本发明的抗体突变体的范围内还包括通过用另一种氨基酸替换以防止氨基酸侧链的这种变化而衍生自本发明的抗GPRC5D抗体的抗体。
本发明的抗体突变体的实例可以包括具有通过保守氨基酸取代衍生自原始抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体。所述保守氨基酸取代是在与氨基酸侧链相关的氨基酸基团中发生的取代。
优选的氨基酸基团如下：酸性基团，诸如天冬氨酸和谷氨酸；碱性基团，诸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；非极性基团，诸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；和不带电的极性家族，诸如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。其他优选的氨基酸基团如下：脂族羟基基团，诸如丝氨酸和苏氨酸；含酰胺基团，诸如天冬酰胺和谷氨酰胺；脂族基团，诸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；和芳香族基团，诸如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。优选在不降低原始抗体的抗原结合活性的情况下进行抗体突变体中的这种氨基酸取代。
本发明的抗GPRC5D抗体、其抗原结合片段、其变体或本发明的分子还涵盖：抗体突变体，其抗原结合片段，包含所述抗体突变体或抗原结合片段的分子等，其具有通过保守氨基酸取代和/或任何其他突变而衍生自本发明的抗体诸如2A4、2B1或7B4的氨基酸序列的氨基酸序列且结合人GPRC5D；小鼠抗体、大鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体、其抗原结合片段，和包含这些的分子等，其具有通过保守氨基酸取代和/或任何其他突变而衍生自本发明的抗体(包括2A4、2B1或7B4等)的CDRH1至CDRH3和CDRL1至CDRL3的任一氨基酸序列的氨基酸序列且结合人GPRC5D；抗体突变体，其抗原结合片段，和包含所述抗体突变体或抗原结合片段的分子等，其具有通过保守氨基酸取代衍生自本发明的抗体诸如C2037、C3048、C3015或C3022的氨基酸序列的氨基酸序列且结合人GPRC5D；和嵌合抗体、人抗体、其抗原结合片段、和包含这些的分子等，其具有通过保守氨基酸取代而衍生自本发明的抗体(包括C2037、C3048、C3015或3022等)的CDRH1至CDRH3和CDRL1至CDRL3的氨基酸序列。
3-3. 抗GPRC5D抗体的抗原结合片段
根据一个方面，本发明提供了本发明的抗GPRC5D抗体的抗原结合片段。本发明的抗GPRC5D抗体的抗原结合片段涵盖嵌合抗体、人源化抗体或人抗体的抗原结合片段。抗体的抗原结合片段意指在抗体的功能中至少维持抗原结合活性的片段或其修饰形式。此类抗体的功能的实例通常可以包括抗原结合活性、抗原活性调节活性(例如，激动活性)，将抗原内化至细胞中的活性，以及抑制或促进抗原与其相互作用物质之间相互作用的活性。
抗体的抗原结合片段没有特别限制，只要抗体的片段在抗体的活性中至少维持抗原结合活性即可。这种抗体的抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、包含经由适当的接头连接的Fab轻链的羧基末端和Fab重链的氨基末端的单链Fab (scFab)、Fv、包含经由适当接头连接的重链和轻链Fv的单链Fv (scFv)和具有单个重链可变区且缺乏轻链序列的单结构域抗体(sdAb；也称为纳米抗体)(Muyldemans S. 等人, Protein Eng.,(1994), 7 (9), 1129-35; 和Hamers-Casterman C. 等人, Nature (1993), 363(6428), 446-448)。本发明的抗体的抗原结合片段的含义还涵盖包含除本发明的抗体的抗原结合片段以外的部分的分子，诸如保留接头部分的scFab和scFv。
3-4抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段和缀合物的修饰形式
本发明提供了所述抗体或其抗原结合片段的修饰形式。本发明的抗体或其抗原结合片段的修饰形式意指提供有化学或生物学修饰的本发明的抗体或其抗原结合片段。化学修饰形式包括，例如，具有与化学部分缀合的氨基酸骨架的形式，和具有化学修饰的N-连接或O-连接的碳水化合物链的形式。生物学修饰形式包括，例如，已经历翻译后修饰(例如，N-连接或O-连接的糖基化，氨基末端或羧基末端区域的加工，脱酰胺，天冬氨酸的异构化或甲硫氨酸的氧化)的形式，或含有通过使用原核宿主细胞表达添加至氨基末端的甲硫氨酸残基的形式。这种修饰形式还意味着包括标记为允许检测或分离本发明的抗体或抗原的形式，例如酶标记形式、荧光标记形式或亲和标记形式。本发明的抗体或其抗原结合片段的这种修饰形式可用于改善本发明的原始抗体或其原始抗原结合片段的稳定性或血液保留，降低抗原性，检测或分离抗体或抗原等。
化学修饰形式中包含的化学部分的实例可以包括水溶性聚合物，诸如聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖和聚乙烯醇。
生物学修饰形式的实例可以包括通过酶促处理、细胞处理等修饰的形式，与通过基因重组添加的另一种肽(诸如标签)融合的形式，和由表达内源或外源糖链修饰酶的宿主细胞制备的形式。
这种修饰可以在所述抗体或其抗原结合片段中的任意位置或期望位置进行。或者，可以在其中的一个或两个或更多个位置处进行相同或两个或更多个不同的修饰。
然而，这些重链序列中的缺失或重链或轻链序列中的修饰对抗体结合抗原的能力及其效应子功能(补体活化、抗体依赖性细胞毒性作用等)影响极小。
因此，本发明还涵盖已经接受缺失或修饰的抗体。其实例可以包括通过在其羧基末端缺失1或2个氨基酸而衍生自重链的缺失变体(Journal of Chromatography A, 705:129-134 (1995))，具有在羧基末端缺乏两个氨基酸残基(甘氨酸和赖氨酸)且反而在羧基末端具有酰胺化的脯氨酸残基的重链的缺失变体的酰胺化形式(AnalyticalBiochemistry, 360:75-83 (2007))，以及在其重链或轻链中具有焦谷氨酰化氨基末端谷氨酰胺或谷氨酸残基的修饰的抗体(国际公开号WO2013/147153)(这些统称为“缺失变体”)。然而，根据本发明的抗体重链或轻链的羧基末端的缺失变体不限于上述类型，只要缺失变体维持其抗原结合能力和效应子功能即可。当根据本发明的抗体包含两条或更多条链(例如，重链)时，两条或更多条链(例如，重链)可以是选自全长重链和上述缺失变体的任一种类型的重链，或者可以是从其中选择的任何两种类型的重链的组合。每种缺失变体的分子的定量比率或其数目比率可以受产生根据本发明的抗体的培养的哺乳动物细胞的类型和培养条件的影响。这种情况的实例可以包括在作为根据本发明的抗体的主要组分的两条重链两者中各自缺失一个羧基末端氨基酸残基。
即使衍生自例如表达载体和/或信号序列的一个至几个氨基酸被添加至本发明的抗体或其抗原结合片段中的氨基末端和/或羧基末端(例如，包含在本发明的分子、多特异性分子、双特异性分子等中)，只要维持期望的抗原结合活性，它就包括在本发明的抗体的修饰形式或其抗原结合片段的修饰形式的范围内，并且包含这种抗体的修饰形式或抗原结合片段的修饰形式的分子包括在本发明的分子的范围内。
在本发明中，“抗体或其抗原结合片段”还包括“抗体或其抗原结合片段”的“修饰形式”的含义。本发明的分子、多特异性分子、双特异性分子等中含有的“抗体或其抗原结合片段”包括“抗体或其抗原结合片段”的“修饰形式”的含义。
此外，可以通过调整与本发明的抗体结合的糖基化(糖基化、去糖基化等)增强抗体依赖性细胞毒性活性。国际专利号WO99/5432、WO00/61739和WO02/31140已知作为用于调整抗体的糖基化的技术，但此技术不限于这些。
本发明还涵盖由经由接头与其他分子连接的前述抗体形成的缀合物(免疫缀合物)。其中抗体与放射性物质或具有药理作用的化合物(药物)缀合的这种抗体-药物复合物的实例可以包括ADC(抗体-药物缀合物)([Methods Mol Biol. (2013) 1045: 1-27;Nature Biotechnology (2005) 23, p.1137-1146))。
此外，本发明还涵盖包含与其他功能多肽连接的这些抗体的缀合物。这种抗体-肽复合物的实例可以包括抗体和白蛋白结合多肽的复合物(Protein Eng Des Sel. (2012)(2): 81-8)。
本发明的抗体涵盖所述抗体的这些修饰形式，已经历糖基化调整的抗体和缀合物。本发明的抗体的抗原结合片段涵盖所述抗体的这些修饰形式、已经历糖基化调整的抗体和缀合物的抗原结合片段。
3-5. 结合相同位点的抗体
结合由本发明提供的抗体或所述抗体的抗原结合片段结合的人GPRC5D上的位点的抗体也包括在本发明的抗体或所述抗体的抗原结合片段中。与某种抗体结合人GPRC5D抗原上的相同的位点的抗体意指结合与所述抗体识别的抗原分子上的相同的位点的另一种抗体。如果第二抗体结合由第一抗体结合的抗原分子上的部分肽或部分三维结构，则确定第一和第二抗体结合相同位点。
或者，通过证实结合所述抗原的第二抗体与第一抗体竞争，即第二抗体干扰第一抗体与抗原的结合，确定第一和第二抗体结合相同位点，即使未确定特异性结合位点的肽序列或三维结构。
当第一和第二抗体结合相同位点时，第二抗体具有与第一抗体具有相同活性的极高概率。
抗体结合位点可以通过本领域技术人员众所周知的方法(诸如免疫测定)测定。例如，通过从其羧基末端或氨基末端适当地切割抗原的氨基酸序列来制备一系列肽，并研究抗体对其的反应性以粗略地确定识别位点。然后，合成较短的肽，并且可以研究抗体对这些肽的反应性，由此确定结合位点。可以使用技术诸如基因重组或肽合成来制备抗原片段肽。
3-6. 本发明的多核苷酸、载体和细胞
本发明还提供了包含编码本发明的抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO:63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89或91)的多核苷酸，包含所述多核苷酸的载体，包含所述多核苷酸或载体的细胞，以及产生本发明的抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段的细胞等。这种多核苷酸、载体(环状形式诸如质粒，和非环状形式，包括整合在染色体中的载体)和细胞可用于产生后面提及的抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段。
除了编码抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列的核苷酸序列以外，本发明的多核苷酸可以含有任意核苷酸序列。例如，除了包含编码本发明的抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO:63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91等)的多核苷酸以外，编码活性信号转导分子肽的氨基酸序列的核苷酸序列和/或编码共刺激分子的氨基酸的核苷酸序列也是本发明的多核苷酸的方面的一部分。本发明还提供了人工免疫细胞(下文中，也称为本发明的人工免疫细胞)，其通过经由用这种多核苷酸转染免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞或单核细胞)而表达的嵌合抗原受体(CAR)具有针对肿瘤细胞的结合活性。
CAR是嵌合蛋白，其具有分别在其氨基末端和羧基末端的包含串联结合的衍生自识别肿瘤细胞上的表面抗原的单克隆抗体的轻链和重链的scFv，和活性信号转导分子(例如，对于T细胞受体，CD3ζ，或对于免疫球蛋白分子，受体FcRγ)，在其之间连接细胞外铰链结构域、跨膜结构域、活化免疫细胞的共刺激分子等。在本发明的细胞中，识别肿瘤细胞上的表面抗原的单克隆抗体是本发明的抗GPRC5D抗体。表达CAR的本发明的免疫细胞经由scFv的形式的本发明的抗GPRC5D抗体识别肿瘤表面上的GPRC5D蛋白，而免疫细胞本身的活化由细胞内活性信号转导分子诱导以攻击肿瘤细胞。
在使用T细胞作为待用本发明的多核苷酸转染的免疫细胞的情况下，通过用该多核苷酸转染T细胞在细胞表面上表达的嵌合抗原受体(CAR)可以引起表达GPRC5D的细胞和T细胞彼此接近以诱导T细胞活化介导的对GPRC5D表达细胞的细胞毒性，即通过T细胞的重新引导的细胞毒性。本发明还提供了这种表达CAR的T细胞(下文中，也称为本发明的T细胞)。
换言之，可以将本发明的T细胞重新引导至表达GPRC5D的肿瘤细胞，以诱导对肿瘤细胞的细胞毒性。
将活性信号转导分子转染至免疫细胞中，以便将来自免疫细胞受体的信号转导至细胞中。在使用例如T细胞作为免疫细胞的情况下，活性信号转导分子的实例包括CD3ζ、DAP12和FcRγ。
将共刺激分子转染至免疫细胞中以更强烈地活化免疫细胞。在使用例如T细胞作为免疫细胞的情况下，共刺激分子的实例包括CD2、CD27、CD28、CD49d、CD134、CD152、CD154、ICOS、4-1BB和RANKL。
4. 具有抗原结合活性的分子
本发明的分子包含本发明的抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段。
进一步，本发明的分子可以包括，例如，信号序列，用于纯化的标签等，氨基末端Gly，ADC的药物接头部分，白蛋白结合多肽，聚合物诸如PEG，除了抗GPRC5D抗体以外的抗体，其抗原结合片段，以及具有抗原结合活性而没有免疫球蛋白骨架的蛋白，这将在后面描述。除抗GPRC5D抗体以外的抗体的实例包括抗CD3抗体。后面描述的多特异性分子包括在本发明的分子的范围中。
4-1. 多特异性分子
本发明的多特异性分子是具有两个或更多个抗原结合位点的分子。具体地，本发明的多特异性分子是能够结合一个分子上与彼此不同的两个或更多个表位或者两个或更多个分子上与彼此不同的表位的分子，并且包含多个与彼此不同的抗原结合片段。这种多特异性分子的实例包括但不限于IgG型多特异性分子和具有两种或更多种类型的可变区的多特异性分子，例如抗体片段诸如串联scFv，单链双抗体，双抗体和三抗体，和通过共价键或非共价键连接的抗体片段。所述多特异性分子可以含有Fc。
本发明的多特异性分子包含本发明的抗GPRC5D抗体或所述抗体的抗原结合片段。本发明的多特异性分子包含本发明的抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段和1或2种或更多种不同于抗GPRC5D抗体且结合GPRC5D中不存在且存在于另一种抗原中的表位的抗体或所述抗体的抗原结合片段。
抗GPRC5D抗体的抗原结合片段的实例可以包括Fab、F(ab)'、Fv、scFv和sdAb。
本发明的多特异性分子特异性结合GPRC5D或可以进一步结合靶标，诸如效应子细胞上的Fc受体。
可以包含在本发明的多特异性分子中的与抗GPRC5D抗体不同的抗体的实例包括抗CD3抗体。
作为优选的实例，可以包含在本发明的多特异性分子中的抗CD3抗体或其抗原结合片段保留包含SEQ ID NO:183 (图206) (GVTFNYYG)代表的氨基酸序列的重链CDR1，
包含SEQ ID NO:238 (图276) (ITXaaXaaGGRI)(其中第一个Xaa和第二个Xaa各自是任意天然氨基酸残基；下文中，重链CDR2中的第一个Xaa和第二个Xaa也分别被称为X1和X2)代表的氨基酸序列的重链CDR2，和
包含SEQ ID NO:185 (图208) (TLDGRDGWVAY)代表的氨基酸序列的CDRH3。
本发明的优选的人源化抗CD3抗体或所述抗体的抗原结合片段中含有的轻链可变区保留
包含SEQ ID NO:186 (图209) (TGNIGSNY)代表的氨基酸序列的轻链CDR1，
包含SEQ ID NO:239 (图277) (RXaaD)(其中Xaa是任意天然氨基酸残基；下文中，轻链CDR2中的Xaa也称为X3)代表的氨基酸序列的轻链CDR2，和
包含SEQ ID NO:188 (图211) (QSYSSGFI)代表的氨基酸序列的轻链CDR3。
在前述重链CDR2 (ITX1X2GGRI)中，优选地，X1选自(A、E、G、H、I、L、T、V、R和S)，且X2是S；或X1是N，且X2选自(E、R、F、Y、L、V、I、K和T)。
在前述轻链CDR2 (RX3D)中，优选地，X3选自(Q、A、G、S、N和D)。
在前述重链CDR2 (ITX1X2GGRI)中，更优选地，X1选自(R和S)，且X2是S。
在前述轻链CDR2 (RX3D)中，更优选地，X3选自(Q、A、G、S、N和D)。
可以在本发明的多特异性分子的优选实例包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:240 (图278)中所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含SEQID NO:241 (图279)、SEQ ID NO:242 (图280)或SEQ ID NO:243 (图281)中所示的氨基酸序列，其中
SEQ ID NO:240中所示的氨基酸序列中的第一Xaa选自(A、E、G、H、I、L、T、V、R和S)，且X2是S；或X1是N，且X2是S；或
第一Xaa是N，且第二Xaa选自(E、R、F、Y、L、V、I、K和T)。
SEQ ID NO: 241、241和243所示的氨基酸序列中任一个的Xaa选自(Q、A、G、S、N，和D)。
可以包含在本发明的多特异性分子中的抗CD3抗体或其抗原结合片段的更优选实例包含如下分子，其中SEQ ID NO:240的第一Xaa选自(R，S)，
第一Xaa是S；SEQ ID NO: 241、241和243之一所示的氨基酸序列的Xaa选自(Q、A、G、S、N，和D)。
本发明的优选的人源化抗CD3抗体或所述抗体的抗原结合片段的具体实例包括这样的抗体或抗体的抗原结合片段，其包含：
重链可变区，其包含：
SEQ ID NO:183 (GVTFNYYG)代表的重链CDR1的氨基酸序列，
SEQ ID NO:184 (ITNSGGRI)代表的重链CDR2的氨基酸序列，和
SEQ ID NO:185 (TLDGRDGWVAY)代表的重链CDR3的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含：
SEQ ID NO:186 (TGNIGSNY)代表的轻链CDR1的氨基酸序列，
SEQ ID NO:187 (RDD)代表的轻链CDR2的氨基酸序列，和
SEQ ID NO:188 (QSYSSGFI)代表的轻链CDR3的氨基酸序列，
且结合人CD3和食蟹猴CD3。根据IMGT的定义确定抗CD3抗体的这些CDR的位置和长度。
具有上述CDR及其可变区的本发明的多特异性分子中含有的抗CD3抗体或其抗原结合片段(下文中，也称为本发明的抗CD3抗体等)结合存在于人CD3复合物的ε链的细胞外区域中的Ig样结构域。此外，这些还结合存在于食蟹猴CD3复合物的ε链的细胞外区域中的Ig样结构域。
由本发明的多特异性分子中含有的抗CD3抗体等结合的存在于人CD3复合物的ε链的细胞外区域中的表位含有以下氨基酸：
Ser55、Glu56、Leu58、Trp59、Asn65、Ile66、Ser77、Asp78、Arg101、Gly102、Ser103、Lys104和Pro105。
优选地，本发明的多特异性分子中含有的抗CD3抗体等可以通过结合含有选自这13个氨基酸的至少7个氨基酸的表位区域而维持与人CD3的结合。
当抗体以4埃内的距离与这些氨基酸相邻时，可以证实这种抗体具有与本发明的多特异性分子中含有的抗CD3抗体等相同的表位特异性。另一方面，在这些表位氨基酸中，Arg101、Gly102、Ser103、Lys104和Pro105也是与本领域中已知的抗CD3抗体OKT3或UCHT1相互作用的表位残基(Lars Kjer-Nielsen等人, PNAS (2004); 和Kelly L Arnett等人,PNAS (2004))。然而，OKT3或UCHT1结合人CD3，但不结合食蟹猴CD3。
本发明的多特异性分子中含有的这种结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段可以使用对于药物产品的非临床开发(临床前开发)有用的灵长类动物、特别是食蟹猴进行对效力或安全性的各种测试，并且因此是优选的。此外，结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体等具有细胞毒性活性，并且可以单独或作为本发明的分子用于治疗或预防食蟹猴中的疾病诸如癌症。药物组合物将在后面描述。
抗CD3抗体可以是非人动物抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。所述抗CD3抗体优选为人源化抗体或人抗体。
抗CD3抗体的抗原结合片段的实例包括Fab、F(ab)'、Fv、scFv和sdAb。
包含上述CDR的抗CD3抗体或所述抗体的抗原结合片段的实例包括人源化抗体或抗体的抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:240 (图278)中所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:241 (图279)、242(图280)和243 (图281)中任一个代表的氨基酸序列。其具体实例包括人源化抗体或抗体的抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:155代表的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:156、158和160中任一个代表的氨基酸序列。
抗CD3抗体或所述抗体的抗原结合片段的具体实例包括包含SEQ ID NO:180、181或182代表的氨基酸序列的抗体或所述抗体的抗原结合片段。其更具体实例包括抗体或抗体的抗原结合片段，其包含如下所示的氨基酸序列：
包含SEQ ID NO:180的氨基酸残基2至243的抗体或所述抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO:181的氨基酸残基2至243的抗体或所述抗体的抗原结合片段，和
包含SEQ ID NO:182的氨基酸残基2至241的抗体或所述抗体的抗原结合片段。
上述抗CD3抗体可以是包含人免疫球蛋白恒定区或Fc的人源化抗体或人抗体。Fc可以是Fc突变。
包含抗GPRC5D抗体或所述抗体的抗原结合片段和抗CD3抗体或所述抗体的抗原结合片段的本发明的多特异性分子的优选实例可以包括衍生自上述2B1的人抗GPRC5D抗体或所述抗体的抗原结合片段，此外，作为抗GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，包含：
・包含SEQ ID NO:207代表的氨基酸序列的氨基酸残基25至142代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:209代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至132代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:211代表的氨基酸序列的氨基酸残基25至142代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:213代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至130代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:244的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:244序列的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:245的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:245的氨基酸残基135至241代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:246的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:246的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:247的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:247的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:248的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:248的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:249的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:249的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:250的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:250的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:251的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:251的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:252的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:252的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:253的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:253的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:254的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:254的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，或
・包含SEQ ID NO:255的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:255的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，并且
包含结合人人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的结合片段。
这些分子中的更优选分子是如下的一个，其中结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，和：
i)包含SEQ ID NO:199代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:203代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
ii)包含SEQ ID NO:201代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:205代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
iii)包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
或
iv)包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至476代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
且
结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段进一步包含Fc突变。
这些之中的甚至更优选分子是如下的分子，其中结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段是包含上述iii)或iv)中所显示的恒定区的结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段。
本发明的多特异性分子的具体优选实例可以包括分子，其包含：
结合人GPRC5D的抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:219代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至499代表的氨基酸序列；
结合人GPRC5D的抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:221代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至497代表的氨基酸序列；
结合人GPRC5D的抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:225代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至497代表的氨基酸序列；
结合人GPRC5D的抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:227代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至499代表的氨基酸序列；
结合人GPRC5D的抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:229代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至499代表的氨基酸序列；
结合人GPRC5D的抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至476代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:231代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至498代表的氨基酸序列；
结合人GPRC5D的抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至476代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:233代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至500代表的氨基酸序列；或
结合人GPRC5D的抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至476代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:235代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至500代表的氨基酸序列。
来自这些之中的更优选实例的具体实例可以包括分子，其包含：
结合人GPRC5D的抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:225代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至497代表的氨基酸序列；
结合人GPRC5D的抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:227代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至499代表的氨基酸序列；
结合人GPRC5D的抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:229代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至499代表的氨基酸序列；
结合人GPRC5D的抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至476代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:231代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至498代表的氨基酸序列；
结合人GPRC5D的抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至476代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:233代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至500代表的氨基酸序列；或
结合人GPRC5D的抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至476代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:235代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至500代表的氨基酸序列。
下文将提及的杂合型双特异性分子包括在这些分子的适用形式中。
本发明的多特异性分子的更优选分子的替代实例可以包括如下分子，其中源自2B1的结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，进一步包含根据上述i)、ii)、iii)或iv)的恒定区，且结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段包含：
v)包含SEQ ID NO:207代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至471代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:209代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至132代表的氨基酸序列的轻链恒定区，或
vi)包含SEQ ID NO:211代表的氨基酸序列的氨基酸残基143至471代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:213代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至236代表的氨基酸序列的轻链恒定区。
这些分子之中的更优选的分子是如下的一个，其中结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段是包含上述iii)或iv)中所显示的恒定区的结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段。
本发明的多特异性分子的更具体的优选实例可以包括：
结合人GPRC5D的抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:199代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:203代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:207代表的氨基酸序列的氨基酸残基25至471代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:209代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至238代表的氨基酸序列的轻链，
或
结合人GPRC5D的抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:201代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:205代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:211代表的氨基酸序列的氨基酸残基25至471代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:213代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至236代表的氨基酸序列的轻链。
下文将提及的FAS型双特异性分子包括在这些分子的适用形式中。
本发明的多特异性分子的进一步替代优选实例，根据权利要求55的分子，其中结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，含有包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，和进一步的Fc突变，且
结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段进一步包含Fc突变。
本发明的此类多特异性分子的具体优选实例可以分子，其包含：
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:223代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至271代表的氨基酸序列和Fc突变，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:219代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变，
或
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:223代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至271代表的氨基酸序列和Fc突变，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:221代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至264代表的氨基酸序列和Fc突变。
下文将提及的双重型双特异性分子包括在这些分子的适用形式中。
本发明的分子还涵盖这样的分子，其包含：抗CD3抗体或其抗原结合片段的部分，其包含由多核苷酸中含有的核苷酸序列编码的氨基酸序列且结合人CD3和食蟹猴CD3，所述多核苷酸在严格条件下与包含编码上述抗CD3抗体或所述抗体的抗原结合片段中含有的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的互补链杂交；和抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段的部分，其结合人GPRC5D并且优选进一步结合食蟹猴GPRC5D。
本发明的分子还涵盖这样的分子，其包含：抗CD3抗体或其抗原结合片段的部分，其包含与上述抗CD3抗体或所述抗体的抗原结合片段中含有的重链可变区的氨基酸序列和/或轻链可变区的氨基酸序列具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高同一性的重链可变区的氨基酸序列和/或轻链可变区的氨基酸序列且结合人CD3和食蟹猴CD3；和抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段的部分，其结合人GPRC5D并且优选进一步结合食蟹猴GPRC5D。
本发明的分子还涵盖这样的分子，其包含具有通过1至几个氨基酸的取代、缺失或修饰而衍生自抗CD3抗体或所述抗体的抗原结合片段中含有的氨基酸序列的氨基酸序列的抗CD3抗体或所述抗体的抗原结合片段，且结合人CD3和食蟹猴CD3以及人GPRC5D，且优选进一步结合食蟹猴GPRC5D。这种抗CD3抗体或所述抗体的抗原结合片段的实例可以包括通过在其羧基末端缺失1或2个氨基酸而衍生自重链的缺失变体(Journal of ChromatographyA, 705:129-134 (1995))，具有在羧基末端缺失两个氨基酸残基(甘氨酸和赖氨酸)且反而在羧基末端具有酰胺化的脯氨酸残基的重链的缺失变体的酰胺化形式(AnalyticalBiochemistry, 360:75-83 (2007))，以及在其重链或轻链中具有焦谷氨酰化氨基末端谷氨酰胺或谷氨酸残基的修饰的抗体(国际公开号WO2013/147153)(这些统称为“缺失变体”)。然而，本发明的分子中含有的抗CD3抗体或所述抗体的抗原结合片段的重链或轻链的羧基末端的缺失变体不限于上述类型，只要缺失变体维持其抗原结合能力和效应子功能即可。当本发明的分子中含有的抗体包含两条或更多条链(例如，重链)时，两条或更多条链(例如，重链)可以是选自全长重链和上述缺失变体的任一种类型的重链，或者可以是从其中选择的任何两种或更多种类型的重链的组合。每种缺失变体的定量比率或其分子数的比率可以受产生本发明的分子的培养的哺乳动物细胞的类型和培养条件的影响。这种情况的实例可以包括在作为本发明的分子的主要组分的两条重链两者中各自缺失一个羧基末端氨基酸残基。
4-2. 本发明的双特异性分子
本发明的多特异性分子的优选实例可以包括双特异性分子。术语“双特异性”意指结合一个分子上与彼此不同的两个表位或两个或更多个分子上与彼此不同的表位的能力。本发明涵盖具有这种双特异性的抗体或抗原结合片段。
本发明的双特异性分子结合GPRC5D且结合不存在于GPRC5D中且存在于另一种抗原中的表位。更具体地，这种双特异性分子(i)结合GPRC5D上的表位(表位1)，且(ii)结合GPRC5D上的不同于表位1的表位(表位2)，或结合除了GPRC5D以外的抗原上的表位(表位3)。
例如，在以BiTE为代表的串联scFv型双特异性分子中，第一抗体的重链可变区中的抗原结合位点和第一抗体的轻链可变区中的抗原结合位点经由接头连接或直接在没有接头的情况下连接以形成第一多肽。而且，第二抗体的重链可变区中的抗原结合位点和第二抗体的轻链可变区中的抗原结合位点经由接头连接或在没有接头的情况下直接连接以形成第二多肽。第一多肽和第二多肽经由接头连接或在没有接头的情况下直接连接。或者，第一多肽和第二多肽可以经由额外的分子连接。
在双抗体型双特异性分子中，第一抗体的重链可变区中的抗原结合位点和第二抗体的轻链可变区中的抗原结合位点经由接头连接或在没有接头的情况下直接连接。而且，第一抗体的轻链可变区中的抗原结合位点和第二抗体的重链可变区中的抗原结合位点经由接头连接或在没有接头的情况下直接连接。而且，双特异性分子可以通过双抗体型双特异性分子的进一步二聚化来制备。此外，所述双抗体型双特异性分子可以经由接头与Fc的一条单链或两条链连接(双抗体Fc型双特异性分子)。
在双scFv型双特异性分子中，结合不同表位的两个scFv分别经由接头或直接在没有接头的情况下与二聚体Fc的两条链连接。或者，结合不同表位的两种类型的scFv分别经由接头与CH和CL连接，并且分别经由接头与二聚体Fc的两条链进一步连接。双重scFv型双特异性分子也被描述为双重型双特异性分子或双重型。
在IgG型双特异性分子中，结合不同表位的两个Fab分别经由接头或直接在没有接头的情况下与二聚体Fc的两条链连接。IgG型双特异性分子也被描述为全尺寸抗体(FSA)型双特异性分子或FSA型。
或者，本发明的双特异性分子可以是双特异性分子，其中第一抗体的Fab和第二抗体的scFv分别经由接头或直接在没有接头的情况下与二聚体Fc的两条链连接。这种双特异性抗体被描述为杂合型的杂合型双特异性抗体或杂合型。
本发明的双特异性分子中含有的scFv和Fab优选为人源化抗体或人抗体的scFv和Fab，且Fc优选为人抗体的Fc。
所述接头还包括单链多肽或单链寡肽，或合成产物，诸如PEG、核苷酸、糖链和化合物。此外，可以使用本领域中已知的任何接头而没有特别限制，只要所述接头连接两个多肽即可。
对于例如肽接头，接头的长度为5至30个氨基酸。当双特异性分子含有多个接头时，所用的所有肽接头都可以具有相同的长度，或者所用的肽接头可以具有不同的长度。
肽接头的实例包括(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser)重复。可以向其中添加除了Gly和Ser以外的1至几个氨基酸残基。
本发明的双特异性分子中含有的结合除了GPRC5D以外的抗原上的表位(表位3)的抗体或其抗原结合片段的实例可以包括前述抗CD3抗体或其抗原结合片段。
本发明的双特异性分子的实例可以包括其中抗CD3抗体或所述抗体的抗原结合片段与本发明的抗GPRC5D抗体或所述抗体的抗原结合片段经由接头或在没有接头的情况下结合的分子。这种分子的优选实例可以包括其中抗-CD3抗体或所述抗体的抗原结合片段和本发明的抗GPRC5D抗体或所述抗体的抗原结合片段(其各自为scFv)经由接头或在没有接头的情况下与彼此结合的分子。
这种分子的优选具体实例可以包括这样的分子，其具有SEQ ID NO:171至179中任一个代表的氨基酸序列，且结合人CD3和食蟹猴CD3以及人GPRC5D，且优选进一步结合食蟹猴GPRC5D。
5. 抗体和分子的产生
5-1. 使用杂交瘤的方法
本发明的抗GPRC5D抗体可以通过使用常规方法获得，所述常规方法涉及用GPRC5D或选自GPRC5D的氨基酸序列的任意多肽免疫动物并收集和纯化体内产生的抗体。根据本领域中已知的方法(例如, Kohler和Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497; 和Kennet,R. 编, Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980))，产生针对GPRC5D的抗体的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，由此建立杂交瘤，也可以从其中获得单克隆抗体。这种方法的具体实例描述于例如国际公开号WO09/48072小册子(在2009年4月16日公开)中。
抗原GPRC5D的生物体物种不限于人，并且动物也可以用源自非人动物诸如小鼠或大鼠的GPRC5D免疫。在这种情况下，可以测试获得的结合非人GPRC5D的抗体与人GPRC5D的交叉反应性，由此选择适用于人类疾病的抗体。
可以在本发明的分子中含有的抗CD3抗体也可以通过使用常规方法获得，所述常规方法涉及用CD3或选自CD3的氨基酸序列的任意多肽免疫动物并收集和纯化体内产生的抗体。根据本领域中已知的方法，产生针对CD3的抗体的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，由此建立杂交瘤，也可以从其中获得单克隆抗体。
抗原CD3的生物体物种不限于人，并且动物也可以用源自非人动物诸如小鼠或大鼠的CD3免疫。可以测试获得的结合非人CD3的抗体与人CD3的交叉反应性，由此选择适用于人类疾病的抗体。
5-2. 细胞免疫方法
表达天然抗原的细胞、表达重组抗原或其片段的细胞等可用作免疫原，由此通过上述杂交瘤方法制备抗体。
表达天然GPRC5D的细胞的实例可以包括人浆细胞、人多发性骨髓瘤患者来源的原代培养细胞和人多发性骨髓瘤患者来源的培养细胞系。表达天然GD3的细胞的实例可以包括人胸腺细胞和T淋巴细胞。
每次免疫注射，此类细胞以1 × 105至1 × 109个细胞、优选1 × 106至1 × 108个细胞、更优选0.5至2 × 107个细胞、甚至更优选1 × 107个细胞的量使用。可以根据抗原的表达水平改变用于免疫的细胞数。免疫原通常腹膜内施用，并且可以通过皮内途径等施用。
5-3. DNA免疫方法
可以在本发明的分子中含有的本发明的抗GPRC5D抗体和抗CD3抗体(下文中，这些抗体也统称为本发明的抗体)也可以通过使用DNA免疫方法获得。该方法涉及用抗原表达质粒转染动物(例如，小鼠或大鼠)个体，且在个体中表达抗原，由此诱导针对抗原的免疫。转染方法的实例包括将质粒直接注射至肌肉的方法，将转染试剂诸如脂质体或聚乙烯亚胺注射至静脉的方法，使用病毒载体的方法，使用基因枪注射附着有质粒的金颗粒的方法，以及将质粒溶液以大量快速注射至静脉的流体动力学方法。
因此建立的大鼠抗人GPRC5D抗体的实际实例可以包括2A4、2B1和7B4。2A4的重链可变区的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:5中。2A4的轻链可变区的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:12中。2B1的重链可变区的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:7中。2B1的轻链可变区的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:14中。7B4的重链可变区的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:9中。7B4的轻链可变区的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:16中。
5-4. 设计人源化抗体
人源化抗体的实例可以包括但不限于具有仅用非人动物抗体的CDR替换的CDR的人来源的抗体(参见Nature (1986), 321, p. 522-525)，通过CDR移植用CDR序列和框架区的一些氨基酸残基移植的人抗体(参见WO90/07861和US6972323)，和在任何这些人源化抗体中具有用于替换一个或两个或更多个非人动物抗体来源的氨基酸的人抗体氨基酸的抗体。
5-5. 设计人抗体
人抗体意指由人来源的抗体的氨基酸序列组成的抗体。人抗体可以通过使用携带包含人抗体重链和轻链基因的人基因组DNA片段的产生人抗体的小鼠的方法获得(参见例如，Tomizuka, K.等人, Nature Genetics (1997) 16, 133-143,; Kuroiwa, Y.等人, Nuc.Acids Res. (1998) 26, 3447-3448; Yoshida, H. 等人, Animal Cell Technology:Basic and Applied Aspects vol.10, 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima,S. 编), Kluwer Academic Publishers, 1999.; Tomizuka, K.等人, Proc. Natl.Acad. Sci. USA (2000) 97, 722-727)。
具体地，这种产生人抗体的动物可以通过破坏非人哺乳动物的内源性免疫球蛋白重链和轻链基因座且反而通过经由酵母人工染色体(YAC)载体等向其引入人免疫球蛋白重链和轻链基因座来制备。或者，可以通过基因重组技术分别用编码这种人抗体的重链和轻链的cDNA转化真核细胞，优选用含有cDNA的载体转化真核细胞。可以培养产生重组人单克隆抗体的转化细胞。该抗体可以从培养上清液获得。
在本文中，例如，真核细胞，优选哺乳动物细胞诸如HEK293F细胞或CHO细胞可用作宿主。
此外，用于获得选自人抗体文库的噬菌体展示来源的人抗体的方法也是已知的。例如，可以使用噬菌体展示方法，其涉及允许人抗体的可变区在噬菌体表面上表达为scFv和选择结合抗原的噬菌体。可以对基于其结合抗原的能力选择的噬菌体进行基因分析，由此测定编码结合抗原的人抗体的可变区的DNA序列。如果测定结合抗原的scFv的DNA序列，则可以制备具有该序列的表达载体并将其引入适当的宿主以使它们表达人抗体(WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, 433-455)。
用于构建人抗体噬菌体文库的方法是众所周知的。参考例如J Biol Chem, 274(26), 18218-30, (1999)或Methods Mol Biol, 178, 59-71, (2002)使用作为模板的从人血液、脾脏或淋巴结收集的cDNA和使用引物扩增人抗体可变区的基因。参考J ImmunolMethods, 201 (1), 35-55 (1997)，可以使用扩增的可变区基因来制备scFv。
5-6. 抗体的抗原结合片段的产生
抗体的抗原结合片段可以通过经由基因工程改造方法修饰抗体、随后在适当的培养细胞中表达来产生。
用于制备例如scFv作为抗体的抗原结合片段的方法是本领域中众所周知的(参见例如，美国专利号4,946,778、5,260,203、5,091,513和5,455,030)。在该scFv中，重链可变区和轻链可变区经由防止它们形成缀合物的接头、优选多肽接头连接(Huston, J.S. 等人, PNAS (1988), 85, 5879-5883)。scFv中的重链可变区和轻链可变区可以衍生自相同的抗体或可以衍生自不同的抗体。
例如，使用由5至30个残基组成的任意单链肽作为连接这些可变区的多肽接头。
为了获得编码抗体的重链或重链可变区的DNA和编码轻链或其轻链可变区的DNA的序列的编码scFv的DNA，编码完整的这些序列或期望氨基酸序列的每个DNA部分用作模板并使用侧接模板的两个末端的引物对通过PCR扩增。随后，组合侧接DNA的两个末端的引物对，进一步扩增编码多肽接头部分的DNA，使得获得的片段可以在其末端分别与重链和轻链DNA连接。或者，编码整个scFv区域的DNA可以通过净合成获得。
编码scFv的DNA可用于由此根据常规方法制备含有所述DNA的表达载体和用表达载体转化的宿主细胞。此外，可以培养宿主细胞，并且可以根据常规方法从培养物回收scFv。
此外，为了获得抗体的任何其他抗原结合片段，根据上述方法获得编码抗原结合片段的基因并将其引入细胞中。可以从细胞的培养物回收目标抗原结合片段。
可以使本发明的抗体多聚化，由此增强其对抗原的亲和力。在该情况下，可以使相同类型的抗体多聚化，或者可以使分别识别相同抗原的多个表位的多个抗体多聚化。用于使这些抗体多聚化的方法的实例可以包括两个scFv与IgG CH3结构域的结合，其与链霉抗生物素蛋白的结合，以及螺旋-转角-螺旋基序的引入。
5-7. 基因重组
为了制备本发明的抗体，将包含编码其重链的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(重链核苷酸)和包含编码其轻链的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(轻链核苷酸)或具有重链核苷酸的插入物的载体和具有轻链核苷酸的插入物的载体引入宿主细胞，且然后培养细胞，且从培养物回收抗体。重链核苷酸和轻链核苷酸可以插入一个载体中。
原核或真核细胞可用作宿主细胞。在使用宿主真核细胞的情况下，可以使用动物细胞、植物细胞或真核微生物。
动物细胞的实例可以包括哺乳动物来源的细胞，即人胚肾细胞HEK293F细胞(Subedi GP等人, J Vis Exp. (2015) 106)，猴肾来源的COS细胞(Gluzman, Y. Cell(1981), 23, 175-182, ATCC CRL-1650)，小鼠成纤维细胞NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658)，中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞, ATCC CCL-61)，其二氢叶酸还原酶缺陷系(CHOdhfr-;Urlaub, G.和Chasin, L.A. PNAS (1980), 77, 4126-4220)，源自禽类诸如鸡的细胞，和源自昆虫的细胞。
此外，通过修饰糖链结构而修饰以增强抗体的生物活性的细胞可用作宿主。例如，经修饰使得在结合抗体的Fc区的复合型N-糖苷连接的糖链中，在其还原末端具有未与N-乙酰葡糖胺结合的岩藻糖的糖链的比例为20%或更多的CHO细胞，可以用于制备具有增强的ADCC活性或CDC活性的抗体(国际公开号WO02/31140)。
真核微生物的实例可以包括酵母。原核细胞的实例可以包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。
用于分泌本发明的抗体(源自每种动物的单克隆抗体、大鼠抗体、小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体等)的信号肽不限于与本发明的抗体相同的物种、相同的类型和相同的亚型的抗体的分泌信号，或本发明的抗体本身的分泌信号。可以选择和使用来自其的不同类型或亚型的抗体的任何分泌信号或源自来自其的不同真核物种或原核物种的蛋白的任何分泌信号。在大多数成熟轻链或成熟重链的核苷酸序列和氨基酸序列中通常不含信号肽。本发明的抗体等或本发明的分子也涵盖含有信号肽的分泌的抗体等。
可以将获得的抗体、抗体的抗原结合片段和分子纯化直至均质，以便不含其他蛋白。通常的蛋白分离和纯化方法可用于分离和纯化抗体、抗体的抗原结合片段和分子。
可以通过适当选择或组合的方法分离和纯化抗体，所述方法例如色谱柱、过滤器、超滤、盐析、透析、制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳和/或等电聚焦，尽管分离和纯化方法不限于此。
分离和纯化方法可以优选地例如通过如下进行：使用编码添加至抗体可变区的羧基末端的His标签或FLAG标签的DNA序列制备表达载体，用该载体转化细胞，然后培养细胞以表达抗体和抗体的抗原结合片段，且在培养完成之后提取培养上清液，随后使用金属(例如，Ni或Co)亲和色谱、抗FLAG标签抗体柱、凝胶过滤、离子交换色谱等纯化。
本发明的抗体、抗体的抗原结合片段或本发明的分子也涵盖含有标签诸如His标签或FLAG标签的氨基酸序列的表达的抗体和抗体的抗原结合片段。
5-8. 多克隆抗体的产生
本发明的抗体可以是多克隆抗体。可以从混合培养的不同抗体产生细胞的培养物回收多克隆抗体(WO2004/061104)。或者，可以混合分开制备的抗体。作为多克隆抗体的一个方面的抗血清可以通过根据标准方法用期望抗原免疫动物并从动物回收血清来制备。
5-9. 提供有对肿瘤细胞的结合特异性的人工免疫细胞的产生
通过经由用例如本发明的抗GPRC5D抗体的基因转染向免疫细胞赋予抗原特异性，可以产生提供有对肿瘤细胞的结合特异性的人工免疫细胞。免疫细胞的实例包括T细胞、NK细胞和单核细胞。
使用T细胞作为免疫细胞的情况将被描述为实例。T细胞可以通过如下诱导：在培养基中在抗CD3抗体、IL-2、IL-12或进一步抗IL-4抗体或IFN-γ存在的情况下培养通过方法诸如比重离心方法从人外周血回收的单核细胞。
接下来，用包含本发明的抗GPRC5D抗体的基因作为组分的嵌合抗原受体(CAR)基因转染该T细胞。CAR基因通常由识别肿瘤细胞上的表面抗原的抗体(在本发明中，抗GPRC5D抗体)的基因和编码T细胞活化所必需的共刺激分子(例如，共刺激物，诸如T细胞受体ζ链和CD28)的基因构成。可以使用各种病毒载体将包含抗GPRC5D抗体的基因的CAR基因转染至T细胞。这种载体的实例包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、仙台病毒载体和脂质体。可以从具有抗GPRC5D抗体的基因的插入物的病毒载体制备重组病毒，并将其转染至上述抗原非特异性活化的T细胞中。可以培养因此用基因转染的T细胞，以获得提供有对肿瘤细胞的特异性的T细胞。
通过本发明的方法获得的本发明的能够通过重新引导诱导细胞毒性的T细胞是否具有因此赋予其的抗原特异性可以通过如下证实：将T细胞与通过丝裂霉素C处理已知表达GPRC5D的抗原阳性肿瘤细胞获得的灭活的细胞共培养，且然后测量培养上清液中IFN-γ或IL-2的量。
5-10. 多特异性分子和双特异性分子的产生
用于制备本发明的多特异性分子和双特异性分子的方法的实例包括涉及将表达质粒引入宿主细胞、随后瞬时表达的方法，涉及将质粒引入宿主细胞且然后通过药物选择来选择稳定表达的细胞、随后组成型表达的方法，以及涉及通过上述任何方法制备相应的抗体或抗原结合片段且然后使用合成肽接头化学连接这些抗体或片段的方法。
至于单链抗体(scFv)，制备方法的实例包括涉及经由肽接头连接两个scFv (串联scFv)的方法，涉及交换两种特异性不同的抗体的相应结构域和通过非共价键形成二聚体(双抗体)的方法，涉及交换两种特异性不同的抗体的相应结构域和形成单链(单链双抗体)的方法，以及涉及制备单链双抗体且然后通过非共价键形成二聚体的方法(TandAb, 美国专利号7129330)。
本发明还提供了编码本发明的抗体或抗体的抗原结合片段的基因，或抗原的修饰形式等，具有基因的插入物的重组载体，用基因或载体转染的细胞，和甚至产生本发明的抗体的细胞。
6. 药物组合物
本发明提供了抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段，本发明的多核苷酸、载体、细胞和人工免疫细胞，和/或包含含有其中至少一种的分子作为活性成分的药物组合物(下文中，也称为本发明的药物组合物)。
本发明的药物组合物可用于治疗或预防与由于GPRC5D或其配体的过表达或GPRC5D突变或基因扩增而导致的GPRC5D信号异常或增加相关的各种疾病(下文称，这些疾病被称为“GPRC5D相关疾病”)，特别是各种癌症。
待治疗或预防的此类癌症的起始或恶化的原因的实例可以包括GPRC5D的高表达，GPRC5D基因的内含子中的单核苷酸多态性(SNP)，组成型活化GPRC5D的错义突变，以及GPRC5D基因的扩增或过表达。
而且，本发明的分子或本发明的药物组合物可以包括通过将免疫细胞诸如T细胞重新引导至所述细胞而对表达GPRC5D的细胞的细胞毒性。因此，本发明提供了用于通过将免疫细胞诸如T细胞重新引导至表达GPRC5D的细胞而诱导对所述细胞的细胞毒性的方法，其包括施用本发明的分子或本发明的药物组合物的步骤。
待用本发明的药物组合物治疗或预防的癌症类型的实例可以包括表达GPRC5D蛋白的癌症，例如，乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、胃癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、结肠直肠癌、食道癌、膀胱癌、子宫颈癌、血癌、淋巴瘤和恶性黑色素瘤。其优选实例可以包括表达GPRC5D蛋白的多发性骨髓瘤。
GPRC5D相关疾病的治疗或预防包括但不限于预防表达GPRC5D蛋白的个体中的疾病的发作，压制或抑制其恶化或进展，减轻患有疾病的个体表现出的一种或两种或更多种症状、压制或缓解其恶化或进展、治疗或预防患有疾病的个体中的继发性疾病等。
本发明的药物组合物可以包含治疗或预防有效量的抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段，和/或包含它们中的至少一种的分子作为活性成分，并且进一步含有药学上可接受的稀释剂、媒介物、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或添加剂。
术语“治疗或预防有效量”意指通过特定剂型和施用途径的方式发挥对特定疾病的治疗或预防作用的量，并且与“药理学有效量”可互换使用。
本发明的药物组合物可以包含用于改变、维持或保持组合物或其中包含的抗体的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、张力、无菌性或稳定性、溶解性、持续释放、吸收性、渗透性、剂型、强度、特性、形状等的材料(下文中，称为“药物材料”)。药物材料没有特别限制，只要该材料是药理学上可接受的即可。例如，无毒性或低毒性是这些药物材料优选具有的特性。
药物材料的实例可以包括但不限于以下：氨基酸，诸如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸和赖氨酸；抗微生物剂；抗氧化剂，诸如抗坏血酸、硫酸钠和亚硫酸氢钠；缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐或硼酸盐缓冲剂、碳酸氢钠和Tris-HCl溶液；填充剂，诸如甘露糖醇和甘氨酸；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；络合剂，诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精；增量剂，诸如葡萄糖、甘露糖和糊精；其他碳氢化合物，诸如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖和糊精；着色剂；矫味剂；稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；低分子量多肽；成盐抗衡离子；防腐剂，诸如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸和过氧化氢；溶剂，诸如甘油、丙二醇和聚乙二醇；糖醇，诸如甘露糖醇和山梨糖醇；混悬剂；表面活性剂，诸如PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯诸如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80、triton、氨丁三醇、卵磷脂和胆固醇；稳定性增强剂，诸如蔗糖和山梨糖醇；弹性增强剂，诸如氯化钠、氯化钾、甘露糖醇和山梨糖醇；转运剂；稀释剂；赋形剂；和/或药物添加剂。
添加的这些药物材料的量是抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段和/或包含它们中的至少一种的分子的重量的0.001至1000倍，优选0.01至100倍，更优选0.1至10倍。
在本发明的药物组合物中还包括包含包封在脂质体中的抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段和/或包含它们中的至少一种的分子的免疫脂质体，或包含含有与脂质体缀合的抗体的修饰的抗体形式的药物组合物(US专利号6214388等)。
赋形剂或媒介物没有特别限制，只要它们是液体或固体材料，并且是通常用于注射用水、盐水、人造脑脊液和用于口服或肠胃外施用的其他制剂中的物质。盐水的实例可以包括中性盐水和含血清白蛋白的盐水。
缓冲液的实例可以包括经调节以使药物组合物的最终pH值达到7.0至8.5的Tris缓冲液，经调节以使其最终pH值达到4.0至5.5的乙酸盐缓冲液，经调节以使其最终pH值达到5.0至8.0的柠檬酸盐缓冲液，和经调节以使其最终pH达到5.0至8.0的组氨酸缓冲液。
本发明的药物组合物是固体、液体、悬浮液等。本发明的药物组合物的另一个实例可以包括冷冻干燥的制备物。可以使用赋形剂诸如蔗糖形成冷冻干燥的制备物。
本发明的药物组合物的施用途径可以是肠内施用、局部施用和肠胃外施用中的任一种。其实例可以包括静脉内施用、动脉内施用、肌内施用、皮内施用、皮下施用、腹膜内施用、经皮施用、骨内施用和关节内施用。
这种药物组合物的组成可以根据施用方法、抗体对GPRC5D蛋白的结合亲和力等来确定。
本发明的药物组合物的剂量不受限制，只要剂量是药理学有效量即可。剂量可以根据个体的物种、疾病的类型、症状、性别、年龄、预先存在的状况、抗体对GPRC5D蛋白的结合亲和力或其生物活性以及其他因素来适当地确定。通常0.01至1000 mg/kg、优选0.1至100 mg/kg的剂量可以每天施用一次，进行180天的时段，或每天施用两次或三次或更多次。
药物组合物的形式的实例可以包括注射剂(包括冷冻干燥的制备物和滴剂)、栓剂、经鼻吸收制备物、经皮吸收制备物、舌下制剂、胶囊、片剂、软膏、颗粒剂、气溶胶、丸剂、粉剂、混悬剂、乳剂、滴眼剂和生物植入物制剂。
本发明的药物组合物可以与额外的药物同时或分开施用。例如，本发明的药物组合物可以在施用额外的药物之后施用，或者额外的药物可以在施用药物组合物之后施用。或者，药物组合物和额外的药物可以同时施用。额外的药物的实例可以包括各种抗癌剂，诸如化学治疗剂和放射治疗剂。这些情况统称为本发明的抗体的“与额外的药物的组合使用”。在本发明中还包括包含本发明的药物组合物的活性成分以及额外的药物的药物组合物。
本发明提供了用于治疗或预防GPRC5D相关疾病诸如癌症的方法，本发明的抗体用于制备用于治疗或预防疾病的药物组合物的用途，以及本发明的抗体用于治疗或预防疾病的用途。本发明还涵盖用于治疗或预防的试剂盒，其包含本发明的抗体。
[实施例]
在下文中，将参考实施例进一步具体描述本发明。然而，本发明不旨在限于它们。
根据"Molecular Cloning" (Sambrook, J., Fritsch, E.F.和Maniatis, T.,eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中描述的方法或本领域技术人员使用的其他实验手册中描述的方法或根据说明书手册使用市售试剂或试剂盒进行在以下实施例中与基因操作相关的程序，除非另有说明。
实施例1. 大鼠抗人GPRC5D抗体的制备
1)-1使用人GPRC5D表达载体的免疫
1)-1-1 人GPRC5D表达载体(pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D)的构建
使用Gateway Vector Convension System (Thermo Fisher Scientific Inc.)从pcDNA3.1(+)制备作为目的载体工程改造的pcDNA3.1-DEST。使用Gateway LR ClonaseEnzyme混合物(Life Technologies Corp.)将编码人GPRC5D蛋白(NP_061124.1)的cDNA克隆至pcDNA3.1-DEST载体中，以构建人GPRC5D表达载体pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D。为了大规模制备人GPRC5D表达载体，使用Endofree Plasmid Giga试剂盒(Qiagen N.V.)。
1)-1-2 大鼠免疫
对于免疫，使用WKY/Izm雌性大鼠(Japan SLC, Inc.)。首先，用透明质酸酶(Sigma-Aldrich Corp.)预处理每只大鼠的两个小腿。然后，将pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D肌内注射至这些部位。随后，使用ECM830 (BTX)和针电极实施这些部位的体内电穿孔。每近似两周重复与上述相同的体内电穿孔一次。然后，从大鼠收集淋巴结或脾脏并用于杂交瘤制备。
1)-2 杂交瘤制备
使用LF301细胞融合单元(BEX Co., Ltd.)将淋巴结细胞或脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14细胞(ATCC, No. CRL-1 581)电融合。用ClonaCell-HY选择培养基D (StemCellTechnologies Inc.)稀释融合的细胞并培养。回收出现的杂交瘤集落，由此制备单克隆杂交瘤。使用ClonaCell-HY选择培养基E(StemCell Technologies Inc.)培养因此回收的每个杂交瘤集落，并将获得的杂交瘤培养上清液用于筛选产生抗人GPRC5D抗体的杂交瘤。
1)-3通过细胞-ELISA的抗体筛选
1)-3-1 通过细胞-ELISA的初级筛选
将细胞系HEK293α细胞(用整联蛋白αv和整联蛋白β3表达载体稳定转染的HEK293细胞)在含有10% FBS的DMEM培养基中调节至5 × 105个细胞/mL。使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific Inc.)根据转染程序向其中转染pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D或对照pcDNA3.1-DEST。将所得细胞以100 μL/孔的量分配至96孔板(Corning Inc.)中，并在含有10% FBS的DMEM培养基中在37℃、5% CO2条件下培养过夜。获得的转染细胞以附着状态用于细胞-ELISA中。
1)-3-2 细胞-ELISA
在从实施例1)-1-1中制备的表达载体转染的HEK293α细胞除去培养上清液之后，将每种杂交瘤培养上清液添加至pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D或pcDNA3.1-DEST-转染的HEK293α细胞中，并将该板在4℃下静置1小时。孔中的细胞用含有5% FBS的PBS洗涤一次。然后，向其中添加用含有5% FBS的PBS稀释500倍的抗大鼠IgG、HRP连接的全Ab山羊(GE HealthcareBio-Sciences Corp.)，并将该板在4℃下静置1小时。孔中的细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次。然后，向其中以100 μL/孔的浓度添加OPD显色溶液(OPD溶液(分别以0.4 mg/mL和0.6% (v/v)的浓度溶解于0.05 M柠檬酸三钠和0.1M磷酸氢二钠十二水合物(pH 4.5)中的邻苯二胺二盐酸盐(Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.)和H2O2)。在偶尔搅拌下进行显色反应，并通过以100 μL/孔的浓度添加1M HCL来终止。然后，使用读板器(ENVISION;PerkinElmer, Inc.)在490 nm处测量吸光度。为了选择产生特异性结合细胞膜表面上表达的人GPRC5D的抗体的杂交瘤，选择产生表现出对于pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D表达载体转染的HEK293α与对照的pcDNA3.1-DEST-转染的HEK293α细胞相比更高的吸光度的培养上清液的杂交瘤作为抗人GPRC5D抗体产生阳性杂交瘤。
1)-4 通过流式细胞术筛选抗体
1)-4-1制备表达抗原基因的细胞用于流式细胞术分析
将HEK293T细胞(Thermo Fisher Scientific Inc.)以4 × 105个细胞/mL的浓度接种至225-cm2烧瓶中，并在含有10% FBS的DMEM培养基中在37℃、5% CO2条件下培养过夜。第二天，使用Lipofectamine LTX (Thermo Fisher Scientific Inc.)将pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D或对照pcDNA3.1-DEST转染至HEK293T细胞，并将细胞在37℃、5% CO2条件下进一步培养过夜。第二天，表达载体转染的HEK293T细胞用TrypLE Express (Thermo FisherScientific Inc.)处理，用含有10% FBS的DMEM洗涤，且然后在含有5% FBS的FBS中调节至5× 106个细胞/mL的浓度。获得的细胞悬浮液用于流式细胞术分析中。
1)-4-2流式细胞术分析
通过流式细胞术进一步证实通过实施例1)-3中的细胞-ELISA确定为阳性的每种杂交瘤产生的抗体的人GPRC5D结合特异性。将实施例1)-4-1中制备的每种HEK293T细胞悬浮液以100 μL/孔的浓度接种至96孔U形底微孔板中并离心以除去上清液。通过添加杂交瘤培养上清液使pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D转染的HEK293T细胞或pcDNA3.1-DEST-转染的HEK293T细胞悬浮，并在4℃下静置1小时。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤一次，然后通过添加用含有5% FBS的PBS稀释100倍的PE山羊抗大鼠抗体(BD)悬浮，并在4℃下静置30分钟。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，且然后重悬浮于含有5% FBS的PBS中，随后使用流式细胞仪(FACSCanto(TM) II:BD)检测。使用Flowjo (Tree Star, Inc.)分析数据。将细胞级分的PE荧光强度绘制成柱状图。选择产生在pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D转染的HEK293T细胞的柱状图中表现出与对照pcDNA3.1-DEST-转染的HEK293T细胞的荧光强度柱状图相比向更强的荧光强度移位的样品的杂交瘤作为产生抗人GPRC5D抗体的杂交瘤。
1)-5通过ADCC测定的抗体筛选
1)-5-1稳定表达β-半乳糖苷酶的细胞的制备
根据所附方案，用pLenti6/V5-GW/LacZ和ViraPower(TM)包装混合物(Thermo FisherScientific Inc.)转染HEK293FT细胞(Thermo Fisher Scientific Inc.)，以制备表达β-半乳糖苷酶基因的重组慢病毒。根据ViraPower慢病毒表达系统(Thermo FisherScientific Inc.)的方案，通过获得的重组慢病毒感染HEK293T细胞。使用10 μg/mL杀稻瘟菌素(Thermo Fisher Scientific Inc.)选择病毒感染的细胞，以获得稳定表达β-半乳糖苷酶的株系。这些稳定表达β-半乳糖苷酶的HEK293T细胞(下文称为“293T-lacZ细胞”)用作ADCC活性的测定中的靶细胞。
1)-5-2靶细胞的制备
将实施例1)-5-1中获得的293T-lacZ细胞以5 × 105个细胞/mL的浓度接种至75-cm2烧瓶中，并在含有10% FBS的DMEM培养基中在37℃、5% CO2条件下培养过夜。第二天，使用Lipofectamine LTX (Thermo Fisher Scientific Inc.)将pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D或对照pcDNA3.1-DEST转染至293T-lacZ细胞，并将细胞在37℃、5% CO2条件下进一步培养过夜。第二天，表达载体转染的293T-lacZ细胞用TrypLE Express (Thermo Fisher ScientificInc.)处理，并用含有5% FBS的无酚红RPMI1640培养基(Thermo Fisher Scientific Inc.)(下文中，被称为“ADCC的培养基”)洗涤两次。通过台盼蓝染料排除测试计数活细胞数。将细胞在ADCC的培养基中重悬浮至1 × 105个细胞/mL，并用作靶细胞。
1)-5-3效应细胞的制备
将根据标准方法使用Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)从志愿者的血液收集的人外周血单核细胞(PBMC)悬浮于含有10% FBS的无酚红RPMI1640培养基(Thermo Fisher Scientific Inc.)中，离心，且然后重悬浮。通过台盼蓝染料排除测试计数活细胞数。在离心之后，除去培养基，并将细胞悬浮并在ADCC的培养基中调节至2 ×106个细胞/mL，并用作效应细胞。
1)-5-4杂交瘤培养上清液的制备
实施例1)-4中获得的每种产生大鼠抗GPRC5D抗体的杂交瘤培养物上清液的浓度使用FastELISA IgG ELISA定量试剂盒(RD-Biotech)测量，并用ClonaCell-HY选择培养基E(StemCell Technologies Inc.)调节至10μg/mL(最终浓度)。
1)-5-5 ADCC测定
将实施例1)-5-2中获得的293T-lacZ细胞以50μl/孔的浓度添加至96孔U形底微孔板中。向其中以50 μl/孔的浓度添加调节至10 μg/mL(最终浓度)的用于阳性对照的实施例1)-5-4中制备的每种杂交瘤培养上清液或小鼠抗GPRC5D IgG2b抗体(R&D Systems, Inc.)或用于阴性对照的小鼠对照抗体(mIgG2b) (R&D Systems, Inc.)，并将该板在4℃下静置1小时。进一步向其中以50 μl/孔的浓度添加实施例1)-5-3中制备的效应细胞。将该板在室温下以1200 rpm离心5分钟，随后在5% CO2条件下在37℃下培养18小时。将每孔中50 μl上清液回收至白板(Corning Inc.)中。向其中以50 μl/孔的量添加β-Glo测定系统(PromegaCorp.)的溶液。使用读板器(ENVISION; PerkinElmer, Inc.)测量发光强度。根据以下表达式计算通过ADCC活性裂解的细胞的百分比：
裂解的细胞的百分比(%) = (A - B) / (C - B) × 100
A：样品孔的计数
B：自发释放(既不补充有抗体、也不补充有效应细胞的孔)计数的平均值(n = 3)。在添加杂交瘤培养上清期间和添加效应细胞期间，添加50 μL ADCC的培养基。否则，进行与样品孔相同的操作。
C：最大释放(含有在表面活性剂中裂解的靶细胞的孔)计数的平均值(n = 3)。在添加杂交瘤培养上清期间和添加效应细胞期间，添加50 μL ADCC的培养基。对于该测定，将150 μL的Glo-Glo测定系统溶液添加至含有细胞的每个孔中并与其混合。将其100 μL等分试样添加至白板中以实施测定。
根据上述方法计算针对pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D转染的293T-lacZ细胞或pcDNA3.1-DEST转染的293T-lacZ细胞的ADCC活性，以选择表现出对pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D-转染的293T-lacZ细胞特异性的ADCC活性和产生表现出ADCC活性高于阳性对照抗体的ADCC活性的抗体的杂交瘤克隆。
1)-6抗体的同种型分析
提示强烈结合人GPRC5D并且在实施例1)-5中具有高ADCC活性的2A4、2B1和7B4选自实施例1)-4中获得的产生大鼠抗GPRC5D抗体的杂交瘤，并通过抗体同种型分析来鉴定。使用大鼠单克隆同种型分析测试试剂盒(AbD Serotec)确定同种型。作为结果，证实大鼠抗GPRC5D单克隆抗体2A4、2B1和7B4的所有同种型都是IgG2b和κ链。
1)-7单克隆抗体的制备
从杂交瘤培养上清液纯化大鼠抗GPRC5D单克隆抗体。首先，使产生2A4、2B1和7B4的杂交瘤在ClonaCell-HY选择培养基E(StemCell Technologies Inc.)中生长至足够量。然后，用补充有20%超低IgG FBS(Thermo Fisher Scientific Inc.)的含有5 μg/mL庆大霉素(Thermo Fisher Scientific Inc.)的杂交瘤SFM (Thermo Fisher Scientific Inc.)替代培养基，随后培养5天。回收该培养上清液，并用0.45 μm过滤器除菌。
通过蛋白G亲和色谱(在4至6℃下)在一步中从杂交瘤上清液纯化每种抗体。蛋白G亲和色谱纯化之后的缓冲液替代步骤在4至6℃下实施。首先，将杂交瘤培养上清液应用至用PBS平衡的用蛋白G(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)包装的柱。在整个培养上清液溶液进入柱中之后，用PBS以柱体积的两倍或更多倍的量洗涤柱。接下来，通过用0.1 M甘氨酸/盐酸(pH 2.7)的水溶液洗脱来收集含有抗体的级分。将收集的级分通过添加1 M Tris-HCl (pH 9.0)调节至pH 7.0至7.5。然后，使用Centrifugal UF Filter DeviceVIVASPIN20 (分子量截止值：UF30K，Sartorius Japan K.K.，4至6℃)用HBSor (25 mM组氨酸/5%山梨糖醇，pH6.0)替代缓冲液，同时将抗体浓缩并且调节至1 mg/mL或更高的抗体浓度。最后，通过Minisart-Plus过滤器(Sartorius Japan K.K.)过滤浓缩液并用作纯化的样品。
实施例2. 大鼠抗GPRC5D抗体(2A4、2B1和7B4)的体外评估
2)-1通过流式细胞术研究获得的大鼠抗GPRC5D抗体(2A4、2B1和7B4)对人GPRC5D的结合活性
将表达GPRC5D的人多发性骨髓瘤细胞系KHM-1B细胞(JCRB Cell Bank)用含有5% FBS的PBS调节至5 × 106个细胞/mL的浓度，以100 μL/孔的量接种至96孔U形底微孔板中，并离心以除去上清液。向其中以100 μL/孔的量添加实施例1)-7中调节至0.32 ng/mL至10 μg/mL的每种大鼠抗GPRC5D抗体(2A4、2B1和7B4)，并将该板在4℃下静置1小时。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次。然后，向其中以100 μL/孔的浓度添加用含有5% FBS的PBS稀释100倍的PE山羊抗大鼠Ab (Becton, Dickinson and Company)，并将该板在4℃静置1小时。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，且然后重悬浮于含有5% FBS的PBS中，随后使用流式细胞仪(FACSCanto(TM) II; Becton, Dickinson and Company)检测。使用Flowjo (TreeStar, Inc.)分析数据。将细胞级分的PE荧光强度绘制成柱状图，并计算平均荧光强度(MFI)。如图1中所示，发现2A4、2B1和7B4结合人GPRC5D (2A4 MFI (max)：1153，2A4 Kd：0.5nM，2B1 MFI (max)：2386，2B1 Kd：14.8 nM，7B4 MFI (max)：2492，7B4 Kd：1.3 nM)。还使用表达GPRC5D的人多发性骨髓瘤细胞系KMS-34细胞(JCRB Cell Bank)实施流式细胞术，并产生类似的结果(2A4 MFI (max)：2064，2A4 Kd：1.4 nM，2B1 MFI (max)：3157，2B1 Kd：12.7nM，7B4 MFI (max)：4471，7B4 Kd：2.1 nM)。
2)-2获得的大鼠抗GPRC5D抗体(2A4、2B1和7B4)的表位的鉴定
2)-2-1通过ELISA鉴定表位
使用具有生物素化的羧基末端肽且缺乏分子内形成的二硫键的人GPRC5D氨基末端肽MYKDCIESTGDYFLLCDAEGPWGIILE(生物素)-NH2 (Sigma-Aldrich Corp.)(序列表的SEQ IDNO:1；图2)和具有含有赖氨酸的生物素化的羧基末端且具有分子内形成的二硫键的人GPRC5D氨基末端肽MYKDCIESTGDYFLLCDAEGPWGIILE-K(Biotin)-NH2 (Peptide Institute,Inc.)(序列表的SEQ ID NO:2；图3)鉴定由获得的大鼠抗GPRC5D抗体(2A4、2B1和7B4)结合的表位。将用PBS稀释的各肽添加至Nunc Immobilizer (Thermo Fisher ScientificInc.)中，并将该板在室温下静置1小时。在用PBST洗涤三次之后，向其中添加含有1% BSA的FBS，并将该板在室温下静置1小时。在用PBST洗涤三次之后，向其中添加实施例1)-7中制备且用PBS稀释至0.1 ng/mL至1 μg/mL的每种大鼠抗GPRC5D抗体(2A4、2B1和7B4)，并将该板在室温下静置1小时。在用PBST洗涤三次之后，向其中添加用PBS稀释500倍的抗大鼠IgG、HRP连接的全山羊抗体(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)，并将该板在室温下静置1小时。在用PBST洗涤三次之后，向其中添加SuperSignal(TM) ELISA Pico化学发光底物(Thermo Fisher Scientific Inc.)，并使用读板器(ENVISION; PerkinElmer, Inc.)测量发光。作为结果，2B1抗体结合人GPRC5D的氨基末端肽序列，而2A4和7B4抗体不与其结合，无论是否二硫键的存在或不存在。这些结果表明，2B1抗体的表位存在于人GPRC5D的氨基末端区域，而2A4和7B4抗体的表位存在于除了氨基末端以外的区域。
2)-2-2通过流式细胞术鉴定表位
将表达GPRC5D的人多发性骨髓瘤细胞系KMS-34细胞用含有5% FBS的PBS调节至2 ×106个细胞/mL的浓度，以100 μL/孔的量接种至96孔U形底微孔板中，并离心以除去上清液。向其中以100 μL/孔的量添加实施例1)-7中调节至7.5 μg/mL的每种大鼠抗GPRC5D抗体(2A4、2B1和7B4)，或大鼠IgG2b同种型对照抗体(Medical & Biological LaboratoriesCo., Ltd. (MBL))。将实施例2)-2-1中使用的两种类型的肽各自用PBS调节至17 ng/mL至34 μg/mL，并以100 μL/孔的量添加至含有抗体稀释液的孔中，并且将该板在4℃下静置1小时。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次。然后，向其中以100 μL/孔的量添加用含有5% FBS的PBS稀释100倍的PE山羊抗大鼠Ab (Becton, Dickinson and Company)，并将该板在4℃静置1小时。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，且然后重悬浮于含有5% FBS的PBS中，随后使用流式细胞仪(FACSCanto(TM) II; Becton, Dickinson and Company)检测。使用Flowjo (Tree Star, Inc.)分析数据。将细胞级分的PE荧光强度绘制成柱状图，并计算平均荧光强度(MFI)。从GPRC5D抗体的MFI值减去对照抗体的MFI值，以计算MFI的相对值(rMFI)。如图4中所示(分子内二硫键存在(A)或不存在(B))，发现2B1的结合通过添加人GPRC5D的氨基末端肽而被抑制，无论是否二硫键的存在或不存在。相反，发现2A4和7B4抗体的结合不通过人GPRC5D的氨基末端肽而被抑制。这些结果表明，2B1抗体的表位存在于人GPRC5D的氨基末端区域，而2A4和7B4抗体的表位存在于除了氨基末端以外的区域。
2)-3获得的大鼠抗GPRC5D抗体(2A4、2B1和7B4)的ADCC活性评估
2)-3-1靶细胞的制备
将人多发性骨髓瘤细胞系KHM-1B细胞用含有10% FBS的RPMI1640培养基(ThermoFisher Scientific Inc.)调节至2 × 106个细胞/mL的浓度。每mL细胞悬浮液添加100 μL铬-51放射性核素(PerkinElmer, Inc.)，并将细胞在37℃下在5% CO2条件下培养2小时。将细胞用含有10% FBS的RPMI1640培养基洗涤三次，然后在含有10% FBS的RPMI1640培养基中重悬浮至2 × 105个细胞/mL，并用作靶细胞。
2)-3-2效应细胞的制备
将实施例1)-5-3中制备的PBMC使用BINKIT (Biotherapy Institute of Japan)分化为NK细胞。将NK细胞用含有10% FBS的RPMI1640培养基调节至1 × 106个细胞/mL，并用作效应细胞。
2)-3-3 ADCC测定
将实施例2)-3-1中制备的KHM-1B细胞以50 μL/孔的浓度添加至96孔U形底微孔板中。向其中以50 μL/孔的量添加调节至0.5081 ng/mL至10 μg/mL(最终浓度)的每种获得的大鼠抗GPRC5D抗体(2A4、2B1和7B4)和大鼠对照抗体(rIgG2b)，并将该板在4℃下静置30分钟。进一步向其中以100 μL/孔的量添加实施例2)-3-2中制备的效应细胞。在室温下以1200rpm离心3分钟之后，将细胞在37℃下在5% CO2条件下培养4小时。将50 μL上清液的等分试样回收至LumaPlate (PerkinElmer, Inc.)中并在50℃下干燥过夜，随后使用读板器(TopCount; PerkinElmer, Inc.)进行测量。根据实施例1)-5-5计算通过ADCC活性裂解的细胞的百分比。如图5中所示，发现2A4、2B1和7B4具有ADCC活性。
实施例3. 编码大鼠抗GPRC5D抗体(2A4、2B1和7B4)的可变区的cDNA的测序
3)-1 编码2A4的可变区的cDNA的测序
3)-1-1从产生2A4的杂交瘤制备总RNA
为了扩增编码2A4的可变区的cDNA，使用TRIzol试剂(Ambion/Thermo FisherScientific Inc.)从产生2A4的杂交瘤制备总RNA。
3)-1-2 cDNA (5'-RACE-Ready cDNA)的合成
使用近似1μg实施例3)-1-1中制备的总RNA和SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)合成cDNA (5'-RACE-Ready cDNA)。
3)-1-3 通过5'-RACE PCR扩增和测序编码2A4的重链可变区的cDNA
用于PCR扩增2A4的重链基因的编码可变区的cDNA的引物是具有UPM (通用引物A 混合物；附着于SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒)和5'-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3'(RG2AR3:SEQ ID NO:3(图6))的序列的寡核苷酸。使用的UPM附着于SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，而RG2AR3由登记在数据库中的大鼠重链恒定区的序列设计。
通过5'-RACE PCR使用该引物组和作为模板的实施例3)-1-2中合成的cDNA (5'-RACE-Ready cDNA)，扩增编码2A4的重链可变区的cDNA。根据SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)的手册，在Touchdown PCR程序上实施该PCR。
通过5'-RACE PCR扩增的编码重链可变区的cDNA使用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen N.V.)纯化，且然后使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen Corp.)克隆。对克隆的编码重链可变区的cDNA的核苷酸序列进行序列分析。
测定的编码2A4的重链可变区的cDNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:4(图8)中，且其氨基酸序列显示于SEQ ID NO:5 (图9)中。
3)-1-4 通过5'-RACE PCR扩增和测序编码2A4的轻链可变区的cDNA
用于PCR扩增2A4的轻链基因的编码可变区的cDNA的引物是具有UPM (通用引物A 混合物；SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒所附)和5'-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3'(RKR5:SEQ ID NO:10(图7))的序列的寡核苷酸。使用的UPM附着于SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，而RKR5由登记在数据库中的大鼠轻链恒定区的序列设计。
通过5'-RACE PCR使用该引物组和作为模板的实施例3)-1-2中合成的cDNA (5'-RACE-Ready cDNA)，扩增编码2A4的轻链可变区的cDNA。根据SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)的手册，在Touchdown PCR程序上实施该PCR。
通过5'-RACE PCR扩增的编码轻链可变区的cDNA使用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen N.V.)纯化，且然后使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen Corp.)克隆。对克隆的编码轻链可变区的cDNA的核苷酸序列进行序列分析。
测定的编码2A4的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:11(图14)中，且其氨基酸序列显示于SEQ ID NO:12 (图15)中。
3)-2 编码2B1的可变区的cDNA的测序
以与实施例3)-1中相同的方式测定序列。
测定的编码2B1的重链可变区的cDNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:6(图10)中，且其氨基酸序列显示于SEQ ID NO:7 (图11)中。编码轻链可变区的cDNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:13(图16)中，且其氨基酸序列显示于SEQ ID NO:14 (图17)中。
3)-3 编码7B4的可变区的cDNA的测序
以与实施例3)-1中相同的方式测定序列。
测定的编码7B4的重链可变区的cDNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:8(图12)中，且其氨基酸序列显示于SEQ ID NO:9 (图13)中。编码轻链可变区的cDNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:15(图18)中，且其氨基酸序列显示于SEQ ID NO:16 (图19)中。
实施例4. 人嵌合抗GPRC5D抗体(c2A4、c2B1和c7B4)的制备
4)-1 嵌合和人源化轻链表达载体pCMA-LK的构建
用限制性酶XbaI和PmeI消化质粒pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen Corp.)。使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)将获得的近似5.4 kb的片段与包含编码人轻链分泌信号和人κ链恒定区的DNA序列(显示于序列表的SEQ ID NO:17(图20)中)的DNA片段融合，以制备pcDNA3.3/LK。
使用如下所示的引物组，以pcDNA3.3/LK作为模板进行PCR。将获得的近似3.8 kb的片段磷酸化，且然后自连接以构建具有CMV启动子下游的编码信号序列、克隆位点和人κ链恒定区的核苷酸序列的嵌合和人源化轻链表达载体pCMA-LK。
引物组
5'-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3' (3.3-F1：序列表的SEQ ID NO:18；图21)
5'-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3' (3.3-R1：序列表的SEQ ID NO:19；图22)。
4)-2嵌合和人源化IgG1型重链表达载体pCMA-G1的构建
pCMA-LK用XbaI和PmeI消化。使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(ClontechLaboratories, Inc.)将除了编码轻链分泌信号和人κ链恒定区的DNA序列以外的获得的DNA片段与包含编码人重链信号序列和人IgG1恒定区的氨基酸的DNA序列(显示于序列表的SEQ ID NO:20(图23)中)的DNA片段融合，以构建具有CMV启动子下游的编码信号序列、克隆位点和人IgG1重链恒定区的核苷酸序列的嵌合和人源化IgG1型重链表达载体pCMA-G1。
4)-3 c2A4轻链表达载体的构建
通过PCR使用作为模板的实施例3)中获得的编码2A4轻链可变区的cDNA和下面所示的引物组，扩增包含编码轻链可变区的cDNA的DNA片段，并使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)插入嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK的限制性酶BsiWI切割的位点中以构建c2A4轻链表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA-LK/c2A4"。c2A4轻链的核苷酸序列和该轻链的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQID NO:21和22(图24和25)中。
用于c2A4轻链的引物组
5'-ATCTCCGGCGCGTACGGCGACATCCAGATGACACAGTCTCCAGC-3' (c2A4-LF：序列表的SEQID NO:23；图26)
5'-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAATTCCAGCTTGGTGCCTC-3' (c2A4-LR：序列表的SEQID NO:24；图27)。
4)-4 c2A4重链表达载体的构建
通过PCR使用作为模板的实施例3)中获得的编码2A4重链可变区的cDNA和下面所示的引物组，扩增包含编码重链可变区的cDNA的DNA片段，并使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)插入嵌合和人源化抗体重链表达载体pCMA-G1的限制性酶BIpI切割的位点中以构建c2A4重链表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA-G1/c2A4"。c2A4重链的核苷酸序列和该重链的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQ ID NO:25和26(图28和29)中。
用于c2A4重链的引物组
5'-CCAGATGGGTGCTGAGCCAGGTCCAGTTGCAGCAATCTGGAGCTG-3' (c2A4-HF：序列表的SEQID NO:27；图30)
5'-CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACTGTGACCATGACTCCTTGGCCCCAG-3' (c2A4-HR：序列表的SEQID NO:28；图31)。
4)-5 c2B1轻链表达载体的构建
通过PCR使用作为模板的实施例3)中获得的编码2B1轻链可变区的cDNA和下面所示的引物组，扩增包含编码轻链可变区的cDNA的DNA片段。以与实施例4)-3中相同的方式构建c2B1轻链表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA-LK/c2B1"。c2B1轻链的核苷酸序列和该轻链的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQ ID NO:29和30(图32和33)中。
用于c2B1轻链的引物组
5'-ATCTCCGGCGCGTACGGCGAAACTGTGATGACCCAGTCTCCCAC-3' (c2B1-LF：序列表的SEQID NO:31；图34)
5'-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAATTCCAGCTTGGTGCCTC-3' (c2B1-LR：序列表的SEQID NO:32；图35)。
4)-6 c2B1重链表达载体的构建
通过PCR使用作为模板的实施例3)中获得的编码2B1重链可变区的cDNA和下面所示的引物组，扩增包含编码重链可变区的cDNA的DNA片段。以与实施例4)-4中相同的方式构建c2B1重链表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA-G1/c2B1"。c2B1重链的核苷酸序列和该重链的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQ ID NO:33和34(图36和37)中。
用于c2B1重链的引物组
5'-CCAGATGGGTGCTGAGCCAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTG-3' (c2B1-HF：序列表的SEQID NO:35；图38)
5'-CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACAGTGACCAGAGTGCCTTGGCCCCAG-3' (c2B1-HR：序列表的SEQID NO:36；图39)。
4)-7 c7B4轻链表达载体的构建
通过PCR使用作为模板的实施例3)中获得的编码7B4轻链可变区的cDNA和下面所示的引物组，扩增包含编码轻链可变区的cDNA的DNA片段。以与实施例4)-3中相同的方式构建c7B4轻链表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA-LK/c7B4"。c7B4轻链的核苷酸序列和该轻链的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQ ID NO:37和38(图40和41)中。
用于c7B4轻链的引物组
5'-ATCTCCGGCGCGTACGGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTC-3' (c7B4-LF：序列表的SEQID NO:39；图42)
5'-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAGTTCCAGCTTGGTCCCAG-3' (c7B4-LR：序列表的SEQID NO:40；图43)。
4)-8 c7B4重链表达载体的构建
通过PCR使用作为模板的实施例3)中获得的编码7B4重链可变区的cDNA和下面所示的引物组，扩增包含编码重链可变区的cDNA的DNA片段。以与实施例4)-4中相同的方式构建c7B4重链表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA-G1/c7B4"。c7B4重链的核苷酸序列和该重链的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQ ID NO:41和42(图44和45)中。
用于c7B4重链的引物组
5'-CCAGATGGGTGCTGAGCGAGATACACCTGCAGGAGTCAGGACCTG-3' (c7B4-HF：序列表的SEQID NO:43；图46)
5'-CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACAGTGACTGAAGCTCCTTGACCCCAG-3' (c7B4-HR：序列表的SEQID NO:44；图47)。
4)-9 人嵌合抗GPRC5D抗体的制备
4)-9-1 人嵌合抗GPRC5D抗体的产生
将FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corp.)根据手册进行亚培养和培养。将对数生长期中的1.2 × 109个FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corp.)接种至3-L FernbachErlenmeyer烧瓶(Corning Inc.)，通过用FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen Corp.)稀释至2.0 × 106个细胞/ml，且然后在8% CO2培养箱中在37℃下以90 rpm振荡培养1小时。将1.8 mg聚乙烯亚胺(Polysciences #24765)溶解于20 ml Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corp.)中。接下来，将使用NucleoBond Xtra (Takara Bio Inc.)制备的每种重链表达载体(0.24 mg)和轻链表达载体(0.36 mg)添加至20 ml Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corp.)中。将20 ml表达载体/Opti-Pro SFM混合溶液添加至20 ml聚乙烯亚胺/Opti-Pro SFM混合溶液中，并将混合物轻轻搅拌，保持静置5分钟，且然后添加至FreeStyle 293F细胞。将细胞在8% CO2培养箱中在37℃下以90 rpm振荡培养4天。然后，向其中添加600 ml EX-CELL VPRO培养基(SAFC Biosciences Inc.)、18 ml GlutaMAX I(Gibco/Thermo Fisher Scientific Inc.)和30 ml Yeastolate Ultrafiltrate (Gibco/Thermo Fisher Scientific Inc.)。将细胞在8% CO2培养箱中在37℃下以90 rpm振荡培养7天，并将获得的培养上清液过滤通过一次性胶囊过滤器(Advantec #CCS-045-E1H)。
通过pCMA-G1/c2A4和pCMA-LK/c2A4的组合获得的人嵌合2A4被命名为"c2A4"。通过pCMA-G1/c2B1和pCMA-LK/c2B1的组合获得的人嵌合2B1被命名为"c2B1"。通过pCMA-G1/c7B4和pCMA-LK/c7B4的组合获得的人嵌合7B4被命名为"c7B4"。
4)-9-2 人嵌合抗GPRC5D抗体的纯化
通过rProtein A亲和色谱(在4至6℃下)在一步中从实施例4)-9-1中获得的培养上清液纯化每种抗体。rProtein A亲和色谱纯化之后的缓冲液替代步骤在4至6℃下实施。将培养上清液应用至用PBS平衡的用MabSelectSuRe(由GE Healthcare Bio-Sciences Corp.制造)包装的柱。在整个培养溶液进入柱中之后，用PBS以柱体积的两倍或更多倍的量洗涤柱。接下来，通过用2 M精氨酸盐酸盐溶液(pH 4.0)洗脱来收集含有抗体的级分。将收集的级分通过透析(Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)用HBSor (25 mM组氨酸/5%山梨糖醇，pH 6.0)缓冲液替代。将抗体浓缩，并使用CentrifugalUF Filter Device VIVASPIN20(分子量截止值：UF10K, Sartorius Japan K.K.，4℃)调节至10 mg/ml或更高的IgG浓度，并用作纯化的样品。最后，将该纯化的样品过滤通过Minisart-Plus过滤器(Sartorius Japan K.K.)。
实施例5. 人嵌合抗GPRC5D抗体(c2A4、c2B1和c7B4)的体外活性
5)-1通过流式细胞术研究人嵌合抗GPRC5D抗体(c2A4、c2B1和c7B4)对人GPRC5D的结合性质
将表达GPRC5D的人多发性骨髓瘤细胞系KHM-1B细胞用含有5% FBS的PBS调节至5 ×106个细胞/mL的浓度，以100 μL/孔的量接种至96孔U形底微孔板中，并离心以除去上清液。向其中以100 μL/孔的量添加调节至1.2 ng/mL至40 μg/mL的每种人嵌合抗GPRC5D抗体(c2A4、c2B1和c7B4)或人IgG同种型对照抗体(Calbiochem/Merck Millipore Corp.)，并将该板在4℃下静置1小时。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次。然后，向其中以100 μl/孔的量添加用含有5% FBS的PBS稀释100倍的R-藻红蛋白AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)，并将该板在4℃下静置1小时。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，且然后重悬浮于含有5% FBS的PBS中，随后使用流式细胞仪(FACSCanto(TM) II; Becton, Dickinson and Company)检测。使用Flowjo(Tree Star, Inc.)分析数据。将细胞级分的PE荧光强度绘制成柱状图，并计算平均荧光强度(MFI)。从GPRC5D抗体的MFI值减去对照抗体的MFI值，以计算MFI的相对值(I)。如图48中所示，发现c2A4、c2B1和c7B4结合人GPRC5D。
5)-2对人嵌合抗GPRC5D抗体(c2A4、c2B1和c7B4)与食蟹猴GPRC5D的交叉反应性的研究
5)-2-1 食蟹猴GPRC5D表达载体(pcDNA3.1-DEST-cGPRC5D)的构建
使用Gateway LR Clonase Enzyme混合物(Life Technologies Corp.)将编码食蟹猴GPRC5D蛋白(XP_005570249.1)的cDNA克隆至实施例1)-1-1中制备的pcDNA3.1-DEST载体中，以构建食蟹猴GPRC5D表达载体pcDNA3.1-DEST-cGPRC5D。为了大规模制备食蟹猴GPRC5D表达载体，使用Endofree Plasmid Giga试剂盒(Qiagen N.V.)。
5)-2-2 表达食蟹猴GPRC5D的细胞系的制备
使用含有10% FBS的RPMI1640培养基将不表达人GPRC5D的多发性骨髓瘤细胞系KMS-11(JCRB Cell Bank)以3.7 × 105个细胞/mL的浓度接种至75-cm2烧瓶中。将pcDNA3.1-DEST-cGPRC5D使用Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.)转染至KMS-11细胞中，并将细胞在5% CO2条件下在37℃下培养2天。将培养的表达载体转染的KMS-11细胞以1× 106个细胞/mL的浓度在含有10% FBS和1 mg/mL遗传霉素(Thermo Fisher ScientificInc.)的RPMI1640培养基中培养，用于药物筛选。通过有限稀释方法使用含有1 mg/mL遗传霉素(Thermo Fisher Scientific Inc.)的ClonaCell-HY选择培养基E培养基(StemCellTechnologies Inc.)制备大量细胞作为单克隆，以建立表达食蟹猴GPRC5D的多发性骨髓瘤细胞系KMS-11_cGPRC5D。
5)-2-3 通过流式细胞术研究人嵌合抗GPRC5D抗体(c2A4、c2B1和c7B4)对食蟹猴GPRC5D的结合性质
将实施例5)-2-2中制备的KMS-11_cGPRC5D细胞用含有5% FBS的PBS调节至5 × 106个细胞/mL的浓度，以100 μL/孔的量接种至96孔U形底微孔板中，并离心以除去上清液。向其中以100 μL/孔的量添加调节至1.2 ng/mL至40 μg/mL的每种人嵌合抗GPRC5D抗体(c2A4、c2B1和c7B4)或人IgG同种型对照抗体(Calbiochem/Merck Millipore Corp.)，并将该板在4℃下静置1小时。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次。然后，向其中以100 μl/孔的量添加用含有5% FBS的PBS稀释100倍的R-藻红蛋白AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)，并将该板在4℃下静置1小时。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，且然后重悬浮于含有5% FBS的PBS中，随后使用流式细胞仪(FACSCanto(TM) II; Becton, Dickinson and Company)检测。使用Flowjo (TreeStar, Inc.)分析数据。将细胞级分的PE荧光强度绘制成柱状图，并计算平均荧光强度(MFI)。从GPRC5D抗体的MFI值减去对照抗体的MFI值，以计算MFI的相对值(rMFI)。如图49中所示，发现c2A4、c2B1和c7B4结合食蟹猴GPRC5D。结合人GPRC5D和食蟹猴GPRC5D的抗体等可以使用对于药物产品的非临床开发(临床前开发)有用的灵长类动物、特别是食蟹猴进行对效力或安全性的各种测试，并且因此是优选的。此外，结合人GPRC5D和食蟹猴GPRC5D的抗体等具有细胞毒性活性，并且可以单独或作为本发明的分子用于治疗或预防食蟹猴中的疾病诸如癌症。
作为以与实施例5)-2中相同的方式研究c2A4、c2B1和c7B4与大鼠GPRC5D和小鼠GPRC5D的交叉反应性的结果，c2A4、c2B1和c7B4无一结合大鼠GPRC5D和小鼠GPRC5D。凭借这些抗体c2A4、c2B1和c7B4，可以实施使用人GPRC5D基因转染的小鼠或大鼠细胞、组织或个体(包括转基因动物、敲除动物和敲入动物)和所述抗体等的各种测定、免疫组织化学测试等，而不受宿主小鼠的GPRC5D的影响。因此，这些抗体优选用于使用小鼠或大鼠研究和非临床开发包含所述抗体等的药物、动物药物或诊断药物等。
5)-3 人嵌合抗GPRC5D抗体(c2A4、c2B1和c7B4)的ADCC活性
将实施例2)-3-1中制备的KHM-1B细胞以50 μL/孔的量添加至96孔U形底微孔板中。向其中以50 μL/孔的量添加调节至0.64 ng/mL至2 μg/mL(最终浓度)的实施例4中制备的每种纯化的人嵌合抗GPRC5D抗体(c2A4、c2B1和c7B4)和人对照抗体(hlgG1) (Calbiochem/Merck Millipore Corp.)，并将该板在4℃下静置30分钟。进一步向其中以100 μL/孔的浓度添加实施例1)-5-3中制备的效应细胞(调节至3 × 106个细胞/mL)。在室温下以1200rpm离心3分钟之后，将细胞在37℃下在5% CO2条件下培养4小时。将50 μL上清液的等分试样回收至LumaPlate (PerkinElmer, Inc.)中并在50℃下干燥过夜，随后使用读板器(TopCount; PerkinElmer, Inc.)进行测量。根据实施例1)-5-5计算通过ADCC活性裂解的细胞的百分比。如图50中所示，发现c2A4、c2B1和c7B4具有ADCC活性。
实施例6. 人嵌合抗GPRC5D抗体(c2A4、c2B1和c7B4)的体内活性
将1 × 107个人多发性骨髓瘤细胞系KHM-1B的细胞悬浮于100%基质胶(Becton,Dickinson and Company)中，并皮下移植至每只BALB/c-nu/nu小鼠(CanN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj，购自Charles River Laboratories Japan Inc.)的腋窝区域。移植之后3天和10天，将每种人嵌合抗GPRC5D抗体(c2A4、c2B1和c7B4)以10 mg/kg的剂量施用于携带癌症的小鼠的尾静脉(n = 12或11)。使用电子数字卡尺(由Mitsutoyo Corp.制造)每周两次测量移植肿瘤的长轴和短轴。根据以下表达式计算肿瘤体积：
肿瘤体积(mm3) = 1/2 × 短轴(mm) × 短轴(mm) × 长轴(mm)。
c2A4抗体的结果显示于图51中。移植之后21天的肿瘤生长抑制的百分比为96%。
c2B1抗体的结果显示于图52中。移植之后21天的肿瘤生长抑制的百分比为95%。
c7B4抗体的结果显示于图53中。移植之后21天的肿瘤生长抑制的百分比为94%。
实施例7. 人嵌合抗GPRC5D抗体(c2B1和c7B4)的人源化版本(h2B1和h7B4)的设计
7)-1 抗GPRC5D抗体2B1的人源化形式的设计
7)-1-1 2B1可变区的分子建模
2B1可变区的分子建模通过通常称为同源建模的方法实施(Methods in Enzymology,203, 121-153, (1991))。将上面确定的2B1的可变区与蛋白数据库中登记的人免疫球蛋白可变区的一级序列(衍生自可得的X射线晶体结构的三维结构)进行比较(Nuc.AcidRes.35, D301-D303 (2007))。作为结果，选择3MBX，因为它与2B1的重链和轻链可变区具有最高的序列同一性。通过组合对应于2B1的重链和轻链的3MBX的坐标，将框架区的三维结构制备为“框架模型”。随后，将每个CDR的典型构象并入框架模型中。最后，进行用于排除不利的原子间接触的能量计算，以便在能量方面获得2B1可变区的可能分子模型。使用市售的蛋白三维结构分析程序BioLuminate(由Schrodinger, LLC制造)进行这些程序。
7)-1-2人源化h2B1的氨基酸序列的设计
通过通常称为CDR移植的方法构建人源化h2B1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,10029-10033 (1989))。基于框架区中氨基酸的身份选择受体抗体。
将2B1的框架区的序列与KABAT等人(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 第5版 Public Health Service National Institutes of Health,Bethesda, MD. (1991))指定的人亚组共有序列或种系序列的框架区进行比较。作为结果，选择人种系序列IGHV2_5x08和IGHJ1x01以及人γ链亚组2共有序列作为重链受体，同时选择人种系序列IGKV1_8x01和IGKJ4x01和人κ链亚组4共有序列作为轻链受体，这是由于它们与框架区的高序列同一性。将受体的框架区的氨基酸残基与2B1框架区的氨基酸残基进行比对，以鉴定其之间不匹配的氨基酸位置。使用上面构建的2B1的三维模型分析这些残基的位置。然后，根据Queen等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))提供的标准选择待移植至受体上的供体残基。将因此选择的一些供体残基转移至受体抗体以构建如下文实施例中所述的人源化h2B1序列。重链不受供体残基的限制，并且取决于位点，向其转移γ链亚组1共有序列的残基。
7)-1-3 2B1重链的人源化
7)-1-3-1人源化h2B1_H1型重链
通过在可变区中用谷氨酰胺替代氨基酸位置3处的苏氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置5处的赖氨酸、用甘氨酸替代氨基酸位置9处的脯氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置11处的异亮氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置12处的亮氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置13处的谷氨酰胺、用脯氨酸替代氨基酸位置43处的丝氨酸、用异亮氨酸替代氨基酸位置50处的亮氨酸、用甘氨酸替代氨基酸位置51处的丙氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置66处的精氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置67处的天冬酰胺、用缬氨酸替代氨基酸位置69处的亮氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置73处的赖氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置77处的天冬酰胺、用丝氨酸替代氨基酸位置81处的苯丙氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置84处的异亮氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置85处的苏氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置86处的天冬酰胺、用苏氨酸替代氨基酸位置88处的天冬氨酸、用丙氨酸替代氨基酸位置89处的苏氨酸、和用缬氨酸替代氨基酸位置94处的苏氨酸而由SEQ ID NO:34中所示的嵌合c2B1重链设计的人源化h2B1重链被称为“人源化h2B1_H1型重链”(也称为“h2B1_H1”)。
人源化h2B1_H1型重链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:74(图83)中。编码SEQ ID NO:74的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:73(图82)中。
7)-1-3-2人源化h2B1_H2型重链
通过在可变区中用谷氨酰胺替代氨基酸位置3处的苏氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置5处的赖氨酸、用甘氨酸替代氨基酸位置9处的脯氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置11处的异亮氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置12处的亮氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置13处的谷氨酰胺、用脯氨酸替代氨基酸位置43处的丝氨酸、用异亮氨酸替代氨基酸位置50处的亮氨酸、用甘氨酸替代氨基酸位置51处的丙氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置66处的精氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置67处的天冬酰胺、用缬氨酸替代氨基酸位置69处的亮氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置81处的苯丙氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置84处的异亮氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置85处的苏氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置86处的天冬酰胺、用苏氨酸替代氨基酸位置88处的天冬氨酸、用丙氨酸替代氨基酸位置89处的苏氨酸、和用缬氨酸替代氨基酸位置94处的苏氨酸而由SEQ ID NO:34中所示的嵌合c2B1重链设计的人源化h2B1重链被称为"人源化h2B1_H2型重链"(也称为"h2B1_H2")。
人源化h2B1_H2型重链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:76(图85)中。编码SEQ ID NO:76的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:75(图84)中。
7)-1-3-3人源化h2B1_H3型重链
通过在可变区中用谷氨酰胺替代氨基酸位置3处的苏氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置5处的赖氨酸、用甘氨酸替代氨基酸位置9处的脯氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置11处的异亮氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置12处的亮氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置13处的谷氨酰胺、用脯氨酸替代氨基酸位置43处的丝氨酸、用异亮氨酸替代氨基酸位置50处的亮氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置66处的精氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置67处的天冬酰胺、用缬氨酸替代氨基酸位置69处的亮氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置81处的苯丙氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置84处的异亮氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置85处的苏氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置86处的天冬酰胺、用苏氨酸替代氨基酸位置88处的天冬氨酸、用丙氨酸替代氨基酸位置89处的苏氨酸、和用缬氨酸替代氨基酸位置94处的苏氨酸而由SEQ ID NO:34中所示的嵌合c2B1重链设计的人源化h2B1重链被称为"人源化h2B1_H3型重链"(也称为"h2B1_H3")。
人源化h2B1_H3型重链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:78(图87)中。编码SEQ ID NO:78的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:77(图86)中。
7)-1-3-4人源化h2B1_H4型重链
通过在可变区中用丙氨酸替代氨基酸位置10处的甘氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置11处的异亮氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置12处的亮氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置13处的谷氨酰胺、用苏氨酸替代氨基酸位置15处的丝氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置19处的丝氨酸、用脯氨酸替代氨基酸位置43处的丝氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置62处的天冬酰胺、用赖氨酸替代氨基酸位置66处的精氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置67处的天冬酰胺、用苏氨酸替代氨基酸位置72处的丝氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置81处的苯丙氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置83处的赖氨酸、用甲硫氨酸替代氨基酸位置84处的异亮氨酸、用甲硫氨酸替代氨基酸位置87处的缬氨酸、用脯氨酸替代氨基酸位置89处的苏氨酸、和用缬氨酸替代氨基酸位置90处的丙氨酸而由SEQ ID NO:34中所示的嵌合c2B1重链设计的人源化h2B1重链被称为"人源化h2B1_H4型重链"(也称为"h2B1_H4")。
人源化h2B1_H4型重链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:80(图89)中。编码SEQ ID NO:80的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:79(图88)中。
7)-1-4 2B1轻链的人源化
7)-1-4-1人源化h2B1_L1型轻链
通过在可变区中用天冬氨酸替代氨基酸位置1处的谷氨酸、用天冬氨酸替代氨基酸位置9处的苏氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置11处的甲硫氨酸、用丙氨酸替代氨基酸位置12处的丝氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置13处的苏氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置15处的异亮氨酸、用丙氨酸替代氨基酸位置19处的缬氨酸、用异亮氨酸替代氨基酸位置21处的亮氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置39处的苏氨酸、用脯氨酸替代氨基酸位置43处的丝氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置63处的苏氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置67处的苯丙氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置77处的天冬酰胺、用亮氨酸替代氨基酸位置78处的缬氨酸、用谷氨酰胺替代氨基酸位置79处的谷氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置83处的亮氨酸、用谷氨酰胺替代氨基酸位置100处的甘氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置104处的亮氨酸、和用异亮氨酸替代氨基酸位置106处的亮氨酸而由SEQ ID NO:30中所示的嵌合c2B1轻链设计的人源化h2B1轻链被称为"人源化h2B1_L1型轻链"(也称为"h2B1_L1")。
人源化h2B1_L1型轻链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:64(图73)中。编码SEQ ID NO:64的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:63(图72)中。
7)-1-4-2人源化h2B1_L2型轻链
通过在可变区中用天冬氨酸替代氨基酸位置1处的谷氨酸、用天冬氨酸替代氨基酸位置9处的苏氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置11处的甲硫氨酸、用丙氨酸替代氨基酸位置12处的丝氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置13处的苏氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置15处的异亮氨酸、用丙氨酸替代氨基酸位置19处的缬氨酸、用异亮氨酸替代氨基酸位置21处的亮氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置39处的苏氨酸、用脯氨酸替代氨基酸位置43处的丝氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置63处的苏氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置69处的精氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置77处的天冬酰胺、用亮氨酸替代氨基酸位置78处的缬氨酸、用谷氨酰胺替代氨基酸位置79处的谷氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置83处的亮氨酸、用谷氨酰胺替代氨基酸位置100处的甘氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置104处的亮氨酸、和用异亮氨酸替代氨基酸位置106处的亮氨酸而由SEQ ID NO:30中所示的嵌合c2B1轻链设计的人源化h2B1轻链被称为"人源化h2B1_L2型轻链"(也称为"h2B1_L2")。
人源化h2B1_L2型轻链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:66(图75)中。编码SEQ ID NO:66的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:65(图74)中。
7)-1-4-3人源化h2B1_L3型轻链
通过在可变区中用天冬氨酸替代氨基酸位置1处的谷氨酸、用天冬氨酸替代氨基酸位置9处的苏氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置11处的甲硫氨酸、用丙氨酸替代氨基酸位置12处的丝氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置13处的苏氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置15处的异亮氨酸、用丙氨酸替代氨基酸位置19处的缬氨酸、用异亮氨酸替代氨基酸位置21处的亮氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置39处的苏氨酸、用脯氨酸替代氨基酸位置43处的丝氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置63处的苏氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置77处的天冬酰胺、用亮氨酸替代氨基酸位置78处的缬氨酸、用谷氨酰胺替代氨基酸位置79处的谷氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置83处的亮氨酸、用谷氨酰胺替代氨基酸位置100处的甘氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置104处的亮氨酸、和用异亮氨酸替代氨基酸位置106处的亮氨酸而由SEQ ID NO:30中所示的嵌合c2B1轻链设计的人源化h2B1轻链被称为"人源化h2B1_L3型轻链"(也称为"h2B1_L3")。
人源化h2B1_L3型轻链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:68(图77)中。编码SEQ ID NO:68的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:67(图76)中。
7)-1-4-4人源化h2B1_L4型轻链
通过在可变区中用天冬氨酸替代氨基酸位置1处的谷氨酸、用天冬氨酸替代氨基酸位置9处的苏氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置11处的甲硫氨酸、用丙氨酸替代氨基酸位置12处的丝氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置13处的苏氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置15处的异亮氨酸、用丙氨酸替代氨基酸位置19处的缬氨酸、用异亮氨酸替代氨基酸位置21处的亮氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置39处的苏氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置63处的苏氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置77处的天冬酰胺、用亮氨酸替代氨基酸位置78处的缬氨酸、用谷氨酰胺替代氨基酸位置79处的谷氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置83处的亮氨酸、用谷氨酰胺替代氨基酸位置100处的甘氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置104处的亮氨酸、和用异亮氨酸替代氨基酸位置106处的亮氨酸而由SEQ ID NO:30中所示的嵌合c2B1轻链设计的人源化h2B1轻链被称为"人源化h2B1_L4型轻链"(也称为"h2B1_L4")。
人源化h2B1_L4型轻链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:70(图79)中。编码SEQ ID NO:70的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:69(图78)中。
7)-1-4-5人源化h2B1_L5型轻链
通过在可变区中用丙氨酸替代氨基酸位置1处的谷氨酸、用精氨酸替代氨基酸位置3处的缬氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置9处的苏氨酸、用苯丙氨酸替代氨基酸位置11处的甲硫氨酸、用丙氨酸替代氨基酸位置13处的苏氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置15处的异亮氨酸、用天冬氨酸替代氨基酸位置17处的谷氨酸、用异亮氨酸替代氨基酸位置21处的亮氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置22处的天冬酰胺、用赖氨酸替代氨基酸位置39处的苏氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置42处的谷氨酰胺、用丝氨酸替代氨基酸位置60处的天冬氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置63处的苏氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置77处的天冬酰胺、用亮氨酸替代氨基酸位置78处的缬氨酸、用谷氨酰胺替代氨基酸位置79处的谷氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置80处的丙氨酸、用苯丙氨酸替代氨基酸位置83处的亮氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置85处的缬氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置104处的亮氨酸、和用异亮氨酸替代氨基酸位置106处的亮氨酸而由SEQ ID NO:30中所示的嵌合c2B1轻链设计的人源化h2B1轻链被称为"人源化h2B1_L5型轻链"(也称为"h2B1_L5")。
人源化h2B1_L5型轻链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:72(图81)中。编码SEQ ID NO:72的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:71(图80)中。
7)-2 抗GPRC5D抗体7B4的人源化形式的设计
7)-2-1 7B4可变区的分子建模
7B4可变区的分子建模通过通常称为同源建模的方法实施(Methods in Enzymology,203, 121-153, (1991))。将上面确定的7B4的可变区与蛋白数据库中登记的人免疫球蛋白可变区的一级序列(衍生自可得的X射线晶体结构的三维结构)进行比较(Nuc.AcidRes.35, D301-D303 (2007))。作为结果，选择1BGX，因为它与7B4的重链和轻链可变区具有最高的序列同一性。通过组合对应于7B4的重链和轻链的1BGX的坐标，将框架区的三维结构制备为“框架模型”。随后，将每个CDR的典型构象并入框架模型中。最后，进行用于排除不利的原子间接触的能量计算，以便在能量方面获得7B4可变区的可能分子模型。使用市售的蛋白三维结构分析程序BioLuminate(Schrodinger, LLC)进行这些程序。
7)-2-2人源化h7B4的氨基酸序列的设计
通过通常称为CDR移植的方法构建人源化h7B4 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,10029-10033 (1989))。基于框架区中氨基酸的身份选择受体抗体。
将7B4的框架区的序列与KABAT等人(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 第5版 Public Health Service National Institutes of Health,Bethesda, MD. (1991))指定的人亚组共有序列或种系序列的框架区进行比较。作为结果，选择人γ链亚组2共有序列作为重链受体，同时选择人κ链亚组3共有序列作为轻链受体，这是由于它们与框架区的高序列同一性。将受体的框架区的氨基酸残基与7B4框架区的氨基酸残基进行比对，以鉴定其之间不匹配的氨基酸位置。使用上面构建的7B4的三维模型分析这些残基的位置。然后，根据Queen等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033(1989))提供的标准选择待移植至受体上的供体残基。将因此选择的一些供体残基转移至受体抗体以构建如下文实施例中所述的人源化h7B4序列。轻链不受供体残基的限制，并且取决于位点，向其转移κ链亚组1共有序列的残基。
7)-2-3 7B4重链的人源化
7)-2-3-1人源化h7B4_H1型重链
通过在可变区中用谷氨酰胺替代氨基酸位置1的谷氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置2处的异亮氨酸、用谷氨酰胺替代氨基酸位置3处的组氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置17处的丝氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置23处的丝氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置25处的苏氨酸、用谷氨酰胺替代氨基酸位置40处的赖氨酸、用脯氨酸替代氨基酸位置41处的苯丙氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置44处的天冬酰胺、用甘氨酸替代氨基酸位置45处的赖氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置46处的甲硫氨酸、用异亮氨酸替代氨基酸位置49处的甲硫氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置68处的异亮氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置69处的丝氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置71处的苏氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置80处的苯丙氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置82处的谷氨酰胺、用丝氨酸替代氨基酸位置84处的天冬酰胺、用丙氨酸替代氨基酸位置88处的苏氨酸、用丙氨酸替代氨基酸位置89处的谷氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置93处的苏氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置117处的丙氨酸、和用亮氨酸替代氨基酸位置118处的丝氨酸而由SEQ ID NO:42中所示的嵌合c7B4重链设计的人源化h7B4重链被称为"人源化h7B4_H1型重链"(也称为"h7B4_H1")。
人源化h7B4_H1型重链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:86(图95)中。编码SEQ ID NO:86的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:85(图94)中。
7)-2-3-2人源化h7B4_H2型重链
通过在可变区中用谷氨酰胺替代氨基酸位置3处的组氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置17处的丝氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置23处的丝氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置25处的苏氨酸、用谷氨酰胺替代氨基酸位置40处的赖氨酸、用脯氨酸替代氨基酸位置41处的苯丙氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置44处的天冬酰胺、用甘氨酸替代氨基酸位置45处的赖氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置46处的甲硫氨酸、用异亮氨酸替代氨基酸位置49处的甲硫氨酸、用甘氨酸替代氨基酸位置50处的丙氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置68处的异亮氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置69处的丝氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置71处的苏氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置80处的苯丙氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置82处的谷氨酰胺、用丝氨酸替代氨基酸位置84处的天冬酰胺、用丙氨酸替代氨基酸位置88处的苏氨酸、用丙氨酸替代氨基酸位置89处的谷氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置93处的苏氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置117处的丙氨酸、和用亮氨酸替代氨基酸位置118处的丝氨酸而由SEQ ID NO:42中所示的嵌合c7B4重链设计的人源化h7B4重链被称为“人源化h7B4_H2型重链”(也称为“h7B4_H2”)。
人源化h7B4_H2型重链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:88(图97)中。编码SEQ ID NO:88的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:87(图96)中。
7)-2-3-3人源化h7B4_H3型重链
通过在可变区中用谷氨酰胺替代氨基酸位置3处的组氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置17处的丝氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置23处的丝氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置25处的苏氨酸、用谷氨酰胺替代氨基酸位置40处的赖氨酸、用脯氨酸替代氨基酸位置41处的苯丙氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置44处的天冬酰胺、用甘氨酸替代氨基酸位置45处的赖氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置46处的甲硫氨酸、用异亮氨酸替代氨基酸位置49处的甲硫氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置68处的异亮氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置69处的丝氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置71处的苏氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置80处的苯丙氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置82处的谷氨酰胺、用丝氨酸替代氨基酸位置84处的天冬酰胺、用丙氨酸替代氨基酸位置88处的苏氨酸、用丙氨酸替代氨基酸位置89处的谷氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置93处的苏氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置117处的丙氨酸、和用亮氨酸替代氨基酸位置118处的丝氨酸而由SEQ ID NO:42中所示的嵌合c7B4重链设计的人源化h7B4重链被称为“人源化h7B4_H3型重链”(也称为“h7B4_H3”)。
人源化h7B4_H3型重链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:90(图99)中。编码SEQ ID NO:90的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:89(图98)中。
7)-2-3-4人源化h7B4_H5型重链
通过在可变区中用谷氨酰胺替代氨基酸位置3处的组氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置17处的丝氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置23处的丝氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置25处的苏氨酸、用脯氨酸替代氨基酸位置41处的苯丙氨酸、用异亮氨酸替代氨基酸位置49处的甲硫氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置68处的异亮氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置69处的丝氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置71处的苏氨酸、用丝氨酸替代氨基酸位置80处的苯丙氨酸、用赖氨酸替代氨基酸位置82处的谷氨酰胺、用丝氨酸替代氨基酸位置84处的天冬酰胺、用丙氨酸替代氨基酸位置88处的苏氨酸、用丙氨酸替代氨基酸位置89处的谷氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置93处的苏氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置117处的丙氨酸、和用亮氨酸替代氨基酸位置118处的丝氨酸而由SEQ ID NO:42中所示的嵌合c7B4重链设计的人源化h7B4重链被称为"人源化h7B4_H5型重链"(也称为"h7B4_H5")。
人源化h7B4_H5型重链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:92(图101)中。编码SEQ ID NO:92的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:91(图100)中。
7)-2-4 7B4轻链的人源化
7)-2-4-1人源化h7B4_L1型轻链
通过在可变区中用谷氨酸替代氨基酸位置1处的天冬氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置3处的谷氨酰胺、用亮氨酸替代氨基酸位置4处的甲硫氨酸、用甘氨酸替代氨基酸位置9处的丝氨酸、用苏氨酸替代氨基酸位置10处的苯丙氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置13处的丙氨酸、用脯氨酸替代氨基酸位置15处的缬氨酸、用丙氨酸替代氨基酸位置19处的缬氨酸、用脯氨酸替代氨基酸位置40处的亮氨酸、用谷氨酰胺替代氨基酸位置42处的谷氨酸、用精氨酸替代氨基酸位置45处的赖氨酸、用天冬氨酸替代氨基酸位置60处的丝氨酸、用精氨酸替代氨基酸位置77处的甘氨酸、用谷氨酸替代氨基酸位置79处的谷氨酰胺、用苯丙氨酸替代氨基酸位置83处的缬氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置85处的苏氨酸、用酪氨酸替代氨基酸位置87处的苯丙氨酸、用谷氨酰胺替代氨基酸位置99处的丙氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置103处的亮氨酸、和用异亮氨酸替代氨基酸位置105处的亮氨酸而由SEQ ID NO:38中所示的嵌合c7B4轻链设计的人源化h7B4轻链被称为"人源化h7B4_L1型轻链"(也称为"h7B4_L1")。
人源化h7B4_L1型轻链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:82(图91)中。编码SEQ ID NO:82的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:81(图90)中。
7)-2-4-2人源化h7B4_L2型轻链
通过在可变区中用丝氨酸替代氨基酸位置10处的苯丙氨酸、用亮氨酸替代氨基酸位置13处的丙氨酸、用脯氨酸替代氨基酸位置15处的缬氨酸、用丙氨酸替代氨基酸位置19处的缬氨酸、用脯氨酸替代氨基酸位置40处的亮氨酸、用谷氨酰胺替代氨基酸位置42处的谷氨酸、用精氨酸替代氨基酸位置45处的赖氨酸、用天冬氨酸替代氨基酸位置60处的丝氨酸、用精氨酸替代氨基酸位置77处的甘氨酸、用谷氨酸替代氨基酸位置79处的谷氨酰胺、用苯丙氨酸替代氨基酸位置83处的缬氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置85处的苏氨酸、用酪氨酸替代氨基酸位置87处的苯丙氨酸、用谷氨酰胺替代氨基酸位置99处的丙氨酸、用缬氨酸替代氨基酸位置103处的亮氨酸、用异亮氨酸替代氨基酸位置105处的亮氨酸而由SEQ ID NO:38中所示的嵌合c7B4轻链设计的人源化h7B4轻链被称为"人源化h7B4_L2型轻链"(也称为"h7B4_L2")。
人源化h7B4_L2型轻链的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:84(图93)中。编码SEQ ID NO:84的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的SEQ ID NO:83(图92)中。
实施例8. 大鼠抗人GPRC5D抗体(2B1和7B4)的人源化抗体(h2B1和h7B4)的表达载体的构建和抗体的制备
8)-1 h2B1重链表达载体的构建
8)-1-1 h2B1_H1型重链的构建
合成包含SEQ ID NO:73代表的h2B1_H1核苷酸序列的核苷酸位置58至426代表的编码h2B1_H1可变区的DNA序列的DNA片段(GeneArt Artificial Gene Synthesis Service)。以与实施例8)-1-1中相同的方式构建h2B1_H1表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA/h2B1_H1"。
8)-1-2 h2B1_H2型重链的构建
合成包含SEQ ID NO:75代表的h2B1_H2核苷酸序列的核苷酸位置58至426代表的编码h2B1_H2可变区的DNA序列的DNA片段(GeneArt Artificial Gene Synthesis Service)。通过PCR扩增合成的DNA片段，并使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(ClontechLaboratories, Inc.)将其插入嵌合和人源化抗体重链表达载体pCMA-G1的限制性酶BlpI-切割位点以构建h2B1_H2表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA/h2B1_H2"。
8)-1-3 h2B1_H3型重链的构建
合成包含SEQ ID NO:77代表的h2B1_H3核苷酸序列的核苷酸位置58至426代表的编码h2B1_H3可变区的DNA序列的DNA片段(GeneArt Artificial Gene Synthesis Service)。以与实施例8)-1-1中相同的方式构建h2B1_H3表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA/h2B1_H3"。
8)-1-4 h2B1_H4型重链的构建
合成包含SEQ ID NO:79代表的h2B1_H4核苷酸序列的核苷酸位置58至426代表的编码h2B1_H4可变区的DNA序列的DNA片段(GeneArt Artificial Gene Synthesis Service)。以与实施例8)-1-1中相同的方式构建h2B1_H4表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA/h2B1_H4"。
8)-2 h2B1轻链表达载体的构建
8)-2-1 h2B1_L1型轻链的构建
合成包含SEQ ID NO:63代表的h2B1_L1核苷酸序列的核苷酸位置61至381代表的编码h2B1_L1可变区的DNA序列的DNA片段(GeneArt Gene Synthesis Service)。通过PCR扩增合成的DNA片段，并使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)将其插入嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK的限制性酶BsiWI-切割位点以构建h2B1_L1表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA/h2B1_L1"。
8)-2-2 h2B1_L2型轻链的构建
合成包含SEQ ID NO:65代表的h2B1_L2核苷酸序列的核苷酸位置61至381代表的编码h2B1_L2可变区的DNA序列的DNA片段(GeneArt Gene Synthesis Service)。以与实施例8)-2-1中相同的方式构建h2B1_L2表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA/h2B1_L2"。
8)-2-3 h2B1_L3型轻链的构建
合成包含SEQ ID NO:67代表的h2B1_L3核苷酸序列的核苷酸位置61至381代表的编码h2B1_L3可变区的DNA序列的DNA片段(GeneArt Gene Synthesis Service)。以与实施例8)-2-1中相同的方式构建h2B1_L3表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA/h2B1_L3"。
8)-2-4 h2B1_L4型轻链的构建
合成包含SEQ ID NO:69代表的h2B1_L4核苷酸序列的核苷酸位置61至381代表的编码h2B1_L4可变区的DNA序列的DNA片段(GeneArt Gene Synthesis Service)。以与实施例8)-2-1中相同的方式构建h2B1_L4表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA/h2B1_L4"。
8)-2-5 h2B1_L5型轻链的构建
合成包含SEQ ID NO:71代表的h2B1_L5核苷酸序列的核苷酸位置61至381代表的编码h2B1_L5可变区的DNA序列的DNA片段(GeneArt Gene Synthesis Service)。以与实施例8)-2-1中相同的方式构建h2B1_L5表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA/h2B1_L5"。
8)-3 h7B4重链表达载体的构建
8)-3-1 h7B4_H1型重链的构建
合成包含SEQ ID NO:85代表的h7B4_H1核苷酸序列的核苷酸位置58至426代表的编码h7B4_H1可变区的DNA序列的DNA片段(GeneArt Artificial Gene Synthesis Service)。以与实施例8)-1-1中相同的方式构建h7B4_H1表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA/h7B4_H1"。
8)-3-2 h7B4_H2型重链的构建
合成包含SEQ ID NO:87代表的h7B4_H2核苷酸序列的核苷酸位置58至426代表的编码h7B4_H2可变区的DNA序列的DNA片段(GeneArt Artificial Gene Synthesis Service)。以与实施例8)-1-1中相同的方式构建h7B4_H2表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA/h7B4_H2"。
8)-3-3 h7B4_H3型重链的构建
合成包含SEQ ID NO:89代表的h7B4_H3核苷酸序列的核苷酸位置58至426代表的编码h7B4_H3可变区的DNA序列的DNA片段(GeneArt Artificial Gene Synthesis Service)。以与实施例8)-1-1中相同的方式构建h7B4_H3表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA/h7B4_H3"。
8)-3-4 h7B4_H5型重链的构建
合成包含SEQ ID NO:91代表的h7B4_H5核苷酸序列的核苷酸位置58至426代表的编码h7B4_H5可变区的DNA序列的DNA片段(GeneArt Artificial Gene Synthesis Service)。以与实施例8)-1-1中相同的方式构建h7B4_H5表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA/h7B4_H5"。
8)-4 h7B4轻链表达载体的构建
8)-4-1 h7B4_L1型轻链的构建
合成包含SEQ ID NO:90代表的h7B4_L1核苷酸序列的核苷酸位置61至378代表的编码h7B4_L1可变区的DNA序列的DNA片段(GeneArt Gene Synthesis Service)。以与实施例8)-2-1中相同的方式构建h7B4_L1表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA/h7B4_L1"。
8)-4-2 h7B4_L2型轻链的构建
合成包含SEQ ID NO:92代表的h7B4_L2核苷酸序列的核苷酸位置61至378代表的编码h7B4_L2可变区的DNA序列的DNA片段(GeneArt Gene Synthesis Service)。以与实施例8)-2-1中相同的方式构建h7B4_L2表达载体。获得的表达载体被命名为"pCMA/h7B4_L2"。
8)-5人源化抗体(h2B1和h7B4)的制备(FreeStyle 293F细胞)
8)-5-1人源化抗体(h2B1和h7B4)的小规模生产
将FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corp.)根据手册进行亚培养和培养。
将对数生长期中的1×107个FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corp.)用FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen Corp.)稀释至9.6 mL，然后接种至30 mL SquareStorage Bottle (Nalgene/Thermo Fisher Scientific Inc.)，并在8% CO2培养箱中以90rpm在37℃下振荡培养1小时。将30 μg聚乙烯亚胺(Polysciences #24765)溶解于200 μLOpti-Pro SFM (Invitrogen Corp.)中。接下来，将使用PureLink HiPure质粒试剂盒(Invitrogen Corp.)制备的每种重链表达载体((4 μg)和轻链表达载体(6 μg)添加至200μL Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.)中。将200 μL表达载体/Opti-Pro SFM混合溶液添加至200 μL聚乙烯亚胺/Opti-Pro SFM混合溶液中，并将混合物轻轻搅拌，进一步保持静置5分钟，且然后添加至FreeStyle 293F细胞。将细胞在8% CO2培养箱中以90 rpm在37℃下振荡培养7天，并将获得的培养上清液通过Minisart-Plus过滤器(Sartorius Japan K.K.)过滤并用作样品用于评估。
通过pCMA/h2B1_H1和pCMA/h2B1_L1的组合获得h2B1_H1/L1。通过pCMA/h2B1_H1和pCMA/h2B1_L2的组合获得h2B1_H1/L2。通过pCMA/h2B1_H2和pCMA/h2B1_L2的组合获得h2B1_H2/L2。通过pCMA/h2B1_H2和pCMA/h2B1_L3的组合获得h2B1_H2/L3。通过pCMA/h2B1_H2和pCMA/h2B1_L4的组合获得h2B1_H2/L4。通过pCMA/h2B1_H2和pCMA/h2B1_L5的组合获得h2B1_H2/L5。通过pCMA/h2B1_H3和pCMA/h2B1_L3的组合获得h2B1_H3/L3。通过pCMA/h2B1_H3和pCMA/h2B1_L4的组合获得h2B1_H3/L4。通过pCMA/h2B1_H3和pCMA/h2B1_L5的组合获得h2B1_H3/L5。通过pCMA/h2B1_H4和pCMA/h2B1_L1的组合获得h2B1_H4/L1。通过pCMA/h2B1_H4和pCMA/h2B1_L3的组合获得h2B1_H4/L3。通过pCMA/h2B1_H4和pCMA/h2B1_L4的组合获得h2B1_H4/L4。通过pCMA/h2B1_H4和pCMA/h2B1_L5的组合获得h2B1_H4/L5。通过pCMA/h7B4_H1和pCMA/h7B4_L2的组合获得h7B4_H1/L2。通过pCMA/h7B4_H2和pCMA/h7B4_L2的组合获得h7B4_H2/L2。通过pCMA/h7B4_H3和pCMA/h7B4_L1的组合获得h7B4_H3/L1。通过pCMA/h7B4_H3和pCMA/h7B4_L2的组合获得h7B4_H3/L2。通过pCMA/h7B4_H5和pCMA/h7B4_L1的组合获得h7B4_H5/L1。
8)-5-2人源化抗体(h2B1和h7B4)的生产
以与实施例4)-9-1中相同的方式产生人源化抗体。具体地，通过pCMA/h2B1_H1和pCMA/h2B1_L1的组合获得h2B1_H1/L1。通过pCMA/h2B1_H2和pCMA/h2B1_L5的组合获得h2B1_H2/L5。通过pCMA/h2B1_H4和pCMA/h2B1_L5的组合获得h2B1_H4/L5。通过pCMA/h7B4_H1和pCMA/h7B4_L2的组合获得h7B4_H1/L2。通过pCMA/h7B4_H3和pCMA/h7B4_L1的组合获得h7B4_H3/L1。
8)-5-3人源化抗体(h2B1和h7B4)的纯化
使用rProtein A亲和色谱(在4至6℃下)和陶瓷羟基磷灰石(在室温下)，通过两步从实施例8)-5-2中获得的培养物上清液纯化每种抗体。rProtein A亲和色谱纯化之后和陶瓷羟基磷灰石纯化之后的缓冲液替代步骤在4至6℃下实施。将培养上清液应用至用PBS平衡的MabSelect SuRe (由GE Healthcare Bio-Sciences Corp.制造, HiTrap柱)。在整个培养上清液进入柱中之后，用PBS以柱体积的至少两倍的量洗涤柱。接下来，通过用2 M精氨酸盐酸盐溶液(pH 4.0)洗脱来收集含有抗体的级分。将级分通过透析(Thermo FisherScientific Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)用PBS缓冲液替代，且然后用5 mM磷酸钠和50 mM MES的缓冲液(pH 7.0)稀释5倍。将所得抗体溶液应用至用5 mM NaPi、50mM MES和30 mM NaCl的缓冲液(pH 7.0)平衡的陶瓷羟基磷灰石柱(Bio-RadLaboratories, Inc., Bio-Scale CHT l型羟基磷灰石柱)。通过使用氯化钠的线性浓度梯度洗脱收集含有抗体的级分。将级分通过透析(Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)用HBSor (25 mM组氨酸和5%山梨糖醇，pH 6.0)缓冲液替代。将级分浓缩，并使用Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN 20(分子量截止值：UF10K,Sartorius Japan K.K.，在4℃下)调节至10 mg/ml或更高的IgG浓度。最后，通过Minisart-Plus过滤器(Sartorius Japan K.K.)过滤抗体溶液并用作纯化的样品。
实施例9. 人源化抗GPRC5D抗体的体外活性评估
9)-1通过流式细胞术评估人源化抗GPRC5D抗体(h2B1_H1/L1至h2B1_H4/L5和h7B4_H1/L2至h7B4_H5/L1)针对人GPRC5D的结合活性
将表达GPRC5D的人多发性骨髓瘤细胞系KHM-1B细胞用含有5% FBS的PBS调节至2 ×106个细胞/mL的浓度，以100 μL/孔的量接种至96孔U形底微孔板中，并离心以除去上清液。向其中以100 μL/孔的量添加调节至14 ng/mL至30 μg/mL的实施例8)-3-1中获得的每种人源化抗GPRC5D抗体的培养上清液或人IgG同种型对照抗体(Calbiochem/Merck MilliporeCorp.)，并将该板在4℃下静置1小时。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次。然后，向其中以100 μl/孔的量添加用含有5% FBS的PBS稀释100倍的R-藻红蛋白AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)，并将该板在4℃下静置1小时。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，且然后重悬浮于含有5% FBS的PBS中，随后使用流式细胞仪(FACSCanto(TM) II; Becton, Dickinson and Company)检测。使用Flowjo (Tree Star, Inc.)分析数据。将细胞级分的PE荧光强度绘制成柱状图，并计算平均荧光强度(MFI)。从GPRC5D抗体的MFI值减去对照抗体的MFI值，以计算MFI的相对值(rMFI)。图102显示关于人源化抗GPRC5D抗体h2B1_H1/L1至h2B1_H4/L5的结果，且图103显示关于人源化抗GPRC5D抗体h7B4_H1/L2至h7B4_H5/L1的结果。如图102和103中所示，发现这些人源化抗GPRC5D抗体结合人GPRC5D。
9)-2通过流式细胞术评估人源化抗GPRC5D抗体(h2B1_H1/L1至h2B1_H4/L5和h7B4_H1/L2至h7B4_H5/L1)对食蟹猴GPRC5D的结合性质
使用实施例5)-2-2中制备的KMS-11_cGPRC5D细胞，以与实施例9)-1中相同的方式实施染色和分析。如图201和202中所示，发现这些人源化抗GPRC5D抗体结合食蟹猴GPRC5D。
9)-3人源化抗GPRC5D抗体(h2B1_H1/L1、h2B1_H2/L5、h2B1_H4/L5、h7B4_H1/L2和h7B4_H3/L1)的ADCC活性评估
将实施例2)-3-1中制备的KHM-1B细胞以50 μL/孔的量添加至96孔U形底微孔板中。向其中以50 μL/孔的量添加调节至0.15 ng/mL至15 μg/mL(最终浓度)的每种人源化抗GPRC5D抗体(h2B1_H1/L1、h2B1_H2/L5、h2B1_H4/L5、h7B4_H1/L2和h7B4_H3/L1)和人对照抗体(hIgG1)(Calbiochem/Merck Millipore Corp.)，并将该板在4℃下静置30分钟。进一步向其中以100 μL/孔的量添加实施例1)-5-3中制备的效应细胞。在室温下以1200 rpm离心3分钟之后，将细胞在37℃下在5% CO2条件下培养4小时。将50 μL上清液的等分试样回收至LumaPlate (PerkinElmer, Inc.)中并在50℃下干燥过夜，随后使用读板器(TopCount;PerkinElmer, Inc.)进行测量。根据实施例1)-5-5计算通过ADCC活性裂解的细胞的百分比。如图104中所示，发现h2B1_H1/L1、h2B1_H2/L5、h2B1_H4/L5、h7B4_H1/L2和h7B4_H3/L1具有ADCC活性。
实施例10. 获得源自人抗体噬菌体文库的抗GPRC5D抗体和结合活性评估
10)-1具有GPRC5D结合活性的scFv的分离
从人抗体噬菌体文库分离结合人GPRC5D和食蟹猴GPRC5D的scFv。将噬菌体添加至Dynabeads链霉抗生物素蛋白M-280 (Thermo Fisher Scientific Inc.)，其上固定具有生物素化羧基末端的人(序列表的SEQ ID NO:2；图3)或食蟹猴GPRC5D的氨基末端肽(由Peptide Institute, Inc.合成)。使用磁力架(DynaMag-2, Thermo Fisher ScientificInc.)通过洗涤操作除去未结合的噬菌体。使用的食蟹猴GPRC5D的氨基末端肽具有以下序列：
食蟹猴GPRC5D的氨基末端肽：MYKDCIESTGDYFLPCDSEGPWGIVLEK(Biotin)-NH2 (序列表的SEQ ID NO:93；图105)。
然后，与GPRC5D氨基末端肽结合的噬菌体感染大肠杆菌(XL-1 Blue, AgilentTechnologies, Inc.)，并回收和扩增与GPRC5D氨基末端肽结合的噬菌体。或者，使用实施例1)-1-1或5)-2-1中制备的GPRC5D表达载体，将噬菌体添加至使得瞬时表达人或食蟹猴GPRC5D的Expi293F细胞(Thermo Fisher Scientific Inc.)中。通过洗涤操作除去未结合的噬菌体。然后，与GPRC5D氨基末端肽结合的噬菌体感染大肠杆菌，并回收和扩增与GPRC5D氨基末端肽结合的噬菌体。对于该肽或使得瞬时表达人或食蟹猴GPRC5D的Expi293F细胞实施总共3轮淘选。从多克隆噬菌粒转移至大肠杆菌的表达载体以将FLAG和His标签添加至scFv的羧基末端之后，用表达载体转化大肠杆菌，并在IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)(Sigma-Aldrich Corp.)存在的情况下表达scFv并通过ELISA进行筛选。
10)-2通过ELISA筛选结合GPRC5D的scFv
将用PBS(含有0.138 M氯化钠和0.0027 M氯化钾的0.01 M磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)，Sigma-Aldrich Corp.)稀释至1 μg/mL的NeutrAvidin (Life Technologies Corp.)以50μL/孔的量添加至384孔Maxi-sorp板(Black, Nunc/Thermo Fisher Scientific Inc.)，并将该板在4℃下静置过夜用于固定。在用含有0.05% Tween-20 (Bio-Rad Laboratories,Inc.)的PBS (ELISA缓冲液)洗涤三次之后，向其中添加用PBS稀释至1 μg/mL的生物素化的人或食蟹猴GPRC5D的氨基末端肽(也用于实施例10)-1中)，并将该板在室温下振荡1小时。在用ELISA缓冲液洗涤三次之后，将该板用Blocker Casein (Thermo Fisher ScientificInc.)封闭，并用ELISA缓冲液洗涤三次。然后，将表达scFv的大肠杆菌的培养溶液添加至板中并在室温下反应2小时。在用ELISA缓冲液洗涤三次之后，向其中以50 μL/孔的量添加用ELISA缓冲液稀释5000倍的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗FLAG抗体(Sigma-AldrichCorp.)并在室温下反应1小时。在用ELISA缓冲液洗涤5次之后，添加SuperSignal PicoELISA化学发光底物(Thermo Fisher Scientific Inc.)。在10分钟之后，使用读板器(Envision 2104 Multilabel Reader, PerkinElmer, Inc.)测量化学发光，并选择结合GPRC5D的scFv。
10)-3 ELISA阳性克隆的测序
通过染料终止子方法(BigDye(R)终止子v3.1，Thermo Fisher Scientific Inc.)分析ELISA阳性克隆(C2037、C3048、C3015和C3022)的重链和轻链可变区的核苷酸序列。序列分析中使用的引物序列如下：
引物A：5'-CTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGA-3' (序列表的SEQ ID NO:94；图106)
引物B：5'-ATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGA-3' (序列表的SEQ ID NO:95；图107)。
通过分析测定C2037抗体、C3048抗体、C3015抗体和C3022抗体的基因的可变区编码核苷酸序列。
测定的编码C2037的重链可变区的cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO:96(图108)，且其氨基酸序列示于SEQ ID NO:97 (图109)。
测定的编码C2037的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO:98(图110)，且其氨基酸序列示于SEQ ID NO:99 (图111)。
测定的编码C3048的重链可变区的cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO:100(图112)，且其氨基酸序列示于SEQ ID NO:101 (图113)。
测定的编码C3048的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO:102(图114)，且其氨基酸序列示于SEQ ID NO:103 (图115)。
测定的编码C3015的重链可变区的cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO:104(图116)，且其氨基酸序列示于SEQ ID NO:105 (图117)。
测定的编码C3015的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO:106(图118)，且其氨基酸序列示于SEQ ID NO:107 (图119)。
测定的编码C3022的重链可变区的cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO:108(图120)，且其氨基酸序列示于SEQ ID NO:109 (图121)。
测定的编码C3022的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO:110(图122)，且其氨基酸序列示于SEQ ID NO:135 (图123)。
10)-4 scFv的表达和纯化
将C2037抗体、C3048抗体、C3015抗体或C3022抗体scFv插入动物细胞的表达载体诸如pcDNA3.1 (Thermo Fisher Scientific Inc.)中，以构建动物细胞的scFv表达载体。将动物细胞的scFv表达载体转染至Expi293F细胞(Thermo Fisher Scientific Inc.)，用于瞬时表达。如果必要，使用His Trap柱(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)和凝胶过滤柱(Superdex 200 Increase, GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)从培养上清液纯化scFv。含有溶解于其中的scFv的缓冲溶液用PBS替代，并将所得溶液进行下面的步骤"10)-6"。
10)-5转化为全长IgG并表达和纯化IgG
通过以下方法制备含有C2037、C3048、C3015或C3022的全长IgG形式。
分别通过常规方法将编码实施例10)-3中鉴定的每种抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列与编码人IgG1重链恒定区(CH1 + Fc区：序列表的SEQ ID NO:144(图156)代表的氨基酸序列的氨基酸序列位置135至464)的核苷酸序列或编码人IgG1轻链恒定区(CL：序列表的SEQ ID NO:145(图157)代表的氨基酸序列的氨基酸序列位置131至236)的核苷酸序列连接。将构建体插入动物细胞的表达载体诸如pcDNA3.1 (Thermo Fisher ScientificInc.)中，以构建动物细胞的IgG表达载体。
重新分析构建的IgG表达载体的核苷酸序列。证实C2037抗体的全长重链的核苷酸序列是序列表的SEQ ID NO:136(图148)代表的核苷酸序列，并且全长轻链的核苷酸序列是序列表的SEQ ID NO:137(图149)代表的核苷酸序列。
证实C3048抗体的全长重链的核苷酸序列是序列表的SEQ ID NO:138(图150)代表的核苷酸序列，并且全长轻链的核苷酸序列是序列表的SEQ ID NO:139(图151)代表的核苷酸序列。
证实C3015抗体的全长重链的核苷酸序列是序列表的SEQ ID NO:140(图152)代表的核苷酸序列，并且全长轻链的核苷酸序列是序列表的SEQ ID NO:141(图153)代表的核苷酸序列。
证实C3022抗体的全长重链的核苷酸序列是序列表的SEQ ID NO:142(图154)代表的核苷酸序列，并且全长轻链的核苷酸序列是序列表的SEQ ID NO:143(图155)代表的核苷酸序列。
由核苷酸序列确定由这些序列编码的C2037、C3048、C3015和C3022抗体的全长重链和轻链的氨基酸序列。
C2037抗体的重链的氨基酸序列是序列表的SEQ ID NO:144(图156)代表的氨基酸序列，并且轻链的氨基酸序列是序列表的ID NO:145(图157)代表的氨基酸序列。
C3048抗体的重链的氨基酸序列是序列表的SEQ ID NO:146(图158)代表的氨基酸序列，并且轻链的氨基酸序列是序列表的ID NO:147(图159)代表的氨基酸序列。
C3015抗体的重链的氨基酸序列是序列表的SEQ ID NO:148(图160)代表的氨基酸序列，并且轻链的氨基酸序列是序列表的ID NO:149(图161)代表的氨基酸序列。
C3022抗体的重链的氨基酸序列是序列表的SEQ ID NO:150(图162)代表的氨基酸序列，并且轻链的氨基酸序列是序列表的ID NO:151(图163)代表的氨基酸序列。
通过用动物细胞的IgG表达载体转染FreeStyle 293F细胞(Thermo FisherScientific Inc.)来瞬时表达C2037、C3048、C3015或C3022抗体的IgG形式。如果必需，使用蛋白A亲和柱(HiTrap Mab Select SuRe, GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)纯化IgG形式。然后，使用Vivaspin 20 (7k MWCO, GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)用PBS替代含有溶解于其中的IgG的缓冲溶液，并将所得溶液进行以下步骤10)-7-7和10)- 9。
10)-6通过ELISA证实scFv与GPRC5D的结合
将用PBS稀释至1 μg/mL的NeutrAvidin以50 μL/孔的量添加至96孔Maxi-sorp板(Black, Nunc/Thermo Fisher Scientific Inc.)中，并将该板在4℃下静置过夜用于固定。在用ELISA缓冲液洗涤三次之后，向其中添加用PBS稀释至1 μg/mL的生物素化的人或食蟹猴GPRC5D的氨基末端肽(用于实施例10)-1中)，并将该板在室温下振荡1小时。在用ELISA缓冲液洗涤三次之后，将该板用Blocker Casein封闭，并用ELISA缓冲液洗涤三次。然后，将C2037、C3048、C3015或C3022 scFv添加至板中并在室温下反应2小时。在用ELISA缓冲液洗涤三次之后，向其中以50 μL/孔的量添加用ELISA缓冲液稀释5000倍的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗FLAG抗体并在室温下反应1小时。在用ELISA缓冲液洗涤5次之后，添加SuperSignal Pico ELISA化学发光底物。在10分钟之后，使用读板器测量化学发光。作为结果，发现C2037、C3048、C3015和C3022 scFv结合人GPRC5D(图164A)和食蟹猴GPRC5D(图164B)的氨基末端肽。
10)-7通过ELISA证实IgG与GPRC5D的结合
将用PBS稀释至1 μg/mL的NeutrAvidin以50 μL/孔的量添加至96孔Maxi-sorp板中，并将该板在4℃下静置过夜用于固定。在用ELISA缓冲液洗涤三次之后，向其中添加用PBS稀释至1 μg/mL的生物素化的人或食蟹猴GPRC5D的氨基末端肽(用于实施例10)-1中)，并将该板在室温下振荡1小时。在用ELISA缓冲液洗涤三次之后，将该板用Blocker Casein封闭，并用ELISA缓冲液洗涤三次。然后，将表达IgG的FreeStyle 293F细胞的培养溶液添加至板中并在室温下反应2小时。在用ELISA缓冲液洗涤三次之后，向其中以50 μL/孔的量添加用ELISA缓冲液稀释2500倍的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人Fab抗体(Jackson ImmunoResearchLaboratories, Inc.)并在室温下反应1小时。在用ELISA缓冲液洗涤5次之后，添加SuperSignal Pico ELISA化学发光底物。在10分钟之后，使用读板器测量化学发光。作为结果，发现C2037、C3048、C3015和C3022 IgG形式结合人GPRC5D和食蟹猴GPRC5D的氨基末端肽(图165)。
10)-8 scFv与表达内源性人GPRC5D的细胞(KMS-34)的结合
通过离心回收KMS-34细胞，用FACS缓冲液(含有0.5% BSA和2 mM EDTA的PBS，pH 7.4)洗涤两次，且然后悬浮于与上述相同的溶液中。将C2037、C3048、C3015或C3022 scFv添加至获得的细胞悬浮液中，并将混合物在4℃下静置2小时。在用FACS缓冲液洗涤两次之后，通过添加抗FLAG抗体(Sigma-Aldrich Corp.)悬浮细胞，并将混合物在4℃下进一步静置1小时。在用FACS缓冲液洗涤两次之后，通过添加Alexa 488标记的抗小鼠IgG抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories, Inc.)悬浮细胞，并将混合物在4℃下进一步静置1小时。在用FACS缓冲液洗涤两次之后，将细胞固定于1% PFA(由32%多聚甲醛溶液(ElectronMicroscopy Sciences)制备)中，随后使用流式细胞仪(FACSCanto(TM) II; Becton,Dickinson and Company)检测。使用Flowjo (Tree Star, Inc.)分析数据。
作为结果，发现C2037、C3048、C3015和C3022 scFv结合表达人GPRC5D的细胞(图166)。
10)-9 IgG与表达内源性人GPRC5D的细胞(KHM-1B)的结合
将表达GPRC5D的人多发性骨髓瘤细胞系KHM-1B细胞用含有5% FBS的PBS调节至2 ×106个细胞/mL的浓度，以100 μL/孔的量接种至96孔U形底微孔板中，并离心以除去上清液。向其中以100 μL/孔的量添加调节至14 ng/mL至30 μg/mL的实施例10)-5中获得的每种人抗GPRC5D抗体(含有C2037、C3048、C3015和C3022的全长IgG形式)的培养上清液或人IgG同种型对照抗体(Calbiochem/Merck Millipore Corp.)，并将该板在4℃下静置1小时。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次。然后，向其中以100 μl/孔的量添加用含有5% FBS的PBS稀释100倍的R-藻红蛋白AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性(JacksonImmunoResearch Laboratories, Inc.)，并将该板在4℃下静置1小时。将细胞用含有5%FBS的PBS洗涤两次，且然后重悬浮于含有5% FBS的PBS中，随后使用流式细胞仪(FACSCanto(TM) II; Becton, Dickinson and Company)检测。使用Flowjo (Tree Star, Inc.)分析数据。将细胞级分的PE荧光强度绘制成柱状图，并计算平均荧光强度(MFI)。从GPRC5D抗体的MFI值减去对照抗体的MFI值，以计算MFI的相对值(rMFI)。作为结果，发现C2037、C3048、C3015和C3022 IgG形式结合表达人GPRC5D的细胞(图167)。
10)-10 C3022和C3048的修饰形式的制备和评估
10)-10-1修饰形式的获得
文库构建通过使用用于通过PCR引入突变的方法(Zaccolo, 等人, J. Mol. Biol.(1996) 255, 589-603)，使用C3022和C3048基因作为模板，或涉及合成用于所有CDR残基的寡聚体的方法，其中将每个残基突变为除了野生型氨基酸以外的19种类型的氨基酸以构建文库(基于寡核苷酸的文库)。筛选文库的具有高结合能力的克隆，并测定它们的核苷酸序列。将鉴定的高结合能力突变组合以获得C3022的高结合能力突变体E1018和C3048的高结合能力突变体D1012。
编码获得的E1018的重链可变区的cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO:190(图213)，且其氨基酸序列示于SEQ ID NO:191 (图214)。
编码获得的E1018的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO:192(图215)，且其氨基酸序列示于SEQ ID NO:193 (图216)。
编码获得的D1012的重链可变区的cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO:194(图217)，且其氨基酸序列示于SEQ ID NO:195 (图218)。
编码获得的D1012的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO:196(图219)，且其氨基酸序列示于SEQ ID NO:197 (图220)。
10)-10-2 使用Biacore证实与GPRC5D的结合
使用Biacore T200通过SPR测试抗GPRC5D抗体对人GPRC5D的氨基末端肽的结合活性。将用HBS-EP +(由GE Healthcare Bio-Sciences Corp.制造)稀释至2 nM的生物素化的人GPRC5D的氨基末端肽通过以10 μL/min的速率接触180秒来固定在Sensor Chip CAP(由GEHealthcare Bio-Sciences Corp.制造)上。然后，使用用HBS-EP+稀释的多种浓度的每种scFv作为分析物，通过动力学分析计算Kd。作为结果，发现E1018和D1012 scFv分别比C3022和C3048更强地结合人GPRC5D的氨基末端肽(图221)。
实施例11. 抗CD3抗体表达载体的构建
11)-1 大鼠抗CD3 scFv抗体表达载体的构建
从通过DNA免疫方法免疫的大鼠的淋巴结或脾脏制备产生大鼠抗CD3单克隆抗体的杂交瘤。从杂交瘤对编码单克隆抗体的VH和VL的cDNA进行测序，并且制备单链Fv表达载体。具体地，使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)融合通过PCR扩增的SEQ ID NO:152(图168)的VH DNA片段、待插入VH和VL之间的接头的DNA片段以及位于羧基末端的通过PCR扩增的DNA片段(其中将编码FLAG-His标签的DNA序列添加至含有SEQ IDNO:153(图169)的VL DNA序列的区域)，以制备ORF中含有SEQ ID NO:154(图170)的核苷酸序列的单链抗体表达载体pC3E-7000。
11)-2 人源化抗CD3 scFv抗体表达载体pC3E-7034的构建
合成包含经由15个氨基酸柔性接头连接含有SEQ ID NO:156(图172)的区域与SEQ IDNO:155(图171)的羧基末端的scFv DNA序列以及其上游和下游的15个碱基额外序列的DNA片段(GeneArt Artificial Gene Synthesis Service)。通过PCR使用该DNA片段作为模板扩增含有C3E-7034 DNA及其上游和下游额外序列的区域，以获得插入DNA片段。通过PCR使用实施例11)-1中制备的表达载体pC3E-7000作为模板扩增除了scFv区域以外的载体区域，以获得载体片段。使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)融合这些DNA片段，以构建在ORF中含有SEQ ID NO:157(图173)的核苷酸序列的表达载体。获得的表达载体被命名为"pC3E-7034"。
11)-3 人源化抗CD3 scFv抗体表达载体pC3E-7035的构建
合成包含经由17个氨基酸柔性接头连接SEQ ID NO:158(图174)与SEQ ID NO:155(图171)的羧基末端的scFv DNA序列以及其上游和下游的15个碱基额外序列的DNA片段(GeneArt Artificial Gene Synthesis Service)。以与实施例11)-2中相同的方式构建在ORF中含有SEQ ID NO:159(图175)的核苷酸序列的表达载体。获得的表达载体被命名为"pC3E-7035"。
11)-4 人源化抗CD3 scFv抗体表达载体pC3E-7036的构建
合成包含经由15个氨基酸柔性接头连接SEQ ID NO:160(图176)与SEQ ID NO:155(图171)的羧基末端连接的scFv DNA序列以及其上游和下游的15个碱基额外序列的DNA片段(GeneArt Artificial Gene Synthesis Service)。以与实施例11)-2中相同的方式构建在ORF中含有SEQ ID NO:161(图177)的核苷酸序列的C3E-7036表达载体。获得的表达载体被命名为"pC3E-7036"。
实施例12. 抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的制备
12)-1抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子表达载体的制备
通过PCR使用实施例10)-4中制备的C2037抗体scFv的DNA序列作为模板，扩增含有C2037抗体scFv的区域的DNA序列、人抗体重链信号序列的一部分和连接scFv的添加的接头，以获得插入DNA模板。而且，通过PCR使用作为模板的实施例11)-2中制备的表达载体pC3E-7034和编码CD3 scFv抗体的信号序列和氨基末端序列的引物，扩增含有CD3 scFvDNA的整个载体区域，以获得载体片段。使用In-Fusion HD克隆试剂盒(ClontechLaboratories, Inc.)融合这些DNA片段，以构建在ORF中含有SEQ ID NO:162(图178)的核苷酸序列的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子表达载体。获得的表达载体被命名为"pC2037-C3E-7034"。
使用C3048抗体scFv和pC3E-7034作为模板，以与上述相同的方式构建在ORF中含有SEQ ID NO:163(图179)的核苷酸序列的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子表达载体。获得的表达载体被命名为"pC3048-C3E-7034"。
以C3022抗体scFv和pC3E-7034作为模板，以与上述相同的方式构建在ORF中含有SEQ ID NO:164(图180)的核苷酸序列的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子表达载体。获得的表达载体被命名为"pC3022-C3E-7034"。
以C2037抗体scFv和pC3E-7035作为模板，以与上述相同的方式构建在ORF中含有SEQ ID NO:165(图181)的核苷酸序列的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子表达载体。获得的表达载体被命名为"pC2037-C3E-7035"。
使用C3048抗体scFv和pC3E-7035作为模板，以与上述相同的方式构建在ORF中含有SEQ ID NO:166(图182)的核苷酸序列的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子表达载体。获得的表达载体被命名为"pC3048-C3E-7035"。
使用C3022抗体scFv和pC3E-7035作为模板，以与上述相同的方式构建在ORF中含有SEQ ID NO:167(图183)的核苷酸序列的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子表达载体。获得的表达载体被命名为"pC3022-C3E-7035"。
使用C2037抗体scFv和pC3E-7036作为模板，以与上述相同的方式构建在ORF中含有SEQ ID NO:168(图184)的核苷酸序列的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子表达载体。获得的表达载体被命名为"pC2037-C3E-7036"。
使用C3048抗体scFv和pC3E-7036作为模板，以与上述相同的方式构建在ORF中含有SEQ ID NO:169(图185)的核苷酸序列的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子表达载体。获得的表达载体被命名为"pC3048-C3E-7036"。
使用C3022抗体scFv和pC3E-7036作为模板，以与上述相同的方式构建在ORF中含有SEQ ID NO:170(图186)的核苷酸序列的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子表达载体。获得的表达载体被命名为"pC3022-C3E-7036"。
12)-2 抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的表达和纯化
以与实施例10)-4中相同的方式表达和纯化C2037-C3E-7034至C3022-C3E-7036。C2037-C3E-7034的氨基酸序列描述于SEQ ID NO:171(图187)中。C3048-C3E-7034的氨基酸序列描述于SEQ ID NO:172(图188)中。C3022-C3E-7034的氨基酸序列描述于SEQ ID NO:173(图189)中。C2037-C3E-7035的氨基酸序列描述于SEQ ID NO:174(图190)中。C3048-C3E-7035的氨基酸序列描述于SEQ ID NO:175(图191)中。C3022-C3E-7035的氨基酸序列描述于SEQ ID NO:176 (图192)中。C2037-C3E-7036的氨基酸序列描述于SEQ ID NO:177(图193)中。C3048-C3E-7036的氨基酸序列描述于SEQ ID NO:178(图194)中。C3022-C3E-7036的氨基酸序列描述于SEQ ID NO:179(图195)中。
实施例13. 抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的体外活性评估
13)-1通过流式细胞术评估抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的结合活性
13)-1-1抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子与表达内源性人GPRC5D的细胞(A4/Fuk)的结合
将淋巴瘤细胞系A4/Fuk细胞(JCRB Cell Bank)用含有5% FBS的PBS调节至适当的浓度。将活的/死的可固定的近红细胞死细胞染色试剂盒添加至细胞中，然后将其在4℃下静置30分钟。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，然后用含有5% FBS的PBS调节至1 × 106个细胞/mL的浓度，以100 μL/孔的量接种至96孔U形底微孔板中，并离心以除去上清液。向其中以100 μL/孔的量添加用含有5% FBS的PBS稀释的每种抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子(在实施例12中制备的C2037-C3E-7034至C3022-C3E-7036)，并将该板在4℃下静置60分钟。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次。然后，向其中以30 μL/孔的量添加用含有5% FBS的PBS稀释的Penta-His Alexa Fluor 488，并将该板在4℃下静置30分钟。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，且然后重悬浮于含有5% FBS的PBS中，随后使用流式细胞仪(FACSCanto(TM) II)检测。使用Flowjo分析数据。计算不含死细胞的级分中的Alexa Fluor 488的平均荧光强度(MFI)。从补充抗体的样品的MFI值减去未补充抗体的样品的MFI值，以计算MFI的相对值(rMFI)。如图196中所示，发现这些抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体结合表达内源性人GPRC5D的细胞。
13)-1-2抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子与表达食蟹猴GPRC5D的细胞的结合
使用实施例5)-2-2中制备的KMS-11_cGPRC5D细胞，以与实施例13)-1-1中相同的方式实施染色和分析。如图197中所示，发现这些抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体结合表达食蟹猴GPRC5D的细胞。
13)-1-3抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子与人CD3 (PBMC)的结合
将市售的人PBMC(Cellular Technology Limited)用含有5%FBS的PBS调节至适当的浓度。将活的/死的可固定的近红细胞死细胞染色试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc.)和抗CD19抗体(Beckman Coulter Inc.)添加至细胞中，然后将其在4℃下静置30分钟。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，然后用含有5% FBS的PBS调节至1 × 106个细胞/mL的浓度，以100 μL/孔的量接种至96孔U形底微孔板中，并离心以除去上清液。向其中以100 μL/孔的量添加用含有5% FBS的PBS稀释的每种抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子(在实施例12中制备的C2037-C3E-7034至C3022-C3E-7036)，并将该板在4℃下静置60分钟。细胞用含有5%FBS的PBS洗涤两次。然后，向其中以30 μL/孔的量添加用含有5% FBS的PBS稀释的Penta-His Alexa Fluor 488 (Qiagen N.V.)，并将该板在4℃下静置30分钟。将细胞用含有5%FBS的PBS洗涤两次，且然后重悬浮于含有5% FBS的PBS中，随后使用流式细胞仪(FACSCanto(TM) II; Becton, Dickinson and Company)检测。使用Flowjo (Tree Star, Inc.)分析数据。计算不含死细胞和CD19阳性细胞的级分中的Alexa Fluor 488的平均荧光强度(MFI)。从补充抗体的样品的MFI值减去未补充抗体的样品的MFI值，以计算MFI的相对值(rMFI)。如图198中所示，发现这些抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体结合表达人CD3的细胞。
13)-1-4抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子与食蟹猴CD3 (PBMC)的结合
根据标准方法使用SepMate (StemCell Technologies Inc.)和淋巴细胞分离溶液(Nacalai Inc.)从食蟹猴的血液收集PBMC。使用收集的食蟹猴PBMC，以与实施例13)-1-3中相同的方式实施染色和分析。如图199中所示，发现这些抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体结合表达食蟹猴CD3的细胞。
13)-2 抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的细胞毒性活性评估
13)-2-1靶细胞的制备
将A4/Fuk细胞用含有10% FBS的RPMI1640培养基(Thermo Fisher Scientific Inc.)调节至1 × 106个细胞/mL的浓度。每mL细胞悬浮液添加100 μL铬-51放射性核素(PerkinElmer, Inc.)，并将细胞在37℃下在5% CO2条件下培养2小时。将细胞用含有10%FBS的RPMI1640培养基洗涤两次，然后在含有10% FBS的RPMI1640培养基中重悬浮至1 ×105个细胞/mL，并用作靶细胞。
13)-2-2效应细胞的制备
将市售的冷冻PBMC(Cellular Technology Limited)在37℃下解冻，转移至补充有抗聚集物洗涤试剂(Cellular Technology Limited)的含有10% FBS的RPMI1640培养基的溶液中，洗涤两次，然后用含有10% FBS的RPMI1640培养基调节至1 × 106个细胞/mL，并用作效应细胞。
13)-2-3细胞毒性测定
将实施例13)-2-1中获得的A4/Fuk细胞以50 μL/孔的浓度添加至96孔U形底微孔板中。向其中以50 μL/孔的量添加调节至不同浓度的每种抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子(在实施例12中制备)。向其中以100 μL/孔的量添加实施例13)-2-2中制备的效应细胞。在室温下以1000 rpm离心1分钟之后，将细胞在37℃下在5% CO2条件下培养20至24小时。将50 μL上清液的等分试样回收至LumaPlate (PerkinElmer, Inc.)中并在50℃下干燥近似2小时，随后使用读板器(TopCount; PerkinElmer, Inc.)进行测量。根据以下表达式计算裂解的细胞的百分比：
裂解的细胞的百分比(%) = (A - B) / (C - B) × 100
A：样品孔的计数
B：背景(未补充抗体的孔)计数的平均值(n = 3)。在添加抗体时，添加50 μL用于测定的培养基。其他程序与样品孔的情况下相同。
C：最大释放(含有在表面活性剂中裂解的靶细胞的孔)计数的平均值(n = 3)。在添加抗体时，添加50 μL用于测定的培养基。100 μ添加100 μL表面活性剂，并将50 μL等分试样转移至LumaPlate，与样品孔一样，并进行测定。
如图200中所示，这些抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体表现出针对A4/Fuk细胞的细胞毒性活性。
实施例14. 含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的制备
14)-1含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子表达载体的制备
14)-1-1全尺寸抗体(FSA)型双特异性分子表达载体的制备
净合成编码实施例8)-1-2中构建的人源化抗GPRC5D抗体(h2B1) H2型重链可变区的DNA (Genscript Custom Gene Synthesis Service)。表达载体"pCL_#13540"和"pCL_#13543"通过将获得的重链可变区、两种类型的人IgG衍生的CH1区以及具有降低的效应子功能且含有异多聚体形成突变的Fc区(WO2014/190441)插入哺乳动物表达载体pTT5(National Research Council，WO2009/137911)来制备。而且，净合成实施例8)-2-5中构建的人源化抗GPRC5D抗体(h2B1) L5型轻链可变区。表达载体"pCL_#12290"和"pCL_#12313"通过将编码获得的轻链可变区和两种类型的人IgG衍生的CL区的DNA插入哺乳动物表达载体pTT5来制备。
接下来，净合成编码实施例11)-2中构建的人源化抗CD3 scFv (C3E-7034)的重链的DNA片段。"pCL_#13552"通过将获得的scFv重链可变区、人IgG衍生的CH1和具有降低的效应子功能且含有异多聚体形成突变的Fc区插入哺乳动物表达载体pTT5来制备。而且，净合成编码实施例11)-2中构建的人源化抗CD3 scFv (C3E-7034)的轻链的DNA片段。"pCL_#12287"通过将获得的scFv轻链可变区和人IgG衍生的CL插入哺乳动物表达载体pTT5来制备。同样地，净合成编码实施例11)-4中构建的人源化抗CD3 scFv (C3E-7036)的重链的DNA序列。"pCL_#13541"通过将编码获得的scFv重链可变区、人IgG衍生的CH1和具有降低的效应子功能且含有异多聚体形成突变的Fc区的DNA序列插入哺乳动物表达载体pTT5来制备。而且，净合成编码实施例11)-4中构建的人源化抗CD3 scFv (C3E-7036)的轻链的DNA片段。"pCL_#12321"通过将编码获得的scFv轻链和人IgG衍生的CL的DNA片段插入哺乳动物表达载体pTT5来制备。
pCL_#13540、pCL_#13543、pCL_#12290、pCL_#12313、pCL_#13552、pCL_#12287、pCL_#13541和pCL_#12321的ORF序列分别示于序列表的SEQ ID NO:198 (图222)、SEQ IDNO:200 (图224)、SEQ ID NO:202 (图226)、SEQ ID NO:204 (图228)、SEQ ID NO:206 (图230)、SEQ ID NO:208 (图232)、SEQ ID NO:210 (图234)和SEQ ID NO:212 (图236)。
14)-1-2杂合型双特异性分子表达载体的制备
制备具有编码人源化抗GPRC5D抗体(h2B1) H2型重链可变区、人IgG衍生的CH1区和具有降低的效应子功能且含有异多聚体形成突变的Fc区的DNA片段的插入物的哺乳动物细胞的表达载体，并命名为"pCL_#13555"。而且，制备具有编码人源化抗GPRC5D抗体(h2B1) L5型轻链可变区和人IgG衍生的CL区的DNA片段的插入物的哺乳动物细胞的表达载体，并命名为"pCL_#12123"。
接下来，制备具有编码人源化抗CD3 scFv (C3E-7034)和具有降低的效应子功能且含有异多聚体形成突变的Fc区的DNA片段的插入物的哺乳动物细胞的表达载体，并命名为"pCL_#13557"。而且，制备具有编码人源化抗CD3 scFv (C3E-7036)和具有降低的效应子功能且含有异多聚体形成突变的Fc区的DNA片段的插入物的哺乳动物细胞的表达载体"pCL_#13561"。
pCL_#13555、pCL_#12123、pCL_#13557和pCL_#13561的ORF序列分别示于序列表的SEQ ID NO:214 (图238)、SEQ ID NO:216 (图240)、SEQ ID NO:218 (图242)和SEQ ID NO:220 (图244)中。
14)-1-3双重型双特异性分子表达载体的制备
实施例8)-1-2中构建的人源化抗GPRC5D抗体(h2B1) H2型重链可变区和L5型轻链可变区经由由3个GGGGS的重复序列组成的柔性接头连接以制备单链抗体(抗体)。"pCL_#13563"通过将编码该抗GPRC5D scFv和具有降低的效应子功能且含有异源多聚体形成突变的Fc区的DNA片段插入哺乳动物表达载体pTT5来制备。pCL_#13563的ORF序列示于序列表的SEQ IDNO:222 (图246)中。
14)-2 含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的产生
根据手册将CHO-3E7细胞亚培养和培养(National Research Council Canada,Raymond C. 等人, Methods (2011) 55 (1), 44-51)。将对数生长期中的CHO-3E7细胞的培养基用含有4 mM谷氨酰胺和0.1% Kolliphor (Sigma-Aldrich Corp.)的FreeStyle F17培养基(Invitrogen Corp.)稀释至2 × 106个细胞/mL，并用于产生各种双特异性抗体。
14)-2-1全尺寸抗体(FSA)型双特异性分子的产生
将8000μg聚乙烯亚胺max (PEImax, Polysciences)溶解于分散的FreeStyle F17培养基中以制备PEImax溶液。将1000 μg以15:15:53:17的比率混合的载体pCL_#13552、pCL_#12287、pCL_#13540和pCL_#12290的混合物或以22:8:17:53的比率混合的载体pCL_#13541、pCL_#12321、pCL_#13543和pCL_#12313的混合物添加至分散的F17培养基的等份试样中，以获得载体混合物。将1000 μg与已经片段化的鲑鱼精子DNA (Sigma-Aldrich Corp.)混合的pAKT和pGFP(均来自National Research Council)的DNA混合物添加至分散的F17培养基的另一等份试样中，以产生DNA溶液。将PEImax溶液、载体混合物和DNA溶液合并，温和搅拌，保持静置5分钟，且然后添加至2 L CHO-3E7细胞悬浮液中。将细胞在5% CO2培养箱中在37℃下振荡培养1天。然后添加0.5 mM丙戊酸(Sigma-Aldrich Corp.)和0.1% (w/v)胰蛋白胨N1(Organotechnie)。将细胞在32℃下进一步振荡培养6天。在培养开始后第7天，回收培养上清液并过滤通过0.2 μm过滤器(Sartorius Japan K.K.)以制备用于评估的样品。
pCL_#13552、pCL_#12287、pCL_#13540和pCL_#12290用于表达和制备C3E-7034和h2B1的FSA型双特异性分子(v19159)。pCL_#13541、pCL_#12321、pCL_#13543和pCL_#12313用于表达和制备C3E-7036和h2B1的FSA型双特异性分子(v19140)。
构成通过从相应载体表达获得的v19159的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:207 (图231)、209 (图233)、199 (图223)和203 (图227)。构成v19140的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:211 (图235)、213 (图237)、201 (图225)和205 (图229)。
14)-2-2杂合型双特异性分子的产生
将8000μg聚乙烯亚胺max (PEImax, Polysciences)溶解于分散的FreeStyle F17培养基中以制备PEImax溶液。将1000 μg以1:1:1.5的比率混合的载体pCL_#13557、pCL_#13555和pCL_#12123的混合物或以1:1:1.5的比率混合的载体pCL_#13561、pCL_#13555和pCL_#12123的混合物添加至分散的F17培养基的等份试样中，以获得载体混合物。将1000μg与已经片段化的鲑鱼精子DNA (Sigma-Aldrich Corp.)混合的pAKT和pGFP(均来自NationalResearch Council)的DNA混合物添加至分散的F17培养基的另一等份试样中，以获得DNA溶液。将PEImax溶液、载体混合物和DNA溶液合并，温和搅拌，保持静置5分钟，且然后添加至2L CHO-3E7细胞悬浮液中。将细胞在5% CO2培养箱中在37℃下振荡培养1天。然后添加0.5mM丙戊酸(Sigma-Aldrich Corp.)和0.1% (w/v)胰蛋白胨N1 (Organotechnie)。将细胞在32℃下进一步振荡培养6天。在培养开始后第7天，回收培养上清液并过滤通过0.2 μm过滤器(Sartorius Japan K.K.)以制备用于评估的样品。
pCL_#13557、pCL_#13555和pCL_#12123用于表达和制备C3E-7034和h2B1的杂合型双特异性分子(v19126)。pCL_#13561、pCL_#13555和pCL_#12123用于表达和制备C3E-7036和h2B1的杂合型双特异性分子(v19125)。
构成通过从相应载体表达获得的v19126的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:219 (图243)、215 (图239)和217 (图241)。构成v19125的氨基酸序列示于序列表的SEQ IDNO:221 (图245)、215 (图239)和217 (图241)。
14)-2-3双重型双特异性分子的产生
将8000μg聚乙烯亚胺max (PEImax, Polysciences)溶解于分散的FreeStyle F17培养基中以制备PEImax溶液。将1000 μg以4:3的比率混合的载体pCL_#13557和pCL_#13563的混合物或以1:1的比率混合的载体pCL_#13561和pCL_#13563的混合物添加至分散的F17培养基的等份试样中，以获得载体混合物。将1000 μg与已经片段化的鲑鱼精子DNA (Sigma-Aldrich Corp.)混合的pAKT和pGFP(均来自National Research Council)的DNA混合物添加至分散的F17培养基的另一等份试样中，以获得DNA溶液。将PEImax溶液、载体混合物和DNA溶液合并，温和搅拌，保持静置5分钟，且然后添加至2 L CHO-3E7细胞悬浮液中。将细胞在5% CO2培养箱中在37℃下振荡培养1天。然后添加0.5 mM丙戊酸(Sigma-Aldrich Corp.)和0.1% (w/v)胰蛋白胨N1 (Organotechnie)。将细胞在32℃下进一步振荡培养6天。在培养开始后第7天，回收培养上清液并过滤通过0.2 μm过滤器(Sartorius Japan K.K.)以制备用于评估的样品。
pCL_#13557和pCL_#13563用于表达和制备C3E-7034和h2B1的双重-scFv(双重)型双特异性分子(v19122)。pCL_#13561和pCL_#13563用于表达和制备C3E-7036和h2B1的双重型双特异性分子(v19121)。
构成通过从相应载体表达获得的v19122的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:219 (图243)和223 (图247)。构成v19121的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:221 (图245)和223 (图247)。
14)-3 含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的纯化
使用蛋白A亲和色谱和凝胶过滤色谱，通过两步从实施例14)-2中获得的培养上清液纯化每种双特异性分子。
将培养上清液应用至用PBS (pH 7.4)平衡的MabSelect SuRe柱(GE HealthcareBio-Sciences Corp.)，以在其上吸附目标双特异性分子。用PBS除去未吸附的组分。然后，用乙酸盐缓冲液(pH 3.6)洗脱吸附的组分。将洗脱的级分用Tris缓冲液(pH 11)调节至中性pH，然后浓缩，并应用至预先用PBS (pH 7.4)平衡的凝胶过滤柱Superdex 200 10/300(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)。通过凝胶过滤色谱获得的峰级分通过SDS毛细管电泳(LabChip-Caliper)分析，以回收对应于目标异二聚体的级分。对于双重型双特异性分子，将回收的级分随后由预先使用HBsor(25 mM组氨酸，5%山梨糖醇，pH6.0)平衡而缓冲液交换为HBsor的脱盐柱HiPrep 26/10 Desalting (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)处理。纯化样品的身份通过质谱和SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)证实为正确组装的目标抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子。
实施例15. 含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的体外活性评估
15)-1通过流式细胞术评估含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的结合活性
15)-1-1含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子与表达内源性人GPRC5D的细胞(KHM-1B)的结合
将表达GPRC5D的人多发性骨髓瘤细胞系KHM-1B用含有5% FBS的PBS调节至适当的浓度。将活的/死的可固定的近红细胞死细胞染色试剂盒添加至细胞中，然后将其在4℃下静置30分钟。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，然后用含有5% FBS的PBS调节至1 × 106个细胞/mL的浓度，以100 μL/孔的量接种至96孔U形底微孔板中，并离心以除去上清液。向其中以100 μL/孔的量添加用含有5% FBS的PBS稀释的每种含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子，并将该板在4℃下静置60分钟。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次。然后，向其中以100 μl/孔的量添加用含有5% FBS的PBS稀释100倍的R-藻红蛋白AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)，并将该板在4℃下静置1小时。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，且然后重悬浮于含有5% FBS的PBS中，随后使用流式细胞仪(FACSCantoI II)检测。使用Flowjo分析数据。将不含死细胞的级分的PE荧光强度绘制成柱状图。计算平均荧光强度(MFI)。作为结果，发现含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体结合表达人GPRC5D的细胞(图248)。
15)-1-2含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子与表达食蟹猴GPRC5D的细胞的结合
使用实施例5)-2-2中制备的KMS-11_cGPRC5D细胞，以与实施例15)-1-1中相同的方式实施染色和分析。如图249中所示，发现这些含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体结合表达食蟹猴GPRC5D的细胞。
15)-1-3 含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子与人CD3 (PBMC)的结合
将市售的人PBMC(Cellular Technology Limited)用含有5%FBS的PBS调节至适当的浓度。将活的/死的可固定的近红细胞死细胞染色试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc.)和抗CD19抗体(Beckman Coulter Inc.)添加至细胞中，然后将其在4℃下静置30分钟。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，然后用含有5% FBS的PBS调节至1 × 106个细胞/mL的浓度，以100 μL/孔的量接种至96孔U形底微孔板中，并离心以除去上清液。向其中以100 μL/孔的量添加用含有5% FBS的PBS稀释的每种含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子(实施例14中制备)，并将该板在4℃下静置60分钟。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次。然后，向其中以100 μl/孔的量添加用含有5% FBS的PBS稀释100倍的R-藻红蛋白AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)，并将该板在4℃下静置1小时。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，且然后重悬浮于含有5%FBS的PBS中，随后使用流式细胞仪(FACSCI(TM) II)检测。使用Flowjo分析数据。将不含死细胞的级分的PE荧光强度绘制成柱状图。计算平均荧光强度(MFI)。作为结果，发现含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体结合表达人CD3的细胞(图250)。
15)-1-4含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子与表达食蟹猴CD3的细胞(食蟹猴PBMC)的结合
使用以与实施例13)-1-4中相同的方式收集的食蟹猴PBMC，以与实施例15)-1中相同的方式实施染色和分析。如图251中所示，发现这些含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体结合表达食蟹猴CD3的细胞。
15)-2 含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的细胞毒性活性评估
15)-2-1靶细胞的制备
以与实施例13)-2-1中相同的方式制备KHM-1B细胞，并用作靶细胞。
15)-2-2效应细胞的制备
将市售的冷冻PBMC(Cellular Technology Limited)在37℃下解冻，转移至补充有抗聚集物洗涤试剂(Cellular Technology Limited)的含有10% FBS的RPMI1640培养基的溶液中，洗涤两次，然后用含有10% FBS的RPMI1640培养基调节至1.5 × 105个细胞/mL，并用作效应细胞。
15)-2-3细胞毒性测定
将实施例15)-2-1中获得的KHM-1B细胞以50 μL/孔的浓度添加至96孔U形底微孔板中。向其中以50 μL/孔的量添加调节至不同浓度的每种含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子(在实施例14中制备)。向其中以100 μL/孔的量添加实施例15)-2-2中制备的效应细胞。在室温下以1000 rpm离心1分钟之后，将细胞在37℃下在5% CO2条件下培养24至48小时。将50 μL上清液的等分试样回收至LumaPlate (PerkinElmer, Inc.)中并在50℃下干燥近似2小时，随后使用读板器(TopCount; PerkinElmer, Inc.)进行测量。根据以下表达式计算裂解的细胞的百分比：
裂解的细胞的百分比(%) = (A - B) / (C - B) × 100
A：样品孔的计数
B：背景(未补充抗体的孔)计数的平均值(n = 3)。在添加抗体时，添加50 μL用于测定的培养基。其他程序与样品孔的情况下相同。
C：最大释放(含有在表面活性剂中裂解的靶细胞的孔)计数的平均值(n = 3)。在添加抗体时，添加50 μL用于测定的培养基。添加100 μL表面活性剂，并将50 μL等分试样转移至LumaPlate，与样品孔一样，并进行测定。
如图252中所示，这些含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体表现出针对KHM-1B细胞的细胞毒性活性。
实施例16. 含有Fc的抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的体内活性评估
16)-1人PBMC和癌细胞共移植模型中的体内活性
将人多发性骨髓瘤细胞系KHM-1B (JCRB)和人PBMC (Cellular Technology Limited)用含有50%基质胶(Corning Inc.)的PBS各自调节至5 × 107个细胞/mL，并以0.1 mL的量皮下共同移植至每只NOD-Scid小鼠(雌性，5周龄)。在移植之后，将小鼠分组，并将每种抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子(0.1 mg/kg)施用至尾静脉中。从移植日(第0天)至第2天每天三次进行施用。使用电子数字卡尺从1周后(第7天)起随着时间测量肿瘤的长轴(mm)和短轴(mm)。根据以下表达式计算估计的肿瘤体积：
估计的肿瘤体积(mm3) = 每个个体的平均估计肿瘤体积
每个个体的估计肿瘤体积=长轴 × 短轴2 / 2
在每个抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子施用组中证实抗肿瘤效力(图253)。
16)-2在人PBMC迁移模型中的体内活性评估
将人PBMC用PBS调节至5 × 107个细胞/mL，并以0.2 mL的量移植入每只NOG小鼠(雌性，6周龄)的尾静脉中(第-4天)。在第0天，将KHM-1B各自用含有50%基质胶的PBS调节至3× 107个细胞/mL，并以0.1 mL的量皮下移植至NOG小鼠。当小鼠的估计肿瘤体积达到近似200 mm3(第12天)时，将小鼠根据其肿瘤体积分组，并将每种抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子施用(1 mg/kg)至尾静脉中。在第12、15和18天实施施用。使用电子数字卡尺随着时间测量肿瘤的长轴(mm)和短轴(mm)。计算估计的肿瘤体积。如图中所示，在每个抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体分子施用组中表现出肿瘤消退。具体地，在v19125治疗组中证实强烈的肿瘤消退效力(图254)。
实施例17. CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的制备
17)-1 CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子表达载体的制备
17)-1-1 CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子(C5D-0004、C5D-0005和C5D-0006)表达载体的制备
在实施例14)-1-2中构建的杂合型双特异性分子(v19125)表达载体中，编码人源化抗CD3 scFv-Fc的pCL_#13561用作定点诱变中的模板以制备将H链CDR2的Asn53修饰成Arg的CDR修饰形式的载体pC3E-8015。同样，在杂合型双特异性分子(v19126)表达载体中，编码人源化抗CD3 scFv-Fc的pCL_#13557用作定点诱变中的模板以制备将H链CDR2的Asn53修饰成Arg的且将L链Asp52修饰成Asn的CDR修饰形式的载体pC3E-8017。而且，pCL_#13557用作定点诱变中的模板以制备将H链CDR2的Asn53修饰成Ser且将L链Asp52修饰成Asn的CDR修饰形式的载体pC3E-8018。
pC3E-8015、pC3E-8017和pC3E-8018的ORF序列分别示于序列表的SEQ ID NO:224(图255)、SEQ ID NO:226 (图257)和SEQ ID NO:228 (图259)。
17)-1-2 C末端添加Lys的CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子(C5D-0014、C5D-0015和C5D-0016)表达载体的制备
在实施例17)-1-1中构建的杂合型双特异性分子(C5D-0004)表达载体中，编码CDR修饰的人源化抗CD3 scFv-Fc的pC3E-8015用作定点诱变中的模板，以制备添加K的CDR修饰的载体pC3E-8025，其含有插入至Fc的C末端的Lys。同样，pC3E-8017和pC3E-8018用作定点诱变中的模板，以制备用于添加K的CDR修饰的载体pC3E-8027和pC3E-8028，其含有插入Fc的C末端的Lys。
在实施例14)-1-2中构建的杂合型双特异性分子(v19125和v19126)表达载体中，编码抗GPRC5D Fab-Fc的pCL_#13555用作定点诱变中的模板以制备用于添加K的载体pTAA_#2，其含有插入Fc的C末端的Lys。
pC3E-8025、pC3E-8027、pC3E-8028和pTAA_#2的ORF序列分别示于序列表的SEQ IDNO:230 (图261)、SEQ ID NO:232 (图263)、SEQ ID NO:234 (图265)和SEQ ID NO:236 (图267)。
17)-2 CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的产生
将CHO-3E7细胞根据手册(National Research Council Canada, Raymond C. 等人,Methods (2011) 55 (1), 44-51)进行亚培养和培养。将对数生长期中的CHO-3E7细胞的培养基用含有4 mM谷氨酰胺的BalanCD Transfectory CHO (Irvine Scientific)稀释至2× 10^6个细胞/mL，并用于产生各种双特异性抗体。
将ExpiCHO-S细胞根据手册(Thermo Fisher Scientific Inc.)进行亚培养和培养。将对数生长期中的ExpiCHO-S细胞的培养基用ExpiCHO表达培养基(Thermo FisherScientific Inc.)稀释至6 × 10^6个细胞/mL，并用于产生各种双特异性抗体。
17)-2-1 CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子(C5D-0004、C5D-0005和C5D-0006)的产生
使用ExpiCHO-S细胞作为宿主，通过培养表达杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体C5D-0004、C5D-0005和C5D-0006。用表达载体转染细胞的方法和培养条件都根据产品附带的手册(Thermo Fisher Scientific Inc.)实施。培养以750 mL的规模进行，并且对于进料添加和培养温度，使用手册中描述的Max滴度方案的条件。在培养开始后第13天，回收培养上清液并过滤通过0.2 μm过滤器(Sartorius Japan K.K.)以制备用于评估的样品。
从pC3E-8015、pCL_#13555和pCL_#12123的组合获得杂合型双特异性分子C5D-0004。从pC3E-8017、pCL_#13555和pCL_#12123的组合获得杂合型双特异性分子C5D-0005。从pC3E-8018、pCL_#13555和pCL_#12123的组合获得杂合型双特异性分子C5D-0006。
构成通过从相应载体表达获得的C5D-0004的氨基酸序列示于序列表的SEQ IDNO:225 (图256)、215 (图239)和217 (图241)。构成C5D-0005的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:227 (图258)、215 (图239)和217 (图241)。构成C5D-0006的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:229 (图260)、215 (图239)和217 (图241)。
17)-2-2 C末端添加Lys的CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体(C5D-0014、C5D-0015和C5D-0016)的产生
将800 μg PEImax (Polysciences)溶解于3 mL Opti-PRO SFM培养基(Thermo FisherScientific Inc.)中以制备PEImax溶液。100 μ将100 μg以1:1:1.5的比率混合的pC3E-_8025、pTAA_#2和pCL_#12123的载体混合物，和将100μg与已经片段化的鲑鱼精子DNA混合的pAKT和pGFP的DNA混合物添加至3 mL Opti-PRO SFM培养基中。将PEImax溶液、载体混合物和DNA溶液合并，温和搅拌，保持静置5分钟，且然后添加至200 mL CHO-3E7细胞培养基中。将细胞在5% CO2培养箱中在37℃下振荡培养1天。然后，向其中添加22 mL TransfectorySupplement (Irvine Scientific)、480 μL抗聚集补充剂(Thermo Fisher ScientificInc.)和500 μL丙戊酸(Sigma-Aldrich Corp.)。将细胞在32℃下进一步振荡培养9天。在培养开始后第10天，回收培养上清液并过滤通过0.2 μm过滤器(Sartorius Japan K.K.)以制备用于评估的样品。
从pC3E-8025、pTAA_#2和pCL_12123的组合获得杂合型双特异性分子C5D-0014。从pC3E-8027、pTAA_#2和pCL_#12123的组合获得杂合型双特异性分子C5D-0015。从pC3E-8028、pTAA_#2和pCL_#12123的组合获得杂合型双特异性分子C5D-0016。
构成通过从相应载体表达获得的C5D-0014的氨基酸序列示于序列表的SEQ IDNO:231 (图262)、237 (图268)和217 (图241)。构成C5D-0015的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:233 (图264)、237 (图268)和217 (图241)。构成C5D-0016的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO:235 (图266)、237 (图268)和217 (图241)。
17)-3 CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体的纯化
17)-3-1 CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子(C5D-0004、C5D-0005和C5D-0006)的纯化
使用蛋白A亲和色谱、羟基磷灰石色谱和阳离子交换色谱，通过三步从17)-2-1中获得的培养上清液纯化每种双特异性分子。具体地，将培养上清液应用至用PBS (pH 7.4)平衡的MabSelect SuRe柱(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)，以吸附目标双特异性分子。用PBS除去未吸附的组分。然后，用100 mM乙酸盐缓冲液(pH 3.5)洗脱吸附的组分。将洗脱的级分用Tris缓冲液(pH 9.0)立即调节至中性pH，然后在50 mM HEPES、10 mM磷酸钾和100mM氯化钠的溶液中透析，并且应用至羟基磷灰石柱Bio-Scale CHT I型(Bio-RadLaboratories, Inc.)。通过线性浓度梯度将溶剂中的氯化钠浓度从0.1 M改变为1 M，洗脱吸附的目标双特异性分子。通过SDS-PAGE分析获得的峰级分，以回收对应于目标双特异性分子的级分。接下来，将回收的级分用50 mM HEPES (pH 8.0)和20 mM氯化钠溶液缓冲液替代，且然后应用至阳离子交换柱Mono S (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)。通过线性浓度梯度将溶剂中的氯化钠浓度从20 mM改变为1 M，洗脱吸附的目标双特异性分子。通过SDS-PAGE分析获得的峰级分，以回收对应于目标双特异性分子的级分。将最终回收的级分通过Hbsor (25 mM组氨酸，5%山梨糖醇，pH 6.0)透析，并过滤通过过滤器以制备纯化的样品。通过质谱、SDS-PAGE和SEC分析证实纯化的样品明确是目标抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子。
17)-3-2 C末端添加Lys的CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体(C5D-0014、C5D-0015和C5D-0016)的纯化
使用蛋白A亲和色谱和羟基磷灰石色谱，在17)-2-2中分两步获得的培养上清液纯化每种双特异性分子。具体地，将培养上清液应用至用PBS (pH 7.4)平衡的MabSelect SuRe柱(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)，以吸附目标双特异性分子。用PBS除去未吸附的组分。然后，用100 mM乙酸盐缓冲液(pH 3.0)洗脱吸附的组分。将洗脱的级分用Tris缓冲液(pH 9.5)立即调节至中性pH，然后在50 mM HEPES、10 mM磷酸钾和100 mM氯化钠的溶液中透析，并且应用至羟基磷灰石柱Bio-Scale CHT I型(Bio-Rad Laboratories, Inc.)。通过线性浓度梯度将溶剂中的氯化钠浓度从0.1 M改变为1 M，洗脱吸附的目标双特异性分子。通过SDS-PAGE分析获得的峰级分，以回收对应于目标双特异性分子的级分。将最终回收的级分用Hbsor (25 mM组氨酸，5%山梨糖醇，pH 6.0)透析，并过滤通过过滤器以制备纯化的样品。通过质谱、SDS-PAGE和SEC分析证实纯化的样品明确是目标抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子。
实施例18. C末端添加Lys的CDR修饰的杂合型和CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体的体外活性评估
18)-1 通过流式细胞术评估C末端添加Lys的CDR修饰的杂合型和CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体的结合活性
18)-1-1 C末端添加Lys的CDR修饰的杂合型和CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体与表达内源性人GPRC5D的细胞(KHM-1B)的结合
以与实施例15)-1-1中相同的方式实施细胞制备、染色和分析。作为结果，发现抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体结合表达人GPRC5D的细胞(图269)。
18)-1-2-2 C末端添加Lys的CDR修饰的杂合型和CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体与表达食蟹猴GPRC5D的细胞的结合
以与实施例15)-1-2中相同的方式实施细胞制备、染色和分析。如图270中所示，发现这些抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体结合表达食蟹猴GPRC5D的细胞。
18)-1-3 C末端添加Lys的CDR修饰的杂合型和CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体与表达人CD3的细胞(PBMC)的结合
以与实施例15)-1-3中相同的方式实施细胞制备、染色和分析。作为结果，发现抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体结合表达人CD3的细胞(图271)。
18)-1-4 C末端添加Lys的CDR修饰的杂合型和CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体与表达食蟹猴CD3的细胞(PBMC)的结合
以与实施例15)-1-4中相同的方式实施细胞制备、染色和分析。如图272中所示，发现这些抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体结合表达食蟹猴CD3的细胞。
18)-2 C末端添加Lys的CDR修饰的杂合型和CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体的细胞毒性活性评估
除了培养时间为24至72小时以外，以与实施例15)-2-3中相同的方式实施细胞毒性活性测定。如图273中所示，这些抗GPRC5D-抗CD3双特异性抗体表现出针对KHM-1B细胞的细胞毒性活性。
实施例19. CDR修饰的杂合型和C末端添加Lys的CDR修饰的杂合型抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子的体内活性评估
19)-1人PBMC和癌细胞共移植模型中的体内活性
将KHM-1B和人PBMC各自用含有50%基质胶的PBS调节至5 × 107个细胞/mL，并以0.1mL的量皮下共移植至每只NOD-Scid小鼠(雌性，5周龄)中。在移植之后，将小鼠分组，并将每种抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子(1 μg/kg)施用至尾静脉中。从移植日(第0天)至第2天每天三次进行施用。1周后(第7天)，使用电子数字卡尺随着时间测量肿瘤的长轴(mm)和短轴(mm)。根据以下表达式计算估计的肿瘤体积：
估计的肿瘤体积(mm3) = 每个个体的平均估计肿瘤体积
每个个体的估计肿瘤体积=长轴 × 短轴2 / 2。
在每个抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子施用组中证实抗肿瘤效力(图274)。
19)-2在人PBMC迁移模型中的体内活性
将人PBMC用PBS调节至5 × 107个细胞/mL，并以0.2 mL的量移植入每只NOG小鼠(雌性，6周龄)的尾静脉中(第-4天)。在第0天，将KHM-1B用含有50%基质胶的PBS调节至3 ×107个细胞/mL，并以0.1 mL的量皮下移植至NOG小鼠。当小鼠的估计肿瘤体积达到近似200mm3(第11天)时，将小鼠根据其肿瘤体积分组，并将每种抗GPRC5D-抗CD3双特异性分子施用(1 mg/kg)至尾静脉中。在第11、14和17天实施施用。使用电子数字卡尺随着时间测量肿瘤的长轴(mm)和短轴(mm)。计算估计的肿瘤体积。如图中所示，对于C5D-0004 (图275A)和C5D-0014 (图275B)，确认了肿瘤消退。
[序列表自由文本]
SEQ ID NO:1：人GPRC5D的氨基末端序列(图2)
SEQ ID NO:2：人GPRC5D的氨基末端序列(图3)
SEQ ID NO:3：用于PCR扩增2A4的重链基因的编码可变区的cDNA的引物
SEQ ID NO:4：编码2A4的重链可变区的cDNA的核苷酸序列(图8)
SEQ ID NO:5：2A4的重链可变区的氨基酸序列(图9)
SEQ ID NO:6：编码2B1的重链可变区的cDNA的核苷酸序列(图10)
SEQ ID NO:7：2B1的重链可变区的氨基酸序列(图11)
SEQ ID NO:8：编码7B4的重链可变区的cDNA的核苷酸序列(图12)
SEQ ID NO:9：7B4的重链可变区的氨基酸序列(图13)
SEQ ID NO:10：用于PCR扩增2A4的轻链基因的编码可变区的cDNA的引物
SEQ ID NO:11：编码2A4的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列(图14)
SEQ ID NO:12：2A4的轻链可变区的氨基酸序列(图15)
SEQ ID NO:13：编码2B1的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列(图16)
SEQ ID NO:14：2B1的轻链可变区的氨基酸序列(图17)
SEQ ID NO:15：编码7B4的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列(图18)
SEQ ID NO:16：7B4的轻链可变区的氨基酸序列(图19)
SEQ ID NO:17：包含编码人κ链分泌信号序列和人κ链恒定区的氨基酸的DNA序列的DNA片段(图20)
SEQ ID NO:18：轻链表达载体的引物F(图21)
SEQ ID NO:19：轻链表达载体的引物R(图22)
SEQ ID NO:20：包含编码人重链信号序列和人IgG1恒定区的氨基酸的DNA序列的DNA片段(图23)
SEQ ID NO:21：人嵌合2A4 (c2A4)的轻链的核苷酸序列(图24)
SEQ ID NO:22：人嵌合2A4 (c2A4)的轻链的氨基酸序列(图25)
SEQ ID NO:23：人嵌合2A4的轻链的引物组F(图26)
SEQ ID NO:24：人嵌合2A4的轻链的引物组R(图27)
SEQ ID NO:25：人嵌合2A4 (c2A4)的重链的核苷酸序列(图28)
SEQ ID NO:26：人嵌合2A4 (c2A4)的重链的氨基酸序列(图29)
SEQ ID NO:27：人嵌合2A4的重链的引物组F(图30)
SEQ ID NO:28：人嵌合2A4的重链的引物组R(图31)
SEQ ID NO:29：人嵌合2B1 (c2B1)的轻链的核苷酸序列(图32)
SEQ ID NO:30：人嵌合2B1 (c2B1)的轻链的氨基酸序列(图33)
SEQ ID NO:31：人嵌合2B1的轻链的引物组F(图34)
SEQ ID NO:32：人嵌合2B1的轻链的引物组R(图35)
SEQ ID NO:33：人嵌合2B1 (c2B1)的重链的核苷酸序列(图36)
SEQ ID NO:34：人嵌合2B1 (c2B1)的重链的氨基酸序列(图37)
SEQ ID NO:35：人嵌合2B1的重链的引物组F(图38)
SEQ ID NO:36：人嵌合2B1的重链的引物组R(图39)
SEQ ID NO:37：人嵌合7B4 (c7B4)的轻链的核苷酸序列(图40)
SEQ ID NO:38：人嵌合7B4 (c7B4)的轻链的氨基酸序列(图41)
SEQ ID NO:39：人嵌合7B4的轻链的引物组F(图42)
SEQ ID NO:40：人嵌合7B4的轻链的引物组R(图43)
SEQ ID NO:41：人嵌合7B4 (c7B4)的重链的核苷酸序列(图44)
SEQ ID NO:42：人嵌合7B4 (c7B4)的重链的氨基酸序列(图45)
SEQ ID NO:43：人嵌合7B4的重链的引物组F(图46)
SEQ ID NO:44：人嵌合7B4的重链的引物组R(图47)
SEQ ID NO:45：大鼠抗GPRC5D抗体2A4的重链CDR1的氨基酸序列(图54)
SEQ ID NO:46：大鼠抗GPRC5D抗体2A4的重链CDR2的氨基酸序列(图55)
SEQ ID NO:47：大鼠抗GPRC5D抗体2A4的重链CDR3的氨基酸序列(图56)
SEQ ID NO:48：大鼠抗GPRC5D抗体2B1的重链CDR1的氨基酸序列(图57)
SEQ ID NO:49：大鼠抗GPRC5D抗体2B1的重链CDR2的氨基酸序列(图58)
SEQ ID NO:50：大鼠抗GPRC5D抗体2B1的重链CDR3的氨基酸序列(图59)
SEQ ID NO:51：大鼠抗GPRC5D抗体7B4的重链CDR1的氨基酸序列(图60)
SEQ ID NO:52：大鼠抗GPRC5D抗体7B4的重链CDR2的氨基酸序列(图61)
SEQ ID NO:53：大鼠抗GPRC5D抗体7B4的重链CDR3的氨基酸序列(图62)
SEQ ID NO:54：大鼠抗GPRC5D抗体2A4的轻链CDR1的氨基酸序列(图63)
SEQ ID NO:55：大鼠抗GPRC5D抗体2A4的轻链CDR2的氨基酸序列(图64)
SEQ ID NO:56：大鼠抗GPRC5D抗体2A4的轻链CDR3的氨基酸序列(图65)
SEQ ID NO:57：大鼠抗GPRC5D抗体2B1的轻链CDR1的氨基酸序列(图66)
SEQ ID NO:58：大鼠抗GPRC5D抗体2B1的轻链CDR2的氨基酸序列(图67)
SEQ ID NO:59：大鼠抗GPRC5D抗体2B1的轻链CDR3的氨基酸序列(图68)
SEQ ID NO:60：大鼠抗GPRC5D抗体7B4的轻链CDR1的氨基酸序列(图69)
SEQ ID NO:61：大鼠抗GPRC5D抗体7B4的轻链CDR2的氨基酸序列(图70)
SEQ ID NO:62：大鼠抗GPRC5D抗体7B4的轻链CDR3的氨基酸序列(图71)
SEQ ID NO:63：人源化2B1轻链(h2B1_L1)的核苷酸序列(图72)。在该序列中，核苷酸位置1至60代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟h2B1_L1轻链的核苷酸序列中。
SEQ ID NO:64：人源化2B1轻链(h2B1_L1)的氨基酸序列(图73)
SEQ ID NO:65：人源化2B1轻链(h2B1_L2)的核苷酸序列(图74)
SEQ ID NO:66：人源化2B1轻链(h2B1_L2)的氨基酸序列(图75)
SEQ ID NO:67：人源化2B1轻链(h2B1_L3)的核苷酸序列(图76)
SEQ ID NO:68：人源化2B1轻链(h2B1_L3)的氨基酸序列(图77)
SEQ ID NO:69：人源化2B1轻链(h2B1_L4)的核苷酸序列(图78)
SEQ ID NO:70：人源化2B1轻链(h2B1_L4)的氨基酸序列(图79)
SEQ ID NO:71：人源化2B1轻链(h2B1_L5)的核苷酸序列(图80)
SEQ ID NO:72：人源化2B1轻链(h2B1_L5)的氨基酸序列(图81)
SEQ ID NO:73：人源化2B1重链(h2B1_H1)的核苷酸序列(图82)
SEQ ID NO:74：人源化2B1重链(h2B1_H1)的氨基酸序列(图83)
SEQ ID NO:75：人源化2B1重链(h2B1_H2)的核苷酸序列(图84)
SEQ ID NO:76：人源化2B1重链(h2B1_H2)的氨基酸序列(图85)
SEQ ID NO:77：人源化2B1重链(h2B1_H3)的核苷酸序列(图86)
SEQ ID NO:78：人源化2B1重链(h2B1_H3)的氨基酸序列(图87)
SEQ ID NO:79：人源化2B1重链(h2B1_H4)的核苷酸序列(图88)
SEQ ID NO:80：人源化2B1重链(h2B1_H4)的氨基酸序列(图89)
SEQ ID NO:81：人源化7B4轻链(h7B4_L1)的核苷酸序列(图90)
SEQ ID NO:82：人源化7B4轻链(h7B4_L1)的氨基酸序列(图91)
SEQ ID NO:83：人源化7B4轻链(h7B4_L2)的核苷酸序列(图92)
SEQ ID NO:84：人源化7B4轻链(h7B4_L2)的氨基酸序列(图93)
SEQ ID NO:85：人源化7B4重链(h7B4_H1)的核苷酸序列(图94)
SEQ ID NO:86：人源化7B4重链(h7B4_H1)的氨基酸序列(图95)
SEQ ID NO:87：人源化7B4重链(h7B4_H2)的核苷酸序列(图96)
SEQ ID NO:88：人源化7B4重链(h7B4_H2)的氨基酸序列(图97)
SEQ ID NO:89：人源化7B4重链(h7B4_H3)的核苷酸序列(图98)
SEQ ID NO:90：人源化7B4重链(h7B4_H3)的氨基酸序列(图99)
SEQ ID NO:91：人源化7B4重链(h7B4_H5)的核苷酸序列(图100)
SEQ ID NO:92：人源化7B4重链(h7B4_H5)的氨基酸序列(图101)
SEQ ID NO:93：食蟹猴GPRC5D的氨基末端肽的氨基酸序列(图105)
SEQ ID NO:94：scFv的序列分析中使用的引物A的核苷酸序列(图106)
SEQ ID NO:95：scFv的序列分析中使用的引物B的核苷酸序列(图107)
SEQ ID NO:96：C2037的重链可变区的核苷酸序列(图108)
SEQ ID NO:97：C2037的重链可变区的氨基酸序列(图109)
SEQ ID NO:98：C2037的轻链可变区的核苷酸序列(图110)
SEQ ID NO:99：C2037的轻链可变区的氨基酸序列(图111)
SEQ ID NO:100：C3048的重链可变区的核苷酸序列(图112)
SEQ ID NO:101：C3048的重链可变区的氨基酸序列(图113)
SEQ ID NO:102：C3048的轻链可变区的核苷酸序列(图114)
SEQ ID NO:103：C3048的轻链可变区的氨基酸序列(图115)
SEQ ID NO:104：C3015的重链可变区的核苷酸序列(图116)
SEQ ID NO:105：C3015的重链可变区的氨基酸序列(图117)
SEQ ID NO:106：C3015的轻链可变区的核苷酸序列(图118)
SEQ ID NO:107：C3015的轻链可变区的氨基酸序列(图119)
SEQ ID NO:108：C3022的重链可变区的核苷酸序列(图120)
SEQ ID NO:109：C3022的重链可变区的氨基酸序列(图121)
SEQ ID NO:110：C3022的轻链可变区的核苷酸序列(图122)
SEQ ID NO:111：C2037的重链CDR1的氨基酸序列(图124)
SEQ ID NO:112：C2037的重链CDR2的氨基酸序列(图125)
SEQ ID NO:113：C2037的重链CDR3的氨基酸序列(图126)
SEQ ID NO:114：C2037的轻链CDR1的氨基酸序列(图127)
SEQ ID NO:115：C2037的轻链CDR2的氨基酸序列(图128)
SEQ ID NO:116：C2037的轻链CDR3的氨基酸序列(图129)
SEQ ID NO:117：C3048的重链CDR1的氨基酸序列(图130)
SEQ ID NO:118：C3048的重链CDR2的氨基酸序列(图131)
SEQ ID NO:119：C3048的重链CDR3的氨基酸序列(图132)
SEQ ID NO:120：C3048的轻链CDR1的氨基酸序列(图133)
SEQ ID NO:121：C3048的轻链CDR2的氨基酸序列(图134)
SEQ ID NO:122：C3048的轻链CDR3的氨基酸序列(图135)
SEQ ID NO:123：C3015的重链CDR1的氨基酸序列(图136)
SEQ ID NO:124：C3015的重链CDR2的氨基酸序列(图137)
SEQ ID NO:125：C3015的重链CDR3的氨基酸序列(图138)
SEQ ID NO:126：C3015的轻链CDR1的氨基酸序列(图139)
SEQ ID NO:127：C3015的轻链CDR2的氨基酸序列(图140)
SEQ ID NO:128：C3015的轻链CDR3的氨基酸序列(图141)
SEQ ID NO:129：C3022的重链CDR1的氨基酸序列(图142)
SEQ ID NO:130：C3022的重链CDR2的氨基酸序列(图143)
SEQ ID NO:131：C3022的重链CDR3的氨基酸序列(图144)
SEQ ID NO:132：C3022的轻链CDR1的氨基酸序列(图145)
SEQ ID NO:133：C3022的轻链CDR2的氨基酸序列(图146)
SEQ ID NO:134：C3022的轻链CDR3的氨基酸序列(图147)
SEQ ID NO:135：C3022的轻链可变区的氨基酸序列(图123)
SEQ ID NO:136：C2037的IgG形式的重链的核苷酸序列(图148)
SEQ ID NO:137：C2037的IgG形式的轻链的核苷酸序列(图149)
SEQ ID NO:138：C3048的IgG形式的重链的核苷酸序列(图150)
SEQ ID NO:139：C3048的IgG形式的轻链的核苷酸序列(图151)
SEQ ID NO:140：C3015的IgG形式的重链的核苷酸序列(图152)
SEQ ID NO:141：C3015的IgG形式的轻链的核苷酸序列(图153)
SEQ ID NO:142：C3022的IgG形式的重链的核苷酸序列(图154)
SEQ ID NO:143：C3022的IgG形式的轻链的核苷酸序列(图155)
SEQ ID NO:144：C2037的IgG形式的重链的氨基酸序列(图156)
SEQ ID NO:145：C2037的IgG形式的轻链的氨基酸序列(图157)
SEQ ID NO:146：C3048的IgG形式的重链的氨基酸序列(图158)
SEQ ID NO:147：C3048的IgG形式的轻链的氨基酸序列(图159)
SEQ ID NO:148：C3015的IgG形式的重链的氨基酸序列(图160)
SEQ ID NO:149：C3015的IgG形式的轻链的氨基酸序列(图161)
SEQ ID NO:150：C3022的IgG形式的重链的氨基酸序列(图162)
SEQ ID NO:151：C3022的IgG形式的轻链的氨基酸序列(图163)
SEQ ID NO:152：大鼠抗CD3抗体的重链可变区的核苷酸序列(图168)
SEQ ID NO:153：大鼠抗CD3抗体的轻链可变区的核苷酸序列(图169)
SEQ ID NO:154：C3E-7000的核苷酸序列(图170)
SEQ ID NO:155：C3E-7034的重链可变区的氨基酸序列(图171)
SEQ ID NO:156：C3E-7034的轻链可变区的氨基酸序列(图172)
SEQ ID NO:157：C3E-7034的核苷酸序列(图173)
SEQ ID NO:158：C3E-7035的轻链可变区的氨基酸序列(图174)
SEQ ID NO:159：C3E-7035的核苷酸序列(图175)
SEQ ID NO:160：C3E-7036的轻链可变区的氨基酸序列(图176)
SEQ ID NO:161：C3E-7036的核苷酸序列(图177)
SEQ ID NO:162：C2037-C3E-7034的核苷酸序列(图178)
SEQ ID NO:163：C3048-C3E-7034的核苷酸序列(图179)
SEQ ID NO:164：C3022-C3E-7034的核苷酸序列(图180)
SEQ ID NO:165：C2037-C3E-7035的核苷酸序列(图181)
SEQ ID NO:166：C3048-C3E-7035的核苷酸序列(图182)
SEQ ID NO:167：C3022-C3E-7035的核苷酸序列(图183)
SEQ ID NO:168：C2037-C3E-7036的核苷酸序列(图184)
SEQ ID NO:169：C3048-C3E-7036的核苷酸序列(图185)
SEQ ID NO:170：C3022-C3E-7036的核苷酸序列(图186)
SEQ ID NO:171：C2037-C3E-7034的氨基酸序列(图187)
SEQ ID NO:172：C3048-C3E-7034的氨基酸序列(图188)
SEQ ID NO:173：C3022-C3E-7034的氨基酸序列(图189)
SEQ ID NO:174：C2037-C3E-7035的氨基酸序列(图190)
SEQ ID NO:175：C3048-C3E-7035的氨基酸序列(图191)
SEQ ID NO:176：C3022-C3E-7035的氨基酸序列(图192)
SEQ ID NO:177：C2037-C3E-7036的氨基酸序列(图193)
SEQ ID NO:178：C3048-C3E-7036的氨基酸序列(图194)
SEQ ID NO:179：C3022-C3E-7036的氨基酸序列(图195)
SEQ ID NO:180：C3E-7034的氨基酸序列(图203)
SEQ ID NO:181：C3E-7035的氨基酸序列(图204)
SEQ ID NO:182：C3E-7036的氨基酸序列(图205)
SEQ ID NO:183：C3E-7000的重链CDR1的氨基酸序列(图206)
SEQ ID NO:184：C3E-7000的重链CDR2的氨基酸序列(图207)
SEQ ID NO:185：C3E-7000的重链CDR3的氨基酸序列(图208)
SEQ ID NO:186：C3E-7000的轻链CDR1的氨基酸序列(图209)
SEQ ID NO:187：C3E-7000的轻链CDR2的氨基酸序列(图210)
SEQ ID NO:188：C3E-7000的轻链CDR3的氨基酸序列(图211)
SEQ ID NO:189：人CD3ε的氨基酸序列(图212)
SEQ ID NO:190：E1018的重链可变区的核苷酸序列(图213)
SEQ ID NO:191：E1018的重链可变区的氨基酸序列(图214)
SEQ ID NO:192：E1018的轻链可变区的核苷酸序列(图215)
SEQ ID NO:193：E1018的轻链可变区的氨基酸序列(图216)
SEQ ID NO:194：D1012的重链可变区的核苷酸序列(图217)
SEQ ID NO:195：D1012的重链可变区的氨基酸序列(图218)
SEQ ID NO:196：D1012的轻链可变区的核苷酸序列(图219)
SEQ ID NO:197：D1012的轻链可变区的氨基酸序列(图220)
SEQ ID NO:198：h2B1 Fab HC_1的核苷酸序列(图222)
SEQ ID NO:199：h2B1 Fab HC_1的氨基酸序列(图223)
SEQ ID NO:200：h2B1 Fab HC_2的核苷酸序列(图224)
SEQ ID NO:201：h2B1 Fab HC_2的氨基酸序列(图225)
SEQ ID NO:202：h2B1 Fab LC_1的核苷酸序列(图226)
SEQ ID NO:203：h2B1 Fab LC_1的氨基酸序列(图227)
SEQ ID NO:204：h2B1 Fab LC_2的核苷酸序列(图228)
SEQ ID NO:205：h2B1 Fab LC_2的氨基酸序列(图229)
SEQ ID NO:206：C3E-7034 Fab HC的核苷酸序列(图230)
SEQ ID NO:207：C3E-7034 Fab HC的氨基酸序列(图231)
SEQ ID NO:208：C3E-7034 Fab LC的核苷酸序列(图232)
SEQ ID NO:209：C3E-7034 Fab LC的氨基酸序列(图233)
SEQ ID NO:210：C3E-7036 Fab HC的核苷酸序列(图234)
SEQ ID NO:211：C3E-7036 Fab HC的氨基酸序列(图235)
SEQ ID NO:212：C3E-7036 Fab LC的核苷酸序列(图236)
SEQ ID NO:213：C3E-7036 Fab LC的氨基酸序列(图237)
SEQ ID NO:214：h2B1 Fab HC_3的核苷酸序列(图238)
SEQ ID NO:215：h2B1 Fab HC_3的氨基酸序列(图239)
SEQ ID NO:216：h2B1 Fab LC_3的核苷酸序列(图240)
SEQ ID NO:217：h2B1 Fab LC_3的氨基酸序列(图241)
SEQ ID NO:218：C3E-7034 scFv Fc的核苷酸序列(图242)
SEQ ID NO:219：C3E-7034 scFv Fc的氨基酸序列(图243)
SEQ ID NO:220：C3E-7036 scFv Fc的核苷酸序列(图244)
SEQ ID NO:221：C3E-7036 scFv Fc的氨基酸序列(图245)
SEQ ID NO:222：h2B1 scFv Fc的核苷酸序列(图246)
SEQ ID NO:223：h2B1 scFv Fc的氨基酸序列(图247)
SEQ ID NO:224：C3E-8015的核苷酸序列(图255)
SEQ ID NO:225：C3E-8015的氨基酸序列(图256)
SEQ ID NO:226：C3E-8017的核苷酸序列(图257)
SEQ ID NO:227：C3E-8017的氨基酸序列(图258)
SEQ ID NO:228：C3E-8018的核苷酸序列(图259)
SEQ ID NO:229：C3E-8018的氨基酸序列(图260)
SEQ ID NO:230：C3E-8025的核苷酸序列(图261)
SEQ ID NO:231：C3E-8025的氨基酸序列(图262)
SEQ ID NO:232：C3E-8027的核苷酸序列(图263)
SEQ ID NO:233：C3E-8027的氨基酸序列(图264)
SEQ ID NO:234：C3E-8028的核苷酸序列(图265)
SEQ ID NO:235：C3E-8028的氨基酸序列(图266)
SEQ ID NO:236：h2B1 Fab HC_4的核苷酸序列(图267)
SEQ ID NO:237：h2B1 Fab HC_4的氨基酸序列(图268)
SEQ ID NO:238：CDR修饰形式的重链CDR2的氨基酸序列(图276)，其中X是任意天然氨基酸。
SEQ ID NO:239：CDR修饰形式的轻链CDR2的氨基酸序列(图277)，其中X是任意天然氨基酸。
SEQ ID NO:240：C3E-7034的CDR修饰形式的重链可变区的氨基酸序列(图278)，其中X是任意天然氨基酸。
SEQ ID NO:241：C3E-7034的CDR修饰形式的轻链可变区的氨基酸序列(图279)，其中X是任意天然氨基酸。
SEQ ID NO:242：C3E-7035的CDR修饰形式的轻链可变区的氨基酸序列(图280)，其中X是任意天然氨基酸。
SEQ ID NO:243：C3E-7036的CDR修饰形式的轻链可变区的氨基酸序列(图281)，其中X是任意天然氨基酸。
SEQ ID NO:244：C3E-7078的氨基酸序列(图282)
SEQ ID NO:245：C3E-7085的氨基酸序列(图283)
SEQ ID NO:246：C3E-7086的氨基酸序列(图284)
SEQ ID NO:247：C3E-7087的氨基酸序列(图285)
SEQ ID NO:248：C3E-7088的氨基酸序列(图286)
SEQ ID NO:249：C3E-7089的氨基酸序列(图287)
SEQ ID NO:250：C3E-7090的氨基酸序列(图288)
SEQ ID NO:251：C3E-7091的氨基酸序列(图289)
SEQ ID NO:252：C3E-7092的氨基酸序列(图290)
SEQ ID NO:253：C3E-7093的氨基酸序列(图291)
SEQ ID NO:254：C3E-7094的氨基酸序列(图292)
SEQ ID NO:255：C3E-7095的氨基酸序列(图293)。
Claims (87)
1.抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含根据以下(I)至(III)中任一项的重链可变区和轻链可变区并且结合人GPRC5D：
(II)
重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:48代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:49代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:50代表的氨基酸序列组成的重链CDR3，
和
轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:57代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:58代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:59代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3，
(I)
重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:45代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:46代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:47代表的氨基酸序列组成的重链CDR3，
和
轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:54代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:55代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:56代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3，和
(III)
重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:51代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:52代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:53代表的氨基酸序列组成的重链CDR3，
和
轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:60代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:61代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:62代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述重链可变区和所述轻链可变区是根据(II)的重链可变区和轻链可变区。
3.根据权利要求1所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述重链可变区和所述轻链可变区是根据(I)的重链可变区和轻链可变区。
4.根据权利要求1所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述重链可变区和所述轻链可变区是根据(III)的重链可变区和轻链可变区。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是嵌合抗体或所述抗体的抗原结合片段。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人源化抗体或所述抗体的抗原结合片段。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人抗体或所述抗体的抗原结合片段。
8.根据权利要求1、2或6中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含：
轻链可变区，其包含由以下代表的任一氨基酸序列：
SEQ ID NO:64代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127，
SEQ ID NO:66代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127，
SEQ ID NO:68代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127，
SEQ ID NO:70代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127，和
SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127，和
重链可变区，其包含由以下代表的任一氨基酸序列：
SEQ ID NO:74代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142，
SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142，
SEQ ID NO:78代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142，和
SEQ ID NO:80代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142。
9.根据权利要求1、2、6或8中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含以下的重链可变区和轻链可变区的任一组合：
・包含SEQ ID NO:74代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:64代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:74代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:66代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:66代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:68代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:70代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:78代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:68代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:78代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:70代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:78代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:80代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:64代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:80代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:68代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:80代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:70代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，或
・包含SEQ ID NO:80代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区。
10.根据权利要求1、4或6中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含：
轻链可变区，其包含由以下代表的氨基酸序列：
SEQ ID NO:82代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126，或
SEQ ID NO:84代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126，和
重链可变区，其包含由以下代表的任一氨基酸序列：
SEQ ID NO:86代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142，
SEQ ID NO:88代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142，
SEQ ID NO:90代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142，和
SEQ ID NO:92代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142。
11.根据权利要求1、4、6或10中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含以下的重链可变区和轻链可变区的任一组合：
・包含SEQ ID NO:86代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:84代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:88代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:84代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:90代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:82代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:90代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:84代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126代表的氨基酸序列的轻链可变区，或
・包含SEQ ID NO:92代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:82代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至126代表的氨基酸序列的轻链可变区。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含Fc。
13.抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体结合人GPRC5D且包含根据以下①至④中任一项的重链可变区和轻链可变区：
①
重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:111代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:112代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:113代表的氨基酸序列组成的重链CDR3，
和
轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:114代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:115代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:116代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3，
②
重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:117代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:118代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:119代表的氨基酸序列组成的重链CDR3，
和
轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:120代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:121代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:122代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3，
③
重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:123代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:124代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:125代表的氨基酸序列组成的重链CDR3，
和
轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:126代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:127代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:128代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3，和
④
重链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:129代表的氨基酸序列组成的重链CDR1，
由SEQ ID NO:130代表的氨基酸序列组成的重链CDR2，和
由SEQ ID NO:131代表的氨基酸序列组成的重链CDR3，
和
轻链可变区，其包含：
由SEQ ID NO:132代表的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
由SEQ ID NO:133代表的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和
由SEQ ID NO:134代表的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
14.根据权利要求13所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述重链可变区和所述轻链可变区是根据①的重链可变区和轻链可变区。
15.根据权利要求13所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述重链可变区和所述轻链可变区是根据②的重链可变区和轻链可变区。
16.根据权利要求13所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述重链可变区和所述轻链可变区是根据③的重链可变区和轻链可变区。
17.根据权利要求13所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述重链可变区和所述轻链可变区是根据④的重链可变区和轻链可变区。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含：
重链可变区，其包含以下中的任一者：
SEQ ID NO:97代表的氨基酸序列，
SEQ ID NO:101代表的氨基酸序列，
SEQ ID NO:105代表的氨基酸序列，和
SEQ ID NO:109代表的氨基酸序列，
和
轻链可变区，其包含以下中的任一者：
SEQ ID NO:99代表的氨基酸序列，
SEQ ID NO:103代表的氨基酸序列，
SEQ ID NO:107代表的氨基酸序列，和
SEQ ID NO:135代表的氨基酸序列。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含以下的重链可变区和轻链可变区的任一组合：
・包含SEQ ID NO:97代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:99代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:101代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:103代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:105代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:107代表的氨基酸序列的轻链可变区，或
・包含SEQ ID NO:109代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:135代表的氨基酸序列的轻链可变区。
20.抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含以下的重链和轻链的任一组合：
・包含SEQ ID NO:144代表的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:145代表的氨基酸序列的轻链，
・包含SEQ ID NO:146代表的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:147代表的氨基酸序列的轻链，
・包含SEQ ID NO:148代表的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:149代表的氨基酸序列的轻链，或
・包含SEQ ID NO:150代表的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:151代表的氨基酸序列的轻链。
21.抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含由多核苷酸中所含的核苷酸序列编码的氨基酸序列且结合人GPRC5D，所述多核苷酸在严格条件下与包含编码根据权利要求8至12和18至20中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段中所含的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的互补链杂交。
22.抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列且结合人GPRC5D，所述氨基酸序列与根据权利要求8至12和18至20中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段中所含的氨基酸序列具有90%或更高同一性。
23.抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列且结合人GPRC5D，所述氨基酸序列通过1至几个氨基酸的取代、缺失或添加而衍生自根据权利要求8至12和18至20中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段中所含的氨基酸序列。
24.抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合人GPRC5D上由根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段结合的位点。
25.抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段竞争结合人GPRC5D。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合食蟹猴GPRC5D。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fa'、F(ab)'、Fv、scFv或sdAb。
28.抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体结合人GPRC5D，包含根据权利要求2、8或9的重链可变区和轻链可变区，和
i)包含SEQ ID NO:199代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:203代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
ii)包含SEQ ID NO:201代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:205代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
iii)包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
或
iv)包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至476代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区。
29.抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体结合人GPRC5D，含有包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ IDNO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，和
i)包含SEQ ID NO:199代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:203代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
ii)包含SEQ ID NO:201代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:205代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
iii)包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
或
iv)包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至476代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区。
30.抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体结合人GPRC5D，包含根据权利要求2、8或9的重链可变区和轻链可变区和Fc突变。
31.抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体结合人GPRC5D，含有包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区和Fc突变。
32.多核苷酸，其编码根据权利要求1至31中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段。
33.载体，其包含根据权利要求32所述的多核苷酸中的任一种。
34.细胞，其包含根据权利要求32所述的多核苷酸或根据权利要求33所述的载体中的任一种，或者用于产生根据权利要求1至31中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段。
35.人工免疫细胞，其包含根据权利要求32的任一种多核苷酸或根据权利要求33所述的载体，或者用于在细胞表面上表达根据权利要求1至31中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段。
36.用于产生结合人GPRC5D的抗体或抗体的抗原结合片段的方法，其包括以下步骤：培养根据权利要求34所述的细胞；和从培养物回收结合人GPRC5D的抗体或抗体的抗原结合片段。
37.结合人GPRC5D的抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段通过根据权利要求36所述的方法获得。
38.用于治疗和/或预防的药物组合物，其包含根据权利要求1至31和37中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段、根据权利要求32所述的多核苷酸、根据权利要求33所述的载体、或根据权利要求35所述的人工免疫细胞作为有效成分。
39.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述药物组合物用于治疗和/或预防癌症。
40.根据权利要求39所述的药物组合物，其中所述癌症是表达GPRC5D蛋白的乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、结肠直肠癌、食道癌、膀胱癌、子宫颈癌、血液癌、淋巴瘤或恶性黑色素瘤。
41.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述癌症是表达GPRC5D蛋白的多发性骨髓瘤。
42.具有抗原结合活性的分子，其包含根据权利要求1至31和37中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段。
43.根据权利要求42所述的分子，其中所述分子是多特异性的。
44.根据权利要求42或43所述的分子，其中所述分子包含根据权利要求1至31和37中任一项所述的结合人GPRC5D的抗体或抗体的抗原结合片段，和含有以下且结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或抗体的抗原结合片段：
重链可变区，其包含：
含有由SEQ ID NO:183代表的氨基酸序列的重链CDR1，
含有由SEQ ID NO:238代表的氨基酸序列的重链CDR2，和
含有由SEQ ID NO:185代表的氨基酸序列的重链CDR3，和
轻链可变区，其包含：
含有由SEQ ID NO:186代表的氨基酸序列的轻链CDR1，
含有由SEQ ID NO:239代表的氨基酸序列的轻链CDR2，和
含有由SEQ ID NO:188代表的氨基酸序列的轻链CDR3。
45.根据权利要求44所述的分子，其中，在重链CDR2中，
第一个Xaa选自(A、E、G、H、I、L、T、V、R和S)，且
第二个Xaa是S；或者
第一个Xaa是N，且
第二个Xaa选自(E、R、F、Y、L、V、I、K和T)，且
在轻链CDR2中，
Xaa选自(Q、A、G、S、N和D)，
且
所述分子结合人CD3和食蟹猴CD3。
46.根据权利要求44或45所述的分子，其中，在重链CDR2中，
第一个Xaa选自(R和S)，且第二个Xaa是S，且
在轻链CDR2中，
Xaa选自(Q、A、G、S、N和D)，且结合人CD3和食蟹猴CD3。
47.根据权利要求42至45中任一项所述的分子，其含有包含SEQ ID NO:240代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:241、242和243中任一个代表的氨基酸序列的轻链可变区；其中
在SEQ ID NO:240代表的氨基酸序列中，第一个Xaa选自(A、E、G、H、I、L、T、V、R和S)，且第二个Xaa是S；或者
第一个Xaa是N，且第二个Xaa选自(E、R、F、Y、L、V、I、K和T)，且
在SEQ ID NO:241、242和243中任一个代表的氨基酸序列中，
Xaa选自(Q、A、G、S、N和D)。
48.根据权利要求47所述的分子，其中
第一个Xaa选自(R和S)，且
第二个Xaa是S，且
在SEQ ID NO:241、242和243中任一个代表的氨基酸序列中，
Xaa选自(Q、A、G、S、N和D)。
49.根据权利要求42至45中任一项所述的分子，其中所述分子包含根据权利要求1至31和37中任一项所述的结合人GPRC5D的抗体或抗体的抗原结合片段，和含有以下且结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或抗体的抗原结合片段：
重链可变区，其包含：
SEQ ID NO:183代表的重链CDR1的氨基酸序列，
SEQ ID NO:184代表的重链CDR2的氨基酸序列，和
SEQ ID NO:185代表的重链CDR3的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含：
SEQ ID NO:186代表的轻链CDR1的氨基酸序列，
SEQ ID NO:187代表的轻链CDR2的氨基酸序列，和
SEQ ID NO:188代表的轻链CDR3的氨基酸序列。
50.根据权利要求49所述的分子，其中所述结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段是这样的抗体或抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:155代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:156、158和160中任一个代表的氨基酸序列的轻链可变区。
51.根据权利要求44至50中任一项所述的分子，其中结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体的抗原结合片段是Fab、F(ab)'、Fv、scFv或sdAb。
52.根据权利要求44至51中任一项所述的分子，其中结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体是包含人免疫球蛋白恒定区或Fc或Fc突变的人源化抗体或人抗体。
53.根据权利要求44至52中任一项所述的分子，其中所述结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段是这样的抗体或抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:180、181和182中任一个代表的氨基酸序列。
54.根据权利要求40至44中任一项所述的分子，其中所述结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段经由接头或不经接头与根据权利要求1至31和37中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段结合。
55.根据权利要求42至44中任一项所述的分子，其中所述分子包含根据权利要求2、8和9所述的结合人GPRC5D的抗体或抗体的抗原结合片段，和
包含选自下文所示的组的任一种重链可变区和轻链可变区的结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含
・包含SEQ ID NO:207代表的氨基酸序列的氨基酸残基25至142代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:209代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至132代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:211代表的氨基酸序列的氨基酸残基25至142代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:213代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至130代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:244的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:244的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:245的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:245的氨基酸残基135至241代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:246的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:246的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:247的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:247的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:248的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:248的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:249的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:249的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:250的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:250的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:251的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:251的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:252的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:252的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:253的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:253的氨基酸残基135至242代表的氨基酸序列的轻链可变区，
・包含SEQ ID NO:254的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:254的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，或
・包含SEQ ID NO:255的氨基酸残基2至119代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:255的氨基酸残基135至243代表的氨基酸序列的轻链可变区，且包含
结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段。
56.根据权利要求55所述的分子，其中结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，和
i)包含SEQ ID NO:199代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:203代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
ii)包含SEQ ID NO:201代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:205代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
iii)包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
或
iv)包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至476代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
且
结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段进一步包含Fc突变。
57.根据权利要求55所述的分子，其中结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，和
iii)包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
或
iv)包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至476代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
且
结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段进一步包含Fc突变。
58.根据权利要求55所述的分子，其包含：
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:219代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:221代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至264代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:225代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至264代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:227代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:229代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:231代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至264代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至476代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:233代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变；或
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至476代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:235代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变。
59.根据权利要求55所述的分子，其包含：
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:225代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至264代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:227代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:229代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至476代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:231代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至264代表的氨基酸序列和Fc突变；
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至476代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:233代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变；或
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至476代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:235代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变。
60.根据权利要求55所述的分子，其中结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，且含有
i)包含SEQ ID NO:199代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:203代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
ii)包含SEQ ID NO:201代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:205代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
iii)包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
或
iv)包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至476代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
且
结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段进一步包含：
v)包含SEQ ID NO:207代表的氨基酸序列的氨基酸残基143至471代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:209代表的氨基酸序列的氨基酸残基133至238代表的氨基酸序列的轻链恒定区，或
vi)包含SEQ ID NO:211代表的氨基酸序列的氨基酸残基143至471代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:213代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至236代表的氨基酸序列的轻链恒定区。
61.根据权利要求55所述的分子，其中：
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:76的氨基酸残基20至142的重链可变区和包含SEQ ID NO:72的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，和
iii)包含SEQ ID NO:215代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至475代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，
或
iv)包含SEQ ID NO:237代表的氨基酸序列的氨基酸残基147至476代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:217代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至237代表的氨基酸序列的轻链恒定区，且
结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，并进一步含有：
v)包含SEQ ID NO:207代表的氨基酸序列的氨基酸残基143至471代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:209代表的氨基酸序列的氨基酸残基133至238代表的氨基酸序列的轻链恒定区，或
vi)包含SEQ ID NO:211代表的氨基酸序列的氨基酸残基143至471代表的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQ ID NO:213代表的氨基酸序列的氨基酸残基131至236代表的氨基酸序列的轻链恒定区。
62.根据权利要求55所述的分子，其包含：
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:199代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:203代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:207代表的氨基酸序列的氨基酸残基25至471代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:209代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至238代表的氨基酸序列的轻链，
或
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:201代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至475代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:205代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至237代表的氨基酸序列的轻链，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:211代表的氨基酸序列的氨基酸残基25至471代表的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:213代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至236代表的氨基酸序列的轻链。
63.根据权利要求55所述的分子，其中结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段进一步含有包含SEQ ID NO:76代表的氨基酸序列的氨基酸残基20至142代表的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:72代表的氨基酸序列的氨基酸残基21至127代表的氨基酸序列的轻链可变区，且进一步包含Fc突变，且结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段进一步包含Fc突变。
64.根据权利要求55所述的分子，其包含：
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:223代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至271代表的氨基酸序列和Fc突变，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:219代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至266代表的氨基酸序列和Fc突变，
或
结合人GPRC5D的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:223代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至271代表的氨基酸序列和Fc突变，和结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:221代表的氨基酸序列的氨基酸残基24至264代表的氨基酸序列和Fc突变。
65.根据权利要求53所述的分子，其中所述结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段经由接头或不经接头与根据权利要求19所述的抗体或抗体的抗原结合片段结合。
66.根据权利要求54或65所述的结合人CD3和食蟹猴CD3以及人GPRC5D的分子，其中所述分子具有SEQ ID NO:171至179中任一个代表的氨基酸序列。
67.分子，其包含由多核苷酸中所含的核苷酸序列编码的氨基酸序列且结合人CD3和食蟹猴CD3以及人GPRC5D，所述多核苷酸在严格条件下与包含编码根据权利要求50、53、58、59、62、64、65和66中任一项所述的分子中所含的结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段中所含的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的互补链杂交。
68.分子，其包含氨基酸序列且结合人CD3和食蟹猴CD3以及人GPRC5D，所述氨基酸序列与根据权利要求50、53、58、59、62、64、65和66中任一项所述的结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段中所含的氨基酸序列具有90%或更高同一性。
69.分子，其包含氨基酸序列且结合人CD3和食蟹猴CD3以及人GPRC5D，所述氨基酸序列通过1至几个氨基酸的取代、缺失或添加而衍生自根据权利要求50、53、58、59、62、64、65和66中任一项所述的分子中所含的结合人CD3和食蟹猴CD3的抗体或所述抗体的抗原结合片段中所含的氨基酸序列。
70.根据权利要求42至69中任一项所述的分子，其中所述分子结合食蟹猴GPRC5D。
71.根据权利要求43至70中任一项所述的分子，其中所述分子是双特异性的。
72.根据权利要求42至71中任一项所述的分子，其中所述分子是多肽。
73.多核苷酸，其包含编码根据权利要求72所述的分子的氨基酸序列的核苷酸序列。
74.载体，其包含根据权利要求73所述的多核苷酸。
75.细胞，其产生根据权利要求73所述的多核苷酸或根据权利要求74所述的载体，或根据权利要求71所述的分子。
76.产生结合人CD3和食蟹猴CD3以及人GPRC5D的分子的方法，其包括以下步骤：培养根据权利要求75所述的细胞；和从培养物回收结合人CD3和食蟹猴CD3和/或人GPRC5D的分子。
77.结合人CD3和食蟹猴CD3以及人GPRC5D的分子，所述分子通过根据权利要求76所述的方法获得。
78.根据权利要求77所述的分子，其中所述分子结合食蟹猴GPRC5D。
79.用于治疗和/或预防的药物组合物，其包含根据权利要求42至72、77和78中任一项所述的分子、根据权利要求73所述的多核苷酸、或根据权利要求74所述的载体作为活性成分。
80.根据权利要求79所述的药物组合物，其中所述药物组合物用于治疗和/或预防癌症。
81.根据权利要求80所述的药物组合物，其中所述癌症是表达GPRC5D蛋白的乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、结肠直肠癌、食道癌、膀胱癌、子宫颈癌、血液癌、淋巴瘤或恶性黑色素瘤。
82.根据权利要求79或80所述的药物组合物，其中所述癌症是表达GPRC5D蛋白的多发性骨髓瘤。
83.用于治疗和/或预防癌症的方法，其包括施用根据权利要求42至72、77和78中任一项所述的分子或根据权利要求79至82中任一项所述的药物组合物。
84.根据权利要求79至82中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物通过将T细胞重新引导至表达GPRC5D的细胞而诱导对所述细胞的细胞毒性。
85.根据权利要求83所述的方法，其中所述方法通过将T细胞重新引导至表达GPRC5D的细胞而诱导对所述细胞的细胞毒性。
86.用于通过将T细胞重新引导至表达GPRC5D的细胞而诱导对所述细胞的细胞毒性的方法，其包括施用根据权利要求42至72、77和78中任一项所述的分子或根据权利要求79至82中任一项所述的药物组合物的步骤。
87.用于将T细胞重新引导至表达GPRC5D的细胞的方法，其包括施用根据权利要求42至72、77和78中任一项所述的分子或根据权利要求79至82中任一项所述的药物组合物的步骤。
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