JPH03502885A - 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法 発明の技術分野 本発明は免疫学、並びにがんの診断および治療に関する。さらに詳しくは、本発 明は増殖因子レセプターと特異的に結合する抗体、該抗体を産生ずるハイブリド ーマ、該抗体を利用した免疫化学物質、および該抗体を用いる診断法に関するも のである。本発明はまた、該抗体を単独で、または細胞毒性因子と併用して、治 療用途に用いることに関するものである。さらにまた本発明は腫瘍形成に関与す るチロ７ンキナーゼの分析法に関するものである。

発明の背景 マクロファージはインビボでの新生物増殖の免疫監視に重要な役割を担っている エフェクター細胞の１種である。インビトロにおいて、細胞仲介性の細胞毒性に は、活性化マクロファージと標的細胞との選択的な結合、並びにそれに伴う細胞 毒性因子の放出が必要である。活性化マクロファージによって分泌される細胞毒 性因子には、例えば、過酸化陰イオンおよび過酸化水素等の反応性酸素種、アル ギナーゼ、インターロイキン１、および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）が含ま れる。これら因子の毒性作用に対する耐性の腫瘍細胞による獲得が、インビボで の腫瘍形成の開始および拡大化を導く機構の１つであると言える。

ＴＮＦ−αが、マクロファージ−によって仲介される抗腫瘍性応答の強力なエフ ェクターとして作用するという観察が、インビボでの腫瘍形成とインビトロでの 腫瘍細胞増殖の調節の研究にＴ　Ｎ　Ｆ−αを用いることの理論的根拠である。

Ｔ　Ｎ　Ｆ−αおよびＴＮＦ−βをコードする遺伝子は、従来、リンホトキンン として知られていた構造的に関連した細胞毒性タンパク質であり、既にクローニ ングされ、対応するタンパク質が大腸菌によって発現されている。これらのタン パク質は、インビボでのＭｅｔｈ　Ａ肉腫の出血性壊死の誘導、インビトロでの 幾つかの膿瘍の増殖阻害、インビトロでのＩＦＮ−γの抗細胞作用に対する相乗 的促進効果、ヒト多形核好中球機能の活性化、および脂質生合成の阻害等、一連 の生物学的活性をあられす。最近、ｒＨｕＴ　Ｎ　Ｆ−αがインビトロにおける 正常な二倍体の増殖を増強することが示された。ｒＨｕＴ　Ｎ　Ｆ−αの存在下 における様々な増殖応答は、Ｔ　Ｎ　Ｆ結合の変化と関連していることもある。

増殖因子およびそれらのレセプターは細胞増殖の調節に関連しており、それらは また腫瘍遺伝子において重要な役割を果しているようである。既知のかん原遺伝 子（プロトオンコシエン）の内、３個は増殖因子または増殖因子レセプターに関 連している。これらの遺伝子には以下のものがある。ｃ　　ｓｉｓニジミアン肉 腫ウィルスの形質転換遺伝子とホモローガスであり、血小板誘導増殖因子（ＰＤ ＧＦ）のＢ鎖である。ｃ−ｒｒａｓ：ネコ内挿ウィルスの形質転換遺伝子とホモ ローガスでありマクロファージのコロニー刺激因子レセプター（Ｃ３Ｆ−ＩＲ） と密接に関連している。ｃ−ｅｒｂＢ　：　Ｅ　Ｇ　Ｆレセプター（ＥＧＦＲ） をコードしており、トリの赤白血痰ウィルス（ｖ−ｅｒｂＢ）の形質転換遺伝子 とホモローガスである。２個のレセプター関連のかん原遺伝子（ｃ−ｆｍｓおよ びｃ−ｅｒｂＢ）はチロシン特異的タンパク質キナーゼ群に属しており、このフ ァミリーには多くのがん原遺伝子が含まれている。

近年、化学的に誘導されたラット神経芽細胞腫から得たＤ　Ｎ　Ａによる形質転 換研究によって新規な形質転換遺伝子が同定された。このｎｅｕと呼ばれる遺伝 子はｃ−ｅｒｂＢがん原遺伝子と近縁ではあるが明確に区別される。ｖ−ｅｒｂ ＢおよびヒトＥＧＦＲをプローブとして用いてヒトゲノムライブラリーおよび相 補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすることにより、ヒトｅ ｒｂ　Ｂと近縁の２個の遺伝子（それぞれ、ＨＥＲ２およびｃ−ｅｒｂＢ−２と 呼称）を別個に単離した。後の配列決定および染色体マツピング研究により、Ｃ −ｅｒｂＢ−２およびＨＥＲ２がｎｅｕの変異種であることが分かった。

これもまたｖ−ｅｒｂＢをプローブとして用いた第４のグループは５−１０倍に 増幅された哺乳類がん細胞系ＭＡＣ１１７とであると同定された。

本明細書中ＨＥＲ２と称する遺伝子はチロシンキナーゼファミリーの新規物質を コードしており、クツセンスら（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）［Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ２３カ 、１１３２（２９８５）コの報告したＥＧＦＲ遺伝子と極めて密接な関係にある が明確に区別し得る。ＨＥＲ２は、ＥＧＦＲ遺伝子が染色体７のバンドｐＨ−ｐ １３に位置するのに対し、染色体１７のバンドｑ２１に認められる点で異なって いる。また、ＥＧＦＲ遺伝子から産生ずる転写物は５．８ｋｂ及び１０ｋｂであ るのに対し、ＨＥＲ２遺伝子から産生ずるｍＲＮＡは４．８ｋｂである点でも異 なる。

最後に、ＥＧＦＲ遺伝子にコードされているタンパク質は分子量１７０．０００ ダルトンであるのに対し、ＨＥＲ２遺伝子にコードされているタンパク質は分子 １１８５．○ｏＯダルトンである。しかし、配列データに基づけば、ＨＥ　Ｒ２ はチロシンキナーゼ類の他のどれよりもＥＧＦＲと近い関係にある。ＥＧＦＲタ ンパク質と同様にＨＥＲ２タンパク質（ｐ１８５）は細胞外ドメイン、２個の／ スティンに富む反復クラスターを有する膜貫通ドメイン（トランスメンブランド メイン）、および細胞質内のキナーゼドメインを有している。これは、未だ同定 されていないが、あるリガンドの細胞性レセプターであることを示唆するもので ある。本明細書では、ＨＥＲ２ｐ１８５をｐ１８５またはＨＥＲ２レセプターと 表わす。

原発性の（−次）ヒト腫瘍細胞および腫瘍から導かれた樹立細胞系のサザーン分 析により、ＥＧＦレセプター遺伝子の増幅、およびある場合にはリアレンジメン ト（再調整）が明らかになった。増幅は特に偏平上皮がんおよび膠芽細胞腫にお いて明白であった。ＨＥＲ２遺伝子はまた、ヒト唾液腺がん、腎細胞がん、乳が ん、および胃がん細胞系でも増幅されていることが分かった。近年、スラモンら ［５ｌａｉｏｎ、　　５ｃｉｅｎｃｅ　２３５．　１７７（１９８７）コは原発 性ヒト乳癌の約３０％に増幅されたＨＥＲ２が含有されていると報告した。配列 のリアレンジメントが幾つか検出されたが、大部分の腫瘍では増幅したＨＥＲ２ 遺伝子と正常なＨＥＲ２遺伝子との間に明らかな差異はなかった。また、ＨＥＲ ２遺伝子の増幅と疾患の否定的な予後および再発可能性は、有意な関係にあった 。

がん原遺伝子ｃ−ｍｏｓおよびＮ−ｍｙｃに観察されたように、過剰発現と細胞 性形質転換との関連性を研究するためにフジャックら［Ｈｕｄｚｉａｋ、　　Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　８４．　７１５９（１９８ ７）コによるＨＥＲ２発現ベクター、およびマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質転換 後に配列を増幅させるような選択手段を用いた。ＮＩＨ３Ｔ３細胞内での未変化 ＨＥＲ２遺伝子の増幅は、ｐ１８５の過剰発現、並びに細胞の形質転換（増殖） と無胸腺マウスにおける腫瘍形成を誘発した。

増殖因子または増殖因子レセプターと特異的に結合する抗体の作用を研究した。

以下に例を挙げて説明する。

ローゼンタールら［Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ、　　Ｃｅ１ｌ　４６．　３０１　（１ ９８６）］はヒ）ＴＧＦ−αｃＤＮＡ発現ベクターを非形質転換うット樹立線維 芽細胞に導入した。これらの細胞によるＴＧＦ−αの合成および分泌はヌードマ ウスでの足場依存性増殖を減少し腫瘍形成を誘導した。抗ヒ）ＴＧＦ−αモノク ローナル抗体は軟寒天上でのラット細胞のコロニー形成を妨げた（足場依存性の 喪失）。ギルら［Ｇ　ｉｌｌ。

−特異的であり、ＥＧＦの結合を阻害し、ＥＧＦにより促進されるチロシンタン パク質キナーゼ活性に対するアンタゴニスト（拮抗物質）であるモノクローナル 抗体を開示した。

ドレピンら［ｑ剣↓支上、６９５（１９８５）］はｎｅｕ＝腫瘍遺伝子で形質転 換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞をｎｅｕ遺伝子産物と反応性のモノクローナル抗体に 暴露すると、ｎｅｕ形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞が、足場依存性増殖に基づいて決 定される非形質転換表現型に変換されることを示した。ドレビンら［Ｄｒｅｂｉ ｎ、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、（ＴＪＳＡ）８３，９１２９（１９８６）］はｎｅｕ腫瘍遺伝子にフー ドされているタンパク質と特異的に結合するモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａア イソタイプ）でインビボ処理すると、ヌードマウスに移植された、ｎｅｕ形質転 換ＮＴＨ３Ｔ３細胞の腫瘍形成性増殖が有意に阻害されることを示した。

アキャマら［Ａｋｉｙａｍａ、　　５ｃｉｅｎｃｅ　２３え、１６４４（１９８ ６）］はｃ−ｅｒｂＢ　−２（ＨＥ　Ｒ２）のヌクレオチド配列から推定される アミノ酸配列のカルボキシ末端から１４アミノ酸残基に相当する合成べブチドに 対する抗体を惹起させた。

増殖因子は相乗的および拮抗的に相互作用することが報告されている。例えば、 ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βはＮＲＫ　　４９Ｆ線維芽細胞騰の増殖を相乗的に 促進するが、ＰＤＧＦは３Ｔ３細胞のＥＧＦレセプター機能をダウン調節（レギ ユレーション）する。種々の形質転換細胞がオートタリン機構により、増殖を刺 激すると考えの感受性腫瘍細胞に対する抗増殖作用を阻害し得ることを示した。

特に、上皮性増殖因子（ＥＧＦ）および組換えヒト腫瘍細胞増殖因子−α（ｒＨ ｕＴＧＦ−ａ）はインビトロで組換えヒト腫瘍壊死因子−α（ｒＨｕＴＮＦ−α ）および組換えヒト腫瘍壊死因子−βのヒト頚管がん細胞系ＭＥ−１８０の抗増 殖作用を妨害することが示された。この阻害作用はＥＧＦまたはｒＨｕＴＧＦ− ａの濃度０．１〜１００ｎｇ／−で認められ、１〜１０ｎｇ／ＭＩで最高であっ た。この応答はＴＮＦＮモレターのダウン調節またはＴＮＦ−αのレセプターへ の親和性の変化によるものではないと思われた。組換えヒトインターフェロン− γの抗増殖作用はＥＧＦまたはｒＨｕＴ　Ｇ　Ｆ−αの存在で有意に影響されな いので、この阻害は組換えＴＮＦ類に特異的であり、増殖因子の増殖促進作用の みによるものではない。どの増殖因子も、腫瘍細胞がｒＨｕＴ　Ｎ　Ｆ−αと組 換えインターフェロン−γに同時にさらされたときに見られる相乗的な細胞毒性 に対する実質的な保護作用を持たなかった。ＴＧＦ−βもインビトロでｒＨｕＴ ＮＦ−αの抗増殖作用を妨害し得る。濃度１　ｎｇ／−以下で、ＴＧＦ−βは有 意にｒＨｕＴ　Ｎ　Ｆ−αのＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞に対する細胞毒性作用を有 意に阻害した。ＥＧＦ、血小板誘導増殖因子、およびＴＧＦ−βはすべてＮＩＨ ３Ｔ３細胞の増殖を促進するがＴＧＦ−βのみがｒＨｕＴ　Ｎ　Ｆ−αの細胞毒 性を妨害することから、ＴＧＦ−βの　゛保護作用と細胞増殖促進作用とは単純 な関係にない。ｒＨｕＴ　Ｇ　Ｆ−αおよびＴＧＦ−βは、ｒＨｕＴ　Ｎ　Ｆ− αを介する他の２個の腫瘍細胞系（ＢＴ−１ｏおよびＬ−９２９細胞）への細胞 毒性作用に対しては有意な保護作用を示さなかった。

本発明は、増殖因子レセプター機能を阻害し得る抗体を提供することを目的とす るものである。

また、本発明は、改良されたＨＥＲ２レセプター分析法を提供する目的とするも のである。

また、本発明は、改良された腸瘍治療法を提供することを目的とするものである 。

さらに、本発明は、増殖因子レセプターおよび／または増殖因子を過剰に発現す る腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供することを目的とするものである。

さらにまた、本発明は、膿瘍細胞を増殖因子レセプター機能を阻害し得る抗体、 および腸瘍壊死因子等の細胞毒性因子で腫瘍を処理することからなる腫瘍の治療 法を提供することを目的とするものである。

さらにまた本発明は、膿瘍形成に関与している可能性のあるチロンンキナーゼの 分析法を提供することを目的とするものである。

本発明の他の目的、特徴および特色は以下の記載並びに特許請求の範囲から明ら かであろう。

発明の要約 本発明はＨＥＲ２レセプターの細胞外ドメインと特異的に結合するモノクローナ ル抗体に関するものである。また本発明はＨＥＲ２レセプターの分析法であって 、細胞をＨＥＲ２レセプターの細胞外ドメインと特異的に結合する抗体に暴露し 、該抗体と該細胞の結合程度を測定することからなる方法に関するものである。

本発明はまた、患者に治療有効量のＨＥＲ２レセプター機能を阻害し得る抗体を 投与することからなる腫瘍細胞の増殖を阻止する方法に関するものである。さら にまた本発明は、治療有効量の増殖因子レセプター機能を阻害し得る抗体、およ び治療有効量の細胞毒性因子を投与する方法に関するものである。さらにまた本 発明はＴＮＦ−α耐性が疑われる細胞をＴＮＦ−αに暴露し、ＴＮＦ−α耐性細 胞を単離し、単離した細胞を増大されたテロ７ンキナーセ活性に関してスクリー ニングし、増大されたチロシンキナーゼ活性を有するレセプターおよび他のタン パク質を単離することからなる腫瘍形成に関与していると思われるチロシンキナ ーゼの分析法に関するものである。

図面の簡単な説明 第１ａ図はＮＩ　Ｈ３Ｔ３細胞のＴＮＦ−α耐性を示しており、種々の濃度のＨ ＥＲ２ｐｌ’８５が見られる。第１ｂ図はＮ　Ｉ　Ｈ３Ｔ　３細胞のマクロファ ージ細胞毒性分析の結果を示し、種々の濃度のＨＥＲ２ｐ１８５が見られる。

第２図は対照細胞系（Ｎ　Ｉ　Ｈ３Ｔ　３　ｎｅｏ／ｄｈｆｒ）およびＨＥＲ２ ｐ１８５を過剰に発現する細胞系（ＨＥＲ２−３，。。）へのＴＮＦ−α結合レ ベルを示す図である。

第３図は抗−ＨＥＲ２モノクローナル抗体によるＳＫ　ＢＲ３細胞の増殖阻害を 示す図である。

第４図は血清中でのＳＫ　ＢＲ３細胞の増殖に対する無関係なモノクローナル抗 体（抗ＨＢＶ）の影響およびモノクローナル抗体４Ｄ５（抗−ＨＥＲ２）の影響 を比較して示した用量応答曲線である。

第５ｇ、５ｂおよび６８図はＴＮＦ−ａ濃度および抗ＨＥＲ２ｐ１８５モノクロ ーナル抗体濃度の増加関数として表した、５ＫＢＲ３細胞の生存率を示す図であ る。各図は異なる抗−ＨＥＲ２ｐ１８５モノクローナル抗体を用いた結果を示す 。第６ｂ図は無関係なモノクローナル抗体を用いた対照である。

第７図はＴＮＦ−αａ度および抗ＨＥＲ２ｐ１８５モノクローナル抗体濃度の増 加関数として表したＭＤＡ−ＭＢ−１７５−■細胞の生存率を示す図である。

第８図はＴ　Ｎ　Ｆ−αおよび抗ＨＥＲ２ｐ１８５モノクローナル抗体濃度の増 加関数として表した、ＨＥＲ２ｐ１８５を過剰に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の生 存率を示す図である。

発明の詳細な説明 新規な抗体を用いる腫瘍細胞の増殖阻害を発明した。驚くべきことに増殖因子レ セプター機能、例えばＨＥＲ２レセプター機能を阻害することにより細胞増殖が 阻害され、細胞は細胞性毒性因子の影響を受は易くなった。従って、例えば、Ｔ ＮＦ−α単独では反応し難い乳がん細胞でも、細胞を増殖因子レセプター機能を 阻害する抗体で処理しておくと、ＴＮＦ−αに反応し易くなる。感受性の増加を 、ＨＥＲ２レセプター、ＨＥＲ２レセプターに対するモノクローナル抗体、並び に腫瘍壊死因子−αを用いて示した。

本発明方法は腫瘍の異常な増殖速度が増殖因子レセプターに依存するような、哺 乳類の悪性または良性腫瘍の治療に有用である。異常な増殖速度とはホメオスタ シス（生体恒常性）にとって必要な速度以上の速度であり、同一起源の正常組織 にとって必要な速度以上の速度である。これらの腫瘍の多くはレセプターが認識 する細胞外から供給される増殖因子依存性であるか、腫瘍細胞によって合成され る増殖因子依存性である。後者の状況を“オートタリン”増殖と称する。

本発明方法は以下の条件を満たせば適用することができる。

（１）増殖因子レセプターおよび／またはリガンド（増殖因子）が発現され、腫 瘍細胞の増殖が増殖因子レセプターの生物学的機能に依存性であり、 （２）増殖因子レセプターの生物学的機能が増殖因子レセプターおよび／または リガンドに特異的に結合する抗体によって阻害される。

本発明は、あくまでも実施面でのいかなる理論によっても制限されないものであ るが、抗体は以下に示す阻害方法の１またはそれ以上によって増殖因子レセプタ ーの生物学的機能を阻害するものと考える。

（ａ）抗体がレセプターの細胞外ドメインと結合してリガンドとレセプターとの 結合を妨げる。

（ｂ）抗体がリガンド（増殖因子）自身と結合してリガンドとレセプターとの結 合を妨げる。

（ｃ）抗体が増殖因子レセプターをダウン（ｄｏｗｎ）調節する。

（ｄ）抗体が腫瘍細胞を、ＴＮＦ−α等の細胞毒性因子の細胞毒性作用に対して 敏感にする。

（ｅ）抗体がレセプターのチロシンキナ−活性を阻害する。

（ｆ）および（ｇ）の場合には、抗体が標的化作用（ターゲツティングファンク シ目ン）を介して間接的に増殖因子レセプターの生物学的機能を阻害する。

（ｆ）抗体がレセプターと複合体を形成して血清中の補体を活性化し、かつ／ま たは抗体依存性の細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を仲介するサブクラスであるか、 またはアイソタイプに属する（例、ＩｇＧ２ａ抗体）。

（ｇ）レセプターまたは増殖因子と結合する抗体が毒素と抱合体を形成する（抗 毒素）。

レセプター上、リガンド結合部位の立体的近接部位に結合することでレセプター 機能を大きく阻害する（レセプター遮断）、かつ／またはリガンドがレセプター に結合することを妨げる（遮断する）ような方法で増殖因子と結合する抗体を選 択することが好都合である。

これらの抗体はインビトロにおける、レセプター機能中和抗体の選択のためのア ッセイによって常法通り選択される。当業者にとって自明の適当な分析法により 、リガンド類似の作用でリガンドアゴニストのような働きをする抗体を排除する 。ある種の腫瘍細胞に対し、抗体はオートタリン増殖系（即ち、細胞が増殖因子 を分泌し、それが同細胞のレセプターと結合する）を阻害する。幾つかのリガン ド、例えばＴＧＦ−αは細胞膜に作用する（止どまる）ことが分かつているので 、抗体の櫟的機能はリガンドおよび／またはレセプターに対するものである。

幾つかの膿瘍細胞は正常な細胞増殖および分化に必要な増殖因子を分泌する。し かしながら、これらの増殖因子はある種の条件下で、腫瘍細胞自身と近辺の正常 細胞の無秩序な増殖をもたらし、腫瘍細胞形成を引き起こし得る。

上皮増殖因子（Ｅ　Ｇ　Ｆ　）は劇的な細胞増殖刺激作用を有する。精製レセプ ター製品において、ＥＧＦレセプターはＥＧＦの結合により活性化されるプロテ ィンキナーゼである。このキナーゼの基質タンパク質のチロシン残基がりん酸化 される。インシュリン、血小板誘導増殖因子（ＰＤＧＦ）および他の増殖ホルモ ンのレセプターはチロシン特異的キナーゼである。レセプターと結合したリガン ドがあるタンパク質のレセプターによるりん酸化の引金となり、その結果、細胞 増殖を促進すると考えられる。約１／３の既知の腫瘍遺伝子が他のタンパク質の チロシン残基をりん酸化するタンパク質をコードしている。これらの腫瘍遺伝子 は、細胞の増殖因子およびホルモンに対する応答と類似のトリツガ−（引金）応 答をもたらすと考えられる。ｅｒｂＢ！ＩＩ瘍遺伝子産物はホルモン結合ドメイ ンを欠いているので、構成的な増殖刺激シグナルを与えるのかもしれない。

本発明の１実施態様は、腫瘍細胞のＨＥＲ２レセプターの生物学的機能を阻害す る抗体の治療有効量を患者に投与することにより腫瘍細胞の増殖を阻止する方法 に関する。

増殖因子レセプターの過剰発現は以下に示すように、細胞のＴＮＦに対する耐性 を増大する。ＨＥＲルセブタ−（ＥＧＦレセプター）の過剰発現はレセプタ一様 がん原遺伝子産物と合致し、全ＨＥＲ２レセプターが、この耐性の増大を示した 。下記実施例にはＨＥＲ２レセプター（ｐ１８５）をコードするＨＥＲ２の発現 の増幅により、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のマクロファージまたはＴＮＦ−αの細胞毒性 作用に対する耐性が誘導されることが記載されている。ｐ１８５過剰発現による ＴＮＦ−αに対するＮＩＨ３Ｔ３細胞の耐性誘導には、ＴＮＦ−αとそのレセプ ターとの結合の変化が伴う。ｐ１８５の過剰発現はまたある種のヒト乳癌細胞系 のＴ　Ｎ　Ｆ−α細胞毒性作用に対する耐性を伴う。

本発明の他の実施態様においては、（１）患者に増殖因子および／またはそのレ セプターに対する抗体であって、レセプターの生物学的機能を阻害し、細胞のＴ ＮＦ等の細胞毒性因子に対する感受性を高める抗体を投与し、ざらに（２）患者 に細胞毒性因子（類）または免疫系細胞を直接的または間接的に刺激して細胞毒 性因子を産生させるような生物学的応答改変剤を投与することにより、腫瘍細胞 を処理する。

Ｔ　Ｎ　Ｆ−α等の細胞毒性因子は細胞分裂阻止（細胞増殖抑制）作用および細 胞毒性（細胞破壊）作用を表す。有用な細胞毒性因子には、例えば、ＴＮＦ−α 、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＦＮ−γ、およびＴ　Ｌ−２、並びに５ＦＵ、　ビ ンブラスチン、アクチノマイシンＤ１エトポシド、シスブラスチン、メトトレキ セート、およびドキンルビンン等の化学療法剤がある。細胞毒性因子は単剤また は複合剤として用いることができる。さらにまた本発明の他の実施態様では、患 者をレセプター機能を阻止する抗体で治療し、またオートローガストランスファ ー治療（例えばＬＡＫまたＴｒＬ細胞）を行う。

腫瘍壊死因子は、ある種の悪性形質転換細胞にとって細胞毒性のマイトジェン刺 激−マクロファージまたはリンパ細胞から産生されるポリペプチドである。ＴＮ Ｆ−αの抗−腫瘍効果はインターフェロンの相乗作用を受けることが知られてい る。インターフェロンαおよびインターフェロンβの抗ウィルス作用と同様、Ｔ 　Ｎ　Ｆ−αおよびＴＮＦ−β混合物の抗腫瘍作用は相加的である。

腫瘍壊死因子にはＴ　Ｎ　Ｆ−αとＴＮＦ−βが含まれる。前者はその組換え細 胞培養中での製造法をも含めて米国特許４，６５０，６７４、および欧州特許出 願０１６８２１４に記載されており、後者は欧州特許出願０１６４９６５に記載 されている。これらの特許書類に記載されているＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βに は細胞毒性の、アミノ酸配列変異体およびグリコジル化変異体が含まれる。非組 換え体起源のＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βも本発明方法には有用である。

好ましいＴＮＦは組換え微生物細胞培養から得られる成熟ヒトＴＮＦ−αである 。通常、ＴＮＦの活性は、約Ｉ　Ｘ　１０’単位／ｚｇ以上で、感受性のあるＬ −Ｍネズミ細胞を溶解するだろうが、この１単位は上記特許出願記載の定義に従 った値である。

本発明の他の実施態様では、１またはそれ以上の付加的なサイト力インおよび／ または細胞毒性因子をＴＮＦ−α、ｅｇｓ、　インターフェロン、インターロイ キン、および化学療法剤と一緒に投与する。

本発明の組成物は、従来、インターフェロンやＴＮＦの治療用投与に用いられて きた薬学的に許容し得るビヒクル、例えば生理学的食塩水または５％デキストリ ンを、通常の安定化剤、および／またはヒト血清アルブミンまたはマンニトール 等の賦形剤と一緒に含有する。組成物は凍結乾燥するか、滅菌水溶液の形で提供 される。

当業者ならば、治療用組成物中のＴＮＦ濃度および投与用量の決定について様々 な変化を考慮するであろう。治療はまた、投与経路および患者の臨床症状によっ ても変化する。

細胞毒性因子（顛）と増殖因子レセプター機能を阻害する抗体とを、−緒に、ま たは別個に投与する。後者の場合には、抗体をまず投与し、２４時間以内にＴＮ Ｆを投与することが好都合である。患者の臨床応答に応じてＴ　Ｎ　Ｆと抗体を 複数回、交互に投与することも本発明の範囲内である。ＴＮＦと抗体とを、例え ば静脈内、鼻腔内、または筋肉的投与等の同一または別個の経路で投与する。

本発明方法を増殖因子レセプターおよび／またはリガンドを過剰に生産する腫瘍 細胞に適用し、増殖因子レセプター機能を阻害する抗体を生産させることもでき る。細胞（例えば乳がん細胞）は該細胞上のレセプター数が正常な健常細胞（例 えば、正常な乳組繊細胞）上のレセプター数よりも多いと、増殖因子レセプター を過剰に産生じている。ＨＥＲ２レセプターが過剰に発現される腫瘍（従って、 本発明方法が適用可能）の例として、ヒト乳がん、腎臓がん、胃がんおよびだ液 腺がんを挙げることができる。

本発明の他の実施態様では、増大したチロシンキナーゼ活性を有するレセプター および他のタンパク質の同定、および細胞を形質転換する膿瘍遺伝子の同定のた めの分析法に関する。チロシンキナーゼをコードしているある種の膿瘍遺伝子の 増幅はＴＮＦ−α耐性と相関する。細胞をＴＮＦ−α耐性に関して選択すると、 その幾つかはチロシンキナーゼ活性が増大している。チロシンキナーゼの幾つか はレセプターである。次いで、遺伝子のクローニングのために、通常の方法でチ ロシンキナーゼをコードする遺伝子をクローニングする。レセプターまたは他の タンパク質を同定することにより、本明細書中、ＨＥＲ２で示したごとく、レセ プター（または他のタンパク質）機能を阻害し、細胞の細胞毒性因子に対する感 受性を高める試薬を考案することができる。また、レセプターを同定すると、次 にレセプターのリガンドを同定することができる。本発明の分析法は、ＴＮＦ− αに感受性を有すると思われる細胞をＴＮＦ−αに暴露し、Ｔ　Ｎ　Ｆ−α耐性 細胞を単離することからなる。次いで、ＴＮＦ−α耐性細胞をチロシンキナーゼ 活性の増大に関してスクリーニングし、チロシンキナーゼ活性の増大を示すレセ プターおよび他のタンパク質を単離する。

抗体 本発明においては、抗原で免疫刺激された免疫リンパ細胞と骨髄腫細胞との融合 によって形成された連続的なハイブリ、ド細胞系から、増殖因子またはＨＥＲ２ レセプターのような増殖因子レセプターと特異的に結合するモノクローナル抗体 を単離した。増殖因子レセプターと結合する本発明のモノクローナル抗体は、レ セプターの細胞外ドメインと結合するものであることが好都合である。本発明の 他の実施態様では、増殖因子または増殖因子レセプターと特異的に結合するポリ クローナル抗体を用いる。

腸瘍治療に用いる本発明の抗体の腫瘍細胞増殖阻止率はインビトロで２０％以上 であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましい。これらの抗体は スクリーニングぐ例えば、第３図の説明を参照）によって得られる。腸瘍治療に 用いられる本発明のＨＥＲ２レセプターに対するモノクローナル抗体は、レセプ ターの血清活性をも阻害し得る。

モノクローナル抗体は単一の抗原部位に対するものであるために高度に特異的で ある。しかも、種々の抗原決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含有する 従来の通常の抗体（ポリクローナル抗体）製品とは対照的に、モノクローナル抗 体はそれぞれ、抗原上の単一の抗原決定基に対するものである。モノクローナル 抗体は、抗原−抗体結合を利用する診断および分析アッセイにおける選択性およ び特異性を改善するのに有用である。モノクローナル抗体の第２の利点はハイブ リドーマ培養により、他の免疫グロブリンによる汚染なしに合成することができ る点にある。モノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞の培養上清またはハイブ リドーマ細胞を腹腔内接種したマウスの復水から調製することができる。

最初コーラ−およびマイルシニタイン［Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉ ｎ。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　６．　５１１（１９７６）］によって記 載されたハイブリドーマの技術は、多くの特異抗原に対する高レベルのモノクロ ーナル抗体を分泌する広範なハイブリッド細胞の生産に適用されてきた。

宿主動物またはそれから得た、抗体産生細胞培養の免疫の方法およびスケジュー ルは、従来の確立された抗体刺激および生産技術に従う。出願人は試験モデルと してマウスを用いたが、これはヒト対象をも含めたあらゆる哺乳類対象、並びに それらの動物から導かれた抗体産生細胞を本発明方法に従って処理し、ヒトをも 含む哺乳類のハイブリッド細胞系を産生ずるための基礎とすることができること を想定したものである。

免疫処置後、免疫リンパ細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリッド細胞系を形 成する。このハイブリッド細胞系を培養し無期限に継代培養し大量のモノクロー ナル抗体を産生ずることができる。本発明の目的から、融合のための免疫リンパ 細胞を、免疫動物のリンパ節組織または肺臓組織から得たリンパ球およびその正 常な分化子孫細胞から選択した。免疫肺臓細胞の方がマウス系において、より高 濃度かつ好都合な抗体産生細胞を与えることから好ましい。骨髄腫細胞は融合ハ イブリ、ド細胞の連続的な増殖の基盤を与える。骨髄腫細胞は血漿細胞から得ら れる膿瘍細胞である。

１つの種の細胞と他の種の細胞とを融合させることもできる。しかしながら、免 疫抗体産生細胞と骨髄腫細胞とが同一種を起源とするものであることか好ましい 。

ハイブリッド細胞系は、細胞培養培地中、インビトロで維持することができる。

本発明の細胞系は既知のヒボキサンチン−アミノプテリンチミジン（ＨＡＴ）培 地中に連続細胞系を含有する組成物として選択および／または維持することがで きる。実際、一度、ノ１イブリドーマ細胞系が樹立されれば、それを種々の栄養 的に十分な培地で維持することができる。さらに、ノーイブリッド細胞系は、凍 結保存や液体窒素中での保存等、任意な常法で貯蔵および保存することができる 。凍結細胞系を再生させ、無期限に培養し、モノクローナル抗体を再び産生、分 泌させることができる。分泌された抗体を、組織培養上清から、沈澱、イオン交 換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の常法により回収 する。

本発明はマウスモノクローナル抗体を用いて示したが、それに限定されるもので はない。事実、ヒト抗体を用いることができ、それが好ましいことが分かるであ ろう。そのような抗体はヒト７％イブリドーマ［コートら（Ｃｏｔｅ）、Ｍｏｎ ｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ８５）］を用い て得ることができる。実際に、本発明方法に従い、“キメラ抗体”の製造のため に開発された方法［モリシンら（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、■、６８５１（１９８４）；＝、−バーガー（’ Ｎ　ｅｕｂｅｒｇｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ　３１２．６０４（１９８４）；タケダ （Ｔ　ａｋｅｄａ）、Ｎａｔｕｒｅ　３ユ」−１４５２（１９８５）コを用いて 適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子を、適当な生物活性（ヒト補体を活性 化したりＡＤＣＣを仲介する能力）を有するヒト抗体分子から得た遺伝子と一緒 にスプライシングすることができる。そのような抗体も本発明の範囲に含まれる 。

他の細胞融合法として、ＥＢＶ不滅化Ｂ細胞を用いて本発明のモノクローナル抗 体を産生させることができる。他のモノクローナル抗体製造法として、組換えＤ ＮＡ法も考えられる。

最も重要な本発明の抗体の免疫化学的誘導体は、（１）抗毒素（抗体と細胞毒性 部分との抱合体）、および（２）標識化（例えば、放射性ラベル、酵素ラベル、 または蛍光色素ラベル）誘導体であって、ラベルが、橋識した抗体を含有する免 疫複合体の同定手段となるものである。また、抗体を天然の補体工程を経る溶解 を導き、正常に存在する抗体依存性の細胞毒性細胞と相互作用させるのに用いる こ抗毒素の細胞毒性部分は細胞毒性薬物、酵素的に活性な細菌または植物起源の 毒素、またはそのような毒素の酵素的に活性な断片（“Ａ鎖”）であってよい。

使用される酵素的に活性な毒素およびそのＰ　Ａ　Ｐ　−Ｓ　）、モモルジ力・ カランチア・インヒビター、クーシン、クロチン、サバオナリア・オフインナリ ス・インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリフトシン、フェノマイシン 、およびエノマイシンが含まれる。他の態様として低分子量の抗がん剤と抱合体 を形成していてもよい。モノクローナル抗体とそれらの細胞毒性部分との抱合体 は種々の２機能性タンパク質カップリング試薬を用いて形成することができる。

そのような試薬には、例えば、５ＳＤＰ。

ＩＴ、ジメチルアジブイミゾ−）ＨＣＩ！のようなイミドエルテルの２機能性誘 導体、ジスクシンイミジルスベレートのような活性エステル、グルタルアルデヒ ド等のアルデヒド、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等のビス− アジド化合物、ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン等のビス ジアゾニウム誘導体、トルイレン２．６−ジイソシアネート等のジイソシアネー ト、および１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等の二（ビス）活性 フッ素化合物等がある。毒素の溶解部分を抗体のＦａｂ断片と結合させる。

ＨＥＲ２レセプター等の標的増殖因子レセプターの細胞外ドメインに、特異的に 結合するモノクローナル抗体をリシンＡ鎖と結合させると好都合である。リシン Ａ鎖が脱グリコジル化されており組換え法で製造されるものであると最も都合が よい。ビテッタら［Ｖｉｔｅｔｔａ、　　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２３８．　１０ ９８（１９８７）］の方法でリシン抗毒素を容易に製造することができる。

診断のために、インビトロでヒトがん細胞を殺す場合には、一般に、細胞培養培 地に抱合体を少なくとも１０ｎＭの濃度になるように加える。インビトロ使用の 処方および方法は重要ではない。培養培地や潅流媒質に適応する水性製剤が、通 常、用いられる。細胞毒性は通常のがんの存在または重篤変の測定法により、知 ることができる。

放射性同位元素（Ｉ、　Ｙ、　　Ｐｒ等）を抗体に結合させることにより、がん 治療用の細胞毒性放射性薬物を製造することができる。本明細書中、“細胞毒性 部分”という語句にはそのような放射性同位元素も包含される。

他の実施態様では、リポソームに細胞毒性薬物を充填し、リポソームを増殖因子 レセプターと特異的に結合する抗体で被覆する。多くのレセプタ一部位があるの で、この方法により大量の薬物が適正な細胞型に伝達されることになる。

抗体依存性細胞性細胞毒性 本発明はまた、（ａ）ＨＥＲ２ｐｌ　８５等の増殖因子レセプターに対する抗体 であって、（ｂ）抗体分子が結合する腫瘍細胞の溶解を媒介し得るサブクラスま たはアイソタイプに属する抗体を使用することに基づく方法を提供するものであ る。さらに詳しくは、これらの抗体は、増殖因子レセプターと複合体を形成する と、血清中の補体を活性化し、かつ／またはナチュラルキラー細胞またはマクロ ファージ等のエフェクター細胞を活性化して抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣ Ｃ）を媒介するサブクラスまたはアイソタイプに属する。

本発明はまた、これらの抗体を天然の形でヒト腫瘍の治療に用いる事を目的とす る。例えば、腫瘍関連の細胞表面抗原と結合する多くのＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ ３マウス抗体をインビボで腫瘍の治療に用いることができる。実際、ＨＥＲ２ｐ １８５は多くの腫瘍上に存在するので、本発明の抗体およびその治療上の使用は 一般的に適用することができる。

抗体の生物学的活性は大多数、抗体分子のＦｃ領域によって決定されることが分 かっている［ウアナヌエ（Ｕ　ａｎａｎｕｅ）およびベナチェルラフ（Ｂ　ｅｎ ａｃｅｒｒａｆ）、工ｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙｓ第２版 、ウィリアムズ・アンド・ウィルキンズ（Ｗｉ１１ｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ） 、２１８頁（１９８４）］。これは、補体活性化能力および白血球の影響下、細 胞の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を含む。

クラスおよびサブクラスが異なる抗体は、この点に関して異なっており、本発明 においては、所望の生物学的活性を何する抗体を選択する。例えば、マウスの免 疫グロブリンＩｇＧ３およびＩｇＧ２ａクラスはコグネート（ｃｏｇｎａｔｅ） 抗原を発現する標的細胞と結合すると血清中の補体を活性化することができる。

一般に、ＩｇＧ２ａおよびＩ　ｇＧ　３サブクラスの抗体、および時にはＩｇＧ １サブクラスの抗体はＡＤＣＣを媒介することができ、１ｇＧ３、ＩｇＧ２ａお よび１ｇＭサブクラスの抗体は血清中の補体と結合し、活性化することができる 。通常、補体の活性化には標的細胞に、少なくとも２分子のＩｇＧ分子が極めて 近接して結合することが必要である。しかしながら、唯一の１ｇＭ分子の結合で 血清の補体が活性化される。

補体の活性化および／またはＡＤＣＣにより、特定の任意の抗体の標的１１瘍細 胞溶解能を分析することができる。目的の腫瘍細胞をインビボで増殖させ、ラベ ルする：抗体を血清補体または抗原抗体複合体によって活性化され得る免疫細胞 と一緒に腫瘍細胞培養物に加える。標的腫瘍細胞の細胞溶解を、溶解細胞のラベ ルにより検出する。事実、患自身の血清を補体および／または免疫細胞の供給源 として用いて抗体をスクリーニングすることができる。次いで、補体を活性化し 、またはＡＤＣＣを媒介することができる抗体を特定の患者の治療的インビトロ 試験に用いることができる。

本発明の実施態様としては、それがＨＥＲ２ｐｌ　８５等の増殖因子レセプター と結合し、かつ補体を活性化するかＡＤＣＣを媒介する限り、実質上、任意の起 源から得た抗体を用いてよい。モノクローナル抗体は、連続的かつ十分な量の供 給源となるので好都合である。実際、例えば、ＨＥＲ２ｐ１８５でマウスを免疫 してｐ１８５に対する抗体を産生ずるハイブリドーマを樹立し、ヒト補体の存在 下に腫瘍細胞を溶解し得る抗体を産生ずるハイブリドーマを選択することによっ て、種々のヒト腫瘍と反応し、溶解することができる抗体群を迅速に樹立し得る 。

抗体の治療上の使用 治療のためにインビボで使用する際には、本発明の抗体の治療有効Ｎ（患者の腫 瘍を消滅または軽減する量）を患者に投与する。それらは、通常、可能ならば標 的細胞部位に、または静注により、非経口的に投与される。用量および投与方法 はがんの性質（原発性であるか、転移性であるか）その数、抗体が攻撃すべき部 位、特定の抗毒素の性質（使用する場合）、例えばその治療指針、患者、および 患者の病歴に依存する。投与される抗体の量は、通常、約０１から約１０ｍ１＋ ／体重に９の範囲である。

非経口投与のために、抗体を薬学的に許容し得る非経口用ビヒクルと一緒に注射 用−同量投与剤形（溶液、懸濁液、エマルション）に製剤化する。そのようなビ ヒクルは遺伝的に無毒であって、非治療的なものである。そのようなビヒクルの 例として、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト 血清アルブミンを挙げることができる。不揮発性油およびオレイン酸エチル当の 非水性ビヒクルも使用可能である。リポソームを担体として用いることができる 。ビヒクルは等強性および化学的安定性を増加するための物質、例えばバッファ ーおよび保存剤を含有することもある。一般にビヒクル中、約ＩＲｇ／ｌＱから １０ｘｇ／ｘＱの濃度で抗体を処方する。

治療のための抗体サブクラスの選択は腫瘍抗原の性質に依存する。

例えば、抗原が腫瘍標的に対して高度に特異的であって、正常細胞には殆んど存 在しないような状況では、ＩｇＭが好ましい。しかしながら、腫瘍関連抗原が非 常に低レベルではあるが正常組織でも発現される場合には、以下のような理由か らＩｇＧサブクラスが好ましいであろう。補体の活性化にはごく近接した少な（ とも２個の１ｇＧ分子の結合が必要であるので、少量の抗原を発現する正常組織 では少しのＩｇＧ抗体分子しが結合しないことから、補体に仲介される損傷が少 ない。また、１８６分子が小さいことにより、ＩｇＭ分子よりも腫瘍組織部分に より多く局在（位置）することができる。

インビボでの補体活性化は種々の生物学的作用、例えば炎症性応答およびマクロ ファージの活性化を導くことが示された［ウアナヌａｍｓ＆Ｗｉ１ｋｉｎｓ）、 ２１８頁（１９８４）コ。腫瘍細胞の活性化されたマクロファージに対する感受 性は正常細胞のそれよりも高い［フィ種々の抗がん剤、例えば化学療法剤、放射 性標識抗体等の腫瘍部位への局在能を高める。従って、本発明の特定タイプの抗 原−抗体の組み合わせを多くの方法で治療的に用いることができ、通常、腫瘍細 胞集団の不均質性によって引き起こされる問題の多くを阻止し得り、ｚ、１０３ （１９８４）］またはそのような抗原に関連する抗−イディオタイプ抗体［ネポ ムら（Ｎｅｐｏｍ）、Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ　ａｔｅ、　Ａ　ｅａｄ、　Ｓ　ｃｉ。

ん、患者での活性な免疫応答を導くことができる。そのような応答には、ヒト補 体を活性化し、ＡＤＣＣを仲介し、それらの機構を介する腫瘍の破壊を導き得る 抗体の形成が含まれる。

イムノア、セイ ここではＨＥＲ２ｐ１８５の存在を決定する血清学的手法について説明する。基 本的に本発明方法は試験すべき試料をモノクローナル抗体と一緒にインキュベー ションするか、またはモノクローナル抗体に暴露した後、反応産物の存在を検出 することからなる。当業者ならばこれら基本的手法には多くの変法があることを 理解するであろう。それらにはＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、沈降法、凝集法、補体固定 化法および免疫蛍光法が含まれる。現時点て好ましい方法は適当に棲識したモノ クローナル抗体を用いる方法である。

様々に標識された抗体を得るための標識には放射性標識および蛍光標識のように 直接検出される標識と、酵素のように反応させるが、誘導体化して検出されねば ならないものがある。放射性標識は現在入手可能な計数装置を任意に用いて検出 することができる。好ましｕ’５位元素ｍｇｆｉｌ；！、”Ｔ　ｃ、１４ｃ、　 ＋３１１．　＋２５１．３）（，３１Ｐ、および′Ｓである。酵素標識は現在用 いられている様々な熱量計、分光光度計、蛍光分光光度計、およびガス分析法で 検出可能である。

カーポジイミド、過ヨウ素酸塩（パーアイオデート）、ジイソシアネート、グル タルアルデヒド等の架橋分子を用いて酵素と抗体とを結合させる。これらの方法 に用いられる多くの酵素が知られておりそれらを利用できる。例えば、ペルオキ シダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシ ダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルツースオキシダーゼ士ペ ルオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼニベルオキシダーゼおよび酸ホスフ ァターゼがある。使用される蛍光性物質にはフルオレスセインおよびその誘導体 、ローダミンおよびその誘導体、オーラミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ル シフェリア、２．３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ 、アルカリホスファターゼ、リゾチーム、グルコース−６−りん酸デヒドロゲナ ーゼ等がある。既知の方法で抗体にそれら標識を結合させる。例えば、アルデヒ ド、カーポジイミド、シマレイミド、イミデート、スクシンイミド、ピッド−ジ アゾ化ベンザジン等を用いて抗体に上記蛍光性、化学発光性および酵素標識を結 合させることができる。種々の標識法がモリラン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）、Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　３２ｂ、＋０３（１９７４）、シバ ネンら（Ｓ　ｙｖａｎｅｎ）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　２８４．３７６２ （１９７３）、および、ポルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）およびハンター（Ｈｕｎｔｅ ｒ）、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ　、　　１３３．５２９（１９７３）によって示 された。

患者のがんの存在を検出する、または既にがんの存在が分かっている患者でのが んの状態を監視するだめの様々なイムノイメージングおよびイムノアッセイに抗 体および標識抗体を用いることができる。がんの状態のモニターに用いる場合に は定量的なイムノアッセイを用いる必要がある。そのようなモニターアッセイを 定期的に行い、結果を比較することにより、患者の腫瘍の重篤度が増大したか減 少したかを決定することができる。使用される通常のアッセイ法には直接法およ び間接法の両者が含まれる。試料が、がん細胞を含有する場合、標識抗体がこれ らの細胞と結合する。組織または細胞を洗浄して結合しなかった標識抗体を除去 した後、組織試料中に存在する標識された免疫複合体を測定する。間接アッセイ では組織または細胞試料を非標識モノクローナル抗体と一緒にインキュベートす る。次いで、試料をモノクローナル抗体に対する標識抗体（例、標識した抗ネズ ミ抗体等）で処理し、洗浄し、３重複合体の存在に関して測定する。

診断面での使用に際しては、通常、抗体をキットの形で分散させて用いる。これ らキットは一般に、適当な容器内の標識形または非標識形抗体、間接アッセイの ためのインキュベーション用試薬、および標識の性質に応じた基質または誘導体 形成試薬からなる。ＨＥＲ２ｐ１８５対照および手引書も含まれる。

以下の実施例は本発明をより詳細に説明するものであるが、本発明の範囲を制限 するものと見なされるべきではない。

実施例 ｐＩＢ　５　Ｍｌ！Ｒ１の増幅された発現およびチロシンキナーゼ活性フジャノ クら（Ｈｕｄｚｉａｋ）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ） 　８先、７１５９（１９８７）の開示に従って種々のレベルでｐ１８５を発現す る一連のＮ　Ｉ　Ｈ３Ｔ　３細胞系を構築した。親細胞系は非形質転換形のＴＮ Ｆ−α感受性表現型を有していた。選択可能マーカーとしてのネオマイシン耐性 、およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（メトトレキセート耐性をコードしており、 結合しているＤＮＡ配列の増幅をもたらす）をコードする発現プラスミドｐＣＶ Ｎで形質転換することにより対照細胞系（Ｎ　Ｉ　Ｈ３Ｔ　３　ｎｅｏ／ｄｈｆ ｒ）を調製した。ｐＣＶＮ−ＨＥＲ２（Ｒ３Ｖ−ＬＴＲの転写制御下にｐ１８５ Ｌｚセブタ一様チロシンキナーゼの全１２２５アミノ酸をコードする）をＮ１） （３Ｔ３細胞に、並行トランスフェクションにより導入した。アミ／グリコシド 抗生物質Ｇ４１８に対する耐性に基づいて形質転換体を選択した。ｐＣＶＮ−Ｈ ＥＲ２一時形質転換体（ＨＥＲ２−３）は導入された形態学を持たず軟寒天上で 増殖することができない。

しかしながら、２００　ｎＭ（ＨＥ　Ｒ２３ｚｏｏ）、４００ｎＭ（ＨＥＲ２− ３、、。）、および８００ｎＭ（ＨＥＲ２３−ｏｏ）のメトトレキセート中にお ける選択による段階的なＨＥＲ２発現の増幅によって、形態学的な判断基準に基 づき、軟寒天での増殖能力、およびヌードマウスでの腫瘍形成能力が導入された 。

ｐ１８５発現の増幅は３ＳＳメチオニンで代謝的に標識した細胞からの免疫沈降 により証明された。これら細胞系におけるｐ１８５関連チロシンキナーゼ活性は インビトロでの自己りん酸化によって測定された。ｓｓ３メチオニン標識ｐ１８ ５のオートラジオグラフィーのために３５８１ｊ識メチオニン２００μＣｉ（ア マ−ジャム；　１１３２Ｃｉ／ｍＭ）を透析した２％ウシ胎児血清を含有するメ チオニン不含標識培地１．５ｘＱに加えた。各型の１．０Ｘ１０’細胞をＣｏｕ ｌｔｅｒ　ｃ。

ｕｎｔｅｒで計数し、５０＋ｘ培養皿（ファルコン）中で培養し、１２時間付着 させた。８時間の標識期間後、細胞を溶解しＨＥＲ２コード化ρ１８５を分析し た。自己りん酸化ＨＥＲ２レセプターチロシンキナーゼのオートラジオグラフィ ーのために、ｐ１８５を免疫沈降させ、ベレットをチロシンキナーゼ反応バ・ノ ファ−５０μＱに再懸濁した。試料を４℃で２０分間インキュベートした。種々 の細胞系由来の自己りん酸化ｐ１８５を、次いでゲル電気泳動の後、オートラジ オグラフィーにかけて観察した。用いた分子量マーカーはミオシン（２００ｋＤ ）およびβ−ガラクトシダーゼ（１１６ｋＤ）である。その結果、ｐ１８５の発 現およびそれに伴う、増幅と並行するチロシンキナーゼの増加が見られた。イン ビトロでの自己りん酸化反応における定量的デンシトメトリーによると、ＨＥＲ ２−３とＨＥＲ２−３＊０ＯＳＨＥＲ２−３ｔｏｏとＨＥ　Ｒ２−３、、ｏとの 間でチロシンキナーゼ活性が少なくとも５〜６倍増加したが、ＨＥＲ２−３，。

。とＨＥＲ２３ｅ。。との間には僅かな相違しかなかった（以下の表１のチロシ ンキナーゼに関する欄を参照）。

表１の各細胞型に存在するチロシンキナーゼの相対的な量はオートラジオグラム を走査する（ＬＫＢ２２０２レーザーデンシトメーター使用）ことによって作成 した曲線の下方の領域の面積比を求めルコトニヨり決定［、た。測定の直線性を 得るために様々な時間、オートラジオグラムをとり、ＨＥＲ２−次形質転換体（ ＨＥＲ２−３）との比較によって標準化した。

ＴＮＦ−αに対重ゑ耐独 次いで、上記の細胞系のＴＮＦ−αおよびマクロファージ誘導細胞毒性に対する 感受性を試験した。

第１ａ図には対照細胞およびＨＥＲ２で形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞の、Ｔ ＮＦ−α耐性が示されている。細胞を９６ウエルのマイクロタイタープレートの 、１０％ウシ血清、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１００ＩＪ／πＱペニシリン、お よび１００ｔｌｉ＋／−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭを入れたウェル に、密度５，０００細胞／ウエルで接種した。細胞を４時間付着させた後、一定 濃度範囲のＴＮＦ−αを加えた。ＴＮＦ−α（組換えヒトＴＮＦ−α）の比活性 をアクチノマイシンＤの存在下、Ｌ−Ｍ細胞毒性アッセイによって測定したろこ ろ、５Ｘ１０’Ｕ／ηであった。３７℃で７２時間インキュベーションした後、 単一層をＰＢＳで洗浄してクリスタルバイオレ・／トで染色し、細胞の相対生存 率を決定した。これらの測定を６回繰り返した。代表的な実験の結果を第１ａ図 に示す。

第１ｂ図には、マクロファージ仲介細胞毒性アッセイが示されている。１０．０ ０００／ｉＱのＴ　Ｎ　Ｆ−αを含有する培地でＮ１）（３Ｔ　３　ｎｅｏ／　 ｄｈｆｒの１つのクローンを継代培養することによりＴＮＦ−α耐性細胞（ｎｅ ｏ／ｄｈｆｒ　ＨＴ　Ｒ）を得た。マクロファージ細胞毒性アッセイのためにＮ ＩＨ３Ｔ３ｎｅｏ／ｄｈｆｒ、　ＨＥＲ２３ａｏｏおよびｎｅｏ／ｄＭｒＨＴＲ 細胞を上記同様、９６ウエルのマイクロタイタープレートに接種した。ヒトマク ロファージを、健常提供者の抹消血から得た付着細胞として得た。付着細胞をか き取って培地に再懸濁し、１０μ９／ｘＱの大腸菌から得たリボ多糖類（ＬＰＳ ；シグマ）と１００ｔＪ／ｆｆρの組換えヒトガンマインターフェロン（ｒＨｕ ＩＦＮ−γ、ジェネンテク、インゴーポレイテッド）で４時間活性化させた。次 いで、細胞懸濁液を１２０Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、得られたベレ７）を培地 で洗浄してＬＰＳおよびｒＨｕｌＦＮ−γを除去した。マクロファージを培地に 再懸濁し、計数し、所望のエフェクター、標的比を得るために標的細胞に加えた ５３７°Ｃで７２時間インキュベーションした後、単一層を培地で洗浄し５１Ｏ ｒの取り込みに基づいて生存率を測定するために、各ウェルに５ＩＯｒを入れた 。

表１ ＨＥＲ２−関連チロジンキナーゼ濃度とＴＮＦ−α耐性との関係細胞型　　　　 　　　生存率　　チロシンキナーゼ１、　ＮＩＨ３Ｔ３　ｎｅｏ／ｄｈｆｒ　　 　　３．６±０．６＊２、ＮＩＨ３Ｔ３　ｎｅｏ／ｄｈｆｒ４００　　８゜３± １．０　　　　　＊３゜）ＩＥＲ２−３２，０±０．４　　　　　１．０４、　 ＨＥＲ２−３，、、２７，５±２．７　　　　　６．７３５、　ＨＥＲ２−３， 。。　　　　　　４８，４±１．４　　　　　３２．４８６、　ＨＥＩ７２−３ ．ｏｏ５８．７±１．３　　　　　３９．６１？、　ＢＴ−２０１，６±０．３ 　　　　　　＜０．１８、ＭＣＦ７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２ ．５土０．３　　　　　　　　　　　０．２６９、　ＭＤＡ−ＭＢ−３６１２６ ，８土６．６　　　　　１０．６５１０、　ＭＤＡ−ＶＢ−１７５−■　　　　 ３１．２＝４．４　　　　　０．９１１、３に−ＢＲ−３５６，４±５．５　　 　　　３１．０１２、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，６４，２二９．３　　　　　　　 　　　　＜０．１＊測定せず 生存率はＴＮＦ−αの細胞毒性単位、１．ＯＸ］Ｏ’／ｌｌｌ７！について求め た。乳がん細胞系はＡＴＣＣがら得、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、 １００Ｕ／ｘｃベニ７リンおよび１００ｕ９／ｘＱスオレブトマインンを補充し たＤＭＥＭ中に維持した。

第１ａ図および表１に記載したようにＨＥ　Ｒ２レセプタ一発現が段階的に増幅 されるのに並行してＴＮＦ−α耐性が増大している。

形質転換による表現型を持たない一次形質転換体（ＨＥ　Ｒ２−３）においては 耐性が殆ど増大しなかった。しかしながら、ＮＤＡ−ＭＢ−１７５−■細胞がｐ １８５系統を高めたが、ＮＩＨ３Ｔ３ｎｅｏ／ｄｈｆｒに比較して、形質転換さ れた細胞系であるＨ　Ｅ　Ｒ２３−ｏｏ、ＨＥ　Ｒ２−３４００−ｉおよびＨＥ 　Ｒ２３−８ｏは段階的にＴＮＦ−ａ仲介細胞毒性に対する感受性の減少を示し た。ＮＤＡ−ＭＢ−１７５−■細胞はＴ　Ｎ　Ｆ−α感受性のＢＴ−２０および ＭＣＦ７細胞系に比べてｐ１８５発現が高められていた（第１ａ図および表１） 。ｐ１８５発現の相関性（表１）において、ＨＥ　Ｒ２−３ｔｏｏとＨＥ　Ｒ２ −３、、。

における感受性の差（Ｔ　Ｎ　Ｆ−α濃度Ｉ　Ｘ　１０’Ｕ／−で２７．５％： ４８．４％）はＨＥＲ２３−ｏｏとＨＥＲ２３−ｏｏとの差（生存率の比が４８ ．４％：５８．７％）よりも大きい（第１ａ図および表１参照）。Ｎ　Ｉ　Ｈ３ Ｔ　３　ｎｅｏ／ｄｈｆｒとＨＥＲ２３ｉｏｏとの活性化マクロファージに対す る感受性を比較した場合にも同様の結果が得られた（第１ｂ図）。これらのデー タはＨＥＲ２の発現の増幅がＴＮＦ−αに対する耐性を誘発し、また、これが宿 主における重要な初期保護機構を成す、活性化マクロファージに対する耐性と相 関関係にあることを示している。対照プラスミド（ｐＣＶ　Ｎ　）の細胞系ＮＩ Ｈ３Ｔ　３　ｎｅｏ／　ｄｈｆｒｎｏｏ中における増幅ではＴＮＦ−αに対する 耐性が増大されなかった（表１）。このことは遺伝子のトランスフェクションま たは遺伝子増幅のいずれも、それ自身が細胞のＴＮＦ−αに対する感受性になん ら影響を及ぼすものでないことを示している。

高濃度のｐ１８５を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞系がＴＮＦ−αまたはマクロファ ージにより誘導される細胞毒性に対して耐性を示すとの観察は、このことが腫瘍 の進展を導く機構の１つであることを暗示している。この可能性を試験するため に、６個の乳がん細胞系をＨＥＲ２の増幅およびＴＮＦ−αを介する細胞毒性に 対する感受性に関してスクリーニングした。その結果（表１）、ＴＮＦ−αにょ る増殖阻害に対する感受性は、ＢＴ−２０，ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１お よび５Ｋ−ＢＲ−３のインビトロでの自己りん酸化アッセイで測定したＨＥＲ２ 関連チ関連チロシンキナ−４及現例することが分かった。しかしながら、ＭＤＡ −ＭＢ−■細胞のｐ１８５発現はＴＮＦ−α感受性のＢＴ−２０およびＭＣＦ７ 細胞系のそれより高いが、２個のＴＮＦ−α耐性孔がん細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ− ■およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）におけるＨＥＲ２発現の増幅はＨＥＲ２−３対 照に比較して証明し得る程ではなかった（表１）。これらの結果は一次乳がんお よび腫瘍誘導細胞系中でのＨＥＲ２増幅頻度に関する先の報告と一致しており、 ＴＮＦ−α耐性を導き得る他の細胞機構の存在を暗示しいている。

実験結果はまた、ＥＧＦレセプターの過剰発現、およびＳｒｅ腫瘍遺伝子による 細胞の形質転換がＴ　Ｎ　Ｆ−α耐性と相関関係にあるこＨＥ　Ｒ２３＝ｏｏ中 で、ＴＮＦ−ａレセプターがＮＩＨ３Ｔ３ｎｅｏ／ｄｈｆｒにおける場合と逆に 変化している否がを調べるために、これらの細胞系の１２５Ｉ−標識ＴＮＦ−α との結合を比較した。第２図はＴＮＦ−αレセプター結合アッセイを示す。置換 曲線は＋２５Ｉ−ＴＮＦ−ａのＮ　Ｉ　Ｈ３Ｔ　３　ｎｅｏ／ｄｈｆｒおよびＨ Ｅ　Ｒ２３８ｏｏに対する結合を示している。競合結合アッセイを行った。簡単 に述べると、２．０Ｘ１０’の細胞懸濁液を終審量０，５ｄで１０％ウシ胎児血 清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地中でインキユベーションした。

種々のａ度の非標識ＴＮＦ−ａに）存在下、”５１−ＴＮＦ−ａ（ｏ。

２　Ｘ　１０　”ｃｐｍ）の細胞への結合を飽和平衡条件下、４℃で測定した。

各データの測定点は３回の測定の平均値である。−夜インキユベーションした後 、細胞をインキュベーションバッファーで２回洗浄し、細胞に結合した放射能を 測定した。結果は非特異的結合〈全結合の１０％であった。

これらの結果はＮ　Ｉ　Ｈ３Ｔ　３ｎｅｏ／ｄｈｒｒに比べて、ＨＥＲ２−３、 ｏｏでは全特異結合の増大が２−３倍であることを示している（第２図）。しか も、ＨＥＲ２３ｅ。。に対する置換曲線はＮＩＨ３Ｔ３ｎｅｏ／ｄｈｆｒのそれ に比較してより低い親和性の方向に移行している（第２図）。

抗ＨＥ　Ｒ２モノクロ一ナル抗体の生産５匹の雌性Ｂａ１ｂ／ｃマウスをＨＥＲ ２増幅ＮＩＨ３Ｔ３細胞で２週間免疫した。最初４回はマウスあたり約１０’細 胞を注射した。

Ｐ　Ｂ　Ｓ　（０，５＋ｆり中の細胞を第Ｏ１２，５および７週目に腹腔的投与 した。第５．６回の注射には全タンパク質濃度約７００μｙ／　ｘ（１の、小麦 胚芽アグルチニンで部分精製したメンプラン製品を用いた。

各マウスに１００μｇを第９および１３３週目腹腔的投与した。最後の注射は融 合の３日前に精製物質を用いて静脈内投与で行った。

様々な時刻に得たマウス血液を、全細胞リゼイトを用いる放射性免疫沈降法によ り試験した。抗体力価が最高である３匹のマウスを殺し、肺臓をミノシェル（Ｍ ｉｓｈｅｌｌ）およびンイギ（Ｓｈｉｉｇｉ）、Ｓ　ｅｖｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　　ダブり二一・ エイチ・フリーマン・アンド・ゴーポレイション（Ｗ、　Ｈ、Ｆ　ｒｅｅｍａｎ ＆　Ｃｏ、　）、サン・フランシスコ（Ｓ　ａｎ　Ｆ　ｒａｎｃｉｓｃｏ）、３ ５７〜３６３頁（１９８Ｏ）の方法に従ってマウス骨髄腫細胞系Ｘ６３−Ａｇ３ ．６５３と融合させた。ただし、細胞を密度約２Ｘ１０’細胞／ウエルで９６ウ エルのマイクロタータープレートで培養した。また／”ｔイブミルノド細胞をヒ ボキサンチンーアミノブテリンーチミシン（ＨＡＴ）ではなくヒボキサンチン− アゾセリンを用いて選択した。

ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡおよび放射性免疫沈降法によりＨＥＲ２レセプ ターに特異的な抗体の存在に関して試験した。

ＥＬＩＳＡのためには、ＰＢＳ中３．５μ９／ｉ（のＨＥＲ２レセプター（小麦 胚芽アグルチニンカラムで精製）をイムロン■マイクロタイタープレートに４° Ｃで一夜または室温で２時間吸着させた。次０でプレートを、０．０５％Ｔｗｅ ｅｎ２０含有りん酸緩衝化食塩水（ＰＢ　５−ＴＷ２０）で洗浄し、結合してい ない抗原を除去した。次いで、ウェルあたり２００μＱのＰＢＳ−ＴＷ２０中２ ０中ン血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）２００μρ中、室温で１時間インキュベー トして残存する結合部位を遮断した。上記のごとくにしてプレートを洗浄し、ハ イブリドーマ上清１００μｇを各ウェルに加えて室温で１時間インキュベートし た。再度プレートを洗浄し、適当に希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼと結 合したヤギ抗−マウス免疫グロブリン約１００μＱを各ウェルに加えた。室温で １時間プレートをインキュベートした後、上記同様に洗浄した。基質として０− フェニレンジアミンンを加え、室温で１５−２０分間インキコベートした後、２ 　、５　Ｍ　Ｈ２Ｓ　Ｏ４で反応を止めた。次いで４９２ｎｍにおける各ウェル の吸光度を測定した。

放射性免疫沈降のために、第１に小麦胚芽精製ＨＥＲ２レセプター沈澱を以下の 方法で自己りん酸化した。２０ｍＭ　　Ｈｅｐｅｓ、０．１％ｔｒｉｔｏｎおよ び１０％グリセリンバッファー（ＨＴＧ）中でそれぞれ、以下の終濃度に希釈し たキナーゼ溶液を調製した。０．１８ｍＣ１／ｄ　７Ｐ”−ＡＴＰ（アマーンヤ ム）、３．４ｍＭ　ＭｇＣｌ２−０．２ｍＭＭｎＣＣｔ、１０μＭＡＴＰ、総タ ンパク濃度３５μｙ／ｘ（ｌの部分精製ＨＥＲ２゜反応混合物を室温で３０分間 インキュベー７ｇンした。

次いでキナーゼ反応混合物５０μａに／％イブリドーマ上清５０μｇを加え、室 温で１時間インキュベーションした。ヤキ抗マウスＩｇＧプレコートプロティン ＡセファロースＣ１４Ｂ　　５０μｇをセファロース濃度８０ＩＩ９／１１Ｑで 各試料に加え、室温で１時間インキュベーションした。得られた免疫複合体を遠 心管中で、ＨＴＧバッファーで２回、最後にＰＢＳ中０．２％デオキシコレート 、０，２％Ｔ　ｗｅｅｅｎで遠心し、遠心の合間に吸引することにより洗浄した 。還元用試料バ・ノファーを各試料に加え、試料を９５℃で２．５分間加熱し、 遠心して不溶性物質を除去し、還元された免疫複合体をＳＤＳ含有７．５％ポリ アクリルアミドゲルに負荷した。ゲルを定常電流３０ａｍｐで展開し、終了後の ゲルからオートラジオグラフィーを得た。

全ウェル上清の約５％がＥＬＩＳＡおよび／または放射性免疫沈降反応において ＨＥ　Ｒ２レセプターと反応した。最初の５％（約１００）の内、幾つかのハイ ブリッドは低親和性抗体を産生ずるものであり、他は不安定で抗体分泌が停止し 、結果的に合計１０の高親和性の安定なＨＥＲ２特異抗体産生細胞系が得られた 。これらを制限希釈法オイ（Ｏｉ、Ｖ、Ｔ、）およびヘルツエンベルブ（Ｈｅｒ ｚｅｎｂｅｒｇ。

Ｌ、Ａ、）、”Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｈｙｂｒ ｉｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ″、３５１−３７２頁、ミツシェル（Ｍｉｓｈｅｌ ｌ）およびシイギ（Ｓ　ｈｉｉｇｉ）編、タフりニー・エイチ・フリーマン・ア ンド・ゴーポレイション（Ｗ、　Ｈ、Ｆ　ｒｅｅｍａｎ＆　Ｃｏ、　）、サン・ フランシスコ（Ｓ　ａｎ　Ｆ　ｒａｎｃｉｓｃｏ）、（１９８０）でエキスバン ドし、クローニングした。クローン化ノーイブリドーマ細胞を、腹水腫を発現さ せるようにブリスタン？？で初回抗原刺激を受けたマウスに注射すると大量の特 異的モノクローナル抗体が産生された。次いで腹水を採取しプロティンＡセファ ロースカラムを用いて精製した。

抗体のスクリーニング 次いで、１０個のモノクローナル抗体１０の高親和性モノクローナル抗体抗−形 質転換または抗−腫瘍細胞活性に関して多くの分析法でスクリーニングした。モ ノクローナル抗体を、乳がんから導かれ、増幅されたＨＥＲ２遺伝子を含有し、 ＨＥＲ２ｐ１８５チロシンキナーゼを過剰に産生するヒト腫瘍細胞系、ＳＫ　　 ＢＲ３に対する増殖阻害活性に基づいて選択した。最初のスクリーニングにはノ ・イブリドーマ細胞系の馴らし培地（その中で細胞を数日間培養し、細胞が産生 じた抗体、および細胞から分泌されるあらゆるものを含有する培地）を用いた。

Ｓ　Ｋ　Ｂ　Ｒ，３細胞を２０，０００細胞／　３５　ｔｉｎ皿の割合で平板培 養した。対照として、ハイブリドーマ親細胞系（抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体 以外のあらゆるものを産生ずる）から得た馴らし培地、または抗ＨＥＲ２モノク ローナル抗体を加えた。６日後、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを用いて５ＫＢＲ３ 細胞の全数を電気的に計数した。細胞をＦ−１２、および１０％ウシ胎児血清、 グルタミン、およびペニシリンストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭの１＝１ 混合物中で増殖させた。プレートあたりの容量は２　ＭＱ／　３５　ａｍ皿であ った。

３５ｘｍ皿あたり骨髄唾馴らし培地０．２ｆｆｆｆを加えた。各対照または抗Ｈ ＥＲ２ＭＡｂを２回分析し、２回の計数値の平均を求めた。

調査の結果を第３図に示す。モノクローナル抗体４Ｄ５は著しく乳がん細胞系５ ＫＢＲ３の増殖を阻害した。他の抗ＨＥＲ２抗体の増殖阻害活性は有意であるが 低い（例、ＭＡｂ、３Ｅ８および３Ｈ４）。他の抗ＨＥＲ２抗体（記載せず）は 増殖を阻害しなかった。

ハイブリドーマ馴らし培地ではなく精製抗体を用いた繰り返し実験で第３図の結 果を確認した。第４図は無関係なモノクローナル（抗ＨＢＶ）およびモノクロー ナル抗体４Ｄ５（抗ＨＥＲ２）の１０％ウシ胎児血清中における５ＫＢＲ３細胞 系の増殖に及ぼす影響を比較して示した用量応答曲線である。

ＨＥＲ２レセプターのダウン制御 ５ＫＢＲ３細胞をメチオニン不含培地中、１００μＣｉ”Ｓ−メチオニンで１２ 時間パルス標識した。無関係な抗体（抗Ｂ型肝炎表面抗原）または抗ＨＥＲ２Ｍ Ａｂ（４Ｄ５）を５μ９／ｘ（ｌで細胞に加えた。１１時間後、細胞を溶解し、 ＨＥＲ２ｐ１８５免疫沈降物とタンパク質を７．５％アクリルアミドゲル、次い でオートラジオグラフィーで分析した。５ＫＢＲ３細胞由来の３５８−メチオニ ン標識ＨＥＲ２ｐ１８５はＨＥＲ２濃度がＭＡｂ４Ｄ５によるダウン制御を受け たことを示していた。

乳がん細胞のモノクローナル抗体およびＴＮＦ−αによる処理５ＫＢＲ３乳がん 細胞を濃度４Ｘ］Ｏ’細胞／ウエルでマイクロタイタープレートに接種し、２時 間付着させた。次いで、細胞を種ｋ（Ｑ濃度、０．ｏ５．０．５まタハ５．０　 ｕ９７ＩＱテ抗ＨＥＲ２モ／７０−ナル抗体（ＭＡｂ）４Ｄ５または無関係なア イソタイプ適合物（抗ｒＨｕｌ　Ｆ　Ｎ　−７ＭＡｂ）で４時間処理した後、ｒ ＨｕＴＮＦ−ａを１００．１，０００または１０．　ＯＯＯＴＪ／＊Ｑで加えた 。７２時間インキニベーションした後、細胞の単一層をクリスタルバイオレット 染色し、対照（未処理）細胞と比較して相対生存率（ＲＰＶ）を求めた。

各処理群に６回の繰り返し実験を行った。結果を第５および６図に示す。これら の図はＨＥＲ２レセプターを過剰に発現する細胞を、レセプターの細胞外ドメイ ンに対する抗体と一緒にインキュベーションすると、ＴＮＦ−αの細胞毒性作用 に対する感受性が誘導されることを示している。乳がん細胞ＭＤＡ、ＭＢ　　１ ７５に対する同等の処理で同様の結果を得た（第７図）。ヒト胎児肺線維芽細胞 （Ｗ■−３８）のＭＡｂによる処理では、予測されるような増殖阻害もＴＮＦ− αに対する感受性の誘導も得られなかった。

ＨＥＲ２ｐ１８５を過剰に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞のモノクロ−ナル抗体およ びＴＮＦ−αによる処理ＮＩＨ３Ｔ３　ＨＥＲ２３４ｏｏ細胞を上記５Ｋ−ＢＲ ３細胞に関する記載のごとく、種々の濃度の抗ＨＥＲ２ＭＡｂで処理した。

ＭＡｂ４Ｄ５に関する結果を第８図に示す。ＨＥＲ２レセプターを過剰に発現す る乳がん細胞系以外の細胞の増殖はＨＥＲ２レセプターに対する抗体により阻害 され、これらの抗体の存在下でＴＮＦ−αに対する感受性が誘導されることを示 唆する結果を得た。

ＨＥ　Ｒ２発現プラスミド（ＮＩＨ３Ｔ３．ｏＯ）またはｎｅｏ−ＤＨＦＲベク ターのいずれかで形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞を０．１−りん酸緩衝化食塩 水中１０６細胞でｎｕ／ｎｕ（無胸腺）マウスに皮下投与した。０、ｌおよび５ 日日、さらに以後４日日毎に無関係な抗体、またはＩ　ｇＧ　２　Ａサブクラス の抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体のいずれかを用！１００μｇ（ＰＢＳ中０．１ ｆｆＣ）を腹腔内注射した。

腫瘍の生成およびサイズを１力月の処置期間中、監視した。

表２ 生存動物の３１日日日 腫瘍数／　平均種瘍サイズ： 群（＃）　　　細胞系 −処置　　　　動物数　−一ヨ良さＸ幅（ｍｍ’）１　　　）ＩＥＲ２（３Ｔ３ ．、、Ｏ）　　無関係なＭＡｂ　　　６／６　　　　　４０１（抗Ｂ型肝炎 ウィルス） ２　　　ＨＥＲ２（３Ｔ３４ｏｏ）　　２Ｈ１１抗−ＨＥＲ２２／６　　　　１ ３９３　　　）ＩＥＲ２（３Ｔ３．。。）３Ｅ８　　抗−ＨＥｌ？２　０／６　 　　　　　　０４　　　ｎｅｏ／ＤＨＦＲ−−０／６　　　　　　　０表２は２ Ｈ１１，ＭＡｂがいくらかの抗腫瘍活性を有すること（腫瘍細胞系ＳＫ　　ＢＨ ３に対してスクリーニングした場合、ＭＡｂ２Ｈ１１の増殖阻害特性はごく僅か である）、および実験期間中を通して３Ｅ８ＭＡｂが１００％の腫瘍増殖阻害活 性を有することを示している。

本発明を、好ましいと考えられる態様について記載したが、本発明はここに開示 した態様に限定されるものではない。むしろ、本発明は特許請求の範囲に記載し た発明の思想および範囲に包含される様々に修飾された、および同等（均等）の 発明を網羅するよう意図している。発明の範囲は、そのような修飾および均等な 発明すべてを最大限広く解釈した範囲である。

１２５４−ＴＮＦ−α竹計Ｋ　　（〔ｐｒｎｌｆＦＪＦ４ｅｒ＠Ｊ　ｘ　２０ 類１４１！、数×２０ １１Ｂ　Ｍ　ｍ　Ｗ　ｉ　ｉ　ｉ墓 −へ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　−丁１［羽咋調査報告 ｍ＋６＋＋ｔｌｌ＠−＾−−””””ＰＣＴ／ＵＳ８９１０００５１−１Ｉ１１ １１１ＩＲａｌ　ＡｍｌｇａｔｎＰ　ＩＩｓ、　ｐＣＴ　／υＳ　８９１０００ ５１国際調査報告 ＬＩＳ　ａ９０００ｓ］

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＥＲ２レセプターの細胞外ドメインと特異的に結合するモノクローナル抗 体。
2. ２．ＨＥＲ２レセプター機能を阻害し得る請求項１記載のモノクローナル抗体。
3. ３．ＨＥＲ２レセプター機能の血清による活性化を阻害し得る請求項１記載のモ ノクローナル抗体。
4. ４．ネズミモノクローナル抗体である請求項１記載のモノクローナル抗体。
5. ５．ネズミーヒトハイブリッド抗体である請求項１記載のモノクローナル抗体。
6. ６．該抗体がＨＥＲ２レセプターのリガンド結合部位を特異的にブロックする請 求項１記載のそノクローナル抗体。
7. ７．ＨＥＲ２レセプターをダウン調節するものである請求項１記載のモノクロー ナル抗体。
8. ８．該抗体が補体を活性化し得るものである請求項１記載のモノクローナル抗体 。
9. ９．該抗体が抗体依存性の細胞性細胞毒性を仲介し得るものである請求項１記載 のモノクローナル抗体。
10. １０．細胞毒性部分と請求項１記載の抗体との抱合体である抗毒素。
11. １１．請求項１記載のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ。
12. １２．ＨＥＲ２レセプターの細胞外ドメインと特異的に結合する抗体に細胞を暴 露し、該抗体と該細胞との結合の程度を測定する工程からなる、腫瘍を検出する ためのアッセイ。
13. １３．該抗体がモノクローナル抗体である請求項１２記載のアッセイ。
14. １４．アッセイがＥＬＩＳＡ法である請求項１２記載のアッセイ。
15. １５．該細胞が哺乳類の体内に存在し、該抗体を放射性同位元素で標識してその 哺乳類に投与し、外的な放射能走査により該抗体と該細胞との結合の程度を測定 することからなる、請求項１２記載のアッセイ。
16. １６．患者に治療有効量のＨＥＲ２レセプター機能を阻害し得る抗体を投与する ことからなる腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
17. １７．該抗体がＨＥＲ２レセプターのリガンド結合部位を特異的にブロックする ものである請求項１６記載の方法。
18. １８．該抗体が細胞毒性部分と抱合体を形成している請求項１６記載の方法。
19. １９．該抗体が補体を活性化し得るものである請求項１６記載の方法。
20. ２０．該抗体が抗体依存性の細胞性細胞毒性を仲介し得るものである請求項１６ 記載の方法。
21. ２１．該抗体がモノクローナル抗体である請求項１６記載の方法。
22. ２２．腫瘍細胞が、ヒト乳がん、腎臓がん、胃がん、および唾液腺がんから選択 されるがんを構成する細胞、またはＨＥＲ２レセプターを発現する他の細胞型で ある請求項１６記載の方法。
23. ２３．患者に治療有効量の増殖因子レセプター機能を阻害し得る抗体を投与し、 さらに、患者に治療有効量の細胞毒性因子を投与することからなる腫瘍細胞を処 置する方法。
24. ２４．該細胞毒性因子がＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＦＮ−γ、およ びＩＬ−２からなる群から選択されるものである請求項２３記載の方法。
25. ２５．該細胞毒性因子がＴＮＦ−αである請求項２３記載の方法。
26. ２６．該抗体がオートクリン増殖系を妨害するものである請求項２３記載の方法 。
27. ２７．該抗体が増殖因子レセプターと特異的に結合するものである請求項２３記 載の方法。
28. ２８．増殖因子レセプターがＥＧＦレセプターおよびＨＥＲ２レセプターからな る群から選択されるものである請求項２７記載の方法。
29. ２９．該抗体が増殖因子と特異的に結合するものである請求項２３記載の方法。
30. ３０．該増殖因子がＥＧＦ、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βからなる群から選択さ れるものである請求項２９記載の方法。
31. ３１．該抗体がモノクローナル抗体である請求項２３記載の方法。
32. ３２．該抗体が細胞毒性部分と抱合体を形成しているものである請求項２３記載 の方法。
33. ３３．該抗体が補体を活性化し得るものである請求項２３記載の方法。
34. ３４．該抗体が抗体依存性の細胞性細胞毒性を仲介し得るものである請求項２３ 記載の方法。
35. ３５．腫瘍細胞が、ヒト乳がん、腎臓がん、胃がん、および唾液腺がんから選択 されるがんを構成する細胞、またはＨＥＲ２レセプターを発現する他の細胞型で ある請求項２３記載の方法。
36. ３６．増大したチロシンキナーゼ活性を有するレセプターおよび他のタンパク質 を分析する方法であって、（ａ）ＴＮＦ−α感受性が疑われる細胞をＴＮＦ−α に暴露し、（ｂ）ＴＮＦ−α耐性細胞を単離し、 （ｃ）単離した細胞を増大されたチロシンキナーゼ活性に関してスクリーニング し、 （ｄ）増大したチロシンキナーゼ活性を有するレセプターおよび他のタンパク質 を単離することからなる方法。
37. ３７．増殖因子レセプター依存性腫瘍を有する患者に投与するのに適した組成物 であって、 （ａ）増殖因子レセプター機能を阻害し得る抗体、および（ｂ）細胞毒性因子か らなる組成物。
38. ３８．細胞毒性因子がＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＦＮ−γ、および ＩＬ−２からなる群から選択されるものである請求項３７記載の組成物。
39. ３９．細胞毒性部分がリシンＡ鎖である請求項１０記載の抗毒素。