PT2519543T - Proteínas de ligação de heterodímero e suas utilizações - Google Patents

Proteínas de ligação de heterodímero e suas utilizações Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO DE HETERODIMERO E SUAS UTILIZAÇÕES A Listagem de Sequências associada a este pedido é proporcionada em formato de texto em vez de cópia em papel, e é aqui incorporado para referência na especificação. 0 nome do ficheiro de texto contendo a Listagem de Sequências é 910180_422PC_SEQUENCE_LISTING.txt. 0 ficheiro de texto tem 839 KB, foi criado em 29 de Dezembro de 2010, e foi submetido eletronicamente via EFS-Web, concorrente com o preenchimento da especificação.
ANTECEDENTES
Campo Técnico A presente revelação geralmente proporciona polipéptidos heterodimero, suas composições, e métodos para a preparação e utilizando estes polipéptidos heterodimero. Mais especificamente, os polipéptidos heterodimero aqui proporcionada são formados, em parte, via heterodimerização natural entre uma região CHl de imunoglobulina e uma região constante de cadeia leve de imunoglobulina (CL) . Adicionalmente, os polipéptidos heterodimero aqui proporcionados compreendem dois ou mais dominios de ligação que ligam especif icamente um ou mais alvos. Além disso, ambos os polipéptidos de cadeia única dos polipéptidos heterodimero aqui proporcionados compreendem, cada um, uma porção da região Fc (e. g., dominios CH2 e CH3 de imunoglobulina).
Descrição da técnica Relacionada 0 processo de transdução de sinal envolve frequentemente proteínas recetoras que têm domínios extracelulares, domínios transmembranares, e domínios intracelulares. Durante a ligação do ligando, moléculas recetoras na superfície da célula oligomerizam ou multimerizam frequentemente (também referidos como "reticulação") para transmitir eficazmente um sinal para o compartimento intracelular da célula. A estimulação ou bloqueio desta interação entre um recetor e um ligando ou a subsequente oligomerização ou multimerização de recetores tem importantes implicações terapêuticas numa grande variedade de doenças.
As moléculas exemplificativas úteis na modulação das interações do recetor e ligando incluem anticorpos ou moléculas derivadas de anticorpos. Por exemplo, um anticorpo ou seu derivado pode funcionar como um recetor antagonista que se liga a um recetor à superfície da célula e inativa-o por bloqueio do sítio de ligação de um ligando de ativação ou evitando a dimerização ou multimerização do recetor necessária para a ativação. Em certos outros casos, um anticorpo ou um seu derivado pode funcionar como um agonista por ligação a e ligando de forma cruzada recetores de membrana únicos, mimando a função de um ligando natural. Outro exemplo é um derivado de anticorpo biespecífico que pode ser utilizado para dirigir agentes citotóxicos ou células efetoras imunitárias para os sítios alvo, tais como tumores.
Os anticorpos biespecíficos são moléculas à base de anticorpo que podem simultaneamente ligar-se a dois antigénios separados e distintos (ou diferentes epitopos do mesmo antigénio). Uma utilização de anticorpos biespecíficos foi o redirecionar células efetoras imunitárias citotóxicas para melhorar a morte de células de tumor por citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Neste contexto, um braço do anticorpo biespecífico liga-se a um antigénio na célula de tumor, e os outros ligam-se um determinante expresso em células efetoras. Através de ligação cruzada de tumor e células efetoras, o anticorpo biespecífico não traz apenas as células efetoras na proximidade das células de tumor mas também desencadeia simultaneamente a sua ativação, levando a morte efetiva de célula de tumor. Os anticorpos biespecíficos foram também utilizados para enriquecer em agentes quimio ou radioterapêuticos tecidos de tumor para minimizar os efeitos prejudiciais ao tecido normal. Neste quadro, um braço do anticorpo biespecífico liga-se a um antigénio expresso na célula alvo de destruição, e o outro braço distribui um fármaco quimioterapêutico, radioisótopo, ou toxina.
Um obstáculo principal no desenvolvimento geral de anticorpos biespecíficos foi a dificuldade em produzir materiais de qualidade e quantidade suficientes para ambos os estudos pré-clínicos e clínicos. Inicialmente, a via principal para a produção de anticorpos biespecíficos foi por co-expressão de ambas as cadeias leves e ambas as cadeias dos dois anticorpos parentais de diferentes especificidades numa célula única. No entanto, os anticorpos biespecíficos competentes para ligação desejados são um produto menor, e a purificação a partir de outros produtos é muito difícil. Outro método tradicional para a produção de anticorpo biespecífico é a conjugação química de dois anticorpos ou seus fragmentos possuindo diferentes especificidades. No entanto, este método é também complicado, e um processo de modificação química pode inativar o anticorpo ou promove agregação. Devido à purificação de produtos indesejados permanece difícil, o baixo rendimento resultante e a baixa qualidade de anticorpo biespecífico torna este processo adequado para a produção em larga escala necessária para o desenvolvimento clínico.
Recentemente, várias técnicas de heterodimerização foram utilizadas para melhorar a produção de anticorpos biespecíficos. No entanto, a fusão de domínios simples de heterodimerização como o Jun/Fos enrolado em serpentina aos domínios scFv levam a uma mistura de homo- e heterodímeros e precisa de ser montada por reorganização (de Kruif e Logtenberg, J. Biol. Chem. 271: 7630-4, 1996). A fusão de fragmentos scFv com anticorpos completos foi também utilizada como um dispositivo de dimerização (Coloma e Morrison, Nat. Biotechnol. 15: 159-63, 1997) . No entanto, esta fusão resulta numa grande molécula com fracas capacidades de penetração. A fusão de dois fragmentos scFv um com o outro foi também utilizada para produzir proteínas biespecíficas (e. g., BITE® anticorpos por Micromet Inc., Bethesda, MD, Patente US N° 7 635 472) . No entanto, estas proteínas não contêm regiões Fc, e deste modo não permitem a manipulação das suas atividades através das regiões Fc. Adicionalmente, estas proteínas são pequenas (-55 kDa) e deste modo tem semi-vidas relativamente curtas no soro. A WO 2006/074399 A2 revela moléculas de ligação multiespecíficas compreendendo péptidos sintéticos de ligação. A WO 02/02781 AI refere-se à produção de anticorpos biespecíficos ou multiespecíficos, bi- ou tetravalentes utilizando métodos de DNA recombinantes e métodos de produção recombinante. O anticorpo resultante consiste em uma ou duas moléculas diacorpo que são heterodimerizadas ao criar uma proteína de fusão com os domínios constantes de imunoglobulina CL e CHI. A US 6 809 185 BI revela uma classe de moléculas especificadas como novos derivados de anticorpo com aplicações múltiplas. A US 2007/014794 AI revela um método de preparação de polipéptidos heteromultiméricos tais como anticorpos biespecíficos, imunoadesinas biespecíficas e quimeras anticorpo-imunoadesinas.
Até à data, a tecnologia de fusão de imunoglobulina não proporcionou proteínas heterodiméricas comercialmente viáveis ou métodos para os preparar. Deste modo, permanece a necessidade na técnica para proteínas heterodiméricas alternativas multiespecíficas assim como métodos eficientes para a produção dos mesmos.
Num primeiro aspeto da presente invenção é proporcionado um polipéptido heterodímero, compreendendo: (a) um primeiro polipéptido de cadeia única (SCP-I) compreendendo de um a quatro domínios de ligação que ligam especificamente de um a quatro alvos, uma charneira (H-I), um domínio de heterodimerização de imunoglobulina (HD-I), e um domínios CH2 e CH3 de imunoglobulina IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, lgA2, IgD, ou qualquer combinação destes (CH2CH3- I) ; e (b) um segundo polipéptido de cadeia única (SCP-II) compreendendo de zero a quatro domínios de ligação que ligam especificamente de zero a quatro alvos, uma charneira (H- II) , uma imunoglobulina com domínio 3 de heterodimerização (HD-II), e domínios CH2 e CH3 da imunoglobulina IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, ou qualquer combinação destes (CH2CH3-II); em que (i) o dominio de heterodimerização de imunoglobulina do primeiro polipéptido de cadeia única (HD-I) e o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do segundo polipéptido de cadeia única (HD-11) associam-se preferencialmente um com o outro para formar um polipéptido heterodímero constituído pelo primeiro polipéptido de cadeia única (SCP-I) e o segundo polipéptido de cadeia única (SCP-II), e (1) o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do primeiro polipéptido de cadeia única (HD-I) compreende uma primeira região CHI de imunoglobulina 1, e o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do segundo polipéptido de cadeia única (HD-II) compreende uma primeira região CL de imunoglobulina, ou (2) o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do primeiro polipéptido de cadeia única (HD-I) compreende uma primeira região CL de imunoglobulina, e o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do segundo polipéptido de cadeia única (HD-II) compreende uma primeira região CHI de imunoglobulina; (ii) em que a primeira região CL de imunoglobulina é uma região Cx de imunoglobulina humana alterada com um ou mais aminoácidos de uma região Ck humana de tipo selvagem substituída em N29, N30, Q52, V55, T56, S68, ou T70, desde que o polipéptido heterodímero compreenda pelo menos dois domínios de ligação que ligam especificamente pelo menos dois alvos diferentes.
Num outro aspeto da presente invenção é também proporcionada uma composição compreendendo o polipéptido heterodímero da presente invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Em outro aspeto da presente invenção é também proporcionado o polipéptido heterodímero da presente invenção para utilização em a) um método para dirigir a ativação de células T, em que o polipéptido heterodímero compreende um domínio de ligação que especificamente se liga a TCRa, TCRP, 0Ό3γ, CD35, CD3s ou uma sua combinação, e a segundo domínio de ligação que especificamente se liga a diferentes alvos; ou b) inibição do crescimento, metástases ou crescimento metastásico de uma malignidade, em que o polipéptido heterodímero compreende um domínio de ligação que especificamente se liga a TCRa, TCR3, CD3y, CD35, CD3s, c-Met ou Ron. c) tratamento de um estado autoimune ou inflamatório, em que o polipéptido heterodímero compreende um domínio de ligação que especificamente se liga a TCRa, TCR3, CD3y, CD35, CD3s, ou CD28.
Em outro aspeto da presente invenção é proporcionado um efetor de expressão capaz de expressar o polipéptido heterodímero da presente invenção compreendendo um vetor de expressão capaz de expressar o polipéptido heterodímero da presente invenção, compreendendo um primeiro polinucleótido que codifica o primeiro polipéptido de cadeia única e um segundo polinucleótido que codifica a segundo polinucleótido de cadeia simples. A presente invenção também proporciona uma célula hospedeira compreendendo o vetor de expressão da presente invenção e uma célula hospedeira compreendendo o primeiro e segundo vetores de expressão capazes de expressar o primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única, respetivamente, do polipéptido heterodimero da presente invenção.
Em outro aspeto da presente invenção é proporcionado um método para preparar um polipéptido heterodimero, compreendendo (a) cultura de uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção em condições adequadas para expressar o primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única, e (b) opcionalmente isolar ou purificar os heterodímeros formados a partir do primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única a partir da cultura. A presente revelação proporciona polipéptidos heterodimero formados entre dois diferentes polipéptidos de cadeia única via heterodimerização natural de uma região CHI de imunoglobulina e uma região constante de cadeia leve de imunoglobulina (CL) . A presente revelação também proporciona ácidos nucleicos, vetores, células hospedeiras e métodos para preparar polipéptidos heterodimero assim como métodos para utilização destes polipéptidos heterodimero, tais como na ativação dirigida de células T, inibindo o crescimento de malignidades sólidas, tratando estados autoimunitários ou inflamatórios, ou tratando distúrbios ou doenças associadas a células B.
Num aspeto, a presente revelação proporciona um polipéptido heterodímero que compreende(a) um primeiro polipéptido de cadeia única (SCP-I) compreendendo de um a quatro dominios de ligação que ligam especificamente de um a quatro alvos, uma charneira (H-I), um dominio de heterodimerização de imunoglobulina (HD-I), e uma porção da região Fc (FRP-I); e (b) um segundo polipéptido de cadeia única (SCP-II) compreendendo de zero a quatro dominios de ligação que ligam especificamente de zero a quatro alvos, uma charneira (H-II), um dominio de heterodimerização de imunoglobulina (HD-II) , e uma porção da região Fc (FRP-II) ; em que (i) a imunoglobulina HD-I e a imunoglobulina HD-II associam-se preferencialmente uma com a outra para formar um polipéptido heterodímero constituído por SCP-I e SCP-II, e (1) o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do primeiro polipéptido de cadeia única (HD-I) compreende uma primeira região CHI de imunoglobulina, e o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do segundo polipéptido de cadeia única (HD-II) compreende a primeira região CL de imunoglobulina, ou (2) o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do primeiro polipéptido de cadeia única (HD- I) compreende uma primeira região CL de imunoglobulina, e o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do segundo polipéptido de cadeia única (HD-II) compreende uma primeira região CHI de imunoglobulina; e (ii) a porção da região Fc de SCP-I e a porção da região Fc de SCP-II compreende um domínio CH2 e CH3 das imunoglobulinas IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, ou qualquer combinação destes; um ou dois domínios CH3 de imunoglobulina de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE, IgM, ou qualquer combinação destes; ou um domínio CH3 e CH4 de imunoglobulina de IgE, IgM, ou qualquer combinação destes, desde que o polipéptido heterodímero compreenda pelo menos dois domínios de ligação que se ligam especificamente a um alvo, por exemplo, pelo menos dois alvos diferentes.
Em certas formas de realização, os domínios de ligação dos polipéptidos heterodímero são polipéptidos Fv de cadeia simples (scFv).
Em certas formas de realização, o polipéptido heterodímero compreende dois domínios de ligação (BD1 e BD2). Numa forma de realização, os dois domínios de ligação (BD1 e BD2) estão ambos no primeiro polipéptido de cadeia única (SCP-I) e em que a HD-I e FRP-I estão dispostos entre BD1 e BD2. Noutra forma de realização, o primeiro domínio de ligação (BD1) está no primeiro polipéptido de cadeia única (SCP-I) e o segundo domínio de ligação (BD2) está no segundo polipéptido de cadeia única (SCP-II). Por exemplo, o primeiro domínio de ligação (BD1) pode ser amino terminal à porção da região Fc do primeiro polipéptido de cadeia única (FRP-I), e o segundo domínio de ligação (BD2) pode ser amino terminal à porção da região Fc do segundo polipéptido de cadeia única (FRP-II). Alternativamente, o primeiro domínio de ligação (BD1) pode ser amino terminal à porção da região Fc do primeiro polipéptido de cadeia única (FRP-I), e o segundo domínio de ligação (BD2) pode ser carboxi-terminal à porção da região Fc do segundo polipéptido de cadeia única (FRP-II). Também alternativamente, o primeiro domínio de ligação (BD1) pode ser carboxi-terminal à porção da região Fc do primeiro polipéptido de cadeia única (FRP-I), e o segundo domínio de ligação (BD2) pode ser carboxi-terminal à porção da região Fc do segundo polipéptido de cadeia única (FRP-II).
Em certas formas de realização, o polipéptido heterodímero compreende três domínios de ligação (BD1, BD2 e BD3). Numa forma de realização, o HD-I e FRP-I estão dispostos entre BD1 e BD2, e o terceiro domínio de ligação (BD3) é amino terminal à porção da região Fc do segundo polipéptido de cadeia única (FRP-II). Numa forma de realização alternativa, o HD-I e FRP-I são dispostos entre BD1 e BD2, e o terceiro domínio de ligação (BD3) é carboxi-terminal à porção da região Fc do segundo polipéptido de cadeia única (FRP-II).
Em certas formas de realização, o polipéptido heterodímero compreende quatro domínios de ligação (BD1, BD2, BD3, e BD4) . Por exemplo, o HD-I e FRP-I podem estar dispostos entre BD1 e BD2, e o HD-II e FRP-II podem estar dispostos entre BD3 e BD4 .
Em certas formas de realização, o polipéptido heterodímero compreende cinco a oito domínios de ligação (e. g.f 5, 6, 7 ou 8 domínios de ligação).
Em certas formas de realização, pelo menos um dos domínios de ligação dos polipéptidos heterodímero aqui proporcionados ligam-se especificamente a, ou são um antagonista de, TCRa, ΤΟΕβ, CD3y, CD35, CD3s, CD28, CD79b, hyperIL-6, monoIL-10, CD86, CD20, PSMA, CD 19, HLA-DR, Ron, c-Met, CEACAM-6, LIGHT, GITRL, CD4 0, PDL1, PDL2, HVEM, LTBR, EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, IGF1R, EphA2, PDGFR, VEGFR1-4, Angiopoietina 2, CD64, CD32A, CD16, CD71, TNFR1, TNFR2, TWEAKR, TACI, BAFF-R, BCMA, FAS, CD32B, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD7 0, TNFa, IL-6, hyperIL-6, IL-2, IL-1, IL-7, IL-8, IL-17A/C, IP-10, IFNy, IFNa, RANKL, FASL, EGFp, IL10, IL17A/F, CSF2, IGF1, IGF2, BLyS/APRIL, HGF, MSP, EGF (incluindo epirregulina, herregulina, β-regulina, neuregulina), HIF-la, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, TNFa, Wnt, SHH, Ε6Γβ, PDGF, TWEAK, EpCAM, CEA, PCTA-1, STEAP-1, PSCA, ALCAM (CD166), EphA2, CD151, CA-125, MUC-1, MAGE-1, TR0P2, CCR5, HER-3, HER-4, EGFR, CEA, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5b, MUC7, PhCG, Lewis-Y, gangliósido GD3, 9-0-Acetil-GD3, GM2, Globo H, fucosil GM1, Poly SA, GD2, Carboanidrase IX (MN/CA IX) , CD44v6, Sonic Hedgehog (Shh), Wue-1, Antigénio contra Células do Plasma, IgE ( ligado a membrana), Proteoglicano Sulfato de Condroitina Melanoma (MCSP), CCR8, precursor TNF-alfa, STEAP, mesotelina, Antigénio A33, Antigénio contra as Células Estaminais da Próstata (PSCA), Ly-6; desmogleina 4, neoepitopo de E-caderina, Recetor de Acetilcolina Fetal, CD25, marcador CA19-9, marcador CA-125 e Recetor tipo II de Substância Inibidora Mueleriana (MIS), sTn (antigénio sialilado Tn; TAG-72) , FAP (antigénio de ativação de fibroblastos), endosialina, EGFRvIII, LG, SAS, CD63, IGF1R, CD151, TGFBR2, GHRHR, GHR, IL-6R, gpl30, TNFR2, OSMRβ, Patched-1, Frizzled, Robol, CD80, CD81, CD86, 0X40, CD40, CD137, LIFERp, TLR7 ou TLR9.
Em determinadas outras formas de realização pelo menos um dos domínios de ligação do polipéptido heterodímero é um agonista de IL-10, HLA-G, HGF, IL-35, PD-1, BTLA, TNFR1, TNFR2, DR4, DR5, TWEAKR, ou FAS.
Em certos polipéptidos heterodímero aqui proporcionados, pelo menos um domínio de ligação liga-se especificamente a complexo de TCR ou um seu componente, e pelo menos outro domínio de ligação liga-se especificamente a PSMA, CD79b, CD19, HLADR, CD20, RON, c-Met, ou CEACAM-6.
Em certos outros polipéptidos heterodímero aqui proporcionados, pelo menos um domínio de ligação liga-se especificamente a CD28, e pelo menos outro domínio de ligação liga-se especificamente a, ou é um antagonista de, CD79b, hyperIL-6, PDL2, monoIL-10, CD86, LIGHT, GITRL, CD40, PDL1, HVEM, OU LTBR.
Em certos outros polipéptidos heterodímero aqui proporcionados, pelo menos um domínio de ligação liga-se especificamente a CD28, e pelo menos outro domínio de ligação é um agonista de IL-10, HLA-G, HGF, IL-35, PD-1, ou BTLA.
Em certas formas de realização, o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do primeiro polipéptido de cadeia única (HD-I) compreende a primeira região CHI de imunoglobulina e o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do segundo polipéptido de cadeia única (HD-II) compreende a primeira região CL de imunoglobulina. Numa forma de realização, a primeira região CHI é amino terminal à porção da região Fc do primeiro polipéptido de cadeia única, e a primeira região CL é amino terminal à porção da região Fc do segundo polinucleótido de cadeia simples. Noutra forma de realização, a primeira região CHI é carboxi-terminal à porção da região Fc do primeiro polipéptido de cadeia única, e a primeira região CL é carboxi-terminal à porção da região Fc do segundo polinucleótido de cadeia simples.
Em certas formas de realização nas quais o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do primeiro polipéptido de cadeia única (HD-I) compreende a primeira região CHI de imunoglobulina e o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do segundo polipéptido de cadeia única (HD-II) compreende a primeira região CL de imunoglobulina, o primeiro polipéptido de cadeia única compreende ainda uma segunda região CHI e o segundo polipéptido de cadeia única compreende ainda uma segunda região CL, e a segunda região CHI do primeiro polipéptido de cadeia única e a segunda região CL do segundo polipéptido de cadeia única associam- se uns com os outros no polipéptido heterodímero. Por exemplo, a porção da região Fc do primeiro polipéptido de cadeia única pode ser disposta entre a primeira e segunda região CHI, e a porção da região Fc do segundo polipéptido de cadeia única pode ser disposta entre a primeira e segunda região CL. Alternativamente, tanto a primeira e segunda região CHI podem ser amino terminais à porção da região Fc do primeiro polipéptido de cadeia única, e a primeira e segunda região CL podem ser amino terminais à porção da região Fc do segundo polinucleótido de cadeia simples. Também alternativamente, a primeira e segunda região CHI podem ser carboxi-terminais à porção da região Fc do primeiro polipéptido de cadeia única, e a primeira e segunda região CL podem ser carboxi-terminais à porção da região Fc do segundo polinucleótido de cadeia simples.
Em determinadas outras formas de realização nas quais o dominio de heterodimerização de imunoglobulina do primeiro polipéptido de cadeia única (HD-I) compreende a primeira região CHI de imunoglobulina e o dominio de heterodimerização de imunoglobulina do segundo polipéptido de cadeia única (HD-II) compreende a primeira região CL de imunoglobulina, o primeiro polipéptido de cadeia única compreende ainda a segunda região CL e o segundo polipéptido de cadeia única compreende ainda a segunda região CHI, e a segunda região CL do primeiro polipéptido de cadeia única e a segunda região CHI do segundo polipéptido de cadeia única associam-se umas com as outras no polipéptido heterodímero. Por exemplo, em uma forma de realização, no primeiro polipéptido de cadeia única, a primeira região CHI é amino terminal à porção da região Fc e a segunda região CL é carboxi-terminal à porção da região Fc; e no segundo polinucleótido de cadeia simples, a primeira região CL é amino terminal à porção da região Fc, e a segunda região CHI é carboxi-terminal à porção da região
Fc. Noutra forma de realização, no primeiro polipéptido de cadeia única, a primeira região CHI é carboxi-terminal à porção da região Fc, e a segunda região CL é amino terminal à porção da região Fc; e no segundo polinucleótido de cadeia simples, a primeira região CL é carboxi-terminal à porção da região Fc, e a segunda região CHI é amino terminal à porção da região Fc. Ainda noutra forma de realização, no primeiro polipéptido de cadeia única, a primeira região CHI e a segunda região CL são amino terminais à porção da região Fc, e a primeira região CHI é amino terminal à segunda região CL; e no segundo polinucleótido de cadeia simples, a primeira região CL e a segunda região CHI são amino terminais à porção da região Fc, e a primeira região CL é amino terminal à segunda região CHI. Ainda noutra forma de realização, no primeiro polipéptido de cadeia única, a primeira região CHI e a segunda região CL são amino terminais à porção da região Fc, e a segunda região CL é amino terminal à primeira região CHI; e no segundo polinucleótido de cadeia simples, a primeira região CL e a segunda região CHI são amino terminais à porção da região Fc, e a segunda região CHI é amino terminal à primeira região CL. Numa outra forma de realização, no primeiro polipéptido de cadeia única, a primeira região CHI e a segunda região CLs são carboxi-terminais à porção da região Fc, e a primeira região CHI é amino terminal à segunda região CL; e no segundo polinucleótido de cadeia simples, a primeira região CL e a segunda região CHI são carboxi-terminais à porção da região Fc, e a primeira região CL é amino terminal à segunda região CHI. Noutra forma de realização, no primeiro polipéptido de cadeia única, a primeira região CHI e a segunda região CL são carboxi-terminais à porção da região Fc, e a segunda região CL é amino terminal à primeira região CHI; e no segundo polinucleótido de cadeia simples, a primeira região CL e a segunda região CHI são carboxi-terminais à porção da região
Fc, e a segunda região CHI é amino terminal à primeira região CL.
Em certas formas de realização, o dominio de heterodimerização de imunoglobulina do primeiro polipéptido de cadeia única (HD-I) compreende a primeira região CL de imunoglobulina, e o dominio de heterodimerização de imunoglobulina do segundo polipéptido de cadeia única (HD-II) compreende a primeira região CHI de imunoglobulina. Numa forma de realização, a primeira região CL é amino terminal à porção da região Fc do primeiro polipéptido de cadeia única, e a primeira região CHI é amino terminal à porção da região Fc do segundo polinucleótido de cadeia simples. Noutra forma de realização, a primeira região CL é carboxi-terminal à porção da região Fc do primeiro polipéptido de cadeia única, e a primeira região CHI é carboxi-terminal à porção da região Fc do segundo polinucleótido de cadeia simples. Ainda em outra forma de realização, o primeiro polipéptido de cadeia única compreende ainda a segunda região CL e o segundo polipéptido de cadeia única compreende ainda a segunda região CHI, e a segunda região CL do primeiro polipéptido de cadeia única e a segunda região CHI do segundo polipéptido de cadeia única associam-se umas com as outras no polipéptido heterodimero. Por exemplo, a porção da região Fc do primeiro polipéptido de cadeia única pode ser disposta entre a primeira e segunda região CL, e a porção da região Fc do segundo polipéptido de cadeia única pode ser disposta entre a primeira e segunda região CHI. Alternativamente, a primeira e segunda região CL podem ser amino terminais à porção da região Fc do primeiro polipéptido de cadeia única, e a primeira e segunda região CHI podem ser amino terminais à porção da região Fc do segundo polinucleótido de cadeia simples. Também alternativamente, a primeira e segunda região CL podem ser carboxi-terminais à porção da região Fc do primeiro polipéptido de cadeia única, e a primeira e segunda região CHI podem ser carboxi-terminais à porção da região Fc do segundo polinucleótido de cadeia simples.
Em certas formas de realização, a primeira região CL é uma região Ck. Em outras formas de realização, a primeira região CL é uma região CÀ.
Em certas formas de realização, a segunda região CL é uma região Ck. Em outras formas de realização, a segunda região CL é uma região CÀ.
Em certas formas de realização, a região Ck é uma região Ck de imunoglobulina humana do tipo selvagem. Em determinadas outras formas de realização, a região Ck é uma região Cx de imunoglobulina humana alterada com um ou mais aminoácidos de uma região Ck humana de tipo selvagem substituída em N29, N30, Q52, V55, T56, T56, S68, ou T70. Por exemplo, a uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser selecionadas a partir de Ala (A) , Arg (R) , Trp (W) , Tyr (Y) , Glu (E) , Gin (Q) , Lys (K), Asp (D), Met (M), Ser (S), e Phe (F) .
Em certas formas de realização, a região CHI é uma região CHI de imunoglobulina humana alterada compreendendo uma substituição de aminoácidos através da qual Vai (V) na posição 68 é substituído por Lys (K), Arg (R) ou His (H), e em que a região Ck é uma região Ck de imunoglobulina humana alterada compreendendo uma substituição de aminoácidos através da qual Leu (L) na posição 29 é substituído por Asp (D) ou Glu (E). Em determinadas outras formas de realização, a região CHI é uma região CHI de imunoglobulina humana alterada compreendendo uma substituição de aminoácidos através da qual Vai (V) na posição 68 é alterada para Asp (D) ou Glu (E) , e em que a região Ck é uma região Ck de imunoglobulina humana alterada compreendendo uma substituição de aminoácidos através da qual Leu (L) na posição 29 é alterada para Lys (K), Arg (R) ou His (H).
Em certas formas de realização, a região CÀ é uma região CÀ de imunoglobulina humana do tipo selvagem.
Em certas formas de realização, a primeira região CHI ou a segunda região CHI quando presente é uma região CHI de imunoglobulina humana do tipo selvagem, tal como uma região CHI de IgGl humana do tipo selvagem.
Em certas formas de realização, a primeira região CHI ou a segunda região CHI quando presente é uma região CHI de imunoglobulina humana alterada, tal como uma região CHI de IgGl humana alterada, com a cisteína de uma região CHI de imunoglobulina humana do tipo selvagem que está envolvida na formação de uma ligação persulfureto com uma região CL de imunoglobulina humana do tipo selvagem removida ou substituída.
Em certas formas de realização, a região Ck é uma região Ck de imunoglobulina humana alterada, tal como uma com o resíduo de cisteína de uma região Ck humana de tipo selvagem que está envolvida na formação de uma ligação persulfureto com a região CHI de imunoglobulina humana do tipo selvagem removida ou substituída.
Em certas formas de realização, a região CÀ é uma região CÀ de imunoglobulina humana alterada com o resíduo de cisteína de uma região CÀ humana do tipo selvagem que está envolvida na formação de uma ligação persulfureto com uma região CHI de imunoglobulina humana do tipo selvagem removida ou substituída.
Em certas formas de realização, a primeira região CHI e a segunda região CHI quando presente é um polipéptido compreendendo a SEQ ID NO:114, 844 ou 845.
Em certas formas de realização, a região Ck quando presente é selecionada a partir de qualquer um dos polipéptidos compreendendo as SEQ ID NOS:141-178, 202, e 838-843.
Em certas formas de realização, a região CX quando presente é um polipéptido compreendendo a SEQ ID NO:140.
Em certas formas de realização, a porção da região Fc do primeiro polipéptido de cadeia única (FRP-I) e a porção da região Fc do segundo polipéptido de cadeia única (FRP-II) compreendem, cada uma, um domínio CH2 de imunoglobulina, tal como um domínio CH2 de IgGl ou um domínio CH2 de IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, ou IgD.
Em certas formas de realização, a porção da região Fc do primeiro polipéptido de cadeia única (FRP-I) e a porção da região Fc do segundo polipéptido de cadeia única (FRP-II) compreendem, cada uma, um domínio CH3 de imunoglobulina, tal como um domínio CH3 de IgGl ou um domínio CH3 de IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE ou IgM.
Em certas formas de realização, a porção da região Fc do primeiro polipéptido de cadeia única (FRP-I) e a porção da região Fc do segundo polipéptido de cadeia única (FRP-II) compreendem, cada uma, um domínio CH2 de imunoglobulina e um domínio CH3 de imunoglobulina, tal como são os domínios CH2 e CH3 de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, ou IgD.
Em algumas formas de realização nas quais a porção da região Fc compreende um domínio CH3 de imunoglobulina que é imediatamente amino terminal a um domínio de heterodimerização de imunoglobulina (e. g., um domínio CHI ou um domínio Ck) , o domínio CH3 de imunoglobulina está ligado ao domínio CHI imediatamente carboxi-terminal ao domínio CH3 de imunoglobulina num polipéptido de cadeia única através de um péptido compreendendo as SEQ ID NOS :846, 847, 848, ou 849; e o domínio CH3 de imunoglobulina está ligado ao domínio Ck imediatamente carboxi-terminal ao domínio CH3 de imunoglobulina nos outros polipéptidos de cadeia única através de um péptido compreendendo as SEQ ID NOs:846, 850, 951, ou 852 .
Em certas formas de realização, a porção da região Fc do primeiro polipéptido de cadeia única (FRP-I) e a porção da região Fc da segunda cadeia de polipéptido (FRP-II) compreende os domínios CH3 e CH4 de IgM ou IgE.
Em certas formas de realização nas quais a porção da região Fc compreende um domínio CH2 de imunoglobulina, o domínio CH2 pode ser um domínio CH2 humano alterado de IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4. Os domínios CH2 exemplificativos humanos alterados de IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 incluem aqueles que compreendem (a) uma substituição de aminoácidos na posição 297 e pelo menos uma substituição ou deleção adicional nas posições 234 a 238; (b) uma ou mais mutações de aminoácidos nas posições 234-238 e pelo menos uma substituição na posição 253, 310, 318, 320, 322, ou 331; ou (c) uma substituição de aminoácidos na asparagina da posição 297, uma ou mais substituições ou deleções nas posições 234 a 238, e pelo menos uma substituição na posição 253, 310, 318, 320, 322, ou 331. Outro domínio CH2 exemplificativo é um domínio CH2 alterado da IgGl humana que compreende substituições de aminoácidos nas posições L234, L235, G237, E318, K320 e K322.
Em certas formas de realização, o domínio CH3 do primeiro polipéptido de cadeia única é um domínio CH3 humano alterado da IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4 que compreende um T366W, e o domínio CH3 do segundo polipéptido de cadeia única é um domínio CH3 humano alterado de IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 que compreende uma substituição Y407A. Em determinadas outras formas de realização, o domínio CH3 do primeiro polipéptido de cadeia única é um domínio CH3 de IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4 humana alterado que compreende uma substituição T366Y, e o domínio CH3 do segundo polipéptido de cadeia única é um domínio CH3 humano alterado de IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 que compreende uma substituição Y407T. Em determinadas outras formas de realização, o domínio CH3 do primeiro polipéptido de cadeia única é um domínio CH3 humano alterado de IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4 que compreende uma substituição T366W, e o domínio CH3 do segundo polipéptido de cadeia única é um domínio CH3 humano alterado de IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 que compreende substituições T366S, L368A e Y407V. Em determinadas outras formas de realização, o domínio CH3 do primeiro polipéptido de cadeia única é um domínio CH3 humano alterado de IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4 que compreende uma substituição Y407A, e o domínio CH3 do segundo polipéptido de cadeia única é um domínio CH3 humano alterado de IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 que compreende uma substituição T366W. Em determinadas outras formas de realização, o domínio CH3 do primeiro polipéptido de cadeia única é um domínio CH3 humano alterado de IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4 que compreende a substituição Y407T, e o domínio CH3 do segundo polipéptido de cadeia única é um domínio CH3 humano alterado de IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 que compreende uma substituição T366Y. Em determinadas outras formas de realização, o domínio CH3 do primeiro polipéptido de cadeia única é um domínio CH3 humano alterado IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4 que compreende as substituições T366S, L368A e Y407W, e o domínio CH3 do segundo polipéptido de cadeia única é um domínio CH3humano alterado de IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 que compreende uma substituição T366W.
Em certas formas de realização, a charneira do primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única é uma região de charneira de imunoglobulina, tal como uma charneira de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, ou IgE. Em certas formas de realização, a charneira de imunoglobulina é uma charneira de imunoglobulina de tipo selvagem. Em determinadas outras formas de realização, a charneira de imunoglobulina é uma charneira de imunoglobulina alterada selecionada a partir de SEQ ID NOS:232, 234, 240, 664-673, 675 e 676.
Em certas formas de realização, a região de charneira está (a) amino terminal à porção da região Fc, (b) disposta entre o domínio de ligação e o domínio de heterodimerização de imunoglobulina, (c) dispostos entre o domínio de heterodimerização de imunoglobulina e a porção da região Fc, (d) no terminal amino do primeiro ou segundo polinucleótido de cadeia simples, (e) dispostos entre a porção da região Fc e um domínio de ligação, ou (f) no terminal carboxilo do primeiro ou segundo polinucleótido de cadeia simples.
Em certas formas de realização, pelo menos uma das charneiras do primeiro e segundo polipéptido de cadeia única é uma região de charneira de lectina de tipo C, tal como um NKg2A ou NKg2D péptido, ou um seu derivado.
Em certas formas de realização, as charneiras do primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única são idênticas. Em determinadas outras formas de realização, as charneiras do primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única são diferentes.
Em certas formas de realização, o primeiro polipéptido de cadeia única compreende um domínio de ligação gue se liga especificamente a um complexo de TCR ou um seu componente, e o segundo polipéptido de cadeia única compreende um domínio de ligação gue se liga especificamente a CD 19, CD79b, HLA-DR ou CD20.
Em certas formas de realização, o primeiro polipéptido de cadeia única compreende um domínio de ligação gue liga especificamente CD28, e o segundo polipéptido de cadeia única compreende um domínio de ligação (a) gue liga especificamente CD79b, hyperIL-6, ou CD86 ou (b) gue compreende um ectodomínio PDL ou um monoIL-10.
Em certas formas de realização, o primeiro polipéptido de cadeia única compreende um domínio de ligação gue liga especificamente c-Met, e o segundo polipéptido de cadeia única compreende um domínio de ligação gue liga especificamente RON.
Em certas formas de realização, o primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única compreendem as SEQ ID NOS: SEQ ID NOS:2 e 4, SEQ ID NOS:6 e 8, SEQ ID NOS:10 e 12, SEQ ID NOS: 14 e 16, SEQ ID N0S:18 e 20, SEQ ID NOS:20 e 22, SEQ ID NOS:20 e 24, SEQ ID NOS:30 e 32, SEQ ID NOS:29 e 31, SEQ ID NOS:2 9 e 32, SEQ ID NOS:30 e 72, SEQ ID NOS:53 e 72, SEQ ID NOS:54 e 72, SEQ ID NOS:55 e 72, SEQ ID NOS:70 e 72, SEQ ID NOS:71 e 72, SEQ ID NOS:63 e 56, SEQ ID NOS:64 e 57, SEQ ID NOS:65 e 60, SEQ ID NOS:66 e 58, SEQ ID NOS:67 e 59, SEQ ID NOS:68 e 61, SEQ ID NOS:69 e 62, SEQ ID NOS:54 e 811, SEQ ID NOS:54 e 812, SEQ ID NOS:54 e 813, SEQ ID NOS:814 e 818, SEQ ID NOS :815 e 818, SEQ ID NOS:816 e 818, SEQ ID NOS:817 e 818, SEQ ID NOS :814 e 820, SEQ ID NOS:814 e 821, SEQ ID NOS: 54 e 819, SEQ ID NOS:814 e 826, SEQ ID NOS:814 e 822, SEQ ID NOS :814 e 823, SEQ ID NOS:814 e 824, SEQ ID NOS:859 e 862, SEQ ID NOS:860 e 863, SEQ ID NOS:861 e 864, SEQ ID NOS :874 e 825, SEQ ID NOS:875 e 879, SEQ ID NOS:876 e 880, SEQ ID NOS :877 e 881, ou SEQ ID NOS:878 e 882.
Noutro aspeto, a presente revelação proporciona uma composição compreendendo uma polipéptido heterodímero aqui proporcionado e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Noutro aspeto, a presente revelação proporciona um vetor de expressão capaz de expressar um polipéptido heterodímero aqui proporcionado, compreendendo um primeiro polinucleótido que codifica o primeiro polipéptido de cadeia única e um segundo polinucleótido que codifica o segundo polinucleótido de cadeia simples.
Noutra aspeto, a presente revelação proporciona uma célula hospedeira compreendendo o vetor de expressão acima.
Noutro aspeto, a presente revelação proporciona uma célula hospedeira compreendendo o primeiro e segundo vetores de expressão capazes de expressar o primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única, respetivamente, do polipéptido heterodímero aqui proporcionado.
Noutro aspeto, a presente revelação proporciona um método para preparar um polipéptido heterodímero, compreendendo (a) cultura de uma célula hospedeira aqui proporcionada em condições adequadas para expressar o primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única, e (b) opcionalmente isolar ou purificar os heterodímeros formados a partir do primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única a partir da cultura.
Noutro aspeto, a presente revelação proporciona um método para dirigir a ativação de células T, compreendendo a administração a um doente com necessidade de uma quantidade eficaz de um polipéptido heterodímero que compreende um domínio de ligação que liga especificamente TCRa, TCRp, CD3y, CD35, CD3s, ou uma sua combinação, e um segundo domínio de ligação que se liga especificamente a diferentes alvos, por exemplo, um antigénio específico para tumor ou outros antigénios à escolha num sítio ou célula onde a ativação de células T é desejada.
Noutro aspeto, a presente revelação proporciona um método para a inibição do crescimento, metástases, ou crescimento metastásico de uma malignidade, compreendendo a administração a um doente com necessidade de uma quantidade eficaz de um polipéptido heterodímero que compreende um domínio de ligação que liga especificamente TCRa, TCRp, CD3y, CD35, CD3s, c-Met, RON, ou uma sua combinação. Em certas formas de realização, o método compreende ainda a administração a um doente com necessidade de um agente quimioterapêutico ou radiação ionizante.
Noutro aspeto, a presente revelação proporciona um método para o tratamento de um estado autoimune ou inflamatório, compreendendo a administração a um doente com necessidade de uma quantidade eficaz de um polipéptido heterodímero que compreende um domínio de ligação que liga especificamente TCRa, TCRP, CD3y, CD35, CD3s, ou CD28.
Noutro aspeto, a presente revelação proporciona um método para tratar um distúrbio ou doença associada a células B compreendendo a administração a um doente com necessidade uma quantidade eficaz de um polipéptido heterodímero que compreende um domínio de ligação que liga especificamente TCRa, TCRp, CD3y, CD3õ, ou CD3s, e um segundo domínio de ligação que liga especif icamente um CD 19, CD20, CD79b ou HLA-DR.
Em certas formas de realização, os métodos para utilização dos polipéptidos heterodímero aqui proporcionados pode compreender ainda a administração a um doente com necessidade de um segundo agente ativo, tal como um segundo polipéptido heterodímero, um anticorpo monoclonal, ou uma proteína de fusão derivada de imunoglobulina.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é uma representação esquemática de polipéptido heterodímero bivalente anti-CD28 X0172 (esquerda) e análise SDS-PAGE de X0172 (direita). "NR" significa "Não Reduzida," e "Red" significa "Reduzida." A Figura 2 mostra que um polipéptido heterodímero monovalente (X0124) e um bivalente (X0172) anti-CD28 tem sinergia com uma concentração subótima de PMA a estimulação de células T humanas purificadas quando comparado com um scFv anti-CD28 (2E12 scFv) mas menos do que uma proteína SMIP anti-CD28 bivalente (2E12 SMIP). A Figura 3 mostra que o polipéptido heterodímero bivalente X0172 liga-se a células T CD4+ melhor do que ο 2E12 scFv e o polipéptido heterodímero monovalente X0124. A Figura 4 mostra cromatografia de troca catiónica de polipéptidos heterodímero X0251, X0252 e X0253 (esquerda) e análise de eletroforese em SDS-PAGE dos mesmos polipéptidos heterodímeros em condições não redutoras (NR) e redutoras (Red) (direita). A Figura 5 mostra o espetro de massa do polipéptido heterodímero X0252, que demonstra que o heterodímero é a espécie predominante. A Figura 6 mostra a análise de eletroforese em SDS-PAGE dos polipéptidos heterodímero X0283 e X0284 m condições não redutoras (NR) e redutoras (Red) (esquerda) e análise de cromatografia de troca catiónica do polipéptido heterodímero X0283. A Figura 7 mostra ligação direta a CD86 do polipéptido heterodímero X0283 conforme examinado por análise BIACORE®, com unidades de resposta (Ru) em função do tempo (esquerda) e uma representação esquemática de X0283.
As Figuras 8A e 8B mostram a ligação de construções biespecificas anti-RON e anti-CD3 (polipéptido heterodímero S0268 e proteína Scorpion S0266) contra células MDA-MB-453 (A) e contra células T isoladas (B).
As Figuras 9A e 9B mostram especificidade de ligação a (A) células Reel (CD19+, CD20+) ou (B) células Jurkat (CD3+) através de heterodímeros biespecificos possuindo domínios de ligação anti-CD19 e anti-CD3 (TSC020) ou possuindo domínios de ligação anti-CD20 e anti-CD3 (TSC021).
As Figuras 10A-10D mostram a proliferação de células T CD4+ e CD8+ em resposta a polipéptidos heterodímero biespecificos TSC054, TSC078, TSC079, e bscl9x3 (TSC036) com (A e B) células Daudi (CD19+) ou (C e D) células MDA-MB-453 (CD19-) ·
As Figuras 11A e 11B mostram citotoxicidade dirigida contra células T induzida por polipéptidos heterodímero biespecíficos TSC054, TSC078, TSC079, e S0268 num ensaio de libertação de crómio (51Cr) com (A) células Daudi (RON-, CD19+) células ou (B) células BxPC-3 (RON+, CD19-). A Figura 12 mostra proliferação de células T dependente do alvo induzida por uma linha de células CD 19+ (Daudi) utilizando os polipéptidos heterodímero biespecíficos TSC165, TSC166, TSC167, TSC168 e TSC100 a concentrações de 0,1 pM a 10000 pM. A Figura 13 mostra a proliferação de células T dependente do alvo induzida por uma linha de células CD19+ (Daudi) utilizando os polipéptidos heterodímero biespecíficos TSC127 e TS165 com bscl9x3 BiTE como um controlo em concentrações de 0,001 pM a 1000 pM. A Figura 14 mostra citotoxicidade de células T redirigidas dependente do alvo numa linha de células CD 19+ (Daudi) utilizando os polipéptidos heterodímero biespecíficos TSC100, TSC165, TC166, TSC167, e TSC168.
DESCRIÇÃO DETALHADA A presente revelação proporciona polipéptidos heterodímero formados entre dois diferentes polipéptidos de cadeia única via heterodimerização natural de uma região CHI de imunoglobulina e uma região constante de cadeia leve de imunoglobulina (CL). O polipéptido heterodímero tem dois ou mais domínios de ligação que ligam especificamente um ou mais alvos (e. g. , um antigénio, um recetor, ou um ligando). Adicionalmente, ambas as cadeias de um heterodímero compreendem cada uma ainda uma porção da região Fc (e. g., domínios CH2 e/ou CH3 de imunoglobulina). A presente revelação também proporciona ácidos nucleicos, vetores, células hospedeiras e métodos para preparar os polipéptidos heterodímero. A tecnologia de heterodimerização aqui descrita tem uma ou mais das seguintes vantagens: (1) potencial para imunogenicidade mínima dos polipéptidos heterodímero porque os dímeros são formados via heterodimerização natural de uma região CHI de imunoglobulina e uma região CL de imunoglobulina; (2) produção eficiente e purificação de polipéptidos heterodímero da presente revelação é possível por co-expressão de dois diferentes polipéptidos de cadeia única, como mostrado nos exemplos; (3) a capacidade para mediar Funções efetoras de Fc (e. g., CDC, ADCC, ADCP), que pode ser modulado positiva ou negativamente por mutagénese, e um tempo de semi-vida no soro mais longo porque cada cadeia de um polipéptido heterodímero de acordo com a presente revelação possui uma porção da região Fc (e. g., domínios CH2 e CH3 de imunoglobulina); e (4) os polipéptidos heterodímero da presente revelação têm um tamanho que é tipicamente menor do que uma molécula de anticorpo, que pode permitir uma melhor penetração no tecido, tal como numa malignidade sólida.
Os polipéptidos heterodímero aqui proporcionados são úteis para dirigir agentes terapêuticos ou células efetoras imunitárias para as células alvo. Por exemplo, em certas formas de realização, os polipéptidos heterodímero podem compreender um domínio de ligação que liga especificamente um complexo de TCR ou um seu componente (e. g., TCRa, TCRp, CD3y, CD35, e CD3s) e outro domínio de ligação que se liga especificamente a um segundo alvo diferente, tal como um alvo oncológico (e. g., c-Met, RON, CEACAM- 6, e PSMA) ou uma Célula B alvo (e. g., CD19, CD79b, HLA-DR e CD20) . 0 domínio de ligação específico para o segundo alvo diferente pode ter uma maior afinidade para o seu alvo do que a afinidade do domínio de ligação para o complexo de TCR ou um seu componente, tal como CD3. Estes polipéptidos heterodímero ligar-se-ão preferencialmente ao alvo oncológico ou à célula B alvo primeiro e subsequentemente recrutam células T para o tumor ou células de cancro que expressam o alvo oncológico ou célula B alvo e são úteis na inibição do crescimento, metástases ou crescimento metastásico de uma malignidade (incluindo cancros de células B) . As utilizações adicionais de polipéptidos heterodímero aqui proporcionadas incluem a ativação dirigida de células T e tratamento de estados autoimunitários ou inflamatórios.
Os cabeçalhos das secções aqui utilizados têm propósito organizacional apenas e não pretendem limitar o assunto descrito. Todos os documentos, ou porções de documentos, aqui citados, incluindo mas não limitados a patentes, pedidos de patentes, artigos, livros, e tratados, são aqui expressamente incorporados para referência na sua totalidade para qualquer propósito. No caso em que um ou mais dos documentos incorporados ou porções de documentos define um termo que contradiz que a definição dos termos na aplicação, a definição que aparece nos controlos deste pedido.
Na presente descrição, qualquer intervalo de concentração, intervalo de percentagem, intervalo de proporção, ou intervalo de inteiro deve ser considerado como incluindo o valor de qualquer inteiro no intervalo citado e, quando apropriado, frações destes (tais como um décimo e um centésimo de um inteiro), a menos que indicado. Como aqui utilizado, "cerca de" significa ± 20% do intervalo indicado, valor, sequência, ou estrutura, a menos que indicado. Deve ser considerado que os termos "um" e "uma" como aqui utilizado referem-se a "um ou mais" dos componentes enumerados a menos que indicado ou explicito pelo seu contexto. A utilização de alternativos (e. g., "ou") deve ser considerado como significando qualquer um, ambos, ou qualquer combinação dos alternativos. Como aqui utilizado, os termos "incluem" e "compreendem" são utilizados como sinónimos. Adicionalmente, deve ser considerado que os polipéptidos de cadeia única individuais ou heterodímeros derivados de várias combinações das estruturas e substituintes (e. g., domínios, regiões, charneiras, e ligantes) aqui descritas são reveladas pelo presente pedido na mesma medida como se cada polipéptido de cadeia única ou heterodímero fossem preparados individualmente. Deste modo, a seleção de componentes particulares para formar polipéptidos de cadeia única individuais ou heterodímeros está no âmbito da presente revelação.
Como aqui utilizado, uma proteína "consiste essencialmente em "vários domínios (e. g., um domínio de ligação que liga especificamente um alvo, uma charneira, um domínio de heterodimerização de imunoglobulina, e uma porção da região Fc) se as outras porções da proteína (e. g., aminoácidos no terminal amino ou carboxilo ou entre dois domínios), em combinação, contribuem no máximo em 20% (e. g., na sua maioria 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1 %) do comprimento da proteína e não afetam substancialmente (i.e., não reduzem a atividade em mais do que 50%, tal como mais do que 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, ou 5%) as atividades de vários domínios (e. g., a afinidade de ligação ao alvo do domínio de ligação, as atividades da porção da região Fc, e a capacidade do domínio de heterodimerização de imunoglobulina para facilitar a heterodimerização). Em certas formas de realização, a proteína (e. g., um polipéptido de cadeia única) consiste essencialmente num domínio de ligação que se liga especificamente ao alvo, um domínio de heterodimerização de imunoglobulina, uma charneira, e uma porção da região Fc podem compreender aminoácidos de junção no terminal amino e/ou carboxilo da proteína e/ou entre dois diferentes domínios (e. g., entre o domínio de ligação e o domínio de heterodimerização de imunoglobulina, entre o domínio de heterodimerização de imunoglobulina e a charneira, e/ou entre a charneira e a porção da região Fc).
Um "polipéptido heterodímero" ou "heterodímero, " como aqui utilizado, refere-se a um dímero formado a partir de dois diferentes polipéptidos de cadeia única. Este termo não inclui um anticorpo formado a partir de quatro polipéptidos de cadeia única (i.e., duas cadeias leves e duas cadeias pesadas). Um "dímero" refere-se a uma entidade biológica que consiste em duas subunidades associadas uma com a outra através de uma ou mais formas de forças intramoleculares, incluindo ligações covalentes (e. g., ligações persulfureto) e outras interações (e. g., interações eletrostáticas, pontes de sal, ligações de hidrogénio, e interações hidrofóbicas), e é estável sob condições apropriadas (e. g., sob condições fisiológicas, numa solução aquosa adequada para expressar, purificar, e/ou armazenar proteínas recombinantes, ou em condições para eletroforese não desnaturante e/ou não redutora).
Um "polipéptido de cadeia única" é um arranjo único, linear e contíguo de aminoácidos covalentemente ligados. Não inclui duas cadeias de polipéptido que se ligam os dois de uma forma não linear, tal como através de uma ligação persulfureto intercadeia (e. g., metade de uma molécula de imunoglobulina na qual uma cadeia leve se liga com uma cadeia pesada através de uma ligação persulfureto) . Em certas formas de realização, um polipéptido de cadeia única pode ter ou formar uma ou mais ligações persulfureto intracadeia.
Um "domínio de heterodimerização de imunoglobulina," como aqui utilizado, refere-se a um domínio de imunoglobulina de um polipéptido de cadeia única que interage preferencialmente ou se associa com um domínio diferente de imunoglobulina de outro polipéptido de cadeia única em que a interação dos diferentes domínios de heterodimerização contribui substancialmente para ou promove eficientemente a heterodimerização do primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única (i.e., a formação de um dímero entre dois diferentes polipéptidos de cadeia única, que é também referido como um "heterodímero"). As interações entre os domínios de heterodimerização "contribuem substancialmente para ou promovem eficientemente" a heterodimerização do primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única se existir uma redução estatisticamente significativa na dimerização entre o primeiro e o segundo polipéptidos de cadeia única na ausência do domínio de heterodimerização do primeiro polipéptido de cadeia única (HD-I) e/ou do domínio de heterodimerização do segundo polipéptido de cadeia única (HD-II). Em certas formas de realização, quando o primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única são co-expressos, pelo menos 60%, pelo menos cerca de 60% a cerca de 70%, pelo menos cerca de 70% a cerca de 80%, pelo menos cerca de 80% a cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%, e pelo menos cerca de 90% a cerca de 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% do primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única formam heterodímeros uns com os outros. O domínio de heterodimerização de imunoglobulinas representativo da presente revelação inclui uma região CHI de imunoglobulina, uma região CL de imunoglobulina (e. g., isotipo Ck ou CX), ou derivados destas, incluindo as regiões CHI e CL de imunoglobulina do tipo selvagem e regiões CHI e CL de imunoglobulina alteradas (ou mutadas), como aqui proporcionado.
Um "domínio de ligação" ou "região de ligação," como aqui utilizado, refere-se a uma proteína, polipéptido, oligopéptido, ou péptido que possui a capacidade de reconhecer e ligar-se especificamente a um alvo (e. g., CD3, TCR, CD28, c-Met, RON). Um domínio de ligação inclui qualquer parceiro de ligação, com uma molécula biológica ou outro alvo de interesse, que ocorre naturalmente, sintético, semi-sintético, ou produzido recombinantemente. Os domínios de ligação exemplificativos incluem regiões variáveis de anticorpo de cadeia única (e. g. , domínios de anticorpos, sFv, scFv, Fab), ectodomínios recetores (e. g., c-Met, RON), ou ligandos (e. g., citocinas, quimiocinas). São conhecidos vários ensaios são conhecidos por identificar domínios de ligação da presente revelação que ligam especificamente um alvo particular, incluindo análise de transferência de Western, ELISA, e análise Biacore.
Um domínio de ligação e a sua proteína de fusão "ligam especif icamente" um alvo se se ligarem ao alvo com uma afinidade ou Ka (i.e., uma constante de equilíbrio de associação de uma interacção de ligação particular com unidades de 1/M) igual a ou maior do que 105 M-1, enquanto não se liga significativamente a outros componentes presentes numa amostra de teste. Os domínios de ligação (ou suas proteínas de fusão) podem ser classificados como domínios de ligação com "afinidade elevada" (ou suas proteínas de fusão) e domínios de ligação de "baixa afinidade" (ou suas proteínas de fusão) . Os domínios de ligação de "afinidade elevada" referem-se aos domínios de ligação com um Ka de pelo menos 107 M-l, pelo menos 108 M-l, pelo menos 109 M-l, pelo menos 1010 M-l, pelo menos 1011 M_1, pelo menos 1012 M-l, ou pelo menos 1013 M~7. Os domínios de ligação de "baixa afinidade" referem-se aos domínios de ligação com uma Ka até 107 M~7, até 106 M~7, até 105 M~7. Alternativamente, a afinidade pode ser definida como uma constante de equilíbrio de dissociação (Kd) de uma interação de ligação particular com unidades de M (e. g., ICO5 M a ICO 13 M). As afinidades do domínio de ligação de polipéptidos e de polipéptidos de cadeia única de acordo com a presente revelação podem ser facilmente determinadas utilizando técnicas convencionais (ver, e. g., Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sei. 51:660; e Patente U.S. Nos. 5 283 173, 5 468 614, ou equivalente). O "recetor de células T" (TCR) é uma molécula encontrada na superfície de células T que, em conjunto com CD3, é geralmente responsável pelo reconhecimento de antigénios ligados a moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Consiste num heterodímero ligado por persulfureto das cadeias α e β altamente variáveis na maioria das células T. Em outras células T, é expresso um recetor alternativo produzido a partir das cadeias variáveis Y e δ. Cada cadeia do TCR é um membro da superfamília das imunoglobulinas e possui um domínio variável N-terminal de imunoglobulina, um domínio constante de imunoglobulina, uma região transmembranar, e uma curta cauda citoplásmica na extremidade C-terminal (ver, Abbas e Lichtman, Cellular and Molecular Immunology (5a Ed.), Editor: Saunders, Filadélfia, 2003; Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4a Ed., Current Biology Publications, pl48, 149, e 172, 1999) . 0 TCR como utilizado na presente revelação pode ser de várias espécies animais, incluindo humano, murganho, rato, ou outros mamíferos. 0 "CD3" é conhecido na técnica como um complexo multi-proteína de seis cadeias (ver, Abbas and Lichtman, 2003; Janeway et al., p. 172 e 178, 1999) . In em mamíferos, o complexo compreende uma cadeia CD3y, uma cadeia CD35, duas cadeias CD3s, e um homodímero de cadeias CD3(. As cadeias CD3y, CD35, e CD3s estão altamente relacionadas com proteínas de superfície da célula da superfamília das imunoglobulinas contendo um domínio único de imunoglobulina. As regiões transmembranares das cadeias CD3y, CD35, e CD3s são negativamente carregados, que é uma caracteristica que permite que estas cadeias se associem com as cadeias do recetor de células T positivamente carregado. As caudas intracelulares das cadeias CD3y, CD35, e CD3s contêm, cada uma, um motivo único conservado conhecido como um motivo de activação do imunorrecetor com base na tirosina ou ITAM, enquanto cada cadeia CD3( tenha três. Crê-se que os ITAMs são importantes para a capacidade de sinalização de um complexo de TCR. O CD3, como utilizado na presente revelação pode provir de várias espécies animais, incluindo humano, murganho, rato, ou outros mamíferos. O "complexo de TCR," como aqui utilizado, refere-se a um complexo formado pela associação de CD3 com TCR. Por exemplo, um complexo de TCR pode ser composto por uma cadeia CD3y, uma cadeia CD35, duas cadeias CD3s, um homodímero de cadeias CD3(, uma cadeia TCRa, e uma cadeia TCRp . Alternativamente, um complexo de TCR pode ser composto por uma cadeia CD3y, uma cadeia CD3õ, duas cadeias CD3s, um homodímero de cadeias CD3(, uma cadeia TCRy, e uma cadeia TCRõ. "Um componente de um complexo de TCR," como aqui utilizado, refere-se a uma cadeia de TCR (i.e., TCRa, TCRp, TCRy ou TCRõ), uma cadeia CD3 (i.e., CD3y, CD3õ, CD3s ou 0ϋ3ζ), ou um complexo formado por duas ou mais cadeias de TCR ou cadeias de CD3 (e. g., um complexo de TCRa e TCRp, um complexo de TCRy e TCRõ, um complexo de CD3s e CD3õ, um complexo de CD3y e CD3s, ou um subcomplexo de TCR de TCRa, TCRβ, CD3y, CD3õ, e duas cadeias CD3s).
Os termos entendidos pelos especialistas na técnica de tecnologia de anticorpos têm, cada um, o significado dado na técnica, a menos que aqui expressamente definido de outra forma. Os anticorpos são conhecidos como tendo regiões variáveis, uma região de charneira, e domínios constantes. A estrutura e função das Imunoglobulinas são revistas, por exemplo, em Harlow et al. , Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988) .
Por exemplo, os termos "VL" e "VH" referem-se à região variável de ligação de uma cadeia leve e pesada de anticorpo, respetivamente. As regiões variáveis de ligação são feitas por sub-regiões discretas, bem definidas conhecidas como "regiões determinantes de complementaridade" (CDRs) e "regiões estruturais" (FRs). 0 termo "CL" refere-se a uma "região constante de cadeia leve de imunoglobulina" ou a uma "região constante de cadeia leve," i.e., uma região constante de uma cadeia leve e pesada de anticorpo. 0 termo "CH" refere-se a uma "região constante de cadeia pesada de imunoglobulina" ou uma "região constante de cadeia pesada," que é ainda divisível, dependendo do isotipo do anticorpo nos domínios CHI, CH2, e CH3 (IgA, IgD, IgG) , ou CHI, CH2, CH3, e CH4 (IgE, IgM) . Um "Fab" (fragmento de ligação de antigénio) é a parte de um anticorpo que se ligam aos antigénios e inclui a região variável e CHI da cadeia pesada ligada à cadeia leve através de uma ligação persulfureto intercadeia.
Como aqui utilizado, "uma porção do domínio constante da região Fc" ou "porção da região Fc" refere-se ao segmento da região constante da cadeia pesada do fragmento Fc (a região do "fragmento cristalizável" ou região Fc) de um anticorpo, que pode incluir um ou mais domínios constantes, tais como CH2, CH3, CH4, ou qualquer combinação destes. A título informativo, a região Fc é responsável pelas funções efetoras de uma imunoglobulina, tais como ADCC (citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo), ADCP (fagocitose celular dependente de anticorpo), CDC (citotoxicidade dependente do complemento) e fixação do complemento, ligação aos recetores Fc (e. g. , CD16, CD32, FcRn), maior semi-vida in vivo relativamente a um polipéptido sem uma região Fc, ligação de proteína A, e talvez mesmo transferência placentária (ver Capon et ai., Nature, 337:525 (1989)).
Adicionalmente, os anticorpos têm uma sequência de charneira que está tipicamente situada entre a região Fab e Fc (mas uma secção de charneira mais curta pode incluir uma porção amino terminal da região Fc) . A título informativo, uma charneira de imunoglobulina atua como um espaçador flexível para permitir que a porção Fab se mova livremente no espaço. Em contraste com as regiões constantes, as charneiras são estruturalmente diversas, variando na sequência e comprimento entre as classes de imunoglobulina e mesmo entre as subclasses. Por exemplo, uma região de charneira da IgGl humana é livremente flexível, que permite que os fragmentos Fab rodem à volta dos seus eixos de simetria e move-se numa esfera centrada na primeira de duas pontes persulfureto intercadeias pesadas. Em comparação, uma charneira de IgG2 humana é relativamente curta e contém uma dupla hélice rígida de poli-prolina estabilizada por quatro pontes persulfureto intercadeias pesadas, que restringe a flexibilidade. Uma charneira de IgG3 humana difere de outras subclasses pela sua região de charneira estendida única (cerca de quatro vezes tão longo como a charneira de IgGl), contendo 62 aminoácidos (incluindo 21 prolinas e 11 cisteínas), formando uma hélice dupla poli-prolina inflexível e proporcionando uma maior flexibilidade porque os fragmentos Fab estão relativamente longe do fragmento Fc. Uma charneira de IgG4 humana é mais curta do que a de IgGl mas tem o mesmo comprimento de IgG2, e a sua flexibilidade é intermédia entre a de IgGl e IgG2.
De acordo com estudos cristalográficos, um domínio de charneira de IgG pode estar funcionalmente e estruturalmente subdividido em três regiões: as regiões de charneira superior, do centro ou meio, e a inferior (Shin et al. , Immunological Reviews 130:87 (1992)). as regiões de charneira superiores exemplificativas incluem EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 227) como encontrado em IgGl, ERKCCVE (SEQ ID NO:211) como encontrado em IgG2, ELKTPLGDTT HT (SEQ ID NO:2 4 5) ou EPKSCDTPPP (SEQ ID NO:246) como encontrado em IgG3, e ESKYGPP (SEQ ID NO:247) como encontrado em IgG4. as regiões de charneira do meio ou centrais exemplificativas incluem CPPCP (SEQ ID NO:228) como encontrado em IgGl e IgG2, CPRCP (SEQ ID NO:248) como encontrado em IgG3, e CPSCP (SEQ ID NO:249) como encontrado em IgG4. Enquanto os anticorpos IgGl, IgG2, e IgG4 parecem ter, cada um, uma charneira única superior e central, o IgG3 tem quatro em tandem - sendo uma ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEQ ID NO:250) e três sendo EPKSCDTPPP CPRCP (SEQ ID NO:251).
Os anticorpos IgA e IgD parecem não ter uma região central tipo IgG, e a IgD parece ter duas regiões de charneira superiores em tandem (ver SEQ ID NOS :222 e 252) . As regiões de charneira superiores exemplificativas tipo selvagem encontradas nos anticorpos IgAl e IgA2 são apresentadas nas SEQ ID NOS :215 e 216.
Os anticorpos IgE e IgM, em contraste, não possuem uma região de charneira típica e em vez, têm um domínio CH2 com propriedades tipo charneira. As seguências tipo charneira superior CH2 do tipo selvagem exemplificativas de IgE e IgM são apresentadas nas SEQ ID NO:253
(VCSRDFTPPTVKILQSSSDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDG QVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFE DSTKKCA) e SEQ ID NO :254 (VIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLIC QATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTI KESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVP), respetivamente.
Como agui utilizado, uma "região de charneira" ou uma "charneira" refere-se a (a) uma região de charneira de imunoglobulina (constituída, por exemplo, de regiões superiores e centrais) ou uma sua variante funcional, incluindo charneiras de imunoglobulina do tipo selvagem e alteradas, (b) uma região de interdomínio de lectina ou uma sua variante funcional, (c) um agrupamento da região haste da molécula diferenciação (CD) ou uma sua variante funcional, ou (d) uma porção de um recetor à superfície da célula (região interdomínio) que liga os domínios tipo V de imunoglobulina ou tipo C de imunoglobulina.
Como aqui utilizado, uma "região de charneira imunoglobulina tipo selvagem" refere-se a sequências de aminoácido da charneira superior e central que ocorrem naturalmente interpostas entre e ligando os domínios CHI e CH2 (para IgG,
IgA, e IgD) ou interpostas entre e ligando os domínios CHI e CH3 (para IgE e IgM) encontradas na cadeia pesada de um anticorpo. Em certas formas de realização, uma sequência da região de charneira de imunoglobulina do tipo selvagem é humana, e pode compreender uma região de charneira da IgG humana. As regiões de charneira de imunoglobulina humana do tipo selvagem exemplificativas são apresentadas nas SEQ ID NOS:215 (charneira de IgGAl), 216 (charneira de IgGA2), 217 (charneira de IgD), 667 (charneira de IgGl), 219 (charneira de IgG2), 220 (charneira de IgG3) e 221 (charneira de IgG4).
Uma "região de charneira de imunoglobulina do tipo selvagem" ou "região de charneira de imunoglobulina alterada" refere-se a (a) uma região de charneira de imunoglobulina tipo selvagem com até 30% de alterações de aminoácidos (e. g., até 25%, 20%, 15%, 10%, ou 5% de substituições ou deleções de aminoácidos) , ou (b) uma porção de uma região de charneira de imunoglobulina tipo selvagem que tem um comprimento de cerca de 5 aminoácidos (e. g. , cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 aminoácidos) até cerca de 120 aminoácidos (por exemplo, possuindo um comprimento de cerca de 10 a cerca de 40 aminoácidos ou cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos ou cerca de 15 a cerca de 20 aminoácidos ou cerca de 20 a cerca de 25 aminoácidos) , tem até cerca de 30% alterações de aminoácidos (e. g., até cerca de 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1% de substituições ou deleções de aminoácidos ou uma sua combinação), e tem uma região de charneira central de IgG como apresentado nas SEQ ID NOS:228, 248, ou 249.
Um "péptido ligante" refere-se a uma sequência de aminoácidos que liga uma região variável de cadeia pesada a uma região variável de cadeia leve e proporciona uma função espaçadora compatível com a interação dos dois subdomínios de ligação de modo a que o polipéptido resultante retém uma afinidade de ligação específica à mesma molécula alvo como um anticorpo que compreende as mesmas regiões variáveis da cadeia leve e pesada. Em certas formas de realização, um ligante é constituído por cinco a cerca de 35 aminoácidos, por exemplo, cerca de 15 a cerca de 25 aminoácidos.
Os "aminoácidos de junção" ou "resíduos de aminoácidos de junção" referem-se a um ou mais (e. g. , cerca de 2-10) resíduos de aminoácidos entre as duas regiões adjacentes ou domínios de um polipéptido de cadeia única, tal como entre uma charneira e uma porção adjacente da região Fc ou entre uma charneira e um domínio de ligação adjacente ou entre um péptido ligante que liga dois domínios variáveis de imunoglobulina e um domínio variável adjacente de imunoglobulina. Os aminoácidos de junção podem resultar da conceção da construção de um polipéptido de cadeia única (e. g.r resíduos de aminoácidos resultantes da utilização de um sítio de enzima de restrição durante a construção de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido de cadeia única) .
Um "ligante entre CH3 e CHI ou CL" refere-se a um ou mais (e. g., cerca de 2-12) resíduos de aminoácidos entre o terminal C de um domínio CH3 (e. g., um CH3tipo selvagem ou um CH3 mutado) e o terminal N de um domínio CHI ou domínio CL (e. g., Ck).
Uma "região de imunoglobulina tipo selvagem" ou "domínio de imunoglobulina tipo selvagem" refere-se a uma região ou domínio que ocorre naturalmente numa imunoglobulina (e. g., uma VL, VH, charneira, CL, CHI, CH2, CH3, ou CH4 que ocorre naturalmente) de várias classes ou subclasses de imunoglobulina (incluindo, por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3,
IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE, e IgM) e de várias espécies (incluindo, por exemplo, humanos, ovinos, murganhos, ratos, e outros mamíferos). As regiões CHI humanas tipo selvagem exemplificativas são apresentadas nas SEQ ID NOS :114, 186-192 e 194, a região Ck humana de tipo selvagem na SEQ ID NO:112, regiões CÀ humanas do tipo selvagem nas SEQ ID NO:113 e 224-226, domínios CH2 humanos tipo selvagem na SEQ ID N0S:115, 195-201 e 203, domínios CH3 humanos tipo selvagem nas SEQ ID NOS:116, 204-210 e 212, e domínios CH4 humanos tipo selvagem nas SEQ ID NO:213 e 214.
Uma "região de imunoglobulina alterada," "domínio de imunoglobulina alterada," "domínio de imunoglobulina mutado," ou afins, refere-se a uma região de imunoglobulina com uma identidade de sequência com uma região ou domínio de imunoglobulina tipo selvagem (e. g., uma VL, VH, charneira, CL, CHI, CH2, CH3, ou CH4 tipo selvagem) de pelo menos 75% (e. g., 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5%). Por exemplo, uma "região CHI de imunoglobulina alterada" ou "região CHI alterada" refere-se a uma região CHI com uma identidade de sequência com uma região CHI imunoglobulina tipo selvagem (e. g., uma CHI humana) de pelo menos 75% (e. g., 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5%). Do mesmo modo, um "domínio CH2 de imunoglobulina alterado" ou "domínio CH2 de alterado" refere-se a um domínio CH2 com uma identidade de sequência com uma região CH2 de imunoglobulina tipo selvagem (e. g., um CH2 humano) de pelo menos 75% (e. g., 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5%). "Identidade de sequência," como aqui utilizado, refere-se à percentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência que são idênticos com os resíduos de aminoácidos noutra sequência de polipéptido de referência após alinhamento das sequências e introduzindo intervalos, se necessário, para conseguir a máxima percentagem de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. Os valores de percentagem de identidade de sequência são produzidos pelo software NCBI BLAST2.0 como definido por Altschul et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs," Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, com os parâmetros de valor por defeito.
Em certas formas de realização, um dominio de imunoglobulina alterada contém apenas substituições de aminoácidos conservadoras de um dominio de imunoglobulina do tipo selvagem. Em determinadas outras formas de realização, um dominio de imunoglobulina alterada contém apenas substituições de aminoácidos não conservadoras de um dominio de imunoglobulina do tipo selvagem. Ainda noutras formas de realização, um dominio de imunoglobulina alterada contém substituições de aminoácidos conservadoras e não conservadoras.
Uma "substituição conservadora" é reconhecida na técnica como uma substituição de um aminoácido por outro aminoácido que tem propriedades semelhantes. As substituições conservadoras exemplificativas são bem conhecidas na técnica (ver, e. g., WO 97/09433, página 10, publicado em 13 de Março de 1997; Lehninger, Biochemistry, Segunda Edição; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY e Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8). Em certas formas de realização, uma substituição conservadora inclui uma substituição de leucina por serina.
Como aqui utilizado, o termo "derivado" refere-se a uma modificação de um ou mais resíduos de aminoácidos de um péptido através de meios químicos ou biológicos, com ou sem uma enzima, e. g. , por glicosilação, alquilação, acilação, formação de éster, ou formação de amida. Geralmente, um "derivado" difere de um "análogo" na medida em que um polipéptido parental pode ser o material de partida para produzir um "derivado," enquanto o polipéptido parental pode não ser necessariamente utilizado como o material de partida para produzir um "análogo." Um derivado pode ter diferentes propriedades químicas, biológicas ou físicas do polipéptido parental. Por exemplo, um derivado pode ser mais hidrofílico ou pode ter reatividade alterada (e. g., um CDR possuindo uma alteração de aminoácido que altera a sua afinidade para um alvo) em comparação com o polipéptido parental.
Como aqui utilizado, a menos que proporcionado de outra forma, uma posição de um resíduo de aminoácido numa região variável de uma molécula de imunoglobulina é numerada de acordo com a convenção de numeração de Rabat (Rabat, Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991)), e uma posição de um resíduo de aminoácido numa região constante de uma molécula de imunoglobulina é numerada de acordo com a nomenclatura EU (Ward et al. , 1995 Therap. Immunol. 2:77-94).
Um "recetor" é uma molécula de proteína presente na membrana plasmática ou no citoplasma de uma célula à qual se pode ligar uma molécula sinal (i.e., um ligando, tal como uma hormona, um neurotransmissor, uma toxina, uma citocina) . A ligação da molécula sinal ao recetor resulta numa alteração conformacional do recetor, que normalmente inicia uma resposta celular. No entanto, alguns ligandos bloqueiam meramente os recetores sem induzir qualquer resposta (e. g., antagonistas). Algumas proteínas recetoras são proteínas periféricas de membrana. Muitos recetores de hormonas e neurotransmissores são proteínas transmembranares que estão embutidas na bicamada lipídica das membranas de células, e outra classe importante de recetores são as proteínas intracelulares tais como aquelas para esteróides e recetores de péptido de hormona intracrina. 0 "distúrbio ou doença associada a células B" ou "uma doença ou distúrbio associada com atividade aberrante de células B" refere-se a uma doença ou distúrbio associada com (e. g., causando ou resultando de) atividade aberrante de células B ou atividade que se desvia do curso normal, apropriado, ou esperado. Por exemplo, um distúrbio ou doença associados a células B pode incluir a proliferação inapropriada de células B que têm DNA danificado ou deficiente ou outros componentes celulares. A atividade aberrante de células B podem incluir a proliferação de células caracterizada por níveis inapropriados elevados de divisão de células B, baixos níveis inapropriados de apoptose de célula B, ou ambos. Estas doenças podem ter, por exemplo, proliferações únicas ou múltiplas anormais de células B, grupos de células B ou tecido (s), seja canceroso ou não canceroso, benigno ou maligno. Um distúrbio ou doença associada a células B pode também incluir produção aberrante de anticorpo, tal como produção de autoanticorpos, ou sobreprodução de anticorpos mais desejável quando produzidos em níveis normais. Está também aqui contemplado que atividade aberrante de células B pode ocorrer em certas subpopulações de células B e não em outras subpopulações, ou pode incluir a estimulação inapropriada de células T, tal como a inapropriada apresentação de antigénio a células T ou através de outras vias de células B. Os exemplos de distúrbios ou doenças associadas a células B incluem uma malignidade de células B ou cancro de células B (e. g., linfoma de células B, leucemia de células B ou mieloma de células B) , uma doença caracterizada por produção de autoanticorpos (e. g., doenças autoimunitários) ou inflamação ou uma doença caracterizada por estimulação inapropriada de células T causadas por apresentação inapropriada de apresentação de antigénio a células T ou causada por outras vias envolvendo células B. "Tratamento," "tratando" ou "melhorando" refere-se a um tratamento terapêutico ou tratamento profilático/preventivo. Um tratamento é terapêutico se pelo menos um sintoma da doença num indivíduo que recebeu tratamento melhora ou um tratamento pode atrasar o piorar de uma doença progressiva num indivíduo, ou evita o início de doenças adicionais associadas.
Uma "quantidade terapeuticamente eficaz (ou dose)" ou "quantidade eficaz (ou dose)" de uma molécula ou composto com ligação específica refere-se à quantidade do composto suficiente para resultar na melhoria de um ou mais sintomas da doença a ser tratada numa maneira estatisticamente significativa. Quando se refere a um ingrediente ativo individual, administrado isolado, uma dose terapeuticamente eficaz refere-se ao ingrediente isolado. Quando se refere a uma combinação, uma dose terapeuticamente eficaz refere-se a quantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, se administrado em série ou simultaneamente (na mesma formulação ou concorrentemente em formulações separadas). 0 termo "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades moleculares e composições que não produzem reacções alérgicas ou outras seriamente adversas quando administradas utilizando as vias bem conhecidas na técnica.
Um "doente com necessidade" refere-se a um doente em risco de, ou a sofrer de, uma doença, distúrbio ou estado que é responsiva ao tratamento ou melhora com um polipéptido heterodímero ou uma sua composição aqui proporcionados. 0 termo "proteína de fusão derivada de imunoglobulina," como aqui utilizado, refere-se a uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma região de imunoglobulina, tal como um domínio VL, VH, CL, CHI, CH2, CH3, e CH4. A região de imunoglobulina pode ser uma região de imunoglobulina tipo selvagem ou uma região de imunoglobulina alterada. Exemplificativas proteínas de fusão derivadas de imunoglobulina incluem fragmento de cadeia única variável de anticorpo (scFv) (ver, e. g., Huston et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-83, 1988), proteínas SMIP™ (ver,
Publicação de Patente U.S. N°s. 2003/0133939, 2003/0118592, e 2005/0136049), proteínas PIMS (ver, Publicação de Pedido PCT N° WO 2009/023386), e proteínas de ligação multifuncionais (tais como proteínas SCORPION™ e Xceptor) (ver, Publicação de Pedido PCT N° WO 2007/146968, Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2006/0051844, e Patente US N° 7 166 707).
As definições adicionais são proporcionadas ao longo da presente revelação.
Polipéptidos Heterodímero
Num aspeto, a presente revelação proporciona um polipéptido heterodímero formado pela associação de dois diferentes polipéptidos de cadeia única. O primeiro polipéptido de cadeia única (SCP-I) compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um a quatro domínios de ligação que ligam especificamente um a quatro alvos, uma charneira (H-I), um domínio de heterodimerização de imunoglobulina (HD-I), e uma porção da região Fc (FRP-I), em que o segundo polipéptido de cadeia única (SCPII) compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em zero a quatro domínios de ligação que ligam especificamente zero a quatro alvos, uma charneira (H-II), um domínio de heterodimerização de imunoglobulina (HD-II), e uma porção da região Fc (FRP-II), desde que o polipéptido heterodímero compreenda pelo menos dois domínios de ligação que ligam especificamente um ou mais alvos, por exemplo, pelo menos dois alvos diferentes. 0 H-I e H-II podem ter a mesma sequência, mas podem ser diferentes. A HD-I pode compreender uma região CHI de imunoglobulina, e o HD-II pode compreender uma região CL de imunoglobulina. Alternativamente, o HD-I pode compreender uma região CL de imunoglobulina, e o HD-II pode compreender uma região CHI de imunoglobulina. 0 FRP-I e FRP-II pode ter a mesma sequência, mas pode ser diferente. Os componentes individuais dos polipéptidos heterodímero da presente revelação são aqui descritos em detalhe.
Domínios de ligação
Como indicado acima, o polipéptido heterodímero da presente revelação compreende dois polipéptidos de cadeia única: Um polipéptido de cadeia única compreende de um a quatro domínios de ligação que ligam especificamente de um a quatro alvos, e o outro polipéptido de cadeia única do polipéptido heterodímero compreende de zero a quatro domínios de ligação que ligam zero a quatro alvos. 0 número total de domínios de ligação do polipéptido heterodímero varia de cerca de dois a oito, e o número total de alvos diferentes que os domínios de ligação ligam variam de cerca de um a oito, por exemplo, de dois a oito, dois a quatro, dois a três ou dois alvos.
Se um polipéptido de cadeia única de um polipéptido heterodímero compreende um único domínio de ligação, o domínio de ligação pode estar localizado amino ou carboxi terminal à porção da região Fc do polipéptido de cadeia única. Por exemplo, um polipéptido de cadeia única compreendendo dois domínios de ligação pode ter um domínio de ligação localizado no terminal amino e os outros carboxilo terminais à porção da região Fc do polipéptido de cadeia única, ou ambos os domínios de ligação podem ser amino terminais ou ambos carboxilo terminais à porção da região Fc. Noutro exemplo, um polipéptido de cadeia única pode compreender três domínios de ligação em que (a) dois domínios de ligação são amino terminais em diferentes proteínas de cadeia única e o terceiro domínio de ligação é carboxilo terminal à porção da região Fc na SCP-I ou SCP-II, (b) dois domínios de ligação são carboxilo terminais em diferentes proteínas de cadeia única e o terceiro domínio de ligação é amino terminal à porção da região Fc na SCP-I ou SCP-II. Ainda noutro exemplo, um polipéptido heterodímero pode compreender quatro domínios de ligação, em que dois domínios de ligação estão localizados amino terminais à porção da região Fc em diferentes cadeias e os outros dois domínios de ligação estão localizado carboxilo terminais à porção da região Fc em diferentes cadeias. Alternativamente, em qualquer destas formas de realização, dois domínios de ligação podem ser ligados a cada outros em tandem e localizados na SCP-I ou SCP-II ou ambas, dependendo do número de domínios de ligação presentes - o empilhamento em tandem é utilizado quando cinco a oito domínios de ligação combinados estão presentes nas SCP-I e SCP-II. A ligação de um alvo por um domínio de ligação modula a interação entre o alvo (e. g., um recetor ou um ligando) e outra molécula. Em certas formas de realização, a ligação de um alvo (e. g., um recetor) por um domínio de ligação estimula certas funções do alvo (e. g., transdução de sinal) ou aproxima alvos diferentes pra um efeito biológico (e. g., dirigindo as células T para um tumor que por sua vez ativa as células T). Em determinadas outras formas de realização, a ligação de um alvo por um domínio de ligação bloqueia a interação entre o alvo e outra molécula e deste modo interfere, reduz ou elimina certas funções do alvo.
Uma molécula alvo, que está especificamente ligada por um domínio de ligação contido num polipéptido heterodímero da presente revelação, pode ser encontrada na ou em associação com uma célula de interesse ("célula alvo"). As células alvo exemplificativas incluem células de cancro, células associadas com uma doença ou distúrbio autoimunitária ou com uma doença ou distúrbio inflamatório, células B e células T. Uma molécula alvo pode também não estar associada com uma célula. As moléculas alvo exemplificativas não associadas com uma célula incluem proteínas solúveis, proteínas segregadas, proteínas depositadas, e proteínas extracelulares estruturais (matriz).
Em certas formas de realização, os domínios de ligação dos polipéptidos heterodímero da presente revelação ligam especificamente um alvo selecionado a partir de células T alvo, antigénios de tumor, célula B alvo, citocinas ou quimiocinas pro-inflamatórias, citocinas ou fatores de crescimento pro-oncogénicos, agentes angiogénicos, recetores Fc, recetor de transferrina, recetor de cinases de tirosina (RTKs), TNFSFRs, ou qualquer combinação destes. Por exemplo, os polipéptidos heterodímero da presente revelação ligam-se especificamente a células T alvo e a um tumor alvo.
Em certas formas de realização, um domínio de ligação de um polipéptido heterodímero da presente revelação liga-se especificamente a células T alvo, tal como a um complexo de TCR ou um seu componente (e. g., TCRa, TCRβ, CD3y, CD3õ, e CD3 ε) , CD28, PD —1, HVEM, BTLA, CD80, CD86, GITR, e TGFBR1.
Em certas formas de realização, um domínio de ligação de polipéptido heterodímero da presente revelação liga-se especificamente a um complexo de TCR ou um seu componente. Por exemplo, em certas formas de realização, um domínio de ligação liga-se especificamente a uma cadeia CD3 humana individual (e. g., cadeia CD3y humana, cadeia CD35 humana, e cadeia CD3s humana) ou uma combinação de duas ou mais das cadeias CD3 humanas individuais (e. g., um complexo de CD3y humano e CD3s humano ou um complexo de CD35 humano e CD3s humano). Em certas formas de realização, um domínio de ligação liga-se especificamente a uma cadeia CD3s humana. Em determinadas outras formas de realização, um domínio de ligação liga-se especificamente a um ou mais de TCRa humano, TCRp humano, ou um heterodímero formado a partir de TCRa humano e TCRp humano. Em determinadas outras formas de realização, um domínio de ligação da presente revelação liga-se a um complexo formado a partir de uma ou mais cadeias de CD3 humano com uma ou mais cadeias de TCR humano, tal como um complexo formado a partir de uma cadeia CD3y humana, uma cadeia CD35 humana, ou uma cadeia CD3s humana com uma cadeia TCRa humana ou uma cadeia TCRp humana. Em qualquer destas formas de realização, um polipéptido heterodímero da presente revelação pode também ligar um tumor alvo.
Em certas formas de realização, um ou mais domínios de ligação de um polipéptido heterodímero da presente revelação liga especificamente um tumor alvo, incluindo RON, c-Met, CEACAM-6, PSMA, EpCAM, CEA, PCTA-1, STEAP-1, PSCA, ALCAM (CD166), EphA2, CD151, CA-125, MUC-1, MAGE-1, TR0P2, IGF1R, CD4 4v6, CD151, TGFBR2, GHRHR, GHR, IL-6R, gpl30, TNFR2, ΟΞΜΒβ, Patched-1, Frizzled, Robol, ΕΤβΤ, CD80, CD81, CD86, CCR5, HER-3, HER-4, EGFR, CEA, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5b, MUC7, βϊιΰΰ, Lewis-Y, CD33, CD30, gangliósido GD3, 9-OAcetil- GD3, GM2, Globo H, fucosil GM1, Poly SA, GD2,
Carboanidrase IX (MN/CA IX), CD44v6, Sonic Hedgehog (Shh), Wue-1, Antigénio contra Células do Plasma, IgE (ligado a membrana), Proteoglicano Sulfato de Condroitina Melanoma (MCSP), CCR8, precursor TNF-alfa, STEAP-2, mesotelina,
Antigénio A33, Antigénio contra as Células Estaminais da Próstata (PSCA), Ly-6; desmogleína 4, neoepitopo de E-caderina, Recetor de Acetilcolina Fetal, CD25, marcador CA19-9, marcador CA-125 e Recetor tipo II de Substância Inibidora Mueleriana (MIS), sTn (antigénio sialilado Tn; TAG-72), FAP (antigénio de ativação de fibroblastos), endosialina, EGFRvIII, LG, SAS, CD63, B7-H3, ou qualquer combinação destes.
Em certas formas de realização, um ou mais domínios de ligação de um polipéptido heterodímero da presente revelação liga especificamente um alvo em células B, tal como CD 19, CD20, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD70, CD79b, HLADR, ou qualquer combinação destes.
Em certas formas de realização, um ou mais domínios de ligação de um polipéptido heterodímero da presente revelação ligam especificamente uma citocina ou quimiocina pro-inflamatória, tal como TNFa, IL-6, hyperIL-6, IL-2, IL-1, IL-8, IP-10, IFNy, IFNa, RANKL, FASL, ΕΰΕβ, IL7, IL10, IL17A/F, TWEAK, CSF2, IGF1, IGF2 ou BLyS/APRIL, ou qualquer combinação destes.
Em certas formas de realização, um ou mais domínios de ligação de um polipéptido heterodímero da presente revelação ligam-se especificamente a citocina ou fator de crescimento prooncogénicos, tais como HGF, MSP, EGF (incluindo epirregulina, herregulina, β-regulina, neurregulina) , HIF-la, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, TNFa, IL-6, hyperIL-6, IL-8, Wnt, sHH, TGF3, PDGF, ou qualquer combinação destes.
Em certas formas de realização, um ou mais domínios de ligação de um polipéptido heterodímero da presente revelação ligam especificamente um agente angiogénico, tal como PDGFR, VEGFR1-4, NRP1, Angiopoietina 2, c-Met ou qualquer combinação destes.
Em certas formas de realização, um ou mais domínios de ligação de um polipéptido heterodímero da presente revelação ligam especificamente um recetor Fc, tal como CD64, CD32A, CD32B, CD16, FcRn, ou qualquer combinação destes.
Em certas formas de realização, um domínio de ligação de um polipéptido heterodímero da presente revelação liga especificamente um recetor de transferrina, tal como CD71.
Em certas formas de realização, um ou mais domínios de ligação de um polipéptido heterodímero da presente revelação liga especificamente um recetor cinase de tirosina, tais como EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, IGF1R, EphA2, c-Met, RON, ou qualquer combinação destes.
Em certas formas de realização, um ou mais domínios de ligação de um polipéptido heterodímero da presente revelação liga especificamente um TNFSFR, tal como TNFR1, TNFR2, TWEAKR, TACI, BAFF-R, BCMA, FAS, 0X40, GITR, 4-1-BB, LTbetaR, HVEM, RANK, ou qualquer combinação destes.
Em certas formas de realização, um ou mais domínios de ligação de um polipéptido heterodímero da presente revelação ligam especificamente hyperIL-6, IL-10, LIGHT, CD40, PDL1, PDL2, ou qualquer combinação destes.
Em certas formas de realização, um ou mais domínios de ligação de um polipéptido heterodímero da presente revelação são um agonista de uma das seguintes moléculas: IL-10, HLA-G, HGF, IL-35, PD-1, BTLA, TNFR1, TNFR2, DR4, DR5, TWEAKR, FAS, ou qualquer combinação destes.
Um domínio de ligação pode ser qualquer péptido que liga especificamente um alvo de interesse. As fontes de domínios de ligação incluem regiões variáveis de anticorpo de várias espécies (que podem ser formatadas como anticorpos, sFvs, scFvs, Fabs, ou domínio VH solúvel ou anticorpos domínio), incluindo humanos, roedores, aves, e ovinos. As fontes adicionais de domínios de ligação incluem regiões variáveis de anticorpos de outras espécies, tais como camelídeos (de camelos, dromedários, ou lamas; Ghahroudi et al. (1997) FEBS Letters 414(3):521-526; Vincke et al. (2009) Journal of Biological Chemistry (2009) 284:3273-3284; Hamers-Casterman et al. (1993) Nature, 363:446 e Nguyen et al. (1998) J. Mol. Biol., 275:413), tubarões lixa (Roux et al. (1998) Proc. Nat'l. Acad. Sei. (USA) 95:11804), peixe serra (Nguyen et al. (2002) Immunogenetics, 54:39), ou lampreia (Herrin et al., (2008) Proc. Nat'l. Acad. Sei. (USA) 105:2040-2045 e Alder et al. (2008) Nature Immunology 9:319-327) . Estes anticorpos podem aparentemente formar regiões de ligação de antigénio utilizando apenas região variável de cadeia pesada, i.e., estes anticorpos funcionais são homodímeros de cadeias pesadas apenas (referidos como "anticorpos de cadeia pesada") (Jespers et al. (2004) Nature Biotechnology 22:1161-1165; Cortez-Retamozo et al. (2004) Cancer Research 64:2853-2857; Baral et al. (2006) Nature Medicine 12:580-584, e Barthelemy et al. (2008) Journal of Biological Chemistry 283:3639-3654).
Os anticorpos anti-CD3 exemplificativos dos quais o domínio de ligação desta revelação pode ser derivado incluem anticorpo monoclonal Cris-7 (Reinherz, E. L. et al. (eds.), Leukocyte typing II., Springer Verlag, Nova Iorque, (1986)), anticorpo monoclonal BC3 (Anasetti et al. (1990) J. Exp. Med. 172:1691), OKT3 (Ortho multicenter Transplant Study Group (1985) N. Engl. J. Med. 313:337) e derivados destes tais como OKT3 ala-ala (Herold et al. (2003) J. Clin. Invest. 11:409), visilizumab (Carpenter et al. (2002) Blood 99:2712), e anticorpo monoclonal 145-2C11 (Hirsch et al. (1988) J. Immunol. 140: 3766) . Um anticorpo anti-TCR exemplificativo é H57 anticorpo monoclonal (Lavasani et al. (2007) Scandinavian Journal of Immunology 65:39-47).
Uma fonte alternativa de domínios de ligação desta revelação inclui sequências que codificam bibliotecas aleatórias de péptido ou sequências que codificam uma diversidade de aminoácidos manipulada em regiões ansa de estruturas alternativas não anticorpo, tal como domínios de fibrinogénio (ver, e. g., Weisel et al. (1985) Science 230:1388), domínios Kunidadez (ver, e. g., Patente US N° 6 423 498), proteínas de repetição de ankquirina (Binz et al. (2003) Journal of Molecular Biology 332:489-503 e Binz et al. (2004) Nature Biotechnology 22(5):575-582), domínios de ligação a fibronectina (Richards et al. (2003) Journal of Molecular Biology 326:1475-1488; Parker et al. (2005)
Protein Engineering Design and Selection 18(9):435-444 e Hackel et al. (2008) Journal of Molecular Biology 381:1238-1252), miniproteinas cisteina-knot (Vita et al. (1995) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 92:6404-6408; Martin et al. (2002) Nature Biotechnology 21:71-76 e Huang et al. (2005) Structure 13:755-768), domínios de repetição de tetratricopéptido (Main et al. (2003) Structure 11:497-508 e Cortajarena et al. (2008) ACS Chemical Biology 3:161-166), domínios de repetições ricas em leucina (Stumpp et al. (2003) Journal of Molecular Biology 332:471-487), domínios de lipocalina (ver, e. g., WO 2006/095164, Beste et al. (1999) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 96:1898-1903 e Schõnfeld et al. (2009) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 106:8198-8203), domínios tipo V (ver, e. g., Publicação de Pedido de Patente US N° 2007/0065431), domínios lectina tipo C (Zelensky e Gready (2005) FEES J. 272:6179; Beavil et al. (1992) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 89:753-757 e Sato et al. (2003) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 100:7779-7784), mAb2 ou FCAB™ (ver, e. g., Pedido de Publicação de Patente PCT N° . WO 2007/098934; WO 2006/072620), ou afins (Nord et al. (1995) Protein Engineering 8 (6) : 601-608; Nord et al. (1997) Nature Biotechnology 15:772-777; Nord et al. (2001) European Journal of Biochemistry 268(15) :4269-4277 e Binz et al. (2005) Nature Biotechnology 23:1257-1268).
Os domínios de ligação desta revelação podem ser produzidos como aqui descrito ou por uma variedade de métodos conhecidos na técnica (ver, e. g., Patentes U.S. N°s 6 291 161 e 6 291 158) . Por exemplo, os domínios de ligação desta revelação podem ser identificados por pesquisa de uma biblioteca de fagos Fab por fragmentos Fab que se ligam especificamente a um alvo de interesse {ver Hoet et al. (2005) Nature Biotechnol. 23:344). Adicionalmente, as estratégias tradicionais para o desenvolvimento de hibridomas utilizando um alvo de interesse como um imunogénio em sistemas convenientes (e. g. , murganhos, HUMAB MOUSE®, TC MOUSE™, KM-MOUSE®, lamas, galinhas, ratos, hamsters, coelhos, etc.) podem ser utilizadas para desenvolver domínios de ligação desta revelação.
Em certas formas de realização, um polipéptido heterodímero compreende um domínio de ligação CD86, tais como um ectodimínio CTLA4, um ectodomínio CD28, ou um domínio de ligação da região variável de imunoglobulina (tal como um scFv) específico para CD86 (e. g., de anticorpos monoclonais 3D1 ou FUN1). Em algumas formas de realização, menos do que um ectodomínio inteiro é utilizado. Por exemplo, os domínios no ectodomínio CTLA4 que liga CD86 e evita a ligação de CD86 a CD28 podem ser utilizados. 0 domínio de ligação CD86 pode bloquear a ligação de CD86 a CD28 e deste modo regular negativamente a ativação de células T.
Em certas formas de realização, um polipéptido heterodímero compreende um agonista de IL-10, tal como IL-10, monoIL-10, ou uma sua região funcional. "MonoIL-10" refere-se a uma molécula IL-10 possuindo um ligante curto (GGGSGG, SEQ ID NO:760) que separa os dois subdomínios da molécula (domínios da extremidade amino e carboxilo) de modo que estes subdomínios podem formar um dímero intramolecular.
Em certas formas de realização, um polipéptido heterodímero compreende um agonista de HLA-G, tal como um HLA-G5, um HLAG1, uma muteína HLA-G, ou uma sua região funcional; um ectodomínio de um HLA-G5, um HLA-G1 ou uma muteína HLA-G; ou um domínio de ligação da região variável de imunoglobulina (tal como um scFv) específico para ILT2, ILT4 ou KIR2DL4.
Em certas formas de realização, um polipéptido heterodímero compreende um agonista de HGF, tal como um HGF ou um seu subdomínio.
Em certas formas de realização, um polipéptido heterodímero compreende um agonista de IL35, tal como um domínio de ligação da região variável de imunoglobulina (tal como um scFv) específico para IL35R ou IL35, ou uma sua região funcional.
Em certas formas de realização, um polipéptido heterodímero compreende um antagonista de LIGHT, tal como um domínio de ligação da região variável de imunoglobulina (tal como um scFv) especifico para LIGHT, ou um ectodominio HVEM ou uma sua região funcional.
Em certas formas de realização, um polipéptido heterodímero compreende um agonista de PD-1, tal como um domínio de ligação da região variável de imunoglobulina (tal como um scFv) específico para PD-1, ou um ligando PD-1 (e. g. PD-L1 ou PD-L2) ou uma sua região funcional.
Em certas formas de realização, um polipéptido heterodímero compreende um agonista de BTLA, tal como um domínio de ligação da região variável tipo imunoglobulina (tal como um scFv) específico para BTLA, ou um ectodominio HVEM ou uma sua região funcional.
Em certas formas de realização, um polipéptido heterodímero compreende um antagonista GITRL, tal como um domínio de ligação da região variável tipo imunoglobulina (tal como um scFv) específico para GITRL, ou um ectodominio GITR, GITR solúvel, ou uma sua região funcional.
Em certas formas de realização, um polipéptido heterodímero compreende um antagonista de CD40, tal como um domínio de ligação da região variável tipo imunoglobulina (tal como um scFv) específico para CD40.
Em algumas formas de realização, um domínio de ligação é um fragmento Fv de cadeia única (scFv) que compreende as regiões VH e VL específicas para um alvo de interesse. Em certas formas de realização, os domínios VH e VL são humanos. As regiões VH exemplificativas incluem a região VH do scFv 2E12 (anti-CD28) como apresentado na SEQ ID NO:106, a região VH do scFv P2C2 (anti-CD79b) como apresentado na SEQ ID NO:184, a região VH do scFv 5D5 (anti-c-Met) como apresentado nas SEQ ID NO:258, a região VH de scFv A2 (anti-hyperIL-6) como apresentado na SEQ ID NO:80, a região VH de scFv 3D1 (anti-CD86) como apresentado na SEQ ID NO:92, a região VH de scFv MET021 (anti-c-Met) como apresentado na SEQ ID NO:100, a região VH de scFv G19-4 (anti-CD3) como apresentado na SEQ ID NO: 103, a região VH de scFv HD37 (anti-CD19) como apresentado na SEQ ID NO: 117, a região VH de scFv M0042 (anti-HLA-DR) como apresentado na SEQ ID NO:121, a região VH de scFv BMA031 (anti-TCR) como apresentado na SEQ ID NO:828, a região VH de scFv OKT3-M (anti-CD3) como apresentado na SEQ ID NO:831, e a região VH de scFv HuM291 (anti-CD3) como apresentado na SEQ ID NO:835. As sequências de nucleótidos que codificam as regiões VH dos scFv A2 (anti-hyperIL-6) e 3D1 (anti-CD86) são apresentadas nas SEQ ID NOS:79 e 91, respetivamente.
Domínios VL exemplares são a região VL de 2E12 (anti-CD28) scFv como apresentado na SEQ ID NO:107, a região VL de P2C2 (anti-CD79b) scFv como apresentado na SEQ ID NO:182, a região VL de 5D5 (anti-c-Met) scFv como apresentado na SEQ ID NO:259, a região VL de A2 (anti-hiper IL-6) scFv como apresentado na SEQ ID NO:84, a região VL de 3D1 (anti- CD86) scFv como apresentado na SEQ ID NO:96, a região VL de MET021 (anti-c-Met) scFv como apresentado na SEQ ID NO: 101, a região VL de G19-4 (anti-CD3) scFv como apresentado na SEQ ID NO: 104, a região VL de HD37 (anti-CD19) scFv como apresentado na SEQ ID NO: 119, a região VL de M0042 (anti-HLA-DR) scFv como apresentado na SEQ ID NO: 122, a região VL de BMA031 (anti-TCR) scFv como apresentado na SEQ ID NO:829, a região VL de OKT3-M (anti-CD3) scFv como apresentado na SEQ ID NO: 833, e a região VL de HuM291 (anti-CD3) scFv como apresentado na SEQ ID NO:836. As sequências de nucleótidos que codificam as regiões VL dos scFv A2 (anti-hiperIL-6) e 3D1 (anti-CD86) são apresentadas nas SEQ ID NOS: 83 e 95, respetivamente.
Em algumas formas de realização, um domínio de ligação é um fragmento Fv de cadeia simples (scFv) que compreende os domínios Vh e Vl específicos para um complexo TCR ou um seu componente. Em certas formas de realização, os domínios Vh e Vl são domínios Vh e Vl humanos ou humanizados. Domínios Vh exemplares incluem os domínios BC3 (anti-CD3) Vh, OKT3 (anti-CD3) Vh, H57 (anti-TCR) VH, e 2C11 (anti-CD3) VH como apresentado na SEQ ID NOS:301, 303, 313, e 317, respetivamente. Outros domínios Vh exemplares incluem domínios Cris-7 (anti-CD3) Vh, tais como aqueles apresentados nas SEQ ID NOS:327 e 331-333. Domínios Vl exemplares são domínios Vl BC3 (anti-CD3) Vl, OKT3 (anti-CD3) Vl, H57 (anti-TCR) VL, e 2C11 (anti-CD3) como apresentado nas SEQ ID NOS:302, 304, 315 e 318, respetivamente. Outros domínios Vl exemplares incluem domínios Vl Cris-7 (anti- CD3), tais como aqueles apresentados nas SEQ ID NOS :328, 329 e 330.
Em certas formas de realização, um domínio de ligação compreende ou é uma sequência que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia leve (Vl) ou a uma região variável da cadeia pesada (Vh) , ou ambas, em que cada CDR compreende zero alterações ou no máximo uma, duas, ou três as, de um anticorpo monoclonal ou seu fragmento ou derivado que se liga especificamente a um alvo de interesse (e.g., c-Met, RON, CD28, CD79b, CD3s, TCRa, TCR3, hiper IL-6, CD86, CD19, e HLA-DR) e cada mutante ou derivado ainda se liga ao seu alvo.
Em certas formas de realização, uma região VH ou VL do domínio de ligação da presente descrição pode ser derivada de ou baseada em uma VH ou VL de um anticorpo monoclonal conhecido e contém uma ou mais (e.g., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) inserções, uma ou mais (e.g., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) deleções, uma ou mais (e.g., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) substituições de aminoácidos (e.g., substituições de aminoácidos conservadoras ou substituições de aminoácidos não conservadoras), ou uma combinação das alterações acima referidas, quando comparadas com a VH ou VL de um anticorpo monoclonal conhecido. A inserção(ões), deleção(ões) ou substituição(ões) pode ocorrer em qualquer lado na região VH, incluindo no terminal amino- ou carboxilo ou e ambas as extremidades desta região, desde que cada CDR compreenda zero alterações ou no máximo uma, duas ou três alterações e desde que um domínio de ligação que contenha a região VH ou VL modificada possa ainda ligar-se especificamente ao seu alvo com uma afinidade aproximadamente igual à do domínio de ligação de tipo selvagem.
Os domínios VH e VL podem ser dispostos em qualquer orientação (i.e., do terminal amino para o terminal carboxilo, VH-VL ou VL-VH) e podem ser unidos através de uma sequência de aminoácidos (e.g., possuindo comprimento de cerca de cinco até cerca de 35 aminoácidos) capaz de proporcionar uma função de espaçador de modo a que dois domínios de sub-ligação podem interagir para formar um domínio de ligação funcional. Em certas formas de realização, uma sequência de aminoácidos que une os domínios VH e VL (também aqui referidos como um "ligante") inclui aqueles que pertencem à família (GlynSer) , tal como (GlysSer) n (Gly4Ser) 1, (GlysSer) i (Gly4Ser) n, (GlysSer) n (Gly4Ser) n, ou (Gly4Ser)n, em que n é um inteiro de 1 a 5. Em certas formas de realização, o ligante é GGGGSGGGGS GGGGS (SEQ ID NO:183) ou GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:108). Um ligante exemplar adicional é GGGGSGGGGSGGGGAS (SEQ ID NO:739). Em certas formas de realização, estes ligantes à base de (GlynSer) são utilizados para ligar os domínios VH e VL num domínio de ligação, mas não são utilizados para ligar um domínio de ligação a um domínio de heterodimerização de imunoglobulina ou a uma porção da região Fc.
Domínios de ligação exemplares específicos para CD28 incluem um 2E12 scFv como apresentado na SEQ ID NO:109, domínios de ligação específicos para CD79b incluem um P2C2 scFv como apresentado na SEQ ID NO:185; domínios de ligação específicos para c-Met incluem um 5D5 scFv como apresentado na SEQ ID NO:257; domínios de ligação específicos para RON incluem um 4C04 scFv como apresentado na SEQ ID NO:261 e um 11H09 scFv como apresentado na SEQ ID NO:265; domínios de ligação específicos para hyperIL-6 incluem um A2 scFv como apresentado na SEQ ID NO:86; domínios de ligação específicos para CD86 incluem um 3D1 scFv como apresentado na SEQ ID NO:98; domínios de ligação específicos para HLA-DR incluem um M0042 scFv como apresentado na SEQ ID NO:120; domínios de ligação específicos para CD3 incluem um G19-4 scFv como apresentado na SEQ ID NO:102, um OKT3-M scFv como apresentado na SEQ ID NO:834, e um HuM291 scFv como apresentado na SEQ ID NO:837; o domínio de ligação específico para CD19 inclui um H37 scFv como apresentado na SEQ ID NO:105; e domínios de ligação específicos para c-Met incluem um MET021 scFv como apresentado na SEQ ID NO:120 (com a cadeia leve CDR1, CDR2, CDR3 e cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 como apresentado na SEQ ID NOS:296-298 e 464-466, respetivamente). As sequências de nucleótidos que codificam o A2 (anti-hyperIL6) e 3D1 (anti-CD86) scFv's são apresentadas nas SEQ ID NOS:85 e 97, respetivamente. Domínios de ligação exemplares que se ligam a um complexo TCR ou um seu componente incluem um BMA031 scFv como apresentado na SEQ ID NO:830 e outros scFv's como apresentado na SEQ ID NOS:310, 311, 312, 319, e 334-340.
Os domínios de ligação adicionais exemplificativos incluem um ectodomínio PDL2 como apresentado na SEQ ID NO: 88 e monoIL-10 como apresentado na SEQ ID NO:90. As sequências de nucleótido que codificam o ectodomínio PDL2 e monoIL-10 são apresentadas nas SEQ ID NOS:87 e 89, respetivamente. A sequência de aminoácidos da cadeia leve do scFv 4C04 (anti-RON) é apresentada na SEQ ID NO: 602, e as suas CDR1, CDR2, e CDR3 são apresentadas nas SEQ ID NOS :604-606, respetivamente. A sequência de aminoácidos da cadeia pesada do scFv 4C04 (anti-RON) é apresentada na SEQ ID NO:603, e as suas CDR1, CDR2, e CDR3 são apresentadas nas SEQ ID NOS :607-609, respetivamente. A sequência de aminoácidos da cadeia leve do scFv 11H09 (anti-RON) é apresentada na SEQ ID NO: 610, e as suas CDR1, CDR2, e CDR3 são apresentadas nas SEQ ID NOS :612-614, respetivamente. A sequência de aminoácidos da cadeia pesada do scFv 11H09 (anti-RON) é apresentada na SEQ ID NO:611, e as suas CDR1, CDR2, e CDR3 são apresentadas nas SEQ ID NOS:615-617, respetivamente.
Pode estar localizado um domínio de ligação amino terminal ou carboxi terminal à porção da região Fc de um polipéptido de cadeia única da presente revelação. Em certas formas de realização, o domínio de ligação está localizado no terminal amino de um polipéptido de cadeia única. Em determinadas outras formas de realização, o domínio de ligação está localizado no terminal carboxilo de um polipéptido de cadeia única. Em determinadas outras formas de realização, um domínio de ligação está localizado nos terminais amino e carboxílico de um polipéptido de cadeia única.
Domínios de Heterodimerização
Como indicado acima, um polipéptido heterodímero da presente revelação compreende um domínio de heterodimerização de imunoglobulina em cada cadeia de polipéptido. 0 domínio de heterodimerização de imunoglobulinas nos dois polipéptidos de cadeia única de um polipéptido heterodímero são diferentes uns dos outros e podem deste modo ser diferencialmente modificados para facilitar a heterodimerização de ambas as cadeias e para minimizar a homodimerização de cada cadeia. Como apresentado nos exemplos, o domínio de heterodimerização de imunoglobulinas aqui proporcionado permite a eficiente heterodimerização entre diferentes polipéptidos e facilita a purificação dos polipéptidos heterodímero resultantes.
Como aqui proporcionado, o domínio de heterodimerização de imunoglobulinas útil para promover a heterodimerização de dois diferentes polipéptidos de cadeia única (e. g., um curto e um longo) de acordo com a presente revelação inclui domínios CHI e CL de imunoglobulina, por exemplo, domínios CHI e CL humanos. Em certas formas de realização, um domínio de heterodimerização de imunoglobulina é uma região CHI tipo selvagem, tal como uma IgGl tipo selvagem, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE, ou região CHI de IgM. Em outras formas de realização, um domínio de heterodimerização de imunoglobulina é uma IgGl humana tipo selvagem, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE, ou região CHI de IgM como apresentado nas SEQ ID N0S:114, 186-192 e 194, respetivamente. Em certas formas de realização, um domínio de heterodimerização de imunoglobulina é uma região CHI de IgGl humana do tipo selvagem como apresentado na SEQ ID NO:114.
Em outras formas de realização, um domínio de heterodimerização de imunoglobulina é uma região CHI de imunoglobulina alterada, tal como uma IgGlalterada, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2 IgD, IgE, ou região CHI de IgM. Em certas formas de realização, um domínio de heterodimerização de imunoglobulina é uma IgGl humana alterada, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE, ou região CHI de IgM. Ainda em outras formas de realização, um resíduo de cisteína de uma região CHI tipo selvagem (e. g., uma CHI humana) envolvida na formação de uma ligação persulfureto com um domínio CL de imunoglobulina tipo selvagem (e. g., uma CL humana) é removida ou substituída na região CHI de imunoglobulina alterada de modo que uma ligação persulfureto não é formada entre a região CHI alterada e o domínio CL tipo selvagem.
Em certas formas de realização, um domínio de heterodimerização de imunoglobulina é um domínio CL tipo selvagem, tal como um domínio Ck tipo selvagem ou um domínio CÀ tipo selvagem. Em formas de realização particulares, um domínio de heterodimerização de imunoglobulina é um Ck humano tipo selvagem ou domínio CÀ humano como apresentado na SEQ ID NOS :112 e 113, respetivamente. Em outras formas de realização, um domínio de heterodimerização de imunoglobulina é um domínio CL de imunoglobulina alterada, tal como um domínio Ck ou CÀ alterado, por exemplo, um Ck humano alterado ou domínio CÀ humano.
Em certas formas de realização, um resíduo de cisteína de um domínio CL tipo selvagem (e. g., um CL humano) envolvido na formação de uma ligação persulfureto com uma região CHI de imunoglobulina tipo selvagem (e. g., uma CHI humana) é removida ou substituída no domínio CL de imunoglobulina alterada. Estes domínios CL alterados podem compreender ainda uma deleção de aminoácido no seu terminal amino. Um domínio Ck exemplificativo é apresentado na SEQ ID NO:141, na qual a primeiro arginina e a última cisteína do domínio Ck humano tipo selvagem são ambos removidos. Em certas formas de realização, apenas a última cisteína do domínio Ck humano tipo selvagem é removido no domínio Ck alterado porque a primeira arginina removida do domínio Ck humano tipo selvagem pode ser proporcionado por um ligante que tem uma arginina no seu terminal carboxilo e liga o terminal amino do domínio Ck alterado com outro domínio (e. g. , uma porção da região Fc). Um domínio CÀ exemplificativo é apresentado na SEQ ID NO:140, na qual a primeira arginina de um domínio CÀ humano tipo selvagem é removido e a cisteína envolvida na formação de uma ligação persulfureto com uma cisteína numa região CHI é substituída por uma serina.
Em outras formas de realização, um domínio de heterodimerização de imunoglobulina é um domínio Ck alterado que contém uma ou mais substituições de aminoácidos, em comparação com um domínio Ck tipo selvagem, nas posições que podem estar envolvidas na formação da rede por ligação intercadeia-hidrogénio numa interface Ck-Ck. Por exemplo, em certas formas de realização, um domínio de heterodimerização de imunoglobulina é um domínio Ck humano alterado possuindo um ou mais aminoácidos nas posições N29, N30, Q52, V55, T56, S68 ou T70 que são substituídas com um diferente aminoácido. A numeração dos aminoácidos é baseada nas suas posições na sequência Ck humana alterada como apresentado na SEQ ID NO:141. Em certas formas de realização, um domínio de heterodimerização de imunoglobulina é um domínio Ck humano alterado possuindo uma, duas, três ou quatro substituições de aminoácidos nas posições N29, N30, V55, ou T70. 0 aminoácido utilizado como um substituto nas posições mencionadas acima podem ser uma alanina, ou um resíduo de aminoácido com uma unidade de cadeia lateral volumosa tal como arginina, triptofano, tirosina, glutamato, glutamina, ou lisina. Os resíduos de aminoácidos adicionais que podem ser utilizados para substituir resíduos de aminoácidos da sequência da Ck humana tipo selvagem nas posições mencionadas acima (e. g., N30) incluem aspartato, metionina, serina e
fenilalanina. Os domínios Ck humanos alterados exemplificativos são apresentados nas SEQ ID NOS: 142-178. Os domínios Ck humanos alterados são os que facilitam a heterodimerização com uma região CHI, mas minimizam a homodimerização com outro domínio Ck. Os domínios Ck humanos alterados representativos são apresentados nas SEQ ID NOS:160 (N29W V55A T70A), 161 (N29Y V55A T70A), 202 (T70E
N29A N30A V55A), 167 (N30R V55A T70A), 168 (N30K V55A T70A), 170 (N30E V55A T70A), 172 (V55R N29A N30A), 175 (N29W N30Y
V55A T70E), 176 (N29Y N30Y V55A T70E), 177 (N30E V55A T70E), 178 (N30Y V55A T70E), 838 (N30D V55A T70E), 839 (N30M V55A T70E), 840 (N30S V55A T70E), e 841 (N30F V55A T70E).
Em certas formas de realização, em adição a ou em alternativa às mutações nos domínios Ck aqui descritos, o domínio de heterodimerização de imunoglobulinas (i.e., domínios CHI e CL de imunoglobulina) de um polipéptido heterodímero têm mutações de modo que o domínio de heterodimerização de imunoglobulinas resultante forma pontes de sal (i.e., interações iónicas) entre os resíduos de aminoácidos nos sítios mutados. Por exemplo, o domínio de heterodimerização de imunoglobulinas de um polipéptido heterodímero pode ser um domínio CHI mutado em combinação com um domínio Ck mutado. No domínio CHI mutado, a valina na posição 68 (V68) do domínio CHI humano tipo selvagem é substituída por um resíduo de aminoácido possuindo uma carga negativa (e. g., aspartato ou glutamato), enquanto a leucina na posição 29 (L29) de um domínio Ck humano mutado no qual a primeira arginina e a última cisteina foram removidas é substituída por um resíduo de aminoácido possuindo uma carga positiva (e. g., lisina, arginina ou histidina). A interação carga-carga entre o resíduo de aminoácido possuindo uma carga negativa do domínio CHI mutado resultante e o resíduo de aminoácido possuindo uma carga positiva do domínio Ck mutado resultante forma uma ponte de sal, que estabiliza a interface heterodimérica entre os domínios mutados CHI e Ck. Alternativamente, V68 de CHI tipo selvagem pode ser substituído por um resíduo de aminoácido possuindo uma carga positiva, enquanto a L29 de um domínio Ck humano mutado, no qual a primeira arginina e a última cisteina foram removidas, pode ser substituída por um resíduo de aminoácido possuindo uma carga negativa. As sequências de CHI mutado exemplificativas nas quais V68 é substituída por um aminoácido com uma carga negativa ou positiva são apresentadas nas SEQ ID NOS :844 e 845. As sequências de Ck mutado exemplificativas nas quais L29 é substituída por um aminoácido com uma carga negativa ou positiva são apresentadas nas SEQ ID NOS :842 e 843.
As posições para além de V68 do domínio CHI humano e L29 do domínio Ck humano podem ser substituídas com aminoácidos possuindo cargas opostas para produzir interações entre os aminoácidos em adição ou em alternativa às mutações na V68 do domínio CHI e L29 do domínio Ck. Estas posições podem ser identificadas por qualquer método adequado, incluindo mutagénese aleatória, análise da estrutura cristal do par CHl-Ck para identificar os resíduos de aminoácidos na interface CHl-Ck, e identificando ainda posições adequadas entre os resíduos de aminoácidos na interface CHl-Ck utilizando um conjunto de critérios (e. g., tendência para participar em interacções iónicas, proximidade de um potencial resíduo parceiro, etc.).
Em certas formas de realização, OS polipéptidos heterodímero da presente revelação contêm apenas um par de domínios de heterodimerização de imunoglobulinas. Por exemplo, uma primeira cadeia de um polipéptido heterodímero pode compreender uma região CHI como um domínio de heterodimerização de imunoglobulina, enquanto uma segunda cadeia pode compreender um domínio CL (e. g., um Ck ou CÀ) como um domínio de heterodimerização de imunoglobulina. Alternativamente, a primeira cadeia pode compreender uma região CL (e. g., uma Ck ou CÀ) como um domínio de heterodimerização de imunoglobulina, enquanto uma segunda cadeia pode compreender uma região CHI como um domínio de heterodimerização de imunoglobulina. Como aqui apresentado, os domínios de heterodimerização de imunoglobulinas da primeira e da segunda cadeia são capazes de associação para formar um polipéptido heterodímero desta revelação.
Em determinadas outras formas de realização, os polipéptidos heterodímero da presente revelação podem ter dois pares de domínios de heterodimerização de imunoglobulinas. Por exemplo, a primeira cadeia de um polipéptido heterodímero pode compreender duas regiões CHI, enquanto uma segunda cadeia pode ter dois domínios CL que se associam com as duas regiões CHI na primeira cadeia. Alternativamente, uma primeira cadeia pode compreender dois domínios CL, enquanto uma segunda cadeia pode ter duas regiões CHI que se associam com os dois domínios CL na primeira cadeia. Em certas formas de realização, uma primeira cadeia de polipéptido compreende uma região CHI e um domínio CL, enquanto uma segunda cadeia de polipéptido compreende um domínio CL e uma região CHI que se associa com a região CHI e o domínio CL, respetivamente, da primeira cadeia de polipéptido.
Nas formas de realização em que um polipéptido heterodímero compreende apenas uma par de heterodimerização (i. e., um domínio de heterodimerização de imunoglobulina em cada cadeia), o domínio de heterodimerização de imunoglobulina de cada cadeia pode ser localizado amino terminal à porção da região Fc dessa cadeia. Alternativamente, o domínio de heterodimerização de imunoglobulina em cada cadeia pode ser localizado carboxi-terminal à porção da região Fc dessa cadeia.
Nas formas de realização em que um polipéptido heterodímero compreende dois pares de heterodimerização (i. e., dois domínios de heterodimerização de imunoglobulinas em cada cadeia), ambos os domínios de heterodimerização de imunoglobulinas em cada cadeia podem ser localizados amino terminais à porção da região Fc dessa cadeia. Alternativamente, ambos os domínios de heterodimerização de imunoglobulinas em cada cadeia podem ser localizados carboxi terminal à porção da região Fc dessa cadeia. Em outras formas de realização, um domínio de heterodimerização de imunoglobulina em cada cadeia pode ser localizado amino terminal à porção da região Fc dessa cadeia, enquanto os outros domínios de heterodimerização de imunoglobulina de cada cadeia podem estar localizados carboxi-terminais à porção da região Fc dessa cadeia. Por outras palavras, nestas formas de realização, a porção da região Fc é interposta entre os dois domínios de heterodimerização de imunoglobulinas de cada cadeia.
Porção da região Fc
Como aqui indicado, os polipéptidos heterodímero da presente revelação compreendem uma porção do domínio constante da região Fc (também referidos como uma porção da região Fc) em cada cadeia de polipéptido. A inclusão de uma porção da região Fc retarda a eliminação dos heterodímeros da circulação após administração a um indivíduo. Por mutações ou outras alterações, a porção da região Fc permite ainda a modulação relativamente fácil do polipéptido heterodímero efector funções (e. g., ADCC, ADCP, CDC, fixação do complemento e ligação aos recetores Fc), que pode ser aumentada ou diminuída dependendo da doença a ser tratada, como conhecido na técnica e aqui descrito. Em certas formas de realização, uma porção da região Fc de polipéptidos heterodímero da presente revelação poderá ser capaz de mediar uma ou mais destas funções efetoras.
Uma porção da região Fc presente em polipéptidos de cadeia única que fazem parte dos polipéptidos heterodímero da presente revelação pode compreender um domínio CH2, um domínio CH3, um domínio CH4 ou qualquer combinação destes. Por exemplo, uma porção da região Fc pode compreender um domínio CH2, um domínio CH3, ambos os domínios CH2 e CH3, ambos os domínios CH3 e CH4, dois domínios CH3, um domínio CH4, ou dois domínios CH4.
Um domínio CH2 que pode formar uma porção da região Fc de um polipéptido de cadeia única de um heterodímero da presente revelação pode ser um domínio CH2 tipo selvagem de imunoglobulina ou um domínio CH2 de imunoglobulina alterado de certas classes ou subclasses de imunoglobulina (e. g., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, ou IgD) e de várias espécies (incluindo humano, murganho, rato, e outros mamíferos).
Em certas formas de realização, um domínio CH2 é um domínio CH2 humano de imunoglobulina tipo selvagem, tal como domínios CH2 tipo selvagem de IgGl humana, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, ou IgD, como apresentado nas SEQ ID NOS :115, 199-201 e 195-197, respetivamente. Em certas formas de realização, o domínio CH2 é um domínio CH2 tipo selvagem da IgGl humana como apresentado nas SEQ ID NO:115.
Em certas formas de realização, um domínio CH2 é uma região CH2 de imunoglobulina alterada (e. g., um domínio CH2 de IgGl humana alterado) que compreende uma substituição de aminoácidos na asparagina da posição 297 (e. g., asparagina por alanina). Esta substituição de aminoácidos reduz ou elimina a glicosilação neste sítio e anula a ligação eficiente de Fc a FcyR e Clq. A sequência de um domínio CH2 alterado da IgGl humana com uma substituição de Asn por Ala na posição 297 é apresentada na SEQ ID NO:324.
Em certas formas de realização, um domínio CH2 é uma região CH2 de imunoglobulina alterada (e. g., um domínio CH2 de IgGl humana alterada) que compreende pelo menos uma substituição ou deleção nas posições 234 a 238. Por exemplo, uma região CH2 de imunoglobulina pode compreender uma substituição na posição 234, 235, 236, 237 ou 238, posições 234 e 235, posições 234 e 236, posições 234 e 237, posições 234 e 238, posições 234-236, posições 234, 235 e 237, posições 234, 236 e 238, posições 234, 235, 237, e 238, posições 236-238, ou quaisquer outras combinações de dois, três, quatro, ou cinco aminoácidos nas posições 234-238. Adicionalmente ou alternativamente, uma região CH2 alterada pode compreender uma ou mais (e. g., dois, três, quatro ou cinco) deleções de aminoácido nas posições 234-238, por exemplo, a da posição 236 ou posição 237 enquanto a outra posição é substituída. As mutações acima mencionadas diminuem ou eliminam a actividade de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) ou capacidade de ligação do recetor Fc de um polipéptido heterodímero que compreende o domínio CH2 de alterado. Em certas formas de realização, os resíduos de aminoácidos em uma ou mais das posições 234-238 foi substituída com um ou mais resíduos de alanina. Em outras formas de realização, apenas um dos resíduos de aminoácidos nas posições 234-238 foi removido enquanto um ou mais dos restantes aminoácidos nas posições 234-238 pode ser substituído com outro aminoácido (e. g., alanina ou serina).
Em determinadas outras formas de realização, um domínio CH2 é uma CH2 região de imunoglobulina alterada (e. g., um domínio CH2 de IgGl humana alterado) que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições 253, 310, 318, 320, 322, e 331. Por exemplo, uma região CH2 de imunoglobulina pode compreender uma substituição na posição 253, 310, 318, 320, 322, ou 331, posições 318 e 320, posições 318 e 322, posições 318, 320 e 322, ou qualquer outra combinação de dois, três, quatro, cinco ou seis aminoácidos nas posições 253, 310, 318, 320, 322, e 331. As mutações acima mencionadas diminuem ou eliminam a citotoxicidade dependente do complemento (CDC) de um polipéptido heterodímero que compreende o domínio CH2 alterado.
Em determinadas outras formas de realização, em adição à substituição do aminoácido na posição 297, uma CH2 região alterada (e. g., um domínio CH2 de IgGl humana alterado) pode compreender ainda uma ou mais (e. g., dois, três, quatro, ou cinco) substituições adicionais nas posições 234-238. Por exemplo, uma região CH2 de imunoglobulina pode compreender uma substituição nas posições 234 e 297, posições 234, 235, e 297, posições 234, 236 e 297, posições 234-236 e 297, posições 234, 235, 237 e 297, posições 234, 236, 238 e 297, posições 234, 235, 237, 238 e 297, posições 236-238 e 297, ou qualquer combinação de dois, três, quatro, ou cinco aminoácidos nas posições 234-238 em adição à posição 297. Adicionalmente ou alternativamente, uma região CH2 alterada pode compreender uma ou mais (e. g., dois, três, quatro ou cinco) deleções de aminoácido nas posições 234-238, tais como na posição 236 ou posição 237. As mutações adicionais diminuem ou eliminam a atividade de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) ou capacidade de ligação do recetor Fc de um polipéptido heterodímero que compreende o domínio CH2 alterado. Em certas formas de realização, os resíduos de aminoácidos numa ou mais das posições 234-238 foram substituídos com um ou mais resíduos de alanina. Em outras formas de realização, apenas um dos resíduos de aminoácidos nas posições 234-238 foi removido enquanto um ou mais dos restantes aminoácidos nas posições 234-238 pode ser substituída por outro aminoácido (e. g., alanina ou serina).
Em certas formas de realização, em adição a um ou mais (e. g., 2, 3, 4, ou 5) substituições de aminoácidos nas posições 234-238, uma região CH2 mutada (e. g., um domínio CH2 de
IgGl humana alterado) numa proteína de fusão da presente revelação pode conter uma ou mais (e. g., 2, 3, 4, 5, ou 6) substituições adicionais de aminoácidos (e. g., substituída com alanina) numa ou mais posições envolvidas na fixação do complemento (e. g., nas posições 1253, H310, E318, K320, K322, ou P331) . Exemplos de regiões CH2 de imunoglobulina mutadas incluem IgGl, IgG2, IgG4 humanas e regiões CH2 de IgG2a de murganho com substituições de alanina nas posições 234, 235, 237 (se presente), 318, 320 e 322. Uma região CH2 de imunoglobulina mutada exemplificativa é a região CH2 de IGHG2c de murganho com substituições de alanina em L234, L235, G237, E318, K320, e K322 (SEQ ID NO:314).
Ainda em outras formas de realização, em adição à substituição de aminoácidos na posição 297 e as deleções ou substituições adicionais nas posições 234-238, uma região CH2 alterada (e. g., um domínio CH2 de IgGl humana alterado) pode compreender ainda uma ou mais (e. g., dois, três, quatro, cinco, ou seis) substituições adicionais nas posições 253, 310, 318, 320, 322, e 331. Por exemplo, uma região CH2 de imunoglobulina pode compreender uma (1) substituição na posição 297, (2) uma ou mais substituições ou deleções ou uma sua combinação nas posições 234-238, e uma ou mais (e. g., 2, 3, 4, 5, ou 6) substituições de aminoácidos nas posições 1253, H310, E318, K320, K322, e P331, tais como uma, dois, três substituições nas posições E318, K320 e K322. Os aminoácidos nas posições acima mencionadas podem ser substituídos por alanina ou serina.
Em certas formas de realização, um polipéptido da região CH2 de imunoglobulina compreende: (i) uma substituição de aminoácidos nas asparaginas da posição 297 e uma substituição de aminoácido na posição 234, 235, 236 ou 237; (i i) uma substituição de aminoácido na asparagina da posição 297 e substituições de aminoácidos em duas das posições 234-237; (iii) uma substituição de aminoácidos na asparagina da posição 297 e substituições de aminoácidos em três das posições 234-237; (iv) uma substituição de aminoácidos na asparagina da posição 297, substituições de aminoácidos nas posições 234, 235 e 237, e uma deleção de aminoácido na posição 236; (v) substituições de aminoácidos em três das posições 234-237 e substituições de aminoácidos nas posições 318, 320 e 322; ou (vi) substituições de aminoácidos em três das posições 234-237, uma deleção de aminoácido na posição 236, e substituições de aminoácidos nas posições 318, 320 e 322 .
As regiões CH2 de imunoglobulina alteradas exemplificativas com substituições de aminoácidos na asparagina da posição 297 incluem: região CH2 de IgGl humana com substituições de alanina em L234, L235, G237 e N297 e uma deleção em G236 (SEQ ID NO:325), região CH2 de IgG2 humana com substituições de alanina em V234, G236, e N297 (SEQ ID NO:326), região CH2 de IgG4 humana com substituições de alanina em F234, L235, G237 e N297 e uma deleção de G236 (SEQ ID NO:322), região CH2 de IgG4 humana com substituições de alanina em F234 e N297 (SEQ ID NO:343), região CH2 de IgG4 humana com substituições de alanina em L235 e N297 (SEQ ID NO:344), região CH2 de IgG4 humana com substituições de alanina em G236 e N297 (SEQ ID NO:345), e região CH2 de IgG4 humana com substituições de alanina em G237 e N297 (SEQ ID NO:346).
Em certas formas de realização, em adição às substituições de aminoácidos acima descritos, uma região CH2 alterada (e. g., um domínio CH2 de IgGl humana alterado) pode conter uma ou mais substituições adicionais de aminoácidos numa ou mais posições para além das posições acima mencionadas. Estas substituições de aminoácidos podem ser conservadoras ou substituições de aminoácidos não conservadoras. Por exemplo, em certas formas de realização, a P233 pode ser alterada para E233 numa região CH2 de IgG2 alterada (ver, e. g., SEQ ID NO:326). Adicionalmente ou alternativamente, em certas formas de realização, a região CH2 alterada pode conter uma ou mais inserções de aminoácidos, deleções, ou ambas. As inserções, deleções ou substituições podem estar em qualquer sitio numa região CH2 de imunoglobulina, tais como nos terminais N ou C de uma região CH2 de imunoglobulina tipo selvagem resultante da ligação da região CH2 com outra região (e. g., um domínio de ligação ou um domínio de heterodimerização de imunoglobulina) através de uma charneira.
Em certas formas de realização, uma região CH2 alterada num polipéptido heterodímero da presente revelação compreende ou é uma sequência que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica à região CH2 de imunoglobulina tipo selvagem, tal como a região CH2 de IgGl, IgG2, ou IgG4 tipo selvagem humana, ou IgG2a de murganho (e. g., IGHG2c).
Uma região CH2 imunoglobulina alterada num polipéptido heterodímero da presente revelação pode ser derivada de uma região CH2 de vários isotipos de imunoglobulina, tais como IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, e IgD, de várias espécies (incluindo humano, murganho, rato, e outros mamíferos). Em certas formas de realização, uma região CH2 de imunoglobulina alterada numa proteína de fusão da presente revelação pode ser derivada de uma região CH2 de IgGl, IgG2 ou IgG4 humana, ou IgG2a de murganho (e. g., IGHG2c), cujas sequências são apresentadas nas SEQ ID NOS:115, 199, 201 e 320.
Em certas formas de realização, um domínio CH2 alterado é um domínio CH2 de IgGl humana com substituições de alanina nas posições 235, 318, 320, e 322 (i.e., um domínio CH2 de IgGl humana com substituições L235A, E318A, K320A e K322A) (SEQ ID NO: 595), e opcionalmente uma mutação N297 (e. g. , para alanina). Em determinadas outras formas de realização, um domínio CH2 alterado é um domínio CH2 de IgGl humana com substituições de alanina nas posições 234, 235, 237, 318, 320 e 322 (i.e., um domínio CH2 de IgGl humana com substituições L234A, L235A, G237A, E318A, K320A e K322A) (SEQ ID NO:596), e opcionalmente uma mutação N297 (e. g., para alanina).
Em certas formas de realização, um domínio CH2 alterado é um domínio CH2 alterado da IgGl humana com mutações conhecidas na técnica que estimula as atividades imunológicas tais como ADCC, ADCP, CDC, fixação do complemento, ligação do recetor Fc, ou qualquer combinação destes. O domínio CH3 que pode formar uma porção da região Fc de um polipéptido de cadeia única de um heterodimero da presente revelação pode ser um domínio CH3 de imunoglobulina tipo selvagem ou um domínio CH3 de imunoglobulina alterado de certas classes ou subclasses de imunoglobulina (e. g., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE, IgM) de várias espécies (incluindo humano, murganho, rato, e outros mamíferos). Em certas formas de realização, um domínio CH3 é um domínio CH3 de imunoglobulina humana tipo selvagem, tal como domínios CH3 tipo selvagem de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE, ou IgM humanas como apresentado nas SEQ ID NOS:116, 208-210, 204-207, e 212, respetivamente. Em certas formas de realização, o domínio CH3 é um domínio CH3 de IgGl humana do tipo selvagem como apresentado na SEQ ID NO:116. Em certas formas de realização, um domínio CH3 é um domínio CH3 de imunoglobulina humana alterado, tal como um domínio CH3 alterado com base ou derivadas de um domínio CH3 tipo selvagem de anticorpos IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE, ou IgM humanos. Por exemplo, um domínio CH3 alterado pode ser um domínio CH3 de IgGl humana com uma ou duas mutações nas posições H433 e N434 (posições são numeradas de acordo com a numeração EU) . As mutações nestas posições podem estar envolvidas na fixação do complemento. Em determinadas outras formas de realização, um domínio CH3 alterado pode ser um domínio CH3 de IgGl humana mas com uma ou duas substituições de aminoácidos na posição F405 ou Y407. Os aminoácidos nestas posições estão envolvidos na interação com outro domínio CH3. Em certas formas de realização, um domínio CH3 alterado pode ser um domínio CH3 de IgGl humana alterado com a sua última lisina removida. A sequência deste domínio CH3 alterado é apresentada na SEQ ID NO:761.
Em certas formas de realização, um polipéptido heterodímero compreende um par CH3 que compreende as denominadas mutações "knobs-intoholes" (ver, Marvin e Zhu, Acta Pharmacologica Sinica 26:649-58, 2005; Ridgway et al., Protein Engineering 9:617-21, 1966). Mais especificamente, as mutações podem ser introduzidas em cada um dos dois domínios CH3 de modo que a complementaridade estérea necessária para a associação CH3/CH3 obriga estes dois domínios CH3 a emparelhar um com o outro. Por exemplo, um domínio CH3 num polipéptido de cadeia única de um polipéptido heterodímero pode conter uma mutação T366W (uma mutação "knob", que substitui um pequeno aminoácido por um maior) , e um domínio CH3 nos outros polipéptidos de cadeia única do polipéptido heterodímero pode conter uma mutação Y407A (uma mutação "hole", que substitui um grande aminoácido por um mais pequeno). Outras mutações knobs-into-holes exemplificativas incluem (1) uma mutação T366Y num domínio CH3 e uma Y407T nos outros domínios CH3, e (2) uma mutação T366W em um domínio CH3 e as mutações T366S, L368A e Y407V nos outros domínios CH3. 0 domínio CH4 que pode formar uma porção da região Fc de um polipéptido de cadeia única de um heterodímero da presente revelação pode ser um domínio CH4 de imunoglobulina tipo selvagem ou um domínio CH4 de imunoglobulina alterada das moléculas IgE ou IgM. Em certas formas de realização, o domínio CH4 é um domínio CH4 de imunoglobulina tipo selvagem humano, tal como domínios CH4 de moléculas IgE e IgM tipo selvagem humanas como apresentado nas SEQ ID NOS :213 e 214, respetivamente. Em certas formas de realização, um domínio CH4 é um domínio CH4 de imunoglobulina humana alterado, tal como um domínio CH4 alterado com base em ou derivadas de um domínio CH4 de moléculas IgE ou IgM humanas, que têm mutações que aumentam ou diminuem uma atividade imunológica conhecida por estar associada com uma região Fc de IgE ou IgM.
Em certas formas de realização, uma porção do domínio constante da região Fc em heterodímeros da presente revelação compreende uma combinação dos domínios CH2, CH3 ou CH4 (i.e., mais do que um subdomínio constante selecionado a partir de CH2, CH3 e CH4) . Por exemplo, a porção da região Fc pode compreender os domínios CH2 e CH3 ou os domínios CH3 e CH4. Em determinadas outras formas de realização, a porção da região Fc pode compreender dois domínios CH3 e sem domínios CH2 ou CH4 (i.e., apenas dois ou mais CH3) . Os subdomínios múltiplos constantes que formam uma porção da região Fc podem ser baseados em ou ser derivadas da mesma molécula de imunoglobulina, ou a mesma classe ou subclasse de moléculas de imunoglobulina. Em certas formas de realização, a porção da região Fc é uma IgG CH2CH3 (e. g., IgGl CH2CH3, IgG2 CH2CH3, e IgG4 CH2CH3) e pode ser uma CH2CH3 humana (e. g. , IgGl, IgG2, e IgG4 humana). Por exemplo, em certas formas de realização, a porção da região Fc compreende (1) domínios CH2 e CH3 de IgGl humana tipo selvagem, (2) CH2 de IgGl humana com substituição N297A (i.e., CH2(N297A)) e CH3 de
IgGl tipo selvagem humana, ou (3) CH2 de IgGl humana(N297A) e um CH3 de IgGl humana alterada com a última lisina removida.
Alternativamente, os subdomínios múltiplos constantes podem ser baseados em ou derivados de diferentes moléculas de imunoglobulinas, ou diferentes classes ou subclasses de moléculas de imunoglobulinas. Por exemplo, em certas formas de realização, uma porção da região Fc compreende o domínio CH3 de IgM humana e o domínio CH3 de IgGl humana. Os subdomínios múltiplos constantes que formam uma porção da região Fc podem ser diretamente ligados um com o outro ou podem ser ligados uns com os outros via um ou mais (e. g., cerca de 2-10) aminoácidos.
As porções da região Fc exemplificativas são apresentadas nas SEQ ID NOS:305-309, 321, 323, 341, 342, e 762.
Em certas formas de realização, as porções da região Fc de ambos os polipéptidos de cadeia única de um polipéptido heterodímero são idênticas umas às outras. Em determinadas outras formas de realização, a porção da região Fc de um polipéptido de cadeia única de um polipéptido heterodímero é diferente da porção da região Fc do outro polipéptido de cadeia única d heterodímero.
Por exemplo, uma porção da região Fc pode conter um domínio CH3 com uma mutação "knob", em que as outras porções da região Fc podem conter um domínio CH3 com uma mutação "hole".
Charneira A região de charneira contida num polipéptido de cadeia única de um polipéptido heterodimero de acordo com a presente revelação pode estar localizada (a) imediatamente amino terminal a uma porção da região Fc (e. g., dependendo do isotipo, amino terminal a um domínio CH2 em que a porção da região Fc é um CH2CH3, ou amino terminal a um domínio CH3 em que a porção da região Fc é um CH3CH4), (b) interposta entre e ligando um domínio de ligação (e. g., scFv) e um domínio de heterodimerização de imunoglobulina, (c) interposta entre e ligando um domínio de heterodimerização de imunoglobulina e uma porção da região Fc (e. g., em que a porção da região Fc é um CH2CH3 ou um CH3CH4, dependendo do isotipo ou isotipos), (d) interposta entre e ligando uma porção da região Fc e um domínio de ligação, (e) no terminal amino do polipéptido de cadeia única, ou (f) no terminal carboxilo do polipéptido de cadeia única. 0 polipéptido de cadeia única compreendendo uma região de charneira como aqui descrito será capaz de se associar a diferentes polipéptidos de fusão de cadeia simples para formar um polipéptido heterodimero aqui proporcionado, e o polipéptido heterodimero formado irá conter um domínio de ligação que retém a sua especificidade para o alvo ou a sua afinidade de ligação específica para o alvo.
Em certas formas de realização, uma charneira presente num polipéptido de cadeia única que forma um polipéptido heterodimero com outro polipéptido de cadeia única pode ser uma região de charneira de imunoglobulina, tal como uma região de charneira de imunoglobulina tipo selvagem ou uma região charneira de imunoglobulina alterada.
Em certas formas de realização, a charneira é uma região de charneira de imunoglobulina tipo selvagem humana (e. g., regiões de charneira de imunoglobulina humana como apresentadas nas SEQ ID NOS :215-221) . Em determinadas outras formas de realização, um ou mais resíduos de aminoácidos podem ser adicionados ao terminal amino ou carboxilo de uma região de imunoglobulina tipo selvagem de charneira como parte de uma conceção de construção de proteína de fusão. Por exemplo, os resíduos adicionais de aminoácidos de junção na charneira amino-terminal pode ser "RT," "RSS," "TG," ou "T", ou a charneira do terminal carboxilo pode ser "SG", ou a deleção da charneira pode ser combinada com uma adição, tal como ΔΡ com "SG" adicionado ao terminal carboxilo.
Em certas formas de realização, uma charneira é uma charneira de imunoglobulina alterada na qual um ou mais resíduos de cisteína numa região de charneira de imunoglobulina tipo selvagem é substituída por um ou mais de outros resíduos de aminoácidos (e. g., serina ou alanina). Por exemplo, uma charneira pode ser uma charneira de imunoglobulina alterada baseada em ou derivada de uma charneira de IgGl tipo selvagem humana como apresentado na SEQ ID NO:667, que desde o terminal amino ao terminal carboxilo compreende a região de charneira superior (EPKSCDKTHT, SEQ ID NO:227) e a região de charneira central (CPPCP, SEQ ID NO:228). As charneiras de imunoglobulina alterada exemplificativa incluem uma região de charneira de imunoglobulina IgGl humana possuindo um, dois ou três resíduos de cisteína encontrados numa charneira de IgGl tipo selvagem humana substituída por um, dois ou três resíduos de aminoácidos diferentes (e. g., serina ou alanina). Uma charneira de imunoglobulina alterada pode adicionalmente ter uma prolina substituída por outro aminoácido (e. g., serina ou alanina). Por exemplo, a charneira de IgGl humana alterada acima descrita pode adicionalmente ter uma prolina localizada no terminal carboxilo das três cisteínas da região de charneira de IgGl tipo selvagem humana substituída por outro resíduo de aminoácido (e. g., serina, alanina). Numa forma de realização, as prolinas da região de charneira central não são substituídas. As charneiras de imunoglobulina alteradas exemplificativas são apresentadas nas SEQ ID NOS: 229-240, 255, 664-677, e 748-759. Um exemplo de uma charneira de IgGl alterada é uma charneira de IgGl humana alterado na qual a primeira cisteína é substituída por serina. A sequência desta charneira de IgGl alterada é apresentada nas SEQ ID NO:664, e é referida como a " charneira SCC-P de IgGl humana" ou "charneira SCC-P." Em certas formas de realização, um ou mais resíduos de aminoácidos (e. g., "RT," "RSS," ou "T") podem ser adicionados no terminal amino ou carboxilo de uma região de charneira de imunoglobulina mutada como parte da conceção de construção de proteína de fusão.
Em certas formas de realização, um polipéptido charneira compreende ou é uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica a uma região de charneira de imunoglobulina tipo selvagem, tal como uma charneira de IgGl tipo selvagem humana, uma charneira de IgG2 tipo selvagem humana, ou uma charneira de IgG4 tipo selvagem humana.
Em outras formas de realização, uma charneira presente num polipéptido de cadeia única que forma um polipéptido heterodímero com outro polipéptido de cadeia única pode ser uma charneira que não é baseada em ou derivada de uma charneira de imunoglobulina tipo selvagem (i.e., não uma charneira de imunoglobulina ou uma charneira de imunoglobulina alterada). Estes tipos de charneira com base em não imunoglobulinas podem ser utilizadas em ou próximo da extremidade carboxílica (e. g., localizado carboxi-terminal à porção das regiões Fc) dos polipéptidos de cadeia única que formam os polipéptidos heterodímero. Exemplos destas charneiras incluem péptidos de cerca de cinco a cerca de 150 aminoácidos do interdomínio ou região haste de lectinas C tipo II ou moléculas CD, por exemplo, péptidos de cerca de oito a 25 aminoácidos e péptidos de cerca de sete a 18 aminoácidos, e derivados destes. A "região interdomínio ou haste" de uma lectina C tipo II ou molécula CD refere-se à porção do domínio extracelular da lectina C tipo II ou molécula CD que está localizada entre o domínio tipo lectina tipo C (CTLD; e. g., semelhante a CTLD de recetores de células killer naturais) e o domínio transmembranar. Por exemplo, na molécula CD94 humana (Acesso GenBank N° AAC50291.1, PRI 30 de Novembro de 1995), o domínio extracelular corresponde aos resíduos de aminoácidos 34-179, enquanto o CTLD corresponde aos resíduos de aminoácidos 61-176. Do mesmo modo, a região interdomínio ou haste da molécula CD94 humana inclui os resíduos de aminoácidos 34-60, que se encontra entre a membrana e o CTLD (ver Boyington et al. , Immunity 10:75, 1999; para descrições de outras regiões haste, ver também Beavil et al., Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 89:753, 1992; e Figdor et al., Nature Rev. Immunol. 2:77, 2002) . Estas lectinas C tipo II ou moléculas CD podem também ter de seis a 10 aminoácidos de junção entre a região haste e a região transmembranar ou a CTLD. Noutro exemplo, a proteína NKG2A humana de 233 aminoácidos (Acesso GenBank N° P26715.1, PRI 15 de Junho de 2010) tem um domínio transmembranar que varia entre os aminoácidos 71-93 e um domínio extracelular que varia entre os aminoácidos 94-233. O CTLD é constituído pelos aminoácidos 119-231, e a região haste compreende os aminoácidos 99-116, que são flanqueados por junções de cinco e dois aminoácidos. Outras moléculas de lectina C tipo II ou CD, assim como os seus domínios de ligação a ligando extracelular, regiões interdomínio ou haste, e os CTLDs são conhecidos na técnica (ver, e. g., Acessos GenBank N°s NP_001993.2; AAH07037.1, PRI 15 de Julho de 2006; NP_001773.1, PRI 20 de Junho de 2010; AAL65234.1, PRI 17 de Janeiro de 2002, e CAA04925.1, PRI 14 de Novembro de 2006, para as sequências de CD23, CD69, CD72, NKG2A e NKG2D humanos e suas descrições, respetivamente).
Um "derivado" de um interdomínio ou região haste, ou fragmento destes, de uma lectina C tipo II ou molécula CD inclui uma sequência de cerca de oito a cerca de 150 aminoácidos na qual um, dois, ou três aminoácidos da região haste de uma lectina C tipo II ou molécula CD tipo selvagem têm uma deleção, inserção, substituição, ou qualquer combinação destes, por exemplo, a uma ou mais alterações são substituições ou a uma ou mais mutações incluem apenas uma deleção. Em outras formas de realização, um derivado de um interdomínio ou região haste é mais resistente a clivagem proteolítica em comparação com a sequência do interdomínio ou região haste tipo selvagem, tal como os derivados de cerca de oito a cerca de 20 aminoácidos de NKG2A, NKG2D, CD23, CD64, CD72, ou CD94.
Em certas formas de realização, as charneiras do interdomínio ou da região haste têm sete a 18 aminoácidos e podem formar uma estrutura hélice α enrolada em espiral. Em certas formas de realização, as charneiras do interdomínio ou região haste contêm 0, 1, 2, 3, ou 4 cisteínas. As charneiras exemplificativas do interdomínio ou região haste são fragmentos de péptidos das regiões interdomínio ou haste, tais como fragmentos de dez a 150 aminoácidos das regiões haste de CD69, CD72, CD94, NKG2A e NKG2D, como apresentado nas SEQ ID NOS:241-244, 716 e 601. As charneiras adicionais exemplificativas a região haste ou interdominio incluem as apresentadas nas SEQ ID NOS:78, 734-737, 742-747, e 766-790.
As charneiras alternativas que podem ser utilizadas nos polipéptidos de cadeia única de polipéptidos heterodimero são de porções de recetor à superfície das células (regiões interdominio) que ligam os domínios de imunoglobulina tipo V ou de imunoglobulina tipo C. As regiões entre os domínios Ig tipo V quando o recetor à superfície da célula contém múltiplos domínios de Ig tipo V em tandem e entre os domínios de Ig tipo C quando o recetor à superfície da célula contém regiões múltiplas de Ig tipo C em tandem estão também contempladas como charneiras úteis em polipéptidos de cadeia única de polipéptidos heterodimero. Em certas formas de realização, as sequências de charneira constituídas por regiões interdominio de recetor à superfície da célula podem ainda conter um motivo que ocorre naturalmente ou adicionado, tal como uma sequência de charneira central de IgG que confere uma ou mais ligações persulfureto para estabilizar a formação do polipéptido heterodimero. Exemplos de charneiras incluem regiões interdominio entre as regiões Ig tipo V e Ig tipo C de CD2, CD4, CD22, CD33, CD48, CD58, CD66, CD80, CD8 6, CD150, CD166, e CD244.
Em certas formas de realização, as sequências de charneira têm cerca de 5 a 150 aminoácidos, 5 a 10 aminoácidos, 10 a 20 aminoácidos, 20 a 30 aminoácidos, 30 a 40 aminoácidos, 40 a 50 aminoácidos, 50 a 60 aminoácidos, 5 a 60 aminoácidos, 5 a 40 aminoácidos, 8 a 20 aminoácidos, ou 10 a 15 aminoácidos. A charneira pode ser primariamente flexível, mas pode também proporcionar características mais rígidas ou pode conter primariamente uma estrutura em hélice α com uma estrutura mínima em folha β. Os comprimentos ou as sequências de como as charneiras podem afetar as afinidades de ligação dos domínios de ligação aos quais as charneiras estão direta ou indirectamente ligadas (através de outra região ou domínio, tal como um domínio de heterodimerização de imunoglobulina) assim como uma ou mais atividades da porção das regiões Fc aos quais as charneiras estão direta ou indirectamente ligadas (ver, Exemplos 9 e 10).
Em certas formas de realização, as sequências de charneira são estáveis no plasma e soro e são resistentes a clivagem proteolítica. A primeira lisina na região de charneira superior de IgGl pode ser mutada para minimizar a clivagem proteolítica, por exemplo, a lisina pode ser substituída por metionina, treonina, alanina ou glicina, ou é removida (ver, e. g., SEQ ID NOS :379-434, que pode incluir aminoácidos de junção no terminal amino tal como RT).
Em algumas formas de realização, as sequências de charneira podem conter um motivo que ocorre naturalmente ou adicionado tal como uma estrutura CPPCP de charneira central de imunoglobulina (SEQ ID NO:228) que confere a capacidade para formar a ligação persulfureto ou múltiplas ligações persulfureto para estabilizar o terminal carboxilo de uma molécula. Em outras formas de realização, as sequências de charneira podem conter um ou mais sítios de glicosilação.
As charneiras exemplificativas, incluindo as charneiras de imunoglobulina alteradas, são apresentadas nas SEQ ID NOS:379-434, 618-749, e 763-791.
Em certas formas de realização, um polipéptido de cadeia única de um polipéptido heterodímero de acordo com a presente revelação compreende mais do que uma charneira. Por exemplo, um polipéptido de cadeia única possuindo dois domínios de ligação, um dos quais no terminal amino e os outros no terminal carboxilo, podem ter duas charneiras. Uma charneira pode ser direta ou indiretamente (e. g., através de um domínio de heterodimerização de imunoglobulina) ligado ao domínio de ligação no terminal amino ou próximo, e as outras charneiras podem estar ligadas (e. g., diretamente ligadas) aos outros domínios de ligação no terminal carboxilo ou próximo. Em certas formas de realização, mesmo se um polipéptido de cadeia única tem apenas um domínio de ligação, pode ter mais do que uma charneira, por exemplo, no seu terminal amino ou carboxilo. Esta charneira pode interagir com uma charneira correspondente nas outras cadeias do heterodimero, formando uma ou mais ligações persulfureto intercadeia, para facilitar ou melhorar a heterodimerização das duas cadeias. A charneira (H-I) de um SCP-I de um polipéptido heterodimero "corresponde a" uma charneira (H-II) de um SCP-II do heterodimero quando H-I e H-II estão localizadas na mesma extremidade da porção da região Fc do seu respetivo polipéptido de cadeia única. Por exemplo, um polipéptido heterodimero pode compreender os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: Uma primeira cadeia polipéptido desde o terminal amino ao carboxílico compreende um primeiro domínio de ligação, CHI, charneira, CH2, e CH3, e uma segunda cadeia de polipéptido desde o terminal amino ao carboxílico compreende uma CK, primeira charneira, CH2, CH3, segunda charneira, e um segundo domínio de ligação. A charneira na primeira cadeia pode ser vista como "correspondente" com a primeira charneira da segunda cadeia porque ambas são amino terminais à porção das regiões Fc às quais estão ligadas.
Em certas formas de realização quando um polipéptido de cadeia única de um polipéptido heterodimero compreende um domínio de ligação no terminal carboxílico ou próximo, uma charneira pode estar presente para ligar o domínio de ligação com outra porção do polipéptido de cadeia única (e. g., uma porção da região Fc ou um domínio de heterodimerização de imunoglobulina). Numa forma de realização, esta charneira é uma charneira não imunoglobulina (i.e., uma charneira não baseada ou derivada de uma charneira de imunoglobulina tipo selvagem) e pode ser uma região haste de uma lectina C tipo II ou molécula CD, uma região interdomínio que liga os domínios da Ig tipo V ou Ig tipo C de um recetor à superfície da célula, ou de um derivado ou sua variante funcional. As charneiras do terminal carboxilo exemplificativas, algumas vezes referidas como charneiras "terminais", incluem as apresentadas nas SEQ ID NOS:78, 734-737, 742-747, e 766-790.
Em certas formas de realização, uma charneira de um polipéptido de cadeia única de um polipéptido heterodímero é idêntica a uma charneira correspondente do outro polipéptido de cadeia única do heterodímero. Em determinadas outras formas de realização, uma charneira de uma cadeia é diferente da de outra cadeia (no seu comprimento ou sequência). As diferentes charneiras nas diferentes cadeias permitem diferente manipulação das afinidades de ligação dos domínios de ligação às quais as charneiras estão ligadas, de modo que o heterodímero é capaz de preferencialmente ligar-se ao alvo de um domínio de ligação em relação ao alvo de outro domínio de ligação. Por exemplo, em certas formas de realização, um polipéptido heterodímero tem um domínio de ligação CD3 ou TCR em uma cadeia e um domínio de ligação de antigénio de tumor na outra cadeia. Tendo duas charneiras diferentes nas duas cadeias pode permitir que o heterodímero se ligue primeiro ao antigénio de tumor, e depois a uma molécula segunda CD3 ou TCR. Deste modo, o heterodímero pode recrutar células T CD3+ para células de tumor portadoras de antigénio de tumor, que por sua vez pode danificar ou destruir as células de tumor.
Outros componentes ou modificações
Em certas formas de realização, um polipéptido de cadeia única que forma um heterodímero com outro polipéptido de cadeia única pode conter um ou mais domínios ou regiões adicionais. Estas regiões adicionais podem ser uma sequência líder (também referidas como "péptido sinal") no terminal amino para secreção de um polipéptido de cadeia única expresso. Os péptidos líder exemplificativas desta revelação incluem sequências líder naturais ou outras, tal como as apresentadas nas SEQ ID NOS :110 e 111.
As regiões adicionais podem também ser sequências no terminal carboxilo para identificar ou purificar polipéptidos de cadeia única (e. g., marcas de epitopo para deteção ou purificação, tal como um marca histidina, biotina, um epitopo FLAG®, ou qualquer combinação destes).
Outras regiões opcionais podem ser resíduos adicionais de aminoácidos (referidos como "aminoácidos de junção" ou "resíduos de aminoácidos de junção") possuindo um comprimento de 1 a cerca de 10 aminoácidos (e. g., cerca de 2 a 5 aminoácidos), que podem ter resultado da utilização de sistemas de expressão específicos ou da conceção de construção para os polipéptidos de cadeia única da presente revelação. Estes resíduos de aminoácidos adicionais (por exemplo, um, dois, três, quatro ou cinco aminoácidos adicionais) podem estar presentes no terminal amino ou carboxílico ou entre várias regiões ou domínios de um polipéptido de cadeia única, tais como entre um domínio de ligação e um domínio de heterodimerização de imunoglobulina, entre um domínio de heterodimerização de imunoglobulina e uma charneira, entre uma charneira e uma porção da região Fc, entre domínios de uma porção da região Fc (e. g., entre os domínios CH2 e CH3 ou entre dois domínios CH3), entre um domínio de ligação e uma charneira, entre uma porção da região Fc e um domínio de heterodimerização de imunoglobulina, ou entre um domínio variável e um ligante. Os aminoácidos exemplificativos da junção amino-terminal com uma charneira incluem RDQ (SEQ ID NO:598), RT, SS, SASS (SEQ ID NO:599) e SSS (SEQ ID N0:600) . Os aminoácidos exemplificativos da junção carboxilo terminal com uma charneira incluem os aminoácidos SG. Os aminoácidos exemplificativos adicionais da junção incluem SR.
Em certas formas de realização, os aminoácidos de junção estão presentes entre uma porção da região Fc que compreende os domínios CH2 e CH3 e um domínio de heterodimerização de imunoglobulina (CHI ou CL). Estes aminoácidos de junção são também referidos como um "ligante entre CH3 e CHI ou CL" se estiverem presentes entre o terminal C de CH3 e o terminal N de CHI ou CL. Este ligante pode ter cerca de 2-12 aminoácidos de comprimento. Em certas formas de realização, a porção da região Fc compreende domínios CH2 e CH3 de IgGl humana nos quais o resíduo de lisina C terminal de CH3 de IgGl humana é removido. Os ligantes exemplificativos entre CH3 e CHI incluem os apresentados nas SEQ ID NO:847-849. Os ligantes exemplificativos entre CH3 e Ck incluem os apresentados nas SEQ ID NOS :850-852 (nas quais a arginina carboxi-terminal nos ligantes pode alternativamente ser vista como a primeira arginina de Ck). Em certas formas de realização, a presença destes ligantes ou pares de ligantes (e. g., SEQ ID NO :847 como um ligante CH3-CH1 num polipéptido de cadeia única de um heterodímero e SEQ ID NO:850 como um ligante CH3-Ck no outro polipéptido de cadeia única do heterodímero; a SEQ ID NO:848 como um ligante CH3-CH1 e SEQ ID NO: 851 como um ligante CH3-Ck; e SEQ ID NO: 849 como um ligante CH3-CH1 e SEQ ID NO:852 como a CH3-Ck ligante) melhora a produção de heterodímero em comparação com a presença de um ligante de referência como apresentado na SEQ ID NO: 846 (na qual a última lisina de CH3 é incluída como parte do ligante) em ambos os polipéptidos de cadeia única de um heterodímero.
Em certas formas de realização, uma região de imunoglobulina Fc (e. g., regiões CH2, CH3, e/ou CH4) de um polipéptido heterodímero da presente revelação podem ter um perfil de glicosilação alterado relativamente a uma sequência de referência de imunoglobulina. Por exemplo, qualquer de uma variedade de técnicas genéticas podem ser empregues para alterar um ou mais resíduos de aminoácidos particulares que formam um sítio de glicosilação (ver Co et al. (1993) Mol. Immunol. 30:1361; Jacquemon et al. (2006) J. Thromb. Haemost. 4:1047; Schuster et al. (2005) Cancer Res. 65:7934; Warnock et al. (2005) Biotechnol. Bioeng. 92:831), tal como N297 do domínio CH2 (numeração EU) . Alternativamente, as células hospedeiras que produzem os polipéptidos heterodímero desta revelação podem ser manipuladas para produzir um perfil de glicosilação alterada. Um método conhecido na técnica, por exemplo, proporciona glicosilação alterada na forma de bissetada, variantes não fucosiladas que aumentam a ADCC. As variantes resultam da expressão numa célula hospedeira contendo uma enzima modificadora de oligossacáridos. Alternativamente, a tecnologia POTELLIGENT® de BioWa/Kyowa Hakko é contemplada para reduzir o conteúdo em fucose das moléculas glicosiladas de acordo com esta revelação. Num método conhecido, é proporcionada uma célula hospedeira CHO para a produção de imunoglobulina recombinante que modifica o perfil de glicosilação da região de imunoglobulina Fc, através da produção de GDP-fucose.
Alternativamente, as técnicas químicas são utilizadas para alterar o perfil de glicosilação de polipéptidos heterodímero desta revelação. Por exemplo, vários inibidores de glicosidase e/ou manosidase proporcionam um ou mais dos efeitos desejados de atividade ADCC aumentada, aumentando a ligação do recetor Fc, e alterando o perfil de glicosilação. Em certas formas de realização, as células que expressam polipéptidos heterodímero da presente revelação são cultivadas num meio de cultura compreendendo um modificador de carbo-hidratos a uma concentração que aumenta a ADCC de moléculas de imunoglicoproteína produzida pela referida célula hospedeira, em que o referido modificador de carbo-hidrato está a uma concentração inferior a 800 mM. Numa forma de realização, as células que expressam estes polipéptidos heterodímero são cultivados num meio de cultura compreendendo castanospermina ou kifunensina, por exemplo, castanospermina a uma concentração de 100-800 mM, tais como 100 mM, 200 mM, 30 0 mM, 400 mM, 50 0 mM, 60 0 mM, 700 mM, ou 800 mM. Os métodos para alterar a glicosilação com um modificador de carbo-hidratos tais como castanospermina são proporcionados na Patente US N° 7 846 434 ou Publicação PCT No. WO 2008/052030.
Arranjos Estruturais e Heterodímeros Exemplificativos
Para formar um polipéptido heterodímero de acordo com a presente invenção, dois polipéptidos de cadeia única são concebidos de modo a que o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do primeiro polipéptido de cadeia única esteja apropriadamente alinhado e interaja com o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do segundo polinucleótido de cadeia simples. Em certas formas de realização, o heterodímero pode compreender um segundo par de domínio de heterodimerização de imunoglobulina para facilitar ou melhorar a heterodimerização das duas cadeias. Em certas formas de realização, em adição à interação entre os dois domínios de heterodimerização de imunoglobulinas, uma porção da região Fc (e. g., um domínio CH3) na primeira cadeia pode interagir com uma região Fc na segunda cadeia para melhorar a heterodimerização (e. g., através da interação entre dois domínios CH3 do tipo selvagem ou entre um par de domínios CH3 com mutações "knobs-into-holes"). Além disso, em certas formas de realização, a charneira na primeira cadeia (e. g., uma charneira de IgGl humana alterada com dois resíduos de cisteína como apresentado nas SEQ ID NO:664) pode interagir com a charneira na segunda cadeia (e. g., a mesma charneira de IgGl humana alterada como apresentado nas SEQ ID NO:664) para formar, por exemplo, as ligações persulfureto, que podem ainda fortalecer a interação entre o primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única para formar um polipéptido heterodímero da presente revelação. Além disso, em certas formas de realização, a primeira e segunda cadeia podem compreender um segundo par de charneira (e. g., no terminal carboxilo das duas cadeias) para depois melhorar as interações entre as duas cadeias.
Em certas formas de realização, um polipéptido heterodímero da presente revelação compreende dois domínios de ligação (BD1 e BD2), em que os domínios de ligação se ligam a duas diferentes moléculas alvo. Em certas formas de realização, os dois domínios de ligação (BD1 e BD2) estão ambos na SCP-I com o domínio de heterodimerização de imunoglobulina (HD-I) e a porção da região Fc (FRP-1) disposta entre BD1 e BD2. Em determinadas outras formas de realização, o primeiro domínio de ligação (BD1) está no SCP-I e o segundo domínio de ligação (BD2) está no SCP-II. Em certas formas de realização, ambos BD1 e BD2 são amino terminais à porção da região Fc do SCP-I e SCP-II, respetivamente. Em determinadas outras formas de realização, o BD1 é amino terminal à porção da região Fc do SCP-I e BD2 é carboxi-terminal à porção da região Fc do SCP-II. Em determinadas outras formas de realização, BD1 é carboxi-terminal à porção da região Fc do SCP-I e BD2 é amino terminal à porção da região Fc do SCP-II. Em determinadas outras formas de realização, ambos BD1 e BD2 são carboxi-terminais à porção da região Fc do SCP-I e SCP-II, respetivamente.
Em certas formas de realização, um polipéptido heterodímero compreende três domínios de ligação (BD1, BD2 e BD3), em que os domínios de ligação se ligam a dois ou três diferentes moléculas alvo. Por exemplo, BDl, BD2, e BD3 ligam, cada uma, um alvo diferente, ou BDl e BD2 ligam-se a um primeiro alvo enquanto BD3 liga a um segundo alvo, ou BDl e BD3 ligam-se a um primeiro alvo enquanto BD2 se liga a um segundo alvo, ou BD2 e BD3 ligam-se a um primeiro alvo enquanto BDl se liga a um segundo alvo. Em certas formas de realização, o domínio de heterodimerização de imunoglobulina e a porção da região Fc estão dispostos entre BDl e BD2 no SCP-I, e BD3 é amino terminal à porção da região Fc do SCP-II. Noutras formas de realização, o domínio de heterodimerização de imunoglobulina e a porção da região Fc são dispostos entre BDl e BD2 em SCP-II, e BD3 é carboxi-terminal à porção da região Fc do SCP-I.
Em certas formas de realização, um polipéptido heterodímero compreende quatro domínios de ligação (BDl, BD2, BD3 e BD4), em que os domínios de ligação se ligam a duas a quatro diferentes moléculas alvo. Em certas formas de realização, 0 domínio de heterodimerização de imunoglobulina e a porção da região Fc do SCP-I estão dispostos entre BD1 e BD2, e o domínio de heterodimerização de imunoglobulina e a porção da região Fc de SCP-II estão dispostos entre BD3 e BD4.
Em certas formas de realização, um polipéptido heterodímero compreende cinco domínios de ligação (BD1, BD2, BD3, BD4 e BD5), em que os domínios de ligação se ligam a duas a quatro diferentes moléculas alvo. Em certas formas de realização, SCP-I compreende três domínios de ligação (BD1, BD2 e BD3), e SCP-II compreende dois domínios de ligação (BD4 e BD5). Em outras formas de realização, BD1 e BD2 podem ser, por exemplo, ligados em tandem uns aos outros (diretamente ou através de um péptido ligante de cerca de dois a oito aminoácidos) no terminal amino (ou carboxilo) de SCP-I com BD3 localizado no terminal carboxilo (ou amino) do SCP-I ou SCP-II, em que BD4 e BD5 estão no SCP-II se BD3 está na SCP-I, ou BD4 ou BD5 estão no SCP-I se BD3 está no SCP-II.
Ainda em formas de realização, o polipéptido heterodímero compreende seis domínios de ligação (BD1-BD6). Em certas formas de realização, SCP-I e SCP-II compreendem cada um, três domínios de ligação (e. g., BD1-BD3 no SCP-I, e BD4-BD6 no SCP-II). Nestas formas de realização, por exemplo, BD1 e BD2 podem ser ligados in tandem e localizados no SCP-I amino (ou carboxilo) terminal, e BD3 pode estar localizado no SCP- 1 carboxilo (ou amino) terminal. Do mesmo modo, BD4 e BD5 podem estar ligados em tandem e localizados no SCP-II amino (ou carboxilo) terminal, e BD6 pode ser localizado no SCP-II carboxilo (ou amino) terminal. Em determinadas outras formas de realização, o primeiro polipéptido de cadeia única (SCP-I) compreende quatro domínios de ligação (BD1-BD4) e o segundo polipéptido de cadeia única (SCP-II) compreende dois domínios de ligação (BD5 e BD6) . Nestas formas de realização, BD1 e BD2 pode estar ligados em tandem e localizado no terminal amino ou próximo de SCPI, BD3 e BD4 pode estar ligados em tandem e localizados no terminal carboxilo ou próximo de SCP-I, e BD5 e BD6 podem estar localizado no terminal amino e carboxilo ou próximos de SCP-II, respetivamente.
Em certas formas de realização, o polipéptido heterodímero compreende sete domínios de ligação (BD1-BD7) . Nestas formas de realização, o SCP-I pode compreender quatro domínios de ligação (BD1-BD4), e SCP-II pode compreender os outros três domínios de ligação (BD5-BD7). Por exemplo, BD1 e BD2 podem ser ligados em tandem e localizados no terminal amino ou próximo de SCP-I, e BD3 e BD4 podem ser ligados em tandem e localizados no terminal carboxilo ou próximo de SCP-II. BD5 e BD6 podem estar ligados em tandem e localizado no terminal amino (ou carboxilo) ou próximo de SCP-II, e BD7 pode estar localizado no terminal carboxilo (ou amino) ou próximo de SCP-II.
Em certas formas de realização, o polipéptido heterodímero compreende oito domínios de ligação (BD1-BD8). nestas formas de realização, o primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única podem compreender, cada um, quatro domínios de ligação. Em cada cadeia, dois domínios de ligação podem estar localizados no terminal amino ou próximo, e os outros dois domínios de ligação localizados no terminal carboxilo ou próximo.
Para simplificar a descrição de como vários componentes podem ser arranjados para preparar os primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única que formam polipéptidos heterodímero da presente revelação, os arranjos nas formas de realização exemplificativas (1) a (50) são proporcionadas a seguir nas quais apenas dois domínios de ligação são incluídos em cada heterodímero.
Na forma de realização (1), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: desde o terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CHI, uma charneira, e uma porção da região Fc; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma região CL (e. g., Ck, CÀ), uma charneira, e uma porção da região
Fc.
Na forma de realização (2), um polipéptido heterodímero compreende os seguintes dois polipéptidos de cadeia única: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma região CHI; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma região CL.
Na forma de realização (3) , um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma segunda região CHI; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma segunda região CL.
Na forma de realização (4), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CHI, uma segunda região CHI, uma charneira, e uma porção da região Fc; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma região CL, uma segunda região CL, uma charneira e uma porção da região Fc.
Na forma de realização (5) , um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI, e uma segunda região CHI; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CL e uma segunda região CL.
Na forma de realização (6), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo a região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira, e um primeiro domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (7), um polipéptido heterodímero é formado a partir dos dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI, um segundo charneira, e um primeiro domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CL, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (8), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda região CHI, uma segunda charneira, e um primeiro domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda região CL, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (9), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CHI, uma segunda região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira, e um primeiro domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CL, uma segunda região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (10), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI, uma segunda região CHI, uma segunda charneira, e um primeiro domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CL, uma segunda região CL, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação. N forma de realização (11), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CL, uma charneira, e uma porção da região Fc; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma região CHI, uma charneira, e uma porção da região Fc.
Na forma de realização (12), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma região CL; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma região CHI.
Na forma de realização (13), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma segunda região CL; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma segunda região CHI.
Na forma de realização (14), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CL, uma segunda região CL, uma charneira, e uma porção da região Fc; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma região CHI, uma segunda região CHI, uma charneira, e uma porção da região Fc.
Na forma de realização (15), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CL, e uma segunda região CL; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI, e uma segunda região CHI.
Na forma de realização (16), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira, e um primeiro domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo a região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (17), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CL, uma segunda charneira, e um primeiro domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (18), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda região CL, uma segunda charneira, e um primeiro domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda região CHI, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (19), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CL, uma segunda região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, um segunda charneira, e um primeiro domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CHI, uma segunda região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (20), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CL, uma segunda região CL, um segunda charneira, e um primeiro domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI, uma segunda região CHI, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (21), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma região CL; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma região CHI.
Na forma de realização (22), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma região CHI; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma região CL.
Na forma de realização (23) , um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CHI, uma região CL, uma charneira, e uma porção da região Fc; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma região CL, uma região CHI, uma charneira e uma porção da região Fc.
Na forma de realização (24), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CL, uma região CHI, uma charneira, e uma porção da região Fc; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma região CHI, uma região CL, uma charneira e uma porção da região Fc.
Na forma de realização (25), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI e uma região CL; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CL e uma região CHI.
Na forma de realização (26), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CL e uma região CHI; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI e uma região CL.
Na forma de realização (27), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CL, uma segunda charneira, e um primeiro domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (28), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI, uma segunda charneira, e um primeiro domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo a região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CL, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (29), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CHI, uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, um segunda charneira, e um primeiro domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CL, uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (30), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CL, uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira, e um primeiro domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CHI, uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (31), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI, uma região CL, uma segunda charneira, e um primeiro domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CL, uma região CHI, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (32), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CL, uma região CHI, uma segunda charneira, e um primeiro domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI, uma região CL, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (33), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CL, uma charneira, e uma região Fc.
Na forma de realização (34), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo a região CHI, uma charneira e uma porção da região Fc.
Na forma de realização (35) , um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CHI, uma charneira e uma porção da região Fc; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (36), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira e um primeiro domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma região CL, uma charneira e uma porção da região Fc.
Na forma de realização (37), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma segunda charneira; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma segunda charneira.
Na forma de realização (38), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação; e o segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma charneira, uma porção da região Fc, e uma região CL.
Na forma de realização (39) , um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma charneira, uma porção da região Fc, e uma região CHI; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CL, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (40), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma região CHI; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CL, uma segunda charneira e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (41), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI, uma segunda charneira e um primeiro domínio de ligação; e o segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma região CL.
Na forma de realização (42), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI, e uma segunda charneira; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CL e uma segunda charneira.
Na forma de realização (43) , um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CHI, uma charneira uma porção da região Fc, uma região CL, uma segunda charneira e um segundo domínio de ligação; e o segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc e uma região CHI.
Na forma de realização (44), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma região CL; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CL, uma charneira, uma região Fc, uma região CHI, uma segunda charneira e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (45) , um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma região CL; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (46), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, uma CL, uma segunda charneira e um primeiro domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma região CHI.
Na forma de realização (47), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda região CHI, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma segunda região CL.
Na forma de realização (48), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma segunda região CHI; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda região CL, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (49), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao terminal carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma segunda região CHI; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda região CL, uma segunda charneira e um segundo domínio de ligação.
Na forma de realização (50), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI, uma segunda charneira, e um primeiro domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação, uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, e uma segunda região CL.
As formas de realização exemplificativas (51) a (60) são também proporcionadas a seguir nas quais três ou quatro domínios de ligação são incluídos em cada heterodímero. Os domínios de ligação adicionais podem ser incluídos para produzir polipéptidos heterodímero que compreendem cinco a oito domínios de ligação de acordo com a presente revelação à vista da descrição geral aqui proporcionada.
Na forma de realização (51), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira e um segundo domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um terceiro domínio de ligação, uma região CL, uma charneira e uma porção da região Fc.
Na forma de realização (52), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira e um terceiro domínio de ligação.
Na forma de realização (53), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira e um segundo domínio de ligação; e o segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um terceiro domínio de ligação, uma região CHI, uma charneira e uma porção da região Fc.
Na forma de realização (54), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira e um segundo domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira e um terceiro domínio de ligação.
Na forma de realização (55) , um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI, uma segunda charneira e um segundo domínio de ligação; e o segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um terceiro domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc e uma região CL.
Na forma de realização (56), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CL, uma segunda charneira, e um terceiro domínio de ligação.
Na forma de realização (57), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CL, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um terceiro domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc e uma região CHI.
Na forma de realização (58), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CL, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI, uma segunda charneira, e um terceiro domínio de ligação.
Na forma de realização (59), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo: um primeiro domínio de ligação, uma região CHI, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira, e um segundo domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um terceiro domínio de ligação, uma região CL, uma charneira, uma porção da região Fc, uma segunda charneira e um quarto domínio de ligação.
Na forma de realização (60), um polipéptido heterodímero compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: do terminal amino ao carboxilo, um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CHI, uma segunda charneira e um segundo domínio de ligação; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo um terceiro domínio de ligação, uma charneira, uma porção da região Fc, uma região CL, uma segunda charneira e um quarto domínio de ligação.
Nas formas de realização (1) a (32), um polipéptido heterodímero da presente revelação compreende os dois polipéptidos de cadeia única que se seguem: um primeiro polipéptido de cadeia única compreendendo um primeiro domínio de ligação (BD1) que liga especificamente a uma célula T alvo (e. g., um complexo de TCR ou um seu componente, incluindo TCRa, TCRp, CD3y, CD35, e CD3s), uma charneira que é uma charneira de IgGl SCC-P, uma porção da região Fc que é de tipo selvagem ou alterada CH2CH3 de IgGl humana, e uma região CL que é tipo selvagem ou uma região Ck humana alterada com substituições N30Y V55A T70E (YAE) ; e um segundo polipéptido de cadeia única compreendendo o domínio de ligação (BD2) que se liga especif icamente a uma célula B alvo (e. g.r CD19, CD79b, HLA-DR, CD37, CD20) ou um antigénio de tumor ou de cancro (e. g., RON, c-Met, EpCAM, CEACAM-6, PSMA), uma charneira que é também uma charneira de IgGl SCC-P, uma porção da região Fc que é um CH2CH3 de IgGl humana do tipo selvagem ou alterada, e uma região CHI que é região CHI humana.
Em outras formas de realização, um polipéptido heterodímero de formas de realização (1) a (32) pode compreender ainda um terceiro domínio de ligação (BD3) que é idêntico a BD1 ou BD2, e está ligado a um polipéptido de cadeia única através de uma segunda charneira (e. g., ligante H75 ou H68 como apresentado nas SEQ ID NOS :742 e 78, respetivamente) . Ainda em outras formas de realização, um polipéptido heterodímero da forma de realização das formas de realização (1) a (32) pode compreender ainda um terceiro e quarto domínios de ligação (BD3) e (BD4) que são cada um idêntico ou diferentes a BD1 ou BD2 e ligados ao polipéptido de cadeia única(s) através de uma segunda charneira (e. g., ligante H75 ou H68 como apresentado nas SEQ ID NOS :742 e 78) .
Em certas formas de realização, os polipéptidos heterodímero da presente revelação pode ser manipulada para ter domínios de ligação com diferentes afinidades para tipos específicos de células alvo. Por exemplo, pode ser desejável para um polipéptido heterodímero com um domínio de ligação para um complexo de TCR ou um seu componente e outro domínio de ligação para um antigénio de tumor (ou uma célula B alvo) para ligar preferencialmente células de tumor possuindo o antigénio de tumor (ou células B portadoras da célula B alvo) com uma maior afinidade de modo que o polipéptido heterodímero ligará primeiro células de tumor (ou as células B) e depois recruta células T através do seu domínio de ligação TCR/CD3 ao sítio do tumor ou células. As afinidades de ligação diferenciais podem ser conseguidos por, por exemplo, seleccionando um domínio de ligação para um alvo com uma maior afinidade de ligação do que outros domínios de ligação têm para o seu alvo ou incluindo domínios de ligação múltiplos para um alvo num polipéptido heterodímero e um domínio de ligação único ou poucos domínios de ligação para o segundo alvo ou outros. Adicionalmente, utilizando diferentes charneiras (e. g., utilizando charneiras de diferentes comprimentos) podem afetar a ligação de um domínio mais do que a outro ou utilizando diferentes charneiras para diferentes domínios de ligação de modo a alterar a actividade de ligação dos domínios de ligação.
Em certas formas de realização, os domínios de ligação múltipla podem precisar de estar localizados a uma distância apropriada uns dos outros de modo que as suas interações com os seus alvos produzirão um efeito desejável. Por exemplo, em certas formas de realização, um polipéptido heterodímero compreendendo um domínio de ligação para um complexo de TCR ou um seu componente num polipéptido de cadeia única e outro domínio de ligação para um antigénio de tumor ou uma célula B alvo num segundo polipéptido de cadeia única podem ter ambos os domínios de ligação nos terminais amino ou carboxilo das suas cadeias correspondentes de modo a estarem na proximidade física uns dos outros no polipéptido heterodímero.
Os heterodímeros exemplificativos podem ser formados a partir dos pares de polipéptidos de cadeia única aqui descritos. Se os números de identificação de sequência aqui mencionados contêm as sequências péptido sinal (e. g., os primeiros 20 aminoácidos), estas sequências de péptido sinal não fazem parte dos polipéptidos de cadeia única mature que formam os polipéptidos heterodímero exemplificativos e deste modo devem ser considerados excluídos.
Os polipéptidos de cadeia única exemplificativos são apresentados nas SEQ ID NOS:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 29-32, 53-72, 74, 810-826, 859-864, e 874-882.
Os heterodímeros exemplificativos podem ser formados a partir dos seguintes pares de polipéptidos de cadeia única: SEQ ID NOS:2 e 4, SEQ ID NOS:6 e 8, SEQ ID NOS:10 e 12, SEQ ID NOS:14 e 16, SEQ ID NOS:18 e 20, SEQ ID NQS:20 e 22, SEQ ID NOS:2 0 e 24, SEQ ID NOS:30 e 32, SEQ ID NOS:29 e 31, SEQ ID NOS:2 9 e 32, SEQ ID NOS:30 e 72, SEQ ID NOS:53 e 72, SEQ ID NOS:54 e 72, SEQ ID NOS:55 e 72, SEQ ID NOS:70 e 72, SEQ ID NOS:71 e 72, SEQ ID NOS:63 e 56, SEQ ID NOS:64 e 57, SEQ ID NOS:65 e 60, SEQ ID NOS:66 e 58, SEQ ID NOS:67 e 59, SEQ ID NOS:6 8 e 61, SEQ ID NOS:69 e 62, SEQ ID NOS:54 e 811, SEQ ID NOS:54 e 812, SEQ ID NOS:54 e 813, SEQ ID NOS:814 e 818, SEQ ID NOS :815 e 818, SEQ ID NOS:816 e 818, SEQ ID NOS:817 e 818, SEQ ID NOS :814 e 820, SEQ ID NOS:814 e 821, SEQ ID NOS: 54 e 819, SEQ ID NOS:814 e 826, SEQ ID NOS:814 e 822, SEQ ID NOS :814 e 823, SEQ ID NOS:814 e 824, SEQ ID NOS:859 e 862, SEQ ID NOS:860 e 863, SEQ ID NOS:861 e 864, SEQ ID NOS :874 e 825, SEQ ID NOS:875 e 879, SEQ ID NOS:876 e 880, SEQ ID NOS :877 e 881, ou SEQ ID NOS:878 e 882. Ácidos Nucleicos, Vetores, Células Hospedeiras, e Métodos para Preparação de Heterodímeros
Num aspeto relacionado, a presente revelação também proporciona moléculas de ácido nucleico isolado (utilizado indistintamente com "polinucleótido") que codificam polipéptidos de cadeia única aqui proporcionados. As moléculas exemplificativas de ácido nucleico (com ou sem uma sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de péptido sinal) são apresentadas nas SEQ ID NOS:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,17, 19, 21, 23, 25-28, 33-52 e 792-808. A presente revelação também proporciona vetores que compreendem sequências de ácido nucleico que codificam os polipéptidos de cadeia única aqui proporcionados. Como aqui utilizado, "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico a que foi ligado. Os vetores exemplificativos incluem plasmideos, cromossomas artificiais de cromossomas, e genomas virais. Certos vetores podem autonomamente replicar-se numa célula hospedeira, enquanto outros vetores pode ser integrados no genoma de uma célula hospedeira e deste modo são replicados com o genoma hospedeiro.
Em certas formas de realização, os vetores podem ser vetores de expressão recombinante. Os "vetores de expressão recombinante" ou "vetores de expressão" referem-se a vetores que contêm sequências de ácido nucleico que estão operativamente ligados a uma sequência de controlo de expressão (e. g., um promotor) e são deste modo capazes de dirigir a expressão destas sequências.
As sequências de promotor úteis em vetores de expressão aqui proporcionados podem ser selecionadas a partir de qualquer gene desejado utilizando vetores CAT (cloranfenicol transferase) ou outros vetores com marcadores selecionáveis. Os promotores eucarióticos incluem o precoce imediato de CMV, cinase de timidina de HSV, precoce e tardio de SV40, LTRs de retrovirus, e metalotioneína-I de murganho. Em certas formas de realização, os promotores são promotores indutiveis.
Em certas formas de realização, um vetor é um vetor de expressão que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um primeiro polipéptido de cadeia única de um polipéptido heterodimero aqui proporcionado. Em determinadas outras formas de realização, um vetor é um vetor de expressão que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um segundo polipéptido de cadeia única de um polipéptido heterodimero aqui proporcionado.
Em certas formas de realização, a vetor é um vetor de expressão que compreende sequências de ácido nucleico que codificam o primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única de um polipéptido heterodimero. 0 promotor para a sequência de ácido nucleico que codifica o primeiro polipéptido de cadeia única pode ser a mesma do promotor para o ácido nucleico que codifica o segundo polinucleótido de cadeia simples. Alternativamente, o promotor para a sequência de ácido nucleico que codifica o primeiro polipéptido de cadeia única pode ser diferente do promotor para o ácido nucleico que codifica o segundo polipéptido de cadeia única de modo que o nivel de expressão do primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única pode ser diferentemente modulada para um máximo de heterodimerização do primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única. Em certas formas de realização, um ou ambos os promotores para o ácido nucleico que codifica o primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única são promotores indutiveis. A presente revelação também proporciona uma célula hospedeira transformada ou transfetada com, ou de outro modo contendo, qualquer dos ácidos nucleicos ou vetores aqui proporcionada. As células hospedeiras exemplificativas incluem células VERO, células HeLa, linhas de células de ovário de hamster chinês (CHO) (incluindo células CHO modificadas capazes de modificar o padrão de glicosilação das moléculas de ligação multivalente expressas, ver Pedido de Publicação de Patente US N° 2003/0115614), células COS (tais como COS-7), W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC 12, K562, células HEK293, células HepG2, células N, células 3T3, células Spodoptera frugiperda (e. g., células Sf9), células Saccharomyces cerevisiae, células Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, ou membros d família Streptomycete.
Em certas formas de realização, uma célula hospedeira compreende um primeiro vetor de expressão contendo um ácido nucleico que codifica um primeiro polipéptido de cadeia única e um segundo vetor de expressão contendo um ácido nucleico que codifica um segundo polinucleótido de cadeia simples.
Em determinadas outras formas de realização, a célula hospedeira compreende um vetor de expressão contendo um ácido nucleico que codifica o primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única. A revelação também inclui um método de produção de polipéptidos heterodímero aqui descrito. Em certas formas de realização, o método compreende a cultura de uma célula hospedeira que compreende ácidos nucleicos que codificam o primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única em condições adequadas para expressar os polipéptidos, e opcionalmente isolar ou purificar os heterodímeros formados a partir do primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única a partir da cultura. 0 ácido nucleico que codifica o primeiro polipéptido de cadeia única e o ácido nucleico que codifica o segundo polipéptido de cadeia única pode estar presente num único vetor de expressão na célula hospedeira ou em dois diferentes vetores de expressão nas células hospedeiras. No último caso, a proporção entre os dois vetores de expressão pode ser controlada para maximizar a heterodimerização do primeiro e segundo polipéptidos de cadeia única. A presente revelação proporciona polipéptidos heterodímero purificados como aqui descrito. 0 termo "purificados," como aqui utilizado, refere-se a uma composição, isolável de outros componentes, em que o polipéptido heterodímero é enriquecido em qualquer grau relativamente ao seu estado naturalmente obtenível. Em certas formas de realização, a presente revelação proporciona substancialmente polipéptidos heterodímero purificados como aqui descrito. "Substancialmente purificados" refere-se a uma composição de polipéptido heterodímero na qual o polipéptido heterodímero forma o componente principal da composição, tal como constituindo pelo menos cerca de 50%, tais como pelo menos cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 99%, dos polipéptidos, em peso, na composição.
As técnicas de purificação de proteína são bem conhecidas dos especialistas na técnica. Estas técnicas envolvem, num nível, o fraccionamento bruto das fracções de polipéptido e não polipéptido. A purificação adicional utilizando técnicas cromatográficas e electroforéticas para conseguir a purificação parcial ou completa (ou purificação até a homogeneidade) é frequentemente desejada. Os métodos analíticos particularmente adequados para a preparação de uma proteína de fusão pura são a cromatograf ia de troca iónica, cromatografia de exclusão de tamanho; electroforese em gel de poliacrilamida; e focagem isoelétrica. Os métodos particularmente eficientes de purificar péptidos são a cromatografia de rápida líquida de proteína e HPLC. Vários métodos para quantificar o grau de purificação são conhecidos dos especialistas na técnica à luz da presente revelação. Estes incluem, por exemplo, estimar a quantidade de polipéptidos heterodímero numa fração por análise SDS/PAGE e HPLC como ilustrado nos exemplos aqui proporcionados. O método para preparar polipéptidos heterodímero aqui proporcionados é vantajoso em relação ao método que expresse primeiro e purifique separadamente os polipéptidos de cadeia única individuais e incubando depois os polipéptidos de cadeia única individuais purificados em conjunto para formar polipéptidos heterodimero. Por exemplo, certos polipéptidos de cadeia única (e. g., certos polipéptidos contendo apenas regiões CHI como o seu domínio de heterodimerização de imunoglobulinas) são instáveis quando expressas isoladas. Adicionalmente, a expressão e purificação separadas dos polipéptidos de cadeia única individuais seguida pela combinação dos polipéptidos de cadeia única individuais purificados envolve mais passos do que a coexpressão de ambos os polipéptidos de cadeia única seguida pela purificação dos polipéptidos heterodimero resultantes e geralmente menos eficientes.
Composições e Métodos para Utilizar Heterodímeros
Adicionalmente aos polipéptidos heterodimero, a presente revelação também proporciona composições farmacêuticas e formas de dosagem unitária que compreendem os polipéptidos heterodimero assim como métodos para a utilização dos polipéptidos heterodimero, as composições farmacêuticas e formas de dosagem unitária.
As composições de polipéptidos heterodimero desta revelação compreendem geralmente um polipéptido heterodimero aqui proporcionado em combinação com um excipiente farmaceuticamente aceitável, incluindo veículos e diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis serão não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregues. Estes são bem conhecidos na técnica farmacêutica e descritos, por exemplo, em Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients: A Comprehensive Guide to Uses, Properties, and Safety, 5a Ed., 2006.
Os veículos farmaceuticamente aceitáveis para utilização terapêutica são também bem conhecidos na técnica farmacêutica, e são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro (Ed.) 1985) . Os veículos farmaceuticamente aceitáveis exemplificativos incluem salino estéril e salino tamponado com fosfato a pH fisiológico. Conservantes, estabilizantes, corantes e afins podem ser proporcionados na composição farmacêutica. Adicionalmente, antioxidantes e agentes de suspensão podem também ser utilizados.
As composições farmacêuticas podem também conter diluentes tais como tampões, antioxidantes tais como ácido ascórbico, polipéptidos de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos), proteínas, aminoácidos, carbo-hidratos (e. g., glucose, sacarose, dextrinas), agentes quelantes (e. g., EDTA), glutationa e outros estabilizantes e excipientes. Salino tamponado neutral ou saline misturado com albumina do soro não específica são diluentes exemplificativos. Por exemplo, o produto pode ser formulado como um liofilizado utilizando soluções apropriadas de excipiente (e. g., sacarose) como diluentes. A presente revelação também proporciona um método para tratar a doença ou distúrbio associada com, por exemplo, transdução de sinal excessiva mediada por recetor, compreendendo a administração a um doente com necessidade de uma quantidade eficaz de um polipéptido heterodímero compreendendo um domínio de ligação que liga especificamente um recetor, tal como um recetor cinase de tirosina, incluindo EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, IGF1R, c-Met, RON, e EphA2.
Doenças ou distúrbios exemplificativos associados com transdução de sinal excessiva mediada por recetor incluem cancro (e. g., malignidade sólida e malignidade hematológica), doenças ou estados autoimunitários ou inflamatórios, sepsia resultante de infecção bacteriana, e infeção virai.
Num aspeto, a presente revelação proporciona um método para dirigir a ativação de células T, compreendendo a administração a um doente com necessidade de uma quantidade eficaz de um polipéptido heterodímero que compreende um domínio de ligação que liga especificamente TCRa, TCRp, CD3y, CD35, CD3s ou uma sua combinação, e um segundo domínio de ligação que liga especificamente um alvo diferente, por exemplo, um antigénio específico para tumor ou outros antigénios à escolha num sítio ou células onde a ativação de células T é desejada.
Noutro aspeto, a presente revelação proporciona um método para a inibição do crescimento, metástases ou crescimento metastásico de uma malignidade (e. g., uma malignidade sólida ou uma malignidade hematológica), compreendendo a administração a um doente com necessidade de uma quantidade eficaz de um polipéptido heterodímero aqui proporcionada ou uma sua composição.
Uma ampla variedade de cancros, incluindo malignidade sólida e malignidade hematológica, é sensível às composições e métodos aqui revelados. Os tipos de cancro que podem ser tratados incluem, mas não estão limitados a: adenocarcinoma da mama, próstata, pâncreas, cólon e reto; todas as formas de carcinoma broncogénico do pulmão (incluindo carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma, cancro do pulmão de célula pequena e cancro do pulmão de célula não pequena); mielóide; melanoma; hepatoma; neuroblastoma; papiloma; apudoma; coristoma; branquioma; síndroma de carcinóide maligno; doença carcinóide cardíaca; e carcinoma (e. g., Walker, célula basal, basoescamosa, Brown-Pearce, ductal, tumor de Ehrlich, Krebs 2, célula de Merkel, mucinosa, célula não pequena do pulmão, célula aveia, papilar, cirroso, brônquico, broncogénico, célula escamosa, e célula de transição) . Os tipos adicionais de cancros que podem ser tratados incluem: distúrbios histiocíticos; leucemia; histiocitose maligna; doença de Hodgkin; pequena imunoproliferativa; linfoma não Hodgkin; plasmacitoma; reticuloendoteliose; melanoma; condroblastoma; condroma; condrossarcoma; fibroma; fibrosarcoma; tumores de célula gigante; histiocitoma; lipoma; lipossarcoma; mesotelioma; mixoma; mixossarcoma; osteoma; osteossarcoma; cordoma; craniofaringioma; disgerminoma; hamartoma; mesenquimoma; mesonefroma; miossarcoma; ameloblastoma; cementoma; odontoma; teratoma; timoma; tumor trofoblástico. Ainda, os seguintes tipos de cancros estão também contemplados como sensíveis ao tratamento: adenoma; colangioma; colesteatoma; ciclindroma; cistadenocarcinoma; cistadenoma; tumor de célula granulosa; ginandroblastoma; hepatoma; hidradenoma; tumor de célula de ilhéu; tumor de célula Leydig; papiloma; tumor de célula de sertoli; tumor de célula teca; leimioma; leiomiossarcoma; mioblastoma; mioma; miossarcoma; rabdomioma; rabdomiossarcoma; ependimoma; ganglioneuroma; glioma; meduloblastoma; meningioma; neurilemmoma; neuroblastoma; neuroepitelioma; neurofibroma; neuroma; paraganglioma; paraganglioma não cromafino; e glioblastoma multiforme. Os tipos de cancro que podem ser tratados também incluem, mas não estão limitados a, angioqueratoma; hiperplasia angiolinfóide com eosinofilia; angioma esclerosante; angiomatose; glomangioma; hemangioendotelioma; hemangioma; hemangiopericitoma; hemangiossarcoma; linfangioma; linfangiomioma; linfangiossarcoma; pinealoma; carcinossarcoma; condrossarcoma; cistossarcoma filodes; fibrossarcoma; hemangiossarcoma; leiomiossarcoma; leucossarcoma; lipossarcoma; linfangiossarcoma; miossarcoma; mixossarcoma; carcinoma do ovário; rabdomiossarcoma; sarcoma; neoplasmas; nerofibromatose; e displasia cervical.
Os cancros exemplificativos adicionais que são também sensíveis às composições e métodos aqui revelados são cancros de células B, incluindo linfomas de célula B [tais como várias formas da doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkins (NHL) ou linfomas do sistema nervoso central], leucemias [tais como leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia de célula Hairi e leucemia mioblástica crónica] e mielomas (tais como mieloma múltiplo). Os cancros adicionais de células B incluem linfoma linfocitico pequeno, leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmocitico, linfoma da zona marginal do baço, mieloma de células do plasma, plasmacitoma solitário do osso, plasmacitoma extraósseo, linfoma de célula B da zona marginal extra-nodal de tecido linfóide associado a mucosa (MALT), linfoma de células B da zona marginal nodal, linfoma folicular, linfoma das células do manto, linfoma de células B grandes difusas, linfoma de células B grandes mediastinais (tímicas), linfoma de células B grandes intravasculares, linfoma de efusão primária, linfoma/leucemia de Burkitt, proliferações de células B de potencial maligno incerto, granulomatose linfomatóide, e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante.
Em certas formas de realização, os polipéptidos heterodímero úteis para a inibição do crescimento de uma malignidade sólida ou metástases ou crescimento metastático de uma malignidade sólida ou uma malignidade hematológica incluem os que se ligam especificamente a um tumor ou antigénio de cancro e uma célula T alvo. Estes heterodimeros são tipicamente concebidos para ter uma maior afinidade de ligação ao antigénio de tumor ou cancro (e. g., pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75 ou 100 vezes mais) do que às células T alvo de modo a que esta se liguem preferencialmente ao tumor ou antigénio de cancro primeiro e subsequentemente se ligam às células T alvo, que por sua vez recrutam e ativam células T para danificar ou destruir o tumor ou células de cancro portadoras do antigénio de tumor ou de cancro na sua superfície. O antigénio de tumor ou cancros exemplificativo e as células T alvo incluem as proporcionadas acima na secção que descreve os domínios de ligação de polipéptidos heterodímero. Por exemplo, um alvo de células T pode ser CD3 ou PSMA.
Em certas formas de realização, os polipéptidos heterodímero úteis para a inibição do crescimento, metástases, ou crescimento metastásico de uma malignidade, ou por ativação dirigida de células T, compreendem pelo menos um domínio de ligação que liga especificamente um alvo oncológico (incluindo um antigénio de tumor ou célula, tal como RON, c-Met, CEACAM-6, ou PSMA) e outro domínio de ligação que liga especificamente um complexo de TCR ou um seu componente (e. g., TCRa, TCR, CD3y, CD3õ, e CD3s).
Em determinadas outras formas de realização, os polipéptidos heterodímero úteis para a inibição do crescimento, metástases, ou crescimento metastásico de uma malignidade compreendem pelo menos um domínio de ligação que liga especificamente CD28 e outro domínio de ligação que liga especificamente CD79b. Estes polipéptidos heterodímero podem compreender ainda um domínio de ligação que compreende um ectodomínio PDL2, um domínio de ligação que liga especificamente hyperIL-6, ou ambos os domínios de ligação.
Em determinadas outras formas de realização, polipéptidos heterodímero úteis para a inibição do crescimento, metástases, ou crescimento metastásico de uma malignidade compreendem pelo menos um domínio de ligação que liga especificamente RON e outro domínio de ligação que liga especificamente c-Met.
Em determinadas outras formas de realização, os polipéptidos heterodímero úteis para a inibição do crescimento, metástases, ou crescimento metastásico de uma malignidade compreendem os domínios de ligação que ligam especificamente um ou mais dos seguintes recetores de cinases de tirosina: c-Met, RON, EGFR, EGFRvIII, Her2, ErbB3, ErbB4, e IGF1R, EphA2. Em certas formas de realização, os heterodímeros podem compreender ainda um ou mais domínios de ligação que ligam especificamente um ou mais dos seguintes agentes antiangiogénicos: PDGFR, VEGFR1-4, e angiopoietina 2. Em certas formas de realização, os heterodímeros acima podem compreender ainda um ou mais domínios de ligação que ligam especificamente um ou mais dos seguintes recetores Fc para aumentar o direccionamento da função efetora citotóxica: CD64, CD32A e CD16. Em certas formas de realização, os heterodímeros acima podem compreender ainda um domínio de ligação que liga especificamente o recetor de transferrina (CD71) para permitir a degradação dos recetores.
Em determinadas outras formas de realização, os polipéptidos heterodímero úteis para a inibição do crescimento, metástases, ou crescimento metastásico de uma malignidade compreendem os domínios de ligação que são agonistas de dois ou mais dos seguintes TNFSFRs: TNFR1, TNFR2, DR4, DR5, TWEAKR, e FAS .
Em determinadas outras formas de realização, os polipéptidos heterodímero úteis para a inibição do crescimento, metástases, ou crescimento metastásico de uma malignidade compreendem os domínios de ligação que ligam especificamente dois ou mais das seguintes citocinas ou fatores de crescimento pro-oncogénicos: HGF, MSP, EGF (incluindo epirregulina, herregulina, β-regulina, neuregulina), HIF-la, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, TNFa, IL-6, hyperIL-6, IL-8, Wnt, sHH, TGFp, ou PDGF.
Em certas formas de realização, os polipéptidos heterodímero úteis para a inibição do crescimento de uma malignidade sólida ou metástases ou crescimento metastático de uma malignidade sólida incluem os que ligam especificamente, por exemplo, EGFR, ErbB3, ErbB4, c- Met, RON, EphA2, IGF1R, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, CD44v6, CD151, EpCAM, CEACAM6, TGFBR2, GHRHR, GHR, IL-6R, gpl30, TNFR2, PD1, TWEAK-R, OSMRP, Patched-1, Frizzled, ou Robol.
Os polipéptidos heterodímero úteis para inibir metástases ou crescimento metastático de uma malignidade hematológica incluem os que ligam especificamente, por exemplo, EGFR, ErbB3, c-Met, RON, EphA2, IGF1R, TGFBR2, IL-6R, gpl30, TNFR2, PD1, OSMRp, LTpR, CD19, CD80, CD81, ou CD86.
Noutro aspeto, a presente revelação proporciona um método para tratar uma doença autoimunitária ou inflamatória, distúrbio ou estado, compreendendo a administração a um doente com necessidade de uma quantidade eficaz de um polipéptido heterodímero aqui proporcionado ou uma sua composição.
As doenças autoimunitárias ou inflamatórias exemplificativas, distúrbios ou estados que podem ser tratados pelas proteínas de fusão e composições e suas formas de dosagem unitária incluem, e não são limitadas a, doença inflamatória do intestino (e. g., doença de Crohn ou colite ulcerativa), diabetes mellitus (e. g., diabetes tipo I), dermatomiosite, polimiosite, anemia perniciosa, cirrose biliar primária, encefalomielite disseminada aguda (ADEM), doença de Addison, espondilite anquilosante, síndroma do anticorpo antifosfolípido (APS), hepatite autoimunitária, síndrome de Goodpasture, doença de Graves, síndroma Guillain-Barré (GBS), doença de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática, lúpus eritematoso sistémico, lúpus nefrite, lúpus neuropsiquiátrico, esclerose múltipla (MS) , miastenia grave, pênfigo vulgar, asma, artrite psoriática, artrite reumatóide, síndroma de Sjõgren, arterite temporal (também conhecida como "arterite da célula gigante"), anemia hemolítica autoimunitária, penfigóide bulhoso, vasculite, doença celíaca, doença pulmonar obstrutiva crónica, endometriose, Hidradenite supurativa, cistite intersticial, morfea, escleroderma, narcolepsia, neuromiotonia, vitiligo, e doença autoimunitária do ouvido interno.
Os polipéptidos heterodímero exemplificativas úteis para tratar um doença autoimunitária ou inflamatória, distúrbio ou estado podem compreender um ou mais domínios de ligação que ligam especif icamente CD28, e um, dois, ou três dos seguintes domínios de ligação adicionais: um domínio de ligação que compreende o ectodomínio PDL2, um domínio de ligação que compreende monoIL-10, e um domínio de ligação que liga especificamente CD86. Por exemplo, um polipéptido heterodímero pode compreender um domínio de ligação que liga especif icamente CD28 e um a três domínios de ligação que ligam especificamente CD86.
Os polipéptidos heterodímero adicionais exemplificativos úteis para tratar um doença autoimunitária ou inflamatória, distúrbio ou estado, podem compreender um ou mais domínios de ligação que ligam especif icamente CD28 e um ou mais domínios de ligação que são um agonista de IL-10a (e. g., monoIL-10), um agonista de HLA-G, um agonista de HGF, um agonista de IL-35, um agonista de PD-1, um agonista de BTLA, um antagonista LIGHT, um antagonista de GITRL ou um antagonista de CD40. Alternativamente, os polipéptidos heterodímero podem compreender dois ou mais domínios de ligação selecionados a partir de um agonista de IL-10a (e. g., monoIL-10), um agonista de HLA-G, um agonista de HGF, um agonista de IL-35, um agonista de PD-1, um agonista de BTLA, um antagonista de LIGHT, um antagonista de GITRL ou um antagonista de CD40.
Os polipéptidos heterodímero adicionais exemplificativos úteis para tratar uma doença autoimunitária ou inflamatória, distúrbio ou estado, podem compreender um ou mais domínios de ligação que ligam especificamente CD32B e um ou mais domínios de ligação que são um agonista de IL-10a (e. g., monoIL-10), um agonista de HLA-G, um agonista de HGF, um agonista de IL-35, um agonista de PD-1, um agonista de BTLA, um antagonista de LIGHT, um antagonista de GITRL ou um antagonista de CD40.
Os polipéptidos heterodímero adicionais exemplificativos úteis para tratar um doença autoimunitária ou inflamatória, distúrbio ou estado, podem compreender domínios de ligação que ligam especificamente um ou mais dos seguintes TNFSFRs: TNFR1, TNFR2, HVEW, LTpR, TWEAKR, TACI, BAFF-R, BCMA, OU FAS .
Os polipéptidos heterodímero adicionais exemplificativos úteis para tratar uma doença autoimunitária ou inflamatória, distúrbio ou estado, podem compreender domínios de ligação que ligam especificamente dois ou mais das seguintes citocinas/quimiocinas pro-inflamatórias, tais como TNFa, IL-6, IL-2, IL-1, IL-8, IP-10, IFNy, IFNa, RANKL, FASL, TGFp, IL7, IL10, IL17A/F, TWEAK, CSF2, IGF1, IGF2 ou BLyS/APRIL.
Os polipéptido heterodímeros úteis para tratar um doença autoimunitária ou inflamatória, distúrbio ou estado, incluem os que se ligam especificamente a, por exemplo, TGFBR2, IL-6R, gp130, TNFR1, TNFR2, PD1, HVEM, 0X40, CD40, CD137, TWEAK-R, LTpR, LIFERp, OSMRP, CD3, TCRa, TCRP CD19, CD28, CD80, CD81, CD86, TLR7, TLR9, ou qualquer combinação destes.
Noutro aspeto, a presente revelação proporciona um método para tratar um distúrbio ou doença associados a células B que compreende a administração a um doente com necessidade (e. g., um doente possuindo ou suspeito de ter um distúrbio ou doença associada a células B) de uma quantidade eficaz de um polipéptido heterodímero aqui proporcionado, tal como os que se ligam especificamente uma célula B alvo.
Os polipéptidos heterodímero úteis no tratamento de um distúrbio ou doença associados a células B podem compreender os domínios de ligação que ligam especificamente uma ou mais células B alvo, tais como CD79b, CD19, HLA-DR, CD20, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, ou CD70. Os polipéptidos heterodímero podem compreender ainda um domínio de ligação que se liga especificamente a células T alvo, tais como um complexo de TCR ou um seu componente, incluindo TCRa, TCRp, CD3y, CD35, ou CD3 ε.
Os polipéptidos heterodímero úteis no tratamento de um distúrbio ou doença associados a células B podem compreender um domínio de ligação que liga especificamente um alvo em células B, tais como CD79b, CD19, HLA-DR, CD20, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, e CD70, e um domínio de ligação que liga especificamente CD64, CD32A, ou CD16 para aumentar o direccionamento da função efetora citotóxica.
Os polipéptidos heterodímero ou composições destes da presente revelação podem ser administrados oralmente, topicamente, transdermicamente, parentericamente, por inalação de spray, vaginalmente, retalmente, ou por injecção intracraniana, ou qualquer combinação destes. Numa forma de realização, os polipéptidos heterodímero ou suas composições são administrados parentericamente. 0 termo "parentérico," como aqui utilizado, inclui injecções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, injecção intracistérnica, ou técnicas de infusão. A administração por injeção intravenosa, intradérmica, intramusclar, intramamária, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar e/ou implantação cirúrgica num sítio particular está também contemplado. Por exemplo, a invenção inclui a administração de polipéptidos heterodímero ou suas composições por injeção intravenosa. A dose farmaceuticamente eficaz depende do tipo de doença, da composição utilizada, da via de administração, do tipo de indivíduo a ser tratado, das características físicas do indivíduo específico em consideração para o tratamento, medicação concorrente, e outros fatores que os especialistas na técnica médica reconhecerão. Por exemplo, uma quantidade entre 0,01 mg/kg e 1000 mg/kg (e. g., cerca de 0,1 a 1 mg/kg, cerca de 1 a 10 mg/kg, cerca de 10-50 mg/kg, cerca de 50-100 mg/kg, cerca de 100-500 mg/kg, ou cerca de 500-1000 mg/kg) de peso corporal (que pode ser administrado como uma dose única, diariamente, semanalmente, mensalmente, ou em qualquer intervalo apropriado) do ingrediente ativo pode ser administrado dependendo da potência de um polipéptido heterodímero desta revelação.
Está também contemplada a administração de polipéptidos heterodímero ou suas composições em combinação com um segundo agente. Um segundo agente pode ser um aceite na técnica como um tratamento padrão para um estado de doença ou distúrbio particular, tal como no cancro, inflamação, autoimunidade, e infeção. Os segundos agentes exemplificativos contemplados incluem polipéptidos heterodímero que se ligam a alvos diferentes daqueles que os polipéptidos heterodímero primários ligam, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, proteínas de fusão derivada de imunoglobulina, quimioterapêuticos, radiação ionizante, esteróides, NSAIDs, agentes anti-infeção, ou outros agentes ativos e auxiliares, ou qualquer combinação destes.
Em certas formas de realização, um polipéptido heterodímero e um segundo agente atuam sinergisticamente. Por outras palavras, estes dois compostos interagem de modo que o efeito combinado dos compostos é superior à soma dos efeitos individuais de cada composto quando administrado isolado (ver, e. g., Berenbaum, Pharmacol. Rev. 41:93, 1989) .
Em determinadas outras formas de realização, um polipéptido heterodímero e um segundo agente atuam aditivamente. Por outras palavras, estes dois compostos interagem de modo a que o efeito combinado dos compostos é o mesmo da soma dos efeitos individuais de cada composto quando administrado isolado.
Os segundos agentes úteis em combinação com os polipéptidos heterodímero ou suas composições aqui proporcionadas podem ser esteróides, NSAIDs, inibidores mTOR (e. g., rapamicina (sirolimus), temsirolimo, deforolimo, everolimo, zotarolimo, curcumina, ácido farnesiltiossalicílico), inibidores de calcineurina (e. g., ciclosporina, tacrolimo), antimetabolitos (e. g., ácido micofenólico, micofenolato de mofetilo), anticorpos policlonais (e. g., globulina anti-timócito), anticorpos monoclonal (e. g., daclizumab, basiliximab), e proteínas de fusão CTLA4-Ig (e. g., abatacept ou belatacept).
Os segundos agentes úteis para a inibição do crescimento de uma malignidade sólida, inibindo metástases ou crescimento metastático de uma malignidade sólida, ou tratando ou melhorando a malignidade hematológica incluem agentes quimioterapêuticos, radiação ionizante, e outros fármacos anti-cancro. Exemplos de agentes quimioterapêuticos contemplados como outros agentes terapêuticos incluem agentes alquilantes, tais como mostardas de azoto (e. g., mecloretmina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan, e clorambucilo); quimioterapêuticos bifuncionais (e. g., bendamustina); ureias nitrosas (e. g. , carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), e semustina (metil-CCNU)); etileneiminas e metil-melaminas (e. g., trietilenomelaminaa (TEM), trietilenotiofosforamida (tiotepa), e hexametilmelamina (HMM, altretamina)); sulfonatos de alquilo (e. g., buslfan); e triazinas (e. g., dacabazina (DTIC)); antimetabolitos, tais como análogos de ácido fólico (e. g., metotrexato, trimetrexato, e pemetrexed (antifolato multi-alvo)); análogos de pirimidina (tais como 5-fluorouracilo (5-FU), fluorodesoxiuridina, gemcitabina, arabindsido de citosina (AraC, citarabina), 5-azacitidina, e 2,2'-difluorodesoxicitidina); e análogos de purina (e. g., 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina, 2'-desoxicoformicina (pentostatina), eritro-hidroxinoniladenina (EHNA), fosfato de fludarabina, 2-clorodesoxiadenosina (cladribina, 2-CdA)); inibidores de topoisomerase Tipo I tais como camptotecina (CPT), topotecano, e irinotecano; produtos naturais, tais como epipodofilotoxinas (e. g., etopósido e tenipósido); e alcaloides vinca (e. g., vinblastina, vincristina, e vinorelbina); antibióticos anti-tumor tais como actinomicina D, doxorrubicina, e bleomicina; radiosensibilizadores tais como 5-bromodesoxiuridina, 5-iododesoxiuridina, e bromodesoxicitidina; complexos de coordenação com platina tais como cisplatina, carboplatina, e oxaliplatina; ureias substituídas, tais como hidroxiureia; e derivados de metil-hidrazina tais como N-metil-hidrazina (MIH) e procarbazina.
Em certas formas de realização, os segundos agentes úteis para a inibição do crescimento metástases ou crescimento metastásico de uma malignidade incluem polipéptidos heterodímero de acordo com a presente revelação que se ligam a alvos de células de cancro para além do alvo a que o primeiro polipéptido heterodímero se liga. Em determinadas outras formas de realização, os segundos agentes úteis para estes tratamentos incluem anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, e proteínas de fusão derivadas de imunoglobulina que se ligam a alvos de células de cancro. Os alvos exemplificativos em células de cancro são proporcionados acima no contexto da descrição dos alvos de polipéptidos heterodímero úteis para o tratamento acima mencionado.
Outros agentes terapêuticos contemplados por esta revelação para o tratamento de doenças autoimunitárias são referidos como agentes imunossupressores, que atuam para suprimir ou mascarar o sistema imunitário dos indivíduos a ser tratados. Os agentes imunossupressores incluem, por exemplo, fármacos anti-inflamatórios não esteróides (NSAIDs), analgésicos, glucocorticóides, fármacos anti-reumáticos que modificam a doença (DMARDs) para o tratamento de artrite, ou modificadores da resposta biológica. As composições na descrição de DMARD são também úteis no tratamento de muitas outras doenças autoimunitárias para além da artrite reumatóide.
Os NSAIDs exemplificativos são seleccionados a partir do grupo consistindo em ibuprofeno, naproxeno, naproxeno de sódio, inibidores de Cox-2 tais como Vioxx e Celebrex, e sialilatos. Os analgésicos exemplificativos são selecionados a partir do grupo consistindo em acetaminofeno, oxicodona, cloridrato de tramadol de proporxifeno. Os glucocorticóides exemplificativos são selecionados a partir do grupo consistindo em cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, ou prednisona. Os modificadores de resposta biológica exemplificativos incluem moléculas dirigidas contra marcadores à superfície da célula (e. g., CD4, CD5, etc.), inibidores de citocina, tais como os antagonistas de TNF (e. g. etanercept (Enbrel), adalimumab (Humira) e infliximab (Remicade)), inibidores de quimiocina e inibidores de moléculas de adesão. Os modificadores de resposta biológica incluem anticorpos monoclonais assim como formas recombinantes de moléculas. Os DMARDs exemplificativos incluem azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, penicilamina, leflunomida, sulfasalazina, hidroxicloroquina, Gold (oral (auranofin) e intramuscular) e minociclina.
Os segundos agentes adicionais úteis para tratar uma doença autoimunitária ou inflamatória, distúrbio ou estado, podem ser um anticorpo policlonal ou monoclonal, uma proteína de fusão derivada de imunoglobulina (e. g., proteínas de fusão scFv, SMIP™, PIMS, SCORPION™) , ou um polipéptido heterodímero de acordo com a presente revelação que ligam especificamente um alvo associado com essa doença, distúrbio ou estado. Exemplos destes alvos são proporcionados acima no contexto de alvos de polipéptidos heterodímero da presente revelação úteis no tratamento acima mencionado.
Está contemplada uma composição de molécula de ligação e o segundo agente ativo pode ser dado simultaneamente na mesma formulação. Alternativamente, os segundos agentes podem ser administrados numa formulação separada mas concorrentemente (i. e., dados a menos de uma hora uns dos outros).
Em certas formas de realização, o segundo agente ativo pode ser administrado antes da administração de um polipéptido heterodímero ou uma sua composição. Antes da administração refere-se a administração do segundo agente ativo pelo menos uma hora antes do tratamento com o polipéptido heterodímero ou da sua composição. Está ainda contemplado que o agente ativo pode ser administrado subsequente à administração da composição da molécula de ligação. Administração subsequente significa descrever a administração pelo menos uma hora após a administração do polipéptido heterodímero ou da sua composição.
Esta revelação contempla uma dose unitária compreendendo uma composição farmacêutica desta revelação. Estas unidades de dosagem incluem, por exemplo, um frasco ou seringa de dose unitária ou multi-dose, incluindo um frasco ou seringa com dois compartimentos, um compreendendo a composição farmacêutica desta revelação na forma liofilizada e o outro um diluente para reconstituição. Uma dose unitária multi-dose pode também ser, e. g., um saco ou tubo para conexão com um dispositivo de infusão intravenoso.
Esta revelação também contempla um kit compreendendo uma composição farmacêutica desta revelação em dose unitária, ou multi-dose, recipiente, e. g., um frasco, e um conjunto de instruções para a administração da composição a doentes que sofrem de um distúrbio tal como um distúrbio acima descrito. EXEMPLOS EXEMPLO 1
POLIPÉPTIDO HETERODÍMERO BIVALENTE COM DOIS PARES DE DOMÍNIOS DE HETERODIMERIZAÇÃO 0 polipéptido heterodímero X0172 foi preparado por co-
expressão de polipéptidos de cadeia única X0130 (2E12 CHI CH2 CH3 Ck) e X0168 (Ck CH2 CH3 CHI H68 2E12) . A cadeia polipéptido X0130 compreende, desde o seu terminal amino ao carboxilo: 2E12 (anti-CD28) scFv, CHI de IgGl humana, charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e Ck humana alterada (sem o primeiro Arg ou o último Cys). As sequências de ácido nucleico e aminoácidos de X130 são apresentadas nas SEQ ID NOS: 1 e 2, respetivamente. 0 polipéptido de cadeia única X0168 compreende, desde o seu terminal amino ao carboxilo: Ck humana alterada (sem o primeiro Arg ou o último Cys) , charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, CHI de IgGl humana, ligante H68, e scFv 2E12 (anti-CD28). As sequências de ácido nucleico e aminoácidos de X0168 são apresentadas nas SEQ ID NOS: 3 e 4, respetivamente. A sequência de aminoácidos do ligante H68 é apresentada nas SEQ ID NO:78.
Para comparação, o polipéptido heterodímero X0124 foi produzido por co-expressão do polipéptido de cadeia única X0112 (2E12 CHI CH2 CH3) e X0113 (Ck CH2 CH3). 0 polipéptido de cadeia única X0112 compreende, desde o seu terminal amino ao carboxilo: 2E12 (anti-CD28) scFv, CHI de IgGl humana, charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana, e CH3 de IgGl humana. As sequências de ácido nucleico e aminoácidos de X0112 são apresentadas nas SEQ ID NOS: 5 e 6, respetivamente. 0 polipéptido de cadeia única X0113 compreende, desde o seu terminal amino ao carboxilo: Ck humana alterada (sem o primeiro Arg ou o último Cys) , charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana, e CH3 de IgGl humana. As sequências de ácido nucleico e de aminoácidos de X0113 são apresentado nas SEQ ID NOS: 7 e 8, respetivamente.
Expressão
No dia antes da transfeção, as células HEK293 foram suspensas a uma concentração de células de 0,5xl06 células/mL em meio de expressão Freestyle 293 (Gibco). Para uma grande transfeção, foram utilizados 250 pL de células, mas para uma pequena transfeção, foram utilizados 60 pL de células. No dia da transfeção, 320 pL de reagente 293fectin (Invitrogen) foram misturados com 8 mL de meio. Ao mesmo tempo, 250 pg de DNA para cada uma das duas cadeias foram também misturados com 8 mL de meio e incubados durante 5 minutos. Após 15 minutos de incubação, a mistura DNA-293fectin foi adicionada aos 250 pL de células 293 e voltaram ao agitador a 37°C e agitadas a uma velocidade de 120 RPM. Para a transfeção utilizando 60 pL de células, foram utilizados um quarto do DNA, 293fectin e meio.
Purificação A cromatografia de afinidade em Proteína A foi utilizada para purificar as proteínas. 2 mL de proteína A agarose (Repligen) empacotados foram adicionados a uma coluna Biorad (coluna de cromatografia Econo-column, tamanho 2,5 x 10 cm), lavados exaustivamente com PBS (lOx volume da coluna) e os sobrenadantes foram aplicados, lavados com PBS de novo e eluídos com 3 volumes de coluna de tampão de eluição de IgG da Pierce. As proteínas foram então dialisadas exaustivamente contra PBS. As proteínas foram então concentradas utilizando dispositivos Amicon de filtração por centrifugação para um volume final de cerca de 0,5 mL.
Para o segundo passo de purificação, foram utilizadas a cromatografia de afinidade com Proteína L ou cromatografia de troca catiónica. Para purificação com a Proteína L, o polipéptido heterodímero purificado por proteína A foi passado pela coluna de agarose e Proteína L que foi pré-equilibrada com PBS, lavada com PBS (lOx volume da coluna) e depois eluída com tampão de eluição de IgG da Pierce. As proteínas foram então dialisadas contra PBS exaustivamente e concentradas utilizando dispositivos Amicon de filtração por centrifugação para um volume final de cerca de 0,5 mL.
As amostras (200-300 pg) de construções de polipéptido heterodímero previamente purificado por afinidade (Proteína A ou Proteína L) foram dialisadas em 20 mM de MES, pH 6,0 (Tampão A) e aplicadas numa coluna de troca catiónica MonoS 5/50 GL (GE Healthcare) a uma taxa de fluxo de 2 mL/min, utilizando um AKTA Explorer FPLC. A coluna foi deixada a equilibrar durante 5 volumes de coluna (CV) e então utilizada num formato de gradiente numa mistura de 50%:50% tampão A:tampão B (sendo o tampão 20 mM de MES, 1 M de NaCl, pH 6,0) em 20 CV. Uma mistura seguinte de 100% de tampão B foi aplicada em 5 CV para limpar a coluna, e o sistema foi utilizado por mais 5 CV a 100% de tampão A para reequilibrar antes da injecção seguinte. Os picos foram recolhidos e analisados por SDS-PAGE e espectrometria de massa electrospray.
Análise SDS-PAGE
As proteínas purificadas foram analisadas num gel SDS-PAGE a 10% utilizando a Invitrogen's X-célula Surelock gel box.
Sinergia com Concentração Subótima de PMA
As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) dos dadores internos foram isoladas a partir de sangue total heparinizado através de centrifugação em Meio de Separação de Linfócitos (MP Biomedicals, Aurora, OH) e lavadas duas vezes com meio RPMI (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA) . As células T CD4+ foram então enriquecidas a partir de PBMC utilizando seleção negativa com um MACS CD4+ T-Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). As células T enriquecidas (>95%) em CD4+ foram então ressuspensas a uma concentração de 1x10® células/mL em RPMI completo/10% de FCS. Os reagentes de teste foram preparados a 40 pg/mL (produzindo uma concentração final de 10 mg/mL) em RPMI completo/10% de FCS e adicionados a 50 pL/poço em placas de 96 poços de fundo plano (BD Falcon, San Jose, CA). PMA (Phorbol 12 myristate 13-acetate; A.G. Scientific, Inc., San Diego, CA) em RPMI completo/10% de FCS foi adicionado em 50 pL/poço a 4 pg/mL (concentração final de 1 μg/mL). Depois as células T em RPMI completo/10% de FCS foram adicionadas a uma concentração de 5 x 104 células/poço num volume de 50 pL, e finalmente uma quantidade apropriada de RPMI completo/10% de FCS foi adicionada cada poço (tipicamente 50 pL) para trazer o volume final para 200 pL/poço. As células foram tratadas com as amostras de teste +/- PMA e incubado durante 72 horas a 37°C em 5% de CO2. Um microlitro de timidina tritiada (Amersham Biosciences, Pisctaway, NJ) numa diluição 1:50 de RPMI completo/10% de FCS (50 pL/poço) foi adicionado aos poços durante as últimas 6 horas de cultura. As placas foram colhidas numa microplaca Unifilter-96, GF/C (Perkin Elmer, Boston, MA) com um Packard Filtermate Harvester (Perkin Elmer, Boston, MA). Os números são expressos em cpm e são a média de amostras em replicado. A Figura 2 mostra que o polipéptido heterodimero X0172 tem uma propriedade diferencial em comparação com 2E12 SMIP M0039 (SEQ ID NO: 77) . Não sinergiza com PMA como o SMIP. Este polipéptido heterodimero bivalente tem uma propriedade mais próxima do polipéptido heterodimero monovalente, X0124, em vez do SMIP bivalente. A Figura 3 mostra que o polipéptido heterodimero bivalente X0172 se liga a células CD4+ melhor do que o scFv 2E12 (SEQ ID NO:109) e o polipéptido heterodimero monovalente X0124. EXEMPLO 2
POLIPÉPTIDO HETERODIMERO BIVALENTE, TRIVALENTE, TETRAVALENTE UTILIZANDO UM PAR DE DOMÍNIO DE HETERODIMERIZAÇÃO ÚNICO O polipéptido heterodimero bivalente X0251 foi preparado por co-expressão de polipéptidos de cadeia única X0244 (Ck(YAE) CH2(N297A) CH3 H68 2E12) e X0245 (2E12 CHI CH2(N297A) CH3). 0 polipéptido de cadeia única X0244 compreende, desde o seu terminal amino ao carboxilo: Ck humana (YAE) (i.e., Ck humana sem o primeiro Arg ou último Cys mas com substituições N30Y, V55A, e T70E), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (N297A) (i.e., CH2 de IgGl humana com uma substituição N297A), CH3 de IgGl humana, ligante H68, e scFv 2E12 (anti-CD28) . As sequências de nucleótidos e aminoácidos de X0244 são apresentadas nas SEQ ID NOS:9 e 10, respetivamente. O polipéptido de cadeia única X0245 compreende, desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv 2E12 (anti-CD28), CHI de IgGl humana, charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (N2 97A), e CH3 de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de X0245 são apresentadas nas SEQ ID NOS:11 e 12, respetivamente. O polipéptido heterodimero trivalente, biespecifico X0252 foi preparado por co-expressão de polipéptidos de cadeia única X0246 (P2C2 Ck(YAE) CH2(N297A) CH3) e X0247 (2E12 CHI CH2(N297A) CH3 H68 2E12) . O polipéptido de cadeia única X0246 compreende, desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv P2C2 (anti-CD79b), Ck humana (YAE), charneira SCCP de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (N297A), e CH3 de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de X0246 são apresentadas nas SEQ ID NOS:13 e 14, respetivamente. O polipéptido de cadeia única X0247 compreende, desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv 2E12 (anti-CD28), CHI de IgGl humana, charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (N297A), CH3 de IgGl humana, ligante H68, e scFv 2E12 (anti-CD28). As sequências de nucleótidos e aminoácidos de X0247 são apresentadas nas SEQ ID NOS: 15 e 16, respetivamente. 0 polipéptido heterodímero tetravalente, triespecífico X0253 foi preparado por co-expressão de polipéptidos de cadeia única X0248 (P2C2 CK(YAE) CH2(N297A) CH3 H68 A2) e X0249 (PDL2 ECD CHI CH2(N297A) CH3 H68 2E12). 0 polipéptido de cadeia única X0248 compreende, desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv P2C2 (anti-CD79b), Ck humana (YAE), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (N297A), CH3 de IgGl humana, ligante H68, e scFv A2 (anti-hyperIL-6) . As sequências de nucleótidos e aminoácidos de X0248 são apresentadas nas SEQ ID NOS:17 e 18, respetivamente. 0 polipéptido de cadeia única X0249 compreende, desde o seu terminal amino ao carboxilo: PDL2 ECD (i.e., ectodominio PDL2), CHI de IgGl humana, charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (N297A), CH3 de IgGl humana, ligante H68, e scFv 2E12 (anti-CD28) . As sequências de nucleótidos e aminoácidos de X0249 são apresentados nas SEQ ID NOS:19 e 20, respetivamente.
Outro polipéptido heterodímero tetravalente, tetraespecífico X0283, foi preparado por co-expressão de polipéptidos de cadeia única X0249 (PDL2 ECD CHI CH2(N297A) CH3 H68 2E12) e X0281 (monoIL-10 Ck(YAE) CH2(N297A) CH3 H68 3D1). O polipéptido de cadeia única X0281 compreende, desde o seu terminal amino ao carboxilo: monoIL-10, Ck humana (YAE), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (N297A), CH3 de IgGl humana, ligante H68, e scFv 3D1 (anti-CD86) . As sequências de nucleótidos e aminoácidos de X0281 são apresentadas nas SEQ ID NOS:21 e 22.
Como um controlo para o polipéptido heterodímero X0283, heterodímero tetravalente, polipéptido heterodímero X0284, foi preparado por co-expressão de polipéptidos de cadeia única X0249 (PDL2 ECD CHI CH2(N297A) CH3 H68 2E12) e X0282 (monoIL-10 Ck CH2(N297A) CH3 H68 3D1) . O polipéptido de cadeia única X0282 é idêntico ao X0281 exceto que não contém as substituições N30Y V55A T70E na sequência Ck humana. Deste modo, o polipéptido de cadeia única X0282 compreende, desde o seu terminal amino ao carboxilo: monoIL-10, Ck humana alterada (sem o primeiro Arg ou o último Cys), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (N297A), CH3 de IgGl humana, ligante H68, e scFv 3D1 (anti-CD86) . As sequências de nucleótidos e aminoácidos de X0282 são apresentadas nas SEQ ID NOS:23 e 24, respetivamente.
As moléculas de polipéptido heterodimero foram expressas e purificadas de acordo com o Exemplo 1. As proteínas purificadas foram analisadas utilizando electroforese SDS-PAGE em condições reduzidas e não reduzidas. A cromatografia de exclusão de tamanho foi efectuada num AKTA Explorer FPLC (Pharmacia Biotech) utilizando uma coluna Superdex200 10/300 GL. Algumas proteínas foram analisadas por espectrometria de massa electrospray utilizando um Agilent 6120 TOF ES/MS.
As medições de ressonância de plasmão de superfície (SPR) foram efetuados num Biacore T100 SPR utilizando HBS-P+ (GE Healthcare) como um tampão de corrida. O alvo foi diretamente imobilizado num chip CM5 utilizando a química convencional de acoplamento de amina (BIACORE® Amine Coupling Kit, GE Healthcare), com níveis finais de imobilização entre 800 e 1900 Ru (unidades de ressonância). O polipéptido heterodimero X0283 foi injetado a 25°C ou 37°C durante 150 segundos a uma taxa de fluxo de 30 mL/min numa série de concentrações de 10 nM a 1 mM. A dissociação foi monitorizada durante 1200 segundos, e a superfície foi reproduzida por injecção de 50 mM de NaOH durante 60 segundos. As interações de ligação com a superfície foram estáveis através de pelo menos 60 ciclos de regeneração. Os dados foram analisados utilizando BiaEvaluation para o software T100 (versão 2.0, GE Healthcare). A eletroforese SDS-PAGE e as análises de cromatografia de troca catiónica mostra que os polipéptidos heterodímero X0251, X0252 e X0253 foram razoavelmente bem expressos e purificados (Figura 4). A análise de espectrometria de massa de X0252 mostra que a proteína é maioritariamente homogénea com uma quantidade dos homodímeros indetetável (Figura 5) . Adicionalmente, a electroforese SDS-PAGE e as análises de cromatografia de troca catiónica de polipéptidos heterodímero X0283 e X0284 mostram que o polipéptido heterodímero X0283 possuindo os domínios de heterodimerização CHl/Ck(YAE) montam-se eficientemente num heterodímero em comparação com o polipéptido heterodímero X0284 de controlo possuindo os domínios heterodimerização CHl/Ck, que formam também homodímeros (Figura 6). A análise Biocore mostra ainda que o domínio de ligação 3D1 (anti-CD86) no terminal carboxilo do polipéptido de cadeia única X0281 liga-se monovalentemente a CD86 (Figura 7). EXEMPLO 3
POLIPÉPTIDOS HETERODÍMERO COM DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO ANTI-RON E ANTI-C-MET
Foram preparados um polipéptido heterodímero bivalente com domínios de ligação anti-RON (ORN151) e dois polipéptidos heterodímero biespecíficos compreendendo os domínios de ligação anti-RON e anti-cMet (ORN152 e ORN153). O polipéptido heterodímero bivalente ORN151 compreende polipéptidos de cadeia única ORN145 (4C04 CH2 CH3 CHI) e ORN148 (11H09 CH2 CH3 Ck(YAE)). O polipéptido de cadeia única ORN145 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv 4C04 (anti-RON), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de ORN145 são apresentadas nas SEQ ID NOS:26 e 30, respetivamente. O polipéptido de cadeia única ORN148 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv 11H09 (anti-RON), charneira SCCP de IgGl humana, CH2 humano, CH3humano, e Ck humana (YAE). As sequências de nucleótidos e aminoácidos de ORN148 são apresentadas nas SEQ ID NOS:28 e 32, respetivamente. O polipéptido heterodimero biespecifico (c-Met, RON) ORN152 compreende os polipéptidos de cadeia única ORN116 (MET021 CH2 CH3 CHI) e ORN146 (4C04 CH2 CH3 Ck(YAE)). O polipéptido de cadeia única ORN116 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv MET021 (anti-c-Met), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de ORN116 são apresentadas nas SEQ ID NOS:25 e 29, respetivamente. O polipéptido de cadeia única ORN146 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv 4C04 (anti-RON), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 humano, CH3 humano, e Ck humana (YAE). As sequências de nucleótidos e aminoácidos de ORN146 são apresentadas nas SEQ ID NOS:27 e 31, respetivamente. O polipéptido heterodimero biespecifico (c-Met, RON) ORN153 compreende os polipéptidos de cadeia única ORN116 (MET021 CH2 CH3 CHI) e ORN148 (11H09 CH2 CH3 Ck(YAE)).
Os polipéptido heterodimeros ORN151, ORN152 e ORN153 foram expressos de acordo com o Exemplo 1. Foram obtidos os seguintes níveis de expressão: 1,9 pg proteína/mL de cultura para 0RN151, 3,1 pg/mL para ORN152, e 4,9 pg/mL para ORN153. EXEMPLO 4 POLIPÉPTIDOS HETERODÍMERO COM DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO ANTI-CD3
Foram preparados vários polipéptidos heterodímero biespecíficos com um domínio de ligação anti-CD3: polipéptidos heterodímero S0268, S0269, e TSC020 to TSC030. 0 polipéptido heterodímero S0268 compreende os polipéptidos de cadeia única ORN145 (4C04 CH2 CH3 CHI) e TSC019 (G19-4 CH2 CH3 Ck(YAE)). 0 polipéptido de cadeia única TSC019 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv G19-4 (anti-CD3) , charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 humano, CH3 humano, e Ck humana (YAE). As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC019 são apresentadas nas SEQ ID NOS:52 e 72, respetivamente. 0 polipéptido heterodímero biespecífico (CD3, c-Met) S0269 compreende polipéptidos de cadeia única ORN160 (5D5 CH2 CH3 CHI) e TSC019 (G19-4 CH2 CH3 Ck (YAE) ) . 0 polipéptido de cadeia única ORN160 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv 5D5 (anti-c-Met), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de ORN160 são apresentadas nas SEQ ID NOS: 33 e 53, respetivamente. 0 polipéptido heterodímero bivalente (CD19) TSC020 compreende os polipéptidos de cadeia única TSC001 (HD37 CH2 CH3 CHI) e TSC019 (G19-4 CH2 CH3 Ck(YAE)). 0 polipéptido de cadeia única TSC001 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC001 são apresentadas nas SEQ ID NOS:34 e 54, respetivamente. O polipéptido heterodimero biespecifico (CD20, CD3) TSC021 compreende os polipéptidos de cadeia única TSC002 (2H7 CH2 CH3 CHI) e TSC019 (G19-4 CH2 CH3 Ck(YAE)). 0 polipéptido de cadeia única TSC002 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv 2H7 (anti-CD20), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC002 são apresentadas nas SEQ ID NOS:35 e 55, respetivamente. 0 polipéptido heterodimero biespecifico (CD79b, CD3) TSC022 compreende os polipéptidos de cadeia única TSC017 (P2C2 H2 CH3 CHI) e TSC019 (G19-4 CH2 CH3 Ck(YAE)). 0 polipéptido de cadeia única TSC017 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv P2C2 (anti-CD79b), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC017 são apresentadas nas SEQ ID NOS:50 e 70, respetivamente. O polipéptido heterodimero biespecifico (HLA-DR, CD3) TSC023 compreende os polipéptidos de cadeia única TSC018 (M0042 CH2 CH3 CHI) e TSC019 (G19-4 CH2 CH3 Ck(YAE)). O polipéptido de cadeia única TSC018 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv M0042 (anti-HLA-DR), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC018 são apresentadas nas SEQ ID NOS:51 e 71, respetivamente. O polipéptido heterodimero bivalente TSC024 compreende os polipéptidos de cadeia única TSC010 (HD37-"charneira de
IgGAlCH2 CH3 CHI) e TSC003 (G19-4-"charneira de IgGAl"-CH2 CH3 Ck (YAE)) . 0 polipéptido de cadeia única TSC010 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), charneira de IgGAl humana alterada (PSTPPTPSPSTPPTPSPSCPPCP, SEQ ID NO:752), CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC010 são apresentadas nas SEQ ID NOS:43 e 63, respetivamente. O polipéptido de cadeia única TSC003 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv G19-4 (anti-CD3), charneira de IgGAl humana alterada (SEQ ID NO:752), CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE) . As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC003 são apresentadas nas SEQ ID NOS:36 e 56, respetivamente. 0 polipéptido heterodimero bivalente TSC025 compreende os polipéptidos de cadeia única TSC011 (HD37-"charneira de IgGA2CH2 CH3 CHI) e TSC004 (G19-4-"charneira de IgGA2"-CH2 CH3 Ck (YAE) ) . 0 polipéptido de cadeia única TSC011 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), charneira de IgGA2 humana alterada (PPPPPCPPCP, SEQ ID NO:748), CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC011 são apresentadas nas SEQ ID NOS:44 e 64, respetivamente. 0 polipéptido de cadeia única TSC004 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv G19-4 (anti-CD3), charneira de IgGA2 humana alterada (SEQ ID NO:748), CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE). As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC004 são apresentadas nas SEQ ID NOS:37 e 57, respetivamente. 0 polipéptido heterodimero bivalente TSC026 compreende os polipéptidos de cadeia única TSC012 (HD37-"charneira de IgGl"- CH2 CH3 CHI) e TSC007 (G19-4-"charneira de IgGl"-CH2 CH3 Ck(YAE)). 0 polipéptido de cadeia única TSC012 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), charneira de IgGl humana alterada (EPKSSDKTHTSPPSPCPPCP, SEQ ID NO:750), CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC012 são apresentadas nas SEQ ID NOS:45 e 65, respetivamente. 0 polipéptido de cadeia única TSC007 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv G19-4 (anti-CD3), charneira de IgGl humana alterada (SEQ ID NO:750), CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE). As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC007 são apresentadas nas SEQ ID NOS:40 e 60, respetivamente. O polipéptido heterodimero bivalente TSC027 compreende os polipéptidos de cadeia única TSC013 (HD37-"charneira de IgG3"- CH2 CH3 CHI) e TSC005 (G19-4-"charneira de IgG3"-CH2 CH3 Ck(YAE)). O polipéptido de cadeia única TSC013 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), charneira de IgG3 humana alterada (EPKSSDTPPPSPRSPCPPCP, SEQ ID NO:751), CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC013 são apresentadas nas SEQ ID NOS:46 e 66, respetivamente. O polipéptido de cadeia única TSC005 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv G19-4 (anti-CD3), charneira de IgG3 humana alterada (SEQ ID NO:751), CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE). As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC005 são apresentadas nas SEQ ID NOS:38 e 58, respetivamente. 0 polipéptido heterodimero bivalente TSC028 compreende os polipéptidos de cadeia única TSC014 (HD37-"charneira de 1 gD" - CH2 CH3 CHI) e TSC006 (G19-4-"charneira de IgD"-CH2 CH3 Ck(YAE)). 0 polipéptido de cadeia única TSC014 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), humano alterado charneira de IgD (ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTCPPCP, SEQ ID NO:754), CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC014 são apresentadas nas SEQ ID NOS:47 e 67, respetivamente. 0 polipéptido de cadeia única TSC006 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv G19-4 (anti-CD3), charneira de IgD humana alterada (SEQ ID NO:754), CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE) . As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC006 são apresentadas nas SEQ ID NOS:39 e 59, respetivamente. 0 polipéptido heterodimero bivalente TSC029 compreende os polipéptidos de cadeia única TSC015 (HD37-"charneira CH2 de IgE"-CH2 CH3 CHI) e TSC008 (G19-4-"charneira CH2 de IgE"-CH2 CH3 Ck(YAE)). 0 polipéptido de cadeia única TSC015 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), charneira CH2 de IgE humana alterada (SEQ ID NO:757), CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC014 são apresentadas nas SEQ ID NOS:48 e 68, respetivamente. 0 polipéptido de cadeia única TSC008 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv G19-4 (anti-CD3), charneira CH2 de IgE humana alterada (SEQ ID NO:757), CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE) . As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC008 são apresentadas nas SEQ ID NOS:41 e 61, respetivamente. 0 polipéptido heterodimero bivalente TSC030 compreende os polipéptidos de cadeia única TSC016 (HD37-"charneira CH2 de IgM"-CH2 CH3 CHI) e TSC009 (G19-4-" charneira CH2 de IgM"-CH2 CH3 Ck (YAE)) . 0 polipéptido de cadeia única TSC016 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), charneira CH2 de IgM humana alterada (SEQ ID NO:759), CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC015 são apresentadas nas SEQ ID NOS:49 e 69, respetivamente. 0 polipéptido de cadeia única TSC009 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv G19-4 (anti-CD3), charneira CH2 de IgM humana alterada (SEQ ID NO:759), CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE). As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC009 são apresentadas nas SEQ ID NOS: 42 e 62, respetivamente.
Os polipéptidos heterodimero biespecificos S0268 (RON, CD3) e S0269 (CD3, c-Met) foram expressos de acordo com o Exemplo 1. Foram obtidos os seguintes níveis de expressão: 2,2 pg proteína/mL de cultura para S0268 e 2,7 pg/mL para S0269. EXEMPLO 5
LIGAÇÃO À CÉLULA DE POLIPÉPTIDOS HETERODIMERO BIESPECÍFICOS
Para comparar a eficácia das moléculas de polipéptido heterodimero biespecífico no direcionamento para um antigénio de célula de tumor e células T, foi comparada a ligação na célula característica de um polipéptido heterodimero anti-RON (domínio de ligação 4C04) x anti-CD3 (domínio de ligação G19-4), S0268 (como descrito no Exemplo 4), com uma estrutura biespecífica diferente (proteína SCORPION™) contendo os mesmos domínios de ligação, S0266. Adicionalmente, a ligação na célula característica dos dois polipéptidos heterodimero biespecificos, TSC020 e TSC021 (como descrito no Exemplo 4), direccionados para diferentes antigénios de células B (CD19 para TSC020 e CD20 para TSC021) assim como para antigénio de células T (CD3) foi comparada. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de proteína SCORPION S0266 são apresentadas nas SEQ ID NOS:73 e 74, respetivamente. As sequências de nucleótidos e aminoácidos dos polipéptidos de cadeia única que constituem os polipéptidos heterodímero biespecíficos S0268, TSC020, e TSC021 são apresentadas nas SEQ ID NOS:26 e 52 (nucleótidos), 30 e 72 (aminoácidos); 34 e 52 (nucleótidos), 54 e 72 (aminoácidos) ; e 35 e 52 (nucleótidos) , 55 e 72 (aminoácidos), respetivamente (ver também Exemplo 4) . A transfeção transiente em células 293 humanas produziram 6,9 pg proteína/mL de cultura para S0266; 2,3 pg/mL de cultura para S0268; 3,0 pg/mL de cultura para TSC020; e 3,2 pg/mL de cultura para TSC021.
As células de carcinoma da mama MDA-MB-453 (RON+), as células de linfoma de células do manto Reel (CD19+, CD20+), e células leucemia de células T Jurkat (CD3+) foram obtidas na ATCC (Manassas, VA) , e cultivadas de acordo com o protocolo proporcionado. As células T foram isoladas a partir de PBMCs dadores utilizando um Pan T Cells Isolation Kit II de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemanha). As células não T foram separadas dos PBMCs sendo indiretamente magneticamente marcadas com anticorpos monoclonais conjugados com biotina e microesferas magnéticas anti-biotina. Estas células foram então removidas por retenção numa coluna circundada por um campo magnético. As células T não foram retidas na coluna e foram colhidas no fluxo. A ligação foi avaliada por incubação das 5xl05 células T ou células alvo (MDA-MB-453, Red, Jurkat) durante 30 minutos a 4°C com moléculas S0266 biespecíficas diluídas em série (proteína aRON 3 aCD3 SCORPION™) ou S0268 (polipéptido heterodímero aRON 3 aCD3) (para MDA-MB-453 células e células T isoladas); ou TSC020 (aCD19 x aCD3) ou TSC021 (aCD20 x aCD3) para células Red e Jurkat, em concentrações de 100 nM a 0,1 nM. As células foram lavadas três vezes e então incubadas com anti-IgG humana-FITC de cabra (diluição 1:200) por mais 30 minutos a 4°C. As células foram então lavadas contra três vezes, fixados em 1% de paraformaldeido e lido num instrumento FACS-Calibur. A análise do subconjunto com FSC elevado, SSC elevado em FlowJo v7.5 (Tree Star, Inc, Ashland, OR) mostrou ligação de moléculas biespecificas S0266 e S0268 dependente da dose a ambos MDA-MB-453 e células T isoladas (Figuras 8A e 8B) . Inesperadamente, o polipéptido heterodímero S0268 ligado com afinidade semelhante à molécula comparável SCORPION™ (S0266) em ambas as células MDA-MB-453 e células T, embora não tivesse o potencial para qualquer avidez. A saturação mais elevada em ambos os tipos de célula alvo foi também observada com o polipéptido heterodímero, que pode ser o caso se o polipéptido heterodímero foi ligado com uma estequiometria mais elevada (ligação de polipéptido heterodímero 1:1 para o antigénio de superfície) do que a SCORPION™ equivalente (ligação potencial 1:2 da Scorpion bivalente para os antigénios de superfície). A comparação do heterodímero biespecífico dirigido para CD 19 (TSC020; domínios de ligação HD37 e G19-4) e o heterodímero biespecífico dirigido para CD20 (TSC021; domínios de ligação 2H7 e G19-4) nas células Red e Jurkat revelou que o heterodímero TSC020 tinha maior afinidade para as células Red do que o heterodímero TSC021 (Figura 9A) . No entanto, ambos os heterodímeros TSC020 e TSC021 mostraram uma ligação semelhante a células Jurkat CD3 + , que se espera uma vez que ambos os heterodímeros possuem o mesmo domínio de ligação anti-CD3 (G19-4) (Figura 9B) . EXEMPLO 6
POLIPÉPTIDOS HETERODÍMERO ADICIONAIS BIVALENTES & TRIVALENTES UTILIZANDO UM PAR DE DOMÍNIOS DE HETERODIMERIZAÇÃO ÚNICOS
Os heterodímeros multiespecíficos adicionais foram preparados: TSC046, TSC047, TSC048, TSC054, TSC055, TSC056, TSC057, TSC078, TSC079, TSC080, TSC099, TSC100, TSC101, e TSC102 . O polipéptido heterodimero bivalente TSC046 compreende polipéptidos de cadeia única TSC001 (HD37 CH2 CH3 CHI) e TSC039 (BMA031 CH2 CH3 Ck(YAE)). O polipéptido de cadeia única TSC001 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC001 são apresentadas nas SEQ ID NOS: 34 e 54, respetivamente. O polipéptido de cadeia única TSC039 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv BMA031 (anti-TCR), charneira SCCP de IgGl humana, CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE) . As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC039 são apresentadas nas SEQ ID NOS :793 e 811, respetivamente. O polipéptido heterodimero bivalente TSC047 compreende polipéptidos de cadeia única TSC001 (HD37 CH2 CH3 CHI) e TSC041 (CRIS7 CH2 CH3 Ck(YAE)). O polipéptido de cadeia única TSC041 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv CRIS7 (anti-CD3), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE) . As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC041 são apresentadas nas SEQ ID NOS :794 e 812, respetivamente. 0 polipéptido heterodímero bivalente TSC048 compreende os polipéptidos de cadeia única TSC001 (HD37 CH2 CH3 CHI) e TSC043 (0KT3-M CH2 CH3 Ck(YAE)). 0 polipéptido de cadeia única TSC043 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv 0KT3-M (variante Micromet anti-CD3, ver também US 7 635 472), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE) . As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC043 são apresentadas nas SEQ ID NOs:795 e 813, respetivamente. 0 polipéptido heterodímero bivalente TSC054 compreende os polipéptidos de cadeia única TSC049 (HD37 CH2(ADCC/ CDC nulo) CH3 CHI) e TSC053 (G19-4 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Ck(YAE)). 0 polipéptido de cadeia única TSC049 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana(ADCC/CDC nulo) (i.e., CH2 de IgGl humana com substituições L234A, L235A, G237A, E318A, K320A, e K322A), CH3 de IgGl humana, e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC049 são apresentadas nas SEQ ID NOS :796 e 814, respetivamente. 0 polipéptido de cadeia única TSC053 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv G19-4 (anti- CD3), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana(ADCC/CDC nulo) (i.e., CH2 de IgGl humana com substituições L234A, L235A, G237A, E318A, K320A, e K322A), CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE) . As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC053 são apresentadas nas SEQ ID NOS:800 e 818, respetivamente. 0 polipéptido heterodímero bivalente TSC055 compreende polipéptidos de cadeia única TSC050 (2H7 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CHI) e TSC053 (G19-4 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Ck(YAE)). 0 polipéptido de cadeia única TSC050 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv 2H7 (anti-CD20), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (ADCC/CDC nulo) , CH3 de IgGl humana, e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSCO50 são apresentadas nas SEQ ID NOS:797 e 815, respetivamente. 0 polipéptido heterodimero bivalente TSC056 compreende polipéptidos de cadeia única TSC051 (P2C2 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CHI) e TSC053 (G19-4 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Ck(YAE)). 0 polipéptido de cadeia única TSC051 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv P2C2 (anti-CD79), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (ADCC/CDC nulo), CH3 de IgGl humana, e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC051 são apresentadas nas SEQ ID NOS :798 e 816, respetivamente. 0 polipéptido heterodimero bivalente TSC057 compreende polipéptidos de cadeia única TSC052 (5D5 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CHI) e TSC053 (G19-4 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Ck(YAE)). 0 polipéptido de cadeia única TSC052 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv 5D5 (anti-cMet) , charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (ADCC/CDC nulo), CH3 de IgGl humana, e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC052 são apresentadas nas SEQ ID NOS:799 e 817, respetivamente. 0 polipéptido heterodimero bivalente TSC078 compreende polipéptidos de cadeia única TSC049 (HD37 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CHI) e TSC076 (0KT3 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Ck(YAE)). 0 polipéptido de cadeia única TSC076 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv 0KT3 (anti-CD3) , charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (ADCC/CDC nulo), CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE) . As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC076 são apresentadas nas SEQ ID NOS:802 e 820, respetivamente. O polipéptido heterodímero bivalente TSC079 compreende polipéptidos de cadeia única TSC049 (HD37 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CHI) e TSC077 (Nuvion CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Ck(YAE)). O polipéptido de cadeia única TSC077 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv Nuvion (anti-CD3), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana(ADCC/CDC nulo), CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE). As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC077 são apresentadas nas SEQ ID NOS:803 e 821, respetivamente. O polipéptido heterodímero trivalente TSC080 compreende polipéptidos de cadeia única TSC001 (HD37 CH2 CH3 CHI) e TSC064 (G19-4 CH2 CH3 Ck(YAE) H75 Met021). O polipéptido de cadeia única TSC064 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv G19-4 (anti-CD3), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana, CH3 de IgGl humana, Ck humana (YAE), ligante H75, e scFv Met021 (anti-c-Met) (com os três resíduos de serina no terminal C removidos). As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC064 são apresentadas nas SEQ ID NOS:801 e 819, respetivamente. O polipéptido heterodímero bivalente TSC099 compreende polipéptidos de cadeia única TSC049 (HD37 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CHI) e TSC097 (4C04 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Ck(YAE)). O polipéptido de cadeia única TSC097 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv 4C04 (anti-RON), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (ADCC/CDC nulo), CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE) . As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC097 são apresentadas nas SEQ ID NOS:808 e 826, respetivamente. 0 polipéptido heterodímero bivalente TSC100 compreende polipéptidos de cadeia única TSC049 (HD37 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CHI) e TSC093 (CRIS7 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Ck(YAE)). 0 polipéptido de cadeia única TSC093 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv CRIS7 (anti-CD3), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (ADCC/CDC nulo), CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE). As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC093 são apresentadas nas SEQ ID NOS:804 e 822, respetivamente. 0 polipéptido heterodímero bivalente TSC101 compreende os polipéptidos de cadeia única TSC049 (HD37 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CHI) e TSC094 (0KT3-M CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Ck(YAE)). 0 polipéptido de cadeia única TSC094 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv 0KT3-M (variante Micromet anti-CD3), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (ADCC/CDC nulo), CH3 de IgGl humana, Ck humana (YAE) . As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC094 são apresentadas nas SEQ ID NOS :805 e 823, respetivamente. O polipéptido heterodímero bivalente TSC102 compreende os polipéptidos de cadeia única TSC049 (HD37 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CHI) e TSC095 (BMA031 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Ck(YAE)). O polipéptido de cadeia única TSC095 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: scFv BMA031 (anti-TCR), charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (ADCC/CDC nulo), CH3 de IgGl humana, Ck humana (YAE). As sequências de nucleótidos e aminoácidos de TSC095 são apresentadas nas SEQ ID NOS:806 e 824, respetivamente.
As moléculas de polipéptido heterodímero foram expressas e purificadas de acordo com o Exemplo 1. EXEMPLO 7
PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS T DEPENDENTES DO ALVO POR POLIPÉPTIDOS HETERODÍMERO
Para comparar a eficácia de diferentes moléculas de polipéptido heterodímero biespecifico na indução de ativação e proliferação de células T dependente do alvo, foram comparadas três diferentes moléculas biespecificas (TSC054, TSC078, e TSC079 como descrito no Exemplo 6) com um domínio de ligação comum anti-CD 19 (HD37) e três diferentes domínios de ligação anti-CD3 (G19-4 para TSC054, 0KT3 para TSC078, HuM291 para TSC079). Como um controlo positivo, uma molécula Biespecífica Cativante de células T (BiTE) conhecida como bscl9x3 foi também preparada (ver Patente U.S. 7 635 472). As sequências de nucleótidos e aminoácidos para bscl9x3 são apresentadas nas SEQ ID NOS:809 e 827, respetivamente. A transfeção transiente em células 293 humanas produziu 2,33 pg/mL de proteína para TSC054, 0,67 pg/mL proteína para TSC078, e 3,5 pg/mL para TSC079.
As células Daudi de linfoma Burkitt (CD19+) e células de carcinoma da mama MDA-MB-453 (CD19-) foram obtidas em ATCC (Manassas, VA) e cultivadas de acordo com o protocolo proporcionado. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas do sangue humano utilizando gradientes padrão de ficol. As células isoladas foram lavadas em tampão salino. As células T foram adicionalmente isoladas utilizando um Pan T-Cell Isolation Kit II de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemanha) utilizando o protocolo do fabricante (ver também o Exemplo 5 para mais informação). A proliferação foi avaliada por marcação de populações de PBMC ou células T isoladas com éster de diacetato succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE). As PBMC ou células T marcados com CFSE foram plaqueadas em placas de 96 poços de fundo em U a 150 000 ou 100 000 células/poço, respetivamente, com vários números de células de tumor, para conseguir proporções de células T para célula de tumor de 10:1 a 3:1. As concentrações das moléculas de teste que varia entre os 8 nM a 0,08 pM foram adicionadas às misturas de células num total de 200 pL/poço em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro humano ou bovino, piruvato de sódio e aminoácidos não essenciais. As placas foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 em incubadores humidificados. Após 3 dias, as células foram marcadas com anticorpos para análise de citometria de fluxo. As células foram marcadas e lavadas nas suas placas originais para minimizar a perda de célula durante as transferências, e toda a marcação foi efectuada em tampão salino com 0,2% de albumina de soro bovino. Primeiro, as células foram pré-incubadas com 100 pg/mL de IgG humana à temperatura ambiente durante 15 min. Subsequentemente, as células foram incubadas com uma mistura (volume total 50 pL) dos seguintes anticorpos marcados com corante: CD5-PE, CD4-APC, CD8-Pacific Blue, CD25-PE-Cy7, assim como 7-Amino Actinomicina D (7AAD daqui em diante) durante 40 min. As placas foram lavadas duas vezes, ressuspensas em volumes de 80 a 120 pL e utilizadas imediatamente num citómetro de fluxo BD LSRII para adquirir 80% dos conteúdos de cada poço. Os ficheiros da amostra foram analisadas utilizando o software FlowJo para calcular as percentagens e números de células que sofreram pelo menos uma divisão celular, de acordo com o seu perfil CFSE, encaminhando sequencialmente as células T ativadas, CD4+ ou CD8+ (7AAD-, CD5+ CD25+ CD4+ ou 7AAD- CD5+ CD25+ CD8 + , respetivamente) vivas. Os valores médios e desvios padrões foram calculados utilizando o software Microsoft Excel. Os gráficos foram apresentados utilizando Microsoft Excel ou Graphpad Prism. A análise de populações CD4+ e CD8+ vivas de células Daudi ou células MDA-MB-453 tratados com PBMCs totais (Figuras 10A-10D) revelaram um aumento significativo no número total de células e na percentagem de células de proliferação na presença de células Daudi apresentando o antigénio CD 19 alvo (Figuras 10A, 10B), mas uma falta de proliferação significativa na presença de células MDA-MB-453 que não tinham o antigénio CD19 (Figuras IOC, 10D) . Foi observada alguma proliferação a um nível mais baixo com as células MDA-MB-453 e PBMCs totais, uma vez que as células B (CD19+) estavam presentes nas PBMCs, mas a proliferação global foi fortemente reduzida em comparação. Esta seletividade foi também observada com células T isoladas. A proliferação foi superior para células T CD8+ do que células T CD4+ na presença de células Daudi ou células MDA-MB-453 tratadas com PBMCs (Figura 10A -10D) , e a proliferação induzida por TSC078 (HD37xOKT3) foi geralmente superior em todas as concentrações do que a resposta induzida por TSC054 (HD37xGl9-4) ou TSC079 (HD37xHuM291) (Figuras 10A-10D) . A proliferação induzida de células T CD4+ foi inferior em todos os casos para TSC054, TSC078, e TSC079 do que BiTE bscl9x3 (Figura 10A), embora TSC078 e TSC079 apresentasse indução superior de proliferação de células CD8+ a concentrações inferiores (e. g. 5 pM) do que a molécula BiTE (Figura 10B). EXEMPLO 8
CITOTOXICIDADE DE CÉLULAS T REDIRECIONADAS POR POLIPÉPTIDOS HETERODÍMEROS
Para comparar a eficácia de diferentes moléculas de polipéptido heterodímero biespecífico na indução de citotoxicidade de células T dependentes de alvo, foram comparadas quatro moléculas biespecíficas diferentes num ensaio de libertação de crómio (51Cr) . Foram testadas três moléculas biespecificas diferentes (TSC054, TSC078, TSC079, como descrito no Exemplo 6) com um domínio de ligação anti-CD19 comum (HD37) e três diferentes domínios de ligação anti-CD3 (G19-4 para TSC054, 0KT3 para TSC078, HuM291 para TSC079) juntamento com uma quarta molécula biespecífica (S0268, descrito no Exemplo 4) com um domínio de ligação anti-RON (4C04) e um domínio de ligação anti-CD3 (G19-4) . A transfeção transiente em células 293 humanas produziram cerca de 2,33 pg/mL proteína para TSC054, cerca de 0,67 pg/mL proteína para TSC078, e cerca de 3,5 pg/mL proteína para TSC079.
As células Daudi de linfoma de Burkitt (CD19+, RON-) e células BxPC-3 (CD 19-, RON+) foram obtidas a partir de ATCC (Manassas, VA) e cultivadas de acordo com o protocolo fornecido. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram isoladas do sangue humano utilizando gradientes de ficoll convencionais. As células isoladas foram lavadas em tampão salino. As células T foram adicionalmente isoladas utilizando um Pan Cell T Isolation Kit II de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemanha) utilizando o protocolo do fabricante (ver também Exemplo 5 para mais informação). A citotoxicidade foi avaliada através de um ensaio de libertação de 51Cr. Aproximadamente 5xl06 células Daudi ou BxPC-3 foram tratadas com 0,3 mCi de 51Cr e incubadas durante 75 minutos a 37 °C. Após 75 minutos, as células foram lavadas 3 vezes com meio (RPMI + 10% FBS) e ressuspensas em 11,5 mL de meio. Para esta suspensão, foram dispensados 50 mL por poço para placas de 96 poços com fundo em U (aproximadamente 20 000 células/poço). Concentrações de moléculas biespecíficas que variam entre 10 nM e 0,1 pM foram adicionadas às células alvo (Daudi, BxPC-3), trazendo o volume total para 100 pL/poço. As células alvo foram incubadas à temperatura ambiente durante 15 minutos. Depois foram adicionados 100 pL de células T isoladas (aproximadamente 200 000) para levar a proporção de células T para células alvo de 10:1. Foram adicionados 50 pL de 0,8% NP-40 a um poço de controlo contendo células alvo, deixadas durante 15 minutos, depois foi adicionado 100 pL de meio para proporcionar um controlo de lise total.
As placas foram incubadas durante 4 horas, centrifugadas a 1500 rpm durante 3 minutos, e foi transferido 25 pL de sobrenadante de cada poço para o poço correspondente de uma placa Luma de 96 poços. As placas das amostras foram deixadas secar ao ar numa câmara de segurança química durante 18 horas, e depois a radioatividade foi medida num contador de cintilações Topcount utilizando um protocolo convencional.
Os resultados da análise de citotoxicidade demonstraram uma falta de citotoxicidade fora do alvo nas células Daudi (RON-) da molécula biespecífica S0268 dirigida anti-RON (Figura 11A) . Do mesmo modo, houve uma falta de citotoxicidade direta observada a partir do tratamento de células Daudi com TSC054 na ausência de células T (Figura 11A) . No entanto, foi observada uma forte citotoxicidade dirigido por células T com as células Daudi na presença de células T e uma molécula biespecífica (TSC054) dirigida anti-CD19, alcançando uma lise máxima a uma concentração entre 10 e 100 pM (Figura 11A). Do mesmo modo, utilizando um segundo dador de células T (Figura 11B), não foi observada citotoxicidade fora do alvo das células BxPC-3 (CD19-) das TSC054, TSC078, ou TSC079, ou as BiTE bscl9x3 dirigidas para CD19 biespecíficas. A citotoxicidade induzida por molécula biespecífica anti-RON dirigida para S0268 em células BxPC-3 (RON+), alcançando um máximo entre 10 e 100 pM (Figura 11B). EXEMPLO 9
MODULAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS T DEPENDENTES DO ALVO PELOS POLIPÉPTIDOS HETERODÍMEROS COM SEQUÊNCIAS DE CHARNEIRA ALTERADAS
Para comparar a eficácia de diferentes moléculas de polipéptido heterodímero biespecificos com sequências de charneira alteradas na indução da ativação de células T dependentes do alvo e proliferação, foram comparados seis heterodímeros biespecificos diferentes (TSC100, TSC127, TSC165, TSC166, TSC167 e TSC168 com um domínio de ligação anti-CD19 comum (HD37), um domínio de ligação anti-CD3 comum (Cris7) e cinco construções de charneira diferentes (IgGl SCC-P charneira para TSC100 e TSC127, charneira de IgGA2 sem o primeiro resíduo Vai ligado à charneira do núcleo da IgGl humana para TSC165, IgGl SSS-P charneira ligada à charneira do núcleo da IgGl humana para TSC166, uma porção de charneira de IgG3 mutada ligada à charneira do núcleo da IgGl para TSC167, e o domínio CH2 de IgM sem o primeiro Vai ligada charneira do núcleo da IgGl para TSC168).
Mais especificamente, o heterodímero biespecífico TSC100 é como descrito no Exemplo 6. O heterodímero biespecífico TSC127 compreende polipéptidos de cadeia única TSC125 (Cris7 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CHI) e TSC096 (HD37 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Ck(YAE). O polipéptido de cadeia única TSC125 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: Cris7 (anti-CD3) scFv humanizado, charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (ADCC/ CDC nulo), CH3 de IgGl humana, e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e de aminoácidos de TSC125 são apresentadas nas SEQ ID NOS :865 e 874, respetivamente. 0 polipéptido de cadeia única TSC096 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: HD37 (anti-CD19) scFv, charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (ADCC/CDC nulo), CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE). As sequências de nucleótidos e de aminoácidos de TSC096 são apresentadas nas SEQ ID NOS :807 e 825, respetivamente. O heterodimero biespecifico TSC 165 compreende polipéptidos de cadeia única TSC157 (Cris7 IgA2UH CH2 (ADCC/CDC nulo) CH3 CHI) e TSC161 (HD37 IgA2UH CH2 (ADCC/CDC nulo) CH3 Ck(YAE)). O polipéptido de cadeia única TSC157 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: Cris7(anti-CD3) scFv humanizado, charneira de IgGA2 humana sem o primeiro Vai ligada a uma charneira de núcleo de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (ADCC/CDC nulo), CH3 de IgGl humana, e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e de aminoácidos de TSC157 são apresentadas nas SEQ ID NOS:866 e 875, respetivamente. O polipéptido de cadeia única TSC161 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: HD37 (anti-CD19) scFv, charneira de IgGA2 humana sem o primeiro Vai ligada com uma charneira de núcleo de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (ADCC/CDC nulo), CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE). As sequências de nucleótidos e de aminoácidos de TSC161 são apresentadas nas SEQ ID NOS:870 e 879, respetivamente. A sequência de aminoácidos da charneira utilizada em TSC157 e TSC161 é apresentada na SEQ ID NO:748. O heterodimero biespecifico TSC166 compreende o polipéptido de cadeia única TSC158 (Cris7 IgGlminiUH CH2 (ADCC/ CDC nulo) CH3 CHI) e TSC162 (HD37 IgGlminiUH CH2 (ADCC/CDC nulo) CH3 Ck(YAE)). O polipéptido de cadeia única TSC158 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: Cris7 (anti-CD3) scFv humanizado, humano IgGl SSC-P charneira ligados com a charneira do núcleo de IgGl humano, CH2 de IgGl humana (ADCC/CDC nulo), CH3 de IgGl humana, e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e de aminoácidos de TSC158 são apresentadas nas SEQ ID NOS:867 e 876, respetivamente. 0 polipéptido de cadeia única TSC162 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: HD37 (anti-CD19) scFv, charneira SSC-P de IgGl humana ligados com a charneira do núcleo de IgGl humano, CH2 de IgGl humana (ADCC/CDC nulo), CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE) . As sequências de nucleótidos e de aminoácidos de TSC162 são apresentadas nas SEQ ID NOS :871 e 880. A sequência de aminoácidos da charneira utilizada em TSC158 e TSC162 é apresentada na SEQ ID NO:750. O heterodimero biespecifico TSC167 compreende o polipéptido de cadeia única TSC159 (Cris7 IgG3UH CH2 (ADCC/CDC nulo) CH3 CHI) e TSC163 (HD37 IgG3UH CH2 (ADCC/CDC nulo) CH3 Ck(YAE)). O polipéptido de cadeia única TSC159 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: Cris7 (anti-CD3) scFv humanizado, a porção de mutado humano charneira de IgG3 ligada com a charneira do núcleo de IgGl humano, CH2 de IgGl humana (ADCC/CDC nulo), CH3 de IgGl humana, e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e de aminoácidos de TSC159 são apresentadas nas SEQ ID NOS:868 e 877, respetivamente. O polipéptido de cadeia única TSC163 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: HD37 (anti-CD19) scFv, a porção de charneira de IgG3 humano mutada ligada com a charneira do núcleo de IgGl humano, CH2 de IgGl humana (ADCC/CDC nulo), CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE) . As sequências de nucleótidos e de aminoácidos de TSC163 são apresentadas nas SEQ ID NOS :872 e 881. A sequência de aminoácidos da charneira utilizada em TSC159 e TSC163 é apresentada na SEQ ID NO:751. 0 heterodímero biespecífico TSC168 compreende o polipéptido de cadeia única TSC160 (Cris7 IgMCH2UH CH2 (ADCC/ CDC nulo) CH3 CHI) e TSC164 (HD37 IgMCH2UH CH2 (ADCC/CDC nulo) CH3 Ck(YAE)). 0 polipéptido de cadeia única TSC160 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: Cris7 (anti-CD3) scFv humanizado, humano IgM CH2 sem o primeiro Vai ligado com a charneira do núcleo de IgGl humano, CH2 de IgGl humana (ADCC/CDC nulo), CH3 de IgGl humana, e CHI de IgGl humana. As sequências de nucleótidos e de aminoácidos de TSC160 são apresentadas nas SEQ ID NOS:869 e 878, respetivamente. 0 polipéptido de cadeia única TSC163 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: HD37 (anti-CD19) scFv, humano IgM CH2 sem o primeiro Vai ligados com uma charneira de núcleo de IgGl humana, CH2 de IgGl humana (ADCC/CDC nulo), CH3 de IgGl humana, e Ck humana (YAE) . As sequências de nucleótidos e de aminoácidos de TSC164 são apresentadas nas SEQ ID NOS :873 e 882. A sequência de aminoácidos da charneira utilizada em TSC160 e TSC164 é apresentada na SEQ ID NO:759.
Como um controlo positivo, uma molécula de envolvimento de Células T biespecificas (BiTE) conhecida como bscl9x3 foi também preparada (ver Patente U.S. 7 635 472). As sequências de nucleótidos e de aminoácidos para bscl9x3 são apresentadas nas SEQ ID NOS:809 e 827, respetivamente. A transfeção transiente em células 293 humanas produziu 3,2 yg proteína/mL da cultura para TSC100, 6,1 yg proteína/mL da cultura para TSC127, 4,8 yg proteína/mL de cultura para TSC165, 6,2 yg proteína/mL de cultura para TSC166, 6,4 yg proteína/mL de cultura para TSC167, e 6,4 yg/mL proteína para TSC168.
As células de Daudi de linfoma de Burkitt (CD19+) e células de carcinoma da próstata C4-2 (CD19-) foram obtidas a partir de ATCC (Manassas, VA) e de MD Anderson Cancer Center (Houston, TX) e cultivadas de acordo com o protocolo fornecido. As células T foram isoladas utilizando um Pan Cell T Isolation Kit II de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemanha) utilizando o protocolo do fabricante (ver também Exemplo 5 para mais informação). A proliferação foi avaliada marcando populações de células T isoladas com éster de succinimidil de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE). As células T marcadas com CFSE foram plaqueadas em placas de 96 poços de fundo em U a 100 000 células/poço, com 10 000 células de tumores/poço, para alcançar uma proporção de células T para células de tumor de 10:1. As concentrações de moléculas de teste que varia entre os 5 nM e os 0, 005 pM foram adicionadas às misturas de células num total de 200 μΐ/poço em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro humano ou bovino, piruvato de sódio e aminoácidos não-essenciais. As placas foram incubadas a 37 °C, 5% CO2 em incubadores humidificados. Após 3 dias, as células foram marcadas com anticorpos para análise de citometria de fluxo. As células foram marcadas e lavadas nas suas placas originais para minimizar as perdas de célula durante transferências, e toda a marcação foi realizada em tampão salino com 0,2% de albumina de soro bovino. Primeiro, as células foram pré-incubadas com 100 pg/ml de IgG humana à temperatura ambiente durante 15 min. Subsequentemente, as células foram incubadas com uma mistura (volume total 50 μΐ) dos seguintes anticorpos marcados com corante: CD5-PE, CD4-APC, CD8-Pacific Blue, CD25-PE-Cy7, assim como 7-Amino Actinomicina D (de aqui em diante designado 7AAD) durante 40 minutos. As placas foram lavadas duas vezes, ressuspensas em volumes de 80 até 120 μΐ e corridas imediatamente num citómetro de fluxo BD LSRII para adquirir 80% dos conteúdos de cada poço. Os ficheiros das amostras foram analisados utilizando o software FlowJo para calcular as percentagens e os números de células que sofreram pelo menos uma divisão celular, de acordo com o seu perfil de CFSE, por análise sequencial de células T vivas CD4+ ou CD8+ activadas (7AAD-, CD5+ CD25+ CD4+ ou 7AAD- CD5+ CD25+ CD8+, respetivamente). Os valores médios e os desvios padrão foram calculados utilizando o software Microsoft Excel. Os gráficos foram representados utilizando Microsoft Excel ou Graphpad Prism. A análise de populações vivas CD4+ e CD8+ de células Daudi ou células C4-2 tratados com células T isoladas revelaram um aumento significativo no número total de células e na percentagem de células em proliferação na presença de células Daudi que apresentam o antigénio alvo CD 19, mas não possuem uma proliferação significativa na presença de células C4-2 que não possuem o antigénio CD19 (Figura 12). A proliferação de células CD8+ foi muito semelhante para moléculas biespecíficas com a charneira de IgGl (TSC100) por omissão, assim como aquela com charneiras mais longas (TSC166, TSC167, TSC168) . Foi observada uma proliferação de CD8+ ligeiramente superior a concentrações baixas, com a biespecifica com a charneira de IgA2 superior mais curta (TSC165). De um modo semelhante, foram observadas diferenças mas mais marcadas com proliferação de células CD4+, em que a molécula contendo a charneira de IgGA2 mais curta (TSC165) apresentou proliferação mais elevada na maior parte das concentrações do que a charneira de IgGl convencional (TSC100), e moléculas com charneiras mais longas (TSC166, TSC167, TSC168) apresentaram proliferação mais baixa.
Para confirmar a atividade diferencial da charneira de IgGA2, foi realizada uma segunda experiência de proliferação com uma titulação para concentrações de proteína mais baixas (Figura 13) , comparando a caraterística biespecífica da charneira de IgGA2 (TSC165) para dois lotes de produção diferentes de um biespecífico caraterizando a charneira de IgGl (TSC127) por omissão e a molécula bscl9x3 BiTE. De um modo semelhante à experiência anterior, foi observada menor variação com proliferação de células CD8+, com TSC165 apresentando uma indução comparável ou superior de proliferação para bscl9x3, que por sua vez apresentou uma proliferação ligeiramente superior ou comparável a TSC127. Novamente, de um modo semelhante à experiência anterior, estas tendências repetidas de um modo ampliado com a proliferação de células CD4+, com TSC165 e bscl9x3 apresentando uma proliferação comparável, que por sua vez foi marcadamente superior à de TSC127. EXEMPLO 10
MODULAÇÃO DE CITOTOXICIDADE DE CÉLULAS T REDIRECIONADA POR POLIPÉPTIDOS HETERODÍMEROS COM SEQUÊNCIAS DE CHARNEIRA ALTERADAS
Para comparar a eficácia da alteração da composição da charneira em moléculas de polipéptido heterodímero biespecíficas na indução da citotoxicidade de células T dependentes do alvo, foram comparadas moléculas biespecíficas diferentes num ensaio de libertação de crómio (51Cr). Foram comparadas cinco moléculas biespecíficas diferentes (TSC100, TSC165, TSC166, TSC167 e TSC168, como descrito no Exemplo 9) com um domínio de ligação anti-CD 19 comum (HD37), um domínio de ligação anti-CD3 comum (Cris7) e cinco diferentes construções de charneira (IgGl SCC-P charneira para TSC100 e TSC127, charneira de IgGA2 sem o primeiro Vai ligado à charneira do núcleo da IgGl humana para TSC165, IgGl SSS-P charneira ligada à charneira do núcleo da IgGl humana para TSC166, uma porção de charneira de IgG3 mutada ligada à charneira do núcleo da IgGl humana para TSC167, e o domínio CH2 de IgM sem a primeira Vai ligada à charneira do núcleo da IgGl humana para TSC168) .
Foram obtidas células Daudi de linfoma de Burkitt (CD19+, RON-) de ATCC (Manassas, VA) e cultivadas de acordo com o protocolo proporcionado. As células T foram isoladas utilizando um Pan T Cell Isolation Kit II de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemanha) utilizando o protocolo do fabricante (ver também Exemplo 5 para mais informação). A citotoxicidade foi avaliada por um ensaio de libertação de 51Cr. Foram tratadas aproximadamente 5xl06 células Daudi com 0,3 mCi de 51Cr e incubadas durante 75 minutos a 37 °C. Após 75 minutos, as células foram lavadas 3 vezes com meio (RPMI + 10% FBS) e ressuspensas em 11,5 mL de meio. Desta suspensão, foram dispensados 50 pL por poço para placas de 96 poços de fundo em U (aproximadamente 20 000 células/poços) . Foram adicionadas às células alvo (Daudi) concentrações de moléculas biespecíficas gue variam entre os 10 nM até 0,1 pM, perfazendo o volume total para 100 pL/poço. As células alvo foram incubadas à temperatura ambiente durante 15 minutos. Depois foram adicionados 100 pL de células T isoladas (aproximadamente 200 000) para levar a proporção de células T para as células alvo até 10:1. Foram adicionados 50 pL de 0,8% NP-40 a um poço de controlo contendo células alvo, deixadas durante 15 minutos, depois foram adicionados 100 pL de meio para proporcionar um controlo total de lise.
As placas foram incubadas durante 4 horas, centrifugadas a 1500 rpm durante 3 minutos, e foi transferido 25 pL de sobrenadante de cada poço para o poço correspondente de uma placa de amostras Luma de 96 poços. As placas de amostras foram deixadas secar ao ar numa câmara de segurança química durante 18 horas, e então a radioatividade foi medida num contador de cintilações Topcount utilizando um protocolo convencional. A análise de resultados de citotoxicidade apresentou uma forte citotoxicidade em células T dirigida para as células Daudi na presença de células T e as moléculas biespecíficas dirigidas para anti-CD 19 (TSC100 - TSC168), alcançando uma lise máxima numa concentração entre 5 e 50 pM (Figura 14). Semelhante às tendências observadas no Exemplo 9, a molécula biespecífica com uma região de charneira superior IgA2 mais curta (TSC165) apresentou uma citotoxicidade comparável ou superior para a molécula com a região de charneira superior IgGl convencional (TSC100), enquanto as moléculas com regiões de charneira superior mais compridas (TSC166, TSC167, TSC168) foram menos potentes na indução da citotoxicidade. EXEMPLO 11
HETERODÍMEROS BIESPECÍFICOS COM VARIAÇÕES DOS LIGANTES CH3-CH1 E CH3-CK
Foram realizadas os seguintes heterodímeros biespecíficos com variações de ligante de CH3-CH1 e CH3-Ck: O heterodímero biespecífico TSC151 compreende polipéptidos de cadeia única TSC145 e TSC148. O polipéptido de cadeia única TSC145 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: Cris7 (anti-CD3) scFv humanizado, charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 humano, e CHI de IgGl humana. 0 CH3 humano e CHI de IgGl humana são ligados por um ligante possuindo a sequência GGGSS (SEQ ID NO:847). As sequências de nucleótidos e de aminoácido de TSC145 são apresentadas nas SEQ ID NOS:853 e 859, respetivamente. 0 polipéptido de cadeia única TSC148 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: HD37 (anti-CD19) scFv, charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 humano, e Ck humana (YAE). 0 CH3 humano e Ck humana (YAE) são ligados com um ligante possuindo a sequência GGGSR (SEQ ID NO:850) nas quais R pode alternativamente ser encarado como a primeira arginina de Ck humana (YAE). As sequências de nucleótidos e de aminoácidos de TSC148 são apresentadas nas SEQ ID NOS:856 e 862, respetivamente. O heterodímero biespecífico TSC152 compreende polipéptidos de cadeia única TSC146 e TSC149. O polipéptido de cadeia única TSC146 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: Cris7 (anti-CD3) scFv humanizado, charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 humano, e CHI de IgGl humana. O CH3 humano e CHI de IgGl humana são ligados por um ligante possuindo a sequência SYSPNS (SEQ ID NO:848). As sequências de nucleótidos e de aminoácidos de TSC146 são apresentadas nas SEQ ID NOS :854 e 860, respetivamente. O polipéptido de cadeia única TSC149 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: HD37 (anti-CD19) scFv, charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 humano, e Ck humana (YAE) . O CH3 humano e Ck humana (YAE) são ligados com um ligante possuindo a sequência SYSPNSR (SEQ ID NO:851) nas quais R pode alternativamente ser encarado como a primeira arginina de Ck humana (YAE). As sequências de nucleótidos e de aminoácidos de TSC149 são apresentadas nas SEQ ID NOS :857 e 863, respetivamente. O heterodímero biespecífico TSC153 compreende polipéptidos de cadeia única TSC147 e TSC150. O polipéptido de cadeia única TSC147 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: Cris7 (anti-CD3) scFv humanizado, charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 humano, e CHI de IgGl humana. 0 CH3 humano e CHI de IgGl humana são ligados por um ligante possuindo a sequência SSLNTPNS (SEQ ID NO:849) . As sequências de nucleótidos e de aminoácidos de TSC147 são apresentadas nas SEQ ID NOS :855 e 861, respetivamente. 0 polipéptido de cadeia única TSC150 compreende desde o seu terminal amino ao carboxilo: HD37 (anti-CD19) scFv, charneira SCC-P de IgGl humana, CH2 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 humano, e Ck humana (YAE) . 0 CH3 humano e Ck humana (YAE) são ligados com um ligante possuindo a sequência SSLNTPNSR (SEQ ID NO:852) na qual R pode alternativamente ser encarado como a primeira arginina de Ck humana (YAE). As sequências de nucleótidos e de aminoácidos de TSC150 são apresentadas nas SEQ ID NOS :858 e 864, respetivamente.
Os heterodimeros biespecificos acima foram expressos de acordo com o Exemplo 1. Foram obtidos os seguintes níveis de expressão: 9,2 pg de proteína/ml de cultura para TSC151, 11,2 pg proteína/ml de cultura para TSC152, e 14,7 pg proteína/ml de cultura para TSC153. Em comparação, foi obtido cerca de 6 pg proteína/ml de cultura para heterodimeros com um ligante CH3-CH1 e CH3-Ck possuindo a sequência de aminoácidos KSR (SEQ ID NO:846).
As várias formas de realização acima descritas podem ser combinadas para proporcionar outras formas de realização. Podem ser modificados aspetos das formas de realização, se necessário, para empregar conceitos das várias patentes, aplicações e publicações para proporcionar ainda outras formas de realização.
Estas e outras alterações podem ser realizadas para as formas de realização à luz da descrição acima detalhada. Em geral, nas seguintes reivindicações, os termos utilizados não devem ser encarados como limitantes das reivindicações para as formas de realização específicas reveladas na descrição e para as reivindicações, mas deve ser encarada como incluindo todas as formas de realização possíveis juntamente com o âmbito total dos equivalentes aos quais as reivindicações se dirigem. Do mesmo modo, as reivindicações não estão limitadas pela descrição.

Claims (20)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Polipéptido heterodímero, que compreende: (a) um primeiro polipéptido de cadeia simples (SCP-I) que compreende desde um até quatro domínios de ligação que se ligam especificamente a desde um até quatro alvos, uma dobra (H-I), um domínio de heterodimerização de imunoglobulina (HD-I), e um domínio de imunoglobulina CH2 e CH3 de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, ou qualquer combinação destes (CH2CH3-I); e (b) um segundo polipéptido de cadeia simples (SCP-II) que compreende desde zero até quatro domínios de ligação que se ligam especificamente a desde zero até quatro alvos, uma dobra (H-II), um domínio de heterodimerização de imunoglobulina (HD-II), e um domínio de imunoglobulina CH2 e CH3 de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, ou qualquer combinação destes (CH2CH3-II); em que (i) o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do primeiro polipéptido de cadeia simples (HD-I) e o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do segundo polipéptido de cadeia simples (HD-II) preferencialmente associados um com o outro para formar um polipéptido heterodímero compreendido do primeiro polipéptido de cadeia simples (SCP-I) e do segundo polipéptido de cadeia simples (SCP-II), e (1) o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do primeiro polipéptido de cadeia simples (HD-I) compreende uma primeira região de imunoglobulina CHI, e o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do segundo polipéptido de cadeia simples (HD-II) compreende uma primeira região de imunoglobulina CL, ou (2) o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do primeiro polipéptido de cadeia simples (HD-I) compreende uma primeira região de imunoglobulina CL, e o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do segundo polipéptido de cadeia simples (HD-II) compreende uma primeira região de imunoglobulina CHI; (ii) em que a primeira região de imunoglobulina CL é uma região de imunoglobulina humana alterada Ck com um ou mais aminoácidos de uma região Ck humana de tipo selvagem substituída em N29, N30, Q52, V55, T56, S68, ou T70, desde que o polipéptido heterodímero compreenda pelo menos dois domínios de ligação que se ligam especificamente a pelo menos dois alvos diferentes.
  2. 2. Polipéptido heterodímero da reivindicação 1, em que os domínios de ligação são polipéptidos Fv (scFv) de cadeia simples.
  3. 3. Polipéptido heterodímero da reivindicação 1, em que o polipéptido heterodímero compreende dois domínios de ligação (BD1 e BD2), em que preferencialmente o primeiro domínio de ligação (BD1) esta no primeiro polipéptido de cadeia simples (SCP-I) e o segundo domínio de ligação (BD2) está no segundo polipéptido de cadeia simples (SCP-II).
  4. 4. Polipéptido heterodímero da reivindicação 3, em que o primeiro domínio de ligação (BD1) é amino terminal em relação a CH2CH3-I do primeiro polipéptido de cadeia simples, e o segundo domínio de ligação (BD2) é amino terminal em relação ao CH2CH3-II do segundo polipéptido de cadeia simples.
  5. 5. Polipéptido heterodímero da reivindicação 1 ou 2, em que o polipéptido heterodímero compreende três domínios de ligação (BD1, BD2 e BD3).
  6. 6. Polipéptido heterodímero da reivindicação 1, em que o polipéptido heterodímero compreende quatro domínios de ligação (BD1, BD2, BD3, e BD4), em que preferencialmente o HD-I e CH2CH3-I estão dispostos entre BD1 e BD2, e o HD-II e CH2CH3-II estão dispostos entre BD3 e BD4.
  7. 7. Polipéptido heterodímero da reivindicação 1 ou 2, em que o polipéptido heterodímero compreende cinco até oito domínios de ligação. 8. 0 polipéptido heterodímero de qualquer uma das reivindicações 1 até 7, em que pelo menos um dos domínios de ligação se ligam especificamente a, ou é um antagonista de, um complexo TCR, TCRa, TCRp, CD3y, CD35, CD3s, CD28, CD79b, hyperIL-6, monoIL-10, CD86, CD20, PSMA, CD19, HLA-DR, Ron, c-Met, CEACAM-6, LIGHT, GITRL, CD4 0, PDL1, PDL2, HVEM, LTBR, EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, IGF1R, EphA2, PDGFR, VEGFR1-4, Angiopoietina 2, CD64, CD32A, CD16, CD71, TNFR1, TNFR2, TWEAKR, TACI, BAFF-R, BCMA, FAS, CD32B, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD70, TNFa, IL-6, hyperIL-6, IL-2, IL-1, IL-7, IL-8, IL-17A/C, IP-10, IFNy, IFNa, RANKL, FASL, TGFp, IL10, IL17A/F, CSF2, IGF1, IGF2, BLyS/APRIL, HGF, MSP, EGF (incluindo epirregulina, herregulina, β-regulina, neuregulina), HIF-Ια, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, TNFa, Wnt, sHH, TGFp, PDGF, TWEAK, EpCAM, CEA, PCTA-1, STEAP-1, PSCA, ALCAM (CD166), EphA2, CD151, CA-125, MUC-1, MAGE-1, TROP2, CCR5, HER-3, HER-4, EGFR, CEA, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5ac, MUC5b, MUC7, phCG, Lewis-Y, gangliósido GD3, 9-O-AcetÍ1-GD3, GM2, Globo H, fucosil GM1, Poli SA, GD2, Carboanidrase IX (MN/CA IX), CD44v6, Sonic Hedgehog (Shh), Wue-1, Antigénio de Célula do Plasma, (ligado à membrana) IgE, Melanoma de Proteoglicano de Sulfato de Condroitina (MCSP), CCR8, precursor de TNF-alfa, STEAP, mesotelina, Antigénio A33, Antigénio de Célula Estaminal da Próstata (PSCA), Ly-6; desmogleina 4, E-caderina neoepitopo, Recetor CD25 da Acetilcolina Fetal, CD25, marcador CA19-9, marcador CA-125 e Substância Inibidora da Muelleriana (MIS) Recetor tipo II, sTn (antigénio Tn sialilado; TAG-72), FAP (antigénio de ativação de fibroblasto), endosialina, EGFRvIII, LG, SAS, CD63, IGF1R, CD151, TGFBR2, GHRHR, GHR, IL-6R, gpl30, TNFR2, OSMRp, Patched-1, Frizzled, Robol, CD80, CD81, CD86, 0X40, CD40, CD137, LIFRp, TLR7 ou TLR9.
  8. 9. Polipéptido heterodímero de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que um ou mais aminoácidos de uma região Ck humana de tipo selvagem são substituídos por uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas a partir de Ala (A), Arg (R), Trp (W) , Tyr (Y) , Glu (E) , Gin (Q) , Lys (K) , Asp (D), Met (M), Ser (S), e Phe (F).
  9. 10. Polipéptido heterodímero de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a região Ck de imunoglobulina humana alterada compreende as seguintes substituições: (i) N30Y V55A T70E; ou (ii) N30M, V55A T70E.
  10. 11. Polipéptido heterodímero de qualquer uma reivindicações anteriores, em que a região CHI é uma região CHI de imunoglobulina humana alterada que compreende uma substituição de aminoácido através da qual Vai (V) na posição 68 é substituído por Lys (K) , Arg (R) ou His (H) , e em que a região Ck é uma região Ck de imunoglobulina humana alterada que compreende uma substituição de aminoácidos pela qual Leu (L) na posição 27 é substituído por Asp (D) ou Glu (E) ou em que a região CHI é uma região CHI de imunoglobulina humana alterada que compreende uma substituição de aminoácidos pela qual Vai (V) na posição 68 é substituído por Asp (D) ou Glu (E), e em que a região Ck é uma região Ck de imunoglobulina humana alterada que compreende uma substituição de aminoácido pela qual Leu (L) na posição 27 é alterado para Lys (K), Arg (R) ou His (H).
  11. 12. Polipéptido heterodímero de qualquer uma das reivindicações 1 até 11, em que a primeira região CHI é uma região CHI de imunoglobulina humana alterada com a cisteína de uma região CHI de imunoglobulina humana de tipo selvagem que está envolvida na formação de uma ligação persulfureto com uma região CL de imunoglobulina humana de tipo selvagem eliminada ou substituída.
  12. 13. Polipéptido heterodímero de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a região Ck é uma região Ck de imunoglobulina humana alterada com o resíduo de cisteina de uma região Ck humana de tipo selvagem que está envolvida na formação de uma ligação persulfureto com uma região CHI de imunoglobulina humana de tipo selvagem eliminada ou substituída.
  13. 14. Polipéptido heterodímero de qualquer uma das reivindicações 1 até 13 em que a dobra do primeiro e do segundo polipéptidos de cadeia simples é uma região da dobra da imunoglobulina.
  14. 15. Polipéptido heterodímero de qualquer uma das reivindicações 1 até 14 em que a região da dobra (a) está no terminal amino para CH2CH3-I ou CH2CH3-II, (b) está disposto entre o domínio de ligação e o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do primeiro polipéptido de cadeia simples (HD-I) e/ou o domínio de heterodimerização de imunoglobulina do segundo polipéptido de cadeia simples (HD-II), (c) está disposto entre a domínio de heterodimerização de imunoglobulina e CH2CH3-I ou CH2CH3-II, (d) está no terminal amino do primeiro ou do segundo polipéptido de cadeia simples, (e) é uma região da dobra de lectina de tipo C, (f) é um péptido NKg2A ou NKg2D, ou um seu derivado, (g) está disposto entre CH2CH3-I e um domínio de ligação, ou (h) está no terminal carboxilo do primeiro ou segundo polipéptido de cadeia simples.
  15. 16. Heterodímero de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o primeiro polipéptido de cadeia simples compreende um domínio de ligação que se liga especificamente ao complexo TCR ou a um seu componente, e o segundo polipéptido de cadeia simples compreende um domínio de ligação que se liga especif icamente a um antigénio específico para o tumor.
  16. 17. Composição que compreende um polipéptido heterodímero de qualquer uma das reivindicações 1 até 16 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
  17. 18. Polipéptido heterodímero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 17 para utilização em: a) um método para controlar a ativação de células T, em que o polipéptido heterodímero compreende um domínio de ligação que se liga especificamente a TCRa, TCRp, CD3y, CD35, CD3s ou uma combinação destes, e um segundo domínio de ligação que se liga especificamente a um alvo diferente; ou b) inibição de crescimento, metástase ou crescimento metastático de uma doença, em que o polipéptido heterodímero compreende um domínio de ligação que se liga especificamente TCRa, TCRp, CD3y, CD3õ, CD3s, c-Met ou Ron. c) tratamento de um estado autoimune ou inflamatório, em que o polipéptido heterodímero compreende um domínio de ligação que se liga especificamente a TCRa, TCRp, CD3y, CD3õ, CD3s, ou CD28 . d) tratamento de um distúrbio ou doença associados a células B, em que o polipéptido heterodímero compreende um domínio de ligação que se liga especificamente a TCRa, TCR3, CD3y, CD35, CD3s, e um segundo domínio de ligação que se liga especificamente a CD19, CD20, CD79b ou HLA-DR.
  18. 19. Vetor de expressão capaz de expressar o polipéptido heterodímero de qualquer uma das reivindicações 1 até 16, que compreende um primeiro polinucleótido que codifica o primeiro polipéptido de cadeia simples e um segundo polinucleótido que codifica o segundo polipéptido de cadeia simples.
  19. 20. Célula hospedeira que compreende (i) o vetor de expressão da reivindicação 19 ou (ii) o primeiro e o segundo vetores de expressão capazes de expressar o primeiro e o segundo polipéptidos de cadeia simples, respetivamente, do polipéptido heterodímero de qualquer uma das reivindicações 1 até 16.
  20. 21. Método para produzir um polipéptido heterodímero, que compreende (a) cultivar uma célula hospedeira da reivindicação 20 em condições adequadas para expressar o primeiro e o segundo polipéptidos de cadeia simples, e (b) isolar ou purificar opcionalmente os heterodímeros formados a partir do primeiro e do segundo polipéptidos de cadeia simples a partir da cultura.
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