KR20220028035A - Gprc5d에 결합하는 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로, 예컨대 T세포를 활성화시키기 위한 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하여 GPRC5D에 결합하는 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체를 부호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 추가적으로, 본 발명은 상기 항체를 생성하기 위한 방법, 및 질병의 치료에서 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.

Description

GPRC5D에 결합하는 항체
본 발명은 일반적으로, 예컨대 T세포를 활성화시키기 위한 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하여 GPRC5D에 결합하는 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체를 부호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 추가적으로, 본 발명은 상기 항체를 생성하기 위한 방법, 및 질병의 치료에서 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.
EU 및 미국에서 매년 75,000명 이하의 새로운 환자에게 영향을 미치는 다발성 골수종(MM)은 가장 흔한 혈액 악성 종양 중 하나이며, 여전히 많은 충족되지 않은 의료적 요구가 있다. 다발성 골수종은 비기능적 단일클론 면역글로불린을 분비하는 말단 분화된 형질 세포를 특징으로 한다. 단기적으로는, 레날리도마이드 및 포말리도마이드와 같은 면역조절제, 및 카르필조밉 또는 보르테조밉과 같은 프로테아좀 억제제가 다발성 골수종에 대한 1차 요법의 핵심으로 남을 수 있다(Moreau, P. and S.V. Rajkumar, multiple myeloma-translation of trial results into reality. Lancet, 2016. 388(10040): p. 111-3). 하지만, 상기 약물은 특히 병든 종양 세포, 예컨대 병든 형질 세포(PC)를 표적으로 하지 않는다. 다발성 골수종에서 형질 세포를 선택적으로 고갈시키려는 노력이 있어 왔다. 형질 세포를 특이적으로 표시하는 표면 단백질의 부족은 다발성 골수종에 대한 항체 또는 세포 요법의 개발을 방해해 왔다. 지금까지, 다라투무맙(항 CD38) 및 엘로투주맙(항 CD319)을 포함하여 성공적인 생물학적 제제의 사례는 거의 없으며, 상기 두 분자는 형질 세포에 의해 고유하게 발현되지 않는다는 경고가 있다. 따라서, 다발성 골수종의 형질 세포로부터의 신규 표적은 RNA 서열분석, 예컨대 건강한 공여자의 형질 세포에 비해 다발성 골수종의 형질 세포에 의해 차등적으로 발현되는 G 단백질 결합 수용체 부류 C군 5원 D(GPRC5D)를 사용하여 확인되었다. GPRC5D는 다발성 골수종 환자의 예후 및 종양 부하와 관련이 있는 것으로 보고되었다(Atamaniuk, J., et al., Overexpression of G protein-coupled receptor 5D in the bone marrow is associated with poor prognosis in patients with multiple myeloma. Eur J Clin Invest, 2012. 42(9): p. 953-60; and Cohen, Y., et al., GPRC5D is a promising marker for monitoring the tumour load and to target multiple myeloma cells. Hematology, 2013. 18(6): p. 348-51).
GPRC5D는 공지된 리간드가 없고 일반적으로 남성과 특히 암에서의 생물 작용이 거의 공지되지 않은 고아 수용체이다. 염색체 12p13.3 상에 매핑된 GPRC5D 부호화 유전자는 3개의 엑손을 함유하고 약 9.6kb에 걸쳐 있다(Brauner-Osborne, H., et al., Cloning and characterization of a human orphan family C G-protein coupled receptor GPRC5D. Biochim Biophys Acta, 2001. 1518(3): p. 237-48). 큰 제1 엑손은 7개의 막관통 도메인을 부호화한다. GPRC5D는 동물의 모낭에서 케라틴 형성에 관여하는 것으로 나타났다(Gao, Y., et al., Comparative Transcriptome Analysis of Fetal Skin Reveals Key Genes Related to Hair Follicle Morphogenesis in Cashmere Goats. PLoS One, 2016. 11(3): p. e0151118; and Inoue, S., T. Nambu, and T. Shimomura, The RAIG family member, GPRC5D, is associated with hard-keratinized structures. J Invest Dermatol, 2004. 122(3): p. 565-73).
WO 2018/017786 A2는 GPRC5D 특이적 항체 또는 항원 결합 단편을 개시한다.
모든 표준 치료법들이 다발성 골수종 환자를 치료하는 것은 아니라는 점을 감안할 때, 강력하고 특정한 신규 치료법을 개발할 필요성이 분명히 있다. 상기 접근법 중 하나는 GPRC5D에 결합하는 항체, 특히 표적 세포 상의 GPRC5D, 및 활성화 T세포 항원, 예컨대 T세포 상의 CD3에 결합하는 이중특이적 항체를 포함한다. 상기 항체가 이의 두 표적 모두에 동시에 결합하면, T세포 시냅스가 형성되어 (세포독성)T세포가 활성화된 후 표적 세포가 용해된다.
본 발명은 인간 GPRC5D에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 포함하는 신규 항체를 제공한다. 특히, GPRC5D를 표적으로 하는 본 발명에 따른 T세포 이중특이적 항체는 다발성 골수종을 치료하는 효능을 갖는다.
본 발명자들은 신규 GPRC5D 항체를 도입하여 GPRC5D 및 활성화 T세포 항원에 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자를 개발하였다.
제1 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서:
(a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고 상기 제1 항원 결합 모이어티는: (i) 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 84의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (ii) 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 85의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (iii) 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (iv) 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 96의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는 (v) 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 92의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제1 항원 결합 모이어티; 및 (b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고 상기 제2 항원 결합 모이어티는: (i) 서열번호 29의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 30의 HCDR 2, 및 서열번호 31의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 32의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 33의 LCDR 2, 및 서열번호 34의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (i) 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는 (ii) 서열번호 106의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 107의 HCDR 2, 및 서열번호 108의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 109의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 110의 LCDR 2, 및 서열번호 111의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
다른 구현예에서, (i) 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VH는 서열번호 13의 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 14의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (ii) 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VH는 서열번호 15의 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (iii) 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VH는 서열번호 48의 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 53의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (iv) 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VH는 서열번호 49의 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 52의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (v) 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VH는 서열번호 57의 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 64의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (vi) 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VH는 서열번호 58의 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 63의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 VH는 (i) 서열번호 35의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 36의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고; (ii) 서열번호 104의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 105의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나; 또는 (iii) 서열번호 112의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 113의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 제1 및/또는 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이다. 이는 상기 제1 항원 결합 모이어티가 Fab 분자일 수 있거나, 상기 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 분자일 수 있거나, 상기 제1 항원 결합 모이어티 및 상기 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 분자들일 수 있음을 의미한다. 다른 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL과 VH 또는 불변 도메인 CL과 CH1, 특히 가변 도메인 VL 및 VH가 상호 대체되는 Fab 분자이다. 다른 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이고, 상기 불변 도메인에서 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트(Kabat)에 따른 넘버링), 위치 123의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환되며(카바트 EU 지수에 따른 넘버링), 위치 213의 아미노산은 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 다른 구현예에서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 상호, 선택적으로 펩티드 링커를 통해, 융합된다. 다른 구현예에서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 분자이고, (i) 상기 제2 항원 결합 모이어티는 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되거나, (ii) 상기 제1 항원 결합 모이어티는 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 다른 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 항원 결합 모이어티를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 제3 항원 모이어티는 상기 제1 항원 결합 모이어티와 동일하다. 다른 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 제1, 제2, 및, 존재하는 경우, 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 분자이고; (i) 상기 제2 항원 결합 모이어티는 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 Fc 도메인의 제1 아단위의 N 말단에 융합되거나, (ii) 상기 제1 항원 결합 모이어티는 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 Fc 도메인의 제1 아단위의 N 말단에 융합되며; 상기 제3 항원 결합 모이어티는, 존재하는 경우, 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 Fc 도메인의 제2 아단위의 N 말단에 융합된다. 다른 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 다른 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 또 다른 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 다른 구현예에서, 상기 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인 내 아미노산 잔기는 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체됨으로써 상기 제2 아단위의 CH3 도메인 내부 공동에 위치가능한 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 돌기를 생성하고, 상기 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인 내 아미노산 잔기는 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체됨으로써 상기 제1 아단위의 CH3 도메인 내부 돌기가 위치가능한 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 공동을 생성한다. 다른 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 Fc 수용체 및/또는 효능기 기능에 대한 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자를 부호화하는 하나 이상의 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 벡터, 특히 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(들)을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드(들) 또는 벡터(들)을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에서, GPRC5D에 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자를 생성하는 방법으로서,
a) 상기 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에서 본원에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 b) 선택적으로 상기 이중특이적 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 제21항에 따른 방법에 의해 생성된 GPRC5D에 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본원에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 본원에 기재된 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 질병의 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 본원에 개시된 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학적 조성물을 제공하고, 상기 질병은 암 또는 자가면역 질환이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학적 조성물을 제공하고, 상기 질병은 다발성 골수종이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에서 본원에 개시된 이중특이적 항원 결합 분자의 사용을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 개체의 질병, 특히 암, 더욱 특히 다발성 골수종을 치료하는 방법으로서, 약학적으로 허용가능한 형태의 본원에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한 조성물의 치료적 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 대안적으로, 상기 질병은 자가면역 질환, 예컨대 전신 홍반성 루푸스 및/또는 류마티스 관절염이다. 상기 구현예들 중 임의의 것에서, 상기 개체는 바람직하게는 포유류, 특히 인간이다.
도 1a-도1z. 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 예시적인 구성의 예시. (도 1a, 도 2d) “1+1 CrossMab” 분자의 예시. (도 1b, 도 1e) Crossfab 및 Fab 성분들의 대안적 순서(“반전됨”)를 갖는 “2+1 IgG Crossfab” 분자의 예시. (도 1c, 도 1f) “2+1 IgG Crossfab” 분자의 예시. (도 1g, 도 1k) Crossfab 및 Fab 성분들의 대안적 순서(“반전됨”)를 갖는 “1+1 IgG Crossfab” 분자의 예시. (도 1h, 도 1l) “1+1 IgG Crossfab” 분자의 예시. (도 1l, 도 1m) 2개의 CrossFab를 갖는 “2+1 IgG Crossfab” 분자의 예시. (도 1j, 도 1n) 2개의 CrossFab 및 Crossfab와 Fab 성분들의 대안적 순서(“반전된”)를 갖는 “2+1 IgG Crossfab” 분자의 예시. (도 1o, 도 1s) “Fab-Crossfab” 분자의 예시. (도 1p, 도 1t) “Crossfab-Fab” 분자의 예시. (도 1q, 도 1u) “(Fab)2-Crossfab” 분자의 예시. (도 1r, 도 1v) “Crossfab-(Fab)2” 분자의 예시. (도 1w, 도 1y) “Fab-(Crossfab)2” 분자의 예시. (도 1x, 도 1z) “(Crossfab)2-Fab” 분자의 예시. 검은 점: 이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인의 선택적 변형. ++, --: CH1 및 CL 도메인 내에 선택적으로 도입된 반대 전하의 아미노산. Crossfab 분자는 VH 및 VL 영역의 교환을 포함하는 것으로 도시되지만, - 전하 변형이 CH1 및 CL 도메인 내에 도입되지 않는 구현예들에서 - CH1 및 CL 도메인의 교환을 대안적으로 포함할 수 있다.
도 2. RNAseq에 의한 형질 세포 및 B세포에 대한 종양 표적의 유전자 발현의 분석.
도 3. 본 발명의 5E11 이중특이적 항원 결합 분자의 예시적인 구성. 검은 점: 이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인의 선택적 변형. ++, --: CH1 및 CL 도메인 내에 선택적으로 도입된 반대 전하의 아미노산.
도 4a-도 4c. GPRC5D 발현 다발성 골수종 세포주 AMO-1, L636, NCI-H929, RPMI-8226, OPM-2 및 대조군 WSU-DLCL2에 대한 이중특이적 항원 결합 분자 5F11-TCB(도 4a) 및 5E11-TCB(도 4b) 및 대조군 항체 ET150-5-TCB(도 4c)의 결합 분석.
도 5a-도 5e. 다발성 골수종 세포주 AMO-1(도 5a), NCI-H929(도 5b), RPMI-8226(도 5c) 및 L363(도 5d) 상의 GPRC5D-TCB 매개 T세포의 세포 독성의 분석. 대조군 세포주는 WSU-DL CL2이다(도 5e). 시험된 분자들: 5E11-TCB, 5F11-TCB. 대조군 분자들: DP47-TCB(비표적) 및 ET150-5-TCB.
도 6. 다발성 골수종 세포주 NCI-H929 및 CD25와 CD69를 상향 조절하는 음성 대조군 세포주 WSU-DLCL2와의 GPRC5D-TCB 활성화 T세포 결합의 분석.
도 7a-도 7j. AMO-1(도 7a), NCI-H929(도 7b), RPMI-8226(도 7c), L363(도 7d) 및 WSU-DLCL2(도 7e)의 존재하에 증가하는 농도의 GPRC5D-TCB 또는 음성 대조군 DP47-TCB와 함께 T세포 배양 시 CD8+ T세포 상의 CD25의 상향 조절에 의해 결정되는 바와 같은; 및 AMO-1(도 7f), NCI-H929(도 7g), RPMI-8226(도 7h), L363(도 7i) 또는 WSU-DLCL2(도 7j)의 존재하에 증가하는 농도의 GPRC5D-TCB 또는 음성 대조군 DP47-TCB와 함께 T세포 배양 시 CD8+ T세포 상의 CD69의 상향 조절에 의해 결정되는 바와 같은 T세포 활성화
도 8a-도 8b. 형광 공초점 현미경에 의한 항체 국소화 및 내재화의 시각화(도 8a) 및 막 대 세포질의 신호 강도 분석(도 8b).
도 9. 인간, 시노몰구스 및 뮤린 GPRC5D에 대한 상이한 항 GPRC5D 항체의 결합은 인간 GPRC5D(클론 12) 또는 시노몰구스 GPRC5D(클론 13), 뮤린 GPRC5D(클론 4) 또는 인간 GPRC5A(클론 30)를 발현하는 안정적으로 형질감염된 CHO 클론을 사용하여 ELISA에 의해 평가되었다.
도 10a-도 10g. 20시간의 공동 배양(E:T = 10:1, 인간 범 T세포) 중 상이한 GPRC5D 또는 BCMA 표적화 T세포 이중특이적 분자들에 의해 유도된 다양한 다발성 골수종(MM)의 T세포 매개 용해. SD를 갖는 복제가 도시되었다.
도 11a-도 11f. 동종이계 범 인간 T세포 및 처리되지 않은 골수 세포의 20시간 공동 배양(E:T = 10:1, 인간 범 T세포) 중 상이한 GPRC5D 또는 BCMA 표적화 T세포 이중특이적 분자들(도 11a의 5E11-TCB; 도 11b의 5F11-TCB; 도 11c의 10B10-TCB; 도 11d의 BCMA-TCB; 도 11e의 B72-TCB; 도 11f의 DP47-TCB)에 의해 유도된 다양한 다발성 골수종(MM)의 T세포 매개 용해. 1명의 대표적인 공여자로부터 CD4(위쪽 행) 또는 CD8T세포(아래쪽 행) 상에서 활성화 표지자 CD69의 상향 조절을 모든 CD4 각각의 CD8 T세포들 중 양성 세포 백분율로 표시하는 FACS 점 도표가 도시되었다.
도 12a-도 12b. 건강한 공여자들로부터의 동종이계 범 인간 T세포 및 처리되지 않은 골수 세포의 ~20시간 공동 배양(E:T = 10:1, 인간 범 T세포) 중 상이한 GPRC5D 또는 BCMA 표적화 T세포 이중특이적 분자들에 의해 유도된 T세포 매개 용해. 4명 모두의 평가된 공여자로부터 50 nM의 TCB(도 12a) 또는 5 nM(도 12b)의 선택된 고정 용량에서 CD8 T세포 상의 활성화 표지자 CD69의 상향 조절을 표시하는 개요가 도시되었다.
도 13a-도 13d. NCI-H929 종양 세포가 이식된 인간화 NSG 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 종양 성장 동력학에 의해 묘사된 바와 같이 상이한 GPRC5D 표적화 T세포 이중특이적 분자(도 13a의 5F11-TCB; 도 13b의 BCMA-TCB; 도 13c의 B72-TCB; 도 13d의 비히클(vehicle))에 의해 유도된 생체내 효능. 단일 마우스를 참조하는 각 라인을 갖는 거미 그래프가 도시된다.
도 14a-도 14d. OPM-2 종양 세포가 이식된 인간화 NSG 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 종양 성장 동력학에 의해 묘사된 바와 같이 상이한 GPRC5D 표적화 T세포 이중특이적 분자(도 14a의 5F11-TCB; 도 14b의 5E11-TCB; 도 14c의 B72-TCB; 도 14d의 비히클)에 의해 유도된 생체내 효능. 단일 마우스를 참조하는 각 라인을 갖는 거미 그래프가 도시된다.
도 15a-도 15b. 발광에 의해 결정된 바와 같은 대략 16시간의 배양 이후 PGLALA-CAR-J 활성화. 후자는 GPRC5D 발현 다발성 골수종 세포주 L-363에 대한 GPRC5D IgG(도 15a의 5F11-IgG; 도 15b의 5E11-IgG), 및 상기 IgG 분자의 Fc 부분에서 PGLALA 돌연변이에 대해 지향된 TCR 을 발현하도록 유전적으로 조작된 저캇(Jurkat)-NFAT 리포터 세포에 대한 PGLALA 변형 Fc 도메인의 동시 결합시 유도된다. SD를 갖는 복제가 도시되었다.
도 16a-도 16d. NCI-H929 세포 상의 인간 GPRC5D(도 16a 및 도 16b) 및 세포 상에서 발현된 저캇 세포 상의 인간 CD3(도 16c 및 도 16d)에 대한 인간화 TCB 분자 대 모 TCB의 결합.
도 17a-도 17g. 지시된 바와 같이 상이한 GPRC5DxCD3 이중특이적 TCB 분자(도 17a-도 17g) 대 비표적 대조군 TCB의 존재하의 저캇-NFAT 활성화 분석.
도 18a-도 18d. 본원에 제시된 GPRC5D-TCB 분자와 GPRC5D 또는 BCMA를 표적으로 하는 당업계에 공지된 분자를 비표적 참조 TCB 분자와 비교하는 종양 세포 용해 분석.
도 19. 상이한 CD3 결합 이중특이적 분자를 갖는 1차 MM 샘플의 배양 시 자가 T세포의 활성화. 본원에 제시된 GPRC5D-TCB를 GPRC5D 또는 BCMA를 표적으로 하는 당업계에 공지된 분자 대 비표적 참조 TCB 분자와 비교하였다.
도 20a-도 20d. 상이한 CD3 결합 이중특이적 분자를 가진 건강한 공여자로부터의 PBMC 배양 시 B세포의 고갈. 본원에 제시된 GPRC5D-TCB를 GPRC5D 또는 BCMA를 표적으로 하는 당업계에 공지된 분자 대 비표적 참조 TCB 분자와 비교하였다. 항체를 50 nM(도 20a), 5 nM(도 20b), 0.5 nM(도 20c) 및 0.05 nM(도 20d)의 농도로 사용하였다.
도 21a-도 21b. 상이한 CD3 결합 이중특이적 분자를 가진 건강한 공여자로부터의 골수 샘플 배양 시 T세포의 활성화. 본원에 제시된 GPRC5D-TCB를 당업계에 공지된 분자들과 비교하였다. 활성화는 모든 CD8+ 및 각각의 CD4+ T세포 중에서 사용된 CD69+CD8+ T세포(도 21a) 및 CD69+CD4+T세포(도 21b) 중 하나의 검출 비율에 의해 결정되었다.
도 22a-도 22b. 건강한 공여자의 인간 전혈에서 사이토카인 방출(도 22a의 TNFa 판독값, 도 22b의 IL6 판독값). 본원에 기재된 GPRC5D-TCB 그리고 양성(가싸이바(Gazyva), 렘트라다(Lemtrada)) 및 음성(얼비툭스(Erbitux)) 참조 분자를 비교하였다.
도 23a-도 23g. 각 라인이 단일 마우스를 나타내는 치료 과정에 따른 치료군당 평균 종양 부피(도 23a), 37일차 종양 부피(도 23b), 및 분자들에 대한 종양 성장(비히클: 도 23c; 6623: 도 23d; 6624: 도 23e, 6625: 도 23f, 6626: 도 23g)을 포함한 NCI-H929(hNSG 마우스) 내 상이한 GPRC5DxCD3 이중특이적 TCB 분자의 생체내 효능.
도 24. hFcRn Tg 및 KO 마우스의 생체 내 SDPK 및 표시된 TCB 분자의 제거 데이터.
도 25a-도 25i. 인간 GPRC5D 발현 다발성 골수종 세포주 OPM-2(도 25a, 도 25d, 도 25g), NCI-H929(도 25b, 도 25e, 도 25h) 및 RPMI-8226(도 25c, 도 25f, 도 25i)에 대한 이중특이적 항원 결합 분자 5E11(6625)-TCB의 결합 분석의 대표적인 예. 세포주당 GPRC5D 항체 결합 부위(ABS)의 수는 괄호 안에 제공되며 이전에 QSC(퀀텀 심플리 셀룰러(Quantum Simply Cellular), 뱅스랩스(BangsLabs))에 의해 결정되었다. SD를 갖는 삼중으로부터 상대 중앙 형광 값(MFI)이 표시된다. 결합의 EC50 값은 그래프패드프리즘(GraphPadPrism)으로 계산하였고 표 14.2에 요약되어 있다.
정의
용어는 하기에서 다르게 정의하지 않는 한, 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 본원에서 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "항원 결합 분자"는 가장 넓은 의미로 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자의 예는 면역글로불린 및 유도체, 예컨대 이의 단편이다.
용어 “이중특이적”은 항원 결합 분자가 적어도 2개의 구별되는 항원 결정기에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 전형적으로, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결합 부위를 포함하고, 이들은 각각 상이한 항원 결정기에 대해 특이적이다. 특정 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결정기, 특히 2개의 구별되는 세포 상에서 발현되는 2개의 항원 결정기에 동시에 결합할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 “결합가(valent)”는 항원 결합 분자 내 명시된 수의 항원 결합 부위의 존재를 나타낸다. 이처럼, 용어 “항원에 대한 일가 결합”은 항원 결합 분자 내 항원에 특이적인 하나(및 하나 이하)의 항원 결합 부위의 존재를 나타낸다.
“항원 결합 부위”는 항원과의 상호작용을 제공하는, 항원 결합 분자의 부위, 즉 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예를 들어, 항체의 항원 결합 부위는 상보성 결정 영역(CDR)으로부터 아미노산 잔기를 포함한다. 선천적 면역글로불린 분자는 전형적으로 2개의 항원 결합 부위를 갖고, Fab 분자는 전형적으로 단일 항원 결합 부위를 갖는다.
본원에서 사용된 용어 "항원 결합 분자"는 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 한 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 자신이 부착되는 실체(예컨대, 제2 항원 결합 모이어티)를, 표적 부위, 예를 들어 항원 결정기를 수반하는 특이적 유형의 종양 세포로 지향시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 이의 표적 항원, 예를 들어 T세포 수용체 복합체 항원을 통해 신호전달을 활성화할 수 있다. 항원 결합 모이어티는 본원에 추가로 정의된 바와 같은 항체 및 이의 단편을 포함한다. 특정 항원 결합 모이어티는 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 특정 구현예들에서, 상기 항원 결합 모이어티는 본원에 추가로 정의되고 당업계에 공지된 항체 불변 영역을 포함할 수 있다. 유용한 중쇄 불변 영역은 5가지 동형 중 임의의 것을 포함한다: α, δ, ε, γ, 또는 μ. 유용한 경쇄 불변 영역은 2가지 동형 중 임의의 것을 포함한다: κ 및 λ.
본원에서 사용된 용어 "항원 결정기"는 "항원" 및 "에피토프"와 동의어이며, 항원 결합 모이어티가 결합되어 항원 결합 모이어티-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자 상의 부위(예컨대, 아미노산의 연속 신장부 또는 비연속 아미노산의 상이한 영역들로 구성된 입체형태 구조)를 말한다. 유용한 항원 결정기는, 예를 들어 종양 세포의 표면 상에서, 바이러스 감염된 세포의 표면 상에서, 다른 병든 세포의 표면 상에서, 면역 세포의 표면 상에서, 혈청에서 자유롭게 및/또는 세포외 기질(ECM)에서 발견될 수 있다. 본원에서 항원으로 지칭된 단백질은, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예컨대, 인간), 비인간 영장류(예컨대, 시노몰구스 원숭이) 및 설치류(예컨대, 마우스 및 쥐)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 형태의 단백질일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 항원은 인간 단백질이다. 본원에서 특이적 단백질이 언급되는 경우에, 상기 용어는 “전장”의 처리되지 않은 단백질뿐만 아니라 세포 내 처리로부터 발생하는 상기 단백질의 임의의 형태를 수반한다. 상기 용어는 또한, 단백질의 자연 발생 변이체, 예컨대 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 수반한다. 항원으로 유용한 예시적인 인간 단백질은 CD3, 특히 CD3의 엡실론 아단위(인간 서열의 경우 유니프롯(UniProt) 번호 P07766(버전 185), NCBI RefSeq no. NP_000724.1, 서열번호 40; 또는 시노몰구스[필리핀 원숭이] 서열의 경우 유니프롯 번호 Q95LI5(버전 69), NCBI 젠뱅크(GenBank) 번호 BAB71849.1, 서열번호 41을 참조), 또는 GPRC5D(인간 서열의 경우 유니프롯 번호 Q9NZD1(버전 115); NCBI RefSeq 번호 NP_061124.1, 서열번호 45를 참조)이다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 상이한 종으로부터의 CD3 또는 GPRC5D 항원 중에서 보존되는 CD3 또는 GPRC5D의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 인간 GPRC5D에 결합한다.
"특이적 결합"은 결합이 항원에 선택적이고, 원하지 않은 또는 비특이적 상호작용과 구별될 있다는 것을 의미한다. 특이적 항원 결정기에 결합하는 항원 결합 모이어티의 능력은 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 또는 당업자에게 익숙한 다른 기술, 예컨대 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술(예컨대, 비아코어(BIAcore) 기기에서 분석됨)(Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) 및 전통적인 결합 분석(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))을 통해 측정하 수 있다. 한 구현예에서, 관련 없는 단백질에 대한 항원 결합 모이어티의 결합 정도는, 예컨대 SPR에 의해 측정될 때 항원에 대한 항원 결합 모이어티의 결합의 약 10%보다 적다. 특정 구현예들에서, 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티, 또는 상기 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 분자는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM(예컨대, 10-8 M 또는 그 이하, 예컨대 10-8 M 내지 10-13 M, 예컨대 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
"친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예컨대, 수용체) 및 이의 결합 짝(예컨대, 리간드) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 다르게 지시되지 않는 한, 본원에서 사용된 “결합 친화도”는 결합 쌍의 구성요소들(예컨대, 항원 결합 모이어티 및 항원, 또는 수용체 및 이의 리간드) 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화도를 지칭한다. 이의 짝 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있으며, 이는 해리 및 결합 속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비율이다. 따라서, 등가의 친화도들은 속도 상수들의 비가 동일하게 유지되는 한, 상이한 속도 상수들을 포함할 수 있다. 친화성은 본원에서 설명된 것들을 비롯한, 당해 분야에서 공지된 충분히 확립된 방법에 의해 계측될 수 있다. 친화도를 측정하기 위한 특정 방법은 표면 플라즈몬 공명(SPR)이다.
“감소된 결합”, 예를 들어 Fc 수용체에 감소된 결합은, 예를 들어 SPR에 의해 측정될 때, 각각의 상호작용에 대한 친화도에서 감소를 지칭한다. 명료함을 위해, 상기 용어는 또한, 0(또는 분석 방법의 검출 한계 미만)까지 친화도의 감소, 즉 상호작용의 완전한 소멸을 포함한다. 반대로, “증가된 결합”은 각각의 상호작용에 대한 결합 친화도에서 증가를 지칭한다.
본원에서 사용된 "활성화 T세포 항원"은 항원 결합 분자와 상호작용시 T세포 활성화를 유도할 수 있는 T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 표면 상에 발현되는 항원 결정기를 지칭한다. 구체적으로, 항원 결합 분자와 활성화 T세포 항원의 상호작용은 T세포 수용체 복합체의 신호전달 캐스케이드를 촉발함으로써 T세포 활성화를 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 활성화 T세포 항원은 CD3, 특히 CD3의 엡실론 아단위(인간 서열의 경우 유니프롯(UniProt) 번호 P07766(버전 144), NCBI RefSeq no. NP_000724.1, 서열번호 40; 또는 시노몰구스[필리핀 원숭이] 서열의 경우 유니프롯 번호 Q95LI5(버전 49), NCBI 젠뱅크(GenBank) 번호 BAB71849.1, 서열번호 41을 참조)이다.
본원에서 사용된 “T세포 활성화”는 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효능기 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 표지자의 발현으로부터 선택되는 T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 하나 이상의 세포 반응을 지칭한다. T세포 활성화를 측정하기 위한 적합한 분석은 당해 분야에서 공지되고 본원에서 설명된다.
본원에서 사용된 “표적 세포 항원”은 표적 세포, 예를 들어 종양 내 세포, 예컨대 암 세포 또는 종양 간질의 세포의 표면 상에서 제시된 항원 결정기를 지칭한다. 특정 구현예에서, 상기 표적 세포 항원은 서열번호 45에 따른 GPRC5D, 특히 인간 GPRC5D이다.
본원에서 사용된 바와 같이, Fab 분자 등에 대한 용어 “제1”, “제2” 또는 “제3”은 각 유형의 모이어티가 하나를 초과할 때 편의상 구분하기 위해 사용한다. 상기 용어의 사용은 분명하게 진술되지 않는 한, 이중특이적 항원 결합 모이어티의 특정한 순서 또는 배향을 부여하는 것으로 의도되지 않는다.
“융합된”은 성분(예컨대, Fab 분자 및 Fc 도메인 아단위)이 직접적으로 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해, 펩티드 결합에 의해 연결되는 것을 의미한다.
“Fab 분자”는 면역글로불린의 중쇄(“Fab 중쇄”)의 VH 및 CH1 도메인 및 경쇄(“Fab 경쇄”)의 VL 및 CL 도메인으로 구성되는 단백질을 지칭한다.
“교차” Fab 분자(“Crossfab”으로도 명명됨)는 Fab 분자로서, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 또는 불변 도메인이 교환되는(즉, 상호 대체되는), 즉 교차 Fab 분자가 경쇄 가변 도메인 VL 및 중쇄 불변 도메인 1 CH1(N에서 C 말단 방향으로 VL-CH1)으로 구성되는 펩티드 사슬, 및 중쇄 가변 도메인 VH 및 경쇄 불변 도메인 CL(N에서 C 말단 방향으로 VH-CL)로 구성되는 펩티드 사슬을 포함하는 것을 의미한다. 명료함을 위해, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인이 교환되는 교차 Fab 분자에서, 중쇄 불변 도메인 1 CH1을 포함하는 펩티드 사슬은 본원에서 (교차)Fab 분자의 “중쇄”로서 지칭된다. 반대로, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 도메인이 교환되는 교차 Fab 분자에서, 중쇄 가변 도메인 VH를 포함하는 펩티드 사슬은 본원에서 (교차)Fab 분자의 “중쇄”로서 지칭된다.
이와 대조적으로, “전통적인” Fab 분자는 이의 자연 형식에서, 즉 중쇄 가변 및 불변 도메인으로 구성되는 중쇄(N에서 C 말단 방향으로 VH-CH1), 및 경쇄 가변 및 불변 도메인으로 구성되는 경쇄(N에서 C 말단 방향으로 VL-CL)를 포함하는 Fab 분자인 것을 의미한다.
용어 “면역글로불린 분자”는 자연 발생 항체의 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, IgG 부류의 면역글로불린은 이황화 결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N 말단에서부터 C 말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VH)에 이어, 중쇄 불변 영역이라고도 불리는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N 말단에서부터 C 말단으로, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 영역으로 또한 불리는 가변 도메인(VL)에 이어, 경쇄 불변 영역으로도 불리는 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG), 또는 μ(IgM)으로 불리는 5가지 유형 중 하나에 배정될 수 있으며, 이들 중에서 일부는 아형, 예컨대 γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 추가로 나눠질 수 있다. 면역글로불린의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2가지 유형 중에서 하나에 배정될 수 있다. 면역글로불린은 본질적으로 면역글로불린 힌지 영역을 통해 연결된, 2개의 Fab 분자 및 Fc 도메인으로 구성된다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미에서 사용되고, 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 수반한다.
본원에서 사용되는 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 개체군에서 수득한 항체를 지칭한다, 즉 상기 개체군 내에 포함된 개별 항체는, 예컨대 자연 발생 돌연변이를 함유하거나 또는 단일클론 항체 제제의 생성 중에 발생하는 가능한 변이체 항체(상기 변이체는 일반적으로 미량으로 존재함)를 제외하고는 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정기(에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정기에 대해 지향된다. 따라서, 수식어 “단일클론”은 항체의 실질적으로 균질한 개체군에서 수득한 것으로서 항체의 특징을 나타내고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법 및 인간 면역글로불린 유전자 자리의 전부 또는 일부를 함유하는 형질전환 동물을 이용하는 방법들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 상기 방법 및 단일클론 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법이 본원에 기재되어 있다.
"분리된" 항체는 이의 자연 환경의 성분, 즉 자연 환경에 있지 않은 성분으로부터 분리된 항체이다. 특정 수준의 정제가 필요하지 않다. 예를 들어, 분리된 항체는 원래 또는 자연 환경에서 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합으로 생성된 항체는 분리, 분획화, 또는 임의의 적합한 기술에 의해 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 항체와 마찬가지로 본 발명에서 분리된 것으로 간주된다. 이처럼, 본 발명의 항체 및 이중특이적 항원 결합 분자는 분리된다. 일부 구현예들에서, 항체는, 예를 들어 전기영동(예컨대, SDS-PAGE, 등전초점조절(IEF), 모세관 전기이동) 또는 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법으로 측정할 때 95% 또는 99% 순도를 초과하여 정제된다. 항체 순도를 평가하는 방법들을 검토하려면, 예컨대 Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)을 참조한다.
용어 “전장 항체,” “원형 항체,” 및 “전체 항체”는 선천적 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 사용된다.
"항체 단편"은 원형 항체가 결합하는 항원에 결합하는 원형 항체의 일부를 포함하는 원형 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체 분자(예컨대, scFv), 및 단일 도메인 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 항체 단편에 관한 검토를 위해, Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)를 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예컨대 Pl
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ckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)을 참조하고; 또한 WO 93/16185호; 및 미국특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호를 참조한다. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 관한 논의를 위해, 미국 특허 제 5,869,046호를 참조한다. 다이아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 가진 항체 단편들이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)를 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디 또한 Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)에서 설명된다. 단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예들에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다(Domantis, Inc., Waltham, MA; 예컨대, 미국 특허 제6,248,516 B1호를 참조). 항체 단편은, 본원에 기재된 바와 같이 원형 항체의 단백질분해 소화뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예컨대, 대장균 또는 파지)에 의한 생성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 상보적인 영역을 포함하는 항체의 일부를 지칭한다. 항원 결합 도메인은, 예를 들어 하나 이상의 항체 가변 도메인(항체 가변 영역으로도 불림)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다.
용어 “가변 영역” 또는 “가변 도메인”은 항체를 항원에 결합시키는 데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 선천적 항체의 중쇄 및 경쇄(각각, VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖는데, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역(FRs) 및 3개의 초가변 영역(HVRs)을 포함한다. 예를 들어, Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)를 참조한다. 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원 결합 특이성을 부여하는 데 충분할 수 있다. 가변 영역 서열과 관련하여 본원에서 사용된 "카바트(Kabat) 넘버링"은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에 기재된 넘버링 시스템을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 모든 불변 영역과 도메인의 아미노산 위치는 본원에서 “카바트에 따른 넘버링” 또는 “카바트 넘버링”으로서 지칭되는, Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에서 설명된 카바트 넘버링 시스템에 따라서 넘버링된다. 구체적으로 카바트 넘버링 시스템 (Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)의 페이지 647-660을 참조)은 카파 및 람다 동형의 경쇄 불변 도메인 CL에 사용되고, 카바트 EU 지수 넘버링 시스템(페이지 661-723을 참조)은 경쇄 불변 도메인(CH1, 힌지, CH2 및 CH3)에 사용되는데, 이는 본원에서 상기에서 “카바트 EU 지수에 따른 넘버링”을 참조함으로써 더욱 명료해진다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변적이고/거나("상보성 결정 영역" 또는 "CDR"; 중쇄 가변 영역/도메인의 CDR 도메인은, 예컨대 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 약칭되고; 경쇄 가변 영역/도메인의 CDR은, 예컨대 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 약칭됨), 구조적으로 정의된 루프("초가변 루프")를 형성하고/하거나 항원 접촉 잔류물("항원 접촉")을 함유하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체들은 6개의 HVR: VH에 3개(H1, H2, H3), 및 VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 본원에서 예시적인 HVR은 하기를 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)에서 발생하는 초가변 루프(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)에서 발생하는 CDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)에서 발생하는 항원 접촉(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3), 및 94-102(H3)를 포함한 (a), (b) 및/또는 (c)의 조합.
다르게 지시되지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인에서 다른 잔기들(예컨대, FR 잔기)은 본원에서 Kabat et al., 상기와 같이 넘버링된다.
“프레임워크” 또는 “FR”은 초가변 영역(HVR)의 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인들로 구성된다: FR1, FR2, FR3 및 FR4. 이에 따라, HVR 및 FR 서열들은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기의 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
“인간화” 항체는 비인간 HVR로부터 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 구현예들에 있어서, 인간화 항체는 적어도 하나 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하는데, 모든 또는 실질적으로 모든 HVR들(예컨대, CDR)이 비인간 항체에 대응하며, 실질적으로 모든 FR이 인간 항체의 것에 대응한다. 상기 가변 도메인은 본원에서 “인간화 가변 영역”으로서 지칭된다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 구현예들에 있어서, 인간화된 항체에서 일부 FR 잔기는 비인간 항체(예컨대, HVR 잔기가 유래된 항체)의 대응 잔기로 대체되어, 예컨대 항체 특이성 또는 친화도를 복원 또는 개선한다. 항체, 예를 들어 비인간 항체의 “인간화 형태”는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다. 본 발명에 수반된 "인간화 항체"의 다른 형태는 불변 영역이 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합과 관련하여 본 발명에 따른 특성을 생성하기 위해 원래 항체의 불변 영역으로부터 추가로 변형 또는 변경된 것이다.
“인간 항체”는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나, 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체 부호화 서열을 활용하는 비인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 상기 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특정적으로 배제한다. 특정 구현예들에서, 인간 항체는 비인간 형질전환 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 또는 토끼로부터 유래된다. 특정 구현예들에서, 인간 항체는 하이브리도마 세포주로부터 유래된다. 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체 또는 항체 단편 또한 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편인 것으로 고려된다.
항체 또는 면역글로불린의 “부류”는 이의 중쇄에 의해 보유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체에는 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있고, 이들 중 몇 가지는 하위부류(동형), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 세분화될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
본원에서 용어 “Fc 도메인” 또는 “Fc 영역”은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는, 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 규정하는 데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 비록 IgC 중쇄의 Fc 영역의 경계가 가변될 수도 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226에서부터, 또는 Pro230에서부터 상기 중쇄의 카르복실 말단까지 확장되는 것으로 일반적으로 정의된다. 하지만, 숙주 세포에 의해 생성된 항체는 중쇄의 C 말단으로부터 1개 이상, 특히 1 또는 2개의 아미노산의 번역후 절단을 거칠 수 있다. 따라서, 전장 중쇄를 부호화하는 특이적 핵산 분자의 발현에 의해 숙주 세포에 의해 생성되는 항체는 전장 중쇄를 포함할 수 있거나, 전장 중쇄의 절단된 변이체(또는 “절단된 변이체 중쇄”로도 본원에서 지칭됨)를 포함할 수 있다. 이는 상기 중쇄의 최종 2개의 C 말단 아미노산이 글리신(G446) 및 리신(K447, 카바트 EU 지수에 따른 넘버링)인 경우에 해당할 수 있다. 따라서, Fc 영역의 C 말단 리신(Lys447), 또는 C 말단 글리신(Gly446) 및 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. Fc 영역(또는 본원에서 정의된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위)을 포함하는 중쇄의 아미노산 서열은 다르게 지시되지 않는 한 C 말단 글리신-리신 디펩티드 없이 표시된다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자 내에 포함된, 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 영역의 아단위를 포함하는 중쇄는 추가의 C 말단 글리신-리신 디펩티드(G446 및 K447, 카바트의 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자 내에 포함된, 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 영역의 아단위를 포함하는 중쇄는 추가의 C 말단 글리신 잔기(G446, 카바트의 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다. 본원의 조성물, 예컨대 본원에 기재된 약학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 군을 포함한다. 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 군은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 절단된 변이체 중쇄를 갖는 분자를 포함할 수 있다. 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 군은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 절단된 변이체 중쇄를 갖는 분자의 혼합물로 구성될 수 있으며, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 절단된 변이체 중쇄를 갖는다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 군을 포함하는 조성물은 추가의 C 말단 글리신-리신 디펩티드(G446 및 K447, 카바트의 EU 인덱스에 따른 넘버링)과 함께 본원에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 군을 포함하는 조성물은 추가의 C 말단 글리신 잔기(G446, 카바트의 EU 인덱스에 따른 넘버링)과 함께 본원에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 조성물은 본원에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 분자들; 추가의 C 말단 글리신 잔기(G446, 카바트의 EU 인덱스에 따른 넘버링)과 함께 본원에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 분자들; 및 추가의 C 말단 글리신-리신 디펩티드(G446 및 K447, 카바트의 EU 인덱스에 따른 넘버링)과 함께 본원에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 분자들로 이루어진 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 군을 포함한다. 본원에서 다르게 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991(또한, 상기 참조)에 기재된 바와 같이 EU 지수으로도 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다. 본원에서 사용된 Fc 도메인의 “아단위”는 이량체성 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중에서 하나, 즉 안정되게 자가 결합할 수 있는, 면역글로불린 중쇄의 C 말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, IgG Fc 도메인의 아단위는 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.
“Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 결합을 촉진하는 변형”은 동종이량체를 형성하기 위해 Fc 도메인 아단위를 포함하는 폴리펩티드의 동일한 폴리펩티드와의 결합을 감소시키거나 예방하는 펩티드 중추의 조작 또는 Fc 도메인 아단위의 번역후 변형이다. 본원에서 사용된 결합을 촉진하는 변형은, 특히 결합하기 원하는 2개의 Fc 도메인 아단위 각각(즉, Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위)에 만들어진 별개의 변형을 포함하고, 상기 변형은 2개의 Fc 도메인 아단위의 결합을 촉진하기 위해 서로에 상보적이다. 예를 들어, 결합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인 아단위의 하나 또는 둘 모두의 구조 또는 전하를 변경하여, 이들의 결합을 각각 입체적으로 또는 정전기적으로 우호적으로 만들 수 있다. 따라서, 각각의 아단위(예컨대, 항원 결합 모이어티)에 융합된 추가 성분이 동일하지 않다는 의미에서 비동일할 수 있는, 제1 Fc 도메인 아단위를 포함하는 폴리펩티드 및 제2 Fc 도메인 아단위를 포함하는 폴리펩티드 사이에서 (이종)이량체화가 일어난다. 일부 구현예들에서, 결합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인 내의 아미노산 돌연변이, 구체적으로 아미노산 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 결합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인의 2개 아단위 각각에서 별개의 아미노산 돌연변이, 구체적으로 아미노산 치환을 포함한다.
용어 "효능기 기능"은 항체 동형에 따라 가변되는, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물 활성을 지칭한다. 항체 효능기 기능들의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC), 항체 의존적 세포 식균작용(ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체 매개 항원 흡수, 세포 표면 수용체(예컨대, B세포 수용체)의 하향 조절, 및 B세포 활성화.
본원에서 사용된 용어 “가공한다, 가공된, 가공”은 펩티드 중추의 임의의 조작, 또는 자연 발생 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편의 번역후 변형을 포함하는 것으로 간주된다. 가공은 아미노산 서열의 변형, 글리코실화 패턴의 변형, 또는 개별 아미노산의 측쇄 기의 변형뿐만 아니라 이들 접근법의 조합을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 “아미노산 돌연변이”는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 변형을 수반하는 것을 의미한다. 최종 작제물이 원하는 특징, 예컨대 Fc 수용체에 대한 결합 감소, 또는 다른 펩티드와의 결합 증가를 보유한다면, 최종 작제물에 도달하기 위해 치환, 결실, 삽입 및 변형의 임의의 조합이 만들어질 수 있다. 아미노산 서열의 결실 및 삽입은 아미노산의 아미노 및/또는 카르복시 말단 결실 및 삽입을 포함한다. 특정 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 변경, 예컨대 Fc 영역의 결합 특성을 위해, 비보존적 아미노산 치환, 즉 하나의 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것이 특히 바람직하다. 아미노산 치환은 비자연 발생 아미노산 또는 20개의 표준 아미노산(예컨대, 4-히드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-히드록시리신)의 자연 발생 아미노산 유도체에 의한 대체를 포함한다. 아미노산 돌연변이는 당해 분야에서 일반적으로 공지된 유전학적 또는 화학적 방법을 이용하여 생성할 수 있다. 유전학적 방법은 특정 부위의 돌연변이유발, PCR, 및 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 유전공학 이외의 방법, 예컨대 화학적 변형에 의해 아미노산의 측쇄 기를 변경하는 방법 또한 유용할 수 있는 것으로 고려된다. 다양한 명칭이 동일한 아미노산 돌연변이를 지시하기 위해 본원에서 사용될 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인의 위치 329에서 프롤린으로부터 글리신으로의 치환은 329G, G329, G329, P329G, 또는 Pro329Gly로서 표시될 수 있다.
참조 폴리펩티드 서열에 대하여 “퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성”은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하면, 갭을 도입한 후에, 그리고 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 참조 폴리펩티드 서열 내에 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내에 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당해 분야의 기술 범위 안에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, 크러스탈(Clustal) W, 메갈라인(Megalign, DNASTAR) 소프트웨어 또는 FASTA 프로그램 패키지를 이용하여 달성될 수 있다. 당업계의 숙련가는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 하지만, 본원에서는, % 아미노산 서열 동일성 값은 FASTA 패키지 버전 36.3.8c 이상의 ggsearch 프로그램을 사용하거나 또는 이후에 BLOSUM50 비교 매트릭스와 함께 사용하여 생성한다. 상기 FASTA 프로그램 패키지는 W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) “Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266:227- 258; 및 Pearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36에 저술되고, http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml.에서 공개적으로 입수 가능하다. 대안적으로, http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi에서 이용할 수 있는 공용 서버를 사용하여 ggsearch(구형 단백질:단백질) 프로그램 및 기본 선택사항(BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup = 2)을 사용하여 서열을 비교함으로써 국소가 아닌 전체 정렬이 실시되도록 할 수 있다. 퍼센트 아미노산 동일성은 출력 정렬 헤더에 제공된다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 분리된 핵산 분자 또는 작제물, 예컨대 메신저 RNA(mRNA), 바이러스 유래 RNA 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포디에스터 결합 또는 비통상적인 결합(예컨대, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 바와 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 1개 이상의 핵산 분절, 예컨대 DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다.
"분리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 그 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미하는 것이다. 예를 들어, 벡터에 함유된 폴리펩티드를 부호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명에서 분리된 것으로 간주된다. 분리된 폴리뉴클레오티드의 추가적인 예는 이종 숙주 세포들내에 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 분리된 폴리뉴클레오티드는 정상적으로 폴리뉴클레오티드 분자를 함유하는 세포 내 함유된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하지만, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체외에 존재하거나 이의 천연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재한다. 분리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체뿐만 아니라 양성 및 음성 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성에 의해 생성된 상기 분자들을 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결자와 같은 조절 요소일 수 있거나 조절 요소를 포함할 수 있다.
“[예컨대, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 결합 분자를] 부호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드(또는 핵산)”는 단일 벡터 또는 별개의 벡터 내 폴리뉴클레오티드 분자(들), 및 숙주 세포 내 하나 이상의 위치에서 존재하는 폴리뉴클레오티드 분자(들)를 포함한 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이의 단편)를 부호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭한다.
용어 "발현 카세트"는 표적 세포 내 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정된 핵산 요소를 사용하여 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 색소체 DNA, 바이러스, 또는 핵산 단편 내로 통합될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 다른 서열들 중에서, 전사되는 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 특정 구현예들에서, 발현 카세트는 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 부호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 세포에서 작동가능하게 결합되는 특정 유전자를 도입하고, 상기 유전자의 발현을 유도하기 위해 사용되는 DNA 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 유전체 내로 혼입된 벡터를 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 대량의 안정된 mRNA의 전사를 가능하게 한다. 일단 발현 벡터가 세포 내부에 있게 되면, 유전자에 의해 부호화되는 리보핵산 분자 또는 단백질이 세포 전사 및/또는 번역 기전에 의해 생성된다. 일 구현예에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이들의 단편을 부호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 그 세포의 자손을 포함하여 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포에는 “형질전환체” 및 “형질전환된 세포”가 포함되는데, 이들은 계대의 수에 상관없이, 일차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 모 세포와 완전히 동일하지는 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수도 있다. 원래 형질전환된 세포에 대하여 선별된 또는 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 보유한 돌연변이 자손이 본원에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 생성하는 데 이용될 수 있는 임의의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예컨대 포유류 배양된 세포, 예컨대 몇몇 예를 들어 HEK 세포, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 생쥐 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포를 포함할 뿐만 아니라, 형질전환 동물, 형질전환 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다.
“활성화 Fc 수용체”는 항체의 Fc 도메인에 의한 결합 이후에, 수용체 보유 세포가 효능기 기능을 수행하도록 자극하는 신호전달 사건을 이끌어 내는 Fc 수용체이다. 인간 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcαRI(CD89)를 포함한다.
항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)은 면역 효능기 세포에 의한 항체 코팅된 표적 세포의 용해를 야기하는 면역 기전이다. 표적 세포는 항체 또는 Fc 영역을 포함하는 이의 유도체가 일반적으로 Fc 영역의 N 말단인 단백질 부분을 통해 특이적으로 결합하는 세포이다. 본원에서 사용된 용어 “감소된 ADCC”는 앞서 정의된 ADCC의 기전에 의해, 표적 세포를 둘러싸는 배지에서 소정의 항체 농도에서 소정의 시점에 용해되는 표적 세포의 수의 감소 및/또는 ADCC의 기전에 의해, 소정의 시점에 소정의 수의 표적 세포의 용해를 달성하는 데 필요한, 표적 세포를 둘러싸는 배지에서 항체의 농도의 증가로서 정의된다. ADCC의 감소는 동일한 표준 생성, 정제, 제형 및 저장 방법(이는 당업자에게 공지됨)을 사용하여 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성된 동일한 항체에 의해 매개되는 ADCC에 비해 상대적이지만, 가공되지는 않은 것이다. 예를 들어, ADCC를 감소시키는 아미노산 치환을 Fc 도메인에 포함하는 항체에 의해 매개되는 ADCC의 감소는 Fc 도메인에서 상기 아미노산 치환이 없는 동일한 항체에 의해 매개되는 ADCC에 비해 상대적이다. ADCC를 측정하기 위한 적합한 분석은 당해 분야에서 일반적으로 공지되어 이다(예컨대, PCT 공보 제WO 2006/082515호 또는 PCT 공보 제WO 2012/130831호를 참조).
작용제의 “유효량”은 작용자게 투여되는 세포 또는 조직에서 생리학적 변화를 유발하는 데 필요한 양을 지칭한다.
작용제, 예컨대 약학적 조성물의 "치료적 유효량"은 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위한 투여량에서 필요한 시간 동안 유효한 양을 지칭한다. 작용제의 치료적 유효량은, 예를 들어 질병의 부정적인 효과를 제거, 감소, 지연, 최소화 또는 예방한다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축(예컨대, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류(예컨대, 인간 및 원숭이와 같은 비인간 영장류), 토끼, 및 설치류(예컨대, 마우스 및 래트)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특히, 개체 또는 대상체는 인간이다.
용어 “약학적 조성물”은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 형태이고, 상기 조성물이 투여될 개체에게 허용하기 어려울 정도로 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는 대상체에게 무독선인 활성 성분 이외의 약학적 조성물의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정제 또는 방부제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된 “치료”(및 이의 문법적 변형, 예컨대 “치료하다” 또는 “치료하는”)는 치료되는 개체에서 질병의 자연스런 과정을 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리의 과정 동안 실시될 수 있다. 치료의 바람직한 효과에는 질병의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 완화, 상기 질병에 대한 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질병 진행 속도의 감소, 상기 질병 상태의 개선 또는 경감, 그리고 관해 또는 개선된 예후가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 항체는 질병의 발병을 지연시키거나 질병의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
용어 “패키지 삽입물(package insert)”은 이러한 치료제 제품의 사용과 연관된 지시, 용도, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보가 포함된 치료제 제품의 시판 포장에 관례적으로 포함되는 지침서를 지칭하기 위해 이용된다.
구현예의 상세한 설명
본 발명은 GPRC5D, 특히 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 및 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 또한, 분자는 치료 적용, 예컨대 효능 및/또는 안전성 및 생성 가능성과 관련하여 다른 유리한 특성들을 갖는다.
GPRC5D 항체
제1 양태에서, 본 발명은 GPRC5D에 결합하는 항체를 제공하고, 상기 항체는 (i) 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 84의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (ii) 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 85의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (iii) 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (iv) 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 96의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는 (v) 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 92의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 항체는 인간화 항체이다. 일 구현예에서, 상기 VH는 인간화 VH이고/이거나 상기 VL은 인간화 VL이다. 일 구현예에서, 상기 항체는 상기 구현예들 중에서 임의의 것에서 CDR을 포함하고, 수용체 인간 프레임워크, 예컨대 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, (i) 상기 VH는 서열번호 13의 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 14의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (ii) 상기 VH는 서열번호 15의 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 상기 VH는 서열번호 48의 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 53의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (iv) 상기 VH는 서열번호 49의 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 52의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (v) 상기 VH는 서열번호 57의 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 64의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (vi) 상기 VH는 서열번호 58의 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 63의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 항체는 (i) 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH, 및 서열번호 14의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL; 또는 (ii) 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH, 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL; 또는 (iii) 서열번호 48의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH, 및 서열번호 53의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL, 및 (iv) 서열번호 49의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH, 및 서열번호 52의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL, 및 (v) 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH, 및 서열번호 64의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL, 및 (vi) 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH, 및 서열번호 63의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL을 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 항체는 IgG, 특히 IgG1, 항체이다. 일 구현예에서, 상기 항체는 전장 항체이다. 다른 구현예에서, 상기 항체는 Fv 분자, scFv 분자, Fab 분자 및 F(ab’)2 분자로 구성된 군에서 선택되는 항체 단편이다. 일 구현예에서, 상기 항체는 단일특이적 항체이다.
특정 구현예들에서, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 또는 VL 서열은 참조 서열에 비하여 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항체는 GPRC5D에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 구현예들에서, 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열번호 13에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고/거나 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열번호 14에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고/거나 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열번호 15에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고/거나 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열번호 16에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고/거나 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열번호 48에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고/거나 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열번호 53에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고/거나 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열번호 49에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고/거나 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열번호 52에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고/거나 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열번호 57에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고/거나 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열번호 64에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고/거나 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열번호 58에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고/거나 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열번호 58에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
특정 구현예들에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 밖에서의(즉, FR에서의) 영역에서 발생한다. 선택적으로, 상기 항체는 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 서열번호 13에서의 VH 서열 및/또는 서열번호 14에서의 VL 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 항체는 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 서열번호 15에서의 VH 서열 및/또는 서열번호 16에서의 VL 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 항체는 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 서열번호 448에서의 VH 서열 및/또는 서열번호 53에서의 VL 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 항체는 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 서열번호 49에서의 VH 서열 및/또는 서열번호 52에서의 VL 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 항체는 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 서열번호 57에서의 VH 서열 및/또는 서열번호 64에서의 VL 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 항체는 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 서열번호 58에서의 VH 서열 및/또는 서열번호 63에서의 VL 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 13 및 서열번호 15로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 13 및 서열번호 12로 구성된 군에서 선택된 VH 서열, 및 서열번호 16의 VL 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 13의 VH 서열 및 서열번호 14의 VL 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 15의 VH 서열 및 서열번호 16의 VL 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 48의 VH 서열 및 서열번호 53의 VL 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 49의 VH 서열 및 서열번호 52의 VL 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 64의 VL 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 58의 VH 서열 및 서열번호 63의 VL 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 항체는 인간 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 항체는 인간 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 분자, 특히 인간 CH1, CH2, CH3 및/또는 CL 도메인을 포함하는 IgG 부류 면역글로불린 분자이다. 인간 불변 도메인의 예시적인 서열은 서열번호 37 및 38(각각, 인간 카파 및 람다 CL 도메인), 그리고 서열번호 39(인간 IgG1 중쇄 불변 영역 CH1-CH2-CH3)에 제시된다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 서열번호 37 또는 서열번호 39의 아미노산, 특히 서열번호 38의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 서열번호 39의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 중쇄 불변 영역은 본원에서 설명된 바와 같이 Fc 도메인에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 항체는 단일클론 항체이다.
일 구현예에서, 상기 항체는 IgG, 특히 IgG1, 항체이다. 일 구현예에서, 상기 항체는 전장 항체이다.
일 구현예에서, 상기 항체는 Fc 도메인, 특히 IgG Fc 도메인, 더욱 특히 IgG1 Fc 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 상기 항체의 Fc 도메인은 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인과 관련하여 본원에 기재된 특징들 중 임의의 것을 단독으로 또는 조합하여 통합할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 항체는 Fv 분자, scFv 분자, Fab 분자 및 F(ab’)2 분자로 구성된 군에서 선택되는 항체 단편; 특히 Fab 분자이다. 다른 구현예에서, 상기 항체 단편은 디아바디, 트리바디 또는 테트라바디이다.
추가의 양태에서, 상기 구현예들 중 임의의 것에 따른 항체는 하기의 섹션에 기재된 바와 같은 특징들 중 임의의 것을 단독으로 또는 조합하여 통합할 수 있다.
글리코실화 변이체
특정 구현예들에서, 본원에 제공된 항체는 상기 항체가 당화되는 정도를 증가 또는 감소시키기 위하여 변경된다. 항체의 당화 부위의 추가 또는 결실은 하나 이상의 당화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편의적으로 달성될 수 있다.
상기 항체가 Fc 영역을 포함할 때, 이에 부착된 올리고당은 변경될 수 있다. 포유류 세포들에 의해 생성된 고유 항체는 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N 링키지에 의해 일반적으로 부착된 분지화된, 이촉각성(biantennary) 올리고당을 전형적으로 포함한다. 예컨대, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)를 참조한다. 상기 올리고당은 다양한 탄수화물, 예컨대 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산뿐 아니라, 이촉각성 올리고당 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸우코스를 포함할 수 있다. 일부 구현예들에 있어서, 본 발명의 항체에서 올리고당의 변형은 특정 개선된 특성들을 가진 항체 변이체들을 생성하기 위하여 실시될 수 있다.
일 구현예에서, 비푸코실화 올리고당, 즉, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로)부착된 푸우코스가 없는 올리고당 구조를 갖는 항체 변이체들이 제공된다. 상기 비푸코실화 올리고당(또한 “탈푸코실화” 올리고당으로도 지칭됨)은 특히 이촉각성 올리고당 구조의 줄기에서 제1 GlcNAc에 부착된 푸우코스 잔기가 없는 N 연결된 올리고당이다. 일 구현예에서, 천연 또는 모 항체와 비교하여 Fc 영역에서 증가된 비율의 비푸코실화 올리고당을 갖는 항체 변이체들이 제공된다. 예를 들어, 비푸코실화 올리고당의 비율은 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 60%, 적어도 약 80% 또는 심지어 약 100%(즉, 푸코실화 올리고당이 존재하지 않음)일 수 있다. 비푸코실화 올리고당의 백분율은, 예를 들어 WO 2006/082515에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 올리고당(예컨대, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조들)의 합에 비하여 푸코스 잔기가 없는 올리고당의 (평균)양이다. Asn297은 Fc 영역에서 대략 위치 297(Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 항체에서 소수의 서열 변이로 인하여 위치 297의 상류 또는 하류의 약 ± 3의 아미노산, 즉 위치 294와 300 사이에 또한 위치할 수 있다. Fc 영역에서 증가된 비율의 비푸코실화 올리고당을 갖는 상기 항체는 개선된 FcγRIIIa 수용체 결합 및/또는 개선된 효능기 기능, 특히 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예컨대, US 2003/0157108; US 2004/0093621을 참조한다.
푸코실화가 감소된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 2003/0157108; 및 WO　2004/056312, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예컨대, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107), 또는 GDP-푸우코스 합성 또는 수송체 단백질의 활성이 감소되거나 제거된 세포(예컨대, US2004259150, US2005031613, US2004132140, US2004110282를 참조)를 포함한다.
추가의 구현예에서, 항체 변이체들에는, 예컨대 상기 항체의 Fc 영역에 부착된 이촉각성 올리고당이 GlcNAc에 의해 양분되어 있는 양분된 올리고당이 제공된다. 상기 항체 변이체들은 상기 기재한 바와 같이 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체들의 예들은, 예컨대, Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878에 기재되어 있다.
Fc 영역에 부착된 올리고당에서 최소한 1개의 갈락토오스 잔기를 가진 항체 변이체들이 또한 제공된다. 상기 항체 변이체들은 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체는, 예컨대 WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 기재되어 있다.
시스테인 가공된 항체 변이체
특정 구현예들에서, 시스테인 가공된 항체, 예컨대 “thioMAbs”를 생성하는 것이 바람직할 수 있고, 여기서 항체의 하나 그 이상의 잔기는 시스테인 잔기로 치환된다. 특정 구현예들에서, 상기 치환된 잔기는 상기 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올기는 따라서 항체의 접근가능한 부위에 위치하고, 상기 항체를 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합하여 본원에서 추가로 기재된 바와 같은 면역접합체를 생성하는데 이용될 수 있다.-시스테인 가공된 항체는, 예컨대 미국 특허 제7,521,541, 8,30,930, 7,855,275, 9,000,130, 또는 WO 2016040856에서 기재된 것과 같이 생성될 수 있다.
항체 유도체
특정 구현예들에서, 본원에서 제공된 항체는 당해 분야에서 공지되고 쉽게 입수 가능한 추가적인 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤릴프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성으로 인해, 제조 시에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 상기 항체에 부착된 중합체의 수는 가변될 수 있고, 하나 초과의 중합체가 부착되는 경우, 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 이용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 향상될 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건하의 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 고려 사항에 근거하여 결정될 수 있다.
다른 구현예에서, 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티 및 항체의 접합체가 제공된다. 일 구현예에서, 상기 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사능은 임의의 파장일 수 있으며, 정상 세포들에게 해를 주지 않지만, 상기 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포들은 사멸되는 온도에서 비단백질성 모이어티에 열을 가하는 파장을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
면역접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 치료제, 예컨대 세포독성 작용제, 화학요법 작용제, 약물, 성장 저해제, 독소(예컨대, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된(화학적으로 결합된) 본원에서 항 GPRC5D 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
일 구현예에서, 면역접합체는 항체가 상기 언급된 치료제 중 하나 이상에 접합된 항체-약물 접합체(ADC)이다. 상기 항체는 전형적으로 링커를 이용하여 치료제 중에서 하나 이상에 연결된다. 치료제 및 약물 및 링커의 예를 포함하는 ADC 기술의 개요는 Pharmacol Review 68:3-19 (2016)에서 제시된다.
다른 구현예에서, 면역접합체는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(녹농균 (Pseudomonas aeruginosa)으로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모디카 차란티아 (momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하지만 이에 제한되지 않는 효소 활성 독소 또는 이의 단편에 접합된 본원에서 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.
다른 구현예에서, 면역접합체는 방사성 접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에서 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소는 방사성 접합체 생성에 이용할 수 있다. At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 예로 포함된다. 상기 방사성 접합체가 검출용으로 이용될 때, 이는 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵자기 공명(NMR) 영상화(또는 자기 공명 영상화, MRI로도 공지됨)를 위한 회전 표지, 예컨대 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 또한 함유할 수 있다.
항체 및 세포독성 물질의 접합체는 다양한 이중기능성 단백질 커플링 물질, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이중기능성 유도체들(예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르(예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예컨대, 글루타알데히드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체들(예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플로린 화합물(예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여 만들 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)에서 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지화된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 대한 방사성뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO94/11026을 참조한다. 상기 링커는 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정 링커, 펩티다아제 민감성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 이황화물 함유 링커(Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); 미국 특허 제5,208,020호)를 사용할 수 있다.
본원에서 면역접합체 또는 ADC는 상업적으로 입수 가능한(예컨대, 피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology, Inc.)로부터, 미국 일리노이주 록퍼드 소재) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC 및 술포-SMPB, 그리고 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 가교제 시약으로 제조된 접합체를 명시적으로 고려하지만, 이에 제한되지는 않는다.
다중특이적 항체
특정 구현예들에서, 본원에서 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2가지 상이한 부위들, 즉, 상이한 항원들 상의 상이한 에피토프 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지는 단일클론 항체이다. 특정 구현예들에서, 상기 다중특이적 항체는 3개 이상의 결합 특이성을 가진다. 특정 구현예들에서, 결합 특이성 중에서 하나는 GPRC5D에 대한 것이고, 다른 특이성(둘 이상)은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 구현예들에서, 이중특이적 항체는 GPRC5D의 2개(또는 그 이상)의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다중특이적(예컨대, 이중특이적) 항체는 또한 세포독성 작용제 또는 세포를, GPRC5D을 발현하는 세포로 국소화하는 데 이용될 수 있다. 다중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시 발현(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)을 참조) 및 “구멍 내로의 돌기(knob-in-hole)” 공학 기술(예컨대, 미국 특허 제5,731,168호 및 Atwell et al., J. Mol. Biol. 27026 (1997)을 참조)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과를 가공함으로써(예컨대, WO 2009/089004를 참조); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교 결합시킴으로써(예컨대, 미국 특허 제4,676,980호 및 Brennan et al. Science 229: 81(1985)를 참조); 이중특이적 항체를 생성하기 위해 류신 지퍼를 사용함으로써(예컨대, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553(1992) 및 WO 2011/034605를 참조); 경쇄 쌍형성 오류 문제를 피하기 위한 일반적인 경쇄 기술을 사용함으로써(예컨대, WO 98/50431을 참조); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 "디아바디" 기술을 사용함으로써(예컨대, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)을 참조); 및 단일사슬 Fv(sFv) 이량체 사용함으로써(예컨대, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368(1994)를 참조); 및 예컨대 Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에 기재된 삼중특이적 항체를 제조함으로써 만들 수 있다.
예를 들어, “문어 항체” 또는 DVD-Ig를 포함한 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 가공된 항체 또한 본원에 포함된다(예컨대, WO 2001/77342 및 WO 2008/024715를 참조). 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다중특이적 항체의 다른 예는 WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO2010/145792, 및 WO 2013/026831에서 찾을 수 있다. 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 GPRC5D뿐만 아니라 다른 상이한 항원, 또는 GPRC5D의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 “이중 작용 FAb” 또는 “DAF”를 포함한다(예컨대, US 2008/0069820 및 WO 2015/095539를 참조).
다중특이적 항체는 또한 동일한 항원 특이성의 하나 이상의 결합 팔에서 도메인 교차를 이용해, 즉 VH/VL 도메인(예컨대, WO 2009/080252 및 WO 2015/150447을 참조), CH1/CL 도메인(예컨대, WO 2009/080253을 참조) 또는 완전한 Fab 팔(예컨대, WO 2009/080251, WO 2016/016299를 참조, 또한 Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191 및 Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20을 참조)을 교환함으로써 비대칭적 형태로 제공될 수 있다. 비대칭적 Fab 팔은 또한 정확한 Fab 쌍 형성을 주도하기 위해 하전된 또는 비하전된 아미노산 돌연변이를 도메인 인터페이스 내로 도입함으로써 가공될 수 있다. 예컨대, WO 2016/172485를 참조한다.
다중특이적 항체에 대한 다양한 추가적인 분자 형태들이 당업계에 공지되어 있으며 본원에 포함된다(예컨대, Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106을 참조).
본원에 또한 포함되는 다중특이적 항체의 특정 유형은 표적 세포를 사멸시키기 위한 T세포의 재표적화를 위해, 표적 세포, 예컨대 종양 세포 상에서 표면 항원에, 그리고 T세포 수용체(TCR) 복합체의 활성화, 불변 구성요소, 예컨대 CD3에 동시에 결합하도록 설계된 이중특이적 항체이다. 따라서, 특정 구현예들에서, 본원에서 제공된 항체는 다중특이적 항체, 특히 이중특이적 항체이고, 여기서 결합 특이성 중에서 하나는 GPRC5D에 대한 것이고 다른 하나는 CD3에 대한 것이다.
상기 목적에 유용할 수 있는 이중특이적 항체 형식의 예는 2개의 scFv 분자가 유연한 링커에 의해 융합되는 소위 “BiTE”(이중특이적 T세포 결합기) 분자(예컨대, WO2004/106381, WO2005/061547, WO2007/042261, 및 WO2008/119567, Nagorsen and Bδuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)을 참조); 디아바디(Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) 및 이들의 유도체, 예컨대 탠덤 디아바디(“TandAb”; Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-56 (1999)); 디아바디 형식에 기초하지만 추가 안정화를 위한 C 말단 이황화 가교를 특징으로 하는 “DART”(이중 친화성 재표적화) 분자(Johnson et al., J Mol Biol 399, 436-449 (2010)), 및 전체 하이브리드 마우스/래트 IgG 분자인 소위 트리오맙(Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)에서 검토됨)을 포함하지만 이들에 제한되지는 않는다. 본원에 포함된 특정 T세포 이중특이적 항체 형식은 WO 2013/026833, WO 2013/026839, WO 2016/020309; Bacac et al., Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498에 기재되어 있다.
GPRC5D 및 제2 항원에 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자
본 발명은 또한 이중특이적 항원 결합 분자, 즉 2개의 별개의 항원 결정기(제1 및 제2 항원)에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 2개의 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 특정 구현예들에 따라서, 이중특이적 항원 분자 내에 포함된 항원 결합 모이어티는 Fab 분자(즉, 가변 도메인 및 불변 도메인을 각각 포함하는, 중쇄 및 경쇄로 구성되는 항원 결합 도메인)이다. 일 구현예에서, 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이다. 일 구현예에서, 상기 Fab 분자는 인간이다. 특정 구현예에서, 상기 Fab 분자는 인간화된다. 또 다른 구현예에서, 상기 Fab 분자는 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
바람직하게는, 항원 결합 모이어티 중에서 적어도 하나는 교차 Fab 분자이다. 상기 변형은 상이한 Fab 분자로부터 중쇄 및 경쇄의 쌍형성 오류를 감소시켜, 재조합 생성에서 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선시킨다. 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자에 유용한 특정 교차 Fab 분자에서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄(각각 VL 및 VH)의 가변 도메인이 교환된다. 하지만, 상기 도메인 교환을 사용하더라도 이중특이적 항원 결합 분자의 제조는 짝이 맞지 않는 중쇄와 경쇄 사이의 소위 벤스존스(Bence Jones) 유형의 상호작용으로 인해 특정 부산물을 포함할 수 있다(Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191를 참조). 상이한 Fab 분자로부터 중쇄 및 경쇄의 쌍형성 오류를 더욱 감소시키고, 따라서 원하는 이중특이적 항원 결합 분자의 순도 및 수율을 증가시키기 위해, 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산이 본원에서 추가로 기재된 바와 같이, 제1 항원(GPRC5D)에 결합하는 Fab 분자, 또는 제2 항원(예컨대, 활성화 T세포 항원, 예컨대 CD3)에 결합하는 Fab 분자 중에서 어느 한 가지의 CH1 및 CL 도메인 내에 특정한 아미노산 위치에서 도입될 수 있다. 이중특이적 항원 결합 분자 내에 포함된 통상적인 Fab 분자(들)(예컨대, 예를 들어 도 1a-도 1c, 도 1g-도 1j에서 도시됨), 또는 이중특이적 항원 결합 분자 내에 포함된 VH/VL 교차 Fab 분자(들)(예컨대, 예를 들어 도 1d-도 1f, 도 1k-도 1n에서 도시됨)(하지만, 둘 모두는 아님)에서 전하 변형이 만들어진다. 특정 구현예들에서, 상기 전하 변형은 이중특이적 항원 결합 분자(특정 구현예들에서 제1 항원, 즉 GPRC5D에 결합함)에 포함된 통상적인 Fab 분자(들)에서 이루어진다.
본 발명에 따른 특정 구현예에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 항원(즉, GPRC5D) 및 제2 항원(예컨대, 활성화 T세포 항원, 특히 CD3)에 동시에 결합할 수 있다. 일 구현예에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 GPRC5D 및 활성화 T세포 항원에 대한 동시적 결합에 의해 T세포 및 표적 세포를 가교결합시킬 수 있다. 보다 더 특정한 구현예에서, 상기 동시적 결합은 표적 세포, 특히 GPRC5D 발현 종양 세포의 용해를 유발한다. 일 구현예에서, 상기 동시적 결합은 T세포의 활성화를 유발한다. 다른 구현예들에서, 상기 동시적 결합은 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효능기 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 표지자의 발현로 구성된 군에서 선택되는 T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 세포 반응을 유발한다. 일 구현예에서, GPRC5D에 대한 동시적 결합 없이 활성화 T세포 항원, 특히 CD3에 대한 이중특이적 항원 결합 분자의 결합은 T세포 활성화를 유발하지 않는다.
일 구현예에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 T세포의 세포독성 활성을 표적 세포로 전향시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 전향은 표적 세포에 의한 MHC 매개 펩티드 항원 제시 및/또는 T세포의 특이성과 무관하다.
바람직하게는, 본 발명의 구현예들 중 임의의 것에 따른 T세포는 세포독성 T세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 T세포는 CD4+ 또는 CD8+ T세포, 특히 CD8+ T세포이다.
제1 항원 결합 모이어티
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 GPRC5D(제1 항원)에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자를 포함한다. 특정 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 GPRC5D에 결합하는 2개의 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자를 포함한다. 상기 특정 구현예에서, 상기 항원 결합 모이어티 각각은 동일한 항원 결정기에 결합한다. 보다 더 특정한 구현예에서, 상기 항원 결합 모이어티의 모두는 동일하다. 즉, 본원에 기재된 바와 같은 CH1 및 CL 도메인 내에 동일한 아미노산 치환(만약 있다면)을 포함하는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 GPRC5D에 결합하는 2개 이하의 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자를 포함한다.
특정 구현예들에서, GPRC5D에 결합하는 항원 결합 모이어티(들)은 통상적인 Fab 분자이다. 상기 구현예들에서, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티(들)은 본원에 기재된 바와 같은 교차 Fab 분자이다. 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 상호 교환/대체되는 Fab 분자이다.
대안적인 구현예들에서, GPRC5D에 결합하는 항원 결합 모이어티(들)은 본원에 기재된 바와 같은 교차 Fab 분자, 즉 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 상호 교환/대체되는 Fab 분자이다. 상기 구현예들에서, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티(들)은 통상적인 Fab 분자이다.
GPRC5D 결합 모이어티는 이중특이적 항원 결합 분자를 표적 부위, 예를 들어 GPRC5D를 발현하는 특정 유형의 종양 세포로 지향시킬 수 있다.
이중특이적 항원 결합 분자의 제1 항원 결합 모이어티는, 과학적으로 명백하게 비합리적이거나 불가능하지 않는 한, GPRC5D에 결합하는 항체와 관련하여 본원에 기재된 특징들 중 임의의 것을 단독으로 또는 조합하여 통합할 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, (a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 84의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제1 항원 결합 모이어티, 및 (b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티를 포함하는, 이중 특이적 결합 분자를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, (a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 85의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제 1 항원 결합 모이어티, 및 (b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티를 포함하는, 이중 특이적 결합 분자를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, (a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제 1 항원 결합 모이어티, 및 (b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티를 포함하는, 이중 특이적 결합 분자를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, (a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 96의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제 1 항원 결합 모이어티, 및 (b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티를 포함하는, 이중 특이적 결합 분자를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, (a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 92의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 제 1 항원 결합 모이어티, 및 (b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티를 포함하는, 이중 특이적 결합 분자를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, (a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 5의 LCDR 2, 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 제 1 항원 결합 모이어티, 및 (b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티를 포함하는, 이중 특이적 결합 분자를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, (a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 7의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 8의 HCDR 2, 및 서열번호 9의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 10의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 11의 LCDR 2, 및 서열번호 12의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 제 1 항원 결합 모이어티, 및 (b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티를 포함하는, 이중 특이적 결합 분자를 제공한다.
일부 구현예들에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 인간화 항체(유래)이다. 일 구현예에서, 상기 VH는 인간화 VH이고/이거나 상기 VL은 인간화 VL이다. 일 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 상기 구현예들 중에서 임의의 것에서 CDR을 포함하고, 수용체 인간 프레임워크, 예컨대 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VH는 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 57 및 서열번호 58로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 63 및 서열번호 64로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 57 및 서열번호 58로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 및 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 63 및 서열번호 64로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 57 및 서열번호 58로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 63 및 서열번호 64로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 57 및 서열번호 58로 구성된 군에서 선택된 VH, 및 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 63 및 서열번호 64로 구성된 군에서 선택된 VL을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 13의 VH 서열 및 서열번호 14의 VL 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 15의 VH 서열 및 서열번호 16의 VL 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 48의 VH 서열 및 서열번호 53의 VL 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 49의 VH 서열 및 서열번호 52의 VL 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 64의 VL 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 58의 VH 서열 및 서열번호 63의 VL 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 인간 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 인간 불변 영역, 특히 인간 CH1 및/또는 CL 도메인을 포함하는 Fab 분자이다. 인간 불변 도메인의 예시적인 서열은 서열번호 37 및 38(각각, 인간 카파 및 람다 CL 도메인), 그리고 서열번호 39(인간 IgG1 중쇄 불변 영역 CH1-CH2-CH3)에 제시된다. 일부 구현예들에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 37 또는 서열번호 38의 아미노산 서열, 특히 서열번호 37의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 상기 경쇄 불변 영역은 “전하 변형” 하에 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있고 및/또는 만약 교차 Fab 분자 내에 있으면 하나 이상(특히 2개)의 N 말단 아미노산의 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 39의 아미노산 서열 내에 포함된 CH1 도메인 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 중쇄 불변 영역 (특이적으로 CH1 도메인)은 “전하 변형” 하에 본원에서 설명된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
제2 항원 결합 모이어티
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 항원(GPRC5D와 상이한)에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자를 포함한다.
특정 구현예들에서, 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티는 본원에 기재된 바와 같은 교차 Fab 분자이다. 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 상호 교환/대체되는 Fab 분자이다. 상기 구현예들에서, 상기 제1 항원(즉, GPRC5D)에 결합하는 항원 결합 모이어티(들)은 바람직하게는 통상적인 Fab 분자이다. 상기 이중특이적 항원 결합 분자 내에 포함된 GPRC5D에 결합하는 하나 초과의 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자가 있는 구현예들에서, 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티는 바람직하게는 교차 Fab 분자이고, GPRC5D에 결합하는 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자이다.
대안적인 구현예들에서, 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자이다. 상기 구현예들에서, 제1 항원(즉, GPRC5D)에 결합하는 항원 결합 모이어티(들)은 본원에 기재된 바와 같은 교차 Fab 분자이다. 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 상호 교환/대체되는 Fab 분자이다. 상기 이중특이적 항원 결합 분자 내에 포함된 제2 항원에 결합하는 하나 초과의 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자가 있는 구현예들에서, GPRC5D에 결합하는 항원 결합 모이어티는 바람직하게는 교차 Fab 분자이고, 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자이다.
일부 구현예들에서, 상기 제2 항원은 활성화 T세포 항원(본원에서 "활성화 T세포 항원 결합 모이어티 또는 활성화 T세포 항원 결합 Fab 분자"로도 지칭됨)이다. 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 활성화 T세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이하의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 활성화 T세포 항원에 대한 1가 결합을 제공한다.
특정 구현예들에서, 상기 제2 항원은 CD3, 특히 인간 CD3(서열번호 40) 또는 시노몰구스 CD3(서열번호 41), 가장 특히 인간 CD3이다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 인간 및 시노몰구스 CD3에 대해 교차반응성이다(즉, 이에 특이적으로 결합한다). 일부 구현예들에서, 상기 제2 항원은 CD3의 엡실론 아단위(CD3 엡실론)이다.
일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 29의 HCDR 1, 서열번호 30의 HCDR 2, 서열번호 31의 HCDR 3, 서열번호 32의 LCDR 1, 서열번호 33의 LCDR 2, 및 서열번호 34의 LCDR 3을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 29의 HCDR 1, 서열번호 30의 HCDR 2, 및 서열번호 31의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 32의 LCDR 1, 서열번호 33의 LCDR 2, 및 서열번호 34의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 인간화 항체(유래)이다. 일 구현예에서, 상기 VH는 인간화 VH이고/이거나 상기 VL은 인간화 VL이다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 상기 구현예들 중에서 임의의 것에서 CDR을 포함하고, 수용체 인간 프레임워크, 예컨대 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 35의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 36의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 35의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 및 서열번호 36의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 VH는 서열번호 35의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 36의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 35의 VH 서열 및 서열번호 36의 VL 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 98의 HCDR 1, 서열번호 99의 HCDR 2, 서열번호 100의 HCDR 3, 서열번호 101의 LCDR 1, 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 98의 HCDR 1, 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 101의 LCDR 1, 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 인간화 항체(유래)이다. 일 구현예에서, 상기 VH는 인간화 VH이고/이거나 상기 VL은 인간화 VL이다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 상기 구현예들 중에서 임의의 것에서 CDR을 포함하고, 수용체 인간 프레임워크, 예컨대 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 104의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 105의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 104의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 및 서열번호 105의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 VH는 서열번호 104의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 105의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 104의 VH 서열 및 서열번호 105의 VL 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 106의 HCDR 1, 서열번호 107의 HCDR 2, 서열번호 108의 HCDR 3, 서열번호 109의 LCDR 1, 서열번호 110의 LCDR 2, 및 서열번호 111의 LCDR 3을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 106의 HCDR 1, 서열번호 107의 HCDR 2, 및 서열번호 108의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 109의 LCDR 1, 서열번호 110의 LCDR 2, 및 서열번호 111의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 인간화 항체(유래)이다. 일 구현예에서, 상기 VH는 인간화 VH이고/이거나 상기 VL은 인간화 VL이다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 상기 구현예들 중에서 임의의 것에서 CDR을 포함하고, 수용체 인간 프레임워크, 예컨대 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 112의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 113의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 112의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 및 서열번호 113의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 VH는 서열번호 112의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 113의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 112의 VH 서열 및 서열번호 113의 VL 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 인간 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 인간 불변 영역, 특히 인간 CH1 및/또는 CL 도메인을 포함하는 Fab 분자이다. 인간 불변 도메인의 예시적인 서열은 서열번호 37 및 38(각각, 인간 카파 및 람다 CL 도메인), 그리고 서열번호 39(인간 IgG1 중쇄 불변 영역 CH1-CH2-CH3)에 제시된다. 일부 구현예들에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 37 또는 서열번호 38의 아미노산 서열, 특히 서열번호 37의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 상기 경쇄 불변 영역은 “전하 변형” 하에 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있고 및/또는 만약 교차 Fab 분자 내에 있으면 하나 이상(특히 2개)의 N 말단 아미노산의 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 39의 아미노산 서열 내에 포함된 CH1 도메인 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 중쇄 불변 영역(특이적으로 CH1 도메인)은 “전하 변형” 하에 본원에서 설명된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 구현예들에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1, 특히 가변 도메인 VL 및 VH가 상호 대체된다(즉, 상기 구현예에 따라서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 도메인이 교환되는 교차 Fab 분자이다). 상기 일 구현예에서, 상기 제1(및 만약 있다면, 상기 제3) 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자이다.
일 구현예에서, 상기 제2 항원(예컨대, CD3과 같은 활성화 T세포 항원)에 결합하는 1개 이하의 항원 결합 모이어티가 상기 이중특이적 항원 결합 분자 내에 존재한다(즉, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 상기 제2 항원에 대한 1가 결합을 제공한다).
전하 변형
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 내부에 포함된 Fab 분자 내에 아미노산 치환을 포함할 수 있는데, 이들 치환은 이의 결합 팔 중 하나(또는 2개 초과의 항원 결합 Fab 분자를 포함하는 분자의 경우에는, 그 이상)에서 VH/VL 교환을 갖는 Fab 기반 이중/다중특이적 항원 결합 분자의 생성에서 발생할 수 있는 경쇄의 비정합 중쇄와의 쌍형성 오류(벤스-존스 유형의 부산물)을 감소시키는 데 특히 효율적이다(또한, 본원에 전체가 원용되는 PCT 공보 제WO 2015/150447호, 특히 이의 실시예를 참조). 결합 팔 중 하나에서 VH/VL 도메인 교환을 갖는 이중특이적 항원 결합 분자에서 발생하는 바람직하지 않은 부산물, 특히 벤스-존스 유형의 부산물과 비교하여 원하는 이중특이적 항원 결합 분자의 비율은 CH1 및 CL 도메인 내에 특정 아미노산 위치에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산을 도입함으로써(때때로 본원에서 “전하 변형”으로 지칭됨) 개선될 수 있다.
이에 따라, 상기 이중특이적 항원 결합 분자의 제1 및 제2 항원 결합 모이어티가 둘 모두 Fab 분자이고, 상기 항원 결합 모이어티들 중 하나(특히, 제2 항원 결합 모이어티)에서 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 상호 대체되는 일부 구현예들에서,
i) 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 양으로 하전된 아미노산(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 음으로 하전된 아미노산(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되거나; 또는
ii) 상기 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 양으로 하전된 아미노산(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 음으로 하전된 아미노산(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환된다.
상기 이중특이적 항원 결합 분자는 i) 및 ii) 하에 언급된 변형 둘 모두를 포함하지는 않는다. VH/VL 교환을 갖는 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 및 CH1은 상호 대체되지 않는다(즉, 교환되지 않은 상태로 남는다).
더욱 특정한 구현예에서,
ii) 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되거나; 또는
ii) 상기 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
상기 일 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
추가의 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
특정 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
더 특정한 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환된다.
보다 더 특정한 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환된다.
특정 구현예들에서, 만약 상기 구현예들에 따른 아미노산 치환이 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 만들어지면, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL은 카파 동형이다.
대안적으로, 상기 구현예들에 따른 아미노산 치환은 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1 대신에 상기 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 만들어질 수 있다. 상기 특정 구현예들에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL은 카파 동형이다.
이에 따라, 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
추가의 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
또 다른 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환된다.
다른 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는:
(a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 84의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCD3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티, 및
(b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티를 포함하고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이고, 상기 Fab 경쇄 및 상기 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 상호 대체되고;
상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로(바람직한 구현예에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로) 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로(바람직한 구현예에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로) 치환되고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는:
(a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 85의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCD3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티, 및
(b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티를 포함하고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이고, 상기 Fab 경쇄 및 상기 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 상호 대체되고;
상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로(바람직한 구현예에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로) 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로(바람직한 구현예에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로) 치환되고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는:
(a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티를 포함하고, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCD3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자이고, 그리고
(b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티를 포함하고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이고, 상기 Fab 경쇄 및 상기 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 상호 대체되고;
상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로(바람직한 구현예에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로) 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로(바람직한 구현예에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로) 치환되고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는:
(a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 96의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCD3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티, 및
(b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티를 포함하고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이고, 상기 Fab 경쇄 및 상기 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 상호 대체되고;
상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로(바람직한 구현예에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로) 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로(바람직한 구현예에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로) 치환되고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는:
(a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 92의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 제1 항원 결합 모이어티, 및
(b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티를 포함하고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이고, 상기 Fab 경쇄 및 상기 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 상호 대체되고;
상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로(바람직한 구현예에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로) 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로(바람직한 구현예에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로) 치환되고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는:
(a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 5의 LCDR 2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 제1 항원 결합 모이어티, 및
(b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티를 포함하고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이고, 상기 Fab 경쇄 및 상기 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 상호 대체되고;
상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로(바람직한 구현예에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로) 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로(바람직한 구현예에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로) 치환되고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는:
(a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 7의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 8의 HCDR 2, 및 서열번호 9의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 10의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 11의 LCDR 2, 및 서열번호 12의 LCD3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티, 및
(b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티를 포함하고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이고, 상기 Fab 경쇄 및 상기 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 상호 대체되고;
상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로(바람직한 구현예에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로) 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로(바람직한 구현예에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로) 치환되고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
이중특이적 항원 결합 분자 형식
본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자의 성분들은 다양한 구성으로 서로 융합될 수 있다. 예시적인 구성은 도 1a-도 1z에 도시된다.
특정 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자 내에 포함된 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이다. 상기 구현예들에서, 제1, 제2, 제3 등의 항원 결합 모이어티는 본원에서 제1, 제2, 제3 등의 Fab 분자로서 각각 지칭될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자의 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 서로에 융합된다. 특정 구현예들에서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 분자이다. 상기 일 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 상기 다른 구현예에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. (i) 상기 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되거나, (ii) 상기 제1 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되는 구현예들에서, 추가적으로 상기 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 및 상기 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄가 선택적으로 펩티드 링커를 통해 서로에 융합될 수 있다.
표적 세포 항원, 예컨대 GPRC5D에 특이적으로 결합할 수 있는 단일 항원 결합 모이어티(예컨대, Fab 분자)을 갖는 이중특이적 항체(예를 들어, 도 1a, 1d, 1g, 1h, 1k, 1l에서 도시된 바와 같은)는 높은 친화성 항원 결합 모이어티의 결합 이후에 표적 세포 항원이 예상되는 경우에 특히 유용하다. 상기 경우들에서, 상기 표적 세포 항원에 특이적인 하나 초과의 항원 결합 모이어티의 존재는 상기 표적 세포 항원의 내재화를 향상시켜 이의 이용가능성을 감소시킬 수 있다.
다른 경우들에서, 하지만, 예를 들어 표적 부위로의 표적화를 최적화하거나 표적 세포 항원의 가교결합을 허용하기 위해 표적 세포 항원에 특이적인 2개 이상의 항원 결합 모이어티(예컨대, Fab 분자)을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자(도 1b, 1c, 1e, 1f, 1i, 1j, 1m 또는 1n에서 도시된 예를 참조)를 갖는 것이 유리할 것이다.
이에 따라, 특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 항원 결합 모이어티를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 상기 제1 항원, 즉 GPRC5D에 결합한다. 일 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이다.
일 구현예에서, 상기 제3 항원 모이어티는 상기 제1 항원 결합 모이어티와 동일하다.
상기 이중특이적 항원 결합 분자의 제3 항원 결합 모이어티는, 과학적으로 명백하게 비합리적이거나 불가능하지 않는 한, GPRC5D에 결합하는 항체 및/또는 상기 제1 항원 결합 모이어티와 관련하여 본원에 기재된 특징들 중 임의의 것을 단독으로 또는 조합하여 통합할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 84의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 85의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 96의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 92의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 4의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 5의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 6의 LCDR 2, 및 서열번호 7의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 7의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 8의 HCDR 2, 및 서열번호 9의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 10의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 11의 LCDR 2, 및 서열번호 12의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 인간화 항체(유래)이다. 일 구현예에서, 상기 VH는 인간화 VH이고/이거나 상기 VL은 인간화 VL이다. 일 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 상기 구현예들 중에서 임의의 것에서 CDR을 포함하고, 수용체 인간 프레임워크, 예컨대 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티의 VH는 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 57 및 서열번호 58로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 63 및 서열번호 64로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 57 및 서열번호 58로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VH 서열, 및 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 63 및 서열번호 64로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VL 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 57 및 서열번호 58로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 63 및 서열번호 64로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 57 및 서열번호 58로 구성된 군에서 선택된 VH, 및 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 63 및 서열번호 64로 구성된 군에서 선택된 VL 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 13의 VH 서열 및 서열번호 14의 VL 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 15의 VH 서열 및 서열번호 16의 VL 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 48의 VH 서열 및 서열번호 53의 VL 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 49의 VH 서열 및 서열번호 52의 VL 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 64의 VL 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 58의 VH 서열 및 서열번호 63의 VL 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 인간 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 인간 불변 영역, 특히 인간 CH1 및/또는 CL 도메인을 포함하는 Fab 분자이다. 인간 불변 도메인의 예시적인 서열은 서열번호 37 및 38(각각, 인간 카파 및 람다 CL 도메인), 그리고 서열번호 39(인간 IgG1 중쇄 불변 영역 CH1-CH2-CH3)에 제시된다. 일부 구현예들에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 37 또는 서열번호 38의 아미노산 서열, 특히 서열번호 37의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 상기 경쇄 불변 영역은 “전하 변형” 하에 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있고 및/또는 만약 교차 Fab 분자 내에 있으면 하나 이상(특히 2개)의 N 말단 아미노산의 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 39의 아미노산 서열 내에 포함된 CH1 도메인 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 상기 중쇄 불변 영역(구체적으로 CH1 도메인)은 “전하 변형” 하에 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
특정 구현예들에서, 상기 제3 및 제1 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 분자이고, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 상기 제1 항원 결합 모이어티와 동일하다. 따라서, 상기 구현예들에서, 상기 제1 및 제3 항원 결합 모이어티는 동일한 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하고, 도메인의 동일한 배열(즉, 통상적 또는 교차)을 갖는다. 또한, 상기 구현예들에서, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 상기 제1 항원 결합 모이어티와 동일한 아미노산 치환(만약 있으면)을 포함한다. 예를 들어, 본원에서 “전하 변형”으로서 기재된 아미노산 치환이 상기 제1 항원 결합 모이어티 및 상기 제3 항원 결합 모이어티 각각의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 만들어질 것이다. 대안적으로, 상기 아미노산 치환은 상기 제 2 항원 결합 모이어티(또한 특정 구현예들에서 Fab 분자임)의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 만들어질 수 있지만, 상기 제1 항원 결합 모이어티 및 상기 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서는 그렇지 않다.
상기 제1 항원 결합 모이어티와 유사하게, 상기 제3 항원 결합 모이어티는 특히 통상적인 Fab 분자이다. 하지만, 상기 제1 및 제3 항원 결합 모이어티가 교차 Fab 분자(및 상기 제2 항원 결합 모이어티가 통상적인 Fab 분자임)인 구현예들도 또한 고려된다. 따라서, 특정 구현예들에서, 상기 제1 및 제3 항원 결합 모이어티는 각각 통상적인 Fab 분자이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 본원에 기재된 바와 같은 교차 Fab 분자, 즉 상기 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 상호 교환/대체되는 Fab 분자이다. 다른 구현예들에서, 상기 제1 및 제3 항원 결합 모이어티는 각각 교차 Fab 분자이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자이다.
제3 항원 결합 모이어티가 존재하는 경우, 특정 구현예에서 상기 제1 및 제3 항원 모이어티는 GPRC5D에 결합하고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 제2 항원, 특히 활성화 T세포 항원, 더욱 특히 CD3, 가장 특히 CD3 엡실론에 결합한다.
특정 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위는 안정되게 연관될 수 있다.
본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자는 상이한 구성을 가질 수 있다. 즉, 제1, 제2(및 선택적으로 제3) 항원 결합 모이어티는 상이한 방식으로 서로에 및 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 상기 성분들은 직접적으로 또는 바람직하게는 하나 이상의 적합한 펩티드 링커를 통해 서로에 융합될 수 있다. Fab 분자가 Fc 도메인의 아단위의 N 말단에 융합되는 경우에, 이는 전형적으로 면역글로불린 힌지 영역을 통해서이다.
일부 구현예들에서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 분자이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합된다. 상기 구현예들에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 또는 Fc 도메인의 아단위 중에서 다른 하나의 N 말단에 융합될 수 있다. 상기 특정 구현예들에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 본원에 기재된 바와 같은 교차 Fab 분자, 즉 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 상호 교환/대체되는 Fab 분자이다. 상기 다른 구현예들에서, 상기 제1 Fab 분자는 교차 Fab 분자이고 상기 제2 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다.
일 구현예에서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 분자이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합되고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 및 제2 Fab 분자, 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인, 및 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 상기 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 상기 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합된다. 상기 구성은 도 1g 및 도 1k에 개략적으로 도시되어 있다(상기 예들에서 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 교차 Fab 분자임). 선택적으로, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가적으로 서로에 융합될 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 분자이고, 상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다. 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 및 제2 Fab 분자, 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인, 및 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 상기 제1 및 제2 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다. 상기 구성은 도 1a 및 도 1d에서 개략적으로 도시된다(상기 예들에서 상기 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 교차 Fab 분자이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자임). 상기 제1 및 제2 Fab 분자는 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 제1 및 제2 Fab 분자는 각각 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 융합된다. 특정 구현예에서, 상기 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이고, 특히 상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다.
일부 구현예들에서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 분자이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합된다. 상기 구현예들에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에(상기 기재된 바와 같이) 또는 Fc 도메인의 아단위 중에서 다른 하나의 N 말단에 융합될 수 있다. 상기 특정 구현예들에서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 본원에 기재된 바와 같은 교차 Fab 분자, 즉 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 상호 교환/대체되는 Fab 분자이다. 상기 다른 구현예들에서, 상기 제1 Fab 분자는 교차 Fab 분자이고 상기 제2 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다.
일 구현예에서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 분자이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합되고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 및 제2 Fab 분자, 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인, 및 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 상기 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 상기 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합된다. 상기 구성은 도 1h 및 도 1l에서 개략적으로 도시된다(상기 예들에서 상기 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 교차 Fab 분자이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자임). 선택적으로, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가적으로 서로에 융합될 수 있다.
일부 구현예들에서, 제3 항원 결합 모이어티, 특히 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합된다. 상기 특정 구현예들에서, 상기 제1 및 제3 Fab 분자는 각각 통상적인 Fab 분자이고, 상기 제2 항원 Fab 분자는 본원에 기재된 바와 같은 교차 Fab 분자, 즉 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 상호 교환/대체되는 Fab 분자이다. 상기 다른 구현예들에서, 상기 제1 및 제3 Fab 분자는 교차 Fab 분자이고 상기 제2 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다.
상기 특정 구현예에서, 상기 제1 및 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인, 및 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 상기 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 상기 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 아단위의 N 말단에 융합되며, 상기 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제2 아단위의 N 말단에 융합된다. 상기 구성은 도 1b 및 도 1e(상기 예들에서 상기 제2 항원 결합 모이어티는 VH/VL 교차 Fab 분자이고, 상기 제1 및 제3 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자임), 및 도 1j 및 도 1n(상기 예들에서 상기 제2 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자이고, 상기 제1 및 제3 항원 결합 모이어티는 VH/VL 교차 Fab 분자임)에서 개략적으로 도시된다. 상기 제2 및 제3 Fab 분자는 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 제2 및 제3 Fab 분자는 각각 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 융합된다. 특정 구현예에서, 상기 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이고, 특히 상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 선택적으로, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가적으로 서로에 융합될 수 있다.
상기 다른 구현예에서, 상기 제1 및 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인, 및 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 상기 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 상기 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 아단위의 N 말단에 융합되며, 상기 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제2 아단위의 N 말단에 융합된다. 상기 구성은 도 1c 및 도 1f(상기 예들에서 상기 제2 항원 결합 모이어티는 VH/VL 교차 Fab 분자이고, 상기 제1 및 제3 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자임), 및 도 1l 및 도 1m(상기 예들에서 상기 제2 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자이고, 상기 제1 및 제3 항원 결합 모이어티는 VH/VL 교차 Fab 분자임)에서 개략적으로 도시된다. 상기 제1 및 제3 Fab 분자는 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 제1 및 제3 Fab 분자는 각각 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 융합된다. 특정 구현예에서, 상기 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이고, 특히 상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 선택적으로, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가적으로 서로에 융합될 수 있다.
Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인의 각각의 아단위의 N 말단에 융합되는 이중특이적 항원 결합 분자의 구성에서, 2개의 Fab 분자, 힌지 영역 및 Fc 도메인은 본질적으로 면역글로불린 분자를 형성한다. 특정 구현예에서, 상기 면역글로불린 분자는 IgG 부류 면역글로불린이다. 보다 더 특정한 구현예에서, 상기 면역글로불린은 IgG1 하위부류 면역글로불린이다. 다른 구현예에서, 상기 면역글로불린은 IgG4 하위부류 면역글로불린이다. 추가의 특정 구현예에서, 상기 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 다른 구현예들에서, 상기 면역글로불린은 키메라 면역글로불린 또는 인간화 면역글로불린이다. 일 구현예에서, 상기 면역글로불린은 인간 불변 영역, 특히 인간 Fc 영역을 포함한다.
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 중 일부에서, 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄가 선택적으로 펩티드 링커를 통해 서로에 융합된다. 상기 제1 및 제2 Fab 분자의 구성에 따라, 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄는 이의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄의 N 말단에 융합되거나, 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 이의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄의 N 말단에 융합될 수 있다. 상기 제1 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄의 융합은 불일치된 Fab 중쇄 및 경쇄의 쌍형성 오류를 추가로 감소시키고, 또한 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 중 일부의 발현에 필요한 플라스미드의 수를 감소시킨다.
항원 결합 모이어티는 직접적으로 또는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2-20개의 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인 또는 서로에 융합될 수 있다. 펩티드 링커는 당해 분야에서 공지되고 본원에서 설명된다. 적합한 비면역원성 펩티드 링커는, 예를 들어 (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커를 포함한다. “n”은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 정수이다. 일 구현예에서, 상기 펩티드 링커는 적어도 5개 아미노산의 길이, 일 구현예에서 5 내지 100개의 길이, 추가의 구현예에서 10 내지 50개 아미노산의 길이를 갖는다. 일 구현예에서, 상기 펩티드 링커는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm이며, G=글리신, S=세린, 및 (x=3, n= 3, 4, 5 또는 6 및 m=0, 1, 2 또는 3) 또는 (x=4, n=2, 3, 4 또는 5 및 m= 0, 1, 2 또는 3), 일 구현예에서 x=4 및 n=2 또는 3, 추가의 구현예에서 x=4 및 n=2이다. 일 구현예에서, 상기 펩티드 링커는 (G4S)2이다. 제1 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄를 서로에 융합하기 위한 특히 적합한 펩티드 링커는 (G4S)2이다. 제1 및 제2 Fab 단편의 Fab 중쇄를 연결하는 데 적합한 예시적인 펩티드 링커는 서열 (D)-(G4S)2(서열번호 43 및 44)를 포함한다. 상기 다른 적합한 링커는 서열 (G4S)4를 포함한다. 추가적으로, 링커는 면역글로불린 힌지 영역(이의 부분)을 포함할 수 있다. 특히 Fab 분자가 Fc 도메인 아단위의 N 말단에 융합되는 경우에, 이는 추가 펩티드 링커와 함께 또는 추가 펩티드 링커 없이 면역글로불린 힌지 영역 또는 이의 부분을 통해 융합될 수 있다.
특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역은 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 Fc 도메인 아단위와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)), 및 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 아단위와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 특정 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는, 예를 들어 이황화 결합에 의해 공유결합으로 연결된다.
특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역은 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 Fc 도메인 아단위와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4)), 및 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 아단위와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 특정 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는, 예를 들어 이황화 결합에 의해 공유결합으로 연결된다.
일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 Fc 도메인 아단위와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 (VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 다른 구현예들에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 Fc 도메인 아단위와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 (VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다.
상기 구현예들 중 일부에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 교차 Fab 경쇄 폴리펩티드를 추가로 포함하는데, 여기서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유한다. 상기 구현예들 중 일부에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 적합하면, 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CL(2)-VL(1)-CL(1)), 또는 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드가 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2))를 추가로 포함한다.
상기 구현예들에 따른 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) Fc 도메인 아단위 폴리펩티드(CH2-CH3(-CH4)), 또는 (ii) 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 아단위(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) 및 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는, 예를 들어 이황화 결합에 의해 공유결합으로 연결된다.
일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 Fc 도메인 아단위와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 다른 구현예들에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 Fc 도메인 아단위와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 (VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다.
상기 구현예들 중 일부에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 교차 Fab 경쇄 폴리펩티드를 추가로 포함하는데, 여기서 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유한다. 상기 구현예들 중 일부에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 적합하면, 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)-VL(1)-CL(1)), 또는 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드가 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2))를 추가로 포함한다.
상기 구현예들에 따른 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) Fc 도메인 아단위 폴리펩티드(CH2-CH3(-CH4)), 또는 (ii) 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 아단위(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) 및 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는, 예를 들어 이황화 결합에 의해 공유결합으로 연결된다.
특정 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인을 포함하지 않는다. 상기 특정 구현예들에서, 상기 제1, 및 존재하는 경우 제3 Fab 분자는 각각 통상적인 Fab 분자이고, 상기 제2 항원 Fab 분자는 본원에 기재된 바와 같은 교차 Fab 분자, 즉 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 상호 교환/대체되는 Fab 분자이다. 상기 다른 구현예들에서, 상기 제1, 및 존재하는 경우 제3 Fab 분자는 교차 Fab 분자이고 상기 제2 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다.
상기 일 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 및 제2 항원 결합 모이어티, 그리고 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 둘 모두 Fab 분자이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 상기 구성은 도 1o 및 도 1s에서 개략적으로 도시된다(상기 예들에서 상기 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 교차 Fab 분자이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자임).
상기 다른 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 및 제2 항원 결합 모이어티, 그리고 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 둘 모두 Fab 분자이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 상기 구성은 도 1p 및 도 1t에서 개략적으로 도시된다(상기 예들에서 상기 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 교차 Fab 분자이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자임).
일부 구현예들에서, 상기 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 항원 결합 모이어티, 특히 제3 Fab 분자를 추가로 포함하고, 상기 제3 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 상기 특정 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 그리고 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 상기 제1 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 상기 제3 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 상기 구성은 도 1q 및 1u(상기 예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 교차 Fab 분자이고, 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 각각 통상적인 Fab 분자임), 또는 도 1x 및 1z(상기 예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 통상적인 Fab 분자이고, 제1 및 제3 항원 결합 모이어티는 각각 VH/VL 교차 Fab 분자임)에서 개략적으로 도시된다.
일부 구현예들에서, 상기 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 항원 결합 모이어티, 특히 제3 Fab 분자를 추가로 포함하고, 상기 제3 Fab 분자가 Fab 중쇄의 N 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 C 말단에 융합된다. 상기 특정 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 그리고 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 상기 제2 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 상기 제3 Fab 분자가 Fab 중쇄의 N 말단에서 상기 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 C 말단에 융합된다. 상기 구성은 도 1r 및 1v(상기 예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 교차 Fab 분자이고, 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 각각 통상적인 Fab 분자임), 또는 도 1w 및 1y(상기 예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 통상적인 Fab 분자이고, 제1 및 제3 항원 결합 모이어티는 각각 VH/VL 교차 Fab 분자임)에서 개략적으로 도시된다.
특정 구현예들에서 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하는) 폴리펩티드(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1))를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
특정 구현예들에서 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하는) 폴리펩티드(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하는) 폴리펩티드(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
특정 구현예들에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
특정 구현예들에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
특정 구현예들에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제1 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는(즉, 제3 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하는) 폴리펩티드(VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-VL(3)-CH1(3))를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(1)-CL(1)) 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(2)-CL(2))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(3)-CL(3))과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 부자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제1 Fab 분자가 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는(즉, 제3 Fab 분자가 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하는) 폴리펩티드(VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1)-VH(3)-CL(3))를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(VL(1)-CH(1)) 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(2)-CL(2))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(VL(3)-CH1(3))과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제3 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제1 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(3)-CH1(3)-VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2))를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(1)-CL(1)) 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(2)-CL(2))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(3)-CL(3))과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제3 Fab 분자가 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제1 Fab 분자가 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(3)-CL(3)-VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2))를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(VL(1)-CH(1)) 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(2)-CL(2))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(VL(3)-CH1(3))과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 84의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티를 포함하고, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 Ch1이 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자이고; c) 상기 제1 항원에 결합하고 상기 제1 항원 결합 모이어티와 동일한 제3 항원 결합 모이어티를 포함하고; 및 d) 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함하는, 이중 특이적 항원 결합 분자이며, 여기서 (i) a) 하의 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하의 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하의 제2 항원 결합 모이어티 및 c) 하의 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하의 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하의 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하의 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하의 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하의 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 각각 융합된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 85의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이며, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 Ch1은 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티; c) 상기 제1 항원에 결합하고 상기 제1 항원 결합 모이어티와 동일한 제3 항원 결합 모이어티; 및 d) 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함하는, 이중 특이적 항원 결합 분자이며, 여기서 (i) a) 하의 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하의 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하의 제2 항원 결합 모이어티 및 c) 하의 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하의 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하의 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하의 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하의 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하의 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 각각 융합된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이며, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 Ch1은 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티; c) 상기 제1 항원에 결합하고 상기 제1 항원 결합 모이어티와 동일한 제3 항원 결합 모이어티; 및 d) 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함하는, 이중 특이적 항원 결합 분자이며, 여기서 (i) a) 하의 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하의 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하의 제2 항원 결합 모이어티 및 c) 하의 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하의 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하의 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하의 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하의 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하의 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 각각 융합된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 96의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이며, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 Ch1은 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티; c) 상기 제1 항원에 결합하고 상기 제1 항원 결합 모이어티와 동일한 제3 항원 결합 모이어티; 및 d) 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함하는, 이중 특이적 항원 결합 분자이며, 여기서 (i) a) 하의 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하의 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하의 제2 항원 결합 모이어티 및 c) 하의 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하의 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하의 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하의 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하의 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하의 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 각각 융합된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 92의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이며, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티; c) 상기 제1 항원에 결합하고 상기 제1 항원 결합 모이어티와 동일한 제3 항원 결합 모이어티; 및 d) 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함하는, 이중 특이적 항원 결합 분자이며, 여기서 (i) a) 하의 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하의 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하의 제2 항원 결합 모이어티 및 c) 하의 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하의 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하의 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하의 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하의 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하의 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 각각 융합된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 5의 LCDR 2, 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이며, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티; c) 상기 제1 항원에 결합하고 상기 제1 항원 결합 모이어티와 동일한 제3 항원 결합 모이어티; 및 d) 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함하는, 이중 특이적 항원 결합 분자이며, 여기서 (i) a) 하의 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하의 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하의 제2 항원 결합 모이어티 및 c) 하의 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하의 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하의 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하의 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하의 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하의 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 각각 융합된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 7의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 8의 HCDR 2, 및 서열번호 9의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 10의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 11의 LCDR 2, 및 서열번호 12의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이며, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티; c) 상기 제1 항원에 결합하고 상기 제1 항원 결합 모이어티와 동일한 제3 항원 결합 모이어티; 및 d) 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함하는, 이중 특이적 항원 결합 분자를 제공하며, 여기서 (i) a) 하의 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하의 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하의 제2 항원 결합 모이어티 및 c) 하의 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하의 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하의 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하의 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하의 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하의 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 각각 융합된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 84의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함하는, 이중 특이적 항원 결합 분자를 제공하고, 여기서 (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 85의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함하는, 이중 특이적 항원 결합 분자를 제공하고, 여기서 (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함하는, 이중 특이적 항원 결합 분자를 제공하고, 여기서 (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 96의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함하는, 이중 특이적 항원 결합 분자를 제공하고, 여기서 (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 92의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함하는, 이중 특이적 항원 결합 분자를 제공하고, 여기서 (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서:
a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 5의 LCDR 2, 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서
(i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 7의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 8의 HCDR 2, 및 서열번호 9의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 10의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 11의 LCDR 2, 및 서열번호 12의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함하는, 이중 특이적 항원 결합 분자를 제공하고, 여기서 (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자의 상이한 모든 구성에서, 본원에 기재된 아미노산 치환은, 존재할 경우, 제1 및(존재할 경우) 제3 항원 결합 모이어티/Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인 내에, 또는 제2 항원 결합 모이어티/Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인 내에 있을 수 있다. 바람직하게는, 제1 및(존재할 경우) 제3 항원 결합 모이어티/Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인 내에 있다. 본 발명의 개념에 따라서, 만약 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 치환이 제1(및 존재할 경우, 제3) 항원 결합 모이어티/Fab 분자에서 이루어지는 경우, 제2 항원 결합 모이어티/Fab 분자에서는 상기 아미노산 치환이 이루어지지 않는다. 반대로, 만약 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 치환이 제2 항원 결합 모이어티/Fab 분자에서 이루어지는 경우, 제1(및 존재할 경우, 제3) 항원 결합 모이어티/Fab 분자에서는 상기 아미노산 치환이 이루어지지 않는다. 아미노산 치환은 특히 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH1이 상호 대체되는 Fab 분자를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에서 이루어진다.
본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자, 특히 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 치환이 제1(및 존재할 경우, 제3) 항원 결합 모이어티/Fab 분자에서 이루어지는 특정 구현예들에서, 제1(및 존재할 경우, 제3) Fab 분자의 불변 도메인 CL은 카파 동형이다. 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자, 특히 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 치환이 제2 항원 결합 모이어티/Fab 분자에서 이루어지는 특정 구현예들에서, 제2 항원 결합 모이어티/Fab 분자의 불변 도메인 CL은 카파 동형이다. 일부 구현예들에서, 제1(및 존재할 경우, 제3) 항원 결합 모이어티/Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 제2 항원 결합 모이어티/Fab 분자의 불변 도메인 CL은 카파 동형이다.
일 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 84의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
일 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 85의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
일 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
일 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 96의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
일 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 92의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
일 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 5의 LCDR 2, 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
일 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 7의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 8의 HCDR 2, 및 서열번호 9의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 10의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 11의 LCDR 2, 및 서열번호 12의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 84의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 상기 제1 항원에 결합하고 상기 제1 항원 결합 모이어티와 동일한 제3 항원 결합 모이어티를 포함하고; d) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 85의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 상기 제1 항원에 결합하고 상기 제1 항원 결합 모이어티와 동일한 제3 항원 결합 모이어티; 및 d) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 상기 제1 항원에 결합하고 상기 제1 항원 결합 모이어티와 동일한 제3 항원 결합 모이어티; 및 d) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 96의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 상기 제1 항원에 결합하고 상기 제1 항원 결합 모이어티와 동일한 제3 항원 결합 모이어티; 및 d) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 92의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 상기 제1 항원에 결합하고 상기 제1 항원 결합 모이어티와 동일한 제3 항원 결합 모이어티; 및 d) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 5의 LCDR 2, 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 상기 제1 항원에 결합하고 상기 제1 항원 결합 모이어티와 동일한 제3 항원 결합 모이어티; 및 d) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 7의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 8의 HCDR 2, 및 서열번호 9의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 10의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 11의 LCDR 2, 및 서열번호 12의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 상기 제1 항원에 결합하고 상기 제1 항원 결합 모이어티와 동일한 제3 항원 결합 모이어티; 및 d) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; (i) a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되거나, (ii) b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 c) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fab 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 84의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 85의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 96의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 92의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 3의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 4의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 5의 LCDR 2, 및 서열번호 6의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서, a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 7의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 8의 HCDR 2, 및 서열번호 9의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 10의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 11의 LCDR 2, 및 서열번호 12의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 상기 Fab 분자는 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR 1), 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR 1), 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
상기 구현예들 중 임의의 것에 따라서, 이중특이적 항원 결합 분자의 성분(예컨대, Fab 분자, Fc 도메인)는 직접적으로 또는 본원에 기재되거나 당해 분야에서 공지된 다양한 링커, 특히 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2-20개 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있다. 적합한 비면역원성 펩티드 링커는, 예를 들어 (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커를 포함하고, n은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 정수이다.
특정 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서 a) 제1 항원에 결합하는 제1 및 제3 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 서열번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 14를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 (통상적인)Fab 분자인 제1 및 제3 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 및 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 및 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티 및 a) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
특정 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서 a) 제1 항원에 결합하는 제1 및 제3 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 (통상적인)Fab 분자인 제1 및 제3 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 여기서 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 및 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 및 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티 및 a) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
특정 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서 a) 제1 항원에 결합하는 제1 및 제3 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 64를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 (통상적인)Fab 분자인 제1 및 제3 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 및 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 및 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티 및 a) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
특정 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서 a) 제1 항원에 결합하는 제1 및 제3 항원 결합 모이어티로서 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 63를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 (통상적인)Fab 분자인 제1 및 제3 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 및 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 및 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티 및 a) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
특정 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서 a) 제1 항원에 결합하는 제1 및 제3 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 53를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 (통상적인)Fab 분자인 제1 및 제3 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티고; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 및 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 및 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티 및 a) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
특정 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서 a) 제1 항원에 결합하는 제1 및 제3 항원 결합 모이어티로서, 여기서 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 52를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 (통상적인)Fab 분자인 제1 및 제3 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 및 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 및 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티 및 a) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
특정 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자로서 a) 제1 항원에 결합하는 제1 및 제3 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고, 상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 63를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 (통상적인)Fab 분자인 제1 및 제3 항원 결합 모이어티; b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되며, 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티고; c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고; 여기서 a) 하에 제1 및 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)(가장 바람직하게는 아르기닌(R)에 의해 치환되고; a) 하에 제1 및 제3 항원 결합 모이어티의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되며; a) 하에 제1 항원 결합 모이어티는 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 및 b) 하에 제2 항원 결합 모이어티 및 a) 하에 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
본 발명의 상기 양태에 따른 일 구현예에서, Fc 도메인의 제1 아단위 내에 위치 366에서 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기(T366W)로 대체되고, Fc 도메인의 제2 아단위 내에 위치 407에서 티로신 잔기가 발린 잔기(Y407V)로 대체되고, 선택적으로 위치 366에서 트레오닌 잔기가 세린 잔기(T366S)로 대체되고 위치 368에서 류신 잔기가 알라닌 잔기(L368A)로 대체된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
본 발명의 상기 양태에 따른 추가 구현예에서, Fc 도메인의 제1 아단위에서 추가적으로 위치 354에서 세린 잔기가 시스테인 잔기(S354C)로 대체되거나 또는 위치 356에서 글루타민산 잔기가 시스테인 잔기(E356C)로 대체되고(특히, 위치 354에서 세린 잔기가 시스테인 잔기로 대체되고), Fc 도메인의 제2 아단위에서 추가적으로 위치 349에서 티로신 잔기가 시스테인 잔기(Y349C)에 의해 대체된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
본 발명의 상기 양태에 따른 다른 추가의 구현예에서, Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 각각에서 위치 234에서 류신 잔기가 알라닌 잔기(L234A)로 대체되고, 위치 235에서 류신 잔기가 알라닌 잔기(L235A)로 대체되며, 위치 329에서 프롤린 잔기가 글리신 잔기(P329G)에 의해 대체된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
본 발명의 상기 양태에 따른 다른 추가의 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인이다.
구체적인 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 17의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 18의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 19의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 20의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 구체적인 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
다른 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 21의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 22의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 23의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 24의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
다른 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 114의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 115의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 116의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 117의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
다른 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 118의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 119의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 120의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 121의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
다른 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 122의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 123의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 124의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 125의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
다른 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 126의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 127의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 128의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
다른 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 130의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 131의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 132의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 133의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
Fc 도메인
특정 구현예들에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함한다. 상기 이중특이적 항원 결합 분자와 관련하여 본원에 기재된 Fc 도메인의 특징은 본 발명의 항체에 포함된 Fc 도메인에 동등하게 적용될 수 있는 것으로 이해된다.
상기 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성된다. 예를 들어, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은 이량체이며, 이의 각 아단위는 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 2개 아단위는 서로 안정되게 결합될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 1개 초과의 Fc 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 다른 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 더 특정한 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 위치 S228(카바트 EU 지수 넘버링)에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 상기 아미노산 치환은 IgG4 항체의 생체내 Fab 팔 교환을 감소시킨다(Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)를 참조). 추가의 특정 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 보다 더 특정한 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 인간 IgG1 Fc 영역의 예시적인 서열은 서열번호 42에서 제공된다.
이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 변형
본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인의 2개 아단위 중 하나 또는 다른 하나에 융합될 수 있는 상이한 항원 결합 모이어티를 포함하고, 따라서 상기 Fc 도메인의 2개의 아단위는 전형적으로 2개의 비동일한 폴리펩티드 사슬 내에 포함된다. 상기 폴리펩티드의 재조합 공동발현 및 이후의 이량체화는 상기 2개의 폴리펩티드의 여러 가능한 조합을 유발한다. 따라서, 재조합 생성에서 이중특이적 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선시키기 위해, 원하는 폴리펩티드의 결합을 촉진하는 변형을 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인에 도입하는 것이 유리할 것이다.
이에 따라, 특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 결합을 촉진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개 아단위 사이에서 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용의 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인 내에 있다. 따라서, 일 구현예에서 상기 변형은 Fc 도메인의 CH3 도메인 내에 있다.
이종이합체화를 실시하기 위한 Fc 도메인의 CH3 도메인에서 변형을 위한 여러 접근법이 존재하는데, 이들은 예컨대 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291에서 충분히 설명된다. 전형적으로, 상기 모든 접근ㅇ법에서 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인 및 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인은 모두 상보적인 방식으로 가공되어 각 CH3 도메인(또는 이를 포함하는 중쇄)이 그 자체로는 더 이상 동종이량체를 형성할 수 없지만, 상보적으로 가공된 다른 CH3 도메인과 이종이량체를 형성하도록 강제될 수 있다(따라서, 제1 및 제2 CH3 도메인이 이종이량체를 형성하고, 2개의 제1 또는 2개의 제2 CH3 도메인 사이에 그 어떤 동종이량체도 형성되지 않도록 할 수 있다). 개선된 중쇄 이종이량체화를 위한 상기 상이한 접근법은 중쇄/경쇄 쌍형성 오류 및 벤스 존스 유형의 생성물을 감소시키는, 이중특이적 항원 결합 분자에서 중쇄-경쇄 변형(예컨대, 하나의 결합 팔에서 VH 및 VL 교환/대체 및 CH1/CL 계면에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 치환의 도입)과 조합으로 상이한 대안으로서 고려된다.
특정 구현예에서, Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 결합을 촉진하는 상기 변형은 Fc 도메인의 2개 아단위 중 하나에서 “돌기” 변형 및 Fc 도메인의 2개 아단위 중 다른 하나에서 “구멍” 변형을 포함하는, 소위 “구멍 내로의 돌기(knob-into-hole)” 변형이다.
상기 구멍 내로의 돌기 기술은, 예컨대 미국 5,731,168; 미국 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) 및 Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)에 기재된다. 일반적으로, 상기 방법은 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해하기 위해 융기가 공동 내에 배치될 수 있도록, 융기(“돌기”)를 제1 폴리펩티드의 계면에서, 그리고 상응하는 공동 (“구멍”)을 제2 폴리펩티드의 계면 내에 도입하는 것을 수반한다. 융기는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(예컨대, 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 구축된다. 융기와 동일한 또는 유사한 크기의 보상성 공동은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄(예컨대, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 폴리펩티드의 계면 내에 생성된다.
이에 따라, 특정 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 공동에서 위치가능한 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 융기를 생성하고 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 융기가 위치가능한 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 공동을 생성한다.
바람직하게는 더 큰 측쇄 용적을 갖는 상기 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직하게는 더 작은 측쇄 용적을 갖는 상기 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로 이루어진 군에서 선택된다.
상기 융기 및 공동은 폴리펩티드를 부호화하는 핵산을, 예컨대 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 또는 펩티드 합성에 의해 변경함으로써 만들어질 수 있다.
특정 구현예에서, Fc 도메인의 제1 아단위(“돌기” 아단위)(이의 CH3 도메인)에서 위치 366에서 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기(T366W)로 대체되고, Fc 도메인의 제2 아단위(“구멍" 아단위)(이의 CH3 도메인)에서 위치 407에서 티로신 잔기가 발린 잔기(Y407V)로 대체된다. 일 구현예에서, Fc 도메인의 제2 아단위에서 추가적으로 위치 366에서 트레오닌 잔기가 세린 잔기(T366S)로 대체되고 위치 368에서 류신 잔기가 알라닌 잔기(L368A)로 대체된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
다른 추가 구현예에서, Fc 도메인의 제1 아단위에서 추가적으로 위치 354에서 세린 잔기가 시스테인 잔기(S354C)로 대체되거나 또는 위치 356에서 글루타민산 잔기가 시스테인 잔기(E356C)로 대체되고(특히, 위치 354에서 세린 잔기가 시스테인 잔기로 대체되고), Fc 도메인의 제2 아단위에서 추가적으로 위치 349에서 티로신 잔기가 시스테인 잔기(Y349C)에 의해 대체된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 상기 2개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 도메인의 2개 아단위 사이에 이황화 가교의 형성을 유발하여, 이량체를 추가로 안정시킨다(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
특정 구현예에서, Fc 도메인의 제1 아단위는 아미노산 치환 S354C 및 T366W를 포함하고, Fc 도메인의 제2 아단위는 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다.
특정 구현예에서, 제2 항원(예컨대, 활성화 T세포 항원)에 결합하는 항원 결합 모이어티는 (선택적으로 GPRC5D에 결합하는 항원 결합 모이어티 및/또는 펩티드 링커를 통해) Fc 도메인의 제1 아단위(“돌기” 변형을 포함)에 융합된다. 이론에 제한됨이 없이, Fc 도메인의 돌기 함유 아단위에 대한 활성화 T세포 항원과 같은 제2 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티의 융합은 활성화 T세포 항원에 결합하는 2개의 항원 결합 모이어티(2개의 돌기 함유 폴리펩티드의 입체 충돌)를 포함하는 항원 결합 분자의 생성을 (추가로) 최소화할 것이다.
이종이량체화를 실시하기 위한 CH3 변형의 다른 기술이 본 발명에 따른 대안으로서 고려되고, 예컨대 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291에 기재된다.
일 구현예에서, EP 1870459에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 사용된다. 상기 접근법은 Fc 도메인의 2개 아단위 사이에서 CH3/CH3 도메인 계면 내에 특정한 아미노산 위치에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 도입에 기초한다. 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자에 대한 바람직한 일 구현예는 아미노산 돌연변이 R409D; 2개의 CH3 도메인(Fc 도메인의) 중 하나에서 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; Fc 도메인의 CH3 도메인 중 다른 하나에서 E357K이다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
다른 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 T366W 및 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, 및 부가적으로 아미노산 돌연변이 R409D; Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 E357K을 포함한다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
다른 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 S354C, T366W 및 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 포함하거나, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366W 및 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 S354C, T366S, L368A, Y407V, 및 부가적으로 아미노산 돌연변이 R409D; Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 E357K를 포함한다(이들 모두 카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
일 구현예에서, WO 2013/157953에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용된다. 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366K를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351D를 포함한다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 추가의 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351K를 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 제2 CH3 도메인은 Y349E, Y349D 및 L368E으로부터 선택되는 아미노산 돌연변이(특히, L368E)를 추가로 포함한다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
일 구현예에서, WO 2012/058768에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용된다. 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 추가의 구현예에서, 제2 CH3 도메인은 위치 T411, D399, S400, F405, N390 또는 K392에서, 예컨대 a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E 또는 T411W, b) D399R, D399W, D399Y 또는 D399K, c) S400E, S400D, S400R 또는 S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V 또는 F405W, e) N390R, N390K 또는 N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F 또는 K392E으로부터 선택되는 추가 아미노산 돌연변이를 포함한다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 추가의 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366V, K409F를 포함한다. 추가의 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K392E, T411E, D399R 및 S400R을 추가로 포함한다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
일 구현예에서, WO 2011/143545에 기재된 이종이량체화 접근법이, 예를 들어 368 및 409(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)로 이루어진 군에서 선택되는 위치에서 아미노산 변형을 통해 대안적으로 이용된다.
일 구현예에서, 상기 기재된 구멍 내로의 돌기 기술을 또한 이용하는 WO 2011/090762에서 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용된다. 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366W를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함한다. 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366Y를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407T를 포함한다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
일 구현예에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 Fc 도메인은 IgG2 하위부류의 것이고, WO 2010/129304에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용된다.
대안적 구현예에서, Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 결합을 촉진하는 변형은, 예를 들어 PCT 공보 제WO 2009/089004호에 기재된 바와 같이 정전기 스티어링 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 상기 방법은 동종이량체 형성이 정전기적으로 불리하지만 이종이량체화가 정전기적으로 유리하게 되도록, 하전된 아미노산 잔기에 의한 2개의 Fc 도메인 아단위의 계면에서 하나 그 이상의 아미노산 잔기의 대체를 수반한다. 상기 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산(예컨대, 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D), 특히 K392D 또는 N392D)으로 K392 또는 N392의 아미노산 치환을 포함하고, 제2 CH3 도메인은 양으로 하전된 아미노산(예컨대, 리신(K) 또는 아르기닌(R), 바람직하게는 D399K, E356K, D356K 또는 E357K, 더 바람직하게는 D399K 및 E356K)으로 D399, E356, D356 또는 E357의 아미노산 치환을 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산(예컨대, 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D), 특히 K409D 또는 R409D)으로 K409 또는 R409의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산(예컨대, 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D))으로 K439 및/또는 K370의 아미노산 치환(모두 카바트 EU 지수에 따른 넘버링)을 추가로 또는 대안적으로 포함한다.
다른 추가의 구현예에서, WO 2007/147901에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용된다. 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K253E, D282K 및 K322D를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 D239K, E240K 및 K292D를 포함한다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
또 다른 구현예에서, WO 2007/110205에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 이용될 수 있다.
일 구현예에서, Fc 도메인의 제1 아단위는 아미노산 치환 K392D 및 K409D를 포함하고, Fc 도메인의 제2 아단위는 아미노산 치환 D356K 및 D399K를 포함한다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
Fc 수용체 결합 및/또는 효능기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형
Fc 도메인은 표적 조직에서 우수한 축적에 기여하는 긴 혈청 반감기 및 우호적인 조직-혈액 분포 비율을 포함하여 우호적인 약동학적 특성을 이중특이적 항원 결합 분자(또는 항체)에 부여한다. 이와 동시에, 하지만 바람직한 항원 보유 세포보다는 Fc 수용체를 발현하는 세포로 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 바람직하지 않은 표적화를 야기할 수 있다. 또한, Fc 수용체 신호전달 경로의 공동 활성화는 T세포 활성화 특성(예컨대, 제2 항원 결합 모이어티가 활성화 T세포 항원에 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자의 구현예들에서) 및 이중특이적 항원 결합 분자의 긴 반감기와 조합하여 전신 투여시 사이토카인 수용체의 과도한 활성화 및 심각한 부작용을 초래하는 사이토카인 방출로 이어진다. T세포 이외의 (Fc 수용체 보유) 면역 세포의 활성화는 T세포의, 예컨대 NK 세포에 의한 잠재적인 파괴로 인해 이중특이적 항원 결합 분자(특히, 제2 항원 결합 모이어티가 활성화 T세포 항원에 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자)의 효능을 감소시킬 수도 있다.
이에 따라, 특히 구현예들에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 선천적 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효능기 기능을 나타낸다. 상기 일 구현예에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자)는 선천적 IgG1 Fc 도메인(또는 선천적 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자)과 비교하여, 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 및 더 바람직하게는 10% 미만 및 가장 바람직하게는 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화성 및/또는 선천적 IgG1 Fc 도메인(또는 선천적 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자)과 비교하여, 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더 바람직하게는 10% 미만, 및 가장 바람직하게는 5% 미만의 효능기 기능을 나타낸다. 일 구현예에서, 상기 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자)은 Fc 수용체에 실질적으로 결합하지 않고/거나 효능기 기능을 유도하지 않는다. 특정 구현예에서, 상기 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일 구현예에서, 상기 Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일 구현예에서, 상기 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정 구현예에서, 상기 Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa이다. 일 구현예에서, 상기 효능기 기능은 CDC, ADCC, ADCP 및 사이토카인 분비로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이다. 특정 구현예에서, 상기 효능기 기능은 ADCC이다. 일 구현예에서, 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교할 때, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대해 실질적으로 유사한 결합 친화도를 나타낸다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합은 상기 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 선천적 IgG1 Fc 도메인(또는 선천적 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자)의 결합 친화도의 약 70% 초과, 특히 약 80% 초과, 더욱 특히 약 90% 초과를 나타낼 때 달성된다.
특정 구현예들에서, 상기 Fc 도메인은 비가공된 Fc 도메인과 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효능기 기능을 갖도록 가공된다. 특정 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효능기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc 도메인의 2개 아단위 각각에서 존재한다. 일 구현예에서, 상기 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 감소시킨다. 일 구현예에서, 상기 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 감소시킨다. Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 감소시키는 하나 초과의 아미노산 돌연변이가 있는 구현예들에서, 상기 아미노산 돌연변이의 조합은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 적어도 10배, 적어도 20배, 또는 심지어 적어도 50배 감소시킬 수 있다. 일 구현예에서, 가공된 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자는 비가공된 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 분자와 비교하여, Fc 수용체에 대한 결합 친화성의 20% 미만, 특히 10% 미만, 더욱 특히 5% 미만을 나타낸다. 특정 구현예에서, 상기 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일부 구현예들에서, 상기 Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일부 구현예들에서, 상기 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정 구현예에서, 상기 Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더 구체적으로는 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로는 인간 FcγRIIIa이다. 바람직하게는, 상기 수용체들 각각에 대한 결합이 감소한다. 일부 구현예들에서, 보체 성분에 대한 결합 친화도, 구체적으로는 C1q에 대한 결합 친화도 또한 감소한다. 일 구현예에서, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화도는 감소하지 않는다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 상기 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도의 보존이 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자)이 비가공 형태의 Fc 도메인(또는 상기 비가공 형태의 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자)의 약 70%를 초과한 FcRn에 대한 결합 친화도를 나타낼 때 달성된다. 본 발명의 Fc 도메인 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자는 약 80% 초과 및 약 90%를 훨씬 더 초과하는 상기 친화성을 나타낼 수 있다. 특정 구현예들에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 비가공된 Fc 도메인과 비교하여 감소된 효능기 기능을 갖도록 가공된다. 감소된 효능기 기능은: 감소된 보체 의존성 세포독성(CDC), 감소된 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC), 감소된 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 감소된 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 감소된 면역 복합체 매개 항원 흡수, NK 세포에 감소된 결합, 대식세포에 감소된 결합, 단핵구에 감소된 결합, 다형핵 세포에 감소된 결합, 감소된 직접적인 신호전달 유도 세포사멸, 표적 결합된 항체의 감소된 가교결합, 감소된 수지상 세포 성숙, 또는 감소된 T세포 초회감작 중에서 하나 이상을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 일 구현예에서, 상기 감소된 효능기 기능은 감소된 CDC, 감소된 ADCC, 감소된 ADCP, 및 감소된 사이토카인 분비로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이다. 특정 구현예에서, 상기 감소된 효능기 기능은 ADCC이다. 일 구현예에서, 감소된 ADCC는 비가공 Fc 도메인(또는 비가공 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자)에 의해 유도된 ADCC의 20% 미만이다.
일 구현예에서, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효능기 기능을 감소시키는 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 일 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)로 구성된 군에서 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 더 특정한 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 L234, L235 및 P329(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)로 구성된 군에서 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A 및 L235A(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다. 상기 일 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 일 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함한다. 더 특정한 구현예에서, 상기 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)이다. 일 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환, 그리고 E233, L234, L235, N297 및 P331(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에서 선택되는 위치에서 추가 아미노산 치환을 포함한다. 더 특정한 구현예에서, 상기 추가 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 특정 구현예들에서, 상기 Fc 도메인은 위치 P329, L234 및 L235(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에서 아미노산 치환을 포함한다. 더 특정한 구현예들에서, 상기 Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(“P329G LALA”, “PGLALA” 또는 “LALAPG”)를 포함한다. 구체적으로, 특정 구현예들에서, Fc 도메인의 각 아단위는 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(카바트 EU 지수 넘버링)를 포함한다. 즉, 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위 각각에서 위치 234에서 류신 잔기가 알라닌 잔기로 대체되고(L234A), 위치 235에서 류신 잔기가 알라닌 잔기로 대체되고(L235A), 그리고 위치 329에서 프롤린 잔기가 글리신 잔기에 의해 대체된다(P329G)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
상기 일 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 아미노산 치환의 “P329G LALA” 조합은 본원에서 그 전체가 원용된 PCT 공보 제WO 2012/130831호에 기재된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체(뿐만 아니라 보체) 결합을 거의 완전히 중지시킨다. WO 2012/130831은 또한 상기 돌연변이체 Fc 도메인을 제조하는 방법, 및 이의 특성, 예컨대 Fc 수용체 결합 또는 효능기 기능을 결정하기 위한 방법을 기재한다.
IgG4 항체는 IgG1 항체와 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및 감소된 효능기 기능을 나타낸다. 따라서, 일부 구현예들에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 일 구현예에서, 상기 IgG4 Fc 도메인은 위치 S228에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다. Fc 수용체에 대한 결합 친화성 및/또는 효능기 기능을 추가로 감소시키기 위해, 일 구현예에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 L235에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 L235E(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다. 다른 구현예에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 P329G(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 IgG4 Fc 도메인은 위치 S228, L235 및 P329에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P, L235E 및 P329G(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다. 상기 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체 및 이의 Fcγ 수용체 결합 특성은 본원에서 그 전체가 원용된 PCT 공보 제WO 2012/130831호에 기재된다.
특정 구현예에서, 선천적 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효능기 기능을 나타내는 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 선택적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인, 또는 아미노산 치환 S228P, L235E 및 선택적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG4 Fc 도메인(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)이다.
특정 구현예들에서, 상기 Fc 도메인의 N 글리코실화가 제거되었다. 상기 일 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 위치 N297에서 아미노산 돌연변이, 특히 아스파라긴을 알라닌(N297A) 또는 아스파르트산(N297D)에 의해 대체하는 아미노산 치환(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)을 포함한다.
본원의 상기에서 및 PCT 공보 제WO 2012/130831호에 기재된 Fc 도메인에 더하여, 감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 효능기 기능을 갖는 Fc 도메인은 또한 Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중에서 하나 이상의 치환을 갖는 것들(미국 특허 제6,737,056호)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)을 포함한다. 상기 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 “DANA” Fc 돌연변이체를 포함하여 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(미국 특허 제7,332,581호).
돌연변이체 Fc 도메인은 당해 분야에서 일반적으로 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 이용한 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형에 의해 제조될 수 있다. 유전학적 방법은 부호화 DNA 서열의 부위 특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는, 예를 들어 염기서열분석에 의해 확인될 수 있다.
Fc 수용체에 대한 결합은, 예컨대 ELISA에 의해, 또는 표준 기기, 예컨대 비아코어(BIAcore) 기기(GE 헬스케어(Healthcare))를 이용한 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 쉽게 결정될 수 있고, Fc 수용체는, 예컨대 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 대안적으로, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인 또는 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자의 결합 친화성은 특정 Fc 수용체를 발현하는 것으로 공지진 세포주, 예컨대 FcγIIIa 수용체를 발현하는 인간 NK 세포를 이용하여 평가될 수 있다.
Fc 도메인 또는 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자의 효능기 기능은 당해 분야에서 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적인 예는 미국 특허 제5,500,362호; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) 및 Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); 미국 특허 제5,821,337호; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)에 기재된다. 대안적으로, 비방사능활성 분석 방법들이 이용될 수 있다(예를 들어, 유동 세포측정을 위한 ACTI™ 비방사능활성 세포독성 분석(셀테크놀로지(CellTechnology, Inc). 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96® 비방사능활성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨 소재)을 참조). 상기 분석에 유용한 효능기 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 자연살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심되는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 동물 모델, 예컨대 Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)에서 개시된 것과 같이 평가될 수 있다.
일부 구현예들에서, 보체 성분, 특히 C1q에 대한 Fc 도메인의 결합이 감소된다. 이에 따라, 상기 Fc 도메인이 감소된 효능기 기능을 갖도록 가공된 일부 구현예들에서, 상기 감소된 효능기 기능은 감소된 CDC를 포함한다. C1q 결합 분석은 Fc 도메인 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 C1q에 결합할 수 있고 따라서 CDC 활성을 갖는지를 결정하기 위해 실시될 수 있다. 예컨대, WO　2006/029879 및 WO　2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석이 실시될 수 있다(예를 들어, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); 및 Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)를 참조).
FcRn 결합 및 생체내 청소율/반감기 측정은 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 실시할 수 있다(예컨대, Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006); WO 2013/120929를 참조).
폴리뉴클레오티드
본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 부호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 단편은 항원 결합 단편이다.
본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 부호화하는 폴리뉴클레오티드는 전체 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 부호화하는 폴리뉴클레오티드로서 또는 공동 발현된 다수의(예컨대, 2개 이상)의 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 공동 발현된 폴리뉴클레오티드에 의해 부호화된 폴리펩티드는, 예컨대 이황화 결합 또는 다른 수단을 통해 결합하여 기능성 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 형성할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 경쇄 부분은 상기 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 중쇄를 포함하는 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 부호화될 수 있다. 공동 발현될 때, 상기 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 결합하여 상기 항체 또는 이중특이적 항원 결합 모이어티를 형성할 것이다. 다른 예에서, 2개의 Fc 도메인 아단위 중에서 하나 및 선택적으로 하나 이상의 Fab 분자(이의 일부)를 포함하는 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 부분은 2개의 Fc 도메인 아단위 중에서 다른 하나 및 선택적으로 Fab 분자(이의 일부)를 포함하는 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 부분으로부터 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 부호화될 수 있었다. 공동 발현될 때, 상기 Fc 도메인 아단위는 결합하여 상기 Fc 도메인을 형성할 것이다.
일부 구현예들에서, 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 본원에서 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 전체 항체 및 이중특이적 항원 결합 분자를 부호화한다. 다른 구현예들에서, 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자 내에 포함된 폴리펩티드를 부호화한다.
특정 구현예들에서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 구현예들에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 메신저 RNA(mRNA)의 형태에서 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는, 예를 들어 고체 상태 펩티드 합성(예컨대, 메리필드(Merrifield) 고체상 합성) 또는 재조합 생성에 의해 수득될 수 있다. 재조합 생성의 경우에, 예컨대 상기 기재된 바와 같은 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자(단편)를 부호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 분리되고 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 이용하여 쉽게 분리되고 염기서열분석될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당업자에게 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 적절한 전사/번역 제어 신호와 함께 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자(단편)의 부호화 서열을 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 상기 방법들은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. 예를 들어, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)를 참조한다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 부분일 수 있거나, 핵산 단편일 수 있다. 상기 발현 벡터는 상기 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자(단편)(즉, 부호화 영역)를 부호화하는 폴리뉴클레오티드(즉, 부호화 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소와 작동가능하게 결합되어 클로닝되는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 사용된 "부호화 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 이루어진 핵산의 부분이다. "종결 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지는 않지만, 존재할 경우, 부호화 영역의 일부인 것으로 고려될 수 있지만, 임의의 측접 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론, 5' 및 3' 비번역 영역 등은 부호화 영역의 일부가 아니다. 2개 이상의 부호화 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 작제물 내에, 예컨대 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 작제물 내에, 예컨대 별개의(상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 부호화 영역을 함유할 수 있거나, 2개 이상의 부호화 영역을 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 벡터는 단백질분해 절단을 통해 최종 단백질로 번역후 또는 공동번역으로 분리되는 하나 이상의 폴리펩티드를 부호화할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 본 발명의 항체, 또는 이중특이적 항원 결합 분자(단편), 또는 이의 변이체 또는 유도체를 부호화하는 폴리뉴클레오티드를 부호화하는 폴리뉴클레오티드에 융합되거나 또는 융합되지 않은 이종성 부호화 영역을 부호화할 수 있다. 이종성 부호화 영역은 특수한 요소 또는 모티프, 예컨대 분비 신호 펩티드 또는 이종성 기능적 도메인을 제한 없이 포함한다. 작동가능한 결합은 유전자 산물의 발현이 조절 서열(들)의 영향 또는 제어하에 놓이도록 하는 방식으로, 유전자 산물, 예컨대 폴리펩티드에 대한 부호화 영역이 하나 이상의 조절 서열과 연관될 때이다. 2개의 DNA 단편(예컨대, 폴리펩티드 부호화 영역 및 이와 결합된 프로모터)은 만약 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 산물을 부호화하는 mRNA의 전사를 유발하고, 만약 상기 2개의 DNA 단편 사이에 결합의 성질이 유전자 산물의 발현을 지시하는 발현 조절 서열의 능력을 간섭하지 않거나 또는 전사되는 DNA 주형의 능력을 간섭하지 않으면 "작동가능하게 결합"된다. 따라서, 프로모터 영역은 만약 상기 프로모터가 핵산의 전사를 달성할 수 있다면, 폴리펩티드를 부호화하는 핵산과 작동가능하게 결합될 것이다. 상기 프로모터는 소정의 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포 특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외에 다른 전사 제어 요소, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 억제인자, 그리고 전사 종결 신호가 세포 특이적 전사를 지시하기 위해 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 결합될 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 제어 영역이 본원에서 개시된다. 다양한 전사 제어 영역이 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 척추동물 세포에서 기능하는 전사 제어 영역, 예컨대 하지만 제한 없이, 시토메갈로바이러스로부터 프로모터와 인핸서 분절(예컨대, 인트론-A와 함께 극초기 프로모터), 유인원 바이러스 40(예컨대, 초기 프로모터), 및 레트로바이러스(예컨대, 예를 들어 라우스 육종 바이러스)를 제한 없이 포함한다. 다른 전사 제어 영역은 척추동물 유전자로부터 유래된 것들, 예컨대 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가의 적합한 전사 제어 영역은 조직 특이적 프로모터 및 인핸서뿐만 아니라 유도성 프로모터(예컨대, 프로모터 유도성 테트라사이클린)를 포함한다. 유사하게, 다양한 번역 제어 요소가 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 리보솜 결합 부위, 번역 개시와 종결 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유래된 요소(특히, 내부 리보솜 유입 부위 또는 IRES, CITE 서열로도 지칭됨)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 발현 카세트는 또한 다른 특징들, 예컨대 복제 기점 및/또는 염색체 통합 요소, 예컨대 레트로바이러스 긴 말단 반복(LTRs) 또는 아데노 연관된 바이러스(AAV) 반전 말단 반복(ITRs)을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 부호화된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 분비 또는 신호 펩티드를 부호화하는 추가 코딩 영역과 연관될 수 있다. 예를 들어, 만약 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 분비가 요망되면, 신호 서열을 부호화하는 DNA가 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 부호화하는 핵산의 상류에 배치될 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비되는 단백질은 거친 소포체를 가로질러 성장하는 단백질 사슬을 내보내기 시작되면 성숙한 단백질에서 절단되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비되는 폴리펩티드가 일반적으로 폴리펩티드의 N 말단에 융합된 신호 펩티드를 가지며, 이는 번역된 폴리펩티드로부터 절단되어 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙한" 형태를 생성한다는 것을 알고 있다. 특정 구현예들에서, 선천적 신호 펩티드, 예컨대 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드가 이용되거나, 자신과 작동가능하게 결합되는 폴리펩티드의 분비를 지시하는 능력을 유지하는 상기 서열의 기능적 유도체가 이용된다. 대안적으로, 이종 포유동물 신호 펩티드 또는 이의 기능적 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환될 수 있다.
추후 정제를 가능하게 하거나(예컨대, 히스티딘 태그) 또는 상기 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 표지화를 보조하는 데 이용될 수 있는 짧은 단백질 서열을 부호화하는 DNA가 상기 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자(단편) 부호화 폴리뉴클레오티드 내에 또는 이의 단부에서 포함될 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 폴리뉴클레오타이드 및 벡터는 각각 폴리뉴클레오타이드 및 벡터와 관련하여 본원에 기재된 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 통합할 수 있다. 상기 일 구현예에서, 숙주 세포는 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자(이의 부분)를 부호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함한다(예컨대, 이로써 형질전환되거나 또는 형질감염되었다). 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 생성하도록 가공될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 지칭한다. 항체 또느 이중특이적 항원 결합 분자를 복제하고 이들의 발현을 뒷받침하는 데 적합한 숙주 세포는 당해 분야에서 일반적으로 공지되어 있다. 상기 세포는 특정 발현 벡터로 타당하게 형질감염되거나 또는 형질도입될 수 있고, 대량의 벡터 함유 세포는 대규모 발효기에 분주되어 임상적 적용을 위한 충분한 양의 항체 및 이중특이적 항원 결합 분자를 수득하기 위해 성장될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 미생물, 예컨대 대장균(E. coli), 또는 다양한 진핵 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 세포 (CHO), 곤충 세포, 또는 기타 유사한 것을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 박테리아에서, 특히 글리코실화가 필요하지 않을 때, 생성될 수 있다. 발현 후, 폴리펩티드는 가용성 분획물에서 박테리아 세포 덩어리로부터 분리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다. 원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 “인간화”되어, 부분적으로 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드의 생성을 유발하는 균류 및 효모 균주를 비롯한, 실모양 균류 또는 효모가 폴리펩티드 부호화 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004) 및 Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)를 참조한다. (글리코실화된) 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 생물체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 이용될 수 있는 다양한 바쿨로바이러스 계통이 확인되었다. 식물 세포 배양물 또한 숙주로서 활용될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제5,959,177호, 6,040,498호, 6,420,548호, 7,125,978호 및 6,417,429호(형질전환 식물에서 항체를 생성하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)TM 기술을 기재함). 척추동물 세포를 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장시키는데 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(예컨대, Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)에 기재된 바와 같은 293 또는 293T세포), 아기 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예컨대, Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)에 기재된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 경부 암종 세포(HELA), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 생쥐 유방 종양 세포(MMT 060562), TRI 세포(예컨대, Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), MRC 5 세포, 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 dhfr- CHO 세포를 포함하여 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0, P3X63 및 Sp2/0을 포함한다. 단백질 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예컨대 Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)을 참조한다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예컨대 몇몇 예를 들면, 포유류 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포를 포함하지만, 또한 유전자도입 동물, 형질전환 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유류 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 림프구양 세포(예컨대, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
상기 시스템에서 외래 유전자를 발현하는 표준 기술은 당해 분야에서 공지된다. 항원 결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄 중에서 어느 한 가지를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포는 발현된 산물이 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 갖는 항체이도록, 상기 항체 사슬 중에서 다른 것을 또한 발현하도록 가공될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 생성하는 방법이 제공되는데, 여기서 상기 방법은 본원에 제시된 바와 같은 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에, 상기 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 부호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 선택적으로 상기 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자(또는 항체)의 성분은 유전적으로 서로 융합될 수 있다. 이중특이적 항원 결합 분자는 이의 성분들이 서로에 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 간접적으로 융합되도록 설계될 수 있다. 링커의 조성과 길이는 당해 분야에서 널리 공지된 방법에 따라서 결정될 수 있고 효능에 대해 검사될 수 있다. 이중특이적 항원 결합 분자의 상이한 성분들 사이의 링커 서열의 예가 본원에 제공된다. 원하는 경우에, 융합의 개별 성분들을 분리하기 위한 절단 부위를 통합하기 위해 추가 서열, 예를 들어 엔도펩티다아제 인식 서열이 또한 포함될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 일반적으로 항원 결정기에 결합할 수 있는 적어도 하나의 항체 가변 영역을 포함한다. 가변 영역은 천연 또는 비천연 항체 및 이의 단편의 일부를 형성하고 이로부터 유래될 수 있다. 다중클론 항체 및 단일클론 항체를 생성하는 방법은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다(예컨대, Harlow and Lane, "Antibodies, a lab manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988을 참조). 비천연 발생 항체는 고체상-펩티드 합성을 사용하여 구축할 수 있거나, 재조합으로 생성할 수 있거나(예컨대, 미국 특허 제4,186,567호에 기재된 바와 같음), 예를 들어 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합 라이브러리를 선별검사함으로써 수득될 수 있다(예컨대, McCafferty의 미국 특허 No. 5,969,108 참조).
항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역의 임의의 동물 종은 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자에 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 비제한적인 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역은 뮤린, 영장류 또는 인간 기원일 수 있다. 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자가 인간 사용을 위한 것이라면, 항체의 불변 영역이 인간 유래인 키메라 형태의 항체가 사용될 수 있다. 상기 항체의 인간화 또는 완전한 인간 형태는 또한 당업계에 일반적으로 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다(예컨대, 미국 특허 제5,565,332호 to Winter를 참조). 인간화는 (a) 비인간(예컨대, 공여자 항체) CDR을 중요한 프레임워크 잔기(예컨대, 우수한 항원 결합 친화도 또는 항체 기능을 유지하는 데 중요한 요소)를 보유하거나 보유하지 않는 인간(예컨대, 수용체 항체) 프레임워크 및 불변 영역에 이식하는 단계, (b) 비인간 특이성 결정 영역(SDR 또는 α-CDR; 항체-항원 상호작용에 중요한 잔기)만을 인간 프레임워크 및 불변 영역에 이식하는 단계, 또는 (c) 전체 비인간 가변 도메인을 이식하지만 표면 잔기를 대체하여 인간과 유사한 섹션으로 "은폐"하는 단계를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 인간화 항체 및 이의 제조 방법은, 예컨대 Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에서 검토되고, 예컨대 Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 제5,821,337호, 7,527,791호, 6,982,321호, 및 7,087,409호; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (특이성 결정 영역(SDR)의 이식을 기재함); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (“재표면처리”를 기재함); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (“FR 셔플링”을 기재함); 및 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 “유도된 선택” 접근법을 기재함)에 추가로 기재되어 있다. 인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역에는 하기가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다: "최적화" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역(예컨대, Sims et al. J. Immunol. J. Immunol. 151:2296 (1993)을 참조); 특정 하위군의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역(예컨대, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)을 참조); 인간 성숙(체세포적으로 돌연변이화된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역(예컨대, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)을 참조); 및 선별검사 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역(예컨대, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)을 참조).
인간 항체는 당해 분야에서 공지된 다양한 기술을 이용하여 생성할 수 있다. 인간 항체는 van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)에서 전반적으로 설명된다. 항원 공격접종(challenge)에 반응하여, 원형 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 가진 원형 항체를 만들기 위하여 변형된 형질전환 동물에 면역원을 주사함으로써, 인간 항체를 만들 수 있다. 상기 동물은 전형적으로 내인성 면역글로불린 자리를 대체하거나, 염색체외로 존재하거나 또는 동물의 염색체 내로 무작위로 통합되는 인간 면역글로불린 자리 중에서 전부 또는 일부를 함유한다. 상기 형질전환 마우스에서 상기 내인성 면역글로불린 자리는 일반적으로 비활성화 되어 있다. 형질전환 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)를 참조한다. 또한, 예컨대 제노마우스(XENOMOUSE)TM 기술을 기재하는 미국 특허 제 6,075,181호 및 6,150,584호; 휴맵(HuMab)® 기술을 기재하는 미국 특허 제5,770,429호; K-M 마우스(MOUSE)® 기술을 기재하는 미국 특허 제7,041,870호, 및 벨로치마우스(VelociMouse) 기술을 기재하는 미국 특허출원공보 제US2007/0061900호를 참조한다. 상기 동물에 의해 생성되는 원형 항체의 인간 가변 영역은, 예컨대 상이한 인간 불변 영역과 조합됨으로써 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마 기반의 방법에 의해 만들어질 수 있다. 인간 단일클론 항체의 생성을 위한 인간 골수종 및 생쥐-인간 헤테로골수종 세포주가 기재되었다. (예컨대, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)를 참조.) 인간 B세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 또한 Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 제7,189,826호(하이브리도마 세포주로부터 단일클론 인간 IgM 항체의 생성을 기재함) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)(인간-인간 하이브리도마를 기재함)에서 설명된 바를 포함한다. 인간 하이브리도마 기법(트리오마 기술) 역시 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에서 설명된다.
인간 항체는 또한 본원에 기재된 바와 같이 인간 항체 라이브러리로부터의 분리에 의해 생성될 수 있다.
본 발명에 유용한 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 선별검사함으로써 분리할 수 있다. 조합 라이브러리를 선별 검사하는 방법은, 예컨대 Lerner et al. in Nature Reviews 16:498-508 (2016)에 검토되어 있다. 예를 들어, 파지 전시 라이브러리를 생성하고 원하는 결합 특성을 보유하는 항체에 대해 상기 라이브러리를 선별검사하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에서 공지되어 있다. 상기 방법들은, 예컨대 Frenzel et al. in mAbs 8:1177-1194 (2016); Bazan et al. in Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012) 및 Zhao et al. in Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016) 뿐만 아니라 Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) 및 in Marks and Bradbury in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)에서 검토하였다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 별개로 클로닝되고, 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되며, 이는 이후 Winter et al. in Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994)에 기재된 바대로 항원 결합 파지에 대해 선별 검사될 수 있다. 파지는 전형적으로, 단일 사슬 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 전시한다. 면역화된 공급원으로부터 라이브러리는 하이브리도마를 구축하는 요건 없이 면역원에 대한 높은 친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 미경험 레퍼토리는 Griffiths et al. in EMBO Journal 12: 725-734 (1993)에 의해 기재된 바대로 임의의 면역화 없이 넓은 범위의 비자가 및 또한 자가 항원에 항체의 단일 공급원을 제공하도록(예컨대, 인간으로부터) 클로닝될 수 있다. 마침내, 미경험 라이브러리는 줄기 세포로부터 비재배열된 V 유전자 절편을 클로닝하고, Hoogenboom and Winter in Journal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992)에 기재된 바대로 고도로 가변인 CDR3 영역을 부호화하고 시험관내 재배열을 달성하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써 합성으로 제조될 수도 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하는 특허 공보는, 예를 들어: 미국 특허 제5,750,373호; 7,985,840호; 7,785,903호 및 8,679,490호 뿐만 아니라 미국 특허 공보 제2005/0079574호, 2007/0117126호, 2007/0237764호 및 2007/0292936호. 원하는 활성 또는 활성을 갖는 항체에 대한 조합 라이브러리를 선별 검사하기위한 당업계에 공지된 방법의 추가적인 예는 박테리아, 포유류 세포, 곤충 세포 또는 효모 세포에 대한 항체 디스플레이 및 선택 방법뿐만 아니라 리보솜 및 mRNA 디스플레이를 포함한다. 효모 표면 발현을 위한 방법들은, 예컨대 Scholler et al. in Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012) and in Cherf et al. in Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015) 뿐만 아니라 Zhao et al. in Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012)에서 검토되어 있다. 리보솜 발현을 위한 방법들은, 예컨대 He et al. in Nucleic Acids Research 25:5132--5134 (1997) 및 Hanes et al. in PNAS 94:4937--4942 (1997)에 설명되어 있다.
본원에서 설명된 바와 같이 제조된 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 공지된 기술 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기이동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제될 수 있다. 특정 단백질을 정제하는 데 이용되는 실제 조건은 순전하, 소수성, 친수성 등과 같은 인자에 부분적으로 의존할 것이고, 당업자에게 명백할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제의 경우, 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원이 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스가 사용될 수 있다. 순차 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 본질적으로 실시예에 기재된 바와 같이 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 분리할 수 있다. 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 순도는 겔 전기이동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함한 임의의 다양한 일반적으로 공지된 분석법에 의해 결정될 수 있다.
분석
본원에서 제공된 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 당해 분야에서 공지된 다양한 분석에 의해, 이의 물리적/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인, 선별검사 또는 특성화할 수 있다.
친화성 분석
Fc 수용체 또는 표적 항원에 대한 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 결합(친화성)은 표준 기계장치, 예컨대 비아코어(BIAcore) 기기(GE 헬스케어)를 이용하여, 예를 들어 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 결정될 수 있고, 수용체 또는 표적 단백질은, 예컨대 재조합 발현에 의해 수득할 수 있다. 대안적으로, 상이한 수용체 또는 표적 항원에 대한 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 결합은 예를 들어 유세포분석법(FACS)에 의해, 특정 수용체 또는 표적 항원을 발현하는 세포주를 이용하여 평가될 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 특정한 예시적이고 모범적인 구현예는 하기에서 설명된다.
일 구현예에 따르면, KD는 비아코어(BIACORE)® T100 기기(GE 헬스케어)를 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명법에 의해 측정된다.
Fc 부분과 Fc 수용체 사이의 상호작용을 분석하기 위해, His 태그가 붙은 재조합 Fc 수용체는 CM5 칩에 고정된 항 Penta His 항체(키아겐)에 의해 포획되고 이중특이적 구조는 분석물로서 사용된다. 간략하게는, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, GE 헬스케어)은 공급업체의 사용설명서에 따라 N-에틸-N’-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 이용하여 활성화시킨다. 항 펜타-히스(Penta-His) Fc 항체는 5 μl/분의 유속으로 주사 전에 10 mM 아세트산나트륨, pH 5.0을 사용하여 40 μg/ml로 희석시켜 커플링된 단백질의 대략 6500 반응 단위(RU)을 달성하였다. 리간드의 주입 이후에, 반응하지 않은 기를 차단하기 위해 1 M 에탄올아민이 주입된다. 그 후, Fc 수용체는 4 또는 10 nM에서 60초 동안 포획한다. 동역학 측정을 위해, 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 4배 연속 희석액(500 nM 내지 4000 nM의 범위)을 HBS-EP(GE 헬스케어, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05%, 계면활성제 P20, pH 7.4)를 25°C에서 120초 동안 30 μl/분의 유속으로 주입한다.
표적 항원에 대한 친화성을 결정하기 위해, 항 펜타-히스 항체에 대해 기재된 바와 같이 활성화된 CM5 센서 칩 표면에 고정된 항인간 Fab 특이적 항체(GE 헬스케어)에 의해 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자가 포획된다. 결합된 단백질의 최종 양은 약 12000 Ru이다. 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 300 nM에서 90초 동안 포획된다. 표적 항원은 30 μl/min의 유속으로 250 내지 1000 nM의 농도 범위에서 180초 동안 유동 셀을 통과한다. 해리는 180초 동안 모니터링된다.
참조 유동 셀에서 수득한 반응을 차감함으로써 벌크 굴절률 차이가 보정되었다. 정상 상태 응답은 랑뮤르 결합 등온선의 비선형 곡선 맞춤에 의해 해리 상수 KD를 유도하는 데 사용하였다. 결합률(k온) 및 해리율(k오프)은 결합 및 해리 센서그램을 동시에 적합시킴으로써 단순한 1 대 1 랭뮤어 결합 모델(비아코어® 평가 소프트웨어 버전 1.1)을 이용하여 계산한다. 평형 해리 상수(KD)는 비율 koff/kon로 산출된다. 예컨대, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)을 참조한다.
활성 분석
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자(또는 항체)의 생물학적 활성은 실시예에서 설명된 바와 같은 다양한 분석에 의해 측정될 수 있다. 생물학적 활성은, 예를 들어 T세포의 증식의 유도, T세포에서 신호전달의 유도, T세포에서 활성화 마커의 발현의 유도, T세포에 의한 사이토킨 분비의 유도, 표적 세포 예컨대 종양 세포의 용해의 유도, 및 종양 퇴화의 유도 및/또는 생존의 향상을 포함할 수 있다.
조성물, 제형 및 투여 경로
추가의 양태에서, 본 발명은, 예컨대 임의의 하기 치료 방법에서 사용을 위한 본원에서 제공된 임의의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 약학적 조성물은 본원에 제공된 임의의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 다른 구현예에서, 약학적 조성물은, 예컨대 하기에 기재된 바와 같이 본원에서 제공된 임의의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자 및 적어도 한 가지의 추가 치료제를 포함한다.
생체내 투여에 적합한 형태에서 본 발명의 항체를 생성하는 방법이 추가로 제공되고, 상기 방법은 (a) 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 수득하는 단계, 및 (b) 상기 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체로 조제하는 단계를 포함하고, 여기서 항체의 제제는 생체내 투여용으로 조제된다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체에 용해되거나 분산된 치료적 유효량의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다. 관용구 "약학적 또는 약학적으로 허용가능한"은 일반적으로 이용된 용량 및 농도에서 수용체에게 비독성인, 즉 적절하면 동물, 예컨대 예를 들어, 인간에게 투여될 때 불리한 반응, 알레르기 반응 또는 다른 부반응을 발생시키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 하나의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자 및 선택적으로 추가 활성 성분을 함유하는 약학적 조성물의 제조는 본원에 원용된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990에 의해 예시된 바와 같이, 본 발명에 비추어 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 또한, 동물(예컨대, 인간) 투여의 경우에, 제제는 FDA 생물 표준 사무국 또는 다른 국가에서 해당 정부 당국에 의해 요구되는 바와 같은 무균, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 기준에 부합해야 하는 것으로 이해될 것이다. 바람직한 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액이다. 본원에서 사용된, "약학적으로 허용가능한 담체"는 당업자에게 공지된 바와 같은, 임의의 모든 용매, 완충액, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제(예컨대, 항세균제, 항진균제), 등장화제, 흡수 지연 작용제, 염, 보존제, 항산화제, 단백질, 약물, 약물 안정제, 중합체, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 염료, 이들과 유사한 물질 및 이들의 조합을 포함한다(예를 들어, 본원에서 원용된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329를 참조). 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 양립할 수 없는 한을 제외하고, 치료적 또는 약학적 조성물에서의 사용이 고려된다.
본 발명의 면역접합체(및 임의의 추가 치료제)는 비경구, 폐내 및 비내를 비롯한 임의의 적절한 수단에 의해, 및 국소 치료를 위해 원하는 경우에, 병소내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 투약은 임의의 적합한 경로에 의해, 예컨대, 부분적으로 투여가 단기 또는 장기인지에 따라서, 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해서 실시될 수 있다.
비경구 조성물은 주사에 의한 투여를 위해 설계된 것들, 피하, 피내, 병변내, 정맥내, 동맥내 근육내, 척추강내 또는 복강내 주사를 포함한다. 주사를 위해, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 수용액, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충액, 예컨대 행크스 용액, 링거 용액 또는 생리식염수 완충액으로 제형화될 수 있다. 용액은 조제 작용제, 예컨대 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 사용 전, 적합한 운반체, 예컨대 무균 발열원 없는 물로 구성을 위한 분말 형태일 수 있다. 멸균 주사 용액은 필요에 따라 하기에 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 혼입함으로써 제조된다. 멸균화는, 예컨대 멸균 여과막을 통한 여과로써 용이하게 달성될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 살균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및/또는 다른 성분을 함유하는 무균 운반체 내로 통합함으로써 제조된다. 무균 주사용액, 현탁액 또는 유제의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 또는 동결 건조 기술인데, 이는 이전에 무균 여과된 액체 배지로부터 활성 성분에 더하여 임의의 추가적인 원하는 성분으로 이루어진 분말을 수득한다. 액체 매질은 필요하면 적절하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 주사 전에 충분한 식염수 또는 글루코오스를 이용해 등장성이 되어야 한다. 조성물은 제조 및 보관의 조건 하에 안정되어야 하고, 미생물, 예컨대 세균 및 균류의 오염 작용에 대항하여 보존해야 한다. 내독소 오염은 안전한 수준에서, 예를 들어 0.5 ng/mg 단백질 미만으로 최소한으로 유지되어야 함을 인지할 것이다. 적합한 약학적으로 허용가능한 담체는 하기를 포함하지만 이들에 제한되지는 않는다: 완충액, 예컨대 인산염, 구연산염, 및 다른 유기 산; 아스코르빈산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 이하의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물(예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 화합물, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 덱스트란, 또는 기타 유사한 것을 함유할 수 있다. 선택적으로, 상기 현탁액은 또한 화합물의 용해도를 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하는 데 적합한 안정제 또는 작용제를 함유할 수 있다. 추가적으로, 활성 화합물의 현탁액은 적합한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 운반체는 지방유, 예컨대 호마유 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 클리트 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜을 포함한다.
활성 성분은 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 각각 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합, 예를 들어 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 준비된 마이크로캡슐 또는 마크로에멀젼 (macroemulsions)안에 포집될 수 있다. 상기 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences (8th Ed. Mack Printing Company, 1990)에 개시되어 있다. 서방형 제재가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예로는 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예컨대 필름 또는 미세캡슐의 형태이다. 특정한 구현예들에서, 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 이들 조성물에서 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이들의 조합의 사용에 의해 달성될 수 있다.
전술된 조성물에 더하여, 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 또한 저장소 제조물로서 조제될 수 있다. 상기 지속성 제제는 이식(예를 들어, 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 적합한 중합성 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용되는 오일에서 유제로서) 또는 이온 교환 수지로, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들어, 난용성 염으로서 조제될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학적 조성물은 전통적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결 건조 과정에 의하여 제조될 수 있다. 약학적 조성물은 이들 단백질의 약학적으로 이용될 수 있는 제조물로의 처리를 가능하게 하는 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 이용하여 통상적인 방식으로 조제될 수 있다. 적절한 제형은 선택한 투여 경로에 따라 다르다.
항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 유리 산 또는 염기, 중성 또는 염 형태에서 조성물로 조제될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 유리 산 또는 염기의 생물학적 활성을 실질적으로 유지하는 염이다. 이들은 산 부가염, 예컨대 단백질성 조성물의 자유 아미노 기로 형성된 것들, 또는 무기 산 예컨대 예를 들면, 염화수소산 또는 인산, 또는 유기 산 예컨대 아세트산, 옥살산, 주석산 또는 만델산으로 형성된 것들을 포함한다. 자유 카르복실 기로 형성된 염은 또한, 무기 염기 예컨대 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철; 또는 유기 염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인으로부터 유래될 수 있다. 약학적 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자성 용매에서 더욱 가용성인 경향이 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에서 제공된 임의의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 치료 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는, 예를 들어 암의 치료에서 면역치료제로서 사용될 수 있다.
치료 방법에서 사용을 위해, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 모범 의료행위 지침과 일치하는 방식으로 조제되고, 투약되고, 투여될 것이다. 상기 문맥에서 고려되는 인자들은 치료될 특정 질환, 치료되는 특정 포유류, 개별 환자의 임상적 상태, 질환의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 전문인에게 공지된 다른 인자들을 포함한다.
일 양태에서, 약제로서 사용을 위한 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 추가의 양태들에서, 질병을 치료하는 데 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 특정 구현예들에서, 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 일 구현예에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에서 질병의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 구현예들에서, 본 발명은 질병을 앓는 개체를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고, 상기 방법은 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 치료적 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예들에서, 치료될 질병은 증식성 장애이다. 특정 구현예에서, 상기 질병은 암이다. 특정 구현예들에서, 상기 방법은 적어도 하나의 추가 치료제, 예컨대 치료될 질병이 암이라면 항암제의 치료적 유효량을 상기 개체에 투여하는 단계를 또한 포함한다. 추가의 구현예들에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 데 사용하기 위한 본원에 기재된 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 구현예들에서, 본 발명은 표적 세포의 용해를 유도하기 위한 항체의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에서 사용하기 위한 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 상기 구현예들 중 임의의 것에 따른 “개체”는 포유동물, 바람직하게는 인간이다. 특정 구현예들에서, 치료될 질병은 자가면역 질환, 특히 전신성 홍반성 루푸스 및/또는 류마티스 관절염이다. 자가 반응성 형질 세포에 의한 병원성 자가항체의 생성은 자가면역 질환의 특징이다. 따라서, GPRC5D는 자가면역 질환에서 자가 반응성 형질 세포를 표적화하는 데 사용할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 약제의 제조 또는 준비에서 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 사용을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 약제는 치료가 필요한 개체에서 질병을 치료하기 위한 것이다. 추가의 구현예에서, 상기 약제는 그 약제의 치료 유효량을 질병을 가진 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 질병의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예들에서, 치료될 질병은 증식성 장애이다. 특정 구현예에서, 상기 질병은 암이다. 일 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 추가 치료제, 예컨대 치료될 질병이 암이라면 항암제의 치료적 유효량을 상기 개체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 약제는 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하기 위한 것이다. 다른 추가의 구현예에서, 상기 약제는 표적 세포의 용해를 유도하기 위한 약제의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에서의 사용을 위한 것이다. 상기 구현예들 중 임의의 것에 따른 "개체"는 포유동물이고, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 질병을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 질병을 갖는 개체에게 치료적 유효량의 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 약학적으로 허용가능한 형태의 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 조성물이 상기 개체에게 투여된다. 특정 구현예들에서, 치료될 질병은 증식성 장애이다. 특정 구현예에서, 상기 질병은 암이다. 특정 구현예들에서, 상기 방법은 적어도 하나의 추가 치료제, 예컨대 치료될 질병이 암이라면 항암제의 치료적 유효량을 상기 개체에 투여하는 단계를 또한 포함한다. 상기 구현예들 중 임의의 것에 따른 "개체"는 포유동물이고, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하기 위한 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 T세포, 특히 세포독성 T세포의 존재하에서, 표적 세포를 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 추가의 양태에서, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하기 위한 방법이 제공된다. 상기 일 구현예에서, 상기 방법은 표적 세포의 용해를 유도하기 위해 유효량의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, “개체”는 인간이다.
특정 구현예들에서, 치료될 질병은 증식성 장애, 특히 암이다. 암의 비제한적 예는 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 결장직장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평상피 세포 암종, 골암, 그리고 신장암을 포함한다. 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 이용하여 치료될 수 있는 다른 세포 증식 장애는 복부, 뼈, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비 샘 (부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계 (중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부 영역, 그리고 비뇨생식기계에서 위치된 신생물을 포함하지만 이들에 제한되지는 않는다. 전암성 상태 또는 병변 및 암 전이 또한 포함된다. 특정 구현예들에서, 상기 암은 신장암, 방광암, 피부암, 폐암, 결장직장암, 유방암, 뇌암, 두경부암 및 전립선암으로 구성된 군에서 선택된다. 일 구현예에서, 상기 암은 전립선암이다. 당업자라면 많은 경우에 있어서 상기 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자가 치유를 제공할 수는 없지만 단지 부분적 이점만을 제공할 수 있음을 쉽게 인지한다. 일부 구현예들에서, 일부 이점을 갖는 생리학적 변화는 또한 치료적으로 유익한 것으로 간주된다. 따라서, 일부 구현예들에서, 생리학적 변화를 제공하는 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 용량은 "유효량" 또는 "치료적 유효량"으로 간주한다. 치료가 필요한 대상체, 환자, 또는 개체는 전형적으로 포유동물, 더 구체적으로는 인간이다.
일부 구현예들에서, 유효량의 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자가 세포에 투여된다. 다른 구현예들에서, 치료적 유효량의 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 질병의 치료를 위해 개체에게 투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가 치료제와 병용될 때)의 적절한 용량은 치료되는 질환의 유형, 투여 경로, 환자의 체중, 특이적 분자, 질환의 중증도와 과정, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는 지의 여부, 이전 또는 동시 치료적 개입, 환자의 임상 병력 및 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의존할 것이다. 어떤 상황에서든, 투여에 대한 책임이 있는 의사가 조성물에서 활성 성분(들)의 농도 및 개별 개체에 대한 적합한 용량(들)을 결정할 것이다. 다양한 시점에 걸쳐 단일 또는 다중 투여, 볼루스(bolus) 투여, 및 펄스 주입을 포함하는 다양한 투여 일정이 고려된다.
상기 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 한 번에 또는 일련의 치료일정에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 질병의 유형과 중증도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg(예컨대, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체 또는 이중특이적 항체가, 예를 들어 하나 이상의 개별 투여에 의해서 또는 연속 주입에 의해서 환자에게 투여하기 위한 최초 후보 투여량이 될 수 있다. 하나의 전형적인 일일 투여량은 상기 언급한 요인들에 따라서 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 질병 징후에 따라서, 치료는 일반적으로 질병 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속된다. 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 한 가지 예시적인 용량은 약 0.005 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위 안에 있을 것이다. 다른 비제한적 예시에서, 용량은 또한 투여마다 약 1 microgram/체중 kg, 약 5 microgram/체중 kg, 약 10 microgram/체중 kg, 약 50 microgram/체중 kg, 약 100 microgram/체중 kg, 약 200 microgram/체중 kg, 약 350 microgram/체중 kg, 약 500 microgram/체중 kg, 약 1 milligram/체중 kg, 약 5 milligram/체중 kg, 약 10 milligram/체중 kg, 약 50 milligram/체중 kg, 약 100 milligram/체중 kg, 약 200 milligram/체중 kg, 약 350 milligram/체중 kg, 약 500 milligram/체중 kg으로부터 약 1000 mg/체중 kg 이상, 그리고 그 안에서 도출가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에서 열거된 숫자로부터 도출가능한 범위의 비제한적 예시에서, 약 5 mg/체중 kg 내지 약 100 mg/체중 kg, 약 5 마이크로그램/체중 kg 내지 약 500 mg/체중 kg, 기타 등등의 범위가 전술된 숫자에 근거하여 투여될 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주마다 또는 3주마다 투여될 수 있다(예컨대, 따라서 환자가 약 2회 내지 약 20회, 또는 예컨대 약 6회 용량의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 투여받는다). 초기 더 높은 부하 용량, 그 이후에 1회 또는 그 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 하지만, 다른 투여량 요법이 유용할 수 있다. 상기 치료의 진행은 통상적인 기술 및 분석법에 의해 용이하게 모니터링된다.
본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 일반적으로, 의도된 목적을 달성하는 데 효과적인 양으로 이용될 것이다. 질병 상태를 치료하거나 예방하는 데 이용을 위해, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자, 또는 이의 약학적 조성물은 치료적 유효량으로 투여되거나 또는 적용된다. 치료적 유효량의 결정은 특히 본원에서 제공된 상술된 개시에 비추어, 당업자의 능력 범위 안에 있다.
전신 투여의 경우, 치료적 유효량은 시험관내 분석, 예컨대 세포 배양 분석으로부터 초기에 추정될 수 있다. 용량은 이후, 세포 배양액에서 결정된 대로의 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 상기 정보는 인간에서 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정하는 데 이용될 수 있다.
초기 용량은 또한, 당해 분야에서 널리 공지된 기술을 이용하여 생체내 데이터, 예를 들면, 동물 모델로부터 추정될 수 있다. 당업자는 동물 데이터에 기초하여 인간에 대한 투여를 용이하게 최적화할 수 있다.
복용량 및 간격은 치료 효과를 유지하는 데 충분한, 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. 주사에 의한 투여에 통상적인 환자 투여량은 약 0.1 내지 50 mg/kg/일, 전형적으로 약 0.5 내지 1 mg/kg/일의 범위이다. 치료적으로 효과적인 혈장 수준은 매일 다수 용량을 투여함으로써 달성될 수 있다. 혈장에서 수준은, 예를 들어 HPLC에 의해 측정할 수 있다.
국소 투여 또는 선택적 흡수의 경우, 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 효과적인 국소 농도는 혈장 농도와 관련이 없을 수도 있다. 당업자는 과도한 실험 없이 치료적으로 효과적인 국부 용량을 최적화할 수 있을 것이다.
본원에 기재된 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 치료적 유효량은 일반적으로 실질적인 독성을 유발하지 않으면서 치료 이점을 제공할 것이다. 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 독성 및 치료 효능은 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 세포 배양액 분석 및 동물 연구가 LD50(개체군의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(개체군의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하는 데 이용될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이에 용량 비율은 치료 지수인데, 이것은 비율 LD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자가 바람직하다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양액 분석 및 동물 연구로부터 수득한 데이터는 인간에서 이용에 적합한 용량의 범위를 공식화하는 데 이용될 수 있다. 용량은 바람직하게는, 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 안에 있다. 용량은 다양한 인자, 예컨대 이용된 제형, 활용된 투여 경로, 개체의 상태 등에 따라서 상기 범위 내에서 가변될 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 용량은 환자의 상태에 비추어 개별 의사에 의해 선택될 수 있다(예컨대, Fingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1, 본원에서 그 전체가 원용됨).
본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자로 치료되는 환자에 대한 주치의는 독성, 장기 기능장애 등으로 인해 투여를 언제 및 어떻게 종결하거나, 중단하거나, 조정할 지를 알고 있을 것이다. 반대로, 주치의는 또한, 만약 임상적 반응이 적절하지 않으면 (독성 배제) 치료를 더욱 높은 수준으로 조정하는 것을 알고 있을 것이다. 관심되는 장애의 관리에서 투여된 용량의 크기는 치료되는 질환의 중증도, 투여 경로 등에 따라서 가변될 것이다. 질환의 중증도는, 예를 들어 부분적으로, 표준 예후적 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 또한, 용량 및 아마도 투약 빈도 또한 개별 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라서 가변될 것이다.
기타 제제들 및 요법
본 발명의 항체 및 이중특이적 항원 결합 분자는 치료 동안 한 가지 이상의 다른 작용제와 병용으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 추가 치료제와 공동투여될 수 있다. 용어 “치료제”는 상기 치료가 필요한 개체에서 증상 또는 질환을 치료하기 위해 투여되는 임의의 작용제를 수반한다. 상기 추가 치료제는 치료되는 특정 징후에 적합한 임의의 활성 성분, 바람직하게는 서로에 부정적으로 영향을 주지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 포함할 수 있다. 특정 구현예들에서, 추가 치료제는 면역조정제, 정균제, 세포 부착의 저해제, 세포독성제, 세포 아폽토시스의 활성인자, 또는 아폽토시스성 유도인자에 대한 세포의 민감도를 증가시키는 작용제이다. 특정 구현예에서, 추가 치료제는 다른 항암제, 예를 들면 미소관 교란물질, 대사길항물질, 국소이성화효소 저해제, DNA 삽입제, 알킬화제, 호르몬 요법, 키나아제 저해제, 수용체 길항제, 종양 세포 아폽토시스의 활성인자, 또는 항신생혈관제이다.
상기 다른 작용제들은 의도한 목적에 효과적인 양으로 적절히 조합되어 존재한다. 상기 다른 작용제들의 유효량은 약학적 조성물 내에 존재하는 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 의존한다. 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 일반적으로 본원에 기재된 것과 같은 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기술된 것과 같은 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 경험적으로/임상적으로 적절하다고 결정된 투여량과 경로로 사용된다.
전술된 병용 요법은 병용 투여(여기서 2가지 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 조성물 내에 포함됨) 및 별개 투여를 포괄하고, 상기 사례에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자의 투여는 추가 치료제 및/또는 어쥬번트의 투여에 앞서, 투여와 동시에 및/또는 투여 이후에 발생할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자는 또한 방사선 요법과 조합하여 사용될 수 있다.
제조 물품
본 발명의 다른 양태에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에서 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 상기 용기 위의 또는 상기 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 용기는 단독으로, 또는 질환을 치료하고, 예방하고 및/또는 진단하는 데 효과적인 다른 조성물과 조합으로 조성물을 보유하고, 그리고 무균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백, 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물에서 적어도 한 가지 활성제는 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 질환을 치료하는 데 이용된다는 것을 지시한다. 또한, 제조 물품은 (a) 조성물이 그 안에 함유된 제1 용기 (여기서 상기 조성물은 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 포함함); 및 (b) 조성물이 그 안에 함유된 제2 용기 (여기서 상기 조성물은 추가 세포독성제 또는 만약 그렇지 않으면 치료제를 포함함)를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 구현예에서 제조 물품은 조성물이 특정 질환을 치료하는 데 이용될 수 있다는 것을 지시하는 포장 삽입물을 더욱 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제조 물품은 약학적으로 허용가능한 완충액, 예컨대 정균성 주사용수(BWFI), 인산염-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 비롯하여, 상업적 관점 및 이용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 더욱 포함할 수도 있다.
진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 구현예들에서, 본원에서 제공된 임의의 항 GPRC5D 항체는 생물학적 샘플에서 GPRC5D의 존재 검출에 유용하다. 본원에서 사용된 용어 “검출하는”은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다. 특정 구현예들에서, 생물학적 표본은 세포 또는 조직, 예컨대 전립선 조직을 포함한다.
일 구현예에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항 GPRC5D 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 생물학적 샘플 중의 GPRC5D의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 항GPRC5D 항체의 GPRC5D으로의 결합을 허용하는 조건하에서 상기 생물학적 샘플을 본원에 기재된 항 GPRC5D 항체와 접촉시키고 복합체가 항 GPRC5D 항체와 GPRC5D 간에 형성되는지를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 일 구현예에서, 예컨대 GPRC5D이 환자의 선택용 바이오마커인 경우, 항 GPRC5D 항체가 사용되어 항 GPRC5D 항체를 이용한 요법에 적격인 대상체를 선택하는데 사용된다.
본 발명의 항체를 이용하여 진단될 수 있는 예시적 질환은 암, 특히 다발성 골수종을 포함한다.
특정 구현예들에서, 표지된 항 GPRC5D 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대, 형광, 색소생산, 전자 밀도, 화학발광 및 방사성 표지)뿐만 아니라 예를 들면, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 예시적인 표지는 염료 전구체를 산화시키는 과산화수소를 이용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토페록시다아제 또는 마이크로페록시다아제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정된 유리 라디칼 등과 연계된 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라아제, 예를 들면, 개똥벌레 루시페라아제 및 세균 루시페라아제 (U.S. 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프타라진디온, 양고추냉이 과산화효소 (HRP), 알칼리 인산분해효소, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다아제, 예를 들면, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제 및 글루코오스-6-인산염 탈수소효소, 헤테로환상 옥시다아제, 예컨대 요산분해효소 및 크산틴 옥시다아제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 추가 양태는 가변 중쇄 영역(VL)을 포함하는 GPRC5D에 결합하는 항체(10B10)에 관한 것으로서, 상기 VL은 서열번호 81의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 항체는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 것으로서, 상기 VL은 서열번호 82의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 항체는 VH 및 VL을 포함하는 것으로서, 상기 VL은 서열번호 81의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 82의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
본 발명의 추가 양태는 항체(10B10-TCB)에 관한 것이다. 상기 항체는 제1 경쇄를 포함하는 것으로서, 상기 제1 경쇄는 서열번호 67의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 항체는 제2 경쇄를 포함하는 것으로서, 상기 제2 경쇄는 서열번호 68의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 항체는 제1 중쇄를 포함하는 것으로서, 상기 제1 중쇄는 서열번호 69의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 항체는 제2 중쇄를 포함하는 것으로서, 상기 제2 중쇄는 서열번호 70의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 68의 아미노산 서열을 포함하는 제21 경쇄, 69의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 70의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함한다.
아미노산 서열
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Figure pct00016
Figure pct00017
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실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 다양한 다른 실시예가 전술한 일반적인 설명에 따라 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1
종양 표적의 발현
정상 형질 세포와 비교하여 다발성 골수종에 의해 발현되는 차등 유전자를 확인하기 위해, 다발성 골수종(MM) 환자에서 유래한 10개의 샘플 및 건강한 기증자의 골수에서 유래한 10개의 형질 세포(PC)에 대해 RNAseq를 실시하였다. RNA는 제조업체의 지침에 따라 RNeasy 마이크로(Micro) 키트(키아겐(Qiagen))를 사용하여 추출하였다. RNA 추출 중에 RNase가 없는 DNase 세트(키아겐)를 사용하여 유전체 DNA를 제거하였다. 추출된 RNA의 품질은 애질런트 진핵생물 종합(Agilent Eukaryote Total) RNA 피코 칩(애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies)) 상에서 제어하였다. 일루미나(Illumina) 서열분석용 SMARTer 초저 RNA 키트(클론테크(Clontech))를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 1.6 ng의 총 RNA에서 cDNA를 제조하고 증폭시켰다. 그런 다음, 증폭된 cDNA 1 ng에 대하여 제조업체의 지침에 따라 넥스테라(Nextera) XT 라이브러리 제조(일루미나)를 실시하였다. 서열분석 라이브러리는 카파 라이브러리 정량화(Kapa Library Quantification) 키트(카파 바이오시스템즈(Kapa Biosystems))를 사용하여 정량화하고 고감도(High Sensitivity) 칩(애질런트 테크놀로지스)을 사용하여 바이오분석기(Bioanalyzer) 상에서 모세관 전기영동으로 품질을 제어하였다. 라이브러리는 버전 4 클러스터 생성 키트 및 버전 4 서열분석 시약(일루미나)을 사용하여 2 x 50 주기 동안 HiSeq2500 서열분석기(일루미나) 상에서 서열분석을 실시하였다.
B세포 성숙 항원(BCMA)은 악성 형질 세포에서 발현되어 다발성 골수종 표적으로 인식되는 세포 표면 단백질이다(Tai YT & Anderson KC, Targeting B-cell maturation antigen in multiple myeloma, Immunotherapy. 2015 Nov; 7(11): 1187-1199). RNAseq 기술을 사용한 심층 분석은 GPRC5D가 다발성 골수종 환자의 형질 세포에서 BCMA만큼 높게 발현되는 것으로 나타났다(도 2). 더 중요하게는, 다발성 골수종 환자의 형질 세포와 건강한 형질 세포 사이의 GPRC5D의 차등 발현은 약 20배이다. 대조적으로, 다발성 골수종 환자의 형질 세포와 건강한 형질 세포 사이의 BCMA의 차등 발현은 단지 2배이다. GPRC5D의 전체 발현은 SLAM7, CD138 및 CD38과 같은 다른 공지된 다발성 골수종 표적 분자의 발현보다 훨씬 높다. 또한, GPRC5D는 건강한 미경험 또는 기억 B세포에서는 거의 발현되지 않는다.
실시예 2
GPRC5D 결합제의 생성 및 T세포 이중특이적(TCB) 항체의 제조
GPRC5D 결합제는 랫트의 DNA 면역화에 의해 생성된 후, 하이브리도마 생성, 하이브리도마의 선별검사 및 서열분석이 뒤따랐다. 특이적 결합을 위한 선별검사는 GPRC5D 발현 형질감염체에 대한 결합에 의해 ELISA로 측정하였다. 하기에서 5E11(서열번호 13 및 14) 및 5F11(서열번호 15 및 16)로 지칭되는 2개의 GPRC5D 결합제가 확인되었다. 특정 결합제가 확인되면, IgG는 T세포 이중특이적 항체로 전환되었다. 결합제를 T세포 이중특이적 항체로 전환시키는 원리는, 당업계, 예컨대 PCT 공보 제WO 2014/131712 A1호에 예시되고 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 원용된다. 상기 T세포 이중특이적 항체는 도 3에 예시된 바와 같이 2개의 GPRC5D 결합 모이어티 및 1개의 CD3 결합 모이어티(항 GPRC5D/항 CD3 T세포 이중특이적 항체)를 포함한다. 하기의 항 GPRC5D/항 CD3 T세포 이중특이적 항체들을 제조하였다: i) 5E11-TCB(서열번호 17, 18, 19 및 20); ii) 5F11-TCB(서열번호 21, 22, 23 및 24); iii) ET150-5-TCB(서열번호 25, 26, 27 및 28); iv) B72-TCB(서열번호 73, 74, 75 및 76); 및 v) BCMA-TCB(서열번호 77, 78, 79, 및 80). ET150-5 GPRC5D 결합 모이어티는 PCT 공보 제WO 2016/090329A2호에 기재되어 있다. 용어 "ET-150-5"는 본원에서 "ET150-5"라는 용어와 동의어로 사용되며 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 음성 대조군으로서 비표적 DP47-TCB를 제조하였다. DP47-TCB는 비표적 T세포 이중특이적 항체로서 CD3에만 결합하지만 GPRC5D에는 결합하지 않는다. DP47-TCB는 PCT 공보 제WO 2014/131712 A1호에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 원용된다. B72-TCB는 WO 2018/0117786 A2의 표 23에 개시된 GCDB72 항체로부터 유래하고 GCDB72의 GPRC5D 결합 모이어티를 포함한다. B72-TCB는 크로스맵 1+1 형식(서열번호 73, 74, 75 및 76)으로 생성되었다. BCMA-TCB는 WO 2016/166629 A1에서 유래하고 본원에 개시된 A02_Rd4_6nM_C01의 GPRC5D 결합 모이어티를 포함한다. BCMA-TCB는 크로스맵 2+1 형식(서열번호 77, 78, 79 및 80)으로 생성되었다.
실시예 3
다발성 골수종 세포주에 대한 T세포 이중특이적 항체의 결합
GPRC5D에 대한 결합을 측정하기 위해, 보고된 다발성 골수종 세포주에 대해 FACS 기반 결합 분석을 실시하였다(Lombardi et al., Molecular characterization of human multiple myeloma cell lines by integrative genomics: insights into the biology of the disease; Genes Chromosomes Cancer. 2007 Mar;46(3):226-38.). 세포주 AMO-1, L363 및 OPM-2는 20% 열 불활성화된 소태아 혈청(FBS, 깁코(Gibco)) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 100X(깁코)가 보충된 RPMI 1640 + 글루타맥스(Glutamax) 배지(깁코)에서 배양하였다. 세포주 WSU-DLCL2(음성 대조군)는 10% FBS만으로 보충된 동일한 배지로 배양하였다. 세포주 NCI-H929 및 RPMI-8226도 50 μM 머르캅토에탄올(깁코) 및 1 mM 피루브산 나트륨(깁코)가 보충된 동일한 배지로 배양하였다. 세포주는 주당 2회 계대하면서 75 cm2 플라스크(TPP)에서 배양하였다.
상이한 항인간 GPRC5D-TCB 항체(5E11-TCB, 5F11-TCB 및 ET150-5 TCB)의 결합을 간접 염색을 사용하여 평가하였다. 세포를 0.2의 계수로 또는 작제물이 없이 연속 희석하여 10 μg/ml 내지 0.00064 μg/ml 범위의 항인간 GPRC5D-TCB 작제물 5E11-TCB, 5F11-TCB 또는 ET150-5 TCB와 함께 완충 식염수(PBS; Gibco)에서 4°C에서 1시간 동안 100 μL의 인산염 내에서 배양하였다. 상기 세포를 4°C에서 20분 동안 PBS에 1:800으로 희석한 라이브 블루(Live Blue) 염료(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))로 염색한 후, 4°C에서 30분 동안 배양된 유세포 분석 염색 완충액(e바이오사이언스(eBioscience))에서 1/300 희석된 PE 접합 염소 항인간 IgG, Fcγ 단편 특이적(잭슨 라보라토리즈(Jackson Laboratories))으로 염색하였다. 유세포 분석 수득은 맞춤형으로 설계된 BD 바이오사이언스 포르테사(Biosciences Fortessa)에서 실시하였으며, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어(트리스타(Tree Star), OR 애실런드 소재) 및 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
도 4a-도 4c는 5E11-TCB 및 5F11-TCB 둘 모두가 시험된 다발성 골수종 세포주 모두에 용량 의존적 방식으로 결합함을 도시한다. 대조적으로, ET150-5-TCB는 시험된 세포주에 훨씬 더 약하게 결합한다. 항 GPRC5D-TCB에 의해 관찰된 WSU-DLCL2 세포(비호지킨 림프종의 GPRC5D- 세포주)에 대한 결합은 없었다.
실시예 4
항 GPRC5D-TCB 매개 T세포 세포독성
항 GPRC5D-TCB 항체의 기능성을 측정하기 위해, 시험관내 T세포 세포독성 분석을 실시하였다. 간단히 말해서, AMO-1, L363 및 OPM-2 세포주는 20% 열 불활성화된 소태아 혈청(FBS, 깁코(Gibco)) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 100X(PS; 깁코)가 보충된 RPMI 1640 + 글루타맥스(Glutamax) 배지(깁코)에서 배양하였다. 세포주 WSU-DLCL2는 10% FBS만으로 보충된 동일한 배지로 배양하였다. 세포주 NCI-H929 및 RPMI-8226은 50 μM 머르캅토에탄올(깁코) 및 1 mM 피루브산 나트륨(깁코)가 보충된 동일한 배지로 배양하였다. 세포주는 주당 2회 계대하면서 75 cm2 플라스크(TPP)에서 배양하였다.
10% FBS(깁코) + 1% PS(깁코)로 보충된 IMDM 배지(깁코)에서 인간 범 T세포 분리 키트(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))를 사용하여 말초혈액 단핵 세포(PBMC)(Blutspende Schlieren로부터의 백혈구 연층)로부터 분리된 3.105 개의 동종이계 T세포와 1:10의 표적:효능기 비율로 세포주를 공동 배양하였다. 항인간 GPRC5D-TCB 항체(5E11-TCB, 5F11-TCB, ET150-5 TCB 또는 DP47-TCB)를 0.1 또는 0 μg/ml의 연속 희석 계수를 사용하여 1 μg/ml 내지 0.000001 μg/ml 범위의 상이한 농도로 공동 배양물에 첨가하였다. 37°C에서 5% CO2와 함께 20시간 동안 배양한 후, 웰당 75 μl의 상청액을 96-웰 흰색 플레이트(그라이너 바이오-온(Greiner bio-one)) 내로 세포독성 분석법(프로메가)의 사이토톡스-글로(CytoTox-Glo) 25 μl와 함께 옮겼다. 실온에서 15분 배양한 후, 퍼킨엘머 엔비전(PerkinElmer EnVision)에서 발광 수득을 실시하고, 그래프패드 프리즘 및 XL 피트(fit) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 데이터는 LDH 방출에 대한 발광 신호로 표시된다.
도 5a-도 5e는 5E11-TCB 및 5F11-TCB 둘 모두 다발성 골수종 세포주, 특히 NCI-H929(도 5b), RPMI-8226(도 5c), L363 및(도 5d) AMO-1(도 5a)에서 강한 T세포 세포독성을 매개하고 음성 대조군 WSU-DLCL2에서는 사멸이 관찰되지 않음을 도시한다(도 5e). 대조적으로, ET150-5-TCB는 시험된 다발성 골수종 세포주에서 거의 또는 유의하게 낮은 사멸을 매개하였다. 표 1은 도 5a-도 5e에 표시된 데이터에서 파생된 EC50 값을 요약한다. EC50 값은 적정 TCB에 대한 신호의 원시 데이터를 도표화하여 엑셀(Excel)의 XLfit 추가 기능을 사용하여 계산하였다.
항 GPRC5D-TCB 매개 사멸의 EC50
NCI-H929 RPMI-8226 L363 AMO-1 WSI-DLCL2
5E11-TCB 0.007 nM 0.024 nM 0.012 nM 0.014 nM /
5F11-TCB 0.001 nM 0.002 nM 0.001 nM 0.003 nM /
ET150-5-TCB 0.833 nM 0.797 nM 0.768 nM 0.0835 nM /
실시예 5
항 GPRC5D-TCB 매개 T세포 활성화
항 GPRC5D-TCB의 작용 방식을 기계적으로 다루기 위해, 항 GPRC5D-TCB의 존재하에 표적 다발성 골수종 세포주와 공동 배양한 후 T세포의 활성화를 측정하였다. 실시예 4 및 도 5a-도 5e에 기재된 실험과 유사하게, 10% FBS(깁코) + 1% PS(깁코)로 보충된 IMDM 배지(깁코)에서 인간 범 T세포 분리 키트(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))를 사용하여 PBMC(Blutspende Schlieren로부터의 백혈구 연층)로부터 분리된 3.105 개의 동종이계 T세포와 1:10의 표적:효능기 비율로 세포주를 공동 배양하였다. 항인간 GPRC5D-TCB 항체(5E11-TCB, 5F11-TCB, ET150-5-TCB 또는 DP47-TCB)를 0.1 또는 0 μg/ml의 연속 희석 계수를 사용하여 1 μg/ml 내지 0.000001 μg/ml 범위의 상이한 농도로 공동 배양물에 첨가하였다. 5% CO2와 함께 37°C에서 20시간 동안 배양한 후, 세포를 염색하여 T세포 활성화를 평가하였다. 세포를 먼저 PBS(깁코)에 1:800으로 희석한 라이브 블루 염료(라이프 테크놀로지스)로 4°C에서 20분 동안 염색하였다. 이후, 상기 세포를 4°C에서 30분 동안 유세포 분석 염색 완충액(eBioscience) 내에 모두 바이오레전드(BioLegend) 및 PE-Cy5.5 항인간 CD3(클론 SK7; e바이오사이언스)로부터의 AF700 항인간 CD4(클론 OKT4), BV711 항인간 CD8(클론 SK1), BV605 항인간 CD25(클론 BC96), APC-Cy7 항인간 CD69(클론 FN50)로 염색하였다. 유세포 분석 수득은 맞춤형으로 설계된 BD 바이오사이언스 포르테사에서 실시하였으며, 플로우조 소프트웨어(트리스타, OR 애실런드 소재) 및 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
도 6은 5F11-TCB가 활성화 마커 CD25 및 CD69를 상향조절함으로써 NCI-H929 세포와의 공동 배양에서 T세포 활성화를 유도하는 반면 대조군, 예컨대 비표적 DP47-TCB 및 임의의 TCB 없이는 T세포 활성화를 유도하지 않는다는 것을 도시한다. 다른 음성 대조군으로서, 5F11-TCB 처리된 T세포를 WSU-DLCL2 세포와 공동 배양하였고, 여기서 T세포는 또한 활성화되지 않았다. 상기 활성화 프로필은 본원에서 연구한 다수의 세포주, 예컨대 AMO-1, NCI-H929, RPMI-8226, L363(도 7a-도 7j)에서 일관되었다. 열악한 사멸 효능에 따라, ET150-5-TCB는 1 mg/kg의 최고 시험 농도를 제외하고는 T세포 활성화를 유도하지 않았다.
실시예 6
항 GPRC5D-TCB의 국소화 및 내재화
NCI-H929 세포를 CMFDA(인비트로겐(Invitrogen))로 염색하고 24웰 플레이트의 폴리(Poly)-L-리신(Lysine)(시그마(Sigma)) 코팅된 원형 커버슬립에 분주하였다. 항체(5E11-IgG, 5E11-TCB, 5F11-IgG, 5F11-TCB)는 2.5의 몰비에서 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647 숙신이미딜 에스테르(인비트로겐, cat#A201106)로 표지되었다. 세포를 37°C에서 밤새 부착되도록 한 후, 형광 태그가 붙은 항체(알렉사 플루오르 647 표지된 -5E11-IgG, -5E11-TCB, -5F11-IgG, -5F11-TCB)를 상이한 기간 및 온도(얼음에서 30분, 37°C에서 1시간 및 37°C에서 3시간)에서 성장 배지 내로 직접 첨가하였다. 각 시점 이후에 반응을 중단시키고 비결합 항체를 씻어내기 위해 차가운 PBS(론자(Lonza))를 사용하였다. 그런 다음, 세포는 사이토픽스(Cytofix, BD)로 20분간 4°C에서 고정하여 PBS로 2회 세척하였다. 이 후, 커버슬립을 옮겨서, 플루오로마운트(Fluoromount) G(e바이오사이언스)로 유리 슬라이드 상에 올렸고, 이미징하기 전에 암실에서 밤새 4°C로 보관하였다. 형광 공초점 현미경 검사는 60x 오일 대물 렌즈를 가진 자이스(Zeiss)사의 역 LSM 700으로 실시하였다. 현미경에 결합된 젠(Zen) 소프트웨어(자이스)를 사용하여 이미지를 수집하고 IMARIS 소프트웨어(비트플레인(Bitplane))에서 시각화하였다. 도 8a는 모든 항체가 4°C 또는 37°C에서 다발성 골수종 세포주의 표면(혈장막)을 염색했음을 도시한다. 만약 항체가 세포에 의해 내재화되면, 37°C에서 배양할 때 형광 염색이 세포질에 나타날 것이다. GPRC5D+ 세포주에 의한 GPRC5D 결합-IgG 또는 GPRC5D 결합-TCB의 내재화는 관찰되지 않았다. 세포의 관심 영역으로 정의된 막 및 세포질로부터 강도의 합계를 적용하여 추가로 확인하였다(3시간에). IMARIS 소프트웨어는 세포질에 대한 막의 신호 비율의 분석 및 정량화에 사용하였다. 도 8b는 상이한 항체로 배양한 후 3시간 후에 막 대 세포질 강도의 비율이 ~4에서 변하지 않았음을 나타내며, 이는 형광 신호가 세포질이 아닌 표면에 집중된다는 것을 의미한다.
실시예 7
GPRC5D 결합제의 특성화: ELISA에 의한 재조합 세포 결합
인간 GPRC5D 또는 시노몰구스 GPRC5D 또는 뮤린 GPRC5D 또는 인간 GPRC5A를 발현하는 안정적인 형질감염된 CHO 클론을 사용하여 IgG로서 잠재적인 리드 후보 항체의 결합을 분석하였다. 구체적으로, 104개의 세포(생존율 ≥98%)를 신선한 배양 배지를 사용한 384개의 웰 마이크로타이터 플레이트(BD 폴리(Poly) D-리신(Lysin), #356662, 부피: 25 μl/well) 내에 분주하였다. 37°C에서 밤새 배양한 후, 항체의 25 μl/웰 희석액을 4°C에서 2시간 동안 세포에 첨가하였다(1xPBS에서 15 x 1:3 희석, 분석 농도는 30 μg/ml에서 시작). 90 μl/웰 PBST(10x PBS, 로슈(Roche), #11666789001 + 0.1% 트윈(Tween) 20)를 사용한 1회 세척 단계 후, 세포를 후속적으로 50 μl/웰 0.05% 글루타르알데히드(시그마 Cat.No: 1xPBS의 G5882)를 첨가하여 실온(RT)에서 10분 동안 고정시켰다. 90 μl/웰 PBST를 사용한 3회의 추가 세척 단계 후, 2차 항체를 검출을 위해 첨가하였다: 인간 항체의 경우 염소 항인간 Ig κ 사슬 항체 HRP 접합체(밀리포어(Millipore) #AP502P)를 차단 완충액(1x PBS(로슈 # 11666789001) + 2% BSA(소혈청 알부민 분획 V, 지방산 무함유, 로슈, # 10735086001) + 0.05% 트윈 20) 내에 1:2000로 희석하여 사용하였다(25μl/웰). 래트 항체의 경우 염소 항 쥐 IgG1 항체 HRP 접합(베틸(Bethyl) #A110-106P), 염소 항 쥐 IgG2a 항체 HRP 접합(베틸 #A110-109P) 및 염소 항 쥐 IgG2b 항체 HRP 접합(베틸 #A110-111P)의 혼합물을 차단 완충액(25 μl/well) 내에 각 항체의 1:10000 희석으로 사용하였다. 실온에서 1시간 동안 배양하고 90 μl/웰 PBST를 사용하여 3회의 추가 세척 단계 후, 25 μl/웰 TMB 기질을 10분 동안 첨가하고(로슈 주문 번호 11835033001) 최종 OD에 대한 발색을 370 nm/492 nm에서 측정하여 결정하였다.
시험된 모든 항체는 pM 범위의 EC50 값(결합력 반영)으로 인간 GPRC5D에 대한 양성 결합을 보여주었다. 랫트 IgG 10B10 및 07A04만이 인간 버전의 수용체에 필적하는 EC50 값으로 시노몰구스 GPRC5D를 발현하는 CHO 세포에서 교차 반응성을 나타냈다(도 9). 시노몰구스 교차 반응성은 다른 모든 항체에 대해서도 검출되었지만 10B10 및 07A04에 비해 낮은 수준이었다(도 9). 뮤린 GPRC5D를 발현하는 CHO 세포에 대한 유의적인 결합 및 인간 버전의 GPRC5A를 발현하는 CHO 세포에 대한 어떠한 결합도 검출되지 않았다(도 9). 결합에 대한 EC50 값은 표 2에서 요약하였다.
종에 걸친 GPRC5D에 대한 ELISA 기반 결합 특성
인간 GPRC5D+ CHO 시노 GPRC5D+ CHO
IgG 항체 EC50 (ng/ml) EC50 (nM) EC50 (ng/ml) EC50 (nM)
5E11 29.57 0.198 - -
5F11 21.67 0.144 - -
10B10 16.34 0.109 12 0,080
07A04 24.26 0.162 114.54 0,764
실시예 8
GPRC5D 결합제: 재조합 GPRC5D-TCB는 MM 세포주에서 T세포 세포독성을 매개한다
GPRC5D-TCB 또는 기타 표적 TCB의 기능성을 비교하기 위해, 본원에서는 다수의 MM 세포주에서 시험관내 T세포 세포 독성 분석을 실시하였다. MOLP-2(도 10b), AMO-1(도 10c), EJM(도 10d) 및 NCI-H929(도 10g). 간단히 말해서, 세포주는 20% 열 불활성화된 소태아 혈청(FBS, 깁코) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 100X(PS; 깁코)가 보충된 RPMI 1640 + 글루타맥스 배지(깁코)에서 배양하였다. MOLP-2는 글루타맥스 1X(깁코)가 보충된 상기 배지로 배양하였다. OPM-2(도 10a), RPMI-8226(도 10e) 및 L-363(도 10f) 세포주는 단지 10% FBS가 보충된 상기 배지로 배양하였다. NCI-H929는 50 μM 머르캅토에탄올(깁코), 1 mM 피브루산 나트륨(깁코) 및 글루타맥스 1X(깁코)가 보충된 상기 배지로 배양하였다. EJM은 IMDM(깁코) + 10% FBS(깁코) 및 1% PS(깁코)에서 배양하였다. 모든 세포주는 75 cm2 플라스크(TPP)에서 주당 2회 계대 배양하였다.
10% FBS(깁코) + 1% PS(깁코)로 보충된 RPMI 배지(깁코)에서 인간 범 T세포 분리 키트(밀테니 바이오텍)를 사용하여 PBMC(Blutspende Schlieren로부터의 백혈구 연층)로부터 분리된 30만개의 동종이계 T세포를 사용한 10 대 1의 효능기 대 표적의 비율로 세포주를 공동 배양하였다. 항인간 GPRC5D TCB 작제물(5E11-TCB, 5F11-TCB, 10B10-TCB, B72-TCB, BCMA-TCB 및 DP47-TCB)을 1/10로 희석한 12.5 nM 내지 0.0000125 nM의 상이한 농도로 공동 배양물에 첨가하고, 처리되지 않은 샘플과 비교하였다. 37°C에서 5% CO2와 함께 20시간 동안 배양한 후, 웰당 75 μl의 상청액을 96-웰 흰색 플레이트(그라이너 바이오-온) 내로 세포독성 분석법(프로메가)의 사이토톡스-글로(CytoTox-Glo) 25 μl와 함께 옮겼다. 실온에서 15분 배양한 후, 퍼킨엘머 엔비전(PerkinElmer EnVision)에서 발광 수득을 실시하고, 그래프패드 프리즘 및 XL 피트(fit) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 데이터는 LDH 방출에 대한 발광 신호로 표시하였다(도 10). 도 10a-도 10g는 5E11-TCB 및 5F11-TCB 둘 모두가 BCMA-TCB, 10B10-TCB 및 B72-TCB보다 MM 세포주에서 더 강한 T세포 세포독성을 매개함을 보여주는 데이터를 요약한다. TCB 매개 사멸의 EC50은 표 3에 나타나 있으며, 다른 공여자 T세포(n=2 또는 n=3)를 사용한 상이한 실험들의 평균으로 계산하였다.
시험관내 사멸 분석의 EC50 값
EC50(pM) n=3 n=2
세포주 NCI-H929
(도 10g)		 AMO-1
(도 10c)		 MOLP-2
(도 10b)		 L363
(도 10f)		 EJM
(도 10d)		 OPM-2
(도 10a)		 RPMI
(도 10e)
5F11-TCB 4 6 1 3 3 1 6
5E11-TCB 7 8 18 17 11 2 64
10B10-TCB 56 84 160 34 79 28 965
B72-TCB 58 109 124 58 60 171 193
BCMA-TCB 311 518 32 127 132 33 11
실시예 9
건강한 인간 골수 세포에서 시험관내 T세포 활성화
4명의 상이한 건강한 공여자(론자 #1M-105, 로트 0000739254; 0000739255; 0000739256 및 0000734008)의 미처리된 신선한 골수를 샘플링 1 또는 2일 후에 처리하였다. 실온에서 5분 동안 BD 팜 라이시스(Pharm Lysis) 완충액(BD #555899; 멸균수 중 1X)을 사용한 빠른 적혈구 용해 후; 세포를 각각 126 g 및 443 g에서 원심분리 및 완충액 교환에 의해 2회 세척하였다. 세포를 계수하고 RPMI 1640 글루타맥스 + 20% HI 소태아 혈청 + 2% 인간 혈청 + 1% 페니실린/스트렙토마이신(모두 깁코에서 제공)에 300,000개 세포/mL로 재현탁하고 100 μL의 세포 현탁액을 96웰 플레이트 둥근 바닥(TPP)에서 웰당 분주하였다. 50 μL의 배지 또는 B72-TCB, 5F11-TCB, 5E11-TCB, BCMA-TCB, 10B10-TCB 또는 DP47-TCB가 1/10으로 연속 희석되어 200 nM(4X) 내지 20 pM으로 보충된 배지를 웰당 추가하였다. 마지막으로, 건강한 공여자의 PBMC에서 범 T세포(밀테니 바이오텍, # 130-096-535)를 사용하여 분리된 동종이계 T세포 50 μL를 6 Mio/mL(효능기 T 대 건강한 골수 표적 세포 비율 10:1)로 첨가하였다. 가습 배양기에서 37°C에서 밤새 배양한 후, 세포를 PBS로 한 번 세척하고 PBS에 1/800로 희석한 라이브 블루(인비트로겐, # L23105) 50 μL로 4°C에서 20분 동안 염색하였다. 세척 후, 세포를 FAC 완충액(PBS 1X, 2% 소태아 혈청, 1% 0.5 m EDTA PH 8, 0.25% NaN3 아지드화 나트륨(20%))에 희석한 하기의 항체 혼합물과 함께 4℃에서 30분 동안 배양하였다: CD25 BV605, CD69 APC-Cy7, BCMA BV421, CD38 BV510, CD138 FITC, FcRH5 PE 1/100 희석 및 CD8 BV711, CD3 PE-Cy5 및 CD4 알렉사플루오르 700 1/300 희석(모두 바이오레전드) 및 GPRC5D 알렉사플루오르 647(사내, 클론 5E11 IgG). 세척 후, 세포를 100 μL의 FAC 완충액에 재현탁하고 포르테사(BD 바이오사이언스)로 수득하였다.
도 11a-도 11f에 제시된 데이터는 B72-TCB가 건강한 골수에서 T세포의 비특이적 활성화(CD69의 상향조절에 의해 측정됨)를 유도했지만, 다른 시험된 TCB에 의해서는 유도되지 않았음을 도시한다. 지시된 바와 같이, B72-TCB에 의해 유도된 비특이적 활성화는 농도 의존적 효과였으며 5 nm에서보다 50 nm에서 더 두드러졌다(도 12a 및 도 12b).
실시예 10
TCB의 생체 내 효능
효능 연구에서 상이한 TCB 작제물(GPRC5D 5F110-TCB, 5E11-TCB, BCMA-TCB 및 B72-TCB)을 완전히 인간화된 NSG 마우스를 보유하는 다발성 골수종에서 종양 퇴행의 관점에서 비교하였다. NCI-H929 세포는 원래 ATCC에서 수득하였고 OPM-2 세포는 DSMZ에서 수득하였다. 두 세포주 모두 확장되었다. 세포를 10% FCS 및 2 mM L-글루타민, 10 mM HEPES, 1 mM 피브루산 나트륨을 함유하는 RPMI에서 배양하였다. 상기 세포는 물 포화된 공기 하에 5% CO2에서 37°C에서 배양하였다. 동물당 2.5 x106 NCI-H929 및 5 x106 OPM-2 세포를 >95.0%의 생존율에서 RPMI 세포 배양 배지(깁코) 및 GFR 마트리겔(1:1, 총 부피 100 ul)에서 동물의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다.
실험 시작 시점에 생후 4~5주인 암컷 NSG 마우스(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, 프랑스 리옹의 찰스 리버(Charles River)에서 사육)를 명확한 지침(GV-솔라스(Solas); 펠라사(Felasa); 티에르쉬그(TierschG))에 따라 12시간 명/12시간 암의 일일 주기로 특이적 병원체가 없는 조건하에서 유지하였다. 실험 연구 프로토콜은 지방 정부(ROB-55.2-2532.Vet_03-16-10)로부터 검토 및 승인을 받았다. 도착 후, 동물은 새로운 환경에 익숙해지도록 1주일 동안 유지 및 관찰하였다. 연속적인 건강 모니터링을 규칙적으로 실시하였다.
상기 프로토콜에 따라 암컷 NSG 마우스에 15 mg/kg의 부술판(Busulfan)을 복강내 주사하였고, 1일 후 제대혈에서 분리한 1x105 인간 조혈 줄기 세포를 정맥내 주사하였다. 줄기세포 주사 후 16~20주째에 마우스를 채혈하고 성공적인 인간화를 위해서 유동 세포 분석에 의해 혈액을 분석하였다. 마우스에 나타난 인간 T세포 빈도에 따라서, 효과적으로 이식된 마우스를 상이한 치료군으로 무작위로 분류하였다(n=10/군). 이 때, 마우스에 종양 세포를 피하 주사하였다. 종양 크기가 대략 200 mm3에 도달할 때 상기 기재된 바와 같이 화합물 또는 PBS(비히클)로 매주 1회 처리하였다. 모든 마우스에 상이한 용량의 TCB 분자를 정맥내 주사하였다(도 13a-도 13d 및 도 14a-도 14d를 참조).
화합물의 적절한 양을 수득하기 위해, 모액을 히스티딘 완충액(20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0)으로 희석하였다. 캘리퍼스를 사용하여 주 2회 종양 성장을 측정하고 종양 부피를 하기와 같이 계산하였:
Tv: (W2/2) x L (W: 폭, L: 길이)
연구를 종료하고 화합물을 4회 주사한 후 모든 마우스를 희생시키고 종양을 체외 이식한 후 무게를 측정하였다.
도 13a-도 13d는 처리 후 NCl-H929 주사를 받은 모든 동물에서 종양 성장 동역학을 도시한다. 5F11-TCB는 1 mg/kg 또는 0.1 mg/kg에서 모든 동물에서 완전한 종양 관해를 유도한 반면(도 13a), B72-TCB는 0.1 mg/kg에서의 효과 없이 1 mg/kg에서 사용될 때 부분적인 종양 관해만을 유도하였다(도 13c). BCMA-TCB는 또한 1 mg/kg에서 부분적인 종양 관해를 유도하였다(도 13b).
도 14a-도 14d는 처리 후 OPM-2 주사를 받은 모든 동물에서 종양 성장 동역학을 도시한다. 5F11-TCB(도 14a, 상단 패널) 및 5E11-TCB(도 14b, 상단 패널)는 0.1 mg/kg에서 대부분의 동물에서 완전한 종양 관해를 유도한 반면, B72-TCB(도 14c, 상단 패널)는 0.1 mg/kg에서 종양 성장을 조절하는 데 덜 강력하였다. 0.01 mg/kg에서 5F11-TCB(도 14a, 하단 패널) 및 5E11-TCB(도 14b, 하단 패널)는 B72-TCB(도 14c, 하단 패널)에 비해 종양 성장을 억제하는 데 더 강력하였다.
실시예 11
항 GPRC5D 항체의 인간화
뮤린 입력 서열(가변 부분에 절편됨)에 대해 인간 V- 및 J-영역 서열의 BLASTp 데이터베이스를 조회함으로써, 적합한 인간 수용체 프레임워크가 확인되었다. 인간 수용체 프레임워크의 선택을 위한 선택 기준은 서열 상동성, 동일하거나 유사한 CDR 길이, 및 인간 생식계열의 추정된 빈도뿐만 아니라 VH-VL 도메인 계면에서 일정한 아미노산의 보존이었다. 생식계열 확인 단계 이후에, 뮤린 입력 서열의 CDR이 인간 수용체 프레임워크 영역 위에 이식되었다. 상기 초기 CDR 이식편 및 부모 항체 사이에 각 아미노산 차이를 개별 가변 영역의 구조적 완전성에 대한 가능한 영향에 대해 평가하였고 적합한 것으로 간주될 때는 언제든지 부모 서열을 향한 “복귀 돌연변이”를 도입하였다. 구조적 평가는 바이오비아 디스커버리 스튜디오 환경(Biovia Discovery Studio Environment), 버전 17R2를 이용하여 실시된 내부(in-house) 항체 구조 상동성 모델링 프로토콜로 생성된 부모 항체 및 인간화 변이체 둘 모두의 Fv 영역 상동성 모델을 기초로 하였다. 일부 인간화 변이체에서, “전향 돌연변이”, 즉 부모 결합제의 소정의 CDR 위치에서 발생하는 본래 아미노산을 인간 수용체 생식계열의 동등한 위치에서 발견되는 아미노산으로 변화시키는 아미노산 교환이 포함되었다. 목적은 인간화 변이체(프레임워크 영역을 뛰어넘어)의 전체 인간 형질을 증가시켜 면역원성 위험을 더욱 감소시키는 것이다.
내부 개발된 인실리코(in silico) 도구가 쌍을 형성한 VH 및 VL 인간화 변이체의 VH-VL 도메인 배향을 예측하는 데 이용되었다(WO 2016/062734A1으로서, 그 전체가 본원에 원용됨). 기하구조에서 본래 항체에 가까운 프레임워크 조합을 선별하기 위해, 결과를 부모 결합제의 예측된 VH-VL 도메인 배향과 비교하였다. 이론적 근거는 결합 특성에 대한 유해한 효과를 나타낼 수도 있는 2개 도메인의 쌍형성에서 교란적 변화를 야기할지도 모르는 VH-VL 계면 영역에서 가능한 아미노산 교환을 검출하는 것이다.
GPRC5D 결합제 5E11에 대한 수용체 프레임워크 및 적응의 선택
수용체 프레임워크는 하기의 표 4에 따라 선택되었다.
GPRC5D 결합제 5E11용 수용체 프레임워크
뮤린(라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)) V 영역 생식계열 인간 수용체 V 영역 생식계열의 선택
VH1abcd IGHV5S13*01 IGHV3-23*03
VL1ac IGKV3S18*01 IGKV4-1*01_인간
VL2ab IGKV3-20*01_인간
VL3ab IGKV1-39*01_인간
포스트-CDR3 프레임워크 영역은 인간 IGHJ 생식계열 IGHJ3*02 (DAFDIWGQGTMVTVSS) 및 인간 IGKJ 생식계열 IGKJ5*01 (ITFGQGTRLEIK)로부터 적응되었다. 수용체 프레임워크의 관련 부분은 굵은 글씨체로 표시한다.구조적 고려사항에 따라, 인간 수용체 프레임워크로부터 부모 결합제의 아미노산으로의 복귀 돌연변이가 5E11 인간화 변이체의 특정 위치에 도입되었다(표 5 및 표 6). 또한, 일부 위치들은 부모 결합제의 CDR에 있는 아미노산이 인간 수용체 생식계열에서 발견되는 아미노산으로 대체되는 전향 돌연변이에 대한 유망한 후보로 확인되었다. 변경 사항은 하기의 표에 자세히 나타내었다.
비고: 복귀 돌연변이는 b가 접두사로 붙고, 전향 돌연변이는 f가 접두사로 붙는다, 예컨대, bS49A는 위치 49에서 세린에서 알라닌으로의 복귀 돌연변이(인간 생식계열 아미노산에서 부모 항체 아미노산으로)를 지칭한다. 카바트 넘버링에 제공된 모든 잔류 지수.
VH/VL 5E11 인간화 변이체의 목록
변이체 명칭 인간 V 영역 생식계열에 대한 동일성(BLASTp)
5E11_VH1a (bS49A_bK94T) 89.7
5E11_VH1b (bV2L_bS49A_bS74A_bK94T) 87.6
5E11_VH1c (bS49A_fR60A_fA65G_bK94T) 91.8
5E11_VH1d (bV2L_bS49A_fR60A_fA65G_bS74A_bK94T) 89.7
5E11_VL1a (bP43Q) 80.2
5E11_VL1c (fR24K_fA25S_bP43Q) 82.2
5E11_VL2a (bA43Q) 86.2
5E11_VL2b (bA43Q_bR45K) 85.1
5E11_VL3a (bA43Q) 83.8
5E11_VL3b (bK42Q_bA43Q) 82.8
표 6. VH/VL 5E11 인간화 변이체의 서열
Figure pct00019
GPRC5D 결합제 5F11에 대한 수용체 프레임워크 및 적응의 선택
수용체 프레임워크는 하기의 표 7에 따라 선택되었다.
GPRC5D 결합제 5F11용 수용체 프레임워크
뮤린(라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)) V 영역 생식계열 인간 수용자 V-영역 생식계열의 선택
VH1abcd IGHV5S13*01 IGHV3-30*03
VH2bd IGHV3-23*04
VL1ab, VL2a IGKV2S17*01 IGKV2-28*01
VL2b IGKV4-1*01
VL2c IGKV3-20*01
포스트-CDR3 프레임워크 영역은 인간 IGHJ 생식계열 IGHJ3*02(DAFDIWGQGTMVTVSS) 및 인간 IGKJ 생식계열 IGKJ2*01(YTFGQGTKLEIK)로부터 적응되었다. 수용체 프레임워크의 관련 부분은 굵은 글씨체로 표시한다.구조적 고려사항에 따라, 인간 수용체 프레임워크로부터 부모 결합제의 아미노산으로의 복귀 돌연변이가 5F11 인간화 변이체의 특정 위치에 도입되었다(표 8 및 표 9). 또한, 일부 위치들은 부모 결합제의 CDR에 있는 아미노산이 인간 수용체 생식계열에서 발견되는 아미노산으로 대체되는 전향 돌연변이에 대한 유망한 후보로 확인되었다. 변경 사항은 하기의 표에 자세히 나타내었다.
비고: 복귀 돌연변이는 b가 접두사로 붙고, 전향 돌연변이는 f가 접두사로 붙는다, 예컨대, bA93T는 위치 93에서 알라닌에서 트레오닌으로의 복귀 돌연변이(인간 생식계열 아미노산에서 부모 항체 아미노산으로)를 지칭한다. 카바트 넘버링에 제공된 모든 잔류 지수.
VH/VL 5F11 인간화 변이체의 목록
변이체 명칭 인간 V 영역 생식계열에 대한 동일성(BLASTp)
5F11_VH1a (bA93T) 89.8
5F11_VH1b (bQ1E_bS74A_bA93T) 87.8
5F11_VH1c (fR60A_bA93T) 90.8
5F11_VH1d (bQ1E_fR60A_bS74A_bA93T) 88.8
5F11_VH2b (bS49A_bS74A_bA93T_bK94R) 86.7
5F11_VH2d (bS49A_fR60A_bS74A_bA93T_bK94R) 87.8
5F11_VL1a (bL46V_bY87H) 86.0
5F11_VL1b (bQ42K_bL46V_bY87H) 85.0
5F11_VL2a (bY87H) 88.0
5F11_VL2b (bY87H) 80.2
5F11_VL2c (fS25A_bY87H) 80.0
Figure pct00020
ELISA에 의한 인간화 변이체의 특성화
GPRC5D 결합제의 VH 및 VL 도메인의 인간화 변이체의 특성화를 위해, 상기 기재된 바와 같은 ELISA 프로토콜을 사용하였다(실시예 7을 참조). 데이터는 5E11의 인간화 변이체에 대한 표 10 및 5F11의 인간화 변이체에 대한 표 11에 요약되어 있다. 표 12는 모 5E11 및 모 5E11 및 선택된 인간화 변이체의 CDR 서열을 나타낸다.
5E11의 인간화 변이체의 특성화
인간 CHO hu GPCR5D CHO cy GPCR5D
테이퍼
(Tapir)		 분류 VH VL VH huID VL huID Fv huID EC/IC50 rel (ng/ml) EC/IC50 rel (nM) EC/IC50 rel (ng/ml)
P1AE5706 1 모 모 　 　 　 10,4 0,07 해당 없음
P1AE5707 2 VH1a VL1a 89,7 80,2 84,95 14,2 0,09 해당 없음
P1AE5708 3 VH1a VL1c 89,7 82,2 85,95 12,0 0,08 해당 없음
P1AE5709 4 VH1a VL2a 89,7 86,2 87,95 19,1 0,13 해당 없음
P1AE5710 5 VH1a VL2b 89,7 85,1 87,4 10,1 0,07 해당 없음
P1AE5712 6 VH1a VL3a 89,7 83,8 86,75 13,1 0,09 해당 없음
P1AE5713 7 VH1a VL3b 89,7 82,8 86,25 16,5 0,11 해당 없음
P1AE5714 8 VH1b VL1a 87,6 80,2 83,9 12,9 0,09 해당 없음
P1AE5715 9 VH1b VL1c 87,6 82,2 84,9 21,1 0,14 해당 없음
P1AE5716 10 VH1b VL2a 87,6 86,2 86,9 15,1 0,10 해당 없음
P1AE5717 11 VH1b VL2b 87,6 85,1 86,35 13,9 0,09 해당 없음
P1AE5718 12 VH1b VL3a 87,6 83,8 85,7 12,1 0,08 해당 없음
P1AE5719 13 VH1b VL3b 87,6 82,8 85,2 16,6 0,11 해당 없음
P1AE5720 14 VH1c VL1a 91,8 80,2 86 21,7 0,14 해당 없음
P1AE5721 15 VH1c VL1c 91,8 82,2 87 18,3 0,12 해당 없음
P1AE5722 16 VH1c VL2a 91,8 86,2 89 19,7 0,13 해당 없음
P1AE5723 17 VH1c VL2b 91,8 85,1 88,45 6,0 0,04 해당 없음
P1AE5724 18 VH1c VL3a 91,8 83,8 87,8 5,3 0,04 해당 없음
P1AE5725 19 VH1c VL3b 91,8 82,8 87,3 5,1 0,03 해당 없음
P1AE5726 20 VH1d VL1a 89,7 80,2 84,95 7,6 0,05 해당 없음
P1AE5727 21 VH1d VL1c 89,7 82,2 85,95 8,7 0,06 해당 없음
P1AE5728 22 VH1d VL2a 89,7 86,2 87,95 7,9 0,05 해당 없음
P1AE5729 23 VH1d VL2b 89,7 85,1 87,4 10,4 0,07 해당 없음
P1AE5730 24 VH1d VL3a 89,7 83,8 86,75 8,0 0,05 해당 없음
P1AE5731 25 VH1d VL3b 89,7 82,8 86,25 5,2 0,03 해당 없음
표 10. 계속
Figure pct00021
5F11의 인간화 변이체의 특성화
인간 CHO hu GPCR5D
분류 VH VL VH huID VL huID Fv huID EC/IC50 rel (ng/ml) EC/IC50 rel (nM)
P1AE5733 1 모 모 　 　 　 5,8 0,04
P1AE5734 2 VH1a VL1a 89,8 86 87,9 5,5 0,04
P1AE5735 3 VH1a VL1b 89,8 85 87,4 6,6 0,04
P1AE5736 4 VH1a VL2a 89,8 88 88,9 3,7 0,02
P1AE5737 5 VH1a VL2b 89,8 80,2 85 5,9 0,04
P1AE5738 6 VH1a VL2c 89,8 80 84,9 4,1 0,03
P1AE5739 7 VH1b VL1a 90,8 86 88,4 4,0 0,03
P1AE5740 8 VH1b VL1b 90,8 85 87,9 6,3 0,04
P1AE5741 9 VH1b VL2a 90,8 88 89,4 6,7 0,04
P1AE5742 10 VH1b VL2b 90,8 80,2 85,5 6,1 0,04
P1AE5743 11 VH1b VL2c 90,8 80 85,4 7,6 0,05
P1AE5744 12 VH1c VL1a 90,8 86 88,4 8,6 0,06
P1AE5745 13 VH1c VL1b 90,8 85 87,9 9,7 0,06
P1AE5746 14 VH1c VL2a 90,8 88 89,4 10,7 0,07
P1AE5747 15 VH1c VL2b 90,8 80,2 85,5 9,0 0,06
P1AE5749 16 VH1c VL2c 90,8 80 85,4 7,4 0,05
P1AE5750 17 VH1d VL1a 89,8 86 87,9 9,4 0,06
P1AE5751 18 VH1d VL1b 89,8 85 87,4 12,4 0,08
P1AE5752 19 VH1d VL2a 89,8 88 88,9 6,2 0,04
P1AE5753 20 VH1d VL2b 89,8 80,2 85 10,4 0,07
P1AE5754 21 VH1d VL2c 89,8 80 84,9 9,0 0,06
P1AE5755 22 VH2b VL1a 90,8 86 88,4 7,8 0,05
P1AE5756 23 VH2b VL1b 90,8 85 87,9 7,8 0,05
P1AE5757 24 VH2b VL2a 90,8 88 89,4 2,9 0,02
P1AE5758 25 VH2b VL2b 90,8 80,2 85,5 2,6 0,02
P1AE5759 26 VH2b VL2c 90,8 80 85,4 3,1 0,02
P1AE5760 27 VH2d VL1a 89,8 86 87,9 4,0 0,03
P1AE5761 28 VH2d VL1b 89,8 85 87,4 3,7 0,02
P1AE5762 29 VH2d VL2a 89,8 88 88,9 4,6 0,03
P1AE5763 30 VH2d VL2b 89,8 80,2 85 6,0 0,04
P1AE5764 31 VH2d VL2c 89,8 80 84,9 4,5 0,03
표 11. 계속
Figure pct00022
인간화 변이체 선택의 CDR 서열
HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR1 LCDR3
5E11 모 서열번호 83 서열번호 84 서열번호 86 서열번호 87 서열번호 88 서열번호 89
5E11_P1AE5723 서열번호 83 서열번호 85 서열번호 86 서열번호 87 서열번호 88 서열번호 89
5E11_P1AE5728 서열번호 83 서열번호 85 서열번호 86 서열번호 87 서열번호 88 서열번호 89
5F11_모 서열번호 90 서열번호 91 서열번호 93 서열번호 94 서열번호 95 서열번호 97
5F11_P1AE5741 서열번호 90 서열번호 91 서열번호 93 서열번호 94 서열번호 96 서열번호 97
5F11_P1AE5745 서열번호 90 서열번호 92 서열번호 93 서열번호 94 서열번호 95 서열번호 97
실시예 12
선택된 항 GPRC5D IgG의 상이한 인간화 변이체의 존재하에 CAR-J 세포의 시험관내 활성화
PGLALA-CAR-J 효능기 세포를 활성화하는 상이한 인간화 항 GPRC5D IgG의 능력을 하기에 기재된 바와 같이 평가하였다. GPRC5D 발현 다발성 골수종 표적 세포 L363(Diehl et al., Blut 36: 331-338(1978))은 IgG 분자의 Fc 부분에서 PGLALA(P329G L234A L235A) 돌연변이에 대해 지향된 TCR을 발현하고 PCT 출원 번호 PCT/EP2018/086038 및 PCT 출원 번호 PCT/EP2018/086067에 개시된 바와 같이 NFAT 프로모터를 함유하는 항 PGLALA-CAR-J 효능기 세포(저캇-NFAT 인간 급성 림프성 백혈병 리포터 세포주)와 공동 배양하였다. L363 세포 및 PGLALA-CAR-J 세포에서 GPRC5D에 대한 IgG 분자의 동시 결합 시, NFAT 프로모터가 활성화되고 활성 반딧불이 루시페라제의 발현을 유도한다.
분석을 위해, 인간화 IgG 변이체를 RPMI 1640 배지(글루타맥스, 15% HI 소태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신 함유, 모두 GIBCO에서 제조)에 희석하고 둥근 바닥 96 웰 플레이트(최종 농도 범위: 0.2 pg/ml에서 10 μg/ml까지) 내로 옮겼다. 웰당 20,000개의 L363 세포 및 항 PGLALA-CAR-J 효능기 세포를 첨가하여 최종 효능기(항 PGLALA-CAR-J) 대 표적(L363) 세포 비율 5:1 및 웰당 최종 부피 200 μl를 수득하였다. 세포를 가습된 배양기에서 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양 시간이 끝난 후, 100 μl/웰의 상청액을 흰색 평평한 바닥 96-웰 플레이트(코스타(Costar))로 옮기고 다른 100 μl/웰의 원-글로(ONE-Glo) 루시퍼라제 기질(프로메가)과 함께 5분 동안 배양한 후 퍼킨엘머 엔비전을 사용하여 발광을 판독하였다. 행 데이터는 그래프패드프리즘을 사용하여 IgG 농도에 대한 상대 발광 신호(RLU)로 표시하였고 EC50은 XL-fit 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
도 15a-도 15b 및 표 13에 나타낸 바와 같이, 평가된 모든 GPRC5D IgG는 GPRC5D 발현 표적 세포 및 항 PGLALA-CAR-J 세포에 대한 동시 결합 시 CAR-J 활성화를 유도한다. 항 GPRC5D 결합제 5F11 및 5E11 둘 모두에 대해, 인간화 변이체는 인간화 전 모 항체와 비교하여 유사하거나 심지어 개선된 EC50 값으로 식별할 수 있었다. 결합제 5F11의 경우, 가장 강력한 활성화는 분자 P1AE5741에 의해 유도될 수 있다(도 15a). 결합제 5E11의 경우, 가장 강력한 활성화는 분자 P1AE5730 및 P1AE5723에 의해 유도될 수 있다(도 15b).
CAR-J 활성화의 EC50 값
결합제 5F11 결합제 5E11
P1AE5733
(모)		 P1AE5741 P1AE5745 P1AE5744 P1AE5763 P1AE5706
(모)		 P1AE5723 P1AE5728 P1AE5730 P1AE5718
EC50 (ng/ml) 2,65 1,4 1,62 3,63 5,47 3,9 3,7 5,6 3,5 105,4
실시예 13
추가 T세포 이중특이적 항체의 제조
결합제를 T세포 이중특이적 항체로 전환시키는 원리는, 당업계, 예컨대 PCT 공보 제WO 2014/131712 A1호에 예시되고 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 원용된다. 상기 T세포 이중특이적 항체는 도 3에 예시된 바와 같이 2개의 GPRC5D 결합 모이어티 및 1개의 CD3 결합 모이어티(항 GPRC5D/항 CD3 T세포 이중특이적 항체)를 포함한다. 하기의 항 GPRC5D/항 CD3 T세포 이중특이적 항체들을 제조하였다: i) 6623(서열번호 114, 115, 116 및 117); ii) 6624(서열번호 118, 119, 120 및 121); iii) 6625(서열번호 122, 123, 124 및 125); iv) 6626(서열번호 126, 127, 128 및 129)으로 생성되었다. DP47-TCB(“비표적 TCB”)는 PCT 공보 제WO 2014/131712 A1호에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 원용된다. B72 TCB는 WO 2018/0117786 A2의 표 23에 개시된 GCDB72 항체로부터 유래하고 GCDB72의 GPRC5D 결합 모이어티를 포함한다(실시예 7). 용어 "B72 TCB"는 또한 본원에서 용어 "B72"를 지칭한다. BCMA-TCB는 WO 2016/166629 A1에서 유래하고 본원에 개시된 A02_Rd4_6nM_C01의 GPRC5D 결합 모이어티를 포함한다. BCMA-TCB는 실시예 2에 대해 기재된 바와 같이 크로스맵 2+1 형식(서열번호 77, 78, 79, 80)으로 생성되었다. "5F11-TCB" 및 "5F11p-CH2527"이라는 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. “5E11-TCB" 및 "5E11p-CH2527"이라는 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
실시예 14.1
다발성 골수종 세포주 및 저캇-NFAT 세포에 대한 T세포 이중특이적 항체의 결합
GPRC5D에 대한 결합을 측정하기 위해, 보고된 다발성 골수종 세포주에 대해 유동 세포 분석 기반 결합 분석을 실시하였다(Lombardi et al., Molecular characterization of human multiple myeloma cell lines by integrative genomics: insights into the biology of the disease; Genes Chromosomes Cancer. 2007 Mar;46(3):226-38.). 세포주 NCI-H929(ATCC® CRL-9068)는 10% FBS, 1x 페니실린/스트렙토마이신(깁코), 1x 피브루산 나트륨(깁코) 및 50μM 베타-메르캅토에탄올(깁코)이 보충된 글루타맥스 배지(깁코)와 함께 RPMI 1640에서 배양하였다. Jurkat-NFAT 리포터 세포(NFAT 프로모터가 있는 CD3 발현 인간 급성 림프성 백혈병 리포터 세포주, 글로리스판스(GloResponse) 저캇 NFAT-RE-luc2P, 프로메가 #CS176501)를 2 g/l 포도당, 2 g/l NaHCO3, 10% FCS, 25 mM HEPES, 2 mM L-글루타민, 1 x NEAA, 1 x 피루브산 나트륨 및 200 μg/ml 하이그로마이신 B를 함유하는 RPMI 1640에서 배양하였다.
96 둥근 바닥 웰 플레이트의 웰당 0.1 Mio 세포를 표시된 GPRC5D-TCB 작제물 5E11p-CH2527, 6625, 6626, 5F11p-CH2527, 6623 또는 6624의 100 nM 내지 1.3 pM(1:5의 연속 희석)과 함께 또는 작제물 없이 4°C에서 30분 동안 배양하였다. 상기 세포를 FACS 완충액(PBS, 2% 소태아 혈청; 1% 0.5 m EDTA pH 8; 0.25% NaN3 아지드화 나트륨(20%))으로 2회 세척하고 FACS 완충액에서 1/100로 희석한 PE 접합 염소 항인간 IgG, Fcγ 단편 특이적(잭슨 라보라토리즈, 109-606-008)을 4°C에서 추가로 30분 동안 염색하였다.
유세포 분석 수득은 맞춤형으로 설계된 BD 바이오사이언스 포르테사에서 실시하였으며 BD 디바(Diva)를 사용하여 분석하였다. EC50 값은 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
도 16은 모든 TCB 분자가 농도 의존적 방식으로 인간 GPRC5D 및 인간 CD3 둘 모두에 결합할 수 있음을 도시한다. 간단히 말해서, 5E11p-CH2527의 두 인간화 버전, 즉 6625 및 6626은 모 TCB와 비교하여 인간 GPRC5D에 대한 향상된 결합을 나타내며, 이는 결합의 EC50 값도 더 낮춘다(도 16a 및 표 14.1). 또한, 6624는 5F11p-CH2527 및 6623과 비교하여 인간 GPRC5D에 대한 결합이 약간 향상되었음을 나타낸다(도 16b). 일반적으로, 모든 5F11 기반 분자는 5E11 기반 분자보다 인간 GPRC5D에 더 잘 결합하는 것으로 나타난다. 모든 5E11 기반 TCB 분자는 인간 CD3에 필적할만한 농도 의존적 결합을 나타내는 반면(도 16c), 5F11p-CH2527의 두 인간화 변이체, 즉 6623 및 6624는 인간 CD3 발현 저캇-NFAT 세포와 함께 배양되는 경우(도 16d) 모체에 비해 가장 높은 항체 농도에서 더 강한 전체 결합 신호를 나타낸다.
표 14.1: NCI-H929에서 발현된 인간 GPRC5D 또는 저캇 세포에서 발현된 인간 CD3에 대해 표시된 GPRC5D-TCB 분자의 결합에 대한 EC50 값(nM).
Figure pct00023
실시예 14.2
다발성 골수종 세포주에 대한 T세포 이중특이적 항체의 결합
실시예 14.1에 제시된 데이터가 10배 만큼 잘못 계산되었기 때문에 EC50 값이 너무 낮다. 따라서, GPRC5D에 대한 결합을 재측정하기 위해, 본원에서는 보고된 다발성 골수종 세포주에 대해 FACS 기반 결합 분석을 실시하였다(Lombardi et al., Molecular characterization of human multiple myeloma cell lines by integrative genomics: insights into the biology of the disease; Genes Chromosomes Cancer. 2007 Mar;46(3):226-38.). 세포주 OPM-2를 20% 열 불활성화 소태아 혈청(FBS, 깁코)이 보충된 RPMI 1640 + 1% 글루타맥스 배지(깁코)에서 배양하였다. 세포주 NCI-H929는 10% 열 활성화 소태야 혈청(FBS, Gibco), 50 μM 머르캅토에탄올(깁코) 및 1 mM 피브루산 나트륨(깁코)가 보충된 RPMI 1640 + 1% 글루타맥스 배지(깁코)에서 배양하였고, RPMI-8226은 RPMI 1640 + 10% 열 불활성화 소태아 혈청(FBS, 깁코)이 보충된 1% 글루타맥스 배지(깁코)에서 배양하였다. 세포주는 주당 2회 계대하면서 75 cm2 플라스크(TPP)에서 배양하였다.
간단히 말해서, 현탁 세포를 채취하고, 계수한 후 생존율을 평가하였다. 모든 후속 단계는 4°C에서 실시하였다.
세포를 ml당 0.5 Mio 세포로 PBS에 재현탁시켰다. 다음으로, 둥근 바닥 96웰 플레이트의 웰당 0.05 Mio 세포를 분주하고 원심분리한 후 상청액을 버렸다. 세포를 Fc 차단(바이오레전드 #422302, 1:400으로 미리 희석)을 함유하는 좀비 아쿠아 생존율 염색약(바이오레전드 #423102, 미리 희석 1:400)으로 웰당 총 부피 50 ul로 20분 동안 염색하였다. 세포를 FACS 완충액으로 세척하고 증가하는 농도의 5E11(6625)-TCB(본원에서 6625로도 지칭됨)(0.7 nM - 500 nM, 웰당 총 부피 25 ul)와 함께 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 분석 플레이트를 원심분리하고 상청액을 버렸다.
그 후, 세포를 부드러운 소용돌이에 의해 재현탁하고 FACS 완충액에 500 nM의 이차 항체(aPGLALA mulG2b 알렉사(Alexa) 647, 내부 생성)를 함유하는 웰당 총 25 μl에서 4℃에서 추가로 30분 동안 배양하였다. 세포를 한 번 세척하고 FACS 디바가 장착된 BD 유세포 분석기에서 분석하였다. 그래프패드프리즘6을 사용하여 결합 곡선 및 EC50 값을 수득하였다. 분석 복제물 1의 EC50 값은 도 25a, 도 25b 및 도 25c에 나타낸 그래프에 해당한다. 분석 복제물 2의 EC50 값은 도 25d, 도 25e 및 도 25f에 나타낸 그래프에 해당한다. 분석 복제물 3의 EC50 값은 도 25g, 도 25h 및 도 25i에 나타낸 그래프에 해당한다.
도 25는 다양한 수준의 인간 GPRC5D를 발현하는 MM 세포주에 대한 5E11(6625)-TCB의 농도 의존적 결합을 도시한다. 결합의 EC50 범위는 20 nM 내지 158 nM이며 세포에 대한 표적 발현 수준의 변동으로 인해 일부 분석 변동을 나타낸다.
표 14.2. EC50 값 - 상이한 확립된 MM 세포주 상에서 발현된 인간 GPRC5D에 대한 5E11(6625)-TCB의 결합
Figure pct00024
실시예 15
인간 CD3 및 인간 GPRC5D에 동시 결합 시 저캇-NFAT 효능기 세포의 CD3 매개 활성화를 유도하는 GPRC5D-TCB의 능력을 RPMI-8226(ATCC® CCL-155) 세포 및 저캇- NFAT 리포터 세포(프로메가 #CS176501)의 공동 배양을 사용하여 평가하였다. RPMI-8226 세포 상의 인간 GPRC5D 및 저캇-NFAT 리포터 세포 상의 인간 CD3에 대한 TCB 분자의 동시 결합 시, NFAT 프로모터를 활성화하고 활성 반딧불이 루시페라제의 발현을 유도한다. 발광 신호(루시페라아제 기질의 첨가 시에 수득됨)의 강도는 CD3 활성화 및 신호전달의 강도에 비례한다.
분석을 위해, 20,000 RPMI8226 세포를 96-웰 플레이트의 웰당 분주하고 표시된 TCB 분자를 첨가하여 20% FBS 및 1% Pen/Strep을 함유한 RPMI에서 1:10의 연속 희석 단계를 사용하여 50 nM 내지 5 fM의 최종 농도 범위를 수득하였다. 50,000 저캇-NFAT 세포를 웰당 첨가하여 2.5:1의 최종 E:T 비율을 수득하였다. 37°C, 5% CO2에서 밤새 배양한 후, 100 μl의 원-글로(ONE-Glo) 시약(프로메가)을 동일한 부피의 분석 상청액에 첨가하고 빛이 차단된 실온에서 5분 동안 배양하였다. 퍼킨 엘머 플레이트 판독기를 사용하여 발광성을 분석하였다.
도 17a에 도시된 바와 같이, 평가된 모든 GPRC5D TCB 분자는 용량 의존적 방식으로 저캇-NFAT 활성화를 유도하는 반면, 2개의 비표적 DP47 TCB 대조군 분자 중 임의의 것의 존재하에서는 어떠한 유의적 신호도 수득되지 않았다. 비표적 DP47 TCB 1은 서열번호 104의 VH 및 서열번호 105의 VL을 포함하는 CD3 결합제를 포함한다. 비표적 DP47 TCB 2은 서열번호 35의 VH 및 서열번호 36의 VL을 포함하는 CD3 결합제를 포함한다. 저캇 활성화에 대한 해당 EC50 값은 그래프패드프리즘6을 사용하여 계산하였고 표 15에 제시하였다. EC50 및 AUC(표 15 참조)를 모두 고려하면 분자의 순위는 하기와 같다: 6624 > 6623 > 5F11p-CH2527 > 6626 ~6625 > 5E11p-CH2527.
흐름(퀀텀 심플리 셀룰러(Quantum Simply Cellular), 뱅스랩스(BangsLabs))에 의해 결정되고 세포주 이름 옆에 괄호 안에 GPRC5D 결합 부위 번호로 표시된 다양한 수준의 인간 GPRC5D를 발현하는 추가(다발성 골수종) 세포주의 존재 하에 유사한 분석을 실시하였다.
EC50 및 AUC는 그래프패드프리즘을 사용하여 계산하였고 x축 대 y축에 표시하였다(도 17b-도 17g).
도 17b-도 17g에 도시된 바와 같이, 모든 분자는 광범위한 상대적 GPRC5D 발현을 갖는 세포주의 존재하에 농도 의존적 저캇 활성화를 나타내고; 분자의 순위는 존재하는 표적 세포주와 무관하게 유사하다.
EC50 값(pM) 또는 곡선 아래 면적(AUC)은 RPMI-8226 세포의 존재하에 저캇-NFAT 리포터 세포의 GPRC5D-TCB 매개 활성화로부터 계산하고, 밤새 배양(~20시간) 후 발광에 의해 측정한다.
5E11p-CH2527 6625 6626 5F11p-CH2527 6623 6624
EC50 (pM) 157 40 49,7 14,0 8,9 4,5
AUC 265 250 571 600 582 400 393 460 778 140 880 720
실시예 16
항 GPRC5D-TCB 매개 T세포 세포독성
항 GPRC5D-TCB 항체의 기능성을 추가로 측정하기 위해, 시험관내 종양 세포 용해 분석을 실시하였다. 간단히 말해서, AMO-1(DSMZ ACC 538), NCI-H929 ATCC® CRL-9068, LP-1(DSMZ ACC 41) 및 IM-9(ATCC® CCL-159) 세포주는 하기와 같이 최종 효능기에서 효능기 세포로서 인간 범 T와 10:1의 표적 비율로 배양하였다. 인간 범 T세포 분리 키트(밀테니 바이오텍)를 사용하여 건강한 공여자의 말초혈액 단핵 세포(PBMC)에서 인간 범 T세포를 분리하였다. 표시된 GPRC5D-(6625 및 B72) 또는 BCMA 표적화 T세포 결합 이중특이적 분자를 감소하는 농도(50 nM 내지 5 pM의 범위, 1:10의 희석 단계)로 첨가하였다. 음성 대조군으로서 비표적 TCB를 포함하였다.
37°C, 5% CO2에서 20시간 동안 배양한 후, 제조사 매뉴얼에 따라 발광 신호(사이토톡스-글로(CytoTox-Glo Cytotoxicity) 분석, 프로메가)를 정량화하여 세포 사멸을 결정하였다. 결정된 세포 사멸의 직접적인 측정으로서 상대 발광 신호(RLU)를 도시하였다. EC50 및 AUC는 그래프패드프리즘을 사용하여 계산하였고 표 16에 요약되어 있다.
도 18a-도 18d는 모든 TCB 분자가 각각 인간 GPRC5D 및 BCMA의 다양한 상대 발현 수준으로 광범위한 종양 세포주의 농도 의존적 용해를 유도할 수 있음을 도시한다. 6625 및 B72의 직접적인 비교는 6625 분자의 증가된 효능 및 역량을 시사한다. 6625 및 BCMA-TCB의 비교는 AMO-1(도 18a), NCI-H929(도 18b) 및 LP-1(도 18c)의 존재 하에 6625의 더 나은 시험관내 효능 및 역량을 나타내는 반면, BCMA-TCB는 다소 낮은 수준의 GPRC5D를 발현하는 IM-9(도 18d)의 더 강한 종양 세포 용해를 유도한다. 시험된 세포주에서 6625 및 BCMA-TCB의 상이한 순위는 상기 세포주에서 GPRC5D 대 BCMA의 상이한 상대적 발현 수준으로 쉽게 설명될 수 있다.
EC50 값(pM)은 표시된 세포주의 존재하에 GPRC5D 또는 BCMA-TCB 매개 종양 세포 용해로부터 계산하고 밤새 배양(~20시간) 후 발광에 의해 결정한다.
EC50 (pM) 종양 표시 6625 B72 BCMA-TCB
AMO-1 형질세포종 8.3 79.9 137.1
NCI-H929 MM 0.597 26.95 171
LP-1 MM 7.99 48.95 76.36
IM-9 MM 환자의 B 림프모구 266.9 197.5 55.69
곡선 아래 면적(AUC) 값은 표시된 세포주의 존재하에 GPRC5D 또는 BCMA-TCB 매개 종양 세포 용해로부터 계산하고 밤새 배양(~20시간) 후 발광에 의해 결정한다.
AUC 종양 표시 6625 B72 BCMA-TCB
AMO-1 형질세포종 80117761 54494020 47326610
NCI-H929 MM 17872547 10854134 10684467
LP-1 MM 15438497 11504124 11100680
IM-9 MM 환자의 B 림프모구 9268093 8600921 10994563
실시예 17
1차 MM 샘플의 존재하에서 항 GPRC5D-TCB 매개 T세포 활성화
1차 다발성 골수종 샘플에 대한 GPRC5D TCB 분자의 활성을 평가하기 위해, 냉동 처리되지 않은 골수 샘플(프로테오제넥스(Proteogenex))을 해동하고 BD 팜 라이시스(Pharm Lysis) 완충액(#555899)를 사용하여 빠른 적혈구 용해를 실시하였다. 그 후, 세포를 세척하고 20% 열 불활성화 소태아 혈청, 2% 인간 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(모두 깁코) 및 100 μL의 세포 현탁액(30,000개 세포)을 포함하는 RPMI 1640 글루타맥스에 재현탁하고 96웰 플레이트 둥근 바닥(TPP)에 웰당 분주하였다. 자가 T세포를 첨가하여 혼합된 BM 샘플의 세포당 10개의 T세포의 최종 비율을 수득하였다. 표시된 분자를 첨가하여 96웰 플레이트의 웰당 총 부피 200 μl에서 50 nM 내지 0.05 nM(1:10 희석 단계)의 최종 농도 범위를 수득하였다.
가습 배양기에서 37°C에서 밤새 배양한 후, 세포를 PBS로 한 번 세척하고 라이브 블루(인비트로겐, # L23105) 50 μL로 4°C에서 20분 동안 염색하여 생존 및 사망 세포를 구분하였다. 제조업체의 제안에 따라 하기의 항체들의 혼합물을 사용하여 표면 염색을 실시하였다: CD25 BV605, CD69 APC-Cy7, CD38 BV510, CD138 FITC, CD8 BV711, CD3 PE-Cy5 및 CD4 알렉사플루오르700(모두 바이오레전드에서 제공). 최종 분석을 위해, 세포를 100 μL의 FAC 완충액에 재현탁하고 포르테사(BD 바이오사이언스)로 수득하였다. 도 19는 초기 활성화 표지자 CD69에 대해 양성인, 살아있는 CD8 T세포의 퍼센트에 의해 결정된 바와 같은 T세포 활성화 퍼센트를 도시한다. T세포 활성화의 EC50은 그래프 패드 프리즘에 의해 계산하였고 표 18에 요약되어 있다. 대표적인 GPRC5D 표적화 이중특이적 분자, 즉 6624 및 6625는 각각 1.06 pM 및 14.8 pM의 EC50으로 농도 의존적 T세포 활성화를 유도할 수 있는 반면, 비표적 TCB 대조군의 존재하에서는 T세포 활성화가 유도되지 않았다. 도시된 경우에, BCMA-TCB는 평가된 GPRC5D TCB 분자 둘 모두보다 적은 정도로 T세포를 활성화시켰다. 잠재적인 이유는 GPRC5D 및 BCMA의 상대적 발현 수준의 차이일 수 있다(평가되지 않음). 유의적인 T세포 활성화는 6624 및 6625에서 관찰된 것보다 훨씬 더 높은 농도에서만 B72 분자에 의해 유도되었지만, B72는 측정된 2개의 가장 높은 농도에서 더 높은 전체 활성화를 유도하였다. 건강한 공여자의 골수 샘플에서 유사한 농도의 B72에서 T세포 활성화를 관찰함에 따라, 1차 MM 샘플의 존재하에 관찰된 B72의 효과가 순전히 표적 의존적인지 여부는 명확하지 않다(도 21을 참조).
자가 T세포의 GPRC5D 또는 BCMA-TCB 매개 활성화로부터 계산된 EC50 값(pM)은 1차 MM 샘플과 함께 배양하고 대략 24시간 후 CD8 T세포에서 CD69의 유세포 분석에 의해 정량화한다.
6624 6625 B72 BCMA-TCB
EC50 (pM) 1.06 14.8 ~ 612.5 52.54
실시예 18
건강한 공여자의 PBMC 배양 시 B세포의 고갈
인간 PBMC는 고전적인 밀도 구배 원심분리에 의해 건강한 공여자의 혈액에서 분리하였다. 200,000 PBMC를 10% FBS 및 1% Pen/Strep를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 96웰 플레이트의 웰당 분주하였다. 표시된 이중특이적 분자를 웰당 200 μl의 총 부피에서 50 nM, 5 nM, 0.5 nM 또는 0.05 nM의 최종 농도를 갖도록 첨가하였다. 가습 배양기에서 37°C에서 48시간 동안 배양한 후, 세포를 FACS 완충액으로 세척하고 Fc 수용체를 제조사의 프로토콜에 따라 휴먼 트루스테인(Human TruStain) FcX™(Fc 차단, 바이오레전드)로 세포를 배양하여 차단하였다. 라이브 블루(인비트로겐, # L23105)를 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하였다(실시예 17을 참조). 하기의 표지자의 표면 발현은 4°C에서 30분 동안 실시하였다: CD19, CD45, CD4, CD38, CD8, CD138(모두 바이오레전드에서 제공). 웰당 B세포의 절대 정량화를 위해, BD FACS 포르테사를 사용한 유세포 분석 전에 10 μl의 카운트브라이트(CountBright) 절대 계수 비드(인비트로겐 #C36950)를 웰당 추가하였다. 도 20a-도 20d는 상이한 항체 농도, 즉 50 nM(도 20a), 5 nM(도 20b), 0.05 nM(도 20c) 및 0.05 nM(도 20D)에서 표시된 이중특이적 분자를 이용해 평가한 5명의 상이한 건강한 공여자에 대한 요약을 도시한다. SD(공여자당)가 있는 복제물을 기반으로 미처리 대조군으로 정규화된 B세포 수가 도시되었다. 건강한 B세포의 유의적 고갈이 BCMA-TCB 및 GPRC5D-TCB 6626 모두에서 관찰된 반면, B72를 포함한 다른 GPRC5D 표적화 TCB 중 그 어느 것도 대부분의 공여자에서 B세포를 유의하게 고갈시키지 않았다. 6626으로 관찰된 B세포 고갈 효과는 ~5 nM 초과의 농도로 제한되었지만, BCMA-TCB는 이미 0.05 nM의 농도에서 건강한 B세포를 고갈시켰다. 요약하면, 이는 GPRC5D를 표적으로 하는 분자가 건강한 B세포를 고갈시킬 위험이 훨씬 낮은 것으로 보이며, 이는 안전상의 이점이 될 수 있음을 시사한다.
실시예 19
건강한 공여자의 골수 샘플 배양 시 T세포 활성화에 미치는 영향
건강한 공여자(론자)의 미처리 골수를 샘플링 1일 후에 평가하였다. BD 팜 라이시스 완충액 #555899를 사용한 빠른 적혈구 용해 후, 세포를 세척하고 RPMI 그 후, 세포를 세척하고 20% 열 불활성화 소태아 혈청, 2% 인간 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(모두 깁코) 및 100 μL의 세포 현탁액(30,000개 세포)을 포함하는 RPMI 1640 글루타맥스에 재현탁하고 96웰 플레이트 둥근 바닥(TPP)에 웰당 분주하였다. 표시된 분자를 첨가하여 96웰 플레이트의 웰당 총 부피 200 μl에서 5 nM 내지 0.05 nM(1:10 희석 단계)의 최종 농도 범위를 수득하였다.
가습 배양기에서 37°C에서 밤새 배양한 후, 세포를 PBS로 한 번 세척하고 라이브 블루(인비트로겐, # L23105) 50 μL로 4°C에서 20분 동안 염색하여 생존 및 사망 세포를 구분하였다. 제조업체의 제안에 따라 하기의 항체들의 혼합물을 사용하여 표면 염색을 실시하였다: CD25 BV605, CD69 APC-Cy7, CD38 BV510, CD138 FITC, CD8 BV711, CD3 PE-Cy5 및 CD4 알렉사플루오르700(모두 바이오레전드에서 제공). 최종 분석을 위해, 세포를 100 μL의 FAC 완충액에 재현탁하고 포르테사(BD 바이오사이언스)로 수득하였다. 도 21은 표시된 처리 시 CD69-양성 CD8+(A) 또는 CD4+ T세포(B)의 백분율로 결정된 T세포 활성화를 도시한다.
골수 샘플에서 명확한 농도 의존적 T세포 활성화는 BCMA-TCB 또는 B72에서 검출되었지만, 6624 또는 6625에서는 검출되지 않았다. 이는 더 높은 용량으로 사용될 때 BCMA-TCB 또는 B72에 비해 6624 및 6625와 같은 분자의 잠재적인 안전상의 이점을 나타낸다.
실시예 20
건강한 공여자의 인간 전혈에서 사이토카인 방출
6명의 건강한 공여자의 전혈을 BD 진공채혈관 리튬-헤파린(Vacutainer Lithium-Heparin) 관으로 수집하고 3시간 이내에 분석하였다. GPRC5D-TCB 6624 및 6625 뿐만 아니라 비표적 TCB 대조군 분자를 PBS(깁코 #14190)에 희석하고 둥근 바닥 96웰 플레이트(코닝(Corning) # 코스타(Costar) 3799)에서 195 μL의 전혈에 5 μL를 첨가하여 50, 0.5 및 0.005 nM의 최종 농도에 도달하도록 하였다. 단클론 항체 가싸이바(Gazyva, 오비누투주맙) 및 렘트라다(알렘투주맙)는 50, 0.5 및 0.005 nM에서 유사하게 분석하였고, 얼비툭스(세툭시맙)는 50 nM에서 시험하였다. PBS는 비히클 대조군으로만 사용하였다. 37°C에서 24시간 배양 후, 플레이트를 1800 g(3000 rpm)에서 5분 동안 원심분리하였다. 제조업체의 제안에 따라 밀리포어(Millipore) 키트(HCYTOMAG-60K)와 루미넥스(Luminex) 판독기 LX 200을 사용하여 다중 사이토카인 검출을 실시하기 전에 혈장 상청액(~70 μl)을 수집하고 -80°C에서 보관하였다. 도 22a(인간 TNFα) 및 도 22b(인간 IL-6)에 요약된 바와 같이, 6624는 가싸이바와 유사한 범위에서 낮은 수준의 TNFα 및 IL-6 분비를 유도한 반면, 6625는 평가된 사이토카인을 훨씬 더 낮은 수준으로 유도하여, 6624가 사이토카인 방출 측면에서 유리한 안전성 프로파일을 나타낼 수 있음을 시사하였다.
실시예 21
상이한 GPRC5DxCD3 이중특이적 TCB 분자의 생체내 효능
NCI-H929(hNSG 마우스)
GPRC5D TCB 분자 6623, 6624, 6625 및 6626의 효능을 추가로 평가하기 위해, 완전히 인간화된 NSG 마우스를 보유한 다발성 골수종에서 종양 퇴행을 유도할 수 있는 가능성을 평가하였다. 생존율 > 95.0%인 2.5 x106 NCI-H929 세포를 RPMI 세포 배양 배지(깁코) 및 GFR 마트리겔(1:1, 총 부피 100 μl)에 재현탁하고 인간화된 암컷 NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다.
상기 마우스의 인간화는 하기와 같이 실시하였다: 실험 시작 시점에 생후 4~5주인 암컷 NSG 마우스(프랑스 리옹의 찰스 리버(Charles River)에서 사육)를 명확한 지침(GV-솔라스(Solas); 펠라사(Felasa); 티에르쉬그(TierschG))에 따라 12시간 명/12시간 암의 일일 주기로 특이적 병원체가 없는 조건하에서 유지하였다. 실험 연구 프로토콜은 지방 정부(ROB-55.2-2532.Vet_03-16-10)로부터 검토 및 승인을 받았다. 도착 후, 동물은 새로운 환경에 익숙해지도록 1주일 동안 유지 및 관찰하였다. 연속적인 건강 모니터링을 규칙적으로 실시하였다. 상기 프로토콜에 따라 암컷 NSG 마우스에 15 mg/kg의 부술판(Busulfan)을 복강내 주사하였고, 1일 후 제대혈에서 분리한 1x105 인간 조혈 줄기 세포를 정맥내 주사하였다. 줄기세포 주사 후 16~20주째에 마우스를 채혈하고 성공적인 인간화를 위해서 유동 세포 분석에 의해 혈액을 분석하였다. 마우스에 나타난 인간 T세포 빈도에 따라서, 효과적으로 이식된 마우스를 상이한 치료군으로 무작위로 분류하였다(n=10/군).
이 때, 마우스에 종양 세포를 피하 주사하였다. 종양 크기가 308 mm3의 중앙 크기(92-841 mm3의 범위)에 도달할 때 상기 기재된 바와 같이 화합물 또는 PBS(비히클)로 매주 1회 처리하였다. 모든 마우스에 0.05 mg/kg 및 0.005 mg/kg의 표시된 TCB 분자를 정맥내 주사하였다(도 23a 및 도 23b를 참조).
화합물의 적절한 양을 수득하기 위해, 모액을 히스티딘 완충액(20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0)으로 희석하였다. 캘리퍼스를 사용하여 주 2회 종양 성장을 측정하고 종양 부피를 하기와 같이 계산하였다:
Tv: (W2/2) x L (W: 폭, L: 길이)
종양 접종 후 41일에 연구를 종료하고 화합물을 3회 주사한 후 모든 마우스를 희생시키고 종양을 체외 이식한 후 무게를 측정하였다. 통계분석은 터키 검증인 이원분산분석에 따라 실시하였다.
도 23a 및 도 23b에 도시된 바와 같이, 0.005 mg/kg의 낮은 용량에서 평가된 GPRC5D-TCB 분자 중 어느 것도 효율적인 종양 성장 억제를 나타내지 않았다. 대조적으로, 0.05 mg/kg에서, 본원에서는 비히클 대조군과 비교하여 평가된 4개의 GPRC5D TCB 분자 모두에 의해 유의적인 항종양 성장 반응을 관찰하였다. 도 23c-도 23g는 처리군당 단일 마우스의 종양 성장 억제를 추가로 입증한다. 평가된 4개 분자 간에는 유의적인 차이가 없었으며, 이는 4개의 GPRC5D TCB 분자 모두에 대한 높은 전임상 효능을 입증한다.
실시예 22
hFcRn Tg 및 KO 마우스의 생체내 SDPK
GPRC5D TCB 분자 6623, 6624, 6625 및 6626의 PK 특성을 평가하기 위해, 각 분자를 꼬리 정맥을 통해 1 mg/kg의 용량으로 -/- huFcRn Tg 라인 32(B6.Cg-Fcgrt<tm1Dcr> Tg(FCGRT)32Dcr) 마우스 또는 -/- muFcRn(B6.129X1-Fcgrttm1Dcr/DcrJ) (JAX 연구소, 미국 바하버 소재)에 1회분씩 정맥 투여하였다. 모든 연구는 동물 보호에 관한 스위스 연방 규정과 국제 실험 동물 관리 협회(AAALAC)의 규정을 엄격하게 준수하여 지역 수의 당국의 승인을 받아 실시하였다. 투여 후 지시된 시점에서 분석을 위한 혈청을 수득하기 위해 상이한 시점에서 정맥 천자(꼬리 정맥)에 의해 혈액을 수집하였다: -/- huFcRn Tg 라인의 경우 0.083, 7, 24, 48, 72, 168, 336, 504 및 672시간 후 투여 및 -/- muFcRn 라인의 경우 32, 0.083, 2, 7, 24, 31, 48, 72 및 96시간 후 투여. 혈액은 코팅을 위해 실온에서 20분 동안 보관하였고 혈청은 4°C에서 5분 동안 15,000 rpm으로 원심분리하여 수득한 후 즉시 동결시켰다. 모든 혈청 샘플은 투여된 항체 및 이의 변이체의 인간 Fab 부분에 특이적인 방법인 전기화학발광 면역분석(ECLIA)으로 분석할 때까지 -20°C에서 보관하였다.
간단히 말해서, 분석 완충액으로 미리 희석한 샘플을 37°C에서 9분 동안 포획 및 검출 분자와 함께 배양하였다. 비오틴화된 mAb<H-Fab(카파)>M-IgG-Bi를 포획 분자로 사용하고 루테늄(II)트리스(비피리딜)32+ 표지된 mAb<H-Fab(CH1)>M-1.19.31-IgG-S-Ru 마우스 모노클로날 항체를 검출에 사용하였다. 스트렙타비딘으로 코팅된 자기 미세입자를 첨가하고 37°C에서 추가로 9분 동안 배양하여 비오틴-스트렙타비딘 상호 작용으로 인한 복합체 형성을 가능하게 하였다. 복합체는 전극 상에 자기적으로 포착되었고 공동 반응물인 트리프로필아민(TPA)을 사용하여 생성된 화학 발광 신호는 광전자 증배관 검출기로 측정하였다. 모든 혈청 샘플 및 양성 또는 음성 대조군 샘플을 4회 분석하고 투여된 해당 항체에 대해 보정하였다.
도 24 및 표 19에 도시된 바와 같이, 4개의 모든 GPRC5D TCB 분자는 고전적 IgG로부터의 범위에서 hFcRn tg32 마우스에서 허용가능한 PK 프로파일을 나타낸다. FcRn ko 마우스에서 생성된 데이터는 면역원성과 관련될 수 있는 비특이적 세포 흡수를 평가하는 데 관련이 있는 것으로 간주된다. 도 10b에 요약된 바와 같이, 6625 및 6626은 유사한 제거율을 나타내는 반면, 6623 및 6624의 제거율은 상승되어 비특이적 세포 흡수에 대한 약간 더 높은 가능성을 시사한다.
hFcRn Tg32 또는 FcRn KO 마우스에 대한 SDPK 연구에서 계산된 청소율 및 각각의 반감기
hFcRn Tg32 마우스 FcRn KO 마우스
분자 청소율(mL/d/kg) 반감기(d) 청소율(mL/d/kg) 반감기(d)
6623 13.6 5.6 97.3 0.3
6624 22.5 6.2 143 0.6
6625 13.0 7.2 61.3 1.2
6626 9.6 7.3 57.8 1.1
전술한 발명은 명확한 이해를 위해 예시 및 실시예를 통해 상세히 설명하였으나, 이러한 설명 및 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시는 그 전체가 명백하게 원용된다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Antibodies binding to GPRC5D <130> P35639 <140> PCT/EP2020/071182 <141> 2020-07-28 <150> EP 19189255.3 <151> 2019-07-31 <160> 133 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Ala Met Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Ala 1 5 10 15 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly Ile Asn Leu Met Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 His Ala Ser Ile Leu Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Gln Gln Thr 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Arg Leu Glu Ser Gly Val 275 280 285 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr 290 295 300 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 305 310 315 320 Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 325 330 335 Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 340 345 350 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 355 360 365 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 370 375 380 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 405 410 415 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 420 425 430 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 435 440 445 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 450 455 460 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 465 470 475 480 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 485 490 495 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 500 505 510 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 515 520 525 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 530 535 540 Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 545 550 555 560 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys 565 570 575 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys 580 585 590 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 595 600 605 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 610 615 620 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 625 630 635 640 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 645 650 655 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 660 665

Claims (32)

  1. 이중특이적 항원 결합 분자로서,
    (a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티로서, 상기 제1 항원은 GPRC5D이고,
    (i) 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 84의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (ii) 서열번호 83의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 85의 HCDR 2, 및 서열번호 86의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 87의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 88의 LCDR 2, 및 서열번호 89의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (iii) 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (iv) 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 91의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 96의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    (v) 서열번호 90의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 92의 HCDR 2, 및 서열번호 93의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 94의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 95의 LCDR 2, 및 서열번호 97의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제1 항원 결합 모이어티; 및
    (b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티로서, 상기 제2 항원은 CD3이고,
    (i) 서열번호 29의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 30의 HCDR 2, 및 서열번호 31의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 32의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 33의 LCDR 2, 및 서열번호 34의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (i) 서열번호 98의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 99의 HCDR 2, 및 서열번호 100의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 101의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 102의 LCDR 2, 및 서열번호 103의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    (ii) 서열번호 106의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 107의 HCDR 2, 및 서열번호 108의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 109의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 110의 LCDR 2, 및 서열번호 111의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티
    를 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    (i) 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VH는 서열번호 13의 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 14의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (ii) 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VH는 서열번호 15의 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (iii) 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VH는 서열번호 48의 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 53의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (iv) 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VH는 서열번호 49의 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 52의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (v) 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VH는 서열번호 57의 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 64의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (vi) 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VH는 서열번호 58의 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 63의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는,
    이중특이적 항원 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제2 항원 결합 모이어티의 VH는 아미노산 서열을 포함하고,
    (i) 상기 아미노산 서열은 서열번호 35의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 36의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (ii) 상기 아미노산 서열은 서열번호 104의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 105의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (iii) 상기 아미노산 서열은 서열번호 112의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, 상기 제2 항원 결합 모이어티의 VL은 서열번호 113의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는,
    이중특이적 항원 결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및/또는 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자인, 이중특이적 항원 결합 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이고, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1, 특히 가변 도메인 VL 및 VH는 상호 대체되는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이고, 상기 불변 도메인에서 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트(Kabat)에 따른 넘버링), 위치 123의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환되며(카바트 EU 지수에 따른 넘버링), 위치 213의 아미노산은 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환되는(카바트 EU 지수에 따른 넘버링), 이중특이적 항원 결합 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 상호, 선택적으로 펩티드 링커를 통해 융합되는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 분자이고, (i) 상기 제2 항원 결합 모이어티는 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되거나, (ii) 상기 제1 항원 결합 모이어티는 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    제3 항원 결합 모이어티를 포함하는, 이중특이적 결합 분자.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 제3 항원 모이어티는 상기 제1 항원 결합 모이어티와 동일한, 이중특이적 결합 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제1, 제2, 및, 존재하는 경우, 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 분자이고; (i) 상기 제2 항원 결합 모이어티는 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 Fc 도메인의 제1 아단위의 N 말단에 융합되거나, (ii) 상기 제1 항원 결합 모이어티는 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 상기 제2 항원 결합 모이어티는 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 Fc 도메인의 제1 아단위의 N 말단에 융합되며; 상기 제3 항원 결합 모이어티는, 존재하는 경우, 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 Fc 도메인의 제2 아단위의 N 말단에 융합되는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인인, 이중특이적 항원 결합 분자.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인인, 이중특이적 항원 결합 분자.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인인, 이중특이적 항원 결합 분자.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인 내 아미노산 잔기는 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체됨으로써 상기 제2 아단위의 CH3 도메인 내부 공동에 위치가능한 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 돌기를 생성하고, 상기 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인 내 아미노산 잔기는 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체됨으로써 상기 제1 아단위의 CH3 도메인 내부 돌기가 위치가능한 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 공동을 생성하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 도메인은 Fc 수용체 및/또는 효능기 기능에 대한 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항원 결합 분자를 부호화하는, 하나 이상의 분리된 폴리뉴클레오티드.
  19. 제18항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 하나 이상의 벡터, 특히 발현 벡터.
  20. 제18항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제19항에 따른 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  21. GPRC5D에 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자를 생성하는 방법으로서,
    a) 상기 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에서 제20항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 b) 선택적으로 상기 이중특이적 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 따른 방법에 의해 생성된, GPRC5D에 결합하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  23. 제1항 내지 제17항 및 제22항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  24. 약제로서 사용하기 위한 제1항 내지 제17항 및 제22항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항원 결합 분자 또는 제23항에 따른 약학적 조성물.
  25. 질병의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제17항 및 제22항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항원 결합 분자 또는 제23항에 따른 약학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 질병은 암 또는 자가면역 질환인, 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학적 조성물.
  27. 제25항에 있어서,
    상기 질병은 다발성 골수종인, 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학적 조성물.
  28. 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에서, 제1항 내지 제17항 및 제22항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항원 결합 분자의 용도.
  29. 개인의 질병을 치료하는 방법으로서, 약학적으로 허용가능한 형태의 제1항 내지 제17항 및 제22항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 상기 개인에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서,
    상기 질병은 암 또는 자가면역 질환인, 용도 또는 방법.
  31. 제28항 또는 제29항에 있어서,
    상기 질병은 다발성 골수종인, 용도 또는 방법.
  32. 본원에 기재된 바와 같은 발명.
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