MX2011014008A

MX2011014008A - Anticuerpos biespecificos facilmente aislados con formato de inmunoglobulina original.

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Publication number: MX2011014008A
Application number: MX2011014008A
Authority: MX
Inventors: Samuel Davis; Eric Smith; Douglas Macdonald; Kara Louise Olson
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2009-06-26
Filing date: 2010-06-25
Publication date: 2012-06-01
Also published as: SG176868A1; US20100331527A1; US11168111B2; MX342623B; AU2015207952A1; KR20180034638A; JP2021004261A; KR102010827B1; CN102471378A; JP2018035193A; KR20140112569A; KR20160141879A; TWI507525B; MX2019012601A; AU2015207952B2; MY192182A; HRP20210637T1; US8586713B2; US9982013B2; EP2975051B1

Abstract

Se provee un formato de anticuerpo biespecífico que provee facilidad de aislamiento, que comprende dominios variables de la cadena pesada de inmunoglobulina que están modificados en forma diferencial en el dominio CH3, en donde las modificaciones diferenciales son no inmunogénicas o sustancialmente no inmunogénicas con respecto a las modificaciones de CH3, y por lo menos una de las modificaciones da como resultado una afinidad diferencial para el anticuerpo biespecífico para un reactivo de afinidad tal como Proteína A, y el anticuerpo biespecífico se puede aislar a partir de una célula rota, a partir del medio, o a partir de una mezcla de anticuerpos tomando como base su afinidad para la Proteína A.

Description

ANTICUERPOS Bl ES PECI FICOS FACILMENTE AISLADOS CON FORMATO DE INMUNOGLOBU LI NA ORIGINAL CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere a proteínas de unión a antígeno o anticuerpos que tienen heterod ímeros de cadenas pesadas, es decir, dos cadenas pesadas de inmunoglobul ina que difieren en por lo menos un aminoácido que permite el aislamiento de la proteína de unión a antígeno tomando como base una afinidad diferencial de una cadena pesada de inm unoglobulina y una cadena pesada de inmunoglobulina modificada o mutada hacía un reactivo de afinidad . La invención también se refiere a proteínas de unión a antígeno (incluyendo anticuerpos biespecíficos) que tienen regiones CH2 y CH3 de IgG con afinidades diferentes con respecto a la Proteína A que permite el aislamiento rápido mediante u nión diferencial de las regiones de IgG a la Proteína A.

ANTECEDENTES DE LA I NVENCION Los anticuerpos son moléculas m ultifuncionales, que portan una especificidad de unión exclusiva para un antígeno objetivo, así como la capacidad de interactuar con el sistema inmune a través de mecanismos que son independientes de antígeno. Muchos agentes terapéuticos biológicos actualmente utilizados para cáncer son anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos que típicamente están sobre-expresados en las células de cáncer elegidas como blanco. Cuando dichos anticuerpos se unen a las células de tumor, éstos pueden provocar citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Por desgracia, las células cancerosas con frecuencia desarrollan mecanismos para suprimir estas respuestas inmunes normales.

En años recientes, los esfuerzos se han encaminado al desarrollo de agentes terapéuticos tipo anticuerpo que tengan más de una especificidad de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos. En el caso de terapias para cáncer, los formatos multiespecíficos podrían permitir la posibilidad de utilizar, por ejemplo, una especificidad para dirigir la molécula hacia un antígeno de la célula de tumor, la otra especificidad para disparar una respuesta que normalmente no esté disponible para el sistema inmune. Los anticuerpos biespecíficos también encuentran uso como ligandos sustitutos para sistemas de receptor heterodimérico de dos componentes, que normalmente son activados por su ligando natural cuando éste se une a y junta ambos componentes.

En la técnica se han desarrollado numerosos formatos para enfrentar las oportunidades terapéuticas obtenidas por moléculas con especificidades de unión múltiples. De manera ideal, dichas moléculas deben ser proteínas de comportamiento adecuado que sean fáciles de producir y purificar, y que posean propiedades in vivo favorables, por ejemplo, farmacocinética apropiada para un propósito pretendido, inmunogenicidad mínima, y, si fuera deseable, funciones efectoras de los anticuerpos convencionales.

La manera más directa para producir un anticuerpo biespecífico (que exprese dos anticuerpos distintos en una célula individual) da origen a especies múltiples, debido a que las cadenas pesadas respectivas forman tanto homodímeros como heterodímeros, pero solamente se desean los heterodímeros. Además, las cadenas ligeras y pesadas se pueden aparecer de manera inadecuada. A continuación se describen varios ejemplos de formatos que intentan solucionar estos problemas en formas diferentes.

Un formato, utilizado para moléculas acopladoras de célula T biespecíficas (BiTE) (véase, por ejemplo, Wolf, E. et al. (2005) Drug Discovery Today 10:1237-1244)), se basa en módulos de fragmento variable de cadena individual (scFv). Un scFv consiste de las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo fusionadas mediante un enlazador flexible, el cual generalmente se puede plegar de manera apropiada y de manera tal que las regiones se puedan unir al antígeno cognado. Una BiTE encadena dos scFv de especificidades diferentes en tándem en una sola cadena (véase figura 1A). Esta configuración excluye la producción de moléculas con dos copias de la misma región variable de la cadena pesada. Además, la configuración del enlazador está diseñada para asegurar el apareamiento correcto de las cadenas ligera y pesada respectivas.

El formato BiTE tiene varias desventajas. Primero, las moléculas de scFv son notorias por su tendencia a ag regarse. Y aunq ue la inmunogenicidad de los enlazadores de scFv es reputadamente baja, la posibilidad de generar anticuerpos contra una BiTE no puede ser excluida. La ausencia de una porción Fe en el formato BiTE también hace q ue su tiempo de vida media en suero sea muy corto, y esto necesita la complicación de administraciones repetidas frecuentes o infusión continua a través de una bomba. Por último, la ausencia de una Fe también implica la ausencia de funciones efectoras mediadas por Fe, lo cual puede ser benéfico en algunas circunstancias.

Un segundo formato (figura 1 B) es un h íbrido de u n anticuerpo monoclonal de ratón y u no de rata, y se basa en una modificación de la cromatografía de afinidad de Proteína A convencional (véase, por ejemplo, Lind hofer, H . et al. (1 995) J . Immunol. 1 55:21 9-225)). En este formato, una lgG2a de ratón y una lgG2b de rata se producen juntas en la misma célula (por ejemplo, ya sea como u na fusión de cuadroma de dos hibridomas, o en células CHO diseñadas). Debido a que las cadenas ligeras de cada anticuerpo se asocian en forma preferente con las cadenas pesadas de su especie cognada, solamente se pueden ensamblar tres especies distintas de anticuerpo: los dos anticuerpos progenitores, y un heterodímero de los dos anticuerpos que comprende un par de cadena pesada/ligera de cada uno, q ue se asocian a través de sus porciones Fe. El heterodímero deseado se puede pu rificar fácilmente a partir de esta mezcla debido a que sus propiedades de unión a la Proteína A son diferentes de aquellas de los anticuerpos progenitores: lgG2b de rata no se une a la Proteína A, m ientras que la lgG2a de ratón si lo hace. Por consiguiente, el heterodímero de ratón-rata se u ne a la Proteína A pero eluye a un pH más alto que el del homod ímero de lgG2a de ratón, y esto hace posible la purificación selectiva del heterodímero biespecífico. Al igual que con el formato BiTE, este formato de híbrido tiene dos sitios de unión a antígeno monovalentes.

La desventaja del híbrido de ratón/rata es que debido a que no es humano, es probable que provoque una respuesta inmune en el paciente, lo cual podría tener efectos secundarios perj udiciales (por ejemplo, reacciones "HAMA" o "HARA") , y/o neutralizar al agente terapéutico.

Un tercer formato, referido como "botones en ojales" (figura 1 C) , ha sido discutido en la técnica antecedente como potencialmente útil para la producción de anticuerpos biespecíficos (patente E. U .A. No. 7, 1 83,076). En esta estrategia, las porciones Fe de dos anticuerpos se diseñan para que una provea un "botón" protuberante y la otra un "ojal" complementario. Cuando se producen en la misma cél ula, se dice que las cadenas pesadas forman de manera preferencial heterod ímeros en lugar de homod ímeros, mediante asociación de los "botones" diseñados con los "ojales" diseñados. Los problemas de apareamiento correcto de la cadena ligera-pesada se solucionan eligiendo anticuerpos que tengan especificidades diferentes pero que empleen cadenas ligeras idénticas.

La desventaja de este formato es que la estrategia de "botones en ojales" puede dar como resultado la producción de una cantidad significativa de homod ímeros indeseables, necesitando por lo tanto de pasos adicionales de purificación. Esta d ificultad es exacerbada por el hecho de que las especies contaminantes son casi idénticas a las especies deseadas en muchas de sus propiedades. Las formas diseñadas también pueden ser potencialmente ¡nmunogénicas, debido a que las mutaciones que producen los "botones" y los "ojales" introducen secuencias exógenas.

Sigue existiendo la necesidad de u n formato de anticuerpo biespecífico, en particular para aplicaciones terapéuticas, q ue red uzca al m ínimo alg unas o todas las desventajas mencionadas anteriormente.

BREVE DESC RI PCION DE LAS FIGU RAS Las figuras 1 A-1 C ilustran tres formatos de anticuerpo biespecífico: (Figura 1 A) acoplador de célula T biespecífico (BiTE); ( Figura 1 B) híbrido de ratón-rata; y, (Figura 1 C) botones en ojales con una cadena ligera com ún .

Las figuras 2A y 2B ilustran la modificación FcAAdp: (Figura 2A) Alineación de las regiones Fe de lgG 1 (SEQ I D NO: 1 ) e lgG3 (S EO. ID NO: 3) de humano, mostrando la modificación FcAAdp en un recuadro; (Figura 2B) una representación esquemática de un anticuerpo biespecífico FcAAdp.

La figura 3 ilustra una alineación de los dominios CH3 de humano (utilizando numeración de exón I MGT y numeración U E) de lgG1 , lgG2, e lgG4 con y sin la modificación de dipéptido AAdp, así como lgG3.

La figura 4 muestra un trazo de columna de Proteína A para aislamiento de anticuerpos biespecíficos, q ue m uestra un perfil de elución utilizando un gradiente escalonado.

La figura 5 muestra el perfil de unión de I L4-Ra e I L-6Ra BIACORE™ de las fracciones de columna eluídas provenientes de la separación cromatográfica mostrada en la figura 4. Los anticuerpos en las fracciones se capturan con anticuerpos anti-Fc inmovilizados, y después se analizan I L4-Ra o IL-6Ra para unión a los anticuerpos capturados.

La figura 6 muestra un perfil farmacocinético de un anticuerpo biespecífico FcAAdp (I L-6RA/I L-4R), un homodímero FcAAdp (I L-6RA/I L-6RA) , un anticuerpo de lgG 1 con la secuencia de CH3 de tipo silvestre (I L-4R/IL-4R) y un anticuerpo monoespecífico de control.

La figura 7 i lustra la eficacia de u n anticuerpo biespecífico CD20xCD3AAdp en una prueba de aniquilación de célula Raji.

La figura 8 ilustra una prueba de aniquilación de célula (293) espectadora con el anticuerpo biespecífico CD20xCD3AAdp.

La figura 9 muestra los resultados para experimentos de expresión utilizando diferentes heterodímeros de mFc. Panel A: análisis Western blot de separación por pH de mlgG2a/mlgG2aPTTTK heterodimérico a partir de mlgG2a homodimérico e lgG2aPTTTK homodimérico; Panel B: análisis Western blot de la separación por pH de mlgG2a/mlgG2aTTTK heterodimérico a partir de mlgG2a homodimérico e lgG2aTTTK homodimérico; IP = alimentación; FT = flujo pasante; W2 = segundo lavado (1x PBS pH 7.2); E1 = primera elución (citrato de Na 20 mM, NaCI 1 M pH 5.5); E2 = segunda elución (citrato de Na 20 mM, NaCI 1 M; 57% a pH 5.5 + 43% a pH 2.6); E3 = tercera elución (citrato de Na 20 mM, NaCI 1 M pH 2.6).

La figura 10 ¡lustra la formación preferencial de heterodímeros de lgG2a muíante con respecto a la formación de heterodímeros de isotipos mezclados (por ejemplo, mlgG2a y mlgG1), utilizando una relación de 4:1 de construcción IFNAR1 :construcción IFNAR2. carril 1: IFNAR1-lgG2a:IFNAR2-lgG1 ; carril 2: INFAR1-lgG2a:IFNAR2-lgG2aTTT; carril 3: IFNAR1-lgG2a:IFNAR2-lgG2aTTTK; carril 4: IFNAR1-lgG2a:IFNAR2-lgG2aPTTTK; carril 5: IFNAR1 -lgG2a: IFNAR2-lgG2aRF.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención se basa por lo menos en parte en utilizar dos secuencias del dominio constante CH3 de la cadena pesada de inmunoglobulina que difieren en por lo menos u n aminoácido en una proteína de unión a antígeno biespecífica . Dicha diferencia de por lo menos un aminoácido da como resultado una capacidad mejorada para aislar la proteína, debido a que la diferencia da como resultado una capacidad diferencial de las secuencias del domi nio CH3 para ligar un agente de afinidad.

En un aspecto, se provee una proteína de unión a antígeno, que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, el primer polipéptido comprende, desde el extremo N-terminal hacia el extremo C-terminal, una primera región de unión a antígeno q ue liga selectivamente un primer antígeno, seg uido por una región constante que comprende una primera región CH3 de una IgG de humano que se selecciona a partir de lgG 1 (SEQ I D NO: 1 ), lgG2 (SEQ I D NO: 3), lgG4 (SEQ I D NO: 5), y una combinación de las mismas; y, u n segu ndo polipéptido que comprende, desde el extremo N-terminal hacia el extremo C-terminal, una segunda región de unión a antígeno que liga selectivamente un segundo antígeno, seguido por una región constante que comprende una segunda reg ión CH3 de una IgG de h umano que se selecciona a partir de lgG 1 , lgG2, lgG4, y una combinación de las mismas, en la cual la segunda región CH3 comprende u na modificación q ue reduce o elimina la unión del segundo dominio CH3 a la Proteína A.

En una modalidad, la segunda región CH3 comprende una modificación 95R (conforme a la numeración de exón I MGT; 435R conforme a la numeración UE). En otra modalidad, la segunda región CH3 también comprende una modificación 96F (IMGT; 436F conforme a la numeración UE). En modalidades específicas, la segunda región CH3 se selecciona a partir de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, y SEQ ID NO:6.

En una modalidad, la segunda región CH3 proviene de una IgG 1 de humano modificada (SEQ ID NO:2), y también comprende una modificación que se selecciona a partir del grupo que consiste de D16E, L18 , N44S, K52N, V57M, y V82I (IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, y V422I conforme a la numeración UE).

En una modalidad, la segunda región CH3 proviene de una lgG2 de humano modificada (SEQ ID NO:4), y también comprende una modificación que se selecciona a partir del grupo que consiste de N44S, K52N, y V82I (IMGT; N384S, K392N, y V422I conforme a la numeración UE).

En una modalidad, la segunda región CH3 proviene de una lgG4 de humano modificada (SEQ ID NO:6), y también comprende una modificación que se selecciona a partir del grupo que consiste de Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, y V82I (IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, y V422I conforme a la numeración UE).

En una modalidad, el dominio CH3 es un dominio quimérico que comprende secuencias de dos o más de IgG 1 de humano, lgG2 de humano, lgG3 de humano, e lgG4 de humano.

En una modalidad, el dominio CH3 proviene de 1gG 1 de humano, lgG2 de h umano, o lgG4 de humano, y la proteína de unión a antígeno también comprende un dominio CH 1 y u n dominio CH2, en la cual el dominio CH 1 y el dominio CH2 se seleccionan de manera independiente a partir del grupo que consiste de u n dominio CH 1 o CH2 de lgG 1 de humano, un dominio CH 1 o CH2 de lgG2 de humano, o un dominio quimérico de lgG 1 /lgG2 de humano/h umano o un dom inio qu imérico de lgG 1 /lgG3 de humano/humano o un dominio quimérico de lgG2/lgG3 de h umano/h umano o un dominio quimérico de lgG 1 /lgG4 de humano/humano o un dominio quimérico de lgG3/lgG4 o un dominio quimérico de lgG2/lgG4. En una modalidad específica, los dominios quiméricos de lgG 1 /lgG2, lgG 1 /lgG3, lgG2/lgG3, lgG 1 /lgG4, lgG3/lgG4, e igG2/lgG4 son no inmunogénicos o sustancialmente no inmunogénicos en un humano.

En una modalidad, la proteína de unión a antígeno también comprende una cadena ligera de inmunoglobulina. En una modalidad la cadena ligera de inmunoglobulina se selecciona a partir de una cadena ligera lambda de humano y una cadena ligera kappa de humano.

En una modalidad , la primera y la segunda regiones de unión a antígeno comprenden cada una por lo menos una CDR, en otra modalidad, por lo menos dos CDRs, en otra modalidad , cada una comprende tres CDRs. En una modalidad específica, las CDRs provienen de una cadena pesada de inm unoglobulina. En otra modalidad específica, la cadena pesada es una cadena pesada de humano.

En una modalidad , la primera región de unión a antígeno comprende u n primer domi nio variable de la cadena pesada de inmunog lobulina, y la segunda región de unión a antígeno comprende un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina.

En una modalidad, el primer dom inio variable y el segundo dominio variable de la cadena pesada de inm unog lobu lina se seleccionan de manera independiente a partir de u n dominio de ratón, rata, hámster, conejo, mono, simio, y humano.

En una modalidad, el primer dom inio variable y el segundo dominio variable de la cadena pesada de inm unoglobuli na comprenden de manera independiente una CDR de h umano, una CDR de ratón , una CDR de rata, una CDR de conejo, una CDR de mono, una CDR de simio, y una CDR humanizada. En una modalidad , la CDR es de humano y está mutada somáticamente.

En una modalidad, el primer dom inio variable y el segundo dominio variable de la cadena pesada de inm unoglobulina comprenden u na reg ión de estructura base (FR) de humano. En una modalidad, la FR de humano es una FR de humano mutada somáticamente.

En una modalidad , la primera y/o la segunda regiones de unión a antígeno se obtienen mediante tamizaje de una genoteca de fago que comprende reg iones variables de anticuerpo para reactividad hacia un antígeno de i nterés. En otra modalidad, la primera y/o la seg unda regiones de unión a antígeno se obtienen med iante i nmunización de un animal no humano tal como un ratón , una rata , un conejo, u n mono, o un simio con un antígeno de interés e identificación de una secuencia de ácido nucleico de la región variable del anticuerpo que codifica para una región variable específica para el antígeno de interés. En una modalidad específica , el animal no humano comprende uno o más genes de la región variable de ¡nmunoglobulina de h umano. En otra modalidad específica, dicho uno o más genes de la región variable de ¡nmunoglobulina de humano están presentes en el animal no h umano de manera extracromosómica, como un reem plazo en un locus de ¡nmunoglobulina endógeno, o como un transgen i ntegrado aleatoriamente dentro del genoma del animal no humano. En una modalidad , la primera y/o la segunda regiones de unión a antígeno se obtienen a partir de un hibridoma o u n cuadroma, en otra modalidad a partir de tamizaje de células inmunes de un animal no h umano inmunizado util izando clasificación de células.

En una modalidad , la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo biespecífico. En una modalidad, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo biespecífico completamente humano y tiene una afinidad para cada epítope, independientemente, en el intervalo micromolar, nanomolar, o picomolar.

En una modalidad , la proteína de unión a antígeno es no ¡nmu nogénica o sustancialmente no i nm unogénica en un huma no. En una modalidad específica, la proteína de unión a antígeno carece de un epítope de célula T de humano no original. En u na modalidad , la modificación de la región CH3 es no inmunogénica o sustancialmente no inmunogénica en un humano. En una modalidad específica, la modificación de la región CH3 no da como resultado u n epítope de célula T de humano no original.

En una modalidad , la proteína de un ión a antígeno comprende una cadena pesada, en la cual la cadena pesada es no inmunogénica o sustancialmente no inmunogénica en un humano. En una modalidad, la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácido q ue no contiene un epítope de célula T no orig inal . E n una modalidad , la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácido cuya proteólisis no puede formar una secuencia de aminoácido de aproximadamente 9 ami noácidos que sea inmunogénica en u n humano. En una modalidad específica, el humano es un humano que está siendo tratado con la prote ína de unión a antígeno. En una modalidad, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácido cuya proteólisis no puede formar una secuencia de aminoácido de aproximadamente 1 3 hasta aproximadamente 1 7 aminoácidos que sea inmunogén ica en un humano. En una modalidad específica, el humano es un humano que está siendo tratado con la proteína de unión a antígeno.

En un aspecto, se provee una proteína de unión biespecífica que comprende una modificación de CH2 y/o CH3 como se describe en la presente sol icitud , en el cual la proteína de un ión biespecífica comprende u na primera porción de unión que específicamente reconoce un antígeno en una célula B, y una segunda porción de unión que específicamente reconoce un antígeno en una célula T.

En una modalidad , la proteína de unión es un anticuerpo biespecífico. En una modalidad específica, el anticuerpo biespecífico comprende una cadena pesada de lgG 1 de humano y una cadena pesada de IgG l AAdp de humano. En una modalidad , la primera porción de unión es un dominio variable de la cadena pesada de humano que específicamente reconoce a CD20. En una modalidad, la segunda porción de unión es un dominio variable de la cadena pesada de humano que específicamente reconoce a CD3. En una modalidad , el anticuerpo biespecífico exhibe una CE50 en una prueba de aniq uilación Raji de aproximadamente 2.8-3.2 x 1 0" 1 2 M , o aproximadamente 2.8-3.0 x 10" 12 M , y exhibe no más de aproximadamente 1 -10%, o 1 -5%, de aniquilación de espectador en una prueba de aniquilación de célula espectadora, en la cual la célula espectadora no comprende un epítope de CD20. En u na modalidad específica, la célula espectadora es u na célula 293. En otra modalidad específica, la aniquilación de célula espectadora en la prueba se mide a través de una concentración de anticuerpo biespecífico de aproximadamente 1 0"8 M hasta aproximadamente 1 0 14 M .

En un aspecto, se provee un método para elaborar u n anticuerpo biespecífico, que comprende: obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica para una primera cadena pesada de ¡nmunoglobulina que comprende un primer dominio variable que reconoce un primer epítope, en el cual la primera cadena pesada de inmunoglobulina comprende un dominio constante de isotipo lgG 1 , lgG2, o lgG4, o un dominio constante de isotipo quimérico de las mismas; obtener una segu nda secuencia de ácido n ucleico que codifica para una segunda cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un segundo dominio variable que reconoce un segundo epítope, en el cual la segunda cadena pesada de inm unoglobulina comprende un dominio constante de isotipo lgG 1 , lgG2, o lgG4, o un dominio constante de isotipo quimérico de las mismas, que comprende u na modificación en su dominio CH3 que erradica o reduce la unión a Proteína A; obtener una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica para una cadena ligera de inmunoglobuli na que se aparea con la primera y la segunda cadena pesada de inmunoglobulina; introducir la primera, seg unda, y tercera secuencia de ácido nucleico en una célula de mamífero; perm itir que la célula exprese una inmunoglobulina, y aislar la inmu noglobulina utilizando Proteína A.

En una modalidad, la célula se selecciona a partir de CHO, COS, 293, HeLa, y una célula retiniana q ue expresa una secuencia de ácido nucleico viral (por ejemplo, una célula PE RC.6™).

En un aspecto, se provee una proteína de unión a antígeno biespecífica que comprende una primera especificidad que se u ne a u n antígeno y una segunda especificidad q ue activa un receptor, en el cual la proteína de unión a antígeno biespecífica comprende un primer polipéptido que comprende un primer dominio CH3 de lgG 1 , lgG2, o lgG4 que comprende un determ inante de unión a Proteína A, y u n seg undo polipéptido que comprende un segundo dominio CH3 de IgG 1 , lgG3, o lgG4 que carece del determ inante de unión a Proteína A.

En una modalidad , la segunda especificidad que activa al receptor se u ne al receptor con una KD que está en el intervalo molar, milimolar, micromolar, nanomolar, o picomolar.

En una modalidad, la segunda especificidad se une a un receptor que se selecciona a partir de un receptor acoplado a proteína G, una tirosina cinasa de receptor, una integrina, y un receptor tipo toll.

En una modalidad, la segunda especificidad entra en contacto con el receptor y ocasiona que el receptor o una subunidad o una proteína físicamente asociada con el mismo lleve a cabo la fosforilación de una serina, treonina, o tirosina; ocasiona ciclización de un nucleótido (por ejemplo, AM Pc, ADPc, o GMPc) ; ocasiona producción de un fosfatidilinositol o derivado del mismo (por ejemplo, I P3 o PI P3) ; ocasiona la producción de un seg undo mensajero l ípido (por ejemplo, diacilclicerol , ceramida, ácido lisofosfatídico, un eicosanoide) ; ocasiona desfosforilación (por ejem plo, actividad de fosfatasa) ; ocasiona fosforilación de un lípido para formar u n segundo mensajero; ocasiona hidrólisis de un segundo mensajero; ocasiona proteólisis; ocasiona señalización redox; ocasiona translocación de una proteína hacia un organelo celular (por ejemplo, hacia el núcleo); ocasiona que el receptor se agregue (consigo mismo) para formar homomultímeros o (con otros receptores) para formar heteromultímeros; u ocasiona la apertura o cierre de un canal de transmembrana.

En un aspecto, se provee un método para elaborar un anticuerpo biespecífico, que comprende: aislar u n anticuerpo biespecífico de i nterés a partir de un cuadroma, en el cual el anticuerpo biespecífico de interés comprende una primera cadena pesada que es un isotipo lgG1 , lgG2, o lgG4, una segunda cadena pesada que es un isotipo lgG1 , lgG2, o lgG4 q ue tiene un dominio constante que comprende una modificación en su dominio CH3 que erradica o reduce la u nión a Proteína A, en el cual el anticuerpo biespecífico de interés se aisla utilizando Proteína A.

En un aspecto, se provee un método para elaborar u n anticuerpo biespecífico, q ue comprende un paso de aislar a partir de una cél ula rota o una mezcla de anticuerpos un anticuerpo biespecífico q ue tiene dominios CH3 de lgG 1 , lgG2, o lgG4 modificados diferencialmente, en el cual los domin ios CH3 modificados diferencialmente son no inmunogénicos o sustancialmente no inmunogénicos en un humano, y en los cuales la mod ificación da como resultado u n anticuerpo biespecífico con una cadena pesada heterodimérica cuyos monómeros tienen una afinidad diferencial para la Proteína A, y el anticuerpo biespecífico se aisla a partir de la célu la rota o la mezcla utilizando Proteína A.

En una modalidad , el anticuerpo biespecífico se aisla utilizando un soporte para afinidad de Proteína A, en la cual el anticuerpo biespecífico eluye a un pH entre aproximadamente 3.9 hasta aproximadamente 4.4, aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 4.3, aproximadamente 4. 1 hasta aproximadamente 4.2, o aproximadamente a pH 4.2. En una modalidad, el anticuerpo biespecífico eluye a un pH de aproximadamente 4, 4. 1 , 4.2, 4.3, 4.4, o 4.5.

En una modalidad, el anticuerpo biespecífico se aisla utilizando un soporte para afinidad de Proteína A y un gradiente o paso de pH , en la cual el gradiente o paso de pH incluye un modificador iónico. En una modalidad específica, el modificador iónico está presente a una concentración de aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 1 .0 molar. En una modal idad específica, el modificador iónico es una sal. En u na modalidad , el modificador iónico se selecciona a partir del grupo que consiste de las sales de acetato de berilio, litio, sodio, y potasio; bicarbonatos de sodio y de potasio; carbonato de litio, sodio, potasio, y cesio; cloru ros de litio, sodio, potasio, cesio, y magnesio; fluoru ros de sodio y potasio; nitratos de sodio, potasio, y calcio; fosfatos de sodio y potasio; y sulfatos de calcio y magnesio. En una modalidad específica, el modificador iónico es una sal halogenuro de un metal alcalino o metal alcalinotérreo. En una modalidad específica, el modificador iónico es cloruro de sodio.

En un aspecto, una proteína de unión comprende una Fe, en el cual la Fe comprende un primer dominio CH3 que está modificado como se describe en la presente solicitud y un segu ndo CH3 que no está modificado, para formar una Fe heterodimérica, en la cual la modificación diferencial da como resultado que la proteína de unión eluya a partir de un material para afinidad de Proteína A, a 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1 .0, 1 .2, 1 .3, o 1 .4 unidades de pH más altas q ue una proteína de unión correspondiente que carece de la modificación d iferencial.

En una modalidad , la proteína de unión d iferencialmente modificada eluye a un pH de aproximadamente 4.2, mientras q ue la proteína de u nión no modificada eluye a un pH de aproximadamente 3. En u na modalidad la proteína de unión diferencialmente modificada eluye a un pH de aproximadamente 4.5, mientras que la proteína de unión no modificada eluye a un pH de aproximadamente 3.5. En una modalidad , la proteína de unión diferencialmente modificada eluye a u n pH de aproximadamente 4, mientras que la proteína de unión no modificada eluye a un pH de aproximadamente 2.8-3.5, 2.8-3.2, o 2.8-3. En una modalidad, la proteína de unión diferencialmente modificada eluye a un pH de aproximadamente 4.2, m ientras q ue la proteína de u nión no modificada eluye a un pH de aproximadamente 2.8. En u na modalidad, la proteína de unión diferencialmente modificada eluye a un pH de aproximadamente 4.4, mientras q ue la proteína de unión no modificada eluye a un pH de aproximadamente 3.6. En estas modalidades, "no modificada" se refiere a la falta de una modificación en 435 (numeración U E), o la falta de una modificación en 435 y 436 (numeración U E) , en ambos dom inios CH3.

Cualquiera de las modalidades y aspectos descritos en la presente solicitud se puede utilizar en conjunto uno con otro, a menos que se indique de otra manera o sea evidente a partir del contexto. Otras modalidades se harán evidentes a los expertos en la técnica a partir de una revisión de la siguiente descripción.

DESC RI PCION DETALLADA DE LA I NVENCION La presente invención no está limitada a los métodos particulares, y condiciones experimentales descritas, ya que d ichos métodos y condiciones pueden variar. También se debe entender que la terminolog ía utilizada en la presente solicitud es para el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no está pensada para que sea limitativa, debido a q ue el alcance de la presente invención q ueda definido por las reivindicaciones.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente solicitud tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por el experto en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar cualesquiera métodos y materiales similares o eq uivalentes a aquellos descritos en la presente solicitud, en la práctica o análisis de la presente invención , se describen a continuación métodos y materiales particulares. Todas las publicaciones mencionadas quedan incorporadas en la presente solicitud para referencia.

El término "anticuerpo", tal como se utiliza en la presente solicitud, incluye moléculas de inmunoglobulina constituidas por cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas ( H) y dos cadenas ligeras (L) conectadas entre sí por puentes de disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (abreviada en la presente solicitud como HCVR o VH ) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios, CH 1 , CH2 y CH3. Cada cadena ligera com prende una región variable de la cadena ligera (abreviada en la presente solicitud como LCVR o VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un domi nio, CL. Las regiones de VH y de VL se pueden subdividi r adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones q ue son más conservadas, denominadas regiones de estructura base (FR). Cada VH y VL está constituida por tres CDRs y cuatro FRs, acomodadas desde el extremo amino-terminal hacia el extremo carboxi-term inal en el siguiente orden : FR 1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (las CDRs de la cadena pesada se pueden abreviar como HCDR1 , HCDR2 y HCDR3; las CDRs de la cadena ligera se pueden abreviar como LCDR 1 , LCDR2 y LCDR3. El término anticuerpo de "alta afinidad" se refiere a aquellos anticuerpos que tienen una afinidad de unión a su objetivo de por lo menos 10"9 M , por lo menos 1 0" 10 M; por lo menos 1 0~ 1 1 M; o por lo menos 1 0" 1 2 M , tal como se mide mediante resonancia de plasmón de superficie, por ejemplo, BIACORE™ o ELISA para afinidad en solución.

La frase "proteína de unión a antígeno" i ncluye una proteína que tiene por lo menos una CDR y que puede reconocer selectivamente u n antígeno, es decir, puede ligar un antígeno con una KD que está por lo menos en el intervalo micromolar. Las proteínas de unión a antígeno terapéuticas (por ejemplo, anticuerpos terapéuticos) frecuentemente requieren una KD que esté en el intervalo nanomolar o el intervalo picomolar. "Proteína de u nión a antígeno" también incluye una proteína que comprende un primer dominio y un segundo dominio CH3 como se describe en la presente solicitud y u n primer dominio de reconocimiento de proteína o ligando y un segundo dominio de reconocimiento de proteína o ligando, en la cual el primer dom inio de reconocimiento de proteína o ligando y el segundo dominio de reconocimiento de proteína o ligando reconocen cada u no de manera independiente la misma prote ína o ligando, o juntos reconocen la misma proteína o ligando, o cada u no reconoce de manera independiente una proteína o ligando diferente. U n ejemplo de dicha proteína es una inmunoad hesina, que comprende un d ímero (heterodímero u homod ímero) de proteína de fusión en la cual los polipéptidos del dímero son polipéptidos de fusión que comprenden un componente de receptor o un com ponente de ligando, en los cuales el componente de ligando comprende una secuencia de aminoácido que liga un receptor.

La frase "anticuerpo biespecífico" incluye un anticuerpo que puede ligar selectivamente dos o más epítopes. Los anticuerpos biespecíficos generalmente comprenden dos cadenas pesadas diferentes, en los que cada cadena pesada liga específicamente un epítope diferente - ya sea en dos moléculas diferentes (por ejemplo, antígenos) o en la misma molécula (por ejemplo, en el mismo antígeno). Si un anticuerpo biespecífico puede ligar selectivamente dos epítopes d iferentes (un primer epítope y un segundo epítope) , la afinidad de la primera cadena pesada para el primer epítope generalmente será de por lo menos uno a dos o tres o cuatro órdenes de mag nitud menor que la afinidad de la primera cadena pesada para el segundo epítope, y viceversa. Los epítopes reconocidos por el anticuerpo biespecífico pueden estar en el mismo objetivo o en u n objetivo diferente (por ejemplo, en la misma proteína o en una proteína diferente) . Los anticuerpos biespecíficos se pueden elaborar, por ejemplo, combi nando cadenas pesadas q ue reconozcan epítopes diferentes del mismo antígeno. Por ejemplo, se pueden fusionar secuencias de ácido nucleico q ue cod ifican para secuencias variables de la cadena pesada que reconozcan epítopes diferentes del mismo antígeno a secuencias de ácido n ucleico que codifiquen para diferentes regiones constantes de la cadena pesada, y dichas secuencias pueden ser expresadas en u na célula q ue exprese una cadena ligera de inmunoglobulina. U n anticuerpo biespecífico típico tiene dos cadenas pesadas de las cuales cada una tiene tres CDRs de la cadena pesada, seguidas por (N-terminal a C-terminal) un dominio CH 1 , un gozne, un dominio CH2, y un dominio CH3, y una cadena ligera de inm unoglobulina que no confiere especificidad de unión a antígeno pero que se puede asociar con cada cadena pesada, o que se puede asociar con cada cadena pesada y que puede ligar uno o más de los epítopes ligados por las regiones de unión a antígeno de la cadena pesada, o que se puede asociar con cada cadena pesada y habilitar la unión de una o ambas cadenas pesadas a uno o ambos epítopes.

El término "célula" incluye cualq uier célula que sea apropiada para expresar una secuencia de ácido nucleico recombinante. Las células incluyen aquellas de procariotas y eucariotas (u nicelulares o multicelulares), células bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp. , Streptomyces spp. , etc. ) , células de micobacteria, células fúngicas, célu las de levadura (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc. ) , células vegetales, células de insecto (por ejemplo, SF-9, SF-21 , células de insecto infectadas con baculovirus, Trichoplusia ni, etc. ) , células de animal no humano, células de humano, o fusiones celulares tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunas modalidades, la célula es una célula de humano, de mono, de simio, de hámster, de rata, o de ratón. En algunas modalidades, la célula es eucariota y se selecciona a partir de las sig uientes células: CHO (por ejemplo, CHO K1 , DXB-1 1 CHO, Veggie-CHO), C.OS (por ejemplo, COS-7) , célula retinia na, Vero, CV1 , renal (por ejemplo, H EK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BH K) , HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, H B 8065, H L-60, (por ejemplo, BH K21 ), Jurkat, Daudi , A431 (epidérmica), CV-1 , U937, 3T3, célula L, célula C 1 27, SP2/0, NS-O, MMT 060562, célula de Sertoli , célula BRL 3A, célula HT1 080, célula de mieloma, célula de tumor, y una l ínea de célula derivada a partir de una célula antes mencionada. En algunas modalidades, la célula comprende uno o más genes vi rales, por ejemplo una célula retiniana que exprese un gen viral (por ejemplo, una célula PER.C6™).

La frase "región determinante de complementariedad", o el término "CDR," incluye una secuencia de aminoácido codificada por una secuencia de ácido nucleico de los genes de inmunoglobulina de u n organ ismo que normalmente (es decir en un animal de tipo silvestre) aparece entre dos regiones de estructura base en una región variable de una cadena ligera o una cadena pesada de una molécula de in mu noglobulina (por ejemplo, un anticuerpo o un receptor de célula T). Una CDR puede ser codificada, por ejemplo, por una secuencia de línea germinal o u na secuencia reacomodada o una secuencia no reacomodada, y, por ejemplo, por u na célula B o una célula T no afectada por tratamiento o por una cél ula B o una célula T madura. En algunas circunstancias (por ejemplo, para una CDR3), las CDRs pueden ser codificadas por dos o más secuencias (por ejemplo, secuencias de línea germinal) que no sean contiguas (por ejemplo, en una secuencia de ácido n ucleico no reacomodada) pero que sean contiguas en una secuencia de ácido nucleico de célula B, por ejemplo, como resultado de empalmar o conectar las secuencias (por ejemplo, recombinación de V-D-J para formar una CDR3 de la cadena pesada).

La frase "cadena pesada", o "cadena pesada de inmunoglobulina" incluye una secuencia de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobu lina proveniente de cualquier organ ismo, y a menos que se especifique de otra manera incluye un dominio variable de la cadena pesada. Los dominios variables de la cadena pesada i ncluyen tres CDRs de la cadena pesada y cuatro regiones de FR, a menos que se especifiq ue de otra manera. Los fragmentos de las cadenas pesadas i ncluyen CDRs, CDRs y FRs, y combinaciones de las mismas. U na cadena pesada típica tiene, después del dominio variable (del extremo N-term inal hacia el extremo C-terminal) , un dominio CH 1 , un gozne, un dominio CH2, y un dominio CH3. Un fragmento funcional de una cadena pesada incluye un fragmento que es capaz de reconocer específicamente un antígeno (por ejemplo, reconocer el antígeno con una KD en el intervalo micromolar, nanomolar, o picomolar) , que se pueda expresar y secretar a partir de u na célula, y que comprenda por lo menos una CDR.

La frase "proteína que contiene Fe" i ncluye anticuerpos, anticuerpos biespecíficos, ¡nm unoadhesinas, y otras proteínas de unión q ue comprenden por lo menos una porción funcional de una región CH2 y CH3 de inmunoglobulina. Una "porción funcional" se refiere a la región CH2 y CH3 que puede ligar a un receptor de Fe (por ejemplo, u n FcyR; o u n FcRn , es decir, un receptor de Fe neonato), y/o que puede participar en la activación del complemento. Si la región CH2 y CH3 contienen deleciones, sustituciones, y/o inserciones u otras modificaciones que la inhabiliten para ligar cualquier receptor de Fe y que también la inhabiliten para activar el complemento, la región CH2 y CH3 no es fu ncional .

Las proteínas que contienen Fe pueden comprender modificaciones en los dominios de inmunog lobulina, incluyendo casos en los que las modificaciones afectan una o más fu nciones efectoras de la proteína de u nión (por ejemplo, modificaciones que afectan la unión a FcyR, la un ión a FcRn y por lo tanto el tiempo de vida media , y/o la actividad CDC). Dichas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, las siguientes modificaciones y combinaciones de las mismas, con referencia a la numeración UE de una región constante de inm unoglobuli na: 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301 , 303, 305, 307, 308, 309, 31 1 , 31 2, 31 5, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331 , 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361 , 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 41 9, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438, y 439.

Por ejemplo, y no a manera de limitación, la proteína de unión es una proteína q ue contiene Fe y exhibe tiempo de vida media en suero incrementado (en comparación con la misma proteína que contiene Fe sin la modificación o modificaciones ind icadas) y tiene u na modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T), y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una mod ificación en 428 y/o 433 (por ejemplo, L/R/S I/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o Y); o una modificación n 250 y/o 428; o una modificación en 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F), y 434. En otro ejemplo, la modificación puede comprender una modificación 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación 428L, 2591 (por ejemplo, V259I), y una modificación 308F (por ejemplo, V308F); una modificación 433K (por ejemplo, H433K) y una modificación 434 (por ejemplo, 434Y); u na modificación 252, 254, y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T, y 256E); una modificación 250Q y 428L (por ejemplo, T250Q y M428L); una modificación 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P).

La frase "modificador iónico" incluye porciones que reducen el efecto de, o alteran , las interacciones iónicas no específicas (es decir, no afinidad) entre proteínas. Los "modificadores iónicos" incluyen, por ejemplo, sales, combinaciones iónicas de metales del Grupo I y Gru po II con acetato, bicarbonato, carbonato, un halógeno (por ejemplo, cloruro o fl uoruro), nitrato, fosfato, o sulfato. U na lista il ustrativa no limitante de "modificadores iónicos" incluye las sales acetato de berilio, litio, sodio, y potasio; bicarbonatos de sodio y potasio; carbonatos de litio, sod io, potasio y cesio; cloruros de litio, sodio, potasio, cesio, y magnesio; fluoruros de sod io y potasio; nitratos de sodio, potasio, y calcio; fosfatos de sodio y potasio; y sulfatos de calcio y magnesio. Los "modificadores iónicos" incluyen aquellas porciones que afectan las interacciones iónicas que, después de la adición a un gradiente o paso de pH, o después que se eq uilibra u n soporte de Proteína A en un "modificador iónico" y de la aplicación de un paso o gradiente de pH , da como resultado un ensanchamiento de la distancia de unidades de pH entre la elución de u na IgG homodimérica y una IgG heterodimérica (por ejemplo, una IgG de humano de tipo silvestre y la misma IgG pero que tiene una o más modificaciones de su dominio CH3 como se describe en la presente solicitud). Una concentración apropiada de u n "modificador iónico" puede ser determi nada por su concentración utilizando la misma colum na, paso o grad iente de pH, con incrementos de la concentración del "modificador iónico" hasta que se alcanza una distancia de pH máxima en un paso de pH o gradiente de pH dado.

La frase "cadena ligera" incluye una secuencia de la región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina proveniente de cualquier organismo, y a menos que se especifique lo contrario incluye las cadenas ligeras kappa y lambda de humano. Los dominios variables de la cadena ligera (VL) típicamente incl uyen tres CDRs de la cadena ligera y cuatro regiones de estructura base ( FR), a menos que se especifique de otra manera. En términos generales, una cadena ligera de longitud completa incluye, desde el extremo amino terminal hacia el extremo carboxilo terminal , u n domi nio de VL que incl uye FR 1 -CDR1 -FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, y un dom inio constante de la cadena ligera. Las cadenas ligeras que se pueden utilizar con esta invención incluyen aquellas, por ejemplo, que no ligan selectivamente cualquiera del primero o segu ndo antígeno ligado selectivamente por la proteína de unión a antígeno. Las cadenas ligeras apropiadas i ncluyen aquellas que se pueden identificar mediante tamizaje para las cadenas ligeras más comúnmente utilizadas en genotecas de anticuerpo existentes (genotecas de laboratorio convencional o en computadora), en las cuales las cadenas ligeras no interfieren sustancialmente con la afinidad y/o selectividad de los dominios de unión a antígeno de las proteínas de unión a antígeno. Las cadenas ligeras apropiadas incluyen aquellas que pueden ligar uno o ambos epítopes que están ligados por las regiones de unión a antígeno de la proteina de unión a antígeno.

La frase "intervalo micromolar" q uiere decir 1 -999 micromolar; la frase "intervalo nanomolar" quiere decir 1 -999 nanomolar; la frase "intervalo picomolar" quiere decir 1 -999 picomolar.

La frase "somáticamente m utado(a)" incluye la referencia a una secuencia de ácido nucleico proveniente de u na célula B que ha experimentado conmutación de clase, en la cual la secuencia de ácido nucleico de una región variable de inmunoglobulina (por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada o que incluya una secuencia de CDR o FR de la cadena pesada) en la célula B sometida a conmutación de clase no es idéntica a la secuencia de ácido nucleico en la célula B antes de la conmutación de clase, tal como, por ejemplo, una diferencia en una secuencia de ácido nucleico de CDR o de estructura base entre una célula B que no ha experimentado conmutación de clase y una cél ula B que ha experimentado conmutación de clase. "Somáticamente mutado(a)" incluye la referencia a secuencias de ácido nucleico provenientes de células B maduradas por afinidad que no son idénticas a las secuencias correspondientes en células B que no son maduradas por afinidad (es decir, secuencias en el genoma de células de línea germinal). La frase "somáticamente mutado(a)" también incluye la referencia a una secuencia de ácido n ucleico proveniente de una célula B después de exposición de la célula B a u n antígeno de interés, en la cual la secuencia de ácido nucleico difiere de la secuencia de ácido nucleico correspondiente antes de la exposición de la célu la B al antígeno de interés. La frase "somáticamente mutado(a)" se refiere a secuencias de anticuerpos que han sido generados en un animal, por ejemplo, u n ratón que tiene secuencias de ácido nucleico de la región variable de inmunoglobulina de humano, en respuesta a u n desafío con antígeno, y q ue resultan de los procesos de selección inherentemente operativos en dicho animal.

La frase "dominio variable" i ncluye una secuencia de aminoácido de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina (modificada segú n se desee) que comprende las siguientes regiones de aminoácido, en secuencia desde el extremo N-terminal hacia el extremo C-terminal (a menos que se indique de otra manera): FR 1 , CDR 1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Un "dominio variable" incluye una secuencia de aminoácido que se puede plegar como un dominio canónico (VH o VL) que tiene una estructu ra de lámina beta dual en la cual las láminas beta están conectadas mediante un puente de disulfuro entre u n residuo de una primera lám ina beta y una segu nda lámi na beta.

Anticuerpos biespecíficos con regiones CH3 de IgG modificadas Los inventores han desarrollado un formato novedoso que combina una estrategia de cadena ligera común con una implementación de un esquema de purificación selectiva de Proteína A q ue se puede utilizar con componentes de anticuerpo de humano.

Se indicó previamente (Lindhofer, H . et al (1995) J . Immunol. 55: 21 9-225)) que debido a que lgG3 de humano no se une a la Proteína A, ésta se puede utilizar potencialmente junto con cualquiera de las otras tres subclases de IgG de humano en una estrategia de purificación similar a la utilizada para los h íbridos de ratón-rata. Sin embargo, aunque las secuencias de todas las cuatro subclases de IgG de humano son altamente homologas, se desconoce qué tan fácilmente las porciones Fe de IgG 1 , lgG2, e lgG4 forman heterod ímeros con lgG3; incluso simplemente la formación preferencial de homodímeros podría tener un impacto negativo sobre los rendim ientos totales de los heterod ímeros deseados bajo ciertas circunstancias (por ejemplo, aislamiento a partir de cuadromas) . También podrían ser necesarias modificaciones adicionales para compensar respecto a la diferencia entre la región de gozne de lgG3 y aquellas de las otras subclases. También sería preferible, en algunas circunstancias, no requerir de la presencia de la Fe de lgG3 completa, debido al impacto potencial sobre las fu nciones efectoras.

Por lo tanto, los inventores han contemplado u n formato "m ínimo" que explota una determinante fortuitamente simple de unión a Proteína A. Se ha reportado (Jendeberg , L. et al. (1 997) J . Immunological Meth. 201 : 25-34)) q ue la incapacidad de lgG3 para ligar la Proteína A es determinada por un solo residuo de aminoácido, Arg435 (numeración EU ; Arg95 de conformidad con la n umeración IMGT), cuya posición correspondiente en las otras subclases de IgG está ocupada por un residuo histidina. Por lo tanto, es posible, en lugar de lgG3, utilizar una secuencia de IgG 1 en la cual His435 esté mutada a Arg . Por lo tanto, una sola mutación de punto en lgG 1 debería ser suficiente para crear las diferentes afinidades de unión de acuerdo con un nuevo esquema de purificación . Esta modificación será referida como IgG l AA, para indicar su incapacidad para ligar la Proteína A (y, de manera similar, lgG2AA e lgG4AA - o de manera más general, FcAA).

Sin embargo, la mutación de punto especificada introduce una secuencia de péptido novedosa a través de la mutación, la cual podría potenclalmente ser inmunogénica. La mutación de punto, en teoría, se podría cargar en una molécula clase I I del MHC y presentar a células T, y consecuentemente provocar una respuesta inmune. Para evitar esta dificultad , se puede utilizar una mutación de d ipéptido, H435R/Y436F (numeración U E ; H95R/Y96F de acuerdo a I MGT). La secuencia resultante en la vecindad de la alteración es idéntica a la de lgG3 (véase figura 2A), y por lo tanto se podría esperar que sea inmunológicamente "invisible", debido a que no habría péptidos cortos no originales disponibles para presentación a las células T. Se ha reportado que este mutante doble tampoco liga a la Proteína A (Jendeberg, L. et al. (1997) J . Imm u nological Meth. 201 : 25-34). Por último, la mutación de dipéptido no incluye ning uno de los residuos que forman la interfaz de d ímero de Fe, así que es improbable que interfiera con la formación de heterodímeros. Esta mutación de dipéptido está designada como "IgG l AAdp" (y, de manera similar, lgG2AAdp, lgG4AAdp, y FcAAdp) . Las colocaciones de la modificación de dipéptido en lgG 1 , lgG2, e lgG4 están indicadas en la figura 3 en las secuencias indicadas IgG l AAdp, lgG2AAdp, e lgG4AAdp, mostradas con las secuencias del dominio CH3 de IgG de humano de tipo silvestre, así como hlgG3, mostrando la nu meración de exón de I MGT y la numeración U E.

La modificación FcAAdp no i ncluye ningu no de los residuos que se cree forman la interfaz de dímero de Fe, de modo que la mod ificación FcAAdp probablemente no interfiera con la formación de los heterod ímeros. Debido a que la FcAAdp es tan m ínima, ésta probablemente también se puede incorporar en otras formas de Fe diseñadas. lgG2AAdp e lgG4AAdp pueden ser convenientes en situaciones en las cuales se desean las funciones efectoras (o la falta de las mismas) asociadas con cada una de éstas últimas.

En resumen, el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente incluye dos anticuerpos de especificidad diferente que utilizan la misma cadena ligera, en los cuales la región Fe de uno de ellos está modificada al formato FcAAdp (véase figura 2B). Su configuración es la de un anticuerpo natural de humano, y por lo tanto debe compartir sus propiedades favorables, incluyendo una baja propensión a agregarse, estabilidad in vivo, inmunogenicidad mínima, propiedades de biodistribución similares a aquellas de los anticuerpos, buena farmacocinética, y, opcionalmente, funciones efectoras. Se proveen métodos para aislar dichos anticuerpos biespecíficos que son relativamente rápidos y de ejecución sencilla.

Proteínas de unión biespecíficas con regiones CH de IqG de ratón modificadas Los inventores han contemplado un método para aislar fácilmente una proteína de unión que comprende una cadena pesada de ¡nmunoglobulina (o fragmento funcional de la misma que contiene CH2 y CH3) que sea heterodimérica con respecto a uno o más aminoácidos en el dominio CH3. Una selección cuidadosa de las modificaciones de un dominio de CH de IgG de ratón y la aplicación de una tecnología de separación particular confieren la capacidad para aislar fácilmente una proteína de unión que comprende dos regiones CH de ratón modificadas diferencialmente a partir de homodímeros y de heterodímeros que no contienen las modificaciones.

IgG 1 de ratón, la cual contiene una prolina en 247, una treonina en 252, 254, y 256, y una lisina en 258, se une sólo débilmente a la Proteína A. Sin embargo, lgG2a e lgG2b de ratón , contienen residuos diferentes en dichas posiciones (con excepción de las posiciones 256 y 258 de lgG2b), e lgG2a e lgG2b de ratón se unen bien a la Proteína A. Modificar en forma diferencial las regiones CH de dos IgGs de ratón en un método para elaborar un anticuerpo que sea heterodimérico para las cadenas pesadas pod ría conferi r una característica de u nión diferencial a la Proteína A a dicho anticuerpo. De esta manera, se contempla un esquema de aislamiento de Proteína A diferencial que permite la separación fácil de un heterod ímero modificado a partir de cualqu ier homodímero de IgG de ratón, ya sea q ue éste sea un homod ímero de IgG 1 (el cual se podría unir en forma solamente m uy débil, si es q ue se une, a la Proteína A) , o un homod ímero de lgG2a de ratón , un homod ímero de lgG2b de ratón, o un heterodímero de lgG2a/lgG2b. Por ejemplo, un anticuerpo que tenga dos dominios variables de la cadena pesada diferentes pero el mismo isotipo, por ejemplo lgG2a, se puede expresar en un sistema de expresión apropiado que utilice las secuencias de la cadena pesada, en las cuales solamente una de las regiones CH de lgG2a se modifica para reducir o el iminar un determinante de unión a la Proteína A. De esta manera, solamente una de las regiones CH de lgG2a exhibirá u na afi nidad sustancial para la Proteína A, y cualquier anticuerpo formado a partir de un dímero de una lgG2a no modificada y una lgG2a mod ificada podrá ser aislado fácilmente a partir del heterodímero modificado.

En varias modalidades, un anticuerpo en el cual una región CH individ ual de un dímero de Fe comprende la región CH modificada , mientras que la otra CH del dímero de Fe carece de las mismas. La región CH de IgG de ratón se modifica para que comprenda aminoácidos particulares en posiciones particulares (numeración UE), que se seleccionan a partir del grupo que consiste de: 252T, 254T, y 256T; 252T, 254T, 256T, y 258K; 247P, 252T, 254T, 256T, y 258K; 435R y 436F; 252T, 254T, 256T, 435R, y 436F; 252T, 254T, 256T, 258K, 435R, y 436F; 24tP, 252T, 254T, 256T, 258K, 435R, y 436F; y, 435R. En una modalidad específica, se hace un grupo particular de modificaciones, que se seleccionan a partir de los grupos que consisten de: M252T, S254T, S256T; M252T, S254T, S256T, I258K; I247P, M252T, S254T, S256T, I258K; H435R, H436F; M252T, S254T, S256T, H435R, H436F; M252T, S254T, S256T, I258K, H435R, H436F; I247P, M252T, S254T, S256T, I258K, H435R, H436F; y, H435R.

Las proteínas de unión basadas en IgG de ratón heterodimérica se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, éstas permiten un método de aislamiento de anticuerpos biespecíficos con dom inios constantes de ratón , en las cuales las modificaciones no interfieren o no interfieren sustancialmente con la unión del anticuerpo a uno o más receptores de Fe de ratón , de modo tal que el anticuerpo puede participar, por ejemplo, en ADCC o CDC y también ligar dos o más epítopes en el m ismo objetivo o en objetivos diferentes.

En un aspecto un método para aislar una proteína de unión q ue comprende una primera reg ión CH de IgG de ratón y una segunda región CH de IgG de ratón, en las cuales la primera región CH de IgG se modifica (pero no la segunda región CH de IgG) para reducir o elimi nar la afinidad de unión a Proteína A de la primera región CH de IgG de ratón pero no de la segu nda reg ión CH de IgG de ratón , y en el cual la proteína de unión comprende una primera porción de unión que se une a un primer epítope y una segunda porción de unión que se une a un segundo epítope.

En una modalidad, la modificación no altera o no altera sustancialmente la afinidad de unión de la prote ína de un ión a un receptor de Fe. En una modalidad, la proteína de u nión comprende una modificación que incrementa o dism inuye la afi nidad para la proteína de unión a un receptor de Fe.

En una modalidad, la modificación no altera o no altera sustancialmente el tiempo de vida media en suero de la proteína de unión en un ratón q ue comprende receptores FcyR originales de ratón y/o un FcRn original de ratón , en comparación con una proteína de unión correspond iente que carece de la mod ificación.

En una modalidad, la modificación no altera o no altera sustancialmente el tiempo de vida media en suero de la proteína de unión en un ratón que comprende un reemplazo de receptores FcyR de alta y baja afinidad originales de ratón y/o un receptor de FcRn , en comparación con una proteína de unión correspondiente que carece de la modificación.

En una modalidad, el primer y el segundo epítopes son diferentes y están en células diferentes o en proteínas diferentes. En una modalidad, el primer epítope y el segundo epítopes son diferentes y están en la misma célula o la misma proteína.

En una modalidad, el receptor de Fe se selecciona a partir de un receptor de Fe de alta afinidad, un receptor de Fe de baja afinidad, y un FcRn. En una modalidad específica, el receptor de Fe se selecciona a partir de uno o más de un FcRn de ratón, un FcyR de ratón, un FcyRIIB de ratón, un FcyRIII de ratón, un FcyRIV de ratón, y una combinación de los mismos. En una modalidad específica, el receptor de Fe se selecciona a partir de uno o más de un FcRn de humano, un FcyR de humano, un FcyRIIB de humano, un FcyRIIC de humano, un FcyRIIIB de humano, un FcyRIIIA de humano, un FcyRIIA de humano, y una combinación de los mismos.

Inmunoqenícidad Una ventaja de muchas modalidades de la invención es la capacidad de utilizar la(s) modificación(es) para elaborar un anticuerpo biespecífico que se puede aislar fácilmente tomando como base la unión diferencial a la Proteína A y también es no inmunogénica o sustancialmente no inmunogénica en un humano. Esta característica hace a dichas modalidades particularmente útiles para elaborar anticuerpos biespecíficos para uso terapéutico en h umanos, y para elaborar inmunoadhesi nas, por ejemplo, que sean no inmu nogénicas o sustancialmente no inmunogénicas (utilizando porciones de unión de humano, es decir, componentes de receptor h umano y/o ligandos de h umano). Esta característica está asociada con anticuerpos biespecíficos q ue tienen dominios CH3 con las modificaciones H95R/Y96F (numeración I MGT) de lgG 1 , lgG2, e lgG3, y aquellos dominios CH3 que contienen modificaciones adicionales que dan como resultado que la posición que está siendo modificada refleje una secuencia de tipo silvestre de un isotipo IgG diferente. Por lo tanto, aunque la modificación no se encuentra en la Naturaleza asociada con el isotipo de IgG particular, la secuencia modificada localmente es idéntica a una secuencia de tipo silvestre dé isotipo IgG diferente, y no se espera que la modificación sea inmunogénica o sustancialmente inmunogénica. También es posible que una mod ificación sea no inm unogénica incluso si su secuencia no es localmente idéntica a cualquier secuencia origi nal; dichas modificaciones pod rían ser igualmente útiles. La mutación de punto m ínima H95R (numeración I MGT), si no es i nm unogénica, podría , por lo tanto, ser una modalidad apropiada de la invención.

Por lo tanto, se proveen anticuerpos biespecíficos que son no inmu nogénicos o sustancialmente no inmunogénicos en un humano, con respecto a sus domi nios constantes de la cadena pesada, pero que sin embargo tienen una o más modificaciones diferenciales del dominio constante de la cadena pesada, incluyendo una modificación que da como resultado una afinidad diferencial de los dominios constantes de ta cadena pesada con respecto a un reactivo de afinidad (por ejemplo, Proteína A). Las modificaciones comprenden aquellas descritas en la presente solicitud. En una modalidad específica, el anticuerpo biespecífico q ue es no inmunogénico o sustancialmente no inmunogénico en un humano con respecto a su dominio CH3, pero que tiene cadenas pesadas modificadas diferencialmente es u na lgG 1 , lgG2, o lgG4 de humano que comprende un dominio CH3 que comprende una de las siguientes modificaciones (o, en otra modalidad , consiste esencialmente de una de las siguientes modificaciones): H95R, o H95R y Y96F (n umeración I MGT).

Se espera q ue los anticuerpos biespecíficos sean no inmunogénicos, o sustancialmente no i nmunogenicos, con respecto a humanos en quienes la tolerancia a las isoformas lgG 1 , lgG2, e lgG4 de humano no ha sido alterada en ningún grado significativo.

En particular, se espera que la modificación FcAAdp sea inmunogénicamente "invisible" debido a que la ranura de unión de las moléculas clase I I del M HC acomodan un nonámero que comprende un determinante principal reconocido por las asas variables del receptor de célu la T, de modo que parecería improbable que los péptidos q ue carecen de cualquier subsecuencia de nonámero original provoquen una respuesta inm une. Sin embargo, los péptidos mayores de 9 monómeros (usualmente alrededor de 1 3 a 1 7 monómeros) son ligados por la clase I I del MHC, y es posi ble que los segmentos que sobresalen puedan potencialmente influir en la unión. Por lo tanto, las modificaciones adicionales (con respecto a la modificación FcAAdp) que eliminan secuencias no originales más largas también podrían reducir el potencial para inmunogenicidad. U n ejemplo específico es la modificación V422I (EU ; V82I de acuerdo a la numeración IMGT), la cual extiende la longitud del péptido no original m ínimo de 14 a 39 residuos en IgG l AAdp, y a 43 residuos en la lgG2AAdp definida de manera análoga. Otro ejemplo es la modificación L445P (EU ; L105P de acuerdo a la numeración I MGT) en lgG4AAdp, la cual extiende la longitud de 1 0 a 14 residuos.

Farmacocinética El sitio de unión para la Proteína A se traslapa con el sitio de unión para el receptor de Fe neonato, FcRN, el cual se cree que es el responsable de conferir un tiempo de vida media en suero prolongado a las inmunoglobulinas. Las modificaciones en la vecindad del sitio de unión a Proteína A, por lo tanto, suscitan la posibilidad de que el formato propuesto en la presente solicitud podría tener un tiempo de vida media en suero más corto que aquellos de lgG 1 , 2, y 4, dado que lgG3 de humano tiene u n tiempo de vida media en suero más corto (aproximadamente 7 d ías) q ue el de las otras subclases de IgG (aproximadamente 21 d ías) . Algunos mutantes de Fe que afectan His435 han demostrado q ue no ligan a FcRN , y que tienen un tiempo de vida media más corto en ratones. Sin embargo, el análisis farmacocinético muestra que el tiempo de vida media en suero del heterodímero lgG 1 AA/lgG 1 no es apreciablemente diferente al del homodímero de lgG 1 (véase ejemplo 2). Por lo tanto, la mutación IgG l AAdp tiene la ventaja de eliminar la u nión a Proteína A y al mismo tiempo seg uir conservando el tiempo de vida media de lgG 1 más largo.

Por consiguiente, en una modalidad , se provee una proteína de unión a antígeno biespecífica que comprende una mod ificación de un dominio CH3 como se describe en la presente solicitud , en la cual la proteína de unión a antígeno m uestra un perfil farmacocinético eq uivalente a la misma proteína de unión a antígeno biespecífica que carece de la modificación del dominio CH3. En una modalidad , se provee u n anticuerpo biespecífico que comprende una Fe heterodimérica lgG 1 AA/lgG1 , en la cual el anticuerpo biespecífico tiene un tiempo de vida media en suero que es aproximadamente 1 .5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 2.5 veces, o aproximadamente 3 veces más alto que el de un anticuerpo biespecífico que por todo lo demás es idéntico pero que comprende un dominio CH3 de lgG3, o que por todo lo demás es idéntico excepto que comprende por lo menos u na cadena pesada de lgG3. En una modalidad , se provee un anticuerpo biespecífico que comprende una Fe heterodimérica lgG 1 AA/lgG1 , en la cual el anticuerpo biespecífico exhibe un tiempo de vida media en suero q ue es aproximadamente el mismo que el del anticuerpo biespecífico sin la modificación IgG l AA (es decir, un anticuerpo biespecífico homodimérico de lgG1 ).

Cadenas pesadas de inmunoglobulina Las regiones variables de la cadena pesada de inmunoglobulina que se pueden utilizar para generar anticuerpos biespecíficos con las características deseadas (por ejemplo, especificidades deseadas, afinidades deseadas, funcionalidades deseadas, por ejemplo, bloqueo, no bloqueo, inhibición , activación , etc. ) se pueden generar utilizando cualquier método conocido en la técnica. Las cadenas pesadas deseadas después se pueden construir clonando las secuencias de ácido nucleico que contienen las regiones variables en construcciones que tienen las regiones constantes de la cadena pesada deseadas descritas en la presente solicitud.

En una modalidad, la primera cadena pesada comprende una región variable que es codificada por un ácido nucleico que se obtiene a partir del genoma de una célula B madura de un primer animal que ha sido inm unizado con un primer antígeno, y la primera cadena pesada reconoce específicamente al primer antígeno. En una modalidad específica, la segunda cadena pesada comprende una región variable que es codificada por un ácido nucleico que se obtiene a partir del genoma de una célula B mad ura de un segu ndo animal que ha sido inmunizado con un segundo antígeno, y la segunda cadena pesada reconoce específicamente al seg undo antígeno.

En una modalidad, el primer animal y/o el segundo animal es un animal genéticamente modificado que comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina de humano no reacomodada. En una modalidad , el primer animal y/o el segundo animal es un animal genéticamente modificado q ue comprende una región variable de la cadena pesada de i nmu nog lobulina de h umano no reacomodada y una región constante de i nmu noglobulina de humano. En una modalidad, el primer animal y/o el seg undo animal es un ratón genéticamente modificado que comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina de h umano no reacomodada.

Las secuencias de la región variable de la cadena pesada de inm unoglobulina se pueden obtener mediante cualquier otro método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante despliegue en fago, y las secuencias obtenidas de esta manera se pueden util izar para elaborar construcciones de ácido n ucleico que se van a unir a ácidos nucleicos que codifican para cualquier cadena pesada apropiada, por ejemplo, cadenas pesadas con dominios CH3 modificados como los descritos en la presente solicitud , y se colocan en una construcción de expresión y se transfieren a una célula que tiene la capacidad de elaborar la cadena pesada, por ejemplo, en presencia de una cadena ligera apropiada.

Cadenas ligeras de inmunoglobulina Los anticuerpos biespecíficos que comprenden dos cadenas pesadas que reconocen dos epítopes diferentes (o dos antígenos diferentes) son aislados más fácilmente en casos en los que éstos se pueden aparear con la misma cadena ligera (és decir, cadenas ligeras que tienen domi nios variables y constantes idénticos). En la técnica se conoce una variedad de métodos para generar cadenas ligeras q ue puedan formar pares con dos cadenas pesadas de especificidad diferente, mientras que no interfieren o sustancial mente no interfieren con la selectividad y/o afinidad del dominio variable de la cadena pesada con su antígeno objetivo.

En u n método, se puede seleccionar una cadena ligera inspeccionando las estadísticas de utilización para todos los dominios variables de la cadena ligera, identificando la cadena ligera más frecuentemente utilizada en anticuerpos h umanos, y apareando d icha cadena ligera con las dos cadenas pesadas de especificidad d iferente.

En otro método, se puede seleccionar un cadena ligera observando las secuencias de cadena ligera en una genoteca de despliegue en fago (por ejemplo, una genoteca de despliegue en fago que comprenda secuencias de la región variable de la cadena ligera de humano, por ejemplo, una genoteca de ScFv de humano) y seleccionando a partir de la genoteca la región variable de la cadena ligera más comúnmente utilizada.

En otro método, se puede seleccionar una cadena ligera analizando una genoteca de desplieg ue en fago de secuencias variables de la cadena ligera utilizando como sondas las secuencias variables de la cadena pesada de ambas cadenas pesadas. Una cadena ligera que se asocie con ambas secuencias variables de la cadena pesada se selecciona como una cadena l igera para las cadenas pesadas y permite la unión y/o activación con respecto a ambos epítopes.

En otro método, se puede seleccionar una cadena ligera combinando cadenas ligeras conocidas con las cadenas pesadas deseadas y analizando el anticuerpo biespecífico resultante respecto a especificidad de unión, afinidad, y/o capacidad de activación .

Hasta el grado en que se encuentre una dificultad en cualquiera de los métodos para seleccionar una cadena ligera (por ejemplo, la cadena ligera interfiere con la unión de una o ambas cadenas pesadas con su antígeno, o la cadena ligera no puede asociarse satisfactoriamente con una o ambas cadenas pesadas) , la cadena ligera se puede alinear con las cadenas ligeras cognadas de las cadenas pesadas, y se hacen modificaciones en la cadena ligera para igualar de manera más cercana las características de secuencia comunes a las cadenas ligeras cognadas de ambas cadenas pesadas . Si fuera necesario reducir al m ín imo las probabi lidades de inmunogenicidad, las modificaciones de preferencia dan como resultado secuencias que están presentes en las secuencias conocidas de la cadena ligera de h umano, de modo tal q ue sea improbable q ue el procesamiento proteol ítico genere u n epítope de célula T tomando como base los parámetros y métodos conocidos en la técnica para evaluar la probabilidad de inm unogenicidad (es decir, pruebas en computadora así como pruebas en laboratorio convencional).

Anticuerpos y proteínas de unión Las composiciones y métodos son particularmente útiles para elaborar anticuerpos biespecíficos de humano, es decir, anticuerpos biespecíficos que comprenden dominios constantes y dominios variables de humano. En algunas modalidades los anticuerpos de humano incluyen aquellos que tienen dominios variables de la cadena pesada y dominios constantes de la cadena pesada obtenidos a partir de secuencias de ¡nmunoglobulina de línea germinal de humano, en algunas modalidades obtenidas a partir de secuencias de ¡nmunoglobulina de humano somáticamente mutadas (generadas, por ejemplo, en un animal que comprende secuencias del gen de ¡nmunoglobulina de humano). En algunas modalidades las regiones variables y/o constantes de humano pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por las secuencias de ¡nmunoglobulina de línea germinal de humano o codificados como resultado de recombinación y/o empalme por ejemplo en las CDRs y en particular CDR3. Anticuerpos de humano no tiene la intención de incluir anticuerpos en los cuales las secuencias de CDR obtenidas a partir de la línea germinal de otra especie mamífera, tal como un ratón, han sido injertadas en secuencias de estructura base de humano. Dichas modalidades son referidas como anticuerpos humanizados o quiméricos. Anticuerpos de humano incluye aquellos que comprenden mutaciones, por ejemplo, introducidas in vitro mediante mutagénesis aleatoria o específica de sitio, pero las mutaciones de preferencia son no inmunogénicas en un humano.

Los métodos y composiciones se pueden utilizar para elaborar anticuerpos quiméricos, de preferencia no inmu nogénicos en un humano, o de baja inm unogenicidad. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos en los cuales uno de una región variable de la cadena pesada o estructura base o CDR o región constante o dominio de la cadena pesada provienen de especies diferentes (por ejemplo, humano de ratón , o humano y primate) . En algunas modal idades, los anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos que tienen una región variable de la cadena pesada de origen no humano (por ejemplo, ratón) y una región constante de la cadena pesada de origen h umano. En algunas modalidades, los anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos que tienen una región variable de la cadena pesada de origen humano y una región constante de la cadena pesada de origen no humano (por ejemplo, ratón). En varias modalidades, las regiones de origen múrido son idénticas o sustancialmente idénticas a una secuencia de línea germinal de inmunoglobulina de ratón con o sin hipermutaciones somáticas. Anticuerpos quiméricos también incluye anticuerpos q ue tienen una región constante de la cadena l igera que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia de l ínea germinal de inmunoglobu lina de humano y una cadena pesada no humana (por ejemplo, de ratón) o cadena pesada quimérica humana/no h umana . Los anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos que tienen un domin io constante de la cadena ligera que es idéntico o sustancialmente idéntico a una secuencia de l ínea germ inal de inmunog lobulina no h umana (por ejemplo, ratón) y una cadena pesada humana o quimérica no humana/humana.

En algunas modalidades, las composiciones y métodos son para elaborar un anticuerpo madurado por afinidad. En algunas modalidades, un anticuerpo madurado por afinidad comprende una o más alteraciones en una o más CDRs que dan como resultado afinidad más alta (por ejemplo, KD en el intervalo nanomolar o picomolar) del anticuerpo para su antígeno objetivo en comparación con un anticuerpo sustancialmente idéntico que carece de la(s) alteración(es). Los anticuerpos madurados por afinidad se pueden elaborar mediante cualquier método apropiado conocido en la técnica, por ejemplo, mediante mutagénesis aleatoria o dirigida a sitio de las CDRs y/o regiones de estructura base seguida por tamizaje por afinidad, intercambio de dominio VH, etc.

En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos neutralizantes. Los anticuerpos neutralizantes incluyen anticuerpos que pueden neutralizar, inhibir, o prevenir la actividad biológica de un antígeno. Los anticuerpos neutralizantes incluyen aquellos que, después de ligar un antígeno, previenen o reducen la capacidad del antígeno de actuar sobre un objetivo natural del antígeno in vivo e in vitro. Los ejemplos de anticuerpos neutralizantes incluyen un anticuerpo para un ligando de proteína de un receptor biológico que evita que el ligando se una al receptor, o un anticuerpo para un receptor biológico que evita que el receptor se una a su ligando, en las cuales la unión al ligando en ausencia del anticuerpo ocasiona que el receptor efectúe un cambio dentro de una célula. Determinar si un anticuerpo es o no un anticuerpo neutralizante generalmente impl ica efectuar una prueba funcional en la cual se mide el efecto del anticuerpo sobre la actividad biológica del antígeno.

Los métodos y composiciones de la invención también son útiles en una variedad de aplicaciones para anticuerpos y otras proteínas de u nión . En la presente se provee una breve descripción de algunas aplicaciones útiles.

Se pueden elaborar proteínas de u nión biespecíficas que comprenden especificidad de unión hacia un antígeno de tumor y un antígeno de célula T que elijan como blanco u n antígeno en una célu la, por ejemplo, CD20, y también que elijan como blanco un antígeno en una célula T, por ejemplo, CD3. De esta manera , el anticuerpo biespecífico elige como blanco tanto una cél ula de interés en un paciente (por ejemplo, cél ula B en un paciente con linfoma , mediante unión a CD20) así como una célula T del paciente. El anticuerpo biespecífico, en varias modalidades, está diseñado para que active la T después de ligar a C D3, acoplando por lo tanto la activación de célula T a una célula de tumor específica, seleccionada.

También se pueden elaborar proteínas de unión biespecíficas que comprendan dos porciones de unión que están dirigidas, cada una, a un compañero de u nión (es decir, cada una dirigida a un objetivo diferente) en la superficie de la misma cél ula. Este diseño es particularmente adecuado para elegir como blanco células o tipos celulares específicos que expresan ambos objetivos en la superficie de la misma célula. Au nque los objetivos podrían aparecer individualmente en otras células, las porciones de u nión de estas proteínas de unión se seleccionan de modo tal que cada porción de unión se una a su objetivo con una afi nidad relativamente baja (por ejemplo, intervalo micromolar bajo, o intervalo nanomolar alto - por ejemplo, KD mayor de un ciento nanomolar, por ejemplo, 500, 600, 700, 800 nanomolar). De esta manera, se favorece la unión prolongada al objetivo solamente en situaciones en las cuales los dos objetivos están en proximidad en la misma célula.

Se pueden elaborar proteínas de unión biespecíficas que comprendan dos porciones de unión que ligan al mismo objetivo, cada una en un epítope diferente del mismo objetivo. Este diseño es particularmente adecuado para aumentar al máximo la probabilidad de bloq uear satisfactoriamente un objetivo con la proteína de u nión . Asas extracelulares múltiples, por ejemplo, de un canal de transmembrana o un receptor de superficie celular, pueden ser elegidas como blanco por la misma molécula de un ión biespecífica.

Se pueden elaborar proteínas de u nión biespecíficas que comprendan dos porciones de unión q ue agrupen y activen reguladores negativos de la señalización inmune para obtener como resultado la supresión inmune. La represión en cis se puede lograr en casos en los que los objetivos están en la misma célula; la represión en trans se puede lograr en casos en los que los objetivos están en células d iferentes. Por ejemplo, la represión en cis se puede lograr con una proteína de unión biespecífica que tiene u na porción de unión anti-lgGRIIb y una porción de unión anti-FelD1, de modo tal que el IgGRIIb se agrupe solamente en presencia de FelD1, con el fin de regular en forma negativa una respuesta inmune hacia FelD1. La represión en trans, por ejemplo, se puede lograr con una proteína de unión biespecífica que tenga una porción de unión anti-BTLA y una porción de unión que específicamente se una a un antígeno de interés específico de tejido, de modo tal que el agrupamiento de la molécula BTLA inhibidora se presente solamente en el tejido objetivo seleccionado, lo cual potencialmente da cuenta de las enfermedades auto-inmunes.

Se pueden elaborar proteínas de unión biespecíficas que activen receptores multi-componentes. En este diseño, dos porciones de unión dirigidas a dos componentes de un receptor ligan, se entrelazan con el receptor, y activan la señalización desde el receptor. Esto se puede hacer, por ejemplo, utilizando una proteína de unión biespecífica con una porción de unión que liga a IFNAR1 y una porción de unión que liga a IFNAR2, en la cual la unión entrelaza al receptor. Dicha proteína de unión biespecífica puede proveer una alternativa para el tratamiento con interferón.

Se pueden elaborar proteínas de unión biespecíficas que transporten porciones de unión a través de una barrera semipermeable, por ejemplo, la barrera hemato-encefálica. En este diseño, una porción de unión liga a un objetivo que puede transitar una barrera selectiva particular; la otra porción de unión elige como blanco una molécula con una actividad terapéutica, en el cual la molécula objetivo con actividad terapéutica normalmente no puede atravesar la barrera. Este tipo de proteína de unión biespecífica es útil para llevar agentes terapéuticos hacia tejidos que el agente terapéutico no podría alcanzar de otra manera. Algunos ejemplos incluyen elegir como blanco al receptor pIGR para transportar u n agente terapéutico hacia el intestino o pu lmón , o para elegir como blanco al receptor de transferrina para transportar un agente terapéutico a través de la barrera hemato-encefálica.

Se pueden elaborar proteínas de u nión biespecíficas que transporten porciones de unión al interior de células o tipos celulares específicos. En este diseño, una porción de unión elige como blanco una proteína de superficie celular (por ejemplo, u n receptor) que es fácilmente interiorizado en la célula. La otra porción de unión elige como blanco una proteína intracelular, en el cual la unión de la proteína intracelular da como resultado un efecto terapéutico.

Proteínas de unión biespecíficas q ue ligan un receptor de superficie de una célula inmune fagocítica y una molécula de superficie de un patógeno infeccioso (por ejemplo, u na levadura o bacteria), para llevar al patógeno infeccioso a la veci ndad de una célula inmu ne fagocítica para facilitar la fagocitosis del patógeno. U n ejemplo de dicho diseño podría ser un anticuerpo biespecífico que elige como blanco una molécula CD64 o CD89 y también un patógeno.

Proteínas de unión biespecíficas q ue tienen una región variable del anticuerpo como u na porción de u nión y una porción que no sea de Ig como una segunda porción de unión . La región variable del anticuerpo logra la elección del blanco, mientras que la porción q ue no es de Ig es un efector o una toxina ligada a una Fe. De esta manera , el ligando (por ejemplo, efector o toxina) es sum inistrado al objetivo ligado por la región variable del anticuerpo.

Proteínas de unión biespecíficas que tienen dos porciones cada una unida a una región de Ig (por ejemplo, u na secuencia de Ig que contiene una región CH2 y CH3) de modo tal que cualesq uiera dos porciones de la proteína se puedan poner en cercan ía una de la otra en el contexto de la Fe. Los ejemplos de este diseño incluyen trampas, por ejemplo, moléculas de trampa homod iméricas o heterodiméricas.

Acidos nucleicos Se pueden obtener secuencias de ácido nucleico que codifiquen para anticuerpos monoclonales mediante cualquier método apropiado conocido en la técnica. Los ejemplos de métodos apropiados para obtener anticuerpos monoclonales (y sus secuencias de ácido nucleico) incluyen , por ejemplo, mediante un método de hibridoma (véase, por ejemplo, Kohler et al. ( 1 975) Natu re 256:495-497) o una genoteca de anticuerpo de fago (véase, por ejemplo, véase Clackson et al. ( 1 991 ) Nature 352:624-628).

En varias modalidades, los domi nios variables de la cadena pesada de ¡nmunoglobulina se obtienen a partir de secuencias de ácido nucleico de un animal genéticamente modificado o un animal transgénico. En algunas modalidades, las regiones se obtienen a partir de un animal que comprende un minilocus de ¡nmunoglobulina de humano. En algu nas modalidades, las regiones se obtienen a partir de ratones que comprenden uno o más ácidos nucleicos extracromosómicos que comprenden uno o más. ácidos nucleicos q ue cod ifican para secuencias de ¡nm unoglobulina. En varias modalidades, el animal puede tener una o más secuencias de ácido nucleico de ¡nmunoglobulina de humano no reacomodadas. En algunas modalidades, el animal comprende secuencias de ácido nucleico de regiones variables de la cadena ligera de humano, en algunas modalidades secuencias variables de la cadena pesada de humano, en algunas modalidades tanto secuencias variables de la cadena pesada como secuencias variables de la cadena ligera, y en algunas modalidades también comprende secuencias de la región constante de humano. En una modalidad específica, las secuencias de ácido nucleico se obtienen a partir de un ratón en el cual los segmentos del gen variable de la cadena pesada y los segmentos del gen variable de la cadena ligera endógenos de ratón han sido reemplazados con segmentos del gen variable de la cadena pesada y segmentos del gen variable de la cadena l igera de humano.

En algunas modalidades, las secuencias de ácido nucleico se obtienen a partir de células B o T no afectadas por tratamiento de dicho animal. En otras modalidades, las secuencias de ácido nucleico se obtienen a partir de célu las B o T de u n animal que ha sido inm unizado con un antígeno de interés.

En varias modalidades, las secuencias de ácido nucleico se obtienen a partir de células amplificándolas con iniciadores, incluyendo por ejemplo conjuntos de iniciadores degenerados, que comprenden una o más secuencias de FR, de u nión , o constantes.

En varias modalidades, los dominios variables de la cadena pesada de inmunoglobulina se obtienen a partir de ácidos nucleicos de un animal que ha sido inmunizado con un antígeno de interés. Por ejemplo, un animal transgénico o genéticamente modificado no h umano se inmuniza con el antígeno de interés (por ejemplo, exponiendo el animal al antígeno o u na célula que tenga el antígeno o u n ácido nucleico que codifica para una forma susceptible de expresión del antígeno) , perm itiendo que el animal experimente una respuesta inm une, aislando células del sistema inmune (por ejemplo, células B) a partir del animal , opcionalmente inmortalizando las células , y tamizando las células para identificar la reactividad con el antígeno y/o identificando y/o aislando una secuencia de ácido n ucleico que codifique para una región variable de inm unoglobulina que pueda reconocer al antígeno cuando se coloca en el contexto de un anticuerpo. En algunas modalidades, la célula es una célula B. En algunas modalidades, se utiliza una célula B del animal inmunizado para elaborar u n hibridoma , y se identifica una célula B que exprese un anticuerpo que reconozca específicamente un epítope del antígeno y se identifican y/o aislan las secuencias de ácido nucleico que cod ifican para una secuencia de aminoácido de la reg ión variable que reconozca al epítope.

En algunas modalidades, los ácidos nucleicos se obtienen a partir de humanos, primates no humanos (por ejemplo, simios tales como chimpancés), monos (por ejemplo, cynomolgus o rhesus), roedores (por ejemplo, ratones, ratas, hámsteres), asnos, cabras, ovejas, etc.

En algunas modalidades, las cadenas pesadas comprenden secuencias que se obtienen a partir de células de humano. Por ejemplo, células fetales de humano expuestas in vitro a un antígeno y colocadas en un animal hospedero apropiado (por ejemplo, un ratón SCID).

En algunas modalidades, los ácidos nucleicos se introducen dentro de una célula utilizando un vector. Los vectores incluyen, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, virus vegetales, YACs, BACs, episomas derivados de EBV.

En algunas modalidades, los ácidos nucleicos están presentes en un vector de expresión o construcción de expresión. En algunas modalidades, el vector o construcción de expresión es un vector que contiene un promotor ligado en forma operable a la secuencia de ácido nucleico de interés de modo tal que la secuencia de ácido nucleico de interés pueda ser expresada bajo condiciones apropiadas en una célula apropiada. Los vectores o construcciones de expresión pueden incluir secuencias líder, incrementadores, elementos promotores que incrementen la transcripción o traducción, secuencias para detención de transcripción, secuencias de empalme, intrones incrementadores de la transcripción , elementos I RES , genes marcadores, secuencias de selección, sitios de reconocimiento de recombi nasa, brazos de homología, secuencias virales, operadores (por ejemplo, operadores procariotas) etc. En alg u nas modalidades, los vectores de expresión comprenden elementos q ue permiten la expresión i nducible, por ejemplo, un operador procariota ligado en forma operable a un promotor eucariota. En algunas modalidades, la expresión se i nduce después de la adición de un inductor de expresión. En otras modalidades, la expresión se i nduce después de remoción de un in hibidor de expresión. En algunas modalidades, la expresión se induce mediante un cambio de temperatura.

En algunas modalidades, una o más secuencias de n ucleótido de la cadena pesada están en el mismo vector. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera en la presente solicitud están en el mismo vector. En una modalidad , dos secuencias de ácido nucleico de la cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera están en el mismo vector.

En algunas modalidades, los ácidos nucleicos se expresan en una célula q ue comprende uno o más ácidos nucleicos provenientes de un virus. En modalidades específicas, el virus se selecciona a partir de adenovirus, virus adeno-asociado, SV-40, virus de Epstein-Barr, un retrovirus, un lentivirus, baculovirus, coronavirus, virus de herpes simplex, poliovirus, virus de Semliki Forest, virus de Sindbis, y virus Vaccinia.

Las célu las hospederas son células que se pueden transformar para que expresen u n ácido nucleico de i nterés. En varias modalidades, la transformación incluye cambiar el contenido de ácido nucleico de una célula de tal manera que ésta contenga ácidos nucleicos exógenos (por ejemplo, un ácido nucleico no encontrado en la célula en la Naturaleza, o una o más copias adicionales de un ácido n ucleico correspondientes a una secuencia de ácido nucleico encontrada en la célula en la Natu raleza). El contenido de ácido nucleico de una célu la se puede cambiar utilizando cualquier método apropiado conocido en la técnica , por ejemplo, mediante integración del ácido nucleico en el genoma de la célula o colocándolo en la célula en u na forma extra-cromosómica o extra-genómica. En algunas modalidades el contenido de ácido nucleico de la célula se puede cambiar de tal manera que la célula exprese en forma transitoria al ácido nucleico de interés, o el contenido de ácido nucleico se puede cambiar de tal manera que la célula exprese de manera estable al ácido n ucleico de interés. En algunas modalidades, el cambio en el contenido genético de la célula se hereda cuando la célula se divide.

Aislamiento de la proteína dé un ión a antíqeno biespecífica U na vez que se seleccionó u n conj unto apropiado de modificaciones tomando como base la información en la presente solicitud, se hicieron intentos para aislar la proteína de unión a antígeno biespecífica utilizando métodos conocidos en la técn ica . Simplemente aplicar el método publicado, en cada circu nstancia, no provee una separación satisfactoria.

Lindhofer et al. prepararon un anticuerpo biespecífico con una cadena pesada heterodimérica que tiene una cadena pesada que liga a la Proteína A (IgG de ratón) y una cadena pesada que no lo hace (IgG de rata), y separaron con éxito el anticuerpo biespecífico heterodimérico de rata/ratón a partir de una mezcla de cuadroma de dímeros de ratón/ratón y rata/rata con u n gradiente pasos de pH de neutro a pH 5.8 para eluir el heterodímero y después un paso de pH de 5.8 a 3.5 para eluir el homod ímero de ratón/ratón . (Véase Lindhofer et al. ( 1995) Preferential species-restricted heavy/light chain pairing in rat/mouse q uadromas: Implications for a single-step purification of bispecific antibod ies. J. Immunol. 1 55( 1 ):219-225.) El método de Lindhofer falla cuando se aplica para separar un homodímero de lgG1 a partir de un heterod ímero de IgG 1 que tiene dos cadenas pesadas de lgG 1 que son idénticas excepto por el hecho de que uno de los dominios CH3 de lgG1 contiene una mod ificación de dipéptido H435R/Y436F. Los inventores encontraron que en un gradiente de pH lineal, la lgG 1 modificada con dipéptido eluye aproximadamente a pH 3.9, mientras que el homodímero de lgG 1 eluye aproximadamente a pH 3.7. Esta diferencia en pH se consideró insuficiente para lograr una separación satisfactoria del heterodímero a partir del homod ímero utilizando el método de Lindhofer. La diferencia no es reprod ucible en una manera predecible.

La variación en el com portamiento cromatográfico se observó en corridas cromatográficas que emplean una fuerza iónica relativamente sustancial proporcionada por la concentración del amortiguador necesaria para mantener el paso o gradiente de pH particular. Pero la separación satisfactoria no se logra agregando un modificador orgánico (1 -propanol). En cambio, de manera algo sorpresiva, para algunas corridas cromatográficas la adición de modificador iónico 0.5 molar a 1 .0 molar (por ejemplo, NaCI) mejora de manera drástica e inesperada la separación de lgG 1 homodimérica e IgG 1 heterodimérica. La adición del modificador iónico ampl ía el intervalo de pH para elución ( 1 .2 unidades de pH con mod ificador iónico, pero 0.2 unidades de pH sin modificador iónico) de modo que u n gradiente de pH por pasos puede separar con éxito las dos especies. En otras corridas, sin embargo, la separación satisfactoria se logra con concentración de NaCI de sólo aproximadamente 1 50 mM (véase Ejemplo 4) . Con el fin de asegurar que se puede lograr la separación satisfactoria, en una modalidad el aislamiento de la proteína de unión a antígeno biespecífica se efectúa en presencia de modificador iónico aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 1 .0 molar.

Por consiguiente, en una modalidad un método para separar una proteína de unión a antígeno biespecífica que comprende una IgG heterodimérica con una cadena que comprende una modificación como la descrita en la presente solicitud, comprende u n paso de utilizar un gradiente de pH en presencia de un modificador iónico. En una modalidad, el modificador iónico está presente a una concentración suficiente para aumentar al máximo la diferencia de pH entre la elución a partir de un soporte de Proteína A de un homodímero de IgG y un heterodímero de IgG como se describe en la presente solicitud (es decir, con modificación(es) de CH3). En una modalidad específica, el modificador iónico está presente a u na concentración de aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 1 .0 molar. En otra modalidad específica, el modificador iónico está presente a una concentración de aproximadamente 0. 1 5 hasta aproximadamente 0.5 molar.

En u na modalidad, el modificador iónico es u na sal . En una modalidad, el modificador iónico es una sal de u n metal alcalino o un metal alcalinotérreo y u n halógeno. En una modalidad específica, la sal es una sal cloruro de un metal alcalino o un metal alcalinotérreo, por ejemplo, NaCI , KCI, LiC I , CaCI2, MgC I2. En una modalidad específica, la sal está presente a una molaridad de aproximadamente 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, ó 1 .0.

En una modalidad , el gradiente de pH es de aproximadamente pH 3.9 hasta aproximadamente pH 4.5, en otra modalidad de aproximadamente pH 4.0 hasta aproximadamente pH 4.4, y en otra modalidad aproximadamente pH 4. 1 hasta aproximadamente pH 4.3. En una modalidad específica, el gradiente es un gradiente lineal.

En una modalidad, el gradiente de pH es un gradiente por pasos. En una modalidad, el método comprende aplicar a una columna de Proteína A equilibrada (equil ibrada, por ejemplo, en PBS u otra solución o líquido amortiguador apropiado) u n paso de aproximadamente pH 3.9, aproximadamente pH 4.0, aproximadamente pH 4.1 , aproximadamente pH 4.2, aproximadamente pH 4.3, o aproximadamente pH 4.4. En una modalidad específica, el paso es de pH 4.2 aproximadamente.

En una modalidad, el anticuerpo biespecífico que comprende el dominio CH3 de IgG heterodimérica eluye del soporte de Proteína A en una o más fracciones sustancialmente libres de IgG no heterodimérica. En una modalidad específica , la fracción o fracciones de anticuerpo biespecífico eluídas comprenden menos de aproximadamente 1 %, 0.5%, o 0.1 % de la proteína total en peso que es anticuerpo no heterodimérico.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proveen para describir a los expertos en la técnica cómo efectuar y utilizar los métodos y composiciones de la invención , y no pretenden limitar el alcance de lo q ue los inventores consideran como su invención . Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los n úmeros utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero se deben considerar algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otra manera, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados, y la presión es o está cerca de la presión atmosférica.

EJEMPLO 1 Proteína de unión a antígeno IL-4Ra/I L-6Ra biespecífica Se descubrió que dos anticuerpos conocidos del isotipo lgG1 de h umano, uno contra I L-4Ra y el otro contra I L-6Ra, tienen cadenas ligeras que difieren en solamente cuatro aminoácidos. Los experimentos de co-expresión revelan q ue la cadena ligera del anticuerpo anti-I L-4Ra podría ser reemplazada con la cadena ligera de I L-6Ra y todavía conservar la unión de alta afinidad a I L-4Ra, haciendo de esta manera que sea posible prod ucir un anticuerpo biespecífico utilizando la cadena pesada anti-I L-4Ra y la cadena pesada anti-I L-6Ra y la misma cadena ligera. Por consiguiente, la cadena pesada del anticuerpo de I L-6Ra se mod ifica hasta la forma FcAAdp (es decir, la modificación de péptido H95R/Y96F de CH3, de conformidad con la n umeración de exón IMGT) .

La cadena ligera anti-I L-6Ra se co-expresa después con las cadenas pesadas anti-I L4Ra/Fc y anti-I L6Ra/FcAAdp en células CHO, y el medio acondicionado proveniente de éstas células se somete a cromatografía con Proteína A. Después de cargar la columna de Proteína A con los sobrenadantes cel ulares que contienen una mezcla de homodímeros y heterod ímeros, la elución se efectúa con un gradiente por pasos de pH que se produce variando combinaciones de dos soluciones amortiguadoras (A: 100 mM de citrato de Na, 150 mM de NaCI, pH 6.0, y B: 100 mM de citrato de Na, 150 mM de NaCI, pH 3.0; véase Figura 4) para producir tres fases a pH 6.0, pH 4.2, y pH 3.0, respectivamente. En la Figura 4, IL-4R representa anti-IL-4Ra, e IL-6RA representa anti-IL-6Ra(lgG1AAdp). Las fracciones de columna indicadas se analizan respecto a unión a las proteínas IL-6Ra e IL-4Ra (véase Figura 5). Se efectúa una elución por pasos, que da origen a un pico que eluye a pH 4.2, y un segundo pico a pH 3.0 (Figura 4). El análisis BIACORE ™ muestra que el material de flujo pasante puede ligar a IL-6Ra soluble, pero no a IL-4Ra, como se esperaba (Figura 5). Las fracciones correspondientes al pico de pH 4.2 pueden ligar cantidades aproximadamente iguales de IL-6Ra e IL-4Ra, consistente con el heterodímero. El pico que eluye a pH 3.0 puede ligar solamente a IL-4Ra, y no a IL-6Ra, correspondientes con el homodímero anti-IL-4Ra esperado. Esto establece que un anticuerpo biespecífico heterodimérico se pueden aislar efectivamente utilizando cromatografía con Proteína A, con un gradiente por pasos de pH sencillo.

EJEMPLO 2 farmacocinética de proteínas FcAAdp Para evaluar si la modificación FcAAdp afecta o no la farmacocinética de una molécula que contiene Fc/FcAAdp heterodimérica, se inyectan ratones con la especie heterodimérica purificada de anti-I L-4Ra/anti-I L-6Ra descrita anteriormente, y se miden las concentraciones de inm unoglobulina de humano en suero a través de un periodo de 28 días (Figura 6; Tabla 1 ). El tiempo de vida media en suero del heterod ímero es de aproximadamente 1 0 d ías, similar al del tipo silvestre. Esto establece que las modificaciones FcAAdp no tienen efecto detectabie sobre el tiempo de vida media en suero.

TABLA 1 Farmacocinética (n = 5) EJEMPLO 3 Proteína de unión a antíqeno CD20/CD3 biespecífica Se descubrió que la cadena pesada de un anticuerpo anti-CD20 conocido de humano, cuando se co-expresa con la cadena ligera de un anticuerpo anti-CD3 (activador) conocido de humano, sigue conservando la capacidad de ligar a CD20. La cadena ligera anti-CD3 después se co-expresa con cualquiera de la cadena pesada anti-CD20/Fc, la cadena pesada anti-CD3/FcAAdp, o ambas cadenas pesadas. La población mixta resultante de homod ímeros y heterodímeros después se utiliza en un bioensayo para determinar la capacidad de an iqu i lar células objetivo que expresan a CD20 (Figura 7) . Brevemente, 2 x 1 07 células PBMC de humano se activan con 6 x 1 07 glóbulos CD3xCD28 (Invitrogen) durante 72 horas. Después se agregan treinta unidades de IL-2 (R & D Systems) y las células se incuban otras 24 horas adicionales. Las cél ulas después se dividen hasta u na concentración de 0.5 x 106/ml y se agregan 30 u nidades adicionales de I L-2. Las células después se incuban 48 horas adicionales y se utilizan en el bioensayo. En el día del bioensayo, 2 x 1 06/mL de células objetivo (Raji) que expresan a CD20 se marcan durante 30 min utos con 8 uM de calceína-AM ( I nvitrogen). Las células objetivo lavadas se agregan a las células hPBMC activadas a una relación 1 : 10 de células objetivo: células efectoras (220, 000 cél ulas totales por cavidad) en un volumen total de 200 microlitros con la cantidad indicada de sobrenadante que contiene anticuerpo. Las células se incuban durante 2 horas y el sobrenadante se recolecta y se cuantifica la fluorescencia. La citotoxicidad se mide calculando la relación de la fluorescencia específica a la fluorescencia máxima. N i el anticuerpo CD20 sólo (utilizando la cadena ligera anti-CD3) ni el anticuerpo anti-CD3 pudieron provocar aniquilación de las células objetivo; tampoco el mezclado de los dos reactivos tuvo efecto. Sin embargo, cuando se co-expresan todos los tres componentes, se observa aniquilación significativa, lo q ue indica que el efecto se debe a la especie heterodimérica biespecifica. Tomando como base la cantidad estimada de anticuerpo biespecífico en el sobrenadante de célula CHO transfectada en forma transitoria, se calcula que la CE50 para este efecto es de aproximadamente 1 5 p .

EJ EMPLO 4 especificidad de aniqu ilación de célula con proteína de unión a antígeno CD20/CD3 biespecifica pu rificada Los sobrenadantes de célula CHO provenientes de las transfecciones descritas en el Ejemplo 3 se someten a cromatografía por afinidad con Proteína A, utilizando un gradiente por pasos para elución . El gradiente por pasos se produce variando combinaciones de dos soluciones amortiguadoras (A: 20 m M de citrato de Na, 1 M de NaCI , pH 5.2; B: 20 mM de citrato de Na, 1 M de NaCI , pH 2.7) para producir tres fases a pH 5.2 , pH 4.2, y pH 2.8, respectivamente. La proteína del pico que eluye a pH 4.2 después se utiliza en una prueba de aniquilación de célula como se describe en el Ejemplo 3. La aniquilación de célula objetivo se observa a una CE5o de 3 pM (Figura 8). Se efectúa u na prueba de citotoxicidad adicional la cual examina la especificidad de objetivo de la aniquilación observada. En este experimento se incuban células objetivo marcadas que expresan a CD20 (Raji) o sin CD20 (293) con PBMCs activadas de h umano. Cada tipo de célu la objetivo se agrega a la prueba ya sea sola o en combinación con células objetivo no marcadas del otro tipo. En todos los casos las células objetivo que expresan a CD20 fueron aniquiladas en forma específica con una CE50 de 3 pM mientras que la línea de célula CD20-negativa no fue aniquilada.

EJEMPLO 5 Separación con Proteína A de una Fe de hlqG2 diferencialmente modificada lgG2 Fc/AAdpFc heterodimérica de h umano diferencialmente modificada y una lgG2 Fc/Fc homodimérica de humano no modificada se enriquecen primero utilizando un procedimiento de unión-y-lavado a través de una colum na de Proteína A (rProteína A FF, GE) . Para separar adicionalmente hlgG2 Fc/AAdpFc de hlgG2 Fc/Fc, se efectúa una elución con gradiente por pasos util izando un sistema SMART™ (GE) como sig ue. El sistema de solvente consiste del solvente A (PBS, 1 X) , solvente B (20 mM de citrato de sodio y 1 M de NaCI, pH 5.5) y solvente C (20 mM de citrato de sodio y 1 M de NaCI , pH 2.5). La elución comienza con una elución ¡socrática con 1 00% de A en los primeros 20 mi nutos seguido por un cambio rápido a 100% de B a los 20 minutos. Después se inicia un gradiente lineal a 33.5% de C y 66.5% de B a través de los siguientes 10 minutos; la concentración de 33.5% de C se mantiene durante 20 minutos hasta elución completa del primer pico (Fc/AAdpFc). Se sigue un gradiente lineal de 33.5% de C hasta 1 00% de C durante 30 m inutos. La velocidad de flujo se mantiene a 250 microlitros/minuto y los cromatogramas se detectan a 280 nm mediante un detector de UV. La hlgG2 Fc/AAdpFc eluye a pH 4.5, mientras que la hlgG2 eluye a pH 3.5.

EJEMPLO 6 Separación con Proteína A de u na Fe de h l qG4 d iferen ci alm ente modificada lgG4 (Fc/AAdpFc) heterodimérica de h umano d iferencialmente modificada y una lgG4 (Fc/Fc) homod imérica no modificada se enriquecen primero utilizando un proced imiento de unión-y-lavado a través de una columna de Proteína A (rProteína A FF, GE). Para separar adicionalmente hlgG4 Fc/AAdpFc de hlgG4 Fc/Fc, se efectúa una elución con gradiente por pasos utilizando un sistema SMART™ (GE) como sigue. El sistema de solvente consiste de solvente A (PBS, 1 X), solvente B (20 mM de citrato de sodio y 1 M de NaCI , pH 5.1 ) y solvente C (20 mM de citrato de sodio y 1 M de NaCI , pH 2.8). La elución comienza con una elución ¡socrática con 1 00% de A en los primeros 20 minutos seguido por u n cambio rápido a 1 00% de B a los 20 minutos. Después se inicia un g radiente lineal a 50% de C y 50% de B a través de los siguientes 1 0 m inutos; la concentración de 50% de C se mantiene durante 20 mi nutos hasta elución completa del primer pico (Fc/AAdpFc) . Se sigue un gradiente lineal de 50% de C a 1 00% de C durante 30 mi nutos. La velocidad de flujo se mantiene a 250 microlitros/m inuto y los cromatogramas se detectan a 280 nm mediante un detector de UV. La hlgG4 Fc/AdpFc eluye aproximadamente a pH 4 mientras que el homodímero el uye durante un gradiente de pH 4 a pH 2.8 aproximadamente.

EJEMPLO 7 Separación con Proteína A de una hlqG 1 CD3xC D20 diferencialmente modificado Se separan lgG1 (Fc/AAdpFc) heterod imérica anti-hCD3xCD20 diferencialmente modificada y un anti-hCD20 homodimérico no modificado en una columna de 1 mi de rProteína AFF (GE Biosciences) como sigue. El sistema de solvente es solución amortiguadora A1 (PBS 1 X) , solución amortig uadora A2 (20 mM de citrato de sodio y 1 M de NaCI pH 5.1 ) , solución amortiguadora B (20 mM de citrato de sodio y 1 M de NaCI pH 2.8) . La m uestra mezclada se une y se lava en PBS y solución amortiguadora A2. Se utiliza un paso para obtener un pH de 4.2, el cual eluye lgG 1 (Fc/AAdpFc) CD3*xCD20 biespecífico, después un gradiente lineal de pH 4.2 a pH 2.8 eluye la lgG 1 anti-hCD20 homodimérica.

EJEMPLO 8 Afinidad de unión de CH3s modificadas a los receptores de Fe La afinidad de unión de un anticuerpo biespecífico del isotipo lgG1 de humano que tiene la modificación AAdp (H435R y Y436F, numeración UE) para una variedad de receptores de Fe de humano se analiza en una prueba de unión en equilibrio en estado constante Biacore™.

Brevemente, se utiliza un chip de dextrano carboxi-metilado (CM5) que tiene un mAb anti-penta-his copulado con amina (Qiagen) para capturar varias construcciones de receptores de Fe de humano. Los siguientes ectodominios del receptor de Fe marcados con histidina se unen a las superficies de diferentes chips CM5 revestidos con anti-penta-his: FcyRI, FcyRIIA(polimorfo R131), FcyRIIB, y FcyRIIIB (cada uno obtenido a partir de R&D Systems); y RcyRIIA(polimorfo H131), FcyRIIIA(polimorfo V176), y RcyRIIIA(polimorfo F176) (cada uno preparado en Regeneron). Los anticuerpos se hacen pasar a través de la superficie a tres concentraciones para el ectodominio FcyRI del receptor de alta afinidad (25 nM, 50 nM, y 100 nM), y entre 5 micromolar a 39 nanomolar para los ectodominios del receptor FcyR de baja afinidad, y se determinan los valores de las constantes de asociación y disociación (ka y kd) y se utilizan para calcular las constantes de disociación en equilibrio (KDs) para los anticuerpos. Los estudios de unión se efectúan a temperatura ambiente utilizando solución amortiguadora HBS-T a pH 7.2 Las KDs se determinan para un anticuerpo de control (hmAb), un anti-CD20, y modificación anti-CD3Adp, y un anticuerpo CD20xCD3Adp biespecífico. Los valores de KD para el anticuerpo anti-CD3Adp no revelan diferencias significativas en la unión a cualquiera de los receptores de Fe analizados en comparación con los anticuerpos del isotipo h lgG1 no modificados (Tabla 2).

TABLA 2 Kn ( n M) para u nió n de Abs hlqG para los ectodom in í os de F CYR EJEMPLO 9 Farmacocinética de un hlqG1 AAdp biespecífico en ratones hFc n Las velocidades de depuración farmacocinéticas del anticuerpo biespecífico anti-hCD3/hCD20 lgG 1 AAdp y sus controles de anticuerpo relacionados (IgG anti-hCD3 IgG y IgGAAdp anti-hCD3 homodimérico) se determinan en ratones de tipo silvestre (WT) y ratones homocigotos para un reemplazo de FcRn de ratón con un gen de hFcRn (ratón hFcRn). Los ratones de tipo silvestre y hFcRn provienen de cepas cruzadas con un antecedente que contiene C57BL6 (75%) y 129Sv (25%). Los cohortes contiene 4 cada uno de cualquiera de los ratones WT o h FcRn , excepto en el caso de un cohorte de ratones WT que reciben un anticuerpo de control ig ualado en cuanto a isotipo lgG 1 en el cual el cohorte contiene 3 ratones. Los ratones reciben 1 mg/kg de un homod ímero de control , anti-hCD3xCD20 IgG AAdp biesspecífico, anti-hCD3 lgG 1 , o anti-hCD3 IgG l AAdp ig ualado en cuanto a isotipo (hlgG 1 ). Todos los artículos de prueba se adm inistran por vía subcutánea. Los sangrados se recolectan a las 0 horas, 6 horas, 1 día, 2 d ías, 3 días, 4 d ías, 7 días, 10 d ías, 14 días, 21 días, y 30 días.

Los niveles en suero de anticuerpos de humanos determinar utilizando una ELISA en emparedado. Brevemente, un anticuerpo a nti-lgG de humano (Fc-específico) policlonal de cabra (Jackson ImmunoResearch) se aplica como revestimiento en placas de 96 cavidades a una concentración de 1 microgramo/ml y se incuba durante la noche a 4°C. Después que las placas se bloquean con BSA, se agregan a la placa muestras de suero en seis di luciones en serie de la dosis y los patrones de referencia de los anticuerpos respectivos en 1 2 diluciones en serie de la dosis y se incuban durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar para eliminar el anticuerpo no unido, los anticuerpos de h umano capturados se detectan utilizando el mismo anticuerpo anti-lgG de humano (Fc-específico) policlonal de cabra conj ugado con peroxidasa de rábano (H RP) (Jackson ImmunoResearch) y se revelan utilizando substrato colorimétrico estándar de tetrametilbencidina (TMB) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las absorbancias a 450 nm se reg istran en una lectora de placas y la concentración de la hlgG en las muestras de suero se calcula utilizando la curva patrón generada en la placa de la m uestra.

No se observa diferencia sig nificativa en el tiempo de vida media en suero de los cuatro anticuerpos de lgG 1 a través del periodo de 30 días analizado. En particular, no hay diferencia significativa observada ente los anticuerpos de lgG 1 que tienen la modificación AAdp y los anticuerpos de lgG 1 de tipo silvestre. No se observa d iferencia entre los anticuerpos con cualquiera de los ratones de tipo silvestre (mFcRn) o los ratones q ue tienen un FcRn humanizado (hFcRn). Como se esperaba, los ratones h FcRn exhiben una depuración ligeramente más rápida que los ratones de tipo silvestre. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3 Estimaciones promedio del parámetro farmacocinético después de invección subcutánea en ratones EJ EMPLO 10 Aislam iento a gran escala en solución amortiguadora baja en sal Se aisla un anticuerpo CD3xCD20AAdp biespecífico de conformidad con la invención a partir de un cultivo a gran escala. Brevemente, se cultiva una línea de célula CHO-K1 q ue expresa un anticuerpo anti-hCD3xCD20AAdp (modificación en la cadena pesada de CD3) biespecífico en un biorreactor de 1 litros. Las células que portan el anticuerpo biespecífico crecen hasta una densidad de aproximadamente 8.25 x 1 06 células/ml, lo q ue produce aproximadamente 250-350 mg de anticuerpo/litro. En contraste, u n anticuerpo anti-hCD3 de control produce aproximadamente 100-150 mg/l.

El anticuerpo se aisla en una resina MabSelect SuRe™ (GE) (altura del lecho 20 cm, diámetro interno 1 cm) equilibrada con fosfato de sodio 10 mM, NaCI 0.5 M, pH 7.2, el cultivo celular clarificado se carga a 19 g/l, y la columna se lava con tres volúmenes de columna de fosfato de sodio 10 mM, NaCI 0.5 M, pH 7.2, seguido por un lavado de 2 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM, pH 7.2 (sin NaCI). El anticuerpo se eluye con acetato 40 mM, pH 3.0.

El anticuerpo anti-CD30 monoespecífico eluye a pH 3.6, mientras que el anti-hCD3xCD20DAdp biespecífico eluye a pH 4.4.

EJEMPLO 11 Elución selectiva con Proteína A de heterodímeros de ratón con pH ligero Células CHO-K1 se transfectan en forma transitoria con construcciones de expresión para el dominio extracelular de IFNAR1 de humano (MFNAR1) y IFNAR2 de humano (hlFNAR2) fusionado con una Fe de mlgG2a de tipo silvestre o un mutante (TTTK o PTTK). La relación entre hlFNAR1-mFc y MFNAR2-mFc se mantiene en 1:1 transfectando las células con cantidades iguales de los dos plásmidos de expresión. El medio de cultivo se recolecta 4 días después de la transfección y se somete a purificación con Proteína A utilizando columnas de centrifugación NAb Protein A Plus™ de 0.2 mi (Thermo Scientific/Pierce). Brevemente, las columnas se equilibran con 1 x PBS , pH 7.2. Un mi del medio de cultivo de CHO-K1 se incuba con la resina de Proteína A durante 10 min utos a temperatura ambiente. Las col umnas se lavan después tres veces con 1 x PBS, pH 7.2. Las proteínas u nidas se eluyen con solución amortig uadora de citrato de sodio 20 mM que contiene NaCI 1 M . Se efectúan tres eluciones utilizando 0.4 mi solución amortig uadora para elución con pH decreciente. Las proteínas en las diferentes fracciones se detectan mediante análisis Western blot.

Los resultados muestran que con elución con gradiente de pH, es posible separar heterodímeros de tipo silvestre y de mutante estrella mlgG2a a partir de homod ímeros de mlgG2a de tipo silvestre (véase fracción E 1 en ambos genes de la Figura 9).

EJEMPLO 12 Formación preferencial del heterodímero de m utantes de mlgG2a con respecto a los heterodímeros del isotipo Se construyen plásmidos de ADN para expresión en mam ífero de los dominios extracelulares de los receptores de interferón tipo I de humano (hlFNARI y hlFNAR2) con Fe de ratón C-terminal (mlgG2a o mlgG 1 ). Las mutaciones en la secuencia de m lgG2a se introducen utilizando mutagénesis dirigida a sitio. Los mutantes son TTT = M252T, S254T, S256T; TTTK = M252T, S254T, S256T, I258K; PTTTK = I247P, M252T, S254T, S256T, I258K; RF = H435R, H436F. Células CHO-K1 se transfectan en forma transitoria con las construcciones de expresión. La relación entre IFNAR1-mFc e IFNAR2-mFc se mantiene en 4:1 transfectando células con 4 veces más plásmido de expresión de hlFNAR1-mFc (hlFNARI -mlgG2a) que de MFNAR2-mFc (mlgG1 o mlgG2a muíante). El medio de cultivo se recolecta 4 días después de la transfección y las proteínas mFc se detectan mediante análisis Western blot.

El resultado muestra que la formación de heterodímero entre mlgG2a y mlgG1 es mucho menos eficiente que aquella entre mlgG2a de tipo silvestre y mutantes de mlgG2a (comparar carril 1 con los carriles 2 a 5 de la Figura 10). Se utiliza una relación de 4:1 de construcción de IFNAR1: construcción de IFNAR2 para mantener un exceso de la construcción de' lgG2a de tipo silvestre en el experimento.

Claims

REIVINDICACIONES 1 . - U na proteína de unión a antígeno biespecífica heterodimérica, que comprende: a. un primer polipéptido que comprende, desde el extremo N-terminal hacia el extremo C-termi nal , una primera región de unión a epítope que liga selectivamente un primer epítope, una región constante de inmunoglobulina que comprende una primera región CH3 de una IgG de humano que se selecciona a partir de lgG 1 , lgG2, e lgG4; y, b. un segu ndo polipéptido que comprende, desde el extremo N-terminal hacia el extremo C-terminal, una segunda región de unión a epítope que liga selectivamente un segundo epítope, u na región constante de inmu noglobulina que comprende una segunda región CH3 de una IgG de humano que se selecciona a partir de lgG 1 , lgG2, e lgG4, en donde la segunda región CH3 comprende una modificación que reduce o elimina la unión del segundo dominio CH3 a la proteína A. 2. - La proteína biespecífica de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el primer polipéptido y el segundo polipéptido son cadenas pesadas de IgG de humano. 3. - La proteína biespecífica de conformidad con la reivindicación 1 , que comprende también una cadena ligera de inmunoglobulina. 4.- La proteína biespecífica de conformidad con la reivindicación 3, en donde la cadena ligera de inmunoglobulina es una cadena ligera de inm unoglobulina de humano. 5. - La proteína biespecífica de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el primer y el segundo polipéptido son cada uno cadenas pesadas de lgG 1 de humano. 6. - La proteína biespecífica de conform idad con la reivindicación 1 , en donde la modificación se selecciona a partir del grupo que consiste de (a) 95R, y (b) 95R y 96F en el sistema de numeración de exón I MGT, o (a') 435R, y (b') 435R y 436F en el sistema de numeración U E. 7. - La proteína biespecífica de conformidad con la reivindicación 6, q ue comprende también una a cinco modificaciones que se seleccionan a partir del grupo q ue consiste de 1 6E , 18M, 44S , 52N , 57 , y 82I en el sistema de n umeración de exón I MGT, o 356E , 358M , 384S, 392N, 397M , y 422I en el sistema de numeración U E. 8. - La proteína biespecífica de conform idad con la reivindicación 6, en donde el dominio CH3 del anticuerpo biespecífico es no inm unogénico o sustancialmente no inmunogén ico en un humano. 9.- La proteína biespecífica de conformidad con la reivindicación 7, en donde el dominio CH3 del anticuerpo biespecífico es no inmunogénico o sustancialmente no inmunogénico en un humano. 10.- U n método para elaborar un anticuerpo biespecífico, que comprende: a. obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica para una primera cadena pesada de ¡nmunoglobu lina que comprende un primer dominio variable que reconoce un primer epítope, en donde la primera cadena pesada de ¡nmunog lobulina comprende un dominio constante de isotipo IgG 1 , lgG2, o lgG4¡ b. obtener una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica para una segunda cadena pesada de ¡ nm unoglobulina que comprende un segundo dominio variable q ue reconoce un segundo epítope, en donde la segunda cadena pesada de ¡nm u noglobulina comprende un dominio constante de isotipo IgG 1 , lgG2, o lgG4 q ue comprende una modificación en su domin io CH3 q ue erradica o reduce la unión a Proteína A; c. obtener una tercera secuencia de ácido n ucleico que codifica para una cadena ligera de ¡nm unoglobulina q ue se aparea con la primera y la segunda cadenas pesadas de ¡nmunoglobulina; d . introducir la primera, segunda, y tercera secuencias de ácido nucleico en una cél ula de mamífero; e. permitir que la célula exprese u n anticuerpo biespecífico; y, f. aislar el anticuerpo biespecífico tomando como base la capacidad del anticuerpo biespecífico de ligar la Proteína A. 1 1 .- El método de conformidad con la reivindicación 1 0, en donde la modificación se selecciona a partir del grupo que consiste de (a) 95R, y (b) 95R y 96F en el sistema de numeración de exón I MGT, o (a') 435R, y (b') 435R y 436F en el sistema de numeración U E. 12. - El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , que comprende también una a cinco modificaciones que se seleccionan a partir del grupo que consiste de 16E , 1 8M , 44S, 52N , 57M, y 82I en el sistema de numeración de exón IMGT, o 356E, 358M , 384S, 392N , 397M , y 422I en el sistema de numeración UE. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , en donde el dominio CH3 del anticuerpo biespecífico es no inmunogénico o sustancialmente no inmunogénico en un humano. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 1 2, en donde el dom inio CH3 del anticuerpo biespecífico es no inmunogénico o sustancialmente no inmunogénico en un humano. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 1 0, en donde el anticuerpo biespecífico se aisla en un soporte sólido que comprende Proteína A. 16. - El método de conformidad con la reivindicación 1 5, en donde el soporte sólido comprende una columna de afinidad de Proteína A, y el anticuerpo biespecífico se aisla utilizando un gradiente de pH . 1 7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 6, en donde el gradiente de pH es un gradiente por pasos que comprende uno o más pasos de pH entre pH 3 y pH 5. 18.- U n método para aislar un anticuerpo biespecífico, que comprende; aislar a partir de una célula rota o u na mezcla de anticuerpos un anticuerpo biespecífico que tiene domi nios CH3 de lgG1 , lgG2, o lgG4 diferencialmente modificados, en donde los dominios CH3 diferencialmente modificados son no inm unogénicos o sustancialmente no inmu nogénicos en un humano, y en donde la modificación da como resultado un anticuerpo biespecífico con una región constante de la cadena pesada heterodimérica cuyos monómeros tienen una afinidad diferencial para la Proteína A, y el anticuerpo biespecífico se aisla a partir de la célula rota o la mezcla tomando como base su afinidad para la Proteína A. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 18, en donde u n monómero de la región constante de la cadena pesada heterodimérica es una lgG1 de humano, y el otro monómero de la región constante de la cadena pesada heterodimérica es una IgG 1 modificada de humano q ue comprende una modificación que se selecciona a partir del grupo que consiste de (a) H95R, y (b) H95R y Y96F en el sistema de numeración de exón I GT, o (a') H435R, y (b') H435R y Y436F en el sistema de numeración U E. 20. - El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde la IgG 1 modificada de humano tam bién comprende una modificación que se selecciona a partir del grupo q ue consiste de D 1 6E, L1 8M , N44S, K52N , V57M, y V82I en el sistema de n umeración de exón IMGT, o D356E, L358M , N384S , K392N, V397M , y V422I en el sistema de numeración UE.