ES2883297T3 - Anticuerpos de función doble específicos para PD-L1 glucosilado y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Anticuerpos de función doble específicos para PD-L1 glucosilado y métodos de uso de los mismos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo quimérico o humanizado aislado que se une específicamente a PD-L1 glucosilado, en el que el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende una CDR H1 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR H2 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y una CDR H3 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o un dominio VH que comprende una CDR H1 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, una CDR H2 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una CDR H3 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio VL que comprende una CDR L1 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, una CDR L2 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y una CDR L3 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o en el que el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende una CDR H1 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, una CDR H2 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y una CDR H3 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 o un VH que comprende una CDR H1 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, una CDR H2 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una CDR H3 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y un dominio VL que comprende una CDR L1 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, una CDR L2 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y una CDR L3 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos de función doble específicos para PD-L1 glucosilado y métodos de uso de los mismos
Campos relacionados
La presente divulgación se refiere en general a los campos de biología molecular, medicina y oncología. Más particularmente, se proporcionan nuevos anticuerpos que se unen específicamente a PD-L1 glucosilado y su uso para tratar cánceres.
Antecedentes
La perpetuación de la activación de linfocitos T ha reconformado drásticamente el tratamiento de un amplio espectro de cánceres malignos. Por ejemplo, el desarrollo de ipilimumab, el primer bloqueo del punto de control aprobado por la FDA dirigido a la respuesta de linfocitos T hizo probable el tratamiento de melanoma metastásico (Hodi, F.S. et al., 2010, NEJM, 363:711 -723; Robert, C. et al., 2013, Clin. Cancer Res., 19:2232-2239; y Robert, C. et a l, 2011, NEJM, 364:2517-2526). Aunque el anticuerpo monoclonal anti-antígeno-4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) mostró resultados prometedores en el tratamiento de pacientes con melanoma, los inhibidores del punto de control de segunda generación dirigidos tanto a PD-1 como a PD-L1 han demostrado mejor actividad clínica y seguridad en ensayos clínicos en fase III (Topalian, S.L. et a l, 2012, NEJM, 366:2443-54; y Brahmer, J.R et al., 2012, NEJM, 366:2455-2465). Porque PD-L1 también posee potencial oncogénico que induce la progresión de células cancerosas (Topalian, S.L. et al., Id.; Page, D.B. et al., 2014, Ann. Rev. Med., 65:185-202). Además de su actividad de inmunosupresión, abordar la interacción de PD-1/PD-L1 proporciona eficacia doble bloqueando la inmunosupresión mediante PD-1 mientras se reduce la progresión celular mediante PD-L1 y se espera que tenga un resultado más sensible (Topalian, S.L. et al., Id.; Brahmer, J.R. et al., Id.; y Hamid, O., 2013, NEJM, 369:134-144). La solicitud internacional WO2015061668 divulga anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al dominio citoplasmático de anticuerpos contra PD-L1 y que son útiles para aplicaciones de diagnóstico, pronóstico y terapéuticas. En 2014, hubo más de 10 ensayos clínicos en curso en EE. UU. ensayando la eficacia de anticuerpos antiPD-L1 y/o antiPD-1 como agente único o en combinación (Page, D.B. et al., Id.). La FDA estadounidense ha aprobado dos anticuerpos terapéuticos antiPD-1 para el tratamiento de determinados cánceres, KEYTRUDA® (pembrolizumab) y OPDIVO® (nivolumab). Sin embargo, la función fisiopatológica y el mecanismo regulador de PD-L1 permanecen incompletamente definidos.
Reanudar la respuesta inmunitaria silenciada, particularmente los linfocitos T efectores, se ha añadido recientemente a un repertorio de opciones de tratamiento que incluyen eliminación quirúrgica, quimioterapia, radioterapia y tratamientos dirigidos. Aunque el uso de anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 (Dunn, G.P., et al., 2002, Nat. Immunol., 3:991-998; y Leach, D.R., et al., 1996, Science, 271:1734-1736) inicialmente demostró éxito en el tratamiento de melanoma metastásico, se ha demostrado que también induce una respuesta autoinmunitaria. A diferencia de los anticuerpos anti-CTLA-4, que afectan solamente a los inmunocitos, los anticuerpos antiPD-L1 y anticuerpos antiPD-1 actúan a nivel celular y en sitios de tumor para bloquear la interacción entre los linfocitos T efectores que expresan PD-1 y las células tumorales que expresan PD-L1. Esto crea un impacto doble tanto de la célula tumoral como el linfocito T, limitando de ese modo los efectos adversos y proporcionando mejor eficacia terapéutica (Okazaki, T., et al., 2013, Nature immunology, 14:1212-1218). Se necesita una mejor comprensión del mecanismo fisiopatológico subyacente a la inmunosupresión mediada por PD-L1 y el efecto oncogénico sobre células tumorales para desarrollar agentes terapéuticos más robustos dirigidos a esta ruta. Sigue habiendo una necesidad de agentes terapéuticos nuevos y más eficaces y metodologías que se dirijan satisfactoriamente a la ruta de PD-1/PD-L1 y activen las células efectoras del sistema inmunitario para atacar las células tumorales y tratar los cánceres.
Compendio
Los autores de la invención han descubierto que la glucosilación de PD-L1 (también conocido como CD274, PDCD1L1 o B7-H1) expresada en células tumorales promueve o potencia la unión a PD-1 expresado en inmunocitos efectores, tales como linfocitos T, aumentando de ese modo la supresión de la actividad de linfocitos T contra células tumorales. Los autores de la invención descubrieron además que la glucosilación de PD-L1 puede estabilizar la expresión de PD-L1 en la superficie celular, reduciendo, por tanto, la tasa de internalización y la degradación intracelular del PD-L1. Los autores de la invención han identificado anticuerpos que se unen preferentemente a polipéptido PD-L1 humano glucosilado con respecto a polipéptido PD-L1 humano aglucosilado. Como se usa en la presente memoria, dichos anticuerpos que se unen preferentemente a PD-L1 humano glucosilado se denominan «anticuerpos antiglucPD-L1." Los anticuerpos antiglucPD-L1, como se describe en la presente memoria, también tienen una funcionalidad doble porque bloquean la interacción de PD-L1/PD-1 y también promueven la internalización y la degradación intracelular de PD-L1 en células que expresan PD-L1; por tanto, estos anticuerpos se denominan anticuerpos "de función doble". Por consiguiente, se proporcionan dichos anticuerpos antiglucPD-L1 que muestran la funcionalidad doble de inhibir la unión de PD-1/PD-L1 y promover la internalización y degradación de PD-L1.
Se proporcionan además métodos de tratamiento del cáncer, particularmente cánceres cuyas células expresan o sobreexpresan PD-L1, en un sujeto que lo necesita administrando uno o más anticuerpos antiglucPD-L1. Los anticuerpos antiglucPD-L1 como se describen en la presente memoria inhiben o bloquean la interacción entre PD-1 y PD-L1 y también reducen los niveles de PD-L1 en las células tumorales, e inhiben de ese modo la inmunosupresión que resulta de la interacción de PD-1/PD-L1 y promueven la perpetuación de la actividad citotóxica de linfocitos T efectores que expresan PD-1 contra células tumorales que expresan PD-L1. Inhibiendo la interacción de PD-1/PD-L1 y reduciendo los niveles de PD-L1 glucosilado en la superficie de células tumorales, los anticuerpos antiglucPD-L1 como se describen pueden potenciar las respuestas de linfocitos T efectores y mediar la actividad antitumoral. Como se usa en la presente memoria, los términos tumor y cáncer se usan de manera intercambiable. Salvo que se indique de otro modo, "PD-L1" como se usa en la presente memoria, se refiere a la proteína, polipéptido o péptido PD-L1, particularmente PD-L1 humana (cuya secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 1); y "PD-1" se refiere a la proteína, polipéptido o péptido PD-1, particularmente PD-1 humano.
Los autores de la invención han descubierto además que PD-L1 humano está glucosilado en cuatro sitios en el dominio extracelular en las posiciones aminoacídicas N35, N192, N200 y/o N219 de la proteína PD-L1 humana, por ejemplo, como se expone en SEQ ID NO: 1. Los anticuerpos antiglucPD-L1 como se describen pueden unirse a uno o más de estos sitios y, por ejemplo, pueden no unirse a PD-L1 que tiene una mutación (por ejemplo, sustitución de glutamina en el lugar de asparagina dentro de la secuencia consenso de glicosilación) en uno de más de estos sitios de glucosilación y, por tanto, no se glucosila en esos uno o más sitios. Por consiguiente, en algunos aspectos de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 se une específicamente a uno o más motivos de glucosilación en el glucopolipéptido PD-L1 o péptidos del mismo. En algunos aspectos de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 se une a un glucopéptido PD-L1 que comprende un motivo de glucosilación y el péptido adyacente. En algunos aspectos de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 se une a una secuencia peptídica que está localizada cerca de uno o más de los motivos de glucosilación en tres dimensiones. Por consiguiente, en aspectos de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 reconoce y se une selectivamente a un epítopo conformacional de PD-L1 glucosilado. A modo de ejemplo, en determinados aspectos de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 se une a PD-L1 glucosilado con una Kd de menos de un 85 %, menos de un 80 %, menos de un 75 %, menos de un 70 %, menos de un 65 %, menos de un 60 %, menos de un 55 %, menos de un 50 %, menos de un 45 % de la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilado, pero en aspectos de esta divulgación, no más de un 5 %, 10 %, 15 %, 20 % o 25 % de la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilado, pero aún muestra la función antiPD-L1 glucosilado doble. Debe entenderse que los valores intermedios, así como iguales a los valores de Kd anteriores están incluidos. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 se une a PD-L1 glucosilado con una Kd de menos de la mitad de la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilado, pero aún muestra la función antiPD-L1 glucosilado doble. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 se une a la proteína PD-L1 glucosilada con una Kd al menos 5 veces menor que la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilado. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 se une a la proteína PD-L1 glucosilada con una Kd al menos 10 veces menor que la Kd mostrada con respecto a la proteína PD-L1 aglucosilada. En determinados aspectos de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 se une preferentemente a células que expresan el PD-L1 glucosilado WT con al menos 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces mayor frecuencia que a células que expresan PD-L1 aglucosilado como se ensaya en, por ejemplo, un ensayo de citometría de flujo celular en que las células que expresan PD-L1 WT y PD-L1 aglucosilado se mezclan y se marcan de manera diferencial, y después se ponen en contacto con un anticuerpo a ensayar marcado con un marcador detectable, por ejemplo, como se describe en el ejemplo 6 y como mide, por ejemplo, por la intensidad medida de fluorescencia (MFI) para las dos poblaciones de células cuando el anticuerpo se marca con un marcador fluorescente. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 se une selectivamente a la proteína PD-L1 glucosilada con una afinidad de 5-20 nM, 5-10 nM o 10-20 nM. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal y, más preferiblemente, un anticuerpo quimérico o humanizado o humano. Las expresiones "se une específicamente" "su une selectivamente" se usan de manera intercambiable en la presente memoria.
Los anticuerpos antiglucPD-L1 descritos en la presente memoria se unen específicamente a PD-L1 glucosilado frente a PD-L1 aglucosilado; reducen, bloquean o inhiben la unión de PD-L1 a PD-1; y promueven la internalización y degradación intracelular de PD-L1. En determinados aspectos de esta divulgación, los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble se unen a epítopos de PD-L1 que son epítopos conformacionales no lineales. Además, y sin limitarse a ninguna teoría, los anticuerpos antiglucPD-L1 se une a epítopos de PD-L1 que contienen o están próximos en la estructura tridimensional de PD-L1 a aminoácidos glucosilados; se cree que dichas regiones glucosiladas de PD-L1 están particularmente implicadas en la interacción de PD-L1/PD-1. Mediante la unión de aminoácidos epitópicos en regiones de PD-L1 que están glucosiladas, los anticuerpos antiglucPD-L1 como se describen pueden funcionar de manera eficaz enmascarando o neutralizando los sitios o regiones de unión de la proteína PD-L1 glucosilada que están implicadas en la interacción de PD-L1/PD-1 y/o en la estabilización de la expresión de PD-L1 en la superficie de células tumorales.
Los anticuerpos antiglucPD-L1 como se describen ejercen funcionalidades dobles en virtud de su unión a PD-L1 glucosilado y, por tanto, se denominan anticuerpos "de función doble" en la presente memoria. Se cree, aunque sin limitarse a ninguna teoría, que el sitio de glucosilación en el extremo N del ECD (N35) está implicado principalmente con la unión de PD-L1/PD-1, mientras que los sitios de glucosilación C terminales (N192, N200 y N219) del ECD están implicados principalmente con la estabilización de PD-L1 en membranas celulares, aunque cada una de estas regiones puede contribuir tanto a la unión de PD-L1/PD-1 como a la estabilización de PD-L1 en las membranas. Por consiguiente, los anticuerpos antiglucPD-L1 que se unen a, bloquean y/o enmascaran la glucosilación en N35 pueden inhibir la unión de PD-L1/PD-1 y los anticuerpos que se unen a, bloquean y/o enmascaran la glucosilación en N192, N200 y/o N219 promueven la internalización y degradación de PD-L1. Los anticuerpos proporcionados en la presente memoria tienen ambas funcionalidades.
En aspectos particulares se proporcionan anticuerpos monoclonales antiglucPD-L1 de función doble STM073 (que tienen una secuencia de aminoácidos del dominio Vh de SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos del dominio Vl de SEQ ID NO: 11, como también se proporciona en la tabla 3, infra) y STM108 (que tiene una secuencia de aminoácidos del dominio Vh de SEQ ID NO: 19 y una secuencia de aminoácidos del dominio Vl de SEQ ID NO: 27, como también se proporciona en la tabla 3, infra), y fragmentos de unión de los mismos específicos para PD-L1 glucosilado, así como quiméricas y humanizadas de los mismos. En un aspecto de esta divulgación, STM073 se une específicamente a un epítopo en PD-L1 correspondiente a residuos aminoacídicos que abarcan las posiciones H69, Y112, R113 y K124 de la secuencia de aminoácidos de PD-L1 humano de SEQ ID NO: 1 en la presente memoria. Este epítopo de STM073 no es contiguo dentro de la secuencia de aminoácidos y es un epítopo conformacional. En un aspecto de esta divulgación, la parte del polipéptido PD-L1 humano que abarca el epítopo del MAb STM073 tiene la secuencia VHGEEDLKVQH.......DAGVYRCMISYGGADYKRITV (SEQ ID NO: 85), en que los residuos aminoacídicos H69, Y112, R113 y K124, que comprenden el epítopo reconocido por el MAb STM073, están subrayados y los guiones entre el residuo aminoacídico histidina (H) en la posición 78 y el residuo aminoacídico ácido aspártico (D) en la posición 108 representan aminoácidos en las posiciones 79-107 de la secuencia de aminoácidos de PD-L1 humano de SEQ ID NO: 1. Se proporcionan anticuerpos que se unen al epítopo de STM073 y anticuerpos que compiten por la unión a PD-L1 con STM073.
En otro aspecto de esta divulgación, el MAb STM108 se une específicamente a un epítopo en PD-L1 correspondiente a los residuos aminoacídicos que abarcan las posiciones S80, Y81, K162 y S169 de la secuencia de aminoácidos de PD-L1 humano de SEQ ID NO: 1 en la presente memoria. Este epítopo de STM108 no es contiguo dentro de la secuencia de aminoácidos y es un epítopo conformacional. En un aspecto de esta divulgación, la parte del polipéptido PD-L1 humano que abarca el epítopo del MAb STM073 tiene la secuencia LKVQHSSYr Qr ....... EGYPKAEVIWTSs Dh Q (residuos 74-173 de SEQ ID NO: 1) en que los residuos aminoacídicos S80, Y81, K162 y S169, que comprenden el epítopo reconocido por el MAb STM108, están subrayados y los guiones entre el residuo aminoacídico arginina (R) en la posición 84 y el residuo aminoacídico ácido glutámico (E) en la posición 158 representan aminoácidos en las posiciones 85-157 de la secuencia de aminoácidos de PD-L1 humano de SEQ ID NO: 1, es decir, la proteína PD-L1 madura de los aminoácidos 19-290 de SEQ ID NO: 1. Se proporcionan anticuerpos que se unen al epítopo de STM108 y anticuerpos que compiten por la unión a PD-L1 con STM108.
El ácido nucleico (ADN) y las secuencias de aminoácidos correspondientes de los dominios variables (V) de la cadena pesada y ligera del MAb STM073 se muestran en la tabla 3 infra. La tabla 3 proporciona tanto secuencias de nucleótidos como de aminoácidos de los dominios Vh y Vl maduros (es decir, que no contienen el péptido de señal) de STM073 (SEQ ID NO: 2, 3, 10 y 11, respectivamente) y las secuencias del dominio Vh y Vl que contienen los péptidos señal (SEQ ID NO: 87, 88, 89 y 90, respectivamente). En el ADN de la cadena pesada y las secuencias del dominio V de la proteína de los dominios de la cadena pesada y ligera que contienen secuencia señal mostrados en la tabla 3, la secuencia señal aminoterminal (nucleótidos 1-58 y aminoácidos 1-19 del dominio Vh y nucleótidos 1-66 y aminoácidos 1-22 del dominio Vl, respectivamente) se representa en fuente cursiva. También se muestran en la tabla 3 las CDR del dominio V de la cadena pesada y ligera del MAb STM073, usando las definiciones de numeración tanto de Kabat como de Chothia.
En una realización, el anticuerpo antiglucPD-L1 de doble función que se une específicamente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio Vh de SEQ ID NO: 3 y un dominio Vl de SEQ ID NO: 11. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble compite por la unión específica a PD-L1 glucosilado con un anticuerpo que comprende un dominio Vh de SEQ ID NO: 3 y un dominio Vl de SEQ ID NO: 11. En una realización, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específicamente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio Vh que comprende las CDR de Chothia 1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8, respectivamente, o las CDR de Kabat 1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9, respectivamente, o una combinación de las mismas. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble compite por la unión específica a PD-L1 glucosilado con un anticuerpo que comprende un dominio Vh que comprende las CDR de Chothia 1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SeQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8, respectivamente, o las CDR de Kabat 1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9, respectivamente, o una combinación de las mismas. En una realización, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específicamente a PD-L1 comprende un dominio V l que comprende las CDR 1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble compite por la unión específica a PD-L1 glucosilado con un anticuerpo que comprende un dominio V l que comprende las CDR 1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. En una aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específicamente a PD-L1 glucosilado comprende (a) un dominio Vh que comprende las CDR de Chothia 1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8, respectivamente, o las CDR de Kabat 1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9, respectivamente, o una combinación de las mismas; y (b) un dominio Vl que comprende las CDR 1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. En aspectos de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-LI compite por la unión específica a PD-L1 glucosilado con un anticuerpo que comprende los dominios Vh y Vl descritos anteriormente y las CDR en los mismas.
En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específicamente a PD-L1 comprende un dominio Vh que es un 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 98 % o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SeQ ID NO: 3 y/o un dominio Vl que es un 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 98 % o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y que inhibe o bloquea la unión de PD-L1 glucosilado a PD-1. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específicamente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio Vh que comprende las CDR 1-3 con al menos 1, 2 o las 3 CDR que tienen al menos 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones aminoacídicas con respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8, respectivamente, o las secuencias aminoacídicas de SEQ ID NO: 5, SEQ ID n O: 7 y SEQ ID NO: 9, respectivamente, cuyo anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble bloquea la unión de PD-L1 glucosilado a PD-1. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específicamente a PD-L1 comprende un dominio V l que comprende las CDR 1 -3 con al menos 1,2 o las 3 CDR que tienen al menos 1,2, 3, 4 o 5 sustituciones aminoacídicas con respecto a secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 que se une específicamente a PD-L1 glucosilado comprende (a) un dominio Vh que comprende las CDR 1-3 con al menos 1,2 o las 3 CDR que tienen al menos 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones aminoacídicas con respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8, respectivamente, o las secuencias aminoacídicas de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9, respectivamente; y (b) un dominio Vl que comprende las CDR 1-3 teniendo al menos 1, 2 o las 3 CDR al menos 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones aminoacídicas con respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, respectivamente, cuyo anticuerpo bloquea la unión de PD-L1 glucosilado a PD-1. Preferiblemente, estos anticuerpos tienen regiones flanqueantes humanas, es decir, son formas humanizadas de STM073, y opcionalmente tienen dominios constantes humanos. También se proporcionan formas humanizadas de STM073 usando las CDR del AbM, de contacto o definidas por IMGT, con regiones flanqueantes humanas y, opcionalmente, dominios constantes humanos. Los expertos en la materia apreciarán que pueden realizarse una o más sustituciones aminoacídicas en las regiones flanqueantes y/o las CDR de un anticuerpo humanizado para mejorar la afinidad de unión.
En aspectos de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble compite por la unión específica a PD-L1 glucosilado con un anticuerpo que comprende los dominios Vh y Vl descritos anteriormente y las CDR en los mismos. En aspectos de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 se une a PD-L1 glucosilado con una Kd menor de la mitad de la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilado. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 se une a la proteína PD-L1 glucosilada con una Kd al menos 5 veces menor que la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilado. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 se une a la proteína PD-L1 glucosilada con una Kd al menos 10 veces menor que la Kd mostrada con respecto a la proteína PD-L1 aglucosilada. En un aspecto de esta divulgación, en un ensayo de unión de citometría de flujo celular como se describe en el ejemplo 6, el anticuerpo muestra unión expresada como MFI a células que expresan PD-L1 WT que es 1,5 veces, 2 veces, 3, veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces mayor que la MFI para la unión a células que expresan PD-L1 aglucosilado. En un aspecto de esta divulgación, la afinidad de unión del anticuerpo STM073 o forma humanizada o quimérica del mismo, o anticuerpo que compite por la unión con el anterior por PD-L1 glucosilado es de 5-20 nM o de 5-10 nM, incluyendo los valores inferior y superior. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo inhibe la interacción de PD-1 con PD-L1, y particularmente inhibe la interacción de PD-1 expresado por linfocitos T efectores con PD-L1, particularmente, PD-L1 glucosilado, expresado por células tumorales y también reduce los niveles de PD-L1, particularmente PD-L1 glucosilado, en la superficie de las células tumorales, particularmente, aumentado la internalización y degradación intracelular del PD-L1. La internalización del PD-L1 expresado en células tumorales después de unión por los anticuerpos antiPD-LI glucosilado proporcionados en la presente memoria es un rasgo característico beneficioso de los anticuerpos antiglucPD-L1, ya que hay menos PD-L1 glucosilado disponible en la célula tumoral para la interacción con PD-1 en los linfocitos T, aumentado de ese modo la función efectora citotóxica de los linfocitos T contra las células tumorales y reduciendo la anergia de los linfocitos T resultante de la interacción de PD-L1/PD-1.
En otro aspecto particular de esta divulgación, se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo que se une específicamente a PD-L1 glucosilado que es el anticuerpo monoclonal antiglucPD-L1 STM108. El ácido nucleico (ADN) y las secuencias de aminoácidos correspondientes de los dominios variables (V) de la cadena pesada y ligera madura (SEQ ID NO: 18, 19, 26 y 27) del MAb STM108 se muestran en la tabla 3 infra. El ADN y las secuencias de aminoácidos de la secuencia del dominio V de la cadena pesada sin procesar (es decir, las que contienen una secuencia señal en el extremo N) también se muestran en la tabla 3 (SEQ ID NO: 91 y 92) y la secuencia señal aminoterminal se representa en fuente cursiva (nucleótidos 1-57 y aminoácidos 1-19 del dominio Vh). También se muestran en la tabla 3 las CDR del dominio V de la cadena pesada y ligera del MAb STM108 de acuerdo con las definiciones de Kabat y Chothia.
En una realización, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio VH de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y un dominio VL de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 compite por la unión específica a PD-L1 glucosilado con un anticuerpo que comprende un dominio VH de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y un dominio Vl de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. En una realización, el anticuerpo antiglucPD-LI que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio Vh que comprende las CDR1-3 de Chothia que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24, respectivamente, o las CDR de Kabat 1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25, respectivamente, o una combinación de las mismas. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 compite por la unión específica a PD-L1 glucosilado con un anticuerpo que comprende un dominio Vh que comprende las CDR de Chothia 1-3 con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24, respectivamente, o las CDR de Kabat 1-3 con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25, respectivamente, o una combinación de las mismas. En una realización, el anticuerpo antiglucPD-L1 que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio V l que comprende las CDR1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32, respectivamente. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 compite por la unión específica a PD-L1 glucosilado con un anticuerpo que comprende un dominio V l que comprende las CDR 1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32, respectivamente. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende (a) un dominio Vh que comprende las CDR 1-3 de Chothia que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID n O: 22 y SEQ ID NO: 24, respectivamente, o las CDR de Kabat 1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25, respectivamente, o una combinación de las mismas; y (b) un dominio Vl que comprende las CDR 1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, SeQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32, respectivamente. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 compite por la unión específica a PD-L1 glucosilado con un anticuerpo que comprende los dominios VH y VL descritos anteriormente y las CDR en los mismas.
En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio Vh que es un 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 98 % o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y un dominio Vl que es un 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 98 % o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio Vh que comprende las CDR 1 -3 teniendo al menos 1, 2 o las 3 CDR al menos 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones aminoacídicas con respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ iD NO: 22 y SEQ ID NO: 24, respectivamente, o teniendo las CDR 1-3 las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25, respectivamente, o una combinación de las mismas. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio V l que comprende las CDR 1-3 teniendo al menos 1,2 o las 3 CDR al menos 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones aminoacídicas con respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, SEQ ID n O: 30 y SEQ ID NO: 32, respectivamente. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende (a) un dominio Vh que comprende las CDR 1 -3 teniendo al menos 1, 2 o las 3 CDR al menos 1,2, 3, 4 o 5 sustituciones aminoacídicas con respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24, respectivamente, o con respecto a las secuencias aminoacídicas de SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25, respectivamente, o una combinación de las mismas; y/b (b) un dominio Vl que comprende las CDR 1 -3 teniendo al menos 1,2 o las 3 CDR al menos 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones aminoacídicas con respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32, respectivamente.
También se proporcionan formas humanizadas de STM108 usando las CDR del AbM, de contacto o definidas por IMGT, con regiones flanqueantes humanas y, opcionalmente, dominios constantes humanos. Preferiblemente, estos anticuerpos tienen regiones flanqueantes humanas, es decir, son formas humanizadas de STM108, y opcionalmente tienen dominios constantes humanos.
En aspectos de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 compite por la unión específica a PD-L1 glucosilado con un anticuerpo que comprende los dominios Vh y Vl descritos anteriormente y las CDR en los mismos. Las formas humanizadas de STM108 pueden tener una o más sustituciones, eliminaciones o inserciones aminoacídicas en las CDR y/o regiones flanqueantes que mejoran una o más propiedades del anticuerpo, tal como afinidad por el antígeno. En aspectos de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 se une a PD-L1 glucosilado con una Kd menor de la mitad de la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilado. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 se une a la proteína PD-L1 glucosilada con una Kd al menos 5 veces menor que la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilado. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 se une a la proteína PD-L1 glucosilada con una Kd al menos 10 veces menor que la Kd mostrada con respecto a la proteína PD-L1 aglucosilada. En un aspecto de esta divulgación, en un ensayo de unión de citometría de flujo celular como se describe en el ejemplo 6, el anticuerpo muestra unión expresada como MFI a células que expresan PD-L1 WT que es 1,5 veces, 2 veces, 3, veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces mayor que la MFI para la unión a células que expresan PD-L1 aglucosilado. En un aspecto de esta divulgación, la afinidad de unión del MAb STM108, o forma quimérica o humanizada del mismo, por PD-L1 glucosilado es de 5-20 nM o de 5-10 nM, incluyendo los valores inferior y superior. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo inhibe la interacción de PD-1 con PD-L1, y particularmente interacción de PD-1 expresado por linfocitos T efectores con PD-L1, particularmente, PD-L1 glucosilado, expresado por células tumorales. El anticuerpo preferiblemente tiene regiones flanqueantes humanas y en determinadas realizaciones un dominio constante humano.
La presente divulgación también abarca un anticuerpo monoclonal antiglucPD-LI de función doble aislado, o forma quimérica o humanizada del mismo, que se une a un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos de PD-L1 humano DAGVYRCMISYGGADYKRITV (SeQ ID NO: 86), que es una parte peptídica de la secuencia de PD-L1 humano de SEQ ID NO: 1. En un aspecto de esta divulgación, el epítopo unido por el anticuerpo incluye aminoácidos no contiguos y epítopo es un epítopo conformacional. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo se une específicamente a un epítopo de PD-L1 humano correspondiente a los residuos aminoacídicos no contiguos que abarcan las posiciones Y112, R113 y S117 de la secuencia de aminoácidos de PD-L1 humano SEQ ID NO: 1 mostrado como los residuos aminoacídicos subrayados en la siguiente secuencia: DAGVYRCMISYGGADYKRITV (SEQ ID NO: 86).
En otro aspecto se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado, por ejemplo un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión del mismo, particularmente un anticuerpo humanizado o humano que se une específicamente a un epítopo dentro de una secuencia de aminoácidos seleccionada de VHGEEDLKVQH....... DAGVYRCMISYGGADYKRITV (SEQ ID NO: 85) o DAGVYRCMISYGGADYKRITV (SEQ ID NO: 86), cuya secuencia está ubicada dentro de la secuencia del polipéptido PD-L1 humano maduro de SEQ ID NO: 1. El anticuerpo preferiblemente tiene regiones flanqueantes humanas y en determinados aspectos de la divulgación un dominio constante humano. En otro aspecto se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado, por ejemplo un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión del mismo, particularmente un anticuerpo humanizado o humano que se une específicamente a un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos LKVQHSSYRQR------EGYPKAEVIWTSSDHQ, que son los aminoácidos 74 a 84 y 158 a 173 de SEQ ID NO:1. El anticuerpo preferiblemente tiene regiones flanqueantes humanas y en determinados aspectos de la divulgación un dominio constante humano
En un determinado aspecto de esta divulgación, se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 aislado, particularmente un anticuerpo monoclonal, humanizado o humano, que se une a un epítopo que comprende los residuos aminoacídicos H69, Y112, R113 y K124 de SEQ ID NO: 1. En un aspecto, se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 aislado que se une específicamente a PD-L1 humano glucosilado, de modo que cuando se une a PD-L1 humano, el anticuerpo se une a al menos uno de los siguientes residuos aminoacídicos: H69, Y112, R113 y K124 de SEQ ID NO: 1. En otro aspecto de esta divulgación, se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 aislado, particularmente un anticuerpo monoclonal, humanizado o humano, que se une a un epítopo que comprende los residuos aminoacídicos S80, Y81, K162 y S169 de SEQ ID NO: 1. En un aspecto, se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 aislado que se une específicamente a PD-L1 humano glucosilado, de modo que cuando se une a PD-L1 humano, el anticuerpo se une a al menos uno de los siguientes residuos aminoacídicos: S80, Y81, K162 y S169 de SEQ ID NO: 1.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado, particularmente un anticuerpo monoclonal, humanizado o humano, que se une específicamente a PD-L1 humano glucosilado, de modo que cuando se une a PD-L1 humano, el anticuerpo se une a al menos uno de los siguientes residuos aminoacídicos: Y112, R113 y S117 de SEQ ID NO: 1.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado, particularmente un anticuerpo monoclonal, humanizado o humano, que se une específicamente a PD-L1 humano glucosilado, de modo que cuando se une a PD-L1 humano, el anticuerpo se une a al menos un aminoácido dentro de la región de aminoácidos de V68 a V128 de SEQ ID NO: 1 o dentro de la región de aminoácidos de D108 a V128 de SEQ ID NO: 1. En un aspecto, se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado que se une específicamente a PD-L1 humano glucosilado, de modo que cuando se une a PD-L1 humano, el anticuerpo monoclonal se une al siguiente grupo de residuos aminoacídicos: H69, Y112, R113 y K124 dentro de la región de aminoácidos de V68 a V128 de SEQ iD NO: 1. En un aspecto, se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado que se une específicamente a PD-L1 humano glucosilado, de modo que cuando se une a PD-L1 humano, el anticuerpo monoclonal se une al siguiente grupo de residuos aminoacídicos: Y112, R113, S117 dentro de la región de aminoácidos de D108 a V128 de SEQ ID NO: 1.
En un aspecto, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble se une dentro de la región de L74 a R84 y/o de E158 a Q173 de SEQ ID NO:1, y preferiblemente, uno o más de los residuos S80, Y81, K162 y S169 de SEQ ID NO: 1.
En otro aspecto se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado, o un fragmento de unión del mismo, particularmente un anticuerpo monoclonal, humanizado o humano, que se une específicamente a la proteína PD-L1 humana glucosilada frente a no glucosilada, de modo que cuando se une a PD-L1, el anticuerpo se une a al menos a la región de aminoácido V68-V128 o al menos la región de aminoácidos D108-V128 de la proteína PD-L1 (SEQ ID NO: 1), o una combinación de las mismas. El anticuerpo preferiblemente tiene regiones flanqueantes humanas y en determinados aspectos de la divulgación un dominio constante humano.
En otro aspecto se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado o un fragmento de unión del mismo, que comprende (a) un dominio Vh que comprende una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SeQ ID NO: 5, SEQ iD NO: 21, SEQ iD NO: 4 o SEQ ID NO: 20; una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 22; y una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SeQ ID NO: 9, s Eq ID NO: 25, SEQ ID NO: 8 o SeQ ID NO: 24; y (b) un dominio Vl que comprende una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 28; una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 30; y una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 32. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado que tiene regiones flanqueantes humanas y, opcionalmente, un dominio constante de anticuerpo humano.
En otro aspecto se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 o 18, que codifica un dominio Vh y/o una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO: 10 o 26, que codifica un dominio Vh. Un aspecto de esta divulgación proporciona una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un dominio Vh de un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble, en el que la secuencia de nucleótidos es al menos un 90-98 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o 18. Otro aspecto de esta divulgación proporciona una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un dominio V l de un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble, en el que la secuencia de nucleótidos es al menos un 90-98 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 19 o 26. En aspectos de esta divulgación, las secuencias de nucleótidos que codifican los dominios Vh y/o Vl son un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idénticas a SEQ ID NO: 2 o 18, o SEQ ID NO: 10 o 26, respectivamente.
En determinados aspectos, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble es una IgG, IgM, IgA, un isotipo de las mismas, tal como IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG4, o un fragmento de unión a antígeno de las mismas. En otros aspectos, el anticuerpo antiglucPD-L1 es un Fab', un F(ab')2, un F(ab')3, un scFv monovalente, un scFv bivalente, un anticuerpo biespecífico, un scFv biespecífico o un anticuerpo de un solo dominio. En algunos aspectos, el anticuerpo antiglucPD-L1 es un anticuerpo quimérico, anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. En un aspecto, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble se produce de manera recombinante. En aspectos adicionales, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble se conjuga con un agente de imágenes, un agente quimioterápico, una toxina o un radionúclido.
En un aspecto, se proporciona una composición que comprende un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble (por ejemplo, un anticuerpo que se une selectiva y preferentemente a PD-L1 glucosilado con respecto a PD-L1 aglucosilado y logra la internalización y/o degradación de PD-L1 como se describe en la presente memoria) en un vehículo o medio farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto adicional se proporciona un polipéptido aislado que comprende un péptido de al menos 7 (por ejemplo, al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos contiguos de PD-L1 humano que comprende al menos un aminoácido correspondiente a la posición N35, N192, N200 o N219 dentro del dominio extracelular (ECD) de PD-L1 humano. En un aspecto de esta divulgación, el polipéptido aislado comprende un péptido de al menos 7 (por ejemplo, al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos contiguos de PD-L1 humano, que comprende al menos un aminoácido correspondiente a la posición N35, N192, N200 o N219 de PD-L1 humano, en que al menos uno de los aminoácidos correspondientes a la posición N35, N192, N200 o N219 de PD-L1 está glucosilado. En un aspecto de esta divulgación, el polipéptido aislado se fusiona o conjuga con un polipéptido inmunógeno (por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, KLH). En determinados aspectos, el polipéptido comprende además un residuo de cisteína (Cys) en su extremo amínico (N) o carboxílico (C). Por ejemplo, el polipéptido puede conjugarse con un polipéptido inmunógeno mediante un enlace disulfuro en el residuo de Cys. En un aspecto particular de esta divulgación, el péptido de PD-L1 que comprende al menos un residuo aminoacídico glucosilado en una posición correspondiente a la posición N35, N192, N200 o N219 de PD-L1 humano se usa como inmunógeno para generar anticuerpos antiglucPD-L1.
En un aspecto adicional, se proporciona una composición que comprende un polipéptido que comprende un péptido de al menos 7 (por ejemplo al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos contiguos de PD-L1 humano que comprende al menos un aminoácido correspondiente a la posición N35, N192, N200 o N219 dentro del ECD de PD-L1 humano, en el que al menos uno de dichos aminoácidos correspondientes a la posición N35, N192, N200 o N219 de PD-L1 está glucosilado, en el que el polipéptido se formula en un vehículo, diluyente, excipiente o medio farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto adicional más, se proporciona una composición inmunógena que comprende un polipéptido que comprende un fragmento peptídico de al menos 7 aminoácidos contiguos de PD-L1 humano, que comprende al menos un aminoácido correspondiente a la posición N35, N192, N200 o N219 del polipéptido PD-L1 humano, en el que al menos uno de los aminoácidos correspondientes a la posición N35, N192, N200 o N219 dentro del ECD del polipéptido PD-L1 está glucosilado, y en el que el polipéptido se formula en un vehículo, diluyente, excipiente o medio farmacéuticamente aceptable. En algunos aspectos, la composición inmunógena comprende además un adyuvante, tal como alumbre o adyuvante de Freund.
En un aspecto adicional de esta divulgación se proporciona un método para tratar a un sujeto que lo necesita, tal como un sujeto con un cáncer, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble como se describe en la presente memoria. En aspectos específicos de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 es una forma humanizada o quimérica de uno de los MAb STM073 o STM108. En otro aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble es un anticuerpo que compite por la unión a PD-L1 glucosilado con MAb STM073 o MAb STM108. En un aspecto de esta divulgación, se proporciona un método de tratamiento de un cáncer en un sujeto que lo necesita, en que el método comprende administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo como se describe en la presente memoria al sujeto. En determinados aspectos preferidos de esta divulgación, las células cancerosas son positivas para PD-L1, particularmente PD-L1 glucosilado. Las células cancerosas también pueden ser positivas para uno o más marcadores de células cancerosas distintos tales como, aunque sin limitación, EGFR. En aspectos de esta divulgación, el cáncer, enfermedad o patología a tratar en el sujeto es un cáncer de mama, cáncer pulmonar, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata, cáncer esofágico, cáncer de tráquea, cáncer de piel, cáncer cerebral, cáncer hepático, cáncer de vejiga, cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer de ovario, cáncer uterino, cáncer cervicouterino, cáncer testicular, cáncer de colon, cáncer rectal o cáncer de piel. En determinados aspectos de esta divulgación, el cáncer a tratar es un cáncer suprarrenal, un cáncer anal, un cáncer de las vías biliares, un cáncer de huesos, un tumor cerebral//del SNC en un adulto, un tumor cerebral/del SNC en un niño, un cáncer de mama en una persona, cáncer en un adolescente, cáncer en un niño, cáncer en un adulto joven, cáncer de procedencia desconocida, enfermedad de Castleman, cáncer cervicouterino, cáncer endometrial, tumor de la familia de Ewing, cáncer ocular, cáncer de la vesícula biliar, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor estromal gastrointestinal (GIST), enfermedad trofoblástica gestacional, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer renal, cáncer laríngeo o hipofaringeo, leucemia (por ejemplo linfocítica aguda en el adulto (ALL), mieloide aguda (AML), linfocítica crónica (CLL), mieloide crónica (CML), mielomonocítica crónica (CMML), leucemia infantil), cáncer pulmonar (por ejemplo no microcítico, microcítico), tumor carcinoide pulmonar, linfoma, linfoma de la piel, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, cáncer de la cavidad naval, cáncer de los senos paranasales, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no hodgkiniano, linfoma no hodgkiniano infantil, cáncer de la cavidad bucal, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer de pene, tumores de la pituitaria, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de la glándula salival, sarcoma (por ejemplo cáncer de tejidos blandos en el adulto), cáncer de piel (por ejemplo basocelular y escamocelular, melanoma, células de Merkel), cáncer del intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer del timo, cáncer tiroideo, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom o tumor de Wilms.
En determinados aspectos, el anticuerpo antiglucPD-L1 se formula en una composición farmacéuticamente aceptable. En aspectos adicionales, el anticuerpo se administra de manera sistémica o parenteral. En aspectos particulares, el anticuerpo se administra por vía intravenosa, intradérmica, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, intratecal o local. En otros aspectos, puede coadministrarse uno o más de un tipo de anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble a un sujeto que lo necesite. La coadministración de anticuerpos puede implicar la administración de un anticuerpo antes, después o simultáneamente con otro anticuerpo.
En un aspecto, se proporciona un método de tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer o tumor, particularmente un cáncer o tumor que expresa PD-L1 en el cáncer o superficie de la célula tumoral. Dicho método comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble para inhibir 0 bloquear la interacción de PD-L1 con PD-1 y evitar la inmunosupresión y promover la destrucción de las células cancerosas o tumorales mediante los linfocitos T efectores del sujeto. En aspectos de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 es una forma quimérica o humanizada de STM073 o STM108, o un anticuerpo que compite con uno o ambos de estos anticuerpos por la unión selectiva a PD-L1 glucosilado.
En algunos aspectos, los métodos comprenden administrar al menos un segundo tratamiento antineoplásico o fármaco al sujeto que está recibiendo tratamiento con un anticuerpo antiglucPD-L1. El segundo tratamiento antineoplásico puede constituir, sin limitación, un tratamiento quirúrgico, quimioterapia, radioterapia, crioterapia, hormoterapia, inmunoterapia o tratamiento con citocinas. Tampoco se pretende que el segundo fármaco antineoplásico esté limitado y podrá determinarse de manera práctica o empírica por el médico, profesional sanitario (por ejemplo, oncólogo) experto en la materia. Como apreciará un experto en la materia, la administración de al menos un segundo tratamiento antineoplásico o fármaco puede producirse antes, después o simultáneamente con la administración de un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble.
En otro aspecto se proporciona un método de determinación de si un paciente con cáncer tiene probabilidad de beneficiarse de tratamiento con (es decir, es un candidato para tratamiento con) un agente que bloquea la unión de PD-L1 con PD-1, comprendiendo el método ensayar la presencia de PD-L1 glucosilado en células derivadas de una muestra de las células cancerosas de un paciente usando un anticuerpo como se describe en la presente memoria, en el que detectar la unión del anticuerpo a las células cancerosas del paciente indica que el paciente es un candidato para tratamiento. El método puede comprender además administrar al paciente una cantidad eficaz de un agente que evita la unión de PD-L1 a PD-1 si se encuentra que las células cancerosas del sujeto son positivas para la expresión de la proteína PD-L1 glucosilada. En un aspecto de esta divulgación, el agente que evita la unión de PD-L1 a PD-1 es un anticuerpo antiglucPD-L1, preferiblemente un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble, un anticuerpo antiPD-1 o una combinación de los mismos. En un aspecto de esta divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 y/o anticuerpo antiPD-1 se administra en combinación con otro fármaco o agente terapéutico antineoplásico. En un aspecto de esta divulgación, se administra un anticuerpo antiglucPD-L1 en combinación con otro anticuerpo antiglucPD-L1, tal como se describe en la presente memoria. En un aspecto de esta divulgación, el método implica además obtener la muestra de células cancerosas del paciente.
En otro aspecto más se proporciona un método para evaluar la glucosilación, glucosilación ligada a N o N-glucosilación de la proteína PD-L1 en una muestra biológica, en que el método comprende poner en contacto la muestra que contiene PD-L1 con un anticuerpo como se describe en la presente memoria. En algunos aspectos, el método es un método o ensayo in vitro. En determinados aspectos, la muestra biológica es una muestra celular, una muestra de tejido, un líquido corporal (por ejemplo, plasma, suero, sangre, orina, esputo, linfa, líquido ascítico, líquido intraperitoneal, líquido cerebral o raquídeo y similares). En aspectos particulares de esta divulgación, la muestra es una muestra celular o una muestra celular de un tumor o cáncer obtenido de un sujeto que tiene un cáncer o tumor. Dicha muestra de células cancerosas o tumorales puede ensayarse para PD-L1 glucosilado en la superficie de la célula cancerosa o tumoral usando los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble como se describe en la presente memoria, particularmente para determinar que, si está presente PD-L1 glucosilado en las células cancerosas o tumorales del sujeto, entonces las células probablemente serían dianas apropiadas para el tratamiento con los anticuerpos antiglucPD-L1 como se describe.
En otro aspecto se proporciona un método de preparación de un anticuerpo en que el método comprende administrar a un sujeto (por ejemplo un animal) un polipéptido de acuerdo con los aspectos de la divulgación (por ejemplo un polipéptido que comprende un fragmento de al menos 7 aminoácidos contiguos de PD-L1 humano que comprende al menos un aminoácido correspondiente a la posición N35, N192, N200 o N219 de PD-L1 humano, en el que al menos uno de dichos aminoácidos correspondientes a la posición N35, N192, N200 o N219 de PD-L1 está glucosilado) y aislar el anticuerpo del sujeto. A modo de ejemplo, el animal puede ser un primate no humano, ratón, rata, conejo, cabra o un ser humano. En determinados aspectos, un método comprende además identificar las CDR del anticuerpo y humanizar las secuencias (es decir, secuencias flanqueantes) que rodean las CDR para producir un anticuerpo humanizado usando métodos y procedimientos conocidos en la técnica. En otros aspectos más, el método comprende expresar de manera recombinante el anticuerpo humanizado. Por tanto, en un aspecto adicional de esta divulgación, se proporciona un anticuerpo aislado producido por el método anterior. Por tanto, en algunos aspectos de esta divulgación, se proporciona un anticuerpo aislado que se une selectivamente a un epítopo, tal como un epítopo conformacional, de un polipéptido PD-L1 glucosilado (por ejemplo un polipéptido que comprende un fragmento de al menos 7 aminoácidos contiguos de PD-L1 humano que comprende al menos un aminoácido correspondiente a la posición N35, N192, N200 o N219 de PD-L1 humano, en el que al menos uno de dichos aminoácidos correspondiente a las posición N35, N192, N200 o N219 de PD-L1 está glucosilado) con respecto a PD-L1 aglucosilado. Otro aspecto proporciona un método para inmunizar a un sujeto para producir una respuesta inmunitaria, por ejemplo, una respuesta de anticuerpos dirigida contra un antígeno, que comprende administrar una cantidad eficaz de un polipéptido de los aspectos de la divulgación (por ejemplo, un polipéptido PD-L1 glucosilado) como antígeno inmunogénico al sujeto.
En aspectos específicos de esta divulgación, se proporcionan métodos de preparación de anticuerpos biparatópicos que tienen dos dominios de unión a antígeno diferentes que se unen cada uno a un epítopo que no solapa con el epítopo del otro dominio de unión a antígeno de PD-L1 glucosilado, y al menos un dominio de unión (y, en determinados aspectos de la divulgación, ambos dominios de unión) se une preferentemente a una forma glucosilada de PD-L1, por ejemplo, mediante unión a un epítopo que contiene uno o más de los sitios de glucosilación enumerados en la presente memoria. Estos anticuerpos pueden reticular proteínas de superficie celular promoviendo la internalización, tráfico lisosómico y degradación. Dichos anticuerpos biparatópicos pueden generarse cribando anticuerpos que se unan preferentemente a una proteína PD-L1 glucosilada con respecto a una forma aglucosilada de PD-L1 usando métodos de cribado conocidos en la técnica, identificando los anticuerpos que se unan a epítopos no solapantes de PD-L1 glucosilado, donde preferiblemente uno o ambos se unen preferentemente a la forma glucosilada de PD-L1 en comparación con la forma aglucosilada. Pueden usarse anticuerpos contra cualquiera de los epítopos que contienen glucosilación o epítopos descritos en la presente memoria a los que se unen preferentemente los anticuerpos contra PD-L1 glucosilado. Los dos dominios de unión a antígeno pueden disponerse en una molécula de anticuerpo, por ejemplo, como se describe en Dimasi et al., J. Mol. Biol., 393:672-692 (2009). En aspectos específicos de la divulgación, uno de los dominios de unión a antígeno se manipula para que esté en el formato de un Fv monocatenario que después se liga al extremo N de las cadenas pesadas y/o ligeras de un anticuerpo que tiene el otro dominio de unión a antígeno o el extremo C del dominio CH3, por ejemplo, mediante un conector peptídico.
En otro aspecto, se proporcionan conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC), en que los anticuerpos antiglucPD-L1 como se describen en la presente memoria, en particular, los que muestran actividad de internalización eficaz después de unión a PD-L1 glucosilado, se ligan químicamente a fármacos y agentes antineoplásicos para producir un conjugado de anticuerpo antiglucPD-L1 -fármaco, como se describe y ejemplifica en la presente memoria. En aspectos de la divulgación, los ADC de MAb antiglucPD-L1 son muy eficaces en destruir células tumorales o cancerosas y en tratamientos antineoplásicos para tratar a sujetos con cáncer. En aspectos de la divulgación, el componente de anticuerpo antiglucPD-L1 del ADC es un anticuerpo biespecífico, multiespecífico, biparatópico o multiparatópico, o una parte de unión a antígeno del mismo. En otros aspectos de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 se liga químicamente a un agente antimitótico, tal como un derivado de maitansina, por ejemplo, un maitansinoide tal como DM1 o DM4, o a una auristatina polimerizante de tubulina, por ejemplo, monometil auristatina E (MMAE) o monometil auristatina F (MMAF), como se describe adicionalmente en la presente memoria. En un aspecto de la divulgación, el conector al anticuerpo antiglucPD-L1 es estable en líquido extracelular, pero se escinde por catepsina una vez el ADC ha entrado en una célula tumoral o cancerosa, activando de este modo el mecanismo antimitótico de MMAE u otro fármaco de toxina. En un aspecto de la divulgación, el componente de anticuerpo del ADC es el MAb STM073 o el MAb STM108 como se describe en la presente memoria. En un aspecto de la divulgación, el ADC que contiene el MAb STM108 (STM108-ADC) se liga químicamente a MMAE mediante un conector escindible. En un aspecto particular de la divulgación, el STM108-ADC comprende una estructura en que el MAb STM108 se liga químicamente mediante residuos de cisteína en su región C a un grupo de fijación de maleimida y ácido caproico (MC), que se liga químicamente a un conector escindible por catepsina, tal como "vc" que consiste en valina (Val) y citrulina (Cit), que se fija químicamente al espaciador "PAB", es decir, ácido paraminobenzoico, que se liga químicamente a citotoxina MMAE, produciendo de este modo el ADC, denominado por su estructura de componentes STM108-MC-vc-PAB-MMAE
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente determinados aspectos de los aspectos descritos en la presente memoria sin ser limitantes. El archivo de patente o solicitud contiene al menos un dibujo ejecutado en color. La oficina proporcionará copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con uno o más dibujos en color tras petición y pago de la tasa necesaria.
FIG. 1A-1H. PD-L1 está glucosilado en células cancerosas. 1A. Expresión de proteína PD-L1 en muestras de paciente con cáncer de mama primario. Análisis de inmunoelectrotransferencia de PD-L1 en muestras representativas de paciente con cáncer de mama. 1B. Análisis de inmunoelectrotransferencia de PD-L1 en cuatro líneas celulares representativas de cáncer de mama, cuatro líneas celulares de melanoma, cuatro líneas celulares de cáncer pulmonar y tres líneas celulares de cáncer de colon. 1C. Análisis de inmunoelectrotransferencia de la expresión de PD-L1 en shCTRL y dos clones estables shPD-L1 independientes de células A431. PD-L1 se transfectó de manera transitoria en el clon sbPD-L1 n.°5. D. Tinción de glucoproteína de la proteína PD-L1 purificada con o sin tratamiento con PNGasa F. El panel teñido con azul de Coomassie represente la cantidad total de proteína PD-L1. Las bandas superiores que aparecen en los carriles 4 y 5 son de la carga de PNGasa F. (-) Ctrl, un control para ausencia de glucoproteína; (+) Ctrl, un control para glucoproteína. E. Patrón de glicosilación de proteínas PD-L1-GFP, HA-PD-L1 y PD-L1-Flag. Los lisados celulares se trataron con PNGasa F y Endo H y se analizaron por inmunoelectrotransferencia. F. PD-L1 de longitud completa marcada con GFP (WT), dominio extracelular (ECD) o dominio intracelular (ICD) se expresaron de forma transitoria en células 293T. Las células entonces se trataron con o sin 5 pg/ml de tunicamicina ™ durante una noche. La expresión proteínica de PD-L1 se examinó usando inmunoelectrotransferencia. G. Diagrama esquemático de una construcción de expresión de la proteína PD-L1 representativa como se usa en los estudios experimentales descritos en la presente memoria, que muestra la proteína PD-L1 de longitud completa y su componente dominio extracelular (ECD), dominio intracelular (ICD), péptido señal (SP), dominio transmembranario (TM). En el diagrama, se muestran en rojo cuatro sitos de N-glucosilación (motivos NXT) en el dominio ECD de PD-L1. Los números indican las posiciones de los residuos aminoacídicos en el polipéptido PD-L1. H. Análisis de inmunoelectrotransferencia del patrón de expresión proteínica de PD-L1 WT y mutantes de glucosilación (mutantes NQ) de PD-L1. El carril 14 indica PD-L1 de tipo silvestre (WT) aglucosilado tratado durante una noche con tunicamicina (TM). En las figuras, los círculos negros indican PD-L1 glucosilado y las cabezas de flecha negras indican PD-L1 aglucosilado.
FIG.2A-2G. La glucosilación estabiliza la expresión de PD-L1 y es necesaria para la inmunosupresión asociada a células cancerosas. A y B: Resultados de análisis de inmunoelectrotransferencia de la proteína PD-L1 en células 293T que expresan PD-L1-Flag. Las células se trataron con cicloheximida (CHX) 20 mM (A) y MG132 5 pM, un inhibidor del proteosoma (B), en los intervalos indicados y se analizaron por inmunoelectrotransferencia. La intensidad de la proteína PD-L1 se cuantificó usando un densitómetro. C. Análisis de inmunoelectrotransferencia de la estabilidad proteínica de PD-L1 WT y los mutantes de glucosilación de PD-L1 N35Q, N192Q, N200Q, N219Q y 4NQ determinada como se describe en (A). Detrás del resultado de análisis de inmunoelectrotransferencia: Cuantificación de la semivida proteínica de PD-L1 WT y los cuatro mutantes NQ mediante densitometría. D. Interacción de las proteínas PD-1 y PD-L1 con o sin TM o tratamiento con anticuerpo antiPD-L1. La imagen confocal muestra la proteína de fusión PD-1/Fc unida en la membrana de células 293T que expresan PD-L1 WT (paneles de tinción en la izquierda). Cuantificación de la proteína PD-1 unida en el ensayo de interacción de PD-L1/PD-1 (diagrama de la derecha). E. Afinidad de unión de PD-1 con PD-L1 WT o proteínas 4NQ. Los lisados de células 293T que expresan PD-L1 WT o 4NQ se incubaron con o sin proteína de fusión de PD-1/Fc. Las proteínas PD-L1 entonces se inmunoprecipitaron con anticuerpo antiFlag y se analizaron por inmunoelectrotransferencia. F. Coinmunoprecipitación que mide la interacción de PD-1 y PD-L1 en células 293T que expresan PD-L1 WT o 4NQ. G. Niveles de expresión de IL-2 soluble en cocultivos de linfocitos T Jurkat y células que expresan PD-L1 WT o 4NQ. Las células se pretrataron con MG132 antes de los experimentos mostrados en (D), (E) y (G). En la figura, los círculos negros indican PD-L1 glucosilado; las cabezas de flecha indican PD-L1 aglucosilado; TM: tunicamicina; * indica estadísticamente significativo por ensayo de la t de Student. Todas las barras de erros se expresan como la media ±DT de 3 experimentos independientes.
FIG. 3A-3D. Expresión de la proteína PD-L1 en células cancerosas. A. Análisis de inmunoelectrotransferencia de PD-L1 en células de cáncer pulmonar. B. Análisis de inmunoelectrotransferencia de PD-L1 en células de cáncer de colon. C. Análisis de inmunoelectrotransferencia de PD-L1 en células de cáncer de mama. D. Análisis de inmunoelectrotransferencia de PD-L1 en células de cáncer de ovario. Círculos negros = PD-L1 glucosilado; cabezas de flecha = PD-L1 aglucosilado.
FIG. 4A-4D. PD-L1 está glucosilado en células cancerosas. A. Análisis de inmunoelectrotransferencia de PD-L1 en células cancerosas usando diferentes anticuerpos antiPD-L1. Se seleccionaron cuatro líneas celulares BLBC, HCC1937, SUM149, MB-231 y BT20, y dos líneas celulares no BLBC, MB-483 y MB-474, para analizar la expresión de PD-L1 usando diferentes anticuerpos. B. Análisis de inmunoelectrotransferencia de PD-L1 en shCTRL y dos clones estables shPD-L1 independientes de células MDA-MB-231 y A431. C. Diagrama esquemático de la construcción de expresión doble para Flag-PD-L1 y ARNhc de PD-L1. D. Patrón de glicosilación de la proteína PD-L1 en células MDA-MB-231 y A431. Los lisados celulares se trataron con PNGasa F y se analizaron por inmunoelectrotransferencia. Círculo negro = PD-L1 glucosilado; cabeza de flecha = PD-L1 aglucosilado.
FIG. 5A-5E. Expresión de proteína PD-L1 glucosilada y aglucosilada. A. Análisis de inmunoelectrotransferencia de las proteínas PD-L1-Myc, PD-L1-Flag y HA-PD-L1 en células tratadas con tunicamicina (TM). B. Análisis de inmunoelectrotransferencia de las proteínas PD-L1 -GFP-WT, PD-L1 -GFP-ECD y PD-L1 -GFP-Ic D en células tratadas o no tratadas con tunicamicina (TM). C. Análisis de inmunoelectrotransferencia de las proteínas PD-L1-Myc, PD-L1-Flag, HA-PD-L1, PD-L1 -GFP-WT, PD-L1 -GFP-ECD y PD-L1-GFP-ICD en células tratadas con tunicamicina (TM). La intensidad de la proteína PD-L1 glucosilada (barras negras) o proteína PD-L1 aglucosilada (barras rojas) se determinó mediante una cuantificación de densitometría (en el gráfico de barras debajo del análisis de inmunoelectrotransferencia). D. La media de la intensidad de la proteína PD-L1 glucosilada (barras negras) o proteína PD-L1 aglucosilada (barras rojas) se obtuvo del gráfico de barras mostrado en (C) anterior. Las barras de error representan la desviación típica (DT). E. Patrón de glicosilación de la proteína PD-L1 en células HEK 293T que expresan PD-L1. Los lisados celulares se trataron con o sin PNGasa F o O-glucosidasa y se analizaron por inmunoelectrotransferencia. Círculo negro = PD-L1 glucosilado; cabeza de flecha = PD-L1 aglucosilado. La tunicamicina es un antibiótico nucleosídico que inhibe la glucosilación ligada a N de las proteínas.
FIG. 6A y 6B. Sitios de N-glucosilación de la proteína PD-L1. Una alineación de secuencias de las secuencias de aminoácidos de PD-L1 de diferentes especies. Cuatro motivos NXT, N35, N192, N200 y N219 están en recuadro y se presentan en rojo, y dos motivos no NXT, N63 y N204 se presentan en verde. Recuadro rojo = motivo NXT conservado. FIG. 6A: Secuencia consenso (SeQ ID NO: 74); Q9NZQ7 HUMANO (SEQ ID NO: 75); Q9EP73 RATÓN (SEQ ID NO: 76); D4AE25 RATA (SEQ ID NO: 77); C5NU11_BOVINO (SEQ ID NO: 78); Q4QTK1 CERDO (SEQ ID NO: 79); y F7DZ76_CABALLO (SEQ ID NO: 80). FIG.6B: Secuencia consenso (SEQ ID NO: 94); Q9NZQ7_HUMANO (SEQ ID NO: 95); Q9EP73 RATÓN (SEQ ID NO: 96); D4AE25 RATA (SEQ ID NO: 97); C5NU11_BOVINO (SEQ ID NO: 98); Q4QTK1 CERDO (SEQ ID NO: 99); y F7DZ76 CABALLO (SEQ ID NO: 100).
FIG. 7A-7H. Identificación basada en CL-EM/EM de N-glucopéptidos. Identificación basada en CL-EM/EM de N-glucopéptidos correspondientes a cada uno de los cuatro sitios de N-glucosilación, N35 (A y E), N192 (B y F), N200 (C y G) y N219 (D y H) de PD-L1 de células HEK 293. Los perfiles de CL-EM (A-D) se muestran como espectros promediados sobre un periodo de tiempo de elución (marcado en las figuras) cuando se detectó un subconjunto representativo de glucoformas. Para cada sitio de N-glucosilación, se muestra un espectro representativo de HCD EM2 (E-H) para ejemplificar su identificación basada en la detección de ion y1 (estructura peptídica tríptica que porta el GlcNAc fijado a la Asn N-glucosilada), junto con los iones b e y que definen su secuencia peptídica. Los símbolos dibujados usados para los glucanos (véase recuadro) se adecúan a la representación recomendada por el Consortium for Functional Glycomics: Hex y HexNAc adicionales se asignaron de manera tentativa como extensión lacNAc (Gal-GlcNAc) o lacdiNAc (GalNAc-GlcNAc) desde el núcleo de trimanosilo (Man3-GlcNAc2), que puede estar fucosilado centralmente o no. Las secuencias representadas en las FIG. 7E-7H se exponen en SEQ ID NO: 81-84, respectivamente.
FIG. 8A-8H. La glucosilación de PD-L1 cambia la estabilidad de la proteína y la función de inmunosupresión de PD-L1. A-B. Análisis de inmunoelectrotransferencia de la proteína PD-L1 en células HEK 293T que expresan PD-L1 -Flag. Las células tratadas con o sin tunicamicina se trataron con cicloheximida 20 mM (CHX) (A) y MG132 5 pM (B), durante los intervalos indicados (h) y se analizaron por inmunoelectrotransferencia. C. Análisis de inmunoelectrotransferencia de PD-L1 en células A431 tratadas o no tratadas con unicamicina y tratadas con cicloheximida 20 mM (CHX) durante los tiempos indicados. El panel inferior muestra una cuantificación por densitometría de la proteína PD-L1 glucosilada frente a aglucosilada. D. Diagrama esquemático de un ensayo de interacción de PD-L1/PD-1. E. Imágenes confocales que muestran las proteínas PD-L1 Wt o 4NQ localizadas en la membrana en células A431. F. Localización en la membrana de las proteínas PD-L1 WT o PD-L1 4NQ. Después de la biotinilación de las proteínas PD-L1 WT o 4NQ localizadas en la membrana, las proteínas biotiniladas se extrajeron mediante agarosa con estreptavidina. Las proteínas PD-L1 WT o 4NQ localizadas en la membrana se examinaron por inmunoelectrotransferencia. La relación de proteína PD-L1 WT o 4NQ unida a la membrana de la cuantificación por densitometría de las muestras se muestra debajo del diagrama. G. La interacción de las proteínas PD-1 y PD-L1 en células que expresan PD-L1 WT, N35Q, N192Q, N200Q, N219Q o 4NQ. Todas las barras de error se expresan como la media ±DT de 3 experimentos independientes. H. Diagrama esquemático de un ELISA diseñado para detectar la producción de IL-2 después de interacción de linfocitos T/células tumorales mediante PD-1/PD-L1, respectivamente. Los clones tumorales que expresan PD-L1 se cocultivaron con linfocitos T Jurkat que sobreexpresaban PD-1. La producción de IL-2 a partir de células Jurkat se midió usando ELISA, como se expone, por ejemplo, en los ejemplos 1,4 y 5 infra. En A-C, círculo negro = PD-L1 glucosilado; cabeza de flecha = PD-L1 aglucosilado.
FIG. 9A-9F. La glucosilación de PD-L1 es necesaria para la inmunosupresión asociada a células cancerosas. A. Citometría de flujo que mide la interacción de PD-1 unido a membrana y PD-L1 WT o la proteína mutante PD-L1 4NQ expresada en células BT549. Las células se pretrataron con MG132 antes del experimento. B. El intervalo de tiempo de las imágenes de microscopia muestra la interacción dinámica entre PD-L1 y PD-1 en el último punto temporal. Imágenes combinadas fluorescentes rojas (RFP restringido nuclear) y fluorescentes verdes (proteína PD-1/Fc marcada fluorescente verde) (20 x) de células que expresan PD-L1 WT o 4NQ. El gráfico cinético a la derecha en (B) muestra la unión cuantitativa de la proteína PD-1/Fc a la proteína PD-L1 WT o PD-L1 4NQ expresada en células BT549 en cada punto temporal horario. C. Ensayo de destrucción de células tumorales mediado por linfocitos T (TTK) que implica la proteína PD-L1 WT o 4NQ PD-L1 expresada en células BT549. Imágenes combinadas fluorescentes rojas (RFP restringido nuclear), y/o fluorescentes verdes (sustrato de caspasa 3/7 NucView™ 488) en fase representativa (10 x) de células que expresan PD-L1 WT o 4NQ, y cocultivos de linfocitos T que expresan PD-1 en presencia de sustrato de caspasa 3/7 a las 96 horas. Los linfocitos T se activaron con anticuerpo antiCD3 (100 ng/ml) e IL-2 (10 ng/ml). Las células fluorescentes verdes se contaron como células muertas. La relación cuantitativa de células muertas frente a células totales asociadas con la proteína PD-L1 WT o PD-L1 4NQ se presenta en el gráfico de barras a la derecha de las imágenes. D. Crecimiento tumoral en ratones BALB/c que portan tumores derivados de células 4T1 inyectadas que expresaban la proteína PD-L1 WT o PD-L1 4NQ mutante. El crecimiento tumoral de células 4T1-luc se mostró in vivo por imágenes de bioluminescencia usando IVIS100 (a la izquierda en D). A la derecha en D: Diagramas de recuadros que muestran el volumen del tumor y fotos que muestran el tamaño del tumor en ratones que portan tumores derivados de células 4T1 que expresan PD-L1 WT frente a proteínas PD-L1 4NQ. Los tumores se midieron y diseccionaron en el punto final. n = 8 ratones por grupo (derecha). E. Tinción con citocinas intracelulares de IFNy en poblaciones de linfocitos T CD8+ CD3+. La significación se determinó por ANOVA bidireccional, con *p < 0,05 y **p < 0,001; n = 7 ratones por grupo. * indica estadísticamente significativo por ensayo de la t de Student. Todas las barras de erros se expresan como la media ±DT de 3 experimentos independientes. F. Diagrama de recuadros que muestra el volumen del tumor en ratones que portan tumores derivados de células 4T1 que expresan proteínas PD-L1 WT (glucosiladas) tratadas con MAb STM073 ("73"), 100 pg o con IgG de control, 100 pg. Los tumores se midieron y diseccionaron en el punto final. n = 7 ratones por grupo. El tratamiento con STM073 produjo un volumen reducido del tumor.
FIG. 10A-10C. Diagrama esquemático de formas glucosiladas y aglucosiladas de la proteína PD-L1 y análisis de inmunoelectrotransferencia. A. Representación esquemática de la proteína PD-L1 glucosilada de tipo silvestre (PD-L1 WT) y cuatro variantes de la proteína PD-L1, teniendo cada una un residuo aminoacídico glucosilado y tres residuos aminoacídicos aglucosilados de los cuatro sitios de N-glucosilación de la proteína PD-L1 (N35/3NQ; N192/3NQ; N200/3NQ y N219/3NQ). Los aminoácidos indicados en negro representan residuos glucosilados; los sitios de aminoácidos mostrados en rojo están aglucosilados en las proteínas PD-L1 variantes. B. Se generaron clones estables de BT 549 que expresan las formas N35/3NQ, N192/3NQ, N200/3NQ y N219/3NQ de la proteína PD-L1. Algunos de los anticuerpos antiglucPD-L1 mostraron un mayor nivel de unión a determinadas variantes de glucosilación de PD-L1 frente a otras como se determina por análisis de inmunoelectrotransferencia, lo que demuestra que esos MAb eran específicos de sitio. Como se muestra en B, por ejemplo, el MAb STM073 reconocía y se unía a las variantes de PD-L1 N35/3NQ, N192/3NQ and N200/3NQ, lo que indica que este anticuerpo monoclonal se unía a las regiones N35, N192 y N200 de PD-L1 glucosilado. C. Muestra los resultados de una inmunoelectrotransferencia de la unión del MAb STM073 a lisados de líneas celulares de cáncer hepático.
FIG. 11. Los anticuerpos antiglucPD-L1 potencian la destrucción de células tumorales por linfocitos T. El MAb STM073 se usó en diferentes cantidades en un ensayo de citotoxicidad celular como se describe en el ejemplo 10 para evaluar la citotoxicidad de linfocitos T derivados de PBMC contra células tumorales (BT549). La FIG. 11 muestra la muerte celular de BT549 (células con RFP de PD-L1 (WT) tratadas con MAb STM073 instantáneamente. En la FIG.
11, la línea dibujada inferior (rombos naranjas rellenos) representa el control (sin linfocitos T de PBMC); los triángulos púrpura invertidos rellenos representan el control sin anticuerpo; los triángulos verdes rellenos representan 10 pg/ml del MAb STM073 usado en el ensayo; los cuadrados rojos rellenos representan 20 pg/ml del MAb STM073 usado en el ensayo; y los círculos azules rellenos representan 40 pg/ml del MAb STM073 usado en el ensayo. Como se observa de la FIG. 11, se demuestra una destrucción proporcional de la dosis de las células tumorales que portan PD-L1 a lo largo del tiempo.
FIG. 12A-12C. Ensayos de unión. Las FIG. 12A-12C muestran los resultados de un ensayo de unión como se describe en el ejemplo 10, en que se observa que el MAb STM073 (A) y el MAb STM108 (B) bloquean la unión de PD-1 a células diana BT549 que expresan PD-L1 WT de una manera dependiente de la dosis frente a los controles de ensayo, es decir, sin PD-1/Fc; sin Ab; controles de Ab de mIgG (C).
FIG. 13. Internalización de PD-L1 por anticuerpos antiglucPD-L1. La FIG. 13 muestra los resultados de una inmunoelectrotransferencia de proteína PD-L1 de células A431 cultivadas durante una noche en medio sin suero y tratadas con anticuerpo antiglucPD-Ll (10 pg) como se describe en la presente memoria durante 2 días. Se presentan exposiciones más cortas y más largas de la transferencia. Se presenta la tubulina como control. El carril indicado "73", representa el tratamiento de células A431 con el MAb STM073 y muestra niveles disminuidos de PD-L1 en las células tratadas con STM073 con respecto al tratamiento con control (carril de IgG). Los resultados apoyan la promoción o potenciación de la internalización y degradación de PD-L1 mediante anticuerpos antiglucPD-L1, tales como STM073, como se describe en la presente memoria.
FIG. 14A-14E. Visualización de internalización celular de anticuerpos antiglucPD-L1. Los MAb STM073 y STM108 se marcaron e incubaron con diferentes tipos de células cancerosas y se visualizó la internalización usando un instrumento IncuCyte ZOOM® como se describe en el ejemplo 11. FIG. 14A: Células BT 549 de tipo silvestre (carcinoma ductal humano, línea celular de cáncer de mama) incubadas con STM073; FIG. 14B: células BT 549 manipuladas molecularmente para que expresen PD-L1 WT (glucosilado) incubadas con STM073; FIG. 14C: células NCI-H226 (línea celular de cáncer pulmonar humano, mesotelioma escamocelular) incubadas con STM073; FIG.
14D: células MCF-7 (línea celular de cáncer de mama humano, adenocarcinoma) incubadas con STM073; y FIG.
14E: células BT 549 que expresan PD-L1 WT (glucosilado) incubadas con STM108.
FIG. 15A-15C. Internalización y degradación de PD-L1 después de unión por anticuerpos antiglucPD-L1. Las FIG. 15A-15C muestran los resultados de imágenes de células vivas de células que expresan PD-L1 incubadas con anticuerpo antiglucPD-LI de función doble. En las FIG. 15A-15C, el anticuerpo antiPD-L1 es el MAb STM108 conjugado con un tinte fluorescente rojo, pHrodo™ Red (éster succinimidílico (pHrodo™ Red, SE), (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Los conjugados de tinte pHrodo™ Red no son fluorescentes fuera de la célula, pero emiten fluorescencia roja brillante en fagosomas, lo que hace que sean reactivos útiles para estudios que varían de fagocitosis de biopartículas a internalización de receptor. Las células que reflejan tinción verde se teñían con LysoT racker® Green DND-26, que es un tinte verde permeable en las células que tiñe compartimentos ácidos (lisosomas) en células vivas de las que se han tomado imágenes mediante imágenes de células vivas. La FIG. 15A muestra que en un primer punto temporal (tiempo 0), STM108 se internaliza en células como se representa por la tinción intracelular roja intensa de las células indicadas por la flecha. La FIG. 15B muestra la tinción roja intracelular debilitada en las mismas células representadas en la FIG. 15A, en un momento 2 minutos después del punto temporal de la FIG. 15A. La FIG. 15C muestra la ausencia de tinción intracelular roja 4 minutos después del punto temporal de la FIG. 15A, que refleja la degradación del anticuerpo STM108 y/o el complejo de anticuerpo-antígeno dentro de las células.
FIG. 16A-16L. Internalización de PD-L1 unido por anticuerpos antiPD-L1 en células tumorales frente a linfocitos T totales. Las FIG. 16A-16L presentan imágenes de células que muestran la capacidad de los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble de internalizarse en células tumorales positivas para PD-L1, pero no en linfocitos T activados o no activados. Las FIG. 16A-16D muestran imágenes de linfocitos T totales no activados de sangre periférica después de incubación con los siguientes anticuerpos: anticuerpo IgG de ratón de control (FIG. 16A); MAb antiglucPD-L1 que no se internaliza STM004 (FIG. 16B); MAb antiglucPD-L1 de función doble STM073 (FIG. 16C); y anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble STM108 (FIG. 16D). Las FIG. 16A-16D muestran que ninguno de los anticuerpos ensayados se internalizaba en linfocitos T totales no activados. Las FIG. 16E-16H muestran imágenes de linfocitos T totales activados de sangre periférica después de incubación con los siguientes anticuerpos: anticuerpo IgG de ratón de control (FIG. 16E); STM004 que no se internaliza (FIG. 16F); STM073 de doble función (FIG. 16G); y STM108 de doble función (FIG. 16H). Para la activación de linfocitos T, los linfocitos T totales se mezclaron con microesferas, por ejemplo, microesferas superparamagnéticas inherentes, acopladas covalentemente con anticuerpos antiCD3 y antiCD28 (por ejemplo, ThermoFisher Scientific, Rochester, NY) a una relación 1:1. Las FIG. 16E-16H muestran que no se observó casi nada de internalización en linfocitos T totales activados con ninguno de los anticuerpos ensayados. Las FIG. 16I-16L muestran imágenes de células NCI-H226 (línea celular de cáncer pulmonar humano, mesotelioma escamocelular) después de incubación con los siguientes anticuerpos: anticuerpo IgG de ratón de control (FIG. 16I); anticuerpo antiglucPD-L1 que no se internaliza STM004 (FIG. 16J); MAb antiglucPD-L1 de función doble STM073 (FIG. 16K); y MAb antiglucPD-L1 de función doble STM108 (FIG. 16L) Las FIG. 16I-16L muestran que los MAb de doble función que se internalizan STM073 y STM108 se internalizaban en células NCI-H226 después de incubación con estas células, como se evidencia por la tinción intracelular roja, en comparación con el anticuerpo de control, mIgG (FIG. 16I) y con un MAb STM004 que no se internaliza.
FIG. 17A-17D. Eficacia antitumoral de un anticuerpo antiglucPD-L1-ADC. Las FIG. 17A-17D presentan los resultados de experimentos que evalúan la eficacia de ADC que comprenden el MAb antiglucPD-L1 de función doble STM108, acoplado con MMAE para producir un conjugado de anticuerpo-fármaco (STM108-ADC) como se describe en la presente memoria, la destrucción de células tumorales que expresan PD-L1 y que no expresan PD-L1 y en la reducción del volumen de tumores en ratones con tumor injertado después de inyección de animales a los que se ha provocado tumor con el STM108-ADC en comparación con animales en los que se ha provocado tumor a los que se ha inyectado controles (IgG y MAb STM108 en solitario). La FIG. 17A muestra el %de viabilidad de células tumorales MDA-MB231 (línea celular de carcinoma de mama humano) que expresan PD-L1 ("MB231") después de exposición a diferentes concentraciones (nM) de STM108-ADC (círculos negros rellenos) en comparación con el % de viabilidad de células MB231 manipuladas molecularmente para inactivar su expresión de PD-L1 ("MB231 PDL1 KO") después de exposición a diferentes concentraciones de STM108-ADC, es decir, "ADC108" (cuadrados negros rellenos). En la FIG. 17B, se usó un modelo de ratón MDA-MB231 de cáncer de mama en que a animales a los que se injertaron tumores derivados de células MB231 se trataron con IgG-MMAE de control (100 gg); o con STM108-ADC ("ADC") a 50 gg, a 100 gg o a 150 gg; o con 100 gg de MAb STM108, como se indica en el gráfico de la FIG. 17B. Se observó respuesta completa ("CR") en 3 de 5 ratones a los que se administró 100 gg de STM108-ADC y en 4 de 5 ratones a los que se administró 150 gg de STM108-ADC. La FIG. 17C muestra el % de viabilidad de células de carcinoma mamario 4T1 manipuladas molecularmente para expresar PD-L1 humano en la superficie celular ("4T1 hPDL1") después de exposición a diferentes concentraciones (nM) de STM108-ADC (círculos rojos vacíos) en comparación con el % de viabilidad de células 4T1 que no expresan de forma natural PD-L1 ("4T1") después de exposición a diferentes concentraciones de STM108-ADC, es decir, "ADC108" (cuadrados rojos vacíos). En la FIG. 17D, se usaron modelos de ratón singénico 4T1 de cáncer de mama en que a los animales (ratones Balb/c) se les injertó tumores derivados de células de carcinoma mamario 4T1 que se habían manipulado molecularmente para expresar PD-L1 o en la superficie celular ("4T1 hPD-L1"), o en que a los ratones Balb/c se les injertó tumores derivados de células de carcinoma mamario 4T1 sin transfectar que no expresan de forma natural PD-L1 en la superficie celular ("4T1"). Los animales que portaban tumores derivados de los dos tipos de células 4T1 se trataron con una IgG-MMAE de control (100 gg); o con el MAb STM108 MAb (100 gg) o con STM108-ADC (100 gg), como se indica en el gráfico de la FIG.
17D. Véase, el ejemplo 14.
Otros aspectos, rasgos característicos y ventajas de las realizaciones y aspectos descritos llegarán a ser evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y ejemplos ilustrativos.
Descripción detallada de las realizaciones y aspectos
La interacción extracelular entre la proteína del ligando 1 de muerte programada (PD-L1) expresada en células tumorales y la proteína de muerte programada 1 (PD-1) expresada en inmunocitos efectores, por ejemplo, linfocitos T, tiene un impacto notable en el escape inmunitario asociado a tumores. A pesar del éxito clínico del bloqueo del punto de control inmunitario usando anticuerpo antiPD-1 o antiPD-L1, los mecanismos reguladores y elementos estructurales subyacentes a la interacción de PD-L1 y PD-1 siguen siendo en gran medida desconocidos. De acuerdo con los hallazgos descritos en la presente memoria, se ha demostrado que la glucosilación ligada a N de PD-L1 estabiliza el ligando proteínico PD-L1 presente en células tumorales y también facilita y potencia su unión a PD-1, lo que promueve la supresión de la respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T. A la inversa, se ha descubierto que la glucosilación ligada a N aberrante o ausente, tal como procedente de desglucosilación parcial o completa del polipéptido PD-L1 expresada en células tumorales, afecta de manera adversa, por ejemplo, debilita o altera, la interacción de PD-L1/PD-1 y promueve la internalización y degradación de PD-L1 en las células tumorales, lo que, a su vez, inhibe la inmunosupresión y promueve la actividad citotóxica de los linfocitos T efectores y la destrucción de las células tumorales. Además, como la supervivencia de los pacientes cuyos tumores expresan PD-L1 altamente glucosilado es escasa, se reconoce PD-L1 glucosilado, basándose en los hallazgos de la presente memoria, como una diana terapéutica eficaz para el tratamiento del cáncer. En la presente memoria se proporcionan y describen agentes terapéuticos antineoplásicos, tales como anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble, que se unen específica y preferentemente e interactúan con PD-L1 glucosilado para alterar una interacción de PD-L1 glucosilado/PD-1 y desestabilizan el PD-L1 expresado en la superficie de células tumorales, inhibiendo de ese modo la inmunosupresión y promoviendo la función efectora de los linfocitos T contra las células tumorales para tratar el cáncer. El tratamiento de tumores con los anticuerpos antiPD-L1 glucosilado de función doble como se describe en la presente memoria ofrece efectos inhibidores de inmunosupresión potenciados con respecto a anticuerpos antiPD-L1 que no son específicos para formas glucosiladas de PD-L1. En aspectos de la divulgación, los anticuerpos antiglucPD-L1 son anticuerpos monoclonales, denominados "MAb" en la presente memoria.
En la presente memoria se proporciona anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble que se unen a epítopos en el dominio extracelular (ECD) de PD-L1 correspondientes a sitios de glucosilación, particularmente en las partes N terminal o C terminal del ECD PD-L1 o, como alternativa, que se une para bloquear o enmascarar esos sitios de glucosilación. Los aminoácidos que están glucosilados en la proteína PD-L1 están en su dominio extracelular, como se muestra en la FIG. 1G, en las posiciones 35, 192, 200 y 219 de PD-L1 como se numeran en SEQ ID NO: 1 en la presente memoria. De acuerdo con los presentes hallazgos, los anticuerpos antiglucPD-L1 descritos en la presente memoria son de funcionalidad doble porque reducen, bloquean o inhiben la unión de PD-L1 a PD-1 y también promueven la internalización y degradación de PD-L1 para reducir los niveles de PD-L1 expresado en la célula tumoral. En aspectos de la divulgación, los anticuerpos antiglucPD-L1 de funcionalidad doble como se describen se unen a epítopos conformacionales no lineales. Además, y sin el deseo de limitarse a teoría alguna, los anticuerpos antiglucPD-L1 se unen a epítopos que contienen aminoácidos o están próximos en el espacio tridimensional a aminoácidos glucosilados; se cree que dichos aminoácidos glucosilados están particularmente implicados en la interacción de PD-L1/PD-1 y también implicados en el mantenimiento del PD-L1 en la superficie de la célula tumoral. Sin limitarse a teoría alguna, las estructuras de glucano asociadas con N35 dentro del extremo N de ECD de PD-L1 glucosilado pueden comprender o contribuir a una estructura o configuración funcional de la proteína PD-L1 glucosilada que se reconoce y se une por la proteína PD-1 y que desempeña una función significativa en la interacción de PD-1/PD-L1. Mediante la unión a un epítopo que comprende el aminoácido en la posición 35, en la región N terminal del ECD de PD-L1, o un epítopo próximo a la posición 35, los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble como se describen enmascaran los sitios de unión o regiones de la proteína PD-L1 glucosilada que pueden estar particularmente implicadas en la interacción de PD-L1/PD-1. Mediante unión o, a través de unión, enmascaramiento, de los aminoácidos en la región C terminal del ECD de PD-L1 que comprende los residuos aminoacídicos glucosilados (N192, N200 y N219), los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble como se describen enmascaran de manera eficaz los sitios de unión o regiones de la proteína PD-L1 glucosilada que pueden estar particularmente implicados en la estabilización de PD-L1 en la superficie de la célula tumoral, promoviendo de ese modo la internalización y degradación de PD-L1 y reduciendo los niveles de PD-L1 en las células tumorales.
Los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble descritos en la presente memoria pueden unirse a epítopos que comprenden o enmascaran aminoácidos en las regiones tanto N como C terminales de ECD de PD-L1, particularmente los aminoácidos dentro de epítopos conformacionales no lineales provocando el enmascaramiento o la ocultación por los anticuerpos antiglucPD-L1 de esos residuos o regiones que contienen de la proteína PD-L1 que están implicados en la interacción de PD-L1/PD-1 y en la estabilización de PD-L1 en la superficie de células tumorales. Dichos anticuerpos antiglucPD-L1 inhiben o bloquean la unión de PD-L1 a PD-1 y también reducen los niveles de PD-L1 en la superficie de células tumorales de modo que están disponibles menos molécula PD-L1 para unirse a PD-1. Los anticuerpos antiglucPD-L1, cuando se proporcionan en mezclas con linfocitos T efectores y células tumorales o cancerosas que portan PD-1, promueven la destrucción de dichas células tumorales o cancerosas mediante los linfocitos T, que no se inmunosuprimen por la interacción de PD-1/PD-L1. (Véase, por ejemplo, la FIG. 11 y el ejemplo 9).
Los ejemplos descritos en la presente memoria proporcionan resultados experimentales que muestran una diferencia significativa, por ejemplo, de 2-3 veces, en la unión de PD-L1 glucosilado frente a PD-L1 aglucosilado por los anticuerpos antiglucPD-L1 como se describe en la presente memoria. En aspectos de la divulgación, los anticuerpos antiglucPD-L1 muestran una afinidad de unión por PD-L1 glucosilado en el intervalo nanomolar, por ejemplo, de aproximadamente 5-20 nM o aproximadamente 10-20 nM, con respecto a PD-L1 aglucosilado. Los ejemplos muestran además que los anticuerpos antiglucPD-L1 se internalizan por células tumorales que expresan PD-L1, pero no por linfocitos T (activados o no activados) (FIG. 16A-16L); los anticuerpos antiglucPD-L1 también reducen la viabilidad y el volumen tumoral de las células tumorales que expresan PD-L1 en un modelo de ratón que porta tumores derivados de líneas celulares tumorales (FIG. 17A-17D).
Definiciones
Como se usa en la presente memoria, el término "un/o" o "una" puede significar uno o más.
Como se usa en la presente memoria, el término "o" significa "y/o" salvo que se indique explícitamente para hacer referencia a alternativas únicamente o las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la divulgación mantiene una definición que se refiere a únicamente las alternativas "y/o".
Como se usa en la presente memoria, el término "otro" significa al menos un segundo o más.
Como se usa en la presente memoria, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la variación inherente de error para el dispositivo, el método que se emplea para determinar el valor o la variación que existe entre los sujetos de estudio.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "ligando 1 de muerte programada" o "PD-L1" se refiere a un polipéptido (los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente memoria) o cualquier PD-L1 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos, macacos cangrejeros (cyno)), perros y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), salvo que se indique de otro modo y, en determinados aspectos de la divulgación, incluyen diversas isoformas de PD-L1, polipéptidos PD-L1 relacionados, incluyendo variantes SNP de los mismos.
Una secuencia de aminoácidos ejemplar de PD-L1 humano (UniProtKB/Swiss-Prot: Q9NZQ7.1; GI: 83287884), se proporciona a continuación:
MRIFAVFIFM TYWHLLNAFT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILWDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPELP LAHPPNERTH LVILGAILLC LGVALTFIFR LRKGRMMDVK KCGIQDTNSK KQSDTHLEET (SEQ ID NO: 1). En SEQ ID NO: 1, los aminoácidos aminoterminales 1-18 constituyen la secuencia de señal de la proteína PD-L1 humana. Por consiguiente, la proteína PD-L1 madura consiste en los aminoácidos 19-290 de SEQ ID NO: 1.
Las abreviaturas para los residuos aminoacídicos que comprenden polipéptidos y péptidos descritos en la presente memoria, y sustituciones conservativas para estos residuos aminoacídicos se muestran en la tabla 1 a continuación. Un polipéptido que contiene una o más sustituciones aminoacídicas conservativas o una variante modificada conservativamente de un polipéptido descrito en la presente memoria se refiere a un polipéptido en que los aminoácidos originales o de origen natural se sustituyen con otros aminoácidos que tienen características similares, por ejemplo, carga, hidrofobicidad/hidrofilia, tamaño de cadena lateral, conformación estructural, estructura y rigidez similares, etc. Por tanto, estos cambios aminoacídicos típicamente pueden hacerse sin alterar la actividad biológica, función u otra propiedad deseada del polipéptido, tal como su afinidad o su especificidad por el antígeno. En general, sustituciones de un solo aminoácido en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica. Además, las sustituciones de aminoácidos que son similares en estructura o función tienen menor probabilidad de alterar la actividad biológica de los polipéptidos.
Tabla 1. Residuos aminoacídicos y ejemplos de sustituciones aminoacídicas conservativas
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Los términos "anticuerpo", "inmunoglobulina" e "Ig" se usan indistintamente en la presente memoria en un sentido amplio y cubren específicamente, por ejemplo, anticuerpos antiPD-L1 individuales, tales como los anticuerpos monoclonales descritos en la presente memoria (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas, neutralizantes, anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos, fragmentos peptídicos de anticuerpos que mantienen la actividad de unión a antígeno), anticuerpos antiPD-L1 aglucosilado y anticuerpos antiPD-L1 glucosilado; composiciones de anticuerpo antiPD-L1 con especificidad poliepitópica o monoepitópica, anticuerpos policlonales o monovalentes, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos o anticuerpos biparatópicos, siempre que muestren la actividad biológica deseada), formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, anticuerpos antiPD-L1 monocatenarios y fragmentos de anticuerpos antiPD-L1, como se describen a continuación. Un anticuerpo puede ser humano, humanizado, quimérico y/o madurado por afinidad. Un anticuerpo puede ser de otra especie, por ejemplo, ratón, rata, conejo, etc. El término "anticuerpo" pretende incluir un producto polipeptídico de linfocitos B dentro de la clase de inmunoglobulina de polipéptidos que puede unirse a un antígeno molecular específico. Un anticuerpo típicamente está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, n el que cada par tiene una cadena pesada (aproximadamente 50-70 kDa) y una cadena ligera (aproximadamente 25 kDa); y en el que la parte aminoterminal de las cadenas pesadas y ligeras incluye una región variable de aproximadamente 100 a aproximadamente 130 o más aminoácidos y la parte carboxiterminal de cada cadena incluye una región constante (véase, Antibody Engineering, Borrebaeck (ed.), 1995, Segunda Ed., Oxford University Press.; Kuby, 1997, Immunology, Tercera Ed., W.H. Freeman and Company, Nueva York). En aspectos específicos de la divulgación, el antígeno molecular específico unido por un anticuerpo proporcionado en la presente memoria incluye un polipéptido PD-L1, un fragmento peptídico de PD-L1 o un epítopo de PD-L1. EL polipéptido PD-L1, fragmento peptídico de PD-L1 o epítopo de PD-L1 puede estar aglucosilado o glucosilado. En un aspecto particular de la divulgación, el polipéptido PD-L1, fragmento peptídico de PD-L1 o epítopo de PD-L1 está glucosilado. Un anticuerpo o un fragmento peptídico del mismo que se une a un antígeno de PD-L1 puede identificarse, por ejemplo, por inmunoensayos, Biacore u otras técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Un anticuerpo o un fragmento del mismo se une específicamente a un antígeno de PD-L1 cuando se une a un antígeno de PD-L1 con mayor afinidad que a cualquier antígeno de reactividad cruzada como se determina usando técnicas experimentales, tales como radioinmunoensayos (RIA) y ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA). Típicamente, una reacción de unión específica o selectiva se da al menos dos veces la señal de fondo o ruido, y más típicamente más de 5-10 veces la señal de fondo o ruido. Véase, por ejemplo, Fundamental Immunology Segunda Edición, Paul, ed., 1989, Raven Press, Nueva York en las páginas 332-336 para un análisis con respecto a la especificidad de los anticuerpos.
Los anticuerpos proporcionados en la presente memoria incluyen , aunque sin limitación, anticuerpos sintéticos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos producidos de manera recombinante, anticuerpos multiespecíficos (incluyendo anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos camelizados, anticuerpos quiméricos, intracuerpos, anticuerpos antiiditípicos (anti-Id) y fragmentos funcionales (por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno tales como fragmentos de unión a PD-L1) de cualquiera de los anteriores. Un fragmento de unión se refiere a una parte de un polipéptido de cadena pesada o ligera del anticuerpo, tal como una parte peptídica, que retiene algo o toda la actividad de unión del anticuerpo del que deriva el fragmento. Ejemplos no limitantes de fragmentos funcionales (por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno tales como fragmentos de unión a PD-L1) incluyen Fv monocatenarios (scFv) (por ejemplo, incluyendo monoespecíficos, biespecíficos, biparatópicos, monovalentes (por ejemplo, con un solo dominio Vh o Vl) o bivalentes, etc.), fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos F(ab)2, fragmentos F(ab')2, Fv unidos por disulfuro (sdFv), fragmentos Fd, fragmentos Fv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y minicuerpos. En particular, los anticuerpos proporcionados en la presente memoria incluyen moléculas de inmunoglobulina y partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, por ejemplo, dominios de unión a antígeno o moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une a un antígeno de PD-L1, en particular, un antígeno de PD-L1 glucosilado, (por ejemplo, una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo antiPD-L1). Puede encontrarse una descripción de dichos fragmentos de anticuerpo en, por ejemplo, Harlow y Lane, 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York; Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, Myers (ed.), Nueva York: VCH Publisher, Inc.; Huston et al., 1993, Cell Biophysics, 22:189-224; Plückthun y Skerra, 1989, Meth. Enzymol., 178:497-515 y en Day, E.D., 1990, Advanced Immunochemistry, Segunda Ed., Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. Los anticuerpos proporcionados en la presente memoria pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), cualquier clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o cualquier subclase (por ejemplo, IgG2a e IgG2b) de molécula de inmunoglobulina. En determinados aspectos de la divulgación, los anticuerpos antiPD-L1 son completamente humanos, tales como anticuerpos antiPD-L1 monoclonales completamente humanos. En determinados aspectos de la divulgación, los anticuerpos antiPD-L1 están humanizados, tales como anticuerpos antiPD-L1 monoclonales humanizados. En determinados aspectos de la divulgación, los anticuerpos proporcionados en la presente memoria son anticuerpos IgG, o una clase (por ejemplo, IgG 1 o IgG4 humana) o subclase de los mismos, en particular, anticuerpos de la subclase IgG 1.
Una unidad de anticuerpo de cuatro cadenas es una glicoproteína heterotetramérica compuesta de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. En el caso de las IgG, el peso molecular de la unidad de anticuerpo de cuatro cadenas (sin reducir) en general es de aproximadamente 150000 dalton. Cada cadena L está unida a una cadena H mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están unidas entre sí mediante uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de la cadena H. Cada cadena H y L también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados de manera regular. En el extremo N, cada cadena H tiene un dominio variable (Vh) seguido de tres dominios constantes (Ch) para cada una de las cadenas a y y y cuatro dominios Ch para los isotipos g y £. Cada cadena L tiene en el extremo N un dominio variable (Vl) seguido de un dominio constante (Cl) en su extremo carboxílico. El dominio Vl se alinea con el dominio Vh, y el dominio Cl se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada (Cm). Se cree que residuos aminoacídicos particulares forman una superficie de contacto entre los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada. El emparejamiento de un Vh y un Vl juntos forma un único sitio de unión a antígeno (aunque determinados dominios Vh y Vl pueden unirse al antígeno independientemente del Vh o Vl compañero, respectivamente). La estructura básica de las moléculas de inmunoglobulina está comprendida por los expertos en la materia. Por ejemplo, la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos pueden encontrarse en Stites, Daniel P. et al., 1994, Basic and Clinical Immunology, 8.a edición, Appleton & Lange, Norwalk, CT, página 71 y capítulo 6.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "antígeno" o "antígeno diana" es una molécula predeterminada a la que puede unirse selectivamente un anticuerpo. Un antígeno diana puede ser un polipéptido, péptido, carbohidrato, ácido nucleico, lípido, hapteno u otro compuesto de origen natural o sintético. En aspectos de la divulgación, un antígeno diana es una molécula pequeña. En determinados aspectos de la divulgación, el antígeno diana es un polipéptido o péptido, preferiblemente un polipéptido PD-L1 glucosilado.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "fragmento de unión a antígeno", "dominio de unión a antígeno", "región de unión a antígeno" y términos similares se refieren a esa parte de un anticuerpo que incluye los residuos aminoacídicos que interactúan con un antígeno y confieren al anticuerpo como agente de unión su especificidad y afinidad por el antígeno (por ejemplo, las CDR de un anticuerpo son regiones de unión a antígeno). La región de unión a antígeno puede derivar de cualquier especie de animal, tal como roedores (por ejemplo, conejo, rata hámster) y seres humanos. En aspectos específicos de la divulgación, la región de unión a antígeno puede ser de origen humano.
Un anticuerpo "aislado" está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente celular o de tejido y/u otros componentes contaminantes de los que deriva el anticuerpo, o está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de un anticuerpo en que el anticuerpo se separa de los componentes celulares de las células de las que se aísla o produce de manera recombinante. Por tanto, un anticuerpo que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de un anticuerpo que tienen menos de aproximadamente un 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % o un 1 % (en peso seco) de proteína heteróloga (también denominada en la presente memoria "proteína contaminante"). En determinados aspectos de la divulgación, cuando el anticuerpo se produce de manera recombinante, está sustancialmente libre de medio de cultivo, por ejemplo, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente un 20 %, 15 %, 10 %, 5 % o un 1 % del volumen de la preparación de proteína. En determinados aspectos de la divulgación, cuando el anticuerpo se produce por síntesis química, está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos, por ejemplo, se separa de los precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. Por consiguiente, dichas preparaciones del anticuerpo tienen menos de aproximadamente un 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % o un 1 % (en peso seco) de precursores químicos o compuestos distintos del anticuerpo de interés. Los componentes contaminantes también pueden incluir, aunque sin limitación, materiales que interferirían con los usos terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo se purifica (1) a más de o igual a un 95 % en peso del anticuerpo, determinado por el método de Lowry (Lowry et al., 1951, J. Bio. Chem., 193: 265-275), tal como un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 %, en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de cubeta giratoria, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o tinción con plata. El anticuerpo aislado también incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Un anticuerpo aislado se prepara típicamente mediante al menos una etapa de purificación. En algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos proporcionados en la presente memoria están aislados.
Como se usa en la presente memoria, las expresiones "se une" o "unión" se refiere a una interacción entre moléculas que incluye, por ejemplo, para formar un complejo. De forma ilustrativa, dichas interacciones abarcan interacciones no covalentes, incluyendo enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, interacciones hidrófobas y/o interacciones de van der Waals. Un complejo también puede incluir la unión de dos o más moléculas mantenidas juntas mediante enlaces covalentes o no covalentes, interacciones o fuerzas. La fuerza de las interacciones no covalentes totales entre un solo sitio de unión a antígeno de un anticuerpo y su epítopo en la molécula diana (antígeno), tal como PD-L1, es la afinidad del anticuerpo o fragmento funcional por ese epítopo. La relación de asociación (kon) a disociación (koff) de un anticuerpo a un antígeno monovalente (kon/koff) es la constante de asociación Ka, que es una medida de la afinidad. El valor de Ka varía para diferentes complejos de anticuerpo y antígeno y depende tanto de kon como de koff. La constante de asociación Ka para un anticuerpo proporcionado en la presente memoria puede determinarse usando cualquier método proporcionado en la presente memoria o cualquier otro método conocido por los expertos en la materia. La afinidad en un sitio de unión no siempre refleja la fuerza verdadera de la interacción entre un anticuerpo y un antígeno. Cuando antígenos complejos que contienen múltiples determinantes antigénicos, tales como un PD-L1 glucosilado, entran en contacto con anticuerpos que contienen múltiples sitios de unión, la interacción del anticuerpo con el antígeno en un sitio aumentará la probabilidad de una interacción en un segundo sitio de unión. La fuerza de dichas múltiples interacciones entre un anticuerpo multivalente y el antígeno se denomina avidez. La avidez de un anticuerpo puede ser una mejor medida de su capacidad de unión que la afinidad de sus sitios de unión individuales. Por ejemplo, una avidez puede compensar una baja afinidad como a veces se encuentra para los anticuerpos IgM pentaméricos, que pueden tener menor afinidad que IgG, pero la avidez de IgM, resultante de su multivalencia, posibilita que se unan al antígeno de manera eficaz.
"Afinidad de unión" se refiere en general a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, una proteína de unión tal como un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). Salvo que se indique de otro modo, como se usa en la presente memoria "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno o receptor y ligando). La afinidad de una molécula de unión X por su compañero de unión Y en general puede representarse mediante la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse por método comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en la presente memoria. Los anticuerpos de baja afinidad en general se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad en general se unen al antígeno más rápido y tienden a permanecer unidos más tiempo al antígeno. Se conoce en la técnica una diversidad de métodos para medir la afinidad de unión, de los que cualquiera de ellos puede usarse con los propósitos de la presente divulgación. Aspectos ilustrativos específicos de la divulgación incluyen los siguientes: En un aspecto de la divulgación, la "Kd" o "valor de Kd" se mide por ensayos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante un ensayo de unión. La Kd puede medirse en un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA), por ejemplo, realizado con la parte Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno (Chen et al., 1999, J. Mol. Biol., 293:865-881). La Kd o valor de Kd también puede medirse usando ensayos de resonancia de plasmones superficiales (SPR) (por Biacore) usando, por ejemplo, un BIAcoreTM-2000 o un BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ), o por interferometría de biocapa (BLI) usando, por ejemplo, el sistema OctetQK384 (ForteBio, Menlo Park, CA) o por tecnología de microequilibrio en cristal de cuarzo (QCM). Una "velocidad de asociación" o "tasa de asociación" o "índice de asociación" o "kon" también puede determinarse con las mismas técnicas de resonancia de plasmones superficiales o interferometría de biocapa descritas anteriormente usando, por ejemplo, un BIAcoreTM-2000 o un BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ), o el sistema OctetQK384 (ForteBio, Menlo Park, CA).
Las expresiones "anticuerpo antiPD-L1", "un anticuerpo que se une específicamente a PD-L1" o "anticuerpo que es específico para PD-L1", "anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo de PD-L1", "un anticuerpo que se une selectivamente a PD-L1", "anticuerpos que se unen selectivamente a un epítopo de PD-L1", "un anticuerpo que se une preferentemente a PD-L1" y términos análogos se usan indistintamente en la presente memoria y se refieren a anticuerpos que pueden unirse a PD-L1, es decir, PD-L1 glucosilado o WT, con suficiente afinidad y especificidad, particularmente en comparación con PD-L1 aglucosilado o mutantes de glucosilación de PD-L1. La "unión preferente" de los anticuerpos antiglucPD-L1 como se proporciona en la presente memoria puede determinarse o definirse basándose en la cuantificación de la intensidad de fluorescencia de la unión de los anticuerpos a PD-L1, es decir, polipéptido PD-L1 glucosilado, o PD-L1 WT, o PD-L1 glucosilado expresado en células frente a un control apropiado, tal como unión a un PD-L1 aglucosilado o variante (por ejemplo, 4NQ PD-L1), o a células que expresan una forma aglucosilada o variante de PD-L1 (por ejemplo, PD-L1 4NQ), por ejemplo, células manipuladas molecularmente, líneas celulares o aislados de células tumorales, tal como se describe en la presente memoria, por ejemplo, en el ejemplo 6. La unión preferente de un anticuerpo antiglucPD-L1 como se describe a un polipéptido PD-L1 glucosilado o a una célula que expresa PD-L1 glucosilado (PD-L1 WT) se indica mediante un valor medido de intensidad de unión fluorescente (MFI), evaluado por citometría de flujo celular, de al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces o mayor, en comparación con la unión del anticuerpo a un polipéptido PD-L1 aglucosilado o mutante glucosilado o a una célula que expresa PD-L1 aglucosilado o mutante glucosilado, y en el que el anticuerpo a ensayar es directa o indirectamente detectable mediante un marcador o marca fluorescente. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo se marca directamente con un marcador fluorescente, tal como FITC. En aspectos de la divulgación, un anticuerpo antiglucPD-L1 que se une preferente o selectivamente a PD-L1 glucosilado muestra un valor de MFI de 1,5 veces a 25 veces, o de 2 veces a 20 veces, o de 3 veces a 15 veces, o de 4 veces a 8 veces, o de 2 veces a 10 veces o de 2 veces a 5 veces o más mayor que el valor de MFI del mismo anticuerpo por la unión a PD-L1 aglucosilado o una variante de glucosilación de PD-L1 como se describe en la presente memoria, por ejemplo, PD-L1 4NQ, que está aglucosilada. Se pretende que los valores de factor de intensidad de fluorescencia entre e iguales a todos los anteriores estén incluidos. En un aspecto de la divulgación, los anticuerpos antiglucPD-L1 se unen específica y preferentemente a un polipéptido PD-L1 glucosilado, tal como un antígeno de PD-L1 glucosilado, fragmento peptídico o epítopo (por ejemplo, PD-L1 glucosilado humano tal como un polipéptido PD-L1 glucosilado humano, antígeno o epítopo). Un anticuerpo que se une específicamente a PD-L1, (por ejemplo, PD-L1 humano glucosilado o de tipo silvestre) puede unirse a un dominio extracelular (ECD) o un péptido derivado del ECD de PD-L1. Un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de PD-L1 (por ejemplo, PD-L1 humano) puede tener reactividad cruzada con antígenos relacionados (por ejemplo, PD-L1 de macaco (cyno)). En un aspecto preferido de la divulgación, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de PD-L1 no reacciona de forma cruzada con otros antígenos. Un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de PD-L1 puede identificarse, por ejemplo, por ensayos de unión de inmunofluorescencia, métodos de inmunoensayo, métodos de ensayo de inmunohistoquímica, Biacore u otras técnicas conocidas por los expertos en la materia.
En otros determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo que se une a PD-L1, como se describe en la presente memoria, tiene una constante de disociación (Kd) de menos de o igual a 20 nM, 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 14 nM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 0,9 nM, 0,8 nM, 0,7 nM, 0,6 nM, 0,5 nM, 0,4 nM, 0,3 nM, 0,2 nM o 0,1 nM, y/o es mayor de o igual a 0,1 nM. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo antiPD-L1 se une a un epítopo de PD-L1 que está conservado entre proteínas de PD-L1 de diferentes especies (por ejemplo, entre PD-L1 humano y de macaco). Un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de PD-L1 cuando se une a un antígeno de PD-L1 con mayor afinidad que a cualquier antígeno de reactividad cruzada como se determina usando técnicas experimentales, tales como radioinmunoensayos (RIA) y ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA). Típicamente una reacción específica o selectiva será al menos dos veces la señal de fondo o ruido y puede ser más de 10 veces el fondo. Véase, por ejemplo, Fundamental Immunology Segunda Edición, Paul, ed., 1989, Raven Press, Nueva York en las páginas 332336 para un análisis con respecto a la especificidad de los anticuerpos. En dichos aspectos de la divulgación, el grado de unión del anticuerpo a una proteína "no diana" será menor de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a su proteína diana particular, por ejemplo, como se determina por análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RIA).
Los anticuerpos antiPD-L1 como se describen en la presente memoria incluyen anticuerpos PD-L1 glucosilado o anticuerpos antiPD-L1 de tipo silvestre, en los que la proteína PD-L1 de tipo silvestre está glucosilada, que son específicos por PD-L1 glucosilado. En algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos antiPD-L1 glicosilados se unen a un motivo de glucosilación lineal de PD-L1. En algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos antiPD-L1 glucosilados se unen a una secuencia peptídica que está ubicada cerca de uno o más de los motivos de glucosilación en tres dimensiones. En algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos antiPD-L1 glucosilados se unen selectivamente a uno o más motivos de glucosilación de PD-L1 o un péptido PD-L1 que tiene un motivo de glucosilación de PD-L1 con respecto a PD-L1 aglucosilado. En otros aspectos de la divulgación, los anticuerpos antiglucPD-L1 se unen a un epítopo lineal que comprende aminoácidos de la proteína PD-L1. En algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos antiPD-L1 glucosilados se unen selectivamente a uno o más motivos de glucosilación de PD-L1, en que los motivos de glucosilación comprenden N35, N192 N200 y/o N219 del polipéptido PD-L1 de SEQ ID NO: 1. En otros aspectos más de la divulgación, los anticuerpos antiglucPD-L1 se unen a un epítopo conformacional (no lineal) que comprende aminoácidos de la proteína PD-L1. En algunos aspectos de la divulgación, un anticuerpo antiglucPD-L1, o una parte de unión del mismo, se une a PD-L1 glucosilado con una Kd menor de al menos un 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75%, 80 %, 85 % o un 90 % de la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilada. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo antiglucPD-L1, o una parte de unión del mismo, se une a PD-L1 glucosilado con una Kd menor de un 50 % de la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilada. En algunos aspectos de la divulgación, un anticuerpo antiglucPD-L1, o una parte de unión del mismo, se une a PD-L1 glucosilado con una Kd menor de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%,, 7 %, 8 %, 9 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75%, 80 %, 85 % o un 90 % de la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilada. En aspectos adicionales, un anticuerpo antiglucPD-L1, o una parte de unión del mismo, se une a PD-L1 glucosilado con una Kd al menos 5-10 veces menor que la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilada. En un aspecto de la divulgación, un anticuerpo antiglucPD-L1, o una parte de unión del mismo, se une a PD-L1 glucosilado con una Kd al menos 10 veces menor que la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilada. En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo se une PD-L1 glucosilado con una Kd que es no más de un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9%, 10 %, 15 % o un 20 % de la Kd mostrada por la unión de PD-L1 aglucosilado. En un aspecto de la divulgación, un anticuerpo antiglucPD-L1, o parte de unión del mismo, se une a PD-L1 glucosilado con una afinidad nanomolar, tal como una afinidad de 5-20 nM o de 10-20 nM, incluyendo los valores inferiores y superiores.
En un aspecto de la divulgación, en un ensayo de unión de citometría de flujo celular como se describe en el ejemplo 6, el anticuerpo muestra unión expresada como MFI a células que expresan PD-L1 WT que es al menos o es 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces mayor que la MFI para la unión a células que expresan PD-L1 aglucosilado, y en determinados aspectos de la divulgación, es no más de 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces mayor que la MFI para la unión a células que expresan PD-L1 aglucosilado.
Como se usa en la presente memoria en referencia a un anticuerpo, la expresión "cadena pesada (H)" se refiere a una cadena polipeptídica de aproximadamente 50-70 kDa, en la que la parte aminoterminal incluye una región variable (V) (también denominada dominio V) de aproximadamente 115 a 130 o más aminoácidos y una parte carboxiterminal que incluye una región constante (C). La región constante (o dominio constante) puede ser uno de cinco tipos distintos, (por ejemplo, isotipos) denominados alfa (a), delta (5), épsilon (s), gamma (y) y mu (p), basados en la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena pesada. Las distintas cadenas pesadas difieren en tamaño: a, 5 y y contienen aproximadamente 450 aminoácidos, mientras que p y £ contienen aproximadamente 550 aminoácidos. Cuando se combinan con una cadena ligera, estos distintos tipos de cadenas pesadas dan lugar a cinco clases bien conocidas (por ejemplo, isotipos) de anticuerpos, concretamente, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, que incluyen cuatro subclases de IgG, concretamente IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4. Una cadena pesada de anticuerpo puede ser una cadena pesada de anticuerpo humano.
Como se usa en la presente memoria en referencia a un anticuerpo, la expresión "cadena ligera (L)" se refiere a una cadena polipeptídica de aproximadamente 25 kDa, en la que la parte aminoterminal incluye un dominio variable de aproximadamente 100 a aproximadamente 110 o más aminoácidos y una parte carboxiterminal que incluye una región constante. La longitud aproximada de una cadena ligera (tanto los dominios V como C) es de 211 a 217 aminoácidos. Hay dos tipos distintos de cadenas ligeras, denominadas kappa (k) y lambda (A), basados en la secuencia de aminoácidos de los dominios constantes. Las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera son bien conocidas en la técnica. Una cadena ligera de anticuerpo puede ser una cadena ligera de anticuerpo humano.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "región variable (V)" o "dominio variable (V)" se refiere a una parte de la cadena ligera (L) o pesada (H) de un polipéptido de anticuerpo que en general está ubicada en el extremo aminoterminal de la cadena L o H. El dominio V de la cadena H tiene una longitud de aproximadamente 115 a 130 aminoácidos, mientras que el dominio V de la cadena L es de aproximadamente 100 a 110 aminoácidos de longitud. Los dominios V de la cadena H y L se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. El dominio V de la cadena H puede denominarse "Vh". La región V de la cadena L puede denominarse "Vl". El término "variable" se refiere al hecho de que determinados segmentos de los dominios V difieren ampliamente en la secuencia entre diferentes anticuerpos. Mientras que el dominio V media la unión al antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular, la variabilidad no está distribuida uniformemente entre el tramo de 110 aminoácidos de los dominios V del anticuerpo. En su lugar, los dominios V consisten en tramos menos variables (por ejemplo, relativamente invariables) denominados regiones flanqueantes (FR) de aproximadamente 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de mayor variabilidad (por ejemplo, variabilidad extrema) denominadas "regiones hipervariables" o "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR) que son cada una de aproximadamente 9-12 aminoácidos de longitud. Los dominios V de las cadenas H y L del anticuerpo comprenden cada uno cuatro FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina p, conectadas mediante tres denominadas regiones hipervariables, que forman bucles que conectan y, en algunos casos forman parte de la estructura de lámina p. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en cercana proximidad mediante las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase, por ejemplo, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)). Los dominios C no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras, tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). Los dominios V difieren ampliamente en la secuencia entre diferentes clases o tipos de anticuerpos. La variabilidad en la secuencia se concentra en las CDR, que son responsables principalmente de la interacción del anticuerpo con el antígeno. En aspectos específicos de la divulgación, el dominio variable de un anticuerpo es un dominio variable humano o humanizado.
Como se usa en la presente memoria, las expresiones "región determinante de la complementariedad", "CDR", "región hipervariable", "HVR" y "HV" se usan indistintamente. Una "CDR" se refiere a una de tres regiones hipervariables (H1, H2 o H3) dentro de la región no flanqueante de la estructura lámina p de Vh del anticuerpo, o a una de tres regiones hipervariables (L1, L2 o L3) dentro de la región no flanqueante de la estructura de lámina p de Vl del anticuerpo. La expresión, cuando se usa en la presente memoria, se refiere a las regiones de un dominio V de anticuerpo de secuencia hipervariable y/o forman bucles estructuralmente definidos. En general, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables: tres (HI, H2, H3) en el dominio Vh y tres (L1, L2, L3) en el dominio Vl. Por consiguiente, las CDR típicamente son secuencias altamente variables intercaladas dentro de las secuencias de región flanqueante del dominio V. Los residuos "flanqueantes" o "FR" son aquellos residuos de la región variable que flanquean las CDR. Los residuos FR están presentes, por ejemplo, en anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos, de dominio, diacuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos biespecíficos o .biparatópicos.
Están en uso varias delineaciones de la región hipervariable y están incluidas en la presente memoria. Las regiones CDR son bien conocidas por los expertos en la materia y se han definido por, por ejemplo, Kabat como las regiones de máxima hipervariabilidad dentro de los dominios V de los anticuerpos (Kabat et al., 1977, J. Biol. Chem., 252:6609-6616; Kabat, 1978, Adv. Prot. Chem., 32:1-75). Las CDR de Kabat se basan en la variabilidad de secuencia y son las más habitualmente usadas (véase, por ejemplo, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Las secuencias de la región CDR también se han definido estructuralmente por Chothia como aquellos residuos que no forman parte de la estructural de lámina p conservada y, por tanto, pueden adoptar diferentes conformaciones (Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917). Chothia se refiere, en su lugar, a la ubicación de los bucles estructurales. El final del bucle CDR-H1 de Chothia cuando se numera usando la convención de numeración de CDR de Kabat varía entre H32 y H34 dependiendo de la longitud del bucle (esto se debe a que el esquema de numeración de Kabat sitúa las inserciones en H35A y H35B; si no están presentes ni 35A ni 35B, el bucle finaliza en 32; si solamente está presente 35A, el bucle finaliza en 33; si están presentes tanto 35A como 35B, el bucle finaliza en 34). Ambos sistemas de numeración y terminología están bien reconocidos en la técnica.
Recientemente, se ha desarrollado un sistema de numeración universal y adoptado ampliamente, ImMunoGeneTics (IMGT) Information System® (Lefranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol., 27(1 ):55-77). IMGT es un sistema de información integrado que se especializa en inmunoglobulinas (Ig), receptores de linfocitos T (TR) y el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) del ser humano y otros vertebrados. En la presente memoria, las CDR se denominan en términos tanto de secuencia de aminoácidos como de ubicación dentro de la cadena ligera o pesada. Como la "ubicación" de las CDR dentro de la estructura del dominio V de la inmunoglobulina está conservada ente especies y presente en estructuras denominadas bucles, usando sistemas de numeración que alinean las secuencias del dominio variable de acuerdo con las características estructurales, los residuos CDR y flanqueantes y se identifican fácilmente. Esta información puede usarse en el injerto y en el remplazo de residuos CDR de inmunoglobulinas de una especie en una región flanqueante aceptadora de, típicamente un anticuerpo humano. Se ha desarrollado un sistema de numeración adicional (AHon) por Honegger et al., 2001, J. Mol. Biol. 309:657-670. La correspondencia entre el sistema de numeración, incluyendo, por ejemplo, la numeración de Kabat y el sistema de numeración único IMGT, es bien conocida por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Kabat, Id.; Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917, supra; Martin, 2010, Antibody Engineering, Vol. 2, Capítulo 3, Springer Verlag; y Lefranc et al., 1999, Nuc. Acids Res., 27:209-212).
Las secuencias de la región CDR también se han definido por AbM, contacto y IMGT. Las regiones hipervariables de AbM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y se usan por el programa informático de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular's (véase, por ejemplo, Martin, Id.). Las regiones hipervariables de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas de complejos disponibles. Los residuos de cada una estas regiones hipervariables o CDR se indican a continuación.
Se ilustran delineaciones ejemplares de secuencias de la región CDR en la tabla 2 a continuación. Las posiciones de las CDR dentro de una región variable de anticuerpo canónico se han determinado por comparación de numerosas estructuras (Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948; Morea et al., 2000, Methods, 20:267-279). Como el número de residuos dentro de una región hipervariable varía en diferentes anticuerpos, residuos adicionales con respecto a las posiciones canónicas se enumeran convencionalmente con a, b, c y así sucesivamente al lado del número del residuo en el esquema de numeración de la región variable canónica (Al-Lazikani et al., Id.). Dicha nomenclatura es asimismo bien conocida por los expertos en la materia.
Tabla 2. Delineaciones ejemplares de secuencias de la región CDR
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Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones (por ejemplo, variaciones de la secuencia de aminoácidos, incluyendo cambios, adiciones y/o eliminaciones) en una o más HVR de las mismas que provoquen una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo original que no posea esa una o más alteraciones. En determinados aspectos de la divulgación, los anticuerpos madurados por afinidad tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno diana, tal como el PD-L1 glucosilado. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen mediante procedimientos conocidos en la técnica. Para revisiones, véase Hudson y Souriau, 2003, Nature Medicine 9:129-134; Hoogenboom, 2005, Nature Biotechnol., 23:1105-1116; Quiroz y Sinclair, 2010, Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51.
Un anticuerpo "quimérico" es uno en que una parte de la cadena H y/o L, por ejemplo, el dominio V, es idéntica u homóloga a una secuencia de aminoácidos correspondiente en un anticuerpo derivado de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la una o más cadenas, por ejemplo, el dominio C, es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como un fragmento de dicho anticuerpo, siempre que muestre la actividad biológica deseada (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4.816.567; y Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855).
Un anticuerpo no humano "humanizado" (por ejemplo, murino) es una forma quimérica de un anticuerpo que se refiere a una secuencia de inmunoglobulina humana (por ejemplo, anticuerpo destinatario) en que los residuos de CDR naturales se remplazan por residuos de las CDR correspondientes de una especie no humana (por ejemplo, anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas para la unión al antígeno y su interacción. En algunos casos, uno o más residuos de la región FR de la inmunoglobulina humana también pueden remplazarse por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo destinatario o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar más el funcionamiento del anticuerpo humanizado. También puede hacerse una o más modificaciones en las regiones CDR para mejorar y refinar el funcionamiento del anticuerpo humanizado, por ejemplo, en un anticuerpo madurado por afinidad. Una cadena H o L del anticuerpo humanizado puede comprender sustancialmente todo de al menos una o más regiones variables, en que todo o sustancialmente todo de las CDR corresponde a las de una inmunoglobulina no humana y todo o sustancialmente todo de las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo humanizado comprenderá al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Aunque es conocido por los expertos en la materia, pueden encontrarse más detalles, si se desea, en, por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-329; y Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596; Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 89:4285-4289; y patentes de Estados Unidos n.°: 6.800.738 (expedida el 5 de octubre 2004), 6.719.971 (expedida el 27 de septiembre de 2005), 6.639.055 (expedida el 28 de octubre de 2003), 6.407.213 (expedida el 18 de junio de 2002), y 6.054.297 (expedida el 25 de abril de 2000).
Las expresiones "anticuerpo humano" y "anticuerpo completamente humano" se usan indistintamente en la presente memoria y se refieren a un anticuerpo que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha preparado usando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos que ponen en práctica los expertos en la materia. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos pueden producirse usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo colecciones de presentación en fagos (Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581) y colecciones de presentación en levaduras (Chao et al., 2006, Nature Protocols, 1: 755-768). También están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos métodos descritos en Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77; Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147(1):86-95. Véase también van Dijk y van de Winkel, 2001, Curr. Opin. Pharmacol., 5:368-74. Los anticuerpos humanos pueden prepararse administrando un antígeno a un animal transgénico cuyos locus de Ig endógenos se han deshabilitado, por ejemplo, un ratón, y que se ha modificado genéticamente para portar genes de inmunoglobulina humana que codifican anticuerpos humanos, de mod que se generen anticuerpos humanos en respuesta a exposición antigénica (véase, por ejemplo, Jakobovits, A., 1995, Curr. Opin. Biotechnol., 6(5):561-6; Brüggemann y Taussing, 1997, Curr. Opin. Biotechnol., 8(4):455-8; y patentes de Estados Unidos n.° 6.075.181 y 6.150.584 con respecto a la tecnología XENOMOUSE™). Véase también, por ejemplo, Li et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 con respecto a anticuerpos humanos generados mediante una tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos. En aspectos específicos de la divulgación, los anticuerpos humanos comprenden una región variable y región constante de origen humano. Los anticuerpos anti-PD-L1 "completamente humanos", en determinados aspectos de la divulgación, también pueden abarcar anticuerpos que se unen a polipéptidos PD-L1 y están codificados por secuencias de nucleótidos que son variantes somáticas de origen natural de la secuencia de ácido nucleico de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En un aspecto específico de la divulgación, los anticuerpos anti-PD-L1 proporcionados en la presente memoria son anticuerpos completamente humanos. La expresión "anticuerpo completamente humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes correspondientes a secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana como se describe por Kabat et al. (véase Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación NIH n.° 91-3242). La frase "anticuerpo humano recombinante" incluye anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora; anticuerpos aislados de una colección combinatoria y recombinante de anticuerpos humanos; anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón o vaca) que es transgénico y/o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor, L. D. et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295); o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden tener regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (véase Kabat, E. A. et al., Id). En determinados aspectos de la divulgación, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de y están relacionadas con las secuencias de VH y VL de la línea germinal, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de anticuerpos de la línea germinal humana in vivo.
Como se usa en la presente memoria, el término "epítopo" es el sitio o sitios o la región o regiones en la superficie de una molécula de antígeno a la que se une una sola molécula de anticuerpo, tal como una región localizada en la superficie de un antígeno, por ejemplo, un polipéptido PD-L1 o un polipéptido PD-L1 glucosilado que puede unirse por una o más regiones de unión a antígeno de un anticuerpo anti-PD-L1 o antiglucPD-L1. Un epítopo puede ser inmunogénico y con capacidad de provocar una respuesta inmunitaria en un animal. Los epítopos no tienen que ser necesariamente inmunogénicos. Los epítopos a menudo consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales glucídicas y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede ser un epítopo lineal o un epítopo conformacional. Una región de un polipéptido que contribuye a un epítopo puede ser aminoácidos contiguos del polipéptido, que forman un epítopo lineal, o el epítopo puede estar formado por dos o más aminoácidos o regiones no contiguas del polipéptido, típicamente denominado epítopo conformacional. El epítopo puede ser o no un elemento superficial tridimensional del antígeno. En determinados aspectos de la divulgación, un epítopo de PD-L1 es un elemento superficial tridimensional de un polipéptido PD-L1. En otros aspectos de la divulgación, un epítopo de PD-L1 es un elemento lineal de un polipéptido PD-L1. En algunos aspectos de la divulgación, el epítopo de PD-L1 está glucosilado en uno o más sitios. En general, un antígeno tiene varios o muchos epítopos diferentes y puede reaccionar con muchos anticuerpos diferentes. En un aspecto particular de la divulgación, un anticuerpo antiglucPD-L1 como se describe en la presente memoria se une a un epítopo de PD-L1, especialmente PD-L1 glucosilado, que es un epítopo conformacional.
Un anticuerpo se une a "un epítopo" o "esencialmente el mismo epítopo" o "el mismo epítopo" como anticuerpo de referencia, cuando los dos anticuerpos reconocen epítopos idénticos, solapantes o adyacentes en un espacio tridimensional. Los métodos más ampliamente usados y rápidos para determinar si dos anticuerpos se unen a epítopos idénticos, solapantes o adyacentes en un espacio tridimensional son los ensayos de competición, que pueden configurarse en varios formatos diferentes, por ejemplo, usando antígeno marcado o anticuerpo marcado. En algunos ensayos, el antígeno se inmoviliza en una placa de 96 pocillos, o se expresa en una superficie celular, y se mide la capacidad de los anticuerpos sin marcar de bloquear la unión de los anticuerpos marcados al antígeno usando una señal detectable, por ejemplo, marcadores radiactivos, fluorescentes o enzimáticos. Además, el epítopo del anticuerpo puede determinarse y después compararse usando métodos conocidos en la técnica y, por ejemplo, descritos en el ejemplo 8 en la presente memoria.
El término "competir", cuando se usa en el contexto de anticuerpos anti-PD-L1 que compiten por el mismo epítopo o sitio de unión en una proteína diana PD-L1 o péptido de la misma significa competición determinada por un ensayo en que el anticuerpo en estudio evita, bloquea o inhibe la unión específica de una molécula de referencia (por ejemplo, un ligando de referencia o proteína de unión a antígeno de referencia, tal como un anticuerpo de referencia) a un antígeno común (por ejemplo, PD-L1 o un fragmento del mismo). Pueden usarse numerosos tipos de ensayos competitivos de unión para determinar si un anticuerpo de ensayo compite con un anticuerpo de referencia por la unión a PD-L1 (por ejemplo, PD-L1 humano o PD-L1 glucosilado humano). Ejemplos de ensayos que pueden emplearse incluyen radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida; inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida; ensayo de competición de tipo sándwich (véase, por ejemplo, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (véase, por ejemplo, Kirkland et al., 1986, J. Immunol.
137:3614-3619); ensayo marcado directo en fase sólida; ensayo de tipo sándwich marcado directo en fase sólida (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA marcado directo en fase sólida usando yodo marcado (marcador de I125) (véase, por ejemplo, Morel et al., 1988, Molec. Immunol.
25:7-15); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (véase, por ejemplo, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); y RIA marcado directo (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). Típicamente, dicho ensayo implica el uso de un antígeno purificado (por ejemplo, PD-L1 tal como PD-L1 humano o PD-L1 glucosilado) unido a una superficie sólida, o células que portan una proteína de unión a antígeno de ensayo sin marcar (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-L1 de ensayo) o una proteína de unión a antígeno de referencia marcada (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-L1 de referencia). La inhibición competitiva puede medirse determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o las células en presencia de una cantidad conocida de la proteína de unión a antígeno de ensayo. Habitualmente, la proteína de unión a antígeno de ensayo está presente en exceso. Los anticuerpos identificados por ensayo de competición (anticuerpos competidores) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y/o anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo unido por el anticuerpo de referencia, provocando que se produzca impedimento estérico. En la presente memoria se describen detalles adicionales con respecto a métodos para determinar la unión competitiva. Habitualmente, cuando una proteína de anticuerpo competidor está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos un 15 %, o al menos un 23 %, por ejemplo, sin limitación, un 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o 75 % o más, así como cantidades porcentuales entre las cantidades indicadas. En algún caso, la unión se inhibe en al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 % o 97 %, 98 %, 99 % o más.
Como se usa en la presente memoria, el término anticuerpo "bloqueante" o anticuerpo "antagonista" se refiere a un anticuerpo que evita, inhibe, bloquea o reduce la actividad biológica o funcional del antígeno al que se une. Los anticuerpos bloqueantes o anticuerpos antagonistas pueden evitar, inhibir, bloquear o reducir sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno. Por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L1 bloqueante puede evitar, inhibir, bloquear o reducir la interacción de unión entre PD-L1 y PD-1, evitando, bloqueando, inhibiendo o reduciendo de este modo las funciones inmunosupresoras asociadas con la interacción de PD-1/PD-L1. Los términos bloquear, inhibir y neutralizar se usan indistintamente en la presente memoria y se refieren a la capacidad de los anticuerpos anti-PD-L1 como se describe en la presente memoria de evitar o alterar de otro modo o reducir la interacción de PD-L1/PD-1.
Como se usa en la presente memoria, el término "polipéptido" o "péptido" se refiere a un polímero de aminoácidos de tres o más aminoácidos en un conjunto seriado, ligados a través de enlaces peptídicos. Los "polipéptidos" pueden ser proteínas, fragmentos proteínicos, análogos proteínicos, oligopéptidos y similares. Los aminoácidos que componen el polipéptido pueden ser derivados naturales o sintéticos. El polipéptido puede purificarse de una muestra biológica. Por ejemplo, un polipéptido o péptido PD-L1 puede estar compuesto de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos contiguos de PD-L1 humano o PD-L1 glucosilado. En algunos aspectos de la divulgación, el polipéptido tiene al menos 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280 o 285 aminoácidos contiguos de PD-L1 humano o PD-L1 glucosilado. En determinados aspectos de la divulgación, el polipéptido PD-L1 comprende al menos 5 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 10 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 15 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 20 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 25 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 40 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 50 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 60 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 70 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 80 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 90 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 100 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 125 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 150 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 175 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 200 residuos aminoacídicos contiguos, al menos 250 residuos aminoacídicos contiguos de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido PD-L1 o un polipéptido PD-L1 glucosilado.
Como se usa en la presente memoria, el término "análogo" se refiere a un polipéptido que posee una función similar o idéntica a un polipéptido de referencia, pero no comprende necesariamente una secuencia de aminoácidos similar o idéntica del polipéptido de referencia, o posee una estructura similar o idéntica del polipéptido de referencia. El polipéptido de referencia puede ser un polipéptido PD-L1, un fragmento de un polipéptido PD-L1, un anticuerpo anti-PD-L1 o un anticuerpo antiglucPD-L1. Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos similar a un polipéptido de referencia se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de referencia, que puede ser un polipéptido PD-L1 o un anticuerpo anti-PD-L1 como se describe en la presente memoria. Un polipéptido con estructura similar a un polipéptido de referencia se refiere a un polipéptido que tiene una estructura secundaria, terciaria o cuaternaria similar a la del polipéptido de referencia, que puede ser un polipéptido PD-L1 o un anticuerpo contra PD-L1 descritos en la presente memoria. La estructura de un polipéptido puede determinarse por métodos conocidos por los expertos en la materia incluyendo, aunque sin limitación, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear y microscopia electrónica cristalográfica. Preferiblemente, el análogo funciona como un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble.
Como se usa en la presente memoria, el término "variante", cuando se usa en relación a un polipéptido PD-L1 o a un anticuerpo anti-PD-L1, se refiere a un polipéptido o un anticuerpo anti-PD-L1 que tiene una o más (tal como, por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5) sustituciones, eliminaciones y/o adicionales en la secuencia de aminoácidos en comparación con una secuencia de PD-L1 natural o sin modificar o secuencia de anticuerpo anti-PD-L1. Por ejemplo, una variante de PD-L1 puede resultar de uno o más (tal como, por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 cambios en la secuencia de aminoácidos de un PD-L1 natural. También a modo de ejemplo, una variante de un anticuerpo anti-PD-L1 puede resultar de uno o más (tal como, por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 cambios en la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-PD-L1 natural o sin modificar previamente. Pueden prepararse variantes polipeptídicas a partir de las moléculas de ácido nucleico correspondientes que codifican las variantes. En determinados aspectos de la divulgación, la variante es un anticuerpo antiglucPD-L1 que tiene una o más sustituciones, eliminaciones o inserciones aminoacídicas en una o más regiones CDR o flanqueantes y, preferiblemente, el análogo funciona como un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble.
El término "identidad" se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas polipeptídicas o dos o más moléculas de ácido nucleico, determinada alineando y comparando las secuencias. "Porcentaje de identidad" significa el porcentaje de residuos idénticos entre los aminoácidos o nucleótidos en las moléculas comparadas y se calcula basándose en el tamaño de la más pequeña de las moléculas que se están comparando. Para estos cálculos, deben abordarse huecos en las alineaciones (si las hay) mediante un modelo matemático particular o programa informático (por ejemplo, un "algoritmo"). Los métodos que pueden usarse para calcular la identidad de los ácidos nucleicos o polipéptidos alineadas incluyen los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., Ed., 1988, Nueva York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Ed., 1993, Nueva York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., Eds., 1994, Nueva Jersey: Humana Press; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., 1987, Nueva York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., Eds., 1991, Nueva York: M. Stockton Press; y Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math., 48:1073.
En el cálculo del porcentaje de identidad, las secuencias que se están comparando pueden alinearse de manera que de la máxima coincidencia entre las secuencias. Un ejemplo de un programa informático que puede usarse para determinar el porcentaje de identidad es el paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res., 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), que es un algoritmo informático usado para alinear los dos polipéptidos o polinucleótidos para determinar su porcentaje de identidad de secuencia. Las secuencias pueden alinearse para coincidencia óptima de sus secuencias respectivas de aminoácidos o nucleótidos (el "tramo coincidente" determinado por el algoritmo). Se usa una penalización por abertura de hueco (que se calcula como 3 veces el promedio de la diagonal, en el que el "promedio de la diagonal" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se esté usando, y la "diagonal" es la puntuación o número asignado a cada coincidencia perfecta de aminoácido por la matriz de comparación particular); y una penalización por extensión de hueco (que es habitualmente 1/10 veces la penalización por abertura de hueco), así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62, junto con el algoritmo. En determinados aspectos de la divulgación, también se usa una matriz de comparación convencional (véase, Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352 para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62) por el algoritmo. Parámetros ejemplares para determinar el porcentaje de identidad para polipéptidos o secuencias de nucleótidos usando el programa GAP incluyen los siguientes: (i) Algoritmo: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol., 48:443-453; (ii) Matriz de comparación: BLo Su M 62 de Henikoff et al., Id.; (iii) Penalización por hueco: 12 (pero sin penalización por huecos finales); (iv) Penalización de longitud de hueco: 4; y (v) Umbral de similitud: 0.
Determinados esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden provocar la coincidencia de solamente una corta región de las dos secuencias, y esta pequeña región alineada puede tener una identidad de secuencia muy alta, aunque no haya relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. Por consiguiente, el método de alineación seleccionado (por ejemplo, el programa GAP) puede ajustarse si así se desea para provocar una alineación que abarque un número representativo de aminoácidos, por ejemplo, al menos 50 aminoácidos contiguos, del polipéptido diana.
El porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación con propósitos de determinación del porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede conseguirse de diversas formas que pertenecen a las habilidades de los expertos en la materia, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se estén comparando.
Como se usa en la presente memoria, el término "derivado" se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de referencia que se ha alterado mediante la introducción de sustituciones, eliminaciones o adiciones de residuos aminoacídicos. El polipéptido de referencia puede ser un polipéptido PD-L1 o un anticuerpo anti-PD-L1. El término "derivado", como se usa en la presente memoria, también se refiere a un polipéptido PD-L1 o un anticuerpo anti-PD-L1 que se ha modificado químicamente, por ejemplo, mediante fijación covalente de cualquier tipo de molécula al polipéptido. Por ejemplo, un polipéptido PD-L1 o un anticuerpo anti-PD-L1 puede modificarse químicamente, por ejemplo, mediante glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular, unión a una molécula de marca peptídica o proteínica, u otra proteína, etc. Los derivados se modifican de manera que sean diferentes del péptido o polipéptido de origen natural o de partida, en el tipo o ubicación de las moléculas fijadas. Los derivados pueden incluir además la eliminación de uno o más grupos químicos que están presentes de forma natural en el péptido o polipéptido. Un derivado de un polipéptido PD-L1 o un anticuerpo anti-PD-L1 puede modificarse químicamente mediante modificaciones químicas usando técnicas conocidas por los expertos en la materia incluyendo, aunque sin limitación, escisión química específica, acetilación, formulación, síntesis metabólica mediante tunicamicina, etc. Además, un derivado de un polipéptido PD-L1 o un anticuerpo anti-PD-L1 puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. Un derivado polipeptídico posee una función similar o idéntica al polipéptido de referencia, que puede ser un polipéptido PD-L1 o un anticuerpo anti-PD-L1 descritos en la presente memoria, especialmente un anticuerpo monoclonal antiglucPD-L1 de función doble.
La expresión "proteína de fusión", como se usa en la presente memoria, se refiere a un polipéptido que incluye secuencias de aminoácidos de al menos dos polipéptidos heterólogos. El término "fusión", cuando se usa en relación a un polipéptido PD-L1 o a un anticuerpo anti-PD-L1, se refiere a la unión, fusión o acoplamiento de un polipéptido PD-L1 o un anticuerpo anti-PD-L1, variante y/o derivado del mismo, con un péptido o polipéptido heterólogo. En determinados aspectos de la divulgación, la proteína de fusión retiene la actividad biológica del polipéptido PD-L1 o el anticuerpo anti-PD-L1. En determinados aspectos de la divulgación, la proteína de fusión incluye una región Vh, región Vl, CDR de Vh (una, dos o tres CDR de Vh) y/o CDR de Vl (una, dos o tres CDR de Vl) del anticuerpo contra PD-L1 acoplada, fusionada o unida a un péptido o polipéptido heterólogo, en la que la proteína de fusión se une a un epítopo en una proteína o péptido PD-L1. En otros aspectos de la divulgación, se proporcionan péptidos PD-L1 glucosilados fusionados a un dominio Fc (preferiblemente un dominio Fc humano). Las proteínas de fusión pueden prepararse mediante reacciones de acoplamiento químico que se practican en la técnica, o mediante tecnología recombinante molecular.
Como se usa en la presente memoria, el término "composición" se refiere a un producto que contiene ingredientes componentes especificados (por ejemplo, un polipéptido o un anticuerpo proporcionados en la presente memoria) en, opcionalmente, cantidades especificadas o eficaces, así como cualquier producto deseado que resulte, directa o indirectamente, de la combinación o interacción de los ingredientes componentes específicos en, opcionalmente, las cantidades especificadas o eficaces.
Como se usa en la presente memoria, el término "vehículo" incluye vehículos, excipientes, diluyentes, medios o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que son atóxicos para la célula o mamífero que se esté exponiendo a ello a las dosificaciones y concentraciones empleadas. A menudo, el vehículo fisiológicamente aceptable es una solución de pH tamponado acuosa. Ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato, succinato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, menos de aproximadamente 10 residuos aminoacídicos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa, sacarosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes glucídicos tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS™. El término "vehículo" también puede referirse a un diluyente, adyuvante (por ejemplo, adyuvante de Freund, completo o incompleto), excipiente o medio con el que se administre el agente terapéutico. Dichos vehículos, incluyendo los vehículos farmacéuticos, pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de vaselina, aceite de sésamo y similares. El agua es un vehículo ejemplar cuando se administra una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) por vía intravenosa. También pueden emplearse soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes adecuados (por ejemplo, excipientes farmacéuticos) incluyen, sin limitación, almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes del pH. Las composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, pastillas, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación mantenida y similares. Las composiciones orales, incluyendo formulaciones, pueden incluir vehículos convencionales tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA. Las composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, pueden contener una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-PD-L1, tal como un anticuerpo antiglucPD-L1, por ejemplo, en forma aislada o purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma para su administración apropiada al sujeto (por ejemplo, paciente). La composición o formulación debe adecuarse al modo de administración.
Como se usa en la presente memoria, el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte que se usa normalmente como diluyente, medio, conservante, aglutinante o agente estabilizante, e incluye, aunque sin limitación, proteínas (por ejemplo, seroalbúmina, etc.), aminoácidos (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, glicina, histidina, etc.), ácidos grasos y fosfolípidos (por ejemplo, alquilsulfonatos, caprilato, etc.), tensioactivos (por ejemplo, SDS, polisorbato, tensioactivo no iónico, etc.), sacáridos (por ejemplo, sacarosa, maltosa, trehalosa, etc.) y polioles (por ejemplo, manitol, sorbitol, etc.). Véase también, por referencia, Remington's Pharmaceutical Sciences, Id.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares, formulaciones y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción perjudicial o indeseada cuando se administra, según lo apropiado, a un animal, tal como un ser humano. La preparación de una composición farmacéutica, que comprende un anticuerpo o ingrediente activo adicional es conocida por los expertos en la materia en vista de la presente divulgación, como se ejemplifica por Remington's Pharmaceutical Sciences, Id. Además, para administración a animales (por ejemplo, seres humanos), se entenderá que las preparaciones deben cumplir normas de esterilidad, pirogenia, seguridad general y pureza requeridas por la agencia reguladora del gobierno federal o estatal, tal como la Oficina de Normas Biológicas de la f Da o como se enumera en la Farmacopea de Estados Unidos, la Farmacopea Europea u otra farmacopea reconocida en general para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos.
La expresión "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica del ingrediente activo (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L1 y un anticuerpo antiglucPD-L1) sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que serían inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administrase la formulación. Dicha formulación puede ser estéril, es decir, aséptica o libre de todo microorganismo vivo y sus esporas, etc.
La expresión "prospecto" se usa para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias con respecto al uso de dichos productos terapéuticos.
Como se usa en la presente memoria, el término "tratar", "tratamiento" o "tratando" se refiere a la administración o aplicación de un agente terapéutico a un sujeto que lo necesite, o el funcionamiento de un procedimiento o modalidad en un sujeto, con el propósito de obtener al menos un efecto terapéutico positivo o beneficio, tal como tratamiento de una enfermedad o alteración relacionada con la salud. Por ejemplo, un tratamiento puede incluir administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo, o una composición o formulación del mismo, que se une específicamente a PD-L1 glucosilado con el propósito de tratar diversos tipos de cáncer. Las expresiones "pauta de tratamiento", "pauta de dosificación" o "protocolo de dosificación" se usan indistintamente y se refieren a la programación y dosis de un agente terapéutico, tal como un anticuerpo antiglucPD-L1 como se describe. Como se usa en la presente memoria, el término "sujeto" se refiere a un ser humano o un animal no humano, tal como primates, mamíferos y vertebrados que tienen un cáncer o se han diagnosticado con un cáncer. En aspectos preferidos de la divulgación, el sujeto es un ser humano. En algunos aspectos de la divulgación, el sujeto es un paciente con cáncer. En un aspecto de la divulgación, el sujeto que lo necesita se beneficiará o se prevé que se beneficiará de un tratamiento con anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "beneficio terapéutico" o "terapéuticamente eficaz" se refiere a promover o potenciar el bienestar de un sujeto que lo necesita (por ejemplo, un sujeto con un cáncer o diagnosticado con un cáncer) con respecto al tratamiento médico, terapia, administración de la dosificación, de una afección, particularmente como resultado del uso de los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble y el funcionamiento de los métodos descritos. Esto incluye, aunque sin limitación, una reducción en la frecuencia o gravedad de los signos o síntomas de una enfermedad. Por ejemplo, el tratamiento de un cáncer puede implicar, por ejemplo, una reducción del tamaño de un tumor, una reducción en la capacidad invasiva o gravedad de un tumor, una reducción de la infiltración de células cancerosas en un tejido u órgano periférico; una reducción en la tasa de crecimiento del tumor o cáncer, o la prevención o reducción de metástasis. El tratamiento del cáncer también puede referirse a conseguir una respuesta mantenida en un sujeto o prolongar la supervivencia de un sujeto con cáncer.
Como se usa en la presente memoria, el término "administrar" o "administración" se refiere al acto de suministrar físicamente, por ejemplo, mediante inyección o vía oral, una sustancia tal cual existe fuera del organismo, a un paciente, tal como por suministro oral, subcutáneo, a la mucosa, intradérmico, intravenoso, intramuscular y/o cualquier otro método de suministro físico descrito en la presente memoria o conocido en la técnica. Cuando una enfermedad, trastorno o afección, o un síntoma de la misma, se está tratando terapéuticamente, la administración de la sustancia se produce típicamente después de la aparición de la enfermedad, trastorno o afección o síntomas de la misma. El tratamiento profiláctico implica la administración de la sustancia en un momento antes de la aparición de la enfermedad, trastorno o afección o síntomas de la misma.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a la magnitud o cantidad de un agente terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo o composición farmacéutica proporcionada en la presente memoria) que es suficiente para reducir, disminuir, aliviar y/o mejorar la gravedad y/o duración de un cáncer o un síntoma relacionado con el mismo. Esta expresión también abarca una cantidad necesaria para la reducción o mejora del avance o progresión de un cáncer; la reducción o mejora de la recidiva, desarrollo o aparición de un cáncer; y/o la mejora o potenciación del efecto o afectos profilácticos o terapéuticos de otro tratamiento antineoplásico (por ejemplo, un tratamiento distinto de la administración de un anticuerpo anti-PD-L1 o anticuerpo antiglucPD-L1 proporcionado en la presente memoria). En algunos aspectos de la divulgación, la cantidad eficaz de un anticuerpo proporcionado en la presente memoria es de aproximadamente o igual a 0,1 mg/kg (mg de anticuerpo por kg de peso del sujeto) a aproximadamente o igual a 100 mg/kg. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad eficaz de un anticuerpo proporcionado en la presente memoria es de aproximadamente o igual a 0,1 mg/kg, aproximadamente o igual a 0,5 mg/kg, aproximadamente o igual a 1 mg/kg, aproximadamente o igual a 3 mg/kg, aproximadamente o igual a 5 mg/kg, aproximadamente o igual a 10 mg/kg, aproximadamente o igual a 15 mg/kg, aproximadamente o igual a 20 mg/kg, aproximadamente o igual a 25 mg/kg, aproximadamente o igual a 30 mg/kg, aproximadamente o igual a 35 mg/kg, aproximadamente o igual a 40 mg/kg, aproximadamente o igual a 45 mg/kg, aproximadamente o igual a 50 mg/kg, aproximadamente o igual a 60 mg/kg, aproximadamente o igual a 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg o 100 mg/kg. Se entiende que estas cantidades incluyen cantidades e intervalos en las mismas. En algunos aspectos de la divulgación, "cantidad eficaz" también se refiere a la cantidad de un anticuerpo proporcionado en la presente memoria para conseguir un resultado especificado (por ejemplo, evitar, bloquear o inhibir la unión de PD-1 de superficie celular a PD-L1 de superficie celular; o evitar, bloquear o inhibir la inmunosupresión mediada por PD-1/PD-L1).
La expresión "en combinación" en el contexto de la administración de otros tratamientos (por ejemplo, otros agentes, fármacos antineoplásicos, tratamientos antineoplásicos) incluye el uso de más de un tratamiento (por ejemplo, tratamiento con fármacos y/o tratamiento antineoplásico). La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (por ejemplo, concurrente) y consecutiva en cualquier orden. El uso de la expresión "en combinación" no restringe el orden en que se administran los tratamientos a un sujeto. A modo de ejemplo no limitante, un primer tratamiento (por ejemplo, agente, tal como un anticuerpo antiglucPD-L1) puede administrarse antes (por ejemplo, 1 minuto, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas o 12 semanas), simultáneamente o después (por ejemplo, 1 minuto, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas o 12 semanas o más) de la administración de un segundo tratamiento (por ejemplo, agente) a un sujeto que tiene o se ha diagnosticado con un cáncer.
La combinación de tratamientos (por ejemplo, uso de agentes, incluyendo agentes terapéuticos) puede ser más eficaz que los efectos aditivos de dos cualesquiera o más tratamientos individuales (por ejemplo, tienen un efecto sinérgico) o puede tener otros beneficios que no se predicen a priori, tales como perfil mejorado de efectos secundarios, eficacia o duración aumentada del efecto terapéutico, población de pacientes más amplia en que la combinación es eficaz, etc. Dicho efecto típicamente es inesperado y no puede predecirse. Por ejemplo, un efecto sinérgico de una combinación de agentes terapéuticos frecuentemente permite el uso de dosificaciones menores de uno o más de los agentes y/o administración menos frecuente de los agentes a un paciente con cáncer. La capacidad de utilizar dosificaciones menores de agentes terapéuticos y tratamiento antineoplásicos y/o de administrar los tratamientos menos frecuentemente reduce la posibilidad de toxicidad asociada con la administración de los tratamientos a un sujeto sin reducir la eficacia de los tratamientos. Además, un efecto sinérgico puede provocar eficacia mejorada de los tratamientos en el tratamiento o alivio de un cáncer. Además, un efecto sinérgico demostrado mediante una combinación de tratamientos (por ejemplo, agentes terapéuticos) puede evitar o reducir los efectos secundarios adversos o indeseados asociados con el uso de cualquier tratamiento individual.
Anticuerpos anti-PD-LI glucosilado de función doble
En la presente memoria se proporcionan anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que se unen a la proteína PD-L1 glucosilada (por ejemplo, una proteína PD-L1 que tiene una estructura de N-glucano específica; glucopéptidos específicos de PD-L1) o péptidos PD-L1 glucosilados y son de función doble porque reducen o bloquean la unión de la interacción de PD-L1/PD-1 y también promueven la internalización y degradación del PD-L1 en la célula tumoral, así como el uso de dichos anticuerpos en el tratamiento de enfermedades, particularmente cáncer. Los anticuerpos preferentemente se unen a PD-L1 glucosilado en comparación con PD-L1 aglucosilado. Los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble como se describe en la presente memoria pueden ser de las clases de Ig IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, así como polipéptidos que comprenden los dominios CDR de anticuerpo que retienen la actividad de unión a antígeno. De forma ilustrativa, los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble pueden ser anticuerpos quiméricos, madurados por afinidad, humanizados o humanos. En un aspecto preferido de la divulgación, los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble son anticuerpos monoclonales. En determinados aspectos de la divulgación, los anticuerpos monoclonales antiglucPD-L1 son STM073 o STM108. En otros aspectos preferidos de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico, particularmente una forma humanizada o quimérica de STM073 o STM108. Por medios conocidos y como se describe en la presente memoria, pueden crearse anticuerpos policlonales o monoclonales, fragmentos de anticuerpo, dominios de unión y CDR (incluyendo formas manipuladas de cualquiera de los anteriores) que sean específicos para el antígeno de PD-L1 glucosilado, uno o más de sus respectivos epítopos, o conjugados de cualquiera de los anteriores, ya sea que dichos antígenos o epítopos están aislados de fuentes naturales o son derivados sintéticos o variantes de los compuestos naturales. Los anticuerpos pueden ser biespecíficos o biparatópicos.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, por ejemplo, un anticuerpo que comprende secuencias de unión a antígeno (por ejemplo, dominios V y/o CDR) de un donador no humano injertadas en una secuencia heteróloga no humana, humana o humanizada (por ejemplo, secuencias flanqueantes y/o del dominio constante). En un aspecto de la divulgación, las secuencias donadoras no humanas son de ratón o rata. En aspectos específicos de la divulgación, los dominios Vh y Vl son no humanos, por ejemplo, murinos y los dominios constantes son humanos. En un aspecto de la divulgación, una secuencia de unión a antígeno es sintética, por ejemplo, obtenida por mutagénesis (por ejemplo, cribado de presentación en fagos de una colección humana de fagos, etc.). En un aspecto de la divulgación, un anticuerpo quimérico tiene regiones V murinas y regiones C humanas. En un aspecto de la divulgación, la región V de la cadena ligera murina se fusiona con una región C de la cadena ligera kappa humana. En un aspecto de la divulgación, la región V de la cadena pesada murina se fusiona con una región C de IgG1 humana.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo es un dominio variable individual de inmunoglobulina derivado de un anticuerpo de camélido, preferiblemente de un anticuerpo de camélido de cadena pesada, desprovisto de cadenas ligeras, que se conocen como secuencias de dominio VhH o Nanobodies™. Un Nanobody™ (Nb) es el fragmento funcional más pequeño o dominio variable individual (VhH) de un anticuerpo monocatenario de origen natural y es conocido por los expertos en la materia. Derivan de los anticuerpos de solamente cadena pesada observados en camélidos (Hamers-Casterman et al., 1993, Nature, 363:446-448; Desmyter et al., 1996, Nat. Struct. Biol., pág. 803­ 811). En la familia de los "camélidos", se encuentran inmunoglobulinas desprovistas de cadenas ligeras. Los "camélidos" comprenden camélidos del viejo mundo (Camelus bactrianus y Camelus dromedarius) y camélidos del nuevo mundo (por ejemplo, Lama paceos, Lama glama, Lama guanicoe y Lama vicugna). El anticuerpo de cadena pesada de dominio variable individual en la presente memoria se denomina Nanobody™ o anticuerpo VhH. El pequeño tamaño y las propiedades biofísicas únicas de los Nb superan a los fragmentos de anticuerpo convencionales para el reconocimiento de epítopos infrecuentes u ocultos y para la unión en cavidades o sitios activos de dianas proteínicas. Además, los Nb pueden diseñarse como anticuerpos multiespecíficos y multivalentes, fijados a moléculas indicadoras, o humanizados. Los Nb son estables, sobreviven al sistema gastrointestinal y pueden fabricarse fácilmente.
En otros aspectos de la divulgación, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico. Unificando dos sitios de unión a antígeno de diferente especificidad en una sola construcción, los anticuerpos biespecíficos tienen la capacidad de juntar dos antígenos diferenciados con especificidad excelente y, por lo tanto, tienen gran potencial como agentes terapéuticos. Los anticuerpos biespecíficos originariamente se prepararon fusionando dos hibridomas, cada uno con capacidad de producir una inmunoglobulina diferente. Los anticuerpos biespecíficos también se producen uniendo dos fragmentos de anticuerpo scFv mientras se omite la parte Fc presente en las inmunoglobulinas completas. Cada unidad scFv en dichas construcciones puede contener un dominio variable de cada una de las cadenas del anticuerpo pesada (Vh) y ligera (Vl), unidas entre sí mediante un conector polipeptídico sintético, estando el último a menudo manipulado genéticamente para que sea mínimamente inmunogénico mientras el resto es resistente al máximo a proteólisis. Las respectivas unidades scFv pueden unirse mediante varias técnicas conocidas, incluyendo incorporación de un espaciador polipeptídico corto (habitualmente de menos de 10 aminoácidos) que conecta las dos unidades scFv, creando de ese modo un anticuerpo monocatenario biespecífico. El anticuerpo monocatenario biespecífico resultante, por lo tanto, es una especie que contiene dos pares VhVl de diferente especificidad en una sola cadena polipeptídica, en que los dominios Vh y Vl en una unidad scFv respectiva están separados por un conector polipeptídico suficientemente largo para permitir la asociación intramolecular entre estos dos dominios, de modo que las unidades scFv así formadas se adhieren de forma contigua entre sí a través de un espaciador polipeptídico que se mantiene suficientemente corto para evitar la asociación indeseada entre, por ejemplo, el dominio Vh de una unidad scFv y el Vl de la otra unidad scFv.
En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo es un anticuerpo biparatópico. Como se usa en la presente memoria, la expresión "anticuerpo biparatópico" se refiere a una molécula de unión biespecífica que comprende dos dominios de unión a antígeno que reconocen y se unen a dos epítopos no solapantes, determinantes antigénicos o dominios diferentes en la misma diana proteínica, por ejemplo, un antígeno diana de PD-L1 asociado a tumor, o un antígeno diana de PD-L1 glucosilado como se describe en la presente memoria. En un aspecto de la divulgación, un anticuerpo biparatópico dirigido contra un glucPD-L1 o una o más partes peptídicas del mismo, como se describe en la presente memoria, comprende un primer dominio variable de inmunoglobulina y un segundo dominio variable de inmunoglobulina, en el que los dos dominios de unión se unen a dos epítopos no solapantes diferentes de la misma proteína glucPD-L1 diana. Uno o los dos epítopos reconocidos por el primer y segundo dominio de unión de la inmunoglobulina pueden estar glucosilados o contener residuos glucosilados. Preferiblemente, al menos una de las inmunoglobulinas se une preferentemente a la forma glucosilada de la proteína glucPD-L1 con respecto a la forma aglucosilada.
En otro aspecto de la divulgación, un anticuerpo biparatópico comprende una inmunoglobulina (preferiblemente una IgG tetravalente) que se une a un epítopo en una molécula diana de glucPD-L1 y un scFv que se une a un epítopo diferente y no solapante en la misma molécula diana de glucPD-L1, en que la inmunoglobulina y el scFv se ligan mediante un conector para permitir la unión de la inmunoglobulina y el scFv a los epítopos diferentes y no solapantes en la molécula diana de glucPD-L1. Por consiguiente, los anticuerpos biparatópicos se crean a partir de dos anticuerpos antiglucPD-L1 que se unen a diferentes epítopos (o dominios) en la misma diana de glucPD-L1 (es decir, unión biparatópica) para potenciar la afinidad/avidez de unión; para aumentar la carga de anticuerpos en las células tumorales para funciones efectoras potenciadas, tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); y/o para mejorar o aumentar el tiempo de retención en el tumor. Además, los anticuerpos biparatópicos bivalentes que se dirigen a dos epítopos no solapantes en un antígeno de glucPD-L1 asociado a tumor tienen el potencial de inducir agrupamiento de moléculas diana de glucPD-L1 en la membrana celular lo que, a su vez, puede promover una internalización, tráfico lisosómico y degradación aumentados. Los anticuerpos biparatópicos dirigidos contra dos epítopos no solapantes diferentes en una proteína/antígeno diana pueden generarse usando técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, B. Roberts et al., 1999, Int. J. Cancer, Vol. 81:285-291 (antígeno carcinoembrionario, CEA); D. Lu et al., 1999, J. Immunol. Methods, Vol. 230:159-71 (receptor 2 del factor de crecimiento del endotelio vascular, VEGF2); publicación internacional WO 2009/068627, Ablynx NV, publicada el 4 de junio de 2009; publicación internacional WO 2010/142534, y Ablynx NV, publicada el 16 de diciembre de 2010.
En un aspecto de la divulgación, un anticuerpo biparatópico bivalente puede producirse usando secuencias del dominio variable de dos anticuerpos antiglucPD-L1 diferentes, identificados como se describe en la presente memoria, que reconocen y se unen a diferentes epítopos no solapantes en una proteína diana de glucPD-L1 dada, en el que el anticuerpo contiene el fragmento variable monocatenario (scFv) de uno de los anticuerpos antiglucPD-L1 fijados al extremo N de la cadena H y/o la cadena L o, como alternativa, el extremo C del dominio Ch3, del segundo anticuerpo anti-PD-L1 que reconoce un epítopo diferente y no solapante en glucPD-L1. El scFv puede ligarse al segundo anticuerpo anti-PD-L1 mediante un conector peptídico, por ejemplo, tal como los usados para ligar dominios de unión en un scFv. Véase, por ejemplo, Dimasi et al., J. Mol. Biol, 393:672-692 (2009). El producto de molécula de unión resultante, o anticuerpo biparatópico, contiene cuatro unidades de unión antiglucPD-L1, o dos unidades de unión en cada brazo de la molécula, que pueden interactuar con y unirse a dos epítopos diferentes en glucPD-L1. De acuerdo con este aspecto de la divulgación, un anticuerpo biparatópico bivalente dirigido a dos epítopos no solapantes en glucPD-L1 expresado en la superficie de una célula tumoral podría reticular de manera eficaz los glucPD-L1 a través de unión al epítopo para inducir agrupamiento de glucPD-L1 en la superficie celular, dando lugar a la formación de complejos grandes que provocan y promueven internalización y degradación lisosómica potenciadas. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biparatópico se liga a una toxina o fármaco antineoplásico para producir un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) como se describe adicionalmente en la presente memoria. La internalización y endocitosis potenciadas de dichos anticuerpos biparatópicos anti-PD-L1 y el tráfico lisosómico finalmente provoca el suministro de mayores cantidades de toxina a las células diana y mayor destrucción de células tumorales o regresión. Dichos efectos se observaron tanto in vitro como in vivo como se describe para un ADC anti-HER2 biparatópico (J.Y. Li et al., 2016, Cancer Cell, Vol. 29:117-129). De forma ilustrativa, pueden producirse anticuerpos antiglucPD-L1 biparatópicos o ADC antiglucPD-L1 que se unen específicamente a dos epítopos no solapantes de PD-L1 glucosilado unido a membrana para evitar o bloquear su interacción con su compañero de unión afín PD-1 y para promover su internalización y degradación, así como la destrucción de las células tumorales si se usa un ADC antiglucPD-L1. En aspectos particulares de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 es STM073, STM108 o formas ADC del mismo.
En otros aspectos de la divulgación, las moléculas de unión o anticuerpo antiglucPD-L1 englobados por la invención pueden ser multiparatópicos, es decir, contienen dominios de unión a antígeno que reconocen y se unen a tres, cuatro o más epítopos o determinantes antigénicos diferentes, preferiblemente no solapantes en la misma molécula diana de glucPD-L1. En otros aspectos más de la divulgación, los anticuerpos antiglucPD-L1 son tanto bi- o multiparatópicos como multivalentes, es decir, también comprenden sitios de unión a antígeno o "parátopos" que reconocen y se unen a uno o más epítopos o determinantes antigénicos diferentes en diferentes moléculas diana de glucPD-L1.
Ejemplos de fragmentos de anticuerpo adecuados para su uso incluyen, sin limitación: (i) el fragmento Fab, que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1 ; (ii) el fragmento "Fd" que consiste en los dominios Vh y Ch1 ; (iii) el fragmento "Fv" que consiste en los dominios Vl y Vh de un solo anticuerpo; (iv) el fragmento "dAb", que consiste en un dominio Vh; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados; (vii) moléculas Fv monocatenarias ("scFv"), en que un dominio Vh y un dominio Vl se ligan mediante un conector peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un dominio de unión; (viii) dímeros de Fv monocatenarios biespecíficos (véase la patente de Estados Unidos n.° 5.091.513); y (ix) diacuerpos, fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos por fusión génica (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20050214860). Las moléculas de Fv, scFv o diacuerpo pueden estabilizarse mediante la incorporación de puentes disulfuro que ligan los dominios Vh y Vl. También pueden ser útiles los minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio Ch3 (Hu et al., 1996, Cancer Res., 56:3055-3061). Además, también se contemplan peptidomiméticos de unión similares a anticuerpos en aspectos de la divulgación. Se ha informado de "peptidomiméticos de unión similares a anticuerpos" (ABiP), que son péptidos que actúan como anticuerpos reducidos y tienen determinadas ventajas de semivida en suero más larga, así como métodos de síntesis menos complicados, por Liu et al., 2003, Cell Mol. Biol., 49:209-216.
Se puede inocular a los animales un antígeno, tal como un polipéptido o péptido PD-L1 glucosilado para generar una respuesta inmunitaria y producir anticuerpos específicos para el polipéptido PD-L1 glucosilado. Frecuentemente, un antígeno se une o conjuga con otra molécula para potenciar la respuesta inmunitaria. Como se usa en la presente memoria, un conjugado es cualquier péptido, polipéptido, proteína o sustancia no proteínica unida a un antígeno que se usa para provocar una respuesta inmunitaria en un animal. Los anticuerpos producidos en un animal en respuesta a la inoculación de antígeno comprenden una diversidad de moléculas no idénticas (anticuerpos policlonales) preparados a partir de una diversidad de linfocitos B individuales productores de anticuerpos. Un anticuerpo policlonal es una población mixta de especies de anticuerpo, de la que cada una de ellas puede reconocer un epítopo diferente en el mismo antígeno. Dadas las condiciones correctas para la producción de anticuerpos policlonales en un animal, la mayoría de los anticuerpos en el suero del animal reconocerán los epítopos colectivos en el compuesto antigénico contra el que se ha inmunizado el animal. Esta especificidad se potencia más mediante purificación por afinidad para seleccionar solamente aquellos anticuerpos que reconozcan el antígeno o epítopo de interés.
Un anticuerpo monoclonal es una sola especie clonal de anticuerpo en la que cada molécula de anticuerpo reconoce el mismo epítopo porque todas las células productoras de anticuerpos derivan de un solo linfocito B productor de anticuerpos. Los métodos para generar anticuerpos monoclonales (MAb) en general empiezan sobre las mismas líneas que aquellas para preparar anticuerpos policlonales. En algunos aspectos de la divulgación, se usan roedores tales como ratones y ratas en la generación de anticuerpos monoclonales. En algunos aspectos de la divulgación, se usan células de conejo, oveja o rana en la generación de anticuerpos monoclonales. El uso de ratas es bien conocido y puede proporcionar determinadas ventajas. Los ratones (por ejemplo, ratones BALB/c) se usan de forma rutinaria y en general dan un alto porcentaje de fusiones estables. La tecnología de hibridoma como se usa en la producción de anticuerpos monoclonales implica la fusión de un solo linfocito B productor de anticuerpos aislado de un ratón previamente inmunizado con una proteína o péptido PD-L1 glucosilado con una célula de mieloma inmortalizada, por ejemplo, una línea celular de mieloma de ratón. Esta tecnología proporciona un método para propagar una sola célula productora de anticuerpos durante un número indefinido de generaciones, de modo que puedan producirse cantidades ilimitadas de anticuerpos estructuralmente idénticos que tienen la misma especificidad antigénica o epitópica, es decir, anticuerpos monoclonales.
Pueden crearse anticuerpos manipulados usando anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos y tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que retienen la especificidad de unión al antígeno o epítopo del anticuerpo original, es decir, la molécula tiene un dominio de unión específica. Dichas técnicas pueden implicar introducir ADN codificante de la región variable de la inmunoglobulina o las CDR de un anticuerpo en el material genético para las regiones flanqueantes, regiones constantes o regiones constantes más regiones flanqueantes, de un anticuerpo diferente. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5.091.513 y 6.881.557.
Mediante medios conocidos como se describe en la presente memoria, pueden crearse anticuerpos policlonales o monoclonales, fragmentos de anticuerpo que tienen actividad de unión, dominios de unión y CDR (incluyendo formas manipuladas de cualquiera de los anteriores), que se unan específicamente a la proteína PD-L1 glucosilada, uno o más de sus epítopos respectivos, y tengan una función doble de bloqueo de la unión de PD-L1 a PD-1 y promoción de la internalización de PD-L1 en células tumorales, o conjugados de cualquiera de los anteriores, ya sea que dichos antígenos o epítopos se aíslen de fuentes naturales o sean derivados sintéticos o variantes de los compuestos naturales.
Los anticuerpos pueden producirse a partir de cualquier fuente animal, incluyendo aves y mamíferos. Preferiblemente, los anticuerpos son ovinos, murinos (por ejemplo, ratón y rata), de conejo, cabra, cobaya, camello, caballo o pollo. Además, pueden obtenerse anticuerpos humanos cribando colecciones combinatorias de anticuerpos humanos. Por ejemplo, la tecnología de expresión de anticuerpos en bacteriófagos permite producir anticuerpos específicos en ausencia de inmunización animal, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 6.946.546. Estas técnicas se describen adicionalmente en Marks, 1992, Bio/Technol., 10:779-783; Stemmer, 1994, Nature, 370:389-391; Gram et al, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3576-3580; Barbas et a l, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3809-3813; y Schier et al., 1996, Gene, 169(2):147-155.
Los métodos para producir anticuerpos policlonales en diversas especies de animales, así como para producir anticuerpos monoclonales de diversos tipos, incluyendo humanizados, quiméricos y completamente humanos, son bien conocidos en la técnica y son muy reproducibles. Por ejemplo, las siguientes patentes de Estados Unidos proporcionan descripciones de dichos métodos: patentes de Estados Unidos n.° 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345 4.196.265 4.275.149 4.277.437 4.366.241 4.469.797; 4.472.509 4.606.855 4.703.003 4.742.159; 4.767.720 4.816.567 4.867.973 4.938.948 4.946.778 5.021.236; 5.164.296 5.196.066 5.223.409 5.403.484; 5.420.253 5.565.332 5.571.698 5.627.052 5.656.434 5.770.376; 5.789.208 5.821.337 5.844.091 5.858.657; 5.861.155 5.871.907 5.969.108 6.054.297 6.165.464 6.365.157; 6.406.867 6.709.659 6.709.873 6.753.407; 6.814.965 6.849.259; 6.861.572; 6.875.434; 6.891.024; 7.407.659; y 8.178.098.
Se espera que los anticuerpos dirigidos a PD-L1 glucosilado proporcionados en la presente memoria tengan la capacidad de neutralizar, bloquear, inhibir o contrarrestar los efectos de PD-L1 glucosilado con respecto a la especie de animal, línea celular monoclonal u otra fuente del anticuerpo. Determinadas especies de animales pueden ser menos preferibles para generar anticuerpos terapéuticos porque pueden tener mayor probabilidad de provocar una respuesta inmunitaria o alérgica debido a la activación del sistema del complemento a través de la parte "Fc" del anticuerpo. Sin embargo, pueden digerirse enzimáticamente anticuerpos completos en el fragmento "Fc" (unión al complemento), y en fragmentos peptídicos que tengan los dominios de unión o CDR. La eliminación de la parte Fc reduce la probabilidad de que este fragmento de anticuerpo provoque una respuesta inmunológica indeseada y, por tanto, los anticuerpos sin una parte Fc pueden ser preferentes para tratamientos profilácticos o terapéuticos. Como se describe anteriormente, también pueden construirse anticuerpos para que sean quiméricos, humanizados o parcial o completamente humanos, para reducir o eliminar los posibles efectos adversos inmunológicos resultantes de la administración a un animal de un anticuerpo que se ha producido en, o tiene secuencias de aminoácidos de otras especies.
Las proteínas de anticuerpo pueden ser recombinantes o sintetizadas in vitro. Se contempla que en composiciones que contienen anticuerpo antiglucPD-L1 como se describe en la presente memoria hay entre aproximadamente 0,001 mg y aproximadamente 10 mg de polipéptido de anticuerpo total por ml. Por tanto, la concentración de proteína de anticuerpo en una composición puede ser aproximadamente, al menos aproximadamente o como mucho aproximadamente o igual a 0,001,0,010, 0,050, 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0 mg/ml o más (o cualquier intervalo derivable en las mismas). De estas, aproximadamente, al menos aproximadamente, como mucho aproximadamente o igual a un 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66 , 67, 68 , 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % puede ser un anticuerpo que se une a PD-L1 glucosilado.
Un anticuerpo o una parte inmunológica de un anticuerpo que retiene la actividad de unión, puede conjugarse químicamente a, o expresarse de forma recombinante como, una proteína de fusión con otras proteínas. Para los propósitos que se describen en la presente memoria, todas estas proteínas fusionadas se incluyen en la definición de anticuerpos o una parte inmunológica de un anticuerpo. En algunos aspectos de la divulgación, están englobados los anticuerpos de funcionalidad doble y las moléculas similares a anticuerpos generadas contra PD-L1 glucosilado, o polipéptidos que se ligan a al menos un agente para formar un conjugado o carga útil de anticuerpo. Para aumentar la eficacia de las moléculas de anticuerpo como agentes de diagnóstico o terapéuticos, el anticuerpo puede ligarse o unirse covalentemente o formar complejo con al menos una molécula o resto deseado con el anticuerpo. Dicha molécula o resto ligado puede ser, aunque sin limitación, al menos una molécula efectora o indicadora. Las moléculas efectoras comprenden moléculas que tienen una actividad deseada, por ejemplo, actividad citotóxica. Ejemplos no limitantes de moléculas efectoras que pueden fijarse a anticuerpos incluyen toxinas, enzimas terapéuticas, antibióticos, nucleótidos radiomarcados y similares. Por el contrario, una molécula indicadora se define como cualquier resto que pueda detectarse usando un ensayo. Ejemplos no limitantes de moléculas indicadoras que pueden conjugarse con anticuerpos incluyen enzimas, radiomarcadores, haptenos, marcadores fluorescentes, moléculas fosforescentes, moléculas quimioluminiscentes, cromóforos, moléculas luminiscentes, moléculas de fotoafinidad, partículas o ligandos coloreados, tales como biotina, y similares. Se conocen varios métodos en la técnica para fijar o conjugar un anticuerpo con una molécula o resto de conjugado. Algunos métodos de fijación implican el uso de un complejo de quelato metálico, empleando, a modo de ejemplo no limitante, un agente quelante orgánico tal como un anhídrido de ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA); ácido etilentriaminatetraacético; N-cloro-p-toluensulfonamida; y/o tetracloro-3-6a-difenilglucourilo-3 fijado al anticuerpo. Los anticuerpos, particularmente los anticuerpos como se describen en la presente memoria, también pueden hacerse reaccionar con una enzima en presencia de un agente de acoplamiento tal como glutaraldehído o peryodato. Los conjugados con marcadores de fluoresceína se preparan convencionalmente en presencia de estos agentes de acoplamiento o mediante reacción con un isotiocianato. En otro aspecto de la divulgación, un anticuerpo antiglucPD-L1 de funcionalidad doble como se describe en la presente memoria puede acoplarse o ligarse a un compuesto o sustancia, tal como polietilenglicol (PEG), para aumentar su semivida in vivo en plasma, suero o sangre después de la administración.
En un aspecto particular de la divulgación se proporcionan anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales, y formas humanizadas y quiméricas de los mismos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específica y preferentemente a la proteína PD-L1 glucosilada con respecto a la proteína PD-L1 no glucosilada y tienen una actividad doble al bloquear la unión de PD-L1/PD-1 y promover la internalización y degradación de PD-L1. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble se une específica o preferentemente a la proteína PD-L1 que está glucosilada en las posiciones 35, 192, 200 y/o 219 de la secuencia de aminoácidos de la proteína PD-L1, por ejemplo, como se expone en SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, la unión específica o selectiva del anticuerpo antiglucPD-L1 implica la unión del anticuerpo al antígeno de PD-L1 glucosilado con una Kd menor de la mitad de la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilado. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 se une a la proteína PD-L1 glucosilada con una Kd al menos 5 veces menor que la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilado. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 se une a la proteína PD-L1 glucosilada con una Kd al menos 10 veces menor que la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilado. En un aspecto de la divulgación, en un ensayo de unión de citometría de flujo celular como se describe en el ejemplo 6 , el anticuerpo muestra unión que se expresa como MFI a células que expresan PD-L1 WT que es 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces mayor que la MFI para la unión a células que expresan PD-L1 aglucosilado.
En un aspecto de la divulgación se proporciona un anticuerpo de función doble o un fragmento de unión del mismo específico para y que se une preferentemente a PD-L1 glucosilado que se une específicamente al epítopo de PD-L1 unido por STM073. En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble se une a un epítopo en PD-L1 que abarca las posiciones H69, Y112, R113 y K124 de la secuencia de aminoácidos de PD-L1 humano de SEQ ID NO: 1. En un aspecto de la divulgación, los aminoácidos del epítopo son no contiguos y el epítopo es un epítopo conformacional. Las regiones del polipéptido PD-L1 humano que abarcan el epítopo del MAb STM073 tienen la secuencia VHGEEDLKVQH.......DAGVYRCMISYGGADYKRITV (es decir, SEQ ID NO: 85 o V68-V128 de SEQ ID NO: 1), en que los residuos aminoacídicos H69, Y112, R113 y K124, que comprenden el epítopo reconocido por el MAb STM073, están subrayados. En la secuencia del epítopo de STM073, los guiones entre el residuo aminoacídico histidina (H) en la posición 78 y el residuo aminoacídico ácido aspártico (D) en la posición 108 representan aminoácidos en las posiciones 79-107 de la secuencia de aminoácidos de PD-L1 humano de SEQ ID NO: 1.
En otro aspecto de la divulgación se proporciona un anticuerpo de función doble o un fragmento de unión del mismo específico para y que se une preferentemente a PD-L1 glucosilado, que es el anticuerpo monoclonal antiglucPD-L1 STM108, o formas humanizadas o quiméricas del mismo. En un aspecto específico de la divulgación, el antiglucPD-L1 de función doble se une específicamente a un epítopo en PD-L1 que abarca las posiciones S80, Y81, K162 y S169 de la secuencia de aminoácidos de PD-L1 humano de SEQ ID NO: 1 en la presente memoria. Las regiones del polipéptido PD-L1 humano que abarcan el epítopo del MAb STM108 tienen la secuencia de aminoácidos LKVQHSSYRQR.......EGYPKAEVIWTSSDHQ (es decir, L74-Q173 de SEQ ID NO: 1), en que los residuos aminoacídicos S80, Y81, K162 y S169, que comprenden el epítopo reconocido por el MAb STM108, están subrayados. En las regiones del epítopo de STM108, los guiones entre el residuo aminoacídico arginina (R) en la posición 84 y el residuo aminoacídico ácido glutámico (E) en la posición 158 representan aminoácidos en las posiciones 85-157 de la secuencia de PD-L1 humano de SEQ ID NO: 1. Por tanto, los aminoácidos del epítopo del MAb STM108 son no contiguos, y el epítopo es un epítopo conformacional.
El ácido nucleico (ADN) y las secuencias de aminoácidos correspondientes de los dominios variables (V) de la cadena pesada y ligera del MAb STM073 se muestran en la tabla 3 infra. La tabla 3 proporciona tanto las secuencias de nucleótidos como de aminoácidos de los dominios Vh y Vl maduros (es decir, que no contienen el péptido señal) de STM073 (SEQ ID NO: 2, 3, 10 y 11, respectivamente) y las secuencias de los dominios Vh y Vl que contienen los péptidos señal (SEQ ID NO: 87, 88 , 89 y 90, respectivamente). En las secuencias de ADN de la cadena pesada y del dominio V de la proteína mostradas en la tabla 3 la secuencia señal aminoterminal se representa en fuente cursiva. También se muestran en la tabla 3 las CDR del dominio V de la cadena pesada y ligera del MAb STM073, determinadas por las definiciones tanto de Kabat como de Chothia.
En una realización, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio Vh de SEQ ID NO: 3 y un dominio Vl de SEQ ID NO: 11. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble compite por la unión específica a PD-L1 glucosilado con un anticuerpo que comprende un dominio Vh de SEQ ID NO: 3 y un dominio Vl de SEQ ID NO: 11. En una realización, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio Vh que comprende las CDR 1-3 de Chothia que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8 , respectivamente, o las CDR 1-3 de Kabat que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9, respectivamente, o una combinación de las mismas. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble compite por la unión específica a PD-L1 glucosilado con un anticuerpo que comprende un dominio Vh que comprende las CDR 1 -3 de Chothia que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8 , respectivamente, o las CDR 1-3 de Kabat que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9, respectivamente, o una combinación de las mismas. En una realización, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio Vl que comprende las CDR 1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble compite por la unión específica a PD-L1 glucosilado con un anticuerpo que comprende un dominio Vl que comprende las CDR 1 -3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, SeQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende (a) un dominio Vh que comprende las CDR 1 -3 de Chothia que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8 , respectivamente, o las CDR 1-3 de Kabat que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9, respectivamente, o una combinación de las mismas; y (b) un dominio Vl que comprende las CDR 1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. En aspectos de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble compite por la unión específica a PD-L1 glucosilado con un anticuerpo que comprende los dominios Vh y Vl descritos anteriormente y las CDR en los mismos.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específicamente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio Vh que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y/o un dominio Vl que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y que inhibe o bloquea la unión de PD-L1 glucosilado a PD-1 y promueve la desestabilización de la expresión de PD-L1 en la membrana celular. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio Vh que comprende las CDR 1-3 teniendo al menos 1, 2 o las 3 CDR al menos 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones aminoacídicas con respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SeQ ID NO: 8 , respectivamente, o las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9, respectivamente, cuyo anticuerpo antiglucPD-L1 bloquea la unión de PD-L1 glucosilado a PD-1 y promueve la desestabilización de la expresión de PD-L1 en la membrana celular. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio Vl que comprende las CDR 1 -3 teniendo al menos 1,2 o las 3 CDR al menos 1,2, 3, 4 o 5 sustituciones aminoacídicas con respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende (a) un dominio Vh que comprende las CDR 1 -3 teniendo al menos 1, 2 o las 3 CDR al menos 1,2, 3, 4 o 5 sustituciones aminoacídicas con respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8 , respectivamente, o las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9, respectivamente; y (b) un dominio Vl que comprende las CDR 1-3 teniendo al menos 1, 2 o las 3 CDR al menos 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones aminoacídicas con respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, respectivamente, cuyo anticuerpo bloquea la unión de PD-L1 glucosilado a PD-1 y promueve la desestabilización de la expresión de PD-L1 en la membrana celular. También se proporcionan formas humanizadas de STM073 usando las CDR definidas de AbM, Contacto o IMGT, con regiones flanqueantes humanas y, opcionalmente, dominios constantes humanos.
Los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble anteriores se unen a PD-L1 glucosilado con una Kd menor de la mitad de la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilado. En un aspecto de la divulgación, los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble se unen a la proteína PD-L1 glucosilada con una Kd al menos 5 veces menor que la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilado. En un aspecto de la divulgación, los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble se unen a la proteína PD-L1 glucosilada con una Kd al menos 10 veces menor que la Kd mostrada con respecto a la proteína PD-L1 aglucosilada. En un aspecto de la divulgación, la afinidad de unión del anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble por PD-L1 glucosilado es de 5-20 nM o de 5-10 nM, incluyendo los valores inferiores y superiores. En un aspecto de la divulgación, en un ensayo de unión de citometría de flujo celular como se describe en el ejemplo 6 , el anticuerpo muestra unión que se expresa como MFI a células que expresan PD-L1 WT que es 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces mayor que la MFI para la unión a células que expresan PD-L1 aglucosilado.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo inhibe la interacción de PD-1 con PD-L1, y particularmente inhibe la interacción de PD-1 expresado por linfocitos T efectores con PD-L1, particularmente PD-L1 glucosilado expresado por células tumorales. El anticuerpo promueve además la internalización de PD-L1 y la degradación de PD-L1, reduciendo de ese modo el nivel de PD-L1 en la superficie celular.
En otro aspecto particular de la divulgación, se proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión del mismo, que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado, que es el anticuerpo monoclonal antiglucPD-L1 STM108. El ácido nucleico (ADN) y las secuencias de aminoácidos correspondientes de los dominios variables (V) de la cadena pesada y ligera madura (SEQ ID NO: 18, 19, 26 y 27) del MAb STM108 se muestran en la tabla 3 infra. El ADN y las secuencias de aminoácidos del dominio V de la cadena pesada sin procesar (es decir, que contiene una secuencia señal en el extremo N) también se muestran en la tabla 3 (SEQ ID NO: 91 y 92, respectivamente). También se muestran en la tabla 3 las CDR del dominio V de la cadena pesada y ligera del MAb STM108, de acuerdo con las definiciones tanto de Kabat como de Chothia.
En una realización, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio VH de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y un dominio VL de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble compite por la unión específica a PD-L1 glucosilado con un anticuerpo que comprende un dominio VH de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y un dominio Vl de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. En una realización, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio Vh que comprende las CDR1-3 de Chothia que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24, respectivamente, o las CDR 1-3 de Kabat que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25, respectivamente, o una combinación de las mismas. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble compite por la unión específica a PD-L1 glucosilado con un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende las CDR 1-3 de Chothia con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 y s Eq ID NO: 24, respectivamente, o las CDR 1-3 de Kabat con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25, respectivamente, o una combinación de las mismas. En una realización, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio VL que comprende las Cd R 1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, s Eq ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32, respectivamente. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble compite por la unión específica a PD-L1 glucosilado con un anticuerpo que comprende un dominio Vl que comprende las CDR 1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32, respectivamente. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende (a) un dominio Vh que comprende las CDR 1 -3 de Chothia que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24, respectivamente, o las CDR 1-3 de Kabat que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25, respectivamente, o una combinación de las mismas; y (b) un dominio Vl que comprende las CDR 1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 , SEq ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32, respectivamente. En aspectos de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 compite por la unión específica a PD-L1 glucosilado con un anticuerpo que comprende los dominios Vh y Vl descritos anteriormente y las CDR en los mismos.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio Vh que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y un dominio Vl que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio Vh que comprende las CDR 1 -3 teniendo al menos 1,2 o las 3 CDR al menos 1,2, 3, 4 o 5 sustituciones aminoacídicas con respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24, respectivamente, o las CDR 1-3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, SeQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25, respectivamente, o una combinación de las mismas. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende un dominio Vl que comprende las CDR 1-3 teniendo al menos 1, 2 o las 3 CDR al menos 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones aminoacídicas con respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32, respectivamente. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble que se une específica y preferentemente a PD-L1 glucosilado comprende (a) un dominio Vh que comprende las CDR 1 -3 teniendo al menos 1, 2 o las 3 CDR al menos 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones aminoacídicas con respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24, respectivamente, o con respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25, respectivamente, o una combinación de las mismas; y/o (b) un dominio Vl que comprende las CDR 1-3 teniendo al menos 1, 2 o las 3 CDR al menos 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones aminoacídicas con respecto a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32, respectivamente. También se proporcionan formas humanizadas de STM108 usando las CDR definidas de AbM, Contacto o IMGT, con regiones flanqueantes humanas y, opcionalmente, dominios constantes humanos.
En aspectos de la divulgación, los anticuerpos antiglucPD-L1 anteriores se unen a PD-L1 glucosilado con una Kd menor de la mitad de la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilado. En un aspecto de la divulgación, los anticuerpos antiglucPD-L1 se unen a la proteína PD-L1 glucosilada con una Kd al menos 5 veces menor que la Kd mostrada con respecto a PD-L1 aglucosilado. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 se une a la proteína PD-L1 glucosilada con una Kd al menos 10 veces menor que la Kd mostrada con respecto a la proteína PD-L1 aglucosilada. En un aspecto de la divulgación, la afinidad de unión del MAb STM108 por PD-L1 glucosilado es de 5-20 nM o de 5-10 nM, incluyendo los valores inferiores y superiores. En un aspecto de la divulgación, en un ensayo de unión de citometría de flujo celular como se describe en el ejemplo 6 , el anticuerpo muestra unión que se expresa como MFI a células que expresan PD-L1 WT que es 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces mayor que la MFI para la unión a células que expresan PD-L1 aglucosilado. Estos anticuerpos antiglucPD-L1 inhiben la interacción de PD-1 con PD-L1, y particularmente inhiben la interacción de PD-1 expresado por linfocitos T efectores con PD-L1, particularmente PD-L1 glucosilado expresado por células tumorales.
En un aspecto de la divulgación también se engloba un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado que se une a un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos de PD-L1 humano DAGVYRCMISYGGADYKRITV (es decir, D108-V128 de SEQ ID NO: 1). En un aspecto de la divulgación, un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado se une específicamente a un epítopo de PD-L1 humano que es no contiguo y abarca las posiciones Y112, R113 y S117 de la secuencia de aminoácidos de PD-L1 humano SEQ ID NO: 1 mostrado como los residuos aminoacídicos subrayados en la siguiente secuencia: DAGVYRCMISYGGADYKRITV (SEQ ID NO: 86 ).
En un aspecto de la divulgación se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado que comprende (a) un dominio Vh que comprende una CDR H1 de Chothia que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o una CDR H1 de Kabat que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; una CDR H2 de Chothia que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o una CDR H2 de Kabat que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y una CDR H3 de Chothia que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 0 una CDR H3 de Kabat que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; y un dominio Vl que comprende una CDR L1 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; una CDR L2 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; y una CDR L3 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. También se proporcionan un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado que es una forma humanizada de STM073 que tiene las CDR de acuerdo con las definiciones de IMGT, AbM o Contacto como se destalla en la tabla 2, supra.
En otro aspecto de la divulgación se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado que comprende (a) un dominio Vh que comprende una CDR H1 de Chothia que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o una CDR H1 de Kabat que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; una CDR H2 de Chothia que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 o una CDR H2 de Kabat que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; y una CDR H3 de Chothia que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 o una CDR H3 de Kabat que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; y un dominio Vl que comprende una CDR L1 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; una CDR L2 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; y una CDR L3 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. También se proporcionan un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado que es una forma humanizada de STM108 que tiene las CDR de acuerdo con las definiciones de IMGT, AbM o Contacto como se destalla en la tabla 2, supra.
En otro aspecto de la divulgación se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, forma quimérica o humanizada del mismo, o fragmento de unión del mismo, que se une específicamente a un epítopo dentro de una secuencia de aminoácidos seleccionada de VHGEEDLKVQH....... DAGVYRCMISYGGADYKRITV (SEQ ID NO: 85), DAGVYRCMISYGGADYKRITV (SEQ ID NO: 86 ) o LKVQHSSYRQR.......EGYPKAEVIWTSSDHQ (que son los aminoácidos 74 a 84 y 158 a 173, respectivamente, de SEQ ID NO: 1), cuyas secuencias están ubicadas dentro de la secuencia del polipéptido PD-L1 humano de SEQ ID NO: 1, es decir, la proteína PD-L1 madura que comprende los aminoácidos 19-290 de SEQ ID NO: 1. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo inhibe la interacción de PD-1 con PD-L1, y particularmente inhibe la interacción de PD-1 expresado por linfocitos T efectores con PD-L1, particularmente PD-L1 glucosilado expresado por células tumorales, y también facilita la internalización de PD-L1 desde la membrana celular en la célula y la degradación intracelular del PD-L1.
En otro aspecto de la divulgación se proporciona un anticuerpo antiglucPD-LI de función doble aislado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, forma quimérica o humanizada del mismo, o fragmento de unión del mismo, que se une al mismo epítopo que el MAb STM073, o un MAb antiglucPD-L1 aislado como se describe en la presente memoria, en el que el epítopo comprende los residuos aminoacídicos H69, Y112, R113 y K124 de SEQ ID NO: 1. En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, forma quimérica o humanizada del mismo, o fragmento de unión del mismo que, cuando se une a PD-L1 glucosilado entra en contacto con al menos uno de los siguientes residuos aminoacídicos: H69, Y112, R113 y K124 de SEQ ID NO: 1. En aspectos de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 entra en contacto con al menos dos, al menos tres o cuatro de los residuos aminoacídicos que componente la una o más regiones epitópicas de PD-L1, es decir, PD-L1 humano glucosilado.
En otro aspecto de la divulgación se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, forma quimérica o humanizada del mismo, o fragmento de unión del mismo, que se une al mismo epítopo que el MAb STM108, o un MAb antiglucPD-L1 aislado que se une a un epítopo que comprende los residuos aminoacídicos S80, Y81, K162 y S169 de SEQ ID NO: 1. En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado que, cuando se une a PD-L1 glucosilado, entra en contacto con al menos uno de los siguientes residuos aminoacídicos: S80, Y81, K162 y S169 de SEQ ID NO: 1.
En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, forma quimérica o humanizada del mismo, o fragmento de unión del mismo que, cuando se une a PD-L1 glucosilado entra en contacto con al menos uno de los siguientes residuos aminoacídicos: Y112, R113 y S117 de SEQ ID NO: 1.
En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, forma quimérica o humanizada del mismo, o fragmento de unión del mismo que, cuando se une a PD-L1 glucosilado entra en contacto con al menos un aminoácido dentro de la región de aminoácidos de V68 a V128 de SEQ ID NO: 1, o dentro de la región de aminoácidos de D108 a V128 de SEQ ID NO: 1, o dentro de la región de aminoácidos de L74 a Q173 de SEQ ID NO: 1, o dentro de las regiones de aminoácidos de L74 a R84, así como de E158 a Q173 de SEQ ID NO: 1. En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, forma quimérica o humanizada del mismo, o fragmento de unión del mismo que, cuando se une a PD-L1 glucosilado entra en contacto con al menos uno del siguiente grupo de residuos aminoacídicos: H69, Y112, R113 y K124 dentro de la región de aminoácidos de V68 a V128 de SEQ ID NO: 1. En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, forma quimérica o humanizada del mismo, o fragmento de unión del mismo que, cuando se une a PD-L1 glucosilado entra en contacto con al menos uno, al menos dos, al menos tres o cuatro del siguiente grupo de residuos aminoacídicos: H69, S80, Y81, Y112, R113, K124, K162, S169 dentro de la región de aminoácidos de V68 a V173 de SEQ ID NO: 1. En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, forma quimérica o humanizada del mismo, o fragmento de unión del mismo que, cuando se une a PD-L1 glucosilado, entra en contacto con el siguiente grupo de residuos aminoacídicos: Y112, R113, S117 dentro de la región de aminoácidos de D108 a V128 de SEQ ID NO: 1.
En otro aspecto de la divulgación se proporciona un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble aislado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, forma quimérica o humanizada del mismo, o fragmento de unión del mismo que, cuando se une a PD-L1 glucosilado, se une a al menos la región de aminoácidos V68-V128 o al menos la región de aminoácidos D108-V128 de la proteína PD-L1 (SEQ ID NO: 1), o una combinación de las mismas.
Otro aspecto más de la divulgación proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o 18 que codifica un dominio Vh y una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 10 o 26 que codifica un dominio VL de anticuerpo. En un aspecto de la divulgación, se proporciona una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un dominio Vh de anticuerpo antiglucPD-L1, en la que la secuencia de nucleótidos es al menos un 90-98 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o 18. En un aspecto de la divulgación, se proporciona una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un dominio Vl de anticuerpo antiglucPD-L1, en la que la secuencia de nucleótidos es al menos un 90-98 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 19 o 26. En aspectos de la divulgación, las secuencias de nucleótidos que codifican los dominios Vh y/o Vl son un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idénticos a SEQ ID NO: 2 o 18, o SEQ ID NO: 10 o 26, respectivamente.
Tabla 3. Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de MAb antiglucPD-LI
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Tratamiento de enfermedades
En determinados aspectos, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, como se describe en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo de función doble que se une específicamente a PD-L1 glucosilado) puede administrarse para tratar un cáncer en un sujeto que padece el mismo o para evitar el cáncer en un sujeto con una predisposición (tal como una predisposición genética, exposición ambiental previa a un carcinógeno, incidencia previa de cáncer, etc.) a desarrollar un cáncer. Por consiguiente, en la presente memoria se proporcionan métodos de tratamiento de un cáncer administrando a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble para tratar el cáncer. Como se indica en la presente memoria, el tratamiento implica reducir, evitar, inhibir o bloquear el crecimiento, proliferación, migración, etc. De células cancerosas, e incluye provocar la destrucción celular o apoptosis de las células cancerosas. El tratamiento también puede evitar o provocar la regresión de la metástasis de las células tumorales. Los métodos descritos en la presente memoria proporcionan un beneficio al sujeto, por ejemplo, un paciente humano, que experimenta tratamiento, en particular con respecto a las células tumorales que expresan proteínas PD-L1 glucosiladas de superficie celular que pueden unirse/interactuar con PD-1 expresado en la superficie celular de inmunocitos efectores, tales como linfocitos T, particularmente linfocitos T citolíticos o citotóxicos.
Se espera que el tratamiento de estos sujetos con una cantidad eficaz de al menos uno de los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble como se describe provoque la unión del anticuerpo o anticuerpos a PD-L1 glucosilado en células tumorales y la prevención, bloqueo o inhibición de la interacción de PD-L1 y PD-1 y la promoción de la internalización y degradación de PD-L1 para evitar, bloquear o inhibir la interacción de las células tumorales que expresan PD-L1 con linfocitos T que expresan PD-1, previniendo o evitando de este modo la inmunosupresión de la actividad de linfocitos T y permitiendo que los linfocitos T se activen para destruir las células tumorales que portan PD-L1. En un aspecto preferido de la divulgación, el anticuerpo anti-PD-L1 de función doble se une a PD-L1 humano y el sujeto es un paciente humano. Por consiguiente, los métodos proporcionados en la presente memoria son ventajosos para un sujeto que necesita, puede beneficiarse de o que desea recibir el beneficio de, los resultados antineoplásicos conseguidos mediante la práctica de los presentes métodos. La búsqueda de un sujeto de los beneficios terapéuticos de los métodos que implican la administración de al menos un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble en una cantidad terapéuticamente eficaz, o que reciben dichos beneficios terapéuticos ofrece ventajas a la técnica. Además, los presentes métodos ofrecen las ventajas adicionales de eliminar o evitar los efectos secundarios, resultados adversos, contraindicaciones y similares, o reducir el riesgo o la posibilidad de que se produzcan dichos problemas en comparación con otros tratamientos y modalidades de tratamiento.
En aspectos específicos de la divulgación, al sujeto que padece o está predispuesto a un cáncer se le administra una cantidad terapéuticamente eficaz de una forma humanizada o quimérica de STM073 o STM108 que es un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble. Puede ser ventajoso administrar más de un tipo de anticuerpo antiglucPD-L1 para el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, pueden coadministrarse formas quiméricas o humanizadas tanto de STM073 como de STM108 a un paciente que lo necesite. Como alternativa, puede coadministrarse una forma quimérica o humanizada de STM073 con otro anticuerpo antiglucPD-L1 a un paciente que lo necesite o puede coadministrarse una forma quimérica o humanizada de STM108 con otro anticuerpo antiglucPD-L1 a un paciente que lo necesite. La coadministración de los anticuerpos antiglucPD-L1 puede ser más terapéutica o profilácticamente eficaz que la administración de cualquier anticuerpo en solitario y/o puede permitir la administración de una dosis menor o con menor frecuencia que cualquier anticuerpo en solitario.
Los cánceres para los que los presentes métodos de tratamiento son útiles incluyen cualquier tipo de célula maligna, tal como las encontradas en un tumor sólido o un tumor hemático, particularmente tumores con células que expresan PD-L1 glucosilado en su superficie. En general, un tumor se refiere a una neoplasia o masa de tejido maligna o una potencialmente maligna de cualquier tamaño, e incluye tumores primarios y tumores secundarios. Un tumor sólido es una masa o crecimiento de tejido anómalo que habitualmente no contiene quistes o líquido. Tumores sólidos ejemplares pueden incluir, aunque sin limitación, un tumor de un órgano seleccionado del grupo que consiste en páncreas, vesícula biliar, colon, ciego, estómago, cerebro, cabeza, cuello, ovario, testículos, riñón, laringe, sarcoma, pulmón, vejiga, melanoma, próstata y mama. Tumores hemáticos ejemplares incluyen tumores de la médula ósea, neoplasias de linfocitos T o B, leucemias, linfomas, blastomas, mielomas y similares. Ejemplos adicionales de cánceres que pueden tratarse usando los métodos proporcionados en la presente memoria incluyen, aunque sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, leucemia, cáncer escamocelular, cáncer pulmonar (incluyendo cáncer pulmonar microcítico, cáncer pulmonar no microcítico, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón), cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal y cáncer estromal gastrointestinal), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervicouterino, cáncer de ovario, cáncer hepático, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello, melanoma, melanoma de propagación superficial, melanoma sobre lentigo maligno, melanomas lentiginosos acrales, melanomas nodulares, así como linfoma de linfocitos B (incluyendo linfoma no hodgkiniano (NHL) de bajo grado/folicular; NHL linfocítico pequeño (SL); NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL pequeño de células no escindidas de alto grado; NHL voluminoso; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfoblástica aguda (ALL), tricoleucemia, mieloma múltiple, leucemia mieloide aguda (AML) y leucemia mieloblástica crónica.
El cáncer puede ser específicamente de los siguientes tipos histológicos, aunque no tienen que limitarse a estos: neoplasia, maligna; carcinoma; carcinoma, indiferenciado; carcinoma de giganticos y fusocelular; carcinoma microcítico; carcinoma papilar; carcinoma escamocelular; carcinoma linfoepitelial; carcinoma basocelular; carcinoma de pilomatriz; carcinoma de células transicionales; carcinoma papilar de células transicionales; adenocarcinoma; gastrinoma, maligno; colangiocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carcinoma hepatocelular y colangiocarcinoma combinado; adenocarcinoma trabecular; carcinoma quístico adenoide; adenocarcinoma en pólipo adenomatoso; adenocarcinoma, poliposis coli familiar; carcinoma sólido; tumor carcinoide, maligno; adenocarcinoma branquioloalveolar; adenocarcinoma papilar; carcinoma cromófobo; carcinoma acidófilo; adenocarcinoma oxífilo; carcinoma basófilo; adenocarcinoma de células claras; carcinoma de células granulares; adenocarcinoma folicular; adenocarcinoma papilar y folicular; carcinoma esclerosante no encapsulante; carcinoma cortical suprarrenal; carcinoma endometroide; carcinoma de anejos cutáneos; adenocarcinoma apocrino; adenocarcinoma sebáceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermoide; cistadenocarcinoma; cistadenocarcinoma papilar; cistadenocarcinoma seroso papilar; cistadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma de células en anillo de sello; carcinoma de conductos infiltrantes; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatorio; enfermedad de Paget, mamario; carcinoma de células acinares; carcinoma adenoescamoso; adenocarcinoma con metaplasia escamosa; timoma, maligno; tumor estromal de ovario, maligno; tecoma, maligno; tumor de células de la granulosa, maligno; androblastoma, maligno; carcinoma de células de Sertoli; tumor de células de Leydig, maligno; tumor de células lipídicas, maligno; paraganglioma, maligno; paraganglioma extramamario, maligno; feocromocitoma; glomangiosarcoma; melanoma maligno; melanoma amelanótico; melanoma de propagación superficial; melanoma maligno en nevo pigmentado gigante; melanoma de células epitelioides; nevo azul, maligno; sarcoma; fibrosarcoma; histiocitoma fibroso, maligno; mixosarcoma; liposarcoma; leiomiosarcoma; rabdomiosarcoma; rabdomiosarcoma embrionario; rabdomiosarcoma alveolar; sarcoma estromal; tumor mixto, maligno; tumor mixto muleriano; nefroblastoma; hepatoblastoma; carcinosarcoma; mesenquimoma, maligno; tumor de Brenner, maligno; tumor filodes, maligno; sarcoma sinovial; mesotelioma, maligno; disgerminoma; carcinoma embrionario; teratoma, maligno; bocio del ovario, maligno; coriocarcinoma; mesonefroma, maligno; hemangiosarcoma; hemangioendotelioma, maligno; sarcoma de Kaposi; hemangiopericitoma, maligno; limfangiosarcoma; osteosarcoma; osteosarcoma yuxtacortical; condrosarcoma; condroblastoma, maligno; condrosarcoma mesenquimatoso; tumor de gigantocitos del hueso; sarcoma de Ewing; tumor odontogénico, maligno; odontosarcoma ameloblástico; ameloblastoma, maligno; fibrosarcoma ameloblástico; pinealoma, maligno; cordoma; glioma, maligno; ependimoma; astrocitoma; astrocitoma protoplásmico; astrocitoma fibrilar; astroblastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligodendroblastoma; neuroectodérmico primitivo; sarcoma cerebeloso; ganglioneuroblastoma; neuroblastoma; retinoblastoma; tumor neurogénico olfativo; meningioma, maligno; neurofibrosarcoma; neurilemoma, maligno; tumor de células granulares, maligno; linfoma maligno; enfermedad de Hodgkin; paragranuloma; linfoma maligno, linfocítico pequeño; linfoma maligno, macrocítico, difuso; linfoma maligno, folicular; micosis fungoide; otros linfomas no hodgkinianos especificados; histiocitosis maligna; mieloma múltiple; sarcoma de mastocitos; enfermedad inmunoproliferativa del intestino delgado; leucemia; leucemia linfoide; leucemia de plasmocitos; eritroleucemia; leucemia de célula de linfosarcoma; leucemia mieloide; leucemia basófila; leucemia eosinófila; leucemia monocítica; leucemia de mastocitos; leucemia megacarioblástica; sarcoma mieloide; y tricoleucemia.
El cáncer a tratar preferiblemente es positivo para PD-L1, particularmente PD-L1 glucosilado. En determinados aspectos de la divulgación, las células tumorales también son positivas para un marcador de células tumorales tal como expresión de EGFR o HER2/neu, por ejemplo, como se expresa en células de cáncer de mama. La presencia o ausencia de estos marcadores puede indicar que la politerapia con un producto terapéutico dirigido, tal como un inhibidor de tirosina cinasa, por ejemplo, gefitinib para un cáncer positivo a EGFR, o Herceptin para un cáncer positivo a HER2/neu, en combinación con los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble como se describe en la presente memoria, proporcionaría un beneficio de tratamiento para un sujeto que lo necesite. En determinados aspectos de la divulgación, el cáncer es un BLBC.
Otros marcadores que pueden usarse para caracterizar los cánceres para guiar la elección de tratamiento o supervisar el tratamiento incluyen reordenamientos génicos y sobreexpresión de ALK en cáncer pulmonar no microcítico y linfoma macrocítico anaplásico; alfa-fetoproteína (AFP) para cáncer hepático y tumores de células germinales; beta-2-microglobulina (B2M) para mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica, y algunos linfomas; gonadotropina coriónica humana beta (Beta-hCG) para coriocarcinoma y tumores de células germinales; mutaciones génicas de BRCA1 y BRCA2 para cáncer de ovario y cáncer de mama; gen de fusión BCR-ABL (cromosoma Philadelphia) para leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda y leucemia mielógena aguda; mutaciones de BRAF V600 para melanoma cutáneo y cáncer colorrectal; C-kit/CD117 para tumor estromal gastrointestinal y melanoma mucoso; CA15-3/CA27.29 para cáncer de mama; CA19-9 para cáncer pancreático, cáncer de vesícula biliar, cáncer de las vías biliares y cáncer gástrico; CA-125 para cáncer de ovario; calcitonina para cáncer medular de tiroides; antígeno carcinoembrionario (CEA) para cáncer colorrectal y algunos otros cánceres; CD20 para linfoma no hodgkiniano; cromogranina A (CgA) para tumores neuroendocrinos; cromosomas 3, 7, 17 y 9p21 para cáncer de vejiga; fragmento 21 -1 de citoqueratina para cáncer pulmonar; análisis de mutación del gen EGFR para cáncer pulmonar no microcítico; receptor de estrógenos (ER)/receptor de progesterona (PR) para cáncer de mama; fibrina/fibrinógeno para cáncer de vejiga; HE4 para cáncer de ovario; amplificación del gen HER2/neu o sobreexpresión de la proteína para cáncer de mama, cáncer gástrico y adenocarcinoma de la unión gastroesofágica; inmunoglobulinas para mieloma múltiple y macroglobulinemia de Waldenstrom; análisis de mutación génica de KRAS para cáncer colorrectal y cáncer pulmonar no microcítico; lactato deshidrogenasa para tumores de células germinales, linfoma, leucemia, melanoma y neuroblastoma; enolasa específica de neuronas (NSE) para cáncer pulmonar microcítico y neuroblastoma; proteína 22 de la matriz nuclear para cáncer de vejiga; antígeno prostático específico (PSA) para cáncer de próstata; tiroglobulina para cáncer de tiroides; y activador de plasminógeno de urocinasa (uPA) e inhibidor del activador de plasminógeno (PAI-1) para cáncer de mama.
Los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble pueden usarse como agentes antitumorales en una diversidad de modalidades. Un aspecto particular de la divulgación se refiere a métodos de uso de un anticuerpo como agente antitumoral y, por lo tanto, comprende poner en contacto una población de células tumorales con una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo, o una composición que contiene el anticuerpo, durante un periodo de tiempo suficiente para bloquear o inhibir el crecimiento de células tumorales o la lograr la apoptosis de las células tumorales. En un aspecto de la divulgación, el contacto de una célula tumoral in vivo se consigue administrando a un paciente que lo necesita, por ejemplo, por inyección intravenosa, subcutánea, intraperitoneal o intratumoral, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición fisiológicamente tolerable que comprende un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble como se describe en la presente memoria. El anticuerpo puede administrarse por vía parenteral por inyección o por infusión gradual a lo largo del tiempo. Las pautas de administración y suministro útiles incluyen intravenosa, intraperitoneal, oral, intramuscular, subcutánea, intracavidad, intratecal, transdérmica, dérmica, medios peristálticos o inyección directa en el tejido que contiene las células tumorales.
Las composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos se administran convencionalmente por vía intravenosa, tal como por inyección de una dosis unitaria, por ejemplo. La expresión "dosis unitaria", cuando se usa en referencia a una composición terapéutica se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosificación unitaria para el sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente requerido, es decir, vehículo o medio. Las composiciones que contienen anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad a administrar depende del sujeto a tratar, la capacidad del sistema del sujeto de utilizar el ingrediente activo, y el grado de efecto terapéutico deseado. Las cantidades precisas de ingrediente activo a administrar dependen del criterio del facultativo y son peculiar para cada individuo. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados para aplicación sistémica se divulgan en la presente memoria y dependen de la vía de administración. También se contemplan pautas adecuadas para administración inicial y de refuerzo y pueden implicar típicamente una administración inicial seguida de dosis repetidas en uno o más intervalos (horas) mediante una inyección posterior u otra administración. Múltiples administraciones ejemplares son adecuadas para mantener de manera continua altos niveles en suero y tejido del anticuerpo. Como alternativa, se contempla infusión intravenosa continua suficiente para mantener las concentraciones en la sangre en los intervalos especificados para tratamientos in vivo.
Se contempla que un anticuerpo antiglucPD-L1 puede administrarse de forma sistémica o local para tratar una enfermedad, tal como para inhibir el crecimiento de células tumorales o para destruir las células cancerosas en paciente con cáncer con cánceres localmente avanzados o metastásicos. Los anticuerpos pueden administrarse en solitario o en combinación con fármacos antiproliferativos o fármacos antineoplásicos. En un aspecto de la divulgación, los anticuerpos antiglucPD-L1 se administran para reducir la carga del cáncer en el paciente antes de cirugía u otros procedimientos. Como alternativa, pueden administrarse a intervalos periódicos después de cirugía para garantizar que cualquier cáncer restante (por ejemplo, cáncer que la cirugía no ha logrado eliminar) se reduzca de tamaño o de capacidad de crecimiento y/o no sobreviva. Como se indica anteriormente en la presente memoria, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo es una cantidad predeterminada calculada para conseguir el efecto deseado. Por tanto, los intervalos de dosificación para la administración de un anticuerpo antiglucPD-L1 son aquellos suficientemente grandes para producir el efecto deseado en que se reducen los síntomas de división celular tumoral o ciclo celular. De forma óptima, la dosificación no debe ser tan grande para provocar efectos secundarios adversos, tales como síndromes de hiperviscosidad, edema pulmonar, insuficiencia cardiaca congestiva, efectos neurológicos y similares. En general, la dosificación variará con la edad, estado, tamaño y género de, y grado de la enfermedad en el paciente y puede determinarla un experto en la materia tal como facultativo médico o médico. Por supuesto, la dosificación puede ajustarse por el médico individual en caso de cualquier complicación.
Métodos de tratamiento
En determinados aspectos de la divulgación, las composiciones y métodos como se describen implican la administración de un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble, en solitario o en combinación con un segundo fármaco o tratamiento o uno adicional. Dichos fármaco o tratamiento puede aplicarse en el tratamiento de cualquier enfermedad que esté asociada con PD-L1 o PD-L1 glucosilado, preferiblemente con la interacción de PD-L1 humano o PD-L1 humano glucosilado con PD-1 humano. Por ejemplo, la enfermedad puede ser un cáncer. Las composiciones y métodos que comprenden al menos un anticuerpo anti-PD-L1 que se une preferentemente a la proteína PD-L1 glucosilada y tanto bloquea o inhibe la unión de PD-L1 a PD-1 como promueve la internalización y degradación de PD-L1, o una parte de unión del mismo, tiene un efecto terapéutico o protector en el tratamiento de un cáncer u otra enfermedad, particularmente evitando, reduciendo, bloqueando o inhibiendo la interacción de PD-1/PD-L1, proporcionando de ese modo un efecto terapéutico y tratamiento.
Las composiciones y métodos, incluyendo las politerapias, tienen un efecto terapéutico o protector y pueden potenciar el efecto terapéutico o protector, y/o aumentan el efecto terapéutico de otro tratamiento antineoplásico o antihiperproliferativo. Los métodos y composiciones terapéuticas y profilácticas pueden proporcionarse en una cantidad combinada eficaz para conseguir el efecto deseado, tal como la destrucción de una célula cancerosa y/o la inhibición de la hiperproliferación celular. Este proceso puede implicar la administración de un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble o un fragmento de unión del mismo y un segundo tratamiento. El segundo tratamiento puede tener o no un efecto citotóxico directo. Por ejemplo, el segundo tratamiento puede ser un agente que regula por aumento el sistema inmunitario sin tener un efecto citotóxico directo. Un tejido, tumor y/o célula puede exponerse a una o más composiciones o una o más formulaciones farmacológicas que comprenden uno o más de los agentes (por ejemplo, un anticuerpo o un agente antineoplásico), o exponiendo el tejido, tumor y/o célula con dos o más composiciones o formulaciones distintas, en el que una composición proporciona, por ejemplo, 1 ) un anticuerpo, 2 ) un agente antineoplásico, 3) tanto un anticuerpo como un agente antineoplásico, o 4) dos o más anticuerpos. En algunos aspectos de la divulgación, el segundo tratamiento también es un anticuerpo anti-PD-L1, preferiblemente un anticuerpo antiglucPD-L1 que se une preferentemente a PD-L1 glucosilado frente a PD-L1 aglucosilado o, en otros aspectos de la divulgación, un anticuerpo anti-PD-1. Sin limitación, los anticuerpos anti-PD-1 ejemplares incluyen pembrolizumab y nivolumab; los anticuerpos anti-PD-L1 ejemplares incluyen atezolizumab. Además, se contempla que dicha politerapia puede usarse junto con quimioterapia, radioterapia, tratamiento quirúrgico o inmunoterapia.
A modo de ejemplo, las expresiones "en contacto" y "expuesta", cuando se aplican a una célula, se usan en la presente memoria para describir un proceso por el que un polipéptido terapéutico, preferiblemente un anticuerpo antiglucPD-L1 como se describe en la presente memoria, se suministra a una célula diana o se coloca en yuxtaposición directa con la célula diana, particularmente para unirse específicamente al antígeno diana, por ejemplo, PD-L1, particularmente, PD-L1 glucosilado, expresado o muy expresado en la superficie de células tumorales o cancerosas. Dicha unión mediante un anticuerpo antiglucPD-L1 terapéutico o fragmento de unión del mismo evita, bloquea, inhibe o reduce la interacción del PD-L1 expresado por la célula tumoral o cancerosa con PD-1 en un linfocito T efector, evitando de ese modo la inmunosupresión asociada con la interacción de PD-L1/PD-1. En aspectos de la divulgación, también se administra o suministra un agente quimioterápico o radioterápico al sujeto junto con el anticuerpo antiglucPD-L1 o fragmento de unión del mismo. Para conseguir la destrucción celular, por ejemplo, se suministran uno o más agentes a una célula en una cantidad combinada eficaz para destruir la célula o evitar que se divida.
Un anticuerpo antiglucPD-L1 puede administrarse antes, durante, después o en diversas combinaciones con respecto a otro tratamiento antineoplásico. Las administraciones pueden ser en intervalos que varían de simultáneamente hasta minutos a días a semanas antes o después entre ellas. En aspectos de la divulgación en que el anticuerpo se proporciona a un paciente por separado de un agente antineoplásico, en general se garantizaría que no pasara un periodo de tiempo significativo entre el momento de cada suministro, de modo que los compuestos administrados aún pudieran ejercer un efecto ventajosamente combinado para el paciente. De forma ilustrativa, en dichos casos, se contempla que se puede proporcionar a un paciente el anticuerpo y el tratamiento antineoplásico en aproximadamente 12 a 24 o 72 h entre sí y, más particularmente, en aproximadamente 6-12 h entre sí. En algunas situaciones, puede ser deseable prolongar el periodo de tiempo para el tratamiento significativamente donde pasan varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1,2, 3, 4, 5, 6 , 7 u 8 ) entre las respectivas administraciones.
En determinados aspectos de la divulgación, un curso de tratamiento o ciclo de tratamiento durará 1-90 días o más (este intervalo incluye días intermedios y el último día). Se contempla que un agente puede administrarse en cualquier día desde el día 1 al día 90 (este intervalo incluye días intermedios y el último día) o cualquier combinación de los mismos, y otro agente se administra en cualquier día desde el día 1 al día 90 (este intervalo incluye días intermedios y el último día) o cualquier combinación de los mismos. En un solo día (periodo de 24 horas), al paciente se le puede administrar una o múltiples administraciones del uno o más agentes. Además, después de un ciclo de tratamiento, se contempla que puede haber un periodo de tiempo en que no se administra tratamiento antineoplásico. Este periodo de tiempo puede durar, por ejemplo, durante 1-7 días, y/o 1-5 semanas, y/o 1-12 meses o más (este intervalo incluye días intermedios y el punto temporal superior), dependiendo del estado del paciente, tal como el pronóstico, la resistencia, la salud, etc. Los ciclos de tratamiento se repetirían según lo necesario. Pueden emplearse diversas combinaciones de tratamientos. En los ejemplos representativos de pautas de tratamiento de combinación mostrados a continuación, un anticuerpo, tal como un anticuerpo antiglucPD-L1 o fragmento de unión del mismo se representa mediante "A" y un tratamiento antineoplásico se representa mediante "B":
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A.
La administración de cualquier anticuerpo o tratamiento de los presentes aspectos de la divulgación a un paciente seguirá los protocolos generales para la administración de dichos compuestos, teniendo en cuenta la toxicidad, si la hay, de los agentes. Por lo tanto, en algunos aspectos de la divulgación, hay una etapa de supervisión de los acontecimientos adversos y la toxicidad, particularmente los que pueden ser atribuibles a politerapia.
En un aspecto de la divulgación, se proporciona un método que implica la administración de un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble en solitario o en combinación con otro agente antineoplásico a un paciente que lo necesita, es decir, un paciente con un cáncer o tumor. Antes de la administración del anticuerpo antiglucPD-L1, puede evaluarse una muestra del tumor o cáncer del paciente para la presencia de PD-L1. Si los resultados de dicha evaluación revelan que el tumor o cáncer del paciente es positivo para PD-L1 glucosilado, el paciente se seleccionaría para tratamiento, basado en la probabilidad de que el tumor o cáncer glucPD-L1+ del paciente fuera más susceptible a tratamiento con el anticuerpo antiglucPD-L1 y el tratamiento puede continuar con un resultado más probablemente beneficioso. Un profesional médico o médico puede aconsejar al paciente a seguir con el método de tratamiento con anticuerpo antiglucPD-L1, y el paciente puede decidir continuar con el tratamiento basándose en el consejo del profesional médico o médico. Además, durante el ciclo de tratamiento, las células tumorales o cancerosas del paciente pueden ensayarse para la presencia de PD-L1 glucosilado como una manera de supervisar el progreso o la eficacia del tratamiento. Si el ensayo muestra un cambio, pérdida o disminución, por ejemplo, en PD-L1 glucosilado en las células tumorales o cancerosas del paciente, el profesional médico puede tomar una decisión junto con el paciente en cuanto a si el tratamiento debe continuar o alterarse de alguna manera, por ejemplo, una dosificación mayor, la adición de otro agente o tratamiento antineoplásico y similares.
Quimioterapia
Puede usarse una amplia diversidad de agentes quimioterápicos de acuerdo con los métodos de tratamiento o terapéuticos de los presentes aspectos de la divulgación. El término "quimioterapia" se refiere al uso de fármacos para tratar el cáncer. Un "agente quimioterápico" indica un compuesto o composición que se administra en el tratamiento del cáncer. Dichos agentes o fármacos se clasifican por su modo de actividad dentro de una célula, por ejemplo, si afectan al ciclo celular y en qué fase del mismo y al crecimiento y proliferación celular. Como alternativa, un agente quimioterápico puede caracterizarse basándose en su capacidad de reticular directamente el ADN, de intercalarse en el ADN o de inducir aberraciones cromosómicas y mitóticas afectando a la síntesis de ácidos nucleicos en una célula.
Ejemplos no limitantes de agentes quimioterápicos incluyen agentes alquilantes, tales como tiotepa y ciclosfosfamida; alquil sulfonatos, tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 and criptoficina 8 ); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1 -TM1 ); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno, tales como clorambucilo, clornafazina, ciclofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida y uramustina; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos, tales como los antibióticos de enediino (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gamma 1 y calicheamicina omega 1); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos antibióticos cromoproteínicos relacionados de enediino, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluyendo morfolinodoxorrubicina, cianomorfolinodoxorrubicina, 2 -pirrolinodoxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina y zorrubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico, tales como denopterina, pteropterina y trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6 -mercaptopurine, tiamiprina y tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6 -azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina y floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano y testolactona; antisuprarrenales, tales como mitotano y trilostano; reponedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides, tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK; razoxano; rizoxina; sizofirán; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2 ,2 ',2 "-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; taxoides, por ejemplo, paclitaxel y docetaxel gemcitabina; 6 -tioguanina; mercaptopurina; complejo de coordinación de platino, tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecán (por ejemplo, CPT-11); inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tales como ácido retinoico; capecitabina; carboplatino, procarbazina, plicomicina, gemcitabina, navelbina, inhibidors de la farnesil-proteína tansferasa, transplatino y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Radioterapia
Radioterapia incluye tratamientos con agentes que provocan daños al ADN. La radioterapia se ha usado ampliamente en tratamientos del cáncer y enfermedades y abarca lo que se conoce habitualmente como rayos y, rayos X y/o el suministro dirigido de radioisótopos a células tumorales. También se contemplan otras formas de factores dañinos del ADN, tales como microondas, irradiación con haces de protones (patentes de Estados Unidos n.° 5.760.395 y 4.870.287), e irradiación con UV. Es muy probable que todos estos factores logren una amplia gama de daños en el propio ADN, en los precursores de ADN, en la replicación y reparación del ADN, y en el ensamblaje y mantenimiento de los cromosomas. Intervalos de dosificación ejemplares para rayos X varían de dosis diarias de 50 a 200 roentgenios durante periodos prolongados de tiempo (de 3 a 4 semanas) a dosis únicas de 2000 a 6000 roentgenios. Los intervalos de dosificación para radioisótopos varían ampliamente y dependen de la semivida del isótopo, la fuerza y tipo de radiación emitida, la captación por células neoplásicas, y la tolerancia del sujeto que se somete a tratamiento.
Inmunoterapia
En algunos aspectos de los métodos, pueden usarse inmunoterapias en combinación o junto con la administración de anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble como se describe en la presente memoria. En el contexto del tratamiento del cáncer, los inmunoterápicos en general se basan en el uso de inmunocitos y moléculas efectoras para abordar y destruir células cancerosas. Rituximab (RITUXAN®) es un ejemplo de este tipo. También pueden administrarse otros inhibidores del punto de control en combinación, incluyendo ipilimumab. Los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble también pueden administrarse en combinación con otros inhibidores anti-PD-1 o anti-PD-L1, tales como anticuerpos contra PD-L1, que incluyen atezolizumab, durvalumab o avelumab, o anticuerpos contra PD-1, incluyendo nivolumab, pembrolizumab o pidilizumab. Además, puede administrarse uno o más de los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble de los aspectos de la divulgación en combinación entre sí. El efector inmunitario puede ser, por ejemplo, un anticuerpo específico para un marcador (proteína de superficie celular o receptor) en la superficie de una célula tumoral. El anticuerpo en solitario puede servir como efector de tratamiento o puede reclutar otras células para lograr realmente la destrucción celular. El anticuerpo también puede conjugarse con un fármaco o toxina (quimioterápico, radionúclido, cadena de ricina A, toxina colérica, toxina pertúsica, etc.) y servir simplemente como agente de dirección. Como alternativa, el efecto puede ser un linfocito que porta una molécula de superficie que interactúa, directa o indirectamente, con una diana de célula tumoral, por ejemplo, la interacción de PD-1 en linfocitos T/PD-L1 en células tumorales. Diversas células efectoras incluyen linfocitos T citotóxicos y linfocitos citolíticos naturales (NK).
En un aspecto de inmunoterapia, la célula tumoral debe portar algún marcador (proteína/receptor) que es susceptible de abordar. Óptimamente, la proteína marcadora/receptor del tumor no está presente en la mayoría de otras células, tal como células no cancerosas o células normales. Existen muchos marcadores tumorales y cualquiera de estos puede ser adecuado para abordarlo por otro fármaco o tratamiento administrado con un anticuerpo antiglucPD-L1 en el contexto de los presentes aspectos de la divulgación. Marcadores tumorales comunes incluyen, por ejemplo, CD20, antígeno carcinoembrionario (CEA), tirosinasa (p97), gp68 , TAG-72, HMFG, antígeno de sialil Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor de laminina, erbB y p155. Un aspecto alternativo de inmunoterapia es combinar afectos antineoplásicos con efectos inmunoestimuladores. También existen moléculas inmunoestimuladoras e incluyen citocinas, tales como IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, IFN gamma; quimiocinas, tales como MIP-1, MCP-1, IL-8 ; y factores de crecimiento, tales como ligando FLT3.
Ejemplos de inmunoterapias actualmente en investigación o en uso son inmunoadyuvantes, por ejemplo, Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, dinitroclorobenceno y compuestos aromáticos (patentes de Estados Unidos n.° 5.801.005 y 5.739.169; Hui y Hashimoto, 1998, Infection Immun., 66 (11 ):5329-5336; Christodoulides et al., 1998, Microbiology, 144(Pt 11):3027-3037); citocinoterapia, por ejemplo, interferones a, p y y ; IL-1, GM-CSF y Tn F (Bukowski et al., 1998, Clinical Cáncer Res., 4(10):2337-2347; Davidson et al., 1998, J. Immunother., 21(5):389-398; Hellstrand et al., 1998, Acta Oncologica, 37(4):347-353); genoterapia, por ejemplo, Tn F, IL-1, IL-2 y p53 (Qin et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(24):14411-14416; Austin-Ward et al., 1998, Revista Médica de Chile, 126(7):838-845; patentes de Estados Unidos n.° 5.830.880 y 5.846.945); y anticuerpos monoclonales, por ejemplo, anti-CD20, antigangliósido GM2 y anti-p185 (Hollander, 2012, Front. Immun., 3:3; Hanibuchi et al., 1998, Int. J. Cancer, 78(4):480-485; patente de Estados Unidos n.° 5.824.311). Se contempla que puede emplearse uno o más tratamientos antineoplásicos con los tratamientos de anticuerpos descritos en la presente memoria.
Cirugía
Aproximadamente un 60 % de los individuos con cáncer se somete a cirugía de algún tipo, que incluye cirugía preventiva, de diagnóstico o estadificación, curativa y paliativa. La cirugía curativa incluye resección en que todo o parte del tejido canceroso se elimina físicamente, se escinde y/o se destruye y puede usarse junto con otros tratamientos, tal como tratamiento con anticuerpo antiglucPD-L1 como se describe en la presente memoria, quimioterapia, radioterapia, hormonoterapia, genoterapia, inmunoterapia y/o tratamientos alternativos, así como combinaciones de los mismos. Resección tumoral se refiere a la eliminación física de al menos parte de un tumor. Además de la resección tumoral, el tratamiento por cirugía incluye cirugía láser, criocirugía, electrocirugía y cirugía controlada con microscopio (cirugía de Mohs). Tras la escisión de parte o la totalidad de las células cancerosas, tejido o tumor, puede formarse una cavidad en el organismo. El tratamiento puede conseguirse por perfusión, inyección directa o aplicación local en la zona de un tratamiento antineoplásico adicional. Dicho tratamiento puede repetirse, por ejemplo, cada 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, o cada 1,2, 3, 4 y 5 semanas o cada 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11 o 12 meses. Estos tratamientos pueden ser, además, de dosificaciones variables.
Purificación de proteínas
Las técnicas de purificación de proteínas, incluyendo anticuerpos y, específicamente, anticuerpos antiglucPD-LI, son bien conocidas por los expertos en la materia. Estas técnicas implican, a un nivel, la homogeneización y fraccionamiento en bruto de las células, tejido u órgano en fracciones polipeptídicas y no polipeptídicas. La proteína o polipéptido de interés puede purificarse además usando técnicas cromatográficas y electroforéticas para conseguir purificación parcial o completa (o purificación a homogeneidad) salvo que se especifique de otro modo. Métodos analíticos particularmente adecuados para la preparación de una proteína o péptido puro son cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de fase inversa, cromatografía en hidroxiapatita, electroforesis en gel de poliacrilamida, cromatografía de afinidad, cromatografía de inmunoafinidad y enfoque isoeléctrico. Un método particularmente eficaz de purificación de péptidos es cromatografía de líquidos de funcionamiento rápido (FPLC) o incluso cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). Como se sabe en general en la técnica, el orden de realización de las diversas etapas de purificación puede cambiarse, y/o puede omitirse determinadas etapas, y aún producir un método adecuado para la preparación de un polipéptido sustancialmente purificado.
Un polipéptido purificado, tal como un anticuerpo antiglucPD-L1 como se describe en la presente memoria, se refiere a un polipéptido que se puede aislar o se aísla de otros componentes y se purifica a cualquier grado con respecto a su estado obtenible de manera natural. Un polipéptido aislado o purificado, por lo tanto, también se refiere a un polipéptido libre del entorno en que puede producirse de forma natural, por ejemplo, células, tejidos, órganos, muestras biológicas y similares. En general, "purificado" se referirá a una composición de polipéptido que se ha sometido a fraccionamiento para eliminar otros diversos componentes, y cuya composición retiene sustancialmente su actividad biológica expresada. Una composición "sustancialmente purificada" se refiere a una en que el polipéptido forma el componente principal de la composición y, por tanto, constituye aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o más del componente proteínico de la composición.
Diversos métodos para cuantificar el grado de purificación de polipéptidos, tales como proteínas de anticuerpo, son conocidos por los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación. Estos incluyen, por ejemplo, determinar la actividad específica de una fracción activa, o evaluar la cantidad de polipéptidos dentro de una fracción por análisis de SDS/PAGE. Un método preferido para evaluar la pureza de una fracción es calcular la actividad específica de la fracción, compararla con la actividad específica del extracto inicial, y calcular, por tanto, el grado de pureza en la misma, evaluada mediante un "número factorial de purificación". Las unidades reales usadas para representar la cantidad de actividad dependerán, por supuesto, de la técnica de ensayo particular elegida para seguir a la purificación, y si el polipéptido expresado muestra o no una actividad detectable.
No hay necesidad general de que el polipéptido se proporcione siempre en su estado más purificado. De hecho, se contempla que productos purificados menos sustancialmente puedan tener utilidad en determinados aspectos de la divulgación. Puede conseguirse purificación parcial usando menos etapas de purificación en combinación, o utilizando formas diferentes del mismo esquema de purificación general. Por ejemplo, se aprecia que una cromatografía en columna de intercambio catiónico realizada utilizando un aparto de HPLC en general producirán un "factor" de purificación mayor que la misma técnica utilizando un sistema de cromatografía de baja presión. Los métodos que muestran un grado menor de purificación relativa pueden tener ventajas en la recuperación total de producto proteínico, o en el mantenimiento de la actividad de una proteína expresada.
La cromatografía de afinidad es un procedimiento cromatográfico que se basa en la afinidad específica entre una sustancia (proteína) a aislar y una molécula a la que puede unirse específicamente, por ejemplo, un tipo de interacción de receptor-ligando. El material de la columna (resina) se sintetiza acoplando covalentemente uno de los compañeros de unión a una matriz insoluble. El material de la columna entonces puede adsorber específicamente la sustancia desde la solución que se pasa sobre la resina de la columna. La elución se produce cambiando las condiciones a aquellas en que la unión se altere/no se produzca (por ejemplo, pH, fuerza iónica, temperatura alterada, etc.). La matriz debe ser una sustancia que no adsorba moléculas a ningún grado significativo y que tenga un amplio intervalo de estabilidad química, física y térmica. El ligando debe acoplarse de tal manera que no afecte a sus propiedades de unión. El ligando también debe proporcionar unión relativamente estrecha; sin embargo, la elución de la sustancia unida debe producirse sin destruir la proteína de muestra o deseada o el ligando.
La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) es un método cromatográfico en que moléculas en solución se separan basándose en su tamaño, o en términos más técnicos, su volumen hidrodinámico. Habitualmente se aplica a moléculas grandes o complejos macromoleculares, tales como proteínas y polímeros industriales. Típicamente, cuando se usa una solución acuosa para transportar la muestra a través de la columna, la técnica se conoce como cromatografía de filtración en gel, frente al nombre cromatografía de permeación en gel, que se usa cuando se usa un disolvente orgánico como fase móvil. El principio subyacente de SEC es que partículas de diferentes tamaños eluirán (filtrarán) a través de una fase estacionaria a diferentes velocidades, provocando la separación de una solución de partículas basada en el tamaño. Siempre que todas las partículas se carguen simultáneamente o casi simultáneamente, las partículas del mismo tamaño deben eluir juntas.
La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (anteriormente conocida como alta presión) (HPLC) es una forma de cromatografía en columna usada frecuentemente en bioquímica y química analítica para separar, identificar y cuantificar compuestos. La HPLC utiliza una columna que aloja material de compactación cromatográfico (fase estacionaria), una bomba que mueve la una o más fases móviles a través de la columna, y un detector que muestra los tiempos de retención de las moléculas. El tiempo de retención varía dependiendo de las interacciones entre la fase estacionaria, las moléculas que se están analizando y el uno o más disolventes usados.
Preparaciones farmacéuticas
Cuando se emprende la aplicación clínica de una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble o polipéptido PD-L1 glucosilado, en general es beneficioso preparar una composición farmacéutica o terapéutica apropiada para la aplicación pretendida. En general, las composiciones farmacéuticas pueden comprender una cantidad eficaz de uno o más polipéptidos o agentes adicionales disueltos o dispersos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En determinados aspectos de la divulgación, las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, al menos aproximadamente un 0,1 % de un polipéptido o anticuerpo. En otros aspectos de la divulgación, un polipéptido o anticuerpo puede comprender entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 75 % del peso de la unidad, o entre aproximadamente un 25 % y aproximadamente un 60 %, por ejemplo, y cualquier intervalo derivable entre ellos, incluyendo los valores superiores e inferiores. La cantidad de uno o más compuestos activos en cada compuesto terapéuticamente útil puede prepararse de tal manera que se obtenga una dosificación adecuada en cualquier dosis unitaria dada. Factores, tales como solubilidad, biodisponibilidad, semivida biológica, vía de administración, periodo de validez del producto, así como otras consideraciones farmacológicas, se contemplan por los expertos en la materia de preparación de dichas formulaciones farmacéuticas y, por tanto, puede ser deseable una diversidad de dosificaciones y pautas de tratamiento.
Además, de acuerdo con determinados aspectos, la composición adecuada para administración puede proporcionarse en un vehículo farmacéuticamente aceptable con o sin un diluyente inerte. El vehículo debe ser asimilable e incluye vehículos líquidos, semisólidos, por ejemplo, geles o pastas, o sólidos. Ejemplos de vehículos o diluyentes incluyen grasas, aceites, agua, soluciones salinas, lípidos, liposomas, resinas, aglutinantes, rellenos y similares, o combinaciones de los mismos. Como se usa en la presente memoria, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes acuosos (por ejemplo, agua, soluciones alcohólicas/acuosas, etanol, soluciones salinas, vehículos parenterales, tales como cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, etc.), disolventes no acuosos (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo), medios de dispersión, recubrimientos (por ejemplo, lecitina), tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos o antifúngicos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes, parabenos (por ejemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal), agentes isotónicos (por ejemplo, glúcidos, cloruro de sodio), agentes retardadores de la absorción (por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina), sales, fármacos, estabilizantes de fármacos (por ejemplo, tampones, aminoácidos, tales como glicina y lisina, carbohidratos, tales como dextrosa, manosa, galactosa, fructosa, lactosa, sacarosa, maltosa, sorbitol, manitol, etc.), geles, aglutinantes, excipientes, agentes de disgregación, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, tintes, reponedores de líquidos y nutrientes, materiales similares y combinaciones de los mismos, como conocería un experto en la materia. Excepto en la medida en que cualquier medio convencional, agente, diluyente o vehículo sea perjudicial para el destinatario o para la eficacia terapéutica de la composición contenida en el mismo, su uso en composición administrable para su uso en la práctica de los métodos es apropiado. El pH y la concentración exacta de los diversos componentes en una composición farmacéutica se ajustan de acuerdo con parámetros bien conocidos. De acuerdo con determinados aspectos, la composición se combina con el vehículo de cualquier manera conveniente y práctica, es decir, mediante solución, suspensión, emulsión, mezcla, encapsulación, absorción, molienda y similares. Dichos procedimientos son rutinarios para los expertos en la materia.
En determinados aspectos de la divulgación, las composiciones pueden comprender diferentes tipos de vehículos dependiendo de si se tienen que administrar en forma sólida, líquida o de aerosol, y si tiene que ser estéril para la vía de administración, tal como inyección. Las composiciones pueden formularse para administración intravenosa, intradérmica, transdérmica, intratecal, intraarterial, intraperitoneal, intranasal, intravaginal, intrarrectal, intramuscular, subcutánea, mucosa, oral, tópica, local, por inhalación (por ejemplo, inhalación de aerosol), por inyección, por infusión, por infusión continua, por perfusión localizada que baña las células diana directamente, mediante un catéter, mediante un lavado, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas), o mediante otros métodos o cualquier combinación de los anteriores como conocería un experto en la materia. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a Ed., 1990. Típicamente, dichas composiciones pueden prepararse como soluciones líquidas o suspensiones; también pueden prepararse formas sólidas o reconstituibles adecuadas para su uso para preparar soluciones o suspensiones tras la adición de un líquido antes de inyección; y las preparaciones también pueden estar emulsionadas.
Los anticuerpos pueden formularse en una composición en una forma de base libre, neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácidos, por ejemplo, las formadas con los grupos amino libres de una composición proteínica, o que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico; o bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína.
En aspectos adicionales de la divulgación, puede usarse una composición de vehículo lipídico farmacéutico que incluye polipéptidos, uno o más lípidos y un disolvente acuoso. Como se usa en la presente memoria, el término "lípido" se refiere a cualquiera de una amplia gama de sustancias que son característicamente insolubles en agua y extraíbles con un disolvente orgánico. Esta clase amplia de compuestos es bien conocida por los expertos en la materia, y como se usa el término "lípido" en la presente memoria, no se limita a ninguna estructura particular. Ejemplos incluyen compuestos que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados. Un lípido puede ser de origen natural o sintético (es decir, diseñado o producido por el ser humano). Sin embargo, un lípido es habitualmente una sustancia biológica. Los lípidos biológicos son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, grasas neutras, fosfolípidos, fosfoglicéridos, esteroides, terpenos, lisolípidos, glucoesfingolípidos, glucolípidos, sulfátidos, lípidos con ácidos grasos ligados a éster y éster, lípidos polimerizables y combinaciones de los mismos. Por supuesto, también se incluyen en las composiciones y métodos compuestos distintos de los descritos específicamente en la presente memoria que los expertos en la materia entienden como lípidos. Un experto en la materia estaría familiarizado con la gama de técnicas que pueden emplearse para dispersar una composición en un vehículo lipídico. Por ejemplo, el anticuerpo puede dispersarse en una solución que contiene un lípido, disolverse con un lípido, emulsionarse con un lípido, mezclarse con un lípido, combinarse con un lípido, unirse covalentemente con un lípido, contenerse como una suspensión en un lípido, contenerse o formar complejos con una micela o liposoma, o asociarse de otro modo con un lípido o estructura lipídica por cualquier medio conocido por los expertos en la materia. La dispersión puede provocar o no la formación de liposomas.
La expresión "dosis unitaria" o "dosificación" se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas para su uso en un sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada del anticuerpo terapéutico o composición que contiene el anticuerpo terapéutico calculada para producir las respuestas deseadas analizadas anteriormente en asociación con su administración, es decir, la vía y pauta de tratamiento apropiadas. La cantidad de administrar, tanto de acuerdo con el número de tratamientos como de la dosis unitaria, depende del efecto deseado. La cantidad de dosificación real de una composición de los presentes aspectos de la divulgación administrada a un paciente o sujeto puede determinarse mediante factores físicos y fisiológicos, tales como peso corporal, edad, salud y sexo del sujeto, el tipo de enfermedad que se esté tratando, el grado de penetración de la enfermedad, intervenciones terapéuticas previas o simultáneas, idiopatía del paciente, la vía de administración y la potencia, estabilidad y toxicidad de la sustancia terapéutica particular. En otros ejemplos no limitantes, una dosis puede comprender también de aproximadamente 1 microgramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 50 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 200 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 350 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 10 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 50 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 100 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 200 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 350 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 500 miligramos/kg/peso corporal, a aproximadamente 1000 miligramos/kg/peso corporal o más por administración, y cualquier intervalo derivable en los mismos. En ejemplos no limitantes de un intervalo derivable de los números enumerados en la presente memoria, puede administrarse un intervalo de aproximadamente 5 miligramos/kg/peso corporal a aproximadamente 100 miligramos/kg/peso corporal, de aproximadamente 5 microgramos/kg/peso corporal a aproximadamente 500 miligramos/kg/peso corporal, etc., basándose en los números descritos anteriormente. Las dosis anteriores incluyen cantidades entre las indicadas y se pretende que también incluyan los valores inferiores y superiores de los intervalos. El facultativo responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la concentración del uno o más ingredientes activos en una composición y la una o más dosis apropiadas para el sujeto individual.
No se pretende que la naturaleza particular de la composición terapéutica o preparación sea limitante. Por ejemplo, pueden proporcionarse composiciones adecuadas en formulaciones junto con vehículos, diluyentes y excipientes líquidos, en gel o sólidos fisiológicamente tolerables. En algunos aspectos de la divulgación, las preparaciones terapéuticas pueden administrarse a mamíferos para uso veterinario, tal como con animales domésticos, y uso clínico en seres humanos de una manera similar a otros agentes terapéuticos. En general, la dosificación requerida para eficacia terapéutica variará de acuerdo con el tipo de uso y modo de administración, así como las necesidades particularizadas de los sujetos individuales, como se describe supra.
PD-L1 glucosilado como biomarcador
Se proporcionan métodos que implican el uso de al menos un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble en ensayos para PD-L1 glucosilado como biomarcador. Dichos métodos pueden ser útiles en evaluaciones de biomarcadores de las células tumorales o cancerosas obtenidas de un sujeto que tiene un cáncer o tumor. Se proporciona un método para determinar si un sujeto que tiene cáncer también tiene un cáncer o tumor que exprese PD-L1 glucosilado, particularmente, un nivel detectable de PD-L1 glucosilado en la superficie celular de dichas células. Por ejemplo, si las células cancerosas o tumorales del sujeto se ensayan y se determina que expresan PD-L1 glucosilado en la superficie celular, entonces es más probable que el sujeto tratado con un anticuerpo antiglucPD-L1 como se describe, en solitario o en combinación con otro reactivo antineoplásico, por ejemplo, se beneficie del tratamiento. Dichos métodos comprenden obtener una muestra de un sujeto que tiene un cáncer o tumor, ensayar la muestra para la presencia de PD-L1 glucosilado en células derivadas del cáncer o tumor del sujeto usando métodos de unión conocidos y usados en la técnica, o como se describe supra, y administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo antiglucPD-L1 en solitario o en combinación con otro agente antineoplásico, si se encuentra que el cáncer o tumor del sujeto es positivo para la expresión en la superficie celular de proteína PD-L1 glucosilada. Diagnosticar que el sujeto tiene un cáncer o tumor que expresa PD-L1 glucosilado antes del tratamiento permite un tratamiento más eficaz y beneficio para el sujeto, ya que el anticuerpo antiglucPD-L1 administrado tiene mayor probabilidad de bloquear o inhibir la interacción de las células cancerosas o tumorales que expresan PD-L1 glucosilado del sujeto con los linfocitos T que expresan PD-1 del sujeto, evitando de ese modo la inmunosupresión de la actividad de los linfocitos T y promoviendo la destrucción de las células tumorales o cancerosas por la destrucción de linfocitos T activados. En un aspecto de la divulgación, el método puede implicar seleccionar, en primer lugar, a un sujeto cuyo cáncer o tumor pueda ser susceptible de ensayo para la presencia de proteína PD-L1 glucosilada expresada.
Pueden usarse métodos similares para supervisar la presencia de PD-L1 glucosilado en las células tumorales de un paciente durante un ciclo de tratamiento o terapia contra el cáncer, incluyendo politerapias con un anticuerpo antiglucPD-L1 y otro fármaco o tratamiento antineoplásico, a lo largo del tiempo, así como después de que haya cesado el tratamiento. Dichos métodos también pueden usarse en métodos de diagnóstico complementarios en que una pauta de tratamiento antineoplásico, o politerapia, implica someter a prueba o ensayar una muestra de tumor o cáncer del paciente para células tumorales o cancerosas que expresan PD-L1 glucosilado, antes del tratamiento y durante el ciclo de tratamiento, por ejemplo, supervisión, para determinar un resultado satisfactorio o la probabilidad del mismo.
En otros aspectos de la divulgación, los anticuerpos antiglucPD-L1 pueden conjugarse con un marcador útil para imágenes in vivo, por ejemplo, un radionúclido tal como I124 para PET o SPECT, un fluorocromo para imágenes ópticas, o un quelato paramagnético para MRI. Los anticuerpos antiglucPD-L1 marcados pueden administrarse al paciente, por ejemplo, por vía intravenosa u otro modo parental de administración y, después de esperar la cantidad apropiada de tiempo, se detecta la presencia y ubicación de los anticuerpos marcados para localizar y cuantificar las células tumorales.
Otros agentes
Se contempla que pueden usarse otros agentes en combinación con determinados aspectos de los presentes aspectos de la divulgación para mejorar la eficacia terapéutica del tratamiento. Estos agentes adicionales incluyen agentes que afectan a la regulación por aumento de receptores de superficie celular y uniones comunicantes, agentes citostáticos y de diferenciación, inhibidores de adhesión celular, agentes que aumentan la sensibilidad de las células hiperproliferativas a inductores apoptóticos, u otros agentes biológicos. Aumentos en la señalización intercelular elevando el número de uniones comunicantes pueden aumentar los efectos antihiperproliferativos en la población celular hiperproliferativa vecina. En otros aspectos de la divulgación, pueden usarse agentes citostáticos o de diferenciación en combinación con determinados aspectos de los presentes aspectos de la divulgación para mejorar la eficacia antihiperproliferativa de los tratamientos. Se contemplan inhibidores de adhesión celular para mejorar la eficacia de los presentes aspectos de la divulgación. Ejemplos de inhibidores de la adhesión celular son los inhibidores de la cinasa de adhesión focal (FAK) y lovastatina. Se contempla además que podrían usarse otros agentes que aumentan la sensibilidad de una célula hiperproliferativa a apoptosis, tal como el anticuerpo c225, en combinación con determinados aspectos de los presentes aspectos de la divulgación para mejorar la eficacia del tratamiento.
Kits y diagnósticos
En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un kit que contiene agentes terapéuticos y/u otros agentes terapéuticos y de suministro. En algunos aspectos de la divulgación, el kit se usa para preparar y/o administrar un tratamiento que implica los anticuerpos antiglucPD-L1 descritos en la presente memoria. El kit puede comprender uno o más viales sellados que contienen cualquiera de las composiciones farmacéuticas como se describe en la presente memoria. El kit puede incluir, por ejemplo, al menos un anticuerpo anti-PD-L1 glucosilado, así como reactivos para preparar, formular y/o administrar uno o más anticuerpos antiglucPD-L1 o para realizar una o más etapas de los métodos descritos. En algunos aspectos de la divulgación, el kit también puede comprender un medio de recipiente adecuado, que es un recipiente que no reaccionará con componentes del kit, tal como un tubo Eppendorf, una placa de ensayo, una jeringa, un frasco o un tubo. El recipiente puede fabricarse de materiales esterilizables, tal como plástico o vidrio.
El kit puede incluir además una hoja de instrucciones que resume las etapas procedimentales de los métodos expuestos en la presente memoria, y seguirá sustancialmente los mismos procedimientos como se describe en la presente memoria o son conocidos por los expertos en la materia. La información de instrucciones puede estar en un medio legible por ordenador que contiene instrucciones legibles mecánicamente que, cuando se ejecuten usando un ordenador, provocan la presentación de un procedimiento real o virtual de suministro de una cantidad farmacéuticamente eficaz del agente terapéutico.
Fusiones y conjugados
Los anticuerpos anti-PD-L1 glucosilado o polipéptidos PD-L1 glucosilados proporcionados en la presente memoria también pueden expresarse como proteínas de fusión con otras proteínas o conjugadas químicamente con otro resto. En algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos o polipéptidos tienen una parte Fc que puede variar de isotipo o subclase, puede ser quimérica o híbrida y/o puede modificarse, por ejemplo, para mejorar las funciones efectoras, controlar la semivida o accesibilidad al tejido, aumentar las características biofísicas, tales como estabilidad, y mejorar la eficacia de producción, que pueden asociarse con reducciones de costes. Muchas modificaciones útiles en la construcción de proteínas de fusión y métodos para prepararlos son conocidas en la técnica, por ejemplo, como se presenta por Mueller, J.P. et al., 1997, Mol. Immun. 34(6):441-452; Swann, P.G., 2008, Curr. Opin. Immunol., 20:493-499; y Presta, L.G., 2008, Curr. Opin. Immunol., 20:460-470. En algunos aspectos de la divulgación, la región Fc es la región Fc de IgG1, IgG2 o IgG4 natural del anticuerpo. En algunos aspectos de la divulgación, la región Fc es un híbrido, por ejemplo, una quimera que contiene regiones constantes Fc de IgG2/IgG4. Modificaciones a la región Fc incluyen, aunque sin limitación, IgG4 modificada para evitar la unión a receptores de Fc gamma y el complemento; IgG1 modificada para mejorar la unión a uno o más receptores de Fc gamma; IgG1 modificada para minimizar la función efectora (cambios aminoacídicos); IgG1 con glucano alterado/sin glucano (típicamente cambiando el hospedador de expresión); e IgG1 con unión dependiente del pH alterada a FcRn. La región Fc puede incluir la región de bisagra completa, o menos que la región de bisagra completa del anticuerpo.
Otro aspecto de la divulgación incluye híbridos de IgG2-4 y mutantes de IgG4 que tienen unión reducida a FcR, lo que aumenta su semivida. Se describen híbridos de IG2-4 y mutantes de IgG4 representativos, por ejemplo, en Angal et al., 1993, Molec. Immunol., 30(1 ):105-108; Mueller et al., 1997, Mol. Immun., 34(6):441-452; y patente de Estados Unidos n.° 6.982.323. En algunos aspectos de la divulgación, se elimina el dominio IgG1 y/o IgG2. Por ejemplo, Angal et al., Id., describen proteínas en que los dominios IgG 1 e IgG2 tienen la serina 241 remplazada con una prolina. En algunos aspectos de la divulgación, se contemplan proteínas o polipéptidos de fusión que tienen al menos 10 , al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos.
En algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos anti-PD-L1 glucosilado o polipéptidos PD-L1 glucosilados se ligan a o se unen covalentemente o forman un complejo con al menos un resto. Dicho resto puede ser, aunque sin limitación, uno que aumenta la eficacia del anticuerpo como agente de diagnóstico o terapéutico. En algunos aspectos de la divulgación, el resto puede ser un agente de imágenes, una toxina, una enzima terapéutica, un antibiótico, un nucleótido radiomarcado, un agente quimioterápico y similares.
En algunos aspectos de la divulgación, el resto que se conjuga o fusiona a un anticuerpo antiglucPD-L1 o polipéptido glucosilado o parte del mismo puede ser una enzima, una hormona, un receptor de superficie celular, una toxina tal como, sin limitación, abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas (es decir, PE-40), toxina diftérica, ricina, gelonina o proteína antivírica de hierba carmín), una proteína (tal como factor de necrosis tumoral, interferón (por ejemplo, interferón a, interferón p), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), activador tisular del plasminógeno (TPA) o un agente apoptótico (por ejemplo, factor de necrosis tumoral-a, factor de necrosis tumoral-p)), un modificador de respuesta biológica (tal como, por ejemplo, una linfocina (por ejemplo, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6 ")), factor estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos ("GM-CSF"), factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF") o factor estimulante de colonias de macrófagos ("M-CSF"), o factores de crecimiento (por ejemplo, hormona de crecimiento ("GH")), una citotoxina (por ejemplo, un agente citostático o citocida, tal como paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, un inhibidor de microtúbulos basado en tubulisina, por ejemplo, un maitansinoide, tal como maitansinoide DM1 (N2'-desacetil-N2'-(3-mercapto-1 -oxopropil)-maitansina; mertansina o emtansina, dependiendo del conector usado; y maitansinoide DM4 (N2'-desacetil-n2'-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil)-6-metilmaitansina; ravtansina), ImmunoGen, Inc., Waltham, MA) y puromicina y análogos u homólogos de la misma), antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6 -mercaptopurina, 6 -tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretaminea, tioepa clorambucilo, melfalán, BiCNU® (carmustina; BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozocina, mitomicina C y cisdiclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), una antraciclina (por ejemplo, daunorrubicina (antiguamente daunomicina) y doxorrubicina), un antibiótico (por ejemplo, dactinomicina (antiguamente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)), un agente antimitótico y/o inhibidor de tubulina, por ejemplo, vincristina y vinblastina, monometilauristatina F (MMAF), monometilauristatina E (o desmetilauristatina E) (MMAE), por ejemplo, vedotina; o combinaciones de los mismos.
Conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC)
Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) son agentes terapéuticos biológicos en que fármacos citotóxicos potentes se unen covalentemente mediante conectores químicos o agentes de acoplamiento a anticuerpos, típicamente anticuerpos monoclonales, que se dirigen a antígenos diana específicos, en particular, antígenos diana expresados o sobreexpresados en las superficies de células tumorales o cancerosas. Dichos anticuerpos "cargados" se diseñan para suministrar cargas citotóxicas letales a células tumorales o cancerosas. Los ADC proporcionan un medio para dirigir el fármaco de carga útil a células neoplásicas mientras se reducen los efectos secundarios y se minimiza la toxicidad sistémica. Los ADC se unen al antígeno diana expresado en superficie celular en virtud de la interacción específica del anticuerpo componente del ADC y su antígeno diana. Después de la unión al antígeno diana, el ADC puede internalizarse en la célula, particularmente, si el anticuerpo tiene actividad de internalización elevada, como los anticuerpos antiglucPD-L1 de las realizaciones descritas en la presente memoria, por ejemplo, STM108 y STM073. Por consiguiente, cuando dichos ADC se internalizan en la célula, actúan directamente destruyendo la célula o molécula diana dentro de la célula, lo que da lugar a apoptosis o muerte celular. Dichos ADC que comprenden los anticuerpos antiglucPD-L1 descritos en la presente memoria, particularmente, anticuerpos monoclonales, humanizados, quiméricos o humanos, combinan la dirección específica de anticuerpos a PD-L1 glucosilado en células tumorales y cancerosas con la capacidad destructora del cáncer de los fármacos o compuestos citotóxicos, proporcionando de ese modo ventajas adicionales para el tratamiento y terapias con los anticuerpos antiglucPD-L1. Las técnicas para preparar y usar los ADC son conocidas en la técnica y no se pretende que sean limitantes para los anticuerpos antiglucPD-L1 descritos en la presente memoria. (Véase, por ejemplo, Valliere Douglass, J.F., etal., 2015, Mol. Pharm., 12(6): 1774-1783; Leal, M. et al., 2014, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1321:41-54; Panowski, S. et al., 2014, mAbs, 6(1 ):34-45; Beck, A. 2014, mAbs, 6(1):30-33; Behrens, C.R. et al., 2014, mAbs, 6(1):46-53; y Flygare, J.A. et al., 2013, Chem. Biol. Drug Des., 81(1):113-121). En aspectos de la divulgación, algunos o todos los restos descritos anteriormente, particularmente, toxinas y citotoxinas, pueden conjugarse con un anticuerpo antiglucPD-L1 para producir ADC eficaces para tratar el cáncer. En aspectos de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 componente del ADC puede ser un anticuerpo biespecífico, multiespecífico, biparatópico o multiparatópico.
Las técnicas para conjugar restos terapéuticos o citotóxicos con anticuerpos son bien conocidas; véase, por ejemplo, Amon et al., ''Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Reisfeld et al. (eds.), 1985, pág. 243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery'', en CONTROLLED DRUG DELIVErY (2.a Ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, pág. 623­ 53, Marcel Dekker, Inc.); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en MONOCLONAL ANTIBODIES '84: BIOLOGICAL AND CLINICAL APPLICATIONS, Pinchera et al. (eds.), 1985, pág.
475-506); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en MONOCLONAL ANTIBODIES FOR CANCER DETECTION AND THERAPY, Baldwin et al. (eds.), 1985, pág. 303-16, Academic Press; Thorpe et al., Immunol. Rev. 62:119-158 (1982); Carter et al., Cancer J. 14(3):154-169 (2008); Alley et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 14(4):529-537 (2010); Carter et al., Amer. Assoc. Cancer Res. Educ. Book.
2005(1): 147-154 (2005); Carter et al., Cancer J. 14(3):154-169(2008); Chari, Acc. Chem Res. 41 (1):98-107 (2008); Doronina et al., Nat. Biotechnol. 21(7):778-784 (2003); Ducry et al., Bioconjug Chem. 21 (1):5-13(2010); Senter, Curr. Opin. Chem. Biol. 13(3):235-244 (2009); y Teicher, Curr Cancer Drug Targets. 9(8):982-1004 (2009). Se encuentra una revisión de los ADC y los productos oncológicos de ADC en Lambert, British J. Clin. Pharmacol., 76(2):248-262 (2013) y en Bouchard et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 24:5357-5363 (2014).
En aspectos específicos de la divulgación, los anticuerpos antiglucPD-L1, que facilitan la internalización de PD-L1 en células tumorales, se conjugan con un fármaco o agente biológicamente muy potente, tal como un agente citotóxico y/o quimioterápico, una toxina o citotoxina como se indica anteriormente, o un radionúclido, típicamente mediante conectores químicos con enlaces inestables, para producir un conjugado de anticuerpo antiglucPD-L1 -fármaco (ADC), denominado anticuerpo antiglucPD-L1-ADC en la presente memoria. El fármaco biológicamente activo o agente citotóxico, por ejemplo, sirve como "carga útil citotóxica", que se suministra a una célula, particularmente una célula tumoral o cancerosa que expresa un receptor o molécula diana de superficie celular que se une por el anticuerpo antiglucPD-L1 -ADC. Dicho anticuerpo antiglucPD-L1 -ADC unido a su molécula diana se internaliza en la célula, donde se libera la carga útil de fármaco citotóxico. La potenciación de la actividad destructora de células cancerosas de los anticuerpos antiglucPD-L1 de internalización descritos en la presente memoria a través de conjugación cargas útiles citotóxicas muy potentes produce productos biológicos de ADC antineoplásicos que tienen alta actividad antitumoral y en general efectos adversos suaves que se toleran bien.
Un anticuerpo antiglucPD-L1 como se describe en los aspectos de la divulgación en la presente memoria puede ligarse a diversos tipos de cargas útiles citotóxicas o que actúan en el ADN como se conoce y se usa en la técnica, o aún por comercializar. Por ejemplo, la maitansina es un benzoansamacrólido que se aisló por primera vez de la corteza del arbusto etíope Maytenus ovatus. Este agente citotóxico y derivados del mismo (por ejemplo, maitansinoides) se unen a tubulina cerca del sitio de unión del alcaloide de las vincas. Se considera que tienen una alta afinidad por tubulina ubicada en los extremos de los microtúbulos y menor afinidad por sitios distribuidos por todos los microtúbulos. La supresión de la dinámica de los microtúbulos provoca que las células se detengan en la fase G2/M del ciclo celular, provocando en última instancia la muerte celular por apoptosis. (Oroudjev et al., Mol. Cancer Ther., 10L2700-2713 (2010)). Dos derivados de maitansina (maitansinoides que contienen tiol) incluyen DM1 y DM4 (ImmunoGen, Inc., Waltham, MA) se han usado ampliamente en combinación con conectores irreversibles y reversibles. En particular, DM1 fijado a un anticuerpo con un conector tioéter se denomina "emtansina"; DM1 fijado a un anticuerpo con un conector SPP se denomina "mertansina". DM4 fijado con un conector SPDB se denomina "ravtansina"; y DM4 fijado con un conector sSPDB se denomina "soravtansina". (ImmunoGen, Inc., Waltham, MA). En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 -ADC comprende la carga útil de maitansinoide que actúa sobre tubulina DM1. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 -ADC comprende la carga útil de maitansinoide que actúa sobre tubulina DM4. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 -ADC comprende una carga útil que actúa sobre el ADN, por ejemplo, DGN462 (ImmunoGen, Inc., Waltham, MA). En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 componente del anticuerpo antiglucPD-L1 -ADC es STM073, o una parte de unión del mismo. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 componente del anticuerpo antiglucPD-L1-ADC es STM108, o una parte de unión del mismo.
En un aspecto particular de la divulgación, el agente citotóxico conjugado con el anticuerpo antiglucPD-L1 es MMAE (monometilauristatina E (o desmetilauristatina E)), un agente antineoplásico muy tóxico cuya actividad antimitótica implica la inhibición de la división celular bloqueando la polimerización de tubulina. Vedotina, una denominación genérica internacional, se refiere a MMAE más su estructura de enlace a un anticuerpo en un conjugado de MMAE-anticuerpo. En aspectos más particulares de la divulgación, el ADC es STM073-MMAE o STM108-MMAE.
Se conocen varios conectores químicos y se usan para conjugar una carga útil de fármaco citotóxico o que actúa sobre el ADN con un anticuerpo para producir ADC. Determinados conectores englobados para su uso en solitario o en combinación para producir ADC que comprenden los anticuerpos antiglucPD-L1, particularmente, los que se internalizan después de la unión a su diana como se describe en la presente memoria, incluyen SMCC (éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 4-(N-maleimidometil)ciclohexanocarboxílico); SPDB (3-(2-piridilditio)butirato de N-succinimidilo); SPP (4-(2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidilo); sulfo-SPDB o sSPDB (N-succinimidil-4-(2-piridilditio)-2-sulfobutanoato); el conector tioéter succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (MCC); y vc (conector dipeptídico de valina-citrulina). A modo de ejemplo, se han diseñado conectores manipulados (por ejemplo, SMCC, SPDB, SSPDB) (Immunogen, Inc.) para que sean estables antes de la unión de un ADC a un tumor y entonces para optimizar la eficacia de la carga útil una vez se internaliza el ACD dentro de una célula cancerosa. Otros conectores, tales como el conector dipeptídico vc, que es un conector escindible con catepsina, pueden usarse para conjugar un anticuerpo con un agente citotóxico, tal como una auristatina que es un inhibidor mitótico derivado de dolastatina 10, por ejemplo, monometilauristatina E (MMAE), por ejemplo, vedotina. Las citotoxinas pueden conjugarse con el anticuerpo de modo que se fije más de una molécula de toxina a cada molécula de anticuerpo, por ejemplo, puede haber, de promedio, 2, 3, 4, 5, 6 , 7 o 8 moléculas de toxina por anticuerpo.
En un aspecto particular de la divulgación, MMAE se une indirectamente a cisteínas del anticuerpo mediante un grupo de fijación de maleimidocaproilo (MC), que se acopla a valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonil-MMAE (MC-vc-PAB-MMAE). En la estructura lineal "MC-vc-PAB-MMAE", "MC" consiste en maleimida y ácido caproico y es el resto que se fija a un anticuerpo, típicamente mediante grupos de cisteína en la cadena H. A su vez, "MC" se fija a un conector "vc" que consiste en valina (Val) y citrulina (Cit) y que es un conector escindible con catepsina que se escinde mediante catepsina dentro de las células tumorales o cancerosas. "vc" se fija al espaciador "PAB", es decir, ácido paraminobenzoico, al que se liga la citotoxina MMAE. Los ADC MC-vc-PAB-MMAE liberan MMAE permeable en la membrana libre cuando se escinde por proteasas tales como catepsina B. En un aspecto de la divulgación, el conector al anticuerpo es estable en líquido extracelular, pero se escinde por catepsina una vez el ADC ha entrado en una célula tumoral o cancerosa activando, por tanto, el mecanismo antimitótico de MMAE u otro fármaco de toxina. En otro aspecto de la divulgación, se liga monometilauristatina F, (MMAF) a las cisteínas del anticuerpo mediante maleimidocaproilo (MC-Mm Af ). En contraste con los ADC MC-vc-PAB-MMAE, los ADC MC-MMAF no son escindibles, como los ADC MCC-DM1, y deben internalizarse y degradarse dentro de una célula, liberando cisteína-MC-MMAF como fármaco activo dentro de la célula.
En un aspecto de la divulgación, la carga útil citotóxica se libera en el lisosoma después de internalización del ADC en una célula. En el lisosoma, las enzimas lisosómicas digieren el anticuerpo componente del ADC. Después de la degradación lisosómica, la carga útil de fármaco (y el fármaco-conector) se libera en el citoplasma, donde el fármaco se une a dianas intracelulares, provocan en última instancia muerte celular. De forma óptima, la carga útil liberada es completamente activa, con el conector aún fijado. En otros aspectos de la divulgación en que la diana unida al ADC provoca poco tráfico al lisosoma, los conectores que son estables fuera de la célula diana, pero que escinden la carga útil del anticuerpo componente una vez dentro de la célula proporcionan un modo alternativo para la liberación de la carga útil dentro de la célula, pero fuera del lisosoma. En otros aspectos de la divulgación, el conector es estable en líquido extracelular, pero se escinde mediante catepsina una vez el ADC ha entrado en un célula tumoral o cancerosa activando, por tanto, el mecanismo antimitótico u otro mecanismo citotóxico del fármaco de toxina. En otros aspectos de la divulgación, una carga útil liberada por la acción de conectores escindibles puede entrar en células cancerosas vecinas y destruirlas mediante un efecto de vecindad aumentando, por tanto, la dirección y actividad de destrucción tumoral de un ADC.
En un aspecto de la divulgación, un anticuerpo antiglucPD-L1 como se describe en la presente memoria, tal como los MAb STM073 o STM108 de función doble, se acopla a DM1 mediante el conector SMCC (4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo). En otro aspecto de la divulgación, un anticuerpo antiglucPD-L1 como se describe en la presente memoria, tal como STM073 o STM108, se acopla a DM4 mediante el conector SPDB (3-(2-piridilditio)butirato de N-succinimidilo) o sSPDB (N-succinimidil-4-(2-piridilditio)-2-sulfobutanoato). En otro aspecto de la divulgación, la auristatina monometilauristatina E se liga a los residuos de cisteína de un anticuerpo antiglucPD-L1 como se describe en la presente memoria, tal como STM073 o STM108, mediante maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonilo (MC-vc-PAB-MMAE). En un aspecto particular de la divulgación, el ADC es STM108-MC-vc-PAB-MMAE. En otro aspecto particular de la divulgación, el ADC es STM073-MC-vc-PAB-MMAE. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo antiglucPD-L1 -ADC comprende múltiples unidades de un fármaco, tal como MMAE, por molécula, tal como 1-10, 1 -5, 2-5, 3-5 o 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10 unidades de fármaco, tal como MMAE, por molécula, así como valores intermedios. En otros aspectos de la divulgación, la relación de anticuerpo-fármaco puede 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10 o mayor, así como intervalo entre 2-10 y valores intermedios. En aspectos de la divulgación, el anticuerpo STM108 o STM073 es un anticuerpo biespecífico, multiespecífico, biparatópico o multiparatópico, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Dichos ADC que comprenden un anticuerpo antiglucPD-L1 de función doble como se describe en la presente memoria, por ejemplo, el STM108-MC-vc-PAB-MMAE mencionado anteriormente, proporcionan efectos antineoplásicos reforzados y multifacéticos en la destrucción de células tumorales y cancerosas para el tratamiento del cáncer. Como unas pocas ventajas ilustrativas, un anticuerpo antiglucPD-L1 humano (por ejemplo, MAb)-ADC, por ejemplo, STM108-ADC, puede bloquear la interacción de PD-1/PD-L1, potenciando de ese modo la inmunidad de y función efectora linfocitos T contra las células tumorales; puede abordar selectivamente PD-L1 glucosilado expresado en células tumorales y cancerosas; puede internalizar PD-L1 en células tumorales o cancerosas después de la unión, reduciendo de ese modo el PD-L1 expresado en superficie en células tumorales o cancerosas y reduciendo además el potencial oncogénico de PD-L1; puede provocar apoptosis de células tumorales o cancerosas en que el anticuerpo se internaliza y se libera el fármaco tóxico para dañar y destruir en última instancia la célula; y puede facilitar un efecto de vecindad destruyendo las células tumorales o cancerosas cercanas o vecinas a través de la liberación de fármaco tóxico desde el tumor o las células que han sufrido apoptosis.
En algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos como se describe en la presente memoria pueden conjugarse con un marcador, tal como un péptido, para facilitar la purificación. En algún aspecto de la divulgación, el marcador es un péptido de hexahistidina (SEQ ID NO: 93), es decir, la marca de hemaglutinina "HA", que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson, I. A. et al., Cell, 37:767-778 (1984)), o la marca "flag" (Knappik, A. et al., Biotechniques 17(4):754-761 (1994)).
En otros aspectos de la divulgación, el resto conjugado con los anticuerpos y polipéptidos como se describe en la presente memoria puede ser un agente de imágenes que puede detectarse en un ensayo. Dichos agentes de imágenes pueden ser enzimas, grupos prostéticos, radiomarcadores, iones metálicos paramagnéticos no radiactivos, haptenos, marcadores fluorescentes, moléculas fosforescentes, moléculas quimioluminiscentes, cromóforos, moléculas luminiscentes, moléculas bioluminiscentes, moléculas de fotoafinidad o partículas coloreadas o ligandos, tales como biotina. En aspectos de la divulgación, enzimas adecuadas incluyen, aunque sin limitación, peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; complejos de grupo prostético incluyen, aunque sin limitación, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes incluyen, aunque sin limitación, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes incluyen, aunque sin limitación, luminol; materiales bioluminiscentes incluyen, aunque sin limitación, luciferasa, luciferina y ecuorina; materiales radiactivos incluyen, aunque sin limitación, bismuto (213Bi), carbono (14C), cromo (51Cr), cobalto (57Co), flúor (18F), gadolinio (153Gd, 159Gd), galio (68Ga, 67Ga), germanio (68Ge), holmio (166Ho), indio (115In, 113In, 112In, 111In), yodo (131I, 125I, 123I, 121I), lantano (140La), lutecio (177Lu), manganeso (54Mn), molibdeno (99Mo), paladio (103Pd), fósforo (32P), praseodimio (142Pr), prometio (149Pm), renio (186Re, 188Re), rodio (105Rh), rutemio (97Ru), samario (153Sm), escandio (47Sc), selenio (75Se), estroncio (85Sr), azufre (35S), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), estaño (113Sn, 117Sn), tritio (3H), xenón (133Xe), iterbio (169Yb, 175Yb), itrio (90Y), cinc (65Zn); metales emisores de positrones usando diversas tomografías de emisión de positrones, e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos.
El agente de imágenes puede conjugarse con los anticuerpos o polipéptidos descritos en la presente memoria directa o indirectamente a través de un intermedio (tal como, por ejemplo, un conector conocido en la técnica) usando técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4.741.900 que informa sobre iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos y otras moléculas como se describe en la presente memoria para su uso como agentes de diagnóstico. Algunos métodos de conjugación implican el uso de un complejo de quelato metálico, empleando, por ejemplo, un agente quelante orgánico tal como anhídrido de ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA); ácido etilentriaminatetraacético; N-cloro-p-toluensulfonamida; y/o tetracloro-3-6a-difenilglucourilo-3 fijado al anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales también pueden hacerse reaccionar con una enzima en presencia de un agente de acoplamiento tal como glutaraldehído o peryodato. Los conjugados con marcadores de fluoresceína pueden prepararse en presencia de estos agentes de acoplamiento o mediante reacción con un isotiocianato.
En algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos antiglucPD-L1 o polipéptidos glucPD-L1 como se describe en la presente memoria pueden conjugarse con un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 4.676.980. Dichos anticuerpos heteroconjugados pueden unirse adicionalmente a haptenos (por ejemplo, fluoresceína), o a marcadores celulares (por ejemplo, sin limitación, 4-1-BB, B7-H4, CD4, CD8 , CD14, CD25, CD27, CD40, CD68 , CD163, CTLA4, GITR, LAG-3, OX40, TIM3, TIM4, TLR2, LIGHT, ICOS, B7-H3, B7-H7, B7-H7CR, CD70, CD47) o a citocinas (por ejemplo, IL-7, IL-15, IL-12, IL-4, TGF-beta, IL-10, IL-17, IFNy, Flt3, BLys) o quimiocinas (por ejemplo, CCL21).
En algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos anti-PD-L1 glucosilado o polipéptidos PD-1 glucosilados descritos en la presente memoria también pueden fijarse a soportes sólidos, que pueden ser útiles para realizar inmunoensayos o purificación del antígeno diana o de otras moléculas que pueden unirse al antígeno diana que se ha inmovilizado en el soporte mediante unión a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se describe en la presente memoria. Dichos soportes sólidos incluyen, aunque sin limitación, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) o polipropileno.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos incluyen para demostrar aspectos de la divulgación que se refieren a los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble que se unen preferentemente a PD-L1 glucosilado en comparación con PD-L1 aglucosilado y/o mutantes de glucosilación PD-L1 y métodos de uso descritos en la presente memoria. Se ejemplifican anticuerpos antiglucPD-LI de función doble representativos. Los expertos en la materia deben apreciar que los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble divulgados son ejemplos.
Ejemplo 1 Materiales y métodos
Cultivo celular, transfectantes estables, y transfección. Todas las células se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Estas células se desarrollaron en un medio DMEM/F12 o RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal (Fb S) al 10 %. Los transfectantes estables PD-L1 en células MDA-MB-468, BT549 y 293T se seleccionan usando puromicina (InvivoGen, San Diego, CA, EE. UU.). Para la transfección transitoria, las células se transfectaron temporalmente con ADN, tal como ADN que codifica PD-L1, usando liposomas SN (Hu, M. C. et al., 2004, Cell, 117:225-237) y Lipofectamine™ 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.).
Generación de células estables usando infección lentivírica. El ARNhc basado lentivirus (plásmidos pGIPZ) usado para atenuar la expresión de PD-L1 (Shen, J. et al., 2013, Nature, 497:383-387) en las células se adquirió de shRNA/ORF Core Facility (UT MD Anderson Cancer Center). Basada en la eficacia de atenuación de la expresión de la proteína PD-L1 en células MDA-MB-231 o A431, los autores de la invención seleccionaron dos clones shPD-L1 para este estudio. Las secuencias de antisentido maduras son como siguen: TCAATTGTCATATTGCTAC (shPD-L1 n .21, SEQ ID NO: 34), TTGACTCCATCTTTCTTCA (shPD-L1 n .25, SEQ ID NO: 35). Usando una construcción de expresión doble pGIPZ-shPD-L1/Flag-PD-L1 para atenuar PD-L1 endógeno y reconstituir Flag-PD-L1 simultáneamente, los autores de la invención establecieron líneas celulares que expresaban PD-L1 endógeno atenuado y el mutante Flag-PD-L1 WT o 4NQ. Para generar el ARNhc de expresión de lentivirus para PD-L1 y Flag-PD-L1, los autores de la invención transfectaron células 293T con pGIPZ-no de silenciamiento (para el virus de control de vector), pGIPZ-shPD-L1 o pGIPZ-shPD-L1/ PD-L1 WT, o el mutante pGIPZ-shPD-L1/PD-L1 4NQ con el reactivo de transfección FuGENE 6. Veinticuatro horas después de la transfección el medio se cambió, y después el medio se recogió en intervalos de 24 horas. El medio recogido que contiene lentivirus se centrifugó para eliminar los desechos celulares, y se filtró a través de filtro de 0,45 gm. Las células se sembraron a un 50 % de confluencia 12 horas antes de la infección, y el medio se remplazó con el medio que contiene lentivirus. Después de infección durante 24 horas, el medio se remplazó con medio reciente y las células infectadas se seleccionaron con 1 gg/ml de puromicina (InvivoGen).
Plásmidos. Se obtuvo un clon de PD-L1 humano de shRNA/ORF Core Facility (UT MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, EE. UU.) y se clonó en los vectores de expresión lentivíricos pCDH para establecer las líneas celulares de expresión de PD-L1-Flag o PD-L1-Myc usando técnicas biológicas moleculares conocidas. Además, el ácido nucleico de PD-L1 humano también se clonó en los vectores de expresión de células de mamífero pEGFP-N1 y pCMV-HA para transfección transitoria. El vector de expresión pCDH/PD-L1 -Flag se usó como molde para generar los mutantes PD-L1-Flag NQ N35Q, N192Q, N200Q, N219Q y 4NQ (N35Q/N192Q/N200Q/N219Q) realizando mutagénesis dirigida al sitio usando cebadores presentados en la tabla 4 a continuación. Para crear una construcción de expresión doble pGIPZ-shPD-L1/Flag-PD-L1 para atenuar PD-L1 endógeno y reconstituir Flag-PD-L1 simultáneamente, se seleccionó una construcción shPD-L1 (shPD-L1 n.° 5) que se dirige a la región 3'-UTR del ARNm de PD-L1. El A d N de tipo silvestre de Flag-PD-L1 (WT) o mutante 4NQ se clonó en pGIPZ-shPD-L1 (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU.) que expresa el ARNhc específico para PD-L1 endógeno. Todas las construcciones se confirmaron usando digestión enzimática y secuenciación de ADN.
Tabla 4. Cebadores para mutagénesis dirigida al sitio
Figure imgf000056_0001
Los ensayos qRT-PCR se llevaron a cabo para medir la expresión del ARNm (Shen et al., 2013, Nature, 497:383-7; y Chang et al., 2011, Nature Cell Biology, 13:317-23) (véase la tabla 5 a continuación). Las células se lavaron dos veces con PBS e inmediatamente se lisaron en QIAzol. La muestra lisada se sometió a la extracción de ARN total usando el RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). Para medir la expresión del ARNm, se sintetizó el ADNc a partir de 1 pg de ARN total purificado mediante el sistema de síntesis de ADNc SuperScript III First-Strand usando hexámeros aleatorios (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La qPCR se llevó a cabo usando una máquina de PCR instantánea (iQ5, BioRad, Hercules, CA, EE. UU.). Todos los análisis de datos se llevaron a cabo utilizando el método Ct comparativo. Los resultados en primer lugar se normalizaron al ARNm de p-actina de control interno.
Tabla 5. Cebadores para qRT-PCR.
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Anticuerpos y productos químicos. Se usaron los siguientes anticuerpos en los experimentos descritos en los rjemplos: Flag (F3165; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.); Myc (11667203001; Roche Diagnostics, Indianápolis, IN, EE. UU.); HA (11666606001; Roche Diagnostics); PD-L1 (13684; Cell Signaling Technology, Danvers, m A, EE. UU.); PD-L1 (329702; BioLegend, San Diego, Ca , EE. UU.); PD-L1 (GTX117446; GeneTex, Irvine, c A, EE. UU.); p D-L1 (AF156; R&D Systems, Mineápolis, m N, EE. UU.); p D-1 (ab52587; Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.); B3GNT3 (ab190458; Abcam); B3GNT3 (18098-1-AP; Proteintech, Chicago, IL, EE. UU.); Granzima B (ab4059; Abcam); EGFR (4267; Cell Signaling Technology); a-Tubullna (B-5-1-2; Sigma-Aldrich); y p-Actina (A2228; Sigma-Aldrich). Para su uso en los experimentos, se adquirieron factor de crecimiento epidérmico (EGF), cicloheximida, y tunicamicina de Sigma- Aldrich. Se obtuvieron gefitinib, erlotinlb, lapatinib, cetuximab y AG1478 de Calbiochem Corp (Billerica, MA, EE. UU.).
Análisis de inmunotransferencia, inmunocitoquímica e inmunoprecipitación. El análisis de inmunotransferencia se llevó a cabo como se describe previamente (Lim et al., 2008, Gastroenterology, 135:2128-40; y Lee et al., 2007, Cell, 130:440-455). La adquisición de imágenes y la cuantificación de la intensidad de las bandas se llevaron a cabo usando un sistema de formación de imágenes infrarrojas Odyssey™ (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, EE. UU.). Para la inmunoprecipitación, las células se lisaron en tampón (Tris HCI 50 mM, pH 8,0, NaCI 150 mM, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) 5 mM y Nonidet P-40 (NP-40) al 0,5 %) y se centrifugaron a 16.000 x g durante 30 minutos para eliminar los desechos. Los lisados eliminados se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos. Para la inmunohistoquímica, las células se fijaron en paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante 15 minutos, se permeabilizaron en Triton X-100 al 5 % durante 5 minutos, y después se tiñeron usando anticuerpos primarios. Los anticuerpos secundarios usados fueron conjugados de tinte Alexa Fluor 488 o 594 antirratón y/o conjugado de tinte Alexa Fluor 488 o 594 anticonejo (Life Technologies). Los núcleos se tiñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (azul DAPI) (Life Technologies). Después del montaje, las células se visualizaron usando un microscopio de barrido láser confocal multifotones (Carl Zeiss, Thornwood, NY, EE. UU.).
Ensayo de interacción de PD-L1 y PD-1 (PD-L1/PD-1). Para medir la interacción de la proteína PD-1 y la proteína PD-L1, las células se fijaron en paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante 15 minutos y después se incubaron con la proteína quimera PD-1-Fc humana recombinante (R&D Systems) durante 1 hora. Los anticuerpos secundarios usados fueron el conjugado de tinte Alexa Fluor 488 antihumano (Life Technologies). Los núcleos se tiñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (azul DAPI) (Life Technologies). La intensidad de fluorescencia de tinte Alexa Fluor 488 entonces se midió usando un lector de microplacas Synergy Neo (BioTeK, Winooski, VT, EE. UU.) y se normalizaron a la intensidad por la cantidad de proteína total. Para tomar una imagen, después del montaje, las células se visualizaron usando un microscopio de barrido láser confocal (Carl Zeiss).
Experimentos de cocultivo y medición de la expresión de IL-2. El cocultivo de linfocitos T Jurkat y células tumorales y la medición de la expresión de IL-2 se llevó a cabo como se describe previamente (Sheppard, K. A. et al., 2004, FEBS letters, 574:37-41). Para analizar el efecto de las células tumorales en la inactivación de linfocitos T, las células tumorales se cocultivaron con linfocitos T Jurkat activados que expresaban PD-1 humano que se activaron con el activador T humano Dynabeads™ CD3/CD28 (Life Technologies). Los cocultivos en relación 5:1 (célula Jurkat:tumoral) se incubaron durante 12 o 24 horas. El nivel de IL-2 secretada en el medio se midió como se describe por el fabricante (Human IL-2 ELISA Kits, Thermo Scientific).
Análisis de glucosilación de PD-L1. Para confirmar la glucosilación de la proteína PD-L1, los lisados celulares se trataron con las enzimas PNGasa F, Endo H, O-glucosidasa (New England BioLabs, Ipswich, MA, EE. UU.) como se describe por el fabricante. Para teñir la proteína PD-L1 glucosilada, la proteína PD-L1 purificada se tiñó usando el kit de tinción de glicoproteína (Peirce/Thermo Scientific) como se describe por el fabricante.
Tinción inmunohistoquímica de muestras de tejido tumoral de mama humano. La tinción inmunohistoquímica (IHC) se llevó a cabo como se describe previamente (Lee et al., 2007, Cell, 130:440-455; Lo et al., 2007, Cancer Research, 67:9066-9076; Chang, C. J. et al., 2011, Cancer cell, 19:86-100). En resumen, las muestras de tejido se incubaron con los anticuerpos contra PD-L1, EGFR, B3GNT3 o Granzima B y un anticuerpo secundario conjugado con biotina y después se incubaron con un complejo de avidina-biotina-peroxidasa. La visualización se llevó a cabo usando el cromógeno de aminoetilcarbazol. Para el análisis estadístico, se usó el ensayo exacto de Fisher y el coeficiente de correlación de clasificación Spearman; un valor de p menor que 0,05 se consideró estadísticamente significativo. De acuerdo con la puntuación histológica, la intensidad de la tinción se clasificó en cuatro grupos: alta (puntuación 3), media (puntuación 2), baja (puntuación 1) y negativa (puntuación 0).
Identificación del N-glucopéptido. La proteína PD-L1 marcada con His purificada se redujo con ditiotreitol (DTT) 10 mM a 37 °C durante 1 hora, se alquiló con yodoacetamída 50 mM en tampón de bicarbonato de amonio 25 mM durante 1 hora en la oscuridad a temperatura ambiente, y después se trató durante la noche con tripsina de grado de secuenciación en una relación de enzima a substrato de 1:50 a 37 °C. Los productos digeridos entonces se diluyeron con ácido fórmico a una concentración final con un 0,1 %, y se limpiaron adicionalmente por ZipTip C18 (Millipore) antes del análisis de CL-EM/EM. Los datos de CL-EM/EM se adquirieron en la Academia Sinica Mass Spectrometry Facility en IBC. La mezcla de péptido se analizó mediante CL-EM/EM con nanopulverización en un Orbitrap Fusion Tribrid (Thermo Scientific) acoplado a un sistema UltiMate 3000 RSLCnano (Dionex) con una columna de retención Acclaim PepMap 100 (2 cm x 100 gm d.i.) (Dionex). Las mezclas de péptidos se cargaron en una columna Acclaim PepMap RSLC 25 cm x 75 gm d.i. (Dionex) y se separaron a un caudal de 500 nl/min usando un gradiente de un 5 % a un 35 % de disolvente B (100 % de acetonitrilo con 0,1 % de ácido fórmico) durante 60 minutos. El disolvente A fue un 0,1 % de ácido fórmico en agua. Los parámetros usados para EM y la adquisición de datos de EM/EM bajo el HCD en paralelo con el modo CID fueron: modo de velocidad superior con un tiempo de ciclo de 3 s; FTMS: intervalo de exploración (m/z) = 400-2000; resolución = 120 K; diana a Gc = 2 x 105; tiempo de inyección máxima (ms) = 50; FTMSn (HCD): modo de aislamiento = cuadrupolo; ventana de aislamiento = 1,6; energía de colisión (%) = 30 con 5 % de energía de colisión en etapas; resolución = 30 K; diana AGC = 5 x 104; tiempo de inyección máxima (ms) = 60; ITMSn (CID): modo de aislamiento = cuadrupolo; ventana de aislamiento = 1,6; energía de colisión (%) = 30; diana AGC = 1 x 104. Los datos sin procesar se convirtieron a formato genérico Mascot (MGF) por Proteome Discoverer 1.4. Para la identificación de glucopéptidos, los datos de HCD EM2 se buscaron usando Byonic (versión 2.0-25) con los siguientes parámetros de búsqueda: tolerancia de péptido = 2 ppm; tolerancia de fragmento = 6 ppm; escisiones perdidas = 1 ; modificaciones: carbamidometil-cisteína (fija), oxidación de metionina (común 2), desamidación en N (1 infrecuente). Los aciertos de glucopéptido sugeridos por Byonic se verificaron adicionalmente de manera manual al combinar los resultados de HCD y CID EM2.
Análisis estadístico. Los datos en los gráficos de barras representan el cambio factorial medio con respecto a los grupos no tratados o de control con desviación típica de tres experimentos independientes. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando SPSS (Ver. 20, SPSS, Chicago, IL). La correlación entre la expresión de la proteína y el subconjunto BLBC se analizó usando la correlación de Spearman y el ensayo de Mann-Whitney. El ensayo de la t de Student se llevó a cabo para los datos experimentales. Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Ejemplo 2 Análisis de expresión de la proteína PD-L1
Para dilucidar el mecanismo subyacente de PD-L1, la expresión de la proteína PD-L1 se examinó en tejidos tumorales humanos y líneas de células cancerosas. Las FIG. 1A y 1B y las FIG. 3A-3D ilustran la expresión de proteína en las líneas celulares de cáncer de pulmón, mama, colon y ovario por análisis de inmunoelectrotransferencia; la FIG. 4A muestra la unión de la proteína PD-L1 en las células por diferentes anticuerpos contra PD-L1. Se observó que una mayoría de la proteína PD-L1 se detectaba en ~45 kDa (círculo negro), pero una fracción más pequeña también se presentaba a 33 kDa (cabeza de flecha negra). La atenuación de PD-L1 por ARN de horquilla corta lentivírico (ARNhc) dirigido a la secuencia codificante (shPD-L1 n.° 1) o la 3'-UTR (shPD-L1 n.° 5) reguló por disminución la expresión tanto de las formas de 33 como de 45 kDa de PD-L1 (FIG.
4B). La reconstitución de PD-L1 restableció la expresión de ambas formas en el clon shPD-L1 n.° 5 (FIG. 1C; la FIG.
4C muestra el diseño del vector). Estos resultados mostraron que ambas bandas en el análisis de inmunoelectrotransferencia son la proteína PD-L1 y que la forma de peso molecular más alto de PD-L1 es indicativa de las modificaciones postraduccionales.
Las proteínas glucosiladas producen frecuentemente patrones heterogéneos en el análisis de inmunoelectrotransferencia, como se observa para el peso molecular más alto (~45 kDa) de PD-L1. Para ensayar si el patrón de glucosilación observado para PD-L1 correspondía a la forma glucosilada, se trataron células m DA-MB 231 y HeLa con glucosidasa recombinante (péptido-N-glucosidasa F; PNGasa F) para eliminar la estructura de N-glucano y después se sometieron a análisis de inmunoelectrotransferencia. Como se muestra en la FIG. 4D, una parte significativa de PD-L1 de 45 kDa se redujo a la forma de 33 kDa de PD-L1 tras tratamiento con PNGasa F. De manera coherente, se observó tinción positiva de la estructura de glucano en PD-L1 marcado con His purificado, pero no en presencia de PNGasa F (FIG. 1D). Estos resultados demuestran que el peso molecular más alto de PD-L1 es de hecho la forma glucosilada de la proteína PD-L1.
Para recapitular la expresión de la proteína PD-L1 en las células, se generaron diversas construcciones de sobreexpresión para imitar la expresión endógena de la proteína. Para evitar una posible escisión en el péptido de señalización N terminal, se fusionaron diferentes secuencias de marca en el extremo N o C (FIG. 5A y 5B, encima de la transferencia). Similar a los resultados del análisis de expresión de PD-L1 endógeno, la transfección transitoria de todo PD-L1 marcado con GFP, HA, Flag o Myc tuvo un desplazamiento de peso molecular ~15 kDa de su tamaño real en el análisis de inmunoelectrotransferencia (FIG. 1E y 5A y 5B). En contraste con el tratamiento con PNGasa F, que elimina toda la estructura de N-glucano en la proteína PD-L1, la adición de glucosidasa recombinante, endoglucosidasa H (Endo H), solamente redujo parcialmente la glucosilación de PD-L1, sugiriendo que los tipos de complejo de las estructuras de glucano ligadas a N (que contienen tanto tipos de alto contenido de manosa como híbridos) existen predominantemente en PD-L1. Además, la glucosilación de PD-L1 se inhibió completamente cuando las células se trataron con el inhibidor de glucosilación ligada a N, tunicamicina (TM) (FIG. 1F y 5A-5D), pero no en O-glucosidasa (FIG. 5E). Juntos, estos resultados indican que PD-L1 se glucosila ampliamente ligado a N en las células ensayadas (Heifetz, A., et al., 1979, Biochemistry, 18:2186-2192).
Ejemplo 3 Análisis de glucosilación
El análisis de inmunoelectrotransferencia usando dos anticuerpos específicos de PD-L1 (anti-PD-L1 y anti-hB7-H1) indicaron que la glucosilación de PD-L1 se producía en su dominio extracelular (ECD, reconocido por anti-hB7-H1) pero no en su dominio intracelular (ICD, reconocido por anti-PD- L1) (FIG. 1F y 5C). Para determinar con precisión los sitios de glucosilación, se llevó a cabo una alineación de secuencia de las secuencias de aminoácidos de PD-L1 de diferentes especies para buscar los motivos NXT evolutivamente conservados, una secuencia de reconocimiento de N-glucosilación consenso (Schwarz, F., et al., 2011, Current opinion in structuralbiology, 21:576-582). Coherente con la predicción anterior (Cheng et al., 2013, JBC, 288:11771-85); y Vigdorovich et al., 2013, Structure, 21:707-17), se identificaron cuatro motivos NXT (FIG. 1G y FIG. 6A y 6B). Para confirmar si estas secuencias de hecho están glucosiladas, se analizaron péptidos trípticos de un PD-L1 humano purificado por nano CL-EM/EM. Se identificaron los glucopéptidos que portan los N-glucanos de tipo complejo para cada uno de los 4 sitios de N-glucosilación (FIG.
7A-7H), coherente con la resistencia aparente al tratamiento con Endo H (FIG. 1E). Se generó una serie de sustituciones de asparagina (N) a glutamina (Q) para determinar el o los sitios de glucosilación específica en la proteína PD-L1. Los cuatro mutantes, N35Q, N192Q, N200Q y N219Q, mostraron un determinado grado de reducción en la glucosilación en comparación con PD-L1 WT (FIG. 1H, carriles 2, 3, 4 y 5). No se observaron diferencias detectables en la glucosilación para los tres mutantes no NXT NQ de PD-L1 (FIG. 1H, carriles 11, 12 y 13). Además, la glucosilación de PD-L1 se eliminó completamente en las variantes de PD-L1 4NQ en las que cuatro asparaginas se mutaron a glutamina como se indica por la ausencia de señales correspondientes a la forma glucosilada en 45 kDa (FIG. 1H, carril 10 (4NQ) y carril 14 (WT)). Basándose en la estructura cristalina del complejo de PD-1/PD-L1 (Lin, D.Y., et al., 2008, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105:3011 -3016, estos cuatro sitios de glucosilación de PD-L1 (N35, N192, N200 y N219) están expuestos en la superficie de la proteína. La mutación de los sitios de glucosilación de PD-L1 (PD-L1 4NQ) no afectaba a la estructura global basándose en la predicción. Estos resultados sugieren que PD-L1 existe exclusivamente como una glucoproteína N-glucosilada en las células y que los cuatro motivos NXT se glucosilan.
Los niveles de PD-L1 glucosilado observados fueron significativamente más altos que la forma aglucosilada de la proteína PD-L1 (FIG. 1A y 1B y 5C y 5D). Basados en estos descubrimientos, los autores de la invención investigaron si la glucosilación estabiliza la proteína PD-L1. Para este fin, se midió la tasa de re cambio de la proteína en presencia del inhibidor de síntesis de la proteína cicloheximida (CHX) para determinar el efecto de la glucosilación en la estabilidad de la proteína PD-L1. La tasa de recambio de PD-L1 marcado con Flag fue mucho más rápida en células HEK 293T tratadas con tunicamicina (TM) que las tratadas con DMSO (FIG. 2A; 8A y 8B). Se observaron resultados similares para PD-L1 endógeno en células A431 (FIG. 8C). En inhibición del proteasoma por MG132, los niveles de PD-L1 aglucosilado aumentaron constantemente durante un periodo de 12 horas (FIG. 2B). De forma coherente, PD-L1 4NQ no glucosilado se degradó rápidamente con la semivida tan corta como 4 horas (FIG. 2C), similar a la de PD-L1 WT aglucosilado (FIG. 2A), sugiriendo que la glucosilación alterada da lugar a la degradación de PD-L1 mediante el proteasoma 26S.
Ejemplo 4 Afinidad de unión de PD-L1
PD-L1 es un inmunosupresor clave a través de su unión con PD-1 durante la progresión del cáncer (Okazaki, T., et al., 2013, Nature immunology, 14:1212-1218. Por tanto, se compararon las afinidades de unión de PD-L1 WT y el mutante deficiente de glucosilación PD-L1 a PD-1. PD-L1 WT y el mutante PD-L1 4NQ se expresaron establemente en células MDA-MB-468 y HEK-293T, y los clones estables con cantidades similares de expresión de PD-L1 WT y 4NQ se seleccionaron y después se incubaron con la proteína de fusión PD-1/Fc recombinante, seguido de la adición del conjugado de fluorescencia de IgG antihumano (específico de Fc) para la amplificación de la señal (Cheng, X. et al., 2013, The Journal of biological chemistry, 288:11771-11785) (FIG. 8D). Aunque no hubo cambios significativos en la localización membranaria entre PD-L1 glucosilado y aglucosilada (FIG. 8E (imagen confocal) y 8F (extracción de biotinilación)), se observó una diferencia marcada en la unión de PD-1 en la membrana celular entre los transfectantes estables tratados con o sin TM (FIG. 2D, el gráfico de cuantificación mostrado a la derecha). Además, la eliminación de la glucosilación de PD-L1 por tratamiento con TM, o la expresión del mutante 4NQ, redujo la asociación de PD-L1 con PD-1 (FIG. 2E y 8G). Los experimentos de unión in vitro también mostraron la pérdida de la interacción de PD-L1 4NQ/PD-1/Fc, sugiriendo que la glucosilación de PD-L1 potencia su asociación con PD-1 (FIG. 2F). Debido a que la actividad de inmunosupresión está asociada con la interacción de célula-célula que implica los linfocitos T citotóxicos, se llevó a cabo un experimento de cocultivo para medir los niveles de expresión de IL-2, un indicador de la respuesta inmunitaria de linfocitos T que se suprime por la interacción de PD-L1 y PD-1, en linfocitos T Jurkat después de la exposición a los clones estables de PD-L1 (Yang, W., et al., 2008, Investigative ophthalmology & visual science, 49:2518-2525) (FIG. 8H). De forma coherente, la pérdida de la glucosilación de PD-L1 alteró su interacción con PD-1 y potenció la liberación de IL-2 soluble (FIG. 2G). Estos resultados revelan que la integridad del glucofenotipo de PD-L1 es necesaria para su función inmunosupresora.
Ejemplo 5 Funcionalidad del glucofenotipo de PD-L1
PD-L1 WT y los mutantes 4NQ se expresaron establemente en células MDA-MB-468 y BT549 reducidas de PD-L1 endógeno. Usando estas líneas celulares, se analizó la afinidad de unión de PD-1 y PD-L1. Como se muestra, la asociación entre la variante de glucosilación PD-L1 4NQ y PD-1 se redujo (FIG. 9A). Los experimentos de unión in vitro demostraron además que la glucosilación es necesaria para la asociación de PD-L1 y PD-1 (FIG. 9B). La destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T se midió in vitro cocultivando líneas celulares estables BT549 que expresaban PD-L1 WT y PD-L1 4NQ con linfocitos T primarios humanos (microscopia de tiempo transcurrido). Coherente con la pérdida de la unión a PD-1, la línea celular estable de PD-L1 4NQ mostró más destrucción mediada por linfocitos T de células cancerosas (FIG. 9C). Además, se midió la función inmunosupresora de PD-L1 in vivo en un modelo de ratón 4T1 singénico en que se midió el crecimiento tumoral en ratones BALB/c que habían recibido células 4T1 que expresaban PD-L1 WT o PD-L1 4NQ. Comparados con los ratones que tienen células que expresaban PD-L1 WT, los ratones que tenían células que expresaban PD-L1 4NQ mostraron tamaño del tumor reducido y linfocitos T citotóxicos más activados (FIG. 9D y 9E). Juntos, estos datos muestran que la pérdida de la glucosilación de PD-L1 altera su interacción con PD-1 y altera la capacidad de interacción de PD-1/PD-L1 para permitir que las células tumorales evadan la vigilancia inmunitaria por los linfocitos T. Por consiguiente, las células tumorales en las que PD-L1 no se glucosila, o se glucosila de forma aberrante, proporciona dianas que son susceptibles de destruirse por linfocitos T efectores funcionales. Este mecanismo para evitar o bloquear que las células tumorales escapen de la vigilancia inmunitaria de linfocitos T por la glucosilación alterada de PD-L1 expresado en la membrana corrobora además que la integridad del glucofenotipo PD-L1 es necesaria para su función inmunosupresora.
Además, el modelo de ratón BALB/c 4T1 singénico como en anteriormente se usó para determinar el efecto de un anticuerpo de función doble representativo, particularmente, STM073, en el crecimiento tumoral (es decir, la función inmunosupresora) en los animales durante un periodo de estudio de 16 días. En resumen, en el estudio, los animales recibieron células 4T1 que expresaban PD-L1 de tipo silvestre (glucosilados) (1 x 105 células 4T1) en el día 0. En los días 3, 5, 7, 9, 11 y 13 después de ello, los animales 4T1 se trataron con MAb STM073 (100 |jg) o anticuerpo de control IgG (100 jg ) mediante inyección. Durante el periodo del tratamiento, la se evaluó la mortalidad y el volumen tumoral en los animales. La FIG. 9F presenta gráficos de recuadros que muestran que el volumen tumoral en los ratones que se trataron con el MAb STM073 ("73") era mediblemente menor en comparación con el volumen tumoral en los animales de control.
Ejemplo 6 Producción de anticuerpos monoclonales que se unen a PD-L1 glucosilado
Se obtuvieron hibridomas que producen anticuerpos monoclonales generados contra PD-L1 humano glucosilado por la fusión de células de mieloma murino SP2/0 con células del bazo aisladas de ratones BALB/c inmunizados con PD-L1 humano (n=6 ) (Antibody Solution, Inc.) de acuerdo con el protocolo normalizado. Antes de la fusión, los sueros de los ratones inmunizados se validaron para la unión al inmunógeno PD-L1 usando análisis FACS. Se generaron hibridomas productores de anticuerpos monoclonales (MAb) y el isotipo de todos los MAb fue lgG1. Los hibridomas que produjeron anticuerpos se ensayaron de nuevo para la especificidad.
Para identificar los MAb antiglucPD-L1 que eran específicos para y que se unían preferentemente al antígeno de PD-L1 glucosilado (es decir, MAb específicos de PD-L1 glucosilado) frente a PD-L1 aglucosilado, se llevaron a cabo diferentes tipos de ensayos. En un ensayo de clasificación para detectar la unión preferente de los MAb a PD-L1 glucosilado, se determinó la unión del anticuerpo basada en la medición de la intensidad de fluorescencia a través de análisis FACS (usando proteínas unidas a membrana celular). A modo de ejemplo, el ensayo se llevó a cabo usando la línea celular de cáncer de mama humano BT549. De forma ilustrativa, las células BT549 que sobreexpresaban PD-L1 WT (completamente glucosilado) se marcaron con biotina de acuerdo con procedimientos convencionales y después se mezclaron con las células BT549 que sobreexpresaban PD-L1 4NQ (variante de PD-L1 completamente aglucosilado). Las células mezcladas se incubaron con anticuerpos anti-PD-L1, por ejemplo, anticuerpos antiglucPD-L1, y se incubaron adicionalmente con anticuerpos secundarios conjugados con FITC como agente de detección. Después del lavado, se midió la intensidad de fluorescencia (intensidad de fluorescencia medida, MFI) mediante FACS/análisis de citometría de flujo para evaluar la unión relativa de los anticuerpos anti-PD-L1 a PD-L1 WT unido a membrana (en las células) o a PD-L1 4NQ (en las células). Los anticuerpos que mostraron MFI significativamente más alta en PD-L1 WT frente a PD-L1 4NQ se seleccionaron para evaluación adicional. Los resultados para el análisis de unión de fluorescencia de los MAb de función doble STM073 y STM108 se presentan en la siguiente tabla 6 , que muestra los valores de MFI para la unión del anticuerpo a las células BT549 que expresan PD-L1 de tipo silvestre (glucosilado) (células BT549PD-L1WT) frente a la unión del anticuerpo a las células BT549 que expresan PD-L1 variante (4NQ aglucosilado) (células BT549PD-L1 4NQ). Los resultados experimentales en la tabla 6 muestran un valor de MFI aproximadamente 5 veces más alto para el MAb STM073 que se une a las células BT549PD-L1WT (células que expresan PD-L1 glucosilado) en comparación con las células BT549PD-L1 4NQ (células que expresan PD-L1 aglucosilado). Asimismo, se determinó un valor de MFI aproximadamente 4 veces más alto para el STM108 que se une a las células BT549PD-L1WT en comparación con las células BT549PD-L1 4NQ.
Tabla 6. Valores medidos de intensidad de fluorescencia para MAb antiglucPD-L1
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Basándose en el análisis de unión, se seleccionaron cuarenta y dos hibridomas productores de MAb candidatos, desarrollados en medio ADCF, y su sobrenadante que contenía el anticuerpo monoclonal se concentró y se purificó.
En algunos casos, los MAbs purificados se ensayaron adicionalmente por su capacidad para neutralizar o inhibir la interacción entre PD-L1 y PD-1 (interacción de PD-L1/PD-1) usando un ensayo de formación de imágenes de células vivas, lncuCyte™ (Essen Bioscience). Para este ensayo, las células BT-549 que expresan PD-L1 se incubaron con el anticuerpo anti- PD-L1 humano y con las proteínas de fusión PD-1 -Fc marcadas fluorescentes. La unión del ligando y el receptor se cuantificó por lncuCyteTMZoom cada hora, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Basándose en este ensayo, se encontró que de los 42 MAb ensayados, 15 MAb bloqueaban completamente la unión de PD-L1 a PD-1. Algunos de los 15 MAb que mostraron una potente eficacia de bloqueo también se unieron a PD-L1 aglucosilado en algún grado.
En otro ensayo, tanto la proteína PD-L1 humana glucosilada como PD-L1 aglucosilado, es decir, la proteína PD-L1 tratada con PNGasa F, se recubrieron sobre una fase sólida y se ensayaron para la afinidad de unión de los MAb a los antígenos de PD-L1. Se entenderá que el "antígeno de PD-L1" es sinónimo de "proteína PD-L1". Doce (12) de los MAb mostraron una interacción de afinidad más alta con la proteína PD-L1 glucosilada en comparación con la proteína PD-L1 aglucosilada (proteína tratada con PNGasa F). Para análisis de especificidad adicional, los MAb seleccionados se analizaron por análisis de inmunoelectrotranferencia y análisis de citometría de flujo FACS. De los diversos análisis, se encontró que MAb, tales como STM073 y STM108, que unían específicamente a la forma glucosilada de PD-L1 en comparación con la forma aglucosilada de PD-L1, lo que validó adicionalmente la especificidad de estos MAb por el antígeno de PD-L1 glucosilado.
Ejemplo 7 Identificación de regiones de unión de anticuerpos monoclonales específicos que se unen a PD-L1 glucosilado
Para identificar las regiones de los anticuerpos antiglucPD-L1 monoclonales que se unen a PD-L1 glucosilado, se sobreexpresaron PD-L1 de tipo silvestre (glucosilado) (PD-L1 WT) y las proteínas variantes de glucosilación N35/3NQ, N192/3NQ, N200/3NQ, y N219/3NQ (en que uno de los sitios de glucosilación en la posición 35, 192, 200 o 219 es la asparagina de tipo silvestre (N) en esa posición y las otras tres posiciones se han mutado a glutamina (Q) que se ha mutado a su forma aglucosilada) (FIG. 10A) en las células BT549 de atenuación de PD-L1. Como se determina por análisis de inmunoelectrotransferencia, algunos MAb reconocieron mutantes de PD-L1 particulares con niveles más altos de unión en comparación con otros mutantes de PD-L1, mostrando que estos MAb eran específicos de sitio. Por ejemplo, el MAb STM073 se unió a los mutantes N35/3NQ, N192/3NQ y N200/3NQ, pero no al mutante N219/3Q, demostrando que este anticuerpo se unía a las regiones N35, N192 y N200 de PD-L1, pero no a N219 (FIG. 10B). Además, el análisis de inmunoelectrotransferencia que usa el lisado celular de cáncer de hígado también reveló un patrón diferencial de glucosilación de PD-L1 para un anticuerpo antiglucPD-L1 representativo tal como STM073 (FIG.
10C).
La relevancia histopatológica de estos MAb se demostró adicionalmente por tinción inmunohistoquímica (IHC). En un análisis de tinción de citoespín, los anticuerpos monoclonales antiglucPD-L1 reconocieron coherentemente y se unieron a la parte glucosilada de la proteína PD-L1, pero no a la proteína PD-L1 aglucosilada. En una muestra de paciente con cáncer de mama triple negativo humano, los anticuerpos monoclonales antiglucPD-L1 también mostraron tinción de membrana y citoplasma en una relación 1:30. Estos datos mostraron que los anticuerpos monoclonales antiglucPD-L1 se pueden usar en análisis de biomarcadores para la detección de PD-L1 glucosilado como biomarcador.
Ejemplo 8 Mapeo de epítopos de anticuerpos de unión a PD-L1 glucosilado
El mapeo de epítopos para el anticuerpo antiglucPD-L1 monoclonal de ratón STM073 se llevó a cabo por CovalX AG (Suiza). Para determinar la naturaleza del epítopo, por ejemplo, ya sea lineal o conformacional, reconocido por los anticuerpos antiglucPD PD-L1 en general, y el MAb STM073 en particular, se realizaron estudios para evaluar si la interacción entre las proteínas del antígeno de PD-L1 y los anticuerpos anti-PD-L1 se podrían inhibir por los péptidos no estructurados generados por la proteólisis del antígeno. Si los péptidos generados por la proteólisis completa del antígeno PD-L1 pueden inhibir la unión del antígeno por el anticuerpo, la interacción no se basa en la conformación, y el epítopo es lineal. Un ensayo de competición simple con una colección de péptidos solapantes generados de la secuencia del antígeno es suficiente para determinar la secuencia del epítopo. Como alternativa, si los péptidos generados por la proteólisis completa del antígeno de PD-L1 pueden inhibir la unión del antígeno por el anticuerpo, la conformación de la diana se determina necesaria para la interacción, y el epítopo es conformacional, por ejemplo, continuo (con una conformación especial tal como un bucle) o discontinuo (debido la estructura terciaria). Para dilucidar adicionalmente la unión a un epítopo conformacional, se empleó marcaje covalente, mapeo de péptidos y la espectrometría de masas de alta resolución.
Los ensayos de competición mostraron que los péptidos generados del antígeno de PD-L1 no inhibieron la unión del MAb STM073 al antígeno de PD-L1, confirmando que el epítopo de MAb STM073 es conformacional y no lineal. Usando reticulación química, la espectrometría de masas MALDI de masa elevada y la espectrometría de masas nLC-Orbitrap, se caracterizaron las superficies de interacción entre la proteína PD-L1 y los anticuerpos. Los ensayos de competición usando proteólisis con pepsina de PD-L1, mezcla de los péptidos PD-L1 generados por pepsina resultantes con los anticuerpos y la proteína PD-L1 intacta, y el análisis de la interacción de antígeno/anticuerpo por los métodos conocidos no mostraron inhibición detectable de la unión del anticuerpo monoclonal STM073 al antígeno de PD-L1 por los péptidos PD-L1. Por consiguiente, el epítopo en PD-L1 reconocido por el MAb STM073 anti-PD-L1 se determinó que es conformacional y no lineal. El epítopo del STM073 se determinó que incluye los residuos aminoacídicos H69, Y112, R113 y K124, que están subrayados en la secuencia que comienza con V68 y termina con V128 (con la región dentro de las posiciones 79 a 107 indicadas como guiones) VHGEEDLKVQH....... DAGVYRCMISYGGADYKRITV (SEQ ID NO: 85). Se descubrió que STM108 se unía a un epítopo dentro de la secuencia LKVQHSSYRQR.......EGYPKAEVIWTSSDHQ, que son los aminoácidos 74 a 84 y 158 a 173, respectivamente, de SEQ ID NO: 1, y contactan con los residuos S80, S81, K162 y S169 de SEQ ID NO. 1, dentro de los residuos 74 a 173 de SEQ ID NO: 1.
Ejemplo 9 Ensayo de destrucción de linfocitos T
Los ensayos de destrucción de linfocitos T se usaron para determinar la actividad citotóxica de los anticuerpos monoclonales antiglucPD-L1 como se describe en la presente memoria en células tumorales. El protocolo seguido es como sigue: En el día 0, el medio que contiene suero se retiró de los cultivos de células diana BT549 RFP que expresan PD-L1 de tipo silvestre (PD-L1 WT) glucosilado y se enjuagaron suavemente dos veces con PBS. Las células se recogieron y se contaron. La suspensión celular se centrifugó (1000 RPM, 4 minutos) y el sedimento celular se volvió a suspender en el medio de cultivo a 50.000 células/ml. Usando una pipeta multicanal manual, las células se sembraron (100 pl/pocillo, es decir, 5000 células/pocillo) en cada pocillo de una microplaca de fondo plano. La placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos y después se colocó en un aparato de imágenes de células vivas IncuCyte ZOOMTM donde se dejó equilibrar durante 20 minutos antes de programar la primera exploración. La exploración de repetición de veinticuatro horas (24 h) (objetivo 10x) se programó para cada 3 horas, comenzando la primera exploración inmediatamente. La confluencia celular se supervisó durante las siguientes 18 horas (durante la noche) hasta que se logró la confluencia deseada (por ejemplo, 20 %).
La siguiente mañana, el día del ensayo (es decir, día 1), una solución de 10 pM de reactivo de detección de fluorescencia verde de apoptosis de caspasa 3/7 lncuCyteTM (Essen BioScience 4440) se preparó en el medio de ensayo (concentración de ensayo final 4x de 2,5 pM) y se calentó hasta 37 °C en una estufa de incubación. Un tratamiento activador de anticuerpo anti-CD3 (100 ng/ml) IL-2 (10 ng/ml) de linfocitos T se preparó a una concentración de ensayo final de 4 x en el medio de ensayo y se calentó hasta 37 °C. También se prepararon los MAb de ensayo. La placa de células diana se retiró de la estufa de incubación y el medio se aspiró, teniendo cuidado de no dañar la capa celular. Usando una pipeta multicanal, 25 pl de la solución de caspasa 3/7 calentada se transfirió en cada pocillo. Después de ello, 25 pl del anticuerpo anti-CD3 IL-2 calentado, y los anticuerpos, se colocaron en los pocillos apropiados de la placa de células. Se añadieron 50 pl adicionales del medio que contenía las células efectoras (PBMC o linfocitos T totales) para formar un volumen de ensayo total de 100 pl. La placa de células sin burbujas se colocó en el instrumento IncuCyte ZOOMTM y se dejó equilibrar durante 20 minutos antes de la primera exploración. La exploración de repetición de 24 h se programó para cada 2-3 horas durante hasta 5 días. (Objetivo 10x; tipo de recipiente: Corning 3596; modo de exploración: convencional; patrón de exploración: 2 imágenes por pocillo; canal: fase "verde" (+ "rojo" si se usaban las células diana rojas NucLight™)).
Para el análisis, se cuantificó la apoptosis de células diana en el programa informático lncuCyte™ contando el número total de objetos fluorescentes verdes "grandes" (núcleo) en el campo de visión a lo largo del tiempo. La proliferación de las células diana se midió del recuento de objetos rojos, que corresponden al número de núcleos de glóbulos rojos. Los datos se expresaron como el número de objetos fluorescentes por mm2. Los datos mostraron que la adición de los anticuerpos como se describe en la presente memoria, específicamente STM073, potenciaron la destrucción de células tumorales (FIG. 11).
Ejemplo 10 Ensayo de unión
Para determinar si un anticuerpo monoclonal antiglucPD-L1 como se describe en la presente memoria inhibe específicamente la interacción de PD-1 y PD-L1, se llevó a cabo el siguiente ensayo de unión. En el día 0 del ensayo, el medio que contiene suero se retiró del cultivo de células diana BT549 que expresan PD-L1 y se enjuagó suavemente dos veces con D-PBS. Las células se recogieron y se contaron. La suspensión celular se centrifugó (1000 RPM, 5 minutos) y el sedimento celular se volvió a suspender en el medio de cultivo a 50.000 células/ml. Una pipeta multicanal manual se usó para sembrar las células (100 pl/pocillo, es decir, 5000 células/pocillo) en cada pocillo de una microplaca de fondo plano. La placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de ello, las placas que contenían las células se incubaron durante la noche en una estufa de incubación de CO2 al 5 %.
En el día 1 del ensayo (es decir, la siguiente mañana), el medio de cultivo que contenía 1 pg/ml de PD-1/Fc y una dilución 1:400 de IgG de cabra-Alexa Fluor 488 antihumano se preparó y se calentó a 37 °C en una estufa de incubación. La placa de células se retiró de la estufa de incubación y el medio se aspiró, teniendo cuidado de no dañar la capa celular. Se añadieron 50 pl del anticuerpo de ensayo a cada pocillo de manera dependiente de la dosis. Se añadieron 50 pl del medio de cultivo que contenía PD-1/Fc e IgG de cabra-Alexa Fluor 488 antihumano a cada pocillo. La placa de células se colocó en un instrumento IncuCyte ZOOMTM y se dejó equilibrar durante 20 minutos antes de la primera exploración. La exploración de repetición automatizada de 24 h (10x) se programó para cada 1-2 horas durante hasta 24 horas. Objetivo: 10x; tipo de recipiente: Corning 3596; modo de exploración: convencional; patrón de exploración: 4 imágenes por pocillo; canal: Fase "verde".
Las FIG. 12A y 12B muestran que los MAb STM073 y STM108 representativos inhibieron la unión de PD-1/Fc a las células que expresaban PD-L1 de una manera dependiente de la dosis. Los resultados del ensayo de control se muestran en la FIG. 12C.
Ejemplo 11 Ensayo de internalización de PD-L1
Para determinar si un anticuerpo monoclonal antiglucPD-LI promueve la internalización y degradación de PD-L1, las células A431 se incubaron en el medio sin suero durante la noche y después se incubaron con 10 pg del anticuerpo antiglucPD-L1 durante dos días. Las células entonces se recogieron, y PD-L1 en las células se evaluó por análisis de inmunoelectrotransferencia. La FIG. 13 muestra que la incubación con STM073 muestra un nivel reducido de PD-L1 en las células en comparación con el control (IgG).
La internalización celular de los MAb STM073 y STM108 se visualizó al marcar los anticuerpos con el tinte rojo pHrodo™ usando el equipo de marcaje de microescala pHrodo™ (ThermoFischer Scientific, Rochester, NY) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, para el análisis, las células se sembraron en tiempo 0, a las 24 horas después de la siembra, las células se incubaron con los MAb STM073 o STM108 marcados (5 pg/ml). Después de 1 hora, una exploración de imagen de las células comenzó usando un instrumento IncuCyte ZOOMTM con la exploración de repetición de 24 horas programada (10x) para cada 1 hora. Objetivo: 10x; tipo de recipiente: Corning 356407; modo de exploración: convencional; patrón de exploración; 3 imágenes por pocillo; canal; fase "rojo". FIG.
14A: Células BT549 de tipo silvestre (carcinoma ductal humano, línea de células de cáncer de mama) incubado con STM073; FIG. 14B: células BT 549 que sobreexpresan PD-L1 Wt (glucosilado) incubadas con STM073; FIG. 14C: células NCI-H226 (línea de células de cáncer de pulmón humano, mesotelioma escamocelular) incubadas con STM073; FIG. 14D: células MCF-7 (línea de células de cáncer de mama humano, adenocarcinoma) incubadas con STM073; y FIG. 14E: células BT 549 que expresan PD-L1 WT (glucosilado) incubadas con STM108.
Ejemplo 12 La unión de PD-L1 por anticuerpos antiglucPD-L1 promueve la internalización y degradación de PD-L1
Las FIG. 15A-15C proporcionan un ejemplo de internalización y degradación de PD-L1 a través del análisis de formación de imágenes de células vivas después de la unión de MAb STM108 antiglucPD-L1 a PD-L1 expresado en células BT549-PD-L1. En las FIG. 15A-15C, el anticuerpo anti-PD-L1 es STM108 conjugado con un tinte fluorescente rojo, pHrodo™ Red (éster succinimidílico (pHrodo™ Red, SE) usando el equipo de marcaje de microescala pHrodo™ Red (ThermoFisher Sclentific, Rochester, NY), como se describe anteriormente en el ejemplo 11. La tinción verde refleja las células teñidas con Verde DND-26 LysoTracker™, que es un tinte verde permeable celular que tiñe los compartimentos ácidos (lisosomas) en las células vivas formadas en imágenes a través de la formación de imágenes de células vivas. La FIG. 15A muestra que un primer punto temporal (tiempo 0), el anticuerpo STM108 se internaliza en las células como se observa por la tinción intracelular roja intensa de las células indicada por la flecha. La FIG. 15B muestra la tinción roja intracelular debilitada en las mismas células representada en la FIG. 15A, en el tiempo de 2 minutos después del tiempo 0 en la FIG. 15A. La FIG. 15C muestra la falta de tinción intracelular roja 4 minutos después de tiempo 0 en la FIG. 15A, que refleja la degradación del anticuerpo STM108 y/o el complejo de anticuerpoantígeno dentro de las células. Estas imágenes reflejan que un anticuerpo antiglucPD-L1 tal como MAb STM108 lleva a cabo la internalización y degradación de PD-L1 después de la unión a PD-L1 expresado en la superficie celular.
Ejemplo 13 Internalización de PD-L1 unido por anticuerpos antiglucPD-L1 en células tumorales frente a linfocitos T totales
Los anticuerpos antiglucPD-L1 se ensayaron para la capacidad de internalizarse en las células tumorales positivas a PD-L1 después de la unión de PD-L1 expresado en la superficie celular, en comparación con linfocitos T activados o no activados. Los anticuerpos antiglucPD-L1 STM004, STM073 y STM108, y la IgG de ratón como control se incubaron con los linfocitos T totales no activados de la sangre periférica, linfocitos T totales activados de sangre periférica y células NCI-H226, que expresan PD-L1. Para la activación de linfocitos T, los linfocitos T totales se mezclaron con microesferas, por ejemplo, microesferas superparamagnéticas inertes, covalentemente acopladas con los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (por ejemplo, ThermoFisher Scientific, Rochester, NY) en una relación 1:1 para estimular las células en una manera que imitara la estimulación por las células presentadoras de antígeno (Véase, por ejemplo, A. Trickett etal., 2003, J. Immunol. Methods, 275, Issues 1-2:251-255). Todos los anticuerpos se marcaron con pHrodo™ Red y la internalización se visualizó como se describe en el ejemplo 11. Las FIG. 16A-16D y FIG. 16E-16H muestran que ninguno de los anticuerpos ensayados se internalizó en los linfocitos T totales no activados o los linfocitos T totales activados. Las FIG. 16I-16L muestran que los MAb STM073 y STM108 de internalización, de función doble se internalizaron en las células NCI-H226 después de la incubación con estas células, como se evidencia por la tinción intracelular roja, en comparación con el anticuerpo de control marcado, mlgG (FIG. 161) y con el MAb STM004 no de internalización marcado (FIG. 16J), que no mostró tinción intracelular roja. Este ejemplo muestra que los anticuerpos antiglucPD-L1 de función doble se internalizan selectivamente en las células tumorales que expresan PD-L1 pero no se internalizan en los linfocitos T ya sea activados o no activados.
Ejemplo 14 Eficacia de ADC de PD-L1 en la destrucción de células tumorales y reducción del volumen del tumor
Se realizaron experimentos tanto in vitro como in vivo para evaluar la eficacia de un ADC que comprende un MAb antiglucPD-L1 humano, es decir, MAb STM108, acoplado a citotoxina MMAE en la destrucción tumoral y en reducir el volumen tumoral. El STM108-ADC comprende el MAb STM108 químicamente ligado mediante cisteínas a MC-vc-PAB-MMAE, como se describe en la presente memoria anteriormente, para el suministro específico de la carga útil de citotoxina MMAE a células tumorales o cancerosas que expresan PD-L1. Las propiedades físicas medidas del STM108-ADC (STM108-MC-vc-PAB-MMAE) son como sigue:
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En relación con este ejemplo, las FIG. 17A-17D presentan los resultados de los experimentos realizados para evaluar la eficacia de STM108-ADC en la destrucción de células tumorales que expresan PD-L1 y que no expresan PD-L1 y en reducir el volumen de los tumores en los ratones injertados con tumor en comparación con los controles. (IgG y MAb STM108 solos). La FIG. 17A muestra el % de viabilidad de las células tumorales MDA-MB231 que expresan PD-L1 (línea de células de cáncer de mama humano) ("MB231") después de la exposición a diferentes concentraciones (nM) de STM108-ADC (círculos negros rellenos) en comparación con el % de viabilidad de las células MB231 manipuladas molecularmente para atenuar su expresión de PD-L1 ("MB231 PDL1 KO") después de la exposición a diferentes concentraciones de STM108-ADC, es decir, "ADC108" (cuadrados negros rellenos). Como se observa, la viabilidad de las células MB231 que no expresaban PD-L1 en su superficie no se vio afectada significativamente por STM108-ADC a una concentración más alta, mientras que la viabilidad de las células MB231 que expresaban PD-L1 se redujo significativamente, particularmente en concentraciones de STM108-ADC 1 nM hasta 100 nM. En la FIG.
17B, se usó un modelo de ratón MDA-MB231 de cáncer de mama en el que los animales injertados con los tumores derivados de las células MB231 se trataron con un control de IgG-MMAE (100 pg); con STM108-ADC a 50 pg, a 100 pg o a 150 pg; o con MAb STM108 solo (100 pg). Los resultados mostraron que el volumen tumoral se redujo de manera eficaz en los animales que portaban tumor tratados con STM108-ADC en todos los niveles de dosis, así como, en algún grado, con MAb STM108 (100 pg), en comparación con los animales tratados con el control de IgG-MMAE. Además, se encontró sorprendentemente que la remisión completa ("CR") se presentó en 3 de 5 (3/5) animales tratados con STM108-a Dc (100 pg) y en 4 de 5 (4/5) animales tratados con STM108-ADC (150 pg) en aproximadamente el día 18.
La FIG. 17C muestra el % de viabilidad de las células de carcinoma de mama 4T1 manipuladas molecularmente para expresar PD-L1 humano en la superficie celular ("4T1 hPDL1") después de la exposición a diferentes concentraciones (nM) de STM108-ADC (círculos rojos vacíos) en comparación con el % de viabilidad de las células 4T1 que no expresaban de forma natural PD-L1 ("4T1") después de la exposición a diferentes concentraciones de STM108-ADC, es decir, "ADC108" (cuadrados rojos vacíos). Como se observa, la viabilidad de las células 4T1 que no expresaban PD-L1 en su superficie no se vio afectada significativamente por STM108-ADC incluso en la concentración más alta, mientras que la viabilidad de las células 4T1 que expresaban PD-L1 se redujo en las concentraciones de STM108-ADC de más que 10 nM a 100 nM.
Se usaron modelos de ratón singénicos 4T1 de cáncer de mama en que los animales (ratones Balb/c) se injertaron con tumores derivados de células de carcinoma de mama 4T1 que se habían manipulado molecularmente para expresar PD-L1 o la superficie celular ("4T1 hPD-L1"), o en que los ratones Balb/c se injertaron con tumores derivados de células de carcinoma de mama 4T1 no transfectado que no expresaba de forma natural PD-L1 en la superficie celular ("4T1"). Todos los procedimientos con los ratones BALB/c (hembras de 6 a 8 semanas de edad; Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, EE. UU.) se realizaron bajo las directrices aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en MD Anderson. Los ratones se dividieron de acuerdo con el volumen tumoral medio en cada grupo. Las células 4T1 (1 x 105 células en 25 pl de medio mezclado con 25 pl de Matrixgel Basement Membrane Matrix [BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.]) se inyectaron en la almohadilla de grasa mamaria. El control de IgG-MMAE (100 pg), MAb STM108 (100 pg), o STM108-ADC (150 pg) se inyectaron por vía intraperitoneal en los días 3, 5, 7, 9, 11 y 13 después de la inoculación de células tumorales de los ratones. Los tumores se midieron cada 3 días con un calibre, y el volumen tumoral se calculó usando la siguiente fórmula: n/6 x longitud x anchura2.
Como se observa en la FIG. 17D, en los animales que portan tumores derivados de 4T1 que tienen poco o nada de expresión de PD-L1 de superficie celular (círculos vacíos/líneas de puntos), los resultados mostraron que el volumen tumoral se incrementó a lo largo del tiempo para todos los tipos de tratamiento, es decir, control de IgG-MMAE, MAb STM108 o STM108-ADC. En los animales que portaban tumores derivados de células 4T1 que expresan PD-L1 y tratados con el control de IgG-MMAE, el volumen tumoral en los animales tratados también se incrementó a lo largo del tiempo (círculos negros rellenos). En contraste, en los animales que portaban tumores derivados de células 4T1 que expresan PD-L1 y tratados con MAb STM108 (círculos azules rellenos) o con STM108-ADC (círculos rojos rellenos), se redujo de manera eficaz el volumen tumoral. Además, se encontró sorprendentemente que la remisión completa ("CR") se presentó en 5 de 7 (5/7) animales tratados con STM108-ADC en aproximadamente el día 21.
Los aspectos antineoplásicos y terapéuticos beneficioso y eficaces relacionados con el uso de un ADC que comprende un MAb antiglucPD-L1 como se describe en la presente memoria anteriormente, tal como STM108, en el tratamiento de cánceres, por ejemplo, dos tipos de tumores de mama, se destacan por los resultados in vivo que muestran la reducción significativa en el volumen tumoral y la remisión completa de los tumores en los animales que se han tratado con el ADC de MAb antiglucPD-L1 en de 25 días después del tratamiento, por ejemplo, en aproximadamente 15-23 días.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo quimérico o humanizado aislado que se une específicamente a PD-L1 glucosilado,
en el que el anticuerpo comprende un dominio Vh que comprende una CDR H1 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR H2 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y una CDR H3 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o un dominio Vh que comprende una CDR H1 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, una CDR H2 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una CDR H3 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio Vl que comprende una CDR L1 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, una CDR L2 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y una CDR L3 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o
en el que el anticuerpo comprende un dominio Vh que comprende una CDR H1 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, una c Dr H2 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y una CDR H3 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 o un Vh que comprende una CDR H1 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, una CDR H2 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una CDR H3 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y un dominio Vl que comprende una CDR L1 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, una CDR L2 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y una CDR L3 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
2. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende un dominio Vh que comprende una CDR H1 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR H2 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y una CDR H3 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o un dominio Vh que comprende una CDR H1 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, una CDR H2 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una CDR H3 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio Vl que comprende una CDR L1 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, una CDR L2 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y una CDR L3 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
3. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende un dominio Vh que comprende una CDR H1 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, una CDR H2 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y una CDR H3 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 o un Vh que comprende una CDR H1 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, una CDR H2 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una CDR H3 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y un dominio Vl que comprende una CDR L1 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, una CDR L2 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y una CDR L3 con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
4. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en el que el dominio Vh tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y el Vl tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
5. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en el que el dominio Vh tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y el dominio Vl tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, que tiene opcionalmente un dominio constante humano.
6. Un anticuerpo aislado de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende un dominio VH codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos un 90 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o 18, y/o un dominio Vl codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos un 90 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 10 o 26.
7. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 y 10 o 18 y 26.
8. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio Vh y un dominio Vl de un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
9. Una composición que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo, diluyente, excipiente o medio farmacéuticamente aceptable.
10. El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o una composición de acuerdo con la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento de un cáncer positivo a PD-L1.
11. El anticuerpo aislado o una composición para el uso de la reivindicación 10, en el que el cáncer positivo a PD-L1 es un cáncer de mama, un cáncer pulmonar, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de próstata, un cáncer esofágico, un cáncer traqueal, un cáncer de la piel, un cáncer cerebral, un cáncer hepático, un cáncer de vejiga, un cáncer de estómago, un cáncer pancreático, un cáncer de ovario, un cáncer uterino, un cáncer cervicouterino, un cáncer testicular, un cáncer de colon, un cáncer rectal, un cáncer hemático o un cáncer de la piel.
12. El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticuerpo se conjuga con un agente antineoplásico, tal como un agente que inhibe la polimerización de la tubulina, para producir un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC).
13. El anticuerpo aislado de la reivindicación 12, en el que el agente es un maitansinoide o una auristatina, en el que, por ejemplo, el maitansinoide es DM1 (N2'-desacetil-N2'-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina) o DM4 (N2'-desacetiln2'-(4-mercapto-4-metil-1 -oxopentil)-6-metilmaitansina en el que, por ejemplo, la auristatina es monometilauristatina E (MMAE) o monometilauristatina F (MMAF).
14. El anticuerpo aislado de la reivindicación 13, en el que el anticuerpo se conjuga químicamente con un grupo de fijación de maleimida y ácido caproico (MC), que se conjuga químicamente a un conector escindible con catepsina, que se conjuga químicamente con un espaciador de ácido paraminobenzoico (PAB), que se conjuga químicamente con MMAE, formando de ese modo el ADC, en el que el conector escindible con catepsina es opcionalmente valinacitrulina (vc).
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