BR112020007736A2 - composição e método de tratamento - Google Patents

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Abstract

Aqui é relatado um método para a geração de anticorpos multiespecíficos diretamente na superfície celular no local da ação, por uma reação de troca de meio-anticorpo entre duas 2/3-IgGs ou dois 2/3-BiFabs desestabilizados ao meio por mutações perturbadoras assimétricas, que promovem a geração de anticorpos bi ou multiespecíficos de comprimento total montados corretamente. O método é realizado nas ligações dissulfeto da região de dobradiça ausentes nos 2/3-IgGs ou 2/3-BiFabs de partida.

Description

“COMPOSIÇÃO E MÉTODO DE TRATAMENTO” CAMPO DA INVENÇÃO
[001] Aqui é relatado um método para a montagem celular in vivo de anticorpos multiespecíficos, tal como por exemplo biespecífico, utilizando um novo método de troca de meio-anticorpo. O método atual é adequado mesmo para anticorpos completos, ou seja, que compreende domínios CH2- CH3 e tendo, assim, função efetora.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Os métodos atuais do estado da técnica para conversão bioquímica de derivados de anticorpos monoespecíficos em anticorpos biespecíficos montados aplicam (i) reações de complementação de meio- anticorpo e (ii) reações de troca de IgG-lgG.
[003] Estas tecnologias são divulgadas, por exemplo, nos documentos WO 2015/046467, Rispens et al., J. Biol. Chem. 289 (2014) 6098- 6109, US 9,409,989, WO 2013/060867, WO 2011/131746, WO 2011/133886, WO 2011/143545, WO 2010/151792, Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 285 (2010) 19637-19646, WO 2009/041613, WO 2009/089004, WO 2008/119353, WO 2007/114325, US 8,765,412, US 8,642,745, WO 2006/047340, WO 2006/106905, WO 2005/042582, WO 2005/062916, WO 2005/000898, US 7,183,076, US 7,951,917, Segal, D.M,, et al., Curr. Opin. Immunol. 11 (1999) 558-562, WO 98/50431, WO 98/04592, Merchant, A.M,, et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681, WO 96/27011, Carter, P., et al., Inmunotechnol. 2 (1996) 73, WO 93/11162, and Kostelny, S.A., et al., J. Imnmunol. 148 (1992) 1547-
1553.
[004] Os métodos de última geração para converter anticorpos monoespecíficos ou derivados de anticorpos em bsAbs têm desvantagens, tais como, por exemplo, limitações relativas a processos e composição de preparações de bsAb pós-montagem.
[005] Por exemplo, a tecnologia de meio-anticorpo reúne lados monoespecíficos e monovalentes de anticorpos em IgGs bivalentes. A expressão das moléculas de entrada, bem como a reação de troca por si só, gera não apenas meio-anticorpos, mas também derivados de anticorpos bivalentes (monoespecíficos) como IgG. Agregados também estão presentes no material de entrada, bem como na saída das reações de montagem. Ambos (anticorpos monoespecíficos bivalentes e agregados) precisam ser removidos quantitativamente do bsAb montado por meio de abordagens de purificação elaboradas ou (como é difícil conseguir a remoção quantitativa de maneira de alto rendimento) eles contaminam' até certo ponto as preparações de bsAb.
[006] A tecnologia de troca de braço Fab, por exemplo, monta IgGs bivalentes biespecíficos a partir de derivados de IgG bivalentes monoespecíficos. Assim, a entrada na reação de troca é bivalente, ou seja, a avidez ativada por padrão. Para garantir a completa falta de material de entrada monoespecífico bivalente remanescente nas reações de troca que devem ser submetidas a avidez ou triagem de anticorpos agonísticos, seria necessário garantir a remoção completa de qualquer entrada bivalente restante, bem como de agregados que possam se formar durante a reação de troca. Devido à alta similaridade da entrada e do bsAb, são necessários procedimentos elaborados para remoção quantitativa (muito difícil de alcançar em alta taxa de transferência), ou a entrada e agregados bivalentes restantes contaminam até certo ponto as preparações finais do bsAb.
[007] Labriin, A.F., et al., Revelaram geração eficiente de 19G1 biespecífica estável por troca de braço Fab controlada (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 110 (2013) 5145-5150).
[008] O documento WO 2014/081955 divulgou anticorpos heterodiméricos e métodos de uso.
[009] O documento WO 2009/089004 divulgou um método para produzir moléculas Fc-heterodiméricas de anticorpos usando efeitos de direção eletrostática. Nele, foi divulgado que apenas quatro pares de resíduos de carga envolvidos na interação domínio-domínio (Asp356---Lys439', Glu357--Lys370', Lys392---Asp399', Asp399---Lys409') somente Lys409---Asp399' é adequado para engenharia, pois ambos os resíduos foram estruturalmente conservados, assim como enterrados. Para os outros três pares, pelo menos um dos parceiros é exposto a solvente (% ASA > 10).
[010] O documento WO 2018/155611 divulgou uma combinação de uma primeira molécula de ligação ao antígeno e uma segunda molécula de ligação ao antígeno que não se ligam por ligação covalente, que quando misturadas em um líquido forma heterodímeros mais facilmente do que os homodímeros. É divulgado aqui em uma forma de realização que a substituição por outros aminoácidos no resíduo de cisteína em uma ou ambas as posições 226 e 229 no sistema de numeração da UE é combinada com uma substituição de um ou de ambos os primeiros CH3 e segundo CH3 por outros resíduos de aminoácidos em pelo menos uma das posições 357 ou 397 no sistema de numeração da UE.
[011] Mayer, K,, et al. (Int. J. Mol. Sci. 16 (2015) 27497-27506) divulgaram TriFabs como derivados de anticorpos biespecíficos trivalentes em forma de IgG, seu desenho, geração, caracterização e aplicação para entrega de carga útil direcionada.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[012] Aqui é relatado um método para a geração de anticorpos multiespecíficos por uma reação de troca de meio-anticorpo diretamente na superfície das células alvo. Isso permite, entre outras coisas, a formação de locais de ligação funcionais a partir de locais inativos de ligação direta diretamente no local de ação pretendido. Essa formação no local elimina o risco de reações colaterais sistêmicas.
[013] Verificou-se que como material de partida anticorpos não completos, tais como 2/3-lgGs ou 2/3-BiFabs que compreende uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo e um fragmento da cadeia pesada de anticorpo, em que a interação cadeia pesada - cadeia pesada é desestabilizada por uma mutação perturbadora assimétrica, preferencialmente no fragmento da cadeia pesada, e em que não há ligações covalentes/ dissulfeto da cadeia inter-pesada cadeia pesada, como as ligações dissulfeto da região de dobradiça ou ligações dissulfeto do domínio inter-CH3, estão presentes, são vantajosos. Verificou-se que esta mutação perturbadora assimétrica promove, por um lado, a dissociação não completa dos anticorpos de partida e, por outro lado, a geração de anticorpos biespecíficos de comprimento total montados corretamente. A ausência de ligações covalentes entre cadeias pesadas e cadeias pesadas permite que a reação possa ser realizada na ausência de agentes redutores, ou seja, sob condições fisiológicas ou in vivo.
[014] O método, de acordo com a invenção, é realizado na ausência de agentes redutores. Assim, os anticorpos de partida não têm ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia pesada, como por exemplo, ligações dissulfureto da região de dobradiça. Assim, a reação de troca em cadeia e o método, de acordo com a presente invenção, permite a montagem de anticorpos biespecíficos sem redução inicial, tornando este método adequado para aplicação in vivo. Por conseguinte, as ligações dissulfureto intramoleculares de ocorrência natural entre as cadeias pesadas das moléculas de partida são removidas, por exemplo, por mutagênese PCR. Apesar da falta de todas as ligações dissulfureto intermoleculares entre as cadeias pesadas, ocorre a formação correta de anticorpos estáveis, ou seja, isoláveis. Assim, com estas moléculas de partida, foi possível realizar uma geração in vivo de anticorpos biespecíficos, empregando uma reação de troca espontânea livre de redução. De forma geral, o método de troca de cadeia livre de redução, de acordo com a presente invenção, permite uma geração eficiente de anticorpos biespecíficos funcionais diretamente na superfície das células in vivo.
[015] Aqui é relatado um método para a produção de um poliligante peptídico/ multimérico (multiespecífico) que compreende as seguintes etapas: - incubação um primeiro ligante (que é mono- ou biespecífico e heteromérico)/ polipeptídeo — multimérico que “compreende um primeiro polipeptídeo (monomérico) e um segundo polipeptíideo (monomérico) ambos que compreende (na direção terminal N a C) um domínio variável de anticorpo (diretamente) seguido por um domínio CH3 da imunoglobulina humana (I9G1), em que i) o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada e o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, ou ii) o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve e o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, em que i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação no puxador (knob) e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações no buraco (hole), ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações no buraco e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação no puxador, em que o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um local de ligação funcional ou pelo menos uma parte de um local de ligação, em que o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 pelo menos 1/ uma primeira mutação perturbadora (selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E3S57L, ES57F, ESS7K,
K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T3661, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394|l, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y4071, K409D, K409E, K409|, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A3S68L, V407Y, S354C, e W366T), em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem com uma imunoglobulina do tipo selvagem (I9G1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora,
em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo se associam de forma não covalente entre si/ formam um dímero não covalente/ estão associados covalentemente entre si/ são um dímero não covalente (em que a mutação perturbadora no segundo polipeptídeo resulta em uma interação desestabilizadora quando o segundo polipeptídeo e o primeiro polipeptídeo formam um heterodímero)
e um segundo ligante (que é mono- ou biespecífico e heteromérico)/ polipeptídeo — multimérico = que “compreende um terceiro polipeptídeo (monomérico) e um quarto polipeptídeo (monomérico) ambos que compreende (na direção terminal N a C) um domínio variável de anticorpo diretamente seguido por um domínio CH3 da imunoglobulina humana (I9G1),
em que i) o domínio variável do terceiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada e o domínio variável do quarto polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, ou ii) o domínio variável do terceiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve e o domínio variável do quarto polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, em que i) o domínio variável do quarto polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, se o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, ou ii) o domínio variável do quarto polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, se o domínio variável do primeiro polipeptídeo for um domínio variável da cadeia leve,
em que i) o domínio CH3 do terceiro polipeptídeo compreende a mutação no puxador e o domínio CH3 do quarto polipeptídeo compreende as mutações no buraco, ou ii) o domínio CH3 do terceiro polipeptídeo compreende as mutações no buraco e o domínio CH3 do quarto polipeptídeo compreende a mutação no puxador, em que i) no caso do primeiro polipeptídeo compreender as mutações no buraco, o quarto polipeptídeo compreende a mutação no puxador, ou ii) no caso do primeiro polipeptídeo compreender a mutação no puxador, o quarto polipeptídeo compreende a mutação no buraco,
em que o quarto polipeptídeo compreende pelo menos um local de ligação funcional ou pelo menos uma parte de um local de ligação,
em que o terceiro polipeptídeo compreende no domínio CH3 pelo menos 1/ uma segunda mutação perturbadora (selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em ES45R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E3S57L, ES57F, ESS7K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T3661], L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394|l, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y4071, K409D, K409E, K409|, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A3S68L, V407Y, S354C, e W366T), em que o quarto polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (I9G1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que a mutação no terceiro polipeptídeo está em uma posição diferente da mutação no segundo polipeptídeo,
em que o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo se associam covalentemente ou não covalentemente um ao outro/ formam um dímero covalente ou não covalente/ são de forma não covalente ou covalente associados um ao outro/ são um dímero não covalente ou covalente (em que a mutação perturbadora no terceiro polipeptídeo resulta em uma interação desestabilizadora quando o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo formam um heterodímero), em que a (primeira); mutação perturbadora no segundo polipeptídeo e a (segunda) mutação perturbadora no terceiro polipeptídeo resultam em uma interação atraente quando o segundo polipeptídeo e o terceiro polipeptídeo formam um heterodímero, em que o domínio variável do primeiro polipeptídeo e o domínio variável do quarto polipeptídeo formam um local de ligação funcional (competente para a ligação ao antígeno) (par de domínios variáveis de anticorpo (par VH/ VL)) e o domínio variável do segundo polipeptídeo e o domínio variável do terceiro polipeptídeo forma um par de domínios variáveis não funcional (não competente para a ligação ao antígeno), e - recuperar o ligante que compreende o primeiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo e, desse modo, produzindo o ligante (multiespecífico)/ polipeptídeo multimérico.
[016] Em uma forma de realização, o primeiro ao quarto polipeptídeo, cada um compreende na direção terminal N a C i) a sequência de aminoácidos DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66), ii) um domínio variável de anticorpo derivado de um domínio variável da IIG1 humana e ili) um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana.
[017] Em uma forma de realização i), o primeiro e o quarto polipeptídeo compreendem ainda um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 da IgG1 humana (um domínio CH1 da IgG1 humana (variante)) e (de forma independente um do outro) um outro domínio variável (cadeia pesada ou cadeia leve), ou ii) o primeiro ou o quarto polipeptídeo compreende um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 da IgG1 humana (um domínio CH1 da IgG1 humana (variante)) e o outro polipeptídeo respectivo compreende um domínio derivado de um domínio constante da cadeia leve (um domínio kappa humano ou lambda CL (variante)) e cada polipeptídeo compreende ainda um domínio variável adicional. Em uma forma de realização, o domínio variável adicional do primeiro polipeptídeo e o domínio variável adicional do quarto polipeptídeo são um (os) domínio (s) variável (is) da cadeia pesada (Diferente). Em uma forma de realização, o domínio variável adicional do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada e o domínio variável adicional do quarto polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve ou vice-versa.
[018] Em uma forma de realização, o primeiro e o quarto polipeptídeo podem ter a mesma ou uma sequência terminal N a C diferente e, no caso em que o primeiro e o quarto polipeptídeo são os mesmos, eles são selecionados a partir do seguinte grupo de polipeptídeos que compreende direção terminal N a C e, caso o primeiro e o quarto polipeptídeos sejam diferentes, eles são, de forma independente um do outro, selecionados a partir do seguinte grupo de polipeptídeos que compreende a direção terminal Na C i) um segundo domínio variável da cadeia pesada (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da I9gG1 humana, iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
iv) um scFv, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
v) um scFab, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
vi) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana,
ix) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo (domínio CH1 derivado do)
domínio CH1 da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
x) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
xi) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
xii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio (CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia leve,
xiii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia leve e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da I9G1 humana,
xiv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da I9gG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente,
um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um (domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana, e xv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve derivado de um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada.
[019] Em uma forma de realização, um entre o primeiro e o quarto polipeptídeo compreende na direção terminal N a C um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado de um) domínio CH1 da IgG1 humana, um terceiro domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio constante da cadeia leve, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana e o outro dentre o primeiro e o quarto polipeptídeo compreende na direção terminal Na C o segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana. Em uma forma de realização, o ligante que compreende o polipeptídeo que compreende dois domínios variáveis da cadeia pesada compreende ainda uma primeira cadeia leve que compreende um primeiro domínio variável da cadeia leve e um segundo domínio constante da cadeia leve (emparelhado com o primeiro domínio variável da cadeia pesada) e uma (domínio trocado) segunda cadeia leve que compreende um segundo domínio variável da cadeia leve e um (domínio CH1 derivado de um) domínio CH1 da IgG1 humana (emparelhado com o segundo domínio variável da cadeia pesada) e o outro ligante compreende ainda a primeira cadeia leve.
[020] Em uma forma de realização, um entre o primeiro e o quarto polipeptídeo compreende na direção terminal N a C um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado de um) domínio CH1 da IgG1 humana, um segundo domínio variável da cadeia leve, um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da 19G1 humana e o outro dentre o primeiro e o quarto polipeptídeo compreende na direção terminal N a C o segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana. Em uma forma de realização, o ligante que compreende o polipeptídeo que compreende dois domínios variáveis compreende ainda uma primeira cadeia leve que compreende um terceiro domínio variável da cadeia leve e um primeiro domínio constante da cadeia leve (emparelhado com o primeiro domínio variável da cadeia pesada) e uma segunda (domínio trocado) cadeia leve que compreende um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio constante da cadeia leve (emparelhado com o primeiro domínio variável da cadeia leve) e o outro ligante compreende ainda a primeira cadeia leve.
[021] Em uma forma de realização, o primeiro e o segundo ligante compreendem ainda uma cadeia leve de anticorpo.
[022] Em uma forma de realização, o: primeiro ligante compreende como primeiro polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um segundo domínio variável da cadeia pesada (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da I9gG1 humana,
iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
iv) um scFv, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
v) um scFab, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
vi) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da I1gG1 humana,
ix) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
x) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
xi) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
xii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio (CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia leve,
xiii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia leve e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana,
xiv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um (domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana, e xv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
que compreende a mutação no puxador ou as mutações no buraco,
e como segundo polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
em que i) o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, se o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, ou ii) o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, se o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada,
em que o domínio CH3 compreende a mutação no puxador, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação no puxador,
que compreende uma primeira mutação perturbadora, selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, ES57A, E357L, ES57F, ESS7K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394|, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y4071, K409D, K409E, K409], K439E, L441Y, Y349C, S366T, ASG8L, V407Y, S354C, e W366T, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (IgG1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora,
em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo se associam de forma não covalente entre si/ formam um dímero não covalente (em que a mutação perturbadora no segundo polipeptídeo resulta em uma interação desestabilizadora quando o segundo polipeptídeo e o primeiro polipeptídeo formam um heterodímero)
e um terceiro polipeptídeo que compreende um domínio variável adicional da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve,
em que o terceiro polipeptídeo está ligado de forma covalente ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto,
e o segundo ligante compreende como quarto polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, em que o domínio CH3 compreende a mutação no puxador, se o segundo polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o segundo polipeptídeo compreender a mutação no puxador,
que compreende uma segunda mutação perturbadora, selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, QO347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E3S57A, E357L, E3S57F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394|, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y4071, K409D, K409E, K409], K439E, L441Y, Y349C, S366T, ASG68L, V407Y, S354C, e W366T, em que o quinto polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (I9G1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que a mutação perturbadora no quarto polipeptídeo está em uma posição diferente da mutação perturbadora no segundo polipeptídeo,
e como quinto polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um segundo domínio variável da cadeia pesada (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da I9gG1 humana,
iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
iv) um scFv, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
v) um scFab, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
vi) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro
(domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da I1gG1 humana,
ix) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
x) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
xi) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
xii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio (CH1 derivado do)
domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia leve,
xiii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia leve e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana,
xiv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um (domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da I9gG1 humana, e xv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
em que o domínio CH3 compreende a mutação no puxador, se o quarto polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o quarto polipeptídeo compreender a mutação no puxador,
em que i) o domínio variável do quarto polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, se o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, ou ii) o domínio variável do quarto polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, se o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, em que o quarto polipeptídeo e o quinto polipeptídeo se associam de forma não covalente entre si/ formam um dímero não covalente (em que a mutação perturbadora no quarto polipeptídeo resulta em uma interação desestabilizadora quando o quarto polipeptídeo e o quinto polipeptídeo formam um heterodímero) e um sexto polipeptídeo que compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve, em que o sexto polipeptídeo está covalentemente ligado ao quarto polipeptídeo por uma ligação dissulfeto.
[023] Em uma forma de realização, a etapa de incubação é na ausência de um agente redutor.
[024] Em uma forma de realização i) o segundo polipeptídeo e o terceiro polipeptídeo, ou ii) o segundo polipeptídeo e o quinto polipeptídeo compreendem ainda um marcador (terminal C). Em uma forma de realização, o marcador tem a sequência de aminoácidos HHHHHH (SEQ ID NO: 67) ou HHHHHHHH (SEQ ID NO: 68) e a recuperação é por cromatografia em uma coluna de cromatografia de afinidade de quelato de metal (níquel).
[025] Em uma forma de realização, o o primeiro ligante compreende como primeiro polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um segundo domínio variável da cadeia pesada (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da I9gG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana,
iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
iv) um scFv, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
v) um scFab, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
vi) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
vili) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana,
ix) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
x) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
xi) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da I9gG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
xii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio (CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia leve,
xili) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia leve e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana,
xiv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um (domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana, e xv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
que compreende a mutação no puxador ou as mutações no buraco,
e como segundo polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
em que i) o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, se o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, ou ii) o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, se o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada,
em que o domínio CH3 compreende a mutação no puxador, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações no buraco ou as mutações no buraco, se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação no puxador,
que compreende uma primeira mutação perturbadora, selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, ES57F, ESS7K, K370E, e K439E, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (IgG1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora,
em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo se associam de forma não covalente entre si/ formam um dímero não covalente (em que a mutação perturbadora no segundo polipeptídeo resulta em uma interação desestabilizadora quando o segundo polipeptídeo e o primeiro polipeptídeo formam um heterodímero)
e um terceiro polipeptídeo que compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve,
em que o terceiro polipeptídeo está ligado de forma covalente ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto,
e o segundo ligante compreende como quarto polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da I9gG1 humana,
em que o domínio CH3 compreende a mutação no puxador, se o segundo polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o segundo polipeptídeo compreender a mutação no puxador,
que compreende uma segunda mutação perturbadora, selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, ES57F, ES57K, K370E, e K439E, em que o quinto polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (I9G1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que a mutação perturbadora no quarto polipeptídeo está em uma posição diferente da mutação perturbadora no segundo polipeptídeo,
e como quinto polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um segundo domínio variável da cadeia pesada (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da I9gG1 humana,
iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
iv) um scFv, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
v) um scFab, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
vi) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
vili) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana,
ix) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
x) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da
SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
xi) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
xii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio (CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia leve,
xiii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia leve e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana,
xiv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um (domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana, e xv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio
CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada, que compreende a mutação no puxador, se o quarto polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o quarto polipeptídeo compreender a mutação no puxador, em que o quarto polipeptídeo e o quinto polipeptídeo se associam de forma não covalente entre si/ formam um dímero não covalente (em que a mutação perturbadora no quarto polipeptídeo resulta em uma interação desestabilizadora quando o quarto polipeptídeo e o quinto polipeptídeo formam um heterodímero) em que o domínio variável do primeiro polipeptídeo e o domínio variável do quarto polipeptídeo formam um local de ligação funcional (competente para a ligação ao antígeno) (par de domínios variáveis de anticorpo (par VH/ VL)) e o domínio variável do segundo polipeptídeo e o domínio variável do terceiro polipeptídeo forma um par de domínios variáveis não funcional (não competente para a ligação ao antígeno), e um sexto polipeptídeo que compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve, em que o sexto polipeptídeo está covalentemente ligado ao quarto polipeptídeo por uma ligação dissulfeto.
[026] Um aspecto, tal como aqui relatado, é um método para identificar uma combinação de ligantes que compreende as etapas de - produzir uma multiplicidade de ligantes submetendo cada combinação de um primeiro ligante selecionado a partir de uma primeira multiplicidade de ligantes e um segundo ligante selecionado a partir de uma segunda multiplicidade de ligantes ao método de acordo com a invenção, - medir individualmente a (quantidade de) ligação simultânea de cada ligante da multiplicidade produzida de ligantes a pelo menos dois antígenos em um ensaio ELISA, e - selecionar um ligante da multiplicidade de ligantes com base no resultado do ELISA e, assim, identificar uma combinação de ligantes.
[027] Um aspecto, tal como aqui relatado, é um polipeptídeo multimérico que compreende um primeiro polipeptíideco e um segundo polipeptídeo em que ambos os polipeptídeos compreendem (na direção terminal N a C, diretamente um após o outro, opcionalmente, com um ligante peptídico entre o domínio variável e o domínio CH3) a sequência de aminoácidos DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66), um domínio variável de anticorpo, e um domínio CH3 da imunoglobulina humana (I9G1), em que i) o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, se o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, ou ii) o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, se o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, em que i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação no puxador e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações no buraco, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações no buraco e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação no puxador, em que o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um local de ligação funcional ou pelo menos uma parte de um local de ligação,
em que o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 pelo menos uma mutação perturbadora (selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, ES57F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394l, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407|, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, e W366T), em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (I9G1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo se associam de forma não covalente entre si/ formam um dímero não covalente (em que a mutação perturbadora no segundo polipeptídeo resulta em uma interação desestabilizadora quando o segundo polipeptídeo e o primeiro polipeptídeo formam um heterodímero), o domínio variável do primeiro polipeptídeo e o domínio variável do segundo polipeptídeo formam um par de domínios variáveis funcional ou não funcional (não competente para a ligação ao antígeno).
[028] Em uma forma de realização, o primeiro polipeptídeo é um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um segundo domínio variável da cadeia pesada (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da I9gG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana,
iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
iv) um scFv, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
v) um scFab, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
vi) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
vili) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana,
ix) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
x) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
xi) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da I9gG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
xii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio (CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia leve,
xili) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia leve e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana,
xiv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um (domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana, e xv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
(que compreende a mutação no puxador ou a mutação no buraco)
e o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana que compreende a mutação no puxador ou as mutações no buraco,
que compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394|, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R,
F405W, Y407W, Y407L, Y407|, K409D, K409E, K409|, K439E, L441Y, Y349C, S366T, ASG8L, V407Y, S354C, e W366T, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (IgG1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora.
[029] Em uma forma de realização, o polipeptídeo multimérico compreende ainda um terceiro polipeptídeo que compreende um domínio variável (adicional) da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve, em que o terceiro polipeptídeo está ligado de forma covalente ao (domínio CH1) do primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto.
[030] Um aspecto, tal como aqui relatado, é uma composição que compreende um primeiro polipeptídeo heterotrimérico que compreende como primeiro polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um segundo domínio variável da cadeia pesada (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da I9gG1 humana, iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
iv) um scFv, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
v) um scFab, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
vi) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana,
ix) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
x) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
xi) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
xii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio (CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia leve,
xiii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia leve e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da I9gG1 humana,
xiv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IGgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um (domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana, e xv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
(que compreende a mutação no puxador ou a mutação no buraco)
e como segundo polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da I9G1 humana,
em que i) o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, se o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, ou ii) o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, se o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada,
em que o domínio CH3 compreende a mutação no puxador, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação no puxador,
que compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394|, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R,
F405W, Y407W, Y407L, Y407|, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, ASG8L, V407Y, S354C, e W366T, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (IgG1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora,
e como terceiro polipeptídeo, um polipeptídeo que compreende um domínio variável adicional da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve, em que o terceiro polipeptídeo está ligado de forma covalente ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto,
e um segundo polipeptídeo heterotrimérico que compreende como primeiro (quarto) polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
em que o domínio CH3 compreende a mutação no puxador, se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender a mutação no puxador,
que compreende uma segunda mutação perturbadora, selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, QO347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, ES57F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394|], V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y4071, K409D, K409E, K409],
K439E, L441Y, Y349C, S366T, ASG8L, V407Y, S354C, e W366T, em que o segundo (quinto) polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (I9G1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que a mutação perturbadora no primeiro (quarto) polipeptídeo está em uma posição diferente da mutação perturbadora no segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero,
e como segundo (quinto) polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um segundo domínio variável da cadeia pesada (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana,
iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
iv) um scFv, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
v) um scFab, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
vi) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da I1gG1 humana,
ix) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
x) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da I9gG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
xi) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
xii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio (CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia leve,
xili) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia leve e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana,
xiv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um (domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da I9G1 humana, e xv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da I9gG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente,
um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
que compreende a mutação no puxador, se o primeiro (quarto) polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o primeiro (quarto) polipeptídeo compreender a mutação no puxador,
em que i) o domínio variável do quinto polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, se o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, ou ii) o domínio variável do quinto polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, se o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada,
e como terceiro (sexto) polipeptídeo, um polipeptídeo que compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve, em que o sexto polipeptídeo está ligado de forma covalente ao primeiro (quarto) polipeptídeo por uma ligação dissulfeto,
em que i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende a mutação no puxador e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende as mutações no buraco, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende as mutações no buraco e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende a mutação no puxador, em que i) no caso do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender as mutações no buraco o segundo polipeptídeo do segundo (quinto) polipeptídeo heterotrímero compreende a mutação no puxador, ou ii) no caso do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender a mutação no puxador, o segundo polipeptideco do segundo (quinto) polipeptídeo heterotrímero compreende as mutações no buraco,
em que o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero e o primeiro polipeptídeo do segundo (quarto) polipeptídeo heterotrímero não compreendem as mutações perturbadoras na mesma posição/ compreendem mutações perturbadoras em posições diferentes, em que o domínio variável do primeiro polipeptídeo e o domínio variável do quinto polipeptídeo formam um local de ligação funcional (competente para a ligação ao antígeno) (par de domínios variáveis de anticorpo (par VH/ VL)) e o domínio variável do segundo polipeptídeo e o domínio variável do quarto polipeptídeo forma um par de domínios variáveis não funcional (não competente para a ligação ao antígeno).
[031] Um aspecto, tal como aqui relatado, é um polipeptídeo multimérico que compreende um primeiro polipeptíideo e um segundo polipeptídeo em que ambos os polipeptídeos compreendem um domínio CH3 da imunoglobulina humana (I9G1), em que i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação no puxador e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações no buraco, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações no buraco e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação no puxador, em que o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um local de ligação funcional ou pelo menos uma parte de um local de ligação, em que o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 pelo menos uma mutação perturbadora (selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, ES57F, ESS7K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394l, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W,
Y407L, Y407|, K409D, K409E, K409|, K439E, L441Y, Y349C, S366T, ASG8L, V407Y, S354C, e W366T), em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (I9G1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo se associam de forma não covalente ou covalente um ao outro/ formam um dímero não covalente ou covalente (em que a mutação perturbadora no segundo polipeptídeo resulta em uma interação desestabilizadora quando o segundo polipeptídeo e o primeiro polipeptídeo formam um heterodímero).
[032] Em uma forma de realização, o primeiro polipeptídeo é um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia pesada e um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da I9gG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um domínio variável da cadeia pesada,
iv) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da I9G1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana,
v) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da 19G1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da I9gG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
vi) um domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) um domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da I9gG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da I9gG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um domínio variável da cadeia leve,
ix) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da I9G1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia leve e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana,
x) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da I9G1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um (domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana,
xi) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da I9G1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um (domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada, e xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente, um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação (do mesmo associado polipeptídico e) formam um local de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo; em uma forma de realização, a primeira parte do domínio de ligação é um fragmento Fab da cadeia pesada de anticorpo (VH-CH1 ou CH1-VH) e a segunda parte do domínio de ligação é um fragmento Fab da cadeia leve (VL-CL ou CL-VL) ou vice-versa, e compreende a mutação no puxador ou a mutação no buraco, e o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana que compreende a mutação no puxador ou as mutações no buraco, que compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E3S45R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394|, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407|, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, ASG8L, V407Y, S354C, e W366T, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (I9G1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora.
[033] Em uma forma de realização, o polipeptídeo multimérico compreende ainda um terceiro polipeptídeo que compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve ligado de forma covalente ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto.
[034] Um aspecto, tal como aqui relatado, é uma composição que compreende um primeiro polipeptídeo heterotrimérico que compreende como primeiro polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um domínio variável da cadeia pesada (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da 19G1 humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia pesada e (domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana,
iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana e um domínio variável da cadeia pesada,
iv) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 derivado de um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio CH1 derivado de um domínio CH1 da I9G1 humana,
v) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 derivado de um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 derivado de um domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
vi) um domínio variável da cadeia pesada (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da 19G1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) um domínio variável da cadeia pesada (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da I9gG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da I9G1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um domínio variável da cadeia leve,
ix) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da I9gG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia leve e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da I9gG1 humana,
x) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um (domínio
CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um (domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana,
xi) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da 19G1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um (domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada, e xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente, um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação (do mesmo associado polipeptídico e) formam um local de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo; em uma forma de realização, a primeira parte do domínio de ligação é um fragmento Fab da cadeia pesada de anticorpo (VH-CH1 ou CH1-VH) e a segunda parte do domínio de ligação é um fragmento Fab da cadeia leve (VL-CL ou CL-VL) ou vice-versa,
que compreende a mutação no puxador ou as mutações no buraco,
e como segundo polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
que compreende a mutação no puxador, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação no puxador,
que compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394|, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407|, K409D, K409E, K409], K439E, L441Y, Y349C, S366T, ASG8L, V407Y, S354C, e W366T, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (IgG1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora,
e como terceiro polipeptídeo, um polipeptídeo que compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve ligado de forma covalente ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto,
e um segundo polipeptídeo heterotrimérico que compreende como primeiro (quarto) polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
que compreende a mutação no puxador, se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender a mutação no puxador,
que compreende uma segunda mutação perturbadora, selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, ES57F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|1, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394], V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y4071, K409D, K409E, K409], K439E, L441Y, Y349C, S366T, ASG8L, V407Y, S354C, e W366T, em que o segundo (quinto) polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (I9G1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que a mutação perturbadora no primeiro (quarto) polipeptídeo está em uma posição diferente da mutação perturbadora no segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero,
e como segundo (quinto) polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um domínio variável da cadeia pesada (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia pesada e (domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana,
iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana e um domínio variável da cadeia pesada,
iv) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 derivado de um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da I9G1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio CH1 derivado de um domínio CH1 da I9G1 humana,
v) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 derivado de um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da I9gG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 derivado de um domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
vi) um domínio variável da cadeia pesada (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) um domínio variável da cadeia pesada (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da 19G1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um domínio variável da cadeia leve,
ix) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da I9gG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia leve e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana,
x) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da I9G1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um (domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana,
xi) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da I9gG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um (domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada, e xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente, um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação (do mesmo associado polipeptídico e) formam um local de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo; em uma forma de realização, a primeira parte do domínio de ligação é um fragmento Fab da cadeia pesada de anticorpo (VH-CH1 ou CH1-VH) e a segunda parte do domínio de ligação é um fragmento Fab da cadeia leve (VL-CL ou CL-VL) ou vice-versa,
que compreende a mutação no puxador, se o primeiro (quarto) polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o primeiro (quarto) polipeptídeo compreender a mutação no puxador,
e como terceiro (sexto) polipeptídeo, um polipeptídeo que compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve ligado de forma covalente ao primeiro (quarto) polipeptídeo por uma ligação dissulfeto,
em que i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende a mutação no puxador e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende as mutações no buraco, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende as mutações no buraco e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende a mutação no puxador, em que i) no caso do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender as mutações no buraco o segundo polipeptídeo do segundo (quinto) polipeptídeo heterotrímero compreende a mutação no puxador, ou ii) no caso do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender a mutação no puxador, o segundo polipeptideco do segundo (quinto) polipeptídeo heterotrímero compreende as mutações no buraco, em que o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero e o primeiro polipeptídeo do segundo (quarto) polipeptídeo heterotrímero não compreendem as mutações perturbadoras na mesma posição/ compreendem mutações perturbadoras em posições diferentes.
[035] Um aspecto, tal como aqui relatado, é formulações farmacêuticas que compreende uma 2/3-lgG sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou que compreende uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou que compreende uma composição que compreende duas 2/3-lgG diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou duas 2/3-BiFab diferentes sem ligação dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, conforme descrito aqui, são preparados através da mistura dessas 2/3-lgG (s) ou 2/3-BiFab (s).
[036] Um aspecto, tal como aqui relatado, é uma 2/3-lgGG sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma composição que compreende duas 2/3-lgG diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou duas 2/3-BiFab diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada para uso como um medicamento.
[037] Um aspecto, tal como aqui relatado, é o uso de uma 2/3- IgG sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou de 2/3- BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou de uma composição que compreende duas 2/3-l9G diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou duas 2/3-BiFab diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada na fabricação ou preparação de um medicamento.
[038] Um aspecto, tal como aqui relatado, é um método para o tratamento de uma doença que compreende a administração a um indivíduo com uma doença de uma quantidade eficaz de 2/3-Ig9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou de uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou de uma composição que compreende duas 2/3-lgG diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou duas 2/3-BiFab diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada.
[039] Em uma forma de realização, a composição compreende um primeiro polipeptídeo heterotrimérico, que compreende um primeiro, um segundo e um terceiro polipeptídeo monomérico, e um segundo polipeptídeo heterotrimérico, que compreende um quarto, um quinto e um sexto polipeptídeo monomérico (ou seja, cada polipeptídeo heterotrimérico é compreendido de três polipeptídeos monoméricos (não idênticos) (que compreende juntos um total de seis polipeptídeos monoméricos (não idênticos) (ou seja, um primeiro, um segundo, um terceiro, um quarto, um quinto e um sexto polipeptídeo monomérico não idêntico))), em que o primeiro, o segundo, o quarto e o quinto polipeptídeo (monomérico) compreendem cada um (na direção terminal N a C) () a sequência de aminoácidos DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66) (ii) um primeiro domínio variável de anticorpo, e (iii) um domínio CH3 da imunoglobulina humana (I9G1), em que (i) (ii) e (iii) são de forma independente um do outro, diretamente ou através de um ligante peptídico, conjugados entre si, em que o primeiro domínio variável de anticorpo do i) primeiro e o segundo polipeptídeo (monomérico), e ii) primeiro e o quinto polipeptídeo
(monomérico), iii) segundo e o quarto polipeptídeo (monomérico), e iv) quinto e o quarto polipeptídeo (monomérico) é um par VH/ VL (ou seja, o primeiro domínio variável do primeiro polipeptídeo (monomérico) é um domínio variável da cadeia pesada ou um domínio variável da cadeia leve, em que, no caso de ser um domínio variável da cadeia pesada, o primeiro domínio variável do segundo e quinto polipeptídeo (monomérico) é um domínio variável da cadeia leve ou, no caso de ser um domínio variável da cadeia leve, o primeiro domínio variável do segundo e do quinto polipeptídeo (monomérico) é um domínio variável da cadeia pesada, e o primeiro domínio variável do quarto polipeptídeo (monomérico) é um domínio variável da cadeia leve, caso o primeiro domínio variável do quinto polipeptídeo (monomérico) seja um domínio variável da cadeia pesada ou seja um domínio variável da cadeia pesada caso o primeiro domínio variável do quinto (polipeptídeo monomérico) seja um domínio variável da cadeia leve),
em que o domínio CH3 de i) primeiro e o quinto polipeptídeo (monomérico) e ii) o primeiro e o segundo polipeptídeo (monomérico), iii) segundo e o quarto polipeptídeo (monomérico) e iv) quinto e o quarto polipeptídeo (monomérico) é um par de puxador-em-buraco (ou seja, o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo (monomérico) compreende a mutação no puxador ou as mutações no buraco, em que, no caso de compreender a mutação no puxador, o domínio CH3 do segundo e do quinto polipeptídeo (monomérico) compreendem as mutações no buraco ou, no caso de compreender as mutações no buraco, o domínio CH3 do segundo e do quinto polipeptídeo (monomérico) compreendem a mutação do buraco, e o domínio CH3 do quarto polipeptídeo (monomérico) compreende a mutação no puxador no caso do domínio CH3 do quinto polipeptídeo (monomérico) compreender as mutações no buraco ou compreende as mutações no buraco no caso em que o domínio CH3 do quinto (polipeptíideo monomérico) compreende a mutação no puxador),
em que o primeiro polipeptídeo (monomérico) e o quinto polipeptídeo (monomérico) compreendem, de forma independente um do outro, em um ou ambos os terminais N e C, de forma independente um do outro, um scFv, ou um scFab, ou um Fab,
em que o segundo e o quarto polipeptídeo (monomérico) compreendem no domínio CH3, pelo menos uma mutação perturbadora (selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, ES57A, E357L, ES57F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394]I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y4071, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, ASG8L, V407Y, S354C, e W366T), em que o primeiro polipeptídeo (monomérico) compreende resíduo (s) de aminoácidos do tipo selvagem de imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (I9G1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora do segundo polipeptídeo (monomérico), em que o quinto polipeptídeo (monomérico) compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (I9G1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora do quarto polipeptídeo (monomérico), em que a mutação perturbadora no segundo polipeptídeo (monomérico) não está na mesma posição na sequência de aminoácidos que a mutação perturbadora no quarto polipeptídeo (monomérico), em que a mutação perturbadora no segundo polipeptídeo (monomérico) e a mutação perturbadora no quarto polipeptídeo (monomérico) resultam em uma interação atraente (carga) quando o segundo polipeptídeo e o quarto polipeptídeo formam um heterodímero, em que as mutações perturbadoras no segundo e no quarto polipeptídeo (monomérico) resultam em interações repulsivas (carga) quando o segundo polipeptídeo (monomérico) forma um heterodímero com o primeiro polipeptídeo (monomérico) e o quarto polipeptídeo (monomérico) forma um heterodímero com o quinto polipeptídeo (monomérico), respectivamente, em que o primeiro e o segundo polipeptídeo (monomérico) formam um dímero não covalente, o quarto e o quinto polipeptídeo (monomérico) formam um dímero não covalente, o terceiro e o primeiro polipeptídeo (monomérico) formam um dímero ligado a dissulfeto, e o sexto e o quinto polipeptídeo (monomérico) formam um dímero ligado a dissulfeto, em que o terceiro e o sexto polipeptídeo (monomérico) são cadeias leves de anticorpos.
[040] Em uma forma de realização, o primeiro polipeptídeo (monomérico) é selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende, na direção terminal N a C: i) um segundo domínio variável da cadeia pesada (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da I9gG1 humana, iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
iv) um scFv, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
v) um scFab, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
vi) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana,
ix) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
x) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
xi) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
xii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio (CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia leve,
xiii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia leve e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da I9gG1 humana,
xiv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IGgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um (domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana, e xv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve derivado de um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada.
[041] Em uma forma de realização, o segundo polipeptídeo (monomérico) é selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende, na direção terminal N a C: uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da I9G1 humana, em que i) o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, se o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, ou ii) o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, se o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, em que o domínio CH3 compreende a mutação no puxador, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação no puxador, que compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394|, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407|, K409D, K409E, K409|, K439E, L441Y, Y349C,
S366T, ASG8L, V407Y, S354C, e W366T, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (IgG1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, e como terceiro polipeptídeo, um polipeptídeo que compreende um domínio variável adicional da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve, em que o terceiro polipeptídeo está ligado de forma covalente ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto.
[042] Em uma forma de realização, o quarto polipeptídeo (monomérico) é selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende, na direção terminal N a C: uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, em que o domínio CH3 compreende a mutação no puxador, se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender a mutação no puxador, que compreende uma segunda mutação perturbadora, selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, QO347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, ES57F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T3941I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y4071, K409D, K409E, K409], K439E, L441Y, Y349C, S366T, AS68L, V407Y, S354C, e W366T, em que o segundo (quinto) polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (I9G1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que a mutação perturbadora no primeiro (quarto) polipeptídeo está em uma posição diferente da mutação perturbadora no segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero.
[043] Em uma forma de realização, o quinto polipeptídeo (monomérico) é selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende, na direção terminal Na C: i) um segundo domínio variável da cadeia pesada (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico (um domínio CH1 derivado de) um domínio CH1 da IgG1 humana, e um segundo domínio variável da cadeia pesada, iv) um scFv, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da I9gG1 humana, v) um scFab, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
vi) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana,
ix) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
x) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
xi) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da
SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
xii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio (CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia leve,
xiii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia leve e um segundo (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana,
xiv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um (domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana, e xv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um (domínio CH1 derivado do) domínio CH1 da IGgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve derivado do) domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada, que compreende a mutação no puxador, se o primeiro (quarto) polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o primeiro (quarto) polipeptídeo compreender a mutação no puxador, em que i) o domínio variável do quinto polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, se o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, ou ii) o domínio variável do quinto polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, se o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada.
[044] Em uma forma de realização, o domínio variável do primeiro polipeptídeo e o domínio variável do quinto polipeptídeo formam um local de ligação funcional (competente para a ligação ao antígeno) (par de domínios variáveis de anticorpo (par VH/ VL)) e o domínio variável do segundo polipeptídeo e o domínio variável do quarto polipeptídeo forma um par de domínios variáveis funcional ou não funcional (não competente para a ligação ao antígeno).
[045] Um aspecto da invenção é um polipeptídeo complexo/ multimérico não covalente (isolado) que compreende: um primeiro polipeptídeo que compreende i) na direção terminal N a C a) um primeiro domínio variável de anticorpo selecionado a partir de um par de um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente a um primeiro alvo e b) um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina G humana, e ii) um par de um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente a um segundo alvo localizado no terminal N no primeiro domínio variável de anticorpo ou no terminal C no primeiro domínio CH3,
um segundo polipeptídeo que compreende i) na direção terminal N a C a) um segundo domínio variável de anticorpo selecionado a partir de um par de um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente a um terceiro alvo e b) um segundo domínio CH3 de imunoglobulina G humana,
em que o segundo domínio variável de anticorpo é um domínio variável da cadeia leve de anticorpo, se o primeiro domínio variável de anticorpo for um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo; ou o segundo domínio variável de anticorpo é um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo, se o primeiro domínio variável de anticorpo for um domínio variável da cadeia leve de anticorpo,
e em que o segundo domínio CH3 compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em D356K, E3S57K, K370E e K439E, em que o primeiro domínio CH3 compreende a) o resíduo de aminoácido K na posição 439 se as mutações perturbadoras forem D356K, ou b) o resíduo de aminoácido K na posição 370 se as mutações perturbadoras forem E357K, ou c) o resíduo de aminoácido E na posição 357 se as mutações perturbadoras forem K370E, ou d) o resíduo de aminoácido D na posição 356 se as mutações perturbadoras forem K439E,
e ii) opcionalmente, um par de um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente ao segundo alvo ou a um quarto alvo localizado no terminal N no segundo domínio variável de anticorpo ou no terminal C no segundo domínio CH3, a localização sendo independente da localização do referido par de domínios variáveis do primeiro polipeptídeo, em que toda a numeração está de acordo com o índice de Kabat EU.
[046] Em uma forma de realização de todos os aspectos, o primeiro domínio CH3 e o segundo domínio CH3 compreendem mutações de aminoácidos como aqui divulgadas para promover a formação de heterodímero, ou seja, conforme descrito na seção D) Heterodimerização aqui abaixo.
[047] Em uma forma de realização de todos os aspectos, o primeiro domínio CH3 e o segundo domínio CH3 compreendem mutações adicionais para promover a formação de heterodímeros entre o referido primeiro domínio CH3 e o referido segundo domínio CH3 e que são diferentes da mutação perturbadora.
[048] Em uma forma de realização de todos os aspectos o primeiro domínio CH3 compreende a) a mutação T366W, ou b) as mutações T366S/ L368A/ Y407V, e o segundo domínio CH3 compreende a) as mutações T366S/ L368A/ Y407V, se o primeiro domínio CH3 compreender a mutação T366W, ou b) a mutação T366W, se o primeiro domínio CH3 compreender as mutações T366S/ L368A/ Y407V.
[049] Um aspecto da invenção é um polipeptídeo complexo/ multimérico não covalente (isolado) que compreende:
um primeiro polipeptídeo que compreende i) na direção terminal N a C a) um primeiro domínio variável de anticorpo selecionado a partir de um par de um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente a um primeiro alvo e b) um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina G humana,
em que o primeiro domínio CH3 compreende a) a mutação T366W, ou as mutações T366S/ L368A/ Y407V,
e b) opcionalmente, a mutação Y349C ou S354C,
e ii) um par de um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente a um segundo alvo localizado no terminal N no primeiro domínio variável de anticorpo ou no terminal C no primeiro domínio CH3,
um segundo polipeptídeo que compreende i) na direção terminal N a C a) um segundo domínio variável de anticorpo selecionado a partir de um par de um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente a um terceiro alvo e b) um segundo domínio CH3 de imunoglobulina G humana,
em que o segundo domínio variável de anticorpo é um domínio variável da cadeia leve de anticorpo, se o primeiro domínio variável de anticorpo for um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo; ou o segundo domínio variável de anticorpo é um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo, se o primeiro domínio variável de anticorpo for um domínio variável da cadeia leve de anticorpo,
e em que o segundo domínio CH3 compreende a) as mutações T366S/ L368A/ Y407V, se o primeiro domínio CH3 compreender a mutação T366W, ou b) a mutação T366W, se o primeiro domínio CH3 compreender as mutações T366S/ L368A/ Y407V, e em que o segundo domínio CH3 compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em D356K, E357K, K370E e K439E, em que o primeiro domínio CH3 compreende a) o resíduo de aminoácido K na posição 439 se as mutações perturbadoras forem D356K, ou b) o resíduo de aminoácido K na posição 370 se as mutações perturbadoras forem E357K, ou c) o resíduo de aminoácido E na posição 357 se as mutações perturbadoras forem K370E, ou d) o resíduo de aminoácido D na posição 356 se as mutações perturbadoras forem K439E, e ii) opcionalmente, um par de um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente ao segundo alvo ou a um quarto alvo localizado no terminal N no segundo domínio variável de anticorpo ou no terminal C no segundo domínio CH3, a localização sendo independente da localização do referido par de domínios variáveis do primeiro polipeptídeo, em que toda a numeração está de acordo com o índice de Kabat EU.
[050] Um aspecto da invenção é um polipeptídeo complexo/ multimérico não covalente (isolado) que compreende:
um primeiro polipeptídeo que compreende i) na direção terminal N a C a) um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina G humana e b) um primeiro domínio variável de anticorpo selecionado a partir de um par de um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente a um primeiro alvo e ii) um par de um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente a um segundo alvo localizado no terminal N do primeiro domínio CH3 de anticorpo ou no terminal C da primeira variável de anticorpo,
um segundo polipeptídeo que compreende i) na direção terminal N a C a) um segundo domínio CH3 de imunoglobulina G humana e b) um segundo domínio variável de anticorpo selecionado a partir de um par de um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente a um terceiro alvo,
em que o segundo domínio variável de anticorpo é um domínio variável da cadeia leve de anticorpo, se o primeiro domínio variável de anticorpo for um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo; ou o segundo domínio variável de anticorpo é um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo, se o primeiro domínio variável de anticorpo for um domínio variável da cadeia leve de anticorpo,
e em que o segundo domínio CH3 compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em D356K, E357K, K370E e K439E, em que o primeiro domínio CH3 compreende a) o resíduo de aminoácido K na posição 439 se as mutações perturbadoras forem D356K, ou b) o resíduo de aminoácido K na posição 370 se as mutações perturbadoras forem E357K, ou c) o resíduo de aminoácido E na posição 357 se as mutações perturbadoras forem K370E, ou d) o resíduo de aminoácido D na posição 356 se as mutações perturbadoras forem K439E, e ii) opcionalmente, um par de um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente ao segundo alvo ou a um quarto alvo, seja no terminal N no segundo domínio CH3 ou no terminal C no segundo domínio variável, a localização sendo independente da localização do referido par de domínios variáveis do primeiro polipeptídeo, em que toda a numeração está de acordo com o índice de Kabat EU.
[051] Em uma forma de realização de todos os aspectos, o primeiro domínio CH3 e o segundo domínio CH3 compreendem mutações de aminoácidos como aqui divulgadas para promover a formação de heterodímero, ou seja, conforme descrito na seção D) Heterodimerização aqui abaixo.
[052] Em uma forma de realização de todos os aspectos, o primeiro domínio CH3 e o segundo domínio CH3 compreendem mutações adicionais para promover a formação de heterodímeros entre o referido primeiro domínio CH3 e o referido segundo domínio CH3 e que são diferentes da mutação perturbadora.
[053] Em uma forma de realização de todos os aspectos o primeiro domínio CH3 compreende a) a mutação T366W, ou b) as mutações T366S/ L368A/ Y407V, e o segundo domínio CH3 compreende a) as mutações T366S/ L368A/ Y407V, se o primeiro domínio CH3 compreender a mutação T366W, ou b) a mutação T366W, se o primeiro domínio CH3 compreender as mutações T366S/ L368A/ Y407V.
[054] Um aspecto da invenção é um polipeptídeo complexo/ multimérico não covalente (isolado) que compreende: um primeiro polipeptídeo que compreende i) na direção terminal N a C a) um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina G humana e b) um primeiro domínio variável de anticorpo selecionado a partir de um par de um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente a um primeiro alvo em que o primeiro domínio CH3 compreende a) a mutação T366W, ou as mutações T366S/ L368A/ Y407V, e b) opcionalmente, a mutação Y349C ou S354C, e ii) um par de um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente a um segundo alvo localizado no terminal N do primeiro domínio CH3 de anticorpo ou no terminal C da primeira variável de anticorpo, um segundo polipeptídeo que compreende i) na direção terminal N a C a) um segundo domínio CH3 de imunoglobulina G humana e b) um segundo domínio variável de anticorpo selecionado a partir de um par de um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente a um terceiro alvo,
em que o segundo domínio variável de anticorpo é um domínio variável da cadeia leve de anticorpo, se o primeiro domínio variável de anticorpo for um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo; ou o segundo domínio variável de anticorpo é um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo, se o primeiro domínio variável de anticorpo for um domínio variável da cadeia leve de anticorpo,
e em que o segundo domínio CH3 compreende a) as mutações T366S/ L368A/ Y407V, se o primeiro domínio CH3 compreender a mutação T366W, ou b) a mutação T366W, se o primeiro domínio CH3 compreender as mutações T366S/ L368A/ Y407V,
e em que o segundo domínio CH3 compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em D356K, E3S57K, K370E e K439E, em que o primeiro domínio CH3 compreende a) o resíduo de aminoácido K na posição 439 se as mutações perturbadoras forem D356K, ou b) o resíduo de aminoácido K na posição 370 se as mutações perturbadoras forem E357K, ou c) o resíduo de aminoácido E na posição 357 se as mutações perturbadoras forem K370E, ou d) o resíduo de aminoácido D na posição 356 se as mutações perturbadoras forem K439E,
e ii) opcionalmente, um par de um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente ao segundo alvo ou a um quarto alvo, seja no terminal N no segundo domínio CH3 ou no terminal C no segundo domínio variável, a localização sendo independente da localização do referido par de domínios variáveis do primeiro polipeptídeo, em que toda a numeração está de acordo com o índice de Kabat EU.
[055] Em uma forma de realização de todos os aspectos de acordo com a invenção, o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são um dímero não covalente.
[056] Em uma forma de realização de todos os aspectos de acordo com a invenção, o primeiro domínio variável e o segundo domínio variável se associam/ estão associados e formam um local de ligação não funcional.
[057] Em uma forma de realização de todos os aspectos de acordo com a invenção, o primeiro e o segundo polipeptídeo compreendem cada um a sequência de aminoácidos DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66) ou DKTHT (SEQ ID NO: 94) ou GGGS (SEQ ID NO: 69) ou DKTHGGGGS (SEQ ID NO: 97) no terminal N, em cada um do primeiro e do segundo domínio variável, caso o primeiro domínio CH3 esteja localizado no terminal C no primeiro domínio variável ou no terminal N, em cada um do primeiro e do segundo domínio CH3 caso o primeiro domínio variável esteja localizado no terminal C do primeiro e do segundo domínio CH3.
[058] Em uma forma de realização de todos os aspectos de acordo com a invenção, a imunoglobulina G humana é I9gG1 humana ou I9G2 humana ou IgG3 humana ou IgG4 humana. Em uma forma de realização de todos os aspectos de acordo com a invenção, a imunoglobulina G humana é
I9G1 humana.
[059] Em uma forma de realização de todos os aspectos de acordo com a invenção, o domínio G3 de imunoglobulina G humana é um domínio CH3 de IgG1 humana ou um domínio CH3 de IgG2 humana ou um domínio CH3 de IgG3 humana ou um domínio CH3 de IgG4 humana.
[060] Em uma forma de realização de todos os aspectos de acordo com a invenção i) o primeiro domínio CH3 compreende a mutação T366W e o resíduo de aminoácido K na posição 439, e o segundo domínio CH3 compreende a mutação perturbadora D356K e as mutações T366S/ L368A/ Y407V, ou ii) o primeiro domínio CH3 compreende a mutação T366W e o resíduo de aminoácido K na posição 370, e o segundo domínio CH3 compreende a mutação perturbadora E357K e as mutações T366S/ L368A/ Y407V, ou iii) o primeiro domínio CH3 compreende as mutações T366S/ L368A/ Y407V e o resíduo de aminoácido E na posição 357, e o segundo domínio CH3 compreende a mutação perturbadora K370E e a mutação T366W, ou iv) o primeiro domínio CH3 compreende as mutações T366S/ L368A/ Y407V e o resíduo de aminoácido D na posição 356, e o segundo domínio CH3 compreende a mutação perturbadora K439E e a mutação T366W.
[061] Em uma forma de realização de todos os aspectos de desestabilizadora entre os domínios CH3; e ii) da ausência de ligações dissulfeto entre os dois domínios CH3 que compreende polipeptídeos dos anticorpos biespecíficos não completos de partida.
[076] A invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta adicional de que, usando compostos de partida, conforme descrito acima, a reação de troca e a formação de anticorpos biespecíficos completos e funcionais estão ocorrendo na ausência de agentes redutores, ou seja, podem ser realizados in vivo. Ou seja, não são necessárias ligações dissulfeto entre o domínio CH3 contendo polipeptídeos das moléculas de partida. Assim, as ligações dissulfureto da região de dobradiça, bem como outras ligações dissulfureto da cadeia pesada - cadeia pesada, podem ser removidas dos anticorpos não completos de partida.
[077] |. DEFINIÇÕES
[078] Como aqui utilizado, as posições de aminoácidos de todas as regiões e domínios constantes da cadeia pesada e leve são numeradas de acordo com o sistema de numeração Kabat descrito em Kabat, E.A,, et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) e é aqui referido como “numeração de acordo com Kabat”. Especificamente, o sistema de numeração Kabat (consulte as páginas 647-660) de Kabat, E.A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) é usado para o domínio constante da cadeia leve CL do isotipo kappa e lambda, e o sistema de numeração de índice de Kabat EU (consulte as páginas 661-723) é usado para os domínios constantes da cadeia pesada (CH1, dobradiça, CH2 e CH3, que aqui são esclarecidos mais detalhadamente consultando “Numeração de acordo com o índice de Kabat EU” neste caso).
[079] Os domínios CH3 nas cadeias pesadas de anticorpo podem ser alterados pela tecnologia “puxador-em-buracos”, que é descrita em detalhes com vários exemplos em, por exemplo, WO 96/027011, Ridgway, J.B. et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; e Merchant, A.M. et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681. Neste método, as superfícies de interação dos dois domínios CH3 são alteradas para aumentar a heterodimerização desses dois domínios CH3 e, portanto, do polipeptídeo que os compreende. Cada um dos dois domínios CH3 (das duas cadeias pesadas) pode ser o “puxador”, enquanto o outro é o “buraco”. A introdução de uma ponte dissulfeto estabiliza ainda mais os heterodímeros (Merchant, AM, et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997)26-35) e aumenta o rendimento. Mas isso está ausente nas moléculas da presente invenção.
[080] A mutação T366W no domínio CH3 (de uma cadeia pesada de anticorpo) é denotada como “puxador-mutação” ou “mutação de puxador" e as mutações T366S, L368A, Y407V no domínio CH3 (de uma cadeia pesada de anticorpo) são denotadas como “buraco-mutação” ou “mutação de buraco” (numeração de acordo com o índice de Kabat EU). Também pode ser utilizada uma ponte dissulfureto inter-cadeia adicional entre os domínios CH3 (Merchant, A.M. et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681), por exemplo, introduzindo uma mutação S354C no domínio CH3 da cadeia pesada com a “mutação no puxador” (denota como “mutações no puxador- cys" ou “mutações no puxador- cys”) e introduzindo uma mutação Y349C no domínio CH3 da cadeia pesada com as “mutações no buraco” (denota como “mutações no buraco- cys” ou “mutações buraco- cys”) (numeração de acordo com o índice de Kabat EU). Mas isso está ausente nas moléculas da presente invenção.
[081] Informações gerais sobre as sequências nucleotídicas das cadeias leves e pesadas de imunoglobulinas humanas são fornecidas em: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).)
[082] Métodos e técnicas úteis para realizar a presente invenção são descritos em, por exemplo, Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes | to Ill (1997); Glover, N.D., e Hames, B.D., ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes | e Il (1985), Oxford University Press; Freshney, R.l. (ed.), Animal Cell Culture - a practical approach, IRL Press Limited (1986); Watson, J.D., et al., Recombinant DNA, Second Edition, CHSL Press (1992); Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers (1987); Celis, J., ed., Cell Biology, Second Edition, Academic Press (1998); Freshney, R.1., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, second edition, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987).
[083] O uso da tecnologia de DNA recombinante permite a geração de derivados de um ácido nucleico. Tais derivados podem, por exemplo, ser modificados em posições individuais ou em várias posições de nucleotídeos por substituição, alteração, troca, exclusão ou inserção. A modificação ou derivatização pode, por exemplo, ser realizada por meio de mutagênese direcionada ao local. Tais modificações podem ser facilmente realizadas por um técnico no assunto (consulte, por exemplo, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B.D., and Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, Inglaterra).
[084] Deve-se notar que, conforme aqui utilizado e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma” e “o/ a” incluem referência plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a “uma célula” inclui uma pluralidade dessas células e seus equivalentes conhecidos pelos técnicos no assunto, e assim por diante. Além disso, os termos “um” (ou “uma”), “um ou mais” e “pelo menos um” podem ser usados de forma intercambiável neste documento. É também de notar que os termos “que compreende”, “incluindo” e “tendo” podem ser usados de forma intercambiável.
[085] O termo “MHCFCcRP” denota um polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada mutado que compreende pelo menos um domínio 3 (CH3) constante de imunoglobulina que compreende a mutação no puxador ou as mutações no buraco e pelo menos uma mutação perturbadora (ou seja, desestabilizadora), que está introduzindo uma carga repulsiva (ou seja, única e/ ou adicional) em relação à sequência do tipo selvagem. Ou seja, quando o MHCFCcRP é emparelhado com um segundo polipeptídeo contendo o domínio CH3, o segundo domínio CH3 compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana em sua sequência de aminoácidos na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem (em uma imunoglobulina do tipo selvagem) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora. Em uma forma de realização, a mutação perturbadora é selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E3S57L, ESS57F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366], L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394]1, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407|, K409D, K409E, K409], K439E, L441Y, Y349C, S366T, A3S68L, V407Y, S354C, e W366T (numeração de acordo com o índice de Kabat EU). Em uma forma de realização preferida, as mutações perturbadoras são selecionadas a partir do grupo de mutações que consiste em D356K, E357K, K370E, e K439E.
[086] O termo “BiFab” denota uma molécula que compreende dois pares de V1-C1/V2-C2, em que V indica um domínio variável de anticorpo e C indica um domínio constante de anticorpo, que estão associados um ao outro. Por exemplo, os pares podem ser VH1-CH1/VL1-CL e VH2-CH31/VL2- CH32. Da mesma forma, o termo “TriFfab” indica uma molécula que compreende três pares de V1-C1/V2-C2, em que V indica um domínio variável de anticorpo e C indica um domínio constante de anticorpo, que estão associados um ao outro. Por exemplo, os pares podem ser VH1-CH1/VL1-CL, VH2-CH1/VL2-CL, e VH3-CH31/VL3-CH3,2.
[087] O termo “cerca de” indica um intervalo de +/- 20% do valor subsequente a seguir. Em uma forma de realização, o termo cerca de indica um intervalo de +/- 10% do valor subsequente a seguir. Em uma forma de realização, o termo cerca de indica um intervalo de +/- 5% do valor subsequente a seguir.
[088] O termo “substituição de aminoácidos" ou “mutação de aminoácidos” denota a substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido em uma sequência de aminoácidos parental predeterminada por um resíduo de aminoácido “de substituição” diferente. O resíduo ou resíduos de substituição podem ser um “resíduo de aminoácido que ocorre naturalmente” (ou seja, codificado pelo código genético) e selecionado a partir do grupo que consiste em: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys); glutamina (Gln); ácido glutâmico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (Ile): leucina (Leu); lisina (Lis); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptofano (Trp); tirosina (Tyr); e valina (Val). Em uma forma de realização, o resíduo de substituição não é cisteína. A substituição por um ou mais resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural também é abrangida pela definição de uma substituição de aminoácidos neste documento. Um “resíduo de aminoácido que não ocorre naturalmente” indica um resíduo, além dos resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente listados acima, que é capaz de ligar covalentemente resíduos ou resíduos de aminoácidos adjacentes em uma cadeia polipeptídica. Exemplos de resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural incluem norleucina, ornitina, norvalina, homoserina, aib e outros análogos de resíduos de aminoácidos, como os descritos em Ellman, et al., Meth. Enzym. 202 (1991)
301-336. Para gerar esses resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente, os procedimentos de Noren, et al. (Science 244 (1989) 182) e/ ou Ellman, et al. (supra) pode ser usado. Resumidamente, esses procedimentos envolvem a ativação química de um tRNA supressor com um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural seguido de transcrição e tradução in vitro do RNA. Os aminoácidos de ocorrência não natural também podem ser incorporados nos peptídeos por síntese química de peptídeos e subsequente fusão desses peptídeos com polipeptídeos produzidos de forma recombinante, como anticorpos ou fragmentos de anticorpos.
[089] O termo “citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)' é uma função mediada pela ligação ao receptor Fc e refere-se à lise das células alvo mediadas por uma região Fc de anticorpo na presença de células efetoras. O ADCC é medido em uma forma de realização pelo tratamento de uma preparação de células eritróides que expressam alvo (por exemplo, células K562 que expressam alvo recombinante) com uma região Fc que compreende o polipeptídeo conforme relatado aqui na presença de células efetoras como PBMC recém-isolado (sangue mononuclear periférico de sangue periférico) células efetoras purificadas de camadas leucocitária (buffy coats), como monócitos ou células NK (natural killer). As células alvo são marcadas com Cr-51 e subsequentemente incubadas com o polipeptídeo, tal como aqui relatado. As células marcadas são incubadas com células efetoras e o sobrenadante é analisado quanto à liberação de Cr-51. Os controles incluem a incubação das células endoteliais alvo com células efetoras, mas sem o polipeptídeo, tal como aqui relatado. A capacidade do polipeptídeo para induzir as etapas de partida que mediam o ADCC é investigada medindo a ligação a células que expressam receptores Fcy, tais como células que expressam células recombinantemente FcyRI e/ ou FCyRIIA ou NK (expressando essencialmente FCyRIIIA). Em uma forma de realização preferida, a ligação a
FcyR nas células NK é medida.
[090] O termo “domínio CH1” indica a parte de um polipeptídeo da cadeia pesada de anticorpo que se estende aproximadamente da posição 118 da UE à posição 215 da UE (sistema de numeração da UE). Em uma forma de realização, um domínio CH1 compreende a sequência de aminoácidos de ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS
WNSGALTSGV HTFPAVLOSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTOT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSC (SEQ ID NO: 27).
[091] O termo “domínio CH2" indica a parte de um polipeptídeo da cadeia pesada de anticorpo que se estende aproximadamente da posição 231 da UE à posição 340 da UE (sistema de numeração da UE de acordo com Kabat). Em uma forma de realização, um domínio CH2 compreende a sequência de aminoácidos de APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT
CVWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQESTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAK (SEQ ID NO: 28). O domínio CH2 é único, pois não está emparelhado estreitamente com outro domínio. Em vez disso, duas cadeias de carboidratos ramificadas ligadas a N são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma região Fc nativa intacta. Especula-se que o carboidrato possa fornecer um substituto para o emparelhamento domínio-domínio e ajudar a estabilizar o domínio CH2. Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206.
[092] O termo “domínio CH3" denota a parte de um polipeptídeo da cadeia pesada de anticorpo que se estende aproximadamente da posição 341 da EU à posição 446 da EU. Em uma forma de realização, o domínio CH3 compreende a sequência de aminoácidos de GQPREPQVYT LPPSRDELTK
NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQOKS LSLSP (SEQ ID NO: 29).
[093] O termo “que compreende” também inclui o termo
“consistindo em”.
[094] O termo “citotoxicidade dependente do complemento (CDC) refere-se à lise de células induzidas pela região Fc de um anticorpo, tal como aqui relatado, na presença de complemento. O CDC é medido em uma forma de realização pelo tratamento de células endoteliais humanas que expressam alvo com um polipeptídeo, tal como aqui relatado, na presença de complemento. As células estão em uma forma de realização marcada com calceína. O CDC é encontrado se o polipeptídeo induzir a lise de 20% ou mais das células alvo a uma concentração de 30 ug/ ml. A ligação ao fator C1q do complemento pode ser medida em um ELISA. Nesse ensaio, em princípio, uma placa ELISA é revestida com faixas de concentração do polipeptídeo, às quais é adicionado C1q humano purificado ou soro humano. A ligação de C1iq é detectada por um anticorpo direcionado contra C1qg seguido por um conjugado marcado com peroxidase. A detecção da ligação (ligação máxima Bmax) é medida como densidade óptica a 405 nm (OD405) para o substrato de peroxidase ABTSº (2,2'-azino-di- [3-etilbenztiazolina-6-sulfonato]).
[095] Conforme aqui utilizado, “tratamento” (e variações gramaticais dos mesmos, como “tratar” ou “tratando”) refere-se à intervenção clínica na tentativa de alterar o curso natural do indivíduo sendo tratado e pode ser realizada para profilaxia ou durante a curso de patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem, entre outros, prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástases, diminuição da taxa de progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença e remissão ou prognóstico melhorado. Em algumas formas de realização, os anticorpos, tais como aqui relatados, são usados para atrasar o desenvolvimento de uma doença ou para retardar a progressão de uma doença.
[096] “Funções efetoras" se referem às atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com a classe de anticorpos da qual é derivada. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação a C1iq e citotoxicidade dependente do complemento (CDC); ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B); e ativação de células B.
[097] As funções efetoras dependentes da ligação ao receptor Fc podem ser mediadas pela interação da região Fc de um anticorpo com os receptores FC (FcRs), que são receptores especializados da superfície celular em células hematopoiéticas. Os receptores Fc pertencem à superfamília da imunoglobulina e demonstraram mediar a remoção de patógenos revestidos por anticorpos por fagocitose de complexos imunes e a lise de eritrócitos e vários outros alvos celulares (por exemplo, células tumorais) apresentando a região Fc, via citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC) (consulte, por exemplo, Van de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524). Os FcRs são definidos por sua especificidade para os isotipos de imunoglobulina: os receptores Fc para as regiões Fc do tipo IgG são referidos como FcyR. A ligação ao receptor Fc é descrita, por exemplo, em Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., et al., Innunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M,, et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; Gessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248.
[098] A reticulação de receptores para a região Fc de anticorpos do tipo IgG (FcyR) desencadeia uma ampla variedade de funções efetoras, incluindo fagocitose, citotoxicidade celular dependente de anticorpo e liberação de mediadores inflamatórios, além de depuração do complexo imune e regulação da produção de anticorpos. Em humanos, foram caracterizadas três classes de FcyR, que são: - FCcyRI (CD64) liga-se à IgG monomérica com alta afinidade e é expresso em macrófagos, monócitos, neutrófilos e eosinófilos. A modificação na IgG da região Fc pelo menos em um dos resíduos de aminoácido E233- G236, P238, D265, N297, A327 e P329 (numeração de acordo com o índice de Kabat UE) reduz a ligação ao FcyRI. Os resíduos de IgG2 nas posições 233- 236, substituídos em IgG1 e IgG4, reduziram a ligação a FcyRI em 10 vezes e eliminaram a resposta do monócito humano aos glóbulos vermelhos sensibilizados por anticorpos (Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624).
- FCcyRII (CD32) liga IgG complexada com afinidade média a baixa e é amplamente expresso. Este receptor pode ser dividido em dois subtipos, FCyRIIA e FCyRIIB. O FcyRIIA é encontrado em muitas células envolvidas na morte (por exemplo, macrófagos, monócitos, neutrófilos) e parece capaz de ativar o processo de morte. O FcyRIIB parece desempenhar um papel nos processos inibitórios e é encontrado nas células B, macrófagos e mastócitos e eosinófilos. Nas células B, parece funcionar para suprimir a produção adicional de imunoglobulinas e a troca de isotipos para, por exemplo, a classe IgE. Nos macrófagos, o FCcyRIIB atua para inibir a fagocitose, mediada por FCyRIIA. Em eosinófilos e mastócitos, a forma B pode ajudar a suprimir a ativação dessas células através da ligação de IgE ao seu receptor separado. A ligação reduzida para FCyRIIA é encontrada, por exemplo, para anticorpos que compreendem uma região Fc de IgG com mutações pelo menos em um dos resíduos de aminoácidos E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q0295, A327, R292, e K414 (numeração de acordo com o índice de Kabat UE).
- FeyRIll (CD16) liga-se à IGG com afinidade média a baixa e existe como dois tipos. FCyRIIIA é encontrada em células NK, macrófagos, eosinófilos e alguns monócitos e células T e medeia o ADCC. FcyRIIIB é altamente expresso em neutrófilos. A ligação reduzida a FCyRIIIA é encontrada, por exemplo, para anticorpos que compreende uma região IgG Fc com mutação pelo menos em um dos resíduos de aminoácido E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 e D376 (numeração de acordo com o índice de Kabat UE).
[099] O mapeamento dos locais de ligação na I9G1 humana para os receptores Fc, os locais de mutação acima mencionados e os métodos para medir a ligação a FcyRI e FCyRIIA são descritos em Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604.
[0100] O termo “região de dobradiça” denota a parte de um polipeptídeo da cadeia pesada de anticorpo que une em uma cadeia pesada de anticorpo do tipo selvagem o domínio CH1 e o domínio CH2, por exemplo, da posição 221 à posição 230, de acordo com o sistema de numeração da Kabat UE, ou da posição 226 à posição 230, de acordo com o sistema de numeração da Kabat UE. As regiões de dobradiça de outras subclasses de IgG podem ser determinadas alinhando-se com os resíduos de cisteína da região de dobradiça da sequência de subclasse de IgG1.
[0101] A região de dobradiça é normalmente uma molécula dimérica que consiste em dois polipeptídeos com sequência de aminoácidos idêntica. A região de dobradiça normalmente possui a sequência de aminoácidos DKTHTCPXCP (SEQ ID NO: 30), em que XK é S ou P ou HTCPXCP (SEQ ID NO: 31), em que X é S ou P ou CPXCP (SEQ ID NO: 32), em que Xé S ou P.
[0102] Em uma forma de realização, a região de dobradiça não possui ligações dissulfeto internas. Isso é alcançado substituindo os resíduos de cisteína na sequência da SEQ ID NO: 32 (e igualmente na SEQ ID NO: 30 e 31) por resíduos de serina ou excluindo o trecho CPXC (SEQ ID NO: 95) da região de dobradiça da SEQ ID NO: 30, 31 ou 32.
[0103] O termo “ligante peptídico” denota um ligante de origem natural e/ ou sintética.
Um ligante peptídico consiste em uma cadeia linear de aminoácidos em que os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente são os blocos de construção monoméricos que são conectados por ligações peptídicas.
A cadeia tem um comprimento de 1 a 50 resíduos de aminoácidos, de forma preferida entre 1 e 28 resíduos de aminoácidos, especialmente preferida entre 3 e 25 resíduos de aminoácidos.
O ligante peptídico pode conter sequências de aminoácidos repetitivas ou sequências de polipeptídeos de ocorrência natural.
O ligante peptídico tem a função de garantir que os domínios de um polipeptídeo de fusão possam desempenhar sua atividade biológica, permitindo que os domínios se dobrem corretamente e sejam apresentados adequadamente.
De preferência, o ligante peptídico é um “ligante peptídico sintético” designado como rico em resíduos de glicina, glutamina e/ ou serina.
Estes resíduos estão dispostos, por exemplo, em pequenas unidades repetitivas de até cinco aminoácidos, como GGGS (SEQ ID NO: 69), GGGGS (SEQ ID NO: 70), QQQG (SEQ ID NO: 71), Q0QQG (SEQ ID NO: 72), SSSG (SEQ ID NO: 73) ou SSSSG (SEQ ID NO: 74). Esta pequena unidade repetitiva pode ser repetida por duas a cinco vezes para formar uma unidade multimérica, como por exemplo (GGGS)2 (SEQ ID NO: 75) (GGGS)3 (SEQ ID NO: 76) (GGGS)4 (SEQ ID NO: 77) (GGGS)5 (SEQ ID NO: 78) (GGGGS)2 (SEQ ID NO: 79) (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 80), ou (GGGGS)A (SEQ ID NO: 81). Em uma forma de realização, o ligante peptídico é selecionado a partir do grupo de ligantes da SEQ ID NO: 69 a 82. Em uma forma de realização, cada um dos ligantes peptídicos é selecionado, de forma independente um do outro, a partir do grupo de ligantes que consiste na SEQ ID NO: 69 a 82. Em uma forma de realização preferida, o ligante peptídico/ cada ligante peptídico é selecionado (de forma independente um do outro) a partir do grupo de ligantes que consiste na SEQ ID NO: 75 a 81. Nas extremidades amino e/ ou carboxi-terminais da unidade multimérica podem ser adicionados até seis aminoácidos arbitrários adicionais que ocorrem naturalmente. Outros ligantes peptídicos sintéticos são compostos de um único aminoácido, que é repetido entre 10 a 20 vezes e pode compreender na extremidade amino e/ ou carboxi-terminal até seis aminoácidos arbitrários adicionais de ocorrência natural, como por exemplo, serina no ligante GSSSSSSSSSSSSSSSG (SEQ ID NO: 82). Todos os ligantes peptídicos podem ser codificados por uma molécula de ácido nucleico e, portanto, podem ser expressos de forma recombinante. Como os ligantes são eles próprios peptídeos, o peptídeo antifusogênico é conectado ao ligante através de uma ligação peptídica que é formada entre dois aminoácidos.
[0104] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula que não seja um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que liga o antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, Fv, scFv, Fab, scFab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpo, veja Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Para uma revisão dos fragmentos scFv, consulte, por exemplo, Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315; ver também WO 93/16185; US 5,571,894 e US 5,587 ,458.
[0105] Os diacorpos são fragmentos de anticorpos com dois locais de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Consulte, por exemplo, EP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; e Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-
6448. Triacorpos e tretracorpos também são descritos em Hudson, P.J. et al.,
Nat. Med. 9 (20039 129-134).
[0106] Anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo que compreende toda ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada ou toda ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de anticorpo. Em certas formas de realização, um anticorpo de domínio único é um anticorpo humano de domínio único (Domantis, Inc., Waltham, MA; consulte, por exemplo, US 6,248,516).
[0107] Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por várias técnicas, incluindo, entre outros, a digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como a produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coli ou fago).
[0108] O termo “fragmento de anticorpo” também inclui um “Fab de ação dupla” ou “DAF” que compreende um local de ligação ao antígeno que se liga a dois antígenos diferentes (consulte, US 2008/0069820, por exemplo).
[0109] UM “anticorpo monoespecífico” indica um anticorpo que possui uma única especificidade de ligação para um antígeno. Os anticorpos monoespecíficos podem ser preparados como anticorpos de tamanho completo ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, F(ab')2) ou combinações dos mesmos (por exemplo, anticorpo de comprimento completo mais fragmentos scFv ou Fab adicionais).
[0110] Um “anticorpo multiespecífico” indica um anticorpo que possui especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes no mesmo antígeno ou dois antígenos diferentes. Os anticorpos multiespecíficos podem ser preparados como anticorpos completos ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2) ou combinações dos mesmos (por exemplo, anticorpo completo, mais fragmentos adicionais de scFv ou Fab). Anticorpos manipulados com dois, três ou mais (por exemplo, quatro) locais de ligação ao antígeno funcional também foram relatados (consulte, por exemplo,
US 2002/0004587 A1) Um anticorpo multiespecífico é um anticorpo biespecífico. Os anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos por efeitos de direção eletrostática de engenharia para produzir moléculas Fc- heterodiméricas de anticorpos (WO 2009/089004).
[0111] O termo “ligação a” denota a ligação de um local de ligação ao seu alvo, como por exemplo, de um local de ligação de anticorpo que compreende um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo e um domínio variável da cadeia leve de anticorpo ao respectivo antígeno. Essa ligação pode ser determinada usando, por exemplo, um ensaio BlAcoreº (GE Healthcare, Uppsala, Suécia). Esse é o termo “ligação (a um antígeno)" denota a ligação de um anticorpo em um ensaio in vitro. Em uma forma de realização, a ligação é determinada em um ensaio de ligação no qual o anticorpo está ligado a uma superfície e a ligação do antígeno ao anticorpo é medida por Ressonância Plasmon de Superfície (SPR). Ligação significa, por exemplo, uma afinidade de ligação (KD) de 108 M ou menos, em algumas formas de realização de 10º a 10º M, em algumas formas de realização de 10? a 10º M. O termo “ligação” também inclui o termo “especificamente vinculativo”.
[0112] A ligação pode ser investigada por um ensaio BlAcoreº (GE Healthcare Biosensor AB, Uppsala, Suécia). A afinidade da ligação é definida pelos termos ka (constante de taxa para a associação de anticorpo do complexo anticorpo/ antígeno), ka (constante de dissociação) e Kp (Kd/ ka).
[0113] Por exemplo, em uma forma de realização possível do ensaio BlAcoreº, o antígeno é ligado a uma superfície e a ligação do local de ligação ao anticorpo é medida por ressonância plasmônica de superfície (SPR). A afinidade da ligação é definida pelos termos ka (constante de associação: constante de taxa para a associação formar um complexo), kd (constante de dissociação; constante de taxa para dissociação do complexo) e KD (kd/ ka). De forma alternativa, o sinal de ligação de um sensorgrama SPR pode ser comparado diretamente ao sinal de resposta de uma referência, com relação à altura do sinal de ressonância e aos comportamentos de dissociação.
[0114]O termo “local de ligação” denota qualquer entidade proteica que mostra especificidade de ligação a um alvo. Isso pode ser, por exemplo, um receptor, um ligante de receptor, uma anticalina, um aficorpo, um anticorpo, etc. Assim, o termo “local de ligação”, conforme aqui utilizado, denota um polipeptídeo que pode se ligar especificamente a ou pode ser especificamente ligado por um segundo polipeptídeo. Em uma forma de realização, o local de ligação é selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que consiste em um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo, um domínio variável da cadeia leve de anticorpo, um par de uma cadeia pesada de anticorpo e um domínio variável da cadeia leve de anticorpo, um receptor ou fragmento funcional do mesmo, um ligante de receptor ou um fragmento funcional do mesmo, uma enzima ou seu substrato.
[0115] No caso de um anticorpo, o local de ligação compreende pelo menos três HVRs (por exemplo, no caso de um VHH) ou seis HVRs (por exemplo, no caso de um anticorpo que ocorre naturalmente, ou seja, nativo). Geralmente, os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno estão formando o local de ligação. Estes resíduos estão normalmente contidos em um par de um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo e um domínio variável da cadeia leve de anticorpo cognato. O local de ligação ao antígeno de um anticorpo compreende resíduos de aminoácidos das “regiões hipervariáveis" ou “HVRsS”. As regiões “Framework” ou “FR” são aquelas regiões de domínio variável que não sejam os resíduos da região hipervariável, conforme aqui definido. Portanto, os domínios variáveis da cadeia leve e pesada de um anticorpo compreendem do terminal N ao C as regiões FR1, HVRI/CDR1, FR2, HVR2/CDR2, FR3, HVR3/CDR3, e FR4 (estrutura de imunoglobulina). Especialmente, a região
HVR3/ CDR3 do domínio variável da cadeia pesada é a região que mais contribui para a ligação ao antígeno e define a especificidade de ligação de um anticorpo. Um “local de ligação funcional” é capaz de se ligar especificamente ao seu alvo. O termo “ligação específica a" denota a ligação de um local de ligação ao seu alvo em um ensaio in vitro, em uma forma de realização em um ensaio de ligação. Esse ensaio de ligação pode ser qualquer ensaio desde que o evento de ligação possa ser detectado. Por exemplo, um ensaio no qual o anticorpo está ligado a uma superfície e a ligação do (s) antígeno (s) ao anticorpo é medido por Ressonância Plasmon de Superfície (SPR). De forma alternativa, um ELISA em ponte pode ser usado. Ligação significa uma afinidade de ligação de anticorpo (ligante) ao seu alvo (KD) de 10º M ou menos, em algumas formas de realização de 10? a 10º M, em algumas formas de realização de 10º a 10º M.
[0116] A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuída por sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, I9gG1, IgG2, I1gG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados a, 8, e, 1, e U, respectivamente.
[0117] O termo “região Fc” indica a região terminal C de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma parte da região de dobradiça, o domínio CH2 e o domínio CH3. Em uma forma de realização, uma região Fc da cadeia pesada de IgG humana se estende de Asp221, ou de Cys226, ou de Pro230, até o terminal carboxil da cadeia pesada. No entanto, a lisina do terminal C (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. A região Fc é composta por dois polipeptídeos da região Fc da cadeia pesada, que podem ser ligados covalentemente entre si através dos resíduos de cisteína da região de dobradiça, formando ligações dissulfeto inter-cadeia.
[0118] Os polipeptídeos/ ligantes multiméricos, tais como aqui relatados, podem compreender uma região Fc completa, em uma forma de realização uma região Fc derivada de origem humana, mas sem os resíduos de cisteína da região de dobradiça. Em uma forma de realização, a região Fc compreende todas as partes da região constante humana, mas sem os resíduos de cisteína da região de dobradiça. A região Fc de um anticorpo está diretamente envolvida na ativação do complemento, ligação a C1q, ativação C3 e ligação ao receptor Fc. Embora a influência de um anticorpo no sistema complemento seja dependente de certas condições, a ligação a C1qg é causada por locais de ligação definidos na região Fc. Tais locais de ligação são conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, por Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., e Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Inmunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Inmunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Inmunology 86 (1995) 319-324; e EP O 307
434. Esses locais de ligação são, por exemplo, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 e P329 (numeração de acordo com o índice de Kabat UE). Os anticorpos das subclasses IgG1, IgG2 e IgG3 geralmente mostram ativação do complemento, ligação de C1iq e ativação de C3, enquanto que IgG4 não ativa o sistema de complemento, não se liga a Ciq e não ativa C3. Uma “região Fc de um anticorpo” é um termo bem conhecido do técnico no assunto e definido com base na clivagem de anticorpos por papaína. Em uma forma de realização, a região Fc é uma região Fc humana. Em uma forma de realização, a região Fc é da subclasse I9gG4 humana que compreende as mutações S228P e/ ou L235E (numeração de acordo com o índice de Kabat UE). Em uma forma de realização, a região Fc é da subclasse I9gG1 humana que compreende as mutações L234A e L235A e opcionalmente, P329G (numeração de acordo com Oo Índice de Kabat UE).
[0119] O termo “anticorpo de comprimento total” denota um anticorpo tendo uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anticorpo nativa. Um anticorpo de comprimento total compreende duas cadeias leves de anticorpo de comprimento total, cada uma compreendendo um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve, e duas cadeias pesadas de anticorpo de comprimento total, cada uma compreendendo um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio constante, uma região de dobradiça, um segundo domínio constante e um terceiro domínio constante. Um anticorpo de comprimento total pode compreender outros domínios, como por exemplo, scFv adicional ou um scFab conjugado com uma ou mais das cadeias de anticorpo de comprimento total. Estes conjugados também são abrangidos pelo termo anticorpo de comprimento total.
[0120] Os termos “célula hospedeira”, “linha celular hospedeira” e “cultura de células hospedeiras” são usados de forma intercambiável e referem- se a células nas quais o ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula transformada primária e a progênie derivada das mesmas, sem levar em consideração o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica no conteúdo de ácido nucleico a uma célula-mãe, mas pode conter mutações. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como rastreada ou selecionada para a célula originalmente transformada está incluída aqui.
[0121] O termo “derivado de” denota que uma sequência de aminoácidos variante é obtida a partir de uma sequência de aminoácidos parental através da introdução de mutações/ mutações em pelo menos uma posição. Assim, uma sequência de aminoácidos derivada difere da sequência de aminoácidos parental correspondente em pelo menos uma posição correspondente. Em uma forma de realização, uma sequência de aminoácidos derivada de uma sequência de aminoácidos parental difere de um a quinze resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes. Em uma forma de realização, uma sequência de aminoácidos derivada de uma sequência de aminoácidos parental difere de um a dez resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes. Em uma forma de realização, uma sequência de aminoácidos derivada de uma sequência de aminoácidos parental difere de um a seis resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes. Da mesma forma, uma sequência de aminoácidos derivada tem uma identidade de sequência de aminoácidos alta à sua sequência de aminoácidos original. Em uma forma de realização, uma sequência de aminoácidos derivada de uma sequência de aminoácidos parental tem 80% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos. Em uma forma de realização, uma sequência de aminoácidos derivada de uma sequência de aminoácidos parental tem 90% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos. Em uma forma de realização, uma sequência de aminoácidos derivada de uma sequência de aminoácidos parental tem 95% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos.
[0122]EM uma forma de realização, um ou ambos os polipeptídeos da região Fc da cadeia pesada são derivados de um polipeptídeo da região Fc da SEQ ID NO: 1 e têm pelo menos uma mutação ou exclusão de aminoácido em comparação com o polipeptídeo da região Fc da SEQ ID NO: 1. Em uma forma de realização, o polipeptídeo da região Fc compreende/ tem de cerca de uma a cerca de dez mutações ou deleções de aminoácidos, e em uma forma de realização, de cerca de uma a cerca de cinco mutações ou deleções de aminoácidos. Em uma forma de realização, o polipeptídeo da região Fc tem pelo menos cerca de 80% de homologia com um polipeptídeo da região Fc humana da SEQ ID NO: 1. Em uma forma de realização, o polipeptídeo da região Fc tem pelo menos cerca de 90% de homologia com um polipeptídeo da região Fc humana da SEQ ID NO: 1. Em uma forma de realização, o polipeptídeo da região Fc tem pelo menos cerca de 95% de homologia com um polipeptídeo da região Fc humana da SEQ ID NO: 1.
[0123] O polipeptídeo da região Fc derivado de um polipeptídeo da região Fc humana da SEQ ID NO: 1 ou 2 ou 3 ou 4 é ainda definido pelas mutações de aminoácidos que estão contidas. Assim, por exemplo, o termo P329G denota um polipeptídeo da região Fc humano derivado do polipeptídeo da região Fc com a mutação de prolina em glicina na posição de aminoácido 329 em relação ao polipeptídeo da região Fc humana da SEQ ID NO: 1 ou 2, ou 3 ou 4.
[0124]UmM polipeptideo da região Fc da I9G1 humana compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVWV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV
KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 1).
[0125] As seguintes regiões Fc são variantes derivadas da região Fc da IgG1 humana do tipo selvagem.
[0126] Um polipeptídeo da região Fc derivada da região Fc da IgG1 humana com as mutações L234A, L235A compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV
KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 05).
[0127] Um polipeptídeo da região Fc derivada da região Fc da I9gG1 humana com as mutações Y349C, T366S, L368A e Y407V compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVWV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCA
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 06).
[0128] Um polipeptídeo da região Fc derivada da região Fc da I9gG1 humana com as mutações S354C, T366W compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCL
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 07).
[0129] Um polipeptídeo da região Fc derivada da região Fc da IgG1 humana com as mutações L234A, L235A e as mutações Y349C, T3668S, L368A, Y407V compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCA
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 08).
[0130] Um polipeptídeo da região Fc derivada da região Fc da IgG1 humana com as mutações L234A, L235A e S354C, T366W compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCL
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 09).
[0131] Um polipeptídeo da região Fc derivada da região Fc da I9G1 humana com a mutação P329G compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 10).
[0132] Um polipeptídeo da região Fc derivada da região Fc da IgG1 humana com as mutações L234A, L235A e uma mutação P329G compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 11).
[0133] Um polipeptídeo da região Fc derivada da região Fc da I9G1 humana com uma mutação P329G e as mutações Y349C, T366S, L368A, Y407V compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCA
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 12).
[0134] Um polipeptídeo da região Fc derivada da região Fc da IgG1 humana com uma mutação P329G e as mutações S354C, T366W compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVWV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCL
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 13).
[0135] Um polipeptídeo da região Fc derivada da região Fc da I9gG1 humana, com as mutações L234A, L235A, P329G e Y349C, T366S, L368A, Y407V, compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCA
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 14).
[0136] Um polipeptídeo da região Fc derivada da região Fc da IgG1 humana com as mutações L234A, L235A, P329G e as mutações S354C, T366W compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCL
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 15).
[0137]UmM polipeptideo da região Fc da IgG4 humana compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLT
CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 4).
[0138] As seguintes regiões Fc são variantes derivadas da região Fc da IgG4 humana do tipo selvagem.
[0139] Um polipeptídeo da região Fc derivada da região Fc da I9gG4 humana com as mutações S228P e L235E compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLT
CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 16).
[0140] Um polipeptídeo da região Fc derivada da região Fc da IgG4 humana com as mutações S228P, L235E e uma mutação P329G compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLT
CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 17).
[0141] Um polipeptídeo da região Fc derivada da região Fc da IgG4 humana com as mutações S354C, T366W compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSL
WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 18).
[0142] Um polipeptídeo da região Fc derivada da região Fc da Ig9gG4 humana com as mutações Y349C, T366S, L368A, Y407V compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLS
CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 19).
[0143] Um polipeptídeo da região Fc derivada da região Fc da I9gG4 humana com as mutações S228P, L235E e S354C, T366W compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSL
WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 20).
[0144] Um polipeptídeo da região Fc derivado da região Fc da I9gG4 humana com as mutações S228P, L235E e Y349C, T366S, L368A, Y407V compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLS
CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 21).
[0145] Um polipeptídeo da região Fc derivado da região Fc da
I9gG4 humana com as mutações P329G compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLT
CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 22).
[0146] Um polipeptídeo da região Fc derivado da região Fc da I9gG4 humana com as mutações P329G e Y349C, T366S, L368A, Y407V compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLS
CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 23).
[0147] Um polipeptídeo da região Fc derivado da região Fc da IgG4 humana com as mutações P329G e S354C, T366W compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSL
WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 24).
[0148] Um polipeptídeo da região Fc derivada da região Fc da IgG4 humana com as mutações S228P, L235E, P329G e Y349C, T366S, L368A, Y407V compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLS
CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 25).
[0149] Um polipeptídeo da região Fc derivado da região Fc da IgG4 humana com as mutações S228P, L235E, P329G e S354C, T366W compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSL
WECLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 26).
[0150] Um anticorpo “humanizado” refere-se a um anticorpo que compreende resíduos de aminoácidos de HVRs não humanos e resíduos de aminoácidos de FRs humanos. Em certas formas de realização, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos os pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis, nos quais todos ou substancialmente todos os HVRs (por exemplo, os CDRs) correspondem aos de um anticorpo não humano e todos ou substancialmente todos os FRs correspondem aos de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado opcionalmente, pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que sofreu humanização.
[0151] O termo “região hipervariável” ou “HVR”, conforme aqui utilizado, refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que compreende os trechos de resíduos de aminoácidos que são hipervariáveis em sequência (“regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs”) e/ ou formar laços estruturalmente definidos (“laços hipervariáveis”)
e/ ou conter os resíduos de contato com o antígeno (“contatos com o antígeno”). Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs; três no domínio variável da cadeia pesada VH (H1, H2, H3) e três no domínio variável da cadeia leve VL (L1, L2, L3).
[0152] As HVRs incluem (a) laços hipervariáveis que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), e 96-101 (H3) (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917); (b) CDRs que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), e 95-102 (H3) (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91- 3242); (c) contatos de antígeno que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), e 93- 101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); e (d) combinações de (a) (b) e/ ou (c), incluindo os resíduos de aminoácidos 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), e 94-102 (H3).
[0153] Salvo indicação em contrário, os resíduos HVR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos FR) são numerados aqui de acordo com Kabat et al., Supra.
[0154] O termo “cadeia leve” denota as cadeias polipeptídicas mais curtas dos anticorpos IgG nativos. A cadeia leve de anticorpo pode ser atribuída a um dos dois tipos, chamados Kappa (K) e lambda (A), com base na sequência de aminoácidos de seu domínio constante. Ver SEQ ID NO: 33 para um domínio constante da cadeia leve kappa humana e SEQ ID NO: 34 para um domínio constante da cadeia leve lambda humana.
[0155] O termo “paratopo” refere-se à parte de uma dada molécula de anticorpo que é necessária para a ligação específica entre um alvo e um local de ligação. Um paratopo pode ser contínuo, ou seja, formado por resíduos de aminoácidos adjacentes presentes no local de ligação, ou descontínuo, ou seja, formado por resíduos de aminoácidos que estão em posições sequencialmente diferentes na sequência primária, como na sequência de aminoácidos das HVRs/ CDRs, mas em estreita proximidade na estrutura tridimensional que o local de ligação adota.
[0156] Um anticorpo “isolado” é aquele que foi separado de um componente do seu ambiente natural. Em algumas formas de realização, um anticorpo é purificado com pureza superior a 95% ou 99%, conforme determinado por, por exemplo, eletroforético (por exemplo, SDS-PAGE, foco isoelétrico (IEF), eletroforese capilar, CE-SDS) ou cromatográfico (por exemplo, cromatografia de exclusão por tamanho ou troca por íons ou HPLC de fase reversa). Para revisão de métodos para avaliação da pureza de anticorpo, consulte, por exemplo, Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87.
[0157] Um ácido nucleico “isolado” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi separada de um componente do seu ambiente natural. Um ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que normalmente contêm a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromossômica ou em um local cromossômico diferente da sua localização cromossômica natural.
[0158] O termo “anticorpo monoclonal”, conforme aqui utilizado, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo naturalmente mutações que ocorrem ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente presentes em pequenas quantidades. Em contraste com as preparações de anticorpos policlonais, que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclional é direcionado contra um único determinante em um antígeno. Assim, o modificador “monoclonal” indica o caráter de anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como exigindo a produção de anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclionais a serem utilizados, de acordo com a presente invenção, podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo, entre outros, o método do hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição de fagos e métodos que utilizam animais transgênicos contendo todos ou parte dos locais de imunoglobulina humana, sendo aqui descritos esses métodos e outros métodos de exemplo para produzir anticorpos monoclionais.
[0159] “Anticorpos — nativos" — referem-se a moléculas de imunoglobulina que ocorrem naturalmente com estruturas variadas. Por exemplo, os anticorpos IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que estão ligadas por dissulfeto. Do terminal Nao C, cada cadeia pesada possui uma região variável (VH), também denominada domínio pesado variável ou domínio variável da cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). Da mesma forma, do terminal N ao C, cada cadeia leve possui uma região variável (VL), também denominada domínio leve variável ou domínio variável da cadeia leve, seguido por um domínio leve constante (CL). A cadeia leve de anticorpo pode ser atribuída a um dos dois tipos, chamados kappa (K) e lambda (A), com base na sequência de aminoácidos de seu domínio constante.
[0160]O termo “formulação farmacêutica” refere-se a uma preparação que é de forma a permitir que a atividade biológica de um ingrediente ativo contido nela seja eficaz e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação seria administrada.
[0161] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, que não seja um ingrediente ativo, que não é tóxico para um sujeito. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a um tampão, excipiente, estabilizador ou conservante.
[0162] O termo “anticorpo recombinante”, como aqui utilizado, denota todos os anticorpos (quiméricos, humanizados e humanos) que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes. Isso inclui anticorpos isolados de uma célula hospedeira, como uma célula NSO, HEK, BHK ou CHO, ou anticorpos expressos usando um plasmídeo de expressão recombinante transfectado para uma célula hospedeira.
[0163] O termo “valente”, conforme usado no presente pedido, denota a presença de um número especifico de locais de ligação em uma molécula (anticorpo). Como tal, os termos “bivalente”, “tetravalente” e “hexavalente” denotam a presença de dois locais de ligação, quatro locais de ligação e seis locais de ligação, respectivamente, em uma molécula (anticorpo). Os anticorpos biespecíficos, tais como aqui relatados, estão em uma forma de realização preferida “trivalente”. Os anticorpos triespecíficos, tais como aqui relatados, estão em uma forma de realização preferida “trivalente”.
[0164] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de um anticorpo da cadeia pesada ou leve que está envolvido na ligação de anticorpo ao seu antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões estruturais (FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs) (consulte, por exemplo, Kindt, TJ et al., Kuby Immunology, 6º ed., WH Freeman and Co., NY (2007), página 91). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno específico podem ser isolados usando um domínio VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para rastrear uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Consulte, por exemplo, Portolano, S. et al., J. Inmunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).
[0165] O termo “variante” denota moléculas que possuem uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos de uma molécula parental. Normalmente, essas moléculas têm uma ou mais mutações, inserções ou deleções. Em uma forma de realização, o anticorpo modificado ou o polipeptideo de fusão modificado compreende uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos uma porção de uma região Fc que não ocorre naturalmente. Tais moléculas têm menos de 100% de identidade de sequência com o domínio parental ou a região Fc. Em uma forma de realização, a variante tem uma sequência de aminoácidos que tem de cerca de 75% a menos de 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos do domínio parental ou região Fc, especialmente de cerca de 80% a menos de 100%, especialmente de cerca de 85% a menos de 100%, especialmente de cerca de 90% a menos de 100% e especialmente de cerca de 95% a menos de 100%. Em uma forma de realização, o domínio parental ou região Fc e o domínio variante ou região Fc diferem em um (um único), dois ou três resíduos de aminoácidos.
[0166] O termo “cruzamento de domínio”, conforme aqui utilizado, indica que em um par de um fragmento VH-CH1 da cadeia pesada de anticorpo e sua correspondente cadeia leve de anticorpo cognato, ou seja, em um braço de ligação de anticorpo (ou seja, no fragmento Fab), a sequência do domínio se desvia da sequência natural em que pelo menos um domínio da cadeia pesada é substituída pelo seu domínio da cadeia leve correspondente e vice- versa. Existem três tipos gerais de cruzamento de domínios (i) o cruzamento dos domínios CH1 e CL, o que leva à cadeia leve de cruzamento de domínio com uma sequência de domínio VL-CH1 e um fragmento da cadeia pesada de cruzamento de domínio com uma sequência de domínio VH-CL (ou uma cadeia pesada de anticorpo de comprimento total com uma sequência de domínio VH- CL-dobradiça-CH2-CH3) (ii) o cruzamento de domínio dos domínios VH e VL, que leva à cadeia leve cruzada de domínio com uma sequência de domínio VH-CL e um fragmento da cadeia pesada de cruzamento de domínio com uma sequência de domínio VL-CH1 e (iii) cruzamento de domínio da cadeia leve completa (VL-CL) e do fragmento da cadeia pesada de VH-CH1 completo (“Fab crossover”), que leva a uma cadeia leve cruzada de domínio com uma sequência de domínio VAH-CH1 e a um fragmento da cadeia pesada cruzada de domínio com uma sequência de domínio VL-CL (todas as sequências de domínio acima mencionadas são indicadas na direção do terminal N ao terminal C).
[0167] Como aqui utilizado, o termo “substituído um pelo outro” em relação aos domínios correspondentes das cadeias pesada e leve refere-se aos cruzamentos de domínio acima mencionados. Como tal, quando os domínios CH1 e CL são “substituídos um pelo outro”, é referido ao cruzamento de domínios mencionado no item (i) e a sequência de domínios resultante da cadeia pesada e leve. Dessa forma, quando VH e VL são “substituídos um pelo outro”, refere-se ao cruzamento de domínio mencionado no item (ii); e quando os domínios CH1 e CL são “substituídos um pelo outro” e os domínios VH1 e VL são “substituídos um pelo outro”, refere-se ao cruzamento de domínios mencionado no item (iii). Anticorpos biespecíficos incluindo cruzamentos de domínio são relatados, por exemplo, nos documentos WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254 e Schaefer, W. et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 108 (2011) 11187-11192.
[0168] O anticorpo multiespecífico produzido com um método, tal como aqui relatado, também pode compreender fragmentos Fab, incluindo um cruzamento de domínio dos domínios CH1 e CL, como mencionado no item (i) acima, ou um cruzamento de domínio dos domínios VH e VL, como mencionado no item (ii) acima. Os fragmentos Fab especificamente ligados ao (s) mesmo (s) antígeno (s) são construídos para ter a mesma sequência de domínio. Portanto, no caso de mais de um fragmento Fab com cruzamento de domínio estar contido no anticorpo multiespecífico, o referido fragmento Fab se liga especificamente ao mesmo antígeno.
[0169] Il. GERAÇÃO DE ANTICORPOS BI-/
MULTIESPECÍFICOS POR REAÇÃO DE TROCA DE ACORDO COM A INVENÇÃO
[0170] A) Método para converter derivados de IgG monovalentes monoespecíficos em IgG bivalentes biespecíficos
[0171]O método de troca conforme descrito a seguir pode conseguir a conversão de anticorpos monoespecíficos (monovalentes) ou fragmentos de anticorpos em anticorpos biespecíficos bivalentes (bsAbs) ou de anticorpos já multiespecíficos em anticorpos multiespecíficos de ordem superior, como por exemplo, anticorpos biespecíficos em anticorpos tri- ou tetraespecíficos.
[0172] Dois meios-anticorpos não funcionais (ou seja, apenas monoespecíficos para o alvo celular) são utilizados como material de partida. Como exemplo, 2/3-lgGs podem ser usados. 2/3-lgGs são compostos de uma cadeia pesada com o primeiro conjunto de mutações do tipo puxador-em-
buraco (KiH), uma cadeia leve complementar a ela, bem como uma região Fc, que é complementar à região Fc da cadeia pesada pelo respectivo segundo conjunto complementar de mutações de puxador-em-buraco. A região Fc complementar pode ser, por exemplo, um fragmento da cadeia pesada da região Fc ou uma segunda cadeia pesada (opcionalmente, sem especificidade de ligação). Para promover ainda a montagem correta de anticorpo bi (multi) específico desejado, a região Fc complementar compreende, além do segundo conjunto complementar de mutações em KiH, uma mutação de carga repulsiva perturbadora (desestabilizadora) adicional. Além disso, a região Fc complementar pode compreender um marcador de afinidade (por exemplo, um marcador His6 ou C) para remoção eficiente de edutos e produtos secundários não desejados após a sua produção. O segundo anticorpo monoespecífico não funcional compreende uma mutação perturbadora complementar. Estas duas mutações perturbadoras se transformam em mutações atraentes quando as metades de anticorpo trocam entre si, por exemplo, após a interação enquanto está ligado na superfície da célula.
[0173] A reação/ método de troca celular que pode ser realizada com as moléculas multiméricas, de acordo com a presente invenção, compreende a seguinte etapa: - trazer um primeiro polipeptídeo multimérico (inicial), que compreende um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, e um segundo polipeptídeo multimérico (inicial), que compreende um terceiro polipeptídeo e um quarto polipeptídeo, na proximidade na superfície de uma célula para trocar de forma cruzada o segundo e o terceiro polipeptídeo para formar um terceiro polipeptídeo multimérico (que compreende o primeiro e o quarto polipeptídeo) e um quarto polipeptídeo multimérico (que compreende o segundo e o terceiro polipeptídeo), em que i) o segundo polipeptídeo compreende uma mutação (primeira perturbação) resultando em uma desestabilização do primeiro polipeptídeo multimérico em comparação com um polipeptídeo (multimérico) idêntico ao referido primeiro polipeptídeo multimérico, exceto pela referida mutação no segundo polipeptídeo,
ii) o terceiro polipeptideo compreende uma mutação (segundo perturbação) resultando em uma desestabilização do segundo polipeptídeo multimérico em comparação com um polipeptídeo multimérico idêntico ao referido segundo polipeptídeo (multimérico), exceto pela referida mutação no terceiro polipeptídeo,
iii) a mutação (primeira perturbação) no segundo polipeptídeo e a mutação (segunda perturbação) no terceiro polipeptídeo resultam em uma estabilização do terceiro polipeptídeo multimérico (trocado) que compreende o referido segundo polipeptídeo e o referido terceiro polipeptídeo em comparação com o primeiro polipeptídeo multimérico (inicial) e/ ou para o segundo polipeptídeo multimérico (inicial),
iv) o quarto polipeptídeo multimérico (trocado) é mais estável em comparação com o primeiro polipeptídeo multimérico (inicial) e/ ou o segundo polipeptídeo multimérico (inicial),
v) o primeiro polipeptídeo multimérico e o segundo polipeptídeo multimérico compreendem apenas uma parte de um ou dois novos locais de ligação que não são funcionais, ou seja, que não podem se ligar ao seu alvo, e vi) o terceiro e/ ou o quarto polipeptídeo multimérico compreendem os um ou dois novos locais de ligação em forma funcional, ou seja, em uma forma que permita ligação específica ao seu respectivo alvo, em que os um ou dois novos locais de ligação funcional foram gerados/ ativados pela troca do segundo e do terceiro polipeptídeo entre o primeiro polipeptídeo multimérico e o segundo polipeptídeo multimérico, ou seja, trazendo as partes não funcionais dos referidos um ou dois novos locais de ligação para formar um ou dois novos locais de ligação funcional.
[0174] Assim, a presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na descoberta de que a adição de uma única mutação desestabilizadora (perturbadora) (unilateral, não emparelhada) em um polipeptídeo (hetero-) multimérico é suficiente para promover a troca de cadeias polipeptídicas com um segundo polipeptídeo (hetero-) multimérico, que compreende também uma única mutação desestabilizadora (perturbadora) (unilateral, não emparelhada), pois ambos os polipeptídeos (hetero-) multiméricos trocados recém-formados resultantes têm estabilidade melhorada em comparação com os polipeptídeos (hetero-) multiméricos de partida (ou seja, energia livre de ligação a CH3-CH3 mais baixa) à medida que as mutações desestabilizadoras se transformam em mutações atraentes após troca e recombinação. A única condição a ser seguida é que as mutações desestabilizadoras (perturbadoras) sejam introduzidas em posições que interagem entre si, uma vez que os respectivos polipeptídeos se associam.
[0175] Esta = metodologia pode ser aplicada a qualquer polipeptídeo (hetero-) multimérico que preenche os critérios descritos acima.
[0176] No entanto, o método, de acordo com a presente invenção, é especialmente útil na área farmacêutica.
[0177] São conhecidos no estado da técnica métodos diferentes para a geração de polipeptídeos (hetero-) multiméricos. Qualquer um desses métodos pode ser utilizado desde que as mutações necessárias para a formação dos polipeptídeos (hetero-) multiméricos de partida não interfiram ou se sobreponham às mutações desestabilizantes (perturbadoras) necessárias para a reação de troca de acordo com a presente invenção.
[0178] Voltando à área farmacêutica, os anticorpos são a classe de ligantes mais amplamente utilizada. Os anticorpos dimerizam por meio de interações em sua região constante, especialmente entre os domínios CH3 das cadeias pesadas.
[0179] Assim, a presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na constatação de que, para realizar o método de acordo com a presente invenção, é suficiente a introdução de uma única mutação desestabilizadora em um domínio CH3 de um par de domínios CH3. Mais detalhadamente, verificou-se que a introdução de uma primeira mutação desestabilizadora na posição 357 em apenas um domínio CH3 do primeiro polipeptídeo (hetero-) multimérico de partida e uma segunda mutação desestabilizadora na posição 370 em apenas um domínio CH3 do segundo o polipeptídeo de partida promove por abordagem espacial entre os dois polipeptídeos (hetero-) multiméricos de partida a troca espontânea de cadeias polipeptídicas entre esses polipeptídeos de partida. Um dos polipeptídeos trocados resultantes compreende o par de domínio CH3 com as mutações nas posições 357 e 370, respectivamente, que resultam em uma estabilização do (hetero-) multímero trocado. O mesmo pode ser alcançado com as mutações nas posições 356 e
439. A numeração de todas as posições está de acordo com o índice de Kabat UE. Um par preferido de mutações é o ES57K e o K370E. Outro par preferido de mutações é D356K e K439E. O método, de acordo com a presente invenção, pode ser aplicado a qualquer subclasse de IgG, ou seja, I9G1, IgG2, I9G3 e IgG4, pois os resíduos em questão são altamente conservados. Em uma forma de realização preferida, o domínio CH3 é da subclasse I9G1.
[0180] A invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de que as cadeias polipeptídicas dos polipeptídeos de partida (hetero-) multiméricos não precisam estar covalentemente ligadas entre si, por exemplo, via ligações dissulfeto, para permitir a formação e isolamento dos polipeptídeos (hetero-) multiméricos de partida. Mais detalhadamente, como os polipeptídeos de partida já são heterodímeros, estes compreenderão outras mutações para heterodimerização. Verificou-se que estas mutações são suficientes para estabilizar os heterodímeros de partida, mesmo na presença de uma mutação unilateral desestabilizadora (perturbadora) específica. Assim, a necessidade de uma ligação covalente das cadeias nos polipeptídeos de partida (hetero-) multiméricos não é mais dada. Assim, em uma forma de realização, no caso de região de dobradiça contendo polipeptídeos de partida (hetero-) multiméricos, essas regiões de dobradiça compreendem as mutações C2268S e C229S ou uma exclusão de toda a sequência CPXC (SEQ ID NO: 95) (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
[0181] Pela omissão de ligações dissulfeto entre a região Fc que compreende cadeias dos polipeptídeos de partida (hetero-) multiméricos, não é necessário agente redutor para iniciar a reação de troca. Isso permite que a reação de troca ocorra sob condições in vivo leves. Além disso, outras ligações dissulfeto podem estar presentes nos polipeptídeos (hetero-) multiméricos de partida, como por exemplo, em um fragmento Fab, desde que estes não interfrtam na reação de troca (ligam covalentemente o domínio CH3 que compreende polipeptídeos juntos).
[0182]A invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de que polipeptídeos (hetero-) multiméricos trocados, por exemplo, aqueles que compreendem apenas os locais funcionais e de ligação ao alvo, podem ainda ser estabilizados pela formação de ligações dissulfeto somente após a reação de troca. Por exemplo, mutações bem estabelecidas para a formação de anticorpos (hetero-) multiméricos são as mutações de puxador- em-buraco. Estes existem em duas variantes: sem e com ligação dissulfeto adicional. Assim, um polipeptídeo de partida (hetero-) multimérico alternativo compreende as mutações de puxadores para dentro dos buracos para a formação dos polipeptídeos de partida (hetero-) multimérico e fornece o resíduo de cisteína dos puxadores para dentro dos buracos apenas na cadeia de polipeptídeo que abriga a segmentação por locais de ligação. Assim, apenas no polipeptídeo (hetero-) multimérico trocado, que compreende os dois locais de ligação ao alvo, estão presentes os dois resíduos de cisteína necessários para a formação de uma ligação dissulfeto nas posições combinantes correspondentes. Assim, apenas no referido produto trocado é formada uma ligação dissulfureto. Isso resulta em uma estabilização adicional do polipeptídeo (hetero-) multimérico trocado por alvo, impedindo a dissociação e/ OU reação reversa.
[0183] O termo “(hetero-) multimérico”, conforme aqui utilizado, denota um polipeptídeo que compreende pelo menos duas cadeias polipeptídicas que não são idênticas nas sequências de aminoácidos, parcial ou totalmente, e que atendem aos requisitos da invenção. O termo também abrange polipeptídeos que compreende três ou mais cadeias polipeptídicas, desde que pelo menos duas delas sejam (hetero-) multiméricas de acordo com a invenção. Assim, o termo “multimérico” denota um polipeptídeo que compreende pelo menos três cadeias polipeptídicas, das quais pelo menos duas são (hetero-) multiméricas e atendem aos requisitos da invenção.
[0184] O termo “mutação perturbadora” denota uma mutação que resulta na desestabilização de um polipeptídeo (hetero-) dimérico. Esta desestabilização é geralmente alcançada alterando a carga de um resíduo de aminoácido, tal como, por exemplo, trocando um resíduo de aminoácido carregado positivamente por um resíduo de aminoácido carregado negativamente, ou vice-versa. Essa troca resulta em cargas iguais em posições de interação da interface do domínio CH3-CH3 e, portanto, na repulsão de carga. Um par preferido de mutações é o E357K e o K370E. Outro par preferido de mutações é D356K e K439E. Adicionalmente, o método, de acordo com a presente invenção, pode ser aplicado a qualquer subclasse de IgG, ou seja, I9G1, IgG2, IgG3 e IgG4, pois os resíduos em questão são altamente conservados. Em uma forma de realização preferida, o domínio CH3 é da subclasse IgG1.
[0185] Um método para avaliar o efeito da mutação do domínio CH3 na estabilidade do dímero é divulgado no documento WO 2009/089004 (incorporado aqui por referência). Nele é descrito como o software EGAD pode ser usado para estimar a energia livre de ligação ao domínio CH3-CH3 (ver também Pokala, N. e Handel, TM, J. Mol. Biol. 347 (2005)203-227, incorporado aqui por referência na sua totalidade):
[0186] O EGAD pode ser usado para comparar aproximadamente a energia livre de ligação de várias mutações feitas na interface do domínio CH3. A energia livre de ligação de um mutante é definida como AAGmut = yu (AGmut - AGwt) (mut = mutante, wt = tipo selvagem). Onde yu (= 0,1, em geral) é o fator de escala usado para normalizar as mudanças previstas na afinidade de ligação para ter uma inclihação de 1 ao comparar com as energias experimentais. A energia livre de dissociação (AG) é definida como a diferença de energia entre o complexo (AGligação) e os estados livres (AGlivre).
[0187] A invenção é exemplificada a seguir com materiais de partida específicos e de exemplo, ou seja, 2/3-lgGs. Ou seja, apresentado como uma exemplificação do conceito geral subjacente e não deve ser interpretado como uma limitação da invenção. O verdadeiro escopo da invenção é apresentado nas reivindicações.
[0188] A Figura 1 mostra o design e a composição modular de 2/3- IgGs utilizados como compostos de partida de exemplo nos métodos de acordo com a presente invenção. 2/3-IgGs são compostos de três cadeias individuais: uma cadeia leve (normalmente uma cadeia leve de comprimento total que compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve), uma cadeia pesada (normalmente uma cadeia pesada de comprimento total que compreende um domínio variável da cadeia pesada e todos os domínios constantes da cadeia pesada, incluindo uma região de dobradiça com ou sem resíduos de cisteína) e um polipeptídeo complementar da região Fc da cadeia pesada (normalmente um fragmento da região Fc da cadeia pesada que compreende pelo menos uma parte de uma dobradiça e CH2-CH3, a região de dobradiça está sem resíduos de cisteína). Os domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada formam um local de ligação funcional, ou seja, um par VH/ VL.
[0189] O design e a composição modular de 2/3-BiFabs que também podem ser utilizados como compostos de partida de exemplo nos métodos, de acordo com a presente invenção, são semelhantes. 2/3-BiFabs são compostos de três cadeias individuais: uma cadeia leve (normalmente uma cadeia leve de comprimento total que compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve), uma cadeia pesada (normalmente uma cadeia pesada de comprimento total variante que compreende um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1, um segundo domínio variável e um domínio CH3 incluindo uma região de dobradiça com ou sem resíduos de cisteína) e um polipeptídeo da cadeia pesada complementar (normalmente um fragmento da cadeia pesada que compreende o domínio variável de dobradiça-CH3, a região de dobradiça com ou sem resíduos de cisteína). Os domínios variáveis da cadeia leve e o primeiro domínio variável da cadeia pesada formam um local de ligação funcional, ou seja, um par VH/ VL, e o segundo domínio variável da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia pesada complementarpolipeptídeo da região Fc também forma um par VH/ VL, que normalmente não é funcional, ou seja, não é competente para ligação.
[0190] A cadeia pesada (normalmente da subclasse I1g9G1 humana) contém i) a mutação no puxador ou as mutações no buraco (a mutação T366W no domínio CH3 de uma cadeia pesada de anticorpo é denotada como “mutação no puxador" e as mutações T366S, L368A e Y407V no domínio CH3 de uma cadeia pesada de anticorpos são denotados como “mutações no buraco” (numeração de acordo com o índice de Kabat EU)) ou ii) as mutações no puxador- cys ou as mutações no buraco- cys (as mutações T366W e S354C no domínio CH3 de uma cadeia pesada de anticorpo são denotados como “mutações no puxador- cys" e as mutações T366S, L368A, Y407V, Y349C no domínio CH3 de uma cadeia pesada de anticorpo são denotadas como “mutações no buraco- cys"; a configuração invertida é igualmente possível: T366W/ Y349C e T366S/ L368A/ Y407V/ S354C (numeração de acordo com o índice de Kabat EU)) no domínio CH3 para permitir a formação de heterodímeros da região Fc de puxador-em-buraco.
[0191] O polipeptídeo complementar da região Fc da cadeia pesada ou o polipeptídeo complementar da cadeia pesada também pode ser indicado como 'dummy-Fc' ou “dummy-HC', ou seja, um derivado de IgG1 que carece de VH e CH1, começa no terminal N com a sequência da região de dobradiça (ou um fragmento do mesmo) seguida por um domínio CH2 ou um domínio variável seguido por um domínio CH3 e, opcionalmente, compreende um marcador de purificação, por exemplo, His6 ou His8 ou marcador C, no seu terminal C. Além disso, este polipeptídeo complementar contém em seu domínio CH3 a mutação no puxador ou no buraco, dependendo das mutações na cadeia pesada. Além da mutação no puxador ou nas mutações no buraco, compreende o polipeptíideco complementar pelo menos uma mutação perturbadora (ou seja, desestabilizadora) introduzindo uma (ou seja, uma única adição adicional) ou mais cargas repulsivas em relação à sequência do tipo selvagem. Por exemplo, a mutação D356K ou E357K, respectivamente, em combinação com a mutação K370E ou K439E, respectivamente (consulte a Figura 2). Tal polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada mutada é indicado como MHCFCRP a seguir.
[0192] A cadeia pesada e o MHCFCRP podem formar dois tipos de heterodímeros, dependendo da distribuição das mutações do puxador-em- buraco: i) buraco da cadeia pesada :: MHCFCRP- buraco e ii) buraco da cadeia pesada :: MHCFcRP- puxador.
[0193] Assim, os 2/3-lgGs e 2/3-BiFabs são heterodímeros com cadeia leve associada, ou seja, heterotrímeros. Estes são, no entanto, um pouco “defeituosos”, pois a mutação de carga no MHCFCRP é sem contrapartida correspondente na cadeia pesada e, se presente na cadeia pesada, a mutação perturbadora de carga do MHCFCRP é sem correspondência com contrapartida (s) da cadeia pesada.
[0194] 2/3-lgGs são derivados monovalentes, não dimerizantes/ agregadores, de anticorpos de um braço que podem ser expressos e purificados com rendimentos semelhantes aos de IgG normais (ver Figura 3). Isso garante a monovalência do material de partida. Se uma 2/3-lgG bivalente for usada, esta pode ser monoespecífica e também biespeciífica.
[0195] Os polipeptídeos que compõem os 2/3-lgGs defeituosos, no entanto, são capazes de reorganizar para anticorpos biespecíficos, como mostrado na Figura 4.
[0196] A reação de troca entre as duas moléculas de partida é impulsionada por uma melhor complementaridade das cadeias pesadas KiH (puxadores-em-buracos) (cadeias H) umas com as outras (sem repulsão de carga e opcionalmente, formação de uma ligação dissulfeto se houver resíduos de cisteína livres)), bem como por uma melhor complementaridade dos dois MHCFCcRPs entre si. Na reação, os complexos da região Fc das duas moléculas de partida se dissociam e trocam polipeptídeos para formar dois complexos mais favoráveis. Isso conduz a reação da seguinte maneira: 2/3-l9G (A) avo + 2/3-lG (B) alo (polipeptíideos heterodiméricos de partida); bsAb (AB) + MHCFCRP (A)- MHCFCRP (B)- alvo (polipeptídeos heterodiméricos trocados).
[0197] No exemplo, como mostrado na Figura 4, a cadeia pesada (puxador- cys) do 2/3-I9G A e a cadeia pesada (buraco- cys) do 2/3-l9G B formam um heterotetrâmero de anticorpo biespecífico correspondente (2xHC + 2xLC).
[0198] Como 2/3-lgGs livres de ligação dissulfeto na região de dobradiça são usados nesta situação na célula/ in vivo, não é necessária nenhuma etapa de redução. O rearranjo da cadeia ocorre espontaneamente.
[0199] O mesmo se aplica a 2/3-BiFabs.
[0200] Veja os exemplos 1 a 5.
[0201] B) Método para converter derivados de IgG mono- ou bivalentes mono- ou biespecíficos em anticorpos b, tri- ou tetravalentes b-, tri- ou tetraespecíficos.
[0202] Com o método de acordo com a presente invenção, não só é possível combinar diferentes especificidades de ligação, mas também ao mesmo tempo produzir essas combinações em diferentes formatos e com diferentes valências. Isso é alcançado expandindo os materiais de partida usados no método, conforme descrito na seção anterior.
[0203] Por exemplo, a partir de 2/3-lIgGs, conforme descrito na seção anterior, o MHCFCcRP é mantido inalterado, mas a cadeia pesada é usada em diferentes formatos. Tais formatos podem ser, por exemplo, cadeias que possuem um local de ligação no terminal C ou no terminal N ou dois locais de ligação (um no terminal N e um no terminal C) (ver Figuras 9 e 10 por exemplo).
[0204] Neste exemplo, diferentes formatos de partida (por exemplo, com um local de ligação ao terminal N, um local de ligação ao terminal C ou locais de ligação ao terminal N e C) são combinados entre si no método de acordo com a invenção, permitindo a geração de diferentes formatos de anticorpos que têm valências diferentes, geometrias diferentes e diferentes posições/ arranjos tridimensionais dos locais de ligação individuais (9 no exemplo atual, veja a Figura 11).
[0205] Para a geração de anticorpos multiespecíficos, o princípio da troca (conversão de moléculas de entrada defeituosas em moléculas de saída correspondentes) não é alterado. Os MHCFcRPs também são mantidos. Assim, apenas a cadeia pesada é alterada.
[0206] Por exemplo, as Figuras 1 e 9 a 10 mostram três moléculas de partida diferentes (2/3-lgG com locais de ligação terminal N, terminal C e terminal N e C) que foram combinadas entre si na reação de troca, ou seja, no método de acordo com a presente invenção, resulta em nove formatos biespecíficos diferentes. Eles diferem em valências, geometrias e posições dos locais de ligação individuais.
[0207] Sem estar vinculado a essa teoria, assume-se que as reações de troca baseadas na separação temporária de heteromultímeros defeituosos de duas 2/3-lgGs ou 2/3-BiFabs devem resultar em produtos que contenham heterodímeros da região Fc preferencialmente correspondentes. À troca, portanto, converte os 2/3-lgGs em IlgGs de quatro cadeias (em diferentes formatos), bem como o heterodímero da região Fc correspondente.
[0208] Se ligações dissulfeto da região de dobradiça estão presentes in vitro, as reações de troca são iniciadas por uma etapa de redução para romper as ligações dissulfeto da região de dobradiça inter-cadeia, que podem ser omitidas na situação celular/ in vivo sem ligações dissulfeto da região de dobradiça. O rearranjo da cadeia ocorre espontaneamente.
[0209] Veja os exemplos 6 e 7.
[0210] C) Reação sem ligações dissulfeto inter-cadeia Fce-Fc e sem etapa de redução
[0211] As ligações dissulfeto inter-cadeia da cadeia pesada estabilizam os anticorpos e definem a flexibilidade dos braços Fab que estão conectados à dobradiça. As abordagens de troca da região de dobradiça que compreende anticorpos de partida requerem a redução desses dissulfetos antes ou durante a reação de troca, bem como a remoção dos agentes redutores após a conclusão da reação de troca (ver Exemplos 3 e 7).
[0212] Assim, aqui é relatada uma reação de troca de moléculas de partida que têm uma região de dobradiça, mas não possuem ligações dissulfeto inter-cadeia.
[0213] Para exemplificar estes 2/3-lgGs, bem como 2/3-BiFabs, nos quais foram produzidas, todas as ligações dissulfeto na região Fc foram eliminadas. Verificou-se que essas moléculas 2/3 desprovidas de dissulfeto podem ser produzidas e purificadas de maneira eficaz, mesmo sem essas ligações dissulfeto inter-cadeia (consulte, por exemplo, Figuras 15 e 20). Ao usar essas moléculas 2/3 desprovidas de ligação dissulfeto como moléculas de partida, é possível aplicar o método, de acordo com a presente invenção, in vivo, pois a etapa de redução não é mais necessária, tornando essas moléculas especialmente adequadas para a reação de troca celular e em aplicação in vivo. Os anticorpos multiespecíficos produzidos a partir desses 2/3-lgGs e 2/3-BiFabs depletados pela ligação dissulfeto são funcionais e estáveis, mantidos juntos por interações Fc-Fc não covalentes sem dissulfetos inter-cadeias (ver Figura 15 e 16).
[0214] Assim, a eliminação de dissulfetos inter-cadeia Fc-Fc, portanto, permite reações de troca acionadas por incompatibilidade na região Fc correspondentes sem a necessidade de redução e re-oxidação, ou seja, em condições fisiológicas. Isso facilita os procedimentos de preparação e triagem (de alto rendimento). Isso também permite que reações de troca de domínio ocorram sob condições fisiológicas, inclusive na superfície das células vivas.
[0215] Veja o exemplo 8.
[0216] Em uma forma de realização, a região de dobradiça é livre de ligação de dissulfeto. A região de dobradiça livre de ligação dissulfeto compreende resíduos de serina no lugar dos resíduos de cisteína na sequência da SEQ ID NO: 32.
[0217] Além da remoção das ligações dissulfeto, a região de dobradiça pode ser reduzida. Utilizando essas regiões de dobradiça modificadas, podem ser obtidos anticorpos biespecíficos que proporcionam diferentes distâncias entre os locais de ligação individuais (ver Figura 51). Assim, em uma forma de realização, a região de dobradiça tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31 (HTCPXCP, X =S ou P) ou SEQ ID NO: 95 (HTSPXSP, X =S ou P) ou SEQ ID NO: 94 (HTPAPE; CPXC da SEQ ID NO: 31 foi excluído) ou DATHGGGGS (SEQ ID NO: 97).
[0218] ll. — O MÉTODO DE ACORDO COM A INVENÇÃO
[0219] Aqui é relatado um método para a montagem na célula/ troca de meio-anticorpo de dois derivados pró-fármaco de anticorpos diferencialmente — direcionados para gerar uma nova funcionalidade, preferencialmente uma que tenha efeito terapêutico, no local de ação indentada diretamente no íon da superfície da célula.
[0220] O método, de acordo com a invenção, é exemplificado a seguir com materiais de partida específicos e de exemplo, ou seja, 2/3-lgGs e 2/3-BiFabs. Ou seja, apresentado apenas como uma exemplificação do conceito geral subjacente e não deve ser interpretado como uma limitação da invenção. O verdadeiro escopo da invenção é apresentado nas reivindicações.
[0221] A) Conversão celular de anticorpos monoespeciíficos monovalentes em IgGs bivalentes
[0222] Os anticorpos monovalentes podem exibir competência de ligação reduzida às superfícies celulares em comparação com os anticorpos bivalentes. Sem estar vinculado a esta teoria, supõe-se que a razão disso seja um aumento induzido por bivalência da afinidade aparente às superfícies celulares, ou seja, um efeito de avidez. A ligação e/ ou retenção com avidez aumentada nas superfícies celulares podem ser obtidas ligando o mesmo antígeno/ epítopo a dois locais de ligação/ dois braços de um anticorpo. Nesse cenário monoespecífico, a ligação bivalente pode aumentar a especificidade de ligação a células que transportam grandes quantidades de antígeno cognato (maior probabilidade de ligação de ambos os braços) em comparação com células com baixa densidade de antígeno (probabilidade reduzida de ligação de ambos os braços).
[0223] A ligação e/ ou retenção com avidez melhorada nas superfícies celulares também podem ser obtidas ligando dois antígenos diferentes com diferentes locais de ligação/ braços diferentes de um anticorpo biespecífico. Sem estar vinculado por essa teoria, supõe-se que, nesse cenário biespecífico, a ligação bivalente resulte em uma especificidade de ligação aumentada para células que apresentam e/ ou expressam ambos os antígenos (ambos os locais de ligação/ ambos os braços se ligam) em comparação com as células que apresentam e/ ou expressam apenas um dos antígenos (apenas um local de ligação/ um braço pode se ligar).
[0224] As tecnologias de ponta para abordar a melhoria da ligação mediada por avidez aplicam bsAbs pré-formados que reconhecem dois alvos. Para obter especificidade, é necessário ter uma afinidade bastante baixa de cada braço monovalente para evitar que a força de ligação suficiente de maneira monovalente substitua o efeito de avidez. Se esse pré-requisito for atendido, os bsAbs podem se ligar com maior especificidade às células que apresentam e/ ou expressam os dois antígenos.
[0225] Uma desvantagem dos conceitos de aprimoramento de ligação acionados por avidez atualmente disponíveis é que a densidade de ambos os antígenos nas superfícies celulares pode não ser um pré-requisito essencial para a ligação de bsAbs pré-formados per se (desde que ambos estejam presentes e acessíveis). As densidades de antígeno podem apenas determinar a quantidade de bsAb que se liga às células que expressam antígenos.
[0226] Entidades com potência muito alta (e/ ou possíveis problemas de toxicidade) carregam, portanto, riscos de ligação a células afetadas e que apresentam/ expressam altos e baixos níveis de ambos os antígenos alvo. Por exemplo, os bsAbs com funcionalidades citotóxicas inerentes ou adicionadas podem não apenas afetar células tumorais que exibem altos níveis de antígeno, mas também células normais não-alvo com baixos níveis de antígeno.
[0227] O método tal como aqui relatado, em que o anticorpo biespecífico é formado pela conversão celular de anticorpos monoespeciíficos e monovalentes, pode ser aplicado para resolver os problemas descritos acima, pois a reação de troca requer interação física de dois parceiros de troca monoespecíficos. A probabilidade de tal interação é dependente da concentração, ou seja, existe uma baixa probabilidade de interagir e trocar em baixas concentrações e maior probabilidade de interagir e trocar em concentrações maiores. Assim, por exemplo, a aplicação (consecutiva) separada de anticorpos monoespeciíficos com diferentes especificidades leva a um acúmulo aumentado (com baixa afinidade) de ambos os componentes monoespecíficos nas células que exibem quantidades maiores de ambos os antígenos. Em consequência, essas células não apenas acumularão concentrações aumentadas dos anticorpos individuais, mas também as converterão muito mais eficazes em bsAbs. Esses bsAbs, por sua vez, são retidos nas células alvo devido à ligação ávida por seus dois locais de ligação aos antígenos da superfície celular, enquanto os anticorpos precursores não trocados se dissociam.
[0228] B) Geração de BiFabs com funcionalidade pró-droga e conversão celular em TriFabs funcional
[0229] A força motriz da reação de troca aqui relatada é a conversão de duas moléculas de entrada com interface CH3 “defeituosa” em dois produtos com interface CH3 correspondente. O design que especifica essas interfaces CH3 está na composição dos MHCFcRPs. Os MHCFcRPs compreendem um domínio CH2 e um domínio CH3. Todas as mutações que contribuem para a composição especial dos MHCFCcRP's, no entanto, estão posicionadas no domínio CH3. É, portanto, possível substituir os domínios CH2 dos MHCFCcRPs, bem como os da cadeia pesada associada por outros domínios diferentes. Eles ainda devem permitir (ou até apoiar) a heterodimerização de MHCFCRP da cadeia pesada para gerar moléculas “defeituosas”.
[0230] A possibilidade de substituir os domínios CH2 das moléculas do tipo IgG por outros domínios de ativação da heterodimerização foi mostrada no formato TriFab (consulte o documento WO 2016/087416; Figura 18). TriFabs apresentam funcionalidades biespecíficas devido a uma troca dos domínios CH2 para um VH e um VL, respectivamente. A “região-tronco” do tipo Fc de tais moléculas é mantida unida por domínios KiH CH3 intactos. Como os domínios KiH CH3 são compatíveis com os domínios CH3 modificados do MHCFCRPs, eles também podem permitir a geração de MHCFCRP contendo análogos 2/3-BiFab com recursos de troca.
[0231] O TriFabs abriga um Fv funcional em vez dos domínios CH2 de uma região Fc porque um domínio CH2 é substituído por um domínio VH e o outro por um domínio VL complementar. Os derivados de 2/3-BiFab contêm MHCFCcRPs com domínios irrelevantes, ou seja, não cognatos, VH ou
VL (na antiga posição CH2), ou seja, estes não se ligam a um alvo. O 2/3- BiFabs retém um braço de ligação monovalente funcional e ainda contém metade do terceiro local de ligação na região do tronco (veja a Figura 18). À reação de troca de duas moléculas complementares 2/3-BiFab reconstitui não apenas o formato TriFfab, mas também leva à reconstituição da terceira funcionalidade de ligação adicional na “posição da haste' (substituição do CH2). A reação de troca, portanto, converte dois pró-fármacos 2/3-BiFab em TriFabs totalmente funcionais.
[0232] A eliminação das ligações dissulfeto inter-cadeia Fc-FC (região de dobradiça e domínio CH3), conforme descrito acima para 2/3-lgGs, permite reações de troca acionadas por MHCFCRP sem a necessidade de redução e re-oxidação controladas. É, portanto, possível que a reação de troca de tais moléculas ocorra sob condições fisiológicas, especialmente incluindo condições nas quais as entidades individuais (monoespeciíficas) estão ligadas às superfícies celulares alvo. Aplicando o mesmo princípio, 2/3-BiFabs acumulam-se nas células alvo após a ligação dos seus braços Fab/ local de ligação funcional. Se dois 2/3-BiFabs complementares (ambos portadores de Fv-tronco inativos, mas ainda complementares) se ligam à superfície da mesma célula, ocorrem reações de troca em cadeia diretamente na superfície das referidas células. Essa troca gera na célula/ in situ/ in vivo, ou seja, diretamente na superfície da célula no local de ação pretendido, um TriFab totalmente funcional com pelo menos dupla ou até tripla especificidade diretamente na superfície da célula, ou seja, no local de ação. O princípio de ativação de pró-fármaco derivado de 2/3-BiFab gera funcionalidades de ligação apenas na superfície das células que expressam um ou mais antígenos-alvo em densidades suficientes. Isso permite a geração de funcionalidades (incluindo as de potência muito alta e/ ou possíveis problemas de PK ou toxicidade) apenas nas células desejadas.
[0233] Com o método da invenção, é possível usar ligantes monoespecíficos de baixa afinidade para gerar diretamente na célula um ligante de alta avidez afim e ao mesmo tempo ativar um local de ligação terapêutica.
[0234]IV. — MOLÉCULAS MULTIESPECÍFICAS PARA USO NO
MÉTODO DE ACORDO COM A INVENÇÃO
[0235] A) Polipeptídeos multiméricos
[0236] Os polipeptídeos multiméricos a serem utilizados na reação/ método de troca celular, de acordo com a presente invenção, são definidos por - compreender um primeiro polipeptídco e um segundo polipeptídeo, em que cada um compreende um domínio CH3 de imunoglobulina e uma parte não funcional de um local de ligação, em que essa parte não funcional de um local de ligação está localizada no terminal N ou no terminal C ao domínio CH3 em ambos os polipeptídeos; e pelo menos um dos polipeptídeos compreende um local de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo de superfície celular, preferencialmente a um alvo de superfície celular não internalizante, - compreender uma mutação (perturbadora) em apenas um dos domínios CH3, resultando na desestabilização do polipeptídeo multimérico em comparação com um polipeptídeo (multimérico) idêntico ao referido polipeptídeo multimérico desestabilizado, exceto pela referida mutação no segundo polipeptídeo, - compreender mutações para a formação de um heterodímero, e - a ausência de ligações dissulfeto entre o referido primeiro e o segundo polipeptídeo.
[0237] Assim, a presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na descoberta de que a adição de uma única mutação desestabilizadora
(perturbadora) (unilateral, não emparelhada) em um polipeptídeo (hetero-) multimérico é suficiente para promover a troca de cadeias polipeptídicas com um segundo polipeptídeo (hetero-) multimérico, que compreende também uma única mutação desestabilizadora (perturbadora) (unilateral, não emparelhada), pois ambos os polipeptídeos (hetero-) multiméricos trocados recém-formados resultantes têm estabilidade melhorada em comparação com os polipeptídeos (hetero-) multiméricos de partida (ou seja, energia livre de ligação a CH3-CH3 mais baixa) à medida que as mutações desestabilizadoras se transformam em mutações atraentes após troca e recombinação. A única condição a ser seguida é que as mutações desestabilizadoras (perturbadoras) sejam introduzidas em posições que interagem entre si, uma vez que os respectivos polipeptídeos se associam.
[0238] Esta = metodologia pode ser aplicada a qualquer polipeptídeo (hetero-) multimérico que preenche os critérios descritos acima.
[0239] Assim, o polipeptídeo multimérico a ser utilizado no método, de acordo com a invenção, pode compreender outros domínios ou polipeptídeos.
[0240] O polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, em uma forma de realização compreende, no primeiro e no segundo polipeptídeo, além de um domínio CH2 de imunoglobulina (diretamente) no terminal N ou (diretamente) no terminal C no domínio CH3. Em uma forma de realização preferida, o domínio CH2 de imunoglobulina adicional é no terminal N ao domínio CH3.
[0241] Em uma forma de realização, o polipeptídeo multimérico compreende uma região de dobradiça e as mutações C226S e C229S ou uma região de dobradiça sem a sequência CPXC (SEQ ID NO: 95) (numeração de acordo com o índice de Kabat EU) ou nenhuma região de dobradiça.
[0242] São conhecidos no estado da técnica métodos diferentes para a geração de polipeptídeos (hetero-) multiméricos. Qualquer um desses métodos pode ser utilizado desde que as mutações necessárias para a formação dos polipeptídeos (hetero-) multiméricos de partida não interfiram ou se sobreponham às mutações desestabilizantes (perturbadoras) necessárias para a reação de troca de acordo com a presente invenção.
[0243] Assim, a presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na constatação de que, para realizar o método de acordo com a presente invenção, é suficiente a introdução de uma única mutação desestabilizadora em um domínio CH3 de um par de domínios CH3. Mais detalhadamente, verificou-se que a introdução de uma primeira mutação desestabilizadora na posição 357 em apenas um domínio CH3 do primeiro polipeptídeo (hetero-) multimérico de partida e uma segunda mutação desestabilizadora na posição 370 em apenas um domínio CH3 do segundo polipeptídeo de partida promove por abordagem espacial entre os dois polipeptídeos (hetero-) multiméricos de partida a troca espontânea de cadeias polipeptídicas entre esses polipeptídeos de partida. Um dos polipeptídeos trocados resultantes compreende o par de domínio CH3 com as mutações nas posições 357 e 370, respectivamente, que resultam em uma estabilização do (hetero-) multímero trocado. O mesmo pode ser alcançado com as mutações nas posições 356 e 439. A numeração de todas as posições está de acordo com o índice de Kabat UE. Um par preferido de mutações é o E357K e o K370E. Outro par preferido de mutações é D356K e K439E. O método, de acordo com a presente invenção, pode ser aplicado a qualquer subclasse de IgG, ou seja, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, pois os resíduos em questão são altamente conservados. Em uma forma de realização preferida, o domínio CH3 é da subclasse Ig9G1.
[0244] Em uma forma de realização, o polipeptídeo multimérico compreende: um primeiro polipeptídeo que compreende i) na direção terminal N a C a) um primeiro domínio variável de anticorpo selecionado a partir de um par de um domínio variável da cadeia leve e pesada de anticorpo que se liga especificamente a um primeiro alvo e b) um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina G humana,
em que o primeiro domínio CH3 compreende a) a mutação T366W, ou b) as mutações T366S/ L368A/ Y407V,
e ii) um par de um domínio variável da cadeia leve e pesada de anticorpo que se liga especificamente a um segundo alvo, seja no terminal N no primeiro domínio variável de anticorpo ou no terminal C no primeiro domínio CcH3,
um segundo polipeptídeo que compreende i) na direção terminal N a C a) um segundo domínio variável de anticorpo selecionado a partir de um par de um domínio variável da cadeia leve e pesada de anticorpo que se liga especificamente a um terceiro alvo e b) um segundo domínio CH3 de imunoglobulina G humana,
em que o segundo domínio variável de anticorpo é um domínio variável da cadeia leve de anticorpo, se o primeiro domínio variável de anticorpo for um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo; ou o segundo domínio variável de anticorpo é um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo, se o primeiro domínio variável de anticorpo for um domínio variável da cadeia leve de anticorpo,
e em que o segundo domínio CH3 compreende a) as mutações T366S/ L368A/ Y407V, se o primeiro domínio CH3 compreender a mutação T366W, ou b) a mutação T366W, se o primeiro domínio CH3 compreender as mutações T366S/ L368A/ Y407V, e em que o segundo domínio CH3 compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em D356K, E3S57K, K370E e K439E, em que o primeiro domínio CH3 compreende a) o resíduo de aminoácido K na posição 439 se as mutações perturbadoras forem D356K, ou b) o resíduo de aminoácido K na posição 370 se as mutações perturbadoras forem E357K, ou c) o resíduo de aminoácido E na posição 357 se as mutações perturbadoras forem K370E, ou d) o resíduo de aminoácido D na posição 356 se as mutações perturbadoras forem K439E, e ii) opcionalmente, um par de um domínio variável da cadeia leve e pesada de anticorpo que se liga especificamente ao segundo ou ao quarto alvo, seja no terminal N no segundo domínio variável de anticorpo ou no terminal C no segundo domínio CH3, em que toda a numeração está de acordo com o índice de Kabat EU.
[0245] Em uma forma de realização, o polipeptídeo multimérico compreende um primeiro polipeptídeo que compreende i) na direção terminal N a C a) um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina G humana e b) um primeiro domínio variável de anticorpo selecionado a partir de um par de um domínio variável da cadeia leve e pesada de anticorpo que se liga especificamente a um primeiro alvo, em que o primeiro domínio CH3 compreende a) a mutação T366W, ou b) as mutações T366S/ L368A/ Y407V,
e ii) um par de um domínio variável da cadeia leve e pesada de anticorpo que se liga especificamente a um segundo alvo, seja no terminal N no primeiro domínio CH3 ou no terminal C no primeiro domínio variável,
um segundo polipeptídeo que compreende i) na direção terminal N a C a) um segundo domínio CH3 de imunoglobulina G humana e b) um segundo domínio variável de anticorpo selecionado a partir de um par de um domínio variável da cadeia leve e pesada de anticorpo que se liga especificamente a um terceiro alvo,
em que o segundo domínio variável de anticorpo é um domínio variável da cadeia leve de anticorpo, se o primeiro domínio variável de anticorpo for um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo; ou o segundo domínio variável de anticorpo é um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo, se o primeiro domínio variável de anticorpo for um domínio variável da cadeia leve de anticorpo,
e em que o segundo domínio CH3 compreende a) as mutações T366S/ L368A/ Y407V, se o primeiro domínio CH3 compreender a mutação T366W, ou b) a mutação T366W, se o primeiro domínio CH3 compreender as mutações T366S/ L368A/ Y407V,
e em que o segundo domínio CH3 compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em D356K, E357K, K370E e K439E, em que o primeiro domínio CH3 compreende a) o resíduo de aminoácido K na posição 439 se as mutações perturbadoras forem D356K, ou b) o resíduo de aminoácido K na posição 370 se as mutações perturbadoras forem E357K, ou c) o resíduo de aminoácido E na posição 357 se as mutações perturbadoras forem K370E, ou d) o resíduo de aminoácido D na posição 356 se as mutações perturbadoras forem K439E, e ii) opcionalmente, um par de um domínio variável da cadeia leve e pesada de anticorpo que se liga especificamente ao segundo ou ao quarto alvo, seja no terminal N no segundo domínio CH3 ou no terminal C no segundo domínio variável, em que toda a numeração está de acordo com o índice de Kabat EU.
[0246] Em uma forma de realização de todos os aspectos da invenção, o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são um dímero não covalente.
[0247] EM uma forma de realização de todos os aspectos da invenção, o primeiro domínio variável e o segundo domínio variável formam um local de ligação não funcional.
[0248] Em uma forma de realização de todos os aspectos da invenção, o primeiro e o segundo polipeptídeo compreendem cada um a sequência de aminoácidos DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66) ou DKTHT (SEQ ID NO: 94) ou GGGS (SEQ ID NO: 69) ou DKTHGGGGS (SEQ ID NO: 97) no terminal N no primeiro e no segundo domínio variável.
[0249] Em uma forma de realização de todos os aspectos da invenção i) o primeiro domínio CH3 compreende a mutação T366W e o resíduo de aminoácido K na posição 439, e o segundo domínio CH3 compreende a mutação perturbadora D356K e as mutações T366S/ L368A/ Y407V, ou ii) o primeiro domínio CH3 compreende a mutação e o resíduo de aminoácido K na posição 370, e o segundo domínio CH3 compreende a mutação perturbadora E357K e as mutações T366S/ L368A/ Y407V, ou iii) o primeiro domínio CH3 compreende as mutações T366S/ L368A/ Y407V e o resíduo de aminoácido E na posição 357, e o segundo domínio CH3 compreende a mutação perturbadora K370E e a mutação T366W, ou iv) o primeiro domínio CH3 compreende as mutações T366S/ L368A/ Y407V e o resíduo de aminoácido D na posição 356, e o segundo domínio CH3 compreende a mutação perturbadora K439E e a mutação T366W.
[0250] Em uma forma de realização de todos os aspectos da invenção, o primeiro, segundo e terceiro alvo são diferentes.
[0251] Em uma forma de realização de todos os aspectos da invenção, o primeiro alvo ou o terceiro alvo é CD3 humano.
[0252] Em uma forma de realização de todos os aspectos, o segundo e, se presente, o quarto alvo são iguais ou diferentes e ambos estão localizados na superfície da mesma célula (alvo).
[0253] Em uma forma de realização de todos os aspectos da invenção, o par de um domínio variável da cadeia leve e pesada de anticorpo que se liga especificamente ao segundo alvo é selecionado a partir do grupo que consiste em Fv, scFc, Fab, scFab, dsscFab, CrossFab, Fab biespeciífico, sdAb, e VHH.
[0254] Em uma forma de realização de todos os aspectos da invenção, o par de um domínio variável da cadeia leve e pesada de anticorpo que se liga especificamente ao quarto alvo é selecionado de forma independente do par de um domínio variável de anticorpo da cadeia leve e da cadeia pesada que se liga especificamente ao segundo alvo, a partir do grupo que consiste em Fv, scFc, Fab, scFab, dsscFab, CrossFab, Fab biespecífico, sdAb e VHH.
[0255] Em uma forma de realização de todos os aspectos da invenção, o primeiro e o segundo polipeptídeo compreendem ainda um domínio CH2 de imunoglobulina G no terminal N em relação ao domínio CH3.
[0256] Em uma forma de realização de todos os aspectos da invenção, a imunoglobulina G humana é IgG1 humana ou IgG2 humana ou 19G3 ou IgG4 humana.
[0257] B) Composições para uso nos métodos de acordo com a invenção.
[0258] A reação/ método de troca celular que pode ser realizado com uma composição que compreende duas moléculas multiméricas, de acordo com a presente invenção, que compreende a etapa a seguir: - trazer um primeiro polipeptídeo multimérico (inicial), que compreende um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, e um segundo polipeptídeo multimérico (inicial), que compreende um terceiro polipeptídeo e um quarto polipeptídeo, na proximidade na superfície de uma célula para de forma troca cruzada o segundo e o terceiro polipeptídeo para formar um terceiro polipeptídeo multimérico e um quarto polipeptídeo multimérico,
em que i) o segundo polipeptídeo compreende uma mutação (primeira perturbação) resultando em uma desestabilização do primeiro polipeptídeo multimérico em comparação com um polipeptídeo (multimérico) idêntico ao referido primeiro polipeptídeo multimérico, exceto pela referida mutação no segundo polipeptídeo,
ii) o terceiro polipeptídeo compreende uma mutação (segundo perturbação) resultando em uma desestabilização do segundo polipeptídeo multimérico em comparação com um polipeptídeo multimérico idêntico ao referido segundo polipeptídeo (multimérico), exceto pela referida mutação no terceiro polipeptídeo,
iii) a mutação (primeira perturbação) no segundo polipeptídeo e a mutação (segunda perturbação) no terceiro polipeptídeo resultam em uma estabilização do terceiro polipeptídeo multimérico (trocado) que compreende o referido segundo polipeptídeo e o referido terceiro polipeptídeo em comparação com o primeiro polipeptídeo multimérico (inicial) e/ ou para o segundo polipeptídeo multimérico (inicial),
iv) o quarto polipeptídeo multimérico (trocado) é estabilizado em comparação com o primeiro polipeptídeo multimérico (inicial) e/ ou o segundo polipeptídeo multimérico (inicial),
v) o primeiro polipeptídeo multimérico e o segundo polipeptídeo multimérico compreendem apenas uma parte de um ou dois novos locais de ligação que não são funcionais, ou seja, que não podem se ligar ao seu alvo, e vi) o terceiro e/ ou o quarto polipeptídeo multimérico compreendem os um ou dois novos locais de ligação em forma funcional, ou seja, em uma forma que permite a ligação específica ao seu respectivo alvo, que foram gerados/ ativados pela troca de polipeptídeo entre o primeiro polipeptídeo multimérico e o segundo polipeptídeo multimérico, ou seja,
reunindo as partes não funcionais dos referidos um ou dois novos locais de ligação para formar um ou dois novos locais de ligação funcional.
[0259]UmM aspecto da invenção é uma composição que compreende um primeiro polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, e um segundo polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção, em que o primeiro domínio CH3 do primeiro polipeptídeo multimérico e o segundo domínio CH3 do segundo polipeptídeo multimérico compreendem a mutação T366W ou as mutações T366S/ L368A/ Y407V, e o segundo domínio CH3 do primeiro polipeptídeo multimérico compreende a mutação D356K e o segundo domínio CH3 do segundo polipeptídeo multimérico compreende a mutação K439E, ou o segundo domínio CH3 do primeiro polipeptídeo multimérico compreende a mutação E357K e o segundo domínio CH3 do segundo polipeptídeo multimérico compreende a mutação K370E, e o primeiro domínio variável de anticorpo do primeiro polipeptídeo multimérico e o primeiro domínio variável de anticorpo do segundo polipeptídeo multimérico são um par de um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente ao primeiro alvo, e o segundo domínio variável de anticorpo do primeiro polipeptídeo multimérico e o segundo domínio variável de anticorpo do segundo polipeptídeo multimérico são um par de um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente ao terceiro alvo,
e o segundo e o quarto alvo são, de forma independente um do outro, um antígeno de superfície celular.
[0260] Em uma forma de realização de todos os aspectos da invenção, o primeiro e/ ou o terceiro alvo é o CD3 humano.
[0261] Em uma forma de realização de todos os aspectos da invenção, a composição é uma composição farmacêutica e compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0262] Em uma forma de realização de todos os aspectos da invenção, a composição é para uso como um medicamento.
[0263] C) variantes da região Fc
[0264] Em certas formas de realização, uma ou mais modificações de aminoácidos adicionais podem ser introduzidas na região Fc de um polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, aqui fornecida, gerando assim uma variante da região Fc. A variante da região Fc pode compreender uma sequência da região Fc humana (por exemplo, uma região Fc da IgG1, I19G2, IgG3 ou IgG4 humana) que compreende uma modificação de aminoácidos (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos.
[0265] Em certas formas de realização, a invenção contempla o polipeptídeo multimérico de acordo com a variante da invenção que possui algumas, mas não todas as funções efetoras, o que a torna uma candidata desejável para aplicações nas quais a meia-vida in vivo é importante, mas certas funções efetoras (como complemento e ADCC) são desnecessários ou deletérios. Ensaios de citotoxicidade in vitro e/ ou in vivo podem ser realizados para confirmar a redução/ depleção das atividades do CDC e/ ou ADCC. Por exemplo, os ensaios de ligação ao receptor FC (FcR) podem ser realizados para garantir que o polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, não possua ligação FcyR (portanto, provavelmente sem atividade ADCC), mas retenha a capacidade de ligação a FcRn.
As células primárias para mediar células ADCC, NK, expressam apenas FcyRlll, enquanto os monócitos expressam FecyRI, FeyRIl e FeyRIll.
A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch, JV. e Kinet, J.P., Annu.
Rev.
Immunol. 9 (1991) 457-492. Exemplos não limitativos de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse são descritos em US 5.500.362 (consulte, por exemplo, Hellstrom, |. et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 83 (1986) 7059- 7063 e Hellstrom, |. et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sei.
USA 82 (1985) 1499-1502); US 5.821.337 (ver Bruggemann, M. et al., J.
Exp.
Med. 166 (1987) 1351-1361). Como alternativa, métodos de ensaios não radioativos podem ser empregados (consulte, por exemplo, ensaio de citotoxicidade não radioativa ACTI'M para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc.
Mountain View, CA; e ensaio de citotoxicidade não radioativa CytoTox 96º (Promega, Madison, Células efetoras úteis para esses ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK)Em alternativa, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal como como o descrito em Clynes, R. et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sei.
USA 95 (1998) 652-656. Também podem ser realizados ensaios de ligação a Ciq para confirmar que o anticorpo é incapaz de se ligar a C1igq e, portanto, não possui atividade do CDC (consulte, por exemplo, ELISA de ligação a Ciq e C3c nos documentos WO 2006/029879 e WO 2005/100402) Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio CDC pode ser realizado (consulte, por exemplo, Gazzano-Santoro, H. et al., J.
Immunol.
Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, MS et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; e Cragg, SENHORA. e M.
J.
Glennie, Blood 103 (2004)2738-2743). A ligação de FcRn e as determinações de depuração/ meia-vida in vivo também podem ser realizadas usando métodos conhecidos no estado da técnica (consulte, por exemplo, Petkova, S.B. et al., Int. Inmunol. 18 (2006: 1759-1769).
[0266] O polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, que compreende regiões Fc com função efetor reduzida inclui aqueles com substituição de um ou mais dos resíduos da região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (US 6.737.056). Tais mutantes da região Fc incluem mutantes da região Fc com substituições em duas ou mais das posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o chamado mutante da região Fc “DANA” com substituição dos resíduos 265 e 297 para alanina (US 7.332.581).
[0267] Certos polipeptídeos multiméricos, de acordo com a invenção, compreendem variantes da região Fc com ligação melhorada ou diminuída a FCcRs (consulte, por exemplo, US 6.737.056; WO 2004/056312, e Shields, RL et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).
[0268]EmM certas formas de realização, um polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, compreende uma variante da região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que melhoram o ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ ou 334 da região FC (numeração da UE de resíduos).
[0269] Em algumas formas de realização, são feitas mutações na região Fc que resultam na ligação de C1iq alterada (ou seja, melhorada ou diminuída) e/ ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC), por exemplo, conforme descrito em US 6.194.551, WO 99/51642 e Idusogie, EE et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.
[0270] Anticorpos com meia-vida aumentada e ligação melhorada ao receptor Fc neonatal (FcRn), responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer, RL et al., J. Imnmunol. 117 (1976) 587-593, e Kim, JK et al., J. Imnmunol. 24 (1994)2429-2434), são descritos no documento US 2005/0014934. Esses anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições nela que melhoram a ligação da região Fc ao FcRn. Essas variantes da região Fc incluem aquelas com substituições em um ou mais dos resíduos da região Fc 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, substituição do resíduo da região Fc 434 (US 7.371.826).
[0271] Ver também Duncan, A.R. e Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821; e WO 94/29351 referente a outros exemplos de variantes da região Fc.
[0272] Em uma forma de realização de todos os aspectos, o polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, compreende (todas as posições de acordo com o índice de Kabat UE) i) uma região Fc da subclasse I9gG1 humana com as mutações P329G, L234A e L235A em ambos os polipeptídeos da região Fc, ou ii) uma região Fc da subclasse I9gG4 humana com as mutações P329G, S228P e L235E em ambos os polipeptídeos da região Fc, ou iii) uma região Fc da subclasse IgG1 humana com as mutações P329G, L234A, L235A, 1253A, H310A e H435A em ambos os polipeptídeos da região Fc ou com as mutações P329G, L234A, L235A, H310A, H433A e Y436A em ambos os polipeptídeos da região Fc, ou iv) uma região Fc heterodimérica da subclasse IgG1 humana, da qual ambos os polipeptídeos da região Fc compreendem as mutações P329G, L234A e L235A e a) um polipeptídeo da região Fc compreende a mutação T366W e o outro polipeptídeo da região Fc compreende as mutações T366S, L368A e Y407V, ou b) um polipeptídeo da região Fc compreende as mutações T366W e Y349C e o outro polipeptídeo da região Fc compreende as mutações T366S, L368A, Y407V e S354C, ou c) um polipeptídeo da região Fc compreende as mutações T366W e S354C e o outro polipeptídeo da região Fc compreende as mutações T366S, L368A, Y407V e Y349C, ou v) uma região Fc heterodimérica da subclasse de IgG4 humana, em que ambos os polipeptídeos da região Fc compreendem as mutações P329G, S228P e L235E e a) um polipeptídeo da região Fc compreende a mutação T366W e o outro polipeptídeo da região Fc compreende as mutações T366S, L368A e Y407V, ou b) um polipeptídeo da região Fc compreende as mutações T366W e Y349C e o outro polipeptídeo da região Fc compreende as mutações T366S, L368A, Y407V e S354C, ou c) um polipeptídeo da região Fc compreende as mutações T366W e S354C e o outro polipeptídeo da região Fc compreende as mutações T366S, L368A, Y407V e Y349C, ou vi) uma combinação de um de i), ii) e iii) com um de iv), e v).
[0273] Em uma forma de realização de todos os aspectos aqui relatados, um polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, que compreende um domínio CH3, compreende um dipeptídeo glicina-lisina terminal C adicional (G446 e K447, numeração de acordo com o índice de Kabat EU). Em uma forma de realização de todos os aspectos, conforme relatado neste documento, um polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, que compreende um domínio CH3 compreende um resíduo de glicina terminal C adicional (G446, numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
[0274] O polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção,
compreende em uma forma de realização uma região Fc caracterizada por ser da subclasse IgG1 humana com mutações PVAZ36, L234A/ L235A e/ ou GLPSS331 (numeração de acordo com o índice de Kabat UE) ou da subclasse I9gG4. Em uma forma de realização adicional, o polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, é caracterizado por compreender uma região Fc de qualquer classe IgG, em uma forma de realização da subclasse IGgG1 ou IgG4, contendo pelo menos uma mutação em E233, L234, L235, G236, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 e/ ou P329 (numeração de acordo com o índice de Kabat UE). É ainda em uma forma de realização que o polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, compreende uma região Fc da subclasse IgG4 humana que contém a mutação S228P, ou as mutações S228P e L235E (Angal, S,, et al., Mol. Immunol. 30 (1993) 105-108) (numeração de acordo com o índice de Kabat UE).
[0275)O0 terminal C dos polipeptideos da região Fc compreendidos no polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, pode ser um terminal C completo que termina com os resíduos de aminoácidos PGK. O terminal C pode ser um terminal C abreviado no qual um ou dois dos resíduos de aminoácidos do terminal C foram removidos. Em uma forma de realização preferida, o terminal C é um terminal C abreviado que termina com os resíduos de aminoácidos PG.
[0276] D) Heterodimerização
[0277] Várias abordagens para modificações de CH3, a fim de apoiar a heterodimerização, foram descritas, por exemplo, nos documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291, que são aqui incluídos por referência.
[0278] Tipicamente, nas abordagens conhecidas no estado da técnica, o domínio CH3 da primeira cadeia pesada e o domínio CH3 da segunda cadeia pesada são projetados de maneira complementar, de modo que a cadeia pesada que compreende um domínio CH3 manipulado não pode mais homodimerizar com outra cadeia pesada da mesma estrutura (por exemplo, uma primeira cadeia pesada projetada por CH3 não pode mais homodimerizar com outra primeira cadeia pesada projetada por CH3; e uma segunda cadeia pesada projetada por CH3 não pode mais homodimerizar com outra segunda cadeia pesada projetada por CH3). Desse modo, a cadeia pesada que compreende um domínio CH3 manipulado heterodimerizo com outra cadeia pesada que compreende o domínio CH3, que é manipulado de maneira complementar. Para esta forma de realização, o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada são modificados de maneira complementar por substituições de aminoácidos, de modo que o primeiro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada e o segundo polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada heterodimeriza, enquanto o primeiro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada e o segundo polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada não homodimeriza mais (por exemplo, por razões estéricas).
[0279] As diferentes abordagens para apoiar a heterodimerização da cadeia pesada conhecidas no estado da técnica, que foram citadas e incluídas acima, são contempladas como diferentes alternativas usadas no fornecimento dos polipeptídeos heterodiméricos/ multiméricos (por exemplo, 2/3-lgGs), tal como aqui relatado.
[0280] Os domínios CH3 do polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, podem ser alterados pela tecnologia “puxador-em-buracos”, que é descrita em detalhes com vários exemplos, por exemplo, WO 96/027011, Ridgway, J.B. et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; e Merchant, A.M. et al.,
Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681. Neste método, as superfícies de interação dos dois domínios CH3 são alteradas para aumentar a heterodimerização de ambos os polipeptídeos da região Fc da cadeia pesada contendo esses dois domínios CH3. Cada um dos dois domínios CH3 (dos dois polipeptídeos da região Fc da cadeia pesada) pode ser o “puxador”, enquanto o outro é o “buraco”. Uma ponte dissulfeto pode ser adicionalmente introduzida para estabilizar ainda mais os heterodímeros (Merchant, AM, et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997)26-35) e aumentar o rendimento na reação de troca de acordo com a presente invenção.
[0281] Em uma forma de realização preferida, o polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, compreende uma mutação T366W no domínio CH3 da “cadeia de puxadores” e as mutações T366S, L368A, Y407V no domínio CH3 da “cadeia de buracos” (numeração de acordo com o índice de Kabat EU) Também pode ser utilizada uma ponte dissulfureto inter-cadeia entre os domínios CH3 (Merchant, A.M. et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681), por exemplo, introduzindo uma mutação Y349C em um dos domínios CH3 das cadeias de puxadores e uma mutação E356C ou uma mutação S354C em um dos domínios CH3 das cadeias de buracos (na reação de troca de acordo com a presente invenção, dois multímetros são usados como materiais de partida em apenas um dos domínios CH3 dos referidos multímeros compreende o resíduo de cisteína adicional, de modo que somente no produto trocado é formada a ligação dissulfeto adicional). Assim, em outra forma de realização preferida, o polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, compreende as mutações Y349C e T366W em um dos domínios CH3 do primeiro multímero e as mutações E356C, T366S, L368A e Y407V no respectivo domínio CH3 complementar do segundo multímero; ou o polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, compreende as mutações Y349C e T366W em um dos domínios CH3 do primeiro multímero e as mutações S354C, T366S, L368A e
Y407V no domínio CH3 complementar respectivo do segundo multímero (a mutação Y349C adicional no domínio CH3 e a mutação adicional ESS6C ou S354C no domínio CH3 correspondente, formando uma ponte dissulfeto inter- cadeia) (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
[0282] Mas também outras tecnologias de puxadores em buracos, como descrito na EP 1 870 459 A1, podem ser usadas de forma alternativa ou adicional. Em uma forma de realização, o polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, compreende as mutações R409D e K370E no domínio CH3 da “cadeia de puxadores" e as mutações D399K e E357K no domínio CH3 da “cadeia de buracos” (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
[0283] Em uma forma de realização, o polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, compreende uma mutação T366W no domínio CH3 da “cadeia de puxadores” e as mutações T366S, L36 multimérico, de acordo com a invenção, para impor a heterodimerização são conhecidas no estado da técnica. Estas tecnologias, especialmente as descritas em WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 e WO 2013/096291 são aqui contemplados como alternativas à “tecnologia puxador-em-buraco” em combinação com um polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção.
[0286]EM uma forma de realização de um polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção, a abordagem descrita na EP 1 870 459 A1 é usada para apoiar a heterodimerização da primeira cadeia pesada e da segunda cadeia pesada do polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção. Esta abordagem baseia-se na introdução de aminoácidos carregados com cargas opostas em posições específicas de aminoácidos na interface do domínio CH3/ CH3 entre a primeira e a segunda cadeia pesada.
[0287] Por conseguinte, esta forma de realização se refere a um polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção, em que na estrutura terciária do multímero do domínio CH3 do primeiro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada formam uma interface que está localizado entre os respectivos domínios CH3, em que as respectivas sequências de aminoácidos do domínio CH3 do primeiro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada compreendem cada um é um conjunto de aminoácidos que é localizado dentro da referida interface na estrutura terciária do polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção, em que, a partir do conjunto de aminoácidos que está localizado na interface no domínio CH3 de um polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, um primeiro aminoácido é substituído por um aminoácido carregado positivamente e do conjunto de aminoácidos localizado na interface no domínio CH3 do outro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada e um segundo aminoácido é substituído por um aminoácido carregado negativamente. O polipeptídeo multimérico de acordo com esta forma de realização é aqui também referido como “polipeptídeo multimérico manipulado por CH3 (+/-”" (em que a abreviação “+/-" representa os aminoácidos de carga oposta que foram introduzidos nos respectivos domínios CH3).
[0288] EM uma forma de realização do referido polipeptídeo multimérico manipulado por CH3 (+/-) de acordo com a invenção, o aminoácido carregado positivamente é selecionado a partir de K, Re H, e o aminoácido carregado negativamente é selecionado a partir de E ou D.
[0289] Em uma forma de realização do referido polipeptídeo multimérico manipulado por CH3 (+/-) de acordo com a invenção, o aminoácido carregado positivamente é selecionado a partir de Ke R e o aminoácido carregado negativamente é selecionado a partir de E ou D.
[0290] Em uma forma de realização do referido polipeptídeo multimérico modificado por CH3 (+/-) de acordo com a invenção, o aminoácido carregado positivamente é K e o aminoácido carregado negativamente é E.
[0291] EM uma forma de realização do referido 2/3-I9G manipulado por CH3 (+/-), como relatado aqui no domínio CH3 de uma cadeia pesada, o aminoácido R na posição 409 é substituído por D e o aminoácido K na posição 370 é substituído por E, e no domínio CH3 da outra cadeia pesada, o aminoácido D na posição 399 é substituído por K e o aminoácido E na posição 357 é substituído por K (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
[0292] EM uma forma de realização de um polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção, a abordagem descrita no documento WO 2013/157953 é usada para apoiar a heterodimerização do primeiro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada e do segundo polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada do polipeptídeo multimérico. Em uma forma de realização do referido polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção, no domínio CH3 de um polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, o aminoácido T na posição 366 é substituído por K e no domínio CH3 do outro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada o aminoácido L na posição 351 é substituído por D (numeração de acordo com o índice de Kabat EU). Em outra forma de realização do referido polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção, no domínio CH3 de um polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, o aminoácido T na posição 366 é substituído por K e o aminoácido L na posição 351 é substituído por K, e no domínio CH3 do outro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, o aminoácido L na posição 351 é substituído por D (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
[0293] Em outra forma de realização do referido polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção, no domínio CH3 de um polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, o aminoácido T na posição 366 é substituído por K e o aminoácido L na posição 351 é substituído por K, e no domínio CH3 do outro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, o aminoácido L na posição 351 é substituído por D (numeração de acordo com o índice de Kabat EU). Além disso, pelo menos uma das seguintes substituições está compreendida no domínio CH3 do outro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada: o aminoácido Y na posição 349 é substituído por E, o aminoácido Y na posição 349 é substituído por D e o aminoácido L na posição 368 é substituído por E (numeração de acordo com o índice de Kabat EU). Em uma forma de realização, o aminoácido L na posição 368 é substituído por E (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
[0294] EM uma forma de realização de um polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção, a abordagem descrita em WO 2012/058768 é usada para apoiar a heterodimerização do primeiro polipeptídeo da região Fc e do segundo polipeptídeo da região Fc do polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção.
Em uma forma de realização do referido polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção, no domínio CH3 de um polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, o aminoácido L na posição 351 é substituído por Y e o aminoácido Y na posição 407 é substituído por A, e no domínio CH3 do outro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, o aminoácido T na posição 366 é substituído por A e o aminoácido K na posição 409 é substituído por F (numeração de acordo com o índice de Kabat EU). Em outra forma de realização, além das substituições mencionadas acima, no domínio CH3 do outro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, pelo menos um dos aminoácidos nas posições 411 (originalmente T), 399 (originalmente D), 400 (originalmente S), 405 (originalmente F), 390 (originalmente N) e 392 (originalmente K) são substituídos (numeração de acordo com o índice de Kabat EU). As substituições preferidas são:
- substituição do aminoácido T na posição 411 por um aminoácido selecionado entre N, R, Q, K, D, E e W (numeração de acordo com o índice de Kabat EU),
- substituição do aminoácido D na posição 399 por um aminoácido selecionado entre R, W, Y e K (numeração de acordo com o índice de Kabat EU),
- substituição do aminoácido S na posição 400 por um aminoácido selecionado entre E, D, R e K (numeração de acordo com o índice de Kabat EU),
- substituição do aminoácido F na posição 405 por um aminoácido selecionado entre |, M, T, S, Ve W (numeração de acordo com o índice de Kabat EU;
- substituição do aminoácido N na posição 390 por um aminoácido selecionado entre R, K e D (numeração de acordo com o índice de Kabat EU; e
- substituição do aminoácido K na posição 392 por um aminoácido selecionado entre V, M, R, L, F e E (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
[0295] Em outra forma de realização do polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção (manipulado de acordo com WO 2012/058768), no domínio CH3 de um polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, o aminoácido L na posição 351 é substituído por Y e o aminoácido Y na posição 407 é substituída por A e, no domínio CH3 do outro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, o aminoácido T na posição 366 é substituído por Ve o aminoácido K na posição 409 é substituído por F (numeração de acordo com o índice de Kabat EU). Em outra forma de realização do referido polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção, no domínio CH3 de um polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, o aminoácido Y na posição 407 é substituído por A e no domínio CH3 do outro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada o aminoácido T na posição 366 é substituído por A e o aminoácido K na posição 409 é substituído por F (numeração de acordo com o índice de Kabat EU). Na referida última forma de realização mencionada, no domínio CH3 do referido outro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, o aminoácido K na posição 392 é substituído por E, o aminoácido T na posição 411 é substituído por E, o aminoácido D na posição 399 é substituído por R e o aminoácido S na posição 400 é substituído por R (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
[0296]EM uma forma de realização de um polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção, a abordagem descrita no documento WO 2011/143545 é usada para apoiar a heterodimerização do primeiro polipeptídeo da região Fc e do segundo polipeptídeo da região Fc do polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção. Em uma forma de realização do referido polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção, modificações de aminoácidos nos domínios CH3 de ambos os polipeptídeos da região Fc da cadeia pesada são introduzidas nas posições 368 e/ ou 409 (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
[0297]EM uma forma de realização de um polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção, a abordagem descrita em WO 2011/090762 é usada para apoiar a heterodimerização do primeiro polipeptídeo da região Fc e do segundo polipeptídeo da região Fc do polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção. O documento WO 2011/090762 refere- se a modificações de aminoácidos de acordo com a tecnologia “puxador-em- buraco”. Em uma forma de realização do referido polipeptídeo multimérico de engenharia CH3 (KiH) de acordo com a invenção, no domínio CH3 de um polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, o aminoácido T na posição 366 é substituído por W e no domínio CH3 do outro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, o aminoácido Y na posição 407 é substituído por A (numeração de acordo com o índice de Kabat EU). Em outra forma de realização do referido polipeptídeo multimérico de engenharia CH3 (KiH) de acordo com a invenção, no domínio CH3 de um polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, o aminoácido T na posição 366 é substituído por Y e no domínio CH3 do outro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, o aminoácido Y na posição 407 é substituído por T (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
[0298]EM uma forma de realização de um polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção, que é do isotipo IgG2, a abordagem descrita no documento WO 2011/090762 é usada para apoiar a heterodimerização do primeiro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada e do segundo polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada do polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção.
[0299] EM uma forma de realização de um polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção, a abordagem descrita no documento WO 2007/147901 é usada para apoiar a heterodimerização do primeiro polipeptídeo da região Fc e do segundo polipeptídeo da região Fc do polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção. Em uma forma de realização do referido polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção, no domínio CH3 de um polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, o aminoácido K na posição 253 é substituído por E, o aminoácido D na posição 282 é substituído por K e o aminoácido o ácido K na posição 322 é substituído por D e, no domínio CH3 do outro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, o aminoácido D na posição 239 é substituído por K, o aminoácido E na posição 240 é substituído por K e o amino o ácido K na posição 292 é substituído por D (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
[0300]EM uma forma de realização de um polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção, a abordagem descrita em WO 2007/110205 é usada para apoiar a heterodimerização do primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo do polipeptídeo multimérico de acordo com a invenção.
[0301] Em uma forma de realização de todos os aspectos, tal como aqui relatado, o polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, tem uma estrutura de domínio constante de um anticorpo do tipo IgG. Em uma forma de realização adicional de todos os aspectos aqui relatados, o polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, é caracterizado por o referido polipeptídeo multimérico compreender uma região Fc da subclasse I9G1 humana, ou da subclasse I9G1 humana com as mutações L234A e L235A e opcionalmente, P329G. Em uma outra forma de realização de todos os aspectos, tal como aqui relatado, o polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, é caracterizado por o referido polipeptídeo multimérico compreender uma região Fc da subclasse I9G2 humana. Em uma outra forma de realização de todos os aspectos, tal como aqui relatado, o polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, é caracterizado por o referido polipeptídeo multimérico compreender uma região Fc da subclasse IgG3 humana. Em uma forma de realização adicional de todos os aspectos aqui relatados, o polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, é caracterizado por o referido polipeptídeo multimérico compreender uma região Fc da subclasse humana IgG4 ou da subclasse humana IgG4 com a mutação adicional S228P e L235E e opcionalmente, P329G.
[0302] Em uma forma de realização de todos os aspectos, o polipeptídeo multimérico, de acordo com a invenção, compreende um primeiro polipeptídeo da região Fc e um segundo polipeptídeo da região Fc, em que i) o primeiro e o segundo polipeptídeo da região Fc compreendem a mutação Y436A, ou ii) o primeiro e o segundo polipeptídeo da região Fc compreendem as mutações 1253A, H310A e H435A, ou ii)) o primeiro e o segundo polipeptídeo da região Fc compreendem as mutações H310A, H433A e Y436A, ou iv) o primeiro e o segundo polipeptídeo da região Fc compreendem as mutações L251D, L314D e L432D, ou v) o primeiro polipeptídeo da região Fc compreende a mutação Y436A e o segundo polipeptídeo da região Fc compreende a) as mutações 1253A, H310A e H435A, ou b) as mutações H310A, H433A e Y436A, ou c) as mutações L251D, L314D e L432D, ou vi) o primeiro polipeptídeo da região Fc compreende as mutações 1253A, H310A e H435A e o segundo polipeptídeo da região Fc compreende a) as mutações H310A, H433A e Y436A, ou b) as mutações L251D, L314D e L432D, ou vii) o primeiro polipeptídeo da região Fc compreende as mutações H310A, H433A e Y436A e o segundo polipeptídeo da região Fc compreende a) as mutações L251D, L314D e L432D.
[0303] V. MÉTODOS RECOMBINANTES E COMPOSIÇÕES
[0304] Os anticorpos podem ser produzidos usando métodos e composições recombinantes, por exemplo, como descrito na US 4.816.567. Em uma forma de realização, é fornecido ácido nucleico isolado que codifica uma 2/3-lgG sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, como aqui descrito. Em uma forma de realização adicional, um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) que compreende esse ácido nucleico são fornecidos. Em uma forma de realização adicional, é fornecida uma célula hospedeira que compreende esse ácido nucleico. Em uma forma de realização, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo, uma célula de rim embrionário humano (HEK) ou uma célula de ovário de hamster chinês (CHO) ou uma célula linfóide (por exemplo, célula YO, NSO, Sp2/ 0). Em uma forma de realização, é fornecido um método de produção de 2/3-lI9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, em que o método compreende a cultura de um célula hospedeira que compreende um ácido nucleico que codifica a 2/3-l9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, como fornecido acima, em condições adequadas para expressão de anticorpo e, opcionalmente, a recuperação do 2/3-I9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada da cadeia hospedeira (ou meio de cultura de células hospedeiras)
[0305] Para a produção recombinante de uma 2/3-I9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, ácido nucleico que codifica uma 2/3-I9G sem inter- ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia pesada ou uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, por exemplo, como descrito acima, são isoladas e inseridas em um ou mais vetores para posterior clonagem e/ ou expressão em um hospedeiro célula.
[0306] As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de 2/3-lgG sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter- pesada - ou um vetor de codificação de 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada-cadeia incluem as células procarióticas ou eucarióticas descritas aqui em.
[0307] Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e a função efetora de Fc não são necessárias. Para expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias, consulte, por exemplo, US 5.648.237, US 5.789.199 e US 5.840.523. (Ver também Charlton, KA, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, BKC (ed.), Humana Pressão, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, descrevendo a expressão de fragmentos de anticorpos em, E. coli.) Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado da pasta celular bacteriana em uma fração solúvel e pode ser ainda mais purificado.
[0308] Além dos procariontes, micróbios eucarióticos, como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para 2/3-I9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada pesada ou uma 2/3-BiFab sem cadeia pesada da cadeia pesada vetores codificadores de ligações dissulfeto de cadeia, incluindo linhagens de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de uma 2/3-lgG sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma cadeia 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano. Ver Gerngross, T.U., Nat. Biotecnologia. 22 (2004) 1409- 1414; e Li, H. et al., Nat. Biotecnologia. 24 (2006)210-215.
[0309] As células hospedeiras adequadas para a expressão de 2/3-lg9G glicosilado sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter- pesada ou uma 2/3-BiFab glicosilada sem ligação dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada são também derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e insetos. Foram identificadas numerosas cepas baculovirais que podem ser usadas em conjunto com células de insetos, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.
[0310] As culturas de células vegetais também podem ser utilizadas como hospedeiros. Consulte, por exemplo, US 5.959.177, US
6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 e US 6.417.429 (descrevendo a tecnologia PLANTIBODIESTM para a produção de anticorpos em plantas transgênicas).
[0311] As células vertebradas também podem ser usadas como hospedeiros. Por exemplo, linhas celulares de mamífero que são adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhas celulares hospedeiras de mamíferos úteis são a linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linha de rim embriônico humano (células 293 ou 293 como descrito, por exemplo, em Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); células renais de hamster de bebê (BHK); células de Sertoli de camundongo (células TM4 como descrito, por exemplo, em Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980)243-252); células renais de macaco (CV1); Células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células renais caninas (MDCK; células hepáticas de ratos búfalos (BRL
3A); células pulmonares humanas (W138); células hepáticas humanas (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, como descrito, por exemplo, em Mather, JP et al., Annals NY Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC 5; e células FS4. Outras linhas celulares de mamíferos úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR-CHO (Urlaub, G et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); e linhas celulares de mieloma como YO, NSO e Sp2/ O. Para uma revisão de certas linhas celulares de mamíferos adequadas para produção de anticorpos, consulte, por exemplo, Yazaki, por exemplo, e Wu, AM, Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, BKC (ed.), Humana Pressão, Totowa, NJ (2004), pp. 255-
268.
[0312]VI. — MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA
DIAGNÓSTICO E DETECÇÃO
[0313] Em certas formas de realização, qualquer uma das 2/3-I9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou a ligação 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada fornecida aqui são úteis para detectar a presença de seus alvos em uma amostra biológica. O termo “detecção”, conforme aqui utilizado, abrange detecção quantitativa ou qualitativa. Em certas formas de realização, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido.
[0314] Em uma forma de realização, é fornecido uma 2/3-lgG sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada para uso em um método de diagnóstico ou detecção.
[0315] Em certas formas de realização, 2/3-I9G marcado sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou 2/3-BiFab marcado sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada- cadeia é fornecido. Os rótulos incluem, mas não estão limitados a, rótulos ou porções que são detectados diretamente (como rótulos fluorescentes, cromofóricos, densos em elétrons, quimioluminescentes e radioativos), bem como porções, como enzimas ou ligantes, que são detectados indiretamente, por exemplo, através de uma reação enzimática ou interação molecular. Marcadores de exemplo incluem, entre outros, os radioisótopos 32P, 14C, 125], 3H e 1311, fluoróforos, como quelatos de terras raras ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, umbeliferona, luceriferases, por exemplo, luciferase de vaga-lume e luciferase bacteriana (US 4.737.456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinodionas, peroxidase de rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina, B-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacarídeo oxidase, por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfatase, desidrogenase, oxidases heterocíclicas, como uricase e xantina oxidase, acopladas a uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio para oxidar um precursor de corante, como HRP, lactoperoxidase ou microperoxidase, biotina/ avidina, rótulos rotativos, rótulos de bacteriófagos, radicais livres estáveis e similares.
[0316] VIl. IMUNOCONJUGADOS
[0317]A invenção também fornece imunoconjugados que compreende uma 2/3-lgG sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, conforme relatado aqui conjugado com um ou mais agentes citotóxicos, tais como agentes ou drogas quimioterapêuticos, agentes inibidores de crescimento, toxinas (por exemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal ou fragmentos dos mesmos) ou isótopos radioativos.
[0318] Em uma forma de realização, um imunoconjugado é um conjugado anticorpo-medicamento (ADC) no qual uma 2/3-l9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada é conjugado com um ou mais medicamentos, incluindo mas não se limitando a um maitansinóide (ver US 5.208.020, US 5.416.064 e EP O 425 235 B1); uma auristatina como porções de fármacos monometil auristatina DE e DF (MMAE e MMAF) (ver US
5.635.483, US 95.780588 e US 7.498298) uma dolastatina;y uma caliqueamicina ou um seu derivado (ver US 5.712.374, US 5.714.586, US
5.739.116, US 5.767.285, US 5.770.701, US 5.770.710, US 5.773.001 e US
5.877.296; Hinman, LM et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342; e Lode, HN et al., Cancer Res. 58 (1998)2925-2928); uma antraciclina como daunomicina ou doxorrubicina (ver Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, SC et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, MY et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, GM et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, HD et al., J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343; e US 6.630.579); metotrexato; vindesina; um taxano como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel e ortataxel, um tricoteceno e CC1065.
[0319] EM outra forma de realização, um imunoconjugado compreende uma 2/3-lgG sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia interpesada como descrito aqui conjugado a uma toxina enzimaticamente ativa ou seus fragmentos, incluindo, entre outros, a cadeia da difteria A, fragmentos ativos não ligados à toxina da difteria, cadeia da exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia da ricina A, cadeia da abrina A, cadeia da modecina A, alfa-sarcino, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrinocina, fenomicina, enomicina e tricotecenos. Consulte, por exemplo, WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993.
[0320] Em outra forma de realização, um imunoconjugado compreende uma 2/3-lgG sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, conforme descrito aqui, conjugado com um átomo radioativo para formar um radioconjugado. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de radioconjugados. Exemplos incluem At211, 1131, 1125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. quando o radioconjugado é usado para detecção, ele pode compreender um átomo radioativo para estudos cintilográficos, por exemplo, TC99m ou 1123, ou um rótulo rotativo para imagens por ressonância magnética nuclear (RMN) (também conhecida como ressonância magnética, MRI), como iodo -123 novamente, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
[0321] Conjugados de uma 2/3-lg9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada e um agente citotóxico podem ser feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento bifuncionais, como N- succinimidil-3- — (2-piridilditio) — propionato — (SPDP), —succinimidil4- — (N- maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (como dimetil adipimidato HCI), ésteres ativos (como o suberato de disuccinimidil), aldeídos (como o glutaraldeído), compostos de bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (como bis- (p-diazônio benzoil) etilenodiamina), di-isocianatos (como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativos (como 1,5- difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104. O ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triamina pentaacético (MX-DTPA)
marcado com carbono-14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para a conjugação de radionucleotídeo no anticorpo. Ver WO 94/11026. O ligante pode ser um “ligante clivável”, facilitando a liberação de um medicamento citotóxico na célula. Por exemplo, um ligante lábil ao ácido, ligante sensível à peptidase, ligante fotolábil, ligante dimetílico ou ligante contendo dissulfeto (Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; US 5,208,020) pode ser usado.
[0322] Os imunoconjugados ou ADCs aqui contemplam expressamente, mas não estão limitados a tais conjugados preparados com reagentes de reticulador, incluindo, mas não limitados a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC e sulfo-SMPB e SVSB (succinimidil- (4-vinilsulfona) benzoato) comercialmente comercializados disponível (por exemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, EUA).
[0323] Conjugados de 2/3-lgG sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou 2/3-BiFab sem ligação dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada da cadeia pesada, conforme relatado aqui e uma ou mais toxinas de moléculas pequenas, como uma caliqueamicina, uma maitansina (US 5,208,020), um tricoteno e CC1065 também são contemplados aqui. Em uma forma de realização da invenção, a 2/3-I9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou a ligação 2/3-BiFab sem ligação dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada é conjugada a uma ou mais moléculas de maitansina (por exemplo, cerca de 1 a cerca de 10 moléculas de maitansina por molécula antagonista). A maitansina pode, por exemplo, ser convertida em May-SS-Me, que pode ser reduzida para May-SH3 e reagida com antagonista modificado (Chari et al., Cancer Research 52: 127- 131 (1992)) para gerar um conjugado de maitansinóide-anticorpo.
[0324] De forma alternativa, o 2/3-I9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou o 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, tal como aqui relatado, é conjugado com uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de antibióticos caliqueamicina é capaz de produzir quebras de DNA de fita dupla em concentrações sub-picomolares. Análogos estruturais da caliqueamicina que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, y11, a21, a3l, N-acetil- y11, PSAG e 811 (Hinman et al., Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) e Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)).
[0325] A presente invenção contempla ainda uma 2/3-I9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, tal como aqui relatado, conjugado com um composto com atividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou uma endonuclease de DNA tal como uma desoxirribonuclease; DNase).
[0326] De forma alternativa, pode ser feita uma proteína de fusão que compreende uma 2/3-lIgG sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, tal como aqui relatado, e agente citotóxico, por exemplo, por técnicas recombinantes ou síntese peptídica.
[0327] VIII. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS
[0328] Formulações farmacêuticas de uma 2/3-I9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou de uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou de uma composição que compreende dois diferentes de 2/3-l9G sem ligações dissulfureto da cadeia pesada - cadeia pesada ou duas 2/3-BiFab diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, como descrito aqui são preparadas através da mistura esses 2/3-Ig9G (s) ou 2/3-BiFab (s)
possuindo o grau de pureza desejado com um ou mais veículos farmaceuticamente —* aceitáveis —opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16º edição, Osol, A. (ed.) (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas.
Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas e incluem, mas não estão limitados a: tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de octadecil dimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, butil ou álcool benzílico; parabenos alquílicos como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e mr-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como poli (vinilpirrolidona); aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, maniitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de proteína Zn); e/ ou tensoativos não iônicos, tais como polietilenoglicol (PEG). Exemplos de transportadores farmaceuticamente aceitáveis neste documento incluem ainda agentes de dispersão intersticial de drogas, tais como glicoproteínas de hialuronidase solúvel em ativo neutro (SsHASEGP), por exemplo, glicoproteínas de hialuronidase PH-20 solúveis em humanos, tais como rhuPH20 (HYLENEXº, Baxter International, Inc.). Certos SHASEGPs e métodos de uso de exemplo, incluindo rhuPH20, são descritos nos documentos US 2005/0260186 e US 2006/0104968. Em um aspecto, um sSHASEGP é combinado com uma ou mais glicosamino glicanases adicionais, como condroitinases.
[0329] Formulações de anticorpos liofiizadas de exemplo são descritas na US 6.267.958. As formulações aquosas de anticorpos incluem aquelas descritas em US 6.171.586 e WO 2006/044908, as últimas formulações incluindo um tampão de histidina-acetato.
[0330] As formulações liofilizadas adaptadas para administração subcutânea são descritas no documento WO 97/04801. Tais formulações liofilizadas podem ser reconstituídas com um diluente adequado para uma alta concentração de proteína e a formulação reconstituída pode ser administrada subcutaneamente ao mamífero a ser tratado aqui.
[0331] A formulação aqui contida também pode conter mais de um ingrediente ativo conforme necessário para a indicação específica a ser tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não se afetam adversamente. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades efetivas para a finalidade pretendida.
[0332] Os ingredientes ativos podem ser presos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli (metacrilato de metila), respectivamente, em sistemas de distribuição de medicamentos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16º edição, Osol, A. (ed.) (1980).
[0333] Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, fimes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli (2-hidroxietilmetacrilato) ou poli (álcool vinílico)), polilactídeos (US 3.773.919), copolímeros de ácido L- glutâmico e y-etil-L-glutamato, copolímeros de etileno-acetato de vinila não degradáveis, copolímeros de ácido lático degradável e ácido glicólico, como o LUPRON DEPOT '“ (microesferas injetáveis compostas por copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e poli-D-(-)- 3-hidroxibutírico ácido.
[0334] As formulações a serem usadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser facilmente alcançada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis. Em uma forma de realização, a formulação é isotônica.
[0335] IX. — MÉTODOS TERAPÊUTICOS E COMPOSIÇÕES
[0336] Qualquer um dos 2/3-lgG sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou do 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada-pesada ou de uma composição que compreende duas 2/3-lgG diferentes sem a interação inter-pesada ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia pesada ou duas 2/3-BiFab diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada-cadeia aqui fornecidas podem ser usadas em métodos terapêuticos.
[0337] Em um aspecto, uma 2/3-lg9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma composição que compreende duas 2/3-lgG diferentes sem interferência são fornecidas ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia pesada ou duas 2/3-BiFab diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada para uso como medicamento. Em certas formas de realização, uma 2/3-I9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma composição que compreende duas 2/3-lI9G diferentes sem interação são fornecidas ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia pesada ou duas 2/3-BiFab diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada para uso em um método de tratamento. Um “indivíduo” de acordo com qualquer uma das formas de realização acima é de preferência um humano.
[0338] Em um aspecto adicional, é aqui proporcionado o uso de uma 2/3-lgG sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou de uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter- pesada ou de uma composição que compreende duas 2/3-lgG diferente sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou duas ligações dissulfeto 2/3-BiFab diferentes sem ligação dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada na fabricação ou preparação de um medicamento. Um “indivíduo” de acordo com qualquer uma das formas de realização acima pode ser um humano.
[0339] Em um aspecto adicional, é aqui proporcionado um método para o tratamento de uma doença. Em uma forma de realização, o método compreende administrar a um indivíduo com uma doença uma quantidade eficaz de uma 2/3-lgG sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter- pesada ou de uma 2/3-BiFab sem cadeia pesada da cadeia pesada ligações dissulfeto ou de uma composição que compreende duas 2/3-lgG diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou duas 2/3- BiFab diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter- pesada. Em uma dessas formas de realização, o método compreende ainda administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, tal como dado abaixo. Um “indivíduo” de acordo com qualquer uma das formas de realização acima pode ser um humano.
[0340] Em um aspecto adicional, são fornecidas aqui formulações farmacêuticas que compreende qualquer um dos 2/3-lI9GGs sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, como aqui fornecido ou dos 2/3-BiFabs sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada como aqui fornecido ou das composições que compreende duas 2/3-IgG diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou duas 2/3-BiFab diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, conforme aqui fornecido, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos acima. Em uma forma de realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer um dos 2/3-lgGs sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou dos 2/3-BiFabs sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou de composições que compreende duas 2/3-lgG diferente sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou duas ligações dissulfeto 2/3-BiFab diferentes sem ligação dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada fornecida aqui e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outra forma de realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer uma das 2/3-lgG sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou do 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou das composições que compreende duas 2/3-lgG diferente sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou duas ligações dissulfeto 2/3-BiFab diferentes sem ligação dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada fornecida aqui e pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme indicado abaixo.
[0341] 2/3-lgGs sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou 2/3-BiFabs sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou composições que compreende duas 2/3-lgG diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou duas 2/3-BiFab diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, tal como aqui relatado, podem ser usadas sozinhas ou em combinação com outros agentes em uma terapia. Por exemplo, uma 2/3-l9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma composição que compreende duas 2/3-lgG diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou duas 2/3-BiFab diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada como relatado neste documento podem ser coadministradas com pelo menos um agente terapêutico adicional.
[0342] Tais terapias combinadas mencionadas acima abrangem administração combinada (onde dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos na mesma ou em formulações separadas) e administração separada; nesse caso, a administração do 2/3-I9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou do 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou da composição que compreende duas 2/3-lgG diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter- pesada ou duas 2/3-BiFab diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada como relatado neste documento podem ocorrer antes da administração simultânea e/ ou após o agente ou agentes terapêuticos adicionais. 2/3-Ig9Gs sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter- pesada ou de 2/3-BiFabs sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou de composições que compreendem duas 2/3-lgG diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou duas 2/3- BiFab diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter- pesada como relatadas aqui também podem ser usadas em combinação com outras terapias de intervenção, como, entre outras, terapia de radiação, terapia comportamental ou outras terapias conhecidas no estado da técnica e apropriadas para o distúrbio neurológico a ser tratado ou prevenido.
[0343] A 2/3-l9dG sem ligações dissulfeto da cadeia pesada -
cadeia inter-pesada ou uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma composição que compreende duas 2/3- 1gG diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou duas 2/3-BiFab diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, conforme relatado aqui (e qualquer agente terapêutico adicional) podem ser administradas por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, intrapulmonar e intranasal, e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. As infusões parentéricas incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser por qualquer via adequada, por exemplo, por injeções, como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. Vários esquemas de dosagem incluindo, entre outros, administrações únicas ou múltiplas ao longo de vários períodos de tempo, administração de bolus e infusão de pulsos são contemplados aqui.
[0344] 2/3-lgGs sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou 2/3-BiFabs sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou composições que compreende duas 2/3-lgG diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou duas 2/3-BiFab diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, conforme relatado neste documento, seriam formuladas, dosadas e administradas de uma maneira consistente com as boas práticas médicas. Os fatores a serem considerados neste contexto incluem o distúrbio específico que está sendo tratado, o mamífero específico que está sendo tratado, a condição clínica de cada paciente, a causa do distúrbio, o local de administração do agente, o método de administração, o agendamento da administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. O 2/3-I9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou o 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou a composição que compreende duas 2/3-lgG diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou duas 2/3-BiFab diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada não precisam ser, mas são opcionalmente, formuladas com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz desses outros agentes depende da quantidade de agente terapêutico presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração descritas aqui, ou cerca de 1a 99% das dosagens aqui descritas, ou em qualquer dosagem e por qualquer via que seja empiricamente/ clinicamente determinada como apropriada.
[0345] Os métodos baseados em lipídios de transportar os compostos através do BBB incluem, mas não estão limitados a, encapsular a construção de fusão ou um composto em lipossomas que são acoplados a entidade de ligação monovalente que se liga a receptores no endotélio vascular do BBB (consulte, por exemplo, US 2002/0025313) e revestimento da entidade de ligação monovalente em partículas de lipoproteína de baixa densidade (consulte, por exemplo, US 2004/0204354) ou apolipoproteína E (consulte, por exemplo, US 2004/0131692).
[0346] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de uma 2/3-lgG sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou de uma 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou de uma composição que compreende duas 2/3-I9G diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou duas ligações dissulfeto 2/3-BiFab diferentes sem ligação dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, conforme relatado neste documento (quando usado sozinho ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais) dependerão do tipo de doença a ser tratada, do tipo de 2/3-l9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou de 2/3-BiFab sem dissulfeto da cadeia pesada da cadeia pesada ligações ou de composição que compreende duas ligações diferentes de 2/3-I9G sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou duas 2/3-BiFab diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, a gravidade e o curso da doença, seja o anticorpo é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, história clínica do paciente e resposta ao anticorpo, e a critério do médico assistente.
O 2/3-l9G sem ligações dissulfureto da cadeia pesada da cadeia pesada ou o 2/3-BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou a composição que compreende duas 2/3-lgG diferentes sem cadeia dissulfeto da cadeia pesada ligações dissulfeto da cadeia pesada ou duas 2/3-BiFab diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada são adequadamente administradas ao paciente ao mesmo tempo ou durante uma série de tratamentos.
Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 ug/kg a mg/ kg (por exemplo, 0,5 mg/ kg - 10 mg/ kg) de anticorpo pode ser uma dose candidata inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas ou por infusão contínua.
Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 ug/ kg a 100 mg/ kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima.
Para administrações repetidas por vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento geralmente é mantido até que ocorra a supressão desejada dos sintomas da doença.
Uma dosagem exemplar de anticorpo estaria na faixa de cerca de 0,05 mg/ kg a cerca de 10 mg/ kg.
Assim, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/ kg, 2,0 mg/ kg, 4,0 mg/ kg ou 10 mg/ kg (ou qualquer combinação dos mesmos) podem ser administradas ao paciente.
Tais doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, a cada semana ou a cada três semanas (por exemplo, de modo que o paciente receba de cerca de duas a cerca de vinte, ou por exemplo, cerca de seis doses de anticorpo). Pode ser administrada uma dose inicial de carga mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas. No entanto, outros regimes posológicos podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.
[0347] Entende-se que qualquer uma das formulações ou métodos terapêuticos acima pode ser realizada usando um imunoconjugado, tal como aqui relatado, no lugar de ou em adição a uma 2/3-lIgG sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou ligações 2/3 -BiFab sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou uma composição que compreende duas 2/3-lgG diferentes sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou dois diferentes 2/3-BiFab sem dissulfeto da cadeia pesada da cadeia pesada títulos.
[0348] A composição que compreende uma 2/3-lgGs sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada ou 2/3-BiFabs sem ligações dissulfeto da cadeia pesada - cadeia inter-pesada, conforme relatado aqui será formulada, dosada e administrada de uma maneira consistente com boas práticas médicas. Os fatores a serem considerados neste contexto incluem a doença ou distúrbio específico que está sendo tratado, o mamífero específico que está sendo tratado, a condição clínica de cada paciente, a causa da doença ou distúrbio, o local de entrega do agente, o método de administração, a programação da administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. À quantidade terapeuticamente eficaz a ser administrada será governada por tais considerações.
[0349] Como observado acima, no entanto, essas quantidades sugeridas a serem administradas estão sujeitas a uma grande dose de discrição terapêutica. O fator chave na seleção de uma dose e programação apropriadas é o resultado obtido, conforme indicado acima. Por exemplo, doses relativamente mais altas podem ser necessárias inicialmente para o tratamento de doenças agudas e em andamento. Para obter os resultados mais eficazes,
dependendo da doença ou distúrbio, o antagonista é administrado o mais próximo possível do primeiro sinal, diagnóstico, aparência ou ocorrência da doença ou distúrbio, tanto quanto possível, ou durante remissões da doença ou distúrbio.
[0350] Técnicas gerais para a conjugação de agentes terapêuticos adicionais a anticorpos são bem conhecidas (consulte, por exemplo, Arnon et al., “Anticorpos monoclonais para segmentação imunológica de medicamentos na terapia do câncer”, em Anticorpos monoclonais e terapia do câncer, Reisfeld et al. (Eds.), 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Anticorpos For Drug Delivery”, em Controlled Drug Delivery (2º Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623 -53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Portadores de Anticorpos de Agentes Citotóxicos em Terapia de Câncer: Uma Revisão”, em Anticorpos Monoclonais “84: Aplicações Biológicas e Clínicas, Pinchera et al. (Eds.), Pp. 475 -506 (1985) e Thorpe et al., “The Preparation And Citotoxic Properties of Anticorpo-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev., 62 (1982) 119-58).
[0351] X. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO
[0352] Em outro aspecto, tal como aqui relatado, é fornecido um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ ou diagnóstico dos distúrbios descritos acima. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um marcador ou bula ou associada ao recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, sacos de solução IV, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é por si só ou combinada com outra composição eficaz para tratar, prevenir e/ ou diagnosticar a condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo tal como aqui relatado. O rótulo ou bula indica que a composição é usada para tratar a condição de escolha. Além disso, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um anticorpo tal como aqui relatado; e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um agente citotóxico ou terapêutico adicional. O artigo de fabricação nesta forma de realização pode ainda compreender um folheto informativo indicando que as composições podem ser usadas para tratar uma condição específica. De forma alternativa, ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode ainda compreender um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
[0353] Entende-se que qualquer um dos artigos de fabricação acima pode incluir um imunoconjugado, tal como aqui relatado, no lugar de ou em adição a um anticorpo biespecífico tal como aqui relatado.
[0354]Xl. CONJUNTOS DE FORMA DE REALIZAÇÃO
ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO
[0355] 1º conjunto:
1. Polipeptídeo multimérico 2/3-BiFab que compreende um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo em que ambos os polipeptídeos compreendem a sequência de aminoácidos DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66), um domínio variável de anticorpo e um domínio CH3 de imunoglobulina G humana (I9G1), em que i) o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, se o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, ou ii) o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, se o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, em que i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação no puxador e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações no buraco, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações no buraco e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação no puxador, em que o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um local de ligação funcional ou pelo menos uma parte de um local de ligação, em que o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 pelo menos uma mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana em sua sequência de aminoácidos (domínio CH3) na (s) posição (ões) de aminoácidos em uma imunoglobulina do tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são um dímero não covalente, em que o domínio variável do primeiro polipeptídeo e o domínio variável do segundo polipeptídeo formam um local de ligação não funcional.
2. O polipeptídeo multimérico 2/3-BiFab, de acordo com a forma de realização 1, em que o primeiro polipeptídeo é um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um domínio CH1 da IgG1 humana,
iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
iv) um scFv, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da I9gG1 humana,
v) um scFab, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
vi) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
vili) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da I9gG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
ix) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
x) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, e um scFv,
xi) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, e um scFab,
xii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia leve,
xili) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da I9G1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia leve e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
xiv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana, e xv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
e o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana que compreende a mutação no puxador ou as mutações no buraco,
em que o domínio CH3 compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, O347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, ES57F, ES57K, K360S, K360E, Q0362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394|, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y4071, K409D, K409E, K409], K439E, L441Y, Y349C, S366T, AS68L, V407Y, S354C, e W366T, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana em sua sequência de aminoácidos
(domínio CH3) na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (domínio CH3) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora.
3. O polipeptídeo multimérico 2/3-BiFab de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 2, em que o polipeptídeo multimérico compreende ainda um terceiro polipeptídeo que compreende um domínio variável adicional da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve, em que o terceiro polipeptídeo está ligado de forma covalente ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto.
4. Composição, que compreende: um primeiro polipeptídeo heterotrimérico 2/3-BiFfab que compreende como primeiro polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um domínio CH1 da IgG1 humana, iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
iv) um scFv, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
v) um scFab, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
vi) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
vili) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
ix) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
x) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, e um scFv,
xi) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, e um scFab,
xii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia leve,
xili) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia leve e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
xiv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana, e xv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
e como segundo polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da I9G1 humana,
em que i) o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, se o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, ou ii) o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, se o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada,
em que o domínio CH3 compreende a mutação no puxador, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação no puxador,
em que o domínio CH3 compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, O347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, ES57A, E357L, E357F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394|, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y4071, K409D, K409E, K409], K439E, L441Y, Y349C, S366T, ASG68L, V407Y, S354C, e W366T, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (I9gG1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora,
e como terceiro polipeptídeo, um polipeptídeo que compreende um domínio variável adicional da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve, em que o terceiro polipeptídeo está ligado de forma covalente ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto,
e um segundo polipeptídeo heterotrimérico 2/3-BiFfab que compreende como primeiro polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
em que o domínio CH3 compreende a mutação no puxador, se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender a mutação no puxador,
em que o domínio CH3 compreende uma segunda mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, ES57F, E3S57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T3661], L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I|, K409D, K409E, K409l, K439E, L441Y, Y349C, S366T, AS68L, V407Y, S354C, e W366T, em que o segundo polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana em sua sequência de aminoácidos (domínio CH3) na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem com o resíduo de aminoácidos na mutação perturbadora,
e como segundo polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um domínio CH1 da IgG1 humana,
iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
iv) um scFv, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
v) um scFab, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
vi) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio
CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
ix) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
x) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, e um scFv,
xi) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, e um scFab,
xii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da I9G1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia leve,
xiii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia leve e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
xiv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda de I9gG1 humana, e xv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda de IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
que compreende a mutação no puxador, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação no puxador,
em que i) o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, se o domínio variável do segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero for um domínio variável da cadeia leve, ou ii) o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, se o domínio variável do segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero for um domínio variável da cadeia pesada,
e como terceiro polipeptídeo, um polipeptídeo que compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve, em que o sexto polipeptídeo está ligado de forma covalente ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto, em que i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende a mutação no puxador e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende as mutações no buraco, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende as mutações no buraco e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende a mutação no puxador, em que i) no caso do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender as mutações no buraco, o segundo polipeptídeo do segundo polipeptídeo heterotrímero compreende a mutação no puxador, ou ii) no caso do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender a mutação no puxador, o segundo polipeptídeo do segundo polipeptídeo do heterotrímero compreender as mutações no buraco, em que o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero e o primeiro polipeptídeo do segundo polipeptídeo heterotrímero compreendem mutações perturbadoras em diferentes posições, em que o domínio variável do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero e o domínio variável do segundo polipeptídeo do segundo heterotrímero forma um local de ligação funcional e o domínio variável do segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero e o domínio variável do primeiro polipeptídeo do segundo heterotrímero formam um par não funcional de domínios variáveis.
5. Polipeptídeo multimérico 2/3-l9G que compreende um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo em que ambos os polipeptídeos compreendem um domínio CH3 da imunoglobulina humana, em que i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação no puxador e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações no buraco, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações no buraco e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação no puxador, em que o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um local de ligação funcional ou pelo menos uma parte de um local de ligação, em que o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 pelo menos uma mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (domínio CH3) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem com o resíduo de aminoácidos na mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são um dímero não covalente ou covalente.
6. O polipeptídeo multimérico de 2/3-IgG, de acordo com à forma de realização 5, em que o primeiro polipeptídeo é um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9gG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IGG1 humana, ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia pesada e um domínio CH1 da I9gG1 humana,
ili) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio CH1 da IgG1 humana e um domínio variável da cadeia pesada,
iv) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
v) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
vi) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9gG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio
CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um domínio variável da cadeia leve,
ix) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia leve e um segundo domínio CH1 da I9G1 humana,
x) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana,
xi) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada, e xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente, um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um local de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo, e o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana que compreende a mutação no puxador ou as mutações no buraco, que compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394|, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407|, K409D, K409E, K409|, K439E, L441Y, Y349C, S366T, ASG8L, V407Y, S354C, e W366T, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina (s) humana em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem com o resíduo de aminoácidos na mutação perturbadora.
7. O polipeptídeo multimérico 2/3-I9G, de acordo com qualquer uma das formas de realização 5 ou 6, em que polipeptídeo multimérico compreende ainda um terceiro polipeptídeo que compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve, em que o terceiro polipeptídeo está ligado de forma covalente ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto.
8. Composição, que compreende:
um primeiro polipeptídeo heterotrimérico —2/3-I9G, que compreende como primeiro polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9gG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG1 humana,
ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia pesada e um domínio CH1 de I9gG1 humano,
iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio CH1 da IgG1 humana e um domínio variável da cadeia pesada,
iv) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
v) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da I9G1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
vi) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9G1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9G1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um domínio variável da cadeia leve,
ix) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia leve e um segundo domínio CH1 da I9gG1 humana,
x) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana,
xi) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda de Ig9G1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada, e xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente, um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um local de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo,
que compreende a mutação no puxador ou as mutações no buraco,
e como segundo polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
que compreende a mutação no puxador, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação no puxador,
que compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V,
K370E, N390E, K392E, K392D, T394|, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407|, K409D, K409E, K409], K439E, L441Y, Y349C, S366T, ASG8L, V407Y, S354C, e W366T, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (IgG1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora,
e como terceiro polipeptídeo, um polipeptídeo que compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve ligado de forma covalente ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto,
e um segundo polipeptideo heterotrimérico 2/3-I9G, que compreende como primeiro polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
em que o domínio CH3 compreende a mutação no puxador, se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender a mutação no puxador,
em que o domínio CH3 compreende uma segunda mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E3S57L, ES57F, ESS57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T3661, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I,
V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409l, K439E, L441Y, Y349C, S366T, AS68L, V407Y, S354C, e W366T, em que o segundo polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana em sua sequência de aminoácidos (do domínio CH3) na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem com o resíduo de aminoácidos na segunda mutação perturbadora,
e como segundo polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9G1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG1 humana,
ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia pesada e um domínio CH1 de IgG1 humano,
iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio CH1 da IgG1 humana e um domínio variável da cadeia pesada,
iv) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da I9G1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
v) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
vi) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9G1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9G1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um domínio variável da cadeia leve,
ix) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia leve e um segundo domínio CH1 da I9G1 humana,
x) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda de I9gG1 humana,
xi) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada, e xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente, um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um local de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo,
que compreende a mutação no puxador, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação no puxador,
e como terceiro polipeptídeo, um polipeptídeo que compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve,
em que o terceiro polipeptídeo está ligado de forma covalente ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto,
em que i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende a mutação no puxador e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende as mutações no buraco, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende as mutações no buraco e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende a mutação no puxador, em que i) no caso do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender as mutações no buraco, o segundo polipeptídeo do segundo polipeptídeo heterotrímero compreende a mutação no puxador, ou ii) no caso do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender a mutação no puxador, o segundo polipeptídeo do segundo polipeptídeo do heterotrímero compreender as mutações no buraco, em que o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero e o primeiro polipeptídeo do segundo polipeptídeo heterotrímero compreendem mutações perturbadoras em posições diferentes.
9. Formulações farmacêuticas que compreende uma 2/3-lgG de acordo com qualquer uma das formas de realização 5, 6 e 7, ou que compreende uma 2/3-BiFab de acordo com qualquer uma das formas de realização 1, 2 e 3, ou que compreende uma composição de acordo com qualquer uma das formas de realização 4 e 8, e opcionalmente, um excipiente farmaceuticamente aceitável.
10. —“Formulações farmacêuticas que compreende um primeiro polipeptídeo heterotrimérico, que compreende um primeiro, um segundo e um terceiro polipeptídeo monomérico, e um segundo polipeptídeo heterotrimérico, que compreende um quarto, um quinto e um sexto polipeptídeo monomérico, em que o primeiro, o segundo, o quarto e o quinto polipeptídeo monomérico compreendem cada um na direção terminal Na C
(i) a sequência de aminoácidos DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66),
(ii) um primeiro domínio variável de anticorpo, e
(iii) um domínio CH3 da imunoglobulina humana (I9G1),
em que ((i) (ii) e (ii) são de forma independente um do outro, diretamente ou através de um ligante peptídico conjugados entre si,
em que o primeiro domínio variável de anticorpo do i) primeiro e o segundo polipeptídeo monomérico, e ii) o primeiro e o quarto polipeptídeo monomérico, iii) o segundo e o quinto polipeptídeo monomérico, e iv) o quarto e o quinto polipeptídeo monomérico são, cada um, um par VH/ VL,
em que o domínio CH3 de i) o primeiro e o quarto polipeptídeo monomérico, e ii) o primeiro e o segundo polipeptídeo monomérico, iii) o segundo e o quinto polipeptídeo monomérico, e iv) o quarto e o quinto polipeptídeo monomérico são, cada um, um par de puxador-em-buraco em que o primeiro polipeptideo monomérico e o quarto polipeptídeo monomérico compreendem cada um, de forma independente um do outro, em um ou ambos os seus terminais N e C, de forma independente um do outro, um scFv, ou um scFab, ou um Fab,
em que o segundo e o quinto polipeptíideco monomérico compreendem cada um no domínio CH3 pelo menos uma mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo monomérico compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana em sua sequência de aminoácidos (domínio CH3) na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem com o resíduo de aminoácidos na mutação perturbadora do segundo polipeptídeo monomérico, em que o quarto polipeptídeo monomérico compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana em sua sequência de aminoácidos (domínio CH3) na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem com o resíduo de aminoácidos na mutação perturbadora do quinto polipeptídeo monomérico, em que a mutação perturbadora no segundo polipeptídeo monomérico não está na mesma posição na sequência de aminoácidos que a mutação perturbadora no quinto polipeptídeo monomérico, em que a mutação perturbadora no segundo polipeptídeo monomérico e a mutação perturbadora no quinto polipeptídeo monomérico resultam em uma interação atraente (carga) quando o segundo polipeptídeo monomérico e o quinto polipeptídeo monomérico formam um heterodímero, em que as mutações perturbadoras no segundo e quinto polipeptídeo monomérico resultam em interações repulsivas (carga) quando o segundo polipeptídeo monomérico forma um heterodímero com o primeiro polipeptídeo monomérico e o quinto polipeptíideo monomérico forma um heterodímero com o quarto polipeptídeo monomérico, respectivamente, em que o primeiro e o segundo polipeptídeo monomérico são um dímero não covalente, o quarto e o quinto polipeptídeo monomérico são um dímero não covalente, o terceiro e o primeiro polipeptídeo monomérico são um dímero ligado a dissulfeto e o sexto e o quarto polipeptídeo monomérico são um dímero ligado a dissulfeto, em que o terceiro e o sexto polipeptídeo monomérico são cadeias leves de anticorpos.
11. A formulação farmacêutica, de acordo com a forma de realização 10, em que o primeiro polipeptídeo é selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um domínio CH1 da IgG1 humana,
iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
iv) um scFv, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
v) um scFab, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
vi) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
ix) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66,
um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
x) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, e um scFv,
xi) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da I9gG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, e um scFab,
xii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia leve,
xiii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia leve e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
xiv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana, e xv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada, e o terceiro polipeptídeo é um polipeptídeo que compreende um domínio variável adicional da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve, em que o terceiro polipeptídeo está ligado de forma covalente ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto.
12. A formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das formas de realização 10 e 11, em que o segundo polipeptídeo é selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da I9gG1 humana, em que i) o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, se o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, ou ii) o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, se o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, em que o domínio CH3 compreende a mutação no puxador, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação no puxador, em que o domínio CH3 compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, O347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, ES57A, E357L, E357F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T3941, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y4071, K409D, K409E, K409], K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, e W366T, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana em sua sequência de aminoácidos (domínio CH3) na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem com o resíduo de aminoácidos na mutação perturbadora.
13. A formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das formas de realização 10 a 12, em que o quinto polipeptídeo é selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, em que o domínio CH3 compreende a mutação no puxador, se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender a mutação no puxador, em que o domínio CH3 que compreende uma segunda mutação perturbadora, selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em E345R, QO347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E3S57L, ES57F, ESS57K, K360S, K360E, Q362E,
S364V, S364L, T3661, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394], V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409l, K439E, L441Y, Y349C, S366T, AS68L, V407Y, S354C, e W366T, em que o quinto polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana em sua sequência de aminoácidos (domínio CH3) na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem com o resíduo de aminoácidos na mutação perturbadora, em que a mutação perturbadora no quinto polipeptídeo está em uma posição diferente da mutação perturbadora no segundo polipeptídeo.
14. A formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das formas de realização 10 a 13, em que o quarto polipeptídeo é selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um domínio CH1 da IgG1 humana, iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada, iv) um scFv, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
v) um scFab, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
vi) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
vili) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
ix) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
x) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, e um scFv,
xi) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, e um scFab,
xii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia leve,
xili) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia leve e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
xiv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana, e xv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada, que compreende a mutação no puxador, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação no puxador, em que |) o primeiro domínio variável do quarto polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada se o primeiro domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, ou ii) o primeiro domínio variável do quarto polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve se o primeiro domínio variável do primeiro polipeptídeo for um domínio variável da cadeia pesada, e o sexto polipeptídeo é um polipeptídeo que compreende um domínio variável adicional da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve, em que o sexto polipeptídeo está ligado de forma covalente ao quarto polipeptídeo por uma ligação dissulfeto.
15. A formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das formas de realização 10 a 14, em que o primeiro domínio variável do primeiro polipeptídeo e o primeiro domínio variável do quarto polipeptídeo formam um local de ligação funcional e o primeiro domínio variável do segundo polipeptídeo e o primeiro domínio variável do quinto polipeptídeo formam um par não funcional de domínios variáveis.
[0356] 2º conjunto: 1 POLIPEPTÍDEO MULTIMÉRICO, que compreende: um primeiro polipeptídeo que compreende na direção terminal N a C um domínio variável de anticorpo e um domínio CH3 da imunoglobulina G humana, um segundo polipeptídeo que compreende na direção terminal N a C um domínio variável de anticorpo e um domínio CH3 de imunoglobulina G humana, em que i) o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, se o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, ou ii) o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, se o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, em que o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 pelo menos uma mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana em sua sequência de aminoácidos (domínio CH3) na (s) posição (ões) de aminoácidos em uma imunoglobulina do tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são um dímero não covalente, em que o domínio variável do primeiro polipeptídeo e o domínio variável do segundo polipeptídeo formam um local de ligação não funcional, em que o primeiro polipeptídeo compreende ainda um local de ligação funcional.
2. O polipeptídeo multimérico de acordo com a forma de realização 1, em que o primeiro e o segundo polipeptídeo compreendem, cada um, a sequência de aminoácidos DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66) ou DKTHT (SEQ ID NO: 94) ou GGGS (SEQ ID NO: 69) ou DKTHGGGGS (SEQ ID NO: 97) no terminal N no domínio variável.
3. POLIPEPTÍDEO MULTIMÉRICO, que compreende: um primeiro polipeptídeo que compreende na direção terminal N a C um domínio CH3 de imunoglobulina G humana e um domínio variável de anticorpo, um segundo polipeptídeo que compreende na direção terminal N a C um domínio CH3 de imunoglobulina G humana e um domínio variável de anticorpo, em que i) o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, se o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, ou ii) o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, se o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, em que o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 pelo menos uma mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana em sua sequência de aminoácidos (domínio CH3) na (s) posição (ões) de aminoácidos em uma imunoglobulina do tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são um dímero não covalente, em que o domínio variável do primeiro polipeptídeo e o domínio variável do segundo polipeptídeo formam um local de ligação não funcional, em que o primeiro polipeptídeo compreende ainda um local de ligação funcional.
4. O polipeptídeo multimérico de acordo com a forma de realização 4, em que o primeiro e o segundo polipeptídeo compreendem, cada um, a sequência de aminoácidos DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66) ou GGGS (SEQ ID NO: 69) ou DKTHT (SEQ ID NO: 94) ou DKTHGGGGS (SEQ ID NO: 97) no terminal N no domínio CH3.
5. O polipeptídeo multimérico de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 4, em que i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação no puxador e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações no buraco, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações no buraco e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação no puxador.
6. O polipeptídeo multimérico de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 5, em que i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações puxador- cys e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações no buraco, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações no buraco- cys e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação no puxador.
7. O polipeptídeo multimérico de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 6, em que as mutações perturbadoras são selecionadas a partir do grupo de mutações que compreende D356K, E357K, K370E e K439E.
8. O polipeptídeo multimérico de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 7, em que o domínio CH3 de imunoglobulina G humana é um domínio CH3 de IgG1 humana ou um domínio CH3 de IgG2 humana ou um domínio CH3 de IgG3 humana ou um domínio CH3 de IgG4 humana.
9. O polipeptídeo multimérico de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 8, em que i) o primeiro polipeptídeo compreende as mutações no puxador ou no puxador- cys e o segundo polipeptídeo compreende a mutação perturbadora D356K e as mutações no buraco, ou ii) o primeiro polipeptídeo compreende as mutações no puxador ou no puxador- cys e o segundo polipeptídeo compreende a mutação perturbadora E357K e as mutações no buraco, ou iii) o primeiro polipeptídeo compreende as mutações no buraco ou buraco- cys e o segundo polipeptídeo compreende a mutação perturbadora K370E e a mutação no puxador, ou iv) o primeiro polipeptídeo compreende as mutações no buraco ou buraco- cys e o segundo polipeptídeo compreende a mutação perturbadora K439E e a mutação no puxador.
10. O polipeptídeo multimérico de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 9, em que o primeiro polipeptídeo é um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9gG1 humana, opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio variável da cadeia pesada ou leve e o domínio CH3 de imunoglobulina G humana, ii) opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio variável da cadeia pesada ou leve, o domínio CH3 de imunoglobulina G humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia pesada e um domínio CH1 da IgG1 humana, ili) opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio variável da cadeia pesada ou leve, o domínio CH3 de imunoglobulina G humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio CH1 da IgG1 humana e um domínio variável da cadeia pesada, iv) um scFv, opcionalmente, um ligante peptídico, opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio variável da cadeia pesada ou leve e o domínio CH3 de imunoglobulina G humana, v) um scFab, opcionalmente, um ligante peptídico, opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio variável da cadeia pesada ou leve e o domínio CH3 de imunoglobulina G humana, vi) opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio variável da cadeia pesada ou leve, o domínio CH3 de imunoglobulina G humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio variável da cadeia pesada ou leve, o domínio CH3 da imunoglobulina humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio variável da cadeia pesada ou leve, o domínio CH3 de imunoglobulina G humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
ix) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio variável da cadeia pesada ou leve, o domínio CH3 de imunoglobulina G humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da I9G1 humana e um domínio variável da cadeia pesada,
x) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9gG1 humana, opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio variável da cadeia pesada ou leve, o domínio CH3 de imunoglobulina G humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
xi) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio variável da cadeia pesada ou leve, o domínio CH3 de imunoglobulina G humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
xii) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio variável da cadeia pesada ou leve, o domínio CH3 de imunoglobulina G humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da I9G1 humana e um domínio variável da cadeia leve,
xiii) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio variável da cadeia pesada ou leve, o domínio CH3 de imunoglobulina G humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um ligante domínio variável da cadeia e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
xiv) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9gG1 humana, opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio variável da cadeia pesada ou leve, o domínio CH3 de imunoglobulina G humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia pesada e um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana,
xv) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9G1 humana, opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio variável da cadeia pesada ou leve, o domínio CH3 de imunoglobulina G humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana e um domínio variável da cadeia pesada,
xvi) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9gG1 humana, opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio CH3 da imunoglobulina G humana, opcionalmente, um ligante peptídico, e o domínio variável da cadeia pesada ou leve,
xvii) um domínio variável da cadeia leve, um domínio CH1 da I9gG1 humana, opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio CH3 da imunoglobulina humana, opcionalmente, um ligante peptídico, e o domínio variável da cadeia pesada ou leve,
xviii) um domínio variável da cadeia leve, um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana, opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio CH3 de imunoglobulina G humana, opcionalmente, um ligante peptídico e o domínio variável da cadeia pesada ou leve e xiv) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana, opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio CH3 de imunoglobulina G humana, opcionalmente,
um ligante peptídico e o domínio variável da cadeia pesada ou leve, e o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio variável da cadeia pesada ou leve, o domínio CH3 de imunoglobulina G humana, ou ii) opcionalmente, SEQ ID NO: 66 ou 69 ou 94 ou 97, o domínio CH3 de imunoglobulina G humana e o domínio variável da cadeia pesada ou leve, em que o domínio CH3 compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em D356K, E357K, K370E e K439E, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana em sua sequência de aminoácidos (domínio CH3) na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (domínio CH3) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora.
11. O polipeptídeo multimérico, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 10, em que polipeptídeo multimérico compreende ainda um terceiro polipeptídeo que compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve, em que o terceiro polipeptídeo está ligado de forma covalente ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto.
12. Composição, que compreende um primeiro polipeptídeo multimérico de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 11, e um segundo polipeptídeo multimérico de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 11, em que i) no primeiro polipeptídeo multimérico, a mutação perturbadora é D356K e no segundo polipeptídeo multimérico, a mutação perturbadora é K439E, ou ii) no primeiro polipeptídeo multimérico, a mutação perturbadora é E357K e no segundo polipeptídeo multimérico, a mutação perturbadora é K370E.
13. “Um multimérico, que compreende um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo em que ambos os polipeptídeos compreendem um domínio CH3 da imunoglobulina humana, em que i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação no puxador e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações no buraco, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações no buraco e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação no puxador, em que o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um local de ligação funcional ou pelo menos uma parte de um local de ligação, em que o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 pelo menos uma mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (domínio CH3) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem com o resíduo de aminoácidos na mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são um dímero não covalente ou covalente.
14. O polipeptídeo multimérico de acordo com a forma de realização 13, em que o primeiro polipeptídeo é um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9gG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG1 humana, ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia pesada e um domínio CH1 da I9gG1 humana, iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio CH1 da IgG1 humana e um domínio variável da cadeia pesada, iv) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana, v) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
vi) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9G1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9G1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um domínio variável da cadeia leve,
ix) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia leve e um segundo domínio CH1 da I9gG1 humana,
x) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana,
xi) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada, e xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente, um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um local de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo, e o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana que compreende a mutação no puxador ou as mutações no buraco, que compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em D356K, E357K, K370E e K439E, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina (s) humana em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem com o resíduo de aminoácidos na mutação perturbadora.
15. O polipeptíideo multimérico de acordo com qualquer uma das formas de realização 13 ou 14, em que o polipeptídeo multimérico compreende ainda um terceiro polipeptídeo que compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve, em que o terceiro polipeptídeo está ligado de forma covalente ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto.
16. “Composição, que compreende um primeiro polipeptídeo multimérico que compreende como primeiro polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9G1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de I9gG1 humana, ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia pesada e um domínio CH1 de IgG1 humano, iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio CH1 da IgG1 humana e um domínio variável da cadeia pesada, iv) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana, v) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
vi) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9G1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9G1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um domínio variável da cadeia leve,
ix) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia leve e um segundo domínio CH1 da I9G1 humana,
x) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um domínio
CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana,
xi) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda de 1gG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada, e xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente, um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um local de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo,
que compreende a mutação no puxador ou as mutações no buraco,
e como segundo polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da I9gG1 humana,
que compreende a mutação no puxador, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco,
se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação no puxador,
que compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em D356K, E357K, K370E e K439E, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana (I9G1) em sua sequência de aminoácido na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem (I9gG1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora,
e como terceiro polipeptídeo, um polipeptídeo que compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve ligado de forma covalente ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto,
e um segundo polipeptídeo multimérico que compreende como primeiro polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
em que o domínio CH3 compreende a mutação no puxador, se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender a mutação no puxador,
em que o domínio CH3 compreende uma segunda mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em D356K, E357K, K370E e K439E, em que o segundo polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana em sua sequência de aminoácidos (do domínio CH3) na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem com o resíduo de aminoácidos na segunda mutação perturbadora,
e como segundo polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9gG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG1 humana,
ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia pesada e um domínio CH1 de I9gG1 humano,
iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio CH1 da IgG1 humana e um domínio variável da cadeia pesada,
iv) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
v) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da I9G1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
vi) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9G1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) um domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da I9G1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um domínio variável da cadeia leve,
ix) um domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável da cadeia leve e um segundo domínio CH1 da I9gG1 humana,
x) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda de IgG1 humana,
xi) um primeiro domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada, e xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente, um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 da IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um local de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo,
que compreende a mutação no puxador, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação no puxador,
e como terceiro polipeptídeo, um polipeptídeo que compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve,
em que o terceiro polipeptídeo está ligado de forma covalente ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto,
em que i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende a mutação no puxador e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende as mutações no buraco, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende as mutações no buraco e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo do primeiro heterotrimero compreende a mutação no puxador, em que i) no caso do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender as mutações no buraco, o segundo polipeptídeo do segundo polipeptídeo heterotrímero compreende a mutação no puxador, ou ii) no caso do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender a mutação no puxador, o segundo polipeptídeo do segundo polipeptídeo do heterotrímero compreender as mutações no buraco, em que o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero e o primeiro polipeptídeo do segundo polipeptídeo heterotrímero compreendem mutações perturbadoras em posições diferentes.
17. Formulações farmacêuticas que compreende um polipeptídeo multimérico de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 15, ou que compreende uma composição de acordo com a forma de realização 16, e opcionalmente, um excipiente farmaceuticamente aceitável.
18. — Formulações farmacêuticas que compreende um primeiro polipeptídeo heterotrimérico, que compreende um primeiro, um segundo e um terceiro polipeptídeo monomérico, e um segundo polipeptídeo heterotrimérico, que compreende um quarto, um quinto e um sexto polipeptídeo monomérico, em que o primeiro, o segundo, o quarto e o quinto polipeptídeo monomérico compreendem cada um na direção terminal Na C (i) a sequência de aminoácidos DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66), (ii) um primeiro domínio variável de anticorpo, e (iii) um domínio CH3 da imunoglobulina humana (I9G1), em que ((i) (ii) e (iii) são de forma independente um do outro, diretamente ou através de um ligante peptídico conjugados entre si, em que o primeiro domínio variável de anticorpo do i) primeiro e o segundo polipeptídeo monomérico, e ii) o primeiro e o quarto polipeptídeo monomérico, iii) o segundo e o quinto polipeptídeo monomérico, e iv) o quarto e o quinto polipeptídeo monomérico são, cada um, um par VH/ VL,
em que o domínio CH3 de i) o primeiro e o quarto polipeptídeo monomérico, e ii) o primeiro e o segundo polipeptídeo monomérico, iii) o segundo e o quinto polipeptídeo monomérico, e iv) o quarto e o quinto polipeptídeo monomérico são, cada um, um par de puxador-em-buraco em que o primeiro polipeptideco monomérico e o quarto polipeptídeo monomérico compreendem cada um, de forma independente um do outro, em um ou ambos os seus terminais N e C, de forma independente um do outro, um scFv, ou um scFab, ou um Fab,
em que o segundo e o quinto polipeptíideco monomérico compreendem cada um no domínio CH3 pelo menos uma mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo monomérico compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana em sua sequência de aminoácidos (domínio CH3) na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem com o resíduo de aminoácidos na mutação perturbadora do segundo polipeptídeo monomérico, em que o quarto polipeptídeo monomérico compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana em sua sequência de aminoácidos (domínio CH3) na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem com o resíduo de aminoácidos na mutação perturbadora do quinto polipeptídeo monomérico, em que a mutação perturbadora no segundo polipeptídeo monomérico não está na mesma posição na sequência de aminoácidos que a mutação perturbadora no quinto polipeptídeo monomérico, em que a mutação perturbadora no segundo polipeptídeo monomérico e a mutação perturbadora no quinto polipeptídeo monomérico resultam em uma interação atraente (carga) quando o segundo polipeptídeo monomérico e o quinto polipeptídeo monomérico formam um heterodímero, em que as mutações perturbadoras no segundo e quinto polipeptídeo monomérico resultam em interações repulsivas (carga) quando o segundo polipeptídeo monomérico forma um heterodímero com o primeiro polipeptídeo monomérico e o quinto polipeptíideo monomérico forma um heterodímero com o quarto polipeptídeo monomérico, respectivamente, em que o primeiro e o segundo polipeptídeo monomérico são um dímero não covalente, o quarto e o quinto polipeptídeo monomérico são um dímero não covalente, o terceiro e o primeiro polipeptídeo monomérico são um dímero ligado a dissulfeto e o sexto e o quarto polipeptídeo monomérico são um dímero ligado a dissulfeto, em que o terceiro e o sexto polipeptídeo monomérico são cadeias leves de anticorpos.
19. A formulação farmacêutica, de acordo com a forma de realização 18, em que o primeiro polipeptídeo é selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um domínio CH1 da IgG1 humana, iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
iv) um scFv, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
v) um scFab, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
vi) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
viii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
ix) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
x) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, e um scFv,
xi) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, e um scFab,
xii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia leve,
xiii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia leve e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
xiv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana, e xv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada, e o terceiro polipeptídeo é um polipeptídeo que compreende um domínio variável adicional da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve, em que o terceiro polipeptídeo está ligado de forma covalente ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto.
20. A formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das formas de realização 18 e 19, em que o segundo polipeptídeo é selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da I9G1 humana, em que i) o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, se o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, ou ii) o domínio variável do segundo polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, se o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada, em que o domínio CH3 compreende a mutação no puxador, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação no puxador, em que o domínio CH3 compreende uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em D356K, E357K, K370E e K439E, em que o primeiro polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana em sua sequência de aminoácidos (domínio CH3) na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem com o resíduo de aminoácidos na mutação perturbadora.
21. A formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das formas de realização 18 a 21, em que o quinto polipeptídeo é selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, em que o domínio CH3 compreende a mutação no puxador, se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender a mutação no puxador, em que o domínio CH3 que compreende uma segunda mutação perturbadora, selecionada a partir do grupo de mutações que consiste em D356K, E3S57K, K370E e K439E, em que o quinto polipeptídeo compreende o (s) resíduo (s) de aminoácido do tipo selvagem da imunoglobulina humana em sua sequência de aminoácido (domínio CH3) na (s) posição (ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina do tipo selvagem com o resíduo de aminoácidos na mutação perturbadora, em que a mutação perturbadora no quinto polipeptídeo está em uma posição diferente da mutação perturbadora no segundo polipeptídeo.
22. A formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das formas de realização 18 a 21, em que o quarto polipeptídeo é selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção terminal Na C i) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
ii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia pesada e um domínio CH1 da IgG1 humana,
iii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia pesada,
iv) um scFv, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
v) um scFab, opcionalmente, um ligante peptídico, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana,
vi) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFv,
vii) uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico e um scFab,
vili) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da I9G1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
ix) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada,
x) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, e um scFv,
xi) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, e um scFab,
xii) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 da IgG1 humana e um segundo domínio variável da cadeia leve,
xili) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 da I9G1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável da cadeia leve e um segundo domínio CH1 da IgG1 humana,
xiv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um terceiro domínio variável da cadeia pesada e um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana, e xv) um segundo domínio variável da cadeia pesada, um domínio CH1 da IgG1 humana, uma região de dobradiça da SEQ ID NO: 66, um primeiro domínio variável da cadeia pesada ou leve, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 da IgG1 humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante da cadeia leve kappa ou lambda humana e um terceiro domínio variável da cadeia pesada, que compreende a mutação no puxador, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações no buraco, ou as mutações no buraco, se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação no puxador, em que i) o primeiro domínio variável do quarto polipeptídeo é um domínio variável da cadeia pesada se o primeiro domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve, ou ii) o primeiro domínio variável do quarto polipeptídeo é um domínio variável da cadeia leve se o primeiro domínio variável do primeiro polipeptídeo for um domínio variável da cadeia pesada, e o sexto polipeptídeo é um polipeptídeo que compreende um domínio variável adicional da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve, em que o sexto polipeptídeo está ligado de forma covalente ao quarto polipeptídeo por uma ligação dissulfeto.
23. A formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das formas de realização 18 a 22, em que o primeiro domínio variável do primeiro polipeptídeo e o primeiro domínio variável do quarto polipeptídeo formam um local de ligação funcional e o primeiro domínio variável do segundo polipeptídeo e o primeiro domínio variável do quinto polipeptídeo formam um par não funcional de domínios variáveis.
[0357] Os exemplos, sequências e figuras a seguir são fornecidos para auxiliar o entendimento da presente invenção, cujo verdadeiro escopo é apresentado nas reivindicações anexas. Entende-se que modificações podem ser feitas nos procedimentos estabelecidos sem se afastar do espírito da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0358] Figura 1: Projeto e composição modular de 2/3-lgGs de exemplo que podem ser utilizados no método de acordo com a presente invenção.
[0359] Figura 2: Interações entre as cadeias pesadas puxador- cys e buraco- cys (parte superior) e a cadeia pesada puxador- cys e o MHCFcRP (parte média e inferior). A ligação dissulfeto covalente é indicada com uma linha tracejada, pares de interação atraentes são representados com linhas entre esferas cheias, interações repulsivas ou impedimento estérico resultante são indicadas com linhas de setas duplas.
[0360] Figura 3A, 3B, 3C e 3D: cromatogramas SEC dos 2/3-lgG purificados com diferentes MHCFCcRPs: são mostrados perfis SEC de preparações 2/3-lgG após extração da proteína A a partir de sobrenadantes da cultura de células; o pico principal de cada perfil representa o 2/3-I9G; com localizações/ especificidades de ligação de fluoresceína (fluos; anti-fluos) ou biotina (bio; anti-bio) (ver Exemplo 2). Figura 3A: com D356K (buraco); Figura 3B: com K370E (puxador); Figura 3C: com E357K (buraco); Figura 3D: com K439E (puxador).
[0361] Figura 4: Geração de bsAbs (anticorpos biespecíficos) por reação de troca, de acordo com a presente invenção, exemplificada com 2/3- IgGs.
[0362] Figura 5: TCEP (x equivalentes molares em relação a 2/3 de IgGs de entrada) é aplicado para (parcialmente) reduzir as ligações dobradiça-dissulfeto. O SEC diferencia a molécula inicial de 2/3-I9G, gerou bsAb e MHCFCRP dimérico. Todas as reações em diferentes concentrações de TCEP foram interrompidas após o mesmo tempo de incubação (triângulo: bsAb; cruzamento: 2/3-lgG, diamante: MHCFCRP dimérico).
[0363] Figura 6: Esquema de remoção de moléculas e subprodutos indesejados não reagidos dos produtos bsAb desejados, se a reação for realizada in vitro.
[0364] Figura 7A e 7B: Figura 7A: Esquema da reação de troca; Figura 7B: página SDS da purificação de NINTA; NINTA ligado (painel superior) representa proteínas eluídas de NINTA, o fluxo de NINTA através (painel inferior) são proteínas que não contêm um marcador His-6 ou His-8; n.r. = não reduzido, r. = reduzido; M = marcador.
[0365] Figura 8: Funcionalidade biespecífica de bsAbs gerada por reação de troca de acordo com a invenção. A funcionalidade foi avaliada por um ELISA em ponte que permite a detecção da ligação simultânea dos locais de ligação de um anticorpo biespecífico. O antígeno A revestido da placa de ELISA era fluoresceína (fluos-BSA, FITC-BSA) e o antígeno B era biotina (bio- Cy5), que é detectado por sua fluorescência.
[0366] Figura 9: Exemplos de 2/3-lgGs para reação de troca de 2/3-Ig9G com locais de ligação no terminal C da cadeia pesada.
[0367] Figura 10: Exemplos de 2/3-lgGs para reação de troca de 2/3-I9G com locais de ligação no terminal N, bem como no terminal C da cadeia pesada.
[0368] Figura 11: Aplicabilidade geral do método, de acordo com a invenção, mostrada pela reação de troca de IgG usando materiais de partida de diferentes especificidades e formatos de ligação, exemplificados com 2/3-lgGs.
[0369] Figura 12: Matriz de formato diferente de bsAb gerada por reação de troca, de acordo com a presente invenção, usando exemplo 2/3-IgG. A matriz foi gerada com uma entidade de ligação à fluoresceína e uma entidade de ligação à biocitinamida. As moléculas de entrada e as moléculas de saída derivadas da troca são mostradas na Figura 11. A funcionalidade dos bsAbs gerados foi avaliada por ELISA em ponte usando o fluos-BSA como antígeno de captura e o bio-Cy5 para detectar a funcionalidade de ligação biespecífica. Os sinais derivados do ELISA em ponte mostram que todos os formatos têm eficácia de ligação biespecífica.
[0370] Figura 13: Matriz para geração e caracterização da diversidade de bsAb por meio de reação de troca de acordo com a presente invenção, utilizando uma abordagem miniaturizada de alto rendimento e automação compatível.
[0371] Figura 14: Formação de anticorpos biespecíficos por reação de troca de acordo com o método da presente invenção com a tecnologia HTS. É mostrado o sinal de um ELISA de ponte exemplar mostrando sinais de fluorescência dependentes da concentração que são indicativos para a formação de anticorpos biespecíficos. ELISA para ponte Fluos-bio, cruzamento: fluos [buraco/ K370E] + bio [puxador/ E3S57K], diamante: bio [buraco/ K370E] + fluos [puxador/ E357K]. Todas as outras curvas: moléculas de entrada 2/3-IgG sem parceiros de troca cognato (elas não mostram sinal de ponte, pois apenas um local de ligação está presente).
[0372] Figura 15: Esquema da reação de troca, de acordo com a presente invenção, exemplificado com 2/3-IgGs sem região dissecada e ligações dissulfeto inter-cadeia do domínio CH3. Isso permite a reação de troca em cadeia no método, de acordo com a presente invenção, sem a necessidade de adicionar um agente redutor.
[0373] Figura 16: Os 2/3-lgGs sem pontes dissulfeto inter-cadeia são secretados em sobrenadantes da cultura como IgGs padrão, purificados por cromatografia padrão de afinidade por proteína A e por exclusão de tamanho, e analisados por SDS-PAGE confirmando os 100 kDa 2/ 3- desejados IgG como produto de expressão. Isto prova a montagem correta dos derivados 2/3-lgG purificados sem pontes dissulfeto inter-cadeia, bem como a ausência de dímeros e agregados indesejados. Purificação de i) anticorpo anti- bio da cadeia leve (SEQ ID NO: 39) + anticorpo anti-bio da cadeia pesada- puxador sem resíduos de cisteína na região de dobradiça (SEQ ID NO: 57) + MHCFCRP- buraco-E357K sem resíduos de cisteína de regiões de dobradiça (SEQ ID NO: 62) (mostrada à esquerda) e ii) anticorpo anti-fluos da cadeia leve (SEQ ID NO: 42) + buraco da cadeia pesada de anticorpo anti-fluos de comprimento total sem ligações dissulfeto na região de dobradiça (SEQ ID NO: 60) + MHCFCRP- puxador- K370E sem resíduos de cisteína na região de dobradiça (SEQ ID NO: 63) (mostrado à direita).
[0374] Figura 17: Resultados da reação de troca, de acordo com a presente invenção, com materiais de partida sem ligações dissulfeto na região de dobradiça: concentração de 2,5 UM de moléculas de entrada com bsAb purificado como controle positivo demonstra geração bem sucedida de bsAb via troca de cadeia com entrada monoespecífica 2/3-I9G moléculas sem ligações dissulfeto inter-cadeia da região Fc.
[0375] Figura 18: Projeto e composição e princípio de troca de cadeias de BiFabs para TriFabs.
[0376] Figura 19A e 19B: Expressão e purificação de 2/3-BiFabs: Figura 19A: KappaSelet; Figura 19B: perfis de SEC são mostrados de forma exemplificativa para LeY-proDig (puxador)-MHCFcRP (buraco).
[0377] Figura 20A e 20B: Expressão e purificação de 2/3-BiFabs:
SDS-Page; n.r = não reduzido; r = reduzido; L = marcador de peso molecular. Figura 20A: LeY-proDig (puxador)-MHCFCRP (buraco), LeY-proDig (buraco)- MHCFCcRP (puxador), MSLN-proDig (buraco)-MHCFCcRP (puxador); Figura 20B: LeY-procCD3 (puxador)-MHCFCRP (buraco), LeY-proCD3 (buraco)-MHCFcRP (puxador), LeY-proCD-AG-2 (puxador)-MHCFCcRP (buraco), LeY-proCD-AG-2 (buraco)-MHCFCRP (puxador).
[0378] Figura 21: Análise FACS de células expostas às moléculas de partida e a molécula obtida por reação de troca de acordo com a presente invenção.
[0379] Figura 22: A reação de troca 2/3-BiFab na superfície da célula é reorganizada e, assim, ativa o terceiro local de ligação (Fv) na região do tronco.
[0380] Figura 23: Conversão na célula de diferentes alvos de antígeno e diferentes pró-fármacos semelhantes a TriFab contendo Fv-tronco em TriFabs tri-específicos ligados a células.
[0381] Figura 24: Princípio de detecção da ativação na célula da funcionalidade de ligação a CD3 pelo ensaio repórter de sinalização de CD3.
[0382] Figura 25: Ativação da funcionalidade de ligação a CD3 pela troca de 2/3-BiFab nas células alvo.
[0383] Figura 26: Princípio da conversão na célula de diferentes antígenos direcionados aos pró-fármacos 2/3-BiFab em TriFabs tri-específicos ativados e ligados a células totalmente funcionais.
[0384] Figura 27: Conversão em célula de diferentes antígenos direcionados aos pró-fármacos 2/3-BiFab. LeY e MSLN visando anticorpos em células A431-H9. Incubação por seis horas a 37 ºC.
[0385] Figura 28: Derivados TriFab contendo módulos de troca de pró-fármacos que podem ser reorganizados para entidades triespecíficas totalmente funcionais.
[0386] Figura 29: Derivados 2/3-BiFab contendo módulos de troca de pró-fármacos de cadeia única que podem ser reorganizados para entidades tetraespecíficas totalmente funcionais.
[0387] Figura 30A e 30B: Co-cultura de PBMCs de dois doadores diferentes e MCF7 com anti-LeY-proCD3 2/3-BiFabs. A liberação de LDH serve como indicador da morte mediada por células das células tumorais alvo. Figura 30A: PBMCs do doador 1; Figura 30B: PBMCs do doador 2.
[0388] Figura 31A e 31B: Figura 31A: Co-cultura de PBMCs e células A431 com anti-EGFR-proCD3 2/3-BiFabs. Figura 31B: Co-cultura de PBMCs e células HELA com anti-AG-4-proCD3 2/3-BiFabs. A liberação de LDH serve como indicador da morte mediada por células das células tumorais alvo.
[0389] Figura 32A, 32B, 32C, 32D e 32E: Quantidades de citocina no sobrenadante após co-cultura de PBMCs e HELA com anti-AG-4-proCD3 2/3-BiFabs em concentrações molares de 4 nM. Figura 32A: quantidades de |IL- 2; Figura 32B: quantidades de IFNy; Figura 32C: Quantidades de granzima B; Figura 32D: quantidades de TNFa; Figura 32E: legenda.
[0390] Figura 33: Nível de expressão dos antígenos de superfície AG-4 e EGFR nas células HELA
[0391] Figura 34: Direcionamento duplo de AG-4 e EGFR com os respectivos proCD3 2/3-BiFabs e a ativação de células T resultante no ensaio do repórter Jurkat.
[0392] Figura 35: Derivados 2/3-BiFab contendo módulos de troca de pró-fármacos de cadeia única que podem se reorganizar para entidades de ligação a Digoxigenina e biotina totalmente funcionais e podem ser analisados por FACS por ligação Dig-Cy5 e Bio-488.
[0393] Figura 36A e 36B: Análise FACS da ligação do corante na superfície celular após conversão do derivado TriFab. Figura 36A: Dig-Cy5; Figura 36B: Bio-488.
[0394] Figura 37: Derivados 2/3-BiFab contendo módulos de troca de pró-fármacos de cadeia única que podem ser reorganizados em ligantes CD3 e CD-AG-2 totalmente funcionais.
[0395] Figura 38: Derivados 2/3-BiFab contendo módulos de troca de pró-fármacos de cadeia única que podem ser reorganizados em ligantes CD3 e CD-AG-2 totalmente funcionais, ativando células T em um ensaio repórter de sinalização CD3.
[0396] Fiqura 39: O MHCFCcRP pode ser equipado com um fragmento variável (VH ou VL) e gerar após a conversão 2/3-BiFab uma molécula Fab de ligação a CD-AG-2 como subproduto.
[0397] Figura 40: Análise FACS CD-AG-2-MHCFCcRP por ligação do produto à superfície celular Jurkat.
[0398] Figura 41: A adição no terminal N de uma entidade Fab direcionada ao MHCFCRP em combinação com duas regiões variáveis proCD3/ proCD-AG-2 dentro do MHCFCRP leva à montagem celular de dois tipos de TriFabs triespecíficos que habilitam a ligação CD3 e CD-AG- 2.
[0399] Figura 42: Capacidade de ativação de células T do TriFab triespecífico em um ensaio de sinalização de CD3.
[0400] Figura 43: Um formato alternativo 2/3-BiFab que contém um domínio CH2 e, portanto, uma região Fc competente da função efetora; os domínios variáveis estão cada um na extremidade terminal C da região Fc.
[0401] Figura 44: Um formato 2/3-BiFab alternativo que contém um domínio CH2 adicional e, assim, uma região Fc competente da função efetora; o domínio variável está entre a região Fc e o Fab de direcionamento ou no terminal N, respectivamente.
[0402] Figura 45: A cromatografia de afinidade analítica de FCRn foi realizada para provar a ligação dependente de CH2 das moléculas 2/3- BiFab competentes em CH2.
[0403] Figura 46A e 46B: Análise FACS da ligação de Dig-Cy5 na superfície celular após aplicação de 2/3-BiFabs contendo CH2. Um local de ligação Dig é apenas convertido mediante a aplicação dos dois BiFabs respectivos. De cima para baixo: MCF-7 + Dig-Cy5; puxador-eduto; buraco- eduto; reação de troca/ embaralhamento na célula; controle de produto. Figura 46A: domínios variáveis no terminal C da região Fc; Figura 46B: domínios variáveis entre a região Fc e Fab de direcionamento.
[0404] Figura 47: A configuração molecular de um BiFab contendo CH2 para geração celular de um local de ligação funcional a CD3.
[0405] Figura 48: Um ensaio repórter de células T revela a capacidade de 2/3-BiFabs contendo CH2 de induzir uma ativação de células T. KN = puxador; HL = buraco.
[0406] Fiqura 49A, 49B e 49C: A análise por microscopia eletrônica de transmissão de manchas negativas (NS-TEM) revela a forma molecular e a flexibilidade de 2/3-BiFabs. Figura 49A: anti-AG-4-proCD3 (buraco)-MHCFCcRP (puxador); Figura 49B: AG-3-proCD3 (puxador)-MHCFcRP (buraco); Figura 49C: anticorpo anti-AG-4/ CD3/ AG-3.
[0407] Figura 50: O embaralhamento independente do alvo ocorre em um nível baixo apenas em altas concentrações (300 nM).
[0408] Figura 51: Por modificação da região de dobradiça IGgG1, ou seja, pela remoção das ligações dissulfeto ou encurtando a região de dobradiça, diferentes distâncias entre os locais de ligação individuais podem ser manipuladas.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
[0409] Projeto e composição modular de 2/3-lgGs.
OBSERVAÇÕES GERAIS
[0410] A Figura 1 mostra o design e a composição modular dos
2/3-lg9Gs utilizados nos métodos de acordo com a presente invenção.
Esses 2/3-lgGs são compostos de três cadeias individuais: uma cadeia leve (normalmente uma cadeia leve de comprimento total que compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve), uma cadeia pesada (normalmente uma cadeia pesada de comprimento total que compreende um domínio variável da cadeia pesada da cadeia e todos os domínios constantes da cadeia pesada, incluindo uma região de dobradiça) e um polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada (normalmente um fragmento da região Fc da cadeia pesada que compreende de dobradiça-CH2-CH3). Os domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada formam um local de ligação funcional.
A cadeia pesada (normalmente derivada da subclasse I9G1 humana) contém as mutações puxador- cys ou mutações buraco- cys (as mutações T366W e S354C no domínio CH3 de uma cadeia pesada de anticorpo são denotadas como “puxador- cys- mutações “e as mutações T366S, L368A, Y407V, Y349C no domínio CH3 de uma cadeia pesada de anticorpo são denotadas como” mutações no cys do buraco “(numeração de acordo com o índice de Kabat EU) no CH3 para permitir a formação de puxador-em dímeros de região Fc de buraco.
O polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada é um chamado “dummy-Fc'/ MHCFCRP (veja abaixo), ou seja, um derivado de IgG1 que carece de VH e CH1, começa no terminal N com pelo menos parte da sequência da região de dobradiça e abriga um marcador His6 no seu terminal C.
Além disso, o polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada do 2/3-IgG contém em seus domínios CH3 a mutação no puxador ou no buraco (a mutação T366W no domínio CH3 de uma cadeia pesada de anticorpo é denotada como “puxador -mutação “e as mutações T366S, L368A, Y407V no domínio CH3 de uma cadeia pesada de anticorpos são denotadas como” mutações no buraco “(numeração de acordo com o índice de Kabat EU)). Além da (s) mutação (ões) de puxador ou buraco, o polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada compreende uma mutação desestabilizadora que introduz uma carga repulsiva (ou seja, uma única adicional) em relação à sequência do tipo selvagem: D356K ou E357K ou K370E ou K439E; SEQ ID NO: 35 a 38; este polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada mutada é indicado como MHCFCRP a seguir.
[0411] A cadeia pesada e o MHCFCRP podem formar dois tipos de heterodímeros, dependendo da distribuição das mutações do puxador-em- buraco: i) buraco da cadeia pesada :: MHCFCRP- buraco e ii) buraco da cadeia pesada :: MHCFCcRP- puxador.
[0412] Esses — heterodímeros são, no entanto, um pouco “defeituosos”, pois a região Fc complementar carece da cisteína CH3 adicional necessária para formar dissulfetos inter-cadeias na cadeia pesada, e também contêm mutações de carga sem coincidir com os equivalentes da cadeia pesada.
EXEMPLO 2
[0413] Expressão e purificação de 2/3-lgGs.
[0414] A expressão de 2/3-lgGs foi alcançada por co-transfecção de plasmídeos que codificam cadeia leve, cadeia pesada (com mutações no puxador ou no buraco) e MHCFCRP (buraco ou puxador) correspondente em células de mamíferos (por exemplo, HEK293) por meio de tecnologias de ponta.
[0415] Em mais detalhes, por exemplo, para a produção de 2/3- IgGs por transfecção transitória (por exemplo, em células HEK293) plasmídeos de expressão baseados em uma organização de cDNA com ou sem um promotor de CMV-Intron A ou em uma organização genômica com uma O promotor CMV foi aplicado.
[0416] Ao lado dos cassetes de expressão de anticorpos, os plasmídeos continham: - uma origem de replicação, que permite a replicação deste plasmídeo em, E. coli, - um gene da R-lactamase, que confere resistência à ampicilina em, E. coli., e - o gene da di-hidrofolato redutase de Mus musculus como marcador selecionável em células eucarióticas.
[0417] A unidade de transcrição de cada gene de anticorpo foi composta pelos seguintes elementos: - locais de restrição exclusivos no final da 5 - potenciador imediato e promotor do citomegalovírus humano, - seguida pela sequência do Intron A no caso da organização do cDNA, - uma região não traduzida em 5 de um gene de anticorpo humano, - uma sequência de sinal da cadeia pesada de imunoglobulina, - a cadeia de anticorpos como cDNA ou em organização genômica (a organização exon-intron de imunoglobulina é mantida), - uma região 3' não traduzida com uma sequência de sinal de poliadenilação, e - locais de restrição exclusivos no final de 3 minutos.
[0418] Os genes de fusão que compreende as cadeias de anticorpos foram gerados por PCR e/ ou síntese de genes e montados por métodos e técnicas recombinantes conhecidas por conexão dos segmentos de ácidos nucleicos correspondentes, por exemplo, utilizando locais de restrição únicos nos respectivos plasmídeos. As sequências de ácidos nucleicos subclonadas foram verificadas por sequenciação de DNA. Para transfecções transitórias, foram preparadas grandes quantidades de plasmídeos por preparação de plasmídeo a partir de culturas de, E. coli transformadas (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).
[0419] Utilizaram-se técnicas de cultura celular padrão como descrito em Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. e Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.
[0420] Os 2/3-lgGs foram gerados por transfecção transitória com o respectivo plasmídeo usando o sistema HEK293-F (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células HEK293-F (Invitrogen) que crescem em suspensão em um balão de agitação ou em um fermentador agitado em meio de expressão FreeStyle '” 293 sem soro (Invitrogen) foram transfectadas com o respectivo plasmídeo de expressão e 293fectin "Y ou fectina (Invitrogen). Para balão de agitação de 2 L (Corning), as células HEK293-F foram semeadas a uma densidade de 1 * 106 células/ mL em 600 mL e incubadas a 120 rpm, 8% de CO2. No dia seguinte às células foram transfectadas a uma densidade celular de aprox. 1,5 * 106 células/ mL com ca. 42 mL de mistura de A)J20 mL de Opti-MEM (Invitrogen) com 600 ug de DNA plasmídeo total (1 ug/ mL) e B)20 mL de Opti-MEM + 1,2 mL de 293 fectina ou fectina (2 ul/ mL). De acordo com o consumo de glicose, foi adicionada solução de glicose durante o decorrer da fermentação. 2/3-lgGs montados corretamente foram secretados em sobrenadantes da cultura como IgGs padrão. O sobrenadante contendo o 2/3-I9G segregado foi colhido após 5-10 dias e 2/3-lgGs foram purificados diretamente do sobrenadante ou o sobrenadante foi congelado e armazenado.
[0421] Como os 2/3-l9GGs contêm uma região Fc, eles foram purificados através da cromatografia de afinidade padrão com proteína A: Os 2/3-lgGs foram purificados a partir de sobrenadantes da cultura de células por cromatografia de afinidade usando MabSeletSure-Sepharose'M (GE
Healthcare, Suécia) e Superdex 200 cromatografia de exclusão por tamanho (GE Healthcare, Suécia).
[0422] Resumidamente, os sobrenadantes estéreis da cultura de células filtradas foram capturados em uma resina MabSeletSuRe equilibrada com tampão PBS (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 mM, KH2PO4 1 mM, NaCl 137 mM e KCI 2,7 mM, pH 7,4), lavados com tampão de equilíbrio e eluidos com citrato de sódio 25 mM a pH 3,0. As frações de anticorpo eluídas foram reunidas e neutralizadas com 2 M Tris, pH 9,0. Os conjuntos de anticorpos foram ainda purificados por cromatografia de exclusão por tamanho usando uma coluna Superdex 200 26/60 GL (GE Healthcare, Suécia) equilibrada com histidina 20 mM, NaCl 140 MM, pH 6,0. As frações contendo 2/3-I9G foram reunidas, concentradas até à concentração requerida utilizando dispositivos de ultrafiltração Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech S.A., França) e armazenadas a -80 ºC.
[0423] A pureza e a integridade foram analisadas após cada etapa de purificação por CE-SDS usando a tecnologia microfluídica Labchip (Caliper Life Science, EUA). A solução de proteína (5 ul) foi preparada para análise de CE-SDS usando o Kit de reagente HT Protein Expressão de acordo com as instruções do fabricante e analisada no sistema LabChip GXIl usando um chip HT Protein Expressão. Os dados foram analisados no LabChip GX Software.
[0424] Por exemplo, os seguintes 2/3-lgGs foram produzidos por co-expressão dos plasmídeos correspondentes que codificam as cadeias L, H e MHCFcRP: anti-fluoresceína- 2/3- anti-biocitinamida- 2/3- IgG- puxador- cys + IgG-buraco- cys + MHCFCcRP Buraco Buraco Puxador Puxador D356K E357K K370E K439E anti-fluoresceína- 2/3- anti-biocitinamida- 2/3- IgG- puxador- cys + IgG-buraco- cys + MHCFCcRP Buraco Buraco Puxador Puxador D356K E3S57K K370E K439E HEK293 Proteína A 122 94 129 117 [Img/ |] SEC >70 > 50 >70 >70 [% de rendimento] Sistema Proteína A > 200 > 200 > 200 > 200 Expi [mg/ L) SEC > 90 > 90 > 80 >80 [% de rendimento]
[0425] Os cromatogramas SEC correspondentes são mostrados na Figura 3.
EXEMPLO 3
[0426] Geração de anticorpos biespecíficos (bsAbs) por reação de troca de 2/3 de IgG.
[0427] Os 2/3-lIgGGs que contêm uma cadeia leve, uma cadeia pesada e MHCFCRP foram gerados em dois tipos de heterodímeros KiH: buraco da cadeia pesada de comprimento total : MHCFCcRP- buraco e buraco da cadeia pesada de comprimento: MHCFCRP- puxador. Ambos os tipos de 2/3-lgGs são um pouco “defeituosos”, pois o MHCFCRP carece da cisteína CH3 adicional necessária para formar dissulfetos inter-cadeias na cadeia pesada, e o MHCFCRP contém mutações de carga sem contrapartida correspondente na cadeia pesada de comprimento total. Os módulos que compõem esses heterodímeros defeituosos, no entanto, são capazes de reorganizar em heterodímeros biespecíficos com cargas correspondentes, conforme mostrado na Figura 4. A cadeia pesada de comprimento total (puxador- cys) de 2/3-I9G À e a cadeia pesada de comprimento total (buraco- cys) de 2/3-lgG B formam um heterodímero correspondente. Os heterodímeros correspondentes também são formados quando o MHCFCRP (carga do buraco) interage com o MHCFcRP (carga do puxador). Assim, reações de troca baseadas na separação temporária de heterodímeros de partida de duas 2/3-lgG diferentes resultaram em produtos que contêm heterodímeros correspondentes preferencialmente (carregados). As reações de troca, portanto, converteram duas 2/3-lgGs monoespecíficos em um heterodímero IgG biespecífico e um MHCFcRP: 2/3-IgG (A)-His6 (8) + 2/3-lgG (B)-His6 (8) — bsAb (AB) + Fc-His6 (8)
[0428] A reação de troca foi iniciada por uma etapa de redução (por exemplo, aplicando 2-MEA ou TCEP em várias concentrações) para quebrar especialmente as ligações dissulfeto inter-cadeia da região de dobradiça. O rearranjo da cadeia ocorreu espontaneamente a partir de então.
[0429] Portanto, as moléculas de entrada anti-fluoresceína-2/3-I9G e anti-biocitinamida-2/3-lgG foram misturadas em quantidades equimolares a uma concentração de proteína de 100 ug/ ml em um volume total de 40 ul 1xPBS + 0,05% de Tween 20 com as concentrações indicadas de TCEP em uma placa REMPº de 384 poços (Brooks, ft 1800030). Após centrifugação, as placas foram seladas e incubadas por uma hora a 27 ºC.
[0430]UM ELISA em ponte de biotina - fluoresceína foi subsequentemente utilizado para quantificar anticorpo biespecífico. Portanto, as placas brancas Nuncº MaxiSorp "sm de 384 poços foram revestidas com 1 uvg/ ml de conjugado de isotiocianato de albumina-fluoresceína (FITC, Sigma, t A9771) e incubadas durante a noite a 4 ºC. Após lavagem 3 vezes com 90 ul de tampão PBST (PBST, água ofertada, 10xXPBS + 0,05% de Tween 20), tampão de bloqueio (1xPBS, gelatina a 2%, 0,1% de Tween-20) foi adicionado 90 ul/ poço e incubado por uma hora a temperatura do quarto. Após lavagem 3 vezes com 90 ul de tampão PBST, 25 ul de uma diluição 1:10 de cada reação de troca foram adicionados a cada poço. Após incubação durante uma hora à temperatura ambiente, as placas foram novamente lavadas 3 vezes com 90 ul de tampão PBST. Adicionou-se 25 ul/ poço de conjugado de biotina-Cy5 em BSA a 0,5%, Tween-20 a 0,025%, 1xPBS a uma concentração final de 0,1 ug/ ml e as placas foram incubadas durante uma hora à temperatura ambiente. Após lavagem 6 vezes com 90 ul de tampão PBST, foram adicionados 25 ul 1xPBS a cada poço. A fluorescência de Cy5 foi medida com um comprimento de onda de emissão de 670 nm (excitação a 649 nm) em um Tecan Safire 2 Reader.
[0431] A Figura 5 mostra os resultados de análises das condições redox para geração de bsAbs por troca de 2/3-lgG. O TCEP é aplicado (parcialmente) para reduzir as ligações dissulfeto-dobradiça entre os polipeptídeos da região Fc da cadeia pesada, ou seja, entre a meia-lgG de comprimento total e o MHCFCRP. A troca de cadeias pode ser identificada pela SEC, que diferencia a entrada 2/3-l9G, a saída bsAb e o subproduto MHCFCRP. O rendimento das reações de troca dependendo da razão entre 2/3-l9G e TCEP é mostrado na Figura 5 (para comparação, todas as reações foram analisadas após o mesmo tempo de reação).
[0432] Todas as moléculas de partida de 2/3-I9G, todos os subprodutos não desejados, bem como todos os agregados que foram potencialmente gerados durante a reação de troca abrigam alvos de afinidade (His6 ou His8). O bsAb desejado produzido na reação de troca é a única molécula que não carrega um marcador His. Portanto, uma simples etapa de absorção de NINTA foi aplicada para remover todas as moléculas indesejadas
(ver Figuras 6 e 7). Os bsAbs restantes (não esgotados pela absorção de NINTA) foram aplicados diretamente nos procedimentos de triagem e analisados para identificar bsAbs com as funcionalidades desejadas. EXEMPLO 4
[0433] Avaliação funcional de anticorpos biespecíficos (bsAbs) gerados pela reação de troca de 2/3-lgG.
[0434] A funcionalidade biespecífica dos bsAbs que foram gerados como produtos das reações de troca de 2/3-I9G foi avaliada por ensaios de ponte-ELISA. A Figura 8 mostra como exemplo o resultado da ligação de um anticorpo biespecífico anti-fluoresceína/ biocitinamida gerado por uma reação de troca, tal como aqui relatado. Na reação, empregou-se 2/3-lgG de ligação de biocitinamida (2) e uma 2/3-I9G de ligação de fluoresceína (fluos) como moléculas de partida. O braço de ligação ao fluos dos anticorpos anti-fluos/ biespecíficos se liga às placas ELISA revestidas com fluos-BSA. A exposição subsequente ao bio-Cy5 gera sinais apenas após a captura do bio-Cy5 mediada por bsAb através do braço de ligação biológica do bsAb. Como os sinais mediados por ponte ocorrem apenas com bsAbs, mas não com os ligantes monoespecíficos Fluos ou Bio, nenhum sinal foi observado ao usar apenas 2/3-lgGs no ensaio. Por esse motivo e porque a reação de troca não força a agregação de moléculas, esse ELISA em ponte pode ser realizado diretamente nas misturas de reação de troca, sem a necessidade de depleção prévia de moléculas não-bsAb mediada por NINTA. Os sinais observados ao aplicar a mistura de reação indicaram geração bem-sucedida e presença de bsAbs funcionais. A geração de sinal via ELISA em ponte dependia da quantidade de entidades de entrada usadas na reação de troca.
EXEMPLO 5
[0435]A reação de troca é funcional independente das especificidades de ligação ou da composição da região V dos 2/3-lgGs de partida.
[0436] Uma variedade de 2/3-lgGs foi produzida para avaliar se a produção de 2/3-lI9G, bem como as reações de troca, funcionam para diferentes anticorpos, independentemente de suas especificidades de ligação e composição da região V, bem como para diferentes combinações de anticorpos.
[0437] Portanto, foram utilizados 2/3-lgGs com especificidades de ligação para biocitinamida (bio), digoxigenina (dig), fluoresceína (fluos), carboidrato LeY (LeY), VEGF e PDGF. Estes foram produzidos por co- transfecção de plasmídeos de expressão que codificam cadeias leves de comprimento total, cadeias pesadas de puxador ou buraco e polipeptídeos da região Fc da cadeia pesada mutada, como descrito acima.
Cadeia | sen | MHCFcRPs buraco-D356K-His8 35 buraco-E357K-His8 36 puxador-K370E-His8 37 puxador-K439E-His8 38 Anticorpo anti-bio da cadeia leve de comprimento total Anticorpo anti-bio da cadeia pesada- puxador- cys de comprimento total Anticorpo anti-bio da cadeia pesada- buraco- cys de comprimento total Anticorpo anti-fluos da cadeia leve de comprimento total comprimento total
Cadeia | sao | e comprimento total Anticorpo anti-LeY da cadeia leve de comprimento total | aB | | Anticorpo anti-VEGF da cadeia leve de comprimento total | a8 | | Fragmento V-CH1 de anticomo anti = | ag | Fragmento VH-CH1 de anticorpo anti-PDGF
[0438] SEQ ID NO: 49-52 descreve a região VH-CH1 de 2/3-lgGs com especificidades para dig, VEGF, PDGF e LeY. Aqueles foram fundidos às regiões de dobradiça-CH2-CH3 (ou seja, substituem as regiões bio VH-CH1) da SEQ ID NO: 40 e 41 para gerar cadeias H completas com a especificidade desejada. Os MHCFCRP's aplicados para gerar essas moléculas estão listados como SEQ ID NO: 35-38.
[0439] Todos estes 2/3-lgGs podem ser produzidos e purificados com rendimentos semelhantes aos de IgGs padrão em condições comparáveis (ver Exemplo 2). Exemplos para expressão desses 2/3-lgGs com diferentes especificidades de ligação são mostrados na tabela a seguir.
—— peça mem pt pt pt
SEC 40 a 60 >70 > 90 >95 >50 [% de rendimento]
[0440] Na matriz de troca, que foi aplicada para gerar bsAbs de diferentes especificidades, foram utilizadas combinações de 2/3-lgGs com especificidades de ligação para fluoresceína, biocitinamida, VEGF, PDGF e digoxigenina em todas as combinações, como mostrado na tabela a seguir. Reação de troca MHCFCRP- puxador- E357K entre
VEGF bio bio bio bio fluos dig VEGF PDGF wu e fluos fluos fluos fluos o x bio dig VEGF PDGF o o É dig dig dig dig 2 d bio fluos VEGF PDGF
S õ VEGF VEGF VEGF VEGF VEGF
IL = bio fluos Dig PDGF
PDGF PDGF PDGF PDGF PDGF bio fluos Dig VEGF
[0441] A troca de cadeia de 2/3-lgGs de partida e a geração de bsAbs com combinações de especificidade desejadas foi monitorada por ELISA em ponte (ver Exemplo 4), em que antígenos revestidos com placa e complexos/ conjugados/ antígenos geradores de sinal foram aplicados que correspondem aos diferentes bsAb combinações de especificidade.
[0442] Os resultados do ELISA em ponte aplicado para avaliar as funcionalidades de diferentes combinações de bsAb são mostrados nas tabelas a seguir. Somente os bsAbs que reconhecem seu par cognato de antígenos presentes como antígeno de captura ou detecção geram sinais no ELISA em ponte. Outros bsAbs gerados na matriz são negativos devido à ausência de pelo menos uma especificidade.
[0443] Tabela: O ELISA de ponte confirma a funcionalidade dos bsAbs gerados. São mostradas as intensidades relativas de sinal dentro de um ensaio na concentração da molécula de entrada 1,3 uM. O valor mais alto é definido como 100% como referência. N/ D. = não disponível.
biocitinamida- fluoresceína fluoresceína- albumina Reação de troca entre MHCFCRP- buraco- K370E [56 Tras | o [ves [105 x DB 100% | 2,5% 2,5% 1,9% mu "o o DD [en] [em [ee] a S VEGF 1,9% | 22% | 23% 2,3% 2 [e dm e en] - digoxigenina- fluoresceína fluoresceína- albumina Reação de troca entre MHCFCcRP- buraco- K370E
[TT Ts Te rs x 1,9% 1,6% 1,4% 1,3% à "o o a S VEGF 1,5% | 1,5% 1,5% 1,5%
X me De] [im es] | VEGF- biocitinamida biocitinamida- Cy5 Reação de MHCFCcRP- buraco- K370E e Dm [55 [om [or o uu "o
R a
X PDGF- biocitinamida biocitinamida- Cy5
Reação de troca MHCFCRP- buraco- K370E o wW e [es o [es [es De | "o x Ê& Ss VEGF 4,0% 3,1% 3,1% 3,2% 2 [e dem | [am dm | - Reação de troca entre MHCFCcRP- buraco- K370E [56 Tres | 06 [eos [1050
Ô uW > e [o [eee e] "o x a S VEGF 6,1% 6,6% 100% 7,0%
Z De ela [ss [65]
Reação de troca MHCFCRP- buraco- K370E x o Wu "o x a S VEGF 3,1% 3,3% 3,0% 2,9% 2
[0444] Para o VEGF contendo anticorpos biespecíficos, foram realizados os mesmos ensaios. Eles também mostraram apenas sinais acima dos níveis de fundo para as respectivas combinações.
[0445] Pode-se observar que a reação de troca, de acordo com a presente invenção, é um método geralmente aplicável: as reações de troca levam ao bsAb funcional independente das especificidades de ligação ou da composição da região V das moléculas de partida.
EXEMPLO 6
[0446] Design, composição e geração de variantes de formato.
[0447] A reação de troca de 2/3-I9G do Exemplo 4 foi expandida para moléculas de partida que possuem um local de ligação no terminal C da cadeia pesada ou cadeias pesadas com locais de ligação no terminal N e também no terminal C. Para a geração dos bsAbs trocados, o princípio de troca (conversão de heterodímeros defeituosos de entrada em heterodímeros de saída correspondentes) foi mantido inalterado. A composição dos MHCFcRPs também foi mantida como descrito acima.
[0448] As Figuras 1, 9 e 10 mostram a composição modular dos três formatos 2/3-I9G que foram aplicados para gerar diferentes formatos de bsAb. Um dos 2/3-lgGs tem um braço Fab na posição terminal N. Outro dos 2/3-lgGs tem o braço Fab anexado através de um ligante flexível ao terminal C da cadeia pesada (ou seja, começa no terminal N com a região de dobradiça). O terceiro 2/3-IgG possui o braço Fab do terminal C, bem como o braço Fab do terminal N.
[0449] A expressão dessas variantes 2/3-lgG foi alcançada por co- transfecção de plasmídeos que codificam cadeia leve, cadeia pesada (puxador ou buraco) e MHCFCRP correspondente (buraco ou puxador) em células de mamíferos (por exemplo, HEK293) (ver Exemplo 2).
[0450] As sequências das cadeias pesadas de comprimento total modificadas usadas para a geração dos diferentes formatos de bsAb são as seguintes:
E MHCFcRPs buraco-D356K-His8 35 buraco-E357K-His8 36 puxador-K370E-His8 37 puxador-K439E-His8 38 total com fusão no terminal C total com fusão nos terminais Ne C
NO: total com fusão no terminal C total com fusão nos terminais Ne C
[0451] Os 2/3-lgGs são secretados em sobrenadantes da cultura como IgGs padrão e foram purificados por cromatografia de afinidade com proteína A padrão (ver Exemplo 2). A análise por exclusão de tamanho e especificação de massa revelou a montagem correta de variantes 2/3-I9G purificadas, bem como a ausência de dímeros e agregados indesejados. Os rendimentos de expressão de 2/3-lgGs foram semelhantes aos observados com I|gGs padrão nos mesmos sistemas de expressão. Os respectivos dados são apresentados na tabela a seguir. anticorpo anti-fluoresceína- anticorpo anti-biocitinamida - puxador- cys buraco- cys SEQ ID NO: | + MHCFCRP- buraco- ESS7K | + MHCFCcRP- puxador- K370E 43+36 | 55+36 | 56+36 | 41+37 | 53+37 | 54+37 (N-Fc) | (C-Fc) | (NC-Fc) | (N-Fc) (C-Fc) (NC-Fc) nm pe e e dede | 94 75 129 87 75 Img/ L]
SEC [% de 55 87 40-80 63 rendimento] EXEMPLO 7
[0452] Caracterização de bsAbs com funcionalidades combinadas de ligação em diferentes valências, estequiometrias e geometrias.
[0453] Três moléculas de partida diferentes (2/3-IgG com locais de ligação terminal N, terminal C, N e terminal C) podem ser combinadas entre si no método, de acordo com a presente invenção, para resultar em nove diferentes formatos bsAb. Eles diferem em valências, geometrias e posições dos locais de ligação individuais. A reação de troca para gerar esses diferentes bsAbs foi realizada nas mesmas condições descritas no Exemplo 3.
[0454] Todos os tipos de formatos de entrada são “defeituosos”, pois o MHCFCRP carece da cisteína CH3 adicional necessária para formar dissulfetos inter-cadeia para a cadeia pesada e, pois, contém uma mutação de carga repulsiva (ou seja, uma carga sem correspondência com a cadeia pesada de comprimento total). As cadeias pesadas que compõem esses heterodímeros “defeituosos” se reorganizam para formar heterodímeros correspondentes (de carga e dissulfeto) no método de acordo com a presente invenção. Os diferentes tipos de cadeias pesadas de comprimento total (puxador- cys com buraco- cys) formam heterodímeros correspondentes. Os heterodímeros correspondentes também são formados a partir do MHCFCcRP (carga de buraco com carga de puxador).
[0455] Sem estar vinculado a essa teoria, assume-se que as reações de troca baseadas na separação temporária de heterodímeros defeituosos de duas 2/3-lgGs diferentes resultam em produtos que contêm preferencialmente heterodímeros perfeitamente compatíveis com cargas correspondentes e, se presentes, resíduos de cisteína para a formação de Ligações dissulfureto. As trocas convertem, portanto, os 2/3-lgGs monoespecíficos em IgGs biespecíficos (em diferentes formatos), bem como o heterodímero da região Fc correspondente (isento de região variável, ou seja, não é competente para ligação ao alvo).
[0456] Para a descrição das reações de troca, as moléculas de entrada são denominadas: - 'nA ou nB' para moléculas que possuem o braço Fab no terminal N normal da cadeia pesada de comprimento total (cadeia H); - “CA ou cB' para moléculas que possuem o braço Fab no terminal C da cadeia H; - “ncA ou ncB' para moléculas com Fab no N e também no terminal C da cadeia H.
[0457] As diferentes reações de troca de formato são as seguintes: 2/3-I1g9G (nA)-His- alvo + 2/3-Ig9G (nB)-His- alvo — bsAb (nAnB) + Fc-His- alvo 2/3-19G (nA)-His- alvo + 2/3-IgG (cB)-His- alvo — bsAb (nAcB) + Fc-His- alvo 2/3-19G (nA)-His- alvo + 2/3-Ig9G (ncB)-His- alvo — bsAb (nAncB) + Fc-His- alvo 2/3-19G (cA)-His- alvo + 2/3-IgG (cB)-His- alvo — bsAb (cAcB) + Fc-His- alvo 2/3-19G (cA)-His- alvo + 2/3-Ig9G (nB)-His- alvo — bsAb (cAnB) + Fc-His- alvo 2/3-I9G (cA)-His- alvo + 2/3-IgG (ncB)-His- alvo — bsAb (cAncB) + Fc-His- alvo 2/3-I9G (ncA)-His- alvo + 2/3-IgG (nB)-His- alvo — bsAb (ncAnB) + Fc-His- alvo 2/3-I9G (ncA)-His- alvo + 2/3-IgG (cB)-His- alvo — bsAb (ncAcB) + Fc-His- alvo 2/3-I9G (ncA)-His- alvo + 2/3-lgG (ncB)-His- alvo — bsAb (ncAncB) + Fc-His- alvo
[0458] As reações de troca são iniciadas por uma etapa de redução para romper as ligações dissulfeto inter-cadeia (região de dobradiça), o rearranjo da cadeia ocorre espontaneamente a partir de então. Todas as moléculas de entrada, todos os subprodutos, bem como todos os agregados que potencialmente podem se formar durante a reação de troca abrigam alvos de afinidade (por exemplo, um tag His6 ou His8). Os produtos bsAb da reação de troca, no entanto, não carregam o marcador de afinidade e, portanto, podem ser separados por cromatografia de absorção por afinidade (por exemplo, NINTA). Os bsAbs (em diferentes formatos) podem ser aplicados diretamente aos procedimentos e análises de triagem para identificar e classificar os diferentes formatos de bsAbs com a funcionalidade ideal.
[0459] Os formatos biespecíficos foram gerados trocando os 2/3- IgGs de entrada descritos acima em um formato MTP de 384 poços, seguido por ELISA em ponte para avaliar a montagem funcional. Portanto, os parceiros de troca (molécula 2/3-lgG 1 que consiste em uma cadeia pesada de comprimento total contendo as mutações cys do buraco e um MHCFcRP- puxador- K370E; molécula 2/3-lgG 2 que consiste em uma cadeia pesada de comprimento completo contendo as mutações puxador- cys e um MHCFcRP- buraco- E357K) foram misturadas em quantidades equimolares (4 uM) em um volume total de 100 ul 1xPBS + 0,05% de Tween 20. As soluções proteicas foram diluídas 11 vezes 1: 2 em um 384 - placa de poço profundo (Greiner 384 masterblockº). 20 ul de cada amostra da série de diluições foram misturados com 20 ul de uma solução de TCEP 0,5 mM até uma concentração final de proteína de 200 - 0,2 ug/ ml e TCEP 0,25 mM em uma placa REMPº de 384 poços (Brooks, % 1800030). Após centrifugação, as placas foram seladas e incubadas por uma hora a 37 ºC.
[0460] Como exemplos de controle, foram utilizados bsAbs contendo a funcionalidade de ligação biológica de um lado e a funcionalidade de ligação de fluoresceína do outro lado. A funcionalidade dos bsAbs resultantes foi avaliada por ELISA em ponte de biotina-fluoresceína. Portanto, as placas brancas Nuncº MaxiSorp '"" de 384 poços foram revestidas com 1 vg/ ml! de conjugado isotiocianato de albumina-fluoresceína (Sigma, % A9771) e incubadas durante a noite a 4 ºC. Após lavagem 3 vezes com 90 ul de tampão PBST (PBST, água destilada dupla, 10xPBS Roche ft 11666789001 + 0,05% de Tween 20), 90 ul/ tampão de bloqueio de poço (1xPBS, 2% de BSA, 0,1% de Tween 20) foi adicionado e incubado por uma hora em temperatura ambiente. Após lavagem 3 vezes com 90 ul de tampão PBST, foram adicionados 25 ul de uma diluição 1: 4 de cada reação de troca a cada poço.
Após incubação durante uma hora à temperatura ambiente, as placas foram novamente lavadas 3 vezes com 90 ul de tampão PBST. Foram adicionados 25 uL por poço de conjugado de biotina-Cy5 em BSA a 0,5%, Tween 20 a 0,025%, 1xPBS a uma concentração final de 0,1 ug/ ml e as placas foram incubadas durante uma hora à temperatura ambiente. Após lavagem 6 vezes com 90 ul de tampão PBST, foram adicionados 25 ul 1xPBS a cada poço. A fluorescência de Cy5 foi medida com um comprimento de onda de emissão de 670 nm (excitação a 649 nm) em um Tecan Safire 2 Reader.
[0461] Diferentes formatos de bsAb por troca de 2/3-lIgGs de diferentes formatos foram gerados com uma entidade de ligação à fluoresceína e uma entidade de ligação à biocitinamida. As moléculas de entrada e as moléculas de saída derivadas de troca são mostradas na Figura 11.
[0462] A funcionalidade dos bsAbs gerados foi avaliada por ELISA em ponte, como mostrado na Figura 12, usando fluos-BSA como antígeno de captura e bio-Cy5 para detectar a funcionalidade de ligação de ponte biespecífica. Todos os diferentes formatos resultam em um sinal ELISA em ponte.
[0463] Estes resultados mostram a viabilidade de gerar diferentes formatos usando um método, de acordo com a presente invenção, por meio de reações de troca em cadeia de maneira robusta e compatível com alto rendimento.
EXEMPLO 8
[0464] A geração de bsAbs funcionais por troca 2/8 de IG ea triagem/ identificação de bsAbs com funcionalidade desejada são compatíveis com miniaturização e alto rendimento, além de tecnologias de automação.
[0465] A aplicação de tecnologias de alto rendimento e automação é desejada e, em muitos casos, necessária para lidar com um grande número de diferentes bsAbs - diferentes na sequência e/ ou no formato do local de ligação. Portanto, foi analisado se a geração de bsAb por meio do método de troca 2/3-IgG de acordo com a presente invenção, bem como a análise/ triagem da funcionalidade, ou seja, a ligação biespecífica, dos anticorpos biespecíficos assim gerados, podem ser miniaturizados para seja compatível com tecnologias de alto rendimento e automação.
[0466] Portanto, foram realizadas reações de troca de 2/3-I9G e os produtos da reação foram analisados em escala miniaturizada em placas de 348 poços.
[0467] Uma triagem matricial foi montada no formato MTP de 384 poços da seguinte forma: Os parceiros de troca (molécula 2/3-IgG 1 consistindo em uma cadeia pesada de comprimento total contendo as mutações cys do buraco e um MHCFCRP- puxador- K370E; 2/3 A molécula -lgG 2 consistindo em uma cadeia pesada de comprimento total contendo as mutações no puxador- cys e um MHCFCRP- buraco- ES57K) foi misturada em quantidades equimolares (4 uM) em um volume total de 30 ul 1xPBS + 0,05% de Tween 20. Proteína as soluções foram diluídas quatro vezes 1: 3 em uma placa de 384 poços (Greiner 384 masterblockº). 20 ul de cada amostra da série de diluições foram misturados com 20 ul de uma solução de TCEP 0,5 mM para uma concentração final de proteína de 2 uM - 0,025 UuM e TCEP 0,25 mM em uma placa REMPº de 384 poços (Brooks, % 1800030). Após centrifugação, as placas foram seladas e incubadas por uma hora a 37 ºC.
[0468] A funcionalidade dos bsAbs assim gerados foi subsequentemente avaliada por meio do ELISA em ponte (veja acima) em um formato miniaturizado de alto rendimento: as placas White Nuncº MaxiSorp Tv 384 poços foram revestidas com 1 ug/ ml de conjugado de isotiocianato de albumina-fluoresceína (Sigma, fé A9771), 1 ug/ ml! de PDGF (CST, 4 8912) ou 1 uvg/ m! de VEGF121 e incubados durante a noite a 4 ºC. Após lavagem 3 vezes com 90 ul de tampão PBST (PBST, água destilada dupla, 10xPBS + 0,05% de
Tween 20), tampão de bloqueio (1xXPBS, 2% de BSA, 0,1% de Tween 20) foi adicionado 90 ul/ poço e incubado por uma hora a temperatura do quarto. Após lavagem 3 vezes com 90 ul de tampão PBST, foram adicionados 25 ul de uma diluição 1: 4 de cada reação de troca a cada poço. Após incubação durante 1 h à temperatura ambiente, as placas foram novamente lavadas 3 vezes com 90 ul de tampão PBST. Foram adicionados 25 ul. por poço de conjugado biotina-Cy5 ou conjugado dig-Cy5 em BSA a 0,5%, Tween 20 a 0,025%, 1xPBS a uma concentração final de 0,1 ug/ ml e as placas foram incubadas durante uma hora à temperatura ambiente. Após lavagem 6 vezes com 90 ul de tampão PBST, foram adicionados 25 ul 1xPBS a cada poço. À fluorescência de Cy5 foi medida com um comprimento de onda de emissão de 670 nm (excitação a 649 nm) em um Tecan Safire 2 Reader. Os detalhes das reações de troca e ELIS de ponte nessas análises com módulos 2/3-lgG que se ligam ao VEGF ou PDGF ou dig ou bio ou fluos são mostrados na Figura 13. Os resultados de um exemplo dessas análises são mostrados na Figura 14 e demonstram que reações de troca de 2/8 de IgG e análises funcionais subsequentes podem ser realizadas e são compatíveis com tecnologias de alto rendimento e automação. EXEMPLO 9
[0469] Geração de bsAbs com três locais de ligação que têm como alvo um primeiro antígeno com um local de ligação e outro antígeno com os outros dois locais de ligação.
[0470] O método, de acordo com a presente invenção, pode ser utilizado para a geração de anticorpos biespecíficos de células T (TCBs). Estes podem ter um formato como descrito anteriormente (consulte, por exemplo, WO 2013/026831). Para a abordagem de troca TCB, uma cadeia H (com puxador- cys ou buraco- cys como descrito acima) contém um terminal N da entidade derivada de CrossFab de ligação a CD3 de sua dobradiça,
estendendo-se ainda mais no terminal N por outra entidade alvo derivada de anticorpos. A reação de troca é realizada nas mesmas condições descritas acima e resulta em um TCB abrigando uma entidade de ligação a CD3 e duas entidades de ligação adicionais. Estes podem se ligar a um antígeno da célula alvo. Essas moléculas podem se ligar simultaneamente a CD3 nas células Te a um antígeno em uma célula alvo (por exemplo, tumor) e assim induzir a morte das células alvo. EXEMPLO 10
[0471] Projeto e geração de 2/3-lgGs sem ligações dissulfeto inter- cadeia da região FC (na região de dobradiça e no domínio CH3) de acordo com a presente invenção.
[0472] A troca de cadeias com dissulfeto da região FC (região de dobradiça) contendo 2/3-lgGs requer redução como etapa inicial para permitir a separação da cadeia e a montagem subsequente dos bsAbs desejados. Para evitar a etapa de redução e a necessidade associada de remover o agente redutor 2/3-lgGs sem ligações dissulfeto na região de dobradiça foram geradas. O princípio é mostrado na Figura 15. Os resíduos de cisteína na região de dobradiça responsáveis pela formação de dobradiça-dissulfeto foram removidos por mutação em serina. Também o CH3-cisteína na posição 354 ou 349 que forma a ligação dissulfeto associada ao KiH foi omitido. As respectivas sequências de aminoácidos são:
E anticorpo anti-bio da cadeia pesada- puxador de comprimento total sem resíduos de cisteína na região de dobradiça sem resíduos de cisteína na dobradiça
Cadeia o sem resíduos de cisteína na dobradiça patamar [5 sem resíduos de cisteína na dobradiça MHCFcRP buraco-D356K-His8 sem resíduos de cisteína na dobradiça 61 buraco-E357K-His8 sem resíduos de cisteína na dobradiça 62 puxador-K370E-His8 sem resíduos de cisteína na dobradiça 63 puxador K439E-His8 sem resíduos de cisteína na dobradiça 64
[0473] A expressão dos 2/3-lIgGs acima foi alcançada por co- transfecção de plasmídeos que codificam cadeia leve, cadeia pesada de comprimento total (puxador ou buraco) e MHCFCRP correspondente (buraco ou puxador) em células de mamíferos (por exemplo, HEK293) (ver Exemplo 2). As 2/3-lgGs foram segregadas em sobrenadantes da cultura como IgGs padrão e foram posteriormente purificadas por cromatografia de afinidade com proteína A padrão e exclusão por tamanho padrão (ver Exemplo 2). Análises subsequentes por cromatografia de exclusão de tamanho e SDS-PAGE o produto de expressão desejado de 100 kDa 2/3-lgG (Figura 16). Isso prova a montagem correta do 2/3-I9G, bem como a ausência de dímeros e agregados indesejados. Isso é surpreendente, pois essas moléculas não são estabilizadas por dissulfetos entre as regiões FC (nem a região de dobradiça nem o domínio CH3). O rendimento de purificação de anti-fluos e anti-bio-2/3-l9Gs sem ligações dissulfeto inter-cadeia da região Fc é apresentado na tabela a seguir Anticorpo anti-bio da cadeia Anticorpo anti-fluos da cadeia leve (SEQ ID NO: 39) + leve (SEQ ID NO: 42) + anticorpo anti-bio da cadeia anticorpo anti-fluos da cadeia pesada- puxador sem pesada- buraco de comprimento resíduos de cisteína na total sem ligações dissulfeto na região de dobradiça (SEQID | região de dobradiça (SEQ ID NO: 57) + MHCFcRP- NO: 60) + MHCFCRP- puxador- buraco- E357K sem resíduos |K370E sem resíduos de cisteína de cisteína na região de na região de dobradiça (SEQ ID dobradiça (SEQ ID NO: 62) NO: 63) Proteína À > 100 > 100 Img/ 1] Rendimento > 50 > 50
SEC [mg/ L 100 kDa] EXEMPLO 11
[0474] Geração de bsAbs funcionais por reação de troca de 2/3- IgG sem redução no método de acordo com a invenção.
[0475] Os 2/3-lgGs que não contêm ligações dissulfeto inter- cadeia da região Fc foram submetidos a reações de troca da cadeia como descrito acima (ver Exemplo 3), exceto por omitir o passo de redução inicial. Os 2/3-lgGs continham locais de ligação de fluos ou bio-regiões e regiões Fc sem ligações dissulfeto inter-cadeia entre a cadeia pesada de comprimento total e o MHCFCRP. A composição e produção destes 2/3-lgGs foi descrita no Exemplo
10. Após reações de troca sem iniciar a redução, foi realizado um ELISA em ponte para demonstrar a funcionalidade biespecífica de bsAbs. O ELISA em ponte compreendeu a adição de produtos de reação de troca ao fluos-BSA imobilizado, seguido pelas etapas de lavagem e subsequente adição de bio-
Cy5 à sonda quanto à presença do segundo braço de ligação do bsAb (veja exemplos anteriores para obter detalhes sobre o ELISA em ponte). Somente os bsAbs funcionais montados corretos podem se ligar pelo local de ligação do fluos à placa de ensaio, são retidos e geram sinais capturando e retendo o bio- Cy5. Moléculas sem biespecificidade não geram sinais, pois não se ligam à placa (ligante somente bio) ou não podem capturar o sinal que gera o bio-Cy5 (ligante somente para fluos). Os resultados dessas análises (realizando a reação de troca neste exemplo na concentração de 2,5 uM de moléculas de entrada com bsAb purificado como controle positivo) são mostrados na Figura
17. Os resultados demonstram uma geração bem sucedida de bsAb via troca de cadeia com entrada monoespecífica de 2/3-I9G moléculas sem ligações dissulfeto inter-cadeia da região Fc. A troca produtiva da cadeia ocorreu sem a necessidade de redução inicial. Assim, a remoção de ligações dissulfeto de polipeptídeo da região Fc eliminou a necessidade de uma etapa de redução inicial. Os bsAbs resultantes são mantidos juntos por interações Fc-Fc não covalentes. A eliminação de dissulfetos inter-cadeia Fc-Fc permite, assim, reações de troca induzidas por região Fc correspondentes, sem a necessidade de redução e, assim, permitindo a aplicação in vivo. EXEMPLO 12
[0476] As reações de troca em cadeia são impulsionadas por cadeias pesadas de comprimento total parcialmente desestabilizadas - interfaces MHCFCRP.
[0477] O driver para a conversão de 2/3-I9GGs em bsAbs é uma interface “falha' projetada entre a cadeia pesada de comprimento total e o MHCFCcRP. Essa interface repulsiva artificial é o resultado de mutações introduzidas nos domínios CH3 de puxador ou buraco do MHCFCRP. O MHCFCRP ainda se associa aos parceiros de puxador ou buraco correspondentes (“normais”) durante a expressão de 2/3-lI9Gs (veja exemplos acima). Essas moléculas têm estabilidade suficiente para apresentar 2/3-lgGs, bem como moléculas comportadas sem tendências de agregação indesejadas.
[0478] Sem estar vinculado a essa teoria, a reação de troca de acordo com a presente invenção, levando a bsAbs, ocorre quando duas 2/3- I|gGs complementares se aproximam e os pares da cadeia pesada :: MHCFcRP de anticorpo de comprimento total são parcialmente liberados um ao lado do outro. A remontagem das cadeias pesadas de comprimento completo, com repulsão e buraco de puxador, repulsas e sem carga, deve ser favorecida nessas condições, porque as interfaces da cadeia pesada de anticorpo (CH3) de comprimento total são perfeitas. Assim, as cadeias pesadas de comprimento total do bsAb formado permanecem associadas à preferência sobre a reformação das moléculas 2/3-lgG parcialmente imperfeitas (com carga incompatível). Assim, uma interface CH3 parcialmente desestabilizada (repulsa de carga) projetada é um parâmetro-chave para reações bem-sucedidas de troca de cadeia dirigida.
[0479] A desestabilização parcial da interface Fc, especialmente a interface CH3-CH3, pode ser alcançada através da mutação de resíduos CH3 do MHCFCcRP, mantendo os resíduos de interação na cadeia pesada de anticorpo de comprimento total.
[0480] Mutações de exemplo que podem ser introduzidas no domínio CH3 do MHCFCRP que afetam a interface cadeia pesada :: MHCFcCRP de anticorpo de comprimento total são fornecidas na Tabela a seguir.
345E R
Posição (numeração da UE) mutação (ões) perturbadora (s) 351L FouY 360K SouE | 364S VouLl 366T | 400S K 401D R
[0481] Algumas das mutações incluem trocas que colocam cargas alteradas na interface. As mutações de carga enfraquecem ou quebram os pares de cargas estabilizantes existentes anteriormente ou resultam em efeitos de repulsão ou em ambos.
[0482] Da mesma forma, aminoácidos com cadeias laterais de tamanhos diferentes podem ser introduzidos para gerar efeitos de repulsão estérica. Tais mutações enfraquecem ou interferem nas interações hidrofóbicas existentes da interface ou geram obstáculos estéricos, ou combinam ambas.
[0483] Mutações que parcialmente desestabilizam via carga e/ ou efeitos estéricos também podem ser combinadas entre si.
[0484] Além disso, um primeiro 2/3-lgG que contém mutações de carga e/ ou estéricas introduzidas no seu MHCFCRP pode ser combinado com um segundo 2/3-lgG que contém diferentes cargas e/ ou mutações estéricas introduzidas no seu MHCFCRP que correspondem às do MHCFCRP do primeiro 2/3-1gG.
[0485] Os 2/3-lgGs, bem como os bsAbs resultantes, se agrupam de uma maneira em que os domínios CH3 emparelhados abrigam mutações no puxador de um lado e as mutações no buraco do outro. Portanto, “back- mutação' para composição do tipo selvagem dos resíduos de puxador ou buraco correspondentes do MHCFCRP também gera distúrbios na interface. Essas combinações de domínios CH3 de puxador ou buraco com domínios do tipo selvagem estão listadas na tabela a seguir.
366S T 368A L 407V Y
[0486] Essas — retromutações —=podem ser aplicadas para desestabilizar parcialmente a interface CH3-CH3.
[0487] Essas retromutações também podem ser aplicadas em combinação com outras mutações perturbadoras, inclusive. os descritos na tabela anterior.
[0488] Todas as mutações individuais parcialmente perturbadoras ou a combinação de mutações, conforme descrito acima, também podem ser escolhidas de uma maneira que desestabilizem parcialmente o 2/3-lgG, e ainda estabilizem um heterodímero puxador-MHCFCRP: buraco-MHCFCRP como o segundo produto da reação de troca e, assim, deslocando o equilíbrio da reação ainda mais para o lado do produto (reação de troca).
EXEMPLO 13
[0489] Conversão celular de derivados monovalentes de 2/3-lgG em bsAbs bivalentes de acordo com a presente invenção.
[0490] Os derivados 2/3-Ig9G sem ligações dissulfeto inter-cadeia entre a cadeia pesada e o MHCFCcRP não requerem redução para iniciar a reação de troca. Portanto, é possível que a troca também possa ser alcançada sob condições fisiológicas, possivelmente mesmo quando 2/3-lgGs individuais estão ligados à superfície celular. Se os braços Fab funcionais de 2/3-lgGs se ligam à superfície celular, eles se acumulam nas células-alvo. Se duas 2/3- IgGs complementares se ligam à superfície da mesma célula, a troca de cadeias pode ocorrer enquanto é ligada diretamente à superfície das referidas células. Essa troca gera um bsAb totalmente funcional com dupla especificidade diretamente na superfície da célula.
[0491] Para demonstrar isso na troca de cadeia celular in situ, duas 2/3-l9Gs complementares que ligam os antígenos LeY ou Her1l são aplicados a células que exibem altos níveis de LeY, altos níveis de Her1 ou altos níveis de ambos. Pode ser demonstrado nas análises de FACS que 2/3-
BiFabs aplicados individualmente se ligam às células e expressam seu antígeno cognato. A co-aplicação (simultânea ou consecutiva) de ambos os 2/3-BiFabs resulta em aumento da ligação apenas às células que expressam os dois antígenos. Isto indica uma geração bem sucedida de produtos bsAb funcionais bivalentes (com ligação melhorada mediada por avidez) por reações de troca celular de 2/3-BiFabs monovalentes (pró-drogas). EXEMPLO 14
[0492] Projeto, composição e funcionalidade de 2/3-BiFabs sem cadeia pesada: ligações dissulfeto MHCFCRP de acordo com a presente invenção.
[0493] TrifFabs são derivados de anticorpos que abrigam funcionalidades biespecíficas devido a uma troca dos domínios de IgG CH2 para VH e VL, respectivamente. A “região-tronco” do tipo Fc de tais moléculas é mantida unida por domínios KiH CH3 intactos. Isso permite a geração de MHCFCRP contendo análogos BiFab com recursos potencialmente ativadores de troca. A Figura 18 mostra o design e a composição de MHCFCRP contendo derivados 2/3-lgG-BiFab. Aplicando os mesmos princípios gerais que os 2/3- IlgGs, os análogos de 2/3-BiFab projetados são compostos de uma cadeia pesada KiH e uma entidade MHCFCRP que abriga um domínio VL ou VH complementar de um anticorpo irrelevante em vez do domínio CH2, bem como um domínio CH3 KiH correspondente. Assim, os domínios CH2 da cadeia pesada e MHCFCRP em 2/3-lgGs são substituídos por um domínio VH ou VL. Além disso, e como uma diferença adicional aos 2/3-lgGs descritos no Exemplo 1, a cadeia pesada e o tronco MHCFCcRP desses derivados 2/3-BiFab não abrigam cisteínas que promovem cadeia pesada: conexões covalentes do MHCFCRP (análogo ao derivado 2/3-l9G do Exemplo 10). Como o 2/3-BiFabs hospeda módulos de troca, ou seja, domínios CH3, com base no mesmo princípio que 2/3-IgGs (sem dissulfetos inter-cadeia), as reações de troca podem ocorrer da mesma maneira descrita e mostrada para 2/3 -lgGs. O princípio geral da reação de troca associada ao 2/3-BiFab é mostrado na Figura 18. As sequências das cadeias leves, cadeias pesadas de puxador ou buraco e cadeias de buraco ou MHCFCRP- puxador aplicadas para produzir 2/ 3- Os BiFabs são os seguintes: a E anticorpo anti-LeY da cadeia leve anticorpo anti-LeY da cadeia pesada com domínio variável de anticorpo anti-dig 84 como puxador do domínio CH2 anticorpo anti-LeY da cadeia pesada com domínio variável de anticorpo anti-dig 85 como buraco do domínio CH2 anticorpo anti-MSLN da cadeia pesada com domínio variável de anticorpo anti-dig 86 como buraco do domínio CH2 anticorpo anti-MSLN da cadeia leve (MSLN = mesotelina) anticorpo anti-LeY da cadeia pesada com domínio variável de anticorpo anti-CD3 88 como puxador do domínio CH2 anticorpo anti-LeY da cadeia pesada com domínio variável de anticorpo anti-CD3 (como buraco do domínio CH2 anticorpo anti-LeY da cadeia pesada com domínio variável de anticorpo anti-CD- AG-2 como puxador do domínio CH2 anticorpo anti-LeY da cadeia pesada com domínio variável de anticorpo anti-CD- AG-2 como buraco do domínio CH2 MHCFcRP com domínio variável não ligante como buraco do domínio CH2 90 com domínio variável não ligante como puxador do domínio CH2 91 EXEMPLO 15
[0494] Expressão e purificação de 2/3-BiFabs de acordo com a invenção.
[0495]A expressão de 2/3-BiFabs foi alcançada pela co- transfecção de plasmídeos que codificam a cadeia leve, cadeia pesada de haste modificada (puxador ou buraco) e haste-MHCFCRP correspondente (buraco ou puxador) em células de mamíferos (por exemplo, HEK293) via estado de as tecnologias artísticas descritas anteriormente (WO 2016/087416). Os 2/3-BiFabs são secretados em sobrenadantes da cultura como IgGs padrão. Devido à ausência de uma região Fc funcional por não terem domínios CcH2, 2/3-BiFabs foram purificados por cromatografia de afinidade com proteína
L padrão (KappaSelet), como mostrado nas Figuras 19 e 20. É surpreendente que 2/3-BiFabs possam ser produzidos e purificados de maneira eficaz, mesmo que eles não possuam uma região V funcional na região do tronco (como é composto por VH e VL não correspondentes) e, embora não contenham dissulfetos inter-cadeias para conexão covalente do correntes.
A exclusão por tamanho e a análise de especificação de massa nativa mostraram a montagem correta de derivados 2/3-BiFab purificados, bem como a ausência de dímeros e agregados indesejados.
Os rendimentos de expressão de 2/3-BiFabs sob condições de expressão transitória não otimizada estão listados na tabela a seguir. 2/3 TriFabs
= ss da | 8 3
6 õ S 8 õ É S
S R $ S R 3 S
2 |âá |â |8 |â |& |z a ' o a a O x
Ss & & & C S É ur o E Pa E ID o
-) Ss O o õ = XI
X 2 X Xz E a =
2 3 [2 | | |$ |
S rr g = BR S S
Ê E 8 | S à | à |ã |& |à |&2 |à |&
2 — 2 à >
8 & a 8 8 < 2
8 8 g 8 g à à
& & z a s 8 S
> ” â » > a a
Ss Hd E o o ' '
= - 7 = -
= = rendimento HighTrap À seleção de 2/3-BiFab 100 | 150 | 110 | 35 75 50 | 100 Kappa [mg] subprodutos
40 25 23 n 20 20
2/3-BiFab = FsFFrFrrAF EXEMPLO 16
[0496] Geração de TriFabs funcionais por troca de cadeia livre de redução de acordo com a invenção.
[0497] A eliminação de dissulfetos inter-cadeia Fce-Fc, como mostrado acima, para 2/3-lgGs permite reações de troca acionadas por MHCFCRP sem a necessidade de redução e re-oxidação controlada, ou seja, em condições fisiológicas. É, portanto, possível “embaralhar” essas moléculas sob condições fisiológicas, potencialmente mesmo quando já ligadas às superfícies celulares alvo.
[0498] Portanto, as reações de troca 2/3-BiFab foram realizadas sem redução como gatilho inicial da reação de troca. As moléculas de entrada nessas reações de troca foram os 2/3-BiFabs de ligação a LeY com braços de ligação a LeY funcionais e a região do tronco de ligação a Dig “dividida (proDig), conforme descrito acima. A depleção de subprodutos 2/3-BiFabs e MHCFCRP não reagidos foi subsequentemente alcançada através da absorção de proteínas indesejadas contendo His8 na resina NINTA. As análises FACS foram subsequentemente aplicadas para avaliar a funcionalidade de ligação do TriFab gerado em comparação com as moléculas precursoras de 2/3-BiFab. Portanto, as células MCF7 que expressam o antígeno LeY foram expostas a 2/3-BiFabs de ligação a LeY individuais ou ao TriFab da reação de troca. Dig- Cy5 foi subsequentemente adicionado e a fluorescência das células foi avaliada. A Figura 21 mostra baixos sinais associados ao Dig-Cy5 com células que foram expostas a 2/3-BiFabs, embora ambas as entidades possuam braços Fab intactos que reconhecem o carboidrato da superfície celular LeY.
[0499] A razão para a incapacidade de 2/3-BiFabs de se ligar à carga útil digoxigenilada é que eles não abrigam um Fv de ligação a Dig funcional em sua região-tronco. O produto TriFab da reação de troca em cadeia, no entanto, exibiu inequivocamente sinais associados a Dig-Cy5, ou seja, funcionalidade de ligação a Dig. Isso demonstra que as moléculas precursoras de 2/3-BiFab com funcionalidade de ligação inativada de seu “tronco-Fy' são convertidas por troca de cadeia em TriFabs totalmente funcionais. EXEMPLO 17
[0500] Conversão celular de pró-fármacos 2/3-BiFabs em TriFabs bi ou tri específicos, ativados e ligados a células, de acordo com a invenção.
[0501] Os 2/3-BiFabs são apenas parcialmente competentes para a não ligação, uma vez que compreendem um braço Fab totalmente funcional. Somente o Fv na ponta da região do tronco não é funcional, pois é composto por domínios VH e VL não complementares (de diferentes anticorpos ou contendo mutações que interferem na ligação a antígenos cognatos, pró-forma inativa precursora do local de ligação) se o braço Fab funcional se ligar às superfícies celulares, 2/3-BiFabs se acumulam nas células alvo. Se dois 2/3- BiFabs complementares (ambos portadores de Fv-tronco inativados ainda se complementam) se ligam à superfície da mesma célula, podem ocorrer reações de troca em cadeia enquanto estão ligadas diretamente na superfície da referida célula. Essa troca gera um TriFab totalmente funcional com pelo menos dupla especificidade diretamente na superfície da célula (Figura 22).
[0502] Para demonstrar experimentalmente a troca de cadeia celular in situ, aplicamos os módulos 2/3 BiFab individuais, bem como aqueles que foram submetidos a embaralhamento bioquímico de cadeia (descrito nos exemplos acima) às células MCF7, seguidas por análises FACS. As células MCF?7 transportam o antígeno LeY em sua superfície celular e, portanto, ligam os 2/3-BiFabs individuais aos seus braços Fab funcionais. A Figura 23 mostra que 2/3-BiFabs aplicados individualmente se ligam a células MCF7, mas não são capazes de capturar o segundo alvo Dig-Cy5 (Figura 23, linhas 2 e 3). Isso reflete a ausência de Fv-tronco funcional no 2/3-BiFab e, portanto, nas células que se ligam apenas a 2/3 do BiFab. A aplicação simultânea de 2/3-BiFabs (complementares), no entanto, permite capturar e reter Dig-Cy5 na superfície das células MCF7 (Figura 23, linha 4). Isso indica um rearranjo/ troca de cadeia bem-sucedido e geração de TriFabs funcionais com funcionalidade de ligação a Dig do stem-Fv. Também foi observada troca de cadeia bem-sucedida da região do tronco e recuperação do tronco-Fv funcional (sinais FACS direcionados associados ao Dig-Cy5) após aplicação consecutiva dos 2/3- BiFabs complementares. A aplicação da primeira entidade para permitir a ligação celular seguida de lavagem extensa para remover moléculas não ligadas e a aplicação subsequente da 2º entidade também gera sinais FACS nas células positivas para o antígeno. Isso confirma que uma reação de troca bem-sucedida (por aplicação simultânea ou sequencial) pode ocorrer em condições fisiológicas na superfície das células-alvo. EXEMPLO 18
[0503] Conversão em cadeia celular de pró-fármaco anti-CD3-alvo 2/3-BiFabs em anticorpos biespecíficos totalmente funcionais de acordo com a invenção.
[0504] Para demonstrar que a conversão celular de pró-fármacos 2/3-BiFfab é um princípio geral que pode ser aplicado a diferentes especificidades de ligação, foram gerados 2/3-BiFabs que contêm domínios VH ou VL de anticorpos de ligação a CD3. Os anticorpos biespecíficos de células T (também denominados recrutadores de células T) são proteínas que combinam entidades de ligação que reconhecem o antígeno na superfície das células tumorais com funcionalidades de ligação a CD3. Tais moléculas se ligam às células tumorais através de suas entidades de ligação ao antígeno tumoral, bem como às células T (via funcionalidade de ligação ao CD3). Por sua vez,
isso gera sinais e processos (de ativação) que resultam em lise/ morte de células tumorais mediadas pelo ataque de células T induzido pela ligação ao anticorpo.
[0505] 2/3-BiFabs com funcionalidade anti-pró-droga CD3, ou seja, o local de ligação ao CD3 está localizado na região do tronco e, portanto, não é competente para a ligação nos estudos de 2/3-BiFab, foram projetados conforme descrito acima (consulte os Exemplos 14 e 15) As cadeias leves, cadeias pesadas de puxador ou buraco e MHCFCcRP's correspondentes foram co-expressas para gerar o 2/3-BiFfab LeY-procD3 (buraco)-MHCFcRP (puxador) e o 2/3-BiFab LeY-proCD3 (puxador)-MHCFCRP (buraco). Os 2/3- BiFabs foram purificados como descrito acima (ver Tabela no Exemplo 15) e sujeitos a reação de troca em cadeia celular.
[0506] Para demonstrar experimentalmente a troca na cadeia celular de 2/3-BiFabs com funcionalidade anti-pró-droga CD3, estes foram então aplicados às células MCF7. A presença ou ausência da funcionalidade de ligação a CD3 foi subsequentemente determinada através de ensaios repórter baseados em células que geram sinais após a ligação ao receptor de CD3 (Bioensaio de ativação de células T Promega (NFAT), cat. % J1621, Figura 24).
[0507] As células MCF7 carregam o antígeno LeY em sua superfície celular e, portanto, os 2/3-BiFabs individuais podem se ligar aos seus braços Fab funcionais. Na Figura 25, pode ser visto que 2/3-BiFabs aplicados individualmente se ligam a células MCF7, mas geram nenhum/ baixo sinal repórter de CD3. Isso reflete a ausência de funcionalidade de ligação a CD3 nessas moléculas. A aplicação simultânea de ambos os 2/3-BiFabs (complementares) gerou sinais significativos que refletem a ligação eficiente a CD3. Isso indica rearranjo/ troca bem-sucedida de cadeia celular/ in vivo e geração de TriFabs funcionais com funcionalidade de ligação a CD3 nas células.
[0508] Também foi observada troca de cadeia bem-sucedida da região do tronco e recuperação do tronco-Fv funcional (sinais CD3) após aplicação consecutiva dos 2/3-BiFabs complementares. A aplicação da primeira entidade para permitir a ligação celular seguida de lavagem extensa para remover moléculas não ligadas e a aplicação subsequente da 2º entidade também geraram sinais nas células positivas para o antígeno. Isso confirmou que a troca e a ativação bem-sucedidas de reações direcionadas às moléculas de pró-fármaco anti-CD3 podem ocorrer em condições fisiológicas na superfície das células-alvo.
EXEMPLO 19
[0509] Conversão celular de diferentes antígenos direcionados aos pró-fármacos 2/3-BiFab em TriFabs tri-específicos ativados, ligados à célula, totalmente funcionais, de acordo com a invenção.
[0510] A troca de cadeia mediada por 2/3-BiFab e a subsequente ativação de derivados de anticorpo do tipo pró-fármaco pode ser combinadas com princípios de ligação dupla ao antígeno. Isso aprimora a especificidade de ativação de pró-fármaco, como mostrado na Figura 26: pares de 2/3 BiFabs que, mediante troca de cadeias, geram TriFabs funcionais, que compreendem funcionalidades-tronco-Fy complementares da mesma especificidade (por exemplo, CD3 (= CD-antígeno 1) ou CD-AG-2 (= antígeno CD 2) ou outros ligantes que se beneficiam de abordagens direcionadas de pró-fármacos), mas compreendem braços Fab de ligação à superfície celular com especificidades diferentes. Assim, a troca da cadeia produtiva e a recuperação da funcionalidade tronco-Fv ocorrem apenas em células que expressam os dois antígenos. Em tais configurações, a reação de troca gera TriFabs triespecíficos na superfície celular com um braço Fab derivado de cada 2/3-BiFab e o tronco- Fv recuperado do complemento de VH e VL de ambos. É fornecida alta especificidade da ativação de pró-fármacos porque a funcionalidade tronco-Fv está ausente no 2/3-BiFab individual ou em células que se ligam apenas a 2/3- BiFab.
Apenas células que transportam antígenos alvo para os 2/3-BiFabs complementares (em densidade suficiente) permitem a troca de cadeias e, assim, a recriação da região funcional do tronco-Fv.
A geração na célula da funcionalidade de ligação biespecífica também contribui para a avidez, pois converte monovalentes em ligantes de superfície celular bivalentes.
Assim, aumenta e estabiliza a ligação do derivado TriFab na superfície da célula alvo (melhora medi aos pró-fármacos TriFab em TriFabs tri-específicos de acordo com a invenção.
[0514] Os derivados 2/3-Bifab como moléculas de partida compreendem como MHCFCRP uma região tronco-Fv modificada sem braço Fab no seu terminal N. A ligação dos braços Fab a essas entidades e sua expressão em combinação com cadeias pesadas gera derivados 2/3-TriFab ativados para troca, como mostrado na Figura 28. Essas moléculas têm seus MHCFCRPs alterados para cadeias competentes potencialmente ligadas ao antígeno que, ao encontrarem seus correspondentes troca de parceiros para TriFabs triespecíficos funcionais.
[0515] Assim, derivados 2/3-TriFab com especificidade de ligação ao alvo da superfície celular “A' podem ser gerados que abrigam um Fv-tronco não funcional composto por VH com especificidade 'X' e VL com especificidade Y'. Correspondentemente, os derivados 2/3-TriFab complementares podem ser gerados com a especificidade de ligação ao alvo da superfície celular “B' abrigam um Fv-tronco não funcional composto por VH com especificidade Y' e VL com especificidade 'X'. A troca de tais moléculas na cadeia celular gera dois tipos de TriFabs triespecíficos, ambos portadores de braços Fab de ligação a células biespecíficas (melhoradas por avidez) (ambos A + B). Um desses Trifabs abriga a funcionalidade stem-Fv totalmente ativa da primeira especificidade, o outro TriFab contém a funcionalidade Fv do segundo tronco (ou X' TriFab totalmente ativo ou TriFab Y' totalmente ativo). A aplicação de tais pares de pró-fármacos TriFab, por exemplo, deve permitir a conversão simultânea de ligantes CD3 inativos em ativos, bem como de ligantes de CD- AG-2 (ou de outros pares de ligantes que se beneficiam da ativação específica de pró-fármaco com avidez) seletivamente apenas nessas células que expressam simultaneamente dois antígenos de superfície definidos (câncer) em densidade suficiente.
EXEMPLO 21
[0516] Derivados pró-fármacos 2/3-BiFab específicos de acordo com a invenção.
[0517] Os derivados 2/3-BiFab foram projetados e podem ser gerados como moléculas de partida para a reação de troca, tal como aqui relatado, em que os MHCFcRPs são covalentemente conjugados com o terminal C da cadeia pesada através de um ligante peptídico, como por exemplo, um vinculador (G4S) 6. Isso gera uma entidade “não-funcional” que se assemelha a um módulo-tronco de cadeia única de TriFabs, como mostrado na Figura 29. A conexão dos braços Fab a esses módulos de haste de cadeia única gera derivados de TriFab ativados para troca. Dois deles podem ser trocados por derivados funcionais de anticorpos tri- ou tetraespecíficos como mostrado na Figura 29.
Cadeia o VL (buraco) VH (puxador)
[0518] A região de ligação a LeY pode ser trocada com sequências que permitem a ligação a outros antígenos para gerar pró-fármacos de anticorpos que se ligam a antígenos diferentes nas células e se reorganizam da mesma maneira descrita na Figura 28.
EXEMPLO 22
[0519] A conversão em cadeia celular de pró-fármaco 2/3-BiFabs anti-CD3 direcionado, de acordo com a invenção, permite a morte eficaz de células tumorais mediada por células T.
[0520] Este exemplo demonstra que a conversão celular de pró- fármacos 2/3-BiFab em TriFabs de ligação a CD3 permite a morte mediada por células T das células tumorais direcionadas: Geraram-se 2/3-BiFabs de ligação a antígeno do tumor LeY que continham VH ou VL domínios de anticorpos de ligação a CD3. O design e a geração desses pró-fármacos 2/3-BiFab são descritos nos exemplos anteriores. As sequências VH e VL do ligante CD3 desses pró-fármacos 2/3-BiFab são descritas na US 2015/0166661 A1.
[0521] Para demonstrar que essas moléculas induzem a morte mediada por células após ligação simultânea, elas foram aplicadas em diferentes concentrações nas células MCF7 LeY positivas. Portanto, as células MCF7 foram semeadas em placas de 96 poços e incubadas durante a noite, seguidas pela exposição dessas células a 2/3-BiFab anti-LeY-proCD3 (puxador)-MHCFCRP (buraco) e 2/3-Bifab antileY-proCD3 (buraco) MHCFCRP (puxador). Esses componentes foram adicionados individualmente/ sequencialmente ou em combinação. Para avaliar a morte mediada por células T, PBMCs de sangue total de doadores saudáveis (isolados por purificação de Ficoll de última geração) foram adicionados em uma proporção de 5: 1. As culturas foram então mantidas a 37 ºC, 5% de CO?2 durante 48 horas, seguidas de avaliação do grau de lise das células tumorais (aplicando os mais modernos ensaios de liberação de LDH).
[0522] Os resultados desses ensaios são mostrados na Figura 30.
[0523] As células MCF7 carregam o antígeno LeY em sua superfície celular e, portanto, os 2/3-BiFabs individuais podem se ligar aos seus braços Fab funcionais. Aplicado individualmente 2/3 BiFab, ou seja, a administração de anti-LeY-proCD3 (puxador)-MHCFCcRP (buraco) ou 2/3-BiFab anti-LeY-proCD3 (buraco)-MHCFCRP (puxador) não resulta em T- relevante morte mediada por células (sem liberação de LDH), mesmo em altas concentrações molares. Isso reflete a ausência da funcionalidade de ligação a CD3 (necessária para a lise celular mediada por células T) dessas moléculas.
[0524] EM contraste, a aplicação simultinea de ambos
(complementar)2/3-BiFabs resultou em liberação significativa de LDH. Isso reflete lise significativa de células tumorais já em concentrações bastante baixas. A razão para isso é o rearranjo/ troca bem-sucedida de cadeias nas superfícies das células tumorais e a geração de TriFabs funcionais com funcionalidade de ligação a CD3. Aqueles TriFabs funcionais de ligação a CD3 recrutam e envolvem células T que, por sua vez, levam à lise de células tumorais direcionadas. EXEMPLO 23
[0525] A conversão em cadeia celular de pró-fármaco anti-CD3 2/3-BiFabs direcionado a AG-4 e EGFR, de acordo com a invenção, permite a morte eficaz de células tumorais mediada por células T e a liberação forte de citocinas.
[0526] Analogamente à configuração experimental descrita no Exemplo 22, as células HELA que expressam AG-4 e as células A431 que expressam EGFR foram direcionadas com os respectivos 2/3-BiFabs.
[0527] A administração de anti-AG-4-proCD3 (puxador)-MHCFcRP (buraco) ou 2/3-BiFab anti-AG-4-proCD3 (buraco)-MHCFCRP (puxador) em células HELA não resulta em células mediadas relevantes abate (sem liberação de LDH). Isso reflete a ausência da funcionalidade de ligação a CD3 (necessária para a lise celular mediada por células T) dessas moléculas.
[0528] Além disso, a administração de anticEGFR-procCD3 (puxador)-MHCFCRP (buraco) ou 2/3-BiFfab anti-EGFR-proCD3 (buraco)- MHCFCRP (puxador) em células A431 não resulta em morte relevante mediada por células (sem liberação de LDH).
[0529] Por outro lado, a aplicação simultânea de ambos os 2/3- BiFabs (complementares) resultou em liberação significativa de LDH em ambas as configurações de células-alvo. Isso reflete lise significativa de células tumorais já em concentrações bastante baixas (Figura 31). A razão para isso é a troca bem-sucedida de cadeias entre os 2/3-BiFabs nas superfícies das células tumorais e a geração de TriFabs funcionais com a funcionalidade de ligação a CD3.
[0530] Além disso, a Figura 32 mostra as quantidades de citocinas segregadas em concentrações de 4 nM para AG-4 direcionadas para células HELA. Quantidades mais significativas de |L-2, IFN-y, Granzima B e TNFa estão presentes no cenário em que anti-AG-4-proCD3 (puxador)-MHCFcRP (buraco) e 2/3-BiFab anti-AG-4- O proCD3 (buraco)-MHCFCcRP (puxador) foi aplicado refletindo uma forte resposta imune também no nível de citocinas (Figura 32).
EXEMPLO 24
[0531] O direcionamento duplo de EGFR e AG4 em células HELA permite a conversão em cadeia celular de anti-CD3-pró-fármaco 2/3-BiFabs, de acordo com a invenção, e ativação eficaz de células T.
[0532] A dupla focalização foi avaliada em um ensaio funcional usando a linha celular repórter que gera sinais após a ligação do receptor CD3 (Bioensaio de ativação de células T Promega (NFAT), cat. té J1621).
[0533] As células HELA que expressam o antígeno 4 da superfície celular (AG-4) e o fator de crescimento epidérmico (EGFR) (Figura 33) foram tratadas com 2/3-BiFab visando AG-4 ou EGFR. O tronco-Fv (inativado) de ambas as construções abrigava VH ou VL de um anticorpo de ligação a CD3. Os resultados indicaram falta de atividade de ligação a CD3 relevante após a aplicação apenas do EGFR-proCD3 (puxador)-MHCFCRP (buraco) ou apenas do AG-4-proCD3 (buraco)-MHCFCRP (puxador). A co-aplicação de ambos, no entanto, leva a uma ligação significativa ao CD3 e à ativação da linha celular repórter (Figura 34). Como controle, as moléculas de EGFR-proCD3 (buraco)- MHCFCRP (puxador) e AG-3-proCD3 (puxador)-MHCFCRP (buraco) foram analisadas. No que diz respeito à expressão antigénica, as células HELA são negativas para AG-3, em que apenas os 2/3-BiFabs alvo de EGFR são capazes de se ligar. Esse controle serve como outra prova de que a reação de embaralhamento ocorre na superfície da célula e somente quando ambos os 2/3-BiFabs estão ligados à superfície da célula. Caso a conversão tivesse sido eficiente, mesmo em baixas concentrações nos meios, o produto de conversão EGFR/ AG-3/ CD3 TriFab teria sido capaz de ligar a superfície celular através da entidade de ligação ao EGFR e, assim, induzir uma mediação mediada por CD3 ativação - que não foi detectada. EXEMPLO 25
[0534] Os derivados pró-fármacos Fab específicos para 2/3, com motivo de haste de cadeia única, sofrem conversão em células de acordo com a invenção, gerando assim dois locais de ligação adicionais e ativando fortemente as células T.
[0535] Os derivados 2/3-BiFab foram projetados e foram gerados como moléculas de partida para a reação de troca, tal como aqui relatado, em que os MHCFCcRPs foram covalentemente conjugados com o terminal C da cadeia pesada via um ligante peptídico, como por exemplo, um ligante (G4S) 6 (SEQ ID NO: 81 x 6). Isso gerou uma entidade “não-funcional' que se assemelha a um módulo-tronco de cadeia única de TriFabs, como mostrado na Figura 29. A conexão dos braços Fab a esses módulos de haste de cadeia única gerou derivados de TriFab ativados por troca. Dois deles foram mostrados para trocar por derivados funcionais específicos de anticorpos, como mostrado na Figura 29.
E (puxador)- Bio VL (buraco)
Cadeia | Bio VH (puxador)
[0536] A Figura 35 representa a configuração para os estudos de ligação via citometria de fluxo. Os resultados obtidos são mostrados na Figura
36. Considerando que qualquer uma das construções isoladamente não levou à ligação de Dig-Cy5 ou Bio-488 (Figura 36A: linhas 2 e 3; Figura 36B: linhas 2 e 3), a co- a aplicação de ambos, no entanto, leva à geração de funcionalidades associadas à superfície celular Dig e Bio-ligação, como indicado pelo aumento da fluorescência dessas células (Figura 36A: linha 4; Figura 36B: linha 4).
[0537] Consequentemente, — anticorpos —triespecíficos foram gerados com entidades de ligação a CD3 e CD-AG-2 combinando cadeia pesada anti-LeY-CD3-TriFab de cadeia única (puxador)-CD-AG-2-VL (buraco) e anti-LeY- de cadeia única Cadeia pesada CD3-TriFab (buraco)-CD-AG-2-VH (puxador) (Figura 37). A capacidade dessas moléculas de ativar células T foi comprovada usando o (Bioensaio de ativação de células T Promega (NFAT), cat. * 1621) e é mostrada na Figura 38.
EXEMPLO 26
[0538] Dímeros MHCFCRP em forma de Fab com um local de ligação adicional como subprodutos da conversão em cadeia celular de anti- CD3-pró-fármaco 2/3-BiFabs direcionados de acordo com a invenção.
[0539] Como representado na Figura 18, os subprodutos do MHCFCRP com especificidade 4 podem não ser obrigatórios. No entanto, adicionando VH ou o respectivo VL de uma entidade de ligação funcional ao MHCFCRP, uma molécula Fab funcional, ou seja, competente para a ligação, foi gerada durante a reação de troca. Para mostrar a funcionalidade de ligação dos subprodutos do MHCFCRP, foram adicionados pares 2/3-BiFabs direcionados para LeY que transportam CD-AG-2 MHCFCRP, sozinhos ou em combinação com a mídia. Além disso, células Jurkat LeY-negativas que expressam CD-AG-2 foram adicionadas. A configuração completa é mostrada na Figura 39. Os subprodutos do MHCFCRP foram detectados com o anticorpo PE-anti-His6. 2/3-BiFabs (Figura 40, linhas 2 e 3) por si só não levaram a uma ligação His6 de anticorpo de detecção devido ao fato de que as células Jurkat são negativas para LeY e o 2/3-BiFab não pôde se ligar à superfície celular. À combinação dos dois 2/3-BiFabs leva à geração de subprodutos do MHCFcRP que foram capazes de se ligar ao CD-AG-2 e podem ser detectados através de um anticorpo anti-His6 por citometria de fluxo (ver Figura 40, linha 4). 2/3- BiFabs não reagidos não foram capazes de se ligar à célula, devido à expressão ausente de LeY. EXEMPLO 27
[0540] O MHCFCRP com um Fab fundido terminal N adicional como entidade de direcionamento permite o direcionamento de células bivalentes, medeia a conversão celular e a produção de subprodutos trivalentes de MHCFCRP de acordo com a invenção.
[0541] Os derivados 2/3-BiFfab como moléculas de partida compreendem como MHCFcRP uma região tronco-Fv modificada sem braço Fab no seu terminal N. A ligação dos braços Fab a essas entidades e sua expressão em combinação com cadeias pesadas gera derivados 2/3-TriFab ativados para troca, como mostrado na Figura 41. Essas moléculas têm seus MHCFCRPs alterados para cadeias competentes de ligação a LeY que - ao encontrar seus correspondentes troca de parceiros para TriFabs triespecíficos funcionais.
[0542] Assim, podem ser gerados derivados 2/3-TriFfab com especificidade de ligação ao alvo LeY que abrigam um Fv-tronco não funcional composto por VH com especificidade de CD3 e VL com especificidade de CD- AG-2, ou vice-versa. A troca de tais moléculas na cadeia celular gera dois tipos de TriFabs triespecíficos, ambos portadores de braços LeY Fab biespecíficos (com avidez). Um desses TriFabs abriga a funcionalidade stem-Fv totalmente ativa da especificidade de CD3, o outro TriFab contém a funcionalidade Fv- tronco CD-AG-2. A aplicação desses pares de pró-fármaco TriFab a células MCF7 que expressam LeY, por exemplo, permite a conversão simultânea de ligantes CD3 inativos em ativos, bem como de ligantes CD-AG-2.
[0543] Os resultados estão representados na Figura 42. Os resultados indicaram falta de entidades ativadoras de células T relevantes mediante a aplicação apenas do LeY-proCD3 (puxador)-LeY-proCD-AG-2- MHCFCRP (buraco) ou LeY-proCD3 (buraco)- LeY-proCD-AG-2-MHCFcRP (puxador). A co-aplicação de ambos, no entanto, leva a uma ativação significativa das células T.
EXEMPLO 28
[0544] Os derivados alternativos 2/3-BiFab permanecem intactos à ligação ao FcRn dependente de CH2 e mostram a conversão na cadeia celular de acordo com a invenção.
[0545] Os derivados 2/3-BiFfab como moléculas de partida compreendem como MHCFcRP uma região tronco-Fv modificada. Para manter o domínio CH2 da IgG convencional e, portanto, a capacidade de se ligar ao FcRn para meia-vida prolongada, o fragmento variável pode ser anexado na extremidade terminal C de um dímero CH2-CH3, como mostrado na Figura 43. As mutações parcialmente desestabilizadoras no o domínio CH3 é o mesmo que em 2/3-BiFabs. Como alternativa, o fragmento variável pode ser introduzido entre a parte FC (CH2 + CH3) e a parte Fab, como mostrado na Figura 44. Todos os anticorpos foram expressos como descrito anteriormente em bons rendimentos (72 mg/ L a 161 mg/ L) A Figura 45 confirma a capacidade dos formatos que contêm CH2 de exibir uma ligação mais alta ao FcRn, revelando uma meia-vida sérica prolongada em comparação com o 2/3- BiFabs inicial (a cromatografia de afinidade analítica do FcRn foi realizada conforme descrito em Schlothauer, T., et al.., MAbs 5 (2013) 576-586).
[0546] A capacidade do CH2 contendo 2/3-BiFabs de conferir a conversão da cadeia celular foi analisada por citometria de fluxo, como descrito acima. Duas moléculas de eduto foram aplicadas sequencialmente (com lavagem duas vezes intermediária) nas células MCF7. Após a troca das cadeias, foi montado um local de ligação anti-digoxigenina funcional e, portanto, capaz de ligar Cy5 digoxigenilado na superfície da célula, o que foi detectado por FACS. Ambas as classes de moléculas de acordo com as Figuras 43 e 44, foram submetidas a uma reação de troca em cadeia com sucesso, de acordo com a invenção, como mostrado na Figura 46.
EXEMPLO 29
[0547] O domínio CH2 contendo 2/3-BiFabs é capaz de converter em locais funcionais de ligação a CD3 em um método, de acordo com a invenção, e, assim, mediar a ativação de células T.
[0548] Os 2/3-BiFabs contendo CH2 com o fragmento variável fixado na extremidade do terminal C (Figura 47) foram analisados quanto à sua capacidade de gerar um ligante CD3 funcional utilizando o ensaio de ativação Jurkat, conforme descrito acima. As células MCF7 serviram como células alvo, LeY como antígeno alvo. Enquanto o 2/3-BiFabs não induziu uma ativação significativa do Jurkat, a combinação de ambos resultou em uma ativação dependente da dose e emissão de luz no sistema repórter (RLU) (Figura 48).
EXEMPLO 30
[0549] A microscopia eletrônica de transmissão confirma a estrutura proposta de 2/3-BiFabs e o produto correspondente e os revela como altamente flexíveis.
[0550] Para analisar a forma e a estrutura dos 2/3-BiFabs e o respectivo produto de troca de cadeia obtido em um método de acordo com a invenção, foi realizada a microscopia eletrônica de transmissão de mancha negativa (NS-TEM). Os resultados (Figura 49) revelam um caráter rígido entre domínios, mas com alta flexibilidade entre domínios.
[0551] Preparação da grelha: As amostras descongeladas recentemente são diluídas em D-PBS até uma concentração de cerca de 5 mg/ ml. 4 ul da amostra diluída foram adsorvidos em grades de cobre revestidas com carbono de 400 mesh, lavadas com 3 gotas de água, incubadas com 3 ul de solução contendo TMV, lavadas com 2 gotas de água e finalmente manchadas com 2 gotas de uranil acetato 2%.
[0552] Microscopia eletrônica de transmissão: As amostras foram fotografadas usando um microscópio eletrônico de transmissão Tecnai12 (FEI, Eindhoven, Holanda), operando a 120 kV. As micrografias eletrônicas foram gravadas em uma câmera com dispositivo acoplado a carga de 2048 x 2048 pixels (Veleta Gloor Instruments) com uma ampliação nominal de 195.000 x, produzindo um tamanho final de pixel de 0,296 nm no nível da amostra. De forma alternativa, as amostras foram fotografadas usando um FEI Tecnai G2 Spirit TEM (FEI, Eindhoven, Holanda) operando a 80 kV. As micrografias eletrônicas foram então gravadas em uma câmera com dispositivo acoplado a carga de 2048 x 2048 pixels (Veleta Soft Imaging Systems) com uma ampliação nominal de 135.000 x, produzindo um tamanho final de pixel de 0,33 nm no nível da amostra.
[0553] Processamento de imagem: O alinhamento sem referência foi realizado em partículas selecionadas manualmente a partir de imagens gravadas usando o pacote de processamento de imagens EMAN?2 (consulte, por exemplo, G. Tang, L., et al., J. Struct. Biol. 157 (2007) 38-46). As partículas extraídas foram alinhadas e classificadas por análise estatística multivariada,
produzindo médias da classe 2D. Além disso, quando a média da classe não era possível, as imagens brutas de partículas também eram manualmente coradas para maior clareza usando o Photoshop. EXEMPLO 31
[0554] A conversão da cadeia não relacionada ao alvo ocorre ineficientemente apenas em altas concentrações.
[0555] Para determinar se a conversão da cadeia também ocorre em altas concentrações nos meios, 2/3-BiFabs foram aplicados a células HELA co-cultivadas com PBMC. Na primeira configuração, foram aplicados anti-AG4- proCD3 (buraco)-MHCFCcRP (puxador) e EGFR-proCD3 (puxador)-MHCFcRP (buraco) (a conversão na célula ocorre porque os dois alvos são expressos nas células HELA). Na segunda configuração, foram aplicados anti-AG-4-proCD3 (buraco)-MHCFCRP (puxador) e AG-3-proCD3 (puxador)-MHCFCRP (buraco) (AG-3 não é expresso em células HELA, portanto, na célula conversão não deve ser possível). No entanto, a porcentagem de mortes em concentrações de 300 nM revela que a conversão no meio e a ligação monovalente à superfície celular HELA através do local de ligação AG-4 raramente ocorrem e media a morte das células alvo apenas em uma porcentagem baixa (Figura 50).

Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1 COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender:
    a) um primeiro polipeptídeo multimérico que compreende um primeiro polipeptídeo que compreende i) na direção terminal N a C a) um primeiro domínio variável de anticorpo selecionado a partir de um par de um domínio variável da cadeia leve e pesada de anticorpo que se liga especificamente a um primeiro alvo e b) um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina G humana,
    ii) um par de um domínio variável da cadeia leve e pesada de anticorpo que se liga especificamente a um antígeno de superfície celular, seja no terminal N no primeiro domínio variável de anticorpo ou no terminal C no primeiro domínio CH3,
    um segundo polipeptídeo que compreende i) na direção terminal N a C a) um segundo domínio variável de anticorpo selecionado a partir de um par de um domínio variável da cadeia leve e pesada de anticorpo que se liga especificamente a um terceiro alvo e b) um segundo domínio CH3 de imunoglobulina G humana,
    em que o segundo domínio variável de anticorpo é um domínio variável da cadeia leve de anticorpo, se o primeiro domínio variável de anticorpo for um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo; ou o segundo domínio variável de anticorpo é um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo, se o primeiro domínio variável de anticorpo for um domínio variável da cadeia leve de anticorpo, e em que o segundo domínio CH3 compreende uma mutação perturbadora D356K ou E357K, em que toda a numeração está de acordo com o Índice de Kabat EU, em que o primeiro domínio CH3 compreende:
    a) o resíduo de aminoácido K na posição 439 se as mutações perturbadoras forem D356K, ou b) o resíduo de aminoácido K na posição 370 se as mutações perturbadoras forem E357K, e b) um segundo polipeptídeo multimérico que compreende um primeiro polipeptídeo que compreende i) na direção terminal N a C a) um primeiro domínio variável de anticorpo selecionado a partir de um par de um domínio variável da cadeia leve e pesada de anticorpo que se liga especificamente a um primeiro alvo, e b) um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina G humana,
    ii) um par de um domínio variável da cadeia leve e pesada de anticorpo que se liga especificamente a um antígeno de superfície celular, seja no terminal N no primeiro domínio variável de anticorpo ou no terminal C no primeiro domínio CH3,
    um segundo polipeptídeo que compreende i) na direção terminal N a C a) um segundo domínio variável de anticorpo selecionado a partir de um par de um domínio variável da cadeia leve e pesada de anticorpo que se liga especificamente a um terceiro alvo, e b) um segundo domínio CH3 de imunoglobulina G humana,
    em que o segundo domínio variável de anticorpo é um domínio variável da cadeia leve de anticorpo, se o primeiro domínio variável de anticorpo for um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo; ou o segundo domínio variável de anticorpo é um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo, se o primeiro domínio variável de anticorpo for um domínio variável da cadeia leve de anticorpo, e em que o segundo domínio CH3 compreende uma mutação perturbadora K370E ou K439E, em que toda a numeração está de acordo com o Índice de Kabat EU, em que o primeiro domínio CH3 compreende a) o resíduo de aminoácido E na posição 357 se as mutações perturbadoras forem K370E, ou b) o resíduo de aminoácido D na posição 356 se as mutações perturbadoras forem K439E, em que o primeiro polipeptídeo multimérico e o segundo polipeptídeo multimérico são definidos por - o segundo domínio CH3 do primeiro polipeptídeo multimérico compreende a mutação D356K e o segundo domínio CH3 do segundo polipeptídeo multimérico compreende a mutação K439E, ou o segundo domínio CH3 do primeiro polipeptídeo multimérico compreende a mutação E357K e o segundo domínio CH3 do segundo polipeptídeo multimérico compreende a mutação K370E; e - o primeiro domínio variável do anticorpo do primeiro polipeptídeo multimérico e o primeiro domínio variável do segundo polipeptídeo multimérico são um par de um domínio variável da cadeia leve do anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada do anticorpo que se liga especificamente ao primeiro alvo, e o segundo domínio variável do anticorpo do primeiro polipeptídeo multimérico e o segundo domínio variável do segundo polipeptídeo multimérico são um par de um domínio variável da cadeia leve do anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada do anticorpo que se liga especificamente ao terceiro alvo.
  2. 2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por dentro do primeiro polipeptídeo multimérico e o segundo polipeptídeo multimérico o primeiro domínio CH3 e o segundo domínio CH3 compreenderem mutações adicionais para promover a formação de heterodímero entre o referido primeiro domínio CH3 e o referido segundo domínio CH3 e que são diferentes da mutação perturbadora.
  3. 3. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo primeiro domínio CH3 do primeiro polipeptídeo multimérico e o segundo domínio CH3 do segundo polipeptídeo multimérico compreendem as mesmas mutações para promover a formação de heterodímero; e em que o segundo domínio CH3 do primeiro polipeptídeo multimérico e o primeiro domínio CH3 do segundo polipeptídeo multimérico compreendem as mesmas mutações para promover a formação de heterodímero.
  4. 4. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por: o primeiro domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreender a) a mutação T366W, ou b) as mutações T366S/ L368A/ Y407V, e o segundo domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreender a) as mutações T366S/ L368A/ Y407V, se o primeiro domínio CH3 compreender a mutação T366W, ou b) a mutação T366W, se o primeiro domínio CH3 compreender as mutações T366S/ L368A/ Y407V.
  5. 5. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo serem um dímero não covalente.
  6. 6. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo primeiro domínio variável e o segundo domínio variável formarem um local de ligação não funcional.
  7. 7. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo primeiro e o segundo polipeptídeo compreenderem, cada um, a sequência de aminoácidos DKTHTSPPS (SEQ ID
    NO: 66) ou DKTHT (SEQ ID NO: 94) ou GGGS (SEQ ID NO: 69) ou DKTHGGGGS (SEQ ID NO: 97) no terminal N, em cada um do primeiro e do segundo domínio variável.
  8. 8. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo primeiro, segundo e terceiro alvo serem diferentes.
  9. 9. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por cada um dentre o primeiro e o segundo polipeptídeo compreenderem ainda um domínio CH2 de imunoglobulina G diretamente no terminal N no domínio CH3.
  10. 10. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo primeiro e/ ou o terceiro alvo ser CD3 humana.
  11. 11. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo segundo polipeptídeo do primeiro polipeptídeo multimérico e/ ou o segundo polipeptídeo do segundo polipeptídeo multimérico compreender um par de um domínio variável de anticorpo da cadeia pesada e leve que se liga especificamente a um antígeno de superfície celular ou terminal N ao segundo domínio variável do anticorpo ou terminal C ao segundo domínio CH3.
  12. 12. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pela imunoglobulina G humana ser IgG1 humana ou IgG2 ou IgG3 humana ou IgG4 humana.
  13. 13. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pela composição ser uma composição farmacêutica e, opcionalmente, compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.
  14. 14. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada por ser para uso como medicamento.
  15. 15. MÉTODO DE TRATAMENTO, caracterizado por compreender a administração de uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, a um paciente com necessidade de tal tratamento.
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