KR102398736B1

KR102398736B1 - 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자

Info

Publication number: KR102398736B1
Application number: KR1020207028953A
Authority: KR
Inventors: 다이치 구라모치; 메이리 가와조에; 나오카 히로니와; 도모유키 이가와
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2011-10-31
Filing date: 2012-10-31
Publication date: 2022-05-16
Also published as: EP2787078A4; CN104011207B; CN109111524A; CN109134658B; CN109134658A; JPWO2013065708A1; MX2014005045A; EP2787078A1; CN109111524B; RU2681885C2; US20200087380A1; HK1259059A1; JP6371059B2; MX359775B; US20140370020A1; WO2013065708A1; CA2853230A1; CN104011207A; ES2732712T3; JP2017212981A

Abstract

CH1과 CL의 계면에 존재하는 아미노산을 전하를 갖는 아미노산으로 치환함으로써 CH1과 CL의 회합을 억제할 수 있고, CH3에 knob와 hole을 단독으로 도입하는 개변을 사용하는 것보다도 효율적으로 헤테로 분자가 형성되는 것을 발견하였다.

Description

중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자{Antigen-binding molecule having regulated conjugation between heavy-chain and light-chain}

본 발명은 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항체, 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항체의 제조방법, 항체의 중쇄와 경쇄의 회합 제어방법 및 그 항체를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물 등에 관한 것이다.

인간 정상영역을 갖는 IgG 타입의 이중 특이성 항체(한쪽 팔에 항원 A에 대한 결합 특이성, 다른 한쪽 팔에 항원 B에 대한 결합 특이성을 갖는 인간 정상영역을 갖는 IgG 타입의 항체)의 제작방법으로서, 지금까지 몇 가지 방법이 보고되어 있다. 일반적으로 IgG 타입의 이중 특이성 항체는 2종류의 H쇄(즉 항원 A에 대한 H쇄와 항원 B에 대한 H쇄) 및 2종류의 L쇄(즉 항원 A에 대한 L쇄와 항원 B에 대한 L쇄)로 이루어진다. 이러한 IgG 타입의 이중 특이성 항체를 발현시키는 경우, 2종류의 H쇄와 2종류의 L쇄를 발현시키기 위해 H2L2의 조합으로서는 10종류의 조합이 생각된다. 그 중 목적의 결합 특이성(한쪽 팔에 항원 A에 대한 결합 특이성, 다른 한쪽 팔에 항원 B에 대한 결합 특이성을 갖는 IgG)을 갖는 조합은 1종류이다. 이 때문에 목적의 이중 특이성 항체를 취득하기 위해서는 10종류의 항체로부터 1종류의 목적의 항체를 정제할 필요가 있어 매우 효율이 낮고 또한 곤란하다.

이 문제를 해결하는 방법으로서 IgG H쇄의 CH3영역에 아미노산 치환을 행함으로써, 항원 A에 대한 H쇄와 항원 B에 대한 H쇄의 이종(異種) 조합의 IgG를 우선적으로 분비시키는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 1, 2, 3, 4 및 비특허문헌 1, 2). 이들에는 "knob;돌기"와 "hole;공극"이라는 물리적인 장애를 이용한 방법이나 전하적인 반발을 이용한 방법이 보고되어 있다.

더욱 효율적으로 목적 분자를 얻기 위해 항원 A에 대한 L쇄와 항원 B에 대한 L쇄를 동일 아미노산 서열로 한 공통 L쇄를 사용하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 5, 6). 그러나 공통 L쇄를 사용함으로써 항원에 대한 친화성(Affinity)이 크게 저하될 가능성이 있어 반드시 최적의 방법은 아니다. 이 때문에 이중 특이성 항체가 2개의 항원에 강한 친화성(Affinity)으로 결합하기 위해서는 항원 A에 대한 H쇄와 L쇄만이 회합하고, 항원 B에 대한 H쇄와 L쇄만이 회합하는 것이 바람직하다. 또한 가변영역에 관계없이 각각의 항원에 대한 H쇄와 L쇄를 회합화시키기 위해, 가변영역이 아니라 정상영역인 CH1과 CL 도메인에 아미노산 치환을 행하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 2, 7). 그러나 목적으로 하는 이중 특이성 항체를 효율적으로 생산하기에는 아직 불충분하다.

WO 96/27011 WO 2006/106905 WO 2009/089004 WO 2010/129304 WO 98/050431 WO 2006/109592 WO 2007/147901

Ridgway JB 등 저, Protein Engineering, 1996년, Vol.9, p.617-621 Merchant AM 등 저, Nature Biotechnology, 1998년, Vol.16, p.677-681

본 발명은 이러한 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항체, 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항체의 제조방법 및 항체의 중쇄와 경쇄의 회합 제어방법을 제공하는 것에 있다. 또한 본 발명은 그 일태양으로서 CH1과 CL의 계면에 있어서의 회합이 제어된 이중 특이성 항체, CH1과 CL의 계면에 있어서의 회합을 제어하여 이중 특이성 항체를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 회합의 제어에 제공하는 중쇄와 경쇄의 영역으로서 중쇄의 정상영역인 CH1 및 경쇄 정상영역(CL)을 선택하고, 이들 CH1과 CL의 회합의 제어에 대해서 예의 연구를 행하였다. 그 결과, CH1과 CL의 계면에 존재하는 아미노산 잔기를 서로 전하적으로 반발하거나 또는 반발하지 않는 아미노산 잔기로 치환함으로써 CH1과 CL의 회합을 억제할 수 있고, 전술한 CH3에 knob과 hole을 단독으로 도입하는 개변을 이용하는 것보다도 효율적으로 헤테로 분자가 형성되는 것을 발견하였다.

즉, 본 발명자들에 의해 발견된 지견(知見)에 의해 CH1과 CL의 회합을 제어하는 것이 가능하다. 또한 본 발명은 CH1과 CL의 회합의 제어에 적용 가능할 뿐 아니라 임의의 폴리펩티드 간의 회합의 제어에 응용하는 것이 가능하다.

또한 본 발명자들은 본 발명의 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 이중 특이성 항체가 실제로 기능을 유지하고 있는 것을 확인하였다.

전술한 바와 같이 본 발명자들은 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자의 개발에 성공하여 본 발명을 완성시켰다.

본 발명은 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자, 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자의 제조방법 및 항원 결합 분자의 중쇄와 경쇄의 회합 제어방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 아래에 관한 것이다.

〔1〕중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자로서,

당해 항원 결합 분자에 있어서 중쇄와 경쇄에 있어서의 아래의 (a)~(c)에 나타내는 아미노산 잔기의 조(set)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1조 또는 2조 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기인 항원 결합 분자；

(a) 중쇄의 정상영역(CH1)에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기 및 경쇄 정상영역(CL)에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치의 아미노산 잔기,

(b) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 131번 위치의 아미노산 잔기,

(c) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 175번 위치의 아미노산 잔기 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 160번 위치의 아미노산 잔기.

〔2〕또한 아래의 (d)에 나타내는 아미노산 잔기의 조의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기인〔1〕에 기재된 항원 결합 분자；

(d) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 213번 위치의 아미노산 잔기 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 123번 위치의 아미노산 잔기.

〔3〕상기 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 아래의 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 조에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는〔1〕또는〔2〕에 기재된 항원 결합 분자；

(X) 글루타민산(E) 또는 아스파라긴산(D),

(Y) 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H).

〔4〕또한 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 계면을 형성하는 2 잔기 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기인〔1〕내지〔3〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.

〔5〕상기 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 아래의 (a) 또는 (b)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 1조 또는 2조의 아미노산 잔기인〔4〕에 기재된 항원 결합 분자；

(a) 중쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서 Kabat 넘버링 39번 위치의 아미노산 잔기 및 경쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서 Kabat 넘버링 38번 위치의 아미노산 잔기,

(b) 중쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서 Kabat 넘버링 45번 위치의 아미노산 잔기 및 경쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서 Kabat 넘버링 44번 위치의 아미노산 잔기.

〔6〕상기 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 아래의 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 조에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는〔4〕또는〔5〕에 기재된 항원 결합 분자；

(X) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D),

(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).

〔7〕중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자로서,

당해 항원 결합 분자에 있어서 회합하는 중쇄와 경쇄에 있어서의 아래의 (a)~(c)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 1조 또는 2조 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기인 항원 결합 분자；

〔8〕또한 아래의 (d)에 나타내는 아미노산 잔기의 조의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기인〔7〕에 기재된 항원 결합 분자；

〔9〕상기 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 아래의 (X)~(Z)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 조의 각각으로부터 선택되는 아미노산 잔기로서, 2개의 조가 (X)와 (Y), (X)와 (Z), (Y)와 (Z) 또는 (Z)와 (Z)의 조합으로부터 선택되는〔7〕또는〔8〕에 기재된 항원 결합 분자；

(X) 글루타민산(E) 또는 아스파라긴산(D),

(Y) 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H),

(Z) 알라닌(A), 아스파라긴(N), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글리신(G), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 티로신(Y) 또는 발린(V).

〔10〕상기 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 175번 위치의 아미노산 잔기가 리신(K), CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치, 131번 위치 및 160번 위치의 아미노산 잔기가 모두 글루타민산(E)인〔7〕내지〔9〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.

〔11〕상기 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치 및 175번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민산(E), CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치, 131번 위치 및 160번 위치의 아미노산 잔기가 모두 리신(K)인〔7〕내지〔9〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.

〔12〕또한 CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 213번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민산(E)이고, CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 123번 위치의 아미노산 잔기가 리신(K)인〔11〕에 기재된 항원 결합 분자.

〔13〕또한 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 계면을 형성하는 2 잔기 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기인〔7〕내지〔12〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.

〔14〕상기 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 아래의 (a) 또는 (b)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 1조 또는 2조의 아미노산 잔기인〔13〕에 기재된 항원 결합 분자；

〔15〕상기 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 아래의 (X)~(Z)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 조의 각각으로부터 선택되는 아미노산 잔기로서, 2개의 조가 (X)와 (Y), (X)와 (Z), (Y)와 (Z) 또는 (Z)와 (Z)의 조합으로부터 선택되는〔13〕또는〔14〕에 기재된 항원 결합 분자；

(X) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D),

(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H),

〔16〕항원 결합 분자가 이중 특이성 항체인〔1〕내지〔15〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.

〔17〕아래의 (1)~(3)의 공정을 포함하는 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자의 제조방법；

(1) 중쇄의 정상영역(CH1) 및 경쇄 정상영역(CL)을 코드하는 핵산을, 아래의 (a)~(c)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 1조 또는 2조 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하도록 핵산을 개변하는 공정,

(a) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치의 아미노산 잔기

(b) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 131번 위치의 아미노산 잔기

(c) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 175번 위치의 아미노산 잔기 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 160번 위치의 아미노산 잔기

(2) 상기 개변된 핵산을 숙주세포로 도입하고 숙주세포를 그 핵산이 발현되도록 배양하는 공정,

(3) 상기 숙주세포의 배양물로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정.

〔18〕상기 공정(1)에 있어서, 추가로 아래의 (d)에 나타내는 아미노산 잔기의 조의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하도록 핵산을 개변하는 공정을 포함하는〔17〕에 기재된 항원 결합 분자의 제조방법；

〔19〕상기 공정(1)에 있어서, 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 아래의 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되도록 핵산을 개변하는 공정을 포함하는〔17〕또는〔18〕에 기재된 항원 결합 분자의 제조방법；

(X) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D),

(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).

〔20〕또한 상기 공정(1)에 있어서, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 계면을 형성하는 2 잔기 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기이도록 핵산을 개변하는 공정을 포함하는〔17〕내지〔19〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자의 제조방법.

〔21〕상기 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 아래의 (a) 또는 (b)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1조의 아미노산 잔기인〔20〕에 기재된 항원 결합 분자의 제조방법；

〔22〕상기 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 아래의 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 조에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는〔20〕또는〔21〕에 기재된 항원 결합 분자의 제조방법；

(X) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D),

(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).

〔23〕아래의 (1)~(3)의 공정을 포함하는 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자의 제조방법；

(1) 중쇄의 정상영역(CH1) 및 경쇄 정상영역(CL)을 코드하는 핵산을, 아래의 (a)~(c)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 1조 또는 2조 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않도록 핵산을 개변하는 공정,

(a) 중쇄의 정상영역(CH1)에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기 및 경쇄 정상영역(CL)에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치의 아미노산 잔기

〔24〕상기 공정(1)에 있어서, 추가로 아래의 (d)에 나타내는 아미노산 잔기의 조의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않도록 핵산을 개변하는 공정을 포함하는〔23〕에 기재된 항원 결합 분자의 제조방법；

〔25〕상기 공정(1)에 있어서, 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 아래의 (X)~(Z)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 조의 각각으로부터 선택되는 아미노산 잔기로서, 2개의 조가 (X)와 (Y), (X)와 (Z), (Y)와 (Z) 또는 (Z)와 (Z)의 조합으로부터 선택되도록 핵산을 개변하는 공정을 포함하는〔23〕또는〔24〕에 기재된 항원 결합 분자의 제조방법；

(X) 글루타민산(E) 또는 아스파라긴산(D),

(Y) 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H),

〔26〕상기 공정(1)에 있어서, 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 175번 위치의 아미노산 잔기가 리신(K), CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치, 131번 위치 및 160번 위치의 아미노산 잔기가 모두 글루타민산(E)이도록 핵산을 개변하는 공정을 포함하는〔23〕내지〔25〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자의 제조방법.

〔27〕상기 공정(1)에 있어서, 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치 및 175번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민산(E), CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치, 131번 위치 및 160번 위치의 아미노산 잔기가 모두 리신(K)이도록 핵산을 개변하는 공정을 포함하는〔23〕내지〔25〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자의 제조방법.

〔28〕추가로 CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 213번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민산(E)이고, CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 123번 위치의 아미노산 잔기가 리신(K)이도록 핵산을 개변하는 공정을 포함하는〔27〕에 기재된 항원 결합 분자의 제조방법.

〔29〕추가로 상기 공정(1)에 있어서, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 계면을 형성하는 2 잔기 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기이도록 핵산을 개변하는 공정을 포함하는〔23〕내지〔28〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자의 제조방법.

〔30〕상기 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 아래의 (a) 또는 (b)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1조의 아미노산 잔기인〔29〕에 기재된 항원 결합 분자의 제조방법；

〔31〕상기 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 아래의 (X)~(Z)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 조의 각각으로부터 선택되는 아미노산 잔기로서, 2개의 조가 (X)와 (Y), (X)와 (Z), (Y)와 (Z) 또는 (Z)와 (Z)의 조합으로부터 선택되는〔29〕또는〔30〕에 기재된 항원 결합 분자의 제조방법；

(X) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D),

(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H),

〔32〕〔17〕내지〔31〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자의 제조방법에 의해 제조되는 항원 결합 분자.

〔33〕항원 결합 분자가 이중 특이성 항체인〔32〕에 기재된 항원 결합 분자.

〔34〕항원 결합 분자의 중쇄와 경쇄의 회합 제어방법으로서,

아래의 (a)~(c)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 1조 또는 2조 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 되도록 핵산을 개변하는 것을 포함하는 방법；

(a) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치의 아미노산 잔기,

〔35〕추가로 아래의 (d)에 나타내는 아미노산 잔기의 조의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 되도록 핵산을 개변하는 것을 포함하는〔34〕에 기재된 방법；

〔36〕상기 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 아래의 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 조에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는〔34〕또는〔35〕에 기재된 방법；

(X) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D),

(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).

〔37〕추가로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 계면을 형성하는 2 잔기 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기인〔34〕내지〔36〕중 어느 하나에 기재된 방법.

〔38〕상기 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 아래의 (a) 또는 (b)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1조의 아미노산 잔기인〔37〕에 기재된 방법；

〔39〕상기 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 아래의 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 조에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는〔37〕또는〔38〕에 기재된 방법；

(X) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D),

(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).

〔40〕항원 결합 분자의 중쇄와 경쇄의 회합 제어방법으로서,

아래의 (a)~(c)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 1조 또는 2조 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 되도록 핵산을 개변하는 것을 포함하는 방법；

〔41〕추가로 아래의 (d)에 나타내는 아미노산 잔기의 조의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 되도록 핵산을 개변하는 것을 포함하는〔40〕에 기재된 방법；

〔42〕상기 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 아래의 (X)~(Z)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 조의 각각으로부터 선택되는 아미노산 잔기로서, 2개의 조가 (X)와 (Y), (X)와 (Z), (Y)와 (Z) 또는 (Z)와 (Z)의 조합으로부터 선택되는〔40〕또는〔41〕에 기재된 방법；

(X) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D),

(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H),

〔43〕상기 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 175번 위치의 아미노산 잔기가 리신(K), CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치, 131번 위치 및 160번 위치의 아미노산 잔기가 모두 글루타민산(E)인〔40〕내지〔42〕중 어느 하나에 기재된 방법.

〔44〕상기 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치 및 175번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민산(E), CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치, 131번 위치 및 160번 위치의 아미노산 잔기가 모두 리신(K)인〔40〕내지〔42〕중 어느 하나에 기재된 방법.

〔45〕또한 CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 213번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민산(E)이고, CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 123번 위치의 아미노산 잔기가 리신(K)인〔44〕에 기재된 방법.

〔46〕항원 결합 분자가 이중 특이성 항체인〔34〕내지〔45〕중 어느 하나에 기재된 방법.

〔47〕〔1〕내지〔16〕,〔32〕또는〔33〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자 및 의약적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.

〔48〕〔1〕내지〔16〕,〔32〕또는〔33〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자를 코드하는 핵산.

〔49〕〔48〕에 기재된 핵산을 갖는 숙주세포.

도 1은 CH1/CL 계면의 모델 도면이다.
도 2는 H쇄 1종류와 L쇄 2종류를 혼합하여 항체를 조제한 경우, 상정되는 H쇄와 L쇄의 조합을 나타낸 항체의 개념도이다. □로 둘러싼 E, K를 조합한 항체의 비율이 많은 변이를 도입한 개소는 전하적으로 상호작용하고 있는 것으로 생각된다.
도 3은 각 항체의 AIEX 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 각 항체의 AIEX 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 각 항체의 AIEX 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 각 항체의 AIEX 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 각 항체의 CIEX 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 각 항체의 CIEX 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 9a는 각 항체의 CIEX 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 9b는 도 9a의 계속되는 도면이다.
도 10은 각 항체의 CIEX 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 각 항체의 CIEX 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 12는 H쇄의 CH1에 대해서 인간의 IgA1(서열번호：63), IgA2(서열번호：64), IgD(서열번호：65), IgE(서열번호：66), IgG1(서열번호：67), IgG2(서열번호：68), IgG3(서열번호：69), IgG4(서열번호：70), IgM(서열번호：71), L쇄는 CL에 대해서 인간의 IgK(Kappa)(서열번호：72), IgL1(서열번호：73), IgL2(서열번호：74), IgL3(서열번호：75), IgL6(서열번호：76), IgL7(서열번호：77)(Lambda)의 아미노산 서열을 얼라인먼트하여 각각 비교한 도면이다.

본 발명은 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항체, 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항체의 제조방법 및 항체의 중쇄와 경쇄의 회합 제어방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 「항체」라는 용어는 「항원 결합 분자」와 동일한 정의로 사용된다. 즉 본 발명에 있어서 「항체」 또는 「항원 결합 분자」라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고, 목적하는 항원 결합 활성, 생물학적 활성을 나타내는 한, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 변이체(키메라 항체, 인간화 항체, 저분자화 항체(임의로 다른 분자가 부가되어 있어도 되는 항체 단편도 포함한다), 다중 특이성 항체 등)가 포함된다. 예를 들면 본 발명에 있어서의 「항체」 또는 「항원 결합 분자」로서 Fab에 HAS 결합 스캐폴드가 부가된 분자(Fab 부분만 통상의 항체)를 들 수 있다. 또한 본 발명에 있어서 「항체」는 폴리펩티드 또는 이종 다량체 중 어느 것이어도 된다. 바람직한 항체는 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, Fc-fusion 항체 및 항체 단편 등의 저분자화 항체이다.

본 발명의 항체는 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항체로서, 항체를 구성하는 중쇄와 경쇄가 목적으로 하는 중쇄와 경쇄의 조합인 중쇄의 정상영역(CH1) 및 경쇄 정상영역의 소정 위치의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기인(동종의 전하인) 항체에 관한 것이다.

본 발명에 있어서는 목적으로 하지 않는 중쇄와 경쇄의 조합의 중쇄의 정상영역(CH1) 및 경쇄 정상영역의 소정 위치의 아미노산 잔기를 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기로(동종의 전하로) 함으로써, 전하의 반발을 이용하여 목적으로 하지 않는 중쇄와 경쇄의 조합의 형성을 방지할 수 있고, 그 결과로서 목적으로 하는 중쇄와 경쇄의 조합을 형성시킬 수 있다.

본 발명의 항체는 다른 태양으로서 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항체로서, 항체를 구성하는 중쇄와 경쇄가 목적으로 하는 중쇄와 경쇄의 조합으로 회합하는, 중쇄의 정상영역(CH1) 및 경쇄 정상영역의 소정 위치의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 항체에 관한 것이다. 목적으로 하는 중쇄와 경쇄의 조합의 중쇄의 정상영역(CH1) 및 경쇄 정상영역의 소정 위치의 아미노산 잔기를 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기로 함으로써, 예를 들면 전하의 흡인력을 이용하여 목적으로 하는 중쇄와 경쇄의 조합을 형성시킬 수 있다.

본 발명에 있어서의 폴리펩티드란 통상 10 아미노산 정도 이상의 길이를 갖는 펩티드 및 단백질을 가리킨다. 또한 통상 생물 유래의 폴리펩티드이나 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 인공적으로 설계된 서열로 이루어지는 폴리펩티드여도 된다. 또한 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드 등 중 어느 것이어도 된다. 추가로 상기 폴리펩티드의 단편도 또한 본 발명의 폴리펩티드에 포함된다.

본 발명에 있어서 「회합을 제어한다」, 「회합이 제어된다」란 목적하는 회합 상태가 되도록 제어하는 것을 말하고, 보다 구체적으로는 중쇄와 경쇄 사이에 있어서 바람직하지 않은 회합이 형성되지 않도록 제어하는 것을 말한다.

본 발명에 있어서의 「계면」이란 통상 회합(상호작용)할 때의 회합면을 가리키고, 계면을 형성하는 아미노산 잔기란 통상 그 회합에 제공되는 폴리펩티드 영역에 포함되는 1 또는 복수의 아미노산 잔기로서, 보다 바람직하게는 회합시에 접근하여 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기를 말한다. 그 상호작용에는 구체적으로는 회합시에 접근하는 아미노산 잔기끼리가 수소 결합, 정전적 상호작용, 염교(salt bridges)를 형성하고 있는 경우 등이 포함된다.

본 발명에 있어서의 「계면을 형성하는 아미노산 잔기」란 상세하게 기술하자면, 계면을 구성하는 폴리펩티드 영역에 있어서 그 폴리펩티드 영역에 포함되는 아미노산 잔기를 말한다. 계면을 구성하는 폴리펩티드 영역이란 일례를 나타내자면 항체, 리간드, 수용체, 기질 등에 있어서 분자 간에 있어서 선택적인 결합을 담당하는 폴리펩티드 영역을 가리킨다. 구체적으로는 항체에 있어서는 중쇄 정상영역, 중쇄 가변영역, 경쇄 정상영역, 경쇄 가변영역 등을 예시할 수 있다.

본 발명에 있어서의 아미노산 잔기의 「개변」이란 구체적으로는 원래의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것, 원래의 아미노산 잔기를 결실시키는 것, 새로운 아미노산 잔기를 부가하는 것 등을 가리키는데, 바람직하게는 원래의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것을 가리킨다.

본 발명의 항체의 바람직한 태양에 있어서는, 회합 제어 전의 목적으로 하지 않는 중쇄와 경쇄의 조합의 중쇄의 정상영역(CH1) 및 경쇄 정상영역의 소정 위치의 아미노산 잔기가 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기를 갖는(동종의 전하를 갖는) 항체이다.

상기 항체에 있어서의 아미노산 잔기를 서로 전하적으로 반발하는(동종의 전하를 갖는) 아미노산 잔기로 개변함으로써, 그 전하의 반발력에 의해 이들 아미노산 잔기끼리의 회합이 저해되는 것으로 생각된다.

본 발명의 항체의 바람직한 다른 태양에 있어서는, 폴리펩티드의 계면에 있어서 회합에 관여하는 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기를 갖는 항체이다.

상기 항체에 있어서 폴리펩티드의 계면에 있어서 회합에 관여하는 아미노산 잔기를 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기로 개변함으로써, 예를 들면 그 전하의 흡인력에 의해 이들 아미노산 잔기끼리의 회합이 촉진되는 것으로 생각된다.

따라서 상기 항체에 있어서 개변되는 아미노산 잔기는 계면을 형성하는 폴리펩티드 영역 간에 있어서 회합시에 서로 접근한 아미노산 잔기인 것이 바람직하다.

회합시에 접근하는 아미노산 잔기는 예를 들면 폴리펩티드의 입체 구조를 해석하고, 그 폴리펩티드의 회합시에 계면을 형성하는 폴리펩티드 영역의 아미노산 서열을 조사함으로써 찾아낼 수 있다. 계면에 있어서 서로 접근한 아미노산 잔기는 본 발명의 항체에 있어서의 「개변」의 바람직한 타깃이 된다.

아미노산 중에는 전하를 띤 아미노산이 알려져 있다. 일반적으로 양의 전하를 띤 아미노산(양전하 아미노산)으로서는 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H)이 알려져 있다. 음의 전하를 띤 아미노산(음전하 아미노산)으로서는 아스파라긴산(D), 글루타민산(E) 등이 알려져 있다. 또한 전하를 띠고 있지 않은 아미노산 또는 비극성 아미노산으로서는 알라닌(A), 아스파라긴(N), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글리신(G), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 티로신(Y) 또는 발린(V) 등이 알려져 있다.

따라서 본 발명에 있어서 서로 전하적으로 반발하는(동종의 전하를 갖는) 아미노산이란,

(1) 한쪽 아미노산이 양의 전하의 아미노산이고 다른 쪽 아미노산도 양의 전하의 아미노산

(2) 한쪽 아미노산이 음의 전하의 아미노산이고 다른 쪽 아미노산도 음의 전하의 아미노산

을 의미한다.

또한 본 발명에 있어서 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산이란,

(1) 한쪽 아미노산이 양의 전하의 아미노산이고 다른 쪽 아미노산이 음의 전하의 아미노산,

(2) 한쪽 아미노산이 양의 전하의 아미노산이고 다른 쪽 아미노산이 전하를 띠고 있지 않은 아미노산 또는 비극성 아미노산,

(3) 한쪽 아미노산이 음의 전하의 아미노산이고 다른 쪽 아미노산이 전하를 띠고 있지 않은 아미노산 또는 비극성 아미노산,

(4) 양쪽 아미노산이 모두 전하를 띠고 있지 않은 아미노산 또는 비극성 아미노산

을 의미한다.

아미노산의 개변은 당 분야에 있어서 공지의 각종 방법으로 행할 수 있다. 이들 방법으로는 다음의 것에 한정되는 것은 아니나, 부위 특이적 변이 유발법(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492), PCR 변이법, 카세트 변이법 등의 방법에 의해 행할 수 있다.

아미노산의 개변은 예를 들면 전하를 띠고 있지 않은 아미노산 또는 비극성 아미노산의 양의 전하의 아미노산으로의 개변, 전하를 띠고 있지 않은 아미노산 또는 비극성 아미노산의 음의 전하의 아미노산으로의 개변, 양의 전하의 아미노산의 음의 전하의 아미노산으로의 개변, 음의 전하의 아미노산의 양의 전하의 아미노산으로의 개변을 들 수 있다. 또한 전하를 띠고 있지 않은 아미노산 또는 비극성 아미노산의 다른 전하를 띠고 있지 않은 아미노산 또는 비극성 아미노산으로의 개변, 양의 전하의 아미노산의 다른 양의 전하의 아미노산으로의 개변, 음의 전하의 아미노산의 다른 음의 전하의 아미노산으로의 개변도 본 발명에 있어서의 아미노산의 개변에 포함된다.

본 발명에 있어서 아미노산의 개변은 중쇄 및 경쇄의 각각에 1개씩 가해도 되고, 또한 복수 개씩 가해도 된다. 또한 중쇄와 경쇄에 가하는 개변의 수는 동일해도 되고 또한 상이해도 된다.

본 발명에 있어서 아미노산의 개변은 중쇄 또는 경쇄의 한쪽에 양의 전하의 아미노산으로의 개변을 복수 가하고, 다른 쪽에는 음의 전하의 아미노산으로의 개변을 복수 가해도 된다. 또한 중쇄 또는 경쇄의 동일한 사슬에 양의 전하의 아미노산으로의 개변과 음의 전하로의 아미노산의 개변을 복수 가해도 된다. 또한 이 개변에 있어서 전하를 띠고 있지 않은 아미노산 또는 비극성 아미노산으로의 개변, 전하를 띠고 있지 않은 아미노산 또는 비극성 아미노산의 개변을 적당히 조합해도 된다.

본 발명의 개변에 있어서 예를 들면 한쪽 사슬의 아미노산을 개변하지 않고 그대로 사용하는 것도 가능하고, 그 경우 반드시 중쇄 및 경쇄 양쪽에 개변을 가할 필요는 없으며 한쪽 사슬에만 개변을 가해도 된다.

본 발명의 항체에 있어서 개변에 제공되는 아미노산 잔기의 수는 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면 항체의 정상영역을 개변하는 경우 항원과의 결합 활성을 저하시키지 않기 위해 또한 면역원성을 올리지 않기 위해 될 수 있는 한 소수의 아미노산 잔기를 개변하는 것이 바람직하다. 상기 「소수」란 예를 들면 1~30개 정도의 수, 바람직하게는 1~20개 정도의 수, 더욱 바람직하게는 1~15개의 수, 가장 바람직하게는 1~5개의 수이다.

본 발명에 있어서 「항체」라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되어 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 변이체(키메라 항체, 인간화 항체, 저분자화 항체(항체 단편도 포함한다), 다중 특이성 항체 등)가 포함된다. 또한 본 발명에 있어서 「항체」는 폴리펩티드 또는 이종 다량체 중 어느 것이어도 된다. 바람직한 항체는 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, Fc-fusion 항체 및 항체 단편 등의 저분자화 항체이다.

본 발명에 있어서 「다중 특이성 항체」(본 명세서에서는 「다종 특이성 항체」와 동일한 의미로 사용한다)란 상이한 다종의 에피토프와 특이적으로 결합 가능한 항체를 말한다. 즉 다중 특이성 항체는 2종류 이상의 상이한 에피토프에 대해 특이성을 갖는 항체로, 상이한 항원을 인식하는 항체 외에 동일 항원 상의 상이한 에피토프를 인식하는 항체도 포함된다(예를 들면 항원이 헤테로 수용체인 경우에는 다중 특이성 항체는 헤테로 수용체를 구성하는 상이한 도메인을 인식하거나 또는 항원이 모노머인 경우에는 다중 특이성 항체는 모노머 항원의 복수 개소를 인식한다). 통상 이러한 분자는 2개의 항원과 결합하는 것인데(이중 특이성 항체：bispecific 항체； 본 명세서에서는 「이종 특이성 항체」와 동일한 의미로 사용한다), 그 이상의(예를 들면 3종류의) 항원에 대해 특이성을 가지고 있어도 된다.

본 발명에 있어서의 「항체」에는 전술한 항체에 대해 추가로 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 또는 키메라화나 인간화 등에 의해 그 아미노산 서열이 개변된 것이 포함된다. 아노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 및 인간화, 키메라화 등의 아미노산 서열의 개변은 당업자에게 공지의 방법에 의해 행하는 것이 가능하다. 마찬가지로 본 발명에 있어서의 항체를 재조합 항체로서 제작할 때 이용하는 항체의 가변영역 및 정상영역도 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 또는 키메라화나 인간화 등에 의해 그 아미노산 서열을 개변해도 된다.

본 발명에 있어서의 항체는 마우스 항체, 인간 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 낙타 항체 등 어떠한 동물 유래의 항체여도 된다. 또한 예를 들면 키메라 항체, 그 중에서도 인간화 항체 등의 아미노산 서열을 치환한 개변 항체여도 된다. 또한 각종 분자를 결합시킨 항체 수식물, 항체 단편, 저분자화 항체 등 어떠한 항체여도 된다.

「키메라 항체」란 상이한 동물 유래의 서열을 조합하여 제작되는 항체이다. 예를 들면 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변(V)영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상(C)영역으로 이루어지는 항체를 예시할 수 있다. 키메라 항체의 제작은 공지이고, 예를 들면 항체 V영역을 코드하는 DNA를 인간 항체 정상영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이를 발현 벡터에 삽입하고 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 키메라 항체를 얻을 수 있다.

「인간화 항체」란 재구성(reshaped) 인간 항체로도 불리는 인간 이외의 포유동물 유래의 항체, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR;complementarity determining region)을 인간 항체의 CDR로 이식한 것이다. CDR을 동정하기 위한 방법은 공지이다(Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877). 또한 그의 일반적인 유전자 재조합 수법도 공지이다(유럽 특허출원 공개번호 EP 125023호 공보, WO 96/02576호 공보 참조). 이에 공지의 방법에 의해 예를 들면 마우스 항체의 CDR을 결정하고, 그 CDR과 인간 항체의 프레임워크 영역(framework region；FR)이 연결된 항체를 코드하는 DNA를 취득하여, 인간화 항체를 통상의 발현 벡터를 사용한 계(system)에 의해 생산할 수 있다. 이러한 DNA는 CDR 및 FR 양쪽의 말단 영역에 오버랩되는 부분을 갖도록 제작한 수 개의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하여 PCR법에 의해 합성할 수 있다(WO98/13388호 공보에 기재된 방법을 참조). CDR을 매개로 연결되는 인간 항체의 FR은 CDR이 양호한 항원 결합 부위를 형성하도록 선택된다. 필요에 따라 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체의 가변영역에 있어서의 FR의 아미노산을 개변해도 된다(Sato et al., Cancer Res. (1993) 53: 851-6). 개변할 수 있는 FR 중의 아미노산 잔기에는 항원에 직접 비공유 결합에 의해 결합하는 부분(Amit et al., Science (1986) 233: 747-53), CDR 구조에 영향 또는 작용하는 부분(Chothia et al., J. Mol. Biol. (1987) 196: 901-17) 및 VH-VL 상호작용에 관련된 부분(EP239400호 특허 공보)이 포함된다.

본 발명의 항체의 중쇄 정상영역은 바람직하게는 인간 중쇄 정상영역이다. 또한 항체의 중쇄 정상영역에는 예를 들면 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM 타입의 정상영역이 존재하고 있다. 본 발명의 항체의 중쇄 정상영역은 특별히 한정되지 않으나 IgG1 타입의 정상영역이 바람직하고, 특히 인간 IgG1 정상영역이 바람직하다. 인간 IgG1 정상영역으로서는 유전자 다형(genetic polymorphism)에 따른 복수의 알로타입 서열이 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242에 기재되어 있는데, 본 발명에 있어서는 그 중 어느 것이어도 된다.

또한 본 발명의 항체의 경쇄 정상영역은 바람직하게는 인간 경쇄 정상영역이다. 또한 항체의 경쇄 정상영역에는 예를 들면 IgK(Kappa), IgL1, IgL2, IgL3, IgL6, IgL7 (Lambda) 타입의 정상영역이 존재하고 있다. 본 발명의 항체의 경쇄 정상영역은 특별히 한정되지 않으나 인간 IgK(Kappa) 정상영역이 바람직하다. 인간 IgK(Kappa) 정상영역의 아미노산 서열은 공지이다(서열번호：72). 인간 IgK(Kappa) 정상영역과 인간 IgL7 (Lambda) 정상영역으로서는 유전자 다형에 따른 복수의 알로타입 서열이 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242에 기재되어 있는데, 본 발명에 있어서는 그 중 어느 것이어도 된다.

항체의 기능이나 항체의 안정성 개선을 위해 항체 정상영역, 특히 중쇄 정상영역을 필요에 따라 개변해도 된다. 항체의 기능을 개선하기 위한 개변으로서는 예를 들면 항체와 Fcγ 수용체(FcγR)의 결합을 증강시키거나 또는 감약시키는 개변, 항체와 FcRn의 결합을 증강시키거나 또는 감약시키는 개변, 항체의 세포상해활성(예를 들면 ADCC 활성, CDC 활성 등)을 증강 또는 감약시키는 개변 등을 들 수 있다. 또한 항체의 이질성(heterogeneity)을 개선하는 개변, 면역원성 및/또는 약물동태를 개선하는 개변이 포함되어도 된다.

또한 IgG 항체의 중쇄 C말단 서열의 이질성으로서, C말단 아미노산의 리신 잔기의 결손 및 C말단의 2아미노산의 글리신, 리신 양쪽의 결손에 의한 C말단 카르복실기의 아미드화가 보고되어 있다(Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83.). 따라서 본 발명에 있어서는 중쇄 C말단의 이질성을 저감시키기 위해 C말단의 리신, 또는 C말단의 리신 및 글리신을 결손시킨 IgG를 사용하는 것이 바람직하다.

인간 유래의 서열을 이용한 키메라 항체 및 인간화 항체는 인간 체내에 있어서의 항원성이 저하되어 있기 때문에 치료 목적 등으로 인간에게 투여하는 경우에 유용할 것으로 생각된다.

또한 저분자화 항체는 체내동태의 성질 면에서도 대장균, 식물세포 등을 사용하여 저비용으로 제조할 수 있는 점에서도 항체로서 유용하다.

항체 단편은 저분자화 항체의 일종이다. 저분자화 항체에는 항체 단편을 그 구조의 일부로 하는 항체도 포함된다. 본 발명에 있어서의 저분자화 항체는 항원으로의 결합능을 가지고 있으면 특별히 그 구조, 제조법 등은 한정되지 않는다. 저분자화 항체 중에는 전장 항체보다도 높은 활성을 갖는 항체도 존재한다(Orita et al., Blood(2005) 105: 562-566). 본 명세서에 있어서 「항체 단편」이란 전장 항체(whole antibody, 예를 들면 whole IgG 등)의 일부분이라면 특별히 한정되지 않으나, 중쇄 가변영역(VH) 또는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하고, 추가로 CH1 또는 CL을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 바람직한 항체 단편의 예로서는 예를 들면 Fab, F(ab')2, Fab' 등을 들 수 있다. 항체 단편 중의 VH, VL, CH1 및 CL의 아미노산 서열은 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 의해 개변되어 있어도 된다. 또한 항원으로의 결합능을 유지하는 한 CH1, CL, VH 및 VL의 일부를 결손시켜도 되고, 약물동태(PK)나 약효를 증강시키기 위해 scFv, Fab, 도메인 항체(domain antibody: dAb), VHH 등의 항체 단편, HAS 결합 스캐폴드(HAS binding scaffold), PEG, 알부민, 사이토카인, 톡신 등(Biodrugs 2009; 23 (2): 93-109, Methods Mol Med. 2005;109:347-74., AAPS J. 2006 Aug 18;8(3):E532-51. 등에 기재된 분자)이 부가되어 있어도 된다.

항체 단편은 항체를 효소, 예를 들면 파파인, 펩신 등의 프로테아제에 의해 처리하여 얻을 수 있다(Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods (1992) 24: 107-17; Brennan et al., Science (1985) 229: 81 참조). 또한 그 항체 단편의 아미노산 서열을 토대로 유전자 재조합에 의해 제조하는 것도 가능하다.

항체 단편을 개변한 구조를 갖는 저분자화 항체는 효소 처리 또는 유전자 재조합에 의해 얻어진 항체 단편을 이용하여 구축할 수 있다. 또는 저분자화 항체 전체를 코드하는 유전자를 구축하고 이를 발현 벡터에 도입한 후 적당한 숙주세포에서 발현시키는 것도 가능하다(예를 들면 Co et al., J. Immunol. (1994) 152: 2968-76; Better and Horwitz, Methods Enzymol. (1989) 178: 476-96; Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol. (1989) 178: 497-515; Lamoyi, Methods Enzymol. (1986) 121: 652-63; Rousseaux et al., Methods Enzymol. (1986) 121: 663-9; Bird and Walker, Trends Biotechnol. (1991) 9: 132-7 참조).

본 발명의 바람직한 항체로서는 예를 들면 2종 이상의 CH1과 2종 이상의 CL을 갖는 이종 다량체를 들 수 있다. 그 이종 다량체는 2종 이상의 에피토프를 인식하는 것이 바람직하고, 예를 들면 다중 특이성 항체를 예시할 수 있다.

본 발명의 다중 특이성 항체로서 바람직하게는 이중 특이성 항체를 들 수 있다. 즉, 본 발명의 항체의 바람직한 태양으로서 예를 들면 2종의 중쇄(제1 중쇄와 제2 중쇄) 및 2종의 경쇄(제1 경쇄와 제2 경쇄)로 구성되는 이중 특이성 항체를 들 수 있다.

본 발명의 항체의 바람직한 태양의 「이중 특이성 항체」에 대해 추가로 상세하게 기술하자면, 상기 「제1 중쇄」란 항체를 형성하는 2개의 중쇄(H쇄) 중 한쪽의 H쇄이고, 제2 H쇄는 제1 H쇄와는 상이한 다른 한쪽의 H쇄를 말한다. 즉 2개의 H쇄 중 임의로 어느 한쪽을 제1 H쇄로 하고, 다른 쪽을 제2 H쇄로 할 수 있다. 마찬가지로 「제1 경쇄」란 이중 특이성 항체를 형성하는 2개의 경쇄(L쇄) 중 한쪽의 L쇄이고, 제2 L쇄는 제1 L쇄와는 상이한 다른 한쪽의 L쇄를 가리키며, 2개의 L쇄 중 어느 한쪽을 임의로 제1 L쇄로 하고, 다른 쪽을 제2 L쇄로 할 수 있다. 통상 제1 L쇄와 제1 H쇄는 어떤 항원(또는 에피토프)을 인식하는 동일 항체에 유래하고, 제2 L쇄와 제2 H쇄도 어떤 항원(또는 에피토프)을 인식하는 동일 항체에 유래한다. 여기서 제1 H쇄와 L쇄로 형성되는 L쇄-H쇄 쌍을 제1 쌍, 제2 H쇄와 L쇄로 형성되는 L쇄-H쇄 쌍을 제2 쌍이라 부른다. 제2 쌍의 유래가 되는 항체를 제작할 때 사용되는 항원(또는 에피토프)은 제1 쌍의 유래가 되는 항체를 제작할 때 사용되는 것과는 상이한 것이 바람직하다. 즉, 제1 쌍과 제2 쌍이 인식하는 항원은 동일해도 되나 상이한 항원(또는 에피토프)을 인식하는 것이 바람직하다. 이 경우, 제1 쌍 및 제2 쌍의 H쇄와 L쇄는 서로 상이한 아미노산 서열을 가지고 있는 것이 바람직하다. 제1 쌍과 제2 쌍이 상이한 에피토프를 인식하는 경우, 그 제1 쌍과 제2 쌍은 전혀 상이한 항원을 인식해도 되고 동일 항원 상의 상이한 부위(상이한 에피토프)를 인식해도 된다. 또한 한쪽이 단백질, 펩티드, 유전자, 당 등의 항원을 인식하고, 다른 쪽이 방사성 물질, 화학요법제, 세포 유래 톡신 등의 세포상해성 물질 등을 인식해도 된다. 그러나 특정 H쇄와 L쇄의 조합으로 형성되는 쌍을 갖는 항체를 제작하고자 생각한 경우에는 그 특정 H쇄와 L쇄를 제1 쌍 및 제2 쌍으로 하여 임의로 결정할 수 있다.

본 발명에 있어서의 변이 도입 전의 항체(본 명세서에 있어서는 간단히 「본 발명의 항체」로 기재하는 경우 있음)의 H쇄 또는 L쇄를 코드하는 유전자는 기지의 서열을 사용하는 것도 가능하며, 또한 당업자에게 공지의 방법으로 취득하는 것도 가능하다. 예를 들면 항체 라이브러리로부터 취득하는 것도 가능하고, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 항체를 코드하는 유전자를 클로닝하여 취득하는 것도 가능하다.

항체 라이브러리에 대해서는 이미 많은 항체 라이브러리가 공지가 되어 있으며, 또한 항체 라이브러리의 제작방법도 공지이기 때문에 당업자는 적당히 항체 라이브러리를 입수하는 것이 가능하다. 예를 들면 항체 파지 라이브러리에 대해서는 Clackson et al., Nature 1991, 352: 624-8, Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581-97, Waterhouses et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2265-6, Griffiths et al., EMBO J. 1994, 13: 3245-60, Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14: 309-14 및 일본국 특허공표 평10-504970호 공보 등의 문헌을 참조할 수 있다. 그 밖에 진핵세포를 라이브러리로 하는 방법(WO95/15393호 팸플릿)이나 리보솜 제시법 등의 공지의 방법을 사용하는 것이 가능하다. 또한 인간 항체 라이브러리를 사용하여 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면 인간 항체의 가변영역을 단일 사슬 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현시켜 항원에 결합하는 파지를 선택할 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석하면 항원에 결합하는 인간 항체의 가변영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열이 명확해지면 당해 서열을 토대로 적당한 발현 벡터를 제작하여 인간 항체를 취득할 수 있다. 이들 방법은 이미 주지이고 WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388을 참고로 할 수 있다.

하이브리도마로부터 항체를 코드하는 유전자를 취득하는 방법은 기본적으로는 공지기술을 사용하고, 목적하는 항원 또는 목적하는 항원을 발현하는 세포를 감작항원으로서 사용하여 이를 통상의 면역방법에 따라 면역하고 얻어지는 면역세포를 통상의 세포 융합법으로 공지의 친세포와 융합시켜, 통상의 스크리닝법에 의해 단일클론 항체 생산세포(하이브리도마)를 스크리닝하고, 얻어진 하이브리도마의 mRNA로부터 역전사효소를 사용하여 항체의 가변영역(V영역)의 cDNA를 합성하여, 이를 목적하는 항체 정상영역을 코드하는 DNA와 연결함으로써 얻을 수 있다.

상기 H쇄 및 L쇄를 코드하는 항체 유전자를 얻기 위한 감작항원으로는 특별히 아래의 예시에 한정되지 않지만, 면역원성을 갖는 완전 항원과 면역원성을 나타내지 않는 합텐 등을 포함하는 불완전 항원 양쪽이 포함된다. 본 발명의 항체의 항원은 특별히 한정되지 않고 예를 들면 목적 단백질의 전장 단백질 또는 부분 펩티드 등, 그 밖에 항원이 될 수 있는 것이 알려져 있는 다당류, 핵산, 지질 등으로 구성되는 물질을 사용할 수 있다. 항원의 조제는 예를 들면 바큘로바이러스를 사용한 방법(예를 들면 WO98/46777 등) 등 당업자에게 공지의 방법에 준하여 행할 수 있다. 하이브리도마의 제작은 예를 들면 밀스테인 등의 방법(G. Kohler and C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3-46) 등에 준하여 행할 수 있다. 항원의 면역원성이 낮은 경우에는 알부민 등의 면역원성을 갖는 거대분자와 결합시켜 면역을 행하면 된다. 또한 필요에 따라 항원을 다른 분자와 결합시킴으로써 가용성 항원으로 하는 것도 가능하다. 수용체와 같은 막 관통 분자를 항원으로서 사용하는 경우, 수용체의 세포외영역 부분을 단편으로서 사용하거나 막 관통 분자를 세포 표면 상에 발현하는 세포를 면역원으로 하여 사용하는 것도 가능하다.

항체 생산 세포는 전술한 적당한 감작항원을 사용하여 동물을 면역화함으로써 얻을 수 있다. 또는 항체를 생산할 수 있는 림프구를 in vitro에서 면역화하여 항체 생산 세포로 하는 것도 가능하다. 면역화하는 동물로서는 각종 포유동물을 사용할 수 있는데 설치목, 토끼목, 영장목의 동물이 일반적으로 사용된다. 구체적으로는 마우스, 랫트, 햄스터 등의 설치목, 토끼 등의 토끼목, 게잡이원숭이, 빨간털원숭이, 망토비비, 침팬지 등의 원숭이 등의 영장목의 동물을 예시할 수 있다.

인간 항체 유전자의 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물도 알려져 있어, 이러한 동물을 사용함으로써 인간 항체를 얻는 것도 가능하다(WO96/34096; Mendez et al., Nat. Genet. 1997, 15: 146-56 참조). 이러한 형질전환 동물을 사용하는 대신에 예를 들면 인간 림프구를 in vitro에서 목적하는 항원 또는 목적하는 항원을 발현하는 세포로 감작하고, 감작된 림프구를 인간 골수종세포, 예를 들면 U266과 융합시킴으로써 항원으로의 결합 활성을 갖는 목적하는 인간 항체를 얻는 것도 가능하다(일본국 특허공고 평1-59878호 공보 참조). 또한 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물을 목적하는 항원으로 면역함으로써 목적하는 인간 항체를 취득할 수 있다(WO93/12227, WO92/03918, WO94/02602, WO96/34096, WO96/33735 참조).

동물의 면역화는 예를 들면 감작항원을 Phosphate-Buffered Saline(PBS) 또는 생리식염수 등으로 적당히 희석, 현탁하고, 필요에 따라 애쥬번트를 혼합하여 유화(emulsion)한 후, 동물의 복강 내 또는 피하에 주사함으로써 행해진다. 그 후 바람직하게는 프로인트 불완전 애쥬번트에 혼합한 감작항원을 4~21일마다 수 회 투여한다. 항체 생산의 확인은 동물의 혈청 중의 목적으로 하는 항체 역가를 관용의 방법으로 측정함으로써 행해질 수 있다.

하이브리도마는 목적하는 항원으로 면역화한 동물 또는 림프구로부터 얻어진 항체 생산 세포를 관용의 융합제(예를 들면 폴리에틸렌글리콜)를 사용하여 골수종세포와 융합하여 제작할 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, 59-103). 그리고 필요에 따라 하이브리도마 세포를 배양·증식하고, 면역침강, 방사 면역분석(RIA), 효소결합 면역흡착 분석(ELISA) 등의 공지의 분석법으로 그 하이브리도마에 의해 생산되는 항체의 결합 특이성, 친화성 또는 활성을 측정한다. 그 후, 필요에 따라 목적으로 하는 결합 특이성, 친화성 또는 활성이 측정된 항체를 생산하는 하이브리도마를 한계희석법 등의 수법으로 서브클로닝하는 것도 가능하다.

계속해서 목적의 항체를 코드하는 유전자를 하이브리도마 또는 항체 생산 세포(감작 림프구 등)로부터 항체에 특이적으로 결합 가능한 프로브(예를 들면 항체 정상영역을 코드하는 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 등)를 사용하여 클로닝할 수 있다. 또한 mRNA로부터 RT-PCR에 의해 클로닝하는 것도 가능하다. 면역 글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 상이한 클래스로 분류된다. 또한 이들 클래스는 몇 개의 서브클래스(아이소타입)(예를 들면 IgG-1, IgG-2, IgG-3 및 IgG-4;IgA-1 및 IgA-2 등)로 나뉜다. 본 발명에 있어서 항체의 제조에 사용하는 H쇄 및 L쇄는 이들 중 어느 클래스 및 서브클래스에 속하는 항체에 유래하는 것이어도 되고 특별히 한정되지 않지만 IgG가 특히 바람직하다.

여기서 H쇄 및 L쇄를 코드하는 유전자를 유전자 공학적 수법으로 개변하는 것도 가능하다. 예를 들면 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 햄스터 항체, 양 항체, 낙타 항체 등의 항체에 대해서 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들면 키메라 항체, 인간화 항체 등을 적절히 제작할 수 있다.

키메라 항체는 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스 항체의 H쇄, L쇄의 가변영역과 인간 항체의 H쇄, L쇄의 정상영역으로 이루어지는 항체로, 마우스 항체의 가변영역을 코드하는 DNA를 인간 항체의 정상영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이를 발현 벡터에 삽입하고 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 얻을 수 있다. 인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체로도 불린다. 이 인간화 항체는 인간 이외의 포유동물(예를 들면 마우스)의 항체의 상보성 결정영역(CDR; complementary determining region)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을 말단부에 오버랩되는 부분을 갖도록 제작한 수 개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해 합성하고, 얻어진 DNA를 인간 항체 정상영역을 코드하는 DNA와 연결하고 이어서 발현 벡터에 삽입하고, 이를 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 얻을 수 있다(EP239400; WO96/02576 참조). CDR을 매개로 연결되는 인간 항체의 FR은 상보성 결정영역이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라 재구성 인간 항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체의 가변영역의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환해도 된다(K. Sato et al., Cancer Res. 1993, 53: 851-856).

전술한 인간화 이외에 예를 들면 항원과의 결합성 등의 항체의 생물학적 특성을 개선하는 개변을 행해도 된다. 이러한 개변은 부위 특이적 돌연변이(예를 들면 Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 참조), PCR 변이, 카세트 변이 등의 방법에 의해 행할 수 있다. 일반적으로 생물학적 특성이 개선된 항체 변이체는 원래 항체의 가변영역의 아미노산 서열에 대해 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상(예를 들면 95% 이상, 97%, 98%, 99% 등)의 아미노산 서열 상동성 및/또는 유사성을 갖는다. 본 명세서에 있어서 서열의 상동성 및/또는 유사성은 서열 상동성이 최대값을 취하도록 필요에 따라 서열을 정렬화 및 갭 도입 후, 기초가 된 항체 잔기와 상동(동일한 잔기) 또는 유사(일반적인 아미노산의 측쇄의 특성에 기초하여 동일한 그룹으로 분류되는 아미노산 잔기)한 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 통상 천연의 아미노산 잔기는 그 측쇄의 성질을 토대로

(1) 소수성：알라닌, 이소류신, 노르류신, 발린, 메티오닌 및 류신；

(2) 중성 친수성：아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 트레오닌 및 세린；

(3) 산성：아스파라긴산 및 글루타민산；

(4) 염기성：아르기닌, 히스티딘 및 리신；

(5) 사슬의 배향에 영향을 미치는 잔기：글리신 및 프롤린； 및

(6) 방향족성：티로신, 트립토판 및 페닐알라닌

의 그룹으로 분류된다.

통상 H쇄 및 L쇄의 가변영역 중에 존재하는 전부 6개의 상보성 결정영역(초가변부;CDR)이 상호작용하여 항체의 항원 결합 부위를 형성하고 있다. 이중 하나의 가변영역이라도 전체 결합 부위를 포함하는 것보다는 낮은 친화성이 되지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력이 있는 것이 알려져 있다. 따라서 본 발명의 H쇄 및 L쇄를 코드하는 항체 유전자는 그 유전자에 의해 코드되는 폴리펩티드가 목적하는 항원과의 결합성을 유지하고 있으면 되고, H쇄 및 L쇄의 각각의 항원 결합 부위를 포함하는 단편 부분을 코드하고 있으면 된다.

아래에 2종의 중쇄 정상영역 CH1(CH1-A와 CH1-B) 및 2종의 경쇄 정상영역(CL-A와 CL-B)을 갖는 IgG형 이중 특이성 항체의 경우에 대해서 보다 상세하게 설명하나, 그 밖의 항체에 대해서도 동일하게 본 발명을 적용할 수 있다.

제1 CH1-A와 제1 CL-A에 의해 한쪽의 에피토프를 인식하고, 또한 제2 CH1-B와 제2 CL-B에 의해 다른 쪽의 에피토프를 인식하는 이중 특이성 항체를 취득하고자 하는 경우, 그 항체의 생산에 있어서 4종의 각각의 사슬을 발현시키면 이론상 10종류의 항체 분자가 생산될 가능성이 있다.

이 경우, 예를 들면 CH1-A와 CL-B 및/또는 CH1-B와 CL-A 사이의 회합을 저해하도록 제어하면 목적하는 항체 분자를 우선적으로 취득하는 것이 가능하다.

예를 들면 CH1-A와 CL-B 사이의 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 양의 전하를 갖는 아미노산 잔기로 개변하고, CH1-B와 CL-A 사이의 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 음의 전하를 갖는 아미노산 잔기로 개변하는 예를 들 수 있다. 이 개변에 의해 목적으로 하지 않는 CH1-A와 CL-B의 회합은 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 모두 양전하이기 때문에 저해되고, CH1-B와 CL-A의 회합도 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 모두 음전하이기 때문에 저해되어, 목적으로 하지 않는 CH1-A와 CL-B의 회합 및 CH1-B와 CL-A의 회합은 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 서로 동일한 전하이기 때문에 저해된다. 그 결과, 목적으로 하는 CH1-A와 CL-A의 회합 및 목적으로 하는 CH1-B와 CL-B의 회합이 발생한 항체를 효율적으로 얻을 수 있다. 또한 목적으로 하는 CH1-A와 CL-A의 회합은 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 서로 이종의 전하를 갖기 때문에 촉진되고, 목적으로 하는 CH1-B와 CL-B의 회합도 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 서로 이종의 전하를 갖기 때문에 촉진된다. 그 결과 목적으로 하는 회합이 발생한 항체를 효율적으로 얻을 수 있다.

또한 CL-A와 CH1-B 사이의 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 서로 전하를 띠고 있지 않은 아미노산 또는 비극성 아미노산인 경우, CH1-A와 CL-B 사이의 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 양의 전하를 갖는 아미노산 잔기로 개변하는 예를 들 수 있다. 이 개변에 의해 목적으로 하지 않는 CH1-A와 CL-B의 회합은 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 모두 양전하이기 때문에 저해된다. 그 한편으로 목적으로 하는 CH1-A와 CL-A의 회합 및 목적으로 하는 CH1-B와 CL-B의 회합은 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산이기 때문에 전하적으로 반발하는 아미노산인 경우에 비해 회합이 일어나기 쉽다. 그 결과, 목적으로 하는 CH1-A와 CL-A의 회합 및 목적으로 하는 CH1-B와 CL-B의 회합이 발생한 항체를 효율적으로 얻을 수 있다. 또한 이 예에 있어서 CL-A와 CH1-B 사이의 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 서로 전하를 띠고 있지 않은 아미노산 또는 비극성 아미노산이 아닌 경우는 서로 전하를 띠고 있지 않은 아미노산 또는 비극성 아미노산이 되도록 개변해도 된다.

또한 CL-B와 CH1-B 사이의 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 서로 전하를 띠고 있지 않은 아미노산 또는 비극성 아미노산인 경우, CH1-A와 CL-A 사이의 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 한쪽을 양전하, 다른 쪽을 음전하를 갖는 아미노산 잔기로 개변하는 예를 들 수 있다. 이 개변에 의해 목적으로 하는 CH1-A와 CL-A의 회합은 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 양전하와 음전하의 조합 때문에 촉진되는 한편으로, 목적으로 하는 CH1-B와 CL-B의 회합은 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산이기 때문에 저해되지 않는다. 그 결과로서, 목적으로 하는 CH1-A와 CL-A의 회합 및 목적으로 하는 CH1-B와 CL-B의 회합이 발생한 항체를 효율적으로 얻을 수 있다. 또한 이 예에 있어서 CL-B와 CH1-B 사이의 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 서로 전하를 띠고 있지 않은 아미노산 또는 비극성 아미노산이 아닌 경우는, 서로 전하를 띠고 있지 않은 아미노산 또는 비극성 아미노산이 되도록 개변해도 된다.

또한 CL-B와 CH1-B 사이의 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 CH1-B에 있어서는 전하를 띠고 있지 않은 아미노산 또는 비극성 아미노산인 경우, CH1-A와 CL-A 사이의 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 한쪽을 양전하, 다른 쪽을 음전하를 갖는 아미노산 잔기로 개변하고, CL-B에 있어서 CL-B와 CH1-B 사이의 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 CH1-A에 가한 개변과 동일한 전하를 갖는 개변을 가하는 예를 들 수 있다. 이 개변에 의해 목적으로 하는 CH1-A와 CL-A의 회합은 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 양전하와 음전하의 조합 때문에 촉진되는 한편으로, 목적으로 하는 CH1-B와 CL-B의 회합은 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산이기 때문에 저해되지 않는다. 그 결과로서 목적으로 하는 CH1-A와 CL-A의 회합 및 목적으로 하는 CH1-B와 CL-B의 회합이 발생한 항체를 효율적으로 얻을 수 있다. 또한 이 예에 있어서 CL-B와 CH1-B 사이의 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 CH1-B에 있어서는 전하를 띠고 있지 않은 아미노산 또는 비극성 아미노산이 아닌 경우는, 전하를 띠고 있지 않은 아미노산 또는 비극성 아미노산이 되도록 개변해도 된다.

또한 본 발명의 회합 제어를 이용함으로써 CH1끼리(CH1-A와 CH1-B) 또는 CL끼리(CL-A와 CL-B)의 회합을 억제하는 것도 가능하다.

당업자라면 본 발명에 의해 회합을 제어하고자 하는 목적하는 폴리펩티드에 대해서 회합했을 때의 CH1과 CL의 계면에 있어서 접근하는 아미노산 잔기의 종류를 적절히 아는 것이 가능하다.

또한 인간, 원숭이, 마우스 및 토끼 등의 생물에 있어서 항체의 CH1 또는 CL로서 이용 가능한 서열을 당업자라면 공공의 데이터베이스 등을 이용하여 적절히 취득할 수 있다. 보다 구체적으로는 후술하는 실시예에 기재된 수단으로 CH1 또는 CL의 아미노산 서열정보를 취득하는 것이 가능하다.

예를 들면 후술하는 실시예에 나타내는 이중 특이성 항체에 대해서는 회합했을 때의 CH1과 CL의 계면에 있어서 접근(상대 도는 접촉)하는 아미노산 잔기의 구체예로서 아래의 조합을 들 수 있다.

·CH1의 EU 넘버링 147번 위치(예를 들면 서열번호：1에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 147번 위치)의 리신(K)과 상대(접촉)하는 CL의 EU 넘버링 180번 위치의 트레오닌(T)

·CH1의 EU 넘버링 147번 위치의 리신(K)과 상대(접촉)하는 CL의 EU 넘버링 131번 위치의 세린(S)

·CH1의 EU 넘버링 175번 위치의 글루타민(Q)과 상대(접촉)하는 CL의 EU 넘버링 160번 위치의 글루타민(Q)

·CH1의 EU 넘버링 213번 위치의 리신(K)과 상대(접촉)하는 CL의 EU 넘버링 123번 위치의 글루타민산(E)

본 발명에 있어서의 EU 넘버링으로서 기재된 번호는 EU numbering(Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242)에 따라 기재한 것이다. 또한 본 발명에 있어서 「EU 넘버링 X번 위치의 아미노산 잔기」, 「EU 넘버링 X번 위치의 아미노산」(X는 임의의 수)은 「EU 넘버링 X번 위치에 상당하는 아미노산 잔기」, 「EU 넘버링 X번 위치에 상당하는 아미노산」으로 대체하는 것도 가능하다.

후술하는 실시예에서 나타내는 바와 같이, 이들 아미노산 잔기를 개변하고 본 발명의 방법을 실시함으로써 목적하는 항체를 우선적으로 취득할 수 있다.

즉, 본 발명은 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항체로서, 당해 항체에 있어서 중쇄와 경쇄에 있어서의 아래의 (a)~(c)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 1조 또는 2조 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기인 항체를 제공한다；

본 발명의 다른 태양으로서 추가로 아래의 (d)에 나타내는 아미노산 잔기의 조의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기인 항체를 제공한다；

상기 항체에 있어서 「서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기」 또는 「동종의 전하를 갖는 아미노산 잔기」는, 예를 들면 아래의 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 조에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 것이 바람직하다；

(X) 글루타민산(E) 또는 아스파라긴산(D),

(Y) 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H).

상기 항체에 있어서 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기로서는 구체적으로는 아래의 아미노산 잔기를 들 수 있다；

·CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 175번 위치의 아미노산 잔기가 리신(K), CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치, 131번 위치 및 160번 위치의 아미노산 잔기가 모두 글루타민산(E)

·CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치 및 175번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민산(E), CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치, 131번 위치 및 160번 위치의 아미노산 잔기가 모두 리신(K)

상기 항체에 있어서 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기로서는, 추가로 CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 213번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민산(E)이고, CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 123번 위치의 아미노산 잔기가 리신(K)을 들 수 있다.

또한 전술한 항체에 대한 제조방법 및 상기 (a)~(d)에 나타내는 아미노산 잔기의 조의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 되도록 개변하는 본 발명의 회합 제어방법도 또한 본 발명의 바람직한 태양이다.

또한 본 발명은 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항체로서, 당해 항체에 있어서 회합하는 중쇄와 경쇄에 있어서의 아래의 (a)~(c)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 1조 또는 2조 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기인 항체를 제공한다；

본 발명의 다른 태양으로서 추가로 아래의 (d)에 나타내는 아미노산 잔기의 조의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기인 항체를 제공한다；

상기 조합에 기재된 각각의 아미노산 잔기는 후술하는 실시예 및 도 1에 나타내는 바와 같이 회합했을 때에 서로 접근해 있다. 당업자라면 목적하는 CH1 또는 CL에 대해서 시판의 소프트웨어를 사용한 호몰로지 모델링 등에 의해 상기 (a)~(d)에 기재된 아미노산 잔기에 대응하는 부위를 찾아낼 수 있어 적절히 그 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.

상기 항체에 있어서 「서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기」는 예를 들면 아래의 (X)~(Z)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 조의 각각으로부터 선택되는 아미노산 잔기로서, 2개의 조가 (X)와 (Y), (X)와 (Z), (Y)와 (Z) 또는 (Z)와 (Z)의 조합으로부터 선택되는 것이 바람직하다；

(X) 글루타민산(E) 또는 아스파라긴산(D)

(Y) 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)

(Z) 알라닌(A), 아스파라긴(N), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글리신(G), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 티로신(Y) 또는 발린(V)

예를 들면 (X)~(Z)로 이루어진 군으로부터 (X)와 (Y)를 선택하고, (X)로부터 글루타민산을 선택하며, (Y)로부터 리신(K)을 선택하여, CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기를 글루타민산(E)으로 개변하고, CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치의 아미노산 잔기를 리신(K)으로 개변하는 경우를 들 수 있다. 이 경우에 있어서, 예를 들면 CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기가 개변 전부터 글루타민산(E)이었던 경우는 개변할 필요는 없다.

상기 항체에 있어서 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기로서는 구체적으로는 아래의 아미노산 잔기를 들 수 있다；

또한 전술한 항체에 대한 제조방법 및 상기 (a)~(d)에 나타내는 아미노산 잔기의 조의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 되도록 개변하는 본 발명의 회합 제어방법도 또한 본 발명의 바람직한 태양이다.

본 발명의 항체에는 중쇄의 제2 정상영역(CH2) 또는 중쇄의 제3 정상영역(CH3)의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 목적으로 하지 않는 중쇄끼리의 회합을 억제하는 기술, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 목적으로 하지 않는 중쇄와 경쇄의 회합을 억제하는 기술, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 계면에 존재하는 소수성 코어를 형성하는 아미노산 잔기를 전하를 갖는 극성 아미노산으로 개변하여 목적으로 하지 않는 중쇄와 경쇄의 회합을 억제하는 기술을 추가로 적용할 수 있다(WO2006/106905 참조).

CH2 또는 CH3의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 의도하지 않는 중쇄끼리의 회합을 억제시키는 기술에 있어서, 중쇄의 다른 정상영역의 계면에서 접촉하는 아미노산 잔기로서는, 예를 들면 CH3영역에 있어서의 377번 위치(356번 위치)와 470번 위치(439번 위치), 378번 위치(357번 위치)와 393번 위치(370번 위치), 427번 위치(399번 위치)와 440번 위치(409번 위치)에 상대하는 영역을 들 수 있다. 항체 정상영역의 넘버링에 대해서는 Kabat 등의 문헌(Kabat EA et al． 1991． Sequences of Proteins of Immunological Interest． NIH)을 참고로 하고 중쇄 정상영역의 넘버링에 대해서는 EU 넘버링을 괄호 안에 나타내었다.

상기 기술과 조합하여 IgG와 Protein A의 결합에 관계하는 부위인 EU 넘버링 435번째의 아미노산 잔기를 Arg 등의 Protein A로의 결합력이 상이한 아미노산으로 개변한다는 기술을 본 발명의 항체에 사용해도 된다. 본 기술을 사용함으로써 H쇄와 Protein A의 상호작용을 변화시키고, Protein A 칼럼을 사용함으로써 헤테로 이량화 항체만을 효율적으로 정제할 수 있다. 또한 본 기술은 상기 기술과 조합하지 않고 단독으로 사용하는 것도 가능하다.

보다 구체적으로는 예를 들면 2종의 중쇄 CH3영역을 포함하는 항체에 있어서는, 제1 중쇄 CH3영역에 있어서의 아래의 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 항체로 할 수 있다；

(1) 중쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기,

(2) 중쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 357번 위치 및 370번 위치의 아미노산 잔기,

(3) 중쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기.

또한 상기 제1 중쇄 CH3영역과는 상이한 제2 중쇄 CH3영역에 있어서의 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 아미노산 잔기의 조로서, 상기 제1 중쇄 CH3영역에 있어서 서로 전하적으로 반발하는 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조에 대응하는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 상기 제1 중쇄 CH3영역에 있어서의 대응하는 아미노산 잔기와는 전하적으로 반발하지 않는 항체로 할 수 있다.

상기 (1)~(3)에 기재된 각각의 아미노산 잔기는 회합했을 때 서로 접근해 있다. 당업자라면 목적하는 중쇄 CH3영역 또는 중쇄 정상영역에 대해서 시판의 소프트웨어를 사용한 호몰로지 모델링 등에 의해 상기 (1)~(3)에 기재된 아미노산 잔기에 대응하는 부위를 찾아낼 수 있어, 적절히 그 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.

상기 항체에 있어서 「전하적으로 반발한다」 또는 「동종의 전하를 갖는다」는 것은, 예를 들면 2개 이상의 아미노산 잔기 모두가 상기 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다. 한편으로 「전하적으로 반발하지 않는」다는 것은 예를 들면 아미노산 잔기가 상기 (X) 또는 (Y), 또는 아래의 (Z)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 조의 각각으로부터 선택되는 아미노산 잔기로서, 2개의 조가 (X)와 (Y), (X)와 (Z), (Y)와 (Z) 또는 (Z)와 (Z)의 조합으로부터 선택되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다.

바람직한 태양에 있어서 상기 항체는 제1 중쇄 CH3영역과 제2 중쇄 CH3영역이 디설피드 결합에 의해 가교되어 있어도 된다.

본 발명에 있어서 「개변」에 제공하는 아미노산 잔기로서는, 전술한 항체의 가변영역 또는 항체의 정상영역의 아미노산 잔기에 한정되지 않는다. 당업자라면 폴리펩티드 변이체 또는 이종 다량체에 대해서 시판의 소프트웨어를 사용한 호몰로지 모델링 등에 의해 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 찾아낼 수 있고, 회합을 제어하도록 그 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다. 호몰로지 모델링이란 시판의 소포트웨어를 사용하여 단백질의 입체구조를 예측하는 수법 중 하나이다. 입체구조가 미지인 단백질의 구조를 구축하는 경우, 먼저 그것에 상동성이 높은 입체구조가 결정되어 있는 단백질을 탐색한다. 다음으로 그 입체구조를 주형(템플레이트)으로 하여 구조가 미지인 단백질의 구조를 구축하고, 추가로 분자 동력학법 등에 의해 구조를 최적화하여 미지의 단백질의 입체구조를 예측하는 수법이다.

중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 목적으로 하지 않는 중쇄와 경쇄의 회합을 억제시키는 기술에 있어서, 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL)의 계면에서 접촉하는 아미노산 잔기로서는, 예를 들면 중쇄 가변영역 상의 kabat 넘버링 39번 위치(FR2영역)의 글루타민(Q)과 상대(접촉)하는 경쇄 가변영역 상의 Kabat 넘버링 38번 위치(FR2영역)의 글루타민(Q)을 들 수 있다. 또한 중쇄 가변영역 상의 Kabat 넘버링 45번 위치(FR2)의 류신(L)과 상대하는 경쇄 가변영역 상의 Kabat 넘버링 44번 위치(FR2)의 프롤린(P)을 적합하게 예시할 수 있다. 또한 이들 부위의 넘버링에 대해서는 Kabat등의 문헌(Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH)을 참고로 하고 있다.

이들 아미노산 잔기는 인간 및 마우스에 있어서 고도로 보존되어 있는 것이 알려져 있는 것으로부터(J. Mol. Recognit. 2003; 16: 113-120), 실시예에 나타내는 항체 이외의 VH와 VL의 회합에 대해서도 상기 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 잔기를 개변함으로써 항체의 가변영역의 회합을 제어할 수 있다.

구체적으로는 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 계면을 형성하는 2 잔기 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기인 항체를 들 수 있다.

보다 구체적으로는 아래의 (a) 또는 (b)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 1조 또는 2조의 아미노산 잔기인 항체를 들 수 있다；

(a) 중쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, (1) Kabat 넘버링 39번 위치의 아미노산 잔기 및 경쇄에 포함되는 아미노산 잔기로서, (2) Kabat 넘버링 38번 위치의 아미노산 잔기,

(b) 중쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, (3) Kabat 넘버링 45번 위치의 아미노산 잔기 및 경쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, (4) Kabat 넘버링 44번 위치의 아미노산 잔기.

상기 (a) 또는 (b)에 기재된 각각의 아미노산 잔기는 회합했을 때 서로 접근해 있다. 당업자라면 목적하는 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역에 대해서 시판의 소프트웨어를 사용한 호몰로지 모델링 등에 의해 상기 (a) 또는 (b)에 기재된 아미노산 잔기에 대응하는 부위를 찾아낼 수 있어, 적절히 그 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.

상기 항체에 있어서 「서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기」란 예를 들면 아래의 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 조에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 것이 바람직하다；

(X) 글루타민산(E) 또는 아스파라긴산(D),

(Y) 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H).

또한 본 발명의 항체의 다른 태양으로서, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 계면을 형성하는 2 잔기 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기인 항체를 들 수 있다. 이러한 항체로서 구체적으로는 상기 (a) 또는 (b)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 1조 또는 2조의 아미노산 잔기인 항체를 들 수 있다.

상기 항체에 있어서 「서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기」란 예를 들면 상기 (X)~(Z)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 조의 각각으로부터 선택되는 아미노산 잔기로서, 2개의 조가 (X)와 (Y), (X)와 (Z), (Y)와 (Z) 또는 (Z)와 (Z)의 조합으로부터 선택되는 것을 의미한다.

상기 (a) 또는 (b)에 기재된 아미노산 잔기는 통상 인간 및 마우스에 있어서는 각각

(1) 글루타민(Q),

(2) 글루타민(Q),

(3) 류신(L),

(4) 프롤린(P)

이다. 따라서 본 발명의 바람직한 태양에 있어서는 이들 아미노산 잔기를 개변(예를 들면 전하를 갖는 아미노산으로의 치환)에 제공한다. 또한 상기 (a) 또는 (b)의 아미노산 잔기의 종류는 반드시 상기 아미노산 잔기에 한정되지 않고, 그 아미노산에 상당하는 다른 아미노산이어도 된다. 예를 들면 경쇄 가변영역 상의 Kabat 넘버링 38번 위치의 아미노산으로서 인간의 경우 예를 들면 히스티딘(H)이어도 된다.

중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 계면에 존재하는 소수성 코어를 형성하는 아미노산 잔기를 전하를 갖는 극성 아미노산으로 개변하고, 목적으로 하지 않는 중쇄와 경쇄의 회합을 억제하는 기술에 있어서 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL)의 계면에서 소수성 코어를 형성할 수 있는 아미노산 잔기로서는, 예를 들면 중쇄 가변영역 상의 Kabat 넘버링 45번 위치(FR2)의 류신(L)과 상대하는 경쇄 가변영역 상의 Kabat 넘버링 44번 위치(FR2)의 프롤린(P)을 적합하게 예시할 수 있다. 또한 이들 부위의 넘버링에 대해서는 Kabat등의 문헌(Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH)을 참고로 하고 있다.

일반적으로 「소수성 코어(hydrophobic core)」란 회합한 폴리펩티드의 내측에 소수성 아미노산의 측쇄가 집합되어 형성하는 부분을 가리킨다. 소수성 아미노산에는 예를 들면 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린 등이 포함된다. 또한 소수 코어의 형성에는 소수성 아미노산 이외의 아미노산 잔기(예를 들면 티로신)가 관여하는 경우도 있다. 이 소수성 코어는 친수성 아미노산의 측쇄가 외측에 노출되는 친수성 표면과 함께 수용성의 폴리펩티드의 회합을 진행시키는 구동력이 된다. 상이한 2개의 도메인의 소수성 아미노산이 분자 표면에 존재하여 수분자에 폭로되면 엔트로피가 증대되어 자유 에너지가 증대되어 버린다. 따라서 2개의 도메인은 자유 에너지를 감소시켜 안정화하기 위해 서로 회합하고 계면의 소수성 아미노산은 분자 내부에 파묻혀 소수 코어를 형성하게 된다.

폴리펩티드의 회합이 일어날 때에 소수성 코어를 형성하는 소수성 아미노산을 전하를 갖는 극성 아미노산으로 개변함으로써, 소수성 코어의 형성이 저해되고 그 결과 폴리펩티드의 회합이 저해되는 것으로 생각된다.

당업자에 있어서는 목적하는 폴리펩티드에 대해서 아미노산 서열을 해석함으로써 소수성 코어 존재의 유무 및 형성 부위(영역) 등을 아는 것이 가능하다. 즉 본 발명의 항체는 예를 들면 계면에 있어서 소수성 코어를 형성할 수 있는 아미노산 잔기를 전하를 갖는 아미노산 잔기로 개변하는 것을 특징으로 하는 항체이다. 보다 구체적으로는 아래의 (1)과 (2) 중 어느 한쪽이 전하를 갖는 아미노산 잔기인 항체를 들 수 있다. 아래의 (1)과 (2)로 나타내는 아미노산 잔기의 측쇄는 근접하여 소수성 코어를 형성할 수 있다.

(1) 중쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, Kabat 넘버링 45번 위치의 아미노산 잔기

(2) 경쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, Kabat 넘버링 44번 위치의 아미노산 잔기

상기 항체에 있어서의 전하를 갖는 아미노산 잔기로서는 바람직하게는 글루타민산(E), 아스파라긴산(D), 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H)을 들 수 있다. 보다 바람직하게는 글루타민산(E), 리신(K)이다.

상기 (1) 및 (2)에 기재된 아미노산 잔기는 통상 인간 및 마우스에 있어서는 각각

(1) 류신(L),

(2) 프롤린(P)

이다. 따라서 본 발명의 바람직한 태양에 있어서는, 이들 아미노산 잔기를 개변(예를 들면 전하를 갖는 아미노산으로의 치환)에 제공한다. 또한 상기 (1) 및 (2)의 아미노산 잔기의 종류는 반드시 상기 아미노산 잔기에 한정되지 않고 그 아미노산에 상당하는 다른 아미노산이어도 된다.

본 발명의 항체에는 추가로 다른 공지기술을 적용할 수 있다. 예를 들면 제1 VH(VH1)와 제1 VL(VL1) 및/또는 제2 VH(VH2)와 제2 VL(VL2)의 회합이 촉진되도록 한쪽 H쇄의 가변영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(knob; 돌기)로 치환하고, 다른 한쪽 H쇄의 상대하는 가변영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(hole; 공극)로 치환함으로써, 돌기가 공극에 배치될 수 있도록 하여 VH1과 VL1 및/또는 VH2와 VL2의 회합을 촉진시켜, 결과적으로 VH1과 VL2 및/또는 VH2와 VL1의 회합을 추가로 억제하는 것이 가능하다(WO1996/027011, Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621, Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681).

예를 들면 인간 IgG1의 경우, 한쪽 H쇄의 CH3영역에 있는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(knob; 돌기)로 하기 위해 Y349C, T366W의 개변을 가하고, 다른 쪽 H쇄의 CH3영역에 있는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄로 하기 위해 D356C, T336S, L368A, Y407V의 개변을 가하는 경우를 들 수 있다.

본 발명의 항체에는 추가로 다른 공지기술을 적용할 수 있다. 항체의 한쪽 H쇄의 CH3의 일부를 그 부분에 대응하는 IgA 유래의 서열로 하고, 다른 한쪽 H쇄의 CH3의 상보적인 부분에 그 부분에 대응하는 IgA 유래의 서열을 도입한 strand-exchange engineered domain CH3를 사용함으로써 목적으로 하는 항체를 CH3의 상보적인 회합화에 의해 효율적으로 제작할 수 있다(Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010).

본 발명의 항체에는 추가로 다른 공지기술을 적용할 수 있다. 이중 특이성 항체의 제작에 있어서, 예를 들면 2종류의 H쇄의 가변영역에 각각 상이한 아미노산 개변을 가함으로써 등전점의 차를 부여하고, 그 등전점의 차를 이용하여 이온 교환 크로마토그래피로 정제함으로써 목적으로 하는 이중 특이성 항체를 제작할 수 있다(WO2007/114325).

본 발명의 개변은 아래와 같은 항체에도 사용할 수 있다. 예를 들면 제1 VH(VH1)와 제1 VL(VL1) 및/또는 제2 VH(VH2)와 제2 VL(VL2)의 회합이 촉진되도록 VH1이 제1 CH1을 매개로 한쪽의 Fc영역에 연결되고 VL1이 제1 CL과 연결되며, VH2가 제2 CL을 매개로 다른 쪽의 Fc영역에 연결되고 VL2가 제2 CH1과 연결된 구조를 갖는 항체를 들 수 있다(WO09/80254).

본 발명의 항체에는 상기 공지기술을 복수, 예를 들면 2개 이상 조합해서 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 상기 공지기술의 개변이 가해진 것을 베이스로 하여 제작한 것이어도 된다.

후술하는 본 발명의 회합 제어방법을 이용함으로써 예를 들면 활성을 갖는 항체 또는 폴리펩티드를 효율적으로 제작할 수 있다. 그 활성으로서는 예를 들면 결합 활성, 중화 활성, 세포 상해 활성, 아고니스트 활성, 안타고니스트 활성, 효소 활성 등을 들 수 있다. 아고니스트 활성이란 수용체 등의 항원에 항체가 결합함으로써 세포 내에 시그날이 전달되거나 하여 어떠한 생리적 활성의 변화를 유도하는 활성이다. 생리적 활성으로서는 예를 들면 증식 활성, 생존 활성, 분화 활성, 전사 활성, 막 수송 활성, 결합 활성, 단백질 분해 활성, 인산화/탈인산화 활성, 산화 환원 활성, 전이 활성, 핵산 분해 활성, 탈수 활성, 세포사 유도 활성, 아포토시스 유도 활성 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다.

또한 본 발명의 방법에 의해 목적하는 항원을 인식하거나 또는 목적하는 수용체와 결합하는 항체 또는 폴리펩티드를 효율적으로 제작할 수 있다.

본 발명의 항원은 특별히 한정되지 않고 어떠한 항원이어도 된다. 항원의 예로서는 예를 들면 수용체 또는 그의 단편, 암항원, MHC 항원, 분화항원 등을 들 수 있는데, 특별히 이들에 제한되지 않는다.

또한 본 발명의 수용체의 예로서는 예를 들면 조혈 인자 수용체 패밀리, 사이토카인 수용체 패밀리, 티로신 키나아제형 수용체 패밀리, 세린/트레오닌 키나아제형 수용체 패밀리, TNF 수용체 패밀리, G 단백질 공액형 수용체 패밀리, GPI 앵커형 수용체 패밀리, 티로신 포스파타아제형 수용체 패밀리, 접착인자 패밀리, 호르몬 수용체 패밀리 등의 수용체 패밀리에 속하는 수용체 등을 들 수 있다. 이들 수용체 패밀리에 속하는 수용체 및 그의 특징에 대해서는 다수의 문헌이 존재하고, 예를 들면 Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehensive Biochemistry Vol.18B "Hormones and their Actions Part II"pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV., New York, USA, Patthy L. (1990) Cell, 61: 13-14., Ullrich A., et al. (1990) Cell, 61: 203-212., Massagul J. (1992) Cell, 69: 1067-1070., Miyajima A., et al. (1992) Annu. Rev. Immunol., 10: 295-331., Taga T. and Kishimoto T. (1992) FASEB J., 7: 3387-3396., Fantl WI., et al. (1993) Annu. Rev. Biochem., 62: 453-481, Smith CA., et al. (1994) Cell, 76: 959-962., Flower DR. (1999) Biochim. Biophys. Acta, 1422: 207-234., 미야사카 마사유키 감수, 세포공학 별책 핸드북 시리즈 「접착인자 핸드북」(1994) (슈쥰사, 동경, 일본) 등을 들 수 있다. 상기 수용체 패밀리에 속하는 구체적인 수용체로서는 예를 들면 인간 또는 마우스 에리트로포에틴(EPO) 수용체, 인간 또는 마우스 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 수용체, 인간 또는 마우스 트롬보포에틴(TPO) 수용체, 인간 또는 마우스 인슐린 수용체, 인간 또는 마우스 Flt-3 리간드 수용체, 인간 또는 마우스 혈소판 유래 증식인자(PDGF) 수용체, 인간 또는 마우스 인터페론(IFN)-α, β 수용체, 인간 또는 마우스 렙틴 수용체, 인간 또는 마우스 성장 호르몬(GH) 수용체, 인간 또는 마우스 인터루킨(IL)-10 수용체, 인간 또는 마우스 인슐린 증식인자(IGF)-I 수용체, 인간 또는 마우스 백혈병 억제인자(LIF) 수용체, 인간 또는 마우스 모양체 신경영양인자(CNTF;ciliary neurotrophic factor) 수용체 등을 예시할 수 있다(hEPOR: Simon, S. et al. (1990) Blood 76, 31-35.; mEPOR: D'Andrea, AD. Et al. (1989) Cell 57, 277-285.; hG-CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 8702-8706.; mG-CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Cell 61, 341-350.; hTPOR: Vigon, I. et al. (1992) 89, 5640-5644.; mTPOR: Skoda, RC. Et al. (1993) 12, 2645-2653.; hInsR: Ullrich, A. et al. (1985) Nature 313, 756-761.; hFlt-3: Small, D. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 459-463.; hPDGFR: Gronwald, RGK. Et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3435-3439.; hIFNα/βR: Uze, G. et al. (1990) Cell 60, 225-234. 및 Novick, D. et al. (1994) Cell 77, 391-400.).

암항원은 세포의 악성화에 수반하여 발현하는 항원으로 종양 특이성 항원으로도 불린다. 또한 세포가 암화되었을 때 세포 표면이나 단백질 분자 상에 나타나는 이상한 당쇄도 암항원으로 암 당쇄 항원으로도 불린다. 암항원의 예로서는 예를 들면 폐암을 비롯한 복수의 암에서 발현하는 EpCAM(Proc Natl Acad Sci U S A. (1989) 86 (1), 27-31)(그 폴리뉴클레오티드 서열은 RefSeq 등록번호 NM_002354.2(서열번호：78)에, 폴리펩티드 서열은 RefSeq 등록번호 NP_002345.2(서열번호：79)에 각각 기재되어 있다.), CA19-9, CA15-3, 시알릴 SSEA-1(SLX) 등을 적합하게 들 수 있다.

MHC 항원에는 MHC class I 항원과 MHC class II 항원으로 크게 구별되고, MHC class I 항원에는 HLA-A,-B,-C,-E,-F,-G,-H가 포함되고 MHC class II 항원에는 HLA-DR,-DQ,-DP가 포함된다.

분자항원에는 CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD71, CD73, CD95, CD102, CD106, CD122, CD126, CDw130 등이 포함된다.

본 발명의 항체는 이중 특이성 항체여도 되고, 그 경우 그 항체가 인식하는 항원(또는 에피토프)은 상기 수용체 또는 그의 단편, 암항원, MHC 항원, 분화항원 등으로부터 임의로 2개를 선택할 수 있다. 예를 들면 수용체 또는 그의 단편으로부터 2개, 암항원으로부터 2개, MHC 항원으로부터 2개, 분화항원으로부터 2개 선택해도 된다. 또한 예를 들면 수용체 또는 그의 단편, 암항원, MHC 항원 및 분화항원으로부터 임의로 선택되는 2개로부터 각각 하나씩 선택해도 된다.

또한 본 발명은 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법의 바람직한 태양으로서는 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항체의 제조방법으로서,

(1) CH1 및 CL을 코드하는 핵산을, 아래의 (a)~(c)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 1조 또는 2조 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 되도록 핵산을 개변하는 공정,

(3) 상기 숙주세포의 배양물로부터 항체를 회수하는 공정.

본 발명의 제조방법의 다른 태양으로서, 상기 제조방법의 공정(1)에 있어서 추가로 아래의 (d)에 나타내는 아미노산 잔기의 조의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 되도록 핵산을 개변하는 공정을 포함하는 항체의 제조방법을 들 수 있다；

또한 본 발명은 상기 공정(1)에 있어서, 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 전술한 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되도록 핵산을 개변하는 공정을 포함하는 제조방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 공정(1)에 있어서, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 계면을 형성하는 2 잔기 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기이도록 핵산을 개변하는 공정을 포함하는 제조방법에 관한 것이다. 여기서 바람직하게는 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기는 예를 들면 아래의 (a) 또는 (b)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1조의 아미노산 잔기이다；

상기 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기는 전술한 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 조에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명의 제조방법의 다른 바람직한 태양으로서는 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항체의 제조방법으로서,

(1) CH1 및 CL을 코드하는 핵산을, 아래의 (a)~(c)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 1조 또는 2조 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 되도록 핵산을 개변하는 공정,

(3) 상기 숙주세포의 배양물로부터 항체를 회수하는 공정

을 포함하는 제조방법을 들 수 있다.

본 발명의 제조방법의 다른 태양으로서, 상기 제조방법의 공정(1)에 있어서 추가로 아래의 (d)에 나타내는 아미노산 잔기의 조의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 되도록 핵산을 개변하는 공정을 포함하는 항체의 제조방법을 들 수 있다.；

또한 본 발명은 상기 공정(1)에 있어서, 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 전술한 (X)~(Z)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 조의 각각으로부터 선택되는 아미노산 잔기로서, 2개의 조가 (X)와 (Y), (X)와 (Z), (Y)와 (Z) 또는 (Z)와 (Z)의 조합으로부터 선택되도록 핵산을 개변하는 공정을 포함하는 제조방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 공정(1)에 있어서 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기로서 구체적으로 아래의 아미노산 잔기를 들 수 있다.

또한 CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 213번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민산(E)이고, CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 123번 위치의 아미노산 잔기가 리신(K)을 들 수 있다.

또한 본 발명은 상기 공정(1)에 있어서, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 계면을 형성하는 2 잔기 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기이도록 핵산을 개변하는 공정을 포함하는 제조방법에 관한 것이다. 여기서 바람직하게는 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기는 예를 들면 아래의 (a) 또는 (b)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1조의 아미노산 잔기이다；

상기 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기는 전술한 (X)~(Z)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 조의 각각으로부터 선택되는 아미노산 잔기로서, 2개의 조가 (X)와 (Y), (X)와 (Z), (Y)와 (Z) 또는 (Z)와 (Z)의 조합으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 항체의 중쇄와 경쇄의 회합 제어방법을 제공한다.

본 발명의 회합 제어방법의 바람직한 태양으로서는, 항체의 중쇄와 경쇄의 회합 제어방법으로서 아래의 (a)~(c)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 1조 또는 2조 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 되도록 핵산을 개변하는 것을 포함하는 방법；

본 발명의 다른 태양으로서, 추가로 아래의 (d)에 나타내는 아미노산 잔기의 조의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 되도록 핵산을 개변하는 것을 포함하는 항체의 회합 제어방법을 제공한다；

본 발명의 회합 제어방법의 다른 바람직한 태양으로서는, 항체의 중쇄와 경쇄의 회합 제어방법으로서 아래의 (a)~(c)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 1조 또는 2조 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 되도록 핵산을 개변하는 것을 포함하는 방법；

본 발명의 다른 태양으로서, 추가로 아래의 (d)에 나타내는 아미노산 잔기의 조의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않는 아미노산 잔기가 되도록 핵산을 개변하는 것을 포함하는 항체의 회합 제어방법을 제공한다；

본 발명의 회합 제어방법에 의해 전술한 바와 같이 예를 들면 목적하는 이중 특이성 항체를 우선적이며 효율적으로 취득할 수 있다. 즉, 모노머 혼합물로부터 목적하는 이종 다량체인 이중 특이성 항체를 효율적으로 형성시킬 수 있다.

본 발명의 상기 방법에 있어서 「핵산을 개변한다」는 것은 본 발명에 있어서의 「개변」에 의해 도입되는 아미노산 잔기에 대응하도록 핵산을 개변하는 것을 말한다. 보다 구체적으로는 원래(개변 전)의 아미노산 잔기를 코드하는 핵산에 대해서 개변에 의해 도입되는 아미노산 잔기를 코드하는 핵산으로 개변하는 것을 말한다. 통상 목적의 아미노산 잔기를 코드하는 코돈이 되도록 원래의 핵산에 대해 1염기 이상을 삽입, 결실 또는 치환하는 유전자 조작 또는 변이 처리를 행하는 것을 의미한다. 즉, 원래의 아미노산 잔기를 코드하는 코돈은 개변에 의해 도입되는 아미노산 잔기를 코드하는 코돈에 의해 치환된다. 이러한 핵산의 개변은 당업자에 있어서는 공지의 기술, 예를 들면 부위 특이적 변이 유발법, PCR 변이 도입법 등을 사용하여 적절히 실시하는 것이 가능하다.

또한 본 발명은 본 발명의 항체를 코드하는 핵산을 제공한다. 추가로 그 핵산을 담지하는 벡터도 또한 본 발명에 포함된다.

본 발명에 있어서의 핵산은 통상 적당한 벡터로 담지(삽입)되어 숙주세포로 도입된다. 그 벡터로서는 삽입한 핵산을 안정하게 보유하는 것이라면 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 숙주에 대장균을 사용하는 것이라면 클로닝용 벡터로서는 pBluescript 벡터(Stratagene사 제조) 등이 바람직하나 시판의 각종 벡터를 이용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 생산할 목적에서 벡터를 사용하는 경우에는 특히 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로서는 시험관 내, 대장균 내, 배양세포 내, 생물개체 내에서 폴리펩티드를 발현하는 벡터라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면 시험관 내 발현이라면 pBEST 벡터(프로메가사 제조), 대장균이라면 pET 벡터(Invitrogen사 제조), 배양세포라면 pME18S-FL3 벡터(GenBank Accession No. AB009864), 생물개체라면 pME18S 벡터(Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)) 등이 바람직하다. 벡터로의 본 발명의 DNA의 삽입은 예를 들면 In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit(클론테크사 제조)를 사용해서 행할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 핵산을 갖는 숙주세포를 제공한다. 그 숙주세포는 특별히 제한되지 않고 목적에 따라 예를 들면 대장균이나 각종 동물세포 등의 각종 숙주세포가 사용된다. 숙주세포는 예를 들면 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드의 제조나 발현을 위한 생산계로서 사용할 수 있다. 폴리펩티드 제조를 위한 생산계에는 in vitro 및 in vivo의 생산계가 있다. in vitro의 생산계로서는 진핵세포를 사용하는 생산계 및 원핵세포를 사용하는 생산계를 들 수 있다.

숙주세포로서 사용할 수 있는 진핵세포로서 예를 들면 동물세포, 식물세포, 진균세포를 들 수 있다. 동물세포로서는 포유류세포, 예를 들면 CHO(J. Exp. Med. (1995) 108: 945), COS, 3T3, 골수종, BHK(baby hamster kidney), HeLa, C127, HEK293, Bowes 흑색종 세포, Vero 등 양서류세포, 예를 들면 아프리카발톱개구리 난모세포(Valle et al., Nature (1981) 291: 338-340) 및 곤충세포, 예를 들면 드로소필라 S2, Sf9, Sf21, Tn5가 예시된다. 본 발명의 항체의 발현에 있어서는 CHO-DG44, CHO-DX11B, COS7 세포, BHK 세포가 적합하게 사용된다. 동물세포에 있어서 대량 발현을 목적으로 하는 경우에는 특히 CHO 세포가 바람직하다.

숙주세포로의 벡터의 도입은 예를 들면 인산칼슘법, DEAE 덱스트란법, 양이온성 리포솜 DOTAP(Boehringer Mannheim 제조)를 사용한 방법, 전기천공법(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9), 리포펙션, 리포펙타민법(GIBCO-BRL사 제조), 마이크로인젝션법 등의 공지의 방법으로 행하는 것이 가능하다. 또한 Free Style 293 Expression System(Invitrogen사 제조)을 사용하여 유전자 도입부터 폴리펩티드의 발현까지를 행하는 것도 가능하다.

식물세포로서는 예를 들면 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 유래의 세포가 단백질 생산계로서 알려져 있어, 이 세포를 캘러스 배양하는 방법에 의해 본 발명의 항체를 생산시킬 수 있다.

진균세포로서는 효모 예를 들면 사카로마이세스(Saccharomyces)속의 세포(사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 폼베(Saccharomyces pombe) 등) 및 사상균 예를 들면 아스퍼질러스(Aspergillus)속의 세포(아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 등)를 사용한 단백질 발현계가 공지로서 본 발명의 항체 생산의 숙주로서 이용할 수 있다.

원핵세포를 사용하는 경우, 세균세포를 사용하는 생산계가 있다. 세균세포로서는 전술한 대장균(E. coli)에 더하여 스트렙토코커스, 스타필로코커스, 대장균, 스트렙토마이세스, 고초균을 사용한 생산계가 알려져 있어 본 발명의 항체 생산에 이용할 수 있다.

본 발명의 숙주세포를 사용하여 항체를 생산하는 경우, 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포의 배양을 행하여 폴리뉴클레오티드를 발현시키면 된다. 배양은 공지의 방법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면 동물세포를 숙주로 한 경우, 배양액으로서 예를 들면 DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM을 사용할 수 있다. 그때 FBS, 소태아 혈청(FCS) 등의 혈청 보액을 병용해도 되고 무혈청 배양으로 세포를 배양해도 된다. 배양시의 pH는 약 6~8로 하는 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 30~40℃에서 약 15~200시간 행하고 필요에 따라 배지의 교환, 통기, 교반을 가한다.

한편 in vivo에서 폴리펩티드를 생산시키는 계로서는, 예를 들면 동물을 사용하는 생산계나 식물을 사용하는 생산계를 들 수 있다. 이들 동물 또는 식물에 목적으로 하는 폴리뉴클레오티드를 도입하고 동물 또는 식물의 체내에서 폴리펩티드를 생산시켜 회수한다. 본 발명에 있어서의 「숙주」란 이들 동물, 식물을 포함한다.

숙주세포에 있어서 발현한 폴리펩티드를 소포체의 내강에 세포 주변강에 또는 세포외의 환경으로 분비시키기 위해 적당한 분비 시그날을 목적의 폴리펩티드에 삽입할 수 있다. 이들 시그날은 목적의 폴리펩티드에 대해 내인성이어도 되고 이종 시그날이어도 된다.

상기 제조방법에 있어서의 폴리펩티드의 회수는 본 발명의 폴리펩티드가 배지에 분비되는 경우는 배지를 회수한다. 본 발명의 폴리펩티드가 세포내에 생산되는 경우는 그 세포를 먼저 용해하고 그 다음에 폴리펩티드를 회수한다.

동물을 사용하는 경우 포유류동물, 곤충을 사용하는 생산계가 있다. 포유류동물로서는 염소, 돼지, 양, 마우스, 소 등을 사용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)). 또한 포유류동물을 사용하는 경우 형질전환 동물을 사용할 수 있다.

예를 들면 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 염소 β카제인과 같은 유즙 중에 고유하게 생산되는 폴리펩티드를 코드하는 유전자와의 융합 유전자로서 조제한다. 이어서 이 융합 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 염소의 배(胚)로 주입하고 이 배를 암컷의 염소로 이식한다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 형질전환 염소 또는 그의 자손이 생산하는 유즙으로부터 목적의 항체를 얻을 수 있다. 형질전환 염소로부터 생산되는 항체를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해 적절히 호르몬을 형질전환 염소에 투여해도 된다(Ebert et al., Bio/Technology (1994) 12: 699-702).

또한 본 발명의 항체를 생산시키는 곤충으로서는 예를 들면 누에를 사용할 수 있다. 누에를 사용하는 경우, 목적의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 삽입한 바큘로바이러스를 누에에 감염시킴으로써 이 누에의 체액으로부터 목적의 항체를 얻을 수 있다(Susumu et al., Nature (1985) 315: 592-4).

또한 식물을 본 발명의 항체 생산에 사용하는 경우 예를 들면 담배를 사용할 수 있다. 담배를 사용하는 경우, 목적으로 하는 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 식물 발현용 벡터, 예를 들면 pMON 530에 삽입하고 이 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테리아를 담배, 예를 들면 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)에 감염시켜 본 담뱃잎으로부터 목적하는 항체를 얻을 수 있다(Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131-8).

이와 같이 하여 얻어진 항체는 숙주세포 내 또는 세포외(배지, 유즙 등)로부터 단리하여 실질적으로 순수하고 균일한 항체로서 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상의 폴리펩티드의 정제에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 되고, 조금도 한정되는 것은 아니다. 예를 들면 황산 암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매 침전, 용매 추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적절히 선택 조합해서 항체를 분리, 정제할 수 있다.

크로마토그래피로서는 예를 들면 친화성 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피 등의 이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성(상호작용) 크로마토그래피, 겔여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피 등을 들 수 있다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al.(1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press). 이들 크로마토그래피는 액상 크로마토그래피, 예를 들면 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 사용해서 행할 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로서는 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들면 프로테인 A를 사용한 칼럼으로서 Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia 제조) 등을 들 수 있다.

필요에 따라 항체의 정제 전 또는 정제 후에 적당한 단백질 수식 효소를 작용시킴으로써 임의로 수식을 가하거나 부분적으로 펩티드를 제거하는 것도 가능하다. 단백질 수식 효소로서는, 예를 들면 트립신, 키모트립신, 리실 엔도펩티다아제, 프로테인 키나아제, 글루코시다아제 등이 사용된다.

전술한 바와 같이 본 발명의 숙주세포를 배양하고, 그 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 공정을 포함하는 본 발명의 항체의 제조방법도 또한 본 발명의 바람직한 태양 중 하나이다.

또한 본 발명은 본 발명의 항체 및 의약적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물(약제)에 관한 것이다. 본 발명에 있어서 의약 조성물이란 통상 질환의 치료 또는 예방, 또는 검사·진단을 위한 약제를 말한다.

본 발명의 의약 조성물은 당업자에게 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 또한 필요에 따라 본 발명의 항체를 그 밖의 의약 성분과 조합해서 제제화하는 것도 가능하다. 예를 들면 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용 가능한 액과의 무균성 용액 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적절히 조합하여 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화함으로써 제제화하는 것을 생각할 수 있다. 이들 제제에 있어서의 유효 성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 설정한다.

주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 사용하여 통상의 제제 실시에 따라서 처방할 수 있다.

주사용 수용액으로서는 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조제(예를 들면 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨)를 포함하는 등장액을 들 수 있다. 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80(TM), HCO-50 등)를 병용해도 된다.

유성액으로서는 참기름, 대두유를 들 수 있고, 용해 보조제로서 안식향산 벤질 및/또는 벤질알코올을 병용해도 된다. 또한 완충제(예를 들면 인산염 완충액 및 초산나트륨 완충액), 무통화제(예를 들면 염산프로카인), 안정제(예를 들면 벤질알코올 및 페놀), 산화방지제와 배합해도 된다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전한다.

본 발명의 의약 조성물은 바람직하게는 비경구 투여에 의해 투여된다. 예를 들면 주사제형, 경비 투여제형, 경폐 투여제형, 경피 투여제형의 조성물로 할 수 있다. 예를 들면 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다.

투여방법은 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 선택할 수 있다. 항체 또는 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 의약 조성물의 투여량은 예를 들면 1회 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎ 내지 1000 ㎎의 범위로 설정하는 것이 가능하다. 또는 예를 들면 환자당 0.001~100000 ㎎의 투여량으로 하는 것도 가능하나, 본 발명은 이들 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량 및 투여방법은 환자의 체중, 연령, 증상 등에 따라 변동되나, 당업자라면 그들의 조건을 고려하여 적당한 투여량 및 투여방법을 설정하는 것이 가능하다.

또한 본 발명에서 기재되어 있는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산은 번역 후에 수식(예를 들면 N말단의 글루타민의 피로글루타밀화에 의한 피로글루타민산으로의 수식은 당업자에게 잘 알려진 수식이다)을 받는 경우도 있으나, 그와 같이 아미노산이 번역 후 수식된 경우라도 당연히 본 발명에서 기재되어 있는 아미노산 서열에 포함된다.

또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로써 본 명세서에 포함된다.

실시예

아래에 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.

〔실시예 1〕CH1/CL의 계면을 제어하는 개소의 탐색

이중 특이성 항체 각각의 CH1과 CL 도메인에 변이를 도입하고 CH1/CL의 계면의 전하를 이용하여 CH1/CL의 계면을 제어함으로써 항원 A에 대한 H쇄와 L쇄만이 회합하고, 항원 B에 대한 H쇄와 L쇄만이 각각 특이적으로 회합하는 것을 생각하였다. 이하 CH1/CL 계면 제어라 기재한다. 이에 결정 구조 모델로부터 CH1/CL 계면 제어가 가능한 개소를 탐색하였다. 아미노산은 소수성 상호작용, 전하적 상호작용, 수소결합 등에 의해 측쇄 사이의 상호작용을 유지하고 있다. 이들 상호작용은 약 4Å의 범위 내에 존재하는 측쇄 사이에 발생하는 것이 알려져 있다. 이에 PDB 모델 1HZH로부터 CH1과 CL의 계면에 있어서 CH1에 존재하는 아미노산과 CL에 있는 아미노산의 거리가 약 4Å인 아미노산을 찾아내었다. 찾아낸 아미노산의 개소를 도 1, 표 1(개변 개소의 정리)에 각각 정리하였다. 표 1에 기재된 아미노산 번호는 EU numbering(Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242)에 따라 기재하였다. 또한 이하의 아미노산 번호도 EU numbering에 따라서 기재하였다. 본 실시예에서는 H쇄는 IgG1, L쇄는 IgK(Kappa)를 사용하였다.

아미노산의 전하를 이용하여 CH1/CL 계면 제어를 행하기 위해, H쇄의 CH1, 또는 L쇄의 CL에 표 1에서 찾아낸 아미노산을 양전하인 Lys 또는 His, 음전하인 Glu 또는 Asp로 치환하였다. 구체적으로는 인간의 G1d(서열번호：1)의 CH1의 아미노산을 양전하인 Lys로 치환한 TH2, TH11, 음전하인 Glu 또는 Asp로 치환한 TH1, TH3, TH4, TH9, TH10, TH12로 각각 치환한 정상영역을 제작하였다. 마찬가지로 인간의 CL(서열번호：13)의 아미노산을 양전하인 Lys로 치환한 TL2, TL4, TL5, TL6, TL8, TL12, His로 치환한 TL11, 음전하인 Glu 또는 Asp로 치환한 TL1, TL3, TL7, TL9, TL10, TL13으로 각각 치환한 정상영역을 제작하였다. 제작한 정상영역의 이름(name), 변이 개소(mutation), 서열번호를 표 2(개변 개소의 정리)에 정리하였다.

〔실시예 2〕CH1/CL 계면 제어를 실시하는 개소의 스크리닝 방법, 각 항체의 제작 및 분석

찾아낸 아미노산의 CH1/CL 계면 제어의 효과를 아래의 방법을 사용하여 확인하였다. Anti-GPC3 항체를 사용하여 스크리닝하는 것으로 하였다. 먼저 H쇄, L쇄의 발현 벡터를 구축하였다. H쇄로서 가변영역인 GpH7(서열번호：34)과 실시예 1에서 제작한 H쇄의 정상영역을 가지고 있는 H쇄의 발현 벡터, L쇄로서 가변영역인 GpL16(서열번호:35)과 실시예 1에서 제작한 L쇄의 정상영역을 가지고 있는 L쇄의 발현 벡터를 각각 참고실시예 1에 따라서 구축하였다. 다음으로 제작한 H쇄, L쇄의 발현 벡터의 조합을 아래와 같이 선택하였다. 실시예 1에서 제작한 정상영역 중 찾아낸 개소의 아미노산이 양의 전하 또는 음의 전하를 가지고 있는 H쇄를 하나 선택하였다. 이 경우 반드시 변이가 도입되어 있다고는 할 수 없다. 예를 들면 TH1의 147번째는 Glu로 치환되어 있는데, G1d는 147번째의 아미노산은 Lys이고, 원래 양전하를 가지고 있기 때문에 변이는 도입되어 있지 않다. 다음으로 선택한 H쇄의 CH1의 변이 개소와 표 1에 있어서 대응하고 있는 개소에 변이를 갖는 L쇄를 표 2로부터 선택하였다. 예를 들면 CH1의 147번째의 아미노산과 CL의 180번째의 아미노산이 CH1/CL의 계면에 있어서 대응하고 있는 것으로 예상되기 때문에, H쇄로서 TH1을 선택한 경우 L쇄로서 TL1, TL2를 선택하였다. 계속해서 선택한 1개의 H쇄에 대해 선택한 2개의 L쇄를 혼합하여 참고실시예 1에 따라서 항체를 발현시켰다. 마지막으로 발현시킨 항체를 참고실시예 3 또는 4에 따라서 분석하고, 각 항체의 발현비율에 따라 CH1/CL 계면 제어에 효과가 있는 개변을 스크리닝하였다. H쇄 1종류와 L쇄 2종류를 혼합하여 발현한 경우, IgG는 H쇄 2개와 L쇄 2개의 복합체로 되어 있기 때문에 3개의 조합이 발현할 것으로 예상된다. 예를 들면 H쇄로서 TH1과 L쇄로서 TL1과 TL2의 조합을 발현시킨 경우,

H쇄_1：H쇄_2：L쇄_1：L쇄_2＝TH1:TH1:TL1:TL1(이를 TH1/TL1으로 표기한다),

H쇄_1：H쇄_2：L쇄_1：L쇄_2＝TH1:TH1:TL1:TL2(이를 TH1/TL1_TL2로 표기한다),

H쇄_1：H쇄_2：L쇄_1：L쇄_2＝TH1:TH1:TL2:TL2(이를 TH1/TL2로 표기한다)

의 3개의 조합이 발현된다(도 2). H쇄와 L쇄의 회합에 선택성이 없는 경우 2개의 L쇄가 등량으로 들어 있기 때문에 TH1/TL1, TH1/TL1_TL2, TH1/TL2＝1:2:1의 비율로 발현될 것으로 예상된다. 그러나 CH1/CL의 계면에 있어서 H쇄가 어느 한쪽의 L쇄와만 우선적으로 결합하는 경우, 그 조합만이 우선적으로 발현될 것으로 생각된다. 예를 들면 H쇄로서 TH1, L쇄로서 TL1 및 TL2를 발현시켰을 때, CH1의 147번째의 아미노산과 CL의 180번째의 아미노산이 CH1/CL의 계면에 있어서 관여하고 있는 경우, CH1의 147번째의 아미노산이 Glu(음전하)인 TH1과 L쇄의 CL의 180번째의 아미노산이 Lys(양전하)인 TL2와의 조합이 우선적으로 발현될 것으로 예상된다. 그러나 CH1의 147번째의 아미노산과 CL의 180번째의 아미노산이 CH1/CL의 계면에 있어서 관여하고 있지 않은 경우, H쇄와 L쇄의 회합에 선택성이 생기지 않기 때문에 TH1/TL1, TH1/TL1_TL2, TH1/TL2＝1:2:1의 비율로 발현될 것으로 예상된다. 이와 같이 H쇄 1종류와 L쇄 2종류를 혼합하여 발현되고, 그 발현 밸런스를 지표로 하여 CH1/CL 계면 제어의 효과가 있는 개변(CH1/CL의 계면에 있어서 관여하고 있는 개변)을 스크리닝하는 것으로 하였다.

H쇄와 L쇄의 조합을 표 3(발현에 사용한 H쇄, L쇄의 조합. H쇄, L쇄 변이 장소도 기재)에 정리하였다.

이 표 3의 조합에 따라서 항체의 발현을 실시하고 선택한 CH1/CL 계면 제어의 효과를 확인하였다. 이때 1종류의 H쇄와 1종류의 L쇄의 항체도 동시에 발현시켜 분석할 때의 대조로 하였다. 항체의 발현은 참고실시예 1의 방법에 따라서 행하였다.

제작한 항체를 참고실시예 3의 방법에 따라 AIEX 분석을 행하였다. AIEX 분석 데이터를 도 3에 정리하였다. AIEX 분석에서는 음이온 교환 칼럼을 사용하고 있기 때문에 음전하를 띠고 있는 항체 쪽이 빠르게 용출된다. 분석한 데이터를 표 4에 정리해서 기재하였다. 용출시간이 빠른 peak의 순번으로 각각 peak1, 2, 3로 하였다. 각 peak 면적의 합계를 100%로 하여 각각의 peak의 비율을 산출하였다.

도 2에서 나타낸 바와 같이 변이를 도입한 개소가 전하적으로 상호작용하고 있는 경우, 회색으로 칠한 peak 위치의 항체의 비율이 많아진다. 즉, 회색으로 칠한 항체의 비율이 25%보다 많은 변이 개소는 전하적으로 상호작용하고 있는 것으로 생각된다.

이와 같이 다양한 개변 개소의 검토를 행한 결과, H쇄에 있어서 147, 175, 213번째, L쇄에 있어서 123, 131, 160, 180번째가 CH1/CL 계면 제어에 효과가 있는 것으로 생각되었다. 또한 WO2006/106905, WO2007/147901에 있어서 보고되어 있는 H쇄의 147번째와 L쇄의 123번째의 개변만의 경우는 H쇄와 L쇄를 특이적으로 회합시키기에는 불충분하고, 본 실시예에서 찾아낸 개변을 조합시킴으로써 비로소 가능한 것이 발견되었다.

〔실시예 3〕개변 개소를 조합한 항체의 제작과 분석

실시예 2에서 찾아낸 CH1/CL 계면 제어의 효과가 큰 것으로 생각된 CH1에 있는 K147, Q175, K213의 개소와, CL에 있는 E123, S131, Q160, T180의 개소를 조합하여 CH1/CL 계면 제어를 보다 효율적으로 행하는 것을 생각하였다. 제작한 항체의 개변의 조합과 발현된 항체에 대해서 표 5(개변 개소의 정리)에 정리하였다.

변이를 도입한 H쇄 또는 L쇄의 발현 벡터의 제작 및 항체의 발현은 참고실시예 1, 제작한 항체의 분석은 참고실시예 3 또는 4의 방법에 따라서 행하였다. 결과를 표 6에 정리하였다.

표 4와 표 6을 비교하면, 개변을 하나 도입한 경우와 비교하여 개변을 조합함으로써 목적으로 하는 H쇄와 L쇄의 조합 비율이 증가한 것을 알 수 있었다. 이 사실로부터 개변을 조합함으로써 목적으로 한 H쇄와 L쇄만이 회합한 항체를 효율적으로 제작할 수 있을 것으로 생각된다.

〔실시예 4〕이중 특이성 항체의 발현과 분석

실시예 3 중에서 CH1/CL 계면 제어의 효과가 컸던 H쇄의 TH2, TH13, TH15, L쇄의 TL16, TL17, TL19, TL20에 대해서 이중 특이성 항체, Bispecific Ab를 제작하는 것을 생각하였다. 본 실시예에서는 Anti-IL6R 항체와 Anti-GPC3 항체를 사용하여 이중 특이성 항체를 제작하는 것으로 하였다.

Anti-IL6R을 인식하는 H쇄(서열번호：59)와 L쇄(서열번호：60), Anti-GPC3를 인식하는 H쇄(서열번호：61)와 L쇄(서열번호：62)의 정상영역을 H쇄의 정상영역은 TH2, TH13, TH15, L쇄의 CL은 TL16, TL17, TL19, TL20로 치환하였다. 또한 H쇄끼리의 회합을 피하기 위해 Knob into Hole(KiH)(WO 96/27011)의 개변을 도입한 H쇄를 제작하였다. 제작한 이들 항체의 변이 개소, 발현된 항체는 표 7(각 이중 특이성 항체의 H쇄, L쇄의 조합)에 정리하였다.

상기 표 7에 있어서, H쇄에 Knob(돌기)의 개변을 도입한 정상영역에는 개변체명에 이어서 「k」를, Hole(공극)의 개변을 도입한 정상영역에는 개변체명에 이어서 「h」를 붙였다. 예를 들면 TH1k는 TH1의 변이에 더하여 knob의 개변이, TH1h는 TH1의 변이에 더하여 Hole의 개변이 도입되어 있다. 변이를 도입한 H쇄 또는 L쇄의 발현 벡터의 제작 및 항체의 발현은 참고실시예 1, 제작한 항체의 분석은 참고실시예 4에 나타낸 CIEX 분석법에 따라 행하였다.

이중 특이성 항체에 사용하는 Anti-IL6R 항체와 Anti-GPC3 항체의 H쇄와 L쇄의 조합을 표 8에 정리하였다.

여기서는 4ch_001, 4ch_002, 4ch_003, 4ch_004, 4ch_011, 4ch_012를 예로서 각 조합을 설명한다. CH1/CL 계면 제어의 개변은 표 8에 정리하였다.

4ch_001은 CH1/CL 계면 제어 및 KiH의 개변이 도입되어 있지 않은 H쇄, L쇄를 사용하여 발현시켰다. 4ch_002는 KiH의 개변이 도입되어 있는 H쇄, L쇄를 사용하여 발현시켰다. 4ch_003은 CH1/CL 계면 제어 개변이 도입되어 있는 H쇄, L쇄를 사용하여 발현시켰다. 4ch_004는 KiH의 개변과 CH1/CL 계면 제어 개변이 도입되어 있는 H쇄, L쇄를 사용하여 발현시켰다. 또한 4ch_011은 KiH의 개변과 CH1/CL 계면 제어 개변이 도입되어 있는 Anti-IL6R 항체의 H쇄와 Anti-GPC3 항체의 H쇄, CH1/CL 계면 제어의 개변이 도입된 Anti-IL6R 항체의 L쇄를 사용하여 발현시켰다. 4ch_012는 KiH의 개변과 CH1/CL 계면 제어 개변이 도입되어 있는 Anti-IL6R 항체의 H쇄와 Anti-GPC3 항체의 H쇄, CH1/CL 계면 제어의 개변이 도입된 Anti-GPC3 항체의 L쇄를 사용하여 발현시켰다. 각각의 항체를 참고실시예 1에 따라서 발현시키고 참고실시예 4에 따라서 CIEX 분석을 실시하여, 그 결과를 도 9a 및 9b에 정리하였다. Anti-IL6R 항체의 H쇄 가변영역을 사용한 경우는 MH0, Anti-GPC3 항체의 H쇄 가변영역을 사용한 경우는 GpH7, Anti-IL6R 항체의 L쇄 가변영역을 사용한 경우는 ML0, Anti-GPC3 항체의 L쇄 가변영역을 사용한 경우는 GpL16으로 기재하였다. CH1/CL 계면 제어 및 KiH의 개변이 도입되어 있지 않은 4ch_001은 H쇄와 L쇄의 다양한 조합으로 생각되는 헤테로 성분이 크로마토그래피 상에서 복수 검출되었다. 그것에 대해 KiH의 개변을 도입한 4ch_002는 H쇄끼리의 회합이 억제되었기 때문에 불순물로 생각되는 크로마토그래피 상의 peak의 수가 감소하였다. 또한 CH1/CL 계면 제어의 개변을 도입한 H쇄의 TH2, TH13, L쇄의 TL16, TL17을 사용한 4ch_003은 H쇄와 L쇄의 회합이 억제되었기 때문에 불순물로 생각되는 크로마토그래피 상의 peak의 수가 감소하였다. 또한 KiH와 CH1/CL 계면 제어의 개변을 조합한 4ch_004에 관하여는 대부분이 메인 peak인 것이 명확해졌다. 4ch_004의 크로마토그래피 상의 peak와 4ch_011의 크로마토그래피 상의 peak가 거의 일치하고 있는 것은 각각의 항체의 등전점(pI)이 가깝기 때문에 크로마토그래피 상에서 분리되어 있지 않은 것으로 생각된다. 4ch_003, 4ch_004, 4ch_011, 4ch_012와 동일한 방법으로 4ch_004와는 상이한 CH1/CL 계면 제어를 가한 4ch_005, 4ch_006, 4ch_015, 4ch_016, 또한 4ch_004에 도입한 CH1/CL 계면 제어의 개변을 Anti-GPC3 항체와 Anti-IL6R 항체 사이에서 교환한 4ch_007, 4ch_008, 4ch_013, 4ch_014, 또한 4ch_006에 도입한 CH1/CL 계면 제어의 개변을 Anti-GPC3 항체와 Anti-IL6R 항체 사이에서 교환한 4ch_009, 4ch_010, 4ch_017, 4ch_018에 대해서도 검토를 실시하였다. 그 결과 4ch_001과 비교하면 크로마토그래피 상의 헤테로 성분이 대폭 감소하였다.

이상으로부터 CH1/CL 계면 제어 개변과 KiH의 개변을 조합함으로써 효율적으로 이중 특이성 항체를 제작하는 것이 명확해졌다.

〔실시예 5〕상이한 항체를 사용한 CH1/CL 계면 제어 개변의 효과

실시예 4로부터 CH1/CL을 사용한 계면 제어가 이중 특이성 항체를 제작하는데 유용한 것이 명확해졌다. 이에 Anti-CD3 항체인 M12(H쇄, 서열번호：54, L쇄, 서열번호：57)와, Anti-GPC3인 GC33(2)(H쇄, 서열번호：55, L쇄, 서열번호：58)을 사용하여 CH1/CL 계면 제어의 효과를 확인하였다. 실시예 4와 마찬가지로 CH1/CL 계면 제어의 효과가 컸던 H쇄의 TH2, TH13, TH15, L쇄의 TL16, TL17, TL19를 사용하여 이중 특이성 항체를 제작하는 것으로 하였다.

CD3를 인식하는 항체인 M12의 H쇄(서열번호：54)와 L쇄(서열번호：57), GPC3를 인식하는 항체 GC33(2)의 H쇄(서열번호：55)와 L쇄(서열번호：58)의 정상영역을 H쇄의 CH1은 TH2, TH13, TH15, L쇄의 CL은 TL16, TL17, TL19로 치환하였다. 또한 H쇄끼리의 회합을 피하기 위해 Knob into Hole(KiH)(특허문헌 1)의 개변을 도입한 H쇄를 제작하였다. 제작한 이들 항체의 변이 개소, 발현된 항체는 표 9(개변 개소의 정리)에 정리하였다.

변이를 도입한 H쇄 또는 L쇄의 발현 벡터의 제작 및 항체의 발현은 참고실시예 1, 제작한 항체의 분석은 참고실시예 4에 나타낸 CIEX 분석법에 따라 행하였다.

Anti-CD3와 Anti-GPC3 항체를 사용해도 CH1/CL 계면 제어는 이중 특이성 항체를 제작하는데 유용한 것이 명확하다.

〔실시예 6〕CH1/CL 계면 제어와 가변영역의 계면 제어의 조합

이중 특이성 항체를 조제할 때 목적으로 한 H쇄와 L쇄만을 특이적으로 회합시키는 기술로서 가변영역의 VH와 VL에 전하적인 반발을 도입하는 기술이 알려져 있다(특허문헌 WO 2006/106905). 이에 목적 성분만을 보다 효율적으로 발현시키기 위해 CH1/CL 계면 제어에 더하여 H쇄와 L쇄를 가변영역끼리 반발시키는 것을 생각하였다. 이를 VH/VL 계면 제어라 한다. Anti-IL6R의 H쇄의 Kabat 넘버링 39번째의 Gln을 Lys로 치환한 MH01(서열번호:46)과 Glu로 치환한 MH02(서열번호:47), L쇄의 Kabat 넘버링 38번째의 Gln을 Glu로 치환한 ML01(서열번호：50)과 Lys로 치환한 ML02(서열번호：51)를 제작하였다. 또한 Anti-GPC3의 H쇄의 Kabat 넘버링 39번째의 Gln을 Lys로 치환한 GpH71(서열번호：48)과 Glu로 치환한 GpH72(서열번호：49), L쇄의 Kabat 넘버링 38번째의 Gln을 Glu로 치환한 GpL161(서열번호：52)과 Lys로 치환한 GpL162(서열번호：53)를 각각 제작하였다. 항체의 발현 벡터의 제작은 참고실시예 1의 방법에 따라서 행하였다. 제작한 항체를 사용하여 이중 특이성 항체를 발현시켰다. 제작한 항체의 개변의 조합과 발현된 항체에 대해서 표 10에 정리하였다.

항체의 발현은 참고실시예 1, 제작한 항체의 분석은 참고실시예 4의 방법에 따라서 행하였다.

CH1/CL 계면 제어의 변이를 도입한 4ch_006, 4ch_008의 크로마토그래피 상에서 관찰된 헤테로 성분으로 생각되는 peak가 VH/VL 계면 제어의 변이를 도입한 4ch_1,2_006, 4ch_2,1_008에서 소실되어 있는 것으로부터, CH1/CL 계면 제어에 더하여 VH/VL 계면 제어를 가함으로써 목적 성분만을 더욱 효율적으로 제작할 수 있는 것이 명확해졌다(도 10 및 도 11). 또한 목적 성분으로 생각되는 성분만이 정제되고 있는 것으로 생각되는 CH1/CL에만 변이를 도입한 4ch_004, 4ch_010에 VH/VL 계면 제어의 변이를 추가로 가해도 새로운 헤테로 성분으로 생각되는 peak는 검출되지 않았다(도 10 및 도 11).

이상의 사실로부터 CH1/CL 계면 제어에 대해 VH/VL 계면 제어를 가함으로써 목적 성분이 더욱 정제되기 쉬워지는 한편으로, 이미 목적 성분이 정제되어 있는 것으로 생각되는 경우에는 그 정제에는 악영향을 미치지 않는 것이 명확해졌다.

〔실시예 7〕개변 개소를 조합한 항체의 Tm 측정

CH1/CL 계면 제어의 개변이 Fab의 안정성에 영향을 미칠 가능성을 생각할 수 있다. 이에 TH2/TL17, TH13/TL16, TH15/TL19의 조합에 대해서 Fab의 안정성, Tm을 참고실시예 2의 방법에 따라 측정하는 것으로 하였다. Anti-IL6R 항체를 사용하여 H쇄/L쇄가 TH2/TL17, TH13/TL16, TH15/TL19로 이루어지는 항체를 제작하였다. 항체의 개변의 조합과 발현된 항체에 대해서 표 11에 정리하였다.

항체의 발현은 참고실시예 1, 제작한 각 항체의 Tm(℃)을 참고실시예 2에 따라서 측정하였다. 그 결과 변이를 도입하고 있지 않은 G1d/k0와 CH1/CL에 변이를 도입한 TH2/TL17, TH13/TL16, TH15/TL19의 Fab의 Tm은 각각 95.0℃, 93.1℃, 95.1℃, 94.8℃였다. 이 사실로부터 CH1/CL 계면 제어의 변이가 Fab의 안정성에 영향을 미치지 않는 것이 명확해졌다.

〔실시예 8〕CH1/CL 계면 제어의 변이를 도입하는 것에 따른 결합 활성의 영향

CH1/CL 계면 제어의 개변이 항원에 대한 결합에 영향을 미칠 가능성이 없다고는 할 수 없다. 이에 IL-6R, GPC3에 대한 결합 활성을 측정하기 위해 TH2/TL17, TH13/TL16, TH15/TL19의 조합에 대해서 결합 활성을 참고실시예 5의 방법에 따라서 측정하였다(표 12).

CH1/CL 계면 제어의 변이를 도입한 TH2/TL17, TH13/TL16, TH15/TL19의 IL-6R과 GPC3에 대한 결합 활성과 천연형의 G1d/k0의 IL-6R과 GPC3에 대한 결합 활성이 변화되어 있지 않은 것으로부터 CH1/CL 계면 제어의 개변은 결합 활성애 영향을 미치지 않는 것이 명확해졌다. 또한 실시예 4에서 제작한 4ch_004, 4ch_006, 4ch_008, 4ch_010을 사용하여 IL-6R과 GPC3의 2개의 항원에 대한 결합 활성을 참고실시예 5에 따라서 측정한 바, 표 12에서 나타내어지고 있는 천연형의 G1d/k0의 결합 활성과 동등하였다(표 13, 14).

실시예 1~8의 검토로부터, CH1/CL에 변이를 도입함으로써 Fab의 안정성을 저하시키지 않고 결합 활성을 저하시키지 않으며 목적 성분만을 효율적으로 정제할 수 있는 것이 명확해졌다.

〔실시예 9〕

H쇄의 CH1에 대해서 인간의 IgA1(서열번호：63), IgA2(서열번호：64), IgD(서열번호：65), IgE(서열번호：66), IgG1(서열번호：67), IgG2(서열번호：68), IgG3(서열번호：69), IgG4(서열번호：70), IgM(서열번호：71)과, L쇄는 CL에 대해서 인간의 IgK(Kappa)(서열번호：72), IgL1(서열번호：73), IgL2(서열번호：74), IgL3(서열번호：75), IgL6(서열번호：76), IgL7(서열번호：77)(Lambda)의 아미노산 서열을 얼라인먼트하여 각각 비교하였다. 결과를 도 12에 나타내었다. 본 실시예에서 찾아낸 개변을 화살표로 나타내었다. 화살표로 표시한 아미노산을 본 실시예에서 나타낸 바와 같이 H쇄의 CH1과 L쇄의 CL이 반응하도록 H쇄와 L쇄에 상이한 전하의 아미노산을 도입함으로써, 목적으로 하는 H쇄와 L쇄를 특이적으로 회합시킬 수 있을 것으로 생각된다.

〔참고실시예 1〕항체의 발현 벡터의 제작 및 항체의 발현과 정제

아미노산 치환의 도입은 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene), PCR 또는 In fusion Advantage PCR cloning kit (TAKARA) 등을 사용하여 당업자 공지의 방법으로 행하여 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정하였다. 제작한 플라스미드를 인간 태아 신장암세포 유래 HEK293H주(Invitrogen) 또는 FreeStyle293 세포(Invitrogen사)에 일과성으로 도입하여 항체의 발현을 행하였다. 얻어진 배양상청으로부터 rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GE 헬스케어)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 항체를 정제하였다. 정제 항체 농도는 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하고, 얻어진 값으로부터 PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 사용하여 항체 농도를 산출하였다(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423).

〔참고실시예 2〕시차 주사형 열량계에 의한 개변 항체의 열변성 중점(Tm) 평가

본 검토에서는 시차 주사형 열량계인 MicroCal Capillary DSC(DKSH)를 사용하여 항체의 열변성 중점(Tm)을 측정함으로써 열안정성을 평가하였다.

각 항체용액을 500 μL씩 측정용 플레이트에 세팅하고 20℃부터 115℃까지 온도를 상승시켰다. 승온속도는 120℃/시로 하고 열용량의 변화를 관측하였다.

데이터는 Origin7(Light stone)을 사용하여 해석을 행하고 열용량 변화가 확인된 온도를 산출하여 이 값을 Tm값으로 하였다.

〔참고실시예 3〕음이온 교환 크로마토그래피(AIEX)법에 의한 분석

Alliance system(Waters)을 사용한 AIEX법에 의해 제작 항체의 분석을 실시하였다. 분석 칼럼에 TSK-gel DEAE-NPR(Tosoh)을 사용하고, 이동상 A로서 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5를, 이동상 B로서 10 mmo/L Tris-HCl/500 mmol/L NaCl, pH 7.5를 사용한 2액 그라디언트법을 실시하였다. 측정은 280 nm의 파장에서 행하였다.

Empower2(Waters)를 사용하여 데이터 해석을 실시하고 검출된 각 피크의 비율을 산출하였다.

〔참고실시예 4〕양이온 교환 크로마토그래피(CIEX)법에 의한 분석

Alliance system(Waters)을 사용한 CIEX법에 의해 제작 항체의 분석을 실시하였다. 분석 칼럼에 WCX-10(Dionex)을 사용하고, 이동상 A로서 25 mmol/L MES, pH 6.1, 이동상 B로서 25 mmo/L MES/ 500 mmol/L NaCl, pH 6.1을 사용한 2액 그라디언트법을 실시하였다. 측정은 280 nm의 파장에서 행하였다.

〔참고실시예 5〕IL6R과 GPC3에 대한 Affinity 측정

Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 목적의 항체와 hIL6R 및 GPC3와의 상호작용 해석을 행하였다. 러닝버퍼에는 HBS-EP+(GE Healthcare)를 사용하고, 측정온도는 25℃로 하였다. Series S Sencor Chip CM5(GE 헬스케어)에 아민커플링법으로 Protein A/G(Thermo Scientific)를 고정화한 칩을 사용하였다. 칩으로 목적의 항체를 캡쳐시키고 러닝버퍼로 희석한 각 항원을 상호작용시켰다. 10 mM glycine-HCl, pH 1.5를 반응시킴으로써 칩에 캡쳐한 항체를 세정하고, 칩을 재생하여 반복해서 사용하였다.

각 항체의 항원에 대한 해리상수(KD)는 Biacore의 측정결과에 대해 속도론적 해석을 실시함으로써 산출하였다. 구체적으로는 Biacore Evaluation Software에 의해 측정하여 얻어진 센서그램을 1:1 Langmuir binding model로 global fitting시킴으로써 결합속도상수 ka(L/mol/s), 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값으로부터 해리상수 KD(mol/L)를 산출하였다.

본 발명에 의해 제공된 방법은 아미노산의 치환 수가 소수여도 되는 것으로부터, 원래의 폴리펩티드(항체)의 구조, 기능, 활성 등을 변화시키지 않고 회합을 제어하는 것이 가능하여 매우 유용성이 높다. 또한 항원성으로의 영향도 적다.

본 발명을 사용함으로써 실제로 활성을 보유하는 이중 특이성 항체의 효율적인 취득이 가능하다.

SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> ANTIGEN BINDING MOLECULES FOR REGULATING THE INTERACTION BETWEEN THE HEAVY CHAIN AND LIGHT CHAIN <130> C1-A1105P <150> JP 2011-238873 <151> 2011-10-31 <160> 79 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 328 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His 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Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Arg Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105 <210> 78 <211> 1731 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 78 aactgcagcg ccggggctgg gggaggggag cctactcact cccccaactc ccgggcggtg 60 actcatcaac gagcaccagc ggccagaggt gagcagtccc gggaaggggc cgagaggcgg 120 ggccgccagg tcgggcaggt gtgcgctccg ccccgccgcg cgcacagagc gctagtcctt 180 cggcgagcga gcaccttcga cgcggtccgg ggaccccctc gtcgctgtcc tcccgacgcg 240 gacccgcgtg ccccaggcct cgcgctgccc ggccggctcc tcgtgtccca ctcccggcgc 300 acgccctccc gcgagtcccg ggcccctccc gcgcccctct tctcggcgcg cgcgcagcat 360 ggcgcccccg caggtcctcg cgttcgggct tctgcttgcc gcggcgacgg cgacttttgc 420 cgcagctcag gaagaatgtg tctgtgaaaa ctacaagctg gccgtaaact gctttgtgaa 480 taataatcgt caatgccagt gtacttcagt tggtgcacaa aatactgtca tttgctcaaa 540 gctggctgcc aaatgtttgg tgatgaaggc agaaatgaat ggctcaaaac ttgggagaag 600 agcaaaacct gaaggggccc tccagaacaa tgatgggctt tatgatcctg actgcgatga 660 gagcgggctc tttaaggcca agcagtgcaa cggcacctcc atgtgctggt gtgtgaacac 720 tgctggggtc agaagaacag acaaggacac tgaaataacc tgctctgagc gagtgagaac 780 ctactggatc atcattgaac taaaacacaa agcaagagaa aaaccttatg atagtaaaag 840 tttgcggact gcacttcaga aggagatcac aacgcgttat caactggatc caaaatttat 900 cacgagtatt ttgtatgaga ataatgttat cactattgat ctggttcaaa attcttctca 960 aaaaactcag aatgatgtgg acatagctga tgtggcttat tattttgaaa aagatgttaa 1020 aggtgaatcc ttgtttcatt ctaagaaaat ggacctgaca gtaaatgggg aacaactgga 1080 tctggatcct ggtcaaactt taatttatta tgttgatgaa aaagcacctg aattctcaat 1140 gcagggtcta aaagctggtg ttattgctgt tattgtggtt gtggtgatag cagttgttgc 1200 tggaattgtt gtgctggtta tttccagaaa gaagagaatg gcaaagtatg agaaggctga 1260 gataaaggag atgggtgaga tgcataggga actcaatgca taactatata atttgaagat 1320 tatagaagaa gggaaatagc aaatggacac aaattacaaa tgtgtgtgcg tgggacgaag 1380 acatctttga aggtcatgag tttgttagtt taacatcata tatttgtaat agtgaaacct 1440 gtactcaaaa tataagcagc ttgaaactgg ctttaccaat cttgaaattt gaccacaagt 1500 gtcttatata tgcagatcta atgtaaaatc cagaacttgg actccatcgt taaaattatt 1560 tatgtgtaac attcaaatgt gtgcattaaa tatgcttcca cagtaaaatc tgaaaaactg 1620 atttgtgatt gaaagctgcc tttctattta cttgagtctt gtacatacat acttttttat 1680 gagctatgaa ataaaacatt ttaaactgaa tttcttaaaa aaaaaaaaaa a 1731 <210> 79 <211> 314 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Met Ala Pro Pro Gln Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Thr Phe Ala Ala Ala Gln Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr 20 25 30 Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gln Cys Gln Cys 35 40 45 Thr Ser Val Gly Ala Gln Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala 50 55 60 Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg 65 70 75 80 Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gln Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp 85 90 95 Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gln Cys Asn Gly 100 105 110 Thr Ser Met Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp 115 120 125 Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile 130 135 140 Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys 145 150 155 160 Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gln Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gln Leu 165 170 175 Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr 180 185 190 Ile Asp Leu Val Gln Asn Ser Ser Gln Lys Thr Gln Asn Asp Val Asp 195 200 205 Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser 210 215 220 Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gln Leu 225 230 235 240 Asp Leu Asp Pro Gly Gln Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala 245 250 255 Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile Ala Val Ile 260 265 270 Val Val Val Val Ile Ala Val Val Ala Gly Ile Val Val Leu Val Ile 275 280 285 Ser Arg Lys Lys Arg Met Ala Lys Tyr Glu Lys Ala Glu Ile Lys Glu 290 295 300 Met Gly Glu Met His Arg Glu Leu Asn Ala 305 310

Claims

2개의 상이한 항원을 인식하고, 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자로서,
상기 항원 결합 분자가 이중 특이성 IgG 항체이고,
상기 항원 결합 분자가 2종류의 중쇄 정상영역(CH1)인 CH1-A 및 CH1-B; 및 2종류의 경쇄 정상영역(CL)인 CL-A 및 CL-B를 포함하고, CH1-A 및 CL-A의 회합에 의해 하나의 항원을 인식하고, CH1-B 및 CL-B의 회합에 의해 다른 하나의 항원을 인식하고,
상기 항원 결합 분자에 있어서, (a)~(d)로부터 선택되는 1조(set) 또는 2조 이상의 아미노산 잔기에서 CH1-A 및 CL-B의 조합 및 CH1-B 및 CL-A의 조합의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하고; CH1-A 및 CL-A의 조합 및 CH1-B 및 CL-B의 조합의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않도록 CH1-A, CH1-B, CL-A 및 CL-B 중 적어도 하나가 개변된 항원 결합 분자:
(a) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 및 131번 위치의 아미노산 잔기,
(b) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 및 175번 위치의 아미노산 잔기 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번, 131번 및 160번 위치의 아미노산 잔기,
(c) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 및 213번 위치의 아미노산 잔기 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번, 131번 및 123번 위치의 아미노산 잔기,
(d) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번, 175번 및 213번 위치의 아미노산 잔기 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번, 131번, 160번 및 123번 위치의 아미노산 잔기.
제1항에 있어서,
상기 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 아래의 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 조에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 항원 결합 분자:
(X) 글루타민산(E) 또는 아스파라긴산(D),
(Y) 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H).
제1항 또는 제2항에 있어서,
추가로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 계면을 형성하는 2 잔기 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기인 항원 결합 분자.
제3항에 있어서,
상기 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 아래의 (a) 또는 (b)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 1조 또는 2조의 아미노산 잔기인 항원 결합 분자:
(a) 중쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서 Kabat 넘버링 39번 위치의 아미노산 잔기 및 경쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서 Kabat 넘버링 38번 위치의 아미노산 잔기,
(b) 중쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서 Kabat 넘버링 45번 위치의 아미노산 잔기 및 경쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서 Kabat 넘버링 44번 위치의 아미노산 잔기.
제3항에 있어서,
상기 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 아래의 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 조에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 항원 결합 분자:
(X) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D),
(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).
2개의 상이한 항원을 인식하고, 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자의 제조방법으로서,
상기 항원 결합 분자가 이중 특이성 IgG 항체이고,
상기 항원 결합 분자가 2종류의 중쇄 정상영역(CH1)인 CH1-A 및 CH1-B; 및 2종류의 경쇄 정상영역(CL)인 CL-A 및 CL-B를 포함하고, CH1-A 및 CL-A의 회합에 의해 하나의 항원을 인식하고, CH1-B 및 CL-B의 회합에 의해 다른 하나의 항원을 인식하고,
아래의 (1)~(3)의 공정을 포함하는 제조방법:
(1) (a)~(d)로부터 선택되는 1조 또는 2조 이상의 아미노산 잔기에서 CH1-A 및 CL-B의 조합 및 CH1-B 및 CL-A의 조합의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하고; CH1-A 및 CL-A의 조합 및 CH1-B 및 CL-B의 조합의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하지 않도록 개변된 CH1-A, CH1-B, CL-A 및 CL-B를 코드하는 적어도 하나의 핵산을 제조하는 공정,
(a) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 및 131번 위치의 아미노산 잔기,
(b) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 및 175번 위치의 아미노산 잔기 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번, 131번 및 160번 위치의 아미노산 잔기,
(c) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 및 213번 위치의 아미노산 잔기 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번, 131번 및 123번 위치의 아미노산 잔기,
(d) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번, 175번 및 213번 위치의 아미노산 잔기 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번, 131번, 160번 및 123번 위치의 아미노산 잔기
(2) 상기 핵산을 숙주세포로 도입하고 숙주세포를 그 핵산이 발현되도록 배양하는 공정,
(3) 상기 숙주세포의 배양물로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정.
제6항에 있어서,
상기 공정(1)에 있어서 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 아래의 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되도록 핵산을 개변하는 공정을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법:
(X) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D),
(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).
제6항 또는 제7항에 있어서,
추가로 상기 공정(1)에 있어서 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 계면을 형성하는 2 잔기 이상의 아미노산 잔기가 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기이도록 핵산을 개변하는 공정을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 아래의 (a) 또는 (b)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1조의 아미노산 잔기인 항원 결합 분자의 제조방법:
(a) 중쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서 Kabat 넘버링 39번 위치의 아미노산 잔기 및 경쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서 Kabat 넘버링 38번 위치의 아미노산 잔기,
(b) 중쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서 Kabat 넘버링 45번 위치의 아미노산 잔기 및 경쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서 Kabat 넘버링 44번 위치의 아미노산 잔기.
제8항에 있어서,
상기 서로 전하적으로 반발하는 아미노산 잔기가 아래의 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 조에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 항원 결합 분자의 제조방법:
(X) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D),
(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).