EA019595B1 - СПЕЦИФИЧНЫЕ ИНГИБИТОРЫ PDGFRβ - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к новым специфичным антагонистам PDGFRβ. Антагонисты включают антитела, которые могут иметь двойную специфичность. Антитела используют для замедления или прекращения роста опухоли и/или для лечения связанных с ростом сосудов заболеваний. Изобретение также включает комбинации специфичных антагонистов PDGFRβ с антагонистами VEGFR для такого лечения. Антагонисты также можно вводить в сочетании с другими антиангиогенными или противоопухолевыми лекарственными средствами.

Description

Данная заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки США № 60/923979, поданной 17 апреля 2007 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Область техники

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для ингибирования ангиогенеза и роста опухоли. Изобретение демонстрирует влияние специфичного ингибирования бета-рецептора тромбоцитарного фактора роста (ΡΌΟΡΡβ) на ангиогенез и обеспечивает лечение ангиогенеза с использованием специфичных антагонистов ΡΌΟΡΡβ, отдельно или в сочетании с ингибиторами рецептора УБОР. Специфичными ингибиторами могут быть антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител. Далее, ингибиторы могут иметь двойную специфичность.

Уровень техники

Тромбоцитарные факторы роста (ΡΌΟΡ) представляют собой семейство эффективных митогенов для почти всех клеток, полученных из мезенхимы. Существует четыре изоформы ΡΌΟΡ: А, В, С и Ό, которые образуют пять различных димерных соединенных дисульфидными связями белков ΡΌΟΡ: АА, ВВ, АВ, СС и ΌΌ. Эти факторы роста реализуют свои клеточные эффекты через два структурно близких друг другу рецептора тирозинкиназы: рецептор ΡΌΟΡ α (ΡΌΟΡΡα) и рецептор ΡΌΟΡ β (ΡΌΟΡΡβ) (8аибу, Ι.Ρ., 1998, Вг. I. 0г11юб. 25:269-74; ΒοίδΗοΙίζ С. е1 а1., 2001, Вюеббауз 23:494-507).

Рецепторы ΡΌΟΡΡα и ΡΌΟΡΡβ структурно сходны и могут образовывать гетеродимеры, а также гомодимеры. Рецепторы ΡΌΟΡ-ВВ и ΡΌΟΡ-ΌΌ являются первичными активаторами для ββ гомодимерных рецепторов. ΡΌΟΡ-АА активирует только димеры рецепторов αα, в то время как ΡΌΟΡ-АВ, ΡΌΟΡВВ и ΡΌΟΡ-СС активируют и димеры рецепторов αβ. Молекулы димерных лигандов связываются с двумя белками-рецепторами одновременно и вызывают димеризацию рецептора, автофосфорилирование специфичных остатков в пределах цитоплазматического домена рецептора и внутриклеточную передачу сигнала. В итоге, активация сигнального пути ΡΌΟΡΡβ индуцирует различные клеточные ответы, включая пролиферацию и миграцию клеток.

Полагают, что ангиогенез необходим как для роста опухоли, так и для метастазирования. Развитие системы сосудов или васкулогенез включает сборку двух главных типов клеток: клеток эндотелия (КЭ) и перицитов/гладкомышечных клеток сосуда (ГМК) в зрелые кровеносные сосуды. Участие сигнального пути ΡΟΟΕ^/ΡΟΟΕ^)! в васкулогенезе подтверждено на мышах с нокаутом ΡΌΟΡ-В и ΡΌΟΡΡβ. Фенотипы нокаута ΡΌΟΡ-В и ΡΌΟΡΡβ фактически идентичны в том отношении, что у мышей наблюдают кровотечения из-за уменьшения покрытия перицитами и гладкомышечными клетками в сосудах. Исследования показали, что ΡΌΟΡΡβ участвует в привлечении перицитов в капилляры и развитие в сосудах гладкомышечных клеток. Привлечение перицитов для покрытия молодого сосуда важно для его стабилизации и дальнейшего создания сосудистой сети. Сосуды без достаточного покрытия перицитами более уязвимы к ингибированию УБОР, чем хорошо развитые зрелые сосуды.

Оказалось, что множество ингибиторов тирозинкиназ, разработанных в качестве противоопухолевых препаратов, ингибируют ΡΌΟΡΡβ. Тем не менее, по меньшей мере, эти соединения имеют множественные тирозинкиназы-мишени. Например, иматиниб мезилат (О1ееуее®/8Т571) был разработан в качестве ингибитора тирозинкиназы АЬеИои (АЫ), но также ингибирует с-кй, ΡΌΟΡΡα и ΡΌΟΡΡβ. Сунитиниб малат (8и1еи®1/8Ш1248) является перорально применимым ингибитором тирозинкиназ широкого спектра с активностью против УБОРК, ΡΌΟΡΡ, с-кй и РБТ-3. СР 673,451 является ингибитором как ΡΌΟΡΡα, так и ΡΌΟΡΡβ. Поскольку эти небольшие молекулы-антагонисты не являются специфичными в отношении этих рецепторов, представляется невозможным различить вклад сигнала от ΡΌΟΡΡβ в ангиогенез, включая связанный с опухолями ангиогенез, стимуляцию и рост опухоли, или токсичность, связанную с введением таких соединений, которая может являться следствием нежелательного действия многочисленных рецепторов.

Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает специфичные антагонисты ΡΌΟΡΡβ, демонстрирующие роль ΡΌΟΡΡβ в ангиогенезе, включая ангиогенез, который поддерживает рост и выживание опухоли, и обеспечивает способы лечения опухолей и ангиогенных заболеваний. Изобретение также демонстрирует преимущество одновременного ингибирования передачи сигнала через ΡΌΟΡΡβ и УЕОРР.

Краткое описание изобретения

Изобретение обеспечивает специфичный к ΡΌΟΡΡβ антагонист передачи сигнала с участием ΡΌΟΡΡβ. В одном варианте реализации изобретения, специфичный антагонист ΡΌΟΡΡβ является антителом, которое специфично связывает β рецептор тромбоцитарного фактора роста (ΡΌΟΡΡβ). Каждое такое антитело имеет гипервариабельные участки, которые по меньшей мере примерно на 90% гомологичны или примерно на 90% идентичны 8ЕО ΙΌ N0:20 в участке ί.’ΌΡΗ1; 8ЕО ΙΌ N0:22 в участке С1Ж112; 8ЕО ΙΌ N0:24 в участке С^ΡΗ3; 8ЕО ΙΌ N0:28 в участке С^Ρ^1; 8ЕО ΙΌ N0:30 в участке ί.’ΌΡΕ2; и 8Е0 ΙΌ N0:32 в участке ί.’ΌΡΕ·3. Другое подобное антитело включает последовательность аминокислот вариабельного домена (вариабельной области) тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0:18 и последовательность аминокислот вариабельного домена легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0:26. В другом варианте реализации

- 1 019595 такое антитело имеет гипервариабельные участки, которые по меньшей мере примерно на 90% гомологичны ЗЕО ГО N0:4 в участке ΟΌΚΗ1; ЗЕО ГО N0:6 в участке ΟΌΚΗ2; ЗЕО ГО N0:8 в участке 0ΌΚΗ3; ЗЕО ГО N0:12 в участке СГОРБЕ ЗЕО ГО N0:14 в участке СОКБ2; и ЗЕО ГО N0:16 в участке С0ВБ3. Другое такое антитело включает последовательность аминокислот вариабельного домена тяжелой цепи ЗЕО ГО N0:2 и последовательность аминокислот вариабельного домена легкой цепи ЗЕО ГО N0:10. Изобретение также включает специфическое к ΡΌΟΡΡβ антитело, которое связывает тот же или перекрывающийся эпитоп, что и одно из вышеупомянутых антител.

Антитела настоящего изобретения могут быть химерными, гуманизированными или антителами человека. Антитела настоящего изобретения могут также быть антиген-связывающими фрагментами, такими как одноцепочечные антитела, РаЬ и Р(аЬ')2 фрагменты, одноцепочечные Ρν§ и однодоменные антитела. Антитела также включают двойные (ЛаЬоЛек) и тройные антитела ЦпаЬоФеЦ. Кроме того, антитела могут иметь двойную специфичность.

Изобретение далее обеспечивает изолированные полинуклеотиды, которые кодируют такие антитела, векторы экспрессии и клетки-хозяева, продуцирующие антитела.

Изобретение обеспечивает способ модуляции активности β-рецептора тромбоцитарного фактора роста (ΡΌΟΡΡβ) у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества специфичного антагониста ΡΌΟΡΡβ. В одном варианте реализации изобретения эффективное количество специфичного антагониста ΡΌΟΡΚβ используют для ингибирования ангиогенеза у млекопитающего. В другом варианте реализации эффективное количество специфичного антагониста ΡΌΟΡΚβ используют для уменьшения роста опухоли у млекопитающего. Специфичный антагонист ΡΌΟΡΚβ может являться антителом, которое связывает ΡΌΟΡΚβ или любое другое вещество, которое связывает ΡΌΟΡΚβ или лиганд ΡΌΟΡΚβ и уменьшает или блокирует обеспечиваемую ΡΌΟΡΚβ передачу сигнала. Способы лечения далее могут включать совместное введение с антагонистом νΞΟΡΚ. Кроме того, способы лечения могут включать вещество, которое одновременно является ΡΌΟΡΚβ специфичным антагонистом и антагонистом νΈΟΡΚ, такое как антитело с двойной специфичностью.

В соответствии с настоящим изобретением лечение опухолей и состояний, связанных с ангиогенезом, может далее включать введение антинеопластического средства, например химиопрепарата или облучения.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показано количественное связывание рецептора и тест на блокирование для антитела к ΡΌΟΡΚβ 1В3. (А) Очищенные ΡаЬ-фрагменты или полноразмерный 1В3 1дО добавляли в планшеты, покрытые ιηΡΌΟΡΡβ/Ρο (1 мкг/мл), и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Связавшиеся с планшетом антитела детектировали с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена антител козы к антителам человека. (В) Антитело 1В3 или ΡаЬ сначала смешивали с фиксированным количеством ιηΡΌΟΡΡβ/Ρο (50 нг) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Смесь затем переносили в планшет, покрытый ΡΌΟΡ-ΒΒ (0,5 мкг/мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Связавшиеся с планшетом ιηΡΌΟΡΡβ/Ρο детектировали с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена антител козы к Ρο-фрагментам человека. Антитело 1МС-1121 является антителом к νΡΟΡΡ2 человека. Данные представляют средние значения со стандартным отклонением для трех повторностей.

На фиг. 2 показано ингибирование индуцированного ΡΌΟΡ-ΒΒ фосфорилирования рецептора и следующих за ним сигнальных молекул МАРК и Ак1, возникающее вследствие связывания антитела 1В3 с ΡΌΟΡΚβ поверхности клетки. (А) Анализ с помощью проточной цитометрии клеток N14/373 (фибробласты), Ό122 (легочная карцинома Льюиса), 4Т1 (рак груди), В16 (меланома) и Η5ν (ΡтТтрансформированные клетки эндотелия), инкубированных с антителами 1В3 к ΡΌΟΡΚβ и конъюгированными с ΡIΤС антителами к Ρο человека. (В) Ингибирование индуцируемого ΡΌΟΡ-ΒΒ фосфорилирования рецептора в клетках ХЩ-3Т3. (С) Ингибирование индуцируемого ΡΌΟΡ-ΒΒ фосфорилирования рецептора в клетках Ό122. (Ό) Ингибирование индуцируемого ΡΌΟΡ-ΒΒ фосфорилирования АКТ и р44/42 ΜΑΡ киназы в клетках Ό122.

Фиг. 3 демонстрирует влияние обработки антителом 1В3 к ιηΡΌΟΡΡβ на рост ксенографтных опухолей человека ίη νίνο. Шесть ксенографтных моделей, ЗΚ-0V-3, 0У-САВ-8, ВхРС-3, 0У-САВ-5, Сак1-1 и NСI-Η460 (от А до Ρ, соответственно) использовали для изучения влияния действия 1В3 на ксенографтные опухоли у безтимусных (голых) мышей. Мышей с развитыми опухолями (-250-300 мм³) произвольно делили на группы и обрабатывали 1В3, нормальным 1дО человека или солевым раствором путем внутрибрюшинной инъекции дважды в неделю (за исключением модели ВхРС-3, в которой мышей обрабатывали три раза в неделю) в указанной дозировке. Объемы опухолей измеряли дважды в неделю и представляли в виде среднего ± стандартное отклонение. *1 показывает потерю одной мыши из-за острого течения заболевания. Антитело 1В3 связывает ΡΌΟΡΒβ мыши, но не человека. Соответственно, наблюдаемые ответы на обработку являются результатом ингибирования стимулирования клеток-хозяев.

Фиг. 4 демонстрирует влияние комбинированной обработки антителом 1В3 (к ιηΡΌΟΡΡβ) и антителом ОС 101 (к ιηνΡΟΡΡΣ) на рост ксенографтных опухолей человека ίη νίνο. Подкожные ксенографты

- 2 019595

ВхРС-3 (А) или 5х10⁶ ΝΟΙ-Η460 (В) пересадили самкам безтимусных мышей (пи/пи). Когда опухоли достигали ~300-350 мм³, мышей перемешивали, произвольно делили на четыре группы (п=12) и вводили солевой раствор (фармакопея США), 40 мг/кг 1В3, 40 мг/кг ШС101 или 40 мг/кг 1В3 плюс 40 мг/кг ΌΟ101, три раза в неделю. Объемы опухолей измеряли дважды в неделю и представляли в виде среднего ± стандартное отклонение. *1 показывает гибель одной мыши вследствие острого течения заболевания. Антитело 1В3 связывает ΡΌΟΡΚβ мыши, но не человека. Соответственно, наблюдаемые ответы на обработку являются результатом ингибирования стимулирования клеток-хозяев.

Фиг. 5 представляет результаты иммуногистохимического анализа ксенографтов человека после обработки 1В3, ΌΟ101 или ΌΟ101 плюс 1В3. На 34-й день после обработки (модель ВхРС3, панель от А до С) или 50-й (модель ΝΟΙ-Η460, панель от Ό до Ρ) умерщвляли шесть мышей из каждой группы и обрабатывали опухоли с помощью ИГХ-анализа. Опухоли препарировали и дважды окрашивали на кровеносные сосуды (антитела к ΟΌ31), и на перициты/покрытие ГМК (α-8ΜΑ, панели В и Е). Для каждого среза делали пять цифровых иммунофлюоресцентных снимков периферии и сердцевины опухоли и подсчитывали общую долю ΟΌ31⁺-сосудов (панели А и Ό), α-δΜΛ'-сосудов (панели В и Е) и процент двойных ΟΌ31⁺/α-8ΜΑ⁺ среди общего числа СО31⁺ сосудов (панели С и Р). Для измерения степени васкуляризации отдельных срезов опухоли использовали два разных количественных способа: плотность сосудов (число сосудов/мм³) и процент площади сосудов (% площади сосудов в общей площади опухоли). Для статистического анализа использовали двухпараметрический дисперсный анализ и критерий наименьшей значимой разности Фишера для множественных сравнений (программное обеспечение 81дша 81а1 3,1 8уз1а1 8ой^аге, 1пс., Ροίηΐ Шсйтопб, СА). *Ρ<0,05 по сравнению с группой солевого раствора. Белые столбики - периферия опухоли; закрашенные столбики - сердцевина опухоли.

На фиг. 6 показано связывание с рецептором блокирования и лиганда (ΡΌΟΡ-ΒΒ) специфичным 2С5 антителом человека относительно ΡΌΟΡΚβ человека и ΡΌΟΡΚβ мыши. Связывание и блокирование лиганда сопоставляли со специфичным к ΡΌΟΡΚβ антителом 1ВЗ, которое связывает только ΡΌΟΡΚβ мыши.

На фиг. 7 представлен Вестерн-блот, демонстрирующий ингибирование индуцированного лигандом (ΡΌΟΡ-ΒΒ) фосфорилирования ΡΌΟΡΚβ в клетках опухоли человека Сак1-1 антителом к ΡΌΟΡΚβ 2С5. Антитело также подавляет фосфорилирование Ак1 и Р44/42.

На фиг. 8 представлен Вестерн-блот, демонстрирующий ингибирование индуцированного лигандом (ΡΌΟΡ-ΒΒ) фосфорилирования ΡΌΟΡΚβ в клетках мыши линий ΝΙΗ-3Τ3 и Ό122 антителом к ΡΌΟΡΚβ 2С5.

На фиг. 9 представлен рост шести подкожных ксенографных опухолей человека у голых мышей, получавших антитело к ΡΌΟΡΚβ 1В3 (специфическое для ΡΌΟΡΚβ мыши) и/или 2С5 (которое связывает ΡΌΟΡΚβ как мыши, так и человека).

На фиг. 10 представлен рост шести подкожных ксенографных опухолей человека у голых мышей, получавших антитело к ΡΌΟΡΚβ 2С5 (которое связывает ΡΌΟΡΚβ как мыши, так и человека) и специфическое антитело к νΕΟΡΚ-2 мыши (ОС101).

На фиг. 11 показаны результаты теста на миграцию клеток, демонстрирующие, что 2С5 подавляет стимулируемую ΡΌΟΡ-ΒΒ миграцию клеток.

На фиг. 12 представлена противоопухолевая активность сочетаний 2С5/химиотерапия и 2С5/химиотерапия/терапия ШС101 на модели ксенографной опухоли.

На фиг. 13 показана противоопухолевая активность терапии сочетаниями 2С5/3Ο3 и 2С5/1Е10 на модели ксенографной опухоли.

Фиг. 14 демонстрирует влияние 2С5 на экспрессию ΡΌΟΡΚβ, ΡΌΟΡ-ΒΒ, νΕΟΡ и ΡΟΡ.

Фиг. 15 демонстрирует связывание 2С5 с доменом ΡΌΟΡΚβ.

На фиг. 16 показаны последовательности ДНК и аминокислот вариабельной тяжелой и вариабельной легкой цепей 1В3, где подчеркнуты участки ΟΌΚ.

На фиг. 17 показаны последовательности ДНК и аминокислот вариабельной тяжелой и вариабельной легкой цепей 2С5, где подчеркнуты участки ΟΌΚ.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает антитела или их фрагменты, которые являются специфичными в отношении ΡΌΟΡΚβ. Антитела согласно настоящему изобретению включают антитела, которые специфично связывают домены 1 и 2 ΡΌΟΡΚβ. Антитела согласно настоящему изобретению включают 2С5 и 1В3.

Настоящее изобретение также обеспечивает композиции и способы лечения опухолей и ангиогенных заболеваний указанными описанными антителами и антагонистами ΡΌΟΡΚβ в сочетании с антагонистами νΕΟΡΚ. В частности, изобретение обеспечивает специфическое использование сигнального пути ΡΌΟΡ-Β/ΡΌΟΡΚβ для терапии рака с помощью противоопухолевых и антиангиогенных механизмов. Также изобретение обеспечивает терапию ангиогенных заболеваний.

Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает антагонисты рецептора тромбоцитарного

- 3 019595 фактора роста (ΡΌΟΡΚβ), которые обладают специфичностью к ΡΌΟΡΚβ. Специфичные антагонисты ΡΌΟΡΚβ являются биологическими молекулами, которые ингибируют преимущественно опосредуемую ΡΌΟΡΚβ передачу сигнала. В соответствии с настоящим изобретением специфичные антагонисты ΡΌΟΡΚβ подавляют опосредуемую ΡΌΟΡΚβ передачу сигнала по меньшей мере в 3, или по меньшей мере в 5, или по меньшей мере в 10 раз сильнее, чем опосредуемую ΡΌΟΡΚα. Один способ определения специфичного ингибирования ΡΌΟΡΚβ состоит в сравнении ингибирования индуцированной ΡΌΟΡ активации созданных для экспрессии ΡΌΟΡΚβ, но не ΡΌΟΡΚα клеток, с ингибированием индуцированной ΡΌΟΡ активации клеток, созданных для экспрессии ΡΌΟΡΚα, но не ΡΌΟΡΚβ. Другой способ состоит в том, чтобы сравнивать ингибирование индуцированной активации ΡΌΟΡ путем использования ΡΌΟΡ, который преимущественно активирует ΡΌΟΡΚβ (например, ΡΌΟΡ-ΌΌ) и ΡΌΟΡ, который преимущественно активирует ΡΌΟΡΚβ (например, ΡΌΟΡ-АА). В одном варианте реализации изобретения специфичный антагонист ΡΌΟΡΚβ является антителом, которое связывает ΡΌΟΡΚβ. В другом варианте реализации изобретения специфичный антагонист ΡΌΟΡΚβ является небольшой молекулой.

Подход к подавлению ангиогенеза, направленный на рецепторы УБОР, постепенно принимается в качестве эффективного при противоопухолевой терапии. Например, антитела к УБОР показаны для лечения определенных опухолей. Далее, антитела мыши к УЕОРК2 блокируют взаимодействие УЕОР/УЕОРВ2 и ингибируют стимулируемую УБОР пролиферацию и выживание клеток сосудов эндотелия у мышей в ксенографной модели. Тем не менее, по меньшей мере, хотя обработка антителом к УЕОРК2 приводила к значимой задержке роста ряда трансплантатов опухолей мышей, регрессия опухоли была редкой. Кроме того, существуют накапливаемые свидетельства, подтверждающие, что некоторые опухоли могут становиться менее чувствительными (или даже приобретать устойчивость) к блокированию УЕОРК2 в течение длительных периодов обработки.

В соответствии с изобретением специфическое ингибирование ΡΌΟΡΚβ значительно повышает как антиангиогенную, так и противоопухолевую активность антагониста УЕОРК Соответственно настоящее изобретение обеспечивает улучшенные способы ингибирования ангиогенеза и снижения или ингибирования роста опухоли путем введения специфичного антагониста ΡΌΟΡΚβ и, возможно, антагониста УЕОРК Антагонисты являются молекулами, которые блокируют, модулируют или препятствуют передаче сигнала, опосредуемого рецептором тирозинкиназы (то есть, ΡΌΟΡΚβ или УЕОРК) и включают, но не ограничиваются, антитела, небольшие молекулы, белки, полипептиды, миметики лигандов, антисмысловые олигодезоксинуклеотиды, антисмысловые РНК, небольшие ингибирующие РНК, образующие тройную спираль нуклеиновые кислоты, доминантные негативные мутации и экспрессию растворимых рецепторов. Кроме того, специфичные антагонисты ΡΌΟΡΚβ и антагонисты УЕОРК можно объединить в единственное соединение, такое как, но без ограничения, антитело с двойной специфичностью.

Рецепторы УЕОР и ΡΌΟΡΚβ относятся к одному и тому же семейству содержащих внутренние киназные домены рецепторов. Однако рецепторы УЕОР имеют семь иммуноглобулин-подобных петель в их экстраклеточных доменах, по сравнению с пятью в ΡΌΟΡΚα и ΡΌΟΡΚβ. Также, рецепторы УЕОР имеют более крупный киназный участок. Последовательности аминокислот ΡΌΟΡΚβ и ΥΞΟΡΚ человека и других млекопитающих, и последовательности нуклеиновых кислот, которые их кодируют, хорошо известны в данной области техники. Последовательности не ограничивающего примера ΡΌΟΡΚβ человека даны под номером доступа ОепВапк ΝΜ_002609. Последовательность нуклеотидов кодирует белок, имеющий отрезаемую сигнальную последовательность. Готовый белок содержит экстраклеточную часть, содержащую примерно 499 аминокислот, 23 аминокислоты в трансмембранном участке и внутриклеточную часть примерно 552 аминокислот. Не ограничивающие примеры последовательностей ΥΞΟΡΚ включают ΝΜ 002019 (УЕОРЮ/ИН человека), ΝΜ_002253 (ΥΒΟΡΚΙ/ΚΌΚ/ΡΙΜ человека) и ΝΜ_182925 (^ΕΟΡ^/ΕΜ человека). Структуры 1д подобного домена экстраклеточных доменов, положение трансмембранных доменов и внутриклеточные домены, включая тирозинкиназные домены для каждого из этих рецепторов, хорошо известны в данной области техники.

Антитела согласно настоящему изобретению связывают ΡΌΟΡΚβ. В настоящей заявке термин антитело относится к молекулам иммуноглобулинов (1д) и иммунологически активным частям или вариантам молекул иммуноглобулинов. Антитела содержат один или более антиген-связывающих сайтов, которые специфично связываются с антигеном. Антитела включают, но не ограничиваются, поликлональные, моноклональные, химерные и гуманизированные антитела. Иммунологически активные части включают моновалентные и бивалентные фрагменты, такие как Ρν, одноцепочечный Ρν (κεΡν), одиночный вариабельный домен (§УО), РаЬ, РаЬ' и Р(аЬ')₂ фрагменты. Иммунологически активные части могут входить в состав мультивалентных антител, например, двойных, тройных и так далее. Антитела далее включают антиген-связывающие фрагменты после фагового дисплея и конъюгаты антител.

Изолированное (выделенное) антитело представляет собой антитело, которое (1) частично, в значительной степени или полностью было очищено от смеси компонентов; (2) было идентифицировано и отделено и/или восстановлено от компонента своей естественной среды; (3) является моноклональным; (4) свободно от других белков того же вида; (5) экспрессируется в клетке другого вида; или (6) не суще

- 4 019595 ствует в природе. Загрязняющие компоненты естественной среды являются материалами, которые могут создавать помехи диагностическому или терапевтическому использованию антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или не белковые растворимые вещества. Примеры изолированных антител включают антитело к ΡΌΟΕΚβ, получаемое в ходе аффинной очистки с использованием ΡΌΟΡΚβ, антитело к ΡΌΟΡΚβ, которое получено с помощью гибридомы или другой клеточной линии ίη νίίτο, антитело к ΡΌΟΡΚβ человека, выделенное из библиотеки, такой как фаговая библиотека, и антитело к ΡΌΟΡΚβ человека, наработанное в трансгенной мыши.

В общих чертах, молекулы антител природного происхождения образованы двумя идентичными тяжелыми цепями и двумя легкими цепями. Каждая легкая цепь обычно ковалентно связана с тяжелой цепью межцепочечной дисульфидной связью, две тяжелые цепи затем связаны друг с другом многочисленными дисульфидными связями в области петли. Отдельные цепи сложены в домены, имеющие сходные размеры (около 110-125 аминокислот) и структуры, но различные функции. Легкая цепь содержит один вариабельный домен (У_ъ) и один константный домен (С_ъ). Тяжелая цепь содержит один вариабельный домен (ν_Η) и, В зависимости от класса или изотипа антитела, три или четыре константных домена (С_н1, С_н2, С_н3 и С_н4). У человека и мышей изотипы представляют собой 1дА, Ι§Ό, 1дЕ, 1дС и 1дМ, причем 1дА и 1дО далее разделяются на подклассы или подтипы. Часть антитела, состоящая из Ун и областей ν_Η, обозначается Εν и составляет антиген-связывающий сайт. Одноцепочечный Εν (κοΕν) представляет собой искусственный белок, содержащий домен VI, и домен ν_Η в одной полипептидной цепи, в которой Ν-конец одного домена и С-конец другого домен соединены гибким линкером. ЕаЬ относится к части антитела, состоящей из ν,-С'|, (то есть, легкой цепи) и ν_ΗΥ_Η1 (также называемой Гб).

Антитела изобретения включают одиночные вариабельные домены (кУЭ) и связывающие антиген белки, которые включают кУЭ. Связывающие сайты кУО можно получить из антигенспецифичных участков Εν (которые включают как ν_Η, так и Уу домены). Часто может быть показано, что аффинность связывания и специфичность участка Εν первоначально содействует одному из вариабельных доменов. Кроме того, 5θΡν можно получать напрямую. Прямые источники §УЭ включают млекопитающих (например, мозоленогих), которые в природе экспрессируют антитела, содержащие только ν_Η домен. Далее, для экспрессии только одиночных вариабельных доменов можно создать библиотеки фагового дисплея. Например, библиотеку фагового дисплея доменов антител человека, коммерчески доступную от Эотапίΐδ (С’атЬпбдс. ИК).

Вариабельные домены антитела показывают значительную вариабельность последовательности аминокислот между антителами, особенно в пределах антиген-связывающего сайта. Три области, называемые определяющими комплементарность участками (СОЯ), обнаружены в каждом домене У_ъ и ν_Η. Участки СОЯ антитела также часто называют гипервариабельными участками.

Ес обозначает часть антитела, которая включает спаренные константные домены тяжелых цепей. В антителе 1дС1, например, Ес включает домены и С^. Фрагмент Ес антитела 1дА или 1дМ, кроме того, включает домен С^. Фрагмент Ес связан со связыванием рецептора Ес, активацией цитотоксического действия комплемента и клеточной цитотоксичностью, вызываемой антителами. Для природных антител, таких как 1дА и 1дМ, которые представляют собой комплексы нескольких 1дО-подобных белков, образование комплекса требует константных доменов Ес.

Наконец, участок петли разделяет части антитела ЕаЬ и Ес, обеспечивая мобильность ЕаЬ друг относительно друга и относительно Ес, а также множественные дисульфидные связи для ковалентного связывания двух тяжелых цепей. Таким образом, антитела согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются, антитела природного происхождения, двухвалентные фрагменты, например (ЕаЬ')₂, моновалентные фрагменты, такие как ЕаЬ, одноцепочечные антитела, одноцепочечные Εν (хсЕу), однодоменные антитела, мультивалентные одноцепочечные антитела, двойные, тройные и так далее антитела, которые специфично связывают антигены. Фрагменты антитела также включают полипептиды с последовательностями аминокислот, в значительной степени сходными с последовательностями аминокислот вариабельного или гипервариабельного участков антител согласно настоящему изобретению. В значительной степени сходная последовательность аминокислот определена в настоящей заявке как последовательность с по меньшей мере 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95% или по меньшей мере примерно 99% гомологии или идентичности со сравниваемой последовательностью аминокислот, как определяют с помощью метода поиска ЕА8ТА в соответствии с ΡοηΐΈοη апб Ь1ртап, Ργο^ Νηΐΐ. Асаб. 8сг И8А 85:2444-2448 (1988).

Изобретение включает химерные антитела. Такие антитела обычно включают вариабельные домены одного антитела и константные домены другого антитела. Обычно для минимизации иммунного ответа хозяина против антитела и усиления ответа хозяина против мишени антитела с сохранением эффекторной функции антитела, константные домены химерного антитела берут из того же вида, которому будут вводить химерные антитела.

Изобретение также охватывает гуманизированные антитела. Гуманизированные вариабельные домены созданы таким образом, что последовательности аминокислот, которые включают один или более гипервариабельных участков (СОЯ), взятых не у человека, перенесены на каркасные участки челове

- 5 019595 ка (ЕВ). Пример можно найти в: 1опе5, Р. Т. е! а1., 1996, Ыа!иге 321, 522-25; Ктесйтаи, Ь. е! а1., 1988, ЫаШге 332, 323-27; и патенте США № 5530101 автор Онееп е! а1. Гуманизированные конструкции особенно ценны для устранения неблагоприятных иммуногенных свойств, например, в случае, если для использования в лечении человека желателен антиген-связывающий домен, взятый не от человека. Вариабельные домены имеют высокую степень структурной гомологии, что позволяет легко идентифицировать аминокислотные остатки в пределах вариабельных доменов, которые соответствуют СЭВ (гипервариабельным участкам) и ЕВ (каркасным участкам). См., например, КаЬа! Е.А., е! а1., 1991, 8ес.|иепсе5 οί Рго!еш8 οί 1ттцпо1одюа1 1п1еге51. 51й еб. Νηΐίοηηΐ Сеп!ег ίοτ Вю1ес1то1оду ΙηίοπηηΙίοη. Νηΐίοηηΐ 1п81йи1е8 οί НеаИй, ВеШеШа. ΜΌ. Таким образом, легко выявить аминокислоты, которые, вероятно, непосредственно участвуют в связывании антигена. Кроме того, были разработаны способы сохранения или повышения аффинности к антигену гуманизированных связывающих доменов, содержащих перенесенные СЭВ. Один путь состоит в том, чтобы включить в вариабельный домен реципиента чужеродные каркасные аминокислоты, которые влияют на конформацию гипервариабельного участка. Второй путь состоит в том, чтобы переносить чужеродные СЭВ на вариабельные домены человека с наибольшей гомологией чужеродному вариабельному участку. Онееп, С. е! а1., 1989, Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 86, 10029-33. Гипервариабельные участки наиболее легко переносить на другой ЕВ путем, во-первых, амплификации отдельных последовательностей ЕВ с использованием перекрывающихся праймеров, которые включают желаемые последовательности гипервариабельных участков, и соединения полученных сегментов гена в последующей реакции амплификации. Перенос гипервариабельного участка в другой вариабельный домен может далее включать замещение аминокислотных остатков, которые примыкают к гипервариабельному участку в последовательности аминокислот или расположены напротив гипервариабельного участка в структуре сложенного вариабельного домена, на которую влияет конформация гипервариабельного участка. Гуманизированные вариабельные домены изобретения, следовательно, включают домены человека, которые включают один или более гипервариабельных участков не человека, а также такие домены, в которых сделаны дополнительные замещения или замены для сохранения или повышения характеристик связывания.

Антитело согласно настоящему изобретению также может содержать вариабельные домены, которые сделаны менее иммуногенными путем замещения экспонированных на поверхности остатков таким образом, чтобы антитело казалось иммунной системе своим (Раб1ап Е.А., 1991, Μο1. 1ттипо1. 28, 48998). Этот процесс модифицирует антитела без потери аффинности (Водикка е! а1., 1994, Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 91, 969-973). Поскольку внутренняя упаковка аминокислотных остатков вблизи от антигенсвязывающего сайта остается неизменной, аффинность сохраняется. Замещение экспонированных на поверхности остатков с целью снижения иммуногенности в соответствии с изобретением не означает замещение остатков СЭВ или смежных остатков, которые повлияют на характеристики связывания.

Часто предпочтительным является применение вариабельных доменов, которые, по существу, принадлежат человеку. Антитела человека включают области каркаса человека У_Н и У_ъ (ЕУ), а также гипервариабельные участки человека (СЭВ). Предпочтительно вариабельные домены У_Н и У_ъ полностью принадлежат человеку или являются производными последовательностей человека. Антитела можно получать непосредственно из клеток человека, например, путем создания гибридом человека.

Кроме того, антитела человека можно получать из трансгенных животных, в которых введены сегменты гена 1д человека без перестроек и в котором инактивированы гены 1д мыши (см. Вгиддетапп апб Таи881д, 1997, Сигг. Орт. Вю1ес1то1. 8, 455-58). Предпочтительные трансгенные животные содержат очень большие непрерывные фрагменты гена 1д, которые по величине превышают 1 млн п.н. (Менбех е! а1., 1997, ЫаШге Сепе!. 15, 146-56), но моноклональные антитела человека с умеренной аффинностью можно получить из трансгенных животных, содержащих меньшие локусы этого гена (см., например, Уадпег е! а1., 1994, Еиг. ί. 1ттипо1. 42, 2672-81; Сгееп е! а1., 1994, №11иге Сепе!. 7, 13-21).

Антитела человека также можно получить из библиотек доменов У_Н и/или У_ъ антител. Например, библиотеку вариабельных доменов можно получить на основе геномных последовательностей человека или из лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих продуктивно процессированные гены вариабельных доменов. Кроме того, библиотека генов человека может быть синтетической. В одном варианте реализации можно сконструировать библиотеку вариабельных доменов, которая включает области каркаса от человека с одним или более СЭВ, которые синтезируют включающими произвольные или частично произвольные последовательности. Например, можно создать библиотеку вариабельных доменов У_Н человека, в котором участники кодируются У_Н сегментом гена человека и синтетической последовательностью для участка СЭВ3Н (то есть, синтетическим сегментом гена Э_Н-1_Н). Подобным образом, вариабельный домен человека У_ъ может кодироваться сегментом гена У_ъ человека и синтетической последовательностью для участка СЭВ3Е (то есть, синтетическим сегментом гена Е.). В другом варианте реализации каркас человека может быть синтетическим, в котором присутствует консенсусная последовательность, производная известных последовательностей антител человека или подгрупп последовательностей человека. В другом случае один или более СЭВ получают с помощью амплификации из лимфоцитов человека, экспрессирующих перестроенные вариабельные домены и затем проводят рекомбинацию с конкретным каркасом антитела человека.

- 6 019595

Для скрининга библиотеки вариабельных доменов обычно применяют библиотеки фагового дисплея, в которых сочетания вариабельных доменов тяжелых и легких цепей человека экспонированы на поверхности филаментозного бактериофага (смотри, например, МсСаГГеПу с1 а1., 1990, Ыа1иге 348, 55254; Аи)ате е1 а1., 1997, Нитап ЛпбЬоФек 8, 155-68). Сочетания вариабельных доменов обычно экспонированы филаментозным фагом в форме ЕаЬ или кеЕу-фрагментов. Библиотеку анализируют в поисках бактериофага, несущего сочетания вариабельных доменов, имеющих желаемые характеристики связывания антигена. Предпочтительными являются одиночные домены и сочетания вариабельных доменов, показавшие высокое сродство к выбранному антигену и небольшую кроссреактивность к другим родственным антигенам. С помощью скрининга очень больших наборов фрагментов антител (смотри например, СпГП1115 е1 а1., 1994, ЕМВО I. 13, 3245-60) отбирают достаточное разнообразие высокоаффинных связывающих доменов, с ожидаемым множеством имеющих сродство к желаемому антигену в концентрациях менее наномоля.

В физиологическом иммунном ответе, мутации и селекция экспрессируемых генов антитела приводят к продукции антител, имеющих высокую аффинность для их антигена-мишени. Входящие в антитела согласно настоящему изобретению домены антител У_Н и У_ъ могут аналогично подвергнуться мутагенезу ίη νίίτο или ίη νίνο и процедуре скрининга для модификации аффинности и/или специфичности. Таким образом, связывающие домены согласно настоящему изобретению включают такие, для которых показатели связывания были улучшены мутациями СЭЯ и/или участков Е\У с помощью направленного мутагенеза, способов созревания аффинности или перемещения цепей. Понято, что аминокислотные остатки, которые являются первичными детерминантами связывания однодоменных антител, могут находиться в пределах, определенных по КаЬа1 СЭЯ, но также могут включать другие остатки. Для кУО важные для связи антигена остатки также могут потенциально включать аминокислоты, которые напротив располагаются на поверхности гетеродимера У_Н-Уь Обычно для скрининга таких мутаций и определения тех из них, которые имеют желаемые показатели связывания, используют фаговый дисплей (см., например, Уапд е1 а1., 1. Мо1. Вю1., 254: 392-403 (1995)). Мутации можно создавать с помощью ряда способов. Один способ состоит в том, чтобы перемешать отдельные остатки или сочетания остатков так, чтобы в популяции во всем остальном идентичных последовательностей в конкретных положениях находились все двадцать аминокислот или часть из них. Кроме того, мутации можно создавать среди остатков СЭЯ с помощью методов склонной к ошибкам ПЦР (см., например, На\\'кш5 е1 а1., 1. Мо1. Вю1., 226: 889-896 (1992)). Например, векторы для фагового дисплея, содержащие вариабельные участки генов тяжелой и легкой цепей, можно размножать в мутаторных штаммах Е. сой (см., например, Боте е1 а1., 1. Мо1. Вю1., 250: 359-368 (1996)). Эти способы мутагенеза иллюстрируются множеством способов, известных специалисту в данной области.

Изобретение также включает антиген-связывающие белки, сконструированные на основе не иммуноглобулинов. Например, антитела, производные иммуноглобулин-связывающего домена белка А стафиллококка 8. Аитеик, не имеют никаких дисульфидных связей и демонстрируют обратимый фолдинг. Другим примером является фибронектин, который имеет подобную антителу структуру и несет СЭЯподобные петли. В отличие от антитела, доменная структура фибронектина не основана на дисульфидных связях и в то же время показывает высокую термодинамическую устойчивость. В таких белкахосновах сайты связывания можно создавать, например, путем создания разнообразия кодонов в определенных положениях и скрининга на связывание с желаемым антигеном. Случайные кодоны можно использовать в петлях, поверхности белка, полости белка или сочетаниях таких положений. Далее, можно осуществлять встраивание внутрь последовательности пептидов, обычно внутрь петель. Связывающие мишень варианты можно выделять из полученных библиотек с использованием способов скрининга и селекции, которые хорошо известны в данной области техники, включающих, но не ограничивающихся, фаговый дисплей, рибосомальный дисплей, бактериальный или дрожжевой дисплей поверхности, и тому подобное.

Для антиген-связывающих белков, предназначенных для терапии, доступны различные стратегии для снижения потенциальной иммуногенности. Можно применять белки-основы человека и минимизировать иммуногенность, например, с помощью ПЭГилирования или изменения Т-клеточных эпитопов (то есть, минимизация числа последовательностей, вызывающих реакцию Т-клеток).

Антиген-связывающие белки на основе неиммуноглобулинов часто можно получать с меньшими затратами, чем белки иммуноглобулинового типа. Например, отсутствие дисульфидных связей или свободного цистеина позволяет осуществлять экспрессию функциональных молекул в восстанавливающей среде цитоплазмы бактерий, которая обычно дает больший выход продукта, чем экспрессия в периплазме, и более удобна, чем повторный фолдинг ίη νίΙΐΌ. Είηχ. Н.К. е1 а1. (Νηί. Вю1ес11. 23:1257-68, 2005) описывает ряд таких антиген-специфичных связывающих белков и способов их разработки.

Как было упомянуто ранее, для совместного введения в качестве альтернативы можно использовать антитело с двойной специфичностью. Существует ряд антител с двойной специфичностью, которые созданы для совмещения различных желаемых характеристик. Например, двойное антитело с двойной специфичностью имеет минимальный размер. Антитела с двойной специфичностью с четырьмя антигенсвязывающими сайтами (два для каждой специфичности связывания) имеют для каждой мишени такую

- 7 019595 же авидность связывания, как и соответствующие природные антитела. Некоторые антитела с двойной специфичностью содержат Ее-фрагменты, таким образом сохраняя эффекторные функции (например, комплемент-зависимую цитотоксичность (КЗЦ) и антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ)) естественных антител. \¥О 01/90192 описывает 1дС-подобные тетравалентные антитела. \¥О 2006/020258 описывает тетравалентные антитела, которые включают два двойных антитела и сохраняют эффекторные функции. Для антиген-связывающего сайта антител с двойной специфичностью можно применять ряд антиген-связывающих фрагментов антител. Они включают, но не ограничиваются, Εν, 5сЕу и δΥΌ.

Другими средствами блокирования передачи связанного с ΡΌΟΕΚβ сигнала являются специфичные небольшие молекулы ингибиторы ΡΌΟΕΚβ. Термин небольшая молекула относится к небольшим органическим соединениям, таким как гетероциклы, пептиды, сахариды, стероиды и тому подобное. Небольшие молекулы-модуляторы предпочтительно имеют молекулярную массу менее примерно 2000 Да, предпочтительно менее примерно 1000 Да и более предпочтительно менее примерно 500 Да. Соединения могут быть модифицированы для повышения эффективности, устойчивости, фармацевтической совместимости и тому подобного. Небольшие молекулы-ингибиторы включают, но не ограничиваются, небольшие молекулы, которые блокируют АТФ-связывающий домен, субстрат-связывающий домен, или киназный домен рецептора тирозинкиназы. В другом варианте реализации небольшая молекулаингибитор связывается с лиганд-связывающим доменом ΡΌΟΕΚβ и блокирует активацию рецептора ΡΌΟΕΚβ лигандом. Библиотеки небольших молекул можно проверять на ингибиторную активность с использованием высокопроизводительных биохимических, ферментативных или клеточных тестов. Тесты можно применять для определения способности тестируемого соединения ингибировать ΡΌΟΕΚβ, но не ΡΌΟΕΚα.

Антисмысловые олигодезоксинуклеотиды, антисмысловые РНК и небольшие ингибиторные РНК (δίΚΝΑ. интРНК) обеспечивают направленное разложение мРНК, таким образом, препятствуя трансляции белков. Соответственно, можно подавлять экспрессию ΡΌΟΕΚβ. Способность антисмысловых олигонуклеотидов подавлять экспрессию гена была обнаружена более 30 лет назад (2атесшк апб 81ерйеп5оп, Ριτκ. №111. Асаб. 8ск ϋδΑ. 75:280-284 (1978)). Антисмысловые олигонуклеотиды образуют пару с мРНК и пре-мРНК, и могут потенциально препятствовать на нескольких этапах процессинга РНК и матричных процессов, включая сплайсинг, полиаденилирование, экспорт, стабильность и трансляцию (8ахаш апб Ко1е, 1. С1ш. [пх'еМ. 112:481-486 (2003)). Однако две наиболее эффективные и широко используемые стратегии применения антисмысловых нуклеотидов представляют собой деградацию мРНК или пре-мРНК посредством РНКазыН и изменение сплайсинга с помощью нарушения образования контактов при сплайсинге. РНКазаН узнает гетеродуплексы ДНК/РНК и расщепляет РНК примерно посередине между 5' и 3' концами ДНК олигонуклеотида.

Врожденные механизмы с участием РНК могут регулировать устойчивость мРНК, трансляцию и организацию хроматина (Ме11о апб Соп1е №1Шге. 431:338-342, 2004). Кроме того, введенная извне длинная двунитевая РНК (днРНК) является эффективным средством для выключения гена в ряде более низкоорганизованных организмов. Однако у млекопитающих длинная днРНК вызывает высоко токсичные ответы, которые связаны с эффектами вирусной инфекции и продукции интерферона (ХУИНашз, Вюсйеш. 8ос. Ттапз. 25:509-513, 1997). С целью избежания этого Е1Ьа8Ыт и коллеги (Е1Ьа§Ыт е! а1., №11иге 411:494498, 2001) начали использовать интРНК, образованные дуплексом 19-нуклеотидных рибоолигонуклеотидов с 5' фосфатом и 2 основаниями на 3' липкого конца на каждой нити, которая избирательно разрушает мРНК-мишени после введения в клетку.

Действие интерферирующей днРНК у млекопитающих обычно включает два ферментативных этапа. Сначала фермент РНКаза III Оюег расщепляет днРНК на сегменты интРНК 21-23 п.н. Затем комплекс РНК-зависимого сайленсинга Ш8С (ΚΝΑ-шбисеб кбепсшд сотр1ех) разворачивает дуплекс РНК, спаривает одну нить с комплементарным участком в сходной мРНК и вносит разрыв на 10 нуклеотидов дальше от 5' конца нити интРНК (Наппоп, №Ш.1ге. 418:244-251, 2002). Короткие химически синтезированные интРНК размером 19-22 п.н. не требуют участия Оюег и могут напрямую активировать комплекс ΚΙ8Ο Следует отметить, что любая из нитей дуплекса РНК потенциально может быть загружена на комплекс ΚΙ8Ο но композиция олигонуклеотидов может повлиять на выбор нити. Таким образом, для достижения избирательной деградации конкретной мРНК мишени следует загружать дуплекс, где компонент антисмысловой нити имеет сравнительно слабое спаривание оснований на своем 5' конце (КШ'огомт Се11. 115:209-216, 2003). Экзогенные интРНК можно получить в виде синтезированных олигонуклеотидов или экспрессировать с плазмидных или вирусных векторов ^аббщоп апб Наппоп, Сигг. Орш. Мо1. Тйет. 5:217-224, 2003). В последнем случае, молекулы предшественника обычно синтезируются в виде коротких РНК-шпилек (δΙιΚΝΑ), которые содержат петлю из 4-8 нуклеотидов и стебель из 19-30 нуклеотидов; затем их расщепляет Экет, и образуются функциональные интРНК.

Другие способы ингибирования пути передачи сигнала с участием ΡΌΟΕΚβ включают, но не ограничиваются, миметики ΡΌΟΕ, которые связываются, но не активируют рецептор, и экспрессию генов или полинуклеотидов, которые снижают уровни ΡΌΟΕΚβ или активность, такие как ингибирующие

- 8 019595 тройные спирали и доминантные негативные мутации ΡΌΟΕΚβ.

Антагонисты ВТК (то есть, специфичные антагонисты ΡΌΟΤΒβ, антагонисты УЕСЕВ) для использования в соответствии с настоящим изобретением демонстрируют одно или более из следующих свойств:

1) Антагонист связывается с внешним доменом ВТК (то есть, ΡΌΟΤΒβ, УЕСТВ) и подавляет связывание лиганда. Ингибирование можно определить, например, в тесте на прямое связывание, с использованием очищенного или связанного с мембраной рецептора.

2) Антагонист нейтрализует рецептор. Связывание лиганда с внешним, внеклеточным доменом рецептора (например, ΡΌΟΕ-ΒΒ или ΡΌ6Ε-ΌΌ с ΡΌΟΕΒβ; УЕСТ или Р1СТ с УЕСТВ) стимулирует аутофосфорилирование рецептора и нижележащих сигнальных молекул, включая МАРК, Ак! и 1В8-1. Нейтрализация рецептора включает ингибирование, уменьшение, инактивацию и/или нарушение одного или более видов активности, в норме связанных с передачей сигнала. Нейтрализацию можно определять ίη νίνο, ех νίνο или ίη νίίτο с использованием, например, тканей, культуры клеток или очищенных компонентов клетки. Таким образом, нейтрализация Ρ^СΕΒβ и/или УЕСТВ имеет различные эффекты, включая ингибирование, уменьшение, инактивацию и/или нарушение роста (пролиферации и дифференцировки), ангиогенез (привлечение кровеносных сосудов, инвазию и метастазирование), и подвижность и метастазирование клеток (адгезию и инвазивность клеток).

Одним способом измерения нейтрализации рецептора является ингибирование тирозинкиназной активности рецептора.

Ингибирование тирозинкиназы можно определять с использованием известных способов; например, путем измерения уровня аутофосфорилирования рекомбинантной киназы рецептора, и/или фосфорилирования природных или синтетических субстратов. Таким образом, при определении нейтрализации антитела в контексте согласно настоящему изобретению пригодны тесты на фосфорилирование. Фосфорилирование можно обнаружить, например, путем использования антитела, специфичного к фосфотирозину в тесте методом твердофазного ЕЬ18А или Вестерн-блоттинга. Некоторые тесты на активность тирозинкиназы описаны в Ρаηек еί а1., 1. Ρ1ιηπικκο1. Ехр. ТЕега. 283: 1433-44 (1997) и Ва!1еу еί а1., Ьйе 8ск 62:143-50 (1998). Антитела согласно настоящему изобретению вызывают уменьшение фосфорилирования тирозина Ρ^СΕΒβ по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 85%, и более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90% в клетках, которые реагируют на лиганд.

Другим показателем нейтрализации рецептора является ингибирование фосфорилирования нижележащих (άο^ηкί^еат) субстратов рецептора или других компонентов сигнальных путей. Соответственно можно измерять уровень фосфорилирования МАРК, Ак1. 1В8-1 и других клеточных компонентов. Снижение фосфорилирования достигает по меньшей мере примерно 40% и может достигать по меньшей мере примерно 60%, или по меньшей мере примерно 80%.

Кроме того, для определения нейтрализации рецептора можно использовать способы обнаружения экспрессии белка, если измеряемый белок регулируется активностью рецепторной тирозинкиназы. Эти способы обнаружения экспрессии белка включают иммуногистохимию (ИГХ), флюоресцентную гибридизацию ίη кйи (ΕΙ8Η) для обнаружения амплификации гена, тест на конкурентное связывание радиоактивного лиганда, способы блоттинга, такие как Нозерн- и Саузерн-блоттинг, обратная транскрипция полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) и твердофазный ЕЬ18А. См., например, СгапФк еί а1., Сапсег, 78:1284-92 (1996); δΐιίιηίζιι еί а1., 1арап 1. Сапсег Век., 85:567-71 (1994); 8аи!ег еί а1., Ат. 1. ΡηίΕ., 148:104753 (1996); СрШпз, СПа 15:289-96 (1995); Вабшкку е! а1., С1ш. Сапсег Век. 1:19-31 (1995); Ее1пс1ек е! а1., Сапсег Век. 50:3934-39 (1990); Ηοΐί^ηη е! а1., Апйсапсег Век. 17:4419-26 (1997); ^1кк!гапб е! а1., Сапсег Век. 55:3140-48 (1995). Также для определения нейтрализации рецептора можно использовать тесты ех νίνο. Например, ингибирование рецепторной тирозинкиназы можно понаблюдать в тесте на митогенность с использованием линии клеток, стимулированных лигандом рецептора в присутствии и в отсутствие ингибитора. Другой способ включает тест на ингибирование роста экспрессирующих ВТК клеток опухоли или линии клеток, трансфецированных с целью экспрессии ΡΌΟΕΒβ. Ингибирование также можно наблюдать с использованием модели опухоли, например, клеток опухоли человека, инъецированных в мышей.

Антагонисты согласно настоящему изобретению не ограничены каким-либо конкретным механизмом нейтрализации рецептора. Антагонисты согласно настоящему изобретению могут связываться снаружи с поверхностным рецептором клетки, блокируя связывание лиганда и последующую передачу сигнала, опосредованную связанной с рецептором тирозинкиназы, и предотвращать фосфорилирование ΡΌ6ΕΒβ и белков, расположенных в каскаде передачи сигнала ниже.

3) Антагонист снижает число рецепторов. Количество присутствующего на поверхности клетки ВТК-рецептора зависит от продукции, интернализации и разложения белка-рецептора. Количество рецептора на поверхности клетки можно измерять косвенно путем обнаружения интернализации рецептора или связанных с рецептором молекул. Например, интернализацию рецептора можно измерить с помощью контакта клеток с рецептор-специфичным меченым антителом. Связанное с мембраной антитело

- 9 019595 затем удаляют, собирают и считают. Интернализованное антитело определяют путем лизиса клеток и детекции метки в лизате.

Другой способ заключается в прямом измерении количества присутствующего в клетке рецептора после обработки антителом к КТК или другим веществом с помощью, например, проточной флюоресцентной цитометрии клеток, окрашенных на экспрессируемые на поверхности КТК. Окрашенные клетки инкубировали при 37°С и измеряли интенсивность флюоресценции во времени. В качестве контроля часть окрашенной популяции можно инкубировать при 4°С (условия, при которых подавлена интернализация рецептора).

КТК на поверхности клеток можно обнаружить и измерить с помощью другого антитела, которое специфично для ΡΌΟΡΚβ и не блокирует или не конкурирует за связывание с тестируемым антителом. В определенных вариантах реализации уменьшение КТК на поверхности клетки в ответ на обработку антагонистом КТК составляет по меньшей мере примерно 50%, или по меньшей мере примерно 75%, или по меньшей мере примерно 90%. Значимое уменьшение обычно можно наблюдать спустя всего 4 ч.

Другим показателем снижения является суммарное уменьшение белков рецепторов, присутствующих в клетке, которое отражает разложение внутренних рецепторов. Соответственно, лечение клеток (особенно раковых клеток) антителами согласно настоящему изобретению приводит к уменьшению суммарного количества КТК клетки. В определенных вариантах реализации уменьшение КТК на поверхности клетки в ответ на лечение антагонистом КТК составляет по меньшей мере примерно 50%, или по меньшей мере примерно 75%, или по меньшей мере примерно 90%.

Специфичность антитела относится к селективному распознаванию антителом конкретного эпитопа антигена. Природные антитела, например, являются моноспецифичными. Антитела с двойной специфичностью (ВкАЬ) являются антителами, которые имеют две различающихся специфичности связывания антигена или сайта связывания. Если антиген-связывающий белок имеет более одной специфичности, известные эпитопы могут быть связаны с единственным антигеном или более чем с одним антигеном.

Предпочтительно антитела согласно настоящему изобретению связывают рецептор с не меньшей эффективностью, чем природный лиганд этого рецептора. Аффинность, представленная константой равновесия диссоциации антигена и антитела (К_д), отражает меру силы связывания между антигенным детерминантом и связывающим сайтом антитела. Авидность является мерой силы связывания антитела со своим антигеном. Авидность обусловлена как аффинностью между эпитопом и его антигенсвязывающим сайтом антитела, так и валентностью антитела. Валентность относится к числу антигенсвязывающих сайтов, которые иммуноглобулин имеет для конкретного эпитопа. Например, моновалентное антитело имеет один сайт связывания для конкретного эпитопа. Антигенный детерминант или эпитоп - это участок антигена, который связывает данное антитело. Типичные величины К составляют от 10⁵ до 10¹¹ л/моль. Любую К меньше 10⁴ л/моль считают показывающей неспецифическое связывание. Обратную К величину определяют как К,|. (К_д также называют константой диссоциации.) Чем меньше значение Кд, тем сильнее связывание между антигенным детерминантом и связывающим сайтом антитела.

Антитела согласно настоящему изобретению включают любое антитело, которое специфично связывает ΡΌΟΡΚβ и уменьшает или подавляет передачу связанного с рецептором сигнала. В определенных вариантах реализации антитела связывают их соответствующие рецепторы с К_д примерно меньше 10^-8 М^-1 или примерно меньше 10^-9 М^-1 или меньше 3 х 10^-10 М^-1. Не ограничивающие примеры конкретных специфичных антител к ΡΌΟΡΚβ раскрываются и/или поясняются далее. Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот двух конкретных антител согласно настоящему изобретению, 1В3 и 2С5, описаны в табл. 1.

В предпочтительном варианте реализации, один, два, три, четыре, пять или все шесть гипервариабельных участков (СБК) антитела выбирают из последовательностей любого из СБК 1В3. В другом предпочтительном варианте реализации один, два, три, четыре, пять или все шесть гипервариабельных участков антитела выбирают из последовательностей группы, состоящей из любого из СБК 2С5.

Антитела согласно настоящему изобретению в другом предпочтительном варианте реализации имеют последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, по существу, идентичную вариабельному домену тяжелой цепи 1В3 или 2С5, и/или последовательность вариабельного домена легкой цепи в значительной степени идентичную вариабельному домену легкой цепи 1В3 или 2с5. По существу, идентичный означает, что последовательности аминокислот по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичны контрольным последовательностям.

В одном варианте реализации или изобретения специфическое антитело к ΡΌΟΡΚβ включает вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот 8ЕО ΙΌ N0:18, и легкую цепь, включающую последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0:26. В другом варианте реализации изобретения, специфическое антитело к ΡΌΟΡΚβ включает вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0:2, и легкую цепь, включающую последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0:10. Специфичные антитела к ΡΌΟΡΚβ согласно настоящему изобретению далее включают такие антитела, которые конкурируют с вышеупомянутыми антителами (то есть, связывают те же или перекрывающиеся эпитопы).

- 10 019595

Настоящее изобретение также включает антитела с последовательностями аминокислот в значительной степени такими же, как последовательность аминокислот вариабельного или гипервариабельного участков вышеупомянутых антител. В значительной степени такая же последовательность аминокислот определена в настоящей заявке как последовательность с по меньшей мере 80% или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95% гомологии или тождества с другой последовательностью аминокислот, что определяют с помощью способа поиска ЕА8ТА в соответствии с Реагаоп апб Ыршап (Ргос. Νη11. Асаб. 8с1. И8А 85: 2444-8 (1998)). Следует ожидать, что в участках каркаса можно сделать ряд замен, особенно ввиду частых мутаций в участках каркаса, которые наблюдают в результате мутаций ίη νίνο и селекции. Тем не менее, по меньшей мере, надо ожидать, что также будут допустимы мутации в определенных позициях СЭР. Например, не все аминокислоты СЭР находятся в прямом контакте с антигеном. Ожидается, что замены аминокислот, особенно консервативные замены в не контактирующих положениях СЭР, повлияют на аффинность связывания, потенциально улучшая, а не нарушая его. Текущая технология позволяет специалисту в данной области легко вносить в последовательности изменения, намеренно или произвольно, и проверять их результаты. Замена консервативной аминокислоты определена как изменение в композиции аминокислот посредством изменения одной или нескольких аминокислот пептида, полипептида или белка, или фрагмента антитела. Замены аминокислот с в общем аналогичными свойствами (например, кислотность, основность, ароматичность, размер, положительный или отрицательный заряд, полярность, неполярность) таковы, что замена в значительной степени не изменяет свойства пептида, полипептида или белка (например, заряд, изоэлектрическую точку, аффинность, авидность, конформацию, растворимость) или активность. Типичная замена, которую можно провести с целью замены консервативной аминокислоты, возможна внутри следующих групп аминокислот: глицин (О), аланин (А), валин (V), лейцин (Ь) и изолейцин (I); аспарагиновая кислота (Ό) и глутаминовая кислота (Е); аланин (А), серин (8) и треонин (Т); гистидин (Н), лизин (К) и аргинин (Р): аспарагин (Ν) и глутамин (О); фенилаланин (Е), тирозин (Υ) и триптофан (XV).

В соответствии с изобретением специфичные антитела к ΡΌΟΕΡβ можно вводить сами по себе, вместе с антителами к УЕОЕР или в форме антител с двойной специфичностью, которые связывают и ΡΌΟΕΡβ, и VΕСΕΡ. Также предусмотрены примеры специфичных антител к VΕСЕΡ. Как обсуждалось в отношении специфичных антител к РОСЕР[Е раскрытые антитела к VΕСΕΡ также не ограничиваются примерами.

Изобретение также обеспечивает антитела, которые связывают определенные домены РОСЕР[Е Антитела, связывающие домены 1 и 2, антитела, связывающие домен 1, и антитела, связывающие домен 2 РОСЕР[Е входят в объем настоящего изобретения. 2С5 представляет собой пример антитела, которое связывает домен 2, и домены 1 и 2 РОСЕР[Е

Каждый вариабельный домен антител согласно настоящему изобретению может составлять полный вариабельный домен тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина, либо он может быть функциональным эквивалентом или мутантной формой или производной природного домена или синтетического домена, созданного, например, с использованием методов ίη νίΐΓο, таких как описаны в νθ 93/11236 (Меб1са1 Рекеагсй СоипсП/СпГП1115 е! а1.). Например, возможно включение доменов, соответствующих вариабельным доменам антитела, которые включают замены аминокислот, делеции, вставки, укорочения с аминоконца и с карбоксильного конца, так что эти мутации обеспечивают белки или фрагменты белков, которые сохраняют активность связывания антигена. Важным характеризующим признаком является способность каждого вариабельного домена соединяться с дополняющим его вариабельным доменом и образовывать антиген-связывающий сайт.

Антитела и фрагменты согласно настоящему изобретению могут быть связаны или слиты с дополнительными аминокислотными остатками. Такие аминокислотные остатки могут быть пептидной меткой, возможно для облегчения выделения. Также предусмотрены другие аминокислотные остатки для доставки антител в специфичные органы или ткани.

В другом аспекте изобретения, антитела или фрагменты антитела могут быть химически или биосинтетически связаны с противоопухолевым веществом или детектируемым сигнальным веществом, особенно если антитело интернализовано.

Противоопухолевые вещества, связанные с антителом, включают любые вещества, которые уничтожают или повреждают опухоль, с которой связалось антитело, или микроокружение клетки, с которой связалось антитело. Например, противоопухолевое вещество является токсичным веществом, таким как химиопрепарат или радиоизотоп. Пригодные химиопрепараты известны специалисту в данной области и включают антрациклины (например, дауномицин и доксорубицин), метотрексат, виндезин, неокарциностатин, цис-платина, хлорамбуцил, арабинозид цитозина, 5-фторуридин, мелфалан, рицин и калихемицин. Химиопрепараты конъюгируют с антителом, используя стандартные способы (См., например, Негшепбп апб 8еПег. Вейппд Ιηκΐ. Μίΐΐ. 82:197-215(1988)).

Детектируемые сигнальные вещества применимы для целей диагностики и ш νίνο, и ш νίΐτο. Сигнальное вещество дает измеримый сигнал, который обнаруживают внешними средствами, обычно путем измерения электромагнитного излучения. Главным образом, сигнальное вещество представляет собой

- 11 019595 фермент или хромофор, или производит свет путем флюоресценции, фосфоресценции или хемилюминесценции. Хромофоры включают красители, которые поглощают свет в ультрафиолетовой или видимой области, и могут быть субстратами или продуктами разложения катализируемых ферментами реакций.

Изобретение далее включает антитела, в которых связаны направляющая или репортерная субъединицы. Направляющая субъединица является первым участником связывающейся пары. Противоопухолевое вещество, например, конъюгировано со вторым участником такой пары, и, тем самым, направляется туда, где связался антиген-связывающий белок. Обычным примером такой связывающейся пары являются авидин и биотин. В предпочтительном варианте реализации, биотин связывают с антигенсвязывающим белком согласно настоящему изобретению и, тем самым, обеспечивают доставку противоопухолевого вещества или другой субъединицы, которая конъюгирована с авидином или стрептавидином. Кроме того, биотин или другую такую субъединицу соединяют с антиген-связывающим белком согласно настоящему изобретению и используют в качестве репортерного, например, в диагностической системе, где обнаруживаемое сигнальное вещество конъюгировано с авидином или стрептавидином.

Радиоизотопы, пригодные для использования в лечении опухолей, также известны специалисту в данной области техники. Например, используют ¹³¹1 или ²¹¹Л1. Эти изотопы связывают с антителом с использованием стандартных способов (См., например, Реб1еу с1 а1., Вг. 1. Сапсег 68:69-13 (1993)). В другом случае, связанное с антителом противоопухолевое вещество представляет собой фермент, который активирует пролекарство. Таким образом, вводимое пролекарство остается в его неактивной форме, пока не достигнет опухоли, где преобразуется в цитотоксическую форму, как только будет введен комплекс антитела. На практике, пациенту вводят конъюгат антитело-фермент и позволяют накопиться в участке ткани, который подлежит лечению. Затем пациенту вводят пролекарство, таким образом преобразование в цитотоксическое лекарство происходит в участке ткани, который нужно обработать. В другом случае, связанное с антителом противоопухолевое вещество представляет собой цитокин, такой как интерлейкин-2 (1Ь-2), интерлейкин-4 (1Ь-4) или фактор некроза опухоли альфа (ΤΝΡ-α). Антитело доставляет цитокин в опухоль для того, чтобы цитокин повреждал или уничтожал опухоль, не влияя на другие ткани. Цитокин соединяют с антителом на уровне ДНК, с использованием стандартных методов рекомбинантных ДНК.

Настоящее изобретение также обеспечивает изолированные полинуклеотиды, кодирующие антитела или их фрагменты, описанные ранее. Изобретение включает нуклеиновые кислоты, имеющие последовательности, кодирующие специфичные антитела к ΡΌΟΕΒβ и антиген-связывающие фрагменты, содержащие один, два, три, четыре, пять и/или все шесть гипервариабельных участков, которые приведены в табл. 1.

Соответственно, изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, которая специфично гибридизуется (или специфично связывается) при жестких условиях гибридизации с последовательностью из 8ЕО ΙΌ N0:1, 8Е0 ΙΌ N0:9, 8Е0 ΙΌ N0:17 и 8Е0 ΙΌ N0:25. Также предусмотрены нуклеиновые кислоты, которые могли бы специфично связываться с вышеупомянутыми последовательностями, если бы не вырожденность генетического кода. Нуклеиновые кислоты могут быть достаточной длины для того, чтобы кодировать полный белок (например, полные Ун или У_ь) или фрагмент антитела.

Г ибридизация при жестких условиях относится к условиям, при которых зонд будет преимущественно гибридизоваться со своей специфической последовательностью, и менее протяженно или вообще не будет гибридизоваться с другими последовательностями. Также следует понимать, что жесткие условия гибридизации и отмывки после гибридизации в отношении экспериментов по гибридизации нуклеиновых кислот, таких как саузерн и нозерн гибридизации зависят от последовательностей и различаются при равных параметрах окружающей среды. В данной области техники хорошо известно, как регулировать состав растворов и температуру гибридизации и отмывки так, чтобы получить жесткие условия гибридизации. Жесткость зависит от таких параметров, как размер и содержание нуклеотидов в использованном зонде. См. 8ашЬгоок е1 а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошпд -А ЬаЬога!огу Мапиа1 (2пб еб.) Уо1. 1-3, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1б 8ргшд НагЬог Ргекк, NΥ, и другие источники для общих описаний и примеров. Другой справочник по гибридизации нуклеиновых кислот приведен в Туккеп, 1993, ЬаЬога!огу Тесйпфиек ίη Вюсйеш1к1гу апб Мо1еси1аг Вю1оду - НуЬпб|/абоп \νί(1ι Шс1ею Ас1б РгоЬек, рай I, сйар!ег 2, 0уегу1ете оГ рппс1р1ек оГ НуЬг1б1ха(1оп апб Ле к1га!е§у оГ пис1ею ас1б ргоЬе аккаук, Е1кеу1ег, КУ.

Предпочтительными жесткими условиями являются такие, которые позволяют зонду гибридизоваться с последовательностью, которая более чем на примерно 90% комплементарна зонду, но не с последовательностью, которая комплементарна зонду менее чем на примерно 70%. Обычно, очень жесткие условия гибридизации и отмывки выбирают такие, которые примерно на 5°С ниже, чем точка плавления (Т_пл) для специфической последовательности при определенной ионной силе и рН. Температура Т_пл составляет (при определенной ионной силе и рН) температуру, при которой 50% последовательности мишени гибридизуются с полностью соответствующим зондом. Очень жесткие условия выбирают такими, которые равны Тпл для конкретного зонда.

Пример жестких условий гибридизации комплементарных нуклеиновых кислот, которые имеют более 100 комплементарных остатков на фильтре в саузерн или нозерн блоттинге, представляет собой 50%

- 12 019595 формамид с 1 мг гепарина при 42°С, гибридизацию проводят в течение суток. Примером очень жестких условий отмывки является 0,15 М ЫаС1 при 72°С в течение примерно 15 мин. Примером жестких условий отмывки является двухкратная отмывка в 88С при 65°С в течение 15 мин (см., 8атЬтоок с1 а1., 1989). Часто отмывке высокой жесткости предшествует отмывка низкой жесткости, для удаления фонового сигнала зонда. Пример отмывки средней жесткости для дуплекса, например, длиннее чем 100 нуклеотидов, составляет 1 раз в 88С при 45°С в течение 15 мин. Пример отмывки слабой жесткости для дуплекса, например, длиннее, чем 100 нуклеотидов, составляет 4-6 раз в 88С при 40°С в течение 15 мин. В общих чертах, уровень сигнала и шума, который наблюдается два раза (или чаще) для неспецифичного зонда в конкретном тесте на гибридизацию, указывает на обнаружение специфической гибридизации.

Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизуются друг с другом при жестких условиях, тем не менее, по меньшей мере, являются, по существу, идентичными, если, по существу, идентичны полипептиды, которые они кодируют. Это происходит, например, когда нуклеиновая кислота создана с использованием максимальной вырожденности кодонов, позволяемой генетическим кодом. Соответственно, последовательности нуклеотидов согласно настоящему изобретению включают последовательности нуклеотидов, которые по меньшей мере примерно на 70%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, и более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90% идентичны 8ЕО ГО N0:1, 8Е0 ГО N0:9, 8Е0 ГО N0:17 или 8Е0 ГО N0:25. Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантные векторы, содержащие нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению. Вектор может быть вектором экспрессии, в котором нуклеиновая кислота оперативно связана с регуляторной последовательностью, такой как промотор и, возможно, энхансер. Для эффективного синтеза полипептидов антител разработан ряд векторов экспрессии в системах прокариот и эукариот, включая, но не ограничиваясь, системы на основе культур клеток дрожжей и млекопитающих.

Можно использовать любой пригодный вектор экспрессии. Применимые в настоящем изобретении векторы экспрессии содержат по меньшей мере одну регулирующую экспрессию последовательность, которая оперативно связана с экспрессируемой последовательностью ДНК или ее фрагментом. Регуляторная последовательность включена в вектор для того, чтобы контролировать и регулировать экспрессию клонированной последовательности ДНК. Примеры применимых регулирующих экспрессию последовательностей включают 1ас систему, 1гр систему, 1ас систему, 1гс систему, основные операторный и промоторный участки фага лямбда, регуляторный участок белка капсида Гб. промоторы генов гликолиза у дрожжей, например, промотор 3-фосфоглицераткиназы, промоторы кислой фосфатазы дрожжей, например, Рйо5, промоторы альфа-фактора спаривания дрожжей и производные промоторов вирусов полиомы, аденовирусов, ретровирусов и вируса обезьян, например, ранний и поздний промоторы 8У40 и другие последовательности, известные в качестве регулирующих экспрессию генов в клетках прокариот или эукариот, и их вирусов, или их сочетания.

Селективный маркер является геном, который кодирует белок, необходимый для выживания или роста трансформированных клеток-хозяев, выращиваемых на селективной культуральной среде. Типичные селективные маркеры кодируют белки, которые (а) обеспечивают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, таким как ампициллин, неомицин, метотрексат или тетрациклин, (Ь) компенсируют ауксотрофность или (с) обеспечивают критические питательные вещества, не доступные из сложной среды, например, ген, кодирующий рацемазу Ό-аланина бацилл. Особенно полезный селективный маркер обеспечивает устойчивость к метотрексату. Например, трансформированные геном ΌΗΕΚ клетки сначала определяют путем культивирования всех трансформантов в культуральной среде, которая содержит метотрексат (Μΐχ), конкурентный антагонист ΌΗΕΚ Подходящими клетками-хозяевами для применения гена ΌΗΕΚ дикого типа являются клетки яичника китайского хомячка (СНО), клеточной линии с недостаточной активностью ΌΗΕΚ, полученные и культивируемые, как описано Иг1аиЬ и Сйабп (1980) Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 77, 4216. Трансформированные клетки затем подвергают повышенному уровню метотрексата. Это приводит к синтезу множественных копий гена ΌΗΕΚ и, соответственно, множественных копий другой ДНК, включающей векторы экспрессии, такой как кодирующая антитело или фрагмент антитела ДНК.

Если желательна экспрессия генной конструкции в дрожжах, примером пригодного гена для селекции в дрожжах является ген Ггр1, присутствующий в плазмиде дрожжей УКр7. ЗбисйсотЬ еГ а1. (1979) №Гше, 282, 39; Кшдктаи еГ а1. (1979) Оеие 7, 141. Ген Ггр1 обеспечивает селективный маркер для штаммов мутантов дрожжей, не способных расти без триптофана, например, АТСС №. 44076 или РЕР4-1. 1оие8 (1977) Оеиебск 85, 12. Наличие повреждений 1гр1 в геноме клетке-хозяине дрожжей дает эффективную среду для обнаружения трансформации благодаря росту в отсутствие триптофана. Аналогично, штаммы дрожжей с недостаточностью Ьеи2 (АТСС 20,622 или 38,626), дополнены известными плазмидами, несущими ген Ьеи2. Примером применимого вектора дрожжей является 2-микронная плазмида.

Примеры прокариотических векторов для клонирования включают плазмиды Е. сой, такие как со1Е1, рСК.1, рВК322, рМВ9, рИС, рК8М и КР4. Прокариотические векторы также включают производные ДНК-фагов, таких как М13, и других филаментозных фагов с однонитевой ДНК. Некоторые антитела удобно нарабатывать в Е. сой с использованием ДНК-конструкций, которые включают в начале каждой полипептидной цепи сигнальные последовательности бактерий для секреции. Ряд бактериальных

- 13 019595 сигнальных последовательностей известен в данной области техники. Предпочтительной сигнальной последовательностью является ген ре1В Επνίηία сато!оуота.

Пригодные для экспрессии в клетках млекопитающих векторы включают известные производные 8У40, аденовирусы, ДНК производные последовательностей ретровирусов и векторы-челноки, происходящие от сочетания функциональных векторов млекопитающих, таких как описанные выше, и функциональных плазмид и ДНК-бактериофагов. ДНК фрагменты, кодирующие антитела, можно клонировать, например, в векторы, содержащие для высокого уровня экспрессии в клетках млекопитающих промоторы и энхансеры цитомегаловируса человека (НСМУ). (См., например, Вепбщ е! а1., ϋ.δ. Ра1еп1 5,840,299; Маеба, е! а1. (1991) Нит. АпйЬоб. НуЬпботак 2, 124-34; Р.1. 8оЩйетп апб Р. Вегд, 1. Мо1. Арр1. Сепе1. 1: 327-41 (1982); 8иЬгаташ е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 1: 854-64 (1981); КаиЕшапп апб 81тгр, Атрййсайоп Апб Е.хргекчоп оЕ 8ес.|иепсе5 Со!гап§Еес!еб νί(Η а Моби1аг Э|йубгоГо1а1е КебисЩке Сотр1етеп!агу ΩΝΛ Сепе. 1. Мо1. Вю1. 159: 601-21 (1982); КаиЕтапп апб 8йагр, Мо1. Се11. Вю1. 159: 601-64 (1982); 8саЫ11 е! а1., Ехргекчоп Апб СйагасЮп/абоп ОЕ Тйе Ргобис! ОЕ А Нитап 1ттипе 1п!егЕегоп ^NΛ Сепе 1п СЫпеке НатЧег Оуату Се118, Ргос. №11'1 Асаб. 8сЕ И8А 80, 4654-59 (1983); иг1аиЬ апб СйаЧп, Ргос. №Е1 Асаб. 8сЕ И8А 77: 4216-20, (1980)).

Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантные клетки-хозяева, содержащие ранее описанные рекомбинантные векторы экспрессии. Конкретные предпочтительные линии клеток выбирают на основании высокого уровня экспрессии, конститутивной экспрессии белка и минимального загрязнения белками хозяина. Применимые клетки прокариот включают, например, штаммы Е. сой, такие как Е. сой 80-936, Е. сой НВ 101, Е. сой №3110, Е. сой Х1776, Е. сой Х2282, Е. сой 1)1 II и Е. сой МК.С1, Ркеиботопак, ВасШик, такие как ВасШик киЬййк и 8!гер!отусеч В качестве системы экспрессии являются доступными хорошо известные в данной области линии клеток млекопитающих, которые включают, но не ограничиваются, многие иммортализованные линии клеток, такие как клетки СО8-7, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки почки детенышей хомячков (ВНК), клетки РЕК.С6 и многие другие, включая линии клеток лимфоидного происхождения, такие как клетки лимфомы, миеломы или гибридомы. Пригодные дополнительные клетки эукариот включают дрожжи и другие грибы.

Трансформированные клетки-хозяева выращивают в соответствии с известными в данной области методами в жидкой среде, содержащей усваиваемые источники углерода, например углеводы, такие как глюкоза или лактоза, азот, например аминокислоты, пептиды, белки или их продукты разложения, такие как пептоны, соли аммиака или тому подобное, и неорганические соли, например, сульфаты, фосфаты и/или карбонаты натрия, калия, магния и кальция. Среда, кроме того, содержит, например, стимулирующие рост вещества, такие как микроэлементы, например железо, цинк, марганец и тому подобное.

Изобретение также обеспечивает способ выработки антитела, включающий культивирование вышеуказанных клеток-хозяев при условиях, позволяющих экспрессию антитела. После экспрессии антител в выращиваемой в пригодной среде клетке-хозяине, их можно выделить из среды и очистить с помощью известных в данной области техники способов.

Настоящее изобретение далее обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую антитело, нуклеиновую кислоту, вектор или клетку-хозяина согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение также относится к способам лечения или подавления роста опухолей, способам лечения или регуляции у млекопитающих связанных с ангиогенезом состояний (например, роста опухоли), или способам лечения ангиогенных заболеваний, которые включают введение специфичного антагониста РПОЕКД В одном варианте реализации антагонист блокирует опосредованную РЭОЕКв стимуляцию клеток опухоли. В другом варианте реализации функция антагониста заключается в подавлении или предотвращении ангиогенеза, тем самым излечивая или регулируя связанное с ангиогенезом состояние. Обычно, эндотелий сосудов паракринным образом стимулируется факторами роста из других источников (например, клеток опухоли). Соответственно, антагонисты РЭСЕКЗ являются эффективными в лечении пациентов с васкуляризованными опухолями или новообразованиями.

Лечение заболевания включает: (1) предотвращение появления заболевания у млекопитающего, которое может иметь к нему предрасположенность, но еще не испытывает или не показывает симптомов заболевания; например, предотвращение возникновения клинических симптомов; (2) подавление заболевания, например прекращение или задержку его развития; или (3) облегчение заболевания, например регрессию симптомов заболевания.

Опухоли, которые можно лечить, включают первичные опухоли и метастазы опухолей, а также устойчивые опухоли. Устойчивые опухоли включают опухоли, которые не отвечают или устойчивы к лечению одними химиопрепаратами, одними антителами, одной лучевой терапией или их сочетаниями. Устойчивые опухоли также охватывают опухоли, которые оказываются подавленными при лечении такими способами, но возвращаются вплоть до пяти лет, иногда вплоть до десяти лет или дольше, после того как лечение прекращают.

Специфичные антагонисты РЭСЕКЗ вводят в дозировках и с частотой, достаточной для существенного насыщения рецептора-мишени или его лиганда. Существенное насыщение составляет по меньшей

- 14 019595 мере примерно 50%, или по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 95% насыщения рецепторов-мишеней. Специфичный антагонист ΡΌΟΡΚβ вводят с частотой, достаточной для поддержания в интервале между дозами существенного насыщения на уровне по меньшей мере примерно 50%, или по меньшей мере примерно 70%, или по меньшей мере примерно 90%. В одном варианте реализации изобретения специфичный антагонист ΡΌΟΡΚβ является антителом. Для терапии режим дозировки составляет примерно от 5 до 700 мг/м². В другом варианте реализации режим дозировки составляет примерно от 10 о 250 мг/м². Специалист в данной области легко может определить подходящую дозу и режим введения, например, используя концентрацию, требуемую для достижения насыщения рецептора или нейтрализации ш νίίτο, или путем анализа концентрации антагониста в сыворотке.

В одном варианте реализации изобретения специфичный антагонист ΡΌΟΡΚβ вводят совместно с химиопрепаратом. Известные в данной области техники или обсуждаемые химиопрепараты можно группировать по классам на основании их мишеней или механизма действия. Например, алкилирующие агенты включают, но не ограничиваются, цисплатин, циклофосфамид, мелфалан и дакарбазин. Примеры антиметаболитов включают, но не ограничиваются, доксорубицин, даунорубицин и паклитаксел, гемцитабин, и ингибиторы топоизомеразы: иринотекан (СРТ-11), аминокамптотецин, камптотецин, ΌΧ-8 951Г и топотекан (топоизомераза Ι), этопозид (νΡ-16) и тенипозид (νΜ-26) (топоизомераза ΙΙ). Специалисту в данной области известны другие пригодные химиопрепараты, включая метотрексат, виндезин, неокарциностатин, хлорамбуцил, арабинозид цитозина, 5-фторуридин, мелфалан, рицин и калихемицин. Антагонист ΡΌΟΡΚβ и химиопрепарат пациенту вводят в количествах, эффективных для подавления ангиогенеза и/или уменьшения роста опухоли. Антагонист ΡΌΟΡΚβ также можно вводить в сочетании с другими методами лечения, например, вместе с лучевой терапией. Источник излучения для излечиваемого пациента может быть как внешним (дистанционная лучевая терапия - ДЛТ), так и внутренним (брахитерапия - БТ).

Доза применяемого антинеопластического средства зависит от множества факторов, включая, например, тип лекарственного вещества, тип и остроту излечиваемой опухоли и способ введении вещества. Следует подчеркнуть, тем не менее, по меньшей мере, что настоящее изобретение не ограничено никакой конкретной дозировкой.

В одном варианте реализации изобретения специфичный антагонист ΡΌΟΡΚβ вводят в сочетании с антагонистом νΕΟΡΚ. Примеры антагонистов νΕΟΡΚ включают антитела, которые связывают νΕΟΡΚ2/ΚΌΚ, такие как 1МС-2С6 (последовательности нуклеотидов и аминокислот ν_Η: 8ΕΟ ΙΌ N0:33 и 34; последовательности нуклеотидов и аминокислот У_ъ: 8ΕΟ ΙΌ N0:35 и 36) (см., \У0 03/075840) и 1МС1121 (последовательности нуклеотидов и аминокислот ν_Η: 8Ε0 ΙΌ N0:33 и 34; последовательности нуклеотидов и аминокислот ν_Β: 8Ε0 ΙΌ N0:37 и 38) (см., \У0 03/075840). Примеры антител, которые связывают νΕΟΡΚ1/Ρ1ί-1, включают 6,12 (последовательности нуклеотидов и аминокислот ν_Η: 8Ε0 ΙΌ N08:39 и 40; последовательности нуклеотидов и аминокислот ν_Β: 8Ε0 ΙΌ N0:41 и 42) и ΙΜΟ-18Ε1 (последовательности нуклеотидов и аминокислот ν_Η: 8Ε0 ΙΌ N0:43 и 44; последовательности нуклеотидов и аминокислот ν_Β: 8Ε0 ΙΌ N0:45 и 46). Примером специфичного для νΕΟΡ антитела является Агайт®®.

Так же, как описано в настоящей заявке для специфичных антител к ΡΌΟΡΚβ, антагонист νΕΟΡΚ уменьшает или подавляет передачу сигнала, связанную с рецептором νΕΟΡ. Механизмы ингибирования включают, но не ограничиваются, блокирование лиганда, димеризацию рецептора или образования мультимера, интернализацию рецептора, ингибирование ферментной активности (например, аутофосфорилирование, модификацию субстратов рецептора) и тому подобное.

В определенных вариантах реализации антитела согласно настоящему изобретению имеют двойную специфичность и способны одновременно связывать два разных антигена. Разные антигены могут находиться на разных клетках или на одной и той же клетке. Перекрестное связывание антигена можно подтвердить ш νίίτο, например, таким образом: на твердую подложку, с которой связан первый антиген, добавляют специфическое для первого антигена антитело с двойной специфичностью, добавляют второй антиген, для которого связывающий белок также является специфичным, и обнаруживают присутствие связанного второго антигена.

Предпочтительные антитела согласно настоящему изобретению способны блокировать взаимодействие между двумя рецепторами и их соответствующими лигандами. Например, специфическое антитело к ΡΌΟΡΚβ и ΚΌΚ подавляет вызываемую ΡΌΟΡ-ΒΒ активацию клеток, а также индуцированную νΕΟΡ или Ρ1ΟΡ миграцию клеток. По сравнению с антителами, имеющими одну специфичность, антитела с двойной специфичностью могут быть более сильными ингибиторами функций клеток.

В одном аспекте изобретения антагонист ΡΌΟΡΚβ вводят совместно с антагонистом νΕΟΡΚ. Данный способ эффективен для лечения солидных или не солидных опухолей, включая, такие из них, которые не васкуляризированы или еще незначительно васкуляризированы.

Опухоли и новообразования, которые можно лечить одним только антагонистом ΡΌΟΡΚβ или в сочетании с антагонистом νΕΟΡΚ, включают, например, злокачественные опухоли и новообразования, такие как бластомы, карциномы или саркомы, и высоко сосудистые опухоли и новообразования. Раковые заболевания, которые можно лечить способами согласно настоящему изобретению, включают, например, рак мозга, мочеполовых путей, лимфатической системы, желудка, почек, кишечника, гортани, легкого и

- 15 019595 костей. Не ограничивающие примеры далее включают опухоли эпидермиса, чешуйчатоклеточные опухоли, такие как опухоли головы и шеи, опухоли прямой кишки, опухоли простаты, опухоли молочной железы, опухоли легкого, включая аденокарциному легкого и мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легкого, опухоли поджелудочной железы, опухоли щитовидной железы, опухоли яичника и опухоли печени. Композиции также используют для лечения васкуляризованного рака кожи, включая чешуйчатоклеточные карциномы, базальноклеточные карциномы, и рака кожи, который можно лечить путем подавления роста малигнизированных кератиноцитов, таких как малигнизированные кератиноциты человека. Другие виды рака, которые можно лечить, включают саркому Капоши, новообразования ЦНС (нейробластомы, капиллярные гемангиобластомы, менингиомы и метастазы в мозг), меланому, карциномы и саркомы желудочно-кишечного тракта и почек, рабдомиосаркому, глиобластому, включая множественную глиобластому и лейомиосаркому.

Примеры не солидных опухолей включают лейкемии, множественные миеломы и лимфомы. Некоторые примеры лейкемий включают острую миелоидную лейкемию (ОМЛ), хроническую миелоидную лейкемию (ХМЛ), острую лимфоцитарную лейкемию (ОЛЕ), хроническую лимфоцитарную лейкемию (ХЛЛ), эритроцитарную лейкемию или моноцитарную лейкемию. Некоторые примеры лимфом включают ходжкинские и неходжкинские лимфомы.

Композиции согласно настоящему изобретению также можно использовать для лечения или предотвращения патологических состояний, характеризующихся чрезмерным ангиогенезом, включая, например, васкуляризацию и/или воспаление, такие как атеросклероз, ревматоидный артрит (РА), неоваскулярная глаукома, пролиферативные ретинопатии, включая пролиферативную диабетическую ретинопатию, дегенерацию сетчатки, гемангиомы, ангиофибромы и псориаз. Другими не ограничивающими примерами неопухолевых ангиогенных заболеваний являются ретинопатии несовершеннолетних (ретролентальная фиброплазия), отторжение трансплантата роговицы, инсулин-зависимый сахарный диабет, множественный склероз, миастения гревис, болезнь Крона, аутоиммунный нефрит, первичный билиарный цирроз, острый панкреатит, отторжение аллотрансплантатов, аллергическое воспаление, контактный дерматит и реакции гиперчувствительности задержанного типа, воспалительные заболевания кишечника, септический шок, остеопороз, остеоартрит, расстройства сознания, вызываемые воспалением нейронов, синдром Ослера-Вебера, рестеноз и грибковые, паразитарные и вирусные инфекции, включая цитомегаловирусную инфекцию.

Определение такого заболевания находится в пределах способностей и знания специалиста в данной области. Например, человек, который либо страдает от клинически значимого новообразования или ангиогенного заболевания, либо который имеет риск развития клинически значимых симптомов, подходит для введения антагониста ΡΌΟΡΚβ, возможно, в сочетании с антагонистом νΕΟΡΚ. Клинический специалист в данной области легко может определить, например, путем использования клинических тестов, медицинского осмотра и медицинской/семейной истории, является ли личность кандидатом для такого лечения.

Настоящие композиции антагонистов можно вводить с целью терапевтического лечения пациенту, страдающему от опухоли или связанного с ангиогенезом патологического состояния в количестве, достаточном для предотвращения, подавления или уменьшения прогрессии опухоли или патологического состояния. Прогрессия включает, например, рост, инвазивность, метастазирование и/или рецидив опухоли или патологического состояния. Требуемое для достижения этого количество определяют как терапевтически эффективную дозу. Эффективное количество для такого использования будет зависеть от остроты заболевания и общего состояния иммунной системы пациента. Режим введения также изменяют в зависимости от состояния заболевания и статуса пациента, и обычно колеблется от однократного введения болюса или непрерывного вливания до многократного введения в течение дня (например, каждые 4-6 ч), или так, как показано лечащим врачом и состоянием пациента. Следует отметить, однако, что настоящее изобретение не ограничено любой конкретной дозировкой.

Способы введения млекопитающему включают, например, пероральный, внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный или внутримышечный способы введения.

Специфичные антитела к ΡΌΟΡΚβ и к νΕΟΡΚ могут быть химически или биосинтетически связаны с другим веществом, таким как антинеопластические или антиангиогенные средства для лечения заболевания. Связанные с антителом противоопухолевые вещества включают любые вещества, которые уничтожают или повреждают опухоль, с которой связалось антитело или микроокружение клетки, с которой связалось антитело. Например, противоопухолевое вещество является токсичным веществом, таким как химиопрепарат или радиоизотоп. Химиопрепараты связывают с антителом с использованием стандартных способов (См., например, Негтеийи апб 8ейег (1988) Вейппд Ιη§ί. Μίίί. 82, 197-215), включая пептидные и не пептидные линкеры.

Специфичные антитела к ΡΌΟΡΚβ согласно настоящему изобретению также могут быть связаны с обнаруживаемым сигнальным веществом, применимым для целей диагностики и ίη νίνο и ίη νίίτο. Сигнальное вещество дает измеримый сигнал, который обнаруживают внешними средствами, обычно путем измерения электромагнитного излучения. Главным образом, сигнальное вещество представляет собой

- 16 019595 фермент или хромофор, или производит свет путем флюоресценции, фосфоресценции или хемилюминисценции. Хромофоры включают красители, которые поглощают свет в ультрафиолетовой или видимой области, и могут быть субстратами или продуктами разложения катализируемых ферментами реакций.

Изобретение далее подразумевает использование таких антител с лекарственными или диагностическими веществами, включенными во вторичные реагенты. Например, один элемент связывающейся пары связан с антителом изобретения. Антинеопластическое средство, например, конъюгировано со вторым участником такой пары, и тем самым направляется туда, где связалось антитело. В предпочтительном варианте реализации биотин связан с антителом согласно настоящему изобретению и, тем самым, обеспечивает доставку антинеопластического средства или другой субъединицы, которая конъюгирована с авидином или стрептавидином. Кроме того, биотин или другую такую субъединицу соединяют с антиген-связывающим белком согласно настоящему изобретению и используют в качестве репортера, например, в диагностической системе, где обнаруживаемое сигнальное вещество конъюгировано с авидином или стрептавидином.

Антагонист ΡΌΟΡΡβ согласно настоящему изобретению, возможно, в сочетании с антагонистом νΕΟΡΡ можно вводить в сочетании с одним или более пригодными адъювантами, например, цитокинами (например, ЬС-10 и ΙΌ-13) или другими иммунными стимуляторами, такими как, не ограничиваясь, хемокины, связанные с опухолями антигены и пептиды. Следует представлять, однако, что введение только антитела является достаточным для предотвращения, подавления или снижения прогрессии опухоли терапевтически эффективным образом.

В определенных вариантах реализации может быть желательным введение антитела согласно настоящему изобретению, которое связывает ΡΤΚ и блокирует связывание лиганда в сочетании с другим антиген-связывающим белком, который связывает лиганд. Связывающие лиганд антитела хорошо известны в данной области техники и включают, например, антитела к νΕΟΡ (ΛναδΙίη®; бевацизумаб).

В соответствии с изобретением, совместное введение специфичного антагониста ΡΌΟΡΡβ и антагониста νΕΟΡΡ может сопровождаться введением антинеопластического средства, такого как химиопрепарат или радиоизотоп. Примеры применимых антинеопластических средств включают описанные выше для совместного введения со специфичными антагонистами ΡΌΟΡΡβ.

При комбинированной терапии антагонист ΡΌΟΡΡβ и антагонист νΕΟΡΡ можно совместно вводить в одинаковом или различающемся режиме, порознь или вместе. Возможно, антагонисты можно сочетать в единственной дозе. Возможно, антагонисты можно сочетать в единственном активном объекте (например, антителе с двумя специфичностями). Терапию антагонистом ΡΌΟΡΡβ/антагонистом νΕΟΡΡ проводят до, в течение или после начала другой терапии, а также в любом их сочетании, то есть, до и в течение, до и после, в течение и после, или до, в течение и после начала другой противоопухолевой терапии. Например, для лечения опухоли или новообразования терапию антагонистом ΡΌΟΡΡβ/антагонистом νΕΟΡΡ можно проводить между 1-м и 30-м днем, предпочтительно между 3-м и 20-м днем, более предпочтительно между 5-м и 12-м днем перед началом лучевой терапии. В соответствии с изобретением, химиотерапию или радиотерапию проводят параллельно, до или после терапии антагонистом ΡΌΟΡΡβ/антагонистом νΕΟΡΡ.

В настоящем изобретении можно использовать любой пригодный способ или путь введения антител согласно настоящему изобретению, и возможно совместное введение антинеопластического средства, антагонистов рецептора или другой фармацевтической композиции. Например, режим введения антинеопластического средства, использованный в соответствии с настоящим изобретением, включает любой режим, который, как предполагают, оптимально пригоден для лечения у пациента новообразования. Различные злокачественные опухоли могут требовать использования специфичных противоопухолевых антител и специфичных антинеопластических средств, которые будут индивидуально определены для пациента. Пути введения включают, например, пероральное, внутривенное, внутрибрюшинное, подкожное или внутримышечное введение. Доза вводимого антинеопластического средства зависит от множества факторов, включая, например, тип лекарственного вещества, тип и остроту излечиваемой опухоли и способ введения антинеопластического средства. Следует подчеркнуть, тем не менее, по меньшей мере, что настоящее изобретение не ограничено никаким конкретным способом или путем введения.

Следует понимать, что антитела согласно настоящему изобретению при использовании с целью профилактики или лечения млекопитающего будут вводиться в форме композиции, возможно, включающей фармацевтически приемлемый носитель. Пригодные фармацевтически приемлемые носители включают, например, один носитель или более из воды, солевого раствора, фосфатного солевого буфера, декстрозы, глицерола, этанола и тому подобного, а также их сочетания. Фармацевтически приемлемые носители могут далее включать незначительное количество вспомогательных веществ, таких как смачиватели или эмульгаторы, консерванты или буферы, которые повышают время существования или эффективность связывающих белков. Композиции для инъекции, как хорошо известно в данной области техники, можно создавать таким образом, чтобы обеспечивать быстрое, продолжительное или отсроченное высвобождение активного компонента после введения его млекопитающему.

Настоящее изобретение также включает наборы для подавления роста опухоли и/или ангиогенеза,

- 17 019595 включающие терапевтически эффективное количество специфичного антагониста ΡΌΟΡΚβ согласно настоящему изобретению. В одном варианте реализации изобретения, набор далее включает антагонист УЕΟΡΚ (например, антагонист УЕОР, Ρ1ΟΡ, УЕΟΡΚ-1/Ε1^1, УЕΟΡΚ-2/Ε1к-1/Κ^Κ, или \·Ί ΌΙ·Κ3/Ι·Ί1-4). Антагонистами УЕОР могут быть, например, небольшие молекулы, связывающие лиганд фрагменты рецептора или антитела. Если антагонист, который вводят человеку, является антителом, предпочтительны антитела человека, гуманизированные или химерные антитела. Наборы могут далее содержать любой пригодный антагонист, например, другой рецептор фактора роста, участвующий в канцерогенезе или ангиогенезе (например, ЕОРК ΙΟΡΚ, ΝΟΡΚ, ΡΟΡΚ, и т.п., как описано ранее). Кроме того или дополнительно, наборы согласно настоящему изобретению могут далее включать антинеопластическое средство. Примеры пригодных антинеопластических средств в контексте настоящего изобретения описаны ранее. Наборы согласно настоящему изобретению могут далее включать адъюванты; примеры также описаны ранее.

Также в объем настоящего изобретения входит применение антител ίη νίνο и ίη νίΐτο в методах исследования или диагностики, которые хорошо известны в данной области техники. Методы диагностики включают наборы, которые содержат антитела согласно настоящему изобретению.

Соответственно, связывающие рецептор антитела, таким образом, можно использовать ίη νίνο и ίη νίίτο в методах исследования, диагностики, профилактики или лечения, которые известны в данной области техники. Конечно, следует понимать и ожидать, что специалист в данной области техники может сделать изменения в принципах раскрытого выше изобретения, и подразумевается, что такие модификации также входят в объем настоящего изобретения.

Все публикации и патентные документы, приведенные в настоящей заявке, включены в нее в полном объеме посредством ссылки.

Примеры

Следующие примеры далее иллюстрируют изобретение, но никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения. Подробные описания стандартных способов, таких как те, что применялись при конструировании векторов и плазмид, введении в такие векторы и плазмиды генов, кодирующих полипептиды, введении плазмид в клетки-хозяева и экспрессии, определении генов и продуктов генов, содержатся в многочисленных публикациях, включая ΦιιηΦοοΙι ί. е1 а1., (1989) ΜοΕοιιΕ-ΐΓ 01οηίη§: А ^аЬο^аΐοτγ Μаηиа1, 2'¹ ей., С'о1й δρτίη^ ΗπιΈογ ^аЬο^аΐο^у ΡΐΌ55; аЫ ί’οΐίβηη ί. е1 а1. (1994) Ситтей ΡτοΐοοοΗ ίη Iттиηο1οду, \Уйеу & δοηκ, Iηсο^ρο^аΐей.

Библиотека фагового дисплея

Для скрининга антител к ιηΡΌΟΡΚβ использовали библиотеку фагового дисплея РаЬ фрагментов человека, содержащую 3,7 х 10¹⁰ клонов (йе Наагй Η. 1. е1 а1., 1999, 1. Βίο1. СНет. 274:18218-30), в соответствии с описанной ранее процедурой (Ьи Ό. е1 а1., 2002, Ιηΐ. ί. Саг1сег 57:393-9; Ζΐιιι Ζ. е1 а1., 1998, Самсег Κο5. 58:3209-14), используя иммобилизованные тΡ^ΟΡΚβ-Ρс. Отдельные клоны фагов, отобранные после 2-го и 3-го раундов селекции, исследовали на наличие связи с иммобилизованным ιηΡΌΟΡΚβ-Рс с помощью твердофазного ЕЫ8А. Для получения растворимого РаЬ использовали плазмиды с отдельными генами связывающихся белков, которыми трансформировали несупрессирующие клетки ЕкскепсЫа теН штамма НВ2151. Растворимые белки РаЬ очищали от экстратов периплазмы посредством аффинной хроматографии с использованием колонок Ρτοϊοιη О (АтеткЬат ЕНагтааа Вю1ес11. Е15са1а^ау. N1) в соответствии с протоколом изготовителя.

Количественные тесты на связывание рецептора и блокирование. В тесте на связывание к покрытым ιηΡΌΟΡΚβ планшетам (50 мкл при 1 мкг/мл) добавляли различное количество 1В3 1дО или РаЬ и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего планшеты 3 раза промывали ΡΒδΤ. Планшеты затем инкубировали при комнатной температуре в течение дополнительного 1 ч с антителом козы к κ-цепям 1д человека, конъюгированным с пероксидазой хрена (ΗΚΡ) (Εκΐίδοη IттиηοΚе5еа^сН. \Уе51 Сгосе, ΡΑ). Планшеты промывали и обрабатывали, как описано ранее (Ьи Ό. е1 а1., 2002; ΖΗυ, Ζ. е1 а1., 1998). В тесте на блокирование различное количество очищенных антител сначала смешивали с фиксированным количеством ιηΡΌΟΡΚβ (50 нг при 0,5 мкг/мл), и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Смесь затем переносили в 96-луночные планшеты, покрытые ΡΌΟΡ-ΒΒ (0,5 мкг/мл), и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После трехкратной промывки ΡΒδΤ планшеты инкубировали с антителом козы к Рс-фрагментам 1д человека, конъюгированным с ΗΚΡ (,Εκ1<5οη 1ттиηο^^τΛ) в течение 1 ч и обрабатывали так, как описано в (Ьи Ό. е1 а1., 2002; Ζΐιιι Ζ. е1 а1., 1998; Όοίζοκ Ν. е1 а1., 2005). Определяли 1С₅₀, концентрацию антитела, которая дает 50% блокирование связывания ιηΡΌΟΡΚβ с его лигандом.

Определение аффинности антитела

Кинетику связывания различных РаЬ и 1дО с ιηΡΌΟΡΚβ измеряли с использованием биосенсора ΒΙΑ^το 3000 (ΒΙΑ^ΚΡ, 1пс., Ирр8а1а, 8тейеи). Вкратце, на сенсорном чипе иммобилизовали ιηΡΌΟΡΚβ и добавляли растворимые антитела в концентрации, колеблющейся от 1,5 до 100 нМ. Для каждой концентрации получали сенсограммы и обрабатывали их с использованием программы ΒΙΑ Еνа1иаΐ^οη 2.0. Константу аффинности К_й вычисляли как отношение скорость диссоциации (кοίί)/скорость ассоциации

- 18 019595 (коп) (Ьи Ό. βί а1., 2002; Ζΐιιι Ζ. βί а1., 1998; Εοίζοδ Ν. βί а1., 2005).

Селекция антитела человека к тΡ^СΕЯβ. В общей сложности 190 клонов из второго раунда и 95 из третьего раунда произвольно выбрали и протестировали на связывание тΡ^СΕЯβ и блокирование активности как путем твердофазного ЕЬ18А с бактериофагами, так и путем твердофазного ЕЬ18А с растворимым ЕаЬ. Оказалось, что более 72% клонов из второго раунда и 98% из третьего раунда специфично связывают тΡ^СΕЯβ, показывая высокую эффективность процесса селекции. Тесты на блокировку лиганд выявили, что примерно 2,5% свывающихся белков также блокируют связывание тΡ^СΕЯβ с его лигандом Ρ^СΕ-ВВ.

Все семь фрагментов ЕаЬ специфично связывали тΡ^СΕЯβ и блокировали тΡ^СΕЯβ от связывания с его лигандом Ρ^СΕ-ВВ с различной силой. Значение 1С₅₀ (то есть, концентрация антитела, требуемая для блокирования 50% взаимодействия тΡ^СΕЯβ/Ρ^СΕ-ВВ) составляла примерно от 4 нМ до >33 нМ (фиг. 1В). Клон 1В3 с наилучшей эффективностью связывания рецептора и потенциалом блокирования взаимодействия рецептор/лиганд (табл. 1) выбрали для дальнейшего исследования.

Таблица 1. №№ 8Е0 ΙΌ для вариабельных доменов и гипервариабельных участков антитела (нуклеотид/аминокислота)

Антитело	Ун	СОР.Н1	СОКН2	СОКНЗ	Уь	СОМЛ	СОКЪ2	СРКЬЗ
1ВЗ	1/2	3/4	5/6	7/8	9/10	11/12	13/14	15/16
2С5	17/18	19/20	21/22	23/24	25/26	27/28	29/30	32/32

Клонирование полноразмерного антитела 1цС и его экспрессия

Последовательности ДНК, кодирующие гены тяжелой и легкой цепей из лучшего клона 1В3, амплифицировали путем ПЦР и клонировали в вектор экспрессии, содержащий константную область легкой к (каппа) цепи человека и константную область тяжелой γ1 (гамма один) цепи человека. Вектором экспрессии трансфецировали клетки миеломы N80 и отбирали стабильные клоны экспрессирующих 1В3 клеток. Клетки выращивали в бессывороточной среде и очищали полноразмерный 1дС 1В3 из супернатанта культуры клеток с помощью аффинной хроматографии на протеине А (Ροτοκ А, АррНеб Вюкуйетк, ΡοδΙοί СЕу, СА).

Как и ожидалось, 1дС 1В3 показывал значительно лучшую эффективность связывания с иммобилизованным тΡ^СΕЯβ, чем его ЕаЬ фрагмент. Значение 1С₅₀ для 1дС 1В3 составляло 0,34 и 1,3 нМ - для 1В3 ЕаЬ (фиг. 1А). Анализ кинетики связывания методом поверхностного плазмонного резонанса на приборе ΡΙΛ^γο выявил, что аффинность 1В3 для связывания тΡ^СΕЯβ приблизительно в 57 раз выше, чем аффинность его ЕаЬ формы (5,1 нМ для ЕаЬ и 0,0 нМ для 1дС). Когда антитело 1В3 проверяли на связывание с Ρ^СΕЯβ человека, не наблюдалось никакой перекрестной реактивности ни с растворимым рекомбинантным белком, ни с экспрессируемым клетками линии опухоли человека поверхностным рецептором. Далее антитело 1В3 не связывало Ρ^СΕЯα ни человека, ни мыши (данные не показаны). В тесте на блокирование антитело 1В3 ингибировало связывание тΡ^СΕЯβ с его лигандом ΡΟ^^Ρ с 1С₅₀ 1,2 нМ, в то время как ЕаЬ имел 1С₅₀ 4,1 нМ (фиг. 1В).

Антитело 1В3 подавляет стимулируемое Ρ^СΕ-ВВ фосфорилирование рецептора и передачу сигнала в тесте на клетках. Несколько клеточных линий мыши, включая ΝΙΗ/3Τ3 (фибробласты), Ό122 (легочная карцинома Льюиса), 4Т1 (рак груди), В16 (меланома) и Η5ν (ΡιηΤ-трансформированные клетки эндотелия) проверяли на экспрессию Ρ^СΕЯβ с помощью проточной цитофлюориметрии, используя 1В3 в качестве тестирующего агента. Клетки аликвотировали в лунки 96-луночного планшета в количестве ~1х 10⁶ на лунку, инкубировали с 1В3 (10 мкг/мл) при 4°С в течение 1 ч, затем инкубировали с антителом к Ес-фрагментам человека, конъюгированным с Е1ТС иаскюп IттиηοЯе8еа^сй) в течение дополнительного часа при 4°С. После нескольких отмывок холодным ΡВ8 клетки анализировали на проточном цитометре ЕЛС8уап1аде 8Е (ВО Вюкаепсек, 8ап Ιοκο, СА). Антитело к тΡ^СΕЯβ от Р&Э использовали в качестве положительного контроля (данные не показаны). Результаты проточной цитофлюориметрии (фиг. 2А) показали, что ΝΙΗ/3Τ3 и Ό122 экспрессируют Ρ^СΕЯβ на умеренном уровне, 4Т1 и В16 экспрессируют рецептор на низком уровне, и Η5ν не дает никакого окрашивания.

Для клеток ΝΙΗ/3Τ3 и Ό122 определяли фосфорилирование рецептора. Клетки помещали на чашки 6 см и выращивали до 70-80% непрерывного слоя, после чего клетки дважды отмывали ΡВ8 и сутки культивировали в бессывороточной среде. Клетки сначала инкубировали с различными антителами при комнатной температуре в течение 30 мин, затем стимулировали кЭСЕ-ВВ при 37°С в течение 15 мин. Клетки лизировали в лизисном буфере (50 мМ Τπδ-ΗΟ, рН 7,4, 150 мМ №С1, 1% Τ^^ίοηX-100, 1 мМ ЕЭТЛ, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, 0,5 мМ МцУО.;, 1 г/мл леупептина, 1 г/мл пепстатина и 1 г/мл апротинина) в течение 1 ч, затем центрифугировали лизат при 12,000 об/мин в течение 10 мин при 4°С. Рецепторы подвергали иммунному осаждению из супернатанта лизата клеток с помощью антитела к ιηΡΟΟΗΚβ (Р&Э 8у51ет5 1пс), затем добавляли 20 мкл бусин ΡτοΛ/С-сефароза. Осажденные белкирецепторы разделяли в 4-12% геле NиΡАСЕ βίδ-ΤΗδ и переносили на мембрану из поливинилиден ди

- 19 019595 фторида. Фосфорилированный белок ιηΡΌΟΡΡβ детектировали на блоттинге с использованием антител к фосфотирозину, конъюгированных с ΗΚΡ (Зап!а Сгих БЮссИ, Зап!а Сгих, СА). Все белки-рецепторы, нанесенные на гель, проверяли антителом к ιηΡΌΟΡΡβ.

Для изучения нижележащего сигнального пути, лизат клеток после описанной обработки разделяли в 4-12% геле NиΡΑΟЕ Βίδ-Τπδ. Фосфорилированные митоген-активирующие протеинкиназы (МАРК) Ак1 и р44/42 детектировали с использованием антител к фосфо-Ак! и фосфо-р44/р42 МАРК и р44/р42 ΜΑΡΚ, соответственно ΟΒίοδ^ι^, Зап О1едо, СА).

Антитело 1В3 ингибировало стимулирумое ΡΌΟΡ-ΒΒ фосфорилирование рецепторов как в клетках NIΗ/3Τ3, так и в 0122, дозозависимым образом (фиг. 2В и 2С). Антитела также сильно ингибировало стимулирумое ΡΌΟΡ-ΒΒ фосфорилирование как Ак1, так и р44/42 МАБ киназы в клетках 0122 (фиг. 2Ό).

Противоопухолевая активность антител к ιηΡΌΟΡΡβ в моделях ксенографтных опухолей. Шесть ксенографтных моделей опухолей человека, включая три карциномы яичника (ЗК-0У-3, 0У-САК-5 и 0У-САК-8), одну карциному поджелудочной железы (ВхРС3), одну карциному легкого (N01-4460) и одну карциному почки (Сак1-1) использовали для определения противоопухолевой активности 1В3 ίη νίνο. Безтимусных мышей (пи/пи) (самки, возраст 7-8 недель) содержали в течение 7-10 дней перед имплантацией ксенографтов. Каждой мыши подкожно впрыскивали 3-10 х 10⁶ клеток опухоли ЗК-0У-3, 0УСАЕ-5, 0УСАЕ-8, Сак1-1, ΒxРС3 или N0^460. Когда опухоли достигали приблизительно 250-300 мм³, мышей случайно распределяли по группам 10-12 животных в каждой и подвергали внутрибрюшинным инъекциям 2-3 раза в неделю, вводя 1В3, ОС101 или 1В3 в сочетании с ОС101. В качестве контрольных групп использовали Ι§Ο человека и/или солевой раствор. Размеры опухолей и вес тела мышей измеряли дважды в неделю. Объем опухоли вычисляли по формуле: π/6 х (длина х ширина²), где длина равна самому длинному диаметру и ширина равна перпендикулярному к длине диаметру. Вычисляли отношение среднего объема опухоли в группе лечения относительно контрольной группы (Т/С%). Статистический анализ проводили с помощью ΐ-теста Стьюдента.

Для изучения влияния противоопухолевой монотерапии антителами к ΡΌΟΡΡβ, мышам дважды в неделю путем внутрибрюшинной инъекции вводили 1В3, нормальный Ι§Ο человека или солевой раствор. В модели ЗК-0У-3 несущие опухоли мыши получали 1В3 в дозировке 6, 20 или 60 мг/кг. У мышей, получавших две более низкие дозы 1В3, не наблюдалось никакого ингибирования роста опухоли (фиг. 3А). В дозе 60 мг/кг 1В3 полностью блокировало рост опухоли вплоть до 29 дней после после начала лечения (Р=0,0028), после чего опухоли начинали быстро расти с такой же скоростью, что в контрольной группе, получавшей Ι§Ο человека, несмотря на продолжавшееся введение антитела (фиг. 3А). Антитело 1В3 (в дозе 60 мг/кг) также демонстрировало значительную противоопухолевую активность в ксенографтных моделях 0У-САЕ-8 и N0^460: оно почти полностью блокировало рост опухолей 0У-САЕ-8 в течение всего лечения (фиг. 3В) (Р=0,0022) и значительно снижало рост опухолей N0^460 (фиг. 3Ρ) (Р<0,05). С другой стороны, 1В3 (в дозировках 40 мг/кг три раза в неделю или 60 мг/кг дважды в неделю) не показало никакой противоопухолевой активности в ксенографтных моделях ВхРС3, 0У-САК-5 и Сак1-1 (фиг. 3С, 3Ό и 3Е). Прием 1В3 не вызывал никакой видимой токсичности, включая изменения веса тела и поведения животного во всех шести обследованных моделях.

Расширение противоопухолевой и антиангиогенной активности антитела к νΈΟΡΡ2 ОС101 с помощью 1В3 в моделях ксенографтных опухолей. Противоопухолевая и антиангиогенная активность антител к νΈΟΡΡ2 была показана на многочисленных моделях с использованием животных (Ριό\\ΜΙ, М. е1 а1., 1999, Сапсег Еек. 59:5209-18). В данной работе мы продемонстрировали, что антитело 1В3 способно повышать противоопухолевую и антиангиогенную активность ОС101 с использованием двух ксенографтных моделей: ВхРС-3 (карцинома поджелудочной железы) и N0-4460 (немелкоклеточная карцинома легкого). Безтимусных голых мышей, несущих ксенографтные опухоли размером 300-350 мм³, случайно распределяли по четырем группам лечения (η=12 на группу) и подвергали три раза в неделю внутрибрюшинной инъекции солевым раствором, 1В3 (40 мг/кг), ОС101 (40 мг/кг) или 1В3 (40 мг/кг) плюс ОС101 (40мг/кг). Как ожидалось, введение ОС101 значительно подавляло рост ксенографтов ВхРСЗ и N0^460 (Р=0,0001 и <0,0001, соответственно) (фиг. 4А и 4В). Монотерапия 1В3 продемонстрировала умеренную противоопухолевую активность в модели NСI-Η460 (Т/С%=66% на 22-й день после лечения, Р=0,0062), но не показало никакой противоопухолевой активности в ксенографтах ВхРС3. Сочетание 1В3 и ОС101 приводило к значительно усиленному подавлению опухоли в модели ВхРС3: Т/С% в конце терапии составляло 27,3% для мышей, которые получали комбинацию, антител по сравнению с 38,7% для мышей, получавших только ОС101 (Р=0,0346). Далее, регрессию опухоли наблюдали у 7 из 12 мышей (58,3%) в группе с комбинацией антител по сравнению с 2 мышами из 11 (18,2%) в группе монотерапии ОС101 и отсутствие регрессии у мышей, получавших только 1В3. В модели NСI-Η460, сочетание 1В3 плюс ОС101 также давало более сильную активность ингибирования опухоли, чем только 1В3 или только ОС101: на 22-й день после лечения Т/С% составляло 22% в группе 1В3 плюс ОС101 по сравнению с 66% в группе 1В3 (Р<0,0001); в конце анализа (50 дней после лечения) средний объем опухоли в группе с комбинацией антител был вдвое меньше, чем в группе с монотерапией ОС101 (813,9±127,8 мм³ против 1660,9±554,4 мм³) (Р=0,025). В то время как в группе с комбинацией антител не было никаких

- 20 019595 смертей, в течение эксперимента в группе Όί.Ί01 две из 12 мышей умерли (одна на 22-й день и другая на 43-й день).

Иммуногистохимия препаратов опухоли

Ксенографтные опухоли из получавших антитела мышей обследовали путем иммуногистохимического окрашивания на плотности сосудов и покрытие сосудов перицитами. На 34-й день (модель ВхРС3) или 50-й день (модель N01-4460) после лечения умерщвляли по шесть мышей из группы монотерапии Ό0101 и комбинированной терапии ЭС101/1В3. Опухоли удаляли, фиксировали в 10% формалине с нейтральным буфером при 4°С в течение суток и заливали парафином. Фиксированные опухоли микротомировали до толщины 6 мкм на микротоме Ье1са ЯМ2135, затем дважды окрашивали на кровеносные сосуды, так и на покрытие перицитами/ГМК.

Срезы опухоли окрашивали антителом к СЭ31 (для окрашивания кровеносных сосудов) и антителом к альфа актину гладких мышц (а-8МА) (для окрашивания перицитов). Срезы сначала инкубировали с антителами крысы РЕСАМ-1 (антитело к СЭ31 мыши, Рйатт1пдеп, 8ап П1едо, СА) при 4°С в течение суток, затем инкубировали с меченными биотином антителами осла к 1дС крысы, затем окрашивали конъюгатом стрептавидин-Су3 (оба от 1асккоп 1ттипоЯе8еатск). Срезы далее окрашивали конъюгатом антитела к а-8МА и МТС (81дта). Наконец, срезы количественно окрашивали ТоРго (Мо1еси1аг РгоЬе, ЬеИеп, №111ег1апб5) при комнатной температуре в течение 5 мин.

Иммунофлюоресцентные снимки (на увеличении 200х) делали с использованием программного обеспечения ΕΖ-ί,Ί 2,20 с помощью цифровой камеры, подключенной к конфокальному микроскопу (N1коп Есбрке ТЕ2000И). Автоматизированный количественный учет морфологии проводили с использованием программного обеспечения 1таде Рго Р1и§ (МеФаСуЬетпабск, 8Пуег 8рппд, МО), анализируя каждый срез.

Из каждого среза отбирали пять цифровых иммунофлюоресцентных снимков периферии и сердцевины опухоли и подсчитывали общие СЭ31⁺ сосуды, а-8МА⁺ сосуды, зрелые сосуды (двойные СЭ31⁺/α8МА⁺) и процент двойных СЭ31⁺/а-8МА⁺ сосудов среди общего числа СЭ31⁺ сосудов. Для измерения степени васкуляризации отдельных срезов опухоли использовали два разных количественных метода: плотность сосудов (число сосудов/мм³) и процент площади сосудов (% площади сосудов в общей области опухоли). Компьютеризованный количественный анализ морфологии проводили с использованием программного обеспечения 1таде Рго Р1и§. Для статистического анализа использовали двухпараметрический дисперсный анализ и критерий наименьшей значимой разности Фишера для множественных сравнений (программное обеспечение 81дта 81а1 3.1 8у51а1 8ойтате, 1пс., Рош! Якйтопб, СА).

Обработка ЭСИИ значительно уменьшала плотность СЭ3Е сосудов в ксенографтах опухоли ВхРС3, главным образом в пределах сердцевины опухоли (фиг. 5А), но оказала только слабый эффект на плотность а-8МА⁺ сосудов (фиг. 5В). Добавление 1В3 к ОС101 не вызывало уменьшения плотности сосудов в сердцевине опухоли, но приводило к существенному уменьшению плотности сосудов на периферии опухоли (фиг. 5А). Антитело 1В3 само по себе не показало никакого значимого эффекта на общую плотность сосудов опухоли (фиг. 5А), но снизило число а-8МА окрашенных на периферии опухоли (фиг. 5В), привело к снижению процента двойных положительных СЭ31/а-8МА (зрелых) сосудов (фиг. 5С). Это указывает на то, что РЭСЕЯв-положительные перициты опухолей были избирательно ингибированы. Интересно, что в обработанных только ЭСИИ и ОС101 плюс 1В3 опухолях степень уменьшения СЭ31⁺-сосудов напрямую коррелирует с уменьшением покрытия а-8МА⁺ перицитов как в сердцевине опухоли, так и на периферии (фиг. 5А и В). В результате, процент зрелых сосудов как на периферии опухоли, так и в сердцевине, то есть, доля двойных СЭ31⁺/а-8МА⁺ сосудов среди общих СЭ31 сосудов, не оказался значительно различающимся между опухолями у мышей, получавших солевой раствор, только ОС101 или ОС101 плюс 1В3 (фиг. 5С). Аналогичные явления также наблюдали на ксенографтах опухоли ΝΟΉ460 (фиг. 5Ό-Ρ). Наконец, почти идентичные наблюдения на обоих ксенографтах опухолей получили в случае, когда степень васкуляризации опухоли определяли с использованием альтернативного способа оценки, в котором измеряют процент площади сосудов среди общей площади опухоли (не показано).

Селекция антитела человека к НРОСЕЯв. Описанную выше библиотеку фагового дисплея скринировали для выявления фага с РаЬ-фрагментом, который связывает РОСРЯР человека. Как было описано ранее для 1В3, последовательности ДНК, кодирующие гены тяжелой и легкой цепей из лучшего связывающего ИРЭСЕЯв клона 2С5 (табл. 1), амплифицировали путем ПЦР и клонировали в вектор экспрессии, содержащий константную область легкой цепи κ человека и константную область тяжелой цепи γ1 человека. Вектором экспрессии трансфецировали клетки миеломы N80 и отбирали стабильные клоны экспрессирующих антитело 2С5 клеток.

Как было определено в ходе анализа В1Асоге, антитело 2С5 связывает ЬРОСРЯв со сходными характеристиками связывания, что и 1В3 связывает шРОСРЯв. Подобно 1В3, антитело 2С5 является специфичным для РОСРЯв и не связывает №ОСЕЯа. Тем не менее, по меньшей мере, в то время как 1В3 связывает РОСРЯв мыши, но не РЭСЕЯв человека, 2С5 связывает оба этих белка (фиг. 6). В одном экс- 21 019595 перименте значения 1С₅₀ для антитела 2С5, определенные методом поверхностного плазмонного резонанса, составляли 1,36х10^-11 М для ΗΡΌΟΕΚβ и 6,05х10^-11 М для тΡ^ΟΕΚβ. Значение 1С₅₀ для связывания 1В3 и ΗΡΌΟΕΚβ составляло 4,17х10^-11 М.

Антитело 2С5 также блокирует связывание ΡΌΟΕ-ВВ с ΡΌΟΕΚβ человека и мыши, как показано на фиг. 6. Значение 1С₅₀ составляло 0,55 нМ для ΗΡΌΟΕΚβ и 0,35 нМ для тΡ^ΟΕΚβ.

Антитело 2С5 подавляет стимулируемое ΡΌΟΕ-ВВ фосфорилирование рецептора и передачу сигнала в тесте на клетках. Способность 2С5 блокировать фосфорилирование ΡΌΟΕΚβ определяли для клеток опухоли человека Сак1-1 (фиг. 7) и мыши ΝΙΗ/3Τ3 и линии клеток Ό122 (фиг. 8). Антитело 2С5 блокировало фосфорилирование рецептора даже в самой низкой проверенной концентрации (1С₅₀<<1,8 мкг/мл). Антитело 2С5 также сильно подавляло стимулируемое ΡΌΟΕ-ВВ фосфорилирование Ак! и р44/42 МАБ киназы в клетках Сак1-1 (фиг. 7) и клетках Ό122 (фиг. 8).

Противоопухолевая активность антител к ΡΌΟΕΚβ в моделях ксенографтных опухолей. Для оценки противоопухолевой активности 2С5 ш νί\Ό использовали пять моделей ксенографтных опухолей человека, которые описывались ранее (ОУСАЯ-5 и ОУСАН-8, ВхРС3, ΝΟΙ-Η460 и Сак1-1). Антитело 2С5, которое связывает и ингибирует рецепторы ΡΌΟΕΚβ в опухолях человека и кровеносных сосудах мыши, сравнивали с 1В3, которое связывается только в кровеносных сосудах мыши. Умеренное уменьшение роста опухоли наблюдали в моделях 8КОУ-3, ОУСАН-8 и ΝΟΙ-Η460, но не в моделях ОУСАН-5, ВхРС3 и Сак1-1 (фиг. 9, табл. 2).

Таблица 2. Монотерапия антителом к ΡΌΟΕΚβ

	Объем	опухоли	МП
1ВЗ	2С5	(флюоресцентный цитосортинг}
Ксенографт	% по		% по
	сравнению	Значение	сравнению	Значение Р
	с	Р теста	с	теста
	контролем		контролем
ЗКОУ-З	57	0,0028	-	-	2
ВхРС-З	100	>0,05	100	>0, 05	1
О7САЕ<-5	92	0,7	84	0, 06	1
СаЫ-1	65	0,1004	91 49	0,6303 0,0733	10
ОУСАН-9	43	0,0022	39	0,0014	5
ЫС1'Н460	60	0,0235	60	0, 0115	2

Противоопухолевая активность сочетания антител к ΡΌΟΕΚβ (2С5)/к тVЕΟΕΚ 2 (ΌΟ101) в моделях ксенографтных опухолей. Антитело 2С5, которое связывает рецепторы ΡΌΟΕΚβ человека и мыши (то есть, рецепторы ΡΌΟΕΚβ как в опухоли, так и в кровеносных сосудах ксенографтов человека и хозяина-мыши), также проверили на ингибирование роста опухоли в сочетании с антителом (ΌΟ01), специфичным для рецептора νΕΟΕΚ2 мыши. Использовали линии ксенографтных клеток ВхРС-3, М1АРаСа-2, Ое!той-562, НСТ-8, ΝΟ-Η460, ИС1-Н292 и НСТ-116. Совместное введение 2С5 и ЦС101 приводило к значительно большему ингибированию роста опухоли, чем любое из антител само по себе (фиг. 10 и табл. 3).

- 22 019595

Таблица 3 Антитело к ΡΌ6ΕΒβ в сочетании с антителом к УЕСТВ2

Антитело	Ксенограф	Модель опухоли	Объем опухоли (СотЬо/0С101 %)	Значение Р теста
1ВЗ + ЦС101	ВхРС-3	Рак поджелудочной железы	65	0,0346
	ЙС1-Н460	Немелкоклеточная карцинома легкого (НМКП)	48	0, 1088
2С5 + ОС101	ОеЕг1оЕ562	Сквамозный рак	65 (40-й день) 40 (74-й день)	0,1146
	ВхРС-3	Рак поджелудочной железы	31	<0,0001
	М1А-РаСа2	Рак поджелудочной железы	49	0,1078
	М1А-РаСа2	Рак поджелудочной железы	75	0,4164
	М1А-РаСа ЬР	Рак поджелудочной железы	200 (по весу)	0,1975
	нет-8	Рак кишечника	4В (30-й день) 121 (41-й день) 36 (49-й день)	0, 001
	НСТ-116	Рак кишечника	80	0,001
	ЫС1-Н460	НИКЛ	61	<0,0001
	ЫС1-Н292	НМКЛ	73	0,3832

Антитело 2С5 подавляет стимулируемую ΡΌ6Ε-ΒΒ миграцию клеток в тесте на клетках. Для определения ингибиторной способности 2С5 на миграцию клеток использовали метод двух камер и линии клеток ΝΕΙ-Η4 60, ОУСАВ8, \ν§-1 и И-118. В верхнюю и нижнюю камеры добавляли коллаген (100 мкг/мл) (100 мкл в верхнюю и 150 мкл в нижнюю) и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. После двухкратной промывки камер ΡΒ8 в верхнюю камеру добавляли 100 мкл голодающих клеток (примерно 1х10⁶/мл в бессывороточной среде) и в нижнюю камеру добавляли 150 мкл бессывороточной среды, затем инкубировали при 37°С в течение 4 ч. Для стимуляции с помощью ΡΌ6Ε-ΒΒ, в нижнюю камеру добавляли ΡΌ6Ε-ΒΒ в конечной концентрации 100 нг/мл. В образцах с антителом 2С5 в верхнюю камеру добавляли 2С5 в конечной концентрации 30 мкг/мл. Немигрировавшие клетки соскабливали с мембраны в верхней камере. После трехкратной промывки ΡΒ8 мигрировавшие клетки на мембране в нижней камере фиксировали 4% формалином и окрашивали красителем ^есЕк! (4 мкг/мл). Результаты фиксировали и клетки считали с помощью флюоресцентной микроскопии. В концентрации 30 мкг/мл антитело 2С5 полностью ингибировало стимулируемую ΡΌ6Ε-ΒΒ миграцию клеток во всех четырех линиях клеток, использованных в тесте (фиг. 11).

Противоопухолевая активность сочетаний антитела к ΡΌ^Ε^ (2С5)/химиопрепарата или антитела к ΡΌ^Κβ (2С5)/химиопрепарата/антитела к тУЕСТ^ (ЭС101) в моделях ксенографтных опухолей. Антитело к ΡΌ6ΕΒβ 2С5 также проверяли на ингибирование роста опухоли в сочетании с химиотерапией (гемцитабин) или химиотерапией (гемцитабин, паклитаксел или оксалиплатин) вместе с антителом к УЕСТВ! (ЭС101). Использовали линии ксенографтных клеток ЫС1-Н292, М1АФаСа-2, ЫС1-Н460 и СЕО. Совместное введение 2С5 и гемцитабина приводило к большему ингибированию роста опухоли, чем 2С5 или гемцитабин сами по себе. Совместное введение 2С5, химиопрепарата и Όί.Ί01 приводило к большему ингибированию роста опухоли, чем сочетание химиопрепарат/ОС101 (фиг. 12 и табл. 4).

- 23 019595

Таблица 4. Антитело к РЭСЕРв в сочетании с химиотерапией и ИС101/химиотерапией

Сочетание	Ксенографт	Модель опухоли	Объем опухоли (СотЬо/геЕ- СЕ1 %)	Значение р теста
гемцитабин	ЫС1-Н292	нмкл	63	0,1753
РС101 + гемцитабин	ЫС1-Н292	нмкл	90	0,5976
БС1О1 + оксалиплатин	СЕО	Рак кишечника	90	0,1759
0СЮ1 + паклитаксел	ΝΟΙ-Η460	НМКЛ	78	0,2692
6С101 + гемцитабин	М1А~РаСа2	Рак поджелудочной железы	52	0,2399

Противоопухолевая активность сочетания антител к РЭСЕРв (2С5)/РЭСЕРа (антитело 3С3 специфическое к ЬРЭСЕРа или 1Е10, специфическое к тРЭСЕРа) в ксенографтных моделях опухолей.

Антитело 2С5 к РЭСЕРв также проверяли на ингибирование роста опухоли в сочетании с антителом к РЭСЕРа. Ксенографтными линиями клеток являлись Сак1-1, НРАС и И-118МС. Совместное применение 2С5 и 3С3 приводит к значительно большему ингибированию роста опухоли, чем любое из антител само по себе (фиг. 13 и табл. 5).

Таблица 5. Антитело к РЭСЕРв в сочетании с антителом к РЭСЕРа

Сочетание	Ксенографт	Модель опухоли	Объем опухоли (СотЬо/ге£- с£1 %)	Значение Р теста
1Е10 (к РбСГКа)	Сак1-1	Рак почки	104	0,9037
	НРАС	Рак поджелудочной железы	56	0/0052
ЗСЗ (к роагкр)	О-118МС	Глиобластома	45	0,0024
	Ц-118МС	Глиобластома	61	0,1346

Эффекты антитела 2С5 на экспрессию РЭСЕРв, РЭСЕ-ВВ и УЕСЕ. Самкам бестимусных мышей подкожно вводили суспензию клеток Ν0ΙΉ460 (5 х 10⁵ клеток/мышь). Когда опухоли достигали ~250 мм³ мышей случайно распределяли по четырем группам лечения (п=35 в каждой, для солевого раствора, 2С5, ИС101 и 2С5 + ИС101). На 3-й, 7-й и 14-й день умерщвляли шесть животных из каждой группы и забирали их опухоли. Лизаты опухолей анализировали с помощью твердофазного ЕЬ18А для определения уровня РИСЕРв, РОСЕ-ВВ. тУЕСЕР2, тУЕСЕ, ЙУЕСЕ, ЕСЕ и Н1Е-1а (фиг. 14).

Антитело 2С5 связывается с доменом 1 (Ό1) и доменом 2 (Ό2) РИСЕРв. Различные химерные конструкции РИСЕРв и РИСЕРа сначала создавали с помощью обмена доменов, начиная с Ν-конца к Сконцу, заменяя домены РИСЕРв на домены РИСЕРа. Химерные рецепторы РИСЕРв/а проверяли на способность связывать 2С5. Затем для подтверждения связывающего 2С5 домена РИСЕРв создали короткие варианты РИСЕРв, включая Ό1Ό2, Ό2Ό3 и Ό1Ό2Ό3. Результаты показали, что 2С5 связывает РИСЕРв как через Ό1, так и Ό2 домен рецептора (фиг. 15 и табл. 6).

- 24 019595

Таблица 6. Картирование эпитопов антитела к РОСЕВЗ

1р4а

2β3α

3β2α

4β1α

!ι5β

т5р

Η5α

112 β/α

η·)2β/α

β1-2

β]-3

β2-3

2С5

X

+

+

+

+

+

X

X

X

+

+

X

ΡϋΟΡΚ-ΑΑ

+

+ слабо

X

X

X

X

+

+ слабо

+ слабо

X

X

X

РОСРК.-ВВ

X

+

+

+

+

+

+ слабо

+ слабо

+

+

X

Список последовательностей

<110>	АймКлсн Системе, Зу, Женлинг	Инк.
<120>	СПЕЦИФИЧНЫЕ ИНГИБИТОРЫ РОСГБр
<130>	11245/55301
<160>	46
<170>	Патентная версия	3.3

<210? 1 <211> 354 <212> ДНК <213> Ногле заргепз <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(354) <400> 1

сад 61п 1

д^д Уа1

сад С1п

сЪд Ьеи

сад дад

Сед Зег

ддд 61у

дда С1у

ддс <31у 10

сСд Ьеи

дСс Уа1

аад Ьуз

ссЬ Рго

ддд С1у 15

ддд С1у

48

С1п 5

С1и

£сс

с£д

ада

сТс

Тсс

Ьд£

дса

дсс

СсИ

дда

ССс

асе

ЬЬс

адЬ

аде

СаЬ

96

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

С1у

РЬе

ТИг

РЬе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

аде

аГд

аас

Ъдд

дЬс

сдс

сад

дсЬ

сса

ддд

аад

ддд

сЬд

дад

Ьдд

дЬс

144

Зег

Ме£

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

ν91

35

40

45

Ьса

Гсс

аГЬ

ад£

ад^

адЪ

адС

адС

Сас

аЬа

Ьас

Ьас

дса

дас

Гсс

дНд

192

Зег

Зег

Не

Зег

Зег

Зег

Зег

Зег

Туг

Не

Туг

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

аад

ддс

едд

асе

а£с

Ъсс

ада

дас

аа1

Ссс

аад

аас

асд

сСд

ЪаС

240

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТИг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТНг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

с£д

саа

аГд

аас

аде

сЬд

ада

дсс

дад

дас

асд

дсс

д^д

еаб

Сае

ЬдС

288

Ьеи

С1п

Ме!:

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

дед

ааа

ддд

ддд

сдс

ссд

сЬе

сСа

дЪс

ыа

дас

ЬСс

Ьдд

ддс

сад

дда

336

А1а

Ьуз

С1у

С1у

Агд

Рго

Ьеи

Ьеи

Уа1

РЬе

Азр

РЬе

Тгр

С1у

С1п

С1у

100

105

110

асе сЬд дЪс асе дЬс Ъса 354

ТИг Ьеи Уа1 ТИг 7а1 Зег

115

<210>	2
<211>	118
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното заргепз
<400>	2

- 25 019595

С1п 7а1 1

С1п

Ьеи

С1п 5

С1и

Зег

61у

Б1у С1у 10

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

С1у 15

Б1у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

01 у

РНе

ТНг

РНе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

Зег

Мек

Азп

Тгр

Уа!

Агд

С1п

А1а

Рго

61у

Ъуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Уа1

35

40

45

Зег

Зег

Не

Зег

Зег

Зег

Зег

Зег

Туг

Не

Туг

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ъуз

С1у

Агд

Рке

ТНг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТНг

Ьеи

Туг

65

ТО

75

80

Ьеи

С1п

Ме!

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

ν$ι

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Ьуз

С1у

С1у

Агд

Рго

Ьеи

Ьеи

Уа1

РНе

Азр

РНе

Тгр

О1у

С1п

С1у

100

105

110

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТНг

Уа!

Зег

115

<210> 3 <211> 15 <212> ДНК <213> Ното зархепз <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(15) <400>3 аде 1а1 аде аС.д аае Зег Туг Зег Ме! Азп <210>4 <211>5 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400>4

Зег Туг Зег Ме! Азп <210>5 <211>51 <212> ДНК <213> Ното зараепз

- 26 019595

<220> <221> <222>	СОЗ (1) ·	(51)
<400>	5
Гее аЬГ	адЬ	ад! адЬ	ад£	ад£	Гас	аса
Зег Не	• Зег	Зех Зег	Зег	Зег	Тух	11е
1		5
ддс
С1у
<210>	6
<211>	17
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното	заргепз
<400>	6
Зег Не	! Зех	Зег Зег	5ег	Зег	Туг	Не
1		5
С1у
<210>	7
<211>	30
<212>	ДНК
<213>	Ното	зархепз
<220>
<221>	СОЗ
<222>	(1) ..	. (30}
<400>	7
ддд ддд сдс	сед с£с	с1а	дЪс	IX	дас
Б Гу С1у Агд	Рго Ьеи	Ьеи	7а1	РНе	Азр
1		5
<210>	8
<211 >	10
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното	заргепз
<400>	8
С1у С1у Агд	Рго Ьеи	Ьеи	Уа1	РЬе	Азр
1		5
<210>	9
<211>	330
<212>	ДНК
<213>	Ното	5ар1еП5

Гас Гас деа дас Гее дГд аад 48

Тух Туг А1а Азр Зег Ή1 Ьуз

15

Тух Тух А1а Азр Зег Уа1 Ьуз

15

ЬЬс 30

РЬе

РЬе <220>

- 27 019595 <221> СОЗ <222> (1)..(330) <400> 9

даа С1и 1

а£Ь Не

дид Уа1

аид Меи

аса ТЬг 5

сад С1п

ЬсЬ Зег

сса Рго

ддс С1у

асе ТЬг 10

С1д Ьеи

ЬсЬ Зег

тлд Ьеи

£с£ Зег

сса Рго 15

999 С1у

даа

ада

дсс

асе

СЬс

Ъсс

£дс

адд

дсс

адЬ

сад

ад11

дЬЬ

аде

аде

аде

С1и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

Зег

Уа1

Зег

Зег

Зег

20

25

30

Ьас

ЪЬа

дсс

*99

иас

сад

сад

ааа

сск

ддс

сад

дс£

ссс

адд

с£с

сЬс

Туг

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

35

40

45

абс

даЕ

дса

исс

аад

адд

дсс

асе

ддс

аис

сса

дсс

адд

СЬс

ад£

Не

Туг

Азр

А1а

Зег

Ьуз

Агд

А1а

ТЬг

С1у

11е

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

50

55

60

ддс

адЬ

ддд

ΐοΐ

ддд

аса

дас

аск

сЬс

асе

а£с

аде

асе

с£а

дад

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

ТЬг

Ьеи

С1и

65

70

75

80

1СЬ

даа

дай

Ьс£

дса

дЬЬ

ГаГ

Ьас

иди

сад

саа

сдЬ

ддс

£ас

Ьдд

ссц

Зег

С1и

Азр

Зег

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

С1п

С1п

Агд

С1у

Туг

Тгр

Рго

85

90

95

ОСС

а^с

асе

ΐία

ддс

саа

ддд

аса

ода

сид

дад

аЬЬ

ааа

еда

Рго

11е

ТЬг

РЬе

С1у

31п

61 у

ТЬг

Агд

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

Агд

100

105

110

<2Ю> :

10

<211>

110

<212> 1

БЕЛОК

<213> 1

Ното

заргепз

<400>

10

С1и

Не

Уа1

МеЬ

ТЬг

С1п

Зег

Рго

С1у

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

1

5

10

15

С1и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

Зег

Уа1

Зег

Зег

Зег

20

25

30

Туг

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

61п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

35

40

45

Не

Туг

Азр

А1а

Зег

Ьуз

Агд

А1а

ТЬг

С1у

11е

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

50

55

60

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Т1е

Зег

ТЬг

Ьеи

С1и

65

70

75

80

Зег

С1и

Азр

Зег

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

С1п

С1п

Агд

С1у

Туг

Тгр

Рго

90 95

- 28 019595

Рго Не ТНг	РНе С1у 100	С1п	С1у	ТИг	Агд 105
<210>	11
<211>	36
<212>	ДНК
<213>	Ното	зарЬепз
<220>
<221>	СОЗ
<222>	11) ..	(36)
<400>	11
адд дсс	: адН	сад адь	дСС	аде	аде	аде
Агд А1а	ι Зет	СЬп Зег	Уа1	Зег	Зег	Зег
1		5
<210>	12
<211>	12
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното	заргепз
<400>	12
Агд А1а Зег	С1п Зег	Уа1	Зег	Зег	Зег
1		5
<210>	13
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Ното	заргепз
<220>
<221>	СОЗ
<222>	(1) .	> (21Ϊ
<400>	13
да£ дса £сс	аад адд	дсс	асе
Азр А1а Зег	Ьуз Агд	А1а	ТЫ
1		5
<210>
<211 >	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното	заргепз
<400>	14
Азр А1а Зег	Ьуз Агд	А1а	ТИг
1		5
<210>	15
<211>	30
<212>	ДНК
<213>	Ното	заргепз

Ьеи С1и Не Ьуз Агд

110

Туг Ьеи А1а

Гас Ыа дсс 36

Туг Ьеи А1а

- 29 019595 <220>

<221> СЬЗ <222> (1)..(30) <400> 15

сад	саа сдЬ	ддс	Гас	Гдд ось	ссс аСс	асе	30
<31п	С1п Агд	О1у	Туг	Тгр Рго	Рго Не	ТЬг
1			5			10

<210>	16
<211>	10
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното	зархепз
<400>	16
С1п 61т1	ι Агд	С1у Туг Тгр Рго Рго	11е ТЫ
1		5	10

<210> 17 <211> 360 <212> ДНК <213> Ното зархепз <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(360) <400> 17

сад дЬд сад

сЬд дСд сад

гсЬ Зег

ддд О1 у

дсГ А1а

дад дГд аад аад

есс Рго

ддд С1у 15

ГСО Зег

48

О1п 1

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1 5

С1п

С1и 10

Уа1

Ьуз Ьуз

Ьсд

9*9

аад

дЬс

Гсс

Где

аад

дсГ

ГсЪ

дда

ддс

асе

ЬГс

аде

аде

ЬаЬ

96

Зег

Уа1

ЬуЗ

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

С1у

ТЬг

РЬе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

дсЬ

аГс

аде

гдд

дЬд

еда

сад

дсс

ссг

дда

саа

ддд

сЫ:

дад

гдд

аГд

144

А1а

11е

Зег

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

01п

С1у

Ьеи

(31и

Тгр

МеГ

35

40

45

дда

адд

аГс

аЬс

есГ

аГс

егь

ддЬ

аЬа

дса

аас

гас

дса

сад

аад

ЬГс

192

С1у

Агд

11е

11е

Рго

11е

Ьеи

<31у

11е

А1а

АЗП

Туг

А1а

С1п

Ьуз

РЬе

50

55

60

сад

ддс

ада

дЬс

асд

аГГ

асе

дед

дас

ааа

Ьсс

асд

аде

аеа

дсс

Гас

240

С1п

С1у

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТНг

А1а

Азр

Ьуз

Зег

ТЬг

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

аЬд

дад

сГд

аде

аде

еЬд

ада

ЬеЬ

дад

дае

асд

дес

дСС

гаг

Гас

ьдь

288

МеГ С1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег 61и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз

90 95

дед А1а

ада даь Агд Азр

аГд МеЬ 100

99* С1у

Ьса Зег

адд ааЬ ЬаС. ГаС

Гас Туг

СГс Гас Ьдд ддс

сад С1п

Агд

Азп Туг 105

Туг

РЬе

Туг

Тгр 110

С1у

дда

асе

сГд

дСс

асе

дГс

Гса

аде

31у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210> 18 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400>18

С1п 1

Уа1

С1п

Ьеи \7а1 С1п Зег 5

С1у

А1а

С1и Уа1 10

Ьуз

Ьуз

Рго

С1у 15

8ег

Зег

Уа1

Ьуз

νβΐ

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

С1у

ТНг

РНе

Зег

8ег

Туг

20

25

30

А1а

Не

Зег

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

01у

О1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

МеС

35

40

45

61у

Агд

Не

Не

Рго

Не

Ьеи

С1у

11е

А1а

Азп

Туг

А1а

С1п

Ьуз

РНе

50

55

60

С1п

С1у

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТНг

А1а

Азр

Ьуз

Зег

ТНг

Зег

ТНг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеС

С1и

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

Агд

Зег

С1и

Азр

ТНг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Азр

МеС

С1у

Зег

Агд

Азп

Туг

Туг

Туг

РНе

Туг

Тгр

С1у

С1п

100

105

110

С1у

ТНг

Ьеи

Уа1

ТНг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210>19 <211>15 <212> ДНК <213> Ното зархепз <220>

<221> СБЗ <222> (1)..(15) <400>19 аде СаС дсС асе аде15

Зег Туг А1а Не Зег <210> 20 <211>5 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400>20

Зег Туг А1а Не Зег

- 31 019595

<210> <211> <212> <213>

21 51 ДНК Ното заргепз

<220> <221> <222>	С05 (1) ..	(51)
<400>	21
адд аЕс	аЕс	ссЕ аЕс	οίί	дд!	аЕа	дса
Агд Не	Не	Рго 11е	Ьеи	С1у	11е	А1а
1		5
ддс
С1у
<210>	22
<211>	17
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното	зархепз
<400>	22
Агд 11е	, Не	Рго 11е	Ьеи	С1у	11е	А1а
1		5
С1у
<210>	23
<211>	33
<212>	ДНК
<213>	Ното	зарТепз
<220>
<221>	СОЗ
<222>	(1) ..	С 33)
<400>	23
даН аСд ддЕ	Еса адд	ааН	ЕаЕ	ЕаЕ	Ъас
Азр Мер С1у	Зег Агд	Азп	Туг	Туг	Туг
1		5
<210>	24
<211>	11
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното	зар1епз
<4 00>	24
Азр МеС С1у	Бег Агд	Азп	Туг	Туг	Туг
1		5

аас бас дса сад аад 'Х.с сад 48

Азп Туг А1а С1п Ьуз РНе С1п

15

Азп Туг А1а С1п Ьуз РЬе С1п

15

ЕЕс Нас 33

РЬе Туг

РЬе Туг

- 32 019595

<210>	25
<211>	324
<212>	ДНК
<213>	Ното заргепз

<220>
<221>	СДЗ
<222>	(1) . .(324)

<400> 25

даа С1и 1

а-Ы: 11е

дбд Уа1

сРд асР

сад 61п

РсР Зег

сса дсс асе

СРд Ьеи

ьсь Зег

РЬд Ьеи

РсР Зег

сса Рго 15

ддд С1у

Ьеи

ТЬг 5

Рго

А1а

ТЬг ю

даа

ада

дсс

асе

сРс

Рсс

Рдс

адд

дсс

адР

сад

а др

дРР

ддс

адд

Рас

С1и

Агд

А1а

гьг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

Зег

Уа1

С1у

Агд

Туг

20

25

30

РРа

дсс

Рдд

Рас

саа

сад

ааа

ССР

ддс

сад

дсР

ссс

адд

ср с

СРс

аРс

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

61п

Ьуз

Рго

61у

С1п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

Не

35

40

45

РаР

ддЬ

дса

Рсс

аас

адд

дсс

асР

ддс

аРс

сса

дсс

адд

РРс

адр

ддс

Туг

С1у

А1а

Вег

Азп

Агд

А1а

ТЬг

С1у

Не

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

61у

50

55

60

адр

ддд

РеР

ддд

аса

дас

РРс

асР

сРс

асе

аРс

аде

аде

сРа

дад

ССР

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи

С1и

Рго

65

70

75

80

даа

дар

РРР

дса

дрр

РаР

Рас

РдР

сад

сад

с др

аде

аас

рдд

ССР

СР с

С1и

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

С1п

С1п

Агд

Зег

Азп

Тгр

Рго

Ьеи

85

90

95

асР

РРс

ддс

дда

ддд

асе

аад

дрд

дад

аРс

ааа

еда

ТЬг

РЬе

С1у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

С1и

11е

Ьуз

Агд

100

105

<210>

26

<211>

108

<212> :

БЕЛОК

<213>

Ното

зар1еп&

<400>

26

С1и

Не

Уа1

Ьеи

ТЬг

61п

Зег

Рго

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

(31у

1

5

10

15

С1и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

01п

Зег

УаЬ

С1у

Агд

Туг

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

61у

А1а

Зег

Азп

Агд

А1а

ТЬг

С1у

11е

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

С1у

50

55

60

- 33 019595

Зег

С1у

Зег

С1у

ТНг

Азр

Рке

ТЬг

Ьеи

ТНг

11е

Зег Зег

Ьеи С1и

Рго

С1и

Авр

РНе

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

С1п

С1п

Агд

Зег Азп

Тгр Рго

Ьеи

Ткг

РЬе <31 у (31у

100

С1у ты

Ьуз

Уа1

С1и

105

Не

Ьуз

Агд <210>

<211>

<212>

<213>

ДНК

Ното зархепз <220>

<221>

<222>

СОЗ (1)..(33) <400>

адд дсс адк

Агд А1а Зег сад адЬ <31п Зег д|. |.

Уа1 ддс

С1у адд Агд

Нас

Туг

Ька

Ьеи дсс

А1а <210>

<211>

<212>

<213>

БЕЛОК Ното ;

зартепз <4 О0>

Агд А1а Зег

С1п Зег

Уа1

С1у

Агд

Туг

Ьеи

А1а <210> <211>

<212>

<213>

ДНК

Ното зархепз <220>

<221>

<222>

СОЗ (1)..(21) <400> ддк дса Осс

С1у А1а Зег аае

Азп адд

Агд дсс

А1а асЬ

Ткг

<210>	30
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното :
<400>	30
С1у А1а 5ег ;

зархепз

Азп Агд

А1а

Ткг

- 34 019595

<210>	31
<211>	27
<212>	ДНК
<213=	Ното зарЬепз

<220>
<221>	СйЗ
<222>	(1) -	(27)
<400>	31
сад сад	ι сдГ	аде аас !дд ссе сес асе

61п С1п Агд Зег Азп Тгр Рго Ьеи ТЬг

1	5
<210>	32
<211>	9
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното зарЬепз
<400>	32
С1п С1п Агд Зег Азп Тгр Рго Ьеи ТЬг
1	5

<210>	33
<211>	348
<212>	ДНК
<213>	Ното

<220>

<221= СОЗ

<222>

(1) ..

(348)

<400> 33

дад

д(:д

сад

сед

дЬд

сад

есе

ддд

дда

ддс

сед

дЬс

аад

ссе

ддд

ддд

48

Б1и

Уа1

Б1п

Ьеи

Уа1

С1п

Зег

С1у

С1у

С1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

С1у

С1у

1

5

10

15

есс

сГд

ада

сйс

есс

ГдЬ

деа

дсс

есе

дда

еес

асе

еес

аде

аде

ГаС

96

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

61у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

аде

аЬд

аас

Сдд

дес

сдс

сад

дсе

сса

ддд

аад

ддд

сед

дад

едд

дГс

144

Зег

Мег

Азп

Тгр

Уа1

Агд

Б1п

А1а

Рго

Й1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

ν31

35

40

45

еса

Гсс

аее

аде

аде

адЬ

аде

аде

еас

аГа

еас

Гас

деа

дас

еса

дГд

192

Зег

Зег

Не

Зег

Зег

Зег

Зег

Зег

Туг

Не

Туг

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

аад

ддс

еда

еес

асе

аГс

есс

ада

дас

аас

дсс

аад

аас

еса

сед

ГаГ

240

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Αερ

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

65

70

75

80

сед

саа

аед

аас

аде

скд

ада

дсс

дад

дас

асд

дсГ

дед

еае

Ъас

ГдГ

288

Ьеи

С1п

Мее

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А! а

С1и

Αερ

ТНг

А1а

Уа!

Туг

Туг

Суз

85

90

95

- 35 019595

дед ада

дбе

аса да!

дс£

ььс

да!

аес

едд

ддс

саа

ддд

аса

аЬд

до с

336

А1а Агд

Уа1

ТЬг Азр

А1а

РЬе

Азр

Не

Тер

01у

С1п

С1у

ТЬг

МеЪ

Уа1

100

105

110

асе д£с

еса

аде

34 8

ТЬг 7а1

Зег

Зег

115

<210> :

34

<211>

116

<212> !

□ЕЛОК

<213> 1

4огпо

эарХепз

<4оо> :

3-5

С1и Уа1

С1п

Ьеи Уа1

31п

Зег

С1у

С1у

С1у

Ьеи

Уа!

Ьуз

Рго

С1у

С1у

1

5

10

15

Зег Ьеи

Агд

Ьеи Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

31у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

Зег Меб

Азп

Тгр Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Уа1

35

40

45

Зег Зег

Не

Зег Зег

Зег

Зег

Зег

Туг

Не

Туг

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз С1у

Агд

РЬе ТЬг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи С1п

МеЪ

Азп Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а Агд

Уа1

ТЬг Азр

А1а

РЬе

Азр

Не

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Μβΐ

Уа1

100

105

НО

ТЬг Уа1

Зег

Зег

115

<210>

35

<211>

321

<212>

ДНК

<213>

Ното

5ар1еп5

<220>

<221>

СОЗ

<222>

(1) .

,(321)

<400

35

даа асе

дед

аЪд аса

Сад

и С и

еса

дсс

асе

с£д

Нд

Г пГ

еса

ддд

48

С1и Не

! Уа1

МеГ ТЬг

С1п

Зег

Рго

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

61у

1

5

10

15

даа ада

. дсс

асе сЕс

£сс

Ьдс

адд

дсс

адР

сад

ад£

д11Ъ

аде

аде

Рас

96

- 36 019595

С1и Агд

А1а

Ткг 20

Ьеи

Зег

Суз Агд

А1а 25

5ег

С1п

Зег

Уа1

Зег 30

Зег

Туг

кка

дсс

!дд

кас

саа

сад

ааа

сс!

ддс

сад

дек

ссс

адд

скс

скс

акс

144

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

Не

35

40

45

как

да!

!са

ксс

аае

адд

дсс

ас!

ддс

акс

сса

дсс

ада

ккс

адк

ддс

192

Туг

Азр

Зег

Зег

Азп

Агд

А1а

ТНг

С1у

Не

Рго

А1а

Агд

Рке

5ег

С1у

50

55

60

адк

ддд

!с!

ддд

аса

дас

ккс

ас!

с!с

асе

акс

аде

аде

ска

дад

сск

240

Зег

01 у

Зег

С1у

Ткг

Азр

Рке

ТНг

Ьеи

Ткг

11е

5ег

Зег

Ьеи

С1и

Рго

65

70

75

30

даа

да!

!!!

дса

аск

как

кас

!д!

с!а

сад

сак

аае

ас!

ккк

сск

ссд

288

αία

Азр

РНе

А1а

Ткг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

С1п

ΕΪ3

Азп

ТЬг

Рке

Рго

Рго

85

90

95

асд

!!с

ддс

саа

ддд

асе

аад

д!д

даа

акс

ааа

321

Ткг

РНе

С1у

С1п

С1у

Ткг

Ьуз

Уа1

С1и

Не

Ьуз

100 105 <210> 36 <211> 107 <212> БЕЛОК

<213

|> Ното

зар1

епз

<400> 36

С1и

11е

7а1

Ме!

ТЫ

С1п

Зег

Рго

А1а

ТНг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

61 у

1

5

10

15

61и

Агд

А1а

ТНг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Бег

С1п

Зег

Уа1

Зег

Зег

Туг

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

61п

Ьуз

Рго

С1у

СЬп

А1а

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

Азр

Зег

Зег

Азп

Агд

А1а

Ткг

С1у

11е

Рго

А1а

Агд

Рке

Зег

С1у

50

55

60

Зег

<31у

Зег

С1у

Ткг

Азр

Рке

Ткг

Ьеи

ТНг

11е

Бег

Зег

Ьеи

С1и

Рго

65

70

75

80

С1и

Азр

Рке

А1а

Ткг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

С1п

Н1з

Азп

ТЬг

Рке

Рго

Рго

85

90

95

ТНг

РНе

С1у

51п

С1у

ТНг

Ьуз

Уа1

С1и

11е

Ьуз

100 105

<210>	37
<211>	321
<212>	ДНК
<213>	Ното зархепз

- 37 019595

<22С

)>

<221

> СОЗ

<222

!>

(I). -

(321

.)

<40С

» 37

дас

акс

сад

акд

асе

сад

кек

сса

кек

ксс

дкд

кек

дса

кек

ака

дда

48

Азр

Не

С1п

Мек

ТЬг

С1п

Зег

Рго

Зег

Зег

Уа1

Зег

А1а

Зег

Не

С1у

1

5

10

15

дас

ада

дкс

асе

акс

аск

кдк

едд

дед

адк

сад

ддк

акк

дас

аас

кдд

96

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

С1у

Не

Азр

Азп

Тгр

2С

25

30

кка

ддс

Ьдд

как

сад

сад

ааа

сск

ддд

ааа

дсс

сск

ааа

скс

скд

акс

144

Ьеи

С1у

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

35

40

45

кас

дак

дса

ксс

аак

ккд

дас

аса

ддд

дке

сса

кеа

адд

ккс

адк

дда

192

Туг

Азр

А1а

Зег

Азп

Ьеи

Азр

ТЬг

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

₽Ье

Зег

С1у

50

55

60

адк

дда

кек

ддд

аса

как

ккк

аск

скс

асе

акс

адк

аде

скд

саа

дек

240

Зег

С1у

Зег

01 у

ТНг

Туг

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТИг

Не

Зег

Зег

Ьеи

С1п

А1а

65

70

75

80

даа

дак

ккк

дса

дкк

как

ккс

кдк

саа

сад

дек

ааа

дек

ккк

сск

ссс

288

С1и

Адр

РНе

А1а

Уа1

Туг

РИе

Суз

С1п

С1п

А1а

Ьуз

А1а

РЬе

Рго

Рго

85

90

95

аск

ккс

ддс

дда

ддд

асе

аад

дкд

дас

акс

ааа

321

ТИг

РЬе

С1у

О1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

Αερ

Не

Ьуз

100

105

<210>

38

<211>

107

<212>

БЕЛОК

<213>

Ното

заргепз

<400>

38

Азр

Не

С1а

Мек

ТИг

С1п

Зег

Рго

Зег

Зег

Уа1

Зег

А1а

Зег

11е

С1у

1

5

10

15

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

СНу

11е

Азр

Азп

Тгр

20

25

30

Ьеи

С1у

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

Азр

А1а

Зег

Азп

Ьеи

Азр

ТЬг

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Туг

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТНг

Не

Зег

Зег

Ьеи

С1п

А1а

65

70

75

50

С1и

Азр

РНе

А1а

Уа1

Туг

РЬе

Суз

С1п

С1п

А1а

Ьуз

А1а

РЬе

Рго

Рго

85

90

95

- 38 019595

ТНг	РНе	С1у	61у 100	£1у ТЬг	Ьуз	Уа1	Азр 105
<210> 39
<211? 348
<212> ДНК
<213> Миз шизси1из
<220>
<221> СОЗ
<222> (	:υ. -	(348)
<400> 39
сад	д£с	ааа	с£д	сад	сад	ΐ с£	ддд	дса
С1п	Уа1	Ьуз	Ьеи	С1п	С1п	Зег	С1у	А1а
1				5
£са	дЪс	аад	1.1д	Ьсс	Ьдс	аса	дсЪ	ЬсЪ
Зег	7а1	Ьу5	Ьеи	Зег	Суз	ТЬг	А1а	Зег
			20					25
ЪаН	аЪа	сас	идд	д£д	аад	сад	аде	сс£
Туг	Не	ΗΪ3	Тгр	Уа1	Ьуз	С1п	Зег	Рго
		35					40
дда	адд	а£с	даЬ	ссЬ	ссд	ааН	да£	аа£
С1у	Агд	11е	Азр	Рго	Рго	Азп	Азр	Азп
	50					55
сад	ддс	аад	дсс	асС	аЬа	аса	дса	дас
61п	(31у	Ьуз	А1а	ТЬг	11е	ТЬг	А1а	Азр
65					70
аСд	сад	сСс	сдс	аде	с£д	аса	ΐσί:	дад
МеЪ	С1п	Ьеи	Агд	Зег	Ьеи	ТЬг	Зег	С1и
				85
дсс	сЬс	сса	ссд	иис	£ас	ΐίΐ	дас	Нас
А1а	Ьеи	Рго	Рго	РЬе	Туг	РЬе	Азр	Туг
			100					105
асе	д£с	Ьсс	£са
ТЬг	Уа1	Зег	Зег
		115

11е	Ьуз
дад	сне	дЬс	аад	сса	ддд	дсс	48
61и 10	Ьеи	Уа1	Ьуз	Рго	С1у 15	А1а
ддс	ЪЬс	аас	аЪ5	ааа	дас	асе	96
С1у	РНе	Азп	11е	Ьуз 30	Азр	ТНг
даа	сад	ддс	с£д	дад	идд	аЪЬ	144
С1и	С1п	С1у	Ьеи 45	С1и	Тгр	11е
ас!	ааа	Ъан	дас	сед	аад	Не	192
ТЬг	Ъуг	Туг 60	Азр	Рго	Ьуз	РЬе
аса	Нсс	£сс	ааЬ	аса	дсс	Ъас	240
ТНг	Зег 75	Зег	Азп	ТЬг	А1а	Туг 80
дас	асС	дсс	дНс		1ас	Ьд1	288
Азр 90	ТНг	А1а	Уа1	Туг	Туг 95	Суз
Сдд	ддс	саЬ	ддс	асе	асд	дЬс	336
Тгр	С1у	ΗΪ5	С1у	ТЬг 110	ТЬг	Уа1	348

<210>	40
<211>	116
<212>	БЕЛОК
<213>	Миз тизси1из
<4 00=	40
С1п Уа1 Ьуз Ьеи С1п С1п	Зег С1у А1а С1и	Ьеи Уа1 Ьуз Рго С1у А1а
1	5	10	15

Зег Уа1 Ьуз

Ьеи Зег Суз ТНг А1а Зег С1у РЬе Азп Не

25

Ьуз Азр ТЬг

- 39 019595

Туг

Не

ΗΪ3 35

Тгр

Уа1

Ьуз

СЬп

Зег 40

Рго

СЬи

СЬп

СЬу

Ьеи 45

СЬи

Тгр

1Ье

СЬу

Агд

Не

Азр

Рго

Рго

Азп

Азр

Азп

Ткг

Ьуз

Туг

Азр

Рго

Ьуэ

Рке

50

55

60

СЬп

СЬу

Ьуз

А1а

Ткг

11е

Ткг

АЬа

Агр

Ткг

Зег

Зег

Авп

Ткг

АЬа

Туг

65

70

75

80

Мек

СЬп

Ьеи

Агд

Зег

Ьеи

Ткг

Зег

СЬи

Азр

Ткх

АЬа

УаЬ

Туг

Туг

Суз

85

90

95

АЬа

Ьеи

Рго

Рго

Рке

Туг

Рке

Азр

Туг

Тгр

СЬу

ΗΪΞ

СЬу

Ткг

Ткг

УаЬ

100 105 110

ТЬг УаЬ Зег Зег

115 <210> 41 <211> 327 <212> ДНК <213> Мне тизси1из

<220> <221> СОЗ

ί 327

')

<222> (

ы..

<400> 4Ь

дас

акс

дад

скс

аск

сад

кек

сеа

ааа

кк с

акд

ксс

аса

кса

дка

дда

Азр

ТЬе

СЬи

Ьеи

Ткг

СЬп

Зег

Рго

Ьуз

Рке

Мек

Зег

Ткг

Зег

УаЬ

СЬу

1

5

10

15

дас

адд

дкс

аде

дке

асе

кде

аад

дсс

адк

сад

аак

дьд

дак

аск

а а к

Азр

Агд

УаЬ

8ег

УаЬ

Ткг

Суз

Ьуз

А1а

Зег

СЬп

Азп

УаЬ

Азр

Ткг

Азп

20

25

30

дка

дсс

кдд

как

саа

сад

ааа

сса

ддд

саа

кек

сек

ааа

деа

скд

акк

УаЬ

АЬа

Тгр

Туг

СЬп

СЬп

Ьуз

Рго

СЬу

СЬп

Зег

Рго

Ьуз

АЬа

Ьеи

1Ье

35

40

45

кас

кед

дса

кос

кас

едд

кас

адк

дда

дке

ОСЬ

дак

сдс

ккс

аса

ддс

Туг

Зег

АЬа

Зег

Туг

Агд

Туг

Зег

СЬу

УаЬ

Рго

Аэр

Агд

Рке

Ткг

СЬу

50

55

60

адк

дда

Ьск

959

аса

дак

ккс

аск

скс

асе

акс

аде

аак

дЬд

сад

кек

Зег

СЬу

Зег

СЬу

Ткг

Азр

Рке

Ткг

Ьеи

Ткг

11е

Зег

Азп

УаЬ

СЬп

Зег

65

70

75

80

даа

дас

ккд

дса

дад

как

ккс

кдк

сад

саа

как

аас

аде

ΐϊϊ

ССк

кас

СЬи

Азр

Ьеи

АЬа

СЬи

Туг

Рке

Суз

СЬп

СЬп

Туг

Азп

5ег

Рке

Рго

Туг

85

90

95

асд

ккс

дда

999

ддд

асе

аад

скд

даа

ака

ааа

едд

дед

Ткг

Рке

СЬу

СЬу

СЬу

Ткг

Ьуз

Ьеи

СЬи

Не

Ьуз

Агд

АЬа

100 105

- 40 019595 <210>42 <2Η>109 <212> БЕЛОК <213> Миз тизси1из <400>42

Азр 1

Не 61и

Ьеи

тьг е1п 5

Зег

Рго Ьуз

РЬе 10

Не!

Зег

ТЬг

Зег

Уа1 15

61у

Азр

Агд

Уа1

Зег

Уа1

ТЬг

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1п

Азп

Уа1

Азр

ТНг

Азп

20

25

30

Уа1

А1а

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

61 у

61П

Зег

Рго

Ьуз

А1а

Ьеи

Не

35

40

45

тух

Зег

А1а

Зег

Туг

Агд

Туг

Зег

С1у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РНе

ТНг

С1у

50

55

60

Зег

61у

Зег

61у

ТЬг

Азр

РЬе

ТНг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Азп

Уа1

С1п

Зег

65

70

75

80

61и

Азр

Ьеи

А1а

61и

Туг

РЬе

Суз

С1п

61п

Туг

Азп

Зег

РЬе

Рго

Туг

65

90

95

ТЬг

РЬе

61 у

С1у

01 у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

<31и

Не

Ьуз

Агд

А1а

100 105 <210>43 <211>378 <212> ДНК <213= Ното зараепз <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(378)

<400> 43

дьд дад ЬсЬ Уа1 С1и Зег 5

ддд 61 у

дда ддс

дъд Уа1

дЪс Уа1

сад НсЪ ддд

адд Агд

46

сад СДп 1

дед А1а

сад С1п

дЬд Уа1

С1у

61у 10

61п

Зег

С1у 15

Ъсс

с^д

ада

сЬс

Ьсс

Ьд!

дса

дед

ксИ

дда

ЬЪс

дсс

Ис

адЬ

аде

Ьас

96

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

61у

РНе

А1а

РЬе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

ддс

а£д

сас

ьдд

д£с

сдс

сад

дсЬ

сса

ддс

аад

ддд

сЬд

дад

Ьдд

дЬд

14 4

С1у

Мег

ΗΪ5

Тгр

Уа1

Агд

61п

А1а

Рго

61 у

Ьуз

С1у

Ьеи

61и

Тгр

Уа1

35

40

45

дса

ςϊΐ

аНа

Ьдд

ЬаЬ

даЬ

дда

аде

ааг

ааа

кас

ьЗь

дса

дас

Ьсс

дЬд

192

А1а

νάΐ

Не

Тгр

Туг

Азр

С1у

Зег

Азп

Ьуз

Туг

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

адд

ддс

еда

Ис

асе

аЬс

Ьсс

ада

дас

ааЬ

Ъсс

дад

аас

асд

С1д

На!

240

- 41 019595

Агд 65

С1у

Агд РЬе

ТЬг

11е 70

Зег Агд Азр

Азп. Бег 75

С1и

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг 80

сГд

саа

аЕд

аас

аде

сЕд

ада

дес

дад

дас

асе

дсЕ

дЕд

ЕаЕ

Нас

сдь

Ьеи

С1п

МеЕ

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

61и

Азр

ТИг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

дсс

ада

даЕ

сас

ЕаЕ

дд£

Есд

ддд

днд

сас

сас

ЕаЕ

ЕЕС

Еас

Еас

ддЕ

А1а

Агд

Азр

Ηίβ

Туг

С1у

Зег

61 у

Уа1

ΗΪ3

ΗΪΞ

Туг

РЬе

Туг

Туг

С1у

100

105

110

сЪд

дас

дЕс

Едд

ддс

саа

ддд

асе

асд

дЪс

асе

дЕс

Есс

Еса

Ьеи

Азр

Уа1

Тгр

61у

С1п

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

Тпг

Уа1

Зег

Зег

115 120 125 <210> 44 <211> 126 <212> БЕЛОК

<213> Ното

заргепз

<400> 44

61п А1а

С1п

Уа1 Уа1

61и

Зег

С1у

С1у

61у

Уа1

Уа1

61п

Зег

61у

Агд

1

5

10

15

Зег Ьеи

Агд

Ьеи Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

61у

РЬе

А1а

РЬе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

С1у МеЕ

ΗΪ3

Тгр Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

61у

Ьеи

С1и

Тгр

Уа1

35

40

45

А1а Уа1

11е

Тгр Туг

Азр

е1у

Зег

Азп

Ьуз

Туг

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Агд 61у

Агд

РЬе ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

61и

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи С1л

МеЕ

Азп Зег

Ьеи

Агд

А1а

61 и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а Агд

Азр

Ηί3 Туг

С1у

Зег

61у

Уа1

Ηίε

Нхз

Туг

РЬе

Туг

Туг

61у

100

105

110

Ьеи Азр

Уа1

Тгр 61у

61п

С1у

ТЬг

ТНг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

125

<210>

45

<211>

324

<212>

ДНК

<213>

Ното

зарЬепя

<220>

<221>

СОЗ

<222>

(1) .

.(324)

- 42 019595 <400> 45

даа 0111 1

а! к Не

дкд \Га1

!!д Ьеи

асд Ткг 5

сад С1п

1С! Зег

сса Рго

ддс С1у

асе Ткг 10

скд Ьби

кек Зег

Пд Ьеи

кек Зег

сса Рго 15

ддд С1у

48

даа

ада

дес

асе

скс

!сс

!дс

адд

дсс

ад!

сад

ад!

д!!

аде

аде

аде

96

С1и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

Зег

Уа1

Зег

Зег

Зег

20

25

30

кас

кка

дсс

!дд

1 ас

сад

сад

ааа

сск

ддс

сад

дек

ОСС

адд

скс

скс

144

Туг

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

35

40

45

акс

!ак

дд!

дса

!сс

аде

адд

дсс

ас!

ддс

а!с

сса

дас

адд

ккс

ад!

192

Не

Туг

С1у

А1а

Зег

Зег

Агд

А1а

Ткг

С1у

Не

Рго

Азр

Агд

Рке

Зег

50

55

60

ддс

ад!

ддд

!с!

ддд

аса

дас

Ис

ас!

с!с

асе

а!с

аде

ада

с!д

дад

240

С1у

бег

С1у

бег

01у

ТЬг

Азр

Рке

Ткг

Ьеи

ткг

11е

Зег

Агд

Ьеи

С1и

65

70

75

80

ос!

даа

да!

П!

дса

д!д

!ак

кас

кд!

сад

сад

как

дд!

аде

кса

ссд

288

Рго

61и

Азр

Рке

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

С1п

О1п

Туг

С1у

Зег

Зег

Рго

35

90

95

скс

ас!

ПС

ддс

дда

ддд

асе

аад

д!д

дад

акс

ааа

324

Ьеи

Ткг

Рке

С1у

О1у

С1у

Ткг

Ьуз

Уа1

61и

Не

Ьуз

100 105 <210> 46 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 46

С1и 1

11е

Уа1

Ьеи Ткг 5

С1п

Зег

Рго

С1у Ткг 10

Ьеи Зег Ьеи

Зег

Рго 15

С1у

С1и

Агд

А1а

Ткг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

Зег

Уа1

Зег

Зег

Зег

20

25

30

Туг

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

01п

С1й

Ьуз

Рго

С1у

С1п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

35

40

45

Не

Туг

С1у

А1а

Зег

Зег

Агд

А1а

Ткг

С1у

Не

Рго

Азр

Агд

Рке

Зег

50

55

60

С1у

Зег

С1у

Зег

<31у

Ткг

Азр

Рке

Ткг

1еи

ТЫ

Не

Зег

Агд

Ьеи

С1и

65

70

75

80

Рго

С1и

Азр

Рке

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

С1п

С1п

Туг

С1у

Зег

Зег

Рго

85

90

ой

Ьеи

Ткг

Рке

01у

С1у

С1у

Ткг

Ьуз

Уа1

61и

Не

Ьуз

100

105

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (8)

1. Антитело или его функциональный фрагмент, которое связывает ΡΌΟΕΚβ человека, включающее гипервариабельные участки: СОЕН1, имеющий последовательность δΥΑΙδ (δΕΟ ΙΌ ЫО:20), СОНН2, имеющий последовательность ΚΙΙΡΙΌΟΙΑΝΥΑρΚΕρΟ (δΕΟ ΙΌ ЫО:22), СОНН3, имеющий последовательность ^МΟδΚNΥΥΥΕΥ (8Е0 ΙΌ ЫО:24), СОНЫ, имеющий последовательность ΚΑδρδνΟΚΥΌΑ (8Е0 ΙΌ ЫО:28), ΕΌΚΡΣ, имеющий последовательность ΟΑδΝΚΑΤ (δΕΟ ΙΌ ЫО:30), и СОИЕ3, имеющий последовательность ΟΟΚδΝνΡΡΤ (δΕΟ ΙΌ ЫО:32).

2. Антитело или его функциональный фрагмент по п.1, отличающееся тем, что включает последовательность аминокислот вариабельного домена тяжелой цепи δΕΟ ΙΌ ΝΌ:26 и последовательность аминокислот вариабельного домена легкой цепи δΕΟ ΙΌ ΝΌ:18.

3. Антитело или его функциональный фрагмент по любому из пп.1 и 2, отличающееся тем, что содержит константную область тяжелой цепи γ1 человека и константную область легкой цепи к человека.

4. Применение антитела или его функционального фрагмента по любому из пп.1-3 в лечении рака.

5. Применение по п.4, отличающееся тем, что рак представляет собой рак яичника, немелкоклеточную карциному легкого, рак поджелудочной железы, рак толстой кишки или глиобластому.

6. Фармацевтическая композиция для применения в лечении рака, включающая антитело или его

- 43 019595 функциональный фрагмент по любому из пп.1-3 вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

7. Продукт для применения в лечении рака, содержащий антитело или его функциональный фрагмент по любому из пп.1-3 и антинеопластическое средство.

8. Применение антитела по любому из пп.1-3 в производстве лекарственных средств для терапевтического использования при раке яичника, немелкоклеточных карциномах легкого, раке поджелудочной железы, раке кишечника или глиобластомах.