JP2004511430A - 二重特異性免疫グロブリン様抗原結合蛋白および製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、二重特異性抗原結合蛋白を目的とするものである。これらの二重特異性抗原結合蛋白は、抗原（群）に対するアビディティが最適化されており、それでいて、補体仲介細胞傷害および抗体依存性細胞毒性を活性化する能力を包含する、天然抗体として機能する能力を維持している。天然のＩｇＧ免疫グロブリンは単一特異性且つ二価であり、同じエピトープに特異的な２個の結合ドメインを持っている。対照的に、本発明に係るＩｇＧ型免疫グロブリンは二重特異性且つ二価であり、各軽鎖に１つのエピトープのための結合ドメインを、そして各重鎖に第二のエピトープに特異的な結合ドメインを持っている。本発明に係る抗原結合蛋白の設計は、産生される実質上全ての抗原結合蛋白が所望のコンフィギュレーションに組み立てられるような効率的な産生を提供する。
Description
【０００１】
発明の分野
本発明は免疫グロブリン（Ｉｇ）型抗原結合蛋白の製造を目的とするものである。より詳細には、本発明は、天然免疫グロブリンの特性を示すことのできる二重特異性抗原結合蛋白を提供する。天然ＩｇＧ免疫グロブリンは単一特異性且つ二価であり、同じ抗原エピトープに特異的な２個の結合ドメインを持っている。これとは対照的に、本発明に係るＩｇＧ型抗原結合蛋白は二重特異性且つ二価である。本発明に係る蛋白は、２つの軽鎖の各々と２つの重鎖の各々に、４個の抗原結合部位を持つ。軽鎖上にある抗原結合部位が重鎖上にある抗原結合部位と異なっている時、この蛋白は二重特異性且つ二価である。この抗原結合部位が同じである時、このＩｇＧ型蛋白は単一特異性且つ四価である。本発明に係る抗原結合蛋白の設計は、望ましくない可変ドメインの対合を回避するやり方で、係る分子の効率的な製造を提供する。
【０００２】
発明の背景
抗体の特異性とは、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を意味する。例えば天然抗体は単一特異性である。二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）とは、２個の異なる抗原結合特異性または部位を持つ抗体である。抗原結合蛋白が１以上の特異性を持つ場合、認識されるエピトープは、単一の抗原と、または１以上の抗原と結合できる。
【０００３】
抗体価とは、抗原結合蛋白が特定のエピトープに対して持つ結合部位の数を意味する。例えば、天然ＩｇＧ抗体は単一特異性且つ二価である。抗原結合蛋白が１以上のエピトープに対して特異性を持つ場合、抗体価は各々のエピトープについて算出する。例えば、４個の結合部位を持ち単一のエピトープを認識する抗原結合蛋白は四価である。４個の結合部位と２個の異なるエピトープに対する特異性を持つ抗原結合蛋白は、二価であると考えられる。
【０００４】
天然の抗体分子は、２つの同一の重鎖と二つの同一の軽鎖で構成されている。各々の軽鎖は鎖間ジスルフィド結合によって重鎖と共有結合している。２つの重鎖はさらに複数のジスルフィド結合によって相互に連結している。図１は、典型的なＩｇＧ抗体の構造を示している。個々の鎖は折り畳まれて、類似の大きさ（１１０−１２５アミノ酸）および構造を持ち異なる機能を有するドメインとなっている。軽鎖は１つの可変ドメイン（ＶＬ）と１つの定常ドメイン（ＣＬ）を含んでいる。重鎖は１つの可変ドメイン（ＶＨ）と、抗体のクラスまたはイソタイプに応じて３または４個の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を含んでいる。マウスおよびヒトでは、イソタイプはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭであり、ＩｇＡとＩｇＧはさらにサブクラスまたはサブタイプに細分される。ＶＬおよびＶＨドメインから成る抗体部分は「Ｆｖ」と呼ばれ、抗原結合部位を構成する。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、１個のポリペプチド鎖上にＶＬドメインとＶＨドメインを含む改変された蛋白であり、ここで、一方のドメインのＮ末端と他方のドメインのＣ末端は可撓性のリンカーによって結合している。「Ｆａｂ」とは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインで構成される抗体の部分を指す。
【０００５】
可変ドメインは、抗体間で、特に抗原結合部位の位置でかなりのアミノ酸配列変化性を示す。各々のＶＬおよびＶＨには、「超可変」または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる３個の領域が見出される。
【０００６】
「Ｆｃ」は、対合した重鎖定常ドメインを含む抗体部分の呼称である。例えばＩｇＧ抗体では、ＦｃはＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＡまたはＩｇＭ抗体のＦｃはさらにＣＨ４ドメインを含む。Ｆｃは、Ｆｃレセプター結合、補体仲介細胞傷害の活性化、および抗体依存性細胞性細胞傷害に関係している。複数のＩｇＧ様蛋白の複合体であるＩｇＡおよびＩｇＭのような天然抗体については、複合体の形成はＦｃ定常ドメインを必要とする。
【０００７】
最後に、「ヒンジ」領域が、２個の重鎖の共有結合のための抗体のＦａｂおよびＦｃ部分を分離し複数のジスルフィド結合を含むと共に、Ｆａｂ相互の、そしてＦｃに対するＦａｂの可動性を与えている。
【０００８】
多特異性抗原結合蛋白は、癌の画像化および治療薬といった幾つかの小規模臨床試験に使用されてきたが、広範な臨床評価は、効率的な製造法の欠如によって阻まれている。これまでこのような蛋白の設計は、主として多特異性を提供することに関心が持たれていた。天然抗体分子の持つその他の有用な機能を与えることに注意が払われた例は殆ど無かった。
【０００９】
近年、二重特異性および／または多価抗体フラグメントの製造のために、多岐にわたる化学的および組換え方法が開発されている。総説としては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ． ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４， ４４６−４４９（１９９３）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ ４， ４６３−４７０（１９９５）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ． ａｎｄ Ｐａｃｋ，Ｐ．， Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３， ８３−１０５（１９９７）を参照されたい。二重特異性および／または二価性は、可撓性リンカー、ロイシンジッパーモチーフ、ＣＨＣＬ−ヘテロ二量体化による２個のｓｃＦｖ分子の融合、ならびに二価単一特異性ｄｉａｂｏｄｙおよび関連構造を形成するためのｓｃＦｖ分子の結合によって達成されてきた。多価性は、例えばｐ５３、ストレプトアビジン、およびヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフを使用することにより、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントのカルボキシまたはアミノ末端に多量体化配列を付加することによって達成されてきた。例えば、（ｓｃＦｖ１）−ヒンジ−ヘリックス−ターン−ヘリックス−（ｓｃＦｖ２）という形のｓｃＦｖ融合蛋白のヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフを介する二量体化により、２個の標的抗原の各々に対して２個のｓｃＦｖ結合部位を有する四価二重特異性ミニ抗体が生成する。
【００１０】
多少なりとも完全なＩｇＧ定常ドメイン構造を持つという点でＩｇＧ抗体に似ている、ＩｇＧ型二重特異性抗体の製造は、２個の異なるＩｇＧ分子の化学的架橋、または同じ細胞からの二種類の抗体の同時発現によって達成された。化学的架橋は効率が悪く、抗体活性の損失を招き得る。構成成分である重鎖および軽鎖の誤対合のため、いずれの方法も、かなりの量の望ましくない且つ非機能的な物質の生成を招く。誤対合を減少または排除するために用いる方法は、別の望ましくない効果を有する。
【００１１】
望ましくない異種生成物の産生は、これまで用いられてきた方法の多くにとって著明な欠点となっている。例えば、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）の製造の際、様々なドメインの適切な結合を保証する方法が無いと、実際にはその生成物の一部だけが二重特異性であるに過ぎない。トランスフェクトされた細胞で同時発現されるＩｇＧ重鎖および軽鎖の、異なる二つの組の間に不要な対合が起こることを克服するために開発された１つの戦略は、同じ抗体重鎖間のホモ二量体化を減らすための、２個の重鎖のＣＨ３ドメインの修飾である。Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６， ６７７−６８１。その方法では、二重特異性抗体の各結合部位に同一の軽鎖の使用を要求することにより、軽鎖の誤対合が排除された。
【００１２】
二重特異性分子の取得を目的とした殆どの仕事において、抗原特異性以外の機能的または構造的側面の維持には殆ど注意が払われてこなかった。例えば、Ｆｃ領域重鎖定常ドメインの存在および機能を必要とする、補体仲介細胞傷害（ＣＭＣ）および抗体依存性細胞仲介細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、殆どの二重特異性抗体において、いずれも失われている。ＣｏｌｏｍａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎは、ｓｃＦｖを完全な重鎖のＣ末端に融合させることにより、Ｆｃドメインを有する二価ＢｓＡｂ分子の均質集団を作製した。この融合物と抗体軽鎖の同時発現は、一端で第一の抗原と、そして他端で第二の抗原と結合する、二価二重特異性分子の均質集団の生成を導いた（Ｃｏｌｏｍａ，Ｍ．Ｊ． ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９９７） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５， １５９−１６３）。しかしながらこの分子は補体を活性化する能力が低下しており、ＣＭＣを奏効させることができなかった。さらに、このＣＨ３ドメインは低い親和性で高親和性Ｆｃレセプター（ＦｃγＲ１）に結合した。
【００１３】
本発明は、（１） 二重特異性且つ二価であり得、（２） 抗原結合部位の選択に関する束縛が排除されており、（３） Ｆｃ定常ドメインおよびこれに付随する機能を有し、（４） 実質上均質であり、そして（５） さらなる加工を行わずに哺乳動物またはその他の細胞で製造できる、抗原結合蛋白を提供することにより、これらの不都合を克服する。
【００１４】
発明の要約
本発明は、免疫グロブリン様複合体中で安定に結合している２個の第一ポリペプチドと２個の第二ポリペプチドの複合体を含む、抗原結合蛋白を目的とするものである。第一ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖第一定常ドメイン（ＣＨ１ドメイン）と安定に結合できる、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬドメイン）のＮ末端に位置する抗原結合部位を含む。第二ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインのＮ末端に位置する抗原結合部位とこれに続く１またはそれ以上の重鎖Ｆｃ領域定常ドメイン（ＣＨドメイン）を含む。このＦｃ ＣＨドメインは安定な自己結合ができ、即ち、各ＣＨドメインは自己の別のコピーと対合または結合することができる。したがって、本発明に係る抗原結合蛋白は一般に４個のポリペプチドおよび４個の抗原結合部位で構成される。抗原結合部位は抗原に結合できる任意のアミノ酸配列によっても提供され得るが、好ましい態様では、抗原結合部位は一本鎖Ｆｖにより提供される。第一および第二ポリペプチドの結合部位が異なっている場合、この抗原結合蛋白は二重特異性である。それらが同じである場合、この抗原結合蛋白は単一特異性である。必ずという訳ではないが通常、これらのポリペプチドはジスルフィド橋によって共有結合している。好ましい態様では、本発明に係る抗原結合蛋白は二重特異性且つ二価である。即ち、これらは同じ抗原または異なる抗原上にあってよい二つの異なるエピトープに結合する。
【００１５】
ポリペプチド鎖の結合に備えることに加え、Ｆｃ定常ドメインは他の免疫グロブリン機能にも貢献する。その機能には、補体仲介細胞傷害の活性化、抗体依存性細胞仲介細胞傷害の活性化、およびＦｃレセプター結合が包含される。本発明に係る抗原結合蛋白を治療または診断目的で投与する場合、Ｆｃ定常ドメインはまた血清半減期にも寄与する。Ｆｃ定常ドメインはいかなる哺乳動物または鳥類の種に由来するものであってもよい。本発明に係る抗原結合蛋白を人間の治療に使用する場合、ヒト起源の定常ドメインが好ましいが、可変ドメインはヒト以外の起源であってもよい。ヒト可変ドメインが好ましい場合、キメラｓｃＦｖを使用できる。
【００１６】
抗原結合部位はいかなる抗原に特異的なものであってもよく、任意の手段で取得できる。例えば、ｓｃＦｖはモノクローナル抗体から、または、ＶＬおよびＶＨドメインの無作為組み合わせライブラリーから取得できる。
【００１７】
好ましい態様では、ｓｃＦｖはヒトキナーゼ挿入ドメイン含有レセプター（ＫＤＲ）に特異的に結合する。特に好ましいのは、ＫＤＲの細胞外ドメインに結合し、そのリガンドである血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）による結合を遮断し、そして／またはＶＥＧＦが誘発するＫＤＲの活性化を中和する、抗原結合蛋白である。別の好ましい態様では、ｓｃＦｖはＦｌｔ−１に特異的に結合する。Ｆｌｔ−１の細胞外ドメインに結合し、そのリガンドＶＥＧＦおよび胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）の一方または両方による結合を遮断し、そして／またはＶＥＧＦが誘発するまたはＰＩＧＦが誘発するＦｌｔ−１の活性化を中和する、抗原結合蛋白もまた特に好ましい。
【００１８】
二官能性抗原結合蛋白による二元的レセプター遮断は、ＶＥＧＦにより刺激される血管新生の阻害において、より有効となり得る。好ましい態様では、組換え二重特異性二価抗原結合蛋白は、Ｆｌｔ−１およびＫＤＲの両者を、ＶＥＧＦおよび胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）を包含するそれらのリガンドとの結合から遮断することができる。したがって、好ましい二重特異性二価抗原結合蛋白は、ＫＤＲ／ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１／ＶＥＧＦおよび／またはＦｌｔ−１／ＰＩＧＦ相互作用を妨害する。このような抗原結合蛋白は、ＶＥＧＦにより刺激されるヒト内皮細胞の分裂誘発の、そしてＶＥＧＦおよびＰＩＧＦにより誘発されるヒト白血病細胞の遊走の、親抗体よりも強力なインヒビターとなり得る。
【００１９】
ＫＤＲおよび／またはＦｌｔ−１のリガンド結合を遮断し、またはその活性化を中和する本発明に係る抗原結合蛋白は、内皮細胞増殖、血管新生および腫瘍成長を低下させ、そしてＶＥＧＦおよびＰＩＧＦにより誘発されるヒト白血病細胞の遊走を阻害するのに有用である。
【００２０】
本発明はさらに、本発明に係る第一および第二ポリペプチドをコードしている１またはそれ以上の組換えＤＮＡ組み立て物を、発現と複合体形成をさせるに充分な時間と方法で、哺乳動物細胞中で同時発現させ、その抗原結合蛋白を回収する、抗原結合蛋白を製造する方法を包含する。
【００２１】
本発明の或る態様では、ｓｃＦｖドメイン（ＶＬおよびＶＨ）をコードしている遺伝子を、ｓｃＦｖ発現およびスクリーニングを提供する細菌ベクター中でクローニングし組み立てる。所望のｓｃＦｖをコードしているヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞中で有効な発現を提供するよう設計したクローニングベクターの所望の重鎖または軽鎖定常ドメインをコードしている配列に、フレーム内で連結する。即ち、ｓｃＦｖと軽鎖定常ドメインをコードしている第一組み立て物と、ｓｃＦｖと重鎖定常ドメインをコードしている第二組み立て物とが同じまたは別個の発現ベクターにある、二つの組み立て物を、宿主細胞中にトランスフェクトし、同時発現させる。
【００２２】
二価且つ二重特異性である本発明に係る抗原結合蛋白は、望ましい特徴の組み合わせを持っている。第一に、これらは均質である。設計により、抗体重鎖および軽鎖の誤対合は大幅に減少または排除される。例えば、典型的な二重特異性抗体は、二つの特異性を提供するために２個の異なる重鎖の使用を必要とする。重鎖がＩｇＧ型分子に配置される場合は４個の組み合わせが可能である。これらのうち２個は誤対合した重鎖で構成され、その結果この生成物は単一特異性である。逆に本発明に係る蛋白では、全ての重鎖が等価であり、誤対合は起こらない。各々の重鎖が第一の完全な結合部位を含み、各々の軽鎖が第二の異なる結合部位を含むため、二重特異性を提供するためにはただ一つの型の重鎖とただ一つの型の軽鎖を必要とするに過ぎない。
【００２３】
本発明に係る二重特異性蛋白の第二の利点は、四量体型においてこれらが各結合特異性に関して二価であるという事である。二量体のＢｓＡｂを欠く天然抗体の特徴は、この天然抗体が、それが有する抗体結合部位に関して二価であるという事である。二量体のＢｓＡｂは、それが有する２個の結合部位のそれぞれに関して一価である。二価性は、結合の協同性と、１個の抗原結合部位を含む分子をはるかに凌駕するアビディティの増大を実現するため、この事は抗体機能にとって重要である。
【００２４】
本発明に係る蛋白の第三の利点は、天然抗体のＦｃ領域を構成し（例えば、ＩｇＧ分子についてはＣＨ２およびＣＨ３）他の抗体機能を提供する重鎖定常ドメインが存在し得る事である。さらに、ＣＬおよびＣＨ１ドメインと共に複数の結合ドメインがＦｃ領域と隔たっており、その結果、Ｆｃ領域により提供される機能が損なわれない。保持される機能はＦｃが或る種の補助分子に結合する能力に関連し（例えば、細胞表面および可溶性Ｆｃレセプターへの結合、ＩｇＡおよびＩｇＭについてはＪ鎖の結合、ＩｇＡについてはＳ蛋白）、そして、補体経路の活性化（補体仲介細胞傷害、ＣＭＣ）、幾つかの異なる白血球集団により標的細胞に結合した抗体の認識（抗体依存性細胞仲介細胞傷害、ＡＤＣＣ）およびオプソニン化（貪食作用の増強）を包含する。加えて、重鎖のカルボキシ末端への大ドメインの付加を回避することにより、立体障害が回避される。これは、上述の機能の多くにとって重要であり、より高次構造の抗体分子の組み立てにとっても重要である（例えば、ＩｇＡは２個のＦｃを介して結合した４個の重鎖で構成され；ＩｇＭは５個のＦｃにより結合した１０個の重鎖で構成されている）。最後に、Ｆｃ重鎖定常ドメインは血清半減期の増大を付与する。
【００２５】
本発明に係る蛋白の第四の利点は、完全な生成物の取得にインビトロでの加工を必要としないことである。人工的な方法で再編成されてはいるものの、各々のドメインは生態系での発現を可能にする本来の性質を持っている。
【００２６】
本発明はまた、単一特異性四価抗原結合蛋白の産生にも適用できる。このような蛋白では、４個の結合部位は全て同じ特異性を持っている。さらに、本発明は一価二重特異性抗原結合蛋白および二価単一特異性抗原結合蛋白の製造方法を提供する。例えば、Ｆａｂ型蛋白を製造できるが、これは、２個の異なる結合部位または２個の等価な結合部位を含み、第一結合部位はＣＬドメインに連結し、第二結合部位はＣＨ１ドメインに連結している。
【００２７】
好ましい態様では、第一および第二結合部位はそれぞれ一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）によって与えられる。第一の結合特異性を持つｓｃＦｖはＣＬドメインと融合してｓｃＦｖ−ＣＬポリペプチドを形成し、第二の結合特異性を持つｓｃＦｖはＣＨと融合してｓｃＦｖ−ＣＨポリペプチドを形成する。本明細書で言及するように、２またはそれ以上のＣＨドメインがあり、そのドメインのうち１個がＣＨ１である限り、ｓｃＦｖ−ＣＨポリペプチドは、抗体重鎖の任意の部分と融合したｓｃＦｖとして定義される。ｓｃＦｖ−ＣＬ−ｓｃＦｖ−ＣＨヘテロ二量体はＣＬおよびＣＨ１定常ドメインの天然の結合により形成される。少なくとも１個のＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４定常ドメインの存在は、一方のポリペプチド上のＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４ドメインと、別のポリペプチド上にあるそれ自身のコピーとの天然の結合によって、４個の結合部位を持つ抗原結合蛋白に２個のｓｃＦｖ−ＣＬ−ｓｃＦｖ−ＣＨヘテロ二量体を対合させる事を可能にする。
【００２８】
正確な重鎖定常ドメイン構造は所望の機能的特性によって決定する。抗原結合蛋白が特定のイソタイプを持つことを望むのであれば、そのイソタイプの免疫グロブリン由来のＣＨドメインが選択されるであろう。例えば、所望のイソタイプがＩｇＧ１である場合、そのドメイン構造は（ｓｃＦｖ）２−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３であり、定常ドメインはＩｇＧ１抗体由来のものである。
【００２９】
このアプローチを使用して、４個の抗原結合部位を持つＩｇＧ様抗原結合蛋白の均質集団を得る。各々のヘテロ二量体が２個の異なる結合部位を含む場合、そのようにして形成される抗原結合蛋白は二重特異性且つ二価である。ヘテロ二量体が２個の等価な結合部位を含む場合、形成される抗原結合蛋白は単一特異性且つ四価である。ここに詳細を述べる態様では、抗原結合部位は抗体可変ドメインに含まれている。しかしながら、本発明はさらに、１またはそれ以上の結合機能が、目的とする特定の蛋白または抗原との既知の結合相互作用に基づいて選ばれた構造によって与えられる、二重特異性分子をも意図している。例えば、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０の一部を、ＣＤ４に結合する能力に基づいて選択することができる。これに代わり、或る結合部位は、同種のレセプター蛋白に結合する能力に基づき選択したホルモンまたはサイトカインに対応するアミノ酸配列を含むかも知れない。
【００３０】
本発明に係る或る抗原結合蛋白は、抗原に結合させるため、または蛋白とそのリガンドの相互作用を遮断するために使用する。本発明に係る別の抗原結合蛋白は、免疫細胞と標的細胞の間の相互作用を促進するために使用する。最後に、本発明に係る抗原結合蛋白は、抗腫瘍物質、標的部分、リポーター分子、または目的抗原に対する検出可能シグナル産生物質を局在化させるために使用する。
【００３１】
本発明はさらに、ＫＤＲおよびその類似体に結合する、または血管新生もしくは腫瘍形成に関与するその他のレセプター分子に結合する抗原結合蛋白を提供する。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明は、均質であり、そして、結合の協同性（アビディティ）といった天然抗体の機能的特性、ならびに補体仲介細胞傷害および抗体依存性細胞毒性を活性化する能力を保持できる、抗原結合蛋白を提供するものである。一般に、本発明に係る抗原結合蛋白は、各々の抗体可変ドメインの代わりに完全な抗原結合部位を有する、天然に存在する抗体の定常ドメイン構造を持つ。即ち、天然に存在する抗体においては、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の組み合わせにより単一の結合部位が提供され、その結果、例えばＩｇＧ型抗体の４個の可変ドメインは２個の完全な結合部位を提供する。対照的に、本発明に係るＩｇＧ型抗原結合蛋白は４個の完全な結合部位を持つが、それは、完全な抗原結合部位を含む構造が天然に存在する抗体の各々のＶＬおよびＶＨ可変ドメインに取って代わるためである。
【００３３】
別途記載の無い限り、または文脈から明白でない限り、本明細書中使用する抗体ドメイン、領域およびフラグメントは、当分野で周知の容認された標準的定義である。例えば、Ａｂｂａｓ，Ａ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡを参照されたい。
【００３４】
典型的なＦｖの抗原結合部位は、抗原に対する結合部位の親和性に様々な度合いで寄与する６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでいる。より少ないＣＤＲ（例えば３、４または５個）を含む抗原結合部位もまた機能的であり、本発明の範囲内に包含される。ＣＤＲおよびフレームワーク領域（ＦＲ）の範囲は、集められたアミノ酸配列のデータベースとの比較によって決定し、ここではそれらの領域が配列間の変異性に従って定義されている。３個の重鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）および３個の軽鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）がある。
【００３５】
アビディティは免疫グロブリンとその抗原の間の結合の強さの尺度である。各結合部位における結合の強さを評価する親和性とは異なり、アビディティは免疫グロブリン分子の親和性と価数の両者に関係する。
【００３６】
本発明に係る蛋白は、１またはそれ以上の免疫グロブリンクラスの抗体の一部から誘導され、またはそれを取り込んでいる。免疫グロブリンのクラスはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥイソタイプを包含し、ＩｇＧおよびＩｇＡの場合それらのサブタイプを包含する。
【００３７】
本発明に係る抗原結合蛋白は、２個の軽鎖と２個の重鎖を含むヘテロ四量体であるという点でＩｇＧタイプの抗体に似ている。しかしながらＩｇＧタイプの抗体とは異なり、これらは４個の抗原結合部位を持ち、少なくともＣＨ１およびもう１個別のＣＨドメインが存在する場合には、より少ない定常ドメインを持っているかも知れない。４個の抗原結合部位はそれぞれ２個の結合特異性のための２個の結合部位、または１個の結合特異性のための４個の結合部位を含み得る。
【００３８】
好ましい態様では、この形を持つ二重特異性蛋白は、天然に存在するＩｇＧ型抗体のようなアビディティ特性を示すことができる。天然に存在するＩｇＧ分子の場合そうであるように、各々の結合特異性について、２個の等価な抗原結合部位の存在が抗原との結合の協同性を実現する。当業者にとっては周知であるが、重鎖定常領域の適切な選択によって、他のクラスの抗体、例えばＩｇＡ、ＩｇＭ、およびその他の型の抗体に似た二重特異性抗体を作製できる事は明白である。
【００３９】
本発明は、重鎖が軽鎖と対合する時に１個のヘテロ二量体分子内で異なる結合特異性が結び付けられるよう、異なる特異性の結合ドメインを重鎖および軽鎖定常ドメインと連結することを意図している。このような分子の集団は、実際において全二量体が第一の特異性を持つ１個の結合ドメインと、第二の特異性を持つ１個の結合ドメインを含むという点で、実質上均質である。ＣＬおよびＣＨ１ドメインの結合を介する重鎖と軽鎖の優先的な自然の対合に依存することにより、同じ特異性を持つ２個の結合ドメインを含む二量体の形成が低下しまたは排除される。同様に、重鎖の優先的結合がＦｃ領域を介して起こり、本発明に係る抗原結合蛋白を形成する。
【００４０】
一般に、本発明に係る抗原結合蛋白は完全なＣＬおよびＣＨ１ドメインを含んでおり、これらは鎖間ジスルフィド結合により共有結合している。しかしながら本発明はまた、アミノ酸が除去または挿入されており、そして該ドメインが安定な複合体として結合できる限り、共に鎖間ジスルフィド結合を持っているかも知れないし持っていないかも知れない修飾ＣＬおよびＣＨ１ドメインの使用をも意図している。
【００４１】
安定な結合、または複合体とは、生理的条件下で抗原結合蛋白のポリペプチドが複合体として存在することを意味する。例えば、非還元条件下の天然ゲル上で、該ポリペプチドは複合体として移動する。全ての抗体軽鎖が与えられた任意の重鎖と有効に結合する訳ではなく、逆もまた同様であるという事が理解できるであろう。しかしながら、有効に対合するＣＬおよびＣＨ１定常ドメインの組み合わせは当分野で周知であり、それが好ましい。
【００４２】
天然抗体がそうであるように、重鎖−軽鎖ヘテロ二量体は特定の重鎖定常ドメインの結合を介して結合し、より高次の構造を形成する。例えば、ＩｇＧ型抗体は、四量体構造において、共有結合により結びついた２個の重鎖−軽鎖ヘテロ二量体を含んでいる。別の或る抗体型は類似の四量体構造を含んでいるが、この四量体構造は例えば２個の四量体（ＩｇＡ）または１０個の四量体（ＩｇＭ）を含む、より高次の構造に組み込まれる。
【００４３】
天然抗体と同様に、本発明に係る二価二重特異性抗原結合蛋白は、重鎖の適切な結合をＦｃ定常ドメインとヒンジ領域に頼っている。一般に本発明に係る抗原結合蛋白は、ヒンジ領域と１またはそれ以上のＦｃ定常ドメインまたはその一部を含んでいる。付随する全ての機能を保持するためには、通常、全てのＦｃ定常ドメインを取り込んでいるのが望ましい。しかし、本発明はさらに、少なくともそのような１個のドメインが存在するならば、或る定常ドメインのみを含んでいることをも意図している。様々なＦｃ機能がＦｃの異なる部分に依存しているので、全ての機能を所望する訳でないのならば、より少ないＣＨドメインを重鎖に取り込むだけでよい。例えば、補体の著しい活性化はＩｇＧのＣＨ２またはＩｇＭのＣＨ３を必要とする。本発明はさらに、重鎖が安定な複合体として結びつくことができる限り、アミノ酸が置換、除去、挿入または修飾された、修飾ヒンジおよびＦｃ重鎖ドメインの使用をも意図している。
【００４４】
好ましい抗原結合蛋白の抗原結合部位は、任意の所望特異性を持つＦｖ領域で構成される。このＦｖは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であり、ドメインを結合させて機能的抗原結合部位を形成させるペプチドリンカーによって連結したＶＨドメインとＶＬドメイン（いずれの順序でもよい）で構成されている（例えば、米国特許第４９４６７７８号、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（Ｇｅｎｅｘ）；ＷＯ８８／０９３４４， Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｉｎｃ．， Ｕｈｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。ＷＯ９２／０１０４７， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，は、可溶性組換え遺伝子ディスプレーパッケージの表面のｓｃＦｖフラグメントのディスプレーを記載している。
【００４５】
ｓｃＦｖの製造に用いるペプチドリンカーは、ＶＬおよびＶＨドメインの適切な三次元折り畳みと結合、ならびに標的分子結合特異性の維持を保証するよう選択された可撓性ペプチドである。一般に、ＶＬまたはＶＨ配列のカルボキシ末端は、このようなペプチドリンカーによって、相補的ＶＨまたはＶＬ配列のアミノ末端に共有結合する。リンカーは一般に１０ないし５０アミノ酸残基であるが、抗原結合部位を形成させるに充分な可撓性を持つ任意の長さが考えられる。好ましくはリンカーは１０ないし３０アミノ酸残基である。より好ましくはリンカーは１２ないし３０アミノ酸残基である。最も好ましくはリンカーは１５ないし２５アミノ酸残基である。このようなリンカーペプチドの例は（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３を包含する。
【００４６】
本発明における使用のため、任意の起源のＶＬおよびＶＨドメインをｓｃＦｖ中に取り込むことができる。例えば、ＶＬおよびＶＨドメインは所望の結合特性を持つモノクローナル抗体から直接取得できる。別法として、ＶＬおよびＶＨドメインは、選択した哺乳動物由来のＶ遺伝子配列のライブラリーからのものであってもよい。このようなライブラリーの要素はＶＬおよびＶＨドメインの無作為の組み合わせを発現し、所望の結合特性を持つ要素を同定するため、任意の所望抗原を用いてスクリーニングする。特に好ましいのはヒトＶ遺伝子ライブラリーである。このようなスクリーニングのための方法は当分野で既知である。選択した非ヒト起源のＶＬおよびＶＨドメインは、例えばＣＤＲループをヒトＶＬおよびＶＨドメインに置換することにより「ヒト化」し、または、当分野で既知のその他の手段によって修飾して、人間に投与した時の免疫原性を低下させることができる。
【００４７】
生理的免疫反応において、発現される抗体遺伝子の突然変異および選択は、標的抗原について高い親和性を有する抗体の産生につながる。ｓｃＦｖで発現されるＶＬおよびＶＨドメインを同様にインビトロ突然変異およびスクリーニング法に付して、高親和性変異体を取得することができる。
【００４８】
細菌分泌シグナル配列および簡便な制限クローニング部位を含む、ｓｃＦｖの組み立てと発現のためのベクターが入手できる。特定の抗原に特異的な結合部位をコードしているＶＬおよびＶＨ遺伝子の組み合わせをＢ細胞ハイブリドーマのｃＤＮＡから単離する。別法として、ＶＬおよびＶＨ遺伝子の無作為組み合わせをゲノムＤＮＡから取得し、次いでその生成物を目的抗原との結合についてスクリーニングする。典型的には、クローニングのために、クローニングベクター中の制限部位と両立し得るプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する。例えば、Ｄｒｅｈｅｒ，Ｍ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３９：１９７−２０５；Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．（１９９３） Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２４：１−２０；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ． ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．（１９９９） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：５６８−５７２を参照されたい。
【００４９】
ＶＬおよびＶＨドメインの、選択したまたは無作為の組み合わせを持つｓｃＦｖを発現させるために、これらのドメインをコードしているＶ遺伝子を細菌の発現ベクター中に組み込む。例えば、細菌分泌シグナル配列およびペプチドリンカーをコードしている配列を持ち、そしてＶＬおよびＶＨ遺伝子の挿入のために都合のよい制限部位を有するベクターを使用することができる。別法として、最初に、例えば部分重複プライマーを用いるＰＣＲ増幅により、必要な全コード化配列（例えば、分泌シグナル、ＶＬ、ＶＨおよびリンカーペプチド）を単一の配列中に組み込み、その後プラスミドまたはその他のベクター中にライゲーションすることが望ましいかも知れない。ＶＬおよびＶＨドメインの特別な組み合わせの取得を望む場合には、それらのドメインをコードしている配列に特異的なＰＣＲプライマーを使用する。多数のＶＬおよびＶＨドメインの多様な組み合わせの作製を望む場合には、複数の配列を増幅するプライマーの混合物を使用する。
【００５０】
好ましい細菌ベクターは線維状ファージのコート蛋白に結合するｓｃＦｖの発現をさせることができる。最も普通に用いられるファージのコート蛋白はファージＭ１３の遺伝子ＩＩＩ蛋白である。線維状ファージ上のｓｃＦｖのディスプレーは、ｓｃＦｖの大集団を所望の結合特性についてスクリーニングすることを望む場合には特に有用である。ｓｃＦｖ−ｇＩＩＩ蛋白融合物を発現する細菌細胞をＭ１３変異体に感染させるが、この変異体は、ｓｃＦｖ−ｇＩＩＩ融合物遺伝子を持つベクターＤＮＡをファージ粒子の中に優先的にパッケージングさせることができ、その中にｓｃＦｖ−ｇＩＩＩコート蛋白融合物が組み込まれる。得られるファージ粒子の各々は特定のｓｃＦｖをディスプレーし、ｓｃＦｖをコードしているベクターを含んでいる。次いでｓｃＦｖの多様な集まりをディスプレーしているこのようなファージ粒子の集団を、パンニング法により所望の結合特性について濃縮する。典型的には、所望の粒子を、所望のファージ粒子が結合することのできる抗原で被覆した固体表面に固定化する。結合した粒子を集め、細菌細胞を感染させるためにさらに使用する。パンニング法を反復して所望の結合特性をさらに濃縮する。
【００５１】
ｓｃＦｖ−ｇＩＩＩ融合物をコードしているベクターはｓｃＦｖおよびｇＩＩＩコード化領域の結合点に翻訳停止コドンを含むことができる。対応する翻訳停止サプレッサーを持つ細菌細胞中で発現される時、この融合蛋白が産生される。対応するサプレッサーを持たない細菌細胞で発現される場合には、遊離のｓｃＦｖが産生する。
【００５２】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、胚の発生中の血管形成、および成人の血管新生プロセス、例えば創傷治癒、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、炎症性疾患、腫瘍の増殖および転移の、重要な調節物質である。ＶＥＧＦは、血管透過性の強力な誘導物質であり、内皮細胞の遊走および増殖の刺激物質であり、そしてその活性を主として２種類のチロシンキナーゼレセプター、ＶＥＧＦレセプター１（ＶＥＧＦＲ−１）、またはｆｍｓ様チロシンレセプター１（Ｆｌｔ−１）、およびＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ−２）、またはキナーゼ挿入ドメイン含有レセプター（ＫＤＲ、およびマウスのＦｌｋ−１）によって仲介する。Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．， Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２３７， １−３０（１９９９）；Ｋｌａｇｓｂｒｕｍ，Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ． ７， ２５９−２７０（１９９６）；Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｇ．， ｅｔ ａｌ． ＦＡＳＥＢ Ｊ． １３， ９−２２（１９９９）。多くの研究が、ＶＥＧＦとそのレセプターの過剰発現は腫瘍に関連する血管新生において、そしてそれ故腫瘍の増殖および転移において重要な役割を果たしていることを示している。
【００５３】
Ｆｌｔ−１およびＫＤＲは胚の血管の発生において別個の機能を持っている。マウスにおいていずれかのレセプターをコードしている遺伝子の選択的除去は胚にとって致死的であり、胚の発生におけるＶＥＧＦ経路の生理的重要性を立証している。ＫＤＲ欠損マウスは血島形成が損なわれ且つ成熟した内皮細胞を欠失しており、一方無Ｆｌｔ−１胚は内皮細胞が潤沢であるにもかかわらず、不完全な血管形成のため、正常な血管系を発達させることができない。Ｓｈａｌａｂｙ，Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７６， ６２−６６（１９９５）；Ｆｏｎｇ，Ｇ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７６， ６６−７０（１９９５）。これに対し、チロシンキナーゼドメインの末端切除によるＦｌｔ−１シグナル伝達の不活性化はマウス胚の血管新生および胚の発生を損なうことがなく、Ｆｌｔ−１レセプターによるシグナル伝達が胚の血管系の発生にとって必須でないことを示唆している。Ｈｉｒａｔｓｕｋａ，Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ９５， ９３４９−９３５４（１９９８）。成人におけるＶＥＧＦに対するＦｌｔ−１およびＫＤＲの生物学的応答もまた異なっているように見受けられる。一般的にＫＤＲは、内皮細胞増殖、遊走、分化、管形成、血管透過性増大、および血管の完全性の維持をもたらす主たるＶＥＧＦシグナルトランスデューサーであると考えられている。Ｆｌｔ−１ははるかに弱いキナーゼ活性を持ち、ＶＥＧＦにより刺激された場合に分裂応答を誘発できない（これはＫＤＲのおよそ１０倍の親和性でＶＥＧＦに結合するのであるが）。Ｆｌｔ−１はさらに、ＶＥＧＦおよび胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）により誘発される単球／マクロファージの遊走と組織因子の産生にも関連している。Ｂａｒｌｅｏｎ，Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８７， ３３３６−３３４３（１９９６）；Ｃｌａｕｓｓ，Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１， １７６２９−１７６３４（１９９６）。
【００５４】
好ましい態様では、本発明に係る抗原結合蛋白は、ＫＤＲに結合しＫＤＲへのＶＥＧＦの結合を遮断するｓｃＦｖを含んでいる。ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１（配列番号２７、２８）はマウスｓｃＦｖファージディスプレーライブラリーから製造する（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。ｐ１Ｃ１１はＶＥＧＦ−ＫＤＲ相互作用を遮断し、ＶＥＧＦにより刺激されるレセプター燐酸化とヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の分裂誘発を阻害する。このｓｃＦｖは、例えばＨＵＶＥＣ上の可溶性ＫＤＲおよび細胞表面発現されるＫＤＲの両者と、高い親和性（Ｋｄ＝２．１ｎＭ）で結合する。
【００５５】
第二の好ましい態様では、本発明に係る抗原結合蛋白は、Ｆｌｔ−１に結合しそしてＦｌｔ−１へのＶＥＧＦの結合および／またはＰＩＧＦの結合を遮断する、ｓｃＦｖを含んでいる。Ｍａｂ ６．１２は可溶性および細胞表面発現されるＦｌｔ−１に結合する。ｓｃＦｖ ６．１２はマウスモノクローナル抗体Ｍａｂ ６．１２のＶＬおよびＶＨドメインを含んでいる。Ｍａｂ ６．１２を産生するハイブリドーマセルラインはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３３４４として寄託されている。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約およびその規則（ブダペスト条約）の規定の下になされた。これは、生きている培養を寄託日から３０年間維持することを保証するものである。この微生物はブダペスト条約の条件の下でＡＴＣＣによって入手可能とされ、関連する米国特許の登録時に無制限の入手可能性を保証する、出願者とＡＴＣＣとの合意の下にある。寄託された菌株の入手可能性は、任意の政府当局の下でその特許法に従って付与された権利に違反してその発明を実施する許可と解釈してはならない。
【００５６】
本発明に係る抗原結合蛋白は任意のエピトープ、抗原部位または蛋白に対する結合部位を持ち得る。好ましい抗原結合蛋白はレセプター蛋白の活性化を中和する。ＶＥＧＦレセプターおよび血管新生に関与するその他のレセプターが特に興味深い。ＶＥＧＦレセプターはＫＤＲ、Ｆｌｋ−１、Ｆｌｔ−１を包含する。インビボ血管新生の可能性ある調節物質として関与しているその他の因子は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）を包含する。対応するレセプターは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−Ｒ）、血小板由来増殖因子レセプター（ＰＤＧＦ−Ｒ）、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）である。血管新生および／または腫瘍形成に関与するレセプターチロシンキナーゼもまた興味深い。このようなレセプターチロシンキナーゼは、ＦＬＴ４、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＴｅｋおよびＴｉｅ２を包含する。興味深いレセプターは、ヒト蛋白およびその他の哺乳動物由来の類似体を包含する。上に列挙したレセプターとして抗体が知られており、それらは本発明に係る抗原結合蛋白に使用するためのｓｃＦｖ ＶＬおよびＶＨドメインの供給源である。列挙したレセプターのいずれかに特異的な本発明に係る抗原結合蛋白は単一特異性または二重特異性であってよい。本発明に係る或る二重特異性抗原結合蛋白は、上記レセプターのうち２種類に結合する。一つの好ましい態様では、係る二重特異性抗原結合蛋白はＨＥＲ２およびＥＧＦ−Ｒに結合する。第二の好ましい態様では、本発明に係る抗原結合蛋白はＫＤＲおよびＦＬＴ−１に結合する。
【００５７】
本発明に係る二重特異性抗原結合蛋白は、標的細胞上の抗原と免疫系エフェクター細胞上の抗原を架橋させることができる。これは、例えば細胞表面に目的とする特定の抗原を持つ細胞に対する免疫反応を促進させるために有用となり得る。本発明によれば、免疫系エフェクター細胞は、抗原特異的細胞、例えば細胞性免疫反応を活性化するＴ細胞、ならびに非特異的細胞、例えば細胞性免疫反応を仲介するマクロファージ、好中球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を包含する。
【００５８】
本発明に係る抗原結合蛋白は、免疫系エフェクター細胞の任意の細胞表面抗原のための結合部位を持ち得る。このような細胞表面抗原は、例えばサイトカインおよびリンホカインレセプター、Ｆｃレセプター、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２およびＣＤ６４を包含する。一般に、抗原結合部位はｓｃＦｖによって提供され、これは前記の抗原に対する抗体から誘導され、当分野で周知である。サイトカインおよびリンホカインレセプターに特異的な本発明に係る抗原結合部位はまた、該レセプターのための天然リガンドの全体または一部に対応するアミノ酸配列であってもよい。例えば、細胞表面抗原がＩＬ−２レセプターである時、本発明に係る抗原結合蛋白は、対応するアミノ酸またはＩＬ−２の配列を含む抗原結合部位を持ち得る。その他のサイトカインおよびリンホカインは、例えばインターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−５（ＩＬ−５）のようなインターロイキン、ならびに顆粒球−マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）を包含する。
【００５９】
本発明に係る好ましい抗原結合蛋白は、ＣＬ軽鎖定常ドメインに連結したｓｃＦｖを有する第一ポリペプチド、ならびにＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３重鎖定常ドメインに連結したｓｃＦｖを有する第二ポリペプチドを発現させることによって作製する。ｓｃＦｖをコードしているＤＮＡフラグメントは、例えば、哺乳動物細胞中でヒト重鎖のいずれかのヒト軽鎖を発現するよう設計したＨＣＭＶベクター中にクローニングできる（例えば、Ｂｅｎｄｉｇ， ｅｔ ａｌ．，米国特許５８４０２９９；Ｍａｅｄａ， ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ２， １２４−１３４を参照されたい）。このようなベクターは、軽鎖および重鎖組み立て物の高レベル転写のためのヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーターおよびエンハンサーを含んでいる。好ましい態様では、軽鎖発現ベクターは、ヒトκ軽鎖をコードしているｐＫＮ１００（Ｄｒ．Ｓ．Ｔａｎｎａｎ Ｊｏｎｅｓ， ＭＲＣ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｅｎｇｌａｎｄより寄贈）であり、重鎖発現ベクターは、ヒトγ−１重鎖をコードしているｐＧ１Ｄ１０５（Ｄｒ．Ｓ．Ｔａｎｎａｎ Ｊｏｎｅｓより寄贈）である。いずれのベクターも、哺乳動物細胞およびＥ．ｃｏｌｉ中で機能するＨＣＭＶプロモーターおよびエンハンサー、複製起点ならびに選択マーカーを含んでいる。
【００６０】
選択マーカーは、形質転換された宿主細胞が選択培養基中で生存または増殖するのに必要な蛋白をコードしている遺伝子である。典型的な選択マーカーは、（ａ） 抗生物質またはその他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メソトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ） 栄養要求性欠陥を補完する、または（ｃ） 複合培地から得られない重要な栄養素、例えばＢａｃｉｌｌｉのためのＤ−アラニンラセマーゼをコードしている遺伝子、を供給する、蛋白をコードしている。特に有用な選択マーカーはメソトレキサートに対する耐性を付与する。例えば、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメソトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養基で全形質転換体を培養することにより、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換した細胞をまず同定する。野生型ＤＨＦＲを使用する場合の適当な宿主細胞は、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（１９８０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７， ４２１６の記載のように調製し増殖させた、ＤＨＦＲ活性を欠失するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）セルラインである。次に、形質転換した細胞を増加レベルのメソトレキサートに暴露する。このことにより多コピーのＤＨＦＲ遺伝子の合成が導かれ、同時にこの発現ベクターを含む多コピーの他のＤＮＡ、例えば抗体または抗体フラグメントをコードしているＤＮＡの合成が導かれる。
【００６１】
酵母中で遺伝子組み立て物を発現させることが望ましい場合、酵母での使用に好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である。Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．（１９７９） Ｎａｔｕｒｅ， ２８２， ３９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７９） Ｇｅｎｅ ７， １４１。このｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１のための選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ（１９７７） Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５， １２。次いでこの酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在が、トリプトファン不在下での増殖により形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠失酵母菌株（ＡＴＣＣ２０６２２または３８６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を持つ既知のプラスミドによって補完される。
【００６２】
ベクターの形質転換および本発明に係る抗原結合蛋白の発現のために好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびリンパ球起源のセルライン、例えばリンパ腫、骨髄腫、またはハイブリドーマ細胞である。その他の真核生物宿主、例えば酵母がこれらに代わって使用できる。形質転換した宿主細胞は、当分野で既知の方法により、同化可能な炭素源、例えばグルコースまたは乳糖のような炭水化物、窒素、例えばアミノ酸、ペプチド、蛋白またはそれらの分解産物、例えばペプトン、アンモニウム塩など、および無機塩類、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウムの硫酸塩、燐酸塩および／または炭酸塩を含有する液体培地で培養する。培地はさらに、例えば微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガンなどの増殖促進物質を含有する。
【００６３】
本発明に係る抗原結合蛋白の各可変ドメインは完全な免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖可変ドメインであるか、または天然に存在するドメインの機能的等価物もしくは突然変異体もしくは誘導体であるか、または例えばＷＯ９３／１１２３６（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｎｃｉｌ ｅｔ ａｌ．／Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．）に記載のような技術を用いてインビトロで組み立てられた合成ドメインとすることができる。例えば、少なくとも１個のアミノ酸を欠失する抗体可変ドメインに対応するドメインを結合させることが可能である。重要な特徴的性質は、相補的可変ドメインと結合して抗原結合部位を形成する、各可変ドメインの能力である。
【００６４】
同様に、定常ドメインの重要な特徴は、安定な複合体を形成する能力である。本発明に係る抗原結合蛋白は完全なＣＬおよびＣＨ１ドメインを含むが、本発明は、該ドメインが安定な複合体として結合できる限り、アミノ酸が除去または挿入されているかも知れない、そして鎖間ジスルフィド結合を持っているかも知れないし持っていないかも知れない、修飾されたＣＬおよびＣＨ１ドメインの使用をも意図している。
【００６５】
Ｆｃ定常ドメインの重要な特徴的性質は、自己結合し、Ｆｃレセプターに結合し、ＣＭＣを開始させ、そしてＡＤＣＣを開始させる自己結合の能力を包含する。先に述べたように、本発明に係る抗原結合蛋白は、あらゆる定常ドメイン構造または機能が存在している必要はない。したがって、重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン、定常ドメイン、ｓｃＦｖおよびＦｃという語は、機能的に等価である全ての変異体を包含すると解するべきである。
【００６６】
本発明の好ましい態様では、二重特異性抗体の抗原結合部位は２種類の異なる結合特異性を持つｓｃＦｖドメインを含む。例えば、ＩｇＧ分子のＶＬおよびＶＨドメインを異なる特異性を持つｓｃＦｖドメインに置換し、その結果、本明細書中でＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧと称する得られた分子はその標的抗原の各々について二価となる。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、様々な発現系、とりわけ哺乳動物細胞中で機能的に発現され且つ組み立てられ、２個の異なるエピトープに同時に結合できる。
【００６７】
本明細書で先に記したように、ｓｃＦｖは軽鎖および重鎖定常ドメインとの結合にとって好ましい。しかしながら、それが望ましいまたは都合のよい場合は、本発明に係る二重特異性抗原結合蛋白の抗原結合部位を含む構造は、Ｆｖ以上または以下を包含する。例えば、これはさらに定常領域部分（例えば、軽鎖または重鎖ドメインへのＦａｂの連結）またはＦｖの一部のみ（例えば、抗原結合が１個の可変ドメインにより前もって決定されており、第二の可変ドメインが親和性または特異性に殆ど寄与しない場合）を包含する。したがって、抗原結合部位は、さらに軽鎖または重鎖定常領域に連結した単一のポリペプチド鎖を含み、それが、該抗原結合蛋白中のドメインの配置を前もって明確に決定し、少なくとも２個の定常ドメインを有するＩｇ型構造全体を形成することを可能にする。
【００６８】
所望の結合特性を持つ抗原結合蛋白に包含させるための抗原結合部位は様々な方法で取得できる。選ばれた結合ドメインのＶＬおよびＶＨ部分のアミノ酸配列は、天然に存在する抗体に対応しているか、または所望の免疫原性もしくは結合特性を得られるよう選択または修飾する。例えば、非ヒト供給源から誘導した抗原結合部位をヒト可変ドメインに置換した、キメラ可変ドメインが組み立てられる。キメラ組み立て物は、例えば非ヒト起源の抗原結合ドメインを人間の治療に使用することを望む場合、有害な免疫原性性質の排除にとって特に貴重である。好ましいキメラドメインは、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）に導入した１またはそれ以上の非ヒト起源相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を有するドメインである。係るキメラの例については、Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．，（１９９６） Ｎａｔｕｒｅ ３２１， ５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎ，Ｌ． ｅｔ ａｌ．，（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３２， ３２３−３２７；米国特許第５５３０１０１号（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．）を参照されたい。可変ドメインは高度の構造的相同性を持っており、ＣＤＲおよびＦＲに対応する可変ドメイン内のアミノ酸残基が容易に同定できる。例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ． ５ｔｈ ｅｄ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， 米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤを参照されたい。したがって、抗原結合に参加するアミノ酸は容易に同定できる。加えて、導入されたＣＤＲを含むキメラ結合ドメインの、抗原に対する親和性を保持または増強する方法が開発された。１つの方法は、ＣＤＲ領域のコンホメーションに影響を及ぼす外来フレームワーク残基をこのキメラドメインに包含させることである。第二の方法は、この外来可変領域に最も近い相同性を持つヒト可変ドメイン上に、外来ＣＤＲを導入することである。Ｑｕｅｅｎ，Ｃ． ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６， １００２９−１００３３。まず、所望のＣＤＲ配列を含む部分重複プライマーを用いて個々のＦＲ配列を増幅し、得られた遺伝子セグメントを次の増幅反応に加えることにより、ＣＤＲを最も容易に異なるＦＲ上に導入できる。異なる可変ドメイン上へのＣＤＲの導入は、このアミノ酸配列のＣＤＲに隣接し、またはＣＤＲのコンホメーションに影響を及ぼす折り畳まれた可変ドメイン構造中のＣＤＲにパッキングされた、アミノ酸残基の置換を含むことができる。故に、本発明に係るヒト化ドメインは、１またはそれ以上の非ヒトＣＤＲと共に、結合特性を保持または増強するためにさらなる置換または置き換えを施した係るドメインを含むヒト抗体を包含する。
【００６９】
本発明に係るキメラ結合ドメインはさらに、ｓｃＦｖを免疫系に対して自己として出現させるため表面露出残基を置き換えることによってヒト化させた抗体をも包含する（Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．（１９９１） Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８， ４８９−４９８）。抗体はこの方法によって親和性を失うことなくヒト化する（Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１， ９６９−９７３）。抗原結合部位近傍におけるアミノ酸残基のパッキングが不変であるため、親和性は保持される。ヒト化目的のための本発明に係るｓｃＦｖの表面露出残基の置換は、結合特性に影響するＣＤＲ残基または隣接残基の置換を意味しない。
【００７０】
本発明は、本質的に人間のものである結合ドメインを意図するものである。ヒト結合ドメインは、ヒト重鎖および軽鎖可変ドメインの組み合わせが線維状ファージの表面にディスプレーされているファージディスプレーライブラリーから取得する（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４８， ５５２−５５４；Ａｕｊａｍｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ８， １５５−１６８）。可変ドメインの組み合わせは典型的にはＦａｂまたはｓｃＦｖの形で線維状ファージ上にディスプレーされる。このライブラリーを、所望の抗原結合特性を持つ可変ドメインの組み合わせを有するファージについてスクリーニングする。好ましい可変ドメインの組み合わせは、選ばれた抗原に対して高い親和性を示し、他の関連抗原に対する交差反応性を殆ど示さない。極めて大レパートリーの抗体フラグメントをスクリーニングすることにより（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４） ＥＭＢＯ Ｊ． １３， ３２４５−３２６０）、充分な多様性を持つ高親和性Ｍａｂが単離でき、多くは所望抗原についてナノモル以下の親和性を有すると予想される。
【００７１】
別法として、ヒト結合ドメインは、再編成されていないヒトＩｇ遺伝子セグメントをその中に導入し、そして内因性マウスＩｇ遺伝子を失活させたトランスジェニック動物から取得することができる（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ（１９９７） Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８， ４５５−４５８）。好ましいトランスジェニック動物は、１Ｍｂを超えるサイズの極めて大きな隣接Ｉｇ遺伝子フラグメントを含んでいる（Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １５， １４６−１５６）が、中等度の親和性のヒトＭａｂは、より小さな遺伝子座を含むトランスジェニック動物から生成することができる（例えば、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４２， ２６７２−２６８１；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ７， １３−２１）。
【００７２】
本発明に係る結合ドメインは結合特性を直接突然変異または親和性成熟の方法によって改善させたものを包含する。親和性と特異性は、ＣＤＲを突然変異させ、所望の特性を有する抗原結合部位についてスクリーニングすることによって修飾または改善できる（例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ． ２５４， ３９２−４０３）。ＣＤＲは様々な方法で突然変異させる。１つの方法は、個々の残基または残基の組み合わせを無作為化する事であり、その結果、他の点では同一の抗原結合部位の集団において、２０の全アミノ酸が特定の位置に見出される。別法として、誤りがちなＰＣＲ法により、ＣＤＲ残基の範囲に突然変異を誘発する（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ． ２２６， ８８９−８９６を参照されたい）。重鎖および軽鎖可変領域遺伝子を含むファージディスプレーベクターをＥ．ｃｏｌｉの突然変異菌株で増殖させる（例えば、Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ． ２５０， ３５９−３６８を参照されたい）。これらの突然変異誘発方法は当業者の知悉する多くの方法の実例である。
【００７３】
本発明の別の態様では、抗原結合蛋白を抗腫瘍物質または検出可能シグナル生成物質に、化学的または生合成的に連結させることができる。抗体に連結させる抗腫瘍物質は、該抗体が結合した腫瘍を、または該抗体が結合した細胞の環境において腫瘍を破壊または損傷する任意の物質を包含する。例えば、抗腫瘍物質は化学療法剤またはラジオアイソトープのような毒性物質である。好適な化学療法剤は当業者に知られており、アントラサイクリン類（例えばダウノマイシンおよびドキソルビシン）、メソトレキサート、ビンデシン、ネオカルジノスタチン、シスプラチン、クロラムブシル、シトシンアラビノシド、５−フルオロウリジン、メルファラン、リシンおよびカリケアミシンを包含する。化学療法剤は常法を用いて抗体とコンジュゲートさせる（例えば、Ｈｅｒｍｅｎｔｉｎ ａｎｄ Ｓｅｉｌｅｒ（１９８８） Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ． Ｍｉｔｔ． ８２， １９７−２１５を参照されたい）。
【００７４】
検出可能シグナル生成物質は、診断目的のためにインビボおよびインビトロで有用である。シグナル生成物質は、外的手段、通常電磁気放射の測定により検出し得る測定可能なシグナルを生成する。大抵は、シグナル生成物質は酵素または発色団であるか、または蛍光、燐光または化学ルミネセンスにより光を発する。発色団は、紫外または可視領域で光を吸収する色素を包含し、酵素触媒反応の基質または分解産物であってよい。
【００７５】
本発明はさらに、標的またはリポーター部分が連結した本発明に係る抗原結合蛋白を意図している。標的部分が結合対の第一の成員である。抗腫瘍物質は、例えば係る対の第二の成員とコンジュゲートさせ、それにより抗原結合蛋白が結合する部位へと導かれる。このような結合対の一般的な例はアビジンとビオチンである。好ましい態様では、ビオチンを本発明に係る抗原結合蛋白にコンジュゲートさせ、それによりアビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートした抗腫瘍物質またはその他の部分のための標的を提供する。別法として、ビオチンまたはもう一つのこのような部分を本発明に係る抗原結合蛋白に連結させ、例えば検出可能なシグナル生成物質がアビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートしている診断系において、リポーターとして使用する。
【００７６】
抗腫瘍物質として使用するための好適なラジオアイソトープもまた当業者に知られている。例えば、１３１Ｉまたは２１１Ａｔを使用する。これらのアイソトープを常套技術を用いて抗体に結合させる（例えば、Ｐｅｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６８， ６９−７３を参照されたい）。別法として、抗体に結合させる抗腫瘍物質は、プロドラッグを活性化する酵素である。このようにして、腫瘍部位に到達するまでは不活性型のままでいるプロドラッグを投与するが、いったん抗体複合体が投与されたならば、その腫瘍部位においてプロドラッグは細胞毒型に変換される。実際には、抗体−酵素コンジュゲートを患者に投与し、治療されるべき組織の領域に局在化させる。次いでプロドラッグをこの患者に投与し、その結果細胞毒性薬物への変換が、治療すべき組織の領域で起こる。別法として、抗体にコンジュゲートさせる抗腫瘍物質はサイトカイン、例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）である。抗体が腫瘍をサイトカインの標的とさせ、その結果、サイトカインは他の組織に影響を及ぼすことなく腫瘍の損傷または破壊を仲介する。サイトカインは常套的組換えＤＮＡ技術を用いてＤＮＡレベルで抗体と融合させる。
【００７７】
本発明に係る蛋白は、さらなるアミノ酸残基、例えば、単離または精製を容易にするためのペプチドタグ、または該蛋白が発現される任意の特定宿主における分泌または膜輸送を促進するためのシグナル配列、と融合させることができる。
【００７８】
ＫＤＲの２個の異なるエピトープに特異的な結合ドメインを持つ二重特異性蛋白に関連し、そして本発明に係る抗原結合蛋白の有利な機能的側面を立証する、本発明の具体例をここに提供する。使用する結合ドメインは、ＫＤＲで免疫したマウスから組み立てたファージディスプレーライブラリーから単離するｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１およびｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７から誘導する（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【００７９】
ｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７は、ＫＤＲおよびマウス相同体Ｆｌｋ−１の両者に共通するエピトープに結合し、いずれのレセプターに対するＶＥＧＦの結合も妨害しない。ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１はＫＤＲの異なるエピトープに結合し、ＶＥＧＦの結合を遮断できるが、Ｆｌｋ−１には結合しない。したがって、各結合ドメインのうち２つをディスプレーする二重特異性二価免疫グロブリン様分子はＫＤＲへの結合について四価であり、Ｆｌｋ−１への結合については二価である。
【００８０】
Ｆｌｋ−１に対して二価であるＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、Ｆｌｋ−１に対する二価ｄｉａｂｏｄｙであるＤＡＢ ｐ４Ｇ７と類似のアビディティを持っている。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＤＡＢ ｐ４Ｇ７のアビディティはそれら各々の一価対応物であるＢｓ（ｓｃＦｖ）２−ＦａｂおよびｓｃＦｖ ｐ４Ｇのおよそ１０ないし２３倍高く、この事は、二価性に起因する増強された結合を立証している。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧはその構成成分の結合部位の両方の生物学的機能を保持しており、ＫＤＲおよびＦｌｋ−１の両者に対し、親抗体と同じ位有効に結合する（図４）。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、ヒト内皮細胞上の表面発現ＫＤＲに結合し、ＫＤＲ／ＶＥＧＦ相互作用を遮断し、そしてＶＥＧＦにより誘発されるＫＤＲレセプター燐酸化を用量依存的に中和する（図５および６）。とりわけＢＳ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、ｃ−ｐ１Ｃ１１よりも低い親和性でＫＤＲに結合し、そしてＫＤＲ／ＶＥＧＦ相互作用の遮断においてＥＬＩＳＡ検定で４倍有効性が低いという事実にも拘わらず、ＶＥＧＦにより誘発されるレセプター燐酸化の中和においてｃ−ｐ１Ｃ１１と同じ位強力である。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧの生物活性の増強は、ＫＤＲに関して四価であることに由来する増強した結合に帰することができる。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、分子内架橋（即ち、同じＫＤＲ分子内部で２個のエピトープを架橋する）および／または細胞表面で多分子複合体を形成するための分子間架橋の能力を持っている。
【００８１】
本発明に係る抗原結合蛋白は人間およびその他の哺乳動物の疾病の治療に有用である。この抗原結合蛋白は、天然および改変抗体についてこれまで知られているのと同じ目的および同じ方法で使用する。したがってこの抗原結合蛋白は、当分野で周知の研究、診断または治療方法のためにインビボおよびインビトロで使用できる。
【００８２】
診断または治療目的で人間の身体に使用する場合、本発明に係る抗原結合蛋白は、薬学上許容し得る担体をさらに含む組成物の形で投与するという事が理解できる。好適な薬学上許容し得る担体は、例えば水、食塩水、燐酸緩衝化食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうち１またはそれ以上、ならびにこれらの組み合わせを包含する。薬学上許容し得る担体はさらに、湿潤もしくは乳化剤、保存料または緩衝剤といった補助物質を少量含み、これらは該結合蛋白の貯蔵期間または有効性を増大させる。本発明に係る組成物は様々な形態であってよい。これらは、例えば固体、半固体および液体投与型、例えば錠剤、丸剤、散剤、液体、分散剤または懸濁剤、リポソーム、坐剤、注射溶液および注入溶液を包含する。好ましい形態は意図する投与方式および治療適応に依存する。好ましい組成物は注射溶液または注入溶液の形態である。
【００８３】
本発明に係る好ましい薬用組成物は、他の抗体による人間の受動免疫に用いられるものに類似している。好ましい投与方式は非経口的である。
【００８４】
本明細書に開示する本発明の原則に当業者が変化を施すことができるという事が理解および予想でき、また、係る修飾は本発明の範囲内に包含される事を意図している。
【００８５】
以下の実施例は本発明をさらに例示するものであるが、いかなる方法によっても本発明の範囲を限定するものと解してはならない。例えばベクターおよびプラスミドの組み立て、係るベクターおよびプラスミドへのポリペプチドをコードしている遺伝子の挿入、宿主細胞へのプラスミドの導入、ならびに遺伝子および遺伝子産物の発現およびその測定といった常法の詳細な説明は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ． ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを包含する多数の刊行物から得ることができる。本明細書に記載する全ての参考文献は引用によりその全体を本明細書の一部とする。
【００８６】
実施例１：材料および方法
蛋白および抗体
完全なＫＤＲコード化配列血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、キナーゼ挿入ドメイン含有レセプター−アルカリホスファターゼ融合蛋白（ＫＤＲ−ＡＰ）およびそのマウス相同体、胎児肝キナーゼ１（Ｆｌｋ−１）−ＡＰをそれぞれバキュロウイルスおよびＮＩＨ３Ｔ３細胞で発現させ、記載の方法に従い精製する（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
【００８７】
ヒトＫＤＲコード化配列は公表されている（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ０３５１２１）。ＫＤＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン除去突然変異体をＰＣＲクローニングにより組み立て、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞で発現させ、記載のように精製する（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，（２０００） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７５， １４３２１−１４３３０）。このＫＤＲ ＥＣＤ Ｉｇドメイン除去突然変異体は以下の構造を有する：
ＫＤＲ（Ｉｇ１−７）：レセプターの７個のＩｇドメイン全てを含む完全長ＫＤＲ ＥＣＤ（アミノ酸Ｍｅｔ１からＶａｌ７４２まで）；
ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）：３個のＮ末端ＥＣＤ Ｉｇドメインを含む突然変異体（アミノ酸Ｍｅｔ１からＬｙｓ３２７まで）；および、
ＫＤＲ（Ｉｇ３−７）：ＫＤＲ ＥＣＤ Ｉｇドメイン３ないし７を含む突然変異体（アミノ酸Ａｓｐ２２５からＶａｌ７４２まで）。
【００８８】
抗ＫＤＲ一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ｐ１Ｃ１１およびｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７を、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８， ３２０９−３２１４およびＬｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２３０， １５９−１７１に報告されたように、ＫＤＲで免疫したマウスから組み立てたファージディスプレーライブラリーから単離する。
【００８９】
二価ｓｃＦｖフラグメントの形態であるｄｉａｂｏｄｙ ＤＡＢ ｐ４Ｇ７（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０， ６４４４−６４４８；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １４， １９２−１９６）を、前にＺｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）およびＬｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）に記載されたようにｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７から組み立てる。ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１から組み立てたマウス／ヒトキメラＩｇＧ１抗体であるｃ−ｐ１Ｃ１１、および表皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプターに対するキメラＩｇＧ１抗体であるＣ２２５は、いずれもＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）で製造されている。Ｚｈｕ， ｅｔ ａｌ．（１９９９）。
【００９０】
抗Ｆｌｔ−１抗体Ｍａｂ６．１２（ＩｇＧ１， κ）を産生するハイブリドーマセルライン（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＰＴＡ−３３４）は、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）において該レセプターの組換え型で免疫したマウスから確立した。
【００９１】
マウスの免疫および一本鎖抗体ファージディスプレーライブラリーの組み立て 雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、Ｒｉｂｉ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ ２００μｌ中のＫＤＲ−ＡＰ １０μｇを２回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、続いて２ヶ月の間にＲＩＢＩアジュバント無しで１回ｉ．ｐ．注射する。このマウスはまた、最初の免疫の時点で、ＲＩＢＩ ２００μｌに入れたＫＤＲ−ＡＰ １０μｇの皮下（ｓ．ｃ．）注射を受ける。このマウスは安楽死の３日前にＫＤＲ−ＡＰ ２０μｇでｉ．ｐ．ブースティングする。ドナーマウスの脾臓を摘出し、細胞を単離する。ＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡを脾臓細胞の全ＲＮＡから精製する。逆転写の後、発現されたＶＬおよびＶＨ遺伝子に対応するｃＤＮＡを個別に増幅する。増幅した生成物を、各遺伝子を受容するよう設計したベクター中に別々に挿入するか、または、分泌シグナル配列およびポリペプチドリンカーをコードしているヌクレオチドに連結し（例えばＰＣＲ増幅により）、融合した生成物を所望ベクター中に挿入することができる。例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８を参照されたい。
【００９２】
マウスｓｃＦｖを線維状ファージ上にディスプレーするための材料と方法は市販品が入手できる（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。簡潔に述べると、ｓｃＦｖを線維状ファージ表面にディスプレーするには、抗体ＶＨおよびＶＬドメインを１５アミノ酸リンカー（ＧＧＧＧＳ）３によって結合させる。この組み立て物のＣ末端を、１５アミノ酸Ｅタグを持ちアンバーコドン（ＴＡＧ）で終わっているファージ蛋白ＩＩＩのＮ末端に連結する。Ｅタグと蛋白ＩＩＩの間に位置するアンバーコドンは、非サプレッサー宿主（例えばＨＢ２１５１細胞）中に導入された場合はｓｃＦｖを可溶性型で産生させ、サプレッサー宿主（例えばＴＧ１細胞）中に導入された場合は蛋白ＩＩＩを介してファージをディスプレーさせる。
【００９３】
このｓｃＦｖ−遺伝子ＩＩＩ組み立て物をｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅベクターにライゲーションする。形質転換したＴＧ１細胞を２ＹＴＡＧプレート（１７ｇ／ｌトリプトン、１０ｇ／ｌ酵母抽出物、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、２０ｇ／ｌグルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１５ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ）に蒔き、インキュベートする。コロニーを削り取って２ＹＴ培地（１７ｇ／ｌトリプトン、１０ｇ／ｌ酵母抽出物、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ ）１０ｍｌに入れ、５０％グリセロール５ｍｌと混合し、ライブラリーストックとして−７０℃で保存する。
【００９４】
生物学的パンニング
ライブラリーストックを対数期まで増殖させ、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージで救済し、２ＹＴＡＫ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍｌおよびカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有する２ＹＴ）で一夜３０℃で増幅する。このファージ調製物を４％ ＰＥＧ／０．５Ｍ ＮａＣｌで沈殿させ、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）５００μｇ／ｍｌを含有する３％脱脂乳／ＰＢＳに再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートして、ＡＰ ｓｃＦｖに対する特異性を持つファージ−ｓｃＦｖを遮断し且つ他の非特異結合を遮断する。
【００９５】
ＫＤＲ−ＡＰ（１０μｇ／ｍｌ）被覆Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｓｔａｒ管（Ｎｕｎｃ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を、まず３％牛乳／ＰＢＳを用いて３７℃で１時間遮断し、次にファージ調製物と共に室温で１時間インキュベートする。この管をＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で１０回洗浄し、その後ＰＢＳで１０回洗浄する。結合したファージを、新たに調製した１００ｍＭトリエチルアミン溶液１ｍｌで１０分間室温で溶離する。溶出したファージを対数期なか頃のＴＧ１細胞１０ｍｌと共に３７℃で静止させて３０分間、振盪しつつ３０分間インキュベートする。次いで、感染したＴＧ１細胞を２ＹＴＡＧプレートに蒔き、ファージストックの作製で上に示したように一夜３０℃でインキュベートする。
【００９６】
スクリーニング操作（パンニング）を連続回実施して、所望の結合特異性を持つディスプレーされたｓｃＦｖをさらに濃縮する。２または３回パンニングを実施した後、個々の細菌コロニーを別々にスクリーニングして所望のＫＤＲ結合特性を持つクローンを同定する。同定したクローンはＶＥＧＦ結合の遮断についてさらに試験することができる。クローンのＤＮＡフィンガープリンティングを用いてユニークなクローンを識別する。各消化パターンの代表的クローンを選び、ＤＮＡ配列決定に付す。
【００９７】
ファージＥＬＩＳＡ
個々のＴＧ１クローンを９６ウェルプレートで３７℃で増殖させ、上記のようにＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージで救済する。増幅したファージ調製物を１／６容量の１８％牛乳／ＰＢＳの添加によりＲＴで１時間遮断し、ＫＤＲ−ＡＰまたはＡＰで被覆したＭａｘｉ−ｓｏｒｐ ９６ウェル微量定量プレート（Ｎｕｎｃ）に加える。室温で１時間のインキュベートの後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ウサギ抗Ｍ１３ファージＡｂ−ＨＲＰコンジュゲートと共にインキュベートする。プレートを５回洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質を加え、４５０ｎｍのＯＤをマイクロプレート読み取り機を用いて読み取る。
【００９８】
可溶性ｓｃＦｖの調製
個々のクローンのファージを用いて非サプレッサーＥ．ｃｏｌｉ宿主ＨＢ２１５１を感染させ、感染させたものを２ＹＴＡＧ−Ｎ（２ＹＴＡＧ；１００μｇ／ｍｌナリジキシン酸）プレート上で選択する。この細胞を１ｍＭイソプロピル−１−チオ−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシドを含有する２ＹＴＡ培地で３０℃で培養することにより、ＨＢ２１５１におけるｓｃＦｖの発現を誘導する。２０％（ｗ／ｖ）蔗糖、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含有する２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に細胞ペレットを再懸濁し、続いて穏やかに振盪しながら４℃で１時間インキュベートすることにより、この細胞のペリプラズム抽出物を調製する。１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、ＲＰＡＳ精製モジュール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いる親和クロマトグラフィーによって可溶性ｓｃＦｖを上清から精製する。
【００９９】
Ｍａｂ６．１２からのｓｃＦｖの調製
Ｍａｂ６．１２のＶＨおよびＶＬ遺伝子を、Ｂｅｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．， Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．， Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ； ｐ１４７−１６８の方法に従い、ハイブリドーマ細胞から単離したｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによってクローニングする。マウス抗体軽鎖リーダー配列の５’末端とハイブリダイズするよう特異的に設計した１１個の５’プライマー、および、マウスκ軽鎖定常領域の５’末端とハイブリダイズする１個の３’プライマーを使用して、ＶＬ遺伝子をクローニングする。マウス抗体重鎖リーダー配列の５’末端とハイブリダイズするよう特異的に設計した１２個の５’プライマー、および、マウスＩｇＧ１重鎖定常領域の５’末端とハイブリダイズする１個の３’プライマーを使用して、ＶＨ遺伝子をクローニングする。抗体の各々について合計２３のＰＣＲ反応（ＶＬ遺伝子について１１およびＶＨ遺伝子について１２）を実施する。ＰＣＲにより生成した４００ないし５００塩基対の間のサイズの全フラグメントを製造者の説明書に記載のようにしてｐＣＲ（登録商標）２．１ベクター中にクローニングし（ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）、その後Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＸＬ−１の形質転換を行う。
【０１００】
部分重複ＰＣＲを用いてｓｃＦｖ６．１２を組み立てるため、ＭＡＢ６．１２のＶＬおよびＶＨ遺伝子をコードしているＰＣＲフラグメントを使用する。このｓｃＦｖでは、１５アミノ酸リンカー（グリシン−グリシン−グリシン−グリシン−セリン）３、または（ＧＧＧＧＳ）３を介してＭａｂ６．１２ ＶＨのＣ末端をＭａｂ６．１２ ＶＬのＮ末端に連結する（図１Ａ）。次いでｓｃＦｖ６．１２コード化遺伝子を、可溶性ｓｃＦｖ蛋白の発現のため、ベクターｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）中にクローニングする。
【０１０１】
ＢｓＡｂ−ＩｇＧ［Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ］およびＢｓＡｂ−Ｆａｂ［Ｂｓ（ｓｖＦｖ）２−Ｆａｂ］のための発現ベクターの組み立て
プライマーＪＺＺ−２（配列番号２９）およびＪＺＺ−３（配列番号３０）を用いるＰＣＲによって、ｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７をコードしている遺伝子をｓｃＦｖ発現ベクターから増幅する。次に、プライマーＪＺＺ−１２（配列番号３１）およびＪＺＺ−３（配列番号３０）を用いるＰＣＲによって、哺乳動物細胞における蛋白分泌のためのリーダーペプチド配列をｓｃＦｖコード化配列の５’末端に加える。
【０１０２】
同様に、プライマーＪＺＺ−２（配列番号２９）およびｐ１Ｃ１１ＶＬ３−２（配列番号３２）を用いるＰＣＲによって、ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１をコードしている遺伝子をｓｃＦｖ発現ベクターから増幅し、続いて、プライマーＪＺＺ−１２（配列番号３１）およびｐ１Ｃ１１ＶＬ３−２（配列番号３２）を用いるＰＣＲによってリーダーペプチド配列を加える。
【０１０３】
軽鎖および重鎖両方の分泌のため、１９アミノ酸より成る同じリーダーペプチドＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ（配列番号３３）を使用する。
【０１０４】
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧの軽鎖および重鎖のため、別々の発現ベクターを組み立てる。クローニングしたｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）を含むベクターｐＫＮ１００（Ｄｒ．Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ， ＭＲＣ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｉｖｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｅｎｇｌａｎｄ、より寄贈）中にライゲーションしてＢｓＡｂ−ＩｇＧ軽鎖ＢｓＩｇＧ−Ｌのための発現ベクターを作り出す。クローニングしたｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（ＣＨ）を含むベクターｐＧ１Ｄ１０５（Ｄｒ．Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓより寄贈）中にライゲーションしてＢｓＡｂ−ＩｇＧ重鎖ＢｓＩｇＧ−Ｈのための発現ベクターを作り出す。これらのベクターは、メソトレキサートに対する耐性を付与しベクター配列の増幅を提供するＤＨＦＲ遺伝子の存在を除いて米国特許５８４０２９９に記載の軽鎖（ＨＣＭＶ−ＶＬ−ＨＣＫ）および重鎖（ＨＣＭＶ−ＶＨ−ＨＣγ １）ベクターに類似している。
【０１０５】
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂのための発現ベクターを製造するため、プライマーＪＺＺ−１２（配列番号３１）およびＪＺＺ−１８（配列番号３４）を用いるＰＣＲによって、蛋白翻訳を停止するための停止コドンを、ベクターＢｓＩｇＧ−Ｈの第一定常ドメイン（ＣＨ１）の直後に導入する。この遺伝子フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮａｅＩで消化し、ベクターｐＧ１Ｄ１０５に挿入してベクターＢｓＦａｂ−Ｈを作り出す。全ての組み立て物を制限酵素消化により調査し、ＤＮＡ配列決定により確認する。
【０１０６】
この実施例で使用したプライマー配列を下記および配列表に記す。
【０１０７】
ＪＺＺ−２配列（配列番号２９）：
５’−ＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＴＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＧＴＣＡＡＧＣＴＧＣ−３’
ＪＺＺ−３配列（配列番号３０）：
５’−ＴＣＧＡＡＧＧＡＴＣＡＣＴＣＡＣＣＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣ−３’
ＪＺＺ−１２配列（配列番号３１）：
５’−ＧＧＴＣＡＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴ−３’
ｐ１Ｃ１１ＶＬ３−２配列（配列番号３２）：
５’−ＴＣＧＡＴＣＴＡＧＡＡＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧ−３’
リーダーペプチド（配列番号３３）：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ
ＪＺＺ−１８（配列番号３４）：
５’−ＴＣＴＣＧＧＣＣＧＧＣＴＴＡＡＧＣＴＧＣＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴ−３’
抗体の発現および精製
Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． １３６， ２０３−２１３に記載の方法に従い、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂそれぞれの一過性発現のため、ベクターＢｓＩｇＧ−ＬおよびＢｓＩｇＧ−Ｈ、またはＢｓＩｇＧ−ＬおよびＢｓＦａｂ−Ｈ由来の同量のＤＮＡを用いてＣＯＳ細胞を同時トランスフェクトする。トランスフェクションの２４時間後、この細胞を無血清培地に交換する。条件付けた上清をトランスフェクションの４８時間および１２０時間後に集める。製造者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）の記載したプロトコルに従い、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂを、プールした上清から、プロテインＧカラムを用いる親和クロマトグラフィーによって精製する。抗体を含有する画分をプールし、緩衝液をＰＢＳに交換し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ １０濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏｒｐ．， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）を用いて濃縮する。抗体の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。精製した抗体の濃度を、捕捉剤として山羊抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異抗体を、そして検出剤としてＨＲＰ−コンジュゲートした山羊抗ヒトκ鎖抗体を使用して、ＥＬＩＳＡにより測定する。標準曲線を臨床等級の抗体Ｃ２２５またはｃ−ｐ１Ｃ１１を用いて検定する。
【０１０８】
ＫＤＲに対する二重特異性抗体の結合検定
上に記載のＢｓＡｂの二重特異性を立証するため２種類の異なる検定を実施する。
【０１０９】
直接結合検定では、まず、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ， Ｒｏｓｋｉｌｄｅ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を、捕捉剤としてウサギ抗ＡＰ抗体（ＤＡＫＯ−Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎｓ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、ＫＤＲ（Ｉｇ１−７）−ＡＰ、ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）−ＡＰまたはＫＤＲ（Ｉｇ３−７）−ＡＰ融合蛋白（ウェルあたり１．０μｇ／ｍｌ ｘ １００μｌ）で被覆する。次いでこのプレートをＢｓＡｂ、ｃ−ｐ１Ｃ１１またはＤＡＢ ｐ４Ｇ７と共に室温で１時間インキュベートし、その後ＢｓＡｂおよびｃ−ｐ１Ｃ１１のためにはウサギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Ｃａｐｐｅｌ， Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐ． Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）と共に、またはＤＡＢ ｐ４Ｇ７のためにはマウス抗Ｅタグ抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共にインキュベートする。このプレートを５回洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を加え、４５０ｎｍのＯＤをマイクロプレート読み取り機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を用いて読み取る（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
【０１１０】
架橋検定では、最初にこの抗体をＫＤＲ（Ｉｇ１−７）−ＡＰ、ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）−ＡＰまたはＫＤＲ（Ｉｇ３−７）−ＡＰと共に溶液中でインキュベートする。混合物をＫＤＲ（Ｉｇ１−３）（タグ無し）で被覆した９６ウェルプレートに移し、室温で２時間インキュベートする。プレートを洗浄し、ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）（タグ無し）に結合したＡＰ活性をＡＰ基質ｐ−ニトロフェノールホスファート（Ｓｉｇｍａ）の添加によって測定し、４０５ｎｍのＯＤを読み取る（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
【０１１１】
ＫＤＲおよびＦｌｋ−１に対するＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂの定量的結合検定 ＫＤＲ−ＡＰまたはＦｌｋ−１−ＡＰ（１００ｎｇ蛋白／ウェル）のいずれかで被覆した９６ウェルＭａｘｉ−ｓｏｒｐ微量定量プレート（Ｎｕｎｃ）に、種々の量のＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂ、ｃ−ｐ１Ｃ１１またはｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７を加え、室温で１時間インキュベートし、その後、二重特異性抗体およびｃ−ｐ１Ｃ１１のためにはウサギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異抗体−ＨＲＰコンジュゲートと共に、またはｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７のためにはマウス抗Ｅタグ抗体−ＨＲＰコンジュゲートと共に、室温で１時間インキュベートする。プレートを洗浄し上記のように発色させる。
【０１１２】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析
初期継代ＨＵＶＥＣ細胞を増殖因子枯渇ＥＢＭ−２培地で一夜増殖させてＫＤＲレセプターの発現を誘導する。細胞を収穫し、ＰＢＳで３回洗浄し、５μｇ／ｍｌのＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧまたはｃ−ｐ１Ｃ１１と共に４℃で１時間インキュベートし、続いてＦＩＴＣ標識したウサギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｃａｐｐｅｌ， Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐ．）と共にさらに１時間インキュベートする。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーにより分析する（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【０１１３】
結合速度の分析
ＢｓＡｂおよび親ｓｃＦｖの結合速度を、ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）を使用し表面プラスモン共鳴により測定する。ＫＤＲ−ＡＰ、Ｆｌｋ−１−ＡＰ、またはＦｌｔ−１−Ｆｃ融合蛋白をセンサーチップ上に固定化し、様々な抗体を１．５ｎＭないし２００ｎＭの範囲の濃度で注入する。各濃度におけるセンサーグラムを得、速度定数ｋｏｎおよびｋｏｆｆを決定するため、プログラムＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ２．０を用いて評価する。速度定数の比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとしてＫｄを算出する。
【０１１４】
ＶＥＧＦ／ＫＤＲ、ＶＥＧＦ／Ｆｌｔ−１、およびＰＩＧＦ／Ｆｌｔ−１リガンド遮断検定
遮断検定では、種々の量のＢｓＡｂ、ｓｃＦｖまたはｃ−ｐ１Ｃ１１を、固定量のＫＤＲ−ＡＰ、Ｆｌｋ−１−ＡＰまたはＦｌｔ−１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）と混合し、室温で１時間インキュベートする。次いでこの混合物をＶＥＧＦ１６５またはＰＩＧＦで被覆した９６ウェルプレートに移し、ＲＴでさらに２時間インキュベートし、その後このプレートを５回洗浄する。ＶＥＧＦ１６５およびＰＩＧＦは典型的には２００ｎｇ／ウェルで被覆する。ＶＥＧＦ１６５はＶＥＧＦの１６５アミノ酸型である。ＫＤＲ−ＡＰまたはＦｌｋ−１−ＡＰについてはＶＥＧＦに結合したＡＰ活性を記載のように定量する（Ｚｈｕ， ｅｔ ａｌ．， １９９８；１９９９）。ＶＥＧＦまたはＰＩＧＦに結合したＦｌｔ−１−Ｆｃを測定するため、プレートをマウス抗ヒトＦｃ−ＨＲＰコンジュゲートと共にインキュベートする。
【０１１５】
燐酸化阻害検定
完全長ＫＤＲ（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でトランスフェクトした安定な２９３セルラインを使用し、かつて記載された方法（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８；１９９９）に従い、ＫＤＲ燐酸化検定を実施する。簡潔に述べると、トランスフェクトした２９３細胞（プレートあたり〜３ｘ１０６細胞）を抗体の存在下または不在下で１５分間インキュベートし、その後２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ １６５により室温でさらに１５分間刺激する。次いでこの細胞を溶解し、細胞溶解液をＫＤＲ燐酸化検定に使用する。ＫＤＲレセプターを、抗ＫＤＲ抗体Ｍａｂ４．１３（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に結合させたプロテインＡセファロースビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．， ＣＡ）を用いて細胞溶解液から免疫沈降させる。蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離しウェスタンブロット分析に付す。ＫＤＲ燐酸化を検出するため、ブロットを抗ホスホチロシンＭａｂ、ＰＹ２０（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． Ａｕｒｏｒａ， ＯＨ）でプロービングする。このシグナルを、増強した化学ルミネセンスを用いて検出する（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）。このブロットをポリクローナル抗ＫＤＲ抗体（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で再プロービングして、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの各列に同量の蛋白がロードされていることを確実とする。
【０１１６】
抗マイトジェン検定
ＨＵＶＥＣ（５ｘ１０３細胞／ウェル）を、ＶＥＧＦ、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、または上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）を除いたＥＢＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）２００ｕｌを入れた９６ウェル組織培養プレート（Ｗａｌｌａｃｈ，Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）に蒔き、３７℃で７２時間インキュベートする。様々な量の抗体を２個ずつのウェルに加え、３７℃で１時間プレインキュベートし、その後ＶＥＧＦ１６５を最終濃度１６ｎｇ／ｍｌとなるように加える。１８時間のインキュベーションの後、［３Ｈ］−チミジン（［３Ｈ］−ＴｄＲ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）０．２５ｕＣｉを各ウェルに加え、さらに４時間インキュベートする。細胞を氷上に置き、血清含有培地で２回洗浄し、引き続き１０％ ＴＣＡと共に４℃で１０分間インキュベートする。次にこの細胞を水で１回洗浄し、２％ ＳＤＳ ２５μｌに可溶化する。シンチレーション液（１５０μｌ／ウェル）を加え、ＤＮＡの取り込んだ放射性をシンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃｈ， Ｍｏｄｅｌ １４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ）で測定する。
【０１１７】
白血病遊走検定
ＨＬ６０およびＨＥＬ細胞を無血清単純ＲＰＭＩ １６４０培地で３回洗浄し、この培地に１ｘ１０６／ｍｌで懸濁する。細胞懸濁液のアリコート１００μｌを３μｍ孔ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔ（ＨＬ６０細胞用）または８μｍ孔ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔ（ＨＥＬ細胞用）（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）， Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ， Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ）のいずれかに加え、抗原結合蛋白と共に３７℃で３０分間インキュベートする。次にこのｉｎｓｅｒｔを、ＶＥＧＦ１６５を加えたまたは加えていない無血清ＲＰＭＩ １６４０ ０．５ｍｌを入れた２４ウェルプレートのウェルに入れる。３７℃、５％ＣＯ２でＨＬ６０細胞については１６−１８時間、ＨＥＬ細胞については４時間遊走を実施する。遊走した細胞を下室から集め、コールターカウンター（Ｍｏｄｅｌ Ｚ１， Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｌｔｄ．， Ｌｕｔｏｎ， Ｅｎｇｌａｎｄ）で計数する。
【０１１８】
実施例２：二重特異性抗体の製造
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂの組み立て
２種類の抗ＫＤＲ ｓｃＦｖ抗体、ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１およびｐ４Ｇ７を、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂの組み立てに使用する（図２Ａ）。ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１はＫＤＲに特異的に結合しＫＤＲ／ＶＥＧＦ相互作用を遮断し、一方ｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７はＫＤＲとそのマウス同族体Ｆｌｋ−１の両者に結合するがＫＤＲ／ＶＥＧＦまたはＦｌｋ−１／ＶＥＧＦ相互作用のいずれをも遮断しない（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。ｐ１Ｃ１１はＫＤＲ ＥＣＤ Ｉｇドメイン１ないし３内部に位置するエピトープに結合し、一方ｐ４Ｇ７のためのエピトープはＩｇドメイン６および７内部に位置するということが、エピトープマッピング研究で明らかとなっている（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１およびｐ４Ｇ７をコードしている遺伝子セグメントを、ヒトＩｇＧ１分子のＣＨおよびＣＬをコードしている遺伝子セグメントにそれぞれ結合させ、その結果ｓｃＦｖ配列はそれぞれＣＨ１およびＣＬのＮ末端に融合して、発現ベクターＢｓＩｇＧ−ＨおよびＢｓＩｇＧ−Ｌが作られる（図２Ａ）。この配置はＩｇＧの元のＶＨおよびＶＬドメインを、各々独立した抗原結合ユニットを構成する２個のｓｃＦｖ分子に置換する（図１）。ＢｓＩｇＧ−ＨおよびＢｓＩｇＧ−Ｌの同時発現は、ＩｇＧ様二価二重特異性分子Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧを生成する（図１）。一価二重特異性Ｆａｂ様分子（図１）、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂもまた、ＢｓＩｇＧ−ＬおよびＢｓＦａｂ−Ｈの同時発現によって生成する。停止コドンをＣＨ１ドメインの末端に導入することにより、ＢｓＩｇＧ−ＨからベクターＢｓＦａｂ−Ｈを組み立てる（図２Ａ）。
【０１１９】
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂの発現と精製
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧとＢｓ（ｓｃＦｖ）２−ＦａｂをＣＯＳ細胞で一過性発現させ、プロテインＧカラムを用いる親和クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製する。精製したＢｓＡｂをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する（図２Ｂ）。非還元条件下で、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは分子量およそ２００ｋＤａの単一のバンドを生じ、一方Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂは〜７５ｋＤａの主たるバンドを生ずる（図２Ｂ、２および３列）。還元条件下では、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、それぞれｓｃＦｖ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３融合物（〜６３ｋＤａ）およびｓｃＦｖ−ＣＬ融合物（〜３７ｋＤａ）に対する予想移動度を持つ２個の主たるバンドを生成する（図２Ｂ、５列）。これに対し、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂは、ｓｃＦｖ−ＣＨ１およびｓｃＦｖ−ＣＬ融合物をそれぞれ示す、〜３８ｋＤａおよび３７ｋＤａの分子量を持つ２個の主たるバンドを生ずる（図２Ｂ、６列）。対照として、ｃ−ｐ１Ｃ１１、キメラＩｇＧ１抗体は、非還元条件下で〜１５０ｋＤａの１個のバンドを（図２Ｂ、１列）、そして還元条件下で〜５０ｋＤａ（重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３融合物）および〜２５ｋＤａ（軽鎖、ＶＬ−ＣＬ融合物）という２個のバンドを生ずる（図２Ｂ、５列）。
【０１２０】
実施例３：ＢｓＡｂは同時に２個のエピトープに結合する
ＢｓＡｂの二重特異性
ＢｓＡｂの二重の特異性を、完全長ＫＤＲ ＥＣＤおよびそのＩｇドメイン除去突然変異体のうちの２個を用いて検定する（図３Ａ）。かつて観察されたようにｐ１Ｃ１１はＩｇドメイン１ないし３を含むＫＤＲ突然変異体とのみ結合し（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９）、一方ｐ４Ｇ７はＩｇドメイン６および７を含む突然変異体とのみ結合する（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。対照的に、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂはいずれも３種類のＫＤＲ変異体の全てに結合し、この事は、ＢｓＡｂは、一方はＩｇドメイン１ないし３上のエピトープに、そして他方はＩｇドメイン６および７上のエピトープに結合する２個の結合部位を有することを示すものである。
【０１２１】
ＢｓＡｂが両方のエピトープに同時に結合できるか否かを調べるため、ＡＰで標識したまたはしていない幾つかのＫＤＲ ＥＣＤ Ｉｇドメイン除去突然変異体を使用して架橋検定を実施する。この検定では、ＢｓＡｂをまずＫＤＲ（Ｉｇ１−７）−ＡＰ、ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）−ＡＰまたはＫＤＲ（Ｉｇ３−７）−ＡＰとインキュベートする。混合物をＫＤＲ（Ｉｇ１−３）（タグ無し）で被覆した微量定量プレートに移し、その後ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）（タグ無し）に結合したＡＰ活性を測定する（図３Ｂ）。プレートに結合したＡＰ活性により立証されるように、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂはいずれも３種類全てのＫＤＲ−ＡＰ変異体と溶液中で有効に結合し、固定化ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）（タグ無し）と架橋複合体を形成する（図３Ｂ）。対照的に、ｃ−ｐ１Ｃ１１は、ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）（タグ無し）を、Ｉｇドメイン１−３を含むＫＤＲ変異体、即ちＫＤＲ（Ｉｇ１−７）−ＡＰおよびＫＤＲ（Ｉｇ１−３）−ＡＰとのみ架橋させ、ＫＤＲ（Ｉｇ３−７）−ＡＰとは架橋させない。予想されたように、ｐ４Ｇ７は、いずれのＫＤＲ変異体をも固定化ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）（タグ無し）と架橋させることができないが、これはｐ４Ｇ７がＫＤＲ（Ｉｇ１−３）突然変異体と結合しないためである。
【０１２２】
ＢｓＡｂによる抗原結合
ＢｓＡｂの抗原結合効率を固定化ＫＤＲ（図４Ａ）およびＦｌｋ−１（図４Ｂ）に関して測定する。図４Ａは、ＫＤＲに対するＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂの用量依存的結合を示している。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧとＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂの両者は、それが誘導されたｐ１Ｃ１１の８ないし１０倍の親和性を持つキメラ抗ＫＤＲ抗体であるｃ−ｐ１Ｃ１１と同じ位有効にＫＤＲに結合する。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−ＦａｂもまたｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７と同様、用量依存的にＦｌｋ−１に結合するが、ｃ−ｐ１Ｃ１１は結合しない。予想されたように、ヒトＥＧＦＲに対するキメラ抗体Ｃ２２５はいずれの抗原とも結合しない。
【０１２３】
細胞表面発現レセプターに対するＢｓＡｂの結合をＦＡＣＳ分析によって検定する。かつてｃ−ｐ１Ｃ１１で観察されたように（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９）、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは初期継代ＨＵＶＥＣ上で発現されたＫＤＲに有効に結合する。
【０１２４】
ＫＤＲおよびＦｌｋ−１に対するＢｓＡｂの結合速度をＢＩＡｃｏｒｅ装置を用いる表面プラスモン共鳴によって測定する（第１表）。ＫＤＲに対するＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂの全体的親和性（Ｋｄ）またはアビディティはそれぞれ１．４ｎＭおよび１．１ｎＭであり、これは一価ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１およびｐ４Ｇ７のそれと似通っているが、二価ｃ−ｐ１Ｃ１１またはＤＡＢ ｐ４Ｇ７のそれの４ないし１０倍弱い。これに対して、Ｆｌｋ−１に対して二価であるＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、二価ＤＡＢ ｐ４Ｇ７（Ｋｄ、 ０．１８ｎＭ）と類似のアビディティ（Ｋｄ、０．３３ｎＭ）を示す。Ｆｌｋ−１に対していずれも一価であるＢｓ（ｓｃＦｖ）２−ＦａｂおよびｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７は類似の親和性（Ｋｄ、それぞれ１．７ｎＭおよび４．２ｎＭ）でＦｌｋ−１に結合し、この親和性はそれらの二価対応物より５ないし２０倍弱い。
【０１２５】
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧによるＶＥＧＦ遮断
図５は、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧが、ＫＤＲ−ＡＰが固定化ＶＥＧＦに結合するのを有効に遮断することを示している。ＫＤＲ結合を５０％遮断するのに要する抗体濃度である、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびｃ−ｐ１Ｃ１１のＩＣ５０は、それぞれ４ｎＭおよび１ｎＭである。ｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７で観察されるように、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、ＶＥＧＦに対するＫＤＲマウス同族体Ｆｌｋ−１の結合を遮断しない（示していない）。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、ＶＥＧＦ／Ｆｌｋ−１結合に影響を及ぼさないｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７に対応するＦｌｋ−１エピトープに結合する。ｓｃＦｖ ｐ１ｃ１１が特異的であるＫＤＲエピトープはＦｌｋ−１には無い。したがってＦｌｋ−１に対するＶＥＧＦ結合は遮断されない。抗ＥＧＦＲ抗体Ｃ２２５は、ＶＥＧＦに対するＫＤＲの結合に効果を示さない。
【０１２６】
ＢｓＡｂによるＫＤＲ燐酸化阻害
ＶＥＧＦにより誘導されるレセプター燐酸化に及ぼすＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧの生物学的効果を、ＫＤＲトランスフェクト２９３細胞を用いて測定する。図６に示すように、ＶＥＧＦ処理はＫＤＲレセプターの強力な燐酸化を誘導する。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧによる前処理はＶＥＧＦで誘導されるレセプター燐酸化を用量依存的に阻害する（図６）。さらに、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、検定した各々の抗体濃度においてｃ−ｐ１Ｃ１１と等しく強力である。
【０１２７】
分裂誘発の阻害
ＶＥＧＦにより刺激されるヒト内皮細胞の分裂誘発に及ぼす抗ＫＤＲ抗体の効果を、ＨＵＶＥＣを用いる［３Ｈ］−ＴｄＲ ＤＮＡ取り込み検定によって測定する。ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＥＧＦを含まないＥＢＭ−２培地２００μｌを入れた９６ウェル組織培養プレートにＨＵＶＥＣ（５ｘ１０３細胞／ウェル）を蒔き、３７℃で７２時間インキュベートする。様々な量の抗体を２個ずつのウェルに加え、３７℃で１時間プレインキュベートし、その後最終濃度１６ｎｇ／ｍｌとなるようにＶＥＧＦ１６５を加える。１８時間インキュベーションした後、０．２５μＣｉの［３Ｈ］−ＴｄＲを各ウェルに加え、さらに４時間インキュベートする。ＤＮＡの取り込んだ放射性をシンチレーションカウンターで測定する。
【０１２８】
ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１およびＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧの両者はＶＥＧＦで刺激されたＨＵＶＥＣの分裂誘発を有効に阻害する。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、親ｓｃＦｖよりも強力な、ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ誘導性分裂誘発のインヒビターである。予想されたように、ＫＤＲと結合しないｓｃＦｖ ｐ２Ａ６、およびＫＤＲ／ＶＥＧＦ結合を遮断しないｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７は、ＶＥＧＦ刺激性内皮細胞増殖に何ら阻害効果を示さない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂ分子の模式図である。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧでは、ヒトＩｇＧ１分子のＶＨおよびＶＬドメインが２個の異なる特異性のｓｃＦｖ抗体に置換されている。哺乳動物細胞におけるｓｃＦｖ−軽鎖およびｓｃＦｖ−重鎖融合ポリペプチドの同時発現は、二価のＩｇＧ様二重特異性分子の形成をもたらす。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂにおいて、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に停止コドンが導入されており、これが二価のＦａｂ様二重特異性分子の発現をもたらす（図２Ａをも参照されたい）。
【図２】
発現組み立て物と、精製したＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂ抗体の例を示す（ドメインは一定の拡大率ではない）。図Ａ：個々のｓｃＦｖ組み立て物を、５’末端で哺乳動物細胞での分泌のためのリーダー配列に、そして３’末端でヒトＩｇＧ分子のＣＬまたはＣＨ１ドメインに融合させる。図Ｂ：プロテインＧ精製したＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂ抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。１−３列は非還元条件でのランである。１列、ｃ−ｐ１Ｃ１１、キメラＩｇＧ１；２列、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ；３列、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂ。４−６列は還元条件でのランである。４列、ｃ−ｐ１Ｃ１１；５列、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ；６列、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂ。分子量標準の位置もまた示す。
【図３】
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２Ｆａｂ抗体の二重特異性についてのＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。図Ａは、ＫＤＲ ＥＣＤ Ｉｇドメイン除去突然変異体−ＡＰ融合蛋白への、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂおよびその親抗体の結合を示す。図Ｂは、異なるＫＤＲ ＥＣＤ Ｉｇドメイン除去突然変異体ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）およびＫＤＲ（Ｉｇ３−７）−ＡＰ上に位置する二つの異なるエピトープへの、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂによる同時結合の検出のための、架橋ＥＬＩＳＡを示す。ＢｓＡｂを、ＫＤＲ（Ｉｇ１−７）−ＡＰ、ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）−ＡＰまたはＫＤＲ（Ｉｇ３−７）−ＡＰと共に溶液中でインキュベートし、タグ無しのＫＤＲ（Ｉｇ１−３）で被覆したプレートに移す。可溶相抗体／ＫＤＲ変異体−ＡＰ複合体と固定化ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）との間で形成した架橋複合体を、プレートに結合したＡＰ活性を測定することにより検出する。示したデータは三重の測定値の平均値±ＳＤである。
【図４】
固定化した完全長ＫＤＲ−ＡＰ（図Ａ）およびＦｌｋ−１−ＡＰ（図Ｂ）への、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂおよびその親抗体の用量依存的結合を示す。示したデータは三重の測定値の平均値±ＳＤである。
【図５】
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびｃ−ｐ１Ｃ１１による、固定化ＶＥＧＦへのＫＤＲの結合の阻害を証明している。示したデータは三重の測定値の平均値±ＳＤである。
【図６】
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびｃ−ｐ１Ｃ１１による、ＫＤＲレセプターの、ＶＥＧＦにより刺激された燐酸化の用量依存的阻害を証明している。ＫＤＲによりトランスフェクトさせた２９３細胞を種々の量の抗体によりＲＴで１５分間処理し、その後ＶＥＧＦ ２０ｎｇ／ｍｌと共に（対照群を除く）ＲＴでさらに１５分間インキュベートした。ＫＤＲの燐酸化をかつて記載されたプロトコルに従い分析する（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８， ３２０９−３２１４；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（１９９９） Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． １３６， ２０３−２１３）。
発明の分野
本発明は免疫グロブリン（Ｉｇ）型抗原結合蛋白の製造を目的とするものである。より詳細には、本発明は、天然免疫グロブリンの特性を示すことのできる二重特異性抗原結合蛋白を提供する。天然ＩｇＧ免疫グロブリンは単一特異性且つ二価であり、同じ抗原エピトープに特異的な２個の結合ドメインを持っている。これとは対照的に、本発明に係るＩｇＧ型抗原結合蛋白は二重特異性且つ二価である。本発明に係る蛋白は、２つの軽鎖の各々と２つの重鎖の各々に、４個の抗原結合部位を持つ。軽鎖上にある抗原結合部位が重鎖上にある抗原結合部位と異なっている時、この蛋白は二重特異性且つ二価である。この抗原結合部位が同じである時、このＩｇＧ型蛋白は単一特異性且つ四価である。本発明に係る抗原結合蛋白の設計は、望ましくない可変ドメインの対合を回避するやり方で、係る分子の効率的な製造を提供する。
【０００２】
発明の背景
抗体の特異性とは、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を意味する。例えば天然抗体は単一特異性である。二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）とは、２個の異なる抗原結合特異性または部位を持つ抗体である。抗原結合蛋白が１以上の特異性を持つ場合、認識されるエピトープは、単一の抗原と、または１以上の抗原と結合できる。
【０００３】
抗体価とは、抗原結合蛋白が特定のエピトープに対して持つ結合部位の数を意味する。例えば、天然ＩｇＧ抗体は単一特異性且つ二価である。抗原結合蛋白が１以上のエピトープに対して特異性を持つ場合、抗体価は各々のエピトープについて算出する。例えば、４個の結合部位を持ち単一のエピトープを認識する抗原結合蛋白は四価である。４個の結合部位と２個の異なるエピトープに対する特異性を持つ抗原結合蛋白は、二価であると考えられる。
【０００４】
天然の抗体分子は、２つの同一の重鎖と二つの同一の軽鎖で構成されている。各々の軽鎖は鎖間ジスルフィド結合によって重鎖と共有結合している。２つの重鎖はさらに複数のジスルフィド結合によって相互に連結している。図１は、典型的なＩｇＧ抗体の構造を示している。個々の鎖は折り畳まれて、類似の大きさ（１１０−１２５アミノ酸）および構造を持ち異なる機能を有するドメインとなっている。軽鎖は１つの可変ドメイン（ＶＬ）と１つの定常ドメイン（ＣＬ）を含んでいる。重鎖は１つの可変ドメイン（ＶＨ）と、抗体のクラスまたはイソタイプに応じて３または４個の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を含んでいる。マウスおよびヒトでは、イソタイプはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭであり、ＩｇＡとＩｇＧはさらにサブクラスまたはサブタイプに細分される。ＶＬおよびＶＨドメインから成る抗体部分は「Ｆｖ」と呼ばれ、抗原結合部位を構成する。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、１個のポリペプチド鎖上にＶＬドメインとＶＨドメインを含む改変された蛋白であり、ここで、一方のドメインのＮ末端と他方のドメインのＣ末端は可撓性のリンカーによって結合している。「Ｆａｂ」とは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインで構成される抗体の部分を指す。
【０００５】
可変ドメインは、抗体間で、特に抗原結合部位の位置でかなりのアミノ酸配列変化性を示す。各々のＶＬおよびＶＨには、「超可変」または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる３個の領域が見出される。
【０００６】
「Ｆｃ」は、対合した重鎖定常ドメインを含む抗体部分の呼称である。例えばＩｇＧ抗体では、ＦｃはＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＡまたはＩｇＭ抗体のＦｃはさらにＣＨ４ドメインを含む。Ｆｃは、Ｆｃレセプター結合、補体仲介細胞傷害の活性化、および抗体依存性細胞性細胞傷害に関係している。複数のＩｇＧ様蛋白の複合体であるＩｇＡおよびＩｇＭのような天然抗体については、複合体の形成はＦｃ定常ドメインを必要とする。
【０００７】
最後に、「ヒンジ」領域が、２個の重鎖の共有結合のための抗体のＦａｂおよびＦｃ部分を分離し複数のジスルフィド結合を含むと共に、Ｆａｂ相互の、そしてＦｃに対するＦａｂの可動性を与えている。
【０００８】
多特異性抗原結合蛋白は、癌の画像化および治療薬といった幾つかの小規模臨床試験に使用されてきたが、広範な臨床評価は、効率的な製造法の欠如によって阻まれている。これまでこのような蛋白の設計は、主として多特異性を提供することに関心が持たれていた。天然抗体分子の持つその他の有用な機能を与えることに注意が払われた例は殆ど無かった。
【０００９】
近年、二重特異性および／または多価抗体フラグメントの製造のために、多岐にわたる化学的および組換え方法が開発されている。総説としては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ． ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４， ４４６−４４９（１９９３）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ ４， ４６３−４７０（１９９５）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ． ａｎｄ Ｐａｃｋ，Ｐ．， Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３， ８３−１０５（１９９７）を参照されたい。二重特異性および／または二価性は、可撓性リンカー、ロイシンジッパーモチーフ、ＣＨＣＬ−ヘテロ二量体化による２個のｓｃＦｖ分子の融合、ならびに二価単一特異性ｄｉａｂｏｄｙおよび関連構造を形成するためのｓｃＦｖ分子の結合によって達成されてきた。多価性は、例えばｐ５３、ストレプトアビジン、およびヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフを使用することにより、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントのカルボキシまたはアミノ末端に多量体化配列を付加することによって達成されてきた。例えば、（ｓｃＦｖ１）−ヒンジ−ヘリックス−ターン−ヘリックス−（ｓｃＦｖ２）という形のｓｃＦｖ融合蛋白のヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフを介する二量体化により、２個の標的抗原の各々に対して２個のｓｃＦｖ結合部位を有する四価二重特異性ミニ抗体が生成する。
【００１０】
多少なりとも完全なＩｇＧ定常ドメイン構造を持つという点でＩｇＧ抗体に似ている、ＩｇＧ型二重特異性抗体の製造は、２個の異なるＩｇＧ分子の化学的架橋、または同じ細胞からの二種類の抗体の同時発現によって達成された。化学的架橋は効率が悪く、抗体活性の損失を招き得る。構成成分である重鎖および軽鎖の誤対合のため、いずれの方法も、かなりの量の望ましくない且つ非機能的な物質の生成を招く。誤対合を減少または排除するために用いる方法は、別の望ましくない効果を有する。
【００１１】
望ましくない異種生成物の産生は、これまで用いられてきた方法の多くにとって著明な欠点となっている。例えば、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）の製造の際、様々なドメインの適切な結合を保証する方法が無いと、実際にはその生成物の一部だけが二重特異性であるに過ぎない。トランスフェクトされた細胞で同時発現されるＩｇＧ重鎖および軽鎖の、異なる二つの組の間に不要な対合が起こることを克服するために開発された１つの戦略は、同じ抗体重鎖間のホモ二量体化を減らすための、２個の重鎖のＣＨ３ドメインの修飾である。Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６， ６７７−６８１。その方法では、二重特異性抗体の各結合部位に同一の軽鎖の使用を要求することにより、軽鎖の誤対合が排除された。
【００１２】
二重特異性分子の取得を目的とした殆どの仕事において、抗原特異性以外の機能的または構造的側面の維持には殆ど注意が払われてこなかった。例えば、Ｆｃ領域重鎖定常ドメインの存在および機能を必要とする、補体仲介細胞傷害（ＣＭＣ）および抗体依存性細胞仲介細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、殆どの二重特異性抗体において、いずれも失われている。ＣｏｌｏｍａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎは、ｓｃＦｖを完全な重鎖のＣ末端に融合させることにより、Ｆｃドメインを有する二価ＢｓＡｂ分子の均質集団を作製した。この融合物と抗体軽鎖の同時発現は、一端で第一の抗原と、そして他端で第二の抗原と結合する、二価二重特異性分子の均質集団の生成を導いた（Ｃｏｌｏｍａ，Ｍ．Ｊ． ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９９７） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５， １５９−１６３）。しかしながらこの分子は補体を活性化する能力が低下しており、ＣＭＣを奏効させることができなかった。さらに、このＣＨ３ドメインは低い親和性で高親和性Ｆｃレセプター（ＦｃγＲ１）に結合した。
【００１３】
本発明は、（１） 二重特異性且つ二価であり得、（２） 抗原結合部位の選択に関する束縛が排除されており、（３） Ｆｃ定常ドメインおよびこれに付随する機能を有し、（４） 実質上均質であり、そして（５） さらなる加工を行わずに哺乳動物またはその他の細胞で製造できる、抗原結合蛋白を提供することにより、これらの不都合を克服する。
【００１４】
発明の要約
本発明は、免疫グロブリン様複合体中で安定に結合している２個の第一ポリペプチドと２個の第二ポリペプチドの複合体を含む、抗原結合蛋白を目的とするものである。第一ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖第一定常ドメイン（ＣＨ１ドメイン）と安定に結合できる、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬドメイン）のＮ末端に位置する抗原結合部位を含む。第二ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインのＮ末端に位置する抗原結合部位とこれに続く１またはそれ以上の重鎖Ｆｃ領域定常ドメイン（ＣＨドメイン）を含む。このＦｃ ＣＨドメインは安定な自己結合ができ、即ち、各ＣＨドメインは自己の別のコピーと対合または結合することができる。したがって、本発明に係る抗原結合蛋白は一般に４個のポリペプチドおよび４個の抗原結合部位で構成される。抗原結合部位は抗原に結合できる任意のアミノ酸配列によっても提供され得るが、好ましい態様では、抗原結合部位は一本鎖Ｆｖにより提供される。第一および第二ポリペプチドの結合部位が異なっている場合、この抗原結合蛋白は二重特異性である。それらが同じである場合、この抗原結合蛋白は単一特異性である。必ずという訳ではないが通常、これらのポリペプチドはジスルフィド橋によって共有結合している。好ましい態様では、本発明に係る抗原結合蛋白は二重特異性且つ二価である。即ち、これらは同じ抗原または異なる抗原上にあってよい二つの異なるエピトープに結合する。
【００１５】
ポリペプチド鎖の結合に備えることに加え、Ｆｃ定常ドメインは他の免疫グロブリン機能にも貢献する。その機能には、補体仲介細胞傷害の活性化、抗体依存性細胞仲介細胞傷害の活性化、およびＦｃレセプター結合が包含される。本発明に係る抗原結合蛋白を治療または診断目的で投与する場合、Ｆｃ定常ドメインはまた血清半減期にも寄与する。Ｆｃ定常ドメインはいかなる哺乳動物または鳥類の種に由来するものであってもよい。本発明に係る抗原結合蛋白を人間の治療に使用する場合、ヒト起源の定常ドメインが好ましいが、可変ドメインはヒト以外の起源であってもよい。ヒト可変ドメインが好ましい場合、キメラｓｃＦｖを使用できる。
【００１６】
抗原結合部位はいかなる抗原に特異的なものであってもよく、任意の手段で取得できる。例えば、ｓｃＦｖはモノクローナル抗体から、または、ＶＬおよびＶＨドメインの無作為組み合わせライブラリーから取得できる。
【００１７】
好ましい態様では、ｓｃＦｖはヒトキナーゼ挿入ドメイン含有レセプター（ＫＤＲ）に特異的に結合する。特に好ましいのは、ＫＤＲの細胞外ドメインに結合し、そのリガンドである血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）による結合を遮断し、そして／またはＶＥＧＦが誘発するＫＤＲの活性化を中和する、抗原結合蛋白である。別の好ましい態様では、ｓｃＦｖはＦｌｔ−１に特異的に結合する。Ｆｌｔ−１の細胞外ドメインに結合し、そのリガンドＶＥＧＦおよび胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）の一方または両方による結合を遮断し、そして／またはＶＥＧＦが誘発するまたはＰＩＧＦが誘発するＦｌｔ−１の活性化を中和する、抗原結合蛋白もまた特に好ましい。
【００１８】
二官能性抗原結合蛋白による二元的レセプター遮断は、ＶＥＧＦにより刺激される血管新生の阻害において、より有効となり得る。好ましい態様では、組換え二重特異性二価抗原結合蛋白は、Ｆｌｔ−１およびＫＤＲの両者を、ＶＥＧＦおよび胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）を包含するそれらのリガンドとの結合から遮断することができる。したがって、好ましい二重特異性二価抗原結合蛋白は、ＫＤＲ／ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１／ＶＥＧＦおよび／またはＦｌｔ−１／ＰＩＧＦ相互作用を妨害する。このような抗原結合蛋白は、ＶＥＧＦにより刺激されるヒト内皮細胞の分裂誘発の、そしてＶＥＧＦおよびＰＩＧＦにより誘発されるヒト白血病細胞の遊走の、親抗体よりも強力なインヒビターとなり得る。
【００１９】
ＫＤＲおよび／またはＦｌｔ−１のリガンド結合を遮断し、またはその活性化を中和する本発明に係る抗原結合蛋白は、内皮細胞増殖、血管新生および腫瘍成長を低下させ、そしてＶＥＧＦおよびＰＩＧＦにより誘発されるヒト白血病細胞の遊走を阻害するのに有用である。
【００２０】
本発明はさらに、本発明に係る第一および第二ポリペプチドをコードしている１またはそれ以上の組換えＤＮＡ組み立て物を、発現と複合体形成をさせるに充分な時間と方法で、哺乳動物細胞中で同時発現させ、その抗原結合蛋白を回収する、抗原結合蛋白を製造する方法を包含する。
【００２１】
本発明の或る態様では、ｓｃＦｖドメイン（ＶＬおよびＶＨ）をコードしている遺伝子を、ｓｃＦｖ発現およびスクリーニングを提供する細菌ベクター中でクローニングし組み立てる。所望のｓｃＦｖをコードしているヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞中で有効な発現を提供するよう設計したクローニングベクターの所望の重鎖または軽鎖定常ドメインをコードしている配列に、フレーム内で連結する。即ち、ｓｃＦｖと軽鎖定常ドメインをコードしている第一組み立て物と、ｓｃＦｖと重鎖定常ドメインをコードしている第二組み立て物とが同じまたは別個の発現ベクターにある、二つの組み立て物を、宿主細胞中にトランスフェクトし、同時発現させる。
【００２２】
二価且つ二重特異性である本発明に係る抗原結合蛋白は、望ましい特徴の組み合わせを持っている。第一に、これらは均質である。設計により、抗体重鎖および軽鎖の誤対合は大幅に減少または排除される。例えば、典型的な二重特異性抗体は、二つの特異性を提供するために２個の異なる重鎖の使用を必要とする。重鎖がＩｇＧ型分子に配置される場合は４個の組み合わせが可能である。これらのうち２個は誤対合した重鎖で構成され、その結果この生成物は単一特異性である。逆に本発明に係る蛋白では、全ての重鎖が等価であり、誤対合は起こらない。各々の重鎖が第一の完全な結合部位を含み、各々の軽鎖が第二の異なる結合部位を含むため、二重特異性を提供するためにはただ一つの型の重鎖とただ一つの型の軽鎖を必要とするに過ぎない。
【００２３】
本発明に係る二重特異性蛋白の第二の利点は、四量体型においてこれらが各結合特異性に関して二価であるという事である。二量体のＢｓＡｂを欠く天然抗体の特徴は、この天然抗体が、それが有する抗体結合部位に関して二価であるという事である。二量体のＢｓＡｂは、それが有する２個の結合部位のそれぞれに関して一価である。二価性は、結合の協同性と、１個の抗原結合部位を含む分子をはるかに凌駕するアビディティの増大を実現するため、この事は抗体機能にとって重要である。
【００２４】
本発明に係る蛋白の第三の利点は、天然抗体のＦｃ領域を構成し（例えば、ＩｇＧ分子についてはＣＨ２およびＣＨ３）他の抗体機能を提供する重鎖定常ドメインが存在し得る事である。さらに、ＣＬおよびＣＨ１ドメインと共に複数の結合ドメインがＦｃ領域と隔たっており、その結果、Ｆｃ領域により提供される機能が損なわれない。保持される機能はＦｃが或る種の補助分子に結合する能力に関連し（例えば、細胞表面および可溶性Ｆｃレセプターへの結合、ＩｇＡおよびＩｇＭについてはＪ鎖の結合、ＩｇＡについてはＳ蛋白）、そして、補体経路の活性化（補体仲介細胞傷害、ＣＭＣ）、幾つかの異なる白血球集団により標的細胞に結合した抗体の認識（抗体依存性細胞仲介細胞傷害、ＡＤＣＣ）およびオプソニン化（貪食作用の増強）を包含する。加えて、重鎖のカルボキシ末端への大ドメインの付加を回避することにより、立体障害が回避される。これは、上述の機能の多くにとって重要であり、より高次構造の抗体分子の組み立てにとっても重要である（例えば、ＩｇＡは２個のＦｃを介して結合した４個の重鎖で構成され；ＩｇＭは５個のＦｃにより結合した１０個の重鎖で構成されている）。最後に、Ｆｃ重鎖定常ドメインは血清半減期の増大を付与する。
【００２５】
本発明に係る蛋白の第四の利点は、完全な生成物の取得にインビトロでの加工を必要としないことである。人工的な方法で再編成されてはいるものの、各々のドメインは生態系での発現を可能にする本来の性質を持っている。
【００２６】
本発明はまた、単一特異性四価抗原結合蛋白の産生にも適用できる。このような蛋白では、４個の結合部位は全て同じ特異性を持っている。さらに、本発明は一価二重特異性抗原結合蛋白および二価単一特異性抗原結合蛋白の製造方法を提供する。例えば、Ｆａｂ型蛋白を製造できるが、これは、２個の異なる結合部位または２個の等価な結合部位を含み、第一結合部位はＣＬドメインに連結し、第二結合部位はＣＨ１ドメインに連結している。
【００２７】
好ましい態様では、第一および第二結合部位はそれぞれ一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）によって与えられる。第一の結合特異性を持つｓｃＦｖはＣＬドメインと融合してｓｃＦｖ−ＣＬポリペプチドを形成し、第二の結合特異性を持つｓｃＦｖはＣＨと融合してｓｃＦｖ−ＣＨポリペプチドを形成する。本明細書で言及するように、２またはそれ以上のＣＨドメインがあり、そのドメインのうち１個がＣＨ１である限り、ｓｃＦｖ−ＣＨポリペプチドは、抗体重鎖の任意の部分と融合したｓｃＦｖとして定義される。ｓｃＦｖ−ＣＬ−ｓｃＦｖ−ＣＨヘテロ二量体はＣＬおよびＣＨ１定常ドメインの天然の結合により形成される。少なくとも１個のＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４定常ドメインの存在は、一方のポリペプチド上のＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４ドメインと、別のポリペプチド上にあるそれ自身のコピーとの天然の結合によって、４個の結合部位を持つ抗原結合蛋白に２個のｓｃＦｖ−ＣＬ−ｓｃＦｖ−ＣＨヘテロ二量体を対合させる事を可能にする。
【００２８】
正確な重鎖定常ドメイン構造は所望の機能的特性によって決定する。抗原結合蛋白が特定のイソタイプを持つことを望むのであれば、そのイソタイプの免疫グロブリン由来のＣＨドメインが選択されるであろう。例えば、所望のイソタイプがＩｇＧ１である場合、そのドメイン構造は（ｓｃＦｖ）２−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３であり、定常ドメインはＩｇＧ１抗体由来のものである。
【００２９】
このアプローチを使用して、４個の抗原結合部位を持つＩｇＧ様抗原結合蛋白の均質集団を得る。各々のヘテロ二量体が２個の異なる結合部位を含む場合、そのようにして形成される抗原結合蛋白は二重特異性且つ二価である。ヘテロ二量体が２個の等価な結合部位を含む場合、形成される抗原結合蛋白は単一特異性且つ四価である。ここに詳細を述べる態様では、抗原結合部位は抗体可変ドメインに含まれている。しかしながら、本発明はさらに、１またはそれ以上の結合機能が、目的とする特定の蛋白または抗原との既知の結合相互作用に基づいて選ばれた構造によって与えられる、二重特異性分子をも意図している。例えば、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０の一部を、ＣＤ４に結合する能力に基づいて選択することができる。これに代わり、或る結合部位は、同種のレセプター蛋白に結合する能力に基づき選択したホルモンまたはサイトカインに対応するアミノ酸配列を含むかも知れない。
【００３０】
本発明に係る或る抗原結合蛋白は、抗原に結合させるため、または蛋白とそのリガンドの相互作用を遮断するために使用する。本発明に係る別の抗原結合蛋白は、免疫細胞と標的細胞の間の相互作用を促進するために使用する。最後に、本発明に係る抗原結合蛋白は、抗腫瘍物質、標的部分、リポーター分子、または目的抗原に対する検出可能シグナル産生物質を局在化させるために使用する。
【００３１】
本発明はさらに、ＫＤＲおよびその類似体に結合する、または血管新生もしくは腫瘍形成に関与するその他のレセプター分子に結合する抗原結合蛋白を提供する。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明は、均質であり、そして、結合の協同性（アビディティ）といった天然抗体の機能的特性、ならびに補体仲介細胞傷害および抗体依存性細胞毒性を活性化する能力を保持できる、抗原結合蛋白を提供するものである。一般に、本発明に係る抗原結合蛋白は、各々の抗体可変ドメインの代わりに完全な抗原結合部位を有する、天然に存在する抗体の定常ドメイン構造を持つ。即ち、天然に存在する抗体においては、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の組み合わせにより単一の結合部位が提供され、その結果、例えばＩｇＧ型抗体の４個の可変ドメインは２個の完全な結合部位を提供する。対照的に、本発明に係るＩｇＧ型抗原結合蛋白は４個の完全な結合部位を持つが、それは、完全な抗原結合部位を含む構造が天然に存在する抗体の各々のＶＬおよびＶＨ可変ドメインに取って代わるためである。
【００３３】
別途記載の無い限り、または文脈から明白でない限り、本明細書中使用する抗体ドメイン、領域およびフラグメントは、当分野で周知の容認された標準的定義である。例えば、Ａｂｂａｓ，Ａ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡを参照されたい。
【００３４】
典型的なＦｖの抗原結合部位は、抗原に対する結合部位の親和性に様々な度合いで寄与する６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでいる。より少ないＣＤＲ（例えば３、４または５個）を含む抗原結合部位もまた機能的であり、本発明の範囲内に包含される。ＣＤＲおよびフレームワーク領域（ＦＲ）の範囲は、集められたアミノ酸配列のデータベースとの比較によって決定し、ここではそれらの領域が配列間の変異性に従って定義されている。３個の重鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）および３個の軽鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）がある。
【００３５】
アビディティは免疫グロブリンとその抗原の間の結合の強さの尺度である。各結合部位における結合の強さを評価する親和性とは異なり、アビディティは免疫グロブリン分子の親和性と価数の両者に関係する。
【００３６】
本発明に係る蛋白は、１またはそれ以上の免疫グロブリンクラスの抗体の一部から誘導され、またはそれを取り込んでいる。免疫グロブリンのクラスはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥイソタイプを包含し、ＩｇＧおよびＩｇＡの場合それらのサブタイプを包含する。
【００３７】
本発明に係る抗原結合蛋白は、２個の軽鎖と２個の重鎖を含むヘテロ四量体であるという点でＩｇＧタイプの抗体に似ている。しかしながらＩｇＧタイプの抗体とは異なり、これらは４個の抗原結合部位を持ち、少なくともＣＨ１およびもう１個別のＣＨドメインが存在する場合には、より少ない定常ドメインを持っているかも知れない。４個の抗原結合部位はそれぞれ２個の結合特異性のための２個の結合部位、または１個の結合特異性のための４個の結合部位を含み得る。
【００３８】
好ましい態様では、この形を持つ二重特異性蛋白は、天然に存在するＩｇＧ型抗体のようなアビディティ特性を示すことができる。天然に存在するＩｇＧ分子の場合そうであるように、各々の結合特異性について、２個の等価な抗原結合部位の存在が抗原との結合の協同性を実現する。当業者にとっては周知であるが、重鎖定常領域の適切な選択によって、他のクラスの抗体、例えばＩｇＡ、ＩｇＭ、およびその他の型の抗体に似た二重特異性抗体を作製できる事は明白である。
【００３９】
本発明は、重鎖が軽鎖と対合する時に１個のヘテロ二量体分子内で異なる結合特異性が結び付けられるよう、異なる特異性の結合ドメインを重鎖および軽鎖定常ドメインと連結することを意図している。このような分子の集団は、実際において全二量体が第一の特異性を持つ１個の結合ドメインと、第二の特異性を持つ１個の結合ドメインを含むという点で、実質上均質である。ＣＬおよびＣＨ１ドメインの結合を介する重鎖と軽鎖の優先的な自然の対合に依存することにより、同じ特異性を持つ２個の結合ドメインを含む二量体の形成が低下しまたは排除される。同様に、重鎖の優先的結合がＦｃ領域を介して起こり、本発明に係る抗原結合蛋白を形成する。
【００４０】
一般に、本発明に係る抗原結合蛋白は完全なＣＬおよびＣＨ１ドメインを含んでおり、これらは鎖間ジスルフィド結合により共有結合している。しかしながら本発明はまた、アミノ酸が除去または挿入されており、そして該ドメインが安定な複合体として結合できる限り、共に鎖間ジスルフィド結合を持っているかも知れないし持っていないかも知れない修飾ＣＬおよびＣＨ１ドメインの使用をも意図している。
【００４１】
安定な結合、または複合体とは、生理的条件下で抗原結合蛋白のポリペプチドが複合体として存在することを意味する。例えば、非還元条件下の天然ゲル上で、該ポリペプチドは複合体として移動する。全ての抗体軽鎖が与えられた任意の重鎖と有効に結合する訳ではなく、逆もまた同様であるという事が理解できるであろう。しかしながら、有効に対合するＣＬおよびＣＨ１定常ドメインの組み合わせは当分野で周知であり、それが好ましい。
【００４２】
天然抗体がそうであるように、重鎖−軽鎖ヘテロ二量体は特定の重鎖定常ドメインの結合を介して結合し、より高次の構造を形成する。例えば、ＩｇＧ型抗体は、四量体構造において、共有結合により結びついた２個の重鎖−軽鎖ヘテロ二量体を含んでいる。別の或る抗体型は類似の四量体構造を含んでいるが、この四量体構造は例えば２個の四量体（ＩｇＡ）または１０個の四量体（ＩｇＭ）を含む、より高次の構造に組み込まれる。
【００４３】
天然抗体と同様に、本発明に係る二価二重特異性抗原結合蛋白は、重鎖の適切な結合をＦｃ定常ドメインとヒンジ領域に頼っている。一般に本発明に係る抗原結合蛋白は、ヒンジ領域と１またはそれ以上のＦｃ定常ドメインまたはその一部を含んでいる。付随する全ての機能を保持するためには、通常、全てのＦｃ定常ドメインを取り込んでいるのが望ましい。しかし、本発明はさらに、少なくともそのような１個のドメインが存在するならば、或る定常ドメインのみを含んでいることをも意図している。様々なＦｃ機能がＦｃの異なる部分に依存しているので、全ての機能を所望する訳でないのならば、より少ないＣＨドメインを重鎖に取り込むだけでよい。例えば、補体の著しい活性化はＩｇＧのＣＨ２またはＩｇＭのＣＨ３を必要とする。本発明はさらに、重鎖が安定な複合体として結びつくことができる限り、アミノ酸が置換、除去、挿入または修飾された、修飾ヒンジおよびＦｃ重鎖ドメインの使用をも意図している。
【００４４】
好ましい抗原結合蛋白の抗原結合部位は、任意の所望特異性を持つＦｖ領域で構成される。このＦｖは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であり、ドメインを結合させて機能的抗原結合部位を形成させるペプチドリンカーによって連結したＶＨドメインとＶＬドメイン（いずれの順序でもよい）で構成されている（例えば、米国特許第４９４６７７８号、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（Ｇｅｎｅｘ）；ＷＯ８８／０９３４４， Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｉｎｃ．， Ｕｈｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。ＷＯ９２／０１０４７， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，は、可溶性組換え遺伝子ディスプレーパッケージの表面のｓｃＦｖフラグメントのディスプレーを記載している。
【００４５】
ｓｃＦｖの製造に用いるペプチドリンカーは、ＶＬおよびＶＨドメインの適切な三次元折り畳みと結合、ならびに標的分子結合特異性の維持を保証するよう選択された可撓性ペプチドである。一般に、ＶＬまたはＶＨ配列のカルボキシ末端は、このようなペプチドリンカーによって、相補的ＶＨまたはＶＬ配列のアミノ末端に共有結合する。リンカーは一般に１０ないし５０アミノ酸残基であるが、抗原結合部位を形成させるに充分な可撓性を持つ任意の長さが考えられる。好ましくはリンカーは１０ないし３０アミノ酸残基である。より好ましくはリンカーは１２ないし３０アミノ酸残基である。最も好ましくはリンカーは１５ないし２５アミノ酸残基である。このようなリンカーペプチドの例は（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３を包含する。
【００４６】
本発明における使用のため、任意の起源のＶＬおよびＶＨドメインをｓｃＦｖ中に取り込むことができる。例えば、ＶＬおよびＶＨドメインは所望の結合特性を持つモノクローナル抗体から直接取得できる。別法として、ＶＬおよびＶＨドメインは、選択した哺乳動物由来のＶ遺伝子配列のライブラリーからのものであってもよい。このようなライブラリーの要素はＶＬおよびＶＨドメインの無作為の組み合わせを発現し、所望の結合特性を持つ要素を同定するため、任意の所望抗原を用いてスクリーニングする。特に好ましいのはヒトＶ遺伝子ライブラリーである。このようなスクリーニングのための方法は当分野で既知である。選択した非ヒト起源のＶＬおよびＶＨドメインは、例えばＣＤＲループをヒトＶＬおよびＶＨドメインに置換することにより「ヒト化」し、または、当分野で既知のその他の手段によって修飾して、人間に投与した時の免疫原性を低下させることができる。
【００４７】
生理的免疫反応において、発現される抗体遺伝子の突然変異および選択は、標的抗原について高い親和性を有する抗体の産生につながる。ｓｃＦｖで発現されるＶＬおよびＶＨドメインを同様にインビトロ突然変異およびスクリーニング法に付して、高親和性変異体を取得することができる。
【００４８】
細菌分泌シグナル配列および簡便な制限クローニング部位を含む、ｓｃＦｖの組み立てと発現のためのベクターが入手できる。特定の抗原に特異的な結合部位をコードしているＶＬおよびＶＨ遺伝子の組み合わせをＢ細胞ハイブリドーマのｃＤＮＡから単離する。別法として、ＶＬおよびＶＨ遺伝子の無作為組み合わせをゲノムＤＮＡから取得し、次いでその生成物を目的抗原との結合についてスクリーニングする。典型的には、クローニングのために、クローニングベクター中の制限部位と両立し得るプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する。例えば、Ｄｒｅｈｅｒ，Ｍ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３９：１９７−２０５；Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．（１９９３） Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２４：１−２０；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ． ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．（１９９９） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：５６８−５７２を参照されたい。
【００４９】
ＶＬおよびＶＨドメインの、選択したまたは無作為の組み合わせを持つｓｃＦｖを発現させるために、これらのドメインをコードしているＶ遺伝子を細菌の発現ベクター中に組み込む。例えば、細菌分泌シグナル配列およびペプチドリンカーをコードしている配列を持ち、そしてＶＬおよびＶＨ遺伝子の挿入のために都合のよい制限部位を有するベクターを使用することができる。別法として、最初に、例えば部分重複プライマーを用いるＰＣＲ増幅により、必要な全コード化配列（例えば、分泌シグナル、ＶＬ、ＶＨおよびリンカーペプチド）を単一の配列中に組み込み、その後プラスミドまたはその他のベクター中にライゲーションすることが望ましいかも知れない。ＶＬおよびＶＨドメインの特別な組み合わせの取得を望む場合には、それらのドメインをコードしている配列に特異的なＰＣＲプライマーを使用する。多数のＶＬおよびＶＨドメインの多様な組み合わせの作製を望む場合には、複数の配列を増幅するプライマーの混合物を使用する。
【００５０】
好ましい細菌ベクターは線維状ファージのコート蛋白に結合するｓｃＦｖの発現をさせることができる。最も普通に用いられるファージのコート蛋白はファージＭ１３の遺伝子ＩＩＩ蛋白である。線維状ファージ上のｓｃＦｖのディスプレーは、ｓｃＦｖの大集団を所望の結合特性についてスクリーニングすることを望む場合には特に有用である。ｓｃＦｖ−ｇＩＩＩ蛋白融合物を発現する細菌細胞をＭ１３変異体に感染させるが、この変異体は、ｓｃＦｖ−ｇＩＩＩ融合物遺伝子を持つベクターＤＮＡをファージ粒子の中に優先的にパッケージングさせることができ、その中にｓｃＦｖ−ｇＩＩＩコート蛋白融合物が組み込まれる。得られるファージ粒子の各々は特定のｓｃＦｖをディスプレーし、ｓｃＦｖをコードしているベクターを含んでいる。次いでｓｃＦｖの多様な集まりをディスプレーしているこのようなファージ粒子の集団を、パンニング法により所望の結合特性について濃縮する。典型的には、所望の粒子を、所望のファージ粒子が結合することのできる抗原で被覆した固体表面に固定化する。結合した粒子を集め、細菌細胞を感染させるためにさらに使用する。パンニング法を反復して所望の結合特性をさらに濃縮する。
【００５１】
ｓｃＦｖ−ｇＩＩＩ融合物をコードしているベクターはｓｃＦｖおよびｇＩＩＩコード化領域の結合点に翻訳停止コドンを含むことができる。対応する翻訳停止サプレッサーを持つ細菌細胞中で発現される時、この融合蛋白が産生される。対応するサプレッサーを持たない細菌細胞で発現される場合には、遊離のｓｃＦｖが産生する。
【００５２】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、胚の発生中の血管形成、および成人の血管新生プロセス、例えば創傷治癒、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、炎症性疾患、腫瘍の増殖および転移の、重要な調節物質である。ＶＥＧＦは、血管透過性の強力な誘導物質であり、内皮細胞の遊走および増殖の刺激物質であり、そしてその活性を主として２種類のチロシンキナーゼレセプター、ＶＥＧＦレセプター１（ＶＥＧＦＲ−１）、またはｆｍｓ様チロシンレセプター１（Ｆｌｔ−１）、およびＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ−２）、またはキナーゼ挿入ドメイン含有レセプター（ＫＤＲ、およびマウスのＦｌｋ−１）によって仲介する。Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．， Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２３７， １−３０（１９９９）；Ｋｌａｇｓｂｒｕｍ，Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ． ７， ２５９−２７０（１９９６）；Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｇ．， ｅｔ ａｌ． ＦＡＳＥＢ Ｊ． １３， ９−２２（１９９９）。多くの研究が、ＶＥＧＦとそのレセプターの過剰発現は腫瘍に関連する血管新生において、そしてそれ故腫瘍の増殖および転移において重要な役割を果たしていることを示している。
【００５３】
Ｆｌｔ−１およびＫＤＲは胚の血管の発生において別個の機能を持っている。マウスにおいていずれかのレセプターをコードしている遺伝子の選択的除去は胚にとって致死的であり、胚の発生におけるＶＥＧＦ経路の生理的重要性を立証している。ＫＤＲ欠損マウスは血島形成が損なわれ且つ成熟した内皮細胞を欠失しており、一方無Ｆｌｔ−１胚は内皮細胞が潤沢であるにもかかわらず、不完全な血管形成のため、正常な血管系を発達させることができない。Ｓｈａｌａｂｙ，Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７６， ６２−６６（１９９５）；Ｆｏｎｇ，Ｇ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７６， ６６−７０（１９９５）。これに対し、チロシンキナーゼドメインの末端切除によるＦｌｔ−１シグナル伝達の不活性化はマウス胚の血管新生および胚の発生を損なうことがなく、Ｆｌｔ−１レセプターによるシグナル伝達が胚の血管系の発生にとって必須でないことを示唆している。Ｈｉｒａｔｓｕｋａ，Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ９５， ９３４９−９３５４（１９９８）。成人におけるＶＥＧＦに対するＦｌｔ−１およびＫＤＲの生物学的応答もまた異なっているように見受けられる。一般的にＫＤＲは、内皮細胞増殖、遊走、分化、管形成、血管透過性増大、および血管の完全性の維持をもたらす主たるＶＥＧＦシグナルトランスデューサーであると考えられている。Ｆｌｔ−１ははるかに弱いキナーゼ活性を持ち、ＶＥＧＦにより刺激された場合に分裂応答を誘発できない（これはＫＤＲのおよそ１０倍の親和性でＶＥＧＦに結合するのであるが）。Ｆｌｔ−１はさらに、ＶＥＧＦおよび胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）により誘発される単球／マクロファージの遊走と組織因子の産生にも関連している。Ｂａｒｌｅｏｎ，Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８７， ３３３６−３３４３（１９９６）；Ｃｌａｕｓｓ，Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１， １７６２９−１７６３４（１９９６）。
【００５４】
好ましい態様では、本発明に係る抗原結合蛋白は、ＫＤＲに結合しＫＤＲへのＶＥＧＦの結合を遮断するｓｃＦｖを含んでいる。ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１（配列番号２７、２８）はマウスｓｃＦｖファージディスプレーライブラリーから製造する（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。ｐ１Ｃ１１はＶＥＧＦ−ＫＤＲ相互作用を遮断し、ＶＥＧＦにより刺激されるレセプター燐酸化とヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の分裂誘発を阻害する。このｓｃＦｖは、例えばＨＵＶＥＣ上の可溶性ＫＤＲおよび細胞表面発現されるＫＤＲの両者と、高い親和性（Ｋｄ＝２．１ｎＭ）で結合する。
【００５５】
第二の好ましい態様では、本発明に係る抗原結合蛋白は、Ｆｌｔ−１に結合しそしてＦｌｔ−１へのＶＥＧＦの結合および／またはＰＩＧＦの結合を遮断する、ｓｃＦｖを含んでいる。Ｍａｂ ６．１２は可溶性および細胞表面発現されるＦｌｔ−１に結合する。ｓｃＦｖ ６．１２はマウスモノクローナル抗体Ｍａｂ ６．１２のＶＬおよびＶＨドメインを含んでいる。Ｍａｂ ６．１２を産生するハイブリドーマセルラインはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３３４４として寄託されている。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約およびその規則（ブダペスト条約）の規定の下になされた。これは、生きている培養を寄託日から３０年間維持することを保証するものである。この微生物はブダペスト条約の条件の下でＡＴＣＣによって入手可能とされ、関連する米国特許の登録時に無制限の入手可能性を保証する、出願者とＡＴＣＣとの合意の下にある。寄託された菌株の入手可能性は、任意の政府当局の下でその特許法に従って付与された権利に違反してその発明を実施する許可と解釈してはならない。
【００５６】
本発明に係る抗原結合蛋白は任意のエピトープ、抗原部位または蛋白に対する結合部位を持ち得る。好ましい抗原結合蛋白はレセプター蛋白の活性化を中和する。ＶＥＧＦレセプターおよび血管新生に関与するその他のレセプターが特に興味深い。ＶＥＧＦレセプターはＫＤＲ、Ｆｌｋ−１、Ｆｌｔ−１を包含する。インビボ血管新生の可能性ある調節物質として関与しているその他の因子は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）を包含する。対応するレセプターは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−Ｒ）、血小板由来増殖因子レセプター（ＰＤＧＦ−Ｒ）、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）である。血管新生および／または腫瘍形成に関与するレセプターチロシンキナーゼもまた興味深い。このようなレセプターチロシンキナーゼは、ＦＬＴ４、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＴｅｋおよびＴｉｅ２を包含する。興味深いレセプターは、ヒト蛋白およびその他の哺乳動物由来の類似体を包含する。上に列挙したレセプターとして抗体が知られており、それらは本発明に係る抗原結合蛋白に使用するためのｓｃＦｖ ＶＬおよびＶＨドメインの供給源である。列挙したレセプターのいずれかに特異的な本発明に係る抗原結合蛋白は単一特異性または二重特異性であってよい。本発明に係る或る二重特異性抗原結合蛋白は、上記レセプターのうち２種類に結合する。一つの好ましい態様では、係る二重特異性抗原結合蛋白はＨＥＲ２およびＥＧＦ−Ｒに結合する。第二の好ましい態様では、本発明に係る抗原結合蛋白はＫＤＲおよびＦＬＴ−１に結合する。
【００５７】
本発明に係る二重特異性抗原結合蛋白は、標的細胞上の抗原と免疫系エフェクター細胞上の抗原を架橋させることができる。これは、例えば細胞表面に目的とする特定の抗原を持つ細胞に対する免疫反応を促進させるために有用となり得る。本発明によれば、免疫系エフェクター細胞は、抗原特異的細胞、例えば細胞性免疫反応を活性化するＴ細胞、ならびに非特異的細胞、例えば細胞性免疫反応を仲介するマクロファージ、好中球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を包含する。
【００５８】
本発明に係る抗原結合蛋白は、免疫系エフェクター細胞の任意の細胞表面抗原のための結合部位を持ち得る。このような細胞表面抗原は、例えばサイトカインおよびリンホカインレセプター、Ｆｃレセプター、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２およびＣＤ６４を包含する。一般に、抗原結合部位はｓｃＦｖによって提供され、これは前記の抗原に対する抗体から誘導され、当分野で周知である。サイトカインおよびリンホカインレセプターに特異的な本発明に係る抗原結合部位はまた、該レセプターのための天然リガンドの全体または一部に対応するアミノ酸配列であってもよい。例えば、細胞表面抗原がＩＬ−２レセプターである時、本発明に係る抗原結合蛋白は、対応するアミノ酸またはＩＬ−２の配列を含む抗原結合部位を持ち得る。その他のサイトカインおよびリンホカインは、例えばインターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−５（ＩＬ−５）のようなインターロイキン、ならびに顆粒球−マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）を包含する。
【００５９】
本発明に係る好ましい抗原結合蛋白は、ＣＬ軽鎖定常ドメインに連結したｓｃＦｖを有する第一ポリペプチド、ならびにＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３重鎖定常ドメインに連結したｓｃＦｖを有する第二ポリペプチドを発現させることによって作製する。ｓｃＦｖをコードしているＤＮＡフラグメントは、例えば、哺乳動物細胞中でヒト重鎖のいずれかのヒト軽鎖を発現するよう設計したＨＣＭＶベクター中にクローニングできる（例えば、Ｂｅｎｄｉｇ， ｅｔ ａｌ．，米国特許５８４０２９９；Ｍａｅｄａ， ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ２， １２４−１３４を参照されたい）。このようなベクターは、軽鎖および重鎖組み立て物の高レベル転写のためのヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーターおよびエンハンサーを含んでいる。好ましい態様では、軽鎖発現ベクターは、ヒトκ軽鎖をコードしているｐＫＮ１００（Ｄｒ．Ｓ．Ｔａｎｎａｎ Ｊｏｎｅｓ， ＭＲＣ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｅｎｇｌａｎｄより寄贈）であり、重鎖発現ベクターは、ヒトγ−１重鎖をコードしているｐＧ１Ｄ１０５（Ｄｒ．Ｓ．Ｔａｎｎａｎ Ｊｏｎｅｓより寄贈）である。いずれのベクターも、哺乳動物細胞およびＥ．ｃｏｌｉ中で機能するＨＣＭＶプロモーターおよびエンハンサー、複製起点ならびに選択マーカーを含んでいる。
【００６０】
選択マーカーは、形質転換された宿主細胞が選択培養基中で生存または増殖するのに必要な蛋白をコードしている遺伝子である。典型的な選択マーカーは、（ａ） 抗生物質またはその他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メソトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ） 栄養要求性欠陥を補完する、または（ｃ） 複合培地から得られない重要な栄養素、例えばＢａｃｉｌｌｉのためのＤ−アラニンラセマーゼをコードしている遺伝子、を供給する、蛋白をコードしている。特に有用な選択マーカーはメソトレキサートに対する耐性を付与する。例えば、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメソトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養基で全形質転換体を培養することにより、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換した細胞をまず同定する。野生型ＤＨＦＲを使用する場合の適当な宿主細胞は、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（１９８０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７， ４２１６の記載のように調製し増殖させた、ＤＨＦＲ活性を欠失するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）セルラインである。次に、形質転換した細胞を増加レベルのメソトレキサートに暴露する。このことにより多コピーのＤＨＦＲ遺伝子の合成が導かれ、同時にこの発現ベクターを含む多コピーの他のＤＮＡ、例えば抗体または抗体フラグメントをコードしているＤＮＡの合成が導かれる。
【００６１】
酵母中で遺伝子組み立て物を発現させることが望ましい場合、酵母での使用に好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である。Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．（１９７９） Ｎａｔｕｒｅ， ２８２， ３９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７９） Ｇｅｎｅ ７， １４１。このｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１のための選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ（１９７７） Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５， １２。次いでこの酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在が、トリプトファン不在下での増殖により形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠失酵母菌株（ＡＴＣＣ２０６２２または３８６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を持つ既知のプラスミドによって補完される。
【００６２】
ベクターの形質転換および本発明に係る抗原結合蛋白の発現のために好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびリンパ球起源のセルライン、例えばリンパ腫、骨髄腫、またはハイブリドーマ細胞である。その他の真核生物宿主、例えば酵母がこれらに代わって使用できる。形質転換した宿主細胞は、当分野で既知の方法により、同化可能な炭素源、例えばグルコースまたは乳糖のような炭水化物、窒素、例えばアミノ酸、ペプチド、蛋白またはそれらの分解産物、例えばペプトン、アンモニウム塩など、および無機塩類、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウムの硫酸塩、燐酸塩および／または炭酸塩を含有する液体培地で培養する。培地はさらに、例えば微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガンなどの増殖促進物質を含有する。
【００６３】
本発明に係る抗原結合蛋白の各可変ドメインは完全な免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖可変ドメインであるか、または天然に存在するドメインの機能的等価物もしくは突然変異体もしくは誘導体であるか、または例えばＷＯ９３／１１２３６（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｎｃｉｌ ｅｔ ａｌ．／Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．）に記載のような技術を用いてインビトロで組み立てられた合成ドメインとすることができる。例えば、少なくとも１個のアミノ酸を欠失する抗体可変ドメインに対応するドメインを結合させることが可能である。重要な特徴的性質は、相補的可変ドメインと結合して抗原結合部位を形成する、各可変ドメインの能力である。
【００６４】
同様に、定常ドメインの重要な特徴は、安定な複合体を形成する能力である。本発明に係る抗原結合蛋白は完全なＣＬおよびＣＨ１ドメインを含むが、本発明は、該ドメインが安定な複合体として結合できる限り、アミノ酸が除去または挿入されているかも知れない、そして鎖間ジスルフィド結合を持っているかも知れないし持っていないかも知れない、修飾されたＣＬおよびＣＨ１ドメインの使用をも意図している。
【００６５】
Ｆｃ定常ドメインの重要な特徴的性質は、自己結合し、Ｆｃレセプターに結合し、ＣＭＣを開始させ、そしてＡＤＣＣを開始させる自己結合の能力を包含する。先に述べたように、本発明に係る抗原結合蛋白は、あらゆる定常ドメイン構造または機能が存在している必要はない。したがって、重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン、定常ドメイン、ｓｃＦｖおよびＦｃという語は、機能的に等価である全ての変異体を包含すると解するべきである。
【００６６】
本発明の好ましい態様では、二重特異性抗体の抗原結合部位は２種類の異なる結合特異性を持つｓｃＦｖドメインを含む。例えば、ＩｇＧ分子のＶＬおよびＶＨドメインを異なる特異性を持つｓｃＦｖドメインに置換し、その結果、本明細書中でＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧと称する得られた分子はその標的抗原の各々について二価となる。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、様々な発現系、とりわけ哺乳動物細胞中で機能的に発現され且つ組み立てられ、２個の異なるエピトープに同時に結合できる。
【００６７】
本明細書で先に記したように、ｓｃＦｖは軽鎖および重鎖定常ドメインとの結合にとって好ましい。しかしながら、それが望ましいまたは都合のよい場合は、本発明に係る二重特異性抗原結合蛋白の抗原結合部位を含む構造は、Ｆｖ以上または以下を包含する。例えば、これはさらに定常領域部分（例えば、軽鎖または重鎖ドメインへのＦａｂの連結）またはＦｖの一部のみ（例えば、抗原結合が１個の可変ドメインにより前もって決定されており、第二の可変ドメインが親和性または特異性に殆ど寄与しない場合）を包含する。したがって、抗原結合部位は、さらに軽鎖または重鎖定常領域に連結した単一のポリペプチド鎖を含み、それが、該抗原結合蛋白中のドメインの配置を前もって明確に決定し、少なくとも２個の定常ドメインを有するＩｇ型構造全体を形成することを可能にする。
【００６８】
所望の結合特性を持つ抗原結合蛋白に包含させるための抗原結合部位は様々な方法で取得できる。選ばれた結合ドメインのＶＬおよびＶＨ部分のアミノ酸配列は、天然に存在する抗体に対応しているか、または所望の免疫原性もしくは結合特性を得られるよう選択または修飾する。例えば、非ヒト供給源から誘導した抗原結合部位をヒト可変ドメインに置換した、キメラ可変ドメインが組み立てられる。キメラ組み立て物は、例えば非ヒト起源の抗原結合ドメインを人間の治療に使用することを望む場合、有害な免疫原性性質の排除にとって特に貴重である。好ましいキメラドメインは、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）に導入した１またはそれ以上の非ヒト起源相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を有するドメインである。係るキメラの例については、Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．，（１９９６） Ｎａｔｕｒｅ ３２１， ５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎ，Ｌ． ｅｔ ａｌ．，（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３２， ３２３−３２７；米国特許第５５３０１０１号（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．）を参照されたい。可変ドメインは高度の構造的相同性を持っており、ＣＤＲおよびＦＲに対応する可変ドメイン内のアミノ酸残基が容易に同定できる。例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ． ５ｔｈ ｅｄ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， 米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤを参照されたい。したがって、抗原結合に参加するアミノ酸は容易に同定できる。加えて、導入されたＣＤＲを含むキメラ結合ドメインの、抗原に対する親和性を保持または増強する方法が開発された。１つの方法は、ＣＤＲ領域のコンホメーションに影響を及ぼす外来フレームワーク残基をこのキメラドメインに包含させることである。第二の方法は、この外来可変領域に最も近い相同性を持つヒト可変ドメイン上に、外来ＣＤＲを導入することである。Ｑｕｅｅｎ，Ｃ． ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６， １００２９−１００３３。まず、所望のＣＤＲ配列を含む部分重複プライマーを用いて個々のＦＲ配列を増幅し、得られた遺伝子セグメントを次の増幅反応に加えることにより、ＣＤＲを最も容易に異なるＦＲ上に導入できる。異なる可変ドメイン上へのＣＤＲの導入は、このアミノ酸配列のＣＤＲに隣接し、またはＣＤＲのコンホメーションに影響を及ぼす折り畳まれた可変ドメイン構造中のＣＤＲにパッキングされた、アミノ酸残基の置換を含むことができる。故に、本発明に係るヒト化ドメインは、１またはそれ以上の非ヒトＣＤＲと共に、結合特性を保持または増強するためにさらなる置換または置き換えを施した係るドメインを含むヒト抗体を包含する。
【００６９】
本発明に係るキメラ結合ドメインはさらに、ｓｃＦｖを免疫系に対して自己として出現させるため表面露出残基を置き換えることによってヒト化させた抗体をも包含する（Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．（１９９１） Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８， ４８９−４９８）。抗体はこの方法によって親和性を失うことなくヒト化する（Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１， ９６９−９７３）。抗原結合部位近傍におけるアミノ酸残基のパッキングが不変であるため、親和性は保持される。ヒト化目的のための本発明に係るｓｃＦｖの表面露出残基の置換は、結合特性に影響するＣＤＲ残基または隣接残基の置換を意味しない。
【００７０】
本発明は、本質的に人間のものである結合ドメインを意図するものである。ヒト結合ドメインは、ヒト重鎖および軽鎖可変ドメインの組み合わせが線維状ファージの表面にディスプレーされているファージディスプレーライブラリーから取得する（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４８， ５５２−５５４；Ａｕｊａｍｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ８， １５５−１６８）。可変ドメインの組み合わせは典型的にはＦａｂまたはｓｃＦｖの形で線維状ファージ上にディスプレーされる。このライブラリーを、所望の抗原結合特性を持つ可変ドメインの組み合わせを有するファージについてスクリーニングする。好ましい可変ドメインの組み合わせは、選ばれた抗原に対して高い親和性を示し、他の関連抗原に対する交差反応性を殆ど示さない。極めて大レパートリーの抗体フラグメントをスクリーニングすることにより（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４） ＥＭＢＯ Ｊ． １３， ３２４５−３２６０）、充分な多様性を持つ高親和性Ｍａｂが単離でき、多くは所望抗原についてナノモル以下の親和性を有すると予想される。
【００７１】
別法として、ヒト結合ドメインは、再編成されていないヒトＩｇ遺伝子セグメントをその中に導入し、そして内因性マウスＩｇ遺伝子を失活させたトランスジェニック動物から取得することができる（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ（１９９７） Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８， ４５５−４５８）。好ましいトランスジェニック動物は、１Ｍｂを超えるサイズの極めて大きな隣接Ｉｇ遺伝子フラグメントを含んでいる（Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １５， １４６−１５６）が、中等度の親和性のヒトＭａｂは、より小さな遺伝子座を含むトランスジェニック動物から生成することができる（例えば、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４２， ２６７２−２６８１；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ７， １３−２１）。
【００７２】
本発明に係る結合ドメインは結合特性を直接突然変異または親和性成熟の方法によって改善させたものを包含する。親和性と特異性は、ＣＤＲを突然変異させ、所望の特性を有する抗原結合部位についてスクリーニングすることによって修飾または改善できる（例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ． ２５４， ３９２−４０３）。ＣＤＲは様々な方法で突然変異させる。１つの方法は、個々の残基または残基の組み合わせを無作為化する事であり、その結果、他の点では同一の抗原結合部位の集団において、２０の全アミノ酸が特定の位置に見出される。別法として、誤りがちなＰＣＲ法により、ＣＤＲ残基の範囲に突然変異を誘発する（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ． ２２６， ８８９−８９６を参照されたい）。重鎖および軽鎖可変領域遺伝子を含むファージディスプレーベクターをＥ．ｃｏｌｉの突然変異菌株で増殖させる（例えば、Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ． ２５０， ３５９−３６８を参照されたい）。これらの突然変異誘発方法は当業者の知悉する多くの方法の実例である。
【００７３】
本発明の別の態様では、抗原結合蛋白を抗腫瘍物質または検出可能シグナル生成物質に、化学的または生合成的に連結させることができる。抗体に連結させる抗腫瘍物質は、該抗体が結合した腫瘍を、または該抗体が結合した細胞の環境において腫瘍を破壊または損傷する任意の物質を包含する。例えば、抗腫瘍物質は化学療法剤またはラジオアイソトープのような毒性物質である。好適な化学療法剤は当業者に知られており、アントラサイクリン類（例えばダウノマイシンおよびドキソルビシン）、メソトレキサート、ビンデシン、ネオカルジノスタチン、シスプラチン、クロラムブシル、シトシンアラビノシド、５−フルオロウリジン、メルファラン、リシンおよびカリケアミシンを包含する。化学療法剤は常法を用いて抗体とコンジュゲートさせる（例えば、Ｈｅｒｍｅｎｔｉｎ ａｎｄ Ｓｅｉｌｅｒ（１９８８） Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ． Ｍｉｔｔ． ８２， １９７−２１５を参照されたい）。
【００７４】
検出可能シグナル生成物質は、診断目的のためにインビボおよびインビトロで有用である。シグナル生成物質は、外的手段、通常電磁気放射の測定により検出し得る測定可能なシグナルを生成する。大抵は、シグナル生成物質は酵素または発色団であるか、または蛍光、燐光または化学ルミネセンスにより光を発する。発色団は、紫外または可視領域で光を吸収する色素を包含し、酵素触媒反応の基質または分解産物であってよい。
【００７５】
本発明はさらに、標的またはリポーター部分が連結した本発明に係る抗原結合蛋白を意図している。標的部分が結合対の第一の成員である。抗腫瘍物質は、例えば係る対の第二の成員とコンジュゲートさせ、それにより抗原結合蛋白が結合する部位へと導かれる。このような結合対の一般的な例はアビジンとビオチンである。好ましい態様では、ビオチンを本発明に係る抗原結合蛋白にコンジュゲートさせ、それによりアビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートした抗腫瘍物質またはその他の部分のための標的を提供する。別法として、ビオチンまたはもう一つのこのような部分を本発明に係る抗原結合蛋白に連結させ、例えば検出可能なシグナル生成物質がアビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートしている診断系において、リポーターとして使用する。
【００７６】
抗腫瘍物質として使用するための好適なラジオアイソトープもまた当業者に知られている。例えば、１３１Ｉまたは２１１Ａｔを使用する。これらのアイソトープを常套技術を用いて抗体に結合させる（例えば、Ｐｅｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６８， ６９−７３を参照されたい）。別法として、抗体に結合させる抗腫瘍物質は、プロドラッグを活性化する酵素である。このようにして、腫瘍部位に到達するまでは不活性型のままでいるプロドラッグを投与するが、いったん抗体複合体が投与されたならば、その腫瘍部位においてプロドラッグは細胞毒型に変換される。実際には、抗体−酵素コンジュゲートを患者に投与し、治療されるべき組織の領域に局在化させる。次いでプロドラッグをこの患者に投与し、その結果細胞毒性薬物への変換が、治療すべき組織の領域で起こる。別法として、抗体にコンジュゲートさせる抗腫瘍物質はサイトカイン、例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）である。抗体が腫瘍をサイトカインの標的とさせ、その結果、サイトカインは他の組織に影響を及ぼすことなく腫瘍の損傷または破壊を仲介する。サイトカインは常套的組換えＤＮＡ技術を用いてＤＮＡレベルで抗体と融合させる。
【００７７】
本発明に係る蛋白は、さらなるアミノ酸残基、例えば、単離または精製を容易にするためのペプチドタグ、または該蛋白が発現される任意の特定宿主における分泌または膜輸送を促進するためのシグナル配列、と融合させることができる。
【００７８】
ＫＤＲの２個の異なるエピトープに特異的な結合ドメインを持つ二重特異性蛋白に関連し、そして本発明に係る抗原結合蛋白の有利な機能的側面を立証する、本発明の具体例をここに提供する。使用する結合ドメインは、ＫＤＲで免疫したマウスから組み立てたファージディスプレーライブラリーから単離するｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１およびｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７から誘導する（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【００７９】
ｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７は、ＫＤＲおよびマウス相同体Ｆｌｋ−１の両者に共通するエピトープに結合し、いずれのレセプターに対するＶＥＧＦの結合も妨害しない。ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１はＫＤＲの異なるエピトープに結合し、ＶＥＧＦの結合を遮断できるが、Ｆｌｋ−１には結合しない。したがって、各結合ドメインのうち２つをディスプレーする二重特異性二価免疫グロブリン様分子はＫＤＲへの結合について四価であり、Ｆｌｋ−１への結合については二価である。
【００８０】
Ｆｌｋ−１に対して二価であるＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、Ｆｌｋ−１に対する二価ｄｉａｂｏｄｙであるＤＡＢ ｐ４Ｇ７と類似のアビディティを持っている。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＤＡＢ ｐ４Ｇ７のアビディティはそれら各々の一価対応物であるＢｓ（ｓｃＦｖ）２−ＦａｂおよびｓｃＦｖ ｐ４Ｇのおよそ１０ないし２３倍高く、この事は、二価性に起因する増強された結合を立証している。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧはその構成成分の結合部位の両方の生物学的機能を保持しており、ＫＤＲおよびＦｌｋ−１の両者に対し、親抗体と同じ位有効に結合する（図４）。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、ヒト内皮細胞上の表面発現ＫＤＲに結合し、ＫＤＲ／ＶＥＧＦ相互作用を遮断し、そしてＶＥＧＦにより誘発されるＫＤＲレセプター燐酸化を用量依存的に中和する（図５および６）。とりわけＢＳ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、ｃ−ｐ１Ｃ１１よりも低い親和性でＫＤＲに結合し、そしてＫＤＲ／ＶＥＧＦ相互作用の遮断においてＥＬＩＳＡ検定で４倍有効性が低いという事実にも拘わらず、ＶＥＧＦにより誘発されるレセプター燐酸化の中和においてｃ−ｐ１Ｃ１１と同じ位強力である。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧの生物活性の増強は、ＫＤＲに関して四価であることに由来する増強した結合に帰することができる。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、分子内架橋（即ち、同じＫＤＲ分子内部で２個のエピトープを架橋する）および／または細胞表面で多分子複合体を形成するための分子間架橋の能力を持っている。
【００８１】
本発明に係る抗原結合蛋白は人間およびその他の哺乳動物の疾病の治療に有用である。この抗原結合蛋白は、天然および改変抗体についてこれまで知られているのと同じ目的および同じ方法で使用する。したがってこの抗原結合蛋白は、当分野で周知の研究、診断または治療方法のためにインビボおよびインビトロで使用できる。
【００８２】
診断または治療目的で人間の身体に使用する場合、本発明に係る抗原結合蛋白は、薬学上許容し得る担体をさらに含む組成物の形で投与するという事が理解できる。好適な薬学上許容し得る担体は、例えば水、食塩水、燐酸緩衝化食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうち１またはそれ以上、ならびにこれらの組み合わせを包含する。薬学上許容し得る担体はさらに、湿潤もしくは乳化剤、保存料または緩衝剤といった補助物質を少量含み、これらは該結合蛋白の貯蔵期間または有効性を増大させる。本発明に係る組成物は様々な形態であってよい。これらは、例えば固体、半固体および液体投与型、例えば錠剤、丸剤、散剤、液体、分散剤または懸濁剤、リポソーム、坐剤、注射溶液および注入溶液を包含する。好ましい形態は意図する投与方式および治療適応に依存する。好ましい組成物は注射溶液または注入溶液の形態である。
【００８３】
本発明に係る好ましい薬用組成物は、他の抗体による人間の受動免疫に用いられるものに類似している。好ましい投与方式は非経口的である。
【００８４】
本明細書に開示する本発明の原則に当業者が変化を施すことができるという事が理解および予想でき、また、係る修飾は本発明の範囲内に包含される事を意図している。
【００８５】
以下の実施例は本発明をさらに例示するものであるが、いかなる方法によっても本発明の範囲を限定するものと解してはならない。例えばベクターおよびプラスミドの組み立て、係るベクターおよびプラスミドへのポリペプチドをコードしている遺伝子の挿入、宿主細胞へのプラスミドの導入、ならびに遺伝子および遺伝子産物の発現およびその測定といった常法の詳細な説明は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ． ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを包含する多数の刊行物から得ることができる。本明細書に記載する全ての参考文献は引用によりその全体を本明細書の一部とする。
【００８６】
実施例１：材料および方法
蛋白および抗体
完全なＫＤＲコード化配列血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、キナーゼ挿入ドメイン含有レセプター−アルカリホスファターゼ融合蛋白（ＫＤＲ−ＡＰ）およびそのマウス相同体、胎児肝キナーゼ１（Ｆｌｋ−１）−ＡＰをそれぞれバキュロウイルスおよびＮＩＨ３Ｔ３細胞で発現させ、記載の方法に従い精製する（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
【００８７】
ヒトＫＤＲコード化配列は公表されている（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ０３５１２１）。ＫＤＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン除去突然変異体をＰＣＲクローニングにより組み立て、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞で発現させ、記載のように精製する（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，（２０００） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７５， １４３２１−１４３３０）。このＫＤＲ ＥＣＤ Ｉｇドメイン除去突然変異体は以下の構造を有する：
ＫＤＲ（Ｉｇ１−７）：レセプターの７個のＩｇドメイン全てを含む完全長ＫＤＲ ＥＣＤ（アミノ酸Ｍｅｔ１からＶａｌ７４２まで）；
ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）：３個のＮ末端ＥＣＤ Ｉｇドメインを含む突然変異体（アミノ酸Ｍｅｔ１からＬｙｓ３２７まで）；および、
ＫＤＲ（Ｉｇ３−７）：ＫＤＲ ＥＣＤ Ｉｇドメイン３ないし７を含む突然変異体（アミノ酸Ａｓｐ２２５からＶａｌ７４２まで）。
【００８８】
抗ＫＤＲ一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ｐ１Ｃ１１およびｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７を、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８， ３２０９−３２１４およびＬｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２３０， １５９−１７１に報告されたように、ＫＤＲで免疫したマウスから組み立てたファージディスプレーライブラリーから単離する。
【００８９】
二価ｓｃＦｖフラグメントの形態であるｄｉａｂｏｄｙ ＤＡＢ ｐ４Ｇ７（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０， ６４４４−６４４８；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １４， １９２−１９６）を、前にＺｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）およびＬｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）に記載されたようにｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７から組み立てる。ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１から組み立てたマウス／ヒトキメラＩｇＧ１抗体であるｃ−ｐ１Ｃ１１、および表皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプターに対するキメラＩｇＧ１抗体であるＣ２２５は、いずれもＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）で製造されている。Ｚｈｕ， ｅｔ ａｌ．（１９９９）。
【００９０】
抗Ｆｌｔ−１抗体Ｍａｂ６．１２（ＩｇＧ１， κ）を産生するハイブリドーマセルライン（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＰＴＡ−３３４）は、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）において該レセプターの組換え型で免疫したマウスから確立した。
【００９１】
マウスの免疫および一本鎖抗体ファージディスプレーライブラリーの組み立て 雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、Ｒｉｂｉ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ ２００μｌ中のＫＤＲ−ＡＰ １０μｇを２回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、続いて２ヶ月の間にＲＩＢＩアジュバント無しで１回ｉ．ｐ．注射する。このマウスはまた、最初の免疫の時点で、ＲＩＢＩ ２００μｌに入れたＫＤＲ−ＡＰ １０μｇの皮下（ｓ．ｃ．）注射を受ける。このマウスは安楽死の３日前にＫＤＲ−ＡＰ ２０μｇでｉ．ｐ．ブースティングする。ドナーマウスの脾臓を摘出し、細胞を単離する。ＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡを脾臓細胞の全ＲＮＡから精製する。逆転写の後、発現されたＶＬおよびＶＨ遺伝子に対応するｃＤＮＡを個別に増幅する。増幅した生成物を、各遺伝子を受容するよう設計したベクター中に別々に挿入するか、または、分泌シグナル配列およびポリペプチドリンカーをコードしているヌクレオチドに連結し（例えばＰＣＲ増幅により）、融合した生成物を所望ベクター中に挿入することができる。例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８を参照されたい。
【００９２】
マウスｓｃＦｖを線維状ファージ上にディスプレーするための材料と方法は市販品が入手できる（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。簡潔に述べると、ｓｃＦｖを線維状ファージ表面にディスプレーするには、抗体ＶＨおよびＶＬドメインを１５アミノ酸リンカー（ＧＧＧＧＳ）３によって結合させる。この組み立て物のＣ末端を、１５アミノ酸Ｅタグを持ちアンバーコドン（ＴＡＧ）で終わっているファージ蛋白ＩＩＩのＮ末端に連結する。Ｅタグと蛋白ＩＩＩの間に位置するアンバーコドンは、非サプレッサー宿主（例えばＨＢ２１５１細胞）中に導入された場合はｓｃＦｖを可溶性型で産生させ、サプレッサー宿主（例えばＴＧ１細胞）中に導入された場合は蛋白ＩＩＩを介してファージをディスプレーさせる。
【００９３】
このｓｃＦｖ−遺伝子ＩＩＩ組み立て物をｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅベクターにライゲーションする。形質転換したＴＧ１細胞を２ＹＴＡＧプレート（１７ｇ／ｌトリプトン、１０ｇ／ｌ酵母抽出物、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、２０ｇ／ｌグルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１５ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ）に蒔き、インキュベートする。コロニーを削り取って２ＹＴ培地（１７ｇ／ｌトリプトン、１０ｇ／ｌ酵母抽出物、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ ）１０ｍｌに入れ、５０％グリセロール５ｍｌと混合し、ライブラリーストックとして−７０℃で保存する。
【００９４】
生物学的パンニング
ライブラリーストックを対数期まで増殖させ、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージで救済し、２ＹＴＡＫ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍｌおよびカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有する２ＹＴ）で一夜３０℃で増幅する。このファージ調製物を４％ ＰＥＧ／０．５Ｍ ＮａＣｌで沈殿させ、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）５００μｇ／ｍｌを含有する３％脱脂乳／ＰＢＳに再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートして、ＡＰ ｓｃＦｖに対する特異性を持つファージ−ｓｃＦｖを遮断し且つ他の非特異結合を遮断する。
【００９５】
ＫＤＲ−ＡＰ（１０μｇ／ｍｌ）被覆Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｓｔａｒ管（Ｎｕｎｃ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を、まず３％牛乳／ＰＢＳを用いて３７℃で１時間遮断し、次にファージ調製物と共に室温で１時間インキュベートする。この管をＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で１０回洗浄し、その後ＰＢＳで１０回洗浄する。結合したファージを、新たに調製した１００ｍＭトリエチルアミン溶液１ｍｌで１０分間室温で溶離する。溶出したファージを対数期なか頃のＴＧ１細胞１０ｍｌと共に３７℃で静止させて３０分間、振盪しつつ３０分間インキュベートする。次いで、感染したＴＧ１細胞を２ＹＴＡＧプレートに蒔き、ファージストックの作製で上に示したように一夜３０℃でインキュベートする。
【００９６】
スクリーニング操作（パンニング）を連続回実施して、所望の結合特異性を持つディスプレーされたｓｃＦｖをさらに濃縮する。２または３回パンニングを実施した後、個々の細菌コロニーを別々にスクリーニングして所望のＫＤＲ結合特性を持つクローンを同定する。同定したクローンはＶＥＧＦ結合の遮断についてさらに試験することができる。クローンのＤＮＡフィンガープリンティングを用いてユニークなクローンを識別する。各消化パターンの代表的クローンを選び、ＤＮＡ配列決定に付す。
【００９７】
ファージＥＬＩＳＡ
個々のＴＧ１クローンを９６ウェルプレートで３７℃で増殖させ、上記のようにＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージで救済する。増幅したファージ調製物を１／６容量の１８％牛乳／ＰＢＳの添加によりＲＴで１時間遮断し、ＫＤＲ−ＡＰまたはＡＰで被覆したＭａｘｉ−ｓｏｒｐ ９６ウェル微量定量プレート（Ｎｕｎｃ）に加える。室温で１時間のインキュベートの後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ウサギ抗Ｍ１３ファージＡｂ−ＨＲＰコンジュゲートと共にインキュベートする。プレートを５回洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質を加え、４５０ｎｍのＯＤをマイクロプレート読み取り機を用いて読み取る。
【００９８】
可溶性ｓｃＦｖの調製
個々のクローンのファージを用いて非サプレッサーＥ．ｃｏｌｉ宿主ＨＢ２１５１を感染させ、感染させたものを２ＹＴＡＧ−Ｎ（２ＹＴＡＧ；１００μｇ／ｍｌナリジキシン酸）プレート上で選択する。この細胞を１ｍＭイソプロピル−１−チオ−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシドを含有する２ＹＴＡ培地で３０℃で培養することにより、ＨＢ２１５１におけるｓｃＦｖの発現を誘導する。２０％（ｗ／ｖ）蔗糖、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含有する２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に細胞ペレットを再懸濁し、続いて穏やかに振盪しながら４℃で１時間インキュベートすることにより、この細胞のペリプラズム抽出物を調製する。１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、ＲＰＡＳ精製モジュール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いる親和クロマトグラフィーによって可溶性ｓｃＦｖを上清から精製する。
【００９９】
Ｍａｂ６．１２からのｓｃＦｖの調製
Ｍａｂ６．１２のＶＨおよびＶＬ遺伝子を、Ｂｅｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．， Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．， Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ； ｐ１４７−１６８の方法に従い、ハイブリドーマ細胞から単離したｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによってクローニングする。マウス抗体軽鎖リーダー配列の５’末端とハイブリダイズするよう特異的に設計した１１個の５’プライマー、および、マウスκ軽鎖定常領域の５’末端とハイブリダイズする１個の３’プライマーを使用して、ＶＬ遺伝子をクローニングする。マウス抗体重鎖リーダー配列の５’末端とハイブリダイズするよう特異的に設計した１２個の５’プライマー、および、マウスＩｇＧ１重鎖定常領域の５’末端とハイブリダイズする１個の３’プライマーを使用して、ＶＨ遺伝子をクローニングする。抗体の各々について合計２３のＰＣＲ反応（ＶＬ遺伝子について１１およびＶＨ遺伝子について１２）を実施する。ＰＣＲにより生成した４００ないし５００塩基対の間のサイズの全フラグメントを製造者の説明書に記載のようにしてｐＣＲ（登録商標）２．１ベクター中にクローニングし（ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）、その後Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＸＬ−１の形質転換を行う。
【０１００】
部分重複ＰＣＲを用いてｓｃＦｖ６．１２を組み立てるため、ＭＡＢ６．１２のＶＬおよびＶＨ遺伝子をコードしているＰＣＲフラグメントを使用する。このｓｃＦｖでは、１５アミノ酸リンカー（グリシン−グリシン−グリシン−グリシン−セリン）３、または（ＧＧＧＧＳ）３を介してＭａｂ６．１２ ＶＨのＣ末端をＭａｂ６．１２ ＶＬのＮ末端に連結する（図１Ａ）。次いでｓｃＦｖ６．１２コード化遺伝子を、可溶性ｓｃＦｖ蛋白の発現のため、ベクターｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）中にクローニングする。
【０１０１】
ＢｓＡｂ−ＩｇＧ［Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ］およびＢｓＡｂ−Ｆａｂ［Ｂｓ（ｓｖＦｖ）２−Ｆａｂ］のための発現ベクターの組み立て
プライマーＪＺＺ−２（配列番号２９）およびＪＺＺ−３（配列番号３０）を用いるＰＣＲによって、ｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７をコードしている遺伝子をｓｃＦｖ発現ベクターから増幅する。次に、プライマーＪＺＺ−１２（配列番号３１）およびＪＺＺ−３（配列番号３０）を用いるＰＣＲによって、哺乳動物細胞における蛋白分泌のためのリーダーペプチド配列をｓｃＦｖコード化配列の５’末端に加える。
【０１０２】
同様に、プライマーＪＺＺ−２（配列番号２９）およびｐ１Ｃ１１ＶＬ３−２（配列番号３２）を用いるＰＣＲによって、ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１をコードしている遺伝子をｓｃＦｖ発現ベクターから増幅し、続いて、プライマーＪＺＺ−１２（配列番号３１）およびｐ１Ｃ１１ＶＬ３−２（配列番号３２）を用いるＰＣＲによってリーダーペプチド配列を加える。
【０１０３】
軽鎖および重鎖両方の分泌のため、１９アミノ酸より成る同じリーダーペプチドＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ（配列番号３３）を使用する。
【０１０４】
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧの軽鎖および重鎖のため、別々の発現ベクターを組み立てる。クローニングしたｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）を含むベクターｐＫＮ１００（Ｄｒ．Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ， ＭＲＣ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｉｖｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｅｎｇｌａｎｄ、より寄贈）中にライゲーションしてＢｓＡｂ−ＩｇＧ軽鎖ＢｓＩｇＧ−Ｌのための発現ベクターを作り出す。クローニングしたｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（ＣＨ）を含むベクターｐＧ１Ｄ１０５（Ｄｒ．Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓより寄贈）中にライゲーションしてＢｓＡｂ−ＩｇＧ重鎖ＢｓＩｇＧ−Ｈのための発現ベクターを作り出す。これらのベクターは、メソトレキサートに対する耐性を付与しベクター配列の増幅を提供するＤＨＦＲ遺伝子の存在を除いて米国特許５８４０２９９に記載の軽鎖（ＨＣＭＶ−ＶＬ−ＨＣＫ）および重鎖（ＨＣＭＶ−ＶＨ−ＨＣγ １）ベクターに類似している。
【０１０５】
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂのための発現ベクターを製造するため、プライマーＪＺＺ−１２（配列番号３１）およびＪＺＺ−１８（配列番号３４）を用いるＰＣＲによって、蛋白翻訳を停止するための停止コドンを、ベクターＢｓＩｇＧ−Ｈの第一定常ドメイン（ＣＨ１）の直後に導入する。この遺伝子フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮａｅＩで消化し、ベクターｐＧ１Ｄ１０５に挿入してベクターＢｓＦａｂ−Ｈを作り出す。全ての組み立て物を制限酵素消化により調査し、ＤＮＡ配列決定により確認する。
【０１０６】
この実施例で使用したプライマー配列を下記および配列表に記す。
【０１０７】
ＪＺＺ−２配列（配列番号２９）：
５’−ＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＴＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＧＴＣＡＡＧＣＴＧＣ−３’
ＪＺＺ−３配列（配列番号３０）：
５’−ＴＣＧＡＡＧＧＡＴＣＡＣＴＣＡＣＣＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣ−３’
ＪＺＺ−１２配列（配列番号３１）：
５’−ＧＧＴＣＡＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴ−３’
ｐ１Ｃ１１ＶＬ３−２配列（配列番号３２）：
５’−ＴＣＧＡＴＣＴＡＧＡＡＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧ−３’
リーダーペプチド（配列番号３３）：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ
ＪＺＺ−１８（配列番号３４）：
５’−ＴＣＴＣＧＧＣＣＧＧＣＴＴＡＡＧＣＴＧＣＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴ−３’
抗体の発現および精製
Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． １３６， ２０３−２１３に記載の方法に従い、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂそれぞれの一過性発現のため、ベクターＢｓＩｇＧ−ＬおよびＢｓＩｇＧ−Ｈ、またはＢｓＩｇＧ−ＬおよびＢｓＦａｂ−Ｈ由来の同量のＤＮＡを用いてＣＯＳ細胞を同時トランスフェクトする。トランスフェクションの２４時間後、この細胞を無血清培地に交換する。条件付けた上清をトランスフェクションの４８時間および１２０時間後に集める。製造者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）の記載したプロトコルに従い、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂを、プールした上清から、プロテインＧカラムを用いる親和クロマトグラフィーによって精製する。抗体を含有する画分をプールし、緩衝液をＰＢＳに交換し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ １０濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏｒｐ．， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）を用いて濃縮する。抗体の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。精製した抗体の濃度を、捕捉剤として山羊抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異抗体を、そして検出剤としてＨＲＰ−コンジュゲートした山羊抗ヒトκ鎖抗体を使用して、ＥＬＩＳＡにより測定する。標準曲線を臨床等級の抗体Ｃ２２５またはｃ−ｐ１Ｃ１１を用いて検定する。
【０１０８】
ＫＤＲに対する二重特異性抗体の結合検定
上に記載のＢｓＡｂの二重特異性を立証するため２種類の異なる検定を実施する。
【０１０９】
直接結合検定では、まず、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ， Ｒｏｓｋｉｌｄｅ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を、捕捉剤としてウサギ抗ＡＰ抗体（ＤＡＫＯ−Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎｓ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、ＫＤＲ（Ｉｇ１−７）−ＡＰ、ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）−ＡＰまたはＫＤＲ（Ｉｇ３−７）−ＡＰ融合蛋白（ウェルあたり１．０μｇ／ｍｌ ｘ １００μｌ）で被覆する。次いでこのプレートをＢｓＡｂ、ｃ−ｐ１Ｃ１１またはＤＡＢ ｐ４Ｇ７と共に室温で１時間インキュベートし、その後ＢｓＡｂおよびｃ−ｐ１Ｃ１１のためにはウサギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Ｃａｐｐｅｌ， Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐ． Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）と共に、またはＤＡＢ ｐ４Ｇ７のためにはマウス抗Ｅタグ抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共にインキュベートする。このプレートを５回洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を加え、４５０ｎｍのＯＤをマイクロプレート読み取り機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を用いて読み取る（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
【０１１０】
架橋検定では、最初にこの抗体をＫＤＲ（Ｉｇ１−７）−ＡＰ、ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）−ＡＰまたはＫＤＲ（Ｉｇ３−７）−ＡＰと共に溶液中でインキュベートする。混合物をＫＤＲ（Ｉｇ１−３）（タグ無し）で被覆した９６ウェルプレートに移し、室温で２時間インキュベートする。プレートを洗浄し、ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）（タグ無し）に結合したＡＰ活性をＡＰ基質ｐ−ニトロフェノールホスファート（Ｓｉｇｍａ）の添加によって測定し、４０５ｎｍのＯＤを読み取る（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
【０１１１】
ＫＤＲおよびＦｌｋ−１に対するＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂの定量的結合検定 ＫＤＲ−ＡＰまたはＦｌｋ−１−ＡＰ（１００ｎｇ蛋白／ウェル）のいずれかで被覆した９６ウェルＭａｘｉ−ｓｏｒｐ微量定量プレート（Ｎｕｎｃ）に、種々の量のＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂ、ｃ−ｐ１Ｃ１１またはｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７を加え、室温で１時間インキュベートし、その後、二重特異性抗体およびｃ−ｐ１Ｃ１１のためにはウサギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異抗体−ＨＲＰコンジュゲートと共に、またはｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７のためにはマウス抗Ｅタグ抗体−ＨＲＰコンジュゲートと共に、室温で１時間インキュベートする。プレートを洗浄し上記のように発色させる。
【０１１２】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析
初期継代ＨＵＶＥＣ細胞を増殖因子枯渇ＥＢＭ−２培地で一夜増殖させてＫＤＲレセプターの発現を誘導する。細胞を収穫し、ＰＢＳで３回洗浄し、５μｇ／ｍｌのＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧまたはｃ−ｐ１Ｃ１１と共に４℃で１時間インキュベートし、続いてＦＩＴＣ標識したウサギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｃａｐｐｅｌ， Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐ．）と共にさらに１時間インキュベートする。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーにより分析する（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【０１１３】
結合速度の分析
ＢｓＡｂおよび親ｓｃＦｖの結合速度を、ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）を使用し表面プラスモン共鳴により測定する。ＫＤＲ−ＡＰ、Ｆｌｋ−１−ＡＰ、またはＦｌｔ−１−Ｆｃ融合蛋白をセンサーチップ上に固定化し、様々な抗体を１．５ｎＭないし２００ｎＭの範囲の濃度で注入する。各濃度におけるセンサーグラムを得、速度定数ｋｏｎおよびｋｏｆｆを決定するため、プログラムＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ２．０を用いて評価する。速度定数の比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとしてＫｄを算出する。
【０１１４】
ＶＥＧＦ／ＫＤＲ、ＶＥＧＦ／Ｆｌｔ−１、およびＰＩＧＦ／Ｆｌｔ−１リガンド遮断検定
遮断検定では、種々の量のＢｓＡｂ、ｓｃＦｖまたはｃ−ｐ１Ｃ１１を、固定量のＫＤＲ−ＡＰ、Ｆｌｋ−１−ＡＰまたはＦｌｔ−１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）と混合し、室温で１時間インキュベートする。次いでこの混合物をＶＥＧＦ１６５またはＰＩＧＦで被覆した９６ウェルプレートに移し、ＲＴでさらに２時間インキュベートし、その後このプレートを５回洗浄する。ＶＥＧＦ１６５およびＰＩＧＦは典型的には２００ｎｇ／ウェルで被覆する。ＶＥＧＦ１６５はＶＥＧＦの１６５アミノ酸型である。ＫＤＲ−ＡＰまたはＦｌｋ−１−ＡＰについてはＶＥＧＦに結合したＡＰ活性を記載のように定量する（Ｚｈｕ， ｅｔ ａｌ．， １９９８；１９９９）。ＶＥＧＦまたはＰＩＧＦに結合したＦｌｔ−１−Ｆｃを測定するため、プレートをマウス抗ヒトＦｃ−ＨＲＰコンジュゲートと共にインキュベートする。
【０１１５】
燐酸化阻害検定
完全長ＫＤＲ（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でトランスフェクトした安定な２９３セルラインを使用し、かつて記載された方法（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８；１９９９）に従い、ＫＤＲ燐酸化検定を実施する。簡潔に述べると、トランスフェクトした２９３細胞（プレートあたり〜３ｘ１０６細胞）を抗体の存在下または不在下で１５分間インキュベートし、その後２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ １６５により室温でさらに１５分間刺激する。次いでこの細胞を溶解し、細胞溶解液をＫＤＲ燐酸化検定に使用する。ＫＤＲレセプターを、抗ＫＤＲ抗体Ｍａｂ４．１３（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に結合させたプロテインＡセファロースビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．， ＣＡ）を用いて細胞溶解液から免疫沈降させる。蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離しウェスタンブロット分析に付す。ＫＤＲ燐酸化を検出するため、ブロットを抗ホスホチロシンＭａｂ、ＰＹ２０（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． Ａｕｒｏｒａ， ＯＨ）でプロービングする。このシグナルを、増強した化学ルミネセンスを用いて検出する（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）。このブロットをポリクローナル抗ＫＤＲ抗体（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で再プロービングして、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの各列に同量の蛋白がロードされていることを確実とする。
【０１１６】
抗マイトジェン検定
ＨＵＶＥＣ（５ｘ１０３細胞／ウェル）を、ＶＥＧＦ、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、または上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）を除いたＥＢＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）２００ｕｌを入れた９６ウェル組織培養プレート（Ｗａｌｌａｃｈ，Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）に蒔き、３７℃で７２時間インキュベートする。様々な量の抗体を２個ずつのウェルに加え、３７℃で１時間プレインキュベートし、その後ＶＥＧＦ１６５を最終濃度１６ｎｇ／ｍｌとなるように加える。１８時間のインキュベーションの後、［３Ｈ］−チミジン（［３Ｈ］−ＴｄＲ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）０．２５ｕＣｉを各ウェルに加え、さらに４時間インキュベートする。細胞を氷上に置き、血清含有培地で２回洗浄し、引き続き１０％ ＴＣＡと共に４℃で１０分間インキュベートする。次にこの細胞を水で１回洗浄し、２％ ＳＤＳ ２５μｌに可溶化する。シンチレーション液（１５０μｌ／ウェル）を加え、ＤＮＡの取り込んだ放射性をシンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃｈ， Ｍｏｄｅｌ １４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ）で測定する。
【０１１７】
白血病遊走検定
ＨＬ６０およびＨＥＬ細胞を無血清単純ＲＰＭＩ １６４０培地で３回洗浄し、この培地に１ｘ１０６／ｍｌで懸濁する。細胞懸濁液のアリコート１００μｌを３μｍ孔ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔ（ＨＬ６０細胞用）または８μｍ孔ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔ（ＨＥＬ細胞用）（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）， Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ， Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ）のいずれかに加え、抗原結合蛋白と共に３７℃で３０分間インキュベートする。次にこのｉｎｓｅｒｔを、ＶＥＧＦ１６５を加えたまたは加えていない無血清ＲＰＭＩ １６４０ ０．５ｍｌを入れた２４ウェルプレートのウェルに入れる。３７℃、５％ＣＯ２でＨＬ６０細胞については１６−１８時間、ＨＥＬ細胞については４時間遊走を実施する。遊走した細胞を下室から集め、コールターカウンター（Ｍｏｄｅｌ Ｚ１， Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｌｔｄ．， Ｌｕｔｏｎ， Ｅｎｇｌａｎｄ）で計数する。
【０１１８】
実施例２：二重特異性抗体の製造
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂの組み立て
２種類の抗ＫＤＲ ｓｃＦｖ抗体、ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１およびｐ４Ｇ７を、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂの組み立てに使用する（図２Ａ）。ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１はＫＤＲに特異的に結合しＫＤＲ／ＶＥＧＦ相互作用を遮断し、一方ｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７はＫＤＲとそのマウス同族体Ｆｌｋ−１の両者に結合するがＫＤＲ／ＶＥＧＦまたはＦｌｋ−１／ＶＥＧＦ相互作用のいずれをも遮断しない（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。ｐ１Ｃ１１はＫＤＲ ＥＣＤ Ｉｇドメイン１ないし３内部に位置するエピトープに結合し、一方ｐ４Ｇ７のためのエピトープはＩｇドメイン６および７内部に位置するということが、エピトープマッピング研究で明らかとなっている（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１およびｐ４Ｇ７をコードしている遺伝子セグメントを、ヒトＩｇＧ１分子のＣＨおよびＣＬをコードしている遺伝子セグメントにそれぞれ結合させ、その結果ｓｃＦｖ配列はそれぞれＣＨ１およびＣＬのＮ末端に融合して、発現ベクターＢｓＩｇＧ−ＨおよびＢｓＩｇＧ−Ｌが作られる（図２Ａ）。この配置はＩｇＧの元のＶＨおよびＶＬドメインを、各々独立した抗原結合ユニットを構成する２個のｓｃＦｖ分子に置換する（図１）。ＢｓＩｇＧ−ＨおよびＢｓＩｇＧ−Ｌの同時発現は、ＩｇＧ様二価二重特異性分子Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧを生成する（図１）。一価二重特異性Ｆａｂ様分子（図１）、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂもまた、ＢｓＩｇＧ−ＬおよびＢｓＦａｂ−Ｈの同時発現によって生成する。停止コドンをＣＨ１ドメインの末端に導入することにより、ＢｓＩｇＧ−ＨからベクターＢｓＦａｂ−Ｈを組み立てる（図２Ａ）。
【０１１９】
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂの発現と精製
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧとＢｓ（ｓｃＦｖ）２−ＦａｂをＣＯＳ細胞で一過性発現させ、プロテインＧカラムを用いる親和クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製する。精製したＢｓＡｂをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する（図２Ｂ）。非還元条件下で、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは分子量およそ２００ｋＤａの単一のバンドを生じ、一方Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂは〜７５ｋＤａの主たるバンドを生ずる（図２Ｂ、２および３列）。還元条件下では、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、それぞれｓｃＦｖ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３融合物（〜６３ｋＤａ）およびｓｃＦｖ−ＣＬ融合物（〜３７ｋＤａ）に対する予想移動度を持つ２個の主たるバンドを生成する（図２Ｂ、５列）。これに対し、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂは、ｓｃＦｖ−ＣＨ１およびｓｃＦｖ−ＣＬ融合物をそれぞれ示す、〜３８ｋＤａおよび３７ｋＤａの分子量を持つ２個の主たるバンドを生ずる（図２Ｂ、６列）。対照として、ｃ−ｐ１Ｃ１１、キメラＩｇＧ１抗体は、非還元条件下で〜１５０ｋＤａの１個のバンドを（図２Ｂ、１列）、そして還元条件下で〜５０ｋＤａ（重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３融合物）および〜２５ｋＤａ（軽鎖、ＶＬ−ＣＬ融合物）という２個のバンドを生ずる（図２Ｂ、５列）。
【０１２０】
実施例３：ＢｓＡｂは同時に２個のエピトープに結合する
ＢｓＡｂの二重特異性
ＢｓＡｂの二重の特異性を、完全長ＫＤＲ ＥＣＤおよびそのＩｇドメイン除去突然変異体のうちの２個を用いて検定する（図３Ａ）。かつて観察されたようにｐ１Ｃ１１はＩｇドメイン１ないし３を含むＫＤＲ突然変異体とのみ結合し（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９）、一方ｐ４Ｇ７はＩｇドメイン６および７を含む突然変異体とのみ結合する（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。対照的に、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂはいずれも３種類のＫＤＲ変異体の全てに結合し、この事は、ＢｓＡｂは、一方はＩｇドメイン１ないし３上のエピトープに、そして他方はＩｇドメイン６および７上のエピトープに結合する２個の結合部位を有することを示すものである。
【０１２１】
ＢｓＡｂが両方のエピトープに同時に結合できるか否かを調べるため、ＡＰで標識したまたはしていない幾つかのＫＤＲ ＥＣＤ Ｉｇドメイン除去突然変異体を使用して架橋検定を実施する。この検定では、ＢｓＡｂをまずＫＤＲ（Ｉｇ１−７）−ＡＰ、ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）−ＡＰまたはＫＤＲ（Ｉｇ３−７）−ＡＰとインキュベートする。混合物をＫＤＲ（Ｉｇ１−３）（タグ無し）で被覆した微量定量プレートに移し、その後ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）（タグ無し）に結合したＡＰ活性を測定する（図３Ｂ）。プレートに結合したＡＰ活性により立証されるように、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂはいずれも３種類全てのＫＤＲ−ＡＰ変異体と溶液中で有効に結合し、固定化ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）（タグ無し）と架橋複合体を形成する（図３Ｂ）。対照的に、ｃ−ｐ１Ｃ１１は、ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）（タグ無し）を、Ｉｇドメイン１−３を含むＫＤＲ変異体、即ちＫＤＲ（Ｉｇ１−７）−ＡＰおよびＫＤＲ（Ｉｇ１−３）−ＡＰとのみ架橋させ、ＫＤＲ（Ｉｇ３−７）−ＡＰとは架橋させない。予想されたように、ｐ４Ｇ７は、いずれのＫＤＲ変異体をも固定化ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）（タグ無し）と架橋させることができないが、これはｐ４Ｇ７がＫＤＲ（Ｉｇ１−３）突然変異体と結合しないためである。
【０１２２】
ＢｓＡｂによる抗原結合
ＢｓＡｂの抗原結合効率を固定化ＫＤＲ（図４Ａ）およびＦｌｋ−１（図４Ｂ）に関して測定する。図４Ａは、ＫＤＲに対するＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂの用量依存的結合を示している。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧとＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂの両者は、それが誘導されたｐ１Ｃ１１の８ないし１０倍の親和性を持つキメラ抗ＫＤＲ抗体であるｃ−ｐ１Ｃ１１と同じ位有効にＫＤＲに結合する。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−ＦａｂもまたｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７と同様、用量依存的にＦｌｋ−１に結合するが、ｃ−ｐ１Ｃ１１は結合しない。予想されたように、ヒトＥＧＦＲに対するキメラ抗体Ｃ２２５はいずれの抗原とも結合しない。
【０１２３】
細胞表面発現レセプターに対するＢｓＡｂの結合をＦＡＣＳ分析によって検定する。かつてｃ−ｐ１Ｃ１１で観察されたように（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９）、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは初期継代ＨＵＶＥＣ上で発現されたＫＤＲに有効に結合する。
【０１２４】
ＫＤＲおよびＦｌｋ−１に対するＢｓＡｂの結合速度をＢＩＡｃｏｒｅ装置を用いる表面プラスモン共鳴によって測定する（第１表）。ＫＤＲに対するＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂの全体的親和性（Ｋｄ）またはアビディティはそれぞれ１．４ｎＭおよび１．１ｎＭであり、これは一価ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１およびｐ４Ｇ７のそれと似通っているが、二価ｃ−ｐ１Ｃ１１またはＤＡＢ ｐ４Ｇ７のそれの４ないし１０倍弱い。これに対して、Ｆｌｋ−１に対して二価であるＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、二価ＤＡＢ ｐ４Ｇ７（Ｋｄ、 ０．１８ｎＭ）と類似のアビディティ（Ｋｄ、０．３３ｎＭ）を示す。Ｆｌｋ−１に対していずれも一価であるＢｓ（ｓｃＦｖ）２−ＦａｂおよびｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７は類似の親和性（Ｋｄ、それぞれ１．７ｎＭおよび４．２ｎＭ）でＦｌｋ−１に結合し、この親和性はそれらの二価対応物より５ないし２０倍弱い。
【０１２５】
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧによるＶＥＧＦ遮断
図５は、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧが、ＫＤＲ−ＡＰが固定化ＶＥＧＦに結合するのを有効に遮断することを示している。ＫＤＲ結合を５０％遮断するのに要する抗体濃度である、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびｃ−ｐ１Ｃ１１のＩＣ５０は、それぞれ４ｎＭおよび１ｎＭである。ｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７で観察されるように、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、ＶＥＧＦに対するＫＤＲマウス同族体Ｆｌｋ−１の結合を遮断しない（示していない）。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、ＶＥＧＦ／Ｆｌｋ−１結合に影響を及ぼさないｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７に対応するＦｌｋ−１エピトープに結合する。ｓｃＦｖ ｐ１ｃ１１が特異的であるＫＤＲエピトープはＦｌｋ−１には無い。したがってＦｌｋ−１に対するＶＥＧＦ結合は遮断されない。抗ＥＧＦＲ抗体Ｃ２２５は、ＶＥＧＦに対するＫＤＲの結合に効果を示さない。
【０１２６】
ＢｓＡｂによるＫＤＲ燐酸化阻害
ＶＥＧＦにより誘導されるレセプター燐酸化に及ぼすＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧの生物学的効果を、ＫＤＲトランスフェクト２９３細胞を用いて測定する。図６に示すように、ＶＥＧＦ処理はＫＤＲレセプターの強力な燐酸化を誘導する。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧによる前処理はＶＥＧＦで誘導されるレセプター燐酸化を用量依存的に阻害する（図６）。さらに、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、検定した各々の抗体濃度においてｃ−ｐ１Ｃ１１と等しく強力である。
【０１２７】
分裂誘発の阻害
ＶＥＧＦにより刺激されるヒト内皮細胞の分裂誘発に及ぼす抗ＫＤＲ抗体の効果を、ＨＵＶＥＣを用いる［３Ｈ］−ＴｄＲ ＤＮＡ取り込み検定によって測定する。ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＥＧＦを含まないＥＢＭ−２培地２００μｌを入れた９６ウェル組織培養プレートにＨＵＶＥＣ（５ｘ１０３細胞／ウェル）を蒔き、３７℃で７２時間インキュベートする。様々な量の抗体を２個ずつのウェルに加え、３７℃で１時間プレインキュベートし、その後最終濃度１６ｎｇ／ｍｌとなるようにＶＥＧＦ１６５を加える。１８時間インキュベーションした後、０．２５μＣｉの［３Ｈ］−ＴｄＲを各ウェルに加え、さらに４時間インキュベートする。ＤＮＡの取り込んだ放射性をシンチレーションカウンターで測定する。
【０１２８】
ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１およびＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧの両者はＶＥＧＦで刺激されたＨＵＶＥＣの分裂誘発を有効に阻害する。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧは、親ｓｃＦｖよりも強力な、ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ誘導性分裂誘発のインヒビターである。予想されたように、ＫＤＲと結合しないｓｃＦｖ ｐ２Ａ６、およびＫＤＲ／ＶＥＧＦ結合を遮断しないｓｃＦｖ ｐ４Ｇ７は、ＶＥＧＦ刺激性内皮細胞増殖に何ら阻害効果を示さない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂ分子の模式図である。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧでは、ヒトＩｇＧ１分子のＶＨおよびＶＬドメインが２個の異なる特異性のｓｃＦｖ抗体に置換されている。哺乳動物細胞におけるｓｃＦｖ−軽鎖およびｓｃＦｖ−重鎖融合ポリペプチドの同時発現は、二価のＩｇＧ様二重特異性分子の形成をもたらす。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂにおいて、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に停止コドンが導入されており、これが二価のＦａｂ様二重特異性分子の発現をもたらす（図２Ａをも参照されたい）。
【図２】
発現組み立て物と、精製したＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂ抗体の例を示す（ドメインは一定の拡大率ではない）。図Ａ：個々のｓｃＦｖ組み立て物を、５’末端で哺乳動物細胞での分泌のためのリーダー配列に、そして３’末端でヒトＩｇＧ分子のＣＬまたはＣＨ１ドメインに融合させる。図Ｂ：プロテインＧ精製したＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂ抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。１−３列は非還元条件でのランである。１列、ｃ−ｐ１Ｃ１１、キメラＩｇＧ１；２列、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ；３列、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂ。４−６列は還元条件でのランである。４列、ｃ−ｐ１Ｃ１１；５列、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ；６列、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂ。分子量標準の位置もまた示す。
【図３】
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２Ｆａｂ抗体の二重特異性についてのＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。図Ａは、ＫＤＲ ＥＣＤ Ｉｇドメイン除去突然変異体−ＡＰ融合蛋白への、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂおよびその親抗体の結合を示す。図Ｂは、異なるＫＤＲ ＥＣＤ Ｉｇドメイン除去突然変異体ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）およびＫＤＲ（Ｉｇ３−７）−ＡＰ上に位置する二つの異なるエピトープへの、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびＢｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂによる同時結合の検出のための、架橋ＥＬＩＳＡを示す。ＢｓＡｂを、ＫＤＲ（Ｉｇ１−７）−ＡＰ、ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）−ＡＰまたはＫＤＲ（Ｉｇ３−７）−ＡＰと共に溶液中でインキュベートし、タグ無しのＫＤＲ（Ｉｇ１−３）で被覆したプレートに移す。可溶相抗体／ＫＤＲ変異体−ＡＰ複合体と固定化ＫＤＲ（Ｉｇ１−３）との間で形成した架橋複合体を、プレートに結合したＡＰ活性を測定することにより検出する。示したデータは三重の測定値の平均値±ＳＤである。
【図４】
固定化した完全長ＫＤＲ−ＡＰ（図Ａ）およびＦｌｋ−１−ＡＰ（図Ｂ）への、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂおよびその親抗体の用量依存的結合を示す。示したデータは三重の測定値の平均値±ＳＤである。
【図５】
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびｃ−ｐ１Ｃ１１による、固定化ＶＥＧＦへのＫＤＲの結合の阻害を証明している。示したデータは三重の測定値の平均値±ＳＤである。
【図６】
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧおよびｃ−ｐ１Ｃ１１による、ＫＤＲレセプターの、ＶＥＧＦにより刺激された燐酸化の用量依存的阻害を証明している。ＫＤＲによりトランスフェクトさせた２９３細胞を種々の量の抗体によりＲＴで１５分間処理し、その後ＶＥＧＦ ２０ｎｇ／ｍｌと共に（対照群を除く）ＲＴでさらに１５分間インキュベートした。ＫＤＲの燐酸化をかつて記載されたプロトコルに従い分析する（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８， ３２０９−３２１４；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（１９９９） Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． １３６， ２０３−２１３）。
Claims (77)
- ２個の第一ポリペプチドと２個の第二ポリペプチドの複合体を含む抗原結合蛋白であって、
第一ポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬドメイン）のＮ末端に位置する抗原結合部位を有し、ここでこのＣＬドメインは免疫グロブリン重鎖第一定常ドメイン（ＣＨ１ドメイン）と安定に結合でき、そして
第二ポリペプチドが該ＣＨ１ドメインのＮ末端に位置する抗原結合部位を有し、このＣＨ１ドメインの後には、安定な自己結合ができる１またはそれ以上の重鎖定常ドメインがある、
抗原結合蛋白。 - １またはそれ以上の前記抗原結合部位が一本鎖Ｆｖにより提供される、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記第一および第二ポリペプチドの前記抗原結合部位が異なる特異性を有する、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記第一および第二ポリペプチドの前記抗原結合部位が同じ特異性を有する、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記特異性が異なる抗原上に存在するエピトープに対するものである、請求項３に記載の抗原結合蛋白。
- 前記特異性が同じ抗原上に存在するエピトープに対するものである、請求項３に記載の抗原結合蛋白。
- 前記第一ポリペプチドと第二ポリペプチドが共有結合している、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記２個の第二ポリペプチドが共有結合している、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記第二ポリペプチドがイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＧの抗体のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記第二ポリペプチドがイソタイプＩｇＥまたはＩｇＭの抗体のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインを有する、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記定常ドメインが哺乳動物の定常ドメインである、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記定常ドメインがヒト定常ドメインである、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- １またはそれ以上の前記一本鎖Ｆｖがマウス一本鎖Ｆｖである、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- １またはそれ以上の前記一本鎖Ｆｖが、ヒトフレームワーク領域を持つキメラ一本鎖Ｆｖである、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記一本鎖ＦｖがヒトＶＬおよびＶＨドメインである、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 安定な自己結合ができる前記重鎖定常ドメインが、任意の免疫グロブリンイソタイプまたはサブタイプ由来のＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインから成る群から選ばれる、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- Ｆｃレセプターと結合できる、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 補体仲介細胞傷害（ＣＭＣ）を奏効することのできる、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 抗体依存性細胞仲介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を奏効することのできる、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 抗腫瘍物質に連結している、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 検出可能シグナル生成物質に連結している、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- ＶＥＧＦレセプターの活性化を中和する、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- ＶＥＧＦレセプターが哺乳動物のものである、請求項２２に記載の抗原結合蛋白。
- ＶＥＧＦレセプターが人間のものである、請求項２２に記載の抗原結合蛋白。
- ＶＥＧＦレセプターがｆｌｔ−１またはｆｌｋ−１遺伝子によりコードされている、請求項２４に記載の抗原結合蛋白。
- 前記抗原結合部位のうち少なくとも１個がＫＤＲに特異的である、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記抗原結合部位のうち少なくとも１個がＦＬＴ１に特異的である、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記抗原結合部位のうち少なくとも１個がＦＬＴ４に特異的である、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記抗原結合部位のうち少なくとも１個がＥＧＦ−Ｒに特異的である、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記抗原結合部位のうち少なくとも１個がＨＥＲ２に特異的である、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記抗原結合部位のうち少なくとも１個がＦＧＦ−Ｒに特異的である、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記抗原結合部位のうち少なくとも１個がＰＤＧＦ−Ｒに特異的である、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記抗原結合部位のうち少なくとも１個がレセプターチロシンキナーゼに特異的である、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 抗原結合部位のうち少なくとも１個がＴｅｋに特異的である、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記抗原結合部位のうち少なくとも１個がＴｉｅ−２に特異的である、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記抗原結合部位のうち一方がＫＤＲに特異的であり、他方の前記結合部位がＦＬＴ１に特異的である、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記抗原結合部位のうち一方がＫＤＲに特異的であり、他方の抗原結合部位がＦＬＴ４、ＥＧＦ−Ｒ、ＨＥＲ２、ＦＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＴｅｋおよびＴｉｅ２から成る群から選ばれる抗原に特異的である、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記抗原結合部位のうち一方がＥＧＦ−Ｒに特異的であり、他方の抗原結合部位がＨＥＲ２に特異的である、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 前記抗原結合部位のうち少なくとも１個が免疫系エフェクター細胞の細胞表面抗原に特異的である、請求項１に記載の抗原結合蛋白。
- 免疫系エフェクター細胞がＴ細胞、マクロファージ、好中球、またはＮＫ細胞である、請求項３９に記載の抗原結合蛋白。
- 前記細胞表面抗原がＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ６４、Ｆｃレセプター、サイトカインレセプターまたはリンホカインレセプターである、請求項３９に記載の抗原結合蛋白。
- 前記細胞表面抗原がサイトカインまたはリンホカインのレセプターであり、そして抗原結合部位がサイトカインもしくはリンホカインまたはそれらの一部のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の抗原結合蛋白。
- レセプターがＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦのレセプターである、請求項４２に記載の抗原結合蛋白。
- 前記抗原結合部位のうち１個が免疫系エフェクター細胞の細胞表面抗原に特異的である、請求項２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５のいずれか１項に記載の抗原結合蛋白。
- 前記免疫系エフェクター細胞がＴ細胞、マクロファージ、好中球、またはＮＫ細胞である、請求項４４に記載の抗原結合蛋白。
- 前記細胞表面抗原がＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ６４、Ｆｃレセプター、サイトカインレセプターまたはリンホカインレセプターである、請求項４４に記載の抗原結合蛋白。
- ２個の第一ポリペプチドと２個の第二ポリペプチドの複合体を含む抗原結合蛋白であって、
第一ポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬドメイン）のＮ末端に位置する一本鎖Ｆｖを有し、ここでこのＣＬドメインは免疫グロブリン重鎖第一定常ドメイン（ＣＨ１ドメイン）と安定に結合でき、そして
第二ポリペプチドが該ＣＨ１ドメインのＮ末端に位置する一本鎖Ｆｖを有し、ここでこのＣＨ１ドメインの後には、安定な自己結合ができる１またはそれ以上の重鎖定常ドメインがある、
抗原結合蛋白。 - 前記第一および第二ポリペプチドの抗原結合部位が異なる特異性を有する、請求項４７に記載の抗原結合蛋白。
- 前記第一および第二ポリペプチドの抗原結合部位が同じ特異性を有する、請求項４７に記載の抗原結合蛋白。
- ＫＤＲの活性化を中和する、請求項４７に記載の抗原結合蛋白。
- 前記一本鎖Ｆｖの一方または両方が一本鎖Ｆｖ ｐ１ｃ１１である、請求項５０に記載の抗原結合蛋白。
- 前記一本鎖Ｆｖの一方または両方が一本鎖Ｆｖ ｐ４Ｇ７である、請求項５０に記載の抗原結合蛋白。
- ＦＬＴ１の活性化を中和する、請求項４７に記載の抗原結合蛋白。
- 前記一本鎖Ｆｖの一方または両方が一本鎖Ｆｖ ６．１２である、請求項５３に記載の抗原結合蛋白。
- 前記一本鎖Ｆｖの一方または両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列が、
ＣＤＲＨ１では配列番号１；
ＣＤＲＨ２では配列番号２；
ＣＤＲＨ３では配列番号３；
ＣＤＲＬ１では配列番号４；
ＣＤＲＬ２では配列番号５；そして、
ＣＤＲＬ３では配列番号６、
で示される、請求項５０に記載の抗原結合蛋白。 - 前記一本鎖Ｆｖの一方または両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードしているヌクレオチド配列が、
ＣＤＲＨ１については配列番号９；
ＣＤＲＨ２については配列番号１０；
ＣＤＲＨ３については配列番号１１；
ＣＤＲＬ１については配列番号１２；
ＣＤＲＬ２については配列番号１３；そして、
ＣＤＲＬ３については配列番号１４、
で示される、請求項５０に記載の抗原結合蛋白。 - 前記一本鎖Ｆｖの一方または両方の可変ドメインのアミノ酸配列が、
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）については配列番号７；そして、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）については配列番号８、
で示される、請求項５０に記載の抗原結合蛋白。 - 前記一本鎖Ｆｖの一方または両方の可変ドメインをコードしているヌクレオチド配列が、
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）については配列番号１５；そして、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）については配列番号１６、
で示される、請求項５０に記載の抗原結合蛋白。 - 一本鎖Ｆｖの一方または両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列が、
ＣＤＲＨ１では配列番号１；
ＣＤＲＨ２では配列番号２１；
ＣＤＲＨ３では配列番号３；
ＣＤＲＬ１では配列番号４；
ＣＤＲＬ２では配列番号５；そして、
ＣＤＲＬ３では配列番号６、
で示される、請求項５０に記載の抗原結合蛋白。 - 前記一本鎖Ｆｖの一方または両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードしているヌクレオチド配列が、
ＣＤＲＨ１については配列番号９；
ＣＤＲＨ２については配列番号２４；
ＣＤＲＨ３については配列番号１１；
ＣＤＲＬ１については配列番号１２；
ＣＤＲＬ２については配列番号１３；そして、
ＣＤＲＬ３については配列番号１４、
で示される、請求項５０に記載の抗原結合蛋白。 - 前記一本鎖Ｆｖの一方または両方の可変ドメインのアミノ酸配列が、
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）については配列番号２２；そして、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）については配列番号２３、
で示される、請求項５０に記載の抗原結合蛋白。 - 前記一本鎖Ｆｖの一方または両方の可変ドメインをコードしているヌクレオチド配列が、
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）については配列番号２５；そして、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）については配列番号２６、
で示される、請求項５０に記載の抗原結合蛋白。 - 前記一本鎖Ｆｖの一方または両方が配列番号２７または配列番号２８で示されるヌクレオチド配列を有する、請求項５０に記載の抗原結合蛋白。
- （ａ） 宿主細胞において、
免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬドメイン）のＮ末端に位置する抗原結合部位を有する第一ポリペプチドをコードしている組換えＤＮＡ組み立て物、ここでこのＣＬドメインは免疫グロブリン重鎖第一定常ドメイン（ＣＨ１ドメイン）と安定に結合できる、および
該ＣＨ１ドメインのＮ末端に位置する抗原結合部位を有する第二ポリペプチドをコードしている組換えＤＮＡ組み立て物、ここでこのＣＨ１ドメインの後には、安定な自己結合ができる１またはそれ以上の重鎖定常ドメインがある、
を、該ポリペプチドの発現および該抗原結合蛋白の形成をさせるに充分な時間および方法で同時発現させ；そして、
（ｂ） 該抗原結合蛋白を回収する、
ことを含む、抗原結合蛋白を製造する方法。 - 前記組み立て物が同じＤＮＡ発現ベクター上にある、請求項６４に記載の方法。
- 前記組み立て物が異なるＤＮＡ発現ベクター上にある、請求項６４に記載の方法。
- 前記宿主細胞が細菌細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞である、請求項６４に記載の方法。
- 前記抗原結合蛋白が宿主細胞から分泌される、請求項６４に記載の方法。
- 細胞を、前記該レセプターの活性化を中和するに充分な量の請求項１に記載の抗原結合蛋白で処理することを含む、ＶＥＧＦレセプターの活性化を中和する方法。
- 前記抗原結合部位のうち少なくとも１個がＫＤＲに特異的である、請求項６９に記載の方法。
- 前記抗原結合部位のうち少なくとも１個がＦＬＴ１に特異的である、請求項６９に記載の方法。
- 細胞を、腫瘍の増殖を低下させるに充分な量の請求項１に記載の抗原結合蛋白で処理することを含み、ここで前記抗原結合部位のうち少なくとも１個はＶＥＧＦレセプターに特異的である、腫瘍の増殖を低下させる方法。
- 前記抗原結合部位のうち少なくとも１個がＫＤＲに特異的である、請求項７２に記載の方法。
- 前記抗原結合部位のうち少なくとも１個がＦＬＴ１に特異的である、請求項７２に記載の方法。
- 細胞を、血管新生を阻害するに充分な量の請求項１に記載の抗原結合蛋白で処理することを含み、ここで抗原結合部位のうち少なくとも１個はＶＥＧＦレセプターに特異的である、血管新生を阻害する方法。
- 前記抗原結合部位のうち少なくとも１個がＫＤＲに特異的である、請求項７５に記載の方法。
- 前記抗原結合部位のうち少なくとも１個がＦＬＴ１に特異的である、請求項７５に記載の方法。
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