EA018717B1 - Антитело или фрагмент антитела, которое связывается с белком ron человека, и его применение - Google Patents

Abstract

Согласно настоящему изобретению предложены антитела или фрагменты антител, включая антитела человека, специфичные в отношении рецептора к белку, стимулирующему макрофаги (MSP-R или RON), которые подавляют активацию RON. Также предложены способы ингибирования RON, в частности применение RON для лечения таких заболеваний, как рак.

Description

Перекрестные ссылки на родственные заявки

По заявке на данный патент испрашивается приоритет согласно временной заявке США υ88Ν 60/989558, поданной 21 ноября 2007 г., содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

Область техники

Изобретение относится к способам и композициям для ингибирования рецептора человека к белку, стимулирующему макрофаги (М8Р-К или ΚΟΝ (тесер1от б'опщпс ηαηίαίδ)). Настоящее изобретение также относится к способам лечения опухолей и других заболеваний у млекопитающих, включающим введение антител или фрагментов антител, специфичных к ΚΌΝ, которые ингибируют активацию ΚΟΝ.

Уровень техники

Рецептор к белку, стимулирующему макрофаги, также известный как ΚΌΝ, принадлежит к семейству с-те! рецепторных тирозинкиназ. ΚΟΝ представляет собой гетеродимерный белок, состоящий из внеклеточной альфа-цепи и трансмембранной бета-цепи. Сначала ΚΌΝ экспрессируется в виде предшественника, состоящего из одной цепи с последующим расщеплением на альфа- и бета-цепи (1). Считается, что бета-цепь необходима для связывания лиганда-белка, стимулирующего макрофаги (М8Р; также известный как НСЕ-подобный белок), с рецептором, а крингл-домены (Кппд1е бошанъ) 2 и 3 М8Р необходимы для взаимодействия ΚΌΝ/МЗР. См. публикацию США № 2003/0073656. Считают, что внеклеточный домен ΚΟΝ обладает низкой степенью гомологии с соответствующими доменами рецепторов семейства с-те!. Действительно, связывание фактора роста гепатоцитов (НСЕ), которое стимулирует другие рецепторы семейства с-те!, с рецептором ΚΟΝ не приводит к стимуляции тирозинкиназной активности (№О 02/083047).

Считается, что ΚΟΝ принимает участие в миграции клеток, изменении формы и инвазии опухолей в ткани (1). Однако в более ранних публикациях сообщалось об ограниченной роли ΚΟΝ в индукции трансформации, но была описана стимуляция инвазивного роста в результате активации ΚΟΝ (16).

Мутации, делеции и перестановки генов, а также альтернативный сплайсинг мРНК могут приводить к активации ΚΟΝ в отсутствие связывания лиганда (1). Изменения в тирозинкиназном домене ΚΟΝ возможно имеют большое значение для активации ΚΟΝ (1). Путем клонирования ΚΟΝ из различных линий раковых клеток была продемонстрирована активация ΚΟΝ в результате различных дефектов мРНК, кодирующей ΚΟΝ.

М8Р является членом семейства родственных плазминогену белков, содержащих крингл-домен (1). Как следует из его названия, первоначально было обнаружено, что М8Р стимулирует макрофаги по различным механизмам (обзор можно найти в 2, 3). Например, добавление М8Р к некоторым макрофагам, экспрессирующим ΚΟΝ, стимулирует изменения формы, хемотаксис, макропиноцитоз, фагоцитоз и продукцию иммуномедиаторов (4, 5, 6). Также было обнаружено, что ΚΟΝ экспрессируется в эпителиальных клетках, таких как кератиноциты, в которых, как было показано, М8Р фосфорилирует ΚΟΝ и активирует ряд сигнальных путей, что вызывает ответы, связанные с адгезией/подвижностью клеток, антиапоптотические и пролиферативные ответы (7, 8). За последние несколько лет повышенную экспрессию ΚΟΝ обнаружили в нескольких опухолях и линиях клеток эпителия (например, толстой кишки (9, 10, 11), легкого (12), груди (13)). В недавнем исследовании у мышей с искусственно повышенной экспрессией ΚΟΝ в легких развивались опухоли легкого (14, 15).

ΚΟΝ экспрессируется в разнообразных линиях раковых клеток. Антитело к ΚΟΝ способно ингибировать активацию этого рецептора (фосфорилированного ΚΟΝ), а также активацию нижележащих по сигнальному пути сигнальных молекул: фосфор-МАРК и фосфор-АКТ, во многих линиях раковых клеток. Было показано, что оба антитела к ΚΟΝ (ΚΟΝ6 и ΚΟΝ8), описанные ниже, при введении бестимусным мышам в значительной степени ослабляют способность некоторых линий клеток, полученных из злокачественных опухолей (НТ-29 толстой кишки, Н-292 легкого, ВхРС3 поджелудочной железы, ЛМТ1 молочной железы), образовывать опухоли. Это наблюдение подтверждает то, что рецепторная тирозинкиназа ΚΟΝ оказывает отрицательное влияние на пролиферацию указанных раковых клеток и приводит к занижению оценки значения ингибирования ΚΟΝ, например, в злокачественных опухолях толстой кишки, легкого, поджелудочной железы и молочной железы. С использованием стандартных процедур метода Вестерн-блот и поточной цитометрии было показано, что ΚΟΝ экспрессируется во многих линиях клеток человека, полученных из разнообразных раковых опухолей: толстой кишки (НТ-29, Со1о205, НСТ-116, ΌΤΌ-1, 8м480, 8^620), поджелудочной железы (ВхРС3, САРАЫ-2, А8РС-1, НРАЕ-11, Ь3.7р1#7, Н§766Т), предстательной железы (Όυ-145, РС-3), желудка (АС8, ΝΟ-Ν87), легкого (А549, Н596), печени (НерС2, 8Νυ-182) и молочной железы (ЛМТ-1, Όυ4475, Аи565).

Таким образом, сохраняется потребность в разработке способов лечения различных заболеваний, в частности рака, основанных на идентификации мишеней, включая специфичные эпитопы ΚΟΝ.

- 1 018717

Краткое изложение сущности изобретения

Соответственно, согласно настоящему изобретению предложены антитела к ΒΟΝ, обладающие повышенной способностью к специфичному связыванию по сравнению с известными антителами к ΒΟΝ, которые были доступны ранее. Указанные антитела могут быть изолированными и/или очищенными. Антитела согласно настоящему изобретению можно использовать для связывания ΒΟΝ, включая ΒΟΝ, кодируемый аллелями дикого типа ΒΟΝ, который обычно встречается в популяции людей, и измененные белки ΒΟΝ, например, варианты с незначительными изменениями или мутациями, сохраняющие активность ΒΟΝ. В одном варианте реализации антитела согласно настоящему изобретению специфичны в отношении ΒΟΝ и обладают К_й (т.е. равновесной константой диссоциации для антигена с антителом), равной приблизительно 1 х 10^-9 М^-1 или меньше. В других вариантах осуществления очищенные антитела согласно настоящему изобретению демонстрируют К_й, равную приблизительно 1х10^-10 М^-1 или приблизительно 1х10^-11 М^-1 или меньше. В других вариантах осуществления антитело или функциональный фрагмент антитела согласно настоящему изобретению являются полностью человеческими по природе.

Настоящее изобретение относится, например, к антителу, которое специфичным образом связывается с белком ΒΟΝ, которое содержит гипервариабельный участок (участок, определяющий комплементарность, СЭВ), полученный из одной или более вариабельных областей антитела, выбранных из группы, состоящей из вариабельной области тяжелой цепи ΒΟΝ6, вариабельной области легкой цепи ΒΟΝ6, вариабельной области тяжелой цепи ΒΟΝ8, вариабельной области легкой цепи ΒΟΝ8 и их комбинаций, причем СОВ вариабельной области тяжелой цепи ΒΟΝ6 представляют собой 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 17, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 19 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 21; ί'ΌΒ вариабельной области легкой цепи ΒΟΝ6 представляют собой 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 23, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 25 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 27; ί'ΌΒ вариабельной области тяжелой цепи ΒΟΝ8 представляют собой 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 29, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 31 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 33 и ί'ΌΒ вариабельной области легкой цепи ΒΟΝ8 представляют собой 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 35, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 37 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 39. Каждая из приведенных вариабельных областей может быть источником трех ί'ΌΒ. Антитело может представлять собой, например, моноклональное антитело, одноцепочечное антитело, ЕаЬ, Εν, диатело или триатело.

В некоторых вариантах осуществления антитело может содержать участки ΟΟΒ, полученные по меньшей мере из двух вариабельных областей антитела, выбранных из группы, состоящей из тяжелой цепи ΒΟΝ6, легкой цепи ΒΟΝ6, тяжелой цепи ΒΟΝ8, легкой цепи ΒΟΝ8 и их комбинаций. В более предпочтительном варианте антитела согласно настоящему изобретению включают ί'ΌΒ. полученные по меньшей мере из трех вариабельных областей антитела, выбранных из группы, состоящей из тяжелой цепи ΒΟΝ6, легкой цепи ΒΟΝ6, тяжелой цепи ΒΟΝ8, легкой цепи ΒΟΝ8 и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой ΒΟΝ6 или ΒΟΝ8.

Далее согласно настоящему изобретению предложена изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, а также рекомбинантный вектор, включающий нуклеиновую кислоту, функционально связанную с одной или более последовательностями, которые обеспечивают экспрессию этой нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине. Также предложены клетки-хозяева, включающие рекомбинантный вектор.

Далее согласно настоящему изобретению предложен способ получения антитела к ΒΟΝ согласно настоящему изобретению, включающий культивирование клетки-хозяина в условиях, допускающих экспрессию антитела, и возможно очистку полученного антитела.

Далее согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, включающая антитело согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция может дополнительно включать один или более других терапевтически эффективных агентов.

Также предусмотрены наборы, включающие антитела к ΒΟΝ согласно настоящему изобретению, отдельно или в комбинации с другими агентами, например химиотерапевтическими агентами.

Также предложены способы с использованием антитела согласно настоящему изобретению, например способы лечения рака, ингибирования ангиогенеза, роста, миграции, пролиферации или инвазии опухолевых клеток, которые экспрессируют ΒΟΝ, включающие введение млекопитающему эффективного количества антитела согласно настоящему изобретению или опухолевые клетки представляют собой клетки фрагмента такого антитела с ингибированием активации ΒΟΝ. Опухолевые клетки представляют собой, например, опухолевые клетки, происходящие из толстой кишки, поджелудочной железы, предстательной железы, желудка, легкого, печени, яичника, почки, молочной железы и мозга, или клетки, имеющие эпителиальное или нейроэндокринное происхождение.

Способы согласно настоящему изобретению дополнительно включают введение других агентов, например, небольших органических молекул, с антителом, причем другие агенты могут включать, но не ограничиваются перечисленными, химиотерапевтический агент, антиангиогенный агент, или ингибируют активацию ΒΟΝ. Антитело может быть, но необязательно, конъюгировано с другим агентом, например, с небольшой органической молекулой.

Антитело согласно настоящему изобретению может быть введено совместно по меньшей мере с одним другим противораковым средством для лечения, например антиангиогенным агентом, антагонистом

- 2 018717

ЕСЕК-3, химиотерапевтическим агентом, излучением, антинеопластическим агентом, небольшой молекулой или другим антителом. Например, антитело согласно настоящему изобретению возможно вводят по меньшей мере с одним дополнительным антителом, которое подавляет опухоли, например с антителом к ЕСЕК, таким как ЕгЬйих® (1тс1опе 8ув1етв, 1пс. Нью-Йорк, Нью-Йорк).

Антитело согласно настоящему изобретению может быть нацелено на или может связывать ΚΟΝ дикого типа или измененный ΚΟΝ (вариант ΚΟΝ).

Способы согласно настоящему изобретению далее включают способ детекции ΚΟΝ в образце, включающий приведение указанного образца в контакт с антителом согласно настоящему изобретению для достижения специфичного связывания и детекции такого связывания.

Также предложен способ профилактики или лечения воспаления у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему антитела согласно настоящему изобретению.

Также предложен способ профилактики или лечения заболевания, например заболевания печени, желчных путей, желчных протоков и желчного пузыря у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества антитела согласно настоящему изобретению.

Также предложен способ ингибирования фосфорилирования ΚΟΝ, МАРК и/или Ак1 у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества антитела согласно настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления описанных выше способов антитело или фрагмент антитела согласно настоящему изобретению можно вводить млекопитающему в дозе от приблизительно 1 до приблизительно 10 мг/кг. В других вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела можно вводить в дозе от приблизительно 3 до приблизительно 8 мг/кг.

Краткое описание фигур

На фиг. 1А показана ДНК (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1) и транслируемая последовательность (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2) вариабельной области тяжелой цепи ΚΟΝ6. Участки СЭК выделены одинарным подчеркиванием.

На фиг. 1В показана ДНК (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 3) и транслируемая последовательность (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 4) вариабельной области легкой цепи ΚΟΝ6. Участки СЭК выделены одинарным подчеркиванием.

На фиг. 1С показана ДНК (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 5) и транслируемая последовательность (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 6) вариабельной области тяжелой цепи ΚΟΝ8. Участки СЭК выделены одинарным подчеркиванием.

На фиг. 1Ό показана ДНК (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 7) и транслируемая последовательность (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 8) вариабельной области легкой цепи ΚΟΝ8. Участки СОК выделены одинарным подчеркиванием.

На фиг. 2А-2С совместно показана полная последовательность ΒΟΝ6-Η (Ι§01 человека, подгруппа Ι), ДНК (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 9) и аминокислотная последовательность (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 10). Секреторная сигнальная последовательность (курсив); вариабельная область (двойное подчеркивание, за исключением участков СЭК); участки СЭК (одинарное подчеркивание); константная область гамма (неизмененная). Звездочкой (*) отмечен стоп-кодон.

На фиг. 2Ό, 2Е совместно показана полная последовательность ΕΟΝ6-Ε (легкая каппа-цепь человека, подгруппа ΙΙΙ), ДНК (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 11) и аминокислотная последовательность (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 12). Секреторная сигнальная последовательность ΕΟΝ6-Ε (курсив); вариабельная область (двойное подчеркивание, за исключением участков СЭК); участки СЭК (одинарное подчеркивание); константная область каппа (немодифицированная).

На фиг. 3А-3С совместно показана полная последовательность КΟN8-Η, ДНК (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 13) и аминокислотная последовательность (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 14). Секреторная сигнальная последовательность (курсив), вариабельная область (двойное подчеркивание) с участками СЭК (подчеркивание), константная область гамма (немодифицированная). Звездочкой (*) отмечен стоп-кодон.

На фиг. 3Ό, 3Е показана полная последовательность ΒΟΝ8-Ε ДНК (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 15) и аминокислотная последовательность (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 16). Секреторная сигнальная последовательность (курсив), вариабельная область (двойное подчеркивание, за исключением участков СОК) с участками СЭК (подчеркивание), константная область каппа (немодифицированная). Звездочкой (*) отмечен стоп-кодон.

На фиг. 4А и 4В показаны графики размера опухоли в зависимости от времени в модели на мышах с ксенографтом Н-292 после введения антител к КΟN, КΟN6 (фиг. 4А) и КΟN8 (фиг. 4В). Графики демонстрируют, что антитела КΟN6 и КΟN8 подавляют рост опухолевых клеток Н-292 в ксенографтной системе на мышах.

На фиг. 4С и 4Ό показаны графики размера опухоли в зависимости от времени в модели на мышах с ксенографтом НТ-29. Графики демонстрируют, что антитела КΟN6 (фиг. 4С) и КΟN8 (фиг. 4С) подавляют рост опухолевых клеток НТ-29 в ксенографтной системе на мышах.

На фиг. 4Е показаны графики размера опухоли в зависимости от времени в модели на мышах с ксенографтом ВхРС3 только с антителом КΟN8, антителом КΟN8 плюс ЕгЬйих® (ЕКВ), только ЕгЬйих® и ЕгЬйих® в комбинации с контрольным Ι§0 (антитела йи1дС). Графики демонстрируют, что антитело к КΟN8 (фиг. 4Е) отдельно подавляет рост опухолевых клеток ВхРС3 в ксенографтной системе на мышах. График также демонстрирует, что в комбинации с ЕгЬйих® имеет место тенденция к регрессии или подавлению опухоли.

- 3 018717

Фиг. 4Е демонстрирует, что антитело к ΚΌΝ8 подавляет рост ксенографтом опухоли молочной железы у бестимусных мышей. Клетки рака молочной железы ЛМТ-1 вводили путем инъекции бестимусным мышам и позволяли опухоли расти до размера приблизительно 250 мм³. На графике изображен объем опухоли на протяжении курса лечения контрольным средством (физиологический раствор), антителом ΚΌΝ8 (60 мг/кг, 2х/неделя), доцетакселом или комбинацией доцетаксел + антитело к ΚΌΝ8.

На фиг. 5А-5С показаны результаты анализа методом Вестерн-блот, подтверждающие подавление фосфорилирования, индуцированного М8Р, антителами к ΡΘΝ. в частности ΡΘΝ6 и Κ.ΟΝ8.

Было подтверждено, что антитела ΚΌΝ6 и Κ.ΟΝ8 ингибируют М8Р-зависимую активацию рецептора ΚΌΝ и активацию каскадов передачи сигналов после рецептора ΡΘΝ соответственно. Для анализа, иллюстрируемого фиг. 5А, клетки ΝΙΗ3Τ3-ΚΌΝ выдерживали без питательных веществ в течение ночи, обрабатывали в течение 2 ч указанной концентрацией антитела, а затем стимулировали 10 нМ М8Р в течение 10 мин. После стимуляции клетки лизировали и полные лизаты клеток разделяли методом электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия (8Ό8-ΡΑΟΕ) и тестировали с указанными антителами. Для анализа, иллюстрируемого фиг. 5В, клетки Н-292 выдерживали без питательных веществ в течение ночи, обрабатывали в течение 2 ч указанной концентрацией антитела, а затем стимулировали 10 нМ М8Р в течение 10 мин. После стимуляции клетки лизировали и полные лизаты клеток разделяли методом электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия (8П8-РА6Е) и тестировали с указанными антителами. Для анализа, иллюстрируемого фиг. 5С, клетки НТ-29 выдерживали без питательных веществ в течение ночи, обрабатывали в течение 2 ч указанной концентрацией антитела, а затем стимулировали 10 нМ М8Р в течение 10 мин. После стимуляции клетки лизировали и полные лизаты клеток разделяли методом электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия (δΌδ-РАбЕ) и тестировали с указанными антителами.

На фиг. 6А характеристики блокирования антитела ΚΌΝ8, определенные в твердофазном анализе. Методом ЕБ18А определяли значение 1С₅₀ антитела ΚΌΝ8, необходимое для блокирования взаимодействия рекомбинантного белка ΡΘΝ человека с иммобилизованным М8Р человека.

Фиг. 6В демонстрирует способность антитела Κ.ΟΝ8 ингибировать миграцию клеток рака легкого Н596.

Фиг. 6С демонстрируют индуцируемый М8Р синтез ДНК в клетках рака поджелудочной железы ВхРСЗ под действием антитела Κ.ΟΝ8.

Фиг. 6С(1) иллюстрирует стимуляцию белком М8Р включения [3Н]-тимидина, который является мерой синтеза ДНК.

На фиг. 6С(2) показана система, в которой клетки вначале обрабатывали антителом Κ.ΟΝ8 в течение 1 ч, а затем добавляли М8Р.

Подробное описание изобретения

Согласно настоящему изобретению предложены антитела к ΚΌΝ, которые можно использовать, например, в средствах и способах анализа для детекции белков ΚΌΝ в диагностических целях и в способах ингибирования активности ΚΌΝ в терапевтических целях. Далее, антитела к ΡΘΝ согласно настоящему изобретению можно вводить животному, например млекопитающему, такому как человек, в терапевтически эффективном количестве, например в количестве, которое обеспечивает подавление роста, пролиферации, метастатической активности (т.е. миграцию и/или инвазию) любой из и всех опухолевых клеток, экспрессирующих ΚΌΝ. Согласно настоящему изобретению также предложены фармацевтические композиции, включающие антитела к ΚΌΝ согласно настоящему изобретению, или фрагменты таких антител. Далее, согласно настоящему изобретению предложены полностью человеческие антитела, которые связывают рецепторную тирозинкиназу ΡΘΝ человека. Такие антитела включают, но не ограничиваются приведенными в качестве примеров ΚΌΝ6 и ΚΌΝ8, а также активные или функциональные фрагменты и производные таких антител.

Для ясности понимания описания следует иметь в виду, что белок-мишень называется ΚΌΝ, как подробно разъясняется выше в разделе Уровень техники, а предпочтительные антитела к ΚΌΝ, приведенные в качестве примеров в настоящем описании, обозначены ΚΌΝ6 и Κ.ΟΝ8 соответственно. Путем скрининга антитела к ΚΌΝ согласно настоящему изобретению были отобраны из сотен кандидатных антител к ΚΌΝ. Как подробно описано в приведенных ниже примерах, антитела согласно настоящему изобретению демонстрируют неожиданно предпочтительные характеристики связывания ΚΌΝ по сравнению с другими антителами к ΚΌΝ, которые были доступны ранее. В частности, новые антитела ΡΘΝ6 и ΚΌΝ8 обладают аффинностью к рецептору ΚΌΝ, в 100 раз большей, чем у ΚΌΝ1, полностью человеческого антитела к ΚΌΝ, которое было получено ранее с использованием системы на основе фаговой библиотеки. Конкретно, ΚΌΝ6 и Κ.ΟΝ8 связывают ΡΘΝ с К_о, равной 4,1х10^-11 и 3,2х10^-11 М соответственно, в то время как ΡΘΝ1 связывает ΡΘΝ с К_с, равной 7,7х10^-9 М. ΡΘΝ1 - текущее обозначение известного в данной области антитела, описанного в международной заявке на патент \УО 2005120557, см. выше, которая включена в настоящее описание путем ссылки.

В настоящем описании информация о последовательности СПЯ, раскрытая в настоящем описании для использования в способах согласно настоящему изобретению, может быть полученной из (произ

- 4 018717 водной), т.е. основанной на, созданной или произошедшей из информации о последовательности из любого и всех возможных источников вариабельных областей антитела, которые могут включать формы дикого типа или измененные (модифицированные) формы, а также встречающиеся в природе или полученные путем синтеза методами, знакомыми специалисту в данной области.

Используемый в настоящем описании термин опухоль включает раковые заболевания (рак) в целом и как злокачественные, так и доброкачественные заболевания, если не указано иное. В настоящем описании злокачественные опухоли включают первичные и вторичные опухоли. Первичные опухоли развиваются непосредственно из ткани, в которой их обнаруживают. Вторичная опухоль, или метастаз, представляет собой опухоль, которая происходит из какого-либо другого участка организма, но распространяется в удаленный орган. Обычные пути распространения метастазов включают прямое прорастание в смежные структуры, распространение через кровеносную или лимфатическую систему и прохождение по поверхности ткани или по полостям организма (перитонеальная жидкость, спинно-мозговая жидкость и др.)

Конкретные типы рака или злокачественных опухолей, первичных или вторичных, которые можно включить для возможного лечения с использованием способов согласно настоящему изобретению включают лейкемии, рак молочной железы, рак кожи, рак кости, рак предстательной железы, рак печени, рак легких, рак мозга, рак гортани, желчного пузыря, поджелудочной железы, прямой кишки, паращитовидной железы, щитовидной железы, надпочечников, нервной ткани, головы и шеи, ободочной кишки, желудка, бронхов, почек, базально-клеточную карциному, плоскоклеточную карциному язвенного и папиллярного типа, метастазирующую карциному кожи, остеосаркому, саркому Эвинга, ретикулоклеточную саркому, миелому, гигантоклеточную опухоль, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, камни в желчном пузыре, опухоли из островковых клеток, первичную опухоль мозга, острые и хронические лимфоцитарные и гранулоцитарные опухоли, волосатоклеточную опухоль, аденому, гиперплазию, медуллярный рак, феохромоцитому, слизистую неврому, кишечные ганглионевромы, гиперпластические опухоли роговичных нервов, опухоль при марфаноидном внешнем виде, опухоль Вильма, семиному, опухоль яичника, лейомиому, дисплазию шейки матки и рак на месте шейки матки, нейробластому, ретинобластому, саркому мягких тканей, злокачественный карциноид, местные поражения кожи, грибковые микозы, рабдомиосаркому, саркому Капоши, остеогенную и другие саркомы, злокачественную гиперкальциемию, гипернефроидный рак, истинную полицитемию, аденокарциному, мультиформную глиобластому, лимфомы, злокачественные меланомы, эпидермоидный рак и другие карциномы и саркомы, но не ограничиваются ими.

Для ясности, также предполагается, что использование терминов в единственном числе для удобства в описании не накладывает никаких ограничений. Так, например, термин антитело или опухоль включает указание на одно или более таких антител или опухолей. Использование терминов во множественном числе также не предполагает ограничения, если не указано иное.

Антитела согласно настоящему изобретению или их фрагменты, специфичные в отношении Κ.ΟΝ, нейтрализуют активацию рецептора Κ.ΟΝ. Используемый здесь термин нейтрализация рецептора обозначает инактивацию внутренней киназной активности рецептора, приводящей к передаче сигнала. Надежным способом анализа нейтрализации Κ.ΟΝ является ингибирование фосфорилирования рецептора.

Настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным механизмом нейтрализации Κ.ΟΝ. Такая нейтрализация, например, может возникать при введении антитела, блокирующего доступ к определенным эпитопам для лиганда, или путем изменения конформации Κ.ΟΝ определенным образом так, что лиганд, в частности М8Р, не сможет активировать рецептор даже несмотря на то, что он может связываться с рецептором. В патенте США 6165464 перечислены возможные механизмы такой нейтрализации, включая антитела, связывающие лиганд сам по себе, антитела, угнетающие рецептор, антитела, ингибирующие тирозинкиназную активность рецептора, или антитела, вызывающие цитотоксический ответ. Отрицательная регуляция может возникать, когда у клеток, экспрессирующих Κ.ΟΝ, в частности клетки с гиперэкспрессией (включая дифференциальную экспрессию) Κ.ΟΝ, снижается число рецепторных Κ.ΟΝ на поверхности. Следовательно, нейтрализация вызывает разные эффекты, включая ингибирование, сокращение, инактивацию и/или нарушение роста (пролиферации и дифференцировки), ангиогенеза (задействования кровеносных сосудов, инвазии и метастазирования) и подвижности клеток и метастазов (адгезии и инвазивности клеток).

Нейтрализация ΡΟΝ под действием антител к ΡΟΝ также может включать нейтрализацию варианта рецепторной тирозинкиназы ΡΟΝ. которая активна в отсутствие связывания лиганда или связывается с лигандом и в дальнейшем не инактивируется. Так, нейтрализация Κ.ΟΝ может включать нейтрализацию Κ.ΟΝ дикого типа и/или его варианта (точечные мутации, делеции, альтернативный сплайсинг и др.).

В настоящем описании термин вариант Κ.ΟΝ может включать белки Κ.ΟΝ, которые короче или длиннее, чем Κ.ΟΝ дикого типа, и возможно будет включать аналоги, содержащие замены аминокислот. Варианты Κ.ΟΝ также можно получить путем альтернативного сплайсинга или инициации и/или точечной мутации (мутаций).

Одной полезной мерой степени нейтрализации Κ.ΟΝ антителами к ΡΟΝ является ингибирование тирозинкиназной активности рецептора. Ингибирование тирозинкиназы может быть определено хорошо

- 5 018717 известными способами; например, путем измерения уровня автофосфорилирования рекомбинантного киназного рецептора, и/или фосфорилирования природных или синтетических субстратов. Так, анализ фосфорилирования применяют при определении нейтрализации антител в контексте настоящего изобретения. Фосфорилирование можно выявить, например, при помощи антител, специфических в отношении фосфортирозина в анализе ЕЬ1§Л (твердофазного иммуноферментного анализа) или вестерн-блот. Некоторые виды анализа тирозинкиназной активности описаны у Рапек е! а1., 1. Рйагшаеок Ехр. Тйега. 283: 1433-44 (1997) и Ва!1еу е! а1., ЫГе 8ά. 62:143-50 (1998).

Другой мерой нейтрализации ΒΟΝ является ингибирование фосфорилирования субстратов, расположенных выше ΒΟΝ в метаболическом пути. Соответственно, можно измерять, например, уровень фосфорилирования МАРК или Ак!.

Существующие в природе антитела обычно включают две идентичные тяжелые цепи и две идентичные легкие цепи, причем каждая легкая цепь ковалентно связана с тяжелой цепью внутрицепочечными дисульфидными связями, и множественные дисульфидные связи дополнительно связывают две тяжелых цепи друг с другом. Отдельные цепи могут скручиваться в домены, обладающие близкими размерами (110-125 аминокислот) и структурами, но разными функциями. Легкая цепь может содержать одну вариабельную область (УЪ) и/или одну константную область (СЬ). Тяжелая цепь также может содержать одну вариабельную область (УН) и/или, в зависимости от класса или изотипа антитела, три или четыре константных области (СН1, СН2, СН3 и СН4). У людей изотипы включают 1дА, Ι§Ό, 1дЕ, 1дО и 1дМ, причем 1дА и 1дО еще подразделяют на подклассы или подтипы (1дА1-2 и 1дО1-4).

В целом, вариабельные домены демонстрируют значительную вариабельность последовательности аминокислот между разными антителами, особенно в антигенсвязывающем сайте. В каждой УЪ или УН обнаруживают три области, именуемые гипервариабельными или комплементарно детерминирующими областями (СЭВ), которые поддерживают менее вариабельные области, называемые каркасными вариабельными областями.

Антитела согласно настоящему изобретению в качестве примера включают моноклональные антитела 1дС. Также предполагается, что антитело или антитела согласно изобретению могут включать фрагменты антител или рекомбинантные формы. Имеют место, например, фрагменты Εν или белки, в которых СЭВ и/или вариабельные домены приводимых в качестве примера антител сконструированы как одноцепочечные антигенсвязывающие белки, димеры и/или тримеры, чтобы обеспечить преимущество новых предложенных в изобретении антител в альтернативных структурных формах.

Кратко, часть антитела, содержащую области УЪ и УН, обозначают Εν (вариабельный фрагмент), и она содержит антигенсвязывающий сайт. Одноцепочечный Εν (5сЕх или 8СА) в фрагменте антитела, содержащий область УЪ и область УН в одной полипептидной цепи, в которой Ν-конец одной области и Сконец другой области соединены гибким линкером (см., например, патент США № 4946778 (Ьайпег е! а1.); в УО 88/09344 (Нийоп е! а1.)). В УО 92/01047 (МсСаГГеПу е! а1.) описан фенотип фрагментов 5сЕх на поверхности растворимых рекомбинантных дисплеев генов, таких как бактериофаг.

Пептидные линкеры, используемые для получения одноцепочечных антител, могут быть гибкими пептидами, которые выбирают, таким образом, чтобы обеспечить адекватное трехмерное скручивание областей УЪ и УН. Линкер обычно включает от 10 до 50 остатков аминокислот. Предпочтительно линкер включает от 10 до 30 остатков аминокислот. Более предпочтительно линкер включает от 12 до 30 остатков аминокислот. Наиболее предпочтительно линкер включает от 15 до 25 остатков аминокислот. Пример таких пептидов-линкеров включает повторы четырех глицинов, после которых идет серин.

Одноцепочечные антитела не имеют части или всех константных доменов, присущих полному антителу, из которого их выделили. Следовательно, они могут преодолевать некоторые из проблем, связанных с применением полного антитела. Например, одноцепочечные антитела обычно не проявляют некоторых нежелательных взаимодействий между константными областями тяжелых цепей и другими биологическими молекулами. Кроме того, одноцепочечные антитела значительно меньше, чем полные антитела, и могут иметь более высокую проницаемость, чем полные антитела, что позволяет одноцепочечным антителам локализовать и связываться с целевыми антигенсвязывающими сайтами с большей эффективностью. Кроме того, относительно малый размер одноцепочечного антитела ведет к снижению вероятности провоцирования нежелательного иммунного ответа у реципиента по сравнению с полными антителами.

Многие одноцепочечные антитела, в которых каждая одиночная цепь содержит один УН и один УЪ домен, ковалентно связанные первым пептидным линкером, могут быть ковалентно связаны по меньшей мере одним или более пептидными линкерами, образуя мультивалентные одноцепочечные антитела, которые могут быть моноспецифичными или мультиспецифичными. Каждая цепь мультивалентного одноцепочечного антитела содержит один вариабельный фрагмент легкой цепи и один вариабельный фрагмент тяжелой цепи и связана пептидным линкером по меньшей мере с одной другой цепью. Пептидный линкер состоит по меньшей мере из пятнадцати остатков аминокислот. Максимальное число остатков аминокислот составляет около одной сотни.

Два одноцепочечных антитела могут быть соединены с получением димера (диатела), который также называют двухвалентным димером. Димеры содержат две цепи и два сайта связывания и могут быть

- 6 018717 моноспецифичными или биспецифичными. Каждая цепь антитела включает домен УН, соединенный с областью УЬ. Области соединены с линкерами, которые достаточно коротки, чтобы не допустить комплементарного связывания между доменами одной цепи, чтобы происходило комплементарное связывание между комплементарными доменами разных цепей с образованием двух антигенсвязывающих сайтов. Исключительно в качестве примера, димер, соответствующий изобретению, может быть биспецифичным и может содержать оба домена, связывающих Κ.ΟΝ6 и Κ.ΟΝ8.

Три одноцепочечных антитела можно соединять с образованием тримеров, также именуемых трехвалентными димерами. Тримеры конструируют путем прямого связывания аминокислотного конца области УТ или УН с карбоксильным концом УЪ или УН домена, т.е. без последовательности линкера. Тример обладает тремя головами Ρν, причем полипептиды выстраиваются циклическим образом, т.е. голова-к-хвосту. Возможной конформацией тримера является плоская конформация, в которой три связывающих сайта лежат в плоскости под углом 120° друг относительно друга. Тримеры могут быть моноспецифичными, биспецифичными или триспецифичными.

РаЬ (антигенсвязывающий фрагмент) обозначает фрагменты антитела, содержащие области УЪ, СЬ, УН, СН1. Фрагменты, образующиеся после расщепления папаином, называют просто РаЬ, в них не сохраняется шарнирная область тяжелой цепи. После расщепления пепсином образуются разные РаЬ, сохраняющие шарнирную область тяжелой цепи. Такие фрагменты с интактными межцепочечными дисульфидными связями обозначают Р(аЬ')₂, а одиночный РаЬ' образуется, когда дисульфидные связи не сохранены. Фрагменты Р(аЬ')₂ обладают более высокой авидностью в отношении антигена, чем моновалентные фрагменты РаЬ.

Рс (фрагмент кристаллизации) - это обозначение для части фрагмента антитела, который содержит соединенные константные домены тяжелых цепей. В антителе ΙβΟ. например Рс содержит домены СН2 и СН3. Рс в антителе 1дА или 1дМ дополнительно содержит домен СН4. Рс ассоциирован со связыванием рецепторов Рс, активацией ковалентно-опосредуемой цитотоксичности и антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС). Для таких антител, как 1дА и 1дМ, которые представляют собой комплексы многих 1дО-подобных белков, образование комплекса требует константных доменов Рс.

Кроме того, шарнирная область отделяет участки РаЬ и Рс антитела, придавая подвижность РаЬ относительно друг друга и относительно Рс, а также включая множественные дисульфидные связи в ковалентное связывание двух тяжелых цепей.

Так, антитела, специфичные в отношении Κ.ΟΝ, включают существующие в природе антитела и их фрагменты, но не ограничиваются ими. Такие фрагменты включают, просто для примера, бивалентные фрагменты, такие как (РаУ)2, моновалентные фрагменты, такие как РаЬ, одноцепочечные антитела, одиночную цепь Ρν (8сΡν), антитела из одиночных доменов, которые специфически связывают ΒΟΝ. Предпочтительно, чтобы такие фрагменты включали один или более СИЯ антител ΒΟΝ6 и/или Κ.ΟΝ8, примеры которых приведены в настоящем изобретении. Определение антител в соответствии с изобретением может также включать рекомбинантные антитела, которые связываются специфически с ΚΟΝ, такие как мультивалентные одноцепочечные антитела, димеры, тримеры и подобные, которые специфически связываются с антигенами. Предпочтительно, чтобы такие мультивалентные рекомбинантные антитела включали один или более СИЯ антител ΚΟΝ6 и/или ΚΟΝ8, примеры которых приведены в настоящем изобретении.

Каждый домен антител согласно настоящему изобретению может являться полным антителом с вариабельным доменом тяжелой и легкой цепи, или он может являться функционально идентичным мутантом или производным существующего в природе домена, или синтетическим доменом, сконструированным, например, ίη νίΐτο с применением методов, таких как один из описанных в \νΟ 93/11236 (СпГПбъ с1 а1.). Например, возможно соединить вместе домены, соответствующие вариабельным доменам антитела, в которых пропущена по меньшей мере одна аминокислота. Важной характерной особенностью является способность каждого домена к связыванию с комплементарным доменом с образованием антигенсвязывающего сайта. Соответственно, термины вариабельный фрагмент тяжелой и легкой цепи не следует толковать с исключением вариантов, которые не обладают материальным эффектом на специфичность.

В настоящем патенте термины антитела и фрагменты антител включают варианты модификации, которые сохраняют специфичность в отношении рецептора ΚΟΝ. Такие модификации включают конъюгацию с молекулой эффектора, такой как химиотерапевтический препарат (например, цисплатин, таксол, доксорубицин) или цитотоксин (например, какой-либо белковый или небелковый органический химиотерапевтический препарат), но не ограничиваются ими. Антитела можно модифицировать путем конъюгации с получением определяемых компонентов-репортеров. Также включены антитела с изменениями, которые влияют на характеристики, не имеющие отношения к связыванию, такие как время полураспада (например, конъюгация с полимерами полиэтиленгликоля).

Белковые и небелковые препараты можно конъюгировать с антителами способами, хорошо известными в области техники. Способы конъюгации включают прямое связывание, связывание при помощи ковалентно присоединенных линкеров и парных членов специфического связывания (например, авидинбиотин). Такие способы включают, например, способ, описанный СгеепПе1б с1 а1., Сапсег Яекеатсй 50, 6600-6607 (1990) для конъюгации доксорубицина, и способ, описанный Агпоп е1 а1., Αάν. Ехр. Меб. Βίο1.

- 7 018717

303, 79-90 (1991), и в КБекха е! а1., Μοί ΒίοΙ. (ИЗЗИ) 25, 508-514 (1991), для конъюгации соединений платины.

Специфичность антитела означает селективное распознавание антителом конкретного эпитопа антигена. Термин эпитоп включает любую белковую детерминанту, способную к специфическому связыванию с иммуноглобулином или рецептором Т-клеток, или к другому взаимодействию с определенной молекулой. Детерминанты эпитопов обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или углеводы, или боковые цепи сахаров, и обычно обладают характерной трехмерной структурой, а также специфическими характеристиками заряда. Эпитоп может быть линейным или конформационным. В линейном эпитопе все точки взаимодействия между белком и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) возникают линейно вдоль первичной последовательности аминокислот белка. В конформационном эпитопе точки взаимодействия возникают по всем остаткам аминокислот на белке, которые отделены один от другого, т.е. в незаменимых аминокислотах, соседствующих из-за третичного скручивания белка. Эпитопы, образуемые из заменимых аминокислот, обычно сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, а эпитопы, образованные третичной структурой, обычно утрачиваются при воздействии денатурирующих растворителей.

Эпитоп обычно включает по меньшей мере 3, еще чаще по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Антитела, которые распознают одинаковый эпитоп, можно проверять путем простого иммуноферментного анализа, показывающего способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с целевым антигеном.

После определения желаемого эпитопа антигена можно получить антитела к данному эпитопу, например, при помощи методов, описанных в настоящем изобретении. В качестве альтернативы, в ходе процесса открытия получение и описание свойств антител может выявить информацию относительно желаемых эпитопов. На основании этой информации далее можно провести скрининг антител по конкурентному связыванию одного и того же эпитопа. Подход к достижению этого состоит в проведении исследований перекрестной конкуренции в целях поиска антител, которые конкурентно связываются друг с другом, например антитела, конкурирующие за связывание с антигеном.

Картирование эпитопов и соответствующие методики.

Для скрининга антител, которые связываются с конкретным эпитопом (например, антител, которые блокируют связывание 1дЕ с его высокоаффинным рецептором), можно использовать рутинный анализ перекрестного блокирования, такой как описан в Η;πΊο\ν & Бале, ΑΝΤΙΒΟΌΙΕ8 (1990), Со1б 8рппд НагЬот БаЬота1оту Рге§8. Другие методы включают аланин-сканирующие мутанты (а1ашие ксапптд тШапй). пептидные блоты (Ветеке, 2004 Ме11юб5 Μο1. Βίο1. 248:443-63) (полностью включена в настоящее описание посредством ссылки) или анализ расщепления пептидов. Кроме того, можно использовать такие способы, как вырезание эпитопов и химическая модификация антигенов (Штеп 2000 Рго1ет 8с1еисе: 9: 487496, полностью включена в настоящее описание путем ссылки).

Функциональные анализы.

Описание на основе модификаций (Μοб^βсаΐ^οη-Α88^8ΐеб Ρτοίϊ1ίη§, ΜΑΡ), также известное как характеристика антител по структуре антигенов (Апйдеп ЗйисФте-Ьакеб ΑηΐΦο6\· ΡτοΓι1ίη§, Α8ΑΡ) представляет собой метод, который позволяет категоризировать большие количества моноклональных антител (ΜΑΤ, тАЬ), направленных против одного и того же антигена, на основании схожести профилей связывания каждого антитела с химически или ферментативно модифицированными поверхностями антигенов (публикация патента США № 2004/0101920, полностью включенная в настоящее описание посредством ссылки). Каждая категория может соответствовать уникальному эпитопу, явно отличающемуся от эпитопа, соответствующему другой категории, или частично перекрывающемуся с таким эпитопом. Данная технология позволяет объединять генетически идентичные антитела, и таким образом, можно сосредоточить характеризацию на генетически различающихся антителах. При применении для скрининга гибридом ΜΑΡ может обеспечить идентификацию редких клонов гибридом, которые продуцируют МАТ, обладающие желаемыми характеристиками. ΜΑΡ можно использовать для сортировки антител Κ.ΟΝ6 и ΚΟΝ8 согласно настоящему изобретению на группы антител, способных связывать различные эпитопы.

Антитела или фрагменты антител согласно настоящему изобретению могут быть моноспецифичными или биспецифичными. Биспецифичные антитела (В^Ь) представляют собой антитела, которые обладают двумя разными специфичностями или сайтами связывания антигенов (см. публикацию заявки США № 2004/0259156, поданной 13 февраля 2004 г.). В случае, когда антитела обладают более чем одной специфичностью, распознаваемые эпитопы могут быть ассоциированы с одним антигеном или более чем с одним антигеном. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложены биспецифичные антитела или фрагменты антител, которые связывают два разных антигена, и при этом по меньшей мере одна специфичность направлена к ΚΟΝ.

Специфичность антител или фрагментов антител в отношении ΚΟΝ может быть установлена на основании аффинности и/или авидности. Аффинность, представленная равновесной константой диссоциации антигена и антитела (Кб), является мерой прочности связывания между антигенной детерминантой и сайтом связывания антитела. Авидность является мерой прочности связывания между антителом и его

- 8 018717 антигеном. Авидность связана как с аффинностью между эпитопом и соответствующим антигенсвязывающим сайтом антитела, так и с валентностью антитела, соответствующей числу антигенсвязывающих сайтов конкретного эпитопа. Связывание антител обычно осуществляется с константой диссоциации (Кб), равной от приблизительно 10^-5 до приблизительно 10^-11 литров/моль (л/моль) (например, Кб <100 нМ). Обычно считается, что любая Кб меньше приблизительно 10^-4 л/моль указывает на неспецифичное связывание. Чем ниже значение Кб, тем выше прочность связывания между антигенной детерминантой и сайтом связывания антитела.

Для стимуляции иммунного ответа ΚΟΝ может быть выделен из различных источников, таких как клетки, которые экспрессируют ΚΟΝ: толстой кишки, поджелудочной железы, предстательной железы, желудка, легкого, печени, яичника, почки, молочной железы и мозга, а также эпителиальные и нейроэндокринные клетки. Также возможно получение синтетического рецепторного пептида с использованием коммерчески доступных аппаратов и соответствующей последовательности аминокислот. Еще одна альтернатива заключается в том, что ΌΝΑ, кодирующую белок ΚΟΝ, такую как кДНК или фрагмент кДНК, можно клонировать и экспрессировать, а полученный белок выделить и использовать в качестве иммуногена для стимуляции образования антител согласно настоящему изобретению. Для приготовления белка ΚΟΝ или фрагмента такого белка, к которому получают антитела, молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует ΚΟΝ, или какую-либо часть ΚΟΝ, или какую-либо его часть, например, внеклеточные части (в частности, части альфа и бета), можно встроить в известный вектор для экспрессии в клеткехозяине с использованием стандартных технологий рекомбинантной ДНК. Аналогичным образом могут быть получены антитела к лигандам ΚΟΝ, в частности М8Р.

Последовательности Κ.ΟΝ и его лиганда М8Р находятся в публичном доступе в базе данных (номер доступа ΚΟΝ Х70040, а номер доступа для Μ8Ρ-ΝΜ 020998, оба указания включены в настоящее описание посредством ссылки), и их можно свободно использовать для получения антитела. Также могут быть получены антитела к вариантам/мутантам ΚΟΝ или М8Р. Интерес представляют антитела к эпитопам, расположенным на внеклеточных доменах вариантов и мутантов. Было показано, что измененный рецептор ΚΟΝ, отличающийся внутрирамочной делецией 109 аминокислот во внеклеточном домене, конститутивно активирован (1). Могут быть получены антитела, например, к такому измененному рецептору ΚΟΝ.

Антитела, специфичные к ΚΟΝ, могут быть получены путем иммунизации млекопитающего ΚΟΝ. Растворимые рецепторы можно использовать в качестве иммуногенов отдельно, или после присоединения к белку-носителю или другим объектам, таким как гранулы, например гранулы из сефарозы. После того как млекопитающее выработало антитела, выделяют смесь клеток, продуцирующих антитело, таких как спленоциты. Моноклональные антитела могут быть получены путем выделения отдельных клеток, продуцирующих антитело, и иммортализации таких клеток путем, например, обеспечения их с клетками миеломы. Полученные в результате гибридомы сохраняют в культуре, и они экспрессируют моноклональные антитела, которые собирают из культуральной среды.

Далее, антитела и фрагменты антител согласно настоящему изобретению могут быть получены по стандартной гибридомной технологии (Наг1о\у & Байе, еб., ΑΝΤΙΒΟΌΙΕ8: Α ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог, 211-213 (1998), Лабораторное руководство, включенное в настоящее описание посредством ссылки) с использованием трансгенных мышей, которые продуцируют тяжелые и легкие цепи иммуноглобулина человека. В предпочтительном варианте осуществления значительную часть генома, кодирующего антитело человека, встраивают в геном мыши, который делают дефицитным по продукции эндогенных антител мыши. Таких мышей можно иммунизировать путем подкожного (8.е.) введения ΚΟΝ в полном адъюванте Фрейнда. К антителам согласно настоящему изобретению можно присоединить дополнительные остатки аминокислот. Такие остатки аминокислот могут представлять собой пептидную метку, возможно, облегчающую выделение. Также предусмотрены остатки аминокислоты, направляющие антитела в определенные органы или ткани.

Антитела ΚΟΝ согласно настоящему изобретению могут быть выделены из библиотеки фагового дисплея, такой как библиотека, конструированная из генов тяжелой цепи человека и легкой цепи человека. Например, вариабельная область согласно настоящему изобретению может быть получена из лимфоцитов периферической крови, которые содержат реорганизованный ген вариабельной области. В качестве альтернативы части вариабельной области, такие как участки СИР. и Е^, могут быть получены из различных последовательностей человека.

Антитела, специфичные к ΚΟΝ, связывают ΚΟΝ с Кб, предпочтительно равной приблизительно 1 х 10^-9 М^-1 или меньше, более предпочтительно приблизительно 1 х 10^-10 М^-1 или меньше и наиболее предпочтительно приблизительно 1 х 10^-11 М^-1 или меньше.

Антитела или фрагменты антител, специфичные к ΚΟΝ, ингибируют активацию данного рецептора. Ингибирование рецептора означает препятствование активации присущей данному рецептору киназной активности, связанной с передачей сигнала. Надежным тестом на ΚΟΝ является ингибирование фосфорилирования рецептора.

Настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным механизмом ингибирования ΚΟΝ.

- 9 018717

Такое ингибирование может осуществляться, например, антителом, блокирующим доступность некоторых эпитопов для лиганда, или посредством изменения конформации ΚΌΝ таким образом, что лиганд, в частности М8Р, не может активировать рецептор, даже несмотря на то, что он связывается с рецептором. В патенте США 6165464 перечислены возможные механизмы такого ингибирования, включая связывание самого лиганда, снижение активности рецептора, ингибирование тирозинкиназной активности рецептора или стимулирование цитотоксического отчета. Снижение активности может иметь место, когда у клеток, которые экспрессируют ΚΌΝ, в частности клеток с повышенной экспрессией (включая дифференциальную экспрессию) ΚΌΝ, снижается число рецепторных тирозинкиназ ΚΘΝ на поверхности. Активность металлопротеиназ матрикса, которые принимают участие в инвазии и метастазировании опухолевых клеток, также может снижаться под действием антител согласно настоящему изобретению.

Ингибирование ΒΘΝ имеет различные эффекты, включая ингибирование, снижение, инактивацию и/или нарушение роста (пролиферации и дифференцировки), ангиогенеза (задействование кровеносных сосудов, инвазию и метастазирование), а также подвижности и метастазирования (адгезия и способность клеток к адгезии).

Настоящее изобретение также предусматривает антитела, которые связывают и инактивируют измененные (вариантные) или мутированные рецепторные тирозинкиназы ΚΌΝ, активные в отсутствие связывания лиганда. У млекопитающего, страдающего заболеванием, связанным с ΚΌΝ, возможно, например, экспрессируются и ΚΌΝ дикого типа, и измененный ΚΘΝ. при этом вариантный рецептор экспрессируется в непропорциональном количестве. Интерес представляют варианты/мутанты, отличающиеся по внеклеточному домену, такие как варианты/мутанты, содержащие делеции во внеклеточном домене, описанные ^апд (1) (9). Таким образом, ингибирование ΚΌΝ может затрагивать ΚΘΝ дикого типа и/или измененный ΚΘΝ (точечные мутации, делеции, альтернативный сплайсинг и т.д.).

Активация ΚΌΝ может осуществляться посредством димеризации и активации с другими ВТК, такими как с-те! или ЕСЕК. Так, ингибирование ΚΘΝ может также включать ингибирование гетеродимеризации между ΚΟΝ и другими рецепторными тирозинкиназами (КТК), такими как ЕСЕК или с-шеЕ Такое ингибирование может также включать ингибирование передачи сигнала образованными димером ΚΟΝ и ЕСЕ или с-шеЕ например. Такая димеризация может быть индуцирована по лиганд-зависимому механизму, например, путем связывания М8Р, НСЕ или ЕСЕ с их рецепторами и стимуляции димеризации.

Одной мерой ингибирования ΚΟΝ является подавление тирозинкиназной активности данного рецептора. Ингибирование тирозинкиназы может быть определено хорошо известными методами; например, путем измерения уровня автофосфорилирования рекомбинантной рецепторной киназы, и/или фосфорилирования природных или синтетических субстратов. Так, средства анализа фосфорилирования можно применять для определения антител согласно настоящему изобретению. Фосфорилирование можно детектировать, например, с использованием антитела, специфичного к фосфотирозину в тесте ЕБ18А или в методе Вестерн-блот. Некоторые анализы на активность тирозинкиназы описаны в Рапек е! а1., 1. Рйагтасок Ехр. Тйет. 283: 1433-44 (1997) и Ва!1еу е! а1., Ьйе 86. 62:143-50 (1998) [52]. Кроме того, для определения ингибирования ΚΟΝ могут быть использованы методы детектирования экспрессии белков. Такие методы включают методы иммуногистохимии (1НС) для определения экспрессии белка, флуоресцентной ίη щ!и гибридизации (Е18Н) для детектирования амплификации генов, конкурентные методы анализа связывания с радиолигандами, методики твердофазного блоттинга, такие как Нозернблот и Саузерн-блот, полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (КТ-РСК) и иммуноферментный анализ (ЕЫ8А).

Другая мера ингибирования ΚΟΝ включает уровень фосфорилирования нижележащих субстратов ΚΟΝ. Соответственно, можно измерять уровень фосфорилирования МАРК или Ак!, например. В одном варианте осуществления млекопитающему вводят антитело, специфичное к ΚΟΝ, включающее один, два, три, четыре, пять или все шесть гипервариабельных участков (СЭК) антител согласно настоящему изобретению. В другом варианте воплощения вводимое антитело включает вариабельные области антител согласно настоящему изобретению. На фиг. 2А-2Е показаны последовательности антител согласно настоящему изобретению. Без конкретного теоретического обоснования считается, что ΚΟN6 и ΚΟN8 связываются с внеклеточным доменом бета ΚΟN, но такая специфичность может также возникать вследствие связывания с другими доменами ΚΟN, или в результате связывания других эпитопов того же домена. Участки СЭК антител ΚΟN6 и ΚΟN8, выделенных согласно настоящему изобретению, включают

- 10 018717

Вариабельная область тяжелой цепи ΚΟΝ6

СОК1

С

С

Т

Р

3

3

β

А

I

Т

(ЗЕО

Ю ΝΟ:17)

ССА

ссс

АСС

ТТС

АСС

АСС

САТ

ССТ

АТС

АСС

(ЗЕО

ΙΒ N0:18)

СОЙ2

С

I

I

Р

I

Ь

С

м

А

N

У

А

ССС

АТС

АТС

ССТ

АТС

СТТ

ССТ

АТС

ССА

ААС

ТАС ΐ

ССА

0

К

Г

0

С

(ЗЕО Ιβ N0:19)

САС

ААС

ТТС

САС

ССС

(ЗЕО 10 N0:20)

СОКЗ

V

А

β

У

У

С

ь

Θ

Т

СТС

ССС

САТ

ТАС

ТАТ

ССТ

ТТС

ССС

АСТ

Υ

У

Н

У

Р

О

ь

(ЗЕО ΙΒ N0:21)

ТАС

ТАС

ТСС

ТАС

ТТС

САТ

СТС

(ЗЕО Ю N0:22

Вариабельная область легкой цепи ΗΟΝ6

С0К1	К	А	3	0	3	V	3
	АСС	ССС	АСТ	САС	АСТ	СТТ	АСС
	3	5	У	Ь	А					(ЗЕО Ю N0:23)
	АСС	АСС	ТАС	ТТА	ССС					(ЗЕО ΙΒ N0:24)
С0К2	С	А	3	3	И	А	Т			(ЗЕО Ю N0:25)
	ССТ	ССА	ТСС	АСС	ТСС	ССС	АСТ			(ЗЕО Ю N0:26)
СОКЗ	0	0	У	0	3	3	₽	Ь	т	(ЗЕО Ιβ N0:27)
	САС	САА	ТАТ	ССТ	АСС	ТСА	ССТ	СТС	АСТ	(ЗЕО ΙΒ N0:28)

Вариабельная область тяжелой цели ΚΟΝΘ

С0К1

С

Г

Т

Г

3

3

У

ь

М

Т

(ЗЕО

ΙΒ N0:29)

ССА

ТТС

АСС

ТТТ

АСТ

АСТ

ТАТ

ТТА

АТС

АСС

(ЗЕО

ΙΒ N0:30)

СВК2

N

I

К

0

β

С

3

Е

К

У

ААС

АТА

ААС

САА

САТ

ССА

АСТ

САС

ААА

ТАС

У

V

β

3

V

К

С

(ЗЕО Ю N0:31)

ТАТ

СТС

САС

ТСТ

СТС

ААС

ССС

(ЗЕО ΙΒ N0:32)

СВКЗ

В

С

У

3

3

С

к

САТ ССС ТАТ АСТ ТСС ССС АСА

Н	У	С	м	β	V	(ЗЕО Ιβ N0:33)
САС	ТАС	ССТ	АТС	САС	СТС	(ЗЕО ΙΒ N0:34)

Вариабельная область легкой цепи ΗΟΝ8

ΟΌΚΙ	к	А	3	0	3	V	3
	АСС	ССС	АСТ	САС	АСТ	СТТ	АСС
	К	У	Ь	А						(ЗЕО Ιβ N0:35}
	АСА	ТАС	ТТА	ССС						(ЗЕО ΙΒ N0:36}
СВК2	β	А	3	N	К	А	Т			(ЗЕО Ю N0:37)
	САТ	ССА	ТСС	ААС	АСС	ССС	АСТ			(ЗЕО Ю N0:38)
СОКЗ	0	0	К	3	N	И	Р	к	т	(ЗЕО 10 N0:39)
	САС	САС	ССТ	АСС	ААС	тсс	ССТ	ссс	АСС	(ЗЕО ΙΒ N0:40)

Специфичные к ΚΌΝ функциональные варианты антител и фрагментов антител также включают полипептиды с последовательностями аминокислот, по существу, близкими последовательностям аминокислот вариабельных или гипервариабельных участков антител согласно настоящему изобретению. По существу, близкая последовательность аминокислот определена в настоящем описании как последовательность, которая имеет по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере примерно 80% и более предпочтительно по меньшей мере примерно 90% гомологии со сравниваемой последовательностью аминокислот, определенной методом поиска РЛ8ТЛ так, как описано в работе Реагзои и Ыршаи, Ргос. №11. Лсаб. 8с1. США 85, 2444-2448 (1988), включая последовательности, которые идентичны по меньшей мере примерно на 70%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90, 95 или 99%, включая все поддиапазоны в указанных пределах. Такие антитела будут иметь идентичные или близкие характеристики связывания, блокирования лиганда и активность ингибирования рецептора как и антитела настоящего изобретения, которые имеют, по существу, те же гипервариабельные участки (СЭЯ).

- 11 018717

Варианты антител и фрагментов антител, специфичных к ΒΟΝ, также включают антитела, включающие одну или более консервативных замен аминокислот. Консервативная замена аминокислоты определена как изменение состава аминокислот путем изменения одной, двух или более аминокислот пептида, полипептида или белка, или его фрагмента. Заменяют аминокислоты в общем с близкими свойствами (например, кислотные, основные, ароматические, одинакового размера, положительно или отрицательно заряженные, полярные, неполярные) таким образом, что замена не приводит к существенному изменению свойств пептида, полипептида или белка (например, заряд, изоэлектрическая точка, аффинность, авидность, конформация, растворимость) или активность. Типичные замены, которые можно сделать в качестве такой консервативной замены аминокислоты, могут быть среди следующих групп аминокислот: глицин (С), аланин (А), валин (V), лейцин (Ь) и изолейцин (I); аспарагиновая кислота (Ό) и глутаминовая кислота (Е); аланин (А), серин (8) и треонин (Т); гистидин (Н), лизин (К) и аргинин (В): аспарагин (Ν) и глутамин Ю); фенилаланин (Е), тирозин (Υ) и триптофан (XV).

Консервативные замены аминокислот можно осуществить, например, в участках, фланкирующих гипервариабельные участки, первоначально отвечающие за характеристики избирательного и/или специфичного связывания молекулы, а также в других частях молекулы, например, кассете вариабельной тяжелой цепи.

Антитела или фрагменты антител также включают такие, для которых характеристики связывания были улучшены путем прямой мутации, методов созревания аффинности, фагового дисплея или перегруппировки цепей.

Аффинность и специфичность могут быть изменены или улучшены путем изменения гипервариабельных участков и/или остатков в каркасе, и путем скрининга на антигенсвязывающие сайты, имеющие желаемые характеристики (см., например, Υαη§ е! а1., 1. Μοί. ΒίοΙ. (1995), 254: 392-403). Один такой метод состоит в случайном комбинировании отдельных остатков или комбинаций остатков таким образом, чтобы в популяции в остальном идентичных антигенсвязывающих сайтов в определенных положениях находились подмножества от двух до двадцати аминокислот. Кроме того, мутации в массиве остатков можно осуществить методами ПЦР с ошибками (см., например, На^к1И8 е! а1., 1. Μοί. Βίοί. (1992), 226: 889-96). В другом примере векторы для фагового дисплея, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, можно поместить в мутагенные штаммы Ε.οοίί (см., например, Εο\ν е! а1., 1. Μοί. Βίοί. (1996), 250: 359-68). Эти способы мутагенеза являются иллюстрацией многих методов, известных специалисту в данной области.

Другой способ повышения аффинности антител настоящего изобретения состоит в перемешивании цепей, где тяжелую или легкую цепь произвольно спаривают с другой тяжелой или легкой цепью для получения антитела с более высокой аффинностью. Различные гипервариабельные участки антитела также можно перемешивать с соответствующими гипервариабельными участками других антител.

Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим антитела или фрагменты антител, а также к векторам экспрессии, включающим такие последовательности нуклеотидов, функционально связанные с последовательностью для экспрессии. Эти нуклеотиды приведены на фиг. 1Α-1Ό, 2А-2Е и 3А-3Е. Также предусмотрены рекомбинантные клетки-хозяева, содержащие один или более векторов экспрессии, которые экспрессируют антитела настоящего изобретения, или фрагменты антител. Также предусмотрены способы производства антител или их фрагментов, включающие выращивание этих клеток в условиях, допускающих экспрессию антител или их фрагментов. Антитела или фрагменты антител затем можно очищать от клеток или среды для культивирования клеток.

Варианты нуклеотидов, приведенные на фиг. 1А-1Э. 2А-2Е и 3А-3Е включают варианты, которые кодируют антитела или фрагменты антител, имеющие ту же функцию, что и антитела согласно настоящему изобретению, т.е. блокирование или ингибирование активации ΒΟΝ. Такие варианты имеют последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 70%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80% и более предпочтительно по меньшей мере на 90% идентична ΒΟΝ дикого типа. Настоящее изобретение также предусматривает белки слияния антител. Такие белки слияния могут кодировать последовательности нуклеотидов фиг. 1А-1Э, 2А-2Е и 3А-3Е, которые оперативно связаны с последовательностями нуклеотидов, кодирующими ферменты, флуоресцентные белки, полипептидыметки или люминесцентные маркеры и/или их сочетания.

Последовательности нуклеотидов согласно настоящему изобретению также включают (а) последовательности ДНК антител, показанные на фиг. 1Α-1Ό, 2А-2Е и 3А-3Е; (Ь) любую последовательность нуклеотидов, которая (ί) гибридизуется с комплементарными последовательностями нуклеотидов, приведенными в изобретении (а) при строгих условиях, например, гибридизации со связанной с фильтром ДНК в 0,5М №1НР0₊ 7% додецилсульфате натрия (8Ό8), 1 мМ ΕΌΤΑ при 65°С и отмывке 0,1х88С/0,1% 8Ό8 при 68°С (Аи8иЬс1 Е.М. е! а!, еде., 1989, СЕ1ШЕХТ РК.ОТОСОЬ8 ΙΝ МОЕЕСЕЕАЕ В1ОЕОС% νοί. I, Сгееп РиЫщЫид Α88οс^аΐе8, 1пс., и ίοΐιη ΧνίΕν & κοπδ, 1пс., №\ν ΥοιΈ а! ρ. 2.10.3), и (ίί) кодирует антитело или фрагмент антитела, имеющие в значительной степени то же функциональное назначение; и (с) любую последовательность нуклеотидов, которая гибридизуется с последовательностью ДНК, которая кодирует последовательность антитела, показанную на фиг. 2А-2Е и 3А-3Е при менее жестких условиях,

- 12 018717 например, в условиях умеренной жесткости, например, отмывке в 0,2х88С/0,1% 8Ό8 при 42°С (АикиЬе1 с1 а1., ранее), при условии, что она кодирует антитело или фрагмент антитела, имеющий в значительной степени то же функциональное назначение. Функциональное назначение антител настоящего изобретения состоит в блокировании активации ΒΟΝ.

Настоящее изобретение также относится к вектору экспрессии, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или фрагмент антитела согласно настоящему изобретению, оперативно связанную с регуляторной последовательностью, а также к клетке-хозяину, содержащей такой вектор экспрессии. Указанные клетки-хозяева можно выращивать в некоторых условиях, обеспечивающих экспрессию антител или фрагментов антител согласно настоящему изобретению, и антитела затем можно очистить от клеток-хозяев.

Для экспрессии антител согласно настоящему изобретению используют стандартные рекомбинантные методы и известные векторы экспрессии. Векторы для экспрессии белков в бактериях, в частности в Е.сой, являются известными. Такие векторы включают векторы РАТН, описанные Э|есктапп и Тхадо1оГГ в 1. Бю1. Сйет. 260, 1513-1520 (1985). Эти векторы содержат последовательности ДНК, которые кодируют антранилат синтетазу (ТгрЕ) с полилинкером на карбоксильном конце. Другие векторные системы экспрессии основываются на бета-галактозидазе (рЕХ); лямбда-РЬ; мальтозосвязывающем белке (рМАЬ); и глутатион-8-трансферазе (рС8Т). См. Сепе 67, 31 (1988) и Рерйбе Βекеа^сй 3, 167 (1990).

Применимые для дрожжей векторы являются доступными. Пригодным примером является плазмида 2 Ό. Также известны векторы, пригодные для экспрессии в клетках млекопитающего. Такие векторы включают хорошо известные производные 8У-40, аденовируса, последовательности ДНК - производные ретровирусов, и челночные векторы, производные от сочетания функциональных векторов млекопитающих, например, тех, что описаны выше, и функциональных плазмид и фаговой ДНК.

В данной области техники известны различные эукариотические векторы (например, Р.1. 8ои111егп и Р. Вегд, 1. Мо1 Арр1. Сепе!. 1, 327-341 (1982); 8. 8иЬгаташ е! а1., Мо1. Се11. Бю1. 1, 854-864 (1981); Β.Ι КаиГтапп апб Р.А. 8Ьагр, АтрНйсайоп апб Ехргеккюп ΟΓ 8ес.|иепсек Со1гапкГес1еб \νί(1ι А Моби1аг ΩίΐινбгоГо1а(е Βебисΐаке Сотр1етеп1агу ΩΝΛ Сепе, 1. Мо1. Вю1. 159, 601-621 (1982); Β4. КаиГтапп апб Р.А. 8йагр, Атрййсайоп апб Ехргеккюп Οί 8ес.|иепсек Со1гапкГес1еб \νί(1ι А Моби1аг 0111убгоГо1а1е Βебисΐаке Сотр1етеп1агу ЭНА Сепе, 1. Мо1. Вю1. 159, 601-664 (1982); 8.Ι. 8са1п11 е( а1., Ехргеккюп апб С.’11агас1епхаЦоп ΟΕ (Не Ргобис( ΟΕ А Нитап Iттипе йИегГегоп ЭХА Сепе Ιπ СЫпеке Натк(ег Ονηπ' Се11к, Ргос. ИаЙ. Асаб. 8с1. И8А 80, 4654-4659 (1983); С. Иг1аиЬ апб Ь.А. СЬаяп, Ргос. ΝΟ1. Асаб. 8ск И8А 77, 4216-4220, (1980)).

Векторы экспрессии, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, содержат по меньшей мере одну последовательность контроля экспрессии, которая функционально связана с последовательностью ДНК или фрагментом, который экспрессируется. Контрольная последовательность включена в вектор для контроля и регуляции экспрессии клонированной последовательности ДНК. Примерами применимых для контроля экспрессии последовательностей являются 1ас-система, (гр-система, (ас-система, (гс-система, основной оператор и промоторный участок бактериофага лямбда, контрольный участок белка оболочки Гб, гликолитические промоторы дрожжей, например промотор для 3фосфоглицераткиназы, промоторы кислой фосфатазы дрожжей, например Р1ю5, промоторы альфафактора спаривания дрожжей, и промоторы, производные от вирусов полиомы, аденовирусов, ретровирусов и вирусов обезьян, например ранний и последний промоторы 8У40, и другие последовательности, о которых известно, что они управляют экспрессией генов в клетках прокариот или эукариот и их вирусов, или их сочетания.

Для использования в настоящему изобретении предусмотрены векторы (рекомбинантные и векторы для экспрессии). Например, векторы экспрессии, содержащие управляющие сигналы и ДНК, подлежащую экспрессии, например, которые кодируют антитела или фрагменты антител согласно настоящему изобретению, встроены в клетку-хозяина для экспрессии. Некоторые применимые для экспрессии клетки-хозяева включают известные клетки прокариот и эукариот. Некоторые применяемые клетки-хозяева прокариот включают, например, Е.сой, такие как Е.сой 8С-936, Е.сой НВ 101, Е.сой ^3110, Е.сой Х1776, Е.сой Х2282, Е.сой ΌΗΙ и Е.сой МΒС1, роды Ркеиботопак, ВасШик, например, ВасШик киЬййк и 8(гер(отусек. Пригодные клетки эукариот включают клетки дрожжей и других грибов, насекомых, животных, такие как клетки СΟ8, линии клеток лимфоидного происхождения, такие как лимфома, миелома (например, Ν8Ο) и клетки СНО, клетки человека и клетки растений в культуре ткани.

Предусмотрен способ получения антител. Этот способ включает культивирование клетки-хозяина, которая содержит пригодный вектор экспрессии, при этом вектор экспрессии содержит одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, например, тяжелой или легкой цепи такого антитела, или его фрагмента, или его сконструированного варианта, в условиях, допускающих экспрессию полипептида. После экспрессии в клетке-хозяине, выращиваемой в пригодной среде, экспрессируемый полипептид можно выделить из среды и очистить известными в данной области техники способами. Если полипептид или пептид не выделяется в культуральную среду, клетки-хозяева перед выделением и очисткой лизируют. Очищенным антителом является такое антитело, которое было отделено и/или выделено из компонентов своей естественной среды. Загрязняющие компоненты в их естественной

- 13 018717 среде, которые являются материалами, которые могут препятствовать диагностическому или терапевтическому использованию антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества, в общем случае удаляют.

Таким образом, например, моноклональные антитела в соответствии с настоящим изобретением секретируются субклонами, которые выделяют или очищают из культуральной среды или асцитной жидкости путем стандартных процедур очистки иммуноглобулинов, таких как, например, сорбция на протеин А-сефарозе, хроматография на гидроксиапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

В другом варианте осуществления антитело по изобретению, которое является специфичным для ΚΟΝ, получают путем экспрессии одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих легкие и/или тяжелые цепи, или их аналоги, которые включает антитело, в трансгенном животном, таким образом, что антитело экспрессируется и может быть выделено. Например, антитело можно экспрессировать тканеспецифическим образом, что облегчает его выделение и очистку. В одном таком варианте осуществления настоящего изобретения антитело по изобретению экспрессируют в молочной железе с целью его секреции во время лактации. Трансгенные животные включают, но не ограничиваются перечисленными, мышей, коз и кроликов. Также можно использовать любую другую известную в данной области трансгенную систему, например экспрессию в белке птичьих яиц, например, куриных яиц.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим антитела к ΚΟΝ согласно настоящему изобретению. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция может включать одно или более антител к ΚΟΝ: ΚΟΝ6 и/или ΚΟΝ8, приведенных в настоящем изобретении. Следует понимать, что антитела к ΚΟΝ согласно настоящему изобретению, используемые с целью профилактики или лечения млекопитающего, будут вводиться в форме композиции, дополнительно включающей фармацевтически приемлемый носитель. Пригодные фармацевтически приемлемые носители включают, например, один или более носителей из следующих: вода, солевой раствор, фосфатно-солевой буфер, декстроза, глицерин, этанол и т.п., а также их сочетания. Фармацевтически приемлемые носители могут далее включать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие агенты или эмульгаторы, консерванты или буферы, которые увеличивают срок хранения или эффективность связанных белков. Композиции для инъекции, как хорошо известно в данной области техники, можно ввести в форму для обеспечения быстрого, непрерывного или задержанного высвобождения активного компонента после введения его млекопитающему.

Термин носитель в настоящем патенте включает фармацевтически приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы, которые нетоксичны для клеток или млекопитающего при использовании их в применяемых дозировках и концентрациях. Часто физиологически приемлемый носитель представляет собой водный раствор с буферизованным рН. Примеры физиологически приемлемых носителей включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные полипептиды (менее чем приблизительно 10 остатков); белки, такие как альбумин сыворотки, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелаторы, такие как ЭДТА; сахароспирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как ΤΑΕΕΝ®. полиэтиленгликоль (ПЭГ) и РЬиВО№С8®.

Активные компоненты также можно заключать в микрокапсулы, полученные, например, путем межфазовой полимеризации, например микрокапсулы гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулы поли(метилметацилата), соответственно, в коллоидных системах доставки лекарств (например, липосомах, микросферах альбумина, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Фармацевтические формы для использования с целью введения ίη νίνο должны быть стерильными. Это условие легко выполняется с помощью фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.

Также можно получать препараты с замедленным высвобождением. Пригодные примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, при этом матрицы находятся в форме формованных тел, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2 гидроксиэтил метакрилат), или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Ь-глутамата, не разрушающиеся этиленвинил ацетат, разрушающиеся сополимеры молочной и гликолевой кислот, например, ΕϋΡΚΟΝ ΌΕΡΟΤ® (микросферы для инъекций, сделанные из сополимера молочной и гликолевой кислот и лейпролид ацетата), и поли-Э-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. В то время как полимеры, такие как этиленвинил ацетат и полимеры молочной и гликолевой кислот, позволяют молекулам высвобождаться свыше 100 дней, определенные гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени.

Когда инкапсулированные антитела остаются в теле долгое время, они могут денатурировать или агрегировать под действием влажности при 37°С, что приводит к потере биологической активности и

- 14 018717 возможным изменениям иммуногенности. Для их стабилизации можно разработать рациональные стратегии, зависящие от вовлеченного механизма. Например, если обнаружено, что механизм агрегации является внутримолекулярным.

Образование 8-8 связи происходит посредством тиодисульфидного обмена, стабилизации ее можно достичь путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизированных из кислых растворов, с помощью контроля за влажностью содержимого, с использованием подходящих добавок и разработки специфичных композиций полимерных матриц.

Изобретение относится к способам лечения, включающим введение млекопитающему терапевтически эффективного количества антител или фрагментов антител, специфичных к ΚΟΝ в виде монотерапии или в комбинации с другими способами лечения. В одном варианте осуществления настоящего изобретения млекопитающее является человеком. Такие антитела могут включать химерные, гуманизированные антитела, антитела мыши, кролика и человека, полученные различными способами. В другом варианте осуществления вводимое антитело является антителом человека. В другом варианте осуществления указанное антитело включает по меньшей мере одну последовательность гипервариабельного участка ΚΟΝ6 или ΚΟΝ8. Состояния, при которых эти способы являются применимыми, включают опухоли, которые экспрессируют ΚΟΝ, воспалительные заболевания, гиперпролиферативные заболевания и заболевания печени, желчного тракта, желчных каналов, желчного пузыря и относящиеся к печеночножелчной системе.

Как обсуждается в настоящем изобретении, предусмотрено, что антитела к ΚΟΝ согласно настоящему изобретению можно использовать для лечения любого патологического состояния, включая, но не ограничиваясь ими, новообразования или другие патологии в виде монотерапии и/или в сочетании с другими терапевтическими агентами. Далее предусмотрено, что при лечении определенных состояний, например рака, антитела можно использовать в одиночку или при конъюгации с другими лекарственными агентами в качестве стратегии первичного лечения (например, в качестве первого курса лечения для пациента с первично диагностированным раком) или в качестве стратегии вторичного лечения (например, при лечении ракового пациента, которого ранее лечили другими способами, но он не дал ответа на первичный лекарственный агент или выработал к нему устойчивость).

Лечение означает любое лечение заболевания млекопитающего и включает (1) предотвращение развития заболевания у млекопитающего, которое может иметь предрасположенность к заболеванию, но еще не поражено или не проявляет симптомов заболевания; например, предотвращение проявления клинических симптомов; (2) подавление заболевания, например, остановка его развития; или (3) облегчение течения заболевания, например регрессия симптомов заболевания.

В способах согласно настоящему изобретению млекопитающему вводят терапевтически эффективное количество антитела изобретения. Термин вводят в настоящем изобретении означает доставку антитела настоящего изобретения внутрь млекопитающего любым методом, который может достичь искомого результата. Антитела можно вводить, например, внутривенно или внутримышечно. Хотя антитела человека по настоящему изобретению особенно применимы для введения людям, их также можно вводить другим млекопитающим. Термин млекопитающее в настоящем описании включает людей, лабораторных животных, домашних животных и сельскохозяйственных животных, но не ограничивается перечисленными. Терапевтически эффективное количество означает количество антитела настоящего изобретения, которое при введении млекопитающему является эффективным для создания желаемого терапевтического эффекта, например, подавления киназной активности или ингибирования роста опухоли.

Антитела к ΚΟΝ в соответствии с настоящим изобретением можно вводить для терапевтического лечения пациенту, страдающему опухолевым или связанным с ангиогенезом патологическим состоянием в количестве, достаточном для профилактики, подавления или уменьшения прогрессирования опухоли или патологического состояния. Прогрессирование включает, например, рост, инвазивность, метастазы и/или рецидивы опухоли или патологического состояния. Требуемое для выполнения этого количество определяют как терапевтически эффективную дозу. Эффективные количества для этого использования будут зависеть от тяжести заболевания и общего состояния собственной иммунной системы пациента. Режим дозирования также зависит от состояния заболевания и состояния пациента и обычно колеблется от единственной дозировки в болюсе или непрерывного вливания до многоразового введения за день (например, каждые 4-6 ч), или так, как предписано лечащим врачом и состоянием пациента. Следует отметить, тем не менее, что настоящее изобретение не ограничивается любой конкретной дозировкой.

Пригодная доза антител согласно настоящему изобретению может быть определена на основании данных ίη νίνο, проиллюстрированных в настоящем описании. В эксперименте ίη νίνο использовали дозу приблизительно 1 мг/20 г каждые три дня. Средняя мышь весила приблизительно 0,02 кг и имела поверхность приблизительно 0,008 м² Средний человек весит приблизительно 70 кг и имеет поверхность приблизительно 1,85 м². Доза приблизительно 200 мг/м² соответствовала приблизительно 40 мг/кг для мыши и приблизительно 2,6 мг/кг для человека. Для определения этой дозы 1 раз в неделю вводили другое антитело, ЕтЬйих®, в дозировке приблизительно 250 мг/м², которая соответствовала приблизительно 6,5 мг/кг для человека. На основании этих вычислений и экспериментов доза для введения человеку со- 15 018717 ставляет предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 10 мг/кг, более предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 8 мг/кг (1 доза в неделю). Доза может быть сходной с дозой для ЕгЬйих®, например, от приблизительно 6 до приблизительно 7 мг/кг.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено, что ίη νίνο ингибирование ΚΌΝ антитела согласно настоящему изобретению подавляет рост опухоли. Как показано на фиг. 4Ό, антитело к ΡΟΝ подавляет клетки НТ-29, выращиваемые подкожно в бестимусных мышах. В различных вариантах осуществления рост опухоли подавляется по меньшей мере на приблизительно 20% или по меньшей мере на приблизительно 40%. Фиг. 4Ό демонстрирует приблизительно 50-60% снижение роста опухоли НТ-29 в течение периода продолжительностью 40 дней.

Антитела к ΡΟΝ согласно настоящему изобретению обладают способностью блокировать, в различных вариантах осуществления, по меньшей мере приблизительно 60%, приблизительно 80% или приблизительно 100% индицируемого М8Р фосфорилирования ΡΟΝ, МАРК и АКТ (например, НТ-29, Со1о205, АС8 и ΌϋΤ45). На фиг. 5А полосы для дорожек 1 и 3 почти идентичны, что указывает на полное блокирование фосфорилирования. Считается, что фосфорилирование МАРК и АКТ важно для пролиферации (увеличения числа клеток во времени), миграции (перемещение клеток к какому-либо агенту, в частности, М8Р, т.е. хемоаттракция), инвазии (способности перемещаться сквозь новую ткань) и выживания клеток. Ингибирование пролиферации прикрепленных клеток НТ-29 и Со1о205 в присутствии антитела ΡΟΝ и 10% сыворотки может составлять от приблизительно 20% до приблизительно 30% или приблизительно 25%. Кроме того, когда клетки НТ-29 и Со1о205 выращивают на мягком агаре в присутствии антитела к ΡΟΝ и 10% сыворотки, ингибирование образования колоний может составлять от приблизительно 60% до приблизительно 80%, более типично приблизительно 75% для НТ-29, и от приблизительно 50% до приблизительно 70%, более типично 60%, для Со1о205.

Настоящее изобретение основано на обнаружении того, что специфичные антитела к ΡΟΝ могут подавлять рост раковых клеток в мягком агаре и подавлять пролиферацию при выращивании прикрепленных клеток в условиях клеточной культуры. Антитело к ΒΟΝ может существенно снизить способность линий раковых клеток к образованию опухолей при введении путем инъекции бестимусным мышам, что демонстрирует тот факт, что ингибирование тирозинкиназного рецептора ΡΟΝ отрицательно влияет на пролиферацию клеток рака толстой кишки.

С использованием обычных методов Вестерн-блот и поточной цитометрии было показано, что ΡΟΝ экспрессируется во многих линиях клеток опухолей человека: толстой кишки (НТ-29, Со1о205, НСТ-116, ΌΕΌ-Ι, 8^480, 8^620), поджелудочной железы (ВхРСЗ, САРАЫ-2, А8РС-1, НРАГ-ΙΙ, Ь3.7р1#7, Н§766Т), предстательной железы (Όυ-145, РС-3), желудка (АС8, ΝΟ-Ν87), легкого (А549, Н596), печени (НерС2, 8Νυ-182) и молочной железы (ЛМТ-1, Όυ4475, Аи565). Соответственно, терапевтическими мишенями антитела к ΡΟΝ являются опухоли, образованные из клеток различных типов.

Согласно настоящему изобретению можно подвергать лечению опухоли, которые включают первичные опухоли и метастатические опухоли, а также не поддающиеся лечению опухоли. Не поддающиеся лечению опухоли включают опухоли, не дающие реакции или устойчивые к лечению химиотерапевтическим агентом в отдельности, антителами в отдельности, к радиотерапии в отдельности или к их комбинациям. Не поддающиеся лечению опухоли также включают опухоли, которые по-видимому ингибируются лечением такими агентами, но рецидивируют до пяти лет, в некоторых случаях до десяти лет или дольше, после того как лечение прекращается.

Согласно настоящему изобретению также можно подвергать лечению опухоли, включающие опухоли, которые не васкуляризированы, или еще не васкуляризированы существенно, а также васкуляризированные опухоли. Примеры солидных опухолей, которые можно лечить, включают карциному молочной железы, карциному легкого, колоректальную карциному, карциному поджелудочной железы, глиому и лимфому. Некоторые примеры таких опухолей включают эпидермоидную опухоль, плоскоклеточную опухоль, такую как опухоль головы и шеи, колоректальные опухоли, опухоли предстательной железы, опухоли молочной железы, опухоли легкого, включая мелкоклеточные и немелкоклеточные опухоли, опухоли поджелудочной железы, опухоли щитовидной железы, опухоли яичек и опухоли печени. Другие примеры включают саркому Капоши, неоплазмы ЦНС, нейробластомы, капиллярные гемангиобластомы, менингиомы и церебральные местастазы, меланому, карциномы желудочно-кишечного тракта и почки и саркомы, рабдомиосаркомы, глиобластому, предпочтительно мультиформную глиобластому, и лейомиосаркому.

В частности, терапевтический интерес представляет рак толстой кишки, поджелудочной железы, предстательной железы, желудка, легкого и печени, однако здесь предусматривается, что любые и все формы патологических состояний, включая неопластические и не неопластические заболевания, при которых введение антител согласно данному изобретению может привести к положительному терапевтическому эффекту, включены в объем данного изобретения. Указанные патологические состояния могут быть определены опытным в данной области человеком с учетом идей, изложенных здесь.

Таким образом, человеческие антитела к ΡΟΝ могут быть эффективны при лечении пациентов с васкуляризированными опухолями или неоплазмами или ангиогенными заболеваниями. Такие опухоли и неоплазмы включают, например, злокачественные опухоли и неоплазмы, такие как бластомы, карцино- 16 018717 мы или саркомы, и сильно васкуляризированные опухоли и неоплазмы. Разновидности раковых заболеваний, которые можно лечить способами согласно данному изобретению, включают, например, рак мочевого пузыря, надпочечников, семенников, центральной и периферической нервной системы, мозга, мочеполовой системы, лимфатической системы, желудка, почек, толстой кишки, гортани, легкого и костей. Неограничивающие примеры далее включают эпидермоидные опухоли, плоскоклеточные опухоли, такие как опухоли головы и шеи, колоректальные опухоли, опухоли предстательной железы, опухоли молочной железы, опухоли легкого, включая аденокарциному легкого и мелкоклеточные и немелкоклеточные опухоли легкого, опухоли поджелудочной железы, опухоли щитовидной железы, опухоли яичек и опухоли печени. Способ также используют для лечения васкуляризированной раковой опухоли кожи, включая плоскоклеточную карциному, базально-клеточную карциному, и разновидности рака кожи, которые возможно лечить, подавляя рост злокачественных кератиноцитов, таких как злокачественные кератиноциты человека. Другие разновидности рака, которые возможно лечить, включают эпителиальномезенхимальные изменения (ЭМИ), саркому Капоши, неоплазмы ЦНС (нейробластомы, капиллярные гемангиобластомы, менингиомы и церебральные метастазы), меланому, гастроинтестинальную и почечную карциному, включая папиллярную карциному почки, и саркомы, рабдомиосаркому, глиобластому, включая мультиформную глиобластому, и лейомиосаркому.

В другом аспекте изобретения антитела к ΡΘΝ ингибируют ангиогенез, связанный с опухолью. Стимуляция слизистого эндотелия рецепторной тирозикиназы связана с васкуляризацией опухолей. Обычно слизистый эндотелий стимулируется по паракринному механизму.

Введение антитела к ΚΌΝ составляет монотерапию. В других предусмотренных вариантах осуществления может применяться комбинированная терапия, в которой антитело анти-ΡΘΝ вводят в комбинации с антинеопластическим агентом или другим агентом, обладающим активностью против данного патологического состояния.

Антинеопластические агенты можно вводить по отдельности или в качестве конъюгата к антителу ΚΌΝ. Антинеопластические агенты, известные на данный момент в области или исследуемые, можно разбить на ряд классов, включающих, например, митотические ингибиторы, алкилирующие агенты, антиметаболиты, интеркалирующие антибиотики, ингибиторы факторов роста, ингибиторы клеточного цикла, ферменты, ингибиторы топоизомеразы, агенты, противодействующие выживанию, модификаторы биологической реакции, антигормоны и антиангиогенные агенты.

Малая органическая молекула согласно изобретению определяется как стандартный антинеопластический агент, например относительно небольшая биомолекула, такая как антитело или нуклеиновая кислота. Например, многие из известных антинеопластических агентов являются маленькими органическими молекулами, такими как ингибиторы топоизомеразы, среди прочих. Таким образом, варианты осуществления изобретения могут включать способы, в которых ингибитор топоизоимеразы вводят в комбинации с антителом, которое связывается с ΚΌΝ. Ингибиторы могут являться ингибиторами топоизомеразы I или топоизомеразы II. Ингибиторы топоизомеразы I включают иринотекан (СРТ-ΙΙ), аминокамптотецин, камптотецин, ΌΧ-89511, топотекан. Ингибиторы топоизомеразы II включают этопозид (УР-16) и тенипозид (УМ-26). Другие вещества на данный момент оцениваются в отношении активности ингибирования топоизомеразы и эффективности в качестве антинеопластических агентов. Все другие антинеопластические агенты с маленькими органическими молекулами, или химиотерапевтические агенты, возможно вводимые вместе с антителами согласно изобретению, могут быть алкилирующими агентами или антиметаболитами. Примеры алкилирующих агентов включают, но не ограничиваются перечисленными, цисплатин, циклофосфамид, мелфалан и декарбазин. Дополнительные малые органические молекулы включают цитотоксичные и/или химиотерапевтические агенты, такие как таксол, доксорубицин, актиномицин-Ό, метотрексат, гемцитабин, оксиплатин, флуороурацил (5-РИ), лейкоурин (ЬИ), цисплатин, иринотекан (СРТ-П), паклитаксел, доцетаксел, винбластин, эпотилон, цисплатин/карбоплатин и пегилированный адриамицин. Малые органические молекулы можно вводить в комбинациях, таких как (СРТ-П; 5-РИ; ЬИ); (Паклитаксел; 5-РИ) и (СРТ-П; 5-РИ; ЬИ).

Антинеопластические агенты также включают радиотерапию. Когда антинеопластическим агентом является радиотерапия, источник излучения может быть как внешним (наружная дистанционная лучевая терапия - НДЛТ), так и внутренним (брахитерапия - БТ) по отношению к субъекту лечения. Доза вводимого антинеопластического агента зависит от многих факторов, включающих, например, тип агента, тип и стадию развития опухоли и способ введения агента. Следует подчеркнуть, однако, что изобретение не ограничивается какой-либо определенной дозой. Излучение может использоваться в сочетании с другими антинеопластическими агентами.

В другом аспекте изобретения антитела к ΚΌΝ или фрагменты антител могут быть химически или биосинтетически связаны с противоопухолевыми агентами или детектируемыми испускающими сигнал агентами, в особенности когда антитело интернализировано. Противоопухолевые агенты, связанные с антителом, включают любые агенты, разрушающие или наносящие вред опухоли, с которой антитело может связываться, или в окружающей среде клетки, с которой антитело может связываться. Например, противоопухолевый агент представляет собой токсичный агент, такой как химиотерапевтический агент или радиоизотоп. Подходящие химиотерапевтические агенты известны специалисту и включают антра

- 17 018717 циклины (например, дауномицин и доксорубицин), метотрексат, виндезин, неокарциностатин, цисплатину, хлорамбуцил, цитозин-арабинозид, 5-флуороуридин, мелфалан, рицин и калихеамицин. Химиотерапевтические агенты конъюгируются к антителу при помощи стандартных способов (см., например, Негтепйп апй 8ейег, ВеЬппд Ιπβΐ. Μίΐΐ. 82:197-215 (1988)).

Антитело к КΟN можно также вводить раковому больному с радиоизотопами. Подходящие радиоизотопы также хорошо известны специалисту в данной области. Например, может быть использован 1311 или 21 ΙΑΐ. Эти изотопы прикрепляются к антителу стандартными технологиями (см., например, Рей1еу е1 а1., Вг. 1. Сапсег 68, 69-73 (1993)). В качестве альтернативы противоопухолевый агент, прикрепленный к антителу, может представлять собой фермент, активирующий пролекарство, таким образом, вводится пролекарство, остающееся в инактивированной форме до тех пор, пока не достигнет очага опухоли, где оно переходит в свою цитотоксичную форму после введения комплекса антитела. На практике, конъюгат антитело-фермент вводят пациенту и обеспечивают его присутствие в области ткани, в которой предполагается осуществлять лечение. Затем пациенту вводится пролекарство, так что превращение в цитотоксичное лекарство осуществляется в области ткани, в которой предполагается производить лечение. В качестве альтернативы противоопухолевый агент, конъюгированный с антителом, представляет собой цитокин, такой как интерлейкин-2 (ГБ-2), интерлейкин-4 (ГБ-4) или фактор некроза опухоли альфа (ΤΝΕ-α, ФНО-α). Антитело доставляет цитокин к опухоли, так что цитоцин наносит вред или разрушает опухоль, не затрагивая другие ткани. Цитокин внедряют в антитело на уровне ДНК путем стандартных технологий рекомбинантной ДНК. Также предусмотрено использование интерферонов.

Изобретение также относится к способу лечения не раковых гиперпролиферативных заболеваний у млекопитающих, включающему введение млекопитающему эффективного количества антитела по изобретению. Как указано здесь, гиперпролиферативное заболевание определяется как состояние, вызванное избыточным ростом не раковых клеток, экспрессирующих члены семейства рецепторов КΟN. Избыточные клетки, генерируемые гиперпролиферативным заболеванием, экспрессируют КΟN на нормальном уровне или могут чрезмерно экспрессировать КΟN.

Различные типы гиперпролиферативных заболеваний, которые можно лечить в соответствии с изобретением, включают гиперпролиферативные заболевания, которые стимулирует лиганд КΟN или мутанты такого лиганда. Примеры гиперпролиферативных заболеваний включают псориаз, актиниевый кератоз и себорейный кератоз, бородавки, келоидные шрамы и экзему. Также включены гиперпролиферативные заболевания, вызываемые вирусными инфекциями, такими как инфекция вируса папилломы. Например, псориаз подходит в различных вариантах и степенях тяжести. Различные типы псориаза проявляют характерные черты, такие как гнойные очаги (гнойный псориаз), сильное шелушение кожи (эритродермальный псориаз), пятна (точечный псориаз) и гладкие воспаленные участки (инверсный псориаз). Лечение всех типов псориаза (например, рюпа^й гиЦагк. рюпа^й ри51и1ова, рюпа^й егуШгойегтюа, рвопа515 аг111гора11иса, рагарюпа^й, ра1тор1ап1аг ри81и1о515) включено в настоящее изобретение.

Для лечения гиперпролиферативных заболеваний введение антител согласно изобретению, как указано выше, может сочетаться с введением любого обычного лечебного агента. Например, если гиперпролиферативным заболеванием является псориаз, существует ряд доступных общепринятых системных и местных агентов. Системные агенты для лечения псориаза включают метотрексат и пероральные ретиноиды, такие как ацитретин, этретинат и изотретиноин. Другие виды системного лечения псориаза включают гидроксимочевину, Ν8ΑΙΌ8, сульфазалазин и 6-тиогуанин. Антибиотики и антимикробные агенты могут использоваться для лечения или профилактики инфекций, которые могут вызывать обострение или ухудшение псориаза. Местные агенты для лечения псориаза включают антралин, кальципотриен, деготь, кортикостероиды, ретиноиды, кератолитики и тазаротен. Местные стероиды являются одним из наиболее распространенных агентов терапии, назначаемых при среднем и умеренном псориазе.

Местные стероиды наносятся на поверхность кожи, но некоторые вводятся в очаги псориаза.

Виды лечения гиперпролиферативных заболеваний далее включают введение анти-ΡΌΝ антител в комбинации с фототерапией. Фототерапия включает применение света любой длины волны, которая уменьшает симптомы гиперпролиферативного заболевания так же, как и фотоактивацию химиотерапевтических агентов (фотохимиотерапия). Для получения дальнейших подробностей о лечении гиперпролиферативных заболеваний см. νΟ 02/11677 (ТеиГе1 е1 а1., бевспЬтд 1геа1теп1 оГ БурегргоШегайуе άίβеавев \νίΐ1ι ер|йегта1 дго\\И1 ГасЮг гесерЮг агПадопйБ).

В настоящем изобретении любые подходящие способы и пути введения могут быть использованы для введения антитела к КΟN согласно изобретению, и возможно, для совместного введения других агентов, например антинеопластических агентов и/или антагонистов других рецепторов. Режимы использования антинеопластических агентов согласно изобретению включают любые режимы, предполагаемые оптимально подходящими для лечения новообразований у пациента. Различные злокачественные образования могут требовать использования специфических противоопухолевых антител и специфичных антинеопластических агентов, которые будут определены на основании данных о пациенте. Способы введения включают, например, инъекции, парентеральное введение, инфузии, пероральное, внутривенное, интраперитонеальное, подкожное или внутримышечное введение. Доза вводимого антагониста зависит от многих факторов, включающих, например, тип антагониста, типа и стадии развития опухоли, и

- 18 018717 способа введения антагониста. Следует подчеркнуть, однако, что настоящее изобретение не ограничивается каким-либо определенным способом введения.

Антитела к ΚΌΝ, в частности для лечения рака, можно вводить с антагонистами внутриклеточной КТК, которые ингибируют активность КТК или ассоциированных с ними бозмпйгеат сигнальных элементов, которые вовлечены в процесс роста опухоли и ассоциированного с опухолью ангиогенеза. Внутриклеточные антагонисты КТК представляют собой предпочтительно малые молекулы. Некоторые примеры маленьких молекул включают органические соединения, органометаллические соединения, соли органических и органометаллических соединений, а также неорганические соединения. Атомы в маленькой молекуле соединены ковалентными и ионными связями; первая характерна для маленьких органических соединений, таких как малые молекулы ингибиторов тирозинкиназы, а вторая типична для маленьких неорганических соединений. Упорядочивание атомов в маленькой органической молекуле может представлять собой цепь, например углерод-углеродную цепь, или углерод-гетероатомную цепь, или может представлять собой кольцо, содержащее атомы углерода, например бензин или полициклическую систему, или комбинацию атомов углерода и гетероатомов, например гетероциклы, такие как пиримидин или хиназолин. Хотя малые молекулы могут иметь любую молекулярную массу, они обычно включают молекулы, которые в остальном рассматривают как биологические молекулы, за тем исключением, что их молекулярная масса не превышает 650 Да. Малые молекулы включают как природные соединения, такие как гормоны, нейромедиаторы, нуклеотиды, аминокислоты, сахара, липиды, и их производные, так и синтетические соединения, полученные как путем традиционного органического синтеза, синтеза с применением биологических компонентов, так и их сочетанием. См., например, Сапекап, Эгид ЭЦсом. Тобау 7(1): 47-55 (1аи. 2002); Ьои, Огпд Шксоу. То4ау, 6(24): 1288-1294 (Пес. 2001).

В одном из вариантов осуществления предполагается использовать маленькую молекулу, так как внутриклеточный антагонист КТК в соответствии с настоящим изобретением является внутриклеточным антагонистом ΚΟΝ, соперничающим с АТФ за присоединение к внутриклеточной области присоединения ЕСЕК с доменом киназы или к белкам, включенным в проводящие пути передачи сигналов с активацией ЕСРК. Примеры таких проводящих путей передачи сигналов включают проводящий путь гакмитоген активированной протеинкиназы (МАРК), проводящий путь фосфатидилинозитал-3 киназы (Р13К)-протеинкиназы В (Ак1), проводящий путь стресс-активированной протеинкиназы (8АРК) и проводящие пути трансдукторов сигналов и активаторов транскрипции (8ТАТ). Неограничивающие примеры белков, включенных в такие проводящие пути (и к которым в соответствии с настоящим изобретением может присоединиться маленькая молекула антагониста ΚΟΝ), включают СКВ-2, 8О8, Как, КаГ, МЕК, МАРК и металлопротеиназы матрикса (ММР).

Способ лечения согласно настоящему изобретению, в частности рака, можно также осуществлять в сочетании с введением других антител. Например, антитело-антагонист ЕСЕК, такое как ЕгЬйих® (цетуксимаб), также можно вводить, в частности, при лечении рака толстой кишки. ЕгЬПпх® МАЕ является рекомбинантным, химерным человек/мышь, моноклональным антителом, которое специфично связывается с внеклеточным доменом человеческого ЕСЕК. ЕгЬйих® является антагонистом ЕСЕК, который блокирует лиганд, связывающийся с ЕСЕК, предотвращает активацию рецептора и ингибирует рост опухолевых клеток, экспрессирующих ЕСЕК. ЕгЬйих® был одобрен для использования в комбинации с иринотеканом или самостоятельно при лечении пациентов с метастатической раковой опухолью толстой кишки, экспрессирующей рецептор эпидермального фактора роста, которые не чувствительны или не переносят химиотерапию на основе иринотекана. ЕгЬПих® также показал свою эффективность в лечении псориаза. В дополнение к ЕгЬйих® могут быть использованы другие антитела, такие как антитело УЕСЕК, антитело 1СЕ-1К, антитело РПСЕКа и антитело РЭСЕКв.

Другие антитела для использования в комбинации включают герцептин (трастузумаб) (против клеток рака молочной железы, экспрессирующих НЕК2, или экспрессии НЕК2 на других раковых клетках) и Амайю® (бевацизумаб) (антитела, ингибирующие ангиогенез). Другие антитела для применения в комбинации и антитела, специфично связывающиеся с человеческим инсулиновым фактором роста-1 (1СЕК), включая антитела 2Е8 и А12, как описано, например, в опубликованной международной заявке на патент \УО 2005/016970, опубликованной 24 февраля 2005 г. (см., например, с. 18, табл. 1), которые имеют следующие последовательности СПК:

- 19 018717

Тяжелая цепь (2Г8/А12)

ΟϋΚΙ 3ΥΑΙΞ (ЗЕО Ю N0:41);

ΟϋΚ2 ΕΙΙΡΙΓΟΤΑΝΥΑΰΚΕΌΰ (ЗЕО Ю N0:42);

ΟϋΚ3 ΑΡΕΚΕ1ΕΗ5Τ0ΟΗΥΥΥΥΥΜθν (ЗЕ<2 1И N0:43)

Легкая цепь (2Е8)

СРК1 ЙСОЗЪКЗУУАЗ (ЗЕО Ю N0:44);

СБЕ2 0ΚΝΝΡΡ3 (5Е0 Ю N0:45);

СЭКЗ Ν3ΚϋΝ3ϋΝΚΓΙ (8Е0 Ю N0:46)

Легкая цепь (А12)

ΟϋΚΙ	ΰΟϋ3ΟΚ3ΥΥΑΤ (ЗЕО Ю N0:47)
СОР2	ΟΕΝΚΚΡ3 (ЗЕО ΙΟ N0:48);
ΟϋΚ3	КЗНОСЗВДНЬУ (ЗЕО Ю N0:49)

Способы лечения, описанные в настоящем патенте, также можно осуществлять с введением других пептидов. Например, можно вводить варианты М8Р в тех случаях, когда такие варианты связываются с ΚΟN, но не активируют ΚΟN, или, по меньшей мере, конкурентно ингибируют М8Р. См., например, публикацию заявки на патент США № 2003/0073656.

Введение антител к ΚΟN с другими антителами и/или малыми органическими молекулами можно осуществлять одновременно, или раздельно, одним или разными путями.

Антитела к ΚΟN согласно настоящему изобретению можно вводить с антагонистами ΚΟN и/или антагонистами других КТК, такими как антитела, которые блокируют лиганды КТК или ингибируют КТК иным образом. Примеры таких других КТК включают ЕСЕК, с-те! и УЕСЕК.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к ΚΟN используют в комбинации с антагонистом УЕСЕК. Например, антагонист УЕСЕК 1МС-18Е1 описан в Уи, е! а1., Сйп Сапсег Кез; 12(21) 6573-6584 (2006). В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к ΚΟN используют в комбинации с антагонистом рецептора, который специфичным образом связывается с рецептором УЕСЕК-2/КЭК (РСТ/И892/01300, подана 20 февраля 1992 г.; Тегтап е! а1., Οηсодеηе 6: 16771683 (1991)). В другом варианте осуществления антитело к ΚΟN вводят в комбинации с антагонистом рецептора, который специфичным образом связывается с рецептором УЕСЕК-1/Е6-1 (8ЫЬиуа М. е! а1., Οηсодеηе 5, 519-524 (1990)). Особенно предпочтительными являются антигенсвязывающие белки, которые связываются с внеклеточным доменом УЕСЕК-1 или УЕСЕК-2 и блокируют связывания лиганда (УЕСЕ или Р1СЕ), и/или ингибируют активацию, индуцируемую УЕСЕ или Р1СЕ. Например, МАТ 1МС1121 связывается с растворимым и экспрессируемым на поверхность клетки КОК. МАТ 1МС-1121 включает области УН и УЪ, полученные из библиотеки ЕаЬ человека на фаговом дисплее (см. \νΟ 03/075840). В другом примере 8сЕу 6.12 связывается с растворимым и экспрессируемым на поверхность клетки Е1!-1. 8сЕу 6.12 включает области УН и УЪ моноклонального антитела мыши МАЬ 6.12. Известна линия клеток гибридомы, продуцирующих МАЬ 6.12, о которой писали Уапд е! а1., В1ооб 104(9), 2893-2902 (2004).

Другим примером таких КТК является рецептор инсулиноподобного фактора роста (1СЕК). В клетках определенных опухолей ингибирование функции КТК может компенсироваться активацией путей передачи сигнала с участием других факторов роста, в частности, путем стимуляции ΚΟN. Кроме того, ингибирование передачи сигнала через 1СЕК приводит к повышению чувствительности опухолевых клеток к некоторым терапевтическим агентам. Стимуляция одного из ΚΟN или 1СЕК приводит к фосфорилированию обычных сигнальных молекул ниже по пути передачи сигнала, включая Ак! и р44/42, хотя и в разной степени. Соответственно, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антагонист 1СЕК (например, антитело, которое связывает 1СЕ или 1СЕК и подавляет данный рецептор) вводят одновременно с антителом согласно настоящему изобретению, что обеспечивает блокирование второго входа общего нижележащего пути передачи сигнала (например, ингибирование активации Ак! и/или р44/42). Примером антитела человека, специфичного в отношении 1СЕК, является 1МС-А12 (см. УС) 2005/016970).

Другой рецептор, который может быть мишенью в комбинации с ΚΟN, представляет собой ЕСЕК. ЕСЕК может быть мишенью для антитела, такого как описанное выше ЕгЬбих®, или небольшой органической молекулы. Одним из примеров небольшой молекулы-антагониста КТК является 1КЕ88 А™ (ΖΌ 1939), которая представляет собой производное хиназолина, функционирующее в качестве миметика АТФ, ингибирующего ЕСЕК. См., например, заявку на патент США № 5616582 (Уепеса Ытйеб); \νΟ 96/33980 (Уепеса Ытйеб), с. 4; см. также, Ко\\тпзку е! а1., АЬз1гас! 5, представленный на 37-й ежегодной встрече Λ8ίΌ, 8ап ЕгапДзсо, СА, 12-15 мая 2001; Ашбо е! а1., АЬз!гас! 1712, представленный на 37-й ежегодной встрече А8ОТ, 8ап Егапазсо, СА, 12-15 мая 2001 г. Другим примером малых молекул антагонистов ЕСЕК является ТАКСЕУА™ (Ο8Ι-774), представляющая собой производное 4(замещенный фениламино)хиназолина [6,7-бис-(2-метоксиэтокси)хиназолин-4-ил]-(3этинилфенил)амингидрохлорид, являющееся ингибитором ЕСЕК. См. \νΟ 96/30347 (РПхег 1пс.), напри- 20 018717 мер, на с. 2, строка 12 по с. 4, строка 34, и с. 19, строки 14-17. См. также Моуег е! а1., Сапсег Яе§., 57: 4838-48 (1997); Ро11аск е! а1., 1. Ркагшасок 291: 739-48 (1999). ТАЯСЕУА™ может ингибировать фосфорилирование ЕСРЯ и нижележащих каскадов передачи сигнала с участием Р13/АЯ1 и МАР (митогенактивируемый белок), что приводит к опосредуемой р27 блокировке клеточного цикла. См. Н1ба1до е! а1., АЬйгас! 281, представленный на 37-й ежегодной встрече АЗСА, 8ап Ргапсщсо, СА, 12-15 мая 2001 г. Описанные выше малые молекулы также могут ингибировать ЯΟN.

Другие примеры рецепторов к факторам роста, участвующих в образовании опухоли, представляют собой рецепторы к тромбоцитарному фактору роста (РЭСР), фактору роста нервов (Ν6Ρ) и фактору роста фибробластов (РОР). Такие рецепторы можно вводить в комбинации с ЯΟN.

В другом варианте осуществления антитела к ЯΟN можно вводить в комбинации с одним или более подходящими вспомогательными агентами, такими как, например, цитокины (например, 1Ь-10 и 1Ь-13), или другие иммуностимуляторы, такие как, без ограничения, хемокины, опухоль-ассоциированные антигены и пептиды.

В комбинированной терапии антитело к ЯΟN вводят перед, во время, по существу одновременно с или после применения другого агента, а также в любой комбинации условий, т.е. перед и после, во время и после или перед, во время и после применения антинеопластической терапии. Например, антитело к ЯΟN можно вводить за от 1 до 30 дней, или от 3 до 20 дней, или от 5 до 12 дней перед применением лучевой терапии. В одном варианте осуществления настоящего изобретения химиотерапевтический агент вводят одновременно или после лечения антителом.

Настоящее изобретение также относится к антителам к ЯΟN или фрагментам таких антител, к которым присоединена нацеливающая группа или репортерная молекула. Нацеливающая группа является одним из членов пары связывающихся молекул. В качестве примера, противоопухолевый агент конъюгируют со вторым членом такой пары и таким образом направляют в сайт, в котором связывается антигенсвязывающий белок. Обычным примером такой пары связывающихся молекул являются авидин и биотин. В предпочтительном варианте осуществления биотин конъюгирован с антигенсвязывающим белком согласно настоящему изобретению и, таким образом, обеспечивает мишень для противоопухолевого агента или другой молекулы, которая конъюгирована с авидином или стрептавидином. В качестве альтернативы биотин или другую подобную молекулу связывают с антигенсвязывающим белком согласно настоящему изобретению и используют в качестве репортера, например, в диагностической системе, в которой агент, обеспечивающий детектируемый сигнал, конъюгирован с авидином или стрептавидином.

Агенты, обеспечивающие детектируемый сигнал, можно использовать ш νί\Ό и т νίΙΐΌ в диагностических целях. Обеспечивающие сигнал агенты порождают измеряемый сигнал, который можно детектировать внешними средствами, обычно путем измерения электромагнитного излучения. Обычно агент, обеспечивающий сигнал, представляет собой фермент или хромофор, или испускает свет по механизму флуоресценции, фосфоресценции или хемилюминесценции. Хромоформы включают красители, которые поглощают свет в ультрафиолетовой или видимой области, и могут быть субстратами или продуктами разрушения в реакциях, катализируемых ферментами.

Кроме того, в объем настоящего изобретения включено применение настоящих антител ш νί\Ό и ш νϊΙΐΌ в диагностических и исследовательских методах, хорошо известных в данной области. Диагностические методы включают наборы, которые содержат антитела согласно настоящему изобретению. Такие наборы могут быть пригодны для идентификации лиц, для которых существует риск развития некоторых видов рака, путем детектирования повышенной экспрессии ЯΟN на поверхности клеток таких лиц. Дополнительно, антитела согласно настоящему изобретению благодаря своей способности выявлять ЯΟN могут быть использованы в лаборатории для исследовательских целей.

Настоящее изобретение также включает наборы, например наборы для подавления роста опухоли и/или ангиогенеза, связанного с опухолью, включающие терапевтически эффективное количество антитела человека к ЕСРЯ. Такие наборы могут дополнительно включать любой подходящий антагонист, например, другого рецептора фактора роста, вовлеченного в опухолегенез или ангиогенез (например, УЕ6РЯ-1/Р11-1, УЕ6РЯ-2, РЭСРЯ 1СРЯ, N6ΡЯ, ЕСРЯ, РСРЯ и т.д., как описано выше). В качестве альтернативы или дополнения, наборы согласно настоящему изобретению могут дополнительно включать антинеопластический агент. Примеры подходящих антинеопластических агентов в контексте настоящего изобретения приведены в данном описании. Наборы согласно настоящему изобретению могут дополнительно включать вспомогательный агент; примеры также были описаны выше.

Настоящее изобретение далее относится к способу идентификации и выделения антител, обладающих теми же функциональными особенностями, что и ЯΟN6 или ЯΟN8, или фрагментов таких антител, в которых скрининг библиотеки включает обеспечения аффинной матрицы, на которой расположен ЯΟN, обладающий функцией связывания лиганда, связанный с твердой подложкой, осуществление контакта аффинной матрицы с библиотекой фрагментов антител и отделение тех фрагментов антител, которые связываются с аффинной матрицей, от тех антител, которые не связываются с аффинной матрицей.

Твердая подложка обозначает неводный матрикс, к которому может прикрепляться ЯΟN. Примеры твердых фаз включают фазы, полностью или частично состоящие из стекла (например, стекло с контролируемым размером пор), полисахаридов (например, агарозы), полиакриламидов, полистирола, поливи- 21 018717 нилового спирта или силикона. В некоторых вариантах осуществления в зависимости от контекста твердые фазы могут также включать лунку или планшет для анализа; в других твердая фаза представляет собой колонку для очистки (например, колонку для аффинной хроматографии). Этот термин также включает не непрерывные твердые фазы, состоящие из дискретных частиц, такие как описаны в патенте

США № 4275149.

Настоящее изобретение также относится к способам лечения, в которых используют антитело к ΚΟΝ, отличное от представленного в настоящем описании.

В настоящем описании подробно описаны некоторые варианты осуществления изобретения. Хотя настоящее изобретение описано со ссылкой на эти конкретные варианты осуществления, очевидно, что настоящее изобретение не ограничено указанными конкретными вариантами реализации. Напротив, предполагается, что объем изобретения охватывает альтернативы, модификации и эквиваленты изобретения, определенного в формуле изобретения. В настоящем описании приведены многочисленные частные подробности, обеспечивающие лучшее понимание настоящего изобретения. Настоящее изобретение может быть осуществлено без одной из или без всех из указанных конкретных деталей. В других примерах известные процессы и операции не были подробно описаны, чтобы не препятствовать пониманию изобретения.

Все упомянутые выше патенты США, публикации заявок на патент США, заявки на патент США, а также иностранные патенты, опубликованные заявки на иностранные патенты и иностранные заявки на патенты полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

Все публикации, цитируемые в настоящем описании, ссылаются на опыт специалиста в области, к которой относится изобретение.

Все такие публикации полностью включены в настоящее описание посредством ссылки, в той же мере как если бы для каждой отдельной публикации было конкретно и отдельно указано, что она включена посредством ссылки.

Примеры

Приведенные ниже примеры представлены исключительно с целью иллюстрации и не ограничивают настоящее изобретение каким-либо образом. Примеры не включают подробное описание традиционных методов, например, тех, которые используют для создания векторов и плазмид, вставки генов, кодирующих полипептиды, в такие векторы и плазмиды или введения плазмид в клетку-хозяина. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области и описаны в многочисленных публикациях, включая 8ашЬгоок, I.. Егккск, Ε.Ε. и Машабк, Т. (1989). Мо1еси1аг С1ошпд: Α 1аЬога!огу Мапиа1, 2пб Еб1Поп, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаФгу Рге§8.

Материалы и методы.

Получение и свойства двух антител к ΚΟΝ: ΚΟΝ6 и ΚΟΝ8.

Пример 1. Получение антител к ΚΟΝ.

Человеческие моноклональные антитела к ΚΟΝ (в настоящем описании ΚΟΝ6 и ΚΟΝ8) получали с помощью стандартных гибридомных методик (Наг1о\у & Ьапе, еб., ЛпНЬоб1е5: Α ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог, 211-213 (1998), включено в настоящее описание посредством ссылки) с использованием мышей НиΜΑЬ (Мебагех, 8ап 1о§е, Са11£.), которые продуцируют гамма-тяжелые и каппа-легкие цепи иммуноглобулина человека. Мышей НиΜΑЬ подкожно иммунизировали фрагментом внеклеточного домена ΚΟΝ, клетки ΚΕ7 и МОСК, экспрессирующие рецептор ΚΟΝ человека в полном адъюванте Фрейнда. Животным трижды внутрибрюшинно вводили одинаковый белок ΚΟΝ в неполном адъюванте Фрейнда перед слиянием. Животным давали отдохнуть в течение месяца перед тем, как ввести 1.р. конечную дозу 25 мкг белка ΚΟΝ в фосфатном буфере (РВ8). Спустя 4 дня из иммунизированных мышей выделяли спленоциты и объединяли их с Вс1-2 трансфектантами плазмоцитомных клеток Р3-Х63Α§8.653 с помощью полиэтиленгликоля (РЕС, М\У: 1450 КО). После слияния клетки ресуспендировали в среде ΗΑΤ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (ЕВ8), и помещали в 96-луночные планшеты в плотности 200 мкл на лунку для получения гибридомных клеток. Спустя 6 дней после слияния 100 мкл среды удаляли и заменяли на 100 мкл свежей среды.

Следует отметить, оказалось, что 180 клонов гибридом после одного слияния продуцировали антитела, взаимодействующие с белком гйи-ΚΟΝ. Из 180 положительных клонов только 5 оказывали блокирующее действие. Из этих 5 для дальнейшей разработки отобрали только 2, ΚΟΝ6 и ΚΟΝ8, на основе повышенной способности к специфичному связывания.

Трижды проводили субклонирование этих клонов гибридом, оказывающих блокирующее действие, для получения моноклональных гибридомных клеточных линий, продуцирующих моноклональные антитела (МАТ), направленные против ΚΟΝ.

Далее проводили селекцию клонов, оказывающих блокирующее действие, на повышенную блокирующую активность. Клоны, обозначенные как ΚΟΝ6 и ΚΟΝ8, обладали большей блокирующей активностью с 1С₅₀ 2-3 нМ, как определили с помощью ΕΗδΑ, и высоким сродством (Кб=45 и 23 пМ соответственно). Эти два клона отобрали для дальнейшей разработки.

Антитела ΚΟΝ6 и ΚΟΝ8 представляют собой 1дС антитела, их соответствующие тяжелые и легкие цепи были просеквенированы. Со структурой каждого антитела можно ознакомиться на приложенных

- 22 018717 фигурах и соответствующих последовательностях, приведенных ниже.

Структура Β0Ν6.

Антитело Β0Ν6 содержит две тяжелые цепи, изображенные на фиг. 2А-2С, которые в совокупности иллюстрируют δΕΟ ΙΌ Ν0: 10, которые кодируются последовательностью ДНК δΕβ ΙΌ Ν0: 9. Следует отметить, что первые 19 остатков/кодонов на фиг. 2А представляют собой сигнальную секреторную последовательность, которая не входит в состав цепи зрелого антитела.

Антитело Β0Ν6 также содержит две легкие цепи, изображенные на фиг. 2Ό-2Ε, которые в совокупности иллюстрируют δΕβ ΙΌ Ν0: 12, которые кодируются последовательностью ДНК δΕβ ΙΌ Ν0: 11.

Следует отметить, что первые 19 остатков/кодонов на фиг. 2Ό представляют собой сигнальную секреторную последовательность, которая не входит в состав цепи зрелого антитела.

Структура Β0Ν8.

Антитело к Β0Ν8 включает две тяжелые цепи, изображенные на фиг. 3А-3С, которые в совокупности иллюстрируют δΕΟ ΙΌ Ν0: 14, которые кодируются последовательностью ДНК δΕβ ΙΌ Ν0: 13. Следует отметить, что первые 19 остатков/кодонов на фиг. 3А представляют собой сигнальную секреторную последовательность, которая не входит в состав цепи зрелого антитела.

Антитело к Β0Ν8 также содержит две легкие цепи, изображенные на фиг. 3Ό-3Ε, которые в совокупности иллюстрируют δΕΟ ΙΌ Ν0: 16, которые кодируются последовательностью ДНК δΕβ ΙΌ Ν0: 15. Следует отметить, что первые 19 остатков/кодонов на фиг. 3Ό представляют собой сигнальную секреторную последовательность, которая не входит в состав цепи зрелого антитела.

Пример 2. Антитела к Β0Ν из примера 1 связываются с Β0Ν и подавляют связывание Β0Ν с его лигандом (ΜδΡ).

ΕΌΙδΑ на связывание: спустя 10-12 дней после слияния проводили скрининг гибридом на предмет продукции антител и избирательное связывающее действие супернатанта культуры с белком Λ-Β0Ν в анализах по связыванию и блокированию ΕΌΙδΑ. Мах1-§огр 96-луночные микротитровальные планшеты (М.1пс) покрывали белком 1Ί1-Β0Ν (1 мкг/млх100 мкл) (Β&Ό δу8!ет8) при КТ в течение 1,5 ч. После отмывания планшетов их блокировали 3% ΡΒδ на молоке. Затем антитела к Β0Ν, полученные из супернатантов гибридом, добавляли в покрытые лунки и инкубировали в течение 1,5 ч при ΒΤ (КТ). После нескольких отмывок в лунки добавляли разведения 1:1000 антител к Ι§6 человека, конъюгированных с НΒΡ, в течение 1,5 ч при ΒΤ для определения положительного связывания. Далее положительные гибридомы трижды клонировали с помощью метода предельного разведения для получения моноклональных гибридом.

ΕΌΙδΑ для определения антител, которые блокируют взаимодействие ΜδΡ/Β0Ν: Мах1-§огр 96луночные микротитровальные планшеты Щипс) покрывали (1 мкг/млх100 мкл) ΜδΡ (Β&Ό δу8!ет8) при ΒΤ в течение 1,5 ч. После отмывки планшеты блокировали 3% ΡΒδ на молоке. Антитела к Β0Ν, выделенные из супернатантов гибридом, первоначально инкубировали на протяжении 1 ч при КТ с 1Ί1-Β0Ν и затем добавляли в лунки, покрытые ΜδΡ. Спустя 1,5 ч инкубации ΒΤ с последующими отмывками, в планшеты добавляли разведение 1:1000 антител к Ι§6 человека, конъюгированных с НΒΡ в течение 1,5 ч при ΒΤ для того, чтобы определить, какое антитело к Β0Ν может блокировать взаимодействие ΜδΡ/Β0Ν.

ΕΌΙδΑ для определения Β0Ν8, блокирующих связывание ΜδΡ с Β0Ν: планшеты для ΕΌΙδΑ покрывали ΜδΡ (100 нг/лунка) без носителя (Β&Ό δу8!ет8) в течение ночи при 4°С на шейкере. Планшеты отмывали 0,2% ΡΒδ/Τ и в течение 2 ч при 37°С блокировали 3% молоком (150 мкл/лунка). Готовили разведения Β0Ν8 15 мкг/мл и последовательно распределяли по другому планшету для ΕΌΙδΑ. К Β0Ν8 добавляли человеческий рекомбинантный ΜδΡΒ в количестве 100 нг/лунка (Β&Ό δу8!ет8). Комплекс Β0Ν8/Λ-ΜδΡΒ формировался в течение 2 ч при комнатной температуре на шейкере. Затем планшеты для ΕΌΙδΑ, покрытые ΜδΡ, отмывали 0,2% ΡΒδ/Τ и в каждую лунку добавляли по 100 мкл комплекса Β0Ν8/Λ-ΜδΡΒ. После 1,5-часовой инкубации при комнатной температуре планшеты пять раз отмывали 0,2% ΡΒδ/Τ и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с разведениями 1:2000 антитела к Н18-метке НΒΡ (δίβΐηπ). которое узнает НЕ метку на рекомбинантном человеческом белке ΜδΡΒ. Планшет отмывали 5 раз 0,2% ΡΒδ/Τ, и в лунки добавляли субстрат 100-АЬ до получения желтого цвета. Реакцию останавливали 50 мкл 1Ν Н^0₄ и измеряли поглощение при 450 нм на стандартном планшетном считывающем устройстве. Результаты представлены на фиг. 6А, на которой представлены блокирующие свойства твердой фазы Β0Ν8. С помощью ΕΌΙδΑ определили значение ΙΟ₅₀ для Β0Ν8, которое необходимо для того, чтобы блокировать взаимодействие рекомбинантного человеческого белка Β0Ν с иммобилизованным рекомбинантным человеческим ΜδΡ.

- 23 018717

Миграция клеток. Для того чтобы определить, способно ли ΚΟΝ8 блокировать миграцию клеток рака легкого Н596 (АТСС, Мапаккак, УА), вызванную М8Р, использовали 24-луночные вставки в клеточные культуры, содержащие пористые прозрачные полиэтиленовые терефталатные трековые мембраны (размер пор 8,0 А; Вески ΩίοΚιηδοη Ра1соп). Перед проведением анализа нижнюю сторону пористых мембран покрывали коллагеном, помещая мембраны в 24-луночные планшеты Еа1соп, заполненные 700 мкл раствора очищенного коллагена УПгодеп-100 (25 мкг/мл; СоНейоп, Ра1о А11о, СА). Вставки оставляли в течение 1 ч при 4°С и затем помещали в новый 24-луночный планшет. Затем 6х10⁵ жизнеспособных клеток, которые в течение 24 ч подвергали бессывороточному голоданию, однократно промывали ФБР (РВ8), после чего сеяли в верхнюю камеру вставки в клеточную культуру в 300 мкл бессывороточной среды. В нижнюю камеру в 700 мкл бессывороточной среды добавляли М8Р в течение 24 ч при 37°С для того, чтобы вызвать миграцию клеток через покрытую коллагеном пористую мембрану. 0% сыворотку использовали в качестве негативного контроля и 10% сыворотку использовали в качестве положительного контроля миграции клеток. Перед добавлением М8Р в некоторые из верхних камер добавляли ΡΟΝ8 на протяжении 1 ч, для того чтобы определить, способен ли он подавить миграцию Н596 клеток, вызванную М8Р. В заключение анализа, мигрировавшие клетки, прикрепившиеся к нижней стороне мембраны, покрытой коллагеном, окрашивали красителем Хехст (2 мкг/мл; 1пуйтодеп-Мо1еси1аг РгоЬек, СаткЬаб, СА), анализировали препараты с помощью флуоресцентного микроскопа при увеличении 100х и считали клетки с помощью программного обеспечения 1таде-Рго Р1и§. Фиг. 6В иллюстрирует способность ΡΟΝ8 подавлять миграцию клеток рака легкого Н596.

Способность ΚΟΝ8 подавлять миграцию в Ιη Уйто анализе заживления ран. На монослой клеток рака легкого Η292 наносили царапину. Добавляли ΚΟΝ8 для того, чтобы определить, может ли он подавлять способность М8Р вызывать миграцию клеток для того, чтобы заполнить рану. Клетки рака легкого Н292 сеяли при плотности 2,5х10⁵ клеток/лунка в 6-луночный планшет Вес1оп О1ск|п5оп Ра1соп и оставляли расти в течение ночи для достижения монослоя. Клетки выдерживали в бессывороточной среде в течение 48 ч. Перед добавлением М8Р некоторые клетки предварительно инкубировали с антителом ΚΟΝ8 в течение 1 ч до нанесения раны. В начале анализа кончиком пластиковой пипетки на 200 мкл наносили небольшую ранку. Затем клетки инкубировали в течение 24 ч в присутствии или в отсутствие М8Р в бессывороточной среде с антителом ΡΟΝ8. 0% сыворотку использовали в качестве негативного контроля, 10% сыворотку использовали в качестве положительного контроля миграции клеток в рану. После 24-часовой инкубации клетки анализировали с помощью микроскопии в светлом поле при увеличении 40х. Наблюдали, что 100 нМ ΡΟΝ8 подавляют миграцию клеток для заполнения раны, благодаря чему показали способность ΚΟΝ8 подавлять миграцию клеток на модели ш νίΙΐΌ.

Способность ΚΟΝ8 подавлять пролиферацию. Фиг. 6С иллюстрирует подавление ΡΟΝ8 синтеза ДНК, вызванного М8Р, в клетках рака поджелудочной железы. Фиг. 6С(1) показывает стимуляцию М8Р включения [3Н]-тимидина, которое является мерой синтеза ДНК. Опухолевые клетки (10000 на лунку) помещали в 96-луночные планшеты для тканевых культур и оставляли в покое. В течение 20 ч клетки стимулировали М8Р. В каждую лунку добавляли [3Н]-тимидин (0,25 тС1) и инкубировали еще 4 ч. Радиоактивность встроенной ДНК определяли с помощью счетчика люминесценции. Точки, среднее из двойной выборки, полоски, стандартное отклонение. На фиг. 6С(2) показана система, в которой клетки предварительно обрабатывали ΡΟΝ8 в течение 1 ч перед добавлением М8Р.

Анализ В1Асоге. Кинетику связывания антител с белками определяли с помощью В1Асоге 3000 (В1Асоге, РксаЦцуау, ΝΊ). Рекомбинантный ΡΟΝ-Рс иммобилизовали на сенсорном чипе и вводили антитела в различных концентрациях. Получали сенсорграммы и с помощью В1А Еуа1иа1топ 2.0 анализировали их на программном обеспечении для определения констант скорости. Константу сродства, К_с, вычисляли из соотношения констант К_о££/К_оп. К_оп, М’¹.8’¹ и Ко££, 8^-1 скорости взаимодействия использовали для определения сродства (К4, М) взаимодействия антитело/рецептор. Скорости К₄, К_оп и К_о££ ΡΟΝ6 составили 4,1е-11, 2,2е6 и 8,6е-5. Для ΚΟΝ8 они составляли 3,2е-11, 6.1е6 и 2,0е-4.

Поточная цитометрия для экспрессии ΚΟΝ поверхности клетки. 1 млн клеток прикрепленных линий опухолевых клеток инкубировали в РВ8+5% ЕС8 в течение получаса с 5 мкг ΡΟΝ8 при 4°С. После отмывки РВ8+5% ЕС8, клетки инкубировали со вторыми антителами против 1дО человека, конъюгированными с фикоэритрином (Засккоп 1ттипо Яекеагск), в течение 30 мин при 4°С. После отмывки РВ8+5% ЕС8 клетки анализировали с помощью проточной цитометрии на проточном цитометре ЕАС8уайаде 8Е (ВесЮп Оюкнъоп).

Вестерн-блоттинг и иммунопреципитация. Клетки сеяли в 10-см или 6-луночные чашки для культивирования и выращивали до плотности 70-80%. Монослой дважды отмывали РВ8 и оставляли в бессывороточной среде в течение ночи. Затем добавляли антитела и инкубировали при 37°С 60-120 мин. Клетки стимулировали М8Р лигандом 10 мин и затем помещали на лед и отмывали ледяным РВ8. Клетки лизировали 50 мМ Ттщ-НС1 (рН 7,4), 150 мМ ЫаС1, 1% ТгПоп Х-100, 1 мМ ЕОТА, 1 мМ фенилметилсульфонилфторидом, 0,5 мМ Nа₃УΟ₄, 1 мкг/мл лейпептина, 1 мкг/мл пепстатина и 1 мкг/мл апротинина на льду в течение 10 мин. Лизат очищали центрифугированием при 4°С. Затем проводили иммунопреципитацию растворимого ΚΟΝ из лизата. Антитело к ΡΟΝ, клон С-20 (8айа Сгнх Вю1ес11по1оду, 8айа Стих,

- 24 018717

СΑ) или ΚΟΝ6 и ΚΟΝ8 инкубировали с 400 мкл лизата 4 мкг/мл в течение ночи при 4°С. Иммунные комплексы осаждали добавлением белковых бусин А-агарозы в течение 1 ч при 4°С, осаждали центрифугированием и трижды отмывали лизирующим буфером. Иммунопреципитаты, связавшиеся с белковыми бусинами А-агарозы, вносили в буфер для образца денатурирующего геля. Проводили денатурирующий гель-электрофорез лизатов иммунопреципитатов в 4-12% акриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану с помощью Вестерн-блоттинга. Фосфорилированный по тирозину белок определяли на отпечатках с помощью антитела против фосфо-ΚΟΝ (Βίοκοιιιτχ) и вторых антител антимышиных с пероксидазой хрена. ΚΟΝ определяли с помощью моноклональных антител ΚΟΝ С-20 (§ап!а Стих Βίο^Εηο1οβ\\ Фосфо-Αкΐ и общие Α1<1 антитела получали из ΡΕηΓΜίη^η (ΒΌ ΒίοδΑικχδ, §ап Όκ§ο, СΑ). Для фосфорилирования ΜΑΡΚ, у Се11 δίβηηΗηβ ТесЕмк^у приобретали фосфо-р44/42 и общие р44/42 антитела. Полоски визуализировали с помощью хемилюминесцентного реагента ^теткЕат ΡΕ;·ιπη;κί;·ι Β^οΐесЕ) на рентгеновской пленке (Еа8ΐтаη Κο6ηΕ КцсЕекк!, ΝΥ).

ΕΟδΑ для определения 1С₅₀ и ЕИ₅₀. Способность антител к ΚΟΝ, ΚΟΝ6 и ΚΟΝ8 связываться с человеческим рекомбинантным рецептором ΚΟΝ и блокировать взаимодействие Μ8Ρ/Κ.ΟΝ определяли с помощью ΕΗδΑ. С рецептором, иммобилизированным на планшете для ΕΗδΑ, значения ЕИ₅₀ для связывания ΚΟΝ6 и ΚΟΝ8 с ΚΟΝ составили 4,2 пМ и 2,1 пМ соответственно. С помощью аналогичного ΕΗδΑ проверяли два антитела по их способности блокировать взаимодействия ΜδΡ/ΚΟΝ. Определенные значения 1С₅₀ составили 46 пМ для ΚΟΝ6 и 62 пМ для ΚΟΝ8.

Модель ксенотрансплантата опухоли человека. Ксенотрансплантаты опухоли получали посредством подкожных инъекций 5/10⁶ клеток, смешанных с Μаΐ^^де1 (Сο11аЬο^аί^νе КекеагсЕ Β^1Ε2ΐηχ;·ι15, Βеб£οτ6, ΜΑ), в левый бок 5-6-недельных бестимусных самок мышей (ш/пц) (СЕаг1ек Ийег ^аЬο^аΐο^^е8, \νί1ιηίη§1οη, ΜΑ). Дожидались, пока опухоли достигнут 150-300 мм³ в объеме, после чего мышей делили на 3 группы по 12 в каждой. Ежедневно в течение 3 дней мышам внутрибрюшинно вводили контрольное антитело (1§С человека) или антитела ΚΟΝ6 и ΚΟΝ8. Обработка животных продолжалась в течение исследования. Два раза в неделю опухоли измеряли циркулем и определяли объем опухолей по следующей формуле: (π/6 (ν1 /\\2/\\2)), где ν1 - максимальный диаметр опухоли и ν2 - минимальный диаметр опухоли. Объем опухолей анализировали с помощью и критерия Манна-Уитни и программы 8|§та81а1 (версия 2.03; 1аг1бе1 8сюпййс, δаη Ка£еа1, СΑ).

Пример 3. Подтверждение подавления опухоли на модели ксенографта опухоли человека.

Эффективность антител ΚΟΝ6 и ΚΟΝ8 в подавлении роста опухоли ίη νίνο подтвердили на четырех различных опухолевых клетках с применением метода ксенографта мыши, описанного выше в примере 2. Использовали следующие клетки: клетки Н-292, выделенные из опухоли легкого, полученные из Американской коллекции культур (Μаηа88а8, νΑ). НТ-29 клетки, выделенные из опухоли прямой кишки, полученные из Американской коллекции культур (Μаηа88а8, νΑ). ΒxΡС3 клетки, выделенные из опухоли поджелудочной железы и полученные из Американской коллекции культур (Μаηа88а8, νΑ). ίΙΜΤ клетки, выделенные из опухоли молочной железы и полученные из Американской коллекции культур (Μаηа88а8, νΑ).

С помощью метода ксенографта, описанного выше, клетки Н-292 вводили 24 мышам. 12 мышам вводили антитело к ΚΟΝ6 в количестве 60 мг/кг и 12 вводили физиологический раствор, как контроль. Наблюдали значительное подавление объема опухоли по сравнению с контролем, как показано на фиг. 4А. Также эксперимент проводили на 40 мышах, поделенных на 4 группы, которым вводили физиологический раствор и антитело к ΚΟΝ8 в количестве 60, 20 и 2 мг/кг соответственно. Наблюдали значительное подавление объема опухоли по сравнению с контролем, как показано на фиг. 4В. Как следует из фиг. 4В, этот эксперимент также подтверждает, что ответ усиливается с дозой антитела.

С помощью метода ксенографта, описанного выше, клетки НТ-29 вводили 24 мышам. 12 мышам вводили антитело к ΚΟΝ6 в количестве 60 мг/кг и 12 вводили физиологический раствор. Наблюдали значительное подавление объема опухоли по сравнению с контролем, как показано на фиг. 4С. Аналогичные эксперименты также проводили с другой группой на 40 мышей, которых разделили на 4 группы, которым вводили физиологический раствор или антитело к ΚΟΝ8 в количестве 60 мг/кг, 20 мг/кг и 2 мг/кг соответственно. Наблюдали значительное подавление объема опухоли по сравнению с контролем, как показано на фиг. 4Ό. Как следует из фиг. 4Ό, этот эксперимент также подтверждает, что ответ усиливается с дозой антитела.

С помощью метода ксенографта, описанного выше, клетки ΒxΡС3 вводили всего 60 мышам. Мышей разделили на 5 групп по 12 в каждой и вводили им соответственно: физиологический раствор, 60 мг/кг ΚΟΝ8, 60 мг/кг ЕтЬЕих® (полученный от ^С^е 8у8(ет8, 1пс.), 60 мг/кг ΚΟΝ8 и 60 мг/кг ЕтЬйих® и 60 мг/кг ЕгЬЕих® и 60 мг/кг Еи1д6 (контроль 1дС, полученный из Μе^^б^аη Ы£е 8с1ег1се8). Результаты, отображенные на фиг. 4Е, подтверждают, что ΚΟΝ8 усиливает противоопухолевый эффект Цетуксимаба на модели ΒxΡС3 (р=0,06 односторонний анализ ΑΝΟνΑ).

С помощью метода ксенографта, описанного выше, клетки ΙΙΜΤ-1 рака молочной железы подкожно вводили голым мышам и позволяли опухоли достигать размеров приблизительно 250 мм³. Наносили на график объем опухоли в процессе лечения, которое включало контроль (физиологический раствор),

- 25 018717

ΚΌΝ8 (60 мг/кг, дважды в неделю), доцетаксел или сочетание доцетаксела и ΚΌΝ8. Получили среднее +/- погрешность среднего. Результаты, отображенные на фиг. 4Р, подтверждают, что ΚΌΝ8 подавляет рост ксенографтов опухоли молочной железы у голых мышей на модели ЛМТ-1.

Цитируемые публикации

1) Уапд, М.Н., Кий/, А.Ь., Скеп, Υ. (200оЬ). 1бепййсайоп οί а поме1 зркстд ргобис! οί 1Пс ΚΌΝ гесерЮг 1уго51пе ктазе ίη китап со1огес1а1 сагстота се11з. Сатстодепез1з 21, 1507-1512.

2) Ьеопагб, ЕЛ., ОапПкотйск, А. (2000). Масгоркаде зйтйайпд рго1е1п. Абм. Сапсег Кез. 77, 139-167.

3) Бкее1, А., Ьеопагб, ЕЛ. (1994). Асйоп апб (агде! се11 зреаПску οί китап тасгоркаде-зйтикЮпд рго1сш (МБР). 1. 1ттипо1. 152, 4618-4623.

4) Ьеопагб, ЕЛ., Бкее1, А. (1976). А зегит рго1ет 1ка1 зйтиЫез тасгоркаде тονетеηΐ, скето1ах!з апб зргеабтд. Ехр. Се11 Кез. 102, 434-438.

5) Етата, А., Уапд, М.Н., Υашадиск^, Ν., Окпо, Ν., Окапо, К., Бибо, Т., Такеуа, М., Сегм-из, Р., Мог155ейе, С., Ьеопагб, ЕЛ. (1995). Тегтта1 б1ГРегеп11а11оп οί типпе гез1беп1 репЮпеа1 тасгоркадез 1з скагас1епхеб Ьу ехргеззюп оГ !ке БТК рго1еш (угозте ктазе, а гесерЮг Гог тасгоркаде-зйти1айпд рго1ет. В1ооб 86, 3394-3403.

6) Уапд, М.Н., Сох, С.У., Υοзк^ши^а, Т., БкеГЙет, Ь.А., Бкее1, А., Ьеопагб, ЕЛ. (1994а). МасгоркадезйтикЮпд рго1ет тЫЬкз тбископ оГ п11г1с ох1бе ртобископ Ьу епбоЮхт- ог су1окте-зйти1а1еб тоизе тасгоркадез. ί. Вю1. Скет. 269, 14027-14031.

7) Уапд, М.Н., Эк^оз/, А.А., Бип, Υ., Биба, Т., Бкее1, А., Ьеопагб, ЕЛ. (1996а). МасгоркадезйтикИтд рго1ет тбисез ртокГегакоп апб плдгаиоп оГ шитше кегайпосу1ез. Ехр. Се11 Кез. 226, 39-46.

8) Уапд, М.Н., Моп1его-1иНап, Р.А., Оаипу, I., Ьеопагб, ЕЛ. (1996Ь). Кес.|шгетеп1 оГ ркозркакбукпозЬ !о1-3 к1пазе Гог ерйкека1 се11 плдгайоп асймйеб Ьу китап тасгоркаде зйтикИтд рго1ет. Опсодепе 13, 2167-2175.

9) Окто, Т., Едат1, Н., Октаскк Н., Така1, Е., Татой, Υ., №1када\\'а, К., Nакаηο, Б., Акад1, ί., Бакато1о, О., Биба, Т., Одата, М. (1999). Ргезепсе оГ ΚΌΝ гесерЮг (угозте ктазе апб кз зркстд мапап1 ίπ такдпап! апб поп-таНдпап! китап со1ошс тисоза. 1п1. 1. Опсо1. 15, 709-714.

10) Скеп, Υ.Ο., 2кои, Υ.Ο., Апде1от, Ό., Кий/, А.Ь., Окшд, Χ.Ζ., Уапд, М.Н. (2000). Омегехртеззюп апб асбмайоп оГ !ке КОХ гесерЮг (утозше ктазе т а рапе1 оГ китап со1огес1а1 сагс1пота се11 кпез. Ехр. Се11 Кез. 261, 229-238.

11) Уапд, М.Н., Кий/, А.Ь., Скеп, Υ. (2000Ь). 1беп11Г1са11оп оГ а поме1 зркстд ргобис! оГ !ке КОН гссерЮг 1угозте ктазе т китап со1огес!а1 сагстота се11з. Сагстодепез1з 21, 1507-1512.

12) УШей, С.С., Уапд, М.Н., Етапиек К.Ь., Сгакат, Б.А., Бтйк, Ό.Ι., Бкпбкаг, V., БидагЬакег, ЬЛ., Бипбау, М.Е. (1998). Мас^οркаде-зΐ^ши1аΐ^пд рго1ет апб Йз гесерЮг т поп-зта11-се11 1ипд йппогз: тбископ оГ гесерЮг 1угозте ркозркогукЮоп апб се11 ппдгайоп. Аш. 1. Кезрт Се11 Мо1. Вю1. 18, 489-496.

13) Маддюта, Р., Матскю, Б., Б!е11а, М.С., С1а1, М., Ве1йоте, А., Эе Войок, М., Όί Кеп/о, М.Р., Соз1ап1то, А., Б1зтопб1, Р., Сотодко, Р.М. (1998). Отегехргеззюп оГ !ке КОК депе т китап Ьгеаз! сагстота. Опсодепе 16, 2927-2933.

14) Скеп, Υ.Ο., Ζ^νι, Υ.Ο., Р1зкег, 1.Н., Уапд М.-Н. (2002). Тагде!еб ехргеззюп оГ !ке гесерЮг 1угозте ктазе КОN т б1з1а1 1ипд ерйкека1 се11з гезикз т тиктрк (итог Гогтайоп: опсодетс ро!еп11а1 оГ КОк т мгмо. Опсодепе 21, 6382-6386.

15) Скеп Υ.Ο., ΖΙμιι Υ.Ο., Ри Ь.Н., Уапд Ό., Уапд М.Н. (2002). Ми1кр1е ри1топагу абепотаз т !ке 1ипд оГ Дапздешс писе омегехргеззтд !ке КОN гесерЮг 1угозте ктазе. Сагстодепез1з 23, 1811-1819.

16) Байого М.М., Со11ез1 С., Сйзепб1 Б., Саибто С., Сотодко Р. (1996). СопзШикме Аскмайоп оГ !ке КОN Сепе РготоЮз 1пмаз1ме Сго\\1к Ьи! №1 ТгапзГоппайоп. Мо1еси1аг апб Се11и1аг Вю1оду, Ьес, р. 70727083.

17) О'Тоо1е ЬМ., КаЬепаи К.Е., Вигпз К., Ьи Ό., МапдайтраШ V., Ва1бегез Р., Сомто Ν., Вазз1 К., Ргс\ус11 М., Соййебзеп КЛ., ТкоЬе М.п., Скепд Υ., Ь1 Υ., Нюккп Ό.ί., ΖΙιιι Ζ., \Уа11х Б.Е., Наутап МЛ., ЬибМд Ь.Ь. апб Регепа, Ь.Б. (2006). Ткетарейю 1тр11сайопз оГ а Нитап №йга11/тд АпйЬобу (о !ке Мас^οркаде-Бΐ^ши1аΐ^πд Рго1ет Кесерйг Тугозте К1пазе (КОN). а с-МЕТ Ратку МетЬег. Сапсег Кезеагск 66: (18), 9162-9170.

18) Райоп К.Т., Тгейакома М.Б., Υ-о ЬЬ., Рарамего V., Нио Ь., Аб1еу В.Р., \Уи С., Ниапд 1., Ртз М.К., Тек В.Т., Халд ХЛ. (2004). Ехргеззюп оГ КОN РгоЮ-опсодепе т Кепа1 ОпсосуЮта апб СкготоркоЬе Кепа1 Се11 Сагстота. Аш 1. Бигд Ра(ко1., Аид 28 (8): 1045-50.

19) Бихик| Υ., РипакозЫ Н., МасЫбе М., Макитой К., Nакаши^а Т. (2008). КедикИюп оГ се11 т1дгакоп апб суЮкше ргобисбоп Ьу НСР-11ке рго1ет (Н^Р)/шас^οркаде зйши1аΐ^пд рго1ет (МБР) т рптагу ш1сгодка. Вютеб Кез. Арг; 29 (2): 77-84.

20) Саибто С., Амап1адд1а1о V., Ео11еп/1 А., Асатрога Ό., Бкпеопе А., СотодНо Р.М. (1995). Тке ргоЮ-опсодепе КОN 1з тмокеб т беνе1οршеπΐ оГ еркке11а1, Ьопе апб пеиго-епбосйпе кззиез. Опсодепе. Ьес 21; 11 (12): 2627-37.

- 26 018717

Перечень последовательностей <110> 1МСЬОЙЕ ььс <120> ИНГИБИРОВАНИЕ РЕЦЕПТОРА БЕЛКА, СТИМУЛИРУЮЩЕГО МАКРОФАГИ (ΚΟΝ), И

СПОСОБЫ ЕГО ЛЕЧЕНИЯ <130> Х18618 <140> РСТ/0308/13130 <141> 2008-11-21 <150> 60/989,559 <151> 2007-11-21 <160> 51 <170> Патентная версия 3.5 <210> 1 <211> 375 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 1

саддЬссадс	рддрдсад!с	!дддссРдад	дЬдаадаад!	с!ддд1сс!с	ддрдаадд!с	60
ϊ ссГдсаадд	сСЬсСддадд	сасс!!садс	адсда!дсЬа	!сасс!ддд!	дсдасаддсс	120
сс1ддасаад	ддс!!дад!д	даСдддаддд	а!саЕсссСа	Гсс!Гдд!а!	ддсааас!ас	180
дсасадаад!	Рссадддсад	ад!сасда!!	ассдсддаса	аа!ссасдаа	сасадссГас	240
а!ддадсбда	дсадссГдад	аЬсЬдаддас	асддссд!д!	а!НИд1дс	дададЬддсс	300
да!ЬасГаЬд	д!!!ддддас	СРасСасРдд	Га-1!сда!с	!с!ддддссд	1ддсассс!д	360

дСсасТдТсТ сстса 375 <210> 2 <211> 125 <212> РКТ <213> Ното зар1епз <4 00> 2

С1п 1

Уа1

С1п

Ьей

Уа1 5

С1п

Зег

С1у

Рго

С1и 10

УаЬ

Ьуз

Ьуз

Зег

С1у 15

Зег

Бег

Уа1

Ьуз

Уа1

Бег

Суз

Ьуз

А1а

Бег

С1у

С1у

ТНг

РНе

Бег

Бет

Азр

20

25

30

А1а

Не

ТНг

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

С1п

С1у

Ьей

С1и

Тгр

Ме!

35

40

<35

С1у

С1у

Не

Не

Рго

11е

Геи

С1у

Ме!

А1а

Азп

Туг

А1а

С1п

Ьуз

РЬе

50

55

60

С1п

С1у

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

А1а

Азр

Ьуз

Бег

ТЪг

Азп

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

- 27 018717

МеЬ

С1и

Ьеи

Зег

Зег 85

Ьеи Агд

Зег С1и Азр 90

ТЬг А1а

Уа1

Туг

РЬе 95

Суз

А1а

Агд

Уа1

А1а

Азр

Туг

Туг

С1у

Ьеи

С1у

ТЬг

Туг

Туг

Тгр

Туг

РЬе

100

105

110

Азр

Ьеи

Тгр

С1у

Агд

С1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

125

<210> 3 <211> 324 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 3

даааЬЬдЬдЬ	ЬдасдсадЬс	Сссаддсасс	сСдЬсЬСЬдЬ	сСссадддда	аададссасс	60
сЬсЬссЬдса	дддссадьса	дадЬдЬ Раде	адсадсЬасЬ	ЬадссЬддЬа	ссадсадааа	120
сс5ддссадд	сЬсссаддсЬ	ссЬсаЬсЬаЬ	ддСдсаСсса	дсЬдддссас	СддсаСссса	180
дасаддСЕса	дЬддсадЬдд	дЬсЬдддаса	дасЬЬсасЬс	ЬсассаЬсад	садасЕддад	240
ссХдаадаЕЕ	ЬЬдсадЬдЬа	ЬЬасЬдЬсад	сааЬаЬддЬа	дсСсассЬсЬ	сасЕГЕсддс	300

ддадддасса аддЬддадаС сааа 324 <210> 4 <211> 108 <212> РКТ <213> Ното зар1епз

<400> 4

Ьеи

Зег

Рго 15

С1у

С1и 1

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг 5

С1п

Зег

Рго

С1у

ТЬг 10

Ьеи

Зег

С1и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

Е1п

Зег

Уа1

Зег

Зег

Зег

20

25

30

Туг

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

61п

Ьуз

Рго

С1у

Е1п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

35

40

45

Не

Туг

С1у

А1а

Зег

Зег

Тгр

А1а

ТЬг

61у

11е

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

50

55

60

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Агд

Ьеи

С1и

65

70

75

80

Рго

С1и

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

С1п

С1п

Туг

С1у

Зег

Зег

Рго

85

90

95

Ьеи

ТЬг

РЬе

С1у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

61и

11е

Ьун

100

105

- 28 018717 <210> 5 <2Ы> 366 <2Ь2> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 5 даддСдсадс ьддрддадСс ьдддддаддс РСддРссаас срддддддбс ссбдадасЬс60

СссЬдЬдсад ссЬсОддабЬ сассШад!: адЬЬаЫРаа ЬдассЬдддЬ ссдссаддсЬ120 ссадддааад ддсьддадьд ддЬддссаас аГааадсаад аеддаадЬда даааЬасГа!180 дЬддасЬсЬд Ьдаадддссд аОЬсассаЬс Ьссададаса асдссаадаа сСсасЬдааЬ240 сЬдсаааЬда асадЬсЬдад адссдаддас асддсЬдЬдЬ аЬОаЬЬдЬас дадддаЬддс300

ЬаЬадЬЬсдд ддадасасЬа сддЪаЕддас д^сЪддддсс аадддассас ддРса£сдРс360

ЬссЕса366 <210> 6 <211> 122 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 6

СЬи 1

УаЬ

СЬп

Ьеи

УаЬ 5

СЬи

Зег

СЬу СЬу

С1у Ьеи 10

УаЬ

СЬп

Рго

СЬу 15

СЬу

Зег

Ьеи

Агд

Ъеи

Зег

Суз

АЬа

АЬа

Зег

СЬу

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

Ьеи

МеЬ

ТЬг

Тгр

УаЬ

Агд

СЬп

АЬа

Рго

СЬу

Ьуз

СЬу

Ьеи

СЬи

Тгр

УаЬ

35

40

45

АЬа

Азп

11е

Ьуз

СЬп

Азр

СЬу

Зег

СЬи

Ьуз

Туг

Туг

УаЬ

Азр

Зег

УаЬ

50

55

60

Ьуз

СЬу

Агд

РЬе

ТЬг

1Ье

Зег

Агд

Азр

Азп

АЬа

Ьуэ

Азп

Зег

Ьеи

Азп

65

70

75

80

Ьеи

СЬп

МеЬ

Азп

Зег

Ьеи

Агд

АЬа

СЬи

Азр

ТЬг

АЬа

УаЬ

Туг

Туг

Суз

85

90

95

ТЬг

Агд

Азр

СЬу

Туг

Зег

Зег

СЬу

Агд

НЬз

Туг

СЬу

Мео

Азр

УаЬ

Тгр

100

105

110

С1у СЬп СЬу ТЬг ТЬг УаЬ 11е УаЬ Зег Зег

115 120 <210> 7 <211> 321 <2Ь2> ДНК <213> Ното зарЬепз

- 29 018717 <400> ~1

даааIίдрди	ЕдасасадПс	Ессадссасс	сЕдЕсЕЕЕдП	сЕссадддда	аададссасс	60
сПсПссЕдса	дддссадПса	дадПдПЕадс	адаЕасПЕад	ссНддНасса	асадааассг	120
ддссаддсПс	ссаддсЕссЕ	саЕсПаПдаП	дсаЕссааса	дддссасЕдд	саесссадсс	180
аддППсадЕд	дсадЕдддПс	Едддасадас	ЕПсасЕсПса	ссаЕсадсад	ссГададссГ	240
даадаиид	садЕЕНаПЕа	сПдЕсадсад	сдЕадсаасН	ддссЕ сддас	дГ ίсддссаа	300

дддассаадд ПддаааЕсаа а 321 <210> 8 <211> 107 <212> РНТ <213> Ното зарпепз

<400> 8

АЬа

ТЬг 10

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго 15

С1у

С1и 1

Не

Уа1

Ьеи

ТОг 5

С1п

Зег

Рго

С1и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

СЬп

Зег

УаЬ

Зег

Агд

Туг

20

25

30

Ьеи

АЬа

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

61п

АЬа

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

Азр

А1а

Зег

Азп

Агд

АЬа

ТКг

С1у

11е

Рго

АЬа

Агд

РЬе

Зег

61у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

С1у

ТНг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи

С1и

Рго

65

70

75

80

С1и

А5Р

РЬе

АЬа

УаЬ

Туг

Туг

Суз

С1п

С1п

Агд

Зег

Азп

Тгр

Рго

Агд

85

90

95

ТЬг

РЪе

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

С1и

11е

Ьуз

100

105

<210> 9 <211> 1425 <212> ДНК <213> Ното	зар1епз
<400> 9 аПдддаПддП	са^д^сЛсаС		дПадсаасПд	саасГддадЕ	асаЕ^сасад	60
дЕссадсЕдд	ГдсадГс^дд	дссГдаддкд	аадаадПсЕд	дд£СсСсддЕ	дааддЕсЕсс	120
ЕдсааддсПП	сГддаддсас	сГГсадсадс	даЕдсПаПса	ссГдддкдсд	асаддсссс1:	180
ддасаадддс	Е£дад1:дда1:	дддаддда£с	аПсссПаП се	^ГддЕаЕддс	аазсГасдса	240
садаадЕЕсс	адддсададГ	сасда£1:асс	дсддасаааП	ссасдаасас	адсс^асаЕд	300

- 30 018717

дадсСдадса	дссХдадаЪс	Ьдаддасасд	дссдЬдба!ΐ	ЫЬдЬдсдад	ад!ддссда!	360
СасХабддСХ	ьддддассга	сЬасГддЬас	ЬРсдассЬс!	ддддссдгдд	сасссСддЬс	420
асГдТсЕссН	садсЁадсас	саадддссса	ЬсддЬсЫсс	сссЬддсасс	□ЬссЬссаад	480
адсассЕсЬд	ддддсасадс	ддсссЬдддс	ЬдссбддЬса	аддасбасЬЬ	ссссдаассд	54 0
дбдасдд^д·!	сдЬддаасЪс	аддсдсссЬд	ассадсддсд	ПдсасассЫ:	сссддсЬдЬс	600
сОасадОсс!:	саддасбсЬа	сбсссЬсадс	адсдсддгда	ссдСдсссТс	садсадсЫд	660
ддсасссада	ссСасаСсСд	саасдЬдаа!	сасаадссса	дсаасассаа	ддгддасаад	720
ададРСдадс	ссаааЬсГГд	Ьдасаааас!	сасасаЁдсс	сассдЬдссс	адсассидаа	780
сЬссЬддддд	дассдЬсад!	сИссксНс	сссссаааас	ссааддасас	сс!саЬдаЬс	840
Ссссддассс	сЬдадд'Ьсас	абдсдбддбд	дбддасдСда	дссасдаада	сссЬдаддЬс	900
аадЬбсаас!	ддбабдбдда	сддсдСддад	дСдсаСаабд	ссаадасааа	дссдсдддад	960
дадсадбаса	асадсасдЬа	ссдЪдНддЬс	адсд!ссЬса	ссдЬссбдса	ссаадасЬдд	1020
сЬдаабддса	аддадЬасаа	дЬдсааддбс	Ьссаасааад	сссОсссадс	ссссаСсдад	1080
аааасса!с!	ссааадссаа	адддсадссс	сдадаассас	аддЬдбасас	ссОдссссса	1140
Осссдддадд	адатдассаа	даассаадбс	адссСдасс!:	дссдддгсаа	аддсИсбаС	1200
сссадсдаса	Ьсдссдбдда	дрдддададс	ааОдддсадс	сддадаасаа	сбасаадасс	1260
асдссГсссд	Ьдс!ддас1с	сдасддсбсс	ЬЬсЬЬссЬс!	аЫссаадс!	сассдЬддас	1320
аададсадд!	ддсадсаддд	даасдбсИс	ЬсаЬдсбссд	СдаСдсаСда	ддсЪсбдсас	1380
аассасраса	сдсадаадад	ссСсЬсссЬд	гсгссдддса	аасда		1425

<210> 10 <211> 474 <212> РРТ <213> Ното заргепз

<400> 10	Не	Ьеи
Ме! 1	С1у	Тгр	Зег	Суз 5	Ле
Уа1	Н13	Зег	С1п 20	Уа1	С1п	Ьеи	Уа1
Зег	С1у	Зег 35	Зег	Уа1	Ьуз	Уа1	Зег 40
Зег	Зег 50	Азр	А1а	Не	ТЕг	Тгр 55	Уа1
αΐιι 65	Тгр	Ме!	С1у	С1у	Не 70	Не	Рго

РЬе	Ьеи 10	Уа1	А1а	ТЬг	А1а	ТЬг 15	С1у
С1П 25	Зег	С1у	Рго	С1и	Уа1 30	Ьуз	Ьуз
Суз	Ьуз	А1а	Зег	С1у 45	С1у	ТИг	Рке
Агд	С1л	А1а	Рго 60	С1у	С1п	С1у	Ьеи
11е	Ьеи	С1у 75	МеЬ	А1а	Азп	Туг	А1а 80

- 31 018717

01η

Ьуз

РЬе

С1п

01у 85

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг 90

А1а

Азр

Ьуз

Зег

ТЬг 95

Азп

ТЬг

А1а

Туг

МеЬ

С1и

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

Агд

Зег

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

100

105

но

Туг

РЬе

Суз

А1а

Агд

Уа1

А1 а

Азр

Туг

Туг

С1у

Ьеи

С1у

ТЬг

Туг

Туг

115

120

125

Тгр

Туг

РЬе

Азр

Ьеи

Тгр

С1у

Агд

61у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

5ег

130

135

140

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

С1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Зег

Ьуз

145

150

155

160

Зег

ТЬг

Зег

С1у

С1у

ТЬг

А1а

А1а

Ьеи

С1у

Суз

Ьеи

Уа 1

Ьуз

Азр

Туг

165

170

175

РЬе

Рго

С1и

Рго

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Тгр

Азп

Зег

С1у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

180

185

190

С1у

Уа1

Н13

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

С1п

Зег

Зег

С1у

Ьеи

Туг

Зег

195

200

205

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

Уа1

ТЬг

Уа1

Рго

Зег

Зег

Зег

Ьеи

С1у

ТЬг

С1п

ТЬг

210

215

220

Туг

Не

Суз

Азп

Уа1

Азп

Н13

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

225

230

235

240

Агд

Уа1

С1и

Рго

Ьуз

Зег

Суз

Азр

Ьуз

ТЬг

Н13

ТЬг

Суз

Рго

Рго

Суз

245

250

255

Рго

А1а

Рго

О1и

Ьеи

Ьеи

С1у

С1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

260

265

270

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЬ

Не

Зег

Агд

ТЬг

Рго

С1и

Уа1

ТЬг

Суз

275

280

285

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Н15

С1и

Азр

Рго

С1и

Уа1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

290

295

300

Туг

Уа1

Азр

С1у

Уа1

С1и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

С1и

305

310

315

320

С1и

С1п

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

325

330

335

- 32 018717

Н1й

С1п

Азр

Тгр 340

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

С1и 34 5

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1 350

Зег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1 а

Рго

11е

С1и

Ьуз

Ткг

11е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

355

360

365

С1п

Рго

Агд

61и

Рго

С1п

Уа1

Туг

Т0г

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

С1и

С1и

370

375

380

Μεΐ

Тпг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТКг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РЬе

Туг

385

390

395

400

Рго

8ег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

е1у

С1п

Рго

С1и

Азп

405

410

415

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

РЬе

РНе

420

425

4 30

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТНг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

С1п

С1п

С1у

Азп

435

440

445

Ча1

Рпе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЬ

Н1з

С1и

А1а

Ьеи

Н1з

Азп

Н1 з

Туг

ТЪг

450

455

460

С1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

Ьуз

<165 470 <210> 11 <211> 705 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 11

аЬдддаЬддЬ	саЬдЬаЬсаЬ	ссЬ1 ЫЬсЬд	дЬадсаасЬд	саасЬддадЬ	асаЬЬсадаа	50
аЬЬдЕдЬ Сда	сдсадЬсСсс	аддсасссЬд	ЬстздЬсЬ с	саддддааад	адссасссЬс	120
ЬссЬдсаддд	ссадЬ садад	ίдг Ьадсадс	адсЬасЬЬад	ссЬддСасса	дсадааассС	180
ддссаддсЬс	ссаддсЬссЬ	саЬсЬаЬддЬ	дсаЬссадсЬ	дддссасЬдд	саЬсссадас	240
аддССсадТд	дсадСдддЬс	Ьдддасадас	СЬсасОсЬ са	ссаЬсадсад	асЬддадссЬ	300
даадаСИСЬд	садГдИаЬЬа	сЬдЬсадсаа	ЕаЬддЬадсЬ	сассСсЬсас	ГСГсддсдда	360
дддассаадд	ьддадаСсаа	асдаасЬдЬд	дссдсассаь	сьдЬсЫ: са£	сС Ьсссдсса	420
ЬсЬдаЬдадс	адЬЬдаааЬс	ЬддаасЬдсс	ЬсЬдЬЬдЬдЬ	дссбдсЬдаа	ЬаасПсЬаЬ	480
сссадададд	ссааадЬаса	дЬддааддЬд	даЬаасдссс	ЕссааЬсддд	ЬаасЬсссад	540
дададЬдкса	сададсадда	садсааддас	адсассСаса	дссСсадсад	сасссТдасд	600
сЬдадсааад	садасЬасда	дааасасааа	дЬсЬасдссЬ	дсдзадьсас	ссаьсадддс	660

- 33 018717 сСдадсЪсдс ссдЬсасааа дадсРЬсаас аддддададЬ дЬЬад 705 <210> 12 <211> 234 <212> РКТ <213> Ното зар1епз <400> 12

Мес 1

С1у

Тгр

Зег

Суз 5

Не

11е

Ьеи

РЬе

Ьеи 10

А1а

ТЬг

А1а

ТЬг 15

С1у

Уа1

Н13

Зег

Й1и

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

С1п

Зег

Рго

С1у

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

20

25

30

Зег

Рго

С1у

С1и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

61п

Зег

Уа1

35

40

45

Зег

Зег

Зег

Туг

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

А1а

Рго

50

55

60

Агд

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

С1у

А1а

Зег

Зег

Тгр

А1а

ТЬг

С1у

11е

Рго

Азр

65

70

75

80

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

61у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

35

90

95

Агд

Ьеи

С1и

Рго

С1и

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

С1п

С1п

Туг

С1у

100

105

110

Зег

Зег

Рго

Ьеи

ТЬг

РЬе

С1у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

61и

11е

Ьуз

Агд

115

120

125

ТЬг

УаЬ

А1а

А1а

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Не

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

С1и

С1п

130

135

140

Ьеи

Ьуз

Зег

С1у

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

145

150

155

160

Рго

Агд

51и

А1а

Ьуз

Уа1

С1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

С1п

Зег

165

170

175

С1у

Азп

Зег

С1п

С1и

Зег

Уа1

ТЬг

<31и

С1п

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

180

185

190

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

С1и

Ьуз

195

200

205

Низ

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

С1и

Уа1

ТЬг

Н1з

С1п

С1у

Ьеи

Зег

Зег

Рго

210

215

220

- 34 018717

Уа1 ТЬг Ьуз Зег РЬе Азп Агд С1у С1и Суз

225 230

<210> 13
<211> 1416 <212> ДНК <213> Ното	зархепз
<400> 13 аРдддаРддР	саРдРаР саР	ссРсРсРсрд	драдсаасрд	саасрддадр	асарр садад	60
дрдсадсРдд	РддадРсСдд	дддаддсРРд	дРссаассРд	дддддРсссР	дадасРсРсс	120
РдГдсадссГ	сРдда РР сас	срРРадРадР	РаРРРааРда	ссРдддРссд	ссаддсР сса	180
дддааадддс	РддадЬдддР	ддссаасаРа	аадсаадаРд	даадрдадаа	аРасРаРдрд	240
дасР срдрда	адддссдаРС	сассаРсРсс	ададасаасд	ссаадаасРс	асРдааРсРд	300
саааРдааса	дРсРдададс	сдаддасасд	дсРдРдРаРР	аРРдРасдад	ддаРддсРаР	360
адЬР сдддда	дасасРасдд	РаРддасдРс	Рддддссаад	ддассасддр	саРсдРсРсс	420
РсадсР адса	ссаадддссс	аРсддРсРРс	ссссрддсас	ссРссРссаа	дадсассРсР	480
дддддсасад	сддсссрддд	сРдссРддРс	ааддасРасР	Рссссдаасс	ддрдасддрд	540
РсдР ддаасР	саддсдсссР	дассадсддс	дрдсасасср	РсссддсРдЬ	ссРасадРсс	600
РсаддасР с!	асР сссРсад	садсдрддрд	ассдрдсссб	ссадсадсРЬ	дддсасссад	660
ассРасаРсС	дсаасдрдаа	Рсасаадссс	адсаасасса	аддрддасаа	дададРРдад	720
сссаааРсРР	дрдасаааас	РсасасаРдс	ссассдрдсс	садсассрда	асРссРдддд	780
ддассдСсад	рсррссрсрр	ссссссаааа	сссааддаса	сссРсаРда Р	сРсссддасс	840
ссРдаддРса	сардсдрддр	ддрддасдрд	адссасдаад	асссРдаддР	саадРРсаас	900
рддрардрдд	асддсдрдда	ддРдсаРааР	дссаадасаа	адссдсддда	ддадсадрас	960
аасадсасдр	ассдрдрддр	садсдРссРс	ассдРссРдс	ассаадасрд	дсРдааРддс	1020
ааддадраса	адрдсааддр	срссаасааа	дсссРсссад	сссссаРсда	даааассаРс	1060
ΐ ссааадсса	аадддсадсс	ссдадаасса	саддрдраса	сссРдссссс	аРсссдддад	1140
дадардасса	адаассаадр	садссРдасс	РдссРддРса	ааддсРРсРа	Рсссадсдас	1200
аРсдссдРдд	адрдддадад	сааРдддсад	ссддадааса	асРасаадас	сасдссРссс	1260
дРдсРддасР	ссдасддсбс	сРРсРРссРс	РаРРссаадс	рсассдрдда	саададсадд	1320
Рддсадсадд	ддаасдр сРР	сЬсаРдсРсс	дРдаРдсаРд	аддсРсРдса	саассасРас	1380
асдсадаада	дссЕсРсссР	дРсРссдддс	ааарда			1416

<21 0>	14
<211>	471
<212>	РВТ
<213>	Ното зар1епз

- 35 018717

<400> 14

Суз 5

Не

11е

Ьеи

РНе

Ьеи 10

Уа1

А1а

ТНг

А1а

ТНг 15

С1у

МеС 1

С1у

Тгр

Зег

Уа1

Ηιε

Зег

С1и

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

С1и

Зег

С1у

С1у

С1у

Ьеи

Уа1

С1п

20

25

30

Рго

С1у

С1у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

С1у

РНе

ТНг

РНе

35

40

45

Зег

Зег

Туг

Ьеи

МеЬ

ТНг

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1 у

Ьуз

Й1у

Ьеи

50

55

60

С1и

Тгр

Уа1

А1а

Азп

Не

Ьуз

С1п

Азр

С1у

Зег

С1и

Ьуз

Туг

Туг

Уа1

65

70

75

80

Азр

Зег

Уа1

Ьуз

С1у

Агд

РНе

ТНг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

85

90

95

Зег

Ьеи

Азп

Ьеи

С1п

МеЁ

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТНг

А1а

νβΐ

100

105

но

Туг

Туг

Суз

ТНг

Агд

Азр

С1у

Туг

Зег

Зег

С1у

Агд

Н1з

Туг

61у

Мер

115

120

125

Азр

Уа1

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТНг

ТНг

Уа1

11е

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТНг

130

135

140

Ьуз

С1у

Рго

Зег

Уа1

РКе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Зег

Ьуз

Зег

ТНг

Зег

145

150

155

150

С1у

С1у

ТНг

А1а

А1а

Ьеи

61у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РНе

Рго

С1и

165

170

175

Рго

Уа1

ТНг

Уа1

Зег

Тгр

Азп

Зег

61у

А1а

Ьеи

ТНг

Зег

С1у

7а1

Н1 з

180

185

190

ТНг

Рке

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

С1п

Зег

Зег

С1у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

195

200

205

Уа1

Уа1

ТНг

Уа1

Рго

Зег

Зег

Зег

Ьеи

61у

ТНг

61п

ТНг

Туг

11е

Суз

210

215

220

Азп

Уа1

Αεη

Н13

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТНг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Агд

Уа 1

С1и

225

230

235

240

Рго

Ьуз

Зег

Суз

Аер

Ьуз

ТНг

Н15

ТНг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

245

250

255

- 36 018717

С1и

Ьеи

Ьеи

С1у 260

61у

Рго

Зег

Уа1

РИе 265

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз 270

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЬ

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

С1и

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

νβΐ

Уа1

275

280

285

Азр

Уа1

Зег

Н1з

С1и

Азр

Рго

С1и

Уа1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

290

295

300

еьу

Уа1

С1и

Уа1

ΗΪ3

Азп

А1а

Ьуз

Т1тг

Ьуз

Рго

Агд

С1и

б1и

С1п

Туг

305

310

315

320

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

ΗΪ3

С1п

Азр

325

330

335

Тгр

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

С1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

340

34 5

350

Рго

А1а

Рго

11е

С1и

Ьуз

ТНг

11е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

01п

Рго

Агд

355

360

365

С1и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТКг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

С1и

С1и

МеЬ

ТЬг

Ьуз

370

375

380

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

385

390

395

400

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

5ег

Азп

51у

С1п

Рго

С1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

405

410

415

ТИг

Ткг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

Б1у

Зег

РИе

РИе

Ьеи

Туг

Зег

420

425

430

Ьуз

Ьеи

ТПг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

С1п

С1п

С1у

Азп

Уа1

РНе

Зел

435

440

445

Суз

Зег

Уа1

Мер

Н1з

С1и

А1а

Ьеи

ΗΪ8

Азп

Ηί 3

Туг

ТНг

С1п

Ьуз

Зег

450

455

460

Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз

465 470 <210> 15 <211> 702 <212> ДНК <213> Ното заргепз <400> 15 аЬдддаСддЬ саЬдТаЬсаЬ ссЬ5Ь'.1с5д дЬадсаасЬд саасЬддадЬ асаЫсадаа 60

- 37 018717

аЕЕдЬдЕ Еда	сасадЕ сЕсс	адссасссБд	ЕсЕЕЕдЕсЕС	саддддааад	адссасссИс	120
ЕссЕдсаддд	ссадЕсадад	1дБ Бадсада	ЕасЕЕадссЕ	ддЕассааса	дааассСддс	180
саддсЕссса	ддсЕссЕсаЕ	сБа^даБдса	Ессаасаддд	ссасЕддсаЕ	сссадссадд	2-30
Е ЕсадЕддса	дЕдддЕ сЕдд	дасадасБйс	асЕсЕсасса	ЕсадсадссЕ	ададссИдаа	300
даЕЕЕЕдсад	ЕЕЕаЕЕасЕд	ίсадсадсдБ	адсаасЕддс	сЕсддасдЕЕ	сддссааддд	360
ассааддЕдд	аааЕсааасд	аасБдБддсБ	дсассаЕсЕд	ЕсЕЕсаЕсЕЕ	сссдссай сг.	•420
даЕдадсадЕ	ЕдаааЕ сЕдд	аас^дссЬсБ	дЕ ЕдЕдЕдсс	ЕдсЕдааЕаа	сЫ: сЪаЬссс	480
адададдсса	аадЕасадЕд	ддаддИддаГ	аасдсссЕсс	ааЕсдддЕаа	сйсссаддад	540
адЕдЕсасад	адсаддасад	сааддасадс	ассЕасадсс	Есадсадсас	сс^дасдсБд	600
адсааадсад	асЕасдадаа	асасааадБс	ЕасдссЕдсд	аадЕсассса	БсадддссБд	660
адсЕсдсссд	Есасааадад	сГГсаасадд	ддададЬдЕЕ	ад		702

<210> 16 <211> 233 <212> РЕТ <213> Ното зар1епз

<400> 16
МеЕ 1	61 у	Тгр	Зег	Суз 5	11е	Не	Ьеи
Уа 1	Н15	Зет	С1и 20	Не	Уа1	Ьеи	ТЬг
Зег	Рго	61у 35	С1и	Агд	А1а	ТЬг	Ьеи 40
Зег	Агд 50	Туг	Ьеи	А1а	Тгр	Туг 55	С1п
Ьеи 65	Ьеи	Не	Туг	Азр	А1а 70	Зег	Азп
РЬе	Зег	С1у	Зег	61у 85	Зег	С1у	ТЬг
Ьеи	С1и	Рго	С1и 100	Азр	РЬе	А1а	Уа1
Тгр	Рго	Агд 115	ТЬг	РЬе	С1у	Е1п	О1у 120
Уа1	А1а 130	А1а	Рго	Зег	Уа1	РЬе 135	11е

РЬе	Ьеи 10	Уа1	А1а	ТЬг	А1а	ТЬг 15	С1у
С1п 25	Зег	Рго	А1а	ТЬг	Ьеи 30	Зег	Ьеи
Зег	Суз	Агд	А1а	Зег 45	61п	Зег	Уа1
С1п	Ьуз	Рго	61у 60	С1п	А1а	Рго	Агд
Агд	А1а	ТЬг 75	С1у	11е	Рго	А1а	Агд 80
Азр	РЬе 90	ТЬг	Ьеи	ТЬг	11е	Зег 95	Зег
Туг 105	Туг	Суз	С1п	С1п	Агд 110	Зег	Азп
ТЬг	Ьуз	Уа1	С1и	Не 125	Ьуз	Агд	ТЬг
РЬе	Рго	Рго	Зег 140	Азр	С1и	61п	Ьеи

Ьуз 145

Зег

СЬу

ТЬг

АЬа

Зег 150

УаЬ

УаЬ

Суз

Ьеи

Ьеи 155

Азп

Азп

РЬе

Туг

Рго 160

Агд

СЬи

АЬа

Ьуз

УаЬ

СЬп

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

АЬа

Ьеи

СЬп

Зег

СЬу

165

170

175

Азп

Зег

СЬп

СЬи

Зег

УаЬ

ТЬг

СЬи

СЬп

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

Туг

180

185

Ь90

Зег

Ьеи

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьуз

АЬа

Азр

Туг

СЬи

Ьуз

НЬз

195

200

205

Ьуз

УаЬ

Туг

АЬа

Суз

<31и

УаЬ

ТЬг

Ηί з

СЬп

СЬу

Ьеи

Зег

Зег

Рго

УаЬ

210

215

220

ТЬг

Ьуз

Зег

РЬе

Азп

Агд

СЬу

СЬи

Суз

225 230 <210> 17 <211> 10 <212> РНТ <213> Ното зарЬепз <400> 17

СЬу СЬу ТЬг РЬе Зег Зег Азр АЬа Не ТЬг

5 10

<210>	18
<211 >	30
<212>	ДНК
<213>	Ното	5ар1еП5
<400>	18
ддаддсассС	Ссадсадсда Едс^аСсасс	30

<210> 19 <211> 17 <212> РНТ <213> Ното заргепз <400> 19

СЬу Не 11е Рго 11е Ьеи С1у МеЬ АЬа Азп Туг АЬа СЬп Ьуэ

I 5 10

РЬе СЬп

СЬу

<210> <211 > <212> <213>	20 51 ДНК Ното зарЬепз
<400>	20

- 39 018717

<210>	22
<211>	48
<212>	ДНК
<213>	Ното
<4 00>	22
дЬддссдаЫ:

<210>	23
<211 >	12
<212>	РКТ
<213>	Ното	5ар1еп5
<400>	23
Агд А1а 5ег	С1п Зег 7а1 Зег Зег Зег Туг Ьеи

<210>	26
<211 >	21
<212>	ДНК
<2 1 3>	Ното	5ар1епз
<400>	26
дд1:дса7сса	дсЪдддссае £	21

<210>	27
<211 >	9
<212>	РКТ
<213>	Ното

- 40 018717

<210>	28
<211>	2Ί
<212>	ДНК
<21 3>	Ното
<4 00>	28
садсаа^аГд

- 41 018717

<210>	34
<211 >	39
<212>	ДНК
<213>	Ното	5ар1епз
<4 00>	34
даТддсГаба	дГСсддддад асасгасддг айддасдйс	39

<2 Ю>	35
<211>	11
<212>	РКТ
<213>	Ното зар1епз
<4 00>	35

Агд А1а Бег С1п Бег Уа1 Бег Агд Туг Ьей А1а

1		5 10
<210>	36
<211>	33
<212>	ДНК
<213>	Ното	зар1епз
<4 00>	36
адддссадГс	адад^д^Гад садаГасИСа дес	33
<210>	37
<211 >	7
<212>	РКТ
<213>	Ното	заргепз
<4 00>	37

Азр А1а Бег Азп Агд А1а ТНг

1		5
<210>	38
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Ното	зар1еп5
<400>	38
да ГдсаГсса	асадддссас й	21
<210>	39
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното	заргепа
<400>	39

С1п С1п Агд Бег Азп Тгр Рго Агд ТЬг

1		5
<21 0>	40
<211 >	27
<212>	ДНК
<213>	Ното	еар1епз
<400>	40
садсадсдба	дсаасГддсс Гсддасд	27

- 42 018717 <210> <211>

<212>

<21 3>

РРТ

Ното заргепз <400>

Зег Туг А1а Не Зег <210>

<211>

<212>

<213>

РКТ

Ното зар1епз <400>

С1у 11е 11е Рго Не

РЬе

С1у

ТНг

А1а

Азп

Туг А1а С1п Ьуз РЬе С1п

С1у <210>

<211>

<212>

<21 3>

РКТ

Ното зарьепз <400>

А1а Рго Ьеи

Агд РНе

Ьеи

С1и

Тгр

Зег

ТНг

31п Азр Н1з Туг Туг Туг

Туг Туг МеС

Азр Уа1 <210>

<211 >

<212>

<213>

РКТ

Ното заргепз <400>

С1п С1у Азр Зег Ьеи

Агд

Зег

Туг

Туг

А1а

Зег <210>

<211>

<212 >

<21 3>

РКТ

Ното заргепз <4 00>

С1у Ьуз Азп Азп Агд

Рго

Зег

<210> 46 <211> 11 <212> РКТ <213> Ното зар1епз

<400> 46

- 43 018717

Азп Зег Агд Азр Азп Зег Азр Азп

1		5
<210>	47
<2 11>	11
<212>	РКТ
<21 3>	Ното	зарЬепз
<400>	47
С1п С1у Азр	5ег Ьеи	Агд	Зег	Туг
1		5
<210>	48
<211>	7
<212>	РКТ
<213>	Ното	зариепз
<400>	48
С1у С1и Азп	Ьуз Агд	Рго	Зег
1		5
<210>	4 9
<211>	11
<212>	РКТ
<213>	Ното	зариепз
<400>	49
Ьуз Зег Агд	Азр С1у	Зег	С1у	С1п
1		5

Туг А1а ТЬг

Низ Ьеи Уа1

Агд Ьеи Не <210>50 <211>452 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400>50

С1 и 1	Уа1	31п	Ьеи	Уа1 5	С1и	Зег	31у
Зег	Ьеи	Агд	Ьеи 20	Зег	Суз	А1а	А1а
Ьеи	МеЬ	ТЬг 35	Тгр	Уа1	Агд	С1п	А1а 40
А1а	Азп 50	Пе	Ьуз	С1п	Азр	С1у 55	Зег
Ьуз 65	С1у	Агд	РЬе	ТЬг	11е 70	Зег	Агд
Ьеи	С1п	Мер	Азп	Зег 85	Ьеи	Агд	А1а

С1у	С1у 10	Ьеи	Уа1	<31 п	Рго	С1у 15	С1у
Зег 25	С1у	РЬе	ТЬг	РЬе	Зег 30	Зег	Туг
Рго	С1у	Ьуз	СЬу	Ьеи 45	С1и	Тгр	Уа1
С1и	Ьуз	Туг	Туг ео	Уа1	Азр	Зег	Уа1
Азр	Азп	А1а 75	Ьуз	Азп	Зег	Ьеи	Азп 80
61и	Азр 90	ТЬг	А1а	\7а1	Туг	Туг 95	Суз

- 44 018717

ТЬг

Агд

Азр

С1у 100

Туг

Зег

Зег

С1у

Агд 105

Н13

Туг

С1у

МеЬ

Азр 110

Уа1

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

11е

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

31у

Рго

115

120

125

Зег

Уа1

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Зег

Ьуз

Зег

ТЬг

Зег

С1у

С1у

ТЬг

130

135

140

А1а

А1а

Ьеи

С1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

С1и

Рго

Уа1

ТЬг

145

150

155

160

Уа1

Зег

Тгр

Азп

Зег

С1у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

С1у

Уа1

Н13

ТЬг

РЬе

Рго

165

170

175

А1а

Уа1

Ьеи

61п

Зег

Зег

С1у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

7а1

ТЬг

180

185

190

Уа1

Рго

Зег

Зег

Зег

Ьеи

С1у

ТЬг

С1п

ТЬг

Туг

11е

Суз

Азп

Уа1

Азп

195

200

205

Н13

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Аар

Ьуз

Агд

Уа1

С1и

Рго

Ьуз

Зег

210

215

220

Суз

Азр

Ьуз

ТЬг

Нхз

ТЬг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

С1и

Ьеи

Ьеи

225

230

235

240

С1у

С1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

245

250

255

МеЬ

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

61и

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

260

265

270

Н1 3

С1 и

Азр

Рго

С1и

Уа1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

С1у

Уа1

С1и

275

280

285

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

С1и

С1и

С1п

Туг

Азп

Зег

ТЬг

290

295

300

Туг

Агд

Уа1

Уа1

5ег

Уа1

Ьеи

ТЬг

νβΐ

Ьеи

Н13

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

305

310

315

320

С1у

Ьуз

С1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

7а1

Зег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго

325

330

335

11е

С1и

Ьуз

ТЬг

Т1е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

С1п

Рго

Агд

С1и

Рго

31п

34 0

345

350

- 45 018717

Уа1

Туг

ТЬг 355

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд 360

С1и

С1и

Мер

ТЬг

Ьуз 365

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

370

375

380

αΐυ

Тгр

С1и

Зег

Азп

61у

С1п

Рго

С1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

385

390

395

400

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

Й1у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

405

410

415

Уа1

Авр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

С1п

С1п

С1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

420

425

430

Мер.

Н1з

С1и

А1а

Ьеи

Н1з

Азп

Н1з

Туг

ТЬг

61п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

435

440

445

Зег

Рго

С1у

Ьуз

450

<210>

51

<211>

214

<212>

РЕТ

<213>

Ното

53р1еП5

<400>

51

С1и

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

С1п

Зег

Рго

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

с1у

1

5

10

15

С1и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

Зег

Уа1

Зег

Агд

Туг

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

61п

Ьуз

Рго

61у

С1п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

Азр

А1а

Зег

Азп

Агд

А1а

ТЬг

С1у

11е

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

С1и

Рго

65

70

75

80

С1и

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

С1п

С1п

Агд

Зег

Азп

Тгр

Рго

Агд

85

90

95

ТЬг

РЬе

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

С1и

Не

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1 а

А1а

100

105

110

- 46 018717

Рго

Зег

УаЬ 115

РЬе

11е

РЬе

Рго

Рхо 120

Зег

Азр

СЬи

СЬп

Ьеи 125

Ьуз

Зег

СЬу

ТЬг

АЬа

Зег

УаЬ

УаЬ

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

СЬи

АЬа

130

135

140

Ьуз

Уа1

СЬп

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

АЬа

Ьеи

61п

Зег

СЬу

Азп

Зег

СЬп

145

150

155

160

С1и

Зег

УаЬ

ТЬг

СЬи

СЬп

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

165

170

175

5ег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьуз

АЬа

Азр

Туг

СЬи

Ьуз

НЬз

Ьуз

УаЬ

Туг

180

185

190

АЬа

Сун

СЬи

УаЬ

ТЬг

нЬн

61п

СЬу

Ьеи

Зег

Зег

Рго

УаЬ

ТЬг

Ьуз

Зег

195

200

205

РЬе

Азп

Агд

СЬу

СЬи

Суз

210

Claims (9)

1. Антитело или фрагмент антитела, которое специфичным образом связывает белок, стимулирующий макрофаги ΒΟΝ, включающее СИВН1, имеющий последовательность СБΤБ88Υ^ΜΤ (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 29), СИВН2, имеющий последовательность NIК^^С8ΕКΥΥV^8VКС (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 31), СИВН3, имеющий последовательность ^СΥ88СΒНΥСΜ^V (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 33), СИВЫ, имеющий последовательность ΒΑ8ρ8ν8ΒΥΌΑ (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 35), СИВЬ2, имеющий последовательность ΌΑ8ΝΒΑΤ (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 37), и СИВЬ3, имеющий последовательность ΟΟΒΞΝνΡΒΤ (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 39).

2. Антитело или фрагмент антитела по п.1, отличающееся тем, что указанное антитело или фрагмент антитела включает вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность

ЕУОЬУЕ8СООЬУОРСК58ЬКЬ8САА8аГТГ55УЬМ17ГУКОАРСК(ЗЬЕИУАН1К(20С8ЕКУУУ1Э5 νΚΟΚΕΤ13Κ.0ΝΑΚΝ8 ЬЫЬОМЫЗ ЬРАЕВТАУУУСТКОСУ 8 ЗСКНУСМВУИО<2ОТТУ1УЗ 3 (ЗЕО Ю N0: 6) , и вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность

Е1УЬТ05РАТЬ5ЬЗРСЕЕАТЬ5СКА303У5ЕУ1ДИУ00КРС0АРКЬЫУОА5ЫКАТ01РАВЕЗ С8С80ТОРТЪТ153ЬЕРЕОРАУ¥УСООК8ШРКТГ(ЗаСТКУЕ1К: (3ΕΩ ΙΏ N0:8).

3. Антитело или фрагмент антитела по п.1 или 2, отличающееся тем, что указанное антитело или фрагмент антитела включает тяжелую цепь, имеющую последовательность

ЕУ<2ЬУЕ ЗООСЬУОРСОЗЬКЬЗ САА8СРТГ 3 3 УЬМтаУВДАРСЖСЬЕИУАЫ IКООСЗЕКУ ΥΥΌ 3 УКСК РТI3ΕΠΝΑΚΝ3 ЬМЬС?4ИЗЬР_АЕВТАУУ ΥΟΤΡϋΟΎ 3 БСР.Н УСМОУНЗаС-ТТ VI УЗ ЗАЗ ТК ОРЗУРРЬАРЗЗ КЗ ТЗОСТААЬОСЬУКОУРРЕ РУТУЗИЫЗСАЬТЗСУНТР РАУЬОЗ3СЬΥ5Σ 8 8 УУТУР865ЬСТОТУ1СЫУЫНКР8ОТКУОККУЕРК5СОКТНТСРРСРАРЕЬЬССР8УРЬР₽РКР КРТЬМ18КТРЕУТСУУУОУ5НЕОРЕУКГЫКУУОСУЕУНЫАКТКРЯЕЕОУ№ТУКУУ5УЬТУЪН 0ОИЬНСКЕУКСКУ8ИКАЬРАР1ЕКТ13КАКС0РЕЕР0УУТЬРРЗКЕЕМТКЫ0У8ЬТСЬУКСРУ Р 801АУЕНЕ 8ΝΟΟΡΕΝΝΥΚΤΤ Р РУЬВ 8 ОС 8 РРЬУЗ КЪТТОКЗ 7 КООСЫУГо СЗ УМНЕАЬНЫНУ ТОКЗЬЗЬЗРСК и легкую цепь, имеющую последовательность Е1УЬТ25РАТЬ8ЬЗРСЕКАТЬ8С1гА808У8ЙУЬАИУ00КР(30АРРЬЬ1УОАЗНКА.ТС1РАКР8 СЗСЗΟΤΏΡΤЬТ133ЬЕРЕОРАУУУСССКЗЫНРЕТЕСОСТКУЕIККТУААР3УГIР₽Р3ОЕСЪК ЗСТАЗУУСЬЬЫКРУРКЕАКУОИКУОЫАЪОЗаМЗОЕЗУТЕСОЗКОЗТУЗЪЗЗТЬТЬЗКАОУЕКН КУУАСЕУТНОСЪЗЗРУТКЗРМКСЕС.

4. Фармацевтическая композиция, включающая антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-3 и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или стабилизатор.

5. Способ подавления ангиогенеза, роста опухоли, пролиферации опухолевых клеток, инвазии опу

- 47 018717 холевых клеток, активации Β0Ν или фосфорилирования Β0Ν, ΜΑΡΚ и/или Ак! у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества антитела или фрагмента антитела по любому из пп.1-3.

6. Способ лечения рака у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества антитела или фрагмента антитела по любому из пп.1-3.

7. Способ по п.6, дополнительно включающий введение указанному млекопитающему другого противоракового средства, выбранного из группы, состоящей из антиангиогенного агента, химиотерапевтического агента, другого антитела и антинеопластического агента.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанный химиотерапевтический агент представляет собой доцетаксел.

9. Способ по п.6, отличающийся тем, что рак выбран из группы, состоящей из опухолевых клеток, происходящих из толстого кишечника, поджелудочной железы, предстательной железы, желудка, легкого, печени, яичника, почки и молочной железы.

0 V 0 Ь V Ώ 8 с Р Е V К К 8 С 8 5 V К V 1 САС СТС САС СТС СТС САС ТСТ ссс сст САС сто ΑΆΘ ААС ТСТ ссс ТСС тсс СТС ААС СТС 5 с К А 8 с С т г 3 3 И А I т ад V к 0 А 61 ТСС тсс ААС ОСТ тст ССА ССС АСС ттс АСС АСС САТ ост АТС АСС тсс СТС ССА САС ССС

Р С 0 С ь Ξ ад м С С I т е I ь с м А N Υ 121 сст ССА САА ссс стт ОАО тсс АТС ССА ссс АТС АТС сст АТС стт сст АТС ССА ААС ТАС А 0 К г 0 С к V т I Т А ϋ К 8 т N т А Υ 181 ССА САС- ААС ттс САС ССС АСА СТС АСС АТТ АСС ссс САС ААА ТСС АСС ААС АСА ССС ТАС м Е ь 8 3 и К 8 Е Ώ т А V Υ Р С А К V А 241 АТС САС СТС АСС АСС СТС АСА ТСТ САС САС' 'АСС ССС СТС ТАТ ттт ТСТ ССС АСА СТС ССС 0 V ¥ 5 ь с Т у Υ И Ϊ г 0 Ь ад с к <3 т и 301 САТ ТАС ТАТ С-СТ ттс ССС АСТ ТАС ТАС тсс ТАС ттс САТ СТС тсс ссс сст ссс АСС СТС