BR112019016204A2

BR112019016204A2 - anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula, imunócito artificial, métodos para produzir um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, para produzir uma molécula que se liga ao cd3 humano e cd3 de macaco cinomolgo e ao gprc5d humano, composição medicinal para tratamento e/ou prevenção, moléculas tendo atividade de ligação a antígeno e que se ligam ao cd3 humano e cd3 de macaco cinomolgo e ao gprc5d humano, e, usos para preparar um medicamento para tratar e/ou prevenir um câncer, para induzir citotoxicidade para as células expressando gprc5d e para redirecionamento de células t para as células expressando gprc5d

Info

Publication number: BR112019016204A2
Application number: BR112019016204-6A
Authority: BR
Inventors: Takashi CHAEN; Toshiaki Ohtsuka; Kenji Iida; Kensuke Nakamura; Takahide Aburatani; Junya ICHIKAWA; Shota KUDO; Chayne Lee PISCITELLI; Mario SANCHES
Original assignee: Daiichi Sankyo Company, Limited
Priority date: 2017-02-07
Filing date: 2018-02-06
Publication date: 2020-07-07
Also published as: CA3052938A1; EP3581651A4; KR20190133160A; CN110462038A; SG11201907321TA; US20190367612A1; EP3581651A1; CO2019009680A2; SG10201912368XA; PH12019501824A1; RU2019128134A; IL268588A; JPWO2018147245A1; WO2018147245A1; MX2019009358A; TW201837174A; ZA201905905B; AU2018218753A1; RU2019128134A3

Abstract

A presente invenção provê um novo anticorpo que se liga ao GPRC5D humano e uma molécula que contém o anticorpo e é capaz de se ligar a um antígeno. São providos: um novo anticorpo que se liga ao GPRC5D humano; uma molécula que contém o anticorpo e é capaz de se ligar a um antígeno; e uma composição medicinal antitumoral que contém o anticorpo ou a molécula como um ingrediente ativo, etc.

Description

12/06/2020 09:56

29409161919972071

Cumprimento de exigência

Número do Processo: BR 11 2019 016204 6

Dados do Depositante (71)

Depositante 1 de 1

Nome ou Razão Social: DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED

Tipo de Pessoa: Pessoa Jurídica

CPF/CNPJ: JP0003200371

Nacionalidade: Japonesa

Qualificação Jurídica: Pessoa Jurídica

Endereço: 3-5-1, NIHONBASHI HONCHO, CHUO-KU, TOKYO 103-8426

Cidade:

Estado:

CEP:

País: Japão

Telefone: 0000-0000

Fax:

Email:

Referência Petição

Pedido : BR112019016204-6

Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 12/06/2020 às 09:56, Petição 870200072994

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[003] Como para a associação do gene GPRC5D com cânceres, GPRC5D é conhecido ser altamente expresso no mieloma múltiplo. Especificamente, é conhecido que, por exemplo: a superexpressão de GPRC5D correlaciona-se com o prognóstico insatisfatório de pacientes com mieloma múltiplo (Literatura Não Patentária 3); e a proporção de células expressando GPRC5D é diminuída pela medicação de pacientes com mieloma múltiplo (Literatura Não Patentária 4). Tal associação da superexpressão de GPRC5D com cânceres sugere a possibilidade de que GPRC5D serve como um alvo terapêutico excelente para cânceres. Além disso, também há um relato sobre um anticorpo antiGPRC5D e um anticorpo biespecífico que compreende o anticorpo e um anticorpo antiCD3 e exibe atividade de ligação contra 3T3 células expressando GPRC5D (Literatura Patentária 1) exogenamente. Entretanto, produtos farmacêuticos medicinais que alvejam GPRC5D não foram ainda desenvolvidos. [Lista de Citação] [Literatura Patentária] [Literatura Patentária 1] Publicação Internacional No. WO2016/090329 [Literatura Não Patentária] [Literatura Não Patentária 1] H Brauner-Osborne, et al., Biochim Biophys Acta., publicada em abril 2001, Vol. 1518 (No. 3), p. 237-248 [Literatura Não Patentária 2] S Inoue, et al., Journal of Investigative Dermatology, publicada em março 2004, Vol. 122 (No. 3), p. 565-573 [Literatura Não Patentária 3] J Atamaniuk, et al., European Journal of Clinical Investigation, publicada em maio 2012, Vol. 42 (No. 9), p. 953-960 [Literatura Não Patentária 4] Y Cohen, et al., Hematology), publicada em novembro 2013, Vol. 18 (No. 6), p. 348-351 [Sumário da Invenção] [Problema Técnico]

[004] Um objetivo da presente invenção é prover um anticorpo

3 / 286 antiGPRC5D tendo um efeito anticâncer, um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo e uma molécula compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo.

[005] Um outro objetivo da presente invenção é prover uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo ou a molécula, etc.

[006] Um objetivo alternativo da presente invenção é prover um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo ou a molécula, um vetor tendo um inserto do polinucleotídeo, uma célula transfectada com o polinucleotídeo ou vetor e um método para produzir o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo ou a molécula, compreendendo a etapa de cultivar a célula. Um outro objetivo alternativo da presente invenção é prover um método para tratar um câncer usando o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo ou a molécula. [Solução para o Problema]

[007] Os presentes inventores conduziram estudos diligentes para atingir os objetivos e completaram a presente invenção pelo desenvolvimento de um novo anticorpo antiGPRC5D e verificaram que o anticorpo tem um efeito anticâncer.

[008] A presente invenção provê: (1) Um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve descritas em qualquer um dos seguintes (I) a (III): (II) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 48,

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CDR2 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 49, e CDR3 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 50, e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 57, CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 58, e CDR3 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 59, (I) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 45, CDR2 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 46, e CDR3 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47, e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 54, CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 55, e CDR3 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 56, e

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(III) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 51, CDR2 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 52, e CDR3 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 53, e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 60, CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 61, e CDR3 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 62 e se liga ao GPRC5D humano; (2) O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com (1), em que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve descritas em (II); (3) O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com (1), em que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve descritas em (I); (4) O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com (1), em que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve descritas em (III);

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(5) O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (4), em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é um anticorpo quimérico ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo; (6) O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (4), em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é um anticorpo humanizado ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo; (7) O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (4), em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é um anticorpo humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo; (8) O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1), (3) e (6), em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácido representadas pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 64, resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 66, resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 68, resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 70, e resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácido representadas pelo

7 / 286 resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 74, resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76, resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 78, e resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80; (9) O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1), (3), (6) e (8), em que o anticorpo compreende qualquer combinação de uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 74 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 64, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 74 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 66, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de

8 / 286 aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 66, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 68, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 70, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 78 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 68, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 78 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos

9 / 286 representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 70, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 78 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 64, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 68, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 70, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80 e uma

10 / 286 região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72; (10) O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1), (4) e (6), em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 82, ou resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 84, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácido representadas pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86, resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 88, resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 90, e resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 92; (11) O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1), (4), (6) e (10), em que o anticorpo compreende qualquer combinação de uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86 e uma

11 / 286 região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 84, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 88 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 84, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 90 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 82, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 90 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 84, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 92 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 82; (12) O anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (11), em que o anticorpo compreende Fc;

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(13) Um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, em que o anticorpo se liga ao GPRC5D humano e compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve descritas em qualquer um dos seguintes ① a ④: ① uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 111, CDR2 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 112, e CDR3 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 113, e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 114, CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 115, e CDR3 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 116, ② uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 117, CDR2 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 118, e CDR3 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 119, e

13 / 286 uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 120, CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 121, e CDR3 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 122, ③ uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 123, CDR2 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 124, e CDR3 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 125, e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 126, CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 127, e CDR3 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 128, e ④ uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 129, CDR2 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 130, e

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CDR3 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 131, e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 132, CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 133, e CDR3 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 134; (14) O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com (13), em que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve descritas em ①; (15) O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com (13), em que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve descritas em ②; (16) O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com (13), em que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve descritas em ③; (17) O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com (13), em que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve descritas em ④; (18) O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (13) a (17), em que o anticorpo compreende

15 / 286 uma região variável de cadeia pesada compreendendo qualquer uma de a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 97, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 101, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 105, e a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 109, e uma região variável de cadeia leve compreendendo qualquer uma de a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 99, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 103, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 107, e a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 135; (19) O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (13) a (18), em que o anticorpo compreende qualquer combinação de uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 97 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 99, uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 101 e uma região

16 / 286 variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 103, uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 105 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 107, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 109 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 135; (20) Um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, em que o anticorpo compreende qualquer combinação de uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 144 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 145, uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 146 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 147, uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 148 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 149, e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 150 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 151;

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(21) Um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendem uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleotídeos contida em um polinucleotídeo hibridizando sob condições severas a um filamento complementar de um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos contida em um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (8) a (12) e (18) a (20) e se liga ao GPRC5D humano; (22) Um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendem uma sequência de aminoácidos 90% ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos contida em um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (8) a (12) e (18) a (20) e se liga ao GPRC5D humano; (23) Um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendem uma sequência de aminoácidos derivada pela substituição, deleção ou adição de 1 a diversos aminoácidos de uma sequência de aminoácidos contida em um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (8) a (12) e 18 a 20 e se liga ao GPRC5D humano; (24) Um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ligam-se a um sítio no GPRC5D humano ligado por um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (20); (25) Um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compete com um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de

18 / 286 acordo com qualquer um de (1) a (20) quanto à ligação ao GPRC5D humano. (26) O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer um de (1) a (25), em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ligam-se ao GPRC5D de macaco cinomolgo; (27) O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (26), em que o fragmento de ligação a antígeno é Fab, F(ab)’, Fv, scFv ou sdAb; (28) Um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve descritas de acordo com (2), (8) ou (9) e compreendendo i) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 199 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 203, ii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 201 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 205, iii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217,

19 / 286 ou iv) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 237 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217.

[009] (29) Um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72 e compreendendo i) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 199 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 203, ii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 201 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 205, iii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido

20 / 286 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, ou iv) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 237 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217.

[0010] (30) Um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve descritas de acordo com (2), (8) ou (9) e compreendendo Fc mutado.

[0011] (31) Um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72 e compreendendo Fc mutado.

[0012] (32) Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (31); (33) Um vetor compreendendo qualquer um dos polinucleotídeos de acordo com (32); (34) Uma célula compreendendo qualquer um dos

21 / 286 polinucleotídeos de acordo com (32) ou um vetor de acordo com (33) ou produzindo um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (31); (35) Um imunócito artificial compreendendo um polinucleotídeo de acordo com (32) ou um vetor de acordo com (33) ou expressando um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (31) na superfície da célula; (36) Um método para produzir um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que se liga ao GPRC5D humano e GPRC5D de macaco cinomolgo, compreendendo as etapas de: cultivar uma célula de acordo com (34); e recuperar um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que se liga ao GPRC5D humano a partir das culturas; (37) Um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que se liga ao GPRC5D humano, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno sendo obtidos por um método de acordo com (37); (38) Uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou prevenção compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (31) e (37), um polinucleotídeo de acordo com (32), um vetor de acordo com (33) ou um artificial imunócito de acordo com (35) como um ingrediente ativo; (39) A composição farmacêutica de acordo com (38), em que a composição farmacêutica é para o tratamento e/ou prevenção de um câncer; (40) A composição farmacêutica de acordo com (39), em que o câncer é câncer mamário, câncer endometrial, câncer ovariano, câncer pulmonar, câncer estomacal, câncer prostático, câncer renal, câncer hepático, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer esofágico, câncer da bexiga urinária, câncer do colo uterino, câncer hematológico, linfoma ou melanoma maligno expressando uma proteína de GPRC5D;

22 / 286

(41) A composição farmacêutica de acordo com (40), em que o câncer é mieloma múltiplo expressando uma proteína de GPRC5D; (42) Uma molécula tendo atividade de ligação a antígeno, compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (31) e (37); (43) A molécula de acordo com (42), em que a molécula é multiespecífica; (44) A molécula de acordo com (42) ou (43), em que a molécula compreende um anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (31) e (37), e um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 183, a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 238, e a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 185, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 186, a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 239, e a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 188, e se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo; (45) A molécula de acordo com (44), em que, na CDR2 de

23 / 286 cadeia pesada, o primeiro Xaa é selecionado do grupo consistindo em (A, E, G, H, I, L, T, V, R e S) e o segundo Xaa é S; ou o primeiro Xaa é N e o segundo Xaa é selecionado do grupo consistindo em (E, R, F, Y, L, V, I, K e T) e na CDR2 de cadeia leve, Xaa é selecionado do grupo consistindo em (Q, A, G, S, N e D) e se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo; (46) A molécula de acordo com (44) ou (45), em que, na CDR2 de cadeia pesada, o primeiro Xaa é selecionado do grupo consistindo em (R e S) e o segundo Xaa é S e na CDR2 de cadeia leve, Xaa é selecionado do grupo consistindo em (Q, A, G, S, N e D) e se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo; (47) A molécula de acordo com qualquer um de (42) a (45), em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 240 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 241, 242 e 243; e na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 240, o primeiro Xaa é selecionado do grupo consistindo em (A, E, G, H, I, L, T, V, R e S) e o segundo Xaa é S; ou o primeiro Xaa é N e o segundo Xaa é selecionado do grupo consistindo em (E, R, F, Y, L, V, I, K e T), e na sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 241, 242 e 243, Xaa é selecionado do grupo consistindo em (Q, A, G, S, N e D); (48) A molécula de acordo com (47), em que o primeiro Xaa é selecionado do grupo consistindo em (R e S) e o segundo Xaa é S na SEQ ID NO: 240 e Xaa é selecionado do grupo consistindo em (Q, A, G, S, N e D) em qualquer uma das SEQ ID NOs: 241, 242 e 243; (49) A molécula de acordo com (42) ou (44), em que a

24 / 286 molécula compreende um anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (31) e (37), e um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 183, a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 184, e a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 185, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 186, a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 187, e a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 188, e se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo; (50) A molécula de acordo com (49), em que o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 155 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 156, 181 e 183; (51) A molécula de acordo com qualquer um de (44) a (50),

25 / 286 em que o fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo é Fab, F(ab)’, Fv, scFv ou sdAb; (52) A molécula de acordo com qualquer um de (44) a (51), em que o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo é um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano compreendendo uma região constante da imunoglobulina humana, Fc ou Fc mutado; (53) A molécula de acordo com qualquer um de (44) a (52), em que o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 180, 181 e 182; (54) A molécula de acordo com qualquer um de (40) a (44), em que o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo é ligado com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (31) e (37) por intermédio de um ligador ou sem um ligador; (55) A molécula de acordo com qualquer um de (42) a (44) em que a molécula compreende um anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com (2), (8) ou (9) e um anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 25 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 207 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 132 da sequência de

26 / 286 aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 209, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 25 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 211 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 130 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 213, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 244 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 244, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 245 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 241 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 245, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 246 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 246, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 247 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos

27 / 286 representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 247, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 248 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 248, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 249 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 249, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 250 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 250, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 251 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 251, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 252 e uma

28 / 286 região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 252, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 253 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 253, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 254 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 254 ou ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 255 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 255; (56) A molécula de acordo com (55) em que o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72 e compreende

29 / 286 i) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 199 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 203, ii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 201 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 205, iii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, ou iv) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 237 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende Fc mutado;

30 / 286

(57) A molécula de acordo com (55) em que o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72 e compreende iii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, ou iv) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 237 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende Fc mutado; (58) A molécula de acordo com (55) que compreende o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24

31 / 286 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 219 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 264 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 221 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco

32 / 286 cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 264 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 225 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 227 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 229 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento

33 / 286 de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 264 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 231 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 233 e Fc mutado; ou o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da

34 / 286 sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 235 e Fc mutado; (59) A molécula de acordo com (55) que compreende o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 264 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 225 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24

35 / 286 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 227 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 229 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 264 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 231 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos

36 / 286 de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 233 e Fc mutado; ou o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 235 e Fc mutado; (60) A molécula de acordo com (55) em que o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72 e compreende

37 / 286 i) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 199 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 203, ii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 201 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 205, iii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, ou iv) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 237 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende v) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma

38 / 286 sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 471 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 207 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 133 a 238 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 209, ou vi) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 143 a 471 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 211 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 236 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 213; (62) A molécula de acordo com (55) que compreende o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 119 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 203 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 25 a 471 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 207 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 238 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 209 ou o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento

39 / 286 de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 201 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 205 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 25 a 471 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 211 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 236 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 213; (63) A molécula de acordo com (55) em que o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72 e Fc mutado e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende Fc mutado; (64) A molécula de acordo com (55) que compreende o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 271 da

40 / 286 sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 223 e Fc mutado e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 219 e Fc mutado ou o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 271 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 223 e Fc mutado e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 264 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 221 e Fc mutado; (65) A molécula de acordo com (53), em que o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo é ligado com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com (19) por intermédio de um ligador ou sem um ligador; (66) A molécula de acordo com (54) ou (65), em que a molécula tem uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 171 a 179 e se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo e ao GPRC5D humano; (67) Uma molécula que compreende uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleotídeos contida em um polinucleotídeo hibridizando sob condições severas a um filamento complementar de um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de

41 / 286 nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos contida em um anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo contida em uma molécula de acordo com qualquer um de (50), (53), (58), (59), (62), (64), (65) e (66) e se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo e ao GPRC5D humano; (68) Uma molécula que compreende uma sequência de aminoácidos 90% ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos contida em um anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (50), (53), (58), (59), (62), (64), (65) e (66) e se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo e ao GPRC5D humano; (69) Uma molécula que compreende uma sequência de aminoácidos derivada pela substituição, deleção ou adição de 1 a diversos aminoácidos de uma sequência de aminoácidos contida em um anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo contida em uma molécula de acordo com qualquer um de (50), (53), (58), (59), (62), (64), (65) e (66) e se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo e ao GPRC5D humano; (70) A molécula de acordo com qualquer um de (42) a (69), em que a molécula se liga ao GPRC5D de macaco cinomolgo; (71) A molécula de acordo com qualquer um de (43) a (70), em que a molécula é biespecífica; (72) A molécula de acordo com qualquer um de (42) a (71), em que a molécula é um polipeptídeo; (73) Um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de uma molécula de acordo com (72); (74) Um vetor compreendendo um polinucleotídeo de acordo com (73);

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(75) Uma célula que produza um polinucleotídeo de acordo com (73) ou um vetor de acordo com (74) ou uma molécula de acordo com (71); (76) Um método para produzir uma molécula que se ligue ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo e ao GPRC5D humano, compreendendo as etapas de: cultivar uma célula de acordo com (75); e recuperar uma molécula que se ligue ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo e/ou ao GPRC5D humano a partir das culturas; (77) Uma molécula que se ligue ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo e ao GPRC5D humano, a molécula sendo obtida por um método de acordo com (76); (78) A molécula de acordo com (77), em que a molécula se liga ao GPRC5D de macaco cinomolgo; (79) Uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou prevenção compreendendo uma molécula de acordo com qualquer um de (42) a (72), (77) e (78), um polinucleotídeo de acordo com (73) ou um vetor de acordo com (74) como um ingrediente ativo; (80) A composição farmacêutica de acordo com (79), em que a composição farmacêutica é para o tratamento e/ou prevenção de um câncer; (81) A composição farmacêutica de acordo com (80), em que o câncer é câncer mamário, câncer endometrial, câncer ovariano, câncer pulmonar, câncer estomacal, câncer prostático, câncer renal, câncer hepático, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer esofágico, câncer da bexiga urinária, câncer do colo uterino, câncer hematológico, linfoma ou melanoma maligno expressando uma proteína de GPRC5D; (82) A composição farmacêutica de acordo com (79) ou (80), em que o câncer é mieloma múltiplo expressando uma proteína de GPRC5D; (83) Um método para tratar e/ou prevenir um câncer, compreendendo administrar uma molécula de acordo com qualquer um de

43 / 286 (42) a (72), (77) e (78) ou uma composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (79) a (82); (84) A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (79) a (82), em que a composição farmacêutica induz citotoxicidade para as células expressando GPRC5D pelo redirecionamento de células T para as células; (85) O método de acordo com (83), em que o método induz citotoxicidade para as células expressando GPRC5D pelo redirecionamento de células T para as células; (86) Um método para induzir citotoxicidade para as células expressando GPRC5D pelo redirecionamento de células T para as células, compreendendo a etapa de administrar uma molécula de acordo com qualquer um de (42) a (72), (77) e (78) ou uma composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (79) a (82); e (87) Um método para o redirecionamento de células T para as células expressando GPRC5D, compreendendo a etapa de administrar uma molécula de acordo com qualquer um de (42) a (72), (77) e (78) ou uma composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (79) a (82). [Efeitos Vantajosos da Invenção]

[0013] De acordo com a presente invenção, um novo anticorpo antiGPRC5D ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que se liga ao GPRC5D humano e uma nova molécula compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo e tendo atividade de ligação a antígeno, são obtidos. A molécula pode compreender um anticorpo antiCD3.

[0014] O uso do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo e da molécula providos pela presente invenção permite o tratamento ou prevenção de vários cânceres, preferivelmente, mieloma múltiplo, expressando uma proteína de GPRC5D. [Breve Descrição dos Desenhos]

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[0015] [Figura 1] A Figura 1 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação de anticorpos antiGPRC5D de rato (2A4, 2B1 e 7B4) contra GPRC5D humano pela citometria de fluxo. O eixo vertical representa um valor relativo da intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

[0016] [Figura 2] A Figura 2 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos do terminal amino de GPRC5D humano (SEQ ID NO: 1 da Listagem de Sequências).

[0017] [Figura 3] A Figura 3 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos do terminal amino de GPRC5D humano (SEQ ID NO: 2 da Listagem de Sequências).

[0018] [Figura 4] A Figura 4 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação dos anticorpos antiGPRC5D de rato (2A4, 2B1 e 7B4) contra GPRC5D humano usando um citômetro de fluxo (FACS). O eixo vertical representa um valor relativo da intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo. A ligação de dissulfeto intramolecular de um peptídeo foi presente (A) ou ausente (B).

[0019] [Figura 5] A Figura 5 é um diagrama mostrando que os anticorpos antiGPRC5D de rato (2A4, 2B1 e 7B4) têm atividade de ADCC.

[0020] [Figura 6] A Figura 6 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um iniciador para a amplificação pela PCR do cDNA que codifica a região variável do gene de cadeia pesada de 2A4 (SEQ ID NO: 3 da Listagem de Sequências).

[0021] [Figura 7] A Figura 7 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um iniciador para a amplificação pela PCR do cDNA que codifica a região variável do gene de cadeia leve 2A4 (SEQ ID NO: 10 da Listagem de Sequências).

[0022] [Figura 8] A Figura 8 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada

45 / 286 de 2A4 (SEQ ID NO: 4 da Listagem de Sequências).

[0023] [Figura 9] A Figura 9 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 2A4 (SEQ ID NO: 5 da Listagem de Sequências).

[0024] [Figura 10] A Figura 10 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada de 2B1 (SEQ ID NO: 6 da Listagem de Sequências).

[0025] [Figura 11] A Figura 11 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 2B1 (SEQ ID NO: 7 da Listagem de Sequências).

[0026] [Figura 12] A Figura 12 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada de 7B4 (SEQ ID NO: 8 da Listagem de Sequências).

[0027] [Figura 13] A Figura 13 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 7B4 (SEQ ID NO: 9 da Listagem de Sequências).

[0028] [Figura 14] A Figura 14 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um cDNA que codifica a região variável de cadeia leve de 2A4 (SEQ ID NO: 11 da Listagem de Sequências).

[0029] [Figura 15] A Figura 15 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 2A4 (SEQ ID NO: 12 da Listagem de Sequências).

[0030] [Figura 16] A Figura 16 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um cDNA que codifica a região variável de cadeia leve de 2B1 (SEQ ID NO: 13 da Listagem de Sequências).

[0031] [Figura 17] A Figura 17 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 2B1 (SEQ ID NO: 14 da Listagem de Sequências).

[0032] [Figura 18] A Figura 18 é um diagrama mostrando a sequência

46 / 286 de nucleotídeos de um cDNA que codifica a região variável de cadeia leve de 7B4 (SEQ ID NO: 15 da Listagem de Sequências).

[0033] [Figura 19] A Figura 19 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 7B4 (SEQ ID NO: 16 da Listagem de Sequências).

[0034] [Figura 20] A Figura 20 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA que codifica os aminoácidos de uma sequência de sinal secretor da cadeia κ humana e uma região constante da cadeia κ humana (SEQ ID NO: 17 da Listagem de Sequências).

[0035] [Figura 21] A Figura 21 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um iniciador F para um vetor de expressão de cadeia leve (SEQ ID NO: 18 da Listagem de Sequências).

[0036] [Figura 22] A Figura 22 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um iniciador R para o vetor de expressão de cadeia leve (SEQ ID NO: 19 da Listagem de Sequências).

[0037] [Figura 23] A Figura 23 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA que codifica os aminoácidos de uma sequência de sinal de cadeia pesada humana e uma região constante da IgG1 humana (SEQ ID NO: 20 da Listagem de Sequências).

[0038] [Figura 24] A Figura 24 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da cadeia leve de 2A4 humano quimérico (c2A4) (SEQ ID NO: 21 da Listagem de Sequências).

[0039] [Figura 25] A Figura 25 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia leve de 2A4 humano quimérico (c2A4) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 20), região variável (posições de aminoácido de 21 a 127), região constante (posições de aminoácido de 128 a 234)) (SEQ ID NO: 22 da Listagem de Sequências).

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[0040] [Figura 26] A Figura 26 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um conjunto de iniciadores F para a cadeia leve de 2A4 humano quimérico (c2A4) (SEQ ID NO: 23 da Listagem de Sequências).

[0041] [Figura 27] A Figura 27 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um conjunto de iniciadores R para a cadeia leve de 2A4 humano quimérico (c2A4) (SEQ ID NO: 24 da Listagem de Sequências).

[0042] [Figura 28] A Figura 28 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de 2A4 humano quimérico (c2A4) (SEQ ID NO: 25 da Listagem de Sequências).

[0043] [Figura 29] A Figura 29 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de 2A4 humano quimérico (c2A4) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), região variável (posições de aminoácido de 20 a 141), região constante (posições de aminoácido de 142 a 471)) (SEQ ID NO: 26 da Listagem de Sequências).

[0044] [Figura 30] A Figura 30 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um conjunto de iniciadores F para a cadeia pesada de 2A4 humano quimérico (c2A4) (SEQ ID NO: 27 da Listagem de Sequências).

[0045] [Figura 31] A Figura 31 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um conjunto de iniciadores R para a cadeia pesada de 2A4 humano quimérico (c2A4) (SEQ ID NO: 28 da Listagem de Sequências).

[0046] [Figura 32] A Figura 32 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da cadeia leve de 2B1 humano quimérico (c2B1) (SEQ ID NO: 29 da Listagem de Sequências).

[0047] [Figura 33] A Figura 33 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia leve de 2B1 humano quimérico (c2B1) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 20), região variável (posições de aminoácido de 21 a 127), região constante (posições de aminoácido de 128 a 234)) (SEQ ID NO: 30 da Listagem de Sequências).

[0048] [Figura 34] A Figura 34 é um diagrama mostrando a sequência

48 / 286 de nucleotídeos de um conjunto de iniciadores F para a cadeia leve de 2B1 humano quimérico (c2B1) (SEQ ID NO: 31 da Listagem de Sequências).

[0049] [Figura 35] A Figura 35 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um conjunto de iniciadores R para a cadeia leve de 2B1 humano quimérico (c2B1) (SEQ ID NO: 32 da Listagem de Sequências).

[0050] [Figura 36] A Figura 36 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de 2B1 humano quimérico (c2B1) (SEQ ID NO: 33 da Listagem de Sequências).

[0051] [Figura 37] A Figura 37 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de 2B1 humano quimérico (c2B1) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), região variável (posições de aminoácido de 20 a 142), região constante (posições de aminoácido de 143 a 472)) (SEQ ID NO: 34 da Listagem de Sequências).

[0052] [Figura 38] A Figura 38 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um conjunto de iniciadores F para a cadeia pesada de 2B1 humano quimérico (c2B1) (SEQ ID NO: 35 da Listagem de Sequências).

[0053] [Figura 39] A Figura 39 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um conjunto de iniciadores R para a cadeia pesada de 2B1 humano quimérico (c2B1) (SEQ ID NO: 36 da Listagem de Sequências).

[0054] [Figura 40] A Figura 40 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da cadeia leve de 7B4 humano quimérico (c7B4) (SEQ ID NO: 37 da Listagem de Sequências).

[0055] [Figura 41] A Figura 41 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia leve de 7B4 humano quimérico (c7B4) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 20), região variável (posições de aminoácido de 21 a 126), região constante (posições de aminoácido de 127 a 233)) (SEQ ID NO: 38 da Listagem de Sequências).

[0056] [Figura 42] A Figura 42 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um conjunto de iniciadores F para a cadeia leve de 7B4

49 / 286 humano quimérico (c7B4) (SEQ ID NO: 39 da Listagem de Sequências).

[0057] [Figura 43] A Figura 43 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um conjunto de iniciadores R para a cadeia leve de 7B4 humano quimérico (c7B4) (SEQ ID NO: 40 da Listagem de Sequências).

[0058] [Figura 44] A Figura 44 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de 7B4 humano quimérico (c7B4) (SEQ ID NO: 41 da Listagem de Sequências).

[0059] [Figura 45] A Figura 45 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de 7B4 humano quimérico (c7B4) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), região variável (posições de aminoácido de 20 a 142), região constante (posições de aminoácido de 143 a 472)) (SEQ ID NO: 42 da Listagem de Sequências).

[0060] [Figura 46] A Figura 46 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um conjunto de iniciadores F para a cadeia pesada de 7B4 humano quimérico (c7B4) (SEQ ID NO: 43 da Listagem de Sequências).

[0061] [Figura 47] A Figura 47 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um conjunto de iniciadores R para a cadeia pesada de 7B4 humano quimérico (c7B4) (SEQ ID NO: 44 da Listagem de Sequências).

[0062] [Figura 48] A Figura 48 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação dos anticorpos humanos quiméricos (c2A4, c2B1 e c7B4) contra GPRC5D humano usando um citômetro de fluxo (FACS). O eixo vertical representa um valor relativo da intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

[0063] [Figura 49] A Figura 49 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação dos anticorpos humanos quiméricos (c2A4, c2B1 e c7B4) contra GPRC5D de macaco cinomolgo usando um citômetro de fluxo (FACS). O eixo vertical representa um valor relativo da intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

[0064] [Figura 50] A Figura 50 é um diagrama mostrando que os

50 / 286 anticorpos humanos quiméricos (c2A4, c2B1 e c7B4) têm atividade de ADCC contra GPRC5D humano.

[0065] [Figura 51] A Figura 51 é um diagrama mostrando a atividade inibidora do crescimento de tumor in vivo de 2A4 humano quimérico (c2A4) contra camundongo BALB/c-nu/nu transplantado com a linhagem de célula de mieloma múltiplo humana KHM-1B expressando GPRC5D.

[0066] [Figura 52] A Figura 52 é um diagrama mostrando a atividade inibidora do crescimento de tumor in vivo de 2B1 humano quimérico (c2B1) contra camundongo BALB/c-nu/nu transplantado com a linhagem de célula de mieloma múltiplo humana KHM-1B expressando GPRC5D.

[0067] [Figura 53] A Figura 53 é um diagrama mostrando a atividade inibidora do crescimento de tumor in vivo de 7B4 humano quimérico (c7B4) contra camundongo BALB/c-nu/nu transplantado com a linhagem de célula de mieloma múltiplo humana KHM-1B expressando GPRC5D.

[0068] [Figura 54] A Figura 54 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada do anticorpo antiGPRC5D de rato 2A4 (SEQ ID NO: 45 da Listagem de Sequências).

[0069] [Figura 55] A Figura 55 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada do anticorpo antiGPRC5D de rato 2A4 (SEQ ID NO: 46 da Listagem de Sequências).

[0070] [Figura 56] A Figura 56 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada do anticorpo antiGPRC5D de rato 2A4 (SEQ ID NO: 47 da Listagem de Sequências).

[0071] [Figura 57] A Figura 57 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada do anticorpo antiGPRC5D de rato 2B1 (SEQ ID NO: 48 da Listagem de Sequências).

[0072] [Figura 58] A Figura 58 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada do anticorpo antiGPRC5D de rato 2B1 (SEQ ID NO: 49 da Listagem de Sequências).

51 / 286

[0073] [Figura 59] A Figura 59 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada do anticorpo antiGPRC5D de rato 2B1 (SEQ ID NO: 50 da Listagem de Sequências).

[0074] [Figura 60] A Figura 60 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada do anticorpo antiGPRC5D de rato 7B4 (SEQ ID NO: 51 da Listagem de Sequências).

[0075] [Figura 61] A Figura 61 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada do anticorpo antiGPRC5D de rato 7B4 (SEQ ID NO: 52 da Listagem de Sequências).

[0076] [Figura 62] A Figura 62 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada do anticorpo antiGPRC5D de rato 7B4 (SEQ ID NO: 53 da Listagem de Sequências).

[0077] [Figura 63] A Figura 63 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve do anticorpo antiGPRC5D de rato 2A4 (SEQ ID NO: 54 da Listagem de Sequências).

[0078] [Figura 64] A Figura 64 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve do anticorpo antiGPRC5D de rato 2A4 (SEQ ID NO: 55 da Listagem de Sequências).

[0079] [Figura 65] A Figura 65 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve do anticorpo antiGPRC5D de rato 2A4 (SEQ ID NO: 56 da Listagem de Sequências).

[0080] [Figura 66] A Figura 66 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve do anticorpo antiGPRC5D de rato 2B1 (SEQ ID NO: 57 da Listagem de Sequências).

[0081] [Figura 67] A Figura 67 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve do anticorpo antiGPRC5D de rato 2B1 (SEQ ID NO: 58 da Listagem de Sequências).

[0082] [Figura 68] A Figura 68 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve do anticorpo antiGPRC5D de rato

52 / 286 2B1 (SEQ ID NO: 59 da Listagem de Sequências).

[0083] [Figura 69] A Figura 69 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve do anticorpo antiGPRC5D de rato 7B4 (SEQ ID NO: 60 da Listagem de Sequências).

[0084] [Figura 70] A Figura 70 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve do anticorpo antiGPRC5D de rato 7B4 (SEQ ID NO: 61 da Listagem de Sequências).

[0085] [Figura 71] A Figura 71 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve do anticorpo antiGPRC5D de rato 7B4 (SEQ ID NO: 62 da Listagem de Sequências).

[0086] [Figura 72] A Figura 72 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de uma cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L1) (SEQ ID NO: 63 da Listagem de Sequências).

[0087] [Figura 73] A Figura 73 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L1) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 20), região variável (posições de aminoácido de 21 a 127), região constante (posições de aminoácido de 128 a 234)) (SEQ ID NO: 64 da Listagem de Sequências).

[0088] [Figura 74] A Figura 74 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de uma cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L2) (SEQ ID NO: 65 da Listagem de Sequências).

[0089] [Figura 75] A Figura 75 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L2) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 20), região variável (posições de aminoácido de 21 a 127), região constante (posições de aminoácido de 128 a 234)) (SEQ ID NO: 66 da Listagem de Sequências).

[0090] [Figura 76] A Figura 76 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de uma cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L3) (SEQ ID NO: 67 da Listagem de Sequências).

53 / 286

[0091] [Figura 77] A Figura 77 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L3) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 20), região variável (posições de aminoácido de 21 a 127), região constante (posições de aminoácido de 128 a 234)) (SEQ ID NO: 68 da Listagem de Sequências).

[0092] [Figura 78] A Figura 78 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de uma cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L4) (SEQ ID NO: 69 da Listagem de Sequências).

[0093] [Figura 79] A Figura 79 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L4) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 20), região variável (posições de aminoácido de 21 a 127), região constante (posições de aminoácido de 128 a 234)) (SEQ ID NO: 70 da Listagem de Sequências).

[0094] [Figura 80] A Figura 80 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de uma cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L5) (SEQ ID NO: 71 da Listagem de Sequências).

[0095] [Figura 81] A Figura 81 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L5) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 20), região variável (posições de aminoácido de 21 a 127), região constante (posições de aminoácido de 128 a 234)) (SEQ ID NO: 72 da Listagem de Sequências).

[0096] [Figura 82] A Figura 82 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de uma cadeia pesada humanizada de 2B1 (h2B1_H1) (SEQ ID NO: 73 da Listagem de Sequências).

[0097] [Figura 83] A Figura 83 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia pesada humanizada de 2B1 (h2B1_H1) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), região variável (posições de aminoácido de 20 a 142), região constante (posições de aminoácido de 143 a 472)) (SEQ ID NO: 74 da Listagem de Sequências).

54 / 286

[0098] [Figura 84] A Figura 84 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de uma cadeia pesada humanizada de 2B1 (h2B1_H2) (SEQ ID NO: 75 da Listagem de Sequências).

[0099] [Figura 85] A Figura 85 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia pesada humanizada de 2B1 (h2B1_H2) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), região variável (posições de aminoácido de 20 a 142), região constante (posições de aminoácido de 143 a 472)) (SEQ ID NO: 76 da Listagem de Sequências).

[00100] [Figura 86] A Figura 86 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de uma cadeia pesada humanizada de 2B1 (h2B1_H3) (SEQ ID NO: 77 da Listagem de Sequências).

[00101] [Figura 87] A Figura 87 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia pesada humanizada de 2B1 (h2B1_H3) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), região variável (posições de aminoácido de 20 a 142), região constante (posições de aminoácido de 143 a 472)) (SEQ ID NO: 78 da Listagem de Sequências).

[00102] [Figura 88] A Figura 88 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de uma cadeia pesada humanizada de 2B1 (h2B1_H4) (SEQ ID NO: 79 da Listagem de Sequências).

[00103] [Figura 89] A Figura 89 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia pesada humanizada de 2B1 (h2B1_H4) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), região variável (posições de aminoácido de 20 a 142), região constante (posições de aminoácido de 143 a 472)) (SEQ ID NO: 80 da Listagem de Sequências).

[00104] [Figura 90] A Figura 90 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de uma cadeia leve humanizada de 7B4 (h7B4_L1) (SEQ ID NO: 81 da Listagem de Sequências).

[00105] [Figura 91] A Figura 91 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada de 7B4 (h7B4_L1) (sequência de

55 / 286 sinal (posições de aminoácido de 1 a 20), região variável (posições de aminoácido de 21 a 126), região constante (posições de aminoácido de 127 a 233)) (SEQ ID NO: 82 da Listagem de Sequências).

[00106] [Figura 92] A Figura 92 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de uma cadeia leve humanizada de 7B4 (h7B4_L2) (SEQ ID NO: 83 da Listagem de Sequências).

[00107] [Figura 93] A Figura 93 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada de 7B4 (h7B4_L2) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 20), região variável (posições de aminoácido de 21 a 126), região constante (posições de aminoácido de 127 a 233)) (SEQ ID NO: 84 da Listagem de Sequências).

[00108] [Figura 94] A Figura 94 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de uma cadeia pesada humanizada de 7B4 (h7B4_H1) (SEQ ID NO: 85 da Listagem de Sequências).

[00109] [Figura 95] A Figura 95 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia pesada humanizada de 7B4 (h7B4_H1) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), região variável (posições de aminoácido de 20 a 142), região constante (posições de aminoácido de 143 a 472)) (SEQ ID NO: 86 da Listagem de Sequências).

[00110] [Figura 96] A Figura 96 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de uma cadeia pesada humanizada de 7B4 (h7B4_H2) (SEQ ID NO: 87 da Listagem de Sequências).

[00111] [Figura 97] A Figura 97 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia pesada humanizada de 7B4 (h7B4_H2) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), região variável (posições de aminoácido de 20 a 142), região constante (posições de aminoácido de 143 a 472)) (SEQ ID NO: 88 da Listagem de Sequências).

[00112] [Figura 98] A Figura 98 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de uma cadeia pesada humanizada de 7B4 (h7B4_H3) (SEQ

56 / 286 ID NO: 89 da Listagem de Sequências).

[00113] [Figura 99] A Figura 99 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia pesada humanizada de 7B4 (h7B4_H3) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), região variável (posições de aminoácido de 20 a 142), região constante (posições de aminoácido de 143 a 472)) (SEQ ID NO: 90 da Listagem de Sequências).

[00114] [Figura 100] A Figura 100 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de uma cadeia pesada humanizada de 7B4 (h7B4_H5) (SEQ ID NO: 91 da Listagem de Sequências).

[00115] [Figura 101] A Figura 101 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia pesada humanizada de 7B4 (h7B4_H5) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), região variável (posições de aminoácido de 20 a 142), região constante (posições de aminoácido de 143 a 472)) (SEQ ID NO: 92 da Listagem de Sequências).

[00116] [Figura 102] A Figura 102 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação dos anticorpos antiGPRC5D humanizados h2B1 contra GPRC5D humano usando um citômetro de fluxo (FACS). O eixo vertical representa um valor relativo da intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

[00117] [Figura 103] A Figura 103 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação dos anticorpos antiGPRC5D humanizados h7B4 contra GPRC5D humano usando um citômetro de fluxo (FACS). O eixo vertical representa um valor relativo da intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

[00118] [Figura 104] A Figura 104 é um diagrama mostrando que 2B1 humanizado e 7B4 humanizado têm atividade de ADCC.

[00119] [Figura 105] A Figura 105 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos do peptídeo do terminal amino de GPRC5D de macaco cinomolgo (SEQ ID NO: 93).

57 / 286

[00120] [Figura 106] A Figura 106 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um iniciador A usado na análise de sequência de scFv (SEQ ID NO: 94).

[00121] [Figura 107] A Figura 107 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de um iniciador B usado na análise de sequência de scFv (SEQ ID NO: 95).

[00122] [Figura 108] A Figura 108 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de um anticorpo humano C2037 (SEQ ID NO: 96 da Listagem de Sequências).

[00123] [Figura 109] A Figura 109 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo humano C2037 (SEQ ID NO: 97 da Listagem de Sequências).

[00124] [Figura 110] A Figura 110 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve de um anticorpo humano C2037 (SEQ ID NO: 98 da Listagem de Sequências).

[00125] [Figura 111] A Figura 111 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo humano C2037 (SEQ ID NO: 99 da Listagem de Sequências).

[00126] [Figura 112] A Figura 112 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de um anticorpo humano C3048 (SEQ ID NO: 100 da Listagem de Sequências).

[00127] [Figura 113] A Figura 113 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo humano C3048 (SEQ ID NO: 101 da Listagem de Sequências).

[00128] [Figura 114] A Figura 114 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve de um anticorpo humano C3048 (SEQ ID NO: 102 da Listagem de Sequências).

[00129] [Figura 115] A Figura 115 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo

58 / 286 humano C3048 (SEQ ID NO: 103 da Listagem de Sequências).

[00130] [Figura 116] A Figura 116 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de um anticorpo humano C3015 (SEQ ID NO: 104 da Listagem de Sequências).

[00131] [Figura 117] A Figura 117 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo humano C3015 (SEQ ID NO: 105 da Listagem de Sequências).

[00132] [Figura 118] A Figura 118 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve do anticorpo humano C3015 (SEQ ID NO: 106 da Listagem de Sequências).

[00133] [Figura 119] A Figura 119 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo humano C3015 (SEQ ID NO: 107 da Listagem de Sequências).

[00134] [Figura 120] A Figura 120 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de um anticorpo humano C3022 (SEQ ID NO: 108 da Listagem de Sequências).

[00135] [Figura 121] A Figura 121 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo humano C3022 (SEQ ID NO: 109 da Listagem de Sequências).

[00136] [Figura 122] A Figura 122 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve do anticorpo humano C3022 (SEQ ID NO: 110 da Listagem de Sequências).

[00137] [Figura 123] A Figura 123 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo humano C3022 (SEQ ID NO: 135 da Listagem de Sequências).

[00138] [Figura 124] A Figura 124 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada do anticorpo humano C2037 (SEQ ID NO: 111 da Listagem de Sequências).

[00139] [Figura 125] A Figura 125 é um diagrama mostrando a

59 / 286 sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada do anticorpo humano C2037 (SEQ ID NO: 112 da Listagem de Sequências).

[00140] [Figura 126] A Figura 126 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada do anticorpo humano C2037 (SEQ ID NO: 113 da Listagem de Sequências).

[00141] [Figura 127] A Figura 127 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve do anticorpo humano C2037 (SEQ ID NO: 114 da Listagem de Sequências).

[00142] [Figura 128] A Figura 128 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve do anticorpo humano C2037 (SEQ ID NO: 115 da Listagem de Sequências).

[00143] [Figura 129] A Figura 129 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve do anticorpo humano C2037 (SEQ ID NO: 116 da Listagem de Sequências).

[00144] [Figura 130] A Figura 130 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada do anticorpo humano C3048 (SEQ ID NO: 117 da Listagem de Sequências).

[00145] [Figura 131] A Figura 131 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada do anticorpo humano C3048 (SEQ ID NO: 118 da Listagem de Sequências).

[00146] [Figura 132] A Figura 132 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada do anticorpo humano C3048 (SEQ ID NO: 119 da Listagem de Sequências).

[00147] [Figura 133] A Figura 133 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve do anticorpo humano C3048 (SEQ ID NO: 120 da Listagem de Sequências).

[00148] [Figura 134] A Figura 134 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve do anticorpo humano C3048 (SEQ ID NO: 121 da Listagem de Sequências).

60 / 286

[00149] [Figura 135] A Figura 135 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve do anticorpo humano C3048 (SEQ ID NO: 122 da Listagem de Sequências).

[00150] [Figura 136] A Figura 136 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada do anticorpo humano C3015 (SEQ ID NO: 123 da Listagem de Sequências).

[00151] [Figura 137] A Figura 137 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada do anticorpo humano C3015 (SEQ ID NO: 124 da Listagem de Sequências).

[00152] [Figura 138] A Figura 138 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada do anticorpo humano C3015 (SEQ ID NO: 125 da Listagem de Sequências).

[00153] [Figura 139] A Figura 139 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve do anticorpo humano C3015 (SEQ ID NO: 126 da Listagem de Sequências).

[00154] [Figura 140] A Figura 140 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve do anticorpo humano C3015 (SEQ ID NO: 127 da Listagem de Sequências).

[00155] [Figura 141] A Figura 141 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve do anticorpo humano C3015 (SEQ ID NO: 128 da Listagem de Sequências).

[00156] [Figura 142] A Figura 142 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada do anticorpo humano C3022 (SEQ ID NO: 129 da Listagem de Sequências).

[00157] [Figura 143] A Figura 143 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada do anticorpo humano C3022 (SEQ ID NO: 130 da Listagem de Sequências).

[00158] [Figura 144] A Figura 144 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada do anticorpo humano

61 / 286 C3022 (SEQ ID NO: 131 da Listagem de Sequências).

[00159] [Figura 145] A Figura 145 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve do anticorpo humano C3022 (SEQ ID NO: 132 da Listagem de Sequências).

[00160] [Figura 146] A Figura 146 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve do anticorpo humano C3022 (SEQ ID NO: 133 da Listagem de Sequências).

[00161] [Figura 147] A Figura 147 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve do anticorpo humano C3022 (SEQ ID NO: 134 da Listagem de Sequências).

[00162] [Figura 148] A Figura 148 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de uma forma de IgG do anticorpo humano C2037 (SEQ ID NO: 136 da Listagem de Sequências).

[00163] [Figura 149] A Figura 149 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da cadeia leve de uma forma de IgG do anticorpo humano C2037 (SEQ ID NO: 137 da Listagem de Sequências).

[00164] [Figura 150] A Figura 150 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de uma forma de IgG do anticorpo humano C3048 (SEQ ID NO: 138 da Listagem de Sequências).

[00165] [Figura 151] A Figura 151 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da cadeia leve de uma forma de IgG do anticorpo humano C3048 (SEQ ID NO: 139 da Listagem de Sequências).

[00166] [Figura 152] A Figura 152 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de uma forma de IgG do anticorpo humano C3015 (SEQ ID NO: 140 da Listagem de Sequências).

[00167] [Figura 153] A Figura 153 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da cadeia leve de uma forma de IgG do anticorpo humano C3015 (SEQ ID NO: 141 da Listagem de Sequências).

[00168] [Figura 154] A Figura 154 é um diagrama mostrando a

62 / 286 sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de uma forma de IgG do anticorpo humano C3022 (SEQ ID NO: 142 da Listagem de Sequências).

[00169] [Figura 155] A Figura 155 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da cadeia leve de uma forma de IgG do anticorpo humano C3022 (SEQ ID NO: 143 da Listagem de Sequências).

[00170] [Figura 156] A Figura 156 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia pesada da forma de IgG do anticorpo humano C2037 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), região variável (posições de aminoácido de 20 a 134), região constante (posições de aminoácido de 135 a 464)) (SEQ ID NO: 144 da Listagem de Sequências).

[00171] [Figura 157] A Figura 157 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia leve da forma de IgG do anticorpo humano C2037 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 20), região variável (posições de aminoácido de 21 a 130), região constante (posições de aminoácido de 131 a 236)) (SEQ ID NO: 145 da Listagem de Sequências).

[00172] [Figura 158] A Figura 158 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia pesada da forma de IgG do anticorpo humano C3048 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), região variável (posições de aminoácido de 20 a 142), região constante (posições de aminoácido de 143 a 472)) (SEQ ID NO: 146 da Listagem de Sequências).

[00173] [Figura 159] A Figura 159 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia leve da forma de IgG do anticorpo humano C3048 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 20), região variável (posições de aminoácido de 21 a 130), região constante (posições de aminoácido de 131 a 236)) (SEQ ID NO: 147 da Listagem de Sequências).

[00174] [Figura 160] A Figura 160 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia pesada da forma de IgG do anticorpo humano C3015 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), região variável (posições de aminoácido de 20 a 140), região constante (posições de

63 / 286 aminoácido de 141 a 470)) (SEQ ID NO: 148 da Listagem de Sequências).

[00175] [Figura 161] A Figura 161 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia leve da forma de IgG do anticorpo humano C3015 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 20), região variável (posições de aminoácido de 21 a 126), região constante (posições de aminoácido de 127 a 232)) (SEQ ID NO: 149 da Listagem de Sequências).

[00176] [Figura 162] A Figura 162 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia pesada da forma de IgG do anticorpo humano C3022 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), região variável (posições de aminoácido de 20 a 134), região constante (posições de aminoácido de 135 a 464)) (SEQ ID NO: 150 da Listagem de Sequências).

[00177] [Figura 163] A Figura 163 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da cadeia leve da forma de IgG do anticorpo humano C3022 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 20), região variável (posições de aminoácido de 21 a 130), região constante (posições de aminoácido de 131 a 236)) (SEQ ID NO: 151 da Listagem de Sequências).

[00178] [Figura 164] A Figura 164 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação de anticorpo humano scFv contra o terminal amino de GPRC5D biotinilado humano (A) ou de macaco cinomolgo (B) pelo ELISA. O eixo vertical representa a intensidade de luminescência ensaiada pelo ELISA.

[00179] [Figura 165] A Figura 165 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação de uma forma de IgG de um anticorpo humano contra o terminal amino de GPRC5D biotinilado humano ou de macaco cinomolgo pelo ELISA. O eixo vertical representa a intensidade de luminescência ensaiada pelo ELISA.

[00180] [Figura 166] A Figura 166 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação de anticorpo humano scFv contra uma linhagem de célula cancerosa expressando GPRC5D humano usando um

64 / 286 citômetro de fluxo (FACS). O eixo vertical representa um valor relativo da intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

[00181] [Figura 167] A Figura 167 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação de uma forma de IgG de um anticorpo humano contra uma linhagem de célula cancerosa expressando GPRC5D humano usando um citômetro de fluxo (FACS). O eixo vertical representa um valor relativo da intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

[00182] [Figura 168] A Figura 168 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeos que codifica a região variável de cadeia pesada de um anticorpo antiCD3 de rato C3-147 (SEQ ID NO: 152).

[00183] [Figura 169] A Figura 169 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeos que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo antiCD3 de rato C3-147 (SEQ ID NO: 153).

[00184] [Figura 170] A Figura 170 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeos que codifica C3E-7000(58-867) (sequência de sinal (posições de nucleotídeo 1 a 57), scFv (posições de nucleotídeo 58 a 783), etiqueta FLAG-His (posições de nucleotídeo 793 a 867)) (SEQ ID NO: 154).

[00185] [Figura 171] A Figura 171 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de C3E-7034 (SEQ ID NO: 155).

[00186] [Figura 172] A Figura 172 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de C3E-7034 (SEQ ID NO: 156).

[00187] [Figura 173] A Figura 173 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeos que codifica C3E-7034(58-864) (sequência de sinal (posições de nucleotídeo 1 a 57), scFv (posições de nucleotídeo 61 a 786), etiqueta FLAG-His (posições de nucleotídeo 790 a 864)) (SEQ ID NO: 157).

[00188] [Figura 174] A Figura 174 é um diagrama mostrando a

65 / 286 sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de C3E-7035 (SEQ ID NO: 158).

[00189] [Figura 175] A Figura 175 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeos que codifica C3E-7035(58-864) (sequência de sinal (posições de nucleotídeo 1 a 57), scFv (posições de nucleotídeo 61 a 786), etiqueta FLAG-His (posições de nucleotídeo 790 a 864)) (SEQ ID NO: 159).

[00190] [Figura 176] A Figura 176 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de C3E-7036 (SEQ ID NO: 160).

[00191] [Figura 177] A Figura 177 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeos que codifica C3E-7036(58-858) (sequência de sinal (posições de nucleotídeo 1 a 57), scFv (posições de nucleotídeo 61 a 780), etiqueta FLAG-His (posições de nucleotídeo 784 a 858)) (SEQ ID NO: 161).

[00192] [Figura 178] A Figura 178 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeos que codifica um vetor de expressão pC2037- C3E7034 (SEQ ID NO: 162).

[00193] [Figura 179] A Figura 179 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeos que codifica a ORF de um vetor de expressão pC3048-C3E-7034 (SEQ ID NO: 163).

[00194] [Figura 180] A Figura 180 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeos que codifica a ORF de um vetor de expressão pC3022-C3E-7034 (SEQ ID NO: 164).

[00195] [Figura 181] A Figura 181 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeos que codifica a ORF de um vetor de expressão pC2037-C3E-7035 (SEQ ID NO: 165).

[00196] [Figura 182] A Figura 182 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeos que codifica a ORF de um vetor de expressão pC3048-C3E-7035 (SEQ ID NO: 166).

[00197] [Figura 183] A Figura 183 é um diagrama mostrando uma

66 / 286 sequência de nucleotídeos que codifica a ORF de um vetor de expressão pC3022-C3E-7035 (SEQ ID NO: 167).

[00198] [Figura 184] A Figura 184 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeos que codifica a ORF de um vetor de expressão pC2037-C3E-7036 (SEQ ID NO: 168).

[00199] [Figura 185] A Figura 185 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeos que codifica a ORF de um vetor de expressão pC3048-C3E-7036 (SEQ ID NO: 169).

[00200] [Figura 186] A Figura 186 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeos que codifica a ORF de um vetor de expressão pC3022-C3E-7036 (SEQ ID NO: 170).

[00201] [Figura 187] A Figura 187 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C2037-C3E-7034 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), C2037 (posições de aminoácido de 21 a 260), C3E- 7034 (posições de aminoácido de 266 a 507)) (SEQ ID NO: 171).

[00202] [Figura 188] A Figura 188 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C3048-C3E-7034 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), C3048 (posições de aminoácido de 21 a 268), C3E- 7034 (posições de aminoácido de 274 a 515)) (SEQ ID NO: 172).

[00203] [Figura 189] A Figura 189 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C3022-C3E-7034 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), C3022 (posições de aminoácido de 21 a 260), C3E- 7034 (posições de aminoácido de 266 a 507)) (SEQ ID NO: 173).

[00204] [Figura 190] A Figura 190 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C2037-C3E-7035 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), C2037 (posições de aminoácido de 21 a 260), C3E- 7035 (posições de aminoácido de 266 a 507)) (SEQ ID NO: 174).

[00205] [Figura 191] A Figura 191 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C3048-C3E-7035 (sequência de sinal (posições

67 / 286 de aminoácido de 1 a 19), C3048 (posições de aminoácido de 21 a 268), C3E- 7035 (posições de aminoácido de 274 a 515)) (SEQ ID NO: 175).

[00206] [Figura 192] A Figura 192 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C3022-C3E-7035 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), C3022 (posições de aminoácido de 21 a 260), C3E- 7035 (posições de aminoácido de 266 a 507)) (SEQ ID NO: 176).

[00207] [Figura 193] A Figura 193 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C2037-C3E-7036 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), C2037 (posições de aminoácido de 21 a 260), C3E- 7036 (posições de aminoácido de 266 a 505)) (SEQ ID NO: 177).

[00208] [Figura 194] A Figura 194 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C3048-C3E-7036 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), C3048 (posições de aminoácido de 21 a 268), C3E- 7036 (posições de aminoácido de 274 a 513)) (SEQ ID NO: 178).

[00209] [Figura 195] A Figura 195 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C3022-C3E-7036 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 19), C3022 (posições de aminoácido de 21 a 260), C3E- 7036 (posições de aminoácido de 266 a 505)) (SEQ ID NO: 179).

[00210] [Figura 196] A Figura 196 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação de uma molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contra células que expressam GPRC5D humano endógeno (células A4/FuK da linhagem de célula de linfoma humano) usando um citômetro de fluxo (FACS). O eixo vertical representa um valor relativo da intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

[00211] [Figura 197] A Figura 197 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contra células que expressam GPRC5D de macaco cinomolgo usando um citômetro de fluxo (FACS). O eixo vertical representa um valor relativo da intensidade de fluorescência média ensaiada pela

68 / 286 citometria de fluxo.

[00212] [Figura 198] A Figura 198 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contra CD3 humano (PBMC) usando um citômetro de fluxo (FACS). O eixo vertical representa um valor relativo da intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

[00213] [Figura 199] A Figura 199 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contra CD3 de macaco cinomolgo (PBMC) usando um citômetro de fluxo (FACS). O eixo vertical representa um valor relativo da intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

[00214] [Figura 200] A Figura 200 é um diagrama mostrando que a molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 tem atividade citotóxica contra células que expressam GPRC5D humano endógeno (células A4/FuK da linhagem de célula de linfoma humano).

[00215] [Figura 201] A Figura 201 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação de 2B1 humanizado contra GPRC5D de macaco cinomolgo usando um citômetro de fluxo (FACS). O eixo vertical representa um valor relativo da intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

[00216] [Figura 202] A Figura 202 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação de 7B4 humanizado contra GPRC5D de macaco cinomolgo usando um citômetro de fluxo (FACS). O eixo vertical representa um valor relativo da intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

[00217] [Figura 203] A Figura 203 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C3E-7034 (posições de aminoácido de 1 a 269). VH(2-119), VL(135-243), etiqueta FLAG-His (244 a 269)) (SEQ ID NO: 180).

69 / 286

[00218] [Figura 204] A Figura 204 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C3E-7035(posições de aminoácido de 1 a 269). VH(2-119), VL(135-243), etiqueta FLAG-His (244 a 269)) (SEQ ID NO: 181).

[00219] [Figura 205] A Figura 205 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C3E-7036 (posições de aminoácido de 1 a 267). VH(2-119), VL(135-241), etiqueta FLAG-His (242 a 267)) (SEQ ID NO: 182).

[00220] [Figura 206] A Figura 206 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada de C3E-7000 (SEQ ID NO: 183).

[00221] [Figura 207] A Figura 207 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada de C3E-7000 (SEQ ID NO: 184).

[00222] [Figura 208] A Figura 208 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada de C3E-7000 (SEQ ID NO: 185).

[00223] [Figura 209] A Figura 209 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve de C3E-7000 (SEQ ID NO: 186).

[00224] [Figura 210] A Figura 210 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve de C3E-7000 (SEQ ID NO: 187).

[00225] [Figura 211] A Figura 211 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve de C3E-7000 (SEQ ID NO: 188).

[00226] [Figura 212] A Figura 212 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de CD3ε humano (SEQ ID NO: 189).

[00227] [Figura 213] A Figura 213 é um diagrama mostrando a

70 / 286 sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de E1018 (SEQ ID NO: 190).

[00228] [Figura 214] A Figura 214 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de E1018 (SEQ ID NO: 191).

[00229] [Figura 215] A Figura 215 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve de E1018 (SEQ ID NO: 192).

[00230] [Figura 216] A Figura 216 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de E1018 (SEQ ID NO: 193).

[00231] [Figura 217] A Figura 217 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de D1012 (SEQ ID NO: 194).

[00232] [Figura 218] A Figura 218 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de D1012 (SEQ ID NO: 195).

[00233] [Figura 219] A Figura 219 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve de D1012 (SEQ ID NO: 196).

[00234] [Figura 220] A Figura 220 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de D1012 (SEQ ID NO: 197).

[00235] [Figura 221] A Figura 221 é um diagrama mostrando constantes de dissociação determinadas ensaiando-se a atividade de ligação dos anticorpos antiGPRC5D (C3022, E1018, C3048 e D1012) contra GPRC5D humano pelo SPR.

[00236] [Figura 222] A Figura 222 é um diagrama mostrando a sequência nucléica de h2B1_Fab_HC_1 (SEQ ID NO: 198).

71 / 286

[00237] [Figura 223] A Figura 223 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de h2B1_Fab_HC_1 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 23), região variável (posições de aminoácido de 24 a 146), região constante (posições de aminoácido de 147 a 475)) (SEQ ID NO: 199).

[00238] [Figura 224] A Figura 224 é um diagrama mostrando a sequência nucléica de h2B1_Fab_HC_2 (SEQ ID NO: 200).

[00239] [Figura 225] A Figura 225 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de h2B1_Fab_HC_2 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 23), região variável (posições de aminoácido de 24 a 146), região constante (posições de aminoácido de 147 a 475)) (SEQ ID NO: 201).

[00240] [Figura 226] A Figura 226 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de h2B1_Fab_LC_1 (SEQ ID NO: 202).

[00241] [Figura 227] A Figura 227 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de h2B1_Fab_LC_1 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 23), região variável (posições de aminoácido de 24 a 130), região constante (posições de aminoácido de 131 a 237)) (SEQ ID NO: 203).

[00242] [Figura 228] A Figura 228 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de h2B1_Fab_LC_2 (SEQ ID NO: 204).

[00243] [Figura 229] A Figura 229 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de h2B1_Fab_LC_2 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 23), região variável (posições de aminoácido de 24 a 130), região constante (posições de aminoácido de 131 a 237)) (SEQ ID NO: 205).

[00244] [Figura 230] A Figura 230 é um diagrama mostrando a sequência nucléica de C3E-7034_Fab_HC (SEQ ID NO: 206).

[00245] [Figura 231] A Figura 231 é um diagrama mostrando a

72 / 286 sequência de aminoácidos de C3E-7034_Fab_HC (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 23), região variável (posições de aminoácido de 25 a 142), região constante (posições de aminoácido de 143 a 471)) (SEQ ID NO: 207).

[00246] [Figura 232] A Figura 232 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de C3E-7034_Fab_LC (SEQ ID NO: 208).

[00247] [Figura 233] A Figura 233 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C3E-7034_Fab_LC (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 23), região variável (posições de aminoácido de 24 a 132), região constante (posições de aminoácido de 133 a 238)) (SEQ ID NO: 209).

[00248] [Figura 234] A Figura 234 é um diagrama mostrando a sequência nucléica de C3E-7036_Fab_HC (SEQ ID NO: 210).

[00249] [Figura 235] A Figura 235 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C3E-7036_Fab_HC (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 23), região variável (posições de aminoácido de 25 a 142), região constante (posições de aminoácido de 143 a 471)) (SEQ ID NO: 211).

[00250] [Figura 236] A Figura 236 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de C3E-7036_Fab_LC (SEQ ID NO: 212).

[00251] [Figura 237] A Figura 237 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C3E-7036_Fab_LC (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 23), região variável (posições de aminoácido de 24 a 130), região constante (posições de aminoácido de 131 a 236)) (SEQ ID NO: 213).

[00252] [Figura 238] A Figura 238 é um diagrama mostrando a sequência nucléica de h2B1_Fab_HC_3 (SEQ ID NO: 214).

[00253] [Figura 239] A Figura 239 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de h2B1_Fab_HC_3 (sequência de sinal (posições

73 / 286 de aminoácido de 1 a 23), região variável (posições de aminoácido de 24 a 146), região constante (posições de aminoácido de 147 a 475)) (SEQ ID NO: 215).

[00254] [Figura 240] A Figura 240 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de h2B1_Fab_LC_3 (SEQ ID NO: 216).

[00255] [Figura 241] A Figura 241 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de h2B1_Fab_LC_3 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 23), região variável (posições de aminoácido de 24 a 130), região constante (posições de aminoácido de 131 a 237)) (SEQ ID NO: 217).

[00256] [Figura 242] A Figura 242 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de C3E-7034_scFv_Fc (SEQ ID NO: 218).

[00257] [Figura 243] A Figura 243 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C3E-7034_scFv_Fc (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 23), scFv (posições de aminoácido de 24 a 266)) (SEQ ID NO: 219).

[00258] [Figura 244] A Figura 2344 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de C3E-7036_scFv_Fc (SEQ ID NO: 220).

[00259] [Figura 245] A Figura 245 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C3E-7036_scFv_Fc (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 23), scFv (posições de aminoácido de 24 a 264)) (SEQ ID NO: 221).

[00260] [Figura 246] A Figura 246 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de 2B1_scFv_Fc humanizado (h2B1_scFv_Fc) (SEQ ID NO: 222).

[00261] [Figura 247] A Figura 247 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de 2B1_scFv_Fc humanizado (h2B1_scFv_Fc) (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 23), scFv (posições de aminoácido de 24 a 271)) (SEQ ID NO: 223).

74 / 286

[00262] [Figura 248] A Figura 248 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação de uma molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo Fc contra células que expressam GPRC5D humano endógeno pela citometria de fluxo. O eixo vertical representa a intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

[00263] A, B e C são diagramas mostrando resultados do teste da atividade de ligação de molécula biespecífica do tipo FSA, tipo Híbrida e tipo Dual respectivamente.

[00264] [Figura 249] A Figura 249 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação de uma molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo Fc contra células que expressam GPRC5D de macaco cinomolgo pela citometria de fluxo. O eixo vertical representa a intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

[00265] A, B e C são diagramas mostrando resultados do teste da atividade de ligação de molécula biespecífica do tipo FSA, tipo Híbrido e tipo Dual respectivamente.

[00266] [Figura 250] A Figura 250 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo Fc contra células que expressam CD3 humano pela citometria de fluxo. O eixo vertical representa a intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

[00267] A, B e C são diagramas mostrando resultados do teste da atividade de ligação de molécula biespecífica do tipo FSA, tipo Híbrido e tipo Dual respectivamente.

[00268] [Figura 251] A Figura 251 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo Fc contra células que expressam CD3 de macaco cinomolgo pela citometria de fluxo. O eixo vertical representa a intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

75 / 286

[00269] A, B e C são diagramas mostrando resultados do teste da atividade de ligação de molécula biespecífica do tipo FSA, tipo Híbrido e tipo Dual respectivamente.

[00270] [Figura 252-1] A Figura 252 é um diagrama mostrando a atividade citotóxica da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo Fc.

[00271] A e B são diagramas mostrando resultados do teste da atividade de ligação de molécula biespecífica do tipo FSA e tipo Híbrido respectivamente.

[00272] [Figura 252-2] A Figura 252 é um diagrama mostrando a atividade citotóxica da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo Fc.

[00273] C é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação de molécula biespecífica do tipo Dual.

[00274] [Figura 253] A Figura 253 é um diagrama mostrando a atividade antitumor da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 tipo híbrida contendo Fc em modelo de coenxerto de tumor/PBMC.

[00275] [Figura 254] A Figura 254 é um diagrama mostrando a atividade antitumor de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 tipo híbrida contendo Fc no modelo transferido com PBMC humana.

[00276] [Figura 255] A Figura 255 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de C3E-8015 (SEQ ID NO: 224).

[00277] [Figura 256] A Figura 256 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C3E-8015 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 23), scFv (posições de aminoácido de 24 a 264)) (SEQ ID NO: 225).

[00278] [Figura 257] A Figura 257 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de C3E-8017 (SEQ ID NO: 226).

[00279] [Figura 258] A Figura 258 é um diagrama mostrando a

76 / 286 sequência de aminoácidos de C3E-8017 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 23), scFv (posições de aminoácido de 24 a 266)) (SEQ ID NO: 227).

[00280] [Figura 259] A Figura 259 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de C3E-8018 (SEQ ID NO: 228).

[00281] [Figura 260] A Figura 260 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C3E-8018 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 23), scFv (posições de aminoácido de 24 a 266)) (SEQ ID NO: 229).

[00282] [Figura 261] A Figura 261 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de C3E-8025 (SEQ ID NO: 230).

[00283] [Figura 262] A Figura 262 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C3E-8025 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 23), scFv (posições de aminoácido de 24 a 264)) (SEQ ID NO: 231).

[00284] [Figura 263] A Figura 263 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de C3E-8027 (SEQ ID NO: 232).

[00285] [Figura 264] A Figura 264 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C3E-8027 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 23), scFv (posições de aminoácido de 24 a 266)) (SEQ ID NO: 233).

[00286] [Figura 265] A Figura 265 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de C3E-8028 (SEQ ID NO: 234).

[00287] [Figura 266] A Figura 266 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de C3E-8028 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 23), scFv (posições de aminoácido de 24 a 266)) (SEQ ID NO: 235).

[00288] [Figura 267] A Figura 267 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeos de h2B1_Fab_HC_4 (SEQ ID NO: 236).

77 / 286

[00289] [Figura 268] A Figura 268 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácidos de h2B1_Fab_HC_4 (sequência de sinal (posições de aminoácido de 1 a 23), região variável (posições de aminoácido de 24 a 146), região constante (posições de aminoácido de 147 a 476)) (SEQ ID NO: 237).

[00290] [Figura 269] A Figura 269 é de diagramas mostrando resultados do teste da atividade de ligação da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 tipo híbrida modificada na CDR e tipo híbrida modificada na CDR pela adição de Lys no terminal C contra células que expressam GPRC5D humano endógeno pela citometria de fluxo. O eixo vertical representa a intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

[00291] A, B e C são diagramas mostrando resultados do teste da atividade de ligação de (C5D-0004 e C5D-0014), (C5D-0005 e C5D-0015) e (C5D-0006 e C5D-0016) respectivamente.

[00292] [Figura 270] A Figura 270 é de diagramas mostrando resultados do teste da atividade de ligação da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 tipo híbrida modificada na CDR e tipo híbrida modificada na CDR pela adição de Lys no terminal C contra células que expressam GPRC5D de macaco cinomolgo pela citometria de fluxo. O eixo vertical representa a intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

[00293] A, B e C são diagramas mostrando resultados do teste da atividade de ligação de (C5D-0004 e C5D-0014), (C5D-0005 e C5D-0015) e (C5D-0006 e C5D-0016) respectivamente.

[00294] [Figura 271] A Figura 271 é de diagramas mostrando resultados do teste da atividade de ligação da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 tipo híbrida modificada na CDR e tipo híbrida modificada na CDR pela adição de Lys no terminal C contra células que

78 / 286 expressam CD3 humano pela citometria de fluxo. O eixo vertical representa a intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

[00295] A, B e C são diagramas mostrando resultados do teste da atividade de ligação de (C5D-0004 e C5D-0014), (C5D-0005 e C5D-0015) e (C5D-0006 e C5D-0016) respectivamente.

[00296] [Figura 272] A Figura 272 é um diagrama mostrando resultados do teste da atividade de ligação da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 tipo híbrida modificada na CDR e tipo híbrida modificada na CDR pela adição de Lys no terminal C contra células que expressam CD3 de macaco cinomolgo pela citometria de fluxo. O eixo vertical representa a intensidade de fluorescência média ensaiada pela citometria de fluxo.

[00297] A, B e C são diagramas mostrando resultados do teste da atividade de ligação de (C5D-0004 e C5D-0014), (C5D-0005 e C5D-0015) e (C5D-0006 e C5D-0016) respectivamente.

[00298] [Figura 273-1] A Figura 273-1 é de diagramas mostrando a atividade citotóxica da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 tipo híbrida modificada na CDR e tipo híbrida modificada na CDR pela adição de Lys no terminal C.

[00299] A e B são diagramas mostrando a atividade citotóxica de C5D- 0004 e C5D-0014 respectivamente.

[00300] [Figura 273-2] A Figura 273-2 é de diagramas mostrando a atividade citotóxica da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 tipo híbrida modificada na CDR e tipo híbrida modificada na CDR pela adição de Lys no terminal C.

[00301] C e D são diagramas mostrando a atividade citotóxica de C5D- 0005 e C5D-0015 respectivamente.

[00302] [Figura 273-3] A Figura 273-3 é de diagramas mostrando a atividade citotóxica da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 tipo

79 / 286 híbrida modificada na CDR e tipo híbrida modificada na CDR pela adição de Lys no terminal C.

[00303] E e F são diagramas mostrando a atividade citotóxica de C5D- 0006 e C5D-0016 respectivamente.

[00304] [Figura 274] A Figura 274 é um diagrama mostrando a atividade antitumor da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 tipo Híbrida modificada na CDR em modelo de coenxerto de tumor/PBMC.

[00305] [Figura 275] A Figura 275 são diagramas mostrando a atividade de regressão de tumor da molécula biespecífica antiGPRC5D- antiCD3 tipo híbrida modificada na CDR (A) e tipo híbrida modificada na CDR com Lys adicionada no terminal C (B) em modelo de tumor estabelecido em camundongos reconstituídos com PBMC humana.

[00306] A e B são diagramas mostrando a atividade de regressão de tumor de C5D-0004 e C5D-0014 respectivamente.

[00307] [Figura 276] A Figura 276 mostra a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada modificada na CDR (SEQ ID NO: 238).

[00308] [Figura 277] A Figura 277 mostra a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve modificada na CDR (SEQ ID NO: 239).

[00309] [Figura 278] A Figura 278 mostra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de um C3E-7034 modificado na CDR (SEQ ID NO: 240).

[00310] [Figura 279] A Figura 279 mostra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do C3E-7034 modificado na CDR (SEQ ID NO: 241).

[00311] [Figura 280] A Figura 280 mostra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do C3E-7035 modificado na CDR (SEQ ID NO: 242).

[00312] [Figura 281] A Figura 281 mostra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do C3E-7036 modificado na CDR (SEQ ID

80 / 286 NO: 243).

[00313] [Figura 282] A Figura 282 mostra a sequência de aminoácidos de C3E-7078(1-269). VH(2-119), VL(135-243), etiqueta FLAG-His(244- 269)(SEQ ID NO: 244).

[00314] [Figura 283] A Figura 283 mostra a sequência de aminoácidos de C3E-7085(1-267). VH(2-119), VL(135-241), etiqueta FLAG-His(242- 267)(SEQ ID NO: 245).

[00315] [Figura 284] A Figura 284 mostra a sequência de aminoácidos de C3E-7086(1-269). VH(2-119), VL(135-243), etiqueta FLAG-His(244- 269)(SEQ ID NO: 246).

[00316] [Figura 285] A Figura 285 mostra a sequência de aminoácidos de C3E-7087(1-269). VH(2-119), VL(135-243), etiqueta FLAG-His(244- 269)(SEQ ID NO: 247).

[00317] [Figura 286] A Figura 286 mostra a sequência de aminoácidos de C3E-7088(1-269). VH(2-119), VL(135-243), etiqueta FLAG-His(244- 269)(SEQ ID NO: 248).

[00318] [Figura 287] A Figura 287 mostra a sequência de aminoácidos de C3E-7089(1-269). VH(2-119), VL(135-243), etiqueta FLAG-His(244- 269)(SEQ ID NO: 249).

[00319] [Figura 288] A Figura 288 mostra a sequência de aminoácidos de C3E-7090(1-269). VH(2-119), VL(135-243), etiqueta FLAG-His(244- 269)(SEQ ID NO: 250).

[00320] [Figura 289] A Figura 289 mostra a sequência de aminoácidos de C3E-7091(1-269). VH(2-119), VL(135-243), etiqueta FLAG-His(244- 269)(SEQ ID NO: 251).

[00321] [Figura 290] A Figura 290 mostra a sequência de aminoácidos de C3E-7092(1-269). VH(2-119), VL(135-243), etiqueta FLAG-His(244- 269)(SEQ ID NO: 252).

[00322] [Figura 291] A Figura 291 mostra a sequência de aminoácidos

81 / 286 de C3E-7093(1-269). VH(2-119), VL(135-243), etiqueta FLAG-His(244- 269)(SEQ ID NO: 253).

[00323] [Figura 292] A Figura 292 mostra a sequência de aminoácidos de C3E-7094(1-269). VH(2-119), VL(135-243), etiqueta FLAG-His(244- 269)(SEQ ID NO: 254).

[00324] [Figura 293] A Figura 293 mostra a sequência de aminoácidos de C3E-7095(1-269). VH(2-119), VL(135-243), etiqueta FLAG-His(244- 269)(SEQ ID NO: 255). [Descrição das Modalidades]

1. Definições

[00325] Na presente invenção, o termo “gene” significa um nucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica os aminoácidos de uma proteína ou seu filamento complementar. O “gene” é intencionado incluir, por exemplo, um polinucleotídeo, um oligonucleotídeo, DNA, mRNA, cDNA e cRNA como o polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica os aminoácidos de uma proteína ou seu filamento complementar. Um tal gene é um nucleotídeo de filamento único, de filamento duplo ou triplo ou de mais filamentos. O “gene” também é intencionado incluir uma associação de filamentos de DNA e RNA, uma mistura de ribonucleotídeos (RNAs) e desoxirribonucleotídeos (DNAs) em um filamento de nucleotídeo e um nucleotídeo de filamento duplo ou triplo ou de mais filamentos compreendendo um tal filamento de nucleotídeo. Na presente invenção, “uma sequência de base” tem o mesmo significado como “uma sequência de nucleotídeo.”

[00326] Na presente invenção, o termo “polinucleotídeo” tem o mesmo significado como um “ácido nucléico” e uma “molécula de ácido nucléico” e também é intencionado incluir, por exemplo, DNA, RNA, uma sonda, um oligonucleotídeo e um iniciador. Um tal polinucleotídeo é um polinucleotídeo de filamento único, de filamento duplo ou triplo ou de mais filamentos. O

82 / 286 “polinucleotídeo” também é intencionado incluir uma associação de filamentos de DNA e RNA, uma mistura de ribonucleotídeos (RNAs) e desoxirribonucleotídeos (DNAs) em um filamento de polinucleotídeo e uma associação de dois filamentos ou três ou mais filamentos compreendendo um tal filamento de polinucleotídeo.

[00327] Na presente invenção, os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” têm o mesmo significado.

[00328] Na presente invenção, o termo “antígeno” tem o mesmo significado como “imunógeno”.

[00329] Na presente invenção, o termo “célula” também inclui, por exemplo, várias células derivadas de animais individuais, células subcultivadas, células primárias cultivadas, linhagens de célula, células recombinantes e células microbianas.

[00330] Na presente invenção, o termo “anticorpo” tem o mesmo significado como uma imunoglobulina. Entretanto, o “anticorpo” usado para o anticorpo antiGPRC5D da presente invenção ou o anticorpo antiCD3 da presente invenção significa uma imunoglobulina tendo regiões constantes e variáveis. O anticorpo não é particularmente limitado e pode ser uma imunoglobulina natural ou pode ser uma imunoglobulina produzida pela síntese parcial ou completa. O anticorpo antiGPRC5D e/ou o anticorpo antiCD3 da presente invenção são incluídos na “molécula” descrita mais tarde.

[00331] A estrutura básica de um anticorpo quaternário é constituída por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve é ligada à cadeia pesada por uma ligação covalente de dissulfeto. As duas cadeias pesadas são ligadas uma à outra por uma ou mais ligações de dissulfeto de acordo com os isótipos das cadeias pesadas. Cada uma das cadeias leves e pesadas tem ligações de dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. Cada uma das cadeias pesadas e leves contém uma

83 / 286 região constante que exibe um grau muito alto de similaridade de sequência de aminoácidos e uma região variável que exibe um grau baixo de similaridade de sequência de aminoácidos. A cadeia leve tem uma região variável (VL) no terminal amino seguida por uma região constante (CL). A cadeia pesada tem uma região variável (VH) no terminal amino seguida por três regiões constantes (CH1, CH2 e CH3). VL e VH são emparelhadas uma com a outra e CL é alinhada com a primeira região constante (CH1) da cadeia pesada. O par de VL e VH forma um sítio de ligação de antígeno único.

[00332] Fab é composto de CH1 de cadeia pesada seguida por VH e CL de cadeia leve seguida por VL. VH e VL cada uma contém regiões determinadoras de complementaridade (CDRs).

[00333] Fc é constituído pelas regiões de terminal carboxila da região constante de cadeias pesadas e é um dímero contendo CH2 e CH3. O Fc da presente invenção pode ser Fc tendo uma sequência natural (Fc natural) ou pode ser uma forma mutada de Fc contendo uma mutação na sequência natural (Fc mutado).

[00334] Exemplos do “Fc mutado” podem incluir, mas não são limitados a uma região Fc modificada compreendida em um heteromultímero (incluindo uma região Fc heterodimérica) com estabilidade aumentada divulgada na WO2013/063702; Fc compreendendo o domínio CH3 de uma imunoglobulina derivada de um anticorpo IgG que tem “protuberância” e “cavidade” e incluído no heteromultímero divulgado na WO96/27011; Fc compreendendo o domínio CH3 incluído no heterodímero que é eletrostaticamente favoráveis obtidas pela substituição de um ou mais resíduos de aminoácido com um aminoácido carregado divulgado na WO2009/089004; regiões Fc herterodiméricas compreendidas no heterodímero que é variante estérica e/ou variante pi (Ponto isoelétrico) divulgadas na WO2014/110601; Fc heterodimérico compreendendo domínio CH3 que erradica ou reduz a ligação à Proteína A divulgada na

84 / 286 WO2010/151792.

[00335] A região variável é composta de regiões, chamadas de regiões hipervariáveis (HVRs), tendo variabilidade extrema e regiões relativamente invariáveis, chamadas de regiões de armação (FRs), interrompidas pelas regiões hipervariáveis. As regiões variáveis de cadeias pesada e leve naturais cada uma contém quatro FRs conectadas por três regiões hipervariáveis. As regiões hipervariáveis de cada cadeia são mantidas em proximidade imediata junto com as regiões hipervariáveis de uma outra cadeia pelas FRs e contribuem para a formação de um sítio de ligação de antígeno no anticorpo.

[00336] As cadeias pesadas e leves de uma molécula de anticorpo são conhecidas cada uma ter três regiões determinadoras de complementaridade (CDRs). As regiões determinadoras de complementaridade também são chamadas de domínios hipervariáveis. Estas regiões estão localizadas nas regiões variáveis de cadeias pesadas e leves do anticorpo. Estes sítios têm uma estrutura primária de modo particular altamente variável e são usualmente separados em três posições nas respectivas estruturas primárias de filamentos de polipeptídeo de cadeia pesada e leve. Na presente invenção, as regiões determinadoras de complementaridade do anticorpo são aludidas como CDR1 de cadeia pesada (CDRH1), CDR2 de cadeia pesada (CDRH2) e CDR3 de cadeia pesada (CDRH3) da sequência de aminoácidos do terminal amino da cadeia pesada para as regiões determinadoras de complementaridade da cadeia pesada e como CDR1 de cadeia leve (CDRL1), CDR2 de cadeia leve (CDRL2) e CDR3 de cadeia leve (CDRL3) da sequência de aminoácidos do terminal amino da cadeia leve para as regiões determinadoras de complementaridade da cadeia leve. Estes sítios são próximos um do outro na estrutura tridimensional e determinam a especificidade para o antígeno a ser ligado.

[00337] Na presente invenção, as posições e comprimentos das CDRs foram determinadas de acordo com a definição de IMGT (Developmental and

85 / 286 Comparative Immunology 27 (2003) 55-77).

[00338] As regiões de armação (FRs) são regiões variáveis exceto para os resíduos de CDR. Cada região variável geralmente tem quatro FRs: FR1, FR2, FR3 e FR4. As FRs de cadeia pesada e leve são aludidas como FRH1, FRH2, FRH3 e FRH4 e FRL1, FRL2, FRL3 e FRL4, respectivamente.

[00339] As CDRs e as FRs contidas nas cadeias pesadas e leves são posicionadas como FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4 e FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4 nesta ordem do terminal amino para o terminal carboxila.

[00340] As CDRs e as FRs contidas nas cadeias pesadas e leves são posicionadas como FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4 e FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4 nesta ordem do terminal amino para o terminal carboxila.

[00341] As posições das CDRs e FRs também podem ser determinadas de acordo com várias definições bem conhecidas na técnica, por exemplo, a definição de IMGT assim como Kabat, Chothia, AbM, contact, etc.

[00342] Na presente invenção, o termo “fragmento de ligação a antígeno do anticorpo” significa um fragmento de anticorpo parcial que é constituído pela região variável de cadeias pesada e leve e tem atividade de ligação contra o antígeno. Os exemplos do “fragmento de ligação a antígeno do anticorpo” podem incluir, mas não são limitados a, fragmento de ligação a antígenos tais como Fab, F(ab’)2, scFv, Fab’, Fv e anticorpo de domínio único (sdAb). Um tal fragmento de ligação a antígeno do anticorpo pode ser obtido tratando-se uma molécula de comprimento completo da proteína de anticorpo com uma enzima tal como papaína ou pepsina ou pode ser uma proteína recombinante produzida em uma célula hospedeira apropriada usando um gene recombinante.

[00343] Na presente invenção, o “sítio” ao qual um anticorpo se liga, isto é, o “sítio” reconhecido por um anticorpo, significa um peptídeo parcial

86 / 286 ou conformação parcial em um antígeno ligado ou reconhecido pelo anticorpo.

[00344] Na presente invenção, um tal sítio também é aludido como um epítopo ou um sítio de ligação de anticorpo.

[00345] Na presente invenção, o termo “mutante de anticorpo” significa um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos do anticorpo original pela substituição, deleção e/ou adição (a adição inclui inserção) (daqui em diante, coletivamente aludida como uma “mutação”) de aminoácido(s) e ligam-se ao antígeno. O número de aminoácidos mutados em um tal mutante de anticorpo é 1 a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40 ou 50. Um tal mutante de anticorpo também é abrangido pelo “anticorpo” da presente invenção.

[00346] Na presente invenção, o termo “diversos” em “1 a diversos” refere-se a 2 a 10.

[00347] no presente relatório descritivo, o termo “molécula” é uma molécula compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo anteriormente mencionado e pode ser uma molécula multiespecífica formada pelos anticorpos ou uma pluralidade de fragmentos de ligação a antígenos derivada dos mesmos.

[00348] No presente relatório descritivo, o termo “molécula que é multiespecífica” tem o mesmo significado como uma “molécula multiespecífica”. Uma tal molécula multiespecífica não é particularmente limitada contanto que a molécula seja capaz de ligação a uma pluralidade de epítopos diferentes um do outro em uma molécula, e/ou epítopos diferentes um do outro em duas ou mais moléculas. A molécula que é multiespecífica também inclui um anticorpo compreendendo as regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e variáveis de cadeia leve (VL). Os exemplos de uma tal molécula multiespecífica incluem, mas não são limitadas a, uma molécula de anticorpo de comprimento completo tendo dois ou mais tipos de cadeias

87 / 286 pesadas e dois ou mais tipos de cadeia leves, isto é, uma molécula multiespecífica tipo IgG e uma molécula consistindo em dois ou mais tipos de fragmentos de ligação a antígeno tendo VLs e VHs, isto é, uma molécula derivada por uma combinação de Fab, Fab’, Fv, scFv, sdAb, etc. (isto é, scFv em tandem, diacorpos, diacorpos de cadeia única e triacorpos). Além disso, uma molécula formada ligando-se genética ou quimicamente uma proteína tendo atividade de ligação a antígeno sem ter um esqueleto de imunoglobulina, a um fragmento de ligação a antígeno também é incluída na molécula multiespecífica.

[00349] Os exemplos de atividades ou propriedades exercidas pelo anticorpo antiCD3 da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo ou pela molécula multiespecífica da presente invenção podem incluir atividades biológicas e propriedades físico-químicas e podem especificamente incluir várias atividades biológicas, atividade de ligação contra um antígeno ou um epítopo, estabilidade durante a produção ou armazenagem e estabilidade térmica.

[00350] Na presente invenção, a frase “hibridizando sob condições severas” significa hibridização sob condições envolvendo hibridização a 65°C em uma solução contendo 5 × SSC, seguida por lavagem a 65°C durante 20 minutos em uma solução aquosa contendo 2 × SSC-0,1% de SDS, a 65°C durante 20 minutos em uma solução aquosa contendo 0,5 × SSC-0,1% de SDS e a 65°C durante 20 minutos em uma solução aquosa contendo 0,2 × SSC-0,1% de SDS ou hibridização sob condições equivalentes a estas. SSC significa uma solução aquosa de 150 mM de NaCl-15 mM de citrato de sódio e n × SSC significa SSC com uma concentração de n vezes.

[00351] Na presente invenção, o termo “citotoxicidade” refere-se a alguma mudança patológica realizada pelas células de uma forma ou de outra e significa não apenas trauma direto, mas todo dano estrutural ou funcional para as células, incluindo clivagem de DNA, formação de dímeros básicos,

88 / 286 ruptura cromossômica, dano ao aparelho mitótico e redução nas atividades de várias enzimas.

[00352] Na presente invenção, o termo “atividade citotóxica” significa atividade que causa a citotoxicidade mencionada acima.

[00353] Na presente invenção, o termo “atividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo”, também chamada de “atividade ADCC”, significa o efeito ou atividade de danificar células alvo tais como células de tumor pelas células NK por intermédio de anticorpos.

[00354] Na presente invenção, o termo “atividade citotóxica pelo redirecionamento de células T” significa que a citotoxicidade é causada por intermédio de uma molécula multiespecífica compreendendo um anticorpo antiantígeno alvo tal como um antígeno antitumor e o anticorpo antiCD3. Preferivelmente, o termo significa que o anticorpo de antígeno antitumor se liga às células alvo de tumor enquanto o anticorpo antiCD3 se liga às células T de modo que as células alvo de tumor e as células T se aproximem uma da outra para induzir a citotoxicidade mediada pela ativação de célula T. A molécula pode estar contida em uma composição farmacêutica.

[00355] Na presente invenção, os termos “aminoácido que ocorre naturalmente” e “resíduo de aminoácido que ocorre naturalmente” significam Ala (A), Arg (R), Asn (N), Asp (D), Cys (C), Gln (Q), Glu (E), Gly (G), His (H), Ile (I), Leu (L), Lys (K), Met (M), Phe (F), Pro (P), Ser (S), Thr (T), Trp (W), Tyr (Y) e Val (V) e seus resíduos e também são aludidos como um “aminoácido natural” ou um “resíduo de aminoácido natural”.

2. Proteína antigênica 2-1. Antígeno de GPRC5D

[00356] Na presente invenção, o termo “GPRC5D” tem o mesmo significado como uma proteína de GPRC5D.

[00357] GPRC5D é classificado no grupo 5 da família C do receptor ligado à proteína G e é uma das proteínas de GPCR humana recém verificadas

89 / 286 pela procura de homologia da base de dados EST usando as sequências de aminoácidos de uma série de GPCRs humanos (Literatura Não Patentária 1). Esta proteína foi registrada sob os depósitos do GenBank Nos: AF209923, NM_018654 e NP_0611124. Entretanto, as funções fisiológicas ou ligante fisiológico de GPRC5D, o subtipo de proteína G (subunidade α) a ser encaixado com ele, etc. Ainda não foram revelados. 2-2. Antígeno CD3

[00358] Na presente invenção, o termo “CD3” tem o mesmo significado como uma proteína CD3.

[00359] CD3 é expresso, como uma porção de um complexo receptor de célula T multimolecular, nas células T e é um complexo de 5 tipos de polipeptídeos (cadeias γ, δ, ε, ζ e η; pesos moleculares: 25000 a 28000, 21000, 20000, 16000 e 22000, respectivamente).

[00360] Os exemplos do complexo de CD3 incluem as cadeias γ, δ, ε, ζ e η. Estas também são chamadas de subunidades. Os anticorpos antiCD3 se ligam às células T para induzir a citotoxicidade mediada pela ativação da célula T. Muitos anticorpos antiCD3 se ligam ao CD3ε.

[00361] A sequência de nucleotídeos de um cDNA que codifica CD3ε humano está registrada no GenBank sob o Acesso No. NM_000733.3. A sequência de nucleotídeos de um cDNA que codifica CD3 de macaco cinomolgo está registrada no GenBank sob Acesso No. NM_001283615,1. A sequência de aminoácidos de CD3ε humano está descrita na SEQ ID NO: 189 da Listagem de Sequências.

[00362] 2-3. Preparação de proteína antigênica

[00363] Cada proteína antigênica anteriormente mencionada (GPRC5D ou CD3 (a seguir, GPRC5D e CD3 também são coletivamente aludidos como a proteína antigênica)) usada na presente invenção pode ser preparada pela purificação ou isolação de tecidos animais (incluindo fluidos corporais), células derivada dos tecidos ou culturas das células, recombinação de gene,

90 / 286 tradução in vitro, síntese química, etc.

[00364] O cDNA da proteína antigênica pode ser obtido, por exemplo, por um chamado método de PCR que realiza a reação em cadeia da polimerase (a seguir, aludida como “PCR”) (Saiki, R. K., et al., Science (1988) 239, 487-489) usando uma biblioteca de cDNA de órgãos expressando o mRNA da proteína antigênica como um padrão e usando iniciadores capazes de amplificar especificamente o cDNA da proteína antigênica.

[00365] Um polinucleotídeo hibridizando sob condições severas a um polinucleotídeo consistindo em uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína antigênica expressa em um ser humano ou um rato e que codifica uma proteína tendo atividades biológicas equivalentes à proteína antigênica também é incluído no cDNA da proteína antigênica.

[00366] Além disso, variantes de junção transcritas a partir dos locais de gene da proteína antigênica expressa em um ser humano ou um rato ou polinucleotídeos que hibridizam a esta sob condições severas e que codifica uma proteína tendo atividades biológicas equivalentes à proteína antigênica também são incluídos no cDNA da proteína antigênica.

[00367] Uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos da proteína antigênica de ser humano ou rato ou a sequência de aminoácidos da mesma exceto para uma sequência de sinal pela substituição, deleção ou a adição de 1 a diversos aminoácidos e tem atividades biológicas equivalentes à proteína antigênica também é incluída na sequência de nucleotídeos do gene da proteína antigênica.

[00368] Uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos codificada por uma variante de junção transcrita a partir dos locais de gene da proteína antigênica humana ou de rato ou uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos pela substituição, deleção ou adição de

91 / 286 1 a diversos aminoácidos e tem atividades biológicas equivalentes à proteína antigênica também é incluída na proteína antigênica. 2-4 Especificidade de ligação para a proteína antigênica

[00369] O anticorpo antiGPRC5D da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, etc. reconhece GPRC5D humano. Em outras palavras, o anticorpo antiGPRC5D da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, etc. se liga a um antígeno de GPRC5D e preferivelmente se liga ao GPRC5D humano e GPRC5D de macaco, mais preferivelmente GPRC5D humano e GPRC5D de macaco cinomolgo. O anticorpo antiGPRC5D humanizado, o anticorpo h2B1 e o anticorpo humano C3048 da presente invenção descrito mais tarde ligam-se ao GPRC5D de macaco cinomolgo além do GPRC5D humano.

[00370] O anticorpo antiCD3 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, etc. contido na molécula multiespecífica da presente invenção reconhece um antígeno de CD3, isto é, se liga a ele. O anticorpo antiCD3 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, etc. contidos na molécula multiespecífica da presente invenção preferivelmente se liga ao CD3 humano, CD3 de macaco e os semelhantes e mais preferivelmente se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo.

[00371] O anticorpo que se liga às proteínas antigênicas humanas e de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo podem ser submetidos aos vários testes em eficácia ou segurança usando primatas, particularmente, macacos cinomolgos, úteis para o desenvolvimento não clínico (desenvolvimento pré-clínico) de produtos farmacêuticos e são assim preferidos.

[00372] Entretanto, preferivelmente, o anticorpo antiGPRC5D da presente invenção não se liga ao GPRC5D de camundongo e/ou rato. Portanto, por exemplo, vários ensaios ou testes imunohistoquímicos usando células, tecidos ou indivíduos de camundongo transfectados com gene

92 / 286 humano de GPRC5D (incluindo animais transgênicos, animais knockout e animais knock-in) e o anticorpo ou a molécula multiespecífica da presente invenção, etc. podem ser realizados sem que sejam influenciados pelo GPRC5D do camundongos e/ou ratos hospedeiros. Assim, o anticorpo ou a molécula multiespecífica da presente invenção, etc. são preferidos para a pesquisa e desenvolvimento não clínico, usando camundongos, de fármacos, fármacos para animal ou fármacos de diagnóstico, etc., compreendendo o anticorpo ou a molécula multiespecífica da presente invenção, etc.

[00373] Do mesmo modo, preferivelmente, o anticorpo antiCD3 contido na molécula multiespecífica da presente invenção não se liga ao CD3 de camundongo e/ou rato. Portanto, por exemplo, vários ensaios ou testes imunohistoquímicos usando células, tecidos ou indivíduos de camundongo transfectados com o gene de CD3 humano (incluindo animais transgênicos, animais knockout e animais knock-in) e o anticorpo ou a molécula multiespecífica da presente invenção, etc. podem ser realizados sem que sejam influenciados pelo CD3 dos camundongos e/ou ratos hospedeiros. Assim, o anticorpo ou a molécula multiespecífica da presente invenção, etc. são preferidos para a pesquisa e desenvolvimento não clínico, usando camundongos, de fármacos, fármacos para animal ou fármacos de diagnóstico, etc., compreendendo o anticorpo ou a molécula multiespecífica da presente invenção, etc.

[00374] Na presente invenção, o termo “reconhecimento”, isto é, “ligação”, significa ligação que não é adsorção não específica. Os exemplos de critérios para a determinação de se o reconhecimento é obtido ou não, isto é, a ligação é obtida ou não pode incluir uma constante de dissociação (daqui em diante, aludida como “KD”). Preferivelmente, o anticorpo, etc. da presente invenção tem um valor KD de 1 × 10-5 M ou mais baixo, 5 × 10-6 M ou mais baixo, 2 × 10-6 M ou mais baixo ou 1 × 10-6 M ou mais baixo para CD3.

[00375] Na presente invenção, a ligação do anticorpo ao antígeno pode

93 / 286 ser ensaiada ou determinada usando um sistema de análise de interação biomolecular (por exemplo, SPR ou BLI), ELISA ou RIA ou os semelhantes. A ligação do anticorpo ao antígeno expresso na superfície da célula pode ser ensaiada pela citometria de fluxo ou os semelhantes.

[00376] O método da SPR (análise de ressonância plasmônica superficial) é usado como uma estratégia de análise de determinar uma constante de dissociação (valor KD), etc. como um índice para a afinidade medindo-se uma constante da taxa de associação (valor Ka) e uma constante da taxa de dissociação (valor Kd) pela análise cinética. Os exemplos de equipamento usado na análise de SPR podem incluir BIAcore® (fabricado pela GE Healthcare Bio-Sciences Corp.), ProteOn® (fabricado pela Bio-Rad Laboratories, Inc.), SPR-Navi® (fabricado pela BioNavis Oy Ltd.), Spreeta® (fabricado pela Texas Instruments Inc.), SPRi-Plex II® (fabricado pela Horiba, Ltd.) e Autolab SPR® (fabricado pela Metrohm Japan Ltd.).

[00377] BLI (interferometria de biocamada) é um método que envolve medir a interação biomolecular usando interferência de biocamada. Os exemplos de equipamento usado na análise da interação de BLI incluem o sistema Octet (fabricado pela Pall ForteBio Corp.).

[00378] O ELISA é um método que envolve capturar um antígeno ou um anticorpo de interesse contido em uma solução de amostra usando um anticorpo ou antígeno específicos, enquanto detecta e quantifica o antígeno ou anticorpo de interesse através do uso de reação enzimática. Um antígeno ou anticorpo rotulado com enzima é incorporado dentro do sistema de reação e a atividade enzimática é detectada. Para a detecção da atividade enzimática, um substrato cujo espectro de absorção é mudado pela reação é usado e o espectro de absorção é digitalizado pela medição de absorbância.

[00379] O ELISA de célula é um método que envolve capturar um análito na superfície da célula em uma base de célula, enquanto detecta e quantifica o análito através do uso de reação enzimática.

94 / 286

[00380] O RIA (radio imunoensaio) pode quantificar um anticorpo pela rotulação do anticorpo com um material radioativo e medindo a radioatividade do anticorpo.

[00381] A citometria de fluxo é uma estratégia de analisar opticamente células individuais dispersando-se as células em um fluido e fluindo uma corrente fina do fluido. Um anticorpo rotulado com pigmento fluorescente se liga a um antígeno de superfície da célula através da reação de antígeno- anticorpo e a intensidade de fluorescência do anticorpo rotulado ligado com células é medida para quantificar a atividade de ligação a antígeno do anticorpo.

3. Anticorpo antiGPRC5D 3-1. Tipo de anticorpo antiGPRC5D

[00382] O anticorpo antiGPRC5D da presente invenção pode ser anticorpo monoclonal ou policlonal. Os exemplos do anticorpo policlonal pode incluir uma mistura de tipos plurais de anticorpos diferindo em uma porção ou no todo dos conjuntos de CDR. Os exemplos do anticorpo monoclonal podem incluir anticorpos derivados de animal não humano (anticorpos de animal não humano), anticorpos humanos, anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados, etc.

[00383] Os exemplos do anticorpo de animal não humano podem incluir anticorpos derivados de vertebrados tais como mamíferos e aves. Os exemplos do anticorpo derivado de mamífero podem incluir anticorpos derivados de roedor tais como anticorpos de camundongo e anticorpos de rato. Os exemplos do anticorpo derivado de ave podem incluir anticorpos de galinha. Os exemplos do anticorpo monoclonal de rato antiGPRC5D humano pode incluir 2A4, 2B1 e 7B4 (Exemplo 1) da presente invenção.

[00384] A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 2A4 é mostrada na SEQ ID NO: 5 da Listagem de Sequências. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 2B1 é

95 / 286 mostrada na SEQ ID NO: 7 da Listagem de Sequências. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 7B4 é mostrada na SEQ ID NO: 9 da Listagem de Sequências.

[00385] A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 2A4 é mostrada na SEQ ID NO: 12 da Listagem de Sequências. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 2B1 é mostrada na SEQ ID NO: 14 da Listagem de Sequências. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 7B4 é mostrada na SEQ ID NO: 16 da Listagem de Sequências.

[00386] 2A4, 2B1 e 7B4 têm atividade de ADCC (Exemplo 2).

[00387] Os exemplos do anticorpo quimérico podem incluir um anticorpo compreendendo regiões variáveis derivadas de anticorpo de animal não humano ligado com regiões constantes de anticorpo humano (imunoglobulina humana).

[00388] Os exemplos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo de rato antiGPRC5D humano 2A4 pode incluir um anticorpo consistindo em uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo nos resíduos de aminoácido 21 a 127 da SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo nos resíduos de aminoácido 20 a 141 da SEQ ID NO: 26. Um exemplo de um tal anticorpo quimérico derivado de 2A4 pode incluir um anticorpo consistindo em uma cadeia leve consistindo nos resíduos de aminoácido 21 a 234 da SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada consistindo nos resíduos de aminoácido 20 a 471 da SEQ ID NO: 26. No presente relatório descritivo, o anticorpo é aludido como c2A4.

[00389] Os exemplos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo de rato antiGPRC5D humano 2B1 pode incluir um anticorpo consistindo em uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo nos resíduos de aminoácido 21 a 234 da SEQ ID NO: 30 e uma cadeia pesada

96 / 286 compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo nos resíduos de aminoácido 20 a 472 da SEQ ID NO: 34. Um exemplo de um tal anticorpo quimérico derivado de 2B1 pode incluir um anticorpo consistindo em uma cadeia leve consistindo nos resíduos de aminoácido 21 a 234 da SEQ ID NO: 30 e uma cadeia pesada consistindo nos resíduos de aminoácido 20 a 472 da SEQ ID NO: 34. No presente relatório descritivo, o anticorpo é aludido como c2B1.

[00390] Os exemplos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo de rato antiGPRC5D humano 7B4 pode incluir um anticorpo consistindo em uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo nos resíduos de aminoácido 21 a 127 da SEQ ID NO: 38 e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo nos resíduos de aminoácido 20 a 142 da SEQ ID NO: 42. Um exemplo de um tal anticorpo quimérico derivado de 7B4 pode incluir um anticorpo consistindo em uma cadeia leve consistindo nos resíduos de aminoácido 21 a 233 da SEQ ID NO: 38 e uma cadeia pesada consistindo nos resíduos de aminoácido 20 a 472 da SEQ ID NO: 42. No presente relatório descritivo, o anticorpo é aludido como c7B4.

[00391] Os exemplos do anticorpo humanizado podem incluir um anticorpo derivado de ser humano contendo apenas regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) (Nature (1986) 321, 522-525), um anticorpo humano enxertado com as sequências de CDR e com alguns resíduos de aminoácido das regiões de armação pelo enxerto de CDR (Publicação Internacional No. WO1990/007861)) e um anticorpo tendo o(s) aminoácido(s) do anticorpo humano substituídos no lugar de um ou dois ou mais aminoácidos derivados de anticorpo de animal não humano em qualquer um destes anticorpos humanizados.

[00392] O anticorpo humanizado derivado de cada anticorpo quimérico mencionado acima mantém todas das 6 sequências de CDR derivadas do

97 / 286 anticorpo quimérico mencionado acima e por extensão, o anticorpo de rato e tem atividade de ADCC. Assim, exemplos do anticorpo que mantém todas das 6 sequências de CDR mostradas abaixo incluem anticorpos de rato, anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados.

[00393] A região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado derivada de 2A4 mencionada acima mantém a CDR1 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 45 (GYTFTSYY), a CDR2 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 46 (VYPGYGGT), e a CDR3 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47 (ARRKGIIRGPGYFDY).

[00394] A região variável de cadeia leve do mesmo mantém a CDR1 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 54 (EGISNS), a CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 55 (GAS), e a CDR3 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 56 (QQGYKYPPT).

[00395] A região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado derivado de 2B1 mencionado acima mantém a CDR1 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 48 (GFSLNTYDMG), a CDR2 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 49 (IWWDDDK), e a CDR3 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 50 (ARIETVRVSRKGFAH).

[00396] A região variável de cadeia leve do mesmo mantém a CDR1 de cadeia leve consistindo na sequência de

98 / 286 aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 57 (QSVGIN), a CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 58 (GAS), e a CDR3 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 59 (LQHGSIPPT).

[00397] A região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado derivado de 7B4 mencionado acima mantém a CDR1 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 51 (GYTITSGYD), a CDR2 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 52 (MSYRGST), e a CDR3 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 53 (ALTRTYWYNYYYVLDA).

[00398] A região variável de cadeia leve do mesmo mantém a CDR1 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 60 (QNINKY), a CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 61 (NTN), e a CDR3 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 62 (LQRNSWYT).

[00399] As sequências de aminoácidos das CDRs mencionadas acima também estão descritas nas Figuras 54 a 71.

[00400] Na presente invenção, as posições e comprimentos das CDRs foram determinadas de acordo com a definição da IMGT (Developmental and Comparative Immunology 27 (2003) 55-77).

[00401] Os exemplos preferidos do anticorpo humanizado podem incluir um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácido representadas pelos

99 / 286 resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 64, resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 66, resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 68, resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 70, e resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácido representadas pelo resíduos de aminoácido 21 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 74, resíduos de aminoácido 21 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76, resíduos de aminoácido 21 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 78, e resíduos de aminoácido 21 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80.

[00402] Os exemplos preferidos alternativos do anticorpo humanizado podem incluir um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 82, ou resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 84, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo qualquer

100 / 286 uma das sequências de aminoácido representadas pelo resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86, resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 88, resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 90, e resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 92.

[00403] Os exemplos preferidos específicos do anticorpo humanizado podem incluir um anticorpo compreendendo qualquer combinação de uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 74 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 64, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 74 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 66, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de

101 / 286 aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 66, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 68, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 70, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 78 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 68, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 78 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos

102 / 286 representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 70, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 78 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 64, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 68, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 70, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80 e uma

103 / 286 região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72.

[00404] Os exemplos preferidos específicos alternativos do anticorpo humanizado podem incluir um anticorpo compreendendo qualquer combinação de uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 84, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 88 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 84, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 90 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 82, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 90 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos

104 / 286 representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 84, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 92 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 82.

[00405] Os exemplos do anticorpo humanizado mais preferidos podem incluir um anticorpo compreendendo qualquer combinação de uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 472 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 74 e uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 234 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 64, uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 472 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 74 e uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 234 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 66, uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 472 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 234 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 66, uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 472 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 234 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 68, uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 472 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e

105 / 286 uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 234 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 70, uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 472 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 234 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72, uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 472 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 78 e uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 234 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 68, uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 472 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 78 e uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 234 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 70, uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 472 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 78 e uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 234 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72, uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 472 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80 e uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 234 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 64, uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 472 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80 e uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 234 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 68, uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 472 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80 e uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 234 da

106 / 286 sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 70, e uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 472 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80 e uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 234 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72.

[00406] Os exemplos alternativos mais preferidos do anticorpo humanizado podem incluir um anticorpo compreendendo qualquer combinação de uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 20 a 472 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86 e uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 233 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 84, uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 20 a 472 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 88 e uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 233 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 84, uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 20 a 472 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 90 e uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 233 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 82, uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 20 a 472 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 90 e uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 233 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 84, e uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 20 a 472 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 92 e uma cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 21 a 233 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 82.

[00407] Os anticorpos de rato, os anticorpos quiméricos e os anticorpos

107 / 286 humanizados mencionados acima podem cada um conter Fc.

[00408] Também, os anticorpos de rato, os anticorpos quiméricos e os anticorpos humanizados mencionados acima podem cada um conter uma região constante de cadeia pesada da imunoglobulina humana.

[00409] Os exemplos ainda mais preferidos do anticorpo humanizado podem incluir um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve anteriormente mencionadas, preferivelmente a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve de um anticorpo humanizado derivado de 2B1 e i) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 199 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 203, ii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 201 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 205, iii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, ou iv) uma região constante de cadeia pesada compreendendo

108 / 286 uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 237 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217.

[00410] Os exemplos particularmente preferidos do anticorpo humanizado podem incluir um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72 e compreendendo i) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 199 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 203, ii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 201 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 205, iii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de

109 / 286 aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, ou iv) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 237 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217.

[00411] Destes, o anticorpo mais preferível pode incluir um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72 e compreendendo iii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, ou iv) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 237 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217.

110 / 286

[00412] Os exemplos específicos deste podem incluir um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, ou uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 237 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217.

[00413] Os exemplos alternativos ainda mais preferidos do anticorpo humanizado podem incluir um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve anteriormente mencionadas, preferivelmente a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve de um anticorpo humanizado derivado de 2B1 e natural ou Fc mutado.

[00414] Os exemplos particularmente preferidos deste anticorpo humanizado pode incluir um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72 e natural ou Fc mutado.

111 / 286

[00415] Os exemplos específicos deste podem incluir um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 271 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 223 e natural ou Fc mutado.

[00416] O anticorpo humano não é particularmente limitado contanto que o anticorpo se liga ao GPRC5D humano. Os exemplos do mesmo também podem incluir um anticorpo humano que se liga ao mesmo sítio como no caso do anticorpo humanizado da presente invenção. Os exemplos do mesmo incluem um anticorpo humano que se liga ao mesmo sítio como no caso de h2B1H2L5.

[00417] Os exemplos do anticorpo humano da presente invenção incluem um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve descritas em qualquer um dos seguintes ((A) a (D): (A) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 111, CDR2 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 112, e CDR3 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 113, e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 114, CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 115, e CDR3 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos

112 / 286 representada pela SEQ ID NO: 116, (B) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 117, CDR2 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 118, e CDR3 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 119, e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 120, CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 121, e CDR3 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 122, (C) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 123, CDR2 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 124, e CDR3 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 125, e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 126,

113 / 286 CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 127, e CDR3 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 128, e (D) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 129, CDR2 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 130, e CDR3 de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 131, e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 132, CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 133, e CDR3 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 134.

[00418] As sequências de aminoácidos das CDRs mencionadas acima também estão descritas nas Figuras 124 a 147.

[00419] Os exemplos preferidos do anticorpo humano podem incluir um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo qualquer uma de a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 97, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 101, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO:

114 / 286 105, e a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 109, e uma região variável de cadeia leve compreendendo qualquer um de a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 99, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 103, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 107, e a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 135 ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo.

[00420] Os exemplos preferidos específicos do anticorpo humano podem incluir um anticorpo compreendendo qualquer combinação de uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 97 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 99, uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 101 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 103, uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 105 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 107, e

115 / 286 uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 109 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 135.

[00421] Um tal anticorpo inclui Fv de cadeia única (também aludido como scFv) (Exemplo 10)-4).

[00422] Um outro exemplo do anticorpo humano inclui um anticorpo tipo IgG compreendendo as regiões variáveis de cadeias leves e pesadas anteriormente mencionadas ligadas às regiões constante de cadeia leve (CL) e constante de cadeia pesada (CH1 e Fc) da imunoglobulina humana, respectivamente. Os exemplos de um tal anticorpo tipo IgG humano incluem um anticorpo compreendendo qualquer combinação de uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 144 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 145, uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 146 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 147, uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 148 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 149, e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 150 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO:

151.

116 / 286

[00423] O anticorpo antiGPRC5D da presente invenção pode ser um anticorpo compreendido de porções derivadas de uma pluralidade de anticorpos diferentes contanto que o anticorpo se liga ao GPRC5D humano. Os exemplos de um tal anticorpo podem incluir um anticorpo compreendendo cadeias pesadas e/ou leves trocadas entre uma pluralidade de anticorpos diferentes, um anticorpo compreendendo cadeias pesadas e/ou leves de comprimento completo trocadas entre, um anticorpo compreendendo regiões variáveis ou constantes trocadas entre e um anticorpo compreendendo todas ou algumas CDRs trocadas entre. A região variável de cadeias pesada e leve do anticorpo quimérico pode ser derivada de anticorpos antiGPRC5D diferentes da presente invenção. A CDR1 de cadeia pesada para CDR3 e a CDR1 de cadeia leve para CDR3 na região variável de cadeias pesada e leve do anticorpo humanizado podem ser derivadas de dois ou mais anticorpos antiGPRC5D diferentes da presente invenção. A CDR1 de cadeia pesada para CDR3 e CDR1 de cadeia leve para CDR3 na região variável de cadeias pesada e leve do anticorpo humano podem ser uma combinação das CDRs carreadas por dois ou mais anticorpos antiGPRC5D diferentes da presente invenção.

[00424] O anticorpo antiGPRC5D da presente invenção inclui uma imunoglobulina de cadeia única compreendendo sequências de cadeia pesada e leve de comprimento completo do anticorpo ligadas por intermédio de um ligador apropriado (Lee, H-S, et al., Molecular Immunology (1999) 36, 61- 71; e Shirrmann, T. et al., mAbs (2010), 2 (1), 1-4). Uma tal imunoglobulina de cadeia única pode ser dimerizada para manter deste modo uma estrutura e atividades similares àquelas do anticorpo, que é originalmente um tetrâmero.

[00425] O anticorpo antiGPRC5D da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo também incluem um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que compreendem uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleotídeos

117 / 286 contida em um polinucleotídeo hibridizando sob condições severas a um filamento complementar de um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos contida no anticorpo antiGPRC5D da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo e se liga ao GPRC5D humano.

[00426] O anticorpo antiGPRC5D da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo pode ser um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que compreenda uma sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada e/ou uma sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais idêntica com a(s) sequência(s) de aminoácidos contida(s) no anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo anteriormente mencionados de acordo com qualquer um de (8) a (12) e (18) a (20) e se liga ao GPRC5D humano.

[00427] Comparadas com as posições e comprimentos das regiões variáveis de cadeia leve usando uma definição da IMGT, as posições e comprimentos das regiões variáveis de cadeia leve usando uma definição diferente da IMGT podem adicionalmente conter um ou dois ou mais aminoácidos, por exemplo, arginina (R) e/ou glicina (G), nos terminais carboxila das sequências de aminoácidos da regiões variáveis de cadeia leve. Um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo tendo uma tal região variável de cadeia leve também é abrangida pelo anticorpo da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[00428] A capacidade do anticorpo, etc. da presente invenção para ligar-se ao GPRC5D, particularmente, GPRC5D humano e/ou de macaco cinomolgo, pode ser otimizada pela introdução de uma mutação ao fragmento de ligação a antígeno do anticorpo antiGPRC5D da presente invenção. Os exemplos específicos do método para introduzir uma mutação pode incluir mutagênese aleatória usando PCR propensa a erro, mutagênese de aminoácido

118 / 286 loco dirigida usando uma biblioteca NNK, mutagênese loco dirigida usando informação de estrutura e combinações das mesmas. 3-2. Mutante de anticorpo de anticorpo antiGPRC5D

[00429] O mutante de anticorpo do anticorpo antiGPRC5D da presente invenção pode preferivelmente exibir, por exemplo, sensibilidade reduzida à degradação ou oxidação de proteína, uma atividade ou função biológicas preservadas ou melhoradas ou redução ou mudança suprimidas na atividade ou função biológicas, uma capacidade melhorada ou ajustada para ligar-se ao antígeno ou propriedades físico-químicas ou funcionais comunicadas a isso. As proteínas são conhecidas variar nas suas funções ou atividades devido à mudança em uma cadeia lateral de aminoácido particular presente na superfície das mesmas. Os exemplos de um tal caso incluem a desamidação de uma cadeia lateral de asparagina e a isomerização de uma cadeia lateral de ácido aspártico. Um anticorpo derivado do anticorpo antiGPRC5D da presente invenção pela substituição com um outro aminoácido de modo a prevenir tal mudança na cadeia lateral de aminoácido também é incluído no escopo do mutante de anticorpo da presente invenção.

[00430] Os exemplos do mutante de anticorpo da presente invenção podem incluir um anticorpo tendo uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos do anticorpo original pela substituição de aminoácido conservativa. A substituição de aminoácido conservativa é uma substituição que ocorre em um grupo de aminoácido relacionado com as cadeias laterais de aminoácido.

[00431] Os grupos de aminoácido preferidos são como segue: um grupo ácido incluindo ácido aspártico e ácido glutâmico; um grupo básico incluindo lisina, arginina e histidina; um grupo não polar incluindo alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina e triptofano; e uma família polar não carregada incluindo glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina e tirosina. Outros grupos preferidos de aminoácido são como

119 / 286 segue: um grupo hidróxi alifático incluindo serina e treonina; um grupo contendo amida incluindo asparagina e glutamina; um grupo alifático incluindo alanina, valina, leucina e isoleucina; e um grupo aromático incluindo fenilalanina, triptofano e tirosina. Tal substituição de aminoácido no mutante de anticorpo é preferivelmente realizada sem reduzir a atividade de ligação a antígeno do anticorpo original.

[00432] O anticorpo antiGPRC5D da presente invenção, o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, a variante do mesmo ou a molécula da presente invenção também abrangem: um mutante de anticorpo que tem uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos do anticorpo da presente invenção tal como 2A4, 2B1 ou 7B4 pela substituição de aminoácido conservativa e/ou qualquer outra mutação e se liga ao GPRC5D humano, um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, uma molécula compreendendo o mutante de anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, etc.; um anticorpo de camundongo, um anticorpo de rato, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano que compreende uma CDR tendo uma sequência de aminoácidos em que a substituição de aminoácido conservativa e/ou qualquer outra mutação ocorre na sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRH1 a CDRH3 e CDRL1 a CDRL3 derivadas do anticorpo da presente invenção tal como 2A4, 2B1 ou 7B4 e se liga ao GPRC5D humano, um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, uma molécula compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, etc.; um mutante de anticorpo que tenha uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos do anticorpo da presente invenção tal como C2037, C3048, C3015 ou C3022 pela substituição de aminoácido conservativa e se liga ao GPRC5D humano, um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, uma molécula compreendendo o mutante de anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, etc.; e anticorpo quimérico ou um anticorpo humano que compreende uma CDR tendo uma sequência de

120 / 286 aminoácidos em que uma mutação de aminoácido conservativa ocorre na sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRH1 a CDRH3 e CDRL1 a CDRL3 derivadas do anticorpo da presente invenção tal como C2037, C3048, C3015 ou 3022 e se liga ao GPRC5D humano, um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, uma molécula compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, etc. 3-3. Fragmento de ligação a antígeno de anticorpo antiGPRC5D

[00433] De acordo com um aspecto, a presente invenção provê um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo antiGPRC5D da presente invenção. O fragmento de ligação a antígeno do anticorpo antiGPRC5D da presente invenção abrange fragmentos de ligação a antígeno de anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. O fragmento de ligação a antígeno do anticorpo significa um fragmento que mantém pelo menos a atividade de ligação a antígeno entre as funções do anticorpo ou uma forma modificada do mesmo. Os exemplos de tais funções do anticorpo podem geralmente incluir a atividade de ligação a antígeno, atividade que regula a atividade de antígeno (por exemplo, atividade agonística), atividade de internalizar um antígeno dentro das células e atividade de inibir ou promover a interação entre um antígeno e sua substância interagente.

[00434] O fragmento de ligação a antígeno do anticorpo não é particularmente limitado contanto que o fragmento do anticorpo mantenha pelo menos atividade de ligação a antígeno entre as atividades do anticorpo. Os exemplos de um tal fragmento de ligação a antígeno do anticorpo incluem, mas não são limitados a, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fab de cadeia única (scFab) compreendendo o terminal carbóxi de uma cadeia leve Fab e o terminal amino de uma cadeia pesada Fab ligados por intermédio de um ligador apropriado, Fv, Fv de cadeia única (scFv) compreendendo Fvs de cadeia pesada e leve ligadas por intermédio de um ligador apropriado e anticorpo de domínio único (sdAb; também chamado nanocorpo) tendo uma única região variável de

121 / 286 cadeia pesada e carecendo de uma sequência de cadeia leve (Muyldemans S. et al., Protein Eng., (1994), 7 (9), 1129-35; e Hamers-Casterman C. et al., Nature (1993), 363 (6428), 446-448). O fragmento de ligação a antígeno do anticorpo da presente invenção também é intencionado incluir uma molécula compreendendo o fragmento de ligação a antígeno do anticorpo da presente invenção assim como outras porções, tais como scFab e scFv retendo uma porção ligadora. 3-4 Forma modificada de anticorpo antiGPRC5D ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e conjugados

[00435] A presente invenção provê uma forma modificada do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. A forma modificada do anticorpo da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo significa um anticorpo da presente invenção ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo providos com modificação química ou biológica. A forma quimicamente modificada inclui, por exemplo, uma forma tendo um esqueleto de aminoácido conjugado com uma porção química e uma forma tendo uma cadeia de carboidrato quimicamente modificada ligada em N ou ligada em O. A forma biologicamente modificada inclui, por exemplo, uma forma que sofreu modificação pós-traducional (por exemplo, glicosilação ligada em N ou ligada em O, processamento de uma região de terminal amino ou terminal carboxila, desamidação, isomerização de ácido aspártico ou oxidação de metionina) e uma forma contendo um resíduo de metionina adicionado ao terminal amino pela expressão usando células hospedeiras procarióticas. Uma tal forma modificada também é intencionada incluir uma forma rotulada para permitir a detecção ou isolação do anticorpo ou do antígeno da presente invenção, por exemplo, uma forma rotulada com enzima, uma forma fluorescentemente rotulada ou uma forma rotulada com afinidade. Uma tal forma modificada do anticorpo da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é útil para a melhora da estabilidade ou retenção

122 / 286 de sangue do anticorpo original da presente invenção ou o fragmento de ligação a antígeno original do mesmo, redução na antigenicidade, detecção ou isolação do anticorpo ou do antígeno, etc.

[00436] Os exemplos da porção química contida na forma quimicamente modificada podem incluir polímeros solúveis em água tais como polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrano e álcool polivinílico.

[00437] Os exemplos da forma biologicamente modificada podem incluir uma forma modificada pelo tratamento enzimático, tratamento com célula ou os semelhantes, uma forma fundida com um outro peptídeo, tal como uma etiqueta, adicionada pela recombinação de gene e uma forma preparada a partir de células hospedeiras que expressam uma enzima endógena ou exógena modificadora da cadeia de açúcar.

[00438] Uma tal modificação pode ser feita em uma posição arbitrária ou uma posição desejada no anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Alternativamente, a mesma ou duas ou mais modificações diferentes podem ser feitas em uma ou duas ou mais posições nesse ponto.

[00439] A deleção nestas sequências de cadeia pesada ou a modificação nas sequências de cadeia pesada ou leve, entretanto, raramente influencia a capacidade do anticorpo para ligar-se ao antígeno e suas funções efetoras (ativação de complemento, efeitos citotóxicos dependentes de anticorpo, etc.).

[00440] Assim, a presente invenção também abrange um anticorpo que que recebeu a deleção ou a modificação. Os exemplos do mesmo podem incluir uma variante de deleção derivada de uma cadeia pesada pela deleção de 1 ou 2 aminoácidos no seu terminal carboxila (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), uma forma amidada da variante de deleção tendo uma cadeia pesada que carece de dois resíduos de aminoácido (glicina e lisina) no terminal carbóxi e ao invés tem um resíduo amidado de prolina no

123 / 286 terminal carbóxi (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)) e um anticorpo modificado tendo um resíduo de glutamina ou ácido glutâmico piroglutamilados no terminal amino na sua cadeia pesada ou leve (Publicação Internacional No. WO2013/147153) (estes são coletivamente aludidos como uma “variante de deleção”). Entretanto, a variante de deleção no terminal carboxila da cadeia pesada ou leve do anticorpo de acordo com a presente invenção não é limitada aos tipos descritos acima contanto que a variante de deleção mantenha a capacidade para ligar-se ao antígeno e as funções efetoras. Quando o anticorpo de acordo com a presente invenção compreende duas ou mais cadeias (por exemplo, cadeias pesadas), as duas ou mais cadeias (por exemplo, cadeias pesadas) podem ser cadeias pesadas de qualquer tipo selecionadas do grupo consistindo na cadeia pesada de tamanho natural e as variantes de deleção descritas acima ou podem ser uma combinação de cadeias pesadas de quaisquer dois tipos selecionados destas. A razão quantitativa de cada variante de deleção ou a razão do número de moléculas do mesmo podem ser influenciadas pelo tipo de células de mamífero cultivadas que produzam o anticorpo de acordo com a presente invenção e condições de cultura. Os exemplos de um tal caso pode incluir a deleção de um resíduo de aminoácido de terminal carbóxi cada um em ambas das duas cadeias pesadas como componentes principais do anticorpo de acordo com a presente invenção.

[00441] O anticorpo da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo (por exemplo, contido na molécula, na molécula multiespecífica, na molécula biespecífica, etc. da presente invenção), mesmo se 1 a diversos aminoácidos derivados, por exemplo, de um vetor de expressão e/ou uma sequência de sinal, são adicionados ao terminal amino e/ou ao terminal carbóxi (e uma porção ou o todo do mesmo forem modificados como descrito acima), são incluídos no escopo da forma modificada do anticorpo da presente invenção ou da forma modificada do

124 / 286 fragmento de ligação a antígeno do mesmo contanto que a atividade desejada de ligação a antígeno seja mantida. Uma molécula compreendendo uma tal forma modificada do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno também é incluído no escopo da molécula da presente invenção.

[00442] Na presente invenção, o escopo do “anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo” é intencionado a incluir também a “variante de deleção” e a “forma modificada” do “anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo” e misturas com estes. O “anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo” contido na molécula, a molécula multiespecífica, a molécula biespecífica, etc. da presente invenção é intencionado a incluir também a “variante de deleção” e a forma modificada” do “anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo” e misturas com estes.

[00443] A presente invenção também abrange conjugados formados pelos anticorpos anteriormente mencionados ligados com outras moléculas por intermédio de ligadores (imunoconjugados). Os exemplos de um tal complexo de anticorpo-fármaco em que o anticorpo é conjugado com um material radioativo ou um composto (fármaco) tendo uma ação farmacológica pode incluir ADC (conjugado anticorpo-fármaco) ([Methods Mol Biol. (2013) 1045: 1-27; Nature Biotechnology (2005) 23, p. 1137-1146)).

[00444] Além disso, a presente invenção também abrange conjugados compreendendo estes anticorpos conectados a outros polipeptídeos funcionais. Os exemplos de um tal complexo de anticorpo-peptídeo podem incluir um complexo do anticorpo e um polipeptídeo de ligação de albumina (Protein Eng Des Sel. (2012) (2): 81-8).

[00445] Estas formas modificadas do anticorpo, anticorpos que sofreram a modificação da cadeia de açúcar assim regulados e conjugados são abrangidos pelo anticorpo da presente invenção. Os fragmentos de ligação a antígeno destas formas modificadas do anticorpo, anticorpos que sofreram a

125 / 286 modificação da cadeia de açúcar assim regulada e conjugados são abrangidos pelo fragmento de ligação a antígeno do anticorpo da presente invenção. 3-5. Ligação de anticorpo ao mesmo sítio

[00446] Um anticorpo que se liga a um sítio no GPRC5D humano ligado pelo anticorpo provido pela presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo também é incluído no anticorpo da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo. O anticorpo que se liga ao mesmo sítio no antígeno GPRC5D humano como no caso de um certo anticorpo significa um outro anticorpo que se liga ao mesmo sítio na molécula de antígeno como aquela reconhecida pelo anticorpo. Se um segundo anticorpo se liga a um peptídeo parcial ou uma estrutura tridimensional parcial em uma molécula de antígeno ligada por um primeiro anticorpo, o primeiro e segundo anticorpos são determinados como ligação ao mesmo sítio.

[00447] Alternativamente, o primeiro e segundo anticorpos são determinados como ligação ao mesmo sítio pela confirmação de que o segundo anticorpo compete com o primeiro anticorpo quanto à ligação ao antígeno, isto é, o segundo anticorpo interfere com a ligação do primeiro anticorpo ao antígeno, mesmo se a sequência de peptídeo ou estrutura tridimensional do sítio de ligação específica não for determinada.

[00448] Quando o primeiro e segundo anticorpos ligam-se ao mesmo sítio, o segundo anticorpo tem uma probabilidade extremamente alta de ter a mesma atividade como o primeiro anticorpo.

[00449] O sítio de ligação de anticorpo pode ser determinado por um método bem conhecido por aqueles habilitados na técnica, tal como imunoensaio. Por exemplo, uma série de peptídeos são preparados clivando- se apropriadamente a sequência de aminoácidos do antígeno do seu terminal carboxila ou terminal amino e a reatividade do anticorpo a isto é estudada para determinar aproximadamente um sítio de reconhecimento. Depois,

126 / 286 peptídeos mais curtos são sintetizados e a reatividade do anticorpo a esses peptídeos pode ser estudada para deste modo determinar o sítio de ligação. Os peptídeos de fragmento de antígeno podem ser preparados usando uma técnica tal como recombinação de gene ou síntese de peptídeo. 3-6. Polinucleotídeo, vetor e célula da presente invenção

[00450] A presente invenção também provê um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos (por exemplo, SEQ ID NO: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89 ou 91) que codifica a sequência de aminoácidos do anticorpo antiGPRC5D da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, um vetor compreendendo o polinucleotídeo, uma célula compreendendo o polinucleotídeo ou o vetor e uma célula que produza o anticorpo antiGPRC5D da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, etc. Um tal polinucleotídeo, vetor (uma forma circular tal como um plasmídeo e uma forma não circular incluindo vetores integrados nos cromossomas) e célula são úteis na produção do anticorpo antiGPRC5D ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo mencionado mais tarde.

[00451] O polinucleotídeo da presente invenção pode conter uma sequência de nucleotídeos arbitrária, além da sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos do anticorpo antiGPRC5D ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Por exemplo, além de um polinucleotídeo compreendendo a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, etc. da Listagem de Sequências) que codifica a sequência de aminoácidos do anticorpo antiGPRC5D da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de um peptídeo de molécula de transdução de sinal da atividade e/ou uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de uma molécula coestimulatória também são parte do aspecto do polinucleotídeo da presente

127 / 286 invenção. A presente invenção também provê um imunócito artificial tendo atividade de ligação contra células de tumor através de um receptor de antígeno quimérico (CAR) expresso pela transfecção de um imunócito (por exemplo, uma célula T, uma célula NK ou um monócito) com um tal polinucleotídeo (daqui em diante, também aludido como o artificial imunócito da presente invenção).

[00452] CAR é uma proteína quimérica tendo scFv compreendendo cadeias leves e pesadas ligadas em tandem derivadas de um anticorpo monoclonal que reconhece um antígeno de superfície nas células de tumor e uma molécula de transdução de sinal da atividade (por exemplo, CD3ζ para receptores de célula T ou um receptor FcRγ para moléculas de imunoglobulina) no seu terminal amino e terminal carbóxi, respectivamente, entre os quais um domínio de dobradiça extracelular, um domínio de transmembrana, uma molécula coestimulatória que ativa imunócitos e os semelhantes são conectados. Na célula da presente invenção, o anticorpo monoclonal que reconhece um antígeno de superfície nas células de tumor é o anticorpo antiGPRC5D da presente invenção. O imunócito da presente invenção expressando CAR reconhece uma proteína de GPRC5D na superfície do tumor por intermédio do anticorpo antiGPRC5D da presente invenção na forma de scFv enquanto que a ativação do próprio imunócito é induzida pela molécula de transdução de sinal da atividade intracelular para atacar as células de tumor.

[00453] No caso de usar uma célula T como o imunócito a ser transfectado com o polinucleotídeo da presente invenção, o receptor de antígeno quimérico (CAR) expresso na superfície da célula pela transfecção da célula T com este polinucleotídeo pode fazer com que uma célula expressando o GPRC5D e a célula T se aproximem uma da outra para induzir a citotoxicidade mediada pela ativação da célula T à célula expressando GPRC5D, isto é, citotoxicidade pelo redirecionamento da célula T. A presente

128 / 286 invenção também provê uma tal célula T expressando CAR (daqui em diante, também aludida como a célula T da presente invenção).

[00454] Em outras palavras, a célula T da presente invenção pode ser redirecionada para as células de tumor que expressam GPRC5D para induzir a citotoxicidade para as células de tumor.

[00455] A molécula de transdução de sinal da atividade é transfectada no imunócito de modo a transduzir sinais de um imunócito receptor dentro da célula. No caso de usar, por exemplo, uma célula T como o imunócito, os exemplos da molécula de transdução de sinal da atividade incluem CD3ζ, DAP12 e FcRγ.

[00456] A molécula coestimulatória é transfectada no imunócito de modo a ativar mais fortemente o imunócito. No caso de usar, por exemplo, uma célula T como o imunócito, os exemplos da molécula coestimulatória incluem CD2, CD27, CD28, CD49d, CD134, CD152, CD154, ICOS, 4-1BB e RANKL.

4. Molécula tendo atividade de ligação a antígeno

[00457] A molécula da presente invenção compreende anticorpo antiGPRC5D da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[00458] Além disso, a molécula da presente invenção pode compreender, por exemplo, uma sequência de sinal, uma etiqueta para purificação, etc., Gly de terminal amino, uma porção de fármaco ligador de ADC, um polipeptídeo de ligação de albumina, um polímero tal como PEG, um anticorpo outro que não o anticorpo antiGPRC5D, um fragmento de ligação a antígeno do mesmo e uma proteína tendo atividade de ligação a antígeno sem ter um esqueleto de imunoglobulina, que será descrito mais tarde. Os exemplos do anticorpo outro que não o anticorpo antiGPRC5D incluem um anticorpo antiCD3. A molécula da presente invenção inclui uma molécula multiespecífica descrita mais tarde.

129 / 286 4-1. Molécula multiespecífica

[00459] A molécula multiespecífica da presente invenção é uma molécula tendo dois ou mais sítios de ligação de antígeno. especificamente, a molécula multiespecífica da presente invenção é uma molécula capaz de ligação a dois ou mais epítopos diferentes um do outro em uma molécula ou epítopos diferentes um do outro em duas ou mais moléculas e compreende uma pluralidade de fragmentos de ligação a antígeno diferentes um do outro. Os exemplos de uma tal molécula multiespecífica incluem, mas não são limitados a, moléculas multiespecíficas tipo IgG e moléculas multiespecíficas tendo dois ou mais tipos de regiões variáveis, por exemplo, fragmentos de anticorpo tais como scFv em tandem, diacorpos de cadeia única, diacorpos e triacorpos e fragmentos de anticorpo ligados por uma ligação covalente ou uma ligação não covalente. A molécula multiespecífica pode conter Fc.

[00460] A molécula multiespecífica da presente invenção compreende o anticorpo antiGPRC5D da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo. A molécula multiespecífica da presente invenção compreende o anticorpo antiGPRC5D da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e 1 ou 2 ou mais anticorpos que são diferentes do anticorpo antiGPRC5D e ligam-se a um epítopo ausente em GPRC5D e presentes em um outro antígeno ou fragmento(s) de ligação a antígeno do(s) anticorpo(s).

[00461] Os exemplos do fragmento de ligação a antígeno do anticorpo antiGPRC5D podem incluir Fab, F(ab)’, Fv, scFv e sdAb.

[00462] A molécula multiespecífica da presente invenção especificamente liga-se ao GPRC5D ou pode ligar-se ainda a um alvo tal como um receptor Fc nas células efetoras.

[00463] Os exemplos do anticorpo diferente do anticorpo antiGPRC5D que podem estar contidos na molécula multiespecífica da presente invenção incluem um anticorpo antiCD3.

130 / 286

[00464] Como um exemplo preferido, o anticorpo antiCD3 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que podem estar contidos na molécula multiespecífica da presente invenção retêm uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 183 (Figura 206) (GVTFNYYG), a CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 238 (Figura 276) (ITXaaXaaGGRI) (em que cada um do primeiro Xaa e do segundo Xaa é um resíduo de aminoácido natural arbitrário; daqui em diante, o primeiro Xaa e o segundo Xaa na CDR2 de cadeia pesada também são aludidos como X1 e X2, respectivamente), e a CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 185 (Figura 208) (TLDGRDGWVAY).

[00465] A região variável de cadeia leve contida em um anticorpo antiCD3 humanizado preferido da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo retém a CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 186 (Figura 209) (TGNIGSNY), a CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 239 (Figura 277) (RXaaD) (em que Xaa é um resíduo de aminoácido natural arbitrário; daqui em diante, Xaa na CDR2 de cadeia leve também é aludido como X3), e a CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 188 (Figura 211) (QSYSSGFI).

[00466] Na CDR2 de cadeia pesada (ITX1X2GGRI) anteriormente mencionada, preferivelmente, X1 é selecionado do grupo consistindo em (A, E, G, H, I, L, T, V, R e S) e X2 é S; ou X1 é N e X2 é selecionado do grupo consistindo em (E, R, F, Y, L, V, I, K e T).

[00467] Na CDR2 de cadeia leve (RX3D) anteriormente mencionada,

131 / 286 preferivelmente, X3 é selecionado do grupo consistindo em (Q, A, G, S, N e D).

[00468] Na CDR2 de cadeia pesada (ITX1X2GGRI) anteriormente mencionada, mais preferivelmente, X1 é selecionado do grupo consistindo em (R e S) e X2 é S.

[00469] Na CDR2 de cadeia leve (RX3D) anteriormente mencionada, mais preferivelmente X3 é selecionado do grupo consistindo em (Q, A, G, S, N e D).

[00470] Os exemplos preferíveis de anticorpo antiCD3 humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que pode ser compreendido em uma molécula da presente invenção compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido mostrados na SEQ ID NO: 240 (Figura 278) e uma região variável de cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido mostrados na SEQ ID NO: 241 (Figura 279), SEQ ID NO: 242 (Figura 280) ou SEQ ID NO: 243 (Figura 281), em que X1 nos resíduos de aminoácido mostrados na SEQ ID NO: 240 é selecionado do grupo consistindo em (A, E, G, H, I, L, T, V, R e S) e X2 é S; ou X1 é N e X2 é selecionado do grupo consistindo em (E, R, F, Y, L, V, I, K e T).

[00471] Os exemplos mais preferíveis de anticorpo antiCD3 humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que podem estar compreendidos em uma molécula da presente invenção compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido mostrados na SEQ ID NO: 240 (Figura 278) e uma região variável de cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido mostrados na SEQ ID NO: 241 (Figura 279), SEQ ID NO: 242 (Figura 280) ou SEQ ID NO: 243 (Figura 281), em que X1 nos resíduos de aminoácido mostrados na SEQ ID NO: 240 é selecionado do grupo consistindo em (R, S) e X2 é S; e X3 é selecionado do grupo consistindo em N e X2 é selecionado do grupo consistindo em (Q, A, G,

132 / 286 S, N e D).

[00472] Os exemplos específicos do anticorpo antiCD3 humanizado preferido da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo incluem um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 183 (GVTFNYYG), a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 184 (ITNSGGRI), e a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 185 (TLDGRDGWVAY), e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 186 (TGNIGSNY), a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 187 (RDD), e a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 188 (QSYSSGFI), e se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo. As posições e comprimentos destas CDRs do anticorpo antiCD3 foram determinadas de acordo com a definição de IMGT.

[00473] O anticorpo antiCD3 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo contido na molécula multiespecífica da presente invenção tendo as CDRs mencionadas acima e as suas regiões variáveis (daqui em diante, também aludido como o anticorpo antiCD3, etc. da presente invenção) ligam- se a um domínio tipo Ig presente na região extracelular da cadeia ε do complexo de CD3 humano. Além disso, estes também se ligam a um domínio tipo IgG presente na região extracelular da cadeia ε do complexo de CD3 de

133 / 286 macaco cinomolgo.

[00474] Os epítopos presentes na região extracelular da cadeia ε do complexo de CD3 humano ligado pelo anticorpo antiCD3, etc. contidos na molécula multiespecífica da presente invenção contêm os seguintes aminoácidos:

[00475] Ser55, Glu56, Leu58, Trp59, Asn65, Ile66, Ser77, Asp78, Arg101, Gly102, Ser103, Lys104 e Pro105.

[00476] Preferivelmente, o anticorpo antiCD3, etc. contido na molécula multiespecífica da presente invenção pode manter a ligação ao CD3 humano pela ligação a uma região de epítopo contendo pelo menos 7 aminoácidos selecionados destes 13 aminoácidos.

[00477] Quando um anticorpo está adjacente a isso aminoácidos em uma distância dentro de 4 angstroms, um tal anticorpo pode ser confirmado ter a mesma especificidade de epítopo como aquela do anticorpo antiCD3, etc. contido na molécula multiespecífica da presente invenção. Por outro lado, entre estes aminoácidos de epítopo, Arg101, Gly102, Ser103, Lys104 e Pro105 também são resíduos de epítopo que interagem com um anticorpo antiCD3 OKT3 ou UCHT1 conhecidos na técnica (Lars Kjer-Nielsen et al., PNAS (2004); e Kelly L Arnett et al., PNAS (2004)). Entretanto, OKT3 ou UCHT1 se ligam ao CD3 humano, mas não se ligam ao CD3 de macaco cinomolgo.

[00478] Um tal anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo contido na molécula multiespecífica da presente invenção pode ser submetido a vários testes sobre a eficácia ou segurança usando primatas, particularmente, macacos cinomolgos, úteis para o desenvolvimento não clínico (desenvolvimento pré-clínico) de produtos farmacêuticos e é assim preferido. Também, a ligação do anticorpo, etc. Ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo tem atividade citotóxica e é útil, sozinha ou como a molécula da

134 / 286 presente invenção, no tratamento ou prevenção de doenças tais como cânceres em macacos cinomolgos. A composição farmacêutica será descrita mais tarde.

[00479] O anticorpo antiCD3 pode ser um anticorpo de animal não humano, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano. O anticorpo antiCD3 é preferivelmente um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano.

[00480] Os exemplos do fragmento de ligação a antígeno do anticorpo antiCD3 incluem Fab, F(ab)’, Fv, scFv e sdAb.

[00481] Os exemplos do anticorpo antiCD3 ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo as CDRs descritas acima incluem um anticorpo humanizado ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 240 (Figura 278) e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 241 (Figura 279), 242 (Figura 280) e 243 (Figura 281). Os exemplos específicos do mesmo incluem um anticorpo humanizado ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 155 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 156, 158 e

160.

[00482] Os exemplos específicos do anticorpo antiCD3 ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo incluem um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 180, 181 ou 182. Os exemplos mais específicos do mesmo incluem um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os resíduos de aminoácido 2 a 243 da SEQ ID NO: 180,

135 / 286 um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os resíduos de aminoácido 2 a 243 da SEQ ID NO: 181, e um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os resíduos de aminoácido 2 a 241 da SEQ ID NO:

182.

[00483] O anticorpo antiCD3 mencionado acima pode ser um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano compreendendo uma região constante da imunoglobulina humana ou Fc. Fc pode ser Fc mutado.

[00484] Os exemplos preferíveis de molécula multiespecífica da presente invenção, compreendendo anticorpo antiGPRC5D ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo e anticorpo antiCD3 ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo pode compreender anticorpo antiGPRC5D ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo derivado de 2B1 anteriormente mencionado e compreende um anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 25 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 207 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 132 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 209, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 25 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 211 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 130 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 213,

136 / 286

・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 244 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 244, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 245 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 241 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 245, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 246 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 246, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 247 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 247, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 248 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de

137 / 286 aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 248, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 249 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 249, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 250 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 250, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 251 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 251, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 252 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 252, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 253 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos

138 / 286 representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 253, ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 254 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 254 ou ・uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 255 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 255.

[00485] A molécula preferível destas em que o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72 e compreende i) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 199 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 203, ii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma

139 / 286 sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 201 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 205, iii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, ou iv) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 237 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende Fc mutado.

[00486] A molécula mais preferível destas em que o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de

140 / 286 aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72 e compreende iii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, ou iv) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 237 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende Fc mutado.

[00487] Os exemplos preferíveis específicos de molécula multiespecífica da presente invenção podem compreender o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo

141 / 286 uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 219 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 264 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 221 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 264 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 225 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada

142 / 286 compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 227 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 229 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e

143 / 286 o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 264 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 231 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 233 e Fc mutado; ou o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 235 e Fc mutado.

144 / 286

[00488] Os exemplos específicos dos exemplos mais preferíveis de molécula multiespecífica da presente invenção podem compreender o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 264 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 225 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 227 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos

145 / 286 de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 229 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 264 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 231 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco

146 / 286 cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 233 e Fc mutado; ou o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 235 e Fc mutado.

[00489] O exemplo alternativo de molécula em que o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72 e compreende i) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 199 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da

147 / 286 sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 203, ii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 201 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 205, iii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, ou iv) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 237 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende v) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 471 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 207 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 133 a 238 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 209, ou

148 / 286 vi) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 143 a 471 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 211 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 236 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 213.

[00490] O exemplo mais preferível da molécula pode compreender iii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, ou iv) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 237 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende v) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 471 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 207 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 133 a 238 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 209, ou

149 / 286 vi) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 143 a 471 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 211 e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 236 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 213.

[00491] O exemplo específico da molécula pode compreender o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 119 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 203 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 25 a 471 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 207 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 238 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 209 ou o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 201 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da

150 / 286 sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 205 e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 25 a 471 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 211 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 236 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 213.

[00492] A molécula alternativa pode compreender o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72 e Fc mutado e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende Fc mutado.

[00493] O exemplo específico destes pode compreender o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 271 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 223 e Fc mutado e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 219 e Fc

151 / 286 mutado ou o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 271 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 223 e Fc mutado e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 264 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 221 e Fc mutado.

[00494] A molécula da presente invenção também abrange uma molécula compreendendo uma porção de um anticorpo antiCD3 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleotídeos contida em um polinucleotídeo hibridizando sob condições severas a um filamento complementar de um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos contida no anticorpo antiCD3 mencionado acima ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo e se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo e uma porção de um anticorpo antiGPRC5D ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga ao GPRC5D humano e preferivelmente se ligam ainda ao GPRC5D de macaco cinomolgo.

[00495] A molécula da presente invenção também abrange uma molécula compreendendo uma porção de um anticorpo antiCD3 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada e/ou uma sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%,

152 / 286 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada e/ou a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve contida no anticorpo antiCD3 mencionado acima ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo e se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo e uma porção de um anticorpo antiGPRC5D ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga ao GPRC5D humano e preferivelmente se ligam ainda ao GPRC5D de macaco cinomolgo.

[00496] A molécula da presente invenção também abrange uma molécula que compreende um anticorpo antiCD3 ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo tendo uma sequência de aminoácidos derivada de uma sequência de aminoácidos contida no anticorpo antiCD3 ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo pela substituição, deleção ou modificação de 1 a diversos aminoácidos e se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo e ao GPRC5D humano e preferivelmente se ligam ainda ao GPRC5D de macaco cinomolgo. Os exemplos de um tal anticorpo antiCD3 ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo pode incluir uma variante de deleção derivada de uma cadeia pesada pela deleção de 1 ou 2 aminoácidos no seu terminal carboxila (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), uma forma amidada da variante de deleção tendo uma cadeia pesada que carece de dois resíduos de aminoácido (glicina e lisina) no terminal carbóxi e ao invés tem um resíduo de prolina amidado no terminal carbóxi (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)) e um anticorpo modificado tendo um resíduo de glutamina ou ácido glutâmico no terminal amino piroglutamilado na sua cadeia pesada ou leve (Publicação Internacional No. WO2013/147153) (estes são coletivamente aludidos como uma “variante de deleção”). Entretanto, a variante de deleção no terminal carboxila da cadeia pesada ou leve do anticorpo antiCD3 ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo contida na molécula da presente invenção não é limitada aos tipos

153 / 286 descritos acima contanto que a variante de deleção mantenha a capacidade para ligar-se ao antígeno e as funções efetoras. Quando o anticorpo contido na molécula da presente invenção compreende duas ou mais cadeias (por exemplo, cadeias pesadas, as duas ou mais cadeias (por exemplo, cadeias pesadas) podem ser cadeias pesadas de qualquer tipo selecionado do grupo consistindo na cadeia pesada de tamanho natural e as variantes de deleção descritas acima ou pode ser uma combinação de cadeias pesadas de quaisquer dois ou mais tipos selecionados das mesmas. A razão quantitativa de cada variante de deleção ou a razão do número de moléculas da mesma pode ser influenciada pelo tipo de células de mamífero cultivadas que produza a molécula da presente invenção e condições de cultura. Os exemplos de um tal caso pode incluir a deleção de um resíduo de aminoácido de terminal carbóxi cada um em ambas das duas cadeias pesadas como componentes principais da molécula da presente invenção. 4-2. Molécula biespecífica da presente invenção

[00497] Os exemplos preferidos da molécula multiespecífica da presente invenção podem incluir moléculas biespecíficas. O termo “biespecífica” significa capacidade de ligação a dois epítopos diferente um do outro em uma molécula ou epítopos diferentes um do outro em duas ou mais moléculas. Um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno tendo tal biespecificidade é abrangida pela presente invenção.

[00498] A molécula biespecífica da presente invenção liga-se ao GPRC5D e liga-se a um epítopo que é ausente em GPRC5D e presente em um outro antígeno. Mais especificamente, uma tal molécula biespecífica (i) ligam-se a um epítopo no GPRC5D (epítopo 1) e (ii) liga-se a um epítopo diferente do epítopo 1 em GPRC5D (epítopo 2) ou liga-se a um epítopo em um antígeno outro que não GPRC5D (epítopo 3).

[00499] Por exemplo, em uma molécula biespecífica tipo scFv em tandem tipificada por BiTE, um sítio de ligação de antígeno na região variável

154 / 286 de cadeia pesada de um primeiro anticorpo e um sítio de ligação de antígeno na região variável de cadeia leve do primeiro anticorpo são ligados por intermédio de um ligador ou diretamente sem um ligador para formar um primeiro polipeptídeo. Também, um sítio de ligação de antígeno na região variável de cadeia pesada de um segundo anticorpo e um sítio de ligação de antígeno na região variável de cadeia leve do segundo anticorpo são ligados por intermédio de um ligador ou diretamente sem um ligador para formar um segundo polipeptídeo. O primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são ligados por intermédio de um ligador ou diretamente sem um ligador. Alternativamente, o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo podem ser ligados por intermédio de uma molécula adicional.

[00500] Em uma molécula biespecífica tipo diacorpo, um sítio de ligação de antígeno na região variável de cadeia pesada de um primeiro anticorpo e um sítio de ligação de antígeno na região variável de cadeia leve de um segundo anticorpo são ligados por intermédio de um ligador ou diretamente sem um ligador. Também, um sítio de ligação de antígeno na região variável de cadeia leve do primeiro anticorpo e um sítio de ligação de antígeno na região variável de cadeia pesada do segundo anticorpo são ligados por intermédio de um ligador ou diretamente sem um ligador. Também, uma molécula biespecífica pode ser preparada pela dimerização adicional de moléculas biespecíficas tipo diacorpo. Além disso, a molécula biespecífica tipo diacorpo pode ser ligada a uma cadeia única ou ambas as cadeias de Fc por intermédio de um ligador (molécula biespecífica tipo diacorpo-Fc).

[00501] Em uma molécula biespecífica tipo scFv dual, duas ligações de scFvs aos epítopos diferentes são ligadas às duas cadeias de Fc dimérico, respectivamente, por intermédio de ligadores ou diretamente sem ligadores. Alternativamente, dois tipos de ligação de scFvs aos epítopos diferentes são ligados à CH e CL, respectivamente, por intermédio de ligadores e ligadas

155 / 286 adicionalmente às duas cadeias de Fc dimérico, respectivamente, por intermédio de ligadores. A molécula biespecífica tipo scFv Dual está descrita como molécula biespecífica tipo Dual ou tipo Dual.

[00502] Em uma molécula biespecífica tipo IgG, duas ligações de Fabs aos epítopos diferentes são ligadas às duas cadeias de Fc dimérico, respectivamente, por intermédio de ligadores ou diretamente sem ligadores. A molécula biespecífica tipo IgG está descrita como molécula biespecífica tipo Anticorpo em Tamanho Real (FSA) ou tipo FSA.

[00503] Alternativamente, a molécula biespecífica da presente invenção pode ser uma molécula biespecífica em que Fab de um primeiro anticorpo e scFv de um segundo anticorpo são ligados às duas cadeias de Fc dimérico, respectivamente, por intermédio de ligadores ou diretamente sem ligadores. Tal anticorpo biespecífico é descrito como anticorpo biespecífico tipo Híbrido.

[00504] O scFv e o Fab contidos na molécula biespecífica da presente invenção são preferivelmente scFv e Fab de um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano e o Fc é preferivelmente Fc de um anticorpo humano.

[00505] O ligador também inclui um polipeptídeo de cadeia única ou um oligopeptídeo de cadeia única ou produtos sintéticos tais como PEG, nucleotídeos, cadeias de açúcar e compostos. Além disso, qualquer ligador conhecido na técnica pode ser usado sem limitações particulares contanto que o ligador se ligue aos dois polipeptídeos.

[00506] O comprimento do ligador é de 5 a 30 aminoácidos, por exemplo, para um ligador de peptídeo. Quando a molécula biespecífica contém uma pluralidade de ligadores, todos os ligadores de peptídeo usados podem ter o mesmo comprimento ou os ligadores de peptídeo usados podem ter comprimentos diferentes.

[00507] Os exemplos do ligador de peptídeo incluem uma repetição (Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Ser). De 1 a diversos resíduos de aminoácido outros que

156 / 286 não Gly e Ser podem ser adicionados a esta.

[00508] Os exemplos do anticorpo que se liga a um epítopo em um antígeno outro que não GPRC5D (epítopo 3) ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo contido na molécula biespecífica da presente invenção podem incluir o anticorpo antiCD3 anteriormente mencionado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[00509] Os exemplos da molécula biespecífica da presente invenção podem incluir uma molécula em que o anticorpo antiCD3 ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo são ligados com o anticorpo antiGPRC5D da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo por intermédio de um ligador ou sem um ligador. Os exemplos preferidos de uma tal molécula podem incluir uma molécula em que o anticorpo antiCD3 ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo e o anticorpo antiGPRC5D da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, cada um do qual é scFv, são ligados entre si por intermédio de um ligador ou sem um ligador.

[00510] Os exemplos específicos preferidos de uma tal molécula podem incluir uma molécula que tenha uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 171 a 179 e se ligue ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo e ao GPRC5D humano e preferivelmente se ligam ainda ao GPRC5D de macaco cinomolgo.

5. Produção de anticorpo e molécula 5-1. Método usando hibridoma

[00511] O anticorpo antiGPRC5D da presente invenção pode ser obtido pelo uso de um método de rotina que envolve imunizar um animal com GPRC5D ou um polipeptídeo arbitrário selecionado da sequência de aminoácidos de GPRC5D e coletando e purificando o anticorpo produzido in vivo. De acordo com um método conhecido na técnica (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497; e Kennet, R. ed., Monoclonals

157 / 286 Antibody, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)), células que produzem anticorpo que produzem anticorpos contra GPRC5D são fundidos com células de mieloma para deste modo estabelecer hibridomas, a partir dos quais anticorpos monoclonais também podem ser obtidos. Os exemplos específicos de um tal método estão descritos, por exemplo, na Publicação Internacional No. WO09/48072 (publicada em 16 de abril de 2009).

[00512] A espécie de organismo do antígeno GPRC5D não é limitada a um ser humano e o animal também pode ser imunizado com GPRC5D derivado de um animal não humano tal como um camundongo ou um rato. Neste caso, o anticorpo que se liga ao GPRC5D não humano obtido pode ser testado quanto à sua reatividade cruzada com GPRC5D humano para deste modo selecionar um anticorpo aplicável às doenças humanas.

[00513] O anticorpo antiCD3 que pode estar contido na molécula da presente invenção também pode ser obtido pelo uso de um método de rotina que envolve imunizar um animal com CD3 ou um polipeptídeo arbitrário selecionado da sequência de aminoácidos de CD3 e coletar e purificar o anticorpo produzido in vivo. De acordo com um método conhecido na técnica, as células que produzem anticorpo que produzem anticorpos contra CD3 são fundidos com células de mieloma para estabelecer deste modo hibridomas, a partir dos quais anticorpos monoclonais também podem ser obtidos.

[00514] A espécie de organismo do antígeno CD3 não é limitada a um ser humano e o animal também pode ser imunizado com CD3 derivado de um animal não humano tal como um camundongo ou um rato. O anticorpo que se liga ao CD3 não humano obtido pode ser testado quanto à sua reatividade cruzada com CD3 humano para deste modo selecionar um anticorpo aplicável às doenças humanas. 5-2. Método da imunização de célula

[00515] As células expressando o antígeno nativo, as células que expressam o antígeno recombinante ou seu fragmento ou os semelhantes,

158 / 286 podem ser usados como imunógenos para preparar deste modo um anticorpo pelo método de hibridoma descrito acima.

[00516] Os exemplos das células que expressam o GPRC5D nativo podem incluir células plasmáticas humanas, células cultivadas primárias derivadas de paciente com mieloma múltiplo humano e linhagens de célula cultivadas derivadas de paciente com mieloma múltiplo humano. Os exemplos das células que expressam o GD3 nativo podem incluir células de timo humanas e linfócitos T.

[00517] Tais células são usadas em uma quantidade de 1 × 105 a 1 × 109 células, preferivelmente 1 × 106 a 1 × 108 células, mais preferivelmente 0,5 a 2 × 107 células, ainda mais preferivelmente 1 × 107 células, por dose de imunização. O número de células usadas para a imunização pode ser mudado de acordo com o nível de expressão de antígeno. Os imunógenos são geralmente administrados intraperitonealmente e podem ser administrados através de uma via intradérmica ou os semelhantes. 5-3. Método de imunização de DNA

[00518] O anticorpo antiGPRC5D da presente invenção e o anticorpo antiCD3 que podem estar contidos na molécula da presente invenção (daqui em diante, estes anticorpos também são coletivamente aludidos como o anticorpo da presente invenção) também podem ser obtidos pelo uso de um método de imunização de DNA. Este método envolve transfectar um indivíduo animal (por exemplo, camundongo ou rato) com um plasmídeo de expressão de antígeno e expressando o antígeno no indivíduo para induzir deste modo imunidade contra o antígeno. Os exemplos da estratégia de transfecção incluindo um método de injetar diretamente o plasmídeo no músculo, um método de injetar um reagente de transfecção tal como um lipossoma ou polietilenimina na veia, uma estratégia usando um vetor viral, uma estratégia de injetar partículas de ouro acopladas com o plasmídeo usando uma pistola de gene e um método hidrodinâmico de injetar

159 / 286 rapidamente uma solução de plasmídeo em uma quantidade grande na veia.

[00519] Os exemplos reais do anticorpo antiGPRC5D humano de rato assim estabelecido pode incluir 2A4, 2B1 e 7B4. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 2A4 é mostrada na SEQ ID NO: 5 da Listagem de Sequências. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 2A4 é mostrada na SEQ ID NO: 12 da Listagem de Sequências. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 2B1 é mostrada na SEQ ID NO: 7 da Listagem de Sequências. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 2B1 é mostrada na SEQ ID NO: 14 da Listagem de Sequências. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 7B4 é mostrada na SEQ ID NO: 9 da Listagem de Sequências. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 7B4 é mostrada na SEQ ID NO: 16 da Listagem de Sequências. 5-4. Planejamento de anticorpo humanizado

[00520] Os exemplos do anticorpo humanizado podem incluir, mas não são limitados a, um anticorpo derivado de ser humano tendo CDRs substituídas apenas com as CDRs de um anticorpo de animal não humano (ver Nature (1986), 321, p. 522-525), um anticorpo humano enxertado com as sequências de CDR e com alguns resíduos de aminoácido de regiões de armação pelo enxerto de CDR (ver a WO90/07861 e US6972323) e um anticorpo tendo aminoácido(s) de anticorpo humano substituído(s) no lugar de um ou dois ou mais aminoácido(s) derivado(s) de anticorpo de animal não humano em qualquer um destes anticorpos humanizados. 5-5. Planejamento de anticorpo humano

[00521] O anticorpo humano significa um anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de um anticorpo derivado de ser humano. O anticorpo humano pode ser obtido por um método usando camundongos que produzam anticorpo humano carregando fragmentos de DNA genômicos humanos compreendendo os genes da cadeia pesada e leve de anticorpo

160 / 286 humano (ver por exemplo, Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. e Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999.; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, 722-727).

[00522] Especificamente, tais animais que produzem anticorpo humano podem ser preparados rompendo-se os locais de gene da cadeia pesada e leve da imunoglobulina endógena de mamíferos não humanos e ao invés introduzir neste ponto locais de gene de cadeia pesada e leve da imunoglobulina humana por intermédio de vetores cromossômicos artificiais de levedura (YAC) ou os semelhantes. Alternativamente, as células eucarióticas podem ser transformadas com cDNAs que codificam as cadeias pesadas e leves, respectivamente, de um tal anticorpo humano, preferivelmente com vetores compreendendo os cDNAs, por uma técnica de recombinação de gene. As células transformadas que produzem um anticorpo monoclonal recombinante humano podem ser cultivadas. Este anticorpo pode ser obtido do sobrenadante de cultura.

[00523] Neste contexto, por exemplo, células eucarióticas, preferivelmente células de mamífero tais como células HEK293F ou células CHO, podem ser usadas como os hospedeiros.

[00524] Também, um método para obter um anticorpo humano derivado da exibição de fago selecionada de uma biblioteca de anticorpo humano também é conhecido. Por exemplo, um método de exibição de fago pode ser usado, que envolve permitir que as regiões variáveis de um anticorpo humano sejam expressas como scFv na superfície de fago e selecionando uma ligação de fago ao antígeno. O fago selecionado com base na sua capacidade para ligar-se ao antígeno pode ser submetido à análise de gene para deste modo determinar as sequências de DNA que codifica as regiões variáveis do

161 / 286 anticorpo humano que se ligam ao antígeno. Se a sequência de DNA da ligação de scFv ao antígeno for determinada, um vetor de expressão tendo esta sequência pode ser preparado e introduzido em hospedeiros apropriados para permitir que eles expressem o anticorpo humano (WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, 433-455).

[00525] O método para construir a biblioteca de fago de anticorpo humano é bem conhecido. Os genes das regiões variáveis de anticorpo humano são amplificados usando cDNAs coletados do sangue, baço ou linfônodo humanos como padrões e iniciadores com referência a, por exemplo, J Biol Chem, 274 (26), 18218-30, (1999) ou Methods Mol Biol, 178, 59-71, (2002). Os genes da região variável amplificados podem ser usados para preparar scFv com referência a J Immunol Methods, 201 (1), 35- 55 (1997). 5-6. Produção de fragmento de ligação a antígeno de anticorpo

[00526] O fragmento de ligação a antígeno do anticorpo pode ser produzido modificando-se o anticorpo por um método de engendramento genético, seguido pela expressão em células cultivadas apropriadas.

[00527] O método para preparar, por exemplo, scFv, como o fragmento de ligação a antígeno do anticorpo é bem conhecido na técnica (ver por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 4.946.778, 5.260.203, 5.091.513 e 5.455.030). Neste scFv, uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve são ligadas por intermédio de um ligador que as impede de formar um conjugado, preferivelmente um ligador de polipeptídeo (Huston, J.S. et al., PNAS (1988), 85, 5879-5883). A região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve no scFv podem ser derivadas do mesmo anticorpo ou podem ser derivadas de anticorpos diferentes.

[00528] Por exemplo, um peptídeo de cadeia única arbitrário consistindo em 5 a 30 resíduos é usado como o ligador de polipeptídeo que

162 / 286 liga estas regiões variáveis.

[00529] De modo a obter o DNA que codifica scFv, das sequências de DNA que codifica a cadeia pesada ou região variável de cadeia pesada do anticorpo e DNA que codifica a cadeia leve ou região variável de cadeia leve do mesmo, cada porção de DNA que codifica o todo ou a sequência de aminoácidos desejada é usada como um padrão e amplificada pela PCR usando um par de iniciadores flanqueando ambas as extremidades do padrão. Subsequentemente, o DNA que codifica a porção de ligador de polipeptídeo é amplificada adicionalmente em combinação com um par de iniciadores flanqueando ambas as extremidades do DNA de modo que o fragmento obtido possa ser ligado nas suas extremidades aos DNAs de cadeia pesada e leve, respectivamente. Alternativamente, o DNA que codifica a região de scFv inteira pode ser obtido pela síntese líquida.

[00530] O DNA que codifica scFv pode ser usado para preparar com isso, de acordo com um método de rotina, um vetor de expressão contendo o DNA e células hospedeiras transformadas com o vetor de expressão. Além disso, as células hospedeiras podem ser cultivadas e o scFv pode ser recuperado a partir das culturas de acordo com um método de rotina.

[00531] Também de modo a obter qualquer outro fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, um gene que codifica um fragmento de ligação a antígeno é obtido de acordo com o método descrito acima e introduzido nas células. O fragmento de ligação a antígeno de interesse pode ser recuperado a partir das culturas de células.

[00532] O anticorpo da presente invenção pode ser multimerizado para deste modo realçar a sua afinidade para o antígeno. Neste caso, anticorpos do mesmo tipo podem ser multimerizados ou uma pluralidade de anticorpos reconhecendo uma pluralidade de epítopos, respectivamente, do mesmo antígeno pode ser multimerizada. Os exemplos de métodos para a multimerização destes anticorpos podem incluir a ligação de dois scFvs a um

163 / 286 domínio CH3 de IgG, a ligação dos mesmos à estreptavidina e a introdução de um motivo de hélice-volta-hélice. 5-7. Recombinação de gene

[00533] De modo a preparar o anticorpo da presente invenção, um polinucleotídeo (nucleotídeo de cadeia pesada) compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de sua cadeia pesada e um polinucleotídeo (nucleotídeo de cadeia leve) compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de sua cadeia leve ou um vetor tendo um inserto de nucleotídeo da cadeia pesada e um vetor tendo um inserto de nucleotídeo da cadeia leve são introduzidos dentro de células hospedeiras e depois as células são cultivadas e o anticorpo pode ser recuperado a partir das culturas. O nucleotídeo de cadeia pesada e o nucleotídeo de cadeia leve podem ser inseridos em um vetor.

[00534] As células procarióticas ou eucarióticas podem ser usadas como as células hospedeiras. No caso de usar células hospedeiras eucarióticas, células animais, células vegetais ou micróbios eucarióticos podem ser usados.

[00535] Os exemplos das células animais podem incluir células derivadas de mamífero, isto é, células renais embrionárias humanas, células HEK293F (Subedi GP et al., J Vis Exp. (2015) 106), células COS derivadas de rim de macaco (Gluzman, Y. Cell (1981), 23, 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblasto de camundongo NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), células do ovário do hamster chinês (células CHO, ATCC CCL-61), linhagens deficientes em dihidrofoliato redutase das mesmas (CHOdhfr-; Urlaub, G. e Chasin, L.A. PNAS (1980), 77, 4126-4220), células derivadas de aves tais como galinhas e células derivadas de insetos.

[00536] Também, as células modificadas para realçar as atividades biológicas de anticorpos pela modificação das estruturas da cadeia de açúcar

164 / 286 podem ser usadas como os hospedeiros. Por exemplo, células CHO modificadas tal que a proporção de cadeias de açúcar com fucose não ligada com N-acetilglicosamina nas suas extremidades redutoras seja de 20% ou mais entre a ligação das cadeias de açúcar ligadas a N-glicosídeo tipo complexo à região Fc do anticorpo, podem ser usadas para preparar um anticorpo tendo atividade de ADCC ou atividade de CDC realçadas (Publicação Internacional No. WO02/31140).

[00537] Os exemplos dos micróbios eucarióticos podem incluir leveduras. Os exemplos das células procariótica podem incluir E. coli e Bacillus subtilis.

[00538] Um peptídeo de sinal para a secreção do anticorpo da presente invenção (anticorpo monoclonal derivado de cada animal, anticorpo de rato, anticorpo de camundongo, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo humano, etc.) não é limitado ao sinal secretor de um anticorpo da mesma espécie, do mesmo tipo e do mesmo subtipo como o anticorpo da presente invenção ou ao próprio sinal secretor do anticorpo da presente invenção. Qualquer sinal secretor de um anticorpo de tipo ou subtipo diferente deste ou qualquer sinal secretor de uma proteína derivada de uma espécie eucariótica diferente desta ou uma espécie procariótica pode ser selecionado e usado. O peptídeo de sinal usualmente não está contido na sequência de nucleotídeos e sequências de aminoácidos da maioria das cadeias leves maduras ou cadeias pesadas maduras. Um anticorpo secretado, etc. contendo o peptídeo de sinal também é abrangido pelo anticorpo, etc. da presente invenção ou pela molécula da presente invenção.

[00539] O anticorpo, fragmento de ligação a antígeno do anticorpo e molécula obtidos podem ser purificados até homogêneos de modo a não conter outras proteínas. Os métodos usuais de separação e purificação de proteína podem ser usados para a separação e purificação do anticorpo, fragmento de ligação a antígeno do anticorpo e molécula.

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[00540] O anticorpo pode ser separado e purificado pela(s) estratégia(s) apropriadamente selecionada(s) ou combinada(s), por exemplo, colunas de cromatografia, filtros, ultrafiltração, dessalinização, diálise, eletroforese em gel de poliacrilamida preparativa, e/ou focalização isoelétrica, embora o método de separação e purificação não seja limitado a isso.

[00541] O método de separação e purificação pode ser preferivelmente realizado, por exemplo, preparando-se um vetor de expressão usando uma sequência de DNA que codifica uma etiqueta His ou uma etiqueta FLAG adicionadas ao terminal carbóxi de uma região variável de anticorpo, transformando as células com este vetor, depois cultivando as células para expressar o anticorpo e fragmento de ligação a antígeno do anticorpo e extrair o sobrenadante de cultura depois da conclusão da cultura, seguido pela purificação usando a cromatografia de afinidade com metal (por exemplo, Ni ou Co), colunas de anticorpo antietiqueta FLAG, filtração em gel, cromatografia de troca iônica ou os semelhantes.

[00542] O anticorpo expresso e o fragmento de ligação a antígeno do anticorpo contendo uma sequência de aminoácidos de uma etiqueta tal como uma etiqueta His ou uma etiqueta FLAG também é abrangida pelo anticorpo da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo ou a molécula da presente invenção. 5-8. Produção de anticorpo policlonal

[00543] O anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal. O anticorpo policlonal pode ser recuperado de culturas de células que produzem anticorpo diferentes cultivadas mistas (WO2004/061104). Alternativamente, anticorpos separadamente preparados podem ser misturados. Antissoro, que é um aspecto do anticorpo policlonal, pode ser preparado pela imunização de animais com um antígeno desejado e recuperar o soro dos animais de acordo com um método padrão.

[00544] 5-9. Produção de imunócito artificial provido com

166 / 286 especificidade de ligação para célula de tumor

[00545] Um imunócito artificial provido com especificidade de ligação para células de tumor pode ser produzido comunicando-se especificidade de antígeno a um imunócito pela transfecção com, por exemplo, o gene do anticorpo antiGPRC5D da presente invenção. Os exemplos das células de imunócito incluem células T, NK e monócitos.

[00546] O caso de usar uma célula T como o imunócito será descrito como um exemplo. A célula T pode ser induzida cultivando-se células mononucleares recuperadas de sangue periférico humano por um método tal como um método centrífugo de gravidade específica, em um meio na presença de um anticorpo antiCD3, IL-2, IL-12 ou adicionalmente, um anticorpo antiIL-4 ou IFN-γ.

[00547] Em seguida, esta célula T é transfectada com um gene de receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo o gene do anticorpo antiGPRC5D da presente invenção como um componente. O gene CAR é tipicamente constituído por um gene de um anticorpo que reconhece um antígeno de superfície nas células de tumor (na presente invenção, o anticorpo antiGPRC5D) e um gene que codifica uma molécula coestimulatória necessária para a ativação de célula T (por exemplo, coestimuladores tais como a cadeia ζ do receptor de célula T e CD28). O gene CAR compreendendo o gene do anticorpo antiGPRC5D pode ser transfectado para a célula T usando vários vetores virais. Os exemplos de um tal vetor incluem vetores lentivirais, vetores retrovirais, vetores adenovirais, vetores virais adenoassociados, vetores do vírus Sendai e lipossomas. Um vírus recombinante pode ser preparado a partir do vetor viral tendo um inserto do gene do anticorpo antiGPRC5D e transfectado para a célula T não especificamente ativada por antígeno mencionada acima. A célula T assim transfectada com o gene pode ser cultivada para se obter uma célula T provida com especificidade para células de tumor.

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[00548] Se a célula T da presente invenção capaz de induzir citotoxicidade pelo redirecionamento, obtida pelo método da presente invenção tem a especificidade a antígeno assim comunicada a ela pode ser confirmado cocultivando-se a célula T com células inativadas obtidas pelo tratamento com mitomicina C de células de tumor positivas em antígeno conhecidas expressar GPRC5D e depois medindo a quantidade de IFN-γ ou IL-2 no sobrenadante de cultura. 5-10. Produção de molécula multiespecífica e molécula biespecífica

[00549] Os exemplos do método para preparar a molécula multiespecífica e a molécula biespecífica da presente invenção incluem um método que envolve introduzir plasmídeos de expressão nas células hospedeiras, seguido pela expressão transitória, um método que envolve introduzir plasmídeos nas células hospedeiras e depois selecionar uma linhagem de célula que expresse estavelmente a linhagem de célula pela seleção com fármaco, seguida pela expressão constitutiva e um método que envolve preparar os respectivos anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno por qualquer um dos métodos descritos acima e depois ligar quimicamente estes anticorpos ou fragmentos usando um ligador de peptídeo sintético.

[00550] Como para o anticorpo de cadeia única (scFv), os exemplos do método de preparação incluem um método que envolve ligar dois scFvs por intermédio de um ligador de peptídeo (scFv em tandem), um método que envolve trocar os respectivos domínios de dois anticorpos diferindo na especificidade e formar um dímero por uma ligação não covalente (diacorpo), um método que envolve trocar os respectivos domínios de dois anticorpos diferindo na especificidade e formar uma cadeia única (diacorpo de cadeia única) e um método que envolve preparar diacorpos de cadeia única e depois formar um dímero por uma ligação não covalente (TandAb, US7129330).

[00551] A presente invenção também provê um gene que codifica o

168 / 286 anticorpo da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo ou uma forma modificada do antígeno, etc., um vetor recombinante tendo um inserto do gene, uma célula transfectada com o gene ou vetor e ainda uma célula que produza o anticorpo da presente invenção.

6. Composição farmacêutica

[00552] A presente invenção provê o anticorpo antiGPRC5D ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, o polinucleotídeo, vetor, célula e imunócito artificial da presente invenção, e/ou uma composição farmacêutica compreendendo a molécula compreendendo pelo menos um deles, como um ingrediente ativo (daqui em diante, também aludida como a composição farmacêutica da presente invenção).

[00553] A composição farmacêutica da presente invenção é útil no tratamento ou prevenção de várias doenças relacionadas com os sinais de GPRC5D anormais ou aumentados devido à superexpressão de GPRC5D ou seu ligante ou mutações de GPRC5D ou amplificação de gene (daqui em diante, estas doenças são aludidas como “doenças relacionadas com GPRC5D”), particularmente, vários cânceres.

[00554] Os exemplos de causas do início ou exacerbação de tais cânceres a serem tratados ou prevenidos pode incluir a alta expressão de GPRC5D, polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) em um intron do gene GPRC5D, mutações de sentido errado que constitutivamente ativam GPRC5D e amplificação ou superexpressão do gene GPRC5D.

[00555] Também, a molécula da presente invenção ou a composição farmacêutica da presente invenção podem incluir citotoxicidade para as células que expressam GPRC5D pelo redirecionamento de imunócitos tais como células T para as células. Portanto, a presente invenção provê um método para induzir citotoxicidade para as células que expressam GPRC5D pelo redirecionamento de imunócitos tais como células T para as células, compreendendo a etapa de administrar a molécula da presente invenção ou a

169 / 286 composição farmacêutica da presente invenção.

[00556] Os exemplos dos tipos de câncer a serem tratados ou prevenidos com a composição farmacêutica da presente invenção pode incluir cânceres expressando a proteína GPRC5D, por exemplo, câncer mamário, câncer endometrial, câncer ovariano, câncer pulmonar (por exemplo, câncer pulmonar de célula não pequena), câncer estomacal, câncer prostático, câncer renal, câncer hepático, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer esofágico, câncer da bexiga urinária, câncer do colo uterino, câncer hematológico, linfoma e melanoma maligno. Os exemplos preferidos dos mesmos podem incluir mieloma múltiplo expressando a proteína de GPRC5D.

[00557] O tratamento ou prevenção de uma doença relacionada com GPRC5D incluem, mas não são limitados à prevenção do início da doença em um indivíduo expressando a proteína de GPRC5D, a supressão ou inibição da exacerbação ou progressão da mesma, o alívio de um ou dois ou mais sintomas exibidos por um indivíduo afetado com a doença, a supressão ou remissão da exacerbação ou progressão da mesma, o tratamento ou prevenção de uma doença secundária em um indivíduo afetado com a doença, etc.

[00558] A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz do anticorpo antiGPRC5D ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, e/ou uma molécula compreendendo pelo menos um deles, como um ingrediente ativo e conter adicionalmente um diluente, veículo, solubilizante, emulsificante, preservante, e/ou aditivo farmaceuticamente aceitáveis.

[00559] O termo “quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz” significa uma quantidade que exerce efeitos terapêuticos ou profiláticos em uma doença particular por meio de uma forma de dosagem e via de administração particulares e é usado intercambiavelmente com uma “quantidade farmacologicamente eficaz”.

[00560] A composição farmacêutica da presente invenção pode

170 / 286 compreender materiais para mudar, manter ou reter o pH, pressão osmótica, viscosidade, transparência, cor, tonicidade, esterilidade ou a estabilidade, solubilidade, liberação prolongada, absorbabilidade, permeabilidade, forma de dosagem, concentração, propriedades, formato, etc., da composição ou do anticorpo nela compreendido (daqui em diante, aludida como “materiais farmacêuticos”). Os materiais farmacêuticos não são particularmente limitados contanto que os materiais sejam farmacologicamente aceitáveis. Por exemplo, nenhuma ou baixa toxicidade é uma propriedade preferivelmente possuída por estes materiais farmacêuticos.

[00561] Os exemplos dos materiais farmacêuticos podem incluir, mas não são limitados aos seguintes: aminoácidos tais como glicina, alanina, glutamina, asparagina, histidina, arginina e lisina; agentes antimicrobianos; antioxidantes tais como ácido ascórbico, sulfato de sódio e bissulfito de sódio; tampões tais como tampões de fosfato, citrato ou borato, bicarbonato de sódio e soluções de Tris-HCl; enchedores tais como manitol e glicina; agentes queladores tais como ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA); agentes complexantes tais como cafeína, polivinilpirrolidina, β-ciclodextrina e hidroxipropil-β-ciclodextrina; agentes de volume tais como glicose, manose e dextrina; outros hidrocarbonetos tais como monossacarídeos, dissacarídeos, glicose, manose e dextrina; agentes de cor; corretores; diluentes; emulsificantes; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidina; polipeptídeos de peso molecular baixo; contraíons formadores de sal; antissépticos tais como cloreto de benzalcônio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico e peróxido de hidrogênio; solventes tais como glicerina, propileno glicol e polietileno glicol; álcoois de açúcar tais como manitol e sorbitol; agentes de suspensão; tensoativos tais como PEG, ésteres de sorbitano, polissorbatos tais como polissorbato 20 e polissorbato 80, triton, trometamina, lecitina e colesterol; realçadores de estabilidade tais como

171 / 286 sacarose e sorbitol; realçadores de elasticidade tais como cloreto de sódio, cloreto de potássio, manitol e sorbitol; agentes de transporte; diluentes; excipientes; e/ou aditivos farmacêuticos.

[00562] A quantidade destes materiais farmacêuticos adicionados é de 0,001 a 1000 vezes, preferivelmente 0,01 a 100 vezes, mais preferivelmente de 0,1 a 10 vezes o peso do anticorpo antiGPRC5D ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, e/ou da molécula compreendendo pelo menos um deles.

[00563] Um imunolipossoma compreendendo o anticorpo antiGPRC5D ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, e/ou a molécula compreendendo pelo menos um deles, encapsulado em um lipossoma ou uma composição farmacêutica compreendendo uma forma modificada do anticorpo compreendendo o anticorpo conjugado com um lipossoma (Patente U.S. No. 6214388, etc.) também são incluídos na composição farmacêutica da presente invenção.

[00564] Os excipientes ou veículos não são particularmente limitados contanto que eles sejam materiais líquidos ou sólidos habitualmente usados em água injetável, solução salina, fluidos cerebroespinhais artificiais e outras preparações para a administração oral ou parenteral. Os exemplos de solução salina podem incluir solução salina neutra e solução salina contendo albumina sérica.

[00565] Os exemplos de tampões podem incluir um tampão de Tris ajustado para levar o pH final da composição farmacêutica para 7,0 a 8,5, um tampão de acetato ajustado para levar o pH final da mesma para 4,0 a 5,5, um tampão de citrato ajustado para levar o pH final da mesma para 5,0 a 8,0 e um tampão de histidina ajustado para levar o pH final pH da mesma para 5,0 a 8,0.

[00566] A composição farmacêutica da presente invenção é um sólido, um líquido, uma suspensão ou os semelhantes. Um outro exemplo da composição farmacêutica da presente invenção pode incluir preparações secas

172 / 286 por congelamento. As preparações secas por congelamento podem ser formadas usando um excipiente tal como sacarose.

[00567] A via de administração da composição farmacêutica da presente invenção pode ser qualquer uma de administração enteral, administração local e administração parenteral. Os exemplos da mesma podem incluir administração intravenosa, administração intra-arterial, administração intramuscular, administração intradérmica, administração hipodérmica, administração intraperitoneal, administração transdérmica, administração intraóssea e administração intra-articular.

[00568] A composição de uma tal composição farmacêutica pode ser determinada de acordo com o método de administração, a afinidade de ligação do anticorpo para a proteína GPRC5D, etc.

[00569] A dose da composição farmacêutica da presente invenção não é limitada contanto que a dose seja uma quantidade farmacologicamente eficaz. A dose pode ser apropriadamente determinada de acordo com a espécie de um indivíduo, o tipo de doença, sintomas, sexo, idade, condições preexistentes, a afinidade de ligação do anticorpo para a proteína GPRC5D ou a sua atividade biológica e outros fatores. Uma dose usualmente de 0,01 a 1000 mg/kg, preferivelmente 0,1 a 100 mg/kg, pode ser administrada uma vez diariamente a cada 180 dias ou duas ou três ou mais vezes ao dia.

[00570] Os exemplos da forma da composição farmacêutica podem incluir injeções (incluindo preparações secas por congelamento e gotas), supositórios, preparações de absorção transnasal, preparações de absorção transdérmica, formulações sublinguais, cápsulas, tabletes, unguentos, grânulos, aerossóis, pílulas, pós, suspensões, emulsões, gotas oculares e formulações de implante biológico.

[00571] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada concorrentemente com ou separadamente de um fármaco adicional. Por exemplo, a composição farmacêutica da presente invenção

173 / 286 pode ser administrada depois da administração do fármaco adicional ou o fármaco adicional pode ser administrado depois da administração da composição farmacêutica. Alternativamente, a composição farmacêutica e o fármaco adicional podem ser administrado concorrentemente. Os exemplos do fármaco adicional podem incluir vários agentes anticâncer tais como produtos quimioterapêuticos e terapêuticos de radiação. Estes casos são coletivamente aludidos como o “uso combinado com um fármaco adicional” do anticorpo da presente invenção. Uma composição farmacêutica compreendendo o ingrediente ativo da composição farmacêutica da presente invenção assim como um fármaco adicional também é incluída na presente invenção.

[00572] A presente invenção provê um método para tratar ou prevenir doenças relacionadas com GPRC5D tais como câncer, uso do anticorpo da presente invenção para preparar uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção das doenças e uso do anticorpo da presente invenção para tratar ou prevenir as doenças. A presente invenção também abrange um kit para o tratamento ou prevenção compreendendo o anticorpo da presente invenção. [Exemplos]

[00573] Daqui em diante, a presente invenção será de modo adicional especificamente descrita com referência aos Exemplos. Entretanto, a presente invenção não é intencionada a ser limitada a eles.

[00574] Procedimentos relacionados com a manipulação gênica nos Exemplos abaixo foram realizados de acordo com os métodos descritos no “Molecular Cloning” (Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ou os métodos descritos em outros manuais experimentais usados por aqueles habilitados na técnica ou usando reagentes ou kits comercialmente disponíveis de acordo com os manuais de instrução, a menos que de outro modo especificados.

174 / 286 Exemplo 1. Preparação de anticorpo de rato antiGPRC5D humano 1)-1 Imunização usando vetor de expressão de GPRC5D humano 1)-1-1 Construção de vetor de expressão de GPRC5D humano (pcDNA3.1- DEST-hGPRC5D) pcDNA3.1-DEST engenheirado como um vetor de destinação foi preparado a partir de pcDNA3.1(+) usando o Sistema de Conversão de Vetor Gateway (Thermo Fisher Scientific Inc.). Um cDNA que codifica a proteína de GPRC5D humano (NP_061124.1) foi clonado no vetor pcDNA3.1-DEST usando a mistura de Enzima Gateway LR Clonase (Life Technologies Corp.) para construir um vetor de expressão de GPRC5D humano pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D. Para a preparação em larga escala do vetor de expressão de GPRC5D humano, o Kit Endofree Plasmid Giga (Qiagen N.V.) foi usado. 1)-1-2 Imunização de rato

[00575] Para a imunização, ratos fêmeas WKY/Izm (Japan SLC, Inc.) foram usados. Primeiro, ambas as coxas inferiores de cada rato foram pré- tratadas com hialuronidase (Sigma-Aldrich Corp.). Depois, o pcDNA3.1- DEST-hGPRC5D foi intramuscularmente injetado nestes sítios. Subsequentemente, a eletroporação in vivo destes sítios foi realizada usando ECM830 (BTX) e um eletrodo de agulha. A mesma eletroporação in vivo como acima foi repetida uma vez durante aproximadamente duas semanas. Depois, o linfônodo ou o baço foi coletado do rato e usado na preparação de hibridoma. 1)-2 Preparação de hibridoma

[00576] As células de linfônodo ou as células do baço foram eletricamente fundidas com células de mieloma de camundongo SP2/0-ag14 (ATCC, No. CRL-1 581) usando a Unidade de Fusão de Célula LF301 (BEX Co., Ltd.). As células fundidas foram diluídas com Meio de Seleção ClonaCell-HY D (StemCell Technologies Inc.) e cultivadas. As colônias de

175 / 286 hibridoma que apareceram foram recuperadas para deste modo preparar hibridomas monoclonais. Cada colônia de hibridoma assim recuperada foi cultivada usando Meio de Seleção ClonaCell-HY E (StemCell Technologies Inc.) e o sobrenadante de cultura hibridoma obtido foi usado para triar quanto a um hibridoma que produz anticorpo antiGPRC5D humano. 1)-3 Triagem de anticorpo pelo ELISA de Célula 1)-3-1 Triagem primária pelo ELISA de Célula

[00577] As células da linhagem de célula HEK293α (células HEK293 estavelmente transfectadas com os vetores de expressão integrina αv e integrina β3) foram ajustados para 5 × 105 células/mL em um meio DMEM contendo 10% de FBS. pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D ou um pcDNA3.1- DEST de controle foi transfectado a isso lugar de acordo com procedimentos de transfecção usando Lipofectamina 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.). As células resultantes foram dispensadas em uma quantidade de 100 µL/poço a uma placa de 96 poços (Corning Inc.) e cultivadas durante a noite a 37°C sob condições de 5% de CO2 em um meio DMEM contendo 10% de FBS. As células transfectadas obtidas foram usadas no estado acoplado no ELISA de Célula. 1)-3-2 ELISA de Célula

[00578] Depois da remoção do sobrenandante de cultura das células HEK293α transfectadas com vetor de expressão preparada no Exemplo 1)-1- 1, cada sobrenadante de cultura de hibridoma foi adicionado ao pcDNA3.1- DEST-hGPRC5D ou células HEK293α transfectadas com pcDNA3.1-DEST e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 1 hora. As células nos poços foram lavadas uma vez com PBS contendo 5% de FBS. Depois, IgG AntiRato, Ab de Cabra Integral Ligado a HRP (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) diluído 500 vezes com PBS contendo 5% de FBS foi adicionada a isto e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 1 hora. As células nos poços foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS. Depois, uma

176 / 286 solução cromogênica de OPD (solução de OPD (Dicloridreto de o- fenilenodiamina (Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) e H2O2 dissolvidos nas concentrações de 0,4 mg/mL e 0,6% (v/v), respectivamente, em 0,05 M de citrato de trissódio e 0,1 M de hidrogeno fosfato de dissódio dodecahidratado, pH 4,5)) foi adicionada a isso em uma concentração de 100 µL/poço. A reação de cor foi realizada com agitação ocasional e interrompida pela adição de HCl 1 M em uma concentração de 100 µL/poço. Depois, a absorbância foi medida a 490 nm usando uma leitora de placa (ENVISION; PerkinElmer, Inc.). De modo a selecionar um hibridoma que produza um ligação específica de anticorpo ao GPRC5D humano expresso na superfície da membrana celular, os hibridomas que produziram um sobrenadante de cultura exibindo absorbância mais alta para as células HEK293α transfectadas com vetor de expressão pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D comparadas com as células HEK293α transfectadas com pcDNA3.1-DEST de controle foram selecionados como hibridomas positivos na produção de anticorpo antiGPRC5D humano. 1)-4 Triagem de anticorpo pela citometria de fluxo 1)-4-1 Preparação de célula expressando gene de antígeno para a análise de citometria de fluxo

[00579] As células T HEK293 (Thermo Fisher Scientific Inc.) foram inoculadas em uma concentração de 4 × 105 células/mL a um frasco de 225 cm2 e cultivadas durante a noite a 37°C sob condições de 5% de CO2 em um meio DMEM contendo 10% de FBS. No dia seguinte, pcDNA3.1-DEST- hGPRC5D ou um pcDNA3.1-DEST de controle foi transfectado para as células T HEK293 usando Lipofectamina LTX (Thermo Fisher Scientific Inc.) e as células foram cultivadas adicionalmente durante a noite a 37°C sob condições a 5% de CO2. No dia seguinte, as células T HEK293 transfectadas com o vetor de expressão foram tratadas com TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific Inc.), lavadas com DMEM contendo 10% de FBS e depois

177 / 286 ajustadas a uma concentração de 5 × 106 células/mL em PBS contendo 5% de FBS. A suspensão de célula obtida foi usada na análise de citometria de fluxo. 1)-4-2 Análise de citometria de fluxo

[00580] A especificidade de ligação do anticorpo GPRC5D humano produzido por cada hibridoma determinado ser positivo pelo ELISA de Célula no Exemplo 1)-3 foi adicionalmente confirmado pela citometria de fluxo. Cada suspensão de célula T HEK293 preparada no Exemplo 1)-4-1 foi inoculada em uma concentração de 100 µL/poço em uma microplaca com fundo em U de 96 poços e centrifugada para remover um sobrenadante. As células T HEK293 transfectadas com pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D ou as células T HEK293 transfectadas com pcDNA3.1-DEST foram colocadas em suspensão pela adição do sobrenadante de cultura de hibridoma e deixadas repousar a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas uma vez com PBS contendo 5% de FBS, depois colocadas em suspensão pela adição de PE Ab de Cabra AntiRato (BD) diluído 100 vezes com PBS contendo 5% de FBS e deixado repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS, seguida por detecção usando um citômetro de fluxo (FACSCanto® II:BD). Os dados foram analisados usando Flowjo (Tree Star, Inc.). A intensidade de fluorescência de PE da fração de célula foi plotada em um histograma. Hibridomas que produziram uma amostra exibindo uma mudança para intensidade de fluorescência mais forte no histograma das células T HEK293 transfectadas com pcDNA3.1-DEST- hGPRC5D comparada com o histograma de intensidade de fluorescência das células T HEK293 transfectadas com pcDNA3.1-DEST de controle foram selecionados como hibridomas que produzem o anticorpo antiGPRC5D humano. 1)-5 Triagem de anticorpo pelo ensaio de ADCC 1)-5-1 Preparação de célula que expressa estavelmente β-galactosidase

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[00581] As células T HEK293F (Thermo Fisher Scientific Inc.) foram transfectadas com pLenti6/V5-GW/LacZ e ViraPower® Packaging Mix (Thermo Fisher Scientific Inc.) de acordo com os protocolos anexos para preparar um lentivírus recombinante expressando o gene da β-galactosidase. As células T HEK293 foram infectadas pelo lentivírus recombinante obtido de acordo com o protocolo de ViraPower Lentiviral Expression Systems (Thermo Fisher Scientific Inc.). As células viralmente infectadas foram selecionadas usando 10 µg/mL de Blasticidina (Thermo Fisher Scientific Inc.) para se obter uma linhagem que expressasse estavelmente β-galactosidase. Estas células T HEK293 que expressam estavelmente β-galactosidase (daqui em diante, aludidas como “células 293T-lacZ”) foram usadas como células alvo no ensaio de atividade de ADCC. 1)-5-2 Preparação de célula alvo

[00582] As células 293T-lacZ obtidas no Exemplo 1)-5-1 foram inoculadas em uma concentração de 5 × 105 células/ml a um frasco de 75 cm2 e cultivadas durante a noite a 37°C sob condições de 5% de CO2 em um meio DMEM contendo 10% de FBS. No dia seguinte, pcDNA3.1-DEST- hGPRC5D ou um pcDNA3.1-DEST de controle foram transfectados para as células 293T-lacZ usando Lipofectamina LTX (Thermo Fisher Scientific Inc.) e as células foram cultivadas ainda durante a noite a 37°C sob condições de 5% de CO2. No dia seguinte, as células 293T-lacZ transfectadas com vetor de expressão foram tratadas com TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific Inc.) e lavadas duas vezes com um meio RPMI1640 livre de vermelho fenol contendo 5% de FBS (Thermo Fisher Scientific Inc.) (daqui em diante, aludido como um “meio para ADCC”). O número de células vivas foi contado pelo teste de exclusão com corante azul de tripano. As células foram recolocadas em suspensão a 1 × 105 células/mL em um meio para ADCC e usadas como células alvo. 1)-5-3 Preparação de célula efetora

179 / 286

[00583] As células mononucleares humanas de sangue periférico (PBMC) coletadas do sangue de um voluntário de acordo com o método padrão usando Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) foram colocadas em suspensão em um meio RPMI1640 livre de vermelho fenol contendo 10% de FBS (Thermo Fisher Scientific Inc.), centrifugadas e depois recolocadas em suspensão. O número de células vivas foi contado pelo teste de exclusão com corante azul de tripano. Depois da centrifugação, o meio foi removido e as células foram colocadas em suspensão e ajustadas para 2 × 106 células/mL em um meio para ADCC e usadas como células efetoras. 1)-5-4 Preparação de sobrenadante de cultura de hibridoma

[00584] A concentração de cada sobrenadante de cultura de hibridoma que produz anticorpo de rato antiGPRC5D obtido no Exemplo 1)-4 foi medida usando o Kit de Quantificação pelo ELISA FastELISA IgG (RD- Biotech) e ajustada para 10 µg/mL (concentração final) com Meio de Seleção ClonaCell-HY E (StemCell Technologies Inc.). 1)-5-5 Ensaio de ADCC

[00585] As células 293T-lacZ obtidas no Exemplo 1)-5-2 foram adicionadas em uma concentração de 50 µl/poço a um microplaca com fundo em U de 96 poços. Cada sobrenadante de cultura de hibridoma preparado no Exemplo 1)-5-4 ou um anticorpo IgG2b antiGPRC5D de camundongo (R&D Systems, Inc.) para um controle positivo ou um anticorpo de controle de camundongo (mIgG2b) (R&D Systems, Inc.) para um controle negativo ajustado para 10 µg/mL (concentração final) foi adicionado a isso em uma concentração de 50 µl/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 1 hora. As células efetoras preparadas no Exemplo 1)-5-3 foram adicionadas ainda a isso em uma concentração de 50 µl/poço. A placa foi centrifugada a 1200 rpm na temperatura ambiente durante 5 minutos, seguido por cultura a 37°C durante 18 horas sob condições de 5% de CO2. 50 µl do sobrenadante em cada poço foram recuperados em uma placa branca (Corning Inc.). Uma

180 / 286 solução de sistema de ensaio β-Glo (Promega Corp.) foi adicionada a isso em uma quantidade de 50 µl/poço. A intensidade de luminescência foi medida usando uma leitora de placa (ENVISION; PerkinElmer, Inc.). A porcentagem de células lisadas pela atividade de ADCC foi calculada de acordo com a seguinte expressão: Porcentagem de células lisadas (%) = (A - B) / (C - B) × 100 A: Contagem do poço de amostra B: Média da contagem de liberação espontânea (poços não suplementados nem com o anticorpo nem com as células efetoras) (n = 3). A mesma operação como no poço de amostra foi realizada exceto que 50 µL de um meio para ADCC foram adicionados ao invés do sobrenadante de cultura de hibridoma e das células efetoras.

[00586] C: Média de contagens de liberação máxima (poços contendo células alvo lisadas em um tensoativo) (n = 3). 50 µl de um meio para ADCC foram adicionados ao invés do sobrenadante de cultura de hibridoma e das células efetoras. Para o ensaio, 150 µL da solução do sistema de ensaio β-Glo foram adicionados a cada poço contendo as células e misturados com elas. Uma alíquota de 100 µL do mesmo foi adicionada a uma placa branca para realizar o ensaio.

[00587] A atividade de ADCC contra as células 293T-lacZ transfectadas com pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D ou as células 293T-lacZ transfectadas com pcDNA3.1-DEST foi calculada de acordo com o método descrito acima para selecionar clones de hibridoma que exibissem atividade de ADCC específica para as células 293T-lacZ transfectadas com pcDNA3.1- DEST-hGPRC5D e produzissem um anticorpo exibindo atividade de ADCC mais alta do que aquela do anticorpo de controle positivo. 1)-6 Isotipagem de anticorpo

[00588] 2A4, 2B1 e 7B4 sugestivos de ligação forte ao GPRC5D humano e tendo alta atividade de ADCC no Exemplo 1)-5 foram selecionados

181 / 286 dentre os hibridomas que produzem anticorpo antiGPRC5D de rato obtido no Exemplo 1)-4 e identificado pela isotipagem de anticorpo. Os isótipos foram determinados usando Kit de teste de isotipagem monoclonal de rato (AbD Serotec). Como um resultado, todos os isótipos dos anticorpos monoclonais antiGPRC5D de rato 2A4, 2B1 e 7B4 foram confirmados ser IgG2b e cadeias κ. 1)-7 Preparação de anticorpo monoclonal

[00589] O anticorpo monoclonal antiGPRC5D de rato foi purificado a partir do sobrenadante de cultura de hibridoma. Primeiro, o hibridoma que produz 2A4, 2B1 e 7B4 foi deixado crescer em uma quantidade suficiente em Meio de Seleção ClonaCell-HY E (StemCell Technologies Inc.). Depois, o meio foi substituído com um Hibridoma SFM (Thermo Fisher Scientific Inc.) contendo 5 µg/mL de gentamicina (Thermo Fisher Scientific Inc.) suplementado com 20% de Ultra Low IgG FBS (Thermo Fisher Scientific Inc.), seguidos por cultura durante 5 dias. Este sobrenadante de cultura foi recuperado e esterilizado através de um filtro de 0,45 µm.

[00590] Cada anticorpo foi purificado a partir do sobrenadante de hibridoma em uma etapa pela cromatografia de afinidade de proteína G (de 4 a 6°C). Uma etapa de substituição de tampão depois da purificação pela cromatografia de afinidade de proteína G foi realizada de 4 a 6°C. Primeiro, o sobrenadante de cultura de hibridoma foi aplicado a uma coluna empacotada com proteína G (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) equilibrado com PBS. Depois da entrada de todo a solução do sobrenadante de cultura dentro da coluna, a coluna foi lavada com PBS em uma quantidade de duas vezes ou mais o volume da coluna. Em seguida, as frações contendo anticorpo foram coletadas pela elução com uma solução aquosa de glicina a 0,1 M/ácido clorídrico (pH 2,7). As frações coletadas foram ajustadas para pH 7,0 a 7,5 pela adição de Tris 1 M-HCl (pH 9,0). Depois, o tampão foi substituído com HBSor (25 mM de histidina/5% de sorbitol, pH 6,0) usando Dispositivo de

182 / 286 Filtração UF Centrífugo VIVASPIN20 (corte de peso molecular: UF30K, Sartorius Japan K.K., de 4 a 6°C) enquanto o anticorpo foi concentrado e ajustado a uma concentração de anticorpo de 1 mg/mL ou mais alta. Finalmente, o concentrado foi filtrado através do filtro Minisart-Plus (Sartorius Japan K.K.) e usado como uma amostra purificada. Exemplo 2. Avaliação in vitro de anticorpos antiGPRC5D de rato (2A4, 2B1 e 7B4) 2)-1 Estudo sobre a atividade de ligação de anticorpos antiGPRC5D de rato obtidos (2A4, 2B1 e 7B4) contra GPRC5D humano pela citometria de fluxo

[00591] As células da linhagem de célula KHM-1B de mieloma múltiplo humano (JCRB Cell Bank) expressando GPRC5D foram ajustadas a uma concentração de 5 × 106 células/mL com PBS contendo 5% de FBS, inoculadas em uma quantidade de 100 µL/poço a uma microplaca com fundo em U de 96 poços e centrifugada para remover um sobrenadante. Cada anticorpo de rato antiGPRC5D (2A4, 2B1 e 7B4) ajustado para 0,32 ng/mL a 10 µg/mL no Exemplo 1)-7 foi adicionado a isso em uma quantidade de 100 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS. Depois, PE Ab de Cabra AntiRato (Becton, Dickinson and Company) diluído 100 vezes com PBS contendo 5% de FBS foi adicionado a isso em uma concentração de 100 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS, seguido por detecção usando um citômetro de fluxo (FACSCanto® II; Becton, Dickinson and Company). Os dados foram analisados usando Flowjo (Tree Star, Inc.). A intensidade de fluorescência de PE da fração de célula foi plotada em um histograma e a intensidade de fluorescência média (MFI) foi calculada. Como mostrado na Figura 1, 2A4, 2B1 e 7B4 foram verificados ligar-se ao GPRC5D humano (2A4 MFI (máx.): 1153, 2A4 Kd: 0,5 nM, 2B1 MFI (máx.): 2386, 2B1 Kd:

183 / 286 14,8 nM, 7B4 MFI (máx.): 2492, 7B4 Kd: 1,3 nM). A citometria de fluxo também foi realizada usando células da linhagem de célula KMS-34 de mieloma múltiplo humano (JCRB Cell Bank) expressando GPRC5D e produziram resultados similares (2A4 MFI (max): 2064, 2A4 Kd: 1,4 nM, 2B1 MFI (max): 3157, 2B1 Kd: 12,7 nM, 7B4 MFI (max): 4471, 7B4 Kd: 2,1 nM). 2)-2 Identificação de epítopo para anticorpos antiGPRC5D de rato obtidos (2A4, 2B1 e 7B4) 2)-2-1 Identificação de epítopo pelo ELISA

[00592] Os epítopos ligados pelos anticorpos antiGPRC5D de rato obtidos (2A4, 2B1 e 7B4) foram identificados usando um peptídeo de terminal amino de GPRC5D humano MYKDCIESTGDYFLLCDAEGPWGIILE(Biotina)-NH2 (Sigma-Aldrich Corp.) (SEQ ID NO: 1 da Listagem de Sequências; Figura 2) tendo um peptídeo de terminal carbóxi biotinilado e carecendo de uma ligação de dissulfeto intramolecularmente formada e um peptídeo de terminal amino de GPRC5D humano MYKDCIESTGDYFLLCDAEGPWGIILE-K(Biotina)- NH2 (Peptide Institute, Inc.) (SEQ ID NO: 2 da Listagem de Sequências; Figura 3) tendo um terminal carbóxi biotinilado contendo lisina e tendo uma ligação de dissulfeto intramolecularmente formada. Cada peptídeo diluído com PBS foi adicionado ao Nunc Immobilizer (Thermo Fisher Scientific Inc.) e a placa foi deixada repousar na temperatura ambiente durante 1 hora. Depois de lavar três vezes com PBST, FBS contendo 1% de BSA foi adicionado a isso e a placa foi deixada repousar na temperatura ambiente durante 1 hora. Depois de lavar três vezes com PBST, cada anticorpo de rato antiGPRC5D (2A4, 2B1 e 7B4) preparado no Exemplo 1)-7 e diluído de 0,1 ng/mL a 1 µg/mL com PBS foi adicionado a isso e a placa foi deixada repousar na temperatura ambiente durante 1 hora. Depois de lavar três vezes com PBST, Ab de Cabra AntiIgG de Rato Inteiro, Ligado a HRP (GE

184 / 286 Healthcare Bio-Sciences Corp.) diluído 500 vezes com PBS foi adicionado a isso e a placa foi deixada repousar na temperatura ambiente durante 1 hora. Depois de lavar três vezes com PBST, Substrato Quimioluminescente SuperSignal® ELISA Pico (Thermo Fisher Scientific Inc.) foi adicionado a isso e a luminescência foi medida usando uma leitora de placa (ENVISION; PerkinElmer, Inc.). Como um resultado, o anticorpo 2B1 ligou-se à sequência de peptídeo de terminal amino de GPRC5D humano ao passo que os anticorpos 2A4 e 7B4 não se a isso, independente da presença ou ausência de uma ligação de dissulfeto. Estes resultados sugeriram que o epítopo para o anticorpo 2B1 foi presente na região de terminal amino de GPRC5D humano enquanto os epítopos para os anticorpos 2A4 e 7B4 foram presente em regiões outras que não o terminal amino. 2)-2-2 Identificação de epítopo pela citometria de fluxo

[00593] As células da linhagem de célula KMS-34 de mieloma múltiplo humano que expressam GPRC5D foram ajustadas a uma concentração de 2 × 106 células/mL com PBS contendo 5% de FBS, inoculadas em uma quantidade de 100 µL/poço a um microplaca com fundo em U de 96 poços e centrifugada para remover um sobrenadante. Cada anticorpo de rato antiGPRC5D (2A4, 2B1 e 7B4) ajustadas para 7,5 µg/mL no Exemplo 1)-7 ou anticorpo de controle de isótipo de IgG2b de rato (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. (MBL)) foi adicionado a isso em uma quantidade de 100 µL/poço. Os dois tipos de peptídeos usados no Exemplo 2)-2-1 foram cada um ajustado para 17 ng/mL a 34 µg/mL com PBS e adicionados em uma quantidade de 100 µL/poço aos poços contendo a diluição de anticorpo e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS. Depois, PE Ab de Cabra AntiRato (Becton, Dickinson and Company) diluído 100 vezes com PBS contendo 5% de FBS foi adicionado a isso em uma quantidade de 100 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 1 hora. As células

185 / 286 foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS, seguido por detecção usando um citômetro de fluxo (FACSCanto® II; Becton, Dickinson and Company). Os dados foram analisados usando Flowjo (Tree Star, Inc.). A intensidade de fluorescência de PE da fração de célula foi plotada a um histograma e a intensidade de fluorescência média (MFI) foi calculada. O valor da MFI do anticorpo de controle foi subtraído do valor de MFI do anticorpo GPRC5D para calcular um valor relativo de MFI (rMFI). Como mostrado na Figura 4 (a ligação de dissulfeto intramolecular foi presente (A) ou ausente (B)), a ligação de 2B1 foi verificada ser inibida pela adição do peptídeo do terminal amino de GPRC5D humano, independente da presença ou ausência de uma ligação de dissulfeto. Ao contrário, a ligação dos anticorpos 2A4 e 7B4 foi verificada não ser inibida pela adição do peptídeo do terminal amino de GPRC5D humano. Estes resultados sugeriram que o epítopo para o anticorpo 2B1 foi presente na região de terminal amino de GPRC5D humano enquanto os epítopos para os anticorpos 2A4 e 7B4 foram presentes em regiões outras que não o terminal amino. 2)-3 Avaliação da atividade de ADCC de anticorpos antiGPRC5D de rato obtidos (2A4, 2B1 e 7B4) 2)-3-1 Preparação de célula alvo

[00594] As células da linhagem de célula KHM-1B de mieloma múltiplo humano foram ajustadas a uma concentração de 2 × 106 células/mL com um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS (Thermo Fisher Scientific Inc.). 100 µL de Radionuclídeo Cromo-51 (PerkinElmer, Inc.) foram adicionados por mL da suspensão de célula e as células foram cultivadas a 37°C durante 2 horas sob condições de 5% de CO2. As células foram lavadas três vezes com um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS, depois recolocadas em suspensão a 2 × 105 células/mL em um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS e usadas como células alvo.

186 / 286 2)-3-2 Preparação de célula efetora

[00595] A PBMC preparada no Exemplo 1)-5-3 foi diferenciada em células NK usando BINKIT (Biotherapy Institute of Japan). As células NK foram ajustadas para 1 × 106 células/mL com um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS e usadas como células efetoras. 2)-3-3 Ensaio de ADCC

[00596] As células KHM-1B preparadas no Exemplo 2)-3-1 foram adicionadas em uma concentração de 50 µL/poço a uma microplaca com fundo em U de 96 poços. Cada anticorpo de rato antiGPRC5D obtido (2A4, 2B1 e 7B4) ou um anticorpo de controle de rato (rIgG2b) ajustadas para 0,5081 ng/mL a 10 µg/mL (concentração final) foi adicionada a isso em uma quantidade de 50 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 30 minutos. As células efetoras preparadas no Exemplo 2)-3-2 foram adicionadas ainda a isso em uma quantidade de 100 µL/poço. Depois da centrifugação na temperatura ambiente a 1200 rpm durante 3 minutos, as células foram cultivadas a 37°C durante 4 horas sob condições de 5% de CO2. Uma alíquota de 50 µL do sobrenadante foi recuperada em LumaPlate (PerkinElmer, Inc.) e secada durante a noite a 50°C, seguida pela medição usando uma leitora de placa (TopCount; PerkinElmer, Inc.). A porcentagem de células lisadas pela atividade de ADCC foi calculada de acordo com o Exemplo 1)-5-5. Como mostrado na Figura 5, 2A4, 2B1 e 7B4 foram verificados ter atividade de ADCC. Exemplo 3. Sequenciamento de regiões variáveis que codificam cDNAs de anticorpos antiGPRC5D de rato (2A4, 2B1 e 7B4) 3)-1 Sequenciamento de regiões variáveis que codificam cDNAs de 2A4 3)-1-1 Preparação de RNA total de hibridoma que produz 2A4

[00597] De modo a amplificar os cDNAs que codificam as regiões variáveis de 2A4, o RNA total foi preparado a partir do hibridoma que produz 2A4 usando Reagente TRIzol (Ambion/Thermo Fisher Scientific Inc.).

187 / 286 3)-1-2 Síntese de cDNA (5’-RACE-Ready cDNA)

[00598] cDNAs (5’-RACE-Ready cDNAs) foram sintetizados usando aproximadamente 1 µg do RNA total preparado no Exemplo 3)-1-1 e o Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.). 3)-1-3 Amplificação e sequenciamento da cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada de 2A4 pela 5’-RACE PCR

[00599] Os iniciadores usados para a amplificação pela PCR do cDNA que codifica a região variável do gene de cadeia pesada de 2A4 foram oligonucleotídeos tendo as sequências de UPM (Mistura de Iniciador Universal A; acoplada ao Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE) e 5’-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3’ (RG2AR3: SEQ ID NO: 3 (Figura 6)). A UPM usada foi acoplada ao Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.), enquanto RG2AR3 foi planejado a partir das sequências da região constante de cadeias pesadas de rato registradas nas bases de dados

[00600] O cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada de 2A4 foi amplificado pela 5’-RACE PCR usando este conjunto de iniciadores e os cDNAs (5’-RACE-Ready cDNAs) sintetizados no Exemplo 3)-1-2 como padrões. Esta PCR foi realizada no programa Touchdown PCR de acordo com o manual do Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.).

[00601] O cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada amplificado pela 5’-RACE PCR foi purificado usando o Kit de Purificação pela PCR MinElute (Qiagen N.V.) e depois clonado usando o Kit de Clonagem pela PCR Zero Blunt TOPO (Invitrogen Corp.). A sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada clonado foi submetida à análise de sequência.

[00602] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada de 2A4 é mostrada na SEQ ID

188 / 286 NO: 4 (Figura 8) e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 5 (Figura 9). 3)-1-4 Amplificação e sequenciamento de cDNA que codifica região variável de cadeia leve de 2A4 pela 5’-RACE PCR

[00603] Os iniciadores usados para a amplificação pela PCR do cDNA que codifica a região variável do gene de cadeia leve 2A4 foram oligonucleotídeos tendo as sequências de UPM (Mistura de Iniciador Universal A; acopladas ao Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE) e 5’-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3’ (RKR5: SEQ ID NO: 10 (Figura 7)). A UPM usada foi acoplada ao Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.), enquanto RKR5 foi planejado a partir das sequências das regiões constantes de cadeia leve de rato registradas na base de dados.

[00604] O cDNA que codifica a região variável de cadeia leve de 2A4 foi amplificada pela 5’-RACE PCR usando este conjunto de iniciadores e os cDNAs (5’-RACE-Ready cDNAs) sintetizados no Exemplo 3)-1-2 como padrões. Esta PCR foi realizada no programa Touchdown PCR de acordo com o manual do Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.).

[00605] O cDNA que codifica a região variável de cadeia leve amplificado pela 5’-RACE PCR foi purificado usando o Kit de Purificação pela PCR MinElute (Qiagen N.V.) e depois clonado usando o Kit de Clonagem pela PCR Zero Blunt TOPO (Invitrogen Corp.). A sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica a região variável de cadeia leve clonado foi submetido à análise de sequência.

[00606] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável de cadeia leve de 2A4 é mostrada na SEQ ID NO: 11 (Figura 14) e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 12 (Figura 15).

189 / 286 3)-2 Sequenciamento de cDNAs que codificam as regiões variáveis de 2B1

[00607] As sequências foram determinadas da mesma maneira como no Exemplo 3)-1.

[00608] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada de 2B1 é mostrada na SEQ ID NO: 6 (Figura 10) e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 7 (Figura 11). A sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica a região variável de cadeia leve é mostrada na SEQ ID NO: 13 (Figura 16) e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 14 (Figura 17). 3)-3 Sequenciamento de cDNAs que codificam as regiões variáveis de 7B4

[00609] As sequências foram determinadas da mesma maneira como no Exemplo 3)-1.

[00610] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada de 7B4 é mostrada na SEQ ID NO: 8 (Figura 12) e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 9 (Figura 13). A sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica a região variável de cadeia leve é mostrada na SEQ ID NO: 15 (Figura 18) e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 16 (Figura 19). Exemplo 4. Preparação de anticorpos antiGPRC5D quiméricos humanos (c2A4, c2B1 e c7B4) 4)-1 Construção de vetor de expressão de cadeia leve quimérico e humanizado pCMA-LK

[00611] Um plasmídeo pcDNA3,3-TOPO/LacZ (Invitrogen Corp.) foi digerido com enzimas de restrição XbaI e PmeI. O fragmento obtido de aproximadamente 5,4 kb foi fundido com um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA (mostrada na SEQ ID NO: 17 (Figura 20) da Listagem de Sequências) que codifica um sinal secretor da

190 / 286 cadeia leve humana e uma região constante da cadeia κ humana usando um Kit de clonagem pela PCR In-Fusion Advantage (Clontech Laboratories, Inc.) para preparar pcDNA3.3/LK.

[00612] A PCR foi realizada com pcDNA3.3/LK como um padrão usando um conjunto de iniciadores mostrado abaixo. O fragmento obtido de aproximadamente 3,8 kb foi fosforilado e depois autoligado para construir um vetor de expressão de cadeia leve quimérico e pCMA-LK humanizado tendo a sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de sinal, um sítio de clonagem e a região constante da cadeia κ humana, a jusante do promotor de CMV. Conjunto de iniciadores 5’-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3’ (3,3- F1: SEQ ID NO: 18 da Listagem de Sequências; Figura 21) 5’-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3’ (3,3- R1: SEQ ID NO: 19 da Listagem de Sequências; Figura 22) 4)-2 Construção de vetor de expressão de cadeia pesada tipo IgG1 quimérico e humanizado pCMA-G1

[00613] O pCMA-LK foi digerido com XbaI e PmeI. O fragmento obtido de DNA exceto para a sequência de DNA que codifica o sinal secretor de cadeia leve e a região constante de cadeia κ humana foi fundida com um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA (mostrada na SEQ ID NO: 20 (Figura 23) da Listagem de Sequências) que codifica os aminoácidos de uma sequência de sinal de cadeia pesada humana e uma região constante da IgG1 humana usando o kit de clonagem de PCR In-Fusion Advantage (Clontech Laboratories, Inc.) para construir um vetor de expressão de cadeia pesada tipo IgG1 quimérico e humanizado pCMA-G1 tendo a sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de sinal, um sítio de clonagem e a região constante de cadeia pesada da IgG1 humana, a jusante do promotor de CMV.

191 / 286 4)-3 Construção do vetor de expressão de cadeia leve c2A4

[00614] Um fragmento de DNA compreendendo um cDNA que codifica a região variável de cadeia leve foi amplificado pela PCR usando o cDNA que codifica a região variável de cadeia leve de 2A4 obtido no Exemplo 3) como um padrão e um conjunto de iniciadores mostrado abaixo e inserido no sítio clivado pela enzima de restrição BsiWI do vetor de expressão de cadeia leve do anticorpo quimérico e humanizado pCMA-LK usando O kit de clonagem pela PCR In-Fusion Advantage (Clontech Laboratories, Inc.) para construir um vetor de expressão de cadeia leve de c2A4. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA-LK/c2A4”. A sequência de nucleotídeos da cadeia leve de c2A4 e a sequência de aminoácidos desta cadeia leve são mostradas nas SEQ ID NOs: 21 e 22 (Figuras 24 e 25), respectivamente, da Listagem de Sequências. Conjunto de iniciadores para c2A4 cadeia leve 5’-ATCTCCGGCGCGTACGGCGACATCCAGATGACACA GTCTCCAGC-3’ (c2A4-LF: SEQ ID NO: 23 da Listagem de Sequências; Figura 26) 5’-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAATTCCAGCT TGGTGCCTC-3’ (c2A4-LR: SEQ ID NO: 24 da Listagem de Sequências; Figura 27) 4)-4 Construção de vetor de expressão da cadeia pesada de c2A4

[00615] Um fragmento de DNA compreendendo um cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada foi amplificado pela PCR usando o cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada de 2A4 obtido no Exemplo 3) como um padrão e um conjunto de iniciadores mostrados abaixo e inseridos no sítio clivado pela enzima de restrição BIpI do vetor de expressão da cadeia pesada do anticorpo quimérico e humanizado pCMA-G1 usando o kit de clonagem pela PCR In-Fusion Advantage (Clontech Laboratories, Inc.) para construir um vetor de expressão da cadeia pesada de

192 / 286 c2A4. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA-G1/c2A4”. A sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de c2A4 e a sequência de aminoácidos desta cadeia pesada são mostradas nas SEQ ID NOs: 25 e 26 (Figuras 28 e 29), respectivamente, da Listagem de Sequências. Conjunto de iniciadores para a cadeia pesada de c2A4 5’-CCAGATGGGTGCTGAGCCAGGTCCAGTTGCAGCAA TCTGGAGCTG-3’ (c2A4-HF: SEQ ID NO: 27 da Listagem de Sequências; Figura 30) 5’-CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACTGTGACCATGACTC CTTGGCCCCAG-3’ (c2A4-HR: SEQ ID NO: 28 da Listagem de Sequências; Figura 31 4)-5 Construção de vetor de expressão da cadeia leve de c2B1

[00616] Um fragmento de DNA compreendendo o cDNA que codifica a região variável de cadeia leve foi amplificado pela PCR usando o cDNA que codifica a região variável de cadeia leve de 2B1 obtido no Exemplo 3) como um padrão e um conjunto de iniciadores mostrado abaixo. Um vetor de expressão da cadeia leve de c2B1 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 4)-3. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA- LK/c2B1”. A sequência de nucleotídeos da cadeia leve de c2B1 e a sequência de aminoácidos desta cadeia leve são mostradas nas SEQ ID NOs: 29 e 30 (Figuras 32 e 33), respectivamente, da Listagem de Sequências. Conjunto de iniciadores para cadeia leve de c2B1 5’-ATCTCCGGCGCGTACGGCGAAACTGTGATGACCCA GTCTCCCAC-3’ (c2B1-LF: SEQ ID NO: 31 da Listagem de Sequências; Figura 34) 5’-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAATTCCAGCT TGGTGCCTC-3’ (c2B1-LR: SEQ ID NO: 32 da Listagem de Sequências; Figura 35) 4)-6 Construção de vetor de expressão da cadeia pesada de c2B1

193 / 286

[00617] Um fragmento de DNA compreendendo um cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada foi amplificado pela PCR usando o cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada de 2B1 obtido no Exemplo 3) como um padrão e um conjunto de iniciadores mostrados abaixo. Um vetor de expressão da cadeia pesada de c2B1 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 4)-4. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA-G1/c2B1”. A sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de c2B1 e a sequência de aminoácidos desta cadeia pesada são mostradas nas SEQ ID NOs: 33 e 34 (Figuras 36 e 37), respectivamente, da Listagem de Sequências. Conjunto de iniciadores para a cadeia pesada de c2B1 5’-CCAGATGGGTGCTGAGCCAGGTTACTCTGAAAGAG TCTGGCCCTG-3’ (c2B1-HF: SEQ ID NO: 35 da Listagem de Sequências; Figura 38) 5’-CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACAGTGACCAGAGTGC CTTGGCCCCAG-3’ (c2B1-HR: SEQ ID NO: 36 da Listagem de Sequências; Figura 39) 4)-7 Construção de vetor de expressão da cadeia leve de c7B4

[00618] Um fragmento de DNA compreendendo o cDNA que codifica a região variável de cadeia leve foi amplificado pela PCR usando o cDNA que codifica a região variável de cadeia leve de 7B4 obtido no Exemplo 3) como um padrão e um conjunto de iniciadores mostrado abaixo. Um vetor de expressão da cadeia leve de c7B4 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 4)-3. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA- LK/c7B4”. A sequência de nucleotídeos da cadeia leve de c7B4 e a sequência de aminoácidos desta cadeia leve são mostradas nas SEQ ID NOs: 37 e 38 (Figuras 40 e 41), respectivamente, da Listagem de Sequências. Conjunto de iniciadores para cadeia leve de c7B4 5’-ATCTCCGGCGCGTACGGCGACATCCAGATGACCCA

194 / 286 GTCTCCTTC-3’ (c7B4-LF: SEQ ID NO: 39 da Listagem de Sequências; Figura 42) 5’-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAGTTCCAGCT TGGTCCCAG-3’ (c7B4-LR: SEQ ID NO: 40 da Listagem de Sequências; Figura 43) 4)-8 Construção de vetor de expressão da cadeia pesada de c7B4

[00619] Um fragmento de DNA compreendendo um cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada foi amplificado pela PCR usando o cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada de 7B4 obtido no Exemplo 3) como um padrão e um conjunto de iniciadores mostrados abaixo. Um vetor de expressão da cadeia pesada de c7B4 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 4)-4. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA-G1/c7B4”. A sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de c7B4 e da sequência de aminoácidos desta cadeia pesada são mostradas nas SEQ ID NOs: 41 e 42 (Figuras 44 e 45), respectivamente, da Listagem de Sequências. Conjunto de iniciadores para a cadeia pesada de c7B4 5’-CCAGATGGGTGCTGAGCGAGATACACCTGCAGGA GTCAGGACCTG-3’ (c7B4-HF: SEQ ID NO: 43 da Listagem de Sequências; Figura 46) 5’-CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACAGTGACTGAAGCTC CTTGACCCCAG-3’ (c7B4-HR: SEQ ID NO: 44 da Listagem de Sequências; Figura 47) 4)-9 Preparação de anticorpo antiGPRC5D humano quimérico 4)-9-1 Produção de anticorpo antiGPRC5D humano quimérico

[00620] Células FreeStile 293F (Invitrogen Corp.) foram subcultivadas e cultivadas de acordo com o manual. 1,2 × 109 células FreeStile 293F (Invitrogen Corp.) na fase de crescimento logarítmico foram inoculadas a um Frasco Erlenmeyer Fernbach de 3 L (Corning Inc.), ajustadas para 2,0 × 106

195 / 286 células/ml pela diluição com meio de expressão FreeStile 293 (Invitrogen Corp.) e depois cultivadas com agitação a 90 rpm a 37°C durante 1 hora em um incubador com 8% de CO2. 1,8 mg de polietilenoimina (Polisciences #24765) foi dissolvido em 20 ml de meio Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). Em seguida, cada vetor de expressão da cadeia pesada (0,24 mg) e vetor de expressão de cadeia leve (0,36 mg) preparados usando NucleoBond Xtra (Takara Bio Inc.) foram adicionados a +20 ml de meio Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). 20 ml de solução mista do vetor de expressão/Opti-Pro SFM foram adicionados a 20 ml da solução mista de polietilenoimina/Opti- Pro SFM e a mistura foi suavemente agitada, deixada durante 5 minutos e depois adicionada às células FreeStile 293F. As células foram cultivadas com agitação a 90 rpm a 37°C durante 4 horas em um incubador com 8 % de CO2. Depois, 600 ml de meio EX-CELL VPRO (SAFC Biosciences Inc.), 18 ml de GlutaMAX I (Gibco/Thermo Fisher Scientific Inc.) e 30 ml de Yeastolate Ultrafiltrado (Gibco/Thermo Fisher Scientific Inc.) foram adicionados a isso. As células foram cultivadas com agitação a 90 rpm a 37°C durante 7 dias em um incubador com 8 % de CO2 e o sobrenadante de cultura obtido foi filtrado através de Filtro de Cápsula Descartável (Advantec #CCS-045-E1H).

[00621] O 2A4 humano quimérico obtido pela combinação de pCMA- G1/c2A4 e pCMA-LK/c2A4 foi planejado como “c2A4”. O 2B1 humano quimérico obtido pela combinação de pCMA-G1/c2B1 e pCMA-LK/c2B1 foi planejado como “c2B1”. O 7B4 humano quimérico obtido pela combinação de pCMA-G1/c7B4 e pCMA-LK/c7B4 foi planejado como “c7B4”. 4)-9-2 Purificação de anticorpo antiGPRC5D humano quimérico

[00622] Cada anticorpo foi purificado a partir do sobrenadante de cultura obtido no Exemplo 4)-9-1 em uma etapa pela cromatografia de afinidade com a rProteína A (de 4 a 6°C). Uma etapa de reposição de tampão depois da purificação pela cromatografia de afinidade com a rProteína foi realizada de 4 a 6°C. O sobrenadante de cultura foi aplicado a uma coluna

196 / 286 empacotada com MabSelectSuRe (fabricado pela GE Healthcare Bio- Sciences Corp.) equilibrada com PBS. Depois da entrada da solução de cultura inteira dentro da coluna, a coluna foi lavada com PBS em uma quantidade de duas vezes ou mais o volume da coluna. Em seguida, as frações contendo anticorpo foram coletadas pela elução com uma solução 2 M de cloridreto de arginina (pH 4,0). As frações coletadas foram substituídas em tampão com HBSor (25 mM de histidina/5% de sorbitol, pH 6,0) pela diálise (Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette). O anticorpo foi concentrado e ajustado a uma concentração de IgG de 10 mg/ml ou superior usando o Dispositivo de Filtração Centrífuga UF VIVASPIN20 (corte de peso molecular: UF10K, Sartorius Japan K.K., 4°C) e usado como uma amostra purificada. Finalmente, esta amostra purificada foi filtrada através de filtro Minisart-Plus (Sartorius Japan K.K.). Exemplo 5. Atividade in vitro de anticorpos antiGPRC5D quiméricos humanos (c2A4, c2B1 e c7B4) 5)-1 Estudo sobre a atividade de ligação de anticorpos antiGPRC5D quiméricos humanos (c2A4, c2B1 e c7B4) contra GPRC5D humano pela citometria de fluxo

[00623] As células da linhagem de célula de mieloma múltiplo humano KHM-1B que expressam GPRC5D foram ajustadas a uma concentração de 5 × 106 células/mL com PBS contendo 5% de FBS, inoculadas em uma quantidade de 100 µL/poço a uma microplaca com fundo em U de 96 poços e centrifugada para remover um sobrenadante. Cada anticorpo antiGPRC5D humano quimérico (c2A4, c2B1 e c7B4) ou anticorpo de controle de isótipo de IgG humano (Calbiochem/Merck Millipore Corp.) ajustadas para 1,2 ng/mL a 40 µg/mL foi adicionado a isso em uma quantidade de 100 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS. Depois, R-Ficoeritrina AffiniPure Fragmento F(ab’)2 de IgG de Cabra Anti-Ser Humano, Fragmento Específico

197 / 286 de Fcγ (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) diluído 100 vezes com PBS contendo 5% de FBS foram adicionados a isso em uma quantidade de 100 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS, seguido por detecção usando um citômetro de fluxo (FACSCanto® II; Becton, Dickinson and Company). Os dados foram analisados usando Flowjo (Tree Star, Inc.). A intensidade de fluorescência de PE da fração de célula foi plotada a um histograma e a intensidade de fluorescência média (MFI) foi calculada. O valor da MFI do anticorpo de controle foi subtraído do valor de MFI do anticorpo GPRC5D para calcular um valor relativo de MFI (I). Como mostrado na Figura 48, c2A4, c2B1 e c7B4 foram verificados ligar-se ao GPRC5D humano. 5)-2 Estudo sobre a reatividade cruzada de anticorpos antiGPRC5D quiméricos humanos (c2A4, c2B1 e c7B4) com GPRC5D de macaco cinomolgo 5)-2-1 Construção do vetor de expressão de GPRC5D de macaco cinomolgo (pcDNA3.1-DEST-cGPRC5D)

[00624] Um cDNA que codifica a proteína de GPRC5D de macaco cinomolgo (XP_005570249,1) foi clonado no vetor pcDNA3.1-DEST preparado no Exemplo 1)-1-1 usando a mistura de Gateway LR Clonase Enzyme (Life Technologies Corp.) para construir um vetor de expressão de GPRC5D de macaco cinomolgo pcDNA3.1-DEST-cGPRC5D. Para a preparação em larga escala do vetor de expressão de GPRC5D de macaco cinomolgo, Endofree Plasmid Giga Kit (Qiagen N.V.) foi usado. 5)-2-2 Preparação de GPRC5D de macaco cinomolgo-expressando linhagem de célula

[00625] Um mieloma múltiplo linhagem de célula KMS-11 (JCRB Cell Bank) expressando no GPRC5D humano foi inoculado em uma

198 / 286 concentração de 3,7 × 105 células/mL a um frasco de 75 cm2 usando um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS. pcDNA3.1-DEST-cGPRC5D foi transfectado para as células KMS-11 usando Lipofectamina 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.) e as células foram cultivadas a 37°C durante 2 dias sob condições de 5% de CO2. As células KMS-11 cultivadas transfectada com vetor de expressão foram cultivadas em uma concentração de 1 × 106 células/mL em um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS e 1 mg/mL de Geneticina (Thermo Fisher Scientific Inc.) para a triagem de fármaco. As células volumosas foram preparadas como clones únicos pelo método da diluição limitante usando meio ClonaCell-HY Selection Medium E (StemCell Technologies Inc.) contendo 1 mg/mL de Geneticina (Thermo Fisher Scientific Inc.) para estabelecer uma linhagem de célula de mieloma múltiplo expressando GPRC5D de macaco cinomolgo KMS-11_cGPRC5D. 5)-2-3 Estudo sobre a atividade de ligação de anticorpos antiGPRC5D quiméricos humanos (c2A4, c2B1 e c7B4) contra GPRC5D de macaco cinomolgo pela citometria de fluxo

[00626] As células KMS-11_cGPRC5D preparadas no Exemplo 5)-2-2 foram ajustadas a uma concentração de 5 × 106 células/mL com PBS contendo 5% de FBS, inoculadas em uma quantidade de 100 µL/poço a uma microplaca com fundo em U de 96 poços e centrifugada para remover um sobrenadante. Cada anticorpo antiGPRC5D humano quimérico (c2A4, c2B1 e c7B4) ou anticorpo de controle de isótipo de IgG humano (Calbiochem/Merck Millipore Corp.) ajustados para 1,2 ng/mL a 40 µg/mL foram adicionados a isso em uma quantidade de 100 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS. Depois, R-Ficoeritrina AffiniPure Fragmento F(ab’)2 de IgG de Cabra Anti-Ser Humano IgG, Fragmento Específico de Fcγ (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) diluído 100 vezes com PBS contendo 5% de FBS foi adicionada a isso em uma quantidade de 100 µL/poço e a

199 / 286 placa foi deixada repousar a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS, seguido por detecção usando um citômetro de fluxo (FACSCanto® II; Becton, Dickinson and Company). Os dados foram analisados usando Flowjo (Tree Star, Inc.). A intensidade de fluorescência de PE da fração de célula foi plotada a um histograma e a intensidade de fluorescência média (MFI) foi calculada. O valor da MFI do anticorpo de controle foi subtraído do valor da MFI do anticorpo GPRC5D para calcular um valor relativo de MFI (rMFI). Como mostrado na Figura 49, c2A4, c2B1 e c7B4 foram verificados ligar-se ao GPRC5D de macaco cinomolgo. O anticorpo, etc. ligação ao GPRC5D humano e GPRC5D de macaco cinomolgo podem ser submetidos aos vários testes sobre eficácia ou segurança usando primatas, particularmente, macacos cinomolgos, úteis para o desenvolvimento não clínico (desenvolvimento pré-clínico) de produtos farmacêuticos e são assim preferidos. Também, o anticorpo, etc. ligação ao GPRC5D humano e GPRC5D de macaco cinomolgo têm atividade citotóxica e são úteis, sozinhos ou como a molécula da presente invenção, no tratamento ou prevenção de doenças tais como cânceres em macacos cinomolgos.

[00627] Como um resultado do estudo a reatividade cruzada de c2A4, c2B1 e c7B4 com GPRC5D de rato e GPRC5D de camundongo da mesma maneira como no Exemplo 5)-2, nenhum dos c2A4, c2B1 e c7B4 ligou ao GPRC5D de rato e GPRC5D de camundongo. Em virtude destes anticorpos c2A4, c2B1 e c7B4, vários ensaios, testes imunohistoquímicos, etc. usando células, tecidos ou indivíduos de camundongo ou rato transfectados com o gene de GPRC5D humano (incluindo animais transgênicos, animais knockout e animais knock-in) e o anticorpo, etc. podem ser realizados sem que sejam influenciados pelo GPRC5D dos camundongos hospedeiros. Assim, estes anticorpos são preferidos para a pesquisa e desenvolvimento não clínico, usando camundongos ou ratos, de fármacos, fármacos para animal ou

200 / 286 fármacos de diagnóstico, etc., compreendendo o anticorpo, etc. 5)-3 Atividade de ADCC de anticorpos antiGPRC5D quiméricos humanos (c2A4, c2B1 e c7B4)

[00628] As células KHM-1B preparadas no Exemplo 2)-3-1 foram adicionadas em uma quantidade de 50 µL/poço a um microplaca com fundo em U de 96 poços. Cada anticorpo antiGPRC5D humano quimérico purificado (c2A4, c2B1 e c7B4) preparado no Exemplo 4 ou um anticorpo de controle humano (hIgG1) (Calbiochem/Merck Millipore Corp.) ajustado para 0,64 ng/mL a 2 µg/mL (concentração final) foi adicionado a isso em uma quantidade de 50 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 30 minutos. As células efetoras (ajustadas para 3 × 106 células/mL) preparadas no Exemplo 1)-5-3 foram adicionadas ainda a isso em uma concentração de 100 µL/poço. Depois da centrifugação na temperatura ambiente a 1200 rpm durante 3 minutos, as células foram cultivadas a 37°C durante 4 horas sob condições de 5% de CO2. Uma alíquota de 50 µL do sobrenadante foi recuperada em LumaPlate (PerkinElmer, Inc.) e seca durante a noite a 50°C, seguida pela medição usando uma leitora de placa (TopCount; PerkinElmer, Inc.). A porcentagem de células lisadas pela atividade de ADCC foi calculada de acordo com o Exemplo 1)-5-5. Como mostrado na Figura 50, c2A4, c2B1 e c7B4 foram verificados ter atividade de ADCC. Exemplo 6. Atividade in vivo de anticorpos antiGPRC5D quiméricos humanos (c2A4, c2B1 e c7B4)

[00629] 1 × 107 células de uma linhagem de célula de mieloma múltiplo humano KHM-1B foram colocadas em suspensão em 100% de Matrigel (Becton, Dickinson and Company) e subcutaneamente transplantadas para a região axilar de cada camundongo BALB/c-nu/nu (CanN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj, adquirido da Charles River Laboratories Japan Inc.). Três e 10 dias depois do transplante, cada anticorpo antiGPRC5D humano quimérico (c2A4, c2B1 e c7B4) foi administrado em uma dose de 10

201 / 286 mg/kg às veias caudais dos camundongos portando câncer (n = 12 ou 11). O eixo maior e o eixo menor do tumor transplantado foram medidos duas vezes por semana usando um paquímetro digital eletrônico (fabricado pela Mitsutoyo Corp.). O volume do tumor foi calculado de acordo com a seguinte expressão: Volume do tumor (mm3) = 1/2 × Eixo menor (mm) × Eixo menor (mm) × Eixo maior (mm)

[00630] Os resultados sobre o anticorpo c2A4 são mostrados na Figura

51. A porcentagem de inibição do crescimento de tumor em 21 dias depois do transplante foi 96%.

[00631] Os resultados sobre o anticorpo c2B1 são mostrados na Figura

52. A porcentagem de inibição do crescimento de tumor em 21 dias depois do transplante foi 95%.

[00632] Os resultados sobre o anticorpo c7B4 são mostrados na Figura

53. A porcentagem de inibição do crescimento de tumor em 21 dias depois do transplante foi 94%. Exemplo 7. Planejamento de versões humanizadas (h2B1 e h7B4) de anticorpos antiGPRC5D quiméricos humanos (c2B1 e c7B4) 7)-1 Planejamento de forma humanizada de anticorpo antiGPRC5D 2B1 7)-1-1 Modelagem molecular de regiões variáveis 2B1

[00633] A modelagem molecular das regiões variáveis 2B1 foi realizada por um método geralmente conhecido como modelagem de homologia (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). As regiões variáveis de 2B1 determinadas acima foram comparadas com as sequências primárias (estruturas tridimensionais derivadas de estruturas cristalinas de raio X estão disponíveis) de regiões variáveis da imunoglobulina humana registradas no Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)). Como um resultado, 3MBX foi selecionado porque o mesmo teve a identidade de sequência mais alta para a região variável de cadeias pesada e

202 / 286 leve de 2B1. As estruturas tridimensionais de regiões de armação foram preparadas como um “modelo de armação” pela combinação das coordenadas de 3MBX correspondendo às cadeias pesadas e leves de 2B1. Subsequentemente, a conformação típica de cada CDR foi incorporada no modelo de armação. Finalmente, o cálculo de energia para excluir contato interatômico desvantajoso foi conduzido de modo a obter modelos moleculares possíveis das regiões variáveis 2B1 em termos de energia. Estes procedimentos foram realizados usando um programa de análise de estrutura tridimensional de proteína comercialmente disponível BioLuminate (fabricado pela Schrodinger, LLC). 7)-1-2 Planejamento de sequência de aminoácidos de h2B1 humanizado

[00634] h2B1 humanizado foi construído por um método geralmente conhecido como enxerto de CDR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029- 10033 (1989)). Um anticorpo aceitador foi selecionado com base na identidade de aminoácidos em regiões de armação.

[00635] As sequências das regiões de armação de 2B1 foram comparadas com as regiões de armação de sequências de consenso de subgrupo humano ou sequências da linha germinativa especificadas por KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Betesda, MD. (1991)). Como um resultado, as sequências da linha germinativa humana IGHV2_5x08 e IGHJ1x01 e uma sequência de consenso do subgrupo 2 da cadeia gama humana foram selecionadas como um aceitador de cadeia pesada enquanto que as sequências da linha germinativa humana IGKV1_8x01 e IGKJ4x01 e uma sequência de consenso do subgrupo 4 da cadeia capa humana foram selecionadas como aceitador de cadeia leve devido à sua alta identidade de sequência como para as regiões de armação. Os resíduos de aminoácido das regiões de armação dos aceitadores foram alinhados com os resíduos de aminoácido das regiões de armação 2B1 para identificar as

203 / 286 posições de aminoácidos que não casaram entre elas. As posições destes resíduos foram analisadas usando o modelo tridimensional de 2B1 construído acima. Depois, os resíduos doadores a serem enxertados nos aceitadores foram selecionados de acordo com os critérios providos por Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Alguns resíduos doadores assim selecionados foram transferidos para o anticorpo aceitador para construir a sequência h2B1 humanizada como descrita nos Exemplos abaixo. A cadeia pesada não foi limitada pelos resíduos doadores e dependendo de um sítio, resíduos de uma sequência de consenso do subgrupo 1 da cadeia gama foram transferidos para esta. 7)-1-3 Humanização de cadeia pesada de 2B1 7)-1-3-1 Cadeia pesada tipo h2B1_H1 humanizada

[00636] Uma cadeia pesada de h2B1 humanizado planejada a partir da cadeia pesada de c2B1 quimérico mostrada na SEQ ID NO: 34 pela substituição na região variável de treonina na posição de aminoácido 3 com glutamina, lisina na aminoácido posição 5 com valina, prolina na posição de aminoácido 9 com glicina, isoleucina na posição de aminoácido 11 com leucina, leucina na posição de aminoácido 12 com valina, glutamina na posição de aminoácido 13 com lisina, serina na posição de aminoácido 43 com prolina, leucina na posição de aminoácido 50 com isoleucina, alanina na posição de aminoácido 51 com glicina, arginina na posição de aminoácido 66 com lisina, asparagina na posição de aminoácido 67 com serina, leucina na posição de aminoácido 69 com valina, lisina na posição de aminoácido 73 com valina, asparagina na posição de aminoácido 77 com lisina, fenilalanina na posição de aminoácido 81 com serina, isoleucina na posição de aminoácido 84 com leucina, treonina na posição de aminoácido 85 com serina, asparagina na posição de aminoácido 86 com serina, ácido aspártico na posição de aminoácido 88 com treonina, treonina na posição de aminoácido 89 com alanina e treonina na posição de aminoácido 94 com valina foi planejada

204 / 286 como “cadeia pesada tipo h2B1_H1 humanizada” (também aludida como “h2B1_H1”).

[00637] A sequência de aminoácidos da cadeia pesada tipo h2B1_H1 humanizada está descrita na SEQ ID NO: 74 (Figura 83) da Listagem de Sequências. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74 está descrita na SEQ ID NO: 73 (Figura 82) da Listagem de Sequências. 7)-1-3-2 Cadeia pesada tipo h2B1_H2 humanizada

[00638] Uma cadeia pesada de h2B1 humanizada planejada a partir da cadeia pesada c2B1 quimérica mostrada na SEQ ID NO: 34 pela substituição na região variável de treonina na posição de aminoácido 3 com glutamina, lisina na posição de aminoácido 5 com valina, prolina na posição de aminoácido 9 com glicina, isoleucina na posição de aminoácido 11 com leucina, leucina na posição de aminoácido 12 com valina, glutamina na posição de aminoácido 13 com lisina, serina na posição de aminoácido 43 com prolina, leucina na posição de aminoácido 50 com isoleucina, alanina na posição de aminoácido 51 com glicina, arginina na posição de aminoácido 66 com lisina, asparagina na posição de aminoácido 67 com serina, leucina na posição de aminoácido 69 com valina, fenilalanina na posição de aminoácido 81 com serina, isoleucina na posição de aminoácido 84 com leucina, treonina na posição de aminoácido 85 com serina, asparagina na posição de aminoácido 86 com serina, ácido aspártico na posição de aminoácido 88 com treonina, treonina na posição de aminoácido 89 com alanina e treonina na posição de aminoácido 94 com valina foi planejada como “cadeia pesada tipo h2B1_H2 humanizada” (também aludida como “h2B1_H2”).

[00639] A sequência de aminoácidos da cadeia pesada tipo h2B1_H2 humanizada está descrita na SEQ ID NO: 76 (Figura 85) da Listagem de Sequências. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 está descrita na SEQ ID NO: 75 (Figura 84)

205 / 286 da Listagem de Sequências. 7)-1-3-3 Cadeia pesada tipo h2B1_H3 humanizada

[00640] Uma cadeia pesada de h2B1 humanizada planejada a partir da cadeia pesada c2B1 quimérica mostrada na SEQ ID NO: 34 pela substituição na região variável de treonina na posição de aminoácido 3 com glutamina, lisina na posição de aminoácido 5 com valina, prolina na posição de aminoácido 9 com glicina, isoleucina na posição de aminoácido 11 com leucina, leucina na posição de aminoácido 12 com valina, glutamina na posição de aminoácido 13 com lisina, serina na posição de aminoácido 43 com prolina, leucina na posição de aminoácido 50 com isoleucina, arginina na posição de aminoácido 66 com lisina, asparagina na posição de aminoácido 67 com serina, leucina na posição de aminoácido 69 com valina, fenilalanina na posição de aminoácido 81 com serina, isoleucina na posição de aminoácido 84 com leucina, treonina na posição de aminoácido 85 com serina, asparagina na posição de aminoácido 86 com serina, ácido aspártico na posição de aminoácido 88 com treonina, treonina na posição de aminoácido 89 com alanina e treonina na posição de aminoácido 94 com valina foi planejada como “h2B1 humanizado_H3 tipo cadeia pesada” (também aludida como “h2B1_H3”).

[00641] A sequência de aminoácidos da cadeia pesada tipo h2B1_H3 humanizada está descrita na SEQ ID NO: 78 (Figura 87) da Listagem de Sequências. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78 está descrita na SEQ ID NO: 77 (Figura 86) da Listagem de Sequências. 7)-1-3-4 Cadeia pesada tipo h2B1_H4 humanizada

[00642] Uma cadeia pesada de h2B1 humanizada planejada a partir da cadeia pesada c2B1 quimérica mostrada na SEQ ID NO: 34 pela substituição na região variável de glicina na posição de aminoácido 10 com alanina, isoleucina na posição de aminoácido 11 com leucina, leucina na posição de

206 / 286 aminoácido 12 com valina, glutamina na posição de aminoácido 13 com lisina, serina na posição de aminoácido 15 com treonina, serina na posição de aminoácido 19 com treonina, serina na posição de aminoácido 43 com prolina, asparagina na posição de aminoácido 62 com serina, arginina na posição de aminoácido 66 com lisina, asparagina na posição de aminoácido 67 com serina, serina na posição de aminoácido 72 com treonina, fenilalanina na posição de aminoácido 81 com valina, lisina na posição de aminoácido 83 com treonina, isoleucina na posição de aminoácido 84 com metionina, valina na posição de aminoácido 87 com metionina, treonina na posição de aminoácido 89 com prolina e alanina na posição de aminoácido 90 com valina foi planejada como “cadeia pesada tipo h2B1_H4 humanizada” (também aludida como “h2B1_H4”).

[00643] A sequência de aminoácidos da cadeia pesada tipo h2B1_H4 humanizada está descrita na SEQ ID NO: 80 (Figura 89) da Listagem de Sequências. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 está descrita na SEQ ID NO: 79 (Figura 88) da Listagem de Sequências. 7)-1-4 Humanização de cadeia leve de 2B1 7)-1-4-1 cadeia leve tipo h2B1_L1 humanizada

[00644] Uma cadeia leve de h2B1 humanizada planejada a partir da cadeia leve de c2B1 quimérica mostrada na SEQ ID NO: 30 pela substituição na região variável de ácido glutâmico na posição de aminoácido 1 com ácido aspártico, treonina na posição de aminoácido 9 com ácido aspártico, metionina na posição de aminoácido 11 com leucina, serina na posição de aminoácido 12 com alanina, treonina na posição de aminoácido 13 com valina, isoleucina na posição de aminoácido 15 com leucina, valina na posição de aminoácido 19 com alanina, leucina na posição de aminoácido 21 com isoleucina, treonina na posição de aminoácido 39 com lisina, serina na posição de aminoácido 43 com prolina, treonina na posição de aminoácido 63

207 / 286 com serina, fenilalanina na posição de aminoácido 67 com serina, asparagina na posição de aminoácido 77 com serina, valina na posição de aminoácido 78 com leucina, ácido glutâmico na posição de aminoácido 79 com glutamina, leucina na posição de aminoácido 83 com valina, glicina na posição de aminoácido 100 com glutamina, leucina na posição de aminoácido 104 com valina e leucina na posição de aminoácido 106 com isoleucina foi planejada como “cadeia leve tipo h2B1_L1 humanizada” (também aludida como “h2B1_L1”).

[00645] A sequência de aminoácidos da cadeia leve tipo h2B1_L1 humanizada está descrita na SEQ ID NO: 64 (Figura 73) da Listagem de Sequências. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 64 está descrita na SEQ ID NO: 63 (Figura 72) da Listagem de Sequências. 7)-1-4-2 Cadeia leve tipo h2B1_L2 humanizada

[00646] Uma cadeia leve de h2B1 humanizada planejada a partir da cadeia leve de c2B1 quimérica mostrada na SEQ ID NO: 30 pela substituição na região variável de ácido glutâmico na posição de aminoácido 1 com ácido aspártico, treonina na posição de aminoácido 9 com ácido aspártico, metionina na posição de aminoácido 11 com leucina, serina na posição de aminoácido 12 com alanina, treonina na posição de aminoácido 13 com valina, isoleucina na posição de aminoácido 15 com leucina, valina na posição de aminoácido 19 com alanina, leucina na posição de aminoácido 21 com isoleucina, treonina na posição de aminoácido 39 com lisina, serina na posição de aminoácido 43 com prolina, treonina na posição de aminoácido 63 com serina, arginina na posição de aminoácido 69 com treonina, asparagina na posição de aminoácido 77 com serina, valina na posição de aminoácido 78 com leucina, ácido glutâmico na posição de aminoácido 79 com glutamina, leucina na posição de aminoácido 83 com valina, glicina na posição de aminoácido 100 com glutamina, leucina na posição de aminoácido 104 com

208 / 286 valina e leucina na posição de aminoácido 106 com isoleucina foi planejada como “cadeia leve tipo h2B1_L2 humanizada” (também aludida como “h2B1_L2”).

[00647] A sequência de aminoácidos da cadeia leve tipo h2B1_L2 humanizada está descrita na SEQ ID NO: 66 (Figura 75) da Listagem de Sequências. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66 está descrita na SEQ ID NO: 65 (Figura 74) da Listagem de Sequências. 7)-1-4-3 cadeia leve tipo h2B1_L3 humanizada

[00648] Uma cadeia leve de h2B1 humanizada planejada a partir da cadeia leve de c2B1 quimérica mostrada na SEQ ID NO: 30 pela substituição na região variável de ácido glutâmico na posição de aminoácido 1 com ácido aspártico, treonina na posição de aminoácido 9 com ácido aspártico, metionina na posição de aminoácido 11 com leucina, serina na posição de aminoácido 12 com alanina, treonina na posição de aminoácido 13 com valina, isoleucina na posição de aminoácido 15 com leucina, valina na posição de aminoácido 19 com alanina, leucina na posição de aminoácido 21 com isoleucina, treonina na posição de aminoácido 39 com lisina, serina na posição de aminoácido 43 com prolina, treonina na posição de aminoácido 63 com serina, asparagina na posição de aminoácido 77 com serina, valina na posição de aminoácido 78 com leucina, ácido glutâmico na posição de aminoácido 79 com glutamina, leucina na posição de aminoácido 83 com valina, glicina na posição de aminoácido 100 com glutamina, leucina na posição de aminoácido 104 com valina e leucina na posição de aminoácido 106 com isoleucina foi planejada como “cadeia leve tipo h2B1_L3 humanizada” (também aludida como “h2B1_L3”).

[00649] A sequência de aminoácidos da cadeia leve tipo h2B1_L3 humanizada está descrita na SEQ ID NO: 68 (Figura 77) da Listagem de Sequências. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de

209 / 286 aminoácidos da SEQ ID NO: 68 está descrita na SEQ ID NO: 67 (Figura 76) da Listagem de Sequências. 7)-1-4-4 cadeia leve tipo h2B1_L4 humanizada

[00650] Uma cadeia leve de h2B1 humanizada planejada a partir da cadeia leve de c2B1 quimérica mostrada na SEQ ID NO: 30 pela substituição na região variável de ácido glutâmico na posição de aminoácido 1 com ácido aspártico, treonina na posição de aminoácido 9 com ácido aspártico, metionina na posição de aminoácido 11 com leucina, serina na posição de aminoácido 12 com alanina, treonina na posição de aminoácido 13 com valina, isoleucina na posição de aminoácido 15 com leucina, valina na posição de aminoácido 19 com alanina, leucina na posição de aminoácido 21 com isoleucina, treonina na posição de aminoácido 39 com lisina, treonina na posição de aminoácido 63 com serina, asparagina na posição de aminoácido 77 com serina, valina na posição de aminoácido 78 com leucina, ácido glutâmico na posição de aminoácido 79 com glutamina, leucina na posição de aminoácido 83 com valina, glicina na posição de aminoácido 100 com glutamina, leucina na posição de aminoácido 104 com valina e leucina na posição de aminoácido 106 com isoleucina foi planejada como “cadeia leve tipo h2B1_L4 humanizada” (também aludida como “h2B1_L4”).

[00651] A sequência de aminoácidos da cadeia leve tipo h2B1_L4 humanizada está descrita na SEQ ID NO: 70 (Figura 79) da Listagem de Sequências. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70 está descrita na SEQ ID NO: 69 (Figura 78) da Listagem de Sequências. 7)-1-4-5 cadeia leve tipo h2B1_L5 humanizada

[00652] Uma cadeia leve de h2B1 humanizada planejada a partir da cadeia leve de c2B1 quimérica mostrada na SEQ ID NO: 30 pela substituição na região variável de ácido glutâmico na posição de aminoácido 1 com alanina, valina na posição de aminoácido 3 com arginina, treonina na posição

210 / 286 de aminoácido 9 com serina, metionina na posição de aminoácido 11 com fenilalanina, treonina na posição de aminoácido 13 com alanina, isoleucina na posição de aminoácido 15 com treonina, ácido glutâmico na posição de aminoácido 17 com ácido aspártico, leucina na posição de aminoácido 21 com isoleucina, asparagina na posição de aminoácido 22 com treonina, treonina na posição de aminoácido 39 com lisina, glutamina na posição de aminoácido 42 com lisina, ácido aspártico na posição de aminoácido 60 com serina, treonina na posição de aminoácido 63 com serina, asparagina na posição de aminoácido 77 com serina, valina na posição de aminoácido 78 com leucina, ácido glutâmico na posição de aminoácido 79 com glutamina, alanina na posição de aminoácido 80 com serina, leucina na posição de aminoácido 83 com fenilalanina, valina na posição de aminoácido 85 com treonina, leucina na posição de aminoácido 104 com valina e leucina na posição de aminoácido 106 com isoleucina foi planejada como “cadeia leve tipo h2B1_L5 humanizada” (também aludida como “h2B1_L5”).

[00653] A sequência de aminoácidos da cadeia leve tipo h2B1_L5 humanizada está descrita na SEQ ID NO: 72 (Figura 81) da Listagem de Sequências. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72 está descrita na SEQ ID NO: 71 (Figura 80) da Listagem de Sequências. 7)-2 Planejamento de forma humanizada de anticorpo antiGPRC5D 7B4 7)-2-1 Modelagem molecular de regiões variáveis de 7B4

[00654] A modelagem molecular das regiões variáveis de 7B4 foi realizada por um método geralmente conhecido como modelagem de homologia (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). As regiões variáveis de 7B4 determinadas acima foram comparadas com as sequências primárias (estruturas tridimensionais derivadas das estruturas cristalinas de raio X estão disponíveis) das regiões variáveis da imunoglobulina humana registradas no Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)).

211 / 286 Como um resultado, 1BGX foi selecionado porque o mesmo teve a identidade de sequência mais alta para a região variável de cadeias pesada e leve de 7B4. As estruturas tridimensionais de regiões de armação foram preparadas como um “modelo de armação” pela combinação das coordenadas de 1BGX correspondentes às cadeias pesadas e leves de 7B4. Subsequentemente, a conformação típica de cada CDR foi incorporada no modelo de armação. Finalmente, o cálculo de energia para excluir contato interatômico desvantajoso foi conduzido de modo a obter modelos moleculares possíveis das regiões variáveis de 7B4 em termos de energia. Estes procedimentos foram realizados usando um programa de análise tridimensional de estrutura de proteína comercialmente disponível BioLuminate (Schrodinger, LLC). 7)-2-2 Planejamento de sequência de aminoácidos de h7B4 humanizado

[00655] h7B4 humanizado foi construído por um método geralmente conhecido como enxerto de CDR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029- 10033 (1989)). Um anticorpo aceitador foi selecionado com base na identidade de aminoácidos nas regiões de armação.

[00656] As sequências das regiões de armação de 7B4 foram comparadas com as regiões de armação de sequências de consenso de subgrupo humano ou sequências da linha germinativa especificadas em KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Betesda, MD. (1991)). Como um resultado, uma sequência de consenso de subgrupo 2 da cadeia gama humana foi selecionada como um aceitador de cadeia pesada enquanto uma sequência de consenso de subgrupo 3 de cadeia capa humana foi selecionada como aceitador de cadeia leve devido à sua alta identidade de sequência como as regiões de armação. Os resíduos de aminoácido das regiões de armação dos aceitadores foram alinhados com os resíduos de aminoácido das regiões de armação 7B4 para identificar as posições de aminoácidos que não casaram entre si. As posições destes resíduos foram

212 / 286 analisadas usando o modelo tridimensional de 7B4 construído acima. Depois, os resíduos doadores a serem enxertados nos aceitadores foram selecionados de acordo com os critérios providos em Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Alguns resíduos doadores assim selecionados foram transferidos para o anticorpo aceitador para construir a sequência de h7B4 humanizada como descrito nos Exemplos abaixo. A cadeia leve não foi limitada pelos resíduos doadores e dependendo de um sítio, os resíduos de uma sequência de consenso de subgrupo 1 da cadeia capa foram transferidos a isso. 7)-2-3 Humanização de cadeia pesada de 7B4 7)-2-3-1 Cadeia pesada tipo h7B4_H1 humanizada

[00657] Uma cadeia pesada de h7B4 humanizada planejada a partir da cadeia pesada de c7B4 quimérica mostrada na SEQ ID NO: 42 pela substituição na região variável de ácido glutâmico na posição de aminoácido 1 com glutamina, isoleucina na posição de aminoácido 2 com valina, histidina na posição de aminoácido 3 com glutamina, serina na posição de aminoácido 17 com treonina, serina na posição de aminoácido 23 com treonina, treonina na posição de aminoácido 25 com serina, lisina na posição de aminoácido 40 com glutamina, fenilalanina na posição de aminoácido 41 com prolina, asparagina na posição de aminoácido 44 com lisina, lisina na posição de aminoácido 45 com glicina, metionina na posição de aminoácido 46 com leucina, metionina na posição de aminoácido 49 com isoleucina, isoleucina na posição de aminoácido 68 com valina, serina na posição de aminoácido 69 com treonina, treonina na posição de aminoácido 71 com serina, fenilalanina na posição de aminoácido 80 com serina, glutamina na posição de aminoácido 82 com lisina, asparagina na posição de aminoácido 84 com serina, treonina na posição de aminoácido 88 com alanina, ácido glutâmico na posição de aminoácido 89 com alanina, treonina na posição de aminoácido 93 com valina, alanina na posição de aminoácido 117 com treonina e serina na

213 / 286 posição de aminoácido 118 com leucina foi planejada como “cadeia pesada tipo h7B4_H1 humanizada” (também aludida como “h7B4_H1”).

[00658] A sequência de aminoácidos da cadeia pesada tipo h7B4_H1 humanizada está descrita na SEQ ID NO: 86 (Figura 95) da Listagem de Sequências. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 86 está descrita na SEQ ID NO: 85 (Figura 94) da Listagem de Sequências. 7)-2-3-2 Cadeia pesada tipo h7B4_H2 humanizada

[00659] Uma cadeia pesada de h7B4 humanizada planejada a partir da cadeia pesada de c7B4 quimérica mostrada na SEQ ID NO: 42 pela substituição na região variável de histidina na posição de aminoácido 3 com glutamina, serina na posição de aminoácido 17 com treonina, serina na posição de aminoácido 23 com treonina, treonina na posição de aminoácido 25 com serina, lisina na posição de aminoácido 40 com glutamina, fenilalanina na posição de aminoácido 41 com prolina, asparagina na posição de aminoácido 44 com lisina, lisina na posição de aminoácido 45 com glicina, metionina na posição de aminoácido 46 com leucina, metionina na posição de aminoácido 49 com isoleucina, alanina na posição de aminoácido 50 com glicina, isoleucina na posição de aminoácido 68 com valina, serina na posição de aminoácido 69 com treonina, treonina na posição de aminoácido 71 com serina, fenilalanina na posição de aminoácido 80 com serina, glutamina na posição de aminoácido 82 com lisina, asparagina na posição de aminoácido 84 com serina, treonina na posição de aminoácido 88 com alanina, ácido glutâmico na posição de aminoácido 89 com alanina, treonina na posição de aminoácido 93 com valina, alanina na posição de aminoácido 117 com treonina e serina na posição de aminoácido 118 com leucina foi planejada como “cadeia pesada tipo h7B4_H2 humanizada” (também aludida como “h7B4_H2”).

[00660] A sequência de aminoácidos da cadeia pesada tipo h7B4_H2

214 / 286 humanizada está descrita na SEQ ID NO: 88 (Figura 97) da Listagem de Sequências. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88 está descrita na SEQ ID NO: 87 (Figura 96) da Listagem de Sequências. 7)-2-3-3 Cadeia pesada tipo h7B4_H3 humanizada

[00661] Uma cadeia pesada de h7B4 humanizada planejada a partir da cadeia pesada de c7B4 quimérica mostrada na SEQ ID NO: 42 pela substituição na região variável de histidina na posição de aminoácido 3 com glutamina, serina na posição de aminoácido 17 com treonina, serina na posição de aminoácido 23 com treonina, treonina na posição de aminoácido 25 com serina, lisina na posição de aminoácido 40 com glutamina, fenilalanina na posição de aminoácido 41 com prolina, asparagina na posição de aminoácido 44 com lisina, lisina na posição de aminoácido 45 com glicina, metionina na posição de aminoácido 46 com leucina, metionina na posição de aminoácido 49 com isoleucina, isoleucina na posição de aminoácido 68 com valina, serina na posição de aminoácido 69 com treonina, treonina na posição de aminoácido 71 com serina, fenilalanina na posição de aminoácido 80 com serina, glutamina na posição de aminoácido 82 com lisina, asparagina na posição de aminoácido 84 com serina, treonina na posição de aminoácido 88 com alanina, ácido glutâmico na posição de aminoácido 89 com alanina, treonina na posição de aminoácido 93 com valina, alanina na posição de aminoácido 117 com treonina e serina na posição de aminoácido 118 com leucina foi planejada como “cadeia pesada tipo h7B4_H3 humanizada” (também aludida como “h7B4_H3”).

[00662] A sequência de aminoácidos da cadeia pesada tipo h7B4_H3 humanizada está descrita na SEQ ID NO: 90 (Figura 99) da Listagem de Sequências. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 90 está descrita na SEQ ID NO: 89 (Figura 98) da Listagem de Sequências.

215 / 286 7)-2-3-4 Cadeia pesada tipo h7B4_H5 humanizada

[00663] Uma cadeia pesada de h7B4 humanizada planejada a partir da cadeia pesada de c7B4 quimérica mostrada na SEQ ID NO: 42 pela substituição na região variável de histidina na posição de aminoácido 3 com glutamina, serina na posição de aminoácido 17 com treonina, serina na posição de aminoácido 23 com treonina, treonina na posição de aminoácido 25 com serina, fenilalanina na posição de aminoácido 41 com prolina, metionina na posição de aminoácido 49 com isoleucina, isoleucina na posição de aminoácido 68 com valina, serina na posição de aminoácido 69 com treonina, treonina na posição de aminoácido 71 com serina, fenilalanina na posição de aminoácido 80 com serina, glutamina na posição de aminoácido 82 com lisina, asparagina na posição de aminoácido 84 com serina, treonina na posição de aminoácido 88 com alanina, ácido glutâmico na posição de aminoácido 89 com alanina, treonina na posição de aminoácido 93 com valina, alanina na posição de aminoácido 117 com treonina e serina na posição de aminoácido 118 com leucina foi planejada como “cadeia pesada tipo h7B4_H5 humanizada” (também aludida como “h7B4_H5”).

[00664] A sequência de aminoácidos da cadeia pesada tipo h7B4_H5 humanizada está descrita na SEQ ID NO: 92 (Figura 101) da Listagem de Sequências. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 92 está descrita na SEQ ID NO: 91 (Figura 100) da Listagem de Sequências. 7)-2-4 Humanização da cadeia leve de 7B4 7)-2-4-1 Cadeia leve tipo h7B4_L1 humanizada

[00665] Uma cadeia leve de h7B4 humanizada planejada a partir da cadeia leve de c7B4 quimérica mostrada na SEQ ID NO: 38 pela substituição na região variável de ácido aspártico na posição de aminoácido 1 com ácido glutâmico, glutamina na posição de aminoácido 3 com valina, metionina na posição de aminoácido 4 com leucina, serina na posição de aminoácido 9 com

216 / 286 glicina, fenilalanina na posição de aminoácido 10 com treonina, alanina na posição de aminoácido 13 com leucina, valina na posição de aminoácido 15 com prolina, valina na posição de aminoácido 19 com alanina, leucina na posição de aminoácido 40 com prolina, ácido glutâmico na posição de aminoácido 42 com glutamina, lisina na posição de aminoácido 45 com arginina, serina na posição de aminoácido 60 com ácido aspártico, glicina na posição de aminoácido 77 com arginina, glutamina na posição de aminoácido 79 com ácido glutâmico, valina na posição de aminoácido 83 com fenilalanina, treonina na posição de aminoácido 85 com valina, fenilalanina na posição de aminoácido 87 com tirosina, alanina na posição de aminoácido 99 com glutamina, leucina na posição de aminoácido 103 com valina e leucina na posição de aminoácido 105 com isoleucina foi planejada como “cadeia leve tipo h7B4_L1 humanizada” (também aludida como “h7B4_L1”).

[00666] A sequência de aminoácidos da cadeia leve tipo h7B4_L1 humanizada está descrita na SEQ ID NO: 82 (Figura 91) da Listagem de Sequências. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82 está descrita na SEQ ID NO: 81 (Figura 90) da Listagem de Sequências. 7)-2-4-2 Cadeia leve tipo h7B4_L2 humanizada

[00667] Uma cadeia leve de h7B4 humanizada planejada a partir da cadeia leve de c7B4 quimérica mostrada na SEQ ID NO: 38 pela substituição na região variável de fenilalanina na posição de aminoácido 10 com serina, alanina na posição de aminoácido 13 com leucina, valina na posição de aminoácido 15 com prolina, valina na posição de aminoácido 19 com alanina, leucina na posição de aminoácido 40 com prolina, ácido glutâmico na posição de aminoácido 42 com glutamina, lisina na posição de aminoácido 45 com arginina, serina na posição de aminoácido 60 com ácido aspártico, glicina na posição de aminoácido 77 com arginina, glutamina na posição de aminoácido 79 com ácido glutâmico, valina na posição de aminoácido 83 com

217 / 286 fenilalanina, treonina na posição de aminoácido 85 com valina, fenilalanina na posição de aminoácido 87 com tirosina, alanina na posição de aminoácido 99 com glutamina, leucina na posição de aminoácido 103 com valina e leucina na posição de aminoácido 105 com isoleucina foi planejada como “cadeia leve tipo h7B4_L2 humanizada” (também aludida como “h7B4_L2”).

[00668] A sequência de aminoácidos da cadeia leve tipo h7B4_L2 humanizada está descrita na SEQ ID NO: 84 (Figura 93) da Listagem de Sequências. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84 está descrita na SEQ ID NO: 83 (Figura 92) da Listagem de Sequências. Exemplo 8. Construção de vetores de expressão para anticorpos humanizados (h2B1 e h7B4) de anticorpos de rato antiGPRC5D humano (2B1 e 7B4) e preparação de anticorpos 8)-1 Construção de vetor de expressão da cadeia pesada de h2B1 8)-1-1 Construção de cadeia pesada tipo h2B1_H1

[00669] Um fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a região variável de h2B1_H1 representada pelas posições de nucleotídeo 58 a 426 da sequência de nucleotídeos de h2B1_H1 representada pela SEQ ID NO: 73 foi sintetizado (GeneArt Artificial Gene Synthesis Service). Um vetor de expressão de h2B1_H1 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 8)-1-1. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA/h2B1_H1”. 8)-1-2 Construção de cadeia pesada tipo h2B1_H2

[00670] Um fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a região variável de h2B1_H2 representada pelas posições de nucleotídeo 58 a 426 da sequência de nucleotídeos de h2B1_H2 representada pela SEQ ID NO: 75 foi sintetizado (GeneArt Artificial Gene Synthesis Service). O fragmento de DNA sintetizado foi amplificado pela PCR e inserido no sítio clivado pela enzima de restrição B1pI do vetor de expressão

218 / 286 da cadeia pesada do anticorpo quimérico e humanizado pCMA-G1 usando o kit de clonagem pela PCR In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para construir um vetor de expressão de h2B1_H2. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA/h2B1_H2”. 8)-1-3 Construção de cadeia pesada tipo h2B1_H3

[00671] Um fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a região variável de h2B1_H3 representada pelas posições de nucleotídeo 58 a 426 da sequência de nucleotídeos de h2B1_H3 representada pela SEQ ID NO: 77 foi sintetizado (GeneArt Artificial Gene Synthesis Service). Um vetor de expressão h2B1_H3 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 8)-1-1. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA/h2B1_H3”. 8)-1-4 Construção de cadeia pesada tipo h2B1_H4

[00672] Um fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a região variável de h2B1_H4 representada pelas posições de nucleotídeo 58 a 426 da sequência de nucleotídeos de h2B1_H4 representada pela SEQ ID NO: 79 foi sintetizado (GeneArt Artificial Gene Synthesis Service). Um vetor de expressão de h2B1_H4 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 8)-1-1. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA/h2B1_H4”. 8)-2 Construção de vetor de expressão de cadeia leve h2B1 8)-2-1 Construção de cadeia leve tipo h2B1_L1

[00673] Um fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a região variável de h2B1_L1 representada pelas posições de nucleotídeo 61 a 381 da sequência de nucleotídeos h2B1_L1 representada pela SEQ ID NO: 63 foi sintetizado (GeneArt Gene Síntese Service). O fragmento de DNA sintetizado foi amplificado pela PCR e inserido no sítio clivado pela enzima de restrição BsiWI do vetor de expressão de cadeia leve de anticorpo quimérico e humanizado pCMA-LK usando O kit de clonagem

219 / 286 pela PCR In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para construir um vetor de expressão h2B1_L1. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA/h2B1_L1”. 8)-2-2 Construção de cadeia leve tipo h2B1_L2

[00674] Um fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a região variável h2B1_L2 representada pelas posições de nucleotídeo 61 a 381 da sequência de nucleotídeos de h2B1_L2 representada pela SEQ ID NO: 65 foi sintetizado (GeneArt Gene Synthesis Service). Um vetor de expressão de h2B1_L2 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 8)-2-1. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA/h2B1_L2”. 8)-2-3 Construção de cadeia leve tipo h2B1_L3

[00675] Um fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a região variável h2B1_L3 representada pelas posições de nucleotídeo 61 a 381 da sequência de nucleotídeos de h2B1_L3 representada pela SEQ ID NO: 67 foi sintetizado (GeneArt Gene Synthesis Service). Um vetor de expressão de h2B1_L3 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 8)-2-1. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA/h2B1_L3”. 8)-2-4 Construção de cadeia leve tipo h2B1_L4

[00676] Um fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a região variável h2B1_L4 representada pelas posições de nucleotídeo 61 a 381 da sequência de nucleotídeos de h2B1_L4 representada pela SEQ ID NO: 69 foi sintetizado (GeneArt Gene Synthesis Service). Um vetor de expressão de h2B1_L4 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 8)-2-1. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA/h2B1_L4”. 8)-2-5 Construção de cadeia leve tipo h2B1_L5

[00677] Um fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA

220 / 286 que codifica a região variável h2B1_L5 representada pelas posições de nucleotídeo 61 a 381 da sequência de nucleotídeos h2B1_L5 representada pela SEQ ID NO: 71 foi sintetizado (GeneArt Gene Synthesis Service). Um vetor de expressão de h2B1_L5 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 8)-2-1. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA/h2B1_L5”. 8)-3 Construção de vetor de expressão da cadeia pesada de h7B4 8)-3-1 Construção de cadeia pesada tipo h7B4_H1

[00678] Um fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a região variável h7B4_H1 representada pelas posições de nucleotídeo 58 a 426 da sequência de nucleotídeos h7B4_H1 representada pela SEQ ID NO: 85 foi sintetizado (GeneArt Artificial Gene Synthesis Service). Um vetor de expressão de h7B4_H1 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 8)-1-1. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA/h7B4_H1”. 8)-3-2 Construção de cadeia pesada tipo h7B4_H2

[00679] Um fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a região variável h7B4_H2 representada pelas posições de nucleotídeo 58 a 426 da sequência de nucleotídeos de h7B4_H2 representada pela SEQ ID NO: 87 foi sintetizado (GeneArt Artificial Gene Synthesis Service). Um vetor de expressão de h7B4_H2 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 8)-1-1. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA/h7B4_H2”. 8)-3-3 Construção de cadeia pesada tipo h7B4_H3

[00680] Um fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a região variável de h7B4_H3 representada pelas posições de nucleotídeo 58 a 426 da sequência de nucleotídeos de h7B4_H3 representada pela SEQ ID NO: 89 foi sintetizado (GeneArt Artificial Gene Synthesis Service). Um vetor de expressão de h7B4_H3 foi construído da mesma

221 / 286 maneira como no Exemplo 8)-1-1. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA/h7B4_H3”. 8)-3-4 Construção de cadeia pesada tipo h7B4_H5

[00681] Um fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a região variável h7B4_H5 representada pelas posições de nucleotídeo 58 a 426 da sequência de nucleotídeos de h7B4_H5 representada pela SEQ ID NO: 91 foi sintetizado (GeneArt Artificial Gene Synthesis Service). Um vetor de expressão de h7B4_H5 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 8)-1-1. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA/h7B4_H5”. 8)-4 Construção de vetor de expressão de cadeia leve de h7B4 8)-4-1 Construção de cadeia leve tipo h7B4_L1

[00682] Um fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a região variável h7B4_L1 representada pelas posições de nucleotídeo 61 a 378 da sequência de nucleotídeos de h7B4_L1 representada pela SEQ ID NO: 90 foi sintetizado (GeneArt Gene Synthesis Service). Um vetor de expressão de h7B4_L1 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 8)-2-1. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA/h7B4_L1”. 8)-4-2 Construção de cadeia leve tipo h7B4_L2

[00683] Um fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a região variável h7B4_L2 representada pelas posições de nucleotídeo 61 a 378 da sequência de nucleotídeos de h7B4_L2 representada pela SEQ ID NO: 92 foi sintetizado (GeneArt Gene Synthesis Service). Um vetor de expressão de h7B4_L2 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 8)-2-1. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pCMA/h7B4_L2”. 8)-5 Preparação de anticorpos humanizados (h2B1 e h7B4) (células FreeStile 293F)

222 / 286 8)-5-1 Produção em pequena escala de anticorpos humanizados (h2B1 e h7B4)

[00684] Células FreeStile 293F (Invitrogen Corp.) foram subcultivadas e cultivadas de acordo com o manual.

[00685] 1 × 107 células FreeStile 293F (Invitrogen Corp.) na fase de crescimento logarítmica foram diluídas a 9,6 mL com meio de expressão FreeStile 293 (Invitrogen Corp.), depois inoculadas Em Garrafa de Armazenagem Quadrada de 30 mL (Nalgene/Thermo Fisher Scientific Inc.) e cultivadas com agitação a 90 rpm a 37°C durante 1 hora em um incubador com 8 % de CO2. 30 µg de polietilenoimina (Polisciences #24765) foram dissolvidos em 200 µL de Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). Em seguida, cada vetor de expressão de cadeia pesada ((4 µg) e vetor de expressão de cadeia leve (6 µg) preparados usando o kit PureLink HiPure Plasmid (Invitrogen Corp.) foram adicionados a 200 µL de Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). 200 µL de solução mista do vetor de expressão/Opti-Pro SFM foram adicionados a 200 µL da solução mista de polietilenoimina/Opti-Pro SFM e a mistura foi suavemente agitada, deixada adicionalmente durante 5 minutos e depois adicionada às células FreeStile 293F. As células foram cultivadas com agitação a 90 rpm a 37°C durante 7 dias em um incubador com 8 % de CO2 e o sobrenadante de cultura obtido foi filtrado através de filtro Minisart-Plus (Sartorius Japan K.K.) e usado como uma amostra para avaliação.

[00686] h2B1_H1/L1 foi obtido pela combinação de pCMA/h2B1_H1 e pCMA/h2B1_L1. h2B1_H1/L2 foi obtido pela combinação de pCMA/h2B1_H1 e pCMA/h2B1_L2. h2B1_H2/L2 foi obtido pela combinação de pCMA/h2B1_H2 e pCMA/h2B1_L2. h2B1_H2/L3 foi obtido pela combinação de pCMA/h2B1_H2 e pCMA/h2B1_L3. h2B1_H2/L4 foi obtido pela combinação de pCMA/h2B1_H2 e pCMA/h2B1_L4. h2B1_H2/L5 foi obtido pela combinação de pCMA/h2B1_H2 e pCMA/h2B1_L5. h2B1_H3/L3 foi obtido pela combinação de

223 / 286 pCMA/h2B1_H3 e pCMA/h2B1_L3. h2B1_H3/L4 foi obtido pela combinação de pCMA/h2B1_H3 e pCMA/h2B1_L4. h2B1_H3/L5 foi obtido pela combinação de pCMA/h2B1_H3 e pCMA/h2B1_L5. h2B1_H4/L1 foi obtido pela combinação de pCMA/h2B1_H4 e pCMA/h2B1_L1. h2B1_H4/L3 foi obtido pela combinação de pCMA/h2B1_H4 e pCMA/h2B1_L3. h2B1_H4/L4 foi obtido pela combinação de pCMA/h2B1_H4 e pCMA/h2B1_L4. h2B1_H4/L5 foi obtido pela combinação de pCMA/h2B1_H4 e pCMA/h2B1_L5. h7B4_H1/L2 foi obtido pela combinação de pCMA/h7B4_H1 e pCMA/h7B4_L2. h7B4_H2/L2 foi obtido pela combinação de pCMA/h7B4_H2 e pCMA/h7B4_L2. h7B4_H3/L1 foi obtido pela combinação de pCMA/h7B4_H3 e pCMA/h7B4_L1. h7B4_H3/L2 foi obtido pela combinação de pCMA/h7B4_H3 e pCMA/h7B4_L2. h7B4_H5/L1 foi obtido pela combinação de pCMA/h7B4_H5 e pCMA/h7B4_L1. 8)-5-2 Produção de anticorpos humanizados (h2B1 e h7B4)

[00687] Anticorpos humanizados foram produzidos da mesma maneira como no Exemplo 4)-9-1. Especificamente, h2B1_H1/L1 foi obtido pela combinação de pCMA/h2B1_H1 e pCMA/h2B1_L1. h2B1_H2/L5 foi obtido pela combinação de pCMA/h2B1_H2 e pCMA/h2B1_L5. h2B1_H4/L5 foi obtido pela combinação de pCMA/h2B1_H4 e pCMA/h2B1_L5. h7B4_H1/L2 foi obtido pela combinação de pCMA/h7B4_H1 e pCMA/h7B4_L2. h7B4_H3/L1 foi obtido pela combinação de pCMA/h7B4_H3 e pCMA/h7B4_L1. 8)-5-3 Purificação de anticorpos humanizados (h2B1 e h7B4)

[00688] Cada anticorpo foi purificado a partir do sobrenadante de cultura obtido no Exemplo 8)-5-2 em duas etapas usando cromatografia de afinidade em rProteína A (de 4 a 6°C) e hidroxiapatita cerâmica (na temperatura ambiente). As etapas de reposição de tampão depois de uma purificação pela cromatografia de afinidade em rProteína e depois da

224 / 286 purificação em hidroxiapatita cerâmica foram realizadas de 4 a 6°C. O sobrenadante de cultura foi aplicado ao MabSelect SuRe (fabricado pela GE Healthcare Bio-Sciences Corp., coluna HiTrap) equilibrada com PBS. Depois da entrada de todo sobrenadante de cultura na coluna, a coluna foi lavada com PBS em uma quantidade pelo menos duas vezes o volume da coluna. Em seguida, as frações contendo anticorpo foram coletadas pela elução com uma solução 2 M de cloridreto de arginina (pH 4,0). As frações foram substituídas no tampão com PBS pela diálise (Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A- Lyzer Dialysis Cassette) e depois diluído 5 vezes com um tampão de 5 mM de fosfato de sódio e 50 mM de MES (pH 7,0). A solução de anticorpo resultante foi aplicada a uma coluna cerâmica de hidroxiapatita (Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-Scale CHT Tipe-1 Hydroxyapatite Colunm) equilibrada com um tampão de 5 mM de NaPi, 50 mM de MES e 30 mM de NaCl (pH 7,0). As frações contendo anticorpo foram coletadas pela elução de gradiente de concentração linear usando cloreto de sódio. As frações foram substituídas no tampão com HBSor (25 mM de histidina e 5% de sorbitol, pH 6,0) pela diálise (Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette). As frações foram concentradas e ajustadas a uma concentração de IgG de 10 mg/ml ou superior usando Dispositivo de Filtração Centrífuga UF VIVASPIN 20 (corte de peso molecular: UF10K, Sartorius Japan K.K., a 4°C). Finalmente, a solução de anticorpo foi filtrada através de filtro Minisart-Plus (Sartorius Japan K.K.) e usado como uma amostra purificada. Exemplo 9. Avaliação de atividade in vitro de anticorpo antiGPRC5D humanizado 9)-1 Avaliação de atividade de ligação dos anticorpos antiGPRC5D humanizados (h2B1_H1/L1 a h2B1_H4/L5 e h7B4_H1/L2 a h7B4_H5/L1) contra GPRC5D humano pela citometria de fluxo

[00689] As células da linhagem de célula de mieloma múltiplo humano KHM-1B que expressam GPRC5D foram ajustadas a uma concentração de 2

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× 106 células/mL com PBS contendo 5% de FBS, inoculadas em uma quantidade de 100 µL/poço a um microplaca com fundo em U de 96 poços e centrifugada para remover um sobrenadante.

O sobrenadante de cultura de cada anticorpo antiGPRC5D humanizado obtido no Exemplo 8)-3-1 ou anticorpo de controle de isótipo de IgG humano (Calbiochem/Merck Millipore Corp.) ajustadas para 14 ng/mL a 30 µg/mL foi adicionada a isso em uma quantidade de 100 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 1 hora.

As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS.

Depois, R-Ficoeritrina AffiniPure F(ab’)2 Fragmento de IgG de Cabra Anti-Ser Humano, Fragmento Específico de Fcγ (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) diluído 100 vezes com PBS contendo 5% de FBS foi adicionada a isso em uma quantidade de 100 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 1 hora.

As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS, seguido por detecção usando um citômetro de fluxo (FACSCanto® II; Becton, Dickinson and Company). Os dados foram analisados usando Flowjo (Tree Star, Inc.). A intensidade de fluorescência de PE da fração de célula foi plotada a um histograma e a intensidade de fluorescência média (MFI) foi calculada.

O valor da MFI do anticorpo de controle foi subtraído do valor da MFI do anticorpo GPRC5D para calcular um valor relativo de MFI (rMFI). A Figura 102 mostra os resultados acerca dos anticorpos antiGPRC5D humanizados h2B1_H1/L1 a h2B1_H4/L5 e a Figura 103 mostra os resultados acerca dos anticorpos antiGPRC5D humanizados h7B4_H1/L2 a h7B4_H5/L1. Como mostrado nas Figuras 102 e 103, estes anticorpos antiGPRC5D humanizados foram verificados ligar-se ao GPRC5D humano. 9)-2 Avaliação da atividade de ligação dos anticorpos antiGPRC5D humanizados (h2B1_H1/L1 a h2B1_H4/L5 e h7B4_H1/L2 a h7B4_H5/L1) contra GPRC5D de macaco cinomolgo pela citometria de fluxo

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[00690] O tingimento e análise foram realizados da mesma maneira como no Exemplo 9)-1 usando as células KMS-11_cGPRC5D preparadas no Exemplo 5)-2-2. Como mostrado nas Figuras 201 e 202, estes anticorpos antiGPRC5D humanizados foram verificados ligar-se ao GPRC5D de macaco cinomolgo. 9)-3 Avaliação da atividade de ADCC de anticorpos antiGPRC5D humanizados (h2B1_H1/L1, h2B1_H2/L5, h2B1_H4/L5, h7B4_H1/L2 e h7B4_H3/L1)

[00691] As células KHM-1B preparadas no Exemplo 2)-3-1 foram adicionadas em uma quantidade de 50 µL/poço a uma microplaca com fundo em U de 96 poços. Cada anticorpo antiGPRC5D humanizado (h2B1_H1/L1, h2B1_H2/L5, h2B1_H4/L5, h7B4_H1/L2 e h7B4_H3/L1) ou anticorpo de controle humano (hIgG1) (Calbiochem/Merck Millipore Corp.) ajustados para 0,15 ng/mL a 15 µg/mL (concentração final) foi adicionado a isso em uma quantidade de 50 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 30 minutos. As células efetoras preparadas no Exemplo 1)-5-3 foram adicionadas ainda a isso em uma quantidade de 100 µL/poço. Depois da centrifugação na temperatura ambiente a 1200 rpm durante 3 minutos, as células foram cultivadas a 37°C durante 4 horas sob condições de 5% de CO2. Uma alíquota de 50 µL do sobrenadante foi recuperada em LumaPlate (PerkinElmer, Inc.) e seca durante a noite a 50°C, seguida pela medição usando uma leitora de placa (TopCount; PerkinElmer, Inc.). A porcentagem de células lisadas pela atividade de ADCC foi calculada de acordo com o Exemplo 1)-5-5. Como mostrado na Figura 104, h2B1_H1/L1, h2B1_H2/L5, h2B1_H4/L5, h7B4_H1/L2 e h7B4_H3/L1 foram verificados ter atividade de ADCC. Exemplo 10. Obtenção de anticorpo antiGPRC5D derivado da biblioteca de fago de anticorpo humano e avaliação da atividade de ligação 10)-1 Isolação de scFv tendo atividade de ligação de GPRC5D

[00692] A ligação de scFv ao GPRC5D humano e GPRC5D de macaco

227 / 286 cinomolgo foi isolada a partir de uma biblioteca de fago de anticorpo humano. Os fagos foram adicionados a Dynabeads Streptavidin M-280 (Thermo Fisher Scientific Inc.) no que o peptídeo de terminal amino (sintetizado pelo Peptide Institute, Inc.) de GPRC5D de ser humano (SEQ ID NO: 2 da Listagem de Sequências; Figura 3) ou de macaco cinomolgo tendo um terminal carbóxi biotinilado foi imobilizado. Os fagos não ligados foram removidos pela operação de lavagem usando um suporte magnético (DynaMag-2, Thermo Fisher Scientific Inc.). O peptídeo de terminal amino de GPRC5D de macaco cinomolgo usado teve a seguinte sequência:

[00693] O peptídeo de terminal amino de GPRC5D de macaco cinomolgo: MYKDCIESTGDYFLPCDSEGPWGIVLEK(Biotina)-NH2 (SEQ ID NO: 93 da Listagem de Sequências; Figura 105)

[00694] Depois, E. coli (XL-1 Blue, Agilent Technologies, Inc.) foi infectada pelos fagos ligados com o peptídeo de terminal amino de GPRC5D e os fagos ligados com o peptídeo de terminal amino de GPRC5D foram recuperados e amplificados. Alternativamente, os fagos foram adicionados às células Expi293F (Thermo Fisher Scientific Inc.) causado expressar transitoriamente GPRC5D de ser humano ou macaco cinomolgo usando o vetor de expressão de GPRC5D preparado no Exemplo 1)-1-1 ou 5)-2-1. Os fagos não ligados foram removidos pela operação de lavagem. Depois, E. coli foi infectada pelos fagos ligados com o peptídeo de terminal amino de GPRC5D e os fagos ligados com o peptídeo de terminal amino de GPRC5D foram recuperados e amplificados. Um total de 3 rodadas de panning foi realizado para o peptídeo ou as células Expi293F causadas expressar transitoriamente GPRC5D de ser humano ou macaco cinomolgo. Depois de transferir de fagomídeo policlonal para um vetor de expressão para E. coli para adicionar etiquetas FLAG e His ao terminal carbóxi de scFv, a E. coli foi transformada com o vetor de expressão e scFv foi expresso na presença de IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo) (Sigma-Aldrich Corp.) e

228 / 286 submetido à triagem pelo ELISA. 10)-2 Triagem quanto ao scFv que liga GPRC5D pelo ELISA

[00695] NeutrAvidin (Life Technologies Corp.) diluído para 1 µg/mL com PBS (0,01 M de solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4) contendo 0,138 M de cloreto de sódio e 0,0027 M de cloreto de potássio, Sigma-Aldrich Corp.) foi adicionado em uma quantidade de 50 µL/poço à placa Maxi-sorp com 384 poços (Preta, Nunc/Thermo Fisher Scientific Inc.) e a placa foi deixada repousar durante a noite a 4°C para imobilização. Depois de lavar três vezes com PBS contendo 0,05% de Tween-20 (Bio-Rad Laboratories, Inc.) (tampão ELISA), o peptídeo de terminal amino do GPRC5D biotinilado de ser humano ou macaco cinomolgo (também usado no Exemplo 10)-1) diluído a 1 µg/mL com PBS foi adicionado a isso e a placa foi agitada na temperatura ambiente durante 1 hora. Depois de lavar três vezes com um tampão de ELISA, a placa foi bloqueada com Blocker Casein (Thermo Fisher Scientific Inc.) e lavadas três vezes com um tampão de ELISA. Depois, a solução de cultura da E. coli expressando scFv foi adicionada à placa e reagida na temperatura ambiente durante 2 horas. Depois de lavar três vezes com um tampão de ELISA, um anticorpo antiFLAG rotulado com peroxidase de rábano (HRP) (Sigma-Aldrich Corp.) diluído 5000 vezes com um tampão de ELISA foi adicionado a isso em uma quantidade de 50 µL/poço e reagido na temperatura ambiente durante 1 hora. Depois da lavagem cinco vezes com tampão de ELISA, substrato SuperSignal Pico ELISA Chemiluminescent (Thermo Fisher Scientific Inc.) foi adicionado. Depois de 10 minutos, a quimioluminescência foi medida usando uma leitora de placa (Envision 2104 Multilabel Reader, PerkinElmer, Inc.) e scFv que liga GPRC5D foi selecionado. 10)-3 Sequenciamento de clone positivo no ELISA

[00696] A sequência de nucleotídeos da região variável de cadeias pesada e leve de clones positivos no ELISA (C2037, C3048, C3015 e C3022)

229 / 286 foram analisados pelo método do terminador de corante (BigDye(R) Terminator v3.1, Thermo Fisher Scientific Inc.). As sequências de iniciador usado na análise de sequência foram como segue: Iniciador A: 5’-CTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGA-3’ (SEQ ID NO: 94 da Listagem de Sequências; Figura 106) Iniciador B: 5’-ATAACAATTTCACACAGGAAACAG CTATGA-3’ (SEQ ID NO: 95 da Listagem de Sequências; Figura 107)

[00697] A sequência de nucleotídeos que codifica a região variável dos genes do anticorpo C2037, do anticorpo C3048, do anticorpo C3015 e do anticorpo C3022 foi determinada pela análise.

[00698] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada de C2037 é mostrada na SEQ ID NO: 96 (Figura 108) e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 97 (Figura 109).

[00699] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável de cadeia leve de C2037 é mostrada na SEQ ID NO: 98 (Figura 110) e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 99 (Figura 111).

[00700] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada de C3048 é mostrada na SEQ ID NO: 100 (Figura 112) e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 101 (Figura 113).

[00701] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável de cadeia leve de C3048 é mostrada na SEQ ID NO: 102 (Figura 114) e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 103 (Figura 115).

[00702] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada de C3015 é mostrada na SEQ ID NO: 104 (Figura 116) e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na

230 / 286 SEQ ID NO: 105 (Figura 117).

[00703] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável de cadeia leve de C3015 é mostrada na SEQ ID NO: 106 (Figura 118) e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 107 (Figura 119).

[00704] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada de C3022 é mostrada na SEQ ID NO: 108 (Figura 120) e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 109 (Figura 121).

[00705] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável de cadeia leve de C3022 é mostrada na SEQ ID NO: 110 (Figura 122) e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 135 (Figura 123). 10)-4 Expressão e purificação de scFv

[00706] O scFv do anticorpo C2037, anticorpo C3048, anticorpo C3015 ou anticorpo C3022 foi inserido em um vetor de expressão para células animais tal como pcDNA3.1 (Thermo Fisher Scientific Inc.) para construir um vetor de expressão de scFv para células animais. O vetor de expressão de scFv para as células animais foi transfectado para as células Expi293F (Thermo Fisher Scientific Inc.), para a expressão transitória. Se necessário, o scFv foi purificado a partir do sobrenadante de cultura usando uma coluna His Trap (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) e uma coluna de filtração em gel (Superdex 200 Increase, GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). A solução tampão contendo o scFv dissolvido nela foi substituída com PBS e a solução resultante foi submetida à etapa “10)-6” a seguir. 10)-5 Conversão para IgG de tamanho completo e expressão e purificação de IgG

[00707] Uma forma de IgG de tamanho completo contendo C2037, C3048, C3015 ou C3022 foi preparada pelo seguinte método.

231 / 286

[00708] A sequência de nucleotídeos que codifica a região variável de cadeias pesada e leve de cada anticorpo identificada no Exemplo 10)-3 foi ligada a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região constante de cadeia pesada de IgG1 humana (região CH1 + Fc: sequência de aminoácidos posições 135 a 464 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 144 (Figura 156) da Listagem de Sequências) e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região constante de cadeia leve de IgG1 humana (CL: sequência de aminoácidos posições 131 a 236 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 145 (Figura 157) da Listagem de Sequências), respectivamente, por um método de rotina. As construções foram inseridas em um vetor de expressão para células animais tais como pcDNA3.1 (Thermo Fisher Scientific Inc.) para construir um vetor de expressão de IgG para células animais.

[00709] A sequência de nucleotídeos do vetor de expressão de IgG construído foi reanalisada. Foi confirmado que a sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de tamanho natural do anticorpo C2037 foi a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 136 (Figura 148) da Listagem de Sequências e a sequência de nucleotídeos da cadeia leve de tamanho completo foi a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 137 (Figura 149) da Listagem de Sequências.

[00710] Foi confirmado que a sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de tamanho natural do anticorpo C3048 foi a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 138 (Figura 150) da Listagem de Sequências e a sequência de nucleotídeos da cadeia leve de tamanho completo foi a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 139 (Figura 151) da Listagem de Sequências.

[00711] Foi confirmado que a sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de tamanho natural do anticorpo C3015 foi a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 140 (Figura 152) da Listagem de

232 / 286 Sequências e a sequência de nucleotídeos da cadeia leve de tamanho completo foi a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 141 (Figura 153) da Listagem de Sequências.

[00712] Foi confirmado que a sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de tamanho natural do anticorpo C3022 foi a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 142 (Figura 154) da Listagem de Sequências e a sequência de nucleotídeos da cadeia leve de tamanho completo foi a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 143 (Figura 155) da Listagem de Sequências.

[00713] As sequências de aminoácidos das cadeias pesadas e leves de tamanho completo dos anticorpos C2037, C3048, C3015 e C3022 codificados por estas sequências foram determinadas da sequência de nucleotídeos.

[00714] A sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo C2037 foi a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 144 (Figura 156) da Listagem de Sequências e a sequência de aminoácidos da cadeia leve foi a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 145 (Figura 157) da Listagem de Sequências.

[00715] A sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo C3048 foi a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 146 (Figura 158) da Listagem de Sequências e a sequência de aminoácidos da cadeia leve foi a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 147 (Figura 159) da Listagem de Sequências.

[00716] A sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo C3015 foi a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 148 (Figura 160) da Listagem de Sequências e a sequência de aminoácidos da cadeia leve foi a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 149 (Figura 161) da Listagem de Sequências.

[00717] A sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo C3022 foi a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 150

233 / 286 (Figura 162) da Listagem de Sequências e a sequência de aminoácidos da cadeia leve foi a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 151 (Figura 163) da Listagem de Sequências.

[00718] A forma IgG dos anticorpos C2037, C3048, C3015 ou C3022 foi transitoriamente expressa pela transfecção de células FreeStile 293F (Thermo Fisher Scientific Inc.) com o vetor de expressão de IgG para células animais. Se necessário, a forma IgG foi purificada usando uma coluna de afinidade de proteína A (HiTrap Mab Select SuRe, GE Healthcare Bio- Sciences Corp.). Depois, a solução tampão contendo a IgG dissolvida nela foi substituída com PBS usando Vivaspin 20 (7k MWCO, GE Healthcare Bio- Sciences Corp.) e a solução resultante foi submetida às etapas 10)-7-7 e 10)-9 a seguir. 10)-6 Confirmação de ligação de scFv ao GPRC5D pelo ELISA

[00719] NeutrAvidin diluído a 1 µg/mL com PBS foi adicionado em uma quantidade de 50 µL/poço à placa Maxi-sorp de 96 poços (Preta, Nunc/Thermo Fisher Scientific Inc.) e a placa foi deixada repousar durante a noite a 4°C para imobilização. Depois de lavar três vezes com um tampão de ELISA, o peptídeo de terminal amino do GPRC5D biotinilado de ser humano ou macaco cinomolgo (usado no Exemplo 10)-1) diluído a 1 µg/mL com PBS foi adicionado a isso e a placa foi agitada na temperatura ambiente durante 1 hora. Depois de lavar três vezes com um tampão de ELISA, a placa foi bloqueada com Blocker Casein e lavada três vezes com um tampão de ELISA. Depois, o scFv de C2037, C3048, C3015 ou C3022 foi adicionado à placa e reagido na temperatura ambiente durante 2 horas. Depois de lavar três vezes com um tampão de ELISA, um anticorpo antiFLAG rotulado com peroxidase de rábano (HRP) diluído 5000 vezes com um tampão de ELISA foi adicionado a isso em uma quantidade de 50 µL/poço e reagido na temperatura ambiente durante 1 hora. Depois de lavagem cinco vezes com um tampão de ELISA, substrato SuperSignal Pico ELISA Chemiluminescent foi

234 / 286 adicionado. Depois de 10 minutos, a quimioluminescência foi medida usando uma leitora de placa. Como um resultado, os scFvs de C2037, C3048, C3015 e C3022 foram verificados ligar-se aos peptídeos de terminal amino de GPRC5D humano (Figura 164A) e GPRC5D de macaco cinomolgo (Figura 164B). 10)-7 Confirmação da ligação de IgG ao GPRC5D pelo ELISA

[00720] NeutrAvidin diluído a 1 µg/mL com PBS foi adicionado em uma quantidade de 50 µL/poço à placa Maxi-sorp de 96 poços e a placa foi deixada repousar durante a noite a 4°C para imobilização. Depois de lavar três vezes com um tampão de ELISA, o peptídeo de terminal amino do GPRC5D de ser humano ou macaco cinomolgo biotinilado (usado no Exemplo 10)-1) diluído a 1 µg/mL com PBS foi adicionado a isso e a placa foi agitada na temperatura ambiente durante 1 hora. Depois de lavar três vezes com um tampão de ELISA, a placa foi bloqueada com Blocker Casein e lavada três vezes com um tampão de ELISA. Depois, a solução de cultura das células FreeStile 293F expressando IgG foi adicionada à placa e reagida na temperatura ambiente durante 2 horas. Depois de lavar três vezes com um tampão de ELISA, um anticorpo anti-Fab humano rotulado com peroxidase de rábano (HRP) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) diluído 2500 vezes com tampão de ELISA foi adicionada a isso em uma quantidade de 50 µL/poço e reagido na temperatura ambiente durante 1 hora. Depois de lavar cinco vezes com um tampão de ELISA, substrato SuperSignal Pico ELISA Chemiluminescent foi adicionado. Depois de 10 minutos, a quimioluminescência foi medida usando uma leitora de placa. Como um resultado, as formas de IgG C2037, C3048, C3015 e C3022 foram verificadas ligar-se aos peptídeos de terminal amino de GPRC5D humano e GPRC5D de macaco cinomolgo (Figura 165). 10)-8 Ligação de scFv à célula expressando GPRC5D humano endógeno (KMS-34)

235 / 286

[00721] As células KMS-34 foram recuperadas pela centrifugação, lavadas duas vezes com um tampão de FACS (PBS contendo 0,5% de BSA e 2 mM de EDTA, pH 7,4) e depois colocadas em suspensão na mesma solução como acima. O scFv de C2037, C3048, C3015 ou C3022 foi adicionado à suspensão de célula obtida e a mistura foi deixada repousar a 4°C durante 2 horas. Depois de lavar duas vezes com um tampão de FACS, as células foram colocadas em suspensão pela adição de um anticorpo antiFLAG (Sigma- Aldrich Corp.) e a mistura foi adicionalmente deixada repousar a 4°C durante 1 hora. Depois de lavar duas vezes com um tampão de FACS, as células foram colocadas em suspensão pela adição de anticorpo anti-IgG de camundongo rotulado com Alexa 488 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) e a mistura foi adicionalmente deixada repousar a 4°C durante 1 hora. Depois de lavar duas vezes com um tampão FACS, as células foram fixadas em 1% de PFA (preparada a partir de uma solução de paraformaldeído a 32% (Electron Microscopy Sciences)), seguido pela detecção usando um citômetro de fluxo (FACSCanto® II; Becton, Dickinson and Company). Os dados foram analisados usando Flowjo (Tree Star, Inc.).

[00722] Como um resultado, os scFvs de C2037, C3048, C3015 e C3022 foram verificados ligar-se às células que expressam GPRC5D humano (Figura 166). 10)-9 Ligação de IgG à célula que expressa GPRC5D humano endógeno (KHM-1B)

[00723] As células da linhagem de célula de mieloma múltiplo humano KHM-1B que expressam GPRC5D foram ajustadas a uma concentração de 2 × 106 células/mL com PBS contendo 5% de FBS, inoculadas em uma quantidade de 100 µL/poço a um microplaca com fundo em U de 96 poços e centrifugadas para remover o sobrenadante. O sobrenadante de cultura de cada anticorpo antiGPRC5D humano (forma de IgG de tamanho completo contendo C2037, C3048, C3015 ou C3022) obtido no Exemplo 10)-5 ou

236 / 286 anticorpo de controle de isótipo de IgG humano (Calbiochem/Merck Millipore Corp.) ajustado para 14 ng/mL a 30 µg/mL foi adicionado a isso em uma quantidade de 100 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS. Depois, R-Ficoeritrina AffiniPure com Fragmento F(ab’)2 de IgG de Cabra Anti-Ser Humano, Fragmento Específico de Fcγ (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) diluído 100 vezes com PBS contendo 5% de FBS foi adicionado a isso em uma quantidade de 100 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS, seguido por detecção usando um citômetro de fluxo (FACSCanto® II; Becton, Dickinson and Company). Os dados foram analisados usando Flowjo (Tree Star, Inc.). A intensidade de fluorescência de PE da fração de célula foi plotada a um histograma e a intensidade de fluorescência média (MFI) foi calculada. O valor MFI do anticorpo de controle foi subtraído do valor da MFI do anticorpo GPRC5D para calcular um valor relativo de MFI (rMFI). Como um resultado, as formas de IgG C2037, C3048, C3015 e C3022 foram verificados ligar-se às células que expressam GPRC5D humano (Figura 167). 10)-10 Preparação e avaliação de formas modificadas de C3022 e C3048 10)-10-1 Obtenção de formas modificadas

[00724] Uma biblioteca foi construída pelo uso de um método para introduzir uma mutação pela PCR usando os genes C3022 e C3048 como padrões (Zaccolo, et al., J. Mol. Biol. (1996) 255, 589-603) ou um método que envolve sintetizar oligômeros tal que como para todos os resíduos das CDRs, cada resíduo fosse mutado para 19 tipos de aminoácidos outros que não os aminoácidos do tipo selvagem para construir uma biblioteca (biblioteca com base em oligo). A biblioteca foi triada quanto aos clones tendo a alta capacidade para se ligarem e a sua sequência de nucleotídeos foi

237 / 286 determinada. As mutações de alta ligação identificadas foram combinadas para se obter um mutante de alta ligação E1018 de C3022 e um mutante de alta ligação D1012 de C3048.

[00725] A sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada da E1018 obtida é mostrada na SEQ ID NO: 190 (Figura 213) e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 191 (Figura 214).

[00726] A sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica a região variável de cadeia leve da E1018 obtida é mostrada na SEQ ID NO: 192 (Figura 215) e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 193 (Figura 216).

[00727] A sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada da D1012 obtida é mostrada na SEQ ID NO: 194 (Figura 217) e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 195 (Figura 218).

[00728] A sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica a região variável de cadeia leve da D1012 obtida é mostrada na SEQ ID NO: 196 (Figura 219) e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 197 (Figura 220). 10)-10-2 Confirmação de ligação ao GPRC5D usando Biacore

[00729] A atividade de ligação dos anticorpos antiGPRC5D contra o peptídeo de terminal amino de GPRC5D humano foi testada pelo SPR usando Biacore T200. O peptídeo de terminal amino de GPRC5D humano biotinilado diluído para 2 nM com HBS-EP+ (fabricado pela GE Healthcare Bio- Sciences Corp.) foi imobilizado no Sensor Chip CAP (fabricado pela GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) pelo contato em uma taxa de 10 µL/min durante 180 segundos. Depois, Kd foi calculada pela análise cinética usando uma pluralidade de concentrações de cada scFv diluído com HBS-EP+ como análitos. Como um resultado, os scFvs E1018 e D1012 foram verificados

238 / 286 ligar-se ao peptídeo de terminal amino de GPRC5D humano mais fortemente do que C3022 e C3048, respectivamente (Figura 221). Exemplo 11. Construção de vetor de expressão de anticorpo antiCD3 11)-1 Construção de vetor de expressão de anticorpo de rato antiCD3 scFv

[00730] Um hibridoma que produz anticorpo monoclonal de rato antiCD3 foi preparado a partir do linfônodo ou baço de um rato imunizado pelo método de imunização de DNA. Os cDNAs que codificam as VH e VL do anticorpo monoclonal foram sequenciados a partir do hibridoma e um vetor de expressão de Fv de cadeia única foi preparado. Especificamente, o fragmento VH de DNA da SEQ ID NO: 152 (Figura 168) amplificado pela PCR, o fragmento de DNA do ligador a ser inserido entre VH e VL e um fragmento de DNA amplificado pela PCR em que uma sequência de DNA que codifica uma etiqueta FLAG-His foi adicionada a uma região contendo a sequência de VL DNA da SEQ ID NO: 153 (Figura 169) tal que a etiqueta FLAG-His estivesse localizada no terminal carboxila, foram fundidos usando o kit de clonagem In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para preparar um vetor de expressão de Fv de cadeia única pC3E-7000 contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 154 (Figura 170) na ORF. 11)-2 Construção de vetor de expressão de anticorpo scFv antiCD3 humanizado pC3E-7034

[00731] Um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA de scFv contendo uma região contendo a região variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 156 (Figura 172)) conectada ao terminal carbóxi da SEQ ID NO: 155 (Figura 171) por intermédio de um ligador flexível de 15 aminoácidos e sequências de 15 bases adicionais a montante e a jusante da mesma foi sintetizado (GeneArt Artificial Gene Synthesis Service). Uma região contendo o DNA de C3E-7034 e as suas sequências adicionais a montante e a jusante foi amplificada pela PCR usando este fragmento de DNA como um padrão para se obter um fragmento de inserto de DNA. Uma

239 / 286 região de vetor exceto para uma região de scFv foi amplificada pela PCR usando o vetor de expressão pC3E-7000 preparado no Exemplo 11)-1 como um padrão para se obter um fragmento de vetor. Estes fragmentos de DNA foram fundidos usando o kit de clonagem In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para preparar um vetor de expressão contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 157 (Figura 173) na ORF. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pC3E-7034”. 11)-3 Construção de vetor de expressão de anticorpo antiCD3 scFv humanizado pC3E-7035

[00732] Um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA de scFv contendo uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 158 (Figura 174) conectado ao terminal carbóxi da SEQ ID NO: 155 (Figura 171) por intermédio de um ligador flexível de 17 aminoácidos e sequências adicionais de 15 bases a montante e a jusante do mesmo foi sintetizado (GeneArt Artificial Gene Synthesis Service). Um vetor de expressão contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 159 (Figura 175) na ORF foi construído da mesma maneira como no Exemplo 11)-2. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pC3E-7035”. 11)-4 Construção de vetor de expressão de anticorpo antiCD3 scFv humanizado pC3E-7036

[00733] Um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA de scFv contendo uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 160 (Figura 176) conectado ao terminal carbóxi da SEQ ID NO: 155 (Figura 171) por intermédio de um ligador flexível de 15 aminoácidos e sequências adicionais de 15 bases a montante e a jusante do mesmo foi sintetizado (GeneArt Artificial Gene Synthesis Service). Um vetor de expressão C3E- 7036 contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 161 (Figura 177) na ORF foi construído da mesma maneira como no Exemplo 11)-2. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pC3E-7036”.

240 / 286 Exemplo 12. Preparação de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 12)-1 Preparação do vetor de expressão de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3

[00734] Uma sequência de DNA de uma região contendo o anticorpo scFv C2037, uma porção de uma sequência de sinal da cadeia pesada de anticorpo humano e um ligador adicionado pata ligar scFvs foi amplificada pela PCR usando a sequência de DNA do anticorpo scFv C2037 preparado no Exemplo 10)-4 como um padrão para se obter um DNA de inserto. Também, a região de vetor inteira contendo o DNA antiCD3 scFv foi amplificado pela PCR usando o vetor de expressão pC3E-7034 preparado no Exemplo 11)-2 como um padrão e iniciadores que codificam uma sequência de sinal e a sequência de terminal amino do anticorpo antiCD3 scFv para se obter um fragmento de vetor. Estes fragmentos de DNA foram fundidos usando o kit de clonagem In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para construir um vetor de expressão de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 162 (Figura 178) na ORF. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pC2037-C3E7034”.

[00735] Um vetor de expressão de molécula biespecífica antiGPRC5D- antiCD3 contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 163 (Figura 179) na ORF foi construído da mesma maneira como acima usando a sequência de DNA do anticorpo scFv C3048 e pC3E-7034 como padrões. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pC3048-C3E7034”.

[00736] Um vetor de expressão de molécula biespecífica antiGPRC5D- antiCD3 contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 164 (Figura 180) na ORF foi construído da mesma maneira como acima usando a sequência de DNA do anticorpo scFv C3022 e pC3E-7034 como padrões. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pC3022-C3E7034”.

[00737] Um vetor de expressão de molécula biespecífica antiGPRC5D- antiCD3 contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 165 (Figura

241 / 286 181) na ORF foi construído da mesma maneira como acima usando a sequência de DNA do anticorpo scFv C2037 e pC3E-7035 como padrões. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pC2037-C3E7035”.

[00738] Um vetor de expressão de molécula biespecífica antiGPRC5D- antiCD3 contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 166 (Figura 182) na ORF foi construído da mesma maneira como acima usando a sequência de DNA do anticorpo scFv C3048 e pC3E-7035 como padrões. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pC3048-C3E7035”.

[00739] Um vetor de expressão de molécula biespecífica antiGPRC5D- antiCD3 contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 167 (Figura 183) na ORF foi construído da mesma maneira como acima usando a sequência de DNA do anticorpo scFv C3022 e pC3E-7035 como padrões. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pC3022-C3E7035”.

[00740] Um vetor de expressão de molécula biespecífica antiGPRC5D- antiCD3 contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 168 (Figura 184) na ORF foi construído da mesma maneira como acima usando a sequência de DNA do anticorpo scFv C2037 e pC3E-7036 como padrões. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pC2037-C3E7036”.

[00741] Um vetor de expressão de molécula biespecífica antiGPRC5D- antiCD3 contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 169 (Figura 185) na ORF foi construído da mesma maneira como acima usando a sequência de DNA do anticorpo scFv C3048 e pC3E-7036 como padrões. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pC3048-C3E7036”.

[00742] Um vetor de expressão de molécula biespecífica antiGPRC5D- antiCD3 contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 170 (Figura 186) na ORF foi construído da mesma maneira como acima usando a sequência de DNA do anticorpo scFv C3022 e pC3E-7036 como padrões. O vetor de expressão obtido foi planejado como “pC3022-C3E7036”. 12)-2 Expressão e purificação de molécula biespecífica antiGPRC5D-

242 / 286 antiCD3

[00743] C2037-C3E7034 a C3022-C3E7036 foram expressos e purificados da mesma maneira como no Exemplo 10)-4. A sequência de aminoácidos de C2037-C3E7034 está descrita na SEQ ID NO: 171 (Figura 187). A sequência de aminoácidos de C3048-C3E7034 está descrita na SEQ ID NO: 172 (Figura 188). A sequência de aminoácidos de C3022-C3E7034 está descrita na SEQ ID NO: 173 (Figura 189). A sequência de aminoácidos de C2037-C3E7035 está descrita na SEQ ID NO: 174 (Figura 190). A sequência de aminoácidos de C3048-C3E7035 está descrita na SEQ ID NO: 175 (Figura 191). A sequência de aminoácidos de C3022-C3E7035 está descrita na SEQ ID NO: 176 (Figura 192). A sequência de aminoácidos de C2037-C3E7036 está descrita na SEQ ID NO: 177 (Figura 193). A sequência de aminoácidos de C3048-C3E7036 está descrita na SEQ ID NO: 178 (Figura 194). A sequência de aminoácidos de C3022-C3E7036 está descrita na SEQ ID NO: 179 (Figura 195). Exemplo 13. Avaliação da atividade in vitro de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 13)-1 Avaliação da atividade de ligação de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 pela citometria de fluxo 13)-1-1 Ligação de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 à célula que expressa GPRC5D humano endógeno (A4/Fuk)

[00744] As células da linhagem de célula de linfoma A4/Fuk (JCRB Cell Bank) foram ajustadas a uma concentração apropriada com PBS contendo 5% de FBS. O Kit de Tingimento de Célula Morta Próximo ao IR Fixável LIVE/DEAD foi adicionada para as células, que foram depois deixadas repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS, depois ajustadas a uma concentração de 1 × 106 células/mL com PBS contendo 5% de FBS, inoculadas em uma quantidade de 100 µL/poço a um microplaca com fundo em U de 96 poços e

243 / 286 centrifugada para remover um sobrenadante. Cada molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 (C2037-C3E7034 a C3022-C3E7036 preparadas no Exemplo 12) diluída com PBS contendo 5% de FBS foi adicionada a isso em uma quantidade de 100 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 60 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS. Depois, Penta-His Alexa Fluor 488 diluído com PBS contendo 5% de FBS foi adicionado a isso em uma quantidade de 30 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS, seguida por detecção usando um citômetro de fluxo (FACSCanto® II). Os dados foram analisados usando Flowjo. A intensidade de fluorescência média (MFI) de Alexa Fluor 488 em uma fração livre de células mortas foi calculada. O valor MFI da amostra não suplementada com o anticorpo foi subtraído do valor da MFI da amostra suplementada com o anticorpo para calcular um valor relativo de MFI (rMFI). Como mostrado na Figura 196, estes anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos foram verificados ligar-se à célula que expressa GPRC5D humano endógeno. 13)-1-2 Ligação de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 às células que expressam GPRC5D de macaco cinomolgo

[00745] O tingimento e análise foram realizados da mesma maneira como no Exemplo 13)-1-1 usando as células KMS-11_cGPRC5D preparadas no Exemplo 5)-2-2. Como mostrado na Figura 197, estes anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos foram verificados ligar-se às células que expressam GPRC5D de macaco cinomolgo. 13)-1-3 Ligação de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 ao CD3 humano (PBMC)

[00746] As PBMC humanas comercialmente disponíveis (Cellular Technology Limited) foram ajustadas a uma concentração apropriada com

244 / 286 PBS contendo 5% de FBS. O Kit de Tingimento de Célula Morta Próximo do IR Fixável LIVE/DEAD (Thermo Fisher Scientific Inc.) e um anticorpo antiCD19 (Beckman Coulter Inc.) foram adicionados às células, que foram depois deixadas repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS, depois ajustadas a uma concentração de 1 × 106 células/mL com PBS contendo 5% de FBS, inoculadas em uma quantidade de 100 µL/poço a um microplaca com fundo em U de 96 poços e centrifugadas para remover um sobrenadante. Cada molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 (C2037-C3E7034 a C3022- C3E7036 preparada no Exemplo 12) diluída com PBS contendo 5% de FBS foi adicionada a isso em uma quantidade de 100 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 60 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS. Depois, Penta-His Alexa Fluor 488 (Qiagen N.V.) diluído com PBS contendo 5% de FBS foi adicionado a isso em uma quantidade de 30 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS, seguido por detecção usando um citômetro de fluxo (FACSCanto® II; Becton, Dickinson and Company). Os dados foram analisados usando Flowjo (Tree Star, Inc.). A intensidade de fluorescência média (MFI) de Alexa Fluor 488 em uma fração livre de células mortas e células positivas em CD19 foi calculada. O valor MFI da amostra não suplementada com anticorpo foi subtraído do valor da MFI da amostra suplementada com anticorpo para calcular um valor relativo de MFI (rMFI). Como mostrado na Figura 198, estes anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos foram verificados ligar- se às células que expressam CD3 humano. 13)-1-4 Ligação de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 ao CD3 de macaco cinomolgo (PBMC)

[00747] As PBMC foram coletadas do sangue de um macaco

245 / 286 cinomolgo de acordo com um método padrão usando SepMate (StemCell Technologies Inc.) e Solução de Separação de Linfócito (Nacalai Inc.). Usando as PBMC de macaco cinomolgo coletadas, o tingimento e análise foram realizados da mesma maneira como no Exemplo 13)-1-3. Como mostrado na Figura 199, estes anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos foram verificados ligar-se às células que expressam CD3 de macaco cinomolgo. 13)-2 Avaliação da atividade citotóxica de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 13)-2-1 Preparação de célula alvo

[00748] As células A4/Fuk foram ajustadas a uma concentração de 1 × 106 células/mL com um meio RPMI1640 (Thermo Fisher Scientific Inc.) contendo 10% de FBS. 100 µL de Radionuclídeo de Cromo-51 (PerkinElmer, Inc.) foram adicionados por mL da suspensão de célula e as células foram cultivadas a 37°C durante 2 horas sob condições de 5% de CO2. As células foram lavadas duas vezes com um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS, depois recolocadas em suspensão a 1 × 105 células/mL em um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS e usadas como células alvo. 13)-2-2 Preparação de célula efetora

[00749] PBMC congeladas comercialmente disponíveis (Cellular Technology Limited) foram descongeladas a 37°C, transferidas para uma solução de um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS suplementado com reagente de Lavagem Antiagregado (Cellular Technology Limited), lavadas duas vezes, depois ajustadas para 1 × 106 células/mL com um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS e usadas como células efetoras. 13)-2-3 Ensaio de Citotoxicidade

[00750] As células A4/Fuk obtidas no Exemplo 13)-2-1 foram adicionadas em uma concentração de 50 µL/poço a um microplaca com fundo em U de 96 poços. Cada molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3

246 / 286 (preparada no Exemplo 12) ajustada para concentrações variáveis foi adicionada a isso em uma quantidade de 50 µL/poço. As células efetoras preparadas no Exemplo 13)-2-2 foram adicionadas a isso em uma quantidade de 100 µL/poço. Depois da centrifugação na temperatura ambiente a 1000 rpm durante 1 minuto, as células foram cultivadas a 37°C durante 20 a 24 horas sob condições de 5% de CO2. Uma alíquota do sobrenadante foi recuperada em LumaPlate (PerkinElmer, Inc.) e secada a 50°C durante aproximadamente 2 horas, seguida por medição usando uma leitora de placa (TopCount; PerkinElmer, Inc.). A porcentagem de células lisadas foi calculada de acordo com a seguinte expressão: Porcentagem de células lisadas (%) = (A - B) / (C - B) × 100 A: Contagem do poço de amostra B: Contagens da média do fundo (poços não suplementados com anticorpo) (n = 3). 50 µL de um meio para o ensaio foram adicionados ao invés de adicionar o anticorpo. Os outros procedimentos foram os mesmos como no caso do poço de amostra.

[00751] C: Contagens da média da liberação máxima (poços contendo células alvo lisadas em um tensoativo) (n = 3). 50 µL de um meio para ensaio foram adicionados ao invés de adicionar o anticorpo. 100 µL do tensoativo foi adicionado e a alíquota de 50 µL foi transferida para LumaPlate, como com o poço de amostra e ensaiada.

[00752] Como mostrado na Figura 200, estes anticorpos anti- GPRC5D-antiCD3 biespecíficos exibiram atividade citotóxica contra as células A4/Fuk.

[00753] Exemplo 14. Preparação de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo Fc 14)-1 Preparação de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo vetor de expressão Fc 14)-1-1 Preparação de vetor de expressão de molécula biespecífica tipo

247 / 286 anticorpo de tamanho completo (FSA)

[00754] O DNA que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo antiGPRC5D humanizado (h2B1) tipo H2 construído no Exemplo 8)-1-2 foi artificialmente sintetizado líquido (Genscript Custom Gene Synthesis Service). Os vetores de expressão “pCL_#13540” e “pCL_#13543” foram preparados pela inserção de DNAs que codificam a região variável de cadeia pesada obtida, dois tipos de regiões CH1 derivadas da IgG humana e uma região Fc com funções efetoras reduzidas e contendo mutações que formam heteromultímero (WO2014/190441) para o vetor de expressão mamífero pTT5 (National Research Council, WO2009/137911). Também, o DNA que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo antiGPRC5D humanizado (h2B1) tipo L5 construído no Exemplo 8)-2-5 foi artificialmente sintetizado líquido. Os vetores de expressão “pCL_#12290” e “pCL_#12313” foram preparados pela inserção de DNAs que codificam a região variável de cadeia leve obtida e dois tipos de regiões de CL derivadas de IgG humana ao vetor de expressão de mamífero pTT5.

[00755] Em seguida, um fragmento de DNA que codifica a cadeia pesada da scFv antiCD3 humanizada (C3E-7034) construída no Exemplo 11)- 2 foi artificialmente sintetizado líquido. “pCL_#13552” foi preparado pela inserção de DNAs que codificam a região variável de cadeia pesada de scFv obtida, CH1 derivado de IgG humana e uma região Fc com funções efetoras reduzidas e contendo mutações que formam heteromultímero ao vetor de expressão de mamífero pTT5. Também, um fragmento de DNA que codifica a cadeia leve da scFv antiCD3 humanizada (C3E-7034) construído no Exemplo 11)-2 foi artificialmente sintetizado líquido. “pCL_#12287” foi preparado inserindo-se DNAs que codificam a região variável de cadeia leve de scFv obtida e CL derivado de IgG humana ao vetor de expressão de mamífero pTT5. Do mesmo modo, um fragmento de DNA que codifica a cadeia pesada da scFv antiCD3 humanizada (C3E-7036) construído no

248 / 286 Exemplo 11)-4 foi sintetizado líquido. “pCL_#13541” foi preparado inserindo-se sequências de DNA que codificam a região variável de cadeia pesada de scFv obtida, CH1 derivado de IgG humana e uma região Fc com funções efetoras reduzidas e contendo mutações que formam heteromultímero ao vetor de expressão de mamífero pTT5. Também, um fragmento de DNA que codifica a cadeia leve da scFv antiCD3 humanizada (C3E-7036) construído no Exemplo 11)-4 foi sintetizado líquido. “pCL_#12321” foi preparado inserindo-se os fragmentos de DNA que codificam a cadeia leve de scFv obtida e CL derivado da IgG humana ao vetor de expressão de mamífero pTT5.

[00756] As sequências da ORF de pCL_#13540, pCL_#13543, pCL_#12290, pCL_#12313, pCL_#13552, pCL_#12287, pCL_#13541 e pCL_#12321 são mostradas na SEQ ID NO: 198 (Figura 222), SEQ ID NO: 200 (Figura 224), SEQ ID NO: 202 (Figura 226), SEQ ID NO: 204 (Figura 228), SEQ ID NO: 206 (Figura 230), SEQ ID NO: 208 (Figura 232), SEQ ID NO: 210 (Figura 234) e SEQ ID NO: 212 (Figura 236), respectivamente, da Listagem de Sequências. 14)-1-2 Preparação de vetores de expressão de molécula biespecífica tipo híbrida.

[00757] Um vetor de expressão para as células de mamífero tendo um inserto de fragmentos de DNA que codificam a região variável de cadeia pesada tipo H2 do anticorpo antiGPRC5D humanizado (h2B1), uma região CH1 derivada de IgG humana e uma região Fc com funções efetoras reduzidas e contendo mutações que formam heteromultímero foi preparado e planejado como “pCL_#13555”. Também, um vetor de expressão para as células de mamífero tendo um inserto de fragmentos de DNA que codifica a região variável de cadeia leve tipo L5 do anticorpo antiGPRC5D humanizado (h2B1) e uma região CL derivada da IgG humana foi preparado e planejado como “pCL_#12123”.

249 / 286

[00758] Em seguida, um vetor de expressão para as células de mamífero tendo um inserto de fragmentos de DNA que codifica o scFv antiCD3 humanizado (C3E-7034) e uma região Fc com funções efetoras reduzidas e contendo mutações que formam heteromultímero foi preparado e planejado como “pCL_#13557”. Também, um vetor de expressão “pCL_#13561” para células de mamífero tendo um inserto de fragmentos de DNA que codifica o scFv antiCD3 humanizado (C3E-7036) e uma região Fc com funções efetoras reduzidas e contendo mutações que formam heteromultímero foi preparado.

[00759] As sequências de ORF de pCL_#13555, pCL_#12123, pCL_#13557 e pCL_#13561 são mostradas na SEQ ID NO: 214 (Figura 238), SEQ ID NO: 216 (Figura 240), SEQ ID NO: 218 (Figura 242) e SEQ ID NO: 220 (Figura 244), respectivamente, da Listagem de Sequências.

[00760] 14)-1-3 Preparação de vetores de expressão de molécula biespecífica tipo dual

[00761] A região variável de cadeia pesada tipo H2 do anticorpo antiGPRC5D humanizado (h2B1) e região variável de cadeia leve tipo L5 construída no Exemplo 8)-1-2 foram ligadas por intermédio de um ligador flexível consistindo em 3 sequências de repetição de GGGGS para preparar um anticorpo de cadeia única (scFv). “pCL_#13563” foi preparado inserindo- se fragmentos de DNA que codificam este scFv antiGPRC5D e uma região Fc com funções efetoras reduzidas e contendo mutações que formam heteromultímero ao vetor de expressão de mamífero pTT5. A sequência da ORF de pCL_#13563 é mostrada na SEQ ID NO: 222 (Figura 246) da Listagem de Sequências. 14)-2 Produção de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo Fc

[00762] Células CHO-3E7 foram subcultivadas e cultivadas de acordo com o manual do fornecedor (National Research Council Canada, Raymond C. et al., Methods (2011) 55 (1), 44-51). Uma cultura de suspensão de células

250 / 286 CHO-3E7 na fase de crescimento logarítmica foi diluída para 2 × 10^6 células/mL com um meio FreeStile F17 (Invitrogen Corp.) contendo 4 mM de glutamina e 0,1% de Kolliphor (Sigma-Aldrich Corp.) e usada na produção de vários anticorpos biespecíficos. 14)-2-1 Produção de molécula biespecífica de anticorpo tipo (FSA) de tamanho completo

[00763] 8000 µg de Polietilenoimina máx. (PEImax, Polisciences) foram dissolvidos em meio FreeStile F17 para preparar uma solução de PEImax. 1000 µg de uma mistura dos vetores pCL_#13552, pCL_#12287, pCL_#13540 e pCL_#12290 misturados em uma razão de 15:15:53:17 ou os vetores pCL_#13541, pCL_#12321, pCL_#13543 e pCL_#12313 misturados em uma razão de 22:8:17:53, foram adicionados a uma alíquota de meio F17 e 1000 µg de uma mistura de DNA de pAKT e pGFP (ambos da National Research Council) misturados com DNA de esperma de salmão já fragmentado (Sigma-Aldrich Corp.) foram adicionados a uma outra alíquota de meio F17. A solução de PEImax, a mistura de vetores e a solução de DNA foram combinadas, suavemente agitadas, incubadas durante 5 minutos e depois adicionadas a 2 L de suspensão de célula CHO-3E7. As células foram cultivadas com agitação a 37°C durante 1 dia em um incubador com 5% CO2. 0,5 mM de ácido valpróico (Sigma-Aldrich Corp.) e 0,1% (p/v) de Triptona N1 (Organotechnie) foram depois adicionados. As células foram cultivadas adicionalmente com agitação a 32°C durante 6 dias. No dia 7 depois do início da cultura, o sobrenadante de cultura foi recuperado e filtrado através de um filtro de 0,2 µm (Sartorius Japan K.K.) para preparar uma amostra para avaliação.

[00764] pCL_#13552, pCL_#12287, pCL_#13540 e pCL_#12290 foram usados na expressão e preparação de uma molécula biespecífica tipo FSA de C3E-7034 e h2B1 (v19159). pCL_#13541, pCL_#12321, pCL_#13543 e pCL_#12313 foram usados na expressão e preparação de uma

251 / 286 molécula biespecífica tipo FSA de C3E-7036 e h2B1 (v19140).

[00765] As sequências de aminoácidos constituindo v19159 obtidas pela expressão a partir dos respectivos vetores são mostrados na SEQ ID NOs: 207 (Figura 231), 209 (Figura 233), 199 (Figura 223) e 203 (Figura 227) da Listagem de Sequências. As sequências de aminoácidos constituindo v19140 são mostradas nas SEQ ID NOs: 211 (Figura 235), 213 (Figura 237), 201 (Figura 225) e 205 (Figura 229) da Listagem de Sequências. 14)-2-2 Produção de molécula biespecífica tipo híbrida

[00766] 8000 µg de Polietilenoimina máx. (PEImax, Polisciences) foram dissolvidos em meio FreeStile F17 para preparar uma solução de PEImax. 1000 µg de uma mistura dos vetores pCL_#13557, pCL_#13555 e pCL_#12123 misturados em uma razão de 1:1:1,5 ou os vetores pCL_#13561, pCL_#13555 e pCL_#12123 misturados em uma razão de 1:1:1,5, foram adicionados a uma alíquota de meio F17 e 1000 µg de uma mistura de DNA de pAKT e pGFP (ambos da National Research Council) misturados com DNA de esperma de salmão já fragmentado (Sigma-Aldrich Corp.) foram adicionados a uma outra alíquota de meio F17. A solução de PEImax, a mistura de vetores e a solução de DNA de esperma de salmão foram combinadas, suavemente agitadas, incubadas durante 5 minutos e depois adicionadas a 2 L de suspensão de célula CHO-3E7. As células foram cultivadas com agitação a 37°C durante 1 dia em um incubador a 5% de CO2. 0,5 mM de ácido valpróico (Sigma-Aldrich Corp.) e 0,1% (p/v) de Triptona N1 (Organotechnie) foram depois adicionados. As células foram cultivadas ainda com agitação a 32°C durante 6 dias. No dia 7 depois do início da cultura, o sobrenadante de cultura foi recuperado e filtrado através de um filtro de 0,2 µm (Sartorius Japan K.K.) para preparar uma amostra para avaliação.

[00767] pCL_#13557, pCL_#13555 e pCL_#12123 foram usados na expressão e preparação de uma molécula biespecífica tipo híbrida de C3E-

252 / 286 7034 e h2B1 (v19126). pCL_#13561, pCL_#13555 e pCL_#12123 foram usados na expressão e preparação de uma molécula biespecífica tipo híbrida de C3E-7036 e h2B1 (v19125).

[00768] As sequências de aminoácidos que constituem v19126 obtidas pela expressão a partir dos respectivos vetores são mostrados nas SEQ ID NOs: 219 (Figura 243), 215 (Figura 239) e 217 (Figura 241) da Listagem de Sequências. As sequências de aminoácidos que constituem v19125 são mostradas nas SEQ ID NOs: 221 (Figura 245), 215 (Figura 239) e 217 (Figura 241) da Listagem de Sequências. 14)-2-3 Produção de molécula biespecífica tipo dual

[00769] 8000 µg de Polietilenoimina máx. (PEImax, Polisciences) foram dissolvidos em meio FreeStile F17 para preparar uma solução de PEImax. 1000 µg de uma mistura dos vetores pCL_#13557 e pCL_#13563 misturados em uma razão de 4:3 ou os vetores pCL_#13561 e pCL_#13563 misturados em uma razão de 1:1, foram adicionados a uma alíquota de meio F17 e 1000 µg de uma mistura de DNA de pAKT e pGFP (ambos da National Research Council) misturados com DNA de esperma de salmão já fragmentado (Sigma-Aldrich Corp.) foram adicionados a uma outra alíquota de meio F17. A solução de PEImax, a mistura de vetores e a solução de pAKT/pGFP/DNA de esperma de salmão foram combinadas, suavemente agitadas, incubadas durante 5 minutos e depois adicionadas a 2 L de suspensão de célula CHO-3E7. As células foram cultivadas com agitação a 37°C durante 1 dia em um incubador com 5% de CO2. 0,5 mM de ácido valpróico (Sigma-Aldrich Corp.) e 0,1% (p/v) de Triptona N1 (Organotechnie) foram depois adicionados. As células foram cultivadas adicionalmente com agitação a 32°C durante 6 dias. No dia 7 depois do início da cultura, o sobrenadante de cultura foi recuperado e filtrado através de um filtro de 0,2 µm (Sartorius Japan K.K.) para preparar uma amostra para avaliação.

253 / 286

[00770] pCL_#13557 e pCL_#13563 foram usados na expressão e preparação de uma molécula biespecífica tipo scFv dual (dual) de C3E-7034 e h2B1 (v19122). pCL_#13561 e pCL_#13563 foram usados na expressão e preparação de uma molécula biespecífica tipo dual de C3E-7036 e h2B1 (v19121).

[00771] As sequências de aminoácidos que constituem v19122 obtidas pela expressão a partir dos respectivos vetores são mostradas nas SEQ ID NOs: 219 (Figura 243) e 223 (Figura 247) da Listagem de Sequências. As sequências de aminoácidos que constituem v19121 são mostradas nas SEQ ID NOs: 221 (Figura 245) e 223 (Figura 247) da Listagem de Sequências. 14)-3 Purificação de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo Fc

[00772] Cada molécula biespecífica foi purificada a partir do sobrenadante de cultura obtido no Exemplo 14)-2 em duas etapas usando cromatografia de afinidade em proteína A e cromatografia de filtração em gel.

[00773] O sobrenadante de cultura foi aplicado a uma coluna MabSelect SuRe (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) equilibrada com PBS (pH 7,4) para adsorver a molécula biespecífica de interesse nela. Os componentes não absorvidos foram removidos com PBS. Depois, o componente absorvido foi eluído com um tampão de acetato (pH 3,6). As frações eluídas foram ajustadas para pH neutro com um tampão Tris (pH 11), depois concentradas e aplicadas a uma coluna de filtração em gel (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) equilibrada de antemão com PBS (pH 7,4). As frações de pico obtidas pela cromatografia de filtração em gel foram analisadas pela eletroforese capilar SDS (LabChip-Caliper) para recuperar as frações correspondentes ao heterodímero de interesse. As frações recuperadas finais foram passadas através de um filtro de 0,2 mícrons para preparar uma amostra purificada estéril. Para as preparações da molécula biespecífica tipo scFv dual, as frações recuperadas foram subsequentemente trocadas em

254 / 286 tampão em HBsor (25 mM de histidina, 5% de sorbitol, pH 6,0) usando resina de dessalinização fina G25 em duas colunas HiPrep 26/10 em tandem (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). A identidade da amostra purificada foi confirmada pela espectrometria de massa e eletroforese em SDS- poliacrilamida (SDS-PAGE) ser a molécula biespecífica antiGPRC5D- antiCD3 corretamente montada de interesse.

[00774] Exemplo 15. Avaliação da atividade in vitro de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo Fc 15)-1 Avaliação da atividade de ligação de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo Fc pela citometria de fluxo 15)-1-1 Ligação da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo Fc à célula que expressa GPRC5D humano endógeno (KHM-1B)

[00775] Uma linhagem de célula de mieloma múltiplo humano KHM- 1B expressando GPRC5D foi ajustada a uma concentração apropriada com PBS contendo 5% de FBS. O Kit de Tingimento de Célula Morta Próximo do IR Fixável LIVE/DEAD foi adicionado às células, que foram depois deixadas repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS, depois ajustadas a uma concentração de 1 × 106 células/mL com PBS contendo 5% de FBS, inoculadas em uma quantidade de 100 µL/poço a uma microplaca com fundo em U de 96 poços e centrifugada para remover um sobrenadante. Cada molécula biespecífica antiGPRC5D- antiCD3 contendo Fc (preparada no Exemplo 14) diluída com PBS contendo 5% de FBS foi adicionada a isso em uma quantidade de 100 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 60 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS. Depois, R-Ficoeritrina AffiniPure Fragmento F(ab’)2 de IgG de Cabra Anti-Ser Humano, Fragmento Específico de Fcγ (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) diluído 100 vezes com PBS contendo 5% de FBS foi adicionado a isso em uma quantidade de 100 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 1

255 / 286 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS, seguido por detecção usando um citômetro de fluxo (FACSCanto® II). Os dados foram analisados usando Flowjo. A intensidade de fluorescência de PE da fração livre de células mortas foi plotada a um histograma. A intensidade de fluorescência média (MFI) foi calculada. Como um resultado, os anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos contendo Fc foram verificados ligar-se às células que expressam GPRC5D humano (Figura 248). 15)-1-2 Ligação de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo Fc às células que expressam GPRC5D de macaco cinomolgo

[00776] O tingimento e análise foram realizadas da mesma maneira como no Exemplo 15)-1-1 usando as células KMS-11_cGPRC5D preparadas no Exemplo 5)-2-2. Como mostrado na Figura 249, estes anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos contendo Fc foram verificados ligar-se às células que expressam GPRC5D de macaco cinomolgo. 15)-1-3 Ligação de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo Fc ao CD3 humano (PBMC humana)

[00777] As PBMC humanas comercialmente disponíveis (Cellular Technology Limited) foram ajustadas a uma concentração apropriada com PBS contendo 5% de FBS. O Kit de Tingimento de Célula Morta Próximo do IR Fixável LIVE/DEAD (Thermo Fisher Scientific Inc.) e um anticorpo antiCD19 (Beckman Coulter Inc.) foram adicionados às células, que foram depois deixadas repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS, depois ajustadas a uma concentração de 1 × 106 células/mL com PBS contendo 5% de FBS, inoculadas em uma quantidade de 100 µL/poço a uma microplaca com fundo em U de 96 poços e centrifugada para remover um sobrenadante. Cada molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo Fc (preparada no Exemplo 14) diluída com PBS contendo 5% de FBS foi adicionada a isso em

256 / 286 uma quantidade de 100 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 60 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS. Depois, R-Ficoeritrina AffiniPure Fragmento F(ab’)2 de IgG de Cabra Anti-Ser Humano, Fragmento Específico de Fcγ (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) diluído 100 vezes com PBS contendo 5% de FBS foi adicionada a isso em uma quantidade de 100 µL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS, seguida por detecção usando um citômetro de fluxo (FACSCanto® II). Os dados foram analisados usando Flowjo. A intensidade de fluorescência de PE da fração livre de células mortas foi plotada a um histograma. A intensidade de fluorescência média (MFI) foi calculada. Como um resultado, os anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos contendo Fc foram verificados ligar-se às células que expressam CD3 humano (Figura 250). 15)-1-4 Ligação de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo Fc ao CD3 de macaco cinomolgo (PBMC de macaco cinomolgo)

[00778] O tingimento e análise foram realizados da mesma maneira como no Exemplo 15)-1-3 usando as PBMC de macaco cinomolgo coletadas da mesma maneira como no Exemplo 13)-1-4. Como mostrado na Figura 251, estes anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos contendo Fc foram verificados ligar-se às células que expressam CD3 de macaco cinomolgo. 15)-2 Avaliação da atividade citotóxica de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo Fc 15)-2-1 Preparação de célula alvo

[00779] As células KHM-1B foram preparadas da mesma maneira como no Exemplo 13)-2-1 e usadas como células alvo. 15)-2-2 Preparação de célula efetora

[00780] PBMC congeladas comercialmente disponíveis (Cellular

257 / 286 Technology Limited) foram descongeladas a 37°C, transferidas para uma solução de um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS suplementado com reagente de lavagem Antiagregado (Cellular Technology Limited), lavadas duas vezes, depois ajustadas para 1,5 × 105 células/mL com um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS e usadas como célula efetora. 15)-2-3 Ensaio de citotoxicidade

[00781] As células KHM-1B obtidas no Exemplo 15)-2-1 foram adicionadas em uma concentração de 50 µL/poço a um microplaca com fundo em U de 96 poços. Cada molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo Fc (preparadas no Exemplo 14) ajustadas para concentrações variáveis foram adicionadas a isso em uma quantidade de 50 µL/poço. As células efetoras preparadas no Exemplo 15)-2-2 foram adicionadas a isso em uma quantidade de 100 µL/poço. Depois da centrifugação na temperatura ambiente a 1000 rpm durante 1 minuto, as células foram cultivadas a 37°C durante 24 ou 48 horas sob condições de 5% de CO2. Uma alíquota de 50 µL do sobrenadante foi recuperada em LumaPlate (PerkinElmer, Inc.) e secada a 50°C durante aproximadamente 2 horas, seguida pela medição usando uma leitora de placa (TopCount; PerkinElmer, Inc.). A porcentagem de células lisadas foi calculada de acordo com a seguinte expressão: Porcentagem de células lisadas (%) = (A - B) / (C - B) × 100 A: Contagem do poço de amostra B: Contagens da média do fundo (poços não suplementados com anticorpo) (n = 3). 50 µL de um meio para ensaio foram adicionados ao invés de adicionar o anticorpo. Os outros procedimentos foram os mesmos como no caso do poço de amostra.

[00782] C: Contagens da média de liberação máxima (poços contendo células alvo lisadas em um tensoativo) (n = 3). 50 µL de um meio para ensaio foram adicionados ao invés de adicionar o anticorpo. 100 µL do tensoativo foram adicionados e a alíquota de 50 µL foi transferida para LumaPlate, como

258 / 286 com o poço de amostra e ensaiada.

[00783] Como mostrado na Figura 252, estes anticorpos antiGPRC5D- antiCD3 biespecíficos contendo Fc exibiram atividade citotóxica contra as células KHM-1B.

[00784] Exemplo 16. Avaliação da atividade in vivo de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 contendo Fc

[00785] 16)-1 Atividade in vivo em modelo de coenxerto de tumor/PBMC

[00786] Uma linhagem de célula de mieloma múltiplo humano KHM- 1B (JCRB) e PBMC humano (Cellular Technology Limited) foram cada uma ajustada para 5 × 107 células/mL com PBS contendo 50% de Matrigel (Corning Inc.) e subcutaneamente coenxertada em uma quantidade de 0,1 mL a cada camundongo NOD-Scid (fêmea, 5 semanas de idade). Depois da inoculação, os camundongos foram agrupados e cada molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 foi administrada (0,1 mg/kg) nas veias da cauda. A administração foi realizada três vezes a cada dia a partir da inoculação dia (dia 0) ao dia 2. O eixo maior (mm) e eixo menor (mm) do tumor foram medidos com o tempo a partir de 1 semana mais tarde (dia 7) usando um paquímetro eletrônico digital. O volume de tumor estimado foi calculado de acordo com a seguinte expressão:

[00787] Volume de tumor estimado (mm3) = Volume de tumor estimado médio dos indivíduos

[00788] Volume de tumor estimado de cada indivíduo = Eixo maior × Eixo menor2 / 2

[00789] Uma eficácia antitumor foi confirmada em cada grupo de administração de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 (Figura 253). 16)-2 Atividade in vivo em modelo de tumor estabelecido em camundongos reconstituídos com PBMC humana

[00790] PBMC humana foram ajustadas para 5 × 107 células/mL com

259 / 286 PBS e implantadas em uma quantidade de 0,2 mL na veia da cauda de cada camundongo NOG (fêmea, 6 semanas de idade) (dia -4). No dia 0, KHM-1B foram ajustadas para 3 × 107 células/mL com PBS contendo 50% de Matrigel e subcutaneamente inoculadas em uma quantidade de 0,1 mL ao camundongo NOG. Quando o volume de tumor estimado do camundongo atingiu aproximadamente 200 mm3 (dia 12), os camundongos foram agrupados de acordo com seus volumes de tumor e cada molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 foi administrada (1 mg/kg) nas veias da cauda. A administração foi realizada nos dias 12, 15 e 18. O eixo maior (mm) e eixo menor (mm) do tumor foram medidos com o tempo usando um paquímetro eletrônico digital. O volume de tumor estimado foi calculado. Os anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos exibiram regressão de tumor. Particularmente, uma eficácia de regressão de tumor forte foi confirmada no grupo de tratamento v19125 (Figura 254). Exemplo 17. Preparação da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 tipo híbrida modificada na CDR 17)-1 Preparação do vetor de expressão da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 tipo híbrida modificada na CDR 17)-1-1 Preparação dos vetores de expressão da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 tipo híbrida modificada na CDR (C5D-0004, C5D- 0005 e C5D-0006)

[00791] Entre os vetores de expressão de molécula biespecífica tipo híbrida (v19125) construída no Exemplo 14)-1-2, pCL_#13561 que codifica o scFv-Fc antiCD3 humanizado foi usado como um padrão na mutagênese locodirigida para preparar um vetor pC3E-8015 para uma forma modificada de CDR contendo Arg no lugar de Asn53 da CDR2 de cadeia H. Do mesmo modo, entre os vetores de expressão da molécula biespecífica tipo híbrida (v19126), pCL_#13557 que codifica o scFv-Fc antiCD3 humanizado foi usado como um padrão na mutagênese locodirigida para preparar um vetor

260 / 286 pC3E-8017 para uma forma modificada de CDR contendo Arg no lugar de Asn53 da CDR2 de cadeia H e Asn no lugar de Asp52 na cadeia L. Também, pCL_#13557 foi usado como um padrão na mutagênese locodirigida para preparar um vetor pC3E-8018 para uma forma modificada de CDR contendo Ser no lugar de Asn53 da CDR2 de cadeia H e Asn no lugar de Asp52 de cadeia L.

[00792] As sequências de ORF de pC3E-8015, pC3E-8017 e pC3E- 8018 são mostradas na SEQ ID NO: 224 (Figura 255), SEQ ID NO: 226 (Figura 257) e SEQ ID NO: 228 (Figura 259), respectivamente, da Listagem de Sequências.

[00793] 17)-1-2 Preparação de vetores de expressão de molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 tipo híbrida modificada na CDR com Lys adicionada no terminal C (C5D-0014, C5D-0015 e C5D-0016)

[00794] Entre os vetores de expressão de molécula biespecífica tipo hibrido (C5D-0004) construído no Exemplo 17)-1-1, pC3E-8015 que codifica o scFv-Fc antiCD3 humanizado modificado na CDR foi usado como um padrão na mutagênese locodirigida para preparar um vetor pC3E-8025 para uma forma modificada de CDR adicionada com K contendo Lys inserido no terminal C de Fc. Do mesmo modo, pC3E-8017 ou pC3E-8018 foram usados como um padrão em uma mutagênese locodirigida para preparar vetores pC3E-8027 e pC3E-8028 para as formas modificadas de CDR adicionada em K contendo Lys inserido no terminal C de Fc.

[00795] Entre os vetores de expressão de molécula biespecífica tipo híbrido (v19125 e v19126) construídos no Exemplo 14)-1-2, pCL_#13555 que codifica o Fab-Fc antiGPRC5D foi usado como um padrão na mutagênese locodirigida para preparar um vetor pTAA_#2 para uma forma adicionada com K contendo Lys inserido no terminal C de Fc.

[00796] As sequências de ORF de pC3E-8025, pC3E-8027, pC3E- 8028 e pTAA_#2 são mostradas na SEQ ID NO: 230 (Figura 261), SEQ ID

261 / 286 NO: 232 (Figura 263), SEQ ID NO: 234 (Figura 265) e SEQ ID NO: 236 (Figura 267), respectivamente, da Listagem de Sequências. 17)-2 Produção da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 tipo híbrida modificada na CDR

[00797] As células CHO-3E7 foram subcultivadas e cultivadas de acordo com o manual do fornecedor (National Research Council Canada, Raymond C. et al., Methods (2011) 55 (1), 44-51). A solução das células CHO-3E7 na fase de crescimento logarítmica foi diluída para 2 × 10610^6 células/mL com BalanCD Transfectory CHO (Irvine Scientific) contendo 4 mM de glutamina e usada na produção de vários anticorpos biespecíficos.

[00798] As células ExpiCHO-S foram subcultivadas e cultivadas de acordo com o manual do fornecedor (Thermo Fisher Scientific Inc.). A solução das células ExpiCHO-S na fase de crescimento logarítmica foi diluída para 6 × 106 células/mL com Meio de expressão ExpiCHO (Thermo Fisher Scientific Inc.) e usadas na produção de vários anticorpos biespecíficos. 17)-2-1 Produção de anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos tipo híbrido modificados na CDR (C5D-0004, C5D-0005 e C5D-0006)

[00799] Os anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos tipo híbrido C5D-0004, C5D-0005 e C5D-0006 foram expressos pela cultura usando as células ExpiCHO-S como um hospedeiro. Um método para transfectar as células com os vetores de expressão e condições de cultura foram todos realizados de acordo com o manual anexo ao produto (Thermo Fisher Scientific Inc.). A cultura foi realizada em uma escala de 750 mL e as condições do protocolo Max titer descrito no manual foram usadas para adição de alimentação e uma temperatura de cultura. Nos 13 dias depois do início da cultura, o sobrenadante de cultura foi recuperado e filtrado através de um filtro de 0,2 µm (Sartorius Japan K.K.) para preparar uma amostra para avaliação.

[00800] Uma molécula biespecífica tipo híbrida C5D-0004 foi obtida a

262 / 286 partir da combinação de pC3E-8015, pCL_#13555 e pCL_#12123. Uma molécula biespecífica tipo híbrido C5D-0005 foi obtida a partir da combinação de pC3E-8017, pCL_#13555 e pCL_#12123. Uma molécula biespecífica tipo híbrida C5D-0006 foi obtida a partir da combinação de pC3E-8018, pCL_#13555 e pCL_#12123.

[00801] As sequências de aminoácidos que constituem C5D-0004 obtidas pela expressão a partir dos respectivos vetores são mostradas nas SEQ ID NOs: 225 (Figura 256), 215 (Figura 239) e 217 (Figura 241) da Listagem de Sequências. As sequências de aminoácidos que constituem C5D-0005 são mostradas nas SEQ ID NOs: 227 (Figura 258), 215 (Figura 239) e 217 (Figura 241) da Listagem de Sequências. As sequências de aminoácidos que constituem C5D-0006 são mostradas nas SEQ ID NOs: 229 (Figura 260), 215 (Figura 239) e 217 (Figura 241) da Listagem de Sequências. 17)-2-2 Produção de anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos tipo híbridos modificados na CDR com Lys adicionada no terminal C (C5D-0014, C5D-0015 e C5D-0016)

[00802] 800 µg de PEImax (Polisciences) foram dissolvidos em 3 mL de um meio Opti-PRO SFM (Thermo Fisher Scientific Inc.) para preparar uma solução de PEImax. 100 µg de uma mistura de vetor de pC3E-_8025, pTAA_#_#2 e pCL_#_#12123 misturados em uma razão de 1:1:1,5 foi adicionada a 3 mL de um meio Opti-PRO SFM e 100 µg de uma mistura de DNA de pAKT e pGFP misturados com DNA de esperma de salmão já fragmentado foram adicionados a 3 mL de um meio Opti-PRO SFM. A solução de PEImax, a mistura de vetores e a solução de DNA foram combinadas, suavemente agitadas, deixadas durante 5 minutos e depois adicionadas a 200 mL da solução de célula CHO-3E7. As células foram cultivadas com agitação a 37°C durante 1 dia em um incubador com 5% de CO2. Depois, 22 mL de Transfectory Supplement (Irvine Scientific), 480 µL de suplemento antiaglomeração (Thermo Fisher Scientific Inc.) e 500 µL de

263 / 286 ácido valpróico (Sigma-Aldrich Corp.) foram adicionados a isso. As células foram cultivadas ainda com agitação a 32°C durante 9 dias. Em 10 dias depois do início da cultura, o sobrenadante de cultura foi recuperado e filtrado através de um filtro de 0,2 µm (Sartorius Japan K.K.) para preparar uma amostra para avaliação.

[00803] Uma molécula biespecífica tipo híbrida C5D-0014 foi obtida a partir da combinação de pC3E-8025, pTAA_#_#2 e pCL_#_12123. Uma molécula biespecífica tipo híbrida C5D-0015 foi obtida a partir da combinação de pC3E-8027, pTAA_#_#2 e pCL_#_#12123. Uma molécula biespecífica tipo híbrida C5D-0016 foi obtida a partir da combinação de pC3E-8028, pTAA_#_#2 e pCL_#_#12123.

[00804] As sequências de aminoácidos que constituem C5D-0014 obtidas pela expressão a partir dos respectivos vetores são mostrados nas SEQ ID NOs: 231 (Figura 262), 237 (Figura 268) e 217 (Figura 241) da Listagem de Sequências. As sequências de aminoácidos que constituem C5D-0015 são mostradas nas SEQ ID NOs: 233 (Figura 264), 237 (Figura 268) e 217 (Figura 241) da Listagem de Sequências. As sequências de aminoácidos que constituem C5D-0016 são mostradas nas SEQ ID NOs: 235 (Figura 266), 237 (Figura 268) e 217 (Figura 241) da Listagem de Sequências. 17)-3 Purificação de anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos tipo híbrido modificados na CDR 17)-3-1 Purificação dos anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos tipo híbrido modificados na CDR (C5D-0004, C5D-0005 e C5D-0006)

[00805] Cada molécula biespecífica foi purificada a partir do sobrenadante de cultura obtido no Exemplo 17)-2-1 pelas três etapas usando cromatografia de afinidade em proteína A, cromatografia de hidroxiapatita e cromatografia de troca cátion. Em resumo, o sobrenadante de cultura foi aplicado a uma coluna MabSelect SuRe (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) equilibrada com PBS (pH 7,4) para absorver a molécula biespecífica de

264 / 286 interesse nela. Os componentes não absorvidos foram removidos com PBS. Depois, o componente absorvido foi eluído com um tampão de acetato a 100 mM (pH 3,5). As frações eluídas foram imediatamente ajustadas para pH neutro com um tampão Tris (pH 9,0), depois dialisadas contra 50 mM de HEPES, 10 mM de fosfato de potássio e uma solução a 100 mM de cloreto de sódio e aplicadas a uma coluna de hidroxiapatita Bio-Scale CHT Tipo-I (Bio- Rad Laboratories, Inc.). A molécula biespecífica absorvida de interesse foi eluída mudando-se a concentração de cloreto de sódio no solvente de 0,1 M para 1 M pelo gradiente de concentração linear. As frações de pico obtidas foram analisadas pela SDS-PAGE para recuperar as frações correspondendo à molécula biespecífica de interesse. Em seguida, as frações recuperadas foram substituídas no tampão com 50 mM de HEPES (pH 8,0) e uma solução a 20 mM de cloreto de sódio e depois aplicadas a uma coluna de troca de cátion Mono S (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). A molécula biespecífica absorvida de interesse foi eluída mudando-se a concentração de cloreto de sódio no solvente de 20 mM para 1 M pelo gradiente de concentração linear. As frações de pico obtidas foram analisadas pela SDS-PAGE para recuperar as frações correspondentes à molécula biespecífica de interesse. As frações finalmente recuperadas foram dialisadas contra HBsor (25 mM de histidina, 5% de sorbitol, pH 6,0) e filtradas através de um filtro para preparar uma amostra purificada. A amostra purificada foi definitivamente confirmada pela espectrometria de massa, SDS-PAGE e análise de SEC ser a molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 de interesse. 17)-3-2 Purificação de anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos tipo híbrido modificados na CDR com Lys adicionada no terminal C (C5D-0014, C5D-0015 e C5D-0016)

[00806] Cada molécula biespecífica foi purificada a partir do sobrenadante de cultura obtido no Exemplo 17)-2-2 em duas etapas usando cromatografia de afinidade em proteína A e cromatografia em hidroxiapatita.

265 / 286 Em resumo, o sobrenadante de cultura foi aplicado a uma coluna MabSelect SuRe (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) equilibrada com PBS (pH 7,4) para absorver a molécula biespecífica de interesse nela. Os componentes não absorvidos foram removidos com PBS. Depois, o componente absorvido foi eluído com um tampão de acetato a 100 mM (pH 3,0). As frações eluídas foram imediatamente ajustadas para pH neutro com um tampão de Tris (pH 9,5), depois dialisadas contra 50 mM de HEPES, 10 mM de fosfato de potássio e uma solução a 100 mM de cloreto de sódio e aplicadas a uma coluna de hidroxiapatita Bio-Scale CHT Tipo-I (Bio-Rad Laboratories, Inc.). A molécula biespecífica adsorvida de interesse foi eluída mudando-se a concentração de cloreto de sódio no solvente de 0,1 M a 1 M pelo gradiente de concentração linear. As frações de pico obtidas foram analisadas pela SDS- PAGE para recuperar frações correspondendo à molécula biespecífica de interesse. As frações finalmente recuperadas foram dialisadas contra HBsor (25 mM de histidina, 5% de sorbitol, pH 6,0) e filtradas através de um filtro para preparar uma amostra purificada. A amostra purificada foi definitivamente confirmada pela espectrometria de massa, análise de SDS- PAGE e SEC ser a molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 de interesse.

[00807] Exemplo 18. Avaliação da atividade in vitro de anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos tipo híbrido modificados na CDR com Lys adicionada no terminal C e tipo híbrido modificados na CDR 18)-1 Avaliação da atividade de ligação de anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos tipo híbrido modificados na CDR com Lys adicionada no terminal C e tipo híbrido modificados na CDR pela citometria de fluxo 18)-1-1 Ligação de anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos tipo híbrido modificados na CDR com Lys adicionada no terminal C e tipo híbrido modificados na CDR às células que expressam GPRC5D humano endógeno (KHM-1B)

[00808] A preparação, tingimento e análise de célula foram realizados

266 / 286 da mesma maneira como no Exemplo 15)-1-1. Como um resultado, os anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos foram verificados ligar-se às células que expressam GPRC5D humano (Figura 269). 18)-1-2-2 Ligação de anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos tipo híbrido modificados na CDR com Lys adicionada no terminal C e tipo híbrido modificados na CDR às células que expressam GPRC5D de macaco cinomolgo

[00809] A preparação, tingimento e análise de célula foram realizados da mesma maneira como no Exemplo 15)-1-2. Como mostrado na Figura 270, estes anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos foram verificados ligar- se às células que expressam GPRC5D de macaco cinomolgo. 18)-1-3 Ligação de anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos tipo híbrido modificados na CDR com Lys adicionada no terminal C e tipo híbrido modificados na CDR ao CD3 humano (PBMC humana)

[00810] A preparação, tingimento e análise de célula foram realizados da mesma maneira como no Exemplo 15)-1-3. Como um resultado, os anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos foram verificados ligar-se às células que expressam CD3 humano (Figura 271). 18)-1-4 Ligação de anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos tipo híbrido modificados na CDR com Lys adicionada no terminal C e tipo híbrido modificados na CDR ao CD3 de macaco cinomolgo (PBMC de macaco cinomolgo)

[00811] A preparação, tingimento e análise de célula foram realizados da mesma maneira como no Exemplo 15)-1-4. Como mostrado na Figura 272, estes anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos foram verificados ligar- se às células que expressam CD3 de macaco cinomolgo. 18)-2 Avaliação da atividade citotóxica de anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos tipo híbrido modificados na CDR com Lys adicionada no terminal C e tipo híbrido modificados na CDR

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[00812] O ensaio da atividade citotóxica foi realizado da mesma maneira como no Exemplo 15)-2-3 exceto que o tempo de cultura foi de 24, 48 ou 72 horas. Como mostrado na Figura 273, estes anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos exibiram atividade citotóxica contra as células KHM-1B. Exemplo 19. Avaliação da atividade in vivo da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 tipo híbrida modificada na CDR e tipo híbrida modificada na CDR com Lys adicionada no terminal C 19)-1 Atividade in vivo em modelo de coenxerto de tumor/PBMC

[00813] KHM-1B e PBMC humanas foram cada um ajustadas para 5 × 107 células/mL com PBS contendo 50% de Matrigel e subcutaneamente cotransplantadas em cada quantidade de 0,1 mL a cada camundongo NOD- Scid (fêmea, 5 semanas de idade). Depois da inoculação, os camundongos foram agrupados e cada molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 foi administrada (1 µg/kg) nas veias da cauda. A administração foi realizada três vezes a cada dia a partir do dia da inoculação (dia 0) até o dia 2. O eixo maior (mm) e o eixo menor (mm) do tumor foram medidos com o tempo a partir de 1 semana mais tarde (dia 7) usando um paquímetro eletrônico digital. O volume de tumor estimado foi calculado de acordo com a seguinte expressão: Volume de tumor estimado (mm3) = Volume de tumor estimado médio dos indivíduos Volume de tumor estimado de cada indivíduo = Eixo maior × Eixo menor2 / 2

[00814] Uma eficácia antitumor foi confirmada em cada grupo de administração da molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 (Figura 274). 19)-2 Atividade in vivo em modelo de tumor estabelecido em camundongos reconstituídos com PBMC humana

[00815] As PBMC humanas foram ajustadas para 5 × 107 células/mL com PBS e implantadas em uma quantidade de 0,2 mL na veia da cauda de

268 / 286 cada camundongo NOG (fêmea, 6 semanas de idade) (dia -4). No dia 0, KHM-1B foi ajustada para 3 × 107 células/mL com PBS contendo 50% de Matrigel e subcutaneamente inoculadas em uma quantidade de 0,1 mL ao camundongo NOG.

Quando o volume de tumor estimado do camundongo atingiu aproximadamente 200 mm3 (dia 11), os camundongos foram agrupados de acordo com seus volumes de tumor e cada molécula biespecífica antiGPRC5D-antiCD3 foi administrada (1 mg/kg) nas veias da cauda.

A administração foi realizada nos dias 11, 14, 15 e 17. O eixo maior (mm) e eixo menor (mm) do tumor foram medidos com o tempo usando um paquímetro eletrônico digital.

O volume de tumor estimado foi calculado.

Os anticorpos antiGPRC5D-antiCD3 biespecíficos exibiram regressão de tumor (C5D-0004 na Figura 275A, C5D-0014 na Figura 275B). [Texto Livre da Listagem de Sequências] SEQ ID NO: 1: Sequência de terminal amino de GPRC5D humano (Figura 2) SEQ ID NO: 2: Sequência de terminal amino de GPRC5D humano (Figura 3) SEQ ID NO: 3: Iniciador para a amplificação pela PCR do cDNA que codifica a região variável do gene de cadeia pesada de 2A4 SEQ ID NO: 4: Sequência de nucleotídeos de um cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada de 2A4 (Figura 8) SEQ ID NO: 5: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 2A4 (Figura 9) SEQ ID NO: 6: Sequência de nucleotídeos de um cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada de 2B1 (Figura 10) SEQ ID NO: 7: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 2B1 (Figura 11) SEQ ID NO: 8: Sequência de nucleotídeos de um cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada de 7B4 (Figura 12)

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SEQ ID NO: 9: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 7B4 (Figura 13) SEQ ID NO: 10: Iniciador para a amplificação pela PCR do cDNA que codifica a região variável do gene de cadeia leve 2A4 SEQ ID NO: 11: Sequência de nucleotídeos de um cDNA que codifica a região variável de cadeia leve de 2A4 (Figura 14) SEQ ID NO: 12: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 2A4 (Figura 15) SEQ ID NO: 13: Sequência de nucleotídeos de um cDNA que codifica a região variável de cadeia leve de 2B1 (Figura 16) SEQ ID NO: 14: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 2B1 (Figura 17) SEQ ID NO: 15: Sequência de nucleotídeos de um cDNA que codifica a região variável de cadeia leve de 7B4 (Figura 18) SEQ ID NO: 16: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 7B4 (Figura 19) SEQ ID NO: 17: Fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA que codifica os aminoácidos de uma sequência de sinal secretor da cadeia  humana e uma região constante da cadeia κ humana (Figura 20) SEQ ID NO: 18: Iniciador F para um vetor de expressão de cadeia leve (Figura 21) SEQ ID NO: 19: Iniciador R para um vetor de expressão de cadeia leve (Figura 22) SEQ ID NO: 20: Fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA que codifica os aminoácidos de uma sequência de sinal de cadeia pesada humana e uma região constante da IgG1 humana (Figura 23) SEQ ID NO: 21: Sequência de nucleotídeos da cadeia leve de 2A4 humano quimérico (c2A4) (Figura 24)

270 / 286

SEQ ID NO: 22: Sequência de aminoácidos da cadeia leve de 2A4 humano quimérico (c2A4) (Figura 25) SEQ ID NO: 23: Conjunto de iniciadores F para a cadeia leve de 2A4 humano quimérico (Figura 26) SEQ ID NO: 24: Conjunto de iniciadores R para a cadeia leve de 2A4 humano quimérico (Figura 27) SEQ ID NO: 25: Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de 2A4 humano quimérico (c2A4) (Figura 28) SEQ ID NO: 26: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de 2A4 humano quimérico (c2A4) (Figura 29) SEQ ID NO: 27: Conjunto de iniciadores F para a cadeia pesada de 2A4 humano quimérico (Figura 30) SEQ ID NO: 28: Conjunto de iniciadores R para a cadeia pesada de 2A4 humano quimérico (Figura 31) SEQ ID NO: 29: Sequência de nucleotídeos da cadeia leve de 2B1 humano quimérico (c2B1) (Figura 32) SEQ ID NO: 30: Sequência de aminoácidos da cadeia leve de 2B1 humano quimérico (c2B1) (Figura 33) SEQ ID NO: 31: Conjunto de iniciadores F para a cadeia leve de 2B1 humano quimérico (Figura 34) SEQ ID NO: 32: Conjunto de iniciadores R para a cadeia leve de 2B1 humano quimérico (Figura 35) SEQ ID NO: 33: Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de 2B1 humano quimérico (c2B1) (Figura 36) SEQ ID NO: 34: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de 2B1 humano quimérico (c2B1) (Figura 37) SEQ ID NO: 35: Conjunto de iniciadores F para a cadeia pesada de 2B1 humano quimérico (Figura 38) SEQ ID NO: 36: Conjunto de iniciadores R para a cadeia

271 / 286 pesada de 2B1 humano quimérico (Figura 39) SEQ ID NO: 37: Sequência de nucleotídeos da cadeia leve de 7B4 humano quimérico (c7B4) (Figura 40) SEQ ID NO: 38: Sequência de aminoácidos da cadeia leve de 7B4 humano quimérico (c7B4) (Figura 41) SEQ ID NO: 39: Conjunto de iniciadores F para a cadeia leve de 7B4 humano quimérico (Figura 42) SEQ ID NO: 40: Conjunto de iniciadores R para a cadeia leve de 7B4 humano quimérico (Figura 43) SEQ ID NO: 41: Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de 7B4 humano quimérico (c7B4) (Figura 44) SEQ ID NO: 42: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de 7B4 humano quimérico (c7B4) (Figura 45) SEQ ID NO: 43: Conjunto de iniciadores F para a cadeia pesada de 7B4 humano quimérico (Figura 46) SEQ ID NO: 44: Conjunto de iniciadores R para a cadeia pesada de 7B4 humano quimérico (Figura 47) SEQ ID NO: 45: Sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada do anticorpo antiGPRC5D de rato 2A4 (Figura 54) SEQ ID NO: 46: Sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada do anticorpo antiGPRC5D de rato 2A4 (Figura 55) SEQ ID NO: 47: Sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada do anticorpo antiGPRC5D de rato 2A4 (Figura 56) SEQ ID NO: 48: Sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada do anticorpo antiGPRC5D de rato 2B1 (Figura 57) SEQ ID NO: 49: Sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada do anticorpo antiGPRC5D de rato 2B1 (Figura 58) SEQ ID NO: 50: Sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada do anticorpo antiGPRC5D de rato 2B1 (Figura 59)

272 / 286

SEQ ID NO: 51: Sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada do anticorpo antiGPRC5D de rato 7B4 (Figura 60) SEQ ID NO: 52: Sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada do anticorpo antiGPRC5D de rato 7B4 (Figura 61) SEQ ID NO: 53: Sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada do anticorpo antiGPRC5D de rato 7B4 (Figura 62) SEQ ID NO: 54: Sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve do anticorpo antiGPRC5D de rato 2A4 (Figura 63) SEQ ID NO: 55: Sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve do anticorpo antiGPRC5D de rato 2A4 (Figura 64) SEQ ID NO: 56: Sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve do anticorpo antiGPRC5D de rato 2A4 (Figura 65) SEQ ID NO: 57: Sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve do anticorpo antiGPRC5D de rato 2B1 (Figura 66) SEQ ID NO: 58: Sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve do anticorpo antiGPRC5D de rato 2B1 (Figura 67) SEQ ID NO: 59: Sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve do anticorpo antiGPRC5D de rato 2B1 (Figura 68) SEQ ID NO: 60: Sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve do anticorpo antiGPRC5D de rato 7B4 (Figura 69) SEQ ID NO: 61: Sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve do anticorpo antiGPRC5D de rato 7B4 (Figura 70) SEQ ID NO: 62: Sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve do anticorpo antiGPRC5D de rato 7B4 (Figura 71) SEQ ID NO: 63: Sequência de nucleotídeos de uma cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L1) (Figura 72). Nesta sequência, as posições de nucleotídeo 1 a 60 representam uma sequência de sinal, que habitualmente não está contida na sequência de nucleotídeos da maioria das cadeias leves h2B1 maduras.

273 / 286

SEQ ID NO: 64: Sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L1) (Figura 73) SEQ ID NO: 65: Sequência de nucleotídeos da cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L2) (Figura 74) SEQ ID NO: 66: Sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L2) (Figura 75) SEQ ID NO: 67: Sequência de nucleotídeos da cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L3) (Figura 76) SEQ ID NO: 68: Sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L3) (Figura 77) SEQ ID NO: 69: Sequência de nucleotídeos da cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L4) (Figura 78) SEQ ID NO: 70: Sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L4) (Figura 79) SEQ ID NO: 71: Sequência de nucleotídeos da cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L5) (Figura 80) SEQ ID NO: 72: Sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada de 2B1 (h2B1_L5) (Figura 81) SEQ ID NO: 73: Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada humanizada de 2B1 (h2B1_H1) (Figura 82) SEQ ID NO: 74: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada humanizada de 2B1 (h2B1_H1) (Figura 83) SEQ ID NO: 75: Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada humanizada de 2B1 (h2B1_H2) (Figura 84) SEQ ID NO: 76: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada humanizada de 2B1 (h2B1_H2) (Figura 85) SEQ ID NO: 77: Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada humanizada de 2B1 (h2B1_H3) (Figura 86) SEQ ID NO: 78: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada

274 / 286 humanizada de 2B1 (h2B1_H3) (Figura 87) SEQ ID NO: 79: Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada humanizada de 2B1 (h2B1_H4) (Figura 88) SEQ ID NO: 80: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada humanizada de 2B1 (h2B1_H4) (Figura 89) SEQ ID NO: 81: Sequência de nucleotídeos da cadeia leve humanizada de 7B4 (h7B4_L1) (Figura 90) SEQ ID NO: 82: Sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada de 7B4 (h7B4_L1) (Figura 91) SEQ ID NO: 83: Sequência de nucleotídeos da cadeia leve humanizada de 7B4 (h7B4_L2) (Figura 92) SEQ ID NO: 84: Sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada de 7B4 (h7B4_L2) (Figura 93) SEQ ID NO: 85: Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada humanizada de 7B4 (h7B4_H1) (Figura 94) SEQ ID NO: 86: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada humanizada de 7B4 (h7B4_H1) (Figura 95) SEQ ID NO: 87: Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada humanizada de 7B4 (h7B4_H2) (Figura 96) SEQ ID NO: 88: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada humanizada de 7B4 (h7B4_H2) (Figura 97) SEQ ID NO: 89: Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada humanizada de 7B4 (h7B4_H3) (Figura 98) SEQ ID NO: 90: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada humanizada de 7B4 (h7B4_H3) (Figura 99) SEQ ID NO: 91: Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada humanizada de 7B4 (h7B4_H5) (Figura 100) SEQ ID NO: 92: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada humanizada de 7B4 (h7B4_H5) (Figura 101)

275 / 286

SEQ ID NO: 93: Sequência de aminoácidos do peptídeo do terminal amino of GPRC5D de macaco cinomolgo (Figura 105) SEQ ID NO: 94: Sequência de nucleotídeos de iniciador A usado na análise de sequência de scFv (Figura 106) SEQ ID NO: 95: Sequência de nucleotídeos de iniciador B usado na análise de sequência de scFv (Figura 107) SEQ ID NO: 96: Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de C2037 (Figura 108) SEQ ID NO: 97: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de C2037 (Figura 109) SEQ ID NO: 98: Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve de C2037 (Figura 110) SEQ ID NO: 99: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de C2037 (Figura 111) SEQ ID NO: 100: Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de C3048 (Figura 112) SEQ ID NO: 101: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de C3048 (Figura 113) SEQ ID NO: 102: Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve de C3048 (Figura 114) SEQ ID NO: 103: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de C3048 (Figura 115) SEQ ID NO: 104: Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de C3015 (Figura 116) SEQ ID NO: 105: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de C3015 (Figura 117) SEQ ID NO: 106: Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve de C3015 (Figura 118) SEQ ID NO: 107: Sequência de aminoácidos da região

276 / 286 variável de cadeia leve de C3015 (Figura 119) SEQ ID NO: 108: Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de C3022 (Figura 120) SEQ ID NO: 109: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de C3022 (Figura 121) SEQ ID NO: 110: Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve de C3022 (Figura 122) SEQ ID NO: 111: Sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada de C2037 (Figura 124) SEQ ID NO: 112: Sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada de C2037 (Figura 125) SEQ ID NO: 113: Sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada de C2037 (Figura 126) SEQ ID NO: 114: Sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve de C2037 (Figura 127) SEQ ID NO: 115: Sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve de C2037 (Figura 128) SEQ ID NO: 116: Sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve de C2037 (Figura 129) SEQ ID NO: 117: Sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada de C3048 (Figura 130) SEQ ID NO: 118: Sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada de C3048 (Figura 131) SEQ ID NO: 119: Sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada de C3048 (Figura 132) SEQ ID NO: 120: Sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve de C3048 (Figura 133) SEQ ID NO: 121: Sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve de C3048 (Figura 134)

277 / 286

SEQ ID NO: 122: Sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve de C3048 (Figura 135) SEQ ID NO: 123: Sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada de C3015 (Figura 136) SEQ ID NO: 124: Sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada de C3015 (Figura 137) SEQ ID NO: 125: Sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada de C3015 (Figura 138) SEQ ID NO: 126: Sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve de C3015 (Figura 139) SEQ ID NO: 127: Sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve de C3015 (Figura 140) SEQ ID NO: 128: Sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve de C3015 (Figura 141) SEQ ID NO: 129: Sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada de C3022 (Figura 142) SEQ ID NO: 130: Sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada de C3022 (Figura 143) SEQ ID NO: 131: Sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada de C3022 (Figura 144) SEQ ID NO: 132: Sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve de C3022 (Figura 145) SEQ ID NO: 133: Sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve de C3022 (Figura 146) SEQ ID NO: 134: Sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve de C3022 (Figura 147) SEQ ID NO: 135: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de C3022 (Figura 123) SEQ ID NO: 136: Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada

278 / 286 de uma forma de IgG de C2037 (Figura 148) SEQ ID NO: 137: Sequência de nucleotídeos da cadeia leve de uma forma de IgG de C2037 (Figura 149) SEQ ID NO: 138: Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de uma forma de IgG de C3048 (Figura 150) SEQ ID NO: 139: Sequência de nucleotídeos da cadeia leve de uma forma de IgG de C3048 (Figura 151) SEQ ID NO: 140: Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de uma forma de IgG de C3015 (Figura 152) SEQ ID NO: 141: Sequência de nucleotídeos da cadeia leve de uma forma de IgG de C3015 (Figura 153) SEQ ID NO: 142: Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de uma forma de IgG de C3022 (Figura 154) SEQ ID NO: 143: Sequência de nucleotídeos da cadeia leve de uma forma de IgG de C3022 (Figura 155) SEQ ID NO: 144: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de uma forma de IgG de C2037 (Figura 156) SEQ ID NO: 145: Sequência de aminoácidos da cadeia leve de uma forma de IgG de C2037 (Figura 157) SEQ ID NO: 146: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de uma forma de IgG de C3048 (Figura 158) SEQ ID NO: 147: Sequência de aminoácidos da cadeia leve de uma forma de IgG de C3048 (Figura 159) SEQ ID NO: 148: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de uma forma de IgG de C3015 (Figura 160) SEQ ID NO: 149: Sequência de aminoácidos da cadeia leve de uma forma de IgG de C3015 (Figura 161) SEQ ID NO: 150: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de uma forma de IgG de C3022 (Figura 162)

279 / 286

SEQ ID NO: 151: Sequência de aminoácidos da cadeia leve da forma de IgG de C3022 (Figura 163) SEQ ID NO: 152: Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de um anticorpo antiCD3 de rato (Figura 168) SEQ ID NO: 153: Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve do anticorpo antiCD3 de rato (Figura 169) SEQ ID NO: 154: Sequência de nucleotídeos de C3E7000 (Figura 170) SEQ ID NO: 155: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de C3E7034 (Figura 171) SEQ ID NO: 156: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de C3E7034 (Figura 172) SEQ ID NO: 157: Sequência de nucleotídeos de C3E7034 (Figura 173) SEQ ID NO: 158: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de C3E7035 (Figura 174) SEQ ID NO: 159: Sequência de nucleotídeos de C3E7035 (Figura 175) SEQ ID NO: 160: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de C3E7036 (Figura 176) SEQ ID NO: 161: Sequência de nucleotídeos de C3E7036 (Figura 177) SEQ ID NO: 162: Sequência de nucleotídeos de C2037- C3E7034 (Figura 178) SEQ ID NO: 163: Sequência de nucleotídeos de C3048- C3E7034 (Figura 179) SEQ ID NO: 164: Sequência de nucleotídeos de C3022- C3E7034 (Figura 180) SEQ ID NO: 165: Sequência de nucleotídeos de C2037-

280 / 286

C3E7035 (Figura 181) SEQ ID NO: 166: Sequência de nucleotídeos de C3048- C3E7035 (Figura 182) SEQ ID NO: 167: Sequência de nucleotídeos de C3022- C3E7035 (Figura 183) SEQ ID NO: 168: Sequência de nucleotídeos de C2037- C3E7036 (Figura 184) SEQ ID NO: 169: Sequência de nucleotídeos de C3048- C3E7036 (Figura 185) SEQ ID NO: 170: Sequência de nucleotídeos de C3022- C3E7036 (Figura 186) SEQ ID NO: 171: Sequência de aminoácidos de C2037- C3E7034 (Figura 187) SEQ ID NO: 172: Sequência de aminoácidos de C3048- C3E7034 (Figura 188) SEQ ID NO: 173: Sequência de aminoácidos de C3022- C3E7034 (Figura 189) SEQ ID NO: 174: Sequência de aminoácidos de C2037- C3E7035 (Figura 190) SEQ ID NO: 175: Sequência de aminoácidos de C3048- C3E7035 (Figura 191) SEQ ID NO: 176: Sequência de aminoácidos de C3022- C3E7035 (Figura 192) SEQ ID NO: 177: Sequência de aminoácidos de C2037- C3E7036 (Figura 193) SEQ ID NO: 178: Sequência de aminoácidos de C3048- C3E7036 (Figura 194) SEQ ID NO: 179: Sequência de aminoácidos de C3022- C3E7036 (Figura 195)

281 / 286

SEQ ID NO: 180: Sequência de aminoácidos de C3E7034 (Figura 203) SEQ ID NO: 181: Sequência de aminoácidos de C3E7035 (Figura 204) SEQ ID NO: 182: Sequência de aminoácidos de C3E7036 (Figura 205) SEQ ID NO: 183: Sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada de C3E7000 (Figura 206) SEQ ID NO: 184: Sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada de C3E7000 (Figura 207) SEQ ID NO: 185: Sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada de C3E7000 (Figura 208) SEQ ID NO: 186: Sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve de C3E7000 (Figura 209) SEQ ID NO: 187: Sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve de C3E7000 (Figura 210) SEQ ID NO: 188: Sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve de C3E7000 (Figura 211) SEQ ID NO: 189: Sequência de aminoácidos de CD3ε humano (Figura 212) SEQ ID NO: 190: Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de E1018 (Figura 213) SEQ ID NO: 191: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de E1018 (Figura 214) SEQ ID NO: 192: Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve de E1018 (Figura 215) SEQ ID NO: 193: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de E1018 (Figura 216) SEQ ID NO: 194: Sequência de nucleotídeos da região

282 / 286 variável de cadeia pesada de D1012 (Figura 217) SEQ ID NO: 195: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de D1012 (Figura 218) SEQ ID NO: 196: Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve de D1012 (Figura 219) SEQ ID NO: 197: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de D1012 (Figura 220) SEQ ID NO: 198: Sequência de nucleotídeos de h2B1 Fab HC_1 (Figura 222) SEQ ID NO: 199: Sequência de aminoácidos de h2B1 Fab HC_1 (Figura 223) SEQ ID NO: 200: Sequência de nucleotídeos de h2B1 Fab HC_2 (Figura 224) SEQ ID NO: 201: Sequência de aminoácidos de h2B1 Fab HC_2 (Figura 225) SEQ ID NO: 202: Sequência de nucleotídeos de h2B1 Fab LC_1 (Figura 226) SEQ ID NO: 203: Sequência de aminoácidos de h2B1 Fab LC_1 (Figura 227) SEQ ID NO: 204: Sequência de nucleotídeos de h2B1 Fab LC_2 (Figura 228) SEQ ID NO: 205: Sequência de aminoácidos de h2B1 Fab LC_2 (Figura 229) SEQ ID NO: 206: Sequência de nucleotídeos de C3E-7034 Fab HC (Figura 230) SEQ ID NO: 207: Sequência de aminoácidos de C3E-7034 Fab HC (Figura 231) SEQ ID NO: 208: Sequência de nucleotídeos de C3E-7034 Fab LC (Figura 232)

283 / 286

SEQ ID NO: 209: Sequência de aminoácidos de C3E-7034 Fab LC (Figura 233) SEQ ID NO: 210: Sequência de nucleotídeos de C3E-7036 Fab HC (Figura 234) SEQ ID NO: 211: Sequência de aminoácidos de C3E-7036 Fab HC (Figura 235) SEQ ID NO: 212: Sequência de nucleotídeos de C3E-7036 Fab LC (Figura 236) SEQ ID NO: 213: Sequência de aminoácidos de C3E-7036 Fab LC (Figura 237) SEQ ID NO: 214: Sequência de nucleotídeos de h2B1 Fab HC_3 (Figura 238) SEQ ID NO: 215: Sequência de aminoácidos de h2B1 Fab HC_3 (Figura 239) SEQ ID NO: 216: Sequência de nucleotídeos de h2B1 Fab LC_3 (Figura 240) SEQ ID NO: 217: Sequência de aminoácidos de h2B1 Fab LC_3 (Figura 241) SEQ ID NO: 218: Sequência de nucleotídeos de C3E-7034 scFv Fc (Figura 242) SEQ ID NO: 219: Sequência de aminoácidos de C3E-7034 scFv Fc (Figura 243) SEQ ID NO: 220: Sequência de nucleotídeos de C3E-7036 scFv Fc (Figura 244) SEQ ID NO: 221: Sequência de aminoácidos de C3E-7036 scFv Fc (Figura 245) SEQ ID NO: 222: Sequência de nucleotídeos de h2B1 scFv Fc (Figura 246) SEQ ID NO: 223: Sequência de aminoácidos de h2B1 scFv Fc

284 / 286

(Figura 247) SEQ ID NO: 224: Sequência de nucleotídeos de C3E-8015 (Figura 255) SEQ ID NO: 225: Sequência de aminoácidos de C3E-8015 (Figura 256) SEQ ID NO: 226: Sequência de nucleotídeos de C3E-8017 (Figura 257) SEQ ID NO: 227: Sequência de aminoácidos de C3E-8017 (Figura 258) SEQ ID NO: 228: Sequência de nucleotídeos de C3E-8018 (Figura 259) SEQ ID NO: 229: Sequência de aminoácidos de C3E-8018 (Figura 260) SEQ ID NO: 230: Sequência de nucleotídeos de C3E-8025 (Figura 261) SEQ ID NO: 231: Sequência de aminoácidos de C3E-8025 (Figura 262) SEQ ID NO: 232: Sequência de nucleotídeos de C3E-8027 (Figura 263) SEQ ID NO: 233: Sequência de aminoácidos de C3E-8027 (Figura 264) SEQ ID NO: 234: Sequência de nucleotídeos de C3E-8028 (Figura 265) SEQ ID NO: 235: Sequência de aminoácidos de C3E-8028 (Figura 266) SEQ ID NO: 236: Sequência de nucleotídeos de h2B1 Fab HC_4 (Figura 267) SEQ ID NO: 237: Sequência de aminoácidos de h2B1 Fab HC_4 (Figura 268)

285 / 286

SEQ ID NO: 238: Sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada de uma CDR-forma modificada (Figura 276) em que X é um aminoácido natural arbitrário.

SEQ ID NO: 239: Sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve da forma modificada de CDR (Figura 277) em que X é um aminoácido natural arbitrário.

SEQ ID NO: 240: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de uma forma modificada de CDR de C3E-7034 (Figura 278) em que X é um aminoácido natural arbitrário.

SEQ ID NO: 241: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve da forma modificada de CDR de C3E-7034 (Figura 279) em que X é um aminoácido natural arbitrário.

SEQ ID NO: 242: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de uma forma modificada de CDR de C3E-7035 (Figura 280) em que X é um aminoácido natural arbitrário.

SEQ ID NO: 243: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de uma forma modificada de CDR de C3E-7036 (Figura 281) em que X é um aminoácido natural arbitrário.

SEQ ID NO: 244: Sequência de aminoácidos de C3E- 7078（Figura 282） SEQ ID NO: 245: Sequência de aminoácidos de C3E-7085 （Figura 283） SEQ ID NO: 246: Sequência de aminoácidos de C3E- 7086（Figura 284） SEQ ID NO: 247: Sequência de aminoácidos de C3E- 7087（Figura 285） SEQ ID NO: 248: Sequência de aminoácidos de C3E- 7088（Figura 286） SEQ ID NO: 249: Sequência de aminoácidos de C3E-

286 / 286

7089（Figura 287） SEQ ID NO: 250: Sequência de aminoácidos de C3E- 7090（Figura 288） SEQ ID NO: 251: Sequência de aminoácidos de C3E- 7091（Figura 289） SEQ ID NO: 252: Sequência de aminoácidos de C3E- 7092（Figura 290） SEQ ID NO: 253: Sequência de aminoácidos de C3E- 7093（Figura 291） SEQ ID NO: 254: Sequência de aminoácidos de C3E- 7094（Figura 292） SEQ ID NO: 255: Sequência de aminoácidos de C3E- 7095（Figura 293）

Claims

1 / 42 REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve descritas em qualquer um dos seguintes (I) a (III): (II) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a cadeia pesada CDR1 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 48, a cadeia pesada CDR2 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 49, e a cadeia pesada CDR3 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 50, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a cadeia leve CDR1 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 57, a CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 58, e a cadeia leve CDR3 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 59, (I) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a cadeia pesada CDR1 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 45, a cadeia pesada CDR2 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 46, e a cadeia pesada CDR3 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47,

2 / 42 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a cadeia leve CDR1 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 54, a CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 55, e a cadeia leve CDR3 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 56, e (III) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a cadeia pesada CDR1 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 51, a cadeia pesada CDR2 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 52, e a cadeia pesada CDR3 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 53, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a cadeia leve CDR1 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 60, a CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 61, e a cadeia leve CDR3 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 62 e liga-se ao GPRC5D humano.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve descritas em (II).

3 / 42

3. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve descritas em (I).

4. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve descritas em (III).

5. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é um anticorpo quimérico ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é um anticorpo humanizado ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo.

7. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é um anticorpo humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo.

8. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com a reivindicação 1, 3 ou 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácido representadas pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 64, resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 66,

4 / 42 resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 68, resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 70, e resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácido representadas pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 74, resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76, resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 78, e resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80.

9. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com a reivindicação 1, 3, 6 ou 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende qualquer combinação de uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 74, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 64, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 74, e uma

5 / 42 região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 66, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 66, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 68, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 70, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a

6 / 42

142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 78, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 68, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 78, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 70, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 78, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 64, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 68, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma

7 / 42 sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 70, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 80, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72.

10. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com a reivindicação 1, 4 ou 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 82, ou resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 84, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácido representadas pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86, resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 88, resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 90, e resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos

8 / 42 representada pela SEQ ID NO: 92.

11. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com a reivindicação 1, 4, 6 ou 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende qualquer combinação de uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 84, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 88, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 84, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 90, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 82, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 90, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 84, e

9 / 42 uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 92, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 126 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 82,

12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende Fc.

13. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga ao GPRC5D humano e compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve descritas em qualquer um dos seguintes (1) a (4): (1) uma região variável de cadeia pesada compreendendo cadeia pesada CDR1 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 111, cadeia pesada CDR2 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 112, e cadeia pesada CDR3 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 113, e uma região variável de cadeia leve compreendendo cadeia leve CDR1 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 114, CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 115, e cadeia leve CDR3 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 116, (2)

10 / 42 uma região variável de cadeia pesada compreendendo cadeia pesada CDR1 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 117, cadeia pesada CDR2 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 118, e cadeia pesada CDR3 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 119, e uma região variável de cadeia leve compreendendo cadeia leve CDR1 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 120, CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 121, e cadeia leve CDR3 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 122, (3) uma região variável de cadeia pesada compreendendo cadeia pesada CDR1 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 123, cadeia pesada CDR2 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 124, e cadeia pesada CDR3 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 125, e uma região variável de cadeia leve compreendendo cadeia leve CDR1 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 126, CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 127, e

11 / 42 cadeia leve CDR3 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 128, e (4) uma região variável de cadeia pesada compreendendo cadeia pesada CDR1 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 129, cadeia pesada CDR2 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 130, e cadeia pesada CDR3 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 131, e uma região variável de cadeia leve compreendendo cadeia leve CDR1 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 132, CDR2 de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 133, e cadeia leve CDR3 consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 134.

14. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve descritas em (1).

15. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve descritas em (2).

16. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são a região

12 / 42 variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve descritas em (3).

17. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve descritas em (4).

18. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo qualquer uma de a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 97, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 101, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 105, e a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 109, e uma região variável de cadeia leve compreendendo qualquer uma de a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 99, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 103, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 107, e a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO:

135.

19. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 18, caracterizado pelo

13 / 42 fato de que o anticorpo compreende qualquer combinação de uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 97, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 99, uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 101, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 103, uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 105, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 107, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 109, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 135.

20. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende qualquer combinação de uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 144, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 145, uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 146, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 147,

14 / 42 uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 148, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 149, e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 150, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO:

151.

21. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendem uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleotídeo contida em um polinucleotídeo hibridizando sob condições severas a um filamento complementar de um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de aminoácidos contida em um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12 e 18 a 20, e ligam-se ao GPRC5D humano.

22. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendem uma sequência de aminoácidos 90% ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos contida em um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 12 ou 18 a 20, e ligam-se ao GPRC5D humano.

23. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendem uma sequência de aminoácidos derivada pela substituição, deleção, ou adição de 1 a vários aminoácidos de uma sequência de aminoácidos contida em um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a

15 / 42 12 ou 18 a 20, e liga-se ao GPRC5D humano.

24. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ligam-se a um sítio no GPRC5D humano ligado por um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20.

25. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno competem com um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20 quanto à ligação ao GPRC5D humano.

26. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ligam-se ao GPRC5D de macaco cinomolgo.

27. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno é Fab, F(ab)’, Fv, scFv ou sdAb.

28. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve descritas como definidas na reivindicação 2, 8 ou 9, e compreendendo i) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 199, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 203,

16 / 42 ii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 201, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 205, iii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, ou iv) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 237, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217.

29. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72, e compreendendo i) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a

17 / 42 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 199, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 203, ii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 201, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 205, iii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, ou iv) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 237, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217.

30. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve descritas como definidas na reivindicação 2, 8 ou 9, e compreendendo Fc mutado.

31. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região

18 / 42 variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72, e compreendendo Fc mutado.

32. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31.

33. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende qualquer um dos polinucleotídeos como definidos na reivindicação 32.

34. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende qualquer um dos polinucleotídeos como definidos na reivindicação 32 ou um vetor como definido na reivindicação 33, ou produzindo um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31.

35. Imunócito artificial, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo como definido na reivindicação 32 ou um vetor como definido na reivindicação 33, ou expressando um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 na superfície celular.

36. Método para produzir um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que se liga ao GPRC5D humano, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: cultivar uma célula como definida na reivindicação 34; e recuperar um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que se liga ao GPRC5D humano a partir das culturas.

37. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que se liga ao GPRC5D humano, o anticorpo ou fragmento de ligação a

19 / 42 antígeno caracterizado pelo fato de que são obtidos por um método como definido na reivindicação 36.

38. Composição medicinal para tratamento e/ou prevenção, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou 37, um polinucleotídeo como definido na reivindicação 32, um vetor como definido na reivindicação 33, ou um imunócito como definido na reivindicação 35 como um ingrediente ativo.

39. Composição medicinal de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que a composição medicinal é para o tratamento e/ou prevenção de um câncer.

40. Composição medicinal de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que o câncer é câncer mamário, câncer endometrial, câncer ovariano, câncer pulmonar, câncer estomacal, câncer prostático, câncer renal, câncer hepático, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer esofágico, câncer da bexiga urinária, câncer do colo uterino, câncer hematológico, linfoma, ou melanoma maligno expressando uma proteína de GPRC5D.

41. Composição medicinal de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que o câncer é mieloma múltiplo expressando uma proteína de GPRC5D.

42. Molécula tendo atividade de ligação a antígeno, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou 37.

43. Molécula de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a molécula é multiespecífica.

44. Molécula de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracterizada pelo fato de que a molécula compreende um anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo

20 / 42 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou 37, e um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de cadeia pesada CDR1 representada pela SEQ ID NO: 183, a sequência de aminoácidos de cadeia pesada CDR2 representada pela SEQ ID NO: 238, e a sequência de aminoácidos de cadeia pesada CDR3 representada pela SEQ ID NO: 185, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 186, a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 239, e a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 188, e liga-se ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo.

45. Molécula de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que, na CDR2 de cadeia pesada, o primeiro Xaa é selecionado do grupo consistindo em (A, E, G, H, I, L, T, V, R, e S), e o segundo Xaa é S; ou o primeiro Xaa é N, e o segundo Xaa é selecionado do grupo consistindo em (E, R, F, Y, L, V, I, K, e T), e na CDR2 de cadeia leve, Xaa é selecionado do grupo consistindo em (Q, A, G, S, N, e D) e liga-se ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo.

46. Molécula de acordo com a reivindicação 44 ou 45, caracterizada pelo fato de que, na cadeia pesada CDR2, o primeiro Xaa é selecionado do grupo consistindo em (R e S), e o segundo Xaa é S, e na CDR2 de cadeia leve, Xaa é selecionado do grupo consistindo em (Q, A, G,

21 / 42 S, N, e D), e liga-se ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo.

47. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 45, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 240 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 241, 242, e 243; e na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 240, o primeiro Xaa é selecionado do grupo consistindo em (A, E, G, H, I, L, T, V, R, e S), e o segundo Xaa é S; ou o primeiro Xaa é N, e o segundo Xaa é selecionado do grupo consistindo em (E, R, F, Y, L, V, I, K, e T), e na sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 241, 242, e 243, Xaa é selecionado do grupo consistindo em (Q, A, G, S, N e D).

48. Molécula de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo fato de que o primeiro Xaa é selecionado do grupo consistindo em (R e S), e o segundo Xaa é S na SEQ ID NO: 240, e Xaa é selecionado do grupo consistindo em (Q, A, G, S, N, e D) em qualquer uma das SEQ ID NOs: 241, 242, e 243.

49. Molécula de acordo com as reivindicações 42 ou 43, caracterizada pelo fato de que a molécula compreende um anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou 37, e um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 183,

22 / 42 a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 184, e a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada representada pela SEQ ID NO: 185, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 186, a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 187, e a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 188, e liga-se ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo.

50. Molécula de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 155 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 156, 158, e 160.

51. Molécula de acordo com a reivindicação 44 ou 50, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo é Fab, F(ab)’, Fv, scFv ou sdAb.

52. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 51, caracterizada pelo fato de que o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo é um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano compreendendo uma região constante da imunoglobulina humana ou Fc ou Fc mutado.

23 / 42

53. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 52, caracterizada pelo fato de que o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 180, 181, e 182.

54. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 53, caracterizada pelo fato de que o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo é ligado com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou 37 por intermédio de um ligante ou sem um ligante.

55. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 44 caracterizada pelo fato de que a molécula compreende um anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definido na reivindicação 2, 8 ou 9, e um anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo  uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 25 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 207 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 132 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 209,  uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 25 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 211 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos

24 / 42 representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 130 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 213,  uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 244 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 244,  uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 245 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 241 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 245,  uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 246 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 246,  uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 247 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 247,  uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 248 e uma

25 / 42 região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 248,  uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 249 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 249,  uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 250 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 250,  uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 251 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 251,  uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 252 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 252,  uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119

26 / 42 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 253 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 253,  uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 254 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 254, ou  uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 2 a 119 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 255 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 135 a 243 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 255.

56. Molécula de acordo com a reivindicação 55 caracterizada pelo fato de que o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72, e compreende i) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 199, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de

27 / 42 aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 203, ii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 201, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 205, iii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, ou iv) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 237, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende Fc mutado.

57. Molécula de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos

28 / 42 representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72, e compreende iii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, ou iv) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 237, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende Fc mutado.

58. Molécula de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de

29 / 42 aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 219 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 264 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 221 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24

30 / 42 a 264 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 225 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 227 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 229 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos

31 / 42 de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 264 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 231 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 233 e Fc mutado; ou o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco

32 / 42 cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 235 e Fc mutado.

59. Molécula de acordo com a reivindicação 55 caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 264 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 225 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 227 e Fc

33 / 42 mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 229 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 264 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 231 e Fc mutado; o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ

34 / 42 ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 233 e Fc mutado; ou o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 235 e Fc mutado.

60. Molécula de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72, e compreende

35 / 42 i) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 199, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 203, ii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 201, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 205, iii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 215, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, ou iv) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 237, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 217, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende v) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma

36 / 42 sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 147 a 471 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 207, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 133 a 238 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 209, ou vi) uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 143 a 471 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 211, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 131 a 236 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 213.

61. Molécula de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que a ligação de anticorpo ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 20 a 142 da SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da SEQ ID NO: 72, e compreende iii) uma região constante de cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 147 a 475 da SEQ ID NO: 215, e uma região constante de cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 131 a 237 da SEQ ID NO: 217 ou iv) uma região constante de cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 147 a 475 da SEQ ID NO: 237, e uma região constante de cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 131 a 237 da SEQ ID NO: 217, e a ligação de anticorpo ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende v) uma região constante de cadeia pesada compreendendo os

37 / 42 resíduos de aminoácido 147 a 471 da SEQ ID NO: 207, e uma região constante de cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 133 a 238 da SEQ ID NO: 209, ou vi) uma região constante de cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido 143 a 471 da SEQ ID NO: 211, e uma região constante de cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido 131 a 236 da SEQ ID NO: 213.

62. Molécula de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 119 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 203, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 25 a 471 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 207 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 238 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 209 ou o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 475 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ

38 / 42 ID NO: 201 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 237 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 205, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 25 a 471 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 211 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 236 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 213.

63. Molécula de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 20 a 142 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 21 a 127 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 72, e Fc mutado, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreende Fc mutado.

64. Molécula de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 271 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 223 e Fc mutado, e

39 / 42 o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 266 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 219 e Fc mutado ou o anticorpo que se liga ao GPRC5D humano ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 271 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 223 e Fc mutado, e o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelos resíduos de aminoácido 24 a 264 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 221 e Fc mutado.

65. Molécula de acordo com a reivindicação 53, caracterizada pelo fato de que o anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo é ligado com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definido na reivindicação 19 por intermédio de um ligante ou sem um ligante.

66. Molécula de acordo com a reivindicação 54 ou 65, caracterizada pelo fato de que a molécula tem uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 171 a 179 e liga-se ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo e ao GPRC5D humano.

67. Molécula, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleotídeo contida em um polinucleotídeo hibridizando sob condições severas a um filamento complementar de um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de aminoácidos contida

40 / 42 em um anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo contido em uma molécula como definida em qualquer uma das reivindicações 50, 53, 58, 59, 62 ou 64 a 66, e liga-se ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo e ao GPRC5D humano.

68. Molécula, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos 90% ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos contida em um anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definida em qualquer uma das reivindicações 50, 53, 58, 59, 62 ou 64 a 66, e liga-se ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo e ao GPRC5D humano.

69. Molécula, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos derivada pela substituição, deleção, ou adição de 1 a vários aminoácidos de uma sequência de aminoácidos contida em um anticorpo que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo contido em uma molécula como definida em qualquer uma das reivindicações 50, 53, 58, 59, 62 ou 64 a 66, e liga-se ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo e ao GPRC5D humano.

70. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 69, caracterizada pelo fato de que a molécula se liga ao GPRC5D de macaco cinomolgo.

71. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 70, caracterizada pelo fato de que a molécula é biespecífica.

72. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 71, caracterizada pelo fato de que a molécula é um polipeptídeo.

73. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácidos de uma molécula como definida na reivindicação 72.

74. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um

41 / 42 polinucleotídeo como definido na reivindicação 73.

75. Célula, caracterizada pelo fato de que produz um polinucleotídeo como definido na reivindicação 73 ou um vetor como definido na reivindicação 74, ou uma molécula como definida na reivindicação 71.

76. Método para produzir uma molécula que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo e ao GPRC5D humano, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: cultivar uma célula como definida na reivindicação 75; e recuperar uma molécula que se ligue ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo e/ou ao GPRC5D humano a partir das culturas.

77. Molécula que se liga ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo e ao GPRC5D humano, caracterizada pelo fato de que a molécula é obtida por um método como definido na reivindicação 76.

78. Molécula de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que a molécula se liga ao GPRC5D de macaco cinomolgo.

79. Composição medicinal para tratamento e/ou prevenção. caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula como definida em qualquer uma das reivindicações 42 a 72, 77 ou 78, um polinucleotídeo como definido na reivindicação 73, ou um vetor como definido na reivindicação 74 como um ingrediente ativo.

80. Composição medicinal de acordo com a reivindicação 79, caracterizada pelo fato de que a composição medicinal é para o tratamento e/ou prevenção de um câncer.

81. Composição medicinal de acordo com a reivindicação 80, caracterizada pelo fato de que o câncer é câncer mamário, câncer endometrial, câncer ovariano, câncer pulmonar, câncer estomacal, câncer prostático, câncer renal, câncer hepático, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer esofágico, câncer da bexiga urinária, câncer do colo uterino, câncer hematológico, linfoma, ou melanoma maligno expressando uma proteína de GPRC5D.

42 / 42

82. Composição medicinal de acordo com a reivindicação 79 ou 80, caracterizada pelo fato de que o câncer é mieloma múltiplo expressando uma proteína de GPRC5D.

83. Uso de uma molécula como definida em qualquer uma das reivindicações 42 a 72, 77 ou 78 ou de uma composição medicinal como definida em qualquer uma das reivindicações 60 a 63, caracterizado pelo fato de que é para preparar um medicamento para tratar e/ou prevenir um câncer.

84. Composição medicinal de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 82, caracterizada pelo fato de que a composição medicinal induz citotoxicidade para as células expressando GPRC5D pelo redirecionamento de células T para as células.

85. Uso de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o medicamento induz citotoxicidade para as células expressando GPRC5D pelo redirecionamento de células T para as células.

86. Uso de uma molécula como definida em qualquer uma das reivindicações 42 a 72, 77 ou 78 ou de uma composição medicinal como definida em qualquer uma das reivindicações 79 a 82, caracterizado pelo fato de que é para preparar um medicamento para induzir citotoxicidade para as células expressando GPRC5D pelo redirecionamento de células T para as células.

87. Uso de uma molécula como definida em qualquer uma das reivindicações 42 a 72, 77 ou 78 ou de uma composição medicinal como definida em qualquer uma das reivindicações 60 a 63, caracterizado pelo fato de que é para preparar um medicamento para redirecionar células T para as células expressando GPRC5D.